JP2023504314A - 治療的編集 - Google Patents

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Abstract

操作されたポリヌクレオチドを含む組成物、それを含む医薬組成物、それを作製する方法、および操作されたポリヌクレオチドを含む組成物を含む処置の方法が、本明細書で開示される。一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチドが本明細書で開示される。ある態様では、操作されたポリヌクレオチドは、標的ＲＮＡの領域に少なくとも部分的に相補的である標的化配列を含む操作されたポリヌクレオチドを含み、この標的ＲＮＡの領域は、（ａ）アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）ポリペプチドを少なくとも部分的にコードする配列を含み、（ｂ）（ａ）の近位にある配列を含み、または（ｃ）（ａ）および（ｂ）を含み、この操作されたポリヌクレオチドは、ＲＮＡ編集実体による標的ＲＮＡのヌクレオチドの塩基の編集を助長するように構成されている。

Description

相互参照
本願は、２０１９年１２月２日に出願した米国特許仮出願第６２／９４２，６８３号、２０１９年１２月２日に出願した米国特許仮出願第６２／９４２，６９３号、２０１９年１２月２日に出願した米国特許仮出願第６２／９４２，６６７号、２０１９年５月１１日に出願した米国特許仮出願第６３／０２２，７２７号、２０２０年５月２６日に出願した仮出願第６３／０３０，１６５号および２０２０年１１月１１日に出願した仮出願第６３／１１２，２８６号の利益を主張するものであり、これらの出願は、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
本願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出した配列表を含み、この配列表は、その全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれる。２０２０年１２月１日に作成した前記ＡＳＣＩＩコピーは、５４７６１＿７１２＿６０１＿ＳＬ．ｔｘｔという名であり、サイズが３５３，４００バイトである。
概要
一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチドが本明細書で開示される。ある態様では、操作されたポリヌクレオチドは、標的ＲＮＡの領域に少なくとも部分的に相補的である標的化配列を含む操作されたポリヌクレオチドを含み、この標的ＲＮＡの領域は、（ａ）アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）ポリペプチドを少なくとも部分的にコードする配列を含み、（ｂ）（ａ）の近位にある配列を含み、または（ｃ）（ａ）および（ｂ）を含み、この操作されたポリヌクレオチドは、ＲＮＡ編集実体による標的ＲＮＡのヌクレオチドの塩基の編集を助長するように構成されている。
一部の実施形態では、ＲＮＡ編集実体による標的ＲＮＡのヌクレオチドの塩基の編集は、編集のない標的ＲＮＡによりコードされるＡＰＰポリペプチドと比べて、セクレターゼ酵素によるＡＰＰポリペプチドの（ａ）プロセシング、（ｂ）切断、または（ｃ）（ａ）および（ｂ）の増加または減少を助長する。一部の実施形態では、セクレターゼ酵素は、アルファセクレターゼ、ベータセクレターゼ、ガンマセクレターゼ、またはこれらの組合せを含む。一部の実施形態では、セクレターゼ酵素は、ベータセクレターゼを含み、このベータセクレターゼは、ベータ部位アミロイド前駆体タンパク質切断酵素１（ＢＡＣＥ１）、カテプシンＢ、またはメプリンベータを含む。
一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチドは、標的ＲＮＡと会合している場合、ＲＮＡ編集実体を少なくとも一部は動員する構造的特徴をさらに含む。一部の実施形態では、構造的特徴は、バルジ、内部ループ、ヘアピン、ミスマッチ、ゆらぎ塩基対、またはこれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、構造的特徴は、バルジを含む。一部の実施形態では、バルジは、非対称バルジを含む。一部の実施形態では、バルジは、対称バルジを含む。一部の実施形態では、バルジは、操作されたポリヌクレオチドの約１～約４ヌクレオチド、および標的ＲＮＡの約０～約４ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、バルジは、操作されたポリヌクレオチドの約０～約４ヌクレオチド、および標的ＲＮＡの約１～約４ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、バルジは、操作されたポリヌクレオチドの３ヌクレオチド、および標的ＲＮＡの３ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、構造的特徴は、内部ループを含む。一部の実施形態では、内部ループは、非対称内部ループを含む。一部の実施形態では、内部ループは、対称内部ループを含む。一部の実施形態では、内部ループは、操作されたポリヌクレオチドまたは標的ＲＮＡのいずれかの約５～約１０ヌクレオチドにより形成される。一部の実施形態では、構造的特徴は、ヘアピンを含む。一部の実施形態では、ヘアピンは、二本鎖ＲＮＡ分子を含み、ヘアピンは、標的化配列を含まない。一部の実施形態では、ヘアピンのステムループは、長さ約３～約１５ヌクレオチドである。一部の実施形態では、構造的特徴は、ミスマッチを含む。一部の実施形態では、ミスマッチは、標的ＲＮＡのヌクレオチドの塩基の向かい側のその塩基と不対合の、操作されたポリヌクレオチドの標的化配列内の塩基を含む。一部の実施形態では、ミスマッチは、グアニン－グアニンミスマッチを含む。一部の実施形態では、ミスマッチは、アデノシン－シトシンミスマッチを含み、この場合、アデノシンは、標的ＲＮＡ中にあり、シトシンは、操作されたポリヌクレオチドの標的化配列内にある。一部の実施形態では、アデノシン－シトシンミスマッチにおけるアデノシンは、ＲＮＡ編集実体により編集される標的ＲＮＡ中のヌクレオチドの塩基である。一部の実施形態では、構造的特徴は、ゆらぎ塩基対を含む。一部の実施形態では、ゆらぎ塩基対は、ウラシルと対合しているグアニンを含む。一部の実施形態では、構造的特徴は、構造モチーフを含み、この構造モチーフは、２つのバルジとアデノシン－シトシンミスマッチとを含む。
一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチドは、ＲＮＡ編集実体を動員することができるＲＮＡ編集実体動員ドメインをさらに含む。一部の実施形態では、ＲＮＡ編集実体は、ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）ポリペプチドまたはその生物活性断片を含む。一部の実施形態では、ＡＤＡＲポリペプチドまたはその生物活性断片は、ＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２、またはこれらのいずれかの生物活性断片を含む。一部の実施形態では、ＡＤＡＲポリペプチドまたはその生物活性断片は、標的ＲＮＡを含む神経細胞において合成的に過剰発現される。一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチドは、ＲＮＡ編集実体動員ドメインを含まない。一部の実施形態では、ヌクレオチドは、ＡＰＰポリペプチドの切断部位に近接しているアミノ酸をコードするコドンに含まれており、このアミノ酸は、配列番号１のポリペプチド配列を含むＡＰＰポリペプチドの６７０、６７１、６７２、６７３、６８２、６８４、６８７、７１２または７１４位にある。一部の実施形態では、切断部位は、アルファ－セクレターゼ切断部位、ベータ－セクレターゼ切断部位、ベータ’－セクレターゼ切断部位、ガンマ－セクレターゼ切断部位、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、標的ＲＮＡは、標的ＲＮＡのヌクレオチドの塩基の編集から生成される改変ＡＰＰポリペプチドと比較して少なくとも１つのアミノ酸残基の差異を含む未改変ＡＰＰポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸残基の差異は、配列番号１のポリペプチド配列を含むＡＰＰポリペプチドのＫ６７０Ｅ、Ｋ６７０Ｒ、Ｋ６７０Ｇ、Ｍ６７１Ｖ、Ｄ６７２Ｇ、Ｅ６８２Ｇ、Ｈ６８４Ｒ、Ｋ６８７Ｒ、Ｋ６８７Ｅ、またはＫ６８７Ｇを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸残基の差異は、配列番号１のポリペプチド配列を含むＡＰＰポリペプチドのＫ６７０ＧまたはＭ６７１Ｖを含む。
一部の実施形態では、組成物は、第２の標的ＲＮＡの領域に少なくとも部分的に相補的である第２の標的化配列を含む第２の操作されたポリヌクレオチドをさらに含む。一部の実施形態では、第２の標的ＲＮＡの領域は、（ａ）タウポリペプチドもしくはアルファ－シヌクレイン（ＳＮＣＡ）ポリペプチドを少なくとも部分的にコードする、（ｂ）（ａ）の近位にある配列を含む、または（ｃ）（ａ）および（ｂ）を含む。一部の実施形態では、第２の標的ＲＮＡの領域は、タウポリペプチドを少なくとも部分的にコードし、この領域は、配列番号１６～配列番号２７を含む。一部の実施形態では、第２の標的ＲＮＡの領域がＳＮＣＡポリペプチドを少なくとも部分的にコードし、その領域が配列番号３６～配列番号４４を含む、請求項３９に記載の組成物。
一部の実施形態では、編集は、ＲＮＡ編集実体による標的ＲＮＡの第２のヌクレオチドの少なくとも第２の塩基の編集をさらに含む。一部の実施形態では、ＲＮＡ編集実体による標的ＲＮＡまたは第２の標的ＲＮＡのヌクレオチドの塩基の編集は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにより判定して、β－アミロイド、ＳＮＣＡポリペプチド、タウポリペプチドの、またはβ－アミロイド、ＳＮＣＡポリペプチドもしくはタウポリペプチドをコードするＲＮＡの形成を低減、防止または消失させるのに十分なものであり、前記ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイは、（ａ）操作されたポリヌクレオチドまたは第２の操作されたポリヌクレオチドを標的ＲＮＡまたは第２の標的ＲＮＡと接触させること、および（ｂ）編集された標的ＲＮＡによりコードされる改変ＡＰＰポリペプチド、編集された第２の標的ＲＮＡによりコードされる改変タウポリペプチド、または編集された第２の標的ＲＮＡによりコードされる改変ＳＮＣＡポリペプチドについてのプロセシングの、切断の、またはプロセシングおよび切断のモジュレーションを、未編集の標的ＲＮＡによりコードされる未改変ＡＰＰポリペプチド、未編集の第２の標的ＲＮＡによりコードされる未改変タウポリペプチド、または未編集の第２の標的ＲＮＡによりコードされる未改変ＳＮＣＡポリペプチドについてのプロセシングの、切断の、またはプロセシングおよび切断のモジュレーションと比較して判定することを含む。
一部の実施形態では、ＲＮＡ編集実体による標的ＲＮＡおよび第２の標的ＲＮＡのヌクレオチドの塩基の編集は、β－アミロイドの形成を低減、防止または消失させるのに十分なものであり、このβ－アミロイドは、Ａベータ４０断片、Ａベータ４２断片、またはＡベータ４０断片およびＡベータ４２断片を含む。一部の実施形態では、ＲＮＡ編集実体による標的ＲＮＡおよび第２の標的ＲＮＡのヌクレオチドの塩基の編集は、組成物との接触のない他の点では同等の細胞と比較して形成を約１／１、１／３、１／５、１／１０または１／５０に低減させるのに十分なものである。一部の実施形態では、編集は、β－アミロイドペプチド形成を消失させるのに十分なものである。一部の実施形態では、編集は、分泌型細胞外ドメインＡＰＰアルファ（ｓＡＰＰａ）の量を増加させるのに十分なものである。
一部の実施形態では、組成物が本明細書で開示される。ある態様では、組成物は、（ａ）標的ＲＮＡの領域に少なくとも部分的に相補的である標的化配列を含む操作されたポリヌクレオチドであって、標的ＲＮＡの領域が、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）ポリペプチドを少なくとも部分的にコードする、操作されたポリヌクレオチドと、（ｂ）第２の標的ＲＮＡの領域に少なくとも部分的に相補的である第２の標的化配列を含む第２の操作されたポリヌクレオチドであって、第２の標的ＲＮＡの領域が、タウポリペプチドまたはアルファ－シヌクレイン（ＳＮＣＡ）ポリペプチドを少なくとも部分的にコードする、第２の操作されたポリヌクレオチドとを含み、この操作されたポリヌクレオチドおよび第２の操作されたポリヌクレオチドは、独立して、ＲＮＡ編集実体による標的ＲＮＡまたは第２の標的ＲＮＡのヌクレオチドの塩基の編集を助長するように構成されている。
一部の実施形態では、第２の標的ＲＮＡの領域は、タウポリペプチドを少なくとも部分的にコードし、この領域は、配列番号１６～配列番号２７を含む。一部の実施形態では、第２の標的ＲＮＡの領域は、ＳＮＣＡポリペプチドを少なくとも部分的にコードし、この領域は、配列番号３６～配列番号４４を含む。
一部の実施形態では、ＲＮＡ編集実体による標的ＲＮＡまたは第２の標的ＲＮＡのヌクレオチドの塩基の編集は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにより判定して、β－アミロイド、ＳＮＣＡポリペプチド、タウポリペプチドの、またはβ－アミロイド、ＳＮＣＡポリペプチドもしくはタウポリペプチドをコードするＲＮＡの形成を低減または消失させるのに十分なものであり、前記ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイは、（ａ）操作されたポリヌクレオチドを標的ＲＮＡと接触させること、または第２の操作されたポリヌクレオチドを第２の標的ＲＮＡと接触させること、および（ｂ）編集された標的ＲＮＡによりコードされる改変ＡＰＰポリペプチド、編集された第２の標的ＲＮＡによりコードされる改変タウポリペプチド、または編集された第２の標的ＲＮＡによりコードされる改変ＳＮＣＡポリペプチドについてのプロセシングの、切断の、またはプロセシングおよび切断のモジュレーションを、未編集の標的ＲＮＡによりコードされる未改変ＡＰＰポリペプチド、未編集の第２の標的ＲＮＡによりコードされる未改変タウポリペプチド、または未編集の第２の標的ＲＮＡによりコードされる未改変ＳＮＣＡポリペプチドについてのプロセシングの、切断の、またはプロセシングおよび切断のモジュレーションと比較して判定することを含む。
一部の実施形態では、ＲＮＡ編集実体による標的ＲＮＡおよび第２の標的ＲＮＡのヌクレオチドの塩基の編集は、組成物との接触のない他の点では同等の細胞と比較して形成を約１／１、１／３、１／５、１／１０または１／５０に低減させるのに十分なものである。一部の実施形態では、モジュレーションは、ａ）改変ＡＰＰポリペプチド、改変タウポリペプチド、改変ＳＮＣＡポリペプチド、もしくはこれらのいずれかの組合せ、ｂ）改変ＡＰＰポリペプチドをコードするｍＲＮＡ転写物、改変タウポリペプチドをコードするｍＲＮＡ転写物、改変ＳＮＣＡポリペプチドをコードするｍＲＮＡ転写物、もしくはこれらのいずれかの組合せ、ｃ）改変ＡＰＰポリペプチドのリン酸化、改変タウポリペプチドのリン酸化、改変ＳＮＣＡポリペプチドのリン酸化、もしくはこれらのいずれかの組合せ、ｄ）改変ＡＰＰポリペプチドの凝集、改変タウポリペプチドの凝集、改変ＳＮＣＡポリペプチドの凝集、もしくはこれらのいずれかの組合せ、またはｅ）それらのいずれかの組合せの、レベルを測定することにより判定される。
一部の実施形態では、ベクターが本明細書で開示される。ある態様では、ベクターは、（ａ）本明細書においておよびそれについて記載される操作されたポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド配列、（ｂ）第２の操作されたポリヌクレオチド、または（ｃ）これらのいずれかの組合せを含む。一部の実施形態では、第３の操作されたポリヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、またはこれらのうちの少なくとも１つを含まない。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、その一部分、その融合産物、およびこれらの任意の組合せを含む群から選択される血清型のものである。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ｒｅｐと、ＡＡＶ２からの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列と、ＡＡＶ５からのｃａｐ配列とを含む。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、突然変異した末端分離部位（ＴＲＳ）を有するＩＴＲであるＩＴＲ配列を含む。
一部の実施形態では、単位用量形態の医薬組成物が本明細書で開示される。ある態様では、単位用量形態の医薬組成物は、本明細書においておよびそれについて記載される操作されたポリヌクレオチド、または本明細書においておよびそれについて記載されるベクターを含む。
一部の実施形態では、疾患または状態の処置または予防を必要とする対象における疾患または状態を処置するまたは予防する方法が本明細書で開示される。ある態様では、疾患または状態の処置または予防を必要とする対象における疾患または状態を処置または予防する方法は、対象に、（ａ）本明細書においておよびそれについて記載されるベクター、（ｂ）本明細書においておよびそれについて記載される医薬組成物、または（ｃ）（ａ）および（ｂ）を投与するステップを含み、投与するステップの後、対象は、（ａ）脳スキャン、血液検査もしくは両方により測定して、投与するステップを受けていない他の点では同等の対象と比較してβ－アミロイドの形成の少なくとも１／１への低減；（ｂ）または操作されたポリヌクレオチドを標的ＲＮＡと接触させることおよびｓＡＰＰａのレベルをウェスタンブロットにより判定することを含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにより判定して、投与するステップを受けていない他の点では同等の対象と比較して分泌型細胞外ドメインＡＰＰアルファ（ｓＡＰＰａ）の少なくとも１倍増加を有する。
一部の実施形態では、β－アミロイドは、Ａベータ４０断片、Ａベータ４２断片または両方のうちの少なくとも１つを含む。
一部の実施形態では、疾患または状態の処置または予防を必要とする対象における疾患または状態を処置するまたは予防する方法が本明細書で開示される。ある態様では、疾患または状態の処置または予防を必要とする対象における疾患または状態を処置または予防する方法は、対象に、操作されたポリヌクレオチド、または操作されたポリヌクレオチドをコードするベクターを含む組成物を投与するステップを含み、この操作されたポリヌクレオチドは、標的ＲＮＡの領域に少なくとも部分的に相補的である標的化配列を含み、この標的ＲＮＡの領域は、（ａ）．アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）ポリペプチドを少なくとも部分的にコードする配列を含み、（ｂ）（ａ）の近位にある配列を含み、または（ｃ）．（ａ）および（ｂ）を含み、この操作されたポリヌクレオチドは、ＲＮＡ編集実体による標的ＲＮＡのヌクレオチドの塩基の編集を助長するように構成されており、それによって、編集された標的ＲＮＡが、他の点では同等の未編集の標的ＲＮＡによりコードされる未改変ＡＰＰポリペプチドと比較してベータセクレターゼによる切断に対する感受性が低下している改変ＡＰＰポリペプチドをコードし、この改変ＡＰＰポリペプチドの切断に対する感受性低下は、ｉ．操作されたポリヌクレオチドを標的ＲＮＡと接触させること、および編集された標的ＲＮＡによりコードされる改変ＡＰＰポリペプチドのベータセクレターゼによる切断を、未編集の標的ＲＮＡによりコードされる未改変ＡＰＰポリペプチドの切断と比較して判定することを含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ、ｉｉ．投与するステップの後のｉｎ ｖｉｖｏ診断、ｉｉｉ．投与するステップの後の血液検査を含むｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ、ｉｖ．投与するステップの後の対象の脳組織の組織学的検査、またはｖ．これらの任意の組合せにより判定して、β－アミロイド形成の低減をもたらす。
一部の実施形態では、ベータセクレターゼは、ベータ部位アミロイド前駆体タンパク質切断酵素１（ＢＡＣＥ１）、カテプシンＢ、またはメプリンベータを含む。一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチドは、標的ＲＮＡと会合している場合、ＲＮＡ編集実体を少なくとも一部は動員する構造的特徴をさらに含む。一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチドは、ＲＮＡ編集実体動員ドメインをさらに含む。一部の実施形態では、疾患または状態は、神経変性疾患または状態を含む。一部の実施形態では、神経変性疾患または状態は、アルツハイマー病、パーキンソン病、認知症、レビー小体型認知症、進行性核上性麻痺、前頭側頭葉変性症、大脳皮質基底核変性症、またはこれらの任意の組合せを含む。
一部の実施形態では、方法は、第２の投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、投与するステップ、第２の投与するステップ、または両方は、独立して、少なくとも月１回、繰り返される。一部の実施形態では、投与するステップ、第２の投与するステップ、または両方は、独立して、非経口経路、経口経路、呼吸器経路、十二指腸内経路、直腸経路、またはこれらの組合せにより行われる。一部の実施形態では、ｉｎ ｖｉｖｏ診断は、陽電子放出断層撮影スキャン、コンピュータ断層撮影法スキャン、磁気共鳴画像法、脊椎穿刺、またはこれらの組合せを含む。
一部の実施形態では、改変ＡＰＰポリペプチドは、未編集の標的ＲＮＡポリペプチドによりコードされる未改変ＡＰＰポリペプチドと比較して、アルファセクレターゼによる切断に対する感受性の増大を有する。一部の実施形態では、アルファセクレターゼによる改変ＡＰＰポリペプチドの切断は、投与するステップを受けていない他の点では同等の対象と比較して、対象における分泌型細胞外ＡＰＰアルファ（ｓＡＰＰａ）の量の増加をもたらす。一部の実施形態では、β－アミロイド形成の低減は、投与するステップを受けていない他の点では同等の対象と比較して、少なくとも約１／１、１／３、１／５、１／１０または１／５０への低減を含む。
一部の実施形態では、ベクターは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、その一部分、その融合産物、またはこれらの任意の組合せを含む群から選択される血清型のＡＡＶベクターを含む。一部の実施形態では、組成物は、（ａ）第２の操作されたポリヌクレオチド、（ｂ）第２の操作されたポリヌクレオチドをコードする第２のベクター、（ｃ）第２の操作されたポリヌクレオチドをさらにコードするベクター、または（ｄ）これらの任意の組合せをさらに含み、この第２の操作されたポリヌクレオチドは、第２の標的ＲＮＡの領域に少なくとも部分的に相補的である第２の標的化配列を含む。一部の実施形態では、第２の標的ＲＮＡの領域は、（ａ）タウポリペプチドもしくはアルファ－シヌクレイン（ＳＮＣＡ）ポリペプチドを少なくとも部分的にコードする、（ｂ）（ａ）の近位にある配列を含む、または（ｃ）（ａ）および（ｂ）を含む。一部の実施形態では、ＲＮＡ編集実体による標的ＲＮＡまたは第２の標的ＲＮＡのヌクレオチドの塩基の編集は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにより判定して、β－アミロイド、ＳＮＣＡポリペプチド、タウポリペプチドの、またはβ－アミロイド、ＳＮＣＡポリペプチドもしくはタウポリペプチドをコードするＲＮＡの形成を低減または消失させるのに十分なものであり、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイは、（ａ）操作されたポリヌクレオチドを標的ＲＮＡと接触させること、または第２の操作されたポリヌクレオチドを第２の標的ＲＮＡと接触させること、および（ｂ）編集された標的ＲＮＡによりコードされる改変ＡＰＰポリペプチド、編集された第２の標的ＲＮＡによりコードされる改変タウポリペプチド、または編集された第２の標的ＲＮＡによりコードされる改変ＳＮＣＡポリペプチドについてのプロセシングの、切断の、またはプロセシングおよび切断のモジュレーションを、未編集の標的ＲＮＡによりコードされる未改変ＡＰＰポリペプチド、未編集の第２の標的ＲＮＡによりコードされる未改変タウポリペプチド、または未編集の第２の標的ＲＮＡによりコードされる未改変ＳＮＣＡポリペプチドについてのプロセシングの、切断の、またはプロセシングおよび切断のモジュレーションと比較して判定することを含む。
一部の実施形態では、神経細胞のｅｘ ｖｉｖｏ集団を組成物と接触させると、サンガーシークエンシングにより測定して、接触後に集団内の神経細胞の少なくとも５％が編集される。一部の実施形態では、集団内の神経細胞の少なくとも１０％、１５％、２０％、３０％、４０％または５０％が編集される。一部の実施形態では、編集は、ＲＮＡ編集実体による標的ＲＮＡの第２のヌクレオチドの少なくとも第２の塩基の編集をさらに含む。一部の実施形態では、対象は、疾患または状態と診断される。一部の実施形態では、方法は、追加の治療剤の第２の投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、投与するステップおよび第２の投与するステップは連続している。一部の実施形態では、投与するステップおよび第２の投与するステップは同時に行われる。一部の実施形態では、
一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチドが本明細書で開示される。ある態様では、操作されたポリヌクレオチドは、配列番号５２～配列番号５２、配列番号７１～配列番号１４８、および配列番号１５９～配列番号１６７から選択される配列の少なくとも一部分と少なくとも９０％、９５％、９７％または９９％の配列同一性を有する配列を含む。
一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチドが本明細書で開示される。ある態様では、操作されたポリヌクレオチドは、ＢＬＡＳＴにより判定して、配列番号１５０～配列番号１５８から選択される配列の一部分と少なくとも９０％、９５％、９７％または９９％の配列同一性を有する配列に少なくとも部分的に結合することができる標的化配列を含む。
一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチドが本明細書で開示される。ある態様では、操作されたポリヌクレオチドは、標的ＲＮＡの領域に少なくとも部分的に相補的である標的化配列を含み、この標的ＲＮＡの領域は、（ａ）アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）ポリペプチド、アルファ－シヌクレイン（ＳＮＣＡ）ポリペプチド、またはタウポリペプチドを少なくとも部分的にコードし、（ｂ）（ａ）の近位にある配列を含み、または（ｃ）（ａ）および（ｂ）を含み、この操作されたポリヌクレオチドは、ＲＮＡ編集実体による標的ＲＮＡの領域内のポリヌクレオチドのヌクレオチドの塩基の編集を助長するように構成されているか、ＡＰＰポリペプチド、ＳＮＣＡポリペプチドもしくはタウポリペプチドの発現のモジュレーションを助長するように構成されているか、またはこれらの組合せである。
ＲＮＡ編集実体による標的ＲＮＡの領域内のポリヌクレオチドのヌクレオチドの塩基の編集を助長する一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチドは、セクレターゼ酵素による標的ＲＮＡのプロセシングおよび／または切断のモジュレーションを助長するように構成されている。一部の実施形態では、標的ＲＮＡは、ＡＰＰポリペプチドである。一部の実施形態では、標的ＲＮＡの領域は、セクレターゼ酵素により切断される。一部の実施形態では、セクレターゼは、ベータセクレターゼ、γ－セクレターゼ、またはベータセクレターゼおよびγ－セクレターゼである。一部の実施形態では、ベータセクレターゼ、およびこのベータセクレターゼは、ベータ部位アミロイド前駆体タンパク質切断酵素１、カテプシンＢ、またはメプリンベータを含む。一部の実施形態では、（ｂ）を含む操作されたポリヌクレオチドについて、ＡＰＰポリペプチド、ＳＮＣＡポリペプチドまたはタウポリペプチドを少なくとも部分的にコードする、標的ＲＮＡの領域の近位にある配列は、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）の少なくとも一部分を含む。一部の実施形態では、（ｂ）を含む操作されたポリヌクレオチドについて、ＡＰＰポリペプチド、ＳＮＣＡポリペプチドまたはタウポリペプチドを少なくとも部分的にコードする標的ＲＮＡの領域の近位にある配列は、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）の少なくとも一部分を含む。一部の実施形態では、５’ＵＴＲの塩基の編集は、ＡＰＰポリペプチド、ＳＮＣＡポリペプチド、またはタウポリペプチドの遺伝子翻訳を少なくとも部分的に調節する結果となる。一部の実施形態では、５’ＵＴＲの領域のポリヌクレオチドのヌクレオチドの塩基の編集は、ＡＰＰのｍＲＮＡ翻訳の調節を助長する結果となる。一部の実施形態では、（ｂ）を含む操作されたポリヌクレオチドについて、ＡＰＰポリペプチド、ＳＮＣＡポリペプチドまたはタウポリペプチドを少なくとも部分的にコードする標的ＲＮＡの領域の近位にある配列は、ポリ（Ａ）テール、マイクロＲＮＡ応答エレメント（ＭＲＥ）、ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）、またはこれらの任意の組合せの、少なくとも一部分を含む。一部の実施形態では、標的ＲＮＡの領域は、ＡＰＰポリペプチドを少なくとも部分的にコードする。一部の実施形態では、標的ＲＮＡの領域は、ＳＮＣＡポリペプチドを少なくとも部分的にコードする。一部の実施形態では、標的ＲＮＡの領域は、タウポリペプチドを少なくとも部分的にコードする。一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチドは、ベータ部位アミロイド前駆体タンパク質切断酵素１による標的ＲＮＡの切断を助長するように構成されている。一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチドは、ＲＮＡ編集実体による標的ＲＮＡの領域のポリヌクレオチドのヌクレオチドの塩基の編集を助長するように構成されている。一部の実施形態では、標的ＲＮＡの領域に少なくとも部分的に相補的である標的化配列は、標的ＲＮＡの領域内のヌクレオチドに相補的でない少なくとも１つのヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、相補的でない少なくとも１つのヌクレオチドは、アデノシン（Ａ）であり、このＡは、Ａ／Ｃミスマッチに含まれている。一部の実施形態では、標的ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｌｉｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｅｘＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、ＹＲＮＡ、およびｈｎＲＮＡを含む群から選択される。一部の実施形態では、標的ＲＮＡは、ｍＲＮＡである。一部の実施形態では、標的ＲＮＡの領域は、野生型ＡＰＰポリペプチド、野生型ＳＮＣＡポリペプチド、または野生型タウポリペプチドをコードする他の点では同等の領域と比較して突然変異を含む。一部の実施形態では、突然変異は、多型を含む。一部の実施形態では、標的化配列は、長さ約４０、６０、８０、１００、または１２０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、標的化配列は、長さ約１００ヌクレオチドである。
一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチドは、ＲＮＡ編集実体を動員することができるＲＮＡ編集実体動員ドメインをさらに含む。一部の実施形態では、ＲＮＡ編集実体動員ドメインは、長さ少なくとも１～約７５ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ＲＮＡ編集実体動員ドメインは、長さ少なくとも３０～５０ヌクレオチドである。
ＲＮＡ編集実体動員ドメインが、グルタミン酸イオンチャネル型受容体ＡＭＰＡ型サブユニット２（ＧｌｕＲ２）配列を含む、請求項２５から２７のいずれか一項に記載の操作されたポリヌクレオチド。一部の実施形態では、ＧｌｕＲ２配列は、配列番号２に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ＧｌｕＲ２配列は、配列番号２を含む。一部の実施形態では、ＲＮＡ編集実体は、ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）ポリペプチドもしくはその生物活性断片、またはｔＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＴ）ポリペプチドもしくはその生物活性断片を含む。一部の実施形態では、ＡＤＡＲ１またはＡＤＡＲ２を含む、ＡＤＡＲポリペプチドまたはその生物活性断片。一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチドは、動員ドメインを欠いている。
一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチドは、ＲＮＡ編集実体を少なくとも一部は動員する構造的特徴をさらに含む。一部の実施形態では、構造的特徴は、バルジ、ヘアピン、内部ループ、構造化モチーフ、およびこれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、構造的特徴は、バルジを含む。一部の実施形態では、バルジは、非対称バルジである。一部の実施形態では、バルジは、対称バルジである。一部の実施形態では、バルジは、長さ１～２９ヌクレオチドである。一部の実施形態では、構造的特徴は、ヘアピンを含む。一部の実施形態では、構造的特徴は、内部ループを含む。一部の実施形態では、内部ループは、非対称ループである。一部の実施形態では、内部ループは、対称ループである。一部の実施形態では、構造的特徴は、構造化モチーフを含む。一部の実施形態では、構造化モチーフは、バルジ、ヘアピンおよび内部ループのうちの少なくとも２つを含む。一部の実施形態では、構造化モチーフは、バルジおよびヘアピンを含む。一部の実施形態では、構造化モチーフは、バルジおよび内部ループを含む。
一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチドは、互いに共有結合で連結されている複数の糖およびリン酸部分を含む骨格を有し、この骨格は、５’還元性ヒドロキシル、３’還元性ヒドロキシル、または両方を含む。一部の実施形態では、骨格内の５’還元性ヒドロキシルの各々は、ホスホジエステル結合によって３’還元性ヒドロキシルの各々に連結されている。一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチドは、互いに共有結合で連結されている複数の糖およびリン酸部分を含む骨格を有し、この骨格は、５’還元性ヒドロキシル、３’還元性ヒドロキシル、または両方を欠いている。一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチドは、標的ＲＮＡの領域と会合しており、この会合体は、ハイブリダイズしたポリヌクレオチド鎖を含む。一部の実施形態では、ハイブリダイズしたポリヌクレオチド鎖は、少なくとも一部は二重鎖を形成している。一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチドは、化学的改変をさらに含む。一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、または両方を含む。一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチドは、ＲＮＡを含む。
一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチドが本明細書で開示される。ある態様では、操作されたポリヌクレオチドは、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）を少なくとも部分的にコードする標的ＲＮＡの領域のポリヌクレオチドのヌクレオチドの塩基の編集を助長するように構成されており、この場合、操作されたポリヌクレオチドおよび標的ＲＮＡと会合しているＲＮＡ編集実体が、標的ＲＮＡの領域のポリヌクレオチドのヌクレオチドの塩基を編集し、この編集によって、改変アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）を少なくとも部分的にコードする編集された標的ＲＮＡが生成されることになる。
一部の実施形態では、ＲＮＡ編集実体は、セクレターゼ酵素を含む。一部の実施形態では、セクレターゼ酵素は、ベータセクレターゼ、γ－セクレターゼ、またはベータセクレターゼおよびγ－セクレターゼである。一部の実施形態では、セクレターゼ酵素は、ベータセクレターゼであり、このベータセクレターゼは、ベータ部位アミロイド前駆体タンパク質切断酵素１、カテプシンＢ、およびメプリンベータからなる群から選択される。
一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチドが本明細書で開示される。ある態様では、操作されたポリヌクレオチドは、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）を少なくとも部分的にコードする標的ＲＮＡの領域のポリヌクレオチドのヌクレオチドの塩基の編集をＲＮＡ編集実体により助長するように構成されており、この編集によって、他の点では同等の未編集の標的ＲＮＡと比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含む編集された標的ＲＮＡが生成されることになり、この編集された標的ＲＮＡは、他の点では同等の未編集の標的ＲＮＡによりコードされる他の点では同等のＡＰＰと比較してベータセクレターゼ切断に対する感受性が変更されたＡＰＰをコードし、この編集された標的ＲＮＡから生成されるＡＰＰポリペプチドを発現する細胞には、ベータ部位アミロイド前駆体タンパク質切断酵素１（ＢＡＣＥ１）による内在性基質の切断を示す代謝物の測定を含むｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにより判定して、未編集の標的ＲＮＡから生成されたＡＰＰポリペプチドを発現する対応する細胞と比較してベータセクレターゼの内在性基質に対するベータセクレターゼ活性の低下が実質的になく、この内在性基質は、アミロイド様タンパク質１（ＡＰＬＰ１）、アミロイド様タンパク質２（ＡＰＬＰ２）、コンタクチン２、Ｊａｇｇｅｄ １、神経細胞接着分子Ｌ１（ＣＨＬ１）、ニューレキシン１α、ニューレキシン３β、ニューレグリン１（ＮＲＧ１）、発作関連タンパク質６（ＳＥＺ６）、発作関連タンパク質６前駆体タンパク質（ＳＥＺ６Ｌ）、電位依存性ナトリウムイオンチャネル（ＶＧＳＣ）サブタイプＮａｖ１のβ（β１－４）補助サブユニット、ＶＧＳＣ補助サブユニットＫＣＮＥ１もしくはＫＣＮＥ２、これらのいずれかの機能的部分、またはそれらの任意の組合せを含む。
一部の実施形態では、ベータセクレターゼは、ＢＡＣＥ１、カテプシンＢ、またはメプリンベータを含む。一部の実施形態では、内在性基質は、ＮＲＧ１、ＳＥＺ６、またはＣＨＬ１を含む。
一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチドが本明細書で開示される。ある態様では、操作されたポリヌクレオチドは、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）を少なくとも部分的にコードする標的ＲＮＡの領域のポリヌクレオチドのヌクレオチドの塩基の編集をＲＮＡ編集実体により助長するように構成されており、この編集によって、同等の未編集の標的ＲＮＡによりコードされる他の点では同等の未改変ＡＰＰと比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含む編集された標的ＲＮＡによりコードされる改変ＡＰＰが生成されることになり、この編集された標的ＲＮＡから生成される改変ＡＰＰポリペプチドは、（ｉ）細胞において発現されたとき、Ａベータ４０もしくはＡベータ４２酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）により測定して、未編集の標的ＲＮＡから生成されるＡＰＰポリペプチドと比較し少ない量のＡベータ４０、Ａベータ４２、もしくは両方を生じさせる、（ｉｉ）細胞において発現されたとき、ｓＡＰＰａ ＥＬＩＳＡにより測定して、未編集の標的ＲＮＡから生成されるｓＡＰＰａと比較して増加した量の分泌型細胞外ドメインＡＰＰアルファ（ｓＡＰＰａ）を生じさせる、または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の任意の組合せである。
一部の実施形態では、ベクターが本明細書で開示される。ある態様では、ベクターは、（ａ）本明細書におけるおよびその操作されたポリヌクレオチド、（ｂ）本明細書におけるおよびその操作されたポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド、または（ｃ）（ａ）および（ｂ）を含む。
一部の実施形態では、ベクターは、第２の操作されたポリヌクレオチド、または第２の操作されたポリヌクレオチドをコードする第２のポリヌクレオチドをさらに含む。一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチドと第２の操作されたポリヌクレオチドは同じである。一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチドと第２の操作されたポリヌクレオチドは異なる。一部の実施形態では、第２の操作されたポリヌクレオチドは、第２の標的ＲＮＡの領域に少なくとも部分的にハイブリダイズする第２の標的化配列を含む。一部の実施形態では、第２の操作されたポリヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、またはこれらのうちの少なくとも１つを含まない。一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチドおよび第２の操作されたポリヌクレオチドは、互いに連続している。一部の実施形態では、ベクターのポリヌクレオチドは、操作されたポリヌクレオチドおよび第２の操作されたポリヌクレオチドを独立してコードし、これらのポリヌクレオチドは、同じプロモーター配列に動作可能に連結されている。一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチドおよび第２の操作されたポリヌクレオチドは、互いに連続していない。
一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチドは、ＡＰＰ標的ＲＮＡの領域に少なくとも部分的に相補的である標的化配列を含み、第２の操作されたポリヌクレオチドは、ＳＮＣＡまたはタウ標的ＲＮＡの領域に少なくとも部分的に相補的である標的化配列を含む。一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチドは、ＡＰＰ標的ＲＮＡの領域に少なくとも部分的に相補的である標的化配列を含み、第２の操作されたポリヌクレオチドは、ＳＮＣＡポリペプチドまたはタウポリペプチドを標的とするｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、ＡＡＶベクターであり、このＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、その一部分、その融合産物、およびそれらの任意の組合せを含む群から選択される血清型のものである。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ｒｅｐと、ＡＡＶ２からのＩＴＲ配列と、ＡＡＶ５からのｃａｐ配列とを含む。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、自己相補型ＩＴＲであるＩＴＲ配列を含む。一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチドをコードするＡＡＶベクターは、自己相補型である。
一部の実施形態では、単位用量形態の医薬組成物が本明細書で開示される。ある態様では、単位用量形態（unit dose dorm）の医薬組成物は、本明細書におけるおよびその操作されたポリヌクレオチドおよびベクターを含む。一部の実施形態では、単位用量の医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤をさらに含む。
一部の実施形態では、組成物を作製する方法が本明細書で開示される。ある態様では、本明細書におけるおよびその操作されたポリヌクレオチドを薬学的に許容される賦形剤、希釈剤または担体と混合するステップを含む、医薬組成物を作製する方法。
一部の実施形態では、単離された細胞が本明細書で開示される。ある態様では、単離された細胞は、本明細書におけるもしくはその操作されたポリヌクレオチド、本明細書におけるもしくはそのベクター、または両方を含む。
一部の実施形態では、キットが本明細書で開示される。ある態様では、キットは、容器内の、本明細書におけるおよびその操作されたポリヌクレオチド、本明細書におけるおよびそのベクター、または両方を含む。一部の実施形態では、キットは、請求項１から６３のいずれか一項に記載の操作されたポリヌクレオチドを容器に挿入することを含む。
一部の実施形態では、疾患または状態の処置または予防を必要とする対象における疾患または状態を処置するまたは予防する方法が本明細書で開示される。ある態様では、疾患または状態の処置または予防を必要とする対象における疾患または状態を処置または予防する方法は、それを必要とする対象に、（ａ）本明細書におけるおよびそのベクター、（ｂ）本明細書におけるおよびその医薬組成物、または（ｃ）（ａ）および（ｂ）を投与するステップを含む。
一部の実施形態では、疾患または状態を処置するまたは予防する方法が本明細書で開示される。ある態様では、疾患または状態を処置または予防する方法は、それを必要とする対象に治療薬を投与するステップを含み、この治療薬は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）を少なくとも部分的にコードする標的ＲＮＡの領域のポリヌクレオチドのヌクレオチドの塩基の編集をＲＮＡ編集実体により助長し、それによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにより判定して、編集されていない他の点では同等のＲＮＡによりコードされる他の点では同等のＡＰＰと比較してベータセクレターゼ耐性ＡＰＰを少なくとも部分的にコードする編集されたＲＮＡが生成されることになり、前記ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイは、ベータセクレターゼ耐性ＡＰＰおよび他の点では同等のＡＰＰを、ａ）ベータセクレターゼ、ｂ）γ－セクレターゼ、ｃ）またはベータセクレターゼおよびγ－セクレターゼと接触させることを含む。
一部の実施形態では、ベータセクレターゼは、ベータ部位アミロイド前駆体タンパク質切断酵素１、カテプシンＢ、またはメプリンベータを含む。一部の実施形態では、治療薬は、標的ＲＮＡの領域に少なくとも部分的にハイブリダイズする標的化配列を含む操作されたポリヌクレオチドを含むベクターを含むか、またはそのようなポリヌクレオチドをコードするベクターを含む。一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチドは、ＲＮＡ編集実体を動員することができるＲＮＡ編集実体動員ドメインをさらに含む。一部の実施形態では、ＲＮＡ編集実体動員ドメインは、長さ少なくとも１～約７５ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ＲＮＡ編集実体動員ドメインは、グルタミン酸イオンチャネル型受容体ＡＭＰＡ型サブユニット２（ＧｌｕＲ２）配列を含む。一部の実施形態では、ＲＮＡ編集実体は、ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）ポリペプチドもしくはその生物活性断片、またはｔＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＴ）ポリペプチドもしくはその生物活性断片を含む。一部の実施形態では、ＲＮＡ編集実体は、ＡＤＡＲポリペプチドまたはその生物活性断片を含み、このＡＤＡＲは、ＡＤＡＲ１またはＡＤＡＲ２を含む。一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチドは、ＲＮＡ編集実体動員配列を欠いている。
一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチドは、構造的特徴をさらに含む。一部の実施形態では、構造的特徴は、バルジ、ヘアピン、内部ループ、構造化モチーフ、およびこれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、構造的特徴は、バルジを含む。一部の実施形態では、バルジは、非対称バルジである。一部の実施形態では、バルジは、対称バルジである。一部の実施形態では、バルジは、長さ１～２９ヌクレオチドである。一部の実施形態では、構造的特徴は、ヘアピンを含む。一部の実施形態では、構造的特徴は、内部ループを含む。一部の実施形態では、内部ループは、非対称性である。一部の実施形態では、内部ループは、非対称性である。一部の実施形態では、構造的特徴は、構造化モチーフを含む。一部の実施形態では、構造化モチーフは、バルジ、ヘアピンおよび内部ループのうちの少なくとも２つを含む。一部の実施形態では、構造化モチーフは、バルジおよびヘアピンを含む。一部の実施形態では、構造化モチーフは、バルジおよび内部ループを含む。
一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチドは、互いに共有結合で連結されている複数の糖およびリン酸部分を含む骨格を有し、この骨格は、５’還元性ヒドロキシル、３’還元性ヒドロキシル、または両方を含む。一部の実施形態では、骨格内の５’還元性ヒドロキシルの各々は、ホスホジエステル結合によって３’還元性ヒドロキシルの各々に連結されている。一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチドは、互いに共有結合で連結されている複数の糖およびリン酸部分を含む骨格を有し、この骨格は、５’還元性ヒドロキシル、３’還元性ヒドロキシル、または両方を欠いている。
一部の実施形態では、ベータセクレターゼ耐性ＡＰＰは、編集されていない他の点では同等のＲＮＡから産生された他の点では同等のＡＰＰと比較して、ベータセクレターゼにより切断され得る位置での切断に対する感受性が低下している。一部の実施形態では、ベータセクレターゼは、ＢＡＣＥ１、カテプシンＢ、またはメプリンベータを含む。一部の実施形態では、ヌクレオチドは、ＡＰＰの切断部位に近接しているアミノ酸をコードするコドンに含まれている。一部の実施形態では、ＡＰＰにおける切断部位は、α－セクレターゼ切断部位、β－セクレターゼ切断部位、β’－セクレターゼ切断部位、γ－セクレターゼ切断部位、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、アミノ酸は、配列番号１のＡＰＰの６６９、６７０、６７１、６７２、６７３、６８２、６８３、６８４、６８７、６８８、７１１、７１２、７１３または７１４位にある。一部の実施形態では、ＢＡＣＥプロテアーゼ耐性ＡＰＰは、編集されていない他の点では同等のＲＮＡから産生された他の点では同等のＡＰＰと比較して、少なくとも１つのアミノ酸残基の差異を含む。一部の実施形態では、１つのアミノ酸残基の差異は、アミノ酸の電荷、疎水性もしくは極性の変化、またはこれらの任意の組合せをもたらす、アミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、アミノ酸の差異は、保存的置換を含む。一部の実施形態では、アミノ酸の差異は、電荷中性置換を含む。一部の実施形態では、アミノ酸残基は、ＫからＥへの変化、ＫからＲへの変化、ＫからＧへの変化、ＭからＶへの変化、ＤからＧへの変化、ＥからＧへの変化、ＨからＲへの変化、またはこれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、アミノ酸残基の差異は、配列番号１のアミロイド前駆体タンパク質のＫ６７０Ｅ、Ｋ６７０Ｒ、Ｋ６７０Ｇ、Ｍ６７１Ｖ、Ｄ６７２Ｇ、Ｅ６８２Ｇ、Ｈ６８４Ｒ、Ｋ６８７Ｒ、Ｋ６８７Ｅ、またはＫ６８７Ｇを含む。一部の実施形態では、１つのアミノ酸の変化は、配列番号１のアミロイド前駆体タンパク質のＫ６７０ＧまたはＭ６７１Ｖを含む。
一部の実施形態では、標的ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｌｉｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｅｘＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、ＹＲＮＡ、ｅＲＮＡ、およびｈｎＲＮＡを含む群から選択される。一部の実施形態では、標的ＲＮＡは、ｍＲＮＡである。
一部の実施形態では、治療薬は、編集を直接助長する。一部の実施形態では、治療薬は、編集を間接的に助長する。一部の実施形態では、疾患または状態は、神経変性疾患または状態を含む。一部の実施形態では、神経変性状態は、アルツハイマー病、パーキンソン病、認知症、レビー小体型認知症、進行性核上性麻痺、前頭側頭葉変性症、大脳皮質基底核変性症、またはこれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、状態は、外傷性脳損傷、ダウン症候群、がん、脆弱Ｘ症候群、自閉症、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、レッシュ・ナイハン病、代謝障害、またはこれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、編集されたＲＮＡまたはＢＡＣＥプロテアーゼ耐性ＡＰＰが、臨床試験で治療薬を投与された対象の少なくとも５％、８％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、または５０％において生成される。一部の実施形態では、方法は、追加の治療剤の第２の投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、投与するステップおよび第２の投与するステップは、連続している。一部の実施形態では、投与するステップおよび第２の投与するステップは、同時に行われる。一部の実施形態では、投与するステップ、第２の投与するステップ、または両方は、独立して、少なくとも週１回、繰り返される。一部の実施形態では、投与するステップ、第２の投与するステップ、または両方は、独立して、非経口投与経路により行われる。一部の実施形態では、投与するステップ、第２の投与するステップ、または両方は、独立して、実質注射、髄腔内注射、側脳室内注射、大槽内注射、静脈内注射、もしくは鼻腔内注射、またはこれらの任意の組合せにより行われる。
図１は、異なる病原性タンパク質により引き起こされる疾患のベン図を示す。Ａベータ斑、アルファ－シヌクレインレビー小体およびタウＮＦＴ病態は組み合わさって、対象のより不良な予後をもたらし得る。アルツハイマー病は、他の神経変性疾患とタンパク質病態を共有し得る。例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）は、次のうちの１つまたは複数に関するタンパク質病態を共有し得る：ＣＢＤ：大脳皮質基底核変性症；ＤＬＢ：レビー小体認知症；ＦＴＤＰ－１７Ｔ：タウ突然変異による１７番染色体に連鎖する前頭側頭型認知症パーキンソニズム；ＬＢＶＡＤ：レビー小体型アルツハイマー病；ＰＤ：パーキンソン病；ＰＤＤ：認知症を伴うパーキンソン病；ＰｉＤ：ピック病；またはＰＳＰ：進行性核上性麻痺。
図２Ａは、ＡＰＰのプロセシングの例示的な概略図を示す。この図は、Ａベータ断片の形成につながり得る、ＡＰＰ上のベータおよびガンマセクレターゼ切断部位も示す。さらに、異なる集団においてアルツハイマー病に関与する病原性突然変異が示されている。β－およびγ－セクレターゼ切断部位の周辺の常染色体優性遺伝子突然変異は、全Ａベータ代謝物産生レベルの上昇を引き起こすこともあり、またはより疎水性であり得るＡベータ４２ペプチドの特異的増加を引き起こすこともあり、早期発症アルツハイマー病リスク（リスク増加とリスク減少の両方）に関連し得る。これらのデータは、β－およびγ－セクレターゼ阻害剤の開発および臨床試験を支援するために使用されている。そのような突然変異の例をさらに説明する。例えば、Ａ６７３Ｖ突然変異は、ＡＰＰプロセシングをアミロイド形成経路の方にシフトさせてＡベータペプチドの産生を増加させることができ、Ａベータ４０とＡベータ４２の両方の凝集および原線維形成特性を著しく強化することができる。Ａ６７３Ｔ突然変異は、ＡＰＰ遺伝子中のβ－セクレターゼ切断部位に隣接して存在し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＡベータペプチドの形成の約４０％低減をもたらすことができる。このバリアントは、ＡＤの症例におけるより加齢対照群におけるほうが有意に多く見られることが判明しており、これは、Ａ６７３ＴがＡＤのリスクを低下させることを示唆する。ＡＰＰの遺伝学およびゲノム研究によって、脳実質および脳血管へのＡベータの堆積につながり得るＡＰＰの５２の病原性突然変異が同定されている。これらのファミリーの研究によって、正常ＡＰＰ配列の過剰発現（トリソミー２１もしくはＡＰＰ重複）、または全Ａベータの上昇、Ａベータ４２の上昇もしくはＡベータ凝集の増加につながる突然変異は、認知症またはＡＤ神経病態につながり得ることが示されている。図は、配列番号１９７を開示するものである。 図２Ｂは、ＡＰＰのｍＲＮＡ塩基編集についての可能な部位を示す例示的な概略図を示す。ｍＲＮＡ塩基編集を使用することにより、本明細書に記載の組成物は、ＢＡＣＥ１媒介タンパク質分解に必要不可欠であり得るアミノ酸残基を特異的に変更することによって、ＢＡＣＥ１機能と正常なＡＰＰレベルの両方を保ちつつアルツハイマー病リスクの増加に関連するＡベータ断片の形成を低減または消失させることができる。図は、出現順に配列番号１９７～１９８をそれぞれ開示するものである。
図２Ｃは、ｉｎ ｖｉｖｏでのＡＰＰプロセシングの略画概略図を示す。ＡＰＰタンパク質である２０１は、Ｎ末端細胞外ドメインおよびより短いＣ末端を有し、このＣ末端は、アダプタータンパク質であるＸ１１およびＦｅ６５が結合する極めて重要なチロシン－グルタミン酸－アスパラギン－プロリン－トレオニン－チロシン（ＹＥＮＰＴＹ）（配列番号１９３）タンパク質選別ドメインを含有する。配列番号２の６７２番目～７２７番目のアミノ酸であるＡベータペプチドを含有する断片である２０２が、２０３に拡大されている。アルファ、ベータ、ベータ’およびガンマ切断部位が、２０３のアミノ酸配列上に記入されている。図は、配列番号１９９を開示するものでもある。
図２Ｄおよび図２Ｅは、ＡＰＰの正常および病原性プロセシングを示す略画概略図を描示する。図２Ｄは、ＡＰＰの正常な非アミロイド形成性のプロセシング中に、アルファセクレターゼによる切断、続いてのガンマセクレターゼによる切断によって、可溶性細胞外ドメインアルファｓＡＰＰアルファ、細胞内Ｃ末端断片ＡＩＣＤ、およびｐ３断片が生成されることになることを示す。図２Ｅは、ＡＰＰの病原性でアミロイド形成性のプロセシング中に、ＢＡＣＥ１が関与する切断、続いてのガンマセクレターゼが関与する切断によって、可溶性細胞外ドメインｓＡＰＰベータＡＩＣＤ、および病原性Ａベータ断片が生成されることになることを示す。
図３は、ＡＰＰ、Ａベータ断片の生成、ならびにＡＰＰプロセシングにおけるＡ６７３ＴおよびＡ６７３Ｖ突然変異の効果を示す。ＡＰＰの一部分のアミノ酸配列が示されている。Ａベータ４０の長さおよびＡベータ４２の配列も示されている。加えて、保護的（Ａベータ１～Ａベータ４２レベルの低下、加齢に伴う認知の改善）であり得、ＢＡＣＥ１切断の低減を示唆し得る突然変異である、Ａ６７３Ｔ突然変異の位置が、示されている。リスク増加（Ａベータ１～Ａベータ４２レベルの増加、認知障害）をもたらし得、ＢＡＣＥ１切断の増加を示唆し得る突然変異である、Ａ６７３Ｖ突然変異の位置が、示されている。完全長ＡＰＰのアミノ酸コンセンサス配列は、配列番号２で提供される。図は、配列番号２００を開示するものである。
