KR20220044493A - 산필립포병 및 기타 장애의 치료를 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

산필립포병 및 기타 장애의 치료를 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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카렌 피그네-아이아쉬
미샤엘 호크밀러
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    • C12Y310/01—Hydrolases acting on sulfur-nitrogen bonds (3.10) acting on sulfur-nitrogen bonds (3.10.1)
    • C12Y310/01001—N-Sulfoglucosamine sulfohydrolase (3.10.1.1)

Abstract

본 개시내용은 유전자 요법 벡터 및 상기 벡터를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 방법을 포함한, 유전적 질환, 뇌 장애, 및 신경계 질환 및 장애를 치료하는 데 유용한 신규한 벡터 및 방법을 제공한다.

Description

산필립포병 및 기타 장애의 치료를 위한 조성물 및 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 7월 18일에 출원된 미국 가출원 번호 62/875,809에 대한 우선권을 주장하며, 상기 출원의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원과 연관된 서열 목록은 종이 사본 대신에 텍스트 형식으로 제공되며, 본원에 명세서에 참조로 포함된다. 서열 목록을 함유하는 텍스트 파일명은 LYSO-003_01WO_SeqList_ST25.txt이다. 텍스트 파일은 약 86 KB이며, 2019년 7월 17일에 생성되었으며, EFS-Web을 통해 전자적으로 제출된 것이다.
배경
분야
일부 실시양태에서, 본 발명은 리소좀 축적 장애(lysosomal storage disorder), 및 뇌 질환 및 장애를 포함한, 유전적 질환(genetic disease)의 치료에서, 유전자 요법 벡터(vector), 뿐만 아니라 이러한 유전자 요법 벡터를 단독으로 또는 1종 이상의 면역억제제와 조합하여 사용하는 방법에 관한 것이다.
관련 기술의 설명
산필립포 증후군(Sanfilippo syndrome)이라고도 칭해지는 제3형 뮤코다당증(Mucopolysaccharidosis type III) (MPSIII)은 뮤코다당증 (MPS) 군에 속하는 희귀 리소좀 축적 질환(lysosomal storage disease) (LSD)이다. 이들 리소좀 축적 질환 (LSD)은 결손(missing) 또는 기능장애 소화 단백질에 의해 유발되며, 이는 세포에 기질의 후속적인 축적을 야기하여, 매우 심각한 세포 및 기관 기능장애를 야기한다. 뮤코다당류 또는 글리코사미노글리칸 (GAG)은 정상적인 세포 기능에 필수적으로 중요한 지속적으로 재활용되는 거대분자이다. MPS에서, GAG의 단계적 분해에 참여하는 리소좀 효소 중 하나의 결핍은 이의 축적을 야기하고, 심각한 세포 기능장애를 결과한다. MPS는 이의 유전적 기점, 생화학적 및 생리학적 장애 및 임상 징후(clinical manifestation)가 상이한 유전적 질환의 복잡한 군을 형성한다. 돌연변이된 유전자에 따라, 하나 또는 몇몇 유형의 GAG의 이화작용이 차단될 것이고, 일부 효소는 다수의 GAG 종의 분해 경로에 관여한다.
제3형 뮤코다당증 (MPSIII)은 100,000명 정상 출산당 0.7 내지 1.8명 (프랑스에서 0.73명, 영국에서 1.7명)에 영향을 미치고 상염색체 열성 유전적 결함이 헤파란 술페이트의 부분적으로 분해된 올리고사카라이드의 축적을 결과하는 희귀 리소좀 축적 질환이다.
A형 산필립포 증후군(Sanfilippo type A syndrome) 또는 제3형 A형 뮤코다당증 (Mucopolysaccharidosis type III type A) (MPSIIIA)은 N-술포글리코사민 술포히드롤라제 (SGSH)의 상염색체 열성 유전적 결함에 의해 유발된다. 이 효소는 조직에서 편재적으로 발현되며 헤파란 술페이트 (HS)의 단계적 분해에 관여된다. 그것이 없으면, 부분적으로 분해된 올리고사카라이드가 독성 수준으로 축적된다.
A형 산필립포 증후군은 아동에게 영향을 미치는 심각한 쇠약 및 생명을 위협하는 리소좀 축적 질환이다. 임상 징후는 대개 생후 5년 동안 관찰되는 초기 증상을 가진 주로 신경계에 있어, 인지 능력의 점진적인 저하를 야기한다. 영향을 받은 아동은 초기 아동기에 특별한 보살핌을 필요로 하며 최소한의 신체 징후로 극심한 정신 지체가 점진적으로 발전한다 [1]. 사망은 대개 15세 이전에 발생하긴 하지만 일부 환자는 20세 이후에도 여전히 살아 있다. 현재 A형 산필립포 증후군을 가진 환자에 대한 이용가능한 어떤 치료법도 없다.
MPS에서 치료적 접근의 근거는 결손(missing) 효소의 전달이 유전적으로 결핍(deficient) 세포의 표현형 이상(phenotypic abnormalities)을 역전시킨다는 관찰을 기반으로 한다. MPS 효소 치환 치료는 만노스-6-포스파제 수용체에 대한 결합을 통해, 결핍 세포에 의한 세포외 효소의 내재화에 의존한다. 효소 대체 요법 (ERT)이 탐구 중이나, 현재 MPSIIIA에 이용가능하지 않다.
MPS는 유전자 요법의 주요 후보 질환으로서 인식되어 왔다. 생체외 또는 계내 유전자 전달을 사용하여, 결손 효소가 생성되어 유전적으로 변형된 세포의 군에 의해 유기체에 배포될 수 있다. MPS의 동물 모델에서 수많은 연구는 치료 활성 효소의 생성을 결과하는, 골수, 피부, 근육, 간 및 뇌를 포함한 조직의 유전적 변형의 효과를 기재하였다. 그러나, 벡터가 말초에서 투여되는 경우, 생성된 효소는 혈액-뇌 장벽을 통과하지 않는다. 순환계에서 단지 매우 높은 용량의 효소가 뇌로 검출가능한 수송을 결과할 수 있다. 유전자 요법 방법의 이러한 단점은 MPS에 제한되지는 않으나, 기타 뇌 질환 및 장애를 치료하기 위한 유전자 요법의 용도를 제한한다.
따라서, MPS 및 뇌에 영향을 미치는 기타 질환 및 장애의 치료를 위해 뇌로의 직접 투여를 제공하는 유전자 요법 벡터 및 방법이 관련 기술분야에 분명히 필요하다. 본 발명은 일반적으로 유전적 질환 및 신경계 질환(neurological disease) 및 뇌 질환 및 장애, 보다 구체적으로 A형 산필립포를 포함한 MPS의 치료에 적용가능한, 개선된 유전자 요법 벡터, 뿐만 아니라 기타 개선된 방법을 제공함으로써 이들 필요성을 해결한다.
본 개시내용은 유전자 요법 벡터를 포함하여, 유전적 질환, 뇌 장애, 및 신경계 질환 및 장애를 치료하는데 유용한 신규한 벡터 및 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 개시내용은, 다음 5'에서 3' 순서로: 프로모터 서열(promoter sequence); 인간 N-술포글루코사민 술포히드롤라제 (SGSH) 폴리펩티드 또는 이의 활성 변이체(active variant)를 암호화(encoding)하는 폴리뉴클레오티드 서열; 및 폴리아데닐화 (폴리 A) 서열을 포함하는 발현 카세트(expression cassette)를 포함하는 복제 결핍성 아데노-연관 바이러스 (AAV)-유래 벡터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 인간 술파타제-변형 인자 1 (SUMF1) 폴리펩티드, 또는 이의 임의의 활성 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, 프로모터 서열은 인간 N-술포글루코사민 술포히드롤라제 폴리펩티드, 또는 이의 활성 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 인간 N-술포글루코사민 술포히드롤라제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호: 13에 따른 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 프로모터 서열은 CMV 조기 인핸서(early enhancer)/닭 β 액틴 (CAG) 프로모터이다. 일부 실시양태에서, CAG 프로모터는 서열번호: 12에 따른 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 IRES 서열을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 폴리 A 서열은 인간 성장 호르몬 1 폴리 A 서열로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 폴리 A 서열은 서열번호: 17에 따른 서열을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 벡터는 AAV 혈청형 rh10이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 서열번호: 9에 따른 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열번호: 9는 LYS-SAF302 입자에서 캡시드화된 DNA의 서열을 포함한다.
벡터의 특정 실시양태에서, 발현 카세트는 다음 5'에서 3' 순서로: CAG 프로모터 서열로부터 유래된 프로모터 서열; 인간 N-술포글루코사민 술포히드롤라제 (SGSH) 폴리펩티드 또는 이의 활성 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열; 및 인간 성장 호르몬 폴리 A 서열로부터 유래된 폴리 A 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 벡터의 특정한 실시양태에서, 발현 카세트는 2개의 AAV2 역위 말단 반복체(inverted terminal repeat) (ITR) 서열에 의해 플랭킹(flanking)되고, 여기서 2개의 AAV2 ITR 서열 중 하나는 발현 카세트의 5'에 위치하고 2개의 AAV2 ITR 서열 중 하나는 발현 카세트의 3'에 위치한다. 일부 실시양태에서, 2개의 ITR 말단은 게놈 복제 및 패키징에 필요한 유일한 시스-작용 요소이다. 일부 실시양태에서, 각각의 ITR은 약 100, 약 110, 약 120, 약 130, 약 140, 약 145, 약 150, 또는 약 160개의 뉴클레오티드를 함유한다. 일부 실시양태에서, 발현 카세트의 5' 말단에 위치한 ITR 서열은 서열번호: 10에 따른 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 발현 카세트의 3' 말단에 위치한 ITR 서열은 서열번호: 11에 따른 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정한 실시양태에서, 벡터는 AAVrh.10 캡시드 또는 혈청형을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 벡터의 DNA는 4.07 kb를 포함하거나 이로 이루어지고 서열 분자량은 1257.4 kDa이다. 일부 실시양태에서, SGSH 서열은 1.35 kb를 포함하거나 이로 이루어지고 SGSH DNA의 분자량은 471.3 kDa이다.
관련 실시양태는 본원에 기재된 발현 카세트 및 본원에 기재된 발현 카세트를 포함하는 플라스미드 중 임의의 것을 포함한다. 추가의 관련된 실시양태는 본원에 기재된 플라스미드 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 숙주 세포는 생체외이다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 293 세포, 예컨대 293T 세포이다.
또 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 2개의 AAV2 내부 말단 반복체 (internal terminal repeat; ITR) 서열에 의해 플랭킹된 본원에 기재된 발현 카세트를 포함하는 플라스미드를 숙주 세포에 도입하며, 상기 숙주 세포를 배양하여 본원에 기재된 벡터를 제조하는 것을 포함하는, 본 개시내용에 따른 벡터를 제조하는 방법 또는 공정을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 발현 카세트는 다음 5'에서 3' 순서로: 프로모터 서열; 인간 N-술포글루코사민 술포히드롤라제 (SGSH) 폴리펩티드 또는 이의 활성 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열; 및 폴리아데닐화 (폴리 A) 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 특정 실시양태에서, 상기 방법 또는 공정은 헬퍼 플라스미드를 상기 숙주 세포에 도입하는 것을 추가로 포함한다. 특정한 실시양태에서, 상기 헬퍼 플라스미드는 예를 들어, AAVrh.10으로부터의 캡시드 단백질; 예를 들어, AAV2로부터의 복제 유전자; 및 예를 들어, 아데노바이러스 혈청형 5로부터 유래된 헬퍼 기능을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 3개의 플라스미드의 사용을 포함하는, 본 개시내용에 따른 벡터를 제조하는 방법 또는 공정을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 플라스미드는 다음 5'에서 3' 순서로: 프로모터 서열, 인간 SGSH 폴리펩티드 또는 이의 활성 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 및 폴리아데닐화 서열을 포함하거나 이로 이루어진 발현 카세트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 발현 카세트는 2개의 AAV ITR 서열에 의해 플랭킹된다. 일부 실시양태에서, 발현 카세트 및 플랭킹 서열은 함께 서열번호: 9에 따른 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 제1 플라스미드는 서열번호: 14에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하거나 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 제2 플라스미드는 캡시드 단백질, 예를 들어 AAVrh10으로부터의 캡시드 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 플라스미드는 서열번호: 15에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제3 플라스미드는 헬퍼 기능, 예를 들어, 아데노바이러스로부터 유래된 헬퍼 기능을 제공한다. 일부 실시양태에서, 제3 플라스미드는 서열번호: 16에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법 및 공정은 숙주 세포에 제1, 제2, 및 제3 플라스미드를 도입하는 것을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법 및 공정은 숙주 세포에 서열번호: 14, 15, 및 16에 따른 서열을 포함하는 플라스미드를 도입하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 플라스미드를 숙주 세포에 도입하여 숙주 세포를 배양하여 본원에 기재된 벡터를 생성한다. 일부 실시양태에서, 생성된 벡터는 SAF302 (본원에서 LYS-SAF302로도 지칭됨)라고 칭해진다.
추가의 관련된 실시양태는 본원에 기재된 벡터 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 제공된 벡터 및 어떤 부형제 또는 보존제도 없는 PBS 완충제를 포함하는 제제를 제공한다. 일부 실시양태에서, PBS 완충제는 KCl, KH2PO4, 및 NaCl, Na2HPO4를 포함한다. 추가 실시양태에서, PBS 완충제는 약 2.67 mM KCl, 약 1.47 mM KH2PO4, 약 137.9 mM NaCl, 및 약 8.05 mM Na2HPO4를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제제는 약 6.8 내지 약 7.8, 또는 약 7.0 내지 약 7.6, 또는 약 7.2 내지 약 7.4의 pH를 갖는다. 일부 실시양태에서, 제제는 -80℃ ± 10℃에서의 저장에 적합하다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 제제는 대상체(subject)에게 투여하기 전에 0.2 마이크로미터 인라인 필터를 통해 여과된다.
본 개시내용의 또 다른 관련된 실시양태는 본원에 기재된 벡터를 포함하는 조성물을 A형 산필립포 증후군의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, A형 산필립포 증후군을 치료하는 방법을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 벡터는 다음 5'에서 3' 순서로: AAV2 ITR 서열; CAG 프로모터 서열; 인간 N-술포글루코사민 술포히드롤라제 (SGSH) 폴리펩티드 또는 이의 활성 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열; 및 인간 성장 호르몬 폴리 A 서열을 포함하거나 이로 이루어진 발현 카세트를 포함하며; 여기서 CAG 프로모터 서열은 SGSH 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된다. 특정 실시양태에서, 발현 카세트는 SUMF1 폴리펩티드, 또는 이의 임의의 활성 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 발현 카세트는 2개의 AAV2 내부 말단 반복체 (ITR) 서열에 의해 플랭킹된다.
이 방법의 특정한 실시양태에서, 조성물은 대상체의 뇌 내의 하나 이상의 부위에 뇌내 주사(intracerebral injection)를 통해 투여된다. 특정 실시양태에서, 조성물은 대상체의 뇌에서 2개 내지 20개 부위, 4개 내지 16개 부위, 8개 내지 16개 부위, 또는 6개 내지 12개 부위에 투여된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 조성물은 대상체당 총 4-8회 주사를 위해, 반구(hemisphere)당 2-4회 주사를 통해 대상체의 뇌에 투여된다. 한 실시양태에서, 조성물은 대상체의 뇌 내의 6개 부위에 투여된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 반구당 3개의 부위에 투여된다. 특정 실시양태에서, 조성물은 대상체의 머리에 하나 이상의 두개 천공(burr hole), 예를 들어 대상체의 머리에 6개의 두개 천공을 통한 주사를 통해 투여되며, 여기서 조성물은 단일 깊이(single depth)에서 각각의 두개 천공 또는 트랙(track)을 통해 투여된다. 각각의 주사 부위는 심부(deep) 또는 표피상(superficial)일 수 있다. 예를 들어, 심부 주사(deep injection)는 피질(cortical) 표면으로부터 약 1.5 cm 내지 약 3.0 cm, 또는 약 1.7 cm 내지 약 2.5 cm, 또는 약 2 cm의 깊이에서 수행되며; 표피상 주사는 피질 표면으로부터 약 0.5 cm 내지 약 2.0 cm, 또는 약 0.7 cm 내지 약 1.5 cm, 또는 약 1 cm의 깊이에서 수행된다. 특정 실시양태에서, 부위는 전방 우측 표피상, 전방 우측 심부, 전방 좌측 표피상, 전방 좌측 심부, 내측 우측 표피상, 내측 우측 심부, 내측 좌측 표피상, 내측 좌측 심부, 후방 우측 표피상, 후방 우측 심부, 후방 좌측 표피상, 및 후방 좌측 심부 중 하나 이상으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, 총 약 1.0x1010 gc 내지 약 1.0x1014 gc, 약 5.0x1010 gc 내지 약 5.0x1013 gc, 약 5.0x1010 gc 내지 약 1.0x1013 gc, 약 1.0x1011 gc 내지 약 1.0x1013 gc, 약 1.0x1011 gc 내지 약 5.0x1012 gc, 약 5.0x1011 gc 내지 약 5.0x1012 gc, 또는 약 5x1010 내지 약 5x1013 gc, 또는 약 7x1010 내지 약 7x1013 gc의 바이러스 벡터가 대상체에게 투여된다. 특정 실시양태에서, 총 약 7.2 x 1012 gc의 바이러스 벡터가 대상체에게 투여된다. 특정 실시양태에서, 약 0.8x109 gc 내지 약 0.8x1013 gc, 약 0.4x1010 gc 내지 약 0.4x1013 gc, 약 0.4x1010 gc 내지 약 0.8x1012 gc, 약 0.8x1010 gc 내지 약 0.8x1012 gc, 약 0.8x1010 gc 내지 약 0.4x1012 gc, 또는 약 0.4x1011 gc 내지 약 0.4x1012 gc의 바이러스 벡터가 대상체의 각각의 부위에 투여된다. 특정한 실시양태에서, 약 1.2x1012 gc의 바이러스 벡터가 대상체의 각각의 부위에 투여된다. 특정한 실시양태에서, 약 1.2x1012 gc의 바이러스 벡터는 약 7.2x1012 gc의 바이러스 벡터가 대상체에게 투여되도록 대상체의 뇌 또는 백질의 6개 부위 각각에 투여된다. 특정 실시양태에서, 각각의 부위에 투여되는 유전자 요법 벡터를 포함하는 조성물의 부피는 약 10 μl 내지 약 600 μl이다. 일부 실시양태에서, 각각의 부위에 투여되는 유전자 요법 벡터를 포함하는 조성물의 부피는 약 500 μl이다. 특정한 실시양태에서, 유전자 요법 벡터를 포함하는 조성물의 투여를 위한 주입 속도는 약 0.1 μl/분 내지 약 10 μl/분, 약 0.2 μl/분 내지 약 8 μl/분, 약 0.3 μl/분 내지 약 6 μl/분, 또는 약 0.4 μl/분 내지 약 4.0 μl/분, 또는 약 0.4 μl/분 내지 약 3.0 μl/분, 또는 약 5.0 μl/분이다. 일부 실시양태에서, 방법은 면역억제 요법(immunosuppressive regimen)을 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역억제 요법은 타크롤리무스, 미코페놀레이트 모페틸, 및 프레드니손을 포함한다.
관련된 실시양태에서, 본 개시내용은 A형 산필립포 증후군 치료에서 의약(medicament)으로서 사용하기 위한 본원에 기재된 벡터를 포함한다. 특정한 실시양태에서, A형 산필립포 증후군 치료에서 의약으로 사용하기 위한 벡터는 다음 발현 카세트를 5'에서 3' 순서로 포함하며, 여기서 CAG 프로모터 서열은 SGSH를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된다: AAV2 ITR 서열; CAG 프로모터 서열; 인간 N-술포글루코사민 술포히드롤라제 (SGSH) 폴리펩티드 또는 이의 활성 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열; 인간 성장 호르몬 폴리 A 서열; 및 AAV2 ITR 서열. 의약으로서 사용하기 위한 벡터는 본원에 제공된 방법을 통한 투여를 위한 것이다.
A형 산필립포 증후군 치료에서 의약으로서 사용하기 위한 벡터의 특정한 실시양태에서, 의약은 제약상 허용되는 지지체, 담체, 희석제, 또는 부형제를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 의약은 에멀젼 또는 수용액이다. 특정 실시양태에서, 의약은 어떤 부형제 또는 보존제도 갖지 않는 완충제를 포함한다. 추가 실시양태에서, 완충제는 PBS 완충제이다.
관련된 실시양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 발현 카세트를 포함하는 플라스미드를 숙주 세포에 도입하고; 숙주 세포를 배양하여 벡터를 제조하는 것을 포함하는, 본 개시내용의 벡터를 제조하는 방법을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 플라스미드는 발현 카세트를 플랭킹하는 AAV2 ITR을 추가로 포함한다.
추가의 관련된 실시양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 발현 카세트를 포함하는 플라스미드를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 플라스미드는 발현 카세트를 플랭킹하는 AAV2 ITR을 추가로 포함한다.
또 다른 관련된 실시양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 벡터, 플라스미드, 또는 발현 카세트를 포함하는 숙주 세포를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 숙주 세포는 인간 배아 신장 세포, 예를 들어 293 또는 293T 세포이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 (a) 본원에 제공된 플라스미드를 포함하는 벡터 및 (b) 이의 사용설명서를 포함하는 키트(kit)를 제공한다. 일부 실시양태에서, 키트는 플라스미드를 포함하는 벡터를 포함하며, 여기서 플라스미드는 본원에 제공된 바와 같은 발현 카세트를 포함하고 AAV2 ITR을 추가로 포함한다.
게다가, 본원에 기재된 방법 및 용도 중 임의의 것은 SGSH 폴리펩티드 또는 이의 변이체의 발현의 증가를 필요로 하는 대상체에서 SGSH 폴리펩티드 또는 이의 변이체의 발현을 증가시키는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 및 용도는 SGSH 활성의 증가 및/또는 회복을 필요로 하는 대상체의 뇌에서 SGSH 활성을 증가 및/또는 회복시킨다. 일부 실시양태에서, 방법 및 용도는 대상체의 뇌에서의 정상 SGSH 활성의 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 또는 그 초과를 회복시킨다.
도 1은 1세대 LYS-SAF301 유전자 요법 벡터인 아데노 연관 바이러스(Adeno Associated Virus) 벡터 구축물의 개략도이다. 이 도면에서, AAV2 ITR은 AAV2 내부 말단 반복체를 지칭하고, muPGK는 뮤린의 포스포글리세롤 키나제 프로모터를 지칭하고, SGSH는 인간 N-술포글루코사민 술포히드롤라제를 지칭하고, EMCV ires는 뇌심근염(encephalomyocarditis) 바이러스 ires를 지칭하고, SUMF1은 인간 술파타제-변형 인자 1을 지칭하고, BGHp는 소 성장 인자 폴리 A를 지칭한다.
도 2a는 1세대 LYS-SAF301 유전자 요법 벡터의 생성에 사용되는 pAVV-PGK-HMPS3A 플라스미드의 개략도이다. 이 도면에서, ITR은 내부 말단 반복체를 지칭하고, PGK는 포스포글리세롤 키나제 프로모터를 지칭하고, SGSH는 인간 N-술포글루코사민 술포히드롤라제를 지칭하고, SUMF1은 인간 술파타제-변형 인자 1를 지칭하고, IRES는 내부 리보솜 진입 부위를 지칭하고, KanR은 카나마이신 내성을 지칭한다.
도 2b는 pPAK-MARH10 헬퍼 플라스미드의 개략도이다. 이 도면에서, AAV2 rep 유전자는 AAV2의 복제를 위한 유전자를 지칭하고, AAVrh10 cap 유전자는 AAV 레서스(rhesus) 10 캡시드를 코딩하는 유전자를 지칭하고, MMTV 프로모터는 마우스 유방 종양 바이러스 프로모터를 지칭하고, KanR은 카나마이신 내성을 나타내고, Ad5 E4 유전자는 아데노바이러스 5 E4 유전자를 지칭한다.
도 3은 LYS-SAF302 발현 카세트 및 플랭킹 서열의 개략도이다.
도 4a 및 4b는 LYS-SAF302 입자에 캡시드화된 DNA의 서열 (서열번호: 9)을 나타낸다. 도 4c 내지 도 4d는 플라스미드 p-LYS-SAF-T5의 전체 서열 (서열번호: 14)을 나타낸다. 도 4c 및 4d에, ITR, CAG 프로모터, SGSh에 대한 cDNA, 폴리 A 부위, 및 AmpR 유전자가 표시되어 있다. 도 4e 내지 도 4f는 캡시드 rh10 (pAAV2-rh10; 서열번호: 15) 서열을 함유하는 플라스미드의 서열을 나타낸다. 도 4e 및 4f에, 플라스미드의 AAV2 REP, CAP1, Lac O, ColE1 기점, AmpR, F1 기점, 및 Lac α 성분이 표시되어 있다. 도 4g 내지 도 4k는 헬퍼 플라스미드 pHGTI, 즉, 아데노바이러스의 헬퍼 기능을 가진 플라스미드의 서열 (서열번호: 16)을 나타낸다. 도 4g 내지 도 4k에, 플라스미드의 VA, Rads, E4, L5, E2A, AmpR, 및 ColE1 기점 성분이 표시되어 있다.
도 5는 주사 후 4주차에 MPSIIIA 마우스의 모든 뇌 영역에 걸친 SGSH 활성에 대한 LYS-SAF301 및 LYS-SAF302의 효과를 나타낸다. 데이터는 WT 수준 ± SEM에 대한 평균 % SGSH 활성이며; ****p < 0.0001, **p < 0.01 및 ns=유의하지 않음이며 오버헤드 막대로 표시되지 않는 한 WT에 대해 유의성을 제공한다.
도 6은 주사 후 4주차에 MPS IIIA 마우스의 모든 뇌 영역에 걸친 총 HS의 양에 대한 LYS-SAF301 및 LYS-SAF302의 효과를 나타낸다. AMAC-표지 디사카라이드의 RP-HPLC로부터 피크 면적 정량 후에 모든 뇌 영역 (영역 1 내지 5의 평균)에서 HS의 평균 상대량. 데이터는 평균 ± SEM이며; WT에 대해 * p < 0.05 유의성.
도 7a-e는 주사 후 4주차에 MPS IIIA 마우스의 모든 뇌 영역에 걸친 염증성 시토카인의 양에 대한 LYS-SAF301 및 LYS-SAF302의 효과를 나타낸다. 모든 뇌 영역에 대한 CBA 플렉스(flex) 세트에 의해 측정한 MIP-1α(7a), MCP-1 (7b), IL-1α (7c), RANTES (7d) 및 KC (7e)의 단백질 수준. 각각의 데이터 포인트는 모든 5개의 뇌 영역에 걸친 각각의 개별 마우스에 대한 값을 나타낸다. P 값은 투키 다중 비교 검정(Tukey's multiple comparisons test)을 사용한 이원(two-way) ANOVA로부터이 것이며, * = P < 0.05, ** = P < 0.01, *** = P < 0.001, **** = P < 0.0001이다.
도 8은 표시된 MOI에서 LYS-SAF302로부터의 SGSH 발현을 나타낸다.
도 9는 표시된 MOI에서 LYS-SAF302로부터 생성된 SGSH의 효소 활성을 나타낸다.
도 10은 MPSIIIA 마우스에서 LYS-SAF302의 뇌실질내 주사 전략을 나타낸다. 주사 부위 (백색 화살표)는 반관상(hemicoronal) 뇌 슬라이스의 위치와 함께 측면 관점으로부터 표시된다. MPSIIIA 마우스는 5주령에 해밀턴(Hamilton) 주사기를 사용하여 LYS-SAF302의 정위(stereotactic) 주사를 받았다 (n=10/성별/군). 벡터는 좌측 및 우측 선조체 각각에 2 μl 그리고 좌측 및 우측 시상 각각에 2 μl를 통해 0.2 μl/분으로 전달된 8 μl 중에서 8.6E+08 vg (저용량), 4.1E+10vg (중간 용량) 또는 9.0E+10 vg (고용량)의 용량으로 투여되었다. 5개의 반관상 슬라이스의 위치가 제시된다.
도 11은 주사 후 12주 및 25주차에 MPS IIIA 마우스의 뇌 슬라이스에서 SGSH 활성에 대한 LYS-SAF302의 용량 의존적 효과를 나타낸다. (□ 남성;
Figure pct00001
여성). P 값은 사후 본페로니 검정(post-hoc Bonferroni testing)을 사용한 일원(one-way) ANOVA로부터의 것이며, * = P < 0.05, ** = P < 0.01, *** = P < 0.001, **** = P < 0.0001이다. 마우스 #225 (17-주령 수컷 MPS IIIA 저용량 군)는 각각의 검정에서 이상치(outlier)여서, SGSH 활성의 어떤 증가도 나타내지 않았다 (MPS IIIA 비히클 마우스 비교). 30주차 코호트에서, 저용량-처리된 수컷 MPS IIIA 마우스 #422, #383 및 #448은 이상치여서, SGSH 활성의 어떤 증가도 나타내지 않았다 (MPS IIIA 비히클 마우스 비교).
도 12는 주사 후 12주 및 25주차에 MPS IIIA 마우스의 뇌 슬라이스에서 HS의 양에 대한 LYS-SAF302의 용량 의존적 효과를 나타낸다. (□ 남성;
Figure pct00002
여성). P 값은 사후 본페로니 검정을 사용한 일원 ANOVA로부터의 것이며, * = P < 0.05, ** = P < 0.01, *** = P < 0.001, **** = P < 0.0001이다. 마우스 #225 (17-주령 수컷 MPS IIIA 저용량 군)는 각각의 검정에서 이상치여서, HS에서의 어떤 감소도 나타내지 않았다 (MPS IIIA 비히클 마우스 비교. 30주차 코호트에서, 저용량-처리된 수컷 MPS IIIA 마우스 #422, #383 및 #448은 이상치여서, HS에서의 어떤 감소도 나타내지 않았다 (MPS IIIA 비히클 마우스 비교). 이것은 이들 마우스 샘플에 대해 기록된 낮은 양의 SGSH 활성과 일치한다.
도 13은 치료 후 25주에 MPS IIIA 마우스의 신경병리학 분석을 나타낸다. 도 13a 및 13b는 도 10에 제공된 지도에 따른 뇌 슬라이스 3에서의 2차 리소좀 축적 생성물 GM2 (A) 및 GM3 (B) 강글리오시드 정량을 나타낸다. 도 13c는 하부 콜리쿠스에서 LIMP2 염색에 의해 평가된 엔도/리소좀 시스템 확장을 나타낸다. 도 13d는 아래 둔덕에서 유비퀴틴(ubiquitin) 염색에 의해 평가된, 축삭 회전타원체의 수를 나타낸다. 도 13e는 아래 둔덕에서 GFAP 염색에 의해 평가된 성상교세포증(astrogliosis)의 정도를 나타낸다. 도 13f는 치상회(dentate gyrus)에서 이소렉틴(isolectin) B4 염색에 의해 평가된 반응성 아메보이드-형상의 미세아교세포의 수를 나타낸다. ****p < 0.0001 및 * p < 0.05는 본페로니 다중 비교 검정(Bonferroni's multiple comparisons test)을 사용한 일원 ANOVA로부터 계산되었다.
도 14a-f는 개의 뇌에서 가돌리늄 확산을 나타낸다. 상기 도면은 MRI 조영제 가돌리늄 (5 mmol)과 함께 500 μl (반구당 2개)의 LYS-SAF302를 10 μL/분 (총 용량 2.0E+12 vg)으로 백질에 4회 주사를 받은 개를 나타낸다. 도 14a는 주사 부위를 포함하는 관상 절편(section)의 위치를 가진 개의 뇌의 좌측 측면도이다. 도 14b-c는 붉은 점 스폿으로 표시된 주사 예정 부위를 가진 주사 전 관상 절편의 MRI 영상이다. 도 14d-e는 백질 내로 가시적인 가돌리늄 신호를 가진 주입 후 관상 절편의 MRI 영상이다. 도 14f는 백질의 부리-꼬리쪽(rostro-caudal) 축을 따라 양쪽 반구에서 가시적인 가돌리늄 신호를 가진 MRI 영상의 3D 재구축의 전방도이다. 스케일 바 = 10 mm.
도 15a-c는 50 μl (반구당 2개)의 LYS-SAF302를 5 μL/분 (총 용량 7.2E+11 vg)으로 백질에 4회 주사를 받은 두 NHP의 뇌에서 SGSH 활성 분포를 나타낸다. 도 15a는 반관상 뇌 슬라이스의 위치와 함께 NHP 뇌의 좌측 측면도를 나타낸다. 부리쪽(Rostral) 주사는 슬라이스 4에서 6 사이에, 꼬리쪽 주사는 슬라이스 8에서 10 사이에 이루어졌다. 하나의 NHP에 대해 분석된 뇌 펀치의 99% (도 15b) 및 또 다른 NHP에 대해 분석된 뇌 펀치의 94% (도 15c)에서 주사 후 6주에 비히클 주사된 대조군에 비해 SGSH 활성의 20% 초과의 증가가 관찰되었다.
