KR20220118512A

KR20220118512A - 어셔 증후군의 치료 방법 및 그것의 조성물

Info

Publication number: KR20220118512A
Application number: KR1020227024955A
Authority: KR
Inventors: 넝인 리우; 저슈엔 이; 펑페이 위안; 얀샤 자오; 강빈 탕
Original assignee: 에디진 테라퓨틱스 (베이징) 인크.
Priority date: 2019-12-30
Filing date: 2020-12-30
Publication date: 2022-08-25
Also published as: JP2023509177A; CN114829598A; US20230067480A1; BR112022012921A2; WO2021136404A1; AU2020418026A1; EP4086346A1; TW202138561A; EP4086346A4; MX2022008197A; CR20220366A; IL294260A; CO2022010430A2; CA3163280A1; ECSP22059858A

Abstract

LEAPER 기술에 기반한, USH2A 유전자 전사체에서의 G의 A로의 돌연변이를 함유하는 표적 RNA를 표적화 편집하기 위한 방법으로서, 상기 방법은 상기 표적 RNA를 편집하기 위한 아데노신 탈아미노효소 리크루팅 RNA(arRNA)의 구축물 또는 상기 arRNA를 인코딩하는 구축물을 세포 내로 도입하는 단계를 포함하고, 상기 arRNA는 표적 RNA에 혼성화하는 상보적 RNA 서열을 포함하고, 또한 상기 arRNA는 RNA에 작용하는 아데노신 탈아미노효소(ADAR)를 리크루팅하여, 표적 RNA에서 표적 아데노신이 탈아미노화되고, 이에 의해 RNA 상에서 염기 A의 I로의 생체내 편집을 안전하고 효과적으로 행하여, 병원성 돌연변이 부위를 복구하고, 어셔 증후군과 같은 질병 치료의 목적을 달성할 수 있는 방법이 제공된다.

Description

어셔 증후군의 치료 방법 및 그것의 조성물

본 출원은 유전자 편집 치료 분야에 속하며, 구체적으로는 LEAPER(RNA 상에서 프로그램 가능한 편집을 위한 내인성 ADAR의 활용) 기술에 기반한, II형 어셔 증후군과 관련된 유전자 돌연변이의 표적화 편집 방법에 관한 것이다.

유전성 난청-망막색소변성 증후군이라고도 알려진 어셔 증후군은 1914년 Charles Howard Usher에 의해 설명되고 명명되었다¹². 이것은 선천성 또는 진행성 시력 및 청력 상실을 유발하는 유전자 돌연변이에 의해 발생되는 상염색체 열성 희귀 질환이다. 어셔 증후군의 발병률은 독일에서 대략 1/12,500명⁸, 노르웨이에서 1/28,000명⁴, 미국에서 1/23,000명이며, 미국의 16,000명의 시각 및 청각 장애인 중 절반 이상이 어셔 증후군을 앓고 있는 것으로 추정된다¹. 전 세계적으로 치료가 시급한 환자는 수만 또는 수십만 명이 존재한다.

1977년에, Davenport 등.은 어셔 증후군을 연구하고, 그 중증도에 따라 I형, II형, III형, IV형으로 분류하였다³. 그 중에서, I형은 중증 선천성 난청으로, 환자는 10세 전후에 중증 시각 장애를 앓고; II형은 중등도에서 중증의 선천성 난청으로, 환자는 10세에서 50세 사이에 점차적으로 시력을 잃는다. III형과 IV형은 비교적 드물고, 질병은 경미하며; 환자의 청각 징후는 진행성 감각신경성 난청이며, 시각 상실의 시기는 불확실하다. I형은 조기 발병으로 인해 개입 이행 기간이 짧으며; 반면에 III형과 IV형은 비교적 경증이다. II형 환자의 시력 상실은 10세에서 20세까지 점진적으로 시작되어, 초기에는 야맹증을 앓다가 결국에는 시력 상실을 앓게 되므로(도 1), 더 긴 치료적 개입 기간을 허용하여 환자에서의 점진적인 시력 상실을 희망적으로 멈추게 할 수 있다.

2017년에, Neuhaus 등.은 고처리량 시퀀싱으로 어셔 증후군 환자 138명을 연구하였다. 결과는 138명의 환자 중 82명이 USH2A 유전자 돌연변이를 가지며, 이들 82명의 환자 중 80명이 II형 어셔 증후군을 갖고 있음을 보여준다(도 2)⁷. 따라서, 단지 II형 어셔 증후군 환자를 고려할 때, USH2A 유전자 돌연변이의 비율은 90% 이상이므로(도 2)⁷, 이들 환자에게 USH2A 유전자에 대한 치료 요법이 이익이 될 수 있다.

USH2A 유전자는 시력에 중요한 역할을 하는 어셔린이라는 단백질을 인코딩하며, 주로 내측 분절과 외측 분절을 연결하는 감광성 원추체와 간상체에 존재한다. USH2A가 돌연변이되면, 원추 세포 및 간상 세포의 퇴행성 사멸을 일으킨다⁵. 2017년에, Neuhaus 등.의 연구는 그들이 시퀀싱한 USH2A 유전자 돌연변이 사례의 13%가 NM_206933.2(USH2A)_c.11864G>A(p.Trp3955Ter)이며, 이 돌연변이 유형은 모든 돌연변이 유형에서 가장 큰 비율을 갖는 단일 돌연변이 유형임을 나타낸다(도 3)⁷.

USH2A 유전자 돌연변이로 인한 어셔린의 정상 기능의 상실은 II형 어셔 증후군의 중요한 원인이다. USH2A 유전자를 표적으로 하는 치료법은 II형 어셔 치료법의 주요 연구 개발 방향이 된다.

현재, 유전자 치료를 통한 II형 어셔 증후군의 치료를 위한 두 가지 주요 연구 개발 방향이 존재한다. 하나는 바이러스를 통해 눈에서 완전한 USH2A 유전자의 재발현을 매개하는 것이다. 그러나, USH2A 유전자의 단백질 서열은 아미노산 길이가 6,000개 이상으로 매우 길기 때문에, 대응하는 코딩 영역 서열은 18,000개 이상의 염기쌍을 갖게 된다. 일반적인 바이러스 벡터는 제한된 전달 길이를 갖는다. 통상, 렌티바이러스는 10,000개 이하의 염기쌍을 전달하지만, 아데노 관련 바이러스는 4,500개 이하의 염기쌍을 전달한다. 이것은 바이러스 벡터에 의한 전장 USH2A 유전자의 전달을 달성하기 어렵게 한다. 따라서, 의과학 연구자들은 절단된 USH2A 유전자만 전달하도록 선택할 수 있다. 이 방법은 질병의 악화를 어느 정도 완화할 수 있지만, 환자가 여전히 정상적인 전장 어셔린이 부족하기 때문에 어셔린 본래의 정상적인 생리 기능을 완전히 달성할 수 없다.

USH2A 유전자 치료에 대한 또 다른 일반적인 연구 개발 방향은 엑손 스키핑(Exon Skipping)을 통해 달성된다. 일부 USH2A 유전자 돌연변이는 특정 엑손의 프레임시프트나 넌센스 돌연변이에 의해 발생하기 때문에, RNA 스플라이싱 단계에서 엑손을 특이적으로 건너뛸 수 있는 한, 엑손 이후의 서열은 정상적으로 번역될 수 있다. 스플라이싱 동안에 번역되는 뉴클레오티드에 의해 표적화된 엑손을 특이적으로 건너뛰기 위해 짧은 단편의 안티센스 뉴클레오티드(안티-센스 올리고, ASO)를 도입하는 것이 일반적인 관행이다. 이 방법은 이전의 방법과 유사하므로, 돌연변이된 엑손을 건너뛰기 때문에 결국 전장 어셔린이 얻어질 수 없다.

최근 수 년 동안, CRISPR(clustered regular interspaced short palindromic repeats)가 주도하는 게놈 편집 기술이 빠르게 발전하고 있으며, 생물학 및 의학의 다수의 분야에 지대한 영향을 미치고 있다. 다수의 연구자 및 생명공학 회사도 이 기술을 임상에 도입하기 위해 노력하고 있다. 2019년 9월에, 페킹 유니버시티의 Deng Hongkui 교수와 그의 동료들이 발표한 논문에서는 CRISPR 기술에 의해 줄기세포를 편집하고, 이를 환자에게 다시 주입하여 에이즈와 백혈병을 치료하는 임상 실험 결과를 보고하고 있으며, 이는 유전자 치료 분야에서 CRISPR 기술의 변화에 크게 기여하였다.

CRISPR 기술은 응용 가능성이 크지만, 일련의 결함을 갖기 때문에 과학적 연구 단계에서 임상 치료 응용으로의 이 기술의 전환을 상당히 어렵게 한다. 문제 중 하나는 CRISPR 기술에 사용되는 핵심 효소인 Cas9이다. CRISPR 기반의 DNA 편집 기술은 Cas9 또는 이와 유사한 기능을 가진 다른 뉴클레아제의 외인성 발현을 필요로 하므로, 다음과 같은 문제를 야기한다. 첫째, 외인성 발현을 필요로 하는 뉴클레아제는 일반적으로 분자량이 커서, 바이러스 벡터를 통해 환자의 체내로 전달되는 효율을 크게 감소시킨다. 둘째, 뉴클레아제의 외인성 발현으로 인해, 이 방법은 뉴클레아제가 오프표적될 가능성이 있어, 적용 시 잠재적인 발암 위험을 야기할 수 있다. 마지막으로, 외인성으로 발현된 Cas9 및 기타 유사한 뉴클레아제는 박테리아에서 발견되지만, 인간이나 포유류에서는 자연적으로 발생하지 않으므로, 환자에게 면역 반응을 유발할 가능성이 있으며, 한편으로 이것은 환자 자신에게 손상을 일으킬 수 있고, 다른 한편으로는 외인성으로 발현된 뉴클레아제가 더 중화되어 적절한 활성을 상실하여 치료 효과에 영향을 미칠 수 있다.

2017년에, MIT의 Zhang Feng 교수와 그의 연구 그룹은 REPAIR(프로그래밍 가능한 A의 I로의 교체를 위한 RNA 편집)라고 불리는 RNA 편집 기술을 보고하였으며, 표적 RNA에서 A의 I로의 편집은 Cas13-ADAR 융합 단백질 및 단일 가이드 RNA(sgRNA)의 외인성 발현을 통해 달성될 수 있지만, CRISPR 기술과 마찬가지로, 이 방법은 여전히 외인성 단백질의 발현을 필요로 하며, 여전히 외래 단백질 발현으로 인한 문제를 해결할 수 없다.

2019년 1월에, Thorsten Stafforst의 그룹은 RESTORE(recruiting endogenous ADAR to specific trans for oligonucleotide-mediated RNA editing, Merkle 등., 2019년)라고 불리는 단일-염기 RNA 편집 기술을 보고하였다. RESTORE는 외래 단백질에 대한 의존성을 없앨 수 있지만, RESTORE 기술의 높은 편집 효율에는 IFN-γ의 존재가 요구되며, IFN-γ는 자가면역의 발달 및 중증도를 결정하는데 핵심 요소이므로, 의료 분야에 있어서 이러한 기술의 적용을 크게 감소시킨다. 한편, RESTORE 기술에서도 가이드 RNA를 사용하며, 사용되는 가이드 RNA는 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드이며, 그것의 안정성을 확보하기 위해 합성된 올리고뉴클레오티드에 인위적으로 많은 화학적 변형을 도입해야 한다. 이들 화학적 변형 중에서, 일부는 올리고뉴클레오티드를 독성 또는 면역원성이 되게 할 수 있는 비자연적인 변형이며; 상기 변형 중 일부는 동일한 염기 사슬의 다른 구조를 유도하여, 동일한 RNA 서열에 대해 수 십개의 다른 구조적 조합이 있을 수 있으므로, RNA를 세포 내로 전달하는데 어려움이 증가한다.

상기 세 가지 기술은 모두 특정한 결점을 갖기 때문에, USH2A 유전자 자체의 특이성의 관점에서, 상기 세 가지 기술은 모두 II형 어셔 증후군의 치료에 이용하기 어렵다.