図４は、疾患、状態の診断のためのまたはその進行をモニターするための例示的な方法を示す。この方法では、遺伝物質を含有する試料４０２を、対象４０１、例えば、ＡＰＰの突然変異を有すると推定されるヒト対象から採取することができる。試料４０２を本明細書に記載の１つまたは複数の方法に付すことができる。一部の場合には、方法は、シークエンシング（例えば、ハイスループットシークエンシング）、遺伝子型判定、ハイブリダイゼーション、増幅、標識、またはこれらの任意の組合せを行うステップ（４０３）を含み得る。方法からの１つまたは複数の結果をプロセシングモジュール４０６に入力することができる。４０６では、１つまたは複数の入力パラメーター、例えば、試料識別情報、対象識別情報、試料型情報、参照情報または他の情報を、プロセッサー４０４に入力することができる。アッセイからの１つまたは複数の測定基準をプロセッサー４０４に入力することができ、その結果、プロセッサーは、結果、例えば、神経変性状態の診断、神経変性状態を発症するリスク、神経変性状態の処置の特定、神経変性状態の処置に対する応答性、またはこれらの任意の組合せを生成することができる。プロセッサーは、結果、入力パラメーター、測定基準、参照、またはこれらの任意の組合せを、ディスプレー４０５、例えば、ビジュアルディスプレーまたはグラフィカルユーザーインタフェースに送信することができる。プロセッサー４０４は、（ｉ）結果、入力パラメーター、測定基準もしくはこれらの任意の組合せをサーバー４０７に送信することができ、（ｉｉ）結果、入力パラメーター、測定基準もしくはこれらの任意の組合せをサーバー４０７から受信することができ、（ｉｉｉ）またはそれらの組合せを行うことができる。
図５は、プロテアーゼによる切断をモジュレートしてＡベータ断片の産生を減じるためのＡＰＰタンパク質配列の標的突然変異部位の非限定的な例を示す、ＡＰＰアミノ酸の模式的な略画（schematic carton）を示す。ＡＰＰは、内在性プロテアーゼ、例えば、ベータ－セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）およびアルファセクレターゼ（例えば、ＡＤＡＭ１０）により切断される非常に多くの切断部位を含有する。図５に示すようなβ部位、β’部位およびα部位付近の突然変異を、ＡＤＡＲによる編集に適していると同定し、さらなる分析に選択した。１５の標的突然変異が最も近い切断部位と共に下記の表１に示される。図は、出現順に配列番号２０１および２０３をそれぞれ開示するものである。
図６は、細胞における突然変異型ＡＰＰの発現に使用するための、表１に収載されている、可能性のある突然変異を各々が独立して含む、ＡＰＰ６９５アイソフォームをコードする例示的なプラスミドを示す。両方向性ＣＭＶプロモーターは、プロモーターの両側からのｍＣｈｅｒｒｙおよびＡＰＰ ６９５の発現を駆動することができる。
図７は、改変ＡＰＰタンパク質を生成するために使用したＡＰＰにおける標的ヌクレオチド突然変異を示す略画を示す。ＢＡＣＥおよびＡＤＡＭ１０切断部位が示されている。枠で囲まれたヌクレオチドは、標的突然変異を示す。図は、出現順に配列番号２０７～２０８、２０７、２０７、および２０９～２１８をそれぞれ開示するものである。
図８は、改変ＡＰＰタンパク質を生成するために使用したＡＰＰにおける標的ヌクレオチド突然変異を示す略画を示す。ＢＡＣＥおよびＡＤＡＭ１０切断部位が示されている。枠で囲まれたヌクレオチドは、標的突然変異を示す。図は、出現順に配列番号２１９～２２０、２１９、２１９、および２２１～２２５をそれぞれ開示するものである。
図９は、ＡＰＰノックアウトに成功した単離された細胞系についてのウェスタンブロットを示す。画像の左側に、発現されたＡＰＰ（ＢｉｏｌｅｇｅｎｄクローンＬＮ２７、１：１０００希釈、予想サイズ１１０ｋＤａ）に対する抗体での処理が示されている。画像の右側は、負荷対照のためのＧＡＰＤＨ（ＢｉｏｌｅｇｅｎｄクローンＦＦ２６Ａ／Ｆ９、１：１０００希釈、予想サイズ３６ｋＤａ）に対する抗体での処理を示す。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ）を用いる標的化の成功は、細胞系２２～２６で示されるように、ＡＰＰの発現を低減または消失させる。
図１０は、標的ＡＰＰバリアントを含有するプラスミドをトランスフェクトしたＡＰＰ ＫＯ ＨＥＫ２９３細胞におけるＨＰＲＴのもの（図９を参照されたい）と比べて異なるＡＰＰ構築物のｍＲＮＡ発現レベルを示す。
図１１Ａは、標的ＡＰＰバリアントを含有するプラスミドをトランスフェクトしたＡＰＰ ＫＯ ＨＥＫ２９３細胞におけるＡＰＰ ｍＲＮＡ発現レベル（図９を参照されたい）に正規化したＡベータ４０タンパク質発現レベル（ＥＬＩＳＡにより検出した）の棒グラフを示す。Ｋ６７０Ｇ、Ｋ６７０Ｒ＋Ｍ６７１Ｖ、Ｋ６７０Ｅ＋Ｍ６７１Ｖ、Ｋ６７０Ｇ＋Ｍ６７１Ｖ、およびＭ６７１Ｖ ＡＰＰタンパク質は、対照（ＫＯ＋ＷＴ－ＡＰＰ）と比較して、Ａベータ４０タンパク質の発現レベルの統計的に有意な低下を示す。Ａ６７３Ｖ ＡＰＰタンパク質は、対照と比較して発現レベルの統計的に有意な上昇を示す。データは、平均＋／－ＳＥＭを表す。ダネット事後検定を伴う一元配置ＡＮＯＶＡ。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
図１１Ｂは、対照と比較して発現が減少した５つの構築物に注目する、図１１Ａの拡大バージョンである。データは、平均＋／－ＳＥＭを表す。ダネット事後検定を伴う一元配置ＡＮＯＶＡ。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
図１２Ａは、標的ＡＰＰバリアントを含有するプラスミドをトランスフェクトしたＡＰＰ ＫＯ ＨＥＫ２９３細胞におけるＡＰＰ ｍＲＮＡ発現レベル（図９を参照されたい）に正規化したＡベータ４２タンパク質発現レベル（ＥＬＩＳＡにより検出した）の棒グラフを示す。Ｋ６７０Ｅ、Ｋ６７０Ｒ＋Ｍ６７１Ｖ、Ｋ６７０Ｅ＋Ｍ６７１Ｖ、Ｋ６７０Ｇ＋Ｍ６７１Ｖ、およびＭ６７１Ｖ ＡＰＰタンパク質は、対照（ＫＯ＋ＷＴ－ＡＰＰ）と比較して発現レベルの統計的に有意な低下を示す。Ａ６７３Ｖ ＡＰＰタンパク質は、対照と比較して発現レベルの統計的に有意な上昇を示す。データは、平均＋／－ＳＥＭを表す。多重比較のためのダネット補正を伴う一元配置ＡＮＯＶＡ。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
図１２Ｂは、対照と比較して発現が減少した５つの構築物に注目する、図１２Ａの拡大バージョンである。データは、平均＋／－ＳＥＭを表す。多重比較のためのダネット補正を伴う一元配置ＡＮＯＶＡ。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
図１３Ａ～１３Ｄは、最小限の意図せぬエクソンスキッピングでさらなる遺伝子標的に対する特異的なガイドＲＮＡ編集を増進する、３’ＳｍＯＰＴおよびＵ７ヘアピンを有する操作されたガイドＲＮＡのＵ７駆動発現を示す。図１３Ａは、ヒトＲＡＢ７ＡおよびＳＮＣＡのエクソン構造を示す。エクソンが灰色セグメントとして示されており、コード領域が上に黒線として示されている。ガイドＲＮＡ標的化部位の位置が紫色で示されており、ＰＣＲプライマーが緑色で示されている。図１３Ｂは、各標的部位でのＡＤＡＲ編集（サンガーシークエンシングにより測定した）を示す。図１３Ｃは、編集された転写物からのｃＤＮＡを、上記プライマーを使用してＰＣＲ増幅し、アガロースゲルで分析したことを示す。ＰＣＲアンプリコンは、正しくスプライシングされたエクソンについての予測サイズを示した。図１３Ｄは、サンガーシークエンシングクロマトグラムが、示されている転写物の標的アデノシンに対する特異的編集を示すことを示す。図は、出現順に配列番号２０２、２０２、２０２、２０２、２０２、２０２、２０２、２０４、２０４、２０４～２０５、２０４、２０４、および２０４をそれぞれ開示するものである。 図１３Ａ～１３Ｄは、最小限の意図せぬエクソンスキッピングでさらなる遺伝子標的に対する特異的なガイドＲＮＡ編集を増進する、３’ＳｍＯＰＴおよびＵ７ヘアピンを有する操作されたガイドＲＮＡのＵ７駆動発現を示す。図１３Ａは、ヒトＲＡＢ７ＡおよびＳＮＣＡのエクソン構造を示す。エクソンが灰色セグメントとして示されており、コード領域が上に黒線として示されている。ガイドＲＮＡ標的化部位の位置が紫色で示されており、ＰＣＲプライマーが緑色で示されている。図１３Ｂは、各標的部位でのＡＤＡＲ編集（サンガーシークエンシングにより測定した）を示す。図１３Ｃは、編集された転写物からのｃＤＮＡを、上記プライマーを使用してＰＣＲ増幅し、アガロースゲルで分析したことを示す。ＰＣＲアンプリコンは、正しくスプライシングされたエクソンについての予測サイズを示した。図１３Ｄは、サンガーシークエンシングクロマトグラムが、示されている転写物の標的アデノシンに対する特異的編集を示すことを示す。図は、出現順に配列番号２０２、２０２、２０２、２０２、２０２、２０２、２０２、２０４、２０４、２０４～２０５、２０４、２０４、および２０４をそれぞれ開示するものである。
図１４Ａ～１４Ｃは、ＳＮＣＡの３’ＵＴＲの編集を示す。図１４Ａは、３’ＵＴＲの編集された部位、および起こり得るオフターゲット編集についての、サンガーシークエンシングクロマトグラムの一例を示す。図は、配列番号２０６を開示するものである。図１４Ｂは、異なるトランスフェクション条件（ヌクレオフェクション、Ｌｏｎｚａ）下で異なる細胞型（Ｋ５６２－ＶＰＲ－ＳＮＣＡ）においてＡＤＡＲ２を過剰発現するまたしない、ヒトＳＮＣＡ ３’ＵＴＲ標的部位の３’ＳｍＯＰＴ Ｕ７ヘアピン構築物を有するマウスまたはヒトＵ７プロモーターを示す。図１４Ｃは、図１４Ｂと同じ構築物を使用して３’ＵＴＲの５’Ｇに対して起こるオフターゲット編集のパーセンテージを示す。 図１４Ａ～１４Ｃは、ＳＮＣＡの３’ＵＴＲの編集を示す。図１４Ａは、３’ＵＴＲの編集された部位、および起こり得るオフターゲット編集についての、サンガーシークエンシングクロマトグラムの一例を示す。図は、配列番号２０６を開示するものである。図１４Ｂは、異なるトランスフェクション条件（ヌクレオフェクション、Ｌｏｎｚａ）下で異なる細胞型（Ｋ５６２－ＶＰＲ－ＳＮＣＡ）においてＡＤＡＲ２を過剰発現するまたしない、ヒトＳＮＣＡ ３’ＵＴＲ標的部位の３’ＳｍＯＰＴ Ｕ７ヘアピン構築物を有するマウスまたはヒトＵ７プロモーターを示す。図１４Ｃは、図１４Ｂと同じ構築物を使用して３’ＵＴＲの５’Ｇに対して起こるオフターゲット編集のパーセンテージを示す。 図１４Ａ～１４Ｃは、ＳＮＣＡの３’ＵＴＲの編集を示す。図１４Ａは、３’ＵＴＲの編集された部位、および起こり得るオフターゲット編集についての、サンガーシークエンシングクロマトグラムの一例を示す。図は、配列番号２０６を開示するものである。図１４Ｂは、異なるトランスフェクション条件（ヌクレオフェクション、Ｌｏｎｚａ）下で異なる細胞型（Ｋ５６２－ＶＰＲ－ＳＮＣＡ）においてＡＤＡＲ２を過剰発現するまたしない、ヒトＳＮＣＡ ３’ＵＴＲ標的部位の３’ＳｍＯＰＴ Ｕ７ヘアピン構築物を有するマウスまたはヒトＵ７プロモーターを示す。図１４Ｃは、図１４Ｂと同じ構築物を使用して３’ＵＴＲの５’Ｇに対して起こるオフターゲット編集のパーセンテージを示す。
図１５は、模擬ｇＲＮＡを用いたＨＥＫ２９３細胞におけるＷＴ ＳＮＣＡ発現レベルに正規化したｇＲＮＡ媒介ＳＮＣＡタンパク質発現低減（ＥＬＩＳＡにより検出した）の棒グラフを示す。操作された標的ポリヌクレオチドであるガイドＡ、ガイドＢ、ＳＮＣＡタンパク質を標的とする２つのｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ１およびｓｈＲＮＡ２）、および模擬ｇＲＮＡを含有するプラスミドを、細胞にトランスフェクトした。ガイドＡおよびガイドＢは、ＳＮＣＡ ｍＲＮＡの開始コドンおよび３’ＵＴＲをそれぞれ標的とする。これら２つのガイドは、異なる特徴も有する。ガイドＡおよびガイドＢのこれらの特徴および配列は、表１４に収載されている。ガイドＡおよびガイドＢは、野生型ＳＮＣＡタンパク質と比較したとき、ＳＮＣＡタンパク質の存在量をそれぞれ約６５％および４０％減少させた。それに対して、ＳＮＣＡタンパク質を標的とする２つのｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ１およびｓｈＲＮＡ２）は、その発現を約９０％～９９％ノックダウンした。
図１６Ａ～図１６Ｂは、ＡＰＰ転写物の異なる領域を標的とする操作されたポリヌクレオチドを使用する、ＡＰＰのＲＮＡ編集を示す。図１６Ａは、異なる操作されたポリヌクレオチドの標的化戦略の略画概略図を示す。０．１００．５０（エクソン－エクソン）（配列番号９７）は、標的アデノシンを有するエクソンおよびその前のエクソンにわたる連続配列を標的とするので、ＡＰＰ ｍＲＮＡに対して特異的である。０．１００．５０（エクソン－イントロン）（配列番号９８）は、標的アデノシンを有するエクソンとその前のイントロンの間の連続配列を標的とするので、ＡＰＰ ｍＲＮＡ前駆体に対して特異的である。０．９０．４５（エクソンのみ）（配列番号９９）は、標的アデノシンの配列のみを標的とするので、ＡＰＰのｍＲＮＡ前駆体とｍＲＮＡの両方を標的とすることができる。白い長方形は、ＡＰＰ転写物のエクソンを示す。斜めの縞模様のある長方形は、ＡＰＰ転写物のイントロンを示す。操作されたポリヌクレオチドの標的化配列は、ＡＰＰ転写物の上に黒線として示されている。図１６Ｂは、図１６Ａにおける操作されたポリヌクレオチドおよびそれらの陰性対照（ＧＦＰプラスミド、およびトランスフェクション無し）を使用するＲＮＡ編集効率の棒グラフを示す。野生型ＨＥＫ２９３細胞に、異なるポリヌクレオチドまたはＧＦＰをコードするプラスミドをトランスフェクトした。ＡＰＰ ｍＲＮＡのＲＮＡ編集をトランスフェクションの４８時間後に分析した。陰性対照における３％未満の編集と比較して、図１６Ａの操作されたポリヌクレオチドを使用してＡＰＰ中の標的アデノシンの約１５～２０％編集を達成した。 図１６Ａ～図１６Ｂは、ＡＰＰ転写物の異なる領域を標的とする操作されたポリヌクレオチドを使用する、ＡＰＰのＲＮＡ編集を示す。図１６Ａは、異なる操作されたポリヌクレオチドの標的化戦略の略画概略図を示す。０．１００．５０（エクソン－エクソン）（配列番号９７）は、標的アデノシンを有するエクソンおよびその前のエクソンにわたる連続配列を標的とするので、ＡＰＰ ｍＲＮＡに対して特異的である。０．１００．５０（エクソン－イントロン）（配列番号９８）は、標的アデノシンを有するエクソンとその前のイントロンの間の連続配列を標的とするので、ＡＰＰ ｍＲＮＡ前駆体に対して特異的である。０．９０．４５（エクソンのみ）（配列番号９９）は、標的アデノシンの配列のみを標的とするので、ＡＰＰのｍＲＮＡ前駆体とｍＲＮＡの両方を標的とすることができる。白い長方形は、ＡＰＰ転写物のエクソンを示す。斜めの縞模様のある長方形は、ＡＰＰ転写物のイントロンを示す。操作されたポリヌクレオチドの標的化配列は、ＡＰＰ転写物の上に黒線として示されている。図１６Ｂは、図１６Ａにおける操作されたポリヌクレオチドおよびそれらの陰性対照（ＧＦＰプラスミド、およびトランスフェクション無し）を使用するＲＮＡ編集効率の棒グラフを示す。野生型ＨＥＫ２９３細胞に、異なるポリヌクレオチドまたはＧＦＰをコードするプラスミドをトランスフェクトした。ＡＰＰ ｍＲＮＡのＲＮＡ編集をトランスフェクションの４８時間後に分析した。陰性対照における３％未満の編集と比較して、図１６Ａの操作されたポリヌクレオチドを使用してＡＰＰ中の標的アデノシンの約１５～２０％編集を達成した。
図１７Ａ～図１７Ｃは、ＳＮＣＡ、ＡＰＰおよびタウを含むがこれらに限定されない、本明細書で提供される操作されたポリヌクレオチドのいずれかについてスクリーニングするための例示的なアッセイを示す。図１７Ａは、未編集の標的（ＡＴＧ）および編集された対照（ＧＴＧ）の場合のルシフェラーゼレポーターの略画概略図を示す。レポーターは、１つのコザックおよびＡＴＧ開始コドンを各々が有する２つのオープンリーディングフレームを含有する。第１のオープンリーディングフレームは、標的ＲＮＡ配列を含有し、その一方で第２のものは、分泌されたルシフェラーゼを含有する。標的開始コドン内のアデノシンの脱アミノ化は、編集率に比例してルシフェラーゼの二次翻訳を促進する。第１のＡＴＧの周囲に標的ＲＮＡ配列を組み込むことにより、異なる特徴－例えば、ガイドの長さ、ガイド内のバルジの位置、またはガイド内のＧＬＵＲ２動員ドメインの位置－を有するガイドのＲＮＡ編集効率を試験することができる。図１７Ｂ～図１７Ｃは、１つのそのような実験の結果を記載するものであり、図１７Ｂは、多数の多様なＡＤＡＲガイドに応じてのｆＰＭＰ２２レポーターのルシフェラーゼ発現のヒートマップを示す。ｆＰＭＰ２２レポーターは、シャルコー・マリー・トゥース症候群１Ａにおける標的転写物配列を第１のオープンリーディングフレームに挿入することにより生成した。安定的発現のためにレポーターをＨＥＫ２９３細胞内に移した。異なる長さ（２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０および２００ヌクレオチド）のガイド、それがプラスミドから５’から３’へ転写された場合のガイドのミスマッチ配置（１０パーセンタイル（５’末端）、９０パーセンタイル（３’末端）、または５０パーセンタイル（中央））は、表１６に収載されている。非特異的ガイドおよびＡＤＡＲ２（ＳＴ０１４５）を有するプラスミドをトランスフェクトした細胞のものに正規化したルシフェラーゼ発現の倍率変化。図１７Ｃは、ガイドの長さ（ｘ軸）とガイドごとに２回の生物学的反復実験でのレポーター発現の倍率変化（ｙ軸）との関係の折れ線グラフを示す。ガイドが自体３’末端にＧＬＵＲ２動員ドメインを含有する実験であって、バルジの位置を変えた３セットの実験の結果を示した。 図１７Ａ～図１７Ｃは、ＳＮＣＡ、ＡＰＰおよびタウを含むがこれらに限定されない、本明細書で提供される操作されたポリヌクレオチドのいずれかについてスクリーニングするための例示的なアッセイを示す。図１７Ａは、未編集の標的（ＡＴＧ）および編集された対照（ＧＴＧ）の場合のルシフェラーゼレポーターの略画概略図を示す。レポーターは、１つのコザックおよびＡＴＧ開始コドンを各々が有する２つのオープンリーディングフレームを含有する。第１のオープンリーディングフレームは、標的ＲＮＡ配列を含有し、その一方で第２のものは、分泌されたルシフェラーゼを含有する。標的開始コドン内のアデノシンの脱アミノ化は、編集率に比例してルシフェラーゼの二次翻訳を促進する。第１のＡＴＧの周囲に標的ＲＮＡ配列を組み込むことにより、異なる特徴－例えば、ガイドの長さ、ガイド内のバルジの位置、またはガイド内のＧＬＵＲ２動員ドメインの位置－を有するガイドのＲＮＡ編集効率を試験することができる。図１７Ｂ～図１７Ｃは、１つのそのような実験の結果を記載するものであり、図１７Ｂは、多数の多様なＡＤＡＲガイドに応じてのｆＰＭＰ２２レポーターのルシフェラーゼ発現のヒートマップを示す。ｆＰＭＰ２２レポーターは、シャルコー・マリー・トゥース症候群１Ａにおける標的転写物配列を第１のオープンリーディングフレームに挿入することにより生成した。安定的発現のためにレポーターをＨＥＫ２９３細胞内に移した。異なる長さ（２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０および２００ヌクレオチド）のガイド、それがプラスミドから５’から３’へ転写された場合のガイドのミスマッチ配置（１０パーセンタイル（５’末端）、９０パーセンタイル（３’末端）、または５０パーセンタイル（中央））は、表１６に収載されている。非特異的ガイドおよびＡＤＡＲ２（ＳＴ０１４５）を有するプラスミドをトランスフェクトした細胞のものに正規化したルシフェラーゼ発現の倍率変化。図１７Ｃは、ガイドの長さ（ｘ軸）とガイドごとに２回の生物学的反復実験でのレポーター発現の倍率変化（ｙ軸）との関係の折れ線グラフを示す。ガイドが自体３’末端にＧＬＵＲ２動員ドメインを含有する実験であって、バルジの位置を変えた３セットの実験の結果を示した。 図１７Ａ～図１７Ｃは、ＳＮＣＡ、ＡＰＰおよびタウを含むがこれらに限定されない、本明細書で提供される操作されたポリヌクレオチドのいずれかについてスクリーニングするための例示的なアッセイを示す。図１７Ａは、未編集の標的（ＡＴＧ）および編集された対照（ＧＴＧ）の場合のルシフェラーゼレポーターの略画概略図を示す。レポーターは、１つのコザックおよびＡＴＧ開始コドンを各々が有する２つのオープンリーディングフレームを含有する。第１のオープンリーディングフレームは、標的ＲＮＡ配列を含有し、その一方で第２のものは、分泌されたルシフェラーゼを含有する。標的開始コドン内のアデノシンの脱アミノ化は、編集率に比例してルシフェラーゼの二次翻訳を促進する。第１のＡＴＧの周囲に標的ＲＮＡ配列を組み込むことにより、異なる特徴－例えば、ガイドの長さ、ガイド内のバルジの位置、またはガイド内のＧＬＵＲ２動員ドメインの位置－を有するガイドのＲＮＡ編集効率を試験することができる。図１７Ｂ～図１７Ｃは、１つのそのような実験の結果を記載するものであり、図１７Ｂは、多数の多様なＡＤＡＲガイドに応じてのｆＰＭＰ２２レポーターのルシフェラーゼ発現のヒートマップを示す。ｆＰＭＰ２２レポーターは、シャルコー・マリー・トゥース症候群１Ａにおける標的転写物配列を第１のオープンリーディングフレームに挿入することにより生成した。安定的発現のためにレポーターをＨＥＫ２９３細胞内に移した。異なる長さ（２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０および２００ヌクレオチド）のガイド、それがプラスミドから５’から３’へ転写された場合のガイドのミスマッチ配置（１０パーセンタイル（５’末端）、９０パーセンタイル（３’末端）、または５０パーセンタイル（中央））は、表１６に収載されている。非特異的ガイドおよびＡＤＡＲ２（ＳＴ０１４５）を有するプラスミドをトランスフェクトした細胞のものに正規化したルシフェラーゼ発現の倍率変化。図１７Ｃは、ガイドの長さ（ｘ軸）とガイドごとに２回の生物学的反復実験でのレポーター発現の倍率変化（ｙ軸）との関係の折れ線グラフを示す。ガイドが自体３’末端にＧＬＵＲ２動員ドメインを含有する実験であって、バルジの位置を変えた３セットの実験の結果を示した。
図１８Ａおよび図１８Ｂは、ＡＤＡＲ１ノックアウト細胞系の生成を示す。図１８Ａは、ＡＤＡＲ１の遺伝子構造およびノックアウト戦略の略画概略図（carton schematic）を示す。ＵＳ ｇＲＮＡおよびＤＳ ｇＲＮＡという２つのｇＲＮＡを、デアミナーゼドメイン（７８９番目～１２２１番目のアミノ酸）を包含する、ＡＤＡＲ１遺伝子座の６ｋｂ領域をカバーするように設計した。６ｋｂ領域の外側の８０ｂｐ相同アームを有する相同組換え修復（ＨＤＲ）オリゴと結合するｇＲＮＡにより方向付けられるＤＮＡ鎖のニッキングによって、デアミナーゼドメインが除去されてＡＤＡＲ１遺伝子座に６ｋｂ欠失が生じる。図１８Ｂは、ＵＳおよびＤＳ ｇＲＮＡをトランスフェクトした異なるクローンにおけるＡＤＡＲ１のウェスタンブロットを示す。ＧＡＰＤＨを対照として使用した。クローン＃９および＃１１は、ウェスタンブロットにより検出可能なＡＤＡＲ１タンパク質発現を示さなかった。
図１９Ａおよび図１９Ｂは、ＡＤＡＲ２ノックアウト細胞系の生成を示す。図１９Ａは、ＡＤＡＲ２の遺伝子構造およびノックアウト戦略の略画概略図を示す。ＵＳ ｇＲＮＡおよびＤＳ ｇＲＮＡという２つのｇＲＮＡを、デアミナーゼドメイン（７０番目～５２２番目のアミノ酸）を包含する、ＡＤＡＲ１遺伝子座の９．５ｋｂ領域をカバーするように設計した。９．５ｋｂ領域の外側の８０ｂｐ相同アームを有する相同組換え修復（ＨＤＲ）オリゴと結合するｇＲＮＡにより方向付けられるＤＮＡ鎖のニッキングによって、デアミナーゼドメインが除去されてＡＤＡＲ２遺伝子座に９．５ｋｂ欠失が生じる。図１９Ｂは、ＵＳおよびＤＳ ｇＲＮＡをトランスフェクトした異なるクローンにおけるＡＤＡＲのＱ－ＰＣＲの棒グラフを示す。
図２０Ａおよび図２０Ｂは、ＡＤＡＲ２を過剰発現（ＯＥ）するＡＤＡＲ１ノックアウト細胞系の生成を示す。図２０Ａは、ＡＤＡＲ２を過剰発現するＡＤＡＲ１ノックアウト（ＫＯ）細胞系を生成するための戦略の略画概略図を示す。ピューロマイシン耐性マーカーを有するＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンとして維持されたＡＤＡＲ２過剰発現構築物を、ＡＤＡＲ１ ＫＯ Ｋ５６２細胞系にトランスフェクトし、それに組み込んだ。組込みに成功した細胞をピューロマイシン耐性により選択した。図２０Ｂは、野生型、ＡＤＡＲ１ ＫＯ、およびＡＤＡＲ１ ＫＯ＋ＡＤＡＲ２細胞におけるＡＤＡＲ１およびＡＤＡＲ２タンパク質発現のウェスタンブロットを示す。ＧＡＰＤＨを対照として使用した。野生型またはＡＤＡＲ１ ＫＯ細胞は、ＡＤＡＲ２を発現しなかった。ＡＤＡＲ２ ＯＥ構築物の組込みに成功したＡＤＡＲ１ ＫＯ細胞のみが、ＡＤＡＲ２を発現した。
図２１は、ＲＮＡ編集効率を測定するためのＢｉｏ－ＲａｄドロップオフデジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）アッセイの使用についての略画概略図を示す。ＰＣＲ試料が調製され、次いで、流体チップで処理されて油懸濁液中のＰＣＲ反応のドロップレットが生成される。標的およびバックグラウンド参照配列が、１、インターカレーター性蛍光色素を用いるＰＣＲ増幅により、または２、ＰＣＲ増幅生成物上の蛍光ＴａｑＭａｎ型プローブにより、検出される。結果として生じるシグナルがドロップレットリーダーにより分析される。その結果、蛍光チャネルごとに多いおよび少ないドロップレット集団を示す二次元ドットプロットでデータが提示される。
図２２Ａおよび図２２Ｂは、ヒト細胞におけるＲＮＡ編集効率を測定するための図２２のドロップオフｄｄＰＣＲアッセイの使用についての略画概略図を示す。図２２Ａは、ＲＮＡ編集効率を測定するためのドロップオフｄｄＰＣＲアッセイにおける異なるＤＮＡプローブセットの使用についての略画概略図を示す。フォワードおよびリバースプライマーは、ゲノム遺伝子座または目的のｍＲＮＡ標的に隣接するように設計される。ドロップオフプローブおよび参照ＴａｑＭａｎプローブは、それぞれ、標的部位およびその標的部位に隣接する領域に結合するように設計される。両方のプローブは、標的部位および隣接部位の野生型配列に結合してシグナルを放出することができ、ドロップオフプローブは、標的部位の編集されたまたは突然変異した配列に結合してシグナルを放出することができない。標的分子、ドロップオフプローブおよび参照プローブが１つずつ１つのドロップレットに割り振られる。ドロップオフｄｄＰＣＲにより測定した、編集されたおよび野生型の標的ゲノム遺伝子座またはｍＲＮＡの集団のパーセンテージを使用して、編集頻度を決定することができる。図２２Ｂは、ヒト細胞におけるＲａｂ７Ａ ＲＮＡ編集を示す２つのドットプロットを描示する。各Ｒａｂ７Ａ ｍＲＮＡ分子を逆転写およびＰＣＲ増幅によってｃＤＮＡ分子に変換し、個々のドロップレットに割り振った。２つのＴａｑＭａｎプローブを標的部位および参照部位用に設計し、これらのプローブは、野生型配列に結合してシグナルを提供するが、編集された配列には結合しない。標的分子、ドロップオフプローブ、参照プローブが１つずつ１つのドロップレットに割り振られる。各プローブのシグナル強度をドロップレットごとに測定した。野生型対照（ＷＴ）試料では、大部分のドロップレットが両方のプローブについて高い蛍光強度を示した。編集された試料では、ドロップレットの約８５％がドロップオフプローブに関して蛍光強度の低下を示した。これは、配列の相当するパーセンテージが編集されたことを示唆する。 図２２Ａおよび図２２Ｂは、ヒト細胞におけるＲＮＡ編集効率を測定するための図２２のドロップオフｄｄＰＣＲアッセイの使用についての略画概略図を示す。図２２Ａは、ＲＮＡ編集効率を測定するためのドロップオフｄｄＰＣＲアッセイにおける異なるＤＮＡプローブセットの使用についての略画概略図を示す。フォワードおよびリバースプライマーは、ゲノム遺伝子座または目的のｍＲＮＡ標的に隣接するように設計される。ドロップオフプローブおよび参照ＴａｑＭａｎプローブは、それぞれ、標的部位およびその標的部位に隣接する領域に結合するように設計される。両方のプローブは、標的部位および隣接部位の野生型配列に結合してシグナルを放出することができ、ドロップオフプローブは、標的部位の編集されたまたは突然変異した配列に結合してシグナルを放出することができない。標的分子、ドロップオフプローブおよび参照プローブが１つずつ１つのドロップレットに割り振られる。ドロップオフｄｄＰＣＲにより測定した、編集されたおよび野生型の標的ゲノム遺伝子座またはｍＲＮＡの集団のパーセンテージを使用して、編集頻度を決定することができる。図２２Ｂは、ヒト細胞におけるＲａｂ７Ａ ＲＮＡ編集を示す２つのドットプロットを描示する。各Ｒａｂ７Ａ ｍＲＮＡ分子を逆転写およびＰＣＲ増幅によってｃＤＮＡ分子に変換し、個々のドロップレットに割り振った。２つのＴａｑＭａｎプローブを標的部位および参照部位用に設計し、これらのプローブは、野生型配列に結合してシグナルを提供するが、編集された配列には結合しない。標的分子、ドロップオフプローブ、参照プローブが１つずつ１つのドロップレットに割り振られる。各プローブのシグナル強度をドロップレットごとに測定した。野生型対照（ＷＴ）試料では、大部分のドロップレットが両方のプローブについて高い蛍光強度を示した。編集された試料では、ドロップレットの約８５％がドロップオフプローブに関して蛍光強度の低下を示した。これは、配列の相当するパーセンテージが編集されたことを示唆する。
図２３は、ガイドＲＮＡの５’および３’末端に付加されているユニバーサルｇＲＮＡ定量（ｇＲＮＡＱ）タグの設計の略画概略図を示す。これらのユニバーサル配列は、ガイド特異的ＴａｑＭａｎプローブが付加されたタグ間に挿入されたあらゆるガイドＲＮＡの検出を可能にする。ｑＰＣＲまたはｄｄＰＣＲでは、プライマーは、増幅用のｇＲＮＡＱタグに結合することになる。ガイド特異的ＴａｑＭａｎプローブは、蛍光シグナルを生成することになり、標準曲線とｑＰＣＲまたはｄｄＰＣＲを使用してその蛍光シグナルを定量することができる。
図２４は、ｇＲＮＡ存在量を測定するための図２３のｇＲＮＡＱアッセイの使用を示す。図２４Ａは、ｄｄＰＣＲ反応におけるｇＲＮＡＱタグを有するＲａｂ７Ａ ｇＲＮＡおよびＧＲＡＰＨ ｍＲＮＡの定量の結果を示す。Ｒａｂ７ ｇＲＮＡおよびＧＡＰＧＨについてポジティブなドロップレットの総数を計数し、次いでポアソン分布により分析して全ての事象の頻度を決定した。図２４Ｂは、試料中のＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡおよびｇＲＮＡの増幅を達成するための試料の複数の段階希釈を実証するドットプロットを示す。主要な標的は、全ての増幅試薬を使用し尽くすことができるので、試料の希釈により、確実に、あらゆる標的を、たとえ微量のものであったとしても、十分に増幅することができる。
図２５は、異なる構造を有するｇＲＮＡを使用する異なるＲＮＡ編集の使用を示す。図２５Ａは、Ｒａｂ７ａに対する異なるｇＲＮＡのＲＮＡ構造の略画概略図を示す。ｇＲＮＡ Ａ ０．１００．５０は、ＡＤＡＲを動員するためのいかなるＧｌｕＲ２ループも含まない。ｇＲＮＡ Ｂ ２．１００．５０は、２つのＧｌｕＲ２ループを両末端に含む。ｇＲＮＡ Ｃは、図２３および２４の２つのｇＲＮＡ定量タグ（ｇＲＮＡＱタグ）を含む。ｇＲＮＡ Ｄは、１つの０．１００．５０（ｇＲＮＡ Ａ）を含み、かつ両端にｇＲＮＡＱタグおよびＵ６．２７保護ループを含む。図２５Ｂは、図２５ＡのｇＲＮＡの使用のＲＮＡ編集効率を示す。ＡＤＡＲ２とｇＲＮＡ ＢおよびＤの共発現は、Ｒａｂ７ａ ＲＮＡ編集効率を上昇させることができた。
図２６は、異なるエンハンサーエレメントを使用するｇＲＮＡの発現に伴うｍＲＮＡ編集の最適化の棒グラフを示す。配列番号１２４で示されるガイドＲＮＡを、Ｒａｂ７ａ ｍＲＮＡを標的とするように設計した。それをｈＵ６プロモーターにより駆動した。ＣＭＶエンハンサーの２つの構成を構築物のうちの幾つかではｈＵ６プロモーターと逆方向に置き、表１７に収載した。構築物を、ＡＤＡＲ２またはＧＦＰと、Ｒａｂ７ａを標的とするガイドの５’および３’末端の２つのＧｌｕＲＤドメインとを共発現するように設計した。約２０，０００のＨＥＫ２９３細胞に、配列番号１２４を発現する１μｇのプラスミドをトランスフェクトした。全ＲＮＡをトランスフェクションの４８時間後に回収した。３つの生物学的反復試料を試験した。
図２７は、ｇＲＮＡ／標的ＲＮＡ複合体のＧｌｕＲ２ヘアピン結合に結合しているＡＤＡＲ２二本鎖ＲＮＡ結合ドメイン（ｄｓＲＢＤ）の三次元構造を示す。編集アデノシン部位が示されている。
詳細な説明
本明細書で開示される一部の実施形態の実践は、別段の指示がない限り、当技術分野における技能の範囲内である免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクスおよび組換えＤＮＡの従来の技法を用いる。別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての専門および科学用語は、当業者により一般に理解されているのと同じ意味を有する。
用語「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、その冠詞の文法上の目的語の１つまたは１つより多く（すなわち、少なくとも１つ）を指す。例として、「エレメント（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つのエレメントまたは１つより多くのエレメントを意味する。
用語「約」または「おおよそ」は、測定可能な値、例えば、量または濃度などを指すときに本明細書で使用される場合、明記されている量の２０％、１０％、５％、１％、０．５％、またはさらには０．１％の変動量を包含するように意図されている。例えば、「約」は、当技術分野での実務に従ってプラスまたはマイナス１０％を意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値のプラスもしくはマイナス２０％、プラスもしくはマイナス１０％、プラスもしくはマイナス５％、またはプラスもしくはマイナス１％の範囲を意味し得る。あるいは、特に生体システムまたは生物学的過程に関して、この用語は、値の１桁以内、最大で５倍、または最大で２倍を意味し得る。特定の値が本願または特許請求の範囲に記載され得る場合、別段の記述がない限り、その特定の値についての許容可能な最大誤差範囲を意味する用語「約」を想定すべきである。また、値の範囲、部分的範囲または両方が提供され得る場合、範囲または部分的範囲は、範囲または部分的範囲の終点を含み得る。用語「実質的に」、「実質的に無い」、「実質的に含まない」、および「おおよそ」は、大きさ、位置または両方を記載する場合、記載されている値がその値についての妥当な最大予想範囲であり得ることを示すために使用され得る。例えば、数値は、述べられている値（もしくは値の範囲）の＋／－０．１％、述べられている値（もしくは値の範囲）の＋／－１％、述べられている値（もしくは値の範囲）の＋／－２％、述べられている値（もしくは値の範囲）の＋／－５％、述べられている値（もしくは値の範囲）の＋／－１０％などであり得る値を有し得る。本明細書で言及されるいずれの数値範囲も、その中の全ての部分的範囲を示すように意図されたものであり得る。
用語「部分的に」、「少なくとも部分的に」、または は、本明細書で使用される場合、所与の値の１００％に達する値を指すことができる。一部の場合には、この用語は、総量の少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または９９．９９％であり得る量を指すことができる。一部の場合には、この用語は、総量の約１００％であり得る量を指すことができる。
用語「および／または」は、本明細書で「Ａおよび／またはＢ」などの句で使用される場合、ＡおよびＢ、ＡまたはＢ、Ａ（単独で）、およびＢ（単独で）を含むように意図されている。同様に、用語「および／または」は、本明細書で「Ａ、Ｂおよび／またはＣ」などの句で使用される場合、次の実施形態の各々を包含するように意図されている：Ａ、Ｂ、およびＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（単独で）；Ｂ（単独で）；ならびにＣ（単独で）。
本明細書で使用される場合、用語「含むこと」は、組成物および方法が述べられている要素を含むが、他のものを除外しないことを意味するように意図されている。組成物および方法を定義するために使用される場合の「から本質的になる」は、意図された使用のための組合せにとってあらゆる本質的に有意なもの以外の要素を除外することを意味するものとする。したがって、本明細書で定義されるような要素から本質的になる組成物は、単離および精製方法からの微量夾雑物、ならびに薬学的に許容される担体、例えばリン酸緩衝食塩水、保存薬などを除外しないことになる。「からなる」は、他の成分の微量元素、および本開示の組成物を投与するための実質的な方法ステップ以外のものを除外することを意味するものとする。これらの移行用語の各々により定義される実施形態は、本開示の範囲内である。
用語「対象」、「宿主」、「個体」、および「患者」は、動物、典型的には哺乳動物を指すために本明細書では同義で使用される。任意の好適な哺乳動物を、本明細書に記載される方法、細胞または組成物により処置することができる。哺乳動物に、本明細書に記載のベクター、操作されたガイドＲＮＡ、前駆体ガイドＲＮＡ、核酸、または医薬組成物を投与することができる。哺乳動物の非限定的な例としては、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、類人猿、テナガザル、チンパンジー、オランウータン、サル、マカクなど）、飼育動物（例えば、イヌおよびネコ）、家畜（例えば、ウマ、雌ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ）および実験動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット）が挙げられる。一部の実施形態では、哺乳動物はヒトである。哺乳動物は、いずれの年齢であってもよく、またはいずれの発育段階にあってもよい（例えば、成体、１０代の若年、子供、乳幼児、または子宮内哺乳動物）。哺乳動物は、雄であることもあり、または雌であることもある。哺乳動物は、妊婦であることもある。一部の実施形態では、対象はヒトである。一部の実施形態では、対象は、神経変性疾患などの疾患を有するか、または有する疑いがある。一部の実施形態では、対象は、がんまたは腫瘍性障害を有するか、または有する疑いがあり得る。他の実施形態では、対象は、異常なタンパク質発現に関連する疾患または障害を有するか、または有する疑いがあり得る。一部の場合には、ヒトは、約：日齢１日～月齢約１０カ月、月齢約９カ月～約２４カ月、年齢約１歳～約８歳、年齢約５歳～約２５歳、年齢約２０歳～約５０歳、年齢約１歳～約１３０歳、または年齢約３０歳～約１００歳より高齢であることがある。ヒトは、年齢約１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０または１２０歳より高齢であることがある。ヒトは、年齢約１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０または１３０歳より若年であることがある。
用語「対象」、「宿主」、「個体」、および「患者」は、動物、典型的には哺乳動物を指すために本明細書では同義で使用される。任意の好適な哺乳動物に本明細書に記載の組成物（例えば、操作されたガイドＲＮＡ）を投与することができ、または任意の好適な哺乳動物を本明細書に記載の方法により処置することができる。対象は、脊椎動物であることもあり、または無脊椎動物であることもある。対象は、実験動物であることもある。哺乳動物の非限定的な例としては、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、類人猿、テナガザル、チンパンジー、オランウータン、サル、マカクなど）、飼育動物（例えば、イヌおよびネコ）、家畜（例えば、ウマ、雌ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ）および実験動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット）が挙げられる。一部の実施形態では、哺乳動物はヒトである。哺乳動物は、いずれの年齢であってもよく、またはいずれの発育段階にあってもよい（例えば、成体、１０代の若年、子供、乳幼児、または子宮内哺乳動物）。哺乳動物は、雄であることもあり、または雌であることもある。一部の実施形態では、対象はヒトである。対象は、患者であることがある。対象は、疾患に罹患していることがある。対象は、疾患の症状を提示することがある。対象は、疾患の症状を提示しないことがあるが、それにもかかわらず疾患を有することがある。対象は、介護者の医療下にあることがある（例えば、対象は入院しており、医師により処置されている）。
用語「タンパク質」、「ペプチド」および「ポリペプチド」は、２つまたはそれより多くのサブユニットアミノ酸、アミノ酸アナログまたはペプチド模倣物の化合物を指すために、同義でおよびそれらの最も広い意味で使用される。これらの用語は、改変されているアミノ酸ポリマー、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または任意の他の操作、例えば標識成分とのコンジュゲーションを有するアミノ酸ポリマーも包含する。本明細書で使用される場合、用語「アミノ酸」は、グリシンおよびＤ光学異性体とＬ光学異性体の両方、ならびにアミノ酸アナログならびにペプチド模倣物を含む、天然および／または非天然または合成アミノ酸のいずれかを指す。サブユニットは、ペプチド結合により連結されていることがある。別の実施形態では、サブユニットは、他の結合、例えば、エステル、エーテルなどにより、結合されていることがある。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含有しなければならないが、タンパク質の配列またはペプチドの配列を構成し得るアミノ酸の最大数に課される制限はない。本明細書で使用される場合、用語「アミノ酸」は、グリシンおよびＤ光学異性体とＬ光学異性体の両方、アミノ酸アナログならびにペプチド模倣物を含む、天然および／または非天然または合成アミノ酸のいずれかを指す。本明細書で使用される場合、用語「融合タンパク質」は、１つより多くの天然に存在するまたは組換えにより産生されたタンパク質からのドメインから構成されたタンパク質であって、一般に各ドメインが異なる機能を果たす、タンパク質を指す。このことに関連して、用語「リンカー」は、これらのドメインを互いに連結させるために－必要に応じて、融合タンパク質ドメインの高次構造を維持するために、および／またはそれらのそれぞれの機能を損なう可能性がある融合タンパク質ドメイン間の好ましくない相互作用を防止するために－使用されるタンパク質断片を指す。
「相同性」または「同一性」または「類似性」は、２つのペプチド間または２つの核酸分子間の配列類似性を指すことができる。相同性は、比較を目的としてアラインされ得る各配列内の位置を比較することにより判定され得る。比較された配列内の位置が同じ塩基またはアミノ酸基によって占有され得る場合には、それらの分子は、その位置において相同であり得る。配列間の相同度は、配列により共有されるマッチ位置または相同位置の数の関数である。「無関係の」または「非相同」配列は、本開示の配列のうちの１つと４０％未満の同一性、または代替的に２５％未満の同一性を共有する。配列相同性は、配列の参照配列に対する同一性％を指すことができる。実際問題として、いずれかの特定の配列が、本明細書に記載されるいずれかの配列（本明細書に記載される特定の核酸配列と一致し得る）と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であり得るかどうか、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．５３７１１）などの公知のコンピュータプログラムを従来通りに使用してそのような特定のポリペプチド配列を判定することができる。Ｂｅｓｔｆｉｔまたは任意の他の配列アラインメントプログラムを使用して、特定の配列が、例えば、参照配列と９５％同一であるかどうかを判定する場合、同一性のパーセンテージを参照配列の完全長にわたって計算することができるように、および全参照配列の最大で５％の配列相同性のギャップを許容することができるように、パラメーターを設定することができる。
一部の場合には、グローバル配列アラインメントとも呼ばれる、参照配列（クエリ配列、すなわち、本開示の配列）と対象配列との同一性を、Ｂｒｕｔｌａｇら（Comp. App. Biosci. 6:237-245 (1990)）のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを使用して判定することができる。一部の実施形態では、ＦＡＳＴＤＢアミノ酸アラインメントで使用される、同一性が狭く解釈され得る特定の実施形態のためのパラメーターは、スコアリングスキーム＝ＰＡＭ（許容突然変異パーセント）０、ｋタプル＝２、ミスマッチペナルティ＝１、結合ペナルティ＝２０、無作為化群の長さ＝０、カットオフスコア＝１、ウィンドウサイズ＝配列長、ギャップペナルティ＝５、ギャップサイズペナルティ＝０．０５、ウィンドウサイズ＝５００または対象配列の長さ（いずれか短い方であり得る）を含み得る。この実施形態によれば、対象配列が、内部欠失が原因ではなくＮまたはＣ末端欠失に起因してクエリ配列より短くなり得る場合、結果に手作業での補正を加えて、ＦＡＳＴＤＢプログラムが全体的な同一性パーセントを計算するときに対象配列のＮおよびＣ末端切断を考慮しないということを考慮に入れることができる。クエリ配列と比べてＮおよびＣ末端が切断された対象配列については、対応する対象残基とマッチ／アラインすることができない対象配列のＮおよびＣ末端の外側性に位置し得るクエリ配列の残基数をクエリ配列の全塩基に対するパーセントとして計算することにより、同一性パーセントを補正することができる。残基をマッチ／アラインすることができるかどうかの判定は、ＦＡＳＴＤＢ配列アラインメントの結果によって行うことができる。次いで、このパーセンテージを、指定パラメーターを使用してＦＡＳＴＤＢプログラムにより計算した同一性パーセントから減算して、最終同一性パーセントスコアに到達することができる。この最終同一性パーセントスコアをこの実施形態のために使用することができる。一部の場合には、クエリ配列とマッチ／アラインすることができない対象配列のＮおよびＣ末端側の残基のみが、同一性パーセントスコアを手作業で調整するために考慮され得る。すなわち、対象配列の最も遠位のＮおよびＣ末端残基の外側のクエリ残基位置のみが、この手作業の補正のために考慮され得る。例えば、９０残基の対象配列を１００残基のクエリ配列とアラインして、同一性パーセントを決定することができる。欠失が対象配列のＮ末端で起こり、そのためＦＡＳＴＤＢアラインメントはＮ末端の最初の１０残基のマッチング／アラインメントを示さない。１０の不対残基は、配列の１０％（マッチしなかったＮおよびＣ末端の残基の数／クエリ配列内の残基の総数）に相当し、そのため、ＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算した同一性パーセントスコアから１０％を減算することができる。残りの９０残基が完全にマッチされた場合、最終同一性パーセントは９０％になり得る。別の例では、９０残基対象配列を１００残基クエリ配列と比較することができる。今回は、欠失は、内部欠失であることがあり、そのため、クエリとマッチ／アラインすることができない対象配列のＮまたはＣ末端の残基は存在しないことがある。この場合、ＦＡＳＴＤＢにより計算される同一性パーセントを手作業で補正することはできない。この場合もやはり、ＦＡＳＴＤＢアラインメントで表示させて、クエリ配列とマッチ／アラインすることができない対象配列のＮおよびＣ末端の外側の残基位置のみを、手作業で補正することができる。
用語「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、同義で使用され、任意の長さの多量体型のヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれかまたはそのアナログを指す。ポリヌクレオチドは、いかなる三次元構造を有してもよく、公知のまたは未知の、いかなる機能を果してもよい。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子もしくは遺伝子断片（例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴもしくはＳＡＧＥタグ）、エクソン、イントロン、遺伝子間ＤＮＡ（限定ではないが、ヘテロクロマチンＤＮＡを含む）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、ある配列の単離されたＤＮＡ、ある配列の単離されたＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ガイドＲＮＡ、核酸プローブ、プライマー、ｓｎＲＮＡ、長鎖ノンコーディングＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ由来の低分子ＲＮＡ（ｔｓＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、または低分子ｒＤＮＡ由来のＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ）。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログなどの改変ヌクレオチドを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造の改変は、ポリヌクレオチドを組み立てる前にもたらされることもあり、または組み立てた後にもたらされることもある。ヌクレオチドの配列に非ヌクレオチド成分が割り込んでいることもある。ポリヌクレオチドは、重合後に、標識成分とのコンジュゲーションなどにより、さらに改変されることもある。この用語はまた、二本鎖分子と一本鎖分子の両方を指す。例えばホスホロチオエート（phosphothioate）骨格を有する核酸を含む、核酸は、１つまたは複数の反応性部分を含み得る。本明細書で使用される場合、反応性部分という用語は、別の分子、例えば、核酸またはポリペプチドと、共有結合性、非共有結合性または他の相互作用によって反応することができる任意の基を含む。例として、核酸は、共有結合性、非共有結合性または他の相互作用によってタンパク質またはポリペプチド上のアミノ酸と反応する、アミノ酸反応性部分を含み得る。別段の指定または要求がない限り、ポリヌクレオチドである本開示のいずれの実施形態も、二本鎖形態と、二本鎖形態を構成することが公知であるかまたは予測される２つの相補的一本鎖形態の各々とを両方とも包含する。
本開示の方法において有用なポリヌクレオチドは、天然核酸配列およびそれらのバリアント、人工核酸配列、またはそのような配列の組合せを含み得る。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ配列を指す。一部の実施形態では、ＤＮＡ配列は、類似のＲＮＡ配列と交換可能である。一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ配列を指す。一部の実施形態では、ＲＮＡ配列は、類似のＤＮＡ配列と交換可能である。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドのＵおよびＴを、本明細書で提供される配列内で交換することができる。
ポリヌクレオチドは、アデニン（Ａ）と、シトシン（Ｃ）と、グアニン（Ｇ）と、チミン（Ｔ）、ポリヌクレオチドがＲＮＡの場合はチミンの代わりにウラシル（Ｕ）、という４つのヌクレオチド塩基の特異的配列で構成されている。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、１つまたは複数の他のヌクレオチド塩基、例えば、ヒポキサンチンがβ－Ｎ９グリコシド結合によってリボフラノースに結合されたときに形成され、結果として下記の化学構造になるヌクレオシドである、イノシン（Ｉ）を含み得る：
Figure 2023504314000002
イノシンは、翻訳機構によりグアニン（Ｇ）として読み取られる。
用語「ポリヌクレオチド配列」は、ポリヌクレオチド分子のアルファベット表現である。このアルファベット表現を、中央処理装置を有するコンピュータのデータベースに入力し、バイオインフォマティクスへの応用、例えば、機能ゲノミクスおよび相同性検索に使用することができる。
本明細書で使用される場合、「発現」は、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写されるプロセス、および／または転写されたｍＲＮＡが、その後、ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを含むことがある。
用語「等価物」または「生物学的等価物」は、特定の分子、生物製剤または細胞物質を指す場合、同義で使用され、わずかな相同性しか有さないがそれにもかかわらず所望の構造または機能を維持するものを意図する。
用語「突然変異」は、本明細書で使用される場合、タンパク質をコードする核酸配列が前記タンパク質のコンセンサス配列と比べて変更されることを指す。「ミスセンス」突然変異は、あるコドンでの別のコドンの置換をもたらし、「ナンセンス」突然変異は、コドンを、特定のアミノ酸をコードするものから停止コドンに変化させる。ナンセンス突然変異は、多くの場合、タンパク質の切断翻訳をもたらす。「サイレント」突然変異は、結果として得られるタンパク質に対して影響を及ぼさない突然変異である。本明細書で使用される場合、用語「点突然変異」は、遺伝子配列内の１つのヌクレオチドのみに影響を与える突然変異を指す。「スプライス部位突然変異」は、ｍＲＮＡ前駆体（イントロンを除去するためのプロセシングの前の）をもたらし、その結果、スプライス部位の誤った描出からタンパク質の誤翻訳および多くの場合切断を生じさせることになる、突然変異である。突然変異は、一塩基変異（ＳＮＶ）を含み得る。突然変異は、配列バリアント、配列変異、配列変更、または対立遺伝子バリアントを含み得る。参照ＤＮＡ配列は、参照データベースから得ることができる。突然変異は、機能に影響を与え得る。突然変異は、機能に影響を与えないこともある。突然変異は、ＤＮＡレベルで１つもしくは複数のヌクレオチドにおいて起こることもあり、リボ核酸（ＲＮＡ）レベルで１つもしくは複数のヌクレオチドにおいて起こることもあり、タンパク質レベルで１つもしくは複数のアミノ酸において起こることもあり、またはこれらの任意の組合せで起こることもある。参照配列は、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＲｅｆＳｅｑ）データベースなどのデータベースから得ることができる。突然変異を構成し得る特異的変化としては、１つもしくは複数のヌクレオチドまたは１つもしくは複数のアミノ酸における置換、欠失、挿入、逆位または変換を挙げることができる。突然変異は、点突然変異であることがある。突然変異は、融合遺伝子であることもある。融合対または融合遺伝子は、突然変異、例えば、転座、中間部欠失、染色体逆位、またはこれらの任意の組合せの結果として生じ得る。突然変異は、三重反復、四重反復または他のものなどの、反復配列の数の可変性を構成する。例えば、突然変異は、所与の配列に関連するコピー数の増加または減少（すなわち、コピー数変異、またはＣＮＶ）であり得る。突然変異は、異なる対立遺伝子の２つもしくはそれより多くの配列変化、または１つの対立遺伝子の２つもしくはそれより多くの配列変化を含み得る。突然変異は、１つの対立遺伝子の１つの位置における２つの異なるヌクレオチド、例えば、モザイクを含み得る。突然変異は、１つの対立遺伝子の１つの位置における２つの異なるヌクレオチド、例えば、キメラを含み得る。突然変異は、悪性組織に存在することもある。突然変異の存在または非存在は、疾患または状態を発症するリスクの増加を示すことがある。突然変異の存在または非存在は、疾患または状態の存在を示すこともある。突然変異は、良性組織に存在することもある。突然変異の非存在は、組織または試料が良性であることを示すこともある。別の可能性として、突然変異の非存在は、組織または試料が良性であることを示さないこともある。本明細書に記載の方法は、試料における突然変異の存在を同定するステップを含み得る。
「標準アミノ酸」は、ヒトの体内に自然に見られる２０のアミノ酸を指し、これらのアミノ酸を、それらの３文字略号、１文字略号、構造、および対応するコドンの各々と共に下記の表に示す：
Figure 2023504314000003
Figure 2023504314000004
Figure 2023504314000005
Figure 2023504314000006
用語「非標準アミノ酸」は、この群の範囲に入らない合成または別様に改変されたアミノ酸であって、典型的には標準アミノ酸の化学合成または改変によって生成されるアミノ酸（例えば、アミノ酸アナログ）を指す。本開示は、タンパク質を構成する非標準アミノ酸を本明細書で開示される方法およびベクターの一部で用いる。非限定的で例示的な非標準アミノ酸は、ピロリシン（ＰｙｌまたはＯ）であり、この化学構造が下記に提供される：
Figure 2023504314000007
イノシン（Ｉ）は、もう１つの例示的な非標準アミノ酸であり、これは、ｔＲＮＡによく見られ、「ゆらぎ塩基対合」による適切な翻訳に不可欠である。イノシンの構造は、上記に提供されている。
用語「相補的」または「相補性」は、核酸が伝統的なワトソン－クリック型または他の非伝統な型のいずれかにより別の核酸配列と水素結合を形成することができることを指す。例えば、配列Ａ－Ｇ－Ｔは、配列Ｔ－Ｃ－Ａに相補的であり得る。相補性パーセントは、第２の核酸配列と水素結合（例えば、ワトソン－クリック塩基対合）を形成することができる、ある核酸分子中の残基のパーセンテージ（例えば、１０個のうちの５個、６個、７個、８個、９個、１０個は、それぞれ、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％および１００％相補的となる）を示す。「完全に相補的」は、核酸配列の連続する残基の全てが、第２の核酸配列内の同数の連続する残基と水素結合することになることを意味する。「実質的に相補的」、「部分的に相補的」、「少なくとも部分的に相補的」、または は、本明細書で使用される場合、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０もしくはそれより多くのヌクレオチドにわたって少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％．９７％、９８％、９９％もしくは１００％であり得る相補性度を指すか、またはストリンジェントな条件（例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件）下でハイブリダイズする２つの核酸を指す。核酸は、非特異的配列を含むこともある。本明細書で使用される場合、用語「非特異的配列」または「特異的でない」は、任意の他の核酸配列に相補的であるように設計することができないまたは部分的にしか相補的であることができない一連の残基を含有する核酸配列を指す。
明確な記述がなければ、および他の意図がある場合を除いて、本開示がポリペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチドまたは抗体に関する場合、そのようなポリペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチドまたは抗体の等価物または生物学的等価物が本開示の範囲内で意図されていると推察されたい。本明細書で使用される場合、用語「その生物学的等価物」は、参照タンパク質、抗体、ポリペプチドまたは核酸への言及が、わずかな相同性しか有さないがそれにもかかわらず所望の構造または機能を維持するものを意図する場合、「その等価物」と同義語であるように意図されている。本明細書に別段の記述がない限り、本明細書で言及されるあらゆるポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはタンパク質がその等価物も含むと考えられる。例えば、等価物は、少なくとも約７０％の相同性もしくは同一性、または少なくとも８０％の相同性もしくは同一性および代替的に、または少なくとも約８５％、または代替的に少なくとも約９０％、または代替的に少なくとも約９５％、または代替的に９８％の相同性または同一性パーセントを意図しており、参照タンパク質、ポリペプチドまたは核酸と実質的に等価の生物活性を示す。あるいは、ポリヌクレオチドに言及する場合、その等価物は、ストリンジェントな条件下で参照ポリヌクレオチドまたはその補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドである。本明細書で使用される節の見出しは、構成のためのものであり、記載される主題を限定すると見なすべきでない。
大要
ＲＮＡ編集は、ＤＮＡ編集の魅力的な代替案として浮上してきた。ＤＮＡ編集とは異なり、ＲＮＡ編集は、ＣＲＩＳＰＲに基づく手法を用いて報告されたものなどの潜在的に危険な免疫反応を引き起こす可能性が低いものであり得る。実際、細菌に由来するＤＮＡ編集酵素Ｃａｓ９とは異なり、ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）などのＲＮＡ編集実体およびそれらの生物活性断片は、適応免疫系を誘発しないヒトタンパク質である。加えて、ＲＮＡ編集は、ＤＮＡ編集で見られるような永久的なゲノム変化のリスクを有さないため、遺伝子治療のより安全な手法であり得る。また、オフサイトＲＮＡ編集が起こることもあるが、オフサイト編集されたｍＲＮＡは、永続的であるオフサイトＤＮＡ編集の場合とは異なり希薄化および／または分解され、例えば、ＤＮＡの浸透と比較してｍＲＮＡの一時的な性質であり、オフサイト編集は、ＤＮＡと比べてＲＮＡとの関連で結果として生じる可能性のほうがはるかに低い。
操作されたポリヌクレオチド（「操作されたガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）」または「ガイドＲＮＡ」とも呼ばれる）の組成物、ならびにＲＮＡの標的化に使用するための、特に、疾患の予防、改善および／または処置のための方法が、本明細書で提供される。本明細書で提供される組成物および方法を用いて多くの疾患を標的とすることができるが、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の突然変異に関連するものを優先的に標的とする。ＡＰＰ突然変異は、中枢神経系（ＣＮＳ）において生じる疾患に関連している。ある態様では、本開示の組成物および方法は、ＣＮＳ疾患を処置するのに好適な手段であって、ＤＮＡ編集を用いる利用可能な技術と比較して標的化が改善され免疫原性が低下した手段を提供する。