도 16a-16e는 주사 후 4개월차에 마우스 뇌에서 SAF302 gFP의 발현을 나타낸다. 도 16a는 5개의 상이한 뇌 영역에 대한 선조체내 주사 부위의 다이어그램이다. MPSIIIA 마우스는 해밀턴 주사기 (n = 6)를 사용하여 8-14주령에 SAF302 gFP의 정위 주사를 받았다. 벡터는 양쪽 반구의 정중선에 측면으로 3 mm, 2 mm 깊이에서 양측 주사를 통해 전달된 3 μL 중 6.1 x 109 게놈 입자의 용량으로 투여되었다. 동물은 주사 후 4개월에 희생시켰고, 조직학적 분석을 위해 뇌를 취하였다. 브레그마(bregma) +1.7, +0.26, -1.18, 및 -2.62 mm (도 16b)로부터의 관상 뇌 절편 및 정중선에 측면으로 1.2 mm에서의 시상 절편(sagittal section) (도 16c)은 NeuN (적색), GFP (녹색), 및 DAPI (청색)로 공동-표지하였다. 스케일 바 = 1,000 μm. (16d 및 16e) (도 16c)에서 파선 상자로 표시된 영역의 고배율 영상은 해마 (도 16d) 및 선조체 (도 16e) 내의 세포 형질도입을 나타낸다. 스케일 바 = 50 μm.
도 17a-e는 SAF302 gFP로 처리한 후 주사 부위 근처에서 GFAP-양성 성상세포의 형질도입을 나타낸다. MPSIIIA 마우스에 2개의 깊이(two depth)에서 SAF302 gFP를 주사하고 4주차에 수확하거나 (도 17a) 또는 1개의 깊이에서 주사하고 4개월차에 수확하였다 (도 17b). 브레그마에 비해 +0.26의 관상 절편은 GFAP (적색), GFP (녹색), 및 DAPI (청색)로 염색되었다. 스케일 바 = 1,000 μm. 대상속(cingulum)/피질 (1), 외부 캡슐/1차 체성감각 피질/선조체 경계 (2), 및 선조체/주사 부위 (3)의 고배율 영상이 표시된다. 스케일 바 = 20 μm. 총 뇌 면적의 비율로서 표시된 브레그마에서 GFP-양성 세포의 백분율의 정량 (도 17c-17e). *p < 0.05는 스튜던트 t-검정(Student's t-test)을 사용하여 계산되었다. 5마리의 마우스가 양쪽 반구에서 주사되고 군당 정량화된, 대표적인 영상이 표시된다.
상세한 설명
다양한 실시양태에서, 본 개시내용은 유전적 질환 (암호화된 유전자 생성물의 감소된 발현 또는 발현 결핍, 변형된 형태의 유전자 생성물의 발현, 또는 유전자 생성물의 발현을 제어하는 조절 요소의 파괴를 야기하는 유전자 결실(deletion) 또는 돌연변이로부터 생긴 것들), 신경계 질환 및 장애, 뇌 질환 및 장애를 포함하나 이에 제한되지 않는, 여러 가지의 질환 및 장애를 치료하는데 유용한 신규 조성물 및 방법을 제공한다. 관련 기술분야에 의해 인식되는 바와 같이, 특정 조성물 및 방법이 본원에 구체적으로 예시되어 있지만, 본 개시내용은 본원에 구체적으로 기재된 것을 포함하나 이에 제한되지 않는 추가의 실시양태 및 용도를 이에 제한되지 않으나 포함한다. 게다가, 다음 설명에서, 본 개시내용의 다양한 실시양태의 완전한 이해를 제공하기 위해 특정 구체적 세부사항이 제시된다. 그러나, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 개시내용이 이들 세부사항 없이 실시될 수 있음을 이해할 것이다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 과학기술 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 개시내용의 목적을 위해, 하기 용어들은 이하에 정의된다.
단어 "a" 및 "an"는 특별히 언급되지 않는 한 하나 이상을 나타낸다.
"약"이란, 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도까지 많이 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다. 용어 "약"과 함께 사용된 수치 값의 맥락에서 논의된 임의의 실시양태에서, 용어 약이 생략될 수 있다는 것이 구체적으로 고려된다.
용어 "활성 변이체"는 "생물학적 활성 단편" 및 "생물학적 활성 변이체"를 둘 다 나타내고 포함한다. 대표적인 생물학적 활성 단편 및 생물학적 활성 변이체는 일반적으로 상호작용, 예를 들어, 분자내 또는 분자간 상호작용에 참여한다. 분자간 상호작용은 특이적 결합 상호작용 또는 효소적 상호작용일 수 있다. 효소적 상호작용 또는 활성의 예는 본원에 기재된 탈히드록실화 및 기타 효소적 활성을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
참조 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 단편에 적용된 바와 같은 용어 "생물학적 활성 단편"은 참조 서열의 적어도 하나의 활성 (예를 들어, 효소 활성)의 적어도 약 20, 22, 24, 26, 28, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000% 또는 그 초과를 갖는 단편을 지칭한다. 용어 "참조 서열"은 일반적으로 또 다른 서열이 비교되는 핵산 코딩 서열 또는 아미노산 서열을 지칭한다. 서열 목록에 제공된 모든 서열은 참조 서열로도 포함된다. 길이가 그 사이의 모든 정수 포함하여 적어도 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 500, 600개 또는 그 초과의 인접하는 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 생물학적 활성 단편이 본 개시내용의 범위 내에 포함된다.
참조 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 변이체에 적용된 바와 같은 용어 "생물학적 활성 변이체"는 참조 서열의 활성 (예를 들어, 효소 활성)의 적어도 약 20, 22, 24, 26, 28, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000% 또는 그 초과를 갖는 변이체를 지칭한다. 그 사이의 모든 정수를 포함하여, 참조 서열과 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80% 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 동일성을 갖는 생물학적 활성 단편이 본 개시내용의 범위 내에 포함된다.
"코딩 서열"이란, 유전자의 폴리펩티드 생성물에 대한 코드에 기여하는 임의의 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다. 대조적으로, 용어 "비코딩 서열"은 유전자의 폴리펩티드 생성물의 코드에 기여하지 않는 임의의 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
문맥이 달리 요구하지 않는 한, 본 명세서 및 청구범위 전체에 걸쳐, 단어 "포함하다" 및 이의 변형, 예컨대, "포함한다" 및 "포함하는"은, 개방적이고 포괄적인 의미, 즉 "포함하나, 에 제한되지는 않는"으로서 이해되어야 한다.
"~로 이루어진"이란, 무엇이든 어구 "~로 이루어진" 뒤에 오는 것을 포함하고 이에 제한됨을 의미한다. 따라서, 어구 "~로 이루어진"은 열거된 요소가 필수이거나 의무적이며, 어떤 다른 요소도 존재하지 않을 수 있음을 의미한다.
"본질적으로 로 이루어진"이란, 상기 어구 뒤에 열거된 임의의 요소를 포함하며, 열거된 요소에 대한 개시내용에 명시된 활성 또는 작용을 방해하거나 그에 기여하지 않는 기타 요소에 제한됨을 의미한다. 따라서, 어구 "본질적으로 로 이루어진"은 열거된 요소가 필수이거나 의무적이며, 기타 요소는 임의적이며 열거된 요소의 활성 또는 작용에 영향을 미치는지 여부에 따라 존재할 수도 있거나 아닐 수도 있음을 의미한다.
본 명세서 전체에서 "한 실시양태" 또는 "일 실시양태"에 대한 언급은 실시양태와 관련하여 기재된 특정한 특색, 구조 또는 특성이 본 개시내용의 적어도 하나의 실시예에 포함된다는 것을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전반에 걸쳐 다양한 곳에서 어구 "한 실시양태에서" 또는 "일 실시양태에서"의 출현이 반드시 모두 동일한 실시양태를 지칭하는 것은 아니다. 더욱이, 특정한 특색, 구조, 또는 특성은 하나 이상의 실시양태에서 임의의 적합한 방식으로 조합될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "기능" 및 "기능적" 등은 생물학적, 효소적, 또는 치료적 기능을 지칭한다.
"유전자"란, 염색체 상의 특이적 유전자좌를 차지하고 전사 및/또는 번역 조절 서열 및/또는 코딩 영역 및/또는 미-번역(non-translated) 서열 (즉, 인트론, 5' 및 3 비번역(untranslated) 서열)로 이루어진 유전의 단위를 의미한다.
유전자와 관련하여, 언급 "돌연변이" 또는 결실"은 일반적으로 야생형 유전자 생성물과 비교하여, 암호화된 유전자 생성물의 발현을 감소시키거나 발현시키지 않거나 유전자의 생성물을 비-기능적 또는 감소된 기능을 갖도록 만드는 유전자의 그러한 변화 또는 변경을 의미한다. 이러한 변화의 예는 표적 유전자의 코딩 또는 조절 서열에 대한 뉴클레오티드 치환, 결실, 또는 첨가를 전체 또는 부분적으로 포함하며, 이는 그 유전자에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 발현을, 전사 수준이든 번역 수준이든, 파괴, 제거, 하향 조절 또는 상당히 감소시키고/거나 상대적으로 불활성 (예를 들어, 돌연변이된 또는 말단절단된) 또는 불안정한 폴리펩티드를 생성한다. 특정 측면에서, 표적화된 유전자는 암호화된 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변경하는 뉴클레오티드 수준에서의 변화 또는 돌연변이에 의해 "비-기능적"이 될 수 있어, 변형된 폴리펩티드가 발현되나, 폴리펩티드의 활성 부위, 이의 세포 국소화, 이의 안정성, 또는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백한 기타 기능적 특색을 변형함으로써 이든 아니든, 하나 이상의 효소 활성과 관련하여 감소된 기능 또는 활성을 갖는다.
"증가된" 또는 "향상된" 양은 전형적으로 "통계적으로 유의한" 양이며, 본원에 기재된 양 또는 수준의 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 또는 50배 또는 그 초과배 (예를 들어, 100, 500, 1000배) (그 사이의 및 1 초과, 예를 들어, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4 등의 모든 정수 및 소수점 포함)인 증가를 포함할 수 있다.
"감소된(decreased)", "감소된(reduced)" 또는 "더 적은" 양은 전형적으로 "통계적으로 유의한" 양이며, 본원에 기재된 양 또는 수준의 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 또는 50배 또는 그 초과배 (예를 들어, 100, 500, 1000배) (그 사이의 및 1 초과, 예를 들어, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8 등의 모든 정수 및 소수점 포함)인 감소를 포함할 수 있다.
"~로부터 수득한"은, 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 같은 샘플이 원하는 유기체 또는 원하는 유기체 내의 특이적 조직과 같은 특정한 공급원으로부터 단리되거나, 이로부터 유래됨을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "작동가능하게 연결된"은 유전자를 프로모터의 조절 제어 하에 두는 것을 의미하며, 이는 이어서 유전자의 전사 및 임의로 번역을 제어한다. 이종 프로모터/구조적 유전자 조합의 구축에서, 일반적으로 유전자 서열 또는 프로모터를 유전자 전사 개시 부위로부터 그 유전자 서열 또는 프로모터와 그것이 이의 자연 환경에서 제어하는 유전자; 즉, 유전자 서열 또는 프로모터가 유래된 유전자 사이의 거리와 대략 동일한 거리에 위치시키는 것이 바람직하다. 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 이 거리의 일부 변화는 기능의 손실 없이 수용될 수 있다. 유사하게, 이의 제어 하에 놓일 이종 유전자와 관련하여 조절 서열 요소의 선호되는 위치잡기는 이의 자연 환경; 즉, 그것이 유래된 유전자에서 요소의 위치잡기에 의해 정의된다. "구성적 프로모터"는 전형적으로 대부분의 조건 하에 활성이며, 즉 전사를 촉진한다. "유도성 프로모터"는 전형적으로 주어진 분자 인자 (예를 들어, IPTG) 또는 주어진 환경 조건의 존재와 같은 특정 조건 하에만 활성이다. 그 조건의 부재 하에, 도성 프로모터는 전형적으로 유의하거나 측정가능한 수준의 전사 활성을 허용하지 않는다. 수많은 표준 유도성 프로모터가 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있을 것이다.
"제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제"는 미국 식품의약국 (FDA)에 의해 인간 또는 가축에서 사용하기에 서용되는 것으로서 승인된, 임의의 아주반트, 담체, 부형제, 활택제, 감미제, 희석제, 보존제, 염료/착색제, 향미 증진제, 계면활성제, 습윤제, 분산제, 현탁제, 안정제, 등장제, 용매 또는 유화제를 제한 없이 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 서술 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 mRNA, RNA, cRNA, rRNA, cDNA 또는 DNA를 지정한다. 상기 용어는 전형적으로 리보뉴클레오티드 또는 데옥시뉴클레오티드 또는 두 가지 유형의 뉴클레오티드의 변형된 형태인, 적어도 10개의 염기 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 지칭한다. 상기 용어는 단일 및 이중 가닥 형태의 DNA 및 RNA를 둘 다 포함한다.
용어 "폴리뉴클레오티드 변이체"는 참조 폴리뉴클레오티드 서열과 실질적인 서열 동일성을 나타내는 폴리뉴클레오티드 또는 이후에 정의되는 엄격한 조건 하에 참조 서열과 혼성화하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 이 용어는 또한 적어도 하나의 뉴클레오티드의 첨가, 결실 또는 치환에 의해 참조 폴리뉴클레오티드와 구별되는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 따라서, 용어 "폴리뉴클레오티드 변이체"는 하나 이상의 뉴클레오티드가 첨가 또는 결실되거나, 상이한 뉴클레오티드로 대체된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이와 관련하여, 돌연변이, 첨가, 결실 및 치환을 포함하는 특정 변경이 참조 폴리뉴클레오티드에 이루어질 수 있다는 것이 관련 기술분야에서 잘 이해되어 있으며, 이에 의해 변경된 폴리뉴클레오티드는 참조 폴리뉴클레오티드의 생물학적 기능 또는 활성을 유지하거나, 참조 폴리뉴클레오티드와관련하여 증가된 활성을 갖는다 (즉, 최적화됨). 폴리뉴클레오티드 변이체는, 예를 들어, 본원에 기재된 참조 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 50% (및 적어도 51% 내지 적어도 99% 및 그 사이의 모든 정수 백분율, 예를 들어, 90%, 95%, 또는 98%) 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 용어 "폴리뉴클레오티드 변이체" 및 "변이체"는 또한 이들 효소를 암호화하는 자연-발생 대립유전자 변이체 및 이종상동체(ortholog)를 포함한다.
폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드와 관련하여, 용어 "외인성"은 야생형 세포 또는 유기체에서 자연적으로 발생하지 않으나, 전형적으로 분자 생물학적 기술에 의해 세포에 도입되는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열을 지칭한다. 외인성 폴리뉴클레오티드의 예는 벡터, 플라스미드, 및/또는 원하는 단백질을 암호화하는 인공 핵산 작제물을 포함한다. 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드와 관련하여, 용어 "내인성" 또는 "천연"은 주어진 야생형 세포 또는 유기체에서 발견될 수 있는 자연-발생 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열을 지칭한다.
"도입된" 폴리뉴클레오티드 서열은 세포 또는 유기체에 첨가되거나 도입되는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. "도입된" 폴리뉴클레오티드 서열은 세포 또는 유기체에 외인성인 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있거나, 세포 또는 유기체에 이미 존재하는 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 분자 생물학적 기술에 의해 이미 이러한 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 미생물에 "도입"될 수 있어, 예를 들어, 그렇지 않으면 자연-발생 폴리뉴클레오티드 서열의 하나 이상의 추가 카피를 생성하고, 이에 의해 암호화된 폴리펩티드의 과발현을 촉진한다.
"폴리펩티드", "폴리펩티드 단편", "펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체 및 이의 변이체 및 합성 유사체를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 따라서, 이들 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가 합성 비-자연 발생 아미노산인 아미노산 중합체, 예컨대 상응하는 자연 발생 아미노산의 화학적 유사체, 뿐만 아니라 자연 발생 아미노산 중합체에 적용된다. 특정 측면에서, 폴리펩티드는 효소 폴리펩티드, 또는 "효소"를 포함할 수 있으며, 이는 전형적으로 다양한 화학 반응을 촉매화한다 (즉, 속도를 증가시킨다).
서술 "폴리펩티드 변이체"는 적어도 하나의 아미노산 잔기의 첨가, 결실 또는 치환에 의해 참조 폴리펩티드 서열과 구별되는 폴리펩티드를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드 변이체는 보존적이거나 비-보존적일 수 있는 하나 이상의 치환에 의해 참조 폴리펩티드와 구별된다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드 변이체는 보존적 치환을 포함하고, 이와 관련하여, 일부 아미노산은 폴리펩티드 활성의 성질을 변화시키지 않으면서 광범위하게 유사한 특성을 가진 다른 아미노산으로 변화될 수 있다는 것이 관련 기술분야에서 잘 이해된다. 폴리펩티드 변이체는 또한 하나 이상의 아미노산이 첨가 또는 결실되거나, 상이한 아미노산 잔기로 대체된 폴리펩티드를 포함한다. 본원에 기재된 참조 서열 중 임의의 것 (예를 들어, 서열 목록 참조)과 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드가 포함된다. 특정한 실시양태에서, 폴리펩티드 변이체는 참조 폴리펩티드의 적어도 하나의 생물학적 활성을 유지한다.
본원에 사용된 바와 같은, 서술 "서열 동일성" 또는, 예를 들어, "와 50% 동일한 서열"을 포함하는 서술은 서열이 비교의 창(window)에 걸쳐서 뉴클레오티드 대 뉴클레오티드(nucleotide-by-nucleotide) 기준으로 또는 아미노산 대 아미노산(amino acid-by-amino acid) 기준으로 동일한 정도를 지칭한다. 따라서, "서열 동일성의 백분율"은 비교의 창에 걸쳐서 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하여, 동일한 핵산 염기 (예를 들어, A, T, C, G, I) 또는 동일한 아미노산 잔기 (예를 들어, Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys 및 Met)가 두 서열 모두에서 발생하는 위치의 수를 결정하여 일치된 위치의 수를 산출하고, 일치된 위치의 수를 비교의 창 (즉, 창 크기)의 총 위치의 수로 나누고, 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산될 수 있다.
2개 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 간의 서열 관계를 기재하는 데 사용되는 용어는 "참조 서열", "비교 창", "서열 동일성", "서열 동일성의 백분율" 및 "실질적 동일성"을 포함한다. "참조 서열"은 길이가 뉴클레오티드 및 아미노산 잔기를 포함하여 적어도 12개이나, 빈번히 15 내지 18개, 그리고 종종 적어도 25개의 단량체 단위이다. 2개의 폴리뉴클레오티드가 각각 (1) 2개의 폴리뉴클레오티드 간에 유사한 서열 (즉, 완전한 폴리뉴클레오티드 서열의 일부만), 및 (2) 2개의 폴리뉴클레오티드 간에 발산하는 서열을 포함할 수 있기 때문에, 2개 (또는 그 초과)의 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 "비교 창"에 걸쳐 상기 2개의 폴리뉴클레오티드의 서열을 비교하여 서열 유사성의 국소적 영역을 확인하고 비교함으로써 수행된다. "비교 창"은 적어도 6개의 인접하는 위치, 대개 약 50 내지 약 100, 보다 대개 약 100 내지 약 150의 개념적 세그먼트를 지칭하며, 여기서 서열은 2개의 서열이 최적으로 정렬된 후에 동일한 수의 인접하는 위치의 참조 서열과 비교된다. 비교 창은 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 참조 서열 (이는 첨가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교하여 약 20% 이하의 첨가 또는 결실 (즉, 갭)을 포함할 수 있다. 비교 창을 정렬하기 위한 서열의 최적 정렬은 알고리즘의 컴퓨터화 구현 (위스콘신 지네틱스 소프트웨어 팩키지 릴리스(Wisconsin Genetics Software Package Release) 7.0 (지네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group), 미국 위스콘신주 메디슨 사이언스 드라이브 5750의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA)에 의해 또는 검사 및 선택된 다양한 방법 중 임의의 것에 의해 생성된 최상의 정렬 (즉, 비교 창에 걸쳐 가장 높은 백분율 상동성을 결과함)에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어 문헌 [Altschul et al., 1997, Nucl. Acids Res. 25:3389]에 기재된 바와 같은 프로그램의 BLAST 패밀리를 또한 참조할 수 있다. 서열 분석에 대한 상세한 논의는 문헌 [Unit 19.3 of Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, Chapter 15]에서 찾을 수 있다.
"형질전환"은 외래 DNA의 숙주-세포 게놈 내로의 흡수 또는 혼입 또는 숙주 세포 내에서 염색체외 유지; 또한, 한 유기체에서 또 다른 유기체의 게놈으로 외인성 유전자의 전달로부터 생긴 세포의 영구적이고 유전가능한 변경을 지칭한다.
"본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료", "치료하다", "치료된" 또는 "치료하는"은 예방 및/또는 요법을 지칭하며, 특히 여기서 목적은 바람직하지 않은 생리학적 변화 또는 장애, 예컨대 예를 들어, 리소좀 축적 질환 (LSD)과 같은 돌연변이된 유전자로부터 생긴 뇌 장애의 발달 및/또는 진행을 예방하거나 둔화시키는 (줄이는) 것이다. 유익하거나 원하는 임상 결과는 증상 완화, 질환 정도의 감소, 질환 상태의 안정화 (즉, 악화되지 않음), 질환 진행의 지연 또는 둔화, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 관해 (부분적이든 전체적이든)를, 검출가능하든 검출가능하지 않든 포함한다. "치료"는 또한 치료를 받지 않는 경우 예상 생존 및/또는 삶의 질과 비교하여 생존 연장 및/또는 삶의 질 증가를 의미할 수 있다. 치료를 필요로 하는 이들은 이미 병태 또는 장애 (예를 들어, LSD와 같은 돌연변이된 유전자로부터 생긴 뇌 장애)를 가진 이들뿐만 아니라 병태 또는 장애를 가질 경향이 있는 이들 또는 병태 또는 장애가 예방될 이들을 포함한다. 따라서, "치료"는 또한 가족력, 유전적 또는 염색체 이상으로 인해, 및/또는 질환에 대한 하나 이상의 생물학적 마커의 존재로 인해 질환에 걸리기 쉬운 것으로 생각되는 그러한 개체에게 본 개시내용의 화합물을 투여하여, 예를 들어, 질환의 발병을 억제, 예방, 또는 지연시키거나 질환의 발생 가능성을 감소시키는 것을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 치료는 다음 중 임의의 것을 포함할 수 있다: 발달적 퇴행의 감소, 언어 장애(language impairment)의 감소 또는 언어 발달의 개선, 운동 기술 장애(motor skill impairment)의 감소, 지적 발달 장애(intellectual development impairment)의 감소, 과잉행동(hyperactivity)의 감소 (과도한 운동 활동(motor activity)), 수면, 주의력, 신체 및 정신 능력 장애의 감소 (환자는 완전한 운동 능력 (걷기, 말하기, 음식섭취 등) 상실, 인지 능력, 중증 발작, 기도 폐쇄(airway obstruction) 및 심부전과 같은 장애 감소, 또는 부분적으로 분해된 헤파란 술페이트의 축적 감소. 특정 실시양태에서, "치료"는 세포가 결손 효소를 생성할 수 있도록 하여 치료 및/또는 질환의 결과를 역전시키는 것, 예를 들어 회복시키거나 SGSH 유전자의 기능을 대상체에 제공하거나 축적된 헤파란 술페이트를 분해시키는 것을 포함한다.
"대상체"는 질환 또는 장애를 갖는 것으로 진단되거나 질환 또는 장애가 발생할 위험이 있는 것으로 결정된 포유동물과 같은, 질환 또는 장애에 대한 치료를 필요로 하는 포유동물을 포함한 포유동물, 예를 들어 인간을 포함한다. 특정한 예에서, 대상체는 MPSIIIA와 같은 MPS를 포함한, 유전적 질환, 뇌 장애, 또는 신경계 질환 또는 장애, 예컨대 리소좀 축적 장애로 진단된 포유동물이다.
"벡터"란, 폴리뉴클레오티드 분자, 예를 들어, 폴리뉴클레오티드가 삽입되거나 클로닝될 수 있는 플라스미드, 박테리오파지, 효모 또는 바이러스로부터 유래된 DNA 분자를 의미한다. 벡터는 전형적으로 하나 이상의 고유한 제한 부위를 포함하고 정의된 숙주 세포에서 자율 복제가 가능할 수 있거나, 클로닝된 서열이 재현가능하도록 정의된 숙주의 게놈과 통합가능할 수 있다. 따라서, 벡터는 자율적으로 복제하는 벡터, 즉 염색체외 독립체(extra-chromosomal entity)로서 존재하는 벡터일 수 있으며, 이의 복제는 염색체 복제와 무관하며, 예를 들어 선형 또는 폐쇄 원형 플라스미드, 염색체외 요소, 미니-염색체 또는 인공 염색체이다. 벡터는 자기-복제를 보장하는 임의의 수단을 함유할 수 있다. 대안적으로, 벡터는 숙주 세포에 도입될 때, 게놈 내로 통합되고 이것이 통합된 염색체(들)와 함께 복제되는 것일 수 있다. 이러한 벡터는 숙주 염색체의 특정한, 원하는 부위로의 재조합을 허용하는 특이적 서열을 포함할 수 있다. 벡터 시스템은 단일 벡터 또는 플라스미드, 둘 이상의 벡터 또는 플라스미드를 포함할 수 있으며, 이는 함께 숙주 세포의 게놈에 도입될 전체 DNA, 또는 트랜스포존을 함유한다. 벡터의 선택은 전형적으로 벡터가 도입될 숙주 세포와 벡터의 적합성에 의존한다. "벡터"는 또한 폴리뉴클레오티드가 삽입되거나 클로닝될 수 있는 바이러스 및 바이러스 입자를 포함한다. 이는 "바이러스 벡터"로 지칭될 수 있다. "유전자 요법 벡터"는 치료적 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열을 이를 필요로 하는 대상체에게 전달하는 데 사용되는 바이러스 벡터를 포함한 벡터이며, 이는 전형적으로, 예를 들어, 대상체에서의 유전적 돌연변이로 인해, 대상체에서 결손, 돌연변이되거나 탈조절된 발현을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이다.
DNA 벡터에 관심 DNA 서열을 삽입하는 통상적인 방법은 제한 부위라고 칭해지는 특이적 부위에서 DNA를 절단하는 제한 효소라는 칭해지는 효소의 사용을 포함한다. "카세트" 또는 "유전자 카세트" 또는 "발현 카세트"는 하나 이상의 발현 생성물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭하며, 이들 생성물의 발현에 필요한 시스-작용 요소를 포함하며, 이는 정의된 제한 부위에서 벡터에 삽입될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "야생형"은 자연-발생 공급원으로부터 단리될 때 그 유전자 또는 유전자 생성물의 특성을 갖는 유전자 또는 유전자 생성물을 지칭한다. 야생형 유전자 또는 유전자 생성물 (예를 들어, 폴리펩티드)은 집단에서 가장 빈번하게 관찰되고 따라서 유전자의 "정상" 또는 "야생형" 형태로 임의로 지정된 것이다.
유전자 요법 벡터
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 MPSIIIA의 치료를 위한 유전자 요법 벡터를 포함한다. 이러한 유전자 요법 벡터는 인간 SGSH 폴리펩티드 또는 이의 활성 변이체를 이를 필요로 하는 대상체 내의 세포에 전달하는 데 사용될 수 있다. 수반하는 실시예에 기재된 바와 같이, 연구는 본 개시내용의 유전자 요법 벡터가 MPSIIIA의 치료에 효과적이고 또한 안전하다는 것을 확립하였다.
이론에 얽매이는 것을 바라지 않으면서, 뇌실질에 투여시, 유전자 요법 벡터 입자 및 효소는 국소적으로 확산될 뿐만 아니라, 축삭을 따라 원격의 해부학적 뇌 구조로 수송되어 확장된 뇌 영역의 수정을 허용하는 것으로 이해된다. 세포에 진입시, SGSH 폴리펩티드를 암호화하는 유전자 요법 벡터는 핵으로 수송될 것이며 여기서 일련의 분자 형질전환을 거쳐 이중 가닥 데옥시리보핵산 (DNA) 분자로서 안정적인 확립을 결과할 것이다. 이 DNA는 전령 리보핵산 (mRNA)으로 전사될 것이고, 이는 차례로 결손 효소인 SGSH로 번역될 것이다. 형질도입된 세포는 SGSH 효소를 지속적으로 발현하고 전달하여, 결핍 내인성 효소를 보완하기 위한 효소 생성의 뇌내 영구 공급원을 구성할 것이다. 본원에 기재된 유전자 요법 벡터는 본원에서 SAF302 또는 AAVrh10-SGSH로도 지칭되는 LYS-SAF302이다. 수반하는 실시예에서 기재된 바와 같이, SAF302는 LYS-SAF301 또는 SAF301이라고 칭해지는 1세대 생성물을 시험하여 얻은 정보를 기반으로 구축된 2세대 생성물이다. LYS-SAF301은 AAVrh.10의 캡시드에 패키징된 PGK 프로모터에 의해 구동되는 SGSH 및 SUMF1 유전자를 함유하는 결함 있는 AAV2 게놈으로 구성된 복제 결핍성 아데노-연관 바이러스 혈청형(replication deficient adeno-associated virus serotype) rh.10 (AAVrh.10)으로 이루어졌다. 이는 AAVrh.10-hMPS3A로도 지칭된다. 이 1세대 벡터는 MPS IIIA 질환을 가진 아동에서 본원에 기재된 임상 연구에 사용되었으며, 12개의 사전-계획된 동시 프레임리스(framelss) 정위 주사 (60 μL/주사)에서 2개의 주사 깊이에서, 뇌 백질에 7.2E+11 바이러스 게놈 (vg)/환자의 용량으로 전달되었다. 용량 및 외과 수술은 내약성이 양호하였으며 어떤 관련 유해 사례도 보고되지 않았다.
본 개시내용은 형질도입된 세포로부터의 발현의 면에서 1세대 생성물과 비교하여 2.7배 더 강력한 개선된 2세대 생성물, LYS-SAF302를 제공한다. 게다가, 본 개시내용은 역류 없이 증가된 유량(flow rate)으로 더 높은 용량 및 더 많은 부피의 주사를 허용하는 개선된 전달 시스템을 제공한다. 본원에 제공된 전달 시스템 및 방법은 광범위한 뇌 분포 및 향상된 효능을 결과한다. 수반하는 실시예에 기재된 바와 같이, MPSIIIA 마우스 모델에서 LYS-SAF301 및 LYS-SAF302의 효능 연구는 본 개시내용의 유전자 요법 벡터가 MPSIIIA 뇌 세포를 형질도입하여 다량의 활성 SGSH를 생성 및 분비하고, 이는 차례로, 1차, 2차 및 기타 신경병리학에서 매우 유의한 감소를 매개함을 낱냈다. 다량의 SGSH가 뇌의 일부 영역에서 검출되었으며, 주사 부위에 대한 이의 근접성과 직접적인 상관관계가 있는 것으로 나타났다. 데이터는 이 벡터가 미세아교세포증(microgliosis)과 같은 하류 사건(downstream event)에 더하여, 1차 및 이차 축적 병리학(storage pathology)의 매우 중요한 개선을 매개하기 위해 충분한 양의 SGSH를 생성하는 것이 가능함을 나타낸다.
본 개시내용의 유전자 요법 벡터는 뇌내 주사 후 뇌에서 높은 수준의 SGSH 발현을 포함하여, 이전에 기재된 것들보다 예상치 못한 이점을 제공하는 것으로 밝혀졌다. 게다가, 본 개시내용의 방법은 놀랍게도 감소된 면역 반응을 결과하였다. 이들 이점은 증가된 효능과 상관관계가 있다. 더욱이, 특정 실시양태에서, 수술 시간 및 마취 하에시간이 최소화되어, 환자에 대한 연관된 위험을 감소시킨다. 게다가, 본 개시내용의 조성물 및 방법은 치료 제품의 개선된 발현, 더 넓은 발현 분포, 및 더 높은 용량, 더 큰 부피, 및, 증가된 주사 유량을 통한 더 효율적인 전달을 통해 향상된 효능을 제공한다.
파보바이러스(Parvovirus) 패밀리의 구성원인 아데노-연관 바이러스 (AAV)는 4.7 킬로베이스(kb) 내지 6kb의 단일-가닥 선형 DNA 게놈을 가진, 소형의 외피가 없는 정이십면체 바이러스이다. AAV의 수명 주기에는 감염 후 AAV 게놈이 부위 특이적으로 숙주 염색체에 통합되는 잠복기 및 아데노바이러스 또는 단순 포진 바이러스 감염 후, 통합된 게놈이 후속적으로 감염성 바이러스로 구조, 복제, 및 패키징되는 감염기를 포함한다. 비병원성, 비분할 세포를 포함한 광범위한 숙주 범위의 감염성, 및 잠재적 부위-특이적 염색체 통합의 특성은 AAV를 유전자 전달을 위한 매력적인 도구로 만든다.