2019년 7월에, 페킹 유니버시티 생명과학부의 Wei Wensheng 교수의 그룹은 Nature Biotechnology에 새로운 핵산 편집 기술인 LEAPER(leveraging endogenous ADAR for programmable editing of RNA, Qu 등., 2019년)를 보고한 "Programmable RNA editing by recruiting endogenous ADAR using engineered RNAs"라고 하는 논문을 발표하였다. 한편으로, 이 기술은 CRISPR 기술과 비교해서 외인성 뉴클레아제의 과발현에 대한 의존성을 원칙적으로 없애고, 소망의 편집 부위에 내인성 뉴클레아제를 리크루팅하기 위한 가이드로 단지 RNA의 단편을 필요로 하므로, 의료 분야로의 전환 단계에서 더욱 큰 이점을 가지며; 다른 한편으로, 이 기술은 게놈에서 서열을 변경하지 않고 전사 레벨에서 아데노신 A의 크레아티닌 I로의 편집(크레아티닌 I는 단백질 번역 시 구아닌 G로 인식될 수 있음)만을 실현하므로, 보다 안전하고 편리하다. LEAPER 기술은 RNA를 화학적으로 합성하여 달성할 수 있을 뿐만 아니라 아데노 관련 바이러스(AAV), 렌티바이러스와 같은 벡터를 통해 RNA를 환자에게 전달함으로써, 전달 방법의 선택을 보다 유연하게 할 수 있다.

본 출원은 LEAPER 기술을 기반에 기반한, USH2A 유전자 전사체에서의 G의 A로의 돌연변이를 함유하는 표적 RNA의 표적화 편집 방법에 관한 것으로, 표적 RNA를 편집하기 위한 아데노신 탈아미노효소 리크루팅 RNA(arRNA)를 포함하는 구축물 또는 상기 RNA를 인코딩하는 구축물은 표적 RNA를 함유하는 세포 내로 도입되어, 상기 arRNA가 RNA에 작용하는 아데노신 탈아미노효소(ADAR)를 리크루팅할 수 있고, 이에 의해 표적 RNA에서 표적 아데노신이 탈아미노화될 수 있다. LEAPER 기술의 최적화 및 개선을 통해, 본 출원은 NM_206933.2(USH2A)_c.11864G>A(p.Trp3955Ter) 돌연변이를 갖는 II형 어셔 증후군과 관련된 표적 RNA와 같이, USH2A 유전자 전사체에서의 G의 A로의 돌연변이를 함유하는 표적 RNA에 창의적으로 적용되며, II형 어셔 증후군의 치료 목적은 돌연변이 부위의 역전 수선을 통해 달성된다.

본 출원의 목적은 인간 USH2A에서 가장 높은 비율을 갖는 돌연변이 유형 NM_206933.2(USH2A)_c.11864G>A(p.Trp3955Ter)의 병원성 유전자와 같은 II형 어셔 증후군을 유발하는 병원성 유전자를 겨냥한 새로운 유형의 기술적 해결방안을 제공하는 것이며, 여기서 표적 RNA 상의 돌연변이 부위의 정밀한 편집은 과대 핵산 또는 외인성 단백질 분자를 도입하지 않고 달성되어, 어셔린 단백질의 완전한 기능을 회복시킬 수 있다.

구체적으로, 본 출원은 다음에 관한 것이다.

1. LEAPER 기술에 기반한, 세포에서의 표적 RNA를 표적화 편집하기 위한 방법으로서, 상기 표적 RNA는 USH2A 유전자 전사체에서의 G의 A로의 돌연변이를 함유하는 RNA이고, 상기 방법은,

상기 표적 RNA를 편집하기 위한 아데노신 탈아미노효소 리크루팅 RNA(arRNA)를 포함하는 구축물 또는 상기 arRNA를 인코딩하는 구축물을 세포 내로 도입하는 단계를 포함하고, 상기 arRNA는 표적 RNA에 혼성화하는 상보적 RNA 서열을 포함하고, 또한 상기 arRNA는 RNA에 작용하는 아데노신 탈아미노효소(ADAR)를 리크루팅하여, 표적 RNA에서 표적 아데노신이 탈아미노화되는, 방법.

2. 항목 1에 있어서, 상기 표적 RNA는 성숙 mRNA 또는 mRNA 전구체(프리-mRNA)인, 방법. 일부 실시형태에 있어서, 상기 표적 RNA는 mRNA 전구체(프리-mRNA)이다.

3. 항목 1 또는 항목 2에 있어서, 상기 arRNA의 길이는 약 151-61nt, 131-66nt, 121-66nt, 111-66nt, 91-66nt, 또는 81-66nt인, 방법. 본 출원은 이 수치 범위 내의 임의의 자연수를 포함한다.

4. 항목 3에 있어서, 상기 arRNA의 길이는 66nt-131nt로부터 선택되는 임의의 자연수인, 방법.

5. 항목 1 내지 항목 4 중 어느 하나에 있어서, 상기 arRNA에서의 표적으로 하는 염기로부터 3' 말단까지의 길이는 ≥7nt, ≥10nt, ≥15nt, 바람직하게는 16-55nt, 20-50nt, 25-45nt, 25-35nt, 또는 25-30nt인 방법. 본 출원은 이 수치 범위 내의 임의의 자연수를 포함한다.

6. 항목 1 내지 항목 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 arRNA에서의 표적으로 하는 염기로부터 5' 말단까지의 길이는 ≥25nt, ≥30, ≥35, ≥45, 바람직하게는 46-90nt, 55-80nt, 60-75nt, 또는 65-70nt인, 방법. 본 출원은 이 수치 범위 내의 임의의 자연수를 포함한다.

7. 항목 1 내지 항목 6 중 어느 하나에 있어서, 표적으로 하는 염기는 상기 arRNA 내로 도입되어 표적 서열에서 표적 A와 쌍을 이루고, 상기 표적으로 하는 염기의 선호도 순서는 높은 것부터 낮은 것 순으로 C, A, U, 또는 G인, 방법.

8. 항목 1 내지 항목 7 중 어느 하나에 있어서, 상기 표적 RNA는 전사된 NM_206933.2(USH2A)_c.11864 G>A(p.Trp3955Ter) 돌연변이 부위를 포함하는 인간 USH2A 유전자 RNA인, 방법.

9. 항목 1 내지 항목 8 중 어느 하나에 있어서, 상기 arRNA는 SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, 및 SEQ ID NO: 4로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 방법.

10. 항목 1 내지 항목 9 중 어느 하나에 있어서, 상기 arRNA는 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, 및 SEQ ID NO: 9로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 방법.

11. 항목 1 내지 항목 10 중 어느 하나에 있어서, 상기 구축물은 선형 핵산, 바이러스 벡터, 또는 플라스미드인, 방법.

12. 항목 11에 있어서, 상기 바이러스는 아데노 관련 바이러스(AAV) 또는 렌티바이러스인, 방법.

13. 항목 12에 있어서, 상기 AAV 벡터는 AAV2, AAV5 또는 AAV8 캡시드 내로 패키징된 후에 감염에 의해 세포 내로 도입되는, 방법.

14. 항목 13에 있어서, 상기 AAV 벡터는 AAV8 캡시드 내로 패키징된 후에 감염에 의해 세포 내로 도입되는, 방법.

15. 항목 1 내지 항목 14 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포는 포유동물의 시신경 세포 또는 청신경 세포인, 방법.

16. USH2A 유전자 전사체에서의 G의 A로의 돌연변이를 함유하는 표적 RNA의 표적화 편집을 위한 arRNA 또는 그것의 코딩 서열로서, 상기 arRNA는 SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, 및 SEQ ID NO: 4로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하거나 이로 구성되는, arRNA 또는 그것의 코딩 서열.

17. 항목 16에 기재된 arRNA를 포함하는, 구축물 또는 전달 벡터.

18. 항목 17에 있어서, 플라스미드, 바이러스, 리포솜, 또는 지질 나노입자인, 구축물 또는 전달 벡터.

19. 항목 18에 있어서, 아데노 관련 바이러스(AAV) 또는 렌티바이러스인, 구축물 또는 전달 벡터.

20. 항목 19에 있어서, 상기 바이러스는 AAV2, AAV5, 또는 AAV8인, 구축물 또는 전달 벡터.

일부 실시형태에 있어서, 본 출원은 상기 arRNA를 포함하거나 상기 구축물 또는 전달 벡터를 포함하는 조성물, 제형, 키트 또는 생물학적 생성물을 제공한다.

21. 항목 1 내지 항목 15 중 어느 하나에 기재된 편집 방법에 의해 얻어지는 세포.

22. 항목 1 내지 항목 15 중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 개체의 세포에서 II형 어셔 증후군과 관련된 G의 A로의 돌연변이를 교정하는 단계를 포함하는, 개체에서 II형 어셔 증후군을 치료하는 방법.

23. 항목 22에 있어서, 항목 16에 기재된 arRNA 또는 항목 17 내지 항목 20 중 어느 하나에 기재된 구축물 또는 전달 벡터를 피험체 내로 도입하는 단계를 포함하는, 방법.

24. 항목 23에 있어서, 항목 16에 기재된 arRNA 또는 항목 17 내지 항목 20 중 어느 하나에 기재된 구축물 또는 전달 벡터가 피험체의 망막하 공간 내로 도입되는, 방법.

본 출원에 의해 제공되는 LEAPER 기술에 기반한, NM_206933.2(USH2A)_c.11864G>A(p.Trp3955Ter) 돌연변이 부위를 함유하는 세포에서의 전사된 표적 RNA의 표적화 편집 방법은 II형 어셔 증후군의 치료에 명백한 이점을 갖는다: 첫째, LEAPER 기술은 151, 131, 121, 또는 111 뉴클레오티드 이내로 제한될 수 있는 짧은 RNA만 도입할 필요가 있으며, 이는 도입된 단편의 길이에 대한 요구 사항이 아데노 관련 바이러스의 전달 길이의 상한보다 훨씬 작아지게 한다. 따라서, 이 기술은 USH2A 유전자의 직접 도입에 비해 아데노 관련 바이러스 벡터의 적용에 매우 적합하다. 눈은 면역이 약한 부위여서, 아데노 관련 바이러스를 제거하는 능력이 매우 떨어지므로, 아데노 관련 바이러스가 눈에 장기간 머무르게 된다. 또한, 기능 세포는 모두 신경 세포이며, 이들은 정상적인 상황에서는 분열하지 않으므로, 상기 아데노 관련 바이러스가 이들 세포에 오랫동안 머물도록 허용하여, 즉 면역에 의해 제거되거나 세포 분열로 인해 희석되지 않는다. 보다 중요하게는, 이전의 일반적인 방법과 비교해서, 본 출원의 기술적 해결방안은 어셔린을 인위적으로 절단하거나 돌연변이된 엑손을 건너뛸 필요가 없으므로, 전장의 정상 어셔린이 얻어질 수 있다. 따라서, 이론상, 환자는 이 기술로 치료한 후에는 일반인과 다를 바 없는 정상적인 어셔린을 얻을 수 있다. II형 어셔 증후군은 열성 유전 질환이므로, 일부 정상 단백질이 기능할 수 있는 한, 정상적인 기능이 얻어질 수 있음을 나타낸다.

본 출원에서, 본 출원의 기술적 해결방안이 II형 어셔 증후군 관련 유전자 전사체(예를 들면, NM_206933.2(USH2A)_c.11864G>A(p.Trp3955Ter) 돌연변이 부위를 함유하는 인간 USH2A 유전자 전사체)를 교정하여, II형 어셔 증후군의 치료 목적을 달성할 수 있음이 실험 데이터에 의해 입증된다.

도 1은 II형 어셔 증후군 환자에서의 야맹증 진행에 대한 개략도를 나타낸다¹³.
도 2는 138명의 어셔 환자에서의 병원성 유전자 돌연변이의 분포를 나타낸다⁷.
도 3은 USH2A 유전자 돌연변이 유형의 분석 차트를 나타낸다⁷.
도 4는 USH2A 유전자 돌연변이 부위의 편집 효율을 반영하는 리포팅 시스템의 설계의 개략도를 나타낸다.
도 5는 USH2A 유전자 변이 부위의 편집 효율의 평가 지표의 개략도를 나타낸다.
도 6은 길이가 상이한 arRNA의 편집 효율의 테스트 결과를 나타낸다.
도 7은 리포팅 시스템에서 위양성 셀에 대한 FITC 채널의 강도를 나타낸다.
도 8은 LEAPER 기술에서 arRNA 길이와 편집 효율 간의 연관성을 나타낸다¹⁰.
도 9는 5' 및 3'로부터 중간까지 절단된 arRNA의 편집 효율의 테스트 결과를 나타낸다.
도 10은 arRNA의 3' 말단의 길이를 25nt로 고정하고, 5'로부터 점차적으로 절단한 후의 편집 효율의 테스트 결과를 나타낸다.
도 11은 표적으로 하는 염기의 위치가 편집 효율에 미치는 영향을 나타낸다.
도 12는 동일한 배치의 arRNA 편집 효율의 반복 테스트의 결과에 대한 비교를 나타낸다. 도면에서, 293T는 리포팅 시스템에 감염되지 않은 293T를 나타내고; "리포팅 시스템 단일"은 리포팅 시스템에 감염된 293T이고; 배지 대조군(Opti-DMEM)은 형질감염에서 RNAi MAX가 없는 배지의 블랭크 대조군이고; "전달 벡터 단일 대조군"은 단지 RNAi MAX를 포함하며, 이전의 테스트에서 대조군(NC) 웰에 대응하는 대조군이고; "랜덤 서열 RNA"는 인간 게놈과 일치하지 않는 91nt 랜덤 RNA 서열이다(uaauccugaauaucgcgcaauuccccagcagagaacaucgcggugugaacgucccuuuauaccgggcagguauagcugaaaucagcguggc(SEQ ID NO: 35)).
도 13은 동일한 배치 arRNA의 차세대 시퀀싱을 통해 얻어진 편집 효율의 반복 실험 결과에 대한 비교를 나타낸다.
도 14는 유리체내 주사를 통해 AAV2 및 AAV5에 의해 전달된 arRNA의 생체내 편집 효율을 나타낸다.
도 15는 망막하 주사에 의해 경시에 따른 AAV5 및 AAV8에 의해 전달된 arRNA의 생체내 편집 효율을 나타낸다.

