JP2017501149A - 粒子送達構成成分を用いた障害及び疾患の標的化のためのｃｒｉｓｐｒ−ｃａｓ系及び組成物の送達、使用及び治療適用 - Google Patents

Abstract

本発明は、標的配列の配列及び／又は活性を操作するための系、方法、及び組成物の送達、エンジニアリング及び最適化を提供する。送達部位を標的化するための手段であるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の１つ以上の構成成分を含む送達粒子製剤及び／又は系が提供される。本発明の送達粒子製剤は、好ましくは、ナノ粒子送達製剤及び／又は系である。また、ベクター及びベクター系であって、その一部がＣＲＩＳＰＲ複合体の１つ以上の構成成分をコードする、ベクター及びベクター系、並びにこのようなベクターの設計及び使用方法も提供される。また、標的認識に対する特異性の増強及び毒性の回避を確実にし、かつ目的のゲノム遺伝子座における標的部位を編集又は改変して疾患状態又は病態を変化又は改善するために、真核細胞におけるＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を誘導する方法も提供される。【選択図】図１

Description

関連出願及び／又は参照による組み入れ
本出願は、２０１４年９月２４日出願の米国仮特許出願第６２／０５４，４９０号明細書、２０１４年６月１０日出願の米国仮特許出願第６２／０１０，４４１号明細書、並びに各々２０１３年１２月１２日出願の米国仮特許出願第６１／９１５，１１８号明細書、米国仮特許出願第６１／９１５，２１５号明細書及び米国仮特許出願第６１／９１５，１４８号明細書からの優先権を主張するものである。

上記の出願、及びこれらの出願で引用される又はこれらの出願の審査中に引用される全ての文献（「出願引用文献」）、及びこの出願引用文献において引用又は参照される全ての文献、及び本明細書において引用又は参照される全ての文献（「本明細書引用文献」）、及び本明細書の引用文献において引用又は参照される全ての文献は、本明細書において又は本明細書での参照により組み入れられる任意の文献において述べられる任意の製品についての任意の製造者の指示書、説明書、製品仕様書、及び製品シートと共に、参照により本明細書に組み入れられ、かつ本発明の実施に利用することができる。

本発明は、一般に、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）及びその構成成分が関係する配列標的化を伴う遺伝子発現の制御、例えばゲノム摂動又は遺伝子編集に用いられる系、方法、及び組成物の送達、エンジニアリング、最適化及び治療適用に関する。詳細には、本発明は、哺乳動物を含めた動物においてゲノム編集によって治療利益が得られるようにＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を送達するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏ系、方法、及び組成物に関する。

連邦政府支援研究に関する記載事項
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）から授与されたＮＩＨパイオニアアワード（ＮＩＨ Ｐｉｏｎｅｅｒ Ａｗａｒｄ）（１ＤＰ１ＭＨ１００７０６）に基づく連邦政府の支援を受けて行われた。連邦政府は本発明に一定の権利を有する。

ゲノムシーケンシング技術及び分析法の近年の進歩により、多様な範囲の生物学的機能及び疾患に関連する遺伝因子を分類及びマッピングする技能が顕著に加速されている。正確なゲノム標的化技術は、個々の遺伝子エレメントの選択的摂動を可能とすることにより原因遺伝子変異体の体系的なリバースエンジニアリングを可能とするため、並びに合成生物学、バイオテクノロジー用途、及び医薬用途を進歩させるために必要とされる。ゲノム編集技術、例えば、デザイナー亜鉛フィンガー、転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）、又はホーミングメガヌクレアーゼが、標的化されるゲノム摂動の産生に利用可能であるが、安価で、設定が容易で、スケーラブルで、真核ゲノム内の複数の位置を標的化しやすい新たなゲノム工学技術が依然として必要とされている。

ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は特定の配列を標的化するためにカスタム化タンパク質の生成を必要としないが、単一のＣａｓ酵素を短いＲＮＡ分子によりプログラムして、特定のＤＮＡ標的を認識することができる。ゲノムシークエンシング技術及び分析法のレパートリーにＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を追加することにより、方法論が著しく簡単になり、多様な範囲の生物学的機能及び疾患に関連する遺伝因子を分類及びマッピングする技能が加速され得る。有害な影響を伴わずにＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系をゲノム編集に利用するために、特許請求される本発明の態様であるこれらのゲノムエンジニアリングツールのエンジニアリング、最適化及び細胞型／組織／臓器特異的な送達の態様を理解することが重要である。

多様な用途の核酸配列標的化のための代替的でロバストな系及び技術が早急に必要とされている。本発明の態様はこの必要性に対処し、関連する利点を提供する。例示的なＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズするガイド配列と複合体を形成するＣＲＩＳＰＲ酵素を含む。ガイド配列はｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に連結され、次にｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズする。

一態様では、本発明は、標的ポリヌクレオチドを改変するための手段として、粒子送達製剤及び／又は系によりＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の１つ以上のエレメント／構成成分を使用するための方法を提供する。好ましい実施形態では、粒子送達製剤及び／又は系はナノ粒子である。本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的ポリヌクレオチドを改変するための有効な手段を提供する。本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体は、種々の組織及び臓器、例えば、内皮細胞、皮膚、心臓、筋肉（ｍｕｃｌｅ）又は肺における多様な細胞型の標的ポリヌクレオチドの改変（例えば、欠失、挿入、転座、不活性化、活性化）を含む様々な種類の有用性を有する。従って、本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体は、例えば、遺伝子又はゲノム編集、遺伝子療法、創薬、薬物スクリーニング、疾患診断、及び予後診断における広範囲の用途を有する。本発明は、医薬、及び遺伝子又はゲノム編集における使用を企図する。

本発明の方法において、生物が動物又は植物である場合、改変はｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで、例えば細胞培養において起こり得ること、及び場合によりｉｎ ｖｉｖｏでは起こり得ないことが認識されるであろう。他の実施形態では、ｉｎ ｖｉｖｏで起こり得る。

一態様では、本発明は、目的のゲノム遺伝子座における標的配列の操作により生物又は非ヒト生物を改変する方法を提供し、本方法は、
（Ａ）−Ｉ．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系キメラＲＮＡ（ｃｈｉＲＮＡ）ポリヌクレオチド配列であって、
（ａ）真核細胞内の標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、
（ｂ）ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、及び
（ｃ）ｔｒａｃｒ配列
を含むポリヌクレオチド配列、及び／又は
ＩＩ．少なくとも１つ以上の核局在化配列を含むＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列
［（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は５’から３’への方向に並び、
転写されるとｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、かつガイド配列がＣＲＩＳＰＲ複合体と標的配列との配列特異的結合を誘導し、
ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、及び（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズ可能なｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成するＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列はＤＮＡ又はＲＮＡである］
を含むか、或いは、
（Ｂ）Ｉ．（ａ）真核細胞内の標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、及び
（ｂ）少なくとも１つ以上のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列
を含むポリヌクレオチド、
ＩＩ．ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列、並びに
ＩＩＩ．ｔｒａｃｒ配列を含むポリヌクレオチド配列
［転写されるとｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、かつガイド配列がＣＲＩＳＰＲ複合体と標的配列との配列特異的結合を誘導し、
ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、及び（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズ可能なｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成するＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列はＤＮＡ又はＲＮＡである］
を含む、天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物をナノ粒子複合体によって送達するステップを含む。

ＣＲＩＳＰＲ酵素はＩ型又はＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素、好ましくはＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素である。このＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素は、任意のＣａｓ酵素であり得る。好ましいＣａｓ酵素は、これがＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系からの複数のヌクレアーゼドメインを有する最大ヌクレアーゼに対する相同性を共有する一般的なクラスの酵素を指すことができるときにＣａｓ９と同定され得る。最も好ましくは、Ｃａｓ９酵素はｓｐＣａｓ９又はｓａＣａｓ９からのものである、或いはこれらに由来する。ＳｐＣａｓ９又はＳａＣａｓ９が、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）又は黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９からのものである、或いはこれらに由来することは認識されるであろう。由来とは、本出願人によると、由来酵素が、野生型酵素と高度の配列相同性を有するという意味で大部分は野生型酵素に基づいているが、本明細書に記載されるように何らかの方法で突然変異（改変）されていることを意味する。他に明白でない限り、Ｃａｓ及びＣＲＩＳＰＲ酵素という用語が一般に本明細書では互換的に使用されることは認識されるであろう。Ｃａｓ酵素は、例えば、天然に存在する任意の細菌Ｃａｓと、任意のキメラ、突然変異体、ホモログ又はオルソログとであり得る。本明細書で使用される残基の付番の多くは、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（代替的に、ＳｐＣａｓ９又はｓｐＣａｓ９と注解される）におけるＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からのＣａｓ９酵素を参照する。しかしながら、本発明が、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＳｐＣａｓ９、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）由来のＳａＣａｓ９、サーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＳｔ１Ｃａｓ９などの他の微生物種からのさらに多くのＣａｓ９を含むことは認識されるであろう。当業者は、関連のアミノ酸配列の比較によって、ＳｐＣａｓ９以外のＣａｓ９酵素における適切な対応する残基を決定することができるであろう。従って、ＳｐＣａｓ９付番を用いて特定のアミノ酸置換が参照される場合、これが他のＣａｓ９酵素を指すように意図されていないことが内容により明らかでない限り、本開示は、他のＣａｓ９酵素における対応する改変も包含することが意図される。

本発明において、Ｃａｓ９酵素は構成的に存在し得る、或いは、例えば、ＣＲＩＳＰＲ系のＲＮＡ構成成分を含有するナノ粒子と共に、Ｃａｓ９のｉｎ ｖｉｖｉｏ発現のための核酸分子を含有するナノ粒子又はそれを含有するベクターを連続又は同時投与することによって、Ｃａｓ９酵素はナノ粒子により、又はＣａｓ９酵素を発現するベクターにより送達され得る。またナノ粒子は、ベクターを送達することもできる。

Ｃａｓ９オルソログは、通常、３〜４のＲｕｖＣドメイン及びＨＮＨドメインの一般的構成を共有する。最も５’側のＲｕｖＣドメインは非相補鎖を切断し、ＨＮＨドメインは相補鎖を切断する。全ての表記はガイド配列を参照する。５’ＲｕｖＣドメイン内の触媒残基は、目的のＣａｓ９と、他のＣａｓ９オルソログ（化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座、サーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座１、サーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座３、及びフランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｃｉｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ）ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に由来するもの）との相同性比較によって同定され、保存Ａｓｐ残基（Ｄ１０）がアラニンに突然変異されて、Ｃａｓ９が相補鎖ニッキング酵素に転換される。同様に、ＨＮＨドメイン内の保存Ｈｉｓ及びＡｓｎ残基はアラニンに突然変異され、Ｃａｓ９が非相補鎖ニッキング酵素に転換される。一部の実施形態では、両方の突然変異セットが作製され、Ｃａｓ９が非切断酵素に転換され得る。従って、Ｃａｓ９は１つ以上の突然変異を含むことができ、機能ドメインとの融合の有無にかかわらず、一般的なＤＮＡ結合タンパク質として使用され得る。突然変異は人工的に導入された突然変異であってもよいし、機能獲得型又は機能喪失型の突然変異であってもよい。突然変異には、それぞれＲｕｖＣ及びＨＮＨ触媒ドメイン内の触媒ドメイン（Ｄ１０及びＨ８４０）の１つにおける突然変異が含まれ得るが、これらに限定されない。さらなる突然変異が特徴付けられており、本発明の１つ以上の組成物において使用され得る。本発明の一態様では、突然変異Ｃａｓ９酵素は、タンパク質ドメイン、例えば転写活性化ドメインなどに融合され得る。一態様では、転写活性化ドメインはＶＰ６４であり得る。本発明の他の態様では、転写リプレッサードメインは、ＫＲＡＢ又はＳＩＤ４Ｘであり得る。従って、突然変異Ｃａｓ９酵素は、転写アクチベーター、リプレッサー、リコンビナーゼ、トランスポザーゼ、ヒストンリモデラー、デメチラーゼ、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、クリプトクロム、光誘導性／制御可能なドメイン又は化学誘導性／制御可能なドメインを含むがこれらに限定されないドメインに融合可能である。本発明のＣａｓ９は、キメラＣａｓ９タンパク質；例えば、キメラであることによって増強された機能を有するＣａｓ９であり得る。キメラＣａｓ９タンパク質は、２つ以上の天然に存在するＣａｓ９からの断片を含有する新しいＣａｓ９であってもよい。これらは、１つのＣａｓ９ホモログのＮ末端断片と、別のＣａｓ９ホモログのＣ末端断片との融合体を含み得る。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のＣａｓは、Ｃａｓ酵素の毒性を低減するような形態であってもよい。例えば、Ｃａｓ９は、酵素の一過性発現のためにｍＲＮＡの形態で細胞内に送達されることが可能であり、これにより毒性が低減される。Ｃａｓ９の発現は、誘導性プロモーターの制御下で可能である。

ｔｒａｃｒＲＮＡ及び直接反復配列は突然変異配列であり得る。或いは、本発明は、細胞内のこれらのＲＮＡの性能の増強を可能にする突然変異キメラガイド配列を含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のＲＮＡを包含し得る。適切なプロモーター、例えばＰｏｌ ＩＩＩプロモーター、例えばＵ６プロモーターは、ナノ粒子によって有利に送達されるガイドＲＮＡに付加され得る。本発明の態様は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されるか、又は合成会社に注文されて直接トランスフェクトされるガイドＲＮＡにも関する。細胞内でＴ７ポリメラーゼの発現により駆動されるＴ７プロモーターの制御下でのガイドＲＮＡの発現も想定される。有利な実施形態では、細胞は真核細胞である。好ましい実施形態では、真核細胞はヒト細胞である。より好ましい実施形態では、ヒト細胞は患者特異的細胞である。

この場合にはヒトに最適化された（即ち、ヒトでの発現に最適化されている）コドン最適化配列の一例は、本明細書において提供されている（ＳａＣａｓ９ヒトコドン最適化配列を参照）。これが好ましいが、他の例も可能であることは認識されるであろう。そして、ヒト以外の宿主種に対するコドン最適化、又は脳などの特定の臓器に対するコドン最適化は既知である。

ポリヌクレオチドが言及され、そのポリヌクレオチドがＲＮＡであり、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列などの特徴を「含む」と言われる場合、ＲＮＡ配列がその特徴を含むことは認識されるであろう。ポリヌクレオチドがＤＮＡであり、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列などの特徴を含む場合、ＤＮＡ配列は問題の特徴を含むＲＮＡに転写されるか、又は転写され得る。特徴がＣＲＩＳＰＲ酵素などのタンパク質である場合、言及されるＤＮＡ又はＲＮＡ配列は翻訳されるか、又は翻訳され得る（ＤＮＡの場合には、最初に転写される）。さらに、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするＲＮＡが細胞に提供される場合、ＲＮＡは、ＲＮＡが送達された細胞によって翻訳されることが可能であると理解される。

従って、特定の実施形態では、本発明は、ナノ粒子を含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を送達するステップを含み、目的のゲノム遺伝子座における標的配列の操作によって、生物、例えば、ヒトを含む哺乳類又は非ヒト哺乳類若しくは生物を改変する方法を提供し、この組成物は、（Ａ）Ｉ．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系キメラＲＮＡ（ｃｈｉＲＮＡ）ポリヌクレオチド配列に機能的に連結された第１の調節エレメントであって、ポリヌクレオチド配列が、（ａ）真核細胞内の標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、（ｂ）ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、及び（ｃ）ｔｒａｃｒ配列を含む第１の調節エレメント、並びにＩＩ．少なくとも１つ以上の核局在化配列（又は、一部の実施形態はＮＬＳを含まないこともあるため、任意選択で少なくとも１つ以上の核局在化配列）を含む、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に機能的に連結された第２の調節エレメント［（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は５’から３’への方向に並び、構成成分Ｉ及びＩＩは系の同じ又は異なるベクターに位置し、転写されるとｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、かつガイド配列がＣＲＩＳＰＲ複合体と標的配列との配列特異的結合を誘導し、及びＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、及び（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズ可能なｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成するＣＲＩＳＰＲ酵素を含む］を含む１つ以上のベクターを含むベクター系を含む、天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を含むか、或いは（Ｂ）Ｉ．（ａ）真核細胞内の標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、及び（ｂ）少なくとも１つ以上のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に機能的に連結された第１の調節エレメント、ＩＩ．ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に機能的に連結された第２の調節エレメント、並びにＩＩＩ．ｔｒａｃｒ配列に機能的に連結された第３の調節エレメント［構成成分Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩは系の同じ又は異なるベクターに位置し、転写されるとｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、かつガイド配列がＣＲＩＳＰＲ複合体と標的配列との配列特異的結合を誘導し、及びＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、及び（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズ可能なｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成するＣＲＩＳＰＲ酵素を含む］を含む１つ以上のベクターを含むベクター系を含む、天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を含む。一部の実施形態では、構成成分Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩは一緒に送達される。他の実施形態では、構成成分Ｉ及びＩＩは別々に送達される。他の実施形態では、構成成分Ｉ及びＩＩＩは一緒に送達されるが、構成成分ＩＩは別々に送達される。

