CN111118017B

CN111118017B - 治疗Leber先天性黑蒙症的载体及其应用

Info

Publication number: CN111118017B
Application number: CN201811297477.5A
Authority: CN
Inventors: 孙晓东; 罗学廷
Original assignee: Shanghai Langsheng Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shanghai Langsheng Biotechnology Co ltd
Priority date: 2018-11-01
Filing date: 2018-11-01
Publication date: 2023-10-03
Anticipated expiration: 2038-11-01
Also published as: CN111118017A

Abstract

本发明涉及治疗Leber先天性黑蒙症的载体及其应用。具体地，本发明对RPE65基因编码序列进行了针对性特殊优化设计，从而获得了一种特别适合在哺乳动物(如人)细胞(尤其是感光细胞)中高效表达RPE65蛋白的核苷酸序列，并构建了一种表达正常人源RPE65蛋白的重组AAV病毒，并在RPE65敲除小鼠模型中证明其有效性。相对于未优化的编码序列，经过特殊优化后的RPE65编码序列(SEQ ID NO.:1)的表达量显著提高，非常适合在哺乳动物(尤其是人)细胞内表达，能有效治疗Leber先天性黑蒙症等眼部疾病。

Description

治疗Leber先天性黑蒙症的载体及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及治疗Leber先天性黑蒙症的载体及其应用。

背景技术

Leber先天性黑蒙症(Leber’s congenital amaurosis,LCA)，属于最严重的遗传性视网膜病变，可导致婴儿在出生后一个月内完全丧失视力。LCA占遗传性视网膜病变的5％以上，是导致儿童先天性盲的主要疾病(占10％-20％)。多呈常染色体隐性遗传，早期眼底检查可无异常或有轻微色素沉着,伴有搜索样眼球震颤和瞳孔对光反射迟钝，呈现黑蒙性瞳孔或者熄灭性视网膜电图波形。晚期出现椒盐样色素和骨细胞样色素沉积，视网膜电图检测到无波形或波幅严重降低等症状临床上以眼球震颤、固视障碍、畏光、指压眼球为特征。还可伴有神经性耳聋、肥胖、糖尿病、尿崩症、性腺功能低下、高尿酸血症及高甘油三酯血症等全身并发症。

既往，临床上没有特异治疗Leber先天性黑蒙症的药物，但是由于先天性黑蒙症有一系列严重并发症，如糖尿病、尿崩症、性腺功能低下、高尿酸血症及高甘油三酯血症等。因此，需要用相关的药物来缓解症状，维持患者正常机能。随着基因检测技术的发展，逐渐了解这类隐性视网膜遗传病是由基因突变造成的相应功能性蛋白缺失导致的，而基因治疗已经在临床前和临床试验中证实能治疗Leber先天性黑蒙症，提高受试动物或患者视力。

截止目前，研究已发现18种与LCA相关的致病基因，其中,RPE65，CEP290,GUCY2D,CRB1,IMPDH1,AIPL1和RPGRIP1是最常见的致病基因,占所有LCA病例的50％-60％。其中以RPE65基因突变引起LCA2的研究最为深入和成熟。RPE65基因的主要功能是结合全反式视黄酯,使之转化为11-顺-视黄醛，进而合成为视紫红质来维持视网膜色素再循环的过程。因此，当RPE65基因失去功能,视网膜的光感受细胞就会因缺乏视紫红质而不能对光发生反应，导致视力丧失。

因此，本领域急需开发能有效治疗Leber先天性黑蒙症的基因治疗方法和治疗药物。

发明内容

本发明的目的是提供一种能有效治疗Leber先天性黑蒙症的基因治疗药物。

本发明的另一目的是提供一种表达正常人源RPE65蛋白的优化编码序列和重组AAV病毒。

本发明的第一方面，提供了一种核苷酸序列，所述核苷酸序列编码RPE65蛋白，且所述核苷酸序列选自下组：

(a)所述核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示；和

(b)所述核苷酸序列与SEQ ID NO.:1所示的核苷酸序列有≥95％相同性，优选地≥98％，更优选地≥99％；

(c)与(a)或(b)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述核苷酸序列包括DNA序列、cDNA序列、或mRNA序列。

在另一优选例中，所述核苷酸序列包括单链序列和双链序列。

在另一优选例中，所述核苷酸序列包括与SEQ ID NO.:1完全互补的核苷酸序列。

本发明的第二方面，提供了一种表达盒，所述表达盒含有本发明第一方面所述的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述表达盒从5’-3’端具有式I结构：

Z1-Z2-Z3-Z4-Z5 (I)

式中，各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；

Z1为无或增强子；

Z2为启动子；

Z3为无或内含子；

Z4为本发明第一方面所述的核苷酸序列；和

Z5为无或polyA。

在另一优选例中，所述启动子为泛素启动子，较佳地为人源泛素启动子。

在另一优选例中，所述内含子为ubC内含子序列。

在另一优选例中，所述polyA为人生长荷尔蒙3’端非编码序列(hGH polyA)。

在另一优选例中，各个核苷酸连接序列的长度为0-30nt，较佳地1-15nt。

本发明的第三方面，提供了一种载体，所述载体含有如本发明第一方面所述的核苷酸序列或本发明第二方面所述的表达盒。

在另一优选例中，所述载体包含一个或多个启动子，所述启动子可操作地与所述核酸序列、增强子、内含子、转录终止信号、多腺苷酸化序列、复制起点、选择性标记、核酸限制性位点、和/或同源重组位点连接。

在另一优选例中，所述的载体包括质粒、病毒载体。

在另一优选例中，所述的载体包括DNA病毒、逆转录病毒载体。

在另一优选例中，所述的载体选自下组：慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体(AAV)、或其组合。较佳地，所述载体为AAV载体。

在另一优选例中，所述载体为含有或插入有本发明第一方面所述的核苷酸序列的AAV载体。

在另一优选例中，所述载体用于表达人RPE65蛋白。

本发明的第四方面，提供了一种腺相关病毒载体，所述腺相关病毒载体含有如本发明第一方面所述的核苷酸序列或本发明第二方面所述的表达盒。

在另一优选例中，所述腺相关病毒的血清型选自：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、rh10、或其组合。

在另一优选例中，所述腺相关病毒载体用于治疗眼部疾病和/或恢复受试者视力或感光能力。

在另一优选例中，所述腺相关病毒载体的序列如SEQ ID NO.:4所示。

其中，第1-141位为左ITR序列；

第145-1240位为人泛素启动子；

第1241-1872位为内含子；

第1883-3484位为优化的人RPE65编码序列；

第3491-4014位为人生长荷尔蒙3’端非编码序列(hGH polyA)；

第4015-4155位为右ITR序列。

本发明的第五方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明第三方面所述的载体或本发明第四方面所述的腺相关病毒载体，或其染色体中整合有外源的本发明第一方面所述的核苷酸序列或本发明第二方面所述的表达盒。

在另一优选例中，所述宿主细胞为哺乳动物细胞，所述哺乳动物包括人和非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述宿主细胞选自下组：HEK细胞、感光细胞(包括视锥细胞和/或视杆细胞)、其他视觉细胞(如双极细胞、水平细胞)、(视)神经细胞、或其组合。

在另一优选例中，所述宿主细胞选自下组：视杆细胞、视锥细胞、给光双极细胞、撤光双极细胞、水平细胞、神经节细胞、无长突细胞、或其组合。

在另一优选例中，所述宿主细胞为感光细胞(即光感受器细胞)。

本发明的第六方面，提供了如本发明第三方面所述的载体或本发明第四方面所述的腺相关病毒载体的用途，用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于治疗眼部疾病和/或恢复受试者视力或感光能力。

在另一优选例中，所述制剂或组合物用于扩大或恢复视网膜的感光细胞功能、恢复受试者视力(或感光能力)、和/或治疗视网膜疾病。

在另一优选例中，所述视网膜疾病选自下组：视网膜营养不良(如视杆营养不良、视杆视锥营养不良、视锥视杆营养不良、视锥营养不良或黄斑营养不良)、视网膜或黄斑退化、视网膜色素变性、Leber先天性黑蒙症、由感光细胞能力的丧失导致的其他疾病、或其组合。

在另一优选例中，所述制剂或组合物用于治疗Leber先天性黑蒙症，较佳地治疗RPE65基因突变导致的Leber先天性黑蒙症。

本发明的第七方面，提供了一种药物制剂，所述的制剂含有(a)本发明第三方面所述的载体或本发明第四方面所述的腺相关病毒载体，以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。

在另一优选例中，所述药物制剂的剂型选自下组：冻干制剂、液体制剂、或其组合。

在另一优选例中，所述药物制剂中载体的含量为1×10⁹-1×10¹⁶个病毒/毫升，较佳地1×10¹²-1×10¹³个病毒/毫升。

在另一优选例中，所述药物制剂用于治疗眼部疾病和/或恢复受试者视力或感光能力。

在另一优选例中，所述眼部疾病由RPE65基因突变引起。

在另一优选例中，所述药物制剂用于扩大或恢复视网膜的感光细胞功能、恢复受试者视力(或感光能力)、和/或治疗视网膜疾病。

在另一优选例中，所述药物制剂用于治疗Leber先天性黑蒙症，较佳地治疗RPE65基因突变导致的Leber先天性黑蒙症。

本发明的第八方面，提供了一种治疗方法，所述方法包括将本发明第三方面所述的载体或本发明第四方面所述的腺相关病毒载体施用于需要的对象。

在另一优选例中，将所述腺相关病毒载体引入到需要的对象的眼睛内。

在另一优选例中，所述需要的对象包括人和非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述治疗方法为治疗眼部疾病的方法。

