KR20230156150A - 제vi형 crispr 오솔로그 및 시스템 - Google Patents

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KR20230156150A
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rna
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sequence
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펑 장
오마르 오 아부다예
조나단 구텐버그
에릭 에스 랜더
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더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드
매사추세츠 인스티튜트 오브 테크놀로지
프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지
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Abstract

본 발명은 핵산을 표적화하기 위한 시스템, 방법, 및 조성물을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 신규 RNA-표적화 CRISPR 이펙터 단백질 및 가이드 RNA와 같은 적어도 하나의 표적화 핵산 성분을 포함하는 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 RNA-표적화 시스템을 제공한다.

Description

제VI형 CRISPR 오솔로그 및 시스템 {TYPE VI CRISPR ORTHOLOGS AND SYSTEMS}
관련 출원 및 참조에 의한 포함
본 출원은 2016년 6월 17일에 출원된 미국 임시 출원 62/351,662 및 62/351,803, 2016년 8월 17일에 출원된 미국 임시 출원 62/376,377, 2016년 10월 19일에 출원된 미국 임시 출원 62/410,366, 2016년 12월 9일에 출원된 미국 임시 출원 62/432,240, 2017년 3월 15일에 출원된 미국 임시 출원 62/471,792, 2017년 4월 12일에 출원된 미국 출원 62/484,786에 대한 우선권을 주장한다.
2017년 3월 15일에 출원된 미국 임시 출원 62/471,710가 참조된다(제목 "Novel Cas13B Orthologues CRISPR Enzymes and Systems," 대리인 참조번호: BI-10157 VP 47627.04.2149). 2016년 12월 9일에 출원된 미국 임시 출원 62/432,553, 2017년 2월 8일에 출원된 미국 임시 출원 62/456,645, 및 2017년 3월 15일에 출원된 미국 임시 출원 62/471,930(제목 "CRISPR Effector System Based Diagnostics," 대리인 참조번호 BI-10121 BROD 0842P) 및 2017 년 4월 12일에 출원된 미국 임시 출원 번호 미지정(제목 "CRISPR Effector System Based Diagnostics," 대리인 참조번호 BI-10121 BROD 0843P)가 추가로 참조된다.
본 명세서에 인용된 문헌들에서 인용되거나 언급된 모든 문헌은, 본 명세서에 언급된 임의의 제품에 대한 임의의 제조사의 지침서, 설명서, 제품 명세서 및 제품 시트(sheet) 또는 본 명세서에 참조로 포함된 임의의 문헌과 함께, 본 명세서에 참조로 포함되어 있으며, 본 발명의 실시에 이용될 수 있다. 더 구체적으로, 모든 참조된 문헌은, 마치 각각의 개별 문헌을 참조로 포함하는 것으로 특정적으로 그리고 개별적으로 나타내는 것과 동일한 정도로 참조로 포함된다.
연방 정부가 후원하는 연구에 대한 성명
본 발명은 미국 국립 보건원(National Institutes of Health)에 의해 지급된 승인 번호 MH100706 및 MH110049 하에 정부 지원으로 수행되었다. 정부는 본 발명에 대해 특정 권리를 갖는다.
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 클러스터링되고 규칙적으로 산재된 짧은 팔린드로믹 반복부(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats; CRISPR)와 관련된 벡터 시스템 및 이의 성분을 사용할 수 있는, 서열 표적화를 수반하는 유전자 발현의 제어, 예를 들어 유전자 전사물의 변동(perturbation) 또는 핵산 편집에 사용되는 시스템, 방법 및 조성물에 관한 것이다.
최근 게놈 시퀀싱 기법 및 분석 방법의 진보는 다양한 범위의 생물학적 기능 및 질환과 연관된 유전적 요인을 목록화하고 매핑하는 능력을 상당히 가속화시켰다. 개별적인 유전 요소의 선택적인 변동을 허용함으로써 원인이 되는 유전 변이의 체계적인 역조작(reverse engineering)을 가능하게 할 뿐만 아니라, 합성 생물학, 생명공학, 및 의학 응용 분야를 진전시키기 위하여, 정확한 게놈 표적화 기술이 필요하다. 게놈-편집 기법, 예를 들어 설계자 징크 핑거(designer zinc finger), 전사 활성자-유사 이펙터(transcription activator-like effector; TALE), 또는 귀소 메가뉴클레아제(homing meganuclease)가 표적화된 게놈 변동을 생성하는 데 이용 가능하지만, 신규 전략과 분자 메커니즘을 이용하고, 입수 가능하며, 설정하기 쉽고, 확장성이 있으며, 진핵세포 게놈 및 트랜스크립톰 내의 다수의 위치를 표적화할 수 있는 새로운 게놈 및 트랜스크립톰 조작 기술에 대한 필요성이 계속 남아 있다. 이는 게놈 조작 및 생명공학에서 새로운 응용 분야에 대한 주요 자원을 제공할 것이다.
박테리아 및 고박테리아의(archaeal) 적응 면역의 CRISPR-Cas 시스템은 단백질 조성 및 게놈 유전자좌 구조의 극단적인 다양성을 나타낸다. CRISPR-Cas 시스템 유전자좌는 50 개 초과의 유전자 패밀리를 가지며, 유전자좌 구조의 빠른 진화 및 극단적인 다양성을 나타내는 엄격한 보편적 유전자는 존재하지 않는다. 지금까지는, 다면적인 접근법을 채택하여, 93 개의 Cas 단백질에 대해 약 395 개의 프로파일의 포괄적인 cas 유전자 확인이 있다. 분류는 유전자 프로파일의 특징 및 유전자좌 구조의 특징을 포함한다. CRISPR-Cas 시스템의 새로운 분류가 제안되어 있으며, 여기서 이들 시스템은 광범위하게 2 개의 부류, 즉 다수 서브유닛 이펙터 복합체를 갖는 클래스 1 및 Cas9 단백질로 예시되는 단일-서브유닛 이펙터 모듈을 갖는 클래스 2로 나뉜다. 클래스 2 CRISPR-Cas 시스템과 연관된 신규 이펙터 단백질은 강력한 게놈 설계 제작 도구로서 개발될 수 있으며, 추정상의 신규 이펙터 단백질 및 이의 설계 제작 및 최적화의 예측이 중요하다.
CRISPR-Cas 적응 면역 시스템은 DNA 또는 RNA-DNA 간섭을 통해 외래 유전 요소에 대항하여 미생물을 방어한다. 최근, 클래스 2 제VI형 단일-성분 CRISPR-Cas 이펙터 C2c2(문헌[Shmakov et al.(2015) "Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR-Cas Systems"; Molecular Cell 60:1-13; doi: http://dx.doi.org/10.1016/j.molcel.2015.10.008])는 RNA-가이드된 알엔아제로 특징 확인되었다(문헌[Abudayyeh et al. (2016), Science, [인쇄 전 전자간행], June 2; "C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector"; doi: 10.1126/science.aaf5573]). C2c2(예를 들어 렙토트리키아 샤히(Leptotrichia shahii) 유래)가 RNA 파지 감염에 대항하여 견고한 간섭을 제공함이 입증되었다. 시험관내 생화학 분석 및 생체내 분석을 통해, C2c2가 3'H(G가 아님) PAM 측면에 배치된 프로토스페이서를 갖는 ssRNA 표적을 절단하도록 프로그래밍될 수 있음이 나타났다. 절단은 촉매적으로 비활성인 RNA-결합 단백질을 생성하는 돌연변이인 C2c2의 2 개의 보존된 HEPN 도메인에서 촉매성 잔기에 의해 매개된다. C2c2는 단일 가이드에 의해 가이드되며 생체내 특정 mRNA를 손실시키도록 재프로그래밍될 수 있다. LshC2c2는 관심 있는 특정 부위에 표적화될 수 있고 일단 동족 표적 RNA로 프라이밍되면 비-특이적인 알엔아제 활성을 수행할 수 있음이 나타났다. 이들 결과는 CRISPR-Cas 시스템에 대한 이해를 넓히고 광범위한 RNA-표적화 도구 세트를 개발하기 위해 C2c2를 활용할 가능성을 입증한다.
C2c2는 현재 Cas13a로 알려져 있다. 본 명세서에서 용어 "C2c2"는 "Cas13a"와 상호 교환 가능하게 사용되는 것으로 이해될 것이다.
이 출원에서의 임의의 문헌의 인용 또는 확인은 이러한 문헌이 본 발명의 선행 기술로서 이용 가능함을 인정하는 것이 아니다.
핵산 또는 폴리뉴클레오티드(예를 들어, DNA 또는 RNA 또는 그의 임의의 하이브리드 또는 유도체)를 넓은 적용, 구체적으로 진핵 생물 시스템, 더욱 구체적으로 포유류 시스템에서 표적화하기 위한 대안적이고 견고한 시스템 및 기법에 대한 절실한 필요성이 존재한다. 본 발명은 이 필요성을 해결하고 관련 이점을 제공한다. 본 출원의 신규한 RNA-표적화 시스템을 게놈, 트랜스크립톰 및 후성유전체 표적화 기법의 목록에 추가하는 것은, 구체적으로 진핵 생물 시스템, 더욱 구체적으로 포유류 시스템(세포, 기관, 조직 또는 생물을 포함) 및 식물 시스템에서의, 직접 검출, 분석 및 조작을 통해 특정 표적 부위의 연구 및 변동 또는 편집을 변환시킬 수 있다. 유해 효과없이 RNA 표적화를 위해 본 출원의 RNA-표적화 시스템을 효과적으로 활용하기 위해서는, 이들 RNA 표적화 도구의 설계 제작 측면 및 최적화 측면을 이해하는 것이 중요하다.
CRISPR-Cas13 패밀리는 CRISPR 시스템의 특징에 대한 박테리아 게놈의 컴퓨터 마이닝(문헌[Shmakov, S. et al. Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR-Cas Systems. Mol Cell 60, 385-397, doi:10.1016/j.molcel.2015.10.008 (2015)])에 의해 단일-이펙터 RNA-가이드된 알엔아제 Cas13a/C2c2(문헌[Abudayyeh, O. O. et al. C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Science 353, aaf5573, doi:10.1126/science.aaf5573 (2016)]) 및 이후에 단일-이펙터 RNA-가이드된 알엔아제 Cas13b(문헌[Shmakov, S. et al. Diversity and evolution of class 2 CRISPR-Cas systems. Nat Rev Microbiol 15, 169-182, doi:10.1038/nrmicro.2016.184 (2017)]; 문헌[Smargon, A. A. et al. Cas13b Is a Type VI-B CRISPR-Associated RNA-Guided RNase Differentially Regulated by Accessory Proteins Csx27 and Csx28. Mol Cell 65, 618-630 e617, doi:10.1016/j.molcel.2016.12.023 (2017)])를 밝혀내며 발견되었다. Cas13a라고도 알려진, 클래스 2 제VI형의 이펙터 단백질 C2c2는 ssRNA를 분해하도록 효율적으로 프로그래밍될 수 있는 RNA-가이드된 알엔아제이다. C2c2(Cas13a)는 CRISPR-Cas 시스템에서 발견되는 다른 알려진 알엔아제의 촉매 메커니즘과 달리 2 개의 HEPN 도메인 내에 보존된 염기성 잔기를 통해 RNA 절단을 달성한다. 4 개의 예상되는 HEPN 도메인 촉매성 잔기 중 임의의 것에서의 (예를 들어, 알라닌) 치환과 같은, HEPN 도메인의 돌연변이는 C2c2를 비활성 프로그래밍 가능한 RNA-결합 단백질(dC2c2, dCas9와 유사)로 전환시킨다.
RNA-가이드된 알엔아제 Cas13의 프로그래밍 가능성 및 특이성은 그것을 트랜스크립톰 조작을 위한 이상적인 플랫폼으로 만들 것이다. 출원인은 포유류 전사물 녹다운 및 결합 도구로 사용하기 위해 Cas13a를 개발한다. 렙토트리키아 샤히 유래의 Cas13a(LshCas13a)는 프로그래밍 가능한 crRNA를 사용하여 촉매적으로 비활성 버전으로 견고한 RNA 절단 및 결합을 할 수 있고 그 절단은 동일성 H(구아닌이 아님)를 갖는 프로토스페이서 측면 부위(PFS)로 알려진 바로 3'-인접 모티프에 의존한다(문헌[Abudayyeh, O. O. et al. C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Science 353, aaf5573, doi:10.1126/science.aaf5573 (2016)]). RNA 절단 시, 활성화된 LshCas13a는 구성적 알엔아제 활성이 비-표적화된 RNA를 절단하는 "부수적 활성"에 참여한다(문헌[Abudayyeh, O. O. et al. C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Science 353, aaf5573, doi:10.1126/science.aaf5573 (2016)]). 이 crRNA-프로그밍된 부수적 활성은 감염의 확산을 막기 위해 박테리아에 의해 생체내 프로그래밍된 세포 사멸을 가능하게 하고(문헌[Abudayyeh, O. O. et al. C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Science 353, aaf5573, doi:10.1126/science.aaf5573 (2016)]), 시험관내 핵산의 특이적 검출에 적용되었다(문헌[Abudayyeh, O. O. et al. C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Science 353, aaf5573, doi:10.1126/science.aaf5573 (2016)]; 문헌[East-Seletsky, A. et al. Two distinct RNase activities of CRISPR-C2c2 enable guide-RNA processing and RNA detection. Nature 538, 270-273, doi:10.1038/nature19802 (2016)]). 부수적 활성은 최근 많은 임상 진단에 유용한 SHERLOCK이라고 지칭되는 매우 민감하고 특이적인 핵산 검출 플랫폼에 대해 영향을 받았다(문헌[Gootenberg, J. S. et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science 356, 438-442 (2017)]).
박테리아에서의 Cas13a 오솔로그(ortholog) 스크리닝 및 후속 생화학적 특징 확인을 통해, 출원인은 RNA 엔도뉴클레아제 활성에 대해 최적화된 오솔로그인 렙토트리키아 와데이 유래의 Cas13a(LwaCas13a)를 선택한다. LwaCas13a는 포유류 세포에서 안정적으로 발현되고, 세포 내에서 리포터 및 내인성 전사물 모두를 효과적으로 녹다운하기 위해 재표적화될 수 있고, 관찰 가능한 부수적 활성 없이 RNAi와 비교하여 높은 수준의 표적화 특이성 수준을 달성한다. 또한, 출원인은 촉매적으로 비활성인 LwaCas13a(dCas13a)가 생체내에서 프로그래밍 가능하게 RNA 전사물에 결합하고 세포에서 전사물을 이미징하는 데 사용될 수 있음을 보여준다. dCas13a에 기반한 음성-피드백 이미징 시스템을 설계 제작함으로써, 스트레스 과립의 형성을 살아있는 세포에서 추적할 수 있다.
특정된 서열에 결합하는 dC2c2(dCas13a)의 능력은 본 발명에 따른 몇몇 양태에서 (i) 대규모 스크리닝, 합성 조절 회로 구축 및 기타 목적에 사용될 수 있는, 기능 또는 번역 조절을 위해 특정 전사물로 이펙터 모듈을 가져오고; (ii) 그들의 운행 및/또는 국소화를 시각화하기 위해 특정 RNA를 형광으로 표지하고; (iii) 특정 세포 내 구획에 대한 친화성을 갖는 도메인을 통해 RNA 국소화를 변경하고; (iv) RNA 및 단백질을 포함하는 근접한 분자 파트너에 대해 강화하기 위해 (dC2c2의 직접 풀다운(pull down) 또는 바이오틴 리가제 활성을 특정 전사물로 국소화하기 위한 dC2c2의 사용을 통해) 특정 전사물을 포획하는 것에 사용될 수 있다.
활성 C2c2는 또한 많은 응용을 가져야 한다. 본 발명의 일 양태는 여기에서 RFP를 이용하는 것과 같이, 파괴를 위하여 특정 전사물을 표적화하는 것을 포함한다. 추가적으로, 일단 동족 표적에 의해 프라이밍되면, C2c2는 시험관내에서 다른 (비-상보성) RNA 분자를 절단할 수 있고 생체내에서 세포 성장을 저해할 수 있다. 생물학적으로, 이 잡다한 알엔아제 활성은 제VI형 CRISPR-Cas 시스템의 프로그래밍된 세포 사멸/휴면(PCD/D)-기반 보호 메카니즘을 반영할 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 양태에서, 특정 세포-예를 들어 구체적인 전사물을 발현하는 암세포, 주어진 클래스의 뉴런, 특정 병원체에 의해 감염된 세포, 또는 다른 비정상 세포 또는 달리 그 존재를 원하지 않는 세포에서의 PCD 또는 휴면을 유발하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명은 하기에 관한 것이다.
[1] 포유류의 관심 표적 유전자좌를 변형시키는 방법으로서, 방법은 하나 이상의 국소화 신호에 융합된 C2c2 이펙터 단백질 및 하나 이상의 핵산 성분을 포함하는 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물을 상기 유전자좌에 전달하는 것을 포함하며, 여기서 적어도 하나 이상의 핵산 성분은 설계 제작되고, 하나 이상의 핵산 성분은 복합체를 관심 표적으로 향하게 하며 이펙터 단백질은 하나 이상의 핵산 성분과 복합체를 형성하고 복합체는 관심 표적 유전자좌에 결합하는, 방법.
[2] 하나 이상의 국소화 신호에 융합된 C2c2 이펙터 단백질 및 하나 이상의 핵산 성분을 포함하는 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물로서, 여기서 적어도 하나 이상의 핵산 성분은 포유류의 관심 표적 유전자좌를 변형시키는 데 사용하기 위해 설계 제작되고, 하나 이상의 핵산 성분은 복합체를 관심 표적으로 향하게 하며 이펙터 단백질은 하나 이상의 핵산 성분과 복합체를 형성하고 복합체는 관심 표적 유전자좌에 결합하는, 조성물.
[3] 하나 이상의 국소화 신호에 융합된 C2c2 이펙터 단백질 및 하나 이상의 핵산 성분을 포함하는 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물의 용도로서, 여기서 적어도 하나 이상의 핵산 성분은 포유류의 관심 표적 유전자좌를 변형시키는 데 사용하기 위해 설계 제작되고, 하나 이상의 핵산 성분은 복합체를 관심 표적으로 향하게 하며 이펙터 단백질은 하나 이상의 핵산 성분과 복합체를 형성하고 복합체는 관심 표적 유전자좌에 결합하는, 용도.
[4] [1] 내지 [3] 또는 [58] 및 [59] 중 어느 하나에 있어서, 관심 표적 유전자좌는 RNA를 포함하는, 방법, 조성물, 또는 용도.
[5] [1] 내지 [4] 또는 [58] 및 [59] 중 어느 하나에 있어서, 상기 국소화 신호는 핵 국소화 신호(NLS) 또는 핵 방출 신호(NES), 바람직하게는 NES인, 방법, 조성물, 또는 용도.
[6] [1] 내지 [5] 중 어느 하나에 있어서, 관심 표적 유전자좌의 변형은 가닥 손상을 포함하는, 방법.
[7] [1] 내지 [6] 또는 [58] 및 [59] 중 어느 하나에 있어서, C2c2 이펙터 단백질은 포유류 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된, 방법, 조성물, 또는 용도.
[8] [1] 내지 [7] 또는 [58] 및 [59] 중 어느 하나에 있어서, C2c2 이펙터 단백질은 하나 이상의 기능성 도메인과 회합되고; 선택적으로 이펙터 단백질은 선택적으로 HEPN 도메인 내의 하나 이상의 돌연변이, 예를 들어 R597A, H602A, R1278A, 및/또는 H1283A를 함유하며, 이에 의해 복합체는 후성적 변형제 또는 전사 또는 번역 활성화 또는 억제 신호를 전달할 수 있는, 방법, 조성물, 또는 용도.
[9] [8]에 있어서, 기능성 도메인은 표적 유전자좌의 전사 또는 번역을 변형시키는, 방법, 조성물, 또는 용도.
[10] [1] 내지 [9] 또는 [58] 및 [59] 중 어느 하나에 있어서, 관심 표적 유전자좌는 세포 내의 핵산 분자에 포함되어 있는, 방법, 조성물, 또는 용도.
[11] [1] 내지 [10] 또는 [58] 및 [59] 중 어느 하나에 있어서, 상기 변형시키는 것은 생체내 또는 생체외에서인, 방법, 조성물, 또는 용도.
[12] [1] 내지 [11] 중 어느 하나에 있어서, 이펙터 단백질과 복합체화될 때 핵산 성분(들)은 관심 표적 유전자좌의 표적 서열에의 복합체의 서열 특이적 결합을 초래할 수 있는, 방법, 조성물, 또는 용도.
[13] [1] 내지 [12] 중 어느 하나에 있어서, 핵산 성분(들)은 이중 직접 반복 서열을 포함하는, 방법, 조성물, 또는 용도.
[14] [1] 내지 [13] 중 어느 하나에 있어서, 이펙터 단백질 및 핵산 성분(들)은 폴리펩티드 및/또는 핵산 성분(들)을 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 분자를 통해 제공되며, 여기서 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 분자는 작동 가능하게 구성되어 폴리펩티드 및/또는 핵산 성분(들)을 발현하는, 방법, 조성물, 또는 용도.
[15] [14]에 있어서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 분자는 폴리펩티드 및/또는 핵산 성분(들)을 발현하기 위해 작동 가능하게 구성된 하나 이상의 조절 요소를 포함하고, 선택적으로 여기서, 하나 이상의 조절 요소는 프로모터(들) 또는 유도성 프로모터(들)을 포함하는, 방법, 조성물, 또는 용도.
[16] [14] 또는 [15]에 있어서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 분자는 하나 이상의 벡터 내에 포함되는, 방법, 조성물, 또는 용도.
[17] [14] 또는 [15]에 있어서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 분자는 하나의 벡터 내에 포함되는, 방법, 조성물, 또는 용도.
[18] [16] 또는 [17]에 있어서, 하나 이상의 벡터는 바이러스 벡터를 포함하는, 방법, 조성물, 또는 용도.
[19] [18]에 있어서, 하나 이상의 바이러스 벡터는 하나 이상의 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 또는 단순 헤르페스바이러스 벡터를 포함하는, 방법, 조성물, 또는 용도.
[20] [14] 또는 [15]에 있어서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 분자는 전달 시스템에 포함되거나, [16] 또는 [17]에 있어서, 하나 이상의 벡터는 전달 시스템에 포함되거나, [1] 내지 [13] 또는 [58] 내지 [59] 중 어느 하나에 있어서, 조립된 복합체는 전달 시스템에 포함되는, 방법, 조성물, 또는 용도.
[21] [1] 내지 [20] 중 어느 하나에 있어서, 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물은 리포좀(들), 입자(들), 엑소좀(들), 미세소포(들), 유전자총 또는 하나 이상의 바이러스 벡터(들)를 포함하는 전달 비히클을 통해 전달되는, 방법, 조성물, 또는 용도.
[22] [1] 내지 [21] 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 특징을 갖는 조성물인 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물.
[23] 하나 이상의 NLS 또는 NES에 융합된 C2c2 이펙터 단백질 및 하나 이상의 핵산 성분을 포함하는 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물로서, 여기서 적어도 하나 이상의 핵산 성분은 설계 제작되고, 하나 이상의 핵산 성분은 복합체를 포유류의 관심 표적으로 향하게 하며 이펙터 단백질은 하나 이상의 핵산 성분과 복합체를 형성하고 복합체는 관심 표적 유전자좌에 결합하는, 조성물.
[24] [23]에 있어서, 관심 표적 유전자좌는 RNA를 포함하는, 조성물.
[25] [23] 또는 [24]에 있어서, 관심 표적 유전자좌의 변형은 가닥 손상을 포함하는, 조성물.
[26] [23] 또는 [24]에 있어서, C2c2 이펙터 단백질은 포유류 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된, 조성물.
[27] [23] 또는 [24]에 있어서, C2c2 이펙터 단백질은 하나 이상의 기능성 도메인과 회합되고; 선택적으로 이펙터 단백질은 선택적으로 HEPN 도메인 내의 하나 이상의 돌연변이, 예를 들어 R597A, H602A, R1278A, 및/또는 H1283A를 함유하며, 이에 의해 복합체는 후성적 변형제 또는 전사 또는 번역 활성화 또는 억제 신호를 전달할 수 있는, 조성물.
[28] [27]에 있어서, 기능성 도메인은 표적 유전자좌의 전사 또는 번역을 변형시키는, 조성물.
[29] [27] 또는 [28]에 있어서, 관심 표적 유전자좌는 세포 내의 핵산 분자에 포함되어 있는, 조성물.
[30] [27] 내지 [29] 중 어느 하나에 있어서, 이펙터 단백질과 복합체화될 때 핵산 성분(들)은 관심 표적 유전자좌의 표적 서열에의 복합체의 서열 특이적 결합을 초래할 수 있는, 조성물.
[31] [27] 내지 [30] 중 어느 하나에 있어서, 핵산 성분(들)은 이중 직접 반복 서열을 포함하는, 조성물.
[32] [27] 내지 [31] 중 어느 하나에 있어서, 이펙터 단백질 및 핵산 성분(들)은 폴리펩티드 및/또는 핵산 성분(들)을 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 분자를 통해 제공되며, 여기서 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 분자는 작동 가능하게 구성되어 폴리펩티드 및/또는 핵산 성분(들)을 발현하는, 조성물.
[33] [32]에 있어서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 분자는 폴리펩티드 및/또는 핵산 성분(들)을 발현하기 위해 작동 가능하게 구성된 하나 이상의 조절 요소를 포함하고, 선택적으로 여기서, 하나 이상의 조절 요소는 프로모터(들) 또는 유도성 프로모터(들)을 포함하는, 조성물.
[34] [32] 또는 [33]에 있어서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 분자는 하나 이상의 벡터 내에 포함되는, 조성물.
[35] [32] 또는 [33]에 있어서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 분자는 하나의 벡터 내에 포함되는, 조성물.
[36] [34] 또는 [35]에 있어서, 하나 이상의 벡터는 바이러스 벡터를 포함하는, 조성물.
[37] [36]에 있어서, 하나 이상의 바이러스 벡터는 하나 이상의 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 또는 단순 헤르페스바이러스 벡터를 포함하는, 조성물.
[38] [32] 또는 [33]에 있어서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 분자는 전달 시스템에 포함되거나, [34] 또는 [35]에 있어서, 하나 이상의 벡터는 전달 시스템에 포함되거나, [23] 내지 [31] 중 어느 하나에 있어서, 조립된 복합체는 전달 시스템에 포함되는, 조성물.
[39] [1] 내지 [38] 중 어느 하나에 있어서, 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물은 리포좀(들), 입자(들), 엑소좀(들), 미세소포(들), 유전자총 또는 하나 이상의 바이러스 벡터(들)를 포함하는 전달 비히클을 통해 전달되는, 조성물.
[40] 하나 이상의 벡터를 포함하는 벡터 시스템으로서, 하나 이상의 벡터는 [1] 내지 [39] 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 특징을 갖는 조성물인 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물의 성분을 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레외드 분자를 포함하는, 벡터 시스템.
[41] [1] 내지 [40] 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 특징을 갖는 조성물인 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물의 C2c2 이펙터 단백질 및 하나 이상의 핵산 성분을 전달하도록 구성된 전달 시스템.
[42] [41]에 있어서, 하나 이상의 벡터 또는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하고, 하나 이상의 벡터 또는 폴리뉴클레오티드 분자는 [1] 내지 [41] 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 특징을 갖는 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물의 C2c2 이펙터 단백질 및 하나 이상의 핵산 성분을 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는, 전달 시스템.
[43] 치료의 치료적 방법에서의 사용을 위한, [1] 내지 [42] 또는 [44] 내지 [161] 중 어느 하나의 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물, 벡터 시스템 또는 전달 시스템.
[44] [1] 내지 [43] 또는 [45] 내지 [161] 중 어느 하나의 조성물 또는 이의 성분을, 선택적으로 유도성으로 또는 구성적으로, 포함하거나 발현하도록 설계 제작되거나, 방법에 따라 변형된 포유류 세포.
[45] [44]에 있어서, 변형은 다음을 초래하는, 포유류 세포:
- 적어도 하나의 RNA 생산물의 변경된 전사 또는 번역을 포함하는 세포;
- 적어도 하나의 RNA 생산물의 변경된 전사 또는 번역을 포함하는 세포로서, 여기서 적어도 하나의 생산물의 발현이 증가되는 세포; 또는
- 적어도 하나의 RNA 생산물의 변경된 전사 또는 번역을 포함하는 세포로서, 여기서 적어도 하나의 생산물의 발현이 감소되는 세포.
[46] 포유류 세포에서의 생체내 또는 생체외에서 다음 사용을 위한, [1] 내지 [45] 중 어느 하나의 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물, 벡터 시스템 또는 전달 시스템:
- RNA 서열 특이적 간섭,
- RNA 서열 특이적 유전자 조절,
- RNA 또는 RNA 생산물 또는 lincRNA 또는 비-코딩 RNA, 또는 핵 RNA, 또는 mRNA의 스크리닝,
- 돌연변이 유발,
- 형광 인 시츄 혼성화,
- 육종,
- 세포 휴면의 시험관내 또는 생체내 유도,
- 세포 주기 정지의 시험관내 또는 생체내 유도,
- 세포 성장 및/또는 세포 증식의 시험관내 또는 생체내 감소,
- 세포 아네르기의 시험관내 또는 생체내 유도,
- 세포 아폽토시스의 시험관내 또는 생체내 유도,
- 세포 괴사의 시험관내 또는 생체내 유도,
- 세포 사멸의 시험관내 또는 생체내 유도, 또는
- 프로그래밍된 세포 사멸의 시험관내 또는 생체내 유도.
[47] [44] 내지 [45] 중 어느 하나에 따른 세포, 또는 이의 자손의 또는 이를 포함하는 세포주.
[48] [44] 또는 [45]에 따른 하나 이상의 세포를 포함하는 포유동물.
[49] [44] 또는 [45]에 따른 하나 이상의 세포를 포함하는 포유류 모델로서; 상기 세포(들)는 선택적으로 유도성으로 또는 구성적으로 [1] 내지 [48] 중 어느 하나의 조성물 또는 이의 성분을 발현하는, 포유류 모델.
[50] [44] 또는 [45]의 세포, 또는 [47] 또는 [48]의 세포주 또는 생물 또는 [49]의 포유류 모델로부터의 생산물로서, 상기 세포 또는 세포주의 세포(들) 또는 포유류 모델의 포유동물은 선택적으로 유도성으로 또는 구성적으로 [1] 내지 [49] 중 어느 하나의 조성물 또는 이의 성분을 발현하는, 생산물.
[51] [50]에 있어서, 생산물의 양은 [1] 내지 [50] 중 어느 하나의 방법 또는 조성물에 의한 변경 또는 변형을 갖지 않는 세포로부터의 생산물의 양보다 더 많거나 더 적은, 생산물.
[52] [50]에 있어서, 생산물은 [1] 내지 [51] 중 어느 하나의 방법 또는 조성물에 의한 변경 또는 변형을 갖지 않는 세포로부터의 생산물과 비교하여 변경된, 생산물.
[53] [1] 내지 [52] 또는 [54] 내지 [161] 중 어느 하나의 시스템 또는 방법 또는 세포를 포함하는 분석, 스크리닝 방법 또는 돌연변이 유발 방법.
[54] RNA-기반 분석, 스크리닝 방법 또는 돌연변이 유발 방법으로서, 여기서 개선은 RNA를 사용하는 것 대신에, 방법은 [1] 내지 [53] 중 어느 하나에서와 같은 조성물을 사용하는 것을 포함하는, 방법.
[55] [53]에 있어서, RNA-기반 분석, 스크리닝 방법 또는 돌연변이 유발 방법은 RNAi 또는 형광 인 시츄 혼성화 방법인, 방법.
[56] [1] 내지 [55] 중 어느 하나의 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물, 벡터 시스템 또는 전달 시스템의 포유류 세포에서의, 바람직하게는 생체내 또는 생체외에서의 다음을 위한 용도:
- RNA 서열 특이적 간섭,
- RNA 서열 특이적 유전자 조절,
- RNA 또는 RNA 생산물 또는 lincRNA 또는 비-코딩 RNA, 또는 핵 RNA, 또는 mRNA의 스크리닝,
- 돌연변이 유발,
- 형광 인 시츄 혼성화,
- 육종,
- 세포 휴면의 시험관내 또는 생체내 유도,
- 세포 주기 정지의 시험관내 또는 생체내 유도,
- 세포 성장 및/또는 세포 증식의 시험관내 또는 생체내 감소,
- 세포 아네르기의 시험관내 또는 생체내 유도,
- 세포 아폽토시스의 시험관내 또는 생체내 유도,
- 세포 괴사의 시험관내 또는 생체내 유도,
- 세포 사멸의 시험관내 또는 생체내 유도, 또는
- 프로그래밍된 세포 사멸의 시험관내 또는 생체내 유도.
[57] [1] 내지 [21] 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 다음을 초래하는, 방법 또는 용도:
- RNA 서열 특이적 간섭,
- RNA 서열 특이적 유전자 조절,
- RNA 또는 RNA 생산물 또는 lincRNA 또는 비-코딩 RNA, 또는 핵 RNA, 또는 mRNA의 스크리닝,
- 돌연변이 유발,
- 형광 인 시츄 혼성화,
- 육종,
- 세포 휴면의 시험관내 또는 생체내 유도,
- 세포 주기 정지의 시험관내 또는 생체내 유도,
- 세포 성장 및/또는 세포 증식의 시험관내 또는 생체내 감소,
- 세포 아네르기의 시험관내 또는 생체내 유도,
- 세포 아폽토시스의 시험관내 또는 생체내 유도,
- 세포 괴사의 시험관내 또는 생체내 유도,
- 세포 사멸의 시험관내 또는 생체내 유도, 또는
- 프로그래밍된 세포 사멸의 시험관내 또는 생체내 유도.
[58] 포유류 세포에서의 다음을 위한 방법으로서, [1] 내지 [57] 중 어느 하나의 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물, 벡터 시스템 또는 전달 시스템을 표적 세포에서 시험관내, 생체외, 또는 생체내 도입하거나 유도하는 것을 포함하는 방법:
- RNA 서열 특이적 간섭,
- RNA 서열 특이적 유전자 조절,
- RNA 또는 RNA 생산물 또는 lincRNA 또는 비-코딩 RNA, 또는 핵 RNA, 또는 mRNA의 스크리닝,
- 돌연변이 유발,
- 형광 인 시츄 혼성화,
- 육종,
- 세포 휴면의 시험관내 또는 생체내 유도,
- 세포 주기 정지의 시험관내 또는 생체내 유도,
- 세포 성장 및/또는 세포 증식의 시험관내 또는 생체내 감소,
- 세포 아네르기의 시험관내 또는 생체내 유도,
- 세포 아폽토시스의 시험관내 또는 생체내 유도,
- 세포 괴사의 시험관내 또는 생체내 유도,
- 세포 사멸의 시험관내 또는 생체내 유도, 또는
- 프로그래밍된 세포 사멸의 시험관내 또는 생체내 유도.
[59] 포유류의 관심 표적 유전자좌의 번역을 조절하는 방법으로서, 방법은 하나 이상의 국소화 신호뿐만 아니라 번역 활성화제 또는 번역 억제제와 같은 (이종) 번역 조절제에 융합된 C2c2 이펙터 단백질; 및 하나 이상의 핵산 성분을 포함하는 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물을 상기 유전자좌로 전달하는 것을 포함하고; 여기서 적어도 하나 이상의 핵산 성분은 설계 제작되고, 하나 이상의 핵산 성분은 복합체를 관심 표적으로 향하게 하며 이펙터 단백질은 하나 이상의 핵산 성분과 복합체를 형성하고 복합체는 관심 표적 유전자좌에 결합하며, 바람직하게는 여기서 상기 이종 도메인은 EIF4, 예를 들어 EIF4E인, 방법.
[60] [59]에 있어서, 상기 C2c2 이펙터 단백질은 촉매적으로 비활성인, 방법.
[61] [1] 내지 [60] 중 어느 하나에 있어서, 상기 C2c2는 렙토트리키아 샤히(Leptotrichia shahii) C2c2, 렙토트리키아 와데이(Leptotrichia wadei) F0279(Lw2) C2c2, 리스테리아 세엘리게리(Listeria seeligeri) C2c2, 라크노스피라세아에 박테리움(Lachnospiraceae bacterium) MA2020 C2c2, 라크노스피라세아에 박테리움 NK4A179 C2c2, 클로스트리디움 아미노필룸(Clostridium aminophilum) DSM 10710 C2c2, 카르노박테리움 갈리나룸(Carnobacterium gallinarum) DSM 4847 C2c2, 카르노박테리움 갈리나룸 DSM 4847 C2c2, 팔루디박터 프로피오니시게네스(Paludibacter propionicigenes) WB4 C2c2, 리스테리아 웨이헨스테파넨시스(Listeria weihenstephanensis) FSL R9-0317, C2c2, 리스테리아세아에 박테리움(Listeriaceae bacterium) FSL M6-0635 C2c2, 렙토트리키아 와데이 F0279 C2c2, 로도박터 캅술라투스(Rhodobacter capsulatus) SB 1003 C2c2, 로도박터 캅술라투스R121 C2c2, 로도박터 캅술라투스 DE442 C2c2를 포함하는 군으로부터 선택되는, 방법, 조성물, 용도, 벡터 시스템, 전달 시스템, 세포, 포유동물, 포유류 모델, 생산물, 또는 분석.
[62] [1] 내지 [59] 중 어느 하나에 있어서, 상기 C2c2는 렙토트리키아 와데이 F0279 (Lw 또는 Lw2) C2c2 또는 리스테리아 뉴요켄시스(Listeria newyorkensis) FSL M6-0635 (LbFSL) C2c2인, 방법, 조성물, 용도, 벡터 시스템, 전달 시스템, 세포, 포유동물, 포유류 모델, 생산물, 또는 분석.
[63] (a) 샘플을
i) RNA를 절단할 수 있는 제VI형 CRISPR-Cas 이펙터 단백질,
ii) 표적 RNA로 혼성화할 수 있는 가이드 RNA, 및
iii) 이펙터 단백질에 의해 비-특이적이고 검출 가능하게 절단될 수 있는 RNA-기반 절단 유도성 리포터와 함께 인큐베이션하는 것,
(b) 상기 RNA-기반 절단 유도성 리포터의 절단에 의해 생성되는 신호에 기반하여 상기 표적 RNA를 검출하는 것을 포함하는,
샘플에서 표적 RNA를 검출하는 방법.
[64] [63]에 있어서, 제VI형 CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 C2c2 이펙터 단백질인, 방법.
[65] [63]에 있어서, RNA-기반 절단 유도성 리포터 작제물은 형광색소 및 소광제를 포함하는, 방법.
[66] [63]에 있어서, 샘플은 무-세포 생물학적 샘플을 포함하는, 방법.
[67] [63]에 있어서, 샘플은 세포 샘플을 포함하는, 방법.
[68] [67]에 있어서, 세포 샘플은 식물 세포를 포함하는, 방법.
[69] [67]에 있어서, 세포 샘플은 동물 세포를 포함하는, 방법.
[70] [67]에 있어서, 세포 샘플은 암세포를 포함하는, 방법.
[71] [63]에 있어서, 표적 RNA는 병원체 RNA를 포함하는, 방법.
[72] [71]에 있어서, 병원체는 바이러스, 박테리아, 균류 또는 기생충을 포함하는, 방법.
[73] [63]에 있어서, 표적 RNA 내의 단일 뉴클레오티드 다형성 또는 RNA 전사물의 스플라이스 변이체를 검출하도록 설계된 가이드 RNA를 포함하는, 방법.
[74] [63]에 있어서, 가이드 RNA는 표적 RNA와의 하나 이상 미스 매치되는 뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
[75] [63]에 있어서, 가이드 RNA는 질병 상태에 대해 진단적인 표적 분자에 결합하는, 방법.
[76] [75]에 있어서, 질병 상태는 암을 포함하는, 방법.
[77] [75]에 있어서, 질병 상태는 자가면역 질병을 포함하는, 방법.
[78] [63]에 있어서, C2c2 이펙터 단백질은 렙토트리키아(Leptotrichia), 리스테리아(Listeria), 코리네박터(Corynebacter), 수테렐라(Sutterella), 레지오넬라(Legionella), 트레포네마(Treponema), 필리팍토르(Filifactor), 유박테리움(Eubacterium), 스트렙토코커스(Streptococcus), 락토바실러스(Lactobacillus), 미코플라스마(Mycoplasma), 박테로이데스(Bacteroides), 플라비볼라(Flaviivola), 플라보박테리움(Flavobacterium), 스파에로카에타(Sphaerochaeta), 아조스피릴룸(Azospirillum), 글루콘아세토박터(Gluconacetobacter), 네이세리아(Neisseria), 로세부리아(Roseburia), 파르비바쿨룸(Parvibaculum), 스타필로코커스(Staphylococcus), 니트라티프락토르(Nitratifractor), 미코플라스마 및 캄필로박터(Campylobacter)로 구성되는 군으로부터 선택되는 생물 유래인, 방법.
[79] a) RNA를 절단할 수 있는 제VI형 CRISPR-Cas 이펙터 단백질,
b) 표적 RNA에 결합할 수 있는 가이드 RNA, 및
c) 이펙터 단백질에 의해 비-특이적이고 검출 가능하게 절단될 수 있는 RNA-기반 절단 유도성 리포터를 포함하는, 리보 핵산(RNA) 검출 시스템.
[80] [79]에 있어서, 제VI형 CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 C2c2 이펙터 단백질인, RNA 검출 시스템.
[81] [79]에 있어서, RNA-기반 절단 유도성 리포터 작제물은 형광색소 및 소광제를 포함하는, RNA 검출 시스템.
[82] [63] 또는 [79]에 있어서, 제VI형 CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 렙토트리키아 샤히 C2c2, 라크노스피라세아에 박테리움 MA2020 C2c2, 라크노스피라세아에 박테리움 NK4A179 C2c2, 클로스트리디움 아미노필룸(DSM 10710) C2c2, 카르노박테리움 갈리나룸(DSM 4847) C2c2, 팔루디박터 프로피오니시게네스(WB4) C2c2, 리스테리아 웨이헨스테파넨시스(FSL R9-0317) C2c2, 리스테리아세아에 박테리움(FSL M6-0635) C2c2, 리스테리아 뉴요켄시스(FSL M6-0635) C2c2, 렙토트리키아 와데이(F0279) C2c2, 로도박터 캅술라투스(SB 1003) C2c2, 로도박터 캅술라투스(R121) C2c2, 로도박터 캅술라투스(DE442) C2c2, 렙토트리키아 와데이(Lw2) C2c2, 또는 리스테리아 세엘리게리 C2c2 중 임의의 것의 야생형 서열에 적어도 80% 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 방법 또는 RNA 검출 시스템.
[83] [63] 또는 [79]에 있어서, 제VI형 CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 적어도 하나의 HEPN 도메인을 포함하는, 방법 또는 RNA 검출 시스템.
[84] [63] 또는 [79]에 있어서, 제VI형 CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 2 개의 HEPN 도메인을 포함하는, 방법 또는 RNA 검출 시스템.
[85] [63] 또는 [79]에 있어서, 제VI형 CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 RxxxxH 모티프를 포함하는 적어도 하나의 촉매적으로 활성의 HEPN 도메인을 포함하는, 방법 또는 RNA 검출 시스템.
[86] [63] 또는 [79]에 있어서, 제VI형 CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 각각 RxxxxH 모티프를 포함하는 2 개의 촉매적으로 활성의 HEPN 도메인을 포함하는, 방법 또는 RNA 검출 시스템.
[87] [63] 또는 [79]에 있어서, 제VI형 CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 야생형 RxxxxH 모티프의 R 또는 H 중 적어도 하나를 돌연변이시키는 것으로부터 수득되는 적어도 하나의 촉매적으로 비활성의 HEPN 도메인을 포함하는, 방법 또는 RNA 검출 시스템.
[88] [63] 또는 [79]에 있어서, 제VI형 CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 각각 야생형 RxxxxH 모티프의 R 또는 H 중 적어도 하나를 돌연변이시키는 것으로부터 수득되는 2 개의 촉매적으로 비활성의 HEPN 도메인을 포함하는, 방법 또는 RNA 검출 시스템.
[89] a) RNA를 절단할 수 있는 제VI형 CRISPR-Cas 이펙터 단백질, 및
b) 이펙터 단백질에 의해 비-특이적이고 검출 가능하게 절단될 수 있는 RNA-기반 절단 유도성 리포터를 포함하는, 키트.
[90] 2 개의 상이한 촉매적으로 비활성의 C2c2 이펙터 단백질을 포함하는 조성물.
[91] [90]에 있어서, 상이한 C2c2 이펙터 단백질 각각은 상이한 리포터 분자에 연결된, 조성물.
[92] [90] 또는 [91]에 있어서, 리포터 분자는 상이한 에피토프 태그 및/또는 형광 분자로부터 개별적으로 선택되는, 조성물. 연구 및 진단 용도 및 바람직하게는 다-색 이미징을 위한 [90] 내지 [92] 중 어느 하나의 조성물의 용도.
[93] 하나 이상의 변형되거나 돌연변이된 아미노산 잔기를 갖는 C2c2 이펙터 단백질로서, 하나 이상의 변형되거나 돌연변이된 아미노산 잔기는, C2c2 컨센서스 넘버링에 따라, K2, K39, V40, E479, L514, V518, N524, G534, K535, E580, L597, V602, D630, F676, L709, I713, R717 (HEPN), N718, H722 (HEPN), E773, P823, V828, I879, Y880, F884, Y997, L1001, F1009, L1013, Y1093, L1099, L1111, Y1114, L1203, D1222, Y1244, L1250, L1253, K1261, I1334, L1355, L1359, R1362, Y1366, E1371, R1372, D1373, R1509 (HEPN), H1514 (HEPN), Y1543, D1544, K1546, K1548, V1551, I1558에 상응하는 C2c2에서의 것들 중 하나 이상이고, 바람직하게는, C2c2 컨센서스 넘버링에 따라, K2, K39, V40, E479, L514, V518, N524, G534, K535, E580, D630, F676, L709, I713, R717 (HEPN), N718, H722 (HEPN), E773, P823, V828, I879, Y880, F884, Y997, L1001, F1009, L1013, Y1093, L1099, L1111, Y1114, L1203, D1222, Y1244, L1250, L1253, K1261, I1334, L1355, L1359, R1362, Y1366, E1371, R1372, D1373, R1509 (HEPN), H1514 (HEPN), Y1543, D1544, K1546, K1548, V1551, I1558에 상응하는 C2c2에서의 것들 중 하나 이상으로부터 선택되며;
하나 이상의 변형되거나 돌연변이된 아미노산 잔기는, 도 67에 표시된 컨센서스 서열에 따라, M35, K36, T38, K39, I57, E65, G66, L68, N84, T86, E88, I103, N105, E123, R128, R129, K139, L152, L194, N196, K198, N201, Y222, D253, I266, F267, S280, I303, N306, R331, Y338, K389, Y390, K391, I434, K435, L458, D459, E462, L463, I478, E479, K494, R495, N498, S501, E519, N524, Y529, V530, G534, K535, Y539, T549, D551, R577, E580, A581, F582, I587, A593, L597, I601, L602, E611, E613, D630, I631, G633, K641, N646, V669, F676, S678, N695, E703, A707, I709, I713, I716, R717, H722, F740, F742, K768, I774, K778, I783, L787, S789, V792, Y796, D799, F812, N818, P820, F821, V822, P823, S824, F825, Y829, K831, D837, L852, F858, E867, A871, L875, K877, Y880, Y881, F884, F888, F896, N901, V903, N915, K916, R918, Q920, E951, P956, Y959, Q964, I969, N994, F1000, I10001, Q1003, F10005, K1007, G1008, F1009, N1019, L1020, K1021, I1023, N1028, E1070, I1075, K1076, F1092, K1097, L1099, L1104, L1107, K1113, Y1114, E1149, E1151, I1153, L1155, L1158, D1166, L1203, D1222, G1224, I1228, R1236, K1243, Y1244, G1245, D1255, K1261, S1263, L1267, E1269, K1274, I1277, E1278, L1289, H1290, A1294, N1320, K1325, E1327, Y1328, I1334, Y1337, K1341, N1342, K1343, N1350, L1352, L1355, L1356, I1359, L1360, R1362, V1363, G1364, Y1365, I1369, R1371, D1372, F1385, E1391, D1459, K1463, K1466, R1509, N1510, I1512, A1513, H1514, N1516, Y1517, L1529, L1530, E1534, L1536, R1537, Y1543, D1544, R1545, K1546, L1547, K1548, N1549, A1550, K1553, S1554, D1557, I1558, L1559, G1563, F1568, I1612, L1651, E1652, K1655, H1658, L1659, K1663, T1673, S1677, E1678, E1679, C1681, V1684, K1685, E1689에 상응하는 C2c2에서의 것들 중 하나 이상이며,
하나 이상의 변형되거나 돌연변이된 아미노산 잔기는, 도 66에 표시된 컨센서스 서열에 따라, K28, K31, R44, E162, E184, K262, E288, K357, E360, K338, R441 (HEPN), H446 (HEPN), E471, K482, K525, K558, D707, R790, K811, R833, E839, R885, E894, R895, D896, K942, R960 (HEPN), H965 (HEPN), D990, K992, K994에 상응하는 C2c2에서의 것들 중 하나 이상인, C2c2 이펙터 단백질.
[94] 관심 표적 유전자좌를 변형시키는 방법으로서, 방법은 [93]에 따른 C2c2 이펙터 단백질 및 하나 이상의 핵산 성분을 포함하는 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물을 상기 유전자좌에 전달하는 것을 포함하며, 여기서 적어도 하나 이상의 핵산 성분은 설계 제작되고, 하나 이상의 핵산 성분은 복합체를 관심 표적으로 향하게 하며 이펙터 단백질은 하나 이상의 핵산 성분과 복합체를 형성하고 복합체는 관심 표적 유전자좌에 결합하는, 방법.
[95] [1]에 따른 C2c2 이펙터 단백질 및 하나 이상의 핵산 성분을 포함하는 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물로서, 여기서 적어도 하나 이상의 핵산 성분은 관심 표적 유전자좌를 변형시키는 데 사용하기 위해 설계 제작되고, 하나 이상의 핵산 성분은 복합체를 관심 표적으로 향하게 하며 이펙터 단백질은 하나 이상의 핵산 성분과 복합체를 형성하고 복합체는 관심 표적 유전자좌에 결합하는, 조성물.
[96] [93]에 따른 C2c2 이펙터 단백질 및 하나 이상의 핵산 성분을 포함하는 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물의 용도로서, 여기서 적어도 하나 이상의 핵산 성분은 관심 표적 유전자좌를 변형시키는 데 사용하기 위해 설계 제작되고, 하나 이상의 핵산 성분은 복합체를 관심 표적으로 향하게 하며 이펙터 단백질은 하나 이상의 핵산 성분과 복합체를 형성하고 복합체는 관심 표적 유전자좌에 결합하는, 용도.
[97] [93] 내지 [96] 중 어느 하나에 있어서, 관심 표적 유전자좌는 RNA를 포함하는, 방법, 조성물, 또는 용도.
[98] [93] 내지 [97] 중 어느 하나에 있어서, 관심 표적 유전자좌의 변형은 가닥 손상을 포함하는, 방법.
[99] [93] 내지 [98] 중 어느 하나에 있어서, C2c2 이펙터 단백질은 진핵 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된, 방법, 조성물, 또는 용도.
[100] [93] 내지 [99] 중 어느 하나에 있어서, C2c2 이펙터 단백질은 하나 이상의 기능성 도메인과 회합되고; 선택적으로 이펙터 단백질은 선택적으로 HEPN 도메인 내의 하나 이상의 돌연변이, 예를 들어 R597A, H602A, R1278A, 및/또는 H1283A를 함유하며, 이에 의해 복합체는 후성적 변형제 또는 전사 또는 번역 활성화 또는 억제 신호를 전달할 수 있는, 방법, 조성물, 또는 용도.
[101] [100]에 있어서, 기능성 도메인은 표적 유전자좌의 전사 또는 번역을 변형시키는, 방법, 조성물, 또는 용도.
[102] [93] 내지 [101] 중 어느 하나에 있어서, C2c2 이펙터 단백질은 적어도 하나 이상의 핵 국소화 신호 또는 핵 방출 신호를 포함하는, 방법, 조성물, 또는 용도.
[103] [93] 내지 [102] 중 어느 하나에 있어서, 관심 표적 유전자좌는 시험관내의 핵산 분자에 포함되어 있는, 방법, 조성물, 또는 용도.
[104] [93] 내지 [10] 중 어느 하나에 있어서, 관심 표적 유전자좌는 세포 내의 핵산 분자에 포함되어 있는, 방법, 조성물, 또는 용도.
[105] [104]에 있어서, 세포는 원핵 세포를 포함하는, 방법, 조성물, 또는 용도.
[106] [12]에 있어서, 세포는 진핵 세포를 포함하는, 방법.
[107] [93] 내지 [106] 중 어느 하나에 있어서, 상기 변형시키는 것은 시험관내, 생체내 또는 생체외에서인, 방법, 조성물, 또는 용도.
[108] [93] 내지 [107] 중 어느 하나에 있어서, 이펙터 단백질과 복합체화될 때 핵산 성분(들)은 관심 표적 유전자좌의 표적 서열에의 복합체의 서열 특이적 결합을 초래할 수 있는, 방법, 조성물, 또는 용도.
[109] [93] 내지 [108] 중 어느 하나에 있어서, 핵산 성분(들)은 이중 직접 반복 서열을 포함하는, 방법, 조성물, 또는 용도.
[110] [93] 내지 [109] 중 어느 하나에 있어서, 이펙터 단백질 및 핵산 성분(들)은 폴리펩티드 및/또는 핵산 성분(들)을 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 분자를 통해 제공되며, 여기서 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 분자는 작동 가능하게 구성되어 폴리펩티드 및/또는 핵산 성분(들)을 발현하는, 방법, 조성물, 또는 용도.
[111] [110]에 있어서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 분자는 폴리펩티드 및/또는 핵산 성분(들)을 발현하기 위해 작동 가능하게 구성된 하나 이상의 조절 요소를 포함하고, 선택적으로 여기서, 하나 이상의 조절 요소는 프로모터(들) 또는 유도성 프로모터(들)을 포함하는, 방법, 조성물, 또는 용도.
[112] [110] 또는 [111]에 있어서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 분자는 하나 이상의 벡터 내에 포함되는, 방법, 조성물, 또는 용도.
[113] [110] 또는 [111]에 있어서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 분자는 하나의 벡터 내에 포함되는, 방법, 조성물, 또는 용도.
[114] [112] 또는 [113]에 있어서, 하나 이상의 벡터는 바이러스 벡터를 포함하는, 방법, 조성물, 또는 용도.
[115] [114]에 있어서, 하나 이상의 바이러스 벡터는 하나 이상의 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 또는 단순 헤르페스바이러스 벡터를 포함하는, 방법, 조성물, 또는 용도.
[116] [110] 내지 [111] 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 분자는 전달 시스템에 포함되거나, [112] 또는 [113]에 있어서, 하나 이상의 벡터는 전달 시스템에 포함되거나, [93] 내지 [109] 중 어느 하나에 있어서, 조립된 복합체는 전달 시스템에 포함되는, 방법, 조성물, 또는 용도.
[117] [93] 내지 [116] 중 어느 하나에 있어서, 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물은 리포좀(들), 입자(들), 엑소좀(들), 미세소포(들), 유전자총 또는 하나 이상의 바이러스 벡터(들)를 포함하는 전달 비히클을 통해 전달되는, 방법, 조성물, 또는 용도.
[118] [93] 내지 [117] 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 특징을 갖는 조성물인 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물.
[119] C2c2 이펙터 단백질 및 하나 이상의 핵산 성분을 포함하는 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물로서, 여기서 적어도 하나 이상의 핵산 성분은 설계 제작되고, 하나 이상의 핵산 성분은 복합체를 관심 표적으로 향하게 하며 이펙터 단백질은 하나 이상의 핵산 성분과 복합체를 형성하고 복합체는 관심 표적 유전자좌에 결합하는, 조성물.
[120] [119]에 있어서, 관심 표적 유전자좌는 RNA를 포함하는, 조성물.
[121] [119] 또는 [120]에 있어서, 관심 표적 유전자좌의 변형은 가닥 손상을 포함하는, 조성물.
[122] [119] 또는 [120]에 있어서, C2c2 이펙터 단백질은 진핵 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된, 조성물.
[123] [119] 또는 [120]에 있어서, C2c2 이펙터 단백질은 하나 이상의 기능성 도메인과 회합되고; 선택적으로 이펙터 단백질은 선택적으로 HEPN 도메인 내의 하나 이상의 돌연변이, 예를 들어 R597A, H602A, R1278A, 및/또는 H1283A를 함유하며, 이에 의해 복합체는 후성적 변형제 또는 전사 또는 번역 활성화 또는 억제 신호를 전달할 수 있는, 조성물.
[124] [123]에 있어서, 기능성 도메인은 표적 유전자좌의 전사 또는 번역을 변형시키는, 조성물.
[125] [119] 내지 [124] 중 어느 하나에 있어서, C2c2 이펙터 단백질은 적어도 하나 이상의 핵 국소화 신호를 포함하는, 조성물.
[126] [119]에 있어서, 관심 표적 유전자좌는 시험관내의 핵산 분자에 포함되어 있는, 조성물.
[127] [119]에 있어서, 관심 표적 유전자좌는 세포 내의 핵산 분자에 포함되어 있는, 조성물.
[128] [127]에 있어서, 세포는 원핵 세포를 포함하는, 조성물.
[129] [127]에 있어서, 세포는 진핵 세포를 포함하는, 조성물.
[130] [119] 내지 [129] 중 어느 하나에 있어서, 이펙터 단백질과 복합체화될 때 핵산 성분(들)은 관심 표적 유전자좌의 표적 서열에의 복합체의 서열 특이적 결합을 초래할 수 있는, 조성물.
[131] [119] 내지 [130] 중 어느 하나에 있어서, 핵산 성분(들)은 이중 직접 반복 서열을 포함하는, 조성물.
[132] [119] 내지 [127] 중 어느 하나에 있어서, 이펙터 단백질 및 핵산 성분(들)은 폴리펩티드 및/또는 핵산 성분(들)을 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 분자를 통해 제공되며, 여기서 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 분자는 작동 가능하게 구성되어 폴리펩티드 및/또는 핵산 성분(들)을 발현하는, 조성물.
[133] [128]에 있어서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 분자는 폴리펩티드 및/또는 핵산 성분(들)을 발현하기 위해 작동 가능하게 구성된 하나 이상의 조절 요소를 포함하고, 선택적으로 여기서, 하나 이상의 조절 요소는 프로모터(들) 또는 유도성 프로모터(들)을 포함하는, 조성물.
[134] [132] 또는 [133]에 있어서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 분자는 하나 이상의 벡터 내에 포함되는, 조성물.
[135] [132] 또는 [133]에 있어서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 분자는 하나의 벡터 내에 포함되는, 조성물.
[136] [134] 또는 [135]에 있어서, 하나 이상의 벡터는 바이러스 벡터를 포함하는, 조성물.
[137] [136]에 있어서, 하나 이상의 바이러스 벡터는 하나 이상의 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 또는 단순 헤르페스바이러스 벡터를 포함하는, 조성물.
[138] [132] 또는 [133]에 있어서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 분자는 전달 시스템에 포함되거나, [134] 또는 [135]에 있어서, 하나 이상의 벡터는 전달 시스템에 포함되거나, [119] 내지 [127] 중 어느 하나에 있어서, 조립된 복합체는 전달 시스템에 포함되는, 조성물.
[139] [1] 내지 [138] 중 어느 하나에 있어서, 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물은 리포좀(들), 입자(들), 엑소좀(들), 미세소포(들), 유전자총 또는 하나 이상의 바이러스 벡터(들)를 포함하는 전달 비히클을 통해 전달되는, 조성물.
[140] 하나 이상의 벡터를 포함하는 벡터 시스템으로서, 하나 이상의 벡터는 [1] 내지 [139] 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 특징을 갖는 조성물인 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물의 성분을 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레외드 분자를 포함하는, 벡터 시스템.
[141] [1] 내지 [140] 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 특징을 갖는 조성물인 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물의 C2c2 이펙터 단백질 및 하나 이상의 핵산 성분을 전달하도록 구성된 전달 시스템.
[142] [141]에 있어서, 하나 이상의 벡터 또는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하고, 하나 이상의 벡터 또는 폴리뉴클레오티드 분자는 [1] 내지 [141] 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 특징을 갖는 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물의 C2c2 이펙터 단백질 및 하나 이상의 핵산 성분을 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는, 전달 시스템.
[143] 치료의 치료적 방법에서의 사용을 위한, [1] 내지 [142] 또는 [144] 내지 [161] 중 어느 하나의 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물, 벡터 시스템 또는 전달 시스템.
[144] [1] 내지 [143] 또는 [145] 내지 [161] 중 어느 하나의 조성물 또는 이의 성분을, 선택적으로 유도성으로 또는 구성적으로, 포함하거나 발현하도록 설계 제작되거나, 방법에 따라 변형된 세포.
[145] [144]에 있어서, 변형은 다음을 초래하는, 세포:
- 적어도 하나의 RNA 생산물의 변경된 전사 또는 번역을 포함하는 세포;
- 적어도 하나의 RNA 생산물의 변경된 전사 또는 번역을 포함하는 세포로서, 여기서 적어도 하나의 생산물의 발현이 증가되는 세포; 또는
- 적어도 하나의 RNA 생산물의 변경된 전사 또는 번역을 포함하는 세포로서, 여기서 적어도 하나의 생산물의 발현이 감소되는 세포.
[146] [145]에 있어서, 세포는 진핵 세포를 포함하는, 세포.
[147] [144] 또는 [145]에 있어서, 포유류 세포를 포함하는, 세포.
[148] [144]에 있어서, 세포는 원핵 세포를 포함하는, 세포.
[149] 다음에서의 사용을 위한, [1] 내지 [148] 중 어느 하나의 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물, 벡터 시스템 또는 전달 시스템:
- RNA 서열 특이적 간섭,
- RNA 서열 특이적 유전자 조절,
- RNA 또는 RNA 생산물 또는 lincRNA 또는 비-코딩 RNA, 또는 핵 RNA, 또는 mRNA의 스크리닝,
- 돌연변이 유발,
- 형광 인 시츄 혼성화,
- 육종,
- 세포 휴면의 시험관내 또는 생체내 유도,
- 세포 주기 정지의 시험관내 또는 생체내 유도,
- 세포 성장 및/또는 세포 증식의 시험관내 또는 생체내 감소,
- 세포 아네르기의 시험관내 또는 생체내 유도,
- 세포 아폽토시스의 시험관내 또는 생체내 유도,
- 세포 괴사의 시험관내 또는 생체내 유도,
- 세포 사멸의 시험관내 또는 생체내 유도, 또는
- 프로그래밍된 세포 사멸의 시험관내 또는 생체내 유도.
[150] [144] 내지 [148] 중 어느 하나에 따른 세포, 또는 이의 자손의 또는 이를 포함하는 세포주.
[151] [146] 또는 [147]에 따른 하나 이상의 세포를 포함하는 다세포 생물.
[152] [144] 내지 [147] 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 세포를 포함하는 식물 또는 동물 모델로서; 상기 세포(들)는 선택적으로 유도성으로 또는 구성적으로 [1] 내지 [151] 중 어느 하나의 조성물 또는 이의 성분을 발현하는, 식물 또는 동물 모델.
[153] 어느 하나의 세포, 또는 어느 하나의 세포주 또는 생물, 또는 [144] 내지 [148], [150] 내지 [152] 중 어느 하나의 식물 또는 동물 모델로부터의 생산물로서, 상기 세포 또는 세포주의 세포(들) 또는 생물 또는 식물 또는 동물 모델은 선택적으로 유도성으로 또는 구성적으로 [1] 내지 [152] 중 어느 하나의 조성물 또는 이의 성분을 발현하는, 생산물.
[154] [153]에 있어서, 생산물의 양은 [1] 내지 [153] 중 어느 하나의 방법 또는 조성물에 의한 변경 또는 변형을 갖지 않는 세포로부터의 생산물의 양보다 더 많거나 더 적은, 생산물.
[155] [153]에 있어서, 생산물은 [1] 내지 [154] 중 어느 하나의 방법 또는 조성물에 의한 변경 또는 변형을 갖지 않는 세포로부터의 생산물과 비교하여 변경된, 생산물.
[156] [1] 내지 [155] 또는 [157] 내지 [161] 중 어느 하나의 시스템 또는 방법 또는 세포를 포함하는 분석, 스크리닝 방법 또는 돌연변이 유발 방법.
[157] RNA-기반 분석, 스크리닝 방법 또는 돌연변이 유발 방법으로서, 여기서 개선은 RNA를 사용하는 것 대신에, 방법은 [1] 내지 [156] 중 어느 하나에서와 같은 조성물을 사용하는 것을 포함하는, 방법.
[158] [157]에 있어서, RNA-기반 분석, 스크리닝 방법 또는 돌연변이 유발 방법은 RNAi 또는 형광 인 시츄 혼성화 방법인, 방법.
[159] [1] 내지 [158] 중 어느 하나의 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물, 벡터 시스템 또는 전달 시스템의 다음을 위한 용도:
- RNA 서열 특이적 간섭,
- RNA 서열 특이적 유전자 조절,
- RNA 또는 RNA 생산물 또는 lincRNA 또는 비-코딩 RNA, 또는 핵 RNA, 또는 mRNA의 스크리닝,
- 돌연변이 유발,
- 형광 인 시츄 혼성화,
- 육종,
- 세포 휴면의 시험관내 또는 생체내 유도,
- 세포 주기 정지의 시험관내 또는 생체내 유도,
- 세포 성장 및/또는 세포 증식의 시험관내 또는 생체내 감소,
- 세포 아네르기의 시험관내 또는 생체내 유도,
- 세포 아폽토시스의 시험관내 또는 생체내 유도,
- 세포 괴사의 시험관내 또는 생체내 유도,
- 세포 사멸의 시험관내 또는 생체내 유도, 또는
- 프로그래밍된 세포 사멸의 시험관내 또는 생체내 유도.
[160] [93] 내지 [117] 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 다음을 초래하는, 방법 또는 용도:
- RNA 서열 특이적 간섭,
- RNA 서열 특이적 유전자 조절,
- RNA 또는 RNA 생산물 또는 lincRNA 또는 비-코딩 RNA, 또는 핵 RNA, 또는 mRNA의 스크리닝,
- 돌연변이 유발,
- 형광 인 시츄 혼성화,
- 육종,
- 세포 휴면의 시험관내 또는 생체내 유도,
- 세포 주기 정지의 시험관내 또는 생체내 유도,
- 세포 성장 및/또는 세포 증식의 시험관내 또는 생체내 감소,
- 세포 아네르기의 시험관내 또는 생체내 유도,
- 세포 아폽토시스의 시험관내 또는 생체내 유도,
- 세포 괴사의 시험관내 또는 생체내 유도,
- 세포 사멸의 시험관내 또는 생체내 유도, 또는
- 프로그래밍된 세포 사멸의 시험관내 또는 생체내 유도.
[161] 다음을 위한 방법으로서, [1] 내지 [160] 중 어느 하나의 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물, 벡터 시스템 또는 전달 시스템을 표적 세포에서 시험관내, 생체외, 또는 생체내 도입하거나 유도하는 것을 포함하는 방법:
- RNA 서열 특이적 간섭,
- RNA 서열 특이적 유전자 조절,
- RNA 또는 RNA 생산물 또는 lincRNA 또는 비-코딩 RNA, 또는 핵 RNA, 또는 mRNA의 스크리닝,
- 돌연변이 유발,
- 형광 인 시츄 혼성화,
- 육종,
- 세포 휴면의 시험관내 또는 생체내 유도,
- 세포 주기 정지의 시험관내 또는 생체내 유도,
- 세포 성장 및/또는 세포 증식의 시험관내 또는 생체내 감소,
- 세포 아네르기의 시험관내 또는 생체내 유도,
- 세포 아폽토시스의 시험관내 또는 생체내 유도,
- 세포 괴사의 시험관내 또는 생체내 유도,
- 세포 사멸의 시험관내 또는 생체내 유도, 또는
- 프로그래밍된 세포 사멸의 시험관내 또는 생체내 유도.
본 발명은 구체적으로 진핵 세포, 조직, 기관, 또는 생물, 더욱 구체적으로 포유류 세포, 조직, 기관, 또는 생물에서 관심 표적 유전자좌의 또는 이와 연관된 핵산 서열을 변형시키는 방법을 제공하며, 방법은 제VI형 CRISPR-Cas 유전자좌 이펙터 단백질 및 하나 이상의 핵산 성분을 포함하는 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물을 상기 유전자좌에 전달하는 것을 포함하며, 여기서 이펙터 단백질은 하나 이상의 핵산 성분과 복합체를 형성하고 상기 복합체의 관심 유전자좌에의 결합 즉시 이펙터 단백질은 관심 표적 유전자좌의 또는 이와 연관된 서열의 변형을 유도한다. 바람직한 구현예에서, 변형은 가닥 손상의 도입이다. 바람직한 구현예에서, 관심 표적 유전자좌의 또는 이와 연관된 서열은 RNA를 포함하고 이펙터 단백질은 제VI형 CRISPR-Cas 유전자좌에 의해 인코딩된다. 복합체는 시험관내 또는 생체외에서 형성되어 세포 내로 도입되거나 RNA와 접촉될 수 있거나; 생체내에서 형성될 수 있다.
용어 Cas 효소, CRISPR 효소, CRISPR 단백질 Cas 단백질 및 CRISPR Cas는 일반적으로 상호 교환 가능하게 사용되며 본 명세서에서 참고문헌의 모든 포인트에서, 구체적인 Cas9의 참조에 의하는 것과 같이 달리 명백하지 않은 한, 유추에 의해 본 명세서에 추가로 기재되는 신규한 CRISPR 이펙터 단백질을 지칭한다. 본 명세서에 기재된 CRISPR 이펙터 단백질은 바람직하게는 C2c2 이펙터 단백질이다.
본 발명은 관심 표적 유전자좌의 또는 이와 연관된 서열을 표적화(예를 들어 변형)하는 방법을 제공하며, 방법은 상기 유전자좌의 또는 이와 관련된 서열에 C2c2 유전자좌 이펙터 단백질(촉매적으로 활성이거나 대안적으로 촉매적으로 비활성인) 및 하나 이상의 핵산 성분을 포함하는 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물을 전달하는 것을 포함하며, 여기서 C2c2 이펙터 단백질은 하나 이상의 핵산 성분과 복합체를 형성하고 상기 복합체의 관심 있는 유전자좌에의 결합 즉시 이펙터 단백질은 관심 표적 유전자좌의 또는 이와 연관된 서열의 변형을 유도한다. 바람직한 구현예에서, 변형은 가닥 손상의 도입이다. 바람직한 구현예에서, C2c2 이펙터 단백질은 하나의 핵산 성분; 유리하게는 설계 제작되거나 비-천연적으로 발생 핵산 성분과 복합체를 형성한다. 복합체는 시험관내 또는 생체외에서 형성되어 세포 내로 도입되거나 RNA와 접촉될 수 있거나; 생체내에서 형성될 수 있다. 관심 표적 유전자좌와 관련되거나 상기 표적 유전자좌에서의 서열의 변형의 도입은 C2c2 이펙터 단백질-핵산으로 가이드될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 하나의 핵산 성분은 CRISPR RNA(crRNA)이다. 바람직한 구현예에서, 하나의 핵산 성분은 성숙 crRNA 또는 가이드 RNA이며, 상기 성숙 crRNA 또는 가이드 RNA는 스페이서 서열(또는 가이드 서열) 및 직접 반복 서열 또는 이들의 유도체를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 스페이서 서열 또는 이의 유도체는 씨드(seed) 서열을 포함하며, 상기 씨드 서열은 표적 유전자좌에서 서열에 대한 인식 및/또는 혼성화에 중요하다.
본 발명의 일 양태는 하나 이상의 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작되거나 변형되거나 최적화된 핵산 성분을 갖는 C2c2 이펙터 단백질 복합체에 관한 것이다. 바람직한 구현예에서, 상기 복합체의 핵산 성분은 직접 반복 서열에 연결된 가이드 서열을 포함할 수 있으며, 상기 직접 반복 서열은 하나 이상의 스템 루프(stem loop) 또는 최적화된 2차 구조를 포함한다. 특정 구현예에서, 직접 반복은 최소한의 길이가 16 nt, 예를 들어 적어도 28 nt이고 단일 스템 루프를 갖는다. 추가 구현예에서, 직접 반복은 길이가 16 nt보다 더 길며, 바람직하게는 17 nt 초과, 에를 들어 적어도 28 nt이고, 하나 초과의 스템 루프 또는 최적화된 2차 구조를 갖는다. 구체적인 구현예에서, 직접 반복은 25 이상 nts, 예를 들어 26 nt, 27 nt, 28 nt 이상, 및 하나 이상의 스템 루프 구조를 갖는다. 바람직한 구현예에서, 직접 반복은 변형되어 하나 이상의 단백질-결합 RNA 압타머를 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 최적화된 2차 구조의 일부와 같은 하나 이상의 압타머가 포함될 수 있다. 이와 같은 압타머는 박테리오파지 코트 단백질에 결합할 수 있다. 박테리오파지 코트 단백질은 Qβ, F2, GA, fr, JP501, MS2, M12, R17, BZ13, JP34, JP500, KU1, M11, MX1, TW18, VK, SP, FI, ID2, NL95, TW19, AP205, φCb5, φCb8r, φCb12r, φCb23r, 7s 및 PRR1을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 박테리오파지 코트 단백질은 MS2이다. 본 발명은 또한 길이가 30 개 이상, 40 개 이상 또는 50 개 이상의 뉴클레오티드인 복합체의 핵산 성분을 제공한다.
본 발명은 제VI형 이펙터 단백질 및/또는 가이드 및 또는 표적 핵산과 이들의 복합체를 포함하는 세포를 제공한다. 특정 구현예에서, 세포는 효모 세포, 식물 세포, 포유류 세포, 동물 세포, 또는 인간 세포를 포함 하나 이에 한정되지 않는, 진핵 세포이다.
본 발명은 또한 구체적으로 진핵 세포, 조직, 기관, 또는 생물, 더욱 구체적으로 포유류 세포, 조직, 기관, 또는 생물에서 관심 표적 유전자좌를 변형시키는 방법을 제공하며, 방법은 C2c2 유전자좌 이펙터 단백질 및 하나 이상의 핵산 성분을 포함하는 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물을 상기 유전자좌에 전달하는 것을 포함하며, 여기서 C2c2 이펙터 단백질은 하나 이상의 핵산 성분과 복합체를 형성하고 상기 복합체의 관심 유전자좌에의 결합 즉시 이펙터 단백질은 관심 표적 유전자좌의 변형을 유도한다. 바람직한 구현예에서, 변형은 가닥 손상의 도입이다. 복합체는 시험관내 또는 생체외에서 형성되어 세포 내로 도입되거나 RNA와 접촉될 수 있거나; 생체내에서 형성될 수 있다.
이러한 방법에서, 관심 표적 유전자좌는 RNA 분자 내에 포함될 수 있다. 또한, 관심 표적 유전자좌는 DNA 분자 내에 포함될 수 있고, 특정 구현예에서, 전사된 DNA 분자 내에 포함될 수 있다. 이러한 방법에서, 관심 표적 유전자좌는 시험관내 핵산 분자에 포함될 수 있다.
이러한 방법에서 관심 표적 유전자좌는 세포, 구체적으로 포유류 세포 또는 식물 세포와 같은 진핵 세포 내의 핵산 분자에 포함될 수 있다. 포유류 세포는 비인간 영장류, 소, 돼지, 설치류 또는 마우스 세포일 수 있다. 세포는 비포유류 진핵 세포, 예를 들어 가금류, 어류 또는 새우일 수 있다. 식물 세포는 농작물, 예를 들어 카사바, 옥수수, 수수, 밀, 또는 벼의 것일 수 있다. 식물 세포는 또한 조류, 수목 또는 채소의 것일 수 있다. 본 발명에 의해 세포에 도입된 변형은, 세포 및 세포의 자손이 생물학적 생성물, 예를 들어 항체, 전분, 알콜 또는 다른 원하는 세포 산출물의 개선된 생성을 위하여 변경되도록 하는 것일 수 있다. 본 발명에 의해 세포에 도입된 변형은 세포 및 세포의 자손이 생성된 생물학적 생성물을 변화시키는 변경을 포함하도록 하는 것일 수 있다.
포유류 세포는 비인간 포유류, 예를 들어 영장류, 소, 양, 돼지, 개, 설치류, 토끼과, 예를 들어 원숭이, 소, 양, 돼지, 개, 토끼, 래트 또는 마우스 세포일수 있다. 세포는 비인간 진핵 세포, 예를 들어 가금류 조류(예를 들어, 닭), 척추동물 어류(예를 들어, 연어) 또는 패류(예를 들어, 굴, 조개, 바닷가재, 새우) 세포일 수 있다. 세포는 또한 식물 세포일 수 있다. 식물 세포는 단자엽식물 또는 쌍자엽식물의 것 또는 작물 또는 곡물 식물, 예를 들어 카사바, 옥수수, 수수, 대두, 밀, 귀리 또는 벼의 것일 수 있다. 식물 세포는 또한 조류, 수목 또는 생산성 식물, 과일 또는 채소(예를 들어, 수목, 예를 들어 감귤 나무, 예를 들어 오렌지, 자몽 또는 레몬 나무; 복숭아 또는 넥타린 나무; 사과 또는 배 나무; 견과류 나무, 예를 들어 아몬드 또는 호두 또는 피스타치오 나무; 가지속 식물; 유채속(Brassica)의 식물; 락투카(Lactuca) 속의 식물; 시금치(Spinacia) 속; 고추속(Capsicum)의 식물; 목화, 담배, 아스파라거스, 당근, 양배추, 브로콜리, 콜리플라워, 토마토, 가지, 후추, 상추, 시금치, 딸기, 블루베리, 라즈베리, 블랙베리, 포도, 커피, 코코아 등)의 것일 수 있다.
본 발명은 관심 표적 유전자좌를 변형시키는 방법을 제공하며, 방법은 제VI형 CRISPR-Cas 유전자좌 이펙터 단백질 및 하나 이상의 핵산 성분을 포함하는 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물을 상기 유전자좌에 전달하는 것을 포함하며, 여기서 C2c2 이펙터 단백질은 하나 이상의 핵산 성분과 복합체를 형성하고 상기 복합체의 관심 유전자좌에의 결합 즉시 이펙터 단백질은 관심 표적 유전자좌의 변형을 유도한다. 바람직한 구현예에서, 변형은 가닥 손상의 도입이다.
본 발명은 또한 관심 표적 유전자좌를 변형시키는 방법을 제공하며, 방법은 C2c2 유전자좌 이펙터 단백질 및 하나 이상의 핵산 성분을 포함하는 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물을 상기 유전자좌에 전달하는 것을 포함하며, 여기서 C2c2 이펙터 단백질은 하나 이상의 핵산 성분과 복합체를 형성하고 상기 복합체의 관심 유전자좌에의 결합 즉시 이펙터 단백질은 관심 표적 유전자좌의 변형을 유도한다. 바람직한 구현예에서, 변형은 가닥 손상의 도입이다.
이러한 방법에서, 관심 표적 유전자좌는 시험관내 핵산 분자에 포함될 수 있다. 이러한 방법에서, 관심 표적 유전자좌는 세포내 핵산 분자에 포함될 수 있다. 바람직하게는, 이러한 방법에서, 관심 표적 유전자좌는 시험관내 RNA 분자 내에 포함될 수 있다. 또한 바람직하게는, 이러한 방법에서, 관심 표적 유전자좌는 세포내 RNA 분자 내에 포함될 수 있다. 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포일 수 있다. 세포는 포유류 세포일 수 있다. 세포는 설치류 세포일 수 있다. 세포는 마우스 세포일 수 있다.
기재된 방법 중 임의의 것에서, 관심 표적 유전자좌는 관심 있는 게놈 또는 후성유전체 유전자좌일 수 있다. 기재된 방법 중 임의의 것에서, 복합체는 다중화된 사용을 위한 다수의 가이드와 함께 전달될 수 있다. 기재된 방법 중 임의의 것에서 하나 초과의 단백질(들)이 사용될 수 있다.
본 발명의 추가의 양태에서, 핵산 성분은 CRISPR RNA(crRNA) 서열을 포함 할 수 있다. 제한없이, 출원인은 이러한 경우에 pre-crRNA가 성숙 crRNA뿐만 아니라 이펙터 단백질 상으로의 crRNA 로딩을 생산하기 위한 프로세싱에 충분한 2차 구조를 포함할 수 있다고 가정한다. 제한이 아닌 예로서, 이러한 2 차 구조는 pre-crRNA 내의, 더욱 구체적으로는 직접 반복 내의 스템 루프를 포함하거나, 스템 루프로 본질적으로 구성되거나, 스템 루프로 구성될 수 있다.
기재된 방법 중 임의의 것에서, 이펙터 단백질 및 핵산 성분은 단백질 및/또는 핵산 성분(들)을 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 분자를 통해 제공될 수 있으며, 여기서 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 분자는 작동 가능하게 구성되어 단백질 및/또는 핵산 성분(들)을 발현한다. 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 분자는 단백질 및/또는 핵산 성분(들)을 발현하기 위해 작동 가능하게 구성된 하나 이상의 조절 요소를 포함할 수 있다. 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 분자는 하나 이상의 벡터 내에 포함될 수 있다. 기재된 방법 중 임의의 것에서, 관심 표적 유전자좌는 관심 있는 게놈 또는 후성유전체 유전자좌일 수 있다. 기재된 방법 중 임의의 것에서, 복합체는 다중화된 사용을 위해 다수의 가이드와 함께 전달될 수 있다. 기재된 방법 중 임의의 것에서, 하나보다 많은 단백질(들)이 사용될 수 있다.
조절 요소는 유도성 프로모터를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 및/또는 벡터 시스템은 유도성 시스템을 포함할 수 있다.
기재된 방법 중 임의의 것에서, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 분자가 전달 시스템에 포함될 수 있거나, 하나 이상의 벡터가 전달 시스템에 포함될 수 있다.
기재된 방법 중 임의의 것에서, 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물은 리포좀, 나노입자를 포함하는 입자, 엑소좀, 미세소포, 유전자총 또는 하나 이상의 바이러스 벡터를 통해 전달될 수 있다.
본 발명은 또한 본 명세서에서 논의되거나 본 명세서에 기재된 방법 중 임의의 것에서 정의된 바와 같은 특징을 갖는 조성물인 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 따라서, 구체적으로 관심 표적 유전자좌를 변형할 수 있거나 또는 변형하도록 환경 설정된 조성물과 같은, 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물을 제공하고, 상기 조성물은 제VI형 CRISPR-Cas 유전자좌 이펙터 단백질 및 하나 이상의 핵산 성분을 포함하며, 여기서 이펙터 단백질은 하나 이상의 핵산 성분과 복합체를 형성하고 상기 복합체의 관심 유전자좌에의 결합 즉시 이펙터 단백질은 관심 표적 유전자좌의 변형을 유도한다. 특정 구현예에서, 이펙터 단백질은 C2c2 유전자좌 이펙터 단백질일 수 있다.
본 발명은 또한 추가의 양태에서, 구체적으로 관심 표적 유전자좌를 변형할 수 있거나 또는 변형하도록 환경 설정된 조성물과 같은, 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물을 제공하고, 상기 조성물은:(a) 가이드 RNA 분자(또는 다중화용 RNA와 같은, 예를 들어 제1 가이드 RNA 분자 및 제2 가이드 RNA 분자인, 가이드 RNA 분자의 조합) 또는 가이드 RNA 분자를 인코딩하는 핵산(또는 가이드 RNA 분자의 조합을 인코딩하는 하나 이상의 핵산);(b) 제VI형 CRISPR-Cas 유전자좌 이펙터 단백질 또는 제VI형 CRISPR-Cas 유전자좌 이펙터 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함한다. 특정 구현예에서, 이펙터 단백질은 C2c2 유전자좌 이펙터 단백질일 수 있다.
본 발명은 또한 추가의 양태에서, (a) 가이드 RNA 분자(또는 예를 들어 제1 가이드 RNA 분자 및 제2 가이드 RNA 분자인, 가이드 RNA 분자의 조합) 또는 가이드 RNA 분자를 인코딩하는 핵산(또는 가이드 RNA 분자의 조합을 인코딩하는 하나 이상의 핵산); (b) C2c2 유전자좌 이펙터 단백질을 포함하는, 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 하나 이상의 벡터를 포함하는 벡터 시스템을 제공하며, 하나 이상의 벡터는 본 명세서에 기재된 방법 중 임의의 것에서 정의된 바와 같은 특징을 갖는 조성물인 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물의 성분을 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 분자를 포함한다.
본 발명은 또한 하나 이상의 벡터 또는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 전달 시스템을 제공하며, 하나 이상의 벡터 또는 폴리뉴클레오티드 분자는 본 명세서에서 논의되거나 본 명세서에 기재된 방법 중 임의의 것에서 정의된 바와 같은 특징을 갖는 조성물인 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물의 성분을 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 분자를 포함한다.
본 발명은 또한 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물, 또는 상기 조성물의 성분을 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 또는 치료의 치료 방법에서 사용하기 위한 상기 조성물의 성분을 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 또는 전달 시스템을 제공한다. 치료의 치료 방법은 유전자 또는 트랜스크립톰 편집, 또는 유전자 요법을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 이펙터 단백질의 하나 이상의 아미노산 잔기가 변형될 수 있는, 예를 들어 설계 제작되거나 비-천연적으로 발생하는 이펙터 단백질 또는 C2c2일 수 있는 방법 및 조성물을 제공한다. 일 구현예에서, 변형은 이펙터 단백질의 하나 이상의 아미노산 잔기의 돌연변이를 포함할 수 있다. 하나 이상의 돌연변이는 이펙터 단백질의 하나 이상의 촉매적으로 활성인 도메인에 존재할 수 있다. 이펙터 단백질은 하나 이상의 돌연변이가 없는 이펙터 단백질과 비교하여 감소되거나 제거된 뉴클레아제 활성을 가질 수 있다. 이펙터 단백질은 관심 표적 유전자좌에서 RNA 가닥의 절단을 지시하지 않을 수 있다. 바람직한 구현예에서, 하나 이상의 돌연변이는 2 개의 돌연변이를 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 잔기는 C2c2 이펙터 단백질, 예를 들어 설계 제작되거나 비-천연적으로 발생하는 이펙터 단백질 또는 C2c2에서 변형된다. 구체적인 구현예에서, 하나 이상의 변형 또는 돌연변이된 아미노산 잔기는 돌연변이 R597A, H602A, R1278A 및 H1283A, 또는 Lsh C2c2 오솔로그에서의 상응하는 아미노산 잔기와 같이, R597, H602, R1278 및 H1283(Lsh C2c2 아미노산 참조)에 상응하는 C2c2에서의 것들 중 하나 이상이다.
구체적인 구현예에서, 하나 이상의 변형 또는 돌연변이된 아미노산 잔기는, C2c2 컨센서스 넘버링에 따라, K2, K39, V40, E479, L514, V518, N524, G534, K535, E580, L597, V602, D630, F676, L709, I713, R717 (HEPN), N718, H722 (HEPN), E773, P823, V828, I879, Y880, F884, Y997, L1001, F1009, L1013, Y1093, L1099, L1111, Y1114, L1203, D1222, Y1244, L1250, L1253, K1261, I1334, L1355, L1359, R1362, Y1366, E1371, R1372, D1373, R1509 (HEPN), H1514 (HEPN), Y1543, D1544, K1546, K1548, V1551, I1558에 상응하는 C2c2에서의 것들 중 하나 이상이다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 변형 또는 돌연변이된 아미노산 잔기는 R717 및 R1509에 상응하는 C2c2에서의 것들 중 하나 이상이다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 변형 또는 돌연변이된 아미노산 잔기는 K2, K39, K535, K1261, R1362, R1372, K1546 및 K1548에 상응하는 C2c2에서의 것들 중 하나 이상이다. 특정 구현예에서, 상기 돌연변이는 변경된 또는 변형된 활성을 갖는 단백질을 초래한다. 특정 구현예에서, 상기 돌연변이는 증가된 특이성과 같은 증가된 활성을 갖는 단백질을 초래한다. 특정 구현예에서, 상기 돌연변이는 감소된 특이성과 같은 감소된 활성을 갖는 단백질을 초래한다. 특정 구현예에서, 상기 돌연변이는 촉매 활성이 없는 단백질(즉, "데드(dead)" C2c2)을 초래한다. 일 구현예에서, 상기 아미노산 잔기는 Lsh C2c2 아미노산 잔기, 또는 상이한 종 유래의 C2c2 단백질의 상응하는 아미노산 잔기에 상응한다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 변형 또는 돌연변이된 아미노산 잔기는, 도 3에 표시된, 즉, 렙토트리키아 와데이(Leptotrichia wadei) F0279("Lew2" 또는 "Lw2") 및 리스테리아 뉴요켄시스(Listeria newyorkensis) FSL M6-0635(리스테리아세아에 박테리움(Listeriaceae bacterium) FSL M6-0635으로도 알려짐("Lib" 또는 "LbFSL"))의 정렬에 기반한, 컨센서스 서열을 참고하여, M35, K36, T38, K39, I57, E65, G66, L68, N84, T86, E88, I103, N105, E123, R128, R129, K139, L152, L194, N196, K198, N201, Y222, D253, I266, F267, S280, I303, N306, R331, Y338, K389, Y390, K391, I434, K435, L458, D459, E462, L463, I478, E479, K494, R495, N498, S501, E519, N524, Y529, V530, G534, K535, Y539, T549, D551, R577, E580, A581, F582, I587, A593, L597, I601, L602, E611, E613, D630, I631, G633, K641, N646, V669, F676, S678, N695, E703, A707, I709, I713, I716, R717, H722, F740, F742, K768, I774, K778, I783, L787, S789, V792, Y796, D799, F812, N818, P820, F821, V822, P823, S824, F825, Y829, K831, D837, L852, F858, E867, A871, L875, K877, Y880, Y881, F884, F888, F896, N901, V903, N915, K916, R918, Q920, E951, P956, Y959, Q964, I969, N994, F1000, I10001, Q1003, F10005, K1007, G1008, F1009, N1019, L1020, K1021, I1023, N1028, E1070, I1075, K1076, F1092, K1097, L1099, L1104, L1107, K1113, Y1114, E1149, E1151, I1153, L1155, L1158, D1166, L1203, D1222, G1224, I1228, R1236, K1243, Y1244, G1245, D1255, K1261, S1263, L1267, E1269, K1274, I1277, E1278, L1289, H1290, A1294, N1320, K1325, E1327, Y1328, I1334, Y1337, K1341, N1342, K1343, N1350, L1352, L1355, L1356, I1359, L1360, R1362, V1363, G1364, Y1365, I1369, R1371, D1372, F1385, E1391, D1459, K1463, K1466, R1509, N1510, I1512, A1513, H1514, N1516, Y1517, L1529, L1530, E1534, L1536, R1537, Y1543, D1544, R1545, K1546, L1547, K1548, N1549, A1550, K1553, S1554, D1557, I1558, L1559, G1563, F1568, I1612, L1651, E1652, K1655, H1658, L1659, K1663, T1673, S1677, E1678, E1679, C1681, V1684, K1685, E1689에 상응하는 C2c2에서의 것들 중 하나 이상이다. 특정 구현예에서, 앞서 표시된 바와 같이, 상기 아미노산 잔기 목록에서, R597, H602, R1278 및 H1283(Lsh C2c2 아미노산 참조)에 상응하는 잔기는 제외된다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 변형 또는 돌연변이된 아미노산 잔기는 하나 이상의 보존된 하전 아미노산 잔기이다. 특정 구현예에서, 상기 아미노산 잔기는 알라닌으로 돌연변이될 수 있다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 변형 또는 돌연변이된 아미노산 잔기는, 도 2에 표시된, 즉, 도 1에 표시된 C2c2 오솔로그의 정렬에 기반한, 컨센서스 서열을 참고하여, K28, K31, R44, E162, E184, K262, E288, K357, E360, K338, R441 (HEPN), H446 (HEPN), E471, K482, K525, K558, D707, R790, K811, R833, E839, R885, E894, R895, D896, K942, R960 (HEPN), H965 (HEPN), D990, K992, K994에 상응하는 C2c2에서의 것들 중 하나 이상이다. 특정 구현예에서, 앞서 표시된 바와 같이, 상기 아미노산 잔기 목록에서, R597, H602, R1278 및 H1283(Lsh C2c2 아미노산 참조)에 상응하는 잔기는 제외된다.
본 발명은 또한 하나 이상의 돌연변이 또는 2 개 이상의 돌연변이가 이펙터 단백질의 촉매적 활성 도메인에 존재하는 것을 제공한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 돌연변이 또는 2 개 이상의 돌연변이는 HEPN 도메인, 또는 HEPN 도메인에 상동인 촉매 활성 도메인을 포함하는 이펙터 단백질의 촉매적 활성 도메인에 존재할 수 있다. 이펙터 단백질은 하나 이상의 이종 기능성 도메인을 포함 할 수 있다. 하나 이상의 이종 기능성 도메인은 하나 이상의 핵 국소화 신호(NLS) 도메인을 포함할 수 있다. 하나 이상의 이종 기능성 도메인은 적어도 2 개 이상의 NLS 도메인을 포함할 수 있다. 하나 이상의 NLS 도메인(들)은 이펙터 단백질(예를 들어, C2c2)의 말단에 또는 근처에 또는 근접하게 위치할 수 있고 2 개 이상의 NLS의 경우, 2 개 각각은 이펙터 단백질(예를 들어, C2c2)의 말단에 또는 근처에 또는 근접하게 위치할 수 있다. 하나 이상의 이종 기능성 도메인은 하나 이상의 번역 활성화 도메인을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 기능성 도메인은 전사 활성화 도메인, 예를 들어 VP64를 포함할 수 있다. 하나 이상의 이종 기능성 도메인은 하나 이상의 전사 억제 도메인을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 전사 억제 도메인은 KRAB 도메인 또는 SID 도메인(예를 들어, SID4X)을 포함한다. 하나 이상의 이종 기능성 도메인은 하나 이상의 뉴클레아제 도메인을 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 뉴클레아제 도메인은 Fok1을 포함한다.
본 발명은 또한 하나 이상의 이종 기능성 도메인이 다음의 활성 중 하나 이상을 갖는 것을 제공한다: 메틸라제 활성, 데메틸라제 활성, 번역 활성화 활성, 번역 억제 활성, 전사 활성화 활성, 전사 억제 활성, 전사 방출 인자 활성, 히스톤 변형 활성, 뉴클레아제 활성, 단일-가닥 RNA 절단 활성, 이중-가닥 RNA 절단 활성, 단일-가닥 DNA 절단 활성, 이중-가닥 DNA 절단 활성 및 핵산 결합 활성. 본 발명의 특정 구현예에서, 하나 이상의 이종 기능성 도메인은 에피토프 태그 또는 리포터를 포함할 수 있다. 에피토프 태그의 비-제한적인 예로는 히스티딘(His) 태그, V5 태그, FLAG 태그, 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 태그, Myc 태그, VSV-G 태그, 및 티오레독신(Trx) 태그가 포함된다. 리포터의 예로는 글루타티온-S-트랜스페라제(GST), 홀스래디쉬 페록시다제(HRP), 클로람페니콜 아세틸트랜스페라제(CAT) 베타-갈락토시다제, 베타-글루쿠로니다제, 루시페라제, 녹색 형광 단백질(GFP), HcRed, DcRed, 시안 형광 단백질(CFP), 황색 형광 단백질(YFP), 및 청색 형광 단백질(BFP)을 포함하는 자가 형광 단백질이 포함된다.
적어도 하나 이상의 이종 기능성 도메인은 이펙터 단백질의 아미노-말단에 또는 상기 말단 근처에 존재할 수 있고/있거나 여기서 적어도 하나 이상의 이종 기능성 도메인은 이펙터 단백질의 카르복시-말단에 또는 상기 말단 근처에 존재한다. 하나 이상의 이종 기능성 도메인은 이펙터 단백질과 융합될 수 있다. 하나 이상의 이종 기능성 도메인은 이펙터 단백질에 묶일 수 있다. 하나 이상의 이종 기능성 도메인은 링커 모이어티에 의해 이펙터 단백질에 연결될 수 있다.
본 발명은 또한 스트렙토코커스(Streptococcus), 캄필로박터(Campylobacter), 니트라티프락토르(Nitratifractor), 스타필로코커스(Staphylococcus), 파르비바쿨룸(Parvibaculum), 로세부리아(Roseburia), 네이세리아(Neisseria), 글루콘아세토박터(Gluconacetobacter), 아조스피릴룸(Azospirillum), 스파에로카에타(Sphaerochaeta), 락토바실러스(Lactobacillus), 유박테리움(Eubacterium), 코리네박터(Corynebacter), 카르노박테리움(Carnobacterium), 로도박터(Rhodobacter), 리스테리아(Listeria), 팔루디박터(Paludibacter), 클로스트리디움(Clostridium), 라크노스피라세아에(Lachnospiraceae), 클로스트리디아리디움(Clostridiaridium), 렙토트리키아(Leptotrichia), 프란시셀라(Francisella), 레지오넬라(Legionella), 알리사이클로바실러스(Alicyclobacillus), 메타노메티오필러스(Methanomethyophilus), 포르피로모나스(Porphyromonas), 프레보텔라(Prevotella), 박테로이데테스(Bacteroidetes), 헬코코커스(Helcococcus), 레토스피라(Letospira), 데설포비브리오(Desulfovibrio), 데설포나트로눔(Desulfonatronum), 오피투타세아에(Opitutaceae), 투베리바실러스(Tuberibacillus), 바실러스(Bacillus), 브레비바실러스(Brevibacilus), 메틸로박테리움(Methylobacterium) 또는 아시다미노코커스(Acidaminococcus)를 포함하는 속으로부터의 생물 유래의 이펙터 단백질을 포함하는 이펙터 단백질을 제공한다. 이펙터 단백질은 제1 이펙터 단백질 오솔로그 유래의 제1 단편 및 제2 이펙터 단백질 오솔로그 유래의 제2 단편을 포함하는 키메라 이펙터 단백질을 포함할 수 있으며, 여기서 제1 및 제2 이펙터 단백질 오솔로그는 상이하다. 제1 및 제2 이펙터 단백질 오솔로그 중 적어도 하나는 스트렙토코커스, 캄필로박터, 니트라티프락토르, 스타필로코커스, 파르비바쿨룸, 로세부리아, 네이세리아, 글루콘아세토박터, 아조스피릴룸, 스파에로카에타, 락토바실러스, 유박테리움, 코리네박터, 카르노박테리움, 로도박터, 리스테리아, 팔루디박터, 클로스트리디움, 라크노스피라세아에, 클로스트리디아리디움, 렙토트리키아, 프란시셀라, 레지오넬라, 알리사이클로바실러스, 메타노메티오필러스, 포르피로모나스, 프레보텔라, 박테로이데테스, 헬코코커스, 레토스피라, 데설포비브리오, 데설포나트로눔, 오피투타세아에, 투베리바실러스, 바실러스, 브레비바실러스, 메틸로박테리움 또는 아시다미노코커스를 포함하는 생물 유래의 이펙터 단백질을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 이펙터 단백질, 구체적으로 제VI형 유전자좌 이펙터 단백질, 더욱 구체적으로 C2c2p는 분류군 알파-프로테오박테리아, 바실리(Bacilli), 클로스트리디아(Clostridia), 푸소박테리아(Fusobacteria) 및 박테로이데테스(Bacteroidetes)에 속하는 박테리아 종으로부터 기원될 수 있거나, 단리될 수 있거나, 유래될 수 있다. 특정 구현예에서, 이펙터 단백질, 구체적으로 제VI형 유전자좌 이펙터 단백질, 더욱 구체적으로 C2c2p는 라크노스피라세아에, 클로스트리디움, 카르노박테리움, 팔루디박터, 리스테리아, 렙토트리키아, 및 로도박터로 구성된 군으로부터 선택되는 속에 속하는 박테리아 종으로부터 기원될 수 있거나, 단리될 수 있거나, 유래될 수 있다. 특정 구현예에서, 이펙터 단백질, 구체적으로 제VI형 유전자좌 이펙터 단백질, 더욱 구체적으로 C2c2p는 라크노스피라세아에 박테리움(Lachnospiraceae bacterium) MA2020, 라크노스피라세아에 박테리움 NK4A179, 클로스트리디움 아미노필룸(Clostridium aminophilum)(예를 들어, DSM 10710), 라크노스피라세아에 박테리움 NK4A144, 카르노박테리움 갈리나룸(Carnobacterium gallinarum)(예를 들어, DSM 4847 균주 MT44), 팔루디박터 프로피오니시게네스(Paludibacter propionicigenes)(예를 들어, WB4), 리스테리아 세엘리게리(Listeria seeligeri)(예를 들어, 혈청형 1/2b 균주 SLCC3954), 리스테리아 웨이헨스테파넨시스(Listeria weihenstephanensis)(예를 들어, FSL R9-0317 c4), 리스테리아 뉴요켄시스(예를 들어, 균주 FSL M6-0635: 또한 "LbFSL", 렙토트리키아 와데이(예를 들어, F0279: 또한 "Lw" 또는 "Lw2", 렙토트리키아 부칼리스(Leptotrichia buccalis)(예를 들어, DSM 1135), 렙토트리키아 종 오랄(Leptotrichia sp. Oral) 분류군 225(예를 들어, 균주 F0581), 렙토트리키아 종 오랄 분류군 879(예를 들어, 균주 F0557), 렙토트리키아 샤히(Leptotrichia shahii)(예를 들어, DSM 19757), 로도박터 캅술라투스(Rhodobacter capsulatus)(예를 들어, SB 1003, R121, 또는 DE442)로 구성된 군으로부터 선택되는 박테리아 종으로부터 기원될 수 있거나, 단리될 수 있거나, 유래될 수 있다. 특정 바람직한 구현예에서, C2c2 이펙터 단백질은 리스테리아세아에 박테리움 (예를 들어, FSL M6-0635: 또한 "LbFSL", 라크노스피라세아에 박테리움 MA2020, 라크노스피라세아에 박테리움 NK4A179, 클로스트리디움 아미노필룸(예를 들어, DSM 10710), 카르노박테리움 갈리나룸(예를 들어, DSM 4847), 팔루디박터 프로피오니시게네스(예를 들어, WB4), 리스테리아 세엘리게리(예를 들어, 혈청형 ?b 균주 SLCC3954), 리스테리아 웨이헨스테파넨시스(예를 들어, FSL R9-0317 c4), 렙토트리키아 와데이(예를 들어, F0279: 또한 "Lw" 또는 "Lw2", 렙토트리키아 샤히(예를 들어, DSM 19757), 로도박터 캅술라투스(예를 들어, SB 1003, R121, 또는 DE442); 바람직하게는 리스테리아세아에 박테리움 FSL M6-0635(즉, 리스테리아 뉴요켄시스 FSL M6-0635: 도 4 내지 7의 "LbFSL" 또는 렙토트리키아 와데이 F0279(또한 "Lw" 또는 "Lw2")로부터 기원한다.
특정 구현예에서, 본 명세서에서 의도된 제VI형 유전자좌는 Cas1, Cas2 및 C2c2p 이펙터 단백질을 인코딩할 수 있다.
특정 구현예에서, 이펙터 단백질, 구체적으로 제VI형 유전자좌 이펙터 단백질, 더욱 구체적으로 천연 C2c2p와 같은 C2c2p는, 약 1100 내지 약 1400 아미노산 길이와 같은, 약 1000 내지 약 1500 아미노산 길이, 예를 들어 약 1000 내지 약 1100, 약 1100 내지 약 1200 아미노산 길이, 또는 약 1200 내지 약 1300 아미노산 길이, 또는 약 1300 내지 약 1400 아미노산 길이, 또는 약 1400 내지 약 1500 아미노산 길이, 예를 들어 약 1000, 약 1100, 약 1200, 약 1300, 약 1400 또는 약 1500 아미노산 길이일 수 있다.
특정 구현예에서, 이펙터 단백질, 구체적으로 제VI형 유전자좌 이펙터 단백질, 더욱 구체적으로 C2c2p는 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 2 개, 예를 들어 더욱 바람직하게는 정확히 2 개의 보존된 RxxxxH 모티프를 포함한다. 촉매성 RxxxxH 모티프는 HEPN(고등 진핵 생물 및 원핵 생물 뉴클레오티드-결합, Higher Eukaryotes and Prokaryotes Nucleotide-binding) 도메인의 특징이다. 따라서, 특정 구현예에서, 이펙터 단백질, 구체적으로 제VI형 유전자좌 이펙터 단백질, 더욱 구체적으로 C2c2p는 적어도 하나 및 바람직하게는 적어도 2 개, 예를 들어 더욱 바람직하게는 정확히 2 개의 HEPN 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, HEPN 도메인은 알엔아제 활성을 보유할 수 있다. 다른 구현예에서, HEPN 도메인은 디엔아제 활성을 보유할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 명세서에서 의도된 제VI형 유전자좌는 30 및 40 bp 길이 사이, 더욱 전형적으로 35 및 39 bp 길이 사이, 예를 들어 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40 bp 길이의 CRISPR 반복을 포함할 수 있다. 구체적인 구현예에서, 직접 반복은 적어도 25 nt 길이이다.
특정 구현예에서, 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 또는 PAM-유사 모티프는 본 명세서에 개시된 이펙터 단백질 복합체의 관심 표적 유전자좌에의 결합을 지시한다. 일부 구현예에서, PAM은 5' PAM(즉, 프로토스페이서의 5' 말단의 업스트림에 위치)일 수 있다. 다른 구현예에서, PAM은 3' PAM(즉, 프로토스페이서의 5' 말단의 다운스트림에 위치)일 수 있다. 용어 "PAM"은 용어 "PFS" 또는 "프로토스페이서 측면 부위" 또는 "프로토스페이서 측면 서열"과 상호 교환 가능하게 사용할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 이펙터 단백질, 구체적으로 제VI형 유전자좌 이펙터 단백질, 더욱 구체적으로 C2c2p는 3' PAM을 인식할 수 있다. 특정 구현예에서, 이펙터 단백질, 구체적으로 제VI형 유전자좌 이펙터 단백질, 더욱 구체적으로 C2c2p는 5'H인 3' PAM을 인식할 수 있으며, 여기서 H는 A, C 또는 U 이다. 특정 구현예에서, 이펙터 단백질은 렙토트리키아 샤히 C2c2p, 더욱 바람직하게는 렙토트리키아 샤히DSM 19757 C2c2일 수 있고, 5' PAM은 5'H이다. 특정 구현예에서, 이펙터 단백질은 렙토트리키아 와데이 F0279(Lw2) C2c2일 수 있고, 5' PAM은 H이며, 여기서 H는 C, U 또는 A이다.
특정 구현예에서, CRISPR 효소는 설계 제작되어 뉴클레아제 활성을 감소시키거나 제거하는 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 돌연변이는 이웃 잔기, 예를 들어 뉴클레아제 활성에 참여하는 상기 표시된 것들 근처의 아미노산에서 또한 일어날 수 있다. 일부 구현예에서, 오직 하나의 HEPN 도메인이 비활성화되고, 다른 구현예에서, 제2 HEPN 도메인이 비활성화된다.
본 발명의 특정 구현예에서, 가이드 RNA 또는 성숙 crRNA는 직접 반복 서열 및 가이드 서열 또는 스페이서 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나 또는 이로 구성된다. 특정 구현예에서, 가이드 RNA 또는 성숙 crRNA는 가이드 서열 또는 스페이서 서열에 연결된 직접 반복 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나 이로 구성된다. 특정 구현예에서, 가이드 RNA 또는 성숙 crRNA는 19 nt의 부분적 직접 반복 뒤에 따라오는 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 이상 nt의 가이드 서열, 예를 들어 18 내지 25, 19 내지 25, 20 내지 25, 21 내지 25, 22 내지 25, 또는 23 내지 25 nt의 가이드 서열 또는 스페이서 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 이펙터 단백질은 C2c2 이펙터 단백질이며, 검출 가능한 DNA 절단을 달성하기 위하여 적어도 16 nt의 가이드 서열을 필요로 하고 시험관내에서 효율적인 DNA 절단을 달성하기 위해 최소 17 nt의 가이드 서열을 필요로 한다. 구체적인 구현예에서, 이펙터 단백질은 C2c2 단백질이고 검출 가능한 RNA 절단을 달성하기 위하여 적어도 19 nt의 가이드 서열을 필요로 한다. 특정 구현예에서, 직접 반복 서열은 가이드 서열 또는 스페이서 서열로부터 업스트림(즉, 5')에 위치된다. 바람직한 구현예에서, C2c2 가이드 RNA의 씨드 서열(즉, 표적 유전자좌의 서열에 대한 인식 및/또는 혼성화에 본질적으로 중요한 서열)은 가이드 서열 또는 스페이서 서열의 5' 말단에서 대략적으로 처음 5 개 nt 내에 존재한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 성숙 crRNA는 스템 루프 또는 최적화된 스템 루프 구조 또는 최적화된 2차 구조를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 성숙 crRNA는 직접 반복 서열에서 스템 루프 또는 최적화된 스템 루프 구조를 포함하며, 여기서 스템 루프 또는 최적화된 스템 루프 구조는 절단 활성에 중요하다. 특정 구현예에서, 성숙 crRNA는 바람직하게 단일 스템 루프를 포함한다. 특정 구현예에서, 직접 반복 서열은 바람직하게 단일 스템 루프를 포함한다. 특정 구현예에서, 이펙터 단백질 복합체의 절단 활성은 스템 루프 RNA 듀플렉스 구조에 영향을 미치는 돌연변이를 도입함으로써 변형된다. 바람직한 구현예에서, 스템 루프의 RNA 듀플렉스를 유지하는 돌연변이가 도입될 수 있으며, 이에 의해 이펙터 단백질 복합체의 절단 활성이 유지된다. 다른 바람직한 구현예에서, 스템 루프의 RNA 듀플렉스 구조를 방해하는 돌연변이가 도입될 수 있으며, 이에 의해 이펙터 단백질 복합체의 절단 활성이 완전히 없어진다.
특정 구현예에서, C2c2 단백질은 Lsh C2c2 이펙터 단백질이고, 성숙 crRNA는 스템 루프 또는 최적화된 스템 루프 구조를 포함한다. 구체적인 구현예에서, crRNA의 직접 반복은 스템 루프를 포함하는 적어도 25 개의 뉴클레오티드를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 스템은 개별적인 염기 교환의 여지가 있으나 활성은 대부분의 2 차 구조 변화 또는 crRNA의 절단에 의해 방해된다. 방해 돌연변이의 예로는 스템 뉴클레오티드 중 2 개 초과의 교환, 스템에 쌍을 이루지 않는 뉴클레오티드 부가, 스템 단축(쌍을 이루는 뉴클레오티드 중 하나의 제거에 의해) 또는 스템 연장(쌍을 이루는 뉴클레오티드 하나의 세트 부가에 의해)이 포함된다. 그러나, crRNA는 본 명세서에 기재된 구체적인 응용에 대해 예상되는 바와 같이, 비-기능성 RNA 서열을 포함하기 위해 5' 및/또는 3' 연장의 여지가 있을 수 있다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 임의의 방법 또는 조성물에서 진핵생물 또는 진핵 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된 이펙터 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 본 발명의 일 구현예에서, 코돈 최적화된 이펙터 단백질 인코딩 뉴클레오티드 서열은 본 명세서에서 논의된 임의의 C2c2를 인코딩하고 진핵 세포 또는 생물, 예를 들어 본 명세서의 다른 곳에 언급된 바와 같은 세포 또는 생물, 예를 들어, 제한 없이, 효모 세포, 또는 마우스 세포, 래트 세포, 및 인간 세포를 포함하는 포유류 세포 또는 생물, 또는 비-인간 진핵 생물, 예를 들어 식물에서 작동 가능성을 위해 코돈 최적화된다.
본 발명의 특정 구현예에서, 적어도 하나의 핵 국소화 신호(NLS)가 C2c2 이펙터 단백질을 인코딩하는 핵산 서열에 부착된다. 바람직한 구현예에서, 적어도 하나 이상의 C-말단 또는 N-말단 NLS가 부착된다(그리고 이에 따라 C2c2 이펙터 단백질을 코딩하는 핵산 분자(들)는 NLS(들)에 대한 코딩을 포함할 수 있어 발현된 생산물이 부착되거나 연결된 NLS(들)를 갖는다). 본 발명의 특정 구현예에서, 적어도 하나의 핵 방출 신호(NES)는 C2c2 이펙터 단백질을 인코딩하는 핵산 서열에 부착된다. 바람직한 구현예에서, 적어도 하나 이상의 C-말단 또는 N-말단 NES가 부착된다(그리고 이에 따라 C2c2 이펙터 단백질을 코딩하는 핵산 분자(들)는 NES(들)에 대한 코딩을 포함할 수 있어 발현된 생산물이 부착되거나 연결된 NES(들)를 갖는다). 바람직한 구현예에서, C-말단 및/또는 N-말단 NLS 또는 NES는 진핵 세포, 바람직하게는 인간 세포에서 최적 발현 및 핵 표적화를 위해 부착된다. 바람직한 구현예에서, 코돈 최적화된 이펙터 단백질은 C2c2이고 가이드 RNA의 스페이서 길이는 15 내지 35 nt이다. 특정 구현예에서, 가이드 RNA의 스페이서 길이는 적어도 16 개 뉴클레오티드, 예를 들어 적어도 17 개 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 18 nt, 예를 들어 바람직하게는 적어도 19 nt, 적어도 20 nt, 적어도 21 nt, 또는 적어도 22 nt이다. 특정 구현예에서, 스페이서 길이는 15 nt 내지 17 nt, 17 nt 내지 20 nt, 20 nt 내지 24 nt, 예를 들어, 20 nt, 21 nt, 22 nt, 23 nt, 또는 24 nt, 23 내지 25 nt, 예를 들어 23 nt, 24 nt, 또는 25 nt, 24 nt 내지 27 nt, 27 nt 내지 30 nt, 30 nt 내지 35 nt, 또는 35 nt 이상이다. 본 발명의 특정 구현예에서, 코돈 최적화된 이펙터 단백질은 C2c2이고, 가이드 RNA의 직접 반복 길이는 적어도 16 개의 뉴클레오티드이다. 특정 구현예에서, 코돈 최적화된 이펙터 단백질은 C2c2이고, 가이드 RNA의 직접 반복 길이는 16 nt 내지 20 nt, 예를 들어 16 개, 17 개, 18 개, 19 개, 또는 20 개 뉴클레오티드이다. 바람직한 특정 구현예에서, 가이드 RNA의 직접 반복 길이는 19 개 뉴클레오티드이다.
본 발명은 또한 다수의 핵산 성분을 전달하기 위한 방법을 포함하며, 여기서 각각의 핵산 성분은 상이한 관심 표적 유전자좌에 특이적이고, 이에 의해 다수의 관심 표적 유전자좌를 변형시킨다. 복합체의 핵산 성분은 하나 이상의 단백질-결합 RNA 압타머를 포함할 수 있다. 하나 이상의 압타머는 박테리오파지 코트 단백질을 결합할 수 있다. 박테리오파지 코트 단백질은 Qβ, F2, GA, fr, JP501, MS2, M12, R17, BZ13, JP34, JP500, KU1, M11, MX1, TW18, VK, SP, FI, ID2, NL95, TW19, AP205, φCb5, φCb8r, φCb12r, φCb23r, 7s 및 PRR1을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 박테리오파지 코트 단백질은 MS2이다. 본 발명은 또한 길이가 30 개 이상, 40 개 이상 또는 50 개 이상의 뉴클레오티드인 복합체의 핵산 성분을 제공한다.
따라서, 출원인이 권리를 유보하도록 임의의 이전에 공지된 생산물, 그 생산물의 제조 공정, 또는 그 생산물의 사용 방법을 본 발명 내에 포함시키지 않으며, 이에 의하여 임의의 이전에 공지된 생산물, 공정, 또는 방법에 대한 권리 포기를 개시하는 것이 본 발명의 목적이다. 본 발명은 출원인이 권리를 유보하도록 USPTO(35 U.S.C. §112, 첫 단락) 또는 EPO(EPC의 83항)의 서면 기재 요건 및 실시 가능 요건을 충족하지 않는, 임의의 생산물, 공정, 또는 그 생산물의 제조 또는 그 생산물의 사용 방법을 본 발명의 범주 내에 포함시키는 것으로 의도되지 않으며, 이에 의하여 임의의 이전에 공지된 생산물, 그 생산물의 제조 공정, 또는 그 생산물의 사용 방법의 권리 포기를 개시함을 추가로 유의한다. 본 발명의 실시에 있어서 Art. 53(c) EPC 및 규칙 28(b) 및(c) EPC에 따르는 것이 유리할 수 있다. 본 명세서에서 어떤 것도 약속으로 해석되어서는 안 된다.
본 개시 내용 및 구체적으로 청구범위 및/또는 단락에서, "포함한다(comprises)", "포함된(comprised)", "포함하는(comprising)" 등과 같은 용어는 미국 특허법에서 이에 귀속된 의미를 가질 수 있음에 유의하며; 예를 들어 이들은 "포함한다(includes)", "포함된(included)", "포함하는(including)" 등을 의미할 수 있고; "본질적으로 구성되는(consisting essentially of)" 및 "본질적으로 구성된다(consists essentially of)"와 같은 용어는 미국 특허법에서 이들에게 할당된 의미를 갖고, 예를 들어 명시적으로 열거되지 않은 요소를 허용하지만, 선행 기술에서 발견되거나 본 발명의 기본적인 또는 신규한 특징에 영향을 미치는 요소는 제외한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 변형된 관심 표적 유전자좌의 생성을 보장하는 본 명세서에 기재된 CRISPR 시스템을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 진핵 세포를 제공하며, 여기서 관심 표적 유전자좌는 본 명세서에 기재된 방법 중 임의의 것에 따라 변형된다. 추가의 양태는 상기 세포의 세포주를 제공한다. 또 다른 양태는 하나 이상의 상기 세포를 포함하는 다세포 생물을 제공한다.
특정 구현예에서, 관심 표적 유전자좌의 변형은 적어도 하나의 유전자 산물의 변경된 (단백질) 발현을 포함하는 진핵 세포; 적어도 하나의 유전자 산물의 변경된 (단백질) 발현을 포함하는 진핵 세포로서, 여기서 적어도 하나의 유전자 산물의 (단백질) 발현은 증가되는 것; 적어도 하나의 유전자 산물의 변경된 (단백질) 발현을 포함하는 진핵 세포로서, 여기서 적어도 하나의 유전자 산물의 (단백질) 발현은 감소되는 것, 또는 편집된 트랜스크립톰을 포함하는 진핵 세포를 초래할 수 있다.
특정 구현예에서, 진핵 세포는 포유류 세포 또는 인간 세포일 수 있다.
추가의 구현예에서, 본 명세서에 기재된 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물, 벡터 시스템, 또는 전달 시스템은 RNA 서열-특이적 간섭, 발현(이소형 특이적 발현 포함)의 RNA 서열 특이적 조절, 안정성, 국소화, 기능성(예를 들어, 리보솜 RNA 또는 miRNA) 등을 위해, 또는 이러한 프로세스의 다중화를 위해 사용될 수 있다.
추가의 구현예에서, 본 명세서에 기재된 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물, 벡터 시스템, 또는 전달 시스템은 생물학적 샘플과 같은 샘플에서의 RNA 검출 및/또는 정량화를 위해 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, RNA 검출은 세포 내에서이다. 일 구현예에서, 본 발명은 (a) 샘플을 i) RNA를 절단할 수 있는 제VI형 CRISPR-Cas 이펙터 단백질, (ii) 표적 RNA로 혼성화할 수 있는 가이드 RNA, 및 iii) 이펙터 단백질에 의해 비-특이적이고 검출 가능하게 절단될 수 있는 RNA-기반 절단 유도성 리포터와 함께 인큐베이션하는 것, (b) 상기 RNA-기반 절단 유도성 리포터의 절단에 의해 생성되는 신호에 기반하여 상기 표적 RNA를 검출하는 것을 포함하는, 샘플에서 표적 RNA를 검출하는 방법을 제공한다.
일 구현예에서, 제VI형 CRISPR-Cas 이펙터 단백질은 C2c2 이펙터 단백질이다. 일 구현예에서, RNA-기반 절단 유도성 리포터 작제물은 형광색소 및 소광제를 포함한다. 특정 구현예에서, 샘플은 무-세포 생물학적 샘플을 포함한다. 다른 구현예에서, 샘플은 예를 들어, 제한 없이, 식물 세포 또는 동물 세포인 세포 샘플을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 표적 RNA는 바이러스, 박테리아, 균류 또는 기생충 유래 표적 RNA를 포함하나 이에 한정되지 않는, 병원체 RNA를 포함한다. 일 구현예에서, 가이드 RNA는 단일 뉴클레오티드 다형성 또는 RNA 전사물의 스플라이스 변이체를 포함하는 표적 RNA를 검출하도록 설계된다. 일 구현예에서, 가이드 RNA는 표적 RNA와의 하나 이상의 미스 매치 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 구현예에서, 가이드 RNA는 암 또는 면역 질병과 같지만 이에 한정되지 않는 질병 상태에 대해 진단적인 aa 표적 분자에 혼성화한다.
본 발명은 a) RNA를 절단할 수 있는 제VI형 CRISPR-Cas 이펙터 단백질, b) 표적 RNA에 결합할 수 있는 가이드 RNA, 및 c) 이펙터 단백질에 의해 비-특이적이고 검출 가능하게 절단될 수 있는 RNA-기반 절단 유도성 리포터를 포함하는, 리보 핵산(RNA) 검출 시스템을 제공한다. 추가로, 본 발명은 a) RNA를 절단할 수 있는 제VI형 CRISPR-Cas 이펙터 단백질, b) 이펙터 단백질에 의해 비-특이적이고 검출 가능하게 절단될 수 있는 RNA-기반 절단 유도성 리포터를 포함하는, RNA 검출용 키트를 제공한다. 특정 구현예에서, RNA-기반 절단 유도성 리포터 작제물은 형광 색소 및 소광제를 포함한다.
추가의 구현예에서, 본 명세서에 기재된 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물, 벡터 시스템, 또는 전달 시스템은 질병 모델 및/또는 스크리닝 시스템을 생성하기 위해 사용될 수 있다.
추가의 구현예에서, 본 명세서에 기재된 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물, 벡터 시스템, 또는 전달 시스템은: 부위-특이적 트랜스크립톰 편집 또는 변동; 핵산 서열-특이적 간섭; 또는 다중화된 게놈 설계 제작을 위해 사용될 수 있다.
또한, 본 명세서에 기재된 세포, 세포주 또는 생물로부터의 유전자 산물이 제공된다. 특정 구현예에서, 발현된 유전자 산물의 양은 변경된 발현 또는 편집된 게놈을 갖지 않은 세포로부터의 유전자 산물의 양보다 더 많거나 더 적을 수 있다. 특정 구현예에서, 유전자 산물은 변경된 발현 또는 편집된 게놈을 갖지 않은 세포로부터의 유전자 산물과 비교하여 변경될 수 있다.
이들 및 다른 구현예는 하기 상세한 설명에 개시되어 있거나 이로부터 명백해지고 이에 의해 포함된다.
본 발명의 신규 특징은 구체적으로 첨부된 청구범위에 제시되어 있다. 본 발명의 원리가 이용된 예시적인 구현예를 제시하는 하기의 상세한 설명을 참조함으로써 본 발명의 특징 및 이점을 더욱 잘 이해할 것이며, 첨부된 도면은 다음과 같다:
도 1a 내지 1d. C2c2 오솔로그의 세포 국소화. (A) HEK293 세포는 핵 국소화 신호(NLS) 또는 핵 방출 신호(NES)와 함께 또는 없이 mCherry에 융합된 상이한 C2c2 오솔로그로 형질감염하였다. (B) 렙토트리키아 와데이 F0279 C2c2(B1) 및 라크노스피라세아에 박테리움 NK4A179 C2c2(B2)의 NES 융합은 세포질에 위치한다. (C) 렙토트리키아 와데이 F0279 C2c2(C1), 라크노스피라세아에 박테리움 NK4A179 C2c2 (C2), 및 렙토트리키아 샤히 C2c2(C3)의 NLS 융합은 핵에 위치하고 일정치 않게 인에 위치한다. (C) NLS 또는 NES에 융합하지 않은 렙토트리키아 와데이 F0279 C2c2(D1), 라크노스피라세아에 박테리움 NK4A179 C2c2(D2), 및 렙토트리키아 샤히 C2c2(D3)는 일정치 않게 핵 및 세포질에 위치한다. (D) 평가된 4 개의 포유류 LwaCas13a 작제물의 개략도(왼쪽) 및 각각의 설계의 국소화 및 발현을 보여주는 이미징(오른쪽).