従って、特定の実施形態では、本発明は、天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物をナノ粒子複合体により送達するステップを含み、例えば、心臓、筋肉又は肺の組織又は細胞内の目的のゲノム遺伝子座における標的配列の操作によって、生物、例えば、ヒトを含む哺乳類又は非ヒト哺乳類若しくは生物を改変する方法を提供し、この組成物は、（Ａ）Ｉ．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系ＲＮＡ又はキメラＲＮＡ（ｃｈｉＲＮＡ）ポリヌクレオチド配列に機能的に連結された第１の調節エレメントであって、ポリヌクレオチド配列が、（ａ）真核細胞内の標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、（ｂ）ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、及び（ｃ）ｔｒａｃｒ配列を含む第１の調節エレメント、並びにＩＩ．少なくとも１つ以上の核局在化配列（又は、有利に２つの核局在化配列）を有利に含む、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結された第２の調節エレメント［（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は５’から３’への方向に並び、構成成分Ｉ及びＩＩは系の同じ又は異なるベクターに位置し、少なくとも構成成分Ｉ又はＩＩ又はＩ及びＩＩの両方を含む１つ又は複数のベクターがナノ粒子又はナノ粒子複合体によって送達され、及び転写されるとｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズ可能であり、かつガイド配列がＣＲＩＳＰＲ複合体と標的配列との配列特異的結合を誘導し、及びＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、及び（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズ可能なｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成するＣＲＩＳＰＲ酵素を含む］を含む１つ以上のベクターを含むベクター系を含む、天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を含むか、或いは（Ｂ）Ｉ．（ａ）真核細胞内の標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、及び（ｂ）少なくとも１つ以上のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に機能的に連結された第１の調節エレメント、ＩＩ．ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に機能的に連結された第２の調節エレメント、並びにＩＩＩ．ｔｒａｃｒ配列に機能的に連結された第３の調節エレメント［構成成分Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩは系の同じ又は異なるベクターに位置し、Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩの少なくとも１つに関するベクター、有利にはＩ、ＩＩ及びＩＩＩの全てに関するベクターがナノ粒子又はナノ粒子複合体によって送達され、及び転写されるとｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、かつガイド配列がＣＲＩＳＰＲ複合体と標的配列との配列特異的結合を誘導し、及びＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、及び（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズ可能なｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成するＣＲＩＳＰＲ酵素を含む］を含む１つ以上のベクターを含むベクター系を含む、天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を含む。一部の実施形態では、構成成分Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩは一緒に送達される。他の実施形態では、構成成分Ｉ及びＩＩは別々に送達される。他の実施形態では、構成成分Ｉ及びＩＩＩは一緒に送達されるが、構成成分ＩＩは別々に送達される。いずれにしても、ナノ粒子の使用、特に、心臓、筋肉又は肺の組織又は細胞を標的化するための使用は、本発明の態様である。

標的配列の操作とは、本出願人によると、標的配列の後成的操作を含み得る、標的配列の変更を意味する。この後成的操作は、例えば、標的配列のメチル化状態の改変（即ち、メチル化又はメチル化パターン又はＣｐＧアイランドの付加又は除去）、ヒストン改変、標的配列への到達性の増大又は低減、又は３次元の折り畳みの促進などによる、標的配列のクロマチン状態の操作であり得る。

目的のゲノム遺伝子座における標的配列の操作によってヒトを含む生物若しくは哺乳動物又は非ヒト哺乳動物若しくは生物を改変する方法が言及される場合、これは生物（又は哺乳動物）に全体として適用されても、又は（その生物が多細胞生物である場合）当該生物の単一細胞若しくは細胞集団だけに適用されてもよいことは理解されるであろう。例えばヒトの場合、出願者らは特に単一細胞又は細胞集団を想定し、それらは好ましくはｅｘ ｖｉｖｏで改変されて、次に再び導入され得る。この場合、生検又は他の組織試料若しくは生体液試料が必要となり得る。これに関して幹細胞もまた特に好ましい。しかし、当然ながらｉｎ ｖｉｖｏ実施形態もまた想定される。

特定の実施形態では、本発明は、目的のゲノム遺伝子座における標的配列の欠損によって引き起こされる状態を、それを必要としている対象（例えば、哺乳類又はヒト）又は非ヒト対象（例えば、哺乳類）において処置又は阻害する方法であって、標的配列の操作により対象又は非ヒト対象を改変することを含み、状態が標的配列の操作による処置又は阻害に対して感受性であり、天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物をナノ粒子複合体によって送達するステップを含む処置を提供することを含む方法を提供し、この組成物は、（Ａ）Ｉ．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系ＲＮＡ又はキメラＲＮＡ（ｃｈｉＲＮＡ）ポリヌクレオチド配列に機能的に連結された第１の調節エレメントであって、ポリヌクレオチド配列が、（ａ）真核細胞内の標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、（ｂ）ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、及び（ｃ）ｔｒａｃｒ配列を含む第１の調節エレメント、並びにＩＩ．少なくとも１つ以上の核局在化配列（又は、有利に２つの核局在化配列）を有利に含む、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結された第２の調節エレメント［（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は５’から３’への方向に並び、構成成分Ｉ及びＩＩは系の同じ又は異なるベクターに位置し、少なくとも構成成分Ｉ又はＩＩ又はＩ及びＩＩの両方を含む１つ又は複数のベクターがナノ粒子又はナノ粒子複合体によって送達され、及び転写されるとｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズ可能であり、かつガイド配列がＣＲＩＳＰＲ複合体と標的配列との配列特異的結合を誘導し、及びＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、及び（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズ可能なｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成するＣＲＩＳＰＲ酵素を含む］を含む１つ以上のベクターを含むベクター系を含む、天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を含むか、或いは（Ｂ）Ｉ．（ａ）真核細胞内の標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、及び（ｂ）少なくとも１つ以上のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に機能的に連結された第１の調節エレメント、ＩＩ．ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に機能的に連結された第２の調節エレメント、並びにＩＩＩ．ｔｒａｃｒ配列に機能的に連結された第３の調節エレメント［構成成分Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩは系の同じ又は異なるベクターに位置し、Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩの少なくとも１つに関するベクター、有利にはＩ、ＩＩ及びＩＩＩの全てに関するベクターがナノ粒子又はナノ粒子複合体によって送達され、及び転写されるとｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、かつガイド配列がＣＲＩＳＰＲ複合体と標的配列との配列特異的結合を誘導し、及びＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、及び（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズ可能なｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成するＣＲＩＳＰＲ酵素を含む］を含む１つ以上のベクターを含むベクター系を含む、天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を含む。一部の実施形態では、構成成分Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩは一緒に送達される。他の実施形態では、構成成分Ｉ及びＩＩは別々に送達される。他の実施形態では、構成成分Ｉ及びＩＩＩは一緒に送達されるが、構成成分ＩＩは別々に送達される。いずれにしても、ナノ粒子の使用、特に、心臓、筋肉又は肺の組織又は細胞を標的化するための使用は、本発明の態様である。

本発明の一部の方法は、発現の誘導を含むことができる。本発明の一部の方法では、生物又は対象は、真核生物（ヒトを含む哺乳類を含む）又は非ヒト真核生物又は非ヒト動物又は非ヒト哺乳類である。一部の実施形態では、生物又は対象は非ヒト動物であり、節足動物、例えば昆虫であってもよいし、線虫であってもよい。本発明の一部の方法では、生物又は対象は植物である。本発明の一部の方法では、生物又は対象は哺乳類又は非ヒト哺乳類である。非ヒト哺乳類は、例えば、齧歯類（好ましくは、マウス又はラット）、有蹄動物、又は霊長類であり得る。

一部の実施形態では、本発明はＣＲＩＳＰＲ酵素を送達することを包含し、例えばナノ粒子複合体によりＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするｍＲＮＡを細胞に送達することを含む。これらの方法のいくつかでは、ＣＲＩＳＰＲ酵素はＣａｓ９である。

本発明はさらに、医薬において、又は治療において、又はより一般的には、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子又はゲノム編集を含む本発明に従う方法において使用するために、発現のためのＣＲＩＳＰＲ複合体構成成分又はベクター、例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体、又はそのＣＲＩＳＰＲ酵素のＲＮＡ（これに含めて又は代替的に、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするｍＲＮＡ）を含有するナノ粒子複合体を包含する。本発明の一部の方法では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、触媒ドメインの１つにおいて１つ以上の突然変異を含む。

ＣＲＩＳＰＲ酵素の突然変異に関連して、酵素がＳｐＣａｓ９でない場合は、突然変異は、ＳｐＣａｓ９の１０位、７６２位、８４０位、８５４位、８６３位、及び／又は９８６位に対応する任意の又は全ての残基で起こり得る（例えば、標準的な配列比較ツールによって確認することができる）。特に、ＳｐＣａｓ９では、任意の又は全ての以下の突然変異が好ましい：Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ、及び／又はＤ９８６Ａ；さらに、任意の置換アミノ酸が保存的置換であることも想定される。一態様では、本発明は、本明細書に記載の任意の、又はそれぞれの、又は全ての実施形態を提供し、この実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素が、少なくとも１つ以上、又は少なくとも２つ以上の突然変異を含み、少なくとも１つ以上の突然変異又は少なくとも２つ以上の突然変異が、ＳｐＣａｓ９タンパク質におけるＤ１０、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、若しくはＤ９８６、例えば、ＳｐＣａｓ９におけるＤ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ、及び／若しくはＤ９８６Ａ、例えば、ＳａＣａｓ９におけるＮ５８０Ａ、又はＳｐ若しくはＳａのオーソログのＣａｓ９における任意の対応する突然変異である、或いはＣＲＩＳＰＲ酵素が、少なくとも１つの突然変異を含み、少なくともＳｐＣａｓ９におけるＨ８４０若しくはＮ８６３Ａ又はＳａＣａｓ９におけるＮ５８０Ａが突然変異し；例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＳｐＣａｓ９タンパク質におけるＨ８４０Ａ、若しくはＤ１０Ａ及びＨ８４０Ａ、若しくはＤ１０Ａ及びＮ８６３Ａ、又はＳｐタンパク質若しくはＳａタンパク質のオーソログのＣａｓ９における任意の対応する突然変異を含む。

本発明の一部の方法では、ＣＲＩＳＰＲ酵素はＣａｓ９ニッカーゼである。本発明は、薬剤の製造のため、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子又はゲノム編集のため、或いは本発明に従う方法で使用するために、発現のためのＣＲＩＳＰＲ複合体構成成分又はベクター、例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体、又はそのＣＲＩＳＰＲ酵素のＲＮＡ（これに含めて又は代替的に、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするｍＲＮＡ）を含有するナノ粒子複合体の使用を想定する。本発明は、発現のためのＣＲＩＳＰＲ複合体構成成分又はベクター、例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体、又はそのＣＲＩＳＰＲ酵素のＲＮＡ（これに含めて又は代替的に、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするｍＲＮＡ）を含有するナノ粒子複合体を包含し、特に、Ｃａｓ９が化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）又は黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９である（又はこれらに由来する）場合、標的配列はその３’末端において５’モチーフを含むＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）配列により隣接される。例えば、適切なＰＡＭは、ＳｐＣａｓ９又はＳａＣａｓ９酵素（又は由来酵素）については、５’−ＮＲＧ又は５’−ＮＮＧＲＲ（ここで、Ｎは任意のヌクレオチド）である。

ＳｐＣａｓ９又はＳａＣａｓ９が、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）又は黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９からのものである、或いはこれらに由来し、現在はＳａＣａｓ９が有利であると考えられていることは認識されるであろう。

本発明は、一部の実施形態では、細胞内の目的のゲノム遺伝子座におけるＤＮＡ二重鎖の逆鎖上の第１及び第２の標的配列の操作によりオフターゲット改変を最小限にすることによって生物又は非ヒト生物を改変する方法を包含し、本方法は、少なくとも１つのナノ粒子複合体により天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物又はその構成成分を送達するステップを含み、前記組成物は、
Ｉ．第１のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系キメラＲＮＡ（ｃｈｉＲＮＡ）ポリヌクレオチド配列であって、
（ａ）第１の標的配列にハイブリダイズ可能な第１のガイド配列、
（ｂ）第１のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、及び
（ｃ）第１のｔｒａｃｒ配列
を含む第１のポリヌクレオチド配列、
ＩＩ．第２のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系ｃｈｉＲＮＡポリヌクレオチド配列であって、
（ａ）第２の標的配列にハイブリダイズ可能な第２のガイド配列、
（ｂ）第２のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、及び
（ｃ）第２のｔｒａｃｒ配列
を含む第２のポリヌクレオチド配列、並びに
ＩＩＩ．少なくとも１つ以上の核局在化配列を含み、かつ１つ以上の突然変異を含む、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列
［（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は５’から３’への方向に並び、転写されると第１及び第２のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がそれぞれ第１及び第２のｔｒａｃｒ配列にハイブリッド形成し、かつ第１及び第２のガイド配列がそれぞれ、第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ複合体と、第１及び第２の標的配列との配列特異的結合を誘導し、第１のＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）第１の標的配列にハイブリダイズ可能な第１のガイド配列、及び（２）第１のｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズ可能な第１のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成するＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、第２のＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）第２の標的配列にハイブリダイズ可能な第２のガイド配列、及び（２）第２のｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズ可能な第２のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成するＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列はＤＮＡ又はＲＮＡであり、及び第１のガイド配列が第１の標的配列の近傍でＤＮＡ二重鎖の一方の鎖の切断を誘導し、第２のガイド配列が第２の標的配列の近傍で他方の鎖の切断を誘導して二本鎖切断を生じさせ、それにより、オフターゲット改変を最小限にすることによって生物又は非ヒト生物を改変する］
を含む。

本発明の一部の方法では、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列、第１及び第２のガイド配列、第１及び第２のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列又は第１及び第２のｔｒａｃｒ配列のいずれか又は全てがＲＮＡであり、及びＲＮＡは、ナノ粒子複合体によって有利に送達される。本発明のさらなる実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列、第１及び第２のガイド配列、第１及び第２のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列又は第１及び第２のｔｒａｃｒ配列を含むポリヌクレオチドはＲＮＡであり、ナノ粒子によって送達される。本発明の特定の実施形態では、第１及び第２のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列は１００％の同一性を共有し、及び／或いは第１及び第２のｔｒａｃｒ配列は１００％の同一性を共有する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、１つ以上のベクターを含むベクター系内に含まれ得る。本発明の好ましい実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素はＣａｓ９酵素、例えばＳｐＣａｓ９又はＳａＣａｓ９である。本発明の一態様では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は触媒ドメインに１つ以上の突然変異を含み、ここで、１つ以上の突然変異は、Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ及びＤ９８６Ａからなる群から選択される。極めて好ましい実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素はＤ１０Ａ突然変異を有する。好ましい実施形態では、第１のＣＲＩＳＰＲ酵素は、その酵素が相補鎖ニッキング酵素であるように１つ以上の突然変異を有し、第２のＣＲＩＳＰＲ酵素は、その酵素が非相補鎖ニッキング酵素であるように１つ以上の突然変異を有する。或いは、第１の酵素は非相補鎖ニッキング酵素であり、第２の酵素は相補鎖ニッキング酵素であり得る。

本発明の好ましい方法では、第１のガイド配列が第１の標的配列の近傍でＤＮＡ二重鎖の一方の鎖の切断を誘導し、第２のガイド配列が第２の標的配列の近傍で他方の鎖の切断を誘導することにより、５’オーバーハングが生じる。本発明の実施形態では、５’オーバーハングは最大で２００塩基対、好ましくは最大で１００塩基対、又はより好ましくは最大で５０塩基対である。本発明の実施形態では、５’オーバーハングは少なくとも２６塩基対、好ましくは少なくとも３０塩基対、又はより好ましくは３４〜５０塩基対である。

本発明は、一部の実施形態では、細胞内の目的のゲノム遺伝子座におけるＤＮＡ二重鎖の逆鎖上の第１及び第２の標的配列の操作によりオフターゲット改変を最小限にすることによって生物又は非ヒト生物を改変する方法を包含し、本方法は、少なくとも１つのナノ粒子複合体により天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物又はその構成成分を送達するステップを含み、前記組成物は、
Ｉ．第１の調節エレメントであって、
（ａ）第１の標的配列にハイブリダイズ可能な第１のガイド配列、及び
（ｂ）少なくとも１つ以上のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列
に機能的に連結している第１の調節エレメント、
ＩＩ．第２の調節エレメントであって、
（ａ）第２の標的配列にハイブリダイズ可能な第２のガイド配列、及び
（ｂ）少なくとも１つ以上のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列
に機能的に連結している第２の調節エレメント、
ＩＩＩ．ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に機能的に連結している第３の調節エレメント、及び
ＩＶ．ｔｒａｃｒ配列に機能的に連結している第４の調節エレメント
［構成成分Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶが系の同じ又は異なるベクターに位置し、転写されると、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、かつ第１及び第２のガイド配列がそれぞれ第１及び第２の標的配列に対する第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を誘導し、第１のＣＲＩＳＰＲ複合体が、（１）第１の標的配列にハイブリダイズ可能な第１のガイド配列、及び（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズ可能なｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、第２のＣＲＩＳＰＲ複合体が、（１）第２の標的配列にハイブリダイズ可能な第２のガイド配列、及び（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズ可能なｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列がＤＮＡ又はＲＮＡであり、及び第１のガイド配列が第１の標的配列の近傍でＤＮＡ二重鎖の一方の鎖の切断を誘導し、かつ第２のガイド配列が第２の標的配列の近傍で他方の鎖の切断を誘導して二本鎖切断を生じさせ、それにより、オフターゲット改変を最小限にすることによって生物又は非ヒト生物を改変する］を含む、１つ以上のベクターを含むベクター系を含む。