在另一优选例中，所述眼部疾病由RPE65基因突变引起。

在另一优选例中，所述眼部疾病为视网膜疾病，较佳地Leber先天性黑蒙症。

在另一优选例中，所述治疗方法用于扩大或恢复视网膜的感光细胞功能、恢复受试者视力或感光能力。

本发明的第九方面，提供了一种RPE65蛋白的制备方法，包括培养本发明第五方面所述的宿主细胞，从而得到RPE65蛋白。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了rAAV/ubC.opti-hRPE65载体的结构示意图。

图2显示了序列优化的rAAV/ubC.opti-hRPE65表达效率比rAAV/CBA.hRPE65高。图A为Western Blot蛋白电泳结果，泳道1:对照HEK-293细胞；泳道2:rAAV/CBA.hRPE65转染HEK-293细胞；泳道3:rAAV/ubC.opti-hRPE65转染HEK-293细胞。图B为rAAV/ubC.opti-hRPE65与rAAV/CBA.hRPE65的相对表达量，图B为对图A中信号强度的量化，把泳道1信号设定为1，泳道2和泳道3以1为参考的比对值。

图3显示了小鼠视网膜电图比对结果。图A从上往下分别为正常鼠、rAAV/ubC.opti-hRPE65注射的RPE65 KO鼠、原始rAAV/CBA.hRPE65注射的RPE65 KO鼠及未注射的RPE65 KO鼠暗适应下视网膜电图对比。图B为正常鼠、rAAV/ubC.opti-hRPE65注射的RPE65KO鼠、rAAV/CBA.hRPE65注射的RPE65 KO鼠及未注射的RPE65 KO鼠暗适应下视网膜电图a波峰值对比，改良的rAAV/ubC.opti-hRPE65注射的RPE65 KO鼠视网膜电图a波波幅高于rAAV/CBA.hRPE65注射的RPE65 KO鼠。其中rAAV/ubC.opti-hRPE65与正常对照相比没有显著性差异，而rAAV/CBA.hRPE65的治疗效果明显不及rAAV/ubC.opti-hRPE65，并存在显著性差异(p<0.01)。

图4显示了小鼠视网膜荧光染色结果。图示分别为：A为正常小鼠，B为未注射的RPE65 KO小鼠，C为rAAV/CBA.hRPE65注射的RPE65 KO小鼠，D为本发明制备的rAAV/ubC.opti-hRPE65注射的RPE65 KO小鼠的视网膜切片DAPI染色。rAAV/ubC.opti-hRPE65注射的RPE65 KO小鼠(D)网膜厚度大于rAAV/CBA.hRPE65注射的RPE65 KO小鼠(C)。

图5显示了小鼠视网膜荧光染色结果。图A、B和C分别为正常小鼠、rAAV/CBA.hRPE65注射的RPE65 KO小鼠和优化的rAAV/ubC.opti-hRPE65注射的RPE65 KO小鼠的RPE染色(红色)。rAAV/ubC.opti-hRPE65注射的RPE65 KO小鼠(C图)表达效率强于rAAV/CBA.hRPE65注射的RPE65 KO小鼠(B图)。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，对RPE65基因编码序列进行了针对性特殊优化设计，从而获得了一种特别适合在哺乳动物(如人)细胞(尤其是感光细胞)中高效表达RPE65蛋白的核苷酸序列，并构建了一种表达正常人源RPE65蛋白的重组AAV病毒，并在RPE65敲除小鼠模型中证明其有效性。实验结果表明，相对于未优化的编码序列，经过特殊优化后的RPE65编码序列(SEQ ID NO.:1)的表达量显著提高，非常适合在哺乳动物(尤其是人)细胞内表达，能有效治疗Leber先天性黑蒙症等眼部疾病。在此基础上，发明人完成了本发明。

术语

为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。

术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。

序列同一性通过沿着预定的比较窗(其可以是参考核苷酸序列或蛋白的长度的50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％)比较两个对齐的序列，并且确定出现相同的残基的位置的数目来确定。通常地，这表示为百分比。核苷酸序列的序列同一性的测量是本领域技术人员熟知的方法。

如本文使用的，术语“受试者”、“需要的对象”指任何哺乳动物或非哺乳动物。哺乳动物包括但不限于人类、脊椎动物诸如啮齿类、非人类灵长类、牛、马、狗、猫、猪、绵羊、山羊。

如本文所用，术语“光感受器”、“感光细胞”和“光感受细胞”可互换使用，包括视杆细胞和视锥细胞。

RPE65

如本文所用，术语“RPE65蛋白”、“多肽”、“本发明蛋白”、“人RPE65蛋白”具有相同的意义，在本文中可互转使用。

视网膜色素上皮(RPE)位于视网膜最外层，具有吞噬感光细胞脱落盘膜、参与维生素A在视网膜中的代谢、构成血视网膜屏障等重要的生理功能。RPE65基因定位于1p31，编码仅在RPE细胞中特异表达的蛋白RPE65。RPE65基因的主要功能是结合全反式视黄酯,使之转化为11-顺-视黄醛，进而合成为视紫红质来维持视网膜色素再循环的过程。因此，当RPE65基因失去功能，视网膜的光感受细胞就会因缺乏视紫红质而不能对光发生反应，导致视力丧失。

核酸编码序列

本发明的要解决的技术问题是克服现有技术中RPE65表达量不高、治疗效果不佳的技术缺陷。本发明的目的是提供一种RPE65优化基因序列。本发明优化后的RPE65编码序列如SEQ ID NO：1所示，其大小为1602bp。经研究发现，本发明优化的RPE65编码序列(SEQID NO.:1)，RPE65蛋白表达效率更高，有更多的RPE65蛋白在患者视网膜感光细胞发挥生理作用。

本发明所述的编码RPE65蛋白的核酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示。在另一优选例中，所述核苷酸序列与SEQ ID NO.:1所示的核苷酸序列有≥95％相同性，优选地≥98％，更优选地≥99％。在本发明中，所述编码RPE65蛋白的核酸又称作RPE65优化基因、RPE65优化核酸或opti-hRPE65。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。在另一优选例中，所述核苷酸为DNA。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。本发明所述的核苷酸序列编码SEQ ID NO.:3所示的氨基酸序列。

RPE65蛋白的NCBI参考序列号:NP_000320.1，氨基酸序列如SEQ ID NO.:3所示。

核酸序列可以是DNA、RNA、cDNA或PNA。核酸序列可以是基因组的、重组的或合成的。核酸序列可以是分离的或纯化的。核酸序列可以是单链或双链的。优选地，核酸序列将编码如本文描述的RPE65蛋白。核酸序列可以通过克隆衍生，例如使用包括限制性酶切、连接、凝胶电泳的标准的分子克隆技术，例如在Sambrook等Molecular Cloning:Alaboratory manual,Cold Spring Harbour Laboratory Press)中描述的。核酸序列可是分离的，例如使用PCR技术分离的。分离意指从任何杂质和从被自然地发现与其来源中的核酸序列缔合的其他核酸序列和/或蛋白中分离核酸序列。优选地，其还将不含细胞材料、培养基或来自纯化/生产过程的其他化学物质。核酸序列可以是合成的，例如通过直接的化学合成产生。核酸序列可以作为裸露的核酸被提供，或可与蛋白或脂质复合提供。

本发明的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明多肽(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或多肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞。上述多核苷酸、载体或宿主细胞可以是分离的。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

在本发明较佳的实施方式中，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术利用所述宿主细胞表达RPE65蛋白的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列获得表达本发明RPE65蛋白的宿主细胞(如哺乳动物细胞)。一般来说包括步骤：将本发明第一方面所述的多核苷酸或本发明第三方面所述的载体或本发明第四方面所述的腺相关病毒载体转导入宿主细胞内。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明多肽的编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达多肽。

宿主细胞可以是原核细胞，或是低等真核细胞，或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞(包括人和非人哺乳动物)。代表性例子有：CHO、NS0、COS7、或293细胞的动物细胞等。在本发明的一个优选实施方式中，选择293T细胞、感光细胞(包括锥状细胞和/或杆状细胞)、其他视觉细胞(如双节细胞)、神经细胞为宿主细胞。在另一优选例中，所述宿主细胞选自下组：视杆细胞、视锥细胞、给光双极细胞、撤光双极细胞、水平细胞、神经节细胞、无长突细胞、或其组合。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的蛋白质。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

序列优化

在本发明中，提供了优化的、特别适合在哺乳动物细胞中表达的RPE65的编码序列，所述编码序列如SEQ ID NO.:1所示。

如本文所用，所述“优化的RPE65编码序列”、“优化RPE65编码基因”均指一种用于编码RPE65的核苷酸序列，所述的核苷酸序列编码SEQ ID NO.:3所示的氨基酸序列。