一部の場合には、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）は、ベータセクレターゼ（ＢＡＣＥ）またはガンマセクレターゼにより切断され得、そのような切断の結果として生じる断片が、３６～４３アミノ酸のアミロイドベータ（「Ａβ」または「Ａベータ」とも呼ばれる）ペプチドであり得る。この切断によるある特定のＡベータペプチド代謝物は、アルツハイマー病の病態および進行に大きく関与し得る。
本明細書に記載される組成物は、ＡＰＰの切断部位を、ベータ／ガンマセクレターゼがＡＰＰの切断の低減を示すようにまたはもはやＡＰＰを切断することができないように編集することができ、したがって、低下したレベルのＡベータ４０／４２を生じさせることまたはいずれのＡベータも生じさせないことができる。
ＲＮＡを神経変性疾患に関与するタンパク質のノックダウンの標的とするための、操作されたポリヌクレオチドの組成物およびそれらの使用方法も、本明細書で開示される。例えば、本明細書で開示される操作されたポリヌクレオチドは、タウ（例えば、ＭＡＰＴ遺伝子からコードされる微小管関連タンパク質タウ（ＭＡＰＴ））またはα－シヌクレイン（ＳＮＣＡ）をノックダウンの標的とすることができる。本明細書で開示される組成物は、１つより多くの操作されたガイドＲＮＡ、例えば、ＡＰＰ中の切断部位をＲＮＡ編集の標的とする操作されたガイド、およびタウまたはＳＮＣＡをノックダウンの標的とする操作されたガイド、の組合せも含む。これらの開示される組成物は、神経変性疾患を予防および／または治癒するために相乗効果を発揮することができる。本明細書で開示される組成物および方法によって、小分子または抗体療法に見られる結果として生じるいずれの問題も伴うことなく、標的を編集および／またはノックダウンすることになるという結果を得ることができる。組成物は、ＡＰＰを（標的切断部位の編集ではなく）部分的にノックダウンすることができる。ＡＰＰ中の標的切断部位に対する編集、および部分的ノックダウンを、個々にまたは組み合わせて展開することができる。
リボ核酸の標的化
ＲＮＡの標的化は、ＲＮＡを特定のヌクレオシドまたは塩基での合成後に酵素的に改変することができるプロセスであり得る。
ＲＮＡの標的化は、ポリペプチドの発現をモジュレートするための方法であり得る。例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路に入るポリペプチドコード二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）基質のモジュレーションによる。このモジュレーションは、ひいては、クロマチンレベルで作用してポリペプチドの発現をモジュレートし得る。
ＲＮＡの標的化は、遺伝子の翻訳を調節する方法でもあり得る。ＲＮＡ編集は、サイレント突然変異および／または非同義突然変異を導入するようにトリプレットコドンを調節することにより転写物の再コード化を調節する機序であり得る。
特定のＲＮＡ編集は、転写物の再コード化につながり得る。イノシンは、グアノシンの塩基対合特性を共有するため、翻訳機構は、編集されたアデノシンをグアノシンと解釈し、それによってトリプレットコドンが変更され、その結果、タンパク質生成物中でのアミノ酸置換が生じ得る。理論上は、遺伝子コードのトリプレットコドンの半分より多くをＲＮＡ編集によって再指定することができるだろう。遺伝子コードの縮重のため、ＲＮＡ編集は、サイレントアミノ酸置換と非同義アミノ酸置換の両方を引き起こし得る。
ＲＮＡの標的化は、標的となるＲＮＡのヌクレオチドの塩基を化学的に転換し得る。一部の場合には、ＲＮＡの標的化は、スプライシングに影響を与え得る。編集の標的となるアデノシンは、ｍＲＮＡ前駆体のスプライスジャンクション付近に偏って局在し得る。したがって、ｄｓＲＮＡ ＡＤＡＲ基質の形成中に、イントロンのシス作用性配列は、ＲＮＡ二重鎖を形成することができ、この二重鎖は、スプライシング部位を包含し、スプライシング機構からそれらの部位を見えなくする可能性がある。さらに、選ばれたアデノシンの改変によって、ＡＤＡＲは、スプライシング部位を作出することもあり、または消失させることもあり、したがって、転写物のその後のスプライシングに幅広い影響を与える。転写機構と同様に、スプライセオソームは、イノシンをグアノシン（Ｇ）と解釈し、それ故、標準ＧＵ ５’スプライス部位およびＡＧ ３’アクセプター部位を、それぞれ、ＡＵ（ＩＵ＝ＧＵ）およびＡＡ（ＡＩ＝ＡＧ）の脱アミノ化によって作出し得る。それに応じて、ＲＮＡ編集は、標準ＡＧ ３’スプライス部位（ＩＧ＝ＧＧ）を破壊し得る。
一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチドおよび標的ＲＮＡ分子は、少なくとも１つのミスマッチを有し得る。一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチドおよび標的ＲＮＡ分子は、１つのミスマッチを有し得る。一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチドおよび標的ＲＮＡ分子は、Ａ／Ｃ、Ａ／Ｇ、Ｕ／Ｃ、Ｕ／Ｇ、Ｃ／Ａ、Ｃ／Ｕ、Ｇ／Ａ、Ｇ／Ｕミスマッチ、またはこれらの任意の組合せを有し得る。一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチドおよび標的ＲＮＡ分子は、Ａ／Ｃミスマッチを有し得る。一部の実施形態では、Ａ／Ｃ、Ａ／Ｇ、Ｃ／Ａ、またはＧ／ＡにおけるＡが、ＲＮＡ編集実体により改変され得る。他の場合には、Ａ／Ｃ、Ｃ／Ａ、Ｃ／Ｕ．またはＵ／ＣにおけるＣが、ＲＮＡ編集実体により改変され得る。他の場合には、Ｕ／Ｃ、Ｃ／Ｕ、Ｇ／Ｕ．またはＵ／ＧにおけるＵが、ＲＮＡ編集実体により改変され得る。他の場合には、Ｕ／Ｇ、Ｇ／Ｕ、Ｇ／Ａ．またはＡ／ＧにおけるＧが、ＲＮＡ編集実体により改変され得る。一部の実施形態では、Ａ／ＣミスマッチにおけるＡが、ＲＮＡ編集実体により改変され得る。そのような改変は、任意の改変、例えば、本明細書においておよびそれについて記載される任意のＲＮＡ編集実体により誘導される化学的改変を含み得る。ある実施形態では、改変は、標的ＲＮＡにおけるミスマッチを、他の点では同等のＷＴ ＲＮＡ中に存在する残基に復帰させる。
標的となるＲＮＡの化学的転換は、化学的に転換された標的となるＲＮＡの翻訳後、化学的に転換されていない他の点では同等のＲＮＡと比べて増加したレベルのタンパク質またはその断片をもたらし得る。一部の実施形態では、標的となるＲＮＡの化学的転換は、化学的に転換された標的となるＲＮＡの翻訳後、化学的に転換されていない他の点では同等のＲＮＡと比べて減少したレベルのタンパク質またはその断片をもたらし得る。一部の実施形態では、化学的転換は、センスコドンを停止コドンに変換し得る。一部の場合には、化学的転換は、停止コドンをセンスコドンに変換し得る。一部の実施形態では、化学的転換は、第１のセンスコドンを第２のセンスコドンに変換し得る。一部の事例では、化学的転換は、第１の停止コドンを第２の停止コドンに変換し得る。一部の実施形態では、化学的転換は、化学的に転換された標的となるＲＮＡの翻訳後、化学的に転換されていない他の点では同等のＲＮＡと比べてタンパク質またはその断片の局在、フォールディング、安定性または合成を変更し得る。一部の場合には、化学的転換は、化学的に転換された標的となるＲＮＡの局在、フォールディング、安定性または合成を、化学的に転換されていない他の点では同等の標的ＲＮＡと比べて変更し得る。一部の実施形態では、標的ＲＮＡは、コーディングまたはノンコーディングＲＮＡを含み得る。
ＲＮＡの標的化は、塩基の挿入、欠失または置換のうちのいずれか１つを含み得る。ＲＮＡ標的化の例としては、プソイドウリジン化（ウリジン残基の異性体化）および脱アミノ化（ウリジンを生じさせるためのシチジンからのアミン基の除去、またはＣ→Ｕ編集）が挙げられる。
ＲＮＡ編集実体およびそれらの生物活性断片
ＲＮＡ編集実体またはその生物活性断片を含む組成物、およびそれらの使用方法が、本明細書で提供される。ある態様では、ＲＮＡ編集実体は、ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）、ｔＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＴ）、およびこれらのいずれかのその生物活性断片を含み得る。ＡＤＡＲおよびＡＤＡＴは、ＲＮＡ中のアデノシンのイノシンへの化学的変換を触媒する酵素であり得る。イノシンの特性はグアノシンのものによく似ている（例えば、イノシンはシトシンと２つの水素結合を形成することになる）ため、イノシンは、細胞の翻訳機構によりグアノシンとして認識され得る。したがって、「アデノシン→イノシン（Ａ→Ｉ）ＲＮＡ編集」は、ＲＮＡ標的の一次配列を有効に変化させる。一般に、ＡＤＡＲおよびＡＤＡＴ酵素は、可変数のアミノ末端ｄｓＲＮＡ結合ドメイン（ｄｓＲＢＤ）と単一のカルボキシ末端触媒デアミナーゼドメインとを含む共通ドメイン構造を共有する。ヒトＡＤＡＲおよびＡＤＡＴは、２つまたは３つのｄｓＲＢＤを保有する。証拠から、ＡＤＡＲおよびＡＤＡＴは、ホモ二量体はもちろん、二本鎖ＲＮＡに結合したときに他のＡＤＡＲおよびＡＤＡＴとヘテロ二量体も形成し得ることが示唆されているが、編集を行うために二量体化が必要であるかどうかは、現在のところ不確定である。
３つのヒトＡＤＡＲ遺伝子（ＡＤＡＲ １～３）が同定されており、ＡＤＡＲ１（公式記号ＡＤＡＲ）およびＡＤＡＲ２（ＡＤＡＲＢ１）タンパク質は、十分に特徴付けられたアデノシン脱アミノ化活性を有する。ＡＤＡＲは、それらのＮ末端領域にｄｓＲＮＡ結合ドメイン（ｄｓＲＢＤ；ＡＤＡＲ１は、３つのｄｓＲＢＤを有し、ＡＤＡＲ２およびＡＤＡＲ３は、各々、２つのｄｓＲＢＤを有する）の少なくとも２つのコピーを含み、続いてＣ末端デアミナーゼドメインを含む、典型的なモジュール型ドメイン構成を有する。ＡＤＡＴは、ｔＲＮＡの脱アミノ化を触媒する。ＡＤＡＴは、Ｅ．ｃｏｌｉではｔａｄＡとも呼ばれる。３つのヒトＡＤＡＴ遺伝子（ＡＤＡＴ １～３）が同定されている。
特定のＲＮＡ編集は、転写物再コード化につながり得る。イノシンは、グアノシンの塩基対合特性を共有するため、翻訳機構は、編集されたアデノシンをグアノシンと解釈し、それによってトリプレットコドンが変更され、その結果、タンパク質生成物中でのアミノ酸置換が生じ得る。遺伝子コードのトリプレットコドンの半分より多くをＲＮＡ編集によって再指定することができるだろう。遺伝子コードの縮重のため、ＲＮＡ編集は、サイレントアミノ酸置換と非同義アミノ酸置換の両方を引き起こし得る。
一部の場合には、ＲＮＡの標的化は、スプライシングに影響を与え得る。編集の標的となるアデノシンは、ｍＲＮＡ前駆体のスプライスジャンクション付近に偏って局在し得る。したがって、ｄｓＲＮＡ ＡＤＡＲ基質の形成中に、イントロンのシス作用性配列は、ＲＮＡ二重鎖を形成することができ、この二重鎖は、スプライシング部位を包含し、スプライシング機構からそれらの部位を見えなくする可能性がある。さらに、選ばれたアデノシンの改変によって、ＡＤＡＲは、スプライシング部位を作出することもあり、または消失させることもあり、したがって、転写物のその後のスプライシングに幅広い影響を与える。転写機構と同様に、スプライセオソームは、イノシンをグアノシンと解釈し、それ故、標準ＧＵ ５’スプライス部位およびＡＧ ３’アクセプター部位を、それぞれ、ＡＵ（ＩＵ＝ＧＵ）およびＡＡ（ＡＩ＝ＡＧ）の脱アミノ化によって作出し得る。それに応じて、ＲＮＡ編集は、標準ＡＧ ３’スプライス部位（ＩＧ＝ＧＧ）を破壊し得る。
ある態様では、ＲＮＡ編集実体は、ＡＤＡＲを含む。一部の実施形態では、ＡＤＡＲは、ＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ１ｐ１１０、ＡＤＡＲ１ｐ１５０、ＡＤＡＲ２、ＡＤＡＲ３、ＡＰＯＢＥＣタンパク質のうちのいずれか１つ、またはこれらの任意の組合せを含み得る。一部の実施形態では、ＡＤＡＲ ＲＮＡ編集実体は、ＡＤＡＲ１である。加えて、または代替的に、ＡＤＡＲ ＲＮＡ編集実体は、ＡＤＡＲ２である。加えて、または代替的に、ＡＤＡＲ ＲＮＡ編集実体は、ＡＤＡＲ３である。ある態様では、ＲＮＡ編集実体は、非ＡＤＡＲであり得る。一部の場合には、ＲＮＡ編集実体は、ＡＰＯＢＥＣ１、ＡＰＯＢＥＣ２、ＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ１ｐ１１０、ＡＤＡＲ１ｐ１５０、ＡＤＡＲ２、ＡＤＡＲ３またはこれらの任意の組合せに対して少なくとも約８０％の配列相同性を有し得る。クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）システムからのものなどの代替編集実体も企図される。
一部の場合には、ＲＮＡ編集実体は、ウイルスにコードされたＲＮＡ依存性のＲＮＡポリメラーゼであり得る。一部の場合には、ＲＮＡ編集実体は、麻疹、流行性耳下腺炎またはパラインフルエンザからのウイルスにコードされたＲＮＡ依存性のＲＮＡポリメラーゼであり得る。一部の事例では、ＲＮＡ編集実体は、標的ＲＮＡにおいてヌクレオチド（単数または複数）を付加または欠失させることができる、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉからの酵素であり得る。一部の事例では、ＲＮＡ編集実体は、標的ＲＮＡにおいて１つのウラシルまたは１つより多くのウラシルを付加または欠失させることができる、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉからの酵素であり得る。一部の事例では、ＲＮＡ編集実体は、組換え酵素を含み得る。一部の場合には、ＲＮＡ編集実体は、融合ポリペプチドを含み得る。
ある態様では、ＲＮＡ編集実体を操作された対象ポリヌクレオチドにより動員し続けることができる。一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチドは、標的ＲＮＡの領域のポリヌクレオチドのヌクレオチドの塩基の編集、ＡＰＰ、ＳＮＣＡ、タウなどの、対象標的ＲＮＡによりコードされるポリペプチドの発現のモジュレーション、またはこれらの組合せを、操作されたポリヌクレオチドおよび標的ＲＮＡと会合しているときまたは標的ＲＮＡと会合していないときに助長する、ＲＮＡ編集実体を動員することができる。操作されたポリヌクレオチドは、ＲＮＡ編集実体を動員することができるＲＮＡ編集実体動員ドメインを含有することができる。
操作されたポリヌクレオチド
ポリヌクレオチド、およびそれらを含む組成物が、本明細書で提供される。ある態様では、ポリヌクレオチドは、操作されたポリヌクレオチドであり得る。ある実施形態では、操作されたポリヌクレオチドは、操作されたポリヌクレオチドであり得る。一部の実施形態では、本開示の操作されたポリヌクレオチドをＲＮＡ編集に、例えば、疾患または状態を予防または処置するために用いることができる。一部の場合には、操作されたポリヌクレオチドを対象ＲＮＡ編集実体に関連して使用して、標的ＲＮＡを編集することまたは標的ＲＮＡによりコードされるポリペプチドの発現をモジュレートすることができる。ある実施形態では、本明細書で開示される組成物は、ＡＤＡＲもしくはＡＤＡＴポリペプチドまたはその生物活性断片などの対象ＲＮＡ編集実体による編集を助長することができる、操作されたポリヌクレオチドを含み得る。
操作されたポリヌクレオチドを、ＲＮＡ標的化に好適な任意の方法で操作することができる。ある態様では、操作されたポリヌクレオチドは、一般に、それが標的ＲＮＡの領域にハイブリダイズすることを可能にする標的化配列を少なくとも含む。一部の場合には、標的化配列は、標的化ドメインまたは標的化領域とも呼ばれることがある。
ある態様では、操作されたポリヌクレオチドの標的化配列は、ワトソン・クリック塩基対合などの塩基対合によって、操作されたポリヌクレオチドによるＲＮＡ配列の標的化を可能にする。ある実施形態では、標的化配列は、操作されたポリヌクレオチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかに位置し得る。一部の場合には、標的化配列は、両方の末端に位置する。標的化配列は、いずれの長さのものであってもよい。一部の場合には、標的化配列は、長さが少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０ヌクレオチド、または最大で約２００ヌクレオチドである。ある実施形態では、操作されたポリヌクレオチドは、長さ約７５～１００、８０～１１０、９０～１２０、または９５～１１５ヌクレオチドである標的化配列を含む。ある実施形態では、操作されたポリヌクレオチドは、長さ約１００ヌクレオチドである標的化配列を含む。
一部の場合には、対象標的化配列は、対象ポリペプチド、例えばＡＰＰ、ＳＮＣＡまたはタウ、を少なくとも部分的にコードする標的ＲＮＡの領域に対して少なくとも部分的な配列相補性を有する。一部の場合には、標的化配列は、標的ＲＮＡに対して９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列相補性を有する。一部の場合には、標的化配列は、標的ＲＮＡ配列に対して１００％未満の相補性を有する。例えば、標的化配列、および標的化配列により結合され得る標的ＲＮＡの領域は、単一の塩基ミスマッチを有し得る。他の場合には、操作された対象ポリヌクレオチドの標的化配列は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、２０、３０、４０または最大で約５０の塩基ミスマッチを含む。一部の態様では、ヌクレオチドミスマッチを本明細書で提供される構造的特徴に関連し得る。一部の態様では、標的化配列は、対象標的ＲＮＡの野生型ＲＮＡとは相補性の点で異なる、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または最大で約１５のヌクレオチドを含む。
ある態様では、操作された対象ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ編集実体動員ドメインを含む。ＲＮＡ編集実体は、操作されたポリヌクレオチド上のＲＮＡ編集実体動員ドメインにより動員され得る。一部の場合には、操作された対象ポリヌクレオチドは、対象標的ＲＮＡの領域のポリヌクレオチドのヌクレオチドの塩基の編集、対象標的ＲＮＡによりコードされるポリペプチドのモジュレーション発現、または両方を助長するように構成されている。一部の場合には、操作されたポリヌクレオチドを、対象ＲＮＡ編集実体によるＲＮＡの領域のヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの塩基の編集を助長するように、構成することができる。編集を助長するために、本開示の操作されたポリヌクレオチドは、ＲＮＡ編集実体を動員することができる。ある特定の実施形態では、操作されたポリヌクレオチドは、ＲＮＡ編集実体動員ドメインを欠いている。いずれにせよ、操作された対象ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ編集実体に結合すること、またはＲＮＡ編集実体により結合されること、および対象標的ＲＮＡの編集を助長することが可能であり得る。
様々なＲＮＡ編集実体動員ドメインを用いることができる。ある実施形態では、動員ドメインは、グルタミン酸イオンチャネル型受容体ＡＭＰＡ型サブユニット２（ＧｌｕＲ２）、ＡＰＯＢＥＣ、ＭＳ２－バクテリオファージコートタンパク質動員ドメイン、Ａｌｕ、ＴＡＬＥＮ動員ドメイン、Ｚｎフィンガーポリペプチド動員ドメイン、メガＴＡＬ動員ドメイン、もしくはＣａｓ１３動員ドメイン、これらの組合せ、またはそれらの改変バージョンを含む。ある特定の実施形態では、１つより多くの動員ドメインを、本開示の操作されたポリヌクレオチドに含めることができる。動員配列が存在する場合、標的化配列、例えばアンチセンス配列、が標的ＲＮＡにハイブリダイズした後、動員配列を用いて、ＲＮＡ編集実体を対象標的ＲＮＡと有効に反応するのに適した位置に置くことができる。一部の場合には、動員配列は、ＲＮＡ編集実体の操作されたポリヌクレオチドへの一時的結合を可能にすることができる。他の場合には、動員配列は、ＲＮＡ編集実体のポリヌクレオチドへの永久結合を可能にする。動員配列は、いずれの長さのものであってもよい。一部の場合では、動員配列は、長さが約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５から、約８０ヌクレオチドまでである。一部の場合には、動員配列は、長さ約４５ヌクレオチドである。一部の場合には、動員配列の少なくとも一部分は、少なくとも１～約７５ヌクレオチドを含む。一部の場合には、動員配列の少なくとも一部分は、約４５ヌクレオチド～約６０ヌクレオチドを含む。
ある実施形態では、ＲＮＡ編集実体動員ドメインは、ＧｌｕＲ２配列またはその機能的断片を含む。一部の場合には、ＧｌｕＲ２配列は、ＲＮＡ編集実体、例えば、ＡＤＡＲまたはその生物活性断片によって認識され得る。一部の実施形態では、ＧｌｕＲ２配列は、天然に存在しない配列であり得る。一部の場合には、ＧｌｕＲ２配列を、例えば動員増進のために、改変することができる。一部の場合には、ＧｌｕＲ２配列は、天然に存在するＧｌｕＲ２配列および合成配列の一部分を含み得る。
ある実施形態では、動員ドメインは、ＧｌｕＲ２配列を含むか、またはＧＵＧＧＡＡＵＡＧＵＡＵＡＡＣＡＡＵＡＵＧＣＵＡＡＡＵＧＵＵＧＵＵＡＵＡＧＵＡＵＣＣＣＡＣ（配列番号１）に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有する配列を含む。一部の場合には、動員ドメインは、配列番号１の少なくとも約１０、１５、２０、２５または３０ヌクレオチドに対して少なくとも約８０％の配列相同性を有し得る。一部の実施形態では、動員ドメインは、配列番号１に対して少なくとも約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列相同性を有し得る。
追加のＲＮＡ編集実体動員ドメインも企図される。ある実施形態では、動員ドメインは、アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素、触媒ポリペプチド様（ＡＰＯＢＥＣ）ドメインを含む。一部の場合には、ＡＰＯＢＥＣドメインは、天然に存在しない配列を含むこともあり、または天然に存在する配列を含むこともある。一部の実施形態では、ＡＰＯＢＥＣドメインコード配列は、改変された部分を含み得る。一部の場合には、ＡＰＯＢＥＣドメインコード配列は、天然に存在するＡＰＯＢＥＣドメインコード配列の一部分を含み得る。別の実施形態では、動員ドメインは、ＭＳ２－バクテリオファージコートタンパク質動員ドメインからのものであり得る。別の実施形態では、動員ドメインは、Ａｌｕドメインからのものであり得る。一部の場合には、動員ドメインは、ＡＰＯＢＥＣ、ＭＳ２－バクテリオファージコートタンパク質動員ドメイン、またはＡｌｕドメインの少なくとも約１５、２０、２５、３０または３５ヌクレオチドに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％または９５％の配列相同性を有し得る。いずれの数の動員配列が本開示のポリヌクレオチドに見られてもよい。一部の場合には、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または最大で約１０の動員配列が、ポリヌクレオチドに含まれている。動員配列は、対象ポリヌクレオチドのいずれの位置にあってもよい。一部の場合には、動員配列は、ポリヌクレオチドのＮ末端、中央、またはＣ末端にある。動員配列は、標的配列の上流にあることもあり、または下流にあることもある。一部の場合には、動員配列は、対象ポリヌクレオチドの標的化配列に隣接している。動員配列は、全てのリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含み得るが、リボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドの両方を含む動員配列は除外されない。
動員配列が非存在であり得る場合、操作されたポリヌクレオチドは、それでもやはり対象ＲＮＡ編集実体（例えば、ＡＤＡＲ）と会合して、標的ＲＮＡの編集を助長することができ、および／または対象標的ＲＮＡによりコードされるポリペプチドの発現をモジュレートすることができる。これは、構造的特徴によって達成され得る。構造的特徴は、ミスマッチ、対称バルジ、非対称バルジ、対称内部ループ、非対称内部ループ、ヘアピン、ゆらぎ塩基対、構造化モチーフ、環状化ＲＮＡ、化学的改変のうちのいずれか１つ、またはこれらの任意の組合せを含み得る。ある態様では、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）基質、例えば、ハイブリダイズしたポリヌクレオチド鎖は、本開示の操作されたポリヌクレオチドの標的ＲＮＡへのハイブリダイゼーションによって形成され得る。本開示のｄｓＲＮＡ基質に存在し得る幾つかの構造的特徴のうちの１つに対応する特徴が、本明細書に記載される。特徴の例としては、ミスマッチ、バルジ（対称バルジもしくは非対称バルジ）、内部ループ（対称内部ループもしくは非対称内部ループ）、またはヘアピン（動員ヘアピン、もしくは非標的化ドメインを含むヘアピン）が挙げられる。本開示の操作されたポリヌクレオチドは、１～５０の特徴を有することができる。本開示の操作されたポリヌクレオチドは、１～５、５～１０、１０～１５、１５～２０、２０～２５、２５～３０、３０～３５、３５～４０、４０～４５、４５～５０、５～２０、１～３、４～５、２～１０、２０～４０、１０～４０、２０～５０、３０～５０、４～７、または８～１０の特徴を有することができる。
本明細書で開示される場合の構造化モチーフは、ｄｓＲＮＡ基質における２つまたはそれより多くの特徴を含む。
二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）基質は、本開示の操作されたポリヌクレオチドの標的ＲＮＡへのハイブリダイゼーションによって形成され得る。本明細書で開示される場合のミスマッチは、ｄｓＲＮＡ内の標的ＲＮＡ中の相対するヌクレオチドと不対合であり得る、ポリヌクレオチド中のヌクレオチドを指す。ミスマッチは、塩基対合しない、相補的であることができない、または両方である、いずれか２つのヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、ミスマッチは、Ａ／Ｃミスマッチであり得る。Ａ／Ｃミスマッチは、標的ＲＮＡ中のＡの向かい側の、本開示の操作されたポリヌクレオチド中のＣを含み得る。Ａ／Ｃミスマッチは、標的ＲＮＡ中のＣの向かい側の、本開示の操作されたポリヌクレオチド中のＡを含み得る。ある実施形態では、Ｇ／Ｇミスマッチは、標的ＲＮＡ中のＧの向かい側の、本開示の操作されたポリヌクレオチド中のＧを含み得る。一部の実施形態では、編集部位の５’に位置するミスマッチは、編集される標的Ａの塩基フリッピングを助長し得る。ミスマッチは、配列特異性の付与にも役立ち得る。ある実施形態では、ミスマッチは、Ｇ／Ｇミスマッチを含む。ある実施形態では、ミスマッチは、Ａ／Ｃミスマッチを含み、この場合、Ａは、標的ＲＮＡ中にあり得、Ｃは、操作されたポリヌクレオチドの標的化配列内にあり得る。別の実施形態では、Ａ／ＣミスマッチにおけるＡは、対象ＲＮＡ編集実体により編集される標的ＲＮＡ中のヌクレオチドの塩基であり得る。
ある態様では、構造的特徴は、操作されたポリヌクレオチドにおいて独立して生じ得る。他の場合には、構造的特徴は、操作されたポリヌクレオチドが標的ＲＮＡに結合したときに生じ得る。構造的特徴は、操作されたポリヌクレオチドが、他の分子、例えば、ペプチド、ヌクレオチドまたは小分子と会合したときにも生じ得る。ある特定の実施形態では、操作されたポリヌクレオチドの構造的特徴は、標的ＲＮＡとは無関係に生じることがあり、その構造は、標的ＲＮＡ領域と操作されたポリペプチドのハイブリダイゼーションの結果として変化することがある。ある特定の実施形態では、構造的特徴は、操作されたポリヌクレオチドが標的ＲＮＡと会合している状態であり得るときに存在し得る。
一部の場合には、構造的特徴は、ヘアピンであり得る。一部の場合には、操作されたポリヌクレオチドは、ヘアピンドメインを欠いていることがある。他の場合には、操作されたポリヌクレオチドは、１つのヘアピンドメインまたは１つより多くのヘアピンドメインを含有することがある。ヘアピンは、ポリヌクレオチド中のどこに位置していてもよい。本明細書で開示される場合のヘアピンは、１本のＲＮＡ鎖自体が折り重なってＲＮＡ二重鎖を形成しているＲＮＡ二重鎖であり得る。１本のＲＮＡ鎖自体が、折り畳み領域の塩基対の上流および下流にヌクレオチド配列を有するため、互いに折り重なる。ヘアピンは、二重鎖構造全体の長さで１０～５００ヌクレオチドを有し得る。ヘアピンのステムループ構造は、３～１５ヌクレオチド長であり得る。ヘアピンは、本明細書で開示される操作されたポリヌクレオチドのいずれにも存在し得る。本明細書で開示される操作されたポリヌクレオチドは、１～１０のヘアピンを有し得る。一部の実施形態では、本明細書で開示される操作されたポリヌクレオチドは、１つのヘアピンを有する。一部の実施形態では、本明細書で開示される操作されたポリヌクレオチドは、２つのヘアピンを有する。本明細書で開示される場合のヘアピンは、動員ヘアピンを指すこともあり、またはヘアピンを指すこともあり、または非動員ヘアピンを指すこともある。ヘアピンは、本開示の操作されたポリヌクレオチド内のどこに位置していてもよい。一部の実施形態では、１つまたは複数のヘアピンは、本開示の操作されたポリヌクレオチドの３’末端に存在することもあり、本開示の操作されたポリヌクレオチドの５’末端に存在することもあり、もしくは本開示の操作されたポリヌクレオチドの標的化配列内に存在することもあり、またはこれらの任意の組合せに存在することもある。
態様では、構造的特徴は、本明細書で開示されるような動員ヘアピンを含む。動員ヘアピンは、ＡＤＡＲなどのＲＮＡ編集実体を動員することができる。一部の実施形態では、動員ヘアピンは、ＧｌｕＲ２ドメインを含む。一部の実施形態では、動員ヘアピンは、Ａｌｕドメインを含む。
さらに別の態様では、構造的特徴は、非動員ヘアピンを含む。非動員ヘアピンは、本明細書で開示される場合、操作されたポリヌクレオチドの標的ＲＮＡへの局在を改善する機能を示すことができる。一部の実施形態では、非動員ヘアピンは、核内繋留を改善する。一部の実施形態では、非動員ヘアピンは、Ｕ７ ｓｎＲＮＡからのヘアピンを含む。
別の態様では、構造的特徴は、ゆらぎ塩基を含む。ゆらぎ塩基対は、弱く対合している２つの塩基を指す。例えば、本開示のゆらぎ塩基対は、Ｕと対合しているＧを指すことができる。
本開示のヘアピンは、いずれの長さのものであってもよい。ある態様では、ヘアピンは、約５～２００またはそれより多くのヌクレオチドであり得る。一部の場合には、ヘアピンは、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、もしくは４００またはそれより多くのヌクレオチドを含むことがある。他の場合には、ヘアピンは、５～１０、５～２０、５～３０、５～４０、５～５０、５～６０、５～７０、５～８０、５～９０、５～１００、５～１１０、５～１２０、５～１３０、５～１４０、５～１５０、５～１６０、５～１７０、５～１８０、５～１９０、５～２００、５～２１０、５～２２０、５～２３０、５～２４０、５～２５０、５～２６０、５～２７０、５～２８０、５～２９０、５～３００、５～３１０、５～３２０、５～３３０、５～３４０、５～３５０、５～３６０、５～３７０、５～３８０、５～３９０、または５～４００ヌクレオチドを含むこともある。ヘアピンは、自体にハイブリダイズして、ヌクレオチドループによって隔てられた二本鎖のハイブリダイズしたＲＮＡからなる二本鎖ＲＮＡモチーフ／構造になるのに十分な相補性を有する、ＲＮＡの１本の鎖から生じる構造的特徴であり得る。
一部の場合には、構造的特徴は、バルジであり得る。バルジは、標的鎖と操作されたポリヌクレオチド鎖の間の単一の（意図的な）核酸ミスマッチを含み得る。他の場合には、塩基のミスマッチしたストレッチであるバルジ領域の両側に相補ｄｓＲＮＡ領域がハイブリダイズして隣接し得るのであれば、鎖間の１つより多くの連続するミスマッチによってバルジが構成される。バルジは、ポリヌクレオチドのいずれの位置にあってもよい。一部の場合には、バルジは、５’ヒドロキシルまたは３’ヒドロキシルから約３０～約７０ヌクレオチドの位置にあり得る。
ある実施形態では、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）基質は、本開示の操作されたポリヌクレオチドの標的ＲＮＡへのハイブリダイゼーションによって形成され得る。本明細書で開示される場合のバルジは、ｄｓＲＮＡ基質の形成によって形成される構造であって、操作されたポリヌクレオチドまたは標的ＲＮＡのいずれかにおけるヌクレオチドが、逆鎖上のそれらの位置的対応物に相補的であることができない、構造を指す。バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の二次または三次構造を変化させ得る。バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側またはｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１～４ヌクレオチドを有し得る。一部の実施形態では、本開示の操作されたポリヌクレオチドは、２つのバルジを有する。一部の実施形態では、本開示の操作されたポリヌクレオチドは、３つのバルジを有する。一部の実施形態では、本開示の操作されたポリヌクレオチドは、４つのバルジを有する。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ基質中のバルジの存在は、ＡＤＡＲを、標的ＲＮＡ中の標的Ａを選択的に編集して非標的のオフターゲット編集を低減させるのに適した位置に置くことができる。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ基質中のバルジの存在は、追加のＡＤＡＲを動員し得る。本明細書で開示されるｄｓＲＮＡ基質中のバルジは、他のタンパク質、例えば、他のＲＮＡ編集実体を動員し得る。一部の実施形態では、編集部位の５’に位置するバルジは、編集される標的Ａの塩基フリッピングを助長し得る。バルジは、配列特異性の付与にも役立ち得る。バルジは、ＡＤＡＲ編集を、それを標的Ａの選択的編集を生じさせる向きに拘束することにより方向付けるのに役立ち得る。
ある態様では、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）基質は、本開示の操作されたポリヌクレオチドの標的ＲＮＡへのハイブリダイゼーションによって形成され得る。バルジは、対称バルジであることもあり、非対称バルジであることもある。バルジは、ｄｓＲＮＡ基質上のポリヌクレオチド側または標的ＲＮＡ側のいずれかの１～４つの関与するヌクレオチドによって形成され得る。対称バルジは、同数のヌクレオチドがバルジの両側に存在し得る場合に形成され得る。対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側またはｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側に２～４つのヌクレオチドを有し得る。例えば、本開示のｄｓＲＮＡ基質中の対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側および標的ＲＮＡ側に同数のヌクレオチドを有し得る。本開示の対称バルジは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側の２つのヌクレオチドとｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の２つのヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称バルジは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側の３つのヌクレオチドとｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の３つのヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称バルジは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側の４つのヌクレオチドとｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の４つのヌクレオチドとによって形成され得る。
二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）基質は、本開示の操作されたポリヌクレオチドの標的ＲＮＡへのハイブリダイゼーションによって形成され得る。バルジは、対称バルジであることもあり、非対称バルジであることもある。非対称バルジは、異なる数のヌクレオチドがバルジの両側に存在し得る場合に形成され得る。非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質上のポリヌクレオチド側または標的ＲＮＡ側のいずれかに１～４つの関与するヌクレオチドを有し得る。例えば、本開示のｄｓＲＮＡ基質中の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側および標的ＲＮＡ側に異なる数のヌクレオチドを有し得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側の０のヌクレオチドとｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１つのヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の０のヌクレオチドとｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側の１つのヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側の０のヌクレオチドとｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の２つのヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の０のヌクレオチドとｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側の２つのヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側の０のヌクレオチドとｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の３つのヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の０のヌクレオチドとｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側の３つのヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側の０のヌクレオチドとｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の４つのヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の０のヌクレオチドとｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側の４つのヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側の１つのヌクレオチドとｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の２つのヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１つのヌクレオチドとｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側の２つのヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側の１つのヌクレオチドとｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の３つのヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１つのヌクレオチドとｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側の３つのヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側の１のヌクレオチドとｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の４つのヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１つのヌクレオチドとｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側の４つのヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側の２つのヌクレオチドとｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の３つのヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の２つのヌクレオチドとｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側の３つのヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側の２つのヌクレオチドとｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の４つのヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の２つのヌクレオチドとｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側の４つのヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側の３つのヌクレオチドとｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の４つのヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称バルジは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の３つのヌクレオチドとｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側の４つのヌクレオチドとによって形成され得る。一部の場合には、構造的特徴は、ループであり得る。
ある態様では、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）基質は、本開示の操作されたポリヌクレオチドの標的ＲＮＡへのハイブリダイゼーションによって形成され得る。本明細書で開示される場合の内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の形成により形成される構造であって、操作されたポリヌクレオチドまたは標的ＲＮＡのいずれかにおけるヌクレオチドが、逆鎖上のそれらの位置的対応物に相補的であることができず、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側または操作されたポリヌクレオチド側のいずれかの内部ループの片側が、５つより多くのヌクレオチドを有する、構造を指す。内部ループは、対称内部ループであることもあり、非対称内部ループであることもある。編集部位の付近に存在する内部ループは、編集される標的ＲＮＡ中の標的Ａの塩基フリッピングに役立ち得る。二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）基質は、本開示の操作されたポリヌクレオチドの標的ＲＮＡへのハイブリダイゼーションによって形成され得る。内部ループは、対称内部ループであることもあり、非対称内部ループであることもある。対称内部ループは、同数のヌクレオチドが内部ループの両側に存在し得る場合に形成され得る。例えば、本開示のｄｓＲＮＡ基質中の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側および標的ＲＮＡ側に同数のヌクレオチドを有し得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側の５つのヌクレオチドとｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の５つのヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側の６つのヌクレオチドとｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の６つのヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側の７つのヌクレオチドとｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の７つのヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側の８つのヌクレオチドとｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の８つのヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側の９つのヌクレオチドとｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の９つのヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ標的の操作されたポリヌクレオチド側の１０のヌクレオチドとｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１０のヌクレオチドとによって形成され得る。
ある態様では、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）基質は、本開示の操作されたポリヌクレオチドの標的ＲＮＡへのハイブリダイゼーションによって形成され得る。内部ループは、対称内部ループであることもあり、非対称内部ループであることもある。非対称内部ループは、異なる数のヌクレオチドが内部ループの両側に存在し得る場合に形成され得る。例えば、本開示のｄｓＲＮＡ基質中の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側および標的ＲＮＡ側に異なる数のヌクレオチドを有し得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側の５つのヌクレオチドとｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の６つのヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の５つのヌクレオチドとｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側の６つのヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側の５つのヌクレオチドとｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の７つのヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の５つのヌクレオチドとｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側の７つのヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側の５つのヌクレオチドとｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の８つのヌクレオチド内部ループとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の５つのヌクレオチドとｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側の８つのヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側の５つのヌクレオチドとｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の９つのヌクレオチド内部ループとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の５つのヌクレオチドとｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側の９つのヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側の５つのヌクレオチドとｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１０のヌクレオチド内部ループとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の５つのヌクレオチドとｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側の１０のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側の６つのヌクレオチドとｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の７つのヌクレオチド内部ループとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の６つのヌクレオチドとｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側の７つのヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側の６つのヌクレオチドとｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の８つのヌクレオチド内部ループとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の６つのヌクレオチドとｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側の８つのヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側の６つのヌクレオチドとｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の９つのヌクレオチド内部ループとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の６つのヌクレオチドとｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側の９つのヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側の６つのヌクレオチドとｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１０のヌクレオチド内部ループとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の６つのヌクレオチドとｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側の１０のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側の７つのヌクレオチドとｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の８つのヌクレオチド内部ループとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の７つのヌクレオチドとｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側の８つのヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側の７つのヌクレオチドとｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の９つのヌクレオチド内部ループとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の７つのヌクレオチドとｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側の９つのヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側の７つのヌクレオチドとｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１０のヌクレオチド内部ループとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の７つのヌクレオチドとｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側の１０のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側の８つのヌクレオチドとｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の９つのヌクレオチド内部ループとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の８つのヌクレオチドとｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側の９つのヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側の８つのヌクレオチドとｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１０のヌクレオチド内部ループとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の８つのヌクレオチドとｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側の１０のヌクレオチドとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側の９つのヌクレオチドとｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の１０のヌクレオチド内部ループとによって形成され得る。本開示の非対称内部ループは、ｄｓＲＮＡ基質の標的ＲＮＡ側の９つのヌクレオチドとｄｓＲＮＡ基質の操作されたポリヌクレオチド側の１０のヌクレオチドとによって形成され得る。
バルジまたはループを含む構造的特徴は、いずれのサイズのものであってもよい。一部の場合には、バルジまたはループは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０塩基を含む。一部の場合には、バルジまたはループは、合計で少なくとも約１～１０、５～１５、１０～２０、１５～２５、または２０～３０塩基を含む。
一部の場合には、構造的特徴は、構造化モチーフであり得る。本明細書で開示される場合の構造化モチーフは、ｄｓＲＮＡ基質における２つまたはそれより多くの構造的特徴を含む。構造化モチーフは、ＡＤＡＲ編集のための理想的な基質を正確な位置に生成するために、上記請求項におけるものなどの、構造的特徴の任意の組合せを含み得る。これらの構造モチーフを人工的に操作してＡＤＡＲ編集を最大にすることができるだろう、および／またはこれらの構造モチーフをモデル化して公知のＡＤＡＲ基質を再現することができる。
一部の場合には、構造的特徴は、ポリヌクレオチドの少なくとも部分的な環状化を含む。一部の場合には、本明細書で提供されるポリヌクレオチドは、環状化することができ、または環状構造であり得る。一部の態様では、少なくとも部分的に環状のポリヌクレオチドは、５’ヒドロキシルまたは３’ヒドロキシルを欠いている。
一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチドは、互いに共有結合で連結されている複数の糖およびリン酸部分を含む骨格を有し得る。一部の場合には、操作されたポリヌクレオチドの骨格は、ＤＮＡのデオキシリボースまたはＲＮＡのリボースの５’炭素上のリン酸基中の第１のヒドロキシル基と、ＤＮＡのデオキシリボースまたはＲＮＡのリボースの３’炭素上の第２のヒドロキシル基との間にホスホジエステル結合連結を含み得る。
一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチドの骨格は、溶媒に曝露され得る５’還元性ヒドロキシル、３’還元性ヒドロキシル、または両方を欠いていることがある。一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチドの骨格は、ヌクレアーゼに曝露され得る５’還元性ヒドロキシル、３’還元性ヒドロキシル、または両方を欠いていることがある。一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチドの骨格は、加水分解酵素に曝露され得る５’還元性ヒドロキシル、３’還元性ヒドロキシル、または両方を欠いていることがある。一部の事例では、操作されたポリヌクレオチドの骨格を、ヌクレオチドを順々に用いて環状２次元形式のポリヌクレオチド配列として表すことができる。一部の事例では、操作されたポリヌクレオチドの骨格を、ヌクレオチドを順々に用いてループ状２次元形式のポリヌクレオチド配列として表すことができる。一部の場合には、５’ヒドロキシル、３’ヒドロキシル、または両方は、リン－酸素結合によって結合されている。一部の場合には、５’ヒドロキシル、３’ヒドロキシル、または両方は、リン含有部分を有するホスホエステルへと改変される。
対象ポリヌクレオチドは、改変を含み得る。改変は、置換、挿入、欠失、化学的改変、物理的改変、安定化、精製、またはこれらの任意の組合せであり得る。一部の場合には、改変は、化学的改変である。好適な化学的改変は、５’アデニル酸、５’グアノシン－三リン酸キャップ、５’Ｎ７－メチルグアノシン－三リン酸キャップ、５’三リン酸キャップ、３’リン酸、３’チオリン酸、５’リン酸、５’チオリン酸、Ｃｉｓ－Ｓｙｎチミジンダイマー、トリマー、Ｃ１２スペーサー、Ｃ３スペーサー、Ｃ６スペーサー、ｄスペーサー、ＰＣスペーサー、ｒスペーサー、スペーサー１８、スペーサー９，３’－３’改変、５’－５’改変、脱塩性、アクリジン、アゾベンゼン、ビオチン、ビオチンＢＢ、ビオチンＴＥＧ、コレステリルＴＥＧ、デスチオビオチンＴＥＧ、ＤＮＰ ＴＥＧ、ＤＮＰ－Ｘ、ＤＯＴＡ、ｄＴ－ビオチン、デュアルビオチン、ＰＣビオチン、ソラレンＣ２、ソラレンＣ６、ＴＩＮＡ、３’ＤＡＢＣＹＬ、ブラックホールクエンチャー１、ブラックホールクエンチャー２、ＤＡＢＣＹＬ ＳＥ、ｄＴ－ＤＡＢＣＹＬ、ＩＲＤｙｅ ＱＣ－１、ＱＳＹ－２１、ＱＳＹ－３５、ＱＳＹ－７、ＱＳＹ－９、カルボキシルリンカー、チオールリンカー、２’デオキシリボヌクレオシドアナログプリン、２’デオキシリボヌクレオシドアナログピリミジン、リボヌクレオシドアナログ、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオシドアナログ、糖改変アナログ、ゆらぎ／ユニバーサル塩基、蛍光色素標識、２’フルオロＲＮＡ、２’Ｏ－メチルＲＮＡ、メチルホスホン酸、ホスホジエステルＤＮＡ、ホスホジエステルＲＮＡ、ホスホロチオエートＤＮＡ、ホスホロチオエートＲＮＡ、ＵＮＡ、プソイドウリジン－５’－三リン酸、５－メチルシチジン－５’－三リン酸、２－Ｏ－メチル３ホスホロチオエートのうちのいずれか１つ、またはこれらの任意の組合せを含む。
改変をポリヌクレオチドの任意の位置で行うことができる。一部の場合には、改変は、５’または３’末端に位置する。一部の場合には、ポリヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、または１５０から選択される塩基における改変を含む。１つより多くの改変をポリヌクレオチドに加えることができる。一部の場合には、改変は、永続的であり得る。他の場合には、改変は、一時的であり得る。一部の場合には、複数の改変がポリ核酸に加えられる。ポリ核酸改変は、ヌクレオチドの物理化学的特性、例えば、それらの立体構造、極性、疎水性、化学反応性、塩基対合相互作用、またはこれらの任意の組合せを変えることができる。