また本発明は、本明細書に記載されるようなベクター系も提供する。この系は１つ、２つ、３つ又は４つの異なるベクターを含むことができ、この系は、この系の構成成分を送達する１つ、２つ、３つ又は４つの異なるナノ粒子複合体を含むことができる。従って、構成成分Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶは１つ、２つ、３つ又は４つの異なるベクター上に位置することができ、１つ、２つ、３つ又は４つの異なるナノ粒子複合体（ナノ粒子複合体により送達されない系の部分については他の送達手段が想定される）によって送達されてもよく、本明細書では構成成分の可能な位置及び複合体の全ての組み合わせが想定される。例えば、構成成分Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶは同じベクター上に位置することができる；構成成分Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶはそれぞれ異なるベクター上に位置することができる；全ての位置の組み合わせを想定して、構成成分Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶは、合計２つ又は３つの異なるベクター上に位置することができる、など；及び構成成分Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶはナノ粒子複合体によって送達され得る；構成成分Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶはナノ粒子複合体によって送達され得る；全ての位置の組み合わせを想定して、構成成分Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶは、合計２つ又は３つの異なる複合体によって送達され得る、などである。そして、肺、心臓又は筋肉の組織又は細胞を標的化する複合体が有利である。

本発明の一部の方法では、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列、第１及び第２のガイド配列、第１及び第２のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列又は第１及び第２のｔｒａｃｒ配列のいずれか又は全てがＲＮＡであり、ナノ粒子複合体によって有利に送達される。本発明のさらなる実施形態では、第１及び第２のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列は１００％の同一性を共有し、及び／或いは第１及び第２のｔｒａｃｒ配列は１００％の同一性を共有する。本発明の好ましい実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素はＣａｓ９酵素、例えばＳｐＣａｓ９である。本発明の一態様では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は触媒ドメインに１つ以上の突然変異を含み、この１つ以上の突然変異は、Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ及びＤ９８６Ａからなる群から選択される。極めて好ましい実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素はＤ１０Ａ突然変異を有する。好ましい実施形態では、第１のＣＲＩＳＰＲ酵素はその酵素が相補鎖ニッキング酵素であるように１つ以上の突然変異を有し、第２のＣＲＩＳＰＲ酵素はその酵素が非相補鎖ニッキング酵素であるように１つ以上の突然変異を有する。或いは、第１の酵素は非相補鎖ニッキング酵素であってもよく、第２の酵素は相補鎖ニッキング酵素であってもよい。本発明のさらなる実施形態では、ベクター又はウイルスベクターの１つ又は複数はナノ粒子によって送達される。

本発明の好ましい方法では、第１のガイド配列が第１の標的配列の近傍でＤＮＡ二重鎖の一方の鎖の切断を誘導し、第２のガイド配列が第２の標的配列の近傍で反対の鎖の切断を誘導することにより、５’オーバーハングが生じる。本発明の実施形態では、５’オーバーハングは最大で２００塩基対、好ましくは最大で１００塩基対、又はより好ましくは最大で５０塩基対である。本発明の実施形態では、５’オーバーハングは少なくとも２６塩基対、好ましくは少なくとも３０塩基対、又はより好ましくは３４〜５０塩基対である。

本発明は、一部の実施形態では、目的の遺伝子産物をコードする二本鎖ＤＮＡ分子を含有及び発現する細胞内に、エンジニアリングされた天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を導入することによりオフターゲット改変を最小限にすることによって目的のゲノム遺伝子座を改変する方法を包含する。本方法において、導入は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の少なくとも一部（例えば、そのＲＮＡ、及び／又はＣａｓ９、及び／又はＣａｓ９をコードするベクター、及び／又はその系のＲＮＡを発現するベクター）を送達する少なくとも１つのナノ粒子複合体によって行われ、この系は、１つ以上の突然変異を有するＣａｓタンパク質と、ＤＮＡ分子の第１の鎖及び第２の鎖をそれぞれ標的化する２つのガイドＲＮＡとを含み、それにより、ガイドＲＮＡは遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を標的にし、Ｃａｓタンパク質は遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子の第１の鎖及び第２の鎖のそれぞれをニッキングし、それにより、遺伝子産物の発現が変更され、及びＣａｓタンパク質及び２つのガイドＲＮＡは天然に一緒に存在しない。

Ｃａｓタンパク質は遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子の第１の鎖及び第２の鎖のそれぞれをニッキングすることができ、５’オーバーハングを生じる。本発明の実施形態では、５’オーバーハングは最大で２００塩基対、好ましくは最大で１００塩基対、又はより好ましくは最大で５０塩基対である。本発明の実施形態では、５’オーバーハングは少なくとも２６塩基対、好ましくは少なくとも３０塩基対、又はより好ましくは３４〜５０塩基対である。

また本発明の実施形態は、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に融合したガイド配列及びｔｒａｃｒ配列を含むガイドＲＮＡも包含する。本発明の一態様では、Ｃａｓタンパク質は、真核細胞、好ましくは哺乳類細胞又はヒト細胞での発現にコドンが最適化されている。本発明のさらなる実施形態では、Ｃａｓタンパク質はＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質、例えばＣａｓ９タンパク質である。極めて好ましい実施形態では、Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９タンパク質、例えばＳｐＣａｓ９である。本発明の態様では、Ｃａｓタンパク質は、Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ及びＤ９８６Ａからなる群から選択される１つ以上の突然変異を有する。極めて好ましい実施形態では、Ｃａｓタンパク質はＤ１０Ａ突然変異を有する。

本発明の態様は、遺伝子産物の発現を低下させること、又は遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子に鋳型ポリヌクレオチドがさらに導入されること、又は２つの５’オーバーハングのリアニーリング及びライゲーションを可能にすることにより介在配列が正確に切り出されること、又は遺伝子産物の活性又は機能を変化させること、又は遺伝子産物の発現を増加させることに関する。本発明の実施形態では、遺伝子産物はタンパク質である。また鋳型ポリヌクレオチドはナノ粒子複合体によって導入され得る。

また本発明は、１つ以上の突然変異を有するＣａｓタンパク質と、細胞内の遺伝子産物をコードする二本鎖ＤＮＡ分子の第１の鎖及び第２の鎖をそれぞれ標的化する２つのガイドＲＮＡとを含む、エンジニアリングされた天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系も包含し、それにより、ガイドＲＮＡは遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を標的とし、Ｃａｓタンパク質は遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子の第１の鎖及び第２の鎖のそれぞれをニッキングし、それにより遺伝子産物の発現が変更され；及びＣａｓタンパク質及び２つのガイドＲＮＡは天然に一緒に存在せず；及びこの系若しくはその構成成分、又はこの系若しくはその構成成分の発現を引き起こすものはナノ粒子複合体によって送達され；及び有利には、複合体は心臓、筋肉又は肺の組織又は細胞を標的化する。

本発明の態様では、ガイドＲＮＡは、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に融合したガイド配列及びｔｒａｃｒ配列を含み得る。本発明の実施形態では、Ｃａｓタンパク質はＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質である。本発明の一態様では、Ｃａｓタンパク質は、真核細胞、好ましくは哺乳類細胞又はヒト細胞での発現にコドンが最適化されている。本発明のさらなる実施形態では、Ｃａｓタンパク質はＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質、例えばＣａｓ９タンパク質である。極めて好ましい実施形態では、Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９タンパク質、例えばＳｐＣａｓ９である。本発明の態様では、Ｃａｓタンパク質は、Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ及びＤ９８６Ａからなる群から選択される１つ以上の突然変異を有する。極めて好ましい実施形態では、Ｃａｓタンパク質はＤ１０Ａ突然変異を有する。

本発明の態様は、遺伝子産物の発現を低下させること、又は遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子に鋳型ポリヌクレオチドがさらに導入されること、又は２つの５’オーバーハングのリアニーリング及びライゲーションを可能にすることにより介在配列が正確に切り出されること、又は遺伝子産物の活性又は機能を変化させること、又は遺伝子産物の発現を増加させることに関する。本発明の実施形態では、遺伝子産物はタンパク質である。

また本発明は、
ａ）遺伝子産物をコードする二本鎖ＤＮＡ分子のそれぞれ第１の鎖及び第２の鎖を標的化する２つのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系ガイドＲＮＡのそれぞれに機能的に連結された第１の調節エレメントと、
ｂ）Ｃａｓタンパク質に機能的に連結された第２の調節エレメントと
を含む１つ以上のベクターを含む、エンジニアリングされた天然に存在しないベクター系も包含し、
構成成分（ａ）及び（ｂ）は系の同じ又は異なるベクター上に位置し、前記ベクターの少なくとも１つは１つ以上のナノ粒子複合体によって送達され、それによりガイドＲＮＡは遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を標的とし、Ｃａｓタンパク質は遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子の第１の鎖及び第２の鎖のそれぞれをニッキングし、それにより遺伝子産物の発現が変更される。ここでＣａｓタンパク質及び２つのガイドＲＮＡは天然に一緒に存在しない。

本発明の態様において、ガイドＲＮＡは、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に融合したガイド配列及びｔｒａｃｒ配列を含み得る。本発明のある実施形態において、Ｃａｓタンパク質はＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質である。本発明の態様において、Ｃａｓタンパク質は、真核細胞、好ましくは哺乳類細胞又はヒト細胞での発現にコドンが最適化されている。本発明のさらなる実施形態において、Ｃａｓタンパク質はＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質、例えばＣａｓ９タンパク質である。極めて好ましい実施形態において、Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９タンパク質、例えばＳｐＣａｓ９である。本発明の態様において、Ｃａｓタンパク質は、Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ及びＤ９８６Ａからなる群から選択される１つ以上の突然変異を有する。Ｃａｓタンパク質は、Ｄ１０Ａ突然変異を有することができる。

本発明の態様は、遺伝子産物の発現を低下させること、又は遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子に鋳型ポリヌクレオチドがさらに導入されること、又は２つの５’オーバーハングのリアニーリング及びライゲーションを可能にすることにより介在配列が正確に切り出されること、又は遺伝子産物の活性又は機能を変化させること、又は遺伝子産物の発現を増加させることに関する。本発明のある実施形態において、遺伝子産物はタンパク質である。本発明の好ましい実施形態において、系のベクターはウイルスベクターである。さらなる実施形態において、系のベクターは、ナノ粒子によって送達される。

一態様では、本発明は、真核細胞において標的ポリヌクレオチドを改変する方法を提供する。一部の実施形態では、本方法は、ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的ポリヌクレオチドへの結合を可能にして前記標的ポリヌクレオチドの切断をもたらし、それにより標的ポリヌクレオチドを改変するステップを含み、ここで、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、前記標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズするガイド配列と複合体を形成するＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、前記ガイド配列はｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に連結され、次にｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし；及び有利には、複合体又はその構成成分はナノ粒子複合体によって送達されている。一部の実施形態では、前記切断は、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素により標的配列の位置で１つ又は２つの鎖を切断することを含む。一部の実施形態では、前記切断は、標的遺伝子の転写の低下をもたらす。一部の実施形態では、本方法はさらに、前記切断された標的ポリヌクレオチドを、外因性鋳型ポリヌクレオチドとの相同組換えによって修復するステップを含み、前記修復は、前記標的ポリヌクレオチドの１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、又は置換を含む突然変異をもたらす。一部の実施形態では、前記突然変異は、標的配列を含む遺伝子からのタンパク質発現において１つ以上のアミノ酸変化をもたらす。一部の実施形態では、本方法はさらに、例えばナノ粒子複合体により、１つ以上のベクターを前記真核細胞に送達するステップを含み、ここで、１つ以上のベクターは、ＣＲＩＳＰＲ酵素、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に連結されたガイド配列、及びｔｒａｃｒ配列の１つ以上の発現を駆動する。一部の実施形態では、前記ベクターは対象において真核細胞に送達される。一部の実施形態では、前記改変は、細胞培養下で前記真核細胞において行われる。一部の実施形態では、本方法はさらに、前記改変の前に前記真核細胞を対象から単離するステップを含む。一部の実施形態では、本方法はさらに、前記真核細胞及び／又はそれに由来する細胞を前記対象に戻すステップを含む。

一態様では、本発明は、真核細胞におけるポリヌクレオチドの発現を変更する方法を提供する。一部の実施形態では、本方法は、ＣＲＩＳＰＲ複合体のポリヌクレオチドへの結合を可能にし、それにより、前記結合が前記ポリヌクレオチドの発現の増大又は減少をもたらすステップを含み、ここで、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、前記ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズするガイド配列と複合体を形成するＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、前記ガイド配列はｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に連結され、次にｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし；及び有利には、複合体又はその構成成分はナノ粒子複合体によって送達されている。一部の実施形態では、本方法はさらに、例えば１つ以上のナノ粒子複合体により、１つ以上のベクターを前記真核細胞に送達するステップを含み、ここで、１つ以上のベクターは、ＣＲＩＳＰＲ酵素、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に連結されたガイド配列、及びｔｒａｃｒ配列の１つ以上の発現を駆動する。

一態様では、本発明は、突然変異疾患遺伝子を含むモデル真核細胞を作成する方法を提供する。一部の実施形態では、疾患遺伝子は、疾患を有する又は発症するリスクの増大に関連する任意の遺伝子である。一部の実施形態では、本方法は、（ａ）１つ以上のベクターを真核細胞に導入するステップであって、１つ以上のベクターが、ＣＲＩＳＰＲ酵素、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に連結されたガイド配列、及びｔｒａｃｒ配列１つ以上の発現を駆動するステップと、（ｂ）ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的ポリヌクレオチドへの結合を可能にして、前記疾患遺伝子内の標的ポリヌクレオチドの切断をもたらすステップとを含み、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、及び（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズ可能なｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成するＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、それにより、突然変異疾患遺伝子を含むモデル真核細胞が生成され；及び有利には、複合体又はその構成成分はナノ粒子複合体により送達されている。一部の実施形態では、前記切断は、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素により標的配列の位置で１つ又は２つの鎖を切断することを含む。一部の実施形態では、前記切断は、標的遺伝子の転写の低下をもたらす。一部の実施形態では、本方法はさらに、前記切断された標的ポリヌクレオチドを、外因性鋳型ポリヌクレオチドとの相同組換えによって修復するステップを含み、前記修復は、前記標的ポリヌクレオチドの１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、又は置換を含む突然変異をもたらす。一部の実施形態では、前記突然変異は、標的配列を含む遺伝子からのタンパク質発現において１つ以上のアミノ酸変化をもたらす。

一態様では、本発明は、真核細胞において標的ポリヌクレオチドを改変する方法を提供する。一部の実施形態では、本方法は、ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的ポリヌクレオチドへの結合を可能にして前記標的ポリヌクレオチドの切断をもたらし、それにより標的ポリヌクレオチドを改変するステップを含み、ここで、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、前記標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズするガイド配列と複合体を形成するＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、前記ガイド配列はｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に連結され、次にｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし；及び有利には、複合体又はその構成成分はナノ粒子複合体によって送達されている。

他の実施形態では、本発明は、真核細胞においてポリヌクレオチドの発現を変更する方法を提供する。本方法は、ポリヌクレオチドに結合するＣＲＩＳＰＲ複合体を用いることによって標的ポリヌクレオチドの発現を増大又は低減するステップを含み；及び有利には、複合体又はその構成成分は、ナノ粒子複合体によって送達されている。

所望される場合には、細胞内の発現の変更をもたらすために、ｔｒａｃｒ配列、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に連結されたガイド配列、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列を含む１つ以上のベクターが細胞に送達され；及び有利には、複合体又はその構成成分はナノ粒子複合体によって送達されている。一部の方法では、１つ以上のベクターは、核局在化配列を含む前記ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に機能的に連結された調節エレメント；及びｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に機能的に連結された調節エレメント、及びｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列の上流にガイド配列を挿入するための１つ以上の挿入部位を含み；及び有利には、複合体又はその構成成分はナノ粒子複合体によって送達されている。発現されると、ガイド配列は、細胞内の標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を誘発する。通常、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、及び（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズ可能なｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成するＣＲＩＳＰＲ酵素を含み；及び有利には、複合体又はその構成成分はナノ粒子複合体によって送達されている。

一部の方法では、標的ポリヌクレオチドは不活性化されて、細胞内の発現の変更をもたらすことができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体が細胞内の標的配列に結合すると、標的ポリヌクレオチドは不活性され、従って配列が転写されなくなる、コードタンパク質が産生されなくなる、又は野生型配列のように配列が機能しなくなる。例えば、タンパク質又はｍｉｃｒｏＲＮＡコード配列は、タンパク質又はｍｉｃｒｏＲＮＡ又はｐｒｅ−ｍｉｃｒｏＲＮＡ転写物が産生されないように不活性化され得る。

特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素はＤ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ又はＤ９８６Ａからなる群から選択される１つ以上の突然変異を含み、及び／或いは１つ以上の突然変異はＣＲＩＳＰＲ酵素のＲｕｖＣ１又はＨＮＨドメイン内にあるか、又は本明細書中の他所で議論されるように突然変異である。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は触媒ドメイン内に１つ以上の突然変異を有し、転写されるとｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、かつガイド配列がＣＲＩＳＰＲ複合体と標的配列との配列特異的結合を誘導し、及び酵素はさらに機能ドメインを含む。一部の実施形態では、突然変異Ｃａｓ９酵素は、タンパク質ドメイン、例えば転写活性化ドメインなどに融合され得る。一態様では、機能ドメインは転写活性化ドメイン、好ましくはＶＰ６４である。一部の実施形態では、機能ドメインは転写抑制ドメイン、好ましくはＫＲＡＢである。一部の実施形態では、転写抑制ドメインはＳＩＤ、又はＳＩＤのコンカテマー（例えば、ＳＩＤ４Ｘ）である。一部の実施形態では、機能ドメインは後成的修飾ドメインであり、従って後成的修飾酵素が提供される。一部の実施形態では、機能ドメインは活性化ドメインであり、これは、Ｐ６５活性化ドメインであってもよい。

