JP2023509177A - Ｕｓｈｅｒ症候群を治療する方法及びその組成物 - Google Patents

Abstract

本願は、ＬＥＡＰＥＲ技術に基づいてＵＳＨ２Ａ遺伝子転写物におけるＧからＡへの突然変異を含む標的ＲＮＡを標的化編集する方法に関し、該方法は、標的ＲＮＡを編集するためのアデノシンデアミナーゼ動員ＲＮＡ（ａｒＲＮＡ）又は前記ａｒＲＮＡをコードする構築体を前記細胞に導入するステップを含み、前記ａｒＲＮＡが前記標的ＲＮＡとハイブリダイズされる相補的ＲＮＡ配列を含み、前記ａｒＲＮＡがＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を動員して標的ＲＮＡにおける標的アデノシンを脱アミノ化することができ、ＲＮＡにおけるＡからＩ塩基へのインビボ編集を安全でかつ効果的に行い、病原性の突然変異部位を修復し、疾患、例えば、Ｕｓｈｅｒ症候群を治療するという目的を達成する。【選択図】なし

Description

本願は、遺伝子編集の治療分野に属し、具体的には、ＬＥＡＰＥＲ（Ｌｅｖｅｒａｇｉｎｇ Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ＡＤＡＲ ｆｏｒ Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｎ ＲＮＡ）技術に基づいてＵｓｈｅｒ症候群ＩＩ型（Ｕｓｈｅｒ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｔｙｐｅ ＩＩ）に関連する遺伝子変異を標的として編集する方法に関する。

Ｕｓｈｅｒ症候群は、遺伝性難聴－網膜色素変性症候群とも呼ばれ、１９１４年に、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｈｏｗａｒｄ Ｕｓｈｅｒによって記載され、名称が付けられ^１２、遺伝子突然変異によって引き起こされ、患者の先天性又は進行性の視覚能力及び聴覚能力の喪失をもたらす常染色体劣性遺伝性希少疾患である。Ｕｓｈｅｒ症候群の発生率は、ドイツでは約１／１２５００であり^８、ノルウェーでは１／２８０００であり^４、アメリカでは１／２３０００であり、アメリカでは１６０００人の視覚及び聴覚障害者のうち、半分以上の患者がＵｓｈｅｒ症候群を罹患すると推定される^１。世界中で数万乃至数十万人の患者の治療は、急務となっている。

１９７７年に、Ｄａｖｅｎｐｏｒｔらは、Ｕｓｈｅｒ症候群を検討して、その重症度によってそれをＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ型に分類する^３。そのうち、Ｉ型は、重度の先天性難聴であり、１０歳前後に重度の視覚障害を有し、ＩＩ型は、中程度から重度の先天性難聴であり、約１０歳～５０歳に徐々に視力を失う。ＩＩＩ、ＩＶ型は、比較的少なく、軽症であり、聴覚について進行性の感音性難聴であり、視力の欠失時間が不確定である。Ｉ型は、発症が早く、治療介入期間が短いが、ＩＩＩ、ＩＶ型は、病状が比較的軽い。ＩＩ型患者の視力喪失は、１０～２０歳から徐々に現れ始め、発症の初期段階において夜盲症として現れ、最終的には視力を失い（図１）、これは、より長い治療介入期間を可能にし、患者の視力の進行性喪失を終了させる見込みがある。

Ｎｅｕｈａｕｓらは、２０１７年に、ハイスループット塩基配列決定により、１３８人のＵｓｈｅｒ症候群患者を研究し、その結果として、１３８人のうち８２人にＵＳＨ２Ａ遺伝子突然変異が現れるが、８２人のうち８０人がＵｓｈｅｒ症候群ＩＩ型であることを示す（図２）^７。したがって、Ｕｓｈｅｒ症候群ＩＩ型患者のみを考慮すると、ＵＳＨ２Ａ遺伝子突然変異の割合は９０％を超え（図２）^７、ＵＳＨ２Ａ遺伝子に対する治療スキームは、これらの患者に利益をもたらす可能性が高い。

ＵＳＨ２Ａ遺伝子は、Ｕｓｈｅｒｉｎと呼ばれるタンパク質をコードし、該タンパク質は、視覚において重要な機能を果たし、主に、感光性の錐体視細胞と桿体視細胞において、インナーセグメント（Ｉｎｎｅｒ Ｓｅｇｍｅｎｔ）とアウターセグメント（Ｏｕｔｅｒ Ｓｅｇｍｅｎｔ）を接続する重要な役割を果たす。ＵＳＨ２Ａが変異すると、錐体視細胞及び桿体視細胞の変性死が引き起こされる^５。Ｎｅｕｈａｕｓらが２０１７年に検討した結果から、その配列決定されたＵＳＨ２Ａ遺伝子突然変異の例のうち、１３％がＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）＿ｃ．１１８６４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３９５５Ｔｅｒ）であるが、この変異型が全ての変異型に占める割合が最も高い単一の変異型であることを示す（図３）^７。

ＵＳＨ２Ａ遺伝子の突然変異によるＵｓｈｅｒｉｎの正常な機能の喪失は、ＵＳＨＥＲ症候群ＩＩ型を引き起こす重要な原因であり、ＵＳＨ２Ａ遺伝子に対する治療は、現在のＵｓｈｅｒＩＩ型の治療の主な研究開発方向となっている。

現在、遺伝子療法でＵＳＨＥＲ症候群ＩＩ型を治療する研究開発方向は、主に２つあり、１つは、ウイルス等の方式により、完全なＵＳＨ２Ａ遺伝子が眼部に再発現されることを媒介する。しかしながら、ＵＳＨ２Ａ遺伝子のタンパク質配列が、６０００アミノ酸を超え、非常に長いため、その対応するコード領域配列は、１８０００塩基対を超える。一般的なウイルスベクターによる送達長は、限られている。一般的には、レンチウイルスの送達量は、１００００塩基対を超えないが、アデノ随伴ウイルスの送達量は、４５００塩基対を超えない。これは、ウイルスベクターによる全長のＵＳＨ２Ａ遺伝子の送達を困難にする。したがって、医療及び科学研究者らは、切断型ＵＳＨ２Ａ遺伝子の送達のみを選択する。このようにすると、病状の進行をある程度緩和することができるが、患者は依然として正常な全長のＵｓｈｅｒｉｎを欠いているため、Ｕｓｈｅｒｉｎの本来の正常な生理機能を完全に果たすことができない。

ＵＳＨ２Ａ遺伝子に対する別の一般的な治療開発方向は、エクソンスキッピング（Ｅｘｏｎ Ｓｋｉｐｐｉｎｇ）によるものである。一部のＵＳＨ２Ａ遺伝子の突然変異方式は、あるエクソンのフレームシフト（Ｆｒａｍｅ Ｓｈｉｆｔ）又はナンセンス突然変異（ナンセンス変異）によって引き起こされるため、ＲＮＡスプライシングの過程において、該エクソンを特異的にスキップすることができれば、該エクソン以降の配列を正常に翻訳することができる。スプライス過程で翻訳ヌクレオチドの標的とするエクソンを特異的にスキップするように、短いアンチセンスヌクレオチド（Ａｎｔｉ－Ｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏ、ＡＳＯ）を導入することが慣行である。この方法は、上記方法と同様に、突然変異が生じたエクソンをスキップするため、最終的に全長のＵｓｈｅｒｉｎを得ることができない。

近年、ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ）を始めとする遺伝子編集技術は、速く発展しており、かつ生物及び医学の多くの分野に深刻な影響を与える。多くの科学研究者及びバイオテクノロジー企業も、該技術を臨床に普及する努力をしている。２０１９年９月に北京大学のデン宏魁教授とその協力者が発表した論文は、ＣＲＩＳＰＲ技術を利用して幹細胞を編集しそれを患者に戻し、それによりそのエイズと白血病を治療する臨床試験結果を^１１回報告し、ＣＲＩＳＰＲ技術の遺伝子治療方向への転換に巨大な貢献をする。

ＣＲＩＳＰＲ技術が非常に広い応用の将来性を有するが、一連の欠点が存在するため、科学研究段階から臨床治療応用への転換に進まない。問題の１つは、ＣＲＩＳＰＲ技術に用いたコア作用酵素であるＣａｓ９にある。ＣＲＩＳＰＲのＤＮＡ編集技術に基づいて、Ｃａｓ９又は類似の機能を有する他のヌクレアーゼを外因的に発現しなければならないため、いくつかの問題を引き起こす。まず、外因的発現を必要とするヌクレアーゼは、一般的により大きな分子量があり、これは、ウイルスベクターによるヌクレアーゼのインビボへの送達効率を劇的に低下させる。次に、ヌクレアーゼの外因的発現のため、このような方法に潜在的なヌクレアーゼオフターゲットの可能性が存在し、これはその応用における潜在的な発癌リスクをもたらす。最後に、外因的に発現されたＣａｓ９などの類似ヌクレアーゼは、細菌から発見されるが、ヒト又は哺乳動物に天然に存在するものではなく、それは、患者体内の免疫反応を引き起こす可能性があり、これは、一方では、患者自身に損傷を与える可能性があり、他方では、外因的に発現されたヌクレアーゼを中和させ、それによりあるべき活性を失い、治療効果に影響を与える可能性がある。

２０１７年には、マサチューセッツ工科大学の張鋒教授及びその研究グループは、ＲＥＰＡＩＲ（ＲＮＡ Ｅｄｉｔｉｎｇ ｆｏｒ Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ａ ｔｏ Ｉ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）というＲＮＡ編集技術を報告した。Ｃａｓ１３－ＡＤＡＲ融合タンパク質及びシングルガイドＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ）を外因的に発現することにより、目的ＲＮＡを標的とするＡからＩへの編集を実現することができるが、該方法は、ＣＲＩＳＰＲ技術と同様であり、依然として外因的タンパク質の発現を必要とする。外因的タンパク質の発現による問題を解決することができない。

２０１９年１月に、Ｔｈｏｒｓｔｅｎ Ｓｔａｆｆｏｒｓｔ研究グループは、ＲＥＳＴＯＲＥ（ｒｅｃｒｕｉｔｉｎｇ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ＡＤＡＲ ｔｏ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｒａｎｓ ｆｏｒ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ、Ｍｅｒｋｌｅ ｅｔ ａｌ．、２０１９）というＲＮＡ単一塩基編集技術を報告した。ＲＥＳＴＯＲＥは、外来タンパク質への依存を回避することができるが、ＲＥＳＴＯＲＥ技術は、ＩＦＮ－γが存在する前提で高い編集効率を有する必要があり、ＩＦＮ－γは、自己免疫の発展と重症度を決定する重要な因子であり、これは、該技術の医学分野における応用を大幅に低下させる。一方、ＲＥＳＴＯＲＥ技術にガイドＲＮＡセグメントも同様に使用されるが、それに使用されるガイドＲＮＡは、化学合成されたオリゴヌクレオチドであり、それが合成したオリゴヌクレオチドは、その安定性を確保するために大量の化学修飾を人為的に導入する必要がある。これらの化学修飾は、一部が非天然の修飾であるため、該オリゴヌクレオチドに毒性又は免疫原性が存在し得る。また、一部の修飾は、同じ塩基鎖の異なるコンフォメーションをもたらし、それにより、同じＲＮＡ配列の場合、コンフォメーションの数十の異なる組み合わせが可能であり、これは、細胞内へのその送達の困難性を増加させる。

上記３種類の技術はいずれも一定の欠陥が存在し、ＵＳＨ２Ａ遺伝子自体の特殊性に鑑み、上記３種類の技術は、いずれもＵＳＨＥＲ症候群ＩＩ型を治療することが困難である。

２０１９年７月に、北京大学の生命科学学院の魏文勝教授の研究グループは、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙに「Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ ｂｙ ｒｅｃｒｕｉｔｉｎｇ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ＡＤＡＲ ｕｓｉｎｇ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＲＮＡｓ」という論文を発表し、初めて新たな核酸編集技術であるＬＥＡＰＥＲ（Ｌｅｖｅｒａｇｉｎｇ Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ＡＤＡＲ ｆｏｒ Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ＲＮＡ、Ｑｕ ｅｔ ａｌ．、２０１９）を報告した。一方では、ＣＲＩＳＰＲ技術と比較し、該技術は、原理的に外因性ヌクレアーゼの過剰発現への依存を回避し、ガイドとしてＲＮＡセグメントのみを必要とし、内因性ヌクレアーゼを編集が必要な部位に動員する。それにより、該技術は、医学分野への変換過程において、より大きな利点を有する。他方では、該技術は、転写レベルのみでアデノシンＡからクレアチニンＩへの編集を実現し（クレアチニンＩは、タンパク質翻訳過程ではグアノシンＧと識別される）、ゲノムにおける配列を変えず、したがってより安全で便利である。ＬＥＡＰＥＲ技術は、化学合成されたＲＮＡにより達成されることではなく、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルスなどのベクターによっても患者に送達して機能することができる。これは、その送達手段の選択をより柔軟にする。