도 2a 내지 2c. 포유류 세포에서의 C2c2 녹다운 효율의 평가를 위한 분석. A) C2c2의 녹다운 효율을 결정하기 위해 사용된 이중 루시페라제 리포터 설계의 개략도. 세포는 상이한 플라스미드로 형질감염하였다: 가우시아 루시페라제(Gluc) 및 사이프리디나 루시페라제(Cluc)를 인코딩하는 플라스미드; C2c2를 인코딩하는 플라스미드(NLS 또는 NES가 있거나 없음); 가우시아 루시페라제를 표적화하는 gRNA를 인코딩하는 플라스미드. Gluc의 녹다운 효율은 Gluc 및 Cluc의 비율에 기반하여 결정한다. (B)가우시아 루시페라제 mRNA를 표적화하는 상이한 gRNA의 위치. (C) 포유류 세포에서 C2c2 녹다운 효율을 평가하기위한 분석. 세포는 상이한 플라스미드로 형질감염하였다: EGFP를 인코딩하는 플라스미드; C2c2를 인코딩하는 플라스미드(NLS 또는 NES가 있거나 없음); 및 EGFP를 표적화하는 gRNA를 인코딩하는 플라스미드. EGFP의 녹다운 효율은 유세포분석법에 의해 결정한다.
도 3a 내지 3q. RNA 절단 활성에 대한 제VI형 CRISPR Cas13a 패밀리의 특징 확인. (A) Cas13a 오솔로그에 대한 PFS 특징 확인 스크린의 개략도. (B) Cas13a 단백질 및 crRNA의 발현을 위한 작제물의 개략도. 나타난 길이 및 잔기 번호는 LwaCas13a에 대한 것이다. (C) Cas13a 생체내 활성의 정량. (D) (C)로부터의 생체내 활성의 비율. (E, F) 생존 이.콜라이 집단에서 강화된 플라스미드의 차세대 시퀀싱에 의해 결정된, LshC2c2 및 LwaC2c2에 대한 PFS 모티프 결정. (G) 표적화 및 비-표적화 샘플에서의 LshC2c2 및 LwaC2c2에 대한 PFS 강화의 분포. (H) 생체내 PFS 스크리닝은 LwaCas13a가 최소한의 PFS 선호를 가짐을 나타낸다. (I) LshC2c2 및 LwC2c2에 대한 표적화 및 비-표적화 생물-반복실험(n=2)에서의 정규화된 PFS 수의 분포를 나타내는 박스 플롯. 박스는 거의 사분위수 범위의 1.5 배를 나타내는 제1 내지 제3사분위수까지 포괄한다. 평균값은 빨간색 가로 막대로 표시된다. (J) 정제 단백질을 사용한 LshC2c2 및 LwC2c2 RNA 절단 활성의 비교. LwaCas13a는 LshCas13a보다 더 활성있는 알엔아제 활성을 갖는다. 5' 표지된 RNA 표적을 C2c2 및 상응하는 crRVA와 함께 30 분 동안 인큐베이션시키고 생산물을 겔 전기영동으로 분석하였다. (K) LwaCas13a는 엘. 와데이 CRISPR 유전자좌 유래의 CRISPR 어레이 전사물을 처리할 수 있다. 2 개-스페이서 Lwa 어레이를 LwC2c2와 함께 30 분 동안 인큐베이션한 후 반응을 겔 전기영동으로 분석하였다. (L) 평가된 포유류 LwaCas13a 작제물의 개략도 및 각각의 설계의 국소화 및 발현을 나타내는 이미징. 축척 막대, 10μm. (M) 루시페라제 단백질 판독값으로 녹다운을 평가하기 위해 사용되는 포유류 리포터 시스템의 개략도. (N) LwaCas13a의 설계 제작 된 변이체를 사용한 가우시안 루시페라제(Gluc)의 녹다운. 가이드 및 shRNA에 대한 서열은 위에 나타난다. (O) LwaCas13a를 이용한 3 개의 상이한 내인성 전사물의 녹다운을 상응하는 RNAi 작제물과 비교. (P) 벼(Oryza sativa) 원형질체에서의 전사물의 LwaCas13a 녹다운의 개략도. (Q) 벼 원형질체에서 전사물당 3 개의 표적화 가이드 및 비-표적화 가이드를 사용하여 3 개 전사물의 LwaCas13a 녹다운. 달리 언급되지 않는 한 모든 값은 n=3 인 평균±SEM이다.
도 4a 내지 4b. Gluc에 대해 향하는 상이한 gRNA를 이용하고 NLS, NES와 융합되거나 태그가 없는 C2c2 오솔로그를 이용한 루시페라제의 정규화된 단백질 발현. (A) C2c2 오솔로그는 렙토트리키아 와데이 F0279(Lw2)이다. 실험에 사용된 스페이서 서열은 (가이드 1) ATCAGGGCAAACAGAACTTTGACTCCCA; (가이드 2) AGATCCGTGGTCGCGAAGTTGCTGGCCA; (가이드 3) TCGCCTTCGTAGGTGTGGCAGCGTCCTG; 및 (가이드 NP) TAGATTGCTGTTCTACCAAGTAATCCAT이다. (B) C2c2 오솔로그는 리스테리아 뉴요켄시스 FSL M6-0635(LbFSL)이다. 실험에 사용된 스페이서 서열은 (가이드 1) TCGCCTTCGTAGGTGTGGCAGCGTCCTG 및 (가이드 NT) tagattgctgttctaccaagtaatccat이다.
도 5a 내지 5b. EGPF에 대해 향하는 상이한 gRNA를 이용하고 NLS, NES와 융합되거나 태그가 없는 C2c2 오솔로그를 이용한 GPF의 정규화된 단백질 발현. (A) C2c2 오솔로그는 렙토트리키아 와데이 F0279(Lw2)이다. 실험에 사용된 스페이서 서열은 (가이드 1) tgaacagctcctcgcccttgctcaccat; (가이드 2) tcagcttgccgtaggtggcatcgccctc; (가이드 3) gggtagcggctgaagcactgcacgccgt; (가이드 4) ggtcttgtagttgccgtcgtccttgaag; (가이드 5) tactccagcttgtgccccaggatgttgc; (가이드 6) cacgctgccgtcctcgatgttgtggcgg; (가이드 7) tctttgctcagggcggactgggtgctca; (가이드 8) gacttgtacagctcgtccatgccgagag; 및 (가이드 NT) tagattgctgttctaccaagtaatccat이다. (B) C2c2 오솔로그는 리스테리아 뉴요켄시스 FSL M6-0635(LbFSL)이다. 실험에 사용된 스페이서 서열은 (가이드 2) tcagcttgccgtaggtggcatcgccctc; (가이드 3) gggtagcggctgaagcactgcacgccgt; (가이드 4) ggtcttgtagttgccgtcgtccttgaag; (가이드 5) tactccagcttgtgccccaggatgttgc; (가이드 6) cacgctgccgtcctcgatgttgtggcgg; (가이드 7) tctttgctcagggcggactgggtgctca; (가이드 8) gacttgtacagctcgtccatgccgagag; 및 (가이드 NT) tagattgctgttctaccaagtaatccat이다.
도 6a 내지 6e. 포유류 녹다운을 위한 LwaCas13a의 설계 제작 및 최적화. (A) A375s 세포에 형질감염된 다양한 가이드를 이용한 LwCas13a에 의한 Gluc 전사물의 녹다운: (B) LwCas13a의 설계제작된 변이체를 이용한 가우시아 루시페라제(Gluc)의 녹다운. (C) LwaCas13a 및 다양한 길이의 스페이서 Gluc crRNA 1에 의한 가우시아 루시페라제(Gluc)의 녹다운. (D) 다양한 가이드를 이용한 LwaCas13a에 의한 KRAS 전사물의 녹다운. (E) 다양한 가이드를 이용한 LwaCas13a에 의한 PPIB 전사물의 녹다운.
도 7. 각각의 표적 유전자에 대해 향하는 gRNA를 이용하고NES와 융합된 C2c2 렙토트리키아 와데이 F0279를 이용한 표적 유전자의 정규화된 단백질 발현. 각각의 표적 유전자에 대한 gRNA는 ctgctgccacagaccgagaggcttaaaa (CTNNB1); tccttgattacacgatggaatttgctgt (PPIB); tcaaggtggggtcacaggagaagccaaa (mAPK14); atgataatgcaatagcaggacaggatga (CXCR4); gcgtgagccaccgcgcctggccggctgt (TINCR); ccagctgcagatgctgcagtttttggcg (PCAT1); ctggaaatggaagatgccggcatagcca (CAPN1); gatgacacctcacacggaccacccctag (LETMD1); taatactgctccagatatgggtgggcca (MAPK14); catgaagaccgagttatagaatactata (RB1); ggtgaaatattctccatccagtggtttc (TP53); 및 aatttctcgaactaatgtatagaaggca (KRAS)이다.
도 8. Gluc에 대해 향하는 상이한 gRNA를 이용하고 NLS, NES와 융합되거나 태그가 없는 C2c2 오솔로그를 이용한 루시페라제의 정규화된 단백질 발현. C2c2 오솔로그는 렙토트리키아 샤히(Lsh), 렙토트리키아 와데이 F0279(Lw2), 클로스트리듐 아미노필룸(Ca), 리스테리아 뉴요켄시스 FSL M6-0635(LbFSL), 라크노스피라세아에 박테리움 NK4A179(LbNk), 및 라크노스피라세아에 박테리움 MA2020(LbM)이다.
도 9. Lw2는 다수의 세포주에서 기능한다. 정규화된 루시페라제 활성은 293FT 세포에 대해 나타난다.
도 10a 내지 10b. Gluc에 대해 향하는 gRNA를 이용하고 촉매적으로 비활성화된 C2c2 오솔로그를 이용한 루시페라제의 상대 단백질 발현. (A) dC2c2 렙토트리키아 와데이(LwC2c2)를 EIF4E, EIF4E 및 NES에 융합했거나 태그가 없다. (B) dC2c2 리스테리아 뉴요켄시스 FSL M6-0635(LbFSL)를 NLS 및 EIF4E에 융합했거나 태그가 없다.
도 11a 내지 11c. 베타 액틴을 표적화하는 렙토트리키아 와데이 C2c2 의 세포 국소화는 NaAsO2로 세포를 처리 즉시 스트레스 과립으로 국소화한다;
도 12. 포유류 세포에서의 RNA 녹다운. C2c2는 2 개의 표적 부위에서 shRNA를 능가한다.
도 13. 증가하는 crRNA 형질감염 양은 녹다운을 증가시킨다.
도 14. NES를 갖는 Lw2C2c2(NES-Lw2C2c2)는 tRNA 및 U6 녹다운의 RNA를 효과적으로 절단한다.
도 15a 내지 15b. (A) 단백질 형질감염 양은 녹다운을 포화시킨다. (B) Gluc crRNA 1 및 다양한 양의 형질감염된 LwaCas13a 플라스미드를 이용한 Gluc 전사물의 녹다운.
도 16. U6-구동되는 DR-스페이서-DR-스페이서 표적화 작제물.
도 17. 내인성 유전자 상의 상응하는 표적에 대해 C2c2가 최적화된 shRNA를 능가한다.
도 18. dLw2C2c2-EIF4E 융합은 3 개의 유전자의 번역을 상향 조절할 수 있다; 웨스턴 블롯 상에서 밴드 강도로 측정한 단백질 수준.
도 19. 개별 전사물의 녹다운. Lw2는 더 적은 변동성 및 더 높은 특이성을 나타낸다.
도 20. 포유류 세포에서의 RNA 녹다운.
도 21. 이미징은 GFP의 수퍼폴딩 유도체(sfGFP)에 의해 향상된다. C2c2-mCherry 및 sfGFP-C2c2 융합 단백질을 HEK293FT 세포 및 마우스 배아 줄기 세포(mESC)에서 비교한다.
도 22a. msfGFP-C2c2는 녹다운을 향상시킨다. NLS 또는 NES를 추가로 포함하는, C2c2의 mCherry 또는 msfGFP와의 다양한 융합 단백질에 의한 루시페라제 녹다운을 묘사한다.
도 22b 내지 22d는 C2c2를 이용한 전사 조절을 위한 단백질 태깅 시스템을 도시하고 변형된 C2c2(SunTag)가 포함하는 짧은 펩티드 서열에 결합하는 전사 개시 인자-연결된 scFv의 구성요소를 나타낸다. 도 22c 내지 22d는 시스템의 전사적 효과를 묘사한다.
도 23a 내지 23b. 리포터 단백질(GFP, Venus, Cre 등)의 분할. 각각의 부분은 C2c2에 융합되어 있다(예를 들어 카스파제를 이용한 개략도 슬라이드 참고). 서로에게 근접한 전사물을 표적화하는 2 개의 가이드를 설계함으로써, 분할된 단백질은 전사물의 존재 하에서 재구성된다.
도 24a 내지 24c. C2c2 부수적 알엔아제 활성에 의한 신속한 RNA 검출. (A) 왼쪽 패널: C2c2 crRNA의 가이드 서열에 상보적인 표적 RNA에 의한 C2c2 부수적 비-특이적 알엔아제 활성이 활성화되는 것은 리포터의 절단을 유도한다. 오른쪽 패널: 표적 RNA 부재 시, 부수적 비-특이적 알엔아제 활성이 유도되지 않으므로 리포터의 절단이 없다. (B) LwaCas13a에 의한 부수적 효과의 활성을 검출하기 위한 분석의 개략도. (C) 표적 RNA의 존재 또는 부재 하에 LwaCas13a-crRNA 복합체와 인큐베이션 후 부수적 RNA 표적의 겔 전기 영동.
도 25. 다양한 농도의 C2c2를 이용한 부수적 효과에 의한 렌티바이러스 검출.
도 26. 부수적 효과에 의한 렌티바이러스 검출의 시간 경과.
도 27. C2c2 부수적 알엔아제 활성에 의한 희귀한 RNA 종의 검출. 증가하는 표적 농도 및 표적 절단에는 증가된 비-특이적 표적외 알엔아제 활성이 동반한다.
도 28a 내지 28b. Lw2C2c2 및 LbuC2c2의 정렬.
도 29a 내지 29c. (A) 스페이서 서열에서의 단일 염기-쌍의 미스매치를 갖는 루시페라제 mRNA 녹다운에 대해 표적화된 βLwC2c2. (B) 스페이서 서열에서의 단일 염기-쌍의 미스매치를 갖는 CXCR4 mRNA 녹다운에 대해 표적화된 LwC2c2. (C) 스페이서 서열에서의 단일 및 연속된 두 염기-쌍 미스매치를 갖는 루시페라제 mRNA 녹다운에 대해 표적화된 LwC2c2.
도 29d-a 내지 29d-c. (A) 루시페라제 리포터 mRNA의 녹다운의 특이성. C2c2는 루시페라제 리포터 mRNA의 녹다운에 대한 RNAi보다 더 특이적이다. 왼쪽: shRNA를 위한 루시페라제 녹다운 조건에 비하여, 비-표적화 형질감염된 대조군의 RNA-seq 라이브러리에서의 모든 검출된 유전자(모든 그래프의 X 축)에 대한 log2(백만 당 전사물(TPM)) 값의 발현 수준. 오른쪽: C2c2를 위한 루시페라제 녹다운 조건에 비하여, 비-표적화 형질감염된 대조군의 RNA-seq 라이브러리에서의 모든 검출된 유전자(모든 그래프의 X 축)에 대한 log2(백만 당 전사물(TPM)) 값의 발현 수준. 녹다운에 대해 표적화된 표적 루시페라제 전사물은 빨간색 점으로 표시된다. n=3 생물학적 반복실험으로부터의 평균값이 나타난다. (B) 내인성 KRAS mRNA의 녹다운의 특이성. C2c2는 내인성 KRAS의 녹다운에 대한 RNAi보다 더 특이적이다. 표적 전사물은 빨간색 점으로 표시된다. (C) 내인성 PPIB mRNA의 녹다운의 특이성. C2c2는 내인성 PPIB의 녹다운에 대한 RNAi보다 더 특이적이다. 표적 전사물은 빨간색 점으로 표시된다.
도 29e 내지 29g. (E) 3 개의 상이한 유전자에서 LwaCas13a 녹다운을 shRNA 녹다운과 비교하는 6 개의 RNA-seq 라이브러리의 차등적 유전자 발현 분석(각각 3 회의 생물학적 반복실험으로). 유전자는 비-표적화 대조군과 비교하여 평균 배수 변화가 2 초과 또는 0.75 미만이고 거짓-발견률(FDR) 0.10 미만인 경우 유의미하게 차등적으로 발현된 것으로 고려한다. (F) RNA seq 라이브러리 유래 표적화된 유전자에 대한 평균 녹다운 수준 정량. (G) 왼쪽: 세포 성장을 측정하기 전에 항생제 선택 있거나 없이 72 시간 동안 LwaCas13a로 형질 감염시킨 세포에 대한 루시페라제 녹다운. 중간: 항생제 선택 있거나 없이 72 시간 동안 LwaCas13a로 형질감염된 세포의 세포 생존력. 오른쪽: 항생제 선택 있거나 없이 72 시간 동안 LwaCas13a로 형질감염된 세포의 GFP 형광. 모든 값은 n=3 인 평균±SEM이다.
도 30a 내지 30e. RNA 녹다운의 수준 및 특이성의 비교. C2c2는 RNAi와 유사한 수준의 녹다운을 유지하면서 증가된 특이성을 입증한다. (A): 분석된 각각의 RNA-seq 라이브러리에서 유의미하게 차등적으로 조절되는 유전자의 수. 3 개의 상이한 유전자에서 LwaCas13a 녹다운을 shRNA 녹다운과 비교하는 6 개의 RNA-seq 라이브러리의 차등적 유전자 발현 분석(각각 3 회의 생물학적 반복실험으로). 유전자는 비-표적화 대조군과 비교하여 평균 배수 변화가 2 초과 또는 0.75 미만이고 거짓-발견률(FDR) 0.10 미만인 경우 유의미하게 차등적으로 발현된 것으로 고려한다. (B) RNA seq 라이브러리 유래 표적화된 유전자에 대한 평균 녹다운 수준 정량. 정규화된 발현은 표적화 조건에서의 표적화된 유전자의 TPM을 비-표적화 조건에서의 표적화된 유전자의 TPM으로 나눈 값으로서 계산한다. 플롯은 도 28의 RNA-seq 플롯의 누적 데이터에 해당한다. 표적외는 유의미하게 조절되지 않은(2 배 초과) 또는 하향 조절된(0.75 배 미만) 유전자로서 결정된다. (C) 비-선택성 및 블라스트시딘-선택성 버전의 C2c2를 이용하여 72 시간 동안 LwaCas13a로 형질감염된 세포에 대한 루시페라제 녹다운. (D) 항생제 선택이 있거나 없이 72 시간 동안 LwaCas13a로 형질감염된 세포에 대한 세포 생존력. (E) 항생제 선택이 있거나 없이 72 시간 동안 LwaCas13a로 형질감염된 세포의 GFP 형광.
도 31. C2c2는 다중화된 녹다운이 가능하다. crRNA는 PPIB, CXCR4, KRAS, TINCR, 및 PCAT를 표적화 하도록 설계하였다. 상단 패널은 나타난 다중화된 crRNA 전사물과 왼쪽에서 오른쪽으로 동일한 순서이고 색상으로 구분된 mRNA의 정규화된 발현 수준을 나타낸다. 하단 패널은 단일로 주입된 가이드를 다중화되고 모아진 가이드와 비교한다.
도 32a 내지 32d. gLuc 또는 cLuc의 길이에 따른 가이드 타일링은 전사물 상의 재표적화 가능성 및 취약 영역을 입증한다. (A) LwaCas13a 어레이된 스크리닝의 개략도. (B) 전사물의 길이에 걸쳐 균등하게 타일링된 186 가이드를 이용하여 LwC2c2에 의한 가우시아 루시페라제 mRNA의 녹다운 효율. (C) 전사물의 길이에 걸쳐 균등하게 타일링된 가이드를 이용하여 LwC2c2에 의한 사이프리디나 루시페라제의 어레이된 녹다운 스크린. (D) shRNA 비교를 통한 어레이된 녹다운 스크린으로부터의 상위 3 개 crRNA의 검증.
도 33a 내지 33b. RNA 면역침강(RIP)은 표적 결합의 강화를 나타낸다. HA-태그를 포함하는 dC2c2-msfGFP는 단백질-RNA 복합체의 침강을 위해 제공된다. 결합된 RNA를 qPCR에 의해 정량화하고 입력 RNA(면역 침강이 없는 샘플) 및 음성 대조군 항체를 갖는 면역침강에 비교하여 강화를 결정하였다. 패널 A는 베타-액틴 RNA 표적의 강화를 나타낸다. 패널 B는 루시페라제 표적의 강화를 나타낸다.
도 34. 3T3L1 섬유아세포에서의 베타-액틴에 대한 C2c2 이미징. 표적화 조건(상단 프레임)에서 C2c2 복합체는 핵을 떠나는 액틴 mRNA와 결합하여, 세포질 베타-액틴 mRNA를 드러낸다. 비-표적화 조건에서, NLS-태그된 C2c2가 핵에서 관찰된다. 왼쪽 및 오른쪽 컬럼은 상이한 시각을 구성한다.
도 35. HEK293FT 세포에서의 베타-액틴에 대한 C2c2 이미징. 표적화 조건(상단 프레임)에서 C2c2 복합체는 핵을 떠나는 액틴 mRNA와 결합하여, 세포질 베타-액틴 mRNA를 드러낸다. 비-표적화 조건에서, NLS-태그된 C2c2가 핵에서 관찰된다. 왼쪽 및 오른쪽 컬럼은 상이한 시각을 구성한다.
도 36. Lw2Cas13a의 RNA 절단 동역학에 대한 시험관내 특징 확인. 하프-로그 단계로 연속 희석된 LwaCas13a-crRNA 복합체 복합체를 사용한 5' 말단-표지된 표적 1의 RNA-절단의 0.5 시간 후의 변성 겔.
도 37. Lw2Cas13a의 RNA 절단 동역학에 대한 시험관내 특징 확인. 5' 말단-표지된 표적 1을 사용한 LwaCas13a ssRNA 절단의 시계열의 변성 겔.
도 38. Lw2C2c2 및 crRNA는 RNA-가이드된 ssRNA 절단을 매개한다. 1 시간 인큐베이션 후 Lw2 C2c2에 의한 crRNA-매개 ssRNA 절단을 입증하는 변성 겔. ssRNA 표적은 IRDye 800으로 5' 표지된다. 절단은 crRNA의 존재를 필요로하고 EDTA의 첨가에 의해 파괴된다.
도 39a 내지 39b. Lw2C2c2및 crRNA는 RNA-가이드된 ssRNA 절단을 매개한다. (A) crRNA에 의해 표적화되는 ssRNA 기질의 개략도. 프로토스페이서 영역은 파란색으로 강조표시되고 PFS는 자홍색 막대로 표시된다. (B) 3 시간 인큐베이션 후 PFS에 대한 필요를 입증하는 변성 겔. PFS를 제외하고 동일한 4 개의 ssRNA 기질(개략도에서 자홍색 X로 표시)은 시험관내 절단 반응에 사용하였다. ssRNA 절단 활성은 표적 부위의 바로 3'에 있는 뉴클레오티드에 의존한다.
도 40. 직접 반복 길이는 Lw2C2c2의 RNA-가이드된 알엔아제 활성에 영향을 미친다. 3 시간의 인큐베이션 후 직접 반복 길이의 함수로서 ssRNA 1의 crRNA-가이드된 절단을 보여주는 변성 겔.
도 41. 스페이서 길이는 Lw2C2c2의 RNA-가이드된 알엔아제 활성에 영향을 미친다. 3 시간의 인큐베이션 후 스페이서 길이의 함수로서 ssRNA 1의 crRNA-가이드된 절단을 보여주는 변성 겔.
도 42a 내지 42c. Lw2C2c2 절단 부위는 표적 RNA의 2차 구조 및 서열에 의해 결정된다. (A) LwCas13a 및 crRNA1과의 인큐베이션 후 ssRNA 4 및 ssRNA 5를 나타내는 변성 겔. (B) ssRNA 4(파란색) 및 (C) ssRNA 5;(녹색)은 동일한 프로토스페이서를 갖지만 상이한 서열이 측면에 배치되어 있다. 동일한 프로토스페이서임에도 불구하고, 상이한 측면 배치 서열이 상이한 절단 패턴을 초래했다.
도 43a 내지 43c. (A) 4 개의 가능한 뉴클레오타이드 각각에 대해 강조 표시된 루프(빨간색)에서 호모폴리머 길이를 이용하여 변형된 ssRNA 4의 개략도. crRNA 스페이서 서열은 파란색으로 강조 표시된다. (B) 3 시간 인큐베이션 후 4 개의 가능한 호모폴리머 표적 각각에 대한 Lw2C2c2-crRNA-매개 절단을 나타내는 변성 겔. Lw2C2c2는 C 및 U를 절단한다. (C) LwaCas13a는 엘. 와데이 CRISPR-Cas 유전자좌로부터의 pre-crRNA를 처리할 수 있다.
도 44a 내지 44k. 촉매적으로 비활성인 LwaCas13a(dCas13a)는 포유류 세포에서 전사물에 결합할 수 있다. (A) dCas13a 결합의 이미징 및 평가에 사용된 dCas13a-GFP 작제물의 개략도. (B) dCas13a 결합의 정량화를 위한 RNA 면역 침강의 개략도. (C) dCas13a 표적화 gLuc 전사물은 비-표적화 대조군에 비해 유의미하게 강화된다. RIP에 의한 가우시안 루시페라제 mRNA에 대한 dC2c2-msfGFP 결합의 정량은 대조군 항체 또는 입력 용해물에 대하여 정규화하였다. 값을 비-표적화 가이드에 대하여 정규화하였다(n=3, t-검정에 의해, *, p<0.05; ****, p<0.0001). (D) 음성-피드백 이미징에 사용되는 dCas13a-GFP-KRAB 작제물의 개략도. 표적 및 가이드의 부재시, 리포터 단백질은 자체 전사를 저해한다. (E) Gluc, Cluc, PPIB, 및 KRAS 녹다운은 전사물의 예상되는 폴딩에 의해 측정된 표적 접근 가능성과 부분적으로 상관관계가 있다. (F) b-액틴 이미징를 위한 dCas13-GFP 및 dCas13a-GFP-KRAB 작제물의 국소화 간의 비교. (G) HEK293 세포에서 b-액틴을 표적화하는 다수 가이드를 이용한 dCas13a-GFP-KRAB 이미징의 대표적인 이미지. (H) ACTB를 표적화하는 다수 가이드를 이용한 dCas13a-GFP-KRAB 이미징의 대표적인 이미지. (I) 핵 대 전체-세포 신호의 비율로 측정된, dCas13a-GFP-KRAB의 세포질 전위의 정량. (J) 400 uM 소듐 아르세나이트로 처리된 293FT 세포의 대표적인 고정 면역 형광 이미지. 스트레스 과립은 마커 G3BP1에 대한 염색으로 표시된다. 축척 막대, 5 μm. 축척 막대, 5 μm. (K) G3BP1 및 dCas13a-GFP-KRAB 공동-국소화는 피어슨의 상관관계에 의해 세포당 정량화하였다. 모든 값은 n=3인 평균±SEM이다. **** p<0.0001; *** p<0.001; ** p<0.01; * p<0.05. ns=유의미하지 않음. 한쪽-꼬리 스튜던트 t-검정은 (a)에서의 비교를 위해 사용되었고, 양쪽-꼬리 스튜던트 t-검정은 (I) 및 (K)에서의 비교를 위해 사용되었다.
도 45. 도 43에 나타낸 바와 같이 C2c2-GFP 이미징 단백질을 사용하는 사용하여 β-액틴의 검출. 비-표적화 가이드(오른쪽 패널) 중 표적화 가이드(왼쪽 패널)와 함께 dC2c2-eGFP-ZF-KRAB-NLS를 사용하여 β-액틴을 이미징 하였다.
도 46. GFP-태그된 G3BP1을 이용한 스트레스 과립의 검출.
도 47. 스트레스 과립 및 스트레스 과립 하위구조("코어")에서의 작용 검출. 표적화 작제물이 있거나 없이 및 코어 하위구조를 안정화하기 위한 NaAsO2 처리가 있거나 없이, 액틴 mRNA는 C2c2-eGFP-ZF-KRAB을 이용하여 이미징하였다. 스트레스 과립은 항-G3BP1을 사용하여 표지하였다.
도 48a 내지 48f: dCas13a는 살아있는 세포에서 스트레스 과립 형성을 이미징할 수 있다. (A) 소듐 아르세나이트 처리 즉시 스트레스 과립으로의 β-액틴 mRNA의 국소화를 이미징하기 위해 음성-피드백 dCas13a-msfGFP-KRAB 작제물을 사용하는 것에 대한 개략도. (B) 400 uM 소듐 아르세나이트로 처리된 293FT 세포의 대표적인 고정된 면역 형광 이미지. β-액틴 mRNA 표적화 가이드와 함께 형질감염된 dCas13a-msfGFP-KRAB는 스트레스 과립으로 국소화한다. 스트레스 과립에 대한 G3BP1 마커에 대한 항체로 면역염색된 고정된 HEK293 세포의 대표적인 이미지가 나타난다. (C) 조건당 약 20 개의 세포에 대한 피어슨 상관관계 분석에 의한 스트레스 과립 국소화의 정량 (D): 조건당 약 20 개의 세포에 대한 만데르의 공동국소화 분석에 스트레스 과립 국소화의 정량 (E) 400 uM 소듐 아르세나이트로 처리에 대응한 스트레스 과립 형성에 대한 살아있는 세포 분석으로부터의 대표적인 이미지 (F) 소듐 아르세나이트로 처리에 대응한 스트레스 과립 형성의 정량.
도 49a 내지 49o LwaCas13a는 내인성 포유류 코딩 및 비-코딩 RNA 표적을 표적화하도록 재프로그래밍할 수 있다. (A) KRAS 전사물에 걸쳐 균등하게 타일링된 93 개의 가이드의 어레이된 녹다운 스크린. (B) PPIB 전사물에 걸쳐 균등하게 타일링된 93 개의 가이드의 어레이된 녹다운 스크린. (C) LwaCas13a 어레이된 스크리닝의 개략도. (D) Gluc전사물에 걸쳐 균등하게 타일링된 186 개의 가이드의 어레이된 녹다운 스크린. (E) 사이프리디니아 루시페라제(Cluc) 전사물에 걸쳐 균등하게 타일링된 93 개의 가이드의 어레이된 녹다운 스크린. (F) KRAS 전사물에 걸쳐 균등하게 타일링된 93 개의 가이드의 어레이된 녹다운 스크린. (G) PPIB 전사물에 걸쳐 균등하게 타일링된 93 개의 가이드의 어레이된 녹다운 스크린. (H) shRNA 비교를 통한 내인성 어레이된 녹다운 스크린으로부터의 상위 3 개 가이드의 검증. 모든 값은 n=3인 평균±SEM이다. ***p<0.001; **p<0.01. 양쪽-꼬리 스튜던트 T-검정을 비교를 위해 사용하였다. (I) MALAT1전사물에 걸쳐 균등하게 타일링된 93 개의 가이드의 어레이된 녹다운 스크린. (J) shRNA 비교를 통한 내인성 어레이된 MALAT1 녹다운 스크린으로부터의 상위 3 개 가이드의 검증. (K) 단일 프로모터의 발현 하에 5 개의 상이한 내인성 유전자에 대한 CRISPR 어레이의 5 개의 가이드를 다중화된 전달하는 것은 견고한 녹다운을 할 수 있다. (L) 3 개의 상이한 내인성 유전자에 대한 3 개의 가이드의 다중화된 전달 또는 각각의 가이드를 비-표적화 서열로 대체한 작제물을 갖는 것은 표적화된 유전자의 특이적인 녹다운을 나타낸다. 모든 값은 n=3인 평균±SEM이다. (M) LwaCas13a를 이용한 3 가지 상이한 내인성 전사물의 녹다운을 상응하는 RNAi 작제물에 대하여 비교. (N) LwaCas13a는 핵 lncRNA 전사물 MALAT1를 녹다운할 수 있다. (O) 3 개의 상이한 내인성 유전자에 대한 3 개의 가이드의 다중화된 전달 또는 각각의 crRNA를 비-표적화 서열로 대체한 작제물을 갖는 것은 표적화된 유전자의 특이적인 녹다운을 나타낸다.
도 50. 21 C2c2 오솔로그 유래의 HEPN서열 모티프.
도 51. 33 C2c2 오솔로그 유래의 HEPN서열 모티프.
도 52. 이펙터 도메인의 연결을 위한 예시적인 위치. 이종 기능성 도메인 (묘사된 mCherry 및 msfGFP)에 대해 C 또는 N 말단에 연결된 C2c2 단백질은 루시페라제 녹다운에 의해 표시되는 바와 같이 기능을 보유한다.
도 53a 내지 53l. (A 내지 K) C2c2 오솔로그의 서열 정렬. (L) HEPN 도메인의 서열 정렬.
도 54. C2c2 오솔로그의 트리 정렬.
도 55a 내지 55b. C2c2 및 Cas13b 오솔로그의 트리 정렬.
도 56a 내지 56f: 포유류 녹다운을 위한 LwaCas13a의 설계 제작 및 최적화. (A) Gluc crRNA 1 및 다양한 양의 형질감염된 LwaCas13a 플라스미드를 이용한 Gluc 전사물의 녹다운. (B) LwaCas13a 및 다양한 양의 형질감염된 Gluc crRNA 1 및 2 플라스미드에 의한 Gluc 전사물의 녹다운. (C) U6 또는 tRNAVal 프로모터로부터 발현된 crRNA를 사용한 Gluc 전사물의 녹다운. (D) U6 또는 tRNAVal 프로모터로부터 발현된 crRNA를 이용한 KRAS 전사물의 녹다운. (E) U6 또는 tRNAVal 프로모터로부터 발현된 가이드를 이용한 KRAS 전사물의 녹다운. (F) XIST 전사물에 걸쳐 균등하게 타일링된 93 개의 가이드의 어레이된 녹다운 스크린.
도 57a 내지 57e: LwaCas13a의 PFS 선호 평가 및 LshCas13a와의 비교. (A) 이 연구에서 평가된 15 개의 Cas13a 오솔로그의 서열 비교 트리. (B) 다양한 손실 임계값에 대하여 손실 임계값 초과하는 LshCas13a 및 LwaCas13a PFS 서열의 수. (C) 표적화 샘플에서, 비-표적화 샘플에 대하여 정규화된, LshCas13a 및 LwaCas13a에 대한 PFS 강화의 분포. (D) 다양한 강화 컷오프 임계값에서 LshCas13a 절단 후 남은 PFS 서열에 대한 서열 로고 및 수. (E) 다양한 강화 컷오프 임계값에서 LshCas13a 절단 후 남은 PFS 서열에 대한 서열 로고 및 수.
도 58a 내지 58d: LwaCas13a 표적화 효율은 전사물에 대한 접근 가능성의 영향을 받는다. (A) 첫 번째 행: 상위 녹다운 가이드는 표적 전사물을 따라 위치에 의해 플롯팅된다. 가이드의 상위 20%는 Gluc 용으로 선택되고 상위 30%의 가이드는Cluc, KRAS 및 PPIB용이다. 두 번째 행: 무작위 귀무-분포(빨간색)와 비교하여 각각의 전사물에 대해 인접한 상위 가이드 사이의 쌍-거리(파란색)에 대한 히스토그램이다. 삽입 그래프는 이들 히스토그램에 대한 누적 빈도 곡선을 나타낸다. 빨간색 곡선(거리의 귀무 부포)의 왼쪽으로의 파란색 곡선(실제 측정된 거리)의 이동은 가이드들이 우연에 의해 예상되는 것보다 서로 근접함을 나타낸다. (B) Gluc, Cluc, PPIB, 및 KRAS 녹다운은 전사물의 예상되는 폴딩에 의해 측정되는 표적 접근 가능성과 부분적으로 상관관계가 있다. (C) 표적 접근 가능성(염기쌍 형성 영역의 확률) 및 LwaCas13a에 의한 녹다운 후의 표적 발현 사이의 상관 관계를 묘사하는 커널 밀도 추정 플롯. (D) 첫 번째 행: 상이한 윈도우 크기(W)에서 및 상이한 k-mer 길이에 대해 측정된 표적 발현과 표적 접근 가능성(염기쌍 형성 영역의 확률) 사이의 상관관계. 두 번째 행: 상이한 윈도우 크기(W)에서 및 상이한 k-mer 길이에 대해 측정된 표적 발현과 표적 접근 가능성(염기쌍 형성 영역의 확률) 사이의 상관관계에 대한 P 값. 색상 기준은 p 값 > 0.05는 빨간색 음영이고 p 값 < 0.05는 파란색 음영이 되도록 설계하였다.
도 59a 내지 59k: 다양한 스페이서 길이에서 crRNA:표적 듀플렉스에서의 미스매치에 대한 LwaCas13a 민감성의 상세 평가. (A) 스페이서 서열에 걸쳐 다양한 위치에서 단일 미스매치를 함유하는 crRNA로 평가된 KRAS의 녹다운. (B) 스페이서 서열에 걸쳐 다양한 위치에서 단일 미스매치를 함유하는 crRNA로 평가된 PPIB의 녹다운 (C) 스페이서 서열에 걸쳐 다양한 위치에서 비-연속 2 개의 미스매치를 함유하는 가이드로 평가된 Gluc의 녹다운. 야생형 서열은 아래에 나타난 미스매치 동일성과 함께 상단에 나타난다. (D) 다양한 스페이서 길이에 대한 ssRNA 1 및 2 상의 부수적 절단 활성(n=4 기술적 반복실험, 막대는 평균±s.e.m.에 해당한다). (E) (D)에서 시험한 crRNA의 특이성 비율. 특이성 비율은 표적외 RNA(ssRNA 2)의 부수적 절단에 대한 표적내 RNA(ssRNA 1)의 부수적 절단의 비율로 계산된다(n=4 기술적 반복실험, 막대는 평균±s.e.m.에 해당한다). (F) 스페이서를 따라 타일링된 합성 미스매치를 갖는 28 nt 스페이서 crRNA에 대한 ssRNA 1 및 2 상의 부수적 절단 활성 (n=4 기술적 반복실험, 막대는 평균±s.e.m.에 해당한다). (G) (F)에서 시험된 crRNA의 특이성 비율. 특이성 비율은 표적외 RNA(ssRNA 2)의 부수적 절단에 대한 표적내 RNA(ssRNA 1)의 부수적 절단의 비율로 계산된다(n=4 기술적 반복실험, 막대는 평균±s.e.m.에 해당한다). (H) 스페이서를 따라 타일링된 합성 미스매치를 갖는 23 nt 스페이서 crRNA에 대한 ssRNA 1 및 2 상의 부수적 절단 활성 (n=4 기술적 반복실험, 막대는 평균±s.e.m.에 해당한다). (I) (H) 에서 시험된 crRNA의 특이성 비율. 특이성 비율은 표적외 RNA(ssRNA 2)의 부수적 절단에 대한 표적내 RNA(ssRNA 1)의 부수적 절단의 비율로 계산된다(n=4 기술적 반복실험, 막대는 평균±s.e.m.에 해당한다). (J) 스페이서를 따라 타일링된 합성 미스매치를 갖는 20 nt 스페이서 crRNA에 대한 ssRNA 1 및 2 상의 부수적 절단 활성 (n=4 기술적 반복실험, 막대는 평균±s.e.m.에 해당한다). (K) (J)에서 시험된 crRNA의 특이성 비율. 특이성 비율은 표적외 RNA(ssRNA 2)의 부수적 절단에 대한 표적내 RNA(ssRNA 1)의 부수적 절단의 비율로 계산된다(n=4 기술적 반복실험, 막대는 평균±s.e.m.에 해당한다).
도 60a 내지 60f: LwaCas13a는 내인성 표적 상의 shRNA 녹다운보다 더 특이적이고 생물학적 잡음에 비교할 만한 변동이 거의 없다. (A) 왼쪽: KRAS-표적화 shRNA(y-축)에 대비한 비-표적화 shRNA-형질감염된 대조군의 RNA-seq 라이브러리에서 검출된 모든 유전자의 log2(백만 당 전사물 (TPM)) 값으로의 발현 수준(x-축). 3 회 생물학적 반복실험의 평균값이 나타난다. KRAS 전사물 데이터 포인트는 빨간색으로 채색된다. 오른쪽: KRAS-표적화 LwaCas13a-crRNA(y-축)에 대비한 비-표적화 LwaCas13a-crRNA-형질감염된 대조군의 RNA-seq 라이브러리에서 검출된 모든 유전자의 log2(백만 당 전사물 (TPM)) 값으로의 발현 수준(x-축). 3 회 생물학적 반복실험의 평균값이 나타난다. KRAS 전사물 데이터 포인트는 빨간색으로 채색된다. (B) 왼쪽: PPIB-표적화 shRNA(y-축)에 대비한 비-표적화 shRNA-형질감염된 대조군의 RNA-seq 라이브러리에서 검출된 모든 유전자의 log2(백만 당 전사물 (TPM)) 값으로의 발현 수준(x-축). 3 회 생물학적 반복실험의 평균값이 나타난다. PPIB 전사물 데이터 포인트는 빨간색으로 채색된다. 오른쪽: PPIB-표적화 LwaCas13a-crRNA(y-축)에 대비한 비-표적화 LwaCas13a-crRNA-형질감염된 대조군의 RNA-seq 라이브러리에서 검출된 모든 유전자의 log2(백만 당 전사물 (TPM)) 값으로의 발현 수준(x-축). 3 회 생물학적 반복실험의 평균값이 나타난다. PPIB 전사물 데이터 포인트는 빨간색으로 채색된다. (C) 비-표적화 shRNA 조건(첫 번째 행) 및 Gluc-표적화 shRNA 조건(두 번째 행)의 개별 반복실험의 비교. (D) 비-표적화 crRNA 조건(첫 번째 행) 및 Gluc-표적화 crRNA 조건(두 번째 행)의 개별 반복실험의 비교. (E) Gluc-표적화 shRNA 조건에 대한 비-표적화 shRNA 조건의 개별 반복실험의 쌍별 비교. (F) Gluc-표적화 crRNA 조건에 대한 비-표적화 crRNA 조건의 개별 반복실험의 쌍별 비교.
도 61a 내지 61c: 모든 샘플에 걸친 LwaCas13a 및 RNAi 녹다운 가변성(표준 편차)에 대한 상세 분석. (A) 루시페라제 리포터 또는 내인성 유전자를 표적화하는 shRNA 또는 crRNA에 대해 표적화 및 비-표적화 반복실험 사이에서의 RNA-seq 라이브러리에서 검출된 모든 유전자의 log2(백만 당 전사물 (TPM+1)) 값에 대한 상관 관계(켄달의 타우) 히트 맵. (B) 모든 반복실험 및 변동 사이에서의 RNA-seq 라이브러리에서 검출된 모든 유전자의 log2(백만 당 전사물 (TPM+1)) 값에 대한 상관 관계(켄달의 타우) 히트 맵. (C) shRNA 또는 crRNA의 경우 표적화된 각각의 유전자에 대한 표적화 및 비-표적화 반복실험 사이에서의 RNA-seq 라이브러리에서 검출된 모든 유전자의 log2(백만 당 전사물 (TPM+1)) 값에 대한 표준 편차 분포.
도 62a 내지 62j: LwaCas13a 녹다운은 측정된 표적외 전사물 상에 아무 활성을 갖지 않고 표적화된 전사물에 특이적이다. (A) Gluc을 타일링한 처음 96 개의 스페이서에 대한 절대 Gluc 신호 히트 맵. (B) Cluc을 타일링한 처음 96 개의 스페이서에 대한 절대 Cluc 신호 히트 맵. (C) 절대 Gluc 신호 및 Gluc 타일링 가이드에 대해 정규화된 루시페라제 사이의 관계. (D) 절대 Cluc 신호 및 Gluc 타일링 가이드에 대해 정규화된 루시페라제 사이의 관계. (E) 절대 Cluc 신호 및 Cluc 타일링 가이드에 대해 정규화된 루시페라제 사이의 관계. (F) 절대 Gluc 신호 및 Cluc 타일링 가이드에 대해 정규화된 루시페라제 사이의 관계. (G) PPIB 2-Ct 수준 및 PPIB 타일링 가이드에 대한 PPIB 녹다운 사이의 관계. (H) GAPDH 2-Ct 수준 및 PPIB 타일링 가이드에 대한 PPIB 녹다운 사이의 관계. (I) KRAS 2-Ct 수준 및 PPIB KRAS 가이드에 대한 KRAS 녹다운 사이의 관계. (J) GAPDH 2-Ct 수준 및 PPIB KRAS 가이드에 대한 KRAS 녹다운 사이의 관계.
도 63a 내지 63f: dCas13a는 리포터 유전자 발현을 억제하고 내인성 유전자와 결합한다. (A) Cluc및 Gluc를 분리하는 합성 HBG1 인트론을 통해 타일링된 dCas13a는 번역 개시 부위로부터 특정 거리에서 Gluc 번역을 억제할 수 있다. (B) dCas13a 및 2 개의 표적화 crRNA 및 1 개의 비-표적화 crRNA로 표적화된 β-액틴 mRNA의 RNA 면역 침강 강화. (C) ACTB를 이미징하기 위한 dCas13-GFP 및 dCas13a-GFP-KRAB 작제물의 국소화 사이의 비교. (D) 비-표적화 가이드와 함께 전달되는 dCas13a-NLS-msfGFP 음성-피드백 작제물에 대한 추가적인 시야. (E) ACTB 가이드와 함께 전달되는 dCas13a-NLS-msfGFP 음성-피드백 작제물에 대한 추가적인 시야. (F) ACTB 가이드와 함께 전달되는 dCas13a-NLS-msfGFP 음성-피드백 작제물에 대한 추가적인 시야.
도 64a 내지 64b dCas13a-NF는 살아있는 세포에서 스트레스 과립 형성을 이미징할 수 있다. (A) 상응하는 ACTB-표적화 및 비-표적화 가이드를 갖는 dCas13a-NF-발현 세포에서의 ACTB 전사물의 RNA FISH로부터의 대표적인 이미지. 세포 외곽선은 파선으로 나타난다. (B) 만데르의 중첩 계수(왼쪽) 및 피어슨 상관관계(오른쪽)에 의해 정량화된 ACTB RNA FISH 신호 및 dCas13a-NF 사이의 전체 신호 중첩. 상관 관계 및 신호 중첩은 세포당 기반으로 픽셀 단위로 계산된다. 모든 값은 n=3 인 평균±SEM이다. ****p < 0.0001; ***p < 0.001; **p < 0.01. 양쪽-꼬리 스튜던트 T-검정을 비교에 사용하였다.
도 65a 내지 65c. 발현에 대한 직접 및 부수적 전사물 녹다운. (A) 활성 대 데드 Cas13a에 의한 루시페라제의 녹다운. (B) 내인성 유전자 발현에 대한 활성 대 데드 Cas13a 녹다운. 데드 Cas13a에 의한 녹다운은 번역 차단으로 인하거나 결합으로 인한 전사물의 불안정화로 인할 수 있다. (C) 포유류 세포에서 데드 Cas13a에 의한 부수적 활성의 부재. (A)에서 루시페라제에 대해 데드 Cas13a 및 가이드 1 및 2를 사용하여, 비-표적화 대조군에 비해 전사물 분포 크기에서의 변화는 관찰되지 않는다.
도 66a 내지 66o. 도 53의 상이한 C2C2 오솔로그 서열들의 표시된 컨센서스 서열과의 정렬.
도 67a 내지 67c. 렙토트리키아 와데이 F0279 C2c2("Lew2C2c2") 및 리스테리아 뉴요켄시스 FSL M6-0635 C2c2("LibC2c2")의 정렬.
도 68. 알엔아제 활성을 나타내는 C2c2 HEPN 도메인의 정렬. 상단 정렬 블록은 이전에 기재된 선택된 HEPN 도메인을 포함하고 하단 블록은 C2c2 이펙터 단백질 유래의 촉매 모티프를 포함한다. 각각의 도메인 구조 밑에는 각 단백질 패밀리의 선택된 대표에서 보존된 모티프의 정렬. 촉매성 잔기는 검정색 배경 상의 흰색 글자로 나타나고; 보존된 소수성 잔기는 노란색으로 강조 표시되고; 보존된 작은 잔기는 녹색으로 강조 표시되고; 가교 나선 정렬에서, 양으로 하전된 잔기는 빨간색이다. 2 차 구조 예측은 정렬된 서열의 밑에 나타난다: H는 α-나선을 의미하며 E는 펼쳐진 형태(β-가닥)를 의미한다. 정렬 블록 사이의 불량하게 보존된 스페이서는 숫자로 나타난다.
본 명세서의 도면은 단지 예시적인 목적을 위한 것이며, 반드시 일정한 비율로 그려진 것은 아니다.
일반적으로, WO 2014/093622(PCT/US2013/074667)와 같은 전술한 문헌에서 사용된 CRISPR-Cas 또는 CRISPR 시스템은 전사물 및, Cas유전자를 인코딩하는 서열, tracr(트랜스-활성화 CRISPR) 서열(예를 들어, tracrRNA 또는 활성 부분 tracrRNA), tracr-메이트 서열(내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서 "직접 반복" 및 tracrRNA-처리된 부분 직접 반복을 포괄하는), 가이드 서열(내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서 "스페이서"로도 지칭되는), 또는 본 명세서에서 사용되는 그 용어와 같은 "RNA"(예를 들어, Cas9와 같은 Cas를 가이드하기 위한 RNA(들), 예를 들어 CRISPR RNA 및 트랜스활성화(tracr) RNA 또는 단일 가이드 RNA(sgRNA)(키메라 RNA)) 또는 CRISPR 유전자좌로부터의 다른 서열 및 전사물을 포함하는, CRISPR-관련("Cas") 유전자의 발현 또는 활성을 지시하는 것에 관여하는 다른 요소를 집합적으로 지칭한다. 일반적으로, CRISPR 시스템은 표적 서열의 부위에서 CRISPR 복합체의 형성을 촉진시키는 요소(내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서 프로토스페이서라고도 지칭됨)를 특징으로 한다. CRISPR 단백질이 C2c2 단백질일 때, tracrRNA는 필요하지 않다.
CRISPR 복합체의 형성 맥락에서, "표적 서열"은 표적 서열과 가이드 서열 사이의 혼성화가 CRISPR 복합체의 형성을 촉진하는, 가이드 서열이 그에 대하여 상보성을 갖도록 설계된 서열을 지칭한다. 표적 서열은 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 세포의 핵 또는 세포질에 위치한다. 일부 구현예에서, 직접 반복은 다음 기준 중 임의의 것 또는 전부를 충족시키는 반복 모티프를 검색함으로써 인실리코로 동정될 수 있다: 1. 제II형 CRISPR 유전자좌 측면에 배치된 게놈 서열의 2 Kb 윈도우에서 발견됨; 2. 20 내지 50 bp에 걸침; 및 3. 20 내지 50 bp 만큼의 간격을 둠. 일부 구현예에서, 이들 기준 중 2 개, 예를 들어 1 및 2, 2 및 3, 또는 1 및 3이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 3 개 기준 모두가 사용될 수 있다.
일반적으로, 가이드 서열은 표적 서열과 혼성화하고 표적 서열에 CRISPR 복합체의 서열-특이적 결합을 지시하기 위해 표적 폴리뉴클레오티드 서열과 충분한 상보성을 갖는 임의의 폴리뉴클레오티드 서열이다. 용어 "표적화 서열"은 표적 서열과 충분한 상보성을 갖는 가이드 서열의 부분을 의미한다. 일부 구현예에서, 적합한 정렬 알고리즘을 사용하여 최적으로 정렬된 경우, 가이드 서열과 그의 상응하는 표적 서열 사이의 상보성 정도는 약 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99%, 또는 그 이상이거나 그보다 크다. 서열을 정렬하기 위한 임의의 적합한 알고리즘으 사용으로 최적 정렬을 결정할 수 있으며, 이의 비-제한적인 예로는 스미스-워터만(Smith-Waterman) 알고리즘, 니들만-분쉬(Needleman-Wunsch) 알고리즘, 버로우즈-휠러(Burrows-Wheeler) 변환 기반 알고리즘(예를 들어, Burrows Wheeler Aligner), ClustalW, Clustal X, BLAT, Novoalign(Novocraft Technologies, www.novocraft.com에서 이용 가능), ELAND(Illumina, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재), SOAP(soap.genomics.org.cn에서 이용 가능), 및 Maq(maq.sourceforge.net에서 이용 가능)이 포함된다. 일부 구현예에서, 가이드 서열은 약 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 또는 그 이상의 뉴클레오티드 길이이거나 그보다 크다. 일부 구현예에서, 가이드 서열은 약 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12, 또는 그 이하의 뉴클레오티드 길이보다 작다. 바람직하게, 가이드 서열은 10 30 뉴클레오티드 길이이다. CRISPR 복합체의 표적 서열에 대한 서열-특이적 결합을 지시하는 가이드 서열의 능력은 임의의 적합한 분석에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 시험될 가이드 서열을 포함하여, CRISPR 복합체를 형성하기에 충분한 CRISPR 시스템의 성분은, 예를 들어 CRISPR 서열의 성분을 인코딩하는 벡터로 형질감염시킴으로써, 상응하는 표적 서열을 갖는 숙주 세포에 제공될 수 있고, 이어서, 예를 들어 본 명세서에 기재된 Surveyor 분석에 의해, 표적 서열 내에서의 선택적인 절단을 평가할 수 있다. 유사하게, 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 절단은 표적 서열, 시험될 가이드 서열 및 시험 가이드 서열과 상이한 대조군 가이드 서열을 포함하는, CRISPR 복합체의 성분을 제공하고, 시험 및 대조군 가이드 서열 반응 사이의 표적 서열에서의 결합 또는 절단 속도를 비교함으로써 시험과에서 평가될 수 있다. 다른 분석이 가능하며 당업자에게 떠오를 것이다.
대표적인 CRISPR-Cas 시스템에서, 가이드 서열과 그의 상응하는 표적 서열 사이의 상보성 정도는 약 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99%, 또는 100%이거나 그보다 클 수 있고; 가이드 또는 RNA 또는 sgRNA는 약 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 또는 그 이상의 뉴클레오티드 길이이거나 그보다 클 수 있거나; 가이드 또는 RNA 또는 sgRNA는 약 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12, 또는 그 이하의 뉴클레오티드 길이보다 작을 수 있다. 그러나, 본 발명의 일 양태는 표적외 상호 작용을 감소시키는 것, 예를 들어, 낮은 상보성을 갖는 표적 서열과 상호 작용하는 가이드를 감소시키는 것이다. 실제로, 실시예에서, 본 발명은 CRISPR-Cas 시스템이 80% 초과 내지 약 95%의 상보성, 예를 들어, 83% 내지 84% 또는 88 내지 89% 또는 94 내지 95% 상보성을 갖는 표적과 표적외 서열 사이를 구별(예를 들어, 1, 2 또는 3 미스매치를 갖는 18 개 뉴클레오티드의 표적외로부터 18 개 뉴클레오티드를 갖는 표적 간의 구별)할 수 있도록 하는 돌연변이를 포함하는 것으로 나타난다. 따라서, 본 발명의 맥락에서, 가이드 서열과 그의 상응하는 표적 서열 사이의 상보성 정도는 94.5% 또는 95% 또는 95.5% 또는 96% 또는 96.5% 또는 97% 또는 97.5% 또는 98% 또는 98.5% 또는 99% 또는 99.5% 또는 99.9% 또는 100% 보다 크다. 표적외는 서열과 가이드 사이에 100% 또는 99.9% 또는 99.5% 또는 99% 또는 99% 또는 98.5% 또는 98% 또는 97.5% 또는 97% 또는 96.5% 또는 96% 또는 95.5% 또는 95% 또는 94.5% 또는 94% 또는 93% 또는 92% 또는 91% 또는 90% 또는 89% 또는 88% 또는 87% 또는 86% 또는 85% 또는 84% 또는 83% 또는 82% 또는 81% 또는 80% 상보성보다 적고, 표적외가 서열과 가이드 사이에 100% 또는 99.9% 또는 99.5% 또는 99% 또는 99% 또는 98.5% 또는 98% 또는 97.5% 또는 97% 또는 96.5% 또는 96% 또는 95.5% 또는 95% 또는 94.5% 상보성인 것이 유리하다.
특정 구현예에서, 절단 효율의 조절은 미스매치, 예를 들어 스페이서/표적을 따라 미스매치의 위치를 포함하여, 스페이서 서열과 표적 서열 사이의 1 또는 2 개의 미스매치와 같은, 1 개 이상의 미스매치의 도입에 의해 개발될 수 있다. 예를 들어 2 개의 미스매치가 더 중심에 있을수록(즉, 3' 또는 5'이 아님), 절단 효율이 더 많이 영향을 받는다. 따라서, 스페이서를 따라 미스매치 위치를 선택함으로써, 절단 효율이 조절될 수 있다. 예로서, 표적의 100% 미만의 절단을 원하는 경우(예를 들어, 세포 집단에서), 스페이스와 표적 서열 사이의 1 개 이상, 예를 들어 바람직하게는 2 개의 미스매치가 스페이서 서열에 도입될 수 있다. 미스매치 위치가 스페이서를 따라 더 중심에 있을수록 절단 백분율은 더 낮아진다.
본 명세서에 기재된 본 발명에 따른 방법은 본 명세서에서 논의된 벡터를 세포에 전달하는 것을 포함하여 본 명세서에서 논의된 진핵 세포(시험관내, 즉 단리된 진핵 세포)에서 하나 이상의 뉴클레오티드 변형을 유도하는 것을 이해한다. 돌연변이(들)는 가이드(들) RNA(들) 또는 sgRNA(들)를 통해 세포(들)의 각각의 표적 서열에의 하나 이상의 뉴클레오티드의 도입, 결실 또는 치환을 포함할 수 있다. 돌연변이는 가이드(들) RNA(들)를 통해 상기 세포(들)의 각각의 표적 서열에의 1 내지 75 개 뉴클레오티드의 도입, 결실 또는 치환을 포함할 수 있다. 돌연변이는 가이드(들) RNA(들)를 통해 상기 세포(들)의 각각의 표적 서열에의 1, 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 또는 75 개의 뉴클레오티드의 도입, 결실 또는 치환을 포함할 수 있다. 돌연변이는 가이드(들) RNA(들)를 통해 상기 세포(들)의 각각의 표적 서열에의 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 또는 75 개의 뉴클레오티드의 도입, 결실 또는 치환을 포함할 수 있다. 돌연변이는 가이드(들) RNA(들)를 통해 상기 세포(들)의 각각의 표적 서열에의 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 또는 75 개의 뉴클레오티드의 도입, 결실 또는 치환을 포함할 수 있다. 돌연변이는 가이드(들) RNA(들)를 통해 상기 세포(들)의 각각의 표적 서열에의 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 또는 75 개의 뉴클레오티드의 도입, 결실 또는 치환을 포함할 수 있다. 돌연변이는 가이드(들) RNA(들)를 통해 상기 세포(들)의 각각의 표적 서열에의 40, 45, 50, 75, 100, 200, 300, 400 또는 500 개의 뉴클레오티드의 도입, 결실 또는 치환을 포함할 수 있다.
독성 및 표적외 효과의 최소화를 위해, Cas mRNA 또는 단백질 및 전달되는 가이드 RNA의 농도를 제어하는 것이 중요할 것이다. Cas mRNA 또는 단백질 및 가이드 RNA의 최적 농도는 세포 또는 비-인간 진핵생물 동물 모델에서 상이한 농도를 시험하고 잠재적인 표적외 게놈 유전자좌에서 변형 정도를 분석하는 딥 시퀀싱을 사용함으로써 결정할 수 있다.
전형적으로, 내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서, CRISPR 복합체(표적 서열에 혼성화되고 하나 이상의 Cas 단백질과 복합체를 이루는 가이드 서열을 포함)의 형성은 표적 서열에서 또는 근처(예를 들어. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50, 또는 그 이상의 염기쌍 내에)에서 절단을 초래하나, 예를 들어, 구체적으로 RNA 표적의 경우에는 2 차 구조에 의존할 수 있다.
Cas를 인코딩하는 핵산 분자는 유리하게는 코돈 최적화된 Cas이다. 코돈 최적화 서열의 예는, 이 경우에는, 본 명세서에서 논의된 진핵 생물, 예를 들어 인간(즉, 인간에서의 발현을 위해 최적화된), 또는 또 다른 진핵 생물, 동물 또는 포유류에서의 발현을 위해 최적화된 서열이다; 예를 들어 WO2014/093622(PCT/US2013/074667)에서의 SaCas9 인간 코돈 최적화된 서열 참고. 이것이 선호되는 반면, 다른 예가 가능하고 인간 이외의 숙주 종에 대한 코돈 최적화, 또는 특정 기관에 대한 코돈 최적화가 알려져 있음을 이해할 것이다. 일부 구현예에서, Cas를 인코딩하는 효소 코딩 서열은 구체적인 세포, 예를 들어 진핵 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다. 진핵 세포는, 인간을 포함하나 이에 한정되지 않는 포유동물, 또는 본 명세서에서 논의된 비-인간 진핵 생물 또는 동물 또는 포유동물, 예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 개, 가축, 또는 비-인간 포유동물 또는 영장류와 같은 구체적인 생물의 것 또는 그로부터 유래한 것일 수 있다. 일부 구현예에서, 인간 또는 동물에게 임의의 실질적인 의학적 이익없이 고통을 초래할 가능성이 있는, 인간의 생식세포 유전적 동일성을 변형하기 위한 공정 및/또는 동물의 유전적 동일성을 변형하기 위한 공정, 및 이러한 공정으로부터 생기는 동물은 또한 제외될 수 있다. 일반적으로, 코돈 최적화는 천연 서열의 적어도 하나의 코돈(예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50 개, 또는 그 이상의 코돈이거나 그보다 많은)을 천연 아미노산 서열을 유지하면서 그 숙주 세포의 유전자에서 더 빈번하게 또는 가장 빈번하게 사용되는 코돈으로 대체함으로써 관심 있는 숙주 세포에서의 향상된 발현을 위해 핵산 서열을 변형시키는 공정을 지칭한다. 다양한 종은 구체적인 아미노산의 특정 코돈에 대해 구체적인 편향을 나타낸다. 코돈 편향(생물 간의 코돈 사용에 있어서의 차이)은 종종 메신저 RNA(mRNA)의 번역 효율과 상관관계가 있고, 이는 결국, 다른 것들 중에서, 번역될 코돈의 특성 및 구체적인 트랜스퍼 RNA(tRNA) 분자의 이용 가능성에 의존하는 것으로 여겨진다. 세포에서 선택된 tRNA의 우세는 일반적으로 펩티드 합성에서 가장 빈번하게 사용되는 코돈의 반영이다. 따라서, 유전자는 코돈 최적화에 기초하여 주어진 생물에서 최적의 유전자 발현을 위해 맞춤화될 수 있다. 코돈 사용 표는 예를 들어 www.kazusa.orjp/codon/에서 이용 가능한 "코돈 사용 데이터베이스(Codon Usage Database)"에서 쉽게 이용할 수 있으며 이들 표는 많은 방식으로 각색될 수 있다. 문헌[Nakamura, Y., et al. "Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000" Nucl. Acids Res. 28:292 (2000)] 참고. 구체적인 숙주 세포에서의 발현을 위해 구체적인 서열을 코돈 최적화하는 컴퓨터 알고리즘 또한 이용 가능하고, 예를 들어 Gene Forge(Aptagen, Jacobus, PA) 또한 이용 가능하다. 일부 구현예에서, Cas를 인코딩하는 서열 중 하나 이상의 코돈(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 또는 그 이상의, 또는 모든 코돈)은 구체적인 아미노산에 대하여 가장 빈번하게 사용되는 코돈에 해당한다.
특정 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법은, 하나 이상의 가이드 RNA를 인코딩하는 하나 이상의 핵산이 제공되거나 하나의 관심 유전자의 프로모터를 포함하는 조절 요소와 작동 가능하게 연결되어 세포 내에 도입된 Cas 유전자 도입 세포를 제공하는 것을 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용된 용어 "Cas 유전자 도입 세포"는 Cas 유전자가 게놈으로 통합된, 진핵 세포와 같은, 세포를 지칭한다. 세포의 본성, 유형, 또는 기원은 본 발명에 따라 구체적으로 한정되지 않는다. 또한 Cas 전이 유전자가 세포 내에 도입되는 방식은 다양할 수 있으며 당 업계에 공지된 임의의 방법일 수 있다. 특정 구현예에서, Cas 유전자 도입 세포는 단리된 세포에 Cas 전이 유전자를 도입함으로써 수득된다. 특정 다른 구현예에서, Cas 유전자 도입 세포는 Cas 유전자 도입 생물로부터 세포를 단리함으로써 수득된다. 예로서, 제한 없이, 본 명세서에서 지칭된 Cas 유전자 도입 세포는 Cas 녹-인 진핵 생물과 같은 Cas 유전자 도입 진핵 생물로부터 유래될 수 있다. 본 명세서에 참조로서 포함된 WO2014/093622(PCT/US13/74667)를 참조한다. Rosa 유전자좌를 표적화하는 것에 대한, Sangamo BioSciences, Inc.에 양도된 미국 특허 공보 제20120017290호 및 제20110265198호의 방법은 본 발명의 CRISPR Cas 시스템을 이용하도록 변형될 수 있다. Rosa 유전자좌를 표적화하는 것에 대한, Cellectis에 양도된 미국 특허 공보 제20130236946호의 방법도 본 발명의 CRISPR Cas 시스템을 이용하도록 변형될 수 있다. 추가의 예로서, 본 명세서에 참조로서 포함된, Cas9 녹-인 마우스를 기술하는, 문헌[Platt et. al. (Cell; 159(2):440-455 (2014))]을 참조한다. Cas 전이 유전자는 Lox-정지-폴리A-Lox(LSL) 카세트를 추가로 포함할 수 있어, Cre 재조합 효소에 의해 Cas 발현이 유도되도록 할 수 있다. 대안적으로, Cas 유전자 도입 세포는 단리된 세포에 Cas 전이 유전자를 도입함으로써 수득될 수 있다. 전이 유전자 전달 시스템은 당업계에 잘 알려져 있다. 예로서, Cas 전이 유전자는 본 명세서의 다른 곳에서도 기재된 바와 같이 벡터(예를 들어, AAV, 아데노바이러스, 렌티바이러스) 및/또는 입자 및/또는 나노입자 전달에 의해 예를 들어 진핵 세포에 전달될 수 있다.
당업자는 본 명세서에서 지칭된 Cas 유전자 도입 세포와 같은 세포가, 예를 들어, 제한 없이 문헌[Platt et al. (2014), Chen et al., (2014) or Kumar et al.. (2009)]에 기재된 바와 같이, 통합된 Cas 유전자 또는, 예를 들어 하나 이상의 발암성 돌연변이와 같은, Cas를 표적 유전자좌로 가이드할 수 있는 RNA와 복합체 형성시 Cas의 서열 특이적 작용으로부터 발생하는 돌연변이를 갖는 것 외에 추가적인 게놈 변경을 포함할 수 있음을 이해할 것이다.
일부 구현예에서, Cas 서열은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 그 이상, 또는 그 보다 많은 NLS 또는 NES와 같은, 하나 이상의 핵 국소화 서열(NLS) 또는 핵 방출 신호(NES)에 융합된다. 일부 구현예에서, Cas는 아미노 말단에서 또는 근처에서 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 그 이상, 또는 그 보다 많은 NLS 또는 NES, 카르복시 말단에서 또는 근처에서 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 그 이상, 또는 그 보다 많은 NLS 또는 NES, 또는 이들의 조합(예를 들어, 아미노 말단에 0 또는 적어도 하나 이상의 NLS 또는 NES 및 카르복시 말단에 0 또는 하나 이상의 NLS 또는 NES)을 포함한다. 하나 보다 많은 NLS 또는 NES가 존재할 때, 각각은 다른 것과 독립적으로 선택될 수 있어, 단일 NLS 또는 NES가 하나보다 많은 카피로 존재할 수 있고/있거나 하나 이상의 다른 NLS 또는 NES와 조합하여 하나 이상의 카피로 존재할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, Cas는 최대 6 개의 NLS를 포함한다. 일부 구현예에서, NLS 또는 NES의 가장 가까운 아미노산이 N- 또는 C-말단으로부터 폴리펩티드 사슬을 따라 약 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 또는 그 이상의 아미노산 내에 있는 경우 NLS 또는 NES는 N- 또는 C-말단 근처로 여겨진다. NLS의 비-제한적 예로는 아미노산 서열 PKKKRKV(SEQ ID NO: X)를 갖는 SV40 바이러스 대형 T-항원의 NLS; 뉴클레오플라스민 유래 NLS(예를 들어, 서열 KRPAATKKAGQAKKKK를 갖는 뉴클레오플라스민 양분 NLS) (SEQ ID NO:X); 아미노산 서열 PAAKRVKLD(SEQ ID NO: X) 또는 RQRRNELKRSP(SEQ ID NO:X)를 갖는 c-myc NLS; 서열 NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY(SEQ ID NO: X)를 갖는 hRNPA1 M9 NLS; 임포틴-알파 유래의 IBB 도메인의 서열 RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV(SEQ ID NO: X); 근종 T 단백질의 서열VSRKRPRP(SEQ ID NO: X) 및 PPKKARED(SEQ ID NO: X); 인간 p53의 서열 POPKKKPL(SEQ ID NO: X); 마우스 c-abl IV의 서열 SALIKKKKKMAP(SEQ ID NO: X); 인플루엔자 바이러스 NS1의 서열 DRLRR(SEQ ID NO: X) 및 PKQKKRK(SEQ ID NO: X); 간염 바이러스 델타 항원의 서열 RKLKKKIKKL(SEQ ID NO: X); 마우스 Mx1 단백질의 서열 REKKKFLKRR(SEQ ID NO: X); 인간 폴리(ADP-리보스) 폴리메라제의 서열 KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK(SEQ ID NO: X); 및 스테로이드 호르몬 수용체(인간) 글루코코르티코이드의 서열 RKCLQAGMNLEARKTKK(SEQ ID NO: X)로부터 유래된 NLS 서열이 포함된다. NES의 비-제한적인 예는 NES 서열 LYPERLRRILT (ctgtaccctgagcggctgcggcggatcctgacc)를 포함한다. 일반적으로, 하나 이상의 NLS 또는 NES는 진핵 세포의 핵 또는 세포질 각각에서 검출 가능한 양으로 Cas의 축적을 추진하기에 충분한 강도이다. 일반적으로 핵 국소화/방출 활성의 강도는 Cas의 NLS/NES 수, 사용된 구체적인 NLS(들) 또는 NES(들), 또는 이들 인자의 조합으로부터 유래할 수 있다. 핵/세포질에서의 축적의 검출은 임의의 적합한 기법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 검출 가능한 마커가 Cas에 융합되어, 예를 들어 핵(예를 들어, DAPI와 같은 핵에 특이적인 염색) 또는 세포질의 위치를 검출하기 위한 수단과 조합하여, 세포 내의 위치가 시각화될 수 있다. 세포 핵은 또한 세포로부터 단리될 수 있으며, 그 다음 그 내용물을 면역조직화학법, 웨스턴 블롯, 또는 효소 활성 분석과 같은 단백질 검출을 위한 임의의 적합한 공정에 의해 분석할 수 있다. 핵 내 축적은 또한 예를 들어, Cas 또는 복합체에 노출되지 않은 대조군, 또는 하나 이상의 NLS 또는 NES가 없는 Cas에 노출된 대조군과 비교하여 CRISPR 복합체 형성 효과에 대한 분석(예를 들어, 표적 서열에서의 DNA 절단 또는 돌연변이에 대한 분석, 또는 CRISPR 복합체 형성 및/또는 Cas 효소 활성에 의해 영향을 받는 변경된 유전자 발현 활성에 대한 분석)에 의해 간접적으로 결정될 수 있다. 특정 구현예에서, 예를 들어, 제한 없이, 미토콘드리아, 플라스티드, 엽록체, 소포, 골지, (핵 또는 세포)막, 리보솜, 인, ER, 세포골격, 공포, 중심체, 뉴클레오솜, 과립, 중심립 등과 같은 세포 기관과 같은 세포의 구체적인 부위에 Cas를 국소화시키기 위하여 다른 국소화 태그를 Cas 단백질에 융합시킬 수 있다.
특정 양태에서, 본 발명은 벡터, 예를 들어 Cas 및/또는 Cas를 표적 유전자좌로 가이드할 수 있는 RNA(즉, 가이드 RNA)를 세포에 전달하거나 도입시키는 것뿐만 아니라, (예를 들어, 원핵 세포에서) 이들 성분을 증식시키는 것을 위한 벡터를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 "벡터"는 한 환경에서 또 다른 환경으로의 실재물의 이동을 가능하게 하거나 용이하게 하는 도구이다. 그것은 플라스미드, 파지, 또는 코즈미드와 같은 레플리콘(replicon)으로, 이 안으로 또 다른 DNA 절편이 삽입되어 삽입된 절편의 복제를 초래할 수 있다. 일반적으로 벡터는 적절한 제어 요소와 연관될 때 복제가 가능한다. 일반적으로, 용어 "벡터"는 그것이 연결된 또 다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 벡터는 단일-가닥, 이중-가닥, 또는 부분적으로 이중-가닥인 핵산 분자, 하나 이상의 자유 말단을 포함하는, 자유 말단을 포함하지 않는(예를 들어 원형) 핵산 분자; DNA, RNA 또는 둘 모두를 포함하는 핵산 분자; 및 당업계에 공지된 다른 다양한 폴리뉴클레오티드를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 벡터의 한 유형은 "플라스미드"이며, 이는, 예를 들어 표준 분자 클로닝 기법에 의해, 추가적인 DNA 절편이 삽입될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA 루프를 지칭한다. 벡터의 또 다른 유형은 바이러스 벡터이며, 여기서, 바이러스-유래 DNA 또는 RNA 서열이 바이러스로의 패키징을 위해 벡터에 존재한다(예를 들어, 레트로바이러스, 복제 결함 있는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 복제 결함 있는 아데노바이러스, 및 아데노-관련 바이러스(AAV)). 바이러스 벡터는 또한 숙주 세포 내로의 형질감염을 위해 바이러스가 가지는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특정 벡터는 그들이 도입된 숙주 세포에서 자체 복제할 수 있다(예를 들어, 박테리아 복제 기원을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유류 벡터). 다른 벡터(예를 들어, 비-에피솜 포유류 벡터)는 숙주 세포 내로 도입 즉시 숙주 세포의 게놈 안에 통합되어, 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터는 작동 가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본 명세서에서 "발현 벡터"로 지칭된다. 재조합 DNA 기법에서 효용있는 통상의 발현 벡터는 종종 플라스미드 형태이다.
재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 핵산의 발현에 적합한 형태로 본 발명의 핵산을 포함할 수 있으며, 이는 재조합 발현 벡터가 하나 이상의 조절 요소를 포함하는 것을 의미하며, 이는 발현될 핵산 서열에 작동 가능하게 연결되는, 발현에 사용되는 숙주 세포에 기반하여 선택될 수 있다. 재조합 발현 벡터 내에서, "작동 가능하게 연결된"은 관심 뉴클레오티드 서열이 (예를 들어, 시험관내 전사/번역 시스템에서 또는 벡터가 숙주 세포에 도입되는 경우 숙주 세포에서) 뉴클레오티드 서열의 발현이 가능하게 하는 방식으로 조절 요소(들)에 연결됨을 의미하는 것으로 의도된다. 재조합 및 클로닝 방법과 관련하여, 2004년 9월 2일 US 2004-0171156 A1으로서 공개된 미국 특허 출원 제10/815,730 호에 대하여 언급되며, 그 내용은 전체가 본 명세서에 참조로서 포함된다.
벡터(들)는 조절 요소(들), 예를 들어, 프로모터(들)를 포함할 수 있다. 벡터(들)는 Cas 인코딩 서열, 및/또는 단일, 그러나 또한 가능하게는 적어도 3 또는 8 또는 16 또는 32 또는 48 또는 50 개의 가이드 RNA(들)(예를 들어, sgRNA) 인코딩 서열, 예를 들어1 내지 2, 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 3 내지 6, 3 내지 7, 3 내지 8, 3 내지 9, 3 내지 10, 3 내지 8, 3 내지 16, 3 내지 30, 3 내지 32, 3 내지 48, 3 내지 50 RNA(들)(예를 들어, sgRNA) 를 포함할 수 있다. 단일 벡터에서, 유리하게는, 약 16 개까지의 RNA(들)가 있는 경우, 각각의 RNA(예를 들어, sgRNA)에 대한 프로모터가 있을 수 있고; 단일 벡터가 16 개 보다 많은 RNA(들)를 제공할 경우, 하나 이상의 프로모터(들)가 하나보다 많은 RNA(들)의 발현을 구동할 수 있으며, 예를 들어, 32 개의 RNA(들)이 있을 경우, 각각의 프로모터는 2 개의 RNA(들)의 발현을 구동할 수 있으며, 48 개의 RNA(들)가 있을 경우 각각의 프로모터는 3 개의 RNA(들)의 발현을 구동할 수 있다. 간단한 산술 및 잘 확립된 클로닝 프로토콜 및 이 개시에서의 교시에 의해, 당업자는 AAV와 같은 적합한 예시적 벡터, 및 U6 프로모터와 같은 적합한 프로모터에 대하여 RNA(들)에 대한 본 발명을 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들어, AAV의 패키징 한계는 약 4.7 kb이다. 단일 U6-gRNA(클로닝을 위한 제한 부위 포함)의 길이는 361 bp이다. 따라서, 당업자는 약 12 내지 16 개, 예를 들어, 13 개의 U6-gRNA 카세트를 단일 벡터에 용이하게 맞출 수 있다. 이것은 TALE 조립에 사용되는 골든 게이트 전략(http://www.genome-engineering.org/taleffectors/)과 같은 임의의 적합한 수단에 의해 조립될 수 있다. 당업자는 U6-gRNA의 수를 약 1.5 배만큼 증가시키기 위해, 예를 들어 12 내지 16 개, 예를 들어 13 개로부터 약 18 내지 24 개, 예를 들어 약 19개 U6-gRNA로 증가시키기 위해 직렬 배열 가이드 전략을 사용할 수도 있다. 따라서, 당업자는 단일 벡터, 예를 들어 AAV 벡터 내에서 약 18 개 내지 24 개, 예를 들어 약 19 개의 프로모터-RNA, 예를 들어 U6-gRNA에 용이하게 도달할 수 있다. 벡터 내 프로모터 및 RNA의 수를 증가시키기 위한 추가의 수단은 절단 가능한 서열에 의해 분리된 RNA의 어레이를 발현하는 단일 프로모터(예를 들어, U6)를 사용하는 것이다. 또한 벡터 내 프로모터-RNA의 수를 증가시키는 또 다른 추가의 수단은 코딩 서열 또는 유전자의 인트론에서 절단 가능한 서열에 의해 분리된 프로모터-RNA의 어레이를 발현하는 것이며; 이 경우, 증가된 발현을 가질 수 있고 조직 특이적 방식으로 긴 RNA의 전사를 가능하게 할 수 있는 폴리메라제 II 프로모터를 사용하는 것이 유리하다 (예를 들어, http://nar.oxfordjournals.org/content/34/7/e53.short, http://www.nature.com/mt/journal/v16/n9/abs/mt2008144a.html 참조). 유리한 구현예에서, AAV는 약 50 개까지의 유전자를 표적화하는 U6 직렬 배열 gRNA를 패키징할 수 있다. 따라서, 당업계의 지식 및 이 개시에서의 교시로부터, 당업자는 벡터(들), 예를 들어, 제어 하에 또는 작동 가능하게 또는 기능적으로 하나 이상의 프로모터에 연결된 다중 RNA 또는 가이드를 발현하는 단일 벡터를, 특히 어떤 과도한 실험 없이 본 명세서에서 논의된 RNA 또는 가이드의 수와 관련하여, 용이하게 제조 및 사용할 수 있다.
가이드 RNA(들) 인코딩 서열 및/또는 Cas 인코딩 서열은 기능적으로 또는 작동 가능하게 조절 요소(들)에 연결될 수 있으며, 따라서 조절 요소(들)는 발현을 추진할 수 있다. 프로모터(들)는 구성적 프로모터(들) 및/또는 조건적 프로모터(들) 및/또는 유도성 프로모터(들) 및/또는 조직 특이적 프로모터일 수 있다. 프로모터는 RNA 폴리메라제, pol I, pol II, pol III, T7, U6, H1, 레트로바이러스 Rous 육종 바이러스(RSV) LTR 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, SV40 프로모터, 디하이드로폴레이트 리덕타제 프로모터, β-액틴 프로모터, 포스포글리세롤 키나제(PGK) 프로모터, 및 EF1α 프로모터로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 유리한 프로모터는 프로모터가 U6인 것이다.
본 발명의 일 양태는 클래스 2 CRISPR-Cas 시스템과 연관된 신규 이펙터 단백질의 동정 및 설계 제작에 관한 것이다. 바람직한 구현예에서, 이펙터 단백질은 단일-서브유닛 이펙터 모듈을 포함한다. 추가 구현예에서, 이펙터 단백질은 시험관내, 생체내 또는 생체외 적용을 위한 원핵 세포 또는 진핵 세포에서 기능적이다. 본 발명의 일 양태는 새로운 클래스 2 CRISPR-Cas 시스템을 예측하고 그 안에 있는 성분을 동정하기 위한 컴퓨터 방법 및 알고리즘을 포함한다.
일 양태에서, 신규한 클래스 2 CRISPR-Cas 유전자좌를 동정하는 컴퓨터 방법은 다음 단계를 포함한다: Cas1 단백질을 인코딩하는 모든 콘티그(contig)를 검출하는 단계; cas1 유전자의 20 kB 내, 더욱 구체적으로 cas1 유전자의 시작으로부터 20 kb 및 cas1 유전자의 말단으로부터 20 kb 영역 내의 모든 예측된 단백질 코딩 유전자를 동정하는 단계; 동정된 유전자를 Cas 단백질-특이적 프로파일과 비교하고 CRISPR 어레이를 예측하는 단계; 500 아미노산(>500 aa)보다 큰 단백질을 함유하는 부분적 및/또는 분류되지 않은 후보 CRISPR-Cas 유전자좌를 선택하는 단계; PSI-BLAST 및 HHPred를 사용하여 선택된 후보를 분석함으로써 신규한 클래스 2 CRISPR-Cas 유전자좌를 단리하고 동정하는 단계. 상기 언급된 단계에 추가적으로, 추가적인 상동체에 대한 메타게노믹스(metagenomics) 데이터베이스를 검색함으로써 후보의 추가적인 분석을 수행할 수 있다.
일 양태에서, Cas1 단백질을 인코딩하는 모든 콘티그를 검출하는 것은 본 명세서에 참조로서 포함되어 있는 문헌["GeneMarkS: a self-training method for prediction of gene starts in microbial genomes. Implications for finding sequence motifs in regulatory regions". John Besemer, Alexandre Lomsadze and Mark Borodovsky, 핵산s Research (2001) 29, pp 2607-2618]에 추가로 기재된 바와 같은 유전자 예측 프로그램인 GenemarkS에 의해 실행된다.
일 양태에서 모든 예측된 단백질 코딩 유전자를 동정하는 것은 동정된 유전자를 Cas 단백질-특이적 프로파일과 비교하고, 오래된 도메인 및 전장 단백질에 대한 주석이 잘 달린 다중 서열 정렬 모델의 집합으로 이루어진 단백질 주석 자료인 NCBI 보존된 도메인 데이터베이스(Conserved Domain Database; CDD)에 따라서 이들에 주석을 붙임으로써 수행된다. 이들은 RPS-BLAST를 통해 단백질 서열 중 보존된 도메인의 빠른 동정을 위한 위치-특이적 스코어 매트릭스(position-specific score matrix; PSSM)로서 이용 가능하다. CDD 내용은 NCBI-큐레이팅된 도메인을 포함하며, 이는 3D-구조 정보를 사용하여 도메인 경계를 한정하고 서열/구조/기능 관계뿐만 아니라 다수의 외부 공급원 데이터베이스(Pfam, SMART, COG, PRK, TIGRFAM)로부터 가져온 도메인 모델에 대한 이해를 제공한다. 추가의 양태에서, 문헌["PILER-CR: fast and accurate identification of CRISPR repeats", Edgar, R.C., BMC Bioinformatics, Jan 20;8:18(2007)](본 명세서에 참조로서 포함되어 있음)에 기재된 바와 같은 CRISPR 반복부를 발견하기 위한 공개 도메인 소프트웨어인 PILER-CR 프로그램을 사용하여 CRISPR 어레이를 예측하였다.
추가의 양태에서, 사례별 분석은 PSI-BLAST(Position-Specific Iterative Basic Local Alignment Search Tool; 위치-특이적 반복 기본 국소 정렬 검색 도구)를 사용하여 실행한다. PSI-BLAST는 단백질-단백질 BLAST를 사용하여 주어진 스코어 임계값 초과로 검출된 서열의 다중 서열 정렬로부터 위치-특이적 스코어 매트릭스(position-specific scoring matrix; PSSM) 또는 프로파일을 유도한다. PSSM은 새로운 매치에 대한 데이터베이스를 추가로 검색하는 데 사용되며, 이들 새로 검출된 서열을 이용하여 후속 반복을 위해 업데이트된다. 따라서, PSI-BLAST는 단백질 간 거리가 있는 관계를 검출하는 수단을 제공한다.
또 다른 양태에서, 사례별 분석은 BLAST 또는 PSI-BLAST와 같이 사용하기 쉽고 동시에 원격 상동체를 찾는 데 훨씬 더 민감한 서열 데이터베이스 검색 및 구조 예측을 위한 방법인 HHpred를 사용하여 실행된다. 사실, HHpred의 민감도는 현재 이용 가능한 구조 예측을 위한 가장 강력한 서버와 경쟁적이다. HHpred는 프로파일 은닉 마르코프 모델(hidden Markov model; HMM)의 쌍별 비교를 기반으로 하는 첫 번째 서버이다. 대부분의 종래 서열 검색 방법이 UniProt 또는 NR과 같은 서열 데이터베이스, HHpred 검색 정렬 데이터베이스, 예를 들어 Pfam 또는 SMART를 검색한다. 이는 단일 서열의 클러터(clutter) 대신에 다수의 서열 패밀리에 대한 히트 목록이 크게 단순화된다. 모든 공개적으로 이용 가능한 주요 프로파일 및 정렬 데이터베이스는 HHpred를 통해 이용 가능하다. HHpred는 입력값으로서 단일 질의 서열 또는 다중 정렬을 허용한다. 단지 몇 분 이내에, PSI-BLAST와 유사한 읽기 쉬운 포맷으로 검색 결과를 가져온다. 검색 옵션은 국소 또는 전체 정렬 및 2차 구조 유사성의 스코어를 포함한다. HHpred는 쌍별 질의-주형 서열 정렬, 병합된 질의-주형 다중 정렬(예를 들어, 이행성 검색을 위함)뿐만 아니라, HHpred 정렬로부터 MODELLER 소프트웨어에 의해 계산된 3D 구조 모델을 생성할 수 있다.
용어 "핵산-표적화 시스템", 여기서, 핵산은 DNA 또는 RNA이고, 일부 양태에서는 또한 DNA-RNA 하이브리드 또는 이의 유도체를 지칭할 수 있음은 DNA 또는 RNA-표적화 CRISPR-관련된("Cas") 유전자의 발현 또는 이의 활성의 유도에 포함되는 전사물 및 다른 요소를 집합적으로 지칭하며, 이는 DNA 또는 RNA-표적화 Cas 단백질을 인코딩하는 서열 및 CRISPR RNA(crRNA) 서열을 포함하는 DNA 또는 RNA-표적화 가이드 RNA 및 (모든 시스템 아닌 일부 시스템에서) 트랜스-활성화 CRISPR/Cas 시스템 RNA(tracrRNA) 서열, 또는 DNA 또는 RNA-표적화 CRISPR 유전자좌로부터의 다른 서열 및 전사물을 포함할 수 있다. 일반적으로, RNA-표적화 시스템은 표적 DNA 또는 RNA 서열의 부위에서 DNA 또는 RNA-표적화 복합체의 형성을 촉진하는 요소들에 의해 특징지어진다. DNA 또는 RNA-표적화 복합체의 형성의 맥락에서, "표적 서열"은 DNA 또는 RNA-표적화 가이드 RNA가 그에 대한 상보성을 갖도록 설계된 DNA 또는 RNA 서열을 지칭하며, 여기서 표적 서열과 RNA-표적화 가이드 RNA 사이에서의 혼성화는 RNA-표적화 복합체의 형성을 촉진한다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 세포의 핵 내 또는 세포질 내에 위치된다.
본 발명의 일 양태에서, 본 출원의 RNA- 또는 RNA-표적화 CRISPR/Cas 또는 CRISPR-Cas 시스템 RNA-표적화 시스템으로도 지칭되는 신규한 RNA 표적화 시스템은 동정된 제VI형 Cas 단백질에 기반하며, 이는 특정 RNA 서열을 표적화하기 위해 맞춤화된 단백질을 생성할 필요가 없고 오히려 단일 효소는 특정 RNA 표적을 인식하기 위해 RNA 분자에 의해 프로그래밍될 수 있고, 즉, 효소가 상기 RNA 분자를 사용하여 특정 RNA 표적에 모집될 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 본 출원의 DNA- 또는 DNA-표적화 CRISPR/Cas 또는 CRISPR-Cas 시스템 RNA-표적화 시스템으로도 지칭되는 신규한 DNA 표적화 시스템은 동정된 제VI형 Cas 단백질에 기반하며, 이는 특정 RNA 서열을 표적화하기 위해 맞춤화된 단백질을 생성할 필요가 없고 오히려 단일 효소는 특정 DNA 표적을 인식하기 위해 RNA 분자에 의해 프로그래밍될 수 있고, 즉, 효소가 상기 RNA 분자를 사용하여 특정 DNA 표적에 모집될 수 있다.
본 명세서에 기재된 핵산-표적화 시스템, 벡터 시스템, 벡터 및 조성물은 다양한 핵산-표적화 응용, 유전자 생성물, 예를 들어 단백질의 합성 변경 또는 변형, 핵산 절단, 핵산 편집, 핵산 스플라이싱; 표적 핵산의 수송, 표적 핵산의 추적, 표적 핵산의 단리, 표적 핵산의 시각화 등에 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 Cas 단백질 또는 CRISPR 효소는 CRISPR-Cas 시스템의 새로운 분류에 제시되는 단백질 중 임의의 것을 지칭한다.
C2c2 뉴클레아제
클래스 2 제VI형 이펙터 단백질 C2c2는 ssRNA를 분해하도록 효율적으로 프로그래밍될 수 있는 RNA-가이드된 알엔아제이다. 본 발명의 C2c2 이펙터 단백질은 다음의 21 개 오솔로그 종을 제한 없이 포함한다(다중 CRISPR 유전자좌 포함하여: 렙토트리키아 샤히; 렙토트리키아 와데이(Lw2); 리스테리아 세엘리게리; 라크노스피라세아에 박테리움 MA2020; 라크노스피라세아에 박테리움 NK4A179; [클로스트리디움] 아미노필룸 DSM 10710; 카르노박테리움 갈리나룸 DSM 4847; 카르노박테리움 갈리나룸 DSM 4847 (제2 CRISPR 유전자좌); 팔루디박터 프로피오니시게네스 WB4; 리스테리아 웨이헨스테파넨시스 FSL R9-0317; 리스테리아세아에 박테리움 FSL M6-0635; 렙토트리키아 와데이 F0279; 로도박터 캅술라투스 SB 1003; 로도박터 캅술라투스 R121; 로도박터 캅술라투스 DE442; 렙토트리키아 부칼리스 C-1013-b; 헤르비닉스 헤미셀룰로실리티카(Herbinix hemicellulosilytica); [유박테리움] 렉탈레([Eubacterium] rectale); 유박테리아세아에 박테리움(Eubacteriaceae bacterium) CHKCI004; 블라우티아 종 마르세일레(Blautia sp. Marseille)-P2398; 및 렙토트리키아 종 오랄 분류군 879 균주 F0557. 12 개의 추가 비-제한적 예는: 라크노스피라세아에 박테리움 NK4A144; 클로로플렉서스 아그레간스(Chloroflexus aggregans); 데메퀴나 아우란티아카(Demequina aurantiaca); 탈라쏘스피라 종(Thalassospira sp.) TSL5-1; 슈도부티리비브리오 종(Pseudobutyrivibrio sp.) OR37; 부티리비브리오 종(Butyrivibrio sp.) YAB3001; 블라우티아 종 마르세일레-P2398; 렙토트리키아 종 마르세일레(Leptotrichia sp. Marseille)-P3007; 박테로이데스 이후아에(Bacteroides ihuae); 포르피로모나다세아에 박테리움(Porphyromonadaceae bacterium) KH3CP3RA; 리스테리아 리파리아(Listeria riparia); 및 인솔리티스피릴룸 페레그리눔(Insolitispirillum peregrinum)이다.
C2c2는 그의 2 개의 HEPN 도메인 내의 보존된 염기성 잔기를 통해 RNA 절단을 달성한다. 예측된 HEPN 도메인 촉매성 잔기의(예를 들어, 알라닌) 치환과 같은 HEPN 도메인의 돌연변이는 C2c2를 비활성 프로그래밍 가능한 RNA-결합 단백질(dC2c2, dCas9에 유사)로 전환시키는 데 사용될 수 있다.
본 발명에 따르면, 다수의 C2c2 오솔로그로부터 컨센서스 서열이 생성될 수 있으며, 이는 C2c2 기능을 매개하는 C2c2 오솔로그 내에 촉매성 잔기 및 HEPN 모티프를 포함하지만 이에 한정되지 않는, 보존된 아미노산 잔기 및 모티프를 위치시키는 데 도움이 될 수 있다. Geneious 정렬을 사용하여 상기 언급된 33 개의 오솔로그로부터 생성된 하나의 이러한 컨센서스 서열은: MKISKVXXXVXKKXXXGKLXKXVNERNRXAKRLSNXLBKYIXXIDKIXKKEXXKKFXAXEEITLKLNQXXXBXLXKAXXDLRKDNXYSXJKKILHNEDINXEEXELLINDXLEKLXKIESXKYSYQKXXXNYXMSVQEHSKKSIXRIXESAKRNKEALDKFLKEYAXLDPRMEXLAKLRKLLELYFYFKNDXIXXEEEXNVXXHKXLKENHPDFVEXXXNKENAELNXYAIEXKKJLKYYFPXKXAKNSNDKIFEKQELKKXWIHQJENAVERILLXXGKVXYKLQXGYLAELWKIRINEIFIKYIXVGKAVAXFALRNXXKBENDILGGKIXKKLNGITSFXYEKIKAEEILQREXAVEVAFAANXLYAXDLXXIRXSILQFFGGASNWDXFLFFHFATSXISDKKWNAELIXXKKJGLVIREKLYSNNVAMFYSKDDLEKLLNXLXXFXLRASQVPSFKKVYVRXBFPQNLLKKFNDEKDDEAYSAXYYLLKEIYYNXFLPYFSANNXFFFXVKNLVLKANKDKFXXAFXDIREMNXGSPIEYLXXTQXNXXNEGRKKEEKEXDFIKFLLQIFXKGFDDYLKNNXXFILKFIPEPTEXIEIXXELQAWYIVGKFLNARKXNLLGXFXSYLKLLDDIELRALRNENIKYQSSNXEKEVLEXCLELIGLLSLDLNDYFBDEXDFAXYJGKXLDFEKKXMKDLAELXPYDQNDGENPIVNRNIXLAKKYGTLNLLEKJXDKVSEKEIKEYYELKKEIEEYXXKGEELHEEWXQXKNRVEXRDILEYXEELXGQIINYNXLXNKVLLYFQLGLHYLLLDILGRLVGYTGIWERDAXLYQIAAMYXNGLPEYIXXKKNDKYKDGQIVGXKINXFKXDKKXLYNAGLELFENXNEHKNIXIRNYIAHFNYLSKAESSLLXYSENLRXLFSYDRKLKNAVXKSLINILLRHGMVLKFKFGTDKKSVXIRSXKKIXHLKSIAKKLYYPEVXVSKEYCKLVKXLLKYK이다.
상기 오솔로그로부터 동정된 HEPN 서열 모티프가 처음 21 개의 오솔로그 및 모든 33 개의 오솔로그 각각을 기초로 하여 도 49 및 도 50에 제공된다. 촉매적으로 데드 C2c2 돌연변이체를 생성하기 위해 돌연변이될 수 있는 아미노산 잔기의 비-제한적인 예는, 상기 컨센서스를 기반으로, HEPN1에 또는 근처에 D372, R377, Q/H382, 및 F383 또는 오솔로그의 상응하는 아미노산, 및 HEPN2에 또는 근처에 K893, N894, R898, N899, H903, F904, Y906, Y927, D928, K930, K932 또는 오솔로그의 상응하는 아미노산을 포함한다.
또 다른 비-제한적인 예에서, 컨센서스 서열의 생성 및 보존된 잔기의 확인을 돕기 위한 서열 정렬 도구는 MUSCLE 정렬 도구(www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/)이다. 예를 들어, MUSCLE을 사용하여, C2c2 오솔로그들 사이에서 보존된 다음의 아미노산 위치를 렙토트리키아 와데이 C2c2에서 확인할 수 있다: K2; K5; V6; E301; L331; I335; N341; G351; K352; E375; L392; L396; D403; F446; I466; I470; R474 (HEPN); H475; H479 (HEPN), E508; P556; L561; I595; Y596; F600; Y669; I673; F681; L685; Y761; L676; L779; Y782; L836; D847; Y863; L869; I872; K879; I933; L954; I958; R961; Y965; E970; R971; D972; R1046 (HEPN), H1051 (HEPN), Y1075; D1076; K1078; K1080; I1083; I1090.
도 52a 내지 52k는 C2c2 오솔로그의 정렬을 나타낸다. 도 52l은 HEPN 도메인의 예시적인 서열 정렬 및 고도로 보존된 잔기를 나타낸다.
C2c2 HEPN은 또한 DNA, 또는 잠재적으로 DNA 및/또는 RNA를 표적화할 수 있다. C2c2의 HEPN 도메인이 적어도 결합할 수 있고 야생형 형태에서 RNA를 절단할 수 있다는 점을 근거로 하여, C2c2 이펙터 단백질은 알엔아제 기능을 갖는 것이 선호된다. 또한, 또는 대안적으로, 디엔아제 기능을 가질 수 있다.
따라서, 일부 구현예에서, 이펙터 단백질은 예를 들어 전사 활성화제 또는 억제제 도메인, NLS 또는 기타 기능성 도메인으로 본 명세서에 기재된 바와 같이 선택적으로 기능화될 수 있는, 데드-Cas 타입 이펙터 단백질과 같은 RNA-결합 단백질일 수 있다. 일부 구현예에서, 이펙터 단백질은 RNA의 단일 가닥을 절단하는 RNA-결합 단백질일 수 있다. 결합된 RNA가 ssRNA인 경우, ssRNA는 완전히 절단된다. 일부 구현예에서, 이펙터 단백질은, 예를 들어 2 개의 알엔아제 도메인을 포함하는 경우, RNA의 이중 가닥을 절단하는 RNA-결합 단백질일 수 있다. 결합된 RNA가 dsRNA인 경우, dsRNA는 완전히 절단된다.
CRISPR 시스템에서의 알엔아제 기능은 알려져 있으며, 예를 들어 mRNA 표적화는 특정 제III형 CRISPR-Cas 시스템(문헌[Hale et al., 2014, Genes Dev, vol. 28, 2432-2443; Hale et al., 2009, Cell, vol. 139, 945-956; Peng et al., 2015, Nucleic acids research, vol. 43, 406-417])에 대하여 보고되었고 상당한 이점을 제공한다. 스태필로코커스 에피더미스(Staphylococcus epidermis) 제III-A형 시스템에서, 표적에 걸친 전사는 Cas10-Csm 리보핵산단백질 이펙터 복합체 내의 독립적인 활성 부위에 의해 매개되는, 표적 DNA 및 그 전사물의 절단을 초래한다(Samai et al., 2015, Cell, vol. 151, 1164-1174 참고). 따라서, 본 이펙터 단백질을 통해 RNA를 표적화하는 CRISPR-Cas 시스템, 조성물 또는 방법이 제공된다.
표적 RNA, 즉 관심 RNA는 표적 RNA상의 관심 표적 부위로의 모집, 및 이펙터 단백질의 결합을 유도하는, 본 발명에 의해 표적화될 RNA이다. 표적 RNA는 임의의 적합한 형태의 RNA 일 수 있다. 이는 일부 구현예에서 mRNA를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 표적 RNA는 tRNA 또는 rRNA를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 표적 RNA는 miRNA를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 표적 RNA는 siRNA를 포함할 수 있다.
간섭 RNA(RNAi) 및 마이크로RNA(miRNA)
다른 구현예에서, 표적 RNA는 간섭 RNA, 즉 진핵 생물 및 원핵 생물 모두에서 shRNA, siRNA 등과 같은 RNA 간섭 경로에 관여하는 RNA를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 표적 RNA는 마이크로RNA(miRNA)를 포함할 수 있다. 간섭 RNA 또는 miRNA에 대한 제어는 생체내 또는 시험관내에서 간섭 RNA 또는 miRNA의 수명을 감소시킴으로써 그러한 접근에서 보이는 표적외 효과(OTE)를 감소시키는 데 도움이 될 수 있다.
특정 구현예에서, 표적은 miRNA 자체가 아니고 miRNA 표적의 miRNA 결합 부위이다.
특정 구현예에서, miRNA는 (예를 들어, 세포 내 재위치되는 것을 포함하여) 격리될 수 있다. 특정 구현예에서, 예를 들어 제한 없이, 헤어핀에서 miRNA는 절단될 수 있다.
특정 구현예에서, miRNA 가공(예를 들어 턴오버 포함)은 증가되거나 감소된다.
이펙터 단백질 및 적합한 가이드가 선택적으로(예를 들어, 적합한 프로모터, 예를 들어 조직- 또는 세포주기-특이적 프로모터 및/또는 인핸서의 제어 하에 공간적으로 또는 시간적으로) 발현되는 경우, 이것은 그들 세포에서 RNAi로부터 (생체내 또는 시험관내) 세포 또는 시스템을 '보호'하는 데 사용될 수 있다. 이것은 RNAi가 필요하지 않은 이웃 조직 또는 세포에서 또는 이펙터 단백질 및 적합한 가이드가 발현되고 발현되지 않는(즉, 각각 RNAi가 제어되지 않는 곳 및 제어되는 곳) 세포 또는 조직의 비교 목적으로 유용할 수 있다. 이펙터 단백질은 리보자임, 리보솜 또는 리보스위치와 같은 RNA를 포함하거나 이로 구성된 분자를 제어하거나 분자에 결합하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, RNA 가이드는 이펙터 단백질을 이들 분자에 모집하여 이펙터 단백질이 그들에 결합할 수 있도록 할 수 있다.
본 출원은 정보가 제공된 시스템의 설계 제작을 위한 기초를 제공하므로, 본 발명의 단백질 시스템은, 본 개시 내용으로부터, 과도한 실험없이 치료, 분석 및 다른 응용을 포함하는 RNAi 기술 분야에 적용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Guidi et al., PLoS Negl Trop Dis 9(5): e0003801. doi:10.1371/journal.pntd; Crotty et al., In vivo RNAi screens: concepts and applications. Shane Crotty ... 2015 Elsevier Ltd. Published by Elsevier Inc., Pesticide Biochemistry and Physiology (Impact Factor: 2.01). 01/2015; 120. DOI: 10.1016/j.pestbp.2015.01.002] 및 문헌[Makkonen et al., Viruses 2015, 7(4), 2099-2125; doi:10.3390/v7042099] 참고).
리보솜 RNA(rRNA)
예를 들어, 아지트로마이신과 같은 아잘리드 항생제가 잘 알려져 있다. 그들은 50S 리보솜 서브유닛을 표적화하고 파괴한다. 본 이펙터 단백질은 50S 리보솜 서브유닛을 표적화하는 적합한 가이드 RNA와 함께, 일부 구현예에서, 50S 리보솜 서브유닛에 모집 및 결합될 수 있다. 따라서, 리보솜(특히 50s 리보솜 서브유닛) 표적을 향하는 적합한 가이드와 함께 본 이펙터 단백질이 제공된다. 리보솜(특히 50s 리보솜 서브유닛) 표적을 향하는 적합한 가이드와 함께 이 사용 이펙터 단백질의 용도는 항생제 용도를 포함할 수 있다. 구체적으로, 항생제 용도는 아지트로마이신과 같은 아잘리드 항생제의 작용과 유사하다. 일부 구현예에서, 원핵 생물에서의 70S 서브유닛, 상기 언급된 50S 서브유닛, 30S 서브유닛뿐만 아니라 16S 및 5S 서브유닛과 같은 원핵 리보솜 서브유닛이 표적화될 수 있다. 다른 구현예에서, 진핵 세포에서의 80S 서브유닛, 60S 서브유닛, 40S 서브유닛뿐만 아니라 28S, 18S. 5.8S 및 5S서브유닛과 같은 진핵 리보솜 서브유닛이 표적화될 수 있다.
일부 구현예에서, 이펙터 단백질은 본 명세서에 기재된 바와 같이 선택적으로 기능화된, RNA-결합 단백질일 수 있다. 일부 구현예에서, 이펙터 단백질은 RNA의 단일 가닥을 절단하는 RNA-결합 단백질일 수 있다. 두 경우 모두, 구체적으로 RNA-결합 단백질이 RNA의 단일 가닥을 절단하는 경우, 리보솜 기능이 조절되고, 구체적으로 감소되거나 파괴될 수 있다. 이것은 임의의 리보솜 RNA 및 임의의 리보솜 서브유닛에 적용될 수 있으며, rRNA의 서열은 잘 알려져 있다.
따라서, 리보솜 활성의 제어가 리보솜 표적에 대한 적합한 가이드와 함께 본 이펙터 단백질의 사용을 통해 예상된다. 이것은 리보솜의 절단 또는 리보솜에의 결합을 통한 것일 수 있다. 구체적으로, 리보솜 활성의 감소가 예상된다. 이것은 생체내 또는 시험관내에서 리보솜 기능을 분석하는 데 유용할 수 있고, 생체내 또는 시험관내에서 리보솜 활성에 기반한 치료법을 제어하는 수단으로서 또한 유용할 수 있다. 또한, 생체내 또는 시험관내 시스템에서의 단백질 합성의 제어(즉, 감소)가 예상되며, 이러한 제어는 항생제 및 연구 및 진단 용도를 포함한다.
리보스위치
리보스위치(압토자임으로도 알려져 있음)는 소분자를 결합하는 메신저 RNA 분자의 조절 부분이다. 이것은 전형적으로 mRNA에 의해 인코딩된 단백질의 생산을 변화시킨다. 따라서, 리보스위치 표적에 대한 적합한 가이드와 함께 본 이펙터 단백질의 사용을 통해 리보스위치 활성의 제어가 예상된다. 이것은 리보스위치의 절단 또는 리보스위치에의 결합을 통한 것일 수 있다. 구체적으로, 리보스위치 활성의 감소가 예상된다. 이것은 생체내 또는 시험관내에서 리보스위치 기능을 분석하는 데 유용할 수 있고, 생체내 또는 시험관내에서 리보스위치 활성에 기반한 치료법을 제어하는 수단으로서 또한 유용할 수 있다. 또한, 생체내 또는 시험관내 시스템에서의 단백질 합성의 제어(즉, 감소)가 예상된다. 이 제어는, rRNA에서와 같이, 항생제 및 연구 및 진단 용도를 포함할 수 있다.
리보자임
리보자임은 효소(물론 단백질임)와 유사한 촉매 특성을 갖는 RNA 분자이다. 리보자임은, 천연적으로 발생한 것 및 설계 제작된 것 모두, RNA를 포함하거나 RNA로 구성되기 때문에, 본 RNA-결합 이펙터 단백질에 의해 또한 표적화될 수 있다. 일부 구현예에서, 이펙터 단백질은 리보자임을 절단함으로써 이를 불능으로 만드는 RNA-결합 단백질일 수 있다. 따라서, 리보자임 표적에 대한 적합한 가이드와 함께 본 이펙터 단백질의 사용을 통해 리보자임 활성의 제어가 예상된다. 이것은 리보자임의 절단 또는 리보자임에의 결합을 통한 것일 수 있다. 구체적으로, 리보자임 활성의 감소가 예상된다. 이것은 생체내 또는 시험관내에서 리보자임 기능을 분석하는 데 유용할 수 있고, 생체내 또는 시험관내에서 리보자임 활성에 기반한 치료법을 제어하는 수단으로서 또한 유용할 수 있다.
RNA 가공을 포함하는, 유전자 발현
이펙터 단백질은 RNA 가공의 제어를 통하는 것을 포함하여, 적합한 가이드와 함께, 유전자 발현을 표적화하는 데 또한 사용될 수 있다. RNA 가공의 제어는 RNApol; 식물에서의 바이로이드를 포함하는 (구체적으로, 위성 바이러스, 박테리오파지 및 레트로바이러스, 예를 들어, HBV, HBC 및 HIV 및 본 명세서에 나열된 다른 것들의) 바이러스 복제; 및 tRNA 생합성의 표적화를 통해, 대안적 스플라이싱을 포함하는 RNA 스플라이싱과 같은 RNA 가공 반응을 포함할 수 있다. 이펙터 단백질 및 적합한 가이드는 또한 RNA 활성화(RNAa)를 제어하는 데 사용될 수 있다. RNAa는 유전자 발현을 촉진하므로 RNAa의 파괴 또는 감소 그에 따른 유전자 발현의 더 적은 촉진을 통해 그와 같이 유전자 발현의 제어가 달성될 수 있다. 이것은 아래에서 상세히 더 논의된다.
RNAi 스크린
녹다운이 표현형 변화와 관련되는 유전자 산물을 동정하여, RNAi 스크린을 통해 생물학적 경로를 조사하고, 구성 부분을 동정할 수 있다. 스크린에서 RNAi의 활성을 제거 또는 감소시키고 그에 따라 (간섭/억제를 제거 또는 감소시킴으로써) 유전자 산물의 (이전에 간섭된) 활성을 회복시키기 위해 이펙터 단백질 및 적합한 가이드를 사용함으로써 이들 스크린을 통해 또는 그 동안 제어가 또한 작용할 수 있다.
위성 RNA(satRNA) 및 위성 바이러스가 또한 처리될 수 있다.
알엔아제 활성과 관련하여 본 명세서에서의 제어는 일반적으로 감소, 음성적 방해 또는 녹-다운 또는 녹-아웃을 의미한다.
생체내 RNA 응용
유전자 발현의 저해
본 명세서에서 제공된 표적-특이적 알엔아제는 표적 RNA의 매우 특이적인 절단을 가능하게 한다. RNA 수준에서의 간섭은 게놈이 변형되지 않으므로 공간적 및 시간적 둘 모두에서 비-침습적 방식으로 조절을 가능하게 한다.
다수의 질병이 mRNA 표적화에 의해 치료 가능한 것으로 입증되었다. 이들 연구의 대부분은 siRNA의 투여에 관한 것이지만, 본 명세서에서 제공되는 RNA 표적화 이펙터 단백질이 유사한 방식으로 적용될 수 있음은 분명하다.
mRNA 표적(및 상응하는 질병 치료)의 예는 VEGF, VEGF-R1 및 RTP801(AMD 및/또는 DME 치료에서), 카스파제 2(Naion 치료에서) ADRB2(안내압 치료에서), TRPVI(건성 안구 증후군 치료에서, Syk 키나제(천식 치료에서), Apo B(고콜레스테롤혈증 또는 저베타지질단백혈증 치료에서), PLK1, KSP 및 VEGF(고형 종양 치료에서), Ber-Abl(CML 치료에서)(문헌[Burnett and Rossi Chem Biol. 2012, 19(1): 60-71)])이다. 유사하게, RNA 표적화는 HIV(HIV Tet 및 Rev의 표적화), RSV(RSV 뉴클레오캡시드의 표적화) 및 HCV(miR-122의 표적화)와 같은 RNA-바이러스 매개 질병의 치료에 효과적임이 입증되었다(문헌[Burnett and Rossi Chem Biol. 2012, 19(1): 60-71]).
본 발명의 RNA 표적화 이펙터 단백질은 돌연변이 특이적 또는 대립유전자 특이적 녹다운에 사용될 수 있다고 추가로 예상된다. 가이드 RNA는 돌연변이 또는 대립유전자-특이적 서열을 포함하는 전사된 mRNA내의 서열을 특이적으로 표적화하도록 설계될 수 있다. 이러한 특이적인 녹다운은 돌연변이된 또는 대립유전자-특이적 유전자 산물과 관련된 장애에 관한 치료적 적용에 특히 적합하다. 예를 들어, 가족성 저베타지질단백혈증(FHBL)의 대부분 사례는 ApoB 유전자의 돌연변이에 의해 야기된다. 이 유전자는 아포지질단백질 B 단백질의 2 가지 버전인 짧은 버전(ApoB-48) 및 긴 버전(ApoB-100)을 인코딩한다. FHBL를 초래하는 몇몇 ApoB 유전자 돌연변이로 인해 ApoB의 2 가지 버전이 비정상적으로 짧아진다. 본 발명의 RNA 표적화 이펙터 단백질을 이용한 돌연변이된 ApoB mRNA 전사물의 특이적 표적화 및 녹다운은 FHBL의 치료에 유익할 수 있다. 또 다른 예로서, 헌팅턴 질병 (HD)은 헌팅틴 단백질을 코딩하는 유전자에서, 비정상적 단백질을 초래하는, CAG 3 개 반복의 확장에 의해 야기된다. 본 발명의 RNA 표적화 이펙터 단백질을 이용한 돌연변이된 또는 대립유전자-특이적인 헌팅틴 단백질 인코딩 mRNA 전사물의 특이적 표적화 및 녹다운은 HD의 치료에 유익할 수 있다.
이 맥락에서, 그리고 더욱 일반적으로는 본 명세서에 기재된 바와 같은 다양한 응용을 위해서, RNA 표적화 이펙터 단백질의 분할된 버전의 사용이 예상될 수 있음이 언급된다. 실제로, 이것은 특이성을 증가시킬뿐만 아니라 전달에 유리할 수도 있다. C2c2는 C2c2 효소의 두 부분이 기능하는 C2c2를 실질적으로 포함한다는 의미에서 분할된다. 이상적으로, 분할은 항상 촉매성 도메인(들)이 영향을 받지 않도록 되어야 한다. 그 C2c2는 뉴클레아제로서 기능할 수 있거나, 촉매성 도메인에서의 전형적인 돌연변이로 인해 촉매 활성이 거의 없거나 전혀 없는 본질적으로 RNA-결합 단백질인 데드-C2c2일 수 있다.
분할된 C2c2의 각각의 절반은 이량체화 파트너에 융합될 수 있다. 제한없이, 예로서, 라파마이신 민감성 이량체화 도메인을 사용함으로써 C2c2 활성의 시간적 제어를 위한 화학적으로 유도성인 분할된 C2c2 생성이 가능하다. 따라서 C2c2는 2 개의 단편으로 분할됨으로써 화학적으로 유도성이 될 수 있고 그 라파마이신-민감성 이량체화 도메인은 C2c2의 제어된 재조립에 사용될 수 있다. 분할된 C2c2의 두 부분은 분할된 C2c2의 N' 말단 부분 및 C' 말단 부분으로 생각될 수 있다. 융합은 전형적으로 C2c2의 분할 지점에서 있다. 다시 말해서, 분할된 C2c2의 N' 말단 부분의 C' 말단은 이량체 절반 중 하나에 융합되는 반면, C' 말단 부분의 N' 말단은 다른 이량체 절반에 융합된다.
손상이 새롭게 생성된다는 의미에서 C2c2가 분할될 필요는 없다. 분할 지점은 전형적으로 인실리코로 설계되고 작제물로 클로닝된다. 함께, 분할된 C2c2의 두 부분, N' 말단 및 C' 말단 부분은 바람직하게는 야생형 아미노산(또는 이들을 인코딩하는 뉴클레오티드)의 적어도 70% 이상, 바람직하게는 적어도 80% 이상, 바람직하게는 적어도 90% 이상, 바람직하게는 적어도 95% 이상, 및 가장 바람직하게는 적어도 99% 이상의 야생형 아미노산(또는 이들을 인코딩하는 뉴클레오티드)을 포함하는 완전한 C2c2를 형성한다. 일부 트리밍이 가능할 수 있고, 돌연변이체가 예상된다. 비-기능성 도메인은 완전하게 제거될 수 있다. 중요한 것은 두 부분이 병합되어 원하는 C2c2 기능이 회복되거나 재구성될 수 있다는 것이다. 이량체는 동종이량체 또는 이종이량체일 수 있다.
특정 구현예에서, 본 명세서에 기재된 C2c2 이펙터는, 돌연변이-특이적, 또는 대립유전자-특이적 녹다운과 같은, 돌연변이-특이적, 또는 대립유전자-특이적 표적화를 위해 사용될 수 있다.
RNA 표적화 이펙터 단백질은 또한 알엔아제 활성을 증가시키거나 또는 메시지의 추가 분해를 보장하기 위해 상승 작용하는, 비-특이적 알엔아제 또는 아르고노트(Argonaute) 2와 같은 또 다른 기능성 알엔아제 도메인에 융합될 수 있다.
RNA 기능의 조절을 통한 유전자 발현의 조절
mRNA의 절단을 통한 유전자 발현에의 직접적인 영향 외에도, RNA 표적화는 또한 세포 내의 RNA 가공의 특정 측면에 영향을 미치기 위해 사용될 수 있으며, 이는 유전자 발현의 더욱 미세한 조절을 가능하게 할 수 있다. 일반적으로, 조절은 예를 들어 단백질의 결합을 차단하거나 RNA 결합 단백질을 모집하는 것과 같이, RNA에 대한 단백질의 결합을 간섭함으로써 예를 들어 매개될 수 있다. 실제로, mRNA의 스플라이싱, 수송, 국소화, 번역 및 턴오버와 같은 상이한 수준에서 조절이 보장될 수 있다. 유사하게, 치료의 맥락에서, RNA-특이적 표적화 분자를 사용함으로써 이들 각각의 수준에서 기능 부전(병원성)을 처리하는 것이 예상될 수 있다. 이들 구현예에서, RNA 표적화 단백질은, 본 명세서 기재된 c2c2의 돌연변이 형태와 같이, RNA 표적을 절단하는 능력을 잃었지만, 그것에 결합하는 능력을 유지하는 "데드" C2c2 인 것이 많은 사례에서 바람직하다.
A) 대안적인 스플라이싱
다수의 인간 유전자는 대안적인 스플라이싱의 결과로서 다수의 mRNA를 발현한다. 상이한 질병이, 발현된 유전자의 기능 상실 또는 기능 획득을 초래하는 비정상적 스플라이싱에 연결된 것으로 나타났다. 이들 질병 중 일부는 스플라이싱 결함을 야기하는 돌연변이에 의해 유발되지만, 이들 중 다수는 그렇지 않다. 하나의 치료 선택지는 스플라이싱 메커니즘을 직접 표적화하는 것이다. 본 명세서에 기재된 RNA 표적화 이펙터 단백질은 예를 들어 슬라이싱을 차단 또는 촉진하고, 엑손을 포함 또는 제외하고, 특정 이소형의 발현에 영향을 미치고/미치거나 대안적 단백질 생산물의 발현을 자극하는 데 사용될 수 있다. 이러한 적용은 아래에서 상세히 더 기재된다.
표적 RNA에 결합하는 RNA 표적화 이펙터 단백질은 스플라이싱 인자의 RNA 서열에 대한 접근을 입체적으로 차단할 수 있다. 스플라이스 부위로 표적화되는 RNA 표적화 이펙터 단백질은, 선택적으로 인접한 부위로 스플라이싱 방향을 바꾸며, 부위에서의 스플라이싱을 차단할 수 있다. 예를 들어, 5' 스플라이스 부위 결합에 결합하는 RNA 표적화 이펙터 단백질은 스플라이소솜의 U1 성분의 모집을 차단하여, 그 엑손을 건너뛰도록 촉진할 수 있다. 대안적으로, 스플라이싱 인핸서 또는 사일렌서로 표적화되는 RNA 표적화 이펙터 단백질은 표적 부위에서의 트랜스작용 조절 스플라이싱 인자의 결합을 방지하고 스플라이싱을 효과적으로 차단 또는 촉진시킬 수 있다. 엑손 제외는 본 명세서에 기재된 RNA 표적화 이펙터 단백질에 의해 엑손 근처에서 전구체 mRNA로 ILF2/3 모집함으로써 추가로 달성될 수 있다. 또 다른 예로서, 글리신이 풍부한 도메인이 hnRNP A1의 모집 및 엑손 제외를 위해 부착될 수 있다(Del Gatto-Konczak et al. Mol Cell Biol. 1999 Jan;19(1):251-60).
특정 구현예에서, gRNA의 적절한 선택을 통해 다른 스플라이스 변이체는 표적화되지 않으면서, 특정 스플라이스 변이체가 표적화될 수 있다.
일부 경우, RNA 표적화 이펙터 단백질은(예를 들어, 스플라이싱이 결함있는 경우) 슬라이싱을 촉진시키는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, RNA 표적화 이펙터 단백질은 추가의 스플라이싱을 위해 스플라이싱 조절 스템-루프를 안정화시킬 수 있는 이펙터와 관련될 수 있다. RNA 표적화 이펙터 단백질은 표적 DNA로 단백질을 모집하기 위해 특정 스플라이싱 인자에 대한 컨센서스 결합 부위 서열에 연결될 수 있다.
비정상적 스플라이싱과 관련된 질병의 예로는, 시냅스에서 기능하는 단백질의 스플라이싱을 조절하는 Nova 단백질의 손실로부터 유래된 부종양성 안진전 간대성근경련 실조(Paraneoplastic Opsoclonus Myoclonus Ataxia, 또는 POMA), 및 낭성 섬유증 막 전도도 조절제의 스플라이싱 결함에 의해 유발되어 비기능성 염화물 채널 생산이 초래되는 낭성 섬유증이 포함된다. 다른 질병에서 비정상적인 RNA 스플라이싱은 기능-획득을 초래한다. 예를 들어, 스플라이싱 결함을 일으키는, mRNA의 3'UTR에서의 CUG 3 개-반복 확장(50 내지 1500 초과 반복)으로 인해 유발되는 근긴장성이영양증에서 그러하다.
RNA 표적화 이펙터 단백질은 원하는 엑손 주위의 인트론 절제를 촉진하기 위해 5' 스플라이싱 부위에 스플라이싱 인자(예를 들어, U1)를 모집함으로써 엑손을 포함시키는 데 사용될 수 있다. 이러한 모집은 스플라이싱 활성화제로서 기능하는 아르기닌/세린 풍부 도메인과의 융합을 통해 매개될 수 있다(문헌[Gravely BR and Maniatis T, Mol Cell. 1998 (5):765-71]).
RNA 표적화 이펙터 단백질이 원하는 유전자좌에서 스플라이싱 시스템을 차단하여 엑손 인식 및 상이한 단백질 산물의 발현 방지를 초래하는 데 사용될 수 있다고 예상된다. 치료될 수 있는 장애의 예는 디스트로핀 단백질을 인코딩하는 유전자의 돌연변이에 의해 유발되는 듀시엔형 근이영양증(Duchenne muscular dystrophy, DMD)이다. 거의 모든 DMD 돌연변이는 프레임쉬프트를 일으켜 디스트로핀 번역의 손상을 초래한다. RNA 표적화 이펙터 단백질은 스플라이스 연결점 또는 엑손 스플라이싱 인핸서(ESE)와 쌍을 이룰 수 있으며, 이로써 엑손 인식을 방지하고 부분적으로 기능하는 단백질의 번역을 초래한다. 이것은 치명적인 듀시엔 표현형을 덜 심한 베커(Becker) 표현형으로 변환시킨다.
B) RNA 변형
RNA 편집은 주어진 서열의 유전자 산물의 다양성이 RNA에서의 사소한 변형에 의해 증가되는 자연적인 과정이다. 전형적으로, 변형은 아데노신(A)의 이노신(I)으로의 변환을 포함하여, 게놈에 의해 인코딩된 것과 상이한 RNA 서열을 초래한다. RNA 변형은 일반적으로 ADAR 효소에 의해 보장되며, 이로써 pre-RNA 표적은 편집될 아데노신을 함유하는 엑손 및 인트론 비-코딩 요소 사이의 염기쌍에 의해 불완전한 듀플렉스 RNA를 형성한다. A-I 편집의 대표적 예는 글루타메이트 수용체 GluR-B mRNA이고, 이로써 변화는 채널의 변형된 전도도 특성을 초래한다(문헌[Higuchi M, et al. Cell. 1993;75:1361-70]).