현재까지, 이의 표면 특성이 다양한 AAV의 적어도 12가지 상이한 혈청형이 인간 또는 비인간 영장류 (NHP)로부터 단리되고 특성화되었다.
용어 "혈청형"은 다른 AAV 혈청형과 혈청학적으로 구별되는 캡시드를 갖는 AAV에 대한 구별이다. 혈청학적 특수성은 다른 AAV 혈청형과 비교하여 한 AAV 혈청형에 대한 항체 간의 교차-반응성의 결핍을 기반으로 결정된다. 벡터라고도 명명되는 본 개시내용의 유전자 요법 벡터는 AVV의 공지된 혈청형 (rh) 중 어느 하나, 예를 들어 rh1, rh2, rh3, rh4, rh5, rh6, rh7, rh8, rh9 또는 rh10, 바람직하게는 rh10을 가질 수 있다. 이들 다양한 AAV 혈청형은 또한 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 또는 AAV10 (AAVrh.10)으로도 지칭될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 벡터는 인공 AAV 혈청형을 가질 수 있다. 인공 AAV 혈청형은, 제한 없이, 자연-발생하지 않는 캡시드 단백질을 가진 AAV를 포함한다. 이러한 인공 캡시드는 본 개시내용의 신규 AAV 서열 (예를 들어, vp1 캡시드 단백질의 단편)을 또 다른 AAV 혈청형 (공지된 또는 신규), 비-AAV 바이러스 공급원, 또는 비-바이러스 공급원으로부터의 동일한 AAV 혈청형의 비인접 부분으로부터 수득될 수 있는 이종 서열과 조합하여 사용하는, 임의의 적합한 기술에 의해 생성될 수 있다. 인공 AAV 혈청형은, 제한 없이, 키메라 AAV 캡시드, 재조합 AAV 캡시드, 또는 "인간화" AAV 캡시드일 수 있다.
AAV 혈청형 rh.10 (AAVrh.10)은 PCT 특허 출원 공개 번호 WO 2003/042397에 기재되어 있다. AAVrh.10 벡터는 혈액-뇌 장벽을 효율적으로 가로지르며 신생 마우스 중추 신경계에서 뉴런 및 성상세포를 형질도입하는 것으로 나타났다 (Zhang, H., et al., Molecular Therapy 19, 1440-1448 (August 2011)). 게다가, AAVrh.10 벡터는 설치류의 뇌에 주사시 우수한 활성을 가지며 [10-12], 인간 집단에서 AAV 혈청형 10을 갖는 어떤 자연 질환도 없다.
AAV 게놈은 짧은 역위 말단 반복체(ITR)에 의해 플랭킹된 두 개의 개방 판독 프레임(open reading frame) (ORF)을 함유하여, 비교적 단순하다. ITR은 특히 바이러스 복제, 구조, 패키징 및 통합에 필요한 시스- 작용 서열을 함유한다. ITR의 통합 기능은 AAV 게놈이 감염 후 세포 염색체에 통합되도록 한다.
비구조적 또는 복제 (Rep) 및 캡시드 (Cap) 단백질은 각각 5' 및 3' 개방 판독 프레임 (ORF)에 의해 암호화된다. 4개의 관련 단백질이 rep 유전자로부터 발현되며; Rep78 및 Rep68은 p5 프로모터로부터 전사되며, 한편 하류 프로모터 p19는 Rep52 및 Rep40의 발현을 지시한다. Rep78 및 Rep68은 AAV 복제뿐만 아니라 바이러스 유전자 발현 조절에 직접 관여한다. cap 유전자는 세 번째 바이러스 프로모터인 p40로부터 전사된다. 캡시드는 중첩 서열의 세 가지 단백질로 이루어지며; 가장 작은 것 (VP-3)이 가장 풍부하다. 역위 말단 반복체가 복제, 패키징, 및 통합을 위해 시스에서 필요한 유일한 AAV 서열이기 때문에, 대부분의 AAV 벡터는 Rep 및 Cap 단백질을 암호화하는 바이러스 유전자를 생략하고 말단 반복체 사이에 삽입된, 단지 외래 유전자(들), 예를 들어 치료 유전자(들)를 함유한다.
N-술포글리코사민 술포히드롤라제 (SGSH, 술파미다제라고도 명명함)는 A형 산필립포 증후군 (MPSIIIA, OMIM #252900)에 관여하는 결핍 단백질이다. N-술포글루코사민 술포히드롤라제 (SGSH, EC 3.10.1.1, MIM 605270)는 헤파란 술페이트 (HS)라고 칭해지는 글리코사미노글리칸 패밀리의 단계적 분해에 필요한 리소좀 히드롤라제의 패밀리에 속한다. SGSH는 헤파란 술페이트 (HS) 분해의 세 번째 단계에 관여한다. SGSH는 HS의 비환원 말단 글루코사미니드 잔기로부터 N-연결된 술페이트의 가수분해를 촉매한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 1세대 유전자 요법 벡터는 SGSH 및 SUMF1 둘 다를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 인간 술파타제-변형 인자 1 cDNA (SUMF1, MIM 607939)는 번역 후 변형에 의해 술파타제 활성을 향상시키는 단백질을 암호화한다. 1세대 생성물에서 SGSH를 SUMF1과 공동발현하는 이유는 이중적이었다. SUMF1이 세포에 존재하긴 하지만, 보조인자가 또한 도입될 때 유전자 전달 후 더 높은 SGSH 활성이 수득된다. SUMF1은 야생형 배양 세포에서 술파타제 cDNA와 공동-형질감염될 때 그리고 술파타제 결핍로 인해 상이한 질환에 의해 영향을 받은 개체로부터의 세포에서 AAV 벡터를 통해 술파타제 cDNA와 공동-전달될 때 술파타제 활성을 강력하게 향상시킨다 [15-17]. 프랄디(Fraldi) 등은 SUMF1과 SGSH의 공동-전달이 AAV2/5 벡터를 사용하여 뇌에서 리소좀 축적, 및 염증 마커의 감소와 연관된 SGSH 활성의 상승적 증가를 결과하였음을 나타냈다 [13].
SGSH의 과발현은 다른 술파타제에 대한 SUMF1의 이용가능성을 극적으로 감소시킬 수 있고, 따라서 이의 기능에 영향을 미칠 수 있다는 가설이 세워졌다. 이 독성 과정은 SUMF1의 돌연변이에 의해 유발된 다중 술파타제 결핍증(Multiple 술파타제 Deficiency)에 설명되어 있다 [15]. 인간의 내인성 SUMF1의 수준은 신장과 간에서 보고된 바에 따르면 높으나, 뇌에서는 매우 낮다 [18-21]. 대조적으로, 내인성 SUMF1의 발현은 마우스 뇌에서 중간 정도이다 [22]. 내인성 SUMF1의 양은 세포와 조직에서 제한 요인이 될 수 있다. 따라서, MPSIIIA용으로 설계된 것들과 같은, 술파타제를 과발현하도록 설계된 유전자 요법 벡터에 SUMF1을 포함하는 것이 유리한 것으로 여겨졌다.
본 발명자들은 SUMF1을 발현하는 폴리뉴클레오티드를 포함하지 않는 본원에 기재된 2세대 벡터인 SAF302가 SUMF1을 발현하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 1세대 생성물과 비교할 때, SGSH의 발현을 향상시키고 HS를 분해하는 효과를 증가시킬 수 있음을 밝혀냈다
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 유전자 요법 벡터는 인간 SGSH 폴리펩티드 또는 이의 활성 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 AAV 혈청형 rh10 벡터이다. 특정 실시양태에서, 이들 유전자 요법 벡터는 이를 필요로 하는 대상체에게 프로모터에 의해 구동되고 AAVrh.10의 캡시드에 패키징되는 인간 SGSH 폴리펩티드 또는 이의 활성 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 결함 있는 AAV2 게놈을 포함하는 복제 결핍성 AAVrh.10 벡터로 투여될 수 있다.
특정 실시양태에서, 유전자 요법 벡터는 추가 조절 서열, 예컨대 프로모터 서열, 인핸서 서열, 및 정확하거나 효율적인 전사 또는 번역에 기여하는 기타 서열, 예컨대 내부 리보솜 결합 부위 (IRES) 또는 폴리아데닐화 (폴리 A) 서열을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 인간 SGSH 폴리펩티드 또는 이의 활성 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 프로모터 서열에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, 유전자 요법 벡터는 폴리 A 서열을 포함하나 IRES 서열은 포함하지 않는다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 5'에서 3' 순서로 다음을 포함하는, 폴리뉴클레오티드 서열, 예를 들어, 발현 카세트를 포함하는 복제 결핍성 아데노-연관 바이러스 (AAV)-유래 벡터를 포함한다:
프로모터 서열;
인간 N-술포글루코사민 술포히드롤라제 (SGSH) 폴리펩티드 또는 이의 활성 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열;
내부 리보솜 진입 부위 (IRES) 서열;
인간 술파타제-변형 인자 1 (SUMF1) 폴리펩티드 또는 이의 활성 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열; 및
폴리아데닐화 (폴리 A) 서열.
특정 실시양태에서, 벡터는 AAV2 ITR 및 AAVrh.10 캡시드 또는 혈청형을 추가로 포함한다.
본 개시내용은 또한 본원에 기재된 발현 카세트의 용도를 포함하나, 여기서 인간 N-술포글루코사민 술포히드롤라제 (SGSH) 폴리펩티드 또는 이의 활성 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 인간 술파타제-변형 인자 1 (SUMF1) 폴리펩티드 또는 이의 활성 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열의 위치가 스위치된다.
특정한 실시양태에서, 본 개시내용은 5'에서 3' 순서로 다음을 포함하는, 폴리뉴클레오티드 서열, 예를 들어, 발현 카세트를 포함하는 복제 결핍성 아데노-연관 바이러스 (AAV)-유래 벡터를 포함하며:
프로모터 서열;
인간 N-술포글루코사민 술포히드롤라제 (SGSH) 폴리펩티드 또는 이의 활성 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열; 및
폴리아데닐화 (폴리 A) 서열;
여기서 벡터는 SUMF1을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하지 않고 IRES 서열을 포함하지 않는다.
특정 실시양태에서, 벡터는 AAV2 ITR 및 AAVrh.10 캡시드 또는 혈청형을 추가로 포함한다.
여러 가지의 적합한 프로모터 서열, IRES 서열, 및 폴리 A 서열이 관련 기술분야에 공지되어 있고 이용가능하며, 본 개시내용에 따라 임의의 것이 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 프로모터는 구성적 프로모터, 유도성 프로모터, 조직 특이적 프로모터 (예를 들어, 뇌-특이적 또는 신경 조직- 또는 신경 세포-특이적 프로모터), 또는 대상체에 내인성인 프로모터이다. 구성적 프로모터의 예는, 제한 없이, CMV 조기 인핸서/닭 β 액틴 (CAG) 프로모터, 레트로바이러스성(retroviral) 라우스 육종 바이러스(Rous sarcoma virus) (RSV) LTR 프로모터 (임의로 RSV 인핸서를 가짐), 거대세포바이러스(cytomegalovirus) (CMV) 프로모터 (임의로 CMV 인핸서를 가짐), SV40 프로모터, 디히드로폴레이트 리덕타제 프로모터, β-액틴 프로모터, 포스포글리세롤 키나제 (PGK) 프로모터, 및 EF1α 프로모터 [인비트로겐(Invitrogen)]를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 프로모터는 포유동물 PGK 프로모터, 예컨대, 예를 들어, 뮤린 PGK 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 CAG 프로모터이고, 여기서 CAG 프로모터는 CMV IE 인핸서, CB 프로모터, CBA 엑손 1, CBA 인트론, 토끼 베타-인트론, 및 토끼 베타-글로빈 엑손 2를 보유한다. 본 개시내용은 SGSH 또는 이의 활성 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 개선된 유전자 요법 벡터이며, 여기서 1세대 생성물의 PGK 프로모터가 CAG 프로모터로 대체되는 상기 벡터를 제공한다. 일부 실시양태에서, CAG 프로모터는 SGSH 서열에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시양태에서, PGK 프로모터를 CAG 프로모터로 대체하면 놀랍게도 SGSH의 발현이 상당히 향상된다.
외인성 공급 프로모터에 의해 조절되는 유도성 프로모터의 예는 아연-유도성 메탈로티오닌 (MT) 프로모터, 덱사메타손 (Dex)-유도성 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV) 프로모터, 엑디손 곤충 프로모터, 테트라사이클린-억제성 시스템(repressible system), 및 테트라사이클린-유도성 시스템을 포함한다. 유도성 프로모터 및 유도성 시스템은 인비트로젠, 클론테크(Clontech) 및 아리아드(Ariad)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 여러 가지의 상업적 공급원으로부터 이용가능하다. 많은 다른 시스템이 기재되어 있으며 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 선택될 수 있다.
IRES (내부 리보솜 진입 부위)는 번역 메커니즘(translation machinery)이 mRNA 내에서 모집되도록 하는 구조적 RNA 요소이며, 한편 번역 개시의 지배적 경로는 5' 말단으로 캡핑된 mRNA 상에 리보솜을 모집한다.
폴리(A) 신호는 mRNA 상에 폴리 A 꼬리의 3' 첨가를 위해 세포에 의해 사용된다. 이 꼬리는 mRNA의 핵 이출(export), 번역, 및 안정성에 중요하다. 일부 실시양태에서, 폴리 A 단위는 인간 성장 호르몬 1 폴리 A 단위이다.
본 개시내용의 벡터의 특정한 실시양태에서, 프로모터 서열은 CAG 프로모터 서열로부터 유래되고/거나; 폴리 A 서열은 인간 성장 호르몬 1 폴리 A 서열로부터 유래된다.
한 실시양태에서, 발현 카세트는 다음 5'에서 3' 순서로 포함한다:
CAG 프로모터 서열로부터 유래된 프로모터 서열;
인간 N-술포글루코사민 술포히드롤라제 (SGSH) 폴리펩티드 또는 이의 활성 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열;
및
인간 성장 호르몬 폴리 A 서열로부터 유래된 폴리 A 서열.
본 개시내용의 벡터의 특정한 실시양태에서, 발현 카세트는 2개의 AAV 내부 말단 반복체 (ITR) 서열, 예를 들어, AAV2 ITR에 의해 플랭킹되며, 여기서 2개의 AAV ITR 서열 중 하나는 발현 카세트의 5'에 위치하고 2개의 AAV ITR 서열 중 하나는 발현 카세트의 3'에 위치한다. ITR 서열은 각각 약 145개의 염기를 포함한다. 이들은 이의 대칭성 때문에 그렇게 명명되었으며, 이는 AAV 게놈의 효율적인 증식에 필요한 것으로 나타났다. 이들 서열의 또 다른 특성은 헤어핀(hairpin)을 형성하는 이의 능력이며, 이는 소위 자기-프라이밍(self-priming)에 기여하고 두 번째 DNA 가닥의 프리마제-독립적(primase-independent) 합성을 가능하게 한다. AAV ITR은 게놈 복제 및 패키징에 필요한 유일한 시스-작용 요소이다.
한 특정한 실시양태에서, 본 개시내용은 5'에서 3' 순서로 다음을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 포함한다:
AAV2 ITR 서열;
CAG 프로모터 서열;
인간 N-술포글루코사민 술포히드롤라제 (SGSH) 폴리펩티드 또는 이의 활성 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열;
인간 성장 호르몬 폴리 A 서열; 및
AAV2 ITR 서열.
1세대 SAF301 벡터의 개략도가 도 1에 제공된다. 2세대 SAF302 벡터인 본 개시내용의 벡터 구축물의 개략도가 도 3에 제공된다.
본 개시내용은 본 개시내용의 유전자 요법 벡터, 뿐만 아니라 이의 단위 투여형을 포함하는 제약 조성물을 비롯한 조성물을 추가로 포함한다.
한 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 유전자 요법 벡터 및 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 조성물을 포함한다. 이러한 조성물은 제약 조성물로 지칭될 수 있다. 한 특정한 실시양태에서, 제약상 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제는 멸균 및/또는 GMP 임상 등급일 수 있는 인산염 완충 식염수 용액이다. 한 특정한 실시양태에서, 본 개시내용의 조성물은 5'에서 3' 순서로 다음을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 포함하며:
AAV2 ITR 서열;
CAG 프로모터 서열;
인간 N-술포글루코사민 술포히드롤라제 (SGSH) 폴리펩티드 또는 이의 활성 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열;
인간 성장 호르몬 1 폴리 A 서열; 및
AAV2 ITR 서열,
여기서 상기 벡터는 멸균 및/또는 GMP 임상 등급일 수 있는 인산염 완충 식염수 용액에 현탁된다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 조성물에 존재하는 벡터의 농도는 약 1x1010 gc/ml 내지 약 1x1014 gc/ml, 약 1x1011 gc/ml 내지 약 1x1013 gc/ml, 또는 약 5x1011 gc/ml 내지 약 5 및 1012 gc/ml이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 조성물에 존재하는 벡터의 농도는 약 1.9x1012 gc/mL 내지 약 3.2x1012 gc/mL, 또는 약 2.4x1012 gc/mL이다.
특정한 실시양태에서, 본 개시내용의 단위 투여 형태는 본 개시내용의 조성물 약 100 μl 내지 2 mL를 함유하는 바이알을 포함한다. 특정 실시양태에서, 단위 투여 형태는 약 1.2 mL의 조성물을 함유하는 바이알을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 단위 투여 형태에 존재하는 벡터의 양은 약 .05x1012 gc 내지 약 3x1012 gc, 또는 약 0.1x1012 gc 내지 약 0.5x1012 gc, 또는 약 0.1x1012 gc 내지 약 2x1012 gc이다.
폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 발현 카세트, 뿐만 아니라 본원에 기재된 발현 카세트 중 임의의 것을 포함하는 플라스미드 및 벡터를 포함하거나 이로 이루어진 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 게다가, 본 개시내용은 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 서열, 벡터 또는 플라스미드 중 임의의 것을 포함하는 세포를 포함한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 표준 분자 및 세포 생물학 기술 및 관련 기술분야의 지식을 사용하여 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 서열, 벡터 및 숙주 세포를 용이하게 생성할 수 있다.
본 개시내용의, 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 발현 카세트의 성분의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열은 공지되어 있다.
뮤린 PGK 프로모터 서열은 서열번호:1의 NCBI 참조 번호 MI8735 위치 +419 - +924, 및 위치 +419 - +924에 제공된다.
IRES 서열은 서열번호:2의 NCBI 참조 번호 NC001479 위치 +13 - +575, 및 위치 +13 - +575에 제공된다.
소 성장 호르몬 폴리 A 서열은 서열번호:3의 NCBI 참조 번호 M57764 위치 +2326 - +2533, 및 위치 +2326 - +2533에 제공된다.
CAG 프로모터 서열은 서열번호: 12로서 및/또는 서열번호: 9의 위치 125-1862로서 제공된다.
인간 성장 호르몬 1 폴리 A 서열은 서열번호: 17로서 및/또는 서열번호: 9의 위치 3414-3923으로서 제공된다.
N-술포글리코사민 술포히드롤라제 (SGSH, 술파미다제라고도 명명함)는 A형 산필립포 증후군 (MPSIIIA, OMIM #252900)에 관여하는 결핍 단백질이다. N-술포글루코사민 술포히드롤라제 (SGSH, EC 3.10.1.1, MIM 605270)는 헤파란 술페이트 (HS)라고 칭해지는 글리코사미노글리칸 패밀리의 단계적 분해에 필요한 리소좀 히드롤라제의 패밀리에 속한다. SGSH는 헤파란 술페이트 (HS) 분해의 세 번째 단계에 관여한다. SGSH는 HS의 비환원 말단 글루코사미니드 잔기로부터 N-연결된 술페이트의 가수분해를 촉매한다. 야생형 인간 N-술포글루코사민 술포히드롤라제 cDNA 서열은 서열번호: 4의 NCBI 참조 번호 U30894 위치 +12 - +1521, 및 위치 +12 - +1521에 제공된다. 야생형 인간 N-술포글루코사민 술포히드롤라제 폴리펩티드 서열은 NP_000190.1 (서열번호: 5)에 제공된다. 야생형 인간 술파타제 변형 인자 1 cDNA 서열은 NCBI 참조 번호 AY208752 위치 +1 - +1125, 및 서열번호: 6의 위치 +1 - +1125에 제공된다. 야생형 인간 술파타제 변형 인자 1 폴리펩티드 서열은 NP_877437.2 (서열번호: 7)에 제공된다. 특정한 실시양태에서, SGSH 및 SUMF1 폴리펩티드는 이의 신호 서열을 포함하며, 한편 다른 실시양태에서는 하나 또는 둘 다가 신호 서열을 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, SGSH 서열은 서열번호: 13으로서 및/또는 서열번호: 9의 아미노산 1867-3401로서 제공된다.
AAV 캡 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예시적인 AAVrh.10 캡 폴리뉴클레오티드 서열은 PCT 특허 출원 공개 번호 WO2003/042397에서 서열번호:59로서 제공되며, 상기 서열은 뉴클레오티드 845-3061에서 VP1, 뉴클레오티드 1256-3061에서 VP2, 및 1454-3061에서 VP3을 암호화한다. 예시적인 AAVrh.10 캡 폴리펩티드 서열은 PCT 특허 출원 공개 번호 WO2003/042397의 서열번호: 81의 아미노산 1-738로서 제공되며, 여기서 VP1 서열은 아미노산 1-738에 있고, VP2는 아미노산 138-738에 있으며, VP3은 아미노산 203-738에 있다.
일부 실시양태에서, 도 1에 예시된 바와 같은 본 개시내용의 하나의 발현 카세트 및 플랭킹 ITR의 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호: 8로서 제공된다. 일부 실시양태에서, 도 3에 예시된 바와 같은 본 개시내용의 하나의 발현 카세트 및 플랭킹 ITR의 폴리뉴클레오티드 서열은 도 4a-4b 및 서열번호: 9에 제공된다. 일부 실시양태에서, 서열번호: 9를 함유하는, 전체 플라스미드 p-Lys-SAF-T-5의 폴리뉴클레오티드는 도 4c 내지 도 4d 및 서열번호: 14에 제공된다.
특정 실시양태에서, 발현 카세트를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열은 폴리뉴클레오티드 서열의 복제 또는 생성을 촉진하기 위해, 벡터 또는 플라스미드, 예를 들어, 클로닝 벡터 또는 발현 벡터에 존재한다. 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 서열은 ITR 서열 또는 제한 부위를 함유하는 DNA 링커 서열의 경계에서 적합한 제한 부위의 이용, 뿐만 아니라 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다른 방법을 통해 벡터에 삽입될 수 있다. 분자 생물학에서 통상적으로 사용되는 플라스미드는 발현 카세트 삽입을 위한 백본, 예컨대, 예를 들어, pBR322 (뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs), 매사추세츠주 베벌리), pRep9 (인비트로겐, 캘리포니아주 샌디에이고), pBS (스트라타진(Stratagene), 캘리포니아주 라호이아)으로서 사용될 수 있다.
본 개시내용의 벡터 또는 플라스미드는, 예를 들어 임상 용도를 위해 유전자 요법 벡터 또는 바이러스 입자를 생성하기 위해, 숙주 세포에 존재할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 발현 카세트를 포함하는 벡터 또는 플라스미드를 포함하는 세포를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 숙주 세포는 293 인간 배아 신장 세포, 예컨대, 예를 들어, SV40 T 항원을 함유하는 293 세포의 고도로 형질전환가능한 유도체인 293T 세포이다. 다른 벡터, 숙주 세포, 및 바이러스 벡터를 제조하는 방법의 예는 문헌 [Kotin RM, Hum Mol Genet, 2011 Apr 15;20(R1):R2-6. Epub 2011 Apr 29)에 기재되어 있다.
추가 실시양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 발현 카세트 중 임의의 것을 포함하는 유전자 요법 벡터 또는 바이러스 입자를 포함하며, 여기서 상기 유전자 요법 벡터 또는 바이러스 입자는 캡시드, 예를 들어 AAVrh.10 캡시드를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 캡시드는 하나 이상의 AAVrh.10 캡시드 폴리펩티드를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드, 발현 카세트 및 벡터는 하나 이상의 활성 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 활성 변이체, 예컨대 프로모터 서열, IRES 서열 또는 폴리 A 서열의 활성 변이체, 또는 SGSH 폴리펩티드 또는 SUMF1 폴리펩티드의 활성 변이체를 포함할 수 있다. 활성 변이체는 본원에 제공된 서열 중 임의의 것의 생물학적 활성 변이체 및 생물학적 활성 단편 둘 다를 포함하며, 이는 참조 서열로서 지칭될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 참조 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 활성 변이체는 디폴트 파라미터를 사용하여 본원의 다른 곳에 기재된 서열 정렬 프로그램에 의해 결정된 바와 같이, 참조 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열에 대해 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 일반적으로 적어도 75%, 80%, 85%, 대개 약 90% 내지 95% 또는 그 초과, 및 전형적으로 약 97% 또는 98% 또는 99% 또는 그 초과의 서열 유사성 또는 동일성을 갖는다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 제공된 임의의 서열, 예컨대 서열번호: 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 및/또는 17에 대해 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
특정 실시양태에서, SGSH 또는 SUMF1을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열의 활성 변이체는 유전 코드(genetic code)의 축퇴성으로 인해 야생형 또는 자연 발생 유전자 또는 cDNA 서열로부터 다양하다. 따라서, 폴리뉴클레오티드 서열은 야생형과는 다르지만, 암호화된 SGSH 또는 SUMF1 폴리펩티드는 야생형 서열을 유지한다. 따라서, 본 개시내용은 SGSH 또는 SUMF1 폴리펩티드 또는 그 안의 활성 변이체를 암호화하는 임의의 폴리뉴클레오티드 서열의 사용을 고려한다.
다른 실시양태에서, 자체적으로 활성인 폴리뉴클레오티드 서열의 활성 변이체, 예를 들어, IRES 또는 폴리 A 서열은 이의 천연 활성을 유지하긴 하지만, 이의 상응하는 야생형 참조 서열과 서열이 다를 수 있다. 참조 폴리뉴클레오티드 서열의 활성 변이체는 일반적으로 200, 100, 50 또는 20개 정도까지 많은 뉴클레오티드 잔기, 또는 적합하게는 1-15개만큼 적은 뉴클레오티드 잔기, 1-10개만큼 적은, 예컨대 6-10개, 5개만큼 적은, 4개, 3개, 2개, 또는 심지어 1개만큼 적은 뉴클레오티드 잔기에 의해 그 서열과 상이할 수 있다.
특정 실시양태에서, 폴리펩티드의 활성 변이체는 생물학적으로 활성이며, 즉, 참조 폴리펩티드의 효소 활성을 계속 보유한다. 이러한 변이체는, 예를 들어, 유전적 다형성으로부터 및/또는 인간 조작으로부터의 결과일 수 있다. 참조 폴리펩티드의 활성 변이체는 일반적으로 200, 100, 50 또는 20개 정도까지 많은 아미노산 잔기, 또는 적합하게는 1-15개만큼 적은 아미노산 잔기, 1-10개만큼 적은, 예컨대 6-10개, 5개만큼 적은, 4개, 3개, 2개, 또는 심지어 1개만큼 적은 아미노산 잔기에 의해 그 폴리펩티드와 상이할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변이체 폴리펩티드는 본원에 언급된 참조 서열과 적어도 1개 그러나 15개, 10개 또는 5개 미만의 아미노산 잔기에 의해 상이하다. 다른 실시양태에서, 이는 적어도 1개의 잔기 그러나 잔기의 20%, 15%, 10% 또는 5% 미만에 의해 참조 서열과 상이하다.
참조 폴리펩티드는 활성 변이체를 생성하기 위해 아미노산 치환, 결실, 말단절단, 및 삽입을 포함한 다양한 방식으로 변경될 수 있다. 이러한 조작을 위한 방법은 일반적으로 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 참조 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체는 DNA의 돌연변이에 의해 제조될 수 있다. 돌연변이유발 및 뉴클레오티드 서열 변경 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Kunkel (1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82: 488-492), Kunkel et al., (1987, Methods in Enzymol, 154: 367-382), 미국 특허 번호 4,873,192, Watson, J. D. et al., ("Molecular Biology of the Gene", Fourth Edition, Benjamin/Cummings, Menlo Park, Calif., 1987)] 및 여기에 인용된 참고문헌을 참조한다. 관심 단백질의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않는 적절한 아미노산 치환에 대한 지침은 문헌 [Dayhoff et al., (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.)]의 모델에서 찾을 수 있다.
특정 실시양태에서, 폴리펩티드 변이체는 참조 폴리펩티드 서열과 비교하여, 이의 서열을 따라 다양한 위치에서 보존적 아미노산 치환을 함유한다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 일반적으로 다음과 같이 하위-분류될 수 있는 관련 기술분야에 정의되어 있다:
산성: 잔기는 생리학적 pH에서 H 이온의 손실로 인해 음전하를 갖고 잔기는 수용액에 의해 끌어당겨서 펩티드가 생리학적 pH에서 수성 매질에 있을 때 그것이 함유된 펩티드의 입체형태의 표면 위치를 찾는다. 산성 측쇄를 갖는 아미노산은 글루탐산 및 아스파르트산을 포함하고; 염기성: 잔기는 생리학적 pH 또는 이의 1 또는 2의 pH 단위 내에서 H 이온과 회합하여 양전하를 가지며 (예를 들어, 히스티딘) 잔기는 수용액에 의해 끌어당겨서 펩티드가 생리학적 pH에서 수성 매질에 있을 때 그것이 함유된 펩티드의 입체형태의 표면 위치를 찾는다. 염기성 측쇄를 갖는 아미노산은 아르기닌, 리신 및 히스티딘을 포함하고;
하전됨: 잔기는 생리학적 pH에서 하전되므로, 산성 또는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 (즉, 글루탐산, 아스파르트산, 아르기닌, 리신 및 히스티딘)을 포함하고;
소수성: 잔기는 생리학적 pH에서 전하를 띠지 않고 잔기는 수용액에 의해 반발되어 펩티드가 수성 매질에 있을 때 그것이 함유된 펩티드의 입체형태의 내부 위치를 찾는다. 소수성 측쇄를 갖는 아미노산은 티로신, 발린, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌 및 트립토판을 포함하고;
중성/극성: 잔기는 생리학적 pH에서 전하를 띠지 않으나, 잔기는 수용액에 의해 충분히 반발되지 않아 펩티드가 수성 매질에 있을 때 그것이 함유된 펩티드의 입체형태의 내부 위치를 찾을 것이다. 중성/극성 측쇄를 갖는 아미노산은 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 히스티딘, 세린 및 트레오닌을 포함한다.
아미노산 잔기는 잔기의 측쇄 치환기 군과 관련하여 시클릭 또는 비시클릭, 및 방향족 또는 비방향족의, 자명한 분류, 및 작거나 큰 것으로서 추가로 하위-분류될 수 있다. 추가 극성 치환기가 존재하는 한, 카르복실 탄소를 포함하여 총 4개 이하의 탄소 원자를 함유하는 경우 잔기는 작은 것으로 간주되며; 그렇지 않은 경우 3개 이하이다. 물론 작은 잔기는 항상 비방향족이다. 아미노산 잔기는, 이의 구조적 특성에 따라, 둘 이상의 부류에 속할 수 있다. 자연-발생 단백질 아미노산의 경우, 이 체계에 따른 하위-분류가 표 1에 제시되어 있다.
[표 1]
아미노산 하위-분류
Figure pct00003
보존적 아미노산 치환은 또한 측쇄를 기반으로 하는 그룹화(grouping)를 포함한다. 예를 들어, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산 군은 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 및 이소류신이고; 지방족-히드록실 측쇄를 갖는 아미노산 군은 세린 및 트레오닌이고; 아미드-함유 측쇄를 갖는 아미노산 군은 아스파라긴 및 글루타민이고; 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 군은 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판이고; 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 군은 리신, 아르기닌, 및 히스티딘이고; 황-함유 측쇄를 갖는 아미노산 군은 시스테인 및 메티오닌이다. 예를 들어, 류신을 이소류신이나 발린으로, 아스파르테이트를 글루타메이트로, 트레오닌을 세린으로 대체하거나, 아미노산을 구조적으로 관련된 아미노산으로 유사한 대체가 생성된 변이체 폴리펩티드의 특성에 주요 영향을 미치지 않을 것으로 예상하는 것이 합리적이다. 아미노산 변화가 기능적 말단절단 및/또는 변이체 폴리펩티드를 결과하는지 여부는 본원에 기재된 바와 같이 이의 효소 활성을 검정함으로써 용이하게 결정할 수 있다. 보존적 치환은 예시적인 치환이라는 제목으로 표 2에 나타냈다. 본 개시내용의 범위에 속하는 아미노산 치환은, 일반적으로, (a) 치환 영역에서 펩티드 백본의 구조, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 벌크를 유지하는데 미치는 이의 영향이 크게 상이하지 않은 치환을 선택함으로써 완수된다. 치환이 도입된 후, 변이체는 생물학적 활성에 대해 스크리닝된다.