在本发明中，所述RPE65的野生DNA编码序列(未优化的DNA编码序列)如SEQ IDNO.:2所示，所述未优化的野生DNA编码序列的表达量很低。

RPE65野生编码序列来自NCBI参考序列:NM_000329.2，具体核酸序列如SEQ IDNO.:2所示。

ATGTCTATCCAGGTTGAGCATCCTGCTGGTGGTTACAAGAAACTGTTTGAAACTGTGGAGGAACTGTCCTCGCCGCTCACAGCTCATGTAACAGGCAGGATCCCCCTCTGGCTCACCGGCAGTCTCCTTCGATGTGGGCCAGGACTCTTTGAAGTTGGATCTGAGCCATTTTACCACCTGTTTGATGGGCAAGCCCTCCTGCACAAGTTTGACTTTAAAGAAGGACATGTCACATACCACAGAAGGTTCATCCGCACTGATGCTTACGTACGGGCAATGACTGAGAAAAGGATCGTCATAACAGAATTTGGCACCTGTGCTTTCCCAGATCCCTGCAAGAATATATTTTCCAGGTTTTTTTCTTACTTTCGAGGAGTAGAGGTTACTGACAATGCCCTTGTTAATGTCTACCCAGTGGGGGAAGATTACTACGCTTGCACAGAGACCAACTTTATTACAAAGATTAATCCAGAGACCTTGGAGACAATTAAGCAGGTTGATCTTTGCAACTATGTCTCTGTCAATGGGGCCACTGCTCACCCCCACATTGAAAATGATGGAACCGTTTACAATATTGGTAATTGCTTTGGAAAAAATTTTTCAATTGCCTACAACATTGTAAAGATCCCACCACTGCAAGCAGACAAGGAAGATCCAATAAGCAAGTCAGAGATCGTTGTACAATTCCCCTGCAGTGACCGATTCAAGCCATCTTACGTTCATAGTTTTGGTCTGACTCCCAACTATATCGTTTTTGTGGAGACACCAGTCAAAATTAACCTGTTCAAGTTCCTTTCTTCATGGAGTCTTTGGGGAGCCAACTACATGGATTGTTTTGAGTCCAATGAAACCATGGGGGTTTGGCTTCATATTGCTGACAAAAAAAGGAAAAAGTACCTCAATAATAAATACAGAACTTCTCCTTTCAACCTCTTCCATCACATCAACACCTATGAAGACAATGGGTTTCTGATTGTGGATCTCTGCTGCTGGAAAGGATTTGAGTTTGTTTATAATTACTTATATTTAGCCAATTTACGTGAGAACTGGGAAGAGGTGAAAAAAAATGCCAGAAAGGCTCCCCAACCTGAAGTTAGGAGATATGTACTTCCTTTGAATATTGACAAGGCTGACACAGGCAAGAATTTAGTCACGCTCCCCAATACAACTGCCACTGCAATTCTGTGCAGTGACGAGACTATCTGGCTGGAGCCTGAAGTTCTCTTTTCAGGGCCTCGTCAAGCATTTGAGTTTCCTCAAATCAATTACCAGAAGTATTGTGGGAAACCTTACACATATGCGTATGGACTTGGCTTGAATCACTTTGTTCCAGATAGGCTCTGTAAGCTGAATGTCAAAACTAAAGAAACTTGGGTTTGGCAAGAGCCTGATTCATACCCATCAGAACCCATCTTTGTTTCTCACCCAGATGCCTTGGAAGAAGATGATGGTGTAGTTCTGAGTGTGGTGGTGAGCCCAGGAGCAGGACAAAAGCCTGCTTATCTCCTGATTCTGAATGCCAAGGACTTAAGTGAAGTTGCCCGGGCTGAAGTGGAGATTAACATCCCTGTCACCTTTCATGGACTGTTCAAAAAATCTTGA(SEQ ID NO.:2)

本发明优化了影响基因表达的序列片段，这些序列片段包括但不限于，密码子使用偏好性，消除不利于表达的二级结构(如发夹结构)，改变GC含量，CpG二核苷酸含量，mRNA的二级结构，隐蔽剪接位点，早期多聚腺苷化位点，内部核糖体进入位点和结合位点，负CpG岛，RNA不稳定区，重复序列(直接重复、反向重复等)和可能影响克隆的限制性位点。通过分析和试验筛选，最终得到如SEQ ID NO.:1所示的特别优化的DNA编码序列。特别优化后的SEQ ID NO.:1所示的编码序列与SEQ ID NO.:2所示的野生编码序列相似度为76％(1214/1602(76％))。

ATGAGCATCCAGGTGGAGCACCCCGCCGGCGGATACAAGAAACTGTTCGAGACCGTGGAGGAGCTGAGCAGCCCCCTGACCGCCCACGTCACCGGAAGGATCCCCCTGTGGCTGACCGGCTCCCTGCTCAGATGCGGCCCCGGACTGTTTGAGGTGGGCTCCGAGCCCTTCTATCACCTGTTTGACGGCCAAGCCCTGCTGCACAAGTTCGACTTCAAGGAAGGTCACGTGACCTATCACCGGCGTTTCATCAGAACCGACGCCTACGTGAGGGCTATGACCGAAAAGCGCATCGTGATCACCGAGTTCGGAACCTGCGCCTTCCCCGACCCCTGCAAGAACATCTTCAGCCGCTTCTTCTCCTACTTCAGAGGCGTGGAGGTGACCGACAACGCCCTGGTGAACGTTTACCCCGTGGGCGAGGACTATTACGCCTGCACTGAAACCAACTTCATCACCAAGATCAACCCCGAGACCCTCGAGACCATCAAACAGGTGGACCTGTGCAACTACGTCTCTGTGAATGGCGCCACCGCTCATCCCCACATCGAGAACGACGGCACCGTCTACAACATCGGCAACTGCTTCGGCAAAAACTTCAGCATCGCCTACAACATCGTCAAAATCCCCCCCCTGCAGGCCGACAAGGAAGACCCCATCAGCAAGAGCGAAATCGTGGTGCAGTTCCCCTGCAGCGACCGGTTCAAGCCCAGCTACGTGCACTCCTTCGGCCTGACCCCCAACTACATCGTCTTCGTGGAAACCCCCGTGAAGATCAACCTGTTCAAGTTCCTGAGCAGCTGGAGCCTGTGGGGAGCTAACTACATGGACTGCTTTGAGAGCAACGAGACAATGGGTGTGTGGCTGCATATTGCTGACAAGAAGAGAAAAAAGTACCTGAACAACAAGTACAGAACCAGCCCCTTCAACCTGTTCCACCACATCAACACCTACGAGGACAACGGCTTCCTGATCGTGGACCTGTGCTGCTGGAAGGGCTTCGAGTTCGTGTACAACTACCTGTACCTGGCCAACCTGAGAGAGAACTGGGAGGAGGTGAAGAAGAACGCCAGAAAGGCCCCCCAGCCCGAGGTGAGAAGATACGTGCTGCCCCTGAACATCGACAAGGCCGACACCGGCAAGAACCTGGTGACCCTGCCCAACACCACCGCCACCGCCATCCTGTGCAGCGACGAGACCATCTGGCTGGAGCCCGAGGTGCTGTTCAGCGGCCCCAGACAGGCCTTCGAGTTCCCCCAGATCAACTACCAGAAGTACTGCGGCAAGCCCTACACCTACGCCTACGGCCTGGGCCTGAACCACTTCGTGCCCGACAGACTGTGCAAGCTGAACGTGAAGACCAAGGAGACCTGGGTGTGGCAGGAGCCCGACAGCTACCCCAGCGAGCCCATCTTCGTGAGCCACCCCGACGCCCTGGAGGAGGACGACGGCGTGGTGCTGAGCGTGGTGGTGAGCCCCGGCGCCGGCCAGAAGCCCGCCTACCTGCTGATCCTGAACGCCAAGGACCTGAGCGAGGTGGCCAGAGCCGAGGTGGAGATCAACATCCCCGTGACCTTCCACGGCCTGTTCAAGAAGAGCTGA(SEQ ID NO.:1)

腺相关病毒

随着人类基因图谱成功构建、分子生物学技术迅猛发展，病毒载体成功应用，使得LCA的基因治疗方面已经取得了一定进展。很多实验研究为LCA的基因疗法应用于临床做了很多铺垫和前期工作。因腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)较其他病毒载体小，无致病性，可转染正在分裂和未分裂的细胞等特性，基于AAV载体的针对眼部特别是遗传性视网膜退行性病变的基因治疗方法受到了广泛的关注。

因腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)较其他病毒载体小，无致病性，可转染正在分裂和未分裂的细胞等特性，基于AAV载体的针对眼部特别是遗传性视网膜退行性病变的基因治疗方法受到了广泛的关注。

腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV),也称腺伴随病毒,属于微小病毒科依赖病毒属,是目前发现的一类结构最简单的单链DNA缺陷型病毒，需要辅助病毒(通常为腺病毒)参与复制。它编码两个末端的反向重复序列(ITR)中的cap和rep基因。ITRs对于病毒的复制和包装具有决定性作用。cap基因编码病毒衣壳蛋白，rep基因参与病毒的复制和整合。AAV能感染多种细胞。

重组腺相关病毒载体(rAAV)源于非致病的野生型腺相关病毒，由于其安全性好、宿主细胞范围广(分裂和非分裂细胞)、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长等特点，被视为最有前途的基因转移载体之一，在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。经过10余年的研究，重组腺相关病毒的生物学特性己被深入了解，尤其是其在各种细胞、组织和体内实验中的应用效果方面已经积累了许多资料。在医学研究中，rAAV被用于多种疾病的基因治疗的研究(包括体内、体外实验)；同时作为一种有特点的基因转移载体，还广泛用于基因功能研究、构建疾病模型、制备基因敲除鼠等方面。

在本发明一个优选的实施例中，载体为重组AAV载体。AAV是相对较小的DNA病毒，其可以稳定和位点特异性方式整合到它们所感染的细胞的基因组中。它们能够感染一大系列的细胞而不对细胞生长、形态或分化产生任何影响，并且它们似乎并不涉及人体病理学。AAV基因组己被克隆、测序及表征。AAV末端包含约145个碱基的反向末端重复序列(ITR)区域，其作为病毒的复制起点。该基因组的其余被分成两个带有衣壳化功能的重要区域：包含涉及病毒复制和病毒基因表达的rep基因的基因组左边部分；以及包含编码病毒衣壳蛋白的cap基因的基因组右边部分。