送達はベクターの形態でよく、特に送達がナノ粒子複合体による場合は、プラスミド又は他の核酸分子形態であってもよく；及びベクターはレンチウイルス又はバキュロウイルス又は好ましくはアデノウイルス／アデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクターであってもよいが、特にナノ粒子複合体によって送達されない複合体の態様に関して、他の送達手段（例えば、酵母系、微小胞、遺伝子銃／ベクターを金ナノ粒子に結合する手段など）が知られており、提供されている。ベクターは、ウイルス又は酵母系（例えば、目的の核酸がプロモーターに機能的に連結され得る、及びプロモーターの制御下にある（発現に関して、最終的にプロセシングされたＲＮＡを提供するためなど）場合）だけでなく、核酸の宿主細胞への直接的な送達も意味し得る；及び有利には、複合体又はその構成成分はナノ粒子複合体により送達される。また、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするｍＲＮＡを細胞へ送達するステップを含む、本発明のＣＲＩＳＰＲ酵素の送達方法も想定される；及び有利には、複合体又はその構成成分はナノ粒子複合体により送達された。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素がトランケート型であり、及び／又は１０００未満のアミノ酸又は４０００未満のアミノ酸で構成され、及び／又はヌクレアーゼ又はニッカーゼであり、及び／又はコドン最適化されており、及び／又は１つ以上の突然変異を含み、及び／又はキメラＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、及び／又は本明細書で議論されるような他の選択肢を含むことは認識されるであろう。ナノ粒子複合体により送達されない場合、ＡＡＶ及びレンチウイルスベクターが好ましい。

特定の実施形態では、標的配列は、その３’末端において、ＣＲＩＳＰＲ酵素、通常Ｃａｓ及び特にＣａｓ９に適したＰＡＭに隣接されるか、ＰＡＭが後に続く。

例えば、適切なＰＡＭは、ＳｐＣａｓ９又はＳａＣａｓ９酵素（又は由来酵素）についてはそれぞれ５’−ＮＲＧ又は５’−ＮＮＧＲＲである。

特定の実施形態では、本発明は１つ以上のガイドＲＮＡを含むナノ粒子製剤を提供し、これは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系との関連においてｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで送達される。

特定の実施形態では、ガイドＲＮＡ−ナノ粒子製剤を、Ｃａｓ９とは別に送達することが有用であり得る。このような例では、Ｃａｓ９がベクターにより送達され、ガイドＲＮＡがナノ粒子製剤において提供されるような二重送達系が想定される、ここで、ベクターは、最も広い観点から、具体的にウイルスベクターではなく、単に任意の送達手段であると考えられる。ガイドＲＮＡ−ナノ粒子製剤及びＣａｓ９の別々の送達は連続的であり得る（例えば、まずＣａｓ９ベクターがベクター系により送達された後、ｓｇＲＮＡ−ナノ粒子製剤が送達される）、或いはｓｇＲＮＡ−ナノ粒子製剤及びＣａｓ９が実質的に同時に送達され得る（即ち、同時送達）ことが想定され得る。連続的な送達は別々の時点で、数日隔てて、数週隔てて、又はさらに数カ月隔てて行われてもよい。

特定の実施形態では、１つ以上の送達ビヒクル中に処方された複数のガイドＲＮＡ（例えば、いくつかのガイドＲＮＡがベクター中で提供され、他はナノ粒子中に処方される場合）が、Ｃａｓ９送達系と共に提供され得る。

特定の実施形態では、Ｃａｓ９は、ナノ粒子製剤中でも送達される。このような例では、ガイドＲＮＡ−ナノ粒子製剤及びＣａｓ９ナノ粒子製剤は別々に送達されてもよいし、或いは実質的に同時に送達されてもよい（即ち、同時送達）。連続的な送達は別々の時点で、数日隔てて、数週隔てて、又はさらに数カ月隔てて行われ得る。

特定の実施形態では、１つ以上のガイドＲＮＡを含むナノ粒子製剤は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系との関連で、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｖｏにおいて、種々の標的遺伝子、種々の標的細胞又は種々の標的種々の組織／臓器、例えば心臓又は筋肉又は肺に送達するために適合される。１つ以上のガイドＲＮＡを含むナノ粒子製剤を用いた多重遺伝子ターゲティングも想定される。

実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の１つ以上の構成成分を含むナノ粒子製剤が提供される。

別の実施形態では、１つ以上のガイドＲＮＡを含むｇＲＮＡ−ナノ粒子製剤が提供される。

特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の１つ以上の構成成分を含むナノ粒子製剤を含む組成物が提供される。

特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の１つ以上の構成成分を含むナノ粒子製剤を含む医薬組成物が提供される。

特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の１つ以上の構成成分を含むナノ粒子製剤を含む組成物を投与するステップを含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏでの機能的遺伝子サイレンシングのための方法が提供される。

特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の１つ以上の構成成分を含むナノ粒子製剤を投与するステップを含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、及び／又はｉｎ ｖｉｖｏでの機能的遺伝子サイレンシングのための方法が提供される。

特定の実施形態では、１つ以上のガイドＲＮＡを含むｇＲＮＡ−ナノ粒子製剤を含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、及び／又はｉｎ ｖｉｖｏでの能的遺伝子サイレンシングのための方法が提供される。

特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の１つ以上の構成成分を含むナノ粒子製剤を投与するステップを含む、内皮細胞におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、及び／又はｉｎ ｖｉｖｏでの機能的遺伝子サイレンシングのための方法が提供される。

特定の実施形態では、１つ以上のガイドＲＮＡを含むｇＲＮＡ−ナノ粒子製剤を投与するステップを含む、内皮細胞におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、及び／又はｉｎ ｖｉｖｏでの機能的遺伝子サイレンシングのための方法が提供される。

特定の実施形態では、１つ以上のガイドＲＮＡを含むｇＲＮＡ−ナノ粒子製剤を含む、肺及び／又は心臓の内皮細胞におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、及び／又はｉｎ ｖｉｖｏでの機能的遺伝子サイレンシングのための方法が提供される。

特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の１つ以上の構成成分を含むナノ粒子製剤を含む組成物を投与することを含む、任意の組織又は臓器の内皮に関連する疾患又は障害に罹患している対象の治療方法。

特定の実施形態では、１つ以上のガイドＲＮＡを含むｇＲＮＡ−ナノ粒子製剤を投与することを含む、任意の組織又は臓器の内皮に関連する疾患又は障害に罹患している対象の治療方法。

活性を改善するために、複合体全体を粒子に処方する前に、ｓｇＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質と予め複合体が形成されてもよい。核酸の細胞内への送達を促進することが知られている種々の構成成分（例えば、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジテトラデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びコレステロール）を種々のモル比で用いて製剤を作製することができる。例えば、ＤＯＴＡＰ：ＤＭＰＣ：ＰＥＧ：コレステロールのモル比は、ＤＯＴＡＰ１００、ＤＭＰＣ０、ＰＥＧ０、コレステロール０；又はＤＯＴＡＰ９０、ＤＭＰＣ０、ＰＥＧ１０、コレステロール０；又はＤＯＴＡＰ９０、ＤＭＰＣ０、ＰＥＧ５、コレステロール５、ＤＯＴＡＰ１００、ＤＭＰＣ０、ＰＥＧ０、コレステロール０であり得る。従って、本発明は、ｓｇＲＮＡ、Ｃａｓ９タンパク質及び粒子を形成する構成成分を混合することと、このような混合から得られる粒子とを包含する。

粒子は、効率的なプロセスを用いて形成した。まず、有利にはヌクレアーゼを含まない滅菌緩衝液、例えば１×ＰＢＳ中、適切な温度、例えば１５〜３０Ｃ、例えば２０〜２５Ｃ、例えば室温で適切な時間、例えば１５〜４５分間、例えば３０分間、適切なモル比、例えば３：１〜１：３又は２：１〜１：２又は１：１モル比において、Ｃａｓ９タンパク質と遺伝子ＥＭＸ１又は対照遺伝子ＬａｃＺを標的化するｓｇＲＮＡとを一緒に混合した。別個に、界面活性剤、例えば、カチオン性脂質、例えば、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）；リン脂質、例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）；生分解性ポリマー、例えばエチレングリコールポリマー又はＰＥＧ、及びリポタンパク質、例えば低密度リポタンパク質、例えばコレステロールなどの、又はこれらを含む粒子構成成分を、アルコール、有利にはＣ_１〜６アルキルアルコール、例えばメタノール、エタノール、イソプロパノール、例えば１００％エタノール中に溶解した。２つの溶液を一緒に混合して、Ｃａｓ９−ｓｇＲＮＡ複合体を含有する粒子を形成した。従って、本発明は、例えば、ｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質混合物と、界面活性剤、リン脂質、生分解性ポリマー、リポタンパク質及びアルコールを含む、又はこれらから本質的になる、又はこれらからなる混合物とを混合するステップを含む、ｓｇＲＮＡ、Ｃａｓ９タンパク質及び粒子を形成する構成成分の混合と、ｇＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質を含有する粒子を形成するためのこのような方法と、それから形成される粒子とを包含する。

好ましい実施形態では、Ｃａｓ９−ｓｇＲＮＡ複合体を含有する粒子は、好ましくは酵素：ガイドＲＮＡ１：１のモル比で、Ｃａｓ９タンパク質及び１つ以上のｓｇＲＮＡを一緒に混合することによって形成され得る。別個に、好ましくはエタノール中に、核酸の送達を促進することが知られている種々の構成成分（例えば、ＤＯＴＡＰ、ＤＭＰＣ、ＰＥＧ、及びコレステロール）が溶解される。２つの溶液が一緒に混合されて、Ｃａｓ９−ｓｇＲＮＡ複合体を含有する粒子が形成される。粒子が形成されたら、Ｃａｓ９−ｓｇＲＮＡ複合体は、細胞（例えば、ＨＳＣ）内にトランスフェクトされ得る。バーコーディングが適用されてもよい。粒子、Ｃａｓ−９及び／又はｓｇＲＮＡがバーコーディングされ得る。

本発明の一態様では、国際公開第２０１３／１３８５８５Ａ１号パンフレットのバーコーディング技術が適用可能である、又は本発明の実施に組み込まれる。国際公開第２０１３／１３８５８５Ａ１号パンフレットは、複数の遺伝的に不均一な細胞型のそれぞれの生存率又は増殖に対する試験条件の効果を同時に決定するための方法を提供する。この方法は、複数（例えば、５、１０、２０、２５、又はそれ以上）の遺伝的に不均一な細胞型（個々の細胞型はそれ自体においては遺伝的に同種であるが、複数の細胞型の他のものとは異なる）を含む単位サンプルを提供するステップであって、各細胞型がさらに、（ｉ）細胞のゲノムに安定的に組み込まれた外因性核酸タグ、例えば、各細胞型に特有であり、複数の細胞型の全ての細胞において同じ増幅プライマー結合配列に隣接するコア配列を含むタグ、及び（ｉｉ）任意選択でマーカー、例えば、選択可能又は検出可能なマーカーを含み、及び各細胞型の既知の数の細胞がサンプル中に存在するステップと、選択された時間の間、サンプルを試験条件に暴露するステップと、各細胞型の外因性核酸タグのレベル（外因性核酸タグのレベルは、試験条件への暴露後のサンプル中の生細胞の数に比例する）を検出するステップと、試験条件への暴露後のサンプル中の生細胞の数を基準の細胞数と比較するステップと含む。基準の細胞数と比較したときの試験条件への暴露後のサンプル中の生細胞の数は、各細胞型の生存率又は増殖に対する試験条件の効果を示す。また国際公開第２０１３／１３８５８５Ａ１号パンフレットは、複数の遺伝的に不均一な細胞型のそれぞれの生存率又は増殖に対する試験条件の効果を同時に決定するための方法も提供する。この方法は、複数（例えば、５、１０、２０、２５、又はそれ以上）の遺伝的に不均一な細胞型を含む単位サンプルを提供するステップであって、各細胞型がさらに、（ｉ）例えば、各細胞型に特有であり、複数の細胞型の全ての細胞において同じ増幅プライマー結合配列に隣接するコア配列を含む、細胞のゲノムに安定的に組み込まれた外因性核酸タグ、及び（ｉｉ）任意選択で、選択可能又は検出可能なマーカーを含み、及び各細胞型の既知の数の細胞がサンプル中に存在するステップと、サンプルを生きている動物に移植するステップと、選択された時間の間、サンプルを試験条件に暴露するステップと、動物からサンプルを回収するステップと、サンプルの各細胞型の外因性核酸タグのレベル（外因性核酸タグのレベルは、試験条件への暴露後のサンプル中の生細胞の数と相関する）を検出するステップと、試験条件への暴露後のサンプル中の生細胞の数を基準の細胞数と比較するステップとを含む。基準の細胞数と比較したときの試験条件への暴露後のサンプル中の生細胞の数は、各細胞型の生存率又は増殖に対する試験条件の効果を示す。タグはＣａｓ９又は別のＴＡＧ、又は非ヒト真核生物、例えば、動物モデル内又は上に移植される細胞のゲノムに組み込まれるか、或いは非ヒトトランスジェニック真核生物、例えば、動物、哺乳類、霊長類、齧歯類、マウス、ラット、ウサギなどのゲノムに組み込まれた（Ｃａｓ９のコード化と共に）マーカーであり得る。試験条件は、Ｃａｓ９をガイドして１つ以上又は複数（例えば、３〜５０又はそれ以上）の突然変異を生じさせるためのＲＮＡの投与又は送達であり得る。試験条件は、推定の化学物質処置及び／又は遺伝子療法処置を伴う投与、送達又は接触であり得る。またタグは、１つ以上又は複数（例えば、３〜５０又はそれ以上）の突然変異であってもよく、試験条件は、推定化学物質処置及び／又は遺伝子療法処置を伴う投与、送達又は接触であり得る。

本発明は、実施形態では、ｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質混合物と、界面活性剤、リン脂質、生分解性ポリマー、リポタンパク質及びアルコールを含むか、又はこれらから本質的になるか、又はこれらからなる混合物とを混合するステップを含む、ｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質含有粒子の調製方法を包含する。実施形態は、この方法から得られるｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質含有粒子を包含する。本発明は、実施形態では、目的のゲノム遺伝子座を含有する細胞を粒子と接触させる（ｓｇＲＮＡが目的のゲノム遺伝子座を標的化する）ステップを含む、目的のゲノム遺伝子座における標的配列の操作による目的のゲノム遺伝子座、又は生物若しくは非ヒト生物の改変方法における、或いは目的のゲノム遺伝子座を含有する細胞を粒子と接触させる（ｓｇＲＮＡが目的のゲノム遺伝子座を標的化する）ステップを含む、目的のゲノム遺伝子座における標的配列の操作による目的のゲノム遺伝子座、又は生物若しくは非ヒト生物の改変方法における粒子の使用を包含する。

従って、本発明の目的は、本発明の範囲内に、既に記載されたあらゆる製品、製品の製造プロセス、又は製品の使用方法を含めないことであり、本出願人らは、あらゆる既知の製品、プロセス、又は方法の権利を留保するが、その放棄をここに明示する。本発明は、ＵＳＰＴＯ（米国特許法第１１２条の第１段落）又はＥＰＯ（ＥＰＣの第８３項）の記述及び実施可能要件を満たさない、あらゆる製品、プロセス、又はこのような製品の製造、又はこのような製品を使用する方法が本発明の範囲内に含まれないものとし、本出願人らは、既に記載されたあらゆる製品、製品の製造プロセス、又は製品の使用方法の権利を留保するが、その放棄をここに明示することにさらに留意されたい。

本開示、特に特許請求の範囲及び／又は段落では、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んだ（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」、及び「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの語は、米国特許法による意味を有し得；例えば、これらの語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含んだ（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」、及び「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味し；そして「〜本質的になっている（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」及び「〜本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」などの語が、米国特許法による意味を有し、例えば、明確に述べられていない要素は許容されるが、従来技術に見られる要素又は本発明の基本的又は新規な特徴に影響を与える要素は排除されることに留意されたい。本発明の実施において、条項５３（ｃ）ＥＰＣ及び規則２８（ｂ）及び（ｃ）ＥＰＣを順守することが有利であろう。本明細書において、誓約は存在しない。

これら及び他の実施形態が、開示される、又は以下の詳細な説明から明らかになり、かつこの説明に包含される。

本発明の新規な特徴は、特に添付の特許請求の範囲で説明される。本発明の原理が利用された例示的な実施形態を説明する以下の詳細な説明及び添付の図面から、本発明の特徴及び利点をより良く理解できるであろう。