본 출원은 II형 어셔 증후군의 병원성 유전자 USH2A에서 가장 높은 비율을 차지하는 돌연변이 NM_206933.2(USH2A)_c.11864G>A(p.Trp3955Ter)에서 새로운 기술적 해결방안을 도출하는 것, 즉 오버사이징 핵산 또는 외인성 단백질 분자를 도입하지 않는 조건 하에서, AAV에 의해 표적 RNA 상의 돌연변이 부위를 정밀하게 편집하여, 어셔린 단백질의 완전한 기능성을 회복하고, 또한 어셔린 단백질의 기능을 장기간 지속적으로 유지하는 것을 목표로 한다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 출원은 세포에서 전사되는 NM_206933.2(USH2A)_c.11864G>A(p.Trp3955Ter) 돌연변이 부위를 포함하는 표적 RNA의 표적화 편집을 위한 LEAPER 기술 기반 방법(이하, 돌연변이 편집 방법이라고 함), NM_206933.2(USH2A)_c.11864G>A(p.Trp3955Ter) 돌연변이 부위를 표적으로 하는 arRNA, 상기 arRNA를 포함하는 구축물, 상기 돌연변이 편집 방법에 의해 제조되는 세포, 세포에서의 표적 RNA를 편집하기 위한 키트, 개체에서 NM_206933.2(USH2A)_c.11864G>A(p.Trp3955Ter) 돌연변이에 의해 유발되는 질병을 치료하기 위한 방법(이하, 치료 방법이라고 함), 및 상기 돌연변이 편집 방법 또는 치료 방법에 사용하기 위한 제제를 제공한다.

규정

RNA 편집은 진핵 세포에서 존재하는 자연적인 단계를 의미한다. RNA 편집은 DNA 전사 후 및 단백질 번역 전에 RNA 레벨에서 발생하는 염기 A(아데닌)를 염기 I(하이포잔틴)로 편집하는 것이다. 하이포잔틴(I)은 번역 동안에 G로 인식되며, RNA에서 A의 I로의 편집은 전사체를 다양화한다. RNA의 총량은 RNA 분자의 부위 특이적이고 정밀한 변형에 의해 수 배 증가된다. 이 편집은 ADAR(RNA에 작용하는 아데노신 탈아미노효소) 프로테아제에 의해 촉매되며, 부위 지정 RNA 편집이라고 한다. 이 편집은 인트론 및 엑손 서열을 포함하는 코딩 영역뿐만 아니라, 비코딩 영역에서도 발생할 수 있으며, 코딩 영역의 편집은 단백질의 코딩 서열을 재규정할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, "LEAPER 기술", 즉 조작된 RNA로 내인성 ADAR을 리크루팅하여 RNA를 편집하는 기술은 WO2020074001A1에 보고된 바와 같은 RNA 편집 기술을 의미한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 조작된 RNA, 즉 아데노신 탈아미노효소 리크루팅 RNA(arRNA)는 ADAR 또는 ADAR 도메인을 포함하는 특정 복합체를 리크루팅함으로써 RNA에서 표적 아데노신을 탈아미노화할 수 있는 RNA를 의미한다. arRNA는 일종의 가이드 RNA이다. 본 출원에 있어서, "가이드 RNA"는 표적 RNA와 상보적인 혼성화 및 상기 표적 염기를 변형시킬 수 있는 효소를 리크루팅하여 표적 염기를 변형시키는 것을 의미한다. 가이드 RNA에는 arRNA 뿐만 아니라 CRISPR와 같은 다른 편집 시스템용 gRNA가 포함된다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "아데노신 탈아미노효소(ADAR)"는 RNA 분자에서 아데노신 A의 이노신 I로의 전환을 촉매할 수 있는, 진핵생물(인간과 같은 포유동물을 포함함)의 다양한 조직에서 다양하게 발현되는 아데노신 탈아미노효소 효소의 부류를 의미한다. 진핵생물의 단백질 합성 단계에서, I는 일반적으로 G로 번역된다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 핵산의 "상보성"은 종래의 왓슨-크릭 염기쌍을 통해 다른 핵산 사슬과 수소 결합을 형성하는 하나의 핵산 사슬의 능력을 의미한다. 상보성 백분율은 다른 핵산 분자와 수소 결합(즉, 왓슨-크릭 염기쌍)을 형성할 수 있는 하나의 핵산 분자 중의 잔기의 백분율(예를 들면, 10 중의 약 5, 6, 7, 8, 9, 10은 각각 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 및 100% 상보인 것으로 나타내어짐)을 나타낸다. "완전히 상보적인"은 핵산 서열의 모든 인접 잔기가 제 2 핵산 서열에서 동일한 수의 인접 잔기와 수소 결합을 형성함을 의미한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "실질적으로 상보적인"은 약 40, 50, 60, 70, 80, 100, 150, 200, 250개 이상의 뉴클레오티드의 영역에 걸쳐 적어도 약 70%, 75%, 80% 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 임의의 상보성 정도를 의미하거나; 또는 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 2개의 핵산을 의미한다. 단일 염기 또는 단일 뉴클레오티드에 대해, 왓슨-크릭 염기쌍 원리에 따라, A가 T 또는 U와 쌍을 이루고, C가 G 또는 I와 쌍을 이룰 때, 이를 상보적 또는 일치라고 하고, 그 반대의 경우도 마찬가지이며; 또한 다른 염기쌍은 모두 비상보적 또는 불일치라고 한다.

"혼성화"는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 반응하여 뉴클레오티드 잔기의 염기 사이의 수소 결합에 의해 안정화되는 복합체를 형성하는 반응을 의미한다. 상기 수소 결합은 왓슨 크릭 염기쌍, 후그스틴 결합, 또는 임의의 다른 서열 특이적 방식으로 발생할 수 있다. 소정의 서열에 혼성화할 수 있는 서열은 소정의 서열의 "상보적 서열"로 지칭된다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "도입"은 핵산 및 단백질과 같은 생체거대분자를 일부 수단에 의해 세포막 외부로부터 세포막으로 도입하는 것을 의미한다. "도입"에는 스팟 형질감염, 리포펙션, 지질-나노입자 전달 등이 포함된다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "전기천공법"은 DNA와 같은 거대분자를 세포에, 및 결과적으로 세포의 핵 내로 전달하기 위해 수 마이크로초 내지 수 밀리초 동안에 세포에 전기장을 인가함으로써 세포막에 작은 기공 또는 구멍을 일시적으로 형성하는 전기천공 형질감염 기술을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "리포펙션(리포)"은 생체내 및 시험관내 전달 비히클로서 리포솜을 사용하는 형질감염 기술을 의미한다. 리포솜에는 중성 리포솜 및 양이온성 리포솜이 포함되며, 여기서 중성 리포솜은 지질막을 사용하여 핵산과 같은 거대분자를 캡슐화함으로써 지질막에 의해 거대분자를 세포막으로 전달하고; 양이온성 리포솜은 양전하를 띠고, 이에 의해 전달된 거대분자는 프리-포매되어 있지 않고, 거대분자 자체의 음전하로 인해 양전하를 띤 리포솜에 자동으로 결합하여 거대분자-양이온성 리포솜 복합체를 형성하고, 음전하를 띤 세포막 표면에 흡착되어 엔도사이토시스를 통해 세포 내로 전달된다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "지질-나노입자(LNP) 전달"은 지질 나노입자를 통한 세포 내로의 핵산 및 단백질과 같은 거대분자의 막관통 전달을 의미한다. 이들 중에서, 지질 나노입자는 이온성 지질, 보조 인지질, 콜레스테롤 및 PEG 지질을 함유하는 에탄올 상, 및 핵산 및 단백질 등의 큰 분자를 함유하는 산성 수상의 두 가지 상을 혼합하여 합성되는 펠릿을 의미한다. 예를 들면, RNA가 패킹된 LNP는 엔도사이토시스를 통해 세포질로 진입할 수 있다.

본문에 있어서, NM_206933.2(USH2A)_c.11864G>A(p.Trp3955Ter) 돌연변이는 인간 USH2A 유전자에서 NM_206933.2(USH2A) 유전자 전사체의 11864번 위치에서 G의 A로의 변화에 대응하는 돌연변이를 의미하고, 돌연변이는 전사체로부터 번역된 펩티드의 위치 3955번에 있는 트립토판(Trp)의 인코딩 서열을 종결 코돈으로 변형시켜, 최종 번역의 아미노산이 위치 3955 이후의 모든 아미노산이 결실되도록 함으로써, 어셔린의 단백질 활성을 상실한다. 이 돌연변이를 가진 환자는 원추 세포와 간상 세포의 퇴행성 사멸을 일으켜, 결과적으로 실명에 이르게 된다. 본 출원의 기술적 해결방안은 전사 레벨에서 이 돌연변이를 역전시켜 어셔린 단백질의 활성을 복원할 수 있다. 본 출원의 일부 실시형태에 있어서, NM_206933.2(USH2A)_c.11864G>A(p.Trp3955Ter) 돌연변이 부위는 USH2A 병원성 부위라고도 한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "표적 RNA"는 USH2A 유전자로부터 전사되고, G의 A로의 돌연변이를 포함하는 편집되는 관심의 RNA를 의미한다. 표적 RNA는 성숙한 mRNA 또는 mRNA 전구체일 수 있다. 본 출원에 있어서, mRNA 전구체는 보다 바람직하다. 일부 실시형태에 있어서, "표적 RNA"는 NM_206933.2(USH2A)_c.11864G>A(p.Trp3955Ter) 돌연변이 부위를 함유하는 RNA이다. "표적 RNA"에서 G의 A로의 돌연변이 부위의 전사에 의해 형성된 A 염기는 "표적 아데노신" 또는 "표적 A"라고 한다. arRNA에서 "표적 A"에 대응하는 염기는 "표적으로 하는 염기"라고 한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "AAV"는 "아데노 관련 바이러스" 또는 "아데노 관련 바이러스 벡터"를 의미한다. 본문에 있어서, "AAV", "아데노 관련 바이러스" 및 "아데노 관련 바이러스 벡터"는 달리 명시되지 않는 한, 상호교환적으로 사용될 수 있다. AAV는 외피가 없는 단일-가닥의 선형 DNA 바이러스인 마이크로바이러스 계열에 속한다. 외인성 유전자는 아데노 관련 바이러스를 사용하여 동물 조직 및 세포 내로 전달될 수 있다. 전달된 외인성 유전자는 숙주 게놈의 유전자 외부에 안정적으로 존재하여 발현될 수 있다. 예를 들면, AAV1, AAV2, AAV5, AAV8, 및 AAV9 등을 포함하는 다수의(12종의) 아데노 관련 바이러스 혈청형이 존재한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "환자" 또는 "피험체"는 상호교환적으로 사용될 수 있다. 본문에 있어서, 달리 명시되지 않는 한, "환자" 또는 "피험체"는 게놈에서 NM_206933.2(USH2A)_c.11864G>A(p.Trp3955Ter) 돌연변이를 갖는 인간 환자를 나타낸다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "전달"은 핵산 및 단백질과 같은 생체거대분자가 일부 수단에 의해 세포막 외부로부터 세포막으로 도입되는 것을 의미한다. 상기 "전달"은 전기형질감염, 리포펙션, 지질-나노입자 전달, 바이러스 전달, 엑소좀 전달 등과 같은 전달 방법을 의미한다. 본문에 있어서, 생체고분자와, 상기 생체고분자 또는 상기 생체고분자와 결합된 물질을 패키징하여 생체고분자가 세포막을 통과하여 세포 내로 진입하도록 촉진시키는데 사용되는 물질의 조합을 "전달 벡터"라고 한다. 예를 들면, 핵산 분자가 패키징되어 있는 리포솜, LNP, 엑소좀, 바이러스 입자 등이다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "구축물"은 선형 핵산 분자, 플라스미드 또는 바이러스 벡터 등일 수 있는 특정 핵산 서열을 함유하는 핵산 벡터를 의미한다. 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 특정 핵산 서열은 DNA 서열 또는 RNA 서열일 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 핵산 서열은 전사, 번역 또는 발현 없이 기능을 직접적으로 발휘한다. 일부 실시형태에 있어서, 핵산 서열은 DNA 서열이고, 전사를 통해 RNA를 형성한 후에 RNA 분자의 형태로 기능을 발휘한다. 일부 실시형태에 있어서, 핵산 서열은 RNA이고, 번역 후에 폴리펩티드 또는 단백질의 형태로 기능을 발휘한다. 일부 실시형태에 있어서, 핵산 서열은 DNA이고, 전사 및 번역 단계를 통해 단백질을 형성한 후에 단백질의 형태로 기능을 발휘한다. 구축물은 바이러스, 지질 나노입자 또는 엑소좀 등으로 패키징하여 표적 세포로 진입하거나, 또는 전기천공, 미세-주입, 화학적 형질전환 및 기타 방법을 통해 표적 세포로 진입할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "변형"은 핵산 또는 단백질의 하나 이상의 특징 또는 기능을 변화시키기 위해, 유전자 조작 방법과 같은 화학적 또는 생물학적 방법을 통해 핵산 또는 단백질의 구성 또는 구조를 변화시키는 것을 의미한다. 본 출원의 일부 실시형태에 있어서, arRNA의 변형은 세포 내로 도입된 후에 arRNA를 보다 안정하게 한다. 본문에 있어서, 표적화 염기의 3' 말단까지의 길이는 표적화 염기의 3'에 가장 가까운 염기로부터 3' 말단의 마지막 염기까지의 모든 염기의 수를 의미하고; 표적화 염기의 5' 말단까지의 길이는 표적화 염기의 5'에 가장 가까운 염기로부터 5' 말단의 마지막 염기까지의 모든 염기의 수를 의미한다.