AAV载体可采用本领域的标准方法制备。任何血清型的腺相关病毒均是合适的。用于纯化载体的方法可见于例如美国专利No.6566118、6989264和6995006，它们的公开内容整体以引用方式并入本文。杂合载体的制备在例如PCT申请No.PCT/US2005/027091中有所描述，该申请的公开内容整体以引用方式并入本文。用于体外和体内转运基因的衍生自AAV的载体的使用己有描述(参见例如国际专利申请公布No.WO91/18088和WO93/09239；美国专利No.4,797,368、6,596,535和5,139,941，以及欧洲专利No.0488528，它们均整体以引用方式并入本文)。这些专利公布描述了其中rep和/或cap基因缺失并被所关注的基因替换的各种来源于AAV的构建体，以及这些构建体在体外(进入培养的细胞中)或体内(直接进入生物体)转运所关注的基因的用途。复制缺陷重组AAV可通过将以下质粒共转染进被人类辅助病毒(例如腺病毒)感染的细胞系而制备：所含的所关注核酸序列的侧翼为两个AAV反向末端重复序列(ITR)区域的质粒，和携带AAV衣壳化基因(rep和cap基因)的质粒。然后通过标准技术纯化所产生的AAV重组体。

在一些实施方案中，重组载体被衣壳化到病毒粒子(例如包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16的AAV病毒粒子)中。因此，本公开包括含有本文所述的任何载体的重组病毒粒子(因其包含重组多核苷酸而为重组的)。产生这样的粒子的方法是本领域己知的，并在美国专利No.6,596,535中有所描述。

表达载体和宿主细胞

本发明还提供了一种用于RPE65蛋白的表达载体，它含有本发明的优化RPE65编码序列。

通过提供的序列信息，熟练的技术人员可以使用可用的克隆技术以产生适于转导进入细胞的核酸序列或载体。

优选地，编码RPE65蛋白的核酸序列作为载体，优选地表达载体被提供。优选地，其可作为优选地适用于在视网膜靶细胞中转导和表达的基因治疗载体被提供。载体可以是病毒的或非病毒的(例如质粒)。病毒载体包括源自以下的那些病毒载体:腺病毒、包括突变的形式的腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒、慢病毒、疱疹病毒、牛痘病毒、MMLV、GaLV、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、HIV、痘病毒和SV40。优选地，病毒载体是复制缺陷的(replicationdefective)，尽管设想其可以是复制缺乏的(replication deficient)、能够复制或条件性复制的。病毒载体通常可以保持染色体外状态而不整合进入靶视网膜细胞的基因组。用于向视网膜靶细胞引入编码RPE65蛋白的核酸序列的优选的病毒载体是AAV载体，例如自身互补的腺相关病毒(scAAV)。使用特定的AAV血清型(AAV血清型2到AAV血清型12)或这些血清型中的任何一个的修饰的版本(包括AAV 4YF和AAV 7m8载体)可以实现选择性靶向。

病毒载体可被修饰以缺失任何非必需的序列。例如，AAV中，病毒可被修饰以缺失全部或部分的IX基因、Ela和/或Elb基因。对于野生型AAV，没有辅助病毒诸如腺病毒的存在，复制是非常低效率的。对于重组的腺相关病毒，优选地，复制基因和衣壳基因以反式被提供(在pRep/Cap质粒中)，并且仅AAV基因组的2ITR被保留并且包装进入病毒体，同时需要的腺病毒基因被被腺病毒或另一个质粒提供。也可对慢病毒载体做出类似的修饰。

病毒载体具有进入细胞的能力。然而，非病毒载体诸如质粒可与剂复合以有利于病毒载体被靶细胞的摄取。此类剂包括聚阳离子剂。可选地，递送系统诸如基于脂质体的递送系统可被使用。用于在本发明中使用的载体优选地适于在体内或体外使用，并且优选地适于在人类中使用。

载体将优选地包含一个或多个调节序列以指导核酸序列在视网膜靶细胞中的表达。调节序列可以包括与核酸序列可操作地连接的启动子、内含子、增强子、转录终止信号、多腺苷酸化序列、复制起点、核酸限制性位点、和同源重组位点。载体还可包括选择性标记，例如来确定载体在生长系统(例如细菌细胞)中或在视网膜靶细胞中的表达。

“可操作地连接”意指，核酸序列在功能上与其可操作地连接的序列相关，以使得它们以使得它们影响彼此的表达或功能的方式连接。例如，与启动子可操作地连接的核酸序列将具有被启动子影响的表达模式。

启动子介导与其连接的核酸序列的表达。启动子可以是组成型的或可以是诱导型的。启动子可以指导在内视网膜细胞中遍在的表达，或神经元特异的表达。在后一种情况中，启动子可以指导细胞类型特异的表达，例如对给视神经节细胞。合适的启动子将是本领域技术人员己知的。例如，合适的启动子可以选自由以下组成的组:L7、thy-1、恢复蛋白、钙结合蛋白、人类CMV、GAD-67、鸡β肌动蛋白、hSyn、Grm6、Grm6增强子SV40融合蛋白。使用细胞特异的启动子可以实现靶向，例如Grm6-SV40用于选择性靶向给视神经细胞。Grm6启动子是Grm6基因的200碱基对增强子序列和SV40真核启动予的融合体，Grm6基因编码给视神经细胞特异的代谢型谷氨酸受体mGluR6。Grm6基因的优选的来源是小鼠和人类。使用泛-神经元的启动子可以实现遍在的表达，其实例在本领域是己知的并且可得的。一个此类实例是CAG。CAG启动子是CMV早期增强子和鸡β肌动蛋白启动子的融合体。

合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列为能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本发明不应被限于组成型启动子的应用。诱导型启动子也被考虑为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够当这样的表达是期望的时，打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，或当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。本发明的一个优选的启动子为人源泛素(ubiquitin)启动子。

许多表达载体可应用RPE65蛋白在哺乳动物细胞(较佳地为人，更佳地为人视神经细胞或感光细胞)表达。本发明优选用腺相关病毒作为表达载体。

本发明还提供一种RPE65优化编码序列的重组应用腺相关病毒载体的构建方法，该方法能快速，简便地构建携带RPE65优化编码序列的重组腺相关病毒载体，并包装获得复杂缺陷腺相关病毒载体。

在另一优选例中，本发明所述的携带RPE65优化编码序列的腺相关病毒载体的序列如SEQ ID NO.:4所示。其中，第1-141位为左ITR序列(斜体部分)；第145-1240位为人元泛素(ubiquitin)启动子(下划线部分)；第1241-1872位为内含子(粗体部分)；第1883-3484位为优化的人RPE65编码序列(加粗且下划线部分)；第3491-4014位为hGH polyA(双下划线部分)；第4015-4155位为右ITR序列。

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本发明还提供了一种宿主细胞，用于表达RPE65蛋白。优选地，所述宿主细胞为哺乳动物细胞(较佳地为人，更佳地为人视神经细胞或感光细胞)，提高RPE65蛋白的表达量。

制剂和组合物

本发明提供一种制剂或组合物，所述制剂或组合物含有(a)本发明第三方面所述的载体或本发明第四方面所述的腺相关病毒载体，以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。

在另一优选例中，所述药物制剂用于治疗眼部疾病，所述眼部疾病是由RPE65基因突变导致的眼部疾病。

本发明所述药物组合物中的“活性成分”是指本发明所述的载体(vector)，例如病毒载体(包括腺相关病毒载体)。本发明所述的“活性成分”、制剂和/或组合物可用于治疗眼部疾病。“安全有效量”指的是：活性成分的量足以明显改善病情或症状，而不至于产生严重的副作用。“药学上可接受的载体或赋形剂(excipient)”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的活性成分以及它们之间相互掺和，而不明显降低活性成分的药效。

组合物可以是液体或固体，例如粉末、凝胶或糊剂。优选地，组合物是液体，优选地可注射液体。合适的赋形剂将是本领域技术人员己知的。

在本发明中，所述载体可通过视网膜下或玻璃体内施用向眼睛施用。在任一种施用模式中，优选地，载体作为可注射液体被提供。优选地，可注射液体作为胶囊或注射器被提供。

药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。

组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。

本发明提供的编码RPE65的核酸或融合核酸，可以体外或体内生产RPE65蛋白，含所述RPE65优化编码序列的制剂可应用于制备治疗眼部疾病的药物。

经优化的编码人RPE65蛋白的核酸表达量更高，从而翻译出更多的RPE65蛋白，比现有技术表达更多的RPE65蛋白，能较好地治疗Leber先天性黑蒙症。

治疗方法

本发明提供了向细胞提供感光细胞功能的方法，所述方法包括将包含编码RPE65的优化序列的载体引入到眼睛内。所述方法可包括向眼睛的内视网膜细胞视网膜下或玻璃体内施用核酸载体。

本发明提供了用于通过向细胞提供感光细胞功能在治疗视网膜退化的方法中使用的核酸载体，所述核酸载体包含编码RPE65的优化序列。本发明组合物可以单独给药，或者与其他治疗药物联合给药(如配制在同一药物组合物中)。

本发明还提供了扩大视网膜中的感光细胞功能的方法，特别是在视杆和/或视锥细胞退化之后扩大视网膜中的感光细胞功能的方法，所述方法包括将核酸载体引入到眼睛的玻璃体腔内，所述核酸载体包含编码RPE65的优化序列。所述方法可包括向眼睛的内视网膜细胞，视网膜下或玻璃体内施用核酸载体。本发明提供了用于通过扩大视网膜中的感光细胞功能在治疗视网膜退化中使用的核酸载体，所述核酸载体包含编码RPE65的优化序列。

本发明还提供了对受试者恢复视力的方法，所述方法包括将包含编码RPE65的优化序列的载体引入到眼睛内。方法可包括视网膜下或玻璃体内施用核酸载体到眼睛的内视网膜细胞。本发明提供了用于在对受试者恢复视力中使用的核酸载体，所述核酸载体包含编码RPE65的优化序列。

本发明还提供了治疗受试者中的视网膜疾病的方法，所述方法包括将包含编码RPE65的优化序列的载体引入到眼睛内。方法可包括视网膜下或玻璃体内施用核酸载体到眼睛的内视网膜细胞。疾病可以是视网膜营养不良，包括视杆营养不良、视杆视锥营养不良、视锥视杆营养不良、视锥营养不良和黄斑营养不良；其他形式的视网膜或黄斑退化、缺血性状况、视网膜色素变性、Leber先天性黑蒙症、葡萄膜炎和由感光细胞能力的丧失导致的任何其他疾病。