Ｂｏｕｇｈｍａｎ，Ｊ．Ａ．，Ｖｅｒｎｏｎ，Ｍ．，＆Ｓｈａｖｅｒ，Ｋ．Ａ．（１９８３）．Ｕｓｈｅｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｓｔｉｍａｔｅ ｏｆ ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｆｒｏｍ ｔｗｏ ｈｉｇｈ－ｒｉｓｋ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｈｒｏｎｉｃ ｄｉｓｅａｓｅｓ， ３６（８），５９５－６０３． Ｃｏｘ，Ｄ．Ｂ．，Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｓ．，Ａｂｕｄａｙｙｅｈ，Ｏ．Ｏ．，Ｆｒａｎｋｌｉｎ，Ｂ．，Ｋｅｌｌｎｅｒ，Ｍ．Ｊ．，Ｊｏｕｎｇ，Ｊ．，＆Ｚｈａｎｇ，Ｆ．（２０１７）．ＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３．Ｓｃｉｅｎｃｅ，３５８（６３６６），１０１９－１０２７． Ｄａｖｅｎｐｏｒｔ，Ｓ．Ｌ．Ｈ．，＆Ｏｍｅｎｎ，Ｇ．Ｓ．（１９７７）．Ｔｈｅ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｏｆ Ｕｓｈｅｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｖｔｈ Ｉｎｔ．Ｃｏｎｆ． Ｂｉｒｔｈ Ｄｅｆｅｃｔｓ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ． Ｇｒｏｎｄａｈｌ，Ｊ．（１９８７）．Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｏｆ ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ ａｎｄ Ｕｓｈｅｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｉｎ Ｎｏｒｗａｙ． Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ３１（４），２５５－２６４． Ｌｉｕ，Ｘ．，Ｂｕｌｇａｋｏｖ，Ｏ．Ｖ．，Ｄａｒｒｏｗ，Ｋ．Ｎ．，Ｐａｗｌｙｋ，Ｂ．，Ａｄａｍｉａｎ，Ｍ．，Ｌｉｂｅｒｍａｎ，Ｍ．Ｃ．，＆Ｌｉ，Ｔ．（２００７）．Ｕｓｈｅｒｉｎ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｏｆ ｒｅｔｉｎａｌ ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ ｎｏｒｍａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｃｏｃｈｌｅａｒ ｈａｉｒ ｃｅｌｌｓ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １０４（１１），４４１３－４４１８． Ｍｅｒｋｌｅ，Ｔ．，Ｍｅｒｚ，Ｓ．，Ｒｅａｕｔｓｃｈｎｉｇ，Ｐ．，Ｂｌａｈａ，Ａ．，Ｌｉ，Ｑ．，Ｖｏｇｅｌ，Ｐ．，…＆Ｓｔａｆｆｏｒｓｔ，Ｔ．（２０１９）．Ｐｒｅｃｉｓｅ ＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ ｂｙ ｒｅｃｒｕｉｔｉｎｇ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ＡＤＡＲｓ ｗｉｔｈ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３７（２），１３３． Ｎｅｕｈａｕｓ，Ｃ．，Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｔ．，Ｄｅｃｋｅｒ，Ｃ．，Ｎａｇｌ，Ｓ．，Ｂｌａｎｋ，Ｃ．，Ｐｆｉｓｔｅｒ，Ｍ．，…＆Ｂｅｃｋ，Ｂ．（２０１７）．Ｎｅｘｔ‐ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅｖｅａｌｓ ｔｈｅ ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ｌａｎｄｓｃａｐｅ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ ｄｉａｇｎｏｓｅｄ Ｕｓｈｅｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ，ｐｈｅｎｏｃｏｐｉｅｓ，ａ ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｒｅａｄ‐ｔｈｒｏｕｇｈ，ａｎｄ ＰＥＸ ２６ ｍｕｔａｔｅｄ ｉｎ Ｈｅｉｍｌｅｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ＆ｇｅｎｏｍｉｃ ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ５（５），５３１－５５２． Ｏｔｔｅｒｓｔｅｄｄｅ，Ｃ．Ｒ．，Ｓｐａｎｄａｕ，Ｕ．，Ｂｌａｎｋｅｎａｇｅｌ，Ａ．，Ｋｉｍｂｅｒｌｉｎｇ，Ｗ．Ｊ．，＆Ｒｅｉｓｓｅｒ，Ｃ．（２００１）．Ａ ｎｅｗ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｕｓｈｅｒ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａ ｎｅｗ ｓｕｂｔｙｐｅ ｏｆ Ｕｓｈｅｒ’ｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｔｙｐｅ Ｉ． Ｔｈｅ Ｌａｒｙｎｇｏｓｃｏｐｅ， １１１（１），８４－８６． Ｐｏｌｌａｒｄ，Ｋ．Ｍ．，Ｃａｕｖｉ，Ｄ．Ｍ．，Ｔｏｏｍｅｙ，Ｃ．Ｂ．，Ｍｏｒｒｉｓ，Ｋ．Ｖ．，＆Ｋｏｎｏ，Ｄ．Ｈ．（２０１３）．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ ａｎｄ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１６（８７），１２３． Ｑｕ，Ｌ．，Ｙｉ，Ｚ．，Ｚｈｕ，Ｓ．，Ｗａｎｇ，Ｃ．，Ｃａｏ，Ｚ．，Ｚｈｏｕ，Ｚ．，…＆Ｂａｏ，Ｙ．（２０１９）．Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ ｂｙ ｒｅｃｒｕｉｔｉｎｇ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ＡＤＡＲ ｕｓｉｎｇ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＲＮＡｓ． Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ３７（９），１０５９－１０６９． Ｘｕ，Ｌ．，Ｗａｎｇ，Ｊ．，Ｌｉｕ，Ｙ．，Ｘｉｅ，Ｌ．，Ｓｕ，Ｂ．，Ｍｏｕ，Ｄ．，…＆Ｚｈａｏ，Ｌ．（２０１９）．ＣＲＩＳＰＲ－ｅｄｉｔｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ａ ｐａｔｉｅｎｔ ｗｉｔｈ ＨＩＶ ａｎｄ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３８１（１３），１２４０－１２４７． Ｕｓｈｅｒ，Ｃ．Ｈ．（１９１４）．Ｏｎ ｔｈｅ ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｏｆ ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ； ｗｉｔｈ ｎｏｔｅ ｏｆ ｃａｓｅｓ． Ｒｏｙａｌ Ｌｏｎｄｏｎ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ Ｈｏｓｐ Ｒｅｐ， １９，１３０－２３６． ｈｔｔｐｓ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｎｙｃｔａｌｏｐｉａ

本願は、ＬＥＡＰＥＲ技術に基づいてＵＳＨ２Ａ遺伝子転写物（トランスクリプト）におけるＧからＡへの突然変異を含む標的ＲＮＡを標的化編集する方法に関し、標的ＲＮＡを編集するために使用されるアデノシンデアミナーゼ動員ＲＮＡ（ａｒＲＮＡ）又は前記ａｒＲＮＡをコードする構築体を、標的ＲＮＡを含有する細胞に導入することによって、前記ａｒＲＮＡがＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を動員して標的ＲＮＡにおける標的アデノシンを脱アミノ化する。本願は、ＬＥＡＰＥＲ技術を最適化及び改善することにより、それをＵＳＨ２Ａ遺伝子転写物におけるＧからＡへの突然変異を含む標的ＲＮＡ、例えばＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）＿ｃ．１１８６４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３９５５Ｔｅｒ）突然変異が起こったＵＳＨＥＲ症候群ＩＩに関連する標的ＲＡＮに創造的に応用し、前記突然変異部位を逆転して修復することにより、ＵＳＨＥＲ症候群ＩＩを治療するという目的を達成する。

本願の目的は、Ｕｓｈｅｒ症候群ＩＩ型病原性遺伝子、例えばヒトＵＳＨ２Ａに占める割合が最も高い突然変異ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）＿ｃ．１１８６４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３９５５Ｔｅｒ）病原性遺伝子に対し、全く新しい技術的解決手段を提供し、過大な核酸又は外因性タンパク質分子を導入する必要がなく、標的ＲＮＡにおいて突然変異部位を正確に編集し、Ｕｓｈｅｒｉｎタンパク質の完全な機能を回復することができる。

具体的には、本願は、以下に関する。
１．ＬＥＡＰＥＲ技術に基づいて細胞における標的ＲＮＡを標的化編集する方法であって、前記標的ＲＮＡは、ＵＳＨ２Ａ遺伝子（例えばヒトＵＳＨ２Ａ遺伝子）転写物におけるＧからＡへの突然変異を含むＲＮＡであり、該方法は、
標的ＲＮＡを編集するためのアデノシンデアミナーゼ動員ＲＮＡ（ａｒＲＮＡ）を含む構築体、又は前記ａｒＲＮＡをコードする構築体を、前記細胞に導入するステップを含み、前記ａｒＲＮＡが前記標的ＲＮＡとハイブリダイズする相補的ＲＮＡ配列を含み、前記ａｒＲＮＡがＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を動員して標的ＲＮＡにおける標的アデノシンを脱アミノ化することができる、方法。
２．前記標的ＲＮＡは、成熟ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ前駆体（Ｐｒｅ－ｍＲＮＡ）である、項１に記載の方法。いくつかの実施形態によれば、前記標的ＲＮＡは、ｍＲＮＡ前駆体（Ｐｒｅ－ｍＲＮＡ）である。
３．前記ａｒＲＮＡの長さは、約１５１～６１ｎｔ、１３１～６６ｎｔ、１２１～６６ｎｔ、１１１～６６ｎｔ、９１～６６ｎｔ又は８１～６６ｎｔである、項１又は２に記載の方法。本願は、該データ範囲内の任意の自然数を包含する。
４．前記ａｒＲＮＡの長さは、６６ｎｔ～１３１ｎｔから選択されるいずれかの自然数である、項３に記載の方法。
５．前記ａｒＲＮＡにおけるターゲット塩基の３’末端からの長さが≧７ｎｔ、≧１０ｎｔ、≧１５ｎｔであり、好ましくは、１６～５５ｎｔ、２０～５０ｎｔ、２５～４５ｎｔ、２５～３５ｎｔ又は２５～３０ｎｔである、項１～４のいずれか１項に記載の方法。本願は、該データ範囲内の任意の自然数を包含する。
６．前記ａｒＲＮＡにおけるターゲット塩基の５’末端からの長さが≧２５ｎｔ、≧３０ｎｔ、≧３５ｎｔ、≧４５ｎｔ、好ましくは、４６～９０ｎｔ、５０～８５ｎｔ、５５～８０ｎｔ、６０～７５ｎｔ又は６５～７０ｎｔである、項１～５のいずれか１項に記載の方法。本願は、該データ範囲内の任意の自然数を包含する。
７．前記ａｒＲＮＡに、標的配列中の標的Ａと対合するターゲット塩基を導入し、該ターゲット塩基の優先度が高い順にＣ、Ａ、Ｕ又はＧである、項１～６のいずれか１項に記載の方法。
いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡに導入される標的配列における標的Ａと対合するターゲット塩基はＣである。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡに導入される標的配列における標的Ａと対合するターゲット塩基はＡである。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡに導入される標的配列における標的Ａと対合するターゲット塩基はＵである。
８．前記標的ＲＮＡは、ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）＿ｃ．１１８６４ Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３９５５Ｔｅｒ）が転写されている突然変異部位を含むヒトＵＳＨ２Ａ遺伝子ＲＮＡである、項１～７のいずれか１項に記載の方法。
９．前記ａｒＲＮＡは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４から選択される、項１～８のいずれか１項に記載の方法。
１０．前記ａｒＲＮＡは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９から選択される、項１～９のいずれか１項に記載の方法。
１１．前記構築体は、直鎖状核酸、ウイルスベクター、又はプラスミドである、項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
１２．前記ウイルスは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）又はレンチウイルスベクターである、項１１に記載の方法。
１３．前記ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５又はＡＡＶ８キャプシドにパッケージングされた後、感染によって前記細胞に導入される、項１２に記載の方法。
１４．前記ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ８キャプシドにパッケージングされた後、感染によって前記細胞に導入される、項１３に記載の方法。
１５．前記細胞は、哺乳動物の視神経細胞又は聴神経細胞である、項１～１４のいずれか１項に記載の方法。
１６．ＵＳＨ２Ａ遺伝子転写物におけるＧからＡへの突然変異を含む標的ＲＮＡを標的化編集するためのａｒＲＮＡ又はそのコード配列であって、前記ａｒＲＮＡは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４から選択される配列を含み、又はそれらから選択される配列で構成される、ａｒＲＮＡ又はそのコード配列。
１７．項１６に記載のａｒＲＮＡを含む構築体又は送達体。
１８．プラスミド、ウイルス、リポソーム、又は脂質ナノ粒子である、項１７に記載の構築体又は送達体。
１９．アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）又はレンチウイルスである、項１８に記載の構築体又は送達体。
２０．前記ウイルスは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５又はＡＡＶ８である、項１９に記載の構築体又は送達体。
いくつかの実施形態では、本願は、上記ａｒＲＮＡ、あるいは上記構築体又は送達体を含む組成物、製剤、キット、又は生物製品を提供する。
２１．項１～１５のいずれか１項に記載の方法で編集された細胞。
２２．個体におけるＵｓｈｅｒＩＩ型症候群を治療する方法であって、項１～１５のいずれか１項に記載の方法で前記個体の細胞におけるＵｓｈｅｒＩＩ型症候群と関連するＧからＡへの突然変異を修正することを含む、方法。
２３．項１６に記載のａｒＲＮＡ又は項１７～２０のいずれか１項に記載の構築体又は送達体を被験者に導入することを含む、項２２に記載の方法。
２４．項１６に記載のａｒＲＮＡ又は項１７～２０のいずれか１項に記載の構築体又は送達体を被験者の網膜下腔に導入する、項２３に記載の方法。