본문에 있어서, 달리 규정하지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명의 분야의 당업자가 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다.

돌연변이의 편집 방법

본 출원은 LEAPER 기술에 기반한, 세포에서의 표적 RNA의 표적화 편집 방법을 제공하며, 상기 표적 RNA는 USH2A 유전자 전사체에서의 G의 A로의 돌연변이를 함유하는 RNA이고, 상기 방법은:

상기 표적 RNA를 편집하기 위한 아데노신 탈아미노효소 리크루팅 RNA(arRNA)를 포함하는 구축물 또는 상기 arRNA를 인코딩하는 구축물을 세포 내로 도입하는 단계를 포함하고, 상기 arRNA는 표적 RNA에 혼성화하는 상보적 RNA 서열을 포함하고, 상기 arRNA는 RNA에 작용하는 아데노신 탈아미노효소(ADAR)를 리크루팅하여, 상기 표적 RNA의 표적 아데노신이 탈아미노화한다.

일부 실시형태에 있어서, 표적 RNA는 mRNA 또는 mRNA 전구체(프리-mRNA)이고, 바람직하게는 표적 RNA는 프리-mRNA이다.

일부 실시형태에 있어서, arRNA의 길이는 >51nt, 바람직하게는 >61nt, 보다 바람직하게는 >65nt이다. 일부 실시형태에 있어서, arRNA의 길이는 66nt 내지 131nt, 예를 들면 약 151-61nt, 131-66nt, 121-66nt, 111-66nt, 91-66nt, 또는 81-66nt이다. 일부 실시형태에 있어서, arRNA의 길이는 66nt, 67nt, 68nt, 69nt, 70nt, 71nt, 72nt, 73nt, 74nt, 75nt, 76nt, 78nt, 79nt, 80nt, 83nt, 85nt, 88nt, 91nt, 96nt, 98nt, 100nt, 105nt, 108nt, 100nt, 105nt, 110nt, 115nt, 120nt, 125nt, 130nt 등으로부터 선택되는 임의의 자연수이다. 형질감염 효율이 동일하게 유지될 수 있는 조건 하에서, 바람직하게는 arRNA의 길이는 약 71nt, 예를 들면 66nt-76nt로부터 임의의 자연수의 nt이다.

일부 실시형태에 있어서, arRNA에서의 표적으로 하는 염기로부터 3' 말단까지의 길이는 ≥5nt, 예를 들면 ≥7nt, ≥10nt, ≥15nt, 예를 들면 16-55nt, 20-50nt, 25-45nt, 25-35nt, 또는 25-30nt로부터 선택되는 임의의 자연수의 nt이다. 일부 실시형태에 있어서, arRNA에서의 표적으로 하는 염기로부터 5' 말단까지의 길이는 ≥25nt, 예를 들면 ≥30, ≥35, ≥45, 예를 들면 46-90nt, 50-85nt, 55-80nt, 60-75nt, 또는 65-70nt로부터 선택되는 임의의 자연수의 nt이다.

일부 실시형태에 있어서, arRNA가 표적 RNA에 상보적으로 혼성화되는 경우, 표적 RNA 상의 표적 염기에 대응하는 arRNA의 표적으로 하는 염기의 선호도 순서는 높은 것부터 낮은 것 순으로 C, A, U 또는 G이다. 즉, 정상적인 경우에 있어서, 표적으로 하는 염기 이외의 길이와 서열이 동일하고, 표적으로 하는 염기가 각각 C, A, U, 또는 G인 arRNA의 경우, 순차적으로 편집 효율이 감소한다. 따라서, 가장 바람직하게는, arRNA의 표적으로 하는 염기는 C, A, U, 및 G의 순이다.

일부 실시형태에 있어서, 표적 RNA는 전사된 NM_206933.2(USH2A)_c.11864 G>A(p.Trp3955Ter) 돌연변이 부위를 포함하는 RNA이다. 일부 실시형태에 있어서, arRNA는 SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, 및 SEQ ID NO: 4로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에 있어서, arRNA는 바람직하게는 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, 및 SEQ ID NO: 9; 보다 바람직하게는 SEQ ID NO: 8, 또는 SEQ ID NO: 9로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

일부 실시형태에 있어서, 구축물은 선형 핵산, 바이러스 벡터, 및 플라스미드로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 선형 핵산은 단일 가닥 RNA, 또는 단일 가닥 DNA와 같은 단일 가닥 핵산; 및 이중 가닥 DNA, 또는 이중 가닥 RNA와 같은 이중 가닥 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 선형 핵산은 2'-O-Me 변형 및/또는 포스포로티오에이트 결합 변형과 같이 화학적으로 변형될 수 있다. 일부 특정 실시형태에 있어서, 선형 핵산은 시험관내에서 화학적으로 합성된다. 일부 특정 실시형태에 있어서, 선형 핵산은 세포 또는 유기체에 의해 합성된 후에 분리 및 추출에 의해 얻어진다. 일부 실시형태에 있어서, 구축물은 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터, 또는 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시형태에 있어서, AAV2, AAV5 또는 AAV8 캡시드 내로 패키징된 후에, AAV 벡터는 감염에 의해 세포 내로 도입된다. 일부 실시형태에 있어서, AAV8 캡시드 내로 패키징된 후에 AAV 벡터는 감염에 의해 세포 내로 도입된다. 일부 실시형태에 있어서, arRNA 코딩 서열은 장기간 발현을 위한 구축물에 의해 세포 게놈 내로 삽입된다. 일부 실시형태에 있어서, 구축물은 arRNA 코딩 서열이 존재하게 하고, 에피좀 핵산으로 해서 세포의 게놈 외부로 발현되게 한다.

일부 실시형태에 있어서, 세포는 진핵 세포이다. 일부 실시형태에 있어서, 세포는 포유동물 세포이다. 일부 실시형태에 있어서, 세포는 신경 세포이다. 일부 실시형태에 있어서, 신경 세포는 감각 신경 세포이다. 일부 실시형태에 있어서, 감각 신경 세포는 시신경 세포 및 청신경 세포로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에 있어서, 시신경 세포는 원추 세포 및/또는 간상 세포이다.

일부 실시형태에 있어서, 도입은 전기형질감염, 리포펙션, 지질-나노입자 전달, 또는 바이러스 감염이다. 본 출원의 실시형태에 있어서, 바이러스 감염이 바람직하다. AAV 또는 렌티바이러스 입자와 같은 감염성 바이러스 입자는, 예를 들면 arRNA-인코딩 바이러스 구축물을 바이러스 캡시드 내로 캡슐화함으로써 형성되고, 상기 arRNA-인코딩 서열은 바이러스 입자를 통한 세포 감염에 의해 세포 내로 도입된다.

기능성 arRNA

본 출원은 LEAPER 기술에 기반한, 세포에서의 표적 RNA의 표적화 편집을 위한 상술의 방법에 사용될 수 있는 arRNA(이하, 기능성 arRNA라고 함)를 더 제공한다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 방법은 NM_206933.2(USH2A)_c.11864G>A (p.Trp3955Ter) 돌연변이 부위를 포함하는, 세포에서의 전사된 표적 RNA의 표적화 편집을 위한 LEAPER 기술 기반 방법이다. arRNA는 표적 RNA에 혼성화할 수 있는 상보적 RNA 서열을 포함하고, 상기 arRNA는 RNA에 작용하는 아데노신 탈아미노효소(ADAR)를 리크루팅하여, 상기 표적 RNA에서 표적 아데노신이 탈아미노화될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, arRNA에 의해 표적화된 표적 RNA는 mRNA 또는 프리-mRNA, 바람직하게는 프리-mRNA로부터 선택된다.

일부 실시형태에 있어서, arRNA의 길이는 >51nt, 바람직하게는 >61nt, 보다 바람직하게는 >65nt이다. 일부 실시형태에 있어서, arRNA의 길이는 약 151-61nt, 131-66nt, 121-66nt, 111-66nt, 91-66nt, 또는 81-66nt이다. 일부 실시형태에 있어서, arRNA의 길이는 66nt 내지 131nt, 예를 들면 66nt, 67nt, 68nt, 69nt, 70nt, 71nt, 72nt, 73nt, 74nt, 75nt, 76nt, 78nt, 79nt, 80nt, 83nt, 85nt, 88nt, 91nt, 96nt, 98nt, 100nt, 105nt, 108nt, 100nt, 105nt, 110nt, 115nt, 120nt, 125nt, 130nt 등으로부터 선택된 임의의 자연수이다. 형질감염 효율이 동일하게 유지될 수 있는 조건 하에서, 바람직하게는 arRNA의 길이는 약 71nt, 예를 들면 66nt-76nt로부터 선택되는 임의의 자연수의 nt이다.

일부 실시형태에 있어서, arRNA에서의 표적으로 하는 염기로부터 3' 말단까지의 길이는 >5nt, 예를 들면 >7nt, >10nt, >15nt, 이를 테면 16-55nt, 20-50nt, 25-45nt, 25-35nt, 또는 25-30으로부터 선택되는 임의의 자연수의 nt이다. 일부 실시형태에 있어서, arRNA에서의 표적으로 하는 염기로부터 5' 말단까지의 길이는 ≥25nt, 예를 들면 ≥30, ≥35, ≥45, 이를 테면 46-90nt, 50-85nt, 55-80nt, 60-75nt, 또는 65nt-70nt로부터 선택되는 임의의 자연수의 nt이다.

일부 실시형태에 있어서, arRNA가 표적 RNA에 상보적으로 혼성화되는 경우, 표적 RNA 상의 표적 염기에 대응하는 arRNA의 표적으로 하는 염기의 선호도 순서는 C, A, U, 또는 G이다. 즉, 정상적인 경우에 있어서, 표적으로 하는 염기 이외에 길이와 서열이 동일하고, 표적으로 하는 염기가 각각 C, A, U, 또는 G인 arRNA의 경우, 순차적으로 편집 효율이 감소한다. 따라서, 가장 바람직하게는, arRNA의 표적으로 하는 염기는 C, A, U, 및 G의 순이다.

일부 실시형태에 있어서, arRNA는 SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, 및 SEQ ID NO: 4로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 일부 실시형태에 있어서, arRNA는 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, 및 SEQ ID NO: 9, 보다 바람직하게는 SEQ ID NO: 8 또는 SEQ ID NO: 9로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에 있어서, 표적 서열에서 표적 A와 쌍을 이루기 위해 arRNA 내로 도입되는 표적으로 하는 염기의 편집 효율은 내림차순으로 C, A, U, G이고, 즉 표적으로 하는 염기 이외의 길이 및 서열이 동일하고, 표적으로 하는 염기가 각각 C, A, U, G인 arRNA의 경우, 편집 효율이 순차적으로 감소한다. 따라서, 가장 바람직하게는, arRNA의 표적으로 하는 염기는 C, A, U 및 G의 순이다.