ＣＲＩＳＰＲ系の図式モデルを示す。化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９ヌクレアーゼ（黄色）は、２０ｎｔガイド配列（青色）及び足場（赤色）からなる合成ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）によってゲノムＤＮＡを標的化する。必要な５’−ＮＧＧプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ；マゼンタ）のすぐ上流のＤＮＡ標的（青色）とのガイド配列塩基対、及びＣａｓ９は、ＰＡＭの約３ｂｐ上流（赤色三角）の二本鎖切断（ＤＳＢ）を媒介する。 例示的なＣＲＩＳＰＲ系、可能性のある作用機構、真核細胞における発現の適応例、並びに核局在化及びＣＲＩＳＰＲ活性を評価する試験の結果を示す。 標的例に対するＳｐＣａｓ９特異性の評価の結果を示す。 例示的なベクター系及び真核細胞における相同組換えの誘導におけるその使用の結果を示す。 プロトスペーサー配列の表を提供し、ヒト及びマウスゲノム中の遺伝子座に対して対応するＰＡＭと共に、例示的な化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）及びサーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ系に基づいて設計されたプロトスペーサー標的についての改変効率の結果を要約する。細胞をＣａｓ９及びｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ又はキメラＲＮＡのいずれかによりトランスフェクトし、トランスフェクションの７２時間後に分析した。インデルパーセントは、表示される細胞株からのＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイの結果に基づいて計算される（全てのプロトスペーサー標的についてＮ＝３、誤差はＳ．Ｅ．Ｍ．であり、Ｎ．Ｄ．はＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイを用いて検出できないことを示し、Ｎ．Ｔ．は本研究おいて試験しなかったことを示す）。 Ｃａｓ９媒介遺伝子ターゲティングについて、異なるｔｒａｃｒＲＮＡ転写物の比較を示す。 二本鎖切断に誘発された微小挿入及び欠失の検出のためのｓｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼアッセイの概略図を示す。 真核細胞におけるＣＲＩＳＰＲ系エレメントの発現のための例示的なバイシストロン性発現ベクターを示す。 ヒトゲノム中の隣接する化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＳＦ３７０遺伝子座１ＰＡＭ（ＮＧＧ）（図９Ａ）及びサーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＬＭＤ９遺伝子座２ＰＡＭ（ＮＮＡＧＡＡＷ）（図９Ｂ）の間の距離のヒストグラム；及び染色体（Ｃｈｒ）による各ＰＡＭに対する距離（図９Ｃ）を示す。 例示的なＣＲＩＳＰＲ系、真核細胞における発現のための適応例、及びＣＲＩＳＰＲ活性を評価する試験の結果を示す。 哺乳類細胞におけるゲノム遺伝子座のターゲティングのためのＣＲＩＳＰＲ系の例示的な操作を示す。 哺乳類細胞におけるｃｒＲＮＡプロセシングのノーザンブロット分析の結果を示す。 ヒトＰＶＡＬＢ及びマウスＴｈ遺伝子座におけるプロトスペーサーの例示的な選択を示す。 ヒトＥＭＸ１遺伝子座におけるサーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ系のプロトスペーサー例及び対応するＰＡＭ配列標的を示す。 Ｓｕｒｖｅｙｏｒ、ＲＦＬＰ、ゲノムシークエンシング、及びノーザンブロットアッセイのために使用されるプライマー及びプローブについての配列の表を提供する。 大型Ｃａｓ９（約１４００アミノ酸）の３つの群及び小型Ｃａｓ９（約１１００アミノ酸）の２つの群を含む５つのＣａｓ９ファミリーを明らかにする系統発生分析の環状表示を示す。 大型Ｃａｓ９（約１４００アミノ酸）の３つの群及び小型Ｃａｓ９（約１１００アミノ酸）の２つの群を含む５つのＣａｓ９ファミリーを明らかにする系統発生分析の線形表示を示す。 相同組換えによるゲノム編集を示す。（ａ）ＲｕｖＣＩ触媒ドメイン内のＤ１０Ａ突然変異を有するＳｐＣａｓ９ニッカーゼの概略図。（ｂ）修復鋳型としてセンス又はアンチセンス一本鎖オリゴヌクレオチドのいずれかを用いたヒトＥＭＸ１遺伝子座における相同組換え（ＨＲ）を表す概略図。上方の赤色矢印はｓｇＲＮＡ切断部位を示し；遺伝子型同定のためのＰＣＲプライマー（表Ｊ及びＫ）は右側パネルの矢印として示される。（ｃ）ＨＲによって改変された領域の配列。ｄ、ＥＭＸ１標的１遺伝子座における野生型（ｗｔ）及びニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）ＳｐＣａｓ９媒介インデルについてのＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイ（ｎ＝３）。矢印は、予測される断片サイズの位置を示す。 ＳｐＣａｓ９のための単一ベクター設計を示す。 Ｃａｓ９オルソログの長さ分布を表すグラフを示す。 突然変異点がＳｐＣａｓ９遺伝子内に位置する配列を示す。 条件的なＣａｓ９、Ｒｏｓａ２６ターゲティングベクターマップを示す。 構成的なＣａｓ９、Ｒｏｓａ２６ターゲティングベクターマップを示す。 構成的及び条件的なＣａｓ９構築物における重要なエレメントの概略図を示す。 細胞内へのＣａｓ９及びキメラＲＮＡのＲＮＡ送達を示す。（Ａ）Ｎｅｕｒｏ−２Ａ細胞へのＤＮＡ又はｍＲＮＡのいずれかとしてのＧＦＰレポーターの送達。（Ｂ）ＲＮＡとしてのＩｃａｍ２遺伝子に対するＣａｓ９及びキメラＲＮＡの送達は、試験した２つのスペーサーのうちの１つに対して切断をもたらす。（Ｃ）ＲＮＡとしてのＦ７遺伝子に対するＣａｓ９及びキメラＲＮＡの送達は、試験した２つのスペーサーのうちの１つに対して切断をもたらす。 ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）修復が遺伝子編集をどのように促進するかを示す。エラープローン非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路において、ＤＳＢの末端は内因性ＤＮＡ修復機構によってプロセシングされ、一緒に再結合され、これは、接合部位においてランダム挿入／欠失（インデル）突然変異をもたらし得る。遺伝子のコード領域内で生じるインデル突然変異はフレームシフト及び未成熟終止コドンを生じることができ、遺伝子ノックアウトがもたらされる。或いは、プラスミド又は一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）の形態の修復鋳型を供給して、高い忠実性及び正確な編集を可能にする相同組換え修復（ＨＤＲ）経路を活用することができる。 ＨＥＫ及びＨＵＥＳ９細胞におけるＨＤＲについて予想される結果を示す。（ａ）相同性アームを有するターゲティングプラスミド又はｓｓＯＤＮ（センス又はアンチセンス）のいずれかを使用して、Ｃａｓ９によって切断される標的ゲノム遺伝子座（赤色三角）において配列を編集することができる。ＨＤＲの効率をアッセイするために、本発明者らは、ＨｉｎｄＩＩＩ部位（赤色バー）を標的遺伝子座に導入し、これを、相同性の領域外でアニールするプライマーによりＰＣＲ増幅した。ＨｉｎｄＩＩＩによるＰＣＲ産物の消化は、ＨＤＲイベントの発生を明らかにする。（ｂ）目的の遺伝子座に対してセンス又はアンチセンス（ｓ又はａ）のいずれかの方向に向けられたｓｓＯＤＮをＣａｓ９と組み合わせて使用して、標的遺伝子座において効率的なＨＤＲ媒介編集を達成することができる。改変の両側に４０ｂｐ、好ましくは９０ｂｐの最小相同性領域が推奨される（赤色バー）。（ｃ）野生型Ｃａｓ９及びＣａｓ９ニッカーゼ（Ｄ１０Ａ）の両方を用いて、ＥＭＸ１遺伝子座においてＨＤＲに対するｓｓＯＤＮの効果の例が示される。各ｓｓＯＤＮは、２つの制限部位の１２ｂｐの挿入に隣接する９０ｂｐの相同性アームを含有する。 嚢胞性線維症ΔＦ５０８突然変異のための修復戦略を示す。 Ｔｅｔ１〜３及びＤｎｍｔ１、３ａ及び３ｂ遺伝子座の効率的なＳｐＣａｓ９媒介ターゲティングのスクリーニングを示す。トランスフェクトしたＮ２Ａ細胞からのＤＮＡにおけるＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイは、異なるｇＲＮＡの使用により効率的なＤＮＡ切断を実証する。 ＡＡＶ１／２送達系において２ベクター系を用いる多重ゲノムターゲティングの戦略を示す。Ｔｅｔ１〜３及びＤｎｍｔ１、３ａ及び３ｂ ｇＲＮＡはＵ６プロモーターの制御下にある。ＧＦＰ−ＫＡＳＨはヒトシナプシンプロモーターの制御下にある。制限側（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｓｉｄｅ）は、サブクローニングによる単純なｇＲＮＡ置換戦略を示す。２つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）に隣接されたＨＡタグ化ＳｐＣａｓ９が示される。両方のベクターが、１：１の比率でＡＡＶ１／２ウイルスによって脳内に送達される。 Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイを用いた多重ＤＮＭＴターゲティングベクター＃１の機能性の検証を示す。ＤＮＭＴ遺伝子ファミリー遺伝子座のＳｐＣａｓ９媒介切断を試験するために、ＤＮＭＴターゲティングベクター＃１（＋）及びＳｐＣａｓ９コードベクターによりＮ２Ａ細胞をコトランスフェクトした。ｇＲＮＡのみ（−）は負の対照である。トランスフェクションの４８時間後にＤＮＡ精製及び下流プロセシングのために細胞を回収した。 Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイを用いた多重ＤＮＭＴターゲティングベクター＃２の機能性の検証を示す。ＤＮＭＴ遺伝子ファミリー遺伝子座のＳｐＣａｓ９媒介切断を試験するために、ＤＮＭＴターゲティングベクター＃１（＋）及びＳｐＣａｓ９コードベクターによりＮ２Ａ細胞をコトランスフェクトした。ｇＲＮＡのみ（−）は負の対照である。トランスフェクションの４８時間後にＤＮＡ精製及び下流プロセシングのために細胞を回収した。 ｉｎ ｖｉｖｏでのＨＡ−ＳｐＣａｓ９発現のために使用される短いプロモーター及び短いポリＡバージョンの図式的な外観を示す。Ｌ−ＩＴＲからＲ−ＩＴＲまでのコード領域のサイズは右側に示される。 ｉｎ ｖｉｖｏでのＨＡ−ＳａＣａｓ９発現のために使用される短いプロモーター及び短いポリＡバージョンの図式的な外観を示す。Ｌ−ＩＴＲからＲ−ＩＴＲまでのコード領域のサイズは右側に示される。 Ｎ２Ａ細胞におけるＳｐＣａｓ９及びＳａＣａｓ９の発現を示す。種々の短いプロモーターの制御下で、短いポリＡ（ｓｐＡ）配列を有するＨＡタグ化ＳｐＣａｓ９及びＳａＣａｓ９バージョンの代表的なウエスタンブロット。チューブリンは負荷対照である。ｍＣｈｅｒｒｙ（ｍＣｈ）はトランスフェクション対照である。トランスフェクションの４８時間後に細胞を回収し、ウエスタンブロッティングのためにさらにプロセシングした。 Ｔｅｔ３遺伝子座の効率的なＳａＣａｓ９媒介ターゲティングのスクリーニングを示す。トランスフェクトしたＮ２Ａ細胞からのＤＮＡにおけるＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイは、ＮＮＧＧＧＴ ＰＵＭ配列を有する異なるｇＲＮＡを用いることによって効率的なＤＮＡ切断を実証する。ＧＦＰトランスフェクト細胞及びＳａＣａｓ９のみを発現する細胞は対照である。 マウス脳におけるＨＡ−ＳａＣａｓ９の発現を示す。ヒトシナプシンプロモーターの制御下でＨＡ−ＳａＣａｓ９の発現を駆動するウイルスを動物の歯状回に注入した。手術の２週間後に動物を屠殺した。ウサギモノクローナル抗体Ｃ２９Ｆ４（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を用いてＨＡタグを検出した。ＤＡＰＩ染色により細胞核を青色に染色した。 形質導入の７日後の培養下の皮質初代ニューロンにおけるＳｐＣａｓ９及びＳａＣａｓ９の発現を示す。種々のプロモーターの制御下で、ｂｇｈ又は短いポリＡ（ｓｐＡ）配列を有するＨＡタグ付きＳｐＣａｓ９及びＳａＣａｓ９バージョンの代表的なウエスタンブロット。チューブリンは負荷対照である。 種々のプロモーターを有するＳｐＣａｓ９及び多重ｇＲＮＡ構築物を保有するＡＡＶ１粒子による形質導入の７日後の初代皮質ニューロンのＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色を示す（最後のパネルにはＤＮＭＴについての例が示される）。ＡＡＶ形質導入後のニューロンを、対照の非形質導入ニューロンと比較した。赤色の核は透過処理された死細胞を示す（パネルの２列目）。生細胞は緑色で示される（パネルの３列目）。 種々のプロモーターを有するＳａＣａｓ９を保有するＡＡＶ１粒子による形質導入の７日後の初代皮質ニューロンのＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色を示す。赤色の核は透過処理された死細胞を示す（パネルの２列目）。生細胞は緑色で示される（パネルの３列目）。 ＴＥＴ及びＤＮＭＴ遺伝子座について、ＳｐＣａｓ９及びｇＲＮＡ多重体を保有するＡＡＶ１ウイルスによる形質導入後のニューロンのモルホロジー比較を示す。形質導入を伴わないニューロンは対照として示される。 初代皮質ニューロンにおけるＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイを用いた多重ＤＮＭＴターゲティングベクター＃１機能性の検証を示す。ＤＮＭＴ遺伝子ファミリー遺伝子座のＳｐＣａｓ９媒介切断を試験するために、ＤＮＭＴターゲティングベクター＃１及び種々のプロモーターを有するＳｐＣａｓ９ウイルスにより細胞を同時導入トした。 脳におけるＳｐＣａｓ９切断のｉｎ ｖｉｖｏ効率を示す。２つの異なるプロモーター：マウスＭｅｃｐ２及びラットＭａｐ１ｂの制御下でＳｐＣａｓ９ウイルスと一緒にＤＮＭＴファミリー遺伝子座を標的とするｇＲＮＡ多重体を保有するＡＡＶ１／２ウイルスをマウスに注射した。注射の２週間後に、脳組織を摘出し、ｇＲＮＡ多重構築物からのシナプシンプロモーターにより駆動されるＧＦＰ発現に基づいて、ＦＡＣＳを用いて核を調製及び選別した。ｇＤＮＡ抽出の後、Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイを実行した。＋はＧＦＰ陽性核を示し、−は同じ動物からの対照のＧＦＰ陰性核を示す。ゲル上の数字は評価したＳｐＣａｓ９効率を示す。 海馬ニューロンからのＧＦＰ−ＫＡＳＨ標識細胞核の精製を示す。細胞核膜の核外膜（ＯＮＭ）は、ＧＦＰ及びＫＡＳＨタンパク質膜貫通ドメインの融合物によりタグ化される。定位手術及びＡＡＶ１／２注射の１週間後に脳における強力なＧＦＰ発現。インタクトな脳から細胞核を精製するための密度勾配遠心分離ステップ。精製した核が示される。Ｖｙｂｒａｎｔ（登録商標）ＤｙｅＣｙｃｌｅ^ＴＭＲｕｂｙ染色によるクロマチン染色は赤色で示され、ＧＦＰ標識核は緑色である。ＧＦＰ＋及びＧＦＰ−細胞核の代表的なＦＡＣＳプロファイル（マゼンタ：Ｖｙｂｒａｎｔ（登録商標）ＤｙｅＣｙｃｌｅ^ＴＭＲｕｂｙ染色、緑色：ＧＦＰ）。 マウス脳におけるＳｐＣａｓ９切断の効率を示す。２つの異なるプロモーター：マウスＭｅｃｐ２及びラットＭａｐ１ｂの制御下でＳｐＣａｓ９ウイルスと一緒にＴＥＴファミリー遺伝子座を標的とするｇＲＮＡ多重体を保有するＡＡＶ１／２ウイルスをマウスに注射した。注射の３週間後に、脳組織を摘出し、ｇＲＮＡ多重構築物からのシナプシンプロモーターにより駆動されるＧＦＰ発現に基づいて、ＦＡＣＳを用いて核を調製及び選別した。ｇＤＮＡ抽出の後、Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイを実行した。＋はＧＦＰ陽性核を示し、−は同じ動物からの対照のＧＦＰ陰性核を示す。ゲル上の数字は評価したＳｐＣａｓ９効率を示す。 培養下の皮質ニューロンにおけるＧＦＰ−ＫＡＳＨ発現を示す。ＴＥＴ遺伝子座を標的とするｇＲＮＡ多重構築物を保有するＡＡＶ１ウイルスによりニューロンを形質導入した。ＫＡＳＨドメインの局在化のために、最強のシグナルは細胞核のまわりに局在化する。 Ｃｒｅ依存的Ｃａｓ９マウスの作製及びｉｎ ｖｉｖｏゲノム編集のためのその用途を示す。（ａ）Ｃａｓ９Ｒｏｓａ２６ターゲティングベクター及びノックイン概略図。導入遺伝子には、（１）５’相同性アーム、（２）普遍的に発現されるＣＡＧプロモーター、（３）Ｃｒｅ依存的なｌｏｘＰ−３ｘＳＶ４０ｐｏｌｙＡ−ｌｏｘＰ停止カセット（ＬＳＬ）、（４）３ｘＦＬＡＧエピトープタグ、（５）２つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）に隣接される化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９、（６）ＷＰＲＥ、（７）ウシ成長ホルモンポリＡ、（８）ｐＰＧＫ−Ｎｅｏ−ｐＡ陽性選択カセット、（９）３’Ｒｏｓａ２６相同性アーム、及び（１０）ｐＰＧＫ−ＤＴＡ−ｐＡ陰性選択カセットが含まれる。（ｂ）定位明視野及びＥＧＦＰイメージングであり、構成的Ｃａｓ９発現マウスにおけるＣａｓ９−Ｐ２Ａ−ＥＧＦＰの構成的な発現を示す。（ｃ）全脳ライセートの免疫ブロットであり、構成的Ｃａｓ９発現マウスでは予測分子量（１６７ｋＤａ）の３ｘＦＬＡＧ−Ｃａｓ９染色を示すが、野生型（ＷＴ）マウスでは示さない。ベータ−チューブリン及びＧＡＰＤＨは、負荷対照として使用した。（ｄ）ＡＡＶベクターの概略図。（ｅ）ＮｅｕＮターゲティング設計及び代表的なＩｌｌｕｍｉｎａシークエンシング測定値であり、予測切断部位（赤色矢印）付近のインデルの形成を示す。（ｆ）開頭注射の概略図であり、Ｃｒｅ依存的Ｃａｓ９マウスの前頭前野に、ＡＡＶ１／２によりｓｇＮｅｕＮ及びＣｒｅ注入したことを示す。（ｇ）鋭く切開した注射部位の免疫ブロットであり、ｓｇＮｅｕＮ注射した半球ではＮｅｕＮの欠乏を示し、注射しなかった反対側の部位（ＣＴＲ）又はＷＴ動物では示さなかった。Ｃａｓ９発現（ａｎｔｉ−３ｘＦＬＡＧ）だけがＣｒｅ送達において検出される（ａｎｔｉ−Ｃｒｅ−ＨＡ）。ベータ−チューブリンは、負荷対照として使用した。（ｈ）前頭前野に注射されたＣｒｅ依存的Ｃａｓ９マウス代表的な免疫蛍光画像であり、Ｃｒｅ発現がＬＳＬカセットを切除して、Ｃａｓ９−Ｐ２Ａ−ＥＧＦＰ発現及びＮｅｕＮ欠乏をもたらすことを示す。下側の行は、感染細胞と非感染細胞の間の境界の拡大図である。スケールバーは２００μｍ（上側）及び５０μｍ（下側）である。（ｉ）前頭前野に両側的に注射されたＣｒｅ依存的Ｃａｓ９マウスの代表的な免疫蛍光画像であり、ｓｇＮｅｕＮ注射半球においてのみＮｅｕＮ欠乏を示し、ｓｇＬａｃＺ注射した半球では示さなかった。スケールバー、２００μｍ。（ｊ）免疫ブロット定量化であり、ｓｇＮｅｕＮ注射したＣｒｅ依存的Ｃａｓ９マウスにおいて有意なＮｅｕＮ欠乏を示し、ｓｇＬａｃＺ注射したＣｒｅ依存的Ｃａｓ９マウスでは示さなかった。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝３マウス）としてプロットされる。^＊＊＊ｐ値＜０．０００５。（ｋ）鋭く切開した脳組織（ｊの場合と同様）からの増幅ＤＮＡからのディープシークエンシングを用いたインデル定量化であり、ｓｇＮｅｕＮ注射したＣｒｅ依存的Ｃａｓ９マウスにおいて有意なインデルを示し、ｓｇＬａｃＺ注射したＣｒｅ依存的Ｃａｓ９マウスでは示さなかった。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝３マウス）としてプロットされる。^＊＊＊ｐ値＜０．０００５。（ｌ）ＡＡＶ−ｓｇＲＮＡにより形質導入されたニューロンの単核遺伝子型同定であり、両方のアレルにおいて細胞の大部分が改変されたことを示す。データは１６７核の平均としてプロットされる。（ｍ）単核アレル突然変異の分析であり、センス（ｓｅｎ）及びミスセンス（ｍｉｓ）突然変異の分布を示す。データは、ヘテロ接合核及びホモ接合核に対してそれぞれ１５及び１４１核の平均としてプロットされる。 細胞型特異的Ｃａｓ９発現及び正常なニューロンの電気生理学を示す。（ａ）ＴＨ−ＩＲＥＳ−Ｃｒｅドライバーと交配したＣｒｅ依存的Ｃａｓ９マウスからの子孫における黒質の代表的な免疫蛍光画像。ダブルの白色矢印は、ＴＨ及びＣａｓ９−Ｐ２Ａ−ＥＧＦＰを発現する細胞を強調する。シングルの白色矢印は、ＴＨもＣａｓ９−Ｐ２Ａ−ＥＧＦＰも発現しない細胞を強調する。スケールバー、５０μｍ。（ｂ）ＰＶ−Ｃｒｅドライバーと交配したＣｒｅ依存的Ｃａｓ９マウスからの子孫における視床の代表的な免疫蛍光画像。ダブルの白色矢印は、ＰＶ及びＣａｓ９−Ｐ２Ａ−ＥＧＦＰを発現する細胞を強調する。シングルの白色矢印は、ＰＶもＣａｓ９−Ｐ２Ａ−ＥＧＦＰも発現しない細胞を強調する。スケールバー、５０μｍ。（ｃ−ｄ）（ｃ）野生型（ＷＴ）及び（ｄ）構成的Ｃａｓ９発現ニューロンからの代表的な電流固定記録及び活動電位発火。（ｅ−ｈ）海馬切片の電気生理学的測定であり、測定基準：（ｅ）基電流、（ｆ）入力抵抗、（ｇ）全細胞容量、及び（ｈ）膜静止電位を用いて、構成的Ｃａｓ９発現ニューロンと、ＷＴマウスからのニューロンとの間に有意差がないことを示す。データは平均±ＳＥＭとしてプロットされる。ＷＴについては２匹のマウスからのｎ＝１２ニューロンであり、構成的Ｃａｓ９発現マウスについては匹のマウスからのｎ＝１５ニューロンである。ｎｓは有意でない。（補表２に関連）。 構成的Ｃａｓ９発現マウスの内皮細胞へのｓｇＲＮＡのナノ粒子送達を示す。（ａ）ナノ粒子：ｓｇＲＮＡの静脈内（ｉ．ｖ．）送達及び下流のアッセイの概略図。（ｂ）動的光散乱（ＤＬＳ）、サイズ分布プロットであり、７Ｃ１：ｓｇＲＮＡナノ粒子が小さい多重膜構造を形成したことを示す（Ｄａｈｌｍａｎ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．９，６４８−６５５（２０１４））。データは平均±ＳＥＭとしてプロットされる。挿入図：７Ｃ１：ｓｇＲＮＡのＣｒｙｏＴＥＭ画像。スケールバー、５０μｍ。（ｃ）ＩＣＡＭ２遺伝子座ターゲティングの概略図及びディープシークエンシング測定値であり、予測切断部位におけるインデルを示す。（ｄ−ｅ）肺（ｄ）及び心臓（ｆ）から選別された内皮（ＣＤ３１^＋及びＣＤ４５⁻）細胞のインデル分析であり、ｓｇＩＣＡＭ２−１＋２０注射した構成的Ｃａｓ９発現マウスにおいて有意なインデルパーセントを示し、ｓｇＬａｃＺ注射した構成的Ｃａｓ９発現マウスでは示さない。データは平均±ＳＥＭとしてプロットされる。^＊＊＊ｐ値＜０．０００５。（ｆ−ｇ）肺（ｆ）及び心臓（ｇ）から分離した内皮（ＣＤ３１^＋及びＣＤ４５⁻）細胞におけるＩＣＡＭ２発現のフローサイトメトリー定量化であり、ｓｇＩＣＡＭ２−１＋２０注射した構成的Ｃａｓ９発現マウスにおいて有意なタンパク質欠乏を示すが、ＬａｃＺ注射した構成的Ｃａｓ９発現マウスでは示さない。データは蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）±ＳＥＭとしてプロットされる。^＊ｐ値＜０．０５、^＊＊ｐ値＜０．００５、^＊＊＊ｐ値＜０．０００５。（ｈ）研究期間に対する体重変化のプロットであり、有意な変化を示さない。データ点は０日目を基準として基準化される。 種々の臓器におけるＣａｓ９−Ｐ２Ａ−ＥＧＦＰ発現を示す。定位画像は、構成的Ｃａｓ９発現マウスからのＣａｓ９−Ｐ２Ａ−ＥＧＦＰ陽性臓器を示すが、野生型マウスからは示さない。 厳密に制御されたＣａｓ９発現を示す。代表的な蛍光画像は、Ｃｒｅ依存的Ｃａｓ９及び野生型マウスにおいてＥＧＦＰ及びＦＬＡＧ染色がないことを示す。 構成的Ｃａｓ９発現マウスの正常細胞のモルホロジーを示す。構成的Ｃａｓ９発現マウス及び野生型マウスからのＨＥ染色組織の代表的な明視野画像。 構成的Ｃａｓ９発現マウスにおいて検出可能なＤＮＡ損傷又はアポトーシスを示さない。ｙＨ２ＡＸ（ＤＮＡ損傷のマーカー）、及び切断カスパーゼ３（ＣＣ３）（後期アポトーシスのマーカー）の、構成的Ｃａｓ９発現マウス及び野生型マウスからの染色組織の代表的な明視野画像。 ＩＣＡＭ２標的化ｓｇＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ検証を示す。（ａ）ＩＣＡＭ２遺伝子座の概略図であり、ｓｇＩＣＡＭ２エクソン標的の位置を示す。ＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼアッセイゲルは、ほとんどのｓｇＲＮＡについてインデルの形成を示す。相対的なバンド強度を用いてインデルパーセントを定量化して下方にプロットした。赤色矢印はＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼ反応からの予測切断産物を強調する。（ｂ）ＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼアッセイは、（図４８ｃ）のインデル分析に使用した同じサンプルに対応する。赤色矢印は、ＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼ反応からの予測切断産物を強調する。