[표 2]
예시적인 아미노산 치환
Figure pct00004
따라서, 참조 폴리펩티드에서 예측된 비필수 아미노산 잔기는 전형적으로 동일한 측쇄 패밀리로부터의 또 다른 아미노산 잔기로 대체된다. "비필수" 아미노산 잔기는 이의 활성 중 하나 이상을 폐지하거나 실질적으로 변경하지 않고 실시양태 폴리펩티드의 야생형 서열로부터 변경될 수 있는 잔기이다. 적합하게는, 변경은 이들 활성 중 하나를 실질적으로 폐지하지 않으며, 예를 들어 활성은 야생형의 적어도 20%, 40%, 60%, 70% 또는 80% 100%, 500%, 1000% 또는 그 초과이다. "필수" 아미노산 잔기는 참조 폴리펩티드의 야생형 서열로부터 변경될 때 야생형 활성의 20% 미만이 존재하도록 모 분자의 활성의 폐지를 결과하는 잔기이다. 예를 들어, 이러한 필수 아미노산 잔기는 다양한 공급원으로부터 참조 폴리펩티드의 효소 부위에 보존된 것들을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 또한 자연-발생 참조 폴리펩티드 서열의 활성 변이체를 고려하며, 여기서 변이체는 하나 이상의 아미노산 잔기의 첨가, 결실, 또는 치환에 의해 자연-발생 서열과 구별된다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드의 활성 변이체는 본원에 기재된 참조 폴리펩티드의 상응하는 서열과 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98% 또는 그 초과의 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 그 참조 폴리펩티드의 효소 활성을 유지한다.
서열 사이의 서열 유사성 또는 서열 동일성의 계산 (상기 용어는 본원에서 상호교환가능하게 사용됨)은 다음과 같이 수행된다. 2개의 아미노산 서열, 또는 2개의 핵산 서열의 퍼센트 동일성을 결정하기 위해, 최적의 비교 목적을 위해 서열을 정렬한다 (예를 들어, 갭은 최적 정렬을 위해 제1 및 제2 아미노산 또는 핵산 서열 중 하나 또는 둘다에 도입될 수 있으며 비-상동성 서열은 비교 목적으로 무시될 수 있다). 특정 실시양태에서, 비교 목적으로 정렬된 참조 서열의 길이는 참조 서열 길이의 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 40%, 보다 바람직하게는 적어도 50%, 60%, 그리고 더욱 보다 바람직하게는 적어도 70%, 80%, 90%, 100%이다. 이어서, 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드가 비교된다. 첫 번째 서열의 위치가 두 번째 서열의 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드에 의해 점유될 경우, 분자는 그 위치에서 동일하다.
두 서열 사이의 퍼센트 동일성은 두 서열의 최적 정렬을 위해 도입되어야 하는, 갭의 수와 각각의 갭의 길이를 고려하여, 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다.
두 개의 서열 사이의 서열 비교 및 동일성 백분율 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 완수할 수 있다. 한 실시양태에서, 두 개의 아미노산 서열 사이의 퍼센트 동일성은 블로썸(Blossum) 62 행렬 또는 PAM250 행렬, 및 갭 가중치 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4 및 길이 가중치 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6을 사용하여, GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램에 통합된 니들만 및 분취(Needleman and Wunsch), (1970, J. Mol. Biol. 48: 444-453) 알고리즘을 사용하여 결정된다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 두 개의 뉴클레오티드 서열 사이의 퍼센트 동일성은 NWSgapdna.CMP 행렬 및 갭 가중치 40, 50, 60, 70, 또는 80 및 길이 가중치 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6을 사용하여, GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램을 사용하여 결정된다. 특히 바람직한 파라미터 세트 (및 달리 특정되지 않는 한 사용되어야 하는 것)는 갭 페널티 12, 갭 확장 페널티 4, 및 프레임시프트 갭 패널티 5를 가진 블로썸 62 점수 행렬이다.
유전자 요법 벡터를 제조하는 방법
본 개시내용의 유전자 요법 벡터는 관련 기술분야에 공지되고 이전에, 예를 들어, PCT 특허 출원 공개 번호 WO03042397 및 미국 특허 번호 6,632,670에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있다.
AAV 게놈은 길이가 약 4.7킬로베이스인 단일-가닥 데옥시리보핵산 (ssDNA)으로 양성 또는 음성으로 감지된다. 게놈은 DNA 가닥의 양쪽 말단에 있는 ITR 및 두 개의 개방 판독 프레임 (ORF): rep 및 cap을 포함한다. Rep는 AAV 수명 주기에 필요한 Rep 단백질을 암호화하는 4개의 중첩 유전자를 포함하고, cap은 상호작용하여 정이십면체 대칭의 캡시드를 형성하는 캡시드 단백질: VP1, VP2 및 VP3을 암호화하는 중첩 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
ITR은 AAV DNA의 숙주 세포 게놈으로의 통합 및 이로부터의 구조, 뿐만 아니라 AAV DNA의 효율적인 캡슐화 및 완전히-어셈블리된 AAV 입자의 생성 모두에 필요한 것으로 여겨진다. 유전자 요법와 관련하여, ITR은 치료 유전자 옆에 있는 cis에서 필요한 유일한 서열인 것으로 보이며, 구조적(cap) 및 패키징 (rep) 유전자는 트랜스로 전달될 수 있다. 따라서, 치료 유전자를 함유하는 재조합 AAV (rAAV) 벡터의 제조를 위해 확립된 특정 방법은 2개 또는 3개의 플라스미드의 사용을 수반한다. 특정한 실시양태에서, 제1 플라스미드는 플랭킹 ITR을 함유하는 치료 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 플라스미드는 rep 및 cap 유전자 및 플랭킹 ITR을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제3 플라스미드는 (예를 들어, 아데노바이러스 혈청형 5로부터) 헬퍼 기능을 제공한다. 재조합 AAV 벡터 스톡을 생성하기 위해, 표준 접근법은 치료 폴리펩티드를 암호화하는 AAV 벡터 플라스미드와 함께 적합한 세포를 공동형질감염시키는데 사용되는 플라스미드 상의 AAV rep 및 cap 유전자 생성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 표준 접근법은 치료용 폴리펩티드를 암호화하는 AAV 벡터 플라스미드 및 헬퍼 기능을 제공하는 플라스미드와 함께 적합한 세포를 공동형질감염시키는데 사용되는 플라스미드 상의 AAV rep 및 cap 유전자 생성물을 제공한다.
특정한 실시양태에서, AAV rep 및 cap 유전자는 AAV ITR 서열을 함유하는 복제 플라스미드 상에 제공된다. 일부 실시양태에서, rep 단백질은 복제 기점으로서 ITR을 활성화시켜, 플라스미드의 복제를 야기한다. 복제 기점은 SV40 복제 기점, 엡스타인-바 (Epstein-Barr) (EBV) 복제 기점, ColE1 복제 기점, 뿐만 아니라 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 기타 기점을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 복제 기점이 활성화 단백질, 예를 들어, T 항원을 필요로 하는 SV40 기점, EBNA 단백질을 필요로 하는 EBV 기점이 필요한 경우, 활성화 단백질은 세포주 공급원, 예를 들어 293T 세포)를 생성하기 위해 안정한 형질감염에 의해, 또는 적절한 유전자를 함유하는 플라스미드로 일시적인 형질감염에 의해 제공될 수 있다.
다른 실시양태에서, AAV rep 및 cap 유전자는 복제 기점을 함유하지 않는 비-복제 플라스미드 상에 제공될 수 있다. 이러한 비-복제 플라스미드는 바이러스 생성을 최적화하기 위해, 세포의 복제 장치가 재조합 AAV 게놈을 복제하도록 지시된다는 것을 추가로 보장한다. 이러한 비-복제 플라스미드에 의해 암호화되는 AAV 단백질의 수준은 이들 유전자의 발현을 구동하기 위한 특정한 프로모터의 사용에 의해 조정될 수 있다. 이러한 프로모터는, 특히, AAV 프로모터, 뿐만 아니라 외인성 공급원, 예를 들어 CMV, RSV, MMTV, E1A, EF1a, 액틴, 사이토케라틴 14, 사이토케라틴 18, PGK, 뿐만 아니라 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 기타 프로모터를 포함한다. 이들 헬퍼 플라스미드에 의해 생성되는 rep 및 cap 단백질의 수준은 원하는 단백질 수준에 최적으로 적합한 각각의 유전자에 대한 프로모터의 선택에 의해 개별적으로 조절될 수 있다.
표준 재조합 DNA 기술을 사용하여, 제한 부위를 함유하는 유전자 및 AAV ITR 서열 (사용되는 경우) 또는 DNA 링커 서열의 경계에서 양립가능한 제한 부위의 이용, 뿐만 아니라 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다른 방법을 포함하여, 본 개시내용의 바이러스 벡터를 제조하는 데 사용되는 헬퍼 플라스미드를 구축할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel., F. et al., eds, Wiley and Sons, New York 1995] 참조),
한 실시양태에서, 본 개시내용의 유전자 요법 벡터는 2 또는 3개의 플라스미드를 293 또는 293T 인간 배아 신장 세포주로 형질감염시킴으로써 제조된다. 일부 실시양태에서, 치료 유전자를 코딩하는 DNA는 하나의 플라스미드에 의해 제공되고, 캡시드 단백질 (AAVrh.10로부터), 복제 유전자 (AAV2로부터) 및 헬퍼 기능 (아데노바이러스 혈청형 5로부터)은 모두 두 번째 플라스미드에 의해 트랜스로 제공된다 . 일부 실시양태에서, 치료 유전자를 코딩하는 DNA는 하나의 플라스미드에 의해 제공되고, 캡시드 단백질 (AAVrh.10로부터) 및 복제 유전자 (AAV2로부터)는 제2 플라스미드에 의해 트랜스로 제공되고, 헬퍼 기능 (아데노바이러스 혈청형 5로부터)은 세 번째 플라스미드에 의해 제공된다. 특정한 실시양태에서, 제1 플라스미드는 플랭킹 ITR을 포함한, 본 개시내용의 발현 카세트를 포함한다.
세포 배양 후, 유전자 요법 벡터는 동결 해동 주기에 의해 세포로부터 방출되고, 아이오딕사놀 단계 구배에 뒤이서 Hi-트랩(-Trap) QHP 컬럼 상에서 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제된다. 생성된 유전자 요법 벡터는 스핀 컬럼에 의해 농축될 수 있다. 정제된 벡터는 예를 들어 인산염 완충 식염수에서 냉동 (-60℃ 이하) 보관할 수 있다.
최종 제제화된 벡터의 특성화는 캡시드 단백질에 대한 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯, 트랜스진 DNA에 대한 실시간 PCR, 웨스턴 분석, 생체내 및 시험관내 일반 및 특정 외래성 바이러스, 및 기능적 유전자 전달에 대한 효소 검정을 통해 달성할 수 있다.
치료 방법
본 개시내용은 MPS와 같은 리소좀 축적 질환을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 뇌 질환 및 장애, 신경계 질환 및 장애, 및 유전적 질환 및 장애를 치료하는 방법을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 MPSIIIA (산필립포 증후군)의 치료를 필요로 하는 대상체에게 대상체의 세포에 의해 흡수될 때 SGSH를 발현하도록 설계된 유전자 요법 벡터를 포함하는 조성물을 제공하는 것을 포함하는 MPSIIIA (산필립포 증후군)를 치료하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 조성물은 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제, 예를 들어, 인산염-완충 식염수를 추가로 포함한다. 특정한 실시양태에서, 대상체는 인간과 같은 포유동물이다. 특정한 실시양태에서, 대상체는, 예를 들어, 대상체의 N-술포글리코사민 술포히드롤라제 (SGSH) 유전자의 돌연변이를 확인하기 위한 유전자 검사를 통해 또는 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플로부터 SGSH 활성을 측정함으로써 MPSIIIA로 진단되었다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 대상체의 뇌 전반에 걸친 정상 SGSH의 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 또는 그 초과를 회복시킨다.
특정한 실시양태에서, 유전자 요법 벡터는 본 개시내용의 임의의 발현 카세트를 포함한다. 따라서, 구체적 실시양태에서, 본 개시내용은 MPSIIIA의 치료를 필요로 하는 대상체에게 5'에서 3' 순서로 다음을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 유전자 요법 벡터를 포함하는 조성물을 투여함으로써 MPSIIIA를 치료하는 방법을 포함한다:
프로모터 서열;
인간 N-술포글루코사민 술포히드롤라제 (SGSH) 폴리펩티드 또는 이의 활성 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열;
및
폴리아데닐화 (폴리 A) 서열.
일부 실시양태에서, 유전자 요법 벡터는 SUMF1을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하지 않고, IRES 서열을 포함하지 않는다.
한 실시양태에서, 발현 카세트는 ITR에 의해 플랭킹되고, 따라서 벡터는 다음 5'에서 3' 순서로 포함한다:
AAV2 ITR 서열;
CAG 프로모터 서열;
인간 N-술포글루코사민 술포히드롤라제 (SGSH) 폴리펩티드 또는 이의 활성 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열;
인간 성장 호르몬 폴리 A 서열; 및
AAV2 ITR 서열.
특정한 실시양태에서, SGSH 폴리펩티드는 야생형 인간 SGSH 폴리펩티드를 포함하거나 이로 이루어지고, 구체적 실시양태에서, 발현 카세트 및 플랭킹 ITR은 서열번호: 9에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정한 실시양태에서, 유전자 요법 벡터를 포함하는 조성물은 대상체의 뇌에 투여된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 유전자 요법 벡터를 포함하는 조성물은 뇌 실질 내로 직접 주사를 통해 투여된다. 특정 실시양태에서, 이는 뇌내 투여된다. 한 실시양태에서, 이는 뇌내 주사에 의해 뇌에 직접 투여된다. 이 기술은 벡터 전달을 제어하기 위해 선택적 신경-해부학적 부위를 표적화할 수 있게 한다.
임의의 특정한 이론에 얽매이는 것을 바라지 않으면서, 뇌 실질에 주입 직후, AAV 벡터 입자가 국소적으로 확산되고 축삭을 따라 원격 해부학적 뇌 구조로 수송될 수도 있는 것으로 여겨진다. 벡터 입자는 신경 세포, 아교 세포, 또는 미세아교세포(microglial cell)에 의해 내재화된다. 이들 세포 각각의 유형은 MPSIIIA 환자에서 SGSH 효소가 결핍되어 있으며 분해되지 않은 헤파란 술페이트 이화대사산물의 독성 축적으로 고통받는다. 세포에 진입 직후, SGSH 단백질을 암호화하는 재조합 게놈은 핵으로 수송되고 여기서 일련의 분자 형질전환을 거쳐 이중 가닥 데옥시리보핵산 (DNA) 분자로서 이의 안정적인 확립을 결과한다. 이 DNA는 세포 메커니즘에 의해 메신저 리보핵산 (mRNA)으로 활발히 전사된다. mRNA는 SGSH로 번역되어, 세포 결핍을 보완할 것이다.
리소좀 저장의 효소 보완 및 수정은 두 가지 상이한 메커니즘에 의해 발생하는 것으로 여겨진다: (1) 효소는 AAV-보유 트랜스진을 함유하고 발현하는 세포의 리소좀에 도달하여 축적된 이화대사산물을 분해할 수 있다, 또는 (2) 효소가 이들 세포 외부로 방출되어, 원거리 세포에 의해 재포획되어 이의 리소좀으로 발송될 수 있다. 따라서, 유전자 변형된 세포의 제한된 군은 확장된 뇌 영역의 수정을 가능하게 한다. 형질도입된 세포는 효소를 지속적으로 발현하고 전달하여, 뇌내 영구적인 효소 생성 공급원을 구성할 것이다.
특정한 실시양태에서, 뇌내 투여는 대상체의 뇌에서 하나 이상, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개의 부위에서 수행된다. 투여는 뇌의 한쪽 또는 양쪽에 수행될 수 있다. 예를 들어, 유전자 요법 벡터가 뇌의 2개 이상의 부위에 투여되는 경우, 이는 뇌의 양쪽에, 예를 들어, 각 면의 유사하거나 동일한 위치에 투여될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 유전자 요법 벡터는 전방 우측, 전방 좌측, 내측 우측, 내측 좌측, 후방 우측, 및 후방 좌측으로부터 선택된 대상체의 뇌 내의 하나 이상의 부위에 투여된다.
특정 실시양태에서, 뇌내 투여는 피막에 인접한 백색질에 있을 수 있는 하나 이상의 두개 천공을 통해 수행된다. 특정한 실시양태에서, 유전자 요법 벡터는 단일 두개 천공을 통해 뇌 또는 백질 내의 2개 이상의 부위에 투여된다. 예를 들어, 유전자 요법 벡터의 2개 이상의 침착물은 단일 두개 천공 또는 트랙을 통해 투여될 수 있으며, 여기서 하나는 심부이고 다른 하나는 표피상이어서, 실질 확산을 향상시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 심부 주사는 피질 표면으로부터 약 1.5 cm 내지 약 3.0 cm, 또는 약 1.7 cm 내지 약 2.5 cm, 또는 약 2 cm의 깊이에서 수행된다. 특정 실시양태에서, 표피상 주사는 피질 표면으로부터 약 0.5 cm 내지 약 2.0 cm, 또는 약 0.7 cm 내지 약 1.5 cm, 또는 약 1 cm의 깊이에서 수행된다.
특정 실시양태에서, 유전자 요법 벡터는 뇌내 주사를 통해 투여되고, 여기서 주사는 단일 깊이에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 유전자 요법 벡터는 단일 깊이에서 양측 주사를 통해 투여된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 유전자 요법 벡터는 백질 내의 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 또는 16개의 두개 천공을 통해, 대상체의 뇌 내에 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 또는 그 초과의 부위에 뇌내 투여를 통해 투여되며, 여기서 각각의 두개 천공 또는 트랙을 통해 유전자 요법 벡터의 단일 침착물이 투여된다. 일부 실시양태에서, 단일 깊이에서의 유전자 요법 벡터의 투여는 놀랍게도 2개의 깊이와 같은 하나 초과의 깊이에서의 유전자 요법 벡터의 투여보다 우수하다. 이론에 얽매이는 것을 바라지 않으면서, 벡터 확산은 유전자 요법 벡터가 2개 이상의 깊이와 비교하여 단일 깊이에서 투여될 때 더 효율적이다.
한 구체적 실시양태에서, 유전자 요법 벡터는 백질의 6개의 두개 천공을 통해 대상체의 뇌 내의 6개 부위에 뇌내 주사를 통해 투여되고, 여기서 각각의 두개 천공 또는 트랙을 통해 유전자 요법 벡터의 단일 침착물이 투여된다. 따라서, 유전자 요법 벡터는 각각의 주사 두개 천공내 단일 깊이로 투여된다. 각각의 두개 천공 내 투여 위치는 전방 우측, 전방 좌측, 내측 우측, 내측 좌측, 후방 우측, 및 후방 좌측으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 각각의 두개 천공 내의 투여 위치는 전방 우측 표피상, 전방 우측 심부, 전방 좌측 표피상, 전방 좌측 심부, 내측 우측 표피상, 내측 우측 심부, 내측 좌측 표피상, 내측 좌측 심부, 후방 우측 표피상, 후방 우측 심부, 후방 좌측 표피상, 및 후방 좌측 심부로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 심부 주사는 피질 표면으로부터 약 1.5 cm 내지 약 3.0 cm, 또는 약 1.7 cm 내지 약 2.5 cm, 또는 약 2 cm의 깊이에서 수행되며; 표피상 주사는 피질 표면으로부터 약 0.5 cm 내지 약 2.0 cm, 또는 약 0.7 cm 내지 약 1.5 cm, 또는 약 1 cm의 깊이에서 수행된다. 일부 실시예에서, 심부 및/또는 표피상 주사는 MRI 영상을 기반으로 하여 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 각각의 주사가 단일 깊이에서 투여되고, 각각의 주사가 심부 또는 표피상 주사가 되도록, 심부 주사 및 표피상 주사의 조합이 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체에게 투여되는 모든 주사는 심부 주사이다. 일부 실시양태에서, 대상체에게 투여되는 모든 주사는 표피상 주사이다.
주사는 단일 신경외과 세션에서 수행될 수 있다. 뇌내 주사는 주입 펌프를 사용하여 수행할 수 있다.
본 개시내용의 다양한 실시양태에서, 용어 또는 단위 게놈 카피 (gc)는 용어 또는 단위 바이러스 게놈 (vg)과 상호교환적으로 사용된다.
특정 실시양태에서, 총 약 1.0x1010 gc 내지 약 1.0x1014 gc, 약 5.0x1010 gc 내지 약 5.0x1013 gc, 약 5.0x1010 gc 내지 약 1.0x1013 gc, 약 1.0x1011 gc 내지 약 1.0x1013 gc, 약 1.0x1011 gc 내지 약 5.0x1012 gc, 약 5.0x1011 gc 내지 약 5.0x1012 gc, 약 8.0x1011 gc 내지 약 8.0x1012, 또는 약 7.0x1012 gc 내지 약 7.4x1012 gc의 바이러스 벡터가 대상체에게 투여된다. 특정한 실시양태에서, 약 7.2x1012 gc의 바이러스 벡터가 대상체에게 투여된다. 특정 실시양태에서, 총 약 0.8x109 gc 내지 약 0.8x1013 gc, 약 0.4x1010 gc 내지 약 0.4x1013 gc, 약 0.4x1010 gc 내지 약 0.8x1012 gc, 약 0.8x1010 gc 내지 약 0.8x1012 gc, 약 0.8x1010 gc 내지 약 0.4x1012 gc, 또는 약 0.4x1011 gc 내지 약 0.4x1012 gc 의 바이러스 벡터가 대상체의 각각의 부위에 투여된다. 특정한 실시양태에서, 약 0.6x1011gc 의 바이러스 벡터가 대상체의 각각의 부위에 투여된다. 특정한 실시양태에서, 약 약 0.6x1011gc의 바이러스 벡터가 대상체의 뇌 또는 백질의 12개 부위 각각에 투여되어, 약 7.2x1011gc의 바이러스 벡터가 대상체에게 투여된다. 특정 실시양태에서, 약 1.2x1012 gc의 바이러스 벡터가 대상체의 각각의 부위에 투여되도록 한다. 특정한 실시양태에서, 약 1.2x1012 gc의 바이러스 벡터가 대상체의 뇌 또는 백질의 6개 부위 각각에 투여되어, 약 7.2x1012 gc의 총 바이러스 벡터가 대상체에게 투여되도록 한다. 일부 실시양태에서, 대상체에 전달되는 바이러스 벡터의 양은 뇌 조직 그램당 약 6.0x109 내지 약 8.0x109 gc (gc/gr)이다. 일부 실시양태에서, 대상체에 전달되는 바이러스 벡터의 양은 약 7.0x109gc/gr 내지 약 7.4x109gc/gr이다. 일부 실시양태에서, 대상체에 전달된 바이러스 벡터의 양은 약 7.2x109gc/gr이다.
일부 실시양태에서, 유전자 요법 벡터는 PBS 완충제를 포함하는 제제로 투여된다. 일부 실시양태에서, PBS 완충제는 어떠한 부형제 또는 보존제도 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, PBS 완충제의 조성물은 KCl, KH2PO4, NaCl, 및/또는 Na2HPO4를 포함한다. 일부 실시양태에서, PBS 완충제의 조성물은 약 2.67mM KCl, 약 1.47mM KH2PO4, 약 137.9mM NaCl, 및 약 8.06mM Na2HPO4를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제형의 pH는 약 6.8 내지 약 7.8, 또는 약 7.2 내지 7.4이다.
특정 실시양태에서, 각각의 부위에 투여되는 유전자 요법 벡터를 포함하는 조성물의 부피는 약 10 μl 내지 약 600 μl, 약 20 μl 내지 약 550 μl, 약 30 μl 내지 약 200 μl, 약 50 μl, 약 100 μl, 또는 약 150 νl이다. 일부 실시양태에서, 각각의 주사에서 각각의 부위에 투여되는 유전자 요법 벡터를 포함하는 조성물의 부피는 약 200 μl, 약 300 μl, 약 400 μl, 약 500 μl, 약 600 μl이다. 특정 실시양태에서, 각각의 주사의 부피는 약 500 μl이다. 특정한 실시양태에서, 유전자 요법 벡터를 포함하는 조성물의 투여를 위한 주입 속도는 약 0.1 μl/분 내지 약 10 μl/분, 약 0.2 μl/분 내지 약 8 μl/분, 약 0.3 μl/분 내지 약 6 μl/분, 또는 약 0.5 μl/분 내지 약 5 μl/분, 또는 약 0.4 μl/분 내지 약 4.0 μl/분, 또는 약 0.4 μl/분 내지 약 3.0 μl/분 또는 약 2.0 μl/분이다. 일부 실시양태에서, 조성물의 투여를 위한 주입 속도는 약 5 μl/분이다. 일부 실시양태에서, 유전자 요법 벡터를 포함하는 조성물은 약 5 μl/분의 유량으로 약 500μl의 다중 주사를 통해 투여된다.
인간을 포함한 포유동물에서의 투여 선택은 다음 효능 및 안전성 기준을 기반으로 할 수 있다: (1) 전체 뇌에 전달되는 벡터 입자의 총량은 상당한 부피의 뇌에서 SGSH 생성을 유도하기에 충분하여야 하고 뇌의 축적 병변(storage lesion)의 발달; 및 (2) 각각의 침적물에서 벡터 입자의 양이 국소 독성을 유발하지 않아야 한다.
다른 MPS 모델에 대한 이전의 전임상 연구는 효능에 관한 일부 정보를 제공하였다. AAV 벡터의 용량은 뇌에 정위 주사한 후, MPS의 개 모델 (MPSI 및 MPSIIIB)에서 평가되었다. 이들 연구는 각각의 침적물에서 6x1010 vg를 나타내는 40 μl x 1.5x1012 vg/ml의 8개 침적물이 전체 개의 뇌에서 효율적인 벡터 전달에 충분하다고 결론지었다. 4배 더 높은 투여량은 안전하였긴 하지만, 뇌 조직에서 벡터 전달과 관련하여 더 효율적이지 않을 수 있다. 이것은 침적물당 6x1010 vg의 용량을 안전하고 효율적인 것으로 특징짓는다.
한 특정한 실시양태에서, 본 개시내용은 MPSIIIA의 치료를 필요로 하는 대상체 (예를 들어, MPSIIIA로 진단된 인간)에게 5에서 3' 순서로 하기 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 바이러스 벡터를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는 MPSIIIA를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 CAG 프로모터 서열은 SGSH를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결되고:
AAV2 ITR 서열;
CAG 프로모터 서열;
인간 N-술포글루코사민 술포히드롤라제 (SGSH) 폴리펩티드 또는 이의 활성 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열;
인간 성장 호르몬 폴리 A 서열; 및
AAV2 ITR 서열,
여기서 상기 조성물은 대상체의 머리에 6개의 두개 천공을 통해 대상체의 뇌 내의 6개 부위에 뇌내 주사를 통해 투여되고,
여기서 조성물은 각각의 두개 천공 또는 트랙을 통해 단일 부위 및 단일 깊이에 투여되고,
여기서 6개의 부위는 전방 우측, 전방 좌측, 내측 우측, 내측 좌측, 후방 우측, 및 후방 좌측이고,
여기서 약 0.8x109 내지 0.8x1013 gc 또는 약 1.2x1012 gc의 바이러스 벡터가 12개의 부위 각각에 투여되고,
여기서 12개의 부위 각각에 투여되는 조성물의 부피는 약 10 μl 내지 약 600 μl, 또는 약 500 μl이고,
여기서 상기 조성물의 투여를 위한 주입 속도는 약 0.1 μl/분 내지 약 10 l/분, 약 0.2 μl/분 내지 약 8 l/분, 약 0.3 l/분 내지 약 6 l/분, 또는 약 0.4μl/분 내지 약 4.0 μl/분, 약 0.4μl/분 내지 약 3.0 μl/분, 또는 약 2.0 μl/분, 또는 약 5.0 μl/분이다.
특정 실시양태에서, 투여는 주입 펌프를 사용하여 수행된다.
MPSIIIA를 치료하는 방법은 치료제를 뇌 및 신경계로 전달하는 데 유리하며, 이들은 상이한 치료제를 사용함으로써 다른 뇌 질환 또는 장애 또는 신경계 질환 또는 장애를 치료하도록 변형될 수 있다.
수반하는 실시예에 추가로 기재된 바와 같이, 본원에 제공된 유전자 요법 벡터인 LYS-SAF302는 LYS-SAF301과 같은 유전자 요법 벡터에 비해 상당한 개선을 제공하였다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, LYS-SAF302는 SGSH를 생성하고 뇌에서 HS의 양을 감소시키는 데 있어서 우수한 발현 및 효력을 결과한다. LYS-SAF302는 약 5.0 μl/분의 주입 속도로 7.2 x 1012 vg의 총 용량으로 안전하고 효과적으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 주사당 단일 깊이 및 5.0 μl/분으로 500 μL 부피 주사로 6회 투여로 투여된 LYS-SAF302는 SGSH 유전자 돌연변이와 관련된 신경계 질환에 대해 매우 효과적이고 안전한 치료를 제공한다.
따라서, 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 야생형 또는 돌연변이되지 않은 형태의 유전자에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이의 활성 변이체를 포함하는 발현 카세트를 포함하는 유전자 요법 벡터를 돌연변이된 유전자로부터 생긴 뇌 또는 신경계 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게 뇌내 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 돌연변이된 유전자로부터 생긴 뇌 또는 신경계 질환 또는 장애를 치료 방법을 포함하며, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 프로모터 서열에 작동가능하게 연결되고, 여기서 상기 뇌내 투여는 약 5x1010 gc 내지 약 5x1013 gc, 또는 약 1.0x1011 gc 내지 약 1.0x1013 gc를 약 6 내지 약 12회 투여량으로 투여하는 것을 포함하며, 각각의 투여량은 약 10 μl 내지 약 500 μl의 부피로 총 약 5.0x109 gc 내지 약 5.0x1012 gc, 또는 약 1.0x1010 gc 내지 약 1.0x1012 gc, 또는 약 6x1010 gc이다. 특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 CAG 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 특정 실시양태에서, 각각의 용량은 약 0.1 μl/분 내지 약 10 l/분, 약 0.2 μl/분 내지 약 8 l/분, 약 0.3 l/분 내지 약 6 l/분, 또는 약 0.4 l/분 내지 약 4.0 μl/분, 약 0.5 μl/분 내지 약 5.0 μl/분, 약 2.0 l/분, 또는 약 5 μl/분의 속도로 투여된다. 특정한 실시양태에서, 뇌내 투여는 임의로 카테터를 포함하는 전달 장치를 사용하여 수행된다. 특정 실시양태에서, 뇌내 투여는 내과피에 인접한 백질의 6개 구멍을 통해 대상체의 뇌 또는 백질에 벡터를 투여하는 것을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 12개의 투여량 중 2개는 6개의 구멍 각각을 통해 투여되며, 여기서 2개의 투여량 중 하나는 심부 투여가고 2개의 투여량 중 하나는 표피상 투여이다. 특정 실시양태에서, 12개의 투여량 각각은 카테터를 통해 투여된다. 한 실시양태에서, 뇌내 투여는 주입 펌프를 사용하여 수행된다. 일부 실시양태에서, 뇌내 투여는 6개의 투여량으로 대상체의 뇌 또는 백색질에 벡터를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 각각의 투여량은 단일 깊이에서의 투여이다.
본 개시내용은 추가로 뇌 또는 신경계 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 뇌 또는 신경계 질환 또는 장애를 치료하는 방법, 또는 뇌에 치료제 제공을 필요로 하는 대상체의 뇌에 치료제를 제공하는 방법을 포함하며, 상기 방법은 상기 치료 또는 제공을 필요로 하는 대상체 (예를 들어, 인간)에게 치료제를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 상기 조성물은 대상체의 뇌의 6개의 두개 천공을 통해 대상체의 뇌 내의 6개 또는 12개 부위에 뇌내 주사를 통해 투여된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 각각의 두개 천공 또는 트랙을 통해 2개의 부위에 투여되고, 여기서 2개의 부위 중 하나는 심부이고 2개의 부위 중 다른 하나는 표피상이며, 여기서 12개의 부위는 전방 우측 표피상, 전방 우측 심부, 전방 좌측 표피상, 전방 좌측 심부, 내측 우측 표피상, 내측 우측 심부, 내측 좌측 표피상, 내측 좌측 심부, 후방 우측 표피상, 후방 우측 심부, 후방 좌측 표피상, 및 후방 좌측 심부이고, 여기서 12개 부위 가각에 투여되는 조성물의 부피는 약 10 μl 내지 약 300 μl이고, 여기서 조성물의 투여를 위한 주입 속도는 약 0.1 μl/분 내지 약 10 μl/분, 약 0.2 μl/분 내지 약 8 μl/분, 약 0.3 μl/분 내지 약 6 μl/분, 또는 약 0.4 μl/분 내지 약 4.0 μl/분, 약 0.5 μL 내지 약 5.0 μL, 약 0.4 μl/분 내지 약 3.0 μl/분, 또는 약 2.0 μl/분, 또는 약 5.0 μ/분이다. 특정 실시양태에서, 투여는 주입 펌프를 사용하여 수행된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 대상체의 뇌의 두개 천공에 투여되고, 여기서 조성물은 각각의 두개 천공 또는 트랙을 통해 단일 부위에 투여된다. 일부 실시예에서, 단일 두개 천공은 심부 또는 표피상 부위로부터 선택된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 투여 각각은 심부 부위이다. 일부 실시양태에서, 각각의 투여는 표피상 부위이다. 일부 실시양태에서, 다중 투여는 심부 및 표피상 부위의 혼합물이며, 즉, 각각의 투여 부위는 심부 또는 표피상 투여를 위해 독립적으로 선택된다.