기능성 구축물

본 출원은 arRNA를 인코딩하는 구축물(이하, 기능적 구축물이라고 함)을 제공하며, 상기 기능적 구축물은 LEAPER 기술에 기반한, 세포에서의 표적 RNA의 표적화 편집을 위한 상술의 방법에 사용될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 방법은 전사된 NM_206933.2(USH2A)_c.11864G>A(p.Trp3955Ter) 돌연변이 부위를 포함하는, 세포에서의 표적 RNA의 표적화 편집을 위한 LEAPER 기술 기반 방법이며; 상기 arRNA는 상술의 기능성 arRNA를 함유한다.

일부 실시형태에 있어서, 구축물은 선형 핵산, 바이러스 벡터, 또는 플라스미드로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 선형 핵산은 단일-가닥 핵산, 예를 들면 단일-가닥 RNA 또는 단일-가닥 DNA; 및 이중-가닥 핵산, 예를 들면 이중-가닥 DNA 또는 이중-가닥 RNA를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 선형 핵산은 2'-O-ME 변형 및/또는 포스포로티오에이트 결합 변형과 같이 화학적으로 변형될 수 있다. 일부 특정 실시형태에 있어서, 선형 핵산은 시험관내에서 화학적으로 합성된다. 일부 특정 실시형태에 있어서, 선형 핵산은 세포 또는 유기체에 의해 합성된 후에 분리 및 추출에 의해 얻어진다. 일부 실시형태에 있어서, 구축물은 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터, 또는 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시형태에 있어서, AAV 벡터는 AAV2, AAV5 또는 AAV8 캡시드에 패키징되어 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스 입자를 형성하고, 이에 의해 AAV 벡터는 바이러스 입자에 의한 세포 감염을 통해 세포 내로 도입된다. 일부 실시형태에 있어서, 바람직하게는 구축물은 AAV8 내로 패키징된다. 일부 실시형태에 있어서, arRNA 코딩 서열은 장기간 발현을 위한 구축물에 의해 세포 게놈 내로 삽입된다. 일부 실시형태에 있어서, 구축물은 arRNA 코딩 서열이 존재하게 하고, 에피좀 핵산으로서 세포의 게놈 외부에 발현되게 한다.

본 출원은 선형 핵산, 플라스미드, 및 바이러스 벡터로 이루어지는 군으로부터 선택되는 상술의 기능성 arRNA를 함유하는 구축물을 제공한다. 본 출원은 구축물을 포함하는 전달 벡터를 더 제공하고, 전달 벡터는 바이러스 입자, 리포솜, 지질 나노입자 및 엑소좀으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

세포

본 출원은 LEAPER 기술에 기반한, 세포에서의 표적 RNA의 표적화 편집을 위한 상술의 방법에 의해 편집되고 제조될 수 있는 세포를 더 제공한다. 일부 실시형태에 있어서, 세포는 NM_206933.2(USH2A)_c.11864G>A(p.Trp3955Ter) 돌연변이 부위를 갖는 환자로부터의 세포이고, 돌연변이 부위로부터 전사된 표적 RNA에서 표적 염기 A는 탈아미노화되어, 상술한 돌연변이 편집 방법에 의해 염기 I를 형성하고, 상기 "I"는 어셔린 단백질의 완전한 기능을 회복하기 위한 후속 번역 과정에서 G로 인식될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 환자의 세포는 줄기 세포 또는 유도된 다능성 줄기 세포이고, 줄기 세포 또는 상기 줄기 세포로부터 유도에 의해 분화된 세포는 환자에서 특정 위치에 이식될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 줄기 세포는 시험관내에서 건강한 원추 세포 및/또는 시각 간상 세포로 유도 및 분화된 후에 기능을 발휘하기 위해 환자의 눈의 특정 위치에 다시 이식될 수 있다.

키트

본 출원은 상술한 기능성 arRNA 또는 arRNA를 인코딩하기 위한 상술의 기능성 구축물을 함유하는, 세포에서의 표적 RNA를 편집하기 위한 키트를 더 제공한다. 일부 실시형태에 있어서, 키트는 NM_206933.2(USH2A)_c.11864G>A(p.Trp3955Ter) 돌연변이를 편집하는데 사용될 수 있는 핵산, 플라스미드, 게놈, 및 세포 등을 포함한다. 또한, 일부 실시형태에 있어서, 키트는 기능성 arRNA 또는 기능성 구축물을 용해시키기에 적합한 용제를 추가로 포함한다. 또한, 일부 실시형태에 있어서, 키트는 키트에 포함된 다양한 성분 및 그것의 내용물, 및/또는 키트를 사용하는 방법을 사용자에게 공지하는 지침서를 추가로 포함한다.

치료 방법

본 출원은 NM_206933.2(USH2A)_c.11864G>A(p.Trp3955Ter) 돌연변이에 의해 유발되는 개체에서의 질병을 치료하는 방법(이하, 치료 방법이라고 함)을 더 제공하며, 상기 방법은 전사된 NM_206933.2(USH2A)_c.11864G>A(p.Trp3955Ter) 돌연변이 부위를 포함하는 세포에서의 표적 RNA의 표적화 편집을 위한 LEAPER 기술에 기반한 상술의 방법을 이용하여 NM_206933.2(USH2A)_c.11864G>A(p.Trp3955Ter) 돌연변이 부위와 관련된 각각의 세포에서의 표적 RNA에서 돌연변이를 교정하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 질병은 II형 어셔 증후군을 포함한다.

일부 실시형태에 있어서, 상기 치료 방법은 표적 RNA를 편집하기 위한 arRNA 또는 상기 arRNA를 인코딩하는 구축물을 피험체의 망막하 공간 또는 유리체 내로 주사하는 단계를 포함한다. 일부 바람직한 실시형태에 있어서, 치료 방법은 표적 RNA를 편집하기 위한 arRNA 또는 상기 arRNA를 인코딩하는 구축물을 피험체의 망막하 공간 내로 주사하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 치료에서 피험체에 대해 단 1회의 주사가 요구된다. 일부 실시형태에 있어서, 치료에서 피험체에 대해 규칙적인 간격의 주사가 요구된다. 일부 특정 실시형태에 있어서, 치료 시 2개월 이상의 간격으로 피험체에게 주사가 요구되며, 예를 들면 1년, 10년, 20년 또는 30년 등의 간격으로 피험체에게 주사가 요구된다.

제형

또한, 본 출원은 상술한 기능성 arRNA, 또는 상기 arRNA 또는 이것들의 전달 벡터를 인코딩하는 상술의 기능성 구축물을 포함하는 제형을 추가로 제공한다. 일부 실시형태에 있어서, 제형은 기능성 arRNA, 또는 기능성 구축물 또는 그것의 전달 벡터, 및 형질감염 시약을 포함한다. 일부 특정 실시형태에 있어서, 기능성 arRNA 또는 기능성 구축물은 리피도솜에 패키징된다. 일부 특정 실시형태에 있어서, 기능성 arRNA 또는 기능성 구축물은 지질 나노입자를 형성하도록 제조된다. 일부 실시형태에 있어서, 제형에 포함되는 기능적 구축물은 AAV 또는 렌티바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터이고, 제형은 살아있는 바이러스 또는 바이러스 동결건조 분말을 포함한다. 따라서, 제형은 인간 알부민, 젤라틴, 수크로오스 등과 같은 적합한 안정화제를 추가로 포함한다.

이상, 본 발명의 바람직한 구현예를 상세하게 설명하였지만, 본 발명은 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 기술적 개념의 범위 내에서, 본 발명의 기술적 해결방안에 기초하여, 각각의 기술적 특성을 다른 적절한 방식으로 조합하는 것을 포함하여 다양한 단순한 변형이 이루어질 수 있다. 이들 단순한 변형 및 조합은 또한 본 발명에 의해 개시되는 내용으로서 간주되어야 하며, 모두 본 발명의 보호 범위에 속한다. 이하, 구체적인 실시예를 참조하여 본 발명의 기술적 방안을 더욱 상세하게 설명하지만, 달리 명시하지 않는 한, 본 발명은 하기 실시예에 한정되는 것은 아니고, 이하에 기재된 시약은 모두 상업적으로 이용가능하다. 간결함을 위해, 일부 동작에서 동작 파라미터, 단계 및 사용된 도구는 상세하게 설명되지 않으며, 이들은 잘 알려져 있고 당업자에 의해 재현될 수 있음을 이해해야 한다.

실시예

실시예 1: 리포팅 시스템의 구축

본 출원은 주로 LEAPER 기술에 의한 NM_206933.2(USH2A)_c.11864G>A(p.Trp3955Ter) 돌연변이 부위의 복구를 연구한다. 따라서, 본 사이트의 편집 효율을 반영할 수 있는 간단하고 사용 가능한 리포팅 시스템이 요구된다. USH2A 유전자의 병원성 돌연변이 부위 NM_206933.2(USH2A)_c.11864G>A(p.Trp3955Ter)에 의해 야기되는 원래의 TGG 코돈으로부터 TAG 코돈으로의 돌연변이는 넌센스 돌연변이이기 때문에, 돌연변이된 mRNA는 번역 동안에 새로 형성된 TAG 종결 코돈에서 정지할 수 있고, 결과적으로 후속 서열은 단백질의 번역을 계속할 수 없다. 상기 특징을 이용하여, 본 출원은 도 4에 나타낸 바와 같은 리포팅 시스템을 설계하였다. 리포팅 시스템은 렌티바이러스 벡터를 사용하며, 도 4에 나타낸 mRNA는 CMV 프로모터에 의해 구동된다. 이 mRNA의 단편은 주로 이하의 부분으로 구성되고: 1) mCherry 적색 형광 단백질 서열로서, 안정적으로 발현되어 편집 여부에 관계없이 정상적으로 번역될 수 있으므로, 적색 형광 강도가 내부 참조로서 사용될 수 있고; 2) USH2A 유전자 돌연변이 부위 및 각각의 측면에 인접한 100개의 염기쌍으로서, 이 영역은 질병-관련 서열이고; 상기 2) 부분의 서열은 USH2A c.11864 부위에서 G의 A로의 점돌연변이 후에 NM_206933.2 서열의 12203-12403 위치로부터 총 201개의 염기쌍을 취하고, 이 서열의 리딩 프레임(프레임 내)에는 TAG 정지 코돈이 존재하므로, 번역 단계 동안에 여기서 번역이 정지되고; 3) GFP(녹색 형광 단백질) 서열로서, 상기 단백질은 녹색 형광을 방출할 수 있고, 형광 강도는 유세포 분석기의 FITC 채널에 의해 검출될 수 있고(GFP 서열은 USH2A-관련 서열과 동일한 판독 프레임에 존재하고, 그 하류에 위치하고 있기 때문임), USH2A-관련 서열에서 TAG 정지 코돈이 LEAPER 기술에 의해 편집되지 않으면, TAG 정지 코돈으로 인해 후속 GFP가 정상적으로 번역되지 않고, 녹색 형광이 나타나지 않고; USH2A-관련 서열에서 TAG 정지 코돈이 LEAPER 기술에 의해 성공적으로 편집되어 TIG 코돈을 형성하면, 정지 코돈은 사라질 수 있고, 후속의 GFP 번역이 계속되며, 녹색 형광이 나타날 수 있고; 4) P2A와 T2A 서열은 mCherry의 하류와 GFP의 상류에 삽입되고, 번역 동안에 이들 2개의 서열의 펩티드 결합 중 하나는 입체 장애로 인해 정상적으로 형성될 수 없고, 따라서 USH2A와 관련된 중간 서열의 201개의 염기쌍인 mCherry의 3개의 부분과 GFP는 번역 단계 동안에 분리되어, 중간에 삽입된 USH2A-관련 서열이 mCherry와 GFP의 기능에 영향을 미치지 않을 수 있다.

상기 서열의 전체 서열은 당업계의 통상적인 기술을 통해 시험관내에서 합성된다. 특정 서열은 SEQ ID NO: 1에 나타내어져 있으며, 이 서열은 CMV 프로모터 후의 다중 클로닝 부위를 통해 pCDH-CMV 벡터 내로 클로닝된다. pCDH-CMV 벡터 플라스미드는 Kazuhiro Oka로부터 제공받았다(Addgene plasmid #72265; http://n2t.net/addgene:72265; RRID: Addgene_72265). 구축된 플라스미드는 차세대 렌티바이러스 패키징 시스템을 통해 렌티바이러스 내로 패키징되고(pCAG-VSVG는 Arthur Nienhuis & Patrick Salmon으로부터 제공받았음, Addgene plasmid #35616; http://n2t.net/addgene:35616; RRID:Addgene_35616; pCMVR8.74는 Didier Trono로부터 제공받았음, Addgene plasmid #22036; http://n2t.net/addgene:22036; RRID:Addgene_22036), 293T 세포를 감염시키는데 사용된다. 감염 48시간 후에 mCherry-양성 세포 집단은 유세포 분석에 의해 분류되고, 이 세포 집단의 세포는 리포팅 시스템의 최종 세포이며, 상기 형광 임계값은 감염되지 않은 293T 세포 또는 형광 강도가 임계값보다 높은 미처리 대조군 리포팅 시스템의 세포수가 1% 미만(가능한 한 1%에 근접함)이 될 때까지 조정되며, 이 때 형광 강도가 형광 임계값보다 높은 세포는 양성 세포로 간주된다. 리포팅 시스템의 테스트에 대해, 일반적으로 도 5에 나타낸 바와 같이 두 가지의 평가 지표가 존재한다: 1. GFP-양성 세포의 비율(%GFP로 축약됨); 2. GFP+ 세포의 평균 형광 강도(MFI). 그 중에서, GFP-양성 세포의 비율(즉, GFP의 강도)이 본 출원에서 규정된 GFP 양성 임계값의 세포 비율보다 높다. %GFP의 레벨은 편집된 세포의 수를 나타낸다. GFP-양성 세포 중에서, 상이한 세포의 상이한 형광 강도로 인해, 리포팅 시스템의 편집 효율 테스트에는 MFI가 추가로 포함된다. 각 웰에서의 세포는 내부 참조와 유사한 적색 형광 강도를 가지므로, GFP% 및 MFI가 높을수록 테스트 조건 하에서 웰에서의 세포의 USH2A 병원성 돌연변이 부위에 대한 편집의 정도가 높은 것으로 간주된다.

