TW202138561A - 治療Usher綜合症的方法和其組合物 - Google Patents

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Abstract

本申請涉及一種基於LEAPER技術靶向編輯USH2A基因轉錄本中含有G到A突變的標靶RNA的方法，包括將用於編輯標靶RNA的腺苷去胺酶招募RNA(arRNA)或編碼所述arRNA的構建體導入所述細胞中，其中所述arRNA包含與所述標靶RNA雜交的互補RNA序列，並且其中所述arRNA能夠招募作用於RNA的腺苷去胺酶（ADAR）以使標靶RNA中的標靶腺苷去胺基，安全有效地進行RNA上由A到I鹼基的體內編輯，修復致病的突變位點，實現治療疾病例如Usher綜合症的目的。

Description

治療Usher綜合症的方法和其組合物
本申請屬於基因編輯治療領域，具體地，涉及一種基於LEAPER (Leveraging Endogenous ADAR for Programmable Editing on RNA)技術靶向編輯Usher綜合症Ⅱ型(Usher Syndrome Type Ⅱ)相關基因突變的方法。
Usher綜合症，又稱遺傳性耳聾-色素性視網膜炎綜合症，是1914年由Charles Howard Usher描述並命名的12 ，是一種由基因突變引起、導致病患先天或逐漸喪失視覺和聽覺能力的常染色體隱性遺傳性罕見病。Usher綜合症發病率在德國約為1/125008 ，在挪威中為1/280004 ，在美國為1/23000，據估計在美國16000盲聾人中，一半以上患有Usher綜合症1 。全球有數萬甚至數十萬病人亟待治療。
1977年，Davenport等人研究了Usher綜合症，並根據其嚴重程度將其分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型3 。其中，Ⅰ型為重度先天性耳聾，10歲左右出現嚴重視覺障礙，Ⅱ型為中度至重度先天性耳聾，約在10~50歲之間逐漸喪失視力。Ⅲ、Ⅳ型相對罕見，並且病情較輕，聽覺表現為進行性感音神經性聾，而視覺喪失時間不確定。由於Ⅰ型發病早，介入視窗較小，而Ⅲ、Ⅳ型相對病情較輕。Ⅱ型病人的視覺喪失會從10~20歲起逐漸開始，發病初期為夜盲症，並最終喪失視力(圖1)，這使得吾人有較長的治療介入視窗，並有希望終止病人視力的逐漸喪失。
Neuhaus等人2017年通過高通量定序對138例Usher綜合症病人進行了研究，其結果顯示在這138例中有82例為USH2A基因突變，而這82例中，又有80例為Usher綜合症Ⅱ型 (圖2)7 。由此，當只考慮Usher綜合症Ⅱ型病人時，USH2A基因突變的占比超過了90% (圖2)7 ，而針對USH2A基因的治療方案，很有可能使得此等病人受益。
USH2A基因編碼一種被稱為Usherin的蛋白，該蛋白在視覺中發揮了重要的功能，主要是在感光的視錐細胞和視杆細胞中，起到連接內節(Inner Segment)與外節(Outer Segment)的重要作用。當USH2A突變後，會導致視錐細胞和視杆細胞的退行性死亡5 。Neuhaus等人2017年的研究表明，在其定序的USH2A基因突變案例中，有13%為NM_206933.2(USH2A)_c.11864G＞A (p.Trp3955Ter)，而這一種突變類型為所有突變類型中占比最多的單一突變類型(圖3)7 。
由於USH2A基因突變而失去Usherin正常功能是導致USHER綜合症Ⅱ型的重要原因，針對USH2A基因的治療成為了目前Usher II型治療的主要研發方向。
目前通過基因療法治療USHER綜合症Ⅱ型的研發方向主要有兩個，一是通過病毒等方式，介導完整的USH2A基因在眼部重新表現。但是，USH2A基因的蛋白序列非常長，大於6000個胺基酸，這使得其對應的編碼區序列大於18000個鹼基對。而通常的病毒載劑的遞送長度有限。通常情況下，慢病毒遞送不超過10000個鹼基對，而腺相關病毒遞送不超過4500個鹼基對。這使得通過病毒載劑遞送全長USH2A基因較難實現。因此，醫療和科研工作者們只能選擇遞送截短的USH2A基因。這樣的方式，雖然可以一定程度緩解病情的惡化，但由於患者依然缺乏正常的全長Usherin，其無法完全實現Usherin原有的正常生理功能。
另外一種常見的針對USH2A基因的治療研發方向是通過外顯子跨越 (Exon Skipping)實現。由於一部分USH2A基因的突變方式是某個外顯子的移碼 (Frame Shift)或者無義突變 (Nonsense Mutation)導致的，因此只要能在RNA剪接的過程中，特異性地跳過該外顯子，就能使得該外顯子之後的序列正常翻譯。常見的做法，是導入一小段反義核苷酸 (Anti-Sense Oligo, ASO)，從而在剪接過程中特異性地跳過所述翻譯核苷酸靶向的外顯子。這種方法與上一種方法類似，由於跳過了出現突變的外顯子，最終仍然不能得到全長的Usherin。
近年來，以CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)為首的基因組編輯技術正在飛速發展，並對生物以及醫學諸多領域產生了深遠的影響。許多科研工作者和生物技術公司也在致力於將該技術推上臨床。2019年9月，北京大學鄧宏魁教授與其合作者發表文章11 次報導了利用CRISPR技術編輯幹細胞並將其回輸至患者，以治療其愛滋病和白血病的臨床試驗結果，為CRISPR技術在基因治療方向的轉化做出了巨大的貢獻。
儘管CRISPR技術存在極大的應用前景，但該技術也存在一系列缺陷，導致該技術從科研階段向臨床治療應用的轉化步履維艱。問題之一便是CRISPR技術用到的核心作用酶：Cas9。基於CRISPR的DNA編輯技術，必須外源表現Cas9或擁有相似功能的其它核酸酶，從而造成了以下幾個問題。首先，需要外源表現的核酸酶通常具有較大的分子量，這使得通過病毒載劑將其遞送至體內的效率急劇下降。其次，由於核酸酶的外源表現，使這種方法存在潛在的核酸酶脫靶可能，這將導致其應用中的潛在致癌風險。最後，外源表現的Cas9等類似核酸酶是從細菌中發現的，而非人類或哺乳動物天然存在的，這使其可能引起患者體內的免疫反應，這一態樣可能會對患者自身造成損傷，另一態樣也可能會使外源表現的核酸酶被中和，從而失去應有的活性，影響治療效果。
2017年，麻省理工學院張鋒教授及其課題組報導了一種名為REPAIR (RNA Editing for Programmable A to I Replacement)的RNA編輯技術，通過外源表現Cas13-ADAR融合蛋白及單嚮導RNA (single guide RNA, sgRNA)可以實現靶向目標RNA的A到I的編輯，但是該方法同CRISPR技術一樣，仍需要外源蛋白的表現。無法解決外源蛋白表現造成的問題。
2019年1月，Thorsten Stafforst課題組報導了名為RESTORE (recruiting endogenous ADAR to specific trans for oligonucleotide-mediated RNA editing, Merkle et al., 2019)的RNA單鹼基編輯技術。RESTORE能夠擺脫對外源蛋白的依賴，但RESTORE技術需要在IFN-γ存在的前提下才能有較高的編輯效率，而IFN-γ是決定自體免疫發展和嚴重程度的關鍵因子，這使得該技術在醫學領域的應用大打折扣。另一態樣，RESTORE技術中同樣也用到一段嚮導RNA，而其使用的嚮導RNA是化學合成的寡核苷酸，並且其合成的寡核苷酸需要人為引入大量的化學修飾以保證其穩定性。在此等化學修飾中，有一部分是非天然的修飾，使得該寡核苷酸可能存在毒性或免疫原性；還有一部分修飾會導致相同鹼基鏈的不同構象，使得對於相同的RNA序列，可能有數十種不同的構象組合，這增加了其向細胞內遞送的難度。
由於上述三種技術均存在一定的缺陷，並且鑒於USH2A基因本身的特殊性，因此上述三種技術均難以用於治療USHER綜合症Ⅱ型。
2019年7月，北京大學生命科學學院教授魏文勝課題組在Nature Biotechnology上發表文章，“Programmable RNA editing by recruiting endogenous ADAR using engineered RNAs”，首次報導了新的核酸編輯技術：LEAPER (Leveraging Endogenous ADAR for Programmable Editing of RNA, Qu et al., 2019)。一態樣與CRISPR技術相比，該技術從原理上擺脫了對外源核酸酶過表現的依賴，而僅需要一段RNA作為嚮導，以將內源的核酸酶招募至所需編輯的位點，使得該技術在向醫學領域轉化的過程中，有更大的優勢；另一態樣該技術只在轉錄水准上實現了腺苷A到肌酐I的編輯（肌酐I在蛋白質翻譯過程中會被識別為鳥酐G），而不改變基因組中的序列，因此更加安全方便。LEAPER技術不僅可以通過化學合成RNA完成，也可以通過腺相關病毒(AAV)、慢病毒等載劑遞送至患者發揮功能，這使得其遞送手段的選擇上更加靈活多變。
本申請涉及基於LEAPER技術靶向編輯USH2A基因轉錄本中含有G到A突變的標靶RNA的方法，通過將用於編輯標靶RNA的腺苷去胺酶招募RNA(arRNA)或編碼所述arRNA的構建體導入含有標靶RNA的細胞中，使所述arRNA能夠招募作用於RNA的腺苷去胺酶（ADAR）以使標靶RNA中的標靶腺苷去胺基。本申請通過對LEAPER技術的優化和改進，創造性地將其應用於USH2A基因轉錄本中含有G到A突變的標靶RNA，例如具有NM_206933.2(USH2A)_c.11864G＞A (p.Trp3955Ter)突變的USHER綜合症Ⅱ相關標靶RAN，通過對所述突變位點進行逆轉修復，達到治療USHER綜合症Ⅱ的目的。
本申請的目的是針對Usher綜合症Ⅱ型致病基因，例如針對人USH2A中占比最高的突變型NM_206933.2(USH2A)_c.11864G＞A (p.Trp3955Ter)致病基因，提供一種全新的技術方案，無需導入過大的核酸或外源蛋白分子，便能使其精准地在標靶RNA上編輯突變位點，恢復Usherin蛋白的完整功能。
具體地，本申請涉及：