本明細書の図面は単に説明のためのものであって、必ずしも正確な縮尺で描かれているわけではない。

ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系、その構成成分、及びこのような構成成分の送達（方法、材料、送達ビヒクル、ベクター、粒子、ウイルスベクター、アデノウイルス、ＡＡＶ、レンチウイルスを含む）、並びにこれらの製造及び使用（量及び製剤に関するものを含む）に関する一般情報（全て本発明の実施において有用である）については以下が参照される：米国特許第８，６９７，３５９号明細書、同第８，７７１，９４５号明細書、同第８，７９５，９６５号明細書、同第８，８６５，４０６号明細書、同第８，８７１，４４５号明細書、同第８，８８９，３５６号明細書、同第８，８８９，４１８号明細書、及び同第８，８９５，３０８号明細書；米国特許出願公開第２０１４−０３１０８３０号明細書（米国特許出願第１４／１０５，０３１号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０２８７９３８Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２１３，９９１号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０２７３２３４Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２９３，６７４号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０２７３２３２Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２９０，５７５号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０２７３２３１号明細書（米国特許出願第１４／２５９，４２０号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０２５６０４６Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２２６，２７４号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０２４８７０２Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２５８，４５８号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０２４２７００Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２２２，９３０号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０２４２６９９Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１８３，５１２号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０２４２６６４Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１０４，９９０号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０２３４９７２Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１８３，４７１号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０２２７７８７Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２５６，９１２号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０１８９８９６Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１０５，０３５号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０１８６９５８号明細書（米国特許出願第１４／１０５，０１７号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０１８６９１９Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１０４，９７７号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０１８６８４３Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１０４，９００号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０１７９７７０Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１０４，８３７号明細書）及び米国特許出願公開第２０１４−０１７９００６Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１８３，４８６号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０１７０７５３号明細書（米国特許出願第１４／１８３，４２９号明細書）；欧州特許出願第２７７１４６８号明細書（欧州特許第１３８１８５７０．７号明細書）、欧州特許出願第２７６４１０３号明細書（欧州特許第１３８２４２３２．６号明細書）、及び欧州特許出願第２７８４１６２号明細書（欧州特許第１４１７０３８３．５号明細書）；並びに国際公開第２０１４／０９３６６１号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４７４３号明細書）、国際公開第２０１４／０９３６９４号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４７９０号明細書）、国際公開第２０１４／０９３５９５号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６１１号明細書）、国際公開第２０１４／０９３７１８号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４８２５号明細書）、国際公開第２０１４／０９３７０９号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４８１２号明細書）、国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７号明細書）、国際公開第２０１４／０９３６３５号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６９１号明細書）、国際公開第２０１４／０９３６５５号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４７３６号明細書）、国際公開第２０１４／０９３７１２号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４８１９号明細書）、国際公開第２０１４／０９３７０１号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４８００号明細書）、及び国際公開第２０１４／０１８４２３号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０５１４１８号明細書）。また、それぞれ２０１３年１月３０日、２０１３年３月１５日、２０１３年３月２８日、２０１３年４月２０日、２０１３年５月６日及び２０１３年５月２８日出願の、米国仮特許出願第６１／７５８，４６８号明細書、同第６１／８０２，１７４号明細書、同第６１／８０６，３７５号明細書、同第６１／８１４，２６３号明細書、同第６１／８１９，８０３号明細書及び同第６１／８２８，１３０号明細書も参照される。また、２０１３年６月１７日出願の米国仮特許出願第６１／８３６，１２３号明細書も参照される。米国仮特許出願第６１／８３５，９３１号明細書、同第６１／８３５，９３６号明細書、同第６１／８３６，１２７号明細書、同第６１／８３６，１０１号明細書、同第６１／８３６，０８０号明細書及び同第６１／８３５，９７３号明細書（それぞれ、２０１３年６月１７日出願）も付加的に参照される。さらに、２０１３年８月５日出願の米国仮特許出願第６１／８６２，４６８号明細書及び同第６１／８６２，３５５号明細書；２０１３年８月２８日出願の同第６１／８７１，３０１号明細書；２０１３年９月２５日出願の同第６１／９６０，７７７号明細書、及び２０１３年１０月２８日出願の同第６１／９６１，９８０号明細書も参照される。またさらに、国際特許出願：国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０３号明細書、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８００号明細書、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０９号明細書、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０４号明細書及び国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０６号明細書（それぞれ、２０１４年６月１０日、６／１０／１４に出願）；国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０８号明細書（２０１４年６月１１日出願）；及び国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／６２５５８号明細書（２０１４年１０月２８日出願）、並びに米国仮特許出願第６１／９１５，２５１号明細書、同第６１／９１５，３０１号明細書及び同第６１／９１５，２６０号明細書（２０１３年１２月１２日出願）；同第６１／９３０，２１４号明細書（２０１４年１月２２日出願）；同第６２／０１０，３２９号明細書及び同第６２／０１０，４４１号明細書（それぞれ、２０１４年６月１０日出願）；同第６１／９３９，２２８号明細書及び同第６１／９３９，２４２号明細書（それぞれ、２０１４年２月１２日出願）；同第６１／９８０，０１２号明細書（２０１４年４月１５日出願）；同第６２／０３８，３５８号明細書（２０１４年８月１７日出願）；同第６２／０５４，４９０号明細書、同第６２／０５５，４８４号明細書、同第６２／０５５，４６０号明細書及び同第６２／０５５，４８７号明細書（それぞれ、２０１４年９月２５日出願）；及び同第６２／０６９，２４３号明細書（２０１４年１０月２７日出願）も参照される。そして、米国仮特許出願第６１／９１５，１５０号明細書（２０１３年１２月１２日出願）；及び同第６２／０１０，８８８号明細書及び同第６２／０１０，８７９号明細書（いずれも、２０１４年６月１１日出願）も参照される。これらの特許、特許公開、及び特許出願のそれぞれ、並びにこれらの特許において又はこれらの審査中に引用される全ての文献（「出願引用文献」）、並びにその出願引用文献において引用又は参照される全ての文献は、これらの特許又はこれらの特許中のいずれかの文献において言及されて参照により本明細書中に組み入れられる任意の製品に関する任意の指示書、説明書、製品仕様書、及び製品シートと共に、参照によって本明細書中に組み入れられ、本発明の実施において使用され得る。全ての文献（例えば、これらの特許、特許公開、及び特許出願、並びに出願引用文献）は、それぞれの個々の文献が具体的かつ個別に参照により組み入れられることが示されるのと同程度に参照により本明細書中に組み入れられる。