SEQ ID NO: 1: 소문자의 서열은 질병-관련 서열을 나타내며, 동일한 염기의 대문자 또는 소문자는 상이한 염기 유형을 나타내지 않는다.

실시예 2: 병원성 돌연변이 부위를 목적으로 하는 arRNA 최적화

LEAPER 기술은 임의의 외인성 단백질을 세포 내로 도입할 필요가 없기 때문에, 병원성 부위에 대한 LEAPER의 편집을 테스트할 때에, 이 실시예에 있어서 리포팅 시스템 세포 내로 arRNA만 도입되도록 요구된다. 이 실시예에 있어서, arRNA는 시험관내에서 합성되고, 서열은 하기 표 1에 나타낸다. 이들 서열은 두 가지 방식으로 명명되며, 특히 "명칭"은 서열의 길이 또는 잘린 길이에 따라 명칭이 명명되고, "통합 명칭"은 X-C-Y 형식으로 명명되고, 여기서, "X"는 5' 말단의 길이를 나타내고, "Y"는 3' 말단의 길이를 나타내며, 또한 "C"는 표적으로 하는 염기 C를 나타낸다. 예를 들면, 111nt는 55-C-55로 명명되고, 이는 5' 말단과 3' 말단의 길이가 모두 55nt임을 의미한다.

이 실시예의 모든 테스트에서, RNAi MAX 시약(Invitrogen 13778150)은 arRNA를 세포 내로 도입하는데 사용된다. 구체적인 단계는 이하와 같다:

1. 세포 배양에는 10% FBS(Vistech SE100-011)를 함유하는 DMEM(Hyclone SH30243.01)이 사용된다. 12웰 플레이트는 리포팅 시스템에서 세포에 대해 15,000개 세포/웰인 세포를 배양하는데 사용된다. 세포 도말 시점은 0시간으로 기록된다.

2. 세포 계대 24시간 후에, RNAi MAX 시약을 사용하여 12.5pmol의 arRNA를 각각의 웰 내로 전달한다. 형질감염 단계에서는 공급업체의 지침을 참조하길 바란다.

3. 세포 계대 72시간 후에, 트립신(Invitrogen 25300054)을 이용하여 전체 웰의 세포를 소화시키고, FITC 채널에서 세포의 형광 강도를 유세포 분석기로 분석한다.

먼저, arRNA는 LEAPER(Leveraging Endogenous ADAR for Programmable Editing of RNA, Qu 등., 2019년, 이 문헌에서 세포관내에서 합성된 arRNA에 대해, 단지 111nt의 길이를 갖는 arRNA가 테스트에 사용됨), 즉 병원성 돌연변이 부위에서 염기 A(표적 A)의 반대 위치의 표적으로 하는 염기가 C로 확인되고, 표적화된 염기의 5' 말단 및 3' 말단의 서열 길이가 동일하게 이루어진다. 111nt(55-C-55)의 총 길이를 갖는 arRNA에 기반하여(참조와 일치), 5' 말단과 3' 말단이 동시에 절단되어 본 출원에 사용된 다양한 테스트용 arRNA를 형성한다. 시험관내 합성 RNA의 한계로 인해, 현재 단계에서는 시험관내에서 더 긴 RNA를 합성하는 것은 어렵다. 따라서, 이 실시예에서는 단지 111nt, 91nt, 71nt 및 51nt의 길이를 갖는 4개의 arRNA를 테스트하고, 편집 효율의 결과를 도 6에 나타내었다.

구체적으로, "대조군"은 임의의 arRNA가 없는 대조군 웰을 의미한다. 도 6으로부터 알 수 있는 바와 같이, 백그라운드로서의 대조군 웰에서 GFP 양성 세포는 매우 적고(약 0.6%), 대조적으로 111nt, 91nt 및 71nt의 세 가지 arRNA에 의해 유발된 %GFP는 모두 90%를 초과하는데 반해, 51nt에 대한 양성 비율은 매우 낮다. 평균 형광 강도의 플롯으로부터 백그라운드로서의 대조군 웰에서 위양성 세포가 소량 존재하며, 도 7에서 나타낸 바와 같이, 이들 세포가 매우 적은 비율을 차지하지만, 형광 강도가 높다는 것을 알 수 있다.

의외로, 상기 LEAPER 참조에서 보고된 것과 달리, 본 출원은 51-111nt arRNA에 의해 바람직한 편집 결과를 달성할 수 있음을 발견하였지만, 편집 시 arRNA가 더 길수록 효율적인 것은 아니다. 도 8에 나타낸 바와 같이, 상기 LEAPER 참조에서 보고된 것(Que 등., 2019년의 도 2d와 마찬가지임)에 따르면, 그것의 리포팅 시스템에서 51-111nt arRNA 사이의 비교가 실시된다. 구체적으로는, 71nt의 GFP+ 세포의 비율이 111nt의 것보다 낮으며, 길이 대 편집 효율의 관계는 편집 효율이 기본적으로 51nt로부터 111nt까지 증가하는 관계에 있음을 알 수 있다. 실시예 1에 있어서의 리포팅 시스템의 테스트에 있어서, 71nt에 의한 GFP 양성 세포의 비율은 111nt의 것과 크게 다르지 않은 반면에, 71nt의 평균 형광 강도는 111nt의 것보다 높다.

둘째, arRNA가 길수록 합성하는데 보다 비용이 많이 들고, arRNA가 길수록 오프표적 가능성이 더욱 커질 수 있기 때문에, 본 출원에서는 다양한 수단으로 절단된 arRNA의 편집 효율이 테스트된다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 표적으로 하는 염기 C는 111nt arRNA 서열(SEQ ID NO: 2)에 대하여 중간점으로 설정되며, 테스트용 arRNA를 얻기 위해 10nt의 단계에서 5' 말단의 상류 또는 3' 말단의 하류로부터 중간까지 점차적으로 절단된다.

도 9로부터, 5' 말단으로부터 절단된 경우에 결과는 LEAPER 참조에서의 보고와 일치하고, 즉 비교적 RNA가 길수록 편집 효율이 더 높지만; 상이한 점은 3' 단부로부터 절단된 경우에 편집 효율이 점차 감소하지 않고, 반대로 3' 단부가 30nt까지 절단된 경우에 가장 높은 편집 효율이 나타난다는 것을 알 수 있다. 3' 말단으로부터 30nt가 절단되고, 이 때의 arRNA의 길이가 55-C-25인 경우에 가장 높은 편집 효율이 나타나므로, 이하의 실험에 있어서, 3' 말단의 길이를 25nt로 설정하고, 5' 말단으로부터 계속 절단을 행하여 테스트용 arRNA를 얻고, 결과를 도 10에 나타내었다.

도 10에 있어서의 "3'-절단 30" 및 "55-C-25" 및 도 9에 있어서의 "3' 말단 절단"의 "-30"은 동일한 arRNA 서열(SEQ ID NO: 8)이고, 상기 도 10에 있어서의 "3'-절단 30" 및 도 9에 있어서의 "3' 말단 절단"의 "-30"은 동일한 배치에서 합성되며, "55-C-25"의 합성 배치와 상이하다." 도 10으로부터, 3' 말단이 25nt로 고정되고, 5' 말단이 절단된 경우, 편집 효율은 기본적으로 5'의 길이 감소와 함께 감소되는 경향을 보이는 것을 알 수 있다. 40-C-25는 상기 경향을 따르지 않지만, MFI나 %GFP는 55-C-25를 초과하지 않는다.

마지막으로, 길이 이외에, 표적으로 하는 염기의 위치도 편집 효율에 영향을 미친다. 따라서, arRNA의 길이를 91nt로 고정하고, 표적으로 하는 염기의 위치를 이동시켜 테스트용 arRNA를 얻는다. 그 결과는 도 11에 나타내어진다.

도 11로부터, 표적으로 하는 염기가 arRNA의 중간에 있을 때에 가장 높은 편집 효율이 나타나지 않고, arRNA가 3' 말단의 길이가 0으로 줄어들기 전에 높은 편집 효율을 가짐을 알 수 있다(85-C-5 및 왼쪽 열로 나타내어짐).

마지막으로, 상기 arRNA를 모두 동일한 배치로 합성하고, 다른 배치로 인한 테스트 오류를 제거하기 위해 다시 테스트한다. 그 결과는 도 12에 나타내어진다. 도 12로부터, 가장 효율적인 3개의 arRNA는 55-C-35(SEQ ID NO: 7), 55-C-25(SEQ ID NO: 8), 55-C-15(SEQ ID NO: 9)임을 알 수 있다. 반복 테스트에 있어서, 전체 편집 효율은 테스트에 사용된 arRNA의 동결 및 해동으로 인해, 제 1 테스트와 비교해서 약간 감소된다. 대칭의 arRNA에 대해, 71nt(35-C-35)의 편집 효율은 111nt(55-C-55)의 것과 비슷하다. 또한, 이 배치에서 가장 긴 111nt arRNA의 편집 효율은 가장 높지 않다. 대조적으로, 55-C-15, 55-C-25 및 55-C-35의 3개의 arRNA는 각각 길이가 71nt, 81nt, 및 91nt로 비교적 편집 효율이 높다.

또한, 종래 기술에서 선호되는 111nt arRNA와 비교하여, 이 실시예에 있어서 55-C-15와 같이 길이가 71nt에 불과한 arRNA는 편집 효율이 높을 뿐만 아니라 합성 비용도 더 낮다(표 2의 참고 가격 참조). 또한, arRNA가 더 짧을수록 오프표적의 위험이 더 낮을 것으로 예상할 수 있다.

GFP 시그널을 판독함으로써, 상이한 arRNA의 편집 효율을 신속하고 대략적으로 판단할 수 있지만, 편집 효율을 좀 더 정확하게 확인하려면, I(G)로 편집되는 mRNA에서의 A의 비율을 최종적으로 확인하기 위해 차세대 시퀀싱(Next Generation Sequencing: NGS)이 요구된다.

본 실시예에서는 상기 동일한 1단계 및 2단계를 따라 세포 도말 및 형질감염이 행해지고, 세포 계대 72시간 후에 800μL의 TRIzol(Invitrogen, 15596018)을 사용하고, Direct-zol RNA Miniprep Kit(Zymo Resaerch, R2052)가 RNA 추출에 사용된다. 각각의 샘플로부터 1000ng의 RNA를 추출하고, TransScript® One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix Kit(TransGen Biotech, AT311)로 역전사를 행하여 cDNA를 합성한다. 그 후, 1μL의 역전사 생성물을 취하여 ggagtgagtacggtgtgcGGAAGAAAACCCCGGTCCTGCTA(SEQ ID NO: 33) 및 gagttggatgctggatggAACAGAACTGAATGAGCACTCGTGG(SEQ ID NO: 34)의 서열을 갖는 2개의 프라이머 및 Q5 hot-start enzyme(NEB, M0494L)을 이용하여 PCR을 행한다. PCR 생성물은 Hi-TOM kit(Novogene, REF PT045)를 이용하여 라이브러리를 구축하는데 사용되며, 하기 단계를 따라 차세대 시퀀싱 및 데이터 분석을 완료한다.

i. 일루미나 시퀀싱

구축된 시퀀싱 라이브러리에 대해 NovaSeq6000 플랫폼을 통해 PE150 모드에서 고처리량 시퀀싱이 행해진다.

ii. 시퀀싱 데이터 프로세싱

원시 데이터의 품질-관리는 fastp(v0.19.6)에 의한 고처리량 시퀀싱으로 얻어지고, 저품질 서열, 어댑터가 있는 서열, 및 polyG를 포함하는 서열은 필터링된다. 얻어진 고품질 시퀀싱 데이터는 대응하는 바코드 서열에 따라 각각의 샘플로 분할되고, BWA(v0.7.17-r1188) 소프트웨어를 사용하여 증폭된 표적 영역의 서열로 정렬이 행해지고, 또한 형식 변환은 SAMtools(v1.9)을 통해 BAM 파일을 생성하기 위해 실시된다. 정렬 정보가 산출되고, 인덱스를 구축하기 위해 순서가 재정렬된다.

iii. 효율성 분석 편집

모든 RNA 돌연변이 가능 부위는 call-1 -a B,R,D,I,Y,M:4 -C ACGT -c 2 -p 1 -P UNSTRANDED -R -u DirMult-CE의 파라미터로 JACUSA(v1.3.0) 소프트웨어를 이용하여 검출된다. 대조군 및 처리된 샘플 모두에서 나타난 고주파 점돌연변이를 필터링한 후, A->G 돌연변이 부위 외부의 평균 돌연변이 빈도의 3배를 임계값으로서 사용하고, 임계값을 초과하는 표적 염기 A->G 돌연변이 빈도의 일부는 표적 A의 G로의 돌연변이의 실제 빈도로서 취해진다.