1. 一種基於LEAPER技術靶向編輯細胞中標靶RNA的方法，其中所述標靶RNA為USH2A基因（例如人USH2A基因）轉錄本中含有G到A突變的RNA，該方法包括：
將包含用於編輯標靶RNA的腺苷去胺酶招募RNA(arRNA)的構建體或編碼所述arRNA的構建體導入所述細胞中，其中所述arRNA包含與所述標靶RNA雜交的互補RNA序列，並且其中所述arRNA能夠招募作用於RNA的腺苷去胺酶（ADAR）以使標靶RNA中的標靶腺苷去胺基。
2. 如項1中所述的方法，其中所述標靶RNA為成熟mRNA或mRNA前體（Pre-mRNA）。在一些實施方案中，所述標靶RNA為mRNA前體（Pre-mRNA）。
3. 如項1或2中所述的方法，其中所述arRNA長約151-61 nt、131-66 nt、121-66 nt、111-66 nt、91-66 nt或81-66 nt。本申請涵蓋該資料範圍內的任何自然數。
4. 如項3中所述的方法，其中所述arRNA長度選自66nt-131nt中的任意自然數。
5. 如項1-4中任一項所述的方法，其中所述arRNA中靶向鹼基距離3’端的長度≥7nt，≥10nt、≥15nt，較佳16-55nt、20-50nt、25-45nt、25-35nt或25-30nt。本申請涵蓋該資料範圍內的任何自然數。
6. 如項1-5中任一項所述的方法，其中所述arRNA中靶向鹼基距離5’端的長度≥25nt，≥30、≥35、≥45，較佳46-90nt、50-85nt、55-80nt、60-75nt或65-70nt。本申請涵蓋該資料範圍內的任何自然數。
7. 項1-6中任一項的方法，其中向所述arRNA引入與標靶序列中的標靶A配對的靶向鹼基，該靶向鹼基的較佳次序從高到低依次為C、A、U或G。
在一些實施方案中，向所述arRNA引入與標靶序列中的標靶A配對的靶向鹼基為C。在一些實施方案中，向所述arRNA引入與標靶序列中的標靶A配對的靶向鹼基為A。在一些實施方案中，向所述arRNA引入與標靶序列中的標靶A配對的靶向鹼基為U。
8. 如項1-7中任一項的方法，其中所述標靶RNA為包含轉錄有NM_206933.2(USH2A)_c.11864 G＞A (p.Trp3955Ter)突變位點的人USH2A基因RNA。
9. 如項1-8中任一項所述的方法，其中所述arRNA選自：SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4。
10. 如項1-9中任一項所述的方法，其中所述arRNA選自：SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9。
11. 如項1-10中任一項所述的方法，其中所述構建體為線性核酸、病毒載劑、或質粒。
12. 如項11中所述的方法，其中所述病毒為腺相關病毒（AAV）或慢病毒。
13. 如項12中所述的方法，其中所述AAV載劑包裝入AAV2、AAV5或AAV8衣殼後通過侵染導入所述細胞中。
14. 如項13中所述的方法，所述AAV載劑包裝入AAV8衣殼後通過侵染導入所述細胞中。
15. 如項1-14中任一項所述的方法，其中所述細胞為哺乳動物視神經細胞或聽神經細胞。
16. 一種用於靶向編輯USH2A基因轉錄本中含有G到A突變的標靶RNA的arRNA或其編碼序列，所述arRNA包含選自如下的序列或由選自如下的序列組成：SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、或SEQ ID NO：4。
17. 包含項16的arRNA的構建體或遞送體。
18. 如項17的構建體或遞送體，其為質粒、病毒、脂質體、或脂質奈米顆粒。
19. 如項18的構建體或遞送體，其為腺相關病毒（AAV）或慢病毒。
20. 如項19的構建體或遞送體，其所述病毒為AAV2、AAV5或AAV8。
在一些實施方案中，本申請提供了包含上述arRNA、或包含上述構建體或遞送體的組合物、製劑、套組或生物製品。
21. 通過項1-15中任一項的方法編輯獲得的細胞。
22. 一種治療個體中Usher II型綜合症的方法，包括使用項1-15中任一項所述的方法校正所述個體的細胞中與Usher II型綜合症有關的G到A的突變。
23. 如項22中所述的方法，其包括將如項16中所述的arRNA或如項17-20中任一項所述的構建體或遞送體導入個體。
24. 項23的方法，其中將如項16中所述的arRNA或如項17-20中任一項所述的構建體或遞送體導入個體視網膜下腔中。
本申請提供的基於LEAPER技術靶向編輯細胞中轉錄有包含NM_206933.2(USH2A)_c.11864G＞A (p.Trp3955Ter)突變位點的標靶RNA的方法，在治療USHER綜合症Ⅱ型態樣具有明顯的優勢：
首先，LEAPER技術只需要導入短RNA，可以限制在151、131、121、111核苷酸以內，這使得其對導入片段長度的要求遠遠小於腺相關病毒的遞送長度上限。因此，與直接通過導入USH2A基因相比，該技術非常適合應用腺相關病毒載劑。而由於眼部為免疫豁免區域，對腺相關病毒的清除能力很差，這使得腺相關病毒可以在眼部停留很長時間。此外，發揮功能的細胞均為神經細胞，正常情況下此等細胞也不會分裂，這使得腺相關病毒可以長期停留在此等細胞中，即不被免疫清除，也不會因為細胞分裂導致病毒被稀釋。更關鍵的是，相比於此前的常用手段，本申請的技術方案既不需要人為截短Usherin，也不需要跨過突變的外顯子，從而可以得到全長的正常的Usherin。因此，理論上，病患通過該技術治療後，可以得到與常人無異的正常Usherin。由於USHER綜合症Ⅱ型是隱性遺傳病，這說明，通常只要有部分正常蛋白可以發揮功能，即可獲得正常的功能。本申請通過實驗資料證明，本申請的技術方案可以校正USHER綜合症Ⅱ型相關基因轉錄本（例如含有NM_206933.2(USH2A)_c.11864 G＞A (p.Trp3955Ter)突變位點的人USH2A基因轉錄本）中的G＞A突變，實現對USHER綜合症Ⅱ型的治療目的。
本申請針對Usher綜合症Ⅱ型致病基因USH2A中占比最高的突變型NM_206933.2(USH2A)_c.11864G＞A (p.Trp3955Ter)，以創造一種全新的技術方案，在不導入過大的核酸或外源蛋白分子的條件下，通過AAV精准地在標靶RNA上編輯突變位點，恢復Usherin蛋白的完整功能，並在相當長的一段時間內持續保持Usherin蛋白的功能。
為滿足上述目的，本申請提供了一種基於LEAPER技術靶向編輯細胞中轉錄有包含NM_206933.2(USH2A)_c.11864G＞A (p.Trp3955Ter)突變位點的標靶RNA的方法（下文簡稱突變編輯方法）、一種靶向NM_206933.2(USH2A)_c.11864G＞A (p.Trp3955Ter)突變位點的arRNA、包含所述arRNA的構建體、一種經過所述突變編輯方法製備的細胞、一種用於編輯細胞中的標靶RNA的套組、一種治療個體中由於NM_206933.2(USH2A)_c.11864G＞A (p.Trp3955Ter)突變導致的疾病的方法（下文簡稱治療方法）、以及一種用於所述突變編輯方法或所述治療方法的製劑。
[定義]
RNA編輯是指存在於真核細胞中的一種天然過程，RNA編輯是在DNA轉錄之後，蛋白質翻譯之前在RNA水准上發生的由鹼基A(腺嘌呤)到I(次黃嘌呤)的編輯，次黃嘌呤在翻譯的過程中被識別為G，RNA中A到I的編輯使轉錄組多樣化。通過位元點特異和精確改變RNA分子的方式將RNA的全部數量增加幾倍。這種編輯是被ADAR(Adenosine Deaminase Acting on RNA)蛋白酶催化產生的，被稱為位點定向RNA編輯。編輯可以發生的編碼區包括內含子和外顯子序列，也可以發生在非編碼區序列，編碼區的編輯可以重新定義蛋白質編碼序列。
如本文所用，“LEAPER技術”即通過使用工程化RNA募集內源性ADAR進行RNA編輯的技術，是指如WO2020074001A1中所報導的RNA編輯技術。所述工程化RNA即腺苷去胺酶募集RNA（arRNA），如本文所用，是指能通過招募ADAR或某些包含ADAR結構域的複合物在RNA中使標靶腺苷脫去胺基的RNA。arRNA是嚮導RNA的一種，在本申請中“嚮導RNA”是指可通過與標靶RNA互補雜交，招募可修飾標靶鹼基的酶對標靶鹼基進行修飾。所述嚮導RNA包含arRNA以及用於CRISPR等其他編輯系統的gRNA。
如本文所用，術語“腺苷去胺酶（ADAR）”是指是一類在真核生物（包括人等哺乳動物）各組織中廣泛表現的腺苷去胺酶，能夠催化RNA分子中腺苷A到肌苷I的轉換。而I在真核生物蛋白質合成過程中，通常被當做G進行翻譯。
如本文所用，核酸的“互補”是指一條核酸通過傳統的Watson-Crick鹼基配對與另一條核酸形成氫鍵的能力。百分比互補性表示核酸分子中可與另一核酸分子形成氫鍵(即，Watson-Crick鹼基配對)的殘基的百分比(例如，10個中的約5、6、7、8、9、10 個分別為約50％，60％，70％，80％，90％和100％互補)。“完全互補”是指核酸序列的所有連續殘基與第二核酸序列中相同數量的連續殘基形成氫鍵。如本文所用，“基本上互補”是指在約40、50、60、70、80、100、150、200、250或更多個核苷酸的區域內，至少約70％，75％，80％，85％，90％，95％，97％，98％，99％或100％中的任何一個的互補程度，或指在嚴格條件下雜交的兩條核酸。對於單個鹼基或單個核苷酸，按照Watson-Crick鹼基配對原則，A與T或U、C與G或I配對時，被稱為互補或匹配，反之亦然；而除此以外的鹼基配對都稱為不互補或不匹配。
“雜交”是指其中一種或多種多核苷酸反應形成複合物的反應，所述複合物通過核苷酸殘基的鹼基之間的氫鍵穩定。所述氫鍵可以通過Watson Crick鹼基配對，Hoogstein結合或以任何其他序列特異性的方式發生。能夠與給定序列雜交的序列稱為給定序列的“互補序列”。
如本文所用，術語“導入”是指將核酸、蛋白等生物大分子通過某些途徑從細胞膜外引入細胞膜內。所述“導入”包括點轉染、脂質體轉染、脂質-奈米顆粒遞送等方式。
如本文所用，術語“電轉染”即電穿孔轉染技術，其通過電場作用於細胞幾微秒到幾毫秒之後，在細胞膜上暫時形成小孔或開口，把大分子如DNA等遞送至細胞並最終進入細胞核的技術。