改変は、代用ホスホロチオエートであることもある。一部の場合には、天然ホスホジエステル結合は、細胞ヌクレアーゼによって急速に分解されやすいことがあり、代用ホスホロチオエート（ＰＳ）結合を使用するヌクレオチド間連結の改変によって、細胞分解による加水分解に対する安定性がより高くなり得る。改変は、ポリ核酸の安定性を増大させることができる。改変は、生物活性を増強することもできる。一部の場合には、ホスホロチオエート増強ＲＮＡポリ核酸は、リボヌクレアーゼＡ、リボヌクレアーゼＴ１、仔ウシ血清ヌクレアーゼ、またはこれらの任意の組合せを阻害することができる。これらの特性は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでのヌクレアーゼへの曝露の可能性が高い応用に使用されるＰＳ－ＲＮＡポリ核酸の使用を可能にすることができる。例えば、ホスホロチオエート（ＰＳ）結合をポリ核酸の５’または３’末端の最後の３～５ヌクレオチドの間に導入することができ、これはエクソヌクレアーゼ分解を阻害することができる。一部の場合には、ホスホロチオエート結合をポリ核酸全体にわたって付加させて、エンドヌクレアーゼによる攻撃を低減させることができる。
操作されたポリヌクレオチドは、塩基の任意の頻度を有し得る。例えば、ポリヌクレオチドは、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、１～５％、３～８％、５～１２％、１０～１５％、８～２０％、１５～２５％、２０～３０％、２５～３５％、または最大で約３０～４０％のアデニンパーセントを有し得る。ポリヌクレオチドは、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、１～５％、３～８％、５～１２％、１０～１５％、８～２０％、１５～２５％、２０～３０％、２５～３５％、または最大で約３０～４０％のシトシンパーセントを有し得る。ポリヌクレオチドは、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、１～５％、３～８％、５～１２％、１０～１５％、８～２０％、１５～２５％、２０～３０％、２５～３５％、または最大で約３０～４０％のチミンパーセントを有し得る。ポリヌクレオチドは、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、１～５％、３～８％、５～１２％、１０～１５％、８～２０％、１５～２５％、２０～３０％、２５～３５％、または最大で約３０～４０％のグアニンパーセントを有し得る。ポリヌクレオチドは、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、１～５％、３～８％、５～１２％、１０～１５％、８～２０％、１５～２５％、２０～３０％、２５～３５％、または最大で約３０～４０％のウラシルパーセントを有し得る。
一部の場合には、操作されたポリヌクレオチドに対して改変後に精度管理を行うことができる。一部の場合には、精度管理は、ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ、ＭＳまたはこれらの任意の組合せを含み得る。一部の場合には、ポリヌクレオチドの質量が決定され得る。質量は、ＬＣ－ＭＳアッセイにより決定され得る。質量は、３０，０００ａｍｕ、５０，０００ａｍｕ、７０，０００ａｍｕ、９０，０００ａｍｕ、１００，０００ａｍｕ、１２０，０００ａｍｕ、１５０，０００ａｍｕ、１７５，０００ａｍｕ、２００，０００ａｍｕ、２５０，０００ａｍｕ、３００，０００ａｍｕ、３５０，０００ａｍｕ、４００，０００ａｍｕ、～約５００，０００ａｍｕであり得る。質量は、ポリヌクレオチドのナトリウム塩の質量であり得る。
一部の場合には、ポリヌクレオチドのエンドトキシンレベルが決定され得る。エンドトキシンの臨床上／治療上許容されるレベルは、３ＥＵ／ｍＬ未満であり得る。エンドトキシンの臨床上／治療上許容されるレベルは、１０ＥＵ／ｍＬ未満であり得る。エンドトキシンの臨床上／治療上許容されるレベルは、８ＥＵ／ｍＬ未満であり得る。エンドトキシンの臨床上／治療上許容されるレベルは、５ＥＵ／ｍＬ未満であり得る。エンドトキシンの臨床上／治療上許容されるレベルは、４ＥＵ／ｍＬ未満であり得る。エンドトキシンの臨床上／治療上許容されるレベルは、３ＥＵ／ｍＬ未満であり得る。エンドトキシンの臨床上／治療上許容されるレベルは、２ＥＵ／ｍＬ未満であり得る。エンドトキシンの臨床上／治療上許容されるレベルは、１ＥＵ／ｍＬ未満であり得る。エンドトキシンの臨床上／治療上許容されるレベルは、０．５ＥＵ／ｍＬ未満であり得る。
一部の場合には、ポリヌクレオチドに対して無菌試験を行うことができる。無菌試験の臨床上／治療上許容されるレベルは、０であることもあり、または培養で増殖がないことにより示されることもある。無菌試験の臨床上／治療上許容されるレベルは、増殖０．５％未満であり得る。無菌試験の臨床上／治療上許容されるレベルは、増殖１％未満であり得る。
一部の場合には、動員配列を含むポリヌクレオチドのいずれか１つもまた、本明細書に記載される構造的特徴を含み得る。
操作された線状ポリヌクレオチドも提供される。線状ポリヌクレオチドは、本明細書で提供される構造的特徴を実質的に欠いていることがある。例えば、線状ポリヌクレオチドは、構造的特徴を欠いていることもあり、または約２つ未満の構造的特徴もしくは部分構造を有することもある。部分構造は、本明細書に記載の構造的特徴を達成するために必要とされる塩基の一部分を含み得る。
他の場合には、操作された線状ポリヌクレオチドは、５’ヒドロキシル、３’ヒドロキシル、または両方のうちの、いずれか１つを含み得る。これらのうちのいずれか１つは、溶媒に曝露されて線状性を維持し得ることが可能である。
本明細書で提供される組成物および方法を用いて標的の発現をモジュレートすることができる。モジュレーションは、遺伝子にまたは遺伝子の突然変異に関連する疾患または状態を緩和することを目的として、様々なステージのいずれか１つにおいて遺伝子またはその一部分の発現を変更することを指すことができる。モジュレーションは、転写レベルで媒介されることもあり、または翻訳後に媒介されることもある。転写のモジュレーションは、遺伝子の突然変異によって生じるスプライスバリアントの異常な発現を修正することができる。一部の場合には、本明細書で提供される組成物および方法を用いて、標的の遺伝子翻訳を調節することができる。モジュレーションは、転写物の存在量を減少させることにより遺伝子またはその一部分の発現を減少またはノックダウンすることを指すことができる。転写物の存在量を減少させることは、転写物のプロセシング、スプライシング、代謝回転もしくは安定性を減少させることにより、またはリボソームなどの翻訳機構による転写物の利用可能性を低下させることにより、媒介され得る。一部の場合には、本明細書に記載される操作されたポリヌクレオチドは、ノックダウンを助長し得る。ノックダウンは、標的ＲＮＡの発現を低減させ得る。一部の場合には、ノックダウンは、ｍＲＮＡの編集に付随して起こり得る。一部の場合には、ノックダウンは、ｍＲＮＡの編集が実質的に殆ど乃至は全くなくても起こり得る。一部の事例では、ノックダウンは、３’ＵＴＲ、５’ＵＴＲまたは両方などの、標的ＲＮＡの非翻訳領域を標的とすることにより行われ得る。一部の場合には、ノックダウンは、標的ＲＮＡのコード領域を標的とすることにより行われ得る。一部の事例では、ノックダウンは、ＲＮＡ編集酵素（例えば、ＡＤＡＲ）により媒介され得る。一部の事例では、ＲＮＡ編集酵素は、ＲＮＡ中の複数のアデノシンの加水分解的脱アミノ化によりノックダウンを生じさせ得る。ＲＮＡ中の複数のアデノシンの加水分解的脱アミノ化は、超編集と呼ばれることもある。一部の場合には、超編集は、シスで（例えば、Ａｌｕエレメントにおいて）行われることもあり、またはトランスで（例えば、操作されたポリヌクレオチドにより標的ＲＮＡにおいて）行われることもある。
ある態様では、操作された対象ポリヌクレオチドを用いて、標的ＲＮＡまたは標的ＲＮＡ領域を超編集することができる。一部の場合には、超編集は、対象標的ＲＮＡの少なくとも２つまたはそれより多くのヌクレオチドに編集を導入することができる。一部の場合には、超編集は、標的ＲＮＡの領域に少なくとももしくは多くとも約２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８の、または少なくとももしくは多くとも約１００の編集を導入することができる。ある実施形態では、超編集は、非翻訳領域、翻訳領域、３’ＵＴＲ、５’ＵＴＲ、またはこの中のおよびその任意の組合せにおいて行われ得る。ある実施形態では、対象ＡＰＰ ｍＲＮＡの標的ＲＮＡを超編集してｍＲＮＡに突然変異を起こさせることによって、改変されていない他の点では同等のＡＰＰポリペプチドと比較して切断が低減または消失した改変されたＡＰＰポリペプチドを生成することができる。ある実施形態では、改変されたポリペプチドがβ－セクレターゼによる切断の低減または消失を有するように、標的ｍＲＮＡの領域におけるβ－セクレターゼ切断部位でならびにその遠位側および近位側の残基で突然変異を起こさせることができる。ある態様では、切断の低減は、例えば、操作された対象ポリペプチド系を使用して、超編集下にない他の点では同等の標的ｍＲＮＡと比較して少なくとも約または多くとも約１／１、１／３、１／５、１／７、１／１０、１／１５、１／２０、１／４０、１／６０、１／８０、または１／１００への低減である。ある実施形態では、超編集は、β－セクレターゼ（ＢＡＣＥ１を含むがこれに限定されない）の基質選好性を低下または消失させること、およびＡＰＰ発現を大きくモジュレートしないこと（その結果として、ＡＰＰの主要細胞機能がおおむね影響を受けない状態を維持することを可能にすることができる）により、疾患のドライバー事象をモジュレートすることができる。ＢＡＣＥ１基質選好性は、そしてまた（個々にまたは組み合わせて）編集され得る推定的アデノシンを有するＡＰＰ ｍＲＮＡ配列も、下記で示される。この方法論の例は、実施例１９および２０で提供される。
ある態様では、操作された対象ポリヌクレオチドを、タイリングを含む方法を用いて設計することができる。例えば、操作されたポリヌクレオチドを、対象標的ＲＮＡの核酸またはポリペプチドに対してタイリングされた、複数の操作されたポリヌクレオチド候補から選択することができる。ある実施形態では、操作されたポリヌクレオチドを、ＡＰＰ、ＳＮＣＡおよび／またはタウなどの、対象標的ＲＮＡの核酸またはポリペプチドに対してタイリングされた、複数の操作されたポリヌクレオチドから選択することができる。一部の場合には、タイリングは、操作されたポリヌクレオチドを対象標的の調節エレメントにわたってタイリングすることを含み得る。一部の場合には、タイリングは、操作されたポリヌクレオチドの、対象標的配列のポリ（Ａ）テール、マイクロＲＮＡ応答エレメント（ＭＲＥ）、ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲのうちのいずれか１つ、またはこれらの任意の組合せにわたっての、タイリングを含み得る。
ある態様では、標的ＲＮＡまたは核酸に対してタイリングされる操作されたポリヌクレオチドを、本明細書に記載される方法における使用のためにプールすることができる。一部の場合には、操作されたポリヌクレオチドを、単一のアッセイで標的を検出するためにプールすることができる。単一の標的に対してタイリングされる操作されたポリヌクレオチドをプールすることは、本明細書に記載される方法を使用する標的ＲＮＡの検出を増進することができる。例えばタイリングは、標的核酸または標的ポリペプチドに沿って逐次的であることがある。時には、タイリングは、標的核酸または標的ＲＮＡに沿って重複していることもある。一部の事例では、タイリングは、標的核酸または標的ＲＮＡに沿ってタイリングされる操作されたポリヌクレオチド間にギャップを含む。一部の事例では、操作されたポリヌクレオチドのタイリングは、非逐次的であることがある。多くの場合、標的核酸および／または標的ＲＮＡを検出する方法は、標的核酸または標的ＲＮＡを操作されたポリヌクレオチドおよびＲＮＡ編集実体および／またはヌクレアーゼのプールと接触させるステップであって、操作されたポリヌクレオチドのプールの操作されたポリヌクレオチドが標的配列に対する標的化配列を含む、ステップ、および編集についてアッセイするステップを含み得る。
一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチドは、シス調節エレメントを含み得る。そのようなシス調節エレメントは、特異的なＲＮＡ配列を含み得る。一部の場合には、シス調節エレメントは、操作されたポリヌクレオチドのＲＮＡ存在量、ＲＮＡ合成、ＲＮＡ安定性、ＲＮＡ分解またはＲＮＡ局在を調節することができる。そのようなシス調節エレメントは、Ｍａｌａｔ１、Ｘｉｓｔ、Ｎｅａｔ１またはｓｎｏＲＮＡ配列を含み得る。Ｍａｌａｔ１配列は、操作されたポリヌクレオチドを核に局在させることができる。Ｍａｌａｔ１、Ｘｉｓｔ、Ｎｅａｔ１またはｓｎｏＲＮＡ配列は、ポリヌクレオチドについての核内繋留シグナルも提供することができる。
一部の場合には、操作されたポリヌクレオチドは、ポリメラーゼＩ、ＩＩまたはＩＩＩプロモーターから発現され得る。他の場合には、プロモーターは、組織特異的プロモーターであり得る。一部の場合には、複数の操作されたポリヌクレオチドがポリメラーゼＩ、ＩＩまたはＩＩＩプロモーターによって発現され得る。一部の場合には、複数の操作されたポリヌクレオチドは、複数の操作されたポリヌクレオチドをポリメラーゼＩ、ＩＩまたはＩＩＩプロモーターの片側から配置することにより、一方向にポリメラーゼＩ、ＩＩまたはＩＩＩプロモーターによって発現され得る。他の場合には、複数の操作されたポリヌクレオチドは、複数の操作されたポリヌクレオチドをポリメラーゼＩ、ＩＩまたはＩＩＩプロモーターの両側から配置することにより、二方向からポリメラーゼＩ、ＩＩまたはＩＩＩプロモーターによって発現され得る。
一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチドは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、または５００ヌクレオチドの長さを有し得る。一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチドは、長さ約５～５０、１０～５０、２０～８０、３０～１００、４０～１３０、５０～１５０、５０～２００、５０～３００、１００～２００、１００～１５０、１００～２５０、１５０～３００、２００～３００、３００～４００、２５０～４００、２５０～５００、２５０～４５０、または４００～５００ヌクレオチドの長さを有し得る。
一部の実施形態では、レポーターアッセイを使用して、操作されたポリヌクレオチドまたは標的ＲＮＡ配列の編集効率を測定することができる。レポーターアッセイは、レポーターを含み得る。レポーターは、核酸レポーターまたはタンパク質レポーターであり得る。核酸レポーターは、プラスミド、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、線状核酸配列、環状核酸、５’または３’還元性ヒドロキシル基を有する核酸上に維持され得る。一部の実施形態では、レポーターは、転写レポーター、転写後レポーター、翻訳レポーター、または翻訳後レポーターを含み得る。一部の場合には、レポーターは、ルシフェラーゼレポーター、蛍光レポーター、薬物耐性レポーター、細胞生存レポーター、タンパク質活性レポーター、酵素活性レポーター、ポリペプチドもしくはタンパク質結合活性レポーター、核酸活性レポーター、または本明細書においておよびそれについて記載される任意の組合せを含み得る。
一部の実施形態では、レポーターは、２つのコザック開始コドンを含み得る。一部の実施形態では、レポーターは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多くのコザック開始コドンを含み得る。開始コドンは、ＡＴＧを含み得る。一部の場合には、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を含むがこれらに限定されない核酸配列を、コザック開始コドンの上流または５’に配置することができる。一部の場合には、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を含むがこれらに限定されない核酸配列を、コザック開始コドンとインフレームで、および／またはコザック開始コドンの下流もしくは３’に、配置することができる。一部の実施形態では、コザック開始コドンとインフレームでおよび／またはコザック開始コドンの下流もしくは３’に配置された配列は、コザック開始コドンで翻訳によって開始され得る。一部の場合には、コザック開始コドンとインフレームでおよびコザック開始コドンの下流または３’に配置された配列は、コザック開始コドンで翻訳によって開始され得ない。一部の実施形態では、レポーターは、第１のコザック開始コドンの上流または５’に配置された第１の核酸配列と、第１のコザック開始コドンとインフレームでおよび／または第１のコザック開始コドンの下流または３’に配置された第２の核酸配列とを含み得る。一部の実施形態では、レポーターは、第１のコザック開始コドンの上流または５’に配置された第１の核酸配列と、第２のコザック開始コドンとインフレームでおよび／または第２のコザック開始コドンの下流または３’に配置された第２の核酸配列とを含み得る。一部の場合には、第１のコザック開始コドンおよび第２のコザック開始コドンは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、または５００ヌクレオチド離れていることがある。他の場合には、第１のコザック開始コドンおよび第２のコザック開始コドンは、０～１０、９～２０、１９～３０、２９～４０、３９～５０、４９～１００、９９～１５０、１４９～２００、１９９～２５０、２４９～３００、２９９～３５０、３４９～４００、３９９～４５０、または４９９～５００ヌクレオチド離れていることがある。一部の場合には、第１のコザック開始コドンの上流または５’に配置された第１の配列は、第２のコザック開始コドンとインフレームでおよび第２のコザック開始コドンの下流または３’に配置された第２の配列の翻訳を増加させることもあり、または減少させることもある。一部の場合には、第１のコザック開始コドンの下流または３’に、しかし第２のコザック開始コドンの前に配置された第１の配列は、第２のコザック開始コドンとインフレームでおよび第２のコザック開始コドンの下流または３’に配置された第２の配列の翻訳を増加させることもあり、または減少させることもある。一部の実施形態では、コザックコドンの５’および３’の配列は、ゲノム遺伝子座またはＲＮＡの配列を含み得る。ＲＮＡは、前駆体ｍＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）前駆体、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、長鎖ノンコーディングＲＮＡ、低分子ＲＮＡ、核ＲＮＡ、細胞質ＲＮＡ、原核生物ＲＮＡ、合成ＲＮＡ、精製ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ミトコンドリアＲＮＡ、およびこれらの任意の組合せを含み得る。一部の実施形態では、標的に対する好適なＲＮＡは、リボザイム、ある配列の単離されたＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ガイドＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、長鎖ノンコーディングＲＮＡ、長鎖遺伝子間ノンコーディングＲＮＡ、エンハンサーＲＮＡ、細胞外ＲＮＡ、Ｙ ＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ由来の低分子ＲＮＡ（ｔｓＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、小分子ｒＤＮＡ由来のＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ）、これらの一部分、およびそれらの任意の組合せを含み得る。一部の実施形態では、ＲＮＡの一部分は、コーディングＲＮＡであることもあり、またはノンコーディングＲＮＡであることもある。他の場合には、ＲＮＡの一部分は、５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲを含み得る。一部の事例では、ＲＮＡの一部分は、シャルコー・マリー・トゥース症候群１Ａ、ＡＰＰ、タウ、またはアルファ－シヌクレインｍＲＮＡからの配列を含み得る。一部の場合には、第２のコザック開始コドンとインフレームでおよび第２のコザック開始コドンの下流または３’に配置された第２の配列は、本明細書においておよびそれについて記載されるレポーターまたはレポーターの一部分をコードする配列を含み得る。
一部の実施形態では、第１のコザック開始コドンの上流／５’または下流に配置された第１の配列のヌクレオチドの塩基の編集は、第１のコザック開始コドンとインフレームでおよび／または第１のコザック開始コドンの下流もしくは３’に配置された第２の核酸配列の翻訳を増加させることもあり、または減少させることもある。一部の場合には、第１のコザック開始コドンとインフレームでおよび／または第１のコザック開始コドンの下流もしくは３’に配置された第２の核酸配列の翻訳の増加または減少は、第２の核酸配列の翻訳開始、伸長、停止、再開始またはこれらの任意の組合せの増加または減少を含み得る。一部の実施形態では、第１のコザック開始コドンの上流／５’に配置された第１の配列のヌクレオチドの塩基の編集の量は、第１のコザックコドンの下流または３’に配置された第２の核酸配列の翻訳開始、伸長、停止、再開始またはこれらの任意の組合せに比例し得る。一部の実施形態では、第１のコザック開始コドンの上流／５’または下流／３’に配置された配列のヌクレオチドの塩基の編集の量は、第１のコザックコドンの下流または３’に配置された第２の核酸配列の翻訳開始、伸長、停止、再開始またはこれらの任意の組合せに比例し得ない。
一部の実施形態では、第１のコザック開始コドンの上流／５’または下流／３’に配置された配列のヌクレオチドの塩基の編集は、第２のコザック開始コドンとインフレームでおよび／または第２のコザック開始コドンの下流もしくは３’に配置された第２の核酸配列の翻訳を増加させることもあり、または減少させることもある。一部の場合には、第２のコザック開始コドンとインフレームでおよび／または第２のコザック開始コドンの下流もしくは３’に配置された第２の核酸配列の翻訳の増加または減少は、第２の核酸配列の翻訳開始、伸長、停止、再開始またはこれらの任意の組合せの増加または減少を含み得る。一部の実施形態では、第１のコザック開始コドンの上流／５’または下流／３’に配置された配列のヌクレオチドの塩基の編集の量は、第２のコザックコドンの下流または３’に配置された第２の核酸配列の翻訳開始、伸長、停止、再開始またはこれらの任意の組合せに比例し得る。一部の実施形態では、第１のコザック開始コドンの上流／５’または下流／３’に配置された配列のヌクレオチドの塩基の編集の量は、第２のコザックコドンの下流または３’に配置された第２の核酸配列の翻訳開始、伸長、停止、再開始またはこれらの任意の組合せに比例し得ない。
好適な標的
本明細書で提供される組成物および方法を用いて、好適なＲＮＡポリペプチドおよびそれらの部分を標的とすることができる。好適なＲＮＡは、非タンパク質コード領域を含むこともあり、またはタンパク質コード領域を含むこともある。例示的な非タンパク質コード領域としては、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、ポリ（Ａ）テール、マイクロＲＮＡ応答エレメント（ＭＲＥ）、ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）、またはこれらの任意の組合せが挙げられるが、それらに限定されない。好適なＲＮＡは、イントロン、エクソン、またはこれらの任意の組合せも含み得る。一部の場合には、本明細書で開示される操作されたガイドＲＮＡは、非タンパク質コード領域を、標的タンパク質ノックダウンを助長するための標的とする。
一部の場合には、標的とするのに好適なＲＮＡとしては、前駆体ｍＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）前駆体、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、長鎖ノンコーディングＲＮＡ、低分子ＲＮＡ、核ＲＮＡ、細胞質ＲＮＡ、原核生物ＲＮＡ、合成ＲＮＡ、精製ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ミトコンドリアＲＮＡ、およびこれらの任意の組合せが挙げられるが、それらに限定されない。一部の実施形態では、標的とするのに好適なＲＮＡは、リボザイム、ある配列の単離されたＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ガイドＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、長鎖ノンコーディングＲＮＡ、長鎖遺伝子間ノンコーディングＲＮＡ、エンハンサーＲＮＡ、細胞外ＲＮＡ、Ｙ ＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、ｃｉｒｃＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ由来の低分子ＲＮＡ（ｔｓＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、小分子ｒＤＮＡ由来のＲＮＡ（ｓｒＲＮＡ）、およびこれらの任意の組合せを含み得る。
メッセンジャーＲＮＡまたはｍＲＮＡは、ＤＮＡから転写され、次いでイントロンとして公知の非コード区画を除去するようにプロセシングされる、核酸分子を含む。結果として得られるｍＲＮＡは、核（またはＤＮＡが存在する別の遺伝子座）から排出され、タンパク質に翻訳され得る。ｍＲＮＡ前駆体は、非コード区画を除去するためのプロセシングの前は核酸鎖を含み得る。
例示的な内在性標的は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、タウ、およびアルファ－シヌクレイン（ＳＮＣＡ）も含み得る。
一部の実施形態では、本明細書で開示される操作されたポリヌクレオチドは、ＡＰＰ中のセクレターゼ酵素切断部位を標的とし、前記切断部位を編集して、セクレターゼ酵素（例えば、ベータセクレターゼ、例えば、ＢＡＣＥ１、カテプシンＢまたはメプリンベータ）によるＡＰＰのプロセシングおよび切断をモジュレートすることができる。一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチドは、ＡＰＰの発現をモジュレートすることができる。一部の場合には、操作されたポリヌクレオチドは、ＡＰＰ ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ前駆体の転写または転写後調節をモジュレートすることができる。他の場合には、操作されたポリヌクレオチドは、ＡＰＰの突然変異によって生じるスプライスバリアントの異常な発現を修正することができる。一部の場合には、操作されたポリヌクレオチドは、ＡＰＰの遺伝子またはタンパク質翻訳をモジュレートすることができる。一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチドは、ＡＰＰ転写物の存在量を減少させることによりＡＰＰの発現を減少、下方調節、またはノックダウンすることができる。一部の事例では、操作されたポリヌクレオチドは、ＡＰＰ転写物のプロセシング、スプライシング、代謝回転もしくは安定性、またはリボソームなどの翻訳機構によるＡＰＰ転写物の利用可能性を、低下または下方調節することができる。一部の場合には、操作されたポリヌクレオチドは、ＡＰＰのノックダウンを助長することができる。ノックダウンは、ＡＰＰの発現を低減させることができる。一部の場合には、ノックダウンは、ＡＰＰ ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ前駆体の編集に付随して起こり得る。一部の場合には、ノックダウンは、ＡＰＰ ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ前駆体の編集が実質的に殆ど乃至は全くなくても起こり得る。一部の事例では、ノックダウンは、３’ＵＴＲ、５’ＵＴＲまたは両方などの、ＡＰＰ ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ前駆体の非翻訳領域を標的とすることによって行われ得る。一部の場合には、ノックダウンは、ＡＰＰ ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ前駆体のコード領域を標的とすることによって行われ得る。
本明細書に記載される組成物は、ＡＰＰの切断部位を、β／γセクレターゼがＡＰＰの切断の低減を示すようにまたはもはやＡＰＰを切断することができないように編集することができ、したがって、低下したレベルのＡベータ４０／４２を生じさせることまたはいずれのＡベータも生じさせないことができる。本開示と整合する組成物は、標的ＡＰＰ切断部位編集のための組成物と、タウ（例えば、ＭＡＰＴ遺伝子からコードされる微小管関連タンパク質タウ（ＭＡＰＴ））ノックダウンのための組成物またはアルファ－シヌクレイン（ＳＮＣＡ）ノックダウンのための組成物を併せ持つものであり得、相乗効果を発揮して、神経変性疾患を予防および／または治癒することができる。本明細書で開示される組成物および方法によって、小分子または抗体療法に見られる結果として生じるいずれの問題も伴うことなく、標的を編集および／またはノックダウンすることになるという結果を得ることができる。組成物は、ＡＰＰを（標的切断部位の編集ではなく）ノックダウンすることができる。ＡＰＰの標的切断部位に対する編集、およびノックダウンを、個々にまたは組み合わせて展開することができる。
一部の場合には、本明細書で提供される操作されたポリヌクレオチドの標的化配列を、標的ＲＮＡの領域に少なくとも部分的にハイブリダイズさせることができる。標的ＲＮＡの領域は、（ａ）本明細書で提供される好適な標的を少なくとも部分的にコードする配列、（ｂ）本明細書で提供される好適な標的を少なくとも部分的にコードする配列の近位側にある配列、（ｃ）（ａ）および（ｂ）を含み得る。例えば、標的ＲＮＡの領域は、（ａ）ＡＰＰを少なくとも部分的にコードする配列、（ｂ）ＡＰＰを少なくとも部分的にコードする配列の近位側にある配列、または（ｃ）（ａ）および（ｂ）を含み得る。本明細書で開示される操作されたポリヌクレオチドを用いて、他の好適な標的を標的とすることができる。
アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）
アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の病原性切断は、アルツハイマー病に関与するアミロイド－ベータ（Ａベータ）断片を生じさせ得る。Ａベータ断片の蓄積は、シナプス機能および関連シグナル伝達経路を損なわせることがあり、ニューロンの活性を変化させることがあり、グリア細胞からの神経毒性メディエーターの放出を誘発することがあり、またはこれらの任意の組合せをもたらすことがある。Ａベータは、キナーゼ機能を変更することがあり、その結果、タウ過剰リン酸化に至る。
β－アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の酵素的切断によるＡベータの生成は、アルツハイマー病の重要なプレーヤーである。図２Ｄ、２Ｅおよび３に示されているように、非アミロイド形成性ＡＰＰプロセシング経路は、アルファ－およびガンマ－セクレターゼによる切断を含む。アルファ－セクレターゼによる切断は、長鎖型の分泌ＡＰＰ（ＡＰＰアルファ）およびＣ末端断片（アルファ－ＣＴＦ）を生成する。ガンマ－セクレターゼによるアルファ－ＣＴＦのさらなるプロセシングは、ｐ３およびＡＩＣＤ断片を生成する。アミロイド形成性ＡＰＰプロセシング経路は、その代わりに、ベータ－およびガンマ－セクレターゼによる切断を含む。ベータ－セクレターゼによる切断は、短鎖型の分泌ＡＰＰ（ＡＰＰベータ）およびＣ末端断片（ベータ－ＣＴＦ）を生成する。ガンマ－セクレターゼによるベータ－ＣＴＦのさらなるプロセシングは、ＡベータおよびＡＩＣＤ断片を生成する。Ａベータ断片のオリゴマー化および線維化は、ＡＤ病態につながる。
図２Ｄおよび２Ｅの出典は、Thinakaran G, Koo EH. 2008 Amyloid precursor protein trafficking, processing, and function. J. Biol. Chem. 283:29615-19である。これらの方法は、参照により本明細書に組み込まれる。
一部の場合には、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）は、ベータセクレターゼ（例えば、ＢＡＣＥ１、カテプシンＢまたはメプリンベータ）またはガンマセクレターゼにより切断され得、そのような切断の結果として生じる断片が、３６～４３アミノ酸のＡベータペプチドであり得る。この切断によるある特定のＡベータペプチド代謝物は、アルツハイマー病の病態および進行に大きく関与し得る。ＡＰＰポリペプチドの野生型配列は、配列番号２で示される。
ＡＰＰ－配列番号２
Figure 2023504314000008
Figure 2023504314000009
ヒトＡＰＰのｍＲＮＡ配列は、表１に収載されている。
Figure 2023504314000010
Figure 2023504314000011
Figure 2023504314000012
Figure 2023504314000013
Figure 2023504314000014
Figure 2023504314000015
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Figure 2023504314000023
Figure 2023504314000024
Figure 2023504314000025
Figure 2023504314000026
Figure 2023504314000027
Figure 2023504314000028
Figure 2023504314000029
Figure 2023504314000030
Figure 2023504314000031
Figure 2023504314000032
Ａベータ断片は、ＡＰＰの一部分を切断することにより形成され得る。酵素は、ＡＰＰを切断することができる。酵素は、ガンマセクレターゼ、ベータセクレターゼ（例えば、ＢＡＣＥ１、カテプシンＢもしくはメプリンベータ）、またはこれらの組合せであり得る。Ａベータ断片は、長さ約３０～約５０アミノ酸であり得る。Ａベータ断片は、長さ約３５～約４５アミノ酸であり得る。Ａベータ断片は、長さ約３８～約４２アミノ酸であり得る。Ａベータ断片は、長さ約３６～約４２アミノ酸であり得る。Ａベータ断片は、長さ約４０～約４５アミノ酸であり得る。Ａベータ断片は、長さ約３３～約４０アミノ酸であり得る。ＡＰＰのｍＲＮＡ塩基編集は、Ａベータ断片の切断を防止することができ、またはＡベータ断片の切断を実質的に低減させることができる。Ａベータ断片は、配列番号１４に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列相同性を有し得る。Ａベータ断片は、配列番号１５に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列相同性を有し得る。
Ａベータ４０－配列番号１４
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Ａベータ４２－配列番号１５
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA
アミロイド前駆体タンパク質を少なくとも部分的にコードするポリヌクレオチドは、改変されたアミロイド前駆体タンパク質を少なくとも部分的にコードする改変されたポリヌクレオチドを生成するために本明細書で開示される組成物（例えば、ＡＰＰの切断部位を標的とする操作されたガイドＲＮＡ）により改変される。一部の場合には、改変されたアミロイド前駆体タンパク質は、未編集のポリヌクレオチドによりコードされるアミロイド前駆体タンパク質と比べてプロテアーゼ切断に対する感受性の変更を有する。一部の場合には、未編集のポリヌクレオチドは、アミロイド前駆体タンパク質の野生型配列の少なくとも一部分をコードする。一部の場合には、未編集のポリヌクレオチドは、配列番号２のアミロイド前駆体タンパク質配列の少なくとも一部分をコードする。一部の実施形態では、Ａベータ断片は、Ａベータ１、Ａベータ２、Ａベータ３、Ａベータ４、Ａベータ５、Ａベータ６、Ａベータ７、Ａベータ８、Ａベータ９、Ａベータ１０、Ａベータ１１、Ａベータ１２、Ａベータ１３、Ａベータ１４、Ａベータ１５、Ａベータ１６、Ａベータ１７、Ａベータ１８、Ａベータ１９、Ａベータ２０、Ａベータ２１、Ａベータ２２、Ａベータ２３、Ａベータ２４、Ａベータ２５、Ａベータ２６、Ａベータ２７、Ａベータ２８、Ａベータ２９、Ａベータ３０、Ａベータ３１、Ａベータ３２、Ａベータ３３、Ａベータ３４、Ａベータ３５、Ａベータ３６、Ａベータ３７、Ａベータ３８、Ａベータ３９、Ａベータ４０、Ａベータ４１、Ａベータ４２、本明細書におけるもしくはその任意の誘導体、またはこの中のおよびその任意の組合せも含み得る。Ａベータ断片の凝集は、Ａベータまたはアミロイド－ベータ斑を作出し得る。Ａベータまたはアミロイド－ベータ斑は、Ａベータ１、Ａベータ２、Ａベータ３、Ａベータ４、Ａベータ５、Ａベータ６、Ａベータ７、Ａベータ８、Ａベータ９、Ａベータ１０、Ａベータ１１、Ａベータ１２、Ａベータ１３、Ａベータ１４、Ａベータ１５、Ａベータ１６、Ａベータ１７、Ａベータ１８、Ａベータ１９、Ａベータ２０、Ａベータ２１、Ａベータ２２、Ａベータ２３、Ａベータ２４、Ａベータ２５、Ａベータ２６、Ａベータ２７、Ａベータ２８、Ａベータ２９、Ａベータ３０、Ａベータ３１、Ａベータ３２、Ａベータ３３、Ａベータ３４、Ａベータ３５、Ａベータ３６、Ａベータ３７、Ａベータ３８、Ａベータ３９、Ａベータ４０、Ａベータ４１、Ａベータ４２、本明細書におけるもしくはその任意の誘導体、またはこの中のおよびその任意の組合せを含み得る。一部の実施形態では、Ａベータまたはアミロイド－ベータ斑は、１つ１、１×１０１、１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、１×１０１３、１×１０１４、１×１０１５、１×１０１６、１×１０１７、１×１０１８、１×１０１９、１×１０２０、１×１０２１、１×１０２２、１×１０２３、１×１０２４、１×１０２５、１×１０２６、１×１０２７、１×１０２８、１×１０２９、１×１０３０、１×１０３１、１×１０３２、１×１０３３、１×１０３４、１×１０３５、１×１０３６、１×１０３７、１×１０３８、１×１０３９、１×１０４０、１×１０４１、１×１０４２、１×１０４３、１×１０４４、１×１０４５、１×１０４６、１×１０４７、１×１０４８、１×１０４９、１×１０５０、１×１０５１、１×１０５２、１×１０５３、１×１０５４、１×１０５５、１×１０５６、１×１０５７、１×１０５８、１×１０５９、１×１０６０、１×１０６１、１×１０６２、１×１０６３、１×１０６４、１×１０６５、１×１０６６、１×１０６７、１×１０６８、１×１０６９、１×１０７０、１×１０７１、１×１０７２、１×１０７３、１×１０７４、１×１０７５、１×１０７６、１×１０７７、１×１０７８、１×１０７９、１×１０８０、１×１０８１、１×１０８２、１×１０８３、１×１０８４、１×１０８５、１×１０８６、１×１０８７、１×１０８８、１×１０８９、１×１０９０、１×１０９１、１×１０９２、１×１０９３、１×１０９４、１×１０９５、１×１０９６、１×１０９７、１×１０９８、１×１０９９、または１×１０１００のＡベータ断片または分子を含み得る。他の場合には、Ａベータまたはアミロイド－ベータ斑は、１～１×１０１、９～１×１０２、０．９９×１０２～１×１０３、０．９９×１０３～１×１０４、０．９９×１０４～１×１０５、０．９９×１０５～１×１０６、０．９９×１０６～１×１０７、０．９９×１０７～１×１０８、０．９９×１０８～１×１０９、０．９９×１０９～１×１０１０、０．９９×１０１０～１×１０１１、０．９９×１０１１～１×１０１２、０．９９×１０１２～１×１０１３、０．９９×１０１３～１×１０１４、０．９９×１０１４～１×１０１５、０．９９×１０１５～１×１０１６、０．９９×１０１６～１×１０１７、０．９９×１０１７～１×１０１８、０．９９×１０１８～１×１０１９、０．９９×１０１９～１×１０２０、０．９９×１０２０～１×１０２１、０．９９×１０２１～１×１０２２、０．９９×１０２２～１×１０２３、０．９９×１０２３～１×１０２４、０．９９×１０２４～１×１０２５、０．９９×１０２５～１×１０２６、０．９９×１０２６～１×１０２７、０．９９×１０２７～１×１０２８、０．９９×１０２８～１×１０２９、０．９９×１０２９～１×１０３０、０．９９×１０３０～１×１０３１、０．９９×１０３１～１×１０３２、０．９９×１０３２～１×１０３３、０．９９×１０３３～１×１０３４、０．９９×１０３４～１×１０３５、０．９９×１０３５～１×１０３６、０．９９×１０３６～１×１０３７、０．９９×１０３７～１×１０３８、０．９９×１０３８～１×１０３９、０．９９×１０３９～１×１０４０、０．９９×１０４０～１×１０４１、０．９９×１０４１～１×１０４２、０．９９×１０４２～１×１０４３、０．９９×１０４３～１×１０４４、０．９９×１０４４～１×１０４５、０．９９×１０４５～１×１０４６、０．９９×１０４６～１×１０４７、０．９９×１０４７～１×１０４８、０．９９×１０４８～１×１０４９、０．９９×１０４９～１×１０５０、０．９９×１０５０～１×１０５１、０．９９×１０５１～１×１０５２、０．９９×１０５２～１×１０５３、０．９９×１０５３～１×１０５４、０．９９×１０５４～１×１０５５、０．９９×１０５５～１×１０５６、０．９９×１０５６～１×１０５７、０．９９×１０５７～１×１０５８、０．９９×１０５８～１×１０５９、０．９９×１０５９～１×１０６０、０．９９×１０６０～１×１０６１、０．９９×１０６１～１×１０６２、０．９９×１０６２～１×１０６３、０．９９×１０６３～１×１０６４、０．９９×１０６４～１×１０６５、０．９９×１０６５～１×１０６６、０．９９×１０６６～１×１０６７、０．９９×１０６７～１×１０６８、０．９９×１０６８～１×１０６９、０．９９×１０６９～１×１０７０、０．９９×１０７０～１×１０７１、０．９９×１０７１～１×１０７２、０．９９×１０７２～１×１０７３、０．９９×１０７３～１×１０７４、０．９９×１０７４～１×１０７５、０．９９×１０７５～１×１０７６、０．９９×１０７６～１×１０７７、０．９９×１０７７～１×１０７８、０．９９×１０７８～１×１０７９、０．９９×１０７９～１×１０８０、０．９９×１０８０～１×１０８１、０．９９×１０８１～１×１０８２、０．９９×１０８２～１×１０８３、０．９９×１０８３～１×１０８４、０．９９×１０８４～１×１０８５、０．９９×１０８５～１×１０８６、０．９９×１０８６～１×１０８７、０．９９×１０８７～１×１０８８、０．９９×１０８８～１×１０８９、０．９９×１０８９～１×１０９０、０．９９×１０９０～１×１０９１、０．９９×１０９１～１×１０９２、０．９９×１０９２～１×１０９３、０．９９×１０９３～１×１０９４、０．９９×１０９４～１×１０９５、０．９９×１０９５～１×１０９６、０．９９×１０９６～１×１０９７、０．９９×１０９７～１×１０９８、０．９９×１０９８～１

×１０９９、または０．９９×１０９９～１×１０１００のＡベータ断片または分子を含み得る。
一部の場合には、未編集のポリヌクレオチドは、配列番号３～１３に対して少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％の配列相同性を有するアミロイド前駆体タンパク質の少なくとも一部分をコードする。ＡＰＰ ｍＲＮＡ配列を標的とすることができる。ある実施形態では、本明細書で提供される組成物および方法を用いて特定の残基を標的とすることができる。特定の残基は、表２、図７および図８で提供されるものなどの野生型配列と比較して点突然変異を含み得る。一部の場合には、本明細書で提供される組成物および方法を用いて、配列の３，５８３残基のいずれか１つを標的とすることができる。一部の場合には、標的残基は、残基１～１００、９９～２００、１９９～３００、２９９～４００、３９９～５００、４９９～６００、５９９～７００、６９９～８００、７９９～９００、８９９～１０００、９９９～１１００、１０９９～１２００、１１９９～１３００、１２９９～１４００、１３９９～１５００、１４９９～１６００、１５９９～１７００、１６９９～１８００、１７９９～１９００、１８９９～２０００、１９９９～２１００、２０９９～２２００、２１９９～２３００、２２９９～２４００、２３９９～２５００、２４９９～２６００、２５９９～２７００、２６９９～２８００、２７９９～２９００、２８９９～３０００、２９９９～３１００、３０９９～３２００、３１９９～３３００、３２９９～３４００、３３９９～３５８３、またはこれらの任意の組合せの中に位置し得る。標的残基は、残基６６９、６７０、６７１、６７２、６７３、６７４、６７５、６７６、６７７、６７８、６７９、６８０、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、６８６、６８７、６８８、６８９、６９０、６９１、６９２、６９３、６９４、６９５、６９６、６９７、６９８、６９９、７００、７０１、７０２、７０３、７０４、７０５、７０６、７０７、７０８、７０９、７１０、７１１、７１２、７１３、および／または７１４に位置し得る。一部の実施形態では、本明細書で開示される操作されたポリヌクレオチドは、ＡＰＰ中のセクレターゼ酵素切断部位を標的とし、前記切断部位を編集して、セクレターゼ酵素（例えば、ベータセクレターゼ、例えば、ＢＡＣＥ１、カテプシンＢまたはメプリンベータ）によるＡＰＰのプロセシングおよび切断をモジュレートすることができる。操作されたポリヌクレオチドによる標的となり得る特定の残基の例が表３で提供される。
Figure 2023504314000033
Figure 2023504314000034
Figure 2023504314000035
一部の場合には、プロテアーゼ切断に対する感受性の変更は、プロテアーゼによる感受性低下を含む。一部の場合には、プロテアーゼ切断に対する感受性低下は、ベータ－セクレターゼにより切断される位置での切断に対する感受性低下を含む。プロテアーゼによる感受性低下は、野生型対照のものの０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、０．０００９９％～０．０１％、０．００９９％～０．１％、０．０９９％～１％、０．９９％～１０％、９．９９％～２０％、１９．９９％～３０％、２９．９９％～４０％、３９．９９％～５０％、４９．９９％～６０％、５９．９９％～７０％、６９．９９％～８０％、または７９．９９％～９０％であり得る。プロテアーゼによる感受性低下はまた、野生型対照のものの１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、または６０％であり得る。一部の場合には、プロテアーゼ切断に対する感受性低下は、ベータ－セクレターゼ（例えば、ＢＡＣＥ１、カテプシンＢまたはメプリンベータ）により切断される位置での切断に対する感受性低下を含む。一部の場合には、切断に対する感受性低下は、アミロイド前駆体タンパク質の１つまたは複数の切断部位での低下である。一部の場合には、切断に対する感受性低下は、図５に示されているようにアミロイド前駆体タンパク質のβ位またはβ’位でのものである。一部の場合には、切断に対する感受性低下は、β部位でのものである。例えば、本開示の操作されたガイドＲＮＡを投与すると、操作されたガイドＲＮＡは、ＡＰＰ中のβ切断部位のＡＤＡＲ媒介編集をもたらし、その結果、β切断部位でベータ－セクレターゼ（例えば、ＢＡＣＥ１、カテプシンＢまたはメプリンベータ）によるＡＰＰの切断が低減されることになる。
一部の場合には、プロテアーゼ切断に対する感受性の変更は、感受性の増強を含む。プロテアーゼによる感受性の増強は、野生型対照のものの１倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１１倍、少なくとも１２倍、少なくとも１３倍、少なくとも１４倍、少なくとも１５倍、少なくとも１６倍、少なくとも１７倍、少なくとも１８倍、少なくとも１９倍、少なくとも２０倍、少なくとも２１倍、少なくとも２２倍、少なくとも２３倍、少なくとも２４倍、少なくとも２５倍、少なくとも２６倍、少なくとも２７倍、少なくとも２８倍、少なくとも２９倍、少なくとも３０倍、少なくとも３１倍、少なくとも３２倍、少なくとも３３倍、少なくとも３４倍、少なくとも３５倍、少なくとも３６倍、少なくとも３７倍、少なくとも３８倍、少なくとも３９倍、少なくとも４０倍、少なくとも４１倍、少なくとも４２倍、少なくとも４３倍、少なくとも４４倍、少なくとも４５倍、少なくとも４６倍、少なくとも４７倍、少なくとも４８倍、少なくとも４９倍、少なくとも５０倍、少なくとも５１倍、少なくとも５２倍、少なくとも５３倍、少なくとも５４倍、少なくとも５５倍、少なくとも５６倍、少なくとも５７倍、少なくとも５８倍、少なくとも５９倍、少なくとも６０倍、少なくとも６１倍、少なくとも６２倍、少なくとも６３倍、少なくとも６４倍、少なくとも６５倍、少なくとも６６倍、少なくとも６７倍、少なくとも６８倍、少なくとも６９倍、少なくとも７０倍、少なくとも７１倍、少なくとも７２倍、少なくとも７３倍、少なくとも７４倍、少なくとも７５倍、少なくとも７６倍、少なくとも７７倍、少なくとも７８倍、少なくとも７９倍、少なくとも８０倍、少なくとも８１倍、少なくとも８２倍、少なくとも８３倍、少なくとも８４倍、少なくとも８５倍、少なくとも８６倍、少なくとも８７倍、少なくとも８８倍、少なくとも８９倍、少なくとも９０倍、少なくとも９１倍、少なくとも９２倍、少なくとも９３倍、少なくとも９４倍、少なくとも９５倍、少なくとも９６倍、少なくとも９７倍、少なくとも９８倍、少なくとも９９倍、少なくとも１００倍、１～２０倍、２～２１倍、３～２２倍、４～２３倍、５～２４倍、６～２５倍、７～２６倍、８～２７倍、９～２８倍、１０～２９倍、１１～３０倍、１２～３１倍、１３～３２倍、１４～３３倍、１５～３４倍、１６～３５倍、１７～３６倍、１８～３７倍、１９～３８倍、２０～３９倍、２１～４０倍、２２～４１倍、２３～４２倍、２４～４３倍、２５～４４倍、２６～４５倍、２７～４６倍、２８～４７倍、２９～４８倍、３０～４９倍、３１～５０倍、３２～５１倍、３３～５２倍、３４～５３倍、３５～５４倍、３６～５５倍、３７～５６倍、３８～５７倍、３９～５８倍、４０～５９倍、４１～６０倍、４２～６１倍、４３～６２倍、４４～６３倍、４５～６４倍、４６～６５倍、４７～６６倍、４８～６７倍、４９～６８倍、５０～６９倍、５１～７０倍、５２～７１倍、５３～７２倍、５４～７３倍、５５～７４倍、５６～７５倍、５７～７６倍、５８～７７倍、５９～７８倍、６０～７９倍、６１～８０倍、６２～８１倍、６３～８２倍、６４～８３倍、６５～８４倍、６６～８５倍、６７～８６倍、６８～８７倍、６９～８８倍、７０～８９倍、７１～９０倍、７２～９１倍、７３～９２倍、７４～９３倍、７５～９４倍、７６～９５倍、７７～９６倍、７８～９７倍、７９～９８倍、８０～９９倍、または８１～１００倍であり得る。一部の場合には、プロテアーゼ切断に対する感受性の増強は、α－セクレターゼまたはγ－セクレターゼにより切断される位置での切断に対する感受性の増強を含む。一部の場合には、切断に対する感受性の増強は、図５に示されているようにアミロイド前駆体タンパク質のα部位に存在する。
一部の場合には、プロテアーゼ切断に対する感受性の変更は、ある切断部位（例えば、β部位またはβ’部位）での切断に対する感受性の低下および別の部位（例えば、α部位）での切断に対する感受性の増強を含み、β部位、β’部位およびα部位は、図５に示されている通りである。しかるが故に、本開示の操作されたポリヌクレオチドは、β部位を標的としてベータ－セクレターゼ（例えば、ＢＡＣＥ１、カテプシンＢまたはメプリンベータ）切断を減少させることができる。加えて、または代替的に、本開示の操作されたポリヌクレオチドは、α部位を標的としてアルファセクレターゼによる切断を増加させることによって、ベータ－セクレターゼ（例えば、ＢＡＣＥ１、カテプシンＢまたはメプリンベータ）切断を間接的に低減させることができる。α部位およびβ部位を標的とする１つより多くの操作されたポリヌクレオチドを有する組成物が企図され、それによってマルチプレックス型療法が可能になる。一部の場合には、改変されたアミロイド前駆体タンパク質は、複数のアミノ酸置換を含有する。一部の場合には、複数のアミノ酸置換は、異なる切断部位に近接している。近接または近接しているとは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、または５００ヌクレオチド離れていることを意味し得る。
一部の実施形態では、本明細書で開示される操作されたポリヌクレオチドは、ＡＰＰ中のセクレターゼ酵素切断部位を標的とし、前記切断部位を編集して、セクレターゼ酵素（例えば、ベータセクレターゼ、例えば、ＢＡＣＥ１、カテプシンＢまたはメプリンベータ）によるＡＰＰのプロセシングおよび切断をモジュレートすることができる。一部の場合には、改変されたアミロイド前駆体タンパク質は、未編集のアミロイド前駆体タンパク質と比較してアミノ酸の置換を含む。本開示は、未編集のＡＰＰと比較して改変されたＡＰＰ中のアミノ酸を標的とし、その置換を媒介する、操作されたガイドＲＮＡを提供する。そのような置換は、開示される操作されたガイドＲＮＡを使用するＡＤＡＲ媒介ＲＮＡ編集によって行われる。一部の場合には、置換は、アミロイド前駆体タンパク質の切断部位に近接している位置に存在する。一部の場合には、置換は、切断部位から最大で２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸離れている位置に存在する。一部の場合には、置換は、切断部位から最大で５アミノ酸離れている位置に存在する。一部の場合には、置換は、切断部位から最大で３アミノ酸離れている位置に存在する。一部の場合には、置換は、切断部位から最大で２アミノ酸離れている位置に存在する。一部の場合には、置換は、切断部位と同じアミノ酸位置に存在する。一部の場合には、置換は、切断部位から最大で５、１０、１５、２０または２５オングストロームの位置に存在する。一部の場合には、切断部位からの距離は、折り畳まれたアミロイド前駆体タンパク質で測定される。一部の場合には、切断部位は、β部位である。一部の場合には、切断部位は、β’部位である。一部の場合には、切断部位は、α部位である。一部の場合には、切断部位は、γ部位である。一部の場合には、切断部位は、β部位、β’部位、α部位、γ部位、またはこれらの任意の組合せである。本開示の操作されたガイドポリヌクレオチドは、ＡベータポリペプチドをコードするｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ前駆体またはｍＲＮＡ）のＡＤＡＲ媒介編集によりβ部位、β’部位、α部位、γ部位、またはこれらの任意の組合せの編集を助長することができ、編集により影響を受けるアミノ酸の置換は、β部位、β’部位、α部位、γ部位、またはこれらの任意の組合せから２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸までに存在する。
一部の場合には、アミノ酸の置換は、アミノ酸の電荷、疎水性もしくは極性の変化、またはこれらの任意の組合せをもたらす置換を含む。一部の場合には、アミノ酸の置換は、アミノ酸の電荷の変化をもたらす置換を含む。一部の場合には、電荷の変化は、正から負へ、負から正へ、中性から正へ、または中性から負へのものである。一部の場合には、アミノ酸の置換は、保存的置換を含む。一部の場合には、アミノ酸の置換は、電荷中性置換を含む。一部の場合には、アミノ酸の置換は、ラジカル置換を含む。一部の場合には、アミノ酸の変化は、ＫからＥへの変化、ＫからＲへの変化、ＫからＧへの変化、ＭからＶへの変化、ＤからＧへの変化、ＥからＧへの変化、ＨからＲへの変化、またはこれらの任意の組合せを含む。
一部の場合には、アミノ酸の置換は、アミロイド前駆体タンパク質の６７０、６７１、６７２、６７３、６８２、６８４、６８７、７１２または７１４位に対応する位置に存在する。一部の場合には、アミノ酸の置換は、アミロイド前駆体タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の６７０、６７１、６７２、６７３、６８２、６８４、６８７、７１２または７１４位に対応する位置に存在する。一部の場合には、アミノ酸の置換は、配列番号２のアミロイド前駆体タンパク質の６７０、６７１、６７２、６７３、６８２、６８４、６８７、７１２または７１４位に対応する位置に存在する。一部の場合には、アミノ酸の置換は、スミス－ウォーターマンアラインメントアルゴリズムにより判定して配列番号２のアミロイド前駆体タンパク質の６７０、６７１、６７２、６７３、６８２、６８４、６８７、７１２または７１４位に対応する位置に存在する。一部の場合には、置換は、アミロイド前駆体タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の６７０または６７１位に対応する位置に存在する。一部の場合には、改変されたアミロイド前駆体タンパク質は、アミロイド前駆体タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の６７０または６７１位に対応する置換を含む。一部の場合には、置換は、アミロイド前駆体タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の６７０位に対応する位置に存在する。一部の場合には、置換は、アミロイド前駆体タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の６７１位に対応する位置に存在する。
一部の場合には、改変されたアミロイド前駆体タンパク質は、複数のアミノ酸置換を含む。一部の場合には、改変されたアミロイド前駆体タンパク質は、アミロイド前駆体タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の６７０または６７１位に対応する位置でのアミノ酸置換、および追加の置換を含む。一部の場合には、改変されたアミロイド前駆体タンパク質は、アミロイド前駆体タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の６７０または６７１位に対応する位置でのアミノ酸置換、および追加の置換を含む。一部の場合には、改変されたアミロイド前駆体タンパク質は、アミロイド前駆体タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の６７０位に対応する位置でのアミノ酸置換、および追加の置換を含む。一部の場合には、改変されたアミロイド前駆体タンパク質は、アミロイド前駆体タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の６７１位に対応する位置でのアミノ酸置換、および追加の置換を含む。一部の場合には、追加のアミノ酸の置換は、アミロイド前駆体タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の６７０、６７１、６７２、６７３、６８２、６８４、６８７、７１２または７１４位に対応する位置に存在する。
一部の場合には、アミロイド前駆体タンパク質をコードする改変されたポリヌクレオチド配列のアミノ酸置換は、Ｋ６７０Ｅ、Ｋ６７０Ｒ、Ｋ６７０Ｇ、Ｍ６７１Ｖ、Ｄ６７２Ｇ、Ｅ６８２Ｇ、Ｈ６８４Ｒ、Ｋ６８７Ｒ、Ｋ６８７Ｅ、またはＫ６８７Ｇを含み、この位置は、スミス－ウォーターマンアラインメントアルゴリズムにより判定して、改変されたアミロイド前駆体タンパク質の配列と配列番号２のアミロイド前駆体タンパク質とを比較することにより決定される。一部の場合には、アミロイド前駆体タンパク質は、配列番号２のアミロイド前駆体タンパク質である。一部の場合には、アミノ酸置換は、Ｋ６７０ＧまたはＭ６７１Ｖを含む。一部の場合には、アミノ酸置換は、Ｋ６７０Ｇを含む。一部の場合には、アミノ酸置換は、Ｍ６７１Ｖを含む。
一部の場合には、操作されたガイドＲＮＡは、アミロイド前駆体タンパク質を少なくとも部分的にコードするポリヌクレオチドにおける編集を助長する。一部の場合には、操作されたガイドＲＮＡは、ポリヌクレオチドの少なくとも一部分に少なくとも部分的に相補的である。一部の場合には、操作されたポリヌクレオチドの少なくとも一部分は、標的となるポリヌクレオチド／ＲＮＡと少なくとも部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドを形成する。この少なくとも部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）基質と呼ばれることもある。例えば、操作されたガイドＲＮＡは、ＡＰＰをコードするポリヌクレオチドの配列にハイブリダイズする配列を有し得る。二本鎖オリゴヌクレオチドまたはｄｓＲＮＡ基質は、ＡＰＰをコードするポリヌクレオチドの配列への操作されたガイドＲＮＡの配列のハイブリダイゼーションによって形成される配列および構造を指す。二本鎖オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの配列と操作されたガイドＲＮＡの対応する配列との単一の塩基ミスマッチを含み得る。単一の塩基ミスマッチは、編集される標的塩基、例えば、ＲＮＡ編集タンパク質により編集される標的ポリヌクレオチド中のアデノシンにおけるものであり得る。一部の場合には、操作されたガイドＲＮＡは、編集タンパク質（例えば、ＡＤＡＲなどのＲＮＡ編集タンパク質）と会合する。一部の場合には、少なくとも部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドと会合している編集タンパク質は、編集タンパク質を動員することができる。ＲＮＡ編集タンパク質（例えば、ＡＤＡＲ）は、１本または２本のポリペプチド鎖を含み得る。２本のポリペプチド鎖は、同一であることがある。２本のポリペプチド鎖は、同一でないこともある。２本のＡＤＡＲポリペプチド鎖は、ホモ二量体を形成し得る。２本のＡＤＡＲポリペプチド鎖は、ヘテロ二量体を形成し得る。少なくとも部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドの形成時に、ホモ二量体またはヘテロ二量体の第１の単量体（ポリペプチド鎖の一方）は、少なくとも部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドと会合し、続いてホモ二量体またはヘテロ二量体の第２の単量体（他方のポリペプチド鎖）と会合し得る。一部の実施形態では、あらかじめ形成されたホモ二量体またはヘテロ二量体が、少なくとも部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドと会合する。一部の場合には、ＡＤＡＲの単量体が、少なくとも部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドと会合し得る。他の場合には、第１の単量体および第２の単量体は、独立して、少なくとも部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドに結合し得る。少なくとも部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドに結合することによって、第１および第２の単量体は、ホモ二量体またはヘテロ二量体を形成し得る。一部の場合には、編集タンパク質は、本明細書で提供される操作されたポリヌクレオチドに結合すると、標的となるポリヌクレオチド／ＲＮＡ中のヌクレオチドの塩基を改変する。詳細には、編集タンパク質は、ＲＮＡ編集タンパク質であり、標的ＲＮＡ中のＲＮＡヌクレオチドのＲＮＡ塩基を改変する。一部の場合には、塩基の改変は、改変されたアミロイド前駆体タンパク質を少なくとも部分的にコードする改変されたポリヌクレオチドを生じさせる。