如本文所用，向细胞提供感光细胞功能意指，之前不具有感光细胞能力或其感光细胞能力已经完全地或部分地退化的细胞，在其中表达编码RPE65的外来核酸序列后，变成感光的。此类细胞在本文中可被称作转化的细胞，因为其在其中包含非天然的核酸。优选地，转化的视网膜细胞展现天然的感光细胞的一些或全部的感光细胞能力。优选地，转化的细胞展现天然的视网膜感光细胞的至少相同或大体上相同的感光能力。优选地，转化的细胞展现比患病的或正在退化的天然的视网膜感光细胞高的感光能力。因此，转化的细胞相比于来自同一来源、保持在同一条件下、未经处理的退化的或患病的细胞，将优选地具有增加的感光细胞。转化的细胞通过其中的外源核酸的存在可与天然的细胞区分。

如本文所用，扩大感光细胞功能意指通过增加感光细胞诸如视杆或视锥细胞中的功能和/或通过向细胞提供感光细胞功能，增加视网膜的感光细胞功能。因此，视网膜相比于未用如本文描述的方法处理的视网膜，将具有增加的接收光信号并且传送此类信号的能力，增加可以是任何量。

如本文所用，恢复受试者中的视力意指，受试者相比于治疗之前，例如使用如本文描述的视力测试，显示改进的视力。恢复包括任何程度的改进，包括视力的完全恢复到完美的或接近完美的视力。

如本文所用，治疗疾病意指施用如本文描述的核酸或载体以改善或减轻疾病的一种或多种症状，所述疾病选自由以下组成的组:视网膜营养不良，包括视杆营养不良、视杆视锥营养不良、视锥视杆营养不良、视锥营养不良和黄斑营养不良；另一种形式的视网膜或黄斑退化、视网膜色素变性、缺血性状况、Leber先天性黑蒙症、葡萄膜炎和由感光细胞能力的丧失导致的任何其他疾病。改善或减轻可导致外周或中央视力、和/或白天或夜间视力的改善。

本发明的方法包括将编码RPE65蛋白的核酸序列引入到眼睛的玻璃体腔内。优选地，方法包括使细胞与包含编码RPE65蛋白的核酸序列的载体(较佳地为病毒，更佳地为腺相关病毒)接触。优选地，细胞是视网膜细胞，优选地视锥细胞、视杆细胞、给光双极细胞、撤光双极细胞、水平细胞、神经节细胞和/或无长突细胞。

当核酸序列和一种或多种酶以多个(两个或多个)剂量被提供时，这些剂量可分隔合适的时间间隔，例如30秒到若干小时或1天或多天。

每个剂量可包含有效量的核酸序列或病毒载体。核酸序列或病毒载体的有效剂量可以在每治疗方案1×10⁹-1×10¹⁶病毒的范围。

本发明是基于靶向编码RPE65的优化的核酸序列到视网膜细胞，以补偿视网膜中感光细胞的退化。核酸序列被靶向至的细胞是视网膜的细胞，其是活的并且能够表达外来核酸序列。视网膜细胞是视网膜的细胞，其是神经或神经元细胞并且能够变兴奋并传送电信号。优选地，靶视网膜细胞将能够产生电信号并且起始信号级联，导致信号向视神经的传送。优选地，靶视网膜细胞是内视网膜的细胞。靶细胞可以是视杆或视锥细胞，和/或可以是非感光细胞(即呈其天然形式的对光不响应的视网膜细胞)。靶视网膜细胞可以包括一种或多种细胞类型，所述细胞类型选自由以下组成的组：视杆细胞、视锥细胞、给光双极细胞、撤光双极细胞、水平细胞、神经节细胞、米勒细胞和/或无长突细胞。

因此，当靶视网膜细胞是靶向视网膜的给光双极细胞、撤光双极细胞、水平细胞、神经节细胞和/或无长突细胞时，编码RPE65的核酸的表达可以被称作异位表达。因此，本发明在其范围内包括在非感光细胞中异位表达编码RPE65的核酸序列的方法。此类异位表达通过其中的异源RPE65蛋白的表达，具有向细胞提供感光细胞功能的作用。这用于增加观察到退化的视网膜的感光能力。

水平细胞是内视网膜细胞，参与信号加工和反馈到感光细胞；双极细胞是内视网膜细胞并且在视杆/视锥细胞和无长突和/或神经节细胞间通信；无长突细胞发现于内视网膜并且允许在感光细胞途径和神经节细胞间的通信；神经节细胞是最内部的视网膜细胞，其将信号从感光细胞传递到视神经。

本文对细胞的提及包括细胞的后代。优选地，根据本发明的对细胞的修饰还发生在转化的宿主细胞以后的代中。后代细胞可以不与最初的靶向细胞一致，但优选地将也展现非天然的RPE65的表达。

与现有技术相比，本发明主要具有以下优点：

1.本发明对RPE65基因序列进行了针对性的特殊优化，基因序列不同于现有技术。与RPE65蛋白的未优化的DNA编码序列SEQ ID NO.2相比，优化后的序列(SEQ ID NO.:1)的RPE65蛋白表达量和含有该优化序列的细胞的感光能力显著提高，具有更强的视网膜电图a波峰值。

2.本发明优化后的RPE65蛋白编码序列非常适合在哺乳动物体内表达。在本发明中，表达的RPE65蛋白既保持了天然RPE65蛋白的活性，且RPE65蛋白表达量高，细胞感光能力强，能够非常有效地治疗由RPE65突变导致的眼部疾病，并且安全性好。

3.本发明表达盒和腺相关病毒载体含有ubC启动子，所述ubC启动子是全人源序列，更安全。

下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1序列优化

在本实施例中，基于RPE65蛋白的氨基酸序列(SEQ ID No.:3)和天然的编码序列(SEQ ID No.:2)，本发明人对编码序列进行了优化。具体地，本发明人优化了影响基因表达的序列片段，这些序列片段包括但不限于：密码子使用偏好性，消除不利于表达的二级结构(如发夹结构)，改变GC含量，CpG二核苷酸含量，mRNA的二级结构，隐蔽剪接位点，早期多聚腺苷化位点，内部核糖体进入位点和结合位点，负CpG岛，RNA不稳定区，重复序列(直接重复、反向重复等)和可能影响克隆的限制性位点。通过分析和试验筛选，最终得到如SEQ IDNO.:1所示的特别优化的DNA编码序列。

构建携带有优化的RPE65编码序列的重组腺相关病毒载体rAAV/ubC.opti-hRPE65，结构如图1所示，序列如SEQ ID NO.:4所示。

对照载体为专利CN107287238A中AAV2-CBA-AT2R Intron 1-hRPE65载体(本发明中简称为rAAV/CBA.hRPE65载体)。

实施例2

1.实验分组：

实验组为出生2周的RPE65 KO小鼠接受rAAV/ubC.opti-hRPE65注射，对照组为同龄RPE65 KO小鼠接受rAAV/CBA.hRPE65注射。饲养环境为清洁级，予以国家标准饲料、过滤无菌水饲养，温度、湿度恒定，光照接近自然光，强度18lux，12h/12h昼/夜循环交替光照。

2.视网膜下腔注射：

小鼠经充分散瞳后全身麻醉，在眼科专用手术显微镜直视下，在角巩膜缘内侧瞳孔范围内用301/2gauge的一次性尖针头穿刺角膜，避免伤及虹膜和晶状体，然后用带33gauge平针头的微量进样器沿穿刺口进入，针头绕过晶体后到达玻璃体，然后逐渐进针至神经视网膜层和视网膜色素上皮(RPE)层之间的潜在视网膜腔隙并缓慢推注，注射量为1ul。注射载体悬浊液中添加0.1％荧光素钠染料(安全浓度)，方便观察注射是否成功及网脱范围。注射过程中，眼表滴2.5％羟丙基甲基纤维素以便于随时观察眼底情况。手术显微镜下如清楚看到眼底局部视网膜呈圆形隆起且网膜隆起下方可见绿色，证明注射成功。一定时间后小泡消失，视网膜局部隆起变平。术中如不能看到视网膜隆起及其下方的绿色或看到视网膜有大出血等并发症，则另选小鼠重新注射。术毕涂1％阿托品眼膏和四环素可的松眼膏，以后每隔1天重复一次，共三次，以减少炎症反应、防止感染。注射后18个月处死动物取眼球进行病理检测。每只小鼠一侧眼注射1μl滴度为1×10¹³的rAAV/ubC.opti-hRPE65(治疗眼)或者rAAV/CBA.hRPE65(治疗眼)，另一侧眼则不注射(未治疗眼或未注射眼)。

3.Western Blot蛋白表达检测

用rAAV/ubC.opti-hRPE65和rAAV/CBA.hRPE65分别感染HEK-293细胞，未转染的HEK-293细胞作为对照。感染2天后，分别提取蛋白，进行Western Blot检测蛋白表达，并检测RPE65蛋白的相对表达量。

用标准Western Blot实验方法对结果进行检测，蛋白样品用蛋白提取试剂盒(天根)处理，人源RPE65一抗(1:1000稀释)

结果如图2所示，rAAV/ubC.opti-hRPE65表达效率明显高于rAAV/CBA.hRPE65，RPE65蛋白表达量约为rAAV/CBA.hRPE65的2.8倍。