본 발명에 따르면, 주어진 전사물의 RNA 염기에서 전이(transition)(A<->G 또는 C<-> 변화) 또는 전환(transversion)(임의의 퓨링에서 임의의 피리미딘으로, 역도 또한 같음)를 유도하기 위해 효소적 접근이 사용된다. 전이는 A를 I로 또는 C를 U로 각각 전환시키는 아데닝(ADAR1/2), APOBEC) 또는 시토신 디아미나제(AID)를 이용함으로써 직접적으로 유도될 수 있다. 전환은 관심있는 염기에 반응성 산소 종 손상을 국소화시켜, 구아닌의 옥소-구아닌으로의 전환과 같이, 영향을 받는 염기에 화학적 변형이 부가되도록 함으로써 간접적으로 유도될 수 있다. 옥소-구아닌은 T로 인식되므로 아데닌과 염기쌍을 형성하여 번역이 영향받도록 한다. ROS-매개된 염기 손상에 대해 모집될 수 있는 단백질은 APEX 및 mini-SOG를 포함한다. 두 접근 모두의 경우 이들 이펙터는 촉매적으로 비활성인 C2c2에 융합되어 이들 돌연변이 유형이 필요한 전사물 상의 부위에 모집될 수 있다.
인간에서, ADAR1 유전자의 이형접합의 기능-삭제 돌연변이는 피부 질병, 인간 색소성 유전피부병(문헌[Miyamura Y, et al. Am J Hum Genet. 2003;73:693-9])을 유도한다. 본 발명의 RNA 표적화 이펙터 단백질은 기능 부전의 RNA 변형을 교정하는 데 사용될 수 있다고 예상된다.
RNA 아데노신 메틸라제(N(6)-메틸아데노신)는 본 발명의 RNA 표적화 이펙터 단백질에 융합되고 관심 전사물로 표적화될 수 있다고 예상된다. 이 메틸라제는 가역적인 메틸화를 야기하고 조절 역할을 하며 다수 RNA-관련 세포 경로를 조절함으로써 유전자 발현 및 세포 운명 결정에 영향을 줄 수 있다(문헌[Fu et al Nat Rev Genet. 2014;15(5):293-306]).
C) 폴리아데닐화
mRNA의 폴리아데닐화는 핵 수송, 번역 효율 및 mRNA의 안정성에 중요하며, 이들 모두뿐만 아니라 폴리아데닐화의 과정은 특정 RBP에 의존한다. 대부분의 진핵 mRNA는 전사 후 약 200 개 뉴클레오티드의 3' 폴리(A) 꼬리를 받는다. 폴리아데닐화는 폴리(A)폴리머라제의 활성을 자극하는 상이한 RNA-결합 단백질 복합체를 포함한다(문헌[Minvielle-Sebastia L et al. Curr Opin Cell Biol. 1999;11:352-7]). 본 명세서에서 제공된 RNA-표적화 이펙터 단백질은 RNA-결합 단백질과 RNA 사이의 상호 작용을 간섭하거나 촉진시키는 데 사용될 수 있다고 예상된다.
폴리아데닐화에 관여되는 결함 단백질과 연관된 질병의 예는 안구인두 근이영양증(OPMD)이다(문헌[Brais B, et al. Nat Genet. 1998;18:164-7]).
D) RNA 방출
pre-mRNA 가공 후, mRNA는 핵으로부터 세포질로 방출된다. 이것은 캐리어 복합체의 생성을 포함하는 세포 메카니즘에 의해 보장되며, 그 후 핵 공극을 통해 전위되어 mRNA를 세포질에 방출하고 이어서 캐리어를 재순환시킨다.
RNA의 방출에 역할을 하는 단백질(예를 들어, TAP)의 과도 발현은 그렇지 않으면 Xenopus에서 비효율적으로 방출되는 전사물의 방출을 증가시키는 것으로 밝혀졌다(문헌[Katahira J, et al. EMBO J. 1999;18:2593-609]).
E) mRNA 국소화
mRNA 국소화는 공간적으로 조절된 단백질 생산을 보장한다. 세포의 특정 영역으로의 전사물의 국소화는 국소화 요소에 의해 보장될 수 있다. 구체적인 구현예에서, 본 명세서에 기재된 이펙터 단백질은 관심 있는 RNA로 국소화 요소를 표적화하는 데 사용될 수 있다고 예상된다. 이펙터 단백질은 표적 전사물을 결합하고 그들을 펩티드 신호 태그에 의해 결정된 세포 내 위치로 왕복시키도록 설계될 수 있다. 더욱 구체적으로, 예를 들어, 하나 이상의 핵 국소화 신호(NLS) 및/또는 하나 이상의 핵 방출 신호(NES)에 융합된 RNA 표적화 이펙터 단백질은 RNA 국소화를 변경시키는 데 사용될 수 있다.
국소화 신호의 추가 예로는 몇몇 비대칭 세포 유형에서 세포질로의 β-액틴의 국소화를 보장하는 우편번호 결합 단백질(ZBP1), KDEL 보유 서열(소포체로의 국소화), 핵 방출 신호(세포질로의 국소화), 미토콘드리아 표적화 신호(미토콘드리아로의 국소화), 페록시솜 표적화 신호(페록시솜으로의 국소화) 및 m6A 표지/YTHDF2(p-바디로의 국소화)가 포함된다. 예상되는 다른 접근은 RNA 표적화 이펙터 단백질을 알려진 국소화의 단백질(예를 들어, 막, 시냅스)과 융합하는 것이다.
대안적으로, 본 발명에 따른 이펙터 단백질은 예를 들어 국소화-의존적 녹다운에서 사용될 수 있다. 이펙터 단백질을 적절한 국소화 신호에 융합시킴으로써 이펙터는 구체적인 세포 구획으로 표적화된다. 이 구획에 상주하는 표적 RNA만 효과적으로 표적화되고, 반면, 다른 세포 구획에 상주하지만 그렇지 않으면 동일한 표적은 표적화되지 않을 것이므로, 국소화 의존적 녹다운이 확립될 수 있다.
F) 번역
본 명세서에 기재된 RNA 표적화 이펙터 단백질은 번역을 향상 또는 억제하는 데 사용될 수 있다. 번역을 상향 조절하는 것은 세포 회로를 제어하는 매우 견고한 방식이라고 예상된다. 또한, 기능성 연구를 위해 단백질 번역 스크린은 전사 상향 조절 스크린보다 유리할 수 있는데, 이는 전사물의 상향 조절이 증가된 단백질 생산으로 번역되지 않는다는 단점을 갖는다.
본 명세서에 기재된 RNA 표적화 이펙터 단백질은 번역을 구동하는 관심 메신저 RNA의 5' 비번역 반복(5'UTR) 부근에 EIF4G와 같은 번역 개시 인자를 가져오는 데 사용될 수 있는 것으로 예상된다(비-재프로그래밍 가능 RNA 결합 단백질에 대하여 문헌[De Gregorio et al. EMBO J. 1999;18(17):4865-74]에 기재된 바와 같이). 또 다른 예로서, 세포질 폴리(A) 폴리메라제인 GLD2는 RNA 표적화 이펙터 단백질에 의해 표적 mRNA에 모집될 수 있다. 이것은 표적 mRNA의 지시된 폴리아데닐화를 가능하게 하여 번역을 자극할 것이다.
유사하게, 본 명세서에서 예상된 RNA 표적화 이펙터 단백질은 ZBP1 (문헌[Huttelmaier S, et al. Nature. 2005;438:512-5])과 같은 mRNA의 번역 억제제를 차단하는 데 사용될 수 있다. 표적 RNA의 번역 개시 부위에 결합함으로써 번역이 직접적으로 영향을 받을 수 있다.
추가적으로, 예를 들어 알엔아제 저해제와 같은 그의 분해를 방지함으로써, mRNA를 안정화시키는 단백질에 RNA 표적화 이펙터 단백질을 융합시켜, 관심있는 전사물로부터 단백질 생산을 증가시키는 것이 가능하다.
본 명세서에 기재된 RNA 표적화 이펙터 단백질은 RNA 전사물의 5'UTR 영역에서 결합하고 리보솜 형성 및 번역 시작을 방지함으로써 번역을 억제하는 데 사용될 수 있다고 예상된다.
또한, RNA 표적화 이펙터 단백질은 CCR4-NOT 데아데닐라제 복합체의 성분인 Caf1을 표적 mRNA에 모집하여 표적 전사물의 데아데닐화 및 단백질 번역의 저해를 초래하는 데 사용될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 RNA 표적화 이펙터 단백질은 치료적으로 관련 있는 단백질의 번역을 증가 또는 감소시키는 데 사용될 수 있다. RNA 표적화 이펙터 단백질이 번역을 하향 조절 또는 상향 조절하는 데 사용될 수 있는 치료적 적용의 예는 근위축성 측삭 경화증(ALS) 및 심혈관 장애에 있다. 감소된 수준의 교세포 글루타메이트 트랜스포터 EAAT2가 ALS 운동 피질 및 척수에서 보고되었을 뿐만 아니라 ALS 뇌 조직에서 다수의 비정상적인 EAAT2 mRNA 전사물이 보고되었다. EAAT2 단백질 및 기능의 손실은 ALS에서 흥분 독성의 주요 원인으로 생각되었다. EAAT2 단백질 수준 및 기능의 회복은 치료적 유익을 제공할 수 있다. 따라서, RNA 표적화 이펙터 단백질은, 예를 들어, 상기 기재된 바와 같이 번역 억제제를 차단하거나 mRNA를 안정화시킴으로써, EAAT2 단백질의 발현을 상향 조절하는 데 유익하게 사용될 수 있다. 아포지질단백질 A1은 고밀도 지질단백질(HDL)의 주요 단백질 성분이며 ApoA1 및 HDL은 일반적으로 아테롬성 동맥경화 방지제로서 고려된다. RNA 표적화 이펙터 단백질이, 예를 들어, 상기 기재된 바와 같이 번역 억제제를 차단하거나 mRNA를 안정화시킴으로써, ApoA1의 발현을 상향 조절하는 데 유익하게 사용될 수 있다고 예상된다.
G) mRNA 턴오버
번역은 mRNA 턴오버 및 조절된 mRNA 안정성에 밀접하게 연결된다. 특정 단백질이 전사물의 안정성(예를 들어, 뉴런의 ELAV/Hu 단백질, 문헌[Keene JD, 1999, Proc Natl Acad Sci U S A. 96:5-7]) 및 트리스테트라프롤린(TTP)에 관여한다고 기재되었다. 이들 단백질은 메시지가 세포질에서 분해되는 것을 방지함으로써 표적 mRNA를 안정화시킨다(문헌[Peng SS et al., 1988, EMBO J. 17:3461-70]).
본 발명의 RNA-표적화 이펙터 단백질은 mRNA 전사물을 안정화시키기 위해 작용하는 단백질의 활성을 간섭하거나 촉진하여, mRNA 턴오버가 영향을 받도록 하기 위해 사용될 수 있다고 예상될 수 있다. 예를 들어, RNA 표적화 이펙터 단백질을 사용하여 표적 RNA에 인간 TTP를 모집하는 것은 아데닐레이트-우리딜레이트-풍부한 요소(AU-풍부 요소) 매개되는 번역 억제 및 표적 분해를 가능하게 할 것이다. AU-풍부 요소는 전-암유전자, 핵 전사 인자, 및 사이토카인을 코딩하는 많은 mRNA의 3'UTR에서 발견되고 RNA 안정성을 촉진한다. 또 다른 예로서, RNA 표적화 이펙터 단백질은 또 다른 mRNA 안정화 단백질인 HuR(문헌[Hinman MN 및 Lou H, Cell Mol Life Sci 2008; 65: 3168-81])에 융합되어 표적 전사물에 그것을 모집하고 그의 수명을 연장시키거나 수명이 짧은 mRNA를 안정화시킬 수 있다.
본 명세서에 기재된 RNA-표적화 이펙터 단백질이 표적 전사물의 분해를 촉진시키는 데 사용될 수 있음이 추가로 예상된다. 예를 들어, m6A 메틸트랜스페라제는 표적 전사물에 모집되어 전사물을 P-바디에 국소화시켜 표적의 분해를 유도할 수 있다.
또 다른 예로서, 본 명세서에 기재된 RNA 표적화 이펙터 단백질은 비-특이적 엔도뉴클레아제 도메인 PilT N-말단(PIN)에 융합되어 이를 표적 전사물로 모집하고 그의 분해를 가능하게 할 수 있다.
부종양성 신경 장애(PND)-관련 뇌척수염 및 신경병증을 갖는 환자는 중추 신경계 외부의 종양에서 Hu-단백질에 대한 자가항체를 발생시킨 후(문헌[Szabo A et al. 1991, Cell.;67:325-33] 혈액-뇌 장벽을 건너는 환자이다. 본 발명의 RNA-표적화 이펙터 단백질은 mRNA 전사물에 대한 자가항체의 결합을 간섭하는 데 사용될 수 있다고 예상될 수 있다.
근긴장성 이영양증-단백질 키나제(DMPK) 유전자의 3 'UTR에서 (CUG)n의 확장에 의해 야기되는 이영양증 제1 형(DM1) 환자는 이러한 전사물의 핵 내 축적을 특징으로 한다. (CUG)n 반복으로 표적화되는 엔도뉴클레아제와 융합된 본 발명의 RNA 표적화 이펙터 단백질은 비정상적인 전사물의 이러한 축적을 저해할 수 있다고 예상된다.
H) 다-기능성 단백질과의 상호작용
일부 RNA-결합 단백질은 다양한 과정에서 기능하는 다수의 RNA상의 다수의 부위에 결합한다. 예를 들어, hnRNP A1 단백질은 엑손 스플라이싱 사일렌서 서열과 결합하여 스플라이싱 인자를 길항시키고, 텔로미어 말단과 관련되고(그에 의해 텔로미어 활성을 자극하고) miRNA와 결합하여 Drosha-매개된 가공을 촉진하고 성숙에 영향을 주는 것으로 밝혀졌다. 본 발명의 RNA-결합 이펙터 단백질은 하나 이상의 위치에서 RNA-결합 단백질의 결합을 간섭할 수 있다고 예상된다.
I) RNA 폴딩
RNA는 그의 생물학적 활성을 수행하기 위해 규정된 구조를 취한다. 대안적인 3 차 구조들 사이에서의 형태 전이는 대부분의 RNA-매개 과정에 결정적이다. 그러나, RNA 폴딩은 몇몇의 문제와 관련될 수 있다. 예를 들어, RNA는 부적절한 대안적인 형태로 폴딩되고 유지되는 경향이 있을 수 있고/있거나 올바른 3 차 구조는 대안적 구조보다 열역학적으로 충분히 유리하지 못할 수 있다. 본 발명의 RNA 표적화 이펙터 단백질, 구체적으로 절단-결함 또는 데드 RNA 표적화 단백질은 (m)RNA의 폴딩을 지시하고/하거나 그의 올바른 3 차 구조를 포획하는 데 사용될 수 있다.
세포 상태 조절에서의 RNA-표적화 이펙터 단백질의 사용
특정 구현예에서, crRNA와의 복합체 중의 C2c2는 표적 RNA에 결합 즉시 활성화되고 이어서 임의의 가까운 ssRNA 표적을 절단한다(즉, "부수적" 또는 "구경꾼" 효과). C2c2는 동족 표적에 의해 일단 프라이밍되면, 다른 (비-상보적인) RNA 분자를 절단할 수 있다. 이러한 잡다한 RNA 절단은 잠재적으로 세포 독성을 유발하거나 그렇지 않으면 세포 생리 또는 세포 상태에 영향을 줄 수 있다.
따라서, 특정 구현예에서, 본 명세서에 기재된 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물, 벡터 시스템 또는 전달 시스템은 세포 휴면 유도를 위해 사용되거나 유도에서의 사용을 위한 것이다. 특정 구현예에서, 본 명세서에 기재된 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물, 벡터 시스템 또는 전달 시스템은 세포주기 정지의 유도를 위해 사용되거나 유도에서의 사용을 위한 것이다. 특정 구현예에서, 본 명세서에 기재된 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물, 벡터 시스템 또는 전달 시스템은 세포 성장 및/또는 세포 증식의 감소를 위해 사용되거나 감소에서의 사용을 위한 것이다. 특정 구현예에서, 본 명세서에 기재된 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물, 벡터 시스템 또는 전달 시스템은 세포 아네르기의 유도를 위해 사용되거나 유도에서의 사용을 위한 것이다. 특정 구현예에서, 본 명세서에 기재된 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물, 벡터 시스템 또는 전달 시스템은 세포 아폽토시스의 유도를 위해 사용되거나 유도에서의 사용을 위한 것이다. 특정 구현예에서, 본 명세서에 기재된 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물, 벡터 시스템 또는 전달 시스템은 세포 괴사의 유도를 위해 사용되거나 유도에서의 사용을 위한 것이다. 특정 구현예에서, 본 명세서에 기재된 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물, 벡터 시스템 또는 전달 시스템은 세포 사멸 유도를 위해 사용되거나 유도에서의 사용을 위한 것이다. 특정 구현예에서, 본 명세서에 기재된 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물, 벡터 시스템 또는 전달 시스템은 프로그래밍된 세포 사멸의 유도를 위해 사용되거나 유도에서의 사용을 위한 것이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물, 벡터 시스템 또는 전달 시스템을 도입 또는 유도하는 것을 포함하는 세포 휴면 유도 방법에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물, 벡터 시스템 또는 전달 시스템을 도입 또는 유도하는 것을 포함하는 세포 주기 정지 유도 방법에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물, 벡터 시스템 또는 전달 시스템을 도입 또는 유도하는 것을 포함하는 세포 성장 및/또는 세포 증식을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물, 벡터 시스템 또는 전달 시스템을 도입 또는 유도하는 것을 포함하는 세포 아네르기 유도 방법에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물, 벡터 시스템 또는 전달 시스템을 도입 또는 유도하는 것을 포함하는 세포 아폽토시스의 유도 방법에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물, 벡터 시스템 또는 전달 시스템을 도입 또는 유도하는 것을 포함하는 세포 괴사 유도 방법에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물, 벡터 시스템 또는 전달 시스템을 도입 또는 유도하는 것을 포함하는 세포 사멸 유도 방법에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물, 벡터 시스템 또는 전달 시스템을 도입 또는 유도하는 것을 포함하는 프로그래밍된 세포 사멸 유도 방법에 관한 것이다.
본 명세서에 기재된 방법 및 용도는 치료적 또는 예방적일 수 있으며, 구체적인 세포, 세포 (하위)집단, 또는 세포/조직 유형을 표적화할 수 있다. 구체적으로, 본 명세서에 기재된 방법 및 용도는 치료적 또는 예방적일 수 있으며, 하나 이상의 구체적인 표적 RNA(예를 들어, ssRNA)와 같은 하나 이상의 표적 서열을 발현하는 구체적인 세포, 세포 (하위)집단, 또는 세포/조직 유형을 표적화할 수 있다. 제한없이, 표적 세포는 예를 들어 구체적인 전사물을 발현하는 암세포, 예를 들어 주어진 클래스의 뉴런, 예를 들어 자가면역을 야기하는 (면역) 세포, 또는 특정(예를 들어, 바이러스성) 병원체에 감염된 세포 등일 수 있다.
따라서, 특정 구현예에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물, 벡터 시스템 또는 전달 시스템을 도입 또는 유도하는 것을 포함하는, 원하지 않는 세포(숙주 세포)의 존재를 특징으로 하는 병리학적 상태를 치료하는 방법에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명은 원하지 않는 세포(숙주 세포)의 존재를 특징으로 하는 병리학적 상태를 치료하는 것을 위한, 본 명세서에 기재된 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물, 벡터 시스템 또는 전달 시스템의 용도에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명은 원하지 않는 세포(숙주 세포)의 존재를 특징으로 하는 병리학적 상태를 치료하는 것에서의 사용을 위한, 본 명세서에 기재된 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물, 벡터 시스템 또는 전달 시스템에 관한 것이다. 바람직하게는 CRISPR-Cas 시스템은 원하지 않는 세포에 특이적인 표적을 표적화함이 이해되어야 한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 암을 치료, 예방 또는 경감시키기 위한, 본 명세서에 기재된 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물, 벡터 시스템 또는 전달 시스템의 용도에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명은 암을 치료, 예방 또는 경감시키는 것에서의 사용을 위한, 본 명세서에 기재된 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물, 벡터 시스템 또는 전달 시스템에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물, 벡터 시스템 또는 전달 시스템을 도입 또는 유도하는 것을 포함하는, 암을 치료, 예방 또는 경감시키는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는 CRISPR-Cas 시스템은 암세포에 특이적인 표적을 표적화함이 이해되어야 한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 병원체에 의한 세포의 감염을 치료, 예방 또는 경감시키기 위한, 본 명세서에 기재된 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물, 벡터 시스템 또는 전달 시스템의 용도에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명은 병원체에 의한 세포의 감염을 치료, 예방 또는 경감시키는 것에서의 사용을 위한, 본 명세서에 기재된 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물, 벡터 시스템 또는 전달 시스템에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물, 벡터 시스템 또는 전달 시스템을 도입 또는 유도하는 것을 포함하는, 병원체에 의한 세포의 감염을 치료, 예방 또는 경감시키는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는 CRISPR-Cas 시스템은 병원체에 의해 감염된 세포에 특이적인 표적(예를 들어, 병원체 유래 표적)을 표적화함이 이해되어야 한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 자가면역 장애를 치료, 예방 또는 경감시키기 위한, 본 명세서에 기재된 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물, 벡터 시스템 또는 전달 시스템의 용도에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명은 자가면역 장애를 치료, 예방 또는 경감시키는 것에서의 사용을 위한, 본 명세서에 기재된 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물, 벡터 시스템 또는 전달 시스템에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물, 벡터 시스템 또는 전달 시스템을 도입 또는 유도하는 것을 포함하는, 자가면역 장애를 치료, 예방 또는 경감시키는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는 CRISPR-Cas 시스템은 자가면역 장애의 원인이 되는 세포(예를 들어, 특정 면역 세포)에 특이적인 표적을 표적화함이 이해되어야 한다.
RNA 검출 또는 단백질 검출에 있어서의 RNA-표적화 이펙터 단백질의 사용
RNA 표적화 이펙터 단백질이 생물학적 샘플에서 핵산 또는 단백질의 검출에 사용될 수 있음이 더 예상된다. 샘플은 세포 또는 무-세포일 수 있다.
노던 블롯 분석에서. 노던 블롯팅은 크기별로 RNA 샘플을 분리하기 위해 전기 영동의 사용을 포함한다. RNA 표적화 이펙터 단백질은 표적 RNA 서열을 특이적으로 결합 및 검출하는 데 사용될 수 있다.
RNA 표적화 이펙터 단백질은 또한 형광 단백질(예를 들어, GFP)에 융합되어 살아있는 세포에서 RNA 국소화를 추적하는 데 사용될 수 있다. 더욱 구체적으로, RNA 표적화 이펙터 단백질은 더 이상 RNA를 절단하지 않는다는 점에서 비활성화될 수 있다. 구체적인 구현예에서, 더욱 정확한 시각화를 보장하기 위해, 신호가 두 서브단백질 모두의 결합에 의존하는, 분할된 RNA 표적화 이펙터 단백질이 사용될 수 있다고 예상된다. 대안적으로, 다수의 RNA 표적화 이펙터 단백질 복합체가 표적 전사물에 결합할 때 재구성되는 분할된 형광 단백질이 사용될 수 있다. 전사물은 mRNA를 따라 다수의 결합 부위에 표적화되므로 형광 신호가 실제 신호를 증폭시키고 초점 식별이 가능하게 할 수 있다고 추가로 예상된다. 또 다른 대안으로서, 형광 단백질은 분할된 인테인(intein)으로부터 재구성될 수 있다.
RNA 표적화 이펙터 단백질은 예를 들어 RNA 또는 특정 스플라이스 변이체의 국소화, mRNA 전사물의 수준, 전사물의 상향- 또는 하향 조절 및 질병-특이적 진단을 결정하는 데 적합하게 사용된다. RNA 표적화 이펙터 단백질은, 예를 들어 형광 현미경 검사 또는 세포의 고-처리량 스크리닝 및 세포 분류 후 살아있는 세포의 회수를 가능하게 하는 형광-활성화된 세포 분류(FACS)와 같은, 유세포 계측법을 사용하여 (살아있는) 세포 내에서 RNA를 시각화하는 데 사용될 수 있다. 추가적으로, 스트레스, 예를 들어, 세포 상에 분자 저해제 또는 저산소 상태를 이용한 암 성장 저해, 하에서 상이한 전사물의 발현 수준을 동시에 평가할 수 있다. 또 다른 적용은 2 개의 광자 현미경을 사용하여 신경 자극 동안 시냅스 연결으로의 전사물의 국소화를 추적하는 것일 것이다.
특정 구현예에서, 본 명세서에 기재된 본 발명에 따른 성분 또는 복합체는 예를 들어, (형광으로) 표지된 C2c2 이펙터를 사용하여, 다중화된 에러-로버스트 형광 인 시츄(in situ) 혼성화(MERFISH; 문헌[Chen et al. Science; 2015; 348(6233)])에서 사용될 수 있다.
시험관내 apex 표지
세포 과정은 단백질, RNA 및 DNA 간의 분자 상호 작용의 네트워크에 의존한다. 단백질-DNA 및 단백질-RNA 상호 작용의 정확한 검출은 이러한 과정을 이해하기 위한 핵심이다. 시험관내 근접 표지 기술은 시험관내에서 관심 단백질 또는 RNA의 부근의 폴리펩티드 및 RNA를 표지하기 위해, 예를 들어, 광활성화 가능한 프로브와 조합된 친화성 태그를 이용한다. UV 조사 후, 광활성화 가능한 그룹은 태그가 부착된 분자에 매우 근접한 단백질 및 기타 분자와 반응하여 그들을 표지한다. 표지된 상호 작용 분자는 이어서 회수되고 식별될 수 있다. 본 발명의 RNA 표적화 이펙터 단백질은 예를 들어 프로브를 선택된 RNA 서열에 표적화하는 데 사용될 수 있다.
이들 응용은 또한 질병 관련 응용 또는 배양하기 어려운 세포 유형의 생체내 이미징을 위한 동물 모델에 적용될 수 있다.
본 발명은 위험요소 테스트 및 RNA-표적화된 치료법 가이드를 포함하는, 무 세포 RNA의 비-침습성 샘플링을 통한 건강 상태의 진단 및 모니터링을 위한 제제 및 방법을 제공하며, 치료의 신속한 투여가 치료 결과에 중요한 환경에서 유용하다. 일 구현예에서, 본 발명은 통상적인 약물 내성 돌연변이의 재발 및/또는 발생을 모니터링하는 것을 포함하여, 종양 RNA를 순환시키는 암 검출 방법 및 제제를 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 예를 들어 질병 진행 및 패혈증을 모니터링하기 위해 혈액 또는 혈청으로부터 직접 박테리아 종을 검출 및/또는 동정하기 위한 검출 방법 및 제제를 제공한다. 본 발명의 일 구현예에서, C2c2 단백질 및 유도체는 라이노바이러스 또는 상부 호흡기 감염과 같은 통상적인 질병을 기관지염과 같은 더욱 심각한 감염과 구별하고 진단하기 데 사용될 수 있다.
본 발명은 예를 들어, VKORC1, CYP2C9 및 CYP2C19 유전형 분석에 기반한 심근 경색 또는 뇌졸중 치료 중 항응고제의 투여에 대한 지침을 포함하여, 응급 약물유전체학을 위한 신속한 유전형분석을 위한 방법 및 제제를 제공한다.
본 발명은 식품 생산 및 전달 체인을 따라 모든 지점에서 박테리아에 의한 식품 오염을 모니터링하기 위한 제제 및 방법을 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은, 예를 들어, 식품 출처 확인 및 순도 결정에 의해, 품질 제어 및 모니터링을 제공한다. 하나의 비-제한적인 예에서, 본 발명은 동물 고기 및 해산물 종과 같은, 식품 출처를 식별하거나 확인하는 데 사용될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 법의학적 결정에서 사용된다. 예를 들어, 혈액 또는 다른 체액을 함유하는 범죄 현장 샘플. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명은 지문으로부터 핵산 샘플을 동정하는 데 사용된다.
RNA 오리가미(origami)/시험관내 조립 라인-조합론에서의 RNA-표적화 이펙터 단백질의 사용
RNA 오리가미는 RNA를 통합된 주형으로 사용하여 2-차원 또는 3-차원 구조를 생성하기 위한 나노 크기 폴딩된 구조를 지칭한다. 폴딩된 구조는 RNA에서 인코딩되며 결과로 발생한 RNA의 모양은 따라서 합성된 RNA 서열(문헌[Geary, et al. 2014. Science, 345 (6198). pp. 799-804])에 의해 결정된다. RNA 오리가미는 단백질과 같은 다른 성분을 복합체로 배열하기 위한 스캐폴드로서 작용할 수 있다. 본 발명의 RNA 표적화 이펙터 단백질은 예를 들어 적합한 가이드 RNA를 사용하여 관심 단백질을 RNA 오리가미로 표적화하는 데 사용될 수 있다.
RNA 단리 또는 정제, 강화 또는 격감에서의 RNA-표적화 이펙터 단백질의 사용
RNA 표적화 이펙터 단백질이 RNA에 복합체화될 때 RNA를 단리 및/또는 정제하는 데 사용될 수 있다는 것이 또한 예상된다. RNA 표적화 이펙터 단백질은 예를 들어, RNA-RNA 표적화 이펙터 단백질 복합체를 단리 및/또는 정제하는 데 사용될 수 있는 친화성 태그에 융합될 수 있다. 이러한 응용은 예를 들어 세포에서의 유전자 발현 프로파일의 분석에 유용하다. 구체적인 구현예에서, RNA 표적화 이펙터 단백질이 특정 비-코딩 RNA(ncRNA)를 표적화하여 그의 활성을 차단하는 데 사용될 수 있고 유용한 기능적 프로브를 제공할 수 있다고 예상될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 명세서에 기재된 이펙터 단백질은 구체적인 RNA에 대해 특이적으로 강화하는 데(안정성 증가 등을 포함하지만 이에 한정되지는 않음), 또는 대안적으로 구체적인 RNA(예를 들어 제한 없이 구체적인 스플라이스 변이체, 이소형 등과 같은)를 특이적으로 격감시키는 데 사용될 수 있다.
lincRNA 기능 및 다른 핵 RNA의 조사
siRNA와 같은 현재의 RNA 녹다운 전략은 단백질 시스템이 기작이 세포액성이기 때문에 주로 세포액의 전사물을 표적화하는 것으로 제한된다는 단점이 있다. 세포 기능에 필수적이지 않은 외인성 시스템인, 본 발명의 RNA 표적화 이펙터 단백질의 이점은 세포 내 임의의 구획에서 사용될 수 있다는 것이다. NLS 신호를 RNA 표적화 이펙터 단백질에 융합함으로써, 핵으로 유도될 수 있고 핵 RNA가 표적화되도록 할 수 있다. 예를 들어 lincRNA의 기능을 조사하는 것이 예상된다. 긴 유전자간 비-코딩 RNA(lincRNA)는 탐구가 덜 된 연구 영역이 대단히 크다. 대부분의 lincRNA는 본 발명의 RNA 표적화 이펙터 단백질을 사용하여 연구될 수 있는 아직 알려지지 않은 기능을 갖는다.
RNA 결합 단백질의 동정
특정 RNA에 결합된 단백질을 동정하는 것은 많은 RNA의 역할을 이해하는 데 유용할 수 있다. 예를 들어, 많은 lincRNA는 전사를 제어하기 위한 전사적 및 후성적 조절제와 관련된다. 어떤 단백질이 주어진 lincRNA에 결합하는지 이해하는 것은 주어진 조절 경로의 성분을 밝히는 데 도움이 될 수 있다. 본 발명의 RNA 표적화 이펙터 단백질은 결합된 단백질을 국소적으로 바이오틴으로 표지하기 위해 특정 전사물에 바이오틴 리가제를 모집하도록 설계될 수 있다. 그 다음 단백질을 풀다운(pull down)하고 질량 분광법으로 분석하여 그들을 동정할 수 있다.
RNA 상의 복합체 조립 및 기질 왕복
본 발명의 RNA 표적화 이펙터 단백질은 RNA상에 복합체를 조립하는 데 추가로 사용될 수 있다. 이것은 다수의 관련 단백질(예를 들어, 구체적인 합성 경로의 성분)로 RNA 표적화 이펙터 단백질을 기능화함으로써 달성될 수 있다. 대안적으로, 다수의 RNA 표적화 이펙터 단백질은 이러한 상이한 관련 단백질로 기능화될 수 있고 동일하거나 인접한 표적 RNA로 표적화될 수 있다. RNA 상에 복합체를 조립하는 것에 대한 유용한 응용은 예를 들어 단백질 간의 기질 왕복을 촉진하는 것이다.
합성 생물학
생물학적 시스템의 개발은 임상적 적용을 포함하여 넓은 유용성을 갖는다. 본 발명의 프로그래밍 가능한 RNA 표적화 이펙터 단백질은 예를 들어 암-연결된 RNA를 표적 전사물로 사용하여 표적화된 세포 사멸을 위해 독성 도메인의 분할된 단백질에 융합되어 사용될 수 있음이 예상된다. 추가로, 예를 들어, 키나제 또는 다른 효소와 같은 적절한 이펙터와의 융합 복합체로, 단백질-단백질 상호 작용을 수반하는 경로가 합성 생물학 시스템에서 영향을 받는다.
단백질 스플라이싱: 인테인
단백질 스플라이싱은 인테인으로 지칭되는, 개입 폴리펩티드가 엑스테인으로 지칭되는, 그 측면에 배치되는 폴리펩티드로부터 자체 절제뿐만 아니라 뒤이은 엑스테인의 연결을 촉매하는 번역-후 과정이다. 2 개 이상의 본 명세서에 기재된 RNA 표적화 이펙터 단백질의 표적 전사물 상의 조립은 분할된 인테인의 방출을 지시함으로써(Topilina and Mills Mob DNA. 2014 Feb 4;5(1):5), mRNA 전사물의 존재에 대한 직접적 계산 및, 대사 효소 또는 (전사 경로의 다운스트림 작동을 위한) 전사 인자와 같은, 단백질 산물의 후속적인 방출이 가능하도록 하는 데 사용될 수 있다. 이 응용은 합성 생물학(상기 참고) 또는 대규모 생물생산(특정 조건에서만 생산물 생산하는)에서 상당한 관련성이 있을 수 있다.
유도성이고, 투여되고 자가-비활성화인 시스템
일 구현예에서, 본 발명의 RNA 표적화 이펙터 단백질 및 이펙터 성분을 포함하는 융합 복합체는 유도성, 예를 들어 광 유도성 또는 화학적 유도성이도록 설계된다. 이러한 유도성은 시간 상 원하는 순간에 이펙터 성분의 활성화를 가능하게 한다.
광 유도성은 예를 들어 융합을 위해 CRY2PHR/CIBN 쌍이 사용되는 융합 복합체를 설계함으로써 달성된다. 이 시스템은 살아있는 세포에서 단백질 상호 작용에 대한 광 유도에 특히 유용하다(문헌[Konermann S, et al. Nature. 2013;500:472-476]).
화학적 유도성은 예를 들어 융합을 위해 FKBP/FRB(FK506 결합 단백질/FKBP 라파마이신 결합) 쌍이 사용되는 융합 복합체를 설계함으로써 제공된다. 이 시스템을 사용하면 라파마이신이 단백질 결합에 필요하다(문헌[Zetsche et al. Nat Biotechnol. 2015;33(2):139-42 describes the use of this system for Cas9]).
추가적으로, DNA로서 세포 내에 도입될 때, 본 발명의 RNA 표적화 이펙터 단백질은 테트라사이클린 또는 독시사이클린 제어되는 전사 활성화(Tet-온 및 Tet-오프 발현 시스템), 예를 들어 엑디손 유도성 유전자 발현 시스템 및 아라비노스-유도성 유전자 발현 시스템과 같은 호르몬 유도성 유전자 발현 시스템과 같은, 유도성 프로모터에 의해 조절될 수 있다. RNA로서 전달될 때, RNA 표적화 이펙터 단백질의 발현은 테트라사이클린과 같은 소분자를 감지할 수 있는 리보스위치를 통해 조절될 수 있다(문헌[Goldfless et al. Nucleic Acids Res. 2012;40(9):e64]에 기재된 바와 같음).
일 구현예에서, 본 발명의 RNA 표적화 이펙터 단백질의 전달은 세포 내의 단백질 또는 crRNA의 양을 변화시키도록 조절될 수 있고, 이에 의해 원하는 효과 또는 임의의 원하지 않는 표적외 효과의 규모를 변화시킬 수 있다.
일 구현예에서, 본 명세서에 기재된 RNA 표적화 이펙터 단백질은 자가-비활성화되도록 설계될 수 있다. mRNA 또는 복제 RNA 치료제(문헌[Wrobleska et al Nat Biotechnol. 2015 Aug; 33(8): 839-841])로서의 RNA로서 세포에 전달될 때, 그들은 자체 RNA를 파괴함으로써 발현 및 후속 효과를 자가-비활성화하고, 이에 의해 상주 및 잠재적인 원하지 않는 효과를 감소시킬 수 있다.
본 명세서에 기재된 RNA 표적화 이펙터 단백질의 추가의 생체내 적용에 대해서는 참조로서 본 명세서에 포함된, 문헌[Mackay JP et al (Nat Struct Mol Biol. 2011 Mar;18(3):256-61), 문헌[Nelles et al (Bioessays. 2015 Jul;37(7):732-9)] 및 문헌[Abil Z and Zhao H (Mol Biosyst. 2015 Oct;11(10):2658-65)])을 참조한다. 구체적으로, 본 발명의 특정 구현예에서, 바람직하게는 촉매적으로 비활성인 C2c2를 사용함으로써 특정 구현예에서 다음의 응용이 예상된다: 번역 향상(예를 들어, C2c2-번역 촉진 인자 융합(예를 들어, eIF4 융합)); 번역 억제(예를 들어, 리보솜 결합 부위를 표적화하는 gRNA); 엑손 건너뛰기(예를 들어, 스플라이스 공여체 및/또는 수용체 부위를 표적화하는 gRNA); 엑손 포함(예를 들어, 구체적인 엑손 스플라이스 공여체 및/또는 수용체 부위를 표적화하는 gRNA가 포함되거나 스플라이소솜 성분(예를 들어, U1 snRNA)에 융합되거나 이를 모집하는 C2c2); RNA 국소화 접근(예를 들어, C2c2-마커 융합(예를 들어, EGFP 융합)); RNA 국소화 변경(예를 들어, C2c2-국소화 신호 융합(예를 들어, NLS 또는 NES 융합)); RNA 분해(이 경우 C2c2의 활성에 의존하는 경우 촉매적으로 비활성인 C2c2는 사용되지 않고, 대안적으로 증가된 특이성을 위해, 분할된 C2c2가 사용될 수 있음); 예를 들어 gRNA의 분해 또는 gRNA의 기능성 부위에의 결합에 의해(아마도 C2c2-신호 서열 융합에 의한 재국소화에 의해 특정 부위에서 적정하는), 비-코딩 RNA 기능의 저해(예를 들어, miRNA)에 의한 억제.
본 명세서에서 이전에 기재되고 실시예에서 입증된 바와 같이, C2c2 기능은 crRNA의 5' 또는 3' 연장 및 crRNA 루프의 연장에 대해 견고하다. 따라서 MS2 루프 및 다른 모집 도메인은, 복합체 형성에 영향을 미치지 않고 표적 전사물에 결합하지 않으면서 crRNA에 부가될 수 있는 것으로 예상된다. 다양한 이펙터 도메인의 모집을 위한 crRNA에 대한 이러한 변형은 상기 기재된 RNA 표적화된 이펙터 단백질의 사용에서 적용 가능하다.
실시예에서 입증된 바와 같이, C2c2, 구체적으로 LshC2c2는 RNA 파지에 대한 저항성을 매개할 수 있다. 따라서, C2c2는, 레트로바이러스(예를 들어, HIV와 같은 렌티바이러스), HCV, 에볼라 바이러스 및 지카(Zika) 바이러스를 포함하나 이에 한정되지 않는 RNA만 갖는 병원체에 대해 예를 들어 동물, 인간 및 식물을 면역화하는 데 사용될 수 있다고 예상된다.
본 발명자는 C2c2가 자체 어레이를 처리(절단)할 수 있음을 보여주었다. 이것은 R597A, H602A, R1278A 및 H1283A로부터 선택되는 하나 이상의 변형과 같은, 하나 이상의 돌연변이된 아미노산 잔기 R597, H602, R1278 및 H1283을 함유하는 야생형 C2c2 단백질 및 돌연변이된 C2c2 단백질 모두에 적용된다. 따라서, 상이한 표적 전사물 및/또는 응용을 위해 설계된 다수의 crRNA가 단일 pre-crRNA로서 또는 하나의 프로모터에 의해 구동되는 단일 전사물로서 전달될 수 있는 것으로 예상된다. 이러한 전달 방법은 실질적으로 더 소형이고, 합성이 더 쉽고, 바이러스 시스템으로 전달하기가 더 쉽다는 이점을 갖는다. 바람직하게, 본 명세서에 기재된 아미노산 넘버링은 Lsh C2c2 단백질을 참조한다. 정확한 아미노산 위치는 Lsh C2c2의 오솔로그들에 대해 달라질 수 있으며, 이는 당업계에 공지되고, 본 명세서의 다른 곳에서 기재된 바와 같이, 단백질 정렬에 의해 적절하게 결정될 수 있음이 이해될 것이다.
본 발명의 일 양태는 또한, 예를 들어 시험관내, 생체내 또는 생체외에서, 원핵 세포 또는 진핵 세포에서 하나 이상의 유전자 또는 하나 이상의 유전자 산물의 (단백질) 발현을 변경하거나 조작하기 위한, 게놈 또는 트랜스크립톰 설계 제작에 있어서 본 명세서에 기재된 조성물 및 시스템의 방법 및 용도를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 세포에서 표적 RNA의 (단백질) 발현을 조절, 예를 들어 감소시키기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 대상 방법에서, RNA의 전사, 안정성 및/또는 번역을 간섭하는 본 발명의 C2c2 시스템이 제공된다.
특정 구현예에서, 유효량의 C2c2 시스템은 RNA를 절단하거나 그렇지 않으면 RNA 발현을 저해하는 데 사용된다. 이와 관련하여, 시스템은 siRNA 및 shRNA와 유사한 용도를 가지므로 이러한 방법으로 대체될 수도 있다. 방법은, 제한없이, 예를 들어 간섭 리보핵산(예를 들어, siRNA 또는 shRNA) 또는 그의 전사 주형, 예를 들어 shRNA를 인코딩하는 DNA,에 대한 대체물로서의 C2c2 시스템의 사용을 포함한다. C2c2 시스템은 예를 들어 표적 세포를 포함하는 포유류에 투여됨으로써 표적 세포로 도입된다.
유리하게는, 본 발명의 C2c2 시스템은 특이적이다. 예를 들어, 간섭 리보핵산(siRNA 또는 shRNA와 같은) 폴리뉴클레오티드 시스템이 설계 및 안정성 문제 및 표적외 결합에 의해 성가신 반면, 본 발명의 C2c2 시스템은 높은 특이성으로 설계될 수 있다.
불안정화된 C2c2
특정 구현예에서, 본 명세서에 기재된 본 발명에 따른 이펙터 단백질(CRISPR 효소; C2c2)은 불안정화 도메인(DD)과 관련되거나 이에 융합된다. 일부 구현예에서, DD는 ER50이다. 이 DD에 대한 상응하는 안정화 리간드는, 일부 구현예에서, 4HT이다. 이와 같이, 일부 구현예에서, 적어도 하나의 DD 중 하나는 ER50이고 이에 대한 안정화 리간드는 4HT 또는 CMP8이다. 일부 구현예에서, DD는 DHFR50이다. 이 DD에 대한 상응하는 안정화 리간드는, 일부 구현예에서 TMP이다. 이와 같이, 일부 구현예에서, 적어도 하나의 DD 중 하나는 DHFR50이고 이에 대한 안정화 리간드는 TMP이다. 일부 구현예에서, DD는 ER50이다. 이 DD에 대한 상응하는 안정화 리간드는, 일부 구현예에서 CMP8이다. 따라서 CMP8은 ER50 시스템에서 4HT에 대한 대안적인 안정화 리간드일 수 있다. CMP8 및 4HT가 경쟁 물질에서 사용될 수 있거나/사용되어야 하는 것이 가능할 수 있는 동안, 일부 세포 유형은 이들 두 리간드 중 하나 또는 다른 것에 더 민감할 수 있으며, 본 개시내용 및 당업계의 지식으로부터 당업자는 CMP8 및/또는 4HT를 사용할 수 있다.
일부 구현예에서, 하나 또는 2 개의 DD는 CRISPR 효소의 C-말단에 융합되면서 하나 또는 2 개의 DD는 CRISPR 효소의 N-말단에 융합될 수 있다. 일부 구현예에서, 적어도 2 개의 DD가 CRISPR 효소와 관련되고 DD는 동일한 DD, 즉 DD는 상동이다. 따라서, 2 개(또는 둘 이상)의 DD는 ER50 DD일 수 있다. 이는 일부 구현예에서 바람직하다. 대안적으로, 2 개(또는 둘 이상)의 DD는 DHFR50 DD일 수 있다. 이는 또한 일부 구현예에서 바람직하다. 일부 구현예에서, 적어도 2 개의 DD가 CRISPR 효소와 관련되고 DD는 상이한 DD, 즉 DD는 이종성이다. 따라서 DDS 중 하나는 ER50 일 수 있고 하나 이상의 DD 또는 임의의 다른 DD는 DHFR50일 수 있다. 이종성인 2 개 이상의 DD를 갖는 것은 더 큰 수준의 분해 제어를 제공할 것이기 때문에 유리할 수 있다. N 또는 C-말단에 하나 초과의 DD를 직렬 융합한 것은 분해를 향상시킬 수 있고; 이러한 직렬 융합은 예를 들어 ER50-ER50-C2c2 또는 DHFR-DHFR-C2c2일 수 있다. 모든 안정화 리간드의 부재 하에 높은 수준의 분해가 발생하고, 하나의 안정화 리간드의 부재 및 다른(또는 또 다른) 안정화 리간드의 존재 하에 중간 수준의 분해가 발생하고, 2 개(또는 그 이상 중 2 개)의 안정화 리간드 존재 하에 낮은 수준의 분해가 발생할 것임이 예상된다. N-말단 ER50 DD 및 C-말단 DHFR50 DD를 가짐으로써 또한 제어가 제공될 수 있다.
일부 구현예에서, CRISPR 효소의 DD와의 융합은 DD와 CRISPR 효소 사이의 링커를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 GlySer 링커이다. 일부 구현예에서, DD-CRISPR 효소는 적어도 하나의 핵 방출 신호(NES)를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, DD-CRISPR 효소는 2 개 이상의 NES를 포함한다. 일부 구현예에서, DD-CRISPR 효소는 적어도 하나의 핵 국소화 신호(NLS)를 포함한다. 이것은 NES에 추가될 수 있다. 일부 구현예에서, CRISPR 효소는 CRISPR 효소와 DD 사이의 링커로서 또는 그 일부로서, 국소화(핵 도입 또는 방출) 신호를 포함하거나 이로 본질적으로 구성되거나 이로 구성된다. HA 또는 Flag 태그는 링커로서 본 발명의 범위 내에 또한 있다. 출원인은 NLS 및/또는 NES를 링커로 사용하고 또한 글리신 세린 링커를 GS만큼 짧게부터 (GGGGS)3까지 사용한다.
불안정화 도메인은 광범위한 단백질에 불안정성을 부여하는 일반적인 유용성을 갖는다; 예를 들어, 참조로서 본 명세서에 포함된 문헌[Miyazaki, J Am Chem Soc. Mar 7, 2012; 134(9): 3942-3945] 참고. CMP8 또는 4-하이드록시타목시펜은 불안정화 도메인일 수 있다. 더욱 일반적으로, N-말단 규칙에 의해 불안정화 잔기인, 포유류 DHFR의 온도-민감 돌연변이체(DHFRts)는 허용 온도에서는 안정하지만 37℃에서는 불안정한 것으로 밝혀졌다. DHFRts를 발현하는 세포에 포유류 DHFR에 대한 고-친화성 리간드인 메토트렉세이트를 첨가하면 부분적으로 단백질 분해가 억제되었다. 이것은 소분자 리간드가 그렇지 않으면 세포에서의 분해를 위해 표적화되는 단백질을 안정화시킬 수 있다는 중요한 입증이었다. mTOR(FRB*)의 FRB 도메인의 불안정한 돌연변이체를 안정화시키고 융합된 키나제인 GSK-3β.6,7의 기능을 회복시키는 데 라파마이신 유도체가 사용되었다. 이 시스템은 리간드-의존적 안정성이 복잡한 생물학적 환경에서 특정 단백질의 기능을 조절하는 매력적인 전략에 해당한다는 것을 입증하였다. 단백질 활성을 제어하는 시스템은 라파마이신에 의해 유도되는 FK506-결합 단백질 및 FKBP12의 이량체화에 의해 유비퀴틴 상보성이 발생하는 경우 DD가 기능적으로 되는 것을 포함할 수 있다. 인간 FKBP12 또는 ecDHFR 단백질의 돌연변이체는 각각 그들의 고-친화성 리간드인 Shield-1 또는 트리메토프림(TTP)이 부재하는 경우 대사적으로 불안정해지도록 설계 제작될 수 있다. 이들 돌연변이체는 본 발명의 실시에 유용한 가능한 불안정화 도메인(DD) 중 일부이고, CRISPR 효소와의 융합으로서 DD의 불안정성은 프로테아솜에 의한 전체 융합 단백질의 CRISPR 단백질 분해를 부여한다. Shield-1 및 TMP는 용량-의존적 방식으로 DD에 결합하고 DD를 안정화시킨다. 에스트로겐 수용체 리간드 결합 도메인(ERLBD, ERS1의 305 내지 549 잔기)은 또한 불안정화 도메인으로서 설계 제작될 수 있다. 에스트로겐 수용체 신호 전달 경로는 유방암과 같은 다양한 질병에 관여하기 때문에, 경로는 널리 연구되어 왔으며 수많은 에스트로겐 수용체의 작용제 및 길항제가 개발되었다. 따라서, ERLBD 및 약물의 양립 가능한 쌍이 알려져 있다. ERLBD의 돌연변이체에는 결합하지만 야생형에는 하지 않는 리간드가 있다. 3 개의 돌연변이(L384M, M421G, G521R)12를 인코딩하는 이들 돌연변이체 도메인 중 하나를 사용함으로써 내인성 에스트로겐-민감성 네트워크를 변동시키지 않는 리간드를 사용하여 ERLBD-유래 DD의 안정성을 조절하는 것이 가능하다. ERLBD를 더 불안정화하고 그것을 잠재적인 DD 후보로서 구성하기 위해 추가적인 돌연변이(Y537S)가 도입될 수 있다. 이 4-돌연변이체는 유리한 DD 개발이다. 돌연변이체 ERLBD는 CRISPR 효소에 융합될 수 있으며 그 안정성은 리간드를 사용하여 조절되거나 변동될 수 있고, 이에 의해 CRISPR 효소는 DD를 갖는다. 또 다른 DD는 Shield1 리간드에 의해 안정화된 돌연변이된 FKBP 단백질에 기반한 12-kDa(107-아미노산) 태그일 수 있다; 예를 들어, 문헌[Nature Methods 5,(2008)] 참고. 예를 들어 DD는 합성, 생물학적으로 비활성인 소분자인 Shield-1에 결합하여 이에 의해 가역적으로 안정화되는 변형된 FK506 결합 단백질 12(FKBP12)일 수 있다; 예를 들어, 문헌[Banaszynski LA, Chen LC, Maynard-Smith LA, Ooi AG, Wandless TJ. A rapid, reversible, and tunable method to regulate protein function in living cells using synthetic small molecules. Cell. 2006;126:995-1004]; 문헌[Banaszynski LA, Sellmyer MA, Contag CH, Wandless TJ, Thorne SH. Chemical control of protein stability and function in living mice. Nat Med. 2008;14:1123-1127]; 문헌[Maynard-Smith LA, Chen LC, Banaszynski LA, Ooi AG, Wandless TJ. A directed approach for engineering conditional protein stability using biologically silent small molecules. The Journal of biological chemistry. 2007;282:24866-24872]; 및 문헌[Rodriguez, Chem Biol. Mar 23, 2012; 19(3): 391-398]을 참고-이들 모두는 본 명세서에 참조로서 포함되며 본 발명의 실시에 있어서 CRISPR 효소와 관련시키는 선택된 DD에서 본 발명의 실시에 활용될 수 있다. 알게 될 수 있는 바와 같이, 당업계의 지식은 다수의 DD를 포함하고, DD는 CRISPR 효소와 관련될 수 있고, 예를 들어 유리하게는 링커를 이용하여 이에 융합될 수 있고, 이에 의해 DD는 리간드의 존재 하에 안정화될 수 있고 이것이 부재하는 경우 DD가 불안정화되며, 이에 의해 CRISPR 효소는 완전히 불안정화되거나, DD는 리간드의 부재 하에 안정화될 수 있고 리간드가 존재하는 경우 DD가 불안정화되며; DD는 CRISPR 효소 및 그에 따른 CRISPR-Cas 복합체 또는 시스템이 조절 또는 제어되도록-말하자면 켜지거나 꺼지도록 하여, 이에 의해 예를 들어, 생체내 또는 시험관내 환경에서, 시스템의 조절 또는 제어의 수단을 제공한다. 예를 들어, 관심 단백질이 DD 태그와의 융합으로서 발현되는 경우, 이것은 예를 들어 프로테아솜에 의해 불안정화되고 세포 내에서 급속히 분해된다. 따라서, 안정화 리간드의 부재는 D 관련된 Cas가 분해되도록 한다. 새로운 DD가 관심 단백질에 융합된 경우, 그의 불안정성이 관심 단백질에 부여되어 전체 융합 단백질의 급속한 분해를 초래한다. Cas에 대한 최고조 활성은 표적외 효과를 감소시키기 위해 때때로 유익하다. 따라서, 높은 활성의 짧은 폭발이 선호된다. 본 발명은 이러한 최고조를 제공할 수 있다. 일부 의미에서 시스템은 유도성이다. 일부 다른 의미에서, 시스템은 안정화 리간드의 부재 하에 억제되고 안정화 리간드의 존재 하에 탈-억제된다.
RNA-표적화RNA-표적화-CRISPR 시스템의 식물 및 효모에의 응용
정의:
일반적으로, 용어 "식물"은 특징적으로 세포 분열에 의해 성장하고, 엽록체를 함유하고, 셀룰로스가 포함된 세포벽을 갖는, 식물계의 임의의 다양한 광합성하는, 진핵성, 단세포 또는 다세포 생물에 관한 것이다. 용어, 식물은 단자엽 및 쌍자엽 식물을 포함한다. 구체적으로, 식물은 제한 없이 속씨 식물 및 겉씨 식물, 예를 들어 아카시아, 알팔파, 아마란스, 사과, 살구, 아티초크, 물푸레나무, 아스파라거스, 아보카도, 바나나, 보리, 콩, 비트, 자작나무, 너도밤나무, 블랙베리, 블루베리, 브로콜리, 방울 양배추(Brussel's sprout), 양배추, 카놀라, 칸탈루프, 당근, 카사바, 콜리플라워, 삼나무, 곡물, 셀러리, 밤, 체리, 중국 배추, 감귤류, 클레멘타인, 클로버, 커피, 옥수수, 목화, 동부, 오이, 사이프러스, 가지, 느릅나무, 꽃상추, 유칼립투스, 회향, 무화과, 전나무, 제라늄, 포도, 자몽, 땅콩, 꽈리, 검 헴록(gum hemlock), 히코리(hickory), 케일, 키위, 콜라비, 낙엽송, 상추, 대파, 레몬, 라임, 로커스트(locust), 소나무, 공작고사리(maidenhair), 메이즈, 망고, 단풍나무, 멜론, 기장, 버섯, 겨자, 견과류, 참나무, 귀리, 기름야자, 오크라, 양파, 오렌지, 장식용 식물 또는 꽃 또는 나무, 파파야, 야자, 파슬리, 파스닙(parsnip), 콩, 복숭아, 땅콩, 배, 피트(peat), 후추, 감, 나무콩, 소나무, 파인애플, 플랜테인(plantain), 자두, 석류, 감자, 호박, 라디키오(radicchio), 무, 유채, 라스베리, 벼, 호밀, 수수, 홍화, 갯버들, 대두, 시금치, 가문비 나무, 호박, 딸기, 사탕무, 사탕수수, 해바라기, 고구마, 스위트콘, 귤, 녹차, 담배, 토마토, 나무, 라이밀(triticale), 잔디풀(turf grass), 순무, 포도나무, 호두, 물냉이, 수박, 밀, 참마(yam), 주목나무, 및 주키니를 포함하는 것으로 의도된다. 용어, 식물은 뿌리, 잎 및 고등 식물을 특징짓는 다른 기관의 결여에 의해서 주로 일차적으로 연합된 광독립영양생물인, 조류를 또한 포함한다.
본 명세서에 기재된 RNA-표적화RNA-표적화 시스템을 이용하는 유전자 발현 조절 방법은 원하는 특성을 본질적으로 임의의 식물에 부여하는 데 사용될 수 있다. 광범위한 종류의 식물 및 식물 세포 시스템은, 본 개시 내용의 핵산 작제물 및 상기 언급된 다양한 형질전환 방법을 이용하여 본 명세서에 기재된 원하는 생리학적 및 작물학적 특징들을 위해, 설계 제작될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 설계 제작을 위한 표적 식물 및 식물 세포로는, 이에 한정되지 않지만, 단자엽성 및 쌍자엽성 식물이 포함되며, 예를 들어 곡물 작물(예를 들어, 밀, 메이즈, 벼, 기장, 보리), 과실 작물(예를 들어, 토마토, 사과, 배, 딸기, 오렌지), 사료 작물(예를 들어, 알팔파), 뿌리 채소 작물(예를 들어, 당근, 감자, 사탕무, 참마), 옆채류 작물(예를 들어, 상추, 시금치)을 포함하는 작물; 화훼 식물(예를 들어, 페튜니아, 장미, 국화), 침엽수 및 소나무(예를 들어, 소나무, 전나무, 가문비나무); 식물환경복원에 사용되는 식물(예를 들어, 중금속 축적 식물); 기름 작물(예를 들어, 해바라기, 유채씨) 및 실험용 목적으로 사용되는 식물(예를 들어, 아라비돕시스)이 포함된다. 따라서, 방법 및 CRISPR-Cas 시스템은 광범위한 식물, 예를 들어 다음 목에 속하는 쌍자엽 식물과 같은 식물: 마그니오랄레스(Magniolales), 일리시알레스(Illiciales), 녹나무목(Laurales), 후추목(Piperales), 아리스토키알레스(Aristochiales), 수련목(Nymphaeales), 미나리아재비목(Ranunculales), 파프베랄레스(Papeverales), 사라세니아세(Sarraceniaceae), 트로코덴드랄레스(Trochodendrales), 하마멜리달레스(Hamamelidales), 유코미알레스(Eucomiales), 레이트네리알레스(Leitneriales), 마이리칼레스(Myricales), 참나무목(Fagales), 카수아리날레스(Casuarinales), 석죽목(Caryophyllales), 바탈레스(Batales), 마디풀목(Polygonales), 갯질경이목(Plumbaginales), 오이과목(Dilleniales), 테알레스(Theales), 아욱목(Malvales), 쐐기풀목(Urticales), 오예목(Lecythidales), 제비꽃목(Violales), 버드나무목(Salicales), 십자화목(Capparales), 진달래목(Ericales), 디아펜살레스(Diapensales), 에베날레스(Ebenales), 앵초목(Primulales), 장미목(Rosales), 콩목(Fabales), 포도스테말레스(Podostemales), 할로라갈레스(Haloragales), 도금양목(Myrtales), 층층나무목(Cornales), 프로테아목(Proteales), 산 탈레스(San tales), 라플레시알레스(Rafflesiales), 노박덩굴목(Celastrales), 대극목(Euphorbiales), 갈매나무목(Rhamnales), 무환자나무목(Sapindales), 저그란달레스(Juglandales), 쥐손이풀목(Geraniales), 원지목(Polygalales), 움벨랄레스(Umbellales), 용담목(Gentianales), 꽃고비목(Polemoniales), 꿀풀목(Lamiales), 질경이목(Plantaginales), 현삼목(Scrophulariales), 초롱꽃목(Campanulales), 꼭두서니목(Rubiales), 산토끼꽃목(Dipsacales), 및 국화목(Asterales) 에 걸쳐 사용될 수 있으며; 방법 및 CRISPR-Cas 시스템은 다음 목에 속하는 것과 같은 단자엽 식물: 택사목(Alismatales), 자러폰목(Hydrocharitales), 나자달레스(Najadales), 트리우리달레스(Triuridales), 닭의장풀목(Commelinales), 에리오카우랄레스(Eriocaulales), 레스티오날레스(Restionales), 벼목(Poales), 준칼레스(Juncales), 사초목(Cyperales), 타이팔레스(Typhales), 브로멜리알레스(Bromeliales), 생강목(Zingiberales), 아레칼레스(Arecales), 사이클란탈레스(Cyclanthales), 판다너스목(Pandanales), 천남성목(Arales), 릴리알레스(Lilliales), 및 난목(Orchid ales), 또는 겉씨식물문(Gymnospermae)에 속하는 식물, 예를 들어 구과목(Pinales), 은행목(Ginkgoales), 소철목(Cycadales), 아라우카리알레스(Araucariales), 쿠페르살레스(Cupressales) 및 네탈레스(Gnetales) 목에 속하는 것들을 이용하여 사용될 수 있다.
본 명세서에 기재된 RNA-표적화RNA-표적화 CRISPR 시스템 및 사용 방법은 다음의 쌍자엽, 단자엽 또는 겉씨식물속의 비-제한적인 리스트에 포함되는 광범위한 식물 종에 걸쳐 사용될 수 있다: 아트로파(Atropa), 알세오다프네(Alseodaphne), 아나카디움(Anacardium), 땅콩속(Arachis), 베일스미에디아(Beilschmiedia), 배추속(Brassica), 카르타무스(Carthamus), 댕댕이덩굴속(Cocculus), 파두속(Croton), 오이속(Cucumis), 감귤속(Citrus), 수박속(Citrullus), 고추속(Capsicum), 카사란터스(Catharanthus), 코코스(Cocos), 커피나무속(Coffea), 호박속(Cucurbita), 당근속(Daucus), 두그에티아(Duguetia), 에쉬솔지아(Eschscholzia), 피쿠스속(Ficus), 딸기속(Fragaria), 글라우시움(Glaucium), 글리신(Glycine), 고시피움(Gossypium), 해바라기속(Helianthus), 히비어(Hevea), 사리풀속(Hyoscyamus), 상추속(Lactuca), 란돌피아(Landolphia), 아마속(Linum), 릿시(Litsea), 토마토속(Lycopersicon), 루피너스(Lupinus), 마니호트(Manihot), 마요라나(Majorana), 말루스(Malus), 개자리속(Medicago), 담배속(Nicotiana), 올리아(Olea), 파르테늄(Parthenium), 양귀비속(Papaver), 페르세아(Persea), 파세올루스(Phaseolus), 피스타시아(Pistacia), 피섬(Pisum), 파이루스(Pyrus), 살구속(Prunus), 라파누스(Raphanus), 피마자속(Ricinus), 세네시오(Senecio), 방기속(Sinomenium), 스테파니아(Stephania), 시나피스(Sinapis), 가지속(Solanum), 테오브로마(Theobroma), 트리폴리움(Trifolium), 트리고넬라(Trigonella), 나비나물속(Vicia), 빙카속(Vinca), 빌리스(Vilis), 및 비냐(Vigna); 및 파속(Allium), 쇠풀속(Andropogon), 아라그로스티스(Aragrostis), 아스파라거스(Asparagus), 아베나속(Avena), 시노돈(Cynodon), 엘라에이스(Elaeis), 페스투카(Festuca), 페스툴로리움(Festulolium), 헤테로칼리스(Heterocallis), 호르데움(Hordeum), 렘나(Lemna), 롤리움(Lolium), 무사(Musa), 벼속(Oryza), 수수속(Panicum), 파네세툼(Pannesetum), 플레움(Phleum), 포아(Poa), 세칼레(Secale), 소검(Sorghum), 트리티쿰(Triticum), 옥수수속(Zea), 침엽수속(Abies), 컨닝하미아(Cunninghamia), 마황속(Ephedra), 가문비나무속(Picea), 피누스(Pinus), 및 미송속(Pseudotsuga)의 속.
RNA 표적화 CRISPR 시스템 및 사용 방법은 광범위한 범위의 "조류" 또는 "조류 세포"에 걸쳐 사용될 수도 있으며; 예를 들어, 홍조 식물(홍조류), 녹조 식물(녹조류), 갈조 식물(갈조류), 규조 식물(규조류), 유스티그마토파이타(Eustigmatophyta) 및 와편모조류를 포함하는 몇몇 진핵성 문 뿐만 아니라 원핵성 남조문(남조류)으로부터 선택된 조류를 포함한다. 용어 "조류"는 예를 들어 다음으로부터 선택된 조류를 포함한다: 암포라(Amphora), 아나베나(Anabaena), 아닉스트로데스미스(Anikstrodesmis), 보트리오코커스(Botryococcus), 센털돌말속(Chaetoceros), 클라미도모나스(Chlamydomonas), 클로렐라(Chlorella), 클로로코쿰(Chlorococcum), 시클로텔라(Cyclotella), 실린드로테카(Cylindrotheca), 두날리엘라(Dunaliella), 에밀리아나(Emiliana), 유글레나(Euglena), 헤마토코쿠스(Hematococcus), 이소크리시스(Isochrysis), 모노크리시스(Monochrysis), 모노라피디움(Monoraphidium), 나노클로리스(Nannochloris), 나노클로롭시스(Nannnochloropsis), 나비쿨라(Navicula), 네프로클로리스(Nephrochloris), 네프로셀미스(Nephroselmis), 니트치아(Nitzschia), 노듈리아(Nodularia), 노스톡(Nostoc), 오오크로모나스(Oochromonas), 오오시스티스(Oocystis), 오실라토리아(Oscillartoria), 파블로바(Pavlova), 페오닥틸럼(Phaeodactylum), 플레이토모나스(Playtmonas), 플웨로크리시스(Pleurochrysis), 포르히라(Porhyra), 슈도아나바에나(Pseudoanabaena), 피라미모나스(Pyramimonas), 스티코코커스(Stichococcus), 시네코코커스(Synechococcus), 시네코시스티스(Synechocystis), 테트라셀미스(Tetraselmis), 탈라시오시라(Thalassiosira), 및 트리코데스뮴(Trichodesmium).
식물의 부분, 즉 "식물 조직"은 본 발명의 방법에 따라 처리되어 개선된 식물을 생산할 수 있다. 식물 조직은 또한 식물 세포를 포함한다. 본 명세서에서 사용된 용어 "식물 세포"는, 온전한 전체 식물 상태로의, 또는 성장 배지 또는 완충액 내 현탁 상태의, 배지 또는 한천 상에서의 시험관내 조직 배양에서 성장한 단리된 형태 상태로의, 또는 예를 들어 식물 조직, 식물 기관 또는 전체 식물과 같은 고도의 조직화된 단위의 일부로서 중 어느 하나의 살아있는 식물의 개별 단위를 지칭한다.
"원형질체"는 예를 들어 기계적 또는 효소적 수단을 이용하여 그의 보호성 세포벽이 완전히 또는 부분적으로 제거된 식물 세포를 지칭하며, 적절한 성장 조건 하에서 그의 세포벽을 재형성하고, 증식 및 재생하여 전체 식물로 성장할 수 있는, 살아있는 식물의 온전한 생화학적 컴피턴트 단위를 초래한다.
용어 "형질전환"은 식물 숙주가 아그로박테리아 또는 다양한 화학적 또는 물리적 방법 중 하나를 이용하여 DNA의 도입에 의해 유전적으로 변형되도록 하는 공정을 대체로 지칭한다. 본 명세서에 사용된 용어 "식물 숙주"는 식물의 임의의 세포, 조직, 기관 또는 자손을 포함하는 식물을 지칭한다. 많은 적합한 식물 조직 또는 식물 세포가 형질전환될 수 있으며, 이에 한정되지 않지만, 원형질체, 체세포배(somatic embryo), 화분, 잎, 묘목, 줄기, 가피(calli), 기는 줄기(stolon), 미소괴경, 및 싹을 포함할 수 있다. 식물 조직은 또한 유성으로 생성되든 또는 무성으로 생성되든, 이러한 식물, 종자, 자손, 번식체의 임의의 클론, 및 절단물 또는 종자와 같은 이들 중 임의의 후손을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 용어 "형질전환된"은, 외래 DNA 분자, 예를 들어 작제물이 그 안으로 도입된 세포, 조직, 기관 또는 생물을 지칭한다. 도입된 DNA 분자는 수령 세포, 조직, 기관 또는 생물의 게놈 DNA 내로 통합될 수 있어서, 도입된 DNA 분자가 이후의 자손에게 전달되도록 한다. 이들 구현예에서, "형질전환된" 또는 "유전자 도입된" 세포 또는 식물은, 세포 또는 식물의 자손, 및 교배에서 부모로서 이러한 형질전환된 식물을 이용하고 도입된 DNA분자의 존재로부터 초래되는 변경된 표현형을 나타내는 육종 프로그램으로부터 생산된 자손을 또한 포함할 수 있다. 바람직하게는, 유전자 도입 식물은 생식력이 있으며, 유성 생식을 통하여 도입된 DNA를 자손에게 전달할 수 있다.
용어 "자손", 예를 들어 유전자 도입 식물의 자손은, 식물 또는 유전자 도입된 식물로부터 태어난, 얻은, 또는 유래된 것이다. 도입된 DNA 분자는 수령 세포 내로 일시적으로 도입되어 도입된 DNA 분자가 이후의 자손에 의해 유전되지 않을 수 있고 따라서 "유전자 도입된"이라고 여겨지지 않는다. 이에 따라, 본 명세서에서 사용된, "비-유전자 도입" 식물 또는 식물 세포는 그의 게놈 내로 안정하게 통합된 외래 DNA를 함유하지 않는 식물이다.
본 명세서에 사용된 용어 "식물 프로모터"는 그의 기원이 식물 세포이든 아니든, 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. 예시적인 적합한 식물 프로모터로는, 이에 한정되지 않지만, 식물, 식물 바이러스, 및 박테리아, 예를 들어 식물 세포에서 발현되는 유전자를 포함하는 아그로박테리움 또는 리조비움으로부터 수득되는 것들이 포함된다.
본 명세서에 사용된 "균류 세포"는 균류 계 내에서 임의의 유형의 진핵 세포를 지칭한다. 균류 계 내의 문(phyla)은 자낭균류(Ascomycota), 담자균류(Basidiomycota), 블라스토클라디아균류(Blastocladiomycota), 호상균류(Chytridiomycota), 글로메로균류(Glomeromycota), 미포자충(Microsporidia) 및 네오칼리마스트릭스균류(Neocallimastigomycota)를 포함한다. 균류 세포는 효모, 곰팡이, 및 사상 균류를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 균류 세포는 효모 세포이다.
본 명세서에 사용된 용어 "효모 세포"는 자낭균류 및 담자균류 문 내의 임의의 균류 세포를 지칭한다. 효모 세포는 출아 효모 세포, 분열 효모 세포, 및 곰팡이 세포를 포함할 수 있다. 이들 생물에 제한되지 않으면서, 실험실 및 산업적 환경에서 사용되는 많은 유형의 효모는 자낭균문의 일부이다. 일부 구현예에서, 효모 세포는 에스. 세레비시에(S. cerervisiae), 클루이베로마이세스 마르시아누스(Kluyveromyces marxianus), 또는 이삿첸키아 오리엔탈리스(Issatchenkia orientalis) 세포이다. 다른 효모 세포는 제한 없이, 칸디다 종(예를 들어, 칸디다 알비칸스(Candida albicans)), 야로이아 종(예를 들어, 야로이아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)), 피키아 종(예를 들어, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)), 클루이베로마이세스 종(예를 들어, 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 및 클루이베로마이세스 마르시아누스), 뉴로스포라 종(예를 들어, 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)), 푸사리움 종(예를 들어, 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum)), 및 이삿첸키아 종(예를 들어, 이삿첸키아 오리엔탈리스, a.k.a. 피키아 쿠드리아바제빌(Pichia kudriavzevii) 및 칸디다 아시도테르모필룸(Candida acidothermophilum))을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 균류 세포는 사상 균류 세포이다. 본 명세서에 사용된 용어 "사상 균류 세포"는 실 모양으로 자라는 임의의 유형의 균류 세포, 즉, 균사 또는 균사체를 지칭한다. 사상 균류 세포의 예로는 제한 없이 누룩곰팡이 종(Aspergillus spp.)(예를 들어, 아스페르길루스 나이거(Aspergillus niger)), 트리코더마 종(Trichoderma spp.)(예를 들어, 트리코더마 리세이(Trichoderma reesei)), 리조푸스 종(Rhizopus spp.)(예를 들어, 리조푸스 오리재(Rhizopus oryzae)), 및 모르티에렐라 종(Mortierella spp.)(예를 들어, 모르티에렐라 이사벨리나)가 포함될 수 있다.
일부 구현예에서, 균류 세포는 산업용 균주이다. 본 명세서에서 사용된 "산업용 균주"는 산업적 공정, 예를 들어 상업적 또는 산업적 규모에서의 생산물의 생산에 사용되거나 그로부터 단리된 균주 세포의 임의의 균주를 지칭한다. 산업용 균주는 산업적 공정에서 전형적으로 사용되는 균류 종을 지칭할 수 있거나, 비-산업적 목적에도 사용될 수 있는(예를 들어, 실험실 연구) 균류 종의 단리물을 지칭할 수 있다. 산업적 공정의 예로는 (예를 들어, 식품 또는 음료 제품의 생산에서의) 발효, 증류, 바이오연료 생산, 화합물의 생산 및 폴리펩티드의 생산이 포함될 수 있다. 산업용 균주의 예는 제한 없이, JAY270 및 ATCC4124를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 균류 세포는 배수체 세포이다. 본 명세서에서 사용된 "배수체" 세포는 그의 게놈이 하나 초과의 카피로 존재하는 임의의 세포를 지칭할 수 있다. 배수체 세포는 천연적으로 배수체 상태로 발견되는 세포의 유형을 지칭할 수 있거나, 배수체 상태로 존재하도록 유도된 세포를 지칭할 수 있다(예를 들어, 특이적 조절, 변경, 비활성화, 활성화, 또는 감수분열, 세포질 분열, 또는 DNA 복제의 변형을 통해). 배수체 세포는 그의 전체 게놈이 배수체인 세포를 지칭할 수 있거나, 구체적인 관심 게놈 유전자좌에서 배수체인 세포를 지칭할 수 있다. 이론에 얽매이기 원하지 않지만, 가이드RNA의 풍부는 반수체 세포에서보다 배수체 세포의 게놈 설계 제작에서 더욱 종종 속도-제한 성분일 수 있으며, 이에 따라 본 명세서에 기재된 C2c2 CRISPR 시스템을 사용하는 방법은 특정 균류 세포 유형 사용을 활용할 수 있는 것으로 생각된다.
일부 구현예에서, 균류 세포는 이배체 세포이다. 본 명세서에서 사용된 "이배체" 세포는 그의 게놈이 2 개의 카피로 존재하는 임의의 세포를 지칭할 수 있다. 이배체 세포는 천연적으로 이배체 상태로 발견되는 세포의 유형을 지칭할 수 있거나, 이배체 상태로 존재하도록 유도된 세포를 지칭할 수 있다(예를 들어, 특이적 조절, 변경, 비활성화, 활성화, 또는 감수분열, 세포질 분열, 또는 DNA 복제의 변형을 통해). 예를 들어, 에스. 세레비시에 균주 S228C는 반수체 또는 이배체 상태로 유지될 수 있다. 이배체 세포는 그의 전체 게놈이 이배체인 세포를 지칭할 수 있거나, 구체적인 관심 게놈 유전자좌에서 이배체인 세포를 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, 균류 세포는 반수체 세포이다. 본 명세서에서 사용된 "반수체" 세포는 그의 게놈이 하나의 카피로 존재하는 임의의 세포를 지칭할 수 있다. 반수체 세포는 천연적으로 반수체 상태로 발견되는 세포의 유형을 지칭할 수 있거나, 반수체 상태로 존재하도록 유도된 세포를 지칭할 수 있다 (예를 들어, 특이적 조절, 변경, 비활성화, 활성화, 또는 감수분열, 세포질 분열, 또는 DNA 복제의 변형을 통해). 예를 들어, 에스. 세레비시에 균주 S228C는 반수체 또는 이배체 상태로 유지될 수 있다. 반수체 세포는 그의 전체 게놈이 반수체인 세포를 지칭할 수 있거나, 구체적인 관심 게놈 유전자좌에서 반수체인 세포를 지칭할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 "효모 발현 벡터"는 RNA 및/또는 폴리펩타이드를 인코딩하는 하나 이상의 서열을 함유하는 핵산을 지칭하며, 핵산(들)의 발현을 제어하는 임의의 원하는 요소뿐만 아니라, 효모 세포 내부에서의 발현 벡터의 복제 및 유지를 가능하게 하는 임의의 요소를 추가로 함유할 수 있다. 많은 적합한 효모 발현 벡터 및 그의 특징은 당업계에 알려져 있다; 예를 들어, 다양한 벡터 및 기법이 문헌[Yeast Protocols, 2nd edition, Xiao, W., ed. (Humana Press, New York, 2007)] 및 문헌[Buckholz, R.G. and Gleeson, M.A. (1991) Biotechnology (NY) 9(11): 1067-72]에 예시되어 있다. 효모 벡터는 제한 없이, 동원체(CEN) 서열, 자율 복제 서열(ARS), 프로모터, 예를 들어, 관심 서열 또는 유전자에 작동 가능하게 연결된, RNA 폴리메라제 III 프로모터, RNA 폴라머라제 III 터미네이터와 같은 터미네이터, 복제 기원, 및 마커 유전자(예를 들어, 영양요구성, 항생제, 또는 다른 선택가능한 마커)를 함유할 수 있다. 효모에서의 이용을 위한 발현 벡터의 예로는, 플라스미드, 효모 인공 염색체, 2μ 플라스미드, 효모 통합성 플라스미드, 효모 복제성 플라스미드, 셔틀 벡터, 및 에피솜 플라스미드가 포함될 수 있다.
식물 및 식물 세포의 게놈 내에서의 RNA 표적화 CRISPR 시스템 성분의 안정한 통합
구체적인 구현예에서, RNA 표적화 CRISPR 시스템의 성분을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 식물 세포의 게놈 내로 안정한 통합을 위해 도입되는 것이 예상된다. 이들 구현예에서, 형질전환 벡터 또는 발현 시스템의 설계는, 가이드 RNA 및/또는 RNA 표적화 유전자(들)가 언제, 어디에서 어떤 조건 하에서 발현되는지에 따라 조정될 수 있다.
구체적인 구현예에서, RNA 표적화 CRISPR 시스템의 성분을 식물 세포의 게놈 DNA 내로 안정적으로 도입하는 것이 예상된다. 추가적으로 또는 대안적으로, RNA 표적화 CRISPR 시스템의 성분을 식물 세포소기관, 예를 들어 이에 한정되지 않지만, 색소체, 미토콘드리아 또는 엽록체의 DNA 내로 안정한 통합을 위하여 도입하는 것이 예상된다.
식물 세포의 게놈 내로의 안정한 통합을 위한 발현 시스템은 하나 이상의 다음 요소를 함유할 수 있다: 가이드 RNA 및/또는 RNA 표적화 효소를 식물 세포에서 발현하는 데 사용될 수 있는 프로모터 요소; 발현을 향상시키는 5' 비번역 영역; 특정 세포, 예를 들어 단자엽 세포 내 발현을 추가로 향상시키는 인트론 요소; 가이드 RNA 및/또는 RNA 표적화 유전자 서열 및 다른 원하는 요소를 하나 이상 삽입하기 위하여 편리한 제한 부위를 제공하는 다중-클로닝 부위; 및 발현된 전사물의 효율적인 종결을 제공하는 3' 비번역 영역.
발현 시스템의 요소는 플라스미드 또는 형질전환 벡터와 같은 원형, 또는 선형 이중 가닥 DNA와 같은 비-원형 중 어느 하나인 하나 이상의 발현 작제물 상에 있을 수 있다.
구체적인 구현예에서, RNA 표적화 CRISPR 발현 시스템은 적어도 다음을 포함하며:
(a) 식물에서 표적 서열과 혼성화하는 가이드 RNA(gRNA)를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열로, 여기서 가이드 RNA는 가이드 서열 및 직접 반복 서열을 포함하는 것, 및
(b) RNA 표적화 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열,
여기서 성분 (a) 또는 (b)는 동일하거나 상이한 작제물 상에 위치되며, 이로 인해 상이한 뉴클레오티드 서열은 식물 세포 내에서 작동 가능한 동일하거나 상이한 조절 요소의 제어 하에 있을 수 있다.
RNA 표적화 CRISPR 시스템의 성분을 함유하는 DNA 작제물(들), 및 적용가능한 경우, 주형 서열은 각종 통상의 기법에 의해 식물, 식물 일부, 또는 식물 세포의 게놈 내로 도입될 수 있다. 공정은 일반적으로 적합한 숙주 세포 또는 숙주 조직을 선택하는 단계, 작제물(들)을 숙주 세포 또는 숙주 조직 내로 도입하는 단계, 및 식물 세포 또는 그로부터의 식물을 재생하는 단계를 포함한다.
구체적인 구현예에서, DNA 작제물은, 이에 한정되지 않지만, 식물 세포 원형질체의 전기천공, 미세주입, 에어로졸 빔 주사와 같은 기법을 이용하여 식물 세포 내로 도입될 수 있거나, DNA 작제물은 DNA 유전자 총(particle bombardment)과 같은 바이오리스틱 방법을 이용하여 식물 조직에 직접 도입될 수 있다(문헌[Fu et al., Transgenic Res. 2000 Feb;9(1):11-9] 또한 참고). 유전자 총의 기초는 관심 유전자/들로 코팅된 입자를 세포를 향해 가속화하는 것으로, 이는 입자에 의한 원형질의 침투 및 전형적으로 게놈 내로의 안정한 통합을 초래한다(예를 들어, 문헌[Klein et al, Nature (1987), Klein et al, Bio/Technology (1992), Casas et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993)] 참고).
구체적인 구현예에서, RNA 표적화 CRISPR 시스템의 성분을 함유하는 DNA 작제물은 아그로박테리움-매개된 형질전환에 의해 식물 내로 도입될 수 있다. DNA 작제물은 적합한 T-DNA 측면 배치 영역과 조합될 수 있으며, 통상의 아그로박테리움 투메파시엔스 숙주 벡터 내로 도입될 수 있다. 외래 DNA는 식물을 감염시킴으로써 또는 하나 이상의 Ti(종양-유도) 플라스미드를 함유하는, 아그로박테리움 박테리아와 함께 식물 원형질체를 인큐베이션함으로써 식물의 게놈 내로 포함될 수 있다(예를 들어, 문헌[Fraley et al., (1985), Rogers et al., (1987) and U.S. Pat. No. 5,563,055] 참고).
식물 프로모터
식물 세포 내 적절한 발현을 보장하기 위하여, 본 명세서에 기재된 C2c2 CRISPR 시스템의 성분은 전형적으로 식물 프로모터, 즉 식물 세포 내에서 작동 가능한 프로모터의 제어 하에 위치된다. 상이한 유형의 프로모터의 이용이 예상된다.
구조적 식물 프로모터는, 오픈 리딩 프레임(open reading frame)(ORF)을 발현할 수 있는 프로모터로, 이는 식물의 모든 또는 거의 모든 발생 단계 동안, 모든 또는 거의 모든 식물 조직에서 제어한다("구조적 발현"으로 지칭됨). 구조적 프로모터의 비-제한적인 일 예는 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터이다. 본 발명은 RNA 서열을 변형하는 방법을 예상하고 또한 이와 같이 식물 생분자의 발현을 조절하는 것을 예상한다. 따라서 본 발명의 구체적인 구현예에서 조절될 수 있는 프로모터의 제어 하에 하나 이상의 RNA 표적화 CRISPR 시스템 요소를 위치시키는 것이 유리하다. "조절되는 프로모터"는 구조적으로가 아닌, 시간적으로- 및/또는 공간적으로-조절되는 방식으로 유전자 발현을 지시하는 프로모터를 지칭하며, 조직-특이적, 조직-선호된 및 유도성 프로모터를 포함한다. 상이한 프로모터는 상이한 조직 또는 세포 유형에서, 또는 상이한 발생 단계에서, 또는 상이한 환경 조건에 반응하여 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 구체적인 구현예에서, 하나 이상의 RNA 표적화 CRISPR 성분은 구조적 프로모터, 예를 들어 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터의 제어 하에 발현된다. 조직-선호된 프로모터는 구체적인 식물 조직 내의 특정 세포 유형 내, 예를 들어, 잎 또는 뿌리 내의 맥관 세포 또는 종자의 특정 세포 내에서의 향상된 발현을 표적화하는 데 활용될 수 있다. RNA 표적화 CRISPR 시스템에서의 이용을 위한 구체적인 프로모터의 예는 문헌[Kawamata et al., (1997) Plant Cell Physiol 38:792-803]; 문헌[Yamamoto et al., (1997) Plant J 12:255-65]; 문헌[Hire et al, (1992) Plant Mol Biol 20:207-18], 문헌[Kuster et al, (1995) Plant Mol Biol 29:759-72], 및 문헌[Capana et al., (1994) Plant Mol Biol 25:681-91]에서 발견된다.
유도성이며 유전자 편집 또는 유전자 발현의 시공간적 제어를 가능하게 하는 프로모터의 예는 에너지의 형태를 이용할 수 있다. 에너지의 형태는 이에 한정되지 않지만, 소리 에너지, 전자기 방사, 화학 에너지 및/또는 열 에너지를 포함할 수 있다. 유도성 시스템의 예로는 테트라사이클린 유도성 프로모터(Tet-온 또는 Tet-오프), 소분자 2-하이브리드 전사 활성화 시스템(FKBP, ABA, 등), 또는 광 유도성 시스템(피토크롬, LOV 도메인, 또는 크립토크롬), 예를 들어 서열-특이적 방식으로 전사 활성에서의 변화를 지시하는 광 유도성 전사 이펙터(LITE)가 포함된다. 광 유도성 시스템의 성분은 RNA 표적화 CRISPR 효소, 광-반응성 시토크롬 이형이량체(예를 들어, 애기장대 유래), 및 전사 활성화/억제 도메인을 포함할 수 있다. 유도성 DNA 결합 단백질 및 그의 사용 방법의 추가적인 예는 US 61/736465 및 US 61/721,283에 제공되며, 이들은 그 전체로 본 명세서에 참조로서 포함된다.
구체적인 구현예에서, 일시적 또는 유도성 발현은 예를 들어, 화학물질-조절되는 프로모터를 이용함으로써 달성될 수 있으며, 즉 이에 의해 외인성 화학물질의 적용이 유전자 발현을 유도한다. 유전자 발현의 조절은 화학물질-억제성 프로모터에 의해 수득될 수도 있으며, 여기서 화학물질의 적용은 유전자 발현을 억제한다. 화학물질-유도성 프로모터는, 이에 한정되지 않지만, 벤젠 술폰아미드 제초제 약해경감제에 의해 활성화되는, 메이즈 ln2-2 프로모터(문헌[De Veylder et al., (1997) Plant Cell Physiol 38:568-77]), 발아 전 제초제로서 사용된 소수성 친전자성 화합물에 의해 활성화되는, 메이즈 GST 프로모터(GST-ll-27, WO93/01294), 및 살리실산에 의해 활성화되는 담배 PR-1 프로모터(문헌[Ono et al., (2004) Biosci Biotechnol Biochem 68:803-7])를 포함한다. 항생제에 의해 조절되는 프로모터, 예를 들어 테트라사이클린-유도성 및 테트라사이클린-억제성 프로모터(문헌[Gatz et al., (1991) Mol Gen Genet 227:229-37]; 미국 특허 5,814,618 및 5,789,156) 또한 본 명세서에서 사용될 수 있다.
특정 식물 세포소기관으로의 전위 및/또는 그에서의 발현
발현 시스템은 특정 식물 세포소기관으로의 전위 및/또는 식물 세포소기관에서의 발현을 위한 요소를 포함할 수 있다.
엽록체 표적화
구체적인 구현예에서, RNA 표적화 CRISPR 시스템은 엽록체 유전자의 발현 및/또는 번역을 특이적으로 변형시키거나, 엽록체에서의 발현을 보장하는 데 사용되는 것으로 예상된다. 이 목적을 위해, 엽록체 형질전환 방법 또는 RNA 표적화 CRISPR 성분의 엽록체로의 구획화를 이용한다. 예를 들어, 색소체 게놈 내 유전적 변형의 도입은 화분을 통한 유전자 흐름과 같은 생물안전성 문제를 감소시킬 수 있다.
엽록체 형질전환 방법은 당업계에 알려져 있으며 유전자 총, PEG 처리, 및 미세주입을 포함한다. 추가적으로, 형질전환 카세트의 핵 게놈으로부터 색소체로의 전위를 수반하는 방법이 WO2010061186에 기재된 바와 같이 사용될 수 있다.
대안적으로, 하나 이상의 RNA 표적화 CRISPR 성분을 식물 엽록체로 표적화하는 것이 예상된다. 이는 발현 작제물 내로, RNA 표적화 단백질을 인코딩하는 서열의 5' 영역에 작동 가능하게 연결된, 엽록체 수송 펩티드(CTP) 또는 색소체 수송 펩티드를 인코딩하는 서열을 포함시킴으로써 달성된다. CTP는 엽록체 내로의 전위 동안 가공 단계에서 제거된다. 발현된 단백질의 엽록체 표적화는 당업자에게 잘 알려져 있(예를 들어, 문헌[Protein Transport into Chloroplasts, 2010, Annual Review of Plant Biology,Vol. 61: 157-180] 참고). 이러한 구현예에서, 하나 이상의 가이드 RNA를 식물 엽록체로 표적화하는 것이 또한 바람직하다. 엽록체 국소화 서열을 이용하여 가이드 RNA를 엽록체 내로 전위하는 데 사용될 수 있는 방법 및 작제물이 예를 들어 US20040142476에 기재되어 있으며, 이는 본 명세서에 참조로서 포함된다. 작제물의 이러한 변형은 본 발명의 발현 시스템 내로 포함되어 RNA 표적화-가이드 RNA를 효율적으로 전위시킬 수 있다.
CRISPR-RNA 표적화 시스템을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 조류 세포 내 도입.
유전자 도입 조류(또는 유채와 같은 다른 식물)는 식물성 기름 또는 바이오연료, 예를 들어 알콜(특히 메탄올 및 에탄올), 또는 다른 생산물의 생산에서 특히 유용할 수 있다. 이들은 기름 또는 바이오연료 산업에서의 이용을 위해 높은 수준의 기름 또는 알콜을 발현 또는 과발현하도록 설계 제작될 수 있다.
US8945839는 Cas9를 이용하여 미세-조류(클라미도모나스 레인하티(Chlamydomonas reinhardtii) 세포) 종)을 설계 제작하는 방법을 기재한다. 유사한 도구를 사용하여, 본 명세서에 기재된 RNA 표적화 CRISPR 시스템의 방법은 클라미도모나스 종 및 다른 조류 상에 적용될 수 있다. 구체적인 구현예에서, RNA 표적화 단백질 및 가이드 RNA(들)는 Hsp70A-Rbc S2 또는 Beta2-튜불린과 같은 구조적 프로모터의 제어 하에서 RNA 표적화 단백질을 발현하는 벡터를 사용하여 발현되는 조류 내에 도입된다. 가이드 RNA는 T7 프로모터를 함유하는 벡터를 사용하여 선택적으로 전달된다. 대안적으로, RNA 표적화 mRNA 및 시험관내 전사된 가이드 RNA는 조류 세포로 전달될 수 있다. 전기천공 프로토콜은 GeneArt 클라미도모나스 설계 제작 키트로부터 권장된 표준 프로토콜과 같이, 당업자에게 이용 가능하다.
RNA 표적화 성분을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 효소 세포 내 도입
구체적인 구현예에서, 본 발명은 효모 세포에서의 RNA 편집을 위한 RNA 표적화 CRISPR 시스템의 이용에 관한 것이다. RNA 표적화 CRISPR 시스템 성분을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 데 사용될 수 있는 효모 세포를 형질전환하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 문헌[Kawai et al., 2010, Bioeng Bugs. 2010 Nov-Dec; 1(6): 395-403)]에 의해 검토되어 있다. 비-제한적인 예로는 리튬 아세테이트 처리(이는 캐리어 DNA 및 PEG 처리를 추가로 포함할 수 있음), 유전자 총 또는 전기천공에 의한 효모 세포의 형질전환이 포함된다.
식물 및 식물 세포 내에서의 RNA 표적화 CRISP 시스템 성분의 일시적 발현
구체적인 구현예에서, 가이드 RNA 및/또는 RNA 표적화 유전자는 식물 세포 내에서 일시적으로 발현되는 것이 예상된다. 이들 구현예에서, RNA 표적화 CRISPR 시스템은, 가이드 RNA 및 RNA 표적화 단백질 모두가 세포 내에 존재하는 때에만 RNA 표적 분자의 변형을 보장할 수 있어서, 게놈 발현이 추가로 제어될 수 있다. RNA 표적화 효소의 발현이 일시적이므로, 이러한 식물 세포로부터 생성된 식물은 전형적으로 외래 DNA를 함유하지 않는다. 구체적인 구현예에서 RNA 표적화 효소는 식물 세포에 의해 안정하게 발현되고 가이드 서열이 일시적으로 발현된다.
구체적으로 선호되는 구현예에서, RNA 표적화 CRISPR 시스템 성분은 식물 바이러스 벡터를 사용하여 식물 세포 내로 도입될 수 있다(문헌[Scholthof et al. 1996, Annu Rev Phytopathol. 1996;34:299-323]). 추가의 구체적인 구현예에서, 상기 바이러스 벡터는 DNA 바이러스 유래의 벡터이다. 예를 들어, 제미니바이러스(예를 들어, 양배추 잎말림 바이러스, 콩 황색 왜소 바이러스, 밀 왜소 바이러스, 토마토 잎말림 바이러스, 메이즈 줄무늬병 바이러스, 담배 잎말림 바이러스, 또는 토마토 골든 모자이크 바이러스) 또는 나노바이러스(예를 들어, 누에콩 괴사성 황색 바이러스). 다른 구체적인 구현예에서, 상기 바이러스 벡터는 RNA 바이러스 유래의 벡터이다. 예를 들어, 토브라바이러스(tobravirus)(예를 들어, 담배 얼룩 바이러스, 담배 모자이크 바이러스), 포텍스바이러스(potexvirus)(예를 들어, 감자 바이러스 X), 또는 호르데이바이러스(hordeivirus)(예를 들어, 보리 반엽 모자이크 바이러스). 식물 바이러스의 복제 게놈은 비-통합성 벡터이고, 이는 GMO 식물의 생산을 피한다는 맥락에서 관심 대상이다.
구체적인 구현예에서, RNA 표적화 CRISPR 작제물의 일시적 발현에 사용되는 벡터는 예를 들어 pEAQ 벡터이고, 이는 원형질체 내에서 아그로박테리움-매개 일시적 발현을 위해 조정된다(문헌[Sainsbury F. et al., Plant Biotechnol J. 2009 Sep;7(7):682-93]). 게놈 위치의 정확한 표적화는, CRISPR 효소를 발현하는 안정한 유전자 도입 식물에서 gRNA를 발현하는 변형된 양배추 잎말림 바이러스(CaLCuV) 벡터를 이용하여 입증되었다(Scientific Reports 5, Article number: 14926 (2015), doi:10.1038/srep14926).
구체적인 구현예에서, 가이드 RNA 및/또는 RNA 표적화 유전자를 인코딩하는 이중-가닥 DNA 단편은 식물 세포 내로 일시적으로 도입될 수 있다. 이러한 구현예에서, 도입된 이중-가닥 DNA 단편은 세포 내 RNA 분자(들)를 변형하기에는 충분한 양으로 제공되지만, 고려된 기간이 지나거나 1 회 이상의 세포 분열 후에는 지속되지 않는다. 식물에서의 직접 DNA 전달 방법은 당업자에 의해 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Davey et al. Plant Mol Biol. 1989 Sep;13(3):273-85] 참고).
다른 구현예에서, RNA 표적화 단백질을 인코딩하는 RNA 폴리뉴클레오티드는 식물 세포 내로 도입되고, 이는 이후 숙주 세포에 의해 번역되고 가공되어(적어도 하나의 가이드 RNA 존재 하에서) RNA 분자(들) 세포를 변형시키기에 충분한 양의 단백질을 생성하지만 고려된 기간이 지나거나 1 회 이상의 세포 분열 후에는 지속되지 않는다. 일시적 발현을 위하여 mRNA를 식물 원형질체로 도입하는 방법은 당업자에게 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Gallie, Plant Cell Reports (1993), 13;119-122] 참고). 상기 기재된 상이한 방법들의 조합이 또한 예상된다.
RNA 표적화 CRISPR 성분의 식물 세포로의 전달
구체적인 구현예에서, RNA 표적화 CRISPR 시스템의 하나 이상의 성분을 식물 세포로 직접적으로 전달하는 것이 관심 대상이다. 이것은, 그중에서도, 비-유전자 도입 식물의 생성을 위해 관심 대상이다(아래 참고). 구체적인 구현예에서, 하나 이상의 RNA 표적화 성분이 식물 또는 식물 세포 외부에서 제조되고 세포로 전달된다. 예를 들어 구체적인 구현예에서, RNA 표적화 단백질은 식물 세포로의 도입 전에 시험관내에서 제조된다. RNA 표적화 단백질은 당업자에게 알려진 다양한 방법에 의해 제조될 수 있으며, 재조합 생산을 포함한다. 발현 후, RNA 표적화 단백질이 단리되고, 필요한 경우 재폴딩되고, 정제되고 선택적으로 임의의 정제 태그, 예를 들어 His-태그를 제거하기 위해 처리된다. 미정제의, 부분적으로 정제된, 또는 더욱 완전하게 정제된 RNA 표적화 단백질이 일단 수득되면, 단백질은 식물 세포로 도입될 수 있다.
구체적인 구현예에서, RNA 표적화 단백질은 관심 RNA를 표적화하는 가이드 RNA와 혼합되어 사전-조립된 리보뉴클레오단백질을 형성한다.
개별적인 성분 또는 사전-조립된 리보뉴클레오단백질은 전기 천공을 통해, RNA 표적화-관련된 유전자 산물 코팅된 입자를 이용한 유전자총에 의해, 화학적 형질감염에 의해, 또는 세포막을 통과하여 수송하는 일부 다른 수단에 의해 식물 세포 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 사전-조립된 CRISPR 리보뉴클레오단백질을 이용한 식물 원형질체의 형질감염은 식물 게놈이 표적화된 변형을 보장하는 것으로 입증되었다(문헌[Woo et al. Nature Biotechnology, 2015; DOI: 10.1038/nbt.3389]에 기재된 바와 같음). 이들 방법은 식물에서 RNA 분자의 표적화된 변형을 달성하기 위해 변형될 수 있다.
구체적인 구현예에서, RNA 표적화 CRISPR 시스템 성분은 나노입자를 사용하여 식물 세포 내로 도입된다. 단백질 또는 핵산으로서, 또는 이의 조합으로 중 어느 하나로, 성분은 나노입자 위에 업로드되거나, 나노입자 내에 패키징되고, 식물에 적용될 수 있다(예를 들어, WO 2008042156 및 US 20130185823에 기재된 것과 같음). 구체적으로, 본 발명의 일 구현예는, WO2015089419에 기재된 바와 같이, RNA 표적화 단백질을 인코딩하는 DNA 분자(들), 가이드 RNA를 인코딩하는 DNA 분자 및/또는 단리된 가이드 RNA로 업로드된 또는 그로 패킹된 나노입자를 포함한다.
RNA 표적화 CRISPR 시스템의 하나 이상의 성분을 식물 세포로 도입하는 추가의 수단은 세포 침투 펩티드(CPP)를 이용하는 것에 의한다. 따라서, 구체적으로 본 발명에서 구현예는 RNA 표적화 단백질에 연결된 세포 침투 펩티드를 포함하는 조성물을 포함한다. 본 발명의 구체적인 구현예에서, RNA 표적화 단백질 및/또는 가이드 RNA(들)는 하나 이상의 CPP에 커플링되어 이들을 식물 원형질체 내부로 효과적으로 수송한다(인간 세포에서의 Cas9에 대한 문헌[Ramakrishna (2014, Genome Res. 2014 Jun;24(6):1020-7)]. 다른 구현예에서, RNA 표적화 유전자 및/또는 가이드 RNA(들)는 식물 원형질체 전달을 위한 하나 이상의 CPP에 커플링되는 하나 이상의 원형 또는 비-원형 DNA 분자(들)에 의해 인코딩된다. 식물 원형질체는 그 후 식물 세포로 그리고 추가로 식물로 재생된다. CPP는 단백질로부터 유래된 또는 수용체 독립적인 방식으로 세포막을 통과하여 생분자를 수송할 수 있는 키메라 서열로부터 유래된, 일반적으로 35 개 미만 아미노산의 짧은 펩티드로서 기재된다. CPP는 양이온 펩티드, 소수성 서열을 갖는 펩티드, 양친매성 펩티드, 프롤린-풍부 및 항균성 서열을 갖는 펩티드, 및 키메라 또는 2부로 구성된 펩티드(Pooga and Langel 2005)일 수 있다. CPP는 생물학적 막을 침투할 수 있고, 그와 같이 다양한 생분자의 세포막을 통과하는 세포질 내로의 이동을 야기하고, 그의 세포내 경로에 따른 수송을 개선시키고, 이에 따라 생분자의 표적과의 상호작용을 촉진한다. CPP의 예로는, 특히: Tat, HIV 제1형에 의해 바이러스 복제에 요구되는 핵 전사 활성화제 단백질, 페네트라틴, 카포시(Kaposi) 섬유아세포 성장 인자(FGF) 신호 펩티드 서열, 인테그린 β3 신호 펩티드 서열; 폴리아르기닌 펩티드 Arg 서열, 구아닌 풍부-분자 수송체, 스위트 애로우(sweet arrow) 펩티드, 등이 포함된다.
식물, 조류 또는 균류 적용을 위해 예상되는 표적 RNA
표적 RNA, 즉 관심 RNA는 본 발명에 의해 표적화될 RNA로서, 표적 RNA상의 관심 표적 부위로의 모집, 및 관심 표적 부위에서의 RNA 표적화 단백질의 결합을 유도한다. 표적 RNA는 임의의 적합한 형태의 RNA 일 수 있다. 이는 일부 구현예에서 mRNA를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 표적 RNA는 전달 RNA(tRNA) 또는 리보솜 RNA(rRNA)를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 표적 RNA는 간섭 RNA(RNAi), 마이크로RNA(miRNA), 마이크로스위치, 마이크로자임, 위성 RNA 및 RNA 바이러스를 포함할 수 있다. 표적 RNA는 식물 세포의 세포질 또는 세포핵 또는 미토콘드리아, 엽록체 또는 색소체와 같은 식물 세포 소기관 내에 위치할 수 있다.
구체적인 구현예에서, RNA 표적화 CRISPR 시스템은 RNA를 절단하거나 그렇지 않으면 RNA 발현을 저해하는 데 사용된다.
RNA 조절을 통한 식물 유전자 발현 조절을 위한 RNA 표적화 CRISPR 시스템의 사용
RNA 표적화 단백질은 또한 RNA 가공의 제어를 통하여 유전자 발현을 표적화하기 위해, 적합한 가이드 RNA와 함께 사용될 수 있다. RNA 가공의 제어는 대안적인 스플라이싱 또는 특정 스플라이스 변이체 또는 이소형을 특이적으로 표적화하는 것을 포함하는, RNA 스플라이싱; 바이러스 복제(구체적으로, 식물 내 바이로이드를 포함하는 식물 바이러스의) 및 tRNA 생합성과 같은 RNA 가공 반응을 포함할 수 있다. 적합한 가이드 RNA와 조합된 RNA 표적화 단백질은 또한 RNA 활성화(RNAa)를 제어하는 데 사용될 수 있다. RNAa는 유전자 발현의 촉진을 유도하므로, 유전자 발현의 제어는 RNAa의 파괴 또는 감소, 이에 따른 유전자 발현의 덜한 촉진을 통하는 방식으로 달성될 수 있다.
본 발명의 RNA 표적화 이펙터 단백질은 식물에서의, 구체적으로 RNA 바이러스에 대한, 항 바이러스 활성을 위해 추가로 사용될 수 있다. 이펙터 단백질은 선택된 바이러스 RNA 서열에 대해 선택적인 적합한 가이드 RNA를 사용하여 바이러스 RNA에 표적화될 수 있다. 구체적으로, 이펙터 단백질은 단일 가닥 RNA와 같은 RNA를 절단하는 활성 뉴클레아제일 수 있다. 따라서, 본 발명의 RNA 표적화 이펙터 단백질의 항 바이러스제로서의 용도가 제공된다. 이 방식으로 중화될 수 있는 바이러스의 예로는 담배 모자이크 바이러스(TMV), 토마토 반점 시듦 바이러스(TSWV), 오이 모자이크 바이러스(CMV), 감자 바이러스 Y(PVY), 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV)(RT 바이러스), 자두 폭스 바이러스(PPV), 브롬 모자이크 바이러스(BMV) 및 감자 바이러스 X(PVX)가 포함된다.
표적화된 유전자 변형의 대안으로서, 식물, 조류 또는 균류에서 RNA 발현을 조절하는 예가 본 명세서에 추가로 기재되어 있다.
mRNA의 조절되는 절단을 통한 유전자 발현의 조절되는 제어가 구체적인 관심 대상이다. 이것은 본 명세서에 기재된 조절되는 프로모터의 제어 하에 RNA 표적화 요소를 위치시킴으로써 달성될 수 있다.
tRNA 분자의 기능성 획복을 위한 RNA 표적화 CRISPR 시스템의 사용.
Pring 외는 DNA보다 mRNA 서열을 상이한 단백질을 코딩하도록 변경시키는 식물 미토콘드리아 및 엽록체에서의 RNA 편집을 기재하고 있다(문헌[Plant Mol. Biol. (1993) 21 (6): 1163-1170. doi:10.1007/BF00023611]). 본 발명의 구체적인 구현예에서, 미토콘드리아 및 엽록체 mRNA를 특이적으로 표적화하는 RNA 표적화 CRISPR 시스템의 요소는 생체내에서 일어나는 과정을 모방하여 이러한 식물 세포 소기관에서 상이한 단백질을 발현하도록 식물 또는 식물 세포에 도입될 수 있다.
RNA 발현을 저해하는 RNA 간섭에 대한 대안으로서의 RNA 표적화 CRISPR 시스템의 사용.
RNA 표적화 CRISPR 시스템은 RNA 저해 또는 RNA 간섭과 유사한 용도를 가지며, 따라서 이러한 방법으로 대체될 수도 있다. 구체적인 구현예에서, 본 발명의 방법은 예를 들어, 간섭 리보핵산(예를 들어, siRNA 또는 shRNA 또는 dsRNA)에 대한 대체물로서의 RNA 표적화 CRISPR의 사용을 포함한다. 표적화된 유전자 변형의 대안으로서의 식물, 조류 또는 균류에서의 RNA 발현의 저해의 예가 본 명세서에 추가로 기재되어 있다.
RNA 간섭을 제어하기 위한 RNA 표적화 CRISPR 시스템의 사용.
간섭 RNA 또는 miRNA에 대한 제어는 생체내 또는 시험관내에서 간섭 RNA 또는 miRNA의 수명을 감소시킴으로써 그 접근에서 나타나는 표적외 효과(OTE)를 감소시키는 데 도움을 줄 수 있다. 구체적인 구현예에서, 표적 RNA는 간섭 RNA, 즉 shRNA, siRNA 등과 같은 RNA 간섭 경로에 관여하는 RNA를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 표적 RNA는 마이크로RNA(miRNA) 또는 이중 가닥 RNA(dsRNA)를 포함할 수 있다.
다른 구체적인 구현예에서, RNA 표적화 단백질 및 적합한 가이드 RNA(들)가 선택적으로(예를 들어 조절되는 프로모터, 예를 들어, 조직- 또는 세포주기-특이적 프로모터 및/또는 인핸서의 제어 하에서 공간적 또는 시간적으로) 발현되는 경우 이것은 그 세포에서 RNAi로부터 세포 또는 시스템(생체내 또는 시험관내)을 '보호'하는 데 사용될 수 있다. 이것은 RNAi가 필요하지 않은 이웃 조직이나 세포에서, 또는 이펙터 단백질 및 적절한 가이드가 발현되는 세포 또는 조직과 발현되지 않는 것(즉, 각각 RNAi가 제어되지 않은 것 및 제어되는 것)의 비교의 목적을 위해 유용할 수 있다. RNA 표적화 단백질은 리보자임, 리보솜 또는 리보스위치와 같은 RNA를 포함하거나 RNA로 구성된 분자를 제어하거나 분자에 결합하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 가이드 RNA는 RNA 표적화 단백질을 이들 분자에 모집하여 RNA 표적화 단백질이 이들에 결합할 수 있다.
본 출원은 정보 제공된 시스템의 설계 제작을 위한 기초를 제공하므로, 본 발명의 RNA 표적화 CRISPR 시스템은 본 기재 내용으로부터 과도한 실험없이, 곤충 해충 관리, 식물 질병 관리 및 제초제 내성의 관리뿐만 아니라 식물 분석에서 및 다른 적용을 위한 것을 포함하는, 식물 내 RNAi 기술 영역에 적용될 수 있다(예를 들어 문헌[Kim et al., in Pesticide Biochemistry and Physiology (Impact Factor: 2.01). 01/2015; 120. DOI: 10.1016/j.pestbp.2015.01.002]; 문헌[Sharma et al. in Academic Journals (2015), Vol.12(18) pp2303-2312)]; 문헌[Green J.M, inPest Management Science, Vol 70(9), pp 1351-1357] 참고).
식물, 조류 및 균류에서 리보스위치를 변형하고 대사 조절을 제어하기 위한 RNA 표적화 CRISPR 시스템의 사용
리보스위치(압토자임으로도 알려짐)는 소분자에 결합하고 교대로 유전자 발현을 조절하는 메신저 RNA의 조절 절편이다. 이 메커니즘은 세포가 이들 소분자의 세포 내 농도를 감지 가능하게 한다. 구체적인 리보스위치는 전형적으로 이 유전자의 전사, 번역 또는 스플라이싱을 변경함으로써 인접한 유전자를 조절한다. 따라서, 본 발명의 구체적인 구현예에서, 리보스위치를 표적화하는 적합한 가이드 RNA와 조합하여 RNA 표적화 단백질의 사용을 통하여 리보스위치 활성의 제어가 예상된다. 이것은 리보스위치의 절단 또는 리보스위치에의 결합을 통한 것일 수 있다. 구체적인 구현예에서, 리보스위치 활성의 감소가 예상된다. 최근, 티아민 피로포스페이트(TPP)에 결합하는 리보스위치가 동정되어 식물 및 조류에서 티아민 생합성을 조절하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 이 요소는 식물에서 주요 대사의 필수 조절제인 것으로 보인다(문헌[Bocobza and Aharoni, Plant J. 2014 Aug; 79(4):693-703. doi: 10.1111/tpj.12540. Epub 2014 Jun 17]). TPP 리보스위치는 뉴로스포라 크라싸(Neurospora crassa)와 같은 특정 균류에서도 발견되고, 이는 업스트림 오픈 리딩 프레임(uORF)을 조건부로 생산하기 위한 대안적 스플라이싱을 제어하고, 이에 의해 다운스트림 유전자의 발현에 영향을 미친다(문헌[Cheah MT et al., (2007)Nature 447 (7143): 497-500. doi:10.1038/nature05769]). 본 명세서에 기재된 RNA 표적화 CRISPR 시스템은 식물, 조류 또는 균류에서 내인성 리보스위치 활성을 조작하고, 그와 같이 이에 의해 제어되는 다운스트림 유전자의 발현을 변경시키는 데 사용될 수 있다. 구체적인 구현예에서, RNA 표적화 CRISP 시스템은 생체내 또는 시험관내에서 리보스위치 기능을 분석하고 대사 네트워크에 대한 관련성을 연구하는 데 사용될 수 있다. 구체적인 구현예에서, RNA 표적화 CRISPR 시스템은 잠재적으로 유전자 제어를 위한 식물 및 플랫폼에서의 대사산물 센서로서 리보스위치의 설계 제작을 위해 사용될 수 있다.
식물, 조류 또는 균류를 위한 RNAi 스크린에서의 RNA 표적화 CRISPR 시스템의 사용
녹다운이 표현형 변화와 관련된 유전자 산물을 동정하여, RNAi 스크린을 통해, 생물학적 경로가 조사되고 구성 부분이 동정될 수 있다. 본 발명의 구체적인 구현예에서, 스크린에서의 RNAi의 활성을 제거 또는 감소시키고 이에 따라 (이전에 간섭된) 유전자 산물의 활성을(간섭/억제를 제거하거나 감소시킴으로써) 회복시키기 위해 본 명세서에 기재된 가이드 29 또는 가이드 30 단백질 및 적합한 가이드 RNA를 사용함으로써 이들 스크린을 통해 또는 이들 스크린 동안 제어가 또한 행사될 수 있다.
생체내 및 시험관내 RNA 분자의 시각화를 위한 RNA 표적화 단백질의 사용
구체적인 구현예에서, 본 발명은 핵산 결합 시스템을 제공한다. RNA의 상보적인 프로브와의 인 시츄 혼성화는 강력한 기법이다. 전형적으로 형광 DNA 올리고뉴클레오티드가 혼성화에 의해 핵산을 검출하는 데 사용된다. 고정된 핵산(LNA)과 같은 특정 변형에 의해 증가된 효율이 달성되었지만, 효율적이고 융통성있는 대안에 대한 요구가 여전히 남아있다. 이와 같이, RNA 표적화 시스템의 표지된 요소는 인 시츄 혼성화를 위한 효율적이고 적응 가능한 시스템에 대한 대안으로서 사용될 수 있다.
식물 및 효모에서 RNA 표적화 CRISPR 시스템의 추가의 응용
바이오연료 생산에서 RNA 표적화 CRISPR 시스템의 사용
본 명세서에 기재된 용어 "바이오연료"는 식물 및 식물-유래된 자원으로부터 제조된 대안적인 연료이다. 재생 가능한 바이오연료는, 에너지가 탄소 고정 과정을 통해 수득되거나 바이오매스의 이용 또는 전환을 통하여 만들어진 유기 물질로부터 추출될 수 있다. 이 바이오매스는 바이오연료를 위해 직접 사용될 수 있거나, 열 전환, 화학 전환 및 생화학 전환에 의한 물질을 함유하는 편리한 에너지로 전환될 수 있다. 이 바이오매스 전환은 고체, 액체, 또는 가스 형태의 연료를 초래할 수 있다. 바이오연료에는 두 가지 유형이 있다: 바이오에탄올 및 바이오디젤. 바이오에탄올은 셀룰로스(전분)의 당 발효 공정에 의해 주로 생산되며, 이는 대부분 메이즈 및 사탕수수로부터 유래된다. 한편, 바이오디젤은 유채씨, 야자 및 대두와 같은 기름 작물로부터 주로 생산된다. 바이오연료는 주로 교통에 사용된다.
바이오연료 생산을 위한 식물 특성의 향상
구체적인 구현예에서, 본 명세서에 기재된 RNA 표적화 CRISPR 시스템을 이용하는 방법은, 발효를 위한 당의 더욱 효율적인 방출을 위해 핵심 가수분해제에 의한 접근을 촉진하기 위하여, 세포벽의 특성을 변경하는 데 사용된다. 구체적인 구현예에서, 셀룰로스 및/또는 리그닌의 생합성이 변형된다. 셀룰로스는 세포벽의 주 성분이다. 셀룰로스 및 리그닌의 생합성은 공동-조절된다. 식물에서 리그닌의 비율을 감소시킴으로써 셀룰로스의 비율이 증가될 수 있다. 구체적인 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법은, 발효 가능한 탄수화물을 증가시키기 위하여 식물에서 리그닌 생합성을 하향조절하는 데 사용된다. 더욱 구체적으로, 본 명세서에 기재된 방법은, WO 2008064289 A2에 개시된 바와 같이, 4-쿠마레이트 3-하이드록실라제(C3H), 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL), 신나메이트 4-하이드록실라제(C4H), 하이드록시신나모일 트랜스페라제(HCT), 카페산 O-메틸트랜스페라제(COMT), 카페오일 CoA 3-O-메틸트랜스페라제(CCoAOMT), 페룰레이트 5-하이드록실라제(F5H), 신나밀 알콜 데하이드로게나제(CAD), 신나모일 CoA-리덕타제(CCR), 4-쿠마레이트-CoA 리가제(4CL), 모노리그놀-리그닌-특이적 글리코실트랜스페라제, 및 알데히드 데하이드로게나제(ALDH)로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 제1 리그닌 생합성 유전자를 하향조절하는 데 사용된다.
구체적인 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법은 발효 동안 더욱 낮은 수준의 아세트산을 생산하는 식물 매스를 생산하는 데 사용된다(WO 200096488 또한 참고).
바이오연료 생산을 위한 효모의 변형
구체적인 구현예에서, 본 명세서에서 제공된 RNA 표적화 효소는 재조합 미생물에 의한 바이오에탄올 생산을 위해 사용된다. 예를 들어, RNA 표적화 효소는 미생물, 예를 들어 효모를 설계 제작하여 발효 가능한 당으로부터 바이오연료 또는 생체고분자를 생성하고, 선택적으로 발효 가능한 당 공급원으로서 농업 폐기물로부터 유래된 식물-유래 리그노셀룰로스를 분해시킬 수 있는 데 사용될 수 있다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 바이오연료 생산에 요구되는 내인성 유전자의 발현을 변형시키고/시키거나 바이오연료 합성을 간섭할 수 있는 내인성 유전자를 변형시키는 데 RNA 표적화 CRISPR 복합체가 사용되는 방법을 제공한다. 더욱 구체적으로, 방법은 피루베이트의 에탄올 또는 또 다른 관심 생산물로의 전환에 관여하는 효소를 인코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열의, 효모와 같은 미생물 내에서의 발현을 자극하는 것을 포함한다. 구체적인 구현예에서 방법은 미생물이 셀룰로스를 분해 가능하도록 하는 하나 이상의 효소, 예를 들어 셀룰라제의 발현의 자극을 보장하도록 한다. 추가의 구현예에서, RNA 표적화 CRISPR 복합체는 바이오연료 생산 경로와 경쟁하는 내인성 대사 경로를 억제하는 데 사용된다.
식물성-기름 또는 바이오연료의 생산을 위한 조류 및 식물의 변형
유전자 도입 조류 또는 유채와 같은 기타 식물은 구체적으로 예를 들어 식물성 기름 또는 알콜(특히 메탄올 및 에탄올)과 같은 바이오연료의 생산에 유용할 수 있다. 이들은 기름 또는 바이오연료 산업에서의 이용을 위해 높은 수준의 기름 또는 알콜을 발현 또는 과발현하도록 설계 제작될 수 있다.
US8945839는 Cas9를 이용하여 미세-조류(클라미도모나스 레인하티 세포)종)을 설계 제작하는 방법을 기재한다. 유사한 도구를 사용하여, 본 명세서에 기재된 RNA 표적화 CRISPR 시스템의 방법은 클라미도모나스 종 및 다른 조류 상에 적용될 수 있다. 구체적인 구현예에서, RNA 표적화 이펙터 단백질 및 가이드 RNA는 Hsp70A-Rbc S2 또는 Beta2-튜불린과 같은 구조적 프로모터의 제어 하에서 RNA 표적화 이펙터 단백질을 발현하는 벡터를 사용하여 발현되는 조류 내에 도입된다. 가이드 RNA는 T7 프로모터를 함유하는 벡터를 사용하여 전달될 것이다. 대안적으로, 시험관내 전사된 가이드 RNA는 조류 세포로 전달될 수 있다. 전기천공 프로토콜은 GeneArt 클라미도모나스 설계 제작 키트로부터 권장된 표준 프로토콜을 따른다.
식물에서의 RNA 표적화 효소의 구체적인 적용
구체적인 구현예에서, 본 발명은 바이러스 RNA를 절단할 수 있기 때문에 식물 시스템에서 바이러스 제거를 위한 치료법으로서 사용될 수 있다. 인간 시스템에서의 이전의 연구는 단일 가닥 RNA 바이러스인 C형 간염을 표적화하는 것에 CRISPR를 활용하는 것의 성공을 입증하였다(문헌[A. Price, et al., Proc. Natl. Acad. Sci, 2015]). 이들 방법은 또한 식물에서의 RNA 표적화 CRISPR 시스템의 사용을 위하여 조정될 수 있다.
개량된 식물
본 발명은 또한 본 명세서에서 제공된 방법에 의해 수득 가능하고 수득된 식물 및 효모 세포를 제공한다. 본 명세서에 기재된 방법에 의해 수득된 개량된 식물은 예를 들어 식물 해충, 제초제, 가뭄, 저온 또는 고온, 과습 등에 대한 내성을 보장하는 유전자의 변형된 발현을 통해 식품 또는 사료 생산에 유용할 수 있다.
본 명세서에 기재된 방법에 의해 수득된 개량된 식물, 특히 작물 및 조류는 예를 들어, 야생형에서 보통 나타나는 것보다 더 높은 단백질, 탄수화물, 영양소 또는 비타민 수준의 발현을 통해 식품 또는 사료 생산에 유용할 수 있다. 이와 관련하여 개량된 식물, 특히 콩류 및 괴경이 선호된다.
개량된 조류 또는 유채와 같은 기타 식물은 예를 들어 식물성 기름 또는 알콜(특히 메탄올 및 에탄올)과 같은 바이오연료의 생산에 특히 유용할 수 있다. 이들은 기름 또는 바이오연료 산업에서의 이용을 위해 높은 수준의 기름 또는 알콜을 발현 또는 과발현하도록 설계 제작될 수 있다.
본 발명은 또한 식물의 개량된 부분을 제공한다. 식물 부분은 잎, 줄기, 뿌리, 괴경, 종자, 배젖, 배주 및 화분을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 본 명세서에서 예상된 식물 부분은 생존 가능, 비 생존 가능, 재생 가능 및/또는 비-재생 가능일 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 생성된 식물 세포 및 식물을 제공하는 것 또한 본 명세서에 포함된다. 전통적인 육종 방법에 의해 생산되는, 유전적 변형을 포함하는 식물의 생식세포, 종자, 접합자 또는 체세포성, 배아, 자손 또는 잡종 또한 본 발명의 범위 내에 포함된다. 이러한 식물은 표적 서열에 또는 표적 서열 대신에 삽입된 이종 또는 외래 DNA 서열을 함유할 수 있다. 대안적으로, 이러한 식물은 하나 이상의 뉴클레오티드에서의 변경(돌연변이, 결실, 삽입, 치환)만을 함유할 수 있다. 이와 같이, 이러한 식물은 오직 구체적인 변형의 존재에 의해 그들의 시조 식물과 상이할 것이다.
본 발명의 일 구현예에서, C2c2 시스템은 예를 들어 박테리아, 균류 또는 바이러스에 의해 유발된 질병에 대한 저항성을 생성시킴으로써 병원체 저항성 식물을 설계 제작하는 데 사용된다. 특정 구현예에서, 병충해 저항성은 곤충 해충에 의해 섭취되어 사망에 이를 C2c2 시스템을 생산하도록 작물을 설계 제작함으로써 달성될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, C2c2 시스템은 비생물적 스트레스 내성을 설계 제작하는 데 사용된다. 또 다른 구현예에서, C2c2 시스템은 가뭄 스트레스 내성 또는 염 스트레스 내성, 또는 추위 또는 열 스트레스 내성을 설계 제작하는 데 사용된다. 문헌[Younis et al. 2014, Int. J. Biol. Sci. 10;1150]은 식물 육종 방법의 잠재적 표적을 검토하였으며, 이들 모두는 본 명세서에 기재된 C2c2 시스템의 사용을 통해 교정 또는 개선을 할 수 있다. 일부 비-제한적인 표적 작물은, 애기장대(Arabidopsis thaliana), 옥수수(Zea mays), 벼(Oryza sativa L), 자두(Prunus domestica L.), 목화(Gossypium hirsutum), 야생 담배(Nicotiana rustica), 옥수수(Zea mays), 알팔파(Medicago sativa), 담배(Nicotiana benthamiana) 및 애기장대(Arabidopsis thaliana)를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서, C2c2 시스템은 작물 해충의 관리에 사용된다. 예를 들어, 작물 해충에서 작동 가능한 C2c2 시스템은 식물 숙주로부터 발현되거나, 예를 들어 바이러스 벡터를 사용하여, 표적에 직접적으로 전달될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 이형접합 비-인간 출발 생물로부터 동형접합 생물을 효율적으로 생산하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 본 발명은 식물 육종에 사용된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 동물 육종에 사용된다. 이러한 구현예에서, 식물 또는 동물과 같은 동형접합 생물은 이중 가닥 손상, 염색체 쌍 형성 및/또는 가닥 교환에 관여하는 적어도 하나의 표적 유전자를 간섭하는 것에 의해 재조합을 방지 또는 억제함으로써 제조된다.