상기 단계를 이용하여, 본 발명자들은 최종적으로 도 12의 모든 샘플에 대해 차세대 시퀀싱을 행하고, 편집 효율은 편집 효율에 기반하여 플로팅함으로써, 표적 염기가 ATCG인 리드의 총 수에 대하여 표적 염기가 G인 리드의 수의 백분율로서 취한다. 그 결과는 도 13에 나타내어진다.

도 12와 도 13의 비교로부터, 상이한 방법으로 얻어진 편집 효율이 기본적으로 동일한 경향을 나타냄을 알 수 있다. 즉, LEAPER 문헌(Qu 등., 2019년)에 따라 설계된 111nt arRNA는 가장 높은 편집 효율을 갖는 arRNA가 아니지만, 표적으로 하는 염기의 3' 말단 및 5' 말단을 절단하고, 서열에서 표적으로 하는 염기의 위치를 조정한 후에는 최종적으로 55-C-15의 서열(SEQ ID NO: 9)이 GFP의 리드값에 대해 높은 편집 효율을 나타낼 뿐만 아니라, A의 G로의 편집 효율이 약 50%에 도달할 수 있음을 차세대 시퀀싱에 의해 추가로 확인할 수 있는 것을 발견하였다. 이것은 55-C-15 arRNA로 편집한 후에 mRNA 상의 표적 염기 부위의 50%에서 A의 G로의 편집이 일어난다는 것을 의미한다.

상기 실험을 통해, 본 출원에서 설명하는 기술적 해결방안에 따라 설계된 arRNA가 선행 기술보다 더 높은 편집 효율 및 더 낮은 비용을 달성할 수 있음을 확인하였다. 동시에, 본 출원의 arRNA의 필요 길이가 더 짧기 때문에, 동일한 수의 형질감염 복제의 조건 하에서, 본 출원에서 세포 내로 형질감염된 arRNA의 질량은 더 낮으며, 이것은 과잉 RNA의 전달로 인한 세포에 대한 독성을 감소시키고, 또한 비표적 RNA 서열에 대한 arRNA의 결합을 더 감소시켜, 생체내 편집 시의 안전성을 향상시키는데 도움이 될 수 있음을 예상할 수 있다.

실시예 3: 마우스 눈에서 Ush2A 유전자 부위의 생체내 편집

실시예 2에서, USH2A 병원성 부위는 시험관내 실험에 의해 편집된다. 시험관내 실험에서는 양호한 편집 효율이 달성될 수 있지만, 시험관내 세포 배양 환경은 인간의 혈류, 면역 체계, 안구내 주사와 같은 다수의 요인을 시뮬레이션할 수 없으므로, 이들은 아직 더 많은 생체내 실험을 통해 검증되어야 할 필요가 있다. 실제 치료와의 후속 연결을 고려할 때, 현재는 일반적으로 AAV(아데노 관련 바이러스)가 작은 RNA를 눈으로 전달하는데 사용되므로, 본 발명자들은 최종적으로 AAV 벡터를 사용하여 마우스 눈에서 Ush2A 유전자 부위의 생체내 편집을 위한 arRNA를 전달하기로 결정하였다. 이 실험을 실시하기 위해, 본 발명자들은 151nt arRNA(SEQ ID NO: 32)를 사용한다. 즉, 본 실시예에서 사용된 테스트용 arRNA는 염기 C를 표적 A에 대해 표적으로 하는 카운터 위치를 포함하고; 상기 arRNA가 표적 RNA와 혼성화할 때, 표적 A에서 일치하지 않는 A-C(미스매치)가 형성될 수 있다. 동시에, arRNA의 표적으로 하는 염기 C의 5' 말단과 3' 말단은 각각 표적 서열과 완전히 상보적인 75nt 염기 서열이다. 마우스 Ush2A 유전자의 서열이 인간 USH2A 유전자의 것과 상이하고, 테스트용 마우스는 어셔 증후군-관련 돌연변이를 갖고 있지 않기 때문에, 본 실시예에서 사용된 151nt arRNA는 인간 USH2A 유전자 서열을 표적으로 하는 arRNA가 아니라, 마우스 Ush2A-관련 부위를 표적으로 하는 arRNA이다. 본 발명자들은 U6 프로모터 개시 부위 이후에 AAV 벡터 내로 arRNA 코딩 서열을 삽입하고, arRNA 서열이 삽입된 AAV 벡터를 AAV2 및 AAV5 내로 1x1013GC/mL로 패키징한다. 특히, AAV 벡터의 구축(구축된 벡터에 대해서는 SEQ ID NO: 16 참조, 여기서, arRNA 코딩 서열은 대문자로 나타내어지고, 동일한 문자의 대문자 또는 소문자는 염기의 상이를 나타내지 않음) 및 AAV 바이러스의 패키징은 Guangzhou PackGene Biotech Co., Ltd.에 의해 모두 완료된다.

본 실시예에서는 6-8주령 SPF 등급의 C57 수컷 마우스를 사용하였으며, 실험군(AAV2, AAV5군)과 대조군(PBS) 각각 8마리씩 총 24마리를 사용하였다. 실험군과 대조군 마우스의 오른쪽 눈에 각각 2μL의 AAV 또는 PBS를 유리체를 통해 주사하였다. 주사 후 7일(이후, 1주로 표시됨) 및 14일(이후, 2주로 표시됨)에 각 그룹의 4마리 마우스를 희생시키고, 오른쪽 눈을 적출하여 가위로 50-100mg의 작은 조각으로 잘게 썬다. 액체 질소로 분쇄한 후, 샘플을 800μL TRIzol(Invitrogen, 15596018)로 수집한다. RNA 추출은 Direct-zol RNA Miniprep Kit(Zymo Resaerch, R2052)를 사용하여 행해진다. 각 샘플로부터 추출된 RNA 1000ng을 TransScript® One-Step gDNA Removal 및 cDNA Synthesis SuperMix Kit(TransGen Biotech, AT311)로 역전사하여 cDNA를 합성한다. 각 마우스에 대한 1μL의 역전사 생성물을 취하여 ggagtgagtacggtgtgcCCCATCTCTTTGGCTTGGAACCAT(SEQ ID NO: 22) 및 gagttggatgctggatggCTTTTCTCTCTGCTCCACTGTGAAGTT(SEQ ID NO: 24)의 2개의 프라이머 및 Q5 hot-start enzyme(NEB, M0494L)을 이용하여 PCR을 행한다. PCR 생성물은 Hi-TOM kit(Novogene, REF PT045)를 이용하여 라이브러리를 구축한 후, 차세대 시퀀싱 및 데이터 분석(시퀀싱 및 데이터 분석 방법은 실시예 2에서의 것과 동일함)을 수행하는데 사용된다.

그 결과를 도 14에 나타내었다. 이 도면으로부터, 마우스 시험관내 테스트에서 마우스 유리체를 통해 주사할 때 마우스 안구 세포에서 AA5의 편집 효율이 AAV2보다 높음을 알 수 있다. 그러나, 도면으로부터 AAV2 또는 AAV5의 편집 효율이 낮다는 것을 명확히 알 수 있다. 예를 들면, 7일째에 AAV2의 평균 편집 효율은 0.5%이며, 이는 PBS 군과 크게 다르지 않다. AAV5의 평균 효율성은 약 1%이지만, 4개의 병렬 테스트는 편집 효율에서 크게 일관성이 없으며, 이들 중 하나의 편집 효율은 2% 초과이고, 나머지 3개의 편집 효율은 약 0.5%이다. 14일째에, AAV2 군의 편집 효율도 거의 1%이고, AAV5 군의 평균 편집 효율은 2%이고, 또한 샘플 중 하나의 편집 효율은 거의 5%이다. 이 테스트를 통해, 본 발명자들은 이하의 문제를 발견하였으며: 첫째, 마우스의 눈에서는 AAV5의 편집 효율이 AAV2의 것보다 높은 것으로 보이고; 둘째, 다른 마우스의 데이터는 상당히 상이한데, 이것은 우리의 유리체 주입 조건이 안정적이지 않아, 그 결과 각 주사에 큰 차이가 있음을 나타낼 수 있으며; 마지막으로, 7일에서 14일로 갈수록 편집 효율이 높아지는 경향이 있고, 검출 시간이 지연되면 더 높은 편집 효율이 검출될 수 있다.

따라서, 본 발명자들은 마우스의 안구 테스트를 다시 개시하고, 다음과 같이 테스트 시스템을 최적화하였다: 1) AAV5의 편집 효율이 AAV2의 것보다 높기 때문에, 본 발명자들은 이 실험에서 AAV5를 유지하고, AAV8과 같은 다른 혈청 유형의 AAV 바이러스를 테스트하였고; 2) 유리체 주입의 불안정한 편집 효과의 문제를 위해, 본 발명자들은 주입 조건을 망막하 공간 주입으로 변경하고, 주입 후, 광학 간섭 단층촬영(OCT)을 통해 마우스의 망막하 공간 주입의 성공 여부를 확인하였고; 3) 검출 시간은 14일(2주), 28일(4주), 42일(6주) 및 56일(8주)로 수정되었고; 4) 어셔 증후군은 망막의 원추 세포와 간상 세포의 퇴행성 병변에 의해 발생하므로, 이 실험은 망막에서 단지 Ush2A의 편집 효율을 검출하였다. 전체 안구의 편집 효율을 검출하는 것과 비교해서, 망막에서 단지 Ush2A의 편집 효율을 검출하는 것이 향후 치료에 보다 유익하다.

이 실험에 있어서, SPF-레벨의 6-8주령 C57 수컷 마우스를 사용하였으며, 각 테스트군(AAV5, AAV8 군)에 20마리, 대조군(NaCl)에 12마리의 마우스를 사용하였다.