本願に係るＬＥＡＰＥＲ技術に基づいて細胞にＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）＿ｃ．１１８６４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３９５５Ｔｅｒ）を含む突然変異部位が転写されている標的ＲＮＡを標的化編集する方法は、ＵＳＨＥＲ症候群ＩＩ型を治療する面に明らかな利点を有する。
第１に、ＬＥＡＰＥＲ技術には、短いＲＮＡの導入のみを必要とし、１５１、１３１、１２１、１１１ヌクレオチド以内に制限することができ、それにより、導入される断片の長さに対する要求は、アデノ随伴ウイルスの送達長の上限よりも遥かに小さくなる。したがって、該技術は、ＵＳＨ２Ａ遺伝子を直接的に導入することに比べて、アデノ随伴ウイルスベクターに非常に適切に適用される。眼が免疫特権領域であるため、アデノ随伴ウイルスに対する除去能力が低く、これはアデノ随伴ウイルスが眼に長時間留まることを可能にする。さらに、機能する細胞は、いずれも神経細胞であり、これらの細胞は、通常、分裂せず、それにより、アデノ随伴ウイルスは、これらの細胞内に長期間留まり、すなわち免疫によって排除されず、細胞分裂のためウイルスが希釈されることもない。さらに重要なことには、本願の技術的解決手段で、従来の一般的な手段に比べて、Ｕｓｈｅｒｉｎの人為的な切断も、突然変異されたエキソンのスキップも必要とせず、それにより、全長の正常なＵｓｈｅｒｉｎを得ることができる。したがって、理論的には、患者は、この技術によって治療された後、ヒトと同じ正常なＵｓｈｅｒｉｎを得ることができる。Ｕｓｈｅｒ症候群ＩＩ型が、劣性遺伝病であるため、これは、通常、正常なタンパク質の一部のみが機能することができるかぎり、正常な機能を得ることができることを示す。本願は、実験データにより、本願の技術的解決手段が、ＵＳＨＥＲ症候群ＩＩ型関連遺伝子転写物（例えば、ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）＿ｃ．１１８６４ Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３９５５Ｔｅｒ）を含む突然変異部位のヒトＵＳＨ２Ａ遺伝子転写物）におけるＧ＞Ａ突然変異を修正することができ、ＵＳＨＥＲ症候群ＩＩ型に対する治療目的を達成すると証明した。

図１は、Ｕｓｈｅｒ症候群ＩＩ型患者の夜盲症病状の進行の概略図を示す^１３。 図２は、１３８人のＵｓｈｅｒ患者の病原性遺伝子の突然変異プロファイルを示す^７。 図３は、ＵＳＨ２Ａ遺伝子の突然変異型の分析を示す。 図４は、ＵＳＨ２Ａ遺伝子突然変異部位の編集効率を反映するレポーター系設計概略図を示す。 図５は、ＵＳＨ２Ａ遺伝子突然変異部位の編集効率を示す評価指標概略図を示す。 図６は、異なる長さのａｒＲＮＡ編集効率の試験結果を示す。 図７は、レポーター系における偽陽性細胞のＦＩＴＣチャネル強度を示す。 図８は、ＬＥＡＰＥＲ技術におけるａｒＲＮＡ長と編集効率との関係を示す^１０。 図９は、ａｒＲＮＡの５’及び３’から中間に向かって切断した編集効率試験の結果を示す。 図１０は、ａｒＲＮＡの３’の長さを２５ｎｔに固定し、５’から段階的に切断した編集効率試験の結果を示す。 図１１は、編集効率に対するターゲット塩基位置の影響を示す。 図１２は、同じバッチのａｒＲＮＡ編集効率の反復試験結果の比較を示す。図中、２９３Ｔは、レポーター系に感染されていない２９３Ｔを示す。サブレポーター系のみは、レポーター系に感染された２９３Ｔであり、Ｏｐｔｉ－ＤＭＥＭは、トランスフェクションにＲＮＡｉ ＭＡＸを添加していない培地ブランクコントロールであり、送達ベクターのみコントロールがＲＮＡｉ ＭＡＸのみがあるコントロールであり、これまでの試験におけるコントロール（ＮＣ）ウェルに対応する。ランダム配列ＲＮＡは、ヒトゲノムに一致しない９１ｎｔのランダムＲＮＡ配列（ｕａａｕｃｃｕｇａａｕａｕｃｇｃｇｃａａｕｕｃｃｃｃａｇｃａｇａｇａａｃａｕｃｇｃｇｇｕｇｕｇａａｃｇｕｃｃｃｕｕｕａｕａｃｃｇｇｇｃａｇｇｕａｕａｇｃｕｇａａａｕｃａｇｃｇｕｇｇｃ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５））である。 図１３は、次世代シークエンシングによって得られた同じバッチのａｒＲＮＡの編集効率反復試験結果の比較を示す。 図１４は、硝子体内注射を用いた場合の、ＡＡＶ２及びＡＡＶ５により送達されたａｒＲＮＡのインビボでの編集効率を示す。 図１５は、網膜下腔注射を用いた場合の、ＡＡＶ５及びＡＡＶ８により送達されたａｒＲＮＡのインビボでの経時的な編集効率を示す。

本願は、Ｕｓｈｅｒ症候群ＩＩ型病原性遺伝子ＵＳＨ２Ａにおける割合が最も高い突然変異ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）＿ｃ．１１８６４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３９５５Ｔｅｒ）に対し、全く新しい技術的解決手段を提供し、過大な核酸又は外因性タンパク質分子を導入しない条件で、ＡＡＶを介して標的ＲＮＡに突然変異部位を正確に編集し、Ｕｓｈｅｒｉｎタンパク質の完全な機能を回復し、且つ相当な時間内にＵｓｈｅｒｉｎタンパク質の機能を保持し続ける。

上記目的を達成するために、本願は、ＬＥＡＰＥＲ技術に基づいて細胞においてＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）＿ｃ．１１８６４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３９５５Ｔｅｒ）を含む突然変異部位が転写される標的ＲＮＡを標的化編集する方法（以下、突然変異編集方法と略称する）、ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）＿ｃ．１１８６４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３９５５Ｔｅｒ）突然変異部位を標的とするａｒＲＮＡ、前記ａｒＲＮＡを含む構築体、前記突然変異編集方法で調製された細胞、細胞における標的ＲＮＡを編集するためのキット、ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）＿ｃ．１１８６４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３９５５Ｔｅｒ）突然変異による個体の疾患を治療する方法（以下、治療方法と略称する）、及び、前記突然変異編集方法又は前記治療方法に用いるための製剤を提供する。

定義
ＲＮＡ編集は、真核細胞に存在する天然のプロセスを指し、ＤＮＡ転写後、かつタンパク質翻訳前にＲＮＡレベルで起こる塩基Ａ（アデニン）からＩ（ヒポキサンチン）への編集であり、ヒポキサンチンは、翻訳中にＧとして認識され、ＲＮＡ中のＡからＩへの編集がトランスクリプトームを多様化させる。ＲＮＡ分子を部位特異的かつ正確に変えることにより、ＲＮＡの総数は数倍に増加する。この編集は、ＡＤＡＲ（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ｄｅａｍｉｎａｓｅ Ａｃｔｉｎｇ ｏｎ ＲＮＡ）プロテアーゼによって触媒され、部位特異的ＲＮＡ編集と呼ばれる。編集が起こり得るコード領域は、イントロン及びエクソン配列を含み、非コード領域配列においても起こり得、コード領域の編集は、タンパク質コード配列を再定義することができる。

本明細書で用いる「ＬＥＡＰＥＲ技術」、すなわち、工学的に操作されたＲＮＡを用いて内因性ＡＤＡＲを動員することによりＲＮＡ編集を行う技術は、ＷＯ２０２００７４００１Ａ１に報告されているＲＮＡ編集技術を指す。前記工学的に操作されたＲＮＡは、すなわち、アデノシンデアミナーゼ動員ＲＮＡ（ａｒＲＮＡ）は、本明細書で使用するように、ＡＤＡＲ、又はＡＤＡＲドメインを含むある特定の複合体を動員することによって、ＲＮＡに標的アデノシンを脱アミノ化することができるＲＮＡを指す。ａｒＲＮＡは、ガイドＲＮＡの１つであり、本願において「ガイドＲＮＡ」とは、標的ＲＮＡと相補的にハイブリダイズし、標的塩基を修飾することができる酵素を動員することによって、標的塩基を修飾することができることを意味する。前記ガイドＲＮＡは、ａｒＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲなどの他の編集システム用のｇＲＮＡを含む。

本明細書で用いられる用語「アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）」は、ＲＮＡ分子中のアデノシンＡからイノシンＩへの変換を触媒することができる、真核生物（ヒトなどの哺乳動物を含む）の各組織において広く発現されるアデノシンデアミナーゼを意味する。Ｉは、真核生物タンパク質の合成過程において、通常、Ｇとして翻訳される。

本明細書で用いられる核酸の「相補的」は、１本の核酸が伝統的なＷａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ塩基対合により他の核酸と共に水素結合を形成する能力を指す。パーセント相補性は、核酸分子中の、別の核酸分子と共に水素結合を形成（Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ塩基対合）することができる残基のパーセントを指す（例えば、１０個のうち、約５、６、７、８、９、１０個をそれぞれ約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％及び１００％相補することを意味する）。「完全に相補的」とは、核酸配列の全ての連続残基が第２核酸配列中の同じ数の連続残基と水素結合を形成することを指す。本明細書で用いられる「実質的に相補的」とは、約４０、５０、６０、７０、８０、１００、１５０、２００、２５０、又はそれ以上のヌクレオチドの領域内において、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％のうちのいずれかの相補程度を指し、又はストリンジェントな条件下でハイブリダイズされた２つの核酸を指す。単一塩基又は単一ヌクレオチドに対し、Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ塩基対合原則に従って、ＡとＴ又はＵ、ＣとＧ又はＩが対合する場合、相補又はマッチングと呼ばれ、逆もまた同様である。それ以外の塩基対合は、いずれも非相補又は非マッチと呼ばれる。

「ハイブリダイゼーション」は、その１つ又は複数のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合によって安定化された複合体を形成するという反応を意味する。前記水素結合は、Ｗａｔｓｏｎ Ｃｒｉｃｋ塩基対合、Ｈｏｏｇｓｔｅｉｎ結合、又は任意の他の配列特異的方法によって生じ得る。所定の配列とハイブリダイズ可能な配列は、所定の配列の「相補的な配列」と呼ばれる。

本明細書で用いられる用語「導入」は、核酸、タンパク質などの生体高分子を細胞膜の外側から細胞膜の内側に何らかの経路で導入することを指す。前記「導入」は、エレクトロトランスフェクション、リポソームトランスフェクション、脂質－ナノ粒子送達などの方式を含む。

本明細書で用いられる用語「エレクトロトランスフェクション」は、電気穿孔トランスフェクション技術であり、これは、細胞に電場を数マイクロ秒から数ミリ秒作用させた後、細胞膜に小さな孔又は開口を一時的に形成し、ＤＮＡなどの高分子を細胞に送達し、最終的に細胞核に入れる技術である。

本明細書で用いられる用語「リポソームトランスフェクション（Ｌｉｐｏ）」は、リポソームをインビボ及びインビトロでの送達ベクターとするトランスフェクション技術を指す。リポソームは、中性リポソーム及びカチオン性リポソームを含み、中性リポソームは、脂質膜を利用して高分子、例えば核酸をパッケージし、脂質膜を介して前記高分子を細胞膜内に送達し、カチオン性リポソームは、正に荷電しており、そのトランスフェクトした高分子は、それに予め埋め込まれていないが、前記高分子自体が負に荷電しているため、正に荷電したリポソームに自動的に結合し、高分子－カチオン性リポソーム複合体を形成し、それにより負に荷電した細胞膜表面に吸着し、エンドサイトーシスにより細胞内に送達される。

本明細書で用いられる用語「脂質－ナノ粒子（ＬＮＰ）送達」は、高分子、例えば核酸、タンパク質などの物質を、脂質ナノ粒子により細胞内へ膜貫通送達を行うことを意味する。ここで、脂質ナノ粒子とは、二相混合により合成された粒子を指し、粒子は、イオン化可能脂質、ヘルパーリン脂質、コレステロール及びＰＥＧ脂質を含むエタノール相と、核酸、タンパク質などの高分子を含む酸性水相とを含む。例えば、ＲＮＡがパッケージされたＬＮＰは、エンドサイトーシスによって細胞質に取り込まれ得る。

本明細書では、ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）＿ｃ．１１８６４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３９５５Ｔｅｒ）突然変異とは、ヒトＵＳＨ２Ａ遺伝子のうちＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）遺伝子転写物の１１８６４位に対応するＧからＡの突然変異を指し、前記突然変異は、前記転写物が翻訳したペプチド鎖の３９５５位のトリプトファン（Ｔｒｐ）コード配列を終止コドンに変換することをもたらし、それにより最終的に翻訳されたアミノ酸が、３９５５位の後の全てのアミノ酸を欠失して、それにより、Ｕｓｈｅｒｉｎのタンパク質活性を失う。この突然変異を生じた患者には、錐体視細胞及び桿体視細胞の変性死が発生し、最終的に失明をもたらす。しかしながら、本願の解決手段は、転写レベルでこの突然変異を逆転させることにより、Ｕｓｈｅｒｉｎタンパク質の活性を回復させることができる。本願のいくつかの実施形態では、ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）＿ｃ．１１８６４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３９５５Ｔｅｒ）突然変異部位は、ＵＳＨ２Ａ病原性部位とも呼ばれる。