최적화된 기능성 RNA 표적화 시스템에서의 C2C2단백질의 적용
일 양태에서, 본 발명은 기능적 성분을 RNA 환경으로 특이적으로 전달하기 위한 시스템을 제공한다. 이것은 상이한 성분의 RNA로의 특이적 표적화를 가능하게 하는 본 발명의 RNA 표적화 이펙터 단백질을 포함하는 CRISPR 시스템을 사용하여 보장될 수 있다. 더욱 구체적으로, 이러한 성분은 RNA 번역, 분해 등의 활성화제 또는 억제제와 같은, 활성화제 또는 억제제를 포함한다. 이 시스템의 적용은 본 명세서의 다른 곳에 기재되어 있다.
일 양태에 따라, 본 발명은 세포의 관심 게놈 유전자좌에서 표적 서열에 혼성화할 수 있는 가이드 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함하는 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 조성물을 제공하며, 여기서 가이드 RNA는 어댑터 단백질에 결합하는 하나 이상의 별개 RNA 서열(들)의 삽입에 의해 변형된다. 구체적인 구현예에서, RNA 서열은 둘 이상의 어댑터 단백질(예를 들어, 압타머)에 결합할 수 있으며, 여기서 각각의 어댑터 단백질은 하나 이상의 기능성 도메인과 회합된다. 본 명세서에 기재된 c2c2 효소의 가이드 RNA는 가이드 서열의 변형이 가능한 것으로 나타난다. 구체적인 구현예에서, 가이드 RNA는 직접 반복 내 직접 반복의 5' 또는 가이드 서열의 3'에 별개의 RNA 서열(들)의 삽입에 의해 변형된다. 하나 초과의 기능성 도메인이 존재하는 경우, 기능성 도메인은 동일하거나 상이할 수 있으며, 예를 들어 동일하거나 상이한 2 개의 활성화제 또는 억제제 중 2 개일 수 있다. 일 양태에서, 본 발명은 본 명세서에서-논의된 조성물을 제공하며, 여기서 하나 이상의 기능성 도메인이 RNA 표적화 효소에 부착되어 표적 RNA에 결합 즉시 기능성 도메인이 그것의 간주되는 성질의 기능으로 기능할 수 있도록 하는 공간적 방향으로 기능성 도메인이 있게 된다; 일 양태에서, 본 발명은 본 명세서에서-논의된 조성물을 제공하며, 여기서 조성물은 적어도 3 개의 기능성 도메인을 갖는 CRISPR-Cas 복합체를 포함하고, 그 중 적어도 하나는 RNA 표적화 효소와 관련되고 그 중 적어도 2 개는 gRNA와 관련된다.
따라서, 일 양태에서, 본 발명은 본 명세서에서-논의된 가이드 RNA 및 RNA 표적화 효소인 CRISPR 효소를 포함하는, 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 CRISPR-Cas 복합체 조성물을 제공하며, 여기서 선택적으로 RNA 표적화 효소는 적어도 하나의 돌연변이를 포함하여, RNA 표적화 효소가 적어도 하나의 돌연변이를 갖지 않는 효소의 뉴클레아제 활성의 5% 이하를 가지게 되고, 선택적으로 적어도 하나 이상의 핵 국소화 서열을 포함하는 하나 이상을 포함한다. 구체적인 구현예에서, RNA 표적화 효소의 결합을 여전히 보장하지만 RNA 표적화 효소에 의한 절단을 방지하기 위해(본 명세서의 다른 곳에서 상세히 설명된 바와 같이), 가이드 RNA가 추가적으로 또는 대안적으로 변형된다.
구체적인 구현예에서, RNA 표적화 효소는 적어도 하나의 돌연변이를 갖지 않는 c2c2 효소와 비교하여 적어도 97% 또는 100%의 감소된 뉴클레아제 활성을 갖는 c2c2 효소이다. 일 양태에서, 본 발명은 본 명세서에서-논의된 조성물을 제공하며, 여기서 C2c2 효소는 2 개 이상의 돌연변이를 포함한다. 돌연변이는, 렙토트리키아 샤히 c2c2 단백질 또는 오솔로그의 상응하는 위치에 따라, 예를 들어, 다음의 돌연변이 중 하나 이상과 같은: R597A, H602A, R1278A 및 H1283A, 다음 아미노산 잔기 중 하나 이상에 대한 돌연변이로부터 선택될 수있다: R597, H602, R1278 및 H1283.
구체적인 구현예에서, RNA 표적화 시스템은 2 개 이상의 기능성 도메인을 포함하는 본 명세서에서 상기 기재된 바와 같이 제공된다. 구체적인 구현예에서, 2 개 이상의 기능성 도메인은 이종의 기능성 도메인이다. 구체적인 구현예에서, 시스템은 기능성 도메인을 포함하는 융합 단백질인 어댑터 단백질을 포함하고, 융합 단백질은 선택적으로 어댑터 단백질과 기능성 도메인 사이에 링커를 포함한다. 구체적인 구현예에서, 링커는 GlySer 링커를 포함한다. 추가적으로 또는 대안적으로, 하나 이상의 기능성 도메인이 링커, 선택적으로 GlySer 링커를 통해 RNA 이펙터 단백질에 부착된다. 구체적인 구현예에서, 하나 이상의 기능성 도메인은 HEPN 도메인 중 하나 또는 둘 모두를 통해 RNA 표적화 효소에 부착된다.
일 양태에서, 본 발명은 본 명세서에서-논의된 조성물을 제공하며, 여기서 어댑터 단백질 또는 RNA 표적화 효소와 회합된 하나 이상의 기능성 도메인은 RNA 번역을 활성화 또는 억제할 수 있는 도메인이다. 일 양태에서, 본 발명은 본 명세서에서-논의된 조성물을 제공하며, 여기서 어댑터 단백질과 회합된 하나 이상의 기능성 도메인 중 적어도 하나는 메틸라제 활성, 데메틸라제 활성, 전사 활성화 활성, 전사 억제 활성, 전사 방출 인자 활성, 히스톤 변형 활성, DNA 통합 활성 RNA 절단 활성, DNA 절단 활성 또는 핵산 결합 활성, 또는 분자 스위치 활성 또는 화학적 유도성 또는 광 유도성을 포함하는 하나 이상의 활성을 갖는다.
일 양태에서, 본 발명은 압타머 서열을 포함하는 본 명세서에서-논의된 조성물을 제공한다. 구체적인 구현예에서, 압타머 서열은 동일한 어댑터 단백질에 특이적인 2 개 이상의 압타머 서열이다. 일 양태에서, 본 발명은 본 명세서에서-논의된 조성물을 제공하며, 여기서 압타머 서열은 상이한 어댑터 단백질에 특이적인 2 개 이상의 압타머 서열이다. 일 양태에서, 본 발명은 본 명세서에서-논의된 조성물을 제공하며, 여기서 어댑터 단백질은 MS2, PP7, Qβ F2, GA, fr, JP501, M12, R17, BZ13, JP34, JP500, KU1, M11, MX1, TW18, VK, SP, FI, ID2, NL95, TW19, AP205, φCb5, φCb8r, φCb12r, φCb23r, 7s, PRR1를 포함한다. 따라서, 구체적인 구현예에서, 압타머는 상기 나열된 어댑터 단백질 중 임의의 하나에 특이적으로 결합하는 결합 단백질로부터 선택된다. 일 양태에서, 본 발명은 본 명세서에서-논의된 조성물을 제공하며, 여기서 세포는 진핵 세포이다. 일 양태에서, 본 발명은 본 명세서에서-논의된 조성물을 제공하며, 여기서 진핵 세포는 포유류 세포, 식물 세포 또는 효모 세포이고, 포유류 세포는 선택적으로 마우스 세포이다. 일 양태에서, 본 발명은 본 명세서에서-논의된 조성물을 제공하며, 여기서 포유류 세포는 인간 세포이다.
일 양태에서, 본 발명은 상기 본 명세서에서-논의된 조성물을 제공하며, 여기서 하나 초과의 gRNA가 존재하고 gRNA는 상이한 서열을 표적화하여, 조성물이 사용될 때 다중화가 존재한다. 일 양태에서, 본 발명은 조성물을 제공하며, 여기서 하나 이상의 어댑터 단백질에 결합하는 별개의 RNA 서열(들)의 삽입에 의해 변형된 하나 초과의 gRNA가 존재한다.
일 양태에서, 본 발명은 본 명세서에서-논의된 조성물을 제공하며, 여기서 하나 이상의 기능성 도메인과 회합된 하나 이상의 어댑터 단백질이 존재하고 이는 가이드 RNA(들)에 삽입된 별개의 RNA 서열(들)에 결합된다.
일 양태에서, 본 발명은 본 명세서에서-논의된 조성물을 제공하며, 여기서 가이드 RNA는 적어도 하나의 비-코딩 기능성 루프를 갖도록 변형되고; 예를 들어, 여기서 적어도 하나의 비-코딩 기능성 루프는 억압성이며; 예를 들어, 여기서 적어도 하나의 비-코딩 기능성 루프는 Alu를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 본 명세서에서 논의된 하나 이상의 조성물을 숙주에 투여하거나 생체내 숙주에서 발현시키는 것을 포함하는 유전자 발현 변형 방법을 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 조성물 또는 그를 코딩하는 핵산 분자의 전달을 포함하며, 여기서 상기 핵산 분자(들)는 조절 서열(들)에 작동 가능하게 연결되고 생체내 발현되는, 본 명세서에서-논의된 방법을 제공한다. 일 양태에서, 본 발명은 본 명세서에서-논의된 방법을 제공하며, 여기서 생체내 발현은 렌티바이러스, 아데노바이러스 또는 AAV를 통한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 본 명세서에-논의된 세포의 포유류 세포주를 제공하며, 여기서 세포주는 선택적으로 인간 세포주 또는 마우스 세포주이다. 일 양태에서, 본 발명은 유전자 도입 포유류 모델, 선택적으로 마우스를 제공하며, 여기서 모델은 본 명세서에서-논의된 조성물로 형질전환되었거나 상기 형질전환체의 자손이다.
일 양태에서, 본 발명은 가이드 RNA 또는 RNA 표적화 CRISPR-Cas 복합체 또는 본 명세서에서-논의된 조성물을 인코딩하는 핵산 분자(들)를 제공한다. 일 양태에서, 본 발명은: 세포의 관심 게놈 유전자좌 내 표적 서열에 혼성화할 수 있는 가이드 서열을 포함하는 가이드 RNA(gRNA)를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공하며, 여기서 gRNA의 직접 반복은 2 개 이상의 어댑터 단백질에 결합하는 별개의 RNA 서열(들)의 삽입에 의해 변형되고, 여기서 각각의 어댑터 단백질은 하나 이상의 기능성 도메인과 회합되거나; 여기서 gRNA는 적어도 하나의 비-코딩 기능성 루프를 갖도록 변형된다. 일 양태에서, 본 발명은: 본 명세서에서-논의된 gRNA 및 RNA 표적화 효소를 포함하는 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 CRISPR-Cas 복합체 조성물을 인코딩하는 핵산 분자(들)을 포함하는 벡터(들)를 제공하며, 여기서 선택적으로 RNA 표적화 효소는 적어도 하나의 돌연변이를 포함하여, RNA 표적화 효소가 적어도 하나의 돌연변이를 갖지 않는 RNA 표적화 효소의 5% 이하의 뉴클레아제 활성을 갖게 되고, 선택적으로 적어도 하나 이상의 핵 국소화 서열을 포함하는 하나 이상을 포함한다. 일 양태에서, 벡터는 가이드 RNA(gRNA)를 인코딩하는 핵산 분자 및/또는 RNA 표적화 효소를 인코딩하는 핵산 분자 및/또는 선택적인 핵 국소화 서열(들)에 작동 가능하게 연결된 진핵 세포에서 작동 가능한 조절 요소(들)를 추가로 포함할 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 상기 본 명세서에서 기재된 하나 이상의 성분을 포함하는 키트를 제공한다. 일부 구현예에서, 키트는 상기 기재된 벡터 시스템 및 키트를 사용하기 위한 지침서를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 기능 획득(GOF) 또는 기능 손실(LOF)에 대한 스크리닝 방법 또는 비-코딩 RNA 또는 잠재적 조절 영역(예를 들어, 인핸서, 억제제)을 스크리닝하는 방법을 제공하며, RNA 표적화 효소를 함유하거나 발현하는 본 명세서에서-논의된 세포주 또는 본 명세서에서-논의된 모델의 세포, 및 세포주 또는 모델의 세포 내로 본 명세서에서-논의된 조성물을 도입하여 gRNA가 활성화제 또는 억제제를 포함하게 되는 것, 및 도입된 gRNA가 활성화제를 포함하는 세포에 대하여 또는 도입된 gRNA가 억제제를 포함하는 세포에 대하여 각각 GOF 또는 LOF를 모니터링하는 것을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작되는 조성물의 라이브러리를 제공하며, 각각, 세포의 관심 표적 RNA 서열에 혼성화할 수 있는 가이드 서열을 포함하는 RNA 표적화 CRISPR 가이드 RNA(gRNA), RNA 표적화 효소를 포함하며, 여기서 RNA 표적화 효소는 적어도 하나의 돌연변이를 포함하여, RNA 표적화 효소가 적어도 하나의 돌연변이를 갖지 않는 RNA 표적화 효소의 5% 이하의 뉴클레아제 활성을 갖게 되며, 여기서 gRNA는 하나 이상의 어댑터 단백질에 결합하는 별개의 RNA 서열(들)의 삽입에 의해 변형되고, 여기서 어댑터 단백질은 하나 이상의 기능성 도메인과 회합되며, 여기서 조성물은 하나 이상의 또는 2 개 이상의 어댑터 단백질을 포함하며, 여기서 각각의 단백질은 하나 이상의 기능성 도메인과 회합되며, 여기서 gRNA는 복수의 RNA 표적화 가이드 RNA(gRNA)를 포함하는 전체 게놈에 걸친 라이브러리를 포함한다. 일 양태에서, 본 발명은 본 명세서에서-논의된 라이브러리를 제공하며, 여기서 RNA 표적화 RNA 표적화 효소는 적어도 하나의 돌연변이를 갖지 않는 RNA 표적화 효소와 비교하여 적어도 97% 또는 100%의 감소된 뉴클레아제 활성을 갖는다. 일 양태에서, 본 발명은 본 명세서에서-논의된 라이브러리를 제공하며, 여기서 어댑터 단백질은 기능성 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 일 양태에서, 본 발명은 본 명세서에서-논의된 라이브러리를 제공하며, 여기서 gRNA는 하나 또는 2 개 이상의 어댑터 단백질에 결합하는 별개의 RNA 서열(들)의 삽입에 의해 변형되지 않는다. 일 양태에서, 본 발명은 본 명세서에서 논의된 라이브러리를 제공하며, 여기서 하나 또는 2 개 이상의 기능성 도메인은 RNA 표적화 효소와 회합된다. 일 양태에서, 본 발명은 본 명세서에서 논의된 라이브러리를 제공하며, 여기서 세포의 세포 집단은 진핵 세포의 집단이다. 일 양태에서, 본 발명은 본 명세서에서 논의된 라이브러리를 제공하며, 여기서 진핵 세포는 포유류 세포, 식물 세포 또는 효모 세포이다. 일 양태에서, 본 발명은 본 명세서에서 논의된 라이브러리를 제공하며, 여기서 포유류 세포는 인간 세포이다. 일 양태에서, 본 발명은 본 명세서에서 논의된 라이브러리를 제공하며, 여기서 세포 집단은 배아 줄기(ES) 세포의 집단이다.
일 양태에서, 본 발명은 본 명세서에서 논의된 라이브러리를 제공하며, 여기서 표적화는 약 100 개 이상의 RNA 서열에 대한 것이다. 일 양태에서, 본 발명은 본 명세서에서 논의된 라이브러리를 제공하며, 여기서 표적화는 약 1000 개 이상의 RNA 서열에 대한 것이다. 일 양태에서, 본 발명은 본 명세서에서 논의된 라이브러리를 제공하며, 여기서 표적화는 약 20,000 개 이상의 서열에 대한 것이다. 일 양태에서, 본 발명은 본 명세서에서 논의된 라이브러리를 제공하며, 여기서 표적화는 전체 트랜스크립톰에 대한 것이다. 일 양태에서, 본 발명은 본 명세서에서 논의된 라이브러리를 제공하며, 여기서 표적화는 관련된 또는 원하는 경로 상에서 초점을 맞춘 표적 서열의 패널에 대한 것이다. 일 양태에서, 본 발명은 본 명세서에서 논의된 라이브러리를 제공하며, 여기서 경로는 면역 경로이다. 일 양태에서, 본 발명은 본 명세서에서 논의된 라이브러리를 제공하며, 여기서 경로는 세포 분열 경로이다.
일 양태에서, 본 발명은 변형된 발현을 갖는 유전자를 포함하는 모델 진핵 세포를 생성하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 질병 유전자는 질병을 갖거나 발병할 위험이 증가하는 것과 관련된 임의의 유전자이다. 일부 구현예에서, 방법은 (a) 상기 본 명세서에서 기재된 시스템의 성분을 인코딩하는 하나 이상의 벡터를 진핵 세포 내로 도입시키는 것, 및 (b) CRISPR 복합체가 표적 폴리뉴클레오티드에 결합하여 유전자 발현을 변형시킬 수 있도록 하고, 그에 의해 변형된 유전자 발현을 포함하는 모델 진핵 세포를 생성하는 것을 포함한다.
본 명세서에서 제공된 구조 정보는 표적 RNA 및 RNA 표적화 효소와의 가이드 RNA의 상호 작용의 조사가 가능하게 하여 전체 RNA 표적화 CRISPR-Cas 시스템의 기능성을 최적화하기 위하여 가이드 RNA 구조의 설계 제작 또는 변경을 가능하게 한다. 예를 들어, 가이드 RNA는 RNA에 결합할 수 있는 어댑터 단백질의 삽입에 의해 RNA 표적화 단백질과 충돌하지 않고 연장될 수 있다. 이들 어댑터 단백질은 하나 이상의 기능성 도메인을 포함하는 이펙터 단백질 또는 융합체를 추가로 모집할 수 있다.
본 발명의 일 양태는 상기 요소가 단일 조성물 내에 포함되거나 개별 조성물 내에 포함된다는 것이다. 이들 조성물은 게놈 수준에 기능적 효과를 이끌어 내기 위해 숙주에게 유리하게 적용될 수 있다.
당업자는 어댑터 + 기능성 도메인의 결합은 가능하게 하지만(예를 들어, CRISPR 복합체의 3 차원 구조 내의 입체적 방해로 인해) 어댑터 + 기능성 도메인의 적절한 위치 결정은 가능하지 않게 하는 가이드 RNA로의 변형은 의도되지 않은 변형임을 이해할 것이다. 하나 이상의 변형된 가이드 RNA는 직접 반복 내의 직접 반복의 5', 또는 가이드 서열의 3'에 개별 RNA 서열(들)을 도입함으로써 변형될 수 있다.
변형된 가이드 RNA, 비활성화된 RNA 표적화 효소(기능성 도메인을 갖거나 갖지 않음) 및 하나 이상의 기능성 도메인을 갖는 결합 단백질은 각각 개별적으로 조성물 내에 포함될 수 있고, 개별적으로 또는 일괄적으로 숙주에 투여될 수 있다. 대안적으로, 이들 성분은 숙주에 투여하기 위해 단일 조성물로 제공될 수 있다. 숙주에의 투여는 숙주로의 전달을 위한 당업자에게 알려지거나 본 명세서에 기재된 바이러스 벡터를 통하여 수행될 수 있다(예를 들어, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, AAV 벡터). 본 명세서에 설명된 바와 같이, 상이한 선택 마커(예를 들어, 렌티바이러스 gRNA 선택을 위해) 및 gRNA 농도(예를 들어, 다수의 gRNA가 사용되는지 여부에 의존함)의 사용은 개선된 효과를 유도하는 데 유리할 수 있다.
제공된 조성물을 사용하여, 당업자는 하나 이상의 게놈 이벤트를 유도하기 위해 동일하거나 상이한 기능성 도메인으로 단일 또는 다수 유전자좌를 유리하게 및 특이적으로 표적화할 수 있다. 조성물은 세포의 라이브러리에서의 스크리닝을 위하여 및 생체내 기능 모델링을 위하여 매우 다양한 방법에 적용될 수 있다(예를 들어, lincRNA의 유전자 활성화 및 기능 확인; 기능-획득 모델링; 기능-손실 모델링; 최적화 및 스크리닝 목적의 세포주 및 유전자 도입 동물을 확립하기 위한 본 발명의 조성물의 사용).
현재 발명은 조건적 또는 유도성 CRISPR RNA 표적화 이벤트를 확립하고 활용하기 위한 현재 발명의 조성물의 사용을 용도를 포함한다(예를 들어, 문헌[Platt et al., Cell (2014), http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2014.09.014], 또는 WO 2014/093622(PCT/US2013/074667)과 같은 본 명세서에 인용된 PCT 특허 공보를 참고하며, 이는 본 발명 또는 출원에 대해 선행으로 여겨지지 않음). 예를 들어, 표적 세포는 RNA 표적화 CRISRP 효소를 조건적 또는 유도성으로(예를 들어, Cre 의존적 작제물의 형태로) 및/또는 어댑터 단백질을 조건적 또는 유도성으로 포함하고, 표적 세포로 도입된 벡터의 발현 시 벡터는 표적 세포에서 s RNA 표적화 효소 발현 및/또는 어댑터 발현의 조건을 유도하거나 발생시키는 그것을 발현한다. 현재 발명의 교시 및 조성물을 CRISPR 복합체를 생성시키는 공지된 방법과 함께 적용함으로써, 기능성 도메인에 의해 영향을 받는 유도성 유전자 발현 또한 현재 발명의 양태이다. 대안적으로, 어댑터 단백질은 스크리닝 목적의 효과적인 모델을 제공하기 위하여 조건적 또는 유도성 s RNA 표적화 효소를 갖는 조건적 또는 유도성 요소로서 제공될 수 있으며, 이는 유리하게 매우 많은 적용을 위하여 최소 설계 및 특정 gRNA의 투여만을 필요로 한다.
데드 가이드 서열을 포함하는 본 발명에 따른 가이드 RNA
일 양태에서, 본 발명은 CRISPR 복합체의 형성 및 표적에의 성공적인 결합을 가능하게 하는 반면 동시에 성공적인 뉴클레아제 활성을 가능하지 않게 하는(즉, 뉴클레아제 활성이 없는/인델 활성이 없는) 방식으로 변형된 가이드 서열을 제공한다. 설명 상, 이러한 변형된 가이드 서열은 "데드 가이드" 또는 "데드 가이드 서열"로 지칭된다. 이들 데드 가이드 또는 가이드 서열은 촉매적으로 비활성이거나 뉴클레아제 활성과 관련하여 형태적으로 비활성인 것으로 생각될 수 있다. 실제로, 데드 가이드 서열은 촉매 활성을 촉진시키거나 표적내 및 표적외 결합 활성을 구별하는 능력과 관련하여 생산적인 염기쌍 형성에 충분히 관여하지 않을 수 있다. 간략하게, 분석은 CRISPR 표적 RNA 및 표적 RNA와의 미스매치를 포함하는 가이드 RNA를 합성하는 것, 이들을 RNA 표적화 효소와 조합하는 것 및 절단 산물에 의해 생성된 밴드의 존재에 기반하여 겔 기반 절단을 분석하는 것, 및 상대적 밴드 강도에 기반하여 절단을 정량하는 것을 포함한다.
따라서, 관련된 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 기능성 RNA 표적화 및 가이드 RNA(gRNA)를 포함하는, 비-천연적으로 발생하거나 설계 제작된 RNA 표적화 CRISPR-Cas 시스템 조성물을 제공하고, 여기서 gRNA는 데드 가이드 서열을 포함하여 gRNA는 표적 서열에 혼성화할 수 있고 RNA 표적화 CRISPR-Cas 시스템은 시스템의 비-돌연변이체 RNA 표적화 효소의 검출 가능한 RNA 절단 활성 없이 세포에서 관심 게놈 유전자좌로 향하게 된다. 본 명세서의 다른 곳에 기재된 본 발명에 따른 gRNA 중 임의의 것은 본 명세서의 아래에 기재된 데드 가이드 서열을 포함하는 데드 gRNA/gRNA로서 사용될 수 있음이 이해되어야 한다. 본 명세서의 다른 곳에 기재된 방법, 생산물, 조성물 및 용도 중 임의의 것은 하기에 추가로 상세히 설명되는 데드 가이드 서열을 포함하는 데드 gRNA/gRNA를 이용하여 동등하게 적용 가능하다. 추가의 안내에 의해, 다음의 구체적인 양태 및 구현예가 제공된다.
CRISPR 복합체의 RNA 표적 서열에의 서열-특이적 결합을 지시하는 데드 가이드 서열의 능력은 임의의 적합한 분석에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 시험될 데드 가이드 서열을 포함하는, CRISPR 복합체를 형성하기에 충분한 CRISPR 시스템의 성분은, 예를 들어 CRISPR 서열의 성분을 인코딩하는 벡터로 형질감염시키고 그 후 표적 서열 내의 선택적인 절단의 평가함으로써 상응하는 표적 서열을 갖는 숙주 세포에 제공될 수 있다. 예를 들어, 표적 서열, 시험될 데드 가이드 서열 및 시험 데드 가이드 서열과 상이한 대조군 가이드 서열을 포함하는, CRISPR 복합체의 성분을 제공하고, 시험 및 대조군 가이드 서열 반응 사이의 표적 서열에서의 결합 및 절단 비율을 비교함으로써, 표적 RNA 폴리뉴클레오티드 서열의 절단이 시험관에서 평가될 수 있다. 다른 분석이 가능하며 당업자에게 떠오를 것이다. 데드 가이드 서열은 임의의 표적 서열을 표적화하기 위해 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 세포의 게놈 내의 서열이다.
본 명세서에서 추가로 설명되는 바와 같이, 몇몇 구조 파라미터는 적절한 프레임워크가 이러한 데드 가이드에 도달 가능하도록 한다. 데드 가이드 서열은 전형적으로 활성 RNA 절단을 초래하는 각각의 가이드 서열보다 짧다. 구체적인 구현예에서, 데드 가이드는 동일한 것으로 향하는 각각의 가이드보다 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 더 짧다.
아래에서 설명되고 당업계에 알려진 바와 같이, gRNA의 일 측면-특이성을 표적화하는 RNA는 직접 반복 서열이며, 이는 이러한 가이드에 적절히 연결되어야 한다. 구체적으로, 이것은 직접 반복 서열이 RNA 표적화 효소의 기원에 의존하여 설계됨을 암시한다. 따라서, 인증된 데드 가이드 서열에 대해 사용 가능한 구조 데이터는 C2c2 특이적 동등물을 설계하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 2 개 이상의 C2c2 이펙터 단백질의 오솔로그 뉴클레아제 도메인 HEPN 사이의 구조적 유사성이 설계 동등한 데드 가이드를 전달하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 본 명세서의 데드 가이드는 길이 및 서열에서 적절하게 변형되어 이러한 C2c2 특이적 동등물을 나타내고, CRISPR 복합체의 형성 및 표적 RNA에의 성공적 결합을 가능하게 하는 반면 동시에 성공적인 뉴클레아제 활성은 가능하지 않게 할 수 있다.
본 명세서뿐만 아니라 당업계 기술 맥락에서 데드 가이드의 사용은 시험관내, 생체외 및 생체내 적용 둘 모두에서 네트워크 생물학 및/또는 시스템 생물학을 위한 놀랍고 예상하지 못한 플랫폼을 제공하며, 다중화된 유전자 표적화, 및 구체적으로 양방향성 다중화된 유전자 표적화가 가능하게 한다. 데드 가이드 사용 전에는, 다수의 표적을 다루는 것이 어려웠고 일부 사례에서는 불가능하였다. 데드 가이드 사용으로, 다수의 표적, 및 이에 따른 다수의 활성이 예를 들어, 동일한 세포에서, 동일한 동물에서, 또는 동일한 환자에서 다뤄질 수 있다. 이러한 다중화는 동시에 발생하거나 원하는 시간에 대해 시차를 둘 수 있다.
예를 들어, 데드 가이드는 뉴클레아제 활성의 결과없이 유전자 표적화를 위한 수단으로서 gRNA를 사용하는 것이 가능하게 하는 동시에 활성화 또는 억제를 위한 지시된 수단을 제공한다. 데드 가이드를 포함하는 가이드 RNA는 유전자 활성의 활성화 또는 억제가 가능하게 하는 방식으로 요소, 구체적으로, 유전자 이펙터(예를 들어, 유전자 활성의 활성화제 또는 억제제)의 기능적인 배치를 가능하게 하는 본 명세서의 다른 곳에 기재된 단백질 어댑터(예를 들어, 압타머)를 더 포함하도록 변형될 수 있다. 일 예는 본 명세서 및 당업계의 기술에서 설명된 바와 같은, 압타머의 포함이다. 단백질-상호작용하는 압타머를 포함하도록 데드 가이드를 포함하는 gRNA를 설계 제작함으로써(문헌[Konermann et al., "Genome-scale transcription activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex," doi:10.1038/nature14136], 참조로서 본 명세서에 포함됨), 다수의 별개의 이펙터 도메인을 조립할 수 있다. 이러한 것은 자연적 과정을 따라 모델화될 수 있다.
따라서, 일 양태는 데드 가이드를 포함하는 본 발명의 gRNA이며, 여기서 gRNA는 본 명세서에 기재된 유전자 활성화 또는 억제를 제공하는 변형을 추가로 포함한다. 데드 gRNA는 하나 이상의 압타머를 포함할 수 있다. 압타머는 유전자 이펙터, 유전자 활성화제 또는 유전자 억제제에 특이적일 수 있다. 대안적으로, 압타머는 차례로 특정 유전자 이펙터, 유전자 활성화제 또는 유전자 억제제에 특이적이고 이를 모집/결합하는 단백질에 특이적일 수 있다. 활성화제 또는 억제제 모집을 위한 다수의 부위가 있는 경우, 부위가 활성화제 또는 억제제에 특이적인 것이 선호된다. 활성화제 또는 억제제 결합을 위한 다수의 부위가 있는 경우, 부위는 동일한 활성화제 또는 동일한 억제제에 특이적일 수 있다. 부위는 또한 상이한 활성화제 또는 상이한 억제제에 특이적일 수 있다. 이펙터, 활성화제, 억제제는 융합 단백질의 형태로 존재할 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 기능화된 CRISPR 시스템을 생물 내의 유전자 좌위로 향하도록 하기 위한 데드 가이드 RNA 표적화 서열을 선택하는 방법을 제공하며, 이는 a) 유전자 좌위에 하나 이상의 CRISPR 모티프를 위치시키는 것; b) 각각의 CRISPR 모티프의 다운스트림에 있는 20 nt서열을 i) 서열의 GC 함량을 결정함으로써; 및 ii) 생물의 게놈에서 서열의 처음 15 nt의 표적외 매치가 있는 여부를 결정함으로써 분석하는 것; c) 서열의 GC 함량이 70% 이하이고 표적외 매치가 확인되지 않으면 가이드 RNA에서의 사용을 위해 서열을 선택하는 것을 포함한다. 일 구현예에서, GC 함량이 50% 이하이면 서열이 선택된다. 일 구현예에서, GC 함량이 40% 이하이면 서열이 선택된다. 일 구현예에서, GC 함량이 30% 이하이면 서열이 선택된다. 일 구현예에서, 2 개 이상의 서열이 분석되고 가장 낮은 GC 함량을 갖는 서열이 선택된다. 일 구현예에서, 표적외 매치는 생물의 조절 서열에서 결정된다. 일 구현예에서, 유전자 좌위는 조절 영역이다. 일 양태는 전술된 방법에 따라 선택된 표적화 서열을 포함하는 데드 가이드 RNA를 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 기능화된 CRISPR 시스템을 생물 내의 유전자 좌위로 표적화하는 데드 가이드 RNA를 제공한다. 본 발명의 일 구현예에서, 데드 가이드 RNA는 표적화 서열을 포함하고 여기서 표적 서열의 CG 함량이 70% 이하이고, 표적화 서열의 처음 15 nt가 생물 내 또 다른 유전자 좌위의 조절 서열 내 CRISPR모티프로부터 다운스트림에 있는 표적외 서열과 매치되지 않는다. 특정 구현예에서, 표적화 서열의 GC 함량은 60% 이하, 55% 이하, 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하 또는 30% 이하. 특정 구현예에서, 표적화 서열의 GC 함량은 70% 내지 60% 또는 60% 내지 50% 또는 50% 내지 40% 또는 40% 내지 30%이다. 일 구현예에서, 표적화 서열은 유전자좌의 잠재적 표적화 서열 중에서 가장 낮은 CG 함량을 갖는다.
본 발명의 일 구현예에서, 데드 가이드의 처음 15 nt는 표적 서열과 매치된다. 또 다른 구현예에서, 데드 가이드의 처음 14 nt는 표적 서열과 매치된다. 또 다른 구현예에서, 데드 가이드의 처음 13 nt는 표적 서열과 매치된다. 또 다른 구현예에서, 데드 가이드의 처음 12 nt는 표적 서열과 매치된다. 또 다른 구현예에서, 데드 가이드의 처음 11 nt는 표적 서열과 매치된다. 또 다른 구현예에서, 데드 가이드의 처음 10 nt는 표적 서열과 매치된다. 본 발명의 일 구현예에서, 데드 가이드의 처음 15 nt는 또 다른 유전자 좌위의 조절 영역 내 CRISPR모티프로부터 다운스트림에 있는 표적외 서열과 매치되지 않는다. 다른 구현예에서, 데드 가이드의 처음 14 nt, 또는 데드 가이드의 처음 13 nt, 또는 가이드의 처음 12 nt, 또는 데드 가이드의 처음 11 nt, 또는 데드 가이드의 처음 10 nt는 또 다른 유전자 좌위의 조절 영역 내 CRISPR모티프로부터 다운스트림에 있는 표적외 서열과 매치되지 않는다. 다른 구현예에서, 데드 가이드의 처음 15 nt, 또는 14 nt, 또는 13 nt, 또는 12 nt, 또는 11 nt는 게놈의 CRISPR 모티프로부터 다운스트림에 있는 표적외 서열과 매치되지 않는다.
특정 구현예에서, 데드 가이드 RNA는 표적 서열과 매치되지 않는 3' 말단에 부가적인 뉴클레오티드를 포함한다. 따라서, CRISPR 모티프의 다운스트림에 있는 처음 20 내지 28 nt를 포함하는 데드 가이드 RNA는 3' 말단에서 길이가 연장될 수 있다.
일반적인 준비
일 양태에서, 본 발명은 핵산 결합 시스템을 제공한다. 상보적인 프로브와 RNA의 인 시츄 혼성화는 강력한 기법이다. 전형적으로 형광 DNA 올리고뉴클레오티드가 혼성화에 의해 핵산을 검출하는 데 사용된다. 고정된 핵산(LNA)과 같은 특정 변형에 의해 증가된 효율이 달성되었지만, 효율적이고 융통성 있는 대안에 대한 요구가 여전히 남아있다. 본 발명은 인 시츄 혼성화를 위한 효율적이고 조정 가능한 시스템을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 용어 가이드 서열 및 가이드 RNA는 상기 인용된 문헌, 예를 들어 WO 2014/093622(PCT/US2013/074667)에서 상호교환 가능하게 사용된다. 일반적으로, 가이드 서열은 표적 서열과 혼성화하고, 표적 서열로의 CRISPR 복합체의 서열-특이적 결합을 지시하기에, 표적 폴리뉴클레오티드 서열과의 충분한 상보성을 갖는 임의의 폴리뉴클레오티드 서열이다. 일부 구현예에서, 가이드 서열과 이의 해당하는 표적 서열 간의 상보성의 정도는 적합한 정렬 알고리즘을 사용하여 최적으로 정렬되는 경우, 약 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99% 이상 또는 이를 초과한다. 최적의 정렬은 서열을 정렬하기에 적합한 임의의 알고리즘의 사용으로 결정될 수 있으며, 그의 비제한적인 예는 스미스-워터만 알고리즘, 니들만-분쉬 알고리즘, 버로우즈-휠러 변환 기반 알고리즘(예를 들어, Burrows Wheeler Aligner), ClustalW, Clustal X, BLAT, Novoalign(Novocraft Technologies; www.novocraft.com에서 이용 가능함), ELAND(Illumina, San Diego, CA), SOAP(soap.genomics.org.cn에서 이용 가능함), 및 Maq(maq.sourceforge.net에서 이용 가능함)를 포함한다. 일부 구현예에서, 가이드 서열은 길이가 약 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75 개 이상이거나 이를 초과한다. 일부 구현예에서, 가이드 서열은 길이가 약 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12 개 이하의 뉴클레오티드 미만이다. 바람직하게 가이드 서열은 길이가 10 개 내지 30 개 뉴클레오티드이다. 표적 서열로의 CRISPR 복합체의 서열-특이적 결합을 지시하는 가이드 서열의 능력은 임의의 적합한 분석에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 시험되는 가이드 서열을 포함하는 CRISPR 복합체를 형성하기에 충분한 CRISPR 시스템의 성분은, CRISPR 서열의 성분을 인코딩하는 벡터를 이용한 형질감염에 의해서와 같이 해당하는 표적 서열을 갖는 숙주 세포로 제공될 수 있으며, 본 명세서에 기재된 바와 같은 Surveyor 분석에 의해서와 같이, 표적 서열 내의 우선적인 절단의 평가로 이어질 수 있다. 유사하게, 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 절단은 표적 서열, 즉 시험되는 가이드 서열 및 시험 가이드 서열과 상이한 대조군 가이드 서열을 포함하는 CRISPR 복합체의 성분을 제공하고, 표적 서열에서 시험 및 대조군 가이드 서열 반응 간의 결합 또는 절단 속도를 비교함으로써 시험관에서 평가될 수 있다. 다른 분석이 가능하며, 이는 당업자에게 일어날 것이다. 가이드 서열은 임의의 표적 서열을 표적화하도록 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 세포의 게놈 내 서열이다. 예시적인 표적 서열은 표적 게놈에서 특유한 것을 포함한다.
일반적으로, 그리고 본 명세서에 걸쳐서, 용어 "벡터"는 그것이 연결되어 있는 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 벡터는, 이에 한정되지 않지만, 단일-가닥, 이중-가닥, 또는 부분적 이중-가닥인 핵산 분자; 하나 이상의 자유 말단을 포함하는 핵산 분자, 자유 말단이 없는 핵산 분자(예를 들어, 원형); DNA, RNA 또는 이들 둘 다를 포함하는 핵산 분자; 및 당업계에서 알려진 다른 다양한 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 벡터의 일 유형으로 "플라스미드"가 있으며, 이는 원형 이중 가닥 DNA 루프를 지칭하며, 그 안으로 예를 들어 표준 분자 클로닝 기법에 의해서 추가적인 DNA 절편이 삽입될 수 있다. 벡터의 또 다른 유형으로 바이러스 벡터가 있으며, 바이러스-유래된 DNA 또는 RNA 서열이 바이러스(예를 들어, 레트로바이러스, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스, 복제 결함 아데노바이러스, 및 아데노-관련 바이러스) 내로의 패키징을 위해 벡터에 존재한다. 바이러스 벡터는 또한 숙주 세포 내로의 형질감염을 위한, 바이러스가 보유하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특정 벡터는 그것이 도입된 숙주 세포에서 자율적 복제가 가능하다(예를 들어, 박테리아 복제 원점을 가진 박테리아 벡터 및 에피솜 포유류 벡터). 다른 벡터(예를 들어, 비-에피솜 포유류 벡터)는 숙주 세포 내로 도입시 숙주 세포의 게놈에 통합되며, 이에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다. 더욱이, 특정 벡터는 그것이 작동 가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이와 같은 벡터는 본 명세서에서 "발현 벡터"로 지칭된다. 진핵 세포에서의 발현을 위한 벡터 및 이를 초래하는 벡터는 본 명세서에서 "진핵 발현 벡터"로 지칭될 수 있다. 재조합 DNA 기법에서 유용성이 있는 통상적인 발현 벡터는 종종 플라스미드 형태이다.
재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 핵산의 발현에 적합한 형태로 본 발명의 핵산을 포함할 수 있는데, 이는 재조합 발현 벡터가 하나 이상의 조절 요소를 포함하는 것을 의미하며, 하나 이상의 조절 요소는 발현에 사용될 숙주 세포에 기반하여 선택될 수 있고, 발현될 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된다. 재조합 발현 벡터 내에서, "작동 가능하게 연결된"은 관심 뉴클레오티드 서열이(예를 들어, 시험관내 전사/번역 시스템에서 또는 벡터가 숙주 세포에 도입된 경우에는 숙주 세포에서) 상기 뉴클레오티드 서열의 발현을 허용하는 방식으로 조절 요소(들)에 연결됨을 의미하는 것으로 의도된다.
용어 "조절 요소"는 프로모터, 인핸서, 내부 리보솜 엔트리 부위(internal ribosomal entry site; IRES), 및 다른 발현 제어 요소(예를 들어, 전사 종결 신호, 예를 들어 폴리아데닐화 신호 및 폴리-U 서열)를 포함하는 것으로 의도된다. 이와 같은 조절 요소는, 예를 들어 문헌[Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif.(1990)]에 기재되어 있다. 조절 요소는 많은 유형의 숙주 세포에서 뉴클레오티드 서열의 구성적 발현을 지시하는 것들과 특정 숙주 세포에서만 뉴클레오티드 서열의 발현을 지시하는 것들(예를 들어, 조직-특이적 조절 서열)을 포함한다. 조직-특이적 프로모터는 근육, 뉴런, 뼈, 피부, 혈액, 특정 장기(예를 들어, 간, 췌장)와 같은 원하는 관심 조직, 또는 특정 세포 유형(예를 들어, 림프구)에서 주로 발현을 지시할 수 있다. 조절 요소는 시간-의존적 방식으로, 예를 들어 세포-주기 의존적 또는 발생 단계 의존적 방식으로 발현을 지시할 수 있으며, 이것은 조직 특이적이거나 세포-유형 특이적일 수 있거나, 또한 그렇지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 하나 이상의 pol III 프로모터(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 개 또는 그 이상의 pol III 프로모터), 하나 이상의 pol II 프로모터(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 개 또는 그 이상의 pol II 프로모터), 하나 이상의 pol I 프로모터(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 개 또는 그 이상의 pol I 프로모터), 또는 이들의 조합을 포함한다. pol III 프로모터의 예들은, 이에 한정되지 않지만, U6 및 H1 프로모터를 포함한다. pol II 프로모터의 예들은, 이에 한정되지 않지만, 레트로바이러스 라우스 육종 바이러스(Rous sarcoma virus; RSV) LTR 프로모터(선택적으로 RSV 인핸서와 함께), 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터(선택적으로 CMV 인핸서와 함께)[예를 들어, 문헌[Boshart et al, Cell, 41:521-530(1985)] 참조], SV40 프로모터, 디하이드로폴레이트 리덕타제 프로모터, β-액틴 프로모터, 포스포글리세롤 키나아제(phosphoglycerol kinase; PGK) 프로모터, 및 EF1α 프로모터를 포함한다. 또한, 용어 "조절 요소"에는 인핸서 요소, 예를 들어 WPRE; CMV 인핸서; HTLV-I의 LTR에서 R-U5' 절편(문헌[Mol. Cell. Biol., Vol. 8(1), p. 466-472, 1988]); SV40 인핸서; 및 토끼 β-글로빈의 엑손 2와 3 사이의 인트론 서열(문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol. 78(3), p. 1527-31, 1981])이 포함된다. 발현 벡터의 설계는 형질전환될 숙주 세포의 선택, 원하는 발현 수준 등과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다는 것이 당업자에 의해서 이해될 것이다. 벡터는 숙주 세포에 도입될 수 있고, 이에 의해 본 명세서에 기재된 바와 같이 핵산에 의해서 인코딩된, 융합 단백질 또는 펩티드를 포함하는, 전사물, 단백질 또는 펩티드(예를 들어, 클러스터링되고 규칙적으로 산재된 짧은 팔린드로믹 반복부(CRISPR) 전사물, 단백질, 효소, 이들의 돌연변이체 형태, 이들의 융합 단백질 등)가 생성될 수 있다.
유리한 벡터로는 렌티바이러스 및 아데노-관련 바이러스를 포함하며, 이와 같은 벡터의 유형은 또한 특정 유형의 세포들의 표적화를 위해 선택될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 제V형 또는 제VI형 CRISPR-Cas 유전자좌 이펙터 단백질의 용어 "crRNA" 또는 "가이드 RNA" 또는 "단일 가이드 RNA" 또는 "sgRNA" 또는 "하나 이상의 핵산 성분"은 표적 핵산 서열과 혼성화하고, 표적 핵산 서열로의 핵산-표적화 복합체의 서열-특이적 결합을 지시하기에, 표적 핵산 서열과의 충분한 상보성을 갖는 임의의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 본 명세서에서 제공된 CRISPR 시스템은 crRNA 또는 가이드 서열을 포함하는 유사 폴리뉴클레오티드를 이용할 수 있으며, 여기서 폴리뉴클레오티드는 RNA, DNA 또는 RNA와 DNA의 혼합물이고/이거나 여기서 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 서열은 이에 한정되지 않지만 벌지(bulge), 헤어핀 또는 스템 루프 구조와 같은 천연 crRNA의 구조를 포함하는, 임의의 구조를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 가이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 RNA 또는 DNA 서열일 수 있는 제2 폴리뉴클레오티드 서열과 듀플렉스를 형성한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 가이드는 비-천연적으로 발생하는 핵산 및/또는 비-천연적으로 발생하는 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오티드 유사체, 및/또는 화학적 변형물을 포함한다. 비-천연적으로 발생하는 핵산은 예를 들어, 천연적으로 및 비-천연적으로 발생하는 뉴클레오티드의 혼합물을 포함할 수 있다. 비-천연적으로 발생하는 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오티드 유사체는 리보스, 포스페이트 및/또는 염기 모이어티에서 변형될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 가이드 핵산은 리보뉴클레오티드 및 비-리보뉴클레오티드를 포함한다. 이러한 일 구현예에서, 가이드는 하나 이상의 리보뉴클레오티드 및 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 가이드는 포스포로티오에이트 결합, 보라노포스페이트 결합을 갖는 뉴클레오티드, 리보스 고리의 2' 및 4' 탄소 사이에 메틸렌 가교를 포함하는 고정된 핵산(LNA) 뉴클레오티드, 또는 가교 핵산(BNA)과 같은 하나 이상의 비-천연적으로 발생하는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 변형된 뉴클레오티드의 다른 예로는 2'-O-메틸 유사체, 2'-데옥시 유사체, 2-티오우리딘 유사체, N6-메틸아데노신 유사체, 또는 2'-플루오로 유사체가 포함된다. 변형된 염기의 추가의 예로는 2-아미노퓨린, 5-브로모-우리딘, 슈도우리딘(Ψ), N1-메틸슈도우리딘(me1Ψ), 5-메톡시우리딘(5moU), 이노신, 7-메틸구아노신이 포함되나 이에 한정되지 않는다.
특정 구현예에서, 화학적으로 변형된 가이드 RNA가 사용된다. 가이드 RNA 화학적 변형의 예로는 제한 없이, 하나 이상의 말단 뉴클레오티드에의 2'-O-메틸(M), 2'-O-메틸 3'포스포로티오에이트(MS), S-구속된 에틸(cEt), 또는 2'-O-메틸 3'티오PACE(MSP)의 포함이 포함된다. 이러한 화학적으로 변형된 가이드 RNA는 변형되지 않은 가이드 RNA와 비교하여 증가된 안정성 및 증가된 활성을 포함할 수 있으나, 그럼에도 표적내 대 표적외 특이성은 예측 가능하지 않다(문헌[Hendel, 2015, Nat Biotechnol. 33(9):985-9, doi: 10.1038/nbt.3290, 2015년 6월 29일 온라인 간행]; 문헌[Allerson et al., J. Med. Chem. 2005, 48:901-904; Bramsen et al., Front. Genet., 2012, 3:154; Deng et al., PNAS, 2015, 112:11870-11875]; 문헌[Sharma et al., MedChemComm., 2014, 5:1454-1471]; 문헌[Li et al., Nature Biomedical Engineering, 2017, 1, 0066 DOI:10.1038/s41551-017-0066] 참고). 화학적으로 변형된 가이드 RNA는 제한없이, 포스포로티오에이트 결합을 갖는 RNA 및 리보스 고리의 2' 및 4' 탄소 사이에 메틸렌 가교를 포함하는 고정된 핵산(LNA) 뉴클레오티드를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 상보성의 정도는 적합한 정렬 알고리즘을 사용하여 최적으로 정렬되는 경우, 약 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99% 이상 또는 이를 초과한다. 최적의 정렬은 서열을 정렬하기에 적절한 임의의 알고리즘의 사용으로 결정될 수 있으며, 그의 비제한적인 예는 스미스-워터만 알고리즘, 니들만-분쉬 알고리즘, 버로우즈-휠러 변환 기반 알고리즘(예를 들어, Burrows Wheeler Aligner), ClustalW, Clustal X, BLAT, Novoalign(Novocraft Technologies; www.novocraft.com에서 이용 가능함), ELAND(Illumina, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재), SOAP(soap.genomics.org.cn에서 이용 가능함), 및 Maq(maq.sourceforge.net에서 이용 가능함)를 포함한다. 표적 핵산 서열로의 핵산-표적화 복합체의 서열-특이적 결합을 지시하는(핵산-표적화 가이드 RNA 내) 가이드 서열의 능력은 임의의 적합한 분석에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 시험되는 가이드 서열을 포함하는 핵산-표적화 복합체를 형성하기에 충분한 핵산-표적화 CRISPR 시스템의 성분은, 핵산-표적화 복합체의 성분을 인코딩하는 벡터를 이용한 형질감염에 의해서와 같이 해당하는 표적 핵산 서열을 갖는 숙주 세포로 제공될 수 있으며, 본 명세서에 기재된 바와 같은 Surveyor 분석에 의해서와 같이, 표적 핵산 서열 내의 우선적인 표적화(예를 들어, 절단)의 평가로 이어질 수 있다. 유사하게, 표적 핵산 서열의 절단은 표적 핵산 서열, 즉 시험 가이드 서열 및 시험 가이드 서열과 상이한 대조군 가이드 서열을 포함하는 핵산-표적화 복합체의 성분을 제공하고, 표적 서열에서 시험 및 대조군 가이드 서열 반응 간의 결합 또는 절단 속도를 비교함으로써 시험관에서 평가될 수 있다. 다른 분석이 가능하며, 이는 당업자에게 일어날 것이다. 가이드 서열, 따라서 핵산-표적화 가이드 RNA는 임의의 표적 핵산 서열을 표적화하도록 선택될 수 있다. 표적 서열은 DNA일 수 있다. 표적 서열은 임의의 RNA 서열일 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 메신저 RNA(mRNA), pre-mRNA, 리보솜 RNA(rRNA), 운반 RNA(tRNA), 마이크로-RNA(miRNA), 작은 간섭 RNA(siRNA), 소형 핵 RNA(snRNA), 소형 핵소체 RNA(snoRNA), 이중 가닥화 RNA(dsRNA), 비-코딩 RNA(ncRNA), 긴 비-코딩 RNA(lncRNA), 및 소형 세포질 RNA(scRNA)로 구성된 군으로부터 선택되는 RNA 분자 내의 서열일 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, 표적 서열은 mRNA, pre-mRNA, 및 rRNA로 구성된 군으로부터 선택되는 RNA 분자 내의 서열일 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, 표적 서열은 ncRNA, 및 lncRNA로 구성된 군으로부터 선택되는 RNA 분자 내의 서열일 수 있다. 일부 더 바람직한 구현예에서, 표적 서열은 mRNA 분자 또는 pre-mRNA 분자 내의 서열일 수 있다.
일부 구현예에서, 핵산-표적화 가이드 RNA는 RNA-표적화 가이드 RNA 내의 2차 구조 정도를 감소시키도록 선택된다. 일부 구현예에서, 핵산-표적화 가이드 RNA의 뉴클레오티드의 약 75%, 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 1% 이하 또는 이의 미만이 최적으로 폴딩된 경우 자기-상보성 염기 쌍형성에 참여한다. 최적 폴딩은 임의의 적합한 폴리뉴클레오티드 폴딩 알고리즘에 의해 결정될 수 있다. 일부 프로그램은 최소 깁스(Gibbs) 자유 에너지 계산을 기반으로 한다. 이와 같은 한 알고리즘의 예는 mFold이며, 이는 문헌[Zuker and Stiegler, Nucleic Acids Res. 9(1981), 133-148]에 기재된 바와 같다. 또 다른 예의 폴딩 알고리즘은, 비엔나 대학의 이론 화학 연구소(Institute for Theoretical Chemistry)에서 개발된, 중심 구조 예측 알고리즘을 사용하는, 온라인 웹서버 RNAfold이다(예를 들어, 문헌[A.R. Gruber et al., 2008, Cell 106(1): 23-24]; 및 [PA Carr and GM Church, 2009, Nature Biotechnology 27(12): 1151-62] 참조).
특정 구현예에서, 가이드 RNA 또는 crRNA는 직접 반복(DR) 서열 및 가이드 서열 또는 스페이서 서열을 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 구성될 수 있거나 이로 구성될 수 있다. 특정 구현예에서, 가이드 RNA 또는 crRNA는 가이드 서열 또는 스페이서 서열에 융합되거나 연결된 직접 반복 서열을 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 구성될 수 있거나 이로 구성될 수 있다. 특정 구현예에서, 직접 반복 서열은 가이드 서열 또는 스페이서 서열로부터 업스트림(즉, 5')에 위치할 수 있다. 다른 구현예에서, 직접 반복 서열은 가이드 서열 또는 스페이서 서열로부터 다운스트림(즉, 3')에 위치할 수 있다.
특정 구현예에서, crRNA는 스템 루프, 바람직하게는 단일 스템 루프를 포함한다. 특정 구현예에서, 직접 반복 서열은 스템 루프, 바람직하게는 단일 스템 루프를 형성한다.
특정 구현예에서, 가이드 RNA의 스페이서 길이는 15 내지 35 nt이다. 특정 구현예에서, 가이드 RNA의 스페이서 길이는 적어도 15 개 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 18 nt, 예를 들어 적어도 19, 20, 21, 22 이상 nt이다. 특정 구현예에서, 스페이서 길이는 15 내지 17 nt, 예를 들어 15, 16 또는 17 nt, 17 내지 20 nt, 예를 들어 17, 18, 19 또는 20 nt, 20 내지 24 nt, 예를 들어 20, 21, 22, 23, 또는 24 nt, 23 내지 25 nt, 예를 들어 23, 24 또는 25 nt, 24 내지 27 nt, 예를 들어 24, 25, 26 또는 27 nt, 27 내지 30 nt, 예를 들어 27, 28, 29, 또는 30 nt, 30 내지 35 nt, 예를 들어 30, 31, 32, 33, 34, 또는 35 nt, 또는 35 nt 이상이다.
출원인은 또한 RNA 표적화 및 절단 능력을 검증하기 위한 도전 실험을 실행한다. 이 실험은 StCas9의 이종성 발현을 위한 에스케리키아 콜라이에서의 유사한 연구와 거의 유사하다(문헌[Sapranauskas, R. et al. Nucleic acids Res 39, 9275-9282(2011)]). 출원인은 이종성 에스케리키아 콜라이 내로 PAM 및 내성 유전자 둘 다를 함유하는 플라스미드를 도입한 다음, 해당하는 항생제 상에 플레이팅한다. 플라스미드 전사된 내성 유전자의 RNA 절단이 있는 경우, 출원인은 생존 콜로니를 관찰하지 않는다.
보다 상세하게, DNA 표적에 대하여 분석은 다음과 같으나, RNA 표적에 대하여 그에 따라 조정될 수 있다. 2 가지 에스케리키아 콜라이 균주가 이 분석에서 사용된다. 하나는 박테리아 균주 유래의 내인성 이펙터 단백질 유전자좌를 인코딩하는 플라스미드를 보유한다. 나머지 균주는 빈 플라스미드(예를 들어, pACYC184, 대조 균주)를 보유한다. 가능한 모든 7 bp 또는 8 bp PAM 서열을 항생제 내성 플라스미드(암피실린 내성 유전자를 갖는 pUC19) 상에 제시한다. PAM은 프로토-스페이서 1의 서열(내인성 이펙터 단백질 유전자좌에서 제1 스페이서에 대한 DNA 표적) 옆에 위치한다. 2 개의 PAM 라이브러리를 클로닝하였다. 하나는 프로토-스페이서의 8 랜덤 bp 5'를 갖는다(예를 들어, 총 65536 개의 상이한 PAM 서열 = 복잡성). 나머지 라이브러리는 프로토-스페이서의 7 랜덤 bp 3'를 갖는다(예를 들어, 총 복잡성은 16384 개의 상이한 PAM임). 둘 모두의 라이브러리가 가능한 PAM 당 평균 500 개의 플라스미드를 갖도록 클로닝되었다. 시험 균주 및 대조 균주를 별도의 형질전환에서 5'PAM 및 3'PAM 라이브러리로 형질전환하고, 형질전환된 세포를 암피실린 플레이트 상에 별도로 플레이팅하였다. 플라스미드를 이용한 인식 및 후속 절단/간섭은 세포를 암피실린에 취약하게 만들고 성장을 방지한다. 대략 형질전환 12 시간 후, 시험 및 대조 균주에 의해 형성된 모든 콜로니를 수확하고 플라스미드 DNA를 분리하였다. 플라스미드 DNA를 PCR 증폭 및 후속 딥 시퀀싱을 위한 주형으로서 사용하였다. 비형질전환 라이브러리에서 모든 PAM의 표시는 형질전환된 세포에서의 예상된 PAM의 표시를 나타내었다. 대조 균주에서 발견된 모든 PAM의 표시는 실제 표시를 나타내었다. 시험 균주에서 모든 PAM의 표시는 어떤 PAM이 효소에 의해 인식되지 않는지를 나타내었고 대조 균주와의 비교는 손실된 PAM의 서열을 추출할 수 있게 한다.
독성 및 표적외 효과의 최소화를 위해, 전달되는 핵산-표적화 가이드 RNA의 농도를 제어하는 것이 중요할 것이다. 핵산-표적화 가이드 RNA의 최적 농도는 세포 또는 비-인간 진핵 생물 동물 모델에서 상이한 농도를 시험함으로써, 그리고 잠재적인 표적외 게놈 유전자좌에서의 변형 정도를 분석하는 딥 시퀀싱을 사용함으로써 결정될 수 있다. 표적외 변형 수준을 최소화하면서 표적상 변형의 가장 높은 수준을 제공하는 농도는 생체내 전달을 위해 선택되어야 한다. 핵산-표적화 시스템은 유리하게 제VI형 CRISPR 시스템으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 핵산-표적화 시스템의 하나 이상의 요소는 내인성 RNA-표적화 시스템을 포함하는 특정 생물로부터 유래한다. 구체적인 구현예에서, 제VI형 RNA-표적화 Cas 효소는 C2c2이다. Cas 단백질의 비제한적인 예는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9(또한 Csn1 및 Csx12로도 알려짐), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, 이의 상동체, 또는 이의 변형된 형태를 포함한다. 일 구현예에서, 본 명세서에서 지칭된 C2c2와 같은 제VI형 단백질은 또한 C2c2와 같은 제VI형 단백질의 상동체 또는 오솔로그를 포함한다. 용어 "오솔로그(orthologue)"(또한 본 명세서에서 "오솔로그(ortholog)"로 지칭됨) 및 "상동체(homologue)"(또한 본 명세서에서 "상동체(homolog)"로 지칭됨)는 당업계에 잘 공지되어 있다. 추가 지침에 의해, 본 명세서에서 사용된 단백질의 "상동체"는 이의 상동체인 단백질과 동일 또는 유사한 기능을 실행하는 동일 종의 단백질이다. 상동성 단백질은 구조적으로 관련될 수 있지만 관련될 필요는 없거나, 부분적으로만 구조적으로 관련된다. 구체적인 구현예에서, 본 명세서에서 지칭된 C2c2와 같은 제VI형 단백질의 상동체 또는 오솔로그는 C2c2와 같은 제VI형 단백질과 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%와 같은 서열 상동성 또는 동일성을 갖는다. 추가의 구현예에서, 본 명세서에서 지칭된 C2c2와 같은 제VI형 단백질의 상동체 또는 오솔로그는 C2c2와 같은 야생형 제VI형 단백질과 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어 적어도 95%와 같은 서열 상동성 또는 동일성을 갖는다.
일 구현예에서, 제VI형 RNA-표적화 Cas 단백질은 렙토트리키아, 리스테리아, 코리네박터(Corynebacter), 수테렐라(Sutterella), 레지오넬라(Legionella), 트레포네마(Treponema), 필리팍토(Filifactor), 유박테리움, 스트렙토코커스, 락토바실러스(Lactobacillus), 미코플라스마(Mycoplasma), 박테로이데스, 플라비볼라(Flaviivola), 플라보박테리움(Flavobacterium), 스파에로카에타(Sphaerochaeta), 아조스피릴룸(Azospirillum), 글루코나세토박터(Gluconacetobacter), 네이세리아(Neisseria), 로세부리아(Roseburia), 파르비바쿨룸(Parvibaculum), 스타필로코커스(Staphylococcus), 니트라티프락토(Nitratifractor), 미코플라스마 및 캄필로박터를 포함하지만 이에 한정되지 않는 속의 생물의 C2c2 오솔로그일 수 있다. 이러한 속의 생물의 종은 본 명세서에서 다르게 논의될 수 있다.
CRISPR-Cas 시스템 효소의 오솔로그를 확인하는 일부 방법은 관심 게놈에서 tracr 서열을 확인하는 것을 수반할 수 있다. tracr 서열의 확인은 다음 단계와 관련될 수 있다: 데이터베이스에서 직접 반복 또는 tracr 메이트 서열을 검색하여 CRISPR 효소를 포함하는 CRISPR 영역을 확인하는 단계. 센스 및 안티센스 방향 둘 다에서 CRISPR 효소의 측면에 배치하는 CRISPR 영역에서 상동성 서열을 검색하는 단계. 전사 종결자 및 2차 구조를 조사하는 단계. 직접 반복 또는 tracr 메이트 서열은 아니지만, 잠재적인 tracr 서열로서 직접 반복 또는 tracr 메이트 서열에 대해 50% 초과의 동일성을 갖는 임의의 서열을 확인하는 단계. 잠재적인 tracr 서열을 취하고, 이와 연관된 전사 종결자 서열에 대해 분석하는 단계.
본 명세서에서 기재된 임의의 기능성은 다수의 오솔로그 유래의 단편을 포함하는 키메라 효소를 포함하는, 다른 오솔로그 유래의 CRISPR 효소로 조작될 수 있음이 이해될 것이다. 이와 같은 오솔로그의 예는 본 명세서의 다른 곳에 기재되어 있다. 따라서, 키메라 효소는 렙토트리키아, 리스테리아, 코리네박터, 수테렐라, 레지오넬라, 트레포네마, 필리팍토르, 유박테리움, 스트렙토코커스, 락토바실러스, 미코플라스마, 박테로이데스, 플라비볼라, 플라보박테리움, 스파에로카에타, 아조스피릴룸, 글루콘아세토박터, 네이세리아, 로세부리아, 파르비바쿨룸, 스타필로코커스, 니트라티프락토르, 미코플라스마 및 캄필로박터를 포함하지만, 이에 한정되지 않은 생물의 CRISPR 효소 오솔로그의 단편을 포함할 수 있다. 키메라 효소는 본 명세서에서 언급된 속 또는 본 명세서에서 언급된 종의 생물의 CRISPR 효소 오솔로그일 수 있으며; 유리하게 단편은 상이한 종의 CRISPR 효소 오솔로그 유래의 것이다.
구현예에서, 제VI형 RNA-표적화 이펙터 단백질, 특히 본 명세서에서 언급된 바와 같은 C2c2 단백질은 또한 C2c2의 기능적 변이체 또는 이의 상동체 또는 오솔로그를 포함한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은 단백질의 "기능적 변이체"는 그 단백질의 활성을 적어도 부분적으로 보유하는 단백질의 변이체를 지칭한다. 기능적 변이체는 돌연변이체(이는 삽입, 결실, 또는 치환 돌연변이체일 수 있음)를 포함할 수 있으며, 이는 다형체 등을 포함한다. 또한, 기능적 변이체 내에는 또 다른, 보통 관련되지 않은, 핵산, 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드와 이와 같은 단백질의 융합 생성물이 포함된다. 기능적 변이체는 천연적으로 발생할 수 있거나 인공적일 수 있다. 유리한 구현예는 설계 제작된 또는 비-천연 발생 제VI형 RNA-표적화 이펙터 단백질을 수반할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 렙토트리키아 샤히C2c2, 라크노스피라세아에 박테리움 MA2020 C2c2, 라크노스피라세아에 박테리움 NK4A179 C2c2, 클로스트리디움 아미노필룸(DSM 10710) C2c2, 카르노박테리움 갈리나룸(DSM 4847) C2c2, 팔루디박터 프로피오니시게네스(WB4) C2c2, 리스테리아 웨이헨스테파넨시스(FSL R9-0317) C2c2, 리스테리아세아에 박테리움(FSL M6-0635) C2c2, 리스테리아 뉴요켄시스(FSL M6-0635) C2c2, 렙토트리키아 와데이(F0279) C2c2, 로도박터 캅술라투스(SB 1003) C2c2, 로도박터 캅술라투스(R121) C2c2, 로도박터 캅술라투스(DE442) C2c2, 렙토트리키아 와데이(Lw2) C2c2, 리스테리아 세엘리게리 C2c2 중 임의의 것의 야생형 서열에 대해 적어도 80% 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 이펙터 단백질이 제공된다.
본 발명의 일 구현예에서, 이펙터 단백질은 본 명세서에 기재된 컨센서스 서열을 포함하지만 이에 한정되지 않는 제VI형 이펙터 단백질 컨센서스 서열에 대해 적어도 80%의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서, 이펙터 단백질은 본 명세서에 기재된 HEPN 도메인, 당업계에 공지된 HEPN 도메인 및 컨센서스 서열 및 모티프와 비교하여 HEPN 도메인으로 인식되는 도메인을 포함하지만 이에 한정되지 않는 적어도 하나의 HEPN 도메인을 포함한다. 몇몇의 이러한 도메인이 본 명세서에 제공된다. 하나의 비-제한적인 예에서, 컨센서스 서열은 본 명세서에서 제공된 C2c2 오솔로그의 서열로부터 유래될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 이펙터 단백질은 RxxxxH 모티프 서열을 포함하는 하나 이상의 HEPN 도메인을 포함한다. RxxxxH 모티프 서열은, 제한없이, 본 명세서에 기재된 HEPN 도메인 또는 당업계에 공지된 HEPN 도메인 유래일 수 있다. RxxxxH 모티프 서열은 2 개 이상의 HEPN 도메인의 부분을 조합함으로써 생성된 모티프 서열을 추가로 포함한다. 언급된 바와 같이, 컨센서스 서열은 US 62/432,240(BI-10035)에 개시된 15 개의 오솔로그의 서열로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 상기 서열 정렬로부터, 제1 HEPN 도메인은 R{N/H}xxxH 모티프를 포함하는 반면 제2 HEPN 도메인은 R{N/K}xxxH 모티프를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서, HEPN 도메인은 R{N/H/K}X1X2X3H의 서열을 포함하는 적어도 하나의 RxxxxH 모티프를 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, HEPN 도메인은 R{N/H}X1X2X3H의 서열을 포함하는 RxxxxH 모티프를 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, HEPN 도메인은 R{N/K}X1X2X3H의 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, X1는 R, S, D, E, Q, N, G, Y, 또는 H이다. 특정 구현예에서, X2는 I, S, T, V 또는 L이다. 특정 구현예에서, X3은 L, F, N, Y, V, I, S, D, E 또는 A이다.
본 발명에 따른 사용을 위한 추가적인 이펙터는 이에 한정되지 않음에도 예를 들어 cas1 유전자의 시작으로부터 20 kb 및 cas1유전자의 말단으로부터 20 kb 영역 내에서 cas1 유전자와의 근접성에 의해 식별될 수 있다. 특정 구현예에서, 이펙터 단백질은 적어도 1 개의 HEPN 도메인 및 적어도 500 개의 아미노산을 포함하고, 여기서 C2c2 이펙터 단백질은 Cas1 유전자 또는 CRISPR 어레이의 업스트림 또는 다운스트림 20 kb 내의 원핵 게놈에 천연적으로 존재한다.
일 구현예에서, 제VI형 RNA-표적화 이펙터 단백질, 특히 C2c2 또는 이의 오솔로그 또는 상동체를 인코딩하는 핵산 분자(들)는 진핵 세포에서 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다. 진핵 생물은 본 명세서에 논의된 바와 같을 수 있다. 핵산 분자(들)는 설계 제작되거나 비-천연적으로 발생할 수 있다.
일 구현예에서, 제VI형 RNA-표적화 이펙터 단백질, 특히 C2c2 또는 이의 오솔로그 또는 상동체는 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다(그리고 따라서 이들을 코딩하는 핵산 분자(들)은 돌연변이(들)를 포함할 수 있다). 돌연변이는 인위적으로 도입된 돌연변이일 수 있으며, 촉매 도메인에 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. Cas9 효소에 관한 촉매 도메인의 예는 RuvC I, RuvC II, RuvC III 및 HNH 도메인을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
일 구현예에서, C2c2 또는 그의 오솔로그 또는 상동체와 같은 제VI형 단백질은 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 돌연변이는 인위적으로 도입된 돌연변이일 수 있으며, 촉매 도메인에서의 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. Cas 효소에 관한 촉매 도메인의 예는 HEPN 도메인을 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는다.
일 구현예에서, 제VI형 단백질, 예를 들어 C2c2 또는 이의 오솔로그 또는 상동체는 기능성 도메인에 융합되거나 작동 가능하게 연결된 총칭적인 핵산 결합 단백질로서 사용될 수 있다. 예시적인 기능성 도메인은 번역 개시제, 번역 활성화제, 번역 억제제, 뉴클레아제, 특히 리보뉴클레아제, 스플라이세오좀(spliceosome), 비드, 광 유도성/제어성 도메인 또는 화학적 유도성/제어성 도메인을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 비-변형된 핵산-표적화 이펙터 단백질은 절단 활성을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, RNA-표적화 이펙터 단백질은 표적 서열의 위치에서 또는 그 가까이에서, 예를 들어 표적 서열 내 및/또는 표적 서열의 상보체 내 또는 표적 서열과 연관된 서열에서, 1 개 또는 2 개의 핵산(DNA 또는 RNA) 가닥의 절단을 지시할 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산-표적화 Cas 단백질은, 표적 서열의 제1 또는 최종 뉴클레오티드로부터의 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500 개 이상의 염기쌍 내에서 1 개 또는 2 개의 DNA 또는 RNA 가닥의 절단을 지시할 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는, 돌연변이된 핵산-표적화 Cas 단백질이 표적 서열을 함유하는 표적 폴리뉴클레오티드의 RNA 가닥을 절단하는 능력이 결여되도록 해당하는 야생형 효소와 관련하여 돌연변이될 수 있는 핵산-표적화 Cas 단백질을 인코딩한다. 추가 예로서, Cas의 2 개 이상의 촉매 도메인(예를 들어, HEPN 도메인)은 돌연변이되어 모든 RNA 절단 활성이 실질적으로 결여된 돌연변이된 Cas를 생성할 수 있다. 일부 실시형태에서, 돌연변이된 효소의 RNA 절단 활성이 효소의 비-돌연변이 형태의 핵산 절단 활성의 약 25%, 10%, 5%, 1%, 0.1%, 0.01% 이하, 또는 그 미만인 경우, 핵산-표적화 이펙터 단백질은 모든 RNA 절단 활성이 실질적으로 결여된 것으로 간주될 수 있으며; 예는, 돌연변이된 형태의 핵산 절단 활성이 0이거나 비-돌연변이된 형태에 비하여 무시해도 될 정도인 경우일 수 있다. 이펙터 단백질은 제VI형 CRISPR 시스템 유래의 다수 뉴클레아제 도메인을 갖는 가장 큰 뉴클레아제에 대하여 상동성을 공유하는 일반적인 부류의 효소를 참조하여 확인될 수 있다. 가장 바람직하게, 이펙터 단백질은 제VI형 단백질, 예를 들어 C2c2이다. 유래됨은, 유래된 효소가 야생형 효소와 높은 정도의 서열 상동성을 갖는 의미에서 크게 기반으로 하지만, 당업계에 공지되거나 본 명세서에 기재된 바와 같은 일부 방법으로 돌연변이된(변형된) 것을 출원인은 의미한다.
다시, 용어 Cas 및 CRISPR 효소 및 CRISPR 단백질 및 Cas 단백질은 일반적으로 상호교환 가능하게 사용되며, Cas9에 대한 특정 언급에 의한 것과 같이 본 명세서에서 달리 명백하지 않다면, 본 명세서에서의 언급한 모든 점은 본 출원에서 추가로 기재된 신규 CRISPR 이펙터 단백질에 대한 유사성을 언급하는 것으로 이해될 것이다. 상기 언급된 바와 같이, 본 명세서에서 사용된 많은 잔기의 넘버링은 제VI형 CRISPR 유전자좌로부터의 이펙터 단백질을 지칭한다. 그러나, 본 발명은 미생물의 다른 종로부터의 다수의 더 많은 이펙터 단백질을 포함한다는 것이 이해될 것이다. 특정 구현예에서, Cas는 구성적으로 존재하거나 유도성으로 존재하거나, 조건부로 존재하거나 투여되거나 전달될 수 있다. Cas 최적화를 사용하여 기능을 향상시키거나 새로운 기능을 발생시킬 수 있으며, 키메라 Cas 단백질을 생성할 수 있다. 그리고 Cas는 총칭적인 핵산 결합 단백질로 사용될 수 있다.
통상적으로, 내인성 핵산-표적화 시스템의 맥락에서(표적 서열에 혼성화되고 하나 이상의 핵산-표적화 이펙터 단백질과 복합체화된 가이드 RNA를 포함하는), 핵산-표적화 복합체의 형성은, 표적 서열 내 또는 가까이에서(예를 들어, 그로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50, 100, 200, 500 개 이상의 염기쌍 내) 1 개 또는 2 개의 DNA 또는 RNA 가닥의 절단을 초래한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "관심 표적 유전자와 관련된 서열(들)"은 표적 서열의 부근 가까이의(예를 들어, 표적 서열로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50, 100, 200, 500 개 이상의 염기쌍 내, 여기서 표적 서열은 관심 표적 유전자좌 내에 포함됨) 서열을 지칭한다.
코돈 최적화된 서열의 예는, 이러한 예에서, 진핵생물, 예를 들어 인간(즉, 인간에서의 발현을 위해 최적화됨), 또는 본 명세서에서 논의된 바와 같은 또 다른 진핵생물, 동물 또는 포유류에서의 발현을 위해 최적화된 서열이며; 예를 들어, 코돈 최적화된 서열의 예로서 WO 2014/093622(PCT/US2013/074667)에서의 SaCas9 인간 코돈 최적화 서열을 참조한다(당업계 및 본 개시 내용의 지식으로부터, 특히 이펙터 단백질(예를 들어, C2c2)에 대해, 핵산 분자(들)를 코딩하는 코돈 최적화는 당업자의 범위 내에 있다). 이것이 바람직하지만, 다른 예들도 가능하며, 인간 이외의 숙주 종에 대한 코돈 최적화, 또는 특정 기관에 대한 코돈 최적화가 공지되어 있다는 것이 이해될 것이다. 일부 구현예에서, DNA/RNA-표적화 Cas 단백질을 인코딩하는 효소 코딩 서열은 진핵 세포와 같은 특정 세포에서의 발현에 대해 코돈 최적화된다. 진핵 세포는, 구체적인 생물, 예를 들어 인간 또는 본 명세서에서 논의된 바와 같은 비-인간 진핵생물 또는 동물 또는 포유동물, 예를 들어 마우스, 래트, 토끼, 개, 가축 또는 비-인간 포유동물 또는 영장류(이에 한정되지 않음)를 포함하는 포유동물의 것이거나 또는 그로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 인간이나 동물에 임의의 실질적인 의학적 이익 없이 그들을 고통스럽게 할 수 있는 인간의 생식계열 유전자 동일성을 변형하기 위한 과정 및/또는 동물의 유전자 동일성을 변형하기 위한 과정과, 또한 이와 같은 과정으로부터 생긴 동물이 배제될 수 있다. 일반적으로, 코돈 최적화는 고유 아미노산 서열을 유지하면서, 고유 서열의 적어도 하나의 코돈(예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50 개 이상, 또는 그를 초과하는 코돈)을 숙주 세포의 유전자에 더 빈번하게 또는 가장 빈번하게 사용되는 코돈으로 대체함으로써, 관심 숙주 세포에서의 발현의 향상을 위해 핵산 서열을 변형시키는 과정을 지칭한다. 다양한 종은 특정 아미노산의 특정 코돈에 대하여 특정 편향을 나타낸다. 코돈 편향(생물 간의 코돈 사용의 차이)은 종종 메신저 RNA(mRNA)의 번역의 효율과 상관관계가 있으며, 이는 결국, 특히, 번역되는 코돈의 특성 및 특정 운반 RNA(tRNA) 분자의 이용 가능성에 좌우되는 것으로 여겨진다. 세포에서의 선택된 tRNA의 우세는 일반적으로 펩티드 합성에 가장 빈번하게 사용되는 코돈을 반영하는 것이다. 따라서, 유전자는 코돈 최적화를 기반으로 하여 주어진 생물에서의 최적의 유전자 발현을 위해 맞춤화될 수 있다. 코돈 사용 표는, 예를 들어 www.kazusa.orjp/codon/에서 이용 가능한 "코돈 사용 데이터베이스"에서 용이하게 이용 가능하며, 이 표는 다수의 방식으로 적합하게 될 수 있다. 문헌[Nakamura, Y., et al. “Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000" Nucl. Acids Res. 28:292(2000)]을 참조한다. 특정 숙주 세포에서의 발현을 위해 특정 서열을 코돈 최적화시키는 컴퓨터 알고리즘이 또한 이용 가능하며, 예를 들어 Gene Forge(Aptagen; 미국 펜실베이니아주 야코부스)도 또한 이용 가능하다. 일부 구현예에서, DNA/RNA-표적화 Cas 단백질을 인코딩하는 서열 내의 하나 이상의 코돈(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50 개 이상의, 또는 모든 코돈)은 특정 아미노산에 대하여 가장 빈번하게 사용되는 코돈에 해당한다.
일부 구현예에서, 벡터는 하나 이상의 핵 국소화 서열(NLS) 또는 핵 방출 서열(NES), 예를 들어 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개 이상, 또는 이를 초과하는 NLS 또는 NES를 포함하는 C2c2와 같은 핵산-표적화 이펙터 단백질, 또는 이의 오솔로그 또는 상동체를 인코딩한다. 일부 구현예에서, RNA-표적화 이펙터 단백질은 아미노-말단 또는 그 근처에 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개 이상, 또는 이를 초과하는 NLS 또는 NES, 카르복시-말단 또는 그 근처에 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개 이상, 또는 이를 초과하는 NLS 또는 NES, 또는 이들의 조합(예를 들어 아미노-말단에서 0 개 또는 적어도 1 개 이상의 NLS 또는 NES, 그리고 카르복시 말단에서 0 개 또는 적어도 1 개 이상의 NLS 또는 NES)을 포함한다. 1 개 초과의 NLS 또는 NES가 존재하는 경우, 각각은 단일의 NLS 또는 NES가 1 개 초과의 복제물로 존재하고/존재하거나 1 개 이상의 복제물로 존재하는 1 개 이상의 다른 NLS 또는 NES와 조합될 수 있도록, 다른 것들로부터 독립적으로 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, NLS 또는 NES는 NLS 또는 NES의 가장 가까운 아미노산이 N- 또는 C-말단으로부터 폴리펩티드 사슬을 따라 약 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 개 이상의 아미노산 내에 존재하는 경우, N- 또는 C-말단 근처에 있는 것으로 간주된다. NLS의 비제한적인 예는 하기로부터 유래된 NLS 서열을 포함한다: 아미노산 서열 PKKKRKV를 갖는 SV40 바이러스 대형 T-항원의 NLS; 뉴클레오플라스민으로부터의 NLS(예를 들어, 서열 KRPAATKKAGQAKKKK를 갖는 뉴클레오플라스민 이분(bipartite) NLS); 아미노산 서열 PAAKRVKLD 또는 RQRRNELKRSP를 갖는 c-myc NLS; 서열 NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY를 갖는 hRNPA1 M9 NLS; 임포틴-알파로부터의 IBB 도메인의 서열 RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV; 마이오마(myoma) T 단백질의 서열 VSRKRPRP 및 PPKKARED; 인간 p53의 서열 POPKKKPL; 마우스 c-abl IV의 서열 SALIKKKKKMAP; 인플루엔자 바이러스 NS1의 서열 DRLRR 및 PKQKKRK; 간염 바이러스 델타 항원의 서열 RKLKKKIKKL; 마우스 Mx1 단백질의 서열 REKKKFLKRR; 인간 폴리(ADP-리보스) 중합효소의 서열 KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK; 및 스테로이드 호르몬 수용체(인간) 글루코코르티코이드의 서열 RKCLQAGMNLEARKTKK. 일반적으로, 하나 이상의 NLS 또는 NES는 진핵 세포의 핵 또는 세포질 각각에서 검출 가능한 양의 DNA/RNA-표적화 Cas 단백질의 축적을 유도하기에 충분한 세기의 것이다. 일반적으로, 핵/세포질 국소화 활성의 세기는 핵산-표적화 이펙터 단백질 내 NLS 또는 NES의 수, 사용되는 특정 NLS(들) 또는 NES(들), 또는 이들 인자의 조합으로부터 유래할 수 있다. 핵/세포질에서의 축적의 검출은 임의의 적합한 기법에 의해 실행될 수 있다. 예를 들어, 검출 가능한 마커는, 예를 들어 핵(예를 들어, 핵에 특이적인 염색제, 예를 들어 DAPI) 또는 세포질의 위치를 검출하기 위한 수단과 함께, 세포 내의 위치가 가시화될 수 있도록, 핵산-표적화 단백질에 융합될 수 있다. 세포 핵을 또한 세포로부터 분리할 수 있으며, 그 다음 이의 내용물을 단백질을 검출하기 위한 임의의 적합한 과정, 예를 들어 면역조직화학, 웨스턴 블롯, 또는 효소 활성 분석에 의해 분석할 수 있다. 또한 핵/세포질에서의 축적은, 핵산-표적화 Cas 단백질 또는 핵산-표적화 복합체에 노출되지 않거나, 하나 이상의 NLS 또는 NES가 결여된 핵산-표적화 Cas 단백질에 노출된 대조군에 비하여, 간접적으로, 예를 들어 핵산-표적화 복합체 형성의 영향에 대한 분석(예를 들어, 표적 서열에서의 RNA 절단 또는 돌연변이에 대한 분석, 또는 RNA-표적화 복합체 형성 및/또는 RNA-표적화 Cas 단백질 활성에 의해 영향을 받는 변경된 유전자 발현 활성에 대한 분석)에 의해 결정될 수 있다. 본 명세서에 기재된 C2c2 이펙터 단백질 복합체 및 시스템의 바람직한 구현예에서, 코돈 최적화된 C2c2 이펙터 단백질은 단백질의 C-말단에 부착된 NLS 또는 NES를 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산-표적화 시스템의 하나 이상의 요소의 발현을 구동하는 하나 이상의 벡터는, 핵산-표적화 시스템의 요소의 발현이 하나 이상의 표적 부위에서 핵산-표적화 복합체의 형성을 지시하도록 숙주 세포 내로 도입된다. 예를 들어, 핵산-표적화 이펙터 효소 및 핵산-표적화 가이드 RNA는 각각 별개의 벡터 상에서 별개의 조절 요소에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 핵산-표적화 시스템의 RNA(들)는 유전자 도입 핵산-표적화 이펙터 단백질 동물 또는 포유동물, 예를 들어 핵산-표적화 이펙터 단백질을 구조적으로 또는 유도적으로 또는 조건적으로 발현하는 동물 또는 포유동물; 또는 그렇지 않으면 핵산-표적화 이펙터 단백질을 발현하거나 핵산-표적화 이펙터 단백질을 함유하는 세포를 갖는 동물 또는 포유동물에게, 예를 들어 생체내 핵산-표적화 이펙터 단백질을 코딩하고 발현하는 벡터 또는 벡터들을 이에 사전 투여함으로써 전달될 수 있다. 대안적으로, 동일하거나 상이한 조절 요소로부터 발현된 둘 이상의 요소는, 제1 벡터 내에 포함되지 않은 핵산-표적화 시스템의 임의의 성분을 제공하는 하나 이상의 추가적인 벡터들과 단일 벡터로 조합될 수 있다. 단일 벡터로 조합된 핵산-표적화 시스템 요소는 임의의 적합한 배향으로, 예를 들어 제2의 요소에 대하여 5'(제2의 요소의 "업스트림") 또는 3'(제2의 요소의 "다운스트림")에 위치되어 배열될 수 있다. 하나의 요소의 코딩 서열은 제2 요소의 코딩 서열의 동일한 가닥 또는 반대의 가닥에 위치될 수 있고, 동일하거나 반대의 방향으로 배향될 수 있다. 일부 구현예에서, 단일 프로모터는 하나 이상의 인트론 서열 내에 임베딩된(예를 들어, 상이한 인트론 내 각각, 적어도 하나의 인트론 내 둘 이상, 또는 단일 인트론 내 모두), 핵산-표적화 가이드 RNA 및 핵산-표적화 이펙터 단백질을 인코딩하는 전사물의 발현을 구동한다. 일부 구현예에서, 핵산-표적화 이펙터 단백질 및 핵산-표적화 가이드 RNA는 동일한 프로모터에 작동 가능하게 연결되고 발현될 수 있다. 핵산-표적화 시스템의 하나 이상의 요소의 발현을 위한 전달 비히클, 벡터, 입자, 나노입자, 제형 및 그의 성분은 이전의 문헌, 예를 들어 WO 2014/093622(PCT/US2013/074667)에서 사용된 바와 같다. 일부 구현예에서, 벡터는 하나 이상의 삽입 부위, 예를 들어 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열(또한 "클로닝 부위"로서 지칭됨)을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 삽입 부위(예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개 이상, 또는 이를 초과하는 삽입 부위)가 하나 이상의 벡터의 하나 이상의 서열 요소의 업스트림 및/또는 다운스트림에 위치된다. 일부 구현예에서, 벡터는 2 개 이상의 삽입 부위를 포함하여, 각각의 부위에서 가이드 서열의 삽입이 가능하게 한다. 이러한 배열에서, 2 개 이상의 가이드 서열은 단일 가이드 서열의 2 개 이상의 카피, 2 개 이상의 상이한 가이드 서열 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 다수의 상이한 가이드 서열이 사용된 경우, 핵산-표적화 활성을 세포 내에서 다수의 상이한 해당하는 표적 서열로 표적화하는 데 단일 발현 작제물이 사용될 수 있다. 예를 들어, 단일 벡터는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 개 이상, 또는 이를 초과하는 가이드 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개 이상, 또는 이를 초과하는 이와 같은 가이드-서열 함유 벡터가 제공될 수 있으며, 선택적으로 세포로 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 핵산-표적화 이펙터 단백질을 인코딩하는 효소-코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 조절 요소를 포함한다. 핵산-표적화 이펙터 단백질 또는 핵산-표적화 가이드 RNA 또는 RNA(들)는 개별적으로 전달될 수 있으며; 유리하게는 이들 중 적어도 하나가 입자 또는 나노입자 복합체를 통해 전달된다. 핵산-표적화 이펙터 단백질 mRNA는 핵산-표적화 이펙터 단백질이 발현될 시간을 제공하기 위하여 핵산-표적화 가이드 RNA 이전에 전달될 수 있다. 핵산-표적화 이펙터 단백질 mRNA는 핵산-표적화 가이드 RNA의 투여 전 1 시간 내지 12 시간(바람직하게는 약 2 시간 내지 6 시간)에 투여될 수 있을 것이다. 대안적으로, 핵산-표적화 이펙터 단백질 mRNA 및 핵산-표적화 가이드 RNA는 함께 투여될 수 있다. 유리하게, 가이드 RNA의 제2 부스터 용량은 핵산-표적화 이펙터 단백질 mRNA + 가이드 RNA의 초기 투여 후 1 시간 내지 12 시간(바람직하게는 약 2 시간 내지 6 시간)에 투여될 수 있다. 핵산-표적화 이펙터 단백질 mRNA 및/또는 가이드 RNA의 추가적인 투여는 게놈 및/또는 트랜스크립톰 변형의 가장 효율적인 수준을 달성하는 데 유용할 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 핵산-표적화 시스템의 하나 이상의 요소의 사용 방법을 제공한다. 본 발명의 핵산-표적화 복합체는 표적 RNA를 변형시키기 위한 효율적인 수단을 제공한다. 본 발명의 핵산-표적화 복합체는 다수의 세포 유형에서 표적 RNA를 변형시키는(예를 들어, 결실시키는, 삽입하는, 전위시키는, 비활성화시키는, 활성화시키는) 것을 포함하는 매우 다양한 유용성을 갖는다. 이와 같이, 본 발명의 핵산-표적화 복합체는, 예를 들어 유전자 치료법, 약물 스크리닝, 질병 진단 및 예후에서 광범위한 적용을 갖는다. 예시적인 핵산-표적화 복합체는 관심 표적 유전자좌 내의 표적 서열에 혼성화되는 가이드 RNA와 복합체화되는 RNA-표적화 이펙터 단백질을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 표적 RNA를 절단하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 표적 RNA와 결합하여 상기 표적 RNA의 절단을 행하는 핵산-표적화 복합체를 사용하여 표적 RNA를 변형하는 것을 포함한다. 일 구현예에서, 본 발명의 핵산-표적화 복합체는, 세포 내에 도입되는 경우, RNA 서열 중에 손상(예를 들어, 단일 또는 이중 가닥 손상)을 생성할 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은 세포에서 질병 RNA를 절단하기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 업스트림 서열과 다운스트림 서열이 측면에 배치된 통합될 서열을 포함하는 외인성 RNA 주형이 세포 내에 도입될 수 있다. 업스트림 서열과 다운스트림 서열은 RNA 내의 통합 부위의 어느 측과 서열 유사성을 공유한다. 원하는 경우, 공여자 RNA는 mRNA일 수 있다. 외인성 RNA 주형은 통합될 서열(예를 들어, 돌연변이된 RNA)을 포함한다. 통합을 위한 서열은 세포에 대해 내인성 또는 외인성인 서열일 수 있다. 통합될 서열의 예는 단백질을 인코딩하는 RNA 또는 비-코딩 RNA(예를 들어, 마이크로RNA)를 포함한다. 따라서, 통합을 위한 서열은 적절한 제어 서열 또는 서열들에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 대안적으로, 통합될 서열은 조절 기능을 제공할 수 있다. 외인성 RNA 주형에서 업스트림 및 다운스트림 서열은 관심 RNA 서열과 공여자 RNA 사이의 재조합을 촉진하도록 선택된다. 업스트림 서열은 통합을 위해 표적화된 부위의 업스트림 RNA 서열과 서열 유사성을 공유하는 RNA 서열이다. 유사하게, 다운스트림 서열은 통합의 표적화된 부위의 다운스트림 RNA 서열과 서열 유사성을 공유하는 RNA 서열이다. 외인성 RNA 주형의 업스트림 및 다운스트림 서열은 표적화된 RNA 서열과 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 서열 동일성을 가질 수 있다. 바람직하게, 외인성 RNA 주형의 업스트림 및 다운스트림 서열은 표적화된 RNA 서열과 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 일부 방법에서, 외인성 RNA 주형의 업스트림 및 다운스트림 서열은 표적화된 RNA 서열과 약 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 업스트림 또는 다운스트림 서열은 약 20 bp 내지 약 2500 bp, 예를 들어 약 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 또는 2500 bp를 포함할 수 있다. 일부 방법에서, 예시적인 업스트림 또는 다운스트림 서열은 약 200 bp 내지 약 2000 bp, 약 600 bp 내지 약 1000 bp, 또는 더 구체적으로 약 700 bp 내지 약 1000 bp를 갖는다. 일부 방법에서, 외인성 RNA 주형은 마커를 추가로 포함할 수 있다. 이와 같은 마커는 표적화된 통합의 스크리닝을 용이하게 할 수 있다. 적합한 마커의 예는 제한 부위, 형광 단백질, 또는 선택성 마커를 포함한다. 본 발명의 외인성 RNA 주형은 재조합 기법을 사용하여 작제될 수 있다(예를 들어, 문헌[Sambrook et al., 2001] 및 문헌[Ausubel et al., 1996] 참조). 외인성 RNA 주형을 통합함으로써 표적 RNA를 변형하는 방법에서, 손상(예를 들어 이중 또는 단일 가닥 DNA 또는 RNA에서 이중 또는 단일 가닥 손상)이 핵산-표적화 복합체에 의해서 DNA 또는 RNA 서열에 도입되며, 이 손상은 주형이 RNA 표적에 통합되도록 외인성 RNA 주형의 상동성 재조합을 통해서 수복된다. 이중-가닥 손상의 존재는 주형의 통합을 촉진한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 진핵 세포에서 RNA의 발현을 변형하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 RNA(예를 들어, mRNA 또는 pre-mRNA)에 결합하는 핵산-표적화 복합체를 사용하여 표적 폴리뉴클레오티드의 발현을 증가시키거나 감소시키는 단계를 포함한다. 일부 방법에서, 표적 RNA는 세포에서 발현의 변형을 행하기 위해 비활성화될 수 있다. 예를 들어, 세포에서 RNA-표적화 복합체와 표적 서열의 결합시, 표적 RNA가 비활성화되며, 이로써 서열이 번역되지 않거나, 코딩된 단백질이 생성되지 않거나, 또는 서열이 야생형 서열처럼 기능하지 않는다. 예를 들어, 단백질 또는 마이크로RNA 코딩 서열은 단백질 또는 마이크로RNA 또는 예비-마이크로RNA 전사물이 생성되지 않도록 비활성화될 수 있다. RNA-표적화 복합체의 표적 RNA는 진핵 세포에 내인성이거나 외인성인 임의의 RNA일 수 있다. 예를 들어, 표적 RNA는 진핵 세포의 핵에 존재하는 RNA일 수 있다. 표적 RNA는 유전자 생성물(예를 들어, 단백질)을 코딩하는 서열(예를 들어, mRNA 또는 pre-mRNA) 또는 비-코딩 서열(예를 들어, ncRNA, lncRNA, tRNA, 또는 rRNA)일 수 있다. 표적 RNA의 예는 신호화 생화학 경로와 연관된 서열, 예를 들어 신호화 생화학적 경로-연관 RNA를 포함한다. 표적 RNA의 예는 질병 관련 RNA를 포함한다. "질병-관련" RNA는 질병이 없는 대조군의 조직 또는 세포에 비하여, 질병-발생 조직으로부터 유래된 세포에서 비정상적인 수준 또는 비정상적인 형태로 번역 산물을 생성하는 임의의 RNA를 지칭한다. 그것은 비정상적으로 높은 수준으로 발현되는 유전자로부터 전사된 RNA일 수 있으며; 그것은 비정상적으로 낮은 수준으로 발현되는 유전자로부터 전사된 RNA일 수 있고, 여기서 변경된 발현은 질병의 발생 및/또는 진행과 상관관계가 있다. 또한, 질병-관련 RNA는 질병의 병인에 직접적인 원인이 있거나, 그에 원인이 있는 유전자(들)와 연관 불균형이 있는 돌연변이(들) 또는 유전적 변이를 갖는 유전자로부터 전사된 RNA를 지칭한다. 번역된 산물은 공지된 것이거나 미공지된 것일 수 있으며, 정상 또는 비정상 수준으로 존재할 수 있다. RNA-표적화 복합체의 표적 RNA는 진핵 세포에 대해 내인성이거나 외인성인 임의의 RNA일 수 있다. 예를 들어, 표적 RNA는 진핵 세포의 핵에 존재하는 RNA일 수 있다. 표적 RNA는 유전자 생성물(예를 들어, 단백질)을 코딩하는 서열(예를 들어, mRNA 또는 pre-mRNA) 또는 비-코딩 서열(예를 들어, ncRNA, lncRNA, tRNA, 또는 rRNA)일 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 핵산-표적화 복합체가 표적 RNA에 결합할 수 있게 하여, 상기 표적 RNA의 절단을 초래하여, 그에 의해 표적 RNA를 변형시키는 단계를 포함하며, 핵산-표적화 복합체는 상기 표적 RNA 내의 표적 서열과 혼성화된 가이드 RNA와 복합체화된 핵산-표적화 이펙터 단백질을 포함한다. 일 양태에서, 본 발명은 진핵 세포에서의 RNA의 발현의 변형 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 핵산-표적화 복합체가 RNA에 결합할 수 있게 하여, 상기 결합이 상기 RNA의 증가된 또는 감소된 발현을 초래하게 하는 단계를 포함하며; 여기서 핵산-표적화 복합체는 가이드 RNA와 복합체화되는 핵산-표적화 이펙터 단백질을 포함한다. 유사한 고려사항 및 조건이 표적 RNA를 변형하는 방법을 위해 상기한 바와 같이 적용된다. 사실상, 이들 샘플링, 배양 및 재도입 선택사항은 본 발명의 전 양태에 적용된다. 일 양태에서, 본 발명은 진핵 세포에서 표적 RNA를 변형하는 방법을 제공하며, 이것은 생체내, 생체외 또는 시험관내에서 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 인간 또는 비인간 동물로부터 세포 또는 세포 집단을 샘플링하는 단계, 및 세포 또는 세포들을 변형하는 단계를 포함한다. 배양은 생체외에서 임의의 단계에서 일어날 수 있다. 세포 또는 세포들은 심지어 비인간 동물 또는 식물에 재도입될 수 있다. 재도입된 세포의 경우, 세포가 줄기 세포인 것이 특히 바람직하다.
실제로, 본 발명의 임의의 양태에서, 핵산-표적화 복합체는 표적 서열과 혼성화된 가이드 RNA와 복합체화된 핵산-표적화 이펙터 단백질을 포함할 수 있다.
본 발명은 핵산-표적화 시스템 및 그의 성분에 관한 RNA 서열 표적화를 수반하는 유전자 발현의 제어에 사용되는 시스템, 방법 및 조성물의 조작 및 최적화에 관한 것이다. 유리한 구현예에서, 이펙터 단백질 효소는 제VI형 단백질, 예를 들어 C2c2이다. 본 방법의 이점은 CRISPR 시스템이 표적외 결합 및 그 결과의 부작용을 최소화시키거나 회피한다는 점이다. 이는 표적 RNA에 대하여 고도의 서열 특이성을 갖도록 배열된 시스템을 사용하여 달성된다.
바람직하게는 핵산-표적화 복합체 또는 시스템과 관련하여, tracr 서열은 하나 이상의 헤어핀을 가지며, 이는 길이가 30 개 이상의 뉴클레오티드, 길이가 40 개 이상의 뉴클레오티드, 또는 길이가 50 개 이상의 뉴클레오티드이고; crRNA 거열은 길이가 10 개 내지 30 개 뉴클레오티드이며, 핵산-표적화 이펙터 단백질은 제VI형 이펙터 단백질이다.
특정 구현예에서, 이펙터 단백질은 리스테리아 종 C2c2p, 바람직하게는 리스테리아 세엘리게리아 C2c2p, 더욱 바람직하게는 리스테리아 세엘리게리아 혈청형 1/2b 균주 SLCC3954 C2c2p일 수 있고 crRNA 서열은, 5' 29-nt 직접 반복(DR) 및 15-nt 내지 18-nt 스페이서를 갖는, 길이가 44 내지 47 뉴클레오티드일 수 있다.
특정 구현예에서, 이펙터 단백질은 렙토트리키아 종 C2c2p, 바람직하게는 렙토트리키아 샤히 C2c2p, 더욱 바람직하게는 렙토트리키아 샤히 DSM 19757 C2c2p일 수 있고, crRNA 서열은, 5' 24 내지 28 nt 직접 반복(DR)과 같은, 적어도 24-nt의 5'직접 반복, 및 14-nt 내지 28-nt 스페이서와 같은, 적어도 14 nt의 스페이서, 또는 19, 20, 21, 22, 이상 nt, 예를 들어 18 내지 28, 19 내지 28, 20 내지 28, 21 내지 28, 또는 22 내지 28 nt와 같은, 적어도 18 nt의 스페이서를 갖는, 길이가 42 내지 58 뉴클레오티드일 수 있다.
더욱 바람직하게, 이펙터 단백질은 렙토트리키아 종, 바람직하게는 렙토트리키아 와데이 F0279, 또는 리스테리아 종. 바람직하게는 리스테리아 뉴요켄시스 FSL M6-0635일 수 있다.
특정 구현예에서, 이펙터 단백질은 제VI형 유전자좌 이펙터 단백질, 더욱 구체적으로 C2c2p일 수 있고, crRNA 서열은 길이가 36 내지 63 뉴클레오티드, 바람직하게는 길이가 37-nt 내지 62-nt, 또는 길이가 38-nt 내지 61-nt, 또는 길이가 39-nt 내지 60-nt, 더욱 바람직하게는 길이가 40-nt 내지 59-nt, 또는 길이가 41-nt 내지 58-nt, 가장 바람직하게는 길이가 42-nt 내지 57-nt일 수 있다. 예를 들어, crRNA는 길이가 26-nt 내지 31-nt, 바람직하게는 길이가 27-nt 내지 30-nt, 더욱 더 바람직하게는 길이가 28-nt 또는 29-nt 또는 길이가 적어도 28 또는 29 nt인 직접 반복(DR), 바람직하게는5'DR, 및 길이가 10-nt 내지 32-nt, 바람직하게는 길이가 11-nt 내지 31-nt, 더욱 바람직하게는 길이가 12-nt 내지 30-nt, 더욱 더 바람직하게는 길이가 13-nt 내지 29-nt, 및 가장 바람직하게는 길이가 14-nt 내지 28-nt, 예를 들어 18 내지 28 nt, 19 내지 28 nt, 20 내지 28 nt, 21 내지 28 nt, 또는 22 내지 28 nt의 스페이서를 포함할 수 있거나, 이로 본질적으로 구성될 수 있거나 이로 구성될 수 있다.
특정 구현예에서, 이펙터 단백질은 제VI형 유전자좌 이펙터 단백질, 더욱 구체적으로는 C2c2p일 수 있고, tracrRNA 서열(존재하는 경우)은 적어도 60-nt 길이, 예를 들어 길이가 적어도 65-nt, 또는 길이가 적어도 70-nt, 예를 들어 길이가 60-nt 내지 70-nt, 또는 길이가 60-nt 내지 70-nt, 또는 길이가 70-nt 내지 80-nt, 또는 길이가 80-nt 내지 90-nt, 또는 길이가 90-nt 내지 100-nt, 또는 길이가 100-nt 내지 110-nt, 또는 길이가 110-nt 내지 120-nt, 또는 길이가 120-nt 내지 130-nt, 또는 길이가 130-nt 내지 140-nt, 또는 길이가 140-nt 내지 150-nt 또는 길이가 150-nt보다 길 수 있다.
특정 구현예에서, 이펙터 단백질은 제VI형 유전자좌 이펙터 단백질, 더욱 구체적으로는 C2c2p일 수 있으며, 절단을 위해 tracrRNA가 요구되지 않을 수 있다.
2 개의 상이한 압타머(각각 별개의 핵산-표적화 가이드 RNA)의 사용은 상이한 핵산-표적화 가이드 RNA를 이용하여, 사용될 활성화제-어댑터 단백질 융합 및 억제제-어댑터 단백질 융합이, 다른 하나는 억제하는 한편 하나의 DNA 또는 RNA의 발현은 활성화시키는 것을 가능하게 한다. 이들은 그들의 상이한 가이드 RNA와 함께, 다중화된 접근법에서 함께, 또는 실질적으로 함께 투여될 수 있다. 이와 같은 변형된 핵산-표적화 가이드 RNA의 다수, 예를 들어 10 개 또는 20 개 또는 30 개 등이 모두 동시에 사용될 수 있고, 한편 비교적 적은 수의 이펙터 단백질 분자로서, 전달되는 이펙터 단백질 분자 중 단지 하나(또는 적어도 최소 수)가 다수의 변형된 가이드와 함께 사용될 수 있다. 어댑터 단백질은 하나 이상의 활성화제 또는 하나 이상의 억제제에 연관(바람직하게는 연결 또는 융합)될 수 있다. 예를 들어, 어댑터 단백질은 제1 활성화제 및 제2 활성화제와 연관될 수 있다. 제1 및 제2 활성화제는 동일할 수 있지만, 이들은 바람직하게 상이한 활성화제이다. 3 개 이상 또는 심지어 4 개 이상의 활성화제(또는 억제제)가 사용될 수 있지만, 패키지 크기는 5 개를 초과하는 개수의 상이한 기능성 도메인은 제한할 수 있다. 어댑터 단백질에 대한 직접 융합에 대하여, 링커가 바람직하게 사용되며, 여기서 2 개 이상의 기능성 도메인은 어댑터 단백질에 연결된다. 적합한 링커는 GlySer 링커를 포함할 수 있다.
또한 핵산-표적화 이펙터 단백질-가이드 RNA 복합체는 전체로서 둘 이상의 기능성 도메인과 회합될 수 있음이 고려된다. 예를 들어, 핵산-표적화 이펙터 단백질과 회합된 둘 이상의 기능성 도메인이 존재할 수 있거나, (하나 이상의 어댑터 단백질을 통해) 가이드 RNA와 회합된 둘 이상의 기능성 도메인이 존재할 수 있거나, (하나 이상의 어댑터 단백질을 통해) 핵산-표적화 이펙터 단백질과 회합된 하나 이상의 기능성 도메인 및 가이드 RNA와 회합된 하나 이상의 기능성 도메인이 존재할 수 있다.
어댑터 단백질과 활성화제 또는 억제제 사이의 융합은 링커를 포함할 수 있다. 예를 들어, GlySer 링커 GGGS가 사용될 수 있다. 이들은 3((GGGGS)3) 또는 6, 9 또는 심지어는 12 이상의 반복부로 사용되어, 필요에 따라 적합한 길이를 제공할 수 있다. 링커는 가이드 RNA와 기능성 도메인(활성화제 또는 억제제) 사이, 또는 핵산-표적화 이펙터 단백질과 기능성 도메인(활성화제 또는 억제제) 사이에서 사용될 수 있다. 사용자는 링커를 "기계적 유연성"의 적절한 양으로 조작한다.
본 발명은 핵산-표적화 이펙터 단백질 및 가이드 RNA를 포함하는 핵산-표적화 복합체를 포괄하며, 여기서 핵산-표적화 이펙터 단백질은 적어도 하나의 돌연변이를 포함하여, 핵산-표적화 Cas 단백질이 적어도 하나의 돌연변이를 갖지 않는 핵산-표적화 Cas 단백질의 활성의 5% 이하, 및 선택적으로 적어도 하나 이상의 핵 국소화 서열을 갖도록 하며; 가이드 RNA는 세포 내 관심 RNA에서 표적 서열에 혼성화할 수 있는 가이드 서열을 포함하고; 여기서 핵산-표적화 이펙터 단백질은 둘 이상의 기능성 도메인과 회합되거나; 가이드 RNA의 적어도 하나의 루프는 하나 이상의 어댑터 단백질에 결합하는 별개의 RNA 서열(들)의 삽입에 의해 변형되고; 여기서 어댑터 단백질은 둘 이상의 기능성 도메인과 회합되거나; 핵산-표적화 이펙터 단백질은 하나 이상의 기능성 도메인과 회합되고, 가이드 RNA의 적어도 하나의 루프는 하나 이상의 어댑터 단백질에 결합하는 별개의 RNA 서열(들)의 삽입에 의해 변형되고, 여기서 어댑터 단백질은 하나 이상의 기능성 도메인에 회합된다.
전달 일반
C2c2 이펙터 단백질 복합체는 작용 이펙터를 전달할 수 있다
DNA수준에서 유전자를 돌연변이시킴으로써 발현을 영구히 제거하는, CRISPR-Cas-매개된 유전자 녹아웃과 달리, CRISPR-Cas 녹다운은 인공 전사 또는 번역 인자의 사용을 통해 유전자 발현의 일시적 감소를 가능하게 한다. C2c2 단백질의 DNA 또는 RNA 절단 도메인 모두에서 중요 잔기를 돌연변이시키는 것은 촉매적으로 비활성인 C2c2의 생성을 초래한다. 촉매적으로 비활성인 C2c2는 가이드 RNA와 복합체화하고, 도메인을 표적화하는 가이드 RNA에 의해 특정된 RNA 서열에 국소화되지만, 이는 표적 RNA를 절단하지 않는다. 비활성 C2c2 단백질의 이펙터 도메인, 예를 들어 전사 또는 번역 억제 도메인으로의 융합은 이펙터의 가이드 RNA에 의해 특정된 임의의 RNA 부위로의 채용을 가능하게 한다. 특정 구현예에서, C2c2는 전사 억제 도메인에 융합될 수 있고, 유전자의 프로모터 영역에 채용될 수 있다. 특히 유전자 억제의 경우, 내인성 전사 인자의 결합 부위를 차단하는 것은 유전자 발현을 하향조절하는 것을 보조할 것으로 본 명세서에서 고려된다. 또 다른 구현예에서, 비활성 C2c2는 크로마틴 변형 단백질에 융합될 수 있다. 크로마틴 상태의 변경은 표적 유전자의 발현 감소를 초래할 수 있다. 추가의 구현예에서, C2c2는 번역 억제 도메인에 융합될 수 있다.
일 구현예에서, 가이드 RNA 분자는 공지된 전사 반응 요소(예를 들어, 프로모터, 인핸서 등), 공지된 업스트림 활성화 서열, 및/또는 표적 RNA의(단백질) 발현을 제어할 수 있는 것으로 의심되는 미지의 또는 공지된 작용의 서열로 표적화될 수 있다.
일부 방법에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 비활성화되어 세포 내에서 발현의 변형을 일으킬 수 있다. 예를 들어, CRISPR 복합체의 세포 내의 표적 서열로의 결합시, 표적 폴리뉴클레오티드는 비활성화되어, 서열이 전사되지 않거나, 코딩된 단백질이 생산되지 않거나, 서열이 야생형 서열이 작용하는 것처럼 작용하지 않게 된다. 예를 들어, 단백질 또는 마이크로RNA 코딩 서열은 비활성화되어 단백질이 생산되지 않게 된다. 일부 방법에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 세포에서 발현의 변형을 가져오기 위해 비활성화될 수 있다. 예를 들어, CRISPR 복합체가 세포의 RNA 표적 서열에 결합 즉시, 표적 폴리뉴클레오티드는 비활성화되어 서열이 번역되지 않고 세포에서 단백질의 발현 수준에 영향을 미친다.
특정 구현예에서, CRISPR 효소는 R597A, H602A, R1278A 및 H1283A로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 포함하고/포함하거나, 하나 이상의 돌연변이는 CRISPR 효소의 HEPN 도메인 내에 있거나, 다르게는 본 명세서에서 논의된 돌연변이다. 일부 구현예에서, CRISPR 효소는 촉매 도메인 내에서 하나 이상의 돌연변이를 갖고, 전사된 경우, 직접 반복 서열은 단일 스템 루프를 형성하고, 가이드 서열은 표적 서열로의 CRISPR 복합체의 서열-특이적 결합을 유도하며, 여기서 효소는 기능성 도메인을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 기능성 도메인은. 일부 구현예에서, 기능성 도메인은 전사 억제 도메인, 바람직하게는 KRAB이다. 일부 구현예에서, 전사 억제 도메인은 SID, 또는 SID의 연쇄체(예를 들어, SID4X)이다. 일부 구현예에서, 기능성 도메인은 후성적 변형 도메인으로, 후성적 변형 효소가 제공되도록 한다. 일부 구현예에서, 기능성 도메인은 활성화 도메인으로, 이는 P65 활성화 도메인일 수 있다.
C2c2 이펙터 단백질 복합체 또는 이의 성분의 전달
본 개시 내용 및 당업계의 지식을 통하여, TALE, CRISPR-Cas 시스템, 또는 이의 성분 또는 이의 핵산 분자 또는 이의 성분을 인코딩하거나 제공하는 핵산 분자는 본 명세서에서 일반적으로 그리고 상세하게 기재된 전달 시스템에 의해 전달될 수 있다.
벡터 전달, 예를 들어 플라스미드, 바이러스 전달: CRISPR 효소, 예를 들어 C2c2와 같은 제V형 단백질, 및/또는 본 발명의 임의의 RNA, 예를 들어 가이드 RNA는 임의의 적합한 벡터, 예를 들어 플라스미드 또는 바이러스 벡터, 예를 들어 아데노 관련 바이러스(AAV), 렌티바이러스, 아데노바이러스 또는 다른 바이러스 벡터 유형, 또는 이의 조합을 사용하여 전달될 수 있다. 이펙터 단백질 및 하나 이상의 가이드 RNA는 하나 이상의 벡터, 예를 들어 플라스미드 또는 바이러스 벡터 내로 패키지될 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터, 예를 들어 플라스미드 또는 바이러스 벡터는, 예를 들어 근육내 주사에 의해 관심 조직으로 전달되는 한편, 다른 경우에 전달은 정맥내, 경피, 비강내, 구강, 점막 또는 다른 전달 방법을 통하여 이루어진다. 이와 같은 전달은 단일 용량 또는 다중 용량 중 어느 하나를 통하여 이루어질 수 있다. 당업자는, 본 명세서에서 전달되는 실제 용량은 다양한 인자, 예를 들어 벡터 선택, 표적 세포, 생물, 또는 조직, 치료될 대상체의 일반 상태, 구하는 형질전환/변형의 정도, 투여 경로, 투여 방법, 구하는 형질전환/변형의 형태 등에 따라 크게 달라질 수 있다.
이와 같은 용량은, 예를 들어 담체(물, 식염수, 에탄올, 글리세롤, 락토오스, 수크로오스, 인산칼슘, 젤라틴, 덱스트란, 한천, 펙틴, 땅콩유, 참기름 등), 희석제, 약학적으로 허용 가능한 담체(예를 들어, 인산염 완충 식염수), 약학적으로 허용 가능한 부형제, 및/또는 당업계에 알려진 다른 화합물을 추가로 함유할 수 있다. 용량은 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 염, 예를 들어 무기산 염, 예를 들어 염산염, 브롬화수소산염, 인산염, 황산염 등; 및 유기산 염, 예를 들어 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트, 벤조에이트 등을 추가로 함유할 수 있다. 추가적으로, 보조 성분, 예를 들어 습윤 또는 유화제, pH 완충 성분, 겔 또는 겔화 물질, 풍미제, 착색제, 마이크로스피어, 중합체, 현탁제 등이 또한 본 명세서에서 제시될 수 있다. 추가적으로, 하나 이상의 다른 통상의 약학 성분들, 예를 들어 보존제, 보수제, 현탁화제, 계면활성제, 산화방지제, 케이킹방지제(anticaking agent), 충전제, 킬레이트화제, 코팅제, 화학 안정화제 등이 또한 존재할 수 있으며, 특히 투약 형태는 재구성 가능한 형태이다. 적합한 예시적인 성분으로는, 미세결정성 셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스 나트륨, 폴리소르베이트 80, 페닐에틸 알콜, 클로로부탄올, 칼륨 소르베이트, 소르빈산, 이산화황, 프로필 갈레이트, 파라벤, 에틸 바닐린, 글리세린, 페놀, 파라클로로페놀, 젤라틴, 알부민 및 이의 조합을 포함한다. 약학적으로 허용 가능한 부형제의 철저한 논의는 문헌[REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES(Mack Pub. Co., N.J. 1991)]에서 이용 가능하며, 이는 본 명세서에 참조로서 포함된다.
본 명세서의 일 구현예에서, 전달은 아데노바이러스를 통한 것으로, 이는 적어도 1 x 105 개의 입자(입자 단위, pu로서도 지칭됨)의 아데노바이러스 벡터를 함유하는 단일 부스터(booster) 용량일 수 있다. 본 명세서의 일 구현예에서, 용량은 바람직하게 적어도 약 1 x 106 개의 입자(예를 들어, 약 1 x 106 개 내지 1 x 1012 개 입자), 더욱 바람직하게는 적어도 약 1 x 107 개의 입자, 더욱 바람직하게는 적어도 약 1 x 108 개 이상의 입자(예를 들어, 약, 1 x 108 개 내지 1 x 1011 개 입자 또는 약 1 x 108 개 내지 1 x 1012 개 입자), 가장 바람직하게는 적어도 약 1 x 100 개의 입자(예를 들어, 약 1 x 109 개 내지 1 x 1010 개 입자 또는 약 1 x 109 개 내지 1 x 1012 입자), 또는 심지어 적어도 약 1 x 1010 개의 입자(예를 들어, 약 1 x 1010 개 내지 1 x 1012 개 입자)의 아데노바이러스 벡터이다. 대안적으로, 용량은 약 1 x 1014 개 이하의 입자, 바람직하게는 약 1 x 1013 개 이하의 입자, 훨씬 더 바람직하게는 약 1 x 1012 개 이하의 입자, 훨씬 더 바람직하게는 약 1 x 1011 개 이하의 입자, 가장 바람직하게는 약 1 x 1010 개 이하의 입자(예를 들어, 약 1 x 109 개 입자)를 포함한다. 따라서, 용량은 단일 용량의 아데노바이러스 벡터를 함유할 수 있으며, 이는 예를 들어 약 1 x 106 입자 단위(pu), 약 2 x 106 pu, 약 4 x 106 pu, 약 1 x 107 pu, 약 2 x 107 pu, 약 4 x 107 pu, 약 1 x 108 pu, 약 2 x 108 pu, 약 4×108 pu, 약 1 x 109 pu, 약 2 x 109 pu, 약 4 x 109 pu, 약 1 x 1010 pu, 약 2 x 1010 pu, 약 4 x 1010 pu, 약 1 x 1011 pu, 약 2 x 1011 pu, 약 4 x 1011 pu, 약 1 x 1012 pu, 약 2 x 1012 pu, 또는 약 4 x 1012 pu의 아데노바이러스 벡터이다. 예를 들어, 아데노바이러스 벡터에 대해, Nabel외에게, 2013년 6월 4일 수여된, 미국 특허 8,454,972 B2를 참조하며, 이는 본 명세서에 참고로 포함되고, 이의 컬럼 29, 36 내지 58 행의 용량을 참조한다. 본 명세서의 일 구현예에서, 아데노바이러스는 다중 용량을 통해 전달된다.
본 명세서의 일 구현예에서, 전달은 AAV를 통해 이루어진다. 인간에 대한 AAV의 생체내 전달을 위한 치료적으로 유효한 용량은, 용액 ml 당 약 1 x 1010 내지 약 1 x 1010의 작용적 AAV를 함유하는 약 20 ml 내지 약 50 ml 범위의 식염수 용액인 것으로 여겨진다. 용량은 임의의 부작용에 대하여 치료 이익의 균형을 맞추도록 조정될 수 있다. 본 명세서의 일 구현예에서, AAV 용량은 일반적으로 약 1 x 105 내지 1 x 1050 개의 게놈 AAV, 약 1 x 108 내지 1 x 1020 개의 게놈 AAV, 약 1 x 1010 내지 약 1 x 1016 개의 게놈, 또는 약 1 x 1011 내지 약 1 x 1016 개의 게놈 AAV의 농도 범위 내에 있다. 인간 용량은 약 1 x 1013 개의 게놈 AAV이다. 이와 같은 농도는 약 0.001 ml 내지 약 100 ml, 약 0.05 ml 내지 약 50 ml, 또는 약 10 ml 내지 약 25 ml의 담체 용액 중에서 전달될 수 있다. 다른 효과적인 용량은 당업자에 의해, 용량 반응 곡선을 수립하는 일상적 시험을 통해 쉽게 수립될 수 있다. 예를 들어, 2013년 3월 26일 등록된 Hajjar 외의 미국 특허 8,404,658 B2, 27 칼럼 45 내지 60 행을 참조한다.
본 명세서의 일 구현예에서, 전달은 플라스미드를 통해 이루어진다. 이와 같은 플라스미드 조성물에서, 용량은 반응을 유발하는 데 충분한 양의 플라스미드여야 한다. 예를 들어, 플라스미드 조성물 중의 플라스미드 DNA의 적합한 양은 70 kg의 개체 당 약 0.1 mg 내지 약 2 mg, 또는 약 1 μg 내지 약 10 μg일 수 있다. 본 발명의 플라스미드는 일반적으로 (i) 프로모터; (ii) 상기 프로모터에 작동 가능하게 연결된 핵산-표적화 CRISPR 효소를 인코딩하는 서열; (iii) 선택 가능 마커; (iv) 복제 원점; 및 (v) (ii)에 작동 가능하게 연결되는 (ii)의 다운스트림 전사 종결자를 포함할 것이다. 플라스미드는 또한 CRISPR 복합체의 RNA 성분을 인코딩할 수 있지만, 대신에 이들 중 하나 이상은 상이한 벡터 상에서 인코딩될 수 있다.
본 명세서의 용량은 평균 70 kg 개체를 기준으로 한다. 투여 빈도는 해당 분야의 숙련된 의학적 또는 수의학적 실행자(예를 들어, 의사, 수의사) 또는 과학자의 영역 내이다. 또한, 실험에 사용된 마우스는 통상적으로 약 20 g이며, 마우스 실험으로부터 70 kg 개체까지 증대될 수 있음이 주목된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 RNA 분자는 리포좀 또는 리포펙틴 제형 등으로 전달되며, 당업자에게 잘 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 이와 같은 방법은, 예를 들어 미국 특허 5,593,972, 5,589,466, 및 5,580,859에 기재되어 있으며, 이들 특허는 본 명세서에 참조로서 포함된다. 포유류 세포 내로의 siRNA의 향상 및 개선된 전달을 구체적으로 목표로 하는 전달 시스템이 개발되었고(예를 들어, 문헌[Shen et al FEBS Let. 2003, 539:111-114]; [Xia et al., Nat. Biotech. 2002, 20:1006-1010]; [Reich et al., Mol. Vision. 2003, 9: 210-216]; [Sorensen et al., J. Mol. Biol. 2003, 327: 761-766]; [Lewis et al., Nat. Gen. 2002, 32: 107-108] 및 [Simeoni et al., NAR 2003, 31, 11: 2717-2724] 참조), 본 발명에 적용될 수 있다. siRNA는 최근에 영장류에서 유전자 발현의 억제를 위해 성공적으로 사용되었다(예를 들어, 또한 본 발명에 적용될 수 있는 문헌[Tolentino et al., Retina 24(4):660] 참조).
실제로, RNA 전달은 생체내 전달의 유용한 방법이다. 리포좀 또는 입자를 사용하여 핵산-표적화 Cas 단백질 Cas9 및 가이드 RNA gRNA(예를 들어, HR 수복 주형)를 세포 내로 전달할 수 있다. 따라서, CasCas9과 같은 핵산-표적화 Cas 단백질/CRISPR 효소의 전달 및/또는 본 발명의 가이드 RNA의 전달은 RNA 형태로, 그리고 미세소포, 리포좀 또는 입자를 통해 이루어질 수 있다. 예를 들어, Cas mRNA 및 가이드 RNA는 생체내 전달을 위해 리포좀 입자 내로 패키징될 수 있다. Life Technologies로부터의 리포펙타민(Lipofectamine)과 같은 리포좀 형질감염 시약 및 시판 중인 다른 시약은 RNA 분자를 간에 효과적으로 전달할 수 있다.