如本文所用，術語“脂質體轉染（Lipo）”是指以脂質體作為體內和體外輸送載劑的轉染技術。脂質體包括中性脂質體和陽離子脂質體，其中中性脂質體是利用脂質膜包裹大分子，例如核酸，借助脂質膜將所述大分子遞送至細胞膜內；陽離子脂質體帶正電荷，其轉載的大分子並沒有預先包埋其中，而是由於所述大分子本身帶負電荷而自動結合到帶正電的脂質體上，形成大分子-陽離子脂質體複合物，從而吸附到帶負電的細胞膜表面，經過內吞被遞送入細胞。
如本文所用，術語“脂質-奈米顆粒（LNP）遞送”是指將大分子，例如核酸、蛋白質等物質通過脂質奈米顆粒向細胞內進行跨膜遞送。其中，脂質奈米顆粒是指由兩相混合合成的顆粒包括含有可電離脂質、輔助磷脂、膽固醇和PEG脂的乙醇相和含有核酸、蛋白質等大分子的酸性水相。例如，包裹有RNA的LNP可通過內吞進入細胞質內。
在本文中，NM_206933.2(USH2A)_c.11864G＞A (p.Trp3955Ter)突變是指人USH2A基因中對應於NM_206933.2(USH2A)基因轉錄本11864位的G至A的突變，所述突變導致所述轉錄本翻譯的肽鏈的3955位色胺酸（Trp）編碼序列轉變為終止密碼子，使得最終翻譯的胺基酸缺失了3955位元之後的全部胺基酸，從而喪失Usherin的蛋白活性。發生這一突變的患者會出現視錐細胞和視杆細胞的退行性死亡，最終導致失明。而本申請中的方案可通過在轉錄水准逆轉這一突變，恢復Usherin蛋白的活性。在本申請的一些實施方案中NM_206933.2(USH2A)_c.11864G＞A (p.Trp3955Ter)突變位點又被稱為USH2A致病位點。
如本文所用，術語“標靶RNA”是指是指待編輯的目標RNA，其由USH2A基因轉錄而成，並包含G至A的突變。標靶RNA可以是成熟mRNA或mRNA前體，在本申請中，更佳mRNA前體。在一些實施方案中，所述“標靶RNA”為轉錄有包含NM_206933.2(USH2A)_c.11864G＞A (p.Trp3955Ter)突變位點的RNA。所述“標靶RNA”中由G至A的突變位點轉錄形成的A鹼基被稱為“標靶腺苷”或“標靶A”。arRNA中與“標靶A”相對的鹼基稱為“靶向鹼基”。
如本文所使用，術語“AAV”是指“腺相關病毒”或“腺相關病毒載劑”，在本文中，如非特別說明，“AAV”、“腺相關病毒”及“腺相關病毒載劑”可以互換使用。AAV屬於微小病毒科，為無包膜的單鏈線狀DNA病毒，利用腺相關病毒可以將外源基因轉入動物組織和細胞中。所述轉入的外源基因可以游離核酸的狀態較為穩定地存在於宿主的基因組基因之外並進行表現。腺相關病毒血清型眾多（12種），包括例如：AAV1、AAV2、AAV5、AAV8和AAV9等。如本文所用，“患者”或“個體”可互換使用，在本文中如非特別指出，本文所述“患者”或“個體”均指基因組中帶有NM_206933.2(USH2A)_c.11864G＞A (p.Trp3955Ter)突變的人類患者。
如本文所用，術語“遞送”是指將核酸、蛋白等生物大分子通過某些途徑從細胞膜外引入細胞膜內。所述“遞送”例如電轉染、脂質體轉染、脂質-奈米顆粒遞送、病毒遞送、外泌體遞送等方式。本文中，將所述生物大分子及包裹所述生物大分子或與所述生物大分子連接以促進所述生物大分子通過細胞膜進入細胞內的物質的結合體稱為“遞送體”。例如包裝了核酸分子的脂質體、LNP、外泌體、病毒顆粒等。
如本文所用，術語“構建體”是指包含某一核酸序列的核酸載劑，所述核酸載劑可以是線性核酸分子、質粒或病毒載劑等。所述核酸分子可以是單鏈也可以是雙鏈分子。所述特定的核酸序列可以是DNA序列也可以是RNA序列。在一些實施方案中，所述核酸序列不經過轉錄、翻譯或表現而直接發揮其功能。在一些實施方案中，所述核酸序列為DNA序列，其經過轉錄形成RNA後以RNA分子形式發揮功能。在一些實施方案中，所述核酸序列為RNA，其經過翻譯後以多肽或蛋白質的形式發揮作用。在一些實施方案中，所述核酸序列為DNA，其經過轉錄和翻譯步驟形成蛋白質後以蛋白質的形式發揮功能。所述構建體可以通過包裝為病毒、脂質奈米顆粒或外泌體等形式進入標靶細胞，亦可以通過電轉化、顯微注射、化學轉化等方式進入標靶細胞。
本申請所用術語“修飾”是指通過化學或生物學方法，例如基因工程方法改變核酸或蛋白的組成或結構，從而使所述核酸或蛋白的一項或多項特性或功能發生改變。在本申請的一些實施方案中，通過對arRNA的修飾，使其在導入細胞後更穩定。在本文中，靶向鹼基距離3’端的長度是指靶向鹼基的3’最近鄰鹼基至3’最末端鹼基的所有鹼基個數；所述靶向鹼基距離5’端的長度是指靶向鹼基的5’最近鄰鹼基至5’最末端鹼基的所有鹼基個數。
除非本文另外定義，否則本文使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬領域的普通技術人員通常所理解的相同含義。
[突變編輯方法]
本申請提供了一種基於LEAPER技術靶向編輯細胞中標靶RNA的方法，其中所述標靶RNA為USH2A基因轉錄本中含有G到A突變的RNA，該方法包括：
將包含用於編輯標靶RNA的腺苷去胺酶招募RNA(arRNA)的構建體或編碼所述arRNA的構建體導入所述細胞中，其中所述arRNA包含與所述標靶RNA雜交的互補RNA序列，並且其中所述arRNA能夠招募作用於RNA的腺苷去胺酶（ADAR）以使標靶RNA中的標靶腺苷去胺基。
在一些實施方案中，所述標靶RNA為mRNA或mRNA前體（Pre-mRNA），較佳地，為Pre-mRNA。
在一些實施方案中，其中所述arRNA長度＞51nt，較佳地＞61nt，更佳地≥65nt。在一些實施方案中，所述arRNA長約151-61 nt、131-66 nt、121-66 nt、111-66 nt、91-66 nt或81-66 nt。在一些實施方案中，所述arRNA長度選自66nt-131nt中的任意自然數，例如66nt、67nt、68nt、69nt、70nt、71nt、72nt、73nt、74nt、75nt、76nt、78nt、79nt、80nt、83nt、85nt、88nt、91nt、96nt、98nt、100nt、105nt、108nt、100nt、105nt、110nt、115nt、120nt、125nt、130nt等。在可保持轉染效率相同的情況下，較佳地，所述arRNA的長度為約71nt，例如：66nt-76nt中的任一自然數個nt。
在一些實施方案中，所述arRNA中靶向鹼基距離3’端的長度＞5nt，例如≥7nt、≥10nt、≥15nt，例如16-55nt、20-50nt、25-45nt、25-35nt或25-30nt中的任意自然數個nt。在一些實施方案中，所述arRNA中靶向鹼基距離5’端的長度≥25nt，例如≥30、≥35、≥45，例如46-90nt、50-85nt、55-80nt、60-75nt或65-70nt中的任意自然數個nt。
在一些實施方案中，當所述arRNA與標靶RNA互補雜交時，所述arRNA與標靶RNA上的標靶鹼基相對的靶向鹼基較佳次序從高到低依次為C、A、U或G。即在通常情況下，對於長度及靶向鹼基以外的序列均相同，而靶向鹼基分別為C、A、U、G的arRNA，其編輯效率依次降低，因此最佳地，所述arRNA的靶向鹼基為C，其次為A，再其次為U，最次為G。
在一些實施方案中，所述標靶RNA為包含轉錄有NM_206933.2(USH2A)_c.11864 G＞A (p.Trp3955Ter)突變位點的RNA。在一些實施方案中，所述arRNA選自：SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4。較佳地，在一些實施方案中，所述arRNA選自：SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9，更佳地為SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9。
在一些實施方案中，所述構建體選自線性核酸、病毒載劑、或質粒。所述線性核酸包括單鏈核酸，例如單鏈RNA、單鏈DNA；以及雙鏈核酸，例如雙鏈DNA、雙鏈RNA。在一些實施方案中，所述線性核酸可以經過化學修飾，例如2’-O-Me修飾和/或硫代磷酸酯鍵修飾。在一些特定的實施方案中，所述線性核酸由體外化學合成。在一些特定的實施方案中，所述線性核酸由細胞或機體合成後經分離提取獲得。在一些實施方案中，所述構建體為腺相關病毒（AAV）載劑或慢病毒載劑。在一些實施方案中，所述其中所述AAV載劑包裝入AAV2、AAV5或AAV8衣殼後通過侵染導入所述細胞中。在一些實施方案中，所述AAV載劑包裝入AAV8衣殼後通過侵染導入所述細胞中。在一些實施方案中，所述構建體將所述arRNA編碼序列插入細胞基因組中長期表現。在一些實施方案中，所述構建體使所述arRNA編碼序列作為游離核酸存在於細胞基因組外並進行表現。
在一些實施方案中，所述細胞為真核細胞。在一些實施方案中，所述細胞為哺乳動物細胞。在一些實施方案中，所述細胞為神經細胞。在一些實施方案中，所述神經細胞為感覺神經細胞。在一些實施方案中，所述感覺神經細胞選自視神經細胞及聽神經細胞。在一些實施方案中，所述視神經細胞為視錐細胞和/或視杆細胞。
在一些實施方案中，所述導入為電轉染、脂質體轉染、脂質-奈米顆粒遞送或病毒侵染。在本申請的實施方案中，較佳地為病毒侵染。例如通過將編碼arRNA的病毒構建體包裹入病毒衣殼形成具有侵染性的病毒顆粒，例如AAV或慢病毒顆粒，並通過所述病毒顆粒對細胞的侵染將所述arRNA的編碼序列導入細胞中。
[功能arRNA]
本申請同時還提供了一種arRNA（下文簡稱為功能arRNA），所述arRNA可用於如前所述的基於LEAPER技術靶向編輯細胞中標靶RNA的方法。在一些實施方案中，所述方法為基於LEAPER技術靶向編輯細胞中轉錄有包含NM_206933.2(USH2A)_c.11864G＞A (p.Trp3955Ter)突變位點的標靶RNA的方法。所述arRNA包含與所述標靶RNA雜交的互補RNA序列，並且其中所述arRNA能夠招募作用於RNA的腺苷去胺酶（ADAR）以使標靶RNA中的標靶腺苷去胺基。在一些實施方案中，所述arRNA靶向的標靶RNA選自mRNA或Pre-mRNA，較佳地為Pre-mRNA。