本明細書で用いる用語「標的ＲＮＡ」は、ＵＳＨ２Ａ遺伝子から転写され、ＧからＡへの突然変異を含む、編集される目的ＲＮＡを指す。標的ＲＮＡは、成熟ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ前駆体であってもよく、本願では、ｍＲＮＡ前駆体がより好ましい。いくつかの実施形態では、前記「標的ＲＮＡ」は、ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）＿ｃ．１１８６４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３９５５Ｔｅｒ）を含む突然変異部位が転写されるＲＮＡである。前記「標的ＲＮＡ」におけるＧからＡへの突然変異部位の転写によって形成されるＡ塩基は、「標的アデノシン」又は「標的Ａ」と呼ばれる。ａｒＲＮＡの「標的Ａ」に対する塩基を「ターゲット塩基」という。

本明細書で用いる用語「ＡＡＶ」は、「アデノ随伴ウイルス」又は「アデノ随伴ウイルスベクター」を指し、本明細書では、特に明記しない限り、「ＡＡＶ」、「アデノ随伴ウイルス」又は「アデノ随伴ウイルスベクター」は、互換可能に使用される。ＡＡＶは、パルボウイルス科に属し、エンベロープを有しない一本鎖線状ウイルスであり、アデノ随伴ウイルスを利用して外来遺伝子を動物組織と細胞に移入することができる。前記移入した外来遺伝子は、宿主のゲノム遺伝子の外に、遊離核酸の状態で比較的安定に存在し、発現することができる。アデノ随伴ウイルスは、血清型が多く（１２種類）、例えば：ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９などを含む。本明細書で用いられる「患者」又は「被験者」は、互換可能に使用され、本明細書で特に明記しない限り、ここに記載の「患者」又は「被験者」は、いずれも、ゲノムにＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）＿ｃ．１１８６４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３９５５Ｔｅｒ）突然変異が起こったヒト患者を指す。

本明細書で用いられる用語「送達」は、核酸、タンパク質などの生体高分子を細胞膜の外側から細胞膜の内側に何らかの経路で導入することを指す。前記「送達」は、例えば、エレクトロトランスフェクション、リポソームトランスフェクション、脂質－ナノ粒子送達、ウイルス送達、エキソソーム送達などの手段である。本明細書では、前記生体高分子及び前記生体高分子をパッケージするか又は前記生体高分子に連結されて、前記生体高分子が細胞膜を通過して細胞内に入ることを促進する物質の結合体を「送達体」という。例えば、核酸分子をパッケージしたリポソーム、ＬＮＰ、エキソソーム、ウイルス粒子などである。

本明細書で用いられる用語「構築体」は、直鎖核酸分子、プラスミド又はウイルスベクターなどであってもよいある核酸配列を含む核酸ベクターを指す。前記核酸分子は、一本鎖又は二本鎖分子であってもよい。前記特定の核酸配列は、ＤＮＡ配列であってもよいし、ＲＮＡ配列であってもよい。いくつかの実施形態では、前記核酸配列は、転写、翻訳又は発現を経ずにその機能を直接発揮する。いくつかの実施形態では、前記核酸配列は、ＲＮＡを形成するように転写された後にＲＮＡ分子形態で機能するＤＮＡ配列である。いくつかの実施形態では、前記核酸配列は、翻訳された後に、ポリペプチド又はタンパク質の形態で機能するＲＮＡである。いくつかの実施形態では、前記核酸配列は、転写及び翻訳プロセスを経てタンパク質を形成した後にタンパク質の形態で機能するＤＮＡである。前記構築体は、ウイルス、脂質ナノ粒子又はエキソソームなどの形態にパッケージングすることにより標的細胞に入ることができ、また、電気穿孔、マイクロインジェクション、化学変換などの方式により標的細胞に入ることもできる。

本明細書で用いられる用語「修飾」は、化学的又は生物学的方法、例えば遺伝子工学的方法で核酸又はタンパク質の組成又は構造を変え、それによって前記核酸又はタンパク質の１つ又は複数の特性又は機能を変えることを指す。本願のいくつかの実施形態では、ａｒＲＮＡを修飾することにより、それは、細胞へ導入された後に安定化される。本明細書では、ターゲット塩基の３’末端からの長さとは、ターゲット塩基の３’最近接塩基から３’最末端塩基までの全ての塩基数を指し、前記ターゲット塩基の５’末端からの長さは、ターゲット塩基の５’最近接塩基から５’最末端塩基までの全ての塩基数を指す。

本明細書で別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。

突然変異編集方法
本願は、ＬＥＡＰＥＲ技術に基づいて細胞における標的ＲＮＡを標的化編集する方法を提供し、前記標的ＲＮＡは、ＵＳＨ２Ａ遺伝子転写物におけるＧからＡへの突然変異を含むＲＮＡであり、該方法は、
標的ＲＮＡを編集するためのアデノシンデアミナーゼ動員ＲＮＡ（ａｒＲＮＡ）を含む構築体、又は前記ａｒＲＮＡをコードする構築体を、前記細胞に導入するステップを含み、前記ａｒＲＮＡが前記標的ＲＮＡとハイブリダイズされた相補的ＲＮＡ配列を含み、前記ａｒＲＮＡがＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を動員して標的ＲＮＡにおける標的アデノシンを脱アミノ化することができる。

いくつかの実施形態では、前記標的ＲＮＡは、ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ前駆体（Ｐｒｅ－ｍＲＮＡ）であり、好ましくは、Ｐｒｅ－ｍＲＮＡである。

いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡの長さは、＞５１ｎｔであり、好ましくは、＞６１ｎｔであり、より好ましくは、≧６５ｎｔである。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡの長さは、約１５１～６１ｎｔ、１３１～６６ｎｔ、１２１～６６ｎｔ、１１１～６６ｎｔ、９１～６６ｎｔ又は８１～６６ｎｔである。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡの長さは、６６ｎｔ～１３１ｎｔから選択されるいずれかの自然数であり、例えば、６６ｎｔ、６７ｎｔ、６８ｎｔ、６９ｎｔ、７０ｎｔ、７１ｎｔ、７２ｎｔ、７３ｎｔ、７４ｎｔ、７５ｎｔ、７６ｎｔ、７８ｎｔ、７９ｎｔ、８０ｎｔ、８３ｎｔ、８５ｎｔ、８８ｎｔ、９１ｎｔ、９６ｎｔ、９８ｎｔ、１００ｎｔ、１０５ｎｔ、１０８ｎｔ、１００ｎｔ、１０５ｎｔ、１１０ｎｔ、１１５ｎｔ、１２０ｎｔ、１２５ｎｔ、１３０ｎｔなどである。トランスフェクション効率を同じに保つことができる場合、好ましくは、前記ａｒＲＮＡの長さは、約７１ｎｔであり、例えば、 ６６ｎｔ～７６ｎｔのうちいずれかの自然数のｎｔである。

いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡにおけるターゲット塩基の３’末端からの長さは、＞５ｎｔ、例えば、≧７ｎｔ、≧１０ｎｔ、≧１５ｎｔ、例えば、１６～５５ｎｔ、２０～５０ｎｔ、２５～４５ｎｔ、２５～３５ｎｔ、又は２５～３０ｎｔのいずれかの自然数のｎｔである。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡにおけるターゲット塩基の５’末端からの長さは、≧２５ｎｔ、例えば、≧３０ｎｔ、≧３５ｎｔ、≧４５ｎｔ、例えば、４６～９０ｎｔ、５０～８５ｎｔ、５５～８０ｎｔ、６０～７５ｎｔ又は６５～７０ｎｔのいずれかの自然数のｎｔである。

いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡが標的ＲＮＡと相補的にハイブリダイズされる場合、標的ＲＮＡ上の標的塩基に対向する前記ａｒＲＮＡのターゲット塩基の優先度は、高い順にＣ、Ａ、Ｕ、又はＧである。即ち、通常、長さ及びターゲット塩基以外の配列は、いずれも、同じであるが、ターゲット塩基がそれぞれＣ、Ａ、Ｕ、ＧのａｒＲＮＡについて、その編集効率が順次低下するため、最も好ましくは、前記ａｒＲＮＡのターゲット塩基がＣであり、次がＡであり、その後がＵであり、最後がＧである。

いくつかの実施形態では、前記標的ＲＮＡは、ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）＿ｃ．１１８６４ Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３９５５Ｔｅｒ）が転写される突然変異部位を含むＲＮＡである。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４から選択される。好ましくは、いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９から選択され、より好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９である。

いくつかの実施形態では、前記構築体は、直鎖核酸、ウイルスベクター、又はプラスミドから選択される。前記直鎖核酸は、一本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡなどの一本鎖核酸と、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡなどの二本鎖核酸を含む。いくつかの実施形態では、前記直鎖核酸は、化学修飾されてもよく、例えば、２’－Ｏ－Ｍｅ修飾及び／又はホスホロチオエート結合修飾されてもよい。いくつかの特定の実施形態では、前記直鎖核酸は、インビトロで化学合成される。いくつかの特定の実施形態では、前記直鎖核酸は、細胞又は生体で合成された後に単離し抽出して得られる。いくつかの実施形態では、前記構築体は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター又はレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、前記ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５又はＡＡＶ８キャプシドにパッケージングされた後、感染によって前記細胞に導入される。いくつかの実施形態では、前記ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ８キャプシドにパッケージングされた後、感染によって前記細胞に導入される。いくつかの実施形態では、前記構築体は、前記ａｒＲＮＡコード配列を細胞ゲノムに組み込んで長期発現させる。いくつかの実施形態では、前記構築体は、前記ａｒＲＮＡコード配列を遊離核酸として細胞ゲノムの外に存在させ、発現する。

いくつかの実施形態では、前記細胞は、真核細胞である。いくつかの実施形態では、前記細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、前記細胞は、神経細胞である。いくつかの実施形態では、前記神経細胞は、感覚神経細胞である。いくつかの実施形態では、前記感覚神経細胞は、視神経細胞及び聴神経細胞から選択される。いくつかの実施形態では、前記視神経細胞は、錐体視細胞及び／又は桿体視細胞である。

いくつかの実施形態では、前記導入は、エレクトロトランスフェクション、リポソームトランスフェクション、脂質－ナノ粒子送達、又はウイルス感染である。本願の実施形態では、ウイルス感染が好ましい。例えば、ａｒＲＮＡをコードするウイルス構築体をウイルスキャプシドにパッケージすることによって感染性を有するウイルス粒子、例えば、ＡＡＶ又はレンチウイルス粒子を形成し、前記ウイルス粒子の細胞への感染により、前記ａｒＲＮＡのコード配列を細胞に導入する。

機能ａｒＲＮＡ
本願は、さらに、ａｒＲＮＡ（以下では、単に機能ａｒＲＮＡと呼ぶ）を提供し、前記ａｒＲＮＡは、前記のように、ＬＥＡＰＥＲ技術に基づいて細胞における標的ＲＮＡを標的化編集する方法に用いることができる。いくつかの実施形態では、前記方法は、ＬＥＡＰＥＲ技術に基づいて、細胞におけるＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）＿ｃ．１１８６４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３９５５Ｔｅｒ）を含む突然変異部位が転写される標的ＲＮＡを標的化編集する方法である。前記ａｒＲＮＡが前記標的ＲＮＡとハイブリダイズされた相補的ＲＮＡ配列を含み、前記ａｒＲＮＡがＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を動員して標的ＲＮＡにおける標的アデノシンを脱アミノ化することができる。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡの標的とする標的ＲＮＡは、ｍＲＮＡ又はＰｒｅ－ｍＲＮＡから選択され、好ましくは、Ｐｒｅ－ｍＲＮＡである。

いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡの長さは、＞５１ｎｔであり、好ましくは、＞６１ｎｔであり、より好ましくは、＞６５ｎｔである。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡの長さは、約１５１～６１ｎｔ、１３１～６６ｎｔ、１２１～６６ｎｔ、１１１～６６ｎｔ、９１～６６ｎｔ又は８１～６６ｎｔである。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡの長さは、６６ｎｔ～１３１ｎｔから選択されるいずれかの自然数であり、例えば、６６ｎｔ、６７ｎｔ、６８ｎｔ、６９ｎｔ、７０ｎｔ、７１ｎｔ、７２ｎｔ、７３ｎｔ、７４ｎｔ、７５ｎｔ、７６ｎｔ、７８ｎｔ、７９ｎｔ、８０ｎｔ、８３ｎｔ、８５ｎｔ、８８ｎｔ、９１ｎｔ、９６ｎｔ、９８ｎｔ、１００ｎｔ、１０５ｎｔ、１０８ｎｔ、１００ｎｔ、１０５ｎｔ、１１０ｎｔ、１１５ｎｔ、１２０ｎｔ、１２５ｎｔ、１３０ｎｔなどである。トランスフェクション効率を同じに保つことができる場合、好ましくは、前記ａｒＲＮＡの長さは、約７１ｎｔであり、例えば、 ６６ｎｔ～７６ｎｔのうちいずれかの自然数のｎｔである。

いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡにおけるターゲット塩基の３’末端からの長さは、＞５ｎｔ、例えば、≧７ｎｔ、≧１０ｎｔ、≧１５ｎｔ、例えば、１６～５５ｎｔ、２０～５０ｎｔ、２５～４５ｎｔ、２５～３５ｎｔ、又は２５～３０ｎｔのいずれかの自然数のｎｔである。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡにおけるターゲット塩基の５’末端からの長さは、≧２５ｎｔ、例えば、≧３０ｎｔ、≧３５ｎｔ、≧４５ｎｔ、例えば、４６～９０ｎｔ、５０～８５ｎｔ、５５～８０ｎｔ、６０～７５ｎｔ又は６５～７０ｎｔのいずれかの自然数のｎｔである。

いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡが標的ＲＮＡと相補的にハイブリダイズされる場合、標的ＲＮＡ上の標的塩基に対向する前記ａｒＲＮＡのターゲット塩基の優先度は、高い順にＣ、Ａ、Ｕ、又はＧである。即ち、通常、長さ及びターゲット塩基以外の配列は、いずれも同じであるが、ターゲット塩基がそれぞれＣ、Ａ、Ｕ、ＧのａｒＲＮＡについて、その編集効率が順次低下するため、最も好ましくは、前記ａｒＲＮＡのターゲット塩基がＣであり、次がＡであり、その後がＵであり、最後がＧである。

いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４から選択される。好ましくは、いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９から選択され、より好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９である。いくつかの実施形態では、前記ａｒＲＮＡに導入する標的配列のうち標的Ａと対合するターゲット塩基の編集効率は、大きい順にＣ、Ａ、Ｕ、Ｇであり、即ち、長さ及びターゲット塩基以外の配列はいずれも同じであるが、ターゲット塩基がそれぞれＣ、Ａ、Ｕ、ＧのａｒＲＮＡについて、その編集効率が順次低下するため、最も好ましくは、前記ａｒＲＮＡのターゲット塩基がＣであり、次がＡであり、その後がＵであり、最後がＧである。

機能的構築体
本願は、さらに、ａｒＲＮＡをコードする構築体（以下、単に機能的構築体と呼ぶ）を提供し、前記機能的構築体は、前記のように、ＬＥＡＰＥＲ技術に基づいて細胞における標的ＲＮＡを標的化編集する方法に用いることができる。いくつかの実施形態では、前記方法は、ＬＥＡＰＥＲ技術に基づいて、細胞におけるＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）＿ｃ．１１８６４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３９５５Ｔｅｒ）を含む突然変異部位が転写される標的ＲＮＡを標的化編集する方法である。そのうち、前記ａｒＲＮＡは、前記のような機能性ａｒＲＮＡを含む。

いくつかの実施形態では、前記構築体は、直鎖核酸、ウイルスベクター、又はプラスミドから選択される。前記直鎖核酸は、一本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡなどの一本鎖核酸と、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡなどの二本鎖核酸を含む。いくつかの実施形態では、前記直鎖核酸は、化学修飾されてもよく、例えば、２’－Ｏ－Ｍｅにより修飾及び／又はホスホロチオエート結合により修飾されてもよい。いくつかの特定の実施形態では、前記直鎖核酸は、インビトロで化学合成される。いくつかの特定の実施形態では、前記直鎖核酸は、細胞又は生体で合成された後に単離し抽出して得られる。いくつかの実施形態では、前記構築体は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター又はレンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、前記ＡＡＶベクターにＡＡＶ２、ＡＡＶ５又はＡＡＶ８をパッケージングして、細胞に感染可能なウイルス粒子を形成し、前記ウイルス粒子は、細胞に感染することにより前記ＡＡＶベクターを細胞に導入する。好ましくは、いくつかの実施形態では、前記構築体は、ＡＡＶ８にパッケージングされる。いくつかの実施形態では、前記構築体は、前記ａｒＲＮＡコード配列を細胞ゲノムに組み込んで長期発現させる。いくつかの実施形態では、前記構築体は、前記ａｒＲＮＡコード配列を遊離核酸として細胞ゲノムの外に存在させ、発現する。

本願は、直鎖核酸、プラスミド、ウイルスベクターから選択される、前述のような機能的ａｒＲＮＡを含む構築体を提供する。本願は、さらに、ウイルス粒子、リポソーム、脂質ナノ粒子、及びエキソソームからなる群より選択される、前記構築体を含む送達体を提供する。

細胞
本願は、さらに、前記のようにＬＥＡＰＥＲ技術に基づいて細胞における標的ＲＮＡを標的化編集する方法により編集及び調製され得る細胞を提供する。いくつかの実施形態では、前記細胞は、ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）＿ｃ．１１８６４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３９５５Ｔｅｒ）突然変異部位を有する患者に由来する細胞であり、前記突然変異編集方法で前記突然変異部位が転写された標的ＲＮＡのうち標的Ａを脱アミノ化してＩを形成し、その後の翻訳過程でＧとして認識してＵｓｈｅｒｉｎタンパク質の完全な機能を回復することができる。いくつかの実施形態では、前記患者の細胞は、幹細胞又は誘導多能性幹細胞であり、前記幹細胞又はその誘導分化した細胞は、患者の特定の部位に移植され得る。いくつかの実施形態では、前記幹細胞は、健康な錐体視細胞及び／又は桿体視細胞にインビトロで誘導分化された後に、患者の眼の特定の位置に再移植されて機能する。

キット
本願は、さらに、細胞内の標的ＲＮＡを編集するためのキットを提供し、前記キットは、前記機能性ａｒＲＮＡ、又は前記のようにａｒＲＮＡをコードする機能性構築体を含む。いくつかの実施形態では、前記キットは、ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）＿ｃ．１１８６４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３９５５Ｔｅｒ）突然変異を編集するために用いられる核酸、プラスミド、ゲノム、細胞などを含む。いくつかの実施形態では、前記キットは、前記機能性ａｒＲＮＡ又は前記機能性構築体を溶解するのに適した溶媒をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記キットは、前記キットに含まれる様々な成分及びその含有量、及び／又は前記キットの使用方法を使用者に知らせるためのプロトコールをさらに含む。

治療方法
本願は、個体におけるＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）＿ｃ．１１８６４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３９５５Ｔｅｒ）突然変異に起因する疾患を治療する方法（以下、治療方法と略称する）をさらに提供し、該方法は、前記のようにＬＥＡＰＥＲ技術に基づいて細胞におけるＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）＿ｃ．１１８６４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３９５５Ｔｅｒ）を含む突然変異部位が転写される標的ＲＮＡを標的化編集する方法で個体細胞におけるＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）＿ｃ．１１８６４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３９５５Ｔｅｒ）突然変異部位に関連する標的ＲＮＡ突然変異を修正することを含む。いくつかの実施形態では、前記疾患は、Ｕｓｈｅｒ ＩＩ型症候群を含む。

いくつかの実施形態では、前記治療方法は、標的ＲＮＡを編集するためのａｒＲＮＡ又は前記ａｒＲＮＡをコードするための構築体を被験者の網膜下腔又は硝子体に注射することを含む。いくつかの好ましい実施形態では、前記治療方法は、標的ＲＮＡを編集するためのａｒＲＮＡ又は前記ａｒＲＮＡをコードするための構築体を被験者の網膜下腔に注射することを含む。いくつかの実施形態では、前記治療は、被験者への１回だけの注射を必要とする。いくつかの実施形態では、前記治療は、一定時間ごとに被験者へ注射する必要がある。いくつかの特定の実施形態では、前記治療は、２ヶ月以上、例えば、１年、１０年、２０年、３０年ごとに被験者へ１回注射する必要がある。

製剤
本願は、さらに、前記機能性ａｒＲＮＡ又は前記のように前記ａｒＲＮＡをコードする機能性構築体又はその送達体を含む製剤を提供する。いくつかの実施形態では、前記製剤は、前記機能性ａｒＲＮＡ又は機能性構築体又はその送達体及びトランスフェクション試薬を含む。いくつかの特定の実施形態では、前記機能性ａｒＲＮＡ又は機能性構築体は、リポソームに封入される。いくつかの特定の実施形態では、前記機能性ａｒＲＮＡ又は機能性構築体は、脂質ナノ粒子を形成するように調製される。いくつかの実施形態では、前記製剤に含まれる機能性構築体は、ＡＡＶ又はレンチウイルスベクターなどのウイルスベクターであり、前記製剤は、生ウイルス又はウイルス凍結乾燥粉末を含み、したがって、前記製剤は、ヒトアルブミン、ゼラチン、スクロースなどの適切な安定剤をさらに含む。

以上、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明したが、本発明は、これらに限定されない。本発明の技術的思想の範囲内で、本発明の技術的解決手段に対して様々な簡単な変形を行うことができ、変形は、各技術的特徴を任意の他の適切な方式で組み合わせることを含み、これらの簡単な変形と組み合わせは、同様に本発明に開示された内容と見なされるべきであり、いずれも本発明の保護範囲に属する。以下、具体的な実施例を参照し、本発明の技術的解決手段をさらに詳しく説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されない。特に明記しない限り、以下に言及される試薬は、すべて商業的に入手可能である。簡単にするために、操作の一部について、操作のパラメータ、ステップ、及び使用される機器を詳述せず、これらは当業者に周知であり、再現可能であることが理解すべきである。

実施例１：レポーター系の構築
本願は、ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）＿ｃ．１１８６４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３９５５Ｔｅｒ）突然変異部位に対するＬＥＡＰＥＲ技術による修復を主に研究する。したがって、該部位の編集効率の高さを示すことができる簡単に利用可能なレポーター系が必要である。ＵＳＨ２Ａ遺伝子の病原性突然変異部位ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）＿ｃ．１１８６４Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３９５５Ｔｅｒ）による、元のＴＧＧコドンからＴＡＧコドンへの突然変異は、ナンセンス突然変異であるため、突然変異後のｍＲＮＡ配列は、翻訳時に、新たに形成されたＴＡＧ終止コドンで停止し、その後の配列がタンパク質に翻訳され続けることができなくなった。以上の特徴を利用し、本願は、図４に示すようなレポーター系を設計した。前記レポーター系は、レンチウイルスベクターを使用し、ＣＭＶプロモーターによって図４に示すようなｍＲＮＡを駆動した。該ｍＲＮＡセグメントは、主に以下の部分を含む：１）ｍＣｈｅｒｒｙ赤色蛍光タンパク質配列であって、該タンパク質は、安定的に発現され、編集されるか否かに関わらず正常に翻訳され、そのため、赤色蛍光強度は、内部参照とすることができ、２）ＵＳＨ２Ａ遺伝子突然変異部位及びその両側に隣接する各１００塩基対であって、該領域は、疾患関連配列であり、（２）における配列は、ＮＭ＿２０６９３３．２配列の１２２０３位～１２４０３位に由来し、合計２０１塩基対であり、ＵＳＨ２Ａ ｃ．１１８６４部位に対してＧからＡへの点変異を行うことにより、該配列にリーディングフレーム（Ｉｎ－ｆｒａｍｅ）内のＴＡＧ終始コドンが存在し、それにより翻訳過程でここで翻訳を停止する、３）ＧＦＰ緑色蛍光タンパク質配列であって、該タンパク質は、緑色蛍光を発することができ、且つフローサイトメータにおいてＦＩＴＣチャネルを介して蛍光強度を検出することができる（ＧＦＰ配列とＵＳＨ２Ａ関連配列は、同一のリーディングフレームに位置し、且つその下流に位置するため、ＵＳＨ２Ａ関連配列におけるＴＡＧ終止コドンは、ＬＥＡＰＥＲ技術により編集されないと、そのうちのＴＡＧ終止コドンは後続のＧＦＰが正常に翻訳されないことを引き起こし、緑色蛍光が発生せず；ＵＳＨ２Ａ関連配列におけるＴＡＧがＬＥＡＰＥＲ技術により成功裏に編集されて、ＴＩＧコドンを形成すると、該終止コドンが消失し、後続のＧＦＰ翻訳が継続し、それにより緑色蛍光が現れ、４）ｍＣｈｅｒｒｙ下流及びＧＦＰ上流にＰ２Ａ、Ｔ２Ａ配列を挿入し、翻訳時に、この２つの配列は、立体障害性によりそのうちの１つのペプチド結合が正常に形成できないことを引き起こし、したがって、翻訳過程においてｍＣｈｅｒｒｙ、中間のＵＳＨ２Ａ関連配列の２０１塩基対及びＧＦＰという３つの部分を分離することにより、中間に挿入されたＵＳＨ２Ａ関連配列は、ｍＣｈｅｒｒｙ及びＧＦＰ機能に影響を与えないようにした。