一部の場合には、本明細書で開示される操作されたガイドＲＮＡは、アミロイド前駆体タンパク質のセクレターゼ切断部位に近接しているアミノ酸をコードするコドンに含まれているヌクレオチドの塩基の編集（例えば、ＡＤＡＲによる）を助長する。アミロイド前駆体タンパク質のセクレターゼ切断部位に近接しているアミノ酸は、本明細書で提供されるアミノ酸のいずれかであり得る。一部の場合には、ヌクレオチドの塩基は、アミロイド前駆体タンパク質のアルファ－セクレターゼ切断部位、ベータ－セクレターゼ切断部位（例えば、βまたはβ’切断部位）もしくはガンマ－セクレターゼ切断部位またはこれらの任意の組合せに近接しているアミノ酸をコードするコドンに含まれている。一部の実施形態では、ヌクレオチドの塩基は、βまたはβ’切断部位に近接しているアミノ酸をコードするコドンに含まれている。一部の場合には、本明細書で開示される操作されたガイドＲＮＡは、アミロイド前駆体をコードする配列の６７０、６７１、６７２、６７３、６８２、６８４、６８７、７１２または７１４位に対応する位置に近接しているアミノ酸をコードするコドンに含まれているヌクレオチドの塩基の編集（例えば、ＡＤＡＲによる）を助長する。一部の場合には、本明細書で開示される操作されたガイドＲＮＡは、スミス－ウォーターマンアラインメントアルゴリズムにより判定して配列番号２のアミロイド前駆体タンパク質の６７０、６７１、６７２、６７３、６８２、６８４、６８７、７１２または７１４位に対応する位置に近接しているアミノ酸をコードするコドンに含まれているヌクレオチドの塩基の編集（例えば、ＡＤＡＲによる）を助長する。一部の場合には、ヌクレオチドの塩基は、スミス－ウォーターマンアラインメントアルゴリズムにより判定して配列番号２のアミロイド前駆体タンパク質の６７０、６７１、６７２、６７３、６８２、６８４、６８７、７１２または７１４位に対応する位置のアミノ酸をコードするコドンに含まれている。ヌクレオチドの塩基は、スミス－ウォーターマンアラインメントアルゴリズムにより判定して配列番号２のアミロイド前駆体タンパク質の６７０位に対応する位置のアミノ酸をコードするコドンに含まれていることがある。ヌクレオチドの塩基は、スミス－ウォーターマンアラインメントアルゴリズムにより判定して配列番号２のアミロイド前駆体タンパク質の６７１位に対応する位置のアミノ酸をコードするコドンに含まれていることがある。一部の場合には、ヌクレオチドの塩基の改変によって、改変されたＲＮＡから翻訳された改変されたアミロイド前駆体タンパク質のアミノ酸配列は、未編集のＲＮＡから翻訳されたアミロイド前駆体タンパク質と比較して変化することになる。アミノ酸の変化は、本明細書で提供されるアミノ酸置換のいずれかであり得る。
一部の場合には、操作されたガイドＲＮＡおよびポリヌクレオチドと会合している編集タンパク質は、ポリヌクレオチドの第２のヌクレオチドの第２の塩基を改変する。一部の実施形態では、第１および第２のヌクレオチドは、同じコドンに属し得る。一部の場合には、第１および第２のヌクレオチドは、２つの異なるコドンに属し得る。一部の事例では、第１のヌクレオチドおよび第２のヌクレオチドは、連続している。
一部の場合には、本開示の操作されたガイドＲＮＡは、ＲＮＡ編集タンパク質（例えばＡＤＡＲ）によってＡＰＰをコードするポリヌクレオチドを改変する。ポリヌクレオチドの配列におけるヌクレオチドの塩基の前記改変は、化学的改変である。一部の場合には、化学的改変は、脱アミノ化である。一部の場合には、改変によって、細胞の翻訳機構が元の未編集の塩基を異なる塩基として読み取ることになる。一部の場合には、塩基は、アデノシンである。一部の場合には、塩基はアデノシンであり、本開示の操作されたガイドＲＮＡは、アデノシンのイノシンへの改変を助長する。一部の場合には、塩基はアデノシンであり、本開示の操作されたガイドＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員し、それによってアデノシンがイノシンに改変される。
一部の場合には、アミロイド前駆体タンパク質を少なくとも部分的にコードするポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ前駆体である。一部の場合には、ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡである。一部の場合には、ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡ前駆体である。一部の場合には、アミロイド前駆体タンパク質を少なくとも部分的にコードするポリヌクレオチドは、ＤＮＡである。例えば、本開示の操作されたガイドＲＮＡは、ＡＤＡＲなどのＲＮＡ編集タンパク質をｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ前駆体に動員することおよびアデノシンをイノシンに改変することにより、ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ前駆体の編集を助長し得る。例えば、本開示の操作されたガイドＲＮＡは、ＡＤＡＲなどのＲＮＡ編集タンパク質をｍＲＮＡに動員することおよびアデノシンをイノシンに改変することにより、ｍＲＮＡの編集を助長し得る。例えば、本開示の操作されたガイドＲＮＡは、ＡＤＡＲなどのＲＮＡ編集タンパク質をｍＲＮＡ前駆体に動員することおよびアデノシンをイノシンに改変することにより、ｍＲＮＡ前駆体の編集を助長し得る。
一部の場合には、改変されたポリヌクレオチドによりコードされる改変されたアミロイド前駆体タンパク質は、操作されたガイドＲＮＡにより助長された場合、プロテアーゼが、未編集のアミロイド前駆体タンパク質と比較して改変されたアミロイド前駆体タンパク質に対して低い活性を有する場合であっても、他の基質のプロテアーゼ切断を別様に阻害しない。例えば、本開示の操作されたガイドＲＮＡは、ＡＰＰ中のベータ－セクレターゼ（例えば、ＢＡＣＥ１、カテプシンＢまたはメプリンベータ）切断部位切断部位での切断の低減をもたらす、ＡＰＰにおける編集を助長することがある一方で、ベータ－セクレターゼ（例えば、ＢＡＣＥ１、カテプシンＢまたはメプリンベータ）の他の内在性標的に対するベータ－セクレターゼ（例えば、ＢＡＣＥ１、カテプシンＢまたはメプリンベータ）切断活性を減弱させないことがある。このことは、ａ）改変されたアミロイド前駆体タンパク質を発現する細胞、およびｂ）未編集のアミロイド前駆体タンパク質を発現する細胞におけるベータ－セクレターゼ（例えば、ＢＡＣＥ１、カテプシンＢまたはメプリンベータ）の他のそのような内在性標的の切断代謝物の量を突き止めること、およびそれらの値を比較することによって、測定することができる。必要に応じて、それらの値を、各細胞における内在性タンパク質発現に、または別の好適なマーカーに正規化することができる。ベータ－セクレターゼ（例えば、ＢＡＣＥ１、カテプシンＢまたはメプリンベータ）の他の内在性標的および切断代謝物の測定は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）または質量分析法の技法、例えばＬＣ－ＭＳもしくはＭＡＬＤＩを含むがこれらに限定されない、様々なｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにより行うことができる。プロテアーゼ活性を示す代謝物の測定に好適であり得る、ベータ－セクレターゼの他の内在性標的の非限定的な例：アミロイド様タンパク質１（ＡＰＬＰ１）、アミロイド様タンパク質２（ＡＰＬＰ２）、コンタクチン２、Ｊａｇｇｅｄ １、神経細胞接着分子Ｌ１（ＣＨＬ１）、ニューレキシン１α、ニューレキシン３β、ニューレグリン１（ＮＲＧ１）、発作関連タンパク質６（ＳＥＺ６）、発作関連タンパク質６前駆体タンパク質（ＳＥＺ６Ｌ）、電位依存性ナトリウムイオンチャネル（ＶＧＳＣ）サブタイプＮａｖ１のβ（β１－４）補助サブユニット、ＶＧＳＣ補助サブユニットＫＣＮＥ１もしくはＫＣＮＥ２、これらのいずれかの機能的部分、またはそれらの任意の組合せ。一部の場合には、ベータセクレターゼ活性が阻害された程度を判定するために調査される内在性基質は、ＮＲＧ１、ＳＥＺ６、またはＣＨＬ１である。
一部の場合には、アミロイド前駆体タンパク質の少なくとも一部分をコードするポリヌクレオチドに含まれているヌクレオチドの塩基に対する改変を助長することができる操作されたガイドＲＮＡは、未編集のポリヌクレオチドと比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含む改変されたアミロイド前駆体タンパク質を生じさせる。一部の場合には、改変されたアミロイド前駆体タンパク質（切断部位切断部位の改変を有する）は、ベータ－セクレターゼ（例えば、ＢＡＣＥ１、カテプシンＢもしくはメプリンベータ）により切断されたときにＡベータ４０、Ａベータ４２の、または細胞において発現されたときに未編集のアミロイド前駆体タンパク質を発現する対応する細胞と同等の期間にわたって比較して両方の、より少ない量を生じさせる。一部の場合には、Ａベータ４０、Ａベータ４２または両方の量は、Ａベータ４０もしくはＡベータ４２ ＥＬＩＳＡ、または両方により測定される。一部の場合には、改変されたアミロイド前駆体タンパク質は、未編集のアミロイド前駆体タンパク質と同等の期間にわたって比較して、細胞に発現されたときに増加した量の分泌型細胞外ドメインＡＰＰアルファ（ｓＡＰＰａ）を生じさせる。一部の場合には、ｓＡＰＰａまたはベータ－ＣＯＯＨ末端断片の量は、ｓＡＰＰａ ＥＬＩＳＡにより測定される。一部の場合には、Ａベータ４０、Ａベータ４２または両方の量、およびｓＡＰＰａの量が測定される。本開示の操作されたガイドＲＮＡを使用して、ＡＰＰ中のベータ－セクレターゼ（例えば、ＢＡＣＥ１、カテプシンＢもしくはメプリンベータ）切断部位での編集を助長することができ、その結果、Ａベータ４０およびＡベータ４２代謝物の産生が減少されることになる。一部の実施形態では、本明細書で開示される操作されたガイドＲＮＡおよび前記操作されたガイドＲＮＡを使用する方法は、未編集のＡＰＰのベータ－セクレターゼ（例えば、ＢＡＣＥ１、カテプシンＢもしくはメプリンベータ）切断によって生成されるものと比較して、Ａベータ４０、４２または両方のタンパク質レベルを１／１以下、１／２以下、１／３以下、１／４以下、１／５以下、１／６以下、１／７以下、１／８以下、１／９以下、１／１０以下、１／１１以下、１／１２以下、１／１３以下、１／１４以下、１／１５以下、１／１６以下、１／１７以下、１／１８以下、１／１９以下、１／２０以下、１／２１以下、１／２２以下、１／２３以下、１／２４以下、１／２５以下、１／２６以下、１／２７以下、１／２８以下、１／２９以下、１／３０以下、１／３１以下、１／３２以下、１／３３以下、１／３４以下、１／３５以下、１／３６以下、１／３７以下、１／３８以下、１／３９以下、１／４０以下、１／４１以下、１／４２以下、１／４３以下、１／４４以下、１／４５以下、１／４６以下、１／４７以下、１／４８以下、１／４９以下、１／５０以下、１／５１以下、１／５２以下、１／５３以下、１／５４以下、１／５５以下、１／５６以下、１／５７以下、１／５８以下、１／５９以下、１／６０以下、１／６１以下、１／６２以下、１／６３以下、１／６４以下、１／６５以下、１／６６以下、１／６７以下、１／６８以下、１／６９以下、１／７０以下、１／７１以下、１／７２以下、１／７３以下、１／７４以下、１／７５以下、１／７６以下、１／７７以下、１／７８以下、１／７９以下、１／８０以下、１／８１以下、１／８２以下、１／８３以下、１／８４以下、１／８５以下、１／８６以下、１／８７以下、１／８８以下、１／８９以下、１／９０以下、１／９１以下、１／９２以下、１／９３以下、１／９４以下、１／９５以下、１／９６以下、１／９７以下、１／９８以下、１／９９以下、１／１００以下、１／１～１／２０、１／２～１／２１、１／３～１／２２、１／４～１／２３、１／５～１／２４、１／６～１／２５、１／７～１／２６、１／８～１／２７、１／９～１／２８、１／１０～１／２９、１／１１～１／３０、１／１２～１／３１、１／１３～１／３２、１／１４～１／３３、１／１５～１／３４、１／１６～１／３５、１／１７～１／３６、１／１８～１／３７、１／１９～１／３８、１／２０～１／３９、１／２１～１／４０、１／２２～１／４１、１／２３～１／４２、１／２４～１／４３、１／２５～１／４４、１／２６～１／４５、１／２７～１／４６、１／２８～１／４７、１／２９～１／４８、１／３０～１／４９、１／３１～１／５０、１／３２～１／５１、１／３３～１／５２、１／３４～１／５３、１／３５～１／５４、１／３６～１／５５、１／３７～１／５６、１／３８～１／５７、１／３９～１／５８、１／４０～１／５９、１／４１～１／６０、１／４２～１／６１、１／４３～１／６２、１／４４～１／６３、１／４５～１／６４、１／４６～１／６５、１／４７～１／６６、１／４８～１／６７、１／４９～１／６８、１／５０～１／６９、１／５１～１／７０、１／５２～１／７１、１／５３～１／７２、１／５４～１／７３、１／５５～１／７４、１／５６～１／７５、１／５７～１／７６、１／５８～１／７７、１／５９～１／７８、１／６０～１／７９、１／６１～１／８０、１／６２～１／８１、１／６３～１／８２、１／６４～１／８３、１／６５～１／８４、１／６６～１／８５、１／６７～１／８６、１／６８～１／８７、１／６９～１／８８、１／７０～１／８９、１／７１～１／９０、１／７２～１／９１、１／７３～１／９２、１／７４～１／９３、１／７５～１／９４、１／７６～１／９５、１／７７～１／９６、１／７８～１／９７、１／７９～１／９８、１／８０～１／９９、または１／８１～１／１００に減少させる結果となり得る。
ｍＲＮＡ塩基編集方法は、タンパク質（例えば、ＡＰＰ）のペプチド結合切断量の少なくとも部分的な低減をもたらすことができる。方法は、β部位、β’部位またはこれらの組合せを含む、ＢＡＣＥ切断部位などの切断部位を変更するステップを含み得る。方法は、ＡＰＰのＢＡＣＥ媒介分解を変更するステップを含み得る。ペプチド結合切断量の低減は、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンもしくはバリン、またはタンパク質に隣接して存在し得る。ペプチド結合切断量の低減は、タンパク質のメチオニンまたはアスパラギン酸に隣接して存在し得る。
ＡＰＰを標的とする操作されたヌクレオチドの有効性をモニターするための方法は、分子のＡＰＰ塩基編集効率、Ａベータ１、Ａベータ２、Ａベータ３、Ａベータ４、Ａベータ５、Ａベータ６、Ａベータ７、Ａベータ８、Ａベータ９、Ａベータ１０、Ａベータ１１、Ａベータ１２、Ａベータ１３、Ａベータ１４、Ａベータ１５、Ａベータ１６、Ａベータ１７、Ａベータ１８、Ａベータ１９、Ａベータ２０、Ａベータ２１、Ａベータ２２、Ａベータ２３、Ａベータ２４、Ａベータ２５、Ａベータ２６、Ａベータ２７、Ａベータ２８、Ａベータ２９、Ａベータ３０、Ａベータ３１、Ａベータ３２、Ａベータ３３、Ａベータ３４、Ａベータ３５、Ａベータ３６、Ａベータ３７、Ａベータ３８、Ａベータ３９、Ａベータ４０、Ａベータ４１、Ａベータ４２産生の低減を、十分なレベルのＡＰＰを天然に発現する細胞、ＡＰＰがノックアウトされるモデル細胞系、ＷＴ ＡＰＰがトランスフェクトされた細胞、または他の細胞型を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで実証するステップであって、他の細胞型が、ヒト神経芽腫細胞、ヒトｉＰＳＣおよびそれに由来する細胞型、ヒト神経前駆細胞およびそれに由来する細胞型、ＬＵＨＭＥＳ細胞、ＮＴｅｒａ－２細胞、ならびに／またはヒト化ＡＰＰ配列を含有するマウスから培養された初代細胞を含むがこれらに限定されない、ステップを含み得る。モデル細胞系は、２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、３Ｔ３マウス線維芽細胞、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２線維芽細胞、ＣＨＯ細胞など含むが、これらに限定されない。例示的な宿主細胞としては、ＨｅＬａ細胞（例えば、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）番号ＣＣＬ－２）、ＣＨＯ細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ９６１８、ＣＣＬ６１、ＣＲＬ９０９６）、２９３細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ－１５７３）、Ｖｅｒｏ細胞、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ－１６５８）、Ｈｕｈ－７細胞、ＢＨＫ細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ１０）、ＰＣ１２細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１７２１）、ＣＯＳ細胞、ＣＯＳ－７細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５１）、ＲＡＴ１細胞、マウスＬ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬＩ．３）、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７３）、ＨＬＨｅｐＧ２細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。
Ａベータオリゴマーは、アルツハイマー病の病態形成を開始させ得るが、それらの抑制は、疾患進行を軽減するのに十分ではあり得ない。不溶性ＡベータおよびＡベータ凝集体を標的とすることで、可溶性Ａベータのおよび／または同じく極めて有毒であるＣ末端断片の毒性を無視することができる。Ａベータの低減のみに伴う効果を期待することで、他の特定されている病原性ドライバー（例えば、ｐ－タウ、アルファ－シヌクレイン）を無視することができる。
一部の実施形態では、ＡＰＰ ｍＲＮＡの塩基の編集は、ＡＰＰポリペプチドの遺伝子翻訳の減少をもたらす。他の場合には、ＡＰＰ ｍＲＮＡの５’ＵＴＲの塩基の編集は、ＡＰＰポリペプチドの遺伝子翻訳の減少をもたらす。ＡＰＰポリペプチドの遺伝子翻訳の減少は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにより測定することができる。そのようなｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳アッセイを含み得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳アッセイは、細胞抽出物を含み得る。細胞抽出物は、ウサギ網状赤血球溶解物、コムギ胚芽抽出物、昆虫細胞、酵母Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、またはＥ ｃｏｌｉ無細胞抽出物を含み得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳アッセイは、細胞抽出物と核酸鋳型、ＡＴＰ、およびアミノ酸を混合することを含み得る。核酸鋳型は、ｍＲＮＡ鋳型またはｃＤＮＡ鋳型を含み得る。核酸鋳型は、表１または１３に収載されているｍＲＮＡ配列を含み得る。核酸鋳型は、表１または１３に収載されているｍＲＮＡ配列に相補的なｃＤＮＡ配列を含み得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳システムをｃＤＮＡ鋳型と共に使用すると、ｃＤＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によりｍＲＮＡに変換することができる。ｃＤＮＡを環状ベクター内に維持することができる。ｃＤＮＡを線状配列として維持することができる。
したがって、本明細書における組成物および方法に関して記載されるものなどの多標的併用療法は、アルツハイマー病に必要な疾患修飾を提供し得る。
タウ
タウタンパク質（タウ－ｐ）は、タウＭＡＰＴの６つのｍＲＮＡアイソフォームによりコードされる。タウ－ｐは、微小管の安定性および輸送に重要な微小管結合タンパク質である。それは、主として、ＣＮＳのニューロンに発現される。ヒトの脳における神経原線維変化（ＮＦＴ）に至る過剰リン酸化突然変異型タウタンパク質の凝集は、アルツハイマー病を含むタウオパチーと呼ばれる神経変性疾患群の原因となる。タンパク質分解的タウ切断断片（Ａベータ産生の下流で活性化される、カルパイン媒介タンパク質分解により形成され得る）もまた、直接神経毒性であり得る。したがって、タウ形成を実質的に低減させるためのマルチプレックス戦略は、神経変性疾患を有効に処置する上で重要であり得る。
ある実施形態では、本明細書で提供される組成物および方法を用いて特定の残基を標的とすることができる。完全タウｍＲＮＡ配列は、表４で示される。一部の場合には、この配列の６，６４４残基のいずれか１つの位置であり得る標的残基を、本明細書で提供される組成物および方法を用いて標的とすることができる。一部の場合には、標的残基は、タウｍＲＮＡの残基１～１００、９９～２００、１９９～３００、２９９～４００、３９９～５００、４９９～６００、５９９～７００、６９９～８００、７９９～９００、８９９～１０００、９９９～１１００、１０９９～１２００、１１９９～１３００、１２９９～１４００、１３９９～１５００、１４９９～１６００、１５９９～１７００、１６９９～１８００、１７９９～１９００、１８９９～２０００、１９９９～２１００、２０９９～２２００、２１９９～２３００、２２９９～２４００、２３９９～２５００、２４９９～２６００、２５９９～２７００、２６９９～２８００、２７９９～２９００、２８９９～３０００、２９９９～３１００、３０９９～３２００、３１９９～３３００、３２９９～３４００、３３９９～３５００、３４９９～３６００、３５９９～３７００、３６９９～３８００、３７９９～３９００、３８９９～４０００、３９９９～４１００、４０９９～４２００、４１９９～４３００、４２９９～４４００、４３９９～４５００、４４９９～４６００、４５９９～４７００、４６９９～４８００、４７９９～４９００、４８９９～５０００、４９９９～５１００、５０９９～５２００、５１９９～５３００、５２９９～５４００、５３９９～５５００、５４９９～５６００、５５９９～５７００、５６９９～５８００、５７９９～５９００、５８９９～６０００、５９９９～６１００、６０９９～６２００、６１９９～６３００、６２９９～６４００、６３９９～６４４４またはこれらの任意の組合せの中に位置し得る。
Figure 2023504314000036
Figure 2023504314000037
Figure 2023504314000038
Figure 2023504314000039
Figure 2023504314000040
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Figure 2023504314000042
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Figure 2023504314000054
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Figure 2023504314000067
一部の実施形態では、タウｍＲＮＡの塩基の編集は、タウポリペプチドの遺伝子翻訳の減少をもたらす。他の場合には、タウｍＲＮＡの５’ＵＴＲの塩基の編集は、タウポリペプチドの遺伝子翻訳の減少をもたらす。タウポリペプチドの遺伝子翻訳の減少は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにより測定することができる。そのようなｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳アッセイを含み得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳アッセイは、細胞抽出物を含み得る。細胞抽出物は、ウサギ網状赤血球溶解物、コムギ胚芽抽出物、昆虫細胞、酵母Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、またはＥ ｃｏｌｉ無細胞抽出物を含み得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳アッセイは、細胞抽出物と核酸鋳型、ＡＴＰ、およびアミノ酸を混合することを含み得る。核酸鋳型は、ｍＲＮＡ鋳型またはｃＤＮＡ鋳型を含み得る。核酸鋳型は、表４に収載されているｍＲＮＡ配列を含み得る。核酸鋳型は、表４に収載されているｍＲＮＡ配列に相補的なｃＤＮＡ配列を含み得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳システムをｃＤＮＡ鋳型と共に使用すると、ｃＤＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によりｍＲＮＡに変換することができる。ｃＤＮＡを環状ベクター内に維持することができる。ｃＤＮＡを線状配列として維持することができる。
表４のｍＲＮＡによりコードされるタウポリペプチドのリストは、表５に収載されている。
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Figure 2023504314000069
Figure 2023504314000070
Figure 2023504314000071
Figure 2023504314000072
Figure 2023504314000073
 アルファ－シヌクレイン（ＳＮＣＡ）
アルファ－シヌクレイン遺伝子は、５つのエクソンで構成されており、約１４．５ｋＤａの予測分子質量を有する１４０アミノ酸タンパク質をコードする。コードされる産物は、未知の機能を有する天然変性タンパク質である。通常、アルファ－シヌクレインは単量体である。ある特定のストレス条件または他の未知の原因のもとで、α－シヌクレインは、自己会合してオリゴマーになる。剖検で確定されたアルツハイマー病患者の脳の５０％より多くにおいてアルファ－シヌクレインから主として構成されている、レビー関連病態（ＬＲＰ）。アルファ－シヌクレインがアルツハイマー病の発症にどのような影響を与えるのかについての分子レベルの機序は不明確であるが、実験上の証拠は、アルファ－シヌクレインがタウ－ｐと相互作用し、タウ－ｐの細胞間凝集の原因となり得ることを示した。さらに、アルファ－シヌクレインは、タウ過剰リン酸化を媒介し得るＧＳＫ３βの活性を調整することができた。アルファ－シヌクレインはまた、自己集合して病原性凝集体（レビー小体）になり得る。タウとα－シヌクレインは両方とも、細胞外空間に放出され、他の細胞に拡散し得る。血管異常は、栄養素の補給および代謝副産物の除去を害し、微小梗塞の原因となり、グリア細胞の活性化を促進する。したがって、タウ形成、アルファ－シヌクレイン形成、またはこれらの組合せを実質的に低減させるためのマルチプレックス戦略は、神経変性疾患を有効に処置する上で重要であり得る。
アルファ－シヌクレインのドメイン構造は、Ｎ末端Ａ２脂質結合アルファ－ヘリックスドメイン、非アミロイドβ成分（ＮＡＣ）ドメイン、およびＣ末端酸性ドメインを含む。５つのＫＸＫＥＧＶ（配列番号１９４）不完全リピートからなる脂質結合ドメイン。ＮＡＣドメインは、ＶＧＧＡＶＶＴＧＶ（配列番号１９５）コンセンサス配列を有するＧＡＶモチーフ、および３つのＧＸＸＸサブモチーフ（ここでのＸは、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＭｅｔのいずれかである）からなる。Ｃ末端酸性ドメインは、ＤＰＤＮＥＡ（配列番号１９６）コンセンサス配列を有する銅結合モチーフを含有する。分子的には、アルファ－シヌクレインは、ニューロンのシグナル伝達およびＤＮＡ修復に関与することが示唆されている。完全ｍＲＮＡ配列は、表６で示される。
一部の場合には、本明細書で提供される組成物を用いて、アルファ－シヌクレインの領域を標的とすることができる。一部の場合には、本明細書で開示される操作されたポリヌクレオチドを用いて、アルファ－シヌクレインｍＲＮＡの領域をノックダウンの標的とすることができる。一部の場合には、アルファ－シヌクレインｍＲＮＡのエクソンまたはイントロンの領域を標的とすることができる。一部の実施形態では、５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲなどの、アルファ－シヌクレインｍＲＮＡの非コード配列の領域を、標的とすることができる。他の場合には、アルファ－シヌクレインｍＲＮＡのコード配列の領域を標的とすることができる。一部の場合には、ポリヌクレオチドは、表６の配列の少なくとも一部分にハイブリダイズすることができる標的化配列を含む。一部の場合には、ポリヌクレオチドは、標的となり得る表６の配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％の配列同一性を有する配列の少なくとも一部分にハイブリダイズすることができる標的化配列を含む。好適な領域としては、Ｎ末端Ａ２脂質結合アルファ－ヘリックスドメイン、非アミロイドβ成分（ＮＡＣ）ドメイン、またはＣ末端酸性ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。
一部の態様では、アルファ－シヌクレインｍＲＮＡ配列が標的とされる。一部の場合には、本明細書で提供される組成物および方法を用いて、配列の３，１７７残基のいずれか１つを標的とすることができる。一部の場合には、標的残基は、残基１～１００、９９～２００、１９９～３００、２９９～４００、３９９～５００、４９９～６００、５９９～７００、６９９～８００、７９９～９００、８９９～１０００、９９９～１１００、１０９９～１２００、１１９９～１３００、１２９９～１４００、１３９９～１５００、１４９９～１６００、１５９９～１７００、１６９９～１８００、１７９９～１９００、１８９９～２０００、１９９９～２１００、２０９９～２２００、２１９９～２３００、２２９９～２４００、２３９９～２５００、２４９９～２６００、２５９９～２７００、２６９９～２８００、２７９９～２９００、２８９９～３０００、２９９９～３１００、３０９９～３１７７、またはこれらの任意の組合せの中に位置し得る。
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Figure 2023504314000075
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一部の場合には、本明細書で提供される組成物を用いて、アルファ－シヌクレインポリペプチドの領域を標的とすることができる。好適な領域としては、Ｎ末端Ａ２脂質結合アルファ－ヘリックスドメイン、非アミロイドβ成分（ＮＡＣ）ドメイン、またはＣ末端酸性ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。
一部の態様では、アルファ－シヌクレインポリペプチド配列が標的とされ、完全ポリペプチド配列は、表７で示される。一部の場合には、本明細書で提供される組成物および方法を用いて、アイソフォーム配列の残基のいずれか１つを標的とすることができる。一部の場合には、標的残基は、残基１～１０、１０～２０、２０～４０、４０～６０、６０～８０、８０～１００、１００～１２０、または１２０～１４０、これらの重複部分、およびそれらの組合せの中に位置し得る。
Figure 2023504314000088
本明細書で提供される組成物を用いて標的とすることができる例示的な領域としては、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、および／または１４０のうちのいずれか１つである、ＳＮＣＡポリペプチド配列の標的残基を挙げることができるが、これらに限定されない。一部の場合には、標的となり得る例示的な残基は、Ｍ１、Ｖ４０、Ｋ８５、Ｓ１２５、Ｋ１２９、またはこれらの任意の組合せを含み得る。
一部の実施形態では、ＳＮＣＡ ｍＲＮＡの塩基の編集は、ＳＮＣＡポリペプチドの遺伝子翻訳の減少をもたらす。他の場合には、ＳＮＣＡ ｍＲＮＡの５’ＵＴＲの塩基の編集は、ＳＮＣＡポリペプチドの遺伝子翻訳の減少をもたらす。ＳＮＣＡポリペプチドの遺伝子翻訳の減少は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにより測定することができる。そのようなｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳アッセイを含み得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳アッセイは、細胞抽出物を含み得る。細胞抽出物は、ウサギ網状赤血球溶解物、コムギ胚芽抽出物、昆虫細胞、酵母Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、またはＥ ｃｏｌｉ無細胞抽出物を含み得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳アッセイは、細胞抽出物と核酸鋳型、ＡＴＰ、およびアミノ酸を混合することを含み得る。核酸鋳型は、ｍＲＮＡ鋳型またはｃＤＮＡ鋳型を含み得る。核酸鋳型は、表６に収載されているｍＲＮＡ配列を含み得る。核酸鋳型は、表６に収載されているｍＲＮＡ配列に相補的なｃＤＮＡ配列を含み得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳システムをｃＤＮＡ鋳型と共に使用すると、ｃＤＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によりｍＲＮＡに変換することができる。ｃＤＮＡを環状ベクター内に維持することができる。ｃＤＮＡを線状配列として維持することができる。
一部の場合には、ＳＮＣＡ ｍＲＮＡ前駆体またはｍＲＮＡに含まれているヌクレオチドの塩基の改変を助長することができる操作されたポリヌクレオチドは、ＳＮＣＡタンパク質の発現を下方調節またはノックダウンすることができる。一部の実施形態では、ＳＮＣＡ ｍＲＮＡ前駆体またはｍＲＮＡの編集は、ＳＮＣＡ ｍＲＮＡ前駆体またはｍＲＮＡの、スプライシング、ｍＲＮＡ核外輸送、ｍＲＮＡ局在、ｍＲＮＡ安定性、ｍＲＮＡ分解、ポリアデニル化、５’キャップ改変、メッセンジャーリボ核タンパク質（ｍＲＮＰ）の組立て、または翻訳を、阻害または下方調節することができる。一部の場合には、ＳＮＣＡ ｍＲＮＡ前駆体またはｍＲＮＡの編集は、未編集のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドと比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含むポリペプチドをコードする編集されたＳＮＣＡ ｍＲＮＡの生成をもたらすことがある。他の場合には、ＳＮＣＡ ｍＲＮＡ前駆体またはｍＲＮＡの編集は、未編集のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドと比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含むポリペプチドをコードする編集されたＳＮＣＡ ｍＲＮＡの生成をもたらさないこともある。一部の場合には、改変されたＳＮＣＡ ｍＲＮＡは、アミノ酸置換があるまたはない、ＳＮＣＡポリペプチドをコードすることができ、未編集のＳＮＣＡ ｍＲＮＡによりコードされるＳＮＣＡタンパク質より少ない量を有する。一部の場合には、アミノ酸置換があるまたはない、ＳＮＣＡポリペプチドの量は、ＳＮＣＡ ＥＬＩＳＡにより測定することができる。ある実施形態では、ＳＮＣＡポリペプチドまたはその断片のより少ない存在量は、少なくとももしくは多くとも約１／１、１／８、１／１５、１／２２、１／２９、１／３６、１／４３、１／５０、１／５７、１／６４、１／７１、１／７８、１／８５、１／９２、１／９９、１／１０６、１／１１３、１／１２０、１／１２７、１／１３４、１／１４１、１／１４８、１／１５５、１／１６２、１／１６９、１／１７６、１／１８３、１／１９０、１／１９７、１／２０４、１／２１１、１／２１８、１／２２５、１／２３２、１／２３９、１／２４６、１／２５３、１／２６０、１／２６７、１／２７４、１／２８１、１／２８８、１／２９５、または最少で約１／３５０であり得る。
ある実施形態では、ＳＮＣＡポリペプチドまたはその断片のより少ない存在量は、未編集のＳＮＣＡ ｍＲＮＡによりコードされるものと比較して、ＳＮＣＡのタンパク質レベルの少なくとももしくは多くとも約０．１～０．２倍、０．１９～０．３倍、０．２９～０．４倍、０．３９～０．５倍、０．４９～０．６倍、０．５９～０．７倍、０．６９～０．８倍、０．７９～０９倍、０．８９～１倍、０．９９～１倍、０．１～０．３倍、０．１～０．４倍、０．１～０．５倍、０．１～０．６倍、０．１～０．７倍、０．１～０．８倍、０．１～０．９倍、１／１～１／２０、１／２～１／２１、１／３～１／２２、１／４～１／２３、１／５～１／２４、１／６～１／２５、１／７～１／２６、１／８～１／２７、１／９～１／２８、１／１０～１／２９、１／１１～１／３０、１／１２～１／３１、１／１３～１／３２、１／１４～１／３３、１／１５～１／３４、１／１６～１／３５、１／１７～１／３６、１／１８～１／３７、１／１９～１／３８、１／２０～１／３９、１／２１～１／４０、１／２２～１／４１、１／２３～１／４２、１／２４～１／４３、１／２５～１／４４、１／２６～１／４５、１／２７～１／４６、１／２８～１／４７、１／２９～１／４８、１／３０～１／４９、１／３１～１／５０、１／３２～１／５１、１／３３～１／５２、１／３４～１／５３、１／３５～１／５４、１／３６～１／５５、１／３７～１／５６、１／３８～１／５７、１／３９～１／５８、１／４０～１／５９、１／４１～１／６０、１／４２～１／６１、１／４３～１／６２、１／４４～１／６３、１／４５～１／６４、１／４６～１／６５、１／４７～１／６６、１／４８～１／６７、１／４９～１／６８、１／５０～１／６９、１／５１～１／７０、１／５２～１／７１、１／５３～１／７２、１／５４～１／７３、１／５５～１／７４、１／５６～１／７５、１／５７～１／７６、１／５８～１／７７、１／５９～１／７８、１／６０～１／７９、１／６１～１／８０、１／６２～１／８１、１／６３～１／８２、１／６４～１／８３、１／６５～１／８４、１／６６～１／８５、１／６７～１／８６、１／６８～１／８７、１／６９～１／８８、１／７０～１／８９、１／７１～１／９０、１／７２～１／９１、１／７３～１／９２、１／７４～１／９３、１／７５～１／９４、１／７６～１／９５、１／７７～１／９６、１／７８～１／９７、１／７９～１／９８、１／８０～１／９９、または１／８１～１／１００への減少となり得る。
ＡＰＰのゲノム編集
一部の実施形態では、ゲノム編集を使用してＡＰＰ遺伝子を変更することができる。ゲノム編集は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ関連タンパク質、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、これらのいずれかの機能的部分、これらのいずれかの融合タンパク質、またはそれらの任意の組合せを含み得る。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ関連タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼを含み得る。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ関連タンパク質は、クラス１またはクラス２ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質を含み得る。クラス２ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ関連タンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質を含み得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ関連タンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃａｓ １２タンパク質、これらのいずれかの機能的部分、これらのいずれかの融合タンパク質、またはそれらの任意の組合せを含み得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ関連タンパク質は、野生型またはバリアントＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ関連タンパク質、これらのいずれかの機能的部分、これらのいずれかの融合タンパク質、またはそれらの任意の組合せを含み得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ関連タンパク質は、塩基エディターを含み得る。塩基エディターは、シチジンデアミナーゼ、デオキシアデノシンデアミナーゼ、これらのいずれかの機能的部分、これらのいずれかの融合タンパク質、またはそれらの任意の組合せを含み得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ関連タンパク質は、逆転写酵素を含み得る。逆転写酵素は、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ－ＭＬＶ）逆転写酵素またはトリ骨髄芽球ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素を含み得る。
本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ関連タンパク質は、それが結合されているガイドＲＮＡによってゲノム内の特定の標的ＤＮＡ配列に標的化される。ガイドＲＮＡは、標的ＤＮＡ内の標的配列に相補的である配列を含み、したがって、結合しているＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質を標的ＤＮＡ（標的配列）内の特定の位置に標的化する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ関連タンパク質は、特定の標的ＤＮＡ配列に標的化された場合、ゲノム内に一本鎖切断、２つの一本鎖切断、二本鎖切断、２つの二本鎖切断、またはこれらの任意の組合せを生じさせ得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ関連タンパク質は、特定の標的ＤＮＡ配列に標的化された場合、ゲノム内にいずれの切断も生じさせないこともある。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ関連タンパク質－ガイドＲＮＡ複合体は、ゲノム内で平滑末端化二本鎖切断、１塩基対（ｂｐ）の互い違いの切断、２ｂｐの互い違いの切断、２塩基対を超えての互い違いの切断、またはこれらの任意の組合せを行うことができる。二本鎖ＤＮＡ切断を末端結合機序または相同組換え修復によって修復することができる。二本鎖ＤＮＡ切断を二本鎖ドナーＤＮＡまたは一本鎖オリゴヌクレオチドドナーＤＮＡでの末端結合機序または相同組換え修復によって修復することもできる。ゲノム内の編集は、確率的なまたはあらかじめ選択された挿入、欠失、塩基置換、逆位、染色体転座、挿入を含み得る。
ガイドＲＮＡは、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、ダブルガイドＲＮＡ、または操作されたプライム編集ガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）を含み得る。ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含み得る。ｃｒＲＮＡは、標的ＤＮＡまたは遺伝子座の標的配列にハイブリダイズする標的化配列を含み得る。ｔｒａｃｒＲＮＡは、ステムループ構造を形成することができる配列を含み得る。そのようなステムループ構造は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ関連タンパク質に結合して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ関連タンパク質のヌクレアーゼ活性を活性化することができる。ｓｇＲＮＡは、１つのＲＮＡ分子内にｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含み得る。ダブルガイドＲＮＡは、２つのＲＮＡ分子内にｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含み得る。ｐｅｇＲＮＡは、ゲノム内のあらかじめ選択された編集または配列を含む配列を含み得る。そのような編集では、あらかじめ選択された配列は、ニックの入った／切断されたＤＮＡ鎖の切断され、遊離された３’末端にハイブリダイズしてプライマー－鋳型複合体を形成し、このニックの入った／切断されたＤＮＡ鎖の切断され、遊離され、ハイブリダイズされた３’末端は、プライマーとしての機能を果たすことができ、その一方で、ｐｅｇＲＮＡのあらかじめ選択された編集または配列は、逆転写を含むがこれに限定されないその後の反応の鋳型としての機能を果たすことができる。
サプレッサーｔＲＮＡでの病原性突然変異の抑制
一部の実施形態では、病原性突然変異を有するｍＲＮＡの翻訳は、操作されたアンチコドン領域を有する操作されたｔＲＮＡによって読み飛ばされることがある。例えば、野生型コドンは、アミノ酸Ａをコードすることができ、その一方で、病原性突然変異は、未成熟停止コドンをコードする突然変異コドンを作出することができる。操作されたｔＲＮＡは、停止コドンを認識することおよび読み飛ばすことができる操作されたアンチコドン領域を有することができる。一部の実施形態では、アンチコドンループ、アーム長、３２／３８位におけるｔＲＮＡ－リボソーム親和性、または他のｔＲＮＡ特徴を最適化して、操作されたｔＲＮＡのコドン使用頻度を増加させることができる。他の場合には、プロモーター、コピー数、または他の特徴を最適化して、操作されたｔＲＮＡのコドン使用頻度を増加させることもできる。一部の実施形態では、本開示の操作されたポリヌクレオチドを、それを必要とする対象に、サプレッサーｔＲＮＡと組み合わせて投与することができる。
ＲＮＡ編集によるＡＰＰ、タウ、ＳＮＣＡポリペプチドのリン酸化の操作
一部の実施形態では、標的ＲＮＡのＲＮＡ編集は、未編集の標的ＲＮＡによりコードされるポリペプチドと比較して、編集された標的ＲＮＡによりコードされるポリペプチドのリン酸化の量を増加させることもあり、または減少させることもある。ＲＮＡ編集は、内在性リン酸化部位の欠失をもたらすアミノ置換をもたらすことができる。内在性リン酸化は、ポリペプチド特異的抗体、リン酸化部位特異的抗体、リン酸化断片特異的抗体、リン酸化ポリペプチド特異的抗体、本明細書におけるおよびその任意の誘導体、または本明細書におけるおよびその任意の組合せにより同定することができる。他の場合、ポリペプチドのリン酸化部位は、コンピュータアルゴリズムにより同定することができる。リン酸化同定コンピュータアルゴリズムは、ＤＩＳＰＨＯＳ １．３、ＥＬＭ、ＧＰＳ、ＮｅｔＰｈｏｒｅｓｔ、ＮｅｔＰｈｏｓ、ＮｅｔｗｏｒＫＩＮ、Ｐ３ＤＢ、ＰＨＯＳＩＤＡ、ＰｈｏｓｐｈｏｒｅｇＤＢ、ＰｈｏｓｐｈｏＳｉｔｅＰｌｕｓ、ＰＲＥＤＩＫＩＮ、ＲＬＩＭＳ、Ｓｃａｎｓｉｔｅ、本明細書におけるおよびその任意の派生品、または本明細書におけるおよびその任意の組合せを含み得る。他の場合、ポリペプチドのリン酸化部位は、質量分析による本明細書におけるおよびその任意の誘導体、または本明細書におけるおよびその任意の組合せを含み得る。一部の実施形態では、ＲＮＡ編集は、内在性リン酸化部位の外側でのアミノ置換をもたらすことができる。内在性リン酸化部位の外側でのアミノ置換は、内在性リン酸化部位のリン酸化量を増加させることもあり、または減少させることもある。他の場合には、アミノ置換は、リン酸化部位を作出し得る。作出されたリン酸化部位は、本明細書においておよびそれについて記載される内在性リン酸化を同定することができる手段により同定することができる。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、リン酸化を模倣することができる。リン酸化の模倣体は、ホスホミメティックを含み得る。ホスホミメティックは、アスパラギン酸へのアミノ置換を含み得る。アスパラギン酸は、リン酸化したセリンを模倣し得る。
ポリペプチドのリン酸化は、ポリペプチドの酵素活性、安定性、細胞内局在、細胞外局在、タンパク質結合活性、オリゴマー化活性、酵素によるプロセシング、分泌、抗菌活性、分解、化学結合、または任意の内在性または人工的活性を増加させることもあり、または減少させることもある。一部の実施形態では、ポリペプチドのリン酸化は、異なるポリペプチドの酵素活性、安定性、細胞内局在、細胞外局在、タンパク質結合活性、オリゴマー化活性、酵素によるプロセシング、分泌、抗菌活性、分解、化学結合、または任意の内在性または人工的活性を増加させることもあり、または減少させることもある。
ポリペプチドのリン酸化は、ポリペプチド特異的抗体、リン酸化部位特異的抗体、リン酸化断片特異的抗体、リン酸化ポリペプチド特異的抗体を用いてウェスタンブロットにより測定することができる。他の場合には、ポリペプチドのリン酸化を質量分析により測定することができる。ポリペプチドのリン酸化を、本明細書においておよびそれについて記載されるポリペプチドの内在性機能により測定することもできる。一部の場合には、ポリペプチドのリン酸化は、放射性３２Ｐ標識ＡＴＰを使用してＡタンパク質を先ずリン酸化してｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにより測定することができる。
ＡＰＰまたはＡベータペプチドのリン酸化は、アルファ、ベータ、ベータ’、ガンマ－セクレターゼ、これらの任意の誘導体、またはそれらの任意の組合せによるＡＰＰまたはＡベータペプチドの酵素的切断を増加させることもあり、または減少させることもある。ＡＰＰまたはＡベータペプチドのリン酸化はまた、ＢＡＣＥ１、カテプシンＢまたはメプリンベータによるＡＰＰまたはＡベータペプチドの酵素的切断を増加させることもあり、または減少させることもある。他の場合には、ＡＰＰまたはＡベータペプチドのリン酸化は、ＡＰＰまたはＡベータペプチドのオリゴマー化またはＡＰＰ／Ａベータ結合能力を増大させることもあり、または低下させることもある。一部の場合には、ＡＰＰまたはＡベータペプチドのリン酸化は、ベータアミロイド斑の形成、凝集または安定性を増大させることもあり、または低下させることもある。
リン酸化部位は、配列番号２、１４または１５の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５０１、５０２、５０３、５０４、５０５、５０６、５０７、５０８、５０９、５１０、５１１、５１２、５１３、５１４、５１５、５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４１、５４２、５４３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、５５０、５５１、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４、５６５、５６６、５６７、５６８、５６９、５７０、５７１、５７２、５７３、５７４、５７５、５７６、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、５８３、５８４、５８５、５８６、５８７、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、６００、６０１、６０２、６０３、６０４、６０５、６０６、６０７、６０８、６０９、６１０、６１１、６１２、６１３、６１４、６１５、６１６、６１７、６１８、６１９、６２０、６２１、６２２、６２３、６２４、６２５、６２６、６２７、６２８、６２９、６３０、６３１、６３２、６３３、６３４、６３５、６３６、６３７、６３８、６３９、６４０、６４１、６４２、６４３、６４４、６４５、６４６、６４７、６４８、６４９、６５０、６５１、６５２、６５３、６５４、６５５、６５６、６５７、６５８、６５９、６６０、６６１、６６２、６６３、６６４、６６５、６６６、６６７、６６８、６６９、６７０、６７１、６７２、６７３、６７４、６７５、６７６、６７７、６７８、６７９、６８０、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、６８６、６８７、６８８、６８９、６９０、６９１、６９２、６９３、６９４、６９５、６９６、６９７、６９８、６９９、７００、７０１、７０２、７０３、７０４、７０５、７０６、７０７、７０８、７０９、７１０、７１１、７１２、７１３、７１４、７１５、７１６、７１７、７１８、７１９、７２０、７２１、７２２、７２３、７２４、７２５、７２６、７２７、７２８、７２９、７３０、７３１、７３２、７３３、７３４、７３５、７３６、７３７、７３８、７３９、７４０、７４１、７４２、７４３、７４４、７４５、７４６、７４７、７４８、７４９、７５０、７５１、７５２、７５３、７５４、７５５、７５６、７５７、７５８、７５９、７６０、７６１、７６２、７６３、７６４、７６５、７６６、７６７、７６８、７６９、７７０位、またはこれらの任意の組合せを含み得る。一部の場合には、リン酸化部位は、配列番号２、１４または１５の１～１０位、９～２０位、１９～３０位、２９～４０位、３９～５０位、４９～６０位、５９～７０位、６９～８０位、７９～９０位、８９～１００位、９９～１１０位、１０９～１２０位、１１９～１３０位、１２９～１４０位、１３９～１５０位、１４９～１６０位、１５９～１７０位、１６９～１８０位、１７９～１９０位、１８９～２００位、１９９～２１０位、２０９～２２０位、２１９～２３０位、２２９～２４０位、２３９～２５０位、２４９～２６０位、２５９～２７０位、２６９～２８０位、２７９～２９０位、２８９～３００位、２９９～３１０位、３０９～３２０位、３１９～３３０位、３２９～３４０位、３３９～３５０位、３４９～３６０位、３５９～３７０位、３６９～３８０位、３７９～３９０位、３８９～４００位、３９９～４１０位、４０９～４２０位、４１９～４３０位、４２９～４４０位、４３９～４５０位、４４９～４６０位、４５９～４７０位、４６９～４８０位、４７９～４９０位、４８９～５００位、４９９～５１０位、５０９～５２０位、５１９～５３０位、５２９～５４０位、５３９～５５０位、５４９～５６０位、５５９～５７０位、５６９～５８０位、５７９～５９０位、５８９～６００位、５９９～６１０位、６０９～６２０位、６１９～６３０位、６２９～６４０位、６３９～６５０位、６４９～６６０位、６５９～６７０位、６６９～６８０位、６７９～６９０位、６８９～７００位、６９９～７１０位、７０９～７２０位、７１９～７３０位、７２９～７４０位、７３９～７５０位、７４９～７６０位、７５９～７７０位、またはこの中のおよびその任意の組合せであり得る。リン酸化部位は、配列番号２のトレオニン６６８（Ｔ６６８）、セリン１９８（Ｓ１９８）、Ｓ８、Ｓ２６、Ｓ２０６、Ｔ１０、Ｔ１１１、Ｙ１１５、Ｔ１５３、Ｓ１８４、Ｓ１８５、Ｓ１９８、Ｔ２０５、Ｓ２０６、Ｓ２０８、Ｔ２１７、Ｓ２６２、Ｓ２８５ Ｔ３８１、Ｓ４４１、Ｓ６７９、Ｓ６９７、Ｙ７２８、Ｔ７２９、Ｓ７３０、Ｔ７４３、Ｙ７５７、Ｔ７６１、Ｙ７６２位、またはこの中のおよびその任意の組合せを含み得る。
タウポリペプチドのリン酸化は、神経原線維変化（ＮＦＴ）の形成、凝集または安定性を増大させることもあり、または低下させることもある。一部の場合には、リン酸化部位は、配列番号２８～３５の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５０１、５０２、５０３、５０４、５０５、５０６、５０７、５０８、５０９、５１０、５１１、５１２、５１３、５１４、５１５、５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４１、５４２、５４３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、５５０、５５１、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４、５６５、５６６、５６７、５６８、５６９、５７０、５７１、５７２、５７３、５７４、５７５、５７６、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、５８３、５８４、５８５、５８６、５８７、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、６００、６０１、６０２、６０３、６０４、６０５、６０６、６０７、６０８、６０９、６１０、６１１、６１２、６１３、６１４、６１５、６１６、６１７、６１８、６１９、６２０、６２１、６２２、６２３、６２４、６２５、６２６、６２７、６２８、６２９、６３０、６３１、６３２、６３３、６３４、６３５、６３６、６３７、６３８、６３９、６４０、６４１、６４２、６４３、６４４、６４５、６４６、６４７、６４８、６４９、６５０、６５１、６５２、６５３、６５４、６５５、６５６、６５７、６５８、６５９、６６０、６６１、６６２、６６３、６６４、６６５、６６６、６６７、６６８、６６９、６７０、６７１、６７２、６７３、６７４、６７５、６７６、６７７、６７８、６７９、６８０、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、６８６、６８７、６８８、６８９、６９０、６９１、６９２、６９３、６９４、６９５、６９６、６９７、６９８、６９９、７００、７０１、７０２、７０３、７０４、７０５、７０６、７０７、７０８、７０９、７１０、７１１、７１２、７１３、７１４、７１５、７１６、７１７、７１８、７１９、７２０、７２１、７２２、７２３、７２４、７２５、７２６、７２７、７２８、７２９、７３０、７３１、７３２、７３３、７３４、７３５、７３６、７３７、７３８、７３９、７４０、７４１、７４２、７４３、７４４、７４５、７４６、７４７、７４８、７４９、７５０、７５１、７５２、７５３、７５４、７５５、７５６、７５７、７５８、７５９、７６０、７６１、７６２、７６３、７６４、７６５、７６６、７６７、７６８、７６９、７７０、７７１、７７２、７７３、７７４、７７５、７７６、７７７、７７８、７７９、７８０、７８１、７８２、７８３、７８４、７８５、７８６、７８７、７８８、７８９、７９０、７９１、７９２、７９３、７９４、７９５、７９６、７９７、７９８、７９９、８００、８０１、８０２、８０３、８０４、８０５、８０６、８０７、８０８、８０９、８１０、８１１、８１２、８１３、８１４、８１５、８１６、８１７、８１８、８１９、８２０、８２１、８２２、８２３、８２４、８２５、８２６、８２７、８２８、８２９、８３０、８３１、８３２、８３３、８３４、８３５、８３６、８３７、８３８、８３９、８４０、８４１、８４２、８４３、８４４、８４５、８４６、８４７、８４８、８４９、８５０、８５１、８５２、８５３、８５４、８５５、８５６、８５７、８５８、８５９、８６０、８６１、８６２、８６３、８６４、８６５、８６６、８６７、８６８、８６９、８７０、８７１、８７２、８７３、８７４、８７５、８７６、８７７、８７８、８７９、８８０、８８１、８８２、８８３、８８４、８８５、８８６、８８７、８８８、８８９、８９０、８９１、８９２、８９３、８９４、８９５、８９６、８９７、８９８、８９９、９００位、またはこの中のおよびその任意の組合せを含み得る。一部の場合には、リン酸化部位は、配列番号２８～３５の１～５０位、４９～１００位、９９～１５０位、１４９～２００位、１９９～２５０位、２４９～３００位、２９９～３５０位、３４９～４００位、３９９～４５０位、４４９～５００位、４９９～５５０位、５４９～６００位、５９９～６５０位、６４９～７００位、６９９～７５０位、７４９～８００位、７９９～８５０位、８４９～８６２位、またはこの中のおよびその任意の組合せを含み得る。リン酸化は、配列番号２８～３５のＹ１８、Ｔ３９、Ｓ４６、Ｔ５０、Ｔ５２、Ｓ５６、Ｓ６１、Ｓ６４、Ｔ６９、Ｔ１１１、Ｓ１３１、Ｔ１４９、Ｔ１５３、Ｓ１７１、Ｔ１７３、Ｔ１７５、Ｔ１８１、Ｓ１９１、Ｓ１９５、Ｓ１９９、Ｓ２０２、Ｓ２０５、Ｓ２０８、Ｓ２１０、Ｓ２１２、Ｓ２１４、Ｓ２１７、Ｓ２３１、Ｓ２３２、Ｓ２３５、Ｓ２３７、Ｓ２３８、Ｓ２４１、Ｓ２５８、Ｓ２８５、Ｓ２８９、Ｓ３１６、Ｓ３２０、Ｓ３５２、Ｓ３５５、Ｓ３６９、Ｔ３７３、Ｔ３８６、Ｓ３８８、Ｓ４１１、Ｔ４６６、Ｔ４７０、Ｓ３９６、Ｓ４００、Ｓ４０４、Ｓ４０９、Ｓ４１２、Ｔ４９８、Ｓ５０１、Ｓ５０２、Ｓ５０８、Ｓ５１２、Ｙ５１４、Ｓ５１５、Ｓ５１６、Ｔ５２２、Ｓ５２５、Ｓ５２７、Ｔ５２９、Ｓ５３１、Ｔ５３４、Ｔ５４８、Ｓ５５２、Ｓ５５４、Ｓ５５５、Ｓ５５８、Ｓ５７９、Ｔ５８０、Ｓ６０２、Ｓ６１０、Ｓ６２２、Ｙ６２７、Ｓ６３３、Ｔ６３６、Ｓ６４１、Ｓ６７３、Ｔ６９４、Ｙ７１１、Ｓ７１３、Ｓ７１７、Ｔ７２０、Ｓ７２１、Ｓ７２６、Ｓ７２９、Ｓ７３０、Ｔ７３１、Ｓ７３３、Ｓ７３９、Ｔ７４４、またはこの中のおよびその任意の組合せを含み得る。