4.视觉电生理的检测：

采用Reti.port系统(德国Roland公司)，刺激器为Ganzfeld Q450SC UV全视野球形刺激器。记录电极为金箔环状角膜电极，直径3rain；参考电极和接地电极均为不锈钢针状电极，各电极阻抗均小于5Q，干扰波幅小于20pV。双眼同时进行视网膜电图(Full.fieldelectroretinograms，F-ERGs)记录，记录时间保持一致性，减小因昼夜节律造成的差异，均选在每天的14：00～17：00之问。F.ERGs记录前将小鼠暗适应过夜，实验时将10％水合氯醛作为麻药注射入小鼠腹腔进行麻醉，同时用复方托吡卡胺滴眼液散瞳。待小鼠全身肌肉松弛，用沾有生理盐水的棉签轻擦眼周，使眼球突出后，置于37℃恒温水浴台上。暗红光下安插电极，记录电极分别置于左右眼角膜，局部滴一滴1％羧甲基纤维素钠滴眼液保持角膜滋润，增加导电性：参考电极刺入前额正中皮下，接地电极置于尾部。再次暗适应5min，按顺序记录暗适应ERG(Scotopic electroretinogram，Scot-ERG)和明适应ERG(Photopicelectroretinogram，Phot.ERG)。记录Scot.ERG时，光强为.2.0log cd·s/m²；记录Phot.ERG时，首先明适应10min，刺激光强度为1.08log cd·s/m²。

RPE65 KO小鼠在生后14天接受视网膜下腔注射rAAV/ubC.opti-hRPE65载体或者rAAV/CBA.hRPE65载体，对照组为未注射的RPE65 KO小鼠。注射3周后行ERG检查。

结果如图3所示，rAAV/ubC.opti-hRPE65注射的RPE65 KO鼠视网膜电图a波波幅高于rAAV/CBA.hRPE65注射的RPE65 KO鼠。其中rAAV/ubC.opti-hRPE65与正常对照相比没有显著性差异，而rAAV/CBA.hRPE65的治疗效果明显不及rAAV/ubC.opti-hRPE65，并存在显著性差异(p<0.01)。

5.免疫组化检测：

(1)眼球冰冻切片制备：颈椎脱臼法处死小鼠，取出眼球前用大头针在小鼠眼球角巩缘上方顶点12：00处留烙印作标记。用弯镊快速取出眼球，立即放入0.01mol/L PBS中；将眼球即刻浸泡在新鲜配制4％多聚甲醛溶液中，并用5ml一次性注射器上的16.19号粗针头在角膜缘穿刺，4℃过夜；分别使用含梯度为10％、20％、30％蔗糖的PBS溶液脱水；剪去角膜，分离出晶状体，冷冻包埋剂(Optimal cutting temperaturecompound，OCT)进行组织包埋2h，用液氮速冻；冰冻切片机制备12¨m的眼球冰冻切片置于粘附载玻片上，储存于.80℃冰箱中。

(2)免疫荧光染色：将冰冻切片从80℃冰箱取出，晾30min后放入0.01mol/L PBS中漂洗，快洗1次，5min×2次，10min×2次；0.3％TritionX.100中室温浸泡30min；使用5％牛血清蛋白封闭，室温下浸泡2h；吸去血清，暗室中用移液枪加兔抗人RPE65一抗(1：500)，每个标本30u1，4℃孵育过夜；O.01mol/LPBS中快洗1次，5min×2次，10min×2次；暗室中滴加山羊抗兔IgG.Cy3二抗稀释液(1：2000)、FITC(1：100)，每个标本30ul，湿盒内孵育1h；0.01mol/L PBS中快速漂洗5次；最后滴加DAPI稀释液(1：500)，每个标本30ul，孵育2min，0.01mol/L PBS中快速漂洗5次，用移液枪加少许抗荧光淬灭液，盖玻片封片，盖玻片四角滴加指甲油固定。

(1)DAPI染色检测：RPE65 KO小鼠在生后14天一只眼接受视网膜下腔注射rAAV/ubC.opti-hRPE65载体或者rAAV/CBA.hRPE65载体，另一只眼不注射，18个月时行视网膜免疫组化检测。

结果如图4所示，两种载体注射后，视网膜厚度均明显大于未注射RPE65 KO小鼠，且rAAV/ubC.opti-hRPE65注射的RPE65 KO小鼠(D)网膜厚度大于rAAV/CBA.hRPE65注射的RPE65 KO小鼠(C)，与正常小鼠相比没有显著性差异。

(2)RPE65表达检测：RPE65 KO小鼠在生后14天一只眼接受视网膜下腔注射rAAV/ubC.opti-hRPE65载体或者rAAV/CBA.hRPE65载体，另一只眼不注射，3周时行视网膜免疫组化检测。

结果如图5所示，两种载体注射后RPE层皆可见到RPE65蛋白表达，且rAAV/ubC.opti-hRPE65载体相比rAAV/CBA.hRPE65载体RPE65蛋白表达明显更多。

实施例3

将本发明rAAV/ubC.opti-hRPE65载体中的ubC启动子替换为CBA启动子，得到rAAV/CBA.opti-hRPE65载体。所述rAAV/CBA.opti-hRPE65载体中除RPE65编码序列不同，其它均与rAAV/CBA.hRPE65载体相同。

结果发现，rAAV/CBA.opti-hRPE65载体的RPE65蛋白表达量明显高于rAAV/CBA.hRPE65载体。注射rAAV/CBA.opti-hRPE65的RPE65 KO小鼠的视网膜厚度明显大于rAAV/CBA.hRPE65注射的RPE65 KO小鼠，视网膜电图a波波幅也高于rAAV/CBA.hRPE65注射的RPE65 KO鼠，并存在显著性差异(p<0.01)。结果表明，rAAV/CBA.opti-hRPE65的治疗效果明显好于rAAV/CBA.hRPE65的治疗效果。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海市第一人民医院