以上の配列の全配列は当分野の従来技術によってインビトロで合成され、具体的な配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すとおりであった。該配列は、ＣＭＶプロモーターの後のマルチクローニング部位を介してｐＣＤＨ－ＣＭＶベクターにクローニングされた。ｐＣＤＨ－ＣＭＶベクタープラスミドは、Ｋａｚｕｈｉｒｏ Ｏｋａから贈与されたものである（Ａｄｄｇｅｎｅ ｐｌａｓｍｉｄ＃７２２６５、ｈｔｔｐ：／／ｎ２ｔ．ｎｅｔ／ａｄｄｇｅｎｅ：７２２６５、ＲＲＩＤ：Ａｄｄｇｅｎｅ＿７２２６５）。構築されたプラスミドは、第二世代レンチウイルスパッケージングシステム（ｐＣＡＧ－ＶＳＶＧは、Ａｒｔｈｕｒ Ｎｉｅｎｈｕｉｓ ＆Ｐａｔｒｉｃｋ Ｓａｌｍｏｎから贈与され、Ａｄｄｇｅｎｅ ｐｌａｓｍｉｄ＃３５６１６、ｈｔｔｐ：／／ｎ２ｔ．ｎｅｔ／ａｄｄｇｅｎｅ：３５６１６、ＲＲＩＤ：Ａｄｄｇｅｎｅ＿３５６１６であり、ｐＣＭＶＲ８．７４は、Ｄｉｄｉｅｒ Ｔｒｏｎｏによって贈与され、Ａｄｄｇｅｎｅ ｐｌａｓｍｉｄ＃２２０３６ ； ｈｔｔｐ：／／ｎ２ｔ．ｎｅｔ／ａｄｄｇｅｎｅ：２２０３６ ； ＲＲＩＤ：Ａｄｄｇｅｎｅ＿２２０３６である）をレンチウイルスにパッケージングし、２９３Ｔ細胞に感染させた。細胞感染の４８時間後、フローサイトメトリーを使用して、最終レポーター系細胞であるｍＣｈｅｒｒｙ陽性の細胞集団を選別した。そのうち、蛍光閾値を、未感染の２９３Ｔ細胞又は未処理のコントロールレポーター系における蛍光強度が閾値より高い細胞数がちょうど１％より小さい（できるだけ１％に近い）時まで調整し、この時、蛍光強度が蛍光閾値より高い細胞は、陽性細胞と考えられた。レポーター系のテストについて、図５に示すように、一般的に、ＧＦＰ陽性細胞の割合（％ＧＦＰと略記）と、ＧＦＰ＋細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ、Ｍｅａｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）という２つの評価指標があった。そのうち、ＧＦＰ陽性細胞の割合は、即ち、ＧＦＰ強度が本明細書で定義されるＧＦＰ陽性閾値を超える細胞の割合％である。ＧＦＰの高さは、編集された細胞数を示した。ＧＦＰ陽性の細胞において、異なる細胞の蛍光強度が異なるため、レポーター系編集効率に対する試験は、さらに、ＭＦＩを含んだ。各ウェルの細胞は、内部標準とする近似した赤色蛍光強度を有するので、ＧＦＰ％が高いほど、ＭＦＩが高いほど、該ウェルの細胞のＵＳＨ２Ａ病原性変異部位が試験条件において編集される程度が高くなることを示すと考えられた。

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１について、小文字配列は、疾患関連配列を示し、同一塩基の大文字及び小文字は、塩基タイプの違いを示さなかった。
ＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＧＡＴＡＡＣＡＴＧＧＣＣＡＴＣＡＴＣＡＡＧＧＡＧＴＴＣＡＴＧＣＧＣＴＴＣＡＡＧＧＴＧＣＡＣＡＴＧＧＡＧＧＧＣＴＣＣＧＴＧＡＡＣＧＧＣＣＡＣＧＡＧＴＴＣＧＡＧＡＴＣＧＡＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＧＡＧＧＧＣＣＧＣＣＣＣＴＡＣＧＡＧＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＧＣＣＡＡＧＣＴＧＡＡＧＧＴＧＡＣＣＡＡＧＧＧＴＧＧＣＣＣＣＣＴＧＣＣＣＴＴＣＧＣＣＴＧＧＧＡＣＡＴＣＣＴＧＴＣＣＣＣＴＣＡＧＴＴＣＡＴＧＴＡＣＧＧＣＴＣＣＡＡＧＧＣＣＴＡＣＧＴＧＡＡＧＣＡＣＣＣＣＧＣＣＧＡＣＡＴＣＣＣＣＧＡＣＴＡＣＴＴＧＡＡＧＣＴＧＴＣＣＴＴＣＣＣＣＧＡＧＧＧＣＴＴＣＡＡＧＴＧＧＧＡＧＣＧＣＧＴＧＡＴＧＡＡＣＴＴＣＧＡＧＧＡＣＧＧＣＧＧＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＡＣＣＣＡＧＧＡＣＴＣＣＴＣＣＣＴＧＣＡＧＧＡＣＧＧＣＧＡＧＴＴＣＡＴＣＴＡＣＡＡＧＧＴＧＡＡＧＣＴＧＣＧＣＧＧＣＡＣＣＡＡＣＴＴＣＣＣＣＴＣＣＧＡＣＧＧＣＣＣＣＧＴＡＡＴＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＣＣＡＴＧＧＧＣＴＧＧＧＡＧＧＣＣＴＣＣＴＣＣＧＡＧＣＧＧＡＴＧＴＡＣＣＣＣＧＡＧＧＡＣＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＡＧＧＧＣＧＡＧＡＴＣＡＡＧＣＡＧＡＧＧＣＴＧＡＡＧＣＴＧＡＡＧＧＡＣＧＧＣＧＧＣＣＡＣＴＡＣＧＡＣＧＣＴＧＡＧＧＴＣＡＡＧＡＣＣＡＣＣＴＡＣＡＡＧＧＣＣＡＡＧＡＡＧＣＣＣＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＣＣＧＧＣＧＣＣＴＡＣＡＡＣＧＴＣＡＡＣＡＴＣＡＡＧＴＴＧＧＡＣＡＴＣＡＣＣＴＣＣＣＡＣＡＡＣＧＡＧＧＡＣＴＡＣＡＣＣＡＴＣＧＴＧＧＡＡＣＡＧＴＡＣＧＡＡＣＧＣＧＣＣＧＡＧＧＧＣＣＧＣＣＡＣＴＣＣＡＣＣＧＧＣＧＧＣＡＴＧＧＡＣＧＡＧＣＴＧＴＡＣＡＡＧＧＣＣＡＣＧＡＡＣＴＴＣＴＣＴＣＴＧＴＴＡＡＡＧＣＡＡＧＣＡＧＧＡＧＡＣＧＴＧＧＡＡＧＡＡＡＡＣＣＣＣＧＧＴＣＣＴＧＣＴＡＧＣｇｃｃｃｔｔｇａａｔｔｔａｔｇｇａｔｇａａｇｇａｇａｃａｃｃｃｔｇａｇｇｃｃｔｔｔｃａｃａｃｔｃｔａｃｇａａｔａｔｃｇｇｇｔｃａｇａｇｃｃｔｇｔａａｃｔｃｃａａｇｇｇｔｔｃａｇｔｇｇａｇａｇｔｃｔｇｔｇｇｔｃａｔｔａａｃａｃａａａｃｔｃｔｇｇａａｇｃｔｃｃａｃｃｔｃａａｇａｔｔｔｔｃｃａｇｃｔｃｃｔｔｇｇｇｃｔｃａａｇｃｃａｃｇａｇｔｇｃｔｃａｔｔｃａｇｔｔｃｔｇｔｔｇａａｔｔｇｇａｃａａａｇｃｃａＧＣＧＧＣＣＧＣＴＧＡＧＧＧＣＡＧＡＧＧＡＡＧＴＣＴＴＣＴＡＡＣＡＴＧＣＧＧＴＧＡＣＧＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＴＣＣＣＧＧＣＣＣＴＴＣＣＧＧＡＡＴＧＧＡＧＡＧＣＧＡＣＧＡＧＡＧＣＧＧＣＣＴＧＣＣＣＧＣＣＡＴＧＧＡＧＡＴＣＧＡＧＴＧＣＣＧＣＡＴＣＡＣＣＧＧＣＡＣＣＣＴＧＡＡＣＧＧＣＧＴＧＧＡＧＴＴＣＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧＡＧＧＧＣＡＣＣＣＣＣＡＡＧＣＡＧＧＧＣＣＧＣＡＴＧＡＣＣＡＡＣＡＡＧＡＴＧＡＡＧＡＧＣＡＣＣＡＡＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣＴＴＣＡＧＣＣＣＣＴＡＣＣＴＧＣＴＧＡＧＣＣＡＣＧＴＧＡＴＧＧＧＣＴＡＣＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＡＣＴＴＣＧＧＣＡＣＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＧＣＴＡＣＧＡＧＡＡＣＣＣＣＴＴＣＣＴＧＣＡＣＧＣＣＡＴＣＡＡＣＡＡＣＧＧＣＧＧＣＴＡＣＡＣＣＡＡＣＡＣＣＣＧＣＡＴＣＧＡＧＡＡＧＴＡＣＧＡＧＧＡＣＧＧＣＧＧＣＧＴＧＣＴＧＣＡＣＧＴＧＡＧＣＴＴＣＡＧＣＴＡＣＣＧＣＴＡＣＧＡＧＧＣＣＧＧＣＣＧＣＧＴＧＡＴＣＧＧＣＧＡＣＴＴＣＡＡＧＧＴＧＧＴＧＧＧＣＡＣＣＧＧＣＴＴＣＣＣＣＧＡＧＧＡＣＡＧＣＧＴＧＡＴＣＴＴＣＡＣＣＧＡＣＡＡＧＡＴＣＡＴＣＣＧＣＡＧＣＡＡＣＧＣＣＡＣＣＧＴＧＧＡＧＣＡＣＣＴＧＣＡＣＣＣＣＡＴＧＧＧＣＧＡＴＡＡＣＧＴＧＣＴＧＧＴＧＧＧＣＡＧＣＴＴＣＧＣＣＣＧＣＡＣＣＴＴＣＡＧＣＣＴＧＣＧＣＧＡＣＧＧＣＧＧＣＴＡＣＴＡＣＡＧＣＴＴＣＧＴＧＧＴＧＧＡＣＡＧＣＣＡＣＡＴＧＣＡＣＴＴＣＡＡＧＡＧＣＧＣＣＡＴＣＣＡＣＣＣＣＡＧＣＡＴＣＣＴＧＣＡＧＡＡＣＧＧＧＧＧＣＣＣＣＡＴＧＴＴＣＧＣＣＴＴＣＣＧＣＣＧＣＧＴＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＣＡＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＧＡＧＣＴＧＧＧＣＡＴＣＧＴＧＧＡＧＴＡＣＣＡＧＣＡＣＧＣＣＴＴＣＡＡＧＡＣＣＣＣＣＡＴＣＧＣＣＴＴＣＧＣＣ

実施例２：病原性突然変異部位に対するａｒＲＮＡの最適化
ＬＥＡＰＥＲ技術は、細胞内にいかなる外来タンパク質を導入する必要がないため、本実施例は、病原性部位へのＬＥＡＰＥＲの編集を試験する時に、レポーター系細胞にａｒＲＮＡを導入するだけで行われた。本実施例におけるａｒＲＮＡは、インビトロで合成され、その配列は、下記表１に示すとおりであった。配列は、２つの方法で命名され、ここで、「名称」は、配列の長短又は切断長さによって命名され、「統一化名称」は、Ｘ－Ｃ－Ｙによって命名され、ここで、Ｘは、５’末端の長さを表し、Ｙは、３’末端の長さを表し、Ｃは、ターゲット塩基Ｃである。例えば、１１１ｎｔが５５－Ｃ－５５と命名されると、その５’及び３’末端の長さがいずれも５５ｎｔであることを示す。

本実施例における全ての試験は、いずれもＲＮＡｉ ＭＡＸ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １３７７８１５０）を用いてａｒＲＮＡを細胞にトランスフェクトし、具体的なステップは、以下のとおりである。
１、細胞培養には、１０％ＦＢＳ（Ｖｉｓｔｅｃｈ ＳＥ１００－０１１）を含有するＤＭＥＭ（Ｈｙｃｌｏｎｅ ＳＨ３０２４３．０１）を用いた。１２ウェルプレートを使用して細胞を培養し、レポーター系の細胞を１５０００細胞／ウェルであった。細胞をプレーティングした時間を０時間とした。
２、細胞継代の２４時間後、ＲＮＡｉ ＭＡＸ試薬で１２．５ｐｍｏｌのａｒＲＮＡを各ウェルに移した。トランスフェクションステップは、供給業者の説明書を参照した。
３．細胞継代の７２時間後、全ウェルの細胞をトリプシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ２５３０００５４）で消化し、フローサイトメータで細胞蛍光強度をＦＩＴＣチャネルで分析した。

まず、ＬＥＡＰＥＲ参考文献におけるａｒＲＮＡの設計原則（Ｌｅｖｅｒａｇｉｎｇ Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ＡＤＡＲ ｆｏｒ Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ＲＮＡ、Ｑｕ ｅｔ ａｌ．，２０１９、該文献においてインビトロで合成されたａｒＲＮＡは、長さ１１１ｎｔのａｒＲＮＡだけを用いて試験した）を参照してａｒＲＮＡを設計し、即ち、病原性突然変異部位のＡ（標的Ａ）の対合ターゲット塩基をＣと決定し、前記ターゲット塩基の５’端末及び３’端末の配列長を一致させた。全長が１１１ｎｔ（５５－Ｃ－５５）のａｒＲＮＡ（参考文献と一致する）に基づいて、５’及び３’末端を同時に切断して、本明細書で使用される各試験ａｒＲＮＡを形成した。インビトロでＲＮＡを合成する制限のため、現段階のより長いＲＮＡの長さは、インビトロで合成されにくいため、本実施例は、１１１ｎｔ、９１ｎｔ、７１ｎｔ及び５１ｎｔという４種類の長さのａｒＲＮＡのみを試験し、編集効率の結果は、図６に示すとおりであった。

ここで、「コントロール」とは、いかなるａｒＲＮＡを導入しないコントロールウェルを意味する。図６から分かるように、コントロールウェルの底部のＧＦＰ陽性細胞が非常に少なく（約０、６％）、それに比べると、１１１ｎｔ、９１ｎｔ、及び７１ｎｔという３つのａｒＲＮＡによる％ＧＦＰがいずれも９０％を超えるが、５１ｎｔのａｒＲＮＡについて、ＧＦＰ陽性の割合が非常に低かった。平均蛍光強度の図から分かるように、コントロールウェルの底部に少量の偽陽性細胞があり、且つ、これらの細胞の割合が非常に少ないが、その蛍光強度が高く、図７に示すとおりであった。