본 개시내용은 소분자, 폴리펩티드, 항체 및 이의 단편, 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, siRNA, 안티센스 RNA, miRNA, 및 바이러스 벡터를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 유형의 치료제의 사용을 고려한다. 특정한 실시양태에서, 치료제는 바이러스 벡터, 예를 들어 AAV 벡터, 예컨대 AAVrh.10 벡터이다. C형 산필립포
특정 실시양태에서, 이 방법은 MPS (C형 산필립포, D형 산필립포, Sl, 헐러-샤이에(Hurler-Scheie), A형 산필립토, 헌터(Hunter), 모르퀴오(모르퀴오), B형 산필립포, 마로토-라미(Maroteaux-Lamy)를 포함하나, 이에 제한되지는 않음), 고셔(Gaucher), 이염성 백질이영양증(Metachromatic Leukodystrophy), 파브리(Fabry), 크라베(Krabbe), 폼페(Pompe), 시스틴증(Cystinosis), 테이-삭스(Tay-Sachs), C형 니만 피크(Niemann Pick C), A/B형 니만 피크, 점액지질증 II/III, Gm1 강글리오시드증(Gangliosidosis), 잔트호프(Sandhoff), 또는 본원에 기재된 임의의 기타를 포함하나, 이에 제한되지는 않는 유전적 결함에 의해 유발된 리소좀 축적 장애를 치료하는 데 사용되며, 여기서 치료제는 특정한 질환과 연관된 결손되거나 돌연변이된 효소의 기능적 또는 야생형 버전을 제공하는 바이러스 벡터이다. 효소는 AAV 바이러스 벡터, 예를 들어 본원에 기재된 것 중 임의의 것으로 제공될 수 있으나, 폴리뉴클레오티드 서열 (및 임의로 IRES)을 암호화하는 SGSH는 원하는 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열로 대체된다. 이들 질환에 대한 유전적 기초는 공지되어 있고, 이러한 효소 및 폴리뉴클레오티드 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있고 이용가능하다. 예를 들어, MPSII와 연관된 효소는 이두로네이트-2-술파타제이고; MPS1과 연관된 효소는 알파-L-이두로니다제이고, MPSIIID와 연관된 효소는 글루코사민-6-술파타제이고, MPSIIIC와 연관된 효소는 N-아세틸트랜스퍼라제이고; MPSIIIB와 관련된 효소는 알파-N-아세틸글루코사미니다제 또는 글루쿠로네이트-2-술파타제이고, MPSVII와 연관된 효소는 베타-D-글루쿠로니다제 또는 글루코사민-3-술파타제이다.
다른 뇌 또는 신경계 질환 및 장애는 또한 본원에 기재된 임의의 것을 포함하나 이에 제한되지 않는 본원에 기재된 방법에 따라 뇌에 치료제를 전달함으로써 치료될 수 있다.
유전자 요법 및 면역억제제의 조합을 사용한 치료 방법
본 개시내용은 또한 1종 이상의 면역억제제와 조합된 유전자 요법 벡터로 유전적 장애를 치료하는 방법을 포함한다. 유전자 요법 벡터의 투여 후 면역억제제를 사용한 장기간 치료가 유전자 요법 벡터에 대한 염증 또는 면역 반응을 감소시킴으로써 유전자 요법 치료의 효능을 향상시킨다는 것은 본 개시내용의 놀랍고 예상치 못한 발견이다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 MPSIIIA의 치료를 필요로 하는 대상체에게 다음을 투여하는 것을 포함하는 MPSIIIA를 치료하는 방법을 포함한다:
(1) SGSH 폴리펩티드 또는 이의 활성 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 유전자 요법 벡터이며, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 프로모터 서열에 작동가능하게 연결되는 벡터; 및
(2) 1종 이상의 면역억제제,
여기서 1종 이상의 면역억제제 중 적어도 1종은 대상체에게 유전자 요법 벡터의 투여 직후 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 4개월, 적어도 5개월, 적어도 6개월, 적어도 8개월, 적어도 10개월, 또는 적어도 12개월의 지속기간 동안 제공된다. 특정 실시양태에서, 1종 이상의 면역억제제 중 적어도 1종은 대상체의 남은 생애 동안, 또는 대상체가 발현 카세트로부터 검출가능한 수준의 SGSH 폴리펩티드를 생성하는 한 대상체에게 제공된다.
특정한 실시양태에서, 본원에 기재된 본 개시내용의 유전자 요법 벡터 중 임의의 것을 사용하여 방법을 실시할 수 있다.
한 특정한 실시양태에서, 본 개시내용은 MPSIIIA의 치료를 필요로 하는 대상체 (예를 들어, MPSIIIA로 진단된 인간)에게 다음을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 MPSIIIA를 치료하는 방법을 포함한다:
(1) 5'에서 3'의 순서로 하기 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 바이러스 벡터를 포함하는 조성물이며, 여기서 CAG 프로모터 서열이 SGSH를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결되는 조성물:
a. AAV2 ITR 서열;
b. CAG 프로모터 서열;
인간 N-술포글루코사민 술포히드롤라제 (SGSH) 폴리펩티드 또는 이의 활성 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열;
c. 인간 성장 호르몬 폴리 A 서열; 및
d. AAV2 ITR 서열; 및
(2) 1종 이상의 면역억제제,
여기서 1종 이상의 면역억제제 중 적어도 1종은 대상체에게 유전자 요법 벡터의 투여 직후 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 4개월, 적어도 5개월, 적어도 6개월, 적어도 8개월, 적어도 10개월, 또는 적어도 12개월의 지속기간 동안 제공된다. 특정 실시양태에서, 1종 이상의 면역억제제 중 적어도 1종은 대상체에게 대상체의 남은 생애 동안, 또는 대상체가 발현 카세트로부터 검출가능한 수준의 SGSH 폴리펩티드를 생성하는 한 제공된다.
이들 방법의 특정한 실시양태에서, 이러한 방법은 하기 특색 중 하나 이상을 포함한다: 상기 조성물은 대상체의 머리의 두개 천공을 통해 대상체의 뇌에 뇌내 주사를 통해 투여된고; 조성물은 4 내지 8개의 두개 천공을 통해 투여되고; 조성물은 각각의 두개 천공 또는 트랙을 통해 1 또는 2개의 부위에 투여되고, 여기서 부위는 독립적으로 심부 및 또는 표피상이며; 부위는 전방 우측 표피상, 전방 우측 심부, 전방 좌측 표피상, 전방 좌측 심부, 내측 우측 표피상, 내측 우측 심부, 내측 좌측 표피상, 내측 좌측 심부, 후방 우측 표피상, 후방 우측 심부, 후방 좌측 표피상, 및 후방 좌측 심부로부터 선택되고, 약 0.8x109 gc 내지 약 0.8x1013 gc, 약 1.0x1010 gc 내지 약 1.0x1013, 또는 약 1.0x1010 gc 내지 약 1.0x1012 gc or 약 6x1010 gc 또는 약 1.2x1012 gc의 투여량의 바이러스 벡타가 6 또는 12개 부위 각각에 투여되고,
여기서, 12개 부위 각각에 투여되는 조성물의 부피는 약 10 μl 내지 약 600 μl이고/이거나, 여기서 벡터의 투여를 위한 주입 속도는 약 0.1 μl/분 내지 약 10 μl/분, 약 0.2 μl/분 내지 약 8 μl/분, 약 0.3 μl/분 내지 약 6 μl/분, 또는 약 0.4 μl/분 내지 약 4.0 μl/분, 약 0.4 μl/분 내지 약 3.0 μl/분 또는 약 2.0 μl/분, 또는 약 5.0 μl/분이다. 특정 실시양태에서, 투여는 주입 펌프를 사용하여 수행된다. 특정 실시양태에서, 조성물은 상기 언급된 12개 부위 모두에 투여된다. 한 실시양태에서, 방법은 상기에 언급된 특색 모두를 포함한다.
1종 이상의 면역억제제를 제공하는 것을 포함하는 방법의 특정한 실시양태에서, 1종 이상의 면역억제제는 칼시뉴린 억제제 (예를 들어, 타크롤리무스), 마크롤리드 (예를 들어, 시롤리무스 또는 라파미신), 및/또는 미코페놀레이트 모페틸을 포함한다. 특정 실시양태에서, 1종 이상의 면역억제제 중 적어도 1종은 대상체에게 유전자 요법 벡터의 투여 직후 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 4개월, 적어도 5개월, 적어도 6개월, 적어도 8개월, 적어도 10개월, 또는 적어도 12개월의 지속기간 동안 제공된다. 특정 실시양태에서, 1종 이상의 면역억제제 중 적어도 1종은 대상체에게 유전자 치료 요법의 투여 전에 일정 지속기간 동안 제공된다.
한 특정한 실시양태에서, 1종 이상의 면역억제제는 칼시뉴린 억제제, 예를 들어 타크롤리무스를 포함하며, 이는 유전자 요법 벡터의 투여 직후 적어도 12개월의 지속기간 동안 대상체에게 제공된다. 한 특정한 실시양태에서, 1종 이상의 면역억제제는 마크롤리드, 예를 들어 시롤리무스를 포함하며, 이는 대상체에게 유전자 요법 벡터의 투여 직후에 적어도 12개월의 지속기간 동안 제공된다. 특정 실시양태에서, 1종 이상의 면역억제제는 칼시뉴린 억제제 (예를 들어, 타크롤리무스) 및 미코페놀레이트 모페틸을 포함한다. 특정 실시양태에서, 1종 이상의 면역억제제는 마크롤리드 (예를 들어, 시롤리무스) 및 미코페놀레이트 모페틸을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 칼시뉴린 억제제 또는 마크롤리드는 유전자 요법 벡터의 투여 직후 적어도 12개월의 지속기간 동안 대상체에게 제공되고, 시코페놀레이트 모페틸은 유전자 치료 벡터의 투여 약 2주 전에 시작하여, 약 2개월 동안 환자에게 제공된다.
또 다른 특정한 실시양태에서, 칼시뉴린 억제제는 타크롤리무스이며, 이는 대상체에게 유전자 요법 벡터의 투여 직후 적어도 2개월 또는 적어도 3개월 동안 0.05 mg/kg/일 - 1.0 mg/kg/일 또는 약 0.2 mg/kg/일의 투여량으로 제공된다. 또 다른 특정한 실시양태에서, 칼시뉴린 억제제는 타크롤리무스이며, 이는 대상체에게 유전자 요법 벡터의 투여 직후 적어도 3개월 동안 일정 기간 동안 10 ng/ml - 15 ng/ml의 타크롤리무스의 혈중 농도를 달성하는 투여량으로 제공된다. 추가의 특정한 실시양태에서, 칼시뉴린 억제제는 타크롤리무스이며, 이는 대상체에게 유전자 요법 벡터의 투여 직후 4개월 내지 12개월 동안 일정 기간 동안 7 ng/ml - 10 ng/ml의 타크롤리무스의 혈중 농도를 달성하는 투여량으로 제공된다. 특정한 실시양태에서, 칼시뉴린 억제제, 예를 들어 타크롤리무스는 대상체에게 유전자 요법 벡터의 투여 후 1년 이하, 2년 이하, 3년 이하, 4년 이하, 5년 이하, 또는 대상체의 삶의 지속기간 동안 제공된다.
또 다른 실시양태에서, 마크롤리드는 시롤리무스이며, 이는 대상체에게 유전자 요법 벡터의 투여 직후 적어도 2개월 또는 적어도 3개월 동안 3 mg/kg/일 또는 약 1.5 mg/kg/일 2회의 투여량으로 제공된다. 또 다른 특정한 실시양태에서, 마크로리드는 시롤리무스이며, 이는 대상체에게 유전자 요법 벡터의 투여 직후 3개월 동안의 일정 기간 동안 10 ng/ml - 25 ng/ml의 시롤리무스의 혈중 수준을 달성하는 투여량으로 제공된다. 추가의 특정한 실시양태에서, 1종 이상의 면역억제제는 시롤리무스이며, 이는 대상체에게 유전자 요법 벡터의 투여 직후 2개월 내지 6개월 동안의 일정 기간 동안 시롤리무스의 혈중 수준을 20 ng/ml로 달성하는 투여량으로 제공된다. 추가의 특정한 실시양태에서, 1종 이상의 면역억제제는 시롤리무스이며, 이는 대상체에게 유전자 요법 벡터의 투여 직후 6개월에 걸쳐 일정 기간 동안 10 ng/ml 내지 15 ng/ml의 시롤리무스의 혈중 수준을 달성하는 투여량으로 제공된다.
또 다른 실시양태에서, 1종 이상의 면역억제제는 미코페놀레이트 모페틸을 포함하고, 이는 대상체에게 유전자 요법 벡터의 투여 직후 2개월 이하 또는 약 2개월 동안 제공된다. 특정 실시양태에서, 미코페놀레이트 모페틸은 대상체에게 200 mg/m2/일 - 1200 mg/m2/일 또는 약 600 mg/m2/일의 투여량으로 제공된다.
또 다른 실시양태에서, 방법은 대상체에게 유전자 요법 벡터의 투여 직후 3일 내지 10일, 약 5일, 약 6일, 또는 약 7일의 지속기간 동안 프레드니솔론을 제공하는 것을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 프레딘솔론은 약 0.2 mg/kg/일 내지 약 5 mg/kg/일 또는 약 1 mg/kg/일의 투여량으로 대상체에게 제공된다.
특정한 방법에서, 대상체는, (1) 유전자 요법 벡터의 투여 전 또는 후 12시간 이내에 시작하여 약 10일 동안 계속되는 약 1 mg/kg/일의 용량의 프레드니솔론; (2) 유전자 요법 벡터의 투여 14일 전부터 시작하여 유전자 요법 벡터의 투여 후 첫 3개월 동안 10 - 15 ng/ml 및 4개월째부터 최대 적어도 1년까지 7-10 ng/ml의 잔류 용량을 목표로 하는 치료 7일 후에 접합화된 약 0.2 mg/kg/일의 시작 용량 (예를 들어, 2회 분할 용량으로 제공)의 타크롤리무스; 및 (3) 유전자 요법 벡터의 투여 14일 전부터 시작하여 유전자 요법 벡터의 투여 후 2개월 또는 8주 동안 유지되는, 1일 2회 600 mg/m2 (최대 2)의 투여량으로 미코페놀레이트 모페틸을 제공받는다.
특정한 방법에서, 대상체는, (1) 유전자 요법 벡터의 투여 전 또는 후 12시간 이내에 시작하여 약 10일 동안 계속되는 약 1 mg/kg/일의 용량의 프레드니솔론; (2) 유전자 요법 벡터의 투여 직후 6개월에 걸쳐 일정 기간 동안 10 ng/ml - 15 ng/ml의 시롤리무스의 혈중 수준를 달성하는 투여량으로 시롤리무스; 및 (3) 유전자 요법 벡터의 투여 14일 전부터 시작하여 유전자 요법 벡터의 투여 후 2개월 또는 8주 동안 유지되는, 1일 2회 600 mg/m2 (최대 2)의 투여량으로 미코페놀레이트 모페틸을 제공받는다.
또 다른 특정한 실시양태에서, 본 개시내용은 MPSIIIA의 치료를 필요로 하는 대상체 (예를 들어, MPSIIIA로 진단된 인간)에게 다음을 투여하는 것을 포함하는, MPSIIIA를 치료하는 방법을 포함한다:
(1) 5'에서 3'의 순서로 하기 서열을 포함하는 발현 카세트 및 플랭킹 서열을 포함하는 바이러스 벡터를 포함하는 조성물이며, 여기서 CAG 프로모터 서열이 SGSH를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결되는 조성물:
a. AAV2 ITR 서열;
b. CAG 프로모터 서열;
인간 N-술포글루코사민 술포히드롤라제 (SGSH) 폴리펩티드 또는 이의 활성 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열
c. 인간 성장 호르몬 폴리 A 서열; 및
d. AAV2 ITR 서열
여기서 상기 조성물은 대상체의 머리에 6개의 구멍을 통해 대상체의 뇌 내의 12개 부위에 뇌내 주사를 통해 투여되고,
여기서 조성물은 각각의 두개 천공 또는 트랙을 통해 하나 또는 두 개의 부위에 투여되며,
일부 실시양태에서, 주사 부위는 전방 우측 표피상, 전방 우측 심부, 전방 좌측 표피상, 전방 좌측 심부, 내측 우측 표피상, 내측 우측 심부, 내측 좌측 표피상, 내측 좌측 심부, 후방 우측 표피상, 후방 우측 심부, 후방 좌측 표피상, 및 후방 좌측 심부로 이루어진 군으로부터 선택되고,
여기서 상기 대상체에게 투여된 조성물의 총량은 약 5x1010 gc 내지 약 5x1013 gc, 약 1.0x1011 gc 내지 약 1.0x1013 gc, 약 1.0x1010 gc 내지 약 1.0x1014 gc, 약 5.0x1010 gc 내지 약 5.0x1013 gc, 약 5.0x1010 gc 내지 약 1.0x1013 gc, 약 1.0x1011 gc 내지 약 1.0x1013 gc, 약 1.0x1011 gc 내지 약 5.0x1012 gc, 또는 약 5.0x1011 gc 내지 약 5.0x1012 gc이고, 여기서 약 5.0x109 gc 내지 약 5.0x1012 gc, 약 1.0x1010 gc 내지 약 1.0x1012 gc, 약 0.8x109 gc 내지 약 0.8x1013 gc, 약 0.4x1010 gc 내지 약 0.4x1013 gc, 약 0.4x1010 gc 내지 약 0.8x1012 gc, 약 0.8x1010 gc 내지 약 0.8x1012 gc, 약 0.8x1010 gc 내지 약 0.4x1012 gc, 또는 약 0.4x1011 gc 내지 약 0.4x1012 gc 또는 약 6x1010 gc 또는 약 1.0x1012 gc 또는 약 1.2x1012 gc 또는 약 1.4x1012 gc의 바이러스 벡터는 12개 부위 각각에 투여되고, 여기서 12개 부위 각각에 투여되는 조성물의 부피는 약 10 μl 내지 약 600 μl이며, 여기서 벡터의 투여를 위한 주입 속도는 약 0.1 μl/분 내지 약 10 μl/분, 약 0.2 μl/분 내지 약 8 μl/분, 약 0.3 μl/분 내지 약 6 μl/분, 또는 약 0.4 μl/분 내지 약 4.0 μl/분, 약 0.4 μl/분 내지 약 3.0 μl/분 또는 약 2.0 μl/분 또는 약 5.0 μl/분이다]; 및
(2) 1종 이상의 면역억제제,
여기서 상기 1종 이상의 면역억제제는, 유전자 요법 벡터의 투여 전 또는 후 12시간 이내에 시작하여 약 10일 동안 계속되는 약 1 mg/kg/일의 용량의 프레드니솔론; 유전자 요법 벡터의 투여 14일 전부터 시작하여 유전자 요법 벡터의 투여 후 첫 3개월 동안 10 - 15 ng/ml 및 4개월째부터 최대 적어도 1년까지 7-10 ng/ml의 잔류 용량을 목표로 하는 치료 7일 후에 접합화된 약 0.2 mg/kg/일의 시작 용량 (예를 들어, 2회 분할 용량으로 제공)의 타크롤리무스; 및 유전자 요법 벡터의 투여 14일 전부터 시작하여 유전자 요법 벡터의 투여 후 2개월 또는 8주 동안 유지되는, 1일 2회 600 mg/m2 (최대 2)의 투여량으로 미코페놀레이트 모페틸을 포함하거나 이로 이루어진다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 1종 이상의 면역억제제의 공동 투여와 연관된 상기 방법 및 이점이 돌연변이되거나 부재하는 유전자 생성물의 기능적 카피를 투여하는 벡터를 사용하는 유전자 요법에 의해 다른 유전적 질환 또는 장애의 치료에 적합화될 수 있음을 인식할 것이다.
따라서, 본 개시내용은 돌연변이된 또는 결실된 유전자에 의해 유발된 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서, 이를 치료하는 방법을 추가로 포함한다:
(1) 상기 대상체에게, 야생형 또는 돌연변이되지 않은 형태의 유전자에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이의 활성 변이체를 포함하는 발현 카세트를 포함하는 유전자 요법 벡터를 투여하는 단계이며, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 프로모터 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 단계; 및
(2) 상기 대상체에게 1종 이상의 면역억제제를 제공하는 단계이며, 여기서 면역억제제 중 적어도 1종이 대상체에게 유전자 요법 벡터의 투여 직후 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 4개월, 적어도 5개월, 적어도 6개월, 적어도 7개월, 적어도 8개월, 적어도 10개월, 또는 적어도 12개월의 지속기간 동안 제공되는 단계.
특정한 실시양태에서, 1종 이상의 면역억제제는 칼시뉴린 억제제, 임의로 타크롤리무스, 또는 미코페놀레이트 모페틸, 및/또는 마크롤리드, 예를 들어, 시롤리무스 또는 라파미신을 포함한다.
추가의 관련된 실시양태에서, 본 개시내용은 돌연변이된 유전자에 의해 유발된 뇌 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게 이의 야생형 또는 돌연변이되지 않은 형태의 유전자에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이의 활성 변이체를 포함하는 발현 카세트를 포함하는 유전자 요법 벡터를 투여하는 단계이며, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 프로모터 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 단계; 및 상기 대상체에게 1종 이상의 면역억제제를 제공하는 단계이며, 여기서 면역억제제 중 적어도 1종이 대상체에게 유전자 요법 벡터의 투여 직후 적어도 2개월의 지속기간 동안 제공되는 단계를 포함하는, 돌연변이된 유전자에 의해 유발된 뇌 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 돌연변이된 유전자에 의해 유발된 뇌 장애를 치료하는 방법을 포함한다.
특정한 실시양태에서, 1종 이상의 면역억제제는 SGSH 폴리펩티드의 전달을 위한 유전자 요법 벡터와 조합된 면역억제제의 투여와 관련하여 본원에 기재된 임의의 투여 요법을 포함한, 본원에 기재된 것들 중 임의의 것 또는 그러한 것들의 임의의 조합을 포함한다. 한 실시양태에서, 1종 이상의 면역억제제는 칼시뉴린 억제제, 임의로 타크롤리무스, 및 미코페놀레이트 모페틸을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 1종 이상의 면역억제제는 마크롤리드, 임의로 시롤리무스, 및 미코페놀레이트 모페틸을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 칼시뉴린 억제제 또는 마크롤리드는 대상체에게 유전자 요법 벡터의 투여 직후에 적어도 3개월, 적어도 6개월, 또는 적어도 12개월의 지속기간 동안 제공된다.
칼시뉴린 억제제가 타크롤리무스인 특정 실시양태에서, 이는 대상체에게 유전자 요법 벡터의 투여 직후 적어도 2개월 또는 적어도 3개월 동안 0.05 mg/kg/일 - 1.0 mg/kg/일 또는 약 0.2 mg/kg/일의 투여량으로 제공된다. 칼시뉴린 억제제가 타크롤리무스인 특정 실시양태에서, 이는 대상체에게 유전자 요법 벡터의 투여 직후 적어도 3개월 동안 일정 기간 동안 10 ng/ml - 15 ng/ml의 타크롤리무스의 혈중 농도를 달성하는 투여량으로 제공된다. 칼시뉴린 억제제가 타크롤리무스인 특정 실시양태에서, 이는 대상체에게 유전자 요법 벡터의 투여 직후 4개월 내지 12개월 동안의 일정 기간 동안 7 ng/ml - 10 ng/ml의 타크롤리무스의 혈중 농도를 달성하는 투여량으로 제공된다.
마크로리드가 시롤리무스인 특정 실시양태에서, 이는 대상체에게 유전자 요법 벡터의 투여 직후 적어도 2개월 또는 적어도 3개월 동안 3 mg/kg/일 또는 약 1.5 mg/kg/1일 2회의 투여량으로 제공된다. 마크로리드가 시롤리무스인 특정한 실시양태에서, 이는 대상체에게 유전자 요법 벡터의 투여 직후 적어도 3개월 동안 일정 기간 동안 10 ng/ml - 25 ng/ml의 시롤리무스의 혈중 농도를 달성하는 투여량으로 제공된다. 마크로리드가 시롤리무스인 특정 실시양태에서, 이는 대상체에게 유전자 요법 벡터의 투여 직후 2개월 내지 6개월 동안의 일정 기간 동안 20 ng/ml의 시롤리무스의 혈중 농도를 달성하는 투여량으로 제공된다.
1종 이상의 면역억제제가 미코페놀레이트 모페틸을 포함하는 특정 실시양태에서, 이는 대상체에게 유전자 요법 벡터의 투여 직후 2개월 이하 또는 약 2개월 동안 제공된다. 특정한 실시양태에서, 미코페놀레이트 모페틸은 대상체에게 200 mg/m2/일 - 1200 mg/m2/일 또는 약 600 mg/m2/일의 투여량으로 제공된다.
특정한 실시양태에서, 방법은 대상체에게 유전자 요법 벡터의 투여 직후 3일 내지 10일, 약 5일, 약 6일, 또는 약 7일의 지속기간 동안 프레드니솔론을 제공하는 것을 추가로 포함한다.
게다가, MPSIIIA의 치료와 관련하여 상기에 기재된 방법의 구체적 특색 중 임의의 것은 구체적 면역억제제 또는 이의 조합 및 구체적 투여량을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 유전자 요법 벡터의 사용과 보다 일반적으로 관련된 방법에 존재할 수 있다.
본 개시내용의 이들 방법은 유전자 요법 벡터를 1종 이상의 면역억제제와 조합하여 사용하여, 하나 이상의 유전자의 결함, 예컨대, 예를 들어, 유전자 돌연변이 또는 결실에 의해 유발되는 것들을 포함한, 임의의 유전 질환 또는 장애를 치료하는 데 사용될 수 있다. 많은 장애 및 질환에 대한 유전적 근거가 공지되어 있다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 상기에 기재된 것들 중 임의의 것을 포함한, 리소좀 축적 질환 또는 장애를 치료하는 데 사용된다. 본 개시내용의 방법에 따라 치료될 수 있는 리소좀 축적 질환 및 장애는 다음을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다: 활성제 결핍증(Activator Deficiency)/GM2 강글리오시드증; 알파-만노시드증(Alpha-mannosidosis); 아스파르틸글루코사민뇨증(Aspartylglucosaminuria); 콜레스테릴 에스테르 축적 질환(Cholesteryl ester storage disease); 만성 헥소사미니다제 A 결핍증(Chronic Hexosaminidase A Deficiency); 시스틴증; 다농병(Danon disease); 파브리병(Fabry disease); 파버병(Farber disease); 푸코시드축적증(Fucosidosis); 갈락토시알리도시스(Galactosialidosis); 고셔병 (제I형, 제II형, 제III형); GM1 강글리오시드증(gangliosidosis) (영아, 후기 영아/청소년. 성인/만성); /GM2 강글리오시드증(영아, 후기 영아/청소년. 성인/만성); I-세포병(I-Cell disease)/제II형 뮤코지질증(Mucolipidosis II); 영아 유리 시알산 축적 질환(Infantile Free Sialic Acid Storage Disease)/ISSD; 청소년 헥소사미니다제 A 결핍증(Juvenile Hexosaminidase A Deficiency); 크라베병 (영아 발병, 후기 발병); 이염성 백질이영양증; 점액다당증 장애(Mucopolysaccharidoses disorder) (가성-헐러 다이영양증(Pseudo-Hurler polydystrophy)/제IIIA형 뮤코지질증; MPSI; MPSI 샤이에 증후군(Scheie Syndrome); MPS I 헐러-샤이에 증후군(Hurler-Scheie Syndrome); MPS II 헌터 증후군(Hunter syndrome); A형 산필립포 증후군/MPS III A; B형 산필립포 증후군/MPS III B; C형 산필립포 증후군/MPS III C, D형 산필립포 증후군/MPS III D형, A형 모르퀴오(Morquio Type A)/MPS IVA, B형 모르퀴오/MPS IVB, MPS IX 히알루로니다제 결핍증(Hyaluronidase Deficiency), MPS VI 마로토-라미, MPS VII 슬라이 증후군(Sly Syndrome); 제I형 뮤코지질증/시알리도시스(Sialidosis); 제IIIC형 뮤코지질증(Mucolipidosis IIIC); 제IV형 뮤코지질증(Mucolipidosis type IV)); 다중 술파타제 결핍증(Multiple sulfatase deficiency); 니만-피크병(Niemann-Pick Disease) (A형, B형, C형); 신경 세로이드 리포푸시노스(Neuronal Ceroid Lipofuscinose) (CLN6 질환 (비정형 후기 영아(Atypical Late Infantile), 후기 발병 변이(Late Onset variant), 초기 청소년(Early Juvenile)), 바텐-스필마이어-보그트(Batten-Spielmeyer-Vogt)/청소년 NCL/CLN3 질환, 핀란드 변종 후기 영아(Finnish Variant Late Infantile) CLN5, 얀스키 빌쇼스키병(Jansky-Bielschowsky disease)/후기 유아(Late infantile) CLN2/TPP1 질환, 쿠프스(Kufs)/성인-발병(Adult-onset) NCL/CLN4 질환, 북부 간질(Northern Epilepsy)/변이형 후기 영아(variant late infantile) CLN8, 산타보오리-할티아(Santavuori-Haltia)/영아 CLN1/PPT 질환, 베타-만노사이드축적증(Beta-mannosidosis)); 폼페병(Pompe disease)/제II형 글리코겐 축적병; 피크노디소토시스(Pycnodysostosis); 잔트호프병/성인 발병/GM2 강글리오시드증; 잔트호프병/GM2 강글리오시드증 - 영아; 잔트호프병/GM2 강글리오시드증 - 청소년; 쉰들러병(Schindler disease); 살라병(Salla disease)/시알산 축적병(Sialic Acid Storage Disease); 테이-삭스/GM2 강글리오시드증; 및 월만병(Wolman disease).
다른 실시양태에서, 본 개시내용은 다음의 회합을 포함한다:
(1) 이의 야생형 또는 돌연변이되지 않은 형태의 유전자에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이의 활성 변이체를 포함하는 발현 카세트를 포함하는 유전자 요법 벡터이며, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 프로모터 서열에 작동가능하게 연결되는 벡터; 및
(2) 돌연변이된 유전자로부터 생긴 뇌 장애의 의약으로서 사용하기 위한, 1종 이상의 면역억제제 화합물.
회합의 특정한 실시양태에서, 유전자 요법 벡터 및 면역억제제는 동시에 또는 후속적으로 투여된다. 특정 실시양태에서, 유전자 요법 벡터는 뇌내 주사에 의해 투여된다.
회합의 특정 실시양태에서, 면역억제제 화합물 중 적어도 1종은 대상체에게 유전자 요법 벡터의 투여 직후 적어도 2개월의 일정 지속기간 동안 제공된다.
회합의 특정 실시양태에서, 1종 이상의 면역억제제 화합물은 칼시뉴린 억제제, 마크롤라이드, 및 미코페놀레이트 모페틸을 포함하는 군으로부터 선택된다. 특정한 실시양태에서, 칼시뉴린 억제제는 타크롤리무스이다. 다른 실시양태에서, 마크롤리드는 시롤리무스이다. 특정 실시양태에서, 면역억제제 화합물 중 적어도 1종은 대상체에게 유전자 요법 벡터의 투여 직후에 적어도 3개월, 적어도 6개월, 또는 적어도 12개월의 지속기간 동안 대상체에게 제공된다. 특정한 실시양태에서, 이 화합물은 칼시뉴린 억제제 또는 마크롤리드이다.
다른 실시양태에서, 1종 이상의 면역억제제 화합물은 또한 대상체에게 유전자 요법 벡터의 투여 전 일정 기간 동안 제공된다.
예시적인 실시양태에서, 칼시뉴린 억제제는 타크롤리무스이며, 이는 유전자 요법 벡터의 투여 직후 적어도 2개월 또는 적어도 3개월 동안 0.05 mg/kg/일 - 1.0 mg/kg/일 또는 약 0.2 mg/kg/일의 투여량으로 제공된다. 관련 실시양태에서, 칼시뉴린 억제제는 타크롤리무스이며, 이는 대상체에게 유전자 요법 벡터의 투여 직후 적어도 3개월 동안 일정 기간 동안 10 ng/ml - 15 ng/ml의 타크롤리무스의 혈청 농도를 달성하는 투여량으로 제공된다. 추가의 관련 실시양태에서, 칼시뉴린 억제제는 타크롤리무스이며, 이는 대상체에게 유전자 요법 벡터의 투여 직후 4개월 내지 12개월 동안 일정 기간 동안 7 ng/ml - 10 ng/ml의 타크롤리무스의 혈청 농도를 달성하는 투여량으로 제공된다.