<120> 治疗Leber先天性黑蒙症的载体及其应用

<130> P2018-1833

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1602

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

atgagcatcc aggtggagca ccccgccggc ggatacaaga aactgttcga gaccgtggag 60

gagctgagca gccccctgac cgcccacgtc accggaagga tccccctgtg gctgaccggc 120

tccctgctca gatgcggccc cggactgttt gaggtgggct ccgagccctt ctatcacctg 180

tttgacggcc aagccctgct gcacaagttc gacttcaagg aaggtcacgt gacctatcac 240

cggcgtttca tcagaaccga cgcctacgtg agggctatga ccgaaaagcg catcgtgatc 300

accgagttcg gaacctgcgc cttccccgac ccctgcaaga acatcttcag ccgcttcttc 360

tcctacttca gaggcgtgga ggtgaccgac aacgccctgg tgaacgttta ccccgtgggc 420

gaggactatt acgcctgcac tgaaaccaac ttcatcacca agatcaaccc cgagaccctc 480

gagaccatca aacaggtgga cctgtgcaac tacgtctctg tgaatggcgc caccgctcat 540

ccccacatcg agaacgacgg caccgtctac aacatcggca actgcttcgg caaaaacttc 600

agcatcgcct acaacatcgt caaaatcccc cccctgcagg ccgacaagga agaccccatc 660

agcaagagcg aaatcgtggt gcagttcccc tgcagcgacc ggttcaagcc cagctacgtg 720

cactccttcg gcctgacccc caactacatc gtcttcgtgg aaacccccgt gaagatcaac 780

ctgttcaagt tcctgagcag ctggagcctg tggggagcta actacatgga ctgctttgag 840

agcaacgaga caatgggtgt gtggctgcat attgctgaca agaagagaaa aaagtacctg 900

aacaacaagt acagaaccag ccccttcaac ctgttccacc acatcaacac ctacgaggac 960

aacggcttcc tgatcgtgga cctgtgctgc tggaagggct tcgagttcgt gtacaactac 1020

ctgtacctgg ccaacctgag agagaactgg gaggaggtga agaagaacgc cagaaaggcc 1080

ccccagcccg aggtgagaag atacgtgctg cccctgaaca tcgacaaggc cgacaccggc 1140

aagaacctgg tgaccctgcc caacaccacc gccaccgcca tcctgtgcag cgacgagacc 1200

atctggctgg agcccgaggt gctgttcagc ggccccagac aggccttcga gttcccccag 1260

atcaactacc agaagtactg cggcaagccc tacacctacg cctacggcct gggcctgaac 1320

cacttcgtgc ccgacagact gtgcaagctg aacgtgaaga ccaaggagac ctgggtgtgg 1380

caggagcccg acagctaccc cagcgagccc atcttcgtga gccaccccga cgccctggag 1440

gaggacgacg gcgtggtgct gagcgtggtg gtgagccccg gcgccggcca gaagcccgcc 1500

tacctgctga tcctgaacgc caaggacctg agcgaggtgg ccagagccga ggtggagatc 1560

aacatccccg tgaccttcca cggcctgttc aagaagagct ga 1602

<210> 2

<211> 1602

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

atgtctatcc aggttgagca tcctgctggt ggttacaaga aactgtttga aactgtggag 60

gaactgtcct cgccgctcac agctcatgta acaggcagga tccccctctg gctcaccggc 120

agtctccttc gatgtgggcc aggactcttt gaagttggat ctgagccatt ttaccacctg 180

tttgatgggc aagccctcct gcacaagttt gactttaaag aaggacatgt cacataccac 240

agaaggttca tccgcactga tgcttacgta cgggcaatga ctgagaaaag gatcgtcata 300

acagaatttg gcacctgtgc tttcccagat ccctgcaaga atatattttc caggtttttt 360

tcttactttc gaggagtaga ggttactgac aatgcccttg ttaatgtcta cccagtgggg 420

gaagattact acgcttgcac agagaccaac tttattacaa agattaatcc agagaccttg 480

gagacaatta agcaggttga tctttgcaac tatgtctctg tcaatggggc cactgctcac 540

ccccacattg aaaatgatgg aaccgtttac aatattggta attgctttgg aaaaaatttt 600

tcaattgcct acaacattgt aaagatccca ccactgcaag cagacaagga agatccaata 660

agcaagtcag agatcgttgt acaattcccc tgcagtgacc gattcaagcc atcttacgtt 720

catagttttg gtctgactcc caactatatc gtttttgtgg agacaccagt caaaattaac 780

ctgttcaagt tcctttcttc atggagtctt tggggagcca actacatgga ttgttttgag 840

tccaatgaaa ccatgggggt ttggcttcat attgctgaca aaaaaaggaa aaagtacctc 900

aataataaat acagaacttc tcctttcaac ctcttccatc acatcaacac ctatgaagac 960

aatgggtttc tgattgtgga tctctgctgc tggaaaggat ttgagtttgt ttataattac 1020

ttatatttag ccaatttacg tgagaactgg gaagaggtga aaaaaaatgc cagaaaggct 1080

ccccaacctg aagttaggag atatgtactt cctttgaata ttgacaaggc tgacacaggc 1140

aagaatttag tcacgctccc caatacaact gccactgcaa ttctgtgcag tgacgagact 1200

atctggctgg agcctgaagt tctcttttca gggcctcgtc aagcatttga gtttcctcaa 1260

atcaattacc agaagtattg tgggaaacct tacacatatg cgtatggact tggcttgaat 1320

cactttgttc cagataggct ctgtaagctg aatgtcaaaa ctaaagaaac ttgggtttgg 1380

caagagcctg attcataccc atcagaaccc atctttgttt ctcacccaga tgccttggaa 1440

gaagatgatg gtgtagttct gagtgtggtg gtgagcccag gagcaggaca aaagcctgct 1500

tatctcctga ttctgaatgc caaggactta agtgaagttg cccgggctga agtggagatt 1560

aacatccctg tcacctttca tggactgttc aaaaaatctt ga 1602

<210> 3

<211> 533

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 3

Met Ser Ile Gln Val Glu His Pro Ala Gly Gly Tyr Lys Lys Leu Phe

1 5 10 15

Glu Thr Val Glu Glu Leu Ser Ser Pro Leu Thr Ala His Val Thr Gly

20 25 30

Arg Ile Pro Leu Trp Leu Thr Gly Ser Leu Leu Arg Cys Gly Pro Gly

35 40 45

Leu Phe Glu Val Gly Ser Glu Pro Phe Tyr His Leu Phe Asp Gly Gln

50 55 60

Ala Leu Leu His Lys Phe Asp Phe Lys Glu Gly His Val Thr Tyr His

65 70 75 80

Arg Arg Phe Ile Arg Thr Asp Ala Tyr Val Arg Ala Met Thr Glu Lys

85 90 95

Arg Ile Val Ile Thr Glu Phe Gly Thr Cys Ala Phe Pro Asp Pro Cys

100 105 110

Lys Asn Ile Phe Ser Arg Phe Phe Ser Tyr Phe Arg Gly Val Glu Val

115 120 125

Thr Asp Asn Ala Leu Val Asn Val Tyr Pro Val Gly Glu Asp Tyr Tyr

130 135 140

Ala Cys Thr Glu Thr Asn Phe Ile Thr Lys Ile Asn Pro Glu Thr Leu

145 150 155 160

Glu Thr Ile Lys Gln Val Asp Leu Cys Asn Tyr Val Ser Val Asn Gly

165 170 175

Ala Thr Ala His Pro His Ile Glu Asn Asp Gly Thr Val Tyr Asn Ile

180 185 190

Gly Asn Cys Phe Gly Lys Asn Phe Ser Ile Ala Tyr Asn Ile Val Lys

195 200 205

Ile Pro Pro Leu Gln Ala Asp Lys Glu Asp Pro Ile Ser Lys Ser Glu

210 215 220

Ile Val Val Gln Phe Pro Cys Ser Asp Arg Phe Lys Pro Ser Tyr Val

225 230 235 240

His Ser Phe Gly Leu Thr Pro Asn Tyr Ile Val Phe Val Glu Thr Pro

245 250 255

Val Lys Ile Asn Leu Phe Lys Phe Leu Ser Ser Trp Ser Leu Trp Gly

260 265 270

Ala Asn Tyr Met Asp Cys Phe Glu Ser Asn Glu Thr Met Gly Val Trp

275 280 285

Leu His Ile Ala Asp Lys Lys Arg Lys Lys Tyr Leu Asn Asn Lys Tyr

290 295 300

Arg Thr Ser Pro Phe Asn Leu Phe His His Ile Asn Thr Tyr Glu Asp

305 310 315 320

Asn Gly Phe Leu Ile Val Asp Leu Cys Cys Trp Lys Gly Phe Glu Phe

325 330 335

Val Tyr Asn Tyr Leu Tyr Leu Ala Asn Leu Arg Glu Asn Trp Glu Glu

340 345 350

Val Lys Lys Asn Ala Arg Lys Ala Pro Gln Pro Glu Val Arg Arg Tyr

355 360 365

Val Leu Pro Leu Asn Ile Asp Lys Ala Asp Thr Gly Lys Asn Leu Val

370 375 380

Thr Leu Pro Asn Thr Thr Ala Thr Ala Ile Leu Cys Ser Asp Glu Thr

385 390 395 400

Ile Trp Leu Glu Pro Glu Val Leu Phe Ser Gly Pro Arg Gln Ala Phe

405 410 415

Glu Phe Pro Gln Ile Asn Tyr Gln Lys Tyr Cys Gly Lys Pro Tyr Thr

420 425 430

Tyr Ala Tyr Gly Leu Gly Leu Asn His Phe Val Pro Asp Arg Leu Cys

435 440 445

Lys Leu Asn Val Lys Thr Lys Glu Thr Trp Val Trp Gln Glu Pro Asp

450 455 460

Ser Tyr Pro Ser Glu Pro Ile Phe Val Ser His Pro Asp Ala Leu Glu

465 470 475 480

Glu Asp Asp Gly Val Val Leu Ser Val Val Val Ser Pro Gly Ala Gly

485 490 495

Gln Lys Pro Ala Tyr Leu Leu Ile Leu Asn Ala Lys Asp Leu Ser Glu

500 505 510

Val Ala Arg Ala Glu Val Glu Ile Asn Ile Pro Val Thr Phe His Gly

515 520 525

Leu Phe Lys Lys Ser

530

<210> 4

<211> 6752

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60

gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120

actccatcac taggggttcc tgcggccgcg gcctccgcgc cgggttttgg cgcctcccgc 180

gggcgccccc ctcctcacgg cgagcgctgc cacgtcagac gaagggcgca gcgagcgtcc 240

tgatccttcc gcccggacgc tcaggacagc ggcccgctgc tcataagact cggccttaga 300

accccagtat cagcagaagg acattttagg acgggacttg ggtgactcta gggcactggt 360

tttctttcca gagagcggaa caggcgagga aaagtagtcc cttctcggcg attctgcgga 420

gggatctccg tggggcggtg aacgccgatg attatataag gacgcgccgg gtgtggcaca 480

gctagttccg tcgcagccgg gatttgggtc gcggttcttg tttgtggatc gctgtgatcg 540

tcacttggtg agtagcgggc tgctgggctg gccggggctt tcgtggccgc cgggccgctc 600

ggtgggacgg aagcgtgtgg agagaccgcc aagggctgta gtctgggtcc gcgagcaagg 660

ttgccctgaa ctgggggttg gggggagcgc agcaaaatgg cggctgttcc cgagtcttga 720

atagaacctt cgctaatgcg ggaaagctct tattcgggtg agatgggctg gggcaccatc 780

tggggaccct gacgtgaagt ttgtcactga ctggagaact cggtttgtcg tctgttgcgg 840

gggcggcagt tatggcggtg ccgttgggca gtgcacccgt acctttggga gcgcgcgccc 900

tcgtcgtgtc gtgacgtcac ccgttctgtt ggcttataat gcagggtggg gccacctgcc 960

ggtaggtgtg cggtaggctt ttctccgtcg caggacgcag ggttcgggcc tagggtaggc 1020

tctcctgaat cgacaggcgc cggacctctg gtgaggggag ggataagtga ggcgtcagtt 1080

tctttggtcg gttttatgta cctatcttct taagtagctg aagctccggt tttgaactat 1140

gcgctcgggg ttggcgagtg tgttttgtga agttttttag gcaccttttg aaatgtaatc 1200

atttgggtca atatgtaatt ttcagtgtta gactagtaaa ttgtccgcta aattctggcc 1260