ＳＮＣＡポリペプチドのリン酸化は、ＳＮＣＡポリペプチドの形成、凝集または安定性を増大させることもあり、または低下させることもある。一部の場合には、リン酸化部位は、配列番号４５～４７の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０位、またはこの中のおよびその任意の組合せを含み得る。リン酸化部位は、配列番号４５～４７の１～１０位、９～２０位、１９～３０位、２９～４０位、３９～５０位、４９～６０位、５９～７０位、６９～８０位、７９～９０位、８９～１００位、９９～１１０位、１０９～１２０位、１１９～１３０位、１２９～１４０位、またはこの中のおよびその任意の組合せを含み得る。リン酸化は、配列番号４５～４７のＹ３９、Ｓ４２、Ｓ８７、Ｙ１２５、Ｓ１２９、Ｙ１３３、Ｙ１３６、またはこの中のおよびその任意の組合せを含み得る。
ベクター
本開示は、本明細書で開示される操作されたガイドＲＮＡをコードするベクターも提供する。
本明細書で提供される組成物を任意の好適な手段により送達することができる。一部の場合には、好適な手段は、ベクターを含む。任意のベクター系を用いることができ、そのようなベクターとしては、プラスミドベクター、ミニサークルベクター、線状ＤＮＡベクター、ドギーボーンベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクター、リポソーム、ナノ粒子、エキソソーム、細胞外小胞、ナノメッシュ、これらの改変バージョン、これらの製造管理および品質管理に関する基準バージョン、これらのキメラ、およびそれらの任意の組合せが挙げられるが、それらに限定されない。一部の場合には、ベクターを使用して、本明細書で提供されるポリヌクレオチドを導入することができる。一部の場合には、ポリヌクレオチドは、本明細書で提供されるＲＮＡの領域にハイブリダイズする標的化配列を含む。一部の実施形態では、ナノ粒子ベクターは、ポリマーに基づくナノ粒子、アミノ脂質に基づくナノ粒子、金属ナノ粒子（例えば、金に基づくナノ粒子）、これらのいずれかについての一部分、またはそれらの任意の組合せを含み得る。
本明細書で提供されるベクターを使用して、本明細書で提供されるポリヌクレオチド組成物を送達することができる。一部の場合には、少なくとも約２つ、３つ、４つ、または最大で５つの異なるポリヌクレオチドが、単一のベクターを使用して送達される。一部の場合には、複数のベクターが送達される。一部の場合には、複数のベクター送達は、同時並行または逐次的であり得る。一部の場合には、少なくとも２つの操作されたポリヌクレオチドが単一のベクターで送達される。他の場合には、少なくとも２つの操作されたポリヌクレオチドが、別々のベクターを用いて送達される。操作されたポリヌクレオチドを裸のポリヌクレオチドとして送達することもできる。ベクターおよび／または非ベクター手法の任意の組合せを使うことができる。
ベクターを用いて核酸を送達することができる。ベクターは、ＤＮＡ、例えば、二本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＤＮＡを含み得る。ベクターは、ＲＮＡを含み得る。一部の場合には、ＲＮＡは、塩基改変を含み得る。ベクターは、組換えベクターを含み得る。ベクターは、天然に存在するベクターから改変されるベクターであり得る。ベクターは、天然に存在しないベクターの少なくとも一部分を含み得る。任意のベクターを用いることができる。ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、これらのいずれかについての一部分、またはそれらの任意の組合せを含み得る。一部の場合には、ベクターは、ＡＡＶベクターを含み得る。ベクターを、改変されたＶＰ１タンパク質を含むように改変することができる（例えば、ＶＰ１タンパク質を含むように改変されたＡＡＶベクター）。ある態様では、ＡＡＶベクターは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターである。ｒＡＡＶは、野生型ＡＡＶ（ｗｔＡＡＶ）に見られるものと実質的に同様のカプシド配列および構造で構成されていることもある。しかし、ｒＡＡＶは、ＡＡＶタンパク質コード配列を実質的に欠いるゲノムであって、適切な場所に設計された治療遺伝子発現カセット、例えば対象ポリヌクレオチド、を有するゲノムを、カプシドに封入している。一部の場合には、ウイルス由来の配列は、ベクター生成中にゲノム複製およびパッケージングを誘導するために必要とされ得る、ＩＴＲであり得る。好適なＡＡＶベクターを任意のＡＡＶ血清型、または血清型の組合せから選択することができる。例えば、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２のうちのいずれか１つ、またはこれらの任意の組合せであり得る。一部の場合には、ベクターは、その天然の指向性に基づいて選択される。一部の場合には、ベクター血清型は、血液脳関門を横断するその能力に基づいて選択される。ＡＡＶ９およびＡＡＶ１０は、血液脳関門を横断してニューロンおよびグリアに形質導入することが示されている。ある態様では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９である。一部の場合には、ＡＡＶベクターは、少なくとも２つの血清型のキメラである。ある態様では、ＡＡＶベクターは、血清型ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、およびＡＡＶ９のものである。一部の場合には、キメラＡＡＶベクターは、ｒｅｐと、ＡＡＶ２からのＩＴＲ配列と、ＡＡＶ５からのｃａｐ配列とを含む。一部の場合には、本明細書で提供される異なるＡＡＶ血清型の全てからｒｅｐ、ｃａｐ、およびＩＴＲ配列を混合し、マッチさせることができる。一部の場合には、好適なＡＡＶベクターを、カプシドまたはｒｅｐタンパク質におけるものなどの改変を包含するようにさらに改変することができる。改変は、欠失、挿入、突然変異、およびこれらの組合せも含み得る。一部の場合には、反復投与を可能にするために免疫原性を低下させるようにベクターに改変が加えられる。一部の場合には、用いられるベクターの血清型は、反復投与が行われる場合に免疫原性を低下および／または消失させるように変えられる。
ベクターを使用して、本明細書で提供される操作されたガイドＲＮＡ、および第２のポリヌクレオチドなどの、治療標的を標的とする追加のポリヌクレオチドを送達することができる。一部の場合には、ベクターは、第２のポリヌクレオチド（例えば、追加の治療標的）と会合する追加のＲＮＡポリヌクレオチドを含むまたはコードする。そのようなベクターを使用して、複数の治療標的、例えば、アルツハイマー病および他の神経変性疾患の場合、アミロイド前駆体タンパク質、および疾患に関与する追加の標的、例えば、タウタンパク質（例えば、ＭＡＰＴ遺伝子からコードされる微小管関連タンパク質タウ（ＭＡＰＴ））またはアルファ－シヌクレインタンパク質、を同時に標的とするマルチプレックス治療薬を送達することができる。あるいは、または加えて、追加の標的は、アミロイド前駆体タンパク質をコードするポリヌクレオチド上の（例えば、同じポリヌクレオチド上の）さらなる編集部位であり得る。操作されたガイドＲＮＡをコードするベクターポリヌクレオチド、および追加のＲＮＡポリヌクレオチドをコードする第２のベクターポリヌクレオチドは、連続していることもあり、または連続していないこともある。第１および第２のベクターポリヌクレオチドが互いに連続している場合、それらは、同じプロモーター配列に動作可能に連結されていることがある。
非ウイルスベクター手法
一部の場合には、ベクターは、ウイルスベクターでないことがある。非ウイルス法は、ポリヌクレオチドを含む組成物の裸の送達などを含み得る。一部の場合には、本明細書で提供される改変をポリヌクレオチドに導入して、裸のポリヌクレオチドとして送達されたときに安定性を増大させることおよび分解に抵抗することができる。他の場合には、非ウイルス手法は、ナノ粒子、リポソームなどの使用を利用することができる。
治療応用
本明細書で提供される操作されたガイドＲＮＡを治療薬として使用することができる。一態様では、状態を処置または予防する方法であって、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）を少なくとも部分的にコードするＲＮＡの編集を助長する治療薬を投与するステップを含み、編集されたＲＮＡが、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにより判定して、編集を有さない他の点では同等のＲＮＡから産生された他の点では同等のＡＰＰと比較してＢＡＣＥプロテアーゼ耐性ＡＰＰをコードし、前記ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイが、ＢＡＣＥプロテアーゼ耐性ＡＰＰおよび他の点では同等のＡＰＰを、ベータセクレターゼ（例えば、ＢＡＣＥ１、カテプシンＢまたはメプリンベータ）、γ－セクレターゼ、またはベータセクレターゼおよびγ－セクレターゼと接触させることを含む、方法が、本明細書に存在する。一部の場合には、治療薬は、編集を直接助長する。一部の場合には、治療薬は、編集を間接的に助長する。一部の場合には、状態は、神経変性状態を含み得る。
方法は、神経変性疾患に関連する１つまたは複数の標的のｍＲＮＡ塩基編集を含み得る。神経変性疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、またはＡベータ断片、タウ、アルファ－シヌクレイン、もしくはこれらの組合せによって媒介される他の状態を含み得る。方法は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）をコードするポリヌクレオチドの一部分を、酵素（例えば、ベータセクレターゼ（ＢＡＣＥ）またはガンマセクレターゼ）が編集部位でＡＰＰを切断することができないように、編集するステップを含み得る。方法は、ＡＰＰをコードするポリヌクレオチドの一部分を、断片（例えば、Ａベータ断片）が形成できないように、編集するステップを含み得る。ＡＰＰをコードするポリヌクレオチドの一部分を編集するステップは、形成されるＡベータ断片の量を実質的に低減させる結果となり得る。一部の実施形態では、編集されたＲＮＡまたはＢＡＣＥプロテアーゼ耐性ＡＰＰが、臨床試験で治療薬を投与された対象の少なくとも５％、８％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、または５０％において生成される。
一部の実施形態では、本開示は、併用療法も提供する。例えば、治療方法は、同じ標的（ＡＰＰ）または異なる標的を有し得る別の治療剤と組み合わせて、本開示の操作されたガイドＲＮＡを使用する、ＡＰＰの標的切断部位のＲＮＡ編集を含み得る。前記追加の治療剤は、他の治療標的（例えば、タウ、アルファ－シヌクレイン）をコードするポリヌクレオチドの編集もしくはノックアウトのためにガイドＲＮＡを含むこともあり、またはＡＰＰのベータ－セクレターゼ（例えば、ＢＡＣＥ１、カテプシンＢもしくはメプリンベータ）切断の望ましくない代謝物を除去する抗体を含むこともある。方法は、ＡＰＰのノックダウン、タウのノックダウン、アルファ－シヌクレインのノックダウン、またはこれらの任意の組合せを含み得る。方法は、組織空間に既に存在するＡベータ断片の除去のための１つまたは複数の抗Ａベータ抗体の送達を含み得る。ｍＲＮＡ塩基編集手法との組合せでの場合、抗体の投与量は、ｍＲＮＡ塩基編集手法の非存在下での投与量と比較して、より少なくなり得る。方法は、切断およびしたがってＡベータ断片形成を低減させるための１つまたは複数のセクレターゼ阻害剤の送達を含み得る。ｍＲＮＡ塩基編集手法との組合せでの場合、セクレターゼ阻害剤投与量は、ｍＲＮＡ塩基編集手法の非存在下での投与量と比較して、より少なくなり得る。方法は、本明細書に記載の１つまたは複数の組成物の送達または組合せ送達を含み得る。
本発明で説明される治療応用は、望ましい薬理作用、生理作用、またはこれらの任意の組合せを得るための処置に使用され得る。一部の事例では、処置は、疾患または状態に起因する有害効果を逆転させることができる。一部の場合には、処置は、疾患または状態を安定させることができる。一部の場合には、処置は、疾患または状態の進行を遅らせることができる。一部の事例では、処置は、疾患または状態の退行を生じさせることができる。一部の事例では、処置は、疾患、状態、またはこれらのいずれかについての症状の発生を少なくとも部分的に予防することができる。一部の実施形態では、処置の効果を測定することができる。一部の場合には、組成物の投与前と投与後の測定値を比較することができる。例えば、対象は、がん退縮を示す処置後の画像と比較される処置前の医用画像を有し得る。一部の事例では、対象は、処置前の血液検査と比較して処置後に改善された血液検査結果を有し得る。一部の事例では、測定値を基準値と比較することができる。
マルチプレックス型療法
一部の場合には、本開示は、複数の標的ＲＮＡのマルチプレックス型編集、標的ＲＮＡ中の複数の標的部位の編集、ＲＮＡおよびノックダウンの編集、またはこれらの任意の組合せを含む、マルチプレックス型療法を包含する。一部の場合には、複数の標的化ガイドＲＮＡを含有するベクターの使用は、Ａベータ生成と神経変性に関連する他のタンパク質を同時に標的とすることを可能にすることができる。具体的には、アルツハイマー病、タウオパチー、パーキンソン病、またはタウ、アルファ－シヌクレインおよびＡベータによって媒介される神経変性に作用する相補的経路の発現を調節する複数の特有の独立した活動を、行うことができる。１つより多くの標的ＲＮＡを同時に標的とすることが重要であり得、タウノックダウンとＡＰＰの切断部位（例えば、β切断部位）の編集との組合せが相乗的に働き得る。一部の場合には、ＡＰＰの発現をノックダウンするための（切断部位を単に編集するのではなく）ｍＲＮＡ塩基編集の使用は、Ａベータ生成を減少させるためのもう１つの手法であり得る。組成物が遺伝子発現ノックダウンに利用され得る場合、それらの組成物は、発現を低減させるための開始部位編集の組合せ、ガイドがリボソーム活性を遮断するので立体障害、標的となるｍＲＮＡの分解の増加、またはこれらの任意の組合せも含むことがあるだろう。したがって、本明細書で開示される組成物および方法は、ＡＤＡＲ依存的におよびＡＤＡＲ非依存的に発現を抑制することができる。
ＡベータとタウまたはＳＮＣＡの両方がアルツハイマー病の開始／進行に関与する。本明細書で開示される組成物および方法は、両方を標的とすることができ、したがって、マルチプレックス型標的化手法を含み得る。マルチプレックス型標的化手法は、独立した作用機序によって２、３、４、５、６、またはそれより多くのプロテイノパチーを標的とすることができる。例えば、本開示の操作されたガイドＲＮＡを使用するｍＲＮＡ塩基編集は、ＡＰＰタンパク質の１つまたは複数の切断部位を編集し、その結果、Ａベータ断片形成を防止することもしくは実質的に低減させることができ、本開示の操作されたガイドＲＮＡを使用するｍＲＮＡ塩基編集は、タウタンパク質形成をノックダウンすることができる。一部の場合には、本開示のガイドＲＮＡを使用するｍＲＮＡ塩基編集は、ＡＰＰタンパク質の１つまたは複数の切断部位を編集し、その結果、Ａベータ断片形成を防止することまたは実質的に低減させることができ、追加の治療剤（例えば、追加のＲＮＡポリヌクレオチド、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチド）、これが、タウタンパク質形成をノックダウンすることができる。
一部の実施形態では、本開示のベクターは、複数の標的ＲＮＡを標的とする複数の操作されたガイドポリヌクレオチドを含有するマルチプレックスベクターであり得る。他の場合には、異なる標的ＲＮＡを標的とする異なる操作されたガイドポリヌクレオチドを異なるベクター上に維持することができる。（ａ）タンパク質標的の切断部位に対する編集を（例えば、ＡＤＡＲなどのＲＮＡ編集タンパク質との会合によって）助長することができる、（ｂ）産生されるタンパク質標的の量を低減させることができる、（ｃ）産生されるタンパク質標的の活性を調節することができる、または（ｄ）これらの組合せであり得る、組成物をコードするベクター。ベクター（単数）またはマルチプレックスベクター（単数）またはベクター（複数）を、単位用量形態で製剤化することができる。マルチプレックスベクターを、神経変性疾患に関与する１つより多くのタンパク質標的をモジュレートするように構成することができる。ベクターは、（ｉ）タンパク質をコードする配列に対する編集を行うこと、（ｉｉ）タンパク質をコードしない配列に対する編集を行うこと、（ｉｉｉ）タンパク質標的と会合されるプロモーター領域を立体的に妨害すること、または（ｉｖ）これらの任意の組合せによって、タンパク質標的の量を低減させることができる。タンパク質標的は、アミロイドベータ、タウ、アルファ－シヌクレイン、またはこれらの任意の組合せを含み得る。
一部の実施形態では、マルチプレックス標的化または編集を受けた標的ＲＮＡは、未編集のＡＰＰのベータセクレターゼ（例えば、ＢＡＣＥ１、カテプシンＢもしくはメプリンベータ）切断によって生成されたものと比較して、Ａベータ４０、４２または両方のタンパク質レベルの１／１以下、１／２以下、１／３以下、１／４以下、１／５以下、１／６以下、１／７以下、１／８以下、１／９以下、１／１０以下、１／１１以下、１／１２以下、１／１３以下、１／１４以下、１／１５以下、１／１６以下、１／１７以下、１／１８以下、１／１９以下、１／２０以下、１／２１以下、１／２２以下、１／２３以下、１／２４以下、１／２５以下、１／２６以下、１／２７以下、１／２８以下、１／２９以下、１／３０以下、１／３１以下、１／３２以下、１／３３以下、１／３４以下、１／３５以下、１／３６以下、１／３７以下、１／３８以下、１／３９以下、１／４０以下、１／４１以下、１／４２以下、１／４３以下、１／４４以下、１／４５以下、１／４６以下、１／４７以下、１／４８以下、１／４９以下、１／５０以下、１／５１以下、１／５２以下、１／５３以下、１／５４以下、１／５５以下、１／５６以下、１／５７以下、１／５８以下、１／５９以下、１／６０以下、１／６１以下、１／６２以下、１／６３以下、１／６４以下、１／６５以下、１／６６以下、１／６７以下、１／６８以下、１／６９以下、１／７０以下、１／７１以下、１／７２以下、１／７３以下、１／７４以下、１／７５以下、１／７６以下、１／７７以下、１／７８以下、１／７９以下、１／８０以下、１／８１以下、１／８２以下、１／８３以下、１／８４以下、１／８５以下、１／８６以下、１／８７以下、１／８８以下、１／８９以下、１／９０以下、１／９１以下、１／９２以下、１／９３以下、１／９４以下、１／９５以下、１／９６以下、１／９７以下、１／９８以下、１／９９以下、１／１００以下、１／１～１／２０、１／２～１／２１、１／３～１／２２、１／４～１／２３、１／５～１／２４、１／６～１／２５、１／７～１／２６、１／８～１／２７、１／９～１／２８、１／１０～１／２９、１／１１～１／３０、１／１２～１／３１、１／１３～１／３２、１／１４～１／３３、１／１５～１／３４、１／１６～１／３５、１／１７～１／３６、１／１８～１／３７、１／１９～１／３８、１／２０～１／３９、１／２１～１／４０、１／２２～１／４１、１／２３～１／４２、１／２４～１／４３、１／２５～１／４４、１／２６～１／４５、１／２７～１／４６、１／２８～１／４７、１／２９～１／４８、１／３０～１／４９、１／３１～１／５０、１／３２～１／５１、１／３３～１／５２、１／３４～１／５３、１／３５～１／５４、１／３６～１／５５、１／３７～１／５６、１／３８～１／５７、１／３９～１／５８、１／４０～１／５９、１／４１～１／６０、１／４２～１／６１、１／４３～１／６２、１／４４～１／６３、１／４５～１／６４、１／４６～１／６５、１／４７～１／６６、１／４８～１／６７、１／４９～１／６８、１／５０～１／６９、１／５１～１／７０、１／５２～１／７１、１／５３～１／７２、１／５４～１／７３、１／５５～１／７４、１／５６～１／７５、１／５７～１／７６、１／５８～１／７７、１／５９～１／７８、１／６０～１／７９、１／６１～１／８０、１／６２～１／８１、１／６３～１／８２、１／６４～１／８３、１／６５～１／８４、１／６６～１／８５、１／６７～１／８６、１／６８～１／８７、１／６９～１／８８、１／７０～１／８９、１／７１～１／９０、１／７２～１／９１、１／７３～１／９２、１／７４～１／９３、１／７５～１／９４、１／７６～１／９５、１／７７～１／９６、１／７８～１／９７、１／７９～１／９８、１／８０～１／９９、または１／８１～１／１００への減少を有し得る。
標的ＲＮＡの標的化がマルチプレックス型である組成物は、アルツハイマー病の疾患進行または発症の停止または阻害に少なくとも少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１１倍、少なくとも１２倍、少なくとも１３倍、少なくとも１４倍、少なくとも１５倍、少なくとも１６倍、少なくとも１７倍、少なくとも１８倍、少なくとも１９倍、少なくとも２０倍、少なくとも２１倍、少なくとも２２倍、少なくとも２３倍、少なくとも２４倍、少なくとも２５倍、少なくとも２６倍、少なくとも２７倍、少なくとも２８倍、少なくとも２９倍、少なくとも３０倍、少なくとも３１倍、少なくとも３２倍、少なくとも３３倍、少なくとも３４倍、少なくとも３５倍、少なくとも３６倍、少なくとも３７倍、少なくとも３８倍、少なくとも３９倍、少なくとも４０倍、少なくとも４１倍、少なくとも４２倍、少なくとも４３倍、少なくとも４４倍、少なくとも４５倍、少なくとも４６倍、少なくとも４７倍、少なくとも４８倍、少なくとも４９倍、少なくとも５０倍、少なくとも５１倍、少なくとも５２倍、少なくとも５３倍、少なくとも５４倍、少なくとも５５倍、少なくとも５６倍、少なくとも５７倍、少なくとも５８倍、少なくとも５９倍、少なくとも６０倍、少なくとも６１倍、少なくとも６２倍、少なくとも６３倍、少なくとも６４倍、少なくとも６５倍、少なくとも６６倍、少なくとも６７倍、少なくとも６８倍、少なくとも６９倍、少なくとも７０倍、少なくとも７１倍、少なくとも７２倍、少なくとも７３倍、少なくとも７４倍、少なくとも７５倍、少なくとも７６倍、少なくとも７７倍、少なくとも７８倍、少なくとも７９倍、少なくとも８０倍、少なくとも８１倍、少なくとも８２倍、少なくとも８３倍、少なくとも８４倍、少なくとも８５倍、少なくとも８６倍、少なくとも８７倍、少なくとも８８倍、少なくとも８９倍、少なくとも９０倍、少なくとも９１倍、少なくとも９２倍、少なくとも９３倍、少なくとも９４倍、少なくとも９５倍、少なくとも９６倍、少なくとも９７倍、少なくとも９８倍、少なくとも９９倍、少なくとも１００倍有効であり得る。
一部の場合には、ポリヌクレオチド塩基編集を、ポリヌクレオチド塩基編集の標的となる同じ遺伝子または神経変性疾患などの疾患に関与する追加の遺伝子のいずれかの遺伝子発現をノックダウンする追加の方法と、併用することができる。例えば、ｍＲＮＡ塩基編集（例えば、本明細書で開示される操作されたガイドＲＮＡを使用するもの）を、ｍＲＮＡ配列と会合するＲＮＡポリヌクレオチドと併用して、標的となる遺伝子の発現を最小限に抑えることができる。標的となる遺伝子発現を最小限に抑えることができるそのようなＲＮＡポリヌクレオチドの例としては、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、またはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）が挙げられる。一部の場合には、ＡＳＯは、オリゴヌクレオチドを安定させる、および／またはヌクレオチドに対するヌクレアーゼ活性を最小限に抑える、バリアントオリゴヌクレオチド構造を含む。そのようなバリアントオリゴヌクレオチドの例としては、モルホリノオリゴマーが挙げられる。したがって、本開示は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）およびアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）から選択される１つまたは複数の追加の治療剤と組み合わせて、操作されたガイドＲＮＡの組成物を提供する。
Ａベータオリゴマーは、アルツハイマー病の病態形成を開始させ得るが、それらの抑制は、疾患進行を軽減するのに十分ではあり得ない。不溶性ＡベータおよびＡベータ凝集体を標的とすることで、可溶性Ａベータおよび／または同じく極めて有毒であるＣ末端断片の毒性を無視することができる。Ａベータの低減のみに伴う効果を期待することで、他の特定されている病原性ドライバー（例えば、ｐ－タウ、アルファ－シヌクレイン）を無視することができる。
遺伝子／神経病態の証拠は、アミロイド－ベータ凝集（Ａベータ／アミロイド－ベータ斑）およびタウ－ｐのもつれをＡＤと結び付け得る。Ａベータは、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の逐次的タンパク質分解から可変長断片として得られ得る。長さがより長いＡベータ断片（長さ４２ＡＡを超える）は凝集し、その結果、斑を形成する。Ａベータ断片は、タウリン酸化を駆動し、その結果、異常なタウ凝集、および毒性（シナプス喪失または神経毒性）獲得に至る。ある実施形態では、ベータアミロイド斑のレベルを、例えば、ＰＥＴスキャン、採血および／または脊椎穿刺などのｉｎ ｖｉｖｏ診断を使用して、決定することができる。別の実施形態では、アミロイドベータ４０（Ａベータ４０）およびアミロイドベータ４２（Ａベータ４２）をはじめとする代謝物を測定することができる。
したがって、本明細書における組成物および方法に関して記載されるものなどの多標的併用療法は、アルツハイマー病に必要な疾患修飾を提供し得る。本明細書に記載の、開示される操作されたガイドＲＮＡをはじめとする組成物を、追加の治療剤と共に投与することができる。追加の治療剤は、５－ＨＴ ６アンタゴニスト、５－ＨＴ２Ａ逆アゴニスト、ＡＢ４２低下剤、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、アルファセクレターゼエンハンサー、アルファ－１アドレナリン受容体アンタゴニスト、アルファ－２アドレナリン作用性アゴニスト、アンジオテンシンＩＩ受容体遮断薬、アンジオテンシン受容体遮断薬、抗アミロイド抗体、抗凝集剤、抗アミロイド免疫療法、抗炎症剤、抗マラリアグリア細胞モジュレーター、抗酸化剤、抗タウ抗体、抗タウ免疫療法、ＢＡＣＥ阻害剤、ベータ－２アドレナリン作用性受容体アゴニスト、アルギナーゼ阻害剤、ベータ－ＨＳＤ１阻害剤、カルシウムチャネル遮断薬、カンナビノイド、ＣＢ１もしくはＣＢ２内在性カンナビノイド受容体アゴニスト、コレステロール低下剤、Ｄ２受容体アゴニスト、ドーパミン－ノルエピネフリン再取込み阻害剤、ＦＬＮＡ阻害剤、ガンマセクレターゼ阻害剤、ＧＡＢＡ受容体モジュレーター、グルカゴン様ペプチド１受容体アゴニスト、グルタミン酸モジュレーター、グルタミン酸受容体アンタゴニスト、グリシン輸送体１阻害剤、性腺刺激ホルモン放出ホルモン受容体アゴニスト、ＧＳＫ－３Ｂ阻害剤、肝細胞増殖因子、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、ＩｇＧ１－Ｆｃ－ＧＡＩＭ融合タンパク質、イオンチャネルモジュレーター、鉄キレート剤、ロイコトリエン受容体アンタゴニスト、ＭＡＰＴ ＲＮＡ阻害剤、マスト細胞安定剤、メラトニン受容体アゴニスト、微小管タンパク質モジュレーター、ミトコンドリアＡＴＰ合成酵素阻害剤、モノアミン酸化酵素Ｂ阻害剤、ムスカリンアゴニスト、ニコチン性アセチルコリン受容体アゴニスト、ＮＭＤＡアンタゴニスト、ＮＭＤＡ受容体モジュレーター、非ホルモン性エストロゲン受容体Ｂアゴニスト、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、非ステロイド性抗炎症剤、オメガ－３脂肪酸、Ｐ３８ ＭＡＰＫ阻害剤、Ｐ７５ニューロトロフィン受容体リガンド、ＰＤＥ ５阻害剤、ＰＤＥ－３阻害剤、ＰＤＥ４Ｄ阻害剤、ＧＡＢＡ－Ａ受容体のポジティブアロステリックモジュレーター、ＰＰＡＲ－ガンマアゴニスト、プロテインキナーゼＣモジュレーター、ＲＩＰＫ１阻害剤、ＡＰＰ産生の選択的阻害剤、選択的ノルエピネフリン再取込み阻害剤、選択的セロトニン再取込み阻害剤、選択的チロシンキナーゼ阻害剤、ＳＧＬＴ２阻害剤、ＳＩＧＬＥＣ－３阻害剤、シグマ－１受容体アゴニスト、シグマ－２受容体アンタゴニスト、幹細胞療法、ＳＶ２Ａモジュレーター、合成顆粒球コロニー刺激因子、合成チアミン、タウタンパク質凝集阻害剤、テロメラーゼ逆転写酵素ワクチン、トロンビン阻害剤、輸送タンパク質ＡＢＣＣ１アクチベーター、ＴＲＥＭ２阻害剤、またはこれらの任意の組合せであり得る。追加の治療剤は、ＡＡＤｖａｃ１、ＡＡＶｒｈ．１０ｈＡＰＯＥ２、ＡＢＢＶ－８Ｅ１２、ＡＢｖａｃ４０、ＡＤ－３５、アデュカヌマブ、ＡＧＢ１０１、ＡＬ００２、ＡＬ００３、アロプレグナノロン、アムロピジン、ＡＭＸ００３５、ＡＮＡＶＥＸ ２－７３、ＡＰＨ－１１０５、ＡＲ１００１、ＡｓｔｒｏＳｔｅｍ、アトルバスタチン、ＡＶＰ－７８６、ＡＸＳ－０５、ＢＡＣ、ベンフォチアミン、ＢＨＶ４１５７、ＢＩ４２５８０９、ＢＩＩＢ０９２、ＢＩＩＰ０６、生物活性食事性ポリフェノール調製物、ＢＰＮ１４７７０、ブレクスピプラゾール、ブリオスタチン、ＣＡＤ１０６、カンデサルタン、ＣＥＲＥ－１１０、シロスタゾール、ＣＫＤ－３５５、ＣＮＰ５２０、ＣＯＲ３８８、クレネズマブ、クロモリン、ＣＴ１８１２、クルクミン、ダビガトラン、ＤＡＯＩ、ダパグリフロジン、デフェリプロン、ＤＨＡ、ＤＨＰ１４０１、ＤＮＬ７４７、ドロナビノール、エファビレンツ、エルダーベリージュース、エレンベセスタット、エスシタロプラム、ホルモテロール、ガンテネルマブ、ｇｉｎｋｇｏ ｂｉｌｏｂａ、ブドウ種子抽出物、ＧＲＦ６０１９、グアンファシン、ＧＶ１００１、ｈＵＣＢ－ＭＳＣｓ、イブプロフェン、イコサペントエチル、ＩＤ１２０１、インスリンアスパルト、インスリングルリジン、ＩＯＮＩＳ ＭＡＰＴＲｘ、Ｊ１４７、ＪＮＪ－６３７３３６５７、レンボレキサント、酢酸ロイプロリドデポー、レベチラセタム、リラグルチド、リチウム、ＬＭ１１Ａ－３１－ＢＨＳ、ロサルタン、Ｌ－セリン、Ｌｕ ＡＦ２０５１３、ＬＹ３００２８１３、ＬＹ３３０３５６０、ＬＹ３３７２９９３、マシチニブ、メチレンブルー、メチルフェニデート、ミルタザピン、ＭＬ－４３３４、ＭＬＣ９０１、モンテルカスト、ＭＰ－１０１、ナビロン、ＮＤＸ－１０１７、ネフラマピモド、ニコチンアミド、ニコチン、ニロチニブ、ＮＰＴ０８、オクタガム１０％、コハク酸オクトヒドロアミノアクリジン、オメガ－３ ＰＵＦＡ、ペリンドプリル、ピマバンセリン、ピロメラチン、ポジフェン、プラゾシン、ＰＴＩ－１２５、ラサギリン、リルゾール、ＲＯ７１０５７０５、ＲＰｈ２０１、サルグラモスチム（sagramostim）、サルサラート、Ｓ－エクオール、ソラネズマブ、ＳＵＶＮ－５０２、テルミサルタン、ＴＥＰ、ＴＨＮ２０１、ＴＰＩ－２８７、トラネウロシン、ＴＲｘ０２３７、ＵＢ－３１１、バラシクロビル、ベンラファキシンｈＭＳＣ（ヒト間葉系幹細胞）、ボリノスタット、ザナメム、ゾルピデム、またはこれらの任意の組合せであり得る。追加の治療剤を、同時に、連続して、または任意の順序で投与することができる。
本開示の、ガイドＲＮＡなどの、操作されたポリヌクレオチドを使用する、ｍＲＮＡ塩基編集手法を、抗体に基づく手法（例えば、抗Ａベータ抗体）と組み合わせることができる。抗体に基づく手法を単独で用いることの不利な点としては血液脳関門を介した少ない／非効率的な移動を挙げることができ、これらの療法で処置された患者のＡＲＩＡ（神経炎症）の発症が治療用量を抑制する。１つより多くのＡベータ種（可溶性Ａベータを含む）が疾患進行の一因となる可能性は高い。したがって、異なる種に対する複数の異なる抗体が必要とされ得る。それを必要とする対象の併用処置のために本明細書で開示される操作されたガイドＲＮＡと組み合わせることができる抗体としては、バピネウズマブ、ソラネズマブ、ガンテネルマブ、クレネズマブ、ポネズマブ、アデュカヌマブ、ＢＡＮ２４０１、またはこれらの任意の組合せを挙げることができる。
本開示の操作されたポリヌクレオチドを使用するｍＲＮＡ塩基編集手法をセクレターゼ阻害剤手法（例えば、ベータセクレターゼおよびγ－セクレターゼ阻害剤）と組み合わせることができる。両方の酵素は、シナプス機能／ニューロンの健康の維持に必要なタンパク質分解活性を有するようであり、したがって、機能を重度にまたは完全に低下させることは、不良な長期転帰につながる。ｍＲＮＡ塩基編集およびセクレターゼ阻害剤手法の複合手法の利用は、セクレターゼ阻害剤を単独で送達する単独手法と比較してセクレターゼ阻害剤の投与の低減を可能にし得る。それを必要とする対象の併用処置のために本明細書で開示される操作されたガイドＲＮＡと組み合わせることができる阻害剤としては、ベルベセスタット、アタベセスタット、ラナベセスタット、エレンベセスタット、ウミベセスタット、アバガセスタット、セマガセスタット、またはこれらの任意の組合せを挙げることができる。
本明細書に記載の組成物および方法は、既存の技術および治療薬、例えばセクレターゼ阻害剤、と比べて改善をもたらすことができる。本明細書に記載の組成物および方法の非限定的で例示的な恩恵および利点としては、（ａ）任意のおよび／または全ての形態のＡベータ断片（様々な長さのもの、および可溶性または凝集状態であり得るものを含む）を同時に標的とすることができること、および（ｂ）（ｉ）内在性ＡＰＰ機能、（ｉｉ）内在性β／γ－セクレターゼ機能、または（ｉｉｉ）炎症（例えば、ＡＲＩＡ）の変更を伴わないことを挙げることができる。
医薬組成物
組成物は、本明細書に記載される任意の編集実体を含み得る。医薬組成物は、第１の活性成分を含み得る。第１の活性成分は、本明細書に記載のウイルスベクター、本明細書に記載の天然に存在しないＲＮＡ、または本明細書に記載の核酸を含み得る。医薬組成物を単位用量形態で製剤化することができる。医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、または担体を含み得る。医薬組成物は、第２、第３または第４の活性成分を、例えば、関連プロテイノパチーのマルチプレックス標的化をもたらすために、含み得る。
本明細書に記載される組成物は、賦形剤を含み得る。賦形剤を、幹細胞に添加することができ、またはその供給源から幹細胞と共に単離することができる。賦形剤は、凍結保存薬、例えば、ＤＭＳＯ、グリセロール、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、またはこれらの任意の組合せを含み得る。賦形剤は、凍結保存薬、例えば、スクロース、トレハロース、デンプン、これらのいずれかについての塩、これらのいずれかについての誘導体、またはそれらの任意の組合せを含み得る。賦形剤は、ｐＨ剤（組成物の成分の酸化もしくは分解を最小限に抑えるために）、安定剤（組成物の成分の改変もしくは分解を防止するために）、緩衝剤（温度安定性を向上させるために）、可溶化剤（タンパク質の溶解度を増すために）、またはこれらの任意の組合せを含み得る。賦形剤は、界面活性剤、糖、アミノ酸、抗酸化剤、塩、非イオン性界面活性剤、可溶化剤、トリグリセリド、アルコール、またはこれらの任意の組合せを含み得る。賦形剤は、炭酸ナトリウム、酢酸塩、クエン酸塩、リン酸塩、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ソルビトール、スクロース、トレハロース、ポリソルベート８０、リン酸ナトリウム、スクロース、リン酸二ナトリウム、マンニトール、ポリソルベート２０、ヒスチジン、クエン酸塩、アルブミン、水酸化ナトリウム、グリシン、クエン酸ナトリウム、トレハロース、アルギニン、酢酸ナトリウム、酢酸塩、ＨＣｌ、エデト酸二ナトリウム、レシチン、グリセリン、キサンタンゴム、大豆イソフラボン、ポリソルベート８０、エチルアルコール、水、テプレノン、またはこれらの任意の組合せを含み得る。
本明細書で開示される組成物および方法は、ｍＲＮＡ塩基編集手法によるマルチプレックス型標的化を含み得る。例えば、本開示は、Ａベータ生成とタウノックダウンまたはアルファ－シヌクレインノックダウンなどの神経変性疾患または状態に関連する１つまたは複数の追加のタンパク質とに対するマルチプレックス型標的化のための、マルチプレックス型ベクターを提供する。これらのマルチプレックス型ベクターは、ＡＰＰを（Ａベータ生成に影響を与えるために）標的とする操作されたガイドＲＮＡと、神経変性疾患または状態に関連する１つまたは複数の追加のタンパク質を標的とする、本明細書で開示される１つまたは複数の追加の操作されたガイドＲＮＡまたは他の治療剤とをコードし得る。組成物は、神経変性状態またはタウ病態（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病）に影響を与える相補的経路の発現を調節する複数の特有の独立した生物活性を果たすことができる。相補的経路は、タウ、アルファ－シヌクレイン、およびＡベータによって媒介される病態を含み得る。一部の場合には、組成物は、独立して、タウノックダウンとＡＰＰ編集の組合せなどの１つより多くの標的ＲＮＡポリヌクレオチドを同時に標的とすることができる。組成物は、相補的経路を独立して標的とする２つ、３つ、４つ、５つ、６つのベクターまたはそれより多くのベクターを含み得る。マルチプレックス型標的化は、マルチプレックス型ベクターを投与した対象において相加的治療効果を生じさせることができる。マルチプレックス型標的化は、マルチプレックス型ベクターを投与した対象において相乗的治療効果を生じさせ、その結果、個々の標的化スキームよりも素晴らしい治療結果をもたらすことができる。
組成物は、（ｉ）切断部位を（例えば、Ａベータ断片形成を低減もしくは防止するために）編集するための、（ｉｉ）タンパク質（例えば、ＡＰＰ）発現をノックダウンするための、または（ｉｉｉ）これらの組合せのための、ｍＲＮＡ塩基編集を含み得る。組成物を、塩基を編集するために、開始部位を（例えば、発現を低減させるために）編集するために、立体障害（例えば、リボソーム活性を遮断することができるガイドＲＮＡ）を生じさせるために、標的となるｍＲＮＡの分解を増加させるために、またはこれらの任意の組合せのために、設計することができる。したがって、本明細書で開示される組成物および方法は、ＡＤＡＲ依存的におよび非依存的に発現を抑制することができる。
編集は、酵素によるタンパク質の切断を防止するためのまたは実質的に低減させるための標的部位（例えば、ＢＡＣＥ切断部位）の編集を含み得る。編集は、（ｉ）開始部位編集（例えば、ＡＴＧ）、（ｉｉ）エクソンスキッピング（例えば、開始部位を含有し得るエクソン）、（ｉｉｉ）領域がプロモーターに接近できないようにすること（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）に基づく手法）、または（ｉｖ）これらの任意の組合せによって達成される、タンパク質（例えば、プロテイノパチーとして神経変性疾患に関与するタンパク質）のノックダウンを含み得る。
本開示の組成物は、標的ＲＮＡポリヌクレオチド配列内のヌクレオチドを編集するための操作されたガイドＲＮＡを含み得る。組成物は、ＡＤＡＲ依存的にまたはＡＤＡＲ非依存的に編集を用いることができる。組成物は、ＲＮＡ編集実体を動員する動員ドメインを含み得る。
本明細書に記載される組成物および方法は、アルツハイマー病の進行を停止または防止するためのＡＰＰとタウまたはＳＮＣＡ ｍＲＮＡの両方のマルチプレックス型標的化を可能にすることができる。異なる標的ＲＮＡを標的とする複数の操作されたポリヌクレオチドを有するベクターの送達は、標的ＲＮＡの同時またはマルチプレックス型標的化を可能にすることができる。一部の場合には、特定の標的ＲＮＡを標的とする操作されたポリヌクレオチドを各々が有するベクターの送達もまた、標的ＲＮＡの同時またはマルチプレックス型標的化を可能にすることができる。
ｍＲＮＡ塩基編集手法は、ＡＰＰ上の１つまたは複数のＢＡＣＥ切断部位を編集することができ、それによって、正常または非罹患ＡＰＰ／ＢＡＣＥ機能を維持しながら毒性Ａベータ断片の形成または蓄積を軽減することができる。ノックダウン手法は、同時にタウ産生を標的としてタウ－ｐ蓄積を低減させることができる。
本明細書で提供される組成物および方法は、医薬組成物を用いることができる。至る所に記載される組成物を製剤化して医薬品にすることができ、疾患と診断された、それを必要とするヒトまたは哺乳動物を処置するために使用することができる。一部の場合には、医薬組成物を予防的に使用することができる。
疾患または状態は、神経変性疾患を含み得る。疾患は、１つまたは複数のプロテイノパチー（例えば、ＡＰＰ、タウ、またはアルファ－シヌクレイン）に関連するに疾患を含み得る。神経変性疾患は、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、毛細血管拡張性運動失調症、常染色体優性小脳性運動失調症、常染色体劣性シャルルヴォア・サグネ型痙性運動失調症、バッジョ・ヨシナリ症候群、バッテン病、コーエン・ギブソン症候群、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、大脳皮質基底核症候群、クロイツフェルト・ヤコブ病、認知症、致死性不眠症、脆弱Ｘ関連振戦／運動失調症候群、フリードライヒ運動失調症、前頭側頭型認知症、タウ突然変異による１７番染色体に連鎖する前頭側頭型認知症パーキンソニズム（ＦＴＤＰ－１７Ｔ）、近位筋優位遺伝性運動感覚ニューロパチー、ハンチントン病（ＨＤ）、乳児レフサム病、ＪＵＮＱおよびＩＰＯＤ、クフォー・ラケブ症候群、クフス病、レビー小体病、レビー小体型アルツハイマー病（ＬＢＶＡＤ）、歩行運動失調、ライム病、マチャド・ジョセフ病、運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）、多系統萎縮症、神経有棘赤血球症、ニーマン・ピック病、パーキンソン病（ＰＤ）、認知症を伴うパーキンソン病（ＰＤＤ）、ピック病（ＰｉＤ）、または進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、橋小脳（pontocerrebellar）低形成症、プリオン病、レフサム病、サンドホフ病、シャイ・ドレーガー症候群、脊髄性筋萎縮症、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）、脊髄小脳（spinocerrebellar）失調症、亜急性脊髄連合変性症、亜急性硬化性全脳炎、脊髄ろう、テイ・サックス病、中毒性脳症（toxic encephalapothay）、中毒性白質脳症、経ニューロン変性、ハリネズミふらつき症候群またはこれらの任意の組合せを含み得る。疾患または状態は、アルツハイマー病、大脳皮質基底核変性症、ボクシング認知症（慢性外傷性脳症）、前頭側頭型認知症、前頭側頭葉変性症、神経節細胞腫、神経節膠腫、リティコ・ボディグ病、髄膜血管腫症、ピック病、脳炎後パーキンソニズム、原発性加齢性タウオパチー、進行性核上性麻痺、タウオパチー、またはこれらの任意の組合せを含む、タウ斑形成に関連する疾患を含み得る。疾患または状態は、アルツハイマー病、レビー小体型認知症、レビー小体病、多系統萎縮症、パーキンソン病、またはこれらの任意の組合せを含む、アルファ－シヌクレイン形成に関連する疾患を含み得る。疾患または状態は、アルツハイマー病、脳アミロイド血管症、封入体筋炎（inclusion body mitosis）、レビー小体認知症、またはこれらの任意の組合せを含む、Ａベータ断片形成に関連する疾患を含み得る。疾患（または状態）は、外傷性脳損傷、ダウン症候群、がん、脆弱Ｘ症候群、自閉症、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、レッシュ・ナイハン病、代謝障害、またはこれらの任意の組合せも含み得る。疾患は、神経変性疾患を含み得る。
本明細書で提供される組成物を、本明細書で提供される方法で用いることができる。本明細書で提供される、提供される組成物のいずれかを、本明細書で提供される方法で用いることができる。一部の場合には、方法は、疾患もしくは状態を、または疾患もしくは状態の症状を、少なくとも部分的に予防、軽減、改善および／または処置することを含む。ある実施形態では、組成物は、ｉｎ ｖｉｖｏ診断を用いて評価される対象のベータアミロイド斑のレベルを低下させるために用いることができる。対象は、ヒトであることもあり、または非ヒトであることもある。対象は、哺乳動物（例えば、ラット、マウス、雌ウシ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ウマ）であり得る。対象は、脊椎動物であることもあり、または無脊椎動物であることもある。対象は、実験動物であることもある。対象は、患者であることがある。対象は、疾患に罹患していることがある。対象は、疾患の症状を提示することがある。対象は、疾患の症状を提示しないことがあるが、それにもかかわらず疾患を有することがある。対象は、介護者の医療下にあることがある（例えば、対象は入院しており、医師により処置されている）。ある実施形態では、対象は、４０、５０、６０または７０歳より高齢である。
投与経路および投与
本明細書に記載される組成物は、対象への送達のためにＡＡＶ（ＩＶ／ＣＮＳ）ベクターを用いることができる。ＡＡＶベクター送達は、単一用量で長期間の効果を得ることができ、マルチプレックス型標的化の機会を提供することができる。方法は、ＣＮＳ／ＩＶ投与による中枢神経指向性および生体内分布を促進することができるＡＡＶ血清型を同定するステップを含み得る。
一部の場合には、投与は、所望の生物学的作用部位への化合物または組成物の送達を可能にするために使用することができる方法を指すことができる。送達は、中枢神経系（ＣＮＳ）への直接適用を含み得る。送達は、血液脳関門の横断を許容するものであり得る。送達は、身体の罹患組織または領域への直接適用を含み得る。送達は、頭蓋内注射を含み得る。送達は、実質注射、髄腔内注射、側脳室内注射、または大槽内注射を含み得る。本明細書で提供される組成物を任意の方法により投与することができる。投与方法は、吸入、動脈内注射、脳室内注射、大槽内注射、筋肉内注射、眼窩下注射、実質内注射、腹腔内注射、脊髄内注射、髄腔内注射、静脈内注射、側脳室内注射、定位的注入、皮下注射、またはこれらの任意の組合せによるものであり得る。送達は、非経口投与（静脈内、皮下、髄腔内、腹腔内、筋肉内、血管内、または注入を含む）、経口投与、吸入投与、十二指腸内投与、直腸投与を含み得る。送達は、皮膚などの、表面の外面への局所投与（例えば、ローション、クリーム、軟膏）を含み得る。一部の場合には、投与は、実質注射、髄腔内注射、側脳室内注射、大槽内注射、静脈内注射、もしくは鼻腔内注射、またはこれらの任意の組合せによるものである。一部の事例では、対象は、監督の非存在下で組成物を投与することができる。一部の事例では、対象は、医療専門家（例えば、医師、看護師、医師助手、病棟勤務員、ホスピス職員など）の監督下で組成物を投与することができる。医療専門家は、組成物を投与することができる。一部の場合には、美容専門家が組成物を投与することができる。
本明細書で開示される、操作されたガイドＲＮＡ、マルチプレックス型ベクター、または併用療法に関するあらゆるものを含めて、組成物の投与または適用を、少なくとも約少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００日の連続するまたは連続しない日数の処置継続期間にわたって行うことができる。処置継続期間は、約１～約３０日、約２～約３０日、約３～約３０日、約４～約３０日、約５～約３０日、約６～約３０日、約７～約３０日、約８～約３０日、約９～約３０日、約１０～約３０日、約１１～約３０日、約１２～約３０日、約１３～約３０日、約１４～約３０日、約１５～約３０日、約１６～約３０日、約１７～約３０日、約１８～約３０日、約１９～約３０日、約２０～約３０日、約２１～約３０日、約２２～約３０日、約２３～約３０日、約２４～約３０日、約２５～約３０日、約２６～約３０日、約２７～約３０日、約２８～約３０日、または約２９～約３０日であり得る。
本明細書で開示される、操作されたガイドＲＮＡ、マルチプレックス型ベクター、または併用療法に関するあらゆるものを含めて、組成物の投与または適用を、少なくとも約１週間、少なくとも約１カ月、少なくとも約１年、少なくとも約２年、少なくとも約３年、少なくとも約４年、少なくとも約５年、少なくとも約６年、少なくとも約７年、少なくとも約８年、少なくとも約９年、少なくとも約１０年、少なくとも約１５年、少なくとも約２０年、またはそれを超える処置継続期間にわたって行うことができる。投与を対象の生涯にわたって反復的に、例えば、対象の生涯にわたって月１回または年１回、行うことができる。投与を対象の人生のかなりの部分にわたって反復的に、例えば、少なくとも約１年、５年、１０年、１５年、２０年、２５年、３０年、またはそれより長い間、月１回または年１回、行うことができる。
一部の場合には、医薬組成物をはじめとする本明細書で提供される任意の組成物の投与は、有効量、例えば、疾患もしくは状態の症状を軽減するためのおよび／または疾患もしくは状態を軽減するために有効な量での投与である。有効量は、所望の効果を得るのに十分なものであり得る。治療的または予防的応用に関して、有効量は、問題となっている状態のタイプおよび重症度、個々の対象の特徴、例えば、全身の健康、年齢、性別、体重、および医薬組成物に対する耐性に依存することになる。免疫原性組成物に関して、一部の実施形態では、有効量は、病原体に対する防御応答をもたらすのに十分な量である。他の実施形態では、免疫原性組成物の有効量は、抗原に対する抗体生成をもたらすのに十分な量である。一部の実施形態では、有効量は、それを必要とする対象に受動免疫を与えるのに必要な量である。免疫原性組成物に関して、一部の実施形態では、有効量は、上記の要因に加えて、使用目的、特定の抗原性化合物の免疫原性の程度、および対象の免疫系の健康／応答性に依存することになる。
操作されたガイドＲＮＡ、マルチプレックス型ベクター、または併用療法に関するあらゆるものを含めて、本開示の組成物の投与または適用を、１日に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４回行うことができる。一部の場合には、本明細書で開示される組成物の投与または適用を、週に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１回行うことができる。一部の場合には、本明細書で開示される組成物の投与または適用を、月に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９または９０回行うことができる。
操作されたガイドＲＮＡ、マルチプレックス型ベクター、または併用療法に関するあらゆるものを含めて、本開示の組成物を、単一用量としてまたは分割された用量として投与／適用することができる。一部の場合には、本明細書に記載される組成物を第１の時点および第２の時点で投与することができる。一部の場合には、第１の投与が他の投与の前に行われ、投与時に１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、１６時間、２０時間、１日、２日、４日、７日、２週間、４週間、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１年またはそれを超える差があるように、組成物を投与することができる。
本開示のベクターを任意の好適な用量で対象に投与することができる。好適な用量は、少なくとも約５×１０７～５０×１０１３ゲノムコピー／ｍＬであり得る。一部の場合には、好適な用量は、少なくとも約５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１０×１０７、１１×１０７、１５×１０７、２０×１０７、２５×１０７、３０×１０７または５０×１０７ゲノムコピー／ｍＬであり得る。一部の実施形態では、好適な用量は、約５×１０７～６×１０７、５．９×１０７～７×１０７、６．９×１０７～８×１０７、７．９×１０７～９×１０７、８．９×１０７～１０×１０７、９．９×１０７～１１×１０７、１０．９×１０７～１５×１０７、１４．９×１０７～２０×１０７、１９．９×１０７～２５×１０７、２４．９×１０７～３０×１０７、２９．９×１０７～５０×１０７、または４９．９×１０７～１００×１０７ゲノムコピー／ｍＬであり得る。一部の場合には、好適な用量は、約５×１０７～１０×１０７、９．９×１０７～２５×１０７、または２４．９×１０７～５０×１０７ゲノムコピー／ｍＬであり得る。一部の場合には、好適な用量は、少なくとも約５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１０×１０８、１１×１０８、１５×１０８、２０×１０８、２５×１０８、３０×１０８または５０×１０８ゲノムコピー／ｍＬであり得る。一部の実施形態では、好適な用量は、約５×１０８～６×１０８、５．９×１０８～７×１０８、６．９×１０８～８×１０８、７．９～９×１０８、８．９×１０８～１０×１０８、９．９×１０８～１１×１０８、１０．９×１０８～１５×１０８、１４．９×１０８～２０×１０８、１９．９×１０８～２５×１０８、２４．９×１０８～３０×１０８、２９．９×１０８～５０×１０８、または４９．９×１０８～１００×１０８ゲノムコピー／ｍＬであり得る。一部の場合には、好適な用量は、約５×１０８～１０×１０８、９．９×１０８～２５×１０８、または２４．９×１０８～５０×１０８ゲノムコピー／ｍＬであり得る。一部の場合には、好適な用量は、少なくとも約５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１０×１０９、１１×１０９、１５×１０９、２０×１０９、２５×１０９、３０×１０９または５０×１０９ゲノムコピー／ｍＬであり得る。一部の実施形態では、好適な用量は、約５×１０９～６×１０９、５．９×１０９～７×１０９、６．９×１０９～８×１０９、７．９×１０９～９×１０９、８．９×１０９～１０×１０９、９．９×１０９～１１×１０９、１０．９×１０９～１５×１０９、１４．９×１０９～２０×１０９、１９．９×１０９～２５×１０９、２４．９×１０９～３０×１０９、２９．９×１０９～５０×１０９、または４９．９×１０９～１００×１０９ゲノムコピー／ｍＬであり得る。一部の場合には、好適な用量は、約５×１０９～１０×１０９、１０×１０９～２５×１０９、または２５×１０９～５０×１０９ゲノムコピー／ｍＬであり得る。一部の場合には、好適な用量は、少なくとも約５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１０×１０１０、１１×１０１０、１５×１０１０、２０×１０１０、２５×１０１０、３０×１０１０または５０×１０１０ゲノムコピー／ｍＬであり得る。一部の実施形態では、好適な用量は、約５×１０１０～６×１０１０、５．９×１０１０～７×１０１０、６．９～８×１０１０、７．９×１０１０～９×１０１０、８．９×１０１０～１０×１０１０、９．９×１０１０～１１×１０１０、１０．９×１０１０～１５×１０１０、１４．９×１０１０～２０×１０１０、１９．９×１０１０～２５×１０１０、２４．９×１０１０～３０×１０１０、２９．９×１０１０～５０×１０１０、または４９．９×１０１０～１００×１０１０ゲノムコピー／ｍＬであり得る。一部の場合には、好適な用量は、約５×１０１０～１０×１０１０、１０×１０１０～２５×１０１０、または２５×１０１０～５０×１０１０ゲノムコピー／ｍＬであり得る。一部の場合には、好適な用量は、少なくとも約５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１０×１０１１、１１×１０１１、１５×１０１１、２０×１０１１、２５×１０１１、３０×１０１１または５０×１０１１ゲノムコピー／ｍＬであり得る。一部の実施形態では、好適な用量は、約５×１０１１～６×１０１１、５．９×１０１１～７×１０１１、６．９～８×１０１１、７．９×１０１１～９×１０１１、８．９×１０１１～１０×１０１１、９．９×１０１１～１１×１０１１、１０．９×１０１１～１５×１０１１、１４．９×１０１１～２０×１０１１、１９．９×１０１１～２５×１０１１、２４．９×１０１１～３０×１０１１、２９．９×１０１１～５０×１０１１、または４９．９×１０１１～１００×１０１１ゲノムコピー／ｍＬであり得る。一部の場合には、好適な用量は、約５×１０１１～１０×１０１１、１０×１０１１～２５×１０１１、または２５×１０１１～５０×１０１１ゲノムコピー／ｍＬであり得る。一部の場合には、好適な用量は、少なくとも約５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、９×１０１２、１０×１０１２、１１×１０１２、１５×１０１２、２０×１０１２、２５×１０１２、３０×１０１２または５０×１０１２ゲノムコピー／ｍＬであり得る。一部の実施形態では、好適な用量は、約５×１０１２～６×１０１２、５．９×１０１２～７×１０１２、６．９～８×１０１２、７．９×１０１２～９×１０１２、８．９×１０１２～１０×１０１２、９．９×１０１２～１２×１０１２、１０．９×１０１２～１５×１０１２、１４．９×１０１２～２０×１０１２、１９．９×１０１２～２５×１０１２、２４．９×１０１２～３０×１０１２、２９．９×１０１２～５０×１０１２、または４９．９×１０１２～１００×１０１２ゲノムコピー／ｍＬであり得る。一部の場合には、好適な用量は、約５×１０１２～１０×１０１２、９．９×１０１２～２５×１０１２、または２４．９×１０１２～５０×１０１２ゲノムコピー／ｍＬであり得る。一部の場合には、好適な用量は、少なくとも約５×１０１３、６×１０１３、７×１０１３、８×１０１３、９×１０１３、１０×１０１３、１１×１０１３、１５×１０１３、２０×１０１３、２５×１０１３、３０×１０１３または５０×１０１３ゲノムコピー／ｍＬであり得る。一部の実施形態では、好適な用量は、約５×１０１３～６×１０１３、５．９×１０１３～７×１０１３、６．９～８×１０１３、７．９×１０１３～９×１０１３、８．９×１０１３～１０×１０１３、９．９×１０１３～１３×１０１３、１０．９×１０１３～１５×１０１３、１４．９×１０１３～２０×１０１３、１９．９×１０１３～２５×１０１３、２４．９×１０１３～３０×１０１３、２９．９×１０１３～５０×１０１３、または４９．９×１０１３～１００×１０１３ゲノムコピー／ｍＬであり得る。一部の場合には、好適な用量は、約５×１０１３～１０×１０１３、９．９×１０１３～２５×１０１３、または２４．９×１０１３～５０×１０１３ゲノムコピー／ｍＬであり得る。一部の場合には、好適な用量は、少なくとも約５×１０１３、６×１０１３、７×１０１３、８×１０１３、９×１０１３、１０×１０１３、１１×１０１３、１５×１０１３、２０×１０１３、２５×１０１３、３０×１０１３または５０×１０１３ゲノムコピー／ｍＬであり得る。一部の実施形態では、好適な用量は、約５×１０１３～６×１０１３、５．９×１０１３～７×１０１３、６．９～８×１０１３、７．９×１０１３～９×１０１３、８．９×１０１３～１０×１０１３、９．９×１０１３～１３×１０１３、１０．９×１０１３～１５×１０１３、１４．９×１０１３～２０×１０１３、１９．９×１０１

３～２５×１０１３、２４．９×１０１３～３０×１０１３，２９．９×１０１３～５０×１０１３、または４９．９×１０１３～１００×１０１３ゲノムコピー／ｍＬであり得る。一部の場合には、好適な用量は、約５×１０１３～１０×１０１３、９．９×１０１３～２５×１０１３、または２４．９×１０１３～５０×１０１３ゲノムコピー／ｍＬであり得る。
一部の場合には、個体に投与されるウイルス粒子の用量は、任意の少なくとも約１×１０７～約１×１０１３ゲノムコピー／ｋｇ体重であり得る。一部の実施形態では、個体に投与されるウイルス粒子の用量は、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、または９×１０７ゲノムコピー／ｋｇ体重であり得る。一部の実施形態では、個体に投与されるウイルス粒子の用量は、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、または９×１０８ゲノムコピー／ｋｇ体重であり得る。一部の実施形態では、個体に投与されるウイルス粒子の用量は、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、または９×１０９ゲノムコピー／ｋｇ体重であり得る。一部の実施形態では、個体に投与されるウイルス粒子の用量は、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、または９×１０１０ゲノムコピー／ｋｇ体重であり得る。一部の実施形態では、個体に投与されるウイルス粒子の用量は、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、または９×１０１１ゲノムコピー／ｋｇ体重であり得る。一部の実施形態では、個体に投与されるウイルス粒子の用量は、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、または９×１０１２ゲノムコピー／ｋｇ体重であり得る。一部の実施形態では、個体に投与されるウイルス粒子の用量は、１×１０１３、２×１０１３、３×１０１３、４×１０１３、５×１０１３、６×１０１３、７×１０１３、８×１０１３、または９×１０１３ゲノムコピー／ｋｇ体重であり得る。
疾患を診断するためのまたは疾患進行をモニターするための方法およびシステム