회합의 특정한 실시양태에서, 1종 이상의 면역억제제는 미코페놀레이트 모페틸을 포함하며, 이는 대상체에게 유전자 요법 벡터의 투여 직후 2개월 이하 또는 약 2개월 동안 제공된다. 특정한 실시양태에서, 미코페놀레이트 모페틸은 200 mg/m2/일 - 1200 mg/m2/일의 투여량으로 제공된다.
회합의 다른 실시양태에서, 회합은 프레드니솔론을 추가로 포함한다.
회합의 특정한 실시양태에서, 돌연변이된 유전자로부터 생긴 뇌질환은 A형 산필립포 증후군이다.
회합의 다양한 실시양태에서, 유전자 요법 벡터는 다음 5'에서 3' 순서로 포함하는 발현 카세트를 포함하는 복제 결핍성 아데노-연관 바이러스 (AAV)-유래 벡터이다:
프로모터 서열;
인간 N-술포글루코사민 술포히드롤라제 (SGSH) 폴리펩티드 또는 이의 활성 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열
및
폴리아데닐화 (폴리 A) 서열.
특정한 실시양태에서, 프로모터 서열은 CAG 프로모터 서열로부터 유래되고; 및/또는
폴리 A 서열은 인간 성장 호르몬 폴리 A 서열로부터 유래한다.
회합의 특정 실시양태에서, 발현 카세트는 다음 5'에서 3' 순서로 포함한다 포함한다:
CAG 프로모터 서열로부터 유래된 프로모터 서열;
인간 N-술포글루코사민 술포히드롤라제 (SGSH) 폴리펩티드 또는 이의 활성 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열; 및
인간 성장 호르몬 폴리 A 서열로부터 유래한 폴리 A 서열.
이들 회합 중 임의의 것의 특정한 실시양태에서, 발현 카세트는 2개의 AAV2 내부 말단 반복체 (ITR) 서열에 의해 플랭킹되며, 여기서 2개의 AAV2 ITR 서열 중 하나는 발현 카세트의 5'에 위치하고 2개의 AAV2 ITR 서열 중 하나는 발현 카세트의 3'에 위치한다. 이들 회합 중 임의의 것의 특정 실시양태에서, 벡터는 AAVrh.10 캡시드, 캡시드 단백질 또는 혈청형을 추가로 포함한다.
본원에 구체적으로 기재된 것들 중 임의의 것을 포함한 유전자 요법 벡터 및 1종 이상의 면역억제제 둘 다의 투여와 관련된 특정 실시양태에서, 유전자 요법 벡터는 본원에 기재된 투여량 중 임의의 것으로 투여된다.
본 개시내용의 유전자 요법 벡터 및 조성물은 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 전달 시스템을 통해 대상체의 뇌에 전달될 수 있다. 특정 실시양태에서, 임상의가 예를 들어 뇌내 주사에 의해 정확한 정밀도로 뇌의 깊이에 있는 표적 부위에 바늘 어셈블리를 통해 바이러스 벡터를 전달할 수 있게 하는 임의의 전달 시스템일 수 있다. 특정 실시양태에서, 전달 시스템은 뇌 조직 내로 하나 이상의 미리 결정된 깊이에 도달할 수 있도록 설계되며, 이 깊이는 예를 들어 예를 들어 [55]에 기재된 바와 같이, 바늘 어셈블리가 부착되는 헤드프레임 아크(headframe arc)호의 위치 변경을 통해 정확하고 일관되게 조정될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 문헌 [Souweidane et al. "Gene therapy for late infantile neuronal ceroid lipofuscinosis: neurosurgical considerations", J Neurosurg Pediatr. 2010 Aug; 6 (2):115-22)]에 기재된 바와 같은 전달 장치 및 절차를 사용하여 수행되며, 상기 문헌의 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다. 본원에 기재된 바와 같이, 유전자 요법 벡터는 12개의 별개의 대뇌 위치 (2깊이/두개 천공(2dpths/bur hole), 75분/주입 및 2 μl/분)로 주입된다. 각각 2개의 주입 깊이를 갖는 6개의 진입 부위가 사용된다. 첫 번째 주사 또는 투여는 전달 시스템의 6개의 카테터를 통해 선택된 위치 중 6개에서 동시에 수행될 수 있으며, 이에 의해 6개의 뇌 위치의 이 첫 번째 세트에서 본 개시내용의 조성물을 전달할 수 있다. 이어서, 6개의 카테터 각각을 이동하여 6개의 캐뉼러의 근위 말단이 각각 다른 6개의 선택된 위치에 도달하도록 할 수 있다. 이어서, 두 번째 주사 또는 투여는 전달 시스템의 6개의 카테터를 통해 선택된 위치 중 6개에서 동시에 수행될 수 있으며, 이에 의해 6개의 추가 뇌 위치의 이 두 번째 세트에서 본 개시내용의 조성물을 전달할 수 있다.
문헌 [Souweidane et al.]에 기재된 바와 같이, 특정한 실시양태에서, 수술 전 영상화 및 표적 계획은 대상체에 대한 전신 마취 하에 수행되고, 정위 계획을 위해 대상체 뇌의 수술 전 MR 영상화가 수행된다. 진입 부위는 브레인렙(BrainLAB) 워크스테이션 (BrainLAB USA)에서 선택될 수 있으며, 각각의 대뇌 반구에 걸쳐 3개의 진입 부위가 선택된다. 구멍은 다음과 같이 배치될 수 있다: 정면 극, 중전두(midfrontal) 영역 및 두정-후두 영역에 각각 1개. 프레임리스(frameless) 탐색 및 진입 위치 국소화가 수행된다. 환자는 최소 5개의 기준 마커를 사용하여 수술 전 MR 영상에 등록할 수 있다. 두피에 미리 계획된 진입 부위를 표시하고, 각각의 진입 부위에 국소 마취제를 투여한다. 카테터 및 유전자 요법 벡터 주입이 수행된다. 20 게이지 척추 바늘은 가요성, 용융 실리카 폴리이미드 코팅 카테터 (내경 150 μm 및 외경 362 μm (폴리마이크로 테트놀로지(polymicro technology))의 삽입을 위한 경질 가이드로서 사용된다. 각각의 카테터는 별도의 주사기에 연결되고, 카테터는 이의 끝이 바늘 끝과 같은 높이가 될 때까지 카테터를 삽입한다. 카테터는 더 깊은 삽입 이전에 카테터와 뇌 사이의 인터페이스 지점으로서 바늘 상단에 표시된다. 척추 바늘은 헤드 프레임의 가요성 견인기 아암(retractor arm)에 부착되고 미리 결정된 정위 궤적과 일치하도록 배향된다. 견인기 아암 및 바늘은 피부 개방 전에 계획된 방향으로 모두 설정된다. 이어서 바늘을 연막(pial) 표면 바로 아래에 삽입하고 견인기 아암을 경질 고정 장치로 고정한다. 죽은 공간은 주입 시스템을 실행하여 플러시된다. 가이드 바늘을 제거하고, 카테터를 초기 목표 깊이까지 전진시키고, 이는 일반적으로 피질 표면d로부터 2 cm이며 범위는 1.7 - 2.5 cm이다. 각각의 카테터는 피질 표면으로부터 원하는 깊이에 상기 팁을 배치하는 초기 제로 표시로부터 거리에 있는 스테리-스트립(Steri-strip)으로 접혀 있다. 캐뉼러 삽입 5분 후, 유전자 요법 벡터는 미세관류 펌프에 의해 6개 부위 각각에 2 μl/분으로 병행하여 주사된다. 완료 5분 후 카테터를 1cm 집어넣고 첫 번째와 유사한 두 번째 주사를 수행한다. 두 번째 주입의 완료 후, 카테터를 제거한다.
또 다른 실시양태에서, 전달 시스템은 US 2011/0060285의 교시내용에 따를 수 있으며, 이의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 유전자 요법 벡터 및 조성물은 캐뉼러를 통해 대상체의 뇌에 전달될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 유전자 요법 벡터 및 조성물은 MRI 인터벤션즈(Interventions) 스마트플로우(SMARTFLOW)® 캐뉼러를 통해 전달된다. 제어된 흐름 캐뉼러의 사용은, 제어된 유량으로 정밀한, 급성 주입을 제공한다. 일부 실시양태에서, 전달 방법은 가이드 튜브가 있는 캐뉼러의 사용을 포함한다.
실시예
실시예 1
AAVRH.10-HMPS3A의 제조
(SAF-301) 유전자 요법 벡터
임상 등급 SAF-301 유전자 요법 벡터는 2개의 플라스미드를 인증된 293T 인간 배아 신장 세포주에 형질감염시켜 GMP 통제하에 제조하였다. 치료 유전자에 대한 DNA 코딩은 하나의 플라스미드 (pAAV-PGK-hMPS3A)에 의해 제공되었고 캡시드 단백질 (AAVrh.10로부터), 복제 유전자 (AAV2로부터) 및 헬퍼 기능 (아데노바이러스 혈청형 5로부터)은 모두 두 번째 플라스미드에 의해 트랜스로 제공되었다.
pAAV-PGK-hMPS3A 플라스미드는 다음과 같이 구축되었다. 시판되는 pAAV2-lacZ (7270 bp)는 스트라타진 (미국 캘리포니아주 캘리포니아주 라호이아)으로부터 입수하였다. pAAV2-lacZ 플라스미드의 암피실린 내성 유전자가 결실되고 시판되는 카나마이신 내성 트랜스포존을 서브클로닝함으로써 카나마이신 내성 유전자 (KanR, 1119 bp)에 의해 치환되어, pAAV2-lacZ (KanR)가 생성되었다. 발현 카세트는 pAAV2-lacZ (KanR)의 역위 말단 반복체 사이에 얼라이언스 산필립포(Alliance Sanfilippo)에 의해 공급된 pAAV-SGSH-IRES-SUMF1로부터 서브클로닝되었다. 결과 플라스미드의 다이어그램은 도 2a에 제공되어 있다.
헬퍼 플라스미드 (pPAK-MArh.10)는 카나마이신 내성 레플리콘을 기반으로 하며 Ad 혈청형 5의 VA (진뱅크(Genbank) M73260의 뉴클레오티드 9,856 내지 11,548), E2A 및 E4 (nt 21,438 - 35,935)를 함유한다. AAV2 rep 5의 발현은 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV) 프로모터 (뉴클레오티드 583 내지 1325, 진뱅크 AF228552)에 의해 구동되었고 AAVrh.10 cap 유전자의 발현은 AAV2의 내인성 p40 프로모터에 의해 구동되었다. 이 플라스미드의 다이어그램은 도 2b에 제공되어 있다.
형질감염된 세포를 배양한 후, 바이러스 벡터는 동결 해동 주기에 의해 세포로부터 방출되었고, 아이오딕사놀 단계 구배에 의해 정제된 후 Hi-트랩 QHP 컬럼 상에서 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제되었다. 생성된 AAVrh.10-hMPS3A 벡터는 스핀 컬럼에 의한 농축을 사용하여 임상 제제으로 전달되었다. 정제된 벡터는 인산염 완충 식염수에 냉동 (-60℃ 이하) 보관된다.
종 제제화된 벡터의 완전한 특성화는 캡시드 단백질에 대한 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯, 트랜스진 DNA에 대한 실시간 PCR, 웨스턴 분석, 생체내 및 시험관내 일반 및 특정 외래성 바이러스, 및 기능적 유전자 전달에 대한 효소 검정을 통해 달성되었다. 동일성, 순도 및 기능을 보장하기 위해 로트(Lot) 방출 기준이 제공되었다.
실시예 2
마우스에서 SAF-301의 생체내 효능
SAF-301로 생체내 연구를 수행하여 뇌에서 트랜스진의 발현을 입증하였다. 연구 설계는 SAF-301 주사 후 유전자의 발현 지속기간 및 지속성을 평가할 수 있었고 표 3에 요약되어 있으며 하기에 추가로 기재되어 있다.
[표 3]
효능 연구 요약
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생체내 효능 연구
5주령의 수컷 및 암컷 MPSIIIA 마우스 또는 비영향(unaffected) 한배 새끼는 SAF-301 또는 GFP를 암호화하는 대조군 AAV 벡터를 받았다. 각각의 군 (n=25)은 총 5 μl의 7.5X109 벡터 게놈 카피를 받았다. 용량은 2개의 선조체내 주사 부위에 분배되었다 [29]. 동물을 12, 23 및 30주령에 희생시켰다.
형질감염의 효능 및 원하는 효소의 생성은 뇌 슬라이드로의 SGSH 양의 평가 및 SGSH 활성의 측정에 의해 평가되었다.
SAF-301 주사의 기능적 활성은 다음 질환 파라미터의 분석에 의해 평가되었다:
(1) 탠덤 질량 분석법을 사용하여 뇌/척수에서 HS-유래 올리고사카라이드의 상대적 수준을 결정하였다; 그리고
(2) 맹검 정량적 면역조직학적 평가는 고정 MPSIIIA/비영향 뇌 조직 (LIMP-II, GFAP, 이소렉틴 B4, 유비퀴틴, GM3 강글리오시드, 에스테르화되지 않은 콜레스테롤)에서 검증된 질환 마커에 대한 요법의 효과를 결정하였다.
5주령에 MPS IIIA 마우스의 좌측 선조체에 SAF-301을 전달은 이 뇌 영역에서 매우 많은 양 (정상의 65x)의 (활성) SGSH의 생성을 결과하였다. SGSH 단백질 (및 활성)은 주사된 반구의 꼬리쪽 영역 및 대측성 반구, 특히 주사 부위에 더 가까운 R2에서 또한 검출되는 반면, 수준은 훨씬 더 낮았으며, 주사 부위로부터 거리가 증가함에 따라 감소되었다. SGSH에 대한 체액성 면역 반응은 이 연구에서 마우스에서 검출되지 않았다.
AAVrh.10-hMPS3A 처리는 23주령까지 일차 축적 물질 (HS-유래 올리고사카라이드) 및 이차 축적 생성물 (GM3 및 에스테르화되지 않은 콜레스테롤) 둘 다에서 크지만 지역적 감소를 매개하였다. 뇌 슬라이스 L2는 편도체 및 무질체와 같이 우리가 조사한 다른 뇌 영역 외에도 선조체 (주사 영역) 및 그 위에 있는 (부리쪽) 피질이 둘 다 함유한다. 좌반구 슬라이스 2에 함유된 병리학적 마커의 검사 결과를 고려할 때, 이 뇌 영역이 GlcNS-UA의 유의한 (86%) 감소 및 GM3 및 콜레스테롤의 매우 큰 감소 (또는 정규화)를 중재하기에 충분한 SGSH를 받았다는 것이 분명하였다. 추가로, LIMP-II의 정규화가 이 슬라이스 (선조체 및 부리쪽 피질)의 구조에서도 관찰되었으며 미세아교세포증은 해당 영역에서 부재/정규화되었다. 유비퀴틴-양성 염색은, 잠재적으로 병변이 형성되는 것을 방지했기 때문에, 크게 감소하였다. 슬라이스 2 (AAV-GFP 또는 AAVrh.10-MPS3A) 영역에서 뇌의 좌측 반구에서 벡터 전달로 인한 성상교세포증은 이들 영역에서 이 마커에 대한 치료 효과의 검사를 배제한다. 우측 반구의 슬라이스 2에서 GlcNS-UA가 41% 감소하고 GM3 및 콜레스테롤 수준이 크게 감소하는 것을 관찰하였으나 이들은 정규화되지 않았다. 유사하게, 미세- 및 성상교세포증 및 유비퀴틴-양성 염색과 마찬가지로, LIMP-II 발현이 크게 감소하였으나, 정규화는 달성되지 않았다.
꼬리쪽으로 이동하면서, AAVrh.10-MPS3A 처리는 좌측 반구 및 우측 반구 슬라이스 4에서 GlcNS-UA를 각각 50% 및 21% 감소시켰다. 이 슬라이스는 평가되지 않은 다른 영역과 함께, 비장후피질, 아래 둔덕 및 수도관주위 회색(periaqueductal gray)을 포함한다. 우리의 데이터는 뇌의 더 먼 영역에서 요법의 다소 혼합된 효과를 밝혔으며, 뇌의 좌측 반구 (우측 반구는 아님)에서 GM3와 콜레스테롤 둘 다의 감소가 관찰되었으나, LIMP-II, 미세아교세포증 또는 성상교세포증이 아래 둔덕에서의 좌측 또는 우측 반구에서 관찰되었다.
데이터는 이 벡터가 미세아교세포증과 같은 하류 사건에 더하여, 1차 및 이차 축적 병리학의 매우 유의한 개선을 매개하기 위해 충분한 양의 SGSH를 생성하는 것이 가능함을 나타낸다. 이것은 주사 영역과 인접 영역에서 특히 분명하다. 그러나 SGSH 면역 정량 검정에서 관찰된 바와 같이, SGSH 활성 검정 및, 결과적으로, 1차 기질 검정 (GlcNS-UA), 형질도입된 뇌 세포에 의한 SGSH 생성은 주사 영역에 상대적으로 제한된 상태로 남아 있는 것으로 보이나, 주사 부위로부터 더 먼 영역을 검사할 때 병리학에 대한 이의 영향은 분명해진다. 뇌의 일부 영역이 SGSH/SUMF1이 불충분하거나 전혀 수신되지 않았으므로, 병리학적 마커가 거의 또는 전혀 개선되지 않음이 쉽게 명백하다. 이들 영역은 인지 기능에 중요한 것으로 여겨지는 부위 예를 들어 해마 및 비장후 피질의 치상회를 포함한다. 이러한 뇌 영역으로의 전달 부족은 MPS IIIA 마우스에서 질환의 임상 파라미터 개선 실패의 기저를 이루는 것으로 여겨진다
이들 발견은 두 개의 주사 트랙 (하나는 부리쪽 피질과 선조체를 포함하고 다른 하나는 해마를 통해 시상으로 통과)을 통해 정상 마우스 뇌에 편측 AAVrh.10 벡터 주사 후 국소 효소 발현을 보고한 문헌 (Cearley and Wolfe [10])의 것들과 일치한다. 그 연구에서 사용된 벡터는 β-글루쿠로니다제를 발현했고 연속적인 뇌 섹션에서 효소의 염색은 상당한 양의 β-글루쿠로니다제가 주사 반구 내에서 검출될 수 있었지만, 대측성 측으로의 효소 '확산'은 훨씬 덜 인상적임을 설명하였으며, 예를 들어, 대뇌 피질의 ~55%가 주사된 쪽에서 염색되었으나, 주사되지 않은 반구에서는 9%만 염색되었다. β-글루쿠로니다제를 가장 많이 받은 대측성 뇌의 영역은 시상이었다 (주사된 쪽은 83%가 염색된 것과 비교하여, 35%가 염색된 영역).
그러나, 우리의 관찰은 AAV5 벡터를 선조체에 편측 투여하고 제한된 벡터 게놈 검출을 또한 기재하였으나, '전체 뇌에서' 신경병리학의 후속 수정 및 MPS IIIB 마우스의 거동 개선을 또한 기술한 문헌 (Cressant et al [29])에 의헤 이루어진 것들과는 직접적으로 대조적이었다. 실험 결과의 차이에 대한 이유는 공지되어 있지 않으나, 이용된 벡터 혈청형 (AAVrh.10 대 AAV5)과 관련이 있을 수 있긴 하지만, 이는 문헌 (Sondhi et al [11])의 조사결과를 고려하면 그럴 가능성은 없다. 이 군은 래트 선조체에 여러 가지의 상이한 AAV 혈청형을 전달한 후 트리펩티딜 펩티다제 I (TPP-I) 단백질의 분포 정도를 조사하였다. AAVrh.10은 AAV2, AAV5 및 AAV8과 비교하여, 우수한 TPP1 분포를 결과하였다. 후기 유아 신경원성세로이드 리포푸신증(neuronal ceroid lipofuscinosis) 모델에서 TPP1의 광범위한 분포를 달성하기 위해, 문헌 [Sondhi et al]은 영향을 받은 마우스에서 반구당 4회의 주사를 후속적으로 수행하였다. 마우스 뇌에 걸쳐 1-27x 정상 수준의 TPP-I의 발현은 LINCL 모델에서 신경병리학의 감소 및 임상 질환 파라미터의 개선 (그러나 정규화 아님)을 허용하였다.
결론적으로, MPS IIIA 마우스 연구의 결과는 AAVrh.10 혈청형 벡터가 형질도입된 MPS IIIA 뇌 세포 (추정 뉴런, [10, 11])가 많은 양의 활성 SGSH를 생성하고 분비하도록 하여, 차례로, 1차, 2차 및 기타 신경병리학에서 매우 유의한 감소를 매개하였음을 나타냈다. 많은 양의 SGSH가 뇌의 일부 영역에서 검출되었으며, 주사 부위에 대한 근접성과 직접적인 상관관계가 있는 것으로 나타났다.
실시예 3
LYS-SAF301을 사용한 인간 임상 연구
인간 임상 시험을 효능에 대한 정보도 제공한 안전성 평가에 대한 I/II상 개방-표지, 단일 아암, 단일중심 연구로서 수행하였다. 간단히 말해서, SAF-301 유전자 요법 벡터 (AAVrh.10-hMPS3A, 인간 SGSH 및 인간 SUMF1 유전자 생성물을 암호화하는 AAV 벡터)를 단일 신경외과 세션에서, 트랙당 2개의 침착물을 가진 6개의 영상-가이드된 트랙을 통해 뇌의 양쪽에 전달하였다. 환자는 진단과 초기 신경학적 증상의 발병 후 조기에 주사를 받았으나, 중증 징후가 나타나기 전이었다. 임상 시험에 대한 보다 상세한 설명은 하기에 제공되어 있다.
유전자 요법 벡터
SAF-301 유전자 요법 벡터를 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하였다. 연구용 작용제의 모든 제조, 제제, 및 패키징은 적용가능한 현행 우수식품·의약품의 제조·관리 기준(Good Manufacturing Practices)에 따랐고 인간에서 사용하기 위한 적용가능한 기준을 충족시켰다. 연구용 제품은 사용 전에 -80℃에서 보관되었다.
각각의 환자는 12회 투여로 7.2x1011 gc를 받았으며, 각각은 총 60 μl (0.6x1011 gc)이었다. 제안된 임상 용량에 대한 근거는, 부분적으로, 보고된 독성 없이 5.0x109 내지 3.2x1012 vg 범위의 AAV 벡터의 총 용량이 투여된 다른 유형의 병리를 가진 환자에 대해 수행된 임상 시험, 뿐만 아니라 0.6x1011 vg/침착물이 안전한 것으로 확립된 본원에 기재된 동물 연구를 기반으로 하였다. 사용된 부피는 50 내지 150 μl이고 벡터 농도는 0.5 내지 1.5x109 vg/μl이다. 뇌 실질에 AAV 주사를 사용한 세 가지 인간 유전자 요법 시험이 참고문헌 [32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40]에 기재되어 있다.
환자 기준
4명의 환자가 치료를 받았다.
환자에 대한 주요 포함 기준은 다음을 포함하였다:
(1) 18개월에서 6세 말의 연령;
(2) 생후 첫 5년 이내에 MPSIIIA의 임상 증상의 발병;
(3) 말초 혈액 세포 및/또는 배양된 섬유모세포 추출물에서 SGSH 활성이 대조군의 10% 미만;
(4) 절차에 대한 가족의 이해 및 고지에 입각한 동의; 및
(5) 정상 범위 내의 중요한 실험실 파라미터.
환자에 대한 배제 기준은 다음을 포함하였다:
(1) 1cm 초과의 피질-경막 거리에 대한 pr-clusion MRI 판단에서 뇌 위축의 존재;
(2) 독립적 보행 (도움 없이 걸을 수 있는 능력)이 없음;
(3) 영구적인 마취를 금하는 모든 상태;
(4) MPSIIIA와 관련이 없는 임의의 다른 영구적인 의학적 상태;
(5) 연구용 약물 투여 1개월 전에 임의의 백신 접종;
(6) 1개월 이내에 아스피린 수령;
(7) 벡터 주사 전 6개월 동안 제공된 MPSIIIA의 자연 경과를 변형하는 것을 목표로 하는 임의의 의약; 및
(8) 프로그라프(Prograf)®, 셀셉트(Cellcept)® 및 솔루프레드(Solupred)®로 치료를 금하는 모든 상태.
투여 프로토콜
벡터는 단일 신경외과 세션에서 6개의 영상-가이드된 트랙 (심부 트랙 하나와 표피상 트랙 하나)을 통해 뇌의 양쪽에 직접 뇌내 주사에 의해 전달하였다. 모든 주사는 단일 수술 세션 동안 수행하였다. 전임상 연구 및 공개된 문헌은 단일 수술 세션에서 AAV 벡터의 전달이 보유된 모든 부위에서 효율적인 유전자 전달에 충분함을 나타낸다. 12개 부위는 다음과 같았다.
[표 4]
벡터 전달 부위
Figure pct00006
조합 면역요법
치료는 상기에 기재된 유전자 요법와 다음 면역억제 치료의 조합을 포함하였다.
주입된 벡터 외에도, 시험 동안 사용된 의약은 다음을 포함하였다:
(1) 타크롤리무스 (프로그라프®)는 수술 14일 전에 시작되었고 연구 내내 유지되었다. 시작 용량은 0.2 mg/kg/일 (2회 분할 용량으로 주어짐)이었고 치료 7일 후에 적합화되어 첫 3개월 동안은 10 내지 15 ng/ml 그리고 4개월부터 최대 1년 까지는 7 내지 10 ng/ml의 잔류 용량을 목표로 하였다;
(2) 미코페놀레이트 모페틸 (셀셉트®)은 수술 14일 전에 시작되었고 경구 용액 1g/5 ml에서 1일 2회 600 mg/m2 (최대 2 g)에서 2개월 동안 유지되었다;
(3) 수술 전날부터 10일 동안 프레드니솔론 (솔루프레드®)과 면역억제제 치료가 회합되었음
4시간의 짧은 약물동태학 연구 (H0, H0.75 및 H4)는 투여에 대한 적합화 규칙을 정의하기 위해 치료 1주일 후에 수행되었다.
수술 당일, 환자들은 금식하였다.
면역억제제 치료의 사용은 개 모델 MPSIIIB 및 MPSI에 대한 연구 결과를 기반으로 하였으며, 여기서 유전자 요법은 벡터 바이러스 항원과 치료 단백질에 대한 뇌내 및 뇌외 면역 반응을 예방하기 위해 효율적인 면역억제제 치료의 조합이 필요함을 나타냈다.
치료 후, 환자를 모니터링하였다. SAF-301 투여 1개월 및 3개월 후, 소변 샘플을 수집하여 SAF-301 게놈 역가를 측정하였다. GMO 검출은 SAF-301 벡터의 트랜스진에 특이적인 DNA의 qPCR 정량에 의해 수행되었다.
연구의 초기 부분에서, 총 4명의 환자가 SAF-301을 받았다. 이 약은 내약성이 양호하였으며 임상 시험 프로토콜에서 정의된 안전성 파라미터의 평가를 기반으로 하여, 심각한 이상 반응 또는 의심되는 예상치 못한 심각한 유해 반응이 발생하지 않았다.
전반적으로, SAF-301 임상 연구의 안전성 경험은 A형 산필립포 증후군을 가진 소아 환자에서 SAF-301로 인한 어떤 유의한 안전성 위험을 확인하지 못하였다. 유의한 안전성 연구결과와 신호의 부족은 SAF-301의 안전성 프로파일이 A형 산필립포 증후군을 가진 환자의 치료에서 사용하기에 적합하다는 것을 뒷받침한다.
4명의 환자는 2-4일 이내에 소변에서 벡터가 완전히 제거되었다.
수술 후 임상 평가는 설명할 수 없는 지속적인 발열, 발작 또는 예상치 못한 신경계 증상을 나타내지 않았다.
어떤 유해 효과도 관찰되지 않았다.
처음 3명의 환자는 다음을 나타냈다:
- 과잉행동의 유의한 감소
- 수면 패턴의 유의한 개선
- 집중력과 사회화 기술의 상당한 개선.
이들 결과는 인간 대상체에서 치료의 유효성을 입증한다.
실시예 4
LYS-SAF302 유전자 요법 벡터
LYS-SAF302는 닭 β-액틴 프로모터/토끼 β 글로빈 인트론 (CAG 프로모터)에 융합된 거대세포 바이러스 인핸서에 의해 구동되는 인간 SGSH 유전자를 함유하는 결함 있는 AAV2 게놈을 보유하는 AAVrh.10 벡터이다. 간단히 말해서, 벡터는 부착성 인간 배아 신장 (HEK293) 세포의 삼중 일시적 형질감염을 통해 제조되었다. 예를 들어, HEK293 세포를 p-LYS-SAF-T5, pAAV-rh10, 및 pHGTI로 공동 형질감염시키고 세포를 배양하여 유전자 요법 벡터를 제조하였다. 세포 수확 및 용해 단계 후, rAAV의 조 바이러스 용해물은 심층 여과에 의한 정화, AVB 수지를 사용한 친화도 크로마토그래피, 및 접선 유동 여과를 포함한 몇몇 정제 단계를 거쳤다. LYS-SAF302를 인산염-완충 식염수 (PBS)에 표적 벡터 농도로 희석하고 0.2 μm 여과에 의해 멸균하였다.
LYS-SAF302 역가는 정방향 프라이머 (CCA GCC CCT CCA CAA TGA), 역방향 프라이머 (CAC TGG AGT GGC AAC TTC CA) 및 프로브 (CAT CCC TGT GAC CCC)를 사용하여 검증된 타크만(Taqman) qPCR 방법을 사용하여 측정하였다.
LYS-SAF2 플라스미드 상의 프로모터, hSGSH 트랜스진, 폴리 A 서열, 및 플랭킹 서열의 개략도는 도 3에 제공되어 있다. 특색의 표 및 각각 특색에 대한 서열번호: 9의 위치는 표 5에 이하에 제공되어 있다. 도 4a 및 도 4b는 플랭킹 서열 및 LYS-SAF302 입자에 캡시드화된 DNA 서열 (서열번호: 9)을 제공한다. 도 4c 내지 도 4d는 hSGSH 트랜스진을 포함하는 발현 카세트를 함유하는 플라스미드 p-LYS-SAF-T5 (서열번호: 14)의 전체 서열을 나타낸다. 도 4e 내지 도 4f는 캡시드 rh10 (pAAV2-rh10; 서열번호: 15) 서열을 함유하는 플라스미드의 서열을 나타낸다. 도 4g 내지 도 4k는 헬퍼 플라스미드 pHGTI, 즉, 아데노바이러스의 헬퍼 기능을 갖는 플라스미드의 서열 (서열번호: 16)을 나타낸다.
[표 5]
LYS-SAF302 성분의 표
Figure pct00007
발현 카세트는 순서대로 CMV 조기 인핸서/닭 β 액틴 (CAG) 프로모터, 인간 N-술포글루코사민 술포히드롤라제 cDNA (hSGSH), 및 인간 성장 호르몬 1 폴리 A 유닛 (hGH1 폴리 A)을 포함한다. 145개 뉴클레오티드를 함유하는 첫 번째 AAV2 역 반복체 (ITR) 및 145개 뉴클레오티드를 함유하는 두 번째 AAV2 ITR이 양쪽에서 발현 카세트에 플랭킹되어 있다. 두 개의 ITR 말단은 게놈 복제 및 패키징에 필요한 유일한 시스-작용 요소이다. hGH1 폴리 A 단위는 mRNA 안정성 및 mRNA 번역을 향한 핵 이출에 관여한다. 특히, SAF301과 달리, SAF302는 SUMF 1 유전자 또는 IRES 서열을 포함하지 않는다. SAF302는 또한 SAF301에 비해 상이한 프로모터 (CAG 프로모터)를 가지고 있다. SAF302는 1세대 SAF301 벡터와 비교하여 더 높은 효소 발현을 나타낸다.
LYS-SAF302 DNA는 4.07 kb로 이루어지며 서열 분자량은 1257.4 kDa이다. SGSH 서열은 1.53 kb로 이루어지며, SGSH DNA 서열의 분자량은 471.3 kDa이다.
실시예 5
LYS-SAF301 및 LYS-SAF302의 비교 연구
LYS-SAF302 및 LYS-SAF301로 연구를 수행하여 뇌에서 트랜스진의 발현 및 생성 및 기능적 활성 달성을 입증하고 비교하였다. 8-14주령에, MPS IIIA 마우스 (군당 6마리)는 비히클 (PBS), LYS-SAF301 또는 LYS-SAF302를 동물당 4E+09 vg의 용량으로 꼬리 조가비핵(caudate putamen)/선조체에 양측 뇌내 주사를 받았다.