RNA의 전달 수단은 또한 바람직하게는 나노입자(문헌[Cho, S., Goldberg, M., Son, S., Xu, Q., Yang, F., Mei, Y., Bogatyrev, S., Langer, R. and Anderson, D., Lipid-like nanoparticles for small interfering RNA delivery to endothelial cells, Advanced Functional Materials, 19: 3112-3118, 2010]) 또는 엑소좀(문헌[Schroeder, A., Levins, C., Cortez, C., Langer, R., and Anderson, D., Lipid-based nanotherapeutics for siRNA delivery, Journal of Internal Medicine, 267: 9-21, 2010, PMID: 20059641])을 통한 RNA의 전달을 포함한다. 실제로, 엑소좀은 RNA-표적화 시스템과 조금 유사한 시스템인 전달 siRNA에서 특히 유용한 것으로 나타났다. 예를 들어, El-Andaloussi S 외(문헌["Exosomes-mediated delivery of siRNA in vitro and in vivo." Nat Protoc. 2012 Dec;7(12):2112-26. doi: 10.1038/nprot.2012.131. Epub 2012 Nov 15.])은 엑소좀이 상이한 생물학적 장벽을 가로질러 약물을 전달하기 위한 촉망받는 도구가 되고 시험관내 및 생체내에서 siRNA의 전달을 위해 이용될 수 있는 방법을 기재한다. 이들의 접근법은 펩티드 리간드와 융합된 엑소좀 단백질을 포함하여, 발현 벡터의 형질감염을 통해 표적화된 엑소좀을 생성하는 것이다. 이어서, 엑소좀은 형질감염된 세포 상청액으로부터 정제 및 특성화된 다음, RNA는 엑소좀에 로딩된다. 본 발명에 따른 전달 또는 투여는 엑소좀을 이용하여, 특히 비제한적으로 뇌로 실행될 수 있다. 비타민 E(α-토코페롤)는 핵산-표적화 Cas 단백질과 컨쥬게이트될 수 있고, 예를 들어 뇌에 짧은 간섭 RNA(siRNA)를 전달하기 위해 Uno 외(HUMAN GENE THERAPY 22:711-719(June 2011))에 의해 행해지는 것과 유사한 방식으로 고밀도 지단백질(HDL)과 함께 뇌에 전달될 수 있다. 마우스에 인산염 완충 식염수(PBS) 또는 유리 TocsiBACE 또는 Toc-siBACE/HDL이 충전되고, 뇌 주입 키트 3(Brain Infusion Kit 3)(Alzet)과 연결된 삼투 미니펌프(Osmotic minipump)(모델 1007D; Alzet, 미국 캘리포니아주 쿠퍼티노 소재)를 통해 주입하였다. 뇌 주입 캐뉼라를 등쪽의 제3 뇌실 내로의 주입을 위해 중앙에서 브레그마(bregma)보다 약 0.5 mm 뒤에 위치시켰다. Uno 외는 HDL과 함께 3 nmol만큼 적은 Toc-siRNA가 동일한 ICV 주입 방법에 의해 유사한 정도로 표적 감소를 유도할 수 있었다는 것을 발견하였다. α-토코페롤에 컨쥬게이트되고 뇌에 표적화된 HDL과 동시-투여되는 유사한 용량의 핵산-표적화 이펙터 단백질이 본 발명에서 인간에 대해 고려될 수 있으며, 예를 들어 뇌에 표적화된 약 3 nmol 내지 약 3 μmol의 핵산-표적화 이펙터 단백질이 고려될 수 있다. Zou 외(HUMAN GENE THERAPY 22:465-475(April 2011))는 래트의 척수에서 생체내 유전자 침묵화를 위한 PKCγ를 표적화하는 짧은 헤어핀 RNA의 렌티바이러스-매개의 전달 방법을 기재한다. Zou 외는 척추강내 카테터에 의해 1 x 109 형질도입 단위(TU)/ml의 역가를 갖는 재조합 렌티바이러스 약 10 μl를 투여하였다. 뇌에 표적화된 렌티바이러스 벡터에서 발현된 유사한 용량의 핵산-표적화 이펙터 단백질이 본 발명에서 인간에 대해 고려될 수 있으며, 예를 들어 1 x 109 형질도입 단위(TU)/ ml의 역가를 갖는 렌티바이러스에서 뇌에 표적화된 약 10 ml 내지 50 ml의 핵산-표적화 이펙터 단백질이 고려될 수 있다.
뇌로의 국소 전달에 관하여, 이는 다양한 방법으로 달성될 수 있다. 예를 들어, 물질은, 예를 들어, 주사에 의해 선상체 내로 전달될 수 있다. 주사는 개두술을 통해 정위적으로 실행될 수 있다.
패키징 및 프로모터 일반
생체내에서 게놈 변형을 매개하기 위해 핵산-표적화 이펙터를 코딩하는 핵산 분자, 예를 들어 DNA를 벡터, 예를 들어 바이러스 벡터로 패키징하는 방법은 다음을 포함한다:
NHEJ-매개 유전자 녹아웃을 달성하는 것:
단일 바이러스 벡터:
두 개 이상의 발현 카세트를 함유하는 벡터:
프로모터-핵산 표적화 이펙터 단백질 코딩 핵산 분자-터미네이터
프로모터-가이드 RNA1-터미네이터
프로모터-가이드 RNA(N)-터미네이터(벡터의 크기 제한까지)
이중 바이러스 벡터:
핵산-표적화 이펙터 단백질의 발현을 구동하기 위한 하나의 발현 카세트를 함유하는 벡터 1
프로모터-핵산-표적화 이펙터 단백질 코딩 핵산 분자-터미네이터
하나 이상의 가이드RNA의 발현을 구동하기 위한 하나 이상의 발현 카세트를 함유하는 벡터 2
프로모터-가이드 RNA1-터미네이터
프로모터-가이드 RNA1(N)-터미네이터(벡터의 크기 제한까지)
상동성-지시되는 수선을 매개하는 것.
상기 기재된 단일 및 이중 바이러스 벡터 접근에 추가하여, 상동성-지시되는 수선 주형을 전달하기 위해 추가적인 벡터가 사용된다.
핵산-표적화 이펙터 단백질 코딩 핵산 분자 발현을 구동하기 위해 사용되는 프로모터는 다음을 포함할 수 있다:
AAV ITR은 프로모터로서 역할을 할 수 있다: 이것은(벡터에서 공간을 차지할 수 있는) 추가적인 프로모터 요소에 대한 필요성을 제거하는 데 유리하다. 해방된 추가 공간은 추가적인 요소(gRNA 등)의 발현을 구동하는 데 사용될 수 있다. 또한, ITR 활성은 상대적으로 더 약하므로 핵산-표적화 이펙터 단백질의 과발현으로 인한 잠재적인 독성을 감소시키는 데 사용될 수 있다.
편재하는 발현을 위해, 프로모터: CMV, CAG, CBh, PGK, SV40, 페리틴 중쇄 또는 경쇄 등을 사용할 수 있다.
뇌 또는 다른 CNS 발현에서, 프로모터: 모든 뉴런에 대해 시냅신I, 흥분성 뉴런에 대해 CaMKII알파, GABAergic 뉴런에 대해 GAD67 또는 GAD65 또는 VGAT 등을 사용할 수 있다.
간 발현에서, 알부민 프로모터를 사용할 수 있다.
폐 발현에서, SP-B를 사용할 수 있다.
내피 세포에서, ICAM을 사용할 수 있다.
조혈 세포에서 IFN베타 또는 CD45를 사용할 수 있다.
조골세포에서 OG-2를 사용할 수 있다.
가이드 RNA를 유도하기 위해 사용되는 프로모터는 다음을 포함할 수 있다:
U6 또는 H1과 같은 Pol III 프로모터.
가이드 RNA를 발현시키기 위한 Pol II 프로모터 및 인트론 카세트의 사용.
아데노 관련 바이러스(AAV)
핵산-표적화 이펙터 단백질 및 하나 이상의 가이드 RNA는 아데노 관련 바이러스(AAV), 렌티바이러스, 아데노바이러스 또는 다른 플라스미드 또는 바이러스 벡터 유형을 사용하여, 특히, 예를 들어, 미국 특허 8,454,972(아데노바이러스에 대한 제형, 용량), 8,404,658(AAV에 대한 제형, 용량) 및 5,846,946(DNA 플라스미드에 대한 제형, 용량)으로부터의 제형 및 용량, 및 렌티바이러스, AAV 및 아데노바이러스를 수반하는 임상 시험 및 임상 시험에 관한 간행물로부터의 제형 및 용량을 사용하여 전달될 수 있다. 예를 들어, AAV에 대해, 투여 경로, 제형 및 용량은 미국 특허 8,454,972에서와 같고, AAV를 수반하는 임상 시험에서와 같을 수 있다. 아데노바이러스에 대해, 투여 경로, 제형 및 용량은 미국 특허 8,404,658에서와 같을 수 있고 아데노바이러스를 수반하는 임상 시험에서와 같을 수 있다. 플라스미드 전달에 대해, 투여 경로, 제형 및 용량은 미국 특허 5,846,946에서와 같고, 플라스미드를 수반하는 임상 연구에서와 같을 수 있다. 용량은 평균 70 kg 개체(예를 들어, 성인 남성)를 기준으로 하거나 또는 이로 추정될 수 있고, 상이한 체중 및 종의 환자, 대상체, 포유류에 대해 조정될 수 있다. 투여 빈도는 환자 또는 대상체의 연령, 성별, 일반적 건강상태, 다른 질환 및 다루어질 특정 질환 또는 증상을 포함하는 보통의 인자에 따라서 의학적 또는 수의학적 실행자(예를 들어, 의사, 수의사)의 영역 내에 있다. 바이러스 벡터는 관심 조직 내에 주사될 수 있다. 세포 유형 특이적 게놈/트랜스크립톰 변형을 위해, 핵산-표적화 이펙터 단백질의 발현은 세포 유형 특이적 프로모터에 의해 유도될 수 있다. 예를 들어, 간 특이적 발현은 알부민 프로모터를 사용할 수 있고, 뉴런 특이적 발현(예를 들어, CNS 장애를 표적화하기 위함)은 시냅신 I 프로모터를 사용할 수 있다.
생체내 전달에 관하여, AAV는 몇 가지 이유로 다른 바이러스 벡터에 비하여 유리하다:
Figure pat00001
낮은 독성(이것은 면역 반응을 활성화시킬 수 있는 세포 입자의 초원심분리를 필요로 하지 않는 정제 방법 때문일 수 있음), 및
Figure pat00002
숙주 게놈 내로 통합하지 않기 때문에 삽입 돌연변이유발을 야기할 확률이 낮음.
AAV는 4.5 또는 4.75 Kb의 패키징 한계를 갖는다. 이것은 핵산-표적화 이펙터 단백질(예를 들어 C2c2 같은 제V형 단백질)뿐만 아니라 프로모터 및 전사 터미네이터가 모두 동일한 바이러스 벡터 내에 맞춰져야 함을 의미한다. 따라서, 본 발명의 일 구현예는 더 짧은 핵산-표적화 이펙터 단백질의 상동체를 이용하는 것을 포함한다.
AAV에 관해서, AAV는 AAV1, AAV2, AAV5 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 표적화될 세포에 관한 AAV의 AAV를 선택할 수 있고; 예를 들어, 뇌 또는 뉴런 세포를 표적화하기 위하여 AAV 혈청형 1, 2, 5 또는 하이브리드 캡시드 AAV1, AAV2, AAV5 또는 이들의 임의의 조합을 선택할 수 있으며; 심장 조직을 표적화하기 위하여 AAV4를 선택할 수 있다. AAV8은 간으로의 전달에 유용하다. 본 명세서의 프로모터 및 벡터는 개별적으로 바람직하다. 이들 세포에 관한 특정 AAV 혈청형의 표 작성(문헌[Grimm, D. et al, J. Virol. 82: 5887-5911(2008)] 참조)은 다음과 같다:
렌티바이러스
렌티바이러스는 유사분열과 유사분열 후 세포 둘 다에서 그들의 유전자를 감염 및 발현시키는 능력을 갖는 복합 레트로바이러스이다. 가장 흔히 알려진 렌티바이러스는 광범위한 세포 유형을 표적화하기 위해 다른 바이러스의 외피 당단백질을 사용하는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)이다.
렌티바이러스는 다음과 같이 제조될 수 있다. (렌티바이러스 전달 플라스미드 백본을 함유하는) pCasES10의 클로닝 후에, 낮은 계대(p=5)에서 HEK293FT를 10% 우태아혈청이 있고 항생제가 없는 DMEM 중의 형질감염 전날에 50% 컨플루언스(confluence)까지 T-75 플라스크에 씨딩하였다. 20시간 후에, 배지를 OptiMEM(무혈청) 배지로 바꾸고, 4 시간 후에 형질감염을 행하였다. 세포를 10 μg의 렌티바이러스 전달 플라스미드(pCasES10), 및 5 μg의 pMD2.G(VSV-g 위형), 및 7.5 μg의 psPAX2(gag/pol/rev/tat)의 패키징 플라스미드를 이용하여 형질감염시켰다. 양이온성 지질 전달제(50 μl 리포펙타민 2000 및 100 μl 플러스(Plus) 시약)를 이용하여 4 ml OptiMEM 중에서 형질감염을 행하였다. 6 시간 후, 배지를 10% 우태아혈청이 있는 무항생제 DMEM으로 바꾸었다. 이들 방법은 세포 배양 동안 혈청을 사용하지만, 무혈청 방법이 바람직하다.
렌티바이러스는 다음과 같이 정제될 수 있다. 바이러스 상청액을 48 시간 후에 수집하였다. 상청액을 먼저 데브리스(debris)를 없애고, 0.45 um 저 단백질 결합(PVDF) 필터를 통해 여과시켰다. 이어서, 이들을 24,000 rpm에서 2 시간 동안 초원심분리기에서 회전시켰다. 바이러스 펠렛을 4C에서 밤새 50 ul의 DMEM 중에서 재현탁화시켰다. 이어서 이들을 분주하고 즉시 -80℃에서 즉시 동결시켰다.
또 다른 구현예에서, 말 감염성 빈혈 바이러스(equine infectious anemia virus; EIAV)에 기반한 최소 비-영장류 렌티바이러스 벡터는 또한, 특히 눈 유전자 치료법을 위해 고려된다(예를 들어, 문헌[Balagaan, J Gene Med 2006; 8: 275 - 285] 참조). 또 다른 구현예에서, RetinoStat®, 망(web) 형태의 노인성 황반변성의 치료를 위한 망막하 주사를 통해 전달되는 혈관신생억제 단백질 엔도스타틴 및 앤지오스타틴을 발현시키는 말 감염성 빈혈 바이러스-기반의 렌티바이러스 유전자 치료법 벡터가 또한 고려되며(예를 들어, 문헌[Binley et al., HUMAN GENE THERAPY 23:980-991(September 2012)]), 이러한 벡터는 본 발명의 핵산-표적화 시스템을 위해 변형될 수 있다.
또 다른 구현예에서, HIV tat/rev에 의해 공유되는 공통 엑손을 표적화하는 siRNA, 핵소체-국소화 TAR 데코이(decoy), 및 항-CCR5-특이적 해머헤드(hammerhead) 리보자임을 이용하는 자가-비활성화 렌티바이러스 벡터(예를 들어, 문헌[DiGiusto et al.(2010) Sci Transl Med 2:36ra43] 참조)가 본 발명의 핵산-표적화 시스템에 대해 사용되고/사용되거나 적합하게 될 수 있다. 최소 2.5 x 106 개 CD34+ 세포/킬로그램(환자의 체중)을 수집하고, 2 x 106 개 세포/ml의 밀도에서 2 μmol/L-글루타민, 줄기 세포 인자(100 ng/ml), Flt-3 리간드(Flt-3L)(100 ng/ml), 및 트롬보포이에틴(10 ng/ml)(CellGenix)을 함유하는 X-VIVO 15 배지(Lonza))에서 16 시간 내지 20 시간 동안 사전자극할 수 있다. 사전자극된 세포는 피브로넥틴(25 mg/cm2)으로 코팅된 75-cm2 조직 배양 플라스크에서 16 시간 내지 24 시간 동안 감염다중도 5로 렌티바이러스에 의해 형질도입될 수 있다(RetroNectin, Takara Bio Inc.).
렌티바이러스 벡터는 파킨슨병의 치료에서와 같이 개시되었으며, 예를 들어 미국 특허 공개 20120295960 및 미국 특허 7303910 및 7351585를 참조한다. 렌티바이러스 벡터는 또한 안질환의 치료용으로 개시되었으며, 예를 들어 미국 특허 공개 20060281180, 20090007284, US20110117189; US20090017543; US20070054961, US20100317109를 참조한다. 렌티바이러스 벡터는 또한 뇌에 대한 전달용으로 개시되었으며, 예를 들어 미국 특허 공개 US20110293571; US20110293571, US20040013648, US20070025970, US20090111106 및 미국 특허 US7259015를 참조한다.
RNA 전달
RNA 전달: 핵산-표적화 Cas 단백질, 예를 들어 C2c2와 같은 제V형 단백질, 및/또는 가이드 RNA는 RNA의 형태로 또한 전달될 수 있다. 핵산-표적화 Cas 단백질(예를 들어 C2c2와 같은 제VI형 단백질) mRNA는 시험관내 전사를 이용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 핵산-표적화 이펙터 단백질(예를 들어 C2c2와 같은 제V형 단백질) mRNA는 다음 요소를 함유하는 PCR 카세트를 사용하여 합성될 수 있다: 베타 글로빈-폴리A 테일(120 개 이상의 아데닌의 스트링(string))로부터의 T7_프로모터-코작 서열(GCCACC)-이펙터 단백질-3' UTR. 카세트는 T7 중합효소에 의한 전사를 위해 사용될 수 있다. 가이드 RNA는 또한 T7_프로모터-GG-가이드 RNA 서열을 함유하는 카세트로부터의 시험관내 전사를 사용하여 전사될 수 있다.
발현을 향상시키고 가능한 독성을 감소시키기 위해, 핵산-표적화 이펙터 단백질-코딩 서열 및/또는 가이드 RNA는, 예를 들어, 슈도-U 또는 5-메틸-C를 사용하여 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드를 포함하도록 변형될 수 있다.
mRNA 전달 방법은 현재 간 전달용으로 특히 촉망된다.
RNA 전달에 대한 많은 임상적 연구는 RNAi 또는 안티센스에 집중되어 있으나, 이들 시스템은 본 발명을 이행하기 위하여 RNA의 전달에 적합하게 될 수 있다. 따라서, RNAi 등에 대한 하기의 참고문헌을 확인해야 한다.
입자 전달 시스템 및/또는 제형:
여러 유형의 입자 전달 시스템 및/또는 제형은 다양한 범위의 생체의학 적용에서 유용하다고 알려져 있다. 일반적으로, 입자는 이의 운반 및 특성에 대해서 전체 유닛으로서 거동하는 작은 물체로서 규정된다. 입자는 직경에 따라서 추가로 분류된다. 조립 입자는 2,500 나노미터 내지 10,000 나노미터 사이의 범위를 망라한다. 미세 입자는 100 나노미터 내지 2,500 나노미터 사이의 크기이다. 초미세 입자, 또는 나노입자는 일반적으로 1 나노미터 내지 100 나노미터 크기 사이이다. 100-nm 한계의 근거는 벌크 물질로부터 입자를 구별하는 신규한 특성이 통상적으로 100 nm 미만의 역치 길이 규모에서 발생한다는 사실이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 입자 전달 시스템/제형은 본 발명에 따른 입자를 포함하는 임의의 생물학적 전달 시스템/제형으로서 규정된다. 본 발명에 따른 입자는 100 미크론(μm) 미만의 가장 큰 크기(예를 들어, 직경)를 갖는 임의의 개체(entity)이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 입자는 10 μm 미만의 가장 큰 치수를 갖는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 입자는 2000 나노미터(nm) 미만의 가장 큰 치수를 갖는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 입자는 1000 나노미터(nm) 미만의 가장 큰 치수를 갖는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 입자는 900 nm, 800 nm, 700 nm, 600 nm, 500 nm, 400 nm, 300 nm, 200 nm, 또는 100 nm 미만의 가장 큰 치수를 갖는다. 통상적으로, 본 발명의 입자는 500 nm 이하의 가장 큰 치수(예를 들어, 직경)를 갖는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 입자는 250 nm 이하의 가장 큰 치수(예를 들어, 직경)를 갖는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 입자는 200 nm 이하의 가장 큰 치수(예를 들어, 직경)를 갖는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 입자는 150 nm 이하의 가장 큰 치수(예를 들어, 직경)를 갖는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 입자는 100 nm 이하의 가장 큰 치수(예를 들어, 직경)를 갖는다. 더 작은 입자, 예를 들어 50 nm 이하의 가장 큰 치수를 갖는 더 작은 입자가 본 발명의 일부 구현예에서 사용된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 입자는 25 nm 및 200 nm 사이 범위의 가장 큰 치수를 갖는다.
입자 특성화(예를 들어, 형태, 치수 등의 특성화를 포함함)는 상이한 기법을 사용하여 수행된다. 일반적인 기법은 전자 현미경검사법(TEM, SEM), 원자력 현미경검사법(AFM), 동적 광 산란(DLS), X-선 광전자 분광법(XPS), 분말 X-선 회절(XRD), 푸리에 형질전환 적외선 분광광도법(FTIR), 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화 비행시간형 질량 분석기(MALDI-TOF), 자외선-가시 분광법, 이중 분극 간섭계 및 핵 자기 공명(NMR)이다. 특성화(치수 측정)는 본 발명의 임의의 시험관내, 생체외 및/또는 생체내 적용을 위한 전달에 있어서 최적인 크기의 입자를 제공하기 위해 고유 입자(즉, 로딩 이전)에 대해 또는 카고(cargo)의 로딩 후(본 명세서에서 카고는, 예를 들어, 하나 이상의 성분의 CRISPR-Cas 시스템, 예를 들어, CRISPR 효소 또는 mRNA 또는 가이드 RNA, 또는 이들의 임의의 조합을 지칭하며, 추가적인 담체 및/또는 부형제를 포함할 수 있음)에 이루어질 수 있다. 바람직한 특정 구현예에서, 입자 치수(예를 들어, 직경) 특성화는 동적 레이저 산란(DLS)을 사용한 측정을 기반으로 한다. 입자, 이들을 제조하고 사용하는 방법 및 이들의 측정과 관련하여 미국 특허 8,709,843; 미국 특허 6,007,845; 미국 특허 5,855,913; 미국 특허 5,985,309; 미국 특허 5,543,158; 및 2014년 5월 11일에 온라인 공개된 간행물(문헌[James E. Dahlman and Carmen Barnes et al. Nature Nanotechnology(2014), doi:10.1038/nnano.2014.84])이 언급된다.
본 발명의 범주 내의 입자 전달 시스템은 고체, 반고체, 에멀젼 또는 콜로이드 입자를 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, 지질-기반 시스템, 리포좀, 미셀, 미세소포, 엑소좀, 또는 유전자총을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 본 명세서에 기재된 전달 시스템 중 임의의 전달 시스템이 본 발명의 범주 내의 입자 전달 시스템으로서 제공될 수 있다.
입자
CRISPR 효소 mRNA 및 가이드 RNA는 입자 또는 지질 외피를 사용하여 동시에 전달될 수 있으며; 예를 들어, 복합체로서, 예를 들어 CRISPR 효소 및 본 발명의 RNA는 문헌[Dahlman et al., WO2015089419 A2] 및 거기서 인용된 문헌들에서와 같이 입자, 예를 들어 7C1(예를 들어, 문헌[James E. Dahlman and Carmen Barnes et al. Nature Nanotechnology(2014), 2014년 5월 11일 온라인 발행, doi:10.1038/nnano.2014.84])을 통해, 예를 들어 지질 또는 리피도이드(lipidoid) 및 친수성 중합체, 예를 들어 양이온성 지질 및 친수성 중합체를 포함하는 전달 입자를 통해 전달될 수 있으며, 예를 들어 양이온 지질은 1,2-디올레일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP) 또는 1,2-디테트라데카노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DMPC)을 포함하고/포함하거나, 여기서 친수성 중합체는 에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함하고/포함하거나; 여기서 입자는 콜레스테롤을 추가로 포함하고(예를 들어, 제형 1 = DOTAP 100, DMPC 0, PEG 0, 콜레스테롤 0; 제형 번호 2 = DOTAP 90, DMPC 0, PEG 10, 콜레스테롤 0; 제형 번호 3 = DOTAP 90, DMPC 0, PEG 5, 콜레스테롤 5로부터의 입자), 여기서 입자는 효율적인 다단계 공정을 사용하여 형성되며, 여기서 먼저 이펙터 단백질 및 RNA는 함께, 예를 들어 1:1의 몰 비로, 예를 들어 실온에서, 예를 들어 30 분 동안, 예를 들어 멸균 무-뉴클레아제 1X PBS 중에서 혼합되고; 별도로 제형에 대해 적용가능함에 따라 DOTAP, DMPC, PEG, 및 콜레스테롤을 알콜, 예를 들어 100% 에탄올에 용해시키고; 2 개의 용액을 함께 혼합하여 복합체를 함유하는 입자를 형성한다.
핵산 및 표적화 단백질(예를 들어, C2c2과 같은 제VI형 단백질) mRNA 및 가이드 RNA는 입자 또는 지질 외피를 사용하여 동시에 전달될 수 있다.
예를 들어, 문헌[Su X, Fricke J, Kavanagh DG, Irvine DJ ("In vitro and in vivo mRNA delivery using lipid-enveloped pH-responsive polymer nanoparticles" Mol Pharm. 2011 Jun 6;8(3):774-87. doi: 10.1021/mp100390w. Epub 2011 Apr 1)]은 인지질 이중층 쉘에 의해 둘러싸인 폴리(β-아미노 에스테르)(PBAE) 코어를 지니는 생분해성 코어-쉘 구조의 입자를 기재한다. 이들은 생체내 mRNA 전달을 위해 개발되었다. pH-반응성 PBAE 성분은 엔도솜 파괴를 촉진하도록 선택되는 한편, 지질 표면층은 다가양이온 코어의 독성을 최소화하도록 선택되었다. 따라서 이와 같은 것은 본 발명의 RNA를 전달하는 데 바람직하다.
일 구현예에서, 모두 뇌로의 펩티드의 구강 전달, 펩티드의 정맥내 전달 및 펩티드의 비강 전달에 적용될 수 있는 생접착성 중합체의 자가 조립에 기반한 입자가 고려된다. 다른 구현예, 예를 들어 소수성 약물의 구강 흡수 및 눈 전달이 또한 고려된다. 분자 외피 기술은 보호되고, 질병의 부위에 전달되는 조작된 중합체 외피를 수반한다(예를 들어, 문헌[Mazza, M. et al. ACSNano, 2013. 7(2): 1016-1026]; [Siew, A., et al. Mol Pharm, 2012. 9(1):14-28]; [Lalatsa, A., et al. J Contr Rel, 2012. 161(2):523-36]; [Lalatsa, A., et al., Mol Pharm, 2012. 9(6):1665-80]; [Lalatsa, A., et al. Mol Pharm, 2012. 9(6):1764-74]; [Garrett, N.L., et al. J Biophotonics, 2012. 5(5-6):458-68]; [Garrett, N.L., et al. J Raman Spect, 2012. 43(5):681-688]; [Ahmad, S., et al. J Royal Soc Interface 2010. 7:S423-33]; [Uchegbu, I.F. Expert Opin Drug Deliv, 2006. 3(5):629-40]; [Qu, X.,et al. Biomacromolecules, 2006. 7(12):3452-9] 및 [Uchegbu, I.F., et al. Int J Pharm, 2001. 224:185-199] 참조). 표적 조직에 따라, 약 5 ㎎/kg 용량의 단일 또는 다중 용량이 고려된다.
일 구현예에서, MIT의 Dan Anderson 연구소에 의해 개발된 종양 성장을 중단시키기 위해 암 세포에 RNA를 전달할 수 있는 입자가 본 발명의 핵산-표적화 시스템에 대해 사용되고/사용되거나 적합하게 될 수 있다. 특히, Anderson 연구소는 새로운 생체재료 및 나노제형의 합성, 정제, 특성화 및 제형화를 위한 완전히 자동화된 조합 시스템을 개발하였다. 예를 들어, 문헌[Alabi et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Aug 6;110(32):12881-6]; [Zhang et al., Adv Mater. 2013 Sep 6;25(33):4641-5]; [Jiang et al., Nano Lett. 2013 Mar 13;13(3):1059-64]; [Karagiannis et al., ACS Nano. 2012 Oct 23;6(10):8484-7]; [Whitehead et al., ACS Nano. 2012 Aug 28;6(8):6922-9] 및 [Lee et al., Nat Nanotechnol. 2012 Jun 3;7(6):389-93]을 참조한다.
미국 특허 출원 20110293703은 또한 본 발명의 핵산-표적화 시스템을 전달하기 위해 적용될 수 있는 폴리뉴클레오티드의 투여에서 특히 유용한 리피도이드 화합물에 관한 것이다. 일 양태에서, 아미노알콜 리피도이드 화합물은 작용제와 병용되어 세포 또는 대상체에게 전달되어 마이크로입자, 나노입자, 리포좀, 또는 미셀을 형성한다. 입자, 리포좀 또는 미셀에 의해 전달될 작용제는 기체, 액체 또는 고체의 형태일 수 있고, 작용제는 폴리뉴클레오티드, 단백질, 펩티드 또는 소분자일 수 있다. 미노알콜 리피도이드 화합물은 다른 아미노알콜 리피도이드 화합물, 중합체(합성 또는 천연), 계면활성제, 콜레스테롤, 탄수화물, 단백질, 지질 등과 조합되어 입자를 형성할 수 있다. 이어서 이들 입자는 선택적으로 약학적 부형제와 조합되어 약학적 조성물을 형성할 수 있다.
미국 특허 공개 20110293703은 또한 아미노알콜 리피도이드 화합물의 제조 방법을 제공한다. 1 이상의 당량의 아민을 본 발명의 아미노알콜 리피도이드 화합물을 형성하기에 적합한 조건 하에서 에폭시드-말단 화합물의 1 당량 이상과 반응되게 한다. 특정 구현예에서, 아민의 모든 아미노기는 에폭시드-말단 화합물과 완전히 반응되어 3 차 아민을 형성한다. 다른 구현예에서, 아민의 모든 아미노기는 3 차 아민을 형성하기 위하여 에폭시드-말단 화합물과 완전히 반응되지 않으며, 이에 의해 아미노알콜 리피도이드 화합물에서 1 차 또는 2 차 아민이 초래된다. 이들 1 차 또는 2 차 아민은 그대로 남아 있거나, 또 다른 친핵체, 예를 들어 상이한 에폭시드-말단 화합물과 반응할 수 있다. 당업자에 의해 인식될 바와 같이, 아민을 과량 미만의 에폭시드-말단 화합물과 반응시키는 것은 다양한 수의 테일을 지니는 복수의 상이한 아미노알콜 리피도이드 화합물을 초래할 것이다. 특정 아민은 2 개의 에폭시드 유래 화합물 테일로 완전히 작용화될 수 있는 반면, 다른 분자는 에폭시드 유래 화합물 테일에 의해 완전히 작용화되지 않을 것이다. 예를 들어, 디아민 또는 폴리아민은 분자의 다양한 아미노 모이어티를 제거하는 1 개, 2 개, 3 개 또는 4 개의 에폭시드 유래 화합물 테일을 포함하여 1 차, 2 차 및 3 차 아민을 초래할 수 있다. 특정 구현예에서, 모든 아미노기는 완전히 작용화되지 않는다. 특정 구현예에서, 2 가지 동일 유형의 에폭시드 말단 화합물이 사용된다. 다른 구현예에서, 2 개 이상의 상이한 에폭시드 말단 화합물이 사용된다. 아미노알콜 리피도이드 화합물의 합성은 용매와 함께 또는 용매 없이 수행되고, 합성은 30℃ 내지 100℃, 바람직하게는 대략 50℃ 내지 90℃ 범위의 고온에서 실행될 수 있다. 제조된 아미노알콜 리피도이드 화합물은 선택적으로 정제될 수 있다. 예를 들어, 아미노알콜 리피도이드 화합물의 혼합물을 정제하여, 특정 수의 에폭시드 유래 화합물 테일을 지니는 아미노알콜 리피도이드 화합물을 수득할 수 있다. 또는 혼합물을 정제하여 특정 입체 이성질체 또는 구조 이성질체를 수득할 수 있다. 아미노알콜 리피도이드 화합물은 또한 알킬 할로겐화물(예를 들어, 요오드화메틸) 또는 다른 알킬화제를 사용하여 알킬화될 수 있고/있거나 이들은 아실화될 수 있다.
미국 특허 공개 20110293703은 또한 본 발명의 방법에 의해 제조된 아미노알콜 리피도이드 화합물의 라이브러리를 제공한다. 이들 아미노알콜 리피도이드 화합물은 액체 핸들러(handler), 로봇, 마이크로타이터 플레이트, 컴퓨터 등을 수반하는 고처리량 기법을 사용하여 제조 및/또는 스크리닝될 수 있다. 특정 구현예에서, 아미노알콜 리피도이드 화합물을 폴리뉴클레오티드 또는 다른 작용제(예를 들어, 단백질, 펩티드, 소분자)를 세포에 형질감염시키는 이들의 능력에 대해 스크리닝한다.
미국 특허 공개 20130302401은 조합 중합을 사용하여 제조된 폴리(베타-아미노 알콜)(PBAA)의 부류에 관한 것이다. 본 발명의 PBAA는 코팅(예를 들어, 의료장치 또는 이식물에 대한 필름 또는 다중층 필름의 코팅), 첨가제, 재료, 부형제, 비생물오손제(non-biofouling agent), 미세패터닝제 및 세포 캡슐화제로서 생명공학 및 생체의학 적용분야에서 사용될 수 있다. 표면 코팅제로서 사용될 때, 이들 PBAA는 이들의 화학적 구조에 따라서 시험관내와 생체내 둘 다에서 상이한 염증 수준을 유발하였다. 이러한 부류의 물질의 큰 화학적 다양성은 출원인이 시험관내 대식세포 활성화를 억제하는 중합체 코팅제를 확인하게 하였다. 더욱이, 이들 코팅제는 카르복실화된 폴리스티렌 마이크로입자의 피하 이식 후에 염증 세포의 동원을 감소시키고, 섬유증을 감소시킨다. 이들 중합체를 사용하여 세포 캡슐화를 위한 고분자전해질 복합체 캡슐을 형성할 수 있다. 본 발명은 또한 미생물방지 코팅, DNA 또는 siRNA 전달, 및 줄기 세포 조직 조작과 같은 다수의 다른 생물학적 적용분야를 가질 수 있다. 미국 특허 공개 20130302401의 교시는 본 발명의 핵산-표적화 시스템에 적용될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 지질 나노입자(LNP)가 고려된다. 항트렌스티레틴(anti트렌스티레틴) 짧은 간섭 RNA는 지질 나노입자에서 캡슐화되고, 인간으로 전달되며(예를 들어, 문헌[Coelho et al., N Engl J Med 2013;369:819-29] 참조), 이와 같은 시스템은 본 발명의 핵산-표적화 시스템에 적합하게 되고, 적용될 수 있다. 정맥내로 투여된 체중 kg 당 약 0.01 ㎎ 내지 약 1 ㎎의 용량이 고려된다. 주입 관련 반응의 위험을 감소시키기 위한 의약이 고려되며, 예를 들어 덱사메타손, 아세탐피노펜, 디펜하이드라민 또는 세티리진 및 라니티딘이 고려된다. 5 회 용량에 있어서 4 주마다 킬로그램 당 약 0.3 ㎎의 다회 용량이 또한 고려된다.
LNP는 siRNA를 간에 전달함에 있어 고도로 효과적인 것으로 나타났으며(예를 들어, 문헌[Tabernero et al., Cancer Discovery, April 2013, Vol. 3, No. 4, pages 363-470] 참조), 따라서 핵산-표적화 이펙터 단백질을 인코딩하는 RNA를 간으로 전달하기 위해 고려된다. 2 주마다 6 ㎎/kg의 LNP의 약 4 회 용량의 용량이 고려될 수 있다. Tabernero 외는 0.7 ㎎/kg으로 투약한 LNP의 처음 2 사이클 후에 종양 퇴행을 관찰하였고, 6 사이클의 종료까지 환자는 림프절 전이의 완전한 퇴행 및 간 종양의 실질적 수축으로 부분적 반응을 달성하였음을 입증하였다. 관해가 남아 있는 이러한 환자에서 40 회 용량 후에 완전한 반응을 수득하였고, 26 개월에 걸쳐 용량을 제공한 후에 치료를 완료하였다. VEGF 경로 억제제를 이용한 사전 치료법 후에 진행한 신장, 폐 및 림프절을 포함하는 RCC 및 간외영역 질병을 지니는 2 명의 환자는 대략 8 개월 내지 12 개월 동안 모든 부위에서 안정적인 질병을 가졌고, PNET 및 간 전이를 지니는 환자는 안정적인 질병과 함께 18 개월(36 회 용량) 동안 연장 연구를 계속하였다.
그러나, LNP의 전하를 고려하여야 한다. 양이온성 지질은 세포내 전달을 용이하게 하는 비이중층 구조를 유도하기 위해 음으로 하전된 지질과 조합되기 때문이다. 하전된 LNP는 정맥내 주사 후 순환으로부터 빠르게 제거되기 때문에, 7 미만의 pKa 값을 지니는 이온화 가능한 양이온성 지질을 개발하였다(예를 들어, 문헌[Rosin et al, Molecular Therapy, vol. 19, no. 12, pages 1286-2200, Dec. 2011] 참조). 음으로 하전된 중합체, 예를 들어 RNA는 이온화 가능한 지질이 양전하를 나타내는 경우 낮은 pH 값(예를 들어, pH 4)에서 LNP에 로딩될 수 있다. 그러나, 생리적 pH 값에서, LNP는 더 긴 순환 시간과 양립 가능한 낮은 표면 전하를 나타낸다. 이온화 가능한 양이온성 지질의 4 개 종, 즉, 1,2-디리네오일-3-디메틸암모늄-프로판(DLinDAP), 1,2-디리놀레일옥시-3-N,N-디메틸아미노프로판(DLinDMA), 1,2-디리놀레일옥시-케토-N,N-디메틸-3-아미노프로판(DLinKDMA), 및 1,2-디리놀레일-4-(2-디메틸아미노에틸)-[1,3]-디옥솔란(DLinKC2-DMA)에 중점을 두었다. 이들 지질을 함유하는 LNP siRNA 시스템은 생체내 간세포에서 현저하게 상이한 유전자 침묵화 특성을 나타내는 것으로 나타났고, 효능은 인자 VII 유전자 침묵화 모델을 이용하는 시리즈 DLinKC2-DMA>DLinKDMA>DLinDMA>>DLinDAP에 따라 다르다(예를 들어, 문헌[Rosin et al, Molecular Therapy, vol. 19, no. 12, pages 1286-2200, Dec. 2011] 참조). 특히 DLinKC2-DMA를 함유하는 제형에 대하여, 1 μg/ml의 용량의 LNP 또는 LNP 중의 또는 이와 회합된 CRISPR Cas RNA가 고려될 수 있다.
LNP의 제조 및 CRISPR-Cas 캡슐화가 사용될 수 있고/있거나 문헌[Rosin et al, Molecular Therapy, vol. 19, no. 12, pages 1286-2200, Dec. 2011]으로부터 적합하게 될 수 있다. 양이온성 지질 1,2-디리네오일-3-디메틸암모늄-프로판(DLinDAP), 1,2-디리놀레일옥시-3-N,N-디메틸아미노프로판(DLinDMA), 1,2-디리놀레일옥시케토-N,N-디메틸-3-아미노프로판(DLinK-DMA), 1,2-디리놀레일-4-(2-디메틸아미노에틸)-[1,3]-디옥솔란(DLinKC2-DMA),(3-o-[2"-(메톡시폴리에틸렌글리콜 2000) 숙시노일]-1,2-디미리스토일-sn-글리콜(PEG-S-DMG), 및 R-3-[(ω-메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)2000) 카르바모일]-1,2-디미리스틸옥시프로필-3-아민(PEG-C-DOMG)은 Tekmira Pharmaceuticals(캐나다 밴쿠버에 소재)에 의해 제공될 수 있거나 합성될 수 있다. 콜레스테롤은 Sigma(미국 미주리주 세인트루이스 소재)로부터 구입할 수 있다. 특정 핵산-표적화 복합체(CRISPR-Cas) RNA는 DLinDAP, DLinDMA, DLinK-DMA 및 DLinKC2-DMA(40:10:40:10 몰비의 양이온성 지질:DSPC:CHOL: PEGS-DMG 또는 PEG-C-DOMG)를 함유하는 LNP 내에 캡슐화될 수 있다. 필요하다면, 0.2% SP-DiOC18(Invitrogen, 캐나다 벌링턴 소재)을 혼입시켜 세포 흡수, 세포내 전달, 및 생체분포를 평가할 수 있다. 캡슐화는 10 mmol/l의 최종 지질 농도로 양이온성 지질:DSPC:콜레스테롤:PEG-c-DOMG(40:10:40:10 몰비)로 구성된 지질 혼합물을 에탄올 중에 용해함으로써 실행될 수 있다. 이러한 지질의 에탄올 용액을 50 mmol/l 시트르산염, pH 4.0에 적가하여 다중 라멜라 소낭를 형성하여 30% 에탄올 vol/vol의 최종 농도를 생성할 수 있다. 압출기(Northern Lipids, 캐나다 벤쿠버 소재)를 사용하여 2 개의 적층 80 nm Nuclepore 폴리카르보네이트 필터를 통해 다중 라멜라 소낭을 압출한 후 거대 단일 라멜라 소낭이 형성될 수 있다. 30% 에탄올 vol/vol을 함유하는 50 mmol/l 시트르산염, pH 4.0 중에 2 mg/ml로 용해시킨 RNA를 압출된 사전형성된 거대 단일 라멜라 소낭에 적가하고, 0.06/1 wt/wt의 최종 RNA/지질 중량비로 일정하게 혼합하면서 30 분 동안 31℃에서 인큐베이션함으로써 캡슐화를 달성할 수 있다. Spectra/Por 2 재생 셀룰로스 투석막을 사용하여 16 시간 동안 인산염 완충 식염수(PBS), pH 7.4에 대해 투석함으로써 에탄올의 제거 및 제형 완충제의 중화를 실행하였다. NICOMP 370 입도 분석기, 소낭/강도 모드, 및 가우시안(Gaussian) 핏팅(Nicomp Particle Sizing, 미국 캘리포니아주 산타 바바라 소재)을 사용하여 동적 광 산란에 의해 입자 크기 분포를 결정할 수 있다. 3 개 모두의 LNP 시스템에 대한 입자 크기는 직경이 약 70 nm일 수 있다. VivaPureD MiniH 컬럼(Sartorius Stedim Biotech)을 사용하여 투석 전 및 후에 수집한 샘플로부터 유리 RNA를 제거함으로써 RNA 캡슐화 효율을 결정할 수 있다. 캡슐화된 RNA는 용리된 입자로부터 추출되고, 260 nm에서 정량화될 수 있다. RNA 대 지질 비는 Wako Chemicals USA(미국 버지니아주 리치몬드 소재)로부터의 콜레스테롤 E 효소 검정을 사용하여 소낭 내 콜레스테롤 함량의 측정에 의해 결정되었다. LNP 및 PEG 지질의 본 명세서에서의 논의와 함께, PEG화 리포좀 또는 LNP는 마찬가지로 핵산-표적화 시스템 또는 이의 성분의 전달에 적합하다.
거대 LNP의 제조는 문헌[Rosin et al, Molecular Therapy, vol. 19, no. 12, pages 1286-2200, Dec. 2011]으로부터 사용될 수 있고/있거나 이에 적합하게 될 수 있다. 지질 예비혼합 용액(20.4 ㎎/㎖ 총 지질 농도)은 50:10:38.5 몰비로 DLinKC2-DMA, DSPC 및 콜레스테롤을 함유하는 에탄올 중에서 제조될 수 있다. 아세트산나트륨은 0.75:1의 몰비(아세트산나트륨:DLinKC2-DMA)로 지질 예비혼합물에 첨가될 수 있다. 지질은 격렬한 교반과 함께 1.85 부피의 시트르산염 완충제(10 mmol/l, pH 3.0)와 혼합물을 합함으로써 이후에 수화되어, 35% 에탄올을 함유하는 수성 완충제 중의 자발적 리포좀 형성을 초래할 수 있다. 리포좀 용액을 37℃에서 인큐베이션시켜 시간-의존적 입자 크기의 증가를 가능하게 할 수 있다. 분취물을 인큐베이션 동안 다양한 시간에 제거하여, 동적 광 산란에 의해 리포좀 크기의 변화를 조사할 수 있다(Zetasizer Nano ZS, Malvern Instruments, 영국 우스터셔 소재). 일단 원하는 입자 크기가 달성되면, 수성 PEG 지질 용액(원액 = 35%(vol/vol) 에탄올 중의 10 mg/ml PEG-DMG)을 리포좀 혼합물에 첨가하여 3.5%의 총 지질의 최종 PEG 몰 농도를 제공할 수 있다. PEG-지질의 첨가 시, 리포좀을 추가 성장을 효과적으로 켄칭시켜 이들의 크기를 해야 한다. 이어서, RNA를 대략 1:10(wt:wt)의 RNA 대 총 지질 비로 빈 리포좀에 첨가한 후에 37℃에서 30 분 동안 인큐베이션시켜 로딩된 LNP를 형성할 수 있다. 혼합물을 후속적으로 PBS 중에 밤새 투석시키고, 0.45-㎛ 주사기 필터로 여과할 수 있다.
구체 핵산(Spherical Nucleic Acid; SNA™) 작제물 및 다른 입자(특히, 금 입자)는 또한 의도된 표적에 핵산-표적화 시스템을 전달하기 위한 수단으로서 고려된다. 유의한 데이터는 핵산 작용화된 금 입자에 기반한 AuraSense Therapeutics의 구체 핵산(SNA™) 작제물이 유용한 것을 나타낸다.
본 명세서의 교시와 함께 이용될 수 있는 문헌은 문헌[Cutler et al., J. Am. Chem. Soc. 2011 133:9254-9257], [Hao et al., Small. 2011 7:3158-3162], [Zhang et al., ACS Nano. 2011 5:6962-6970], [Cutler et al., J. Am. Chem. Soc. 2012 134:1376-1391], [Young et al., Nano Lett. 2012 12:3867-71], [Zheng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2012 109:11975-80], [Mirkin, Nanomedicine 2012 7:635-638], [Zhang et al., J. Am. Chem. Soc. 2012 134:16488-1691], [Weintraub, Nature 2013 495:S14-S16], [Choi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2013 110(19):7625-7630], [Jensen et al., Sci. Transl. Med. 5, 209ra152(2013)] 및 [Mirkin, et al., Small, 10:186-192]을 포함한다.
RNA를 지니는 자가 조립 입자는, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 원위 말단에 부착된 Arg-Gly-Asp(RGD) 펩티드 리간드로 PEG화된 폴리에틸렌이민(PEI)을 이용하여 작제될 수 있다. 이러한 시스템은, 예를 들어 인테그린을 발현하는 종양 신생혈관을 표적화하고, 혈관 내피 성장 인자 수용체-2(VEGF R2) 발현을 억제하는 siRNA를 전달하여, 이에 의해, 종양 혈관형성을 달성하기 위한 수단으로 사용된다(예를 들어, 문헌[Schiffelers et al., Nucleic Acids Research, 2004, Vol. 32, No. 19] 참조). 나노플렉스(nanoplex)를 동일한 부피의 양이온성 중합체 및 핵산의 수용액을 혼합함으로써 제조하여 2 내지 6의 범위에 걸쳐 인산염(핵산)에 대한 순 몰 과량의 이온화 가능한 질소(중합체)를 제공할 수 있다. 양이온성 중합체와 핵산 간의 정전기적 상호작용은 약 100 nm의 평균 입자 크기 분포를 갖는 폴리플렉스(polyplex)의 형성을 초래하며, 따라서 본 명세서에서 나노플렉스로서 지칭된다. Schiffelers외의 자가 조립 입자에서의 전달을 위해 약 100 mg 내지 200 mg의 핵산-표적화 복합체 RNA의 용량이 예상된다.
Bartlett 외(문헌[PNAS, September 25, 2007,vol. 104, no. 39])의 나노플렉스가 또한 본 발명에 적용될 수 있다. Bartlett 외의 나노플렉스는 동일 부피의 양이온성 중합체 및 핵산의 수용액을 혼합함으로써 제조되어 2 내지 6의 범위에 걸쳐 인산염(핵산)에 대한 순 몰 과량의 이온화 가능한 질소(중합체)를 제공한다. 양이온성 중합체와 핵산 간의 정전기적 상호작용은 약 100 nm의 평균 입자 크기 분포를 지니는 폴리플렉스의 형성을 초래하였고, 따라서 본 명세서에서 나노플렉스로서 지칭된다. Bartlett 외의 DOTA-siRNA를 다음과 같이 합성하였다: 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산 모노(N-하이드록시숙신이미드 에스테르)(DOTA-NHS에스테르)를 Macrocyclics(미국 텍사스주 달라스 소재)에서 주문하였다. 탄산염 완충제(pH 9) 중의 100 배 몰 과량의 DOTA-NHS-에스테르에 의한 아민 변형 RNA 센스 가닥을 마이크로원심분리 튜브에 첨가하였다. 내용물을 실온에서 4 시간 동안 교반시킴으로써 반응시켰다. DOTA-RNA센스 컨쥬게이트를 에탄올 침전시키고, 수 중에 재현탁화한 다음, 미변형 안티센스 가닥에 어닐링시켜 DOTA-siRNA를 수득하였다. 모든 액체를 Chelex-100(Bio-Rad, 미국 캘리포니아주 허큘러스 소재)으로 전처리하여 미량의 금속 오염물질을 제거하였다. Tf-표적화 및 비표적화 siRNA 입자를 사이클로덱스트린-함유 다가양이온을 사용함으로써 형성할 수 있다. 전형적으로, 입자를 전하비 3(+/-) 및 siRNA 농도 0.5 g/리터로 수 중에서 형성하였다. 표적화된 입자의 표면 상의 아다만탄-PEG 분자의 1%를 Tf로 변형시켰다(아다만탄-PEG-Tf). 입자를 주사용 5%(wt/vol) 글루코스 담체 용액 중에서 현탁화시켰다.
Davis 외(문헌[Nature, Vol 464, 15 April 2010])는 표적화된 입자-전달 시스템(임상 시험 등록 번호 NCT00689065)을 사용하는 RNA 임상 시험을 수행한다. 표준 치료 치료법에 난치성인 고형암을 지니는 환자에게 30 분 정맥내 주입에 의해 21 일 사이클 중 제1 일, 제3 일, 제8 일 및 제10 일에 표적화된 입자의 용량을 투여한다. 입자는 하기를 함유하는 합성 전달 시스템을 포함하거나, 으로 essentially 이루어지거나, 으로 이루어진다:(1) 선형, 사이클로덱스트린-기반 중합체(CDP), (2) 암 세포의 표면 상의 TF 수용체(TFR)에 맞물리는 나노입자 외부에 나타나는 인간 트랜스페린 단백질(TF) 표적화 리간드, (3) 친수성 중합체(생물학적 유체 중에서 나노입자 안정성을 촉진하기 위해 사용되는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)), 및 (4) RRM2의 발현을 감소시키도록 설계된 siRNA(임상에서 사용한 서열은 앞서 정의한 siR2B+5였음). TFR는 악성 세포에서 상향조절되는 것으로 오랫동안 알려져 있고, RRM2는 확립된 항암 표적이다. 이들 입자(CALAA-01로서 정의된 임상 형태)는 비-인간 영장류에서의 다회 투약 연구에서 잘 용인되는 것으로 나타났다. 만성 골수성 백혈병을 지니는 단일 환자에게 리포좀 전달에 의해 siRNA가 투여되었지만, Davis 외의 임상 시험은 표적화된 전달 시스템을 이용하여 siRNA를 전신으로 전달하기 위한 그리고 고형암을 지니는 환자를 치료하기 위한 초기 인간 시험이다. 표적화된 전달 시스템이 인간 종양으로의 기능성 siRNA의 효과적인 전달을 제공할 수 있는지 여부를 확인하기 위해, Davis 외는 3 개의 상이한 투약 코호트로부터의 3 명 환자로부터의 생검을 조사하였으며; 환자 A, B 및 C는 모두 전이성 흑색종을 가졌고, 각각 18 mg m-2, 24 mg m-2 및 30 ㎎ m-2 siRNA의 CALAA-01 용량을 받았다. 유사한 용량이 또한 본 발명의 핵산-표적화 시스템을 위해 고려될 수 있다. 본 발명의 전달은 선형, 사이클로덱스트린-기반 중합체(CDP), 암세포의 표면 상의 TF 수용체(TFR)에 맞물리는 입자 외부에 나타나는 인간 트랜스페린 단백질(TF) 표적화 리간드 및/또는 친수성 중합체(예를 들어, 생물학적 유체 중에서 입자 안정성을 촉진하기 위해 사용되는 폴리에틸렌 글리콜(PEG))를 함유하는 입자에 의해 달성될 수 있다.
본 발명과 관련하여, 입자 또는 지질 외피를 사용하여 핵산-표적화 복합체의 하나 이상의 성분, 예를 들어 핵산-표적화 이펙터 단백질 또는 mRNA, 또는 가이드 RNA가 전달될 수 있는 것이 바람직하다. 다른 전달 시스템 또는 벡터가 본 발명의 입자 양태와 함께 사용될 수 있다.
일반적으로, "나노입자"는 1000 nm 미만의 직경을 갖는 임의의 입자를 나타낸다. 바람직한 특정 구현예에서, 본 발명의 나노입자는 500 nm 이하의 가장 큰 치수(예를 들어, 직경)를 갖는다. 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 나노입자는 25 nm 내지 200 nm 범위의 가장 큰 치수를 갖는다. 다른 바람직한 구현에에서, 본 발명의 입자는 100 nm 이하의 가장 큰 치수를 갖는다. 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 나노입자는 35 nm 내지 60 nm 범위의 가장 큰 치수를 갖는다.
본 발명에 포함된 입자는 상이한 형태, 예를 들어 고체 입자(예를 들어, 금속, 예를 들어 은, 금, 철, 티타늄), 비-금속, 지질-기반 고체, 중합체), 입자의 현탁액, 또는 이들의 조합물로 제공될 수 있다. 금속, 유전체, 및 반도체 입자뿐만 아니라 하이브리드 구조(예를 들어, 코어-쉘 입자)가 제조될 수 있다. 반도체 물질로 제조된 입자는 또한 이들이 전자 에너지 수준의 양자화가 발생하기에 충분히 작은(통상적으로, 10 nm 이하) 경우 양자점으로 표지화될 수 있다. 이와 같은 나노규모 입자는 약물 담체 또는 이미징 작용제로서 생물의학 응용에서 사용되며, 본 발명에서 유사한 목적을 위해 적합하게 될 수 있다.
반고체 및 연성 입자가 제조되었고, 이들은 본 발명의 범주 내에 속한다. 반고체 성질의 프로토타입 입자는 리포좀이다. 다양한 유형의 리포좀 입자가 항암 약물 및 백신을 위한 전달 시스템으로서 현재 임상적으로 사용된다. 절반이 친수성이고, 나머지 절반이 소수성인 입자는 야누스(Janus) 입자로 명명되며, 에멀젼을 안정화시키는 데 특히 효과적이다. 이들은 물/오일 계면에서 자가-조립되며, 고체 계면활성제로 작용할 수 있다.
참고로 본 명세서에 포함되는 미국 특허 제8,709,843 호는 조직, 세포, 및 세포내 구획으로의 치료제-함유 입자의 표적화된 전달을 위한 약물 전달 시스템을 제공한다. 상기 발명은 계면활성제, 친수성 중합체 또는 지질에 컨쥬게이트된 중합체를 포함하는 표적화된 입자를 제공한다.
참고로 본 명세서에 포함되는 미국 특허 제6,007,845 호는 다작용성 화합물과 하나 이상의 소수성 중합체 및 하나 이상의 친수성 중합체를 공유적으로 연결시킴으로써 형성된 멀티블록 공중합체의 코어를 갖고, 생물학적으로 활성인 물질을 함유하는 입자를 제공한다.
참고로 본 명세서에 포함되는 미국 특허 제5,855,913 호는 폐기관계로의 약물 전달을 위해 표면 상에 계면활성제가 혼입된, 0.4 g/㎤ 미만의 탭 밀도(tap density)와 함께 5 ㎛ 내지 30 ㎛의 평균 직경을 갖는 공기역학적으로 가벼운 입자를 갖는 미립자 조성물을 제공한다.
참고로 본 명세서에 포함되는 미국 특허 제5,985,309 호는 폐기관계로의 전달을 위한 계면활성제 및/또는 양으로 또는 음으로 하전된 치료제 또는 진단제 및 반대 전하로 하전된 분자의 친수성 또는 소수성 복합체가 혼입된 입자를 제공한다.
참고로 본 명세서에 포함되는 미국 특허 제5,543,158 호는 표면 상에 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티 및 생물학적 활성 물질을 함유하는 생분해성 고체 코어를 갖는 생분해성 주사가능한 입자를 제공한다.
참고로 본 명세서에 포함되는 WO2012135025(또한 US20120251560으로 공개됨)는 컨쥬게이트된 폴리에틸렌이민(PEI) 중합체 및 컨쥬게이트된 아자-마크로사이클(집합적으로, "컨쥬게이트된 리포머" 또는 "리포머"로 지칭됨)이 기재한다. 특정 구현예에서, 이와 같은 본 명세서에 인용된 문서의 방법 및 물질, 예를 들어, 컨쥬게이트된 리포머가 단백질 발현의 조절을 포함하여 유전자 발현을 변형시키기 위한 시험관내, 생체외 및 생체내 게놈 변동을 달성하기 위해 핵산-표적화 시스템의 상황에서 사용될 수 있음이 계획될 수 있다.
일 구현예에서, 입자는 에폭시드-변형된 지질-중합체, 유리하게는 7C1일 수 있다(예를 들어, 문헌[James E. Dahlman and Carmen Barnes et al. Nature Nanotechnology(2014), 2014년 5월 11일 온라인 발행, doi:10.1038/nnano.2014.84] 참조). C71을 14:1의 몰비로 C15 에폭시드-말단 지질과 PEI600을 반응시킴으로써 합성하였고, 적어도 40 일 동안 PBS 용액에서 안정적인 입자(35 nm 내지 60 nm의 직경)를 생성시키기 위해 C14PEG2000과 함께 제형화하였다.
폐, 심혈관 또는 신장 세포로 본 발명의 핵산-표적화 시스템을 전달하기 위해 에폭시드-변형된 지질-중합체가 이용될 수 있으나, 당업자는 다른 표적 기관으로 전달하기 위해 시스템을 적합하게 할 수 있다. 약 0.05 mg/kg내지 약 0.6 mg/kg 범위의 용량이 계획된다. 약 2 mg/kg의 전체 용량의 수 일 또는 수 주에 걸친 용량이 또한 계획된다.
엑소좀
엑소좀은 뇌 및 다른 표적 기관에 RNA를 전달할 수 있는, 단백질 및 RNA를 전달하는 내인성 나노-소낭이다. 면역원성을 감소시키기 위해, Alvarez-Erviti외(문헌[2011, Nat Biotechnol 29: 341])는 엑소좀 생성을 위해 자가-유래 수상돌기 세포를 사용하였다. 뉴런-특이적 RVG 펩티드에 융합된 엑소좀 막 단백질인 Lamp2b를 발현하도록 수상돌기 세포를 조작함으로써 뇌로의 표적화를 달성하였다. 정제된 엑소좀에 전기천공법에 의해 외인성 RNA를 로딩하였다. 정맥내로 주사한 RVG-표적화 엑소좀은 뇌 내의 뉴런, 미세아교세포, 희소돌기신경교에 특이적으로 GAPDH siRNA를 전달하여, 특이적 유전자 녹다운을 초래하였다. RVG 엑소좀에 대한 사전 노출은 녹다운을 약화시키지 않았고, 다른 조직에서의 비-특이적 흡수는 관찰되지 않았다. 엑소좀-매개 siRNA 전달의 치료 잠재력은 알츠하이머병에서의 치료 표적인 BACE1의 강력한 mRNA(60%) 및 단백질(62%) 녹다운에 의해 입증되었다.
면역학적으로 비활성인 엑소좀의 풀을 얻기 위해, Alvarez-Erviti외는 상동성 주조직적합성 복합체(MHC) 단상형을 지니는 근친교배 C57BL/6 마우스로부터 골수를 수집하였다. 미성숙 수상돌기 세포가 MHC-II 및 CD86과 같은 T-세포 활성화제가 없는 다량의 엑소좀을 생성하기 때문에, Alvarez-Erviti외는 7 일 동안 과립구/대식세포-콜로니 자극 인자(GM-CSF)를 지니는 수상돌기 세포에 대해 선택하였다. 잘 확립된 초원심분리 프로토콜을 사용하여 다음날 배양 상청액으로부터 엑소좀을 정제하였다. 생성된 엑소좀은 물리적으로 균질하였고, 크기 분포는 입자 트래킹 분석(NTA) 및 전자 현미경에 의해 결정하였을 때, 직경 80 nm에서 최고였다. Alvarez-Erviti외는 106 개 세포당 6 μg 내지 12 μg의 엑소좀(단백질 농도를 기준으로 측정)을 얻었다.
다음에, Alvarez-Erviti외는 나노규모 적용에 적합한 전기천공법 프로토콜을 사용하여 외인성 카고로의 변형된 엑소좀의 로딩 가능성을 조사하였다. 나노미터 규모에서 막 입자에 대한 전기천공법은 제대로 특성화되지 않기 때문에, 비특이적 Cy5-표지화 RNA를 전기천공법 프로토콜의 경험적 최적화를 위해 사용하였다. 캡슐화된 RNA의 양을 엑소좀의 초원심분리 및 용해 후에 분석하였다. 400 V 및 125 μF에서의 전기천공법은 RNA의 가장 큰 보유를 초래하였고, 모든 후속 실험에 대해 사용하였다.
Alvarez-Erviti외는 150 μg의 RVG 엑소좀 중에 캡슐화된 150 μg의 각각의 BACE1 siRNA를 정상 C57BL/6 마우스에게 투여하고, 녹다운 효율을 4 개의 대조군, 즉 미처리 마우스, RVG 엑소좀만을 주사한 마우스, 생체내 양이온성 리포좀 시약에 복합체화된 BACE1 siRNA를 주사한 마우스, 및 siRNA에 정전기적으로 결합된 9 개의 D-아르기닌에 컨쥬게이트된 RVG 펩티드인 RVG-9R에 복합체화된 BACE1 siRNA를 주사한 마우스에 대하여 비교하였다. 투여 3 일 후 피질 조직 샘플을 분석하였고, siRNA-RVG-9R-처리 마우스와 siRNARVG 엑소좀-처리 마우스 둘 다에서 BACE1 mRNA 수준의 상당한 감소(각각 66% [+ 또는 -] 15%, P < 0.001 및 61% [+ 또는 -] 13%, P < 0.01)로부터 초래되는 상당한 단백질 녹다운(45%, P < 0.05, 대 62%, P < 0.01)을 관찰하였다. 게다가, 출원인은 RVG-엑소좀-처리 동물에서 알츠하이머 병증에서의 아밀로이드 플라크의 주요 성분인 총 [베타]-아밀로이드 1 내지 42 수준에서 상당한 감소(55%, P < 0.05)를 입증하였다. 관찰한 감소는 BACE1 억제제의 정맥내 주사 후 정상 마우스에서 입증된 β-아밀로이드 1 내지 40 감소보다 더 컸다. Alvarez-Erviti외는 BACE1 절단 생성물에 대해 cDNA 말단의 5'-신속한 증폭(RACE)을 수행하였는데, 이는 siRNA에 의한 RNAi-매개 녹다운의 증거를 제공하였다.
최종적으로, Alvarez-Erviti 외는 IL-6, IP-10, TNFα 및 IFN-α 혈청 농도를 평가함으로써 RNA-RVG 엑소좀이 생체내 면역 반응을 유도하였는지 여부를 조사하였다. 엑소좀 처리 후에, 모든 사이토카인에서의 중요하지 않은 변화가 IL-6 분비를 강력하게 자극한 siRNA-RVG-9R과 대조적으로 siRNA-형질감염 시약 처리와 유사하게 등록되었는데, 이는 엑소좀 처리의 면역학적 비활성 프로파일을 확인시켜준다. 엑소좀이 단지 20%의 siRNA를 캡슐화하는 것을 고려해 볼 때, RVG-엑소좀에 의한 전달은 비슷한 mRNA 녹다운으로서 RVG-9R 전달보다 더 효율적인 것으로 나타나며, 대응하는 면역 자극 수준 없이, 더 큰 단백질 녹다운이 5 배 더 적은 siRNA에 의해 달성되었다. 이 실험은 신경변성 질병과 관련된 유전자의 장기간 침묵화에 잠재적으로 적합한 RVG-엑소좀 기술의 치료 잠재력을 입증하였다. Alvarez-Erviti 외의 엑소좀 전달 시스템은 치료 표적, 특히 신경변성 질병에 본 발명의 핵산-표적화 시스템을 전달하기 위해 적용될 수 있다. 약 100 mg 내지 1000 mg의 RVG 엑소좀에서 캡슐화된 약 100 mg 내지 1000 mg의 핵산-표적화 시스템의 용량은 본 발명을 위해 고려될 수 있다.
El-Andaloussi 외(Nature Protocols 7,2112-2126(2012))는 배양 세포로부터 유래된 엑소좀이 시험관내 및 생체내 RNA의 전달을 위해 이용될 수 있는 방법을 개시한다. 이 프로토콜은 펩티드 리간드와 융합된 엑소좀 단백질을 포함하는 발현 벡터의 형질감염을 통한 표적화된 엑소좀의 생성을 처음으로 기재한다. 다음에, El-Andaloussi외는 형질감염된 세포 상청액으로부터 엑소좀을 정제하고 특성화하는 방법을 설명한다. 다음에, El-Andaloussi 외는 RNA를 엑소좀에 로딩하기 위한 결정적인 단계를 상술한다. 최종적으로, El-Andaloussi 외는 마우스 뇌에서 시험관내 및 생체내 RNA를 효율적으로 전달하기 위해 엑소좀을 사용하는 방법을 약술한다. 엑소좀-매개 RNA 전달이 기능성 분석 및 영상에 의해 평가되는 예상된 결과의 예가 또한 제공된다. 전체 프로토콜은 약 3 주가 걸린다. 본 발명에 따른 전달 또는 투여는 자가-유래 수상돌기 세포로부터 생성된 엑소좀을 사용하여 실행될 수 있다. 본 명세서의 교시로부터, 이는 본 발명의 실시에 이용될 수 있다.
또 다른 구현예에서, Wahlgren 외(문헌[Nucleic Acids Research, 2012, Vol. 40, No. 17 e130])의 혈장 엑소좀이 고려된다. 엑소좀은 수상돌기 세포(DC), B 세포, T 세포, 비만 세포, 상피 세포 및 종양 세포를 포함하는 다수의 세포 유형에 의해 생성된 나노 크기 소낭(30 nm 내지 90 nm 크기)이다. 이들 소낭은 후기 엔도솜의 안쪽으로 향하는 출아에 의해 형성되며, 이어서 혈장막과 융합시 세포외 환경으로 방출된다. 엑소좀은 천연적으로 세포 간에 RNA를 운반하기 때문에, 이 특성은 유전자 치료법에 유용할 수 있으며, 이러한 개시 내용으로부터, 본 발명의 실시에 이용될 수 있다.
혈장으로부터의 엑소좀은 20 분 동안 900 g에서 버피 코트의 원심분리로 혈장을 분리시킨 다음에 세포 상청액을 수집하고 10 분 동안 300 g에서 그리고 30 분 동안 16 500 g에서 원심분리하여 세포를 제거한 후 0.22 mm 필터를 통해 여과시킴으로써 제조될 수 있다. 엑소좀을 120 000 g에서 70 분 동안 초원심분리에 의해 펠렛화시킨다. siRNA의 엑소좀 내로의 화학적 형질감염을 RNAi 인간/마우스 스타터 키트(Human/Mouse Starter Kit)(Quiagen, 독일 힐덴 소재)에서 제조업자의 지침서에 따라 수행한다. siRNA를 2 mmol/ml의 최종 농도로 100 ml PBS에 첨가한다. HiPerFect 형질감염 시약을 첨가한 후에, 혼합물을 실온에서 10 분 동안 인큐베이션시킨다. 과량의 미셀을 제거하기 위해, 알데하이드/설페이트 라텍스 비드를 사용하여 엑소좀을 재분리시킨다. 엑소좀 내로의 핵산-표적화 시스템의 화학적 형질감염은 siRNA와 유사하게 수행될 수 있다. 엑소좀은 건강한 공여자의 말초혈액으로부터 분리된 림프구 및 단핵구와 동시배양될 수 있다. 따라서, 핵산-표적화 시스템을 함유하는 엑소좀은 인간의 단핵구 및 림프구에 도입될 수 있고 인간에게 자가 조직으로 재도입될 수도 있는 것이 고려될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 전달 또는 투여는 혈장 엑소좀을 사용하여 실행될 수 있다.
리포좀
본 발명에 따른 전달 또는 투여는 리포좀을 이용하여 실행될 수 있다. 리포좀은 내부 수성 구획을 둘러싸는 단일 또는 다중 라멜라 지질 이중층 및 상대적으로 불투과성인 외측 친지성 인지질 이중층으로 구성된 구체 소낭 구조이다. 리포좀은 이들이 생체적합성, 비독성이기 때문에 약물 전달 담체로서 상당한 관심을 얻었고, 친수성과 친지성 약물 분자를 둘 다 전달할 수 있으며, 혈장 효소에 의한 분해로부터 그들의 카고를 보호하고, 생물학적 막 및 혈액 뇌 장벽(BBB)을 가로질러 그들의 로드를 전달할 수 있다(예를 들어, 검토를 위해 문헌[Spuch and Navarro, Journal of Drug Delivery, vol. 2011, Article ID 469679, 12 pages, 2011. doi:10.1155/2011/469679] 참조).
리포좀은 몇몇 상이한 유형의 지질로부터 만들어질 수 있지만; 약물 담체로서 리포좀을 생성하는 데 인지질이 가장 통상적으로 사용된다. 지질 필름이 수용액과 혼합될 때 리포좀 형성은 자발적이지만, 또한 균질화기, 초음파처리기, 또는 압출 장치를 사용하는 것에 의한 진탕 형태로 힘을 적용함으로써 더 신속히 처리될 수 있다(예를 들어, 검토를 위해 문헌[Spuch and Navarro, Journal of Drug Delivery, vol. 2011, Article ID 469679, 12 pages, 2011. doi:10.1155/2011/469679] 참조).
리포좀의 구조 및 특성을 변형시키기 위해 몇몇 다른 첨가제가 리포좀에 첨가될 수 있다. 예를 들어, 콜레스테롤 또는 스핑고미엘린을 리포좀 혼합물에 첨가하여 리포좀 구조를 안정화시키는 데 도움을 주고 리포좀 내부 카고의 누출을 방지할 수 있다. 추가로, 리포좀을 수소화된 난(egg) 포스파티딜콜린 또는 난 포스파티딜콜린, 콜레스테롤, 및 디세틸 포스페이트로부터 제조하고, 리포좀의 평균 소낭 크기를 약 50 nm 및 100 nm로 조정하였다(예를 들어, 검토를 위해 문헌[Spuch and Navarro, Journal of Drug Delivery, vol. 2011, Article ID 469679, 12 pages, 2011. doi:10.1155/2011/469679] 참조).
리포좀 제형은 주로 천연 인지질 및 지질, 예를 들어 1,2-디스테아로릴-sn-글리세로-3-포스파티딜 콜린(DSPC), 스핑고미엘린, 난 포스파티딜콜린 및 모노시알로강글리오사이드로 구성될 수 있다. 이 제형은 인지질만으로 구성되기 때문에, 리포좀 제형은 다수의 난제와 마주치는데, 그 중 하나는 혈장 내 불안정성이다. 구체적으로 지질막의 조작에서 이들 난제를 극복하기 위한 몇몇 시도가 이루어졌다. 이들 시도 중 하나는 콜레스테롤의 조작에 집중되어 있다. 통상의 제형으로의 콜레스테롤의 첨가는 캡슐화된 생활성 화합물의 혈장 내로의 신속한 방출을 감소시키거나 또는 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE)은 안정성을 증가시킨다(예를 들어, 검토를 위해 문헌[Spuch and Navarro, Journal of Drug Delivery, vol. 2011, Article ID 469679, 12 pages, 2011. doi:10.1155/2011/469679] 참조).
특히 유리한 구현예에서, 트로이 목마 리포좀(또한 분자 트로이 목마로 알려져 있음)이 바람직하며, 프로토콜은 http://cshprotocols.cshlp.org/content/2010/4/pdb.prot5407.long에서 찾을 수 있다. 이들 입자는 혈관내 주사 후 전체 뇌로의 전이유전자의 전달을 가능하게 한다. 제한에 의해 구속되지 않고, 표면에 컨쥬게이트된 특이적 항체를 지니는 중성 지질 입자는 엔도시토시스를 통해 혈액 뇌 장벽을 가로지르는 것으로 여겨진다. 출원인은 혈관내 주사를 통해 뇌에 뉴클레아제의 CRISPR 패밀리를 전달하기 위해 트로이 목마 리포좀을 이용하는 것을 가정하는데, 이는 배아 조작에 대한 필요 없이 전체 뇌 유전자 도입 동물을 가능하게 할 것이다. 약 1 g 내지 5 g의 DNA 또는 RNA가 리포좀 내 생체내 투여를 위해 고려될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 핵산-표적화 시스템 또는 이의 성분은 안정적인 핵산-지질 입자(SNALP)와 같은 리포좀으로 투여될 수 있다(예를 들어, 문헌[Morrissey et al., Nature Biotechnology, Vol. 23, No. 8, August 2005] 참조). SNALP에서 표적화된 특이적 핵산-표적화 시스템의 약 1 mg/kg/일, 3 mg/kg/일 또는 5 mg/kg/일의 매일의 정맥내 주사가 고려된다. 매일의 치료는 약 3 일에 걸쳐 이루어질 수 있고, 이어서 약 5 주 동안 주마다 이루어질 수 있다. 또 다른 구현예에서, 약 1 mg/kg 또는 2.5 mg/kg 의 용량에서 정맥내 주사에 의해 투여되는 특정 핵산-표적화 시스템 캡슐화된 SNALP가 또한 고려된다(예를 들어, 문헌[Zimmerman et al., Nature Letters, Vol. 441, 4 May 2006] 참조). SNALP 제형은 지질 3-N-[(w메톡시폴리(에틸렌 글리콜) 2000) 카바모일]-1,2-디미리스틸옥시-프로필아민(PEG-C-DMA), 1,2-디리놀레일옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판(DLinDMA), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC) 및 콜레스테롤을 2:40:10:48 몰 백분율 비로 함유할 수 있다(예를 들어, 문헌[Zimmerman et al., Nature Letters, Vol. 441, 4 May 2006] 참조).
또 다른 구현예에서, 안정적인 핵산-지질 입자(SNALP)는 고도로 혈관화된 HepG2-유래 간 종양에 대해 효과적인 전달 분자인 것으로 입증되었지만, 불량하게 혈관화된 HCT-116 유래 간 종양에 대해서는 그렇지 않다(예를 들어, 문헌[Li, Gene Therapy(2012) 19, 775-780] 참조). SNALP 리포좀은 25:1의 지질/siRNA 비 및 48/40/10/2 몰비의 콜레스테롤/D-Lin-DMA/DSPC/PEG-C-DMA를 사용하여 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 콜레스테롤 및 siRNA로 D-Lin-DMA 및 PEG-C-DMA를 제형화함으로써 제조될 수 있다. 생성된 SNALP 리포좀은 크기가 약 80 nm 내지 100 nm이다.
또 다른 구현예에서, SNALP는 합성 콜레스테롤(Sigma-Aldrich, 미국 미주리주 세인트루이스 소재), 디팔미토일포스파티딜콜린(Avanti Polar Lipids, 미국 앨라배마주 앨러배스터 소재), 3-N-[(w-메톡시 폴리(에틸렌 글리콜)2000)카바모일]-1,2-디미레스틸옥시프로필아민, 및 양이온성 1,2-디리놀레일옥시-3-N,N 디메틸아미노프로판(예를 들어, 문헌[Geisbert et al., Lancet 2010; 375: 1896-905] 참조)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 볼루스 정맥내 주입으로서 투여되는 용량당 약 2 mg/kg의 총 핵산-표적화 시스템의 용량이 고려될 수 있다.
또 다른 구현예에서, SNALP는 합성 콜레스테롤(Sigma-Aldrich), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC; Avanti Polar Lipids Inc.), PEG-cDMA, 및 1,2-디리놀레일옥시-3-(N;N-디메틸)아미노프로판(DLinDMA)(예를 들어, 문헌[Judge, J. Clin. Invest. 119:661-673(2009)] 참조)을 포함할 수 있다. 생체내 연구를 위해 사용되는 제형은 약 9:1의 최종 지질/RNA 질량비를 포함할 수 있다.
RNAi 나노의학의 안전성 프로파일은 Alnylam Pharmaceuticals의 Barros 및 Gollob에 의해 검토되었다(예를 들어, 문헌[Advanced Drug Delivery Reviews 64(2012) 1730-1737] 참조). 안정적인 핵산 지질 입자(SNALP)는 4 가지 상이한 지질, 즉 낮은 pH에서 양이온성인 이온화 가능한 지질(DLinDMA), 중성 헬퍼 지질, 콜레스테롤, 및 확산성 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-지질로 구성된다. 입자는 직경이 대략 80 nm이고, 생리학적 pH에서 중성 전하이다. 제형화 동안, 이온화 가능한 지질은 입자 형성 동안 음이온성 RNA와 지질을 축합하는 작용을 한다. 점점 더 산성인 엔도좀 조건 하에 양으로 하전될 때, 이온화 가능한 지질은 또한 RNA의 세포질 내로의 방출을 가능하게 하는 엔도좀 막과 SNALP의 융합을 매개한다. PEG-지질은 입자를 안정화시키고, 제형화 동안 응집을 감소시키며, 후속적으로 약동학적 특성을 개선시키는 외부의 중성 친수성을 제공한다.
지금까지, RNA가 있는 SNALP 제형을 사용하여 2 가지 임상 프로그램을 개시하였다. Tekmira Pharmaceuticals는 최근에 상승된 LDL 콜레스테롤을 지니는 성인 출원인에서 SNALP-ApoB의 I상 단일 용량 연구를 완료하였다. ApoB는 간 및 공장에서 대부분 발현되며, VLDL 및 LDL의 어셈블리 및 분비에 필수적이다. 17 명의 대상체에 단일 용량의 SNALP-ApoB를 제공하였다(7 가지 용량 수준에 걸친 용량 상승). 간 독성의 증거는 없었다(전임상 연구에 기반한 잠재적 용량 제한 독성으로서 예상). 가장 높은 용량에서(둘 중) 한 명의 대상체는 면역계 자극과 일치되는 감기-유사 증상을 경험하였고, 시험을 끝내는 결정을 하였다.
Alnylam Pharmaceuticals는 상기 기재한 SNALP 기술을 이용하고, TTR 아밀로이드증(ATTR)을 치료하기 위해 돌연변이체와 야생형 TTR 둘 다의 간세포 생성을 표적화하는 유사하게 진보된 ALN-TTR01을 갖는다. 3 가지 ATTR 증후군이 기재되었다: 가족성 아밀로이드성 다발신경병증(FAP) 및 가족성 아밀로이드성 심근증(FAC)(둘 다 TTR에서의 상염색체 우성 돌연변이에 의해 야기됨); 및 야생형 TTR에 의해 야기되는 노인 전신성 아밀로이드증(SSA). ALN-TTR01의 위약 조절, 단일 용량 상승 I상 시험을 ATTR을 지니는 환자에서 최근에 완료하였다. ALN-TTR01을 0.01 mg/kg 내지 1.0 mg/kg(siRNA 기준)의 용량 범위 내에서 31 명의 환자(연구 약물에 의한 23 명 및 위약에 의한 8 명)에 대한 15 분 IV 주입으로서 투여하였다. 간 기능 시험에서 유의한 증가 없이 치료는 잘 용인되었다. 주입 관련 반응은 0.4 mg/kg 이상에서 23 명의 환자 중 3 명에서 언급되었고; 모두 주입 속도의 늦춤에 반응하였으며, 모두 연구를 계속하였다. 1 mg/kg의 가장 높은 용량에서 2 명의 환자에서 혈청 사이토카인 IL-6, IP-10 및 IL-1ra의 최소 및 일시적 상승이 언급되었다(전임상 및 NHP 연구로부터 예상되는 바와 같음). 혈청 TTR의 저하, ALN-TTR01의 예상된 약동학적 효과가 1 mg/kg에서 관찰되었다.
또 다른 구현예에서, SNALP는 양이온성 지질, DSPC, 콜레스테롤 및 PEG-지질을, 예를 들어 각각 40:10:40:10의 몰비로, 예를 들어 에탄올 중에 용해시킴으로써 제조될 수 있다(문헌[Semple et al., Nature Niotechnology, Volume 28 Number 2 February 2010, pp. 172-177] 참조). 지질 혼합물을 혼합하면서, 각각 30%(vol/vol) 및 6.1 mg/ml의 최종 에탄올 및 지질 농도로 수성 완충제(50 mM 시트르산염, pH 4)에 첨가하고, 2 분 동안 22℃에서 평형화되게 한 후 압출시켰다. 수화된 지질을 동적 광 산란 분석에 의해 결정될 때 70 nm 내지 90 nm의 소낭 직경이 수득될 때까지 Lipex Extruder(Northern Lipids)를 사용하여 22℃에서 2층 80 nm 기공 크기 필터(Nuclepore)를 통해 압출하였다. 이는 일반적으로 1 회 내지 3 회의 통과를 필요로 하였다. siRNA(30% 에탄올을 함유하는 50 mM 시트르산염, pH 4 수용액 중에 용해)를 혼합하면서 약 5 ml/분의 속도로 사전 평형화된(35℃) 소낭에 첨가하였다. 0.06(wt/wt)의 최종 표적 siRNA/지질 비에 도달한 후, 혼합물을 35℃에서 추가 30 분 동안 인큐베이션시켜 소낭 재조직화 및 siRNA의 캡슐화를 가능하게 하였다. 이어서, 에탄올을 제거하고, 투석 또는 접선 유동 정용여과에 의해 외부 완충제를 PBS로 대체하였다(155 mM NaCl, 3 mM Na2HPO4, 1 mM KH2PO4, pH 7.5). siRNA를 제어된 계단식 희석 방법 과정을 사용하여 SNALP에서 캡슐화하였다. KC2-SNALP의 지질 성분은 57.1:7.1:34.3:1.4의 몰비로 사용한 DLin-KC2-DMA(양이온성 지질), 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC; Avanti Polar Lipids), 합성 콜레스테롤(Sigma) 및 PEG-C-DMA였다. 로딩된 입자의 형성시에, SNALP를 PBS에 대해 투석하였고, 사용 전 0.2 μm 필터를 통해 멸균 여과시켰다. 평균 입자 크기는 75 nm 내지 85 nm였고, siRNA의 90% 내지 95%는 지질 입자 내에서 캡슐화되었다. 생체내 시험을 위해 사용한 제형 내 최종 siRNA/지질 비는 약 0.15(wt/wt)였다. 인자 VII siRNA를 함유하는 LNP-siRNA 시스템을 사용 직전에 멸균 PBS 중에서 적절한 농도로 희석시켰고, 제형을 총 10 ml/kg의 부피로 옆 꼬리 정맥을 통해 정맥내로 투여하였다. 이러한 방법 및 이들 전달 시스템은 본 발명의 핵산-표적화 시스템에 대해 추론될 수 있다.
다른 지질
다른 양이온성 지질, 예를 들어 아미노 지질 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노에틸-[1,3]-디옥솔란(DLin-KC2-DMA)은 예를 들어, siRNA와 유사한 핵산-표적화 시스템 또는 이의 성분 또는 이를 코딩하는 핵산 분자(들)를 캡슐화하기 위해 이용될 수 있으며(예를 들어, 문헌[Jayaraman, Angew. Chem. Int. Ed. 2012, 51, 8529 - 8533] 참조), 이런 이유로, 본 발명의 실시에 이용될 수 있다. 다음의 지질 조성물이 있는 사전 형성된 소낭이 고려될 수 있다: 대략 0.05(w/w)의 FVII siRNA/총 지질 비 및 각각 40/10/40/10의 몰비의 아미노 지질, 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 콜레스테롤 및(R)-2,3-비스(옥타데실옥시) 프로필-1-(메톡시 폴리(에틸렌 글리콜)2000)프로필카바메이트(PEG-지질). 70 nm 내지 90 nm 범위의 좁은 입자 크기 분포 및 0.11±0.04(n=56)의 낮은 다분산지수를 보장하기 위해, 입자를 가이드 RNA를 첨가하기 전에 80 nm 막을 통해 최대 3 회까지 압출시킬 수 있다. 매우 강력한 아미노 지질 16을 함유하는 입자가 사용될 수 있으며, 여기서 4 가지 지질 성분, 16, DSPC, 콜레스테롤 및 PEG-지질의 몰비(50/10/38.5/1.5)는 생체내 활성을 향상시키도록 추가로 최적화될 수 있다.
Michael S D Kormann 외(문헌["Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice: Nature Biotechnology, Volume:29, Pages: 154-157(2011)])는 RNA를 전달하기 위한 지질 외피의 사용을 기재한다. 지질 외피의 사용은 또한 본 발명에서 바람직하다.
또 다른 구현예에서, 지질은 본 발명의 핵산-표적화 시스템 또는 이의 성분(들) 또는 이를 코딩하는 핵산 분자(들)와 함께 제형화되어 지질 나노입자(LNP)를 형성할 수 있다. 지질은 DLin-KC2-DMA4, C12-200 및 공지질 디스테로일포스파티딜 콜린을 포함하지만 이들로 제한되지 않으며, 콜레스테롤, 및 PEG-DMG는 자발적 소낭 형성 절차를 사용하여 siRNA 대신 RNA-표적화 시스템을 이용하여 제형화될 수 있다(예를 들어, 문헌[Novobrantseva, Molecular Therapy-핵산s(2012) 1, e4; doi:10.1038/mtna.2011.3] 참조). 성분 몰비는 약 50/10/38.5/1.5(DLin-KC2-DMA 또는 C12-200/디스테로일포스파티딜 콜린/콜레스테롤/PEG-DMG)일 수 있다. 최종 지질:siRNA 중량비는 DLin-KC2-DMA 및 C12-200 지질 입자(LNP)의 경우에 각각 약 12:1 및 9:1일 수 있다. 제형은 90% 초과의 포획 효율을 지니는 약 80 nm의 평균 입자 직경을 가질 수 있다. 3 mg/kg 용량이 고려될 수 있다.
Tekmira는 LNP 및 LNP 제형의 다양한 양태와 관련된 미국 및 해외에서의 대략 95 개의 특허 패밀리의 포트폴리오를 가지며(예를 들어, 미국 특허 7,982,027; 7,799,565; 8,058,069; 8,283,333; 7,901,708; 7,745,651; 7,803,397; 8,101,741; 8,188,263; 7,915,399; 8,236,943 및 7,838,658 및 유럽 특허 1766035; 1519714; 1781593 및 1664316 참조), 이들 모두는 본 발명에 대해 사용되고/사용되거나 적합하게 될 수 있다.
핵산-표적화 시스템 또는 이의 성분 또는 이를 코딩하는 핵산 분자(들)는 단백질, 단백질 전구체, 또는 단백질 또는 단백질 전구체의 부분적으로 또는 완전히 가공된 형태를 인코딩할 수 있는 변형된 핵산 분자를 포함하는 조성물의 제형의 양태에 관한 미국 출원 공개 20130252281 및 20130245107 및 20130244279(Moderna Therapeutics 출원)에서 추가로 기재된 것과 같은 PLGA 미소구체에서 캡슐화되어 전달될 수 있다. 제형은 몰비 50:10:38.5:1.5 내지 3.0(양이온성 지질:융합생성 지질:콜레스테롤:PEG 지질)을 가질 수 있다. PEG 지질은 PEG-c-DOMG, PEG-DMG로부터 선택될 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 융합생성 지질은 DSPC일 수 있다. 또한, Schrum외의 미국 출원 공개 20120251618(Delivery and Formulation of Engineered Nucleic Acids)을 참조한다.
나노머 기술은 저분자량 소수성 약물, 펩티드 및 핵산 기반 치료제(플라스미드, siRNA, miRNA)를 포함하는 광범위한 치료제에 대한 생체이용성 난제를 다룬다. 기술이 명확한 이점을 입증한 특정 투여 경로는 경구 경로, 혈액 뇌 장벽을 가로지르는 전달, 고형 종양으로의 전달뿐만 아니라, 눈으로의 전달을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Mazza et al., 2013, ACS Nano. 2013 Feb 26;7(2):1016-26]; 문헌[Mazza et al., 2013, ACS Nano. 2013 Feb 26;7(2):1016-26]; [Uchegbu and Siew, 2013, J Pharm Sci. 102(2):305-10] 및 [Lalatsa et al., 2012, J Control Release. 2012 Jul 20; 161(2):523-36]을 참조한다.
미국 특허 공개 20050019923은 생활성 분자, 예를 들어 폴리뉴클레오티드 분자, 펩티드 및 폴리펩티드 및/또는 약제학적 작용제를 포유류 신체에 전달하기 위한 양이온성 덴드리머를 기재한다. 덴드리머는, 예를 들어 간, 비장, 폐, 신장 또는 심장(또는 심지어 뇌)으로의 생활성 분자의 전달을 표적화하는 데 적합하다. 덴드리머는 단순한 분지형 단량체 단위로부터 단계적 방식으로 제조된 합성 3-차원 거대분자이며, 이의 특성 및 기능성은 용이하게 제어되고 달라질 수 있다. 덴드리머는 다작용성 코어에 대한(합성에 대한 확산적 접근), 또는 다작용성 코어를 향한(합성에 대한 수렴적 접근) 빌딩 블록의 반복된 첨가로부터 합성되고, 빌딩 블록의 3차원 쉘의 각각의 첨가는 덴드리머의 더 고차 세대의 형성을 야기한다. 폴리프로필렌이민 덴드리머는 디아미노부탄 코어로부터 출발하며, 이것에 일차 아민으로의 아크릴로니트릴의 이중 마이클 첨가(Michael addition)에 의해 아미노기 수의 2 배가 첨가된 후, 니트릴이 수소화된다. 이는 아미노기의 배가를 초래한다. 폴리프로필렌이민 덴드리머는 100% 양성자화 가능한 질소 및 최대 64 개의 말단 아미노기를 함유한다(5세대, DAB 64). 양성자화 가능한 기는 보통 중성 pH에서 양성자를 수용할 수 있는 아민기이다. 유전자 전달제로서 덴드리머의 용도는 콘주게이팅 단위로서 각각 아민/아미드 또는 N--P(O2)S의 혼합물과 함께 폴리아미도아민 및 인 함유 화합물의 용도에 크게 집중되어 있는데 유전자 전달을 위한 더 낮은 세대 폴리프로필렌이민 덴드리머의 용도에 대해 보고한 연구는 없었다. 폴리프로필렌이민 덴드리머는 또한 주변 아미노기에 의해 화학적으로 변형될 때 약물 전달을 위해 그리고 게스트 분자의 캡슐화를 위해 pH 감수성 제어 방출 시스템으로서 연구되었다. 세포독성 및 DNA와 폴리프로필렌이민 덴드리머의 상호작용뿐만 아니라 DAB 64의 형질감염 효능이 또한 연구되었다.
미국 특허 공개 20050019923은 이전의 보고와 상반되게 양이온성 덴드리머, 예를 들어 폴리프로필렌이민 덴드리머가 유전 물질과 같은 생활성 분자의 표적화된 전달에서 사용하기 위한 적합한 특성, 예를 들어 특이적 표적화 및 낮은 독성을 나타낸다는 관찰에 기반한다. 추가적으로, 양이온성 덴드리머의 유도체는 또한 생활성 분자의 표적화된 전달을 위한 적합한 특성을 나타낸다. 또한, 미국 출원 공개 20080267903의 생활성 중합체를 참조하며, 이는 "양이온성 폴리아민 중합체 및 덴드리머 중합체를 포함하는 다양한 중합체가 항증식 활성을 갖는 것으로 나타나며, 따라서 신생물 및 종양과 같은 바람직하지 않은 세포 증식을 특징으로 하는 장애, 염증 장애(자가면역 장애를 포함함), 건선 및 아테롬성 동맥경화증의 치료에 유용할 수 있다. 중합체는 단독으로 활성제로서 또는 다른 치료제, 예를 들어 유전자 치료법을 위한 약물 분자 또는 핵산을 위한 전달 비히클로서 사용될 수 있다. 이와 같은 경우에, 중합체 자체의 고유 항종양 활성은 전달될 작용제의 활성을 보완할 수 있다"고 개시한다. 이들 특허 간행물의 개시 내용은 핵산-표적화 시스템(들) 또는 이의 성분(들) 또는 이를 코딩하는 핵산 분자(들)의 전달을 위한 본 발명의 교시와 함께 이용될 수 있다.
초하전(supercharged) 단백질
초하전 단백질은 대단히 높은 양 또는 음의 이론적 순전하를 지니는 조작된 또는 천연적으로 발생하는 단백질의 부류이며, 핵산-표적화 시스템(들) 또는 이의 성분(들) 또는 이를 코딩하는 핵산 분자(들)의 전달에 이용될 수 있다. 초음성으로 하전된 단백질과 초양성으로 하전된 단백질은 둘 모두 열적으로 또는 화학적으로 유도된 응집을 견뎌내는 현저한 능력을 나타낸다. 초양성으로 하전된 단백질은 또한 포유류 세포를 침투할 수 있다. 카고와 이들 단백질, 예를 들어 플라스미드 DNA, RNA 또는 다른 단백질의 회합은 시험관내와 생체내 둘 다에서 포유류 세포 내로 이들 거대분자의 기능적 전달을 가능하게 할 수 있다. David Liu 연구소는 2007년에 초하전 단백질의 생성 및 특성화를 보고하였다(문헌[Lawrence et al., 2007, Journal of the American Chemical Society 129, 10110-10112]).
포유류 세포 내로의 RNA 및 플라스미드 DNA의 비바이러스 전달은 연구와 치료 응용 둘 다에 대해 가치가 있다(문헌[Akinc et al., 2010, Nat. Biotech. 26, 561-569]). 정제된 +36 GFP 단백질(또는 다른 초양성으로 하전된 단백질)은 적절한 무혈청 배지에서 RNA와 혼합되고, 세포에 첨가 전 복합체화되게 한다. 이 단계에서 혈청의 포함은 초하전 단백질-RNA 복합체의 형성을 억제하고, 치료 효능을 감소시킨다. 다음의 프로토콜은 다양한 세포주에 대해 효과적이 되는 것으로 관찰되었다(문헌[McNaughton et al., 2009, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106, 6111-6116]) 그러나, 단백질 및 RNA의 용량을 변화시키는 파일럿 실험은 특정 세포주에 대하여 절차를 최적화하도록 수행되어야 한다.
(1) 처리 하루 전, 48-웰 플레이트에서 웰당 1 x 105 개 세포를 플레이팅함.
(2) 처리일에, 최종 농도 200 nM로 무혈청 배지에서 정제된 +36 GFP 단백질을 희석시킴. RNA를 50 nM의 최종 농도로 첨가함. 와류시켜 혼합하고 실온에서 10 분 동안 인큐베이션시킴.
(3) 인큐베이션 동안, 세포로부터 배지를 흡입하고, PBS로 1 회 세척함.
(4) +36 GFP 및 RNA의 인큐베이션 후에, 단백질-RNA 복합체를 세포에 첨가함.
(5) 37℃에서 4 시간 동안 복합체와 세포를 인큐베이션시킴.
(6) 인큐베이션 후에, 배지를 흡입하고, 20 U/ml 헤파린 PBS로 3 회 세척함. 활성에 대한 검정에 따라 추가 48 시간 또는 그 이상 동안 혈청-함유 배지와 세포를 인큐베이션시킴.
(7) 세포를 면역블롯, qPCR, 표현형 분석 또는 다른 적절한 방법에 의해 분석함.
David Liu 연구소는 다양한 세포에서 +36 GFP가 효과적인 플라스미드 전달 시약인 것으로 추가로 발견하였다. 플라스미드 DNA는 siRNA보다 더 큰 카고이기 때문에, 비례하여 더 많은 +36 GFP 단백질이 효과적으로 플라스미드와 복합체화하는 데 필요로 한다. 효과적인 플라스미드 전달을 위해, 출원인들은 인플루엔자 바이러스 혈구응집소 단백질로부터 유래된 공지된 엔도좀-파괴 펩티드인 C-말단의 HA2 펩티드 태그를 보유하는 +36 GFP의 변이체를 개발하였다. 다음의 프로토콜은 다양한 세포에서 효과적이었지만, 상기와 같이 플라스미드 DNA 및 초하전 단백질 용량이 특정 세포주 및 전달 응용분야를 위해 최적화되는 것이 권장된다.
(1) 처리 하루 전, 48-웰 플레이트에서 웰당 1 x 105 개를 플레이팅함.
(2) 처리일에, 최종 농도 2 mM로 무혈청 배지에서 정제된 þ36 GFP 단백질을 희석시킴. 1 ㎎의 플라스미드 DNA를 첨가함. 와류시켜 혼합하고 실온에서 10 분 동안 인큐베이션시킴.
(3) 인큐베이션 동안, 세포로부터 배지를 흡입하고, PBS로 1 회 세척함.
(4) þ36 GFP 및 플라스미드 DNA의 인큐베이션 후에, 단백질-DNA 복합체를 세포에 온건하게 첨가함.
(5) 37C에서 4 시간 동안 복합체와 세포를 인큐베이션시킴.
(6) 인큐베이션 후에, 배지를 흡입하고, PBS로 세척함. 혈청-함유 배지에서 세포를 인큐베이션시키고 추가 24 시간 내지 48 시간 동안 인큐베이션시킴.
(7) 적절하다면(예를 들어, 플라스미드-유도 유전자 발현에 의해) 플라스미드 전달을 분석함.
또한, 예를 들어, 문헌[McNaughton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106, 6111-6116(2009)]; [Cronican et al., ACS Chemical Biology 5, 747-752(2010)]; [Cronican et al., Chemistry & Biology 18, 833-838(2011)]; [Thompson et al., Methods in Enzymology 503, 293-319(2012)]; [Thompson, D.B., et al., Chemistry & Biology 19(7), 831-843(2012)]을 참조한다. 초하전된 단백질의 방법은 본 발명의 핵산-표적화 시스템의 전달을 위해 사용되고/사용되거나 이를 위해 적합하게 될 수 있다. Lui 박사 및 본 명세서의 교시와 함께 본 명세서의 문헌의 이들 시스템은 핵산-표적화 시스템(들) 또는 이의 성분(들) 또는 이를 코딩하는 핵산 분자(들)의 전달에 이용될 수 있다.
세포 투과성 펩티드(CPP)
또 다른 구현예에서, 세포 투과성 펩티드(CPP)가 CRISPR Cas 시스템의 전달을 위해 고려된다. CPP는 다양한 분자 카고(나노크기 입자로부터 작은 화학 분자 및 DNA의 큰 단편까지)의 세포 흡수를 용이하게 하는 짧은 펩티드이다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "카고"는 치료제, 진단 프로브, 펩티드, 핵산, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 플라스미드, 단백질, 나노입자를 포함하는 입자, 리포좀, 발색단, 소분자 및 방사성 물질로 구성된 군을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 양태에서, 카고는 또한 CRISPR Cas 시스템의 임의의 성분 또는 전체 기능성 CRISPR Cas 시스템을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 양태는 하기를 포함하는, 원하는 카고를 대상체로 전달하는 방법을 제공한다: (a) 본 발명의 세포 투과성 펩티드 및 원하는 카고를 포함하는 복합체를 제조하는 단계, 및 (b) 대상체에게 복합체를 경구, 관절내, 복강내, 척추강내, 동맥내, 비강내, 뇌실내, 피하내, 근육내, 정맥내, 피부, 직장내, 또는 국소투여하는 단계. 카고는 공유 결합을 통한 화학적 결합 또는 비-공유 상호작용을 통해 펩티드와 회합된다.
CPP의 기능은 카고를 세포로 전달하는 것이며, 살아있는 포유류 세포의 엔도솜으로 전달된 카고의 엔도시토시스를 통해 일반적으로 발생하는 공정이다. 세포-침투성 펩티드는 상이한 크기, 아미노산 서열, 및 전하를 가지지만, 모든 CPP가, 혈장 막을 전위시키고 세포질 또는 세포소기관으로 다양한 분자 카고의 전달을 용이하게 하는 능력인 하나의 별개 특징을 갖는다. CPP 전위는 3 개의 주요 엔트리 메커니즘으로 분류될 수 있다: 막에서의 직접 투과, 엔도시토시스-매개 엔트리, 및 일시적 구조의 형성을 통한 전위. CPP는 암을 포함하는 상이한 질병의 치료에서 약물 전달제, 바이러스 억제제뿐만 아니라, 세포 표지화를 위한 조영제로서 의약에서의 많은 적용이 발견되었다. 후자의 예는 GFP에 대한 담체, MRI 조영제, 또는 양자점으로서 작용하는 것을 포함한다. CPP는 연구 및 의약에서의 용도에서 시험관내 및 생체내 전달 벡터로서 훌륭한 잠재성을 보유한다. CPP는 통상적으로 리신 또는 아르기닌과 같은 상대적으로 풍부한 양전하 아미노산을 함유하거나 극성/전하 아미노산 및 비-극성 소수성 아미노산의 교대 패턴을 함유하는 서열을 갖는 아미노산 조성물을 갖는다. 이들 2 가지 유형의 구조는 각각 다가이온성 또는 양친매성으로서 지칭된다. CPP의 세번째 부류는 낮은 순 전하를 갖는 극성 잔기만을 함유하는 소수성 펩티드이거나, 세포 흡수에 결정적인 소수성 아미노산 그룹을 갖는다. 발견된 초기 CPP 중 하나는 배양에서 많은 세포 유형에 의해 배지 주위로부터 효율적으로 취득되어 발견되는 인간 면역결핍 바이러스 1(HIV-1)로부터의 트랜스-활성화 전사 활성화제(Tat)였다. 그 이후부터, 많은 공지된 CPP는 상당히 확장되었으며 더 효과적인 단백질 형질도입 특성을 갖는 소분자 합성 유사체가 생성되었다. CPP는 페너트라틴, Tat(48-60), 트란스포르탄, 및(R-AhX-R4)(Ahx=아미노헥사노일)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
미국 특허 8,372,951은 높은 세포-투과 효율 및 낮은 독성을 나타내는 호산구 양이온성 단백질(ECP)으로부터 유래된 CPP를 제공한다. 척추동물 대상체로 CPP를 이의 카고와 함께 전달하는 양태가 또한 제공된다. CPP 및 이의 전달의 추가 양태는 미국 특허 8,575,305; 8;614,194 및 8,044,019에 기재되어 있다. CPP는 CRISPR-Cas 시스템 또는 이의 성분을 전달하기 위해 사용될 수 있다. CPP가 CRISPR-Cas 시스템 또는 이의 성분을 전달하기 위해 이용될 수 있는 것은 또한 본 명세서에 전체가 참조로서 포함된, Suresh Ramakrishna, Abu-Bonsrah Kwaku Dad, Jagadish Beloor외의 문헌["Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA", Gees.nome R 2014 Apr 2. [인쇄 전 전자논문상태]]에서 제공되며, 여기에서 CPP-컨쥬게이트된 재조합 Cas9 단백질 및 CPP-복합체화 가이드 RNA를 이용한 치료가 인간 세포주에서의 내인성 유전자 파괴를 이끌어냄이 입증되었다. 이 논문에서 Cas9 단백질은 티오에스테르 결합을 통해 CPP에 컨쥬게이트되는 반면, 가이드 RNA는 CPP와 복합체화되어, 축합된 양으로 하전된 입자를 형성한다. 변형된 Cas9 및 가이드 RNA와 함께, 배아 줄기 세포, 피부 섬유아세포, HEK293T 세포, HeLa 세포, 및 배아 암종 세포를 포함하는 인간 세포의 동시 및 순차적 치료가 플라스미드 형질감염에 비하여 감소된 표적외 돌연변이로 효율적인 유전자 파괴를 이끌어냄을 나타내었다.
이식 가능한 장치
또 다른 구현예에서, 핵산-표적화 시스템 또는 이의 성분(들) 또는 이를 코딩하는 핵산 분자(들)의 전달을 위해 이식 가능한 장치가 또한 고려된다. 예를 들어, 미국 특허 공개 20110195123은 국소적으로 그리고 연장된 기간 동안 약물을 용리하는 이식 가능한 의료 장치(이와 같은 장치의 몇 가지 유형, 실행의 처리 방식 및 이식 방법을 포함함)가 제공됨을 개시한다. 장치는 중합체 기질, 예를 들어 매트릭스, 예를 들어 장치 몸체로서 사용되는 매트릭스, 및 약물, 및 일부 경우에 추가적인 스캐폴딩 재료, 예를 들어 금속 또는 추가적인 중합체, 및 가시성 및 이미징을 향상시키는 재료를 포함한다. 이식 가능한 전달 장치는 국소적인, 그리고 연장된 기간에 걸친 방출을 제공하는 데 유리할 수 있으며, 여기서 약물은, 예를 들어 종양, 염증, 변성과 같은 병에 걸린 영역의 세포외 매트릭스(ECM)로 직접 방출되거나, 증상 목표를 위해, 또는 손상된 평활근 세포에 또는 예방을 위해 방출된다. 한 종류의 약물은 상기 개시된 바와 같은 RNA이며, 이러한 시스템은 본 발명의 핵산-표적화 시스템에 사용될 수 있고/있거나 적합하게 될 수 있다. 일부 구현예에서 이식 방식은 근접 치료법 및 바늘 생검을 포함하는 다른 치료를 위해 오늘날 개발되고 사용되는 기존의 이식 절차이다. 이와 같은 경우에, 본 발명에 기재된 새로운 이식물의 치수는 본래의 이식물과 유사하다. 전형적으로 소수의 장치는 동일한 치료 절차 동안 이식된다.
미국 특허 공개 20110195123은, 복강과 같은 강에 적용 가능한 시스템을 포함하는 약물 전달 이식 가능한 또는 삽입 가능한 시스템 및/또는 임의의 다른 유형의 투여를 제공하며, 여기서, 예를 들어 선택적으로 매트릭스일 수 있는 생체안정성 및/또는 분해가능 및/또는 생체흡수성 중합체성 기질을 포함하는 약물 전달 시스템은 고정 또는 부착되지 않는다. 용어 "삽입"은 또한 이식을 포함하는 것을 주목하여야 한다. 약물 전달 시스템은 바람직하게 미국 특허 공개 20110195123에 기재된 바와 같은 "로더(Loder)"로서 실행된다.
중합체 또는 복수의 중합체는 생체적합성이며, 제어된 속도로 작용제를 방출시킬 수 있는 작용제 및/또는 복수의 작용제를 혼입하며, 중합체성 기질, 예를 들어 일부 구현예에서 매트릭스의 총 부피는, 선택적으로 그리고 바람직하게는 작용제의 치료 수준이 도달되게 하는 최대 부피 이하이다. 비제한적 예로서, 이와 같은 부피는 작용제 로드를 위한 부피에 의해 필요한 바와 같은 바람직하게는 0.1 ㎥ 내지 1000 ㎣ 범위 내에 있다. 로더는, 예를 들어 크기가 기능성에 의해 결정되는 장치, 예를 들어 제한 없이, 무릎 관절, 자궁내 또는 자궁경부 링 등과 함께 혼입될 때, 선택적으로 더 클 수 있다.
(조성물을 전달하기 위한) 약물 전달 시스템은 바람직하게 일부 구현예에서 분해성 중합체를 이용하도록 설계되거나(주요 방출 메카니즘은 벌크 침식(bulk erosion)임); 또는 일부 구현예에서, 비분해성 또는 서서히 분해되는 중합체가 사용되며(주요 방출 메카니즘은 벌크 침식보다는 확산임), 따라서 외부는 막으로서 기능하고, 내부는 약물 저장소로서 기능하는데, 이는 연장된 기간(예를 들어, 약 1 주 내지 약 수 개월) 동안 주변에 의해 실제로 영향받지 않는다. 상이한 방출 메카니즘을 지니는 상이한 중합체의 조합이 또한 선택적으로 사용될 수 있다. 표면에서 농도 기울기는 바람직하게 총 약물 방출 기간의 상당한 기간 동안 효과적으로 일정하게 유지되고, 따라서 확산 속도는 효과적으로 일정하다("제로 방식" 확신으로 지칭됨). 용어 "일정한"은 더 낮은 치료적 유효성의 역치 초과로 바람직하게 유지되지만, 여전히 선택적으로 초기 버스트를 특징으로 하고/하거나 변동할 수 있는, 예를 들어 특정 정도로 증가 및 감소할 수 있는 확산 속도를 의미한다. 확산 속도는 바람직하게 연장된 기간 동안 이렇게 유지되며, 치료적으로 효과적인 기간, 예를 들어 효과적인 침묵화 기간을 최적화하기 위해 특정 수준으로 일정한 것으로 고려될 수 있다.
약물 전달 시스템은 선택적으로 그리고 바람직하게는 성질이 화학물질이든 대상체의 체내의 효소 및 다른 인자로부터의 공격에 기인하든, 분해로부터 뉴클레오티드 기반 치료제를 보호하도록 설계된다.
미국 특허 공개 20110195123의 약물 전달 시스템은 장치의 이식 시 및/또는 이식 후에, 활성화 및/또는 가속화/감속화의 비침습적 및/또는 최소 침습적 방법에 의해 작동되는 감지 및/또는 활성화 기기와 선택적으로 연동되며, 예를 들어 선택적으로 제한되는 것은 아니지만, 열적인 가열 및 냉각, 레이저 빔 및 집속 초음파 및/또는 RF(무선주파수)를 포함하는 초음파 방법 또는 장치를 포함한다.
미국 특허 공개 20110195123의 일부 구현예에 따르면, 국소 전달을 위한 부위는 선택적으로 종양을 포함하는 세포의 고도 비정상 증식, 및 억제된 아폽토시스, 자가면역질병 상태를 포함하는 활성 및 또는 만성 염증 및 감염, 근육 및 신경 조직을 포함하는 변성 조직, 만성 통증, 변성 부위, 및 뼈 골절 위치 및 조직 재생의 향상을 위한 다른 상처 위치, 및 손상된 심근, 평활근 및 횡문근을 특징으로 하는 표적 부위를 포함할 수 있다.
조성물의 이식을 위한 부위, 또는 표적 부위는 바람직하게 표적화된 국소 전달에 충분히 작은 반경, 면적 및/또는 부피를 특징으로 한다. 예를 들어, 표적 부위는 선택적으로 약 0.1 mm 내지 약 5 cm 범위의 직경을 갖는다.
표적 부위의 위치는 바람직하게 최대 치료 효능에 대해 선택된다. 예를 들어, 약물 전달 시스템의 조성물(선택적으로 상기 기재한 바와 같은 이식을 위한 장치와 함께)은 선택적으로 그리고 바람직하게는 종양 환경, 또는 이들의 연관된 혈액 공급 내에서 또는 이에 근접하여 이식된다.
예를 들어 조성물은(선택적으로 장치와 함께) 선택적으로 췌장, 전립선, 유방, 간 내에 또는 그에 근접하여, 니플을 통해, 혈관계 내 등에 이식된다.
표적 위치는(선택적으로 체내의 임의의 부위가 로더를 이식하는 데 적합할 수 있기 때문에 단지 비제한적 예로서): 1. 기저핵, 백질 및 회백질에서 파킨슨병 또는 알츠하이머병에서와 같은 변성 부위의 뇌; 2. 근위축성 측삭경화증(ALS)의 경우에서와 같은 척추; 3. HPV 감염을 예방하기 위한 자궁경부; 4. 활성 및 만성 염증 관절; 5. 건선의 경우에서와 같은 진피; 6. 진통 효과를 위한 교감 및 감각 신경 부위; 7. 골내이식; 8. 급성 및 만성 감염 부위; 9. 질내; 10. 내이--청각기관, 내이의 미로, 전정계; 11. 기관내; 12. 심장내; 관상동맥, 심외막; 13. 방광; 14. 담도계; 15. 신장, 간, 비장을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 실질세포; 16. 림프절; 17. 침샘; 18. 치과용 수지; 19. 관절내(관절 내로); 20. 안내; 21. 뇌조직; 22. 뇌실; 23. 복강을 포함하는 강(예를 들어, 제한되는 것은 아니지만, 난소암); 24. 식도내 및 25. 직장내를 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 구성된 군으로부터 선택적으로 선택된다.
선택적으로 시스템의 삽입(예를 들어, 조성물을 함유하는 장치)은 표적 부위의 및 이러한 부위 부근의, 국소 pH 및/또는 온도 및/또는 ECM 내 약물의 확산 및/또는 약물 역학에 영향을 미치는 다른 생물학적 인자에 영향을 미치도록 하는 표적 부위 및 해당 부위 부근에서 ECM에 대한 물질의 주사와 연관된다.
선택적으로, 일부 구현예에 따르면, 상기 작용제의 방출은 삽입 전 및/또는 삽입 시 및/또는 삽입 후, 레이저빔, 조사, 열적 가열 및 냉각, 및 집속 초음파 및/또는 RF(무선주파수)를 포함하는 초음파 방법 또는 장치 및 화학적 활성화제를 포함하는 활성화 및/또는 가속화/감속화의 비침습적 및/또는 최소 침습적 및/또는 그 밖의 방법에 의해 작동되는 감지 및/또는 활성화 기기와 연관될 수 있었다.
미국 특허 공개 20110195123의 다른 구현예에 따르면, 약물은 바람직하게, 예를 들어 이하에 기재되는 바와 같이 유방, 췌장, 뇌, 신장, 방광, 폐 및 전립선에서 국소화된 암 경우를 위한 RNA를 포함한다. RNAi로 예시되지만, 약물이 로더 기질, 예를 들어 매트릭스와 함께 캡슐화될 수 있는 한, 다수 약물이 로더에서 캡슐화되어 적용 가능하고, 본 발명과 함께 사용될 수 있으며, 이러한 시스템이 본 발명의 핵산-표적화 시스템을 전달하는 데 사용되고/사용되거나 그에 적합하게 될 수 있다.
구체적 적용의 또 다른 예로서, 신경 및 근육 변성 질병은 비정상 유전자 발현에 기인하여 발생한다. RNA의 국소 전달은 이와 같은 비정상 유전자 발현을 방해하는 치료적 특성을 가질 수 있다. 작은 약물 및 거대분자를 포함하는 아폽토시스방지, 염증방지 및 변성방지 약물의 국소 전달은 또한 선택적으로 치료적일 수 있다. 이와 같은 경우에, 로더는 일정한 속도로 및/또는 별도로 이식되는 전용 장치를 통해 연장된 방출을 위해 적용된다. 이것 모두는 본 발명의 핵산-표적화 시스템 에 사용될 수 있고/있거나 적합하게 될 수 있다.
구체적 적용의 또 다른 예로서, 정신과적 및 인지 장애가 유전자 변형자를 이용하여 치료된다. 유전자 녹다운은 치료적 선택사항이다. 중추 신경계 부위에 작용제를 국소적으로 전달하는 로더는 정신병, 양극성 질병, 신경성 장애 및 행동 병폐를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 정신과적 및 인지 장애에 대한 치료적 선택사항이다. 로더는 또한 특정 뇌 부위에 이식시 작은 약물 및 거대분자를 포함하는 약물을 국소적으로 전달할 수 있었다. 이것 모두는 본 발명의 핵산-표적화 시스템 에 사용될 수 있고/있거나 적합하게 될 수 있다.
구체적 적용의 또 다른 예로서, 국소 부위에서 선천성 및/또는 적응성 면역 매개체의 침묵화는 기관 이식 거부를 예방할 수 있다. 이식된 기관 및/또는 이식된 부위에 이식된 로더를 이용한 RNA 및 면역조절 시약의 국소 전달은 이식 기관에 대해 활성화된 CD8과 같은 면역 세포를 퇴치함으로써 국소 면역 억제를 제공한다. 이것 모두는 본 발명의 핵산-표적화 시스템에 사용될 수 있고/있거나 적합하게 될 수 있다.
구체적 적용의 또 다른 예로서, VEGF 및 안지오제닌 등을 포함하는 혈관 성장 인자는 신혈관형성에 필수적이다. 인자, 펩티드, 펩티드모방체의 국소 전달 또는 이들의 억제제의 억제는 중요한 치료적 양식이며; 억제제의 침묵화 및 로더를 이용한 혈관형성을 자극하는 인자, 펩티드, 거대분자 및 작은 약물의 국소 전달은 말초, 전신 및 심혈관 질병에 대하여 치료적이다.
이식과 같은 삽입 방법은 선택적으로 다른 유형의 조직 이식을 위해 및/또는 삽입을 위해 및/또는 조직 샘플링을 위해 선택적으로 변형 없이, 또는 대안적으로 선택적으로 이와 같은 방법에서 주요하지 않은 변형만을 이용하여 이전에 사용될 수 있다. 이와 같은 방법은 선택적으로 근접치료 방법, 생검, 초음파와 함께 및/또는 초음파 없이 내시경, 예를 들어 ERCP, 뇌 조직 내로의 정위적 방법, 관절, 복부 기관, 방광벽 및 체강 내로의 복강경의 이식을 포함하는 복강경검사를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 논의된 이식 가능한 장치 기술이 본 명세서의 교시와 함께 이용될 수 있으며, 이에 따라 본 개시 내용 및 당업계의 지식에 의해, CRISPR-Cas 시스템 또는 이의 성분 또는 이의 핵산 분자 또는 성분의 인코딩 또는 제공이 이식 가능한 장치를 통해 전달될 수 있다.
환자-특이적 스크리닝 방법
RNA, 예를 들어 트리뉴클레오티드 반복부를 표적화하는 핵산-표적화 시스템을 사용하여 이와 같은 반복부의 존재에 대하여 환자 또는 환자 샘플을 스크리닝할 수 있다. 반복부는 핵산-표적화 시스템의 RNA의 표적일 수 있으며, 핵산-표적화 시스템에 의한 이로의 결합이 존재한다면, 결합을 검출하여, 이와 같은 반복부가 존재하는 것을 나타낼 수 있다. 따라서, 핵산-표적화 시스템을 사용하여 환자 또는 환자 샘플을 반복부의 존재에 대하여 스크리닝할 수 있다. 그 다음, 환자에게 질환을 다루기 위한 적합한 화합물(들)을 투여할 수 있거나; 또는 이에 결합하고 삽입, 결실 또는 돌연변이를 야기하며, 질환을 완화시키는 핵산-표적화 시스템을 투여할 수 있다.
본 발명은 핵산을 사용하여 표적 RNA 서열에 결합한다.
CRISPR 이펙터 단백질 mRNA 및 가이드 RNA
CRISPR 이펙터 단백질 mRNA 및 가이드 RNA는 또한 별도로 전달될 수 있다. CRISPR 이펙터 단백질 mRNA는 가이드 RNA 전에 전달되어 CRISPR 이펙터 단백질이 발현될 시간을 제공할 수 있다. CRISPR 이펙터 단백질 mRNA는 가이드 RNA 투여 1 시간 내지 12 시간(바람직하게는, 약 2 시간 내지 6 시간) 전에 투여될 수 있다.
대안적으로, CRISPR 이펙터 단백질 mRNA 및 가이드 RNA는 함께 투여될 수 있다. 유리하게, 가이드 RNA의 제2 부스터 용량은 CRISPR 이펙터 단백질 mRNA + 가이드 RNA의 초기 투여 1 시간 내지 12 시간(바람직하게는, 약 2 시간 내지 6 시간) 이후에 투여될 수 있다.
본 발명의 CRISPR 이펙터 단백질, 즉 C2c2 이펙터 단백질은 때때로 본 명세서에서 CRISPR 효소로 지칭된다. 이펙터 단백질은 효소를 기반으로 하거나 효소로부터 유래되어, 따라서 용어 '이펙터 단백질'은 일부 구현예에서 확실히 '효소'를 포함하는 것으로 이해될 것이다. 그러나, 또한 이펙터 단백질은, 일부 구현예에서 요구되는 바와 같이, DNA 또는 RNA 결합을 가질 수 있지만, 반드시 데드-Cas 이펙터 단백질 기능을 포함하여 절단 또는 닉킹, 활성을 필요로 하는 것은 아님을 이해할 것이다.
CRISPR 이펙터 단백질 mRNA 및/또는 가이드 RNA의 추가적인 투여는 가장 효율적인 수준의 게놈 변형을 달성하기 위해 유용할 수 있다. 일부 구현예에서, 표현형 변경은 특히 치료 방법에서, 바람직하게는 표현형의 교정 또는 변경을 위해 수복 주형이 제공된 경우에서, 바람직하게는 유전적 질병이 표적화된 경우 게놈 변형의 결과이다.
일부 구현예에서, 표적화될 수 있는 질병은 질병-유발 스플라이스 결함과 연관이 있는 것들을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포 표적은, 조혈 줄기/선조 세포(CD34+); 인간 T 세포; 및 눈(망막 세포)(예를 들어, 광수용체 전구 세포)를 포함한다.
일부 구현예에서, 유전자 표적은, 인간 베타 글로빈 - HBB((내인성 주형으로서 밀접하게 관련된 HBD 유전자를 사용하여 )유전자-전환을 자극시키는 것을 포함하는, 겸상 적혈구 빈혈증의 치료를 위함); CD3(T-세포); 및 CEP920 - 망막(눈)을 포함한다.
일부 구현예에서, 질병 표적은 또한, 암; 겸상 적혈구 빈혈증(점 돌연변이를 기반으로 함); HIV; 베타-지중해빈혈(Beta-Thalassemia); 및 안과질환 또는 안 질환(예를 들어, 레베르 선천성 흑암시(Leber Congenital Amaurosis; LCA)-유발 스플라이스 결함을 포함한다.
일부 구현예에서, 전달 방법은, 효소-가이드 복합체(리보뉴클레오단백질)의 양이온 지질 매개 "직접" 전달 및 플라스미드 DNA의 전기천공을 포함한다.
본 발명의 방법은, dsODN 또는 ssODN일 수 있는 수복 주형과 같은 주형의 전달을 추가로 포함할 수 있으며, 하기를 참조한다. 주형의 전달은 임의의 또는 모든 CRISPR 이펙터 단백질 또는 가이드의 전달과 함께 또는 이와 분리된 전달을 통해 그리고 동일하거나 상이한 전달 메커니즘을 통한 것일 수 있다. 일부 구현예에서, 주형은 가이드와 함께, 바람직하게는 또한 CRISPR 이펙터 단백질과 함께 전달되는 것이 바람직하다. 예는, AAV 벡터일 수 있다.
본 발명의 방법은 (a) 상기 이중 가닥 손상에 의해 형성된 오버행에 대해 상보적인 오버행을 포함하는 이중-가닥 올리고데옥시뉴클레오티드(dsODN)를 세포로 전달하는 것으로서, 상기 dsODN은 관심 유전자 내로 통합되는 것; 또는 (b) 단일-가닥 올리고데옥시뉴클레오티드(ssODN)를 세포로 전달하는 것으로서, 상기 ssODN은 상기 이중 가닥 손상의 상동 직접 수복을 위한 주형으로서 작용하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 본 발병의 방법은 개인에서 질병의 예방 또는 치료를 위한 것일 수 있으며, 선택적으로 상기 질병은 상기 관심 유전자좌에서의 결함에 의해 유발된다. 본 발명의 방법은 개인에서 생체내에서 또는 개인으로부터 취한 세포 상에서 생체외에서 수행될 수 있으며, 여기서 선택적으로 상기 세포는 개인에게 되돌려진다.
독성 및 표적외 효과의 최소화를 위해, 전달되는 CRISPR 이펙터 단백질 mRNA 및 가이드 RNA의 농도를 제어하는 것이 중요할 것이다. CRISPR 이펙터 단백질 mRNA 및 가이드 RNA의 최적 농도는 세포 또는 동물 모델에서 상이한 농도를 시험하고, 잠재적인 표적외 게놈 유전자좌에서 변형 정도를 분석하는 딥 시퀀싱을 사용함으로써 결정될 수 있다. 예를 들어, 인간 게놈의 EMX1 유전자에서 5'-GAGTCCGAGCAGAAGAAGAA-3'를 표적화하는 가이드 서열에 있어서, 딥 시퀀싱을 사용하여 2 가지 표적외 유전자좌, 즉 1: 5'-GAGTCCTAGCAGGAGAAGAA-3' 및 2: 5'-GAGTCTAAGCAGAAGAAGAA-3'에서의 변형 수준을 평가할 수 있다. 표적외 변형의 수준을 최소화하면서 표적상 변형의 가장 높은 수준을 제공하는 농도가 생체내 전달을 위하여 선택되어야 한다.