また、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系に関する一般情報については、以下を参照されたい：
それぞれ参照により本明細書に組み入れられ、以下に簡単に説明される：
Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｃｏｎｇ，Ｌ．，Ｒａｎ，Ｆ．Ａ．，Ｃｏｘ，Ｄ．，Ｌｉｎ，Ｓ．，Ｂａｒｒｅｔｔｏ，Ｒ．，Ｈａｂｉｂ，Ｎ．，Ｈｓｕ，Ｐ．Ｄ．，Ｗｕ，Ｘ．，Ｊｉａｎｇ，Ｗ．，Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ，Ｌ．Ａ．，＆ Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｅｂ １５；３３９（６１２１）：８１９−２３（２０１３）；
ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｇｅｎｏｍｅｓ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｊｉａｎｇ Ｗ．，Ｂｉｋａｒｄ Ｄ．，Ｃｏｘ Ｄ．，Ｚｈａｎｇ Ｆ，Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ ＬＡ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｍａｒ；３１（３）：２３３−９（２０１３）；
Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｅ Ｃａｒｒｙｉｎｇ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｇｅｎｅｓ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｗａｎｇ Ｈ．，Ｙａｎｇ Ｈ．，Ｓｈｉｖａｌｉｌａ ＣＳ．，Ｄａｗｌａｔｙ ＭＭ．，Ｃｈｅｎｇ ＡＷ．，Ｚｈａｎｇ Ｆ．，Ｊａｅｎｉｓｃｈ Ｒ．Ｃｅｌｌ Ｍａｙ ９；１５３（４）：９１０−８（２０１３）；
Ｏｐｔｉｃａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔａｔｅｓ．Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ Ｓ，Ｂｒｉｇｈａｍ ＭＤ，Ｔｒｅｖｉｎｏ ＡＥ，Ｈｓｕ ＰＤ，Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ Ｍ，Ｃｏｎｇ Ｌ，Ｐｌａｔｔ ＲＪ，Ｓｃｏｔｔ ＤＡ，Ｃｈｕｒｃｈ ＧＭ，Ｚｈａｎｇ Ｆ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１３ Ａｕｇ ２２；５００（７４６３）：４７２−６．ｄｏｉ：１０．１０３８／Ｎａｔｕｒｅ１２４６６．Ｅｐｕｂ ２０１３ Ａｕｇ ２３；
Ｄｏｕｂｌｅ Ｎｉｃｋｉｎｇ ｂｙ ＲＮＡ−Ｇｕｉｄｅｄ ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９ ｆｏｒ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．Ｒａｎ，ＦＡ．，Ｈｓｕ，ＰＤ．，Ｌｉｎ，ＣＹ．，Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ，ＪＳ．，Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ，Ｓ．，Ｔｒｅｖｉｎｏ，ＡＥ．，Ｓｃｏｔｔ，ＤＡ．，Ｉｎｏｕｅ，Ａ．，Ｍａｔｏｂａ，Ｓ．，Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，＆ Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｃｅｌｌ Ａｕｇ ２８．ｐｉｉ：Ｓ００９２−８６７４（１３）０１０１５−５．（２０１３）；
ＤＮＡ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｈｓｕ，Ｐ．，Ｓｃｏｔｔ，Ｄ．，Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，Ｊ．，Ｒａｎ，ＦＡ．，Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ，Ｓ．，Ａｇａｒｗａｌａ，Ｖ．，Ｌｉ，Ｙ．，Ｆｉｎｅ，Ｅ．，Ｗｕ，Ｘ．，Ｓｈａｌｅｍ，Ｏ．，Ｃｒａｄｉｃｋ，ＴＪ．，Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ，ＬＡ．，Ｂａｏ，Ｇ．，＆ Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２６４７（２０１３）；
Ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍ．Ｒａｎ，ＦＡ．，Ｈｓｕ，ＰＤ．，Ｗｒｉｇｈｔ，Ｊ．，Ａｇａｒｗａｌａ，Ｖ．，Ｓｃｏｔｔ，ＤＡ．，Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｎｏｖ；８（１１）：２２８１−３０８．（２０１３）；
Ｇｅｎｏｍｅ−Ｓｃａｌｅ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌｓ．Ｓｈａｌｅｍ，Ｏ．，Ｓａｎｊａｎａ，ＮＥ．，Ｈａｒｔｅｎｉａｎ，Ｅ．，Ｓｈｉ，Ｘ．，Ｓｃｏｔｔ，ＤＡ．，Ｍｉｋｋｅｌｓｏｎ，Ｔ．，Ｈｅｃｋｌ，Ｄ．，Ｅｂｅｒｔ，ＢＬ．，Ｒｏｏｔ，ＤＥ．，Ｄｏｅｎｃｈ，ＪＧ．，Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｃ １２．（２０１３）．［Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ］；
Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｃａｓ９ ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ．Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ，Ｈ．，Ｒａｎ，ＦＡ．，Ｈｓｕ，ＰＤ．，Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ，Ｓ．，Ｓｈｅｈａｔａ，ＳＩ．，Ｄｏｈｍａｅ，Ｎ．，Ｉｓｈｉｔａｎｉ，Ｒ．，Ｚｈａｎｇ，Ｆ．，Ｎｕｒｅｋｉ，Ｏ．Ｃｅｌｌ Ｆｅｂ ２７．（２０１４）．１５６（５）：９３５−４９；
Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｃａｓ９ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｗｕ Ｘ．，Ｓｃｏｔｔ ＤＡ．，Ｋｒｉｚ ＡＪ．，Ｃｈｉｕ ＡＣ．，Ｈｓｕ ＰＤ．，Ｄａｄｏｎ ＤＢ．，Ｃｈｅｎｇ ＡＷ．，Ｔｒｅｖｉｎｏ ＡＥ．，Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ Ｓ．，Ｃｈｅｎ Ｓ．，Ｊａｅｎｉｓｃｈ Ｒ．，Ｚｈａｎｇ Ｆ．，Ｓｈａｒｐ ＰＡ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１４）Ａｐｒ ２０．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２８８９，
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ Ｋｎｏｃｋｉｎ Ｍｉｃｅ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ，Ｐｌａｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １５９（２）：４４０−４５５（２０１４）ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１４．０９．０１４，
Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ １５７，１２６２−１２７８（Ｊｕｎｅ ５，２０１４）（Ｈｓｕ ２０１４），
Ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｃｒｅｅｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍ，Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１４ Ｊａｎｕａｒｙ ３；３４３（６１６６）：８０−８４．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２４６９８１，
Ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｈｉｇｈｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｓｇＲＮＡｓ ｆｏｒ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｄｏｅｎｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ オンラインで公表 ３ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１４；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３０２６，及び
Ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｂｒａｉｎ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９，Ｓｗｉｅｃｈ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；オンラインで公表 １９ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１４；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３０５５．

Ｃｏｎｇらは、サーモフィラス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９及び化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９の両方をベースとした真核細胞で使用されるＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をエンジニアリングして、Ｃａｓ９ヌクレアーゼが、短鎖ＲＮＡによって誘導されて、ヒト細胞及びマウス細胞におけるＤＮＡの正確な切断を誘導できることを実証した。彼らの研究は、切断酵素に変換されるＣａｓ９を使用して、変異原作用が最小限の真核細胞における相同組換え修復を容易にできることをさらに示した。加えて、彼らの研究は、複数のガイド配列を単一ＣＲＩＳＰＲアレイにコードすることができ、これにより哺乳動物ゲノム内の内因性ゲノム遺伝子座部位におけるいくつかの同時編集を可能にすることを実証し、ＲＮＡガイドヌクレアーゼ技術が容易にプログラム可能であること及びその広範な適用性を実証している。細胞においてＲＮＡを用いて配列特異的ＤＮＡ切断をプログラムするこの能力は、ゲノム工学ツールの新たなクラスを定義した。これらの研究は、他のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座が、哺乳動物細胞に移植可能である可能性が高く、哺乳動物ゲノム切断も媒介し得ることをさらに示した。重要なことに、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のいくつかの態様をさらに改善して、その効率及び多用途性を高めることができることが企図され得る。
Ｊｉａｎｇらは、二重ＲＮＡと複合体を形成した、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）−関連Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを使用して、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）及び大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のゲノムに正確な突然変異を導入した。このアプローチは、標的ゲノム部位における二重ＲＮＡ：Ｃａｓ９依存性切断に依存して、突然変異しなかった細胞を殺し、選択マーカー又はカウンター選択系の必要性を回避した。この研究は、編集鋳型が単一ヌクレオチド変化及び複数ヌクレオチド変化を有するように短鎖ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）の配列を変更することによる二重ＲＮＡ：Ｃａｓ９特異性の再プログラミングを報告した。この研究は、２つのｃｒＲＮＡの同時の使用により多重突然変異誘発を可能にすることを示した。さらに、このアプローチが、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）においてリコンビニアリングと組み合わせて使用される場合、説明されるアプローチを用いて回収された細胞のほぼ１００％が所望の突然変異を含み、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）では、回収した６５％が突然変異を含んでいた。
Ｋｏｎｅｒｍａｎｎらは、ＤＮＡ結合ドメインをベースとするＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９酵素及び転写アクチベーター様エフェクターの光学的及び化学的調節を可能にする用途の広いロバストな技術についての当該技術分野の要求に対処した。
本明細書で論じられるように、微生物ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系からのＣａｓ９ヌクレアーゼは、２０ｎｔのガイド配列により特定のゲノム遺伝子座を標的とし、このガイド配列は、ＤＮＡ標的に対する特定のミスマッチを許容することができ、これにより不所望の標的外の突然変異を促進する。これに対処するために、Ｒａｎらは、Ｃａｓ９ニッカーゼ突然変異を対ガイドＲＮＡと組み合わせて標的二本鎖切断を導入するアプローチを説明した。ゲノム中の個々の切れ目は、高い忠実性で修復されるため、適切にオフセットされたガイドＲＮＡによる同時ニッキングが、二本鎖切断に必要であり、標的切断のために特異的に認識される塩基の数を増加させる。著者らは、対ニッキング（ｐａｉｒｅｄ ｎｉｃｋｉｎｇ）を用いて、細胞株において標的外活性を１／５０〜１／１，５００に低下させて、標的上の切断有効性を犠牲にすることなく、マウス接合体における遺伝子ノックアウトを容易にできることを実証した。この多用途戦略は、高い特異性を必要とする多様なゲノム編集用途を可能にする。
Ｈｓｕらは、標的部位の選択を知らせて標的外の影響を回避するためにヒト細胞におけるＳｐＣａｓ９標的化特異性を特徴付けた。この研究は、２９３Ｔ細胞及び２９３ＦＴ細胞の１００を超える推定ゲノム標的外遺伝子座における７００を超えるガイドＲＮＡ変異体及びＳｐＣＡｓ９誘導性挿入欠失変異レベルを評価した。著者らは、ＳｐＣａｓ９が、配列依存的に異なる位置でのガイドＲＮＡと標的ＤＮＡとの間のミスマッチを許容し、ミスマッチの数、位置、及び分布の影響を受けるという。著者らは、ＳｐＣａｓ９媒介切断がＤＮＡメチル化による影響を受けないこと、並びにＳｐＣａｓ９及びｓｇＲＮＡの量を、標的外の変更を最小限にするために増減できることをさらに示した。加えて、哺乳動物ゲノムエンジニアリングの用途を拡大するために、著者らは、標的配列の選択及び評価及び標的外分析をガイドするウェブベースのソフトウェアツールを提供することを報告した。
Ｒａｎらは、哺乳動物細胞における非相同末端結合（ＮＨＥＪ）又は相同依存性修復（ＨＤＲ）によるＣａｓ９媒介ゲノム編集のための一連のツール、及び下流機能の研究のための改変細胞株の作製について説明した。標的外切断を最小限にするために、著者らは、対ガイドＲＮＡを用いるＣａｓ９ニッカーゼ突然変異を使用するダブルニッキング法についてさらに説明した。著者らによって提供されるプロトコルは、標的部位の選択、切断効率の評価、及び標的外の活性の分析についてのガイドラインを経験的に導き出した。この研究は、標的の設計から開始して、遺伝子改変を僅か１〜２週間で達成することができ、改変クローナル細胞系を２〜３週間以内に得ることができることを示した。
Ｓｈａｌｅｍらは、ゲノム規模で遺伝子機能を問い合わせる新たな方法について説明した。著者らの研究は、１８，０８０の遺伝子を標的とするゲノム規模ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ノックアウト（ＧｅＣＫＯ）ライブラリの６４，７５１のユニークなガイド配列を用いた送達により、ヒト細胞におけるネガティブ選択スクリーニング及びポジティブ選択スクリーニングの両方が可能になることを示した。第１に、著者らは、ＧｅＣＫＯライブラリを使用した、癌細胞及び多能性幹細胞において細胞の生存に必須の遺伝子の同定を示した。次に、黒色腫モデルにおいて、著者らは、その減少が、変異プロテインキナーゼＢＲＡＦを阻害する治療薬であるベムラフェニブに対する耐性に影響を与える遺伝子をスクリーニングした。著者らの研究は、最高位の候補が、既に評価された遺伝子ＮＦ１及びＭＥＤ１２、並びに新規にヒットしたＮＦ２、ＣＵＬ３、ＴＡＤＡ２Ｂ、及びＴＡＤＡ１を含むことを示した。著者らは、同じ遺伝子を標的とする独立のガイドＲＮＡと高いヒット確認率との間の高いレベルの一貫性を観察し、従ってＣａｓ９を用いたゲノム規模のスクリーニングが有望であることを実証した。
Ｎｉｓｈｉｍａｓｕらは、ｓｇＲＮＡ及びその標的ＤＮＡと複合体を形成した化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９の結晶構造を２．５Åの解像度で報告した。この構造により、その界面で正に帯電した溝にｓｇＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二重鎖を収容する、標的認識ローブとヌクレアーゼローブからなる２ローブ構造が明らかになった。認識ローブは、ｓｇＲＮＡとＤＮＡの結合に必須であるが、ヌクレアーゼローブは、ＨＮＨヌクレアーゼドメイン及びＲｕｖＣヌクレアーゼドメインを含み、ＨＮＨヌクレアーゼドメインは、標的ＤＮＡの相補鎖の切断に適切な位置にあり、ＲｕｖＣヌクレアーゼドメインは、非相補鎖の切断に適切な位置にある。ヌクレアーゼローブは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）との相互作用に関与するカルボキシ末端ドメインも含む。この高解像度構造及び付随する機能分析は、Ｃａｓ９によるＲＮＡガイドＤＮＡ標的化の分子機構を明らかにし、従って新規な多用途ゲノム編集技術の合理的設計の道が開かれた。
Ｗｕらは、マウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）において単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）が付加された化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）から触媒不活性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）のゲノムワイド結合部位をマッピングした。著者らは、試験された４種類のｓｇＲＮＡのそれぞれが、ｓｇＲＮＡの５−ヌクレオチドシード領域によって頻繁に特徴付けられる数十〜数千のゲノム部位とＮＧＧプロトスペーサー近接モチーフ（ＰＡＭ）との間のｄＣａｓ９を標的とすることを示した。クロマチン非アクセシビリティ（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｉｎａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）により、マッチングシード配列を有するｄＣａｓ９の他の部位への結合が減少し；従って、標的外部位の７０％が遺伝子に関連する。著者らは、触媒活性Ｃａｓ９でトランスフェクトされたｍＥＳＣにおける２９５のｄＣａｓ９結合部位のターゲットシークエンシングにより、バックグラウンドレベルよりも高い突然変異部を１つしか同定されなかったことを示した。著者らは、シードマッチ（ｓｅｅｄ ｍａｔｃｈ）が結合をトリガーするが切断のために標的ＤＮＡとの広範な対合を必要とする、Ｃａｓ９の結合及び切断のための２状態モデルを提案した。
Ｈｓｕ ２０１４は、ヨーグルトからゲノム編集までのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９の歴史を一般的に論じる総説であり、このゲノム編集には、２０１４年６月５日以前に出願された本出願の系統の出願の情報、データ、及び知見中にある細胞の遺伝子スクリーニングが含まれる。Ｈｓｕ ２０１４の一般的な教示は、特定のモデル、本明細書の動物に無関係である。