결과는 LYS-SAF302가 LYS-SAF301과 비교하여 우수한 발현을 제공함을 나타냈다. 주사 4주 후, LYS-SAF302는 LYS-SAF301을 주사한 마우스에서보다 2.7배 더 높은 주사된 마우스의 뇌에서 SGSH 효소 증가를 야기하였다 (도 5). 전체 헤파란 술페이트 (HS)의 약간의 감소가 LYS-SAF301에서 관찰되었다. 대조적으로, LYS-SAF302는 LYS-SAF302 처리 후 주사 후 단 4주에 걸쳐 MPS IIIA의 WT 수준 9.2배에서 4.7배로 HS 수준을 유의하게 하락시켰다 (도 6). 따라서, LYS-SAF302는 LYS-SAF301과 비교하여 유의ㅎ게 더 높은 효소 발현 및 HS 수준의 유의한 하락을 결과하였다.
LYS-SAF302의 면역원성을 평가하고 이의 면역원성을 LYS-SAF301의 면역원성과 비교하기 위한 연구도 수행되었다. 결과는 도 7a 내지 도 7e에 제공되며 케모카인 및 시토카인의 유의한 감소가 LYS-SAF301 및 LYS-SAF302 처리된 마우스에서 관찰되었음을 나타낸다. MIP-1α, MCP-1 및 IL-1α 단백질 (각각 도 7a, 도 7b, 및 도 7c)은 WT와 비교하여 처리되지 않은 MPS IIIA 마우스에서 유의하게 상승하였다. 각각의 처리군에서 MIP-1α이 감소하는 경향이 있었지만, 처리되지 않은 마우스와 비교하여 LYS-SAF302 처리된 마우스에서만 수치가 유의하게 감소하였다. 모든 치료군에서 MCP-1의 유의한 감소가 관찰되었다. IL-1α의 수준은 모든 처리에서 감소했지만, LYS-SAF302로 처리한 경우에만 유의한 감소가 관찰되었다. RANTES와 KC에서는 유의한 차이가 관찰되지 않았다 (도 7d 및 도 7e). 두 벡터 모두 피질내 주사 후 항체 반응을 도출하지 못하였다. 요약하면, 결과는 염증성 시토카인이 LYS-SAF301 또는 LYS-SAF302의 투여에 의해 감소되었지만, LYS-SAF302가 특정 시토카인에서 더 유의한 감소를 나타냈음을 나타냈다.
종합하면, LYS-SAF301과 LYS-SAF302를 비교한 약력학 연구는 2세대 생성물인 LYS-SAF302가 1세대 생성물인 LYS-SAF301과 비교하여 효소 발현이 더 높고 병원성 기질과 염증 마커의 감소가 더 양호함을 확인하였으며, 둘 사이에 필적할만한 면역원성 프로파일을 갖는다.
실시예 6
LYS-SAF302의 약리학
LYS-SAF302 벡터의 시험관내 발현 및 효능을 평가하기 위해 반정량적 웨스턴-블롯 및 효소 검정을 기반으로 하는 이중 발현/효능 (기능) 검정이 개발되었다. 먼저, HeLa 세포 (12개 웰-플레이트 형식으로 시딩됨)를 50,000; 100,000; 및 500,000 MOI (감염 다중도)에서 rAAV2/rh10 벡터 LYS-SAF302로 형질도입하였다. 세포 감염 벡터의 양은 다음 공식을 기반으로 하여 계산되었다:
μL의 벡터 부피 (V) =
(MOI x 웰당 세포 수 x 1000) /
(vg/mL의 벡터 역가)
형질도입 후 약 72시간에, Hela 세포를 배양 플레이트로부터 수집하고 원심분리하였다. 세포 펠렛을 용해 완충제으로 처리하고 동결 해동 사이클을 적용하여 세포로부터 단백질을 추출하였다. 세포 현탁액을 원심분리하고 상청액을 새 튜브로 옮겼다.
이어서, 이들 샘플을 -80℃로 옮기고 후속적으로 웨스턴 블롯 검정에 의해 SGSH의 발현을 검출하고 효능 검정에 의해 효소 활성을 결정하는 데 사용하였다. 웨스턴 블롯 검정 전에, 세포 용해물의 총 단백질 함량은 BCA 검정 (비신초닌산 분석)에 의해 결정되었는데, 이 총 단백질 정량은 전기영동 겔 (SDS-Page)에 대해 정의된 양의 단백질을 로딩하는 데 사용되었기 때문이다. 공지된 양의 hSGSH를 사용하는 표준 곡선도 포함되어 단백질 발현 정량을 허용하였다. 단백질이 이의 분자량에 따라 분리되도록 전기영동 이동 후, 이들은 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다. 이어서 관심 단백질은 항-액틴 및 항-SGSH 항체 및 형광색소-결합 이차 항체를 사용하여 밝혀졌다. hSGSH 단백질 발현은 대략 57 kDa의 분자량에서 형광 신호를 통해 측정되었고 대략 42 kDa에서 관찰된 액틴 단백질의 형광 신호에 의해 정규화되었다. 발현 결과는 μg로 표시하였다.
효능은 문헌 [Karpova et. al. (1996)]에 의해 개발된 효소 검정에 의해 결정되었다. 간단히 말해서, SGSH는 2-술파미노-2-데옥시-d글루코피라노실 잔기의 N-술페이트를 절단하여 4MU-αGlcNH2를 생성한다. 이어서 4MU 모이어티는 글루코사민 잔기에 대한 α-글루코사미니다제 활성으로 인해 α-글리코시다제로 소화에 의해 유리된다. 효능 결과는 nmol/h/mg로 표시되었다.
두 가지 검정 결과는 도 8 및 도 9에 제공되어 있다. 음성 대조군과 감염된 세포 사이에서 증가가 관찰되었다. 게다가, MOI가 증가함에 따라 발현 및 약간의 효능 증가가 관찰되었다.
실시예 7
LYS-SAF302를 사용한 동물 연구
LYS-SAF302의 효능, 용량 범위, 및 독성 연구는 MPS IIIA 마우스, 개, 및 비인간 영장류 (NHP)에서 수행되었다.
마우스 연구
LYS-SAF302의 효능/독성 및 용량 범위 연구는 5주령 MPS IIIA 마우스에서 수행되었다. 5주령에, MPS IIIA 마우스 (군당 성별당 5마리)는 꼬리 조가비핵/선조체 및 시상 각각에 LYS-SAF302의 비히클 (PBS) 또는 세 가지 상이한 용량 (8.6E+08, 4.1E+10, 및 9.0E+10 vg/마우스) 중 하나의 양측 뇌내 주사를 받았다. 마우스는 폴리에틸렌 튜빙을 통해 해밀턴 주사기에 연결된 27G 바늘을 통해 0.2 μl/분의 속도로 총 8 μL의 LYS-SAF302 또는 비히클 (부위당 2 μl)을 받았다. 양측 표적 부위 (브레그마와 관련하여)는, 백색 섬유로(white fiber tract)를 포함하려는 선조체의 후방 측면 - A 0.75 mm, L 1.5 mm, V 3 mm 및 시상 - P 2 mm, L 1.5 mm, V 3 mm이었다. 마우스는 통증 완화를 위해 0.05 mg/kg의 부프레노르핀을 받았고 절차 동안 체액 교체를 위해 생리식염수에 4% 덱스트로스를 받았다. 5개의 반-관상 슬라이스의 주사 부위와 위치는 도 10에 나타냈다.
모든 마우스는 15주령에 개방-필드 (거동) 시험을 받았다. 17주령 (수술 후 12주)에, 미리 결정된 마우스 코호트를 안락사시키고 완전한 사후 분석을 수행하였다. 나머지 마우스는 28주령에 개방-필드 시험을 받았고 30주령 (수술 후 25주)에 안락사되었다. SGSH 활성 및 HS 축적은 3개의 뇌 슬라이스에서 평가되었다: 뇌의 가장 앞쪽 부분에 위치한 슬라이스 1; 주사 부위 근처에 위치한 슬라이스 3; 및 소뇌를 함유하는 슬라이스 5.
뇌 균질액에서의 SGSH 활성은 형광 기질 4-메틸움벨리페릴-β-D-N-글루코사미니드 (4MU-αGlcNS)를 사용하여 측정되었다. 결과는 4MU 표준 곡선과 비교하여 pmol/분/mg 총 단백질로 표시되었다.
SGSH 활성의 용량-의존적 증가 (도 11) 및 1차 헤파란 술페이트 (HS) 축적의 용량-의존적 감소 (도 12)는 30주령까지 지속된 LYS-SAF302 투여 후 (치료 후 25주) 12주 기간 동안 나타났다. 전체적으로, 뇌의 가장 앞쪽 부분 (슬라이스 1) 또는 소뇌를 함유하는 슬라이스 (슬라이스 5)와 비교하여 주사 부위 (슬라이스 3) 근처에서 치료의 더 높은 효과가 관찰되었다.
게다가, 도 13a 내지 도 13f에 도시된 바와 같이, GM2/GM3의 이차 축적, 엔도/리소좀 시스템 확장, 성상세포증 및 미세아교세포증 및 축삭 회전타원체의 분해가 30주령까지 (치료 후 25주) 지속된 LYS-SAF302 투여 후 12주 기간 동안 나타났다. 강글리오시드의 이차 축적은 MPS IIIA 21을 포함한 몇몇 MPS 질환에서 보고되었다. GM2 및 GM3은 치료 후 12주 및 25주에 뇌 슬라이스 1, 3 및 5 (도 10에 제공되어 있는 바와 같음)에서 측정되었다 (도 13a 및 13b에 제시된 주사 후 25주에 슬라이스 3의 데이터.. 모든 비히클-처리 MPS IIIA 마우스는 모든 3개의 뇌 슬라이스에서 GM2/3의 유의한 증가를 나타냈고, 결과는 두 안락사 연령 각각에서 관찰할 수 있는 것으로 나타났다. 비히클-처리 또는 LYS-SAF302-처리된 코호트 중 임의의 것의 강글리오시드 수준에 대한 성별의 영향 없는 것으로 보였다. LYS-SAF302의 세 가지 용량 각각은 뇌 슬라이스 1 및 3에서 GM2 및 GM3 강글리오시드 수준의 정규화를 결과하였다 (도 13a, 도 13b). 강글리오시드 수준은 슬라이스 5에서 정규화되지 않았지만, 치료 후 GM2 및 GM3 수준에서 감소가 있었으며 더 높은 2개의 용량에서 특히 두드러졌다.
엔도/리소좀 확장 및 회전타원체형 병변으로 이루어진 MPS IIIA와 연관된 특징적인 신경 형태학적 이상은 치료 후 12주와 25주에 몇몇 뇌 영역에서 평가되었다. 리소좀 통합막 단백질-2 (LIMP2) 면역조직화학에 의해 반영된 엔도/리소좀 확장은 17주 및 30주 도태 군 둘 다에서 검사된 MPS IIIA 비히클-처리 마우스 뇌 영역의 대다수에서 유의하게 증가되었다 (도 13c에 제시된 주사 후 25주에 아래 둔덕의 대표적 데이터) LIMP2 염색의 용량-의존적 감소가 뇌의 부리-꼬리쪽 축을 가로질러 관찰되었으며 특히 중간 및 고용량의 LYS-SAF302로 처리된 마우스에서, 처리 후 25주까지 유지되었다.
> 5 μm의 유비퀴틴-양성 회전타원체형 병변의 수를 평가하였으며, 두 도태 시간 모두에서, 모든 영역은 연령-매칭된 비영향 비히클-처리 마우스와 비교하여 비히클-처리 MPS IIIA 마우스 뇌의 유비퀴틴 반응성 병변의 유의한 증가를 나타냈다 (도 13d에 제시된 주사 후 25주에 아래 둔덕의 대표적 데이터). 모든 LYS-SAF302 용량은 뇌량을 제외하고, 검사된 모든 뇌 영역에서 병변의 수를 유의하게 감소시켰다.
MPS IIIA와 연관된 신경염증은 신경교 섬유성 산성 단백질(glial fibrillary acidic protein)의 면역조직화학적 검출을 사용하여 성상교 활성화의 존재에 의해 그리고 이소렉틴 B4 반응성 아메바의 미세아교세포의 조직화학적 염색을 사용하여 활성화된 미세아교세포의 존재에 의해 평가되었다. 성상교세포 활성화를 나타내는 상당히 증가된 GFAP 발현이 치상회 및 소뇌를 제외하고, 연령-매칭된 비영향 비히클-처리 마우스와 비교하여 두 시점 모두에서 비히클-처리 MPS IIIA 마우스의 뇌 영역에서 관찰되었다. 주사 후 25주에 아래 둔덕에 대한 대표적인 데이터는 도 13e에 제시되어 있다. 치료 효과는 17주령에서 식별하기 어려웠으며, 꼬리, 시상 및 아래 둔덕에서 GFAP 발현의 어떤 감소도 관찰되지 않았다. 주사 영역에서 더 멀리 떨어진, 초기 도태 시점에서 뇌간과 부리쪽 피질 및 아래 둔덕에서 GFAP 염색이 감소하였다. 30주령까지, 아래 둔덕의 두 수준 모두, 특히 더 높은 2회 용량에서 GFAP의 유의한 감소를 나타냈다 (도 13e). 그러나. 이 시점에서 저용량-처리 MPS IIIA 마우스와 비교하여 중간 및 고용량-처리 MPS IIIA 마우스 부리쪽 피질 (중앙선) 및 꼬리 주사 수준에서 훨씬 더 많은 GFAP가 관찰되었다.
많은 수의 활성화된 미세아교세포가 비히클-처리 MPS IIIA 마우스 뇌에서 비히클-처리 비영향 마우스 뇌와 비교하여 명백하였다. 세 가지 용량 모두는 본질적으로 뇌의 더 부리쪽/중앙쪽 측면에 걸쳐 비활성화로 해석되는 미세아교세포 형태의 정규화를 결과하였다. 이 결과는 30주령까지 유지되었다. 주사 후 25주차 치상회에 대한 대표적인 데이터가 도 13f에 제시되어 있다. 용량 의존적 결과는 뇌간과 소뇌에서 관찰되었으며, 낮은 용량은 어느 시점에서든 후자의 미세아교세포를 탈활성화하지 못하였다.
15주령과 28주령의 암컷 마우스로부터의 개방-필드 데이터는 암컷 비히클-처리 MPS IIIA 마우스가 비영향 비히클-처리 암컷 마우스와 비교하여 특징적으로 더 낮은 개방-필드 활성을 나타냈다는 것을 나타내었긴 하지만, 데이터는 잠재적으로 전력 부족으로 인해, 통계적 유의성에 실패하였다. LYS-SAF302-처리 마우스, 특히 중간 및 고용량을 투여받은 그러한 코호트의 성능 개선이 관찰되었다.
15주 및 28주령 둘 다에서, 비히클-처리 수컷 MPS IIIA 마우스는 이 시험에서 특징적인 더 낮은 오픈 필드 활성을 나타내지 못하였다. 그러나, 수컷 고용량 처리된 MPS IIIA 마우스는 15주령에 이의 비영향 및 MPS IIIA 비히클-처리 마우스보다 훨씬 덜 활동적이었다. 고용량 처리된 MPS IIIA 수컷의 양육 활동만이 비영향 연령-매칭된 수컷과 비교하여 통계적으로 유의하게 다른 것으로 입증되었다. 수컷 마우스의 비정상적인 행동에 대한 이유는 공지되어 있지 않았다. 이러한 거동적 차이를 뒷받침할 수 있는 조직병리학적 분석 동안 수컷과 암컷의 차이는 발견되지 않았다.
종합하면, 마우스 연구의 데이터는 LYS-SAF302가 이 실험의 기간 (즉, 투여 후 25주)에 MPS IIIA-관련 뇌 병리에 대한 용량-의존적 효과를 매개할 수 있음을 나타냈다. 이것은 일부 경우에 기존 질환 병변 (HS 축적, 리소좀 확장 및 미세아교세포증, 이는 투여 시점에 상당한 수준으로 존재할 것임)을 감소시키는 것으로 해석된다. 이것은 또한 성상교세포증 및 축삭 회전타원체 형성과 같은 다른 경우에서 병변 형성의 발병을 예방하는 것으로 해석되는데, 그 이유는 이러한 유형의 병변은 발달 속도가 더 느리고 치료 개시 당시 더 낮은 수준으로 또는 일부 뇌 영역에만 존재했을 것이기 때문이다. MPS IIIA 마우스의 뇌에서 미세아교세포증을 유의하게 감소시키는 LYS-SAF302의 능력은 활성화된 미세아교세포에 의해 매개되는 신경염증이 MPS 발병기전 및 질환 진행에서 핵심적인 역할을 하는 것으로 생각되기 때문에 특히 관련이 있다. MPS IIIA 23에서 신경 손상을 유발하고 악화시키는 것으로 생각되는 미세아교세포의 신경염증 표현형을 장기간 역전시키는 LYS-SAF302의 능력은 이의 치료 잠재력에 중대한 영향을 미칠 수 있다.
개 연구
다양한 주사 파라미터를 평가하는 비-GLP 개 생체분포 연구를 수행하였다. 이들 연구의 목적은 MRI 인터벤션즈 스마트플로우 캐뉼러를 사용하여 성인 및 청소년 뇌의 분포에 대한 다양한 주입 부피 및 주입량의 효과를 평가하는 것이었다.
성체 비글견에서 수행된 한 연구에서, LYS-SAF302는 MRI 조영제인 가돌리늄 (2-5 mmol)과 함께 백질에 1.0E+12vg/mL 및 10 μl/분의 주사 속도에서 공동 주입되었다. 4마리의 동물은 반구당 500 μL (총 용량 1.0E+12vg/mL)의 1회 주사를 받았고 한 동물은 반구당 500 μL (총 용량 2.0E+12vg/mL)의 2회 주사를 받았다. 주사는 10 μl/분의 주입 유량을 사용하여 수행되었다. 주사 후 촬영한 MRI 영상을 분석하여 추적자의 분포를 정량하였다. 모든 동물은 체중 변화, 임상 소견 및 육안 시험 물품-관련 소견 없이 예정된 부검 시간까지 생존하였다. 동물을 주사 후 1주 또는 4주에 인도적으로 안락사시켰다. 뇌의 우측 및 좌측 반구를 4 mm 두께의 슬라이스로 절단하였다. 짝수 슬라브를 멸균 페트리 접시에 놓고 즉시 8 mm 생검 펀치 (동물당 40개)를 채취하여 qPCR의 경우 절반으로 그리고 SGSH 효소 분석의 경우 절반으로 절단하였다 (4주 평가항목 군).
MRI는 수술 직후 수행되었으며 수집된 영상은 가돌리늄 신호를 정량하기 위해 오시릭스(Osirix) 소프트웨어를 사용하여 분석되었다. 도 14a는 주사 부위를 포함하는 관상 절편의 위치를 가진 개의 뇌의 좌측 측면도이다. 이어서, 반구당 가돌리늄 신호의 부피를 해당 주입 부피로 정규화하고 가돌리늄 분포 부피/주사 부피의 비율로 표시하였다. 도 14b 내지 도 14c는 붉은 점 반점으로 표시된 주사 예정 부위를 가진 주사 전 관상 절편의 MRI 영상이다. 도 14d 내지 도 14e는 백질 내로 보이는 가돌리늄 신호를 주사한 후 관상 절편의 MRI 영상이다. 도 14f는 백질의 부리-꼬리쪽 축을 따라 양쪽 반구에서 보이는 가돌리늄 신호를 갖는 MRI 영상의 3D 재구성의 전방도이다. 결과는 스마트플로우® 캐뉼러가 역류가 검출되지 않고 잘 수행되었음을 나타낸다. 시험 물품의 트랙당 500 μL의 투여는 부리쪽 및 꼬리쪽 주사관 둘 다에서 측심실로 누출과 관련된 것으로 밝혀졌다. 가돌리늄 분포 부피/주입 부피의 평균 비는 3.1 +/- 0.2였다 (표 6).
벡터 카피 분석은 트랜스진에 특이적인 프라이머 및 프로브를 사용하여 타크만 qPCR에 의해 수행되었다. 이 (또는 더 높은) 수준이 항상 SGSH 활성 증가와 연관되어 있다는 관찰을 기반으로 하여 세포당 0.1 벡터 카피의 임계값이 설정되었다. LYS-SAF302 주사 4주 후, 세포당 0.1개 초과의 벡터 카피가 시험된 뇌 펀치의 37%(+/-4)에서 발견되었다 (표 6).
뇌 균질액에서 SGSH 활성은 형광 기질 4-메틸움벨리페릴-β-D-N-글루코사미니드 (4MU-αGlcNS)를 사용하여 측정되었다. 결과는 내인성 활성의 %로 표현되었으며, 두 개의 별개 동물의 2개의 비히클 주사 반구로부터 80회의 뇌 펀치의 평균값으로 결정되었다. 20% 초과의 SGSH 활성 증가는 시험된 뇌 펀치의 78%(+/-6)에서 발견되었다 (표 6).
[표 6]
주사후 4주 개 뇌의 생체분포 데이터. 주사후 4주 평가항목으로 3마리의 개로부터 LYS-SAF302가 주사된 6개 반구로부터의 데이터
Figure pct00008
종합하면, 결과는 MRI 중재 캐뉼러가 10 μl/분의 주입 속도에서 검출된 역류 없이 잘 수행되었음을 나타냈다. 반구당 1회 주사한 동물과 반구당 2회 주사한 동물 사이에 큰 차이는 발견되지 않았다. 이것은 대략 75cm3 뇌의 매우 좁은 백색 섬유관으로 인해 두 주입 부위로부터의 확산의 중첩 및 주입된 부피의 일부가 측심실로 잠재적 누출을 반영한다. 개 뇌에서 대략 75cm3의 매우 좁은 백색 섬유관으로 인해 주사된 부피의 일부가 측심실로 누출되었음에도 불구하고, 이 연구는 1.0E+12의 벡터 농도에서 반구당 500 μL를 3회 주입해야 함을 나타낸다. 효소 활성이 20% 이상 증가하는 치료 수준으로 아동 뇌의 많은 부분을 덮기에 충분한다.
추가 파일럿 연구는 5 μl/분의 감소된 주사 속도로 더 낮은 부피 (최대 300 μL)를 사용하여 12주령 개에서 수행되었다. 세 (3)마리의 동물에게 LYS-SAF302 또는 PBS를 반구당 1회 (200 μL 또는 300 μL) 주사하고 1마리의 동물에게 우반구에서 LYS-SAF302 또는 좌측 반구에서 PBS를 반구당 2회(2x200 μL) 주사하였다(총 용량: 6E+11vg 내지 1.8E+12vg). 평균 가돌리늄 분포 부피/부피 비율은 2.9(+/-0.5)였으며, 시험한 뇌 펀치의 37%(+/-9)에서 세포당 0.1개 초과의 벡터 카피가 발견되었으며 20% 초과의 SGSH 활성 증가가 시험한 뇌 펀치의 53%(+/-8)에서 발견되었다.
비인간 영장류 (NHP) 연구
비인간 영장류 (NHP)는 독성을 평가하는 데 사용되는 동물 모델이기도 하며 뇌 해부학은 개 해부학보다 인간과 더 유사하다. 따라서 NHP는 인간의 뇌 분포 및 독성 결과에 대한 더 나은 예측을 제공하기 위해 GLP 독성학/생체분포/용량 범위 연구에서 사용하기 위해 특별히 선택되었다. 이와 병행하여. 신경외과 의사에게 장치에 대한 실습 경험을 제공하고 주사 용량 및 총 용량 (뇌 용량에 상대적)의 생체분포를 결정하기 위해 NHP에서 비-GLP 연구를 수행하였다.
이 연구의 목적은 이들 연구의 목적은 MRI 인터벤션즈 스마트플로우 캐뉼러를 사용하여 중추 임상 시험에서 시험할 것과 유사한 주사량, 총 부피 (뇌 부피와 관련됨), 및 총 용량 (뇌 부피와 관련)에서 백색 섬유질에 직접 주사하여 투여한 LYS-SAF302의 NHP 안전성 및 생체분포 데이터를 획득하는 것이었다. 이들 연구는 또한 신경외과 의사에게 임상 수술 설정을 사용하여 이 새로운 장치에 대한 실습 경험을 제공하였다.
세 (3)마리의 수컷 사이노몰구스 원숭이 (마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis)) (4.2세 내지 4.5세)에게 LYS-SAF302 (n=2) 또는 PBS (n=1)를 투여하였다. LYS-SAF302는 MR 조영제 가돌리늄 (0.125 mmol/mL)과 3E+12vg/mL로 동시 주입되었다. 백질 (7.2E+11vg의 총 용량)에 각각의 동물 (반구당 2개)에서 50 μL의 4회 주입이 이루어졌다. 벡터 카피 수뿐만 아니라 리소좀 효소 활성 (SGSH) 분포는 주사 후 6주에 측정되었다.
벡터 카피 분석은 트랜스진에 특이적인 프라이머 및 프로브와 함께 타크만 qPCR을 사용하여 수행되었다. 개 연구에서와 같이 세포당 0.1 벡터 카피의 임계값을 설정하였다. LYS-SAF302 투여 6주 후, 세포당 0.1개 초과의 벡터 카피가 시험된 뇌 펀치의 11%(+/-1)에서 발견되었다 (표 6).
뇌 균질액에서 SGSH 활성은 4MU-αGlcNS를 사용하여 측정되었다. 결과는 내인성 활성의 %로 표시되었으며, PBS를 주사한 한 마리의 동물의 2개 반구로부터 85개 펀치의 평균값으로 결정되었다. SGSH 효소 활성 분석도 수행하였고 결과는 내인성 활성의 %로 표시하였다. 주사 6주 후, 시험된 뇌 펀치의 97%(+/-2)에서 20% 초과의 SGSH 활성 증가가 발견되었다 (표 6 및 도 15).
[표 6]
주사후 6주 NHP 뇌의 생체분포 데이터. 주사후 6주 평가항목을 사용하여 2 NHP로부터 LYS-SAF302가 주사된 4개 반구로부터의 데이터
Figure pct00009
주사된 부피로 정규화되었을 때, 벡터 확산은 개 연구 (주사된 500 μL 또는 1 mL로 덮인 37%)와 비교하여 NHP 연구 (주사된 100 μL로 뇌의 11% 덮음)에서 더 광범위하였으며, 이는 NHP 뇌의 더 큰 백색 섬유관과 더 낮은 주입 부피로 인해 측심실로의 주사된 누출 감소를 반영한다. 개와 비교하여 NHP에서 벡터 확산의 절대 수준이 더 낮음에도 불구하고, SGSH 활성은 NHP 뇌 전체에 더 광범위하게 분포되었다 (뇌의 97%에서 최소 20% 활성 증가 대 개에서 78%). 두 연구 사이에서 관찰된 차이점은 가능한 종의 차이 때문일 수 있거나 개의 4주 기간과 비교하여 6주 기간 후에 NHP 뇌에서 더 나은 효소 분비 및 광범위한 확산을 반영할 수 있다. 결과는 MRI 중재 캐뉼러가 5 μl/분의 주사 속도에서 검출된 역류 없이 잘 수행되었음을 나타낸다. 시험한 뇌 펀치의 11%(±1)가 세포당 0.1개 이상의 벡터 카피를 가지고 있는 반면, 시험된 브레인 펀치의 97%(±2)는 6주 기간 동안 모든 뇌에서 효소 분비 및 확산을 반영하여 20% 초과의 SGSH 활성 증가를 나타낸다.
결론적으로, 동물 연구의 결과는 LYS-SAF302가 MPS IIIA의 유전자 요법을 위한 유망한 새로운 후보임을 입증하였다. 1세대 벡터 LYS-SAF301을 7.2E+08 vg/g 뇌 용량으로 MPS IIIA를 가진 아동 4명에서 수행한 1/2상 시험에서 고무적인 개선 징후가 나타났다. 본 개시내용은 1세대 벡터보다 약 3배 더 강력할 뿐만 아니라 10배 더 높은 임상 용량 (7.2E+09 vg/g 뇌)이고 최적화된 전달 기술을 사용하는 본원에 기재된 2세대 벡터를 제공한다. 이론에 얽매이는 것을 바라지 않으면서, 본 연구의 결과는 상대적으로 낮은 용량의 LYS-SAF302가 MPS IIIA 환자의 뇌 전체에 걸쳐 정상 SGSH 활성의 적어도 20%를 회복할 수 있어야 함을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 이러한 수준의 효소 활성 회복은 질환 진행에 상당한 긍정적인 영향을 미친다.
실시예 8
단일 깊이 주사
LYS-SAF301의 임상 연구에서와 같이 두 개의 깊이에 걸쳐 전달하는 것과 대조적으로 단일 깊이에서 더 큰 주사 부피를 사용하여 분포를 향상시킬 수 있는지 여부를 조사하고, LYS-SAF302 벡터의 장기간 발현을 평가하기 위해, LYS-녹색 형광 단백질 (GFP)이 트랜스진을 대체한 SAF302 변이체가 생성되었다. 벡터 SAF302 gFP는 hSGSH 유전자가 GFP 유전자로 대체된 것을 제외하고는 LYS-SAF302와 동일하였다. GFP 분포 연구는 SAF302 gFP 주사 후 4개월 후에 마우스를 평가하기 위해 수행되었다.
MPSIIIA 마우스는 단일 선조체 깊이에서 양측 주사를 통해 8-14주령에 AAV-SAF302 gFP의 정위 주사를 받았으며, 여기서 벡터는 양쪽 반구에서 정중선 옆으로 2 mm인 3 mm의 단일 깊이에서 전달된 3 μL의 6.1 x 109 게놈 입자의 용량으로 투여되었다 (도 16a, n=5). 이어서, 주사 후 약 4개월인 대략 6개월령에 동물을 희생시켰다. 비교를 위해, MPSIIIA 마우스의 2-깊이 군은 8-14주령에 AAV-SAF302 gFP의 정위 주사를 받았으며, 여기서 벡터는 4 μL에서 4.1 x 109 게놈 입자의 용량으로 투여되었으며, 양쪽 반구에서 정중선의 측면으로 각각 2 mm인, 선조체내 깊이 (2 및 3 mm)에서 1 μL 침적물을 통해 전달되었다. 2-깊이 군의 마우스는 수술 후 대략 4주차에 희생되었다. 뇌 전체의 벡터 분포에 대한 포괄적인 개요를 제공하기 위해 관상 및 시상 절편을 NeuN, GFP, 및 DAPI로 공동 표지하였다.
뇌 절편의 이미징은 두 개의 깊이에서 주사를 받은 동물과 비교하여 단일 깊이에서 주사를 받은 동물에서 향상된 벡터 분포를 나타냈다. 도 16b 내지 도 24e는 단일 깊이 군에서 수집된 데이터를 나타낸다. 최대 GFP 발현은 주사 부위의 지역에 존재하여 이 지역에서 멀어질수록 범위와 강도가 감소하였다. 관상 절편 (2)는 주사 부위에서 방출되는 선조체 전체에 걸쳐 GFP 양성 세포를 나타낸다. GFP-양성 세포는 또한 외부 캡슐의 백질 관과 뇌량 내에서 접촉하는 선조체 및 피질을 따라 볼 수 있었다. 발현은 두 가지 심층 연구에서 마우스에 비해 관상 절편 (3)에서 상당히 더 컸으며, 해마 내에서 GFP 양성 세포가 더 광범위하게 확산되어 벡터의 확산이 증가했음을 나타낸다. 내부 캡슐 염색도 명백하였으며, 벡터 퍼짐은 관상 절편 (4)의 내부 캡슐에서 발생하는 대뇌 다리(cerebral peduncle)에서 명백하였다 (도 16b).
해마 및 선조체의 고배율 영상 (도 16c에 도시된 시상 절편에서 점선 상자로 표시됨)는 SAF302 gFP 벡터 (각각 도 16d 및 16e)의 뉴런 특이성을 확인하고 GFP와 뉴런 핵 마커 NeuN의 강력한 공동국재화를 확인하였으며, GFP는 신경 과정을 따라 확장된다.
2-깊이 및 단일-깊이 동물 둘 다에서 성상교세포 마커 GFAP를 사용한 GFP의 공동-염색은 성상세포의 일부가 뉴런과 함께 형질도입되었음을 나타냈다 (도 17a (2-깊이) 및 17b (단일 깊이)). 그러나 표적화된 성상세포의 비율은 뉴런에 비해 감소하였다.
단일-깊이 동물에서 SAF302 gFP의 선조체내 주사 후 소뇌 내의 세포가 형질도입되지 않았으며, 이는 이중 깊이 연구 부문에서 달성된 결과와 유사하다. 두 가지 주입 전략을 사용한 후 브레그마에 걸친 GFP의 발현은 총 뇌 면적에 대한 GFP 양성 세포의 백분율로 정량되었다 (도 17c 내지 도 17e, n = 군당 동물 5마리). 주사 부위 (브레그마 +0.26) 부근에서, 단일 주사 전략은 2-깊이 전략과 비교하여 증가된 전체 GFP를 유도하였다 (도 17d). 주사 부위에서 원위의 세포의 증가된 형질도입은 단일 볼루스 주사에서도 명백했으며, 한편 원위 부위에서의 이중-높이 주사로부터의 형질도입은 거의 관찰되지 않았다 (도 17c 및 도 17e).