gtttttggct tttttgttag acgaagctaa ggcgcgcctg agaacttcag ggtgagtttg 1320

gggacccttg attgttcttt ctttttcgct attgtaaaat tcatgttata tggagggggc 1380

aaagttttca gggtgttgtt tagaatggga agatgtccct tgtatcacca tgcatggacc 1440

ctcatgataa ttttgtttct ttcactttct actctgttga caaccattgt ctcctcttat 1500

tttcttttca ttttctgtaa ctttttcgtt aaactttagc ttgcatttgt aacgaatcta 1560

gacaatcagg gtatattata ttgtacttca gcacagtttt agagaacaat tgttataatt 1620

aaatgataag gtagaatatt tctgcatata aattctggct ggcgtggaaa tattcttatt 1680

ggtagaaaca actacatcct ggtcatcatc ctgcctttct ctttatggtt acaatgatat 1740

acactgtttg agatgaggat aaaatactct gagtccaaac cgggcccctc tgctaaccat 1800

gttcatgcct tcttcttttt cctacagctc ctgggcaacg tgctggttat tgtgctgtct 1860

catcaagctt aagaattcca ccatgagcat ccaggtggag caccccgccg gcggatacaa 1920

gaaactgttc gagaccgtgg aggagctgag cagccccctg accgcccacg tcaccggaag 1980

gatccccctg tggctgaccg gctccctgct cagatgcggc cccggactgt ttgaggtggg 2040

ctccgagccc ttctatcacc tgtttgacgg ccaagccctg ctgcacaagt tcgacttcaa 2100

ggaaggtcac gtgacctatc accggcgttt catcagaacc gacgcctacg tgagggctat 2160

gaccgaaaag cgcatcgtga tcaccgagtt cggaacctgc gccttccccg acccctgcaa 2220

gaacatcttc agccgcttct tctcctactt cagaggcgtg gaggtgaccg acaacgccct 2280

ggtgaacgtt taccccgtgg gcgaggacta ttacgcctgc actgaaacca acttcatcac 2340

caagatcaac cccgagaccc tcgagaccat caaacaggtg gacctgtgca actacgtctc 2400

tgtgaatggc gccaccgctc atccccacat cgagaacgac ggcaccgtct acaacatcgg 2460

caactgcttc ggcaaaaact tcagcatcgc ctacaacatc gtcaaaatcc cccccctgca 2520

ggccgacaag gaagacccca tcagcaagag cgaaatcgtg gtgcagttcc cctgcagcga 2580

ccggttcaag cccagctacg tgcactcctt cggcctgacc cccaactaca tcgtcttcgt 2640

ggaaaccccc gtgaagatca acctgttcaa gttcctgagc agctggagcc tgtggggagc 2700

taactacatg gactgctttg agagcaacga gacaatgggt gtgtggctgc atattgctga 2760

caagaagaga aaaaagtacc tgaacaacaa gtacagaacc agccccttca acctgttcca 2820

ccacatcaac acctacgagg acaacggctt cctgatcgtg gacctgtgct gctggaaggg 2880

cttcgagttc gtgtacaact acctgtacct ggccaacctg agagagaact gggaggaggt 2940

gaagaagaac gccagaaagg ccccccagcc cgaggtgaga agatacgtgc tgcccctgaa 3000

catcgacaag gccgacaccg gcaagaacct ggtgaccctg cccaacacca ccgccaccgc 3060

catcctgtgc agcgacgaga ccatctggct ggagcccgag gtgctgttca gcggccccag 3120

acaggccttc gagttccccc agatcaacta ccagaagtac tgcggcaagc cctacaccta 3180

cgcctacggc ctgggcctga accacttcgt gcccgacaga ctgtgcaagc tgaacgtgaa 3240

gaccaaggag acctgggtgt ggcaggagcc cgacagctac cccagcgagc ccatcttcgt 3300

gagccacccc gacgccctgg aggaggacga cggcgtggtg ctgagcgtgg tggtgagccc 3360

cggcgccggc cagaagcccg cctacctgct gatcctgaac gccaaggacc tgagcgaggt 3420

ggccagagcc gaggtggaga tcaacatccc cgtgaccttc cacggcctgt tcaagaagag 3480

ctgactcgag agatctacgg gtggcatccc tgtgacccct ccccagtgcc tctcctggcc 3540

ctggaagttg ccactccagt gcccaccagc cttgtcctaa taaaattaag ttgcatcatt 3600

ttgtctgact aggtgtcctt ctataatatt atggggtgga ggggggtggt atggagcaag 3660

gggcaagttg ggaagacaac ctgtagggcc tgcggggtct attgggaacc aagctggagt 3720

gcagtggcac aatcttggct cactgcaatc tccgcctcct gggttcaagc gattctcctg 3780

cctcagcctc ccgagttgtt gggattccag gcatgcatga ccaggctcag ctaatttttg 3840

tttttttggt agagacgggg tttcaccata ttggccaggc tggtctccaa ctcctaatct 3900

caggtgatct acccaccttg gcctcccaaa ttgctgggat tacaggcgtg aaccactgct 3960

cccttccctg tccttctgat tttgtaggta accacgtgcg gaccgagcgg ccgcaggaac 4020

ccctagtgat ggagttggcc actccctctc tgcgcgctcg ctcgctcact gaggccgggc 4080

gaccaaaggt cgcccgacgc ccgggctttg cccgggcggc ctcagtgagc gagcgagcgc 4140

gcagctgcct gcaggggcgc ctgatgcggt attttctcct tacgcatctg tgcggtattt 4200

cacaccgcat acgtcaaagc aaccatagta cgcgccctgt agcggcgcat taagcgcggc 4260

gggtgtggtg gttacgcgca gcgtgaccgc tacacttgcc agcgccctag cgcccgctcc 4320

tttcgctttc ttcccttcct ttctcgccac gttcgccggc tttccccgtc aagctctaaa 4380

tcgggggctc cctttagggt tccgatttag tgctttacgg cacctcgacc ccaaaaaact 4440

tgatttgggt gatggttcac gtagtgggcc atcgccctga tagacggttt ttcgcccttt 4500

gacgttggag tccacgttct ttaatagtgg actcttgttc caaactggaa caacactcaa 4560

ccctatctcg ggctattctt ttgatttata agggattttg ccgatttcgg cctattggtt 4620

aaaaaatgag ctgatttaac aaaaatttaa cgcgaatttt aacaaaatat taacgtttac 4680

aattttatgg tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagccccg 4740

acacccgcca acacccgctg acgcgccctg acgggcttgt ctgctcccgg catccgctta 4800

cagacaagct gtgaccgtct ccgggagctg catgtgtcag aggttttcac cgtcatcacc 4860

gaaacgcgcg agacgaaagg gcctcgtgat acgcctattt ttataggtta atgtcatgat 4920

aataatggtt tcttagacgt caggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat 4980

ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc atgagacaat aaccctgata 5040

aatgcttcaa taatattgaa aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc gtgtcgccct 5100

tattcccttt tttgcggcat tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa cgctggtgaa 5160

agtaaaagat gctgaagatc agttgggtgc acgagtgggt tacatcgaac tggatctcaa 5220

cagcggtaag atccttgaga gttttcgccc cgaagaacgt tttccaatga tgagcacttt 5280

taaagttctg ctatgtggcg cggtattatc ccgtattgac gccgggcaag agcaactcgg 5340

tcgccgcata cactattctc agaatgactt ggttgagtac tcaccagtca cagaaaagca 5400

tcttacggat ggcatgacag taagagaatt atgcagtgct gccataacca tgagtgataa 5460

cactgcggcc aacttacttc tgacaacgat cggaggaccg aaggagctaa ccgctttttt 5520

gcacaacatg ggggatcatg taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc tgaatgaagc 5580

cataccaaac gacgagcgtg acaccacgat gcctgtagca atggcaacaa cgttgcgcaa 5640

actattaact ggcgaactac ttactctagc ttcccggcaa caattaatag actggatgga 5700

ggcggataaa gttgcaggac cacttctgcg ctcggccctt ccggctggct ggtttattgc 5760

tgataaatct ggagccggtg agcgtgggtc tcgcggtatc attgcagcac tggggccaga 5820

tggtaagccc tcccgtatcg tagttatcta cacgacgggg agtcaggcaa ctatggatga 5880

acgaaataga cagatcgctg agataggtgc ctcactgatt aagcattggt aactgtcaga 5940

ccaagtttac tcatatatac tttagattga tttaaaactt catttttaat ttaaaaggat 6000

ctaggtgaag atcctttttg ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt 6060

ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc ctttttttct 6120

gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc 6180

ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc 6240

aaatactgtc cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc 6300

gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct gctgccagtg gcgataagtc 6360

gtgtcttacc gggttggact caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg 6420

aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg aactgagata 6480

cctacagcgt gagctatgag aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta 6540

tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc 6600

ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg 6660

atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt 6720

cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat gt 6752

Claims

1.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒含有编码RPE65蛋白的核酸分子，且所述核酸分子的核苷酸序列选自下组：

(a) 所述核苷酸序列如SEQ ID NO.: 1所示；和

(b)与(a)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列；

并且，所述表达盒从5’-3’端具有式I结构：

Z1-Z2-Z3-Z4-Z5 (I)

式中，各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；

Z1为无或增强子；

Z2为人源泛素启动子；

Z3为ubC内含子；

Z4为所述的核苷酸序列；和

Z5为无或polyA。

2. 如权利要求1所述的表达盒，其特征在于，所述polyA为人生长荷尔蒙3’端非编码序列hGH polyA。

3.一种载体，其特征在于，所述载体含有如权利要求1所述的表达盒。

4.一种腺相关病毒载体，其特征在于，所述腺相关病毒载体含有如权利要求1所述的表达盒。

5. 如权利要求4所述的腺相关病毒载体，其特征在于，所述腺相关病毒载体的序列如SEQ ID NO.: 4所示。

6.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求3所述的载体或权利要求5所述的腺相关病毒载体，或其染色体中整合有外源的权利要求1所述的表达盒。

7.如权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞选自下组：HEK细胞、感光细胞、双极细胞、水平细胞、或其组合。

8.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，所述感光细胞包括视锥细胞和视杆细胞。

9.如权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为神经细胞。

10.如权利要求9所述的宿主细胞，其特征在于，所述神经细胞包括视神经细胞。

11.如权利要求3所述的载体或权利要求4所述的腺相关病毒载体的用途，其特征在于，用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于治疗Leber先天性黑蒙症和/或恢复受试者视力或感光能力。

12.如权利要求11所述的用途，其特征在于，所述制剂或组合物用于扩大或恢复视网膜的感光细胞功能和/或恢复受试者视力或感光能力。

13.一种药物制剂，其特征在于，所述的制剂含有(a)权利要求3所述的载体或权利要求4所述的腺相关病毒载体，以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。

14.如权利要求13所述的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂的剂型选自下组：冻干制剂、液体制剂、或其组合。

15.如权利要求13所述的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂中载体的含量为1×10⁹-1×10¹⁶个病毒/毫升。

16.如权利要求13所述的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂中载体的含量为1×10¹²-1×10¹³个病毒/毫升。