在一些實施方案中，所述arRNA長度＞51nt，較佳地＞61nt，更佳地＞65nt。在一些實施方案中，所述arRNA長約151-61 nt、131-66 nt、121-66 nt、111-66 nt、91-66 nt或81-66 nt。在一些實施方案中，所述arRNA長度選自66nt-131nt中的任意自然數，例如66nt、67nt、68nt、69nt、70nt、71nt、72nt、73nt、74nt、75nt、76nt、78nt、79nt、80nt、83nt、85nt、88nt、91nt、96nt、98nt、100nt、105nt、108nt、100nt、105nt、110nt、115nt、120nt、125nt、130nt等。在可保持轉染效率相同的情況下，較佳地，所述arRNA的長度為約71nt，例如：66nt-76nt中的任一自然數個nt。
在一些實施方案中，所述arRNA中靶向鹼基距離3’端的長度＞5nt，例如≥7nt、≥10nt、≥15nt，例如16-55nt、20-50nt、25-45nt、25-35nt或25-30nt中的任意自然數個nt。在一些實施方案中，所述arRNA中靶向鹼基距離5’端的長度≥25nt，例如≥30、≥35、≥45，例如46-90nt、50-85nt、55-80nt、60-75nt或65-70nt中的任意自然數個nt。
在一些實施方案中，當所述arRNA與標靶RNA互補雜交時，所述arRNA與標靶RNA上的標靶鹼基相對的靶向鹼基較佳次序從高到低依次為C、A、U或G。即在通常情況下，對於長度及靶向鹼基以外的序列均相同，而靶向鹼基分別為C、A、U、G的arRNA，其編輯效率依次降低，因此最較佳地，所述arRNA的靶向鹼基為C，其次為A，再其次為U，最次為G。
在一些實施方案中，所述arRNA選自：SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4。較佳地，在一些實施方案中，所述arRNA選自：SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9，更佳地為SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9。在一些實施方案中，所述arRNA引入與標靶序列中的標靶A配對的靶向鹼基編輯效率從大到小依次為C、A、U、G，即：對於長度及靶向鹼基以外的序列均相同，而靶向鹼基分別為C、A、U、G的arRNA，其編輯效率依次降低，因此最佳地，所述arRNA的靶向鹼基為C，其次為A，再其次為U，最後為G。
[功能構建體]
本申請還提供了一種編碼arRNA的構建體（下文簡稱為功能構建體），其中所述功能構建體可以用於如前所述的基於LEAPER技術靶向編輯細胞中標靶RNA的方法。在一些實施方案中，所述方法為基於LEAPER技術靶向編輯細胞中轉錄有包含NM_206933.2(USH2A)_c.11864G＞A (p.Trp3955Ter)突變位點的標靶RNA的方法。其中，所述arRNA包含如前所述的功能arRNA。
在一些實施方案中，所述構建體選自線性核酸、病毒載劑、或質粒。所述線性核酸包括單鏈核酸，例如單鏈RNA、單鏈DNA；以及雙鏈核酸，例如雙鏈DNA、雙鏈RNA。在一些實施方案中，所述線性核酸可以經過化學修飾，例如2’-O-Me修飾和/或硫代磷酸酯鍵修飾。在一些特定的實施方案中，所述線性核酸由體外化學合成。在一些特定的實施方案中，所述線性核酸由細胞或機體合成後經分離提取獲得。在一些實施方案中，所述構建體為腺相關病毒（AAV）載劑或慢病毒載劑。在一些實施方案中，所述AAV載劑包裝入AAV2、AAV5或AAV8以形成可侵染細胞的病毒顆粒，所述病毒顆粒通過侵染細胞將所述AAV載劑導入細胞中。較佳地，在一些實施方案中，所述構建體包裝入AAV8。在一些實施方案中，所述構建體將所述arRNA編碼序列插入細胞基因組中長期表現。在一些實施方案中，所述構建體使所述arRNA編碼序列作為游離核酸存在於細胞基因組外並進行表現。
本申請提供了包含如前所述的功能arRNA的構建體，選自線性核酸、質粒、病毒載劑。本申請還提供了包含所述構建體的遞送體，所述遞送體選自病毒顆粒、脂質體、脂質奈米顆粒和外泌體。
[細胞]
本申請還提供了一種細胞，其可通過如前所述的基於LEAPER技術靶向編輯細胞中標靶RNA的方法進行編輯和製備。在一些實施方案中，所述細胞為源自具有NM_206933.2(USH2A)_c.11864G＞A (p.Trp3955Ter)突變位點的患者的細胞，通過如前所述的突變編輯方法可將所述突變位點轉錄的標靶RNA中的標靶A去胺基形成I，在後續的翻譯過程中將被識別為G而恢復Usherin蛋白完整的功能。在一些實施方案中，所述患者的細胞為幹細胞或誘導多能幹細胞，所述幹細胞或其誘導分化的細胞可以移植至患者特定位置。在一些實施方案中，所述幹細胞在體外通過誘導分化為健康的視錐和/或視杆細胞後再移植回患者眼部特定位置發揮功能。
[套組]
本申請還提供了一種用於編輯細胞中的標靶RNA的套組，其包含如前所述的功能arRNA或如前所述所述的編碼arRNA的功能構建體。在一些實施方案中，所述套組包含可以用於編輯NM_206933.2(USH2A)_c.11864G＞A (p.Trp3955Ter)突變的核酸、質粒、基因組、細胞等。在一些實施方案中，所述套組還進一步包含適於溶解所述功能arRNA或所述功能構建體的溶劑。在一些實施方案中，所述套組還進一步包含使用說明，以告知使用者所述套組中包含的各種成分及其含量，和/或所述套組的使用方法。
[治療方法]
本申請同時還提供了一種治療個體中由於NM_206933.2(USH2A)_c.11864G＞A (p.Trp3955Ter)突變導致的疾病的方法（下文簡稱治療方法），包括使用如前所述的基於LEAPER技術靶向編輯細胞中轉錄有包含NM_206933.2(USH2A)_c.11864G＞A (p.Trp3955Ter)突變位點的標靶RNA的方法校正個體細胞中與NM_206933.2(USH2A)_c.11864G＞A (p.Trp3955Ter)突變位點相關的標靶RNA突變。在一些實施方案中，所述疾病包括Usher II型綜合症。
在一些實施方案中，所述治療方法包含將用於編輯標靶RNA的arRNA或編碼所述arRNA的構建體注射入個體視網膜下腔或玻璃體。在一些較佳的實施方案中，所述治療方法包含將用於編輯標靶RNA的arRNA或編碼所述arRNA的構建體注射入個體視網膜下腔。在一些實施方案中，所述治療僅需對個體進行一次注射。在一些實施方案中，所述治療需要每隔一段時間對個體進行一次注射。在一些特定的實施方案中，所述治療需要每隔≥2個月對個體進行一次注射，例如每隔1年、10年、20年、30年等對個體進行一次注射。
[製劑]
本申請還進一步提供了一種製劑，其包含如前所述的功能arRNA或如前所述所述的編碼所述arRNA的功能構建體或其遞送體。在一些實施方案中，所述製劑包含所述功能arRNA或功能構建體或其遞送體以及轉染試劑。在一些特定的實施方案中，所述功能arRNA或功能構建體包裹在脂質體中。在一些特定的實施方案中，所述功能arRNA或功能構建體經製備形成脂質奈米顆粒。在一些實施方案中，所述製劑包含的功能構建體為病毒載劑，例如AAV或慢病毒載劑，所述製劑包含活體病毒或病毒凍乾粉，因此所述製劑還進一步包括適宜的穩定劑，例如人血白蛋白、明膠、蔗糖等。
以上詳細描述了本發明的較佳實施方式，但是，本發明並不限於此。在本發明的技術構思範圍內，可以對本發明的技術方案進行多種簡單變型，包括各個技術特徵以任何其它的合適方式進行組合，此等簡單變型和組合同樣應當視為本發明所公開的內容，均屬於本發明的保護範圍。下面結合具體實施例，對本發明的技術方案作進一步的詳述，但本發明並不限於以下實施例。如未特別指出，以下所涉及的試劑均可通過商業途徑購得。為簡便起見，部分操作未詳述操作的參數、步驟及所使用的儀器，應當理解，此等都是熟習此項技術者所熟知並可重複再現的。
實施例
實施例 1 ：報告體系的構建
本申請主要研究LEAPER技術對NM_206933.2(USH2A)_c.11864G＞A (p.Trp3955Ter)突變位點的修復。因此，需要一個簡單可用的，可以反應該位點編輯效率高低的報告體系。由於USH2A基因致病突變位點NM_206933.2(USH2A)_c.11864G＞A (p.Trp3955Ter)導致的原TGG密碼子至TAG密碼子的突變為無義突變，突變後的mRNA序列在翻譯時，會停止在新形成的TAG終止密碼子處，導致其後序列無法繼續翻譯成蛋白。利用以上特點，本申請設計了如圖4所示的報告體系。所述報告體系使用慢病毒載劑，由CMV啟動子驅動如圖4所示的mRNA。該段mRNA主要包含以下部分：1) mCherry紅色螢光蛋白序列，該蛋白將穩定表現，無論是否經過編輯均會正常翻譯，因此紅色螢光強度可以作為內部參照；2) USH2A基因突變位點以及其兩側相鄰的各100個鹼基對，該區域為疾病相關序列；（2）中的序列取自NM_206933.2序列的第12203到12403位，共201個鹼基對，經過對USH2A c.11864位點進行G到A的點突變，使得該序列中存在閱讀框 (In-frame)內的TAG終止密碼子，從而在翻譯過程中會在此停止翻譯）；3) GFP綠色螢光蛋白序列，該蛋白可以發綠色螢光，並在流式細胞儀中可以經FITC通道偵測螢光強度（由於GFP序列與USH2A相關序列位於同一閱讀框且位於其下游，若USH2A相關序列中的TAG終止密碼子未通過LEAPER技術進行編輯，則其中的TAG終止密碼子會導致後續GFP無法被正常翻譯，而不會出現綠色螢光；若USH2A相關序列中的TAG成功通過LEAPER技術進行編輯，形成TIG密碼子，則該終止密碼子消失，後續GFP翻譯繼續，從而出現綠色螢光；4) 在mCherry下游以及GFP上游插入P2A、T2A序列，在翻譯時，這兩個序列會由於空間位阻導致其中的一個肽鍵無法正常形成，因而會在翻譯過程中將mCherry、中間的USH2A相關序列的201個鹼基對以及GFP三個部分分開，從而使得中間插入的USH2A相關序列不會對mCherry以及GFP功能產生影響。