驚くべきことに、上記ＬＥＡＰＥＲ参考文献の報告とは異なり、本願は、５１ｎｔ～１１１ｎｔのａｒＲＮＡがより良好な編集効果を得ることができることを見出したが、ａｒＲＮＡが長いほど編集効率が高くなるわけではなかった。図８に示すように、上記ＬＥＡＰＥＲ参考文献（同Ｑｕ ｅｔ ａｌ．，２０１９ 図２ｄ）の報告に基づいて、そのレポーター系において、５１ｎｔ～１１１ｎｔのａｒＲＮＡを比較した。ここで、７１ｎｔのＧＦＰ＋細胞の割合は、１１１ｎｔよりも低く、その長さと編集効率との関係は、５１ｎｔ～１１１ｎｔの範囲内でほぼ徐々に高くなる傾向があった。しかしながら、実施例１のレポーター系の試験では、１１１ｎｔに比べて、７１ｎｔによるＧＦＰ陽性細胞の割合差は小さいが、平均蛍光強度はより高かった。

次に、ａｒＲＮＡが長いほど合成コストはより高くなり、より長いａｒＲＮＡは、より大きいオフターゲット可能性をもたらし、したがって、本願は、様々な手段によって短く切断されたａｒＲＮＡの編集効率を試験した。図９に示すように、ターゲット塩基Ｃを中心とし、１１１ｎｔのａｒＲＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を基に、５’末端の上流又は３’末端の下流から１０ｎｔをステップサイズとして、中央に向かって段階的に切断して、試験用のａｒＲＮＡを得た。

図９から容易に分かるように、５’末端から短く切断する時、ＬＥＡＰＥＲ参考文献における報告に一致し、すなわち、比較的長いＲＮＡ編集効率がより高いが、対照的に、３’末端から短く切断する時、編集効率が徐々に低下せず、かえって３’末端から３０ｎｔ切断する時、最も高い編集効率を示した。３’末端から３０ｎｔ切断する時に編集効率が最も高いが、この時のａｒＲＮＡ長さは、５５－Ｃ－２５であり、したがって、その後の試験では、本発明者らは、３’末端の長さを２５ｎｔにし、５’末端から切断し続けて試験ａｒＲＮＡを得て、結果は、図１０に示すとおりであった。

図１０における「３’－３０切断」及び「５５－Ｃ－２５」は、図９における「３’切断」の「－３０」と同じａｒＲＮＡ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）であり、そのうち、図１０における「３’－３０切断」は、図９における「３’切断」の「－３０」と同じバッチで合成され、「５５－Ｃ－２５」と異なるバッチで合成された。図１０から容易に分かるように、３’末端を２５ｎｔに固定し、５’末端から切断した場合、編集効率は、実質的に５’の長さが減少するにつれて減少する傾向を示し、ここで、４０－Ｃ－２５は、上記傾向に従わないが、そのＭＦＩ も％ＧＦＰも５５－Ｃ－２５を超えなかった。

最後に、長さに加えて、ターゲット塩基の位置も編集効率に影響を及ぼした。したがって、その後に、本発明者らは、ａｒＲＮＡの長さを９１ｎｔに固定し、ターゲット塩基位置を移すことにより試験ａｒＲＮＡを得て、結果は、図１１に示すとおりであった。

図１１から分かるように、ターゲット塩基がａｒＲＮＡの中央位置にある時に効率が最も高いわけではなく、３’末端の長さが０に減少する前に（８５－Ｃ－５及びその左側のカラムに示すように）、ａｒＲＮＡは、いずれもより高い編集効率があった。

最後に、本発明者らは、上記のすべてのａｒＲＮＡを同じバッチで合成し、異なるバッチによる試験誤差を排除するためにそれを再試験した。結果を図１２に示した。図１２から容易に分かるように、最も効率的な３つのａｒＲＮＡは５５－Ｃ－３５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）、５５－Ｃ－２５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）、５５－Ｃ－１５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）であった。反復試験では、使用したａｒＲＮＡが凍結融解したため、最初の試験と比較して全体的な編集効率が僅かに低下した。両端が対称的なａｒＲＮＡについて、７１ｎｔ（３５－Ｃ－３５）は、１１１ｎｔ（５５－Ｃ－５５）と同等であった。さらに、このバッチでは最も長い１１１ｎｔのａｒＲＮＡの編集効率は、最高ではなく、それに比べて、長さがそれぞれ７１ｎｔ、８１ｎｔ、９１ｎｔである３本の５５－Ｃ－１５、５５－Ｃ－２５、５５－Ｃ－３５ａｒＲＮＡは、比較的高い編集効率があった。

且つ、従来技術における好ましい１１１ｎｔのａｒＲＮＡに比べ、本実施例における５５－Ｃ－１５などの長さが７１ｎｔのみのａｒＲＮＡは、編集効率がより高いだけでなく、また合成コストがより低かった（価格は、表２を参照）。さらに、より短いａｒＲＮＡは、より低いオフターゲットリスクを有し得ることが予想された。

ＧＦＰ信号を読み取ることにより、本発明者らは、異なるａｒＲＮＡの編集効率を迅速に大まかに判断することができるが、編集効率をより正確に確認するために、次世代配列決定（Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、ＮＧＳ）により、ｍＲＮＡにおけるＩ（Ｇ）に編集されるＡの割合を最終的に確認する必要があった。

本実施例における上記同じステップ１及び２に従って、細胞をプレーティングしトランスフェクトし、細胞継代の７２時間後に、８００μＬのＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１５５９６０１８）で試料を回収し、Ｄｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓａｅｒｃｈ、Ｒ２０５２）でＲＮＡを抽出した。各試料として抽出されたＲＮＡを１０００ｎｇ取り、ＴｒａｎｓＳｃｒｉｐｔ（登録商標） Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ｇＤＮＡ Ｒｅｍｏｖａｌ ａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ＳｕｐｅｒＭｉｘキット（ＴｒａｎｓＧｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＡＴ３１１）を用いて逆転写して、ｃＤＮＡを合成した。その後、１μＬの逆転写産物を取り、配列がｇｇａｇｔｇａｇｔａｃｇｇｔｇｔｇｃＧＧＡＡＧＡＡＡＡＣＣＣＣＧＧＴＣＣＴＧＣＴＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）及びｇａｇｔｔｇｇａｔｇｃｔｇｇａｔｇｇＡＡＣＡＧＡＡＣＴＧＡＡＴＧＡＧＣＡＣＴＣＧＴＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）である２つのプライマー及びＱ５ホットスタート酵素（ＮＥＢ、Ｍ０４９４Ｌ）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をＨｉ－ＴＯＭキット（Ｎｏｖｏｇｅｎｅ、ＲＥＦ ＰＴ０４５）を用いてライブラリーを構築し、以下の手順に従って二世代配列決定及びデータ解析を行った。

ｉ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定
構築された配列決定ライブラリーに対して、ＮｏｖａＳｅｑ６０００プラットフォームを用いてハイスループット塩基配列決定を行った。
ｉｉ、配列決定データ処理
ハイスループット塩基配列決定で得られた生データに対してｆａｓｔｐ（ｖ０．１９．６）で品質管理を行い、低品質、リンカー付きの配列、及びｐｏｌｙＧ等を含む配列を濾過して除去した。得られた高品質の配列決定データを、対応するｂａｒｃｏｄｅ配列に従って各試料に分割し、ＢＷＡ（ｖ０．７．１７－ｒ１１８８）ソフトウェアを使用して、増幅された目的領域の配列と比較し、ＳＡＭｔｏｏｌｓ（ｖ１．９）によりフォーマット変換を行ってＢＡＭファイルを生成した。比較情報を統計し、改めて順序付けし、インデックスを作成した。
ｉｉｉ、編集効率解析
ＪＡＣＵＳＡ（ｖ１．３．０）ソフトウェアを用いて全ての潜在的なＲＮＡ突然変異部位を検出し、用いられるパラメータは、ｃａｌｌ－１－ａ Ｂ、Ｒ、Ｄ、Ｉ、Ｙ、Ｍ：４－Ｃ ＡＣＧＴ－ｃ ２－ｐ １－Ｐ ＵＮＳＴＲＡＮＤＥＤ－Ｒ－ｕ ＤｉｒＭｕｌｔ－ＣＥであった。コントロールサンプルと処理サンプルに同時に現れる高頻度点変異を濾過して除去した後、Ａ～Ｇ突然変異部位以外の平均変異頻度の三倍を閾値とし、標的塩基Ａ～Ｇ変異頻度が閾値以上の部分を標的ＡがＧに変異する真の頻度とした。

以上のステップを採用し、本発明者らは、最終的に図１２における全てのサンプルに対して次世代配列決定を行い、標的塩基がＧであるＲｅａｄｓ数を、それがＡＴＣＧである全てのＲｅａｄｓ数を占める百分率を編集効率とし、且つこれに基づいて図を作成し、結果は、図１３に示すとおりであった。

図１２と図１３を比較すると、容易に分かるように、異なる方法で測定された編集効率は、基本的に同じ傾向を示した。すなわちＬＥＡＰＥＲ文献（Ｑｕ ｅｔ ａｌ．，２０１９）に設計された１１１ｎｔのａｒＲＮＡは、編集効率が最も高いａｒＲＮＡではなく、本発明者らは、ターゲット塩基３’末端から切断し、５’末端から切断し、配列におけるターゲット塩基の位置を調整することにより、５５－Ｃ－１５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）の配列がＧＦＰの読み値で比較的高い編集効率を示すと最終的に発見するだけでなく、次世代配列決定によりさらに確認することもでき、そのＡからＧへの編集効率が５０％程度に達することができ、これは、５５－Ｃ－１５のａｒＲＮＡによる編集後の細胞のうち５０％のｍＲＮＡの標的塩基部位にＡからＧへの編集が発生したことを意味した。

以上の試験により、本発明者らは、本願に記載の技術的解決手段に従って設計されたａｒＲＮＡが、従来技術に比べてより高い編集効率を達成でき、且つコストがより低いことを証明した。同時に、本願のａｒＲＮＡの必要な長さがより短いため、トランスフェクションコピー数が同じである場合、本願におけるａｒＲＮＡの細胞にトランスフェクトした質量がより低く、これは、過剰なＲＮＡのトランスフェクションの細胞に対する毒性を低減することに役立ち、また、ａｒＲＮＡと非標的ＲＮＡ配列との結合を低減し、それにより、インビボ編集の安全性を向上させると予測することができる。

実施例３：マウスの眼部のＵｓｈ２Ａ遺伝子部位のインビボ編集
実施例２では、インビトロ試験によってＵＳＨ２Ａ病原性部位を編集した。インビトロ試験では、良好な編集効率を取得することができるが、インビトロ細胞培養の環境は、人体内循環、免疫システム及び眼球内注射等の複数の要因をシミュレートすることができず、これらは、依然としてより多くの体内試験検証を必要とした。実際の治療への後続の適用を考慮し、現在、眼部への低分子ＲＮＡの送達に対して、アデノ随伴ウイルス（Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ、ＡＡＶ）を選択することが多く、本発明者らは、最終的に、マウスの眼部のＵＳＨ２Ａ遺伝子部位のインビボ編集のためにＡＡＶベクターをａｒＲＮＡの送達手段として使用することを選択した。本発明者らは、１５１ｎｔ ａｒＲＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２）を用いて本試験を行った。すなわち、本実施例に用いられる試験用ａｒＲＮＡに標的Ａと対向するターゲット塩基Ｃが含まれ、該ａｒＲＮＡが標的ＲＮＡとハイブリダイズされる場合、標的ＡにＡ－Ｃ不整合（ミスマッチ）を形成することができた。また、該ａｒＲＮＡ標的塩基Ｃの５’末端と３’末端は、それぞれ標的配列と完全に相補的な７５ｎｔの塩基配列であった。マウスＵＳＨ２Ａ遺伝子がヒトＵＳＨ２Ａ遺伝子配列とは異なるので、試験用マウスには、Ｕｓｈｅｒ症候群関連変異を持たないため、本実施例で使用した１５１ｎｔのａｒＲＮＡは、マウスＵｓｈ２Ａ関連部位を標的とするａｒＲＮＡであるが、ヒトＵＳＨ２Ａ遺伝子配列を標的とするａｒＲＮＡではなかった。本発明者らは、該ａｒＲＮＡコード配列を、ＡＡＶベクターＵ６プロモーター開始部位に挿入した後に、ａｒＲＮＡ配列が挿入されたＡＡＶベクターを１×１０^１３ＧＣ／ｍＬのＡＡＶ２及びＡＡＶ５にパッケージングした。そのうち、ＡＡＶベクターの構築（構築されたベクターはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６を参照し、そのうちａｒＲＮＡコード配列は大文字で表示され、同一の文字の大きさは塩基差を示さない）及びＡＡＶウイルスのパッケージングは、いずれも広州派真生物技術有限公司によって完成された。