망막하 공간 주입 방법은 다음과 같다: 동공확대용 동물의 양안 내로 트로피카미드 화합물 점안액 1-2방울을 떨어뜨리고, Zoletil^® 50(50mg/kg, 50mg/ml)을 근육 주사하여 동물을 전신마취한다. 마취된 마우스를 수술대 옆에 놓는다. 폴리혼 요오드 면봉을 사용하여 마우스의 안와 피부를 소독한다. 톱니가 있는 마이크로-핀셋을 사용하여 안구의 측면 상의 결막을 고정하고, 마이크로-가위를 사용하여 구근 결막 아래의 근막을 절단하여 일부 공막을 노출시킨다. 마이크로-핀셋을 고정시킨 상태로 두고, 각막을 덮개 유리로 덮고; Kabham의 점안액을 사용하여 공기를 제거하고, 이어서 일회용 인슐린 바늘을 사용하여 공막과 작은 각도를 형성하여 망막 상피와 망막의 접합부에 직접 공막과 맥락막의 천공을 행하여 채널을 형성한다. 마이크로-핀셋을 계속 고정시킨 상태로 두고, 이어서 인슐린 바늘을 분리하고, 33G 현미경 시린지로 교체한다. 현미경 시린지는 1μL의 제제를 천천히 투여한 후에 적어도 3-5초 동안 바늘을 멈추게 하여, 채널 개구부로부터 망막하까지 관통하게 한다. 현미경 시린지는 동물의 양호한 마취 상태 하에서 약 30초 동안 채널에 계속 유지(바늘을 분리할 때 누출의 체적을 최소화하기 위해)된다. 교차 오염이 없는지 확인하기 위해 각 마우스를 투여한 후에 바늘을 세정할 필요가 있다. 양안 주입이 완료된 후, OCT 스캔을 사용하여 주입 위치가 망막하 공간에 위치되어 있음을 확인한다. 양쪽 눈의 망막하 공간에 성공적으로 주입되면, 동물 주사가 성공된 것으로 판단한다. 주사 후, 14일, 28일, 42일, 및 56일에 각각 5마리(테스트군) 또는 3마리(대조군) 마우스를 안락사시켰다. 마우스의 왼쪽 눈을 적출하여 메스로 윤부를 따라 각막을 360° 절단한다. 홍채와 수정체를 제거하여 망막-맥락막-공막 복합체를 적출하고, 가장 바깥쪽 공막을 제거하여 작은 조각으로 커팅하고, 400μl의 미리 냉각된 TRIzol(Thermo, 15596018)이 있는 멸균 EP 튜브에 넣고, 이어서 조직 호모지나이저로 혼합한다. RNA는 Direct-Zol RNA Microprep kit(Zymo Resaerch, R2062)를 사용하여 추출된다. 각 샘플로부터 추출된 총 RNA의 1000ng는 TransGen Biotech(TransGen Biotech, AH341-01)의 역전사 키트를 사용하여 역전사된다. 5μL의 역전사된 cDNA를 사용하여 ggagtgagtacggtgtgcCCCATCTCTTTGGCTTGGAACCAT(SEQ ID NO: 22) 및 gagttggatgctggatggCTTTTCTCTCTGCTCCACTGTGAAGTT(SEQ ID NO: 24)의 2개의 프라이머 및 Q5 hot-start enzyme(NEB, M0494L)을 이용하여 PCR을 행한다. PCR 생성물은 Hi-TOM kit(Novogene, REF PT045)를 이용하여 라이브러리를 구축하고, 이어서 차세대 시퀀싱 및 데이터 분석(시퀀싱 및 데이터 분석 방법은 실시예 2의 것과 마찬가지임)을 행한다. 그 결과는 도 15에 나타내었다. 이 도면으로부터, 1차 테스트(도 14)의 최고 평균 편집 효율 2%와 비교하면, 이 실험은 5% 이상의 편집 효율에 도달할 수 있음을 분명히 알 수 있다. 또한, 본 실험에서 마우스의 안구 전체를 절단 및 연삭하는 대신에 시퀀싱을 위한 샘플을 수집하도록 마우스의 망막을 벗겨내기 때문에, 실제 치료 동안에 발생되는 실제 치료 효과를 더 잘 반영할 수 있다. 이 실험을 통해, LEAPER 기술은 쥐의 시험관내 실험에서 망막 세포에서의 Ush2A 내인성 유전자 부위를 편집할 수 있고, 이 편집은 쥐에서 적어도 2개월 동안 지속될 수 있음을 증명할 수 있다. 상기 실시예의 결과에 기초하여, 본 출원은 본 출원에 개시된 기술적 해결방안을 이용하여 어셔 증후군의 치료 가능성을 충분히 입증한다.

(참조 문헌)

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gaaacgcgcg agacgaaagg gcctcgtgat acgcctattt 3480 ttataggtta atgtcatgat aataatggtt tcttagacgt caggtggcac ttttcgggga 3540 aatgtgcgcg gaacccctat ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc 3600 atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa aaaggaagag tatgagtatt 3660 caacatttcc gtgtcgccct tattcccttt tttgcggcat tttgccttcc tgtttttgct 3720 cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc agttgggtgc acgagtgggt 3780 tacatcgaac tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga gttttcgccc cgaagaacgt 3840 tttccaatga tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg cggtattatc ccgtattgac 3900 gccgggcaag agcaactcgg tcgccgcata cactattctc agaatgactt ggttgagtac 3960 tcaccagtca cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag taagagaatt atgcagtgct 4020 gccataacca tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc tgacaacgat cggaggaccg 4080 aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg taactcgcct tgatcgttgg 4140 gaaccggagc tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg acaccacgat gcctgtagca 4200 atggcaacaa cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac ttactctagc ttcccggcaa 4260 caattaatag actggatgga ggcggataaa gttgcaggac cacttctgcg ctcggccctt 4320 ccggctggct ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg agcgtgggtc tcgcggtatc 4380 attgcagcac tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg tagttatcta cacgacgggg 4440 agtcaggcaa ctatggatga acgaaataga cagatcgctg agataggtgc ctcactgatt 4500 aagcattggt aactgtcaga ccaagtttac tcatatatac tttagattga tttaaaactt 4560 catttttaat ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg ataatctcat gaccaaaatc 4620 ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct 4680 tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta 4740 ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc 4800 ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtc cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac 4860 ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct 4920 gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact caagacgata gttaccggat 4980 aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg 5040 acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagctatgag aaagcgccac gcttcccgaa 5100 gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg 5160 gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga 5220 cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc 5280 aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat gt 5332 <210> 17 <211> 76 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> arRNA <400> 17 aaggagcugg aaaaucuuga gguggagcuu ccagaguuug uguuaaugac cacagacucu 60 ccacugaacc cuugga 76 <210> 18 <211> 71 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> arRNA <400> 18 gcuggaaaau cuugaggugg agcuuccaga guuuguguua augaccacag acucuccacu 60 gaacccuugg a 71 <210> 19 <211> 66 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> arRNA <400> 19 aaaaucuuga gguggagcuu ccagaguuug uguuaaugac cacagacucu ccacugaacc 60 cuugga 66 <210> 20 <211> 61 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> arRNA <400> 20 cuugaggugg agcuuccaga guuuguguua augaccacag acucuccacu gaacccuugg 60 a 61 <210> 21 <211> 56 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> arRNA <400> 21 gguggagcuu ccagaguuug uguuaaugac cacagacucu ccacugaacc cuugga 56 <210> 22 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 22 ggagtgagta cggtgtgccc catctctttg gcttggaacc at 42 <210> 23 <211> 91 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> arRNA <400> 23 aaggagcugg aaaaucuuga gguggagcuu ccagaguuug uguuaaugac cacagacucu 60 ccacugaacc cuuggaguua caggcucuga c 91 <210> 24 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 24 gagttggatg ctggatggct tttctctctg ctccactgtg aagtt 45 <210> 25 <211> 91 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> arRNA <400> 25 gcuugagccc aaggagcugg aaaaucuuga gguggagcuu ccagaguuug uguuaaugac 60 cacagacucu ccacugaacc cuuggaguua c 91 <210> 26 <211> 91 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> arRNA <400> 26 ucguggcuug agcccaagga gcuggaaaau cuugaggugg agcuuccaga guuuguguua 60 augaccacag acucuccacu gaacccuugg a 91 <210> 27 <211> 91 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> arRNA <400> 27 agcacucgug gcuugagccc aaggagcugg aaaaucuuga gguggagcuu ccagaguuug 60 uguuaaugac cacagacucu ccacugaacc c 91 <210> 28 <211> 91 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> arRNA <400> 28 gaaugagcac ucguggcuug agcccaagga gcuggaaaau cuugaggugg agcuuccaga 60 guuuguguua augaccacag acucuccacu g 91 <210> 29 <211> 91 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> arRNA <400> 29 gaacugaaug agcacucgug gcuugagccc aaggagcugg aaaaucuuga gguggagcuu 60 ccagaguuug uguuaaugac cacagacucu c 91 <210> 30 <211> 91 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> arRNA <400> 30 caacagaacu gaaugagcac ucguggcuug agcccaagga gcuggaaaau cuugaggugg 60 agcuuccaga guuuguguua augaccacag a 91 <210> 31 <211> 91 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> arRNA <400> 31 caauucaaca gaacugaaug agcacucgug gcuugagccc aaggagcugg aaaaucuuga 60 gguggagcuu ccagaguuug uguuaaugac c 91 <210> 32 <211> 151 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> arRNA <400> 32 ccacugcagc agcaaagccc ggcccuuuuc ucucugcucc acugugaagu ucaucagucc 60 gcuuggggca gauuccaaag ucuuaaucag gguccagggg cucgacaccu uuccugcacu 120 guuuacagcc accacaccaa ugugguaugu u 151 <210> 33 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 33 ggagtgagta cggtgtgcgg aagaaaaccc cggtcctgct a 41 <210> 34 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR primer <400> 34 gagttggatg ctggatggaa cagaactgaa tgagcactcg tgg 43 <210> 35 <211> 91 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> arRNA <400> 35 uaauccugaa uaucgcgcaa uuccccagca gagaacaucg cggugugaac gucccuuuau 60 accgggcagg uauagcugaa aucagcgugg c 91

Claims

LEAPER 기술에 기반한, 세포에서의 표적 RNA를 표적화 편집하기 위한 방법으로서, 상기 표적 RNA는 USH2A 유전자 전사체에서의 G의 A로의 돌연변이를 함유하는 RNA이고, 상기 방법은,
상기 표적 RNA를 편집하기 위한 아데노신 탈아미노효소 리크루팅 RNA(adenosine deaminase recruiting RNA: arRNA)를 포함하는 구축물 또는 상기 arRNA를 인코딩하는 구축물을 세포 내로 도입하는 단계를 포함하고, 상기 arRNA는 표적 RNA에 혼성화하는 상보적 RNA 서열을 포함하고, 또한 상기 arRNA는 RNA에 작용하는 아데노신 탈아미노효소(adenosine deaminase acting on RNA: ADAR)를 리크루팅하여, 표적 RNA에서 표적 아데노신이 탈아미노화되는, 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 표적 RNA는 프리-mRNA인, 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 arRNA의 길이는 약 151-61nt, 131-66nt, 121-66nt, 111-66nt, 91-66nt, 또는 81-66nt인, 방법.
제 3 항에 있어서,
상기 arRNA의 길이는 66nt-131nt로부터 선택되는 임의의 자연수인, 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 arRNA에서의 표적으로 하는 염기로부터 3' 말단까지의 길이는 ≥7nt, ≥10nt, ≥15nt, 바람직하게는 16-55nt, 20-50nt, 25-45nt, 25-35nt, 또는 25-30nt인, 방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 arRNA에서의 표적으로 하는 염기로부터 5' 말단까지의 길이는 ≥25nt, ≥30, ≥35, ≥45, 바람직하게는 46-90nt, 55-80nt, 60-75nt, 또는 65-70nt인, 방법.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
표적으로 하는 염기는 상기 arRNA 내로 도입되어 표적 서열에서의 표적 A와 쌍을 이루고, 상기 표적으로 하는 염기의 선호도 순서는 높은 것부터 낮은 것 순으로 C, A, U, 또는 G인, 방법.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 표적 RNA는 전사된 인간 USH2A 유전자 NM_206933.2(USH2A)_c.11864 G>A(p.Trp3955Ter) 돌연변이 부위를 포함하는 RNA인, 방법.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 arRNA는 SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, 및 SEQ ID NO: 4로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 방법.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 arRNA는 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, 및 SEQ ID NO: 9로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 방법.
제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 구축물은 선형 핵산, 바이러스 벡터, 또는 플라스미드인, 방법.
제 11 항에 있어서,
상기 바이러스 벡터는 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터 또는 렌티바이러스 벡터인, 방법.
제 12 항에 있어서,
상기 AAV 벡터는 AAV2, AAV5 또는 AAV8 캡시드 내로 패키징된 후에 감염에 의해 세포 내로 도입되는, 방법.
제 13 항에 있어서,
상기 AAV 벡터는 AAV8 캡시드 내로 패키징된 후에 감염에 의해 세포 내로 도입되는, 방법.
제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세포는 포유동물의 시신경 세포 또는 청신경 세포인, 방법.
USH2A 유전자 전사체에서의 G의 A로의 돌연변이를 함유하는 표적 RNA의 표적화 편집을 위한 arRNA로서,
SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, 및 SEQ ID NO: 4로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하거나 이로 구성되는, arRNA.
제 16 항에 기재된 arRNA를 포함하는, 구축물 또는 전달 벡터.
제 17 항에 있어서,
플라스미드, 바이러스, 리포솜, 또는 지질 나노입자인, 구축물 또는 전달 벡터.
제 18 항에 있어서,
아데노 관련 바이러스(AAV) 또는 렌티바이러스인, 구축물 또는 전달 벡터.
제 19 항에 있어서,
상기 바이러스는 AAV2, AAV5, 또는 AAV8인, 구축물 또는 전달 벡터.
제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 기재된 편집 방법에 의해 얻어지는 세포.
제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 개체의 세포에서 II형 어셔 증후군과 관련된 G의 A로의 돌연변이를 교정하는 단계를 포함하는, 개체에서 II형 어셔 증후군을 치료하는 방법.
제 22 항에 있어서,
제 16 항에 기재된 arRNA 또는 제 17 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 기재된 구축물 또는 전달 벡터를 피험체 내로 도입하는 단계를 포함하는, 방법.
제 23 항에 있어서,
제 16 항에 기재된 arRNA 또는 제 17 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 기재된 구축물 또는 전달 벡터가 피험체의 망막하 공간 내로 도입되는, 방법.
II형 어셔 증후군을 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서, 제 16 항에 기재된 arRNA 또는 제 17 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 기재된 구축물 또는 전달 벡터의 용도.