以上序列全序列通過业内常規技術進行體外合成，具體序列為如SEQ ID NO：1所示。該序列通過CMV啟動子後的多純系位點純系至pCDH-CMV載劑載劑。pCDH-CMV載劑質粒由Kazuhiro Oka惠贈 (Addgene plasmid # 72265; http://n2t.net/addgene:72265; RRID: Addgene_72265)。構建好的質粒通過二代慢病毒包裝體系(pCAG-VSVG 由Arthur Nienhuis & Patrick Salmon惠贈，Addgene plasmid # 35616 ; http://n2t.net/addgene:35616 ; RRID:Addgene_35616; pCMVR8.74 由 Didier Trono惠贈，Addgene plasmid # 22036 ; http://n2t.net/addgene:22036 ; RRID:Addgene_22036)包裝成慢病毒並侵染293T細胞。細胞侵染48h後使用流式細胞儀分選mCherry陽性的細胞群，該細胞群為最終的報告體系細胞。其中，調節螢光閾值直至未侵染的293T細胞或未處理的對照報告體系中螢光強度高於閾值的細胞數剛好小於1%（儘量接近1%）時為止，此時螢光強度高於螢光閾值的細胞即被認為是陽性細胞。對於報告體系的測試，如圖5所示通常有兩個評價指標：1. GFP陽性細胞比例（縮略為%GFP）；2. GFP+細胞平均螢光強度（MFI，Mean Fluorescent Intensity）。其中，GFP陽性細胞比例，即：GFP強度超過本申請所定義的GFP陽性閾值的細胞的比例。%GFP的高低表示發生編輯的細胞數量。而在GFP陽性的細胞中，由於不同細胞的螢光強度不同，因此對報告體系編輯效率的測試還進一步包括了MFI。由於每孔細胞均有近似的作為內參的紅色螢光強度，因此認為GFP%越高以及MFI越高，則代表該孔細胞的USH2A致病突變位點在測試條件中被編輯的程度越高。
SEQ ID NO：1：其中，小寫字母序列表示疾病相關序列，同一種鹼基的大小寫字母不代表鹼基類型的差異。
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAACATGGCCATCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCACATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGTGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCTCAGTTCATGTACGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACTTGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAGGTGAAGCTGCGCGGCACCAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCTCCGAGCGGATGTACCCCGAGGACGGCGCCCTGAAGGGCGAGATCAAGCAGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACGACGCTGAGGTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTACAACGTCAACATCAAGTTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTACAAGGCCACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAGCAGGAGACGTGGAAGAAAACCCCGGTCCTGCTAGCgcccttgaatttatggatgaaggagacaccctgaggcctttcacactctacgaatatcgggtcagagcctgtaactccaagggttcagtggagagtctgtggtcattaacacaaactctggaagctccacctcaagattttccagctccttgggctcaagccacgagtgctcattcagttctgttgaattggacaaagccaGCGGCCGCTGAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTTCCGGAATGGAGAGCGACGAGAGCGGCCTGCCCGCCATGGAGATCGAGTGCCGCATCACCGGCACCCTGAACGGCGTGGAGTTCGAGCTGGTGGGCGGCGGAGAGGGCACCCCCAAGCAGGGCCGCATGACCAACAAGATGAAGAGCACCAAAGGCGCCCTGACCTTCAGCCCCTACCTGCTGAGCCACGTGATGGGCTACGGCTTCTACCACTTCGGCACCTACCCCAGCGGCTACGAGAACCCCTTCCTGCACGCCATCAACAACGGCGGCTACACCAACACCCGCATCGAGAAGTACGAGGACGGCGGCGTGCTGCACGTGAGCTTCAGCTACCGCTACGAGGCCGGCCGCGTGATCGGCGACTTCAAGGTGGTGGGCACCGGCTTCCCCGAGGACAGCGTGATCTTCACCGACAAGATCATCCGCAGCAACGCCACCGTGGAGCACCTGCACCCCATGGGCGATAACGTGCTGGTGGGCAGCTTCGCCCGCACCTTCAGCCTGCGCGACGGCGGCTACTACAGCTTCGTGGTGGACAGCCACATGCACTTCAAGAGCGCCATCCACCCCAGCATCCTGCAGAACGGGGGCCCCATGTTCGCCTTCCGCCGCGTGGAGGAGCTGCACAGCAACACCGAGCTGGGCATCGTGGAGTACCAGCACGCCTTCAAGACCCCCATCGCCTTCGCC
實施例 2 ：針對致病突變位點的 arRNA 優化
由於LEAPER技術無需向細胞內導入任何外源蛋白，本實施例在測試LEAPER對致病位點的編輯時，只需向報告體系細胞中導入arRNA。本實施例中的arRNA由體外合成，其序列見下表1。序列以兩種方式命名，其中“名稱”根據序列的長短或截短長度進行命名，“統一化名稱”以X-C-Y進行命名，其中X代表5’端的長度，Y代表3’端的長度，C為靶向鹼基C。例如111nt命名為55-C-55則表示其5’及3’短的長度均為55nt。
表1. 實施例2所用arRNA序列匯總
名稱 統一化名稱 RNA序列
111nt 55-C-55 SEQ ID NO：2： agcccaaggagcuggaaaaucuugagguggagcuuccagaguuuguguuaaugaccacagacucuccacugaacccuuggaguuacaggcucugacccgauauucguagag
91nt 45-C-45 SEQ ID NO：3：gcuggaaaaucuugagguggagcuuccagaguuuguguuaaugaccacagacucuccacugaacccuuggaguuacaggcucugacccgau
71nt 35-C-35 SEQ ID NO：4：cuugagguggagcuuccagaguuuguguuaaugaccacagacucuccacugaacccuuggaguuacaggcu
51nt 25-C-25 SEQ ID NO：5：agcuuccagaguuuguguuaaugaccacagacucuccacugaacccuugga
3-10 55-C-45 SEQ ID NO：6：agcccaaggagcuggaaaaucuugagguggagcuuccagaguuuguguuaaugaccacagacucuccacugaacccuuggaguuacaggcucugacccgau
3-20 55-C-35 SEQ ID NO：7：agcccaaggagcuggaaaaucuugagguggagcuuccagaguuuguguuaaugaccacagacucuccacugaacccuuggaguuacaggcu
3-30 55-C-25 SEQ ID NO：8：agcccaaggagcuggaaaaucuugagguggagcuuccagaguuuguguuaaugaccacagacucuccacugaacccuugga
3-40 55-C-15 SEQ ID NO：9：agcccaaggagcuggaaaaucuugagguggagcuuccagaguuuguguuaaugaccacagacucuccacug
3-50 55-C-5 SEQ ID NO：10：agcccaaggagcuggaaaaucuugagguggagcuuccagaguuuguguuaaugaccacaga
5-10 45-C-55 SEQ ID NO：11：gcuggaaaaucuugagguggagcuuccagaguuuguguuaaugaccacagacucuccacugaacccuuggaguuacaggcucugacccgauauucguagag
5-20 35-C-55 SEQ ID NO：12：cuugagguggagcuuccagaguuuguguuaaugaccacagacucuccacugaacccuuggaguuacaggcucugacccgauauucguagag
5-30 25-C-55 SEQ ID NO：13：agcuuccagaguuuguguuaaugaccacagacucuccacugaacccuuggaguuacaggcucugacccgauauucguagag
5-40 15-C-55 SEQ ID NO：14：guuuguguuaaugaccacagacucuccacugaacccuuggaguuacaggcucugacccgauauucguagag
5-50 5-C-55 SEQ ID NO：15：augaccacagacucuccacugaacccuuggaguuacaggcucugacccgauauucguagag
50-C-25 50-C-25 SEQ ID NO：17：aaggagcuggaaaaucuugagguggagcuuccagaguuuguguuaaugaccacagacucuccacugaacccuugga