연구 결과에 따르면 예기치 않게, LYS-SAF302를 두 개의 깊이에 주입하는 것은 단일 깊이 전략으로 투여된 부피가 감소했음에도 불구하고 단일 깊이에 주입하는 것보다 효율성이 떨어지는 것으로 나타났다. 벡터는 단일 주입 깊이 연구에서 유리하게 발생한 주사 부위의 끝에서 측면으로 퍼지기보다는, 두 개의 깊이에서 주사에서 주사 트랙을 따라 더 많이 분포되었다. 이론에 얽매이지 않기를 바라면서, 이것은 단일 깊이에서 바이러스 볼루스를 전달할 때 달성될 수 있는 더 큰 측면 압력을 생성하기보다는, 바늘을 빼낼 때 벡터의 역류를 반영할 수 있다.
실시예 9
SAF-302의 인간 임상 연구
A형 산필립포 증후군을 앓고 있는 대상체에게 LYS-SAF302의 뇌내 투여의 안전성과 효능을 평가하기 위해 2/3상, 단일 아암, 개방 표지, 다기관, 중재적 연구가 수행된다. 이 연구는 3년 장기간 추적 관찰을 포함한다. 7.2E+12vg의 단일 용량 (6개의 주사 부위 (반구당 3개), 주사당 500 μL)이 뇌 양쪽의 천막상 영역에 대상체에게 투여된다. LYS-SAF302는 단일 신경외과 세션에서 6개의 영상-유도 천막상 트랙을 통해 주사되어 피막에 인접한 백질을 표적으로 한다.
1차 효능 분석은 치료 후 24개월에 수행된다. 잠재적인 초기 효능 신호를 확인하기 위해 수술 후 1년에 중간 분석이 수행된다. 예상되는 치료 효과는 기준선에서 연령 및 DQ를 기반으로 예측 가능한 질환 경과를 갖도록 선택된 연구 모집단에서 질환 진행을 최소한 중단시키는 것이다. 효능은 기준선과 24개월 사이의 비율 (DQ24/DQ0)로 표시되는 DQ의 관찰된 (수술 후) 진화와 2개의 자연 상태의 현재 연구의 적격성 기준을 충족한 병력 연구에서 12명의 환자 데이터를 기반으로 회귀 계수를 적용하여 계산된 예상 비율을 비교하여 평가된다 (문헌 [Shapiro et al, 2016[ 및 SAF301의 1/2상 연구에서 임상적으로 완료된 환자). 그들은 12개월과 24개월에 치료가 없을 때 예상되는 인지 결과를 계산하는 데 사용된다.
2/3상 임상 연구를 위해 임상 등급 SAF302 유전자 요법 벡터가 GMP 통제하에 생성되었다. 완제품은 부형제나 보존제 없이 PBS 완충제에서 제제화되었다. 용액은 투명하거나 약간 유백색이었고 희끄무레한 작은 반투명 입자를 포함할 수 있다. 약물 투여 절차 동안 주사기와 스마트플로우 캐뉼러 사이에 배치된 0.2-마이크로미터 인라인 필터를 통해 입자의 존재가 완화되었으며, 약물 제품 LYS-SAF302의 강도 또는 역가에 대한 검출가능한 영향이 없었다.
PBS 완충제의 조성은 다음과 같았다:
· 2.67 mM KCl
· 1.47 mM KH2PO4
· 137.9 mM NaCl
· 8.06 mM Na2HPO4
· pH 7.2-7.4
LYS-SAF302의 제품 기본 패키징은 다음으로 이루어진다:
· Ompi로부터의 즉시 사용 가능한 멸균 3 mL (2R) 유리 바이알;
· 웨스트 파마슈티컬즈(West Pharmaceuticals)로부터의 즉시 멸균 가능한 13 mm 플루로텍(FluroTec) 스토퍼 (노바스에프(Novasep)에 의해 멸균된 증기);
· 웨스트 파마슈티컬즈로부터의 13 mm 즉시 사용 가능한 방사선조사된 플립 오프 캡.
바이알은 2.4E+12vg/mL 표적 벡터 농도에서 1.2 mL의 LYS-SAF302로 충전된다 (출시 사양: 1.9E+12 내지 3.2E+12 vg/mL).
치료 벡터는 미리 정의된 (MRI에 의한) 동시 프레임리스 정위 뇌 주사 (각각 500 μL, 즉 1.2E+12vg)에서 약 7.2E+12vg/환자 (약 2.4E+12vg/mL 농도)의 용량으로 대략 100분 (5 μl/분)에 기저핵의 전방, 내측 및 후방 백질 내에서 양측으로 (반구당 3개의 주사 부위) 전달된다. 수술은 숙련된 신경외과 의사가 수행한다.
환자는 형질도입된 세포의 제거를 피하기 위해 면역억제 요법 (타크롤리무스, 미코페놀레이트 모페틸 및 단기 프레드니솔론)을 병용한다. 이 연구는 본원에 제공된 투여 전략을 통해 전달된 LYS-SAF302가 A형 산필립포 증후군과 같은 SGSH 결핍과 관련된 질환의 매우 임상적으로 효과적인 치료를 결과한다는 것을 나타낸다.
본 명세서에 언급된 모든 미국 특허, 미국 특허 출원 간행물, 미국 특허 출원, 외국 특허, 외국 특허 출원 및 비특허 간행물은 본 설명과 일치하지 않는 것이 아닌 정도까지, 그 전문이 참조로 본원에 포함된다.
전술한 내용으로부터, 본 발명의 구체적 실시양태가 예시의 목적으로 여기에 설명되었긴 하지만, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 다양한 수정이 이루어질 수 있음을 인식할 것이다.
참고문헌
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
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840 ctacacccag acatttggcc aagtttgaaa tgttctcagt ccctggaggg aagggtaggt 900 ggggctggca ggagatcagg cgtctagctc cctggggccc tccgtcgcgg ccctcctggt 960 ctctccctag gcccccggac ctccctgctc ctggctttcg ccctgctctg cctgccctgg 1020 actcaggtgg tgggcgcctt cccagccatg tccttgtccg gcctgtttgc caacgctgtg 1080 ctccgggctc agcacctgca tcagctggct gctgacacct tcaaagagtt tgtaagctcc 1140 cgagggatgc gtcctagggg tggggaggca ggaaggggtg aatccacacc ccctccacac 1200 agtgggagga aactgaggag ttcagccgta ttttatccaa gtagggatgt ggttagggga 1260 gcagaaacgg gggtgtgtgg ggtggggagg gttccgaata aggcggggag gggaaccgcg 1320 caccagctta gacctgggtg ggtgtgttct tcccccagga gcgcacctac atcccggagg 1380 gacagagata ctccatccag aacacccagg ttgccttctg cttctctgaa accatcccgg 1440 cccccacggg caagaatgag gcccagcaga aatcagtgag tggcaacctc ggaccgagga 1500 gcaggggacc tccttcatcc taagtaggct gccccagctc ccgcaccggc ctggggcggc 1560 cttctccccg aggtggcgga ggttgttgga tggcagtgga ggatgatggt gggcggtggt 1620 ggcaggaggt cctcgggcag aggccgacct tgcagggctg ccccagaccc gcggcaccca 1680 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cgtcctccat ggttggggga cgtcgcgccg caccgcgtcc gcgctcgggg 6060 gtggtttcgc gctgctcctc ttcccgactg gccatttcct tctcctatag gcagaaaaag 6120 atcatggagt cagtcgagaa gaaggacagc ctaaccgccc cctctgagtt cgccaccacc 6180 gcctccaccg atgccgccaa cgcgcctacc accttccccg tcgaggcacc cccgcttgag 6240 gaggaggaag tgattatcga gcaggaccca ggttttgtaa gcgaagacga cgaggaccgc 6300 tcagtaccaa cagaggataa aaagcaagac caggacaacg cagaggcaaa cgaggaacaa 6360 gtcgggcggg gggacgaaag gcatggcgac tacctagatg tgggagacga cgtgctgttg 6420 aagcatctgc agcgccagtg cgccattatc tgcgacgcgt tgcaagagcg cagcgatgtg 6480 cccctcgcca tagcggatgt cagccttgcc tacgaacgcc acctattctc accgcgcgta 6540 ccccccaaac gccaagaaaa cggcacatgc gagcccaacc cgcgcctcaa cttctacccc 6600 gtatttgccg tgccagaggt gcttgccacc tatcacatct ttttccaaaa ctgcaagata 6660 cccctatcct gccgtgccaa ccgcagccga gcggacaagc agctggcctt gcggcagggc 6720 gctgtcatac ctgatatcgc ctcgctcaac gaagtgccaa aaatctttga gggtcttgga 6780 cgcgacgaga agcgcgcggc aaacgctctg caacaggaaa acagcgaaaa tgaaagtcac 6840 tctggagtgt tggtggaact cgagggtgac aacgcgcgcc tagccgtact aaaacgcagc 6900 atcgaggtca cccactttgc ctacccggca cttaacctac cccccaaggt catgagcaca 6960 gtcatgagtg agctgatcgt gcgccgtgcg cagcccctgg agagggatgc aaatttgcaa 7020 gaacaaacag aggagggcct acccgcagtt ggcgacgagc agctagcgcg ctggcttcaa 7080 acgcgcgagc ctgccgactt ggaggagcga cgcaaactaa tgatggccgc agtgctcgtt 7140 accgtggagc ttgagtgcat gcagcggttc tttgctgacc cggagatgca gcgcaagcta 7200 gaggaaacat tgcactacac ctttcgacag ggctacgtac gccaggcctg caagatctcc 7260 aacgtggagc tctgcaacct ggtctcctac cttggaattt tgcacgaaaa ccgccttggg 7320 caaaacgtgc ttcattccac gctcaagggc gaggcgcgcc gcgactacgt ccgcgactgc 7380 gtttacttat ttctatgcta cacctggcag acggccatgg gcgtttggca gcagtgcttg 7440 gaggagtgca acctcaagga gctgcagaaa ctgctaaagc aaaacttgaa ggacctatgg 7500 acggccttca acgagcgctc cgtggccgcg cacctggcgg acatcatttt ccccgaacgc 7560 ctgcttaaaa ccctgcaaca gggtctgcca gacttcacca gtcaaagcat gttgcagaac 7620 tttaggaact ttatcctaga gcgctcagga atcttgcccg ccacctgctg tgcacttcct 7680 agcgactttg tgcccattaa gtaccgcgaa tgccctccgc cgctttgggg ccactgctac 7740 cttctgcagc tagccaacta ccttgcctac cactctgaca taatggaaga cgtgagcggt 7800 gacggtctac tggagtgtca ctgtcgctgc aacctatgca ccccgcaccg ctccctggtt 7860 tgcaattcgc agctgcttaa cgaaagtcaa attatcggta cctttgagct gcagggtccc 7920 tcgcctgacg aaaagtccgc ggctccgggg ttgaaactca ctccggggct gtggacgtcg 7980 gcttaccttc gcaaatttgt acctgaggac taccacgccc acgagattag gttctacgaa 8040 gaccaatccc gcccgcctaa tgcggagctt accgcctgcg tcattaccca gggccacatt 8100 cttggccaat tgcaagccat caacaaagcc cgccaagagt ttctgctacg aaagggacgg 8160 ggggtttact tggaccccca gtccggcgag gagctcaacc caatcccccc gccgccgcag 8220 ccctatcagc agcagccgcg ggcccttgct tcccaggatg gcacccaaaa agaagctgca 8280 gctgccgccg ccacccacgg acgaggagga atactgggac agtcaggcag aggaggtttt 8340 ggacgaggag gaggaggaca tgatggaaga ctgggagagc ctagacgagg aagcttccga 8400 ggtcgaagag gtgtcagacg aaacaccgtc accctcggtc gcattcccct cgccggcgcc 8460 ccagaaatcg gcaaccggtt ccagcatggc tacaacctcc gctcctcagg cgccgccggc 8520 actgcccgtt cgccgaccca accgtagatg ggacaccact ggaaccaggg ccggtaagtc 8580 caagcagccg ccgccgttag cccaagagca acaacagcgc caaggctacc gctcatggcg 8640 cgggcacaag aacgccatag ttgcttgctt gcaagactgt gggggcaaca tctccttcgc 8700 ccgccgcttt cttctctacc atcacggcgt ggccttcccc cgtaacatcc tgcattacta 8760 ccgtcatctc tacagcccat actgcaccgg cggcagcggc agcaacagca gcggccacac 8820 agaagcaaag gcgaccggat agcaagactc tgacaaagcc caagaaatcc acagcggcgg 8880 cagcagcagg aggaggagcg ctgcgtctgg cgcccaacga acccgtatcg acccgcgagc 8940 ttagaaacag gatttttccc actctgtatg ctatatttca acagagcagg ggccaagaac 9000 aagagctgaa aataaaaaac aggtctctgc gatccctcac ccgcagctgc ctgtatcaca 9060 aaagcgaaga tcagcttcgg cgcacgctgg aagacgcgga ggctctcttc agtaaatact 9120 gcgcgctgac tcttaaggac tagtttcgcg ccctttctca aatttaagcg cgaaaactac 9180 gtcatctcca gcggccacac ccggcgccag cacctgttgt cagcgccatt atgagcaagg 9240 aaattcccac gccctacatg tggagttacc agccacaaat gggacttgcg gctggagctg 9300 cccaagacta ctcaacccga ataaactaca tgagcgcggg accccacatg atatcccggg 9360 tcaacggaat acgcgcccac cgaaaccgaa ttctcctgga acaggcggct attaccacca 9420 cacctcgtaa taaccttaat ccccgtagtt ggcccgctgc cctggtgtac caggaaagtc 9480 ccgctcccac cactgtggta cttcccagag acgcccaggc cgaagttcag atgactaact 9540 caggggcgca gcttgcgggc ggctttcgtc acagggtgcg gtcgcccggg cagggtataa 9600 ctcacctgac aatcagaggg cgaggtattc agctcaacga cgagtcggtg agctcctcgc 9660 ttggtctccg tccggacggg acatttcaga tcggcggcgc cggccgctct tcattcacgc 9720 ctcgtcaggc aatcctaact ctgcagacct cgtcctctga gccgcgctct ggaggcattg 9780 gaactctgca atttattgag gagtttgtgc catcggtcta ctttaacccc ttctcgggac 9840 ctcccggcca ctatccggat caatttattc ctaactttga cgcggtaaag gactcggcgg 9900 acggctacga ctgaatgtta agtggagagg cagagcaact gcgcctgaaa cacctggtcc 9960 actgtcgccg ccacaagtgc tttgcccgcg actccggtga gttttgctac tttgaattgc 10020 ccgaggatca tatcgagggc ccggcgcacg gcgtccggct taccgcccag ggagagcttg 10080 cccgtagcct gattcgggag tttacccagc gccccctgct agttgagcgg gacaggggac 10140 cctgtgttct cactgtgatt tgcaactgtc ctaaccctgg attacatcaa gatcttattc 10200 cctttaacta ataaaaaaaa ataataaagc atcacttact taaaatcagt tagcaaattt 10260 ctgtccagtt tattcagcag cacctccttg ccctcctccc agctctggta ttgcagcttc 10320 ctcctggctg caaactttct ccacaatcta aatggaatgt cagtttcctc ctgttcctgt 10380 ccatccgcac ccactatctt catgttgttg cagatgaagc gcgcaagacc gtctgaagat 10440 accttcaacc ccgtgtatcc atatgacacg gaaaccggtc ctccaactgt gccttttctt 10500 actcctccct ttgtatcccc caatgggttt caagagagtc cccctggggt actctctttg 10560 cgcctatccg aacctctagt tacctccaat ggcatgcttg cgctcaaaat gggcaacggc 10620 ctctctctgg acgaggccgg caaccttacc tcccaaaatg taaccactgt gagcccacct 10680 ctcaaaaaaa ccaagtcaaa cataaacctg gaaatatctg cacccctcac agttacctca 10740 gaagccctaa ctgtggctgc cgccgcacct ctaatggtcg cgggcaacac actcaccatg 10800 caatcacagg ccccgctaac cgtgcacgac tccaaactta gcattgccac ccaaggaccc 10860 ctcacagtgt cagaaggaaa gctagccctg caaacatcag gccccctcac caccaccgat 10920 agcagtaccc ttactatcac tgcctcaccc cctctaacta ctgccactgg tagcttgggc 10980 attgacttga aagagcccat ttatacacaa aatggaaaac taggactaaa gtacggggct 11040 cctttgcatg taacagacga cctaaacact ttgaccgtag caactggtcc aggtgtgact 11100 attaataata cttccttgca aactaaagtt actggagcct tgggttttga ttcacaaggc 11160 aatatgcaac ttaatgtagc aggaggacta aggattgatt ctcaaaacag acgccttata 11220 cttgatgtta gttatccgtt tgatgctcaa aaccaactaa atctaagact aggacagggc 11280 cctcttttta taaactcagc ccacaacttg gatattaact acaacaaagg cctttacttg 11340 tttacagctt caaacaattc caaaaagctt gaggttaacc taagcactgc caaggggttg 11400 atgtttgacg ctacagccat agccattaat gcaggagatg ggcttgaatt tggttcacct 11460 aatgcaccaa acacaaatcc cctcaaaaca aaaattggcc atggcctaga atttgattca 11520 aacaaggcta tggttcctaa actaggaact ggccttagtt ttgacagcac aggtgccatt 11580 acagtaggaa acaaaaataa tgataagcta actttgtgga ccacaccagc tccatctcct 11640 aactgtagac taaatgcaga gaaagatgct aaactcactt tggtcttaac aaaatgtggc 11700 agtcaaatac ttgctacagt ttcagttttg gctgttaaag gcagtttggc tccaatatct 11760 ggaacagttc aaagtgctca tcttattata agatttgacg aaaatggagt gctactaaac 11820 aattccttcc tggacccaga atattggaac tttagaaatg gagatcttac tgaaggcaca 11880 gcctatacaa acgctgttgg atttatgcct aacctatcag cttatccaaa atctcacggt 11940 aaaactgcca aaagtaacat tgtcagtcaa gtttacttaa acggagacaa aactaaacct 12000 gtaacactaa ccattacact aaacggtaca caggaaacag gagacacaac tccaagtgca 12060 tactctatgt cattttcatg ggactggtct ggccacaact acattaatga aatatttgcc 12120 acatcctctt acactttttc atacattgcc caagaataaa gaatcgtttg tgttatgttt 12180 caacgtgttt atttttcaat tgcagaaaat ttcaagtcat ttttcattca gtagtatagc 12240 cccaccacca catagcttat acagatcacc gtaccttaat caaactcaca gaaccctagt 12300 attcaacctg ccacctccct cccaacacac agagtacaca gtcctttctc cccggctggc 12360 cttaaaaagc atcatatcat gggtaacaga catattctta ggtgttatat tccacacggt 12420 ttcctgtcga gccaaacgct catcagtgat attaataaac tccccgggca gctcacttaa 12480 gttcatgtcg ctgtccagct gctgagccac aggctgctgt ccaacttgcg gttgcttaac 12540 gggcggcgaa ggagaagtcc acgcctacat gggggtagag tcataatcgt gcatcaggat 12600 agggcggtgg tgctgcagca gcgcgcgaat aaactgctgc cgccgccgct ccgtcctgca 12660 ggaatacaac atggcagtgg tctcctcagc gatgattcgc accgcccgca gcataaggcg 12720 ccttgtcctc cgggcacagc agcgcaccct gatctcactt aaatcagcac agtaactgca 12780 gcacagcacc acaatattgt tcaaaatccc acagtgcaag gcgctgtatc caaagctcat 12840 ggcggggacc acagaaccca cgtggccatc ataccacaag cgcaggtaga ttaagtggcg 12900 acccctcata aacacgctgg acataaacat tacctctttt ggcatgttgt aattcaccac 12960 ctcccggtac catataaacc tctgattaaa catggcgcca tccaccacca tcctaaacca 13020 gctggccaaa acctgcccgc cggctataca ctgcagggaa ccgggactgg aacaatgaca 13080 gtggagagcc caggactcgt aaccatggat catcatgctc gtcatgatat caatgttggc 13140 acaacacagg cacacgtgca tacacttcct caggattaca agctcctccc gcgttagaac 13200 catatcccag ggaacaaccc attcctgaat cagcgtaaat cccacactgc agggaagacc 13260 tcgcacgtaa ctcacgttgt gcattgtcaa agtgttacat tcgggcagca gcggatgatc 13320 ctccagtatg gtagcgcggg tttctgtctc aaaaggaggt agacgatccc tactgtacgg 13380 agtgcgccga gacaaccgag atcgtgttgg tcgtagtgtc atgccaaatg gaacgccgga 13440 cgtagtcata tttcctgaag caaaaccagg tgcgggcgtg acaaacagat ctgcgtctcc 13500 ggtctcgccg cttagatcgc tctgtgtagt agttgtagta tatccactct ctcaaagcat 13560 ccaggcgccc cctggcttcg ggttctatgt aaactccttc atgcgccgct gccctgataa 13620 catccaccac cgcagaataa gccacaccca gccaacctac acattcgttc tgcgagtcac 13680 acacgggagg agcgggaaga gctggaagaa ccatgttttt ttttttattc caaaagatta 13740 tccaaaacct caaaatgaag atctattaag tgaacgcgct cccctccggt ggcgtggtca 13800 aactctacag ccaaagaaca gataatggca tttgtaagat gttgcacaat ggcttccaaa 13860 aggcaaacgg ccctcacgtc caagtggacg taaaggctaa acccttcagg gtgaatctcc 13920 tctataaaca ttccagcacc ttcaaccatg cccaaataat tctcatctcg ccaccttctc 13980 aatatatctc taagcaaatc ccgaatatta agtccggcca ttgtaaaaat ctgctccaga 14040 gcgccctcca ccttcagcct caagcagcga atcatgattg caaaaattca ggttcctcac 14100 agacctgtat aagattcaaa agcggaacat taacaaaaat accgcgatcc cgtaggtccc 14160 ttcgcagggc cagctgaaca taatcgtgca ggtctgcacg gaccagcgcg gccacttccc 14220 cgccaggaac catgacaaaa gaacccacac tgattatgac acgcatactc ggagctatgc 14280 taaccagcgt agccccgatg taagcttgtt gcatgggcgg cgatataaaa tgcaaggtgc 14340 tgctcaaaaa atcaggcaaa gcctcgcgca aaaaagaaag cacatcgtag tcatgctcat 14400 gcagataaag gcaggtaagc tccggaacca ccacagaaaa agacaccatt tttctctcaa 14460 acatgtctgc gggtttctgc ataaacacaa aataaaataa caaaaaaaca tttaaacatt 14520 agaagcctgt cttacaacag gaaaaacaac ccttataagc ataagacgga ctacggccat 14580 gccggcgtga ccgtaaaaaa actggtcacc gtgattaaaa agcaccaccg acagctcctc 14640 ggtcatgtcc ggagtcataa tgtaagactc ggtaaacaca tcaggttgat tcacatcggt 14700 cagtgctaaa aagcgaccga aatagcccgg gggaatacat acccgcaggc gtagagacaa 14760 cattacagcc cccataggag gtataacaaa attaatagga gagaaaaaca cataaacacc 14820 tgaaaaaccc tcctgcctag gcaaaatagc accctcccgc tccagaacaa catacagcgc 14880 ttccacagcg gcagccataa cagtcagcct taccagtaaa aaagaaaacc tattaaaaaa 14940 acaccactcg acacggcacc agctcaatca gtcacagtgt aaaaaagggc caagtgcaga 15000 gcgagtatat ataggactaa aaaatgacgt aacggttaaa gtccacaaaa aacacccaga 15060 aaaccgcacg cgaacctacg cccagaaacg aaagccaaaa aacccacaac ttcctcaaat 15120 cgtcacttcc gttttcccac gttacgtcac ttcccatttt aagaaaacta caattcccaa 15180 cacatgttta aacggatcca cgatatcctg caggaagctt tctggcgcct ggccggcgca 15240 attgaatggg cccctctagt caaggcctta agtgagtcgt attacggact ggccgtcgtt 15300 ttacaacgtc gtgactggga aaaccctggc gttacccaac ttaatcgcct tgcagcacat 15360 ccccctttcg ccagctggcg taatagcgaa gaggcccgca ccgatcgccc ttcccaacag 15420 ttgcgcagcc tgaatggcga atggcgcttc gcttggtaat aaagcccgct tcggcgggct 15480 tttttttgtt aactacgtca ggtggcactt ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt 15540 gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa ccctgataaa 15600 tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta tgagtattca acatttccgt gtcgccctta 15660 ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag 15720 taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca 15780 gcggtaagat ccttgagagt tttcgccccg aagaacgttc tccaatgatg agcactttta 15840 aagttctgct atgtggcgcg gtattatccc gtgttgacgc cgggcaagag caactcggtc 15900 gccgcataca ctattctcag aatgacttgg ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc 15960 ttacggatgg catgacagta agagaattat gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca 16020 ctgcggccaa cttacttctg acaacgatcg gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc 16080 acaacatggg ggatcatgta actcgccttg atcgttggga accggagctg aatgaagcca 16140 taccaaacga cgagcgtgac accacgatgc ctgtagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac 16200 tattaactgg cgaactactt actctagctt cccggcaaca attaatagac tggatggagg 16260 cggataaagt tgcaggacca cttctgcgct cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg 16320 ataaatctgg agccggtgag cgtgggtctc gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg 16380 gtaagccctc ccgtatcgta gttatctaca cgacggggag tcaggcaact atggatgaac 16440 gaaatagaca gatcgctgag ataggtgcct cactgattaa gcattggtaa ctgtcagacc 16500 aagtttactc atatatactt tagattgatt taccccggtt gataatcaga aaagccccaa 16560 aaacaggaag attgtataag caaatattta aattgtaaac gttaatattt tgttaaaatt 16620 cgcgttaaat ttttgttaaa tcagctcatt ttttaaccaa taggccgaaa tcggcaaaat 16680 cccttataaa tcaaaagaat agcccgagat agggttgagt gttgttccag tttggaacaa 16740 gagtccacta ttaaagaacg tggactccaa cgtcaaaggg cgaaaaaccg tctatcaggg 16800 cgatggccca ctacgtgaac catcacccaa atcaagtttt ttggggtcga ggtgccgtaa 16860 agcactaaat cggaacccta aagggagccc ccgatttaga gcttgacggg gaaagcgaac 16920 gtggcgagaa aggaagggaa gaaagcgaaa ggagcgggcg ctagggcgct ggcaagtgta 16980 gcggtcacgc tgcgcgtaac caccacaccc gccgcgctta atgcgccgct acagggcgcg 17040 taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga 17100 gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc 17160 tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt 17220 ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc 17280 gcagatacca aatactgttc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc 17340 tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg 17400 cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg 17460 gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga 17520 actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc 17580 ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg 17640 gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg 17700 atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt 17760 tttacggttc ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg taatgtgagt tagctcactc 17820 attaggcacc ccaggcttta cactttatgc ttccggctcg tatgttg 17867 <210> 17 <211> 510 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 17 acgggtggca tccctgtgac ccctccccag tgcctctcct ggccctggaa gttgccactc 60 cagtgcccac cagccttgtc ctaataaaat taagttgcat cattttgtct gactaggtgt 120 ccttctataa tattatgggg tggagggggg tggtatggag caaggggcaa gttgggaaga 180 caacctgtag ggcctgcggg gtctattggg aaccaagctg gagtgcagtg gcacaatctt 240 ggctcactgc aatctccgcc tcctgggttc aagcgattct cctgcctcag cctcccgagt 300 tgttgggatt ccaggcatgc atgaccaggc tcagctaatt tttgtttttt tggtagagac 360 ggggtttcac catattggcc aggctggtct ccaactccta atctcaggtg atctacccac 420 cttggcctcc caaattgctg ggattacagg cgtgaaccac tgctcccttc cctgtccttc 480 tgattttgta ggtaaccacg tgcggaccga 510

Claims (28)

  1. 다음 5'에서 3' 순서로:
    a. 프로모터 서열(promoter sequence);
    b. 인간 N-술포글루코사민 술포히드롤라제 폴리펩티드 또는 이의 활성 변이체(active variant)를 암호화(encoding)하는 폴리뉴클레오티드 서열;
    및
    c. 폴리아데닐화 (폴리 A) 서열
    을 포함하는 발현 카세트(expression cassette)를 포함하는 복제 결핍성 아데노-연관 바이러스 혈청형(replication deficient adeno-associated virus serotype) rh. 10 (AAVrh.10)-유래 벡터이며,
    여기서 인간 술파타제 변형 인자 1 또는 이의 임의의 활성 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하지 않는 상기 복제 결핍성 아데노-연관 바이러스 혈청형 rh. 10 (AAVrh.10)-유래 벡터.
  2. 제1항에 있어서,
    프로모터 서열이 CMV 조기 인핸서(early enhancer) / 닭 베타 액틴 (CAG) 프로모터 서열로부터 유래되는 벡터.;
  3. 제1항에 있어서, 폴리 A 서열이 인간 성장 호르몬 1 서열로부터 유래되는 벡터.
  4. 제1항에 있어서, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES) 서열을 포함하지 않는 벡터.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 카세트가 다음 5'에서 3' 순서로 이루어지는 벡터:
    a. CAG 프로모터 서열로부터 유래된 프로모터 서열;
    b. 인간 N-술포글루코사민 술포히드롤라제 폴리펩티드 또는 이의 활성 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열; 및
    c. 인간 성장 호르몬 1 폴리 A 서열로부터 유래된 폴리 A 서열.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 발현 카세트가 2개의 AAV2 내부 말단 반복체 (internal terminal repeat; ITR) 서열에 의해 플랭킹(flanking)되고, 여기서 2개의 AAV2 ITR 서열 중 하나는 발현 카세트의 5'에 위치하고 2개의 AAV2 ITR 서열 중 하나는 발현 카세트의 3'에 위치하는 벡터.
  7. 제6항에 있어서, 발현 카세트의 5' 말단에 위치한 ITR 서열이 서열번호: 10에 따른 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 발현 카세트의 3' 말단에 위치한 ITR 서열은 서열번호: 11에 따른 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터.
  8. 제2항에 있어서, CAG 프로모터 서열이 서열번호: 12에 따른 서열을 포함하는 벡터.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 N-술포글루코사민 술포히드롤라제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열이 서열번호: 13에 따른 서열을 포함하는 벡터.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리아데닐화 (폴리 A) 서열이 서열번호: 17에 따른 서열을 포함하는 벡터.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, AAVrh.10 캡시드 또는 AAVrh.10 캡시드 단백질을 추가로 포함하는 벡터.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 다음 서열을 다음 5'에서 3' 순서로 포함하는 벡터:
    a. AAV2 ITR 서열;
    b. CAG 프로모터 서열로부터 유래된 프로모터 서열;
    c. 인간 N-술포글루코사민 술포히드롤라제 폴리펩티드 또는 이의 활성 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열;
    d. 인간 성장 호르몬 1 폴리 A 서열로부터 유래된 폴리 A 서열; 및
    e. AAV ITR 서열.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호: 9에 따른 서열을 포함하는 벡터.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호: 14에 따른 서열을 포함하는 벡터.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 벡터를 A형 산필립포 증후군(Sanfilippo type A syndrome)의 치료를 필요로 하는 대상체(subject)에게 투여하는 것을 포함하는, A형 산필립포 증후군을 치료하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 벡터가 대상체에게 뇌내 주사(intracerebral injection)를 통해 투여되는 방법.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 벡터가 대상체에게 뇌내 주사를 통해 투여되고, 여기서 각각의 주사는 단일 주사 깊이로 투여되는 방법.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터가 대상체에게 반구(hemisphere)당 2 내지 4회 주사를 통해 투여되는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 벡터가 대상체에게 반구당 3회 주사를 통해 투여되는 방법.
  20. 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 주사가 약 500 μL의 부피로 투여되는 방법.
  21. 제15항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 투여되는 벡터의 총 용량이 약 5 x 1010 내지 약 5 x 1013 vg인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 대상체에게 투여되는 벡터의 총 용량이 약 7.2 x 1012 vg인 방법.
  23. 제15항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 면역억제 요법(regimen)을 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 면역억제 요법이 타크롤리무스, 미코페놀레이트 모페틸, 및 프레드니손을 포함하는 방법.
  25. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 A형 산필립포 증후군 치료에서 의약(medicament)으로서 사용하기 위한 벡터(vector).
  26. 제25항에 있어서, 의약이 제약상 허용되는 지지체, 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는, A형 산필립포 증후군 치료에서 의약으로서 사용하기 위한 벡터.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 의약이 에멀젼 또는 수용액인, A형 산필립포 증후군 치료에서 의약으로서 사용하기 위한 벡터.
  28. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 벡터 및 이의 사용설명서를 포함하는 키트(kit).
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