유도성 시스템
일부 구현예에서, CRISPR 이펙터 단백질은 유도성 시스템의 성분을 형성할 수 있다. 시스템의 유도성 성질은 에너지 형태를 사용하여 유전자 편집 또는 유전자 발현의 시공간적 제어를 가능하게 할 것이다. 에너지의 형태는 이에 한정되지 않지만, 전자기 방사, 음향 에너지, 화학 에너지 및 열 에너지를 포함할 수 있다. 유도성 시스템의 예는 테트라사이클린 유도성 프로모터(Tet-온 또는 Tet-오프), 소분자 2-하이브리드 전사 활성화 시스템(FKBP, ABA 등), 또는 광 유도성 시스템(피토크롬, LOV 도메인, 또는 크립토크롬)을 포함한다. 일 구현예에서, CRISPR 이펙터 단백질은 서열-특이적 방식으로 전사 활성에서의 변화를 유도하기 위한 광 유도성 전사 이펙터(LITE)의 일부일 수 있다. 광의 성분은 CRISPR 이펙터 단백질, 광-반응성 시토크롬 이형이량체(예를 들어, 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 유래), 및 전사 활성화/억제 도메인을 포함할 수 있다. 유도성 DNA 결합 단백질 및 이의 사용을 위한 방법의 추가의 예는 미국 특허 제61/736465 호, 미국 특허 제61/721,283호 및 WO 2014018423에서 제공되며, 이는 전체가 참고로 본 명세서에 포함된다.
CRISPR Cas 시스템의 예시적인 방법
본 발명은 비-천연 발생 또는 조작된 조성물, 또는 상기 조성물의 성분을 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 조성물의 성분을 인코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 또는 전달 시스템의, 생체내, 생체외 또는 시험관내에서 표적 세포를 변형시키는 데 있어서의 이용을 제공하며, 세포를 변경시키는 방식으로 수행되어, 일단 변형되면, CRISPR 변형된 세포의 자손 또는 세포주가 변경된 표현형을 보유하도록 한다. 변형된 세포 및 자손은, 원하는 세포 유형으로의 CRISPR 시스템의 생체외 또는 생체내 적용을 갖는, 식물 또는 동물과 같은 다세포 생물의 일부일 수 있다. CRISPR 발명은 치료 처리 방법일 수 있다. 치료 처리 방법은 유전자 또는 게놈 편집 또는 유전자 치료법을 포함할 수 있다.
CRISPR Cas 시스템 또는 복합체(예를 들어, C2c2-RNA 복합체)를 이용한 표적 변형
일 양태에서, 본 발명은, 생체내, 생체외 또는 시험관내일 수 있는 진핵 세포 내에서 표적 폴리뉴클레오티드를 변형하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 인간 또는 비-인간 동물로부터 세포 또는 세포 집단을 샘플링하는 단계 및 세포 또는 세포들을 변형하는 단계를 포함한다. 배양은 생체외 임의의 단계에서 일어날 수 있다. 세포 또는 세포들은 비-인간 동물 또는 식물 내로 재도입될 수 있다. 재도입된 세포들의 경우, 세포는 줄기 세포인 것이 특히 바람직하다.
일부 구현예에서, CRISPR 복합체가 표적 폴리뉴클레오티드에 결합하도록 허용하는 것을 포함하여, 상기 표적 폴리뉴클레오티드를 절단시켜, 이에 의해 표적 폴리뉴클레오티드를 변형시키고, 여기서 CRISPR 복합체는 상기 표적 폴리뉴클레오티드 내에서 표적 서열에 혼성화된 또는 혼성화될 수 있는 가이드 서열과 복합체화된 CRISPR 이펙터 단백질을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 진핵 세포에서 폴리뉴클레오티드의 발현을 변형시키는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 방법은 CRISPR 복합체가 폴리뉴클레오티드에 결합하도록 허용하는 것을 포함하여, 상기 결합이 상기 폴리뉴클레오티드의 증가된 또는 감소된 발현을 결과로서 초래하도록 하며; 여기서 CRISPR 복합체는 상기 폴리뉴클레오티드 내에서 표적 서열에 혼성화된 또는 혼성화될 수 있는 가이드 서열과 복합체화된 CRISPR 이펙터 단백질을 포함한다. 유사한 고려사항 및 조건이 표적 폴리뉴클레오티드를 변형시키는 방법에 대해 상기와 같이 적용된다. 실제로, 이들 샘플링, 배양 및 재도입 옵션은 본 발명의 일 양태에 걸쳐 적용된다.
실제로, 본 발명이 임의의 양태에서, CRISPR 복합체는 표적 서열에 혼성화된 또는 혼성화될 수 있는 가이드 서열과 복합체화된 CRISPR 이펙터 단백질을 포함할 수 있다. 유사한 고려사항 및 조건이 표적 폴리뉴클레오티드를 변형시키는 방법에 대해 상기와 같이 적용된다.
따라서, 본 명세서에서 설명된 임의의 비-천연 발생 CRISPR 이펙터 단백질은 하나 이상의 변형을 포함하고, 이로 인해 이펙터 단백질은 소정의 개선된 능력을 갖는다. 특히, 임의의 이펙터 단백질은 가이드 RNA와의 CRISPR 복합체를 형성할 수 있다. 그러한 복합체가 형성된 경우, 가이드 RNA는 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 결합할 수 있고, 이펙터 단백질은 표적 유전자좌를 변형시킬 수 있다. 추가적으로, CRISPR 복합체 내 이펙터 단백질은 비변형된 효소/이펙터 단백질에 비하여, 하나 이상의 표적외 유전자좌를 변형시키는 감소된 능력을 갖는다.
추가적으로, 본 명세서에서 설명된 변형된 CRISPR 효소는 효소를 포괄하고, 이로 인해 CRISPR 복합체 내에서 이펙터 단백질은 비변형된 효소/이펙터 단백질에 비하여, 하나 이상의 표적 유전자좌를 변형시킬 수 있는 증가된 능력을 갖는다. 그러한 작용은 개별적으로 제공될 수 있거나 하나 이상의 표적외 유전자좌를 변형시키는 감소된 능력인 상기 설명된 작용과 함께 제공될 수 있다. 임의의 그러한 이펙터 단백질에는 본 명세서에서 설명된 바와 같이 CRISPR 이펙터 단백질에 대한 추가의 임의의 변형, 예를 들어 하나 이상의 연관된 상동성 기능성 도메인에 의해 제공된 임의의 활성과 조합된, 뉴클레아제 활성 등을 감소시키는 임의의 추가의 돌연변이가 제공될 수 있다.
본 발명의 유리한 구현예에서, 변형된 CRISPR 이펙터 단백질은 비변형된 효소/이펙터 단백질에 비하여 하나 이상의 표적외 유전자좌를 변형시키는 감소된 능력 및 비변형된 효소/이펙터 단백질에 비하여 하나 이상의 표적외 유전자좌를 변형시키는 증가된 능력이 있다. 이펙터 단백질에 대한 추가의 변형과 조합하여, 현저히 증진된 특이성이 달성될 수 있다. 예를 들어, 그러한 유리한 구현예의 하나 이상의 추가의 돌연변이와의 조합이 제공되며, 여기서 하나 이상의 추가적인 돌연변이는 하나 이상의 촉매적으로 활성인 도메인이다. 그러한 이펙터 단백질에서, 증진된 특이성은 이펙터 단백질 활성 면에서 개선된 특이성으로 인해 달성될 수 있다.
본 명세서에 기재된 변형된 CRISPR 이펙터 단백질로 설계 제작될 수 있는 추가적인 기능은 다음을 포함한다. 1. 단백질 3 차 또는 2 차 구조에 영향을 주지 않으면서 RNA:단백질 상호 작용을 방해하는 변형된 CRISPR 이펙터 단백질. 이것에는 RNA:RNA 듀플렉스의 임의의 부분과 접촉하는 잔기가 포함된다. 2. RNA 결합(표적내 또는 표적외)에 대한 반응으로의 뉴클레아제 절단에 필수적인 형태로 C2c2를 유지하는 단백질 내 상호 작용을 약화시키는 변형된 CRISPR 이펙터 단백질. 예를 들어: HNH 도메인의 뉴클레아제 형태를 약간 저해하지만 여전히 가능하게 하는 변형(분리되기 쉬운 포스페이트에 위치된). 3. RNA 결합(표적내 또는 표적외)에 대한 반응으로의 뉴클레아제 활성을 저해하는 형태로 C2c2를 유지하는 단백질 내 상호 작용을 강화시키는 변형된 CRISPR 이펙터 단백질. 예를 들어, 분리되기 쉬운 포스페이트로부터 멀리 떨어져 있는 형태로 HNH 도메인을 안정화시키는 변형. 임의의 이러한 추가적인 기능 향상은 본 명세서의 다른 부분에서 상세히 기재된 CRISPR 이펙터 단백질에 대한 임의의 다른 변형과 조합하여 제공될 수 있다.
본 명세서에 기재된 개선된 기능성 중 임의의 것은 임의의 CRISPR 이펙터 단백질, 예를 들어 C2c2 이펙터 단백질에게 만들어질 수 있다. 그러나, 본 명세서에 기재된 기능성 중 임의의 것은 다수의 오솔로그 유래의 단편을 포함하는 키메라 이펙터 단백질을 포함하는, 다른 오솔로그로부터의 C2c2 이펙터 단백질로 설계 제작될 수 있음이 이해될 것이다.
본 발명은 표적 DNA 서열에 결합하는 핵산을 사용한다. 이는, 핵산이 단백질보다 생산이 훨씬 더 쉽고 더 저렴하기 때문에 유리하며, 특이성은 상동성이 구해지는 스트레치의 길이에 따라 변화될 수 있다. 다수의 핑거의 복합체 3-D 위치선정은, 예를 들어 요구되지 않는다. 용어 "폴리뉴클레오티드", "뉴클레오티드", "뉴클레오티드 서열", "핵산" 및 "올리고뉴클레오티드"는 상호교환 가능하게 사용된다. 그것들은 임의의 길이의 뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 중 어느 하나, 또는 그의 유사체의 중합체 형태를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있으며, 기지의 또는 미지의 임의의 기능을 수행할 수 있다. 다음은 폴리뉴클레오티드의 비제한적인 예이다: 유전자 또는 유전자 단편의 코딩 또는 비-코딩 영역, 연결 분석으로부터 정의된 유전자좌들(유전자좌), 엑손, 인트론, 전령 RNA(mRNA), 운반 RNA, 리보솜 RNA, 짧은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로-RNA(miRNA), 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 분리된 DNA, 임의의 서열의 분리된 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머. 또한, 상기 용어는 합성 백본이 있는 핵산-유사 구조를 포괄하며, 예를 들어, 문헌 [Eckstein, 1991; Baserga et al., 1992; Milligan, 1993; WO 97/03211; WO 96/39154; Mata, 1997; Strauss-Soukup, 1997; 및 Samstag, 1996]을 참조한다. 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드, 예를 들어, 메틸화 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 구조에 대한 변형이 존재한다면, 중합체의 조립 전에 또는 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비뉴클레오티드 성분에 의해 단속될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 중합 후에, 예를 들어, 표지화 성분과의 콘주게이션에 의해 추가로 변형될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "야생형"은 해당 분야의 숙련자에 의해 이해되는 해당 분야의 용어이며, 그것이 돌연변이체 또는 변이체로부터 구별되는 정도로 천연에서 발생하는 것과 같은 통상적인 형태의 생물, 균주, 유전자 또는 특징을 의미한다. "야생형"은 기준선일 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "변이체"는 천연에서 발생하는 것에서 벗어난 패턴을 갖는 특질의 표현을 의미하는 것으로 이해해야 한다. 용어 "비-천연 발생" 또는 "설계 제작된"은 상호교환 가능하게 사용되며, 인간의 손의 개입을 나타낸다. 상기 용어는 핵산 분자 또는 폴리펩티드에 대하여 언급되는 경우, 핵산 분자 또는 폴리펩티드에 그들이 천연에서 천연적으로 회합되어 있고, 천연에서 관찰되는 적어도 하나의 다른 성분이 적어도 실질적으로 없음을 의미한다. "상보성"은 통상의 왓슨-크릭 염기쌍 형성 또는 기타 비-통상적 유형에 의해 다른 핵산 서열과 수소 결합(들)을 형성하는 핵산의 능력을 지칭한다. 상보성 백분율은 제2 핵산 서열과 수소 결합(예를 들어, 왓슨-크릭 염기쌍 형성)을 형성할 수 있는 핵산 분자 내의 잔기의 백분율을 나타낸다(예를 들어, 10 개 중 5, 6, 7, 8, 9, 10 개는 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 및 100% 상보성임). "완전한 상보성"은 핵산 서열의 모든 연속 잔기가 동일한 수의 제2 핵산 서열 내의 연속 잔기와 수소 결합할 것임을 의미한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "실질적인 상보성"은 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 개 이상의 뉴클레오티드의 영역에 걸쳐 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100%인 상보성 정도를 지칭하거나, 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 2 개의 핵산을 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 혼성화를 위한 "엄격한 조건"은 표적 서열에 대하여 상보성을 갖는 핵산 서열이 대개 표적 서열과 혼성화하며, 비-표적 서열에는 실질적으로 혼성화하지 않는 조건을 지칭한다. 엄격한 조건은 일반적으로 서열-의존적이며, 다수의 요인에 따라 달라진다. 일반적으로, 서열이 길수록, 서열이 그의 표적 서열에 특이적으로 혼성화하는 온도가 더 높아진다. 엄격한 조건의 비제한적인 예는 문헌[Tijssen(1993), Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes Part I, Second Chapter "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay", Elsevier, N.Y]에 상세히 기재되어 있다. 폴리뉴클레오티드 서열이 언급될 때, 상보성 또는 부분 상보성 서열도 생각된다. 이들은 바람직하게 높은 엄격성 조건하에 기준 서열에 혼성화할 수 있다. 일반적으로, 혼성화 속도를 최대화하기 위해서, 상대적으로 낮은 엄격성 혼성화 조건이 선택된다: 열 융점(Tm)보다 약 20 내지 25℃ 낮은 온도. Tm은 특정 표적 서열의 50%가 규정된 이온 세기와 pH에서 용액 중에서 완전히 상보성인 프로브와 혼성화하는 온도이다. 일반적으로, 혼성화된 서열의 적어도 약 85%의 뉴클레오티드 상보성을 요구하기 위해서, 높은 엄격성 세척 조건은 Tm보다 약 5 내지 15℃ 낮도록 선택된다. 혼성화된 서열의 적어도 약 70%의 뉴클레오티드 상보성을 요구하기 위해서, 중등의 엄격성 세척 조건은 Tm보다 약 15 내지 30℃ 낮도록 선택된다. 아주 관대한(매우 낮은 엄격성) 세척 조건은 Tm보다 50℃ 정도 낮을 수 있으며, 이것은 혼성화된 서열들 간에 높은 수준의 미스매칭을 허용한다. 당업자는 표적 서열과 프로브 서열 간 상동성의 특정 수준으로부터 검출 가능한 혼성화 신호의 결과에 영향을 미치기 위해서 혼성화 및 세척 단계에서 다른 물리화학적 변수들도 변경될 수 있다는 것을 인정할 것이다. 바람직한 높은 엄격성 조건은 42℃에서 50% 포름아미드, 5xSSC, 및 1% SDS 인큐베이션, 또는 65℃에서 5xSSC 및 1% SDS 인큐베이션과 65℃에서 0.2xSSC 및 0.1% SDS 세척을 포함한다. "혼성화"는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 반응하여, 복합체를 형성하고, 이 복합체는 뉴클레오티드 잔기의 염기 사이의 수소 결합을 통해 안정화되는 반응을 지칭한다. 수소 결합은 왓슨 크릭 염기쌍 형성, 훅스타인 결합 또는 임의의 다른 서열 특이적 방식으로 발생할 수 있다. 복합체는 듀플렉스 구조를 형성하는 2 개의 가닥, 다중 가닥 복합체를 형성하는 3 개 이상의 가닥, 단일의 자가 혼성화 가닥 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 혼성화 반응은 PCR의 개시 또는 효소에 의한 폴리뉴클레오티드의 절단과 같은 보다 광범위한 과정에서 하나의 단계를 이룰 수 있다. 주어진 서열과 혼성화할 수 있는 서열은 주어진 서열의 "상보물"로 지칭된다. 본 명세서에서 사용된 용어 "게놈 유전자좌" 또는 "유전자좌"(복수의 유전자좌)는 염색체에서 유전자 또는 DNA 서열의 특정 위치이다. "유전자"는 생물에서 활동하는 기능적 역할을 가진 RNA 사슬 또는 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA 또는 RNA의 스트레치로서, 이에 따라, 살아있는 생물에서 유전의 분자 단위를 말한다. 본 발명의 목적을 위해서, 유전자는 이러한 조절 서열이 코딩 서열 및/또는 전사된 서열에 인접하든 아니든 유전자 산물의 생성을 조절하는 영역을 포함하는 것으로 간주될 수 있다. 따라서, 반드시 제한되는 것은 아니지만, 유전자는 프로모터 서열, 종결자, 리보솜 결합 부위 및 내부 리보솜 진입 부위와 같은 번역 조절 서열, 인핸서, 사일렌서, 인슐레이터, 경계 요소, 복제 원점, 매트릭스 부착 부위 및 유전자좌 조절 영역을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 "게놈 유전자좌의 발현" 또는 "유전자 발현"은 유전자로부터의 정보가 기능적 유전자 산물의 합성에서 사용되는 과정이다. 유전자 발현의 산물은 주로 단백질이지만, rRNA 유전자 또는 tRNA 유전자와 같은 비-단백질 코딩 유전자에서는 이 산물은 기능적 RNA이다. 유전자 발현 과정은 생존을 위한 기능적 산물들을 생성하기 위해서 모든 알려진 생명체, 즉 진핵생물(다세포 생물 포함), 원핵생물(박테리아 및 고박테리아) 및 바이러스에 의해서 사용된다. 본 명세서에서 사용된 유전자 또는 핵산의 "발현"은 세포 유전자 발현뿐만 아니라 클로닝 시스템 및 임의의 다른 맥락에서 핵산(들)의 전사 및 번역을 포괄한다. 본 명세서에서 사용된 "발현"은 또한 폴리뉴클레오티드가 DNA 주형으로부터(예를 들어, mRNA 또는 다른 RNA 전사물로) 전사되는 과정 및/또는 전사된 mRNA가 이어서 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질로 번역되는 과정을 말한다. 전사물 및 인코딩된 폴리펩티드는 집합적으로 "유전자 산물"이라고 언급될 수 있다. 폴리뉴클레오티드가 게놈 DNA로부터 유래된다면, 발현은 진핵 세포에서 mRNA의 스플라이싱을 포함할 수 있다. 용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 본 명세서에서 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭하기 위해 상호교환 가능하게 사용된다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있으며, 그것은 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 그것은 비-아미노산에 의해 단속될 수 있다. 또한, 상기 용어는 변형된 아미노산 중합체; 예를 들어, 이황화 결합 형성, 글리코실화, 지질화(lipidation), 아세틸화, 인산화 또는 임의의 기타 조작, 예를 들어, 표지화 성분과의 콘주게이션을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "아미노산"은 글리신 및 D 또는 L 광학 이성질체 및 아미노산 유사체 및 펩티드모방체를 포함하는 천연 및/또는 비천연 또는 합성 아미노산을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 용어 "도메인" 또는 "단백질 도메인"은 단백질 사슬의 나머지 부분과 독립적으로 존재하며 기능할 수 있는 단백질 서열의 일부를 말한다. 본 발명의 양태에서 설명된 대로, 서열 동일성은 서열 상동성과 연관된다. 상동성 비교는 눈으로, 또는 더 일반적으로는 쉽게 이용 가능한 서열 비교 프로그램의 도움으로 수행될 수 있다. 이들 상업적으로 이용 가능한 컴퓨터 프로그램은 둘 이상의 서열 사이의 상동성 백분율(%)을 계산할 수 있고, 또한 둘 이상의 아미노산 또는 핵산 서열에 의해서 공유된 서열 동일성을 계산할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 용어 "가이드 RNA"는 하나 이상의 추정되거나 확인된 tracr 서열 및 추정되거나 확인된 crRNA 서열 또는 가이드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 구체적인 구현예에서, "가이드 RNA"는 추정되거나 확인된 crRNA 서열 또는 가이드 서열을 포함한다. 추가의 구현예에서, 가이드 RNA는 추정되거나 확인된 tracr 서열을 포함하지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "야생형"은 당업자에 의해 이해되는 당업계의 용어이며, 이것이 돌연변이체 또는 변이체 형태로부터 구별되는 정도로 천연에서 발생하는 것과 같은 통상적인 형태의 생물, 균주, 유전자 또는 특징을 의미한다. "야생형"은 기준선일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "변이체"는 천연에서 발생하는 것에서 벗어난 패턴을 갖는 특질의 표현을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
용어 "비-천연 발생" 또는 "설계 제작된"은 상호교환 가능하게 사용되며, 인간의 손의 개입을 나타낸다. 상기 용어는 핵산 분자 또는 폴리펩티드에 대하여 말하는 경우, 핵산 분자 또는 폴리펩티드에 이들이 천연에서 천연적으로 회합되어 있고, 천연에서 관찰되는 적어도 하나의 다른 성분이 적어도 실질적으로 없음을 의미한다. 모든 양태 및 구현예에서, 이들 용어가 포함되는지 아닌지의 여부에 관계없이, 바람직하게는 이는 선택적일 수 있으며, 이에 따라 바람직하게는 포함되거나 또는 바람직하게는 포함되지 않을 수 있는 것으로 이해될 것이다. 추가로, 용어 "비-천연 발생" 및 "설계 제작된"은 상호교환 가능하게 사용될 수 있으며, 따라서 단독으로 또는 조합되어 사용될 수 있고 하나 또는 다른 것들이 함께 언급된 것들을 대체할 수 있다. 특히, "비-천연 발생" 또는 "비-천연 발생 및/또는 설계 제작된" 대신에 "설계 제작된"이 바람직하다.
서열 상동성은 본 분야에 알려진 다수의 컴퓨터 프로그램, 예를 들어 BLAST 또는 FASTA 등의 임의의 것에 의해서 생성될 수 있다. 이러한 정렬을 수행하기 위한 적합한 컴퓨터 프로그램은 GCG 위스콘신 베스트핏(Wisconsin Bestfit) 패키지이다(University of Wisconsin, U.S.A; 문헌[Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12:387]). 서열 비교를 수행할 수 있는 다른 소프트웨어의 예들은, 이에 한정되지 않지만 BLAST 패키지(상기 문헌[Ausubel et al., 1999] - 18장 참조), FASTA(문헌[Atschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 403-410]) 및 GENEWORKS 비교 도구 묶음을 포함한다. BLAST와 FASTA는 모두 오프라인과 온라인 검색을 위해 이용할 수 있다(상기 문헌[Ausubel et al., 1999], 페이지 7-58 내지 7-60 참조). 그러나, GCG 베스트핏 프로그램을 사용하는 것이 바람직하다. 서열 상동성 백분율(%)은 연속 서열에 걸쳐서 계산될 수 있는데, 즉 하나의 서열이 다른 서열과 정렬되고, 하나의 서열에서 각 아미노산 또는 뉴클레오티드가 다른 서열에서 상응하는 아미노산 또는 뉴클레오티드와 한번에 하나의 잔기씩 직접 비교된다. 이것은 "비갭"(ungapped) 정렬이라고 불린다. 전형적으로, 이러한 비갭 정렬은 상대적으로 짧은 수의 잔기에 걸쳐서만 수행된다. 이것은 매우 간단하고 일관된 방법이지만, 예를 들어 다른 동일한 쌍의 서열에서, 하나의 삽입 또는 결실이 이후의 아미노산 잔기를 정렬되지 않도록 할 수 있다는 것을 고려하지 않으므로, 전반적 정렬이 수행될 때는 잠재적으로 상동성%에 상당한 감소가 있게 된다. 결론적으로, 대부분의 서열 비교 방법은 전체 상동성 또는 동일성 점수에 과도한 패널티 부과 없이 가능한 삽입과 결실을 고려하는 최적 정렬을 생성하도록 설계된다. 이것은 국소 상동성 또는 동일성을 최대화하도록 시도하도록 서열 정렬에 "갭"을 삽입함으로써 달성된다. 그러나, 이런 더 복잡한 방법은 정렬에서 발생한 각 갭에 "갭 패널티"를 배정하며, 이로써 동일한 수의 동일한 아미노산에 대해, 가능한 적은 갭을 가진 서열 정렬 - 비교된 두 서열 간의 더 높은 연관성 반영 - 이 많은 갭을 가진 것보다 더 높은 점수를 달성할 수 있다. "친화성 갭 점수"가 통상적으로 사용되는데, 이것은 갭의 존재에는 상대적으로 높은 점수를 매기고, 갭의 각 연속 잔기에는 더 적은 패널티를 매긴다. 이것은 가장 흔히 사용되는 갭 점수배정 시스템이다. 높은 갭 패널티는 당연히 갭이 적을수록 최적화된 정렬을 생성할 수 있다. 대부분의 정렬 프로그램은 갭 패널티의 변형을 허용한다. 그러나, 서열 비교에 이러한 소프트웨어를 사용할 때 디폴트 값을 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들어, GCG 위스콘신 베스트핏 패키지를 사용할 때, 아미노산 서열에 대한 디폴트 갭 패널티는 갭에 대해 -12 및 각 연장에 대해 -4이다. 따라서, 최대 상동성%의 계산은 먼저 갭 패널티를 고려한 최적 정렬의 생성을 요구한다. 이러한 정렬을 수행하기 위한 적합한 컴퓨터 프로그램은 GCG 위스콘신 베스트핏 패키지이다(문헌[Devereux et al., 1984 Nuc. Acids Research 12 p387]). 서열 비교를 수행할 수 있는 다른 소프트웨어의 예들은, 이에 한정되지 않지만, BLAST 패키지(문헌[Ausubel et al., 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed. Chapter 18] 참조), FASTA(문헌[Altschul et al., 1990 J. Mol. Biol. 403-410]) 및 GENEWORKS 비교 도구 묶음을 포함한다. BLAST와 FASTA는 모두 오프라인과 온라인 검색으로 이용할 수 있다(문헌[Ausubel et al., 1999, Short Protocols in Molecular Biology, pages 7-58 to 7-60] 참조). 그러나, 일부 응용에는, GCG 베스트핏 프로그램을 사용하는 것이 바람직하다. BLAST 2 서열이라고 불리는 새로운 도구도 단백질 및 뉴클레오티드 서열을 비교하는 데 이용할 수 있다(문헌[FEMS Microbiol Lett. 1999 174(2): 247-50]; 문헌[FEMS Microbiol Lett. 1999 177(1): 187-8] 및 National Institutes for Health 웹사이트에서 National Center for Biotechnology 웹사이트 참조). 최종 상동성%는 동일성에 관하여 측정될 수 있지만, 전형적으로 정렬 과정 자체는 양단간의 쌍 비교에 기초하지 않는다. 대신, 축척된 유사성 점수 행렬이 일반적으로 사용되는데, 이것은 화학적 유사성 또는 진화적 거리에 기초하여 각 쌍-방식 비교에 점수를 배정한다. 흔히 사용되는 이러한 행렬의 예는 BLOSUM62 행렬로서, 이것은 BLAST 프로그램 묶음의 디폴트 행렬이다. GCG 위스콘신 프로그램은 일반적으로 공개된 디폴트 값이나 제공되는 경우에는 사용자 지정 기호 비교표(추가의 상세한 설명을 위해 사용자 매뉴얼 참조)를 사용한다. 일부 응용에는, GCG 패키지에 대한 공개된 디폴트 값을 사용하거나, 또는 다른 소프트웨어의 경우에는 BLOSUM62와 같은 디폴트 행렬을 사용하는 것이 바람직하다. 대안적으로, 상동성 백분율은 CLUSTAL과 유사한 알고리즘에 기초한, DNASIS™(Hitachi Software)의 다중 정렬 특징을 사용하여 계산될 수 있다(문헌[Higgins DG & Sharp PM(1988), Gene 73(1), 237-244]). 일단 소프트웨어가 최적 정렬을 생성하면, 상동성%, 바람직하게는 서열 동일성%를 계산하는 것이 가능하다. 소프트웨어는 통상적으로 서열 비교의 일부로서 이것을 행하고, 수치 결과를 생성한다. 서열은 또한 침묵성 변화를 생성하여 기능적으로 동등한 물질을 야기하는 아미노산 잔기의 결실, 삽입 또는 치환을 가질 수 있다. 아미노산 특성(예를 들어, 잔기의 극성, 전하, 용해성, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성)의 유사성을 기초로 의도적인 아미노산 치환이 만들어질 수 있으며, 따라서 작용기에 있어서 아미노산을 함께 그룹화하는 데 유용하다. 아미노산은 그것의 측쇄만의 특성에 기초하여 그룹화될 수 있다. 그러나, 돌연변이 데이터를 포함하는 것도 역시 더 유용하다. 이렇게 유도된 아미노산 세트는 구조적 이유로 보존될 수 있다. 이들 세트는 벤다이어그램의 형태로 설명될 수 있다(문헌[Livingstone C.D. and Barton G.J.(1993) "Protein sequence alignments: a strategy for the hierarchical analysis of residue conservation" Comput. Appl. Biosci. 9: 745-756])(문헌[Taylor W.R.(1986) "The classification of amino acid conservation" J. Theor. Biol. 119; 205-218]). 보존적 치환은, 예를 들어 일반적으로 용인된 벤다이어그램 아미노산 그룹화를 설명한 아래 표에 따라서 이루어질 수 있다.
용어 "대상체", "개인", 및 "환자"는 본 명세서에서 상호교환 가능하게 사용되어 척추동물, 바람직하게는 포유류, 더 바람직하게는 인간을 지칭한다. 포유류는 이에 한정되지 않지만 뮤린, 유인원, 인간, 농장 동물, 경기용 동물, 및 반려동물을 포함한다. 생체내에서 수득된 또는 시험관내에서 배양된 생물학적 개체의 조직, 세포 및 이들의 자손 또한 포함된다.
용어 "치료제", "치료 가능제" 또는 "처리제"는 상호교환 가능하게 사용되며, 대상체로의 투여에 몇 가지 유익한 효과를 부여하는 분자 또는 화합물을 지칭한다. 유익한 효과는 진단 결정의 가능화; 질병, 증상, 장애, 또는 병리학적 질환의 개선; 질병, 증상, 장애 또는 질환의 개시의 감소 또는 예방; 및 일반적으로 질병, 증상, 장애 또는 병리학적 질환의 대응을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "치료" 또는 "치료하는" 또는 "완화" 또는 "개선하는"은 상호교환 가능하게 사용된다. 이들 용어는 이에 한정되지 않지만 치료 이익 및/또는 예방 이익을 포함하는, 유익하거나 원하는 결과를 수득하기 위한 접근을 지칭한다. 치료적 이익이라 함은, 치료 하에 있는 하나 이상의 질병, 질환, 또는 증상에서의 임의의 치료 관련 개선 또는 이에 대한 효과를 의미한다. 예방적 이익을 위해, 조성물은 특정 질병, 질환, 또는 증상 발전의 위험에 있는 대상체에, 또는 질병, 질환, 또는 증상이 아직 표명되지 않을 수 있다 하더라도 질병의 하나 이상의 생리학적 증상이 보고되는 대상체에게 투여될 수 있다.
용어 "유효량" 또는 "치료적 유효량"은 유익하거나 원하는 결과를 발생시키기에 충분한 제제의 양을 지칭한다. 치료적 유효량은, 치료될 대상체 및 질병 상태, 대상체의 체중 및 연령, 질병 상태의 심각도, 투여 방법 등 중 하나 이상에 따라 달라질 수 있으며, 이는 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 용어는 또한 본 명세서에서 기재된 임의의 하나의 이미지화 방법에 의한 검출을 위한 이미지를 제공할 용량에 적용된다. 특정 용량은, 선택된 특정 제제, 이후 따르는 투약 섭생, 다른 화합물과 조합되어 투여되는지의 여부, 투여 타이밍, 이미징될 조직, 및 용량이 운반되는 물리적 전달 시스템 중 하나 이상에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 실시는, 달리 표시되지 않는 한, 당업계의 기술 내에 있는 면역학, 생화학, 화학, 분자 생물학, 미생물학, 세포 생물학, 유전체학 및 재조합 DNA의 통상적인 기법을 사용한다. 문헌[Sambrook, Fritsch and Maniatis, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd edition (1989)]; 문헌[CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, et al. eds., (1987))]; 시리즈 문헌[METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995))], 문헌[Harlow and Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, and ANIMAL CELL CULTURE (R.I. Freshney, ed. (1987))] 참고.
본 발명의 일부 양태는 하나 이상의 벡터를 포함하는 벡터 시스템, 또는 이와 같은 벡터에 관한 것이다. 벡터는 원핵 또는 진핵 세포에서 CRISPR 전사물(예를 들어, 핵산 전사물, 단백질, 또는 효소)의 발현을 위해 설계될 수 있다. 예를 들어, CRISPR 전사물은 박테리아 세포, 예를 들어 에스케리키아 콜라이, 곤충 세포(배큘로바이러스 발현 벡터 사용), 효모 세포, 또는 포유류 세포에서 발현될 수 있다. 적합한 숙주 세포는 문헌[Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif.(1990)]에 추가로 논의되어 있다. 대안적으로, 재조합 발현 벡터는, 예를 들어 T7 프로모터 조절 서열 및 T7 중합효소를 사용하여 시험관내에서 전사되고 번역될 수 있다.
본 발명의 일 구현예는, 아미노산의 경우 유사한 것으로의 치환, 예를 들어 염기성을 염기성으로, 산성을 산성으로, 극성을 극성으로 등등의 치환을 일으킬 수 있는 상동성 치환(치환 및 대체는 모두 본 명세서에서 기존 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 대안적인 잔기 또는 뉴클레오티드로의 교환을 의미하도록 사용됨)을 포함할 수 있는 서열(폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 모두)을 포함한다. 비-상동성 치환, 즉 한 부류의 잔기로부터 다른 부류의 잔기로의 치환, 또는 대안적으로 오르니틴(이후 Z로 언급), 디아미노부티르산 오르니틴(이후 B로 언급), 노르류신 오르니틴(이후 O로 언급), 피리일알라닌, 티에닐알라닌, 나프틸알라닌 및 페닐글리신과 같은 비천연 아미노산의 포함을 수반하는 치환이 일어날 수 있다. 변이체 아미노산 서열은 글리신 또는 β-알라닌 잔기와 같은 아미노산 스페이서에 더하여 메틸, 에틸 또는 프로필기와 같은 알킬기를 포함하는 서열의 임의의 두 아미노산 잔기 사이에 삽입될 수 있는 적합한 스페이서 기를 포함할 수 있다. 펩토이드 형태로 하나 이상의 아미노산 잔기의 존재를 포함하는 추가의 형태의 변형도 해당 분야의 숙련자에게 잘 이해될 수 있다. 의심을 피하기 위해서, "펩토이드 형태"는 α-탄소 치환기가 α-탄소가 아니라 잔기의 질소 원자에 존재하는 변이체 아미노산 잔기를 말하기 위해서 사용된다. 펩토이드 형태로 펩티드를 제조하는 과정은 해당 분야에, 예를 들어 문헌[Simon RJ et al., PNAS(1992) 89(20), 9367-9371] 및 문헌[Horwell DC, Trends Biotechnol.(1995) 13(4), 132-134]에 공지되어 있다.
상동성 모델링: 다른 C2c2 오솔로그에서의 해당 잔기는 문헌 [Zhang et al., 2012(Nature; 490(7421): 556-60) and Chen et al., 2015(PLoS Comput Biol; 11(5): e1004248)]의 방법 - 도메인-모티프 계면에 의해 매개된 상호작용을 예측하는 계산상 단백질-단백질 상호작용(PPI) 방법에 의해 확인될 수 있다. PrePPI(예측 PPI)는 구조 기준 PPI 예측 방법으로, 베이지안(Bayesian) 통계 프레임워크를 이용하여 비-구조적 증거와 구조적 증거를 조합한다. 이 방법은 문의되는 단백질의 쌍을 취하고, 구조적 정렬을 이용하여 그의 실험적으로 결정된 구조 또는 상동성 모델 중 어느 하나에 상응하는 구조적 대표물을 확인하는 것을 포함한다. 구조적 정렬은 전반적인 및 국소의 기하 관계를 고려함으로써 가까운 구조적 이웃 및 먼 구조적 이웃 모두를 확인하는 데 추가로 사용된다. 구조적 대표물의 두 이웃이 단백질 데이터 뱅크에 보고된 복합체를 형성할 때마다, 이는 두 개의 문의되는 단백질 사이의 상호작용을 모델링하기 위한 주형을 정의한다. 복합체의 모델은 대표 작제물을 주형 내에서 그의 상응하는 구조적 이웃에 겹쳐놓음으로써 창출된다. 이러한 접근은 문헌[Dey et al., 2013(Prot Sci; 22: 359-66)]에 추가로 기재되어 있다.
본 발명의 목적을 위하여, 증폭은 타당한 충실도로 표적 서열을 복제할 수 있는 폴리머라제 및 프라이머를 사용하는 임의의 방법을 의미한다. 증폭은 천연 또는 재조합 DNA 폴리머라제, 예를 들어, TaqGold™, T7 DNA 폴리머라제, 이.콜라이(에스케리키아 콜라이) DNA 폴리머라제의 클레나우(Klenow) 단편 및 역전사효소에 의해 수행될 수 있다. 바람직한 증폭 방법은 PCR이다.
특정 양태에서, 본 발명은 벡터를 포함한다. 본 명세서에서 사용된 "벡터"는 개체를 하나의 환경에서 다른 환경으로 전달하는 것을 허용 또는 촉진하는 도구이다. 이는 레플리콘, 예를 들어 플라스미드, 파지, 또는 코스미드로, 다른 DNA 절편이 그 안에 삽입될 수 있어서, 삽입된 절편의 복제를 유발한다. 일반적으로, 벡터는 적절한 제어 요소와 연결된 경우 복제할 수 있다. 일반적으로, 용어 "벡터"는 그것이 연결되어 있는 다른 핵산을 전달할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 벡터는, 이에 한정되지 않지만, 단일 가닥, 이중 가닥, 또는 부분적으로 이중 가닥인 핵산 분자; 하나 이상의 자유 말단을 포함하는 핵산 분자, 자유 말단이 없는 핵산 분자(예를 들어, 원형); DNA, RNA 또는 이들 둘 모두를 포함하는 핵산 분자; 및 해당 분야에서 알려진 다른 각종 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 벡터의 일 종류로 "플라스미드"가 있으며, 이는 원형 이중 가닥 DNA 루프를 지칭하며, 그 안으로 예를 들어 표준 분자 클로닝 기술에 의해서 추가의 DNA 절편이 삽입될 수 있다. 벡터의 또 다른 종류로 바이러스 벡터가 있으며, 바이러스-유래된 DNA 또는 RNA 서열이 바이러스(예를 들어, 레트로바이러스, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스, 복제 결함 아데노바이러스, 및 아데노-관련 바이러스(AAV)) 내로의 패키징을 위해 벡터에 존재한다. 바이러스 벡터는 또한 숙주 세포 내로의 트랜스펙션을 위한, 바이러스가 지니는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특정 벡터는 그것이 도입된 숙주 세포에서 자율적 복제가 가능하다(예를 들어, 박테리아 복제 원점을 가진 박테리아 벡터 및 에피솜 포유류 벡터). 다른 벡터(예를 들어, 비-에피솜 포유류 벡터)는 숙주 세포 내로 도입시 숙주 세포의 게놈에 통합되며, 이로써 숙주 게놈과 함께 복제된다. 더욱이, 특정 벡터는 그것이 작동 가능하게 연결된 유전자의 발현을 유도할 수 있다. 이러한 벡터는 본 명세서에서 "발현 벡터"로 지칭된다. 재조합 DNA 기술에서 활용되는 통상적인 발현 벡터는 주로 플라스미드의 형태이다.
재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 핵산의 발현에 적합한 형태로 본 발명의 핵산을 포함할 수 있는데, 이것은 재조합 발현 벡터가 하나 이상의 조절 요소를 포함하는 것을 의미하며, 하나 이상의 조절 요소는 발현에 사용될 숙주 세포에 기초하여 선택될 수 있고, 발현될 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된다. 재조합 발현 벡터 내에서 "작동 가능하게 연결된"은 관심 뉴클레오티드 서열이(예를 들어, 시험관내 전사/번역 시스템에서 또는 벡터가 숙주 세포에 도입된 경우에는 숙주 세포에서) 그 뉴클레오티드 서열의 발현을 허용하는 방식으로 조절 요소(들)에 연결됨을 의미하고자 한다. 재조합 및 클로닝 방법에 관련하여, 2004년 9월 2일 간행된 미국 특허 출원 10/815,730이 언급될 수 있으며, 이의 모든 내용은 그 전체로서 본 명세서에 포함된다.
본 발명의 일 양태는 가이드 RNA 및 야생형, 변형된 또는 돌연변이된 CRISPR 이펙터 단백질/효소(예를 들어, C2c2)에 대한 비시스트로닉(bicistronic) 벡터에 관한 것이다. 비시스트로닉 발현 벡터 가이드 RNA 및 야생형, 변형된 또는 돌연변이된 CRISPR 이펙터 단백질/효소(예를 들어, C2c2)가 바람직하다. 일반적으로 그리고 특히 이 구현예에서, 야생형, 변형된 또는 돌연변이된 CRISPR 이펙터 단백질/효소(예를 들어, C2c2)는 바람직하게 CBh 프로모터에 의해서 유도된다. RNA는 바람직하게 Pol III 프로모터, 예를 들어, U6 프로모터에 의해 유도된다. 이상적으로 2 개가 조합된다.
일부 구현예에서, 가이드 RNA에서 루프가 제공된다. 이는 스템 루프 도는 테트라 루프일 수 있다. 이 루프는 바람직하게 GAAA이지만, 이 서열에만 제한되는 것은 아니며, 또는 실제로 단지 4 bp 길이에만 제한되는 것도 아니다. 실제로, 헤어핀 구조에서 사용하기 위한 바람직한 루프 형성 서열은 4 개 뉴클레오티드 길이이고, 가장 바람직하게 서열 GAAA를 갖는다. 그러나, 더 길거나 짧은 루프 서열도 사용될 수 있으며, 대안적인 서열도 사용될 수 있다. 서열은 바람직하게 뉴클레오티드 트리플렛(예를 들어, AAA), 및 추가의 뉴클레오티드(예를 들어, C 또는 G)를 포함한다. 루프 형성 서열의 예들은 CAAA 및 AAAG를 포함한다.
본 명세서에 개시된 임의의 방법을 실시하는 데 있어서, 적합한 벡터가, 이에 한정되지 않지만, 미세주입, 전기천공, 소노포레이션(sonoporation), 바이오리스틱스, 칼슘 포스페이트-매개 트랜스펙션, 양이온 트랜스펙션, 리포좀 트랜스펙션, 덴드리머 트랜스펙션, 열 충격 트랜스펙션, 뉴클레오펙션 트랜스펙션, 마그네토펙션, 리포펙션, 임페일펙션, 광학 트랜스펙션, 핵산의 전용 제제-증진 흡수, 및 리포좀, 면역리포좀, 비로좀 또는 인공 비리온을 통한 전달을 포함하는 해당 분야에 알려진 하나 이상의 방법을 통해서 세포 또는 배아에 도입될 수 있다. 일부 방법에서, 벡터는 미세주입에 의해서 배아에 도입될 수 있다. 벡터 또는 벡터들은 배아의 핵 또는 세포질에 미세주입될 수 있다. 일부 방법에서, 벡터 또는 벡터들은 뉴클레오펙션에 의해서 세포 내로 도입될 수 있다.
용어 "조절 요소"는 프로모터, 인핸서, 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 및 다른 발현 조절 요소(예를 들어, 전사 종결 신호, 예를 들어 폴리아데닐화 신호 및 폴리-U 서열)를 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 조절 요소는, 예를 들어 문헌[Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif.(1990)]에 기재되어 있다. 조절 요소는 많은 유형의 숙주 세포에서 뉴클레오티드 서열의 구성적 발현을 유도하는 것들과 특정 숙주 세포에서만 뉴클레오티드 서열의 발현을 유도하는 것들(예를 들어, 조직-특이적 조절 서열)을 포함한다. 조직-특이적 프로모터는 근육, 뉴런, 뼈, 피부, 혈액, 특정 장기(예를 들어, 간, 췌장)와 같은 요망되는 관심 조직, 또는 특정 세포 유형(예를 들어, 림프구)에서 주로 발현을 유도할 수 있다. 조절 요소는 시간-의존적 방식으로, 예를 들어 세포-주기 의존적 또는 발생 단계 의존적 방식으로 발현을 유도할 수 있으며, 이것은 조직 특이적이거나 세포-유형 특이적일 수 있거나, 그렇지 않을 수도 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 하나 이상의 pol III 프로모터(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 개 또는 그 이상의 pol III 프로모터), 하나 이상의 pol II 프로모터(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 개 또는 그 이상의 pol II 프로모터), 하나 이상의 pol I 프로모터(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 개 또는 그 이상의 pol I 프로모터), 또는 이들의 조합을 포함한다. pol III 프로모터의 예들은, 이에 한정되지 않지만, U6 및 H1 프로모터를 포함한다. pol II 프로모터의 예들은, 이에 한정되지 않지만, 레트로바이러스 라우스 육종 바이러스(RSV) LTR 프로모터(선택적으로 RSV 인핸서와 함께), 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터(선택적으로 CMV 인핸서와 함께)[예를 들어, 문헌[Boshart et al, Cell, 41:521-530(1985)] 참조], SV40 프로모터, 디하이드로폴레이트 리덕타제 프로모터, β-액틴 프로모터, 포스포글리세롤 키나아제(PGK) 프로모터, 및 EF1α 프로모터를 포함한다. 또한, 용어 "조절 요소"에는 인핸서 요소, 예를 들어 WPRE; CMV 인핸서; HTLV-I의 LTR에서 R-U5' 절편(문헌[Mol. Cell. Biol., Vol. 8(1), p. 466-472, 1988]); SV40 인핸서; 및 토끼 β-글로빈의 엑손 2와 3 사이의 인트론 서열(문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol. 78(3), p. 1527-31, 1981])도 포함된다. 발현 벡터의 설계는 형질전환될 숙주 세포의 선택, 요망되는 발현 수준 등과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다는 것이 해당 분야의 숙련자에 의해서 인정될 것이다. 벡터는 숙주 세포에 도입될 수 있고, 이로써 본 명세서에 설명된 바와 같이 핵산에 의해서 인코딩된, 융합 단백질 또는 펩티드를 포함하는, 전사물, 단백질 또는 펩티드가 생성될 수 있다(예를 들어, 클러스터링되고 규칙적으로 산재된 짧은 팔린드로믹 반복부(CRISPR) 전사물, 단백질, 효소, 이들의 돌연변이체 형태, 이들의 융합 단백질 등). 조절 서열과 관련하여, US 특허 출원 10/491,026이 언급되며, 그의 내용은 본 명세서에 그 전체로서 참고문헌으로 통합된다. 프로모터와 관련하여, PCT 공보 WO 2011/028929 및 미국 특허 출원 12/511,940이 언급되며, 그의 내용은 본 명세서에 그 전체로서 참고문헌으로 통합된다.
벡터는 원핵 또는 진핵 세포에서 CRISPR 전사물(예를 들어, 핵산 전사물, 단백질 또는 효소)의 발현을 위해 설계될 수 있다. 예를 들어, CRISPR 전사물은 박테리아 세포, 예를 들어 이.콜라이, 곤충 세포(배큘로바이러스 발현 벡터 사용), 효모 세포 또는 포유류 세포에서 발현될 수 있다. 적절한 숙주 세포는 문헌[Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif.(1990)]에 추가로 논의되어 있다. 대안적으로, 재조합 발현 벡터는 예를 들어, T7 프로모터 조절 서열 및 T7 폴리머라제를 사용하여 시험관내에서 전사되고 번역될 수 있다.
벡터는 원핵생물, 또는 원핵 세포에 도입되고, 그에서 증식될 수 있다. 일부 구현예에서, 원핵생물은 진핵 세포로 도입될 벡터 또는 진핵 세포로 도입되는 벡터의 생성에서 중간체 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 패키징 시스템의 일부로서 플라스미드 증폭)로서 벡터의 복사(copy)를 증폭시키기 위해서 사용된다. 일부 구현예에서, 원핵생물은 벡터의 복사를 증폭시키고, 하나 이상의 핵산을 발현하기 위해, 예를 들어, 숙주 세포 또는 숙주 생물로의 전달을 위한 하나 이상의 단백질의 공급원을 제공하기 위해 사용된다. 원핵생물에서의 단백질의 발현은 종종 융합 또는 비-융합 단백질 중 어느 하나의 발현을 유도하는 구성성 또는 유도성 프로모터를 함유하는 벡터를 사용하여 이.콜라이에서 실시된다. 융합 벡터는 거기에서 인코딩된 단백질에, 예를 들어 재조합 단백질의 아미노 말단에 수많은 아미노산을 부가한다. 이러한 융합 벡터는 다음과 같은 하나 이상의 목적을 제공할 수 있다: (i) 재조합 단백질의 발현의 증가; (ii) 재조합 단백질의 용해도의 증가; 및 (iii) 친화성 정제에서 리간드로 작용함으로써 재조합 단백질의 정제의 보조. 종종, 융합 발현 벡터에서, 단백질분해 절단 부위는 융합 모이어티와 재조합 단백질의 연접부에 도입되어, 융합 단백질의 정제 이후에 융합 모이어티로부터 재조합 단백질의 분리를 가능하게 한다. 이러한 효소 및 그들의 동족 인식 서열은 인자 Xa, 트롬빈 및 엔테로키나아제를 포함한다. 예시적인 융합 발현 벡터는 pGEX(파마시아 바이오테크 인코포레이티드(Pharmacia Biotech Inc); 문헌[Smith and Johnson, 1988. Gene 67: 31-40]), pMAL(미국 매사추세츠주 비벌리 소재의 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)) 및 pRIT5(미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재의 파마시아(Pharmacia))를 포함하며, 이는 각각 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST), 말토스 E 결합 단백질 또는 단백질 A를 표적 재조합 단백질에 융합시킨다.
적절한 유도성 비-융합 이.콜라이 발현 벡터의 예는 pTrc(문헌[Amrann et al.,(1988) Gene 69:301-315]) 및 pET 11d(문헌[Studier et al., GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif.(1990) 60-89])를 포함한다.
일부 구현예에서, 벡터는 효모 발현 벡터이다. 효모 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)에서의 발현을 위한 벡터의 예에는 pYepSec1(문헌[Baldari, et al., 1987. EMBO J. 6: 229-234]), pMFa(문헌[Kuijan and Herskowitz, 1982. Cell 30: 933-943]), pJRY88(문헌[Schultz et al., 1987. Gene 54: 113-123]), pYES2(미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 인비트로겐 코포레이션) 및 picZ(미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재의 인비트로겐 코포레이션)가 포함된다.
일부 구현예에서, 벡터는 배큘로바이러스 발현 벡터를 사용하여 곤충 세포에서 단백질 발현을 유도한다. 배양된 곤충 세포(예를 들어, SF9 세포)에서 단백질의 발현에 이용 가능한 배큘로바이러스 벡터는 pAc 시리즈(문헌[Smith, et al., 1983. Mol. Cell. Biol. 3: 2156-2165]) 및 pVL 시리즈(문헌[Lucklow and Summers, 1989. Virology 170: 31-39])를 포함한다.
일부 구현예에서, 벡터는 포유류 발현 벡터를 사용하여 포유류 세포에서 하나 이상의 서열의 발현을 유도할 수 있다. 포유류 발현 벡터의 예는 pCDM8(문헌[Seed, 1987. Nature 329: 840]) 및 pMT2PC(문헌[Kaufman, et al., 1987. EMBO J. 6: 187-195])를 포함한다. 포유류 세포에서 사용되는 경우, 발현 벡터의 제어 작용은 통상적으로 하나 이상의 조절 요소에 의해 제공된다. 예를 들어, 통상적으로 사용되는 프로모터는 폴리오마, 아데노바이러스 2, 사이토메갈로바이러스, 유인원 바이러스 40 및 본 명세서에 개시되고 당업계에 공지되어 있는 기타의 것으로부터 유래된다. 원핵 및 진핵 세포 둘 모두를 위한 다른 적절한 발현 시스템에 대하여, 예를 들어, 문헌[Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989]의 16 및 17장을 참조한다.
일부 구현예에서, 재조합 포유류 발현 벡터는 특정 세포 유형에서 우선적으로 핵산의 발현을 유도할 수 있다(예를 들어, 핵산을 발현하기 위하여 조직-특이적 조절 요소가 사용됨). 조직-특이적 조절 요소는 해당 분야에 공지되어 있다. 적절한 조직-특이적 프로모터의 비제한적인 예에는 알부민 프로모터(간-특이적; 문헌[Pinkert, et al., 1987. Genes Dev. 1: 268-277]), 림프-특이적 프로모터(문헌[Calame and Eaton, 1988. Adv. Immunol. 43: 235-275]), 특히, T 세포 수용체(문헌[Winoto and Baltimore, 1989. EMBO J. 8: 729-733]) 및 면역글로불린의 프로모터(문헌[Baneiji, et al., 1983. Cell 33: 729-740]; 문헌[Queen and Baltimore, 1983. Cell 33: 741-748]), 뉴런-특이적 프로모터(예를 들어, 신경섬유 프로모터; 문헌[Byrne and Ruddle, 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5473-5477]), 췌장-특이적 프로모터(문헌[Edlund, et al., 1985. Science 230: 912-916]) 및 유선-특이적 프로모터(예를 들어, 유장(milk whey) 프로모터; 미국 특허 4,873,316 및 유럽 출원 공보 264,166)가 포함된다. 발생-조절 프로모터, 예를 들어, 뮤린 hox 프로모터(문헌[Kessel and Gruss, 1990. Science 249: 374-379]) 및 α-태아단백질 프로모터(문헌[Campes and Tilghman, 1989. Genes Dev. 3: 537-546])도 또한 포함된다. 이들 원핵 및 진핵 벡터와 관련하여, 미국 특허 제6,750,059 호가 언급되며, 그의 내용은 본 명세서에 그 전체로서 참고문헌으로 통합된다. 본 발명의 다른 구현예들은 바이러스 벡터의 사용에 관한 것일 수 있으며, 이에 관해서는 미국 특허 출원 제13/092,085 호가 언급되며, 그의 내용은 본 명세서에 그 전체로서 참고문헌으로 통합된다. 조직-특이적 조절 요소는 해당 분야에 공지이며, 이에 관해서는 미국 특허 제7,776,321 호이 언급되며, 그의 내용은 본 명세서에 그 전체로서 참고문헌으로 통합된다.
일부 구현예에서, 조절 요소는 CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소에 작동 가능하게 연결되어 CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소의 발현을 유도한다. 일반적으로, SPIDR(스페이서 산재된 직접 반복)로도 알려져 는 CRISPR(클러스터링되고 규칙적으로 산재된 짧은 팔린드로믹 반복부)은 통상 특정 박테리아 종에 특이적인 DNA 유전자좌의 패밀리를 구성한다. CRISPR 유전자좌는 이.콜라이에서 인식되는 별개의 부류의 산재된 짧은 서열 반복부(SSR) 및 관련 유전자를 포함한다(문헌[Ishino et al., J. Bacteriol., 169:5429-5433 [1987]]; 및 문헌[Nakata et al., J. Bacteriol., 171:3553-3556 [1989]]). 유사한 산재된 SSR이 할로페락스 메디테라네이(Haloferax mediterranei), 스트렙토코커스 피오게네스, 아나바에나(Anabaena) 및 미코박테리움 튜베르큘로시스(Mycobacterium tuberculosis)에서 확인되었다(문헌[Groenen et al., Mol. Microbiol., 10:1057-1065 [1993]]; 문헌[Hoe et al., Emerg. Infect. Dis., 5:254-263 [1999]]; 문헌[Masepohl et al., Biochim. Biophys. Acta 1307:26-30 [1996]]; 및 문헌[Mojica et al., Mol. Microbiol., 17:85-93 [1995]] 참조). CRISPR 유전자좌는 통상적으로 SRSR(규칙적으로 산재된 짧은 반복부(short regularly spaced repeat))로 명명된 반복부의 구조가 다른 SSR과 상이하다(문헌[Janssen et al., OMICS J. Integ. Biol., 6:23-33 [2002]]; 및 문헌[Mojica et al., Mol. Microbiol., 36:244-246 [2000]]). 일반적으로, 반복부는 실질적으로 고정된 길이를 갖는 독특한 개재 서열에 의해 규칙적으로 산재된 클러스터에 존재하는 짧은 요소이다(상기 문헌[Mojica et al., [2000]]). 반복 서열이 균주들 간에 고도로 보존되어 있지만, 산재된 반복부의 수와 스페이서 영역의 서열은 통상적으로 균주마다 상이하다(문헌[van Embden et al., J. Bacteriol., 182:2393-2401 [2000]]). CRISPR 유전자좌는 40 개가 넘는 원핵생물에서 확인되며(예를 들어, Jansen 등의 Mol. Microbiol., 43:1565-1575 [2002]; 및 Mojica 등의 [2005] 참조), 에로피룸(Aeropyrum), 피로박쿨룸(Pyrobaculum), 설포로부스(Sulfolobus), 아캐오글로부스(Archaeoglobus), 할로카르쿨라(Halocarcula), 메타노박테리움, 메타노코커스, 메타노사르시나(Methanosarcina), 메타노피루스(Methanopyrus), 피로코커스, 피크로필루스(Picrophilus), 테르모플라스마, 코리네박테리움, 미코박테리움, 스트렙토마이세스, 아퀴펙스, 포르피로모나스, 클로로비움, 테르무스(Thermus), 바실러스, 리스테리아, 스태필로코커스, 클로스트리디움, 테르모언에어로박터, 미코플라스마, 푸소박테리움, 아자르쿠스(Azarcus), 크로모박테리움, 네이세리아, 니트로소모나스, 데술포비브리오(Desulfovibrio), 게오박터(Geobacter), 마익소코커스(Myxococcus), 캄필로박터, 올리넬라(Wolinella), 아시네토박터, 어위니아, 에스케리키아, 레지오넬라, 메틸로코커스, 파스퉤렐라(Pasteurella), 포토박테리움, 살모넬라, 크산토모나스, 여시니아, 트레포모나, 및 테르모토가(Thermotoga)를 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다.
일반적으로, 본 출원에서 사용되는 바와 같은 "핵산-표적화 시스템"은 핵산-표적화 CRISPR-회합된("Cas") 유전자(또한, 본 명세서에서 이펙터 단백질로 지칭됨)의 발현 또는 활성을 유도하는 데 수반된 다른 요소 및 전사물을 종합적으로 지칭하며, 이는 핵산-표적화 Cas(이펙터) 단백질 및 가이드 RNA(crRNA 서열 및 트랜스-활성화 CRISPR/Cas 시스템 RNA(tracrRNA) 서열을 포함)를 인코딩하는 서열 또는 핵산-표적화 CRISPR 유전자좌로부터의 전사물 및 다른 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산-표적화 시스템의 하나 이상의 요소는 제V형/제VI형 핵산-표적화 CRISPR 시스템으로부터 유도된다. 일부 구현예에서, 핵산-표적화 시스템의 하나 이상의 요소는 내인성 핵산-표적화 CRISPR 시스템을 포함하는 특정 생물로부터 유도된다. 일반적으로, 핵산-표적화 시스템은 표적 서열의 부위에서 핵산-표적화 복합체의 형성을 촉진하는 요소에 의해 특징지어진다. 핵산-표적화 복합체의 형성의 맥락에서, "표적 서열"은 가이드 서열이 이에 대해 상보성을 갖도록 설계되는 서열을 지칭하며, 여기서 표적 서열과 가이드 RNA 사이의 혼성화는 DNA 또는 RNA-표적화 복합체의 형성을 촉진한다. 혼성화를 유발하고 핵산-표적화 복합체의 형성을 촉진하기에 충분한 상보성이 있다면, 완전한 상보성이 반드시 요구되지는 않는다. 표적 서열은 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 세포의 핵 내 또는 세포질 내에 위치된다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 진핵 세포의 세포소기관 내, 예를 들어 미토콘드리아 또는 엽록체에 있을 수 있다. 표적 서열을 포함하는 표적화된 유전자좌 내로의 재조합을 위해 사용될 수 있는 서열 또는 주형은 "편집 주형" 또는 "편집 RNA" 또는 "편집 서열"로 지칭된다. 본 발명의 일 양태에서, 외인성 주형 RNA는 편집 주형으로서 지칭될 수 있다. 본 발명의 일 양태에서 재조합은 상동성 재조합이다.
전형적으로, 내인성 핵산-표적화 시스템의 맥락에서, 핵산-표적화 복합체(표적 서열에 혼성화되고, 하나 이상의 핵산-표적화 이펙터 단백질과 복합체화된 가이드 RNA를 포함함)의 형성은 표적 서열 내 또는 가까이에서(예를 들어, 이로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50 개 이상의 염기쌍) 하나 또는 2 개의 RNA 가닥의 절단을 초래한다. 일부 구현예에서, 핵산-표적화 시스템의 하나 이상의 요소의 발현을 유도하는 하나 이상의 벡터가 숙주 세포 내로 도입되어 핵산-표적화 시스템의 요소의 발현이 하나 이상의 표적 부위에서 핵산-표적화 복합체의 형성을 유도하도록 한다. 예를 들어, 핵산-표적화 이펙터 단백질 및 가이드 RNA는 각각 별개의 벡터 상에서 별개의 조절 요소에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 대안적으로, 동일하거나 상이한 조절 요소로부터 발현된 둘 이상의 요소가 단일 벡터 내에 조합될 수 있으며, 핵산-표적화 시스템의 임의의 성분을 제공하는 하나 이상의 추가적인 벡터는 첫번째 벡터에 포함되지 않는다. 단일 벡터 내에서 조합되는 핵산-표적화 시스템 요소는, 예를 들어 제2 요소에 대해 3'(이의 "다운스트림") 또는 제2 요소에 대해 5'(이의 "업스트림")에 위치되는 하나의 요소와 같이, 임의의 적합한 배향으로 배열될 수 있다. 일 요소의 코딩 서열은 제2 요소의 코딩 서열의 동일하거나 반대의 가닥 상에 위치될 수 있거나, 동일하거나 상이한 방향으로 배향된다. 일부 구현예에서, 단일 프로모터는 하나 이상의 인트론 서열 내에 임베딩된 가이드 RNA 및 핵산-표적화 이펙터 단백질을 인코딩하는 전사물의 발현을 유도할 수 있다(예를 들어, 상이한 인트론 내에서 각각, 적어도 하나의 인트론 내에서 둘 이상, 또는 단일 인트론 내에서 모두). 일부 구현예에서, 핵산-표적화 이펙터 단백질 및 가이드 RNA는 동일한 프로모터에 작동 가능하게 연결되고 발현된다.
일반적으로, 가이드 서열은 표적 서열과 혼성화하고, 핵산-표적화 복합체의 표적 서열로의 서열-특이적 결합을 유도하기에 충분한 표적 폴리뉴클레오티드와의 상보성을 갖는 임의의 폴리뉴클레오티드 서열이다. 일부 구현예에서, 가이드 서열과 이의 상응하는 표적 서열 간의 상보성 정도는, 적합한 정렬 알고리즘을 사용하여 최적으로 정렬된 경우, 약 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99% 이상 또는 이를 초과한다. 최적 정렬은 정렬 서열에 대한 임의의 적합한 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있으며, 이의 비제한적인 예는 스미스-워터만 알고리즘, 니들만-분쉬 알고리즘, 버로우즈-휠러 변환 기반 알고리즘(예를 들어, Burrows Wheeler Aligner), ClustalW, Clustal X, BLAT, Novoalign(Novocraft Technologies), ELAND(Illumina, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재), SOAP(soap.genomics.org.cn에서 이용 가능함), 및 Maq(maq.sourceforge.net에서 이용 가능함)를 포함한다. 일부 구현예에서, 가이드 서열은 길이가 약 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75 개 이상의 뉴클레오티드이거나 이를 초과한다. 일부 구현예에서, 가이드 서열은 길이가 약 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12 개 이하의 뉴클레오티드 미만이다. 표적 서열로의 핵산-표적화 복합체의 서열-특이적 결합을 지시하는 가이드 서열의 능력은 임의의 적절한 분석에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 시험되는 가이드 서열을 포함하는 핵산-표적화 복합체를 형성하기에 충분한 핵산-표적화 시스템의 성분은, 핵산-표적화 서열의 성분을 인코딩하는 벡터를 이용한 형질감염에 의해서와 같이 해당하는 표적 서열을 갖는 숙주 세포로 제공될 수 있으며, 본 명세서에 기재된 바와 같은 Surveyor 분석에 의해서와 같이, 표적 서열 내 또는 그 부근에서의 우선적인 절단의 평가로 이어질 수 있다. 유사하게, 표적 폴리뉴클레오티드 서열(또는 이의 부근의 서열)의 절단은 표적 서열, 즉 시험되는 가이드 서열 및 시험 가이드 서열과 상이한 대조군 가이드 서열을 포함하는 핵산-표적화 복합체의 성분을 제공하고, 표적 서열에서 또는 이 부근에서의 시험 및 대조군 가이드 서열 반응 간의 결합 또는 절단 속도를 비교함으로써 시험관에서 평가될 수 있다. 다른 분석이 가능하며, 이는 당업자에게 일어날 것이다.
가이드 서열은 임의의 표적 서열을 표적화하도록 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 유전자 전사물 또는 mRNA 내 서열이다.
일부 구현예에서, 표적 서열은 세포의 게놈 내 서열이다.
일부 구현예에서, 가이드 서열은 가이드 서열 내 2차 구조의 정도를 감소시키도록 선택된다. 2차 구조는 임의의 적합한 폴리뉴클레오티드 폴딩 알고리즘에 의해 결정될 수 있다. 일부 프로그램은 최소 깁스 자유 에너지 계산을 기반으로 한다. 이와 같은 한 알고리즘의 예는 mFold이며, 이는 문헌[Zuker and Stiegler, Nucleic Acids Res. 9(1981), 133-148]에 기재된 바와 같다. 또 다른 예의 폴딩 알고리즘은, 비엔나 대학의 이론 화학 연구소에서 개발된, 중심 구조 예측 알고리즘을 사용하는, 온라인 웹서버 RNAfold이다(예를 들어, 문헌[A.R. Gruber et al., 2008, Cell 106(1): 23-24]; 및 [PA Carr and GM Church, 2009, Nature Biotechnology 27(12): 1151-62] 참조). 추가의 알고리즘은 미국 출원 일련 번호 TBA(대리인 도켓 44790.11.2022; 브로드 레퍼런스 BI-2013/004A)에서 찾을 수 있으며; 이는 본 명세서에 참조로서 포함된다.
일부 구현예에서, 핵산-표적화 이펙터 단백질은 하나 이상의 이종성 단백질 도메인(예를 들어, 핵산-표적화 이펙터 단백질에 추가적으로, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개 이상 또는 이를 초과하는 도메인)을 포함하는 융합 단백질의 일부이다. 일부 구현예에서, CRISPR 이펙터 단백질/효소는 하나 이상의 이종성 단백질 도메인(예를 들어, CRISPR 효소에 추가적으로, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개 이상 또는 이를 초과하는 도메인)을 포함하는 융합 단백질의 일부이다. CRISPR 이펙터 단백질/효소 융합 단백질은 임의의 추가의 단백질 서열 및 선택적으로 임의의 2 개 도메인 사이의 링커 서열을 포함할 수 있다. 이펙터 단백질에 융합될 수 있는 단백질 도메인의 예는 제한 없이, 에피토프 태그, 리포터 유전자 서열 및 하기의 활성 중 하나 이상을 갖는 단백질 도메인을 포함한다: 메틸라제 활성, 데메틸라제 활성, 전사 활성화 활성, 전사 억제 활성, 전사 방출 인자 활성, 히스톤 변형 활성, RNA 절단 활성, 및 핵산 결합 활성. 에피토프 태그의 비제한적인 예는 히스티딘(His) 태그, V5 태그, FLAG 태그, 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 태그, Myc 태그, VSV-G 태그 및 티오레독신(Trx) 태그를 포함한다. 리포터 유전자의 예는, 이로 한정되지 않지만, 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST), 호스라디시(horseradish) 과산화효소(HRP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT) 베타-갈락토시다제, 베타-글루쿠로니다제, 루시퍼라제, 녹색 형광 단백질(GFP), HcRed, DsRed, 청록색 형광 단백질(CFP), 황색 형광 단백질(YFP) 및 청색 형광 단백질(BFP)을 포함하는 자가형광 단백질을 포함한다. 핵산-표적화 이펙터 단백질은 DNA 분자에 결합하거나, 이에 한정되지 않지만, 말토스 결합 단백질(MBP), S-태그, Lex A DNA 결합 도메인(DBD) 융합물, GAL4 DNA 결합 도메인 융합물 및 단순 포진 바이러스(HSV) BP16 단백질 융합체물을 포함하는 다른 세포 분자에 결합하는 단백질 또는 단백질의 단편을 인코딩하는 유전자 서열에 융합될 수 있다. 핵산-표적화 이펙터 단백질을 포함하는 융합 단백질의 부분을 형성할 수 있는 추가의 도메인은 본 명세서에 참고 문헌으로 포함되는 US20110059502에 기재되어 있다. 일부 구현예에서, 태그가 부착된 핵산-표적화 이펙터 단백질을 사용하여 표적 서열의 위치를 확인한다.
일부 구현예에서, CRISPR 효소는 유도성 시스템의 성분을 형성할 수 있다. 이 시스템의 유도성 성질은 에너지 형태를 사용하여 유전자 편집이나 유전자 발현의 시공간적 제어를 가능하게 할 것이다. 에너지의 형태는 이에 한정되지 않이지만, 전자기 방사, 음향 에너지, 화학 에너지 및 열 에너지를 포함할 수 있다. 유도성 시스템의 예는 테트라사이클린 유도성 프로모터(Tet-온 또는 Tet-오프), 소분자 2-하이브리드 전사 활성화 시스템(FKBP, ABA 등), 또는 광 유도성 시스템(피토크롬, LOV 도메인, 또는 크립토크롬)을 포함한다. 일 구현예에서, CRISPR 효소는 서열-특이적 방식으로 전사 활성에서의 변화를 유도하기 위한 광 유도성 전사 이펙터(LITE)의 일부일 수 있다. 광의 성분은 CRISPR 효소, 광-반응성 시토크롬 이형이량체(예를 들어, 아라비돕시스 탈리아나 유래), 및 전사 활성화/억제 도메인을 포함할 수 있다. 유도성 DNA 결합 단백질 및 이의 사용을 위한 방법의 추가의 예는 US 61/736465 및 US 61/721,283 및 WO 2014/018423 및 US8889418, US8895308, US20140186919, US20140242700, US20140273234, US20140335620, WO2014093635에서 제공되며, 이는 전체가 참조로서 본 명세서에 포함된다.
일부 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 폴리뉴클레오티드, 하나 이상의 벡터, 하나 이상의 이의 전사물, 및/또는 이로부터의 하나 이상의 단백질을 숙주 세포에 전달하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 이와 같은 방법에 의해 생산된 이와 같은 세포, 및 상기 세포를 포함하거나 상기 세포로부터 생산된 생물(예를 들어, 동물, 식물, 또는 균류)를 제공한다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA와 조합된(및 선택적으로 이와 복합체화된) 핵산-표적화 이펙터 단백질은 세포로 전달된다. 통상의 바이러스 및 비-바이러스 기반 유전자 수송 방법이 포유류 세포 또는 표적 조직 내로 핵산을 도입시키는 데 사용될 수 있다. 이와 같은 방법은 핵산-표적화 시스템의 성분을 인코딩하는 핵산을 배양물, 또는 숙주 생물 내 세포로 투여하는 데 사용될 수 있다. 비-바이러스 벡터 전달 시스템은 DNA 플라스미드, RNA(예를 들어, 본 명세서에 기재된 벡터의 전사물), 네이키드 핵산, 및 리포좀과 같은 전달 비히클과 복합체화된 핵산을 포함한다. 바이러스 벡터 전달 시스템은 DNA 및 RNA 바이러스를 포함하며, 이는 세포로의 전달 후 에피솜 또는 통합된 게놈 중 하나를 갖는다. 유전자 치료법 절차의 검토에 대해서는, 문헌[Anderson, Science 256:808-813(1992)]; [Nabel & Felgner, TIBTECH 11:211-217(1993)]; [Mitani & Caskey, TIBTECH 11:162-166(1993)]; [Dillon, TIBTECH 11:167-175(1993)]; [Miller, Nature 357:455-460(1992)]; [Van Brunt, Biotechnology 6(10):1149-1154(1988)]; [Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36(1995)]; [Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31-44(1995)]; [Haddada et al., in Current Topics in Microbiology and Immunology, Doerfler and Bohm(eds)(1995)]; 및 [Yu et al., Gene Therapy 1:13-26(1994)]을 참조한다.
핵산의 비-바이러스 전달 방법은 리포펙션, 뉴클레오펙션, 미세주입, 바이오리스틱스, 비로좀, 리포좀, 면역리포좀, 다가양이온 또는 지질:핵산 컨쥬게이트, 네이키드 DNA, 인공 비리온, 및 DNA의 제제-향상 흡수를 포함한다. 리포펙션은, 예를 들어 미국 특허 5,049,386, 4,946,787; 및 4,897,355에 기재되어 있으며, 리포펙션 시약은 상업적으로 판매된다(예를 들어, 형질감염am™ 및 Lipofectin™). 폴리뉴클레오티드의 효율적인 수용체-인식 리포펙션에 대해 적합한 양이온성 및 중성 지질은 Felgner의 WO 91/17424; WO 91/16024의 것을 포함한다. 전달은 세포(예를 들어, 시험관내 또는 생체외 투여) 또는 표적 조직(예를 들어, 생체내 투여)으로 이루어질 수 있다.
면역지질 복합체와 같은 표적화된 리포좀을 포함하는, 지질:핵산 복합체의 제조는 당업자에게 잘 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Crystal, Science 270:404-410(1995)]; [Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2:291-297(1995)]; [Behr et al., Bioconjugate Chem. 5:382-389(1994)]; [Remy et al., Bioconjugate Chem. 5:647-654(1994)]; [Gao et al., Gene Therapy 2:710-722(1995)]; [Ahmad et al., Cancer Res. 52:4817-4820(1992)]; 미국 특허 4,186,183, 4,217,344, 4,235,871, 4,261,975, 4,485,054, 4,501,728, 4,774,085, 4,837,028, 및 4,946,787 참조).
핵산 전달을 위한 RNA 또는 DNA 바이러스 기반 시스템의 사용은 바이러스를 체내 특정 세포로 표적화하고, 핵으로의 바이러스 페이로드(payload)를 수송하기 위한 매우 진화된 공정을 이용한다. 바이러스 벡터는 환자에게 직접(생체내) 투여될 수 있거나, 또는 이들은 시험관내에서 세포를 처리하는 데 사용될 수 있고, 변형된 세포는 환자에게 선택적으로 투여될 수 있다(생체외). 통상의 바이러스 기반 시스템은 유전자 운반을 위해 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 및 단순포진 바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 숙주 게놈 내 통합은 레트로바이러스, 렌티바이러스, 및 아데노-관련 바이러스 유전자 운반 방법에서 가능하며, 이는 종종 삽입된 전이유전자의 장기간 발현을 초래한다. 추가적으로, 높은 형질도입 효능은 많은 상이한 세포 유형 및 표적 조직에서 관찰되었다.
레트로바이러스의 친화성은 외부 외피 단백질을 통합하여 변경될 수 있으며, 이는 표적 세포의 잠재적 표적 집단을 확장한다. 렌티바이러스 벡터는 비-분열 세포를 형질도입하거나 감염하고 통상적으로 높은 바이러스 역가를 생산할 수 있는 레트로바이러스 벡터이다. 그러므로, 레트로바이러스 유전자 이동 시스템의 선택은 표적 조직에 의존할 것이다. 레트로바이러스 벡터는 최대 6 kb 내지 10 kb까지의 외부 서열에 대한 패키징 능력을 갖는 cis-작용의 긴 말단 반복부로 구성된다. 최소한의 cis-작용 LTR은 벡터의 복제 및 패키징에 대하여 충분하며, 이들은 그 후 표적 세포 내로 치료적 유전자를 통합하는 데 사용되어 영구적인 전이유전자 발현을 제공한다. 널리 사용된 레트로바이러스 벡터는 뮤린 백혈병 바이러스(MuLV), 기본 유인원(gibbon ape) 백혈병 바이러스(GaLV), 원숭이 면역결핍 바이러스(SIV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 및 이들의 조합을 기반으로 한 벡터를 포함한다(예를 들어, 문헌[Buchscher et al., J. Virol. 66:2731-2739(1992)]; [Johann et al., J. Virol. 66:1635-1640(1992)]; [Sommnerfelt et al., Virol. 176:58-59(1990)]; [Wilson et al., J. Virol. 63:2374-2378(1989)]; [Miller et al., J. Virol. 65:2220-2224(1991)]; PCT/US94/05700 참조). 일시적인 발현이 바람직한 적용에서, 아데노바이러스 기반 시스템이 사용될 수 있다. 아데노바이러스 기반 벡터는 많은 세포 유형에서 매우 높은 형질도입 효율을 가능하게 하며 세포 분열을 필요로 하지 않는다. 이와 같은 벡터로, 높은 역가 및 발현 수준이 수득되었다. 이 벡터는 상대적으로 간단한 시스템에서 다량으로 생산될 수 있다. 아데노-관련 바이러스("AAV") 벡터는 또한, 예를 들어 핵산 및 펩티드의 시험관내 생산에서, 그리고 생체내 및 생체외 유전자 치료법 과정을 위해 세포를 표적 핵산으로 세포 형질도입시키는 데 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[West et al., Virology 160:38-47(1987)]; 미국 특허 4,797,368; WO 93/24641; 문헌[Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801(1994)]; [Muzyczka, J. Clin. Invest. 94:1351(1994)] 참조). 재조합 AAV 벡터의 구성은 미국 특허 5,173,414; 문헌[Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260(1985)]; [Tratschin, et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081(1984)]; [Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:6466-6470(1984)]; 및 [Samulski et al., J. Virol. 63:03822-3828(1989)]을 포함하여, 다수의 간행물에 기재되어 있다.
유전적 및 후성적 조건의 모델
본 발명의 방법은, 예를 들어 관심 돌연변이의 모델 또는 질병 모델을 통하여, 질병 모델로서 사용될 수 있는 식물, 동물 또는 세포를 형성하고/형성하거나 관심 유전적 또는 후성적 질환을 연구하는 데 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이 "질병"은 대상체에서 질병, 장애 또는 징후를 지칭한다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 질병과 연관된 하나 이상의 핵산 서열에서의 변형을 포함하는 동물 또는 세포, 또는 질병과 연관된 하나 이상의 핵산 서열의 발현이 변경된 식물, 동물 또는 세포를 만드는 데 사용될 수 있다. 그러한 핵산 서열은 질병 관련 단백질 서열을 인코딩할 수 있거나, 질병 관련 제어 서열일 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 일 구현예에서, 식물, 대상체, 환자, 생물 또는 세포는 비-인간 대상, 환자, 생물 또는 세포일 수 있는 것으로 이해된다. 따라서, 본 발명은 본 발명에 의해 생산된, 식물, 동물 또는 세포, 또는 그의 자손을 제공한다. 그 자손은 생산된 식물 또는 동물의 클론일 수 있거나, 추가의 바람직한 특성을 그의 자손에게 유전자 이입(introgress)하기 위해 동일 종의 다른 개체와의 교잡에 의한 유성 생식으로부터의 것일 수 있다. 세포는 다세포 생물, 특히 동물 또는 식물의 경우 생체내 또는 생체외일 수 있다. 세포가 배양된 경우, 적절한 배양 조건이 맞추어지고 바람직하게는 세포가 이러한 목적을 위해 적합하게 조정되는 경우 세포주가 수립될 수 있다(예를 들어, 줄기 세포). 본 발명에 의해 생산된 박테리아 세포주가 또한 고려된다. 이에 따라, 세포주 또한 고려된다.
일부 방법에서, 질병 모델은 동물 또는 세포에서 돌연변이의 효과 및 질병 연구에서 흔히 사용되는 기준을 이용하여 질병의 발생 및/또는 진전을 연구하는 데 사용될 수 있다. 대안적으로, 그러한 질병 모델은 약학 활성 화합물의 질병에 대한 효과를 연구하는 데 유용하다.
일부 방법에서, 질병 모델은 잠재적인 유전자 치료 전략의 효능을 평가하는데 사용될 수 있다. 즉, 질병-관련 유전자 또는 폴리뉴클레오티드는 질병 발생 및/또는 진전이 저해 또는 감소되도록 변형될 수 있다. 특히, 방법은 변경된 단백질이 생산되고, 그 결과 동물 또는 세포가 변경된 반응을 갖도록 질병 관련 유전자 또는 폴리뉴클레오티드를 변형시키는 것을 포함한다. 따라서, 일부 방법에서, 유전학적으로 변형된 동물은, 유전자 치료법 이벤트의 효과가 평가될 수 있도록, 질병이 발생되기 쉬운 동물에 비교될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은, 질병 유전자와 연관된 세포 신호화 이벤트를 조절하는 생물학적 활성제의 개발 방법을 제공한다. 본 방법은 하나 이상의 CRISPR 효소, 및 가이드 서열에 연결된 직접 반복 서열의 발현을 유도하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 세포와 시험 화합물을 접촉시키는 단계; 및 예를 들어 세포 내에 포함된 질병 유전자 내 돌연변이와 연관된 세포 신호화 이벤트의 감소 또는 증강을 나타내는 판독값에서의 변화를 검출하는 단계를 포함한다.
세포 모델 또는 동물 모델은 세포 작용 변화를 스크리닝하기 위한 본 발명의 방법과 조합되어 구축될 수 있다. 그러한 모델은 본 발명의 CRISPR 복합체에 의해 변형된 게놈 서열의 관심 세포 작용에 대한 효과를 연구하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 세포 작용 모델은 변형된 게놈 서열의 세포내 신호화 또는 세포외 신호화에 대한 효과를 연구하는 데 사용될 수 있다. 대안적으로, 세포 작용 모델은 변형된 게놈 서열의 감각 인지에 대한 효과를 연구하는 데 사용될 수 있다. 그러한 일부 모델에서, 모델 내 신호화 생화학 경로와 연관된 하나 이상의 게놈 서열은 변형된다.
몇몇 질병 모델은 특히 연구되어 왔다. 이들은 새로운 자폐증 위험 유전자 CHD8, KATNAL2, 및 SCN2A; 및 증후군성 자폐증(엔젤만(Angelman) 증후군) 유전자 UBE3A를 포함한다. 이들 유전자 및 결과의 자폐증 모델은 물론 바람직하지만, 유전자 및 상응하는 모델에 걸친 본 발명의 광범위한 적용성을 나타내는 역할을 한다.
신호화 생화학 경로와 연관된 하나 이상의 게놈 서열의 변경된 발현은, 시험 모델 세포와 대조구 세포들이 후보물질과 접촉되는 경우, 시험 모델 세포와 대조구 세포들 간의 상응 유전자의 mRNA 수준에서의 차이에 대한 분석에 의해 결정될 수 있다. 대안적으로, 신호화 생화학 경로와 연관된 서열의 차등 발현은 인코딩된 폴리뉴클레오티드 또는 유전자 생성물의 수준에서의 차이를 검출함으로써 결정된다.
mRNA 전사물 또는 상응하는 폴리뉴클레오티드의 수준에서 약제-유도된 변경을 분석하기 위하여, 샘플 내 포함된 핵산을 먼저 해당 분야의 표준 방법에 따라 추출한다. 예를 들어, mRNA는 문헌 [Sambrook et al.(1989)]에 설명된 절차에 따라 각종 용균 효소 또는 화학 용액을 이용하여 분리될 수 있거나, 제조자에 의해 제공된 첨부 안내서에 따라 핵산-결합 수지에 의해 추출될 수 있다. 추출된 핵산 샘플 내에 포함된 mRNA는 이후 당 분야에서 공지된 방법 또는 본 명세서에서 예시된 방법에 기초한, 증폭 절차 또는 통상의 혼성화 분석(예를 들어, 노던 블롯 분석)에 의해 검출된다.
본 발명의 목적을 위하여, 증폭은 타당한 충실도로 표적 서열을 복제할 수 있는 폴리머라제 및 프라이머를 사용하는 임의의 방법을 의미한다. 증폭은 천연 또는 재조합 DNA 폴리머라제, 예를 들어, TaqGold™, T7 DNA 폴리머라제, 이.콜라이 DNA 폴리머라제의 클레나우 단편 및 역전사효소에 의해 수행될 수 있다. 바람직한 증폭 방법은 PCR이다. 특히, 분리된 RNA는 신호화 생화학 경로와 연관된 서열의 발현 수준을 정량화하기 위하여 정량적 폴리머라제 연쇄반응과 연결된 역전사 분석(RT-PCR) 처리될 수 있다.
유전자 발현의 검출은 증폭 분석에서 실시간으로 수행될 수 있다. 일 양태에서, 증폭된 생성물은 이에 한정되지 않지만 DNA 삽입제 및 DNA 홈 결합제를 포함하는 형광 DNA-결합제로 직접 시각화될 수 있다. 이중-가닥 DNA 분자 내로 혼입된 삽입제의 양은 통상적으로 증폭된 DNA 생성물의 양에 비례하기 때문에, 증폭된 생성물의 양은 해당 분야의 통상적인 광학 시스템을 이용하여 삽입된 염료의 형광을 정량화함으로써 편리하게 결정될 수 있다. 본 적용에 적합한 DNA-결합 염료는 SYBR 녹색, SYBR 청색, DAPI, 프리디늄 요오드, 회스트(Hoeste), SYBR 금색, 에티디윰 브로마이드, 아크리딘, 프로플라빈, 아크리딘 오렌지, 아크리플라빈, 플루오르쿠마린, 엘립티신, 다우노마이신, 클로로퀸, 디스타마이신 D, 크로모마이신, 호미디윰, 미트라마이신, 루테늄 폴리피리딜스, 안트라마이신 등을 포함한다.
또 다른 양태에서, 서열 특이적 프로브와 같은 기타 형광 표지는, 증폭된 생성물의 검출 및 정량화를 촉진하기 위하여 증폭 반응에서 사용될 수 있다. 프로브-기준 정량적 증폭은 원하는 증폭 생성물의 서열-특이적 검출에 의존한다. 이는 형광, 표적-특이적 프로브(예를 들어, TaqMan® 프로브)를 이용하여, 그 결과 특이성 및 감도를 증가시킨다. 프로브-기준 정량적 증폭의 수행 방법은 당 기술 분야에서 잘 확립되어 있으며, 미국 특허 제5,210,015 호에 교시되어 있다.
그러나 또 다른 양태에서, 신호화 생화학 경로와 연관된 서열과 상동성을 공유하는 혼성화 프로브를 이용하는 통상의 혼성화 분석이 수행될 수 있다. 전형적으로, 프로브는, 혼성화 반응에서 시험 대상체로부터 유래된 생물학적 샘플 내에 포함된 신호화 생화학 경로와 연관된 서열과 안정한 복합체를 형성하는 것을 가능하게 한다. 안티센스가 프로브 핵산으로서 사용된 경우, 샘플 내에 제공된 표적 폴리뉴클레오티드는 그 안티센스 핵산의 서열에 상보적이도록 선택됨을 해당 분야의 숙련자는 이해할 것이다. 역으로, 뉴클레오티드 프로브가 센스 핵산인 경우, 표적 폴리뉴클레오티드는 센스 핵산의 서열에 상보적이도록 선택된다.
혼성화는 각종 엄격성 조건 하에서 수행될 수 있다. 본 발명의 실시에 적합한 혼성화 조건은 프로브와 신호화 생화학 경로와 연관된 서열 간의 인식 상호작용이 충분히 특이적이고 충분히 안정적이도록 하는 것이다. 혼성화 반응의 엄격성을 증가시키는 조건은 해당 기술 분야에서 공지 및 공개되어 있다. 예를 들어, 문헌[(Sambrook, et al.,(1989); Nonradioactive In Situ Hybridization Application Manual, Boehringer Mannheim, second edition)] 참조. 혼성화 분석은, 이에 한정되지 않지만 니트로셀룰로스, 유리, 규소, 및 각종 유전자 어레이를 포함하는 임의의 고체 기재 상에 고정화된 프로브를 이용하여 형성될 수 있다. 바람직한 혼성화 분석은 미국 특허 5,445,934에 기재된 바와 같은 고밀도 유전자 칩 상에서 수행된다.
혼성화 분석 동안 형성된 프로브-표적 복합체의 편리한 검출을 위하여, 뉴클레오티드 프로브는 검출 가능한 표지에 컨쥬게이트된다. 본 발명에서의 이용에 적합한 검출 가능한 표지는 광화학, 생화학, 분광학 면역 화학, 전기, 광학 또는 화학적 수단에 의해 검출 가능한 임의의 조성물을 포함한다. 광범위한 종류의 적절한 검출 가능한 표지는 해당 분야에서 알려져 있으며, 이는 형광 또는 화학발광 표지, 방사성 동위원소 표지, 효소 또는 기타 리간드를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 형광 표지 또는 효소 태그, 예를 들어 디곡시제닌, β-갈락토시다제, 우레아제, 알칼리성 포스파타제 또는 퍼옥시다제, 아비딘/바이오틴 복합체가 바람직하게 사용될 것이다.
혼성화 또는 강도를 검출 또는 정량화하는 데 사용되는 검출 방법은 통상적으로 상기 선택된 표지에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 방사성표지는 사진 필름 또는 포스포이미저(phosphoimager)를 이용하여 검출될 수 있다. 형광 마커는 방출된 광을 검출하기 위한 광검출기를 이용하여 검출 및 정량화될 수 있다. 효소 표지는 통상적으로 효소에 기재를 제공하고, 효소의 작용에 의해 기재 상에 생성된 반응 생산물을 측정하여 검출되고; 최종적으로 비색성 표지는 착색된 표지를 단순히 시각화함으로써 검출된다.
신호화 생화학 경로와 연관된 서열의 발현에서의 약제-유도된 변화는 상응하는 유전자 생성물을 검사함으로써 결정될 수도 있다. 단백질 수준의 결정은 통상적으로, a) 생물학적 샘플 내에 포함된 단백질을, 신호화 생화학 경로와 연관된 단백질에 특이적으로 결합하는 약제와 접촉시키는 단계; 및 b) 그렇게 형성된 어떤 약제:단백질 복합체를 확인하는 확인하는 단계를 포함한다. 이러한 구현예의 일 양태에서, 신호화 생화학 경로와 연관된 단백질에 특이적으로 결합하는 약제는 항체, 바람직하게는 단일클론성 항체이다.
반응은 그 약제를, 시험 샘플로부터 유래된 신호화 생화학 경로와 연관된 단백질의 샘플과, 그 약제와 신호화 생화학 경로와 연관된 단백질간에 복합체가 형성되는 것을 가능하게 하는 조건 하에서 접촉시킴으로써 수행된다. 복합체의 형성은 해당 기술 분야의 표준 절차에 따라 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있다. 직접 검출 방법에서, 약제에는 검출 가능한 표지가 공급되고, 미반응된 약제는 복합체로부터 제거될 수 있으며; 따라서 남아있는 표지의 양은 형성된 복합체의 양을 나타낸다. 그러한 방법의 경우, 엄격한 세척 조건 동안에도 약제에 부착된 채로 잔류하는 표지를 선택하는 것이 바람직하다. 표지는 결합 반응을 간섭하지 않는 것이 바람직하다. 대안에서, 간접적 검출 절차는, 화학적으로 또는 효소적으로 도입된 표지를 함유하는 약제를 사용할 수 있다. 바람직한 표지는 일반적으로 결합 또는 그 결과의 약제:폴리펩티드 복합체의 안정성을 간섭하지 않는다. 그러나, 표지는 전형적으로 효과적인 결합 및 그에 따라 검출 가능한 신호를 생성하기 위하여 항체에 접근 가능하도록 설계된다.
단백질 수준을 검출하는 데 적합한 광범위한 각종 표지는 당 기술 분야에서 알려져 있다. 비제한적인 예로는 방사성동위원소, 효소, 콜로이드성 금속, 형광 화합물, 생물발광 화합물, 및 화학발광 화합물이 포함된다.
결합 반응 동안 형성된 약제:폴리펩티드 복합체의 양은 표준 정량 분석에 의해 정량화될 수 있다. 상기 예시된 바와 같이, 약제:폴리펩티드 복합체의 형성은 결합 부위에서 유지된 표지의 양에 의해 직접적으로 측정될 수 있다. 대안에서, 신호화 생화학 경로와 연관된 단백질은, 특정 약제 상의 결합 부위에 대해 표지된 유사체와 경쟁하는 그의 능력에 대해 시험된다. 이러한 경쟁적 분석에서, 포착된 표지의 양은 시험 샘플에 존재하는 신호화 생화학 경로와 연관된 단백질 서열의 양에 역비례한다.
상기 개괄된 일반 원칙을 기준으로 한 다수의 단백질 분석 기술은 해당 기술분야에서 이용 가능하다. 그들은 이에 한정되지 않지만, 방사성면역분석, ELISA(효소 결합 면역흡착 분석), "샌드위치" 면역분석, 면역방사계 분석, 제위치 면역분석(예를 들어, 콜로이드성 금, 효소 또는 방사성동위원소 표지를 이용), 웨스턴 블롯 분석, 면역침강 분석, 면역형광 분석, 및 SDS-PAGE를 포함한다.
신호화 생화학 경로와 연관된 단백질을 특이적으로 인식 또는 결합하는 항체는 상기 언급된 단백질 분석을 수행하는 것이 바람직하다. 바람직한 경우, 번역후 변형의 특이적 유형(예를 들어, 신호화 생물학 경로 유도성 변형)을 인식하는 항체가 사용될 수 있다. 번역후 변형은 이에 한정되지 않지만, 글리코실화, 지질화, 아세틸화 및 인산화를 포함한다. 이들 항체는 판매업체로부터 구매할 수 있다. 예를 들어, 티로신-포스포릴화 단백질을 특이적으로 인식하는 항-포스포티로신 항체가 Invitrogen 및 Perkin Elmer를 포함하는 다수의 판매사로부터 입수 가능하다. 항 포스포티로신 항체는, 특히 ER 스트레스에 반응하여 그의 티로신 잔기 상에서 별도로 포스포릴화된 단백질을 검출하는 데 있어서 특히 이용 가능하다. 그러한 단백질은 이에 한정되지 않지만, 진핵성 번역 개시 인자 2 알파(eIF-2α)가 포함된다. 대안적으로, 이들 항체는 통상의 다클론성 또는 단일클론성 항체 기술을 이용하여, 숙주 동물 또는 항체-생산 세포를 바람직한 번역후 변형을 나타내는 표적 단백질로 면역화함으로써 생성될 수 있다.
본 방법을 실시하는 데 있어서, 상이한 신체 조직에서, 상이한 세포 유형에서, 및/또는 상이한 하위세포 작제물에서 신호화 생화학 경로와 연관된 단백질의 발현 패턴을 식별하는 것이 바람직할 수 있다. 이들 연구는, 특정 조직, 세포 유형 또는 하위 구조 내에서 우선적으로 발현되는 단백질 마커에 결합할 수 있는 조직-특이적, 세포-특이적 또는 하위세포 구조 특이적 항체를 이용하여 수행될 수 있다.
신호화 생화학 경로와 연관된 유전자의 변경된 발현은 또한 제어 세포에 대하여 유전자 생성물의 활성에서의 변화를 시험함으로써 결정될 수 있다. 신호화 생화학 경로와 연관된 단백질의 활성에서의 약제-유도된 변화에 대한 분석은, 연구 중에 있는 생물학적 활성 및/또는 신호 형질도입 경로에 의존할 것이다. 예를 들어, 단백질이 키나아제인 경우, 다운스트림 기재(들)를 포스포릴화하는 그의 능력에서의 변화는 해당 기술에서 알려진 각종 분석에 의해 결정될 수 있다. 대표적인 분석으로는 이에 한정되지 않이지만, 포스포릴화 단백질을 인식하는 포스포릴화 항-포스포티로신 항체와 같은 항체를 이용하는 면역블롯팅 및 면역침강이 포함된다. 추가적으로, 키나아제 활성은, AlphaScreen™(Perkin Elmer로부터 입수 가능) 및 eTag™ 분석(문헌[Chan-Hui, et al.(2003) Clinical Immunology 111: 162-174])와 같은 고처리량(high throughput) 화학발광 분석에 의해 검출될 수 있다.
신호화 생화학 경로와 연관된 단백질이 세포 내 pH 조건의 동요를 일으키는 신호화 캐스케이드(cascade) 반응의 일부인 경우, 형광 pH 염료와 같은 pH 민감성 분자가 리포터 분자로서 사용될 수 있다. 또 다른 예에서, 신호화 생화학 경로와 연관된 단백질이 이온 채널인 경우, 막 전위 및/또는 세포내 이온 농도에서의 동요는 모니터링될 수 있다. 다수의 상용 키트 및 고속 처리 장치는 이온 채널의 조절제에 대한 신속하고 강건한 스크리닝에 특히 적합하다. 대표적인 기기로는 FLIPRTM(Molecular Devices, Inc.) 및 VIPR(Aurora Biosciences)가 포함된다. 이들 기기는 마이크로플레이트의 1000 개가 넘는 샘플 웰 내 반응들을 검출할 수 있고, 1 초 또는 심지어 밀리 초(minisecond) 내의 실시간 측정 및 작용 데이터를 제공할 수 있다.
본 명세서에 개시된 임의의 방법의 실시에 있어서, 적합한 벡터가, 이에 한정되지 않지만, 미세주입, 전기천공, 소노포레이션(sonoporation), 바이오리스틱스, 칼슘 포스페이트-매개 트랜스펙션, 양이온 트랜스펙션, 리포좀 트랜스펙션, 덴드리머 트랜스펙션, 열 충격 트랜스펙션, 뉴클레오펙션 트랜스펙션, 마그네토펙션, 리포펙션, 임페일펙션, 광학 트랜스펙션, 핵산의 전용 제제-증진 흡수, 및 리포좀, 면역리포좀, 비로좀 또는 인공 비리온을 통한 전달을 포함하는 해당 분야에 알려진 하나 이상의 방법을 통해서 세포 또는 배아에 도입될 수 있다. 일부 방법에서, 벡터는 미세주입에 의해 배아 내로 도입된다. 벡터 또는 벡터들은 핵 내로 또는 배아의 세포질 내로 미세주입될 수 있다. 일부 방법에서, 벡터 또는 벡터들은 뉴클레오펙션(nucleofection)에 의해 세포 내로 도입될 수 있다.
CRISPR 복합체의 표적 폴리뉴클레오티드는 진핵 세포에 대해 내생 또는 외인성 임의의 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 예를 들어, 표적 폴리뉴클레오티드는 진핵 세포의 핵 내에 존재하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 표적 폴리뉴클레오티드는 유전자 생성물을 코딩하는 서열(예를 들어, 단백질) 또는 비-코딩 서열(예를 들어, 조절 폴리뉴클레오티드 또는 정크 DNA)일 수 있다.
표적 폴리뉴클레오티드의 예는 신호화 생화학 경로, 예를 들어 신호화 생화학 경로와 연관된 서열, 예를 들어 신호화 생화학 경로-연관 유전자 또는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 표적 폴리뉴클레오티드의 예는 질병 관련 유전자 또는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. "질병-관련된" 유전자 또는 폴리뉴클레오티드는, 비-질병 대조군의 조직 또는 세포에 비하여 질병-발생된 조직으로부터 유도된 세포에서의 비정상 수준 또는 비정상 형태의 전사 또는 번역 생성물을 산출하는 임의의 유전자 또는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 이는 비정상적으로 높은 수준으로 발현된 유전자일 수 있고; 비정상적으로 낮은 수준으로 발현되는 유전자일 수 있으며, 여기서 변경된 발현은 질병의 발생 및/또는 진전과 상관관계가 있다. 질병-관련 유전자는 또한, 질병의 병인론에 책임이 있는 유전자(들)와의 연결 불균형 상태 또는 직접적으로 책임이 있는 유전자 가공 돌연변이(들) 또는 유전 변이를 지칭한다. 전사된 또는 번역된 생성물은 공지되거나 공지되지 않은 것일 수 있으며, 정상 또는 비정상 수준일 수 있다.
CRISPR 복합체의 표적 폴리뉴클레오티드는 진핵 세포에 대해 내인성 또는 외인성인 임의의 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 예를 들어, 표적 폴리뉴클레오티드는 진핵 세포의 핵 내에 존재하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 표적 폴리뉴클레오티드는 유전자 생성물(예를 들어, 단백질)을 코딩하는 서열 또는 비-코딩 서열(예를 들어, 조절 폴리뉴클레오티드 또는 정크 DNA)일 수 있다. 이론에 의해 구애되고자 하지 않지만, 표적 서열은 PAM(프로토스페이서 인접 모티프)와 연관되어야 하는 것으로 여겨지며; 이는 CRISPR 복합체에 의해 인식된 짧은 서열이다. PAM에 대한 정확한 서열 및 길이 요구사항은 사용된 CRISPR 효소에 따라 다르지만, PAM은 프로토스페이서(즉, 표적 서열)에 인접한 통상적으로 2 내지 5 개의 염기쌍 서열이다. PAM 서열의 예는 하기 예의 섹션에서 제공되며, 숙련자는 주어진 CRISPR 효소와의 이용을 위한 추가의 PAM 서열을 확인할 수 있을 것이다.
CRISPR 복합체의 표적 폴리뉴클레오티드는 다수의 질병-관련 유전자 및 폴리뉴클레오티드뿐만 아니라, 신호화 생화학 경로-관련 유전자 및 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 이는 각각 "SYSTEMS METHODS AND COMPOSITIONS FOR SEQUENCE MANIPULATION"라는 명칭으로 2012년 12월 12일 및 2013년 1월 2일에 출원된 미국 임시 출원 61/736,527 및 61/748,427, 및 "DELIVERY, ENGINEERING AND OPTIMIZATION OF SYSTEMS, METHODS AND COMPOSITIONS FOR SEQUENCE MANIPULATION AND THERAPEUTIC APPLICATIONS"라는 명칭으로 2013년 12월 12일에 출원된 PCT 출원 PCT/US2013/074667에 열거된 바와 같으며, 이들의 모든 내용은 본 명세서에 전체가 참조로서 포함된이다.
표적 폴리뉴클레오티드의 예로는 신호화 생화학 경로, 예를 들어 신호화 생화학 경로-연관 유전자 또는 폴리뉴클레오티드와 연관된 서열을 포함한다. 표적 폴리뉴클레오티드의 예로는 질병 관련 유전자 또는 폴리뉴클레오티드가 포함된다. "질병-관련" 유전자 또는 폴리뉴클레오티드는, 비-질병 대조구의 조직 또는 세포에 비하여 질병-발생된 조직으로부터 유도된 세포에서의 비정상 수준 또는 비정상 형태의 전사 또는 번역 생성물을 산출하는 임의의 유전자 또는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 이는 비정상적으로 높은 수준으로 발현된 유전자일 수 있고; 비정상적으로 낮은 수준으로 발현되는 유전자일 수 있으며, 여기서 변경된 발현은 질병의 발생 및/또는 진전에 상관한다. 질병-관련 유전자는 또한, 질병의 병인론에 책임이 있는 유전자(들)과의 연결 불균형 상태 또는 직접적으로 책임이 있는 유전자 가공 돌연변이(들) 또는 유전적 변이를 또한 지칭한다. 전사된 또는 번역된 생성물은 기지 또는 미지일 수 있으며, 정상 또는 비정상 수준일 수 있다.
트랜스크립톰 전체에 걸친 녹-다운 스크리닝
본 명세서에 설명된 CRISPR 이펙터 단백질 복합체는 효율적이며 비용효과적인 기능성 트랜스크립톰 스크리닝을 수행하는 데 사용될 수 있다. 그러한 스크리닝은 CRISPR 이펙터 단백질 기반 트랜스크립톰 전체에 걸친 라이브러리를 이용할 수 있다. 그러한 스크리닝 및 라이브러리는 유전자의 작용을 결정하는 데 제공될 수 있고, 세포 경로 유전자가 관련되고, 유전자 발현에서 임의의 변경은 어떠하게 특정 생물학적 공정을 결과로서 초래할 수 있다. 본 발명의 장점은 CRISPR 시스템이 표적외 결합 및 그 결과로 인한 부작용을 회피한다는 것이다. 이는 표적 DNA에 대한 고도의 서열 특이성을 갖도록 배열된 시스템을 이용하여 달성된다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, CRISPR 이펙터 단백질 복합체는 C2c2 이펙터 단백질 복합체이다.
본 발명의 구현예에서, 트랜스크립톰 전체에 걸친 라이브러리는 본 명세서에서 설명된 바와 같이, 복수의 C2c2 가이드 RNA를 포함할 수 있으며, 이는 진핵 세포의 집단 내 복수의 유전자좌에서 복수의 표적 서열을 표적화할 수 있는 가이드 서열을 포함한다. 세포의 집단은 배아 줄기(ES) 세포의 집단일 수 있다. 유전자좌 내 표적 서열은 비코딩 서열일 수 있다. 비코딩 서열은 인트론, 조절 서열, 스플라이스 부위, 3' UTR, 5' UTR, 또는 폴리아데닐화 신호일 수 있다. 하나 이상의 유전자 생성물의 유전자 기능은 상기 표적화에 의해 변경될 수 있다. 표적화는 유전자 기능의 녹아웃을 결과로서 초래할 수 있다. 유전자 생성물의 표적화는 하나 초과의 가이드 RNA를 포함할 수 있다. 유전자 생성물은 유전자 당, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개의 가이드 RNA, 바람직하게는 3 내지 4 개의 가이드 RNA에 의해 표적될 수 있다. 표적외 변형은 C2c2 이펙터 단백질 복합체에 의해 생성된 엇갈린 이중 가닥 손상을 이용함으로써 또는 CRISPR-Cas9 시스템에서 사용된 것과 유사한 방법을 이용함으로써 최소화될 수 있다(예를 들어, 본 명세서에 참조로 포함된 문헌[DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Hsu, P., Scott, D., Weinstein, J., Ran, FA., Konermann, S., Agarwala, V., Li, Y., Fine, E., Wu, X., Shalem, O., Cradick, TJ., Marraffini, LA., Bao, G., & Zhang, F. Nat Biotechnol doi:10.1038/nbt.2647(2013)] 참조). 표적화는 약 100 개 이상의 서열일 수 있다. 표적화는 약 1000 개 이상의 서열일 수 있다. 표적화는 약 20,000 개 이상의 서열일 수 있다. 표적화는 전체 게놈일 수 있다. 표적화는 관련 또는 바람직한 경로에 집중된 일단의 표적 서열들일 수 있다. 경로는 면역 경로일 수 있다. 경로는 세포 분열 경로일 수 있다.
본 발명이 일 양태는 복수의 유전자좌에서 복수의 표적 서열을 표적화할 수 있는 가이드 서열을 포함할 수 있는 복수의 C2c2 가이드 RNA를 포함할 수 있는 트랜스크립톰 전체에 걸친 라이브러리를 포함하며, 여기서 상기 표적화는 유전자 기능의 녹다운을 결과로서 초래한다. 이러한 라이브러리는 생물의 게놈 내 각각 및 모든 유전자를 표적화하는 가이드 RNA를 잠재적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 일부 구현예예서, 생물 또는 대상체는 진핵 생물(인간을 포함하는 포유류 포함) 또는 비-인간 진핵 생물 또는 비-인간 동물 또는 비-인간 포유류다. 일부 구현예에서, 생물 또는 대상체는 비-인간 동물이며, 예를 들어 곤충과 같은 절지 동물일 수 있거나, 선충일 수 있다. 본 발명의 일부 방법에서, 생물 또는 대상체는 식물이다. 본 발명의 일부 방법에서, 생물 또는 대상체는 포유류 또는 비-인간 포유류다. 비-인간 포유류는, 예를 들어 설치류(바람직하게는 마우스), 유제류, 또는 영장류일 수 있다. 본 발명의 일부 방법에서, 생물 또는 대상체는 미세조류를 포함하는 조류, 또는 균류이다.
유전자 기능의 녹다운은: I. C2c2 이펙터 단백질, 및 II. 하나 이상의 가이드 RNA를 포함하는 조작된, 비-천연 발생 C2c2 이펙터 단백질 시스템을 포함하는 하나 이상의 벡터의 벡터 시스템을, 세포 집단 내 각각의 세포로 도입시키는 단계로서, 여기서 성분 I 및 성분 II는 시스템의 동일하거나 상이한 벡터일 수 있는 단계, 성분 I 및 II를 각각의 세포로 통합하는 단계로서, 여기서 성분 I 및 성분 II는 시스템의 동일하거나 상이한 벡터인 단계; 성분 I 및 II를 각각의 세포로 통합하는 단계로서, 여기서 가이드 서열은 각각의 세포 내 독특한 유전자를 표적화하고, 여기서 C2c2 이펙터 단백질은 조절 요소에 작동 가능하게 연결되고, 전사된 경우, 가이드 서열을 포함하는 가이드 RNA가 C2c2 이펙터 단백질 시스템의 독특한 유전자의 게놈 유전자좌 내의 표적 서열로의 서열-특이적 결합을 유도하는 단계; C2c2 이펙터 단백질에 의해 게놈 유전자좌의 절단을 유도하는 단계; 및 세포 집단의 각각의 세포에서 다수의 독특한 유전자에서 상이한 녹다운 이벤트를 확인하여, 이에 의해 유전자 녹다운 세포 라이브러리를 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명은 세포 집단이 진핵 세포의 집단인 것을 포함하며, 바람직한 구현예에서, 세포들의 집단은 배아 줄기(ES) 세포의 집단이다.
하나 이상의 벡터는 플라스미드 벡터이다. 벡터는 C2c2 이펙터 단백질, sgRNA, 및 선택적으로 표적 서열 내로의 선택 마커를 포함하는 단일 벡터일 수 있다. 이론에 구애되지는 않지만, 단일 벡터를 통하여 C2c2 이펙터 단백질 및 sgRNA를 동시에 전달하는 능력은, C2c2 이펙터 단백질을 발현하는 세포주를 먼저 생성할 필요 없이, 임의의 관심 세포 유형에의 적용을 가능하게 한다. 조절 요소는 유도성 프로모터일 수 있다. 유도성 프로모터는 독시사이클린 유도성 프로모터일 수 있다. 본 발명의 일부 방법에서, 가이드 서열의 발현은 T7 프로모터의 제어 하에 있으며, T7 폴리머라제의 발현에 의해 유도된다. 상이한 녹다운 이벤트의 확인은 전체 트랜스크립톰 시퀀싱에 의할 수 있다. 녹다운 이벤트는 100 개 이상의 독특한 유전자에서 달성될 수 있다. 녹다운 이벤트는 1000 개 이상의 독특한 유전자에서 달성될 수 있다. 녹다운 이벤트는 20,000 개 이상의 독특한 유전자에서 달성될 수 있다. 녹다운 이벤트는 전체 트랜스크립톰에서 달성될 수 있다. 유전자 기능의 녹다운은 특정 생리학적 경로 또는 조건에서 작용하는 복수의 독특한 유전자에서 달성될 수 있다. 경로 또는 조건은 면역 경로 또는 조건일 수 있다. 경로 또는 조건은 세포 분열 경로 또는 조건일 수 있다.
본 발명은 본 명세서에서 언급된 트랜스크립톰 전체에 걸친 라이브러리를 포함하는 키트를 또한 제공한다. 키트는 본 발명의 라이브러리를 포함하는 벡터 또는 플라스미드를 포함하는 단일 용기를 포함할 수 있다. 키트는 또한 본 발명의 라이브러리로부터의 가이드 서열을 포함하는 독특한 C2c2 이펙터 단백질 시스템 가이드 RNA의 선택을 포함하는 패널을 포함할 수 있으며, 여기서 선택은 특정 생리학적 조건을 나타낸다. 본 발명은, 표적화가 약 100 개 이상의 서열, 약 1000 개 이상의 서열 또는 약 20,000 개 이상의 서열 또는 전체 트랜스크립톰인 것을 포함한다. 추가로, 일단의 표적 서열은, 면역 경로 또는 세포 분열과 같은 관련 또는 바람직한 경로에 집중될 수 있다.
본 발명의 추가의 양태에서, C2c2 이펙터 단백질은 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있고, 기능성 도메인에 대한 융합 또는 융합 없이 일반적인 RNA 결합 단백질로서 사용될 수 있다. 돌연변이는 인공적으로 도입된 돌연변이 또는 기능 획득 돌연변이 또는 기능 손실 돌연변이일 수 있다. 돌연변이가 본 명세서에 기재된 바와 같이 특징화된다. 본 발명의 일 양태에서, 기능성 도메인은 VP64일 수 있는 전사 활성화 도메인일 수 있다. 본 발명의 일 양태에서, 기능성 도메인은 KRAB 또는 SID4X일 수 있는 전사 억제제 도메인일 수 있다. 다른 양태에서, 본 발명은 이에 한정되지 않지만, 전사 활성화제, 억제제, 재조합효소, 트랜스포사제, 히스톤 림델러, 데메틸라제, DNA 메틸트랜스퍼라제, 크립토크롬, 광 유도성/제어성 도메인 또는 화학적으로 유도성/제어성 도메인을 포함하는 도메인에 융합되는 돌연변이된 C2c2 이펙터 단백질 효소에 관한 것이다. 본 발명의 일부 방법은 표적된 유전자의 발현의 유도를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 진핵 세포의 집단에서 복수의 게놈 유전자좌의 복수의 표적 서열을 표적화함에 의한 발현 유도는 기능성 도메인의 이용에 의한다.
C2c2 3이펙터 단백질 복합체를 이용하는 본 발명의 실시에서 CRISPR-Cas9 시스템에 사용되는 방법이 유용하며, 하기가 참고된다:
Genome-Scale CRISPR-Cas9 Knockout Screening in Human Cells. Shalem, O., Sanjana, NE., Hartenian, E., Shi, X., Scott, DA., Mikkelson, T., Heckl, D., Ebert, BL., Root, DE., Doench, JG., Zhang, F. Science Dec 12.(2013). [Epub ahead of print]; Published in final edited form as: Science. 2014 Jan 3; 343(6166): 84-87.
Shalem 외는 게놈-전체에 걸친 규모에서 유전자 기능을 질의하기 위한 새로운 방식을 이용한다. 그들의 연구는 64,751 개의 독특한 가이드 서열을 이용하여 18,080 개 유전자를 표적화시킨 게놈-규모의 CRISPR-Cas9 녹아웃(GeCKO) 라이브러리의 전달이 인간 세포에서 음성 및 양성 선택 스크리닝 둘 모두를 가능하게 하는 것을 보여주었다. 먼저, 상기 저자는 암 및 만능성 줄기 세포에서 세포 생존력에 필수적인 유전자를 확인하기 위한 GeCKO 라이브러리의 사용을 보여주었다. 다음으로, 흑색종 모델에서, 상기 저자는 유전자의 소실이 돌연변이 단백질 키나아제 BRAF를 억제하는 치료제인 베무라페닙(vemurafenib)에 대한 내성과 관련된 유전자를 스크리닝하였다. 그들의 연구는 가장 높은 순위의 후보물질이 이전에 확인된 유전자 NF1 및 MED12뿐만 아니라 새로운 히트(hit) NF2, CUL3, TADA2B, 및 TADA1을 포함한 것을 나타내었다. 상기 저자는 동일한 유전자를 표적으로 하는 독립적 가이드 RNA와 높은 비율의 히트 확인 사이에 높은 수준의 일치를 관찰하였고, 따라서 Cas9를 이용한 게놈-규모 스크리닝의 가망성을 입증하였다.
미국 특허 공개 번호 US20140357530; 및 PCT 특허 공보 WO2014093701을 참조하며, 이들은 본 명세서에 참고문헌으로 통합된다.
기능성 변경 및 스크리닝
또 다른 양태에서, 본 발명은 유전자의 기능성 평가 및 스크리닝 방법을 제공한다. 기능성 도메인을 정확하게 전달하거나, 유전자를 활성화 또는 억제하거나 관심 특정 유전자좌 상에서 메틸화 부위를 정확하게 변경시킴으로써 후성적 상태를 변경시키기 위한 본 발명의 CRISPR 시스템의 사용은, 생체외 또는 생체내에서 복수의 가이드 RNA(sgRNA)를 포함하는 라이브러리의 투여 또는 발현을 포함하는 세포의 풀(pool) 중 게놈에 적용되는 라이브러리와 함께이거나 단일 세포 또는 세포 집단에 적용되는 하나 이상의 가이드 RNA와 함께일 수 있으며, 여기서 스크리닝은 C2c2 이펙터 단백질의 사용을 추가로 포함하고, C2c2 이펙터 단백질을 포함하는 CRISPR 복합체는 변형되어 이종 기능성 도메인을 포함한다. 일 양태에서, 본 발명은 숙주로의 투여 또는 라이브러리의 숙주에서의 생체내 발현을 포함하는 게놈/트랜스크립톰의 스크리닝 방법을 제공한다. 일 양태에서, 본 발명은 본 명세서에서 논의된 바와 같이, 숙주로 투여되거나 숙주 내에서 발현되는 활성화제를 추가로 포함하는 방법을 제공한다. 일 양태에서, 본 발명은 본 명세서에서 논의된 바와 같은 방법을 제공하며, 여기서 활성화제는 C2c2 이펙터 단백질에 부착된다. 일 양태에서, 본 발명은 본 명세서에서 논의된 바와 같은 방법을 제공하며, 여기서 활성화제는 C2c2 이펙터 단백질의 N 말단 또는 C 말단에 부착된다. 일 양태에서, 본 발명은 본 명세서에서 논의된 바와 같은 방법을 제공하며, 여기서 활성화제는 sgRNA 루프에 부착된다. 일 양태에서, 본 발명은 숙주에 투여되거나 숙주에서 발현되는 억제제를 추가로 포함하는, 본 명세서에서 논의된 바와 같은 방법을 제공한다. 일 양태에서, 본 발명은 본 명세서에서 논의된 바와 같은 방법을 제공하며, 여기서 스크리닝은 유전자좌에서의 유전자 활성화, 유전자 억제, 또는 절단에 영향을 미치거나 검출하는 것을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 효율적인 표적상 활성을 제공하고, 표적외 활성은 최소화한다. 일 양태에서, 본 발명은 C2c2 이펙터 단백질에 의한 효율적인 표적상 절단을 제공하고, C2c2 이펙터 단백질에 의한 표적외 절단은 최소화한다. 일 양태에서, 본 발명은 DNA 절단 없이, 유전자좌에서의 C2c2 이펙터 단백질의 가이드 특이적 결합을 제공한다. 따라서, 일 양태에서, 본 발명은 표적-특이적 유전자 조절을 제공한다. 일 양태에서, 본 발명은 DNA 절단 없이 유전자좌에서 C2c2 이펙터 단백질의 가이드 특이적 결합을 제공한다. 따라서, 일 양태에서, 본 발명은 단일 C2c2 이펙터 단백질을 사용하여 하나의 유전자좌에서의 절단 및 상이한 유전자좌에서의 유전자 조절을 제공한다. 일 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 C2c2 이펙터 단백질 및/또는 효소를 사용하여 다수의 표적의 직교(orthogonal) 활성화 및/또는 억제 및/또는 절단을 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 본 명세서에서 논의된 바와 같은 방법을 제공하며, 여기서 숙주는 진핵 세포이다. 일 양태에서, 본 발명은 본 명세서에서 논의된 바와 같은 방법을 제공하며, 여기서 숙주는 포유류 세포이다. 일 양태에서, 본 발명은 본 명세서에서 논의된 바와 같은 방법을 제공하며, 여기서 숙주는 비-인간 진핵 생물이다. 일 양태에서, 본 발명은 본 명세서에서 논의된 바와 같은 방법을 제공하며, 여기서 비-인간 진핵 생물은 비-인간 포유동물이다. 일 양태에서, 본 발명은 본 명세서에서 논의된 바와 같은 방법을 제공하며, 여기서 비-인간 포유동물은 마우스이다. 일 양태에서, 본 발명은 C2c2 이펙터 단백질 복합체 또는 이의 성분(들) 또는 이에 대해 코딩하는 핵산 분자(들)의 전달을 포함하는, 본 명세서에서 논의된 바와 같은 방법을 제공하며, 여기서 상기 핵산 분자(들)는 조절 서열(들)에 작동 가능하게 연결되고 생체내에서 발현된다. 일 양태에서, 본 발명은 본 명세서에서 논의된 바와 같은 방법을 제공하며, 여기서 생체내 발현은 렌티바이러스, 아데노바이러스, 또는 AAV를 통한 것이다. 일 양태에서, 본 발명은 본 명세서에서 논의된 바와 같은 방법을 제공하며, 여기서 전달은 입자, 나노입자, 지질 또는 세포 투과 펩티드(CPP)를 통한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 C2c2 이펙터 단백질을 포함하는 CRISPR 복합체의 쌍을 제공하며, 이들 각각은 세포에서 관심 게놈 유전자좌에서 표적 서열에 혼성화할 수 있는 가이드 서열을 포함하는 가이드 RNA(sgRNA)를 포함하며, 여기서 각 sgRNA의 적어도 하나의 루프는 하나 이상의 어댑터 단백질에 결합하는 별개의 RNA 서열(들)의 삽입에 의해 변형되고, 여기서 어댑터 단백질은 하나 이상의 기능성 도메인과 회합되고, 여기서 각각의 C2c2 이펙터 단백질 복합체의 각각의 sgRNA는 DNA 절단 활성을 갖는 기능성 도메인을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 C2c2 이펙터 단백질 복합체의 세포 또는 이의 성분(들) 또는 이를 코딩하는 핵산 분자(들)로의 전달을 포함하는, 관심 유전자좌에서 표적 서열을 절단하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 핵산 분자(들)는 조절 서열(들)에 작동 가능하게 연결되고 생체내 발현된다. 일 양태에서, 본 발명은 상기 논의된 바와 같은 방법을 제공하고, 여기서 전달은 렌티바이러스, 아데노바이러스, 또는 AAV를 통한 것이다.
일 양태에서, 본 발명은 본 명세서에서 논의된 바와 같은 라이브러리, 방법 또는 복합체를 제공하며, 여기서 sgRNA는 적어도 하나의 비-코딩 기능성 루프를 갖도록 변형되고, 예를 들어 여기서 적어도 하나의 비-코딩 기능성 루프는 반복적이고; 예를 들어 여기서 적어도 하나의 비-코딩 기능성 루프는 Alu를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 유전자 생성물의 발현을 변경 또는 변형하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 유전자 생성물을 인코딩하는 DNA 분자를 함유 및 발현하는 세포 내로 C2c2 이펙터 단백질 및 그 RNA 분자를 표적화하는 가이드 RNA를 포함하는 조작된 비-천연 발생 CRISPR 시스템을 도입시키는 것을 포함할 수 있으며, 이로 인해 가이드 RNA는 유전자 생성물을 인코딩하는 RNA 표적 분자를 표적화하고, C2c2 이펙터 단백질은 유전자 생성물을 인코딩하는 RNA 분자를 절단하고, 이로 인해 유전자 생성물의 발현이 변경되고; 여기서 C2c2 이펙터 단백질 및 가이드 RNA는 함께 자연적으로 발생하지 않는다. 본 발명은 직접 반복 서열에 연결된 가이드 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포괄한다. 본 발명은 진핵 세포에서 발현에 대해 최적화된 코돈인 C2c2 이펙터 단백질을 추가로 포괄한다. 바람직한 구현예에서, 진핵 세포는 포유류 세포이고, 더 바람직한 구현예에서 포유류 세포는 인간 세포이다. 본 발명의 추가 구현예에서, 유전자 생성물의 발현은 감소된다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 기능성 도메인은 C2c2 이펙터 단백질과 연관된다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 문헌 [Konnerman et al.(Nature 517, 583-588, 29 January 2015)]의 변형된 가이드와 함께 사용된 바와 같이, 하나 이상의 기능성 도메인은 어댑터 단백질과 연관된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 기능성 도메인은 데드 sgRNA(dRNA)와 연관된다. 일부 구현예에서, 활성 C2c2 이펙터 단백질과의 dRNA 복합체는 유전자좌 상에서 기능성 도메인에 의한 유전자 조절을 유도하는 한편, sgRNA는 또 다른 유전자좌에서 활성 C2c2 이펙터 단백질에 의한 DNA 절단을 유도하며, 예를 들어, 이는 문헌[Dahlman et al., 'Orthogonal gene control with a catalytically active Cas9 nuclease' Nature Biotechnology 33, p. 1159-61(November, 2015)]에 의한 CRISPR-Cas9 시스템에서 유사하게 기재된 바와 같다. 일부 구현예에서, dRNA는 표적외 조절에 비하여 관심 유전자좌에 대한 조절의 선택성을 최대화하도록 선택된다. 일부 구현예에서, dRNA는 표적 유전자 조절을 최대화하고 표적 절단은 최소화하도록 선택된다.