一般に、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系又はＣＲＩＳＰＲ系は、上記の文献、例えば、国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７号明細書）で使用され、これらの系はまとめて、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ］）遺伝子の発現又はその活性の誘導に関与する転写物及び他のエレメントを指し、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列、ｔｒａｃｒ（トランス−活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ又は活性な部分的ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒ−ｍａｔｅ配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の文脈において「直接反復」及びｔｒａｃｒＲＮＡ処理された部分的直接反復を包含する）、ガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の文脈において「スペーサー」とも呼ばれる）、又は本明細書で使用される語である「ＲＮＡ」（例えば、Ｃａｓ９をガイドするＲＮＡ、例えば、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及びトランス活性化（ｔｒａｃｒ）ＲＮＡ、又は単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）（キメラＲＮＡ））、又はＣＲＩＳＰＲ遺伝子座由来の他の配列及び転写物を含む。一般に、ＣＲＩＳＰＲ系は、標的配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の文脈においてプロトスペーサーとも呼ばれる）の部位におけるＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するエレメントによって特徴付けられる。ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成の文脈において、「標的配列」は、ガイド配列が相補性を有するように設計される配列を指し、標的配列とガイド配列との間のハイブリダイゼーションが、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。標的配列は、任意のポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡポリヌクレオチド又はＲＮＡポリヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、標的配列は、細胞の核内又は細胞質内に位置する。一部の実施形態では、直接反復は、次の基準：１．ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に隣接したゲノム配列の２Ｋｂの枠内に見られる；２．２０〜５０ｂｐに及ぶ；３．２０〜５０ｂｐの間隔が空いている、のいずれか又は全てを満たす反復モチーフを検索することによってコンピューター内で特定することができる。一部の実施形態では、これらの基準の２つ、例えば、１と２、２と３、又は１と３を使用することができる。一部の実施形態では、３つ全ての基準を使用することができる。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ複合体において、ｔｒａｃｒ配列が、１つ以上のヘアピンを有し、かつ３０以上のヌクレオチド長、４０以上のヌクレオチド長、又は５０以上のヌクレオチド長であり：ガイド配列が、１０〜３０ヌクレオチド長であり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素がＩＩ型Ｃａｓ９酵素であることが好ましいであろう。本発明の実施形態では、ガイド配列及びガイドＲＮＡという語は、上記の文献、例えば、国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７号明細書）と互換的に使用される。一般に、ガイド配列は、標的配列とハイブリダイズしてＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列への配列特異的結合を誘導するように、標的ポリヌクレオチド配列と十分な相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列である。一部の実施形態では、適切なアラインメントアルゴリズムを用いて最適に整列されたときの、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、約５０％、約６０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７．５％、約９９％、若しくはそれよりも高い、又は約５０％を超える、約６０％を超える、約７５％を超える、約８０％を超える、約８５％を超える、約９０％を超える、約９５％を超える、約９７．５％を超える、約９９％を超える、若しくはそれよりも高い。最適なアラインメントは、配列を整列させるための任意の適切なアルゴリズムを用いて決定することができ、このような適切なアルゴリズムの非限定的な例として、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ）に基づいたアルゴリズム、ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；ｗｗｗ．ｎｏｖｏｃｒａｆｔ．ｃｏｍで入手可能）、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎで入手可能）、及びＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔで入手可能）が挙げられる。一部の実施形態では、ガイド配列は、約５、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約７５、若しくはそれ以上、又は約５を超える、約１０を超える、約１１を超える、約１２を超える、約１３を超える、約１４を超える、約１５を超える、約１６を超える、約１７を超える、約１８を超える、約１９を超える、約２０を超える、約２１を超える、約２２を超える、約２３を超える、約２４を超える、約２５を超える、約２６を超える、約２７を超える、約２８を超える、約２９を超える、約３０を超える、約３５を超える、約４０を超える、約４５を超える、約５０を超える、約７５を超える、若しくはそれ以上のヌクレオチド長である。一部の実施形態では、ガイド配列は、約７５未満、約５０未満、約４５未満、約４０未満、約３５未満、約３０未満、約２５未満、約２０未満、約１５未満、約１２未満、又はそれ未満のヌクレオチド長である。好ましくは、ガイド配列は、１０〜３０ヌクレオチド長である。ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列に対する配列特異的結合を誘導するガイド配列の能力は、任意の適切なアッセイによって評価することができる。例えば、試験するべきガイド配列を含む、ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するのに十分なＣＲＩＳＰＲ系の構成成分を、例えば、ＣＲＩＳＰＲ配列の構成成分をコードするベクターでのトランスフェクションによって、対応する標的配列を有する宿主細胞に導入し、続いて、標的配列内の優先的切断の評価を、例えば、本明細書に記載のＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイによって行うことができる。同様に、標的ポリヌクレオチド配列の切断は、標的配列、試験するべきガイド配列及びこの試験ガイド配列とは異なる対照ガイド配列を含むＣＲＩＳＰＲ複合体の構成成分を用意し、そして標的配列における結合又は切断率を試験配列反応と対照ガイド配列反応との間で比較することによって試験管で評価することができる。他のアッセイも可能であり、当業者であれば想到するであろう。ガイド配列は、任意の標的配列を標的とするように選択することができる。一部の実施形態では、標的配列は、細胞のゲノム内の配列である。例示的な標的配列として、標的ゲノム中のユニークな配列が挙げられる。例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９の場合は、ゲノム中のユニークな標的配列は、ＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧの形態のＣａｓ９標的部位を含むことができ、このＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧ（ＮはＡ、Ｇ、Ｔ、又はＣであり；かつＸはいずれであってもよく；ＷはＡ又はＴである）は、ゲノム中の単一発生を有する。ゲノム中のユニークな標的配列は、ＭＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧの形態の化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９標的部位を含むことができ、このＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧ（ＮはＡ、Ｇ、Ｔ、又はＣであり；Ｘはいずれであってもよい）は、ゲノム中の単一発生を有する。サーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ１ Ｃａｓ９の場合は、ゲノム中のユニークな標的配列は、ＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＸＡＧＡＡＷの形態のＣａｓ９標的部位を含むことができ、このＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＸＡＧＡＡＷ（ＮはＡ、Ｇ、Ｔ、又はＣであり；Ｘはいずれであってもよく；ＷはＡ又はＴである）は、ゲノム中の単一発生を有する。ゲノム中のユニークな標的配列は、ＭＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＸＡＧＡＡＷの形態のサーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ１ Ｃａｓ９標的部位を含むことができ、このＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＸＡＧＡＡＷ（ＮはＡ、Ｇ、Ｔ、又はＣであり；Ｘはいずれであってもよく；ＷはＡ又はＴである）は、ゲノム中の単一発生を有する。化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９の場合は、ゲノム中のユニークな標的配列は、ＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧＸＧの形態のＣａｓ９標的部位を含むことができ、このＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧＸＧ（ＮはＡ、Ｇ、Ｔ、又はＣであり；かつＸはいずれであってもよい）は、ゲノム中の単一発生を有する。ゲノム中のユニークな標的配列は、ＭＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧＸＧの形態の化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を含むことができ、このＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧＸＧ（ＮはＡ、Ｇ、Ｔ、又はＣであり；かつＸはいずれであってもよい）は、ゲノム中の単一発生を有する。これらの配列のそれぞれにおいて、「Ｍ」は、Ａ、Ｇ、Ｔ、又はＣであり得、配列をユニークと見なす際に考慮する必要がない。一部の実施形態では、ガイド配列は、このガイド配列内の二次構造の程度を低下させるように選択される。一部の実施形態では、ガイド配列のヌクレオチドの約７５％、約５０％、約４０％、約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％、約５％、約１％、若しくはそれより未満、又は約７５％未満、約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約１％未満、若しくはそれ未満が、最適に折り畳まれるときの自己相補的塩基対形成に関与する。最適な折り畳みは、任意の適切なポリヌクレオチド折り畳みアルゴリズムによって決定することができる。一部のプログラムは、最小ギブズ自由エネルギーの算出に基づいている。１つのこのようなアルゴリズムの例は、ｍＦｏｌｄであり、Ｚｕｋｅｒ及びＳｔｉｅｇｌｅｒ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９（１９８１），１３３−１４８）によって説明されている。折り畳みアルゴリズムの別の例は、重心構造予測アルゴリズム（例えば、Ａ．Ｒ．Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｃｅｌｌ １０６（１）：２３−２４；及びＰＡ Ｃａｒｒ ａｎｄ ＧＭ Ｃｈｕｒｃｈ，２００９，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２７（１２）：１１５１−６２を参照）を用いて、ウィーン大学の理論化学研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）で開発されたオンラインウェブサーバーＲＮＡｆｏｌｄである。

一般に、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列は：（１）対応するｔｒａｃｒ配列を含む細胞内のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に隣接したガイド配列の切除；及び（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列を含むＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列での形成、の１つ以上を促進する、ｔｒａｃｒ配列との十分な相補性を有する任意の配列を含む。一般に、相補性の程度は、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列とｔｒａｃｒ配列の短い方の長さに沿った、これらの配列の最適なアラインメントについてである。最適なアラインメントは、任意の適切なアラインメントアルゴリズムによって決定することができ、かつ二次構造、例えば、ｔｒａｃｒ配列又はｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列のいずれかの中の自己相補性をさらに考慮することができる。一部の実施形態では、最適に整列されたときのｔｒａｃｒ配列とｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列の短い方の長さに沿ったこれらの配列間の相補性の程度は、約２５％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９７．５％、約９９％、若しくはそれよりも高い、又は約２５％を超える、約３０％を超える、約４０％を超える、約５０％を超える、約６０％を超える、約７０％を超える、約８０％を超える、約９０％を超える、約９５％を超える、約９７．５％を超える、約９９％を超える、若しくはそれよりも高い。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒ配列は、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２５、約３０、約４０、約５０、若しくはそれを超える、又は約５を超える、約６を超える、約７を超える、約８を超える、約９を超える、約１０を超える、約１１を超える、約１２を超える、約１３を超える、約１４を超える、約１５を超える、約１６を超える、約１７を超える、約１８を超える、約１９を超える、約２０を超える、約２５を超える、約３０を超える、約４０を超える、約５０を超える、若しくはそれを超えるヌクレオチド長である。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒ配列及びｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列は、これらの配列間のハイブリダイゼーションが、二次構造、例えば、ヘアピンを有する転写物を形成するように、単一転写物内に含まれる。本発明の一実施形態では、転写物又は転写されたポリヌクレオチド配列は、少なくとも２つ以上のヘアピンを有する。好ましい実施形態では、転写物は、２つ、３つ、４つ、又は５つのヘアピンを有する。本発明のさらなる実施形態では、転写物は、最多で５つのヘアピンを有する。ヘアピン構造において、ループの上流の最後の「Ｎ」の５’側の配列の部分がｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に対応し、ループの３’側の配列の部分がｔｒａｃｒ配列に対応する。ガイド配列、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、及びｔｒａｃｒ配列を含む単一ポリヌクレオチドのさらなる非限定的な例は、以下のとおりであり（５’から３’に記載）、配列中の「Ｎ」は、ガイド配列の塩基を表し、小文字の第１のブロックはｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列を表し、小文字の第２のブロックはｔｒａｃｒ配列を表し、かつ最終ポリＴ配列は転写ターミネーターを表す：
（１）ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮｇｔｔｔｔｔｇｔａｃｔｃｔｃａａｇａｔｔｔａＧＡＡＡｔａａａｔｃｔｔｇｃａｇａａｇｃｔａｃａａａｇａｔａａｇｇｃｔｔｃａｔｇｃｃｇａａａｔｃａａｃａｃｃｃｔｇｔｃａｔｔｔｔａｔｇｇｃａｇｇｇｔｇｔｔｔｔｃｇｔｔａｔｔｔａａＴＴＴＴＴＴ；（２）ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮｇｔｔｔｔｔｇｔａｃｔｃｔｃａＧＡＡＡｔｇｃａｇａａｇｃｔａｃａａａｇａｔａａｇｇｃｔｔｃａｔｇｃｃｇａａａｔｃａａｃａｃｃｃｔｇｔｃａｔｔｔｔａｔｇｇｃａｇｇｇｔｇｔｔｔｔｃｇｔｔａｔｔｔａａＴＴＴＴＴＴ；（３）ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮｇｔｔｔｔｔｇｔａｃｔｃｔｃａＧＡＡＡｔｇｃａｇａａｇｃｔａｃａａａｇａｔａａｇｇｃｔｔｃａｔｇｃｃｇａａａｔｃａａｃａｃｃｃｔｇｔｃａｔｔｔｔａｔｇｇｃａｇｇｇｔｇｔＴＴＴＴＴＴ；（４）ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａＧＡＡＡｔａｇｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａａｃｔｔｇａａａａａｇｔｇｇｃａｃｃｇａｇｔｃｇｇｔｇｃＴＴＴＴＴＴ；（５）ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａＧＡＡＡＴＡＧｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａａｃｔｔｇａａａａａｇｔｇＴＴＴＴＴＴＴ；及び（６）ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａｇＡＡＡＴＡＧｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａＴＴＴＴＴＴＴＴ．
一部の実施形態では、配列（１）〜（３）は、サーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ１からのＣａｓ９と組み合わせて使用される。一部の実施形態では、配列（４）〜（６）は、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９と組み合わせて使用される。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒ配列は、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列を含む転写物とは別個の転写物である。

一部の実施形態では、候補ｔｒａｃｒＲＮＡは、以下の基準のいずれか又は全てを満たす配列によって後に予測することができる：１．反復を誘導する配列相同性（最大１８ｂｐのミスマッチでのＧｅｎｅｉｏｕｓにおけるモチーフの検索）；２．転写方向における推定Ｒｈｏ依存性転写ターミネーターの存在；及び３．ｔｒａｃｒＲＮＡと直接反復との間の安定なヘアピン二次構造。一部の実施形態では、これらの基準の２つ、例えば、１と２、２と３、又は１と３を使用することができる。一部の実施形態では、３つ全ての基準を使用することができる。

一部の実施形態では、キメラ合成ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の設計は、直接反復とｔｒａｃｒＲＮＡと間に少なくとも１２ｂｐの二重鎖構造を含み得る。

毒性及び標的外の影響を最小限にするために、送達されるＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡの濃度を制御することが重要である。ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡの最適な濃度は、細胞又は非ヒト真核動物モデルにおいて異なる濃度を試験し、そしてディープシークエンシングを用いて潜在的な標的外ゲノム遺伝子座における変更の程度を分析することによって決定することができる。例えば、ヒトゲノムのＥＭＸ１遺伝子における５’−ＧＡＧＴＣＣＧＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡ−３’を標的とするガイド配列の場合は、ディープシークエンシングを使用して、次の２つの標的外遺伝子座、１：５’−ＧＡＧＴＣＣＴＡＧＣＡＧＧＡＧＡＡＧＡＡ−３’及び２：５’−ＧＡＧＴＣＴＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡ−３’における変更のレベルを評価することができる。標的外の変更のレベルを最低にすると共に標的上の変更を最高レベルにする濃度を、ｉｎ ｖｉｖｏ送達のために選択するべきである。別法では、毒性及び標的外の影響のレベルを最小限にするために、ＣＲＩＳＰＲ酵素ニッカーゼｍＲＮＡ（例えば、Ｄ１０Ａ突然変異を有する化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９）を、目的の部位を標的とするガイドＲＮＡの対で送達することができる。２つのガイドＲＮＡは、以下のように離間させる必要がある。毒性及び標的外の影響を最小限にするガイド配列及び戦略は、国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７号明細書）と同様とすることができる。

ＣＲＩＳＰＲ系は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系から有利に送達される。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントは、内因性ＣＲＩＳＰＲ系を含む特定の生物、例えば、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来する。本発明の好ましい実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ系は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系であり、Ｃａｓ酵素は、ＤＮＡの切断を触媒するＣａｓ９である。Ｃａｓタンパク質の非限定的な例として、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２としても知られている）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、これらのホモログ、又はこれらの修飾型が挙げられる。

一部の実施形態では、非修飾ＣＲＩＳＰＲ酵素、例えば、Ｃａｓ９は、ＤＮＡ切断活性を有する。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の位置、例えば、標的配列内及び／又は標的配列の相補体内の一方又は両方の鎖の切断を誘導する。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の最初又は最後のヌクレオチドから、約１つ、約２つ、約３つ、約４つ、約５つ、約６つ、約７つ、約８つ、約９つ、約１０、約１５、約２０、約２５、約５０、約１００、約２００、約５００、又はそれよりも多い塩基対以内の一方又は両方の鎖の切断を誘導する。一部の実施形態では、ベクターは、突然変異ＣＲＩＳＰＲ酵素が、標的配列を含む標的ポリヌクレオチドの一方又は両方の鎖を切断する能力を喪失するように対応する野生型酵素に対して突然変異したＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする。例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９のＲｕｖＣ Ｉ触媒ドメインにおけるアスパラギン酸のアラニンへの置換（Ｄ１０Ａ）は、Ｃａｓ９を両方の鎖を切断するヌクレアーゼからニッカーゼ（一本鎖を切断する）に変換する。Ｃａｓ９をニッカーゼにする突然変異の他の例として、限定されるものではないが、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、及びＮ８６３Ａが挙げられる。さらなる例として、Ｃａｓ９の２つ以上の触媒ドメイン（ＲｕｖＣ Ｉ、ＲｕｖＣ ＩＩ、及びＲｕｖＣ ＩＩＩ、又はＨＮＨドメイン）は、全てのＤＮＡ切断活性を実質的に失った突然変異Ｃａｓ９を作製するために突然変異させることができる。一部の実施形態では、Ｄ１０Ａ突然変異を、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、又はＮ８６３Ａ突然変異の１つ以上と組み合わせて、全てのＤＮＡ切断活性を実質的に失ったＣａｓ９酵素を作製する。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、突然変異酵素のＤＮＡ切断活性が、非突然変異型の酵素のＤＮＡ切断活性の約２５％以下、約１０％以下、約５％以下、約１％以下、約０．１％以下、約０．０１％以下、又はそれ未満である場合に、全てのＤＮＡ切断活性を実質的に喪失していると見なされる；一例は、突然変異型のＤＮＡ切断活性が、ゼロ、又は非突然変異型と比較してごく僅かであるときであり得る。酵素がＳｐＣａｓ９でない場合は、突然変異は、ＳｐＣａｓ９の１０位、７６２位、８４０位、８５４位、８６３位、及び／又は９８６位に対応する一部又は全ての残基において生じさせることができる（例えば、標準的な配列比較ツールによって確認することができる）。特に、以下の突然変異の一部又は全ては、ＳｐＣａｓ９において好ましい：Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ、及び／又はＤ９８６Ａ；また置換アミノ酸のいずれかの保存的な置換も企図される。他のＣａｓ９における対応する位置でのこれらの突然変異の同じ（又は保存的な）置換も好ましい。ＳｐＣａｓ９におけるＤ１０及びＨ８４０が特に好ましい。しかしながら、他のＣａｓ９では、ＳｐＣａｓ９ Ｄ１０及びＨ８４０に対応する残基も好ましい。ＳｐＣａｓ９のオーソログを、本発明の実施に使用することができる。Ｃａｓ酵素は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系からの複数のヌクレアーゼドメインを有する最大のヌクレアーゼと相同性を共有する一般的なクラスの酵素を指し得るため、同定されたＣａｓ９であり得る。最も好ましくは、Ｃａｓ９酵素は、ｓｐＣａｓ９（化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９）又はｓａＣａｓ９（黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９）からであるか、又はこれらに由来する。ＳｔＣａｓ９”は、サーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）からの野生型Ｃａｓ９を指し、このタンパク質配列は、アクセッション番号Ｇ３ＥＣＲ１としてＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースに存在する。同様に、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９又はｓｐＣａｓ９も、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースにアクセッション番号Ｑ９９ＺＷ２として収蔵されている。由来とは、本発明者らにおいては、由来酵素は、野生型酵素と高度の配列相同性を有するという点で大いに野生型酵素に基づいているが、本明細書に記載される任意の方法で突然変異している（修飾されている）ことを意味する。Ｃａｓ及びＣＲＩＳＰＲ酵素という語は、明確な記載がなければ、一般に本明細書では互換的に使用されることを理解されたい。上述のように、本明細書で使用される残基の付番の多くは、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）におけるＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からのＣａｓ９酵素を指す。しかしながら、本発明は、他の種の微生物からのより多くのＣａｓ９、例えば、ＳｐＣａｓ９、ＳａＣａ９、及びＳｔ１Ｃａｓ９などを含むことを理解されたい。化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９又は任意の近縁のＣａｓ９による酵素作用は、ガイド配列の２０のヌクレオチドにハイブリダイズする標的部位の配列において二本鎖の切断を果たし、この標的配列は、その２０のヌクレオチドに続くプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列（例として、本明細書に記載されるように決定することができるＮＧＧ／ＮＲＧ又はＰＡＭが挙げられる）を有する。部位特異的ＤＮＡ認識及び切断についてのＣａｓ９によるＣＲＩＳＰＲ活性