本実施例は、６～８週齢のＳＰＦレベルＣ５７雄性マウスを採用し、試験群（ＡＡＶ２及びＡＡＶ５群）とコントロール群（ＰＢＳ）は、それぞれ８匹のマウスであり、合計２４匹であった。試験群及びコントロール群のマウスの右眼の硝子体に、ＡＡＶ又はＰＢＳをそれぞれ２μＬ注入した。注射後の７日目（後に第１週とマーク付けされる）、１４日目（後に２週目とマーク付けされる）に、各群のマウスをそれぞれ４匹屠殺し、その右眼を取り出し、ハサミで５０～１００ｍｇ の小さいブロックに細断した。液体窒素を加えて研磨した後、８００μＬのＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１５５９６０１８）で試料を回収した。Ｄｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓａｅｒｃｈ、Ｒ２０５２）を用いてＲＮＡ抽出を行った。各試料として抽出されたＲＮＡを１０００ｎｇ取り、ＴｒａｎｓＳｃｒｉｐｔ（登録商標） Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ｇＤＮＡ Ｒｅｍｏｖａｌ ａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ＳｕｐｅｒＭｉｘキット（ＴｒａｎｓＧｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＡＴ３１１）を用いて逆転写して、ｃＤＮＡを合成した。各マウスからそれぞれ１μＬの逆転写産物を取り、配列がｇｇａｇｔｇａｇｔａｃｇｇｔｇｔｇｃＣＣＣＡＴＣＴＣＴＴＴＧＧＣＴＴＧＧＡＡＣＣＡＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）及びｇａｇｔｔｇｇａｔｇｃｔｇｇａｔｇｇＣＴＴＴＴＣＴＣＴＣＴＧＣＴＣＣＡＣＴＧＴＧＡＡＧＴＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）である２つのプライマー及びＱ５ホットスタート酵素（ＮＥＢ、Ｍ０４９４Ｌ）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をＨｉ－ＴＯＭキット（Ｎｏｖｏｇｅｎｅ、ＲＥＦ ＰＴ０４５）を用いてライブラリーを構築し、且つ二世代配列決定及びデータ解析を完了した（配列決定及びデータ解析方法は実施例２と同じである）。

結果を図１４に示した。図から分かるように、マウスのインビボ試験では、マウスの硝子体に注射する時、マウス眼球細胞におけるＡＡ５編集効率は、ＡＡＶ２よりも高かった。しかしながら、図から明らかなように、ＡＡＶ２もＡＡＶ５も編集効率が低かった。例えば、７日目に、ＡＡＶ２の平均編集効率は、０．５％であり、ＰＢＳ群と有意差はなかった。しかしながら、ＡＡＶ５の平均効率が約１％であるが、４つの並行試験は明らかに一致しない編集効率を示し、そのうち１つの編集効率は２％以上であり、他の３つは、約０、５％であった。１４日目までに、ＡＡＶ２群もほぼ１％の編集効率を有したが、ＡＡＶ５群は、平均値が２％の編集効率を有し、そのうち１つの試料は、ほぼ５％の編集効率があった。該試験により、本発明者らは、以下の問題を発見した。まず、マウス眼球においてＡＡＶ５の編集効率がＡＡＶ２より高いと思われ、次に、異なるマウス間のデータの差異が大きく、これは、本発明者らの硝子体注射の条件が安定しないため、毎回の注射の差異が大きいことを示す可能性があり、最後に、７日目から１４日目まで編集効率が上昇する傾向があり、これは、検出時間を遅らせれば、より高い編集効率が検出される可能性があることを意味した。

そのため、本発明者らはマウス眼球注射の試験を改めて行い、且つ試験システムに対して以下の最適化を行った。１）、ＡＡＶ５の編集効率がＡＡＶ２よりも高いため、今回の試験ではＡＡＶ５を残し、別の血清型のＡＡＶウイルスであるＡＡＶ８を試験した。２）、硝子体注射の編集効果が安定しないという問題に対し、本発明者らは注射条件を網膜下腔注射に変更し、且つ注射した後に光コヒーレンストモグラフィ（Ｏｐｔｉｃａｌ Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ、ＯＣＴ）によってマウス網膜下腔注射が成功することを確認し、３）、検出時間を第１４日（第２週）、第２８日（第４週）、第４２日（第６週）、第５６日（第８週）に変更し、４）、Ｕｓｈｅｒ症候群が網膜における錐体視細胞及び桿体視細胞の変性病変に起因するものであるため、今回の試験は、網膜におけるＵｓｈ２Ａの編集効率のみを検出し、眼球全体の編集効率を検出することに比べ、網膜におけるＵｓｈ２Ａの編集効率のみを検出することは、将来の治療に対してより指導価値があった。

本試験では、用いたマウスは、６～８週齢のＳＰＦレベルＣ ５７雄性マウスであり、試験群（ＡＡＶ５、ＡＡＶ８群）は、それぞれ２０匹であり、コントロール群（ＮａＣｌ）は、１２匹であった。

網膜下腔注射方法は、動物の両眼にそれぞれ化合物トピラミンの点眼剤を１～２滴滴下して散瞳を行い、Ｚｏｌｅｔｉｌ ５０を用いて（５０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｍＬ）筋肉内注射して動物に全身麻酔を施すことであった。麻酔後のマウスを作業台に横臥させた。マウスの眼窩周囲皮膚をポビドンヨード綿球で消毒した。眼球側の結膜を歯のある顕微鏡用鉗子で挟み、眼球結膜下筋膜を顕微解剖用ハサミで切り、強膜の一部を露出させた。顕微鏡用鉗子を動かないように保持し、カバーガラスで角膜を覆い、その間の空気をカルボマー点眼剤で排除し、続いて使い捨てインスリン針を用いて、強膜と小さい角度で、網膜上皮と網膜との境界まで強膜、脈絡膜を刺し、チャネルを形成した。顕微鏡用鉗子を動かないように保持し続け、インスリン針を取り出し、それを３３Ｇマイクロシリンジに交換した。３３Ｇマイクロシリンジを、チャネル開口部から網膜下に刺し、１μＬゆっくりと投与した後、針を少なくとも３～５ｓ止めた。動物の麻酔状態が良好な状態で、（針抜き時の液漏れ体積をできるだけ減らすために）マイクロシリンジをチャネル内に約３０ｓ保持し続けた。交差汚染がないことを確保するために、各マウスへの投与後に針を洗浄する必要があった。両眼の注射を終了した後、ＯＣＴスキャンを用いて注射位置が網膜下腔であることを確認した。両眼がいずれも網膜下腔に成功裏に注射されると、該動物注射が成功すると判定した。注射後の１４日目、２８日目、４２日目、５６日目にそれぞれ５匹（試験群）又は３匹（コントロール群）のマウスを安楽死させた。マウスの左眼を摘出し、角強膜縁に沿ってメスで角膜を３６０°切開した。虹彩及び水晶体を除去し、網膜－脈絡膜－強膜複合体を取り出し、最も外側の強膜を除去した後、細かく切り刻み、事前に冷却された４００μＬのＴＲＩｚｏｌ（Ｔｈｅｒｍｏ、１５５９６０１８）を充填した滅菌ＥＰチューブに入れた。次に、組織ホモジナイザーで均一に混合した。Ｄｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ ＲＮＡ Ｍｉｃｒｏｐｒｅｐキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓａｅｒｃｈ、Ｒ２０６２）を用いてＲＮＡを抽出した。各サンプルとして抽出された全ＲＮＡを１０００ｎｇ取り、ＴｒａｎｓＧｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ逆転写キット（ＴｒａｎｓＧｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＡＨ３４１－０１）で逆転写し、５μＬ の逆転写されたｃＤＮＡを取り、配列がｇｇａｇｔｇａｇｔａｃｇｇｔｇｔｇｃＣＣＣＡＴＣＴＣＴＴＴＧＧＣＴＴＧＧＡＡＣＣＡＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）及びｇａｇｔｔｇｇａｔｇｃｔｇｇａｔｇｇＣＴＴＴＴＣＴＣＴＣＴＧＣＴＣＣＡＣＴＧＴＧＡＡＧＴＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）である２つのプライマー及びＱ５ホットスタート酵素（ＮＥＢ、Ｍ０４９４Ｌ）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をＨｉ－ＴＯＭキット（Ｎｏｖｏｇｅｎｅ、ＲＥＦ ＰＴ０４５）を用いてライブラリーを構築し、且つ二世代配列決定及びデータ解析を完了した（配列決定及びデータ解析方法は実施例２と同じである）。

結果を図１５に示した。図から明らかなように、今回の試験は、最初の試験における最大平均値が２％の編集効率（図１４）に比べて、最大５％を超える編集効率に達することができた。また、今回の試験では、マウス網膜を剥離して試料を回収して配列を決定するが、マウスの眼球全体をせん断粉砕しないため、実際の治療時に発生する実際の治療効果をより反応することができた。本試験により、ＬＥＡＰＥＲ技術がマウスインビボ試験において網膜細胞におけるＵｓｈ２Ａ内因性遺伝子部位を編集することができ、かつそのような編集がマウスにおいて少なくとも２ヶ月間持続することができることを実証することができた。

以上の実施例の結果をまとめると、本願は、本願に開示される技術的解決手段を使用してＵｓｈｅｒ症候群を治療する実行可能性を十分に実証した。

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２：
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６：
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Claims (25)

1. ＬＥＡＰＥＲ技術に基づいて細胞における標的ＲＮＡを標的化編集する方法であって、前記標的ＲＮＡは、ＵＳＨ２Ａ遺伝子転写物におけるＧからＡへの突然変異を含むＲＮＡであり、該方法は、
   標的ＲＮＡを編集するためのアデノシンデアミナーゼ動員ＲＮＡ（ａｒＲＮＡ）を含む構築体、又は前記ａｒＲＮＡをコードする構築体を、前記細胞に導入するステップを含み、前記ａｒＲＮＡが前記標的ＲＮＡとハイブリダイズされる相補的ＲＮＡ配列を含み、前記ａｒＲＮＡがＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を動員して標的ＲＮＡにおける標的アデノシンを脱アミノ化することができる、ことを特徴とする方法。
2. 前記標的ＲＮＡは、ｍＲＮＡ前駆体（Ｐｒｅ－ｍＲＮＡ）である、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 前記ａｒＲＮＡの長さは、約１５１～６１ｎｔ、１３１～６６ｎｔ、１２１～６６ｎｔ、１１１～６６ｎｔ、９１～６６ｎｔ又は８１～６６ｎｔである、ことを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記ａｒＲＮＡの長さは、６６ｎｔ～１３１ｎｔから選択されるいずれかの自然数である、ことを特徴とする請求項３に記載の方法。
5. 前記ａｒＲＮＡにおけるターゲット塩基の３’末端からの長さが≧７ｎｔ、≧１０ｎｔ、≧１５ｎｔであり、好ましくは、１６～５５ｎｔ、２０～５０ｎｔ、２５～４５ｎｔ、２５～３５ｎｔ又は２５～３０ｎｔである、ことを特徴とする請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記ａｒＲＮＡにおけるターゲット塩基の５’末端からの長さが≧２５ｎｔ、≧３０ｎｔ、≧３５ｎｔ、≧４５ｎｔ、好ましくは、４６～９０ｎｔ、５０～８５ｎｔ、５５～８０ｎｔ、６０～７５ｎｔ、又は６５～７０ｎｔである、ことを特徴とする請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記ａｒＲＮＡに、標的配列中の標的Ａと対合するターゲット塩基を導入し、該ターゲット塩基の優先度が高い順にＣ、Ａ、Ｕ又はＧである、ことを特徴とする請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記標的ＲＮＡは、ヒトＵＳＨ２Ａ遺伝子ＮＭ＿２０６９３３．２（ＵＳＨ２Ａ）＿ｃ．１１８６４ Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｔｒｐ３９５５Ｔｅｒ）が転写されている突然変異部位を含むＲＮＡである、ことを特徴とする請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記ａｒＲＮＡは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４から選択される、ことを特徴とする請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記ａｒＲＮＡは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９から選択される、ことを特徴とする請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記構築体は、直鎖状核酸、ウイルスベクター、又はプラスミドである、ことを特徴とする請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター又はレンチウイルスベクターである、ことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
13. 前記ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５又はＡＡＶ８キャプシドにパッケージングされた後、感染によって前記細胞に導入される、ことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
14. 前記ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ８キャプシドにパッケージングされた後、感染によって前記細胞に導入される、ことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
15. 前記細胞は、哺乳動物の視神経細胞又は聴神経細胞である、ことを特徴とする請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。
16. ＵＳＨ２Ａ遺伝子転写物におけるＧからＡへの突然変異を含む標的ＲＮＡを標的化編集するためのａｒＲＮＡであって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４から選択される配列を含み、又はそれらから選択される配列で構成される、ことを特徴とするａｒＲＮＡ。
17. 請求項１６に記載のａｒＲＮＡを含む構築体又は送達体。
18. プラスミド、ウイルス、リポソーム、又は脂質ナノ粒子である、ことを特徴とする請求項１７に記載の構築体又は送達体。
19. アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）又はレンチウイルスである、ことを特徴とする請求項１８に記載の構築体又は送達体。
20. 前記ウイルスは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５又はＡＡＶ８である、ことを特徴とする請求項１９に記載の構築体又は送達体。
21. 請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法により編集された細胞。
22. 個体におけるＵｓｈｅｒＩＩ型症候群を治療する方法であって、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法で前記個体の細胞におけるＵｓｈｅｒＩＩ型症候群と関連するＧからＡへの突然変異を修正することを含む、ことを特徴とする方法。
23. 請求項１６に記載のａｒＲＮＡ又は請求項１７～２０のいずれか１項に記載の構築体又は送達体を被験者に導入することを含む、ことを特徴とする請求項２２に記載の方法。
24. 請求項１６に記載のａｒＲＮＡ又は請求項１７～２０のいずれか１項に記載の構築体又は送達体を被験者の網膜下腔に導入する、ことを特徴とする請求項２３に記載の方法。
25. Ｕｓｈｅｒ ＩＩ症候群を治療する医薬の調製における、請求項１６に記載のａｒＲＮＡ又は請求項１７～２０のいずれか１項に記載の構築体又は送達体の使用。

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