하기 논의의 목적을 위하여, 기능성 도메인에 대한 기준은 C2c2 이펙터 단백질과 연관된 기능성 도메인 또는 어댑터 단백질과 연관된 기능성 도메인일 수 있다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 기능성 도메인은 NLS(핵 국소화 서열) 또는 NES(핵외 수송 신호)이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 기능성 도메인은 전사 활성화 도메인으로, VP64, p65, MyoD1, HSF1, RTA, SET7/9 및 히스톤 아세틸트랜스퍼라제를 포함한다. CRISPR 효소와 연관된 것들에 대하여 활성화(또는 활성화제) 도메인에 대한 기타 참조는 임의의 기지의 전사 활성화 도메인을 포함하며, 특히 VP64, p65, MyoD1, HSF1, RTA, SET7/9 또는 히스톤 아세틸트랜스퍼라제.
일부 구현예에서, 하나 이상의 기능성 도메인은 전사 억제제 도메인이다. 일부 구현예에서, 전사 억제제 도메인은 KRAB 도메인이다. 일부 구현예에서, 전사 억제제 도메인은 NuE 도메인, NcoR 도메인, SID 도메인 또는 SID4X 도메인이다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 기능성 도메인은 번역 활성화 활성, 번역 억제 활성, 메틸라제 활성, 데메틸라제 활성, 전사 활성화 활성, 전사 억제 활성, 전사 방출 인자 활성, 히스톤 변형 활성, RNA 절단 활성, DNA 절단 활성, DNA 통합 활성 또는 핵산 결합 활성을 포함하는 하나 이상의 활성을 갖는다.
히스톤 변형 도메인 또한 일부 구현예에서 바람직하다. 예시적인 히스톤 변형 도메인이 하기에서 논의된다. 트랜스포사제 도메인, HR(상동성 재조합) 기구 도메인, 재조합효소 도메인, 및/또는 인테그라제 도메인이 본 발명의 기능성 도메인으로서 또한 바람직하다. 일부 구현예에서, DNA 통합 활성은 HR 기구 도메인, 인테그라제 도메인, 재조합효소 도메인 및/또는 트랜스포사제 도메인을 포함한다. 히스톤 아세틸트랜스퍼라제가 일부 구현예에서 바람직하다.
일부 구현예에서, DNA 절단 활성은 뉴클레아제로 인한 것이다. 일부 구현예에서, 뉴클레아제는 Fok1 뉴클레아제를 포함한다. 문헌 ["Dimeric CRISPR RNA-guided FokI nucleases for highly specific genome editing", Shengdar Q. Tsai, Nicolas Wyvekens, Cyd Khayter, Jennifer A. Foden, Vishal Thapar, Deepak Reyon, Mathew J. Goodwin, Martin J. Aryee, J. Keith Joung Nature Biotechnology 32(6): 569-77(2014) 참조]은 연장된 서열을 인식하고, 인간 세포에서 고효율로 내인성 유전자를 편집할 수 있는, 이량체성 RNA-가이드된 FokI 뉴클레아제에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 기능성 도메인은 C2c2 이펙터 단백질에 부착되어, sgRNA 및 표적에 대한 결합 시, 기능성 도메인은 그 기능성 도메인이 그에 귀속된 작용으로 작용하는 것을 가능하게 하는 공간 배향으로 존재하도록 한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 기능성 도메인은 어댑터 단백질에 부착되며, C2c2 이펙터 단백질의 sgRNA 및 표적에 대한 결합 시, 기능성 도메인은 그 기능성 도메인이 그에 귀속된 작용으로 작용하는 것을 가능하게 하는 공간 배향으로 존재하도록 한다.
일 양태에서, 본 발명은 본 명세서에서 논의된 바와 같은 조성물을 제공하며, 여기서 하나 이상의 기능성 도메인은, 본 명세서에서 논의된 바와 같은, 링커, 선택적으로 GlySer 링커를 통해 C2c2 이펙터 단백질 또는 어댑터 단백질에 부착된다.
또한 예를 들어 번역, 안정성 등과 관련된 내인성(조절) 제어 요소를 표적화하는 것이 선호된다. 공지된 제어 요소의 표적화는 관심 유전자를 활성화 또는 억제하는 데 사용될 수 있다. 한편 추정적인 제어 요소의 표적화는 그러한 요소를 확인하는(관심 유전자의 번역을 측정함으로써) 또는 신규 제어 요소를 검출하는 수단으로서 사용될 수 있다. 추가적으로, 추정적인 제어 요소의 표적화는 질병의 유전적 원인을 이해하는 맥락에서 유용할 수 있다. 질병 표현형과 연관된 많은 돌연변이 및 일반 SNP 변이체는 코딩 영역 외부에 위치된다. 본 명세서에서 설명된 활성화 또는 저해 시스템 중 어느 하나를 이용한 그러한 영역의 표적화에 이어, a) 추정적인 표적의 세트(예를 들어, 제어 요소의 최근접부에 위치된 유전자의 세트) 또는 b) 예를 들어, RNAseq 또는 마이크로어레이에 의한, 전체-트랜스크립톰 판독 중 어느 하나의 전사 판독에 뒤따를 수 있다. 이는 질병 표현형과 관련된 가능성 있는 후보 유전자의 확인을 가능하게 할 것이다. 그러한 후보 유전자는 신규 약물 표적으로서 유용할 수 있다.
히스톤 아세틸트랜스퍼라제(HAT) 억제제가 본 명세서에 언급된다. 그러나, 대안적인 일부 구현예에서 하나 이상의 기능성 도메인이 아세틸트랜스퍼라제, 바람직하게는 히스톤 아세틸트랜스퍼라제를 포함하는 것이다. 이들은 후성유전학(epigenomics) 분야, 예를 들어 후성유전자에서 정보를 얻는 방법에서 유용하다. 표적화 후성유전자 서열은 후성유전자 표적 서열로 유도되는 가이드를 포함할 수 있다. 후성유전자 표적화는 일부 구현예에서, 프로모터, 사일렌서 또는 인핸서 서열을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 설명된 바와 같이 후성유전자 서열을 표적하기 위한 C2c2 이펙터 단백질, 바람직하게는 데드-C2c2 이펙터 단백질, 더욱 바람직하게는 데드-FnC2c2 이펙터 단백질에 연결된 기능성 도메인의 이용은 프로모터, 사일렌서 또는 인핸서를 활성화 또는 억제하는 데 사용될 수 있다.
아세틸트랜스퍼라제의 예는 알려져 있지만, 일부 구현예에서, 히스톤 아세틸트랜스퍼라제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 히스톤 아세틸트랜스퍼라제는 인간 아세틸트랜스퍼라제 p300의 촉매 중심을 포함할 수 있다(Gjerbasch & Reddy, Nature Biotech, 2015년 4월 6일).
일부 바람직한 구현예에서, 기능성 도메인은 데드-C2c2 이펙터 단백질에 연결되어 프로모터 또는 인핸서와 같은 후성유전자 서열을 표적 및 활성화한다. 그러한 프로모터 또는 인핸서로 유도된 하나 이상의 가이드는 또한 CRISPR 효소의 그러한 프로모터 또는 인핸서로의 결합을 유도하기 위해 제공될 수 있다.　　
특정 구현예에서, 본 발명의 RNA 표적화 이펙터 단백질은 DNA/염색질 구조의 공동-전사 변형, RNA-지시되는 DNA 메틸화, 또는 RNA-지시되는 DNA/염색질의 침묵화/활성화를 간섭하는 데 사용될 수 있다. RNA-지시되는 DNA 메틸화(RdDM)는 식물에서 최초로 발견된 후성적 과정이다. RdDM 동안 이중-가닥 RNA(dsRNA)는 21 내지 24 개의 뉴클레오티드 소형 간섭 RNA(siRNA)로 처리되고 상동성 DNA 유전자좌의 메틸화를 가이드한다. RNA 분자 외에도 아르고노트, DNA 메틸트랜스페라제, 염색질 리모델링 복합체 및 식물-특이적 PolIV 및 PolV와 같이, RdDM의 확립에 많은 단백질이 관여한다. 이들 모두는 시토신의 5' 위치에 메틸기를 부가하기 위해 협력하여 작용한다. 소형 RNA는 아르고노트-함유 복합체를 상보적인 신생 (비-코딩) RNA 전사물로 가이드함으로써 염색질 구조를 변형시키고 전사를 침묵화할 수 있다. 그 후 히스톤 및 DNA 메틸트랜스페라제를 포함하는, 염색질-변형 복합체의 모집이 매개된다. 본 발명의 RNA 표적화 이펙터 단백질은 이러한 소형 RNA를 표적화하고 이들 소형 RNA와 신생의 비-코딩 전사물 사이의 상호 작용을 간섭하는 데 사용될 수 있다.
용어 "회합된"이 기능성 도메인의 C2c2 이펙터 단백질 또는 어댑터 단백질로의 연결에 관하여 본 명세서에서 사용된다. 이는 어떻게 하나의 분자가 다른 하나에 대해서, 예를 들어 어댑터 단백질과 기능성 도메인 사이에서 또는 C2c2 이펙터 단백질과 기능성 도메인 사이에서 '회합되는'지에 관하여 사용된다. 이와 같은 단백질-단백질 상호 작용의 경우, 이러한 회합은 항체가 에피토프를 인식하는 방식에서의 인식이라는 면에서 생각될 수 있다. 대안적으로, 하나의 단백질은, 둘 예를 들어 다른 서브유닛에 융합되는 하나의 서브유닛의 융합을 통해 또 다른 단백질과 회합될 수 있다. 융합은 예를 들어 각각의 단백질 또는 서브유닛을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함께 스플라이싱을 통해, 통상적으로 하나의 아미노산 서열의 다른 아미노산 서열로의 부가에 의해 일어난다. 대안적으로, 이는 본질적으로 두 개의 분자간의 결합 또는 직접 연결, 예를 들어 융합 단백질로서 생각될 수 있다. 어쨌든, 융합 단백질은 관심의 두 서브유닛 사이(즉, 효소와 기능성 도메인 또는 어댑터 단백질와 기능성 도메인 사이)의 링커를 포함할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, C2c2 이펙터 단백질 또는 어댑터 단백질은 거기 결합함으로써 기능성 도메인과 회합된다. 다른 구현예에서, C2c2 이펙터 단백질 또는 어댑터 단백질은 기능성 도메인과 함께 회합되는데, 이는 이들 둘이 함께, 선택적으로 중간체 링커를 통해 융합되기 때문이다.
포화(saturating) 돌연변이 유발
본 명세서에 기재된 C2c2 이펙터 단백질 시스템(들)은, 예를 들어 유전자 발현, 약물 내성 및 질병의 전환에 요구되는 작용 요소의 개별 취약성 및 임계 최소 특징의 결정을 위해 세포 표현형과 함께 게놈 유전자좌의 포화 또는 딥 스캐닝 돌연변이 유발을 수행하는 데 사용될 수 있다. 포화 또는 딥 스캐닝 돌연변이 유발이라 함은 모든 또는 본질적으로 모든 RNA 염기가 게놈 유전자좌 내에서 절단됨을 의미한다. C2c2 이펙터 단백질 가이드 RNA의 라이브러리는 세포의 집단 내로 도입될 수 있다. 라이브러리가 도입될 수 있어서, 각각의 세포는 단일 가이드 RNA(sgRNA)를 수령하게 된다. 라이브러리가 본 명세서에서 설명된 바와 같은 바이러스 벡터의 형질도입에 의해 도입되는 경우, 낮은 감염 다중도(MOI)가 사용된다. 라이브러리는 게놈 유전자좌에서(프로토스페서 인접 모티프)(PAM) 서열의 업스트림에 있는 모든 서열을 표적화하는 sgRNA를 포함할 수 있다. 라이브러리는 게놈 유전자좌 내의 모든 1000 개의 베이스 염기쌍에 대해 PAM의 업스트림에서 100 개 이상의 비-중복 게놈 서열을 포함할 수 있다. 라이브러리는 하나 이상의 상이한 PAM 서열의 업스트림에서 서열을 표적화하는 sgRNA를 포함할 수 있다. C2c2 이펙터 단백질 시스템은 하나 초과의 C2c2 단백질을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 기재된 바와 같은, 상이한 PAM 서열을 인식하는 오솔로그 또는 설계 제작된 C2c2 이펙터 단백질을 포함하는, 임의의 C2c2 이펙터 단백질이 사용될 수 있다. sgRNA에 대한 표적외 부위의 빈도는 500 개 미만일 수 있다. 표적외 점수는 최저 표적외 부위를 갖는 sgRNA를 선택하기 위해 생성될 수 있다. sgRNA 표적 부위에서의 절단과 연관되는 것으로 결정된 임의의 표현형은 sgRNA의 표적화를 단일 시험에서 동일한 부위를 이용함으로써 확인될 수 있다. 표적 부위의 확인은 본 명세서에서 설명된 바와 같은, 변형된 C2c2 이펙터 단백질, 및 관심 게놈 부위를 표적화하는 두 개의 sgRNA를 이용함으로써 수행될 수도 있다. 이론에 구애되고자 하지는 않지만, 표현형에서의 변화가 확인 실험에서 관찰된다면, 표적 부위가 제대로 확인된 것이다.
포화 또는 딥 스캐닝 돌연변이 유발을 위한 C2c2 이펙터 단백질 시스템(들)은 세포의 집단에서 사용될 수 있다. C2c2 이펙터 단백질 시스템(들)은, 이에 한정되지 않지만, 포유류 및 식물 세포를 포함하는 진핵 세포에서 사용될 수 있다. 세포의 집단은 원핵 세포일 수 있다. 진핵 세포의 집단은 배아 줄기(ES) 세포, 뉴런 세포, 상피 세포, 면역 세포, 내분비 세포, 근육 세포, 적혈구, 림프구, 식물 세포 또는 효모 세포의 집단일 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 표현형에서의 변화와 연관된 작용 요소에 대한 스크리닝 방법을 제공한다. 라이브러리는 C2c2 이펙터 단백질을 함유하도록 조정된 세포 집단 내로 도입될 수 있다. 세포는 표현형을 기준으로 둘 이상의 군으로 분류될 수 있다. 표현형은 유전자, 세포 성장, 또는 세포 생육력의 발현일 수 있다. 각 군에 존재하는 가이드 RNA의 상대적 표시가 결정되며, 이로 인해 표현형에서의 변화와 연관된 게놈 부위는 각 군에 존재하는 가이드 RNA의 표시에 의해 결정될 수 있다. 표현형에서의 변화는 관심 유전자의 발현에서의 변화일 수 있다. 관심 유전자는 상향조절, 하향조절, 또는 녹아웃될 수 있다. 세포는 고발현 군과 저발현 군으로 분류될 수 있다. 세포 집단은 표현형을 결정하는 데 사용되는 리포터 작제물을 포함할 수 있다. 리포터 작제물은 검출 가능한 마커를 포함할 수 있다. 세포는 검출 가능한 마커의 이용에 의해 분류될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 화학 화합물에 대한 내성과 관련된 유전자좌의 스크리닝 방법을 제공한다. 화학 화합물은 약물 또는 살충제일 수 있다. 라이브러리는 C2c2 이펙터 단백질을 함유하도록 조절된 세포 집단 내로 도입될 수 있으며, 여기서 집단의 세포 각각은 단지 하나의 가이드 RNA를 함유하며, 세포 집단은 화학 화합물로 처리되며; 가이드 RNA의 표시는 초기 시점에 비하여, 이후의 시점에서 화학 화합물로 처리 후에 결정되며, 이로 인해 화학 화합물에 대한 내성과 연관된 부위는 가이드 RNA의 풍부화에 의해 결정된다. sgRNA의 표시는 딥 시퀀싱 방법에 의해 결정될 수 있다.
C2c2 이펙터 단백질 복합체를 이용하는 본 발명의 실시에 있어서 CRISPR-Cas9 시스템에서 사용되는 방법이 유용하고, Cas9-매개된 동일계내 포화 돌연변이유발에의한 BCL11A 인핸서 절제(BCL11A enhancer dissection by Cas9-mediated in situ saturating mutagenesis)라는 명칭의 논문이 언급된다. 논문[Canver, M.C., Smith, E.C., Sher, F., Pinello, L., Sanjana, N.E., Shalem, O., Chen, D.D., Schupp, P.G., Vinjamur, D.S., Garcia, S.P., Luc, S., Kurita, R., Nakamura, Y., Fujiwara, Y., Maeda, T., Yuan, G., Zhang, F., Orkin, S.H., & Bauer, D.E. DOI:10.1038/nature15521, 2015년 9월 16일 간행]은 참고문헌으로 본 명세서에 통합되고, 아래 간략히 논의된다:
Canver 외의 문헌은, 이전에 태아 헤모글로빈(HbF) 수준과 연관된 인핸서로서, 그의 마우스 오솔로그가 적혈구 BCL11A 발현에 필요한 것으로 확인된, 인간 및 마우스 BCL11A 적혈구 인핸서의 현장 포화 돌연변이 유발을 수행하기 위하여 신규 풀화된(pooled) CRISPR-Cas9 가이드 RNA 라이브러리를 수반한다. 이 시도는 이들 인핸서의 임계 최소 특징 및 개별 취약성을 밝혔다. 1 차 인간 조상 및 마우스 유전자 도입의 편집을 통해, 저자는 BCL11A 적혈구 인핸서를 HbF 재도입을 위한 표적으로서 확인하였다. 저자는 치료적 게놈 편집을 알려주는 상세한 인핸서 맵을 생성하였다.
세포 또는 생물을 변형시키기 위하여 C2c2 시스템을 이용하는 방법
일부 구현예에서 본 발명은 세포 또는 생물을 변형시키는 방법을 포함한다. 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포일 수 있다. 세포는 포유류 세포일 수 있다. 포유류 세포는 많은 경우 비-인간 영장류, 소, 돼지, 설치류 또는 마우스 세포일 수 있다. 세포는 가금류, 어류 또는 새우와 같은 비-포유류 진핵 세포일 수 있다. 세포는 식물일 수도 있다. 식물 세포는 카사바, 옥수수, 수수, 밀 또는 벼와 같은 작물 식물의 것일 수 있다. 식물 세포는 또한 조류, 나무 또는 채소일 수 있다. 본 발명에 의해 세포에 도입된 변형은, 세포 및 세포의 자손이 항체, 전분, 알콜 또는 기타 바람직한 세포 산출물과 같은 생물학적 생성물의 개선된 생산에 대해 변경되도록 할 수 있다. 본 발명에 의해 세포에 도입된 변형은, 세포 및 세포의 자손이 생산된 생물학적 생성물을 변화시키는 변경을 포함하도록 할 수 있다.
시스템은 하나 이상의 상이한 벡터를 포함할 수 있다. 본 발명의 일 양태에서, 이펙터 단백질은 바람직한 세포 유형, 우선적으로는 진핵 세포, 바람직하게는 포유류 세포 또는 인간 세포의 발현에 대해 코돈 최적화된다.
세포를 패키징하는 것은 통상적으로 숙주 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스 입자를 형성하는 데 사용된다. 이와 같은 세포는, 아데노바이러스를 패키징하는 293 개의 세포를 포함하고, 레트로바이러스를 패키징하는 ψ2 세포 또는 PA317 세포를 포함한다. 유전자 치료법에서 사용되는 바이러스 벡터는 보통 핵산 벡터를 바이러스 입자로 패키징하는 세포주를 생성함으로써 생성된다. 벡터는 통상적으로 숙주로의 패키징 및 후속 통합에 요구되는 최소 바이러스 서열을 함유하고, 다른 바이러스 서열은 발현될 폴리뉴클레오티드(들)에 있어서 발현 카세트에 의해 대체된다. 누락된 바이러스 작용은 통상적으로 패키징 세포주에 의해 트랜스로 공급된다. 예를 들어, 유전자 치료법에서 사용되는 AAV 벡터는 통상적으로 숙주 게놈으로의 패키징 및 통합에 요구되는, AAV 게놈 유래의 ITR 서열만을 갖는다. 바이러스 DNA는 세포주에서 패키징되고, 이는 다른 AAV 유전자를 인코딩하는 헬퍼 플라스미드, 즉 rep 및 cap를 함유하지만, ITR 서열은 결여되어 있다. 세포주는 또한 헬퍼로서 아데노바이러스로 감염될 수 있다. 헬퍼 바이러스는 AAV 벡터의 복제 및 헬퍼 플라스미드로부터 AAV 유전자의 발현을 촉진시킨다. 헬퍼 플라스미드는 ITR 서열의 결여로 인하여 상당한 양으로 패키징되지 않는다. 아데노바이러스로 인한 오염은, 예를 들어 아데노바이러스가 AAV보다 더 민감한 열 처리에 의해 감소될 수 있다. 핵산의 세포로의 전달을 위한 추가적인 방법은 당업자들에게 알려져 있다. 예를 들어, 본 명세서에 참조로서 포함된 US20030087817을 참조한다.
일부 구현예에서, 숙주 세포는 본 명세서에 기재된 하나 이상의 벡터로 일시적으로 또는 비-일시적으로 형질감염된다. 일부 구현예에서, 세포는 대상체에서 자연적으로 발생하기 때문에 형질감염된다. 일부 구현예에서, 형질감염된 세포는 대상체로부터 취한다. 일부 구현예에서, 세포는 대상체로부터 취한 세포로부터 유래되며, 예를 들어 세포주이다. 조직 배양을 위한 매우 다양한 세포주가 당업계에 알려져 있다. 세포주의 예로는 이에 한정되지 않이지만, C8161, CCRF-CEM, MOLT, mIMCD-3, NHDF, HeLa-S3, Huh1, Huh4, Huh7, HUVEC, HASMC, HEKn, HEKa, MiaPaCell, Panc1, PC-3, TF1, CTLL-2, C1R, Rat6, CV1, RPTE, A10, T24, J82, A375, ARH-77, Calu1, SW480, SW620, SKOV3, SK-UT, CaCo2, P388D1, SEM-K2, WEHI-231, HB56, TIB55, Jurkat, J45.01, LRMB, Bcl-1, BC-3, IC21, DLD2, Raw264.7, NRK, NRK-52E, MRC5, MEF, Hep G2, HeLa B, HeLa T4, COS, COS-1, COS-6, COS-M6A, BS-C-1 원숭이 신장 상피세포, BALB/ 3T3 마우스 배아 섬유아세포, 3T3 Swiss, 3T3-L1, 132-d5 인간 태아 섬유아세포; 10.1 마우스 섬유아세포, 293-T, 3T3, 721, 9L, A2780, A2780ADR, A2780cis, A172, A20, A253, A431, A-549, ALC, B16, B35, BCP-1 세포, BEAS-2B, bEnd.3, BHK-21, BR 293, BxPC3, C3H-10T1/2, C6/36, Cal-27, CHO, CHO-7, CHO-IR, CHO-K1, CHO-K2, CHO-T, CHO Dhfr -/-, COR-L23, COR-L23/CPR, COR-L23/5010, COR-L23/R23, COS-7, COV-434, CML T1, CMT, CT26, D17, DH82, DU145, DuCaP, EL4, EM2, EM3, EMT6/AR1, EMT6/AR10.0, FM3, H1299, H69, HB54, HB55, HCA2, HEK-293, HeLa, Hepa1c1c7, HL-60, HMEC, HT-29, Jurkat, JY 세포, K562 세포, Ku812, KCL22, KG1, KYO1, LNCap, Ma-Mel 1-48, MC-38, MCF-7, MCF-10A, MDA-MB-231, MDA-MB-468, MDA-MB-435, MDCK II, MDCK II, MOR/0.2R, MONO-MAC 6, MTD-1A, MyEnd, NCI-H69/CPR, NCI-H69/LX10, NCI-H69/LX20, NCI-H69/LX4, NIH-3T3, NALM-1, NW-145, OPCN / OPCT 세포주, Peer, PNT-1A / PNT 2, RenCa, RIN-5F, RMA/RMAS, Saos-2 세포, Sf-9, SkBr3, T2, T-47D, T84, THP1 세포주, U373, U87, U937, VCaP, Vero 세포, WM39, WT-49, X63, YAC-1, YAR, 및 이들의 유전자 도입 변형들을 포함한다. 세포주는 당업자에게 알려진 다양한 공급원으로부터 입수 가능하다(예를 들어, 미국 균주 은행(American Type Culture Collection; ATCC)(미국 버지니아주 매나서스 소재) 참조). 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 하나 이상의 벡터로 형질감염된 세포는 하나 이상의 벡터-유래된 서열을 포함하는 신규 세포주를 구축하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 핵산-표적화 시스템의 성분으로 일시적으로 형질감염되고(예를 들어, 하나 이상의 벡터의 일시 형질감염, 또는 RNA를 이용한 형질감염에 의해), 핵산-표적화 복합체의 활성을 통하여 변형된 세포는 변형을 포함하지만 임의의 다른 외인성 서열은 결여한 세포를 포함하는 새로운 세포주를 수립하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 하나 이상의 벡터를 이용하여 일시적으로 또는 비-일시적으로 형질감염된 세포, 또는 이와 같은 세포로부터 유래된 세포주는 하나 이상의 시험 화합물을 평가하는 데 사용된다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 하나 이상의 벡터가 비-인간 유전자 도입 동물 또는 유전자 도입 식물을 생산하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 유전자 도입 동물은 포유류, 예를 들어 마우스, 래트 또는 토끼다. 특정 구현예에서, 생물 또는 대상체는 식물이다. 특정 구현예에서, 생물 또는 대상체 또는 식물은 조류이다. 유전자 도입 식물 및 동물을 생산하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 일반적으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 세포 형질 감염 방법으로 시작한다.
일 양태에서, 본 발명은 진핵 세포에서 표적 폴리뉴클레오티드를 변형시키는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 방법은 핵산-표적화 복합체가 표적 폴리뉴클레오티드에 결합 가능하게 하여 상기 표적 폴리뉴클레오티드의 절단을 가져옴으로써 표적 폴리뉴클레오티드를 변형시키는 것을 포함하며, 여기서 핵산-표적화 복합체는 상기 표적 폴리뉴클레오티드 내의 표적 서열에 혼성화된 가이드 RNA와 복합체화된 핵산-표적화 이펙터 단백질을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 진핵 세포에서 폴리뉴클레오티드의 발현을 변형시키는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 방법은 핵산-표적화 복합체가 폴리뉴클레오티드에 결합 가능하게 하여 상기 결합이 상기 폴리뉴클레오티드의 증가되거나 감소된 발현을 초래하는 것을 포함하며; 여기서 핵산-표적화 복합체는 상기 폴리뉴클레오티드 내의 표적 서열에 혼성화된 가이드 RNA와 복합체화된 핵산-표적화 이펙터 단백질을 포함한다.
C2c2 이펙터 단백질 복합체는 식물에서 사용될 수 있다
C2c2 이펙터 단백질 시스템(들)(예를 들어, 단일 또는 다중화된)은 작물 유전체학에서의 최근의 진전과 함께 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 시스템은 효율적 및 비용 효과적으로 식물 유전자 또는 게놈 측정 또는 편집 또는 조작(예를 들어, 식물 유전자 또는 게놈의 신속한 조사 및/또는 선택 및/또는 측정 및/또는 비교 및/또는 조작 및/또는 형질전환)을 실행하는 데 사용될 수 있으며; 예를 들어 특성(들) 또는 특징(들)을 형성, 확인, 발생, 최적화 또는 식물(들)에게 부여 또는 식물 게놈을 형질전환한다. 따라서 식물, 특성 또는 특징의 새로운 조합을 갖는 새로운 식물 또는 향상된 특성을 갖는 새로운 식물의 개선된 생산이 있을 수 있다. 그러한 C2c2 이펙터 단백질 시스템(들)은 식물에 대하여 부위-유도된 통합(SDI) 또는 유전자 편집(GE) 또는 임의의 근접 역전 브리딩(NRB) 또는 역전 브리딩(RB) 기법에서 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 C2c2 이펙터 단백질 시스템의 이용 양태는 식물에서 CRISPR-Cas(예를 들어, CRISPR-Cas9) 시스템의 사용과 유사할 수 있으며, 아리조나 대학 웹사이트 "CRISPR-PLANT"(http://www.genome.arizona.edu/crispr/)(Penn State 및 AGI 후원)가 언급된다. 본 발명의 일 구현예는 식물에서 또는 RNAi 또는 유사한 게놈 편집 기술이 이미 사용된 곳에서 게놈 편집에 사용될 수 있다; 예를 들어, 문헌 [Nekrasov, "Plant genome editing made easy: targeted mutagenesis in model and crop plants using the CRISPR-Cas system," Plant Methods 2013, 9:39(doi:10.1186/1746-4811-9-39)]; 문헌 [Brooks, "Efficient gene editing in tomato in the first generation using the CRISPR-Cas9 system," Plant Physiology September 2014 pp 114.247577]; 문헌 [Shan, "Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR-Cas system," Nature Biotechnology 31, 686-688(2013)]; 문헌 [Feng, "Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cas system," Cell Research(2013) 23:1229-1232. doi:10.1038/cr.2013.114; 2013년 8월 20일 온라인 간행됨]; 문헌 [Xie, "RNA-guided genome editing in plants using a CRISPR-Cas system," Mol Plant. 2013 Nov;6(6):1975-83. doi: 10.1093/mp/sst119. 2013년 8월 17일 전자출판]; 문헌 [Xu, "Gene targeting using the Agrobacterium tumefaciens-mediated CRISPR-Cas system in rice," Rice 2014, 7:5(2014)]; 문헌 [Zhou et al., "Exploiting SNPs for biallelic CRISPR mutations in the outcrossing woody perennial Populus reveals 4-coumarate: CoA ligase specificity and Redundancy," New Phytologist(2015)(Forum) 1-4(www.newphytologist.com에서만 온라인으로만 이용 가능)]; 문헌 [Caliando et al, "Targeted DNA degradation using a CRISPR device stably carried in the host genome, NATURE COMMUNICATIONS 6:6989, DOI: 10.1038/ncomms7989, www.nature.com/naturecommunications DOI: 10.1038/ncomms7989]; 미국 특허 제6,603,061 호 - Agrobacterium-Mediated Plant Transformation Method; 미국 특허 제7,868,149 호 - Plant Genome Sequences and Uses Thereof, 및 미국 2009/0100536 - Transgenic Plants with Enhanced Agronomic Traits 참조, 이들 각각의 내용 및 개시 내용 모두는 그 전체로 본 명세서에 참고문헌으로 포함된다. 본 발명의 실시에서, 문헌 [Morrell et al "Crop genomics: advances and applications," Nat Rev Genet. 2011 Dec 29;13(2):85-96]의 내용 및 개시 내용; 이들 각각은, 본 명세서의 구현예가 식물에 대하여 어떻게 사용되는지를 포함하여, 본 명세서에서 참고문헌으로 통합된다. 따라서, 동물 세포에 대한 본 명세서의 참고문헌 또한 달리 명백하지 않은 경우, 식물 세포에 또한 적절한 변형을 가하여 적용될 수 있고; 본 명세서에서 감소된 표적외 효과를 갖는 효소 및 그러한 효소를 사용하는 시스템은, 본 명세서에서 언급된 것들을 포함하여, 식물 응용분야에서 사용될 수 있다.
Sugano 외(Plant Cell Physiol. 2014 Mar;55(3):475-81. doi: 10.1093/pcp/pcu014. Epub 2014 Jan 18)는, 육상 식물 진화를 연구하기 위한 모델 종으로서 떠오른, 우산이끼 마르찬티아 폴리모파 L(Marchantia polymorpha L.)에서의 표적화된 돌연변이유발에 CRISPR-Cas9의 적용을 보고한다. 마르찬티아 폴리모파의 U6 프로모터가 확인되고, 클로닝되어 gRNA를 발현하였다. gRNA의 표적 서열은 마르찬티아 폴리모파에서 옥신 반응 인자 1(ARF1)을 인코딩하는 유전자를 파괴하도록 설계되었다. 아그로박테리움-매개 형질전환을 사용하여, Sugano외는 마르찬티아 폴리모파의 배우체 생성에서 안정적인 돌연변이체를 분리하였다. 생체내에서 CRISPR-Cas9-기반 부위-특이적 돌연변이유발은, 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S 또는 마르찬티아 폴리모파 EF1α 프로모터 중 어느 하나를 사용하여 Cas9를 발현하도록 달성되었다. 옥신-내성 표현형을 나타내는 분리된 돌연변이체 개체는 키메라가 아니었다. 나아가, 안정적인 돌연변이체는 T1 식물의 무성 생식에 의해 생산되었다. arf1 겹대립형질(multiple allele)은 CRIPSR/Cas9-기반의 표적화된 돌연변이유발을 사용하여 용이하게 수립되었다. 본 발명의 C2c2 시스템은 동일뿐만 아니라 다른 유전자를 조절하는 데 사용될 수 있으며, RNAi 및 siRNA와 같은 발현 제어 시스템과 같이 본 발명의 방법은 유도성 및 가역성일 수 있다.
Kabadi 외(Nucleic Acids Res. 2014 Oct 29;42(19):e147. doi: 10.1093/nar/gku749. Epub 2014 Aug 13)는, 편리한 골든 게이트 클로닝 방법에 의하여 벡터 내로 혼입된 독립된 RNA 중합효소 III 프로모터로부터, Cas9 변이체, 리포터 유전자 및 최대 4 개의 sgRNA를 발현시키기 위하여 단일 렌티바이러스 시스템을 개발하였다. 각각의 sgRNA는 효율적으로 발현되었고, 불사화된 일차 인간 세포에서 다중화 유전자 편집 및 지속된 전사 활성화를 매개할 수 있다. 본 발명은 Kabadi의 식물 유전자를 조절하는 데 사용될 수 있다.
Xing 외(BMC Plant Biology 2014, 14:327)는, pGreen 또는 pCAMBIA 백본뿐만 아니라, gRNA를 기반으로 한 CRISPR-Cas9 바이너리 벡터 세트를 개발하였다. 이러한 도구 키트(toolkit)는 최소한 하나의 클로닝 단계에서 메이즈(maize)-코돈 최적화된 Cas9 및 하나 이상의 gRNA를 품고 있는 최종 작제물을 고효율로 생성하기 위해, BsaI 외의 제한 효소를 필요로 하지 않는다. 도구 키트는 메이즈 원형질, 유전자 도입 메이즈 계통, 및 유전자 도입 아라비돕시스 계통을 사용하여 확인되었으며, 높은 효율 및 특이성을 보이는 것으로 나타났다. 더욱 중요하게는, 이러한 도구 키트를 사용하여, 3 개의 아라비돕시스 유전자의 표적화된 돌연변이가 T1 세대의 유전자 도입 묘목에서 검출되었다. 또한, 다중-유전자 돌연변이가 그 다음 세대로 유전될 수 있었다. 식물에서 다중화 게놈 편집을 위한 도구 키트로서, (가이드 RNA) 모듈 벡터 세트. 본 발명의 C2c2 시스템 및 단백질은 Xing에 의해 표적화된 유전자를 표적화하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 C2c2 CRISPR 시스템은 식물 바이러스의 검출에 사용될 수 있다. Gambino 외(Phytopathology. 2006 Nov;96(11):1223-9. doi: 10.1094/PHYTO-96-1223)는 9 개의 포도덩굴 바이러스의 동시 검출을 위해 증폭 및 다중 PCR에 의존하였다. 본 발명의 C2c2 시스템 및 단백질은 유사하게 숙주에서 다수의 표적을 검출하는 데 사용될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 시스템은 가치가 큰 품종에서의 바이러스 유전자 발현을 동시에 녹다운시키고 발현된 바이러스 RNA를 표적화함으로써 활성화 또는 추가 감염을 방지하는 데 사용될 수 있다.
Murray 외(Proc Biol Sci. 2013 Jun 26;280(1765):20130965. doi: 10.1098/rspb.2013.0965; 2013월 8월 22일 간행)는 12 종의 식물 RNA 바이러스를 분석하여 진화 속도를 조사하였으며 아마도 상이한 숙주 유전자형 또는 종 사이에서의 이동으로 인한 우발적 선택의 증거를 밝혀냈다. 본 발명의 C2c2 시스템 및 단백질은 숙주에서 이러한 바이러스에 대해 표적화 또는 면역화하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 시스템은 바이러스 RNA 발현 이에 따른 복제를 차단하는 데 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 절단을 위해 핵산을 표적화하는 것뿐만 아니라 발현 또는 활성화를 표적화하는 데 사용될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 시스템은 다수의 표적 또는 동일한 바이러스의 다수의 단리물을 공격하도록 다중화될 수 있다.
Ma 외(Mol Plant. 2015 Aug 3;8(8):1274-84. doi: 10.1016/j.molp.2015.04.007)는 단자엽 및 쌍자엽 식물에서 편리하고 고효율의 다중화된 게놈 편집을 위해, 식물 코돈 최적화된 Cas9 유전자를 활용하는, 견고한 CRISPR-Cas9 벡터 시스템을 보고한다. Ma 외는 다수의 sgRNA 발현 카세트를 신속하게 생성하기 위해 PCR-기반 절차를 설계하였으며, 이는 골든 게이트 연결 또는 Gibson 조립에 의한 한 차례의 클로닝에서 2 부분으로 이루어진 CRISPR-Cas9 벡터 내로 조립될 수 있다. 이 시스템을 이용하여, Ma 외는, 평균 85.4%의 돌연변이율로, 대부분 2-대립형질 및 동형 접합 상태로, 벼의 46 개 표적 부위를 편집하였다. Ma 외는 유전자 패밀리의 다수의(8 개까지) 구성원, 생합성 경로에서의 다수의 유전자, 또는 단일 유전자에서 다수의 부위의 동시 표적화에 의해 T0 벼 및 T1 애기장대 식물에서 기능-손실 유전자 돌연변이의 예를 제공한다. 유사하게, 본 발명의 C2c2 시스템은 다수의 유전자의 발현을 동시에 효율적으로 표적화할 수 있다.
Lowder 외(Plant Physiol. 2015 Aug 21. pii: pp.00636.2015) 또한 CRISPR-Cas9 툴박스(toolbox)를 개발하여 식물에서 발현된, 침묵화된 또는 비-코딩 유전자의 다중화된 게놈 편집 및 전사 조절을 가능하게 한다. 이 툴박스는 골든 게이트 및 게이트웨이 클로닝 방법을 사용하여 단자엽 및 쌍자엽에 대한 기능성 CRISPR-Cas9 T-DNA 작제물을 빠르고 효율적으로 조립하기 위한 프로토콜 및 시약을 연구원에게 제공한다. 그것은 다중화된 유전자 편집 및 식물 내인성 유전자의 전사 활성화 또는 억제를 포함하는 전체 세트의 성능을 제공한다. T-DNA 기반의 형질 전환 기술은 현대 식물 생명 공학, 유전학, 분자 생물학 및 생리학의 기본이다. 이와 같이 Cas9(WT, 니카제 또는 dCas9) 및 gRNA(들)를 관심 T-DNA 목적-벡터에 조립하는 방법을 개발하였다. 조립 방법은 골든 게이트 조립 및 MultiSite 게이트웨이 재조합 모두를 기반으로 한다. 조립을 위해서 3 개의 모듈이 요구된다. 제1 모듈은 Cas9 엔트리 벡터이며, 이는 attL1 및 attR5 부위의 측면에 배치되는 프로모터 없는 Cas9 또는 이의 유도체 유전자를 함유한다. 제2 모듈은 attL5 및 attL2 부위의 측면에 배치되는 엔트리 gRNA 발현 카세트를 함유하는 gRNA 엔트리 벡터이다. 제3 모듈은 Cas9 발현을 위한 선택의 프로모터를 제공하는, attR1-attR2-함유 목적 T-DNA 벡터를 포함한다. Lowder 외의 툴박스는 본 발명의 C2c2 이펙터 단백질 시스템에 적용될 수 있다.
효모 및 미세 조류와 같은 생물은 합성 생물학에 널리 사용된다. Stovicek 외(Metab. Eng. Comm., 2015; 2:13는 산업적 생산용 견고한 균주를 효율적으로 생산하기 위한 산업 효모, 예를 들어, 사카로마이세스 세레비사에의 게놈 편집을 기재하고 있다. Stovicek은 동시에 내인성 유전자의 두 대립유전자 모두를 파괴하고 이종 유전자를 녹인하기 위해 효모에 대해 코돈-최적화된 CRISPR-Cas9 시스템을 사용하였다. Cas9 및 gRNA는 게놈 또는 에피솜 2 μ-기반 벡터 위치로부터 발현되었다. 저자는 또한 Cas9 및 gRNA 발현 수준을 최적화함으로써 유전자 파괴 효율이 향상될 수 있음을 보여주었다. Hlavovα 외(Biotechnol. Adv. 2015)는 삽입 돌연변이유발 및 스크리닝을 위해 핵 및 엽록체 유전자를 표적화하는 CRISPR과 같은 기법을 사용하는 미세 조류의 종 또는 균주의 개발에 대해 논의한다. 동일한 플라스미드 및 벡터가 본 발명의 C2c2 시스템에 적용될 수 있다.
Petersen("Towards precisely glycol engineered plants," Plant Biotech Denmark Annual meeting 2015, Copenhagen, Denmark)은 아라비돕시스에서 게놈 변화를 조작하기 위하여, 예를 들어 원하는 번역후 변형을 갖는 생성물 및 단백질의 생산을 위해 아라비돕시스를 글리코 조작하기 위하여, CRISPR/Cas9를 사용하는 방법을 개발하였다. Hebelstrup 외(Front Plant Sci. 2015 Apr 23; 6:247)은 식물체 내 전분 생물공학을 개괄하며, 전분 변형 효소를 발현하고, 전분의 산업적 화학적 및/또는 물리적 처리에 의해 보통 제조되는 생성물을 직접 생산하는 작물을 제공한다. Petersen 및 Hebelstrup의 방법은 본 발명의 C2c2 이펙터 단백질 시스템에 적용될 수 있다.
Kurth 외, J Virol. 2012 Jun;86(11):6002-9. doi: 10.1128/JVI.00436-12. Epub 2012 Mar 21)는 게놈에 대한 유전적 변형없이 포도덩굴에 원하는 형질을 도입하기 위해 RNA 바이러스-기반 벡터를 개발하였다. 벡터는 바이러스-유도된 유전자 침묵에 의해 내인성 유전자의 발현을 조절하는 능력을 제공하였다. 본 발명의 C2c2 시스템 및 단백질은 게놈에 대한 유전적 변형없이 유전자 및 단백질을 침묵시키는 데 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 식물은 콩과 식물일 수 있다. 본 발명은 예를 들어 제한 없이 대두, 완두콩 및 땅콩을 탐구 및 변형하기 위하여 본 명세서에 개시된 CRISP-Cas 시스템을 이용할 수 있다. Curtin 외는 콩과 식물 기능 유전체학을 위한 툴박스를 제공한다(Curtin et al., "A genome engineering toolbox for legume Functional genomics," International Plant and Animal Genome Conference XXII 2014 참고). Curtin은 털이 많은 뿌리 및 전체 식물 시스템 모두에서 단일 카피 및 복제된 콩과 식물 유전자를 녹-아웃/다운하기 위해 CRISPR의 유전 형질 변환을 이용하였다. 표적 유전자 중 일부는 녹-아웃/다운 시스템의 특징을 탐구 및 최적화하기 위해 선택된 것인 반면(예를 들어, 피토엔 불포화화 효소), 다른 것들은 애기장대 다이서-유사 유전자에 대한 대두 상동성에 의해 또는 개자리속(Medicago)의 마디 생성에 대한 게놈-전체에 걸친 관련성 연구에 의해 확인되었다. 본 발명의 C2c2 시스템 및 단백질은 시스템을 녹아웃/녹다운시키는 데 사용될 수 있다.
땅콩 알레르기 및 콩과 식물에 대한 알레르기는 일반적으로 실제적이고 심각한 건강 상의 문제이다. 본 발명의 C2c2 이펙터 단백질 시스템은 이러한 콩과 식물의 알레르기 유발 단백질을 인코딩하는 유전자를 동정하고 그 후 편집하거나 침묵시키는 데 사용될 수 있다. 이러한 유전자 및 단백질에 대한 제한 없이, Nicolaou 외는 땅콩, 대두, 렌틸, 완두콩, 루핀, 껍질콩 및 녹두에서 알레르기 유발 단백질을 확인한다. 문헌[Nicolaou et al., Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology 2011;11(3):222)] 참고.
유리한 구현예에서, 식물은 나무일 수 있다. 본 발명은 또한 본 명세서에서 개시된 CRISPR Cas 시스템을 초본경에 이용할 수 있다(예를 들어, 문헌[Belhaj et al., Plant Methods 9: 39] 및 문헌[Harrison et al., Genes & Development 28: 1859-1872] 참조). 특히 유리한 구현예에서, 본 발명의 CRISPR Cas 시스템은 나무에서 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)을 표적화할 수 있다(예를 들어, 문헌[Zhou et al., New Phytologist, Volume 208, Issue 2, pages 298-301, October 2015] 참조). Zhou 외의 연구에서, 저자는, 케이스 연구로서 4-쿠마레이트:CoA 리가제(4CL) 유전자 패밀리를 사용하여 다년생 목본 사시나무속(Populus)에서 CRISPR Cas 시스템을 적용하고, 표적화된 2 개의 4CL 유전자에 대해 100% 돌연변이 효율을 달성하였으며, 검사한 모든 형질전환체는 이중대립형질 변형을 가졌다. Zhou 외의 연구에서, CRISPR-Cas9 시스템은 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)에 대해 고도로 민감하였으며, 제3의 4CL 유전자에 대한 절단은 표적 서열 내 SNP로 인해 삭제되었다. 이러한 방법은 본 발명의 C2c2 이펙터 단백질 시스템에 적용될 수 있다.
Zhou 외의 방법(New Phytologist, Volume 208, Issue 2, pages 298-301, October 2015)은 본 발명에 다음과 같이 적용될 수 있다. 리그닌 및 플라보노이드 생합성에 연관된, 2 개의 4CL 유전자, 즉 4CL1 및 4CL2는 각각 CRISPR-Cas9 편집에 대해 표적화된다. 형질전환에 일상적으로 사용되는 포퓰러스 트레뮬라(Populus tremula) x alba 클론 717-1B4는 게놈-시퀀싱된 포퓰러스 트리코카르파(Populus trichocarpa)로부터 분기된다. 따라서, 기준 게놈으로부터 설계된 4CL1 및 4CL2 gRNA는 인-하우스 717 RNA-Seq 데이터로 질의되어 Cas 효율을 제한할 수 있는 SNP의 부재를 보장한다. 4CL1의 게놈 복제물인, 4CL5에 대해 설계된 제3 gRNA 또한 포함된다. 상응하는 717 서열은 PAM 가까이/내의 각각의 대립형질에서 하나의 SNP를 포함하며, 이들 모두는 4CL5-gRNA에 의한 표적화를 제거하는 것으로 예상된다. 3 개의 gRNA 표적 부위 모두는 제1 엑손 내에 위치된다. 717 형질전환의 경우, gRNA는 바이너리 벡터 내 CaMV 35S 프로모터의 제어 하에, 인간 코돈-최적화된 Cas와 함께 개자리(Medicago) U6.6 프로모터로부터 발현된다. Cas-만의 벡터를 이용한 형질전환은 대조군으로서 제공될 수 있다. 무작위로 선택된 4CL1 및 4CL2 계통은 앰플리콘-시퀀싱 처리된다. 그 데이터는 이후 가공되고, 이중대립형질 돌연변이는 모든 경우에서 확인된다. 이들 방법은 본 발명의 C2c2 이펙터 단백질 시스템에 적용될 수 있다.
식물에서, 병원균은 종종 숙주-특이적이다. 예를 들어, 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum) f. sp. 리코페르시시(lycopersici)는 토마토의 시듬을 유발하지만 토마토만을 공격하고, F. 옥시스포룸 f. 다이안티 푸치니아 그라미니스(dianthii Puccinia graminis) f. sp. 트리티시(tritici)는 밀만 공격한다. 식물은 대부분의 병원균에 견디는 기존 및 유도된 방어를 갖는다. 식물 세대에 걸친 돌연변이 및 재조합 사건은, 특히 병원균이 식물보다 더욱 높은 빈도로 번식함에 따라, 감수성이 증가되는 유전적 변동성을 일으킨다. 식물에서는, 비-숙주 내성이 존재할 수 있으며, 예를 들어 숙주 및 병원균은 비양립성이다. 통상적으로 많은 유전자에 의해 제어되는, 수평 내성, 예를 들어 병원균의 모든 종족에 대하여 부분 내성, 및 통상적으로 몇몇 유전자에 의해 제어되는, 수직 내성, 예를 들어 다른 종족은 아니지만 일부 종족의 병원균에 대해 완전한 내성이 또한 존재할 수 있다. 유전자 대 유전자 수준에서, 식물 및 병원균은 함께 진화하며, 하나의 균형에서의 유전적 변화는 다른 하나에서 변화를 일으킨다. 따라서, 자연적 변동성을 사용하여, 품종 개량자는, 산출량, 품질, 균일성, 강인성(hardiness), 내성에 대해 가장 유용한 유전자를 조합한다. 내성 유전자 공급원은 천연 또는 외래의 변종들, 토종(Heirloom Varieties), 야생 근연 식물, 및 유도된 돌연변이, 예를 들어 돌연변이원성 제제를 이용한 식물 재료 처리를 포함한다. 본 발명을 사용하여, 식물 품종 개량자는 돌연변이를 유도하는 새로운 도구를 제공받는다. 따라서, 당업자는 내성 유전자의 게놈을 분석할 수 있고, 원하는 특징 또는 특성을 갖는 변종들에서, 이전의 돌연변이원성 제제보다 더욱 정확하고, 이에 따라 식물 품종 개량 프로그램을 가속화하고 개선하는 내성 유전자의 증가를 유도하기 위하여 본 발명을 이용할 수 있다.
본 명세서에서 및 상기에서 달리 논의된 식물 외에도, 이펙터 단백질 및 적합한 가이드에 의해 변형된 설계 제작된 식물 및 그의 자손이 제공된다. 이들에는 밀, 보리, 벼, 대두 또는 옥수수와 같은 질병 또는 가뭄 저항성 작물; 자가 수분 능력을 제거 또는 감소시키기 위해 변형된 식물(그러나 대신 할 수 있고, 선택적으로 대신 혼성화할 수 있음); 및 면역원성 단백질이 이펙터 단백질 및 적합한 가이드를 통해 표적화됨으로써 장애, 파괴 또는 방해된, 땅콩 및 견과류와 같은 알레르기 유발 식품이 포함될 수 있다.
치료적 처리
본 출원이 시스템의 정보 제공된 설계 제작을 위한 기초를 제공하므로, 본 발명의 시스템은 본 개시 내용으로부터 과도한 실험없이, 치료, 분석 및 다른 응용을 포함하여, 이전의 RNA 절단 기술 분야에 적용될 수 있다. 본 발명은 RNA 과발현, 독성 RNA 및/또는 돌연변이된 RNA(예를 들어, 스플라이싱 결함 또는 절단과 같은)에 의해 야기되는 질병의 치료적 처리를 제공한다. 독성 RNA의 발현은 뇌, 심장 또는 골격근에서 핵 봉입 형성 및 후기-개시되는 퇴행성 변화와 관련될 수 있다. 가장 잘 연구된 예인 근긴장성 이영양증에서, 독성 RNA의 주요 병원성 효과는 결합 단백질을 격리시키고 대안적 스플라이싱의 조절을 손상시키는 것으로 보인다(문헌[Hum. Mol. Genet. (2006) 15 (suppl 2): R162-R169]). 근긴장성 이영양증 [dystrophia myotonica(DM)]은 극히 광범위한 임상 특징을 생산하기 때문에 유전학자들에게 특히 관심 대상이다. 부분적인 목록에는 근육 소모, 백내장, 인슐린 내성, 고환 위축, 심장 전도 감속, 피부 종양 및 인지에 대한 영향이 포함될 것이다. 현재 DM 제1형(DM1)으로 불리는 DM의 전형적인 형태는 시토졸 단백질 키나제를 인코딩하는 유전자인 DMPK의 3'-비번역 영역(UTR)에서 CTG 반복의 확장에 의해 야기된다.
하기 표는 DM1 골격근, 심장 또는 뇌에서 잘못 조절된 대안적 스플라이싱을 갖는 것으로 나타난 엑손의 목록을 나타낸다.
본 발명의 효소는 과발현된 RNA 또는 독성 RNA, 예를 들어 DMPK 유전자 또는, 예를 들어 상기 표에서, DM1 골격근, 심장 또는 뇌에서의 잘못 조절된 대안적 스플라이싱 중 임의의 것과 같은 것을 표적화할 수 있다.
본 발명의 효소는 또한 하기 표에 나타난 바와 같은 질병을 유발하는 RNA-의존적 기능(문헌[Cell. 2009 Feb 20; 136(4): 777-793]에 요약됨)에 영향을 미치는 트랜스-작용 돌연변이를 표적화할 수 있다.
본 발명의 효소는 또한 AD와 유사한 NFT를 갖지만 플라크는 없는, 일차 연령-관련 타우병증(PART)/신경섬유 매듭-우세한 노인성 치매, 권투선수치매(만성 외상 뇌병증), 진행핵상마비, 피질기저 변성, 염색체 17에 연관된 전측두엽 치매 및 파킨슨병, 리티코-보디그 병(lytico-Bodig disease)(괌의 파킨슨-치매 복합), 신경절교종 및 신경절세포종, 수막혈관종증, 뇌염후 파킨슨병, 아급성경화범뇌염, 뿐만 아니라 납중독뇌병증, 결절경화증, 할러포르덴-스파츠병(Hallervorden-Spatz disease), 및 리포푸신증, 알츠하이머 병과 같은 일차 및 이차 타우병증을 비롯한 다양한 타우병증(tauopathy)의 치료에 사용될 수 있다. 본 발명의 효소는 또한 스플라이싱 결함 및 질병을 야기하는 시스-작용 스플라이싱 코드 방해 돌연변이를 표적화할 수있다(문헌[Cell. 2009 Feb 20; 136(4): 777-793]에 요약됨). 운동 뉴런 퇴행성 질병 SMA는 SMN1 유전자의 결실로부터 기인한다. 나머지 SMN2 유전자는 엑손 스플라이싱 인핸서(ESE)를 비활성화하고 엑손 스플라이싱 사일렌서(ESS)를 생성하는 엑손 7에서의 C->T 치환을 갖고 있으며, 이는 엑손 7 건너뛰기 및 절단된 단백질(SMNΔ7)을 유도한다. 디스트로핀 유전자의 엑손 31에서의 T->A 치환은 미성숙 종료 코돈(STOP) 및 ESS를 동시에 생성하여 엑손 31 건너뛰기를 유도한다. 엑손 31이 결여된 mRNA는 부분적으로 기능적인 단백질을 생산하기 때문에 이 돌연변이는 DMD의 경미한 형태를 유발한다. 타우 단백질을 인코딩하는 MAPT 유전자의 엑손 10내의 및 이의 다운스트림의 돌연변이는 스플라이싱 조절 요소에 영향을 미치고 엑손 10을 포함하거나 제외하는 mRNA의 정상 1:1 비율을 방해한다. 이것은 4 개 또는 3 개의 미세소관-결합 도메인(4R-타우 및 3R-타우, 각각)을 함유하는 타우 단백질들 사이에서 변동된 균형을 초래하여, 신경병리학적 장애 FTDP-17을 유발한다. 나타난 예는 엑손 10 포함을 촉진하고 증가된 4R-타우 쪽으로 균형을 이동시키는 ESE 기능을 향상시키는 N279K 돌연변이이다. CFTR 유전자 엑손 9의 3' 스플라이스 부위 내의 다형성 (UG)m(U)n 영역은 엑손 9 포함 정도 및 전장 기능성 단백질의 수준에 영향을 주어, CFTR 유전자의 다른 곳에 있는 돌연변이에 의해 유발되는 낭포성 섬유증(CF)의 중증도를 변형시킨다.
선천 면역 시스템은 감염된 세포 내에서 바이러스 핵산을 인식함으로써 바이러스 감염을 일차적으로 검출하는데, 이는 DNA 또는 RNA 감지로 지칭된다. 시험관내 RNA 감지 분석은 특정 RNA 기질을 검출하는 데 사용될 수 있다. RNA 표적화 이펙터 단백질은 예를 들어 살아있는 세포에서의 RNA-기반 감지에 사용될 수 있다. 응용의 예는 예를 들어 질병-특이적 RNA의 감지에 의한 진단이다.
본 발명의 RNA 표적화 이펙터 단백질은, 구체적으로 RNA 바이러스에 대한, 항 바이러스 활성에 추가로 사용될 수 있다. 이펙터 단백질은 선택된 바이러스 RNA 서열에 대해 선택적인 적합한 가이드 RNA를 사용하여 바이러스 RNA에 표적화될 수 있다. 구체적으로, 이펙터 단백질은 단일 가닥 RNA와 같은 RNA를 절단하는 활성 뉴클레아제일 수 있다. 따라서, 항 바이러스제로서의 본 발명의 RNA 표적화 이펙터 단백질의 용도가 제공된다.
RNA 상기 언급된 RNA를 표적화하는 본 발명의 효소 시스템의 치료적 투여량은 약 0.1 내지 약 2 mg/kg 인 것으로 고려되며, 투여량은 모니터링된 반응과 함께 순차적으로 투여될 수 있고, 필요한 경우, 환자 당 약 7 내지 10 투여량까지 투여량 반복될 수 있다. 유리하게는, 치료의 효과를 확인하기 위해 치료 요법 동안 각각의 환자로부터 샘플을 수집한다. 예를 들어, RNA 샘플을 단리하고 정량하여 발현이 감소되거나 개선되는지 여부를 결정할 수 있다. 이러한 진단은 당업자의 이해 범위 내에 있다.
전사물 검출 방법
본 발명의 이펙터 단백질 및 시스템은 세포 또는 다른 샘플에서 RNA의 특이적 검출에 유용하다. 관심 RNA 표적의 존재 하에서, 가이드-의존적 C2c2 뉴클레아제 활성은 부수적 표적에 대한 비-특이적 알엔아제 활성에 의해 수반될 수 있다. 알엔아제 활성을 이용하기 위해서, 필요한 모든 것은 검출 가능하게 절단될 수 있는 리포터 기질이다. 예를 들어, 리포터 분자는 한쪽 끝에 형광 리포터 분자(플루오르)로 다른 쪽에는 소광제로 태깅된 RNA를 포함할 수 있다. C2c2 알엔아제 활성이 부재하는 경우, 소광제의 물리적 근접성은 형광을 플루오르로부터 낮은 수준으로 약화시킨다. C2c2 표적 특이적 절단이 관심 있는 RNA 표적 및 적합한 가이드 RNA의 존재에 의해 활성화될 때, RNA-함유 리포터 분자는 비-특이적으로 절단되고 플루오르 및 소광제는 공간적으로 분리된다. 이것은 적절한 파장의 빛에 의해 여기될 때 플루오르가 검출 가능한 신호를 방출하도록 한다.
일 양태에서, 본 발명은 RNA 표적화 이펙터, 상응하는 RNA 표적에 결합하도록 설계된 하나 이상의 가이드 RNA; 및 RNA-기반 절단 유도성 리포터 작제물을 포함하는 (표적) RNA 검출 시스템에 관한 것이다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 RNA 표적화 이펙터, 상기 (표적) RNA에 결합하도록 설계된 하나 이상의 가이드 RNA, 및 RNA-기반 절단 유도성 리포터 작제물을 상기 샘플에 첨가하는 것을 포함하는, 샘플에서 (표적) RNA 검출하는 방법에 관한 것이다. 추가의 양태에서, 본 발명은 본 명세서에서 정의된 (표적) RNA 검출 시스템을 포함하는 키트 또는 장치, 또는 적어도 RNA 표적화 이펙터 및 RNA-기반 절단 유도성 리포터 작제물을 포함하는 키트 또는 장치에 관한 것이다. 추가의 양태에서, 본 발명은 (표적) RNA 검출을 위한 본 명세서에서 정의된 RNA 표적화 시스템 또는 키트 또는 장치의 용도에 관한 것이다. 특정 구현예에서 RNA 표적화 이펙터는 RNA 가이드된 알엔아제이다. 특정 구현예에서, RNA 표적화 이펙터는 CRISPR 이펙터이다. 특정 구현예에서, RNA 표적화 이펙터는 클래스 2 CRISPR 이펙터이다. 특정 구현예에서, RNA 표적화 이펙터는 클래스 2, 제VI형 CRISPR 이펙터이다. 선호되는 구현예에서, RNA 표적화 이펙터는 C2c2이다. 특정 구현예에서, RNA 표적화 이펙터, 바람직하게 C2c2는 본 명세서의 다른 곳에 기재된 종으로부터 유래된다. 본 명세서에 기재된 바와 같이 상기 (표적) RNA에 결합하도록 설계된 가이드 RNA는 RNA 표적화 이펙터와 복합체를 형성할 수 있고 여기서 상기 복합체 내의 가이드 RNA는 표적 RNA 분자에 결합할 수 있어, 역시 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같이, 표적 RNA가 절단된다는 것이 이해될 것이다. 가이드 RNA는 전형적으로 본 명세서의 다른 곳에 기재된, 가이드 서열 및 직접 반복을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 가이드 RNA는 질병 상태에 대해 진단적인 하나 이상의 표적 분자에 결합하도록 설계된다. 특정 구현예에서, 질병 상태는 바이러스, 박테리아, 균류 또는 기생충 감염과 같은 감염이다. 특정 구현예에서, 질병 상태는 비정상적 (표적) RNA 발현을 특징으로 한다. 특정 구현예에서, 질병 상태는 암이다. 특정 구현예에서, 질병 상태는 자가면역 질병이다. RNA-기반 절단 유도성 리포터 작제물은 RNA를 포함하고, RNA의 절단은 검출 가능한 판독 결과를 초래하고, 즉 검출 가능한 신호가 RNA의 절단 즉시 생성된다. 특정 구현예에서, RNA-기반 절단 유도성 리포터 작제물은 형광색소 및 소광제를 포함한다. 당업자는 상이한 유형의 형광색소 및 상응하는 소광제가 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 당업자는 본 RNA 절단 리포터 작제물에서의 사용을 위해 조정될 수 있는 다른 유형의 유도성 리포터 시스템을 용이하게 예상할 것이다.
하나의 예시적인 분석 방법에서, C2c2 이펙터, 관심 표적-특이적 가이드 RNA, 및 리포터 분자가 세포 샘플에 첨가된다. 형광의 증가는 관심 RNA 표적의 존재를 암시한다. 또 다른 예시적인 방법에서, 검출 어레이가 제공된다. 어레이의 각각의 위치는 C2c2 이펙터, 리포터 분자, 및 관심 표적-특이적 가이드 RNA로 제공된다. 수행되는 분석에 따라, 어레이의 각각의 위치에서의 관심 표적-특이적 가이드 RNA는 동일하거나 상이할 수 있거나 이들의 조합일 수 있다. 예를 들어, 단일 출처 샘플에서 하나 이상의 표적을 시험하고자 할 때, 상이한 관심 표적-특이적 가이드 RNA가 제공될 수 있다. 예를 들어, 동일한 표적에 대해 다수의 샘플을 시험하고자 할 때, 각각의 위치에서 동일한 관심 표적-특이적 가이드 RNA가 제공될 수 있다.
본 명세서에 사용된 "마스킹 작제물"은 본 명세서에 기재된 활성화된 CRISPR 시스템 이펙터 단백질에 의해 절단되거나 그렇지 않으면 탈활성화될 수 있는 분자를 지칭한다. 특정 예시적 구현예에서, 마스킹 작제물은 RNA-기반 마스킹 작제물이다. 마스킹 작제물은 양성의 검출 가능한 신호의 생성 또는 검출을 방지한다. 양성의 검출 가능한 신호는 당업계에 공지된 광학, 형광, 화학발광, 전기화학적 또는 다른 검출 방법을 사용하여 검출될 수 있는 임의의 신호일 수 있다. 마스킹 작제물은 마스킹 작제물인 제거되거나 그렇지 않으면 침묵될 때까지 검출 가능한 양성 신호의 생성을 방지하거나 검출 가능한 양성 신호의 존재를 마스킹할 수 있다. 용어 "양성의 검출 가능 신호"는 마스킹 작제물의 존재 하에서 검출될 수 있는 다른 검출 가능한 신호와 구별하기 위해 사용된다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 마스킹 제제가 존재할 때 제1 신호가 검출될 수 있으며(즉, 음성의 검출 가능한 신호), 그 후 이는 활성화된 CRISPR 이펙터 단백질에 의한 표적 분자의 검출 및 마스킹 제제의 절단 또는 탈활성화 즉시 제2 신호(예를 들어, 양성의 검출 가능한 신호)로 전환된다.
특정 예시적 구현예에서, 마스킹 작제물은 유전자 산물의 생성을 억제할 수 있다. 유전자 산물은 샘플에 첨가되는 리포터 작제물에 의해 인코딩될 수 있다. 마스킹 작제물은 shRHN 또는 siRNA와 같은 RNA 간섭 경로에 관여되는 간섭 RNA일 수 있다. 마스킹 작제물은 또한 마이크로RNA(miRNA)를 포함할 수 있다. 존재하는 동안, 마스킹 작제물은 유전자 산물의 발현을 억제한다. 유전자 산물은 형광 단백질일 수 있거나 마스킹 작제물의 존재가 없었다면 표지된 프로브 또는 항체에 의해 검출 가능할 다른 RNA 전사물 또는 단백질일 수 있다. 이펙터 단백질의 활성화 즉시 마스킹 작제물은 절단되거나 그렇지 않으면 침묵되어 양성의 검출 가능한 신호로서 유전자 산물의 발현 및 검출을 가능하게 한다.
특정 예시적 구현예에서, 마스킹 작제물은 검출 가능한 양성 신호를 생성하는 데 필요한 하나 이상의 시약을 격리하여, 마스킹 작제물로부터의 하나 이상의 시약의 방출이 검출 가능한 양성 신호의 생성을 초래하도록 할 수 있다. 하나 이상의 시약은 결합하여 비색 신호, 화학발광 신호, 형광 신호 또는 임의의 다른 검출 가능한 신호를 생산할 수 있으며, 이러한 목적에 적합한 것으로 알려진 임의의 시약을 포함할 수 있다. 특정 예시적 구현예에서, 하나 이상의 시약은 하나 이상의 시약에 결합하는 RNA 압타머에 의해 격리된다. 하나 이상의 시약은 표적 분자의 검출 즉시 이펙터 단백질이 활성화될 때 방출된다. 특정 예시적 구현예에서, 하나 이상의 시약은, 하나 이상의 RNA 압타머가 단백질에 결합함으로써 단백질이 검출 가능한 신호를 생성할 수 없도록 저해되거나 격리된, 비색, 화학발광 또는 형광 신호와 같은 검출 가능한 신호의 생성을 촉진시킬 수 있는, 효소와 같은 단백질이다. 본 명세서에 개시된 이펙터 단백질의 활성화 시, RNA 압타머는 검출 가능 신호를 생성하는 단백질의 능력을 더 이상 저해하지 않는 정도까지 절단되거나 분해된다.
일 구현예에서, 트롬빈은 예를 들어 다음의 서열을 갖는 저해성 압타머와 함께 신호 증폭 효소로서 사용된다:GGGAACAAAGCUGAAGUACUUACCC. 이 압타머가 절단되면 트롬빈은 활성화되어 펩티드 비색 기질(예를 들어, www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t3068?lang=en&region=US 참고) 또는 형광 기질(예를 들어, www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/b9385?lang=en&region=US 참고)을 절단할 것이다. 비색 기질, 파라-니트로아닐리드(pNA),는 트롬빈을 위한 펩티드 기질에 공유 결합된다. 트롬빈에 의한 절단 시, pNA는 방출되어 황색으로 되고 쉽게 눈으로 볼 수 있다. 형광 기질은 유사한 원리에 의해 작동하며 트롬빈에 의한 절단 즉시 형광 검출기를 사용하여 검출될 수 있는 청색 형광단인 7-아미노-4-메틸쿠마린을 방출한다. 트롬빈의 대안으로는 유사하게 비색 또는 형광 신호를 생성하는 데 사용될 수 있고 저해성 압타머에 의해 저해될 수 있는 홀스라디시 페록시다제(HRP), β-갈락토시다제 및 송아지 알칼라인 포스파타제(CAP)가 포함된다.
특정 예시적 구현예에서, 마스킹 작제물은 개별 분리된 부피로(아래에서 추가로 정의됨) 고체 기질 상에 고정화될 수 있고 단일 시약을 격리할 수 있다. 예를 들어, 시약은 염료를 포함하는 비드일 수 있다. 고정된 시약에 의해 격리될 때, 개별 비드는 검출 가능한 신호를 생성하기에 너무 분산되어 있지만, 마스킹 작제물로부터의 방출 시, 예를 들어 응집 또는 용액 농도의 단순한 증가에 의해 검출 가능한 신호를 생성할 수 있다. 특정 예시적 구현예에서, 고정화된 마스킹 제제는 표적 분자의 검출 시 활성화된 이펙터 단백질에 의해 절단될 수 있는 RNA-기반의 압타머이다.
특정 다른 예시적 구현예에서, 마스킹 작제물은 용액 중 고정화된 시약에 결합함으로써 시약이 용액 중 유리된 별도의 표지된 결합 파트너에 결합하는 능력을 차단한다. 따라서, 샘플에 세척 단계 적용 시, 표지된 결합 파트너는 표적 분자의 부재 하에 샘플로부터 세척될 수 있다. 그러나, 이펙터 단백질이 활성화되면, 마스킹 작제물은 마스킹 작제물이 시약에 결합하는 능력을 간섭하기에 충분한 정도로 절단되어, 표지된 결합 파트너가 고정화된 시약에 결합할 수 있게 한다. 따라서, 표지된 결합 파트너는 세척 단계 후에 남아있고, 이는 샘플 내 표적 분자의 존재를 나타낸다. 특정 양태에서, 고정화된 시약에 결합하는 마스킹 작제물은 RNA 압타머이다. 고정화된 시약은 단백질일 수 있고, 표지된 결합 파트너는 표지된 항체일 수 있다. 대안적으로, 고정화된 시약은 스트렙타비딘일 수 있고, 표지된 결합 파트너는 바이오틴 표지될 수 있다. 상기 구현예에서 사용된 결합 파트너 상의 표지는 당업계에 공지된 임의의 검출 가능한 표지일 수 있다. 추가적으로 본 명세서에 기재된 전체적인 설계에 따라 다른 공지된 결합 파트너가 사용될 수 있다.
특정 예시적 구현예에서, 마스킹 작제물은 리보자임을 포함할 수 있다. 리보자임은 촉매 특성을 갖는 RNA 분자이다. 리보자임은 천연적인 것 및 설계 제작된 것 모두, RNA를 포함하거나 RNA로 구성되므로, 본 명세서에 개시된 이펙터 단백질에 의해 표적화될 수 있다. 리보자임은 음성의 검출 가능한 신호를 생성하거나 양성의 제어 신호의 생성을 방지하는 반응을 촉매하도록 선택되거나 설계 제작될 수 있다. 활성화된 이펙터 단백질 분자에 의한 리보자임의 탈활성화 시, 음성의 제어 신호를 생성하거나 양성의 검출 가능한 신호의 생성을 방지하는 반응이 제거되어, 양성의 검출 가능한 신호가 검출 가능하게 한다. 일 예시적 구현예에서, 리보자임은 용액이 제1 색으로 보이도록 하는 비색 반응을 촉매할 수 있다. 리보자임이 탈활성화되면, 그 후 용액은 제2 색으로 변하고, 제2 색은 검출 가능한 양성 신호이다. 리보자임이 비색 반응을 촉매하는 데 어떻게 사용될 수 있는지에 대한 예가 문헌[Zhao et al. "Signal amplification of glucosamine-6-phosphate based on ribozyme glmS," Biosens Bioelectron. 2014; 16:337-42]에 기재되어 있고, 이러한 시스템이 어떻게 본 명세서에 개시된 구현예들의 맥락에서 작동하도록 변형될 수 있는지에 대한 예를 제공한다. 대안적으로, 리보자임은, 존재하는 경우, 예를 들어 RNA 전 사물의 절단 산물을 생성할 수 있다. 따라서, 양성의 검출 가능한 신호의 검출은 리보자임의 부재 하에만 생성되는 비-절단 RNA 전사물의 검출을 포함할 수 있다
일 예시적 구현예에서, 마스킹 작제물은 검출 제제가 용액 중 응집되거나 분산되는지 여부에 따라 색을 변화시키는 검출 제제를 포함한다. 예를 들어, 콜로이드 금과 같은 특정 나노입자는 응집체에서 분산된 입자로 이동할 때 가시적인 보라색에서 빨간색으로의 변화를 겪는다. 따라서, 특정 예시적 구현예에서, 이러한 검출 제제는 하나 이상의 가교 분자에 의해 응집체로 유지될 수 있다. 가교 분자의 적어도 일부는 RNA를 포함한다. 본 명세서에 개시된 이펙터 단백질의 활성화 시, 가교 분자의 RNA 부분이 절단되어 검출 제제가 분산되고 대응하는 색 변화를 초래하도록 한다. 특정 예시적 구현예에서, 가교 분자는 RNA 분자이다. 특정 예시적 구현예에서, 검출 제제는 콜로이드성 금속이다. 콜로이드성 금속 물질은 수-불용성 금속 입자 또는 액체 중 분산된 금속 화합물, 하이드로졸 또는 금속 졸을 포함할 수 있다. 콜로이드성 금속은 주기율표의 IA, IB, IIB 및 IIIB 족의 금속뿐만 아니라 전이 금속, 특히 VIII 족의 것들로부터 선택될 수 있다. 선호되는 금속은 금, 은, 알루미늄, 루테늄, 아연, 철, 니켈 및 칼슘을 포함한다. 다른 적합한 금속은 또한 모든 다양한 산화 상태에서의 다음을 포함한다: 리튬, 소듐, 마그네슘, 포타슘, 스칸듐, 티타늄, 바나듐, 크롬, 망간, 코발트, 구리, 갈륨, 스트론튬, 니오븀, 몰리브덴, 팔라듐, 인듐, 주석, 텅스텐, 레늄, 백금 및 가돌리늄. 금속은 바람직하게는 적절한 금속 화합물 유래의 이온 형태, 예를 들어 A13+, Ru3+, Zn2+, Fe3+, Ni2+ 및 Ca2+ 이온으로 제공된다.
특정 다른 예시적 구현예에서, 마스킹 작제물은 검출 가능한 표지에 부착된 RNA 올리고뉴클레오티드 및 그 검출 가능한 표지의 마스킹 제제를 포함할 수 있다. 이러한 검출 가능한 표지/마스킹 제제 쌍의 예는 형광단 및 형광단의 소광제이다. 형광단의 소광은 형광단과 또 다른 형광단 사이의 비-형광 복합체 또는 비-형광 분자의 형성의 결과로서 발생할 수 있다. 이 메커니즘은 기저-상태 복합체 형성, 정적 소광 또는 접촉 소광으로 알려져 있다. 따라서, RNA 올리고뉴클레오티드는 형광단 및 소광제가 접촉 소광이 일어나기에 충분히 근접하도록 설계될 수 있다. 형광단 및 이의 동족 소광제는 당업계에 공지되어 있고 당업자에 의해 이 목적으로 선택될 수 있다. 구체적인 형광단/소광제 쌍은, 형광단/소광제 쌍의 선택이 형광단의 마스킹을 보장하는 것을 제외하고는, 본 발명의 맥락에서 중요하지 않다. 본 명세서에 개시된 이펙터 단백질의 활성화 즉시, RNA 올리고뉴클레오티드는 절단됨으로써 접촉 소광 효과를 유지하는 데 필요한 형광단과 소광제 사이의 근접성을 단절한다. 따라서, 형광단의 검출은 샘플 내의 표적 분자의 존재를 결정하는 데 사용될 수 있다.
일 예시적 구현예에서, 마스킹 작제물은 양자점을 포함할 수 있다. 양자점은 표면에 부착된 다수의 링커 분자를 가질 수 있다. 링커 분자의 적어도 일부는 RNA를 포함한다. 링커 분자는 한 쪽 말단은 양자점에 부착되고 링커의 길이를 따라 또는 끝 말단들은 하나 이상의 소광제에 부착되어 양자점의 소광이 발생하기에 충분히 근접하게 소광제를 유지시킨다. 링커는 분지될 수 있다. 위와 같이 양자점/소광제 쌍의 선택이 형광단의 마스킹을 보장하는 것을 제외하고는, 양자점/소광제 쌍은 중요하지 않다. 양자점 및 이의 동족 소광제는 당업계에 공지되어 있고 당업자에 의해 이 목적으로 선택될 수 있다. 본 명세서에 개시된 이펙터 단백질의 활성화 즉시, 링커 분자의 RNA 부분은 절단됨으로써 소광 효과를 유지하는 데 필요한 양자점과 하나 이상의 소광제 사이의 근접성을 제거한다. 일 구현예에서, 양자점은 Qdot® 625 스트렙타비딘 컨쥬게이트(www.thermofisher.com/order/catalog/product/A10196)와 같이 스트렙타비딘 컨쥬게이트된다. RNA는 바이오틴 링커를 통해 부착되고 /5Biosg/UCUCGUACGUUC/3IAbRQSp/ 또는 /5Biosg/UCUCGUACGUUCUCUCGUACGUUC/3IAbRQSp/ 서열로 소광 분자를 모집하며, 여기서 /5Biosg/는 바이오틴 태그이고 /3IAbRQSp/는 아이오와 검정 소광제이다. 절단 시, 소광제가 방출되고 양자점이 가시적으로 형광을 낼 것이다.
유사한 방식으로, 형광 에너지 전달(FRET)이 검출 가능한 양성 신호를 생성하는 데 사용될 수 있다. FRET은 에너지적으로 여기된 형광단(즉, "공여자 형광단")으로부터의 광자가 또 다른 분자(즉, "수용자")의 전자의 에너지 상태를 더욱 높은 진동 수준의 여기된 단일항 상태로 상승시키는 비-방사성 과정이다. 공여자 형광단은 그 형광단의 형광 특징을 방출하지 않고 기저 상태로 돌아간다. 수용자는 또 다른 형광단 또는 비-형광 분자일 수 있다. 수용자가 형광단인 경우, 전달된 에너지는 그 형광단의 형광 특징으로 방출된다. 수용자가 비-형광 분자인 경우 흡수된 에너지는 열로 손실된다. 따라서, 본 명세서에 개시된 구현예의 맥락에서, 형광단/소광제 쌍은 올리고뉴클레오티드 분자에 부착된 공여자 형광단/수용자 쌍으로 대체된다. 원래의 경우, 마스킹 작제물은 수용자로부터 방출된 형광 또는 열에 의해 검출되는 제1 신호(음성의 검출 가능한 신호)를 생성한다. 본 명세서에 개시된 이펙터 단백질의 활성화 즉시, RNA 올리고뉴클레오티드는 절단되고 FRET는 파괴되어 공여자 형광단의 형광이 이제 검출되게 된다(양성의 검출 가능한 신호).
알엔아제의 검출을 위한 비색 판독결과의 일 방식은 인터칼레이팅 염료에 기반한 것이고, 이는 긴 RNA의 짧은 뉴클레오티드로의 절단에 반응하여 그들의 흡광도를 변화시킨다. 이들 특성을 갖는 몇몇의 기존 염료가 존재한다. Wagner(1983)로부터, 피로닌-Y는 RNA와 복합체화하고 572 nm에서 흡광도를 갖는 복합체를 형성할 것이고; RNA의 절단은 흡광도 손실 및 색 변화를 초래한다. Greiner-Stoeffele(1996)는 유사한 방식으로 메틸렌 블루를 사용하였으며, 알엔아제 활성에 따라 688 nm에서 흡광도가 변하였다.
비색 판독결과의 또 다른 방식은 절단 즉시 색이 변화하는 핵산 기질을 포함한다. Witmer(1991)는, 절단 후 리포터 기를 방출하는, 합성 리보뉴클레오티드 기질인 U-3'-BCIP를 이용하여 650 nm에서의 흡광도 생성을 초래하였다.
CRISPR-Cas 시스템, 그의 성분 및 이러한 성분의 전달에 대한, 양 및 제형에 관한, 본 발명의 실시에 유용한 모든 것 포함하여, 방법, 재료, 전달 비히클, 벡터, 입자, AAV 및 이들의 제조 및 사용을 포함하는, 일반적인 정보 관련하여, 다음을 참조한다: 미국 특허 번호 8,999,641, 8,993,233, 8,945,839, 8,932,814, 8,906,616, 8,895,308, 8,889,418, 8,889,356, 8,871,445, 8,865,406, 8,795,965, 8,771,945 및 8,697,359; 미국 특허 공보 US 2014-0310830(미국 출원 번호 14/105,031), US 2014-0287938 A1(미국 출원 번호 14/213,991), US 2014-0273234 A1(미국 출원 번호 14/293,674), US2014-0273232 A1(미국 출원 번호 14/290,575), US 2014-0273231(미국 출원 번호 14/259,420), US 2014-0256046 A1(미국 출원 번호 14/226,274), US 2014-0248702 A1(미국 출원 번호 14/258,458), US 2014-0242700 A1(미국 출원 번호 14/222,930), US 2014-0242699 A1(미국 출원 번호 14/183,512), US 2014-0242664 A1(미국 출원 번호 14/104,990), US 2014-0234972 A1(미국 출원 번호 14/183,471), US 2014-0227787 A1(미국 출원 번호 14/256,912), US 2014-0189896 A1(미국 출원 번호 14/105,035), US 2014-0186958(미국 출원 번호 14/105,017), US 2014-0186919 A1(미국 출원 번호 14/104,977), US 2014-0186843 A1(미국 출원 번호 14/104,900), US 2014-0179770 A1(미국 출원 번호 14/104,837) 및 US 2014-0179006 A1(미국 출원 번호 14/183,486), US 2014-0170753(미국 출원 번호 14/183,429); 유럽 특허 EP 2 784 162 B1 및 EP 2 771 468 B1; 유럽 특허 출원 EP 2 771 468(EP13818570.7), EP 2 764 103(EP13824232.6), 및 EP 2 784 162(EP14170383.5); 및 PCT 특허 공보 PCT 특허 공보 WO 2014/093661(PCT/US2013/074743), WO 2014/093694(PCT/US2013/074790), WO 2014/093595(PCT/US2013/074611), WO 2014/093718(PCT/US2013/074825), WO 2014/093709(PCT/US2013/074812), WO 2014/093622(PCT/US2013/074667), WO 2014/093635(PCT/US2013/074691), WO 2014/093655(PCT/US2013/074736), WO 2014/093712(PCT/US2013/074819), WO 2014/093701(PCT/US2013/074800), WO 2014/018423(PCT/US2013/051418), WO 2014/204723(PCT/US2014/041790), WO 2014/204724(PCT/US2014/041800), WO 2014/204725(PCT/US2014/041803), WO 2014/204726(PCT/US2014/041804), WO 2014/204727(PCT/US2014/041806), WO 2014/204728(PCT/US2014/041808), WO 2014/204729(PCT/US2014/041809). 또한 다음을 참조한다: 미국 임시 특허 출원 61/758,468; 61/802,174; 61/806,375; 61/814,263; 61/819,803 및 61/828,130, 각각 2013년 1월 30일; 2013년 3월 15일; 2013년 3월 28일; 2013년 4월 20일; 2013년 5월 6일 및 2013년 5월 28일에 출원. 또한 2013년 6월 17일에 출원된 미국 임시 특허 출원 61/836,123을 참조한다. 추가적으로 다음을 참조한다: 미국 임시 특허 출원 61/835,931, 61/835,936, 61/836,127, 61/836,101, 61/836,080 및 61/835,973, 각각 2013년 6월 17일에 출원. 추가로 다음을 참조한다: 2013년 8월 5일 출원된 미국 임시 특허 출원 61/862,468 및 61/862,355; 2013년 8월 28일에 출원된 61/871,301; 2013년 9월 25일에 출원된 61/960,777, 및2013년 10월 28일에 출원된 61/961,980. 더욱 추가적으로 다음을 참조한다: PCT 특허 출원 번호: PCT/US2014/041803, PCT/US2014/041800, PCT/US2014/041809, PCT/US2014/041804 및 PCT/US2014/041806, 각각 2014년 6월 10일에 출원 6/10/14; 2014년 6월 11일에 출원된 PCT/US2014/041808; 및 2014년 10월 28일에 출원된 PCT/US2014/62558, 및 미국 임시 특허 출원 번호: 61/915,150, 61/915,301, 61/915,267 및 61/915,260, 각각 2013년 12월 12일에 출원; 2013년 1월 29일 및 2013년 2월 25일에 출원된 61/757,972 및 61/768,959; 2013년 6월 17일에 출원된 61/835,936, 61/836,127, 61/836,101, 61/836,080, 61/835,973, 및 61/835,931; 62/010,888 및 62/010,879, 둘 다 2014년 6월 11일에 출원; 62/010,329 및 62/010,441, 각각 2014년 6월 10일에 출원; 61/939,228 및 61/939,242, 각각 2014년 2월 12일에 출원; 2014년 4월 15일에 출원된 61/980,012; 2014년 8월 17일에 출원된 62/038,358; 62/054,490, 62/055,484, 62/055,460 및 62/055,487, 각각 2014년 9월 25일에 출원; 및 2014년 10월 27일에 출원된 62/069,243. 또한 다음을 참조한다: 2014년 9월 25일에 출원된 미국 임시 특허 출원 번호 62/055,484, 62/055,460, 및 62/055,487; 2014년 4월 15일에 출원된 미국 임시 특허 출원 61/980,012; 및 2014년 2월 12일에 출원된 미국 임시 특허 출원 61/939,242. 그 중에서도, 미국을 지정한 PCT 출원, 2014년 6월 10일에 출원된 출원 번호 PCT/US14/41806을 참조한다. 2014년 1월 22일에 출원된 미국 임시 특허 출원 61/930,214를 참조한다. 각각 2013년 12월 12일에 출원된 미국 임시 특허 출원 61/915,251; 61/915,260 및 61/915,267를 참조한다. 2014년 4월 15일에 출원된 미국 임시 특허 출원 USSN 61/980,012를 참조한다. 그 중에서도, 미국을 지정한 PCT 출원, 2014년 6월 10일에 출원된 출원 번호 PCT/US14/41806를 참조한다. 2014년 1월 22일에 출원된 미국 임시 특허 출원 61/930,214를 참조한다. 각각 2013년 12월 12일에 출원된 미국 임시 특허 출원 61/915,251; 61/915,260 및 61/915,267를 참조한다.
또한 다음에 대하여 언급된다: 미국 출원 62/091,455, 12-Dec-14 출원, PROTECTED GUIDE RNAS(PGRNAS); 미국 출원 62/096,708, 24-Dec-14, PROTECTED GUIDE RNAS(PGRNAS); 미국 출원 62/091,462, 12-Dec-14, DEAD GUIDES FOR CRISPR TRANSCRIPTION FACTORS; 미국 출원 62/096,324, 23-Dec-14, DEAD GUIDES FOR CRISPR TRANSCRIPTION FACTORS; 미국 출원 62/091,456, 12-Dec-14, ESCORTED AND FUNCTIONALIZED GUIDES FOR CRISPR-CAS SYSTEMS; 미국 출원 62/091,461, 12-Dec-14, DELIVERY, USE AND THERAPEUTIC APPLICATIONS OF THE CRISPR-CAS SYSTEMS AND COMPOSITIONS FOR GENOME EDITING AS TO HEMATOPOETIC STEM CELLS(HSCs); 미국 출원 62/094,903, 19-Dec-14, UNBIASED IDENTIFICATION OF DOUBLE-STRAND BREAKS AND GENOMIC REARRANGEMENT BY GENOME-WISE INSERT CAPTURE SEQUENCING; 미국 출원 62/096,761, 24-Dec-14, ENGINEERING OF SYSTEMS, METHODS AND OPTIMIZED ENZYME AND GUIDE SCAFFOLDS FOR SEQUENCE MANIPULATION; 미국 출원 62/098,059, 30-Dec-14, RNA-TARGETING SYSTEM; 미국 출원 62/096,656, 24-Dec-14, CRISPR HAVING OR ASSOCIATED WITH DESTABILIZATION DOMAINS; 미국 출원 62/096,697, 24-Dec-14, CRISPR HAVING OR ASSOCIATED WITH AAV; 미국 출원 62/098,158, 30-Dec-14, ENGINEERED CRISPR COMPLEX INSERTIONAL TARGETING SYSTEMS; 미국 출원 62/151,052, 22-Apr-15, CELLULAR TARGETING FOR EXTRACELLULAR EXOSOMAL REPORTING; 미국 출원 62/054,490, 24-Sep-14, DELIVERY, USE AND THERAPEUTIC APPLICATIONS OF THE CRISPR-CAS SYSTEMS AND COMPOSITIONS FOR TARGETING DISORDERS AND DISEASES USING PARTICLE DELIVERY COMPONENTS; 미국 출원 62/055,484, 25-Sep-14, SYSTEMS, METHODS AND COMPOSITIONS FOR SEQUENCE MANIPULATION WITH OPTIMIZED FUNCTIONAL CRISPR-CAS SYSTEMS; 미국 출원 62/087,537, 4-Dec-14, SYSTEMS, METHODS AND COMPOSITIONS FOR SEQUENCE MANIPULATION WITH OPTIMIZED FUNCTIONAL CRISPR-CAS SYSTEMS; 미국 출원 62/054,651, 24-Sep-14, DELIVERY, USE AND THERAPEUTIC APPLICATIONS OF THE CRISPR-CAS SYSTEMS AND COMPOSITIONS FOR MODELING COMPETITION OF MULTIPLE CANCER MUTATIONS IN VIVO; 미국 출원 62/067,886, 23-Oct-14, DELIVERY, USE AND THERAPEUTIC APPLICATIONS OF THE CRISPR-CAS SYSTEMS AND COMPOSITIONS FOR MODELING COMPETITION OF MULTIPLE CANCER MUTATIONS IN VIVO; 미국 출원 62/054,675, 24-Sep-14, DELIVERY, USE AND THERAPEUTIC APPLICATIONS OF THE CRISPR-CAS SYSTEMS AND COMPOSITIONS IN NEURONAL CELLS/TISSUES; 미국 출원 62/054,528, 24-Sep-14, DELIVERY, USE AND THERAPEUTIC APPLICATIONS OF THE CRISPR-CAS SYSTEMS AND COMPOSITIONS IN IMMUNE DISEASES OR DISORDERS; 미국 출원 62/055,454, 25-Sep-14, DELIVERY, USE AND THERAPEUTIC APPLICATIONS OF THE CRISPR-CAS SYSTEMS AND COMPOSITIONS FOR TARGETING DISORDERS AND DISEASES USING CELL PENETRATION PEPTIDES(CPP); 미국 출원 62/055,460, 25-Sep-14, MULTIFUNCTIONAL-CRISPR COMPLEXES AND/OR OPTIMIZED ENZYME LINKED FUNCTIONAL-CRISPR COMPLEXES; 미국 출원 62/087,475, 4-Dec-14, FUNCTIONAL SCREENING WITH OPTIMIZED FUNCTIONAL CRISPR-CAS SYSTEMS; 미국 출원 62/055,487, 25-Sep-14, FUNCTIONAL SCREENING WITH OPTIMIZED FUNCTIONAL CRISPR-CAS SYSTEMS; 미국 출원 62/087,546, 4-Dec-14, MULTIFUNCTIONAL CRISPR COMPLEXES AND/OR OPTIMIZED ENZYME LINKED FUNCTIONAL-CRISPR COMPLEXES; 및 미국 출원 62/098,285, 30-Dec-14, CRISPR MEDIATED IN VIVO MODELING AND GENETIC SCREENING OF TUMOR GROWTH AND METASTASIS.
이들 특허, 특허 공보 및 출원 각각, 및 그 안에 또는 그들 절차 중에 인용된 모든 문헌("출원 인용 문헌") 및 상기 출원 인용 문헌에 인용되거나 참조된 모든 문헌은 상기 그 안에 또는 그 안의 및 본 명세서에 참조로서 포함된 임의의 문헌에서 언급된 임의의 제품에 대한 임의의 지침서, 설명서, 제품 명세서, 및 제품 시트와 함께, 참조로서 본 명세서에 포함되며, 본 발명의 실시에 이용될 수 있다. 모든 문헌(예를 들어, 이들 특허, 특허 공보 및 출원 및 출원 인용 문헌)은 각각의 개별적 문헌이 참조로서 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시된 것과 같이 동일한 정도로 참조로서 본 명세서에 포함된다.
또한 CRISPR-Cas 시스템에 관한 일반적인 정보와 관련하여,(또한 본 명세서에서 참조로서 포함되는) 다음이 언급된다:
Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Cong, L., Ran, F.A., Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Habib, N., Hsu, P.D., Wu, X., Jiang, W., Marraffini, L.A., & Zhang, F. Science Feb 15;339(6121):819-23 (2013);
RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Jiang W., Bikard D., Cox D., Zhang F, Marraffini LA. Nat Biotechnol Mar;31(3):233-9 (2013);
One-Step Generation of Mice Carrying Mutations in Multiple Genes by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering. Wang H., Yang H., Shivalila CS., Dawlaty MM., Cheng AW., Zhang F., Jaenisch R. Cell May 9;153(4):910-8 (2013);
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이들 각각은 본 명세서에 참조로서 포함되고, 본 발명의 실시에서 고려될 수 있으며, 아래에서 간략히 논의된다:
Cong 외는 스트렙토코커스 테르모필루스 Cas9 및 또한 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 둘 모두를 기초로 하여 진핵 세포에서 사용하기 위해 II형 CRISPR/Cas 시스템을 조작하였고, Cas9 뉴클레아제가 짧은 RNA에 의해 유도되어 인간 및 마우스 세포에서 DNA의 정밀한 절단을 유도할 수 있는 것을 입증하였다. 이들의 연구는 닉킹 효소로 전환됨에 따라 Cas9가 최소의 돌연변이유발 활성을 갖는 진핵 세포에서 상동성-유도된 수복을 촉진하는 데 이용될 수 있음을 추가로 보여준다. 또한, 그들의 연구는 다수의 가이드 서열이 단일의 CRISPR 어레이로 인코딩되어 포유류 게놈 내의 내인성 게놈 유전자좌 위치에서 몇몇의 동시 편집을 가능하게 할 수 있음을 입증하였으며, 이는 RNA-안내된 뉴클레아제 기술의 용이한 프로그램화가능성 및 폭넓은 응용 가능성을 입증한다. 세포에서 서열 특이적 DNA 절단을 프로그램화하기 위해 RNA를 이용하는 이러한 능력은 게놈 조작 도구의 새로운 부류를 규정하였다. 이들 연구는 다른 CRISPR 유전자좌가 포유류 세포로 이식될 수 있고, 또한 포유류 게놈 절단을 매개할 수 있음을 추가로 보여준다. 중요하게는, CRISPR/Cas 시스템의 여러 양태가 그의 효능 및 다능성을 증가시키기 위해 추가로 개선될 수 있음이 예견될 수 있다.
Jiang 외는 스트렙토코커스 뉴모니애 및 에스케리키아 콜라이의 게놈에서 정밀한 돌연변이를 도입시키기 위해 이중-RNA와 복합체화된 클러스터링되고 규칙적으로 산재된 짧은 팔린드로믹 반복부(CRISPR)-회합된 Cas9 엔도뉴클레아제를 이용하였다. 상기 접근법은 돌연변이되지 않은 세포를 사멸시키기 위해 표적화된 게놈 부위에서의 이중-RNA:Cas9-유도된 절단에 의존하며, 선택 마커 또는 반대-선택 시스템의 필요를 회피한다. 상기 연구는 편집 주형에서 수행되는 단일- 및 다중 뉴클레오티드 변화를 만들기 위해 짧은 CRISPR RNA(crRNA)의 서열을 변화시킴에 의한 이중-RNA:Cas9 특이성의 재프로그램화를 보고하였다. 상기 연구는 2 개의 crRNA의 동시 사용이 다중화 돌연변이유발을 가능하게 하는 것을 보여준다. 또한, 상기 접근법이 리컴비니어링(recombineering)과 병용하여 이용된 경우, 스트렙토코커스 뉴모니애에서 기재된 접근법을 이용하여 회수된 세포의 거의 100%가 요망되는 돌연변이를 함유하였고, 에스케리키아 콜라이에서, 회수된 65%가 돌연변이를 함유하였다.
Wang 외는(2013) 배아 줄기 세포에서의 순차적인 재조합 및/또는 많은 시간이 걸리는, 단일 돌연변이를 갖는 마우스의 이종교배에 의한 전통적으로 다수의 단계로 생성된 다수의 유전자에서의 돌연변이를 함유한 마우스들의 일-단계 생성을 위해 CRISPR/Cas 시스템을 사용하였다. CRISPR/Cas 시스템은 작용적으로 중복인 유전자 및 상위 유전자 상호작용의 생체내 연구를 크게 촉진할 것이다.
Konermann 외는(2013) DNA-결합 도메인 기반 CRISPR Cas9 효소 및 또한 전사 활성화제 유사 이펙터의 광학적 및 화학적 조절을 가능하게 하는 다능성이고 강력한 기술에 대한 해당 분야의 요구를 다루었다.
Ran 외는(2013-A) 표적화된 이중-가닥 손상을 도입시키기 위해 쌍을 형성하는 가이드 RNA와 Cas9 닉카아제 돌연변이체를 병용한 접근법을 기재하였다. 이는 가이드 서열에 의해 특정 게놈 유전자좌로 표적되는 미생물 CRISPR-Cas 시스템으로부터의 Cas9 뉴클레아제의 문제를 다루며, 이는 DNA 표적으로의 특정 미스매치를 용인할 수 있고, 이에 의해 바람직하지 않은 표적외 돌연변이유발을 촉진할 수 있다. 게놈 내의 개별의 닉은 높은 정확도로 수복되므로, 적절한 오프셋 가이드 RNA를 통한 동시 닉킹이 이중-가닥 손상에 필요하고, 표적 절단을 위한 특이적으로 인식된 염기의 수를 연장시킨다. 상기 저자는 쌍을 형성한 닉킹을 이용하는 것이 세포주에서 50 내지 1,500 배까지 표적외 활성을 감소시킬 수 있고, 표적에 대한 절단 효율을 희생시키지 않고 마우스 스플라이싱체에서 유전자 녹아웃을 촉진하는 것을 입증하였다. 이러한 다능성 전략은 높은 특이성을 필요로 하는 매우 다양한 게놈 편집 응용을 가능하게 한다.
Hsu 외는(2013) 표적 부위의 선택을 알아내고, 표적외 효과를 피하기 위해 인간 세포에서 SpCas9 표적화 특이성을 특성화하였다. 상기 연구는 293T 및 293FT 세포에서 100 개 초과의 예측 게놈 표적외 유전자좌에서 SpCas9-유도된 삽입-결실 돌연변이 수준 및 700 개 초과의 가이드 RNA 변이체를 평가하였다. 상기 저자는 SpCas9가 미스매치의 수, 위치 및 분포에 민감한 서열-의존성 방식으로 상이한 위치에서 가이드 RNA와 표적 DNA 사이의 미스매치를 용인하는 것을 보고하였다. 상기 저자는 SpCas9-매개 절단이 DNA 메틸화에 의해 영향을 받지 않고, SpCas9 및 sgRNA의 용량을 적정하여 표적외 변형을 최소화시킬 수 있음을 추가로 나타내었다. 또한, 포유류 게놈 조작 응용을 용이하게 하기 위해, 상기 저자는 표적 서열의 선택 및 확인뿐만 아니라 표적외 분석을 안내하기 위해 웹-기반 소프트웨어 도구를 제공한 것을 보고하였다.
Ran 외는(2013-B) 포유류 세포에서 비-상동성 말단 연결(NHEJ) 또는 상동성-유도 수복(HDR)뿐만 아니라 다운스트림 기능성 연구를 위한 변형된 세포주의 생성을 통한 Cas9-매개 게놈 편집을 위한 일련의 도구를 기재하였다. 표적외 절단을 최소화시키기 위해, 상기 저자는 쌍을 형성한 가이드 RNA와 함께 Cas9 닉카아제 돌연변이체를 이용한 이중-닉킹 전략을 추가로 기재하였다. 상기 저자에 의해 제공된 프로토콜은 표적 부위의 선택, 절단 효율의 평가 및 표적외 활성의 분석을 위한 가이드를 실험적으로 유래하였다. 상기 연구는 표적 설계로 시작하여, 유전자 변형은 1 내지 2 주만큼 적은 기간 내에 달성될 수 있고, 변형된 클론성 세포주가 2 내지 3 주 내에 유래될 수 있음을 나타내었다.
Shalem 외는 게놈-전체에 걸친 규모에서 유전자 기능을 질의하기 위한 새로운 방식을 기재한다. 그들의 연구는 64,751 개의 독특한 가이드 서열을 이용하여 18,080 개 유전자를 표적화시킨 게놈-규모의 CRISPR-Cas9 녹아웃(GeCKO) 라이브러리의 전달이 인간 세포에서 음성 및 양성 선택 스크리닝 둘 모두를 가능하게 하는 것을 보여주었다. 먼저, 상기 저자는 암 및 만능성 줄기 세포에서세포 생존력에 필수적인 유전자를 확인하기 위한 GeCKO 라이브러리의 사용을 보여주었다. 다음으로, 흑색종 모델에서, 상기 저자는 유전자의 소실이 돌연변이 단백질 키나제 BRAF를 억제하는 치료제인 베무라페닙(vemurafenib)에 대한 내성과 관련된 유전자를 스크리닝하였다. 그들의 연구는 가장 높은 순위의 후보물질이 이전에 확인된 유전자 NF1 및 MED12뿐만 아니라 새로운 히트(hit) NF2, CUL3, TADA2B, 및 TADA1을 포함한 것을 나타내었다. 상기 저자는 동일한 유전자를 표적으로 하는 독립적 가이드 RNA와 높은 비율의 히트 확인 사이에 높은 수준의 일치를 관찰하였고, 따라서 Cas9를 이용한 게놈-규모 스크리닝의 가망성을 입증하였다.
Nishimasu 외는 2.5 A°해상도로 sgRNA 및 그의 표적 DNA와의 복합체에서 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9의 결정 구조를 보고하였다. 상기 구조는 그들의 계면에서 양으로 하전된 홈에서 sgRNA:DNA 이형이중가닥을 수용하는 표적 인식 및 뉴클레아제 엽으로 구성된 2 엽 구조를 나타내었다. 인식 엽이 sgRNA 및 DNA 결합에 필수적인 반면, 뉴클레아제 엽은 각각 표적 DNA의 상보적 및 비-상보적 가닥의 절단을 위해 적절하게 위치된 HNH 및 RuvC 뉴클레아제 도메인을 함유한다. 뉴클레아제 엽은 또한 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)와의 상호작용을 담당하는 카르복실-말단 도메인을 함유한다. 이러한 고-해상도 구조 및 수반하는 기능 분석은 Cas9에 의한 RNA-안내된 DNA 표적화의 분자 메카니즘을 나타내었고, 이에 따라 새로운 다능성 게놈-편집 기술의 합리적 설계를 용이하게 한다.
Wu 외는 마우스 배아 줄기 세포(mESC)에서 단일 가이드 RNA(sgRNA)가 로딩된 스트렙토코커스 피오게네스 유래의 촉매적 비활성 Cas9(dCas9)의 게놈-와이드 결합 부위를 맵핑하였다. 저자는 4 개의 sgRNA 각각이 NGG 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 및 sgRNA 내의 5-뉴클레오티드 씨드 영역을 종종 특징으로 하는 수십 내지 수천 개의 게놈 부위에 대하여 표적 dCas9를 시험한 것을 보여주었다. 염색질 비접근성은 씨드 서열과 일치하는 다른 부위로의 dCas9 결합을 감소시키고; 따라서 표적외 부위의 70%가 유전자와 회합된다. 상기 저자는 촉매적 활성 Cas9로 트랜스펙션된 mESC 내의 295 개의 dCas9 결합 부위의 표적화된 시퀀싱에 의해, 백그라운드 수준 초과로 돌연변이된 단지 하나의 부위가 확인된 것을 나타내었다. 상기 저자는 씨드 매치가 결합을 촉발하나, 표적 DNA와의 광범위한 쌍형성이 절단에 필요한 Cas9 결합 및 절단을 위한 2-상태 모델을 제안하였다.
Platt 외는 Cre-의존성 Cas9 낙인 마우스를 수립하였다. 저자는 뉴런, 면역 세포, 및 상피 세포에서 가이드 RNA의 아데노-관련 바이러스(AAV)-, 렌티바이러스-, 또는 입자-매개된 전달을 이용하여 생체내 및 생체외 게놈 편집을 증명하였다.
Hsu 외는(2014) 요거트부터 세포의 유전적 스크리닝을 포함하는 게놈 편집까지 CRISPR-Cas9 전력를 일반적으로 논의하는 리뷰 기사이다.
Wang 외는(2014) 게놈-규모 렌티바이러스 단일 가이드 RNA(sgRNA) 라이브러리를 이용하는 양성 및 음성 선택 모두에 적합한 풀화된(pooled) 기능 손실 유전학적 스크리닝 시도에 관한 것이다.
Doench 외는 6 개의 내인성 마우스 및 3 개의 내인성 인간 유전자의 패널의 모든 가능한 표적 부위에 걸쳐 타일링하는(tiling) sgRNA의 풀을 만들고, 항체 염색 및 유세포분석기에 의해 표적 유전자의 널 대립형질을 생산하는 그의 능력을 정량적으로 평가하였다. 저자들은 PAM 개선된 활성의 최적화를 보였으며, sgRNA의 설계를 위한 온라인 도구를 또한 제공하였다.
Swiech 외는 AAV-매개된 SpCas9 게놈 편집이 뇌 내 유전자 기능의 역전 유전적 구조를 가능하게 할 수 있음을 증명하였다.
Konermann 외는(2015) 다수의 이펙터 도메인, 예를 들어 전사 활성화제, 예를 들어 작용적 및 후성유전자적 조절제를 링커 없이 또는 링커와 함께 줄기 또는 테트라루프와 같은 가이드 상에서 적절한 위치에 부착시키는 능력을 논의한다.
Zetsche 외는 Cas9 효소가 둘로 분열될 수 있고, 이에 따라 활성화를 위한 Cas9 조립이 제어될 수 있음을 증명한다.
Chen 외는 마우스들에서 게놈-와이드 생체내 CRISPR-Cas9 스크린은 폐 전이를 조절하는 유전자를 드러냄을 증명함에 의한 다중화 스크리닝에 관한 것이다.
Ran 외는(2015) SaCas9 및 게놈을 편집하는 그의 능력에 관한 것으로, 생화학 분석으로부터 추론할 수 없음을 증명한다. Shalem 외(2015)는 촉매적으로 비활성인 Cas9(dCas9) 융합체가 합성적으로 발현을 억제(CRISPRi) 또는 활성화(CRISPRa)하는 데 사용되는 방법을 기재하였고, 이는, 어레이된 및 모아진 스크린을 포함하는, 게놈-규모 스크린, 게놈 유전자좌를 비활성화시키는 녹아웃 접근 및 전사 활성을 조절하는 전략에 Cas9를 사용하는 진보를 보여준다.
Shalem 외는(2015), 촉매적으로 비활성인 Cas9(dCas9) 융합물이 발현을 합성적으로 저해(CRISPRi) 또는 활성(CRISPRa)하는 데 사용되는 방법을 설명하며, 이는 배열되고 풀화된 스크린을 포함하는, 게놈-규모 스크린을 위해 Cas9를 이용하는 진전, 비활성 게놈 유전자좌를 비활성화하는 녹아웃 시도 및 전사 활성을 조절하는 전략을 보여준다.
Xu 외는(2015) CRISPR-기반 스크린에서 단일 가이드 RNA(sgRNA) 효율에 기여하는 DNA 서열 특징을 평가하였다. 저자들은 CRISPR/Cas9 녹아웃 및 절단 부위에서 뉴클레오티드 선호성을 탐구하였다. 저자들은 또한 CRISPRi/a에 대한 서열 선호성이 CRISPR/Cas9 녹아웃에 대한 선호와 실질적으로 상이함을 발견하였다.
Parnas 외는(2015) 박테리아성 지질다당류(LPS)에 의해 종양 괴사 인자(Tnf)의 유도를 제어하는 유전자를 확인하기 위하여 게놈-와이드 풀화된 CRISPR-Cas9 라이브러리를 수지상 세포(DC) 내로 도입하였다. Tlr4 신호화의 알려진 조절자 및 이전에 알려지지 않은 후보물질들이 확인되었으며, LPS에 대한 정규 반응에 대한 구별된 효과를 갖는 3 개의 작용 모듈로 확인되었다.
Ramanan 외는(2015) 감염된 세포에서 바이러스 에피좀성 DNA(cccDNA)의 절단을 증명하였다. HBV 게놈은 공유결합 폐환형 DNA(cccDNA)로도 명명되는 3.2 kb의 이중-가닥 에피좀 DNA 종으로서 감염된 간세포의 핵에 존재하고, 그의 복제가 현재 치료법에 의해 억제되지 않는 HBV 생애 주기에서 주요 성분이다. HBV의 고도로 보존된 영역을 특이적으로 표적화하는 sgRNA가 바이러스 복제 및 손실 된 cccDNA를 저해함을 보여주었다.
Nishimasu 외는(2015) 5'-TTGAAT-3' PAM 및 5'-TTGGGT-3' PAM을 함유하는 단일 가이드 RNA(sgRNA) 및 그의 이중-가닥 DNA 표적과 함께 복합체화되는 SaCas9의 결정 구조를 보고하였다. SpCas9 와 SaCas9의 구조 비교는 구조적 보존 및 다양성 모두에서 강조표시하였으며, 이는 그들의 구별되는 PAM 특이성 및 오솔로그성 sgRNA 인식을 설명한다.
Zetsche 외(2015)는 추정되는 클래스 2 CRISPR 이펙터인 Cpf1의 특징 확인을 보고하였다. Cpf1이 Cas9와 구별되는 특징을 갖는 견고한 DNA 간섭을 매개함이 입증되었다. 이 간섭 메커니즘의 확인은 CRISPR-Cas 시스템에 대한 이해를 넓히고 게놈 편집 응용을 발전시킨다.
Shmakov 외(2015)는 3 가지 별개의 클래스 2 CRISPR-Cas 시스템의 특징 확인을 보고하였다. 확인된 시스템 중 2 개의 이펙터인 C2c1 및 C2c3은 Cpf1과 멀리 관련된 RuvC 유사 엔도뉴클레아제 도메인을 함유한다. 세 번째 시스템 인 C2c2는 2 개의 예측된 HEPN 알엔아제 도메인을 갖는 이펙터를 함유한다.
Gao 외(2016)는 Cpf1의 표적화 범위를 증가시키기 위해 구조-가이드되는 포화 돌연변이 유발 스크린을 사용하여 보고하였다. Cpf1 변이체는 돌연변이 S542R/K607R 및 S542R/K548V/N552R로 설계 제작 되어, 시험관내 및 인간 세포에서 향상된 활성으로 각각 TYCV/CCCC 및 TATV PAM을 갖는 표적 부위를 절단할 수 있다.
또한, 문헌 ["Dimeric CRISPR RNA-guided FokI nucleases for highly specific genome editing", Shengdar Q. Tsai, Nicolas Wyvekens, Cyd Khayter, Jennifer A. Foden, Vishal Thapar, Deepak Reyon, Mathew J. Goodwin, Martin J. Aryee, J. Keith Joung Nature Biotechnology 32(6): 569-77(2014)]은, 연장된 서열을 인식하고 인간 세포에서 높은 효율을 갖는 내인성 유전자를 편집할 수 있는 이량체성 RNA-가이드된 FokI 뉴클레아제에 관한 것이다.
추가적으로, 제목이 "DELIVERY, USE AND THERAPEUTIC APPLICATIONS OF THE CRISPR-CAS SYSTEMS AND COMPOSITIONS FOR TARGETING DISORDERS AND DISEASES USING PARTICLE DELIVERY COMPONENTS인 PCT 출원 PCT/US14/70057, 대리인 참조 47627.99.2060 및 BI-2013/107(2014년 9월 24일에 출원된 미국 임시 특허 출원 62/054,490, 2014년 6월 10일에 출원된 62/010,441 및 각각 2013년 12월 12일에 출원된 61/915,118, 61/915,215 및 61/915,148 중 하나 이상 또는 모두로부터 우선권 주장)("입자 전달 PCT")이 언급되며, 이는 본 명세서에 참조로서 포함되고, 이는 sgRNA 및 Cas9 단백질 (및 선택적으로 HDR 주형)을 포함하는 혼합물을, 계면활성제, 인지질, 생분해성 중합체, 지질단백질 및 알콜를 포함하거나 이로 본질적으로 구성되거나 이로 구성되는 혼합물과 혼합하는 것을 포함하는, sgRNA-및-Cas9 단백질 함유 입자를 제조하는 방법 및 이러한 공정으로부터의 입자에 관한 것이다. 예를 들어, 여기서 Cas9 단백질 및 sgRNA는 적합한, 예를 들어 3:1 내지 1:3 또는 2:1 내지 1:2 또는 1:1의 몰비로, 적합한 온도에서, 예를 들어 15 내지 30 C, 예를 들어 20 내지 25 C, 예를 들어 실온에서, 적합한 시간동안 예를 들어 15 내지 45, 예를 들어 30 분, 유리하게는 멸균된 뉴클레아제 없는 완충액, 예를 들어, 1X PBS에서 함께 혼합되었다. 별도로, 계면 활성제, 예를 들어 양이온성 지질, 예를 들어 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP); 인지질, 예를 들어 디미리스토일포스파티딜콜린(DMPC); 생분해성 중합체, 예를 들어 에틸렌-글리콜 중합체 또는 PEG, 및 지질단백질, 예를 들어 저-밀도 지질단백질, 예를 들어 콜레스테롤과 같은 또는 이를 포함하는 입자 성분이 알코올, 유리하게는 C1-6 알킬 알콜, 예를 들어 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 예를 들어 100% 에탄올에 용해되었다. 두 용액을 함께 혼합하여 Cas9-sgRNA 복합체를 함유하는 입자를 형성시켰다. 따라서, sgRNA는 입자 내 전체 복합체를 만들기 전에 Cas9 단백질과 미리 복합체화될 수 있다. 제형은 세포 내로의 핵산 전달을 촉진시키는 것으로 알려진 상이한 성분의 상이한 몰 비로 제조될 수 있다(예를 들어, 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판(DOTAP), 1,2-디테트라데카노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DMPC), 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 콜레스테롤). 예를 들어 DOTAP:DMPC:PEG:콜레스테롤 몰 비는 DOTAP 100, DMPC 0, PEG 0, 콜레스테롤 0; 또는 DOTAP 90, DMPC 0, PEG 10, 콜레스테롤 0; 또는 DOTAP 90, DMPC 0, PEG 5, 콜레스테롤 5일 수 있다. DOTAP 100, DMPC 0, PEG 0, 콜레스테롤 0. 따라서 그 적용은 sgRNA, Cas9 단백질 및 입자를 형성하는 성분을 혼합하는 것;뿐만 아니라 이러한 혼합으로부터의 입자를 포함한다. 본 발명의 일 양태는 입자를 포함할 수 있고; 예를 들어 입자는 예를 들어, 본 발명에서와 같은 sgRNA 및/또는 Cas9를 포함하는 혼합물 및 예를 들어, 입자 전달 PCT에서와 같은, 입자를 형성하는 성분을 혼합함으로써, 입자 전달 PCT의 그것과 유사한 공정을 사용하여, 이러한 혼합으로부터 입자 및 입자들을 형성한다(또는 물론, 본 발명에서와 같은 sgRNA 및/또는 Cas9를 포함하는 다른 입자).
실시예
실시예 1: Cas13a 패밀리의 특징 확인
출원인은 암피실린 내성 박테리아 분석(도 3a)을 사용하여 PFS 선호도 및 활성(도 57a)에 대해 15 개의 Cas13a 오솔로그를 포괄적으로 평가하였다. 간략하게, Cas13a는 무작위 PFS 뉴클레오티드가 측면에 배치된 β-락타마제 전사물 상의 5' 범위의 서열을 표적화하도록 프로그램한다. Cas13a 절단 활성은 암피실린 선택 하에서 박테리아의 사멸을 초래하고, 그 다음에 PFS 손실은 차세대 시퀀싱에 의해 분석한다. 오솔로그 간의 양적 비교를 가능하게 하기 위해, 출원인은 pJ23119 작은 RNA 프로모터의 발현 하에 있는 근처의 단일-스페이서 CRISPR 어레이와 함께 pLac 프로모터 하에 각각의 Cas13a 오솔로그를 클로닝하였다. 이.콜라이에서 Cas13a 오솔로그 플라스미드 각각과 PFS 플라스미드 라이브러리의 동시 형질전환 후, 출원인은 형질 전환체 계수를 통해 박테리아 생존을 측정하였고 렙토트리키아 와데이(LwaCas13a) 유래 Cas13a 오솔로그가 가장 활성있고 렙토트리키아 샤히 Cas13a(LshCas13a)가 그 뒤를 따른다는 것을 발견하였다(도 3c, 3d). LwaCas13a 및 LshCas13a 스크린으로부터의 PFS 분포에 대한 차세대 시퀀싱 분석으로 대부분의 LwCas13a PFS 서열이 손실되었음을 밝혔으며(도 3g 및 57b, 57c), 이는 강력한 LwCas13a RNA 절단 활성을 시사한다. 실제로, 다양한 임계값에서 손실된 PFS 서열에 대한 모티프 분석은 LshCas13a의 예상 3 'H 모티프를 밝혔지만 LwCas13a에 대해서는 유의미한 PFS 모티프가 없었다(도 3h, 56d, 56e). 핵산 검출을 위한 LwCas13a에 대한 최근 발전에서, 출원인은 LwCas13a가 LshCas13a보다 더 활성있음을 발견했으며, 생화학적 특징 확인에 의해 약한 3'H PFS를 발견하였다. LwCas13a는 시험된 15 개의 Cas13a 오솔로그 중 가장 활성있고 박테리아에서 PFS를 갖지 않는 것으로 밝혀졌다.
실시예 2: 진핵 세포에서의 C2c2 발현
다음의 C2c2 오솔로그는 포유류 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화하였다.
상기 종의 단백질 서열을 하기 표에 나열한다.
mCherry 및 선택적으로 NLS 또는 NES와의 C2c2 오솔로그 각각의 융합 작제물을 제조하고 포유류 발현 벡터(도 1a)에 클로닝하였다. 다양한 C2c2 오솔로그를 HEK293T 세포에 형질감염하였고 세포 국소화는 mCherry 발현에 기반하여 평가하였다. C-말단 및 N-말단 NES에 융합될 때, C-말단 및 N-말단 NLS에 융합될 때, 또는 NES 또는 NLS 융합이 없을 때 상이한 C2c2 오솔로그의 대표적인 국소화를 도 1b,c, 및 d에 각각 나타내었다. NES 융합은 효율적으로 C2c2 단백질의 세포질 국소화를 초래하였다. NLS 융합은 효율적으로 C2c2 단백질의 핵 국소화를 초래하였다. 가변적으로, 인 국소화 또한 NLS 융합으로 관찰될 수 있다. C2c2가 NLS 또는 NES에 융합되지 않았을 때, 가변적인 세포질/핵 국소화가 관찰되었다.
실시예 3: 진핵세포에서의 C2c2(Cas13a)의 활성
루시페라제 표적화 분석은 Gluc에 대해 안내되는 상이한 gRNA를 사용하여 도 2에 나타난 바와 같이 수행하였다. C2c2 오솔로그 렙토트리키아 와데이 F0279(Lw2) 및 리스테리아 뉴요켄시스(리스테리아 뉴요켄시스) FSL M6-0635(LbFSL)는 NLS 또는 NES에 융합하였거나 대안적으로 국소화 신호에 융합하지 않았다. 루시페라제의 정규화된 단백질 발현을 결정하고 비 표적화(NT) gRNA와 비교하였다. 결과는 도 4에 나타내었다. 효율적인 녹다운이 명백하였다. 도 4a 및 도 4b에 기술된 실험에서 사용된 스페이서 서열은 다음과 같다:
도 4a
가이드 1 ATCAGGGCAAACAGAACTTTGACTCCca
가이드 2 AGATCCGTGGTCGCGAAGTTGCTGGCCA
가이드 3 TCGCCTTCGTAGGTGTGGCAGCGTCCTG
가이드 NT tagattgctgttctaccaagtaatccat
도 4b
가이드 1 TCGCCTTCGTAGGTGTGGCAGCGTCCTG
가이드 NT tagattgctgttctaccaagtaatccat
GFP 발현에 기반한 표적화 분석은 EGFP에 대해 안내되는 상이한 gRNA를 사용하여 도 2c에 나타난 바와 같이 수행하였다. C2c2 오솔로그 렙토트리키아 와데이 F0279(Lw2) 및 리스테리아 뉴요켄시스 FSL M6-0635(LbFSL)는NLS 또는 NES에 융합하였거나 대안적으로 국소화 신호에 융합하지 않았다. GFP의 정규화된 발현을 결정하고 비 표적화(NT) gRNA와 비교하였다. 결과는 도 5에 나타내었다. 효율적인 녹다운이 명백하였다. 도 5a 및 도 5b에 기술된 실험에서 사용된 스페이서 서열은 다음과 같다:
도 5a
가이드 1 tgaacagctcctcgcccttgctcaccat
가이드 2 tcagcttgccgtaggtggcatcgccctc
가이드 3 gggtagcggctgaagcactgcacgccgt
가이드 4 ggtcttgtagttgccgtcgtccttgaag
가이드 5 tactccagcttgtgccccaggatgttgc
가이드 6 cacgctgccgtcctcgatgttgtggcgg
가이드 7 tctttgctcagggcggactgggtgctca
가이드 8 gacttgtacagctcgtccatgccgagag
가이드 NT tagattgctgttctaccaagtaatccat
도 5b
가이드 2 tcagcttgccgtaggtggcatcgccctc
가이드 3 gggtagcggctgaagcactgcacgccgt
가이드 4 ggtcttgtagttgccgtcgtccttgaag
가이드 5 tactccagcttgtgccccaggatgttgc
가이드 6 cacgctgccgtcctcgatgttgtggcgg
가이드 7 tctttgctcagggcggactgggtgctca
가이드 8 gacttgtacagctcgtccatgccgagag
가이드 NT tagattgctgttctaccaagtaatccat
표적화 분석은 내인성 표적 유전자에 대해 안내되는 gRNA를 사용하여 HEK293 세포에서 상이한 내인성 표적 유전자에 대해 수행하였다. C2c2 렙토트리키아 와데이F0279(Lw2)를 NES에 융합하였다. 각각의 표적 유전자의 정규화된 단백질 발현을 결정하였다(비 표적화(NT) gRNA와 비교). 결과는 도 7에 나타내었다. 효율적인 녹다운이 명백하였다. 도 7에 기술된 실험에서 사용된 스페이서 서열은 다음과 같다:
도 7
CTNNB1 ctgctgccacagaccgagaggcttaaaa
PPIB tccttgattacacgatggaatttgctgt
mAPK14 tcaaggtggggtcacaggagaagccaaa
CXCR4 atgataatgcaatagcaggacaggatga
TINCR gcgtgagccaccgcgcctggccggctgt
PCAT1 ccagctgcagatgctgcagtttttggcg
CAPN1 ctggaaatggaagatgccggcatagcca
LETMD1 gatgacacctcacacggaccacccctag
MAPK14 taatactgctccagatatgggtgggcca
RB1 catgaagaccgagttatagaatactata
TP53 ggtgaaatattctccatccagtggtttc
KRAS aatttctcgaactaatgtatagaaggca
실시예 4: 번역 활성화제/프로모터에 융합된 촉매적으로 비활성인 C2c2를 이용한 진핵 세포에서의 번역 상향조절
촉매적으로 비활성인 C2c2 오솔로그 렙토트리키아 와데이 F0279(Lw) 및 리스테리아 뉴요켄시스 FSL M6-0635(LbFSL)를 생성하였다.
Lw C2c2를 NES에 또는 국소화 신호없이 및 선택적으로 EIF4E에 융합하였다.
LbFSL을 NLS 및 선택적으로 EIF4E에 융합하였다.
Gluc를 표적화하였다(도 2 참조).
상대 단백질 발현은 EIF4E를 갖거나 갖지 않는 C2c2로 표적화하는 것 간의 비교에 기반하여 평가하였다.
결과를 도 10에 나타내었다.
효율적인 번역 상향조절이 명백하였다. 도 10에 기술된 실험에서 사용된 스페이서 서열은 tagattgctgttctaccaagtaatccat이고, 표적은 이 스페이서에 대한 3x 결합 부위를 갖는다.