45-C-25 45-C-25 SEQ ID NO：18：gcuggaaaaucuugagguggagcuuccagaguuuguguuaaugaccacagacucuccacugaacccuugga
40-C-25 40-C-25 SEQ ID NO：19：aaaaucuugagguggagcuuccagaguuuguguuaaugaccacagacucuccacugaacccuugga
35-C-25 35-C-25 SEQ ID NO：20：cuugagguggagcuuccagaguuuguguuaaugaccacagacucuccacugaacccuugga
30-C-25 30-C-25 SEQ ID NO：21：gguggagcuuccagaguuuguguuaaugaccacagacucuccacugaacccuugga
50-C-40 50-C-40 SEQ ID NO：23：aaggagcuggaaaaucuugagguggagcuuccagaguuuguguuaaugacCacagacucuccacugaacccuuggaguuacaggcucugac
60-C-30 60-C-30 SEQ ID NO：25：gcuugagcccaaggagcuggaaaaucuugagguggagcuuccagaguuuguguuaaugacCacagacucuccacugaacccuuggaguuac
65-C-25 65-C-25 SEQ ID NO：26：ucguggcuugagcccaaggagcuggaaaaucuugagguggagcuuccagaguuuguguuaaugacCacagacucuccacugaacccuugga
70-C-20 70-C-20 SEQ ID NO：27：agcacucguggcuugagcccaaggagcuggaaaaucuugagguggagcuuccagaguuuguguuaaugacCacagacucuccacugaaccc
75-C-15 75-C-15 SEQ ID NO：28：gaaugagcacucguggcuugagcccaaggagcuggaaaaucuugagguggagcuuccagaguuuguguuaaugacCacagacucuccacug
80-C-10 80-C-10 SEQ ID NO：29：gaacugaaugagcacucguggcuugagcccaaggagcuggaaaaucuugagguggagcuuccagaguuuguguuaaugacCacagacucuc
85-C-5 85-C-5 SEQ ID NO：30：caacagaacugaaugagcacucguggcuugagcccaaggagcuggaaaaucuugagguggagcuuccagaguuuguguuaaugacCacaga
90-C-0 90-C-0 SEQ ID NO：31：caauucaacagaacugaaugagcacucguggcuugagcccaaggagcuggaaaaucuugagguggagcuuccagaguuuguguuaaugacC
注：RNA序列中大寫字母僅用於區分靶向鹼基，同一種鹼基的大小寫字母不代表鹼基類型的差異。
本實施例中所有測試均使用RNAi MAX試劑(Invitrogen 13778150)將arRNA轉染入細胞，具體步驟如下：
1. 細胞培養使用含有10%FBS (Vistech SE100-011)的DMEM (Hyclone SH30243.01)。使用12孔板培養細胞，報告體系細胞為15000個細胞/孔。鋪入細胞的時間記為0小時。
2. 細胞傳代後24小時，用RNAi MAX試劑將12.5pmol的arRNA轉入各孔。轉染步驟參照供應商說明書。
3. 細胞傳代後72小時，用胰酶 (Invitrogen 25300054)消化整孔細胞，並用流式細胞儀在FITC通道分析細胞螢光強度。
首先，參照LEAPER參考文獻中的arRNA的設計原則(Leveraging Endogenous ADAR for Programmable Editing of RNA, Qu et al., 2019，該文獻中體外合成的arRNA僅採用了111nt長度的arRNA進行測試)設計arRNA，即將致病突變位點的A（標靶A）的對位靶向鹼基確定為C，使所述靶向鹼基的5’端以及3’端的序列長度一致。從總長111nt（55-C-55）的arRNA（與參考文獻一致）為基礎，同時對5’及3’端進行截短，以形成本申請所使用的各測試arRNA。由於體外合成RNA的限制，目前階段更長的RNA長度難以在體外合成，因此本實施例僅測試了111nt、91nt、71nt和51nt這四種長度的arRNA，編輯效率的結果見圖6。
其中，“對照”表示不轉入任何arRNA的對照孔。從圖6中可以看出，對照孔本底的GFP陽性細胞很少 (約0.6%)，相比之下111nt、91nt和71nt的三條arRNA導致的%GFP均超過90%，而51nt只有很低的GFP陽性比例。從平均螢光強度的圖中可以看出，對照孔本底有少量假陽性細胞，且雖然此等細胞占比很少，但其螢光強度較高，如圖7所示。
令人意外的是，與上述LEAPER參考文獻報導不同，本申請發現51nt~111nt的arRNA可以取得較好的編輯效果，然而並非越長的arRNA編輯效率越高。如圖8所示，根據上述LEAPER參考文獻(同Qu et al., 2019 圖2d)中的報導，在其報告體系中，比較了51nt~111nt的arRNA。其中，可見71nt的GFP+細胞比例比111nt要低，其長度與編輯效率的關係從51nt~111nt的範圍內基本呈現逐漸增高的趨勢。而在實施例1的報告體系測試中，與111nt相比，71nt導致的GFP陽性細胞比例差異不大，而平均螢光強度卻更高。
其次，由於越長的arRNA合成成本越高，並且較長的arRNA可能會導致更大的脫靶可能性，因此，本申請中測試了通過各種方式截短的arRNA的編輯效率。如圖9所示，以靶向鹼基C為中點，以111nt的arRNA序列（SEQ ID NO：2）為基礎，從5’端上游或3’端下游以10nt為步長，逐步向中間截短，以獲得用於測試的arRNA。
從圖9中不難看出，從5’端截短時，與LEAPER參考文獻中的報導相符，即相對更長的RNA編輯效率更高，然而不同的是，從3’端截短時，編輯效率並非逐漸下降，反而在3’端截短30nt時表現出最高的編輯效率。由於從3’端截短30nt時編輯效率最高，而此時的arRNA長度為：55-C-25，因此，在後續試驗中，吾人將3’端的長度為25nt，從5’端繼續進行截短以獲得測試arRNA，結果如圖10所示。
圖10中的“3’-截短30”以及“55-C-25”與圖9中“3’截短”的“-30”為相同的arRNA序列（SEQ ID NO：8），其中，圖10中的“3’-截短30”與圖9中“3’截短”的“-30”為同批次合成，與“55-C-25”為不同批次合成。從圖10中，不難看出，當3’端固定為25nt而從5’端截短時，編輯效率基本呈現隨5’長度下降而下降的趨勢，其中40-C-25雖然不符合以上趨勢，但無論其MFI還是%GFP均未超過55-C-25。
最後，除了長度以外，靶向鹼基的位置也對編輯效率有影響。因此隨後吾人將arRNA長度固定為91nt，通過對靶向鹼基位置的移動獲得測試arRNA，結果如圖11所示。
從圖11中可以看出，並非靶向鹼基在arRNA中間位置時效率最高，且在3’端長度減少到0之前(如85-C-5及其左側柱子所示)，arRNA均有較高編輯效率。
最後，吾人在同一批次中合成了以上所有arRNA，並對其進行了再次測試，以便排除不同批次導致的測試誤差。結果如圖12所示。從圖12中不難看出，效率最高的3條arRNA為55-C-35（SEQ ID NO：7）、55-C-25（SEQ ID NO：8）、55-C-15（SEQ ID NO：9）。重複測試中，可能由於所用的arRNA經過凍融，整體編輯效率相比第一次測試略有下降。對於兩端對稱的arRNA，71nt (35-C-35)與111nt (55-C-55)相當。此外，本批次中最長的111nt arRNA編輯效率並非最高，相比之下，55-C-15、55-C-25、55-C-35這3條長度分別為71nt、81nt、91nt的arRNA擁有相對更高的編輯效率。
並且，相較於現有技術中較佳的111nt arRNA，本實施例中55-C-15等長度僅71nt的arRNA不僅有更高的編輯效率，而且合成成本更低（參考價格見表2）。此外，可以預期，更短的arRNA可能會有更低的脫靶風險。
表2. arRNA合成長度及價格
arRNA長度 arRNA名稱 合成量 合成參考價格
111nt 55-C-55 3nmol $750
71nt 55-C-15 5nmol $314
通過對GFP信號的讀取，吾人可以快速粗略地判斷不同arRNA的編輯效率，但如果更準確地確認編輯效率，則需通過二代定序（Next Generation Sequencing, NGS)，來最終確認mRNA中有多少比例的A被編輯成I(G)。
按照本實施例中上述相同步驟1、2進行細胞鋪板和轉染，並於細胞傳代後72h用800μL TRIzol (Invitrogen, 15596018)收樣，採用Direct-zol RNA Miniprep套組(Zymo Resaerch, R2052)進行RNA提取。每個樣品取1000ng提取的RNA，用TransScript® One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix套組(全式金，AT311)進行反轉錄，以合成cDNA。之後，取1μL反轉錄產物，用序列為ggagtgagtacggtgtgcGGAAGAAAACCCCGGTCCTGCTA（SEQ ID NO：33）和gagttggatgctggatggAACAGAACTGAATGAGCACTCGTGG（SEQ ID NO：34）兩個引子以及Q5暖開機酶(NEB, M0494L)進行PCR。PCR產物用Hi-TOM套組(諾禾致源，REF PT045)進行建庫並按照以下步驟完成二代定序和資料分析。
i. Illumina定序