医師は、アルツハイマー病を診断するために病歴、身体検査、神経学的検査、精神状態検査、遺伝子検査、および脳イメージングを使用することになる。病歴協議は、現在もしくは過去の病気があるかどうか、または家族の一員がアルツハイマー病に罹患している可能性があるかどうかを調査することを含む。身体検査は、認知症様症状を引き起こす医学的な問題の特定に役立ち得る。身体検査は、食事、栄養、アルコールの使用、薬物療法、血圧、体温、脈拍、心肺機能、または他の健康状態を調査することを含み得る。身体検査は、血液および尿検査も含み得る。神経学的検査は、患者がアルツハイマー病以外の他の脳障害を有するかどうかを評価することができる。神経学的検査は、反射、協調、筋緊張／筋力、眼球運動、発話、または感覚を検査することを含み得る。神経学的検査は、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、または陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）を含むがこれらに限定されない、脳イメージング研究も含み得る。精神状態検査は、記憶、問題解決能力、または他の認知能力を評価することができる。精神状態検査は、自己認識、時間もしくは空間認識、記憶、計算能力、または他の認知能力を調査することを含み得る。精神状態検査は、精神状態短時間検査（ＭＭＳＥ）、Ｍｉｎｉ－Ｃｏｇテスト、ＦＤＡにより承認されたコンピュータによるテスト、気分評価、または他のものも含み得る。ＦＤＡにより承認されたコンピュータによるテストは、Ｃａｎｔａｂ Ｍｏｂｉｌｅ、Ｃｏｇｎｉｇｒａｍ、Ｃｏｇｎｉｖｕｅ、Ｃｏｇｎｉｓｉｏｎおよび自動神経心理学的評価指標（ＡＮＡＭ）デバイスを含み得る。遺伝子検査は、ＡＰＰ、ＰＳＥＮ－１、ＰＳＥＮ－２、またはａｐｏＥ４を検査することを含み得る。アルツハイマー病の他のリスク遺伝子としては、ＡＢＣＡ７、ＣＬＵ、ＣＲ１、ＰＩＣＡＬＭ、ＰＬＤ３、ＴＲＥＭ２、またはＳＯＲＬ１が挙げられる。上に列挙した全ての情報を用いて、医師は、患者が、「アルツハイマー型認知症の可能性がある」（認知症が別の原因に起因することがある）かどうか、「アルツハイマー型認知症の可能性が高い」（認知症の他の原因を見出すことができない）かどうか、または何らかの他の問題を有するかどうかを判定することができる。
キット
本明細書に記載される組成物のいずれも、キットに含まれていることがある。非限定的な例では、ベクター、ポリヌクレオチド、ペプチド、本明細書で提供されるポリヌクレオチドを生成するための試薬、およびこれらの任意の組合せが、キットに含まれていることがある。一部の場合には、キット成分は、好適な容器手段に入れて提供される。
キットは、好適に小分けされた組成物を含み得る。キットの成分は、水性培地中に入れて包装されることもあり、凍結乾燥形態で包装されることもある。キットの容器手段は、成分を入れることができる、好ましくは、成分を適切に小分けすることができる、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、瓶、注射器または他の容器手段を一般に含むことになる。キット内に１つより多くの成分が存在する場合、キットは、追加の成分を別々に入れることができる第２の、第３のまたは他の追加の容器も、一般に含むことになる。しかし、成分の様々な組み合わせが１つのバイアルに含まれていることもある。キットは、商業販売のために厳重に密封された状態で成分を収容するための手段も、概して含むことになる。そのような容器としては、射出成形またはブロー成形プラスチック容器を挙げることができ、その中に所望のバイアルが保持される。
しかし、キットの成分は、乾燥粉末として備えられていることもある。試薬および／または成分が、乾燥粉末として備えられている場合、粉末を好適な溶媒の添加により再構成することができる。溶媒が別の容器手段に備えられていることもあることが想定される。
一部の実施形態では、キットは、操作されたガイドＲＮＡ、操作されたガイドＲＮＡ前駆体、操作されたガイドＲＮＡもしくは操作されたガイドＲＮＡ前駆体を含むベクター、または操作されたガイドＲＮＡもしくは操作されたガイドＲＮＡ前駆体の核酸、または医薬組成物、および容器を含み得る。一部の事例では、容器は、プラスチック、ガラス、金属、またはこれらの任意の組合せであり得る。
一部の事例では、本明細書に記載される組成物を含む包装された製品に適切な表示を付けることができる。一部の事例では、本明細書に記載される医薬組成物を、製造管理および品質管理に関する基準（ｃＧＭＰ）および表示規制に従って製造することができる。一部の場合には、本明細書で開示される医薬組成物は、無菌であり得る。
（実施例１）
アルツハイマー病の処置
本実施例は、本開示の操作されたガイドＲＮＡを使用するアルツハイマー病の処置を記載する。
対象をアルツハイマー病と診断する。図４は、そのような診断の例を示す。
中心となる考えは、ベータ切断部位の突然変異誘発、およびそれらの切断部位の周辺のアミノ酸のＲＮＡ編集である。この手法には、１）ベータ－セクレターゼ（主としてＢＡＣＥ１だが他のものであってもよい）の基質選好性を減弱させることによって疾患におけるドライバー事象を直接モジュレートする、および２）正常なＡＰＰ機能に干渉せず、内在性ＡＰＰ発現におおむね影響を与えずに放置するという、二重の利点がある。ＢＡＣＥ１基質選好性を下の表８に示す。
Figure 2023504314000089
対象に医薬組成物の投与レジメンを処方する。医薬組成物は、セクレターゼ切断部位を編集する操作されたポリヌクレオチドまたは少なくとも２つの操作されたポリヌクレオチド（例えば、本開示のいずれかの操作されたガイドＲＮＡ）を含む。セクレターゼ切断部位は、ＢＡＣＥセクレターゼ切断部位である。切断部位は、ＡＰＰ（例えば、本明細書で開示されるＡＰＰアイソフォームのいずれか）のベータまたはベータ’切断部位である。医薬組成物を、頭蓋組織への直接注射、ＩＣＭ注射またはＩＣＶ注射により対象に投与する。対象は、ヒトまたは非ヒト動物である。操作されたガイドＲＮＡでの処置後のＡベータ断片形成量は、セクレターゼ阻害剤での処置後のＡベータ断片形成量より少ない（例えば、少なくとも約１／４である）。操作されたガイドＲＮＡを対象に－例えば、これらに限定されないが、対象の脳への対応するガイドＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ送達によって－投与すると、アルツハイマー病の症状が緩和されるか、または全ての症状が消失される。
ＡＰＰを標的とするために、操作されたポリヌクレオチドを、配列番号４８で示す肝要なＡＰＰ標的配列領域に基づいて設計する。
配列番号４８
Figure 2023504314000090
アンチセンスまたは相補配列（長さ２０～１００ｂｐの）は、配列番号４８におけるＡＰＰ領域の全ての可能性のある部分に相補的な配列を含むことになる。標的アデニンの向かい側の領域がシトシンと対合することになる（配列番号４８に下線を引いた通り）。アンチセンス配列例を表９に収載する。
Figure 2023504314000091
表９に収載したものに基づく操作されたポリヌクレオチド配列を、表１０に収載する。
Figure 2023504314000092
 （実施例２）
アルツハイマー病の処置のためのマルチプレックス型組成物
本実施例は、アルツハイマー病の処置のためのマルチプレックス型組成物（例えば、異なるＲＮＡポリヌクレオチドを標的とする本開示の２つの操作されたガイドＲＮＡ）を記載する。対象をアルツハイマー病と診断する。対象に医薬組成物の投与レジメンを処方する。医薬組成物は、ＡＰＰのＢＡＣＥ切断部位（βまたはβ’切断部位）の編集のための操作されたガイドＲＮＡと、非タンパク質コード領域（例えば、開始部位）を標的とするまたはタウ遺伝子の開始部位のエクソンスキッピングを引き起こす（いずれの場合もタウノックダウンをもたらす）操作されたガイドＲＮＡとを含む、マルチプレックス型組成物を含む。医薬組成物を、パーキンソン病を処置するために有効な量で、実質注射、頭蓋組織への直接注射、ＩＣＭ注射またはＩＣＶ注射により対象に投与する。対象にマルチプレックス型組成物を投与すると、アルツハイマー病の症状が緩和されるか、または全ての症状が消失される。
（実施例３）
アルツハイマー病の併用処置
本実施例は、アルツハイマー病の処置のためのマルチプレックス型組成物（例えば、異なるＲＮＡポリヌクレオチドを標的とする本開示の２つの操作されたガイドＲＮＡ）を記載する。対象をアルツハイマー病と診断することになる。対象に医薬組成物の投与レジメンを処方することになる。医薬組成物は、ＡＰＰのＢＡＣＥ切断部位（βまたはβ’切断部位）の編集のための操作されたガイドＲＮＡと、アルファ－シヌクレインノックダウンをもたらすＳＮＣＡの非タンパク質コード領域（例えば、プロモーター領域の開始部位）を標的とする操作されたガイドＲＮＡとを含む、マルチプレックス型組成物を含むことになる。操作されたガイドＲＮＡおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドを、単一の医薬組成物または別々の医薬組成物に製剤化する。医薬組成物（単数または複数）を、アルツハイマー病を処置するために有効な量で、実質注射、頭蓋組織への直接注射、ＩＣＭ注射またはＩＣＶ注射により対象に投与することになる。対象にマルチプレックス型組成物を投与すると、アルツハイマー病の症状が緩和されるか、または全ての症状が消失される。
（実施例４）
アルツハイマー病の処置のためのマルチプレックス型ベクター
本実施例は、アルツハイマー病の処置のためのマルチプレックス型ベクターを記載する。対象をアルツハイマー病と診断する。対象に医薬組成物の投与レジメンを処方する。医薬組成物は、ＡＰＰを標的とする操作されたガイドＲＮＡを含む第１のベクターと、タウ－ｐを標的とする第２の操作されたガイドＲＮＡを含む第２のベクターとを含む。医薬組成物を、アルツハイマー病を処置するために有効な量で、中枢神経系（ＣＮＳ）への直接注射、実質注射、頭蓋組織への直接注射、ＩＣＭ注射またはＩＣＶ注射により対象に投与する。対象にマルチプレックス型ベクターを投与すると、アルツハイマー病の症状が緩和されるか、または全ての症状が消失される。
（実施例５）
単一のベクターによるマルチプレックス型の操作されたポリヌクレオチドの送達
異なる遺伝子の多型は、アルツハイマー病のリスク増加または重症度上昇に関連するので、少なくとも２つの標的ＲＮＡの発現の同時操作は、有用な処置であり得る。本発明で例証されるようなＲＮＡ編集は、モジュール式であり、ＲＮＡ編集酵素および操作されたポリヌクレオチドは、２つの異なる実体である。それ故、ＲＮＡ編集をマルチプレックス化して、複数の別個の標的を同時に修正することができる。例えば、原因となるＡＰＰおよびタウまたはＳＮＣＡ多型を有するアルツハイマー病患者を処置するために、２つのコード配列を生成する。第１のコード配列は、表１および１３に収載するものいずれか１つまたは表１０もしくは１７のガイドＲＮＡのいずれかなどの、任意のＡＰＰアイソフォームの標的ＲＮＡ配列に結合することができるガイドＲＮＡのいずれかをコードする。これらのガイドＲＮＡは、ＡＰＰの切断部位を、Ａベータ４０／４２の産生を阻害するように編集することができる。第２のコード配列は、表４および６に収載したタウもしくはＳＮＣＡ ｍＲＮＡの開始ＡＴＧを標的とするガイドＲＮＡ、または表１４～１６に収載するいずれかのガイドＲＮＡをコードする。それは、開始ＡＴＧの任意のヌクレオチドを任意の他のヌクレオチドに変換することができる。開始ＡＴＧは除去されるので、タウまたはＳＮＣＡの発現は減少するはずである。これらの２つのコード配列を、各々、ポリメラーゼＩＩＩプロモーターと対合させ、単一のウイルスベクター－例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）、レンチウイルスベクター、またはレトロウイルスベクター－にクローニングして両方のコード配列を発現させる。ベクターを患者の脳に脳室内注射によって注射する。
対象をアルツハイマー病と診断する。対象に医薬組成物の投与レジメンを処方する。医薬組成物は、Ａベータ４０／４２を標的とする第１の操作されたガイドＲＮＡをコードする第１のポリヌクレオチドとタウ／ＳＮＣＡを標的とする第２の操作されたガイドＲＮＡをコードする第２のポリヌクレオチドとを含むベクターのマルチプレックス標的化スキームを含む。医薬組成物を、アルツハイマー病を処置するために有効な量で中枢神経系（ＣＮＳ）への直接注射によって対象に投与する。
（実施例６）
複数のベクターによるマルチプレックス型の操作されたポリヌクレオチドの送達
ＲＮＡ編集実体およびＲＮＡ標的化ポリヌクレオチドのモジュール方式により、様々な方法でのマルチプレックス型標的化の実行が可能になる。例えば、原因となるＡＰＰおよびタウまたはＳＮＣＡ多型を有するアルツハイマー病患者を処置するために、２つのコード配列を生成する。第１のコード配列は、表１および１３に収載するものいずれか１つまたは表１０もしくは１７のガイドＲＮＡのいずれかなどの、任意のＡＰＰアイソフォームの標的ＲＮＡ配列に結合することができるガイドＲＮＡのいずれかをコードする。第２のコード配列は、表４および６に収載したタウもしくはＳＮＣＡ ｍＲＮＡのいずれか１つの開始ＡＴＧを標的とする操作されたポリヌクレオチド、または表１４～１６に収載するいずれかのガイドＲＮＡをコードし、開始ＡＴＧの任意のヌクレオチドをいずれかの他のヌクレオチドに変換することができる。開始ＡＴＧは除去されるので、タウまたはＳＮＣＡの発現は減少するはずである。これらの２つのコード配列を、各々、ポリメラーゼＩＩＩプロモーターと対合させ、各々、単一のウイルスベクター－例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）、レンチウイルスベクター、またはレトロウイルスベクター－にクローニングして各コード配列を個々に発現させる。ベクターを患者の脳に脳室内注射によって注射する。
対象をアルツハイマー病と診断する。対象に医薬組成物の投与レジメンを処方する。医薬組成物は、Ａベータ４０／４２を標的とする第１の操作されたガイドＲＮＡをコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１のベクター、およびタウ／ＳＮＣＡを標的とする第２の操作されたポリヌクレオチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む第２のベクターの、マルチプレックス標的化スキームを含むことになる。医薬組成物を、アルツハイマー病を処置するために有効な量で中枢神経系（ＣＮＳ）への直接注射によって対象に投与する。
（実施例７）
複数のベクターによるマルチプレックス型の操作されたポリヌクレオチドの送達
本発明で説明する操作されたポリヌクレオチドを、いずれのウイルスベクターも用いずに維持し、投与することができ、例えば、表１および１３に収載するもののいずれか１つなどの任意のＡＰＰアイソフォームの標的ＲＮＡ配列に結合することができるガイドＲＮＡのいずれか、または表１０もしくは１７のガイドＲＮＡのいずれかをコードする、第１のコード配列、および表４および６に収載したタウもしくはＳＮＣＡ ｍＲＮＡのいずれか１つの開始ＡＴＧを標的とする操作されたポリヌクレオチド、または表１４～１６に収載するいずれかのガイドＲＮＡをコードする、第２のコード配列であって、各々がポリメラーゼＩＩＩプロモーターと対合するコード配列を、脳室内注射により患者の脳に注射する。
対象をアルツハイマー病と診断する。対象に医薬組成物の投与レジメンを処方する。医薬組成物は、Ａベータ４０／４２を標的とする第１の操作されたガイドＲＮＡをコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１のベクター、およびタウ／ＳＮＣＡを標的とする第２の操作されたポリヌクレオチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む第２のベクターの、マルチプレックス標的化スキームを含む。医薬組成物を、アルツハイマー病を処置するために有効な量で中枢神経系（ＣＮＳ）への直接注射によって対象に投与する。
（実施例８）
複数のベクターによるマルチプレックス型の操作されたポリヌクレオチドの送達
実施例６、７および８に記載したいずれかの操作されたポリヌクレオチドを組合せ、脳室内注射により患者の脳に注射する。
対象をアルツハイマー病と診断する。対象に医薬組成物の投与レジメンを処方する。医薬組成物ｗは、Ａベータ４０／４２を標的とする第１の操作されたガイドＲＮＡをコードする第１のポリヌクレオチドを含む第１のベクター、およびタウ／ＳＮＣＡを標的とする第２の操作されたポリヌクレオチドをコードする第２のポリヌクレオチドを含む第２のベクターの、マルチプレックス標的化スキームを含む。医薬組成物を、アルツハイマー病を処置するために有効な量で中枢神経系（ＣＮＳ）への直接注射によって対象に投与する。
（実施例９）
ＡＰＰをコードするＲＮＡ中の標的ＲＮＡ切断部位の同定
突然変異を含有する標的ＲＮＡの同定
標的ＲＮＡ部位を、ヒトＡＰＰアミノ酸配列と、前記アミノ酸配列をＡＰＰのプロテアーゼ切断部位におよび／または付近にコードする対応するヌクレオチド配列とを分析することにより同定した。表５から分かるように、ＡＰＰは、内在性プロテアーゼ、例えば、ベータ－セクレターゼ（例えば、ＢＡＣＥ１、カテプシンＢまたはメプリンベータ）およびアルファセクレターゼ（例えば、ＡＤＡＭ１０）により切断される非常に多くの切断部位を含有する。非アミロイド形成性である、および／または内在性ＡＰＰのＡＤＡＲ編集により作製され得る、突然変異型ＡＰＰタンパク質を選択する。アミロイドベータ４０（Ａベータ４０）およびアミロイドベータ４２（Ａベータ４２）をはじめとする代謝物を形成するベータアミロイド斑のレベルを測定した。図５に示すようなβ部位、β’部位およびα部位付近の突然変異を、ＡＤＡＲによる編集に適していると同定し、さらなる分析に選択した。
例示的な突然変異型ＡＰＰポリペプチドを発現する細胞系の生成
配列番号２で提供する野生型ＡＰＰポリペプチドおよび表２に収載した突然変異を有するＡＰＰポリペプチドを発現する細胞系を生成した。例示的な試みで、表２に収載した所望の突然変異を有するＡＰＰ６９５アイソフォームをコードするプラスミドを生成した。ＡＰＰ６９５アイソフォームは、神経細胞に最も高度に発現されるので選択したが、他のアイソフォームを用いてもよい。哺乳動物コドン最適化ＡＰＰ６９５アイソフォームを単一ｇブロック遺伝子断片として合成した。次いで、ギブソンアセンブリーを使用してＡＰＰ６９５をｐＢＩ－ＣＭＶ－ｍＣｈｅｒｒｙ骨格にクローニングした。これを表１１で提供する。プラスミドの特徴部の位置の概要を表１２で提供する。
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表２に収載した突然変異を有するＡＰＰポリペプチドを生成する突然変異を各々が含むプラスミド配列の例示的な部分を表６に示す。ＷＴ ＡＰＰ６９５アイソフォームではなく、配列番号５６～７０のＣＤＳ１領域（塩基６４７～２７３４）にこれらの突然変異型ＡＰＰ遺伝子配列を含有する全てのプラスミドを、配列番号５５に関して表１２のＣＤＳ１に列挙する。これらの配列を表１３に収載する。
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ＡＰＰ６９５プラスミドに対して部位特異的突然変異誘発を行って、表１３に収載した所望のＡＰＰ突然変異体を作製した。ＢＡＣＥ切断部位（β部位およびβ’部位）におけるまたはその付近の各標的突然変異体のヌクレオチド置換を、Ａ６７３Ｖ突然変異（病原性対照）およびＡ６７３Ｔ突然変異（保護的突然変異対照）に対応するヌクレオチド置換と共に図７に示す。ヌクレオチド配列中の囲み枠は、標的突然変異を示す。ＡＤＡＭ１０切断部位（α部位）におけるまたはその付近の各標的突然変異体のヌクレオチド置換を図８に示す。調製したら、所望の標的突然変異を含むプラスミドを市販のプラスミドＭｉｄｉｐｒｅｐキットを使用して精製した。
配列番号５５に関する表１２のＣＤＳ１の野生型ＡＰＰだけでなく、表１３に明記した合計で１５のＡＰＰ構築物も調製し、各構築物の同一性をシークエンシングによって確認した。シークエンシングは、キャピラリーシークエンシング、バイサルファイトフリーシークエンシング、バイサルファイトシークエンシング、ＴＥＴ支援バイサルファイト（ＴＡＢ）シークエンシング、ＡＣＥシークエンシング、ハイスループットシークエンシング、マクサム・ギルバートシークエンシング、大規模並行シグネチャーシークエンシング、ポロニーシークエンシング、４５４パイロシークエンシング、サンガーシークエンシング、Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシング、ＳＯＬｉＤシークエンシング、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ半導体シークエンシング、ＤＮＡナノボールシークエンシング、Ｈｅｌｉｓｃｏｐｅ １分子シークエンシング、１分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）シークエンシング、ナノポアシークエンシング、ショットガンシークエンシング、ＲＮＡシークエンシング、Ｅｎｉｇｍａシークエンシング、またはこれらの任意の組合せを含み得る。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＰＰ切断アッセイ
内在性プロテアーゼによる切断ならびにＡベータ４０およびＡベータ４２代謝物の産生に対する各ＡＰＰ突然変異型ポリペプチドの感受性を評価するために、ＨＥＫ２９３ ＡＰＰノックアウトクローン細胞系を生成した。手短に述べると、ＨＥＫ２９３細胞に、ＡＰＰポリペプチドの第５エクソンと第６エクソンの間のイントロンを標的とする３つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ）の組合せをヌクレオフェクトした。次いで、細胞を限界希釈法によりクローニングし、ウェスタンブロットによりスクリーニングして、ＡＰＰがノックアウトされた細胞を同定した。ＡＰＰノックアウトに成功した単離された細胞系について得られたウェスタンブロットを図９に示す。二次抗体（ｍ－ＩｇＧｋ ＢＰ－ＨＲＰ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ｓｃ－５１６１０２、１：１０００希釈）での処理に従ってウェスタンブロットを可視化した。
次いで、９６ウェル形式のＴｒａｎｓｉｔ－２９３を使用して、ＨＥＫ２９３ ＡＰＰノックアウト細胞系に３００ｎｇのＡＰＰ構築物（野生型および対照を含む）を５０，０００細胞／ウェルでトランスフェクトした。次いで、細胞をトランスフェクション後４８時間培養し、４８時間の時点で培地および細胞溶解物を回収した。分泌されたＡベータ４０およびＡベータ４２レベルを、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＤＡＢ１４０ＢおよびＤＡＢ１４２キット）を使用して測定した。３日の異なる日に３回の別々のトランスフェクション（３つのスクリーン）で構築物ごとに合計で９つの試料について実験を行った。ＦＡＭおよびＶＩＣにそれぞれコンジュゲートしたプライマーを使用して、同じウェルにおけるＨＰＲＴ ｍＲＮＡレベルに対するＡＰＰ ｍＲＮＡ発現により、トランスフェクション効率を評定した。３つのスクリーンの各々における代表ウェルからこのようにして測定したＨＰＲＴレベルに対するＡＰＰ発現レベルを図１０に示す。構築物間のＡＰＰ ｍＲＮＡ発現の有意差は観察されなかった（一元配置ＡＮＯＶＡ）。図１１Ａは、野生型ＡＰＰを含む試験した構築物の各々についての各トランスフェクション日に検出されたＡＰＰ ｍＲＮＡ発現に正規化したＡベータ４０レベルを示す。各棒は、平均＋／－ＳＥＭを示す。Ａ６７３Ｖ病原性突然変異を含有する構築物は、予想通り、全ての他の群と比較してＡベータ４０レベルの大幅な上昇を示した。各試料をノックアウト＋野生型ＡＰＰ（ＫＯ＋ＷＴ－ＡＰＰ）と比較する一元配置ＡＮＯＶＡ（Ｐ＜０．０００１）は、有意差を実証した。星印は、ダネット事後検定を使用する、それぞれのＡＰＰ構築物とＫＯ＋ＷＴ－ＡＰＰ構築物間の統計的有意性を表す。Ｋ６７０ＧおよびＭ６７１Ｖは、ＡＰＰ ｍＲＮＡ発現に正規化したＡベータ４０レベルの最も統計的に有意な低下をもたらすように見える。図１２Ａは、野生型ＡＰＰを含む試験した構築物の各々についての各トランスフェクション日に検出されたＡＰＰ ｍＲＮＡ発現に正規化したＡベータ４２レベルを示す。各棒は、平均＋／－ＳＥＭを示す。Ａ６７３Ｖ病原性突然変異を含有する構築物は、予想通り、全ての他の群と比較してＡベータ４２レベルの大幅な上昇を示した。各試料をノックアウト＋野生型ＡＰＰ（ＫＯ＋ＷＴ－ＡＰＰ）と比較する一元配置ＡＮＯＶＡ（Ｐ＜０．０００１）は、有意差を実証した。星印は、ダネット事後検定を使用する、それぞれのＡＰＰ構築物とＫＯ＋ＷＴ－ＡＰＰ構築物間の統計的有意性を表す。Ｍ６７１Ｖ突然変異は、ＡＰＰ ｍＲＮＡ発現に正規化したＡベータ４２レベルの最も統計的に有意な低下をもたらすように見える。
（実施例１０）
標的ＲＮＡの操作されたポリヌクレオチド編集
Ａベータ４０および／またはＡベータ４２に対する標的化配列を含む操作されたポリヌクレオチド、例えばガイドＲＮＡを使用して、ＡＰＰ突然変異含有ｍＲＮＡを修正する。突然変異がヘテロ接合性であるＥＢＶ形質転換Ｂ細胞をポリヌクレオチドで処理する。
手短に述べると、Ｌｏｎｚａ Ｘヌクレオフェクターを使用してプログラムＥＨ１００でガイドをＬＣＬ細胞にヌクレオフェクトする。約４０ｎｍｏｌまたは６０ｎｍｏｌの各ＩＶＴガイドＲＮＡを反応条件ごとに約２×１０５ＬＣＬ細胞にヌクレオフェクトする。３時間または７時間いずれかの時点でＲＮＡ単離のための細胞を回収するために、各々１×１０５を含有する２つのウェルに反応物を分割する。回収時に、細胞を１分間、１，５００×ｇで遠心する。培地を除去する。１８０ｕｌのＲＬＴ緩衝剤＋ＢＭｅを各ウェルに添加する。Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙプロトコールおよびキットを使用して細胞からＲＮＡを単離する。Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ） ＰｒｏｔｏＳｃｒｉｐｔ ＩＩ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成キットを使用して、ｃＤＮＡを単離されたＲＮＡから合成する。ＡＰＰのｃＤＮＡをサンガーシークエンシングによりシークエンシングした。シークエンシングは、Ｇｅｎｅｗｈｉｚに外注した。サンガートレースを分析して、各ＩＶＴガイドの編集効率を評定する。
（実施例１１）
ＮＲＧ１のベータセクレターゼ切断
本実施例は、別のベータセクレターゼ基質であるニューレグリン１（ＮＲＧ１）のベータセクレターゼ（例えば、ＢＡＣＥ１、カテプシンＢ、またはメプリンベータ）切断を記載する。９６ウェル形式のＴｒａｎｓｉｔ－２９３を使用して、ＨＥＫ２９３ ＡＰＰノックアウト細胞系に３００ｎｇの突然変異型ＡＰＰ構築物および野生型 ＡＰＰ構築物を５０，０００細胞／ウェルでトランスフェクトする。次いで、トランスフェクション後４８時間、細胞を培養する。培地および細胞溶解物を回収する。必要に応じて、ベータセクレターゼ阻害剤を試料処理の直前に培地および細胞溶解物に添加する。分泌されたＡベータ４０およびＡベータ４２レベルを、培地および／または溶解物の一部分を使用し、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＤＡＢ１４０ＢおよびＤＡＢ１４２キット）を使用して測定する。培地および／または細胞溶解物の一部分を液体クロマトグラフィー／質量分析法により分析して、ベータセクレターゼによるニューレグリン１（ＮＲＧ１）の切断時に生成されるペプチド代謝物の量を定量する。例えば、アミノ酸Ｆ２３７とＭ２３８の間でのベータセクレターゼによるＮＲＧ１の切断生成物を測定し、定量する。定量されたペプチドの量を、必要に応じて、トランスフェクションの４８時間後に細胞に存在する完全長ＮＲＧ１の量に正規化する。ＡＰＰ構築物がトランスフェクトされた細胞に存在する、完全長ＮＲＧ１の量およびＮＲＧ１のベータセクレターゼ媒介切断から生成された代謝物の量を、ＮＲＧ１ ＥＬＩＳＡによりまたは存在するＮＲＧ１の量の定量に好適な他の方法により測定する。次いで、ＡＰＰ突然変異体がトランスフェクトされた細胞に存在する、ＮＲＧ１切断生成物の量、またはＮＲＧ１切断生成物のＮＲＧ１の量に対する比を、野生型ＡＰＰ構築物がトランスフェクトされた細胞に存在する、ＮＲＧ１切断生成物の量、またはＮＲＧ１切断生成物のＮＲＧ１の量に対する比と、比較する。細胞にトランスフェクトされた所望のＡＰＰ突然変異体は、野生型ＡＰＰトランスフェクト細胞と比較して、ＮＲＧ１切断生成物の実質的に同じプロファイルを有する。
本実施例に記載する実験は、ベータセクレターゼ切断を示す代謝物を生成するベータセクレターゼの標的となる他のタンパク質の切断生成物を測定するように変更することができる。他のそのようなタンパク質の非限定的な例としては、アミロイド様タンパク質１（ＡＰＬＰ１）、アミロイド様タンパク質２（ＡＰＬＰ２）、コンタクチン２、Ｊａｇｇｅｄ １、神経細胞接着分子Ｌ１（ＣＨＬ１）、ニューレキシン１α、ニューレキシン３β、発作関連タンパク質６（ＳＥＺ６）、発作関連タンパク質６前駆体タンパク質（ＳＥＺ６Ｌ）、電位依存性ナトリウムイオンチャネル（ＶＧＳＣ）サブタイプＮａｖ１のβ（β１－４）補助サブユニット、およびＶＧＳＣ補助サブユニットＫＣＮＥ１またはＫＣＮＥ２が挙げられる。
好ましい実施形態を本明細書に示し、説明したが、そのような実施形態を単なる例として提供することは、当業者には明らかであろう。非常に多くの変形形態、変更形態および置換形態が今や当業者の心に浮かぶことであろう。本明細書に記載する実施形態の様々な代替形態を用いることができることは理解されるはずである。下記の請求項により範囲が定義されること、およびこれらの請求項の範囲内の方法および構造ならびにそれらの均等物が本明細書でカバーされることを意図している。
（実施例１２）
ＲＡＢ７ａおよびＳＮＣＡ ｍＲＮＡの編集
本実施例では、異なる領域であるＲＡＢ７ａおよびアルファ－シヌクレイン（ＳＮＣＡ）を、異なるガイドＲＮＡ構築物を使用して編集した。ＲＡＢ７ａについては、第１エクソン、第２エクソン、および３’ＵＴＲを編集の標的としたが、ＳＮＣＡに関しては開始コドンおよび３’ＵＴＲを標的とした。図１３Ａは、ヒトＲＡＢ７ＡおよびＳＮＣＡのエクソン構造の概略図を示す。エクソンを灰色セグメントとして示し、コード領域を上に黒線として示す。ガイドＲＮＡ標的化部位の位置を紫色で示し、ＰＣＲプライマーを緑色で示す。
ヒトＲＡＢ７Ａ第１エクソン、第３エクソン、もしくは３’ＵＴＲ、またはヒトＳＮＣＡ開始コドンもしくは３’ＵＴＲを標的とする１００ｎｔのガイドＲＮＡを、３’ヘアピンを有さないｈＵ６プロモーター、または３’ＳｍＯＰＴ Ｕ７ヘアピンを有するｍＵ７もしくはｈＵ７プロモーターを使用して発現させた。図１３Ｂは、ＡＤＡＲ２過剰発現の存在または非存在下で異なるガイドＲＮＡ構築物を使用する編集の結果を要約する。３’ＳｍＯＰＴ Ｕ７ヘアピンと組み合わせたＵ７プロモーターは、各標的部位でのＡＤＡＲ編集を増進した（サンガーシークエンシングにより測定した）。３’ＵＴＲを標的とする構築物は、過剰発現ＡＤＡＲレベルに対してかなり低い内在性ＡＤＡＲレベルでも同等に作用したが、他の領域を標的とする構築物には、依然として、ＡＤＡＲ２過剰発現が有効であった。
異なるエクソン選択が生じるかどうかを確認するために、編集された転写物に由来するｃＤＮＡを単離し、表示されているプライマーを使用してＰＣＲ増幅した。ＲＡＢ７ａのコード決定配列に及ぶＲＡＢ７ａプライマーは、エクソン構造が維持された場合、４３７ｂｐアンプリコンを生成する。ＲＡＢ７ａの第３エクソンがスキップされた場合、３１０ｂｐアンプリコンが予期される。ＳＮＣＡプライマーを使用すると、３２３ｂｐ ＰＣＲアンプリコンが予期される。図１３Ｃは、最小第３エクソンスキッピングを示す。図１３Ｄは、サンガーシークエンシングクロマトグラムが、示されている転写物の標的アデノシンに対する特異的編集を示すことを示す。囲み枠は、オンターゲット編集部位を示す。一部の実施形態では、Ｕ７プロモーター下にあってｓｍＯｐｔヘアピン配列も含む操作されたガイドＲＮＡの組成物を本明細書で開示する。前記操作されたガイドＲＮＡは、ＳＮＣＡに対応する標的ＲＮＡ配列にハイブリダイズして、アデノシンのＡＤＡＲ媒介編集を助長する（図１を参照されたい）。ＳＮＣＡ遺伝子の編集を、ＳＮＣＡを高度に過剰発現するＫ５６２細胞におけるトランスフェクションによって評定した。９１％のオンターゲット編集（「標的Ａ」により示されているような）を示すサンガー配列トレースが左側にある。
（実施例１３）
Ｋ５６２細胞におけるＳＮＣＡの３’ＵＴＲのオンおよびオフターゲット編集
Ｕ７プロモーター下にあってｓｍＯｐｔヘアピン配列も含む操作されたガイドＲＮＡの組成物を本明細書で開示する。前記操作されたガイドＲＮＡは、ＳＮＣＡに対応する標的ＲＮＡ配列にハイブリダイズして、アデノシンのＡＤＡＲ媒介編集を助長する（図１４を参照されたい）。ＳＮＣＡ遺伝子の編集を、ＳＮＣＡを過剰発現するＫ５６２細胞における操作されたガイドＲＮＡのトランスフェクションによって評定した。１．５μｇの操作されたガイドＲＮＡを２×１０５のＳＮＣＡ過剰発現Ｋ５６２細胞にヌクレオフェクション（Ｌｏｎｚａ）によりトランスフェクトした。ＲＮＡ編集をトランスフェクションの４０および７２時間後に測定した。図１４Ａは、９１％のオンターゲット編集（「標的Ａ」により示されるような）を示すサンガー配列クロマトグラムである。図１４Ｂは、マウスＵ７プロモーターまたはヒトＵ７プロモーターのいずれかのもとでのＡＤＡＲ２を有するまたは有さないＫ５６２細胞における４０時間および７２時間時点でのオンターゲット編集を示すグラフである。長時間にわたって高い編集レベル（全ての構築物について４０％を超える）が観察された。図１４Ｃは、Ｇを有するアデノシンのオフターゲット編集を直接示すグラフを描示する。
（実施例１４）
ＳＮＣＡのタンパク質発現のＲＮＡ編集による調節
ＳＮＣＡタンパク質発現をＲＮＡ編集によって調節するための方法を本明細書で開示する。
ＳＮＣＡ ｍＲＮＡおよび模擬ｇＲＮＡ（陰性対照として）に対する操作された標的ポリヌクレオチド（ガイドＡおよびガイドＢ）およびｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ１およびｓｈＲＮＡ２）を含有するプラスミドを、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。ガイドＡおよびガイドＢは、ＳＮＣＡ ｍＲＮＡの開始コドンおよび３’ＵＴＲをそれぞれ標的とする。これら２つのガイドはまた、異なる特徴を有する。ガイドＡおよびガイドＢのこれらの特徴および配列を表１４に収載する。
Figure 2023504314000129
ガイドＡおよびガイドＢをＵ１ ｓｍＯｐｔプラスミドにクローニングした。溶解物をトランスフェクションの７日後に調製し、溶解物からのＳＮＣＡタンパク質存在量をＥＬＩＳＡにより測定した。いかなるトランスフェクションも施していないＨＥＫ細胞溶解物のＳＮＣＡタンパク質存在量を使用してＳＮＣＡ存在量（ＷＴタンパク質の％）を正規化した。図１５に示されているように、ガイドＡおよびガイドＢは、ＳＮＣＡタンパク質の存在量をそれぞれ約６５％および４０％減少させた。ｓｈＲＮＡ１およびｓｈＲＮＡ２は、ＳＮＣＡタンパク質発現を約９０％～９９％ノックダウンした。
（実施例１５）
ＳＮＣＡ ｍＲＮＡに対するタイル型ＲＮＡ編集
ｇＲＮＡタイリングアッセイを行って、開始部位に焦点を合わせた第１のアッセイで種々のｇＲＮＡ長およびミスマッチ位置を決定した。ガイドＲＮＡを表１５に収載する。
Figure 2023504314000130
Figure 2023504314000131
Figure 2023504314000132
Figure 2023504314000133
Figure 2023504314000134
Figure 2023504314000135
Ｕ１ ｓｍＯｐｔプラスミドおよびＳＮＣＡにクローニングした操作されたポリヌクレオチドをＨＥＫ３９２細胞にトランスフェクトした。ＳＮＣＡ ３’ＵＴＲを標的とするｇＲＮＡを含有するヒトＵ１ｓｍＯＰＴプラスミドの配列を表１６に収載する。
Figure 2023504314000136
Figure 2023504314000137
Figure 2023504314000138
Figure 2023504314000139
Figure 2023504314000140
細胞溶解物をトランスフェクションの７日後に調製した。ＥＬＩＳＡを使用して、細胞溶解物中のＳＮＣＡタンパク質の存在量を測定した。図１５は、操作されたポリヌクレオチドガイドＡおよびガイドＢが、野生型ＳＮＣＡタンパク質と比較して突然変異ＳＮＣＡタンパク質の存在量をそれぞれ約６５％および４０％減少させたことを示す。それに対して、突然変異ＳＮＣＡタンパク質を標的とする２つのｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ１およびｓｈＲＮＡ２）は、その発現を約９０～９９％ノックダウンした。
（実施例１６）
ＡＰＰ中の標的アデノシンの編集
本実施例は、本開示の操作されたガイドＲＮＡを使用するＡＰＰ中の標的アデノシンの編集を記載する。ガイドを、内在性ＡＤＡＲが野生型の内在性ＡＰＰ ｍＲＮＡを認識するために利用され得るかどうかを試験するために設計し、目的の臨床的に意義のあるアデノシンから２ヌクレオチド離れているアデノシンを編集する（Ｍ６７１Ｖ）ようにプログラムした。ＡＰＰ中のアデノシンを標的とするガイド配列を設計した。それを表１７に要約する。
Figure 2023504314000141
Figure 2023504314000142
Figure 2023504314000143
操作されたポリヌクレオチドをモデル細胞系においてＡＤＡＲによる標的アデノシンの動員および編集について試験し、陰性対照（ＧＦＰプラスミド、およびトランスフェクション無しの対照）と比較した。操作されたガイドＲＮＡを、図１６Ａに示されているように、ｍＲＮＡ前駆体およびｍＲＮＡに対して設計した。０．１００．５０（エクソン－エクソン）（配列番号１５９）は、標的アデノシンを有するエクソンおよびその前のエクソンにわたる連続配列を標的とするので、ＡＰＰ ｍＲＮＡに対して特異的である。０．１００．５０（エクソン－イントロン）（配列番号１６０）は、標的アデノシンを有するエクソンとその前のイントロンの間の連続配列を標的とするので、ＡＰＰ ｍＲＮＡ前駆体に対して特異的である。０．９０．４５（エクソンのみ）（配列番号１６１）は、標的アデノシンの配列のみを標的とするので、ＡＰＰのｍＲＮＡ前駆体とｍＲＮＡの両方を標的とすることができる。
各々の操作されたポリヌクレオチドをｐＡＡＶプラスミド骨格（ＳＴＸ－３６４）にクローニングした。ＳＴＸ－３６４の配列を表１８に収載する。
Figure 2023504314000144
Figure 2023504314000145
Figure 2023504314000146
Figure 2023504314000147
Figure 2023504314000148
ＡＤＡＲ１を発現する約２０，０００のＷＴ－ＨＥＫ２９３細胞に５００ｎｇの各プラスミドおよび対照ＧＦＰプラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞をトランスフェクションの４８時間後に溶解した。ＡＰＰ ｍＲＮＡを抽出し、サンガーシークエンシングにより分析した。ＥｄｉｔＲソフトウェアを使用して編集効率を定量した。図１６Ｂに示されているように、陰性対照における３％未満の編集と比較して、ＡＰＰ中の標的アデノシンの約１５～２０％編集を達成した。
（実施例１７）
ヒト細胞における操作されたポリヌクレオチドを最適化するための方法
ヒト細胞における操作されたポリヌクレオチドを最適化するための方法を本明細書で提供する。
ガイドＲＮＡをスクリーニングするためのロバストなアッセイ
本実施例は、ヒト細胞における操作されたポリヌクレオチドをスクリーニングするためのロバストなアッセイを記載する。操作されたポリヌクレオチド（またはガイド）のＲＮＡ編集効率についてのルシフェラーゼレポーター（例えば、これに限定されないが、ｆＰＭＰ２２）を開発した。図１７Ａに示されているように、レポーターは、１つのコザックＡＴＧ開始コドンを各々が有する２つのオープンリーディングフレームを含有する。第１のオープンリーディングフレームは、標的ＲＮＡ配列を含有し、その一方で第２のものは、ルシフェラーゼを含有する。翻訳が第１のＡＴＧ開始コドンから開始すると、ルシフェラーゼの翻訳は阻害される。第１のＡＴＧの標的アデノシンを突然変異させて、いずれの翻訳も開始させることができないグアニンにすると、ルシフェラーゼの翻訳が増加する。第１のＡＴＧの周囲に標的ＲＮＡ配列を組み込むことにより、異なる特徴－例えば、ガイドの長さ、ガイド内のバルジの位置、またはガイド内のＧＬＵＲ２動員ドメインの位置－を有するガイドのＲＮＡ編集効率を試験することができる。
図１７Ｂ～図１７Ｃは、ＳＮＣＡ、ＡＰＰおよびタウを含むがこれらに限定されない、本明細書で提供する組成物または方法のいずれか１つと共に使用するためのｆＰＭＰ２２レポーターを使用するスクリーンの結果を説明する。図１７Ｂは、ｆＰＭＰ２２レポーターにおけるルシフェラーゼ発現のヒートマップを示す。ｆＰＭＰ２２レポーターは、シャルコー・マリー・トゥース症候群１Ａにおける標的転写物配列を第１のオープンリーディングフレームに挿入することにより生成した。レポーターを安定的発現のためにＨＥＫ２９３細胞内に移した。異なる長さ（２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０および２００ヌクレオチド）を有するガイド、それがプラスミドから５’から３’へ転写された場合にはガイドのミスマッチ配置（１０パーセンタイル（５’末端）、９０パーセンタイル（３’末端）、または５０パーセンタイル（中央））が、一過的に発現された。一部の場合には、特定のＧＬＵＲ２動員ドメイン（０、１または２）およびそれらの位置（５’末端、３’末端、両方、またはいずれも無し）の組み込み／排除も試験することができる。非特異的ガイドおよびＡＤＡＲ２（ＳＴ０１４５）を有するプラスミドをトランスフェクトした細胞のものに正規化したルシフェラーゼ発現の倍率変化。これらのガイドの配列を表１９に収載する。
Figure 2023504314000149
Figure 2023504314000150
Figure 2023504314000151
レポーター転写物を発現する約５０，０００のＨＥＫ２９３細胞に、上記のガイド発現プラスミドの各々３００ｎｇを、生物学的二重反復でトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、上清を回収し、ルシフェラーゼ活性について評定した。ルシフェラーゼ基質とのインキュベーション後に吸光度の測定をｖａｒｉｏｓｋａｎ ｌｕｘで行い、非特異的ガイドを発現するプラスミドに対してプラスミドおよび／またはＡＤＡＲ発現について対照に正規化した。
図１７Ｃは、ガイドの長さ（ｘ軸）とガイドごとに２回の生物学的反復実験でのレポーター発現の倍率変化（ｙ軸）との関係の折れ線グラフを示す。ガイドが自体３’末端にＧＬＵＲ２動員ドメインを含有する実験であって、バルジの位置を変えた３セットの実験の結果を示した。
細胞系の開発
異なる細胞系を操作してＲＮＡ編集を調査した。
内在性ＡＤＡＲ１を改変してＲＮＡ編集におけるその機能を調査した。図１８Ａは、ＡＤＡＲ１遺伝子座のノックアウト戦略を示す。ＵＳ ｇＲＮＡおよびＤＳ ｇＲＮＡという２つのｇＲＮＡを、デアミナーゼドメイン（７８９番目～１２２１番目のアミノ酸）を包含する、ＡＤＡＲ１遺伝子座の６ｋｂ領域をカバーするように設計した。Ｋ５６２細胞系に、ｇＲＮＡと、６ｋｂ領域の外側に８０ｂｐ相同アームを有する相同組換え修復（ＨＤＲ）オリゴとをトランスフェクトした。ｇＲＮＡは、ＤＮＡ鎖をニッキングした。ＨＤＲオリゴは、相同組換え修復経路を通してＡＤＡＲ１遺伝子座の６ｋｂ欠失を生じさせることになり、その結果、デアミナーゼドメインは除去されることになる。図１８Ｂは、ＵＳおよびＤＳ ｇＲＮＡをトランスフェクトした異なるクローンにおけるＡＤＡＲ１のウェスタンブロットを示す。ＧＡＰＤＨを対照として使用した。２つのクローン＃９および＃１１は、ウェスタンブロットにより検出可能なＡＤＡＲ１タンパク質発現を示さなかった。
内在性ＡＤＡＲ２を改変してＲＮＡ編集におけるその機能を調査した。図１９Ａは、ＡＤＡＲ２遺伝子座のノックアウト戦略を示す。ＵＳ ｇＲＮＡおよびＤＳ ｇＲＮＡという２つのｇＲＮＡを、デアミナーゼドメイン（７０番目～５２２番目のアミノ酸）を包含する、ＡＤＡＲ１遺伝子座の９．５ｋｂ領域をカバーするように設計した。Ｋ５６２細胞系に、ｇＲＮＡと、９．５ｋｂ領域の外側に８０ｂｐ相同アームを有する相同組換え修復（ＨＤＲ）オリゴとをトランスフェクトした。ｇＲＮＡは、ＤＮＡ鎖をニッキングした。ＨＤＲオリゴは、相同組換え修復経路を通してＡＤＡＲ２遺伝子座の９．５ｋｂ欠失を生じさせることになり、その結果、デアミナーゼドメインは除去されることになる。
ＡＤＡＲ２を発現するがＡＤＡＲ１を発現しない細胞系を生成した。図２０Ａは、ＡＤＡＲ２を過剰発現するＡＤＡＲ１ノックアウト（ＫＯ）細胞系を生成するための戦略を示す。ピューロマイシン耐性マーカーを有するＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンとして維持されたＡＤＡＲ２過剰発現構築物を、ＡＤＡＲ１ ＫＯ Ｋ５６２細胞系にトランスフェクトし、それに組み込んだ。組込みに成功した細胞をピューロマイシン耐性により選択した。図２０Ｂは、野生型、ＡＤＡＲ１ ＫＯ、およびＡＤＡＲ１ ＫＯ＋ＡＤＡＲ２細胞におけるＡＤＡＲ１およびＡＤＡＲ２タンパク質発現のウェスタンブロットを示す。ＧＡＰＤＨを対照として使用した。野生型またはＡＤＡＲ１ ＫＯ細胞は、ＡＤＡＲ２を発現しなかった。ＡＤＡＲ２ ＯＥ構築物の組込みに成功したＡＤＡＲ１ ＫＯ細胞のみが、ＡＤＡＲ２を発現した。
ＲＮＡ編集を測定するためのアッセイ
デジタルドロップレットＰＣＲおよび蛍光定量を用いてＲＮＡ編集効率を測定するアッセイを開発した。
図２１は、ＲＮＡ編集効率を測定するためのＢｉｏ－ＲａｄドロップオフデジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）アッセイの一般的なスキームを示す。調製し、次いで、流体チップで処理して油懸濁液中でＰＣＲ反応のドロップレットを生成した、ＰＣＲ試料。標的およびバックグラウンド参照配列を、１、インターカレーター性蛍光色素を用いるＰＣＲ増幅により、または２、ＰＣＲ増幅生成物上の蛍光ＴａｑＭａｎ型プローブにより、検出する。結果として生じたシグナルをドロップレットリーダーにより分析する。その結果、蛍光チャネルごとに多いおよび少ないドロップレット集団を示す二次元ドットプロットでデータが提示される。
図２２は、ｄｄＰＣＲドロップオフアッセイプローブの設計を示す。フォワードおよびリバースプライマーは、Ｒａｂ７ ｍＲＮＡに隣接するように設計した（ＤＮＡ編集を測定する場合にはゲノム遺伝子座も標的とすることができる）。ドロップオフプローブおよび参照ＴａｑＭａｎプローブをＲａｂ７の標的部位およびその標的部位に隣接する領域に結合するように設計した。両方のプローブは、標的部位および隣接部位の野生型配列に結合してシグナルを放出することができ、ドロップオフプローブは、標的部位の編集されたまたは突然変異した配列に結合してシグナルを放出することができなかった。各Ｒａｂ７Ａ ｍＲＮＡ分子を逆転写およびＰＣＲ増幅によってｃＤＮＡ分子に変換し、個々のドロップレットに割り振った。ｄｄＰＣＲにより測定した、編集されたＲａｂ７ ｍＲＮＡ分子の集団の野生型Ｒａｂ７ ｍＲＮＡ分子の集団に対するパーセンテージを計数して、編集効率を決定した。図２２Ｂは、この実験の結果を示す。編集のない野生型対照（ＷＴ）試料では、大部分のドロップレットが両方のプローブについて高い蛍光強度を示した。編集された試料では、ドロップレットの約８５％がドロップオフプローブに関して蛍光強度の低下を示した。これは、配列の相当するパーセンテージが編集されたことを示唆する。
ｇＲＮＡレベルを定量するためのアッセイ
ｇＲＮＡレベルを定量するためのアッセイを開発した。
図２３は、ｇＲＮＡ存在量を定量するための１対のユニバーサルｇＲＮＡ定量（ｇＲＮＡＱ）タグの設計を示す。これらをガイドＲＮＡの５’および３’末端に付加する。これらのユニバーサル配列は、ガイド特異的ＴａｑＭａｎプローブが付加されたタグ間に挿入されたあらゆるガイドＲＮＡの検出を可能にする。ｑＰＣＲまたはｄｄＰＣＲでは、プライマーは、増幅用のｇＲＮＡＱタグに結合することになる。ガイド特異的ＴａｑＭａｎプローブは、蛍光シグナルを生成することになり、標準曲線とｑＰＣＲまたはｄｄＰＣＲを使用してｇＲＮＡ存在量を測定してその蛍光シグナルを定量することができる。
図２４Ａは、Ｒａｂ７を標的とするｇＲＮＡのｇＲＮＡＱタグでの定量の結果を示す。ＧＲＡＰＨ ｍＲＮＡを対照として使用した。Ｒａｂ７ ｇＲＮＡおよびＧＡＰＧＨについてポジティブなドロップレットの総数を計数した。ポアソン分布を仮定して、全事象の頻度を決定した。
高度に存在量が多い標的は、全ての増幅試薬を使用し尽くし得るので、より存在量の少ない標的に十分な増幅剤を割り振ることができない可能性があった。１つの回避法は、あらゆる標的を、微量のものであっても、適切に増幅されるように試料を希釈することである。図２４Ｂは、試料におけるＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡおよびＲａｂ７ ｇＲＮＡの増幅を達成するための試料の複数の段階希釈（５０倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１６００倍、３２００倍、６４００倍）を実証するドットプロットを示す。希釈倍率を上昇させつつＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡを最後まで希薄化して、より多くのＲａｂ７ ｇＲＮＡポジティブドロップレットを同定した。
ｇＲＮＡ構造
図２５に示されているように、ｇＲＮＡの両末端に保護ループを有するｇＲＮＡは、ｇＲＮＡのＲＮＡ編集効率を高めることができた。細胞に種々のｇＲＮＡとＡＤＡＲ２を発現するベクターとをトランスフェクトした。ＡＤＡＲ２を発現しないベクターをトランスフェクトした細胞を対照として使用した。トランスフェクションの少なくとも２日後、細胞を溶解し、Ｒａｂ７ａ ＲＮＡ編集効率を、実施例１３、１４および１８で説明したようにサンガーシークエンシングにより分析した。２回の生物学的反復実験を行った。
ｇＲＮＡ発現の最適化
ガイドＲＮＡの発現を最適化してＲＮＡ編集効率を向上させた。
Ｒａｂ７を標的とするｇＲＮＡをＣＭＶエンハンサーにより駆動した。ＣＭＶエンハンサーの２つの構成を構築物のうちの幾つかではｈＵ６プロモーターとは逆方向に置き、表２０に収載した。構築物を、ＡＤＡＲ２またはＧＦＰと、Ｒａｂ７ａを標的とするガイドの５’および３’末端上の２つのＧｌｕＲＤドメインとを共発現するように設計した。使用したガイドは１００ｎｔ長であり、５０番目の塩基位置にＡ／Ｃミスマッチがある。使用したガイド配列を配列番号１９２で示す。
配列番号１９２：
Figure 2023504314000152
約２０，０００のＨＥＫ２９３細胞に、配列番号１９２を発現する１μｇのプラスミドをトランスフェクトした。全ＲＮＡをトランスフェクションの４８時間後に回収した。３つの生物学的反復試料を試験した。編集結果を図２６に示す。各実験の特徴を表２０に収載する。
Figure 2023504314000153
種々のプロモーター、例えば、ヒトＵ６（ｈｕ６）、ｘｉａＣＭＶｅｎ－ｈｕ６、およびｓｇＣＭＶｅｎ－ｈｕ６プロモーターを使用して、Ｒａｂ７ａに対するｇＲＮＡの発現を駆動した。ｇＲＮＡは、２つのバルジを含む。いずれのｇＲＮＡも与えなかった場合（ＳＴ００３５）、ＲＮＡ編集は、最少であった。ｇＲＮＡがｈｕ６により発現された場合、ＡＤＡＲ２の共発現がＲＮＡ編集効率を引き上げる。
設計
ｇＲＮＡ／標的ＲＮＡ複合体に結合するＡＤＡＲ２の３次元溶液構造を図２７に示す。この構造は、ｇＲＮＡ／標的ＲＮＡ複合体のＧｌｕＲ２ヘアピンに結合する２つのｄｓＲＢＤ（ｄｓＲＢＤ １および２）の接触の位置を示す。標的編集部位アデノシンは、ｄｓＲＢＤ２の近くに位置する。ｇＲＮＡまたはＡＤＡＲ２タンパク質の構造を溶解構造の接触に基づいて合理的に最適化することができる。
（実施例１８）
ＲＮＡ編集データを処理するためのプラットフォーム
ＲＮＡ編集データを処理するためのプラットフォームのためのプラットフォームを本明細書で提供する。
ＥｄｉｔＲは、ＲＮＡ編集データを処理および解析するためのアルゴリズムである。これは、Ｒパッケージとして入手可能であり、またはＳｈｉｎｙによってオンラインで入手可能である。サンガーシークエンシングまたは次世代シークエンシングのいずれかでのシークエンシングデータを、ＥｄｉｔＲで解析することができる。
例えば、ＧをＡに変換する場合のＡ→Ｉ ｍＲＮＡ編集などの場合、配列の３つのパラメーターをＥｄｉｔＲで指定する。１、配列を、サンガーファイル形式（．ａｂ１）などの場合、プログラムプラットフォームにロードする；２、目的の領域、通常は、実験に使用したｇＲＮＡの標的領域全体、を指定する；３、配列を標的または逆相補配列として指定する。
すると、ＥｄｉｔＲは、可能な編集のための配列を指定された標的領域にわたって評定する。各位置の各塩基についてのピークの高さおよび曲線下面積を使用して、ＥｄｉｔＲが各位置での各塩基のパーセンテージを予測する。次いで、標的残基中のＡおよびＧの頻度を決定する。
（実施例１９）
ＲＮＡ超編集
ＲＮＡ超編集のための方法を本明細書で提供する。
一部の場合には、１つより多くのヌクレオチドの編集が有利であり得る。超編集と本明細書では呼ぶこのタイプの編集は、１つより多くのヌクレオチド変化を有する編集されたＲＮＡ分子を生成することができる。ヌクレオチドは、一部の場合には、１つより多くのアミノ酸置換に至ることがある。ヌクレオチドは、他の場合には、いずれのアミノ酸置換にも至らないこともある。いずれにしても、超編集されたＲＮＡおよびそれによりコードされる改変されたポリペプチドは、有利な治療可能性を有し得る。例えば、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲおよびコード配列における複数のヌクレオチド置換は、人工コザック開始コドンを作出することがあり、またはおよび内在性のものを消失させることがある。この場合、ｍＲＮＡの翻訳フレームは破壊される。３’ＵＴＲにおける複数のヌクレオチド置換は、ｍＲＮＡのポリＡテールなどの、ＲＮＡ安定性または輸送にとって重要な配列を破壊し、その結果、翻訳を受けるその能力を損なわせ得る。コード配列における複数のヌクレオチド置換は、複数のアミノ酸置換をもたらし得る。これらの変化は、プロセシング酵素による標的部位などのタンパク質機能に影響を与え得る。一例は、複数の酵素および切断（およびグリコシル化）が通常は関与する、分泌または膜貫通タンパク質の翻訳後プロセシングである。
超編集は、標的領域との複数のミスマッチを有するガイドＲＮＡを設計することにより果たすことができ、例えば、表１６に収載したｇＲＮＡを使用してＳＮＣＡ ｍＲＮＡの３’ＵＴＲの超編集を生じさせる。ｍＲＮＡのコード配列における複数のヌクレオチド置換を用いて複数のアミノ酸置換を生じさせる例を実施例１に示す。配列番号５１を使用して、表８を踏まえてＢＡＣＥ１によるＡＰＰプロセシングに影響を与えることにつながる、複数のアミノ酸変化を生じさせる。
超編集は、標的領域と塩基対合するもの以外の、ガイドＲＮＡのエレメントの設計によって果たすこともでき、例えば、ガイドＲＮＡは、一旦会合すると、標的ＲＮＡに対する複数の編集を強いるＲＮＡ編集実体を放出することができない、ＲＮＡ編集実体動員ドメインを有することができる。
（実施例２０）
ＲＮＡ編集の効果を測定するための追加のアッセイ。
ＲＮＡ編集の様々な生物学的効果を測定するための方法を本明細書で提供する。これらの方法を、任意の標的ＲＮＡ、または標的ＲＮＡによりコードされるポリペプチドに適用することができる。そのような標的ＲＮＡとしては、ＡＰＰ、ＳＮＣＡ、またはタウｍＲＮＡもしくはｍＲＮＡ前駆体を挙げることができる。
ＲＮＡ編集は、標的ＲＮＡの存在量に効果を及ぼし得る。ＲＮＡ編集は、標的ｍＲＮＡの存在量を減少させるヌクレオチド置換を生じさせることができる。そのような効果を測定するために、説明に役立つ実例としてタウを使用して、標的ｍＲＮＡを標的とするｇＲＮＡを細胞にトランスフェクトする。トランスフェクションの少なくとも４８時間後、細胞のｍＲＮＡを調製することができ、タウｍＲＮＡをＱ－ＰＣＲにより測定することができる。
ＲＮＡ編集は、標的ＲＮＡによりコードされるポリペプチドの存在量に効果を及ぼし得る。そのような効果を測定するために、説明に役立つ実例としてタウを使用して、標的ｍＲＮＡを標的とするｇＲＮＡを細胞にトランスフェクトする。トランスフェクションの少なくとも４８時間後、細胞のタンパク質溶解物を調製することができ、タウポリペプチドを、タウ特異的抗体を使用するウェスタンブロットにより測定することができる。抗体を利用できない場合、タウポリペプチドをコードする融合タウｍＲＮＡを発現する核酸を含むベクターと親和性タグを細胞にコトランフェクトすることができる。そのような親和性は、ＦＬＡＧ、ＨＩＳ、ＨＡ、ＭＹＣ、または当技術分野で公知の任意の他の親和性タグであり得る。ＲＮＡ編集効率を示す、タグ付きタウポリペプチドの存在量を、親和性タグおよびウェスタンブロットを使用して追跡および測定することができる。
ＲＮＡ編集は、標的ＲＮＡによりコードされるポリペプチドの切断などの酵素的プロセシングに効果を及ぼし得る。そのような効果を測定するために、説明に役立つ実例としてタウを使用して、標的ｍＲＮＡを標的とするｇＲＮＡを細胞にトランスフェクトする。トランスフェクションの少なくとも４８時間後、細胞のタンパク質溶解物を調製することができ、タウポリペプチドを、タウ特異的抗体を使用するウェスタンブロットにより測定することができる。抗体を利用できない場合、タウポリペプチドをコードする融合タウｍＲＮＡを発現する核酸を含むベクターと親和性タグを細胞にコトランフェクトすることができる。そのような親和性は、ＦＬＡＧ、ＨＩＳ、ＨＡ、ＭＹＣ、または当技術分野で公知の任意の他の親和性タグであり得る。ＲＮＡ編集効率を示す、タグ付きタウポリペプチドの切断などの酵素プロセスを、親和性タグおよびウェスタンブロットを使用して追跡および測定することができる。
ＲＮＡ編集は、標的ＲＮＡによりコードされるポリペプチドのリン酸化状態に効果を及ぼし得る。そのような効果を測定するために、説明に役立つ実例としてタウを使用して、標的ｍＲＮＡを標的とするｇＲＮＡを細胞にトランスフェクトする。トランスフェクションの少なくとも４８時間後、細胞のタンパク質溶解物を調製することができ、タウポリペプチドを、タウ特異的抗体を使用するウェスタンブロットにより測定することができる。抗体を利用できない場合、タウポリペプチドをコードする融合タウｍＲＮＡを発現する核酸を含むベクターと親和性タグを細胞にコトランフェクトすることができる。そのような親和性は、ＦＬＡＧ、ＨＩＳ、ＨＡ、ＭＹＣ、または当技術分野で公知の任意の他の親和性タグであり得る。ＲＮＡ編集効率を示す、タグ付きタウポリペプチドのリン酸化を、親和性タグおよびウェスタンブロットを使用して追跡および測定することができる。これらの場合、タウポリペプチドの分子量は、ポリペプチドのリン酸化状態による影響を受ける。通常、リン酸化の多いポリペプチドのほうが、リン酸化が少ないものより遅く泳動する。この現象は、当技術分野においてゲルシフトとしても公知である。
ＲＮＡ編集は、標的ＲＮＡによりコードされるポリペプチドの凝集状態に効果を及ぼし得る。そのような効果を測定するために、説明に役立つ実例としてタウを使用して、標的ｍＲＮＡを標的とするｇＲＮＡを細胞にトランスフェクトする。トランスフェクションの少なくとも４８時間後、細胞のタンパク質溶解物を調製することができ、タウポリペプチドを、タウ特異的抗体を使用するウェスタンブロットにより測定することができる。抗体を利用できない場合、タウポリペプチドをコードする融合タウｍＲＮＡを発現する核酸を含むベクターと親和性タグを細胞にコトランフェクトすることができる。そのような親和性は、ＦＬＡＧ、ＨＩＳ、ＨＡ、ＭＹＣ、または当技術分野で公知の任意の他の親和性タグであり得る。ＲＮＡ編集効率を示す、タグ付きタウポリペプチドの凝集状態を、親和性タグおよびウェスタンブロットを使用して追跡および測定することができる。凝集したタウポリペプチドを、大きなゲルシフトに基づいて検出する。
ポリペプチドのリン酸化状態は、リン酸化部位特異的、リン酸化断片特異的、またはリン酸化ポリペプチド特異的抗体により測定することもできる。この場合、リン酸化されたタウポリペプチドのみが抗体により検出される。
ポリペプチドのリン酸化状態を質量分析により測定することもできる。内在性またはエピトープタグ付きタンパク質を、細胞溶解物から免疫精製（ＩＰ）し、ゲル電気泳動または沈降によって精製し、酵素的に消化してペプチドにする。必要に応じて、試料を、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）または二酸化チタン（ＴｉＯ２）を使用してリン酸化ペプチドについて富化し、次いで、毛管液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析法（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）により分析することができる。
ポリペプチドのリン酸化能力をｉｎ ｖｉｔｒｏリン酸化アッセイによっても測定する。ｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイは、多くの場合、放射性３２Ｐまたは３３Ｐ標識ＡＴＰを使用して行う。ＡＴＰ（または時にはＧＴＰ）から基質、本実施例ではタウ、へのガンマリン酸基の転移を測定する。タンパク質を発現させ、精製する。精製されたタンパク質をキナーゼおよび３２Ｐまたは３３Ｐ標識ＡＴＰと共にインキュベートする。ポリペプチドがリン酸化されると、そのポリペプチドは放射性ＡＴＰにより放射性標識される。このタンパク質をウェスタンブロットで泳動させる場合には、オートラジオグラフを使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼアッセイ中のポリペプチドのリン酸化量を表す、放射性ＡＴＰ量を測定する。
実施形態
実施形態１ 標的ＲＮＡの領域に少なくとも部分的に相補的である標的化配列を含む操作されたポリヌクレオチドであって、標的ＲＮＡの領域が、（ａ）アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）ポリペプチド、アルファ－シヌクレイン（ＳＮＣＡ）ポリペプチド、またはタウポリペプチドを少なくとも部分的にコードする、（ｂ）（ａ）の近位にある配列を含む、または（ｃ）（ａ）および（ｂ）を含む、操作されたポリヌクレオチドであり、ＲＮＡ編集実体による標的ＲＮＡの領域内のポリヌクレオチドのヌクレオチドの塩基の編集を助長するように構成されているか、ＡＰＰポリペプチド、ＳＮＣＡポリペプチドもしくはタウポリペプチドの発現のモジュレーションを助長するように構成されているか、またはこれらの組合せである、操作されたポリヌクレオチド。