실시예 5: NaASO 2 처리시 C2c2 및 이의 표적 베타-액틴의 동시-국소화
소듐 아르세나이트(NaAsO2)의 영향 하에 베타-액틴을 표적화하는 C2c2의 국소화를 조사하였다. 렙토트리키아 와데이 C2c2의 mCherry 및 NES와의 융합 작제물을 제조하고 베타-액틴 표적화 가이드 또는 비-표적화 가이드와 함께 포유류 발현 벡터에 클로닝하였다. C2c2의 세포 국소화는 mCherry 발현에 기반하여 평가하였고, 스트레스 과립은 G3BP1-GFP로 표지하였다. 베타 액틴을 표적화하는 Lw C2c2는 NaAsO2 처리시 스트레스 과립으로 국소화하는 것으로 밝혀졌다(도 11a). 이 국소화는 베타-액팅 표적화 가이드에서만 보였고 비-표적화 가이드에서는 아니었으므로 가이드-의존적이었다(도 11b,c).
실시예 6: 녹다운 활성을 촉진하기 위해 대안적 crRNA 프로모터를 사용함
간섭 효과를 추가로 증가시키기 위해, crRNA를 U6 프로모터 제어 하에 두었다.
C2c2에 의한 간섭 효율을 향상시킬 목적으로, tRNA-crRNA 및 U6로 구동되는 crRNA 및 shRNA를 사용하여 표적화된 유전자의 발현을 비교하였다. 신뢰성있는 표적 유전자의 녹다운이 shRNA와 비슷한 효율로 관찰되었다(도 12, 도 14). 추가의 실험은 crRNA 형질감염 양의 증가(도 13), 단백질 형질전환 양의 증가(도 15)의 효과 및 DR-스페이서-DR-스페이서 작제물의 효과를 결정하기 위해 수행하였다(도 16). C2c2는 내인성 유전자 상의 상응하는 표적에 대해 최적화된 shRNA를 능가하는 것으로 밝혀졌다.
실시예 7: C2c2와의 융합 작제물
도 18에서 입증된 바와 같이, dLw2C2c2-EIF4E 융합은 3 가지 유전자의 번역을 상향 조절할 수 있다; 웨스턴 블롯에서 밴드 강도로 측정되는 단백질 수준.
실시예 8: 표적 유도된 비-특이적 알엔아제 활성
C2c2 표적 유도된 비-특이적 알엔아제 활성은 표본에서 RNA 종을 검출하는 데 유용하다. 관심 RNA 표적이 존재하면, 부수적 표적에 대한 비-특이적 알엔아제 활성은 가이드-의존적 C2c2 뉴클레아제 활성을 동반한다. 예를 들어, 형광 모이어티 및 형광 소광제를 포함하는 리포터 RNA는 활성화된 C2c2에 의해 비-특이적으로 절단된다. RNA 기질은 한쪽 끝에 형광 리포터 분자(플루오르)로 다른 쪽에 소광제로 표시한다. C2c2 알엔아제 활성이 부재하면, 소광제의 물리적 근접성은 플루오르로부터의 형광을 낮은 수준으로 약화시킨다. C2c2 표적 특이적 절단이 활성화될 때, RNA 기질은 비-특이적으로 절단되고 플루오르 및 소광제는 공간적으로 분리된다. 이것은 적절한 파장 길이의 빛에 의해 여기될 때 플루오르로 하여금 신호를 방출하게 한다. 이러한 분석의 개략도가 도 24a에 나타난다.
실시예 9: Lw2C2c2(LwaCas13a)의 생화학적 특징 확인
방법론은 본질적으로 문헌[Abudayyeh et al. (2016) "C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector"; Science 353(6299), DOI: 10.1126/science.aaf5573]에 기재된 바와 같고; 본 명세서에 참고로서 포함된다.
박테리아 세포에서의 LwaCas13a의 원하는 절단 활성 때문에, 출원인은 포유류 세포에서의 시험 전에 이의 절단을 더 잘 이해하기 위해 추가의 생화학적 특징 확인을 탐구하였다. LshCas13a 및 LwaCas13a 둘 모두를 사용한 시험관내 절단 반응은 LshCas13a보다 LwaCas13a 효율의 생체내 증가를 확인하는 것뿐만 아니라 28 nt 스페이서를 인코딩하는 가이드를 사용하는 프로그래밍 가능한 표적 절단 및 Mg2+에 대한 필요(도 3i)를 입증하였다. 단일 가닥 RNA 표적(ssRNA 1)의 LwaCas13a 및 가이드와의 인큐베이션은 30 분의 인큐베이션 후 거의 완전한 절단으로 2 분 내에 검출 가능한 절단을 나타낸 반면, 가이드 없는 LwaCas13a에는 관찰 가능한 절단이 없었고(도 37), 절단은 LwaC2c2-가이드 복합체 수준으로 용량 의존적이었다(도 36). 스테레오타입의 절단 생산물의 외관을 고려하여 출원인은 LshCas13a 절단 패턴이 LshCas13a와 유사하게, 표적-의존적이라는 가설을 세웠다(Abudayyeh, O. O. et al. C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Science 353, aaf5573, doi:10.1126/science.aaf5573 (2016)). 다양한 인실리코-예측된 2차 구조(도 42)를 갖는 다수의 RNA 표적과의 인큐베이션은 실질적으로 상이한 절단 패턴을 나타내었다(도 42). LwaCas13a 절단이 표적 상의 노출된 단일 가닥 부위에서의 염기 동일성에 의존하는지 여부를 결정하기 위해, 출원인은 표적 상 LwaCas13a(변형된 ssRNA 표적 4)를 루프 상의 호모폴리머 치환과 인큐베이션하였다(도 43). 출원인은 C 또는 U 치환에서 표적에 대해 더 강한 절단을 발견하였으며(도 43), 이는 LwaCas13a가 U 잔기에서 우선적으로 절단하는 LshCas13a보다 기질 유연성이 더 많음을 나타낸다(문헌[Abudayyeh, O. O. et al. C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Science 353, aaf5573, doi:10.1126/science.aaf5573 (2016)]). 표적 알엔아제 활성에 더하여, Cas13 패밀리는 엘.와디에 유래의 자체 상응하는 pre-crRNA 전사물을 처리하는 것으로 보고되었다(도 43c)(문헌[East-Seletsky, A. et al. Two district RNase activities of CRISPR-C2c2 enable guide-RNA processing and RNA detection, Nature 538, 270-273 (2016)]). 출원인은 또한 스페이서 또는 직접 반복(DR) 서열을 절단함으로써 LwaCas13a 절단에 대한 가이드 제한을 탐구하였다. 출원인은 LwaCas13a가 20 nt만큼 짧은 스페이서 길이로 시험관내 절단 활성을 유지하고(도 41), 27 nt만큼 짧은 DR 절단으로 절단할 수 있으며(도 40), 하나의 DR 길이 절단(32 nt)이 활성을 제거하는 것으로 보일지라도 아마도 2차 구조 변동에 기인함을 발견하였다. 20 nt 미만의 가이드 길이는 더 이상 촉매 활성을 나타내지 않지만, LwaCas13-가이드 복합체는 여전히 결합 활성을 유지할 수 있어 단일 촉매 효소와의 직교 적용이 가능하게 한다(문헌[Dahlman, J. E. et al. Orthogonal gene knockout and activation with a catalytically active Cas9 nuclease. Nat Biotechnol 33, 1159-1161, doi:10.1038/nbt.3390 (2015)]).
Cas13 패밀리는 Cpf1과 유사한 방식으로(문헌[Fonfara, I., Richter, H., Bratovic, M., Le Rhun, A. & Charpentier, E. The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA. Nature 532, 517-521, doi:10.1038/nature17945 (2016)]; 문헌[Zetsche, B. et al. Multiplex gene editing by CRISPR-Cpf1 using a single guide array. Nat Biotechnol 35, 31-34, doi:10.1038/nbt.3737 (2017)]), 전장 CRISPR 전사물의 처리를 위한 이중 알엔아제 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다(문헌[East-Seletsky, A. et al. Two distinct RNase activities of CRISPR-C2c2 enable guide processing and RNA detection. Nature 538, 270-273, doi:10.1038/nature19802 (2016)]). 출원인은 LwaCas13a가 엘.와데이 유래의 상응하는 CRISPR 스페이서 전사물을 절단할 수 있고(도 3j),이 절단은 농도 의존적임(도 15b)을 밝혀냈다. 또한, LwaCas13a는 겔 전기영동에 의해 분리된 RNA 생산물(도 24c)에 부수적 활성을 나타내어(도 24b), 소광된 형광단 절단에 의해 부수적 활성에 대한 이전의 특징을 확인하였다(문헌[Gootenberg, J. S. et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science 인쇄중 (2017)]).
렙토트리키아 와데이 F0279(Lwa2) C2c2는 절단 동역학(도 36 내지 37), 양이온의 존재에 대한 절단 활성의 의존성(도 38), PFS 선호(도 39), 직접 반복 길이의 효과(도 40), 스페이서 길이의 효과(도 41), 표적 RNA 서열 및 2차 구조의 효과(도 42) 및 뉴클레오티드 컷 선호(도 43)를 평가하기 위한 시험관내 분석에서 사용하였다.
실시예 10: LwaCas13a는 리포터 mRNA를 녹다운하기 위해 재프로그래밍될 수 있다.
LwaCas13a의 강력한 RNA 절단 활성 및 유연한 서열 선호를 고려할 때, 출원인은 포유류 세포에서 전사물을 절단하는 능력을 평가하기로 결정하였다. 출원인은 먼저 포유류 코돈 최적화된 LwaCas13a를 C- 또는 N-말단 상의 msfGFP 융합 및 이중 인접 핵 방출 서열(NES) 또는 핵 국소화 서열(NLS) 중 하나와 함께 포유류 발현 벡터로 클로닝하고 발현 및 국소화를 평가하였다(도 1d). 출원인은 msfGFP-융합된 LwaCas13a 작제물이 잘 발현되고 국소화 서열에 따라 세포질 또는 핵으로 효과적으로 국소화됨을 밝혔다. LwaCas13a의 생체내 절단 활성을 평가하기 위해 출원인은 가우시아(Gaussia) 루시페라제(Gluc) 및 사이프리디니아(Cypridinia) 루시페라제(Cluc) 모두를 동일 벡터 상의 상이한 프로모터 하에서 발현하는, 이중 루시페라제 리포터 시스템을 개발하여, 하나의 전사물이 Cas13a 표적으로 역할하고 다른 것은 용량 대조군으로 역할하도록 하였다(도 2a). 그 후 출원인은 Gluc에 대한 가이드를 설계하고 tRNAVal-프로모터-발현 가이드 벡터로 이들을 클로닝하였다. 출원인은 LwaCas13a 발현 벡터, 가이드 벡터, 및 이중-루시페라제 작제물을 HEK293FT로 형질감염시키고 형질감염 48 시간 후에 루시페라제 활성을 측정하였다. 출원인은 핵-국소화된 LwaCas13a-msfGFP가 위치 매치된 shRNA 대조군에 유사하게(가이드 1의 경우 78.3%, 가이드 2의 경우 51.1%), 가장 높은 수준의 녹다운을 초래했으며(가이드 1의 경우 75.7%, 가이드 2의 경우 72.9%)(도 6b), 이는 표적 영역에서의 접근 가능성 및 서열을 제어한다. LwaCas13a-msfGFP-NLS 작제물의 우수한 절단 때문에, 출원인은 모든 추가의 녹다운 실험에 이 설계를 사용하였다. 핵 국소화된 LwaCas13a-msfGFP는 또한, 아마도 msfGFP에 의해 제공되는 향상된 안정성으로 인해, mCherry 융합 버전보다 더 좋은 성능을 나타냈다. 설계 제작된 융합에 의해 LwaCas13a 활성을 조작하는 능력은 Cas13a 도구의 유연성을 강조한다. LwaCas13a는 또한 A375 흑색종 세포주에서 녹다운할 수 있어(도 6a, 도 9), Cas13의 다목적성을 입증한다. 출원인은 또한 LwaCas13a가 28 nt의 스페이서 길이로 최상의 Gluc 녹다운을 생산함(73.8%)(도 6c) 및 녹다운은 단백질 및 가이드 또는 crRNA 형질감염된 벡터 양 모두에 용량-반응적임(도 56a,b)을 밝혔다. 가이드 발현은 프로모터 선택에 민감하지 않으며, tRNAVal 또는 U6 프로모터로부터 발현된 가이드 또는 crRNA는 유사한 수준의 Gluc 녹다운을 초래한다(tRNAval의 경우 66.3%, U6의 경우 74.5%)을 초래한다(도 56c).
출원인은 다음으로 3 가지 내인성 유전자인 KRAS, CXCR4 및 PPIB에 대한 녹다운을 시험하였고, 다양한 수준의 녹다운을 밝혔고, 3 가지 유전자 중 2 가지에 대해, LwaCas13a 녹다운(PPIB의 경우 40.4%, CXCR4의 경우 83.9%, KRAS의 경우 57.5%)은 위치 매치된 shRNA를 사용한 RNAi(PPIB의 경우 63.0%, CXCR4의 경우 73.9%, KRAS의 경우 44.3%)와 유사하였다(도 3o). 출원인은 또한 내인성 유전자 녹다운이 tRNAVal 또는 U6 프로모터로부터 발현된 가이드에 대해 유사한 수준의 녹다운으로(tRNAVal에 대해서 86.7%, U6에 대해서 77.6%), 가이드 프로모터 선택에 유연하다는 것을 밝혔다(도 56d). 출원인은 또한 LwaCas13a가 A375 흑색종 세포주에서 녹다운할 수 있음을 밝혔다(도 56e). LwaCas13a 녹다운의 다목적성을 확장하기 위해, 출원인은 벼(Oryza sativa) 유전자 EPSPS, HCT 및 PDS에 대한 전사물에 대한 가이드를 설계하고 LwaCas13a 및 가이드 벡터를 오.사티바 원형질체로 동시 형질감염시켰다(도 3p). 형질감염 후, 출원인은 시험된 3 가지 유전자 모두 및 9 개의 가이드 중 7 개에 대해 50% 초과의 녹다운을 관찰하였고 최고 녹다운은 78.0%였다(도 3q). 함께, 이들 결과는 LwaCas13a가 RNAi와 유사한 수준의 RNA 녹다운을 매개할 수 있음을 시사한다. Cas13 패밀리의 추가적인 구성원에 대한 추가 탐구는 더욱 강력한 녹다운 효과를 달성할 수 있는 단백질을 밝힐 수 있다.
실시예 11: 리포터 및 내인성 전사물에 대한 LwaCas13a 녹다운 스크리닝
LwaCas13a 녹다운의 효율에 대한 RNA 맥락 의존성을 포괄적으로 특징 확인하기 위해, 출원인은 Gluc, KRAS, PPIB 또는 Cluc 전사물의 길이를 따라 가이드를 타일링하기 위한 LwaCas13a의 프로그래밍 가능성을 이용하였다(도 32a). Gluc 및 Cluc 스크린은 60%보다 높은 녹다운을 갖는 가이드를 나타냈고(도 32), Gluc 표적화 가이드 중 대부분은 최대 83%까지의 녹다운으로 50%보다 많은 녹다운을 가졌다. LwaCas13a 녹다운을 RNAi와 비교하기 위해, 출원인은 Gluc 및 Cluc에 대한 상위 3 개 성능 가이드를 선택하고 그들을 위치 매치된 shRNA와 비교하였다. 출원인은 상위 6 개 성능 가이드 중 5 개가 그들의 매치된 shRNA보다 유의미하게 더 높은 수준의 녹다운(p < 0.05)을 달성함을 밝혔다(도 32d).
리포터 유전자에 대한 강력한 녹다운을 입증하여, 출원인은 다음으로 Cas13a가 KRAS 및 PPIB 2 가지 유전자의 타일링을 통해 내인성 전사물을 표적화하도록 설계 제작될 수 있는지 여부를 탐구하였다. 출원인은 녹다운 효율이 전사물 의존적인 반면, 출원인이 KRAS 및 PPIB에 대해 각각 85% 및 75%의 최대 녹다운으로 각 표적에 대해 50% 녹다운을 달성할 수 있는 가이드를 여전히 찾을 수 있음을 밝혔다(도 49a,b). 출원인은 또한 내인성 유전자 녹다운이 tRNAVal 또는 U6 프로모터로부터 발현된 crRNA에 대해 유사한 수준의 녹다운으로, 가이드 발현 설계에 유연함을 밝혔다(도 56d).
LwaCas13 녹다운 대 RNAi 효율을 더 이해하기 위해, 출원인은 동일한 표적 영역에 위치 매치된 shRNA 작제물에 다양한 가이드를 비교하였다. 출원인은 내인성 타일링 스크린(KRAS 및 PPIB) 각각으로부터 상위 3 개의 가이드를 선택하고 shRNA 녹다운(61.8% 내지 95.2%)에 의해 달성된 수준에 동등한 Cas13a를 이용한 강력한 녹다운(53.7% 내지 88.8%)을 관찰하였고, 6 개 가이드 중 2 개에 대해서는 shRNA이 더 좋았고(p<0.01) 6 개 가이드 중 2 개에 대해서는 Cas13a가 더 좋았다(p<0.01)(도 49h).
실시예 12: LwaCas13a 녹다운은 표적 전사물 내의 접근 가능한 부위에서 최적임
출원인은 LshCas13a 활성이 이.콜라이에서 표적 접근 가능성에 의해 좌우됨을 발견했기 때문에(문헌[Abudayyeh, O. O. et al. C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Science 353, aaf5573, doi:10.1126/science.aaf5573 (2016)]), 출원인은 가이드 타일링 스크린에서 표적화된 4 개의 전사물을 따라 접근 가능성의 영역에 위치하는 가이드에 대해 LwaCas13a 활성이 증가했는지 여부를 조사하기로 결정하였다. 출원인은 먼저 가장 효과적인 가이드가 정의된 영역으로 클러스터를 이루는 것처럼 보임을 발견했고(도 58a) 효과적인 가이드 사이의 쌍 거리를 귀무 분포와 비교함으로써 출원인은 4 개 전사물 모두에 대해 관찰된 가이드가 우연에 의해 예상되는 것보다 유의미하게 더 서로 가깝다는 것을 밝혔다(도 58a). 이들 초기 클러스터링 결과는 접근 가능성의 영역이 더 나은 LwaCas13a 절단 활성을 위해 강화될 수 있음을 시사한다.
전사물 접근 가능성이 LwaCas13a 활성에 영향을 주는지 확인하기 위해, 출원인은 전사물 각각에 걸친 모든 표적 영역의 접근 가능성을 컴퓨터로 예측하고, 이들 컴퓨터 예측이 부분적으로는 녹다운 효율과 상관관계가 있음을 밝혔다(도 58b 내지 58d). 4 개의 표적화된 전사물에 걸쳐, 예측된 표적 접근 가능성은 표적화 효능에서의 변동(녹다운에 있어서 4.4% 내지 16%의 변동)의 일부를 설명할 수 있으며, 이는 접근 가능성이 녹다운 효율의 결정 요인인 반면 염기 동일성, 서열 특성 및 RNA에의 단백질 결합과 같은 다른 인자 또한 표적화 효능에 중요한 역할을 할 수 있음을 나타낸다. 미래에 더욱 광범위한 스크리닝으로 이들 메커니즘을 보다 명확하게 설명할 수 있을 가능성이 있을 것이다.
실시예 13: 내인성 전사물에 대한 LwaCas13a 녹다운 및 RNAi의 비교
LwaCas13 녹다운 대 RNAi 효율을 더 이해하기 위해, 출원인은 동일한 표적 영역에 매치된 shRNA 작제물에 다양한 가이드를 비교하였다. 출원인은 먼저 내인성 타일링 스크린(KRAS 및 PPIB) 각각으로부터 상위 3 개의 가이드를 선택하고, 거의 모든 가이드에 대해 shRNA에 동등한 녹다운으로 Cas13a를 이용한 강력한 녹다운을 관찰하였다(도 49c). shRNA와 추가로 비교하기 위해 출원인은 또한 KRAS, PPIB 및 CXCR4에 대해 RNAx 알고리즘에 의해 예측된 접근 가능성 영역에서의 Cas13a crRNA를 설계했으며 shRNA에 유사한 수준의 녹다운을 발견하였다(도 48d).
실시예 14: MALAT1 IncRNA에 대한LwaCas13a 녹다운 스크리닝
LwaCas13a는 세포 국소화를 위해 설계 제작될 수 있기 때문에, RNA 녹다운을 위해 표적화될 수 있는 세포의 구획에 대하여 다목적성을 갖는다. 출원인은 핵 국소화된 전체 lncRNA MALAT1 전사물에 걸쳐 고르게 타일링된 93 개의 가이드를 설계하고 이들 가이드를 핵 국소화된 LwaCas13a로 형질 감염시켰다. 출원인은 하나의 실험에서 약 40% 내지 50%의 녹다운 만큼까지로, 다양한 수준의 녹다운을 발견하였다(도 49e). 검출 가능한 녹다운을 나타내지 않았던(p > 0.05) 위치 매치된 shRNA와 비교하여, Cas13a는 유의미하게 더 높은 수준의 녹다운(39.0 내지 66.5%, p < 0.05)을 달성하였다(도 49j). 출원인은 또한 lncRNA XIST 전사물을 타일링하여 모든 가이드에 걸쳐 평균 22.0% 및 최대 83.9%의 녹다운을 발견하였다(도 56f).
실시예 15: 내인성 전사물에 대한 다중화된 녹다운
Cpf1과 같은, CRISPR 어레이 처리 활성을 갖는 다른 CRISPR 이펙터는 하나의 프로모터 하에서 다수의 가이드를 발현함으로써 다중화된 유전자 편집을 위해 영향받았다(Zetsche, B. et al. Multiplex gene editing by CRISPR-Cpf1 using a single guide array. Nat Biotechnol 35, 31-34, doi:10.1038/nbt.3737 (2017)). LwaCas13a는 자체 어레이를 처리할 수 있기 때문에 출원인은 단일 프로모터 하에서 발현되는 CRISPR 어레이로서 LwaCas13a 가이드의 다중화된 전달을 시험하기로 결정하였다. 출원인은 내인성 PPIB, CXCR4, KRAS, TINCR, 및 PCAT 전사물에 대해 5 개의 상이한 가이드를 설계하였고, U6 프로모터의 발현 하의, 처리되지 않은 DR 및 절단된 스페이서에 해당하는, 36 nt 직접 반복(DR)이 측면에 배치된 28 nt 가이드를 갖는 CRISPR 어레이로서 표적화 시스템을 전달하였다. 이 접근으로, 출원인은 단일 또는 집단의 가이드 대조군에 유사한, 각각의 유전자에 대한 녹다운 수준을 발견 하였다(도 49f).
표적외 LwaCas13a 활성이 CRISPR 어레이에 의해 표적화된 5 개 전사물의 비-특이적 녹다운을 일으킬 수 있다는 우려 때문에, 출원인은 PPIB, CXCR4 및 KRAS에 대한 3 개 가이드 및 3 개의 가이드 중 각각의 하나가 비-표적화 가이드로 대체된 3 가지 변이체의 다중화된 전달로 실험을 설계하였다. 출원인은 가이드가 어레이에 부재한 각각의 경우에, 누락된 가이드에 의해 표적화된 전사물의 유의미한 녹다운이 없었으며 오직 표적화된 전사물만 LwaCas13a에 의해 녹다운되었음을 밝혔고, 이는 녹다운이 전사물의 비특이적 분해에 기인한 것이 아니고 사실은 LwaCas13a에 의한 특이적, 다중화된 녹다운에 기인한 것임을 입증한다(도 49g).
실시예 16: LwaCas13a 녹다운은 미스매치에 민감함
특이성은 핵산 표적화 도구에 대한 중요 우려이고, RNAi 및 Cas9 DNA-표적화 시스템 모두의 특이성(문헌[Mali, P. et al. CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering. Nat Biotechnol 31, 833-838, doi:10.1038/nbt.2675 (2013)]; 문헌[Fu, Y. et al. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nat Biotechnol 31, 822-826, doi:10.1038/nbt.2623 (2013)]; 문헌[Pattanayak, V. et al. High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed Cas9 nuclease specificity. Nat Biotechnol 31, 839-843, doi:10.1038/nbt.2673 (2013)]; 문헌[Hsu, P. D. et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat Biotechnol 31, 827-832, doi:10.1038/nbt.2647 (2013)]; 문헌[Doench, J. G. et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nat Biotechnol 34, 184-191, doi:10.1038/nbt.3437 (2016)])은 광범위하게 특징 확인되었다. LshCas13a의 초기 특징 확인은 시험관내에서 겨우 2 개의 미스 매치에도 민감할 수 있음을 보여주었고(문헌[Abudayyeh, O. O. et al. C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Science 353, aaf5573, doi:10.1126/science.aaf5573 (2016)]), 부수적 효과를 통한 LwaCas13a의 특이성 프로파일링(문헌[Gootenberg, J. S. et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science 인쇄중 (2017)])은 식별이, 가이드:표적 듀플렉스의 씨드 영역에서는 단일-뉴클레오티드 해상도이면서, 2 개 뉴클레오티드 해상도에서 달성될 수 있음을 밝혔다. 생체내에서 Cas13a의 특이성을 조사하기 위해, 출원인은 Gluc(도 29a) 또는 내인성 유전자 CXCR4, KRAS 및 PPIB(도 29b, 도 59a 내지 59b)를 표적화하는 가이드에 미스 매치를 도입하였다. 출원인은 Cas13a 특이성에 대한 이전의 시험관내 특징 확인과 일치하여, 모든 전사물에 대해, 가이드:표적 듀플렉스의 중심 영역이 단일 미스매치에 가장 민감함을 밝혔다(문헌[Abudayyeh, O. O. et al. C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Science 353, aaf5573, doi:10.1126/science.aaf5573 (2016)]). 씨드 영역에서는 녹다운이 감소된 반면, 출원인은 단일 미스매치가 Gluc와 같은 일부 표적 상의 실질적인 수준의 특이성에 충분하지 않음을 밝혔다. Gluc에 대한 스페이서에 대한 연속적인 2 개 미스매치의 타일링은(도 29a) 2 개 미스매치가 8 배까지의 활성 감소를 초래하였음을 밝혔고, 이는 특이적 생체내 표적화 도구로서의 Cas13a의 장래성을 나타낸다. 출원인은 또한 비-연속적인 2 개 미스매치의 효과를 조사하여 대부분의 2 개 미스매치가, 가이드 서열의 5' 또는 3' 말단에 위치하는 2 개 미스매치를 제외하고는, 80.4%에서 60% 미만으로 녹다운을 감소시킴을 밝혔다(도 59c).
시험관내 다중 특이성 파라미터에 걸쳐 Cas13a의 추가 특징 확인을 위해, 출원인은 직접적 Cas13a 활성에 대한 대용물로서 부수적 활성의 검출(문헌[Gootenberg, J. S. et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science 인쇄중 (2017)])을 사용하였다. 더 짧은 스페이서 길이에 의해 특이성이 증가할 수 있음을 나타낸 Cas9 실험 결과를 고려할 때(문헌[Fu, Y., Sander, J. D., Reyon, D., Cascio, V. M. & Joung, J. K. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nat Biotechnol 32, 279-284, doi:10.1038/nbt.2808 (2014)]), 출원인은 스페이서 길이가 단일 미스매치에 의해 상이한 2 개의 표적에 대한 Cas13a 특이성에 영향을 미쳤는지 여부가 궁금하였다. 출원인은 더 짧은 스페이서는 감소된 활성을 갖는 반면(도 59d), 생체내 LwaCas13a 결과로부터 기대되는 바와 같이, 더 짧은 스페이서는 또한 단일 염기-미스매치 구별을 개선함을 밝혔다(도 59d, 59e). 출원인은 이 접근이 LwaCas13a를 이용한 시험관내 단일-미스매치 구별에 성공적으로 사용되었기 때문에(문헌[Gootenberg, J. S. et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science 인쇄중 (2017)]), 다음으로 스페이서 서열에서의 추가적인 합성 미스매치를 설계함으로써 특이성이 개선될 수 있는지 여부를 탐구하였다. 출원인은, 전장 스페이서(도 59f, 59g)와 비교하여, 23 nt(59h, 59i) 또는 20 nt(도 59j, 59k)로 절단된 스페이서는 전체 활성은 더 적지만 실질적으로 증가된 특이성을 가짐을 밝혔다. 종합하면, LwaCas13a의 시험관내 및 생체내 설계 제작은 특이적 녹다운 도구로서 이의 사용에 대한 장래성을 나타낸다. 단일-염기 특이성을 부여하기 위해 가이드를 설계 제작하는 능력은 LwaCas13a에 의한 대립 유전자-특이적 전사물 녹다운을 용이하게 할 것이다.
실시예 17: LwaCas13a를 이용한 전사물 녹다운은 매우 특이적임
LwaCas13a 녹다운의 표적외 효과가 있는지 여부를 포괄적으로 이해하기 위해, 출원인은 트랜스크립톰-전체에 걸친 mRNA 시퀀싱을 수행하였다. 출원인은 LwaCas13a 또는 위치 매치된 shRNA 작제물로 Gluc 전사물을 표적화하고, 표적 전사물의 유의미한 녹다운을 발견하였다(도 29b-a). KRAS 및 PPIB의 2 가지 내인성 유전자 상에서의 동일한 비교에 대해서도 유사한 결과가 발견되었다(도 29b-b, 29b-c). shRNA 조건은 LwaCas13a 조건보다 표적화 및 비-표적화 대조군 간에 더 많은 트랜스크립톰-전체에 걸친 변이 및 약한 상관관계를 가졌으며, 이는 shRNA 표적화 실험에서의 더 많은 표적외를 시사한다. 출원인은 차등 발현 분석에 의해 유의미한 표적외 수를 추가로 특징 확인하고 shRNA 조건 각각에서 수백 개의 표적외를 발견하였으나, 표적 전사물의 유사한 수준의 녹다운에도 불구하고(Gluc, KRAS, 및 PPIB 각각에 대하여, shRNA에서는 30.5%, 43.5%, 및 64.7%, Cas13a에서는 62.6%, 27.1%, 및 29.2%)(도 30b), LwaCas13a 조건에서는 표적외를 0 개 발견하였다(도 30a). 출원인은 Gluc 표적화 RNA-seq 비교에 대한 추가적인 분석을 수행하였고, shRNA 조건에서의 가변성의 주된 출처가 개별 반복실험에서의 표적화 및 비-표적화 조건 간의 차이에 기인함을 밝혔다(평균 켄달 타우=0.917)(도 60c 내지 60e). 동일한 조건의 개별 반복실험을 비교할 때 훨씬 높은 상관 관계 및 더 적은 가변성이 있었으며(평균 켄달 타우=0.941), 이는 관찰된 변이가 주어진 shRNA 작제물의 일관된 표적외 효과로부터 나온 것임을 나타낸다. 이 분석을 3 가지 유전자에 대해 분석된 모든 RNA-seq 라이브러리에 걸쳐 적용하면, 모든 LwaCas13a 조건은 전사물 분포의 좁은 다양성으로 인해 상이한 가이드 서열에도 불구하고 서로 높은 상관 관계를 갖는다. 대조적으로, shRNA 조건 각각에 대한 3 가지 반복실험 세트는 각각의 상이한 shRNA 서열에 대한 표적외 변이 양으로 인해 shRNA 조건들 사이보다 세트 내 상관 관계가 더 높다(도 61a, 61b). 또한, 각각의 가이드 조건에 대한 표준 편차의 분포를 3 개의 전사물에 걸쳐 각각의 shRNA 조건에 비교할 때, shRNA 조건에서 유의미하게 더 많은 변이가 관찰된다(p<10-192, 양측 K-S 테스트)(도 61c).
실시예 18: LwaCas13a는 포유류 세포에서 관찰할 수 있는 부수적 활성을 나타내지 않음
Cas13a의 부수적 활성은 시험관내에서 생화학적으로 직접적으로 관찰되고 박테리아에서의 성장 억제를 통해 간접적으로 관찰되었다. 다중화된 단일 제거법(leave-one-out) 및 RNA-seq 분석은 비-특이적 RNA 분해의 결여 및 따라서 포유류 세포에서의 부수적 활성의 결여를 시사하기 때문에 출원인은 부수적 활성으로 인한 전체 표적외 발현의 감소가 녹다운 실험에서 발생했는지 여부를 알아보고 싶었다. 출원인은 표적 전사물 녹다운의 결과로서 대조군에서의 변이가 있었는지 여부를 알아보기 위하여 루시페라제 및 내인성 녹다운 실험에서 유전자 대조군을 분석하였다. 초기 Gluc 타일링 실험으로부터, 많은 가이드가 Gluc의 유의미한 녹다운을 나타낸 반면 Cluc 수준에서는 변이가 거의 없었음이 분명하였다(도 62a, 62b). 그 다음 출원인은 표적내 발현에 대한 표적내 녹다운 또는 표적외 발현에 대한 표적내 녹다운(내인성 표적화의 경우에는 루시페라제 대조군 또는 GAPDH) 간의 상관 관계를 분석하기로 결정하였다. 출원인은 4 가지 표적 각각에 대해, 표적내 녹다운 및 대조군 유전자 발현 사이에 상관 관계는 훨씬 약하거나 없는 반면(Gluc: R=-0.078, p>0.05; PPIB: R=-0.058, p>0.05; KRAS: R=-0.51, p<0.0001)(도 61c 내지 61j), 표적내 녹다운 및 표적내 발현 사이에는 유의미한 양의 상관관계가 있음(Gluc: R=0.89, p<0.0001; PPIB: R=0.81, p<0.0001; KRAS: R=0.52, p<0.0001)을 밝혔으며, 이는 검출 가능한 표적외 녹다운이 없음을 나타낸다.
대조군 발현 및 녹다운 사이의 유의미한 상관 관계의 결여는 포유류 세포에서 LwaCas13a의 부수적 활성이 거의 없거나 전혀 없음을 시사한다. 출원인은 전사물 녹다운 동안의 세포의 성장 제한이 이전에 박테리아에서 관찰된 바와 같이 나타나는지를 알아봄으로써 이것을 더 조사하고자 하였다(문헌[Abudayyeh, O. O. et al. C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Science 353, aaf5573, doi:10.1126/science.aaf5573 (2016)]). 출원인은 Gluc에 대한 다수의 가이드로 선택하거나 선택하지 않고 LwaCas13a를 72 시간 동안 형질감염한 다음 녹다운을 측정한 직후 GFP 형광을 통해 세포 생존력 및 LwaCas13a 발현을 측정하였다. 출원인은 5 개의 모든 Gluc 표적화 가이드에 대해 유의미한 수준의 녹다운을 관찰하였으나(도 30c), 표적화 가이드 및 비-표적화 가이드 대조군 사이에 세포 성장 또는 GFP 형광에서의 유의미한 차이는 없었다(도 30d, 30e).
Cas13a의 부수적 활성은 시험관내에서 생화학적으로 직접적으로 및 박테리아에서 성장 억제를 통해 간접적으로 관찰되었으나, 포유류 세포에서의 이러한 활성의 정도는 불명확하다. 출원인은 RNA 시퀀싱 실험에서 서열-특이적 표적외 LwaCas13a 활성을 발견하지 못했고, 표적화된 전사물의 LwaCas13a-매개된 녹다운은 유사한 수준의 LwaCas13a를 발현하는 포유류 세포의 성장에 영향을 미치지 않았다(도 29g). 추가적으로, 검출 가능한 유전자 발현 변화가 없었으며, 이는 LwaCas13a 표적화의 존재가 트랜스크립톰 수준에서 관찰 가능한 세포 스트레스 반응을 유도하지 않음을 나타낸다(도 29a, 도 60a, 60b)(문헌[Subramanian, A. et al. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles, Proc. Natl. Acad. Sci USA 102, 15545-15550 (2005)]). 요약하면, 출원인은 낮은 수준의 균일한 부수적 활성 절단이 발생할 수 있는 가능성을 배제할 수 없지만, 출원인은 4 개의 다음 관찰에 걸쳐 검출 가능한 부수적 활성을 발견하지 못했다: 1) 모든 타일링 실험에서, 출원인은 표적 전사물 녹다운 및 인-라인(in-line) 대조군 유전자 녹다운 사이에 유의미한 상관 관계를 관찰하지 못했고(도 62), 2) 출원인은 RNA 시퀀싱 분석에서 트랜스크립톰에 대한 최소한의 변동을 관찰하였으며 유의미한 표적외를 관찰하지 못했고(도 29a), 3) 단일 제거 다중화 실험에서 출원인은 제외된 유전자의 녹다운을 관찰하지 못했고(도 49l), 4) 출원인은 LwaCas13a 표적화로 인한 세포 성장 또는 스트레스에 대한 표현형 효과를 관찰하지 못했다(도 29g).
실시예 19: 포유류 세포에서 dCas13a는 프로그래밍 가능하게 전사물에 결합함
프로그래밍 가능한 RNA-결합 단백질이 광범위한 적용을 위한 기초로서 역할할 수 있기 때문에, 출원인은 LwaCas13a가 촉매적으로 비활성인 변이체(dCas13a)로서 설계 제작될 수 있는지 여부를 탐구하였다. 이전의 연구들은 촉매성 잔기의 돌연변이를 통한 LshCas13a의 비활성화가 알엔아제 활성을 제거하면서도 RNA-결합을 유지함을 입증하였다(문헌[Abudayyeh, O. O. et al. C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Science 353, aaf5573, doi:10.1126/science.aaf5573 (2016)]). 출원인은 LwaCas13a에서 촉매적 아르기닌 잔기를 돌연변이시켜 dCas13a를 생성하였으며(도 44a), 리포터 코딩 서열의 5' UTR 업스트림으로의 dCas13a의 표적화가 번역 및 리포터 유전자 발현의 감소를 초래함을 밝혔다(도 63a). dCas13a에 의한 RNA 결합을 정량하기 위해, 출원인은 36 nt DR 및 28 nt 스페이서를 함유하는 가이드를 사용하여 RNA 면역침강(RIP)을 수행하였고(도 58b) 루시페라제 전사물(도 44a) 또는 ACTB mRNA(도 63b) 중 하나에 표적화되는 dCas13a의 풀다운이 비-표적화 대조군 대비 상응하는 표적의 유의미한 강화를 초래하였음을 밝혔고(루시페라제에 대해 7.8 내지 11.2x 강화 및 ACTB에 대해 2.1 내지 3x 강화; p<0.05), 이는 재프로그래밍 가능한 RNA 결합 단백질로서의 dCas13a를 인증하는 것이다.
실시예 20: dCas13a를 이용한 전사물의 음성 패드백 이미징
생체내 이미징을 위해 dCas13a를 설계 제작하고 미결합 단백질로 인한 배경 잡음을 감소시키기 위해, 출원인은 징크 핑거 자가-표적화 및 KRAB 도메인 억제에 기반한 음성-피드백 시스템을 포함시켰다(문헌[Gross, G. G. et al. Recombinant probes for visualizing endogenous synaptic proteins in living neurons. Neuron 78, 971-985, doi:10.1016/j.neuron.2013.04.017 (2013)])(도 44b). 징크 핑거, KRAB 도메인 및 NLS의 dCas13a에의 융합은 음성 피드백 작제물(dCas13a-NF)을 초래하였다. dCas13a-NF가 표적 전사물에 결합하지 않을 경우, 그것은 핵으로 국소화되며 자체 발현을 억제한다. 전사물 결합 시, 새롭게 번역된 dCas13a-NF가 세포질 내에 계속 머무르는 것 또한 가능하나, dCas13a-NF는 세포질 내로 방출되어 발현을 증가시킨다. 전사물 결합의 결과로 보통 수준의 세포질 전위(또는 유지)를 나타내는 dCas13a와 비교하여, dCas13a-NF는 ACTB mRNA에 표적화될 때 효과적으로 전위 또는 재-국소화되었다(도 63e). dCas13a-NF의 전위 정도를 추가로 특징 확인하기 위해, 출원인은 2 개의 가이드로 ACTB 전사물을 표적화하고 두 가이드가 비-표적화 가이드에 비해 전위를 증가시켰음을 밝혔다(3.1 내지 3.7x 세포/핵 신호 비율, p<0.0001)(도 44c, 도 11c 내지 11e). 전위의 정량화는 표적화 가이드가 비-표적화 가이드보다 세포질에서 유의미하게 더 많은 형광 분획을 초래하였음을 나타냈고, 이는 전사물 이미징 도구로서의 dCas13a-NF의 유용성을 보여주었다. dCas13a-NF 이미징을 추가로 검증하기 위해, 출원인은 ACTB mRNA 형광 인 시츄 혼성화(FISH) 신호에 대한 dCas13a-NF 신호의 상관 관계를 분석하였고(도 64a), 표적화 가이드 대 비-표적화 가이드 조건에 대하여 유의미한 상관 관계 및 신호 중첩이 있음을 밝혔다(가이드 1 및 2에 대해 각각 R=0.27 및 0.30, 및 비-표적화 가이드 조건에 대해 R=0.00; p<0.0001(도 64b).
실시예 21: 살아있는 세포에서의 스트레스 과립에 대한 dCas13a 이미징
산화 스트레스는 폴리아데닐화된 전사물 및 단백질을 세포질 내의 스트레스 과립으로 응집되게 하고(문헌[Nelles, D. A. et al. Programmable RNA Tracking in Live Cells with CRISPR/Cas9. Cell 165, 488-496, doi:10.1016/j.cell.2016.02.054 (2016)]; 문헌[Unsworth, H., Raguz, S., Edwards, H. J., Higgins, C. F. & Yague, E. mRNA escape from stress granule sequestration is dictated by localization to the endoplasmic reticulum. FASEB J 24, 3370-3380, doi:10.1096/fj.09-151142 (2010)]), 스트레스 과립의 발달은 암, 신경 퇴행성 질병, 및 근병증을 포함한 많은 병리학과 관련되어 있다(문헌[Wyss-Coray, T. Ageing, neurodegeneration and brain rejuvenation. Nature 539, 180-186, doi:10.1038/nature20411 (2016)]; 문헌[Protter, D. S. & Parker, R. Principles and Properties of Stress Granules. Trends Cell Biol 26, 668-679, doi:10.1016/j.tcb.2016.05.004 (2016)]). 출원인은 스트레스 과립, G3BP1의 잘 알려진 마커(문헌[Tourriere, H. et al. The RasGAP-associated endoribonuclease G3BP assembles stress granules. J Cell Biol 160, 823-831, doi:10.1083/jcb.200212128 (2003)])의 시각화와 전사물의 dCas13a-NF 이미징을 조합함으로써 mRNA의 스트레스 과립으로의 축적을 조사하였다(도 48a). 고정된 샘플에서 mRNA 추적을 확인하기 위해, 출원인은 2 개의 ACTB를 표적화하는 crRNA 또는 가이드 중 하나를 dCas13a-NF와 함께 동시 형질감염하고, 소듐 아르세나이트로 스트레스 과립 형성을 유도하고, 면역 형광으로 G3BP1을 시각화하였다(도 48b). dCas13a-NF는 예상되는 바와 같이 표적화 조건에 대해 세포질 내로 전위되거나 재-국소화되었고, 출원인은 비-표적화 대조군과 비교하여 dCas13a-NF 신호 및 G3BP1 형광 사이에 유의미한 상관 관계를 밝혔으며(가이드 1 및 가이드 2의 경우 각각 R=0.49 및 0.50, 및 비-표적화 가이드의 경우 0.08; p<0.001)(도 48c, 48d), 이는 스트레스 과립 형성을 추적하는 dCas13a-NF의 능력을 시사한다. 고정된 샘플에서의 공동-국소화를 고려할 때, 출원인은 다음으로 살아있는 세포에서 스트레스 과립 추적을 수행하였다. 출원인은 ACTB 표적화 가이드 및 비-표적화 가이드를 dCas13a-NF와 함께 형질 감염시켰으며, 형질 감염 24 시간 후 소듐 아르세나이트로 스트레스 과립 형성을 유도하고, 시간 경과에 따라 살아있는 세포를 이미징하였다(도 48e). 스트레스 과립 마커로서 G3BP1-RFP 융합을 사용하여, 출원인은 ACTB에 표적화되는 dCas13a-NF가 상응하는 비-표적화 대조군보다 시간에 따라 세포 당 유의미하게 더 많은 스트레스 과립으로 국소화함을 밝혔다(p<0.05)(도 48f).
실시예 22: 논의
클래스 2 제VI형 CRISPR-Cas 이펙터 Cas13a는 포유류 세포에서 녹다운하거나 전사물에 결합하는 crRNA 또는 가이드로 효과적으로 재프로그래밍될 수 있다. 출원인은 박테리아에서 RNA 절단을 위한 15 가지 Cas13a 오솔로그 중 가장 활성인 것으로 LwaCas13a를 동정하고 RNAi에 유사한 수준으로의 포유류 RNA 녹다운을 위해 이를 이용하였다. 출원인은 박테리아 스크리닝을 통해 검출 가능한 PFS가 없으며 가이드 활성이 PFS에 의해 영향을 받지 않음을 밝혔다. LwaCas13a는 생체내 스페이서:표적 듀플렉스에서의 미스매치에 민감하며, 이 민감성은 RNAi에 비해 높은 특이성의 녹다운으로 번역된다. 출원인은 또한 RNA 녹다운 도구로서의 LwaCas13a의, 단백질을 추가로 설계 제작하고 최적화할 수 있는 능력, 가이드의 다중화된 전달, 및 핵 lncRNA의 녹다운을 포함하는, 특유의 특성을 자세히 보여주었다. 중요하게는, 출원인은 LwaCas13a의 부수적 활성을 관찰하지 못하였으며, 이 특징은 시험관내에서 매우 활성있고 진단과 같은 많은 응용에 유용하다(문헌[Gootenberg, J. S. et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science 인쇄중 (2017)]). 또한, 출원인은 LwaCas13a가 촉매적으로 비활성으로 되어, 프로그램 가능한 RNA 결합 플랫폼으로서 사용될 수 있음을 보여주고, 출원인은 살아있는 세포에서 스트레스 과립에의 전사물 축적을 추적하기 위한 이의 유용성을 입증하였다.
중요하게도, 출원인은 포유류 세포에서 LwaCas13a의 부수적 활성을 관찰하지 못했고, 이는 출원인이 시험관내에서 관찰하여 진단 응용을 위해 이용한 특징이다(문헌[Gootenberg, J.S. et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2, Science, 인쇄중 (2017)]). 부수적 활성은 집단으로부터 감염된 세포를 제거하거나 감염된 세포에게 감염에 적응하고 극복할 시간을 제공하는, 본래 박테리아 세포에서의 프로그램된 세포 사멸/휴지 경로의 일부로 추정되었고, 이는 Cas13a 의 표적내 바이러스 전사물 절단 활성을 보충한다. 포유류 세포에서의 부수적 활성의 결여는 본래의 세포 맥락에서 이의 존재 가능성을 배제하지 않는다.
Cas13 패밀리 구성원에 기반한 RNA-표적화 도구의 개선 및 다양화를 위한 많은 기회가 있다. Cas13b(문헌[Smargon, A. A. et al. Cas13b Is a Type VI-B CRISPR-Associated RNA-Guided RNase Differentially Regulated by Accessory Proteins Csx27 and Csx28. Mol Cell 65, 618-630 e617, doi:10.1016/j.molcel.2016.12.023 (2017)]) 또는 Cas13c(문헌[Shmakov, S. et al. Diversity and evolution of class 2 CRISPR-Cas systems. Nat Rev Microbiol 15, 169-182, doi:10.1038/nrmicro.2016.184 (2017)])와 같은 추가적인 Cas13 단백질의 생체내 특징 확인은 절단 또는 결합 능력의 추가 개선을 산출할 수 있으며, 다중 색상 이미징을 포함하는, 직교 RNA 결합 단백질을 필요로 하는 응용을 가능하게 할 수 있다. 추가적으로, 더 작은 오솔로그는 아데노-관련 바이러스 벡터와 같은 크기-제한적 전달 선택지를 가능하게 할 것이다(문헌[Ran, F. A. et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature 520, 186-191, doi:10.1038/nature14299, nature14299 [pii] (2015)]). 마지막으로, 증가된 구조 데이터(문헌[Liu, L. et al. Two Distant Catalytic Sites Are Responsible for C2c2 RNase Activities. Cell 168, 121-134 e112, doi:10.1016/j.cell.2016.12.031 (2017)])와 결합된 Cas13 구성원의 다양성에 대한 탐구는 생물 정보학-(문헌[Zinn, E. et al. In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector. Cell Rep 12, 1056-1068, doi:10.1016/j.celrep.2015.07.019 (2015)]) 또는 구조-(문헌[Kleinstiver, B. P. et al. High-fidelity CRISPR-Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects. Nature 529, 490-495, doi:10.1038/nature16526 (2016)]; 문헌[Slaymaker, I. M. et al. Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity. Science 351, 84-88, doi:10.1126/science.aad5227 (2016)]) 안내되는 합리적 설계를 가능하게 할 수 있다. 개선된 RNA 결합 도구는 분할된 형광단의 재구성을 통한 이미징(문헌[Ozawa, T., Natori, Y., Sato, M. & Umezawa, Y. Imaging dynamics of endogenous mitochondrial RNA in single living cells. Nat Methods 4, 413-419, doi:10.1038/nmeth1030 (2007)]), 번역 조절(문헌[De Gregorio, E., Preiss, T. & Hentze, M. W. Translation driven by an eIF4G core domain in vivo. EMBO J 18, 4865-4874, doi:10.1093/emboj/18.17.4865 (1999)]; 문헌[Adamala, K. P., Martin-Alarcon, D. A. & Boyden, E. S. Programmable RNA-binding protein composed of repeats of a single modular unit. Proc Natl Acad Sci U S A 113, E2579-2588, doi:10.1073/pnas.1519368113 (2016)]; 문헌[Campbell, Z. T., Valley, C. T. & Wickens, M. A protein-RNA specificity code enables targeted activation of an endogenous human transcript. Nat Struct Mol Biol 21, 732-738, doi:10.1038/nsmb.2847 (2014)]; 문헌[Cao, J. et al. Light-inducible activation of target mRNA translation in mammalian cells. Chem Commun (Camb) 49, 8338-8340, doi:10.1039/c3cc44866e (2013)]; 문헌[Cooke, A., Prigge, A., Opperman, L. & Wickens, M. Targeted translational regulation using the PUF protein family scaffold. Proc Natl Acad Sci U S A 108, 15870-15875, doi:10.1073/pnas.1105151108 (2011)]), RNA 염기 편집(문헌[Nishikura, K. A-to-I editing of coding and non-coding RNAs by ADARs. Nat Rev Mol Cell Biol 17, 83-96, doi:10.1038/nrm.2015.4 (2016)]; 문헌[Wedekind, J. E., Dance, G. S., Sowden, M. P. & Smith, H. C. Messenger RNA editing in mammals: new members of the APOBEC family seeking roles in the family business. Trends Genet 19, 207-216, doi:10.1016/S0168-9525(03)00054-4 (2003)]), 후성트랜스크립톰 변동(문헌[Harcourt, E. M., Kietrys, A. M. & Kool, E. T. Chemical and structural effects of base modifications in messenger RNA. Nature 541, 339-346, doi:10.1038/nature21351 (2017)]), RNA 발현 수준에 기반한 아폽토시스의 표적화된 유도(문헌[Rider, T. H. et al. Broad-spectrum antiviral therapeutics. PLoS One 6, e22572, doi:10.1371/journal.pone.0022572 (2011)]), 또는 스플라이싱 조절(문헌[Wang, Y., Cheong, C. G., Hall, T. M. & Wang, Z. Engineering splicing factors with designed specificities. Nat Methods 6, 825-830, doi:10.1038/nmeth.1379 (2009)])을 포함하는, 추가적인 기능화를 가능하게 할 것이다.
Cas13a를 이용한 RNA 녹다운은 게놈-전체에 걸쳐 모아진(pooled) 녹다운 스크리닝, lncRNA 및 발생기 전사물 기능에 대한 조사, 대립 유전자-특이적 녹다운, 및 RNA 바이러스 치료제를 포함하는, 다수의 생물학적 맥락에서 RNA를 변동시키는 데 적용될 수 있다. 추가적으로, dCas13a 및 유도체는 RNA-단백질 상호 작용 연구, 살아있는 세포에서 전사물 추적, 및 RNA 수준에 기반한 세포의 표적화된 파괴를 위해 RNA 풀다운을 가능하게 하며, 이는 특정 세포 집단을 연구하거나 암세포를 죽이는 데 유용할 것이다. 출원인은 Cas13이 포유류 및 식물 세포에서 프로그래밍 가능한 녹다운 및 RNA 결합 모두를 위한 견고한 플랫폼임을 보여주었으며, 이 플랫폼은 다른 진핵 생물으로도 확장될 수 있다. 창조적인 설계 제작 접근과 결합된 CRISPR-Cas13은 핵산 기반 진단 및 치료제를 위한 강력한 플랫폼이 될 것이며 트랜스크립톰 연구에 혁명을 불러올 수 있다.
실시예 23: 아폽토시스를 위한 분할 설계
특정 세포 유형의 역할을 연구하기 위한 기초 생물학 적용 또는 암 또는 노화 세포 청소와 같은 치료적 적용을 위해, 전사적 특징 또는 특정 유전자 발현에 기반하여 세포를 손실시키거나 사멸시키는 것이 종종 바람직하다(문헌[Baker, D.J., Childs, B.G., Durik, M., Wijers, M.E., Sieben, C.J., Zhong, J., Saltness, R.A., Jeganathan, K.B., Verzosa, G.C., Pezeshki, A., et al. (2016). Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan. Nature 530, 184-189]). 이 표적화된 세포 사멸은 분할된 아폽토시스 도메인을 Cas13 단백질에 융합시킴으로써 달성될 수 있는데, 이는 전사물에 결합 즉시 재구성되어, 표적화된 유전자 또는 유전자 세트를 특이적으로 발현하는 세포의 사멸을 유도한다. 특정 구현예에서, 아폽토시스 도메인은 분할된 카스파제 3일 수 있다(문헌[Chelur, D.S., and Chalfie, M. (2007). Targeted cell killing by reconstituted caspases. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 2283-2288]). 다른 가능성으로는 Cas13 결합을 통해 2 개의 카스파제 8(문헌[Pajvani, U.B., Trujillo, M.E., Combs, T.P., Iyengar, P., Jelicks, L., Roth, K.A., Kitsis, R.N., and Scherer, P.E. (2005). Fat apoptosis through targeted activation of caspase 8: a new mouse model of inducible and reversible lipoatrophy. Nat. Med. 11, 797-803]) 또는 카스파제 9(문헌[Straathof, K.C., Pule, M.A., Yotnda, P., Dotti, G., Vanin, E.F., Brenner, M.K., Heslop, H.E., Spencer, D.M., and Rooney, C.M. (2005). An inducible caspase 9 safety switch for T-cell therapy. Blood 105, 4247-4254]) 이펙터를 근접하게 가져오는 것과 같은, 카스파제의 결집이다. 전사물 상의 Cas13 결합을 통해 분할된 TEV를 재구성하는 것도 또한 가능하다(문헌[Gray, D.C., Mahrus, S., and Wells, J.A. (2010). Activation of specific apoptotic caspases with an engineered small-molecule-activated protease. Cell 142, 637-646]). 이 분할된 TEV는 발광 및 형광 판독을 포함하는, 다양한 판독에서 사용될 수 있다(문헌[Wehr, M.C., Laage, R., Bolz, U., Fischer, T.M., Grunewald, S., Scheek, S., Bach, A., Nave, K.-A., and Rossner, M.J. (2006). Monitoring regulated protein-protein interactions using split TEV. Nat. Methods 3, 985-993]). 일 구현예는, 세포 사멸을 초래하는, 변형된 프로-카스파제 3 또는 프로-카스파제 7을 절단하기 위한 이 분할된 TEV의 재구성을 수반한다(문헌[Gray, D.C., Mahrus, S., and Wells, J.A. (2010). Activation of specific apoptotic caspases with an engineered small-molecule-activated protease. Cell 142, 637-646]).
실시예 24: 이미징을 위한 분할 설계
현재의 출원에서 언급되었지만, 2 개의 Cas13 단백질이 전사물에 결합한 즉시 분할된 형광단의 재구성을 통한 감소된 배경을 갖는 이미징을 위해 추가적인 분할된-형광단 작제물을 설계하였다. 이들 분할된 단백질로는 iSplit(문헌[Filonov, G.S., and Verkhusha, V.V. (2013). A near-infrared BiFC reporter for in vivo imaging of protein-protein interactions. Chem. Biol. 20, 1078-1086.)], Split Venus(문헌[Wu, B., Chen, J., and Singer, R.H. (2014). Background free imaging of single mRNAs in live cells using split fluorescent proteins. Sci. Rep. 4, 3615.]), 및 Split 초양성 GFP(문헌[Blakeley, B.D., Chapman, A.M., and McNaughton, B.R. (2012). Split-superpositive GFP reassembly is a fast, efficient, and robust method for detecting protein-protein interactions in vivo. Mol. Biosyst. 8, 2036-2040.])가 포함된다.
실시예 25: 추가적인 전사 활성, 루시페라제를 위한 분할 설계
Cas13 단백질에 의해 구성될 수 있는 추가적인 가능한 분할 융합은 발광 이미징을 위한 루시페라제(문헌[Kim, S.B., Ozawa, T., Watanabe, S., and Umezawa, Y. (2004). High-throughput sensing and noninvasive imaging of protein nuclear transport by using reconstitution of split Renilla luciferase. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 11542-11547]) 또는 RNA-감지 기반 방식의 유전자 회로의 유전자 발현을 구동하기 위한 분할된 전사 인자를 포함할 수 있다. 가능한 분할된 전사 인자로는, 분할된-유비퀴틴-LexA 시스템과 같은 분할된-유비퀴틴 기반 시스템(문헌[Petschnigg, J., Groisman, B., Kotlyar, M., Taipale, M., Zheng, Y., Kurat, C.F., Sayad, A., Sierra, J.R., Mattiazzi Usaj, M., Snider, J., et al. (2014). The mammalian-membrane two-hybrid assay (MaMTH) for probing membrane-protein interactions in human cells. Nat. Methods 11, 585-592])이 포함된다.
실시예 26: C2c2 오솔로그의 동정
하기 C2c2 오솔로그는 포유류 세포에서 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다.
상기 종의 단백질 서열을 하기 표에 나열한다.
실시예 27: C2c2 오솔로그의 동정
특정 Cas13b 오솔로그는 놀랍게도 C2c2와 유사하다. 도 54는 C2c2 및 Cas13b 단백질의 트리 정렬을 제공한다. 다음의 Cas13b 단백질은 포유류 세포에서 발현을 위해 코돈 최적화될 수 있다.
실시예 28: C2c2 오솔로그의 식별
C2c2 효소의 특성을 개선하거나 달리 변경하기 위해, 아미노산의 변형을 수행한다. 변화 가능한 잔기는 보존된 하전 잔기의 서브세트로 확인된다. 이들 잔기는 도 53의 정렬에서 80% 초과의 보존을 갖는다. 이들은 비하전 잔기(전형적으로 알라닌)로 변화될 수 있다. 표시된 잔기 중 하나 이상이 돌연변이되었다. 아미노산 잔기 넘버링은 도 66(맨윗 줄)에 표시된 컨센서스 넘버링에 상응하며, 아래에 재현되었다:
MWISIKTLIHHLGVLFFCDMGNLFGHMKIXKVXHEKRXAKXKXPXKKVXVKRKYSGGGLLLNYNENPNKNKSXENILIKKKISFXXLKSSSKLBKTINKPDXKKXXXXLQWFLSEIVKKINRRNGLVLSDMLSVDKRXXEKIXEKXXXLKYFXXXXXXLXKLHQEKPSKKLFNLKDLKEXEEXVLFLKXKFKNEJXYXXENDXXKDIEKILXEXLRXGFXPADKKLKXKFLIEXXWGIFSXXXKLEPYXIQEDFXEXYIEDFKKLNKXKXJXKSIENNKIVSQKSSDSQIYEXGKNIIMSXXGXIESIIEXXSKRKXXLDKYATXXLXEKLLLDEXLXIEQXXXNXXEXXDKLASNLKXYXLXKLYFYVKXDKKKSXXEVAKAAVSAAKDXNKDKYQNEVWXXHEXRKEDKRDFIXXXLEIXXIXKXIXKVKXXIXKXAXXEAXEXIKXXNIGKYRXXJDLFELEEDNXLNQFXXFVNIEXXKFFXHYXPNXIKRIXXXKNDAXAXXLKXGELXKKVEKQLKNGALSIYXIXXGKAVYYXXFAMKXLADSDYWTXKDLEXIKISEAFLRKFIGACSFAYXSLXAXNILQPECXXDILGKGDLLXKATVNIXQXXSEHIMYLGKLRHNDIDXLLXFKEDIAKSTXKXGXGXLXKNLIQFFGGESTWDNKIFXAAYXXXLXGXXENEDFLGWALRGAIXSIRNEXFHSFKIKKHXXXXFLNIXNFIXXKLXEFEKXXXXKXKEXXHXXXTSYXXXLIKKLFXNEXXKXXLPXXIKELKLKSSGVXMYYSXDDLKKLLENIYFKFSLLKIXEENXEXAXFVPSFKKVYXRADGVKGFDYQXXXTRXHAYXLKLXPFFDXEEXEXEAFNARYYLLKXIYYNXILEXXXEENEXXXXFLPKFXXXNNXAFREXXNFXADXIEXYYKRLQINKKKGAXKXXKKKXQXKVXNXYNRKXFAYAFENIRXMXFXETPREYMQYIQSEYXIENNGKEXKKSXXENKRNKDXFXHXEKFLLQVFIKGFDXYJDXRXENFXFILXPEPQNGTKEYLYEEXXAILDEXXXXNXLRXXXITXNKXLKLXEFJPEXKSDIKVXPXLVEEIYDYIKKIKINKIKKDXEJAFWQDAALYLFCEKLLDARHLSXXLRXELIKYKQFXKDIKXRAXXNGNXINHSXXXNXXXVXECTDELEIIELXLLLNDRXSNDFKDYFDDEEAXIXXXXLCRIIFYAEYLXKYXKEEDDXXXXAEXXXFXALEPFCQSDTAREAKNDIYXDGGXNPELRVPILNRGIXQXKKIYGTEXXLEKLFDKNXLFBIDGXBIPXFKVSEEXAIIXEXXEKKXEIXEXSQYKXRGELHTEWXQKAREIEEYXXXXXKXKFXKKPQNXXFEKRFIEKHGQEYKKAXXXIXEYXWLKNKVEXNXLNELHELLIXLLGRLIGYSALFERDLQYFXNGFHYXCLNNDXEKLAXYXNJSXVXXKNRXIXKAXLYQIFAMYXXGLPFYSKDXDXXXAXXSGXKXSXXXXSXXTAGXGKKJKKFKKYSXYXLIXXXLXXDXSKKLDXYLAGLELFENXEEHDNXTEXIRNYIAHFNYLXXAGXXADXSLLELYNXLRDRLXSYDRKLKNAVSKSLIDILDRHGMILKFKFKXXXKLIGXNDXXXXAIKHKDXARITIXEPNGVTSEXFTYKLLXXVAALEIXSLEPKKIRHLXXXARLLYYPKXATAQSQPDQKXXXKXKKKNIXKGYIERXTNQVSSNQEEYCELVKKLLETXXLXXLAVXGVAXBIGLHISRLRRIREDAIIVGRRYRFRVEIYVPPKSNTSKLNAADLVRID
MUSCLE 정렬(www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/)을 사용하여 컨센서스 서열에 기반한 돌연변이된 잔기. Lsh의 상응하는 위치가 표시된다.
상기 아미노산 잔기 중 임의의 하나 이상을 단독으로 또는 조합하여 갖는, 돌연변이된 C2c2 단백질은 변형된 특이성 및/또는 활성 및/또는 대안적인 PAM 인식을 나타낸다.
실시예 29:
Lw2 및 FSL의 정렬(도 67)에 기반하여, 다음의 보존된 잔기가 확인되었다:
표시된 잔기 중 하나 이상이 돌연변이되었다. 아미노산 잔기 넘버링은 도 67(동일한 잔기를 나타내는 2 개의 오솔로그 정렬된 서열 사이의 중앙선)에 표시된 넘버링에 상응한다.
Lew2 C2c2 및 Lib C2c2간에 동일한, 도 67에 표시된 잔기 중 임의의 하나 이상을 C2c2 단백질 활성, 특이성 또는 기능성을 변형하기 위해 돌연변이한다. 돌연변이된 상기 아미노산 잔기 중 임의의 하나 이상을 단독으로 또는 조합하여 갖는 C2c2 단백질은 변경된 특이성 및/또는 활성 및/또는 대안적 PAM 인식을 나타낸다.
실시예 30: 방법
활성 스크리닝 및 재조합 발현을 위한 오솔로그 클로닝
15 개의 Cas13a 오솔로그(Genscript, Jiangsu, China)(보충 표 9)의 인간 코돈-최적화된 버전을 합성하고 pLac 프로모터에 의한 발현 하에 이들을 pACYC184로 클로닝하였다. Cas13a 발현 카세트에 인접하여, 베타-락타마제 표적화 또는 비-표적화 스페이서 측면에 배치되는 오솔로그의 상응하는 직접 반복을 클로닝하였다. 스페이서 어레이 발현은 J23119 프로모터에 의해 구동하였다.
LwaCas13a의 정제를 위해, 포유류 코돈-최적화된 LwaCas13a 서열을 단백질 정제용 박테리아 발현 벡터에 클로닝하였다(6x His/Twin Strep SUMO, Ilya Finkelstein(텍사스 대학교 오스틴 캠퍼스)로부터 선물로 받은 pET-기반 발현 벡터).
이 연구에서 사용된 모든 플라스미드는 보충 표 1에 나열되어 있다.
Cas13a 활성 및 PFS 동일성을 위한 박테리아 생체내 시험
스크린은 다음과 같이 기능한다. 간략하게, Cas13a는 무작위 PFS 뉴클레오티드가 측면에 배치된 β-락타마제 전사물 상의 5' 범위의 서열을 표적화하도록 프로그래밍한다. Cas13a 절단 활성은 암피실린 선택 하에 박테리아의 사멸을 초래하고, 그 다음에 PFS 손실은 차세대 시퀀싱으로 분석한다. 오솔로그 사이의 양적 비교를 가능하게 하기 위해, pJ23119 작은 RNA 프로모터의 발현 하에 있는 근처의 단일-스페이서 CRISPR 어레이와 함께 pLac 프로모터 하에 각각의 Cas13a 오솔로그를 클로닝하였다.
Cas13a 오솔로그의 활성을 시험하기 위해, 표적화 또는 비-표적화 가이드를 갖는 90 ng의 오솔로그 발현 플라스미드를 이전에 기재된 베타-락타마제 표적 플라스미드 25 ng과 함께 NovaBlue Singles 수용성 세포(Millipore) 내로 동시-형질전환하였다. 형질전환 후, 세포를 희석하고, 100 μg/uL 암피실린 및 25 μg/uL 클로람페니콜로 보충된 LB-한천에 플레이팅하고, 하룻밤 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 다음날 형질전환체를 계수하였다.
LshCas13a 및 LwaCas13a PFS 동일성의 결정을 위해, 표적화 또는 비-표적화 스페이서를 갖는 40 ng의 오솔로그 발현 플라스미드를 생물학적 복제 당 2 분취물의 NovaBlue GigaSingles(Millipore) 내로 25 ng의 베타-락타마제 표적 플라스미드와 함께 동시-형질전환하였다. 2 개의 생물학적 복제를 수행하였다. 형질전환 후, 세포를 1 시간 동안 생물학적 복제 당 500 uL의 SOC(ThermoFisher Scientific)에서 37℃에서 회수하고, 100 μg/uL 암피실린 및 25 μg/uL의 클로람페니콜로 보충된 LB-한천(Affymetrix)을 갖는 바이오-분석 플레이트(코닝)에 플레이팅하고, 37℃에서 16 시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음 콜로니를 스크래핑으로 수확하고 다음의 시퀀싱을 위해 플라스미드 DNA를 NuceloBond Xtra EF(Macherey-Nagel)로 정제하였다.
수확된 플라스미드 샘플을 NEBNext High Fidelity 2X 마스터 믹스(New England Biosciences)를 사용하여 바코딩 프라이머 및 Illumina 유동 세포 핸들을 갖는 PCR에 의한 차세대 시퀀싱을 위해 제조하였다. PCR 생산물을 모으고 Zymoclean 겔 추출 키트(Zymo Research)를 사용하여 겔 추출하고 MiSeq 차세대 시퀀싱 기기(Illumina)를 사용하여 시퀀싱하였다.
PFS의 컴퓨터 분석
LshCas13a 및 LwaCas13a PFS 스크리닝 라이브러리의 차세대 시퀀싱으로부터, 무작위 PFS 영역 측면에 배치된 서열을 정렬하고 PFS 동일성을 추출하였다. 서열 적용 범위를 향상시키기 위해 PFS 동일성을 4 뉴클레오티드로 접고, 각각의 고유 PFS의 빈도를 계수하고, 가짜수(pseudocount)를 1로 하여 각각의 라이브러리에 대한 총 판독 수로 정규화하였다. 도 1e에 표시된 각각의 분포의 강화는 -log2(f조건/fpACYC184)로서 pACYC184 대조군(단백질 없음/가이드 유전자좌)에 대해 계산하였으며, 여기서 f조건은 실험 조건에서의 PFS 동일성의 빈도이며 fpACYC184는 pACYC184 대조군에서의 PFS 동일성의 빈도이다. 보존된 PFS 모티프의 분석을 위해, 다음과 같이 각각의 조건에서의 비-표적화 대조군을 사용하여 최고 손실된 PFS 동일성을 계산하였다: -log2(fi,표적화/fi,비-표적화) 여기서 fi,표적화는 표적화 스페이스를 갖는 조건 i에서의 PFS 동일성의 빈도이고 fi,비-표적화는 비-표적화 스페이서를 갖는 조건 i에서의 PFS 동일성의 빈도이다. 확장된 데이터 도 1d, 1e에 나타난 바와 같이 PFS 모티프를 임계값의 범위에 대해 분석하였다.
LwaCas13a의 정제
LwaCas13a의 정제는 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다. 간랸하게, LwaCas13a 박테리아 발현 벡터를 Rosetta 2(DE3)pLysS singles 수용성 세포(Millipore) 내로 형질전환시키고 Terrific Broth 4 성장 배지(TB) 4 L를 출발 배양으로 씨딩하였다. 세포 단백질 발현을 IPTG로 유도하고 하룻밤 동안 성장시킨 후, 세포 펠렛을 수확하여 -80℃에서 보관하였다. 세포 용해 후, 단백질은 StrepTactin Sepharose 수지(GE)를 사용하여 결합시키고 단백질은 SUMO 프로테아제 분해(ThermoFisher)로 용출시켰다. 단백질은 HiTrap SP HP 양이온 교환 컬럼(GE Healthcare Life Sciences)을 사용하여 양이온 교환하고 이어서 Superdex 200 Increase 10/300 GL 컬럼(GE Healthcare Life Sciences)을 사용하여 겔 여과하며, 두 단계 모두 FPLC(AKTA PURE, GE Healthcare Life Sciences)를 통하여 추가 정제하였다. LwaCas13a 단백질을 함유하는 최종 분획을 모으고 저장 완충액(600 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 5% 글리세롤, 2 mM DTT)에 농축시키고, 분취물을 장기 저장을 위해 -80℃에서 동결시켰다.
포유류 발현 작제물 클로닝
인간 코돈 최적화된 Cas13a 유전자를 합성하고(Genscript) EF1-α 프로모터에 의한 발현 하에 핵 방출 서열(NES) 또는 핵 국소화 서열(NLS)을 갖는 포유류 발현 벡터 내로 클로닝 하였다. 단량체-수퍼-폴드 GFP(msfGFP)에 의해 부여된 안정성 때문에, msfGFP를 LwaCas13a의 C 말단에 융합시켰다. LwaCas13a의 전장 직접-반복은 U6 프로모터 하에서의 발현으로 가이드 백본 플라스미드를 클로닝하는 데 사용하였다. 촉매적으로 비활성인 LwaCas13a-msfGFP 작제물(데드 Cas13a 또는 dCas13a)은 2 개의 HEPN 도메인에 R474A 및 R1046A 돌연변이를 도입함으로써 생성하였다. LwaCas13a-msfGFP의 약물-선택성 버전은 2 A 펩티드 서열을 통해 C-말단에 연결된 블라스티시딘 선택 마커를 갖는 백본에 단백질을 클로닝함으로써 생성하였다. dCas13a-msfGFP 작제물의 음성 피드백 버전은 dCas13a-msfGFP의 프로모터 업스트림에 징크-핑거 결합 부위를 클로닝하고 징크 핑거 및 KRAB 도메인을 C-말단에 융합시킴으로써 생성하였다.
리포터 루시페라제 작제물은 CMV에 의한 발현 하에 사이프리디니아 루시페라제(Cluc) 및 EF1-α에 의한 발현 하에 가우시아 루시페라제(Gluc)를 둘 모두 단일 벡터 상에 클로닝함으로써 생성하였다. 단일 벡터 상의 두 루시페라제 모두의 발현은 하나의 루시페라제가 다른 루시페라제의 녹다운의 정규화를 위한 용량 대조군으로서 작용할 수 있도록 하여, 형질감염 조건으로 인한 변동을 제어한다.
도 1g의 내인성 녹다운 실험에 있어서, RNAxs siRNA 설계 알고리즘을 사용하여 가이드 및 shRNA를 설계하였다. shRNA를 설계하기 위해 예측 툴을 사용하였고 shRNA 및 Cas13a 녹다운 사이의 비교를 가능하게 하기 위하여 가이드는 동일한 위치에서 설계하였다.
벼 액틴 프로모터(pOsActin)를 pANIC6A로부터 PCR 증폭시키고 각각의 Cas13a를 기존 Cas13a 작제물로부터 PCR 증폭시켰다. 이들 단편을 기존의 식물 발현 플라스미드 내에 결찰하여 각각의 Cas13a가 벼 액틴 프로모터에 의해 구동되고 전사가 HSP 터미네이터에 의해 종결되도록 하였다. Cas13a gRNA는 벼 U6 프로모터(pOsU6)로부터 발현하였다. gRNA 표적 서열은 각각의 유전자에 대해 동일했으나 스캐폴드 서열은 Cas13a-특이적이었다. 이들 실험에서 글리포세이트-기반 제초제의 표적인 5-에놀피루빌쉬키메이트-3-포스페이트 신타제(OsEPSPS) 유전자 및, 적절한 식물 성장을 위해 필요한 벼 히드록시신나모일-CoA 쉬키메이트/퀴네이트 히드록시신나모일 트랜스페라제(OsHCT) 유전자를 표적화했다.
이 연구에서 사용된 모든 가이드 및 shRNA는 보충 표 2 및 3에 나열되어 있다.
원형질체 제조
녹색 벼 원형질체(Oryza sativa L. ssp. japonica var. Nipponbare)를 약간 변형하여 이전에 기재된 바와 같이 제조하였다. 모종을 14 일 동안 성장시키고, 원형질체를 0.1 M CaCl2를 함유하는 MMG 완충액에 재현탁시켰다. WI 완충액 대용으로뿐만 아니라 새로운 40% PEG 완충액을 제조하기 위해 이 변형된 MMG 완충액을 사용하였다. 마지막으로, 원형질체는 형질전환 후 48 시간 동안 전체 암흑 상태에서 유지하였다. 다른 모든 조건은 이전에 기재된 바와 같았다.
시험관내 반응 및 부수적 활성을 위한 핵산 표적 및 crRNA 제조
핵산 표적의 생성을 위해, 올리고뉴클레오티드를 KAPA Hifi Hot Start(Kapa Biosystems)로 PCR 증폭시켰다. dsDNA 앰플리콘을 겔 추출하고 MinElute 겔 추출 키트(Qiagen)를 사용하여 정제하였다. 초래된 정제 dsDNA는 HiScribe T7 Quick High Yield RNA 합성 키트(New England Biolabs)를 사용하여 30℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션을 통해 전사시켰다. 전사된 RNA는 MEGAclear Transciption Clean-up 키트(Thermo Fisher)를 사용하여 정제하였다. 이 연구에서 사용 된 모든 RNA 표적은 보충 표 4 및 6에 나열되어 있다.
crRNA를 생성하기 위해, 올리고뉴클레오티드를 추가적인 5' T7 프로모터 서열을 갖는 DNA(Integrated DNA Technologies)로서 주문하였다. crRNA 주형 DNA를 T7 프라이머(최종 농도 10 μM)로 어닐링시킨 후 HiScribe T7 Quick High Yield RNA 합성 키트(New England Biolabs)로 37℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하여 전사시켰다. 초래된 전사 crRNA를, 추가적인 1.8x 비율의 이소프로판올(Sigma)로 보충되고, 2x 비율의 비드 대 반응물 부피를 사용하여, RNAXP 클린 비드(Beckman Coulter)로 정제하였다. 시험관내 실험 연구에 사용된 crRNA 작제물은 보충 표 5에 나열되어 있으며 부수적 검출에 사용된 crRNA 작제물은 보충 표 6에 나열되어 있다.
LwaCas13a 절단 및 부수적 활성 검출
LwaCas13a의 생화학적 특징 확인을 위해, 이전에 기재된 바와 같이 분석을 수행하였다. 간략하게, 달리 표시되지 않는 한, 160 nM의 말단-표지된 ssRNA 표적, 200 nM의 정제된 LwaCas13a, 및 100 nM crRNA로 뉴클레아제 분석을 수행하였다. 모든 분석은 뉴클레아제 분석 완충액(40 mM Tris-HCl, 60 mM NaCl, 6 mM MgCl2, pH 7.3)에서 수행하였다. 어레이 프로세싱을 위해, 100 ng의 시험관내 전사된 어레이를 뉴클레아제 분석마다 사용하였다. 반응은 37℃에서 1 시간 동안 진행하도록 두었고(달리 표시하지 않는 한), 프로테이나제 완충액(프로테이나제 K, 60 mM EDTA, 및 4 M 우레아)으로 37℃에서 15 분 동안 소멸시켰다. 그 다음 95℃에서 5 분 동안 4.5 M 우레아 변성 완충액으로 반응물을 변성시켰다. 샘플을 45℃에서 10% PAGE TBE-우레아(Invitrogen) 상의 변성 겔 전기영동 실행에 의해 분석하였다. 겔은 Odyssey 스캐너(LI-COR Biosciences)를 사용하여 이미징하였다.
부수적 활성 검출 분석은 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다. 간략하게, 반응은, 달리 표시되지 않는 한, 뉴클레아제 분석 완충액(40 mM Tris-HCl, 60 mM NaCl, 6 mM MgCl2, pH 7.3)내에 45 nM 정제된 LwCas13a, 22.5 nM crRNA, 125 nM 소광된 형광 RNA 리포터(알엔아제 Alert v2, Thermo Scientific), 2 μL 쥐 알엔아제 저해제(New England Biolabs), 100 ng의 배경 총 인간 RNA(HEK293FT 배양으로부터 정제), 및 가변하는 양의 입력 핵산 표적으로 구성되었다. 반응은 매 5 분마다 형광 동력학이 측정되는 형광 플레이트 리더(BioTek) 상에서 37℃에서 1 내지 3 시간 동안(달리 표시되지 않는 한) 진행되도록 두었다.
RNA 추출 및 qRT-PCR
트리졸 및 첨부 프로토콜을 사용하여 48 시간의 인큐베이션 후 전체 RNA를 단리하였다. SuperScript III Plantinum SYBR Green One-Step qRT-PCR 키트(Invitrogen)에서 첨부된 프로토콜을 사용하여 총 RNA 중 1 나노그램을 사용하였다. 모든 샘플은 LightCycler 480 Instrument(Roche) 상에서 384-웰 포맷으로 3 개의 생물학적 반복실험에 대한 기술적 3 회로 실행하였다. 모든 PCR 프라이머는 용융 곡선 분석에 기반하여 특이적인 것으로 인증되었고 다음과 같다: OsEPSPS (Os06g04280), 5' - TTG CCA TGA CCC TTG CCG TTG TTG - 3' 및 5' - TGA TGA TGC AGT AGT CAG GAC CTT - 3'; OsHCT (Os11g07960), 5' - CAA GTT TGT GTA CCC GAG GAT TTG - 3' 및 5' - AGC TAG TCC CAA TAA ATA TGC GCT - 3'; OsEF1a (Os03g08020), 5' - CTG TAG TCG TTG GCT GTG GT - 3' 및 5' - CAG CGT TCC CCA AGA AGA GT - 3'. OsEF1a에 대한 프라이머는 이전에 기재되었다. 모든 데이터는 EF1a의 발현에 비례하여 각각의 샘플을 이용한 평균±표준 오차로 나타난다.
타일링 가이드 스크린의 클로닝
타일링 가이드 스크린을 위하여, 스페이서는 전사물의 전체 길이를 완전히 커버하기 위하여 균일한 간격으로 mRNA 전사물을 표적화하도록 설계하였다. 스페이서는 IDT로부터 주문하여, 어닐링하고, Gluc 및 Cluc 스크린용 tRNAval 프로모터 또는 모든 내인성 스크린용 U6 프로모터를 갖는 LwaCas13a 가이드 발현 작제물 내로 골든-게이트 클로닝하였다.
LwaCas13a를 이용한 녹다운을 위한 포유류 세포 배양 및 형질감염
달리 언급되지 않는 한, 모든 포유류 세포 실험을 HEK293FT 라인(ATCC)에서 수행하였다. HEK293FT 세포를 10% 태아 소 혈청(VWR Seradigm) 및 1X 페니실린-스트렙토마이신(Thermo Fisher Scientific)으로 보충된, 고 글루코스, 소듐 피루베이트, 및 GlutaMAX(Thermo Fisher Scientific)를 갖는 Dulbecco's Modified Eagle 배지에서 배양하였다. 세포를 70% 미만의 컨플루언시(confluency)를 유지하기 위해 계대시켰다. A375(ATCC)를 포함하는 실험을 위해, 세포를 9% 태아 소 혈청(VWR Seradigm) 및 1X 페니실린-스트렙토마이신(Thermo Fisher Scientific)으로 보충된 RPMI 배지 1640(Thermo Fisher Scientific)에서 배양하였다.
내인성 유전자의 녹다운을 시험하기 위해, 달리 언급되지 않는 한, 웰당 150 ng의 LwaCas13a 플라스미드 및 250 ng의 가이드 플라스미드를 사용하여 리포펙타민 2000(Thermo Fisher Scientific) 형질감염을 수행하였다. 리포터 플라스미드의 녹다운 시험 실험은 웰당 12.5 ng 리포터 작제물로 보충하였다. 형질감염 16 시간 전에, 세포를 96-웰 플레이트에 약 20,000 세포/웰로 플레이팅하고, 하룻밤 동안 90% 컨플루언시로 성장하도록 두었다. 각각의 웰에 대해 플라스미드를 Opti-MEM® I 환원 혈청 배지(Thermo Fisher)와 조합하여 총 25 uL로 하고, 개별적으로 0.5 uL의 리포펙타민 2000을 24.5 uL의 Opti-MEM과 조합하였다. 그 다음 플라스미드 및 리포펙타민 용액을 조합하고, 5 분 동안 인큐베이션하고, 파쇄를 막기 위해 천천히 세포 상에 피펫팅하였다.
녹색 벼 원형질체의 형질전환
녹색 벼 실험을 위해, 각각의 Cas13a를 발현하는 플라스미드 및 상응하는 gRNA를 등몰비로 혼합하여 총 30 mg의 DNA를 사용하여 형질전환당 총 200,000 개의 원형질체를 형질전환시켰다.
루시페라제 활성의 측정
달리 언급되지 않는 한, 형질감염 후 48 시간에 분비된 루시페라제를 함유하는 배지를 수확하였다. 배지를 PBS로 1:5로 희석한 다음 주입 프로토콜로 Biotek Synergy 4 플레이트 판독기 상에서 NEB 사이프리디니아 및 가우시아 루시페라제 측정 키트를 사용하여 루시페라제 활성을 측정하였다. 모든 반복실험은 생물학적 반복실험으로 수행하였다.
총 RNA의 수확 및 정량적 PCR
형질감염 48 시간 후, 세포 수확 및 cDNA 생성을 위한 역전사는 시판되는 Cells-to-Ct 키트(Thermo Fisher Scientific)의 이전에 기재된 변형92을 사용하여 수행하였다. 그 다음 전사물 발현은 Fast Advanced Master Mix(Thermo Fisher Scientific) 및 GAPDH 대조군 프로브(Thermo Fisher Scientific)를 갖는 TaqMan qPCR 프로브(Thermo Fisher Scientific, 보충 표 7 및 8)를 사용하여 qPCR로 정량화하였다. 모든 qPCR 반응은 384-웰 포맷에서 4 기술적 반복실험으로 5 uL 반응에서 수행하였고, LightCycler 480 Instrument II(Roche)를 사용하여 판독하였다. 다중화된 표적화 반응의 경우, 상이한 표적의 판독은 별도의 웰에서 수행하였다.
발현 수준은 표적 Ct 값으로부터 하우스키핑 대조군(GAPDH) Ct 값을 빼는 것으로 계산하여 총 입력에 대해 정규화하고, ΔCt 수준을 얻었다. 상대적 전사물 존재량은 2^(-ΔCt)로 계산하였다. 모든 반복실험은 생물학적 반복실험으로 수행하였다.
표적 접근 가능성에 대한 컴퓨터 분석
먼저 표적 접근 가능성을 분석하기 위해, 타일링 스크린으로부터 상위 가이드를 분석하였고, 접근 가능성의 영역이 있다면 그 영역에서 다수의 가이드가 매우 활성있을 것임을 기대할 수 있다는 가정 하에, 그들이 예상보다 서로 가깝게 그룹화하였는지 여부를 결정하였다. Gluc 타일링 스크린에 대해서는 상위 20% 성능 가이드 및 Cluc, KRAS 및 PPIB 타일링 스크린에 대해서는 상위 30% 성능 가이드로 상위 가이드를 정의하였다. 무작위로 시뮬레이션된 10,000 개의 가이드 위치에 의하여 가이드 간 쌍 거리에 대한 귀무 확률 분포를 생성한 다음 실험적으로 결정된 상위 가이드 쌍 거리를 비교하였다.
접근 가능성은 Vienna RNA 소프트웨어 세트93에서 RNApl 폴드 알고리즘을 사용하여 예측하였다. 70 nt의 기본 윈도우 크기를 사용하였고 쌍이 되지 않은 표적 영역의 확률은 표적 영역에 걸친 28 개의 단일-뉴클레오티드 쌍 없는 확률의 평균으로 계산하였다. 이들 접근 가능성 곡선을 스무딩하고 4 개 전사물 각각에 걸쳐 스무딩된 녹다운 곡선과 비교하였고, 두 인자 간의 상관 관계를 피어슨 상관 계수를 사용하여 계산하였다. 이들 두 인자의 확률 공간은 또한 두 변수에 걸쳐 2D 커널 밀도 추정을 수행하여 시각화하였다.
RNA 시퀀싱 및 분석
LwaCas13a 녹다운의 특이성을 결정하기 위해, LwaCas13a 및 shRNA 작제물 모두를 포함하는 녹다운 실험 유래의 mRNA상에서 RNA 시퀀싱을 수행하였다. 총 RNA는 Qiagen RNeasy Plus Mini mit를 사용하여 48 시간 후 형질감염 실험으로부터 제조하였다. 그 다음 NEBNext® Poly(A) mRNA 자기 단리 모듈을 사용하여 mRNA를 추출하고 Illumina®를 위한 NEBNext® Ultra™ 방향성 RNA 라이브러리 프렙 키트를 사용하여 RNA-seq 라이브러리를 제조하였다. RNA-시퀀싱 라이브러리는 Illumina NextSeq 장비 상에서 라이브러리당 적어도 10 M 리드(read)로 시퀀싱하였다.
RefSeq GRCh38 어셈블리를 사용하여 인덱스를 생성하고 디폴트 파라미터94를 사용하여 Bowtie 및 RSEM v1.2.31을 사용하여 리드를 정렬하고 정량하였다. 발현 수를 위해 백만 당 전사물(TPM) 값을 사용하였고 log2(TPM+1)를 취하여 로그-공간으로 변환하였다.
차등적으로 발현된 유전자를 찾기 위해, 3 개의 표적화 반복실험 대 3 개의 비-표적화 반복실험에 대하여 스튜던트 t-검정을 수행하였다. 통계 분석은 6 개의 반복실험 중 적어도 2 개에서 log2(TPM+1) 값이 2.5 초과인 유전자에 대해서만 수행하였다. 차등적 발현이 2보다 크거나 0.75보다 작고, 0.10 미만의 거짓 발견율인 유전자만이 유의미하게 차등적으로 발현되는 것으로 보고되었다.
반복실험과 반복실험의 평균 사이의 교차 상관은 켄달의 타우 계수를 사용하여 수행하였다. shRNA 대 Cas13a 라이브러리의 변동은 6 개의 반복실험(3 개의 표적화 및 3 개의 비-표적화 반복실험)에 걸친 유전자 발현에 대한 표준 편차의 분포를 고려하여 분석하고 바이올린 플롯으로 플로팅하였다.
포유류 세포에서의 부수적 활성에 대한 LwaCas13a 평가
LwaCas13a는 임의의 잠재적인 성장 제한 효과에 대해 시험함으로써 부수적 활성에 대해 추가적으로 평가하였다. 포유류 세포를 루시퍼라제 리포터 표적, 가이드 플라스미드, 및 LwaCas13a 또는 약물-선택성 LwaCas13a중 하나로 형질감염시켰다. 형질감염 24 시간 후, 세포를 새 배지로 1:5 분할하고 약물-선택성 LwaCas13a 샘플을 10 ug/mL 블라스티시딘 에스(Thermo Fisher Scientific)로 보충하였다. 추가 성장 48 시간 후, 루시페라제 녹다운, 다중모드 플레이트 판독기(Biotek Neo2) 상의 GFP 형광 측정을 통한 LwaCas13a 발현 유지, 및 CellTiter-Glo® 발광 세포 생존력 분석(Promega)에 의한 세포 성장에 대하여 세포를 분석하였다.
RIP를 이용한 dCas13a 결합 정량화
RNA 면역침강 실험을 위해, HEK293FT 세포를 6-웰 플레이트에 플레이팅하고, 리포터 표적화를 수반하는 조건의 경우 추가적인 150 ng의 리포터 플라스미드와 함께, 1.3 ug의 dCas13a 발현 플라스미드 및 1.7 ug의 가이드 플라스미드로 형질감염시켰다. 형질감염 48 시간 후, 세포를 얼음-냉각시킨 PBS(Sigma)로 2 회 세척하고 실온에서 15 분 동안 PBS 중의 0.2% 파라포름알데히드(Electron Microscopy Sciences)로 고정시켰다. 고정 후, 파라포름알데히드를 제거하고, PBS 중의 125 mM 글리신을 첨가하여 가교 결합을 소멸시키고, 세포를 10 분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 얼음-냉각시킨 PBS로 다시 2 회 세척하고, 스크래핑하여 수확하고, 세포 현탁액을 800g에서 4 분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화하였다. 상청액을 제거하고 펠렛을 용해 전에 PBS로 세척하였다. 세포를 cOmplete™ ULTRA Tablets, EDTA-없음(Sigma) 및 리보뉴클레아제 저해제(Sigma R1158)로 보충된 1X RIPA 완충액(Cell Signaling) 200 uL로 용해시켰다. 세포를 얼음 위에서 10 분 동안 용해되도록 둔 다음 Bioruptor 초음파 분쇄기(Diagenode)상에서 저 강도에서 30 초 켜기/30 초 끄기 주기로 2 분 동안 초음파처리 하였다. 불용성 물질을 4C에서 16,000 g에서 10 분 동안 원심분리하여 펠렛화하고, 맑아진 용해물을 함유하는 상청액을 자성 비드를 이용하여 풀다운하기 위해 사용하였다.
항체를 자기 비드에 스플라이싱시키기 위해, 면역침강을 위한 Dynabeads® 단백질 A(Thermo Fisher Scientific) 샘플당 100 μL 를 자석을 적용하여 펠렛화하고, 상청액을 제거하였다. 비드를 200 μL의 세척 완충액(0.02% Tween-20(Sigma)으로 보충된 PBS)에 재현탁시키고 5 μg의 토끼 항-마우스 IgG(Sigma M7023)를 첨가하였다. 샘플을 회전기 상에서 실온에서 10 분 동안 인큐베이션하여 항체가 비드에 스플라이싱되도록 하였다. 인큐베이션 후, 비드를 자석을 통해 펠렛화하고, 상청액을 제거하고, 비드를 세척 완충액으로 2 회 세척하였다. 펠렛을 100 μL 세척 완충액에 재현탁하고 항-HA 항체(Thermo Fisher Scientific 26183) 또는 IgG 항체 대조군(Sigma I5381)의 스플라이싱을 위해 2 개의 50 μL 부피로 분할하였다. 각각의 항체에 대해 2.5 μg의 항체를 200 μL 세척 완충액과 함께 첨가하고 회전기 상에서 실온에서 10 분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 비드를 자석을 통해 펠렛화하고 세척 완충액으로 2 회 세척하고 리보뉴클레아제 저해제(Sigma R1158) 및 프로테아제 저해제 칵테일(Sigma P8340)을 포함하는 200 μL 1X RIPA에 재현탁하였다. 샘플 용해물 100 μL를 비드에 첨가하고 4℃에서 하룻밤 동안 회전시켰다.
샘플 용해물과 함께 인큐베이션 후, 비드를 펠렛화하고, 1X RIPA, 0.02% Tween-20으로 3 회 세척한 다음, 디엔아제 완충액(350 mM Tris-HCl [pH 6.5]; 50 mM MgCl2; 5 mM DTT)으로 세척하였다. 비드를 디엔아제 완충액에 재현탁시키고, TURBO 디엔아제(Life Technologies)를 0.08 유닛/μl의 최종 농도로 첨가하였다. 디엔아제를 회전기상에서 37℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 그 다음 0.1 유닛/μl의 최종 농도로 프로테이나제 K(New England Biosciences)를 첨가하여 단백질을 분해하고 37℃에서 추가 30 분 동안 회전하며 인큐베이션하였다. 변성 및 정제를 위해 우레아(Sigma)를 최종 농도 2.5 M로 첨가하고 샘플을 30 분 동안 인큐베이션하고, Direct-Zol RNA 미니프렙(Zymo Research)을 사용하여 RNA를 정제하였다. 정제된 RNA는 qScript Flex cDNA(Quantabio)를 사용하여 cDNA로 역전사하였고, 풀다운은 Fast Advanced Master Mix 및 TaqMan qPCR 프로브(보충 표 7 및 8)를 사용하여 qPCR로 정량되었다. 모든 qPCR 반응은 384-웰 포맷에서 4 회 기술적 반복실험으로 5 μL 반응으로 수행하였고, LightCycler 480 Instrument II를 사용하여 판독하였다. 강화는 매치되는 IgG 항체 대조군과 비교하여 샘플에 대하여 정량하였다.
LwaCas13a 및 LwaCas13a-NF의 전위 측정
HEK293FT 세포를 폴리-D-리신 커버슬립(Corning) 상의 24-웰 조직 배양 플레이트에 플레이팅하고 ACTB 이미징을 위한 dCas13a-NF 벡터 150 ng 및 300 ng의 가이드로 형질감염시켰다. 전위 실험을 위해서, 세포를 4% PFA로 고정시키고 48 시간 후에 0.2% Triton X-100으로 투과성을 높이고 DAPI(Vectashield)를 갖는 안티페이드 마운팅(antiface mounting) 매질을 사용하여 마운팅하였다. 공초점 현미경 관찰은 Andor Yokagawa Spinning disk Revolution WD 시스템을 갖는 Nikon Eclipse Ti1을 사용하여 수행하였다.
ACTB mRNA를 표적화하는 가이드를 갖는 dCas13a-NF-msfGFP의 핵 방출을 평균 세포질 및 핵 msfGFP 형광을 측정하고 표적화 및 비-표적화 조건 간의 많은 세포에 걸친 비율을 비교함으로써 분석하였다.
ACTB 전사물의 형광 인 시츄 혼성화(FISH)
HEK293FT 세포를 폴리-D-리신 커버슬립(코닝)상의 24-웰 조직 배양 플레이트에 플레이팅하고 ACTB를 이미징하기 위한 dCas13a-NF 벡터 75 ng 및 가이드 250 ng으로 형질감염시켰다. 48 시간 후, 세포를 4% PFA로 45 분 동안 고정시켰다. QuantiGene viewRNA ISH 세포 분석 키트(Affymetrix)는 세포 샘플 상에서 FISH를 수행하기 위해 사용하였으며 프로토콜은 제조업자에 의해 기재된 바대로 따랐다. FISH 절차를 완료한 후, 안티페이드 마운팅 매질(Vectashield)을 사용하여 커버슬립을 마운팅하였다. 공초점 현미경 관찰은 Andor Yokagawa Spinning disk Revolution WD 시스템을 갖는 Nikon Eclipse Ti1을 사용하여 수행하였다.
스트레스 과립에 대한 LwaCas13a 추적
HEK293FT 세포를 폴리-D-리신 커버슬립(코닝) 상의 24-웰 조직 배양 플레이트에 플레이팅하고 ACTB를 이미징하기 위한 dCas13a-NF 벡터 75 ng 및 250 ng 가이드로 형질감염시켰다. 스트레스 과립 실험을 위해, 세포를 고정시키고 투과성 높이기 전에 200 μM 소듐 아르세나이트를 1 시간 동안 적용하였다. G3BP1의 면역형광을 위해, 세포를 20% 염소 혈청으로 차단하고, 항-G3BP1 일차 항체(Abnova H00010146-B01P)로 실온에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 그 다음 세포를 Alexa 플루오르 594로 표지된 이차 항체와 함께 인큐베이션하고 DAPI(Vectashield)가 있는 안티페이드 마운팅 매질을 사용하여 마운팅하였다. 공초점 현미경 관찰은 Andor Yokagawa Spinning disk Revolution WD 시스템을 갖는 Nikon Eclipse Ti1을 사용하여 수행하였다.
스트레스 과립의 dCas13a-NF-msfGFP와의 공동-국소화는 피어슨 상관 계수를 사용한 세포당 평균 msfGFP 및 G3BP1 신호를 사용하여 계산하였다. 공동국소화 분석은 Coloc 2 플러그인을 사용하여 이미지 분석 소프트웨어 FIJI95에서 수행하였다.
라이브 이미징 실험을 위해, HEK293FT 세포를 96-웰 조직 배양 플레이트에 플레이팅하고 ACTB 이미징을 위한 150 ng dCas13a-NF 벡터, 300 ng의 가이드, 및 5 ng의 G3BP1-RFP 리포터로 형질감염하였다. 48 시간 후, 세포를 0 μM 또는 400 μM 소듐 아르세나이트를 겪게 하고 20x 물 대물렌즈를 갖는 회전 디스크 공초점 세팅을 사용하여 Opera Phenix™ 고 함량 스크리닝 시스템(PerkinElmer) 상에서 매 2 시간마다 매 15 분마다 이미징하였다. 세포를 50% CO2를 갖는 가습 챔버에서 37℃로 유지시켰다. 스트레스 과립에서살아있는 세포 dCas13a-NF-msfGFP의 G3BP1-RFP와의 공동국소화는 Opera Phenix Harmony 소프트웨어(PerkinElmer)를 사용하여 측정하였다.
표적 접근 가능성 및 녹다운의 상관관계
출원인은 LshCas13a가 우연에 의해 예상되는 것보다 더 근접하게 함께 그룹화된 매우 효과적인 가이드로 한정된 위치에서 MS2 ssRNA 게놈을 표적화함을 보여주었다1. 출원인은 효과적인 가이드의 클러스터가 표적 결합의 입체 배치 및 이용 가능성으로 인해 LshCas13a에 의해 더 잘 표적화되는 접근 가능성 영역으로부터 발생할 수 있다고 추정하였다. 이들 결과가 LwCas13a를 이용한 포유류 mRNA의 표적화에까지 확장될 지 여부를 분석하고자 하였고 그래서 가이드로 타일링한 4 개 유전자: Gluc, Cluc, KRAS 및 PPIB에 대해 유사한 분석을 수행하였다. 먼저 효과적인 가이드를 녹다운 효율에 의해 측정된 바와 같이 Gluc에 대해서는 상위 20%의 가이드 및 다른 3 개 유전자에 대해서는 상위 30%의 가이드로 정의하였다(Gluc보다 50% 더 적은 가이드로 타일링하였으므로 Cluc, KRAS 및 PPIB에 대한 임계값에 대해 더 관대하다는 것을 주의). 이들 임계값을 사용하여 정의된 가장 효과적인 가이드만 분석함에 있어서, 그들은 우연에 의해 예상되는 것보다 더 근접하게 함께 모여있는 것으로 나타났다.
다음으로, Vienna RNA 소프트웨어 모음으로부터 RNAplfold 알고리즘을 사용하여 표적 전사물의 접근 가능성을 모델링하고자 하였다. 윈도우 크기 70(기본값)에 걸쳐 접근 가능성 및 전사물 상의 주어진 뉴클레오티드 위치가 쌍이 없을 확률을 계산하였다. 그 다음, 주어진 가이드에 대해, 주어진 가이드 표적이 쌍이 없고 따라서 접근 가능할 평균 확률을 얻기 위해 28 nt에 걸친 확률을 평균화할 수 있다. 이 계산을 표적 접근 가능성에 대한 측정으로서 취하고 각각의 가이드에 대한 표적 발현에 대하여 비교한다. 가이드별로 발생하는 변동 때문에, 특히 유전자를 조밀하게 타일링하지 않았기 때문에, 표적 접근 가능성 및 표적 발현 곡선 모두를 스무딩하기로 결정하였다. 이들 곡선을 플롯팅하고 상관관계를 분석함으로써 표적 접근 가능성이 표적 발현과 유의미한 상관관계가 있고 표적 발현에서의 변동의 4.4% 내지 16%를 설명할 수 있음을 밝혔다. 스무딩의 거짓 효과를 상쇄하기 위해 커널 밀도 추정을 사용하여 확률 공간에서의 확률 대 녹다운 데이터를 또한 분석하였다. 이 분석은 염기쌍 형성된 표적 영역의 확률 및 표적 발현 사이에 유사한 양의 관계를 밝혔다. 마지막으로, 염기쌍 형성 확률에 대한 거짓 상관관계를 만드는 RNAplfold의 임의의 파라미터-특이적 측면을 상쇄하기 위해, 윈도우 크기 및 k-mer 크기의 파라미터 그리드에 대해 쌍이 없을 확률을 계산했다. 처음에 1의 k-mer에 대한 확률 즉, 주어진 위치가 쌍이 없고 28 nt 표적 영역에 걸쳐 평균화된 확률만을 계산하였다. k=2에서, 뉴클레오티드 쌍이 쌍이 없을 확률을 계산하고 28 nt 영역에 걸쳐 그들을 평균화하고 28까지의 k에 대하여 계속한다. 이 분석은 각각의 전사물에 대해 양의 상관 관계를 만드는 파라미터 영역을 밝혔고 이는 상관관계를 제공하는 것은 특정 파라미터 세트만이 아니라는 확신을 더 제공한다. 예상할 수 있듯이, KRAS와 같은 더 큰 전사물은 더 큰 윈도우 크기에 대해 양의 상관관계를 갖고 PPIB와 같은 더 작은 전사물은 훨씬 더 작은 윈도우 크기에 대해 양의 상관관계를 갖는다.
shRNA 및 Cas13a 사이의 표적 녹다운 특이성 비교
shRNA 및 Cas13a 전사물 녹다운 특이성 사이의 엄밀한 비교를 위해, 표적화 및 비-표적화 대조군 사이에 비교된 트랜스크립톰 전체에 걸친 변동의 효과를 평가하고자 하였다. 표적외는 동일성 라인에서부터 편차로서 나타날 것이며, 리포터 작제물을 표적화할 때 Cas13a보다 shRNA에 대해 더 많은 표적외가 발생함은 명백하다. 유사한 증가된 편차가 내인성 유전자에 대해 발생한다. 내인성 전사물의 녹다운이 생물학적 기능의 변화로 인한 추가적인 유전자 발현 변화를 초래할 것으로 예상될 수 있는 반면, Cas13a를 이용한 PPIB 및 KRAS 녹다운은 발현 변화를 초래하지 않았음을 발견하였고, 이는 아마도 녹다운의 수준이 실질적인 다운스트림 효과에 충분하지 않기 때문이다.
다음으로, 차등적 유전자 발현을 통해 표적외의 수를 정량화하였다: 표적외 전사물은 적어도 100% 상향 조절 또는 25% 하향 조절을 갖는 유전자로 정의한다. 그 다음, 유의미한 표적외를 표적화 및 비-표적화 조건 사이에서 스튜던트 t-검정에 의해0.1의 FDR로 Benjamini-Hochberg 절차를 통해 보정된 다중 비교로 비교하였다. 시험된 3 개 전사물 모두에서 shRNA 표적화의 결과로 수백 개의 유의미한 표적외 전사물이 있었으나, Cas13a 표적화의 결과로는 유의미한 표적외가 없었음을 밝혔다.
표적화 및 비-표적화 조건 사이의 shRNA 변동에서의 큰 변동은, 생물학적 반복실험 사이에 유사한 편차를 초래할, 증가된 전체 유전자 발현 변이로 인한 것이거나, 동일 조건에 대한 반복실험 사이에서 증가된 상관관계로 나타날, 재현가능하고 일관된 표적외로 인한 것일 수 있다. Gluc 변동에 대해 비-표적화 및 표적화 반복실험을 서로와 비교하면서, 반복실험 사이에는 거의 변동이 없음을 발견하였다. 그러나, shRNA 또는 Cas13a에 대해 표적화 조건 대 모든 비-표적화 조건의 개별 반복실험을 비교하였을 때, 반복실험 간의 비교는 평균 측정에서 보여진 표적외를 재정리했음을 발견하였다. 반복실험 간의 상관 관계를 정량화하기 위해, 리포터 및 내인성 유전자 전반에 걸쳐 표적화 및 비-표적화 조건에 대한 모든 반복실험을 비교하였다. shRNA 샘플은 비-표적화 및 표적화 조건 사이보다 반복실험 내에서 더 높은 상관 관계를 보였으나, Cas13a 샘플 간의 상관 관계는 표적화 및 비-표적화 변동 사이에서 더 적은 변동을 가졌다. 그 다음, 모든 샘플을 서로 비교하여 shRNA 샘플이 샘플 간에 더 낮은 상관관계를 갖고 Cas13a내에서 보다 Cas13a와 더 낮은 상관관계를 가짐을 밝혔고, 이는 Cas13a가 더 일관성이 있음을 나타낸다. 마지막으로, 표적화 및 비-표적화 반복실험 모두에 걸쳐 유전자 당 표준 편차를 계산하였고, 표준 편차의 분포는 트랜스크립톰에 걸쳐 shRNA 변동에서보다 Cas13a 변동에서 더 낮음을 밝혔다. 전체적으로, 이 증거는 Cas13a 표적화가 트랜스크립톰 전체에 걸친 변동을 더 적게 초래함을 나타낸다.
포유류 세포에서 부수적 활성 결여에 대한 증거
LshCas13a 및 LwCas13a는 시험관내에서 견고한 부수적 활성을 나타내는 것으로 보인다. 부수적 효과로 인한 세포 건강 및 LwCas13a 녹다운의 특이성에 대한 우려때문에, 부수적 효과가 포유류 세포에서 실제로 존재하는지 여부를 연구하려고 시도하였다. 원고 전체에 걸쳐 LwCas13a에 대한 부수적 활성의 결여를 시사하는 데이터를 수집하고, 여기서 모든 증거 조각을 모아 상세하게 논의한다.
1. RNA 시퀀싱: RNA 시퀀싱을 수행하여 LwCas13a 녹다운의 특이성을 결정하였고, LwCas13a가 RNAi보다 훨씬 더 높은 특이성을 나타냄을 발견하였다. 차등적 발현 분석에서, 표적 전사물의 유의미한 녹다운에도 불구하고, 분석된 임의의 LwCas13a 조건에 대해 유의미한 차등적 발현된 표적외가 없었다. 인간 트랜스크립톰에서 모든 전사물의 균일한 녹다운이 없었다고 가정할 때, 이는 LwCas13a에 의한 녹다운이 특이적이고 포유류 세포에서 부수적 효과가 없다는 실질적 증거를 제공하는 것으로 여겨진다.
2. 타일링 스크린: 수행한 4 가지 유전자 타일링 스크린에서, 정규화에 사용된 대조군 유전자의 녹다운을 보지 못하였다. 이것은 트랜스크립톰이 아닌 하나의 다른 유전자에만 초점을 맞춤에도 불구하고 RNA 시퀀싱 유사한 분석이다. 그러나 시험된 수백 개의 가이드에 걸쳐 부수적 활성을 보지 못했기 때문에, LwCas13a가 생체내에서 부수적 활성을 강력하게 나타내지 않는다는 확신을 제공하면서, 이 결과는 중요하다.
3. 단일 제거 다중화: 다중화 실험에서 유전자 녹다운의 특이성을 확인하기 위해, 3 개의 상이한 유전자에 대한 가이드를 함유하는 가이드 발현 어레이에서 각각의 유전자-표적화 가이드가 비-표적화 가이드로 대체되는 실험을 설계했다. 부재한 가이드에 의해 표적화된 유전자에 대한 유전자 발현에 유의미한 변화가 없음을 발견하였다. 가이드의 존재 유무에도 불구하고 3 가지 유전자 모두 항상 녹다운을 나타낼 것으로 기대되기 때문에, 이는 또한 포유류 세포에서의 부수적 활성의 결여에 대한 좋은 입증으로 여겨진다.
4. 성장 실험: 이전에, 출원인은 LshCas13a가 유전자 녹다운 동안 박테리아에서 성장 제한을 야기함을 보였다1. 포유류 세포에서의 녹다운의 성장 효과가 있는지 여부를 측정하기 위한 간단한 실험을 설계하였다. Gluc를 표적화하는 LwCas13a를 갖는 세포를 72 시간 동안 성장하도록 둔 다음 세포 생존력을 측정하였고 표적화 및 비-표적화 가이드 조건 사이에 성장에서의 차이가 없음을 발견하였다. C-말단 msfGFP 융합의 형광을 관찰함으로써 LwCas13a 발현에 대해 추가로 제어하였고 발현은 모든 조건에 걸쳐 동일했고 잠재적으로 해로운 표현형으로 인해 선택되지 않음을 밝혔다. RNA 세포질 밀도, 사이토졸 조성, 및 절단된 전사물의 가공 메커니즘에서의 차이를 포함하여, 박테리아 성장 억제에 대한 이전 관찰에도 불구하고 포유류 세포에서 성장 저해의 결여에 대한 많은 가능한 원인이 있다.
포인트 1 내지 3은 표적화된 유전자 녹다운이 표적화된 유전자 이외의 다른 유전자에 영향을 미치지 않음을 총괄하여 나타내고 포인트 4는 유전자 녹다운에 대한 관찰 가능한 부작용이 없음을 나타낸다. 이 데이터는 모두 포유류 세포에서의 LwCas13a 부수적 활성의 결여에 대한 실질적인 증거이며 Cas13 녹다운은 매우 특이적인 것으로 여겨진다.
dCas13a 이미징을 위한 음성-피드백 작제물의 중요성
살아있는 세포 이미징을 위해, 높은 신호 대 잡음 비를 유지하고 배경을 감소시키는 것이 중요하다. dCas13a와 같은 형광단-표지된 작제물의 경우, 결합되지 않은 dCas13a는 세포에서 제거될 수 없거나 결합된 단백질과 구별될 수 없기 때문에, 배경에 대한 우려가 특히 중요하다. 배경을 감소시키는 한 가지 접근법은 핵 국소화 신호(NLS) 태그를 통해 핵에 단백질을 격리하는 것이고; 발생기 전사물 결합 즉시 단백질은 일시적으로 세포질로 방출된다. 이 기술은 MS2 시스템에서 활용되었지만, 표적외 핵 유출 및 표적내 핵 탈출로 인하여 이것은 불완전함을 발견하였다. 출원인은 NLS-태깅만 있는 경우의 신호 대 잡음을 향상시키기 위해, 핵 상주 단백질이 dCas13a의 추가 발현을 저해할 음성 피드백 시스템을 포함시켰다. 음성 피드백 조절은 세포질로의 가짜 전위를 감소시키고 표적화 조건과 비교하여 비-표적화 조건에서의 dCas13a-NF 수준의 전체적인 수준의 감소를 유도함으로써 이미징 도구로서의 dCas13a의 활용성을 증가시킴을 밝혔다.
보충 표
[보충 표 1]
[보충 표 2]
[보충 표 3]
[보충 표 4]
[보충 표 5]
[보충 표 6]
[보충 표 7]
[보충 표 8]
[보충 표 9]
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본 발명의 선호되는 구현예가 본 명세서에 나타나고 기재되었지만, 이러한 구현예가 단지 예로서 제공된 것임이 당업자에게 자명할 것이다. 이제 본 발명을 벗어나지 않으면서 많은 변이, 변화, 및 치환이 당업자에게 떠오를 것이다. 본 명세서에 기재된 본 발명의 일 구현예에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실시함에 있어서 이용될 수 있음이 이해되어야 한다. 다음의 청구항이 본 발명의 범위를 규정하고 이들 청구항의 범위 내의 방법 및 구조 및 이들의 균등물이 이에 의해 포함되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> THE BROAD INSTITUTE INC. MASSACHUSETTS INSTITUTE OF TECHNOLOGY PRESIDENT AND FELLOWS OF HARVARD COLLEGE <120> NOVEL TYPE VI CRISPR ORTHOLOGS AND SYSTEMS <130> 47627.99.2133 <140> PCT/US2017/038154 <141> 2017-06-19 <150> 62/484,786 <151> 2017-04-12 <150> 62/471,792 <151> 2017-03-15 <150> 62/432,240 <151> 2016-12-09 <150> 62/410,366 <151> 2016-10-19 <150> 62/376,377 <151> 2016-08-17 <150> 62/351,803 <151> 2016-06-17 <150> 62/351,662 <151> 2016-06-17 <160> 577 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1 atcagggcaa acagaacttt gactccca 28 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2 agatccgtgg tcgcgaagtt gctggcca 28 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 3 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Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 19 gcgtgagcca ccgcgcctgg ccggctgt 28 <210> 20 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 20 ccagctgcag atgctgcagt ttttggcg 28 <210> 21 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 21 ctggaaatgg aagatgccgg catagcca 28 <210> 22 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 22 gatgacacct cacacggacc acccctag 28 <210> 23 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 23 taatactgct ccagatatgg gtgggcca 28 <210> 24 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 24 catgaagacc gagttataga atactata 28 <210> 25 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 25 ggtgaaatat tctccatcca gtggtttc 28 <210> 26 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 26 aatttctcga actaatgtat agaaggca 28 <210> 27 <211> 7 <212> PRT <213> Simian virus 40 <400> 27 Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 1 5 <210> 28 <211> 16 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Nucleoplasmin bipartite NLS sequence" <400> 28 Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys 1 5 10 15 <210> 29 <211> 9 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: C-myc NLS sequence" <400> 29 Pro Ala Ala Lys Arg Val Lys Leu Asp 1 5 <210> 30 <211> 11 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> 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Lys Ser Leu Ile Asp Ile Leu Asp Arg His 1610 1615 1620 Gly Met Ile Leu Lys Phe Lys Phe Lys Xaa Xaa Xaa Lys Leu Ile 1625 1630 1635 Gly Xaa Asn Asp Xaa Xaa Xaa Xaa Ala Ile Lys His Lys Asp Xaa 1640 1645 1650 Ala Arg Ile Thr Ile Xaa Glu Pro Asn Gly Val Thr Ser Glu Xaa 1655 1660 1665 Phe Thr Tyr Lys Leu Leu Xaa Xaa Val Ala Ala Leu Glu Ile Xaa 1670 1675 1680 Ser Leu Glu Pro Lys Lys Ile Arg His Leu Xaa Xaa Xaa Ala Arg 1685 1690 1695 Leu Leu Tyr Tyr Pro Lys Xaa Ala Thr Ala Gln Ser Gln Pro Asp 1700 1705 1710 Gln Lys Xaa Xaa Xaa Lys Xaa Lys Lys Lys Asn Ile Xaa Lys Gly 1715 1720 1725 Tyr Ile Glu Arg Xaa Thr Asn Gln Val Ser Ser Asn Gln Glu Glu 1730 1735 1740 Tyr Cys Glu Leu Val Lys Lys Leu Leu Glu Thr Xaa Xaa Leu Xaa 1745 1750 1755 Xaa Leu Ala Val Xaa Gly Val Ala Xaa Asx Ile Gly Leu His Ile 1760 1765 1770 Ser Arg Leu Arg Arg Ile Arg Glu Asp Ala Ile Ile Val Gly Arg 1775 1780 1785 Arg Tyr Arg Phe Arg Val Glu Ile Tyr Val Pro Pro Lys Ser Asn 1790 1795 1800 Thr Ser Lys Leu Asn Ala Ala Asp Leu Val Arg 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Synthetic oligonucleotide" <400> 191 tagattgctg ttctaccaag taatccat 28 <210> 192 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 192 tccttgatta cacgatggaa tttgctgt 28 <210> 193 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 193 atgataatgc aatagcagga caggatga 28 <210> 194 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 194 aatttctcga actaatgtat agaaggca 28 <210> 195 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 195 ccaccaccac cgcctcccgc cgcccccg 28 <210> 196 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" 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Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 263 gtagatgctc tttcctcctg tgccatct 28 <210> 264 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 264 ctagatgctc tttcctcctg tgccatct 28 <210> 265 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 265 gtacatgctc tttcctcctg tgccatct 28 <210> 266 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 266 gtagatcctc tttcctcctg tgccatct 28 <210> 267 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 267 gtagatgctg tttcctcctg tgccatct 28 <210> 268 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 268 gtagatgctc ttacctcctg tgccatct 28 <210> 269 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 269 gtagatgctc tttccacctg tgccatct 28 <210> 270 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 270 gtagatgctc tttcctccag tgccatct 28 <210> 271 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 271 gtagatgctc tttcctcctg tcccatct 28 <210> 272 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 272 gtagatgctc tttcctcctg tgccttct 28 <210> 273 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 273 gtagatgctc tttcctcctg tgccatca 28 <210> 274 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 274 gtgcagccag ctttccgggc attggctt 28 <210> 275 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 275 cagcagccag ctttccgggc attggctt 28 <210> 276 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 276 gtggtgccag ctttccgggc attggctt 28 <210> 277 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 277 gtgcagggag ctttccgggc attggctt 28 <210> 278 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 278 gtgcagccac gtttccgggc attggctt 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<220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 289 gtggagccag cattccgggc attggctt 28 <210> 290 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 290 gtggagccag ctttcggggc attggctt 28 <210> 291 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 291 gtggagccag ctttccgggg attggctt 28 <210> 292 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 292 gtgcaggcag gtttccgggc attggctt 28 <210> 293 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 293 gtgcaggcag ctttgcgggc attggctt 28 <210> 294 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 294 gtgcaggcag ctttccggcc attggctt 28 <210> 295 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 295 gtgcaggcag ctttccgggc ataggctt 28 <210> 296 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 296 gtgcagccac cttaccgggc attggctt 28 <210> 297 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 297 gtgcagccac ctttccgcgc attggctt 28 <210> 298 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 298 gtgcagccac ctttccgggc aatggctt 28 <210> 299 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 299 gtgcagccac ctttccgggc attgggtt 28 <210> 300 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 300 gtgcagccag ctatcccggc attggctt 28 <210> 301 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 301 gtgcagccag ctatccgggc tttggctt 28 <210> 302 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 302 gtgcagccag ctatccgggc attgcctt 28 <210> 303 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 303 gtgcagccag ctttcggggg attggctt 28 <210> 304 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 304 gtgcagccag ctttcggggc attcgctt 28 <210> 305 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 305 gtgcagccag ctttcggggc attggcta 28 <210> 306 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 306 gtgcagccag ctttccggcc ataggctt 28 <210> 307 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 307 gtgcagccag ctttccggcc attggcat 28 <210> 308 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 308 atcagggcaa acagaacttt gactccca 28 <210> 309 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 309 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Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 319 ccuucuauac auuaguucga gcucgagcuc gaacuaaugu auagaagg 48 <210> 320 <211> 48 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 320 aagccaaugc ccggaaagcu gcucgagcag cuuuccgggc auuggcuu 48 <210> 321 <211> 48 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 321 agauuccugg guucaaggac ucucgagagu ccuugaaccc aggaaucu 48 <210> 322 <211> 48 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 322 aaaguucugu uugcccugau ccucgaggau cagggcaaac agaacuuu 48 <210> 323 <211> 48 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 323 aaguggcugg agacaucauu gcucgagcaa ugaugucucc agccacuu 48 <210> 324 <211> 48 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328 aaucuguaaa uuuuuaaccu acucgaguag guuaaaaauu uacagauu 48 <210> 329 <211> 48 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 329 agauggcaca ggaggaaaga gcucgagcuc uuuccuccug ugccaucu 48 <210> 330 <211> 48 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 330 agcgcuuccc cgaugagaac ucucgagagu ucucaucggg gaagcgcu 48 <210> 331 <211> 48 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 331 aacauaacag acuuggccaa gcucgagcuu ggccaagucu guuauguu 48 <210> 332 <211> 48 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 332 aagcugagua cauuuugcug gcucgagcca gcaaaaugua cucagcuu 48 <210> 333 <211> 48 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source 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uucucuuuaa aauaucguuc gaacuggacu cccggucguu 120 uuaacucgac uggggccaaa acgaaacagu ggcacuaccc cgccggaagc auaaag 176 <210> 341 <211> 174 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 341 ggguaggugu uccacagggu agccagcagc auccugcgau gcaaauaugg auuacuuggu 60 agaacagcaa ucuaauccgg aacauaaugg ugcagggcgc ugacuuccgc guuuguuuua 120 aaucaaacac ggaaaccgaa gaccauucau guuguugcug ccggaagcau aaag 174 <210> 342 <211> 174 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 342 ggguaggugu uccacagggu agccagcagc auccugcgau gcaaauaugg auuacuuggu 60 agaacagcaa ucuaauccgg aacauaaugg ugcagggcgc ugacuuccgc guuugcccca 120 aaccaaacac ggaaaccgaa gaccauucau guuguugcug ccggaagcau aaag 174 <210> 343 <211> 174 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 343 ggguaggugu uccacagggu agccagcagc auccugcgau gcaaauaugg auuacuuggu 60 agaacagcaa ucuaauccgg aacauaaugg ugcagggcgc ugacuuccgc guuuggggga 120 aagcaaacac ggaaaccgaa gaccauucau guuguugcug ccggaagcau aaag 174 <210> 344 <211> 174 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 344 ggguaggugu uccacagggu agccagcagc auccugcgau gcaaauaugg auuacuuggu 60 agaacagcaa ucuaauccgg aacauaaugg ugcagggcgc ugacuuccgc guuugaaaaa 120 aaacaaacac ggaaaccgaa gaccauucau guuguugcug ccggaagcau aaag 174 <210> 345 <211> 178 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 345 ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu uucuuuucuu cgauguggau 60 ugguuuacca ggauuuagac uaccccaaaa acgaagggga cuaaaacgua aaauagauac 120 aauaacuucu ucuacaugau uuagacuacc ccaaaaacga aggggacuaa aacgcgcg 178 <210> 346 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> 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Leptotrichia wadei <400> 520 Met Leu Asn Ala Ile Thr Ser Ile Arg His Arg Val Val His Tyr 1 5 10 15 <210> 521 <211> 16 <212> PRT <213> Leptotrichia wadei <400> 521 Leu Ala Gly Tyr Thr Ser Leu Trp Glu Arg Asp Leu Gln Phe Lys Leu 1 5 10 15 <210> 522 <211> 14 <212> PRT <213> Leptotrichia wadei <400> 522 Ile Arg Asn Tyr Ile Ala His Phe Asn Tyr Ile Pro Asp Ala 1 5 10 <210> 523 <211> 16 <212> PRT <213> Leptotrichia wadei <400> 523 Phe Ile Ala Arg Asn Arg Gln Asn Glu Ala Phe Leu Arg Asn Ile Ile 1 5 10 15 <210> 524 <211> 15 <212> PRT <213> Leptotrichia wadei <400> 524 Ile Asp Glu Ala Ile Ser Ser Ile Arg His Gly Ile Val His Phe 1 5 10 15 <210> 525 <211> 16 <212> PRT <213> Leptotrichia wadei <400> 525 Leu Val Gly Tyr Thr Ser Ile Trp Glu Arg Asp Leu Arg Phe Arg Leu 1 5 10 15 <210> 526 <211> 14 <212> PRT <213> Leptotrichia wadei <400> 526 Ile Arg Asn Tyr Ile Ala His Phe Asn Tyr Ile Pro His Ala 1 5 10 <210> 527 <211> 16 <212> PRT <213> Rhodobacter capsulatus <400> 527 Gly Gln Thr Glu Ile Lys Glu Ser 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