將構建好的定序文庫，通過NovaSeq6000平臺以PE150方式進行高通量定序。
ii. 定序資料處理
將高通量定序得到的原始資料用fastp (v0.19.6)進行質控，過濾掉低品質、帶有連接子的序列、以及含有polyG等的序列。將得到的高品質定序數據按照相應的barcode序列拆分到每個樣本，使用BWA (v0.7.17-r1188)軟體與擴增的目的地區域的序列進行比對，通過SAMtools (v1.9)進行格式轉換以生成BAM檔。統計比對資訊並重新排序和建立索引。
iii. 編輯效率分析
使用JACUSA (v1.3.0)軟體偵測所有潛在的RNA突變位點，所用參數為：call-1 -a B,R,D,I,Y,M:4 -C ACGT -c 2 -p 1 -P UNSTRANDED -R -u DirMult-CE。過濾掉同時在對照和處理樣本中出現的高頻點突變之後，以A-＞G突變位點之外的平均突變頻率的三倍作為閾值，將標靶鹼基A-＞G突變頻率在閾值之上的部分作為真實的標靶A突變為G的頻率。
採用如上步驟，吾人最終對圖12中全部樣品進行了二代定序，以標靶鹼基為G的Reads數占其為ATCG的全部Reads數的百分比作為編輯效率，並以此作圖，結果如圖13所示。
對比圖12與圖13，不難看出，通過不同方法測試得到的編輯效率呈現基本相同的趨勢。即按照LEAPER文獻(Qu et al., 2019)中設計的111nt的arRNA並非編輯效率最高的arRNA，而經過吾人對靶向鹼基3’端的截短、5’端的截短以及對靶向鹼基在序列中位置的調整，最終發現55-C-15（SEQ ID NO：9）的序列不僅在GFP的讀值上體現出較高的編輯效率，並且通過二代定序也可以進一步證實，其A到G的編輯效率可達到50%左右，這意味著經55-C-15的arRNA編輯後的細胞中有50%的mRNA上的標靶鹼基位點發生了從A到G的編輯。
通過以上試驗，吾人證實，按照本申請所述技術方案設計的arRNA相較於現有技術可以達到更高的編輯效率，並且成本更低。同時，可以預知，由於本申請的arRNA所需長度更短，因此在轉染拷貝數相同的情況下，本申請中的arRNA轉染入細胞的品質更低，這將有益於降低過量RNA的轉入對細胞造成的毒性，同時也減少了arRNA與非標靶RNA序列的結合，從而提高了體內編輯的安全性。
實施例 3 ：小鼠眼部 Ush2A 基因位點的體內編輯
實施例2中，通過體外試驗對USH2A致病位點進行了編輯。雖然體外試驗可以取得好的編輯效率，但體外細胞培養的環境無法模擬人體內迴圈、免疫系統以及眼球內注射等多態樣因素，此等仍需更多體內試驗驗證。考慮到後續與實際治療對接，而目前對於眼部的小RNA遞送，通常選用腺病毒相關病毒(Adeno-Associated Virus，AAV)，吾人最終選擇了使用AAV載劑作為arRNA的遞送方式進行小鼠眼部Ush2A基因位點的體內編輯。吾人採取了151nt arRNA(SEQ ID NO：32)進行本試驗。即本實施例所使用的測試arRNA中包含了與標靶A對位靶向鹼基C，當該arRNA與標靶RNA雜交時，即可在標靶A處形成A-C不匹配（錯配）。同時，該arRNA靶向鹼基C的5’端和3’端則分別為與標靶序列完全互補的75nt鹼基序列。由於小鼠Ush2A基因與人USH2A基因序列不同，且測試小鼠並不攜帶Usher綜合症相關突變，本實施例中使用的151nt arRNA是靶向小鼠Ush2A相關位點的arRNA，而非靶向人USH2A基因序列的arRNA。吾人將該arRNA編碼序列插入至AAV載劑U6啟動子起始位點之後，並將插入arRNA序列的AAV載劑包裝成1×1013 GC/mL的AAV2和AAV5。其中，AAV載劑的構建(構建後的載劑見SEQ ID NO：16, 其中arRNA編碼序列以大寫表示，同一字母的大小不代表鹼基差異)和AAV病毒的包裝均由廣州派真生物技術有限公司完成。
本實施例採用的是6~8周齡的SPF級別C57雄性小鼠，試驗組(AAV2及AAV5組)與對照組(PBS)每組各8只小鼠，一共24只。通過玻璃體向試驗組及對照組小鼠右眼分別注入2μL AAV或PBS。在注射後第7天(後標記為第1周)、第14天(後標記為第2周)，將每組小鼠各處死4只，並取出其右眼，用剪刀剪碎至50~100mg的小塊。加液氮研磨後用800μL TRIzol (Invitrogen, 15596018)收樣。採用Direct-zol RNA Miniprep套組(Zymo Resaerch, R2052)進行RNA提取。每個樣品取1000ng提取的RNA用TransScript® One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix套組(全式金，AT311)進行反轉錄以合成cDNA。每只小鼠各取1μL反轉錄產物，用序列為ggagtgagtacggtgtgcCCCATCTCTTTGGCTTGGAACCAT（SEQ ID NO：22）和gagttggatgctggatggCTTTTCTCTCTGCTCCACTGTGAAGTT（SEQ ID NO：24）的兩個引子以及Q5暖開機酶(NEB, M0494L)進行PCR。PCR產物用Hi-TOM套組(諾禾致源，REF PT045)進行建庫並完成二代定序和資料分析(定序和資料分析方法同實施例2)。
結果如圖14所示。從圖中可以看出，在小鼠體內試驗中，通過小鼠玻璃體注射時，小鼠眼球細胞中的AA5編輯效率較AAV2更高。但是從圖中可以明顯的看出，無論是AAV2還是AAV5，編輯效率均較低。例如，在第7天，AAV2的平均編輯效率為0.5%，與PBS組無明顯差異。而AAV5的平均效率雖然為1%左右，但4個平行試驗呈現明顯不一致的編輯效率，其中一個編輯效率為2%以上，另外3個為約0.5%。而到了第14天，AAV2組也有了將近1%的編輯效率，而AAV5組有平均2%的編輯效率，並且其中有一個樣品有接近5%的編輯效率。通過該試驗，吾人發現如下幾個問題：首先，在小鼠眼球中似乎AAV5比AAV2的編輯效率更高；其次，不同小鼠間資料差異較大，這可能預示著吾人玻璃體注射的條件並不穩定，導致每次注射的差異較大；最後，從第7天到第14天編輯效率有上升的趨勢，這意味著如果延後偵測時間，可能會偵測到更高的編輯效率。
因此，吾人重新進行了小鼠眼球注射的試驗，並對試驗體系進行了如下的優化：1)由於AAV5比AAV2的編輯效率高，此次試驗吾人保留了AAV5，並且測試了另一血清型的AAV病毒：AAV8；2) 針對玻璃體注射編輯效果不穩定的問題，吾人將注射條件改為視網膜下腔注射，並在注射後通過光學相干斷層掃描(Optical Coherence Tomography，OCT)確認小鼠視網膜下腔注射成功；3) 偵測時間修改為第14 (第2周)、28 (第4周)、42 (第6周)、56 (第8周)；4)由於Usher綜合症是由於視網膜中視錐細胞和視杆細胞的退行性病變導致的，因此本次試驗僅偵測了視網膜中Ush2A的編輯效率，相較於偵測整個眼球的編輯效率，僅偵測視網膜中Ush2A的編輯效率對未來治療更具指導意義。
在本次試驗中，採用的小鼠為6~8周齡的SPF級別C57雄性小鼠，試驗組(AAV5、AAV8組)每組各20只，對照組(NaCl)12只。
視網膜下腔注射方法如下：向動物雙眼各滴複方托吡卡胺滴眼液 1~2 滴散瞳，用舒泰50進行肌肉注射（50 mg/kg， 50 mg/mL）以對動物進行全身麻醉。使麻醉後的小鼠側臥於操作臺上。使用聚維酮碘棉球對小鼠眶周皮膚進行消毒。用有齒顯微鑷夾住眼球一側的結膜，用顯微剪剪開球結膜下筋膜，暴露部分鞏膜。保持顯微鑷不動，將蓋玻片覆蓋在角膜上，用卡波姆滴眼液排除其間空氣，後用一次性胰島素針與鞏膜成一個小角度，行鞏膜、脈絡膜穿刺，直達視網膜上皮與視網膜交界處，形成通道。繼續保持顯微鑷不動，退出胰島素針，並將其更換為33G顯微注射器。將33G顯微注射器從通道口紮至視網膜下，緩慢給藥1μL後，停針至少3-5 s。在動物麻醉狀況良好的狀態下繼續將顯微注射器保持在通道內30s左右(以儘量減少退針時的漏液體積)。在每只小鼠給藥後需清洗針頭，以確保無交叉污染。雙眼注射結束後，使用OCT掃描確認注射位置為視網膜下腔。若雙眼均成功注射至視網膜下腔則判定該動物注射成功。注射後於第14、28、42、56天分別安樂死5只(試驗組)或3只(對照組)小鼠。取出小鼠左眼，用手術刀沿角鞏膜緣360°切開角膜。去掉虹膜和晶狀體，取視網膜-脈絡膜-鞏膜複合體，將最外側鞏膜剔除後，剪碎並放入裝有經預冷的400μL TRIzol（Thermo, 15596018）的無菌 EP 管中。然後用組織勻漿機混勻。用Direct-zol RNA Microprep套組(Zymo Resaerch, R2062)提取RNA。每個樣品取1000ng提取的總RNA用全式金反轉錄套組(全式金，AH341-01)反轉錄，並取5μL 反轉錄後的cDNA用序列為ggagtgagtacggtgtgcCCCATCTCTTTGGCTTGGAACCAT（SEQ ID NO：22）和gagttggatgctggatggCTTTTCTCTCTGCTCCACTGTGAAGTT（SEQ ID NO：2）的兩個引子以及Q5暖開機酶(NEB, M0494L)進行PCR。PCR產物用Hi-TOM套組(諾禾致源，REF PT045)進行建庫並完成二代定序和資料分析(定序和資料分析方法同實施例2)。
結果如圖15所示。從圖中可以明顯的看出，相比於首次試驗最高平均2%的編輯效率（圖14），本次試驗最高可達超過5%的編輯效率。另外，由於本次試驗剝離了小鼠視網膜進行收樣定序，而非將小鼠整個眼球剪碎研磨，因此更能反應實際治療時產生的實際治療效應。通過本試驗可以證明，LEAPER技術可以在小鼠體內試驗中編輯視網膜細胞中Ush2A內源基因位點，並且這種編輯可以在小鼠體內持續至少2個月。
綜合以上實施例結果，本申請充分證明了使用本申請公開的技術方案治療Usher綜合症的可行性。
SEQ ID NO：32： CCACUGCAGCAGCAAAGCCCGGCCCUUUUCUCUCUGCUCCACUGUGAAGUUCAUCAGUCCGCUUGGGGCAGAUUCCAAAGUCUUAAUCAGGGUCCAGGGGCUCGACACCUUUCCUGCACUGUUUACAGCCACCACACCAAUGUGGUAUGUU