実施形態２ ＲＮＡ編集実体による標的ＲＮＡの領域内のポリヌクレオチドのヌクレオチドの塩基の編集を助長することにより、セクレターゼ酵素による標的ＲＮＡのプロセシングおよび／または切断のモジュレーションを助長するように構成されている、実施形態１の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態３ 標的ＲＮＡがＡＰＰポリペプチドである、実施形態２の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態４ 標的ＲＮＡの領域が、セクレターゼ酵素により切断される、実施形態１～３のいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態５ セクレターゼが、ベータセクレターゼ、γ－セクレターゼ、またはベータセクレターゼおよびγ－セクレターゼである、実施形態４の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態６ ベータセクレターゼを含み、ベータセクレターゼが、ベータ部位アミロイド前駆体タンパク質切断酵素１、カテプシンＢ、またはメプリンベータを含む、実施形態５の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態７ ＡＰＰポリペプチド、ＳＮＣＡポリペプチドまたはタウポリペプチドを少なくとも部分的にコードする標的ＲＮＡの領域の近位にある配列が、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）の少なくとも一部分を含む、（ｂ）を含む、実施形態１～６のいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態８ ＡＰＰポリペプチド、ＳＮＣＡポリペプチドまたはタウポリペプチドを少なくとも部分的にコードする標的ＲＮＡの領域の近位にある配列が、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）の少なくとも一部分を含む、（ｂ）を含む、実施形態１～７のいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態９ ５’ＵＴＲの塩基の編集が、ＡＰＰポリペプチド、ＳＮＣＡポリペプチド、またはタウポリペプチドの遺伝子翻訳を少なくとも部分的な調節する結果となる、実施形態８の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態１０ ５’ＵＴＲの領域のポリヌクレオチドのヌクレオチドの塩基の編集が、ＡＰＰのｍＲＮＡ翻訳の調節を助長する結果となる、実施形態８の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態１１ ＡＰＰポリペプチド、ＳＮＣＡポリペプチドまたはタウポリペプチドを少なくとも部分的にコードする標的ＲＮＡの領域の近位にある配列が、ポリ（Ａ）テール、マイクロＲＮＡ応答エレメント（ＭＲＥ）、ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）、またはこれらの任意の組合せの、少なくとも一部分を含む、（ｂ）を含む、実施形態１～１０のいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態１２ 標的ＲＮＡの領域が、ＡＰＰポリペプチドを少なくとも部分的にコードする、実施形態１～１１のいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態１３ 標的ＲＮＡの領域が、ＳＮＣＡポリペプチドを少なくとも部分的にコードする、実施形態１～１１のいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態１４ 標的ＲＮＡの領域が、タウポリペプチドを少なくとも部分的にコードする、実施形態１～１１のいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態１５ ベータ部位アミロイド前駆体タンパク質切断酵素１による標的ＲＮＡの切断を助長するように構成されている、実施形態６の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態１６ ＲＮＡ編集実体による標的ＲＮＡの領域のポリヌクレオチドのヌクレオチドの塩基の編集を助長するように構成されている、実施形態１～１５のいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態１７ 標的ＲＮＡの領域に少なくとも部分的に相補的である標的化配列が、標的ＲＮＡの領域内のヌクレオチドに相補的でない少なくとも１つのヌクレオチドを含む、実施形態１～１６のいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態１８ 相補的でない少なくとも１つのヌクレオチドが、アデノシン（Ａ）であり、Ａが、Ａ／Ｃミスマッチに含まれている、実施形態１７の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態１９ 標的ＲＮＡが、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｌｉｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｅｘＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、ＹＲＮＡ、およびｈｎＲＮＡを含む群から選択される、実施形態１～１８のいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態２０ 標的ＲＮＡがｍＲＮＡである、実施形態１９の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態２１ 標的ＲＮＡの領域が、野生型ＡＰＰポリペプチド、野生型ＳＮＣＡポリペプチドまたは野生型タウポリペプチドをコードする他の点では同等の領域と比較して突然変異を含む、実施形態１～２０のいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態２２ 突然変異が多型を含む、実施形態２１の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態２３ 標的化配列が、長さ約４０、６０、８０、１００、または１２０ヌクレオチドである、実施形態１～２２のいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態２４ 標的化配列が、長さ約１００ヌクレオチドである、実施形態２３の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態２５ ＲＮＡ編集実体を動員することができるＲＮＡ編集実体動員ドメインをさらに含む、実施形態１～２４のいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態２６ ＲＮＡ編集実体動員ドメインが、長さ少なくとも１～約７５ヌクレオチドである、実施形態２５の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態２７ ＲＮＡ編集実体動員ドメインが、長さ少なくとも３０～５０ヌクレオチドである、実施形態２６の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態２８ ＲＮＡ編集実体動員ドメインが、グルタミン酸イオンチャネル型受容体ＡＭＰＡ型サブユニット２（ＧｌｕＲ２）配列を含む、実施形態２５～２７のいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態２９ ＧｌｕＲ２配列が、配列番号２に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の配列同一性を有する、実施形態２８の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態３０ ＧｌｕＲ２配列が、配列番号１を含む、実施形態２９の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態３１ ＲＮＡ編集実体が、ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）ポリペプチドもしくはその生物活性断片、またはｔＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＴ）ポリペプチドもしくはその生物活性断片を含む、実施形態１～３０のいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態３２ ＡＤＡＲ１またはＡＤＡＲ２を含む、ＡＤＡＲポリペプチドまたはその生物活性断片を含む、実施形態３１の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態３３ 動員ドメインを欠いている、実施形態１～２４のいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態３４ ＲＮＡ編集実体を少なくとも一部は動員する構造的特徴をさらに含む、実施形態１～３３のいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態３５ 構造的特徴が、バルジ、ヘアピン、内部ループ、構造化モチーフ、およびこれらの任意の組合せを含む、実施形態３４の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態３６ 構造的特徴が、バルジを含む、実施形態３５の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態３７ バルジが、非対称バルジである、実施形態３６の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態３８ バルジが、対称バルジである、実施形態３６の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態３９ バルジが、長さ１～２９ヌクレオチドである、実施形態３６～３８のいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態４０ 構造的特徴が、ヘアピンを含む、実施形態３５の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態４１ 構造的特徴が、内部ループを含む、実施形態３５の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態４２ 内部ループが、非対称ループである、実施形態４１の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態４３ 内部ループが、対称ループである、実施形態４１の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態４４ 構造的特徴が、構造化モチーフを含む、実施形態３５の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態４５ 構造化モチーフが、バルジ、ヘアピンおよび内部ループのうちの少なくとも２つを含む、実施形態４４の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態４６ 構造化モチーフが、バルジおよびヘアピンを含む、実施形態４５の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態４７ 構造化モチーフが、バルジおよび内部ループを含む、実施形態４５の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態４８ 互いに共有結合で連結されている複数の糖およびリン酸部分を含む骨格を有し、骨格が、５’還元性ヒドロキシル、３’還元性ヒドロキシル、または両方を含む、実施形態１～４７のいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態４９ 骨格内の５’還元性ヒドロキシルの各々が、ホスホジエステル結合によって３’還元性ヒドロキシルの各々に連結されている、実施形態４８の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態５０ 互いに共有結合で連結されている複数の糖およびリン酸部分を含む骨格を有し、骨格が、５’還元性ヒドロキシル、３’還元性ヒドロキシル、または両方を欠いている、実施形態１～４７のいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態５１ 標的ＲＮＡの領域と会合している場合、会合体が、ハイブリダイズしたポリヌクレオチド鎖を含む、実施形態１～５０のいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態５２ ハイブリダイズしたポリヌクレオチド鎖が、少なくとも一部は二重鎖を形成している、実施形態５１の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態５３ 化学的改変をさらに含む、実施形態１～５２のいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態５４ ＲＮＡ、ＤＮＡ、または両方を含む、実施形態１～５３のいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態５５ ＲＮＡを含む、実施形態５４の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態５６ アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）を少なくとも部分的にコードする標的ＲＮＡの領域のポリヌクレオチドのヌクレオチドの塩基の編集を助長するように構成されている、操作されたポリヌクレオチドであって、操作されたポリヌクレオチドおよび標的ＲＮＡと会合しているＲＮＡ編集実体が、標的ＲＮＡの領域のポリヌクレオチドのヌクレオチドの塩基を編集し、この編集によって、改変アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）を少なくとも部分的にコードする編集された標的ＲＮＡが生成されることになる、操作されたポリヌクレオチド。
実施形態５７ ＲＮＡ編集実体が、セクレターゼ酵素を含む、実施形態５６の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態５８ セクレターゼ酵素が、ベータセクレターゼ、γ－セクレターゼ、またはベータセクレターゼおよびγ－セクレターゼである、実施形態５７の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態５９ セクレターゼ酵素がベータセクレターゼであり、ベータセクレターゼが、ベータ部位アミロイド前駆体タンパク質切断酵素１、カテプシンＢ、およびメプリンベータからなる群から選択される、実施形態５８の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態６０ アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）を少なくとも部分的にコードする標的ＲＮＡの領域のポリヌクレオチドのヌクレオチドの塩基の編集をＲＮＡ編集実体により助長するように構成されている操作されたポリヌクレオチドであって、この編集によって、他の点では同等の未編集の標的ＲＮＡと比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含む編集された標的ＲＮＡが生成されることになり、編集された標的ＲＮＡが、他の点では同等の未編集の標的ＲＮＡによりコードされる他の点では同等のＡＰＰと比較して、ベータセクレターゼ切断に対する感受性が変更されたＡＰＰをコードし、編集された標的ＲＮＡから生成されるＡＰＰポリペプチドを発現する細胞に、ベータ部位アミロイド前駆体タンパク質切断酵素１（ＢＡＣＥ１）による内在性基質の切断を示す代謝物の測定を含むｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにより判定して、未編集の標的ＲＮＡから生成されたＡＰＰポリペプチドを発現する対応する細胞と比較してベータセクレターゼの内在性基質に対するベータセクレターゼ活性の低下が実質的になく、内在性基質が、アミロイド様タンパク質１（ＡＰＬＰ１）、アミロイド様タンパク質２（ＡＰＬＰ２）、コンタクチン２、Ｊａｇｇｅｄ １、神経細胞接着分子Ｌ１（ＣＨＬ１）、ニューレキシン１α、ニューレキシン３β、ニューレグリン１（ＮＲＧ１）、発作関連タンパク質６（ＳＥＺ６）、発作関連タンパク質６前駆体タンパク質（ＳＥＺ６Ｌ）、電位依存性ナトリウムイオンチャネル（ＶＧＳＣ）サブタイプＮａｖ１のβ（β１－４）補助サブユニット、ＶＧＳＣ補助サブユニットＫＣＮＥ１もしくはＫＣＮＥ２、これらのいずれかの機能的部分、またはそれらの組合せを含む、操作されたポリヌクレオチド。
実施形態６１ ベータセクレターゼが、ＢＡＣＥ１、カテプシンＢ、またはメプリンベータを含む、実施形態６０の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態６２ 内在性基質が、ＮＲＧ１、ＳＥＺ６、またはＣＨＬ１を含む、実施形態６０の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態６３ アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）を少なくとも部分的にコードする標的ＲＮＡの領域のポリヌクレオチドのヌクレオチドの塩基の編集をＲＮＡ編集実体により助長するように構成されている操作されたポリヌクレオチドであって、この編集によって、同等の未編集の標的ＲＮＡによりコードされる他の点では同等の未改変ＡＰＰと比較して少なくとも１つのアミノ酸置換を含む編集された標的ＲＮＡによりコードされる改変ＡＰＰが生成されることになり、編集された標的ＲＮＡから生成される改変ＡＰＰポリペプチドが、（ｉ）細胞において発現されたとき、Ａベータ４０もしくはＡベータ４２酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定して、未編集の標的ＲＮＡから生成されるＡＰＰポリペプチドと比較して少ない量のＡベータ４０、Ａベータ４２、もしくは両方を生じさせる、（ｉｉ）細胞において発現されたとき、ｓＡＰＰａ ＥＬＩＳＡによって測定して、未編集の標的ＲＮＡから生成されるｓＡＰＰａと比較して増加した量の分泌型細胞外ドメインＡＰＰアルファ（ｓＡＰＰａ）を生じさせる、または（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の任意の組合せである、操作されたポリヌクレオチド。
実施形態６４ （ａ）実施形態１～６３のいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド、（ｂ）実施形態１～６３のいずれか１つの操作されたポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド、または（ｃ）（ａ）および（ｂ）を含む、ベクター。
実施形態６５ 第２の操作されたポリヌクレオチド、または第２の操作されたポリヌクレオチドをコードする第２のポリヌクレオチドをさらに含む、実施形態６４のベクター。
実施形態６６ 操作されたポリヌクレオチドと第２の操作されたポリヌクレオチドが同じである、実施形態６５のベクター。
実施形態６７ 操作されたポリヌクレオチドと第２の操作されたポリヌクレオチドが異なる、実施形態６５のベクター。
実施形態６８ 第２の操作されたポリヌクレオチドが、第２の標的ＲＮＡの領域に少なくとも部分的にハイブリダイズする第２の標的化配列を含む、実施形態６４～６７のいずれか１つのベクター。
実施形態６９ 第２の操作されたポリヌクレオチドが、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、またはこれらのうちの少なくとも１つを含まない、実施形態６５～６８のいずれか１つのベクター。
実施形態７０ 操作されたポリヌクレオチドと第２の操作されたポリヌクレオチドが互いに連続している、実施形態６５～６９のいずれか１つのベクター。
実施形態７１ ベクターのポリヌクレオチドが、操作されたポリヌクレオチドおよび第２の操作されたポリヌクレオチドを独立してコードし、これらのポリヌクレオチドが同じプロモーター配列に動作可能に連結されている、実施形態６５～７０のいずれか１つのベクター。
実施形態７２ 操作されたポリヌクレオチドと第２の操作されたポリヌクレオチドが、互いに連続していない、実施形態６５～７０のいずれか１つのベクター。
実施形態７３ 操作されたポリヌクレオチドが、ＡＰＰ標的ＲＮＡの領域に少なくとも部分的に相補的である標的化配列を含み、第２の操作されたポリヌクレオチドが、ＳＮＣＡまたはタウ標的ＲＮＡの領域に少なくとも部分的に相補的である標的化配列を含む、実施形態６５～７２のいずれか１つのベクター。
実施形態７４ 操作されたポリヌクレオチドが、ＡＰＰ標的ＲＮＡの領域に少なくとも部分的に相補的である標的化配列を含み、第２の操作されたポリヌクレオチドが、ＳＮＣＡポリペプチドまたはタウポリペプチドの領域を標的とする、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、実施形態６５～７３のいずれか１つのベクター。
実施形態７５ ウイルスベクターである、実施形態６４～７４のいずれか１つのベクター。
実施形態７６ ウイルスベクターが、ＡＡＶベクターであり、ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、その一部分、その融合産物、およびそれらの任意の組合せを含む群から選択される血清型のものである、実施形態７５のベクター。
実施形態７７ ＡＡＶベクターが、ｒｅｐと、ＡＡＶ２からのＩＴＲ配列と、ＡＡＶ５からのｃａｐ配列とを含む、実施形態７６のベクター。
実施形態７８ ＡＡＶベクターが、自己相補型ＩＴＲであるＩＴＲ配列を含む、実施形態７６～７７のいずれか１つのベクター。
実施形態７９ 操作されたポリヌクレオチドをコードするＡＡＶベクターが、自己相補型である、実施形態７６～７８のいずれか１つのベクター。
実施形態８０ 実施形態１～６３のいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド、または実施形態６４～７９のいずれか１つのベクターを含む、単位用量形態の医薬組成物。
実施形態８１ 薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤をさらに含む、実施形態８０の単位用量形態の医薬組成物。
実施形態８２ 医薬組成物を作製する方法であって、実施形態１～６３のいずれか１つの操作されたポリヌクレオチドを薬学的に許容される賦形剤、希釈剤または担体と混合するステップを含む、方法。
実施形態８３ 実施形態１～６３のいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド、実施形態６４～７９のいずれか１つのベクター、または両方を含む、単離された細胞。
実施形態８４ 容器内の、実施形態１～６３のいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド、実施形態６４～７９のいずれか１つのベクター、または両方を含む、キット。
実施形態８５ キットを作製する方法であって、実施形態１～６３のいずれか１つの操作されたポリヌクレオチドを容器に挿入するステップを含む方法。
実施形態８６ 疾患または状態の処置または予防を必要とする対象における疾患または状態を処置または予防する方法であって、それを必要とする対象に、（ａ）実施形態６４～７９のいずれか１つのベクター、（ｂ）実施形態８０～８１のいずれか１つの医薬組成物、または（ｃ）（ａ）および（ｂ）を投与するステップを含む方法。
実施形態８７ 疾患または状態を処置または予防する方法であって、それを必要とする対象に治療薬を投与するステップを含み、治療薬が、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）を少なくとも部分的にコードする標的ＲＮＡの領域のポリヌクレオチドのヌクレオチドの塩基の編集をＲＮＡ編集実体により助長し、それによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにより判定して、編集されていない他の点では同等のＲＮＡによりコードされる他の点では同等のＡＰＰと比較してベータセクレターゼ耐性ＡＰＰを少なくとも部分的にコードする編集されたＲＮＡが生成されることになり、前記ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイが、ベータセクレターゼ耐性ＡＰＰおよび他の点では同等のＡＰＰを、ａ）ベータセクレターゼ、ｂ）γ－セクレターゼ、ｃ）またはベータセクレターゼおよびγ－セクレターゼと接触させることを含む、方法。
実施形態８８ ベータセクレターゼが、ベータ部位アミロイド前駆体タンパク質切断酵素１、カテプシンＢ、またはメプリンベータを含む、実施形態８７の方法。
実施形態８９ 治療薬が、標的ＲＮＡの領域に少なくとも部分的にハイブリダイズする標的化配列を含む操作されたポリヌクレオチドを含むベクターを含むか、またはそのようなポリヌクレオチドをコードするベクターを含む、実施形態８８の方法。
実施形態９０ 操作されたポリヌクレオチドが、ＲＮＡ編集実体を動員することができるＲＮＡ編集実体動員ドメインをさらに含む、実施形態８７～８９のいずれか１つの方法。
実施形態９１ ＲＮＡ編集実体動員ドメインが、長さ少なくとも１～約７５ヌクレオチドである、実施形態９０の方法。
実施形態９２ ＲＮＡ編集実体動員ドメインが、グルタミン酸イオンチャネル型受容体ＡＭＰＡ型サブユニット２（ＧｌｕＲ２）配列を含む、実施形態９０～９１のいずれか１つの方法。
実施形態９３ ＲＮＡ編集実体が、ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）ポリペプチドもしくはその生物活性断片、またはｔＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＴ）ポリペプチドもしくはその生物活性断片を含む、実施形態８７～９２のいずれか１つの方法。
実施形態９４ ＲＮＡ編集実体が、ＡＤＡＲポリペプチドまたはその生物活性断片を含み、ＡＤＡＲが、ＡＤＡＲ１またはＡＤＡＲ２を含む、実施形態９３の方法。
実施形態９５ 操作されたポリヌクレオチドが、ＲＮＡ編集実体動員配列を欠いている、実施形態８７～８９のいずれか１つの方法。
実施形態９６ 操作されたポリヌクレオチドが、構造的特徴をさらに含む、実施形態８７～９５のいずれか１つの方法。
実施形態９７ 構造的特徴が、バルジ、ヘアピン、内部ループ、構造化モチーフ、およびこれらの任意の組合せを含む、実施形態９６の方法。
実施形態９８ 構造的特徴が、バルジである、実施形態９７の方法。
実施形態９９ バルジが、非対称バルジである、実施形態９８の方法。
実施形態１００ バルジが、対称バルジである、実施形態９８の方法。
実施形態１０１ バルジが、長さ１～２９ヌクレオチドである、実施形態９８～１００のいずれか１つの方法。
実施形態１０２ 構造的特徴が、ヘアピンを含む、実施形態９７の方法。
実施形態１０３ 構造的特徴が、内部ループを含む、実施形態９７の方法。
実施形態１０４ 内部ループが、非対称である、実施形態１０３の方法。
実施形態１０５ 内部ループが、非対称である、実施形態１０３の方法。
実施形態１０６ 構造的特徴が、構造化モチーフを含む、実施形態９７の方法。
実施形態１０７ 構造化モチーフが、バルジ、ヘアピンおよび内部ループのうちの少なくとも２つを含む、実施形態９７の方法。
実施形態１０８ 構造化モチーフが、バルジおよびヘアピンを含む、実施形態１０７の方法。
実施形態１０９ 構造化モチーフが、バルジおよび内部ループを含む、実施形態１０７の方法。
実施形態１１０ 操作されたポリヌクレオチドが、互いに共有結合で連結されている複数の糖およびリン酸部分を含む骨格を有し、骨格が、５’還元性ヒドロキシル、３’還元性ヒドロキシル、または両方を含む、実施形態８７～１０９のいずれか１つの方法。
実施形態１１１ 骨格内の５’還元性ヒドロキシルの各々が、ホスホジエステル結合によって３’還元性ヒドロキシルの各々に連結されている、実施形態１１０の操作されたポリヌクレオチド。
実施形態１１２ 互いに共有結合で連結されている複数の糖およびリン酸部分を含む骨格を有し、骨格が、５’還元性ヒドロキシル、３’還元性ヒドロキシル、または両方を欠いている、実施形態８７～１０９のいずれか１つの操作されたポリヌクレオチド。
実施形態１１３ ベータセクレターゼ耐性ＡＰＰが、編集されていない他の点では同等のＲＮＡから産生された他の点では同等のＡＰＰと比較して、ベータセクレターゼにより切断され得る位置での切断に対する感受性が低下している、実施形態８７～１１２のいずれか１つの方法。
実施形態１１４ ベータセクレターゼが、ＢＡＣＥ１、カテプシンＢ、またはメプリンベータを含む、実施形態１１３の方法。
実施形態１１５ ヌクレオチドが、ＡＰＰの切断部位に近接しているアミノ酸をコードするコドンに含まれている、実施形態８７～１１４のいずれか１つの方法。
実施形態１１６ ＡＰＰにおける切断部位が、α－セクレターゼ切断部位、β－セクレターゼ切断部位、β’－セクレターゼ切断部位、γ－セクレターゼ切断部位、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される、実施形態１１５の方法。
実施形態１１７ アミノ酸が、配列番号２のＡＰＰの６６９、６７０、６７１、６７２、６７３、６８２、６８３、６８４、６８７、６８８、７１１、７１２、７１３または７１４位にある、実施形態８７～１１６のいずれか１つの方法。
実施形態１１８ ＢＡＣＥプロテアーゼ耐性ＡＰＰが、編集されていない他の点では同等のＲＮＡから産生された他の点では同等のＡＰＰと比較して、少なくとも１つのアミノ酸残基の差異を含む、実施形態８７～１１７のいずれか１つの方法。
実施形態１１９ １つのアミノ酸残基の差異が、アミノ酸の電荷、疎水性もしくは極性の変化、またはこれらの任意の組合せをもたらす、アミノ酸置換を含む、実施形態１１８の方法。
実施形態１２０ アミノ酸の差異が、保存的置換を含む、実施形態１１８～１１９のいずれか１つの方法。
実施形態１２１ アミノ酸の差異が、電荷中性置換を含む、実施形態１１８～１１９のいずれか１つの方法。
実施形態１２２ アミノ酸残基の差異が、ＫからＥへの変化、ＫからＲへの変化、ＫからＧへの変化、ＭからＶへの変化、ＤからＧへの変化、ＥからＧへの変化、ＨからＲへの変化、またはこれらの任意の組合せを含む、実施形態１１８～１１９のいずれか１つの方法。
実施形態１２３ アミノ酸残基の差異が、配列番号２のアミロイド前駆体タンパク質のＫ６７０Ｅ、Ｋ６７０Ｒ、Ｋ６７０Ｇ、Ｍ６７１Ｖ、Ｄ６７２Ｇ、Ｅ６８２Ｇ、Ｈ６８４Ｒ、Ｋ６８７Ｒ、Ｋ６８７Ｅ、またはＫ６８７Ｇを含む、実施形態１２２の方法。
実施形態１２４ １つのアミノ酸の変化が、配列番号２のアミロイド前駆体タンパク質のＫ６７０ＧまたはＭ６７１Ｖを含む、実施形態１２２または１２３の方法。
実施形態１２５ 標的ＲＮＡが、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｌｉｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｅｘＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、ＹＲＮＡ、ｅＲＮＡ、およびｈｎＲＮＡを含む群から選択される、実施形態８７～１２４のいずれか１つの方法。
実施形態１２６ 標的ＲＮＡが、ｍＲＮＡである、実施形態１２５の方法。
実施形態１２７ 治療薬が、編集を直接助長する、実施形態８７～１２５のいずれか１つの方法。
実施形態１２８ 治療薬が、編集を間接的に助長する、実施形態８７～１２５のいずれか１つの方法。
実施形態１２９ 疾患または状態が、神経変性疾患または状態を含む、実施形態８７～１２８のいずれか１つの方法。
実施形態１３０ 神経変性状態が、アルツハイマー病、パーキンソン病、認知症、レビー小体型認知症、進行性核上性麻痺、前頭側頭葉変性症、大脳皮質基底核変性症、またはこれらの任意の組合せを含む、実施形態１２９の方法。
実施形態１３１ 状態が、外傷性脳損傷、ダウン症候群、がん、脆弱Ｘ症候群、自閉症、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、レッシュ・ナイハン病、代謝障害、またはこれらの任意の組合せを含む、実施形態８７～１２８のいずれか１つの方法。
実施形態１３２ 編集されたＲＮＡまたはＢＡＣＥプロテアーゼ耐性ＡＰＰが、臨床試験で治療薬を投与された対象の少なくとも５％、８％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、または５０％において生成される、実施形態８７～１３１のいずれか１つの方法。
実施形態１３３ 追加の治療剤の第２の投与するステップをさらに含む、実施形態８７～１３２のいずれか１つの方法。
実施形態１３４ 投与するステップおよび第２の投与するステップが連続している、実施形態１３３の方法。
実施形態１３５ 投与するステップおよび第２の投与するステップが同時に行われる、実施形態１３３の方法。
実施形態１３６ 投与するステップ、または第２の投与するステップ、または両方が、独立して、少なくとも週１回、繰り返される、実施形態１３３～１３５のいずれか１つの方法。
実施形態１３７ 投与するステップ、または第２の投与するステップ、または両方が、独立して、非経口投与経路により行われる、実施形態１３３～１３６のいずれか１つの方法。
実施形態１３８ 投与するステップ、または第２の投与するステップ、または両方が、独立して、実質注射、髄腔内注射、側脳室内注射、大槽内注射、静脈内注射、もしくは鼻腔内注射、またはこれらの任意の組合せにより行われる、実施形態１３３～１３７のいずれか１つの方法。

Claims (87)

  1. 標的ＲＮＡの領域に少なくとも部分的に相補的である標的化配列を含む操作されたポリヌクレオチドを含む組成物であって、前記標的ＲＮＡの前記領域が、
    （ａ）アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）ポリペプチドを少なくとも部分的にコードする配列を含み、
    （ｂ）（ａ）の近位にある配列を含み、または
    （ｃ）（ａ）および（ｂ）を含み、
    前記操作されたポリヌクレオチドが、ＲＮＡ編集実体による前記標的ＲＮＡのヌクレオチドの塩基の編集を助長するように構成されている、組成物。
  2. 前記ＲＮＡ編集実体による前記標的ＲＮＡの前記ヌクレオチドの前記塩基の前記編集が、前記編集のない前記標的ＲＮＡによりコードされるＡＰＰポリペプチドと比べて、セクレターゼ酵素による前記ＡＰＰポリペプチドの（ａ）プロセシング、（ｂ）切断、または（ｃ）（ａ）および（ｂ）の増加または減少を助長する、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記セクレターゼ酵素が、アルファセクレターゼ、ベータセクレターゼ、ガンマセクレターゼ、またはこれらの組合せを含む、請求項２に記載の組成物。
  4. 前記セクレターゼ酵素が、前記ベータセクレターゼを含み、前記ベータセクレターゼが、ベータ部位アミロイド前駆体タンパク質切断酵素１（ＢＡＣＥ１）、カテプシンＢ、またはメプリンベータを含む、請求項３に記載の組成物。
  5. 前記操作されたポリヌクレオチドが、前記標的ＲＮＡと会合している場合、前記ＲＮＡ編集実体を少なくとも一部は動員する構造的特徴をさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  6. 前記構造的特徴が、バルジ、内部ループ、ヘアピン、ミスマッチ、ゆらぎ塩基対、またはこれらの任意の組合せを含む、請求項５に記載の組成物。
  7. 前記構造的特徴が、前記バルジを含む、請求項６に記載の組成物。
  8. 前記バルジが、非対称バルジを含む、請求項７に記載の組成物。
  9. 前記バルジが、対称バルジを含む、請求項７に記載の組成物。
  10. 前記バルジが、前記操作されたポリヌクレオチドの約１～約４ヌクレオチド、および前記標的ＲＮＡの約０～約４ヌクレオチドを含む、請求項７から９のいずれか一項に記載の組成物。
  11. 前記バルジが、前記操作されたポリヌクレオチドの約０～約４ヌクレオチド、および前記標的ＲＮＡの約１～約４ヌクレオチドを含む、請求項７から１０のいずれか一項に記載の組成物。
  12. 前記バルジが、前記操作されたポリヌクレオチドの３ヌクレオチド、および前記標的ＲＮＡの３ヌクレオチドを含む、請求項７から１１のいずれか一項に記載の組成物。
  13. 前記構造的特徴が、前記内部ループを含む、請求項６に記載の組成物。
  14. 前記内部ループが、非対称内部ループを含む、請求項１３に記載の組成物。
  15. 前記内部ループが、対称内部ループを含む、請求項１３に記載の組成物。
  16. 前記内部ループが、前記操作されたポリヌクレオチドまたは前記標的ＲＮＡのいずれかの約５～約１０ヌクレオチドにより形成される、請求項１３から１５のいずれか一項に記載の組成物。
  17. 前記構造的特徴が、前記ヘアピンを含む、請求項６に記載の組成物。
  18. 前記ヘアピンが、二本鎖ＲＮＡ分子を含み、前記ヘアピンが、前記標的化配列を含まない、請求項１７に記載の組成物。
  19. 前記ヘアピンのステムループが、長さ約３～約１５ヌクレオチドである、請求項１７から１８のいずれか一項に記載の組成物。
  20. 前記構造的特徴が、前記ミスマッチを含む、請求項６に記載の組成物。
  21. 前記ミスマッチが、前記標的ＲＮＡの前記ヌクレオチドの前記塩基の向かい側の前記塩基と不対合の、前記操作されたポリヌクレオチドの前記標的化配列内の塩基を含む、請求項２０に記載の組成物。
  22. 前記ミスマッチが、グアニン－グアニンミスマッチを含む、請求項２０から２１のいずれか一項に記載の組成物。
  23. 前記ミスマッチが、アデノシン－シトシンミスマッチを含み、前記アデノシンが、前記標的ＲＮＡ中にあり、前記シトシンが、前記操作されたポリヌクレオチドの前記標的化配列内にある、請求項２０から２１のいずれか一項に記載の組成物。
  24. 前記アデノシン－シトシンミスマッチにおける前記アデノシンが、前記ＲＮＡ編集実体により編集される前記標的ＲＮＡ中の前記ヌクレオチドの前記塩基である、請求項２３に記載の組成物。
  25. 前記構造的特徴が、前記ゆらぎ塩基対を含む、請求項６に記載の組成物。
  26. 前記ゆらぎ塩基対が、ウラシルと対合しているグアニンを含む、請求項２５に記載の組成物。
  27. 前記構造的特徴が、構造モチーフを含み、前記構造モチーフが、２つのバルジとアデノシン－シトシンミスマッチとを含む、請求項５から２６のいずれか一項に記載の組成物。
  28. 前記操作されたポリヌクレオチドが、前記ＲＮＡ編集実体を動員することができるＲＮＡ編集実体動員ドメインをさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  29. 前記ＲＮＡ編集実体が、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）ポリペプチドまたはその生物活性断片を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  30. 前記ＡＤＡＲポリペプチドまたはその生物活性断片が、ＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２、またはこれらのいずれかの生物活性断片を含む、請求項２９に記載の組成物。
  31. 前記ＡＤＡＲポリペプチドまたはその生物活性断片が、前記標的ＲＮＡを含む神経細胞において合成的に過剰発現される、請求項２９から３０のいずれか一項に記載の組成物。
  32. 前記操作されたポリヌクレオチドが、ＲＮＡ編集実体動員ドメインを含まない、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  33. 前記ヌクレオチドが、前記ＡＰＰポリペプチドの切断部位に近接しているアミノ酸をコードするコドンに含まれており、前記アミノ酸が、配列番号１のポリペプチド配列を含むＡＰＰポリペプチドの６７０、６７１、６７２、６７３、６８２、６８４、６８７、７１２または７１４位にある、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  34. 前記切断部位が、アルファ－セクレターゼ切断部位、ベータ－セクレターゼ切断部位、ベータ’－セクレターゼ切断部位、ガンマ－セクレターゼ切断部位、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項３３に記載の組成物。
  35. 前記標的ＲＮＡが、前記標的ＲＮＡの前記ヌクレオチドの前記塩基の前記編集から生成される改変ＡＰＰポリペプチドと比較して少なくとも１つのアミノ酸残基の差異を含む未改変ＡＰＰポリペプチドをコードする、請求項３４に記載の組成物。
  36. 前記少なくとも１つのアミノ酸残基の差異が、配列番号１のポリペプチド配列を含むＡＰＰポリペプチドのＫ６７０Ｅ、Ｋ６７０Ｒ、Ｋ６７０Ｇ、Ｍ６７１Ｖ、Ｄ６７２Ｇ、Ｅ６８２Ｇ、Ｈ６８４Ｒ、Ｋ６８７Ｒ、Ｋ６８７Ｅ、またはＫ６８７Ｇを含む、請求項３５に記載の組成物。
  37. 前記少なくとも１つのアミノ酸残基の差異が、配列番号１のポリペプチド配列を含むＡＰＰポリペプチドのＫ６７０ＧまたはＭ６７１Ｖを含む、請求項３５または３６に記載の組成物。
  38. 第２の標的ＲＮＡの領域に少なくとも部分的に相補的である第２の標的化配列を含む第２の操作されたポリヌクレオチドをさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  39. 前記第２の標的ＲＮＡの前記領域が、
    （ａ）タウポリペプチドもしくはアルファ－シヌクレイン（ＳＮＣＡ）ポリペプチドを少なくとも部分的にコードする、
    （ｂ）（ａ）の近位にある配列を含む、または
    （ｃ）（ａ）および（ｂ）を含む、
    請求項３８に記載の組成物。
  40. 前記第２の標的ＲＮＡの前記領域が、前記タウポリペプチドを少なくとも部分的にコードし、前記領域が、配列番号１６～配列番号２７を含む、請求項３９に記載の組成物。
  41. 前記第２の標的ＲＮＡの前記領域が、前記ＳＮＣＡポリペプチドを少なくとも部分的にコードし、前記領域が、配列番号３６～配列番号４４を含む、請求項３９に記載の組成物。
  42. 前記編集が、前記ＲＮＡ編集実体による前記標的ＲＮＡの第２のヌクレオチドの少なくとも第２の塩基の編集をさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の組成物。
  43. 前記ＲＮＡ編集実体による前記標的ＲＮＡまたは前記第２の標的ＲＮＡの前記ヌクレオチドの前記塩基の前記編集が、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにより判定して、β－アミロイド、ＳＮＣＡポリペプチド、タウポリペプチドの、または前記β－アミロイド、前記ＳＮＣＡポリペプチドもしくは前記タウポリペプチドをコードするＲＮＡの形成を低減、防止または消失させるのに十分なものであり、前記ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイが、
    ａ．前記操作されたポリヌクレオチドまたは前記第２の操作されたポリヌクレオチドを前記標的ＲＮＡまたは前記第２の標的ＲＮＡと接触させること、および
    ｂ．編集された標的ＲＮＡによりコードされる改変ＡＰＰポリペプチド、編集された第２の標的ＲＮＡによりコードされる改変タウポリペプチド、または編集された第２の標的ＲＮＡによりコードされる改変ＳＮＣＡポリペプチドについてのプロセシングの、切断の、またはプロセシングおよび切断のモジュレーションを、未編集の標的ＲＮＡによりコードされる未改変ＡＰＰポリペプチド、未編集の第２の標的ＲＮＡによりコードされる未改変タウポリペプチド、または未編集の第２の標的ＲＮＡによりコードされる未改変ＳＮＣＡポリペプチドについてのプロセシングの、切断の、またはプロセシングおよび切断のモジュレーションと比較して判定すること
    を含む、請求項３９から４２のいずれか一項に記載の組成物。
  44. 前記ＲＮＡ編集実体による前記標的ＲＮＡおよび前記第２の標的ＲＮＡの前記ヌクレオチドの前記塩基の前記編集が、前記β－アミロイドの形成を低減、防止または消失させるのに十分なものであり、前記β－アミロイドが、Ａベータ４０断片、Ａベータ４２断片、または前記Ａベータ４０断片および前記Ａベータ４２断片を含む、請求項４３に記載の組成物。
  45. 前記ＲＮＡ編集実体による前記標的ＲＮＡおよび前記第２の標的ＲＮＡの前記ヌクレオチドの前記塩基の前記編集が、前記組成物との前記接触のない他の点では同等の細胞と比較して前記形成を約１／１、１／３、１／５、１／１０または１／５０に低減させるのに十分なものである、請求項４３から４４のいずれか一項に記載の組成物。
  46. 前記編集が、前記β－アミロイドペプチド形成を消失させるのに十分なものである、請求項４３から４５のいずれか一項に記載の組成物。
  47. 前記編集が、分泌型細胞外ドメインＡＰＰアルファ（ｓＡＰＰａ）の量を増加させるのに十分なものである、請求項４３から４６のいずれか一項に記載の組成物。
  48. ａ．標的ＲＮＡの領域に少なくとも部分的に相補的である標的化配列を含む操作されたポリヌクレオチドであって、前記標的ＲＮＡの前記領域が、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）ポリペプチドを少なくとも部分的にコードする、操作されたポリヌクレオチドと、
    ｂ．第２の標的ＲＮＡの領域に少なくとも部分的に相補的である第２の標的化配列を含む第２の操作されたポリヌクレオチドであって、前記第２の標的ＲＮＡの前記領域が、タウポリペプチドまたはアルファ－シヌクレイン（ＳＮＣＡ）ポリペプチドを少なくとも部分的にコードする、第２の操作されたポリヌクレオチドと
    を含む、組成物であって、
    前記操作されたポリヌクレオチドおよび前記第２の操作されたポリヌクレオチドが、独立して、ＲＮＡ編集実体による前記標的ＲＮＡまたは前記第２の標的ＲＮＡのヌクレオチドの塩基の編集を助長するように構成されている、組成物。
  49. 前記第２の標的ＲＮＡの前記領域が、前記タウポリペプチドを少なくとも部分的にコードし、前記領域が、配列番号１６～配列番号２７を含む、請求項４８に記載の組成物。
  50. 前記第２の標的ＲＮＡの前記領域が、前記ＳＮＣＡポリペプチドを少なくとも部分的にコードし、前記領域が、配列番号３６～配列番号４４を含む、請求項４８に記載の組成物。
  51. 前記ＲＮＡ編集実体による前記標的ＲＮＡまたは前記第２の標的ＲＮＡの前記ヌクレオチドの前記塩基の前記編集が、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにより判定して、β－アミロイド、ＳＮＣＡポリペプチド、タウポリペプチドの、または前記β－アミロイド、前記ＳＮＣＡポリペプチドもしくは前記タウポリペプチドをコードするＲＮＡの形成を低減または消失させるのに十分なものであり、前記ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイが、
    ａ．前記操作されたポリヌクレオチドを前記標的ＲＮＡと接触させること、または前記第２の操作されたポリヌクレオチドを前記第２の標的ＲＮＡと接触させること、および
    ｂ．編集された標的ＲＮＡによりコードされる改変ＡＰＰポリペプチド、編集された第２の標的ＲＮＡによりコードされる改変タウポリペプチド、または編集された第２の標的ＲＮＡによりコードされる改変ＳＮＣＡポリペプチドについてのプロセシングの、切断の、またはプロセシングおよび切断のモジュレーションを、未編集の標的ＲＮＡによりコードされる未改変ＡＰＰポリペプチド、未編集の第２の標的ＲＮＡによりコードされる未改変タウポリペプチド、または未編集の第２の標的ＲＮＡによりコードされる未改変ＳＮＣＡポリペプチドについてのプロセシングの、切断の、またはプロセシングおよび切断のモジュレーションと比較して判定すること
    を含む、請求項４８から５０に記載の組成物。
  52. 前記ＲＮＡ編集実体による前記標的ＲＮＡおよび前記第２の標的ＲＮＡの前記ヌクレオチドの前記塩基の前記編集が、前記組成物との前記接触のない他の点では同等の細胞と比較して前記形成を約１／１、１／３、１／５、１／１０または１／５０に低減させるのに十分なものである、請求項５１に記載の組成物。
  53. 前記モジュレーションが、
    ａ）前記改変ＡＰＰポリペプチド、前記改変タウポリペプチド、前記改変ＳＮＣＡポリペプチド、もしくはこれらのいずれかの組合せ、
    ｂ）前記改変ＡＰＰポリペプチドをコードするｍＲＮＡ転写物、前記改変タウポリペプチドをコードするｍＲＮＡ転写物、前記改変ＳＮＣＡポリペプチドをコードするｍＲＮＡ転写物、もしくはこれらのいずれかの組合せ、
    ｃ）前記改変ＡＰＰポリペプチドのリン酸化、前記改変タウポリペプチドのリン酸化、前記改変ＳＮＣＡポリペプチドのリン酸化、もしくはこれらのいずれかの組合せ、
    ｄ）前記改変ＡＰＰポリペプチドの凝集、前記改変タウポリペプチドの凝集、前記改変ＳＮＣＡポリペプチドの凝集、もしくはこれらのいずれかの組合せ、または
    ｅ）それらのいずれかの組合せ
    のレベルを測定することにより判定される、請求項４３から５２のいずれか一項に記載の組成物。
  54. （ａ）請求項１から５３のいずれか一項に記載の操作されたポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド配列、
    （ｂ）請求項１から５３のいずれか一項に記載の操作されたポリヌクレオチド、
    （ｃ）第３の操作されたポリヌクレオチド、または
    （ｄ）これらのいずれかの組合せ
    を含む、ベクター。
  55. 前記第３の操作されたポリヌクレオチドが、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、またはこれらのうちの少なくとも１つを含まない、請求項５４に記載のベクター。
  56. ＡＡＶベクターであり、前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、その一部分、その融合産物、およびそれらの任意の組合せを含む群から選択される血清型のものである、前記請求項のいずれか一項に記載のベクター。
  57. 前記ＡＡＶベクターが、ｒｅｐと、ＡＡＶ２からの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列と、ＡＡＶ５からのｃａｐ配列とを含む、請求項５６に記載のベクター。
  58. 前記ＡＡＶベクターが、突然変異した末端分離部位（ＴＲＳ）を有するＩＴＲであるＩＴＲ配列を含む、請求項５４から５７のいずれか一項に記載のベクター。
  59. 請求項１から５３のいずれか一項に記載の操作されたポリヌクレオチド、または請求項５４から５８のいずれか一項に記載のベクターを含む、単位用量形態の医薬組成物。
  60. 疾患または状態の処置または予防を必要とする対象における疾患または状態を処置または予防する方法であって、前記対象に、（ａ）請求項５４から５８のいずれか一項に記載のベクター、（ｂ）請求項５９に記載の医薬組成物、または（ｃ）（ａ）および（ｂ）を投与するステップを含み、前記投与するステップの後、前記対象が、
    ａ．脳スキャン、血液検査もしくは両方により測定して、前記投与するステップを受けていない他の点では同等の対象と比較してβ－アミロイドの少なくとも１／１に低減された形成、または
    ｂ．ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにより判定して、前記投与するステップを受けていない他の点では同等の対象と比較して分泌型細胞外ドメインＡＰＰアルファ（ｓＡＰＰａ）の少なくとも１倍増加
    を有し、前記ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイが、前記操作されたポリヌクレオチドを前記標的ＲＮＡと接触させることおよび前記ｓＡＰＰａのレベルをウェスタンブロットにより判定することを含む、
    方法。
  61. 前記β－アミロイドが、Ａベータ４０断片、Ａベータ４２断片または両方のうちの少なくとも１つを含む、請求項６０に記載の方法。
  62. 疾患または状態の処置または予防を必要とする対象における疾患または状態を処置または予防する方法であって、前記対象に、操作されたポリヌクレオチドを含む組成物、または前記操作されたポリヌクレオチドをコードするベクターを投与するステップを含み、前記操作されたポリヌクレオチドが、標的ＲＮＡの領域に少なくとも部分的に相補的である標的化配列を含み、前記標的ＲＮＡの前記領域が、
    ａ．アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）ポリペプチドを少なくとも部分的にコードする配列を含み、
    ｂ．（ａ）の近位にある配列を含み、または
    ｃ．（ａ）および（ｂ）を含み、
    前記操作されたポリヌクレオチドが、ＲＮＡ編集実体による前記標的ＲＮＡのヌクレオチドの塩基の編集を助長するように構成されており、それによって、編集された標的ＲＮＡが、他の点では同等の未編集の標的ＲＮＡによりコードされる未改変ＡＰＰポリペプチドと比較してベータセクレターゼによる切断に対する感受性が低下している改変ＡＰＰポリペプチドをコードし、前記改変ＡＰＰポリペプチドの切断に対する感受性低下が、
    ｉ．前記操作されたポリヌクレオチドを前記標的ＲＮＡと接触させること、および前記編集された標的ＲＮＡによりコードされる改変ＡＰＰポリペプチドの前記ベータセクレターゼによる切断を、未編集の標的ＲＮＡによりコードされる未改変ＡＰＰポリペプチドの切断と比較して判定することを含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ、
    ｉｉ．前記投与するステップの後のｉｎ ｖｉｖｏ診断、
    ｉｉｉ．前記投与するステップの後の血液検査を含むｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ、
    ｉｖ．前記投与するステップの後の前記対象の脳組織の組織学的検査、または
    ｖ．これらの任意の組合せ
    により判定して、β－アミロイド形成の低減をもたらす、方法。
  63. 前記ベータセクレターゼが、ベータ部位アミロイド前駆体タンパク質切断酵素１（ＢＡＣＥ１）、カテプシンＢ、またはメプリンベータを含む、請求項６２に記載の方法。
  64. 前記操作されたポリヌクレオチドが、前記標的ＲＮＡと会合している場合、前記ＲＮＡ編集実体を少なくとも一部は動員する構造的特徴をさらに含む、請求項６２または６３に記載の方法。
  65. 前記操作されたポリヌクレオチドが、ＲＮＡ編集実体動員ドメインをさらに含む、請求項６２から６４のいずれか一項に記載の方法。
  66. 前記疾患または状態が、神経変性疾患または状態を含む、請求項６２から６５のいずれか一項に記載の方法。
  67. 前記神経変性疾患または状態が、アルツハイマー病、パーキンソン病、認知症、レビー小体型認知症、進行性核上性麻痺、前頭側頭葉変性症、大脳皮質基底核変性症、またはこれらの任意の組合せを含む、請求項６６に記載の方法。
  68. 第２の投与するステップをさらに含む、請求項６２から６７のいずれか一項に記載の方法。
  69. 前記投与するステップ、前記第２の投与するステップ、または両方が、独立して、少なくとも月１回、繰り返される、請求項６８に記載の方法。
  70. 前記投与するステップ、前記第２の投与するステップ、または両方が、独立して、非経口経路、経口経路、呼吸器経路、十二指腸内経路、直腸経路、またはこれらの組合せにより行われる、請求項６９に記載の方法。
  71. 前記ｉｎ ｖｉｖｏ診断が、陽電子放出断層撮影スキャン、コンピュータ断層撮影法スキャン、磁気共鳴画像法、脊椎穿刺、またはこれらの組合せを含む、請求項６２から７０のいずれか一項に記載の方法。
  72. 前記改変ＡＰＰポリペプチドが、未編集の標的ＲＮＡポリペプチドによりコードされる未改変ＡＰＰポリペプチドと比較して、アルファセクレターゼによる切断に対する感受性の増大を有する、請求項６２から７１のいずれか一項に記載の方法。
  73. 前記アルファセクレターゼによる前記改変ＡＰＰポリペプチドの切断が、前記投与するステップを受けていない他の点では同等の対象と比較して、前記対象における分泌型細胞外ドメインＡＰＰアルファ（ｓＡＰＰａ）の量の増加をもたらす、請求項７２に記載の方法。
  74. 前記β－アミロイド形成の低減が、前記投与するステップを受けていない他の点では同等の対象と比較して、少なくとも約１／１、１／３、１／５、１／１０または１／５０への低減を含む、請求項６２から７３のいずれか一項に記載の方法。
  75. 前記ベクターが、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、その一部分、その融合産物、またはこれらの任意の組合せを含む群から選択される血清型のＡＡＶベクターを含む、請求項６２から７４のいずれか一項に記載の方法。
  76. 前記組成物が、（ａ）第２の操作されたポリヌクレオチド、（ｂ）前記第２の操作されたポリヌクレオチドをコードする第２のベクター、（ｃ）前記第２の操作されたポリヌクレオチドをさらにコードする前記ベクター、または（ｄ）これらの任意の組合せをさらに含み、前記第２の操作されたポリヌクレオチドが、第２の標的ＲＮＡの領域に少なくとも部分的に相補的である第２の標的化配列を含む、請求項６２から７５のいずれか一項に記載の方法。
  77. 前記第２の標的ＲＮＡの前記領域が、（ａ）タウポリペプチドもしくはアルファ－シヌクレイン（ＳＮＣＡ）ポリペプチドを少なくとも部分的にコードする、（ｂ）（ａ）の近位にある配列を含む、または（ｃ）（ａ）および（ｂ）を含む、請求項７６に記載の方法。
  78. 前記ＲＮＡ編集実体による前記標的ＲＮＡまたは前記第２の標的ＲＮＡの前記ヌクレオチドの前記塩基の前記編集が、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにより判定して、β－アミロイド、ＳＮＣＡポリペプチド、タウポリペプチドの、または前記β－アミロイド、前記ＳＮＣＡポリペプチドもしくは前記タウポリペプチドをコードするＲＮＡの形成を低減または消失させるのに十分なものであり、前記ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイが、
    ａ．前記操作されたポリヌクレオチドを前記標的ＲＮＡと接触させること、または前記第２の操作されたポリヌクレオチドを前記第２の標的ＲＮＡと接触させること、および
    ｂ．編集された標的ＲＮＡによりコードされる改変ＡＰＰポリペプチド、編集された第２の標的ＲＮＡによりコードされる改変タウポリペプチド、または編集された第２の標的ＲＮＡによりコードされる改変ＳＮＣＡポリペプチドについてのプロセシングの、切断の、またはプロセシングおよび切断のモジュレーションを、未編集の標的ＲＮＡによりコードされる未改変ＡＰＰポリペプチド、未編集の第２の標的ＲＮＡによりコードされる未改変タウポリペプチド、または未編集の第２の標的ＲＮＡによりコードされる未改変ＳＮＣＡポリペプチドについてのプロセシングの、切断の、またはプロセシングおよび切断のモジュレーションと比較して判定すること
    を含む、請求項７７に記載の方法。
  79. 神経細胞のｅｘ ｖｉｖｏ集団を前記組成物と接触させると、サンガーシークエンシングにより測定して、前記接触後に前記集団内の前記神経細胞の少なくとも５％が編集される、請求項６２から７８のいずれか一項に記載の方法。
  80. 前記集団内の前記神経細胞の少なくとも１０％、１５％、２０％、３０％、４０％または５０％が編集される、請求項７９に記載の方法。
  81. 前記編集が、前記ＲＮＡ編集実体による前記標的ＲＮＡの第２のヌクレオチドの少なくとも第２の塩基の編集をさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
  82. 前記対象が、前記疾患または状態と診断される、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
  83. 追加の治療剤の第２の投与するステップをさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
  84. 前記投与するステップおよび前記第２の投与するステップが連続している、請求項８３に記載の方法。
  85. 前記投与するステップおよび前記第２の投与するステップが同時に行われる、請求項８４に記載の方法。
  86. 配列番号５２～配列番号５２、配列番号７１～配列番号１４８、および配列番号１５９～配列番号１６７から選択される配列の少なくとも一部分と少なくとも９０％、９５％、９７％または９９％の配列同一性を含む配列を含む、操作されたポリヌクレオチド。
  87. ＢＬＡＳＴにより判定して、配列番号１５０～配列番号１５８から選択される配列の一部分と少なくとも９０％、９５％、９７％または９９％の配列同一性を含む配列に少なくとも部分的に結合することができる標的化配列を含む、操作されたポリヌクレオチド。
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