SEQ ID NO：16： cctgcaggcagctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcctgcggccattcggtacaattcacgcgtgagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccgCCACTGCAGCAGCAAAGCCCGGCCCTTTTCTCTCTGCTCCACTGTGAAGTTCATCAGTCCGCTTGGGGCAGATTCCAAAGTCTTAATCAGGGTCCAGGGGCTCGACACCTTTCCTGCACTGTTTACAGCCACCACACCAATGTGGTATGTTtttttttttggtaccaggtcttgaaaggagtgggcgcgtgtcgacattgattattgactagctctggtcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctactcgaggccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgggagcgggatcagccaccgcggtggcggccctagagtcgatcgaggaactgaaaaaccagaaagttaactggtaagtttagtctttttgtcttttatttcaggtcccggatccggtggtggtgcaaatcaaagaactgctcctcagtggatgttgcctttacttctaggcctgtacggaagtgttacttctgctctaaaagctgcggaattgtacccgcggccgatccaccggtcgccaccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaaatcgaattccgctcgagataatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttagttcttgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgtttatttgtgaaatttgtgatgctattgctttatttgtaaccatctagctttatttgtgaaatttgtgatgctattgctttatttgtaaccattataagctgcaataaacaagttaacaacaacaattgcattcattttatgtttcaggttcagggggagatgtgggaggttttttaaagcggccgcaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagctgcctgcaggggcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatacgtcaaagcaaccatagtacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgatttgggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcgggctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgtttacaattttatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgagacgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgt
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無
圖1顯示了Usher綜合症Ⅱ型病人夜盲症病情進展示意圖13 。 圖2顯示了138例Usher病人致病基因突變分佈圖7 。 圖3顯示了USH2A基因突變類型分析圖7 。 圖4顯示了反映USH2A基因突變位點的編輯效率的報告體系設計示意圖。 圖5顯示了USH2A基因突變位點的編輯效率的評判指標示意圖。 圖6顯示了不同長度的arRNA編輯效率的測試結果。 圖7顯示了報告體系中假陽性細胞的FITC通道強度。 圖8顯示了LEAPER技術中arRNA長度與編輯效率的關係10 。 圖9顯示了arRNA從5’以及3’向中間截短後的編輯效率測試結果。 圖10顯示了固定arRNA 3’長度為25nt並從5’逐漸截短後的編輯效率測試結果。 圖11顯示了靶向鹼基位置對編輯效率的影響。 圖12顯示了同批次arRNA編輯效率的重複測試結果的比較。圖中293T表示未侵染報告體系的293T；僅報告子體系為侵染有報告體系的293T；Opti-DMEM為在轉染中不加入RNAi MAX的培養基空白對照；僅遞送載劑對照為僅有RNAi MAX的對照，對應此前測試中的對照(NC)孔；隨機序列RNA為不與人類基因組匹配的91nt隨機RNA序列(uaauccugaauaucgcgcaauuccccagcagagaacaucgcggugugaacgucccuuuauaccgggcagguauagcugaaaucagcguggc (SEQ ID NO：35))。 圖13顯示了同批次arRNA通過二代定序獲得的編輯效率重複測試結果的比較。 圖14 顯示採用玻璃體內注射時，通過AAV2和AAV5遞送的arRNA在體內的編輯效率。 圖15 顯示採用視網膜下腔注射時，通過AAV5和AAV8遞送的arRNA在體內隨時間變化的編輯效率。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
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Claims (25)

  1. 一種基於LEAPER技術靶向編輯細胞中標靶RNA的方法，其中所述標靶RNA為USH2A基因轉錄本中含有G到A突變的RNA，該方法包括： 將包含用於編輯標靶RNA的腺苷去胺酶招募RNA(arRNA)的構建體或編碼所述arRNA的構建體導入所述細胞中，其中所述arRNA包含與所述標靶RNA雜交的互補RNA序列，並且其中所述arRNA能夠招募作用於RNA的腺苷去胺酶（ADAR）以使標靶RNA中的標靶腺苷去胺基。
  2. 如請求項1所述的方法，其中所述標靶RNA為mRNA前體（Pre-mRNA）。
  3. 如請求項1或請求項2所述的方法，其中所述arRNA長約151-61 nt、131-66 nt、121-66 nt、111-66 nt、91-66 nt或81-66 nt。
  4. 如請求項3所述的方法，其中所述arRNA長度選自66nt-131nt中的任意自然數。
  5. 如請求項1至請求項4中任一項所述的方法，其中所述arRNA中靶向鹼基距離3’端的長度≥7nt，≥10nt、≥15nt，較佳16-55nt、20-50nt、25-45nt、25-35nt或25-30nt。
  6. 如請求項1至請求項5中任一項所述的方法，其中所述arRNA中靶向鹼基距離5’端的長度≥25nt，≥30、≥35、≥45，較佳46-90nt、50-85nt、55-80nt、60-75nt或65-70nt。
  7. 請求項1至請求項6中任一項的方法，其中向所述arRNA引入與標靶序列中的標靶A配對的靶向鹼基，該靶向鹼基的較佳次序從高到低依次為C、A、U或G。
  8. 如請求項1至請求項7中任一項的方法，其中所述標靶RNA為包含轉錄有人USH2A基因NM_206933.2(USH2A)_c.11864 G＞A (p.Trp3955Ter)突變位點的RNA。
  9. 如請求項1至請求項8中任一項所述的方法，其中所述arRNA選自：SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4。
  10. 如請求項1至請求項9中任一項所述的方法，其中所述arRNA選自：SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9。
  11. 如請求項1至請求項10中任一項所述的方法，其中所述構建體為線性核酸、病毒載劑、或質粒。
  12. 如請求項11所述的方法，其中所述病毒載劑為腺相關病毒（AAV）載劑或慢病毒載劑。
  13. 如請求項12中所述的方法，其中所述AAV載劑包裝入AAV2、AAV5或AAV8衣殼後通過侵染導入所述細胞中。
  14. 如請求項13所述的方法，所述AAV載劑包裝入AAV8衣殼後通過侵染導入所述細胞中。
  15. 如請求項1至請求項14任一項所述的方法，其中所述細胞為哺乳動物視神經細胞或聽神經細胞。
  16. 一種用於靶向編輯USH2A基因轉錄本中含有G到A突變的標靶RNA的arRNA，包含選自如下的序列或由選自如下的序列組成：SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、或SEQ ID NO：4。
  17. 一種包含如請求項16所述的arRNA的構建體或遞送體。
  18. 如請求項17所述的構建體或遞送體，其為質粒、病毒、脂質體、或脂質奈米顆粒。
  19. 如請求項18所述的構建體或遞送體，其為腺相關病毒（AAV）或慢病毒。
  20. 如請求項19所述的構建體或遞送體，其所述病毒為AAV2、AAV5或AAV8。
  21. 一種通過如請求項1至請求項15中任一項所述的方法編輯獲得的細胞。
  22. 一種治療個體中Usher II型綜合症的方法，包括使用如請求項1至請求項15中任一項所述的方法校正所述個體的細胞中與Usher II型綜合症有關的G到A的突變。
  23. 如請求項22所述的方法，其包括將如請求項16所述的arRNA或如請求項17至請求項20中任一項所述的構建體或遞送體導入個體。
  24. 如請求項23所述的方法，其中將如請求項16所述的arRNA或如請求項17至請求項20中任一項所述的構建體或遞送體導入個體視網膜下腔中。
  25. 一種如請求項16所述的arRNA或如請求項17至請求項20中任一項所述的構建體或遞送體在製備治療Usher II型綜合症的藥物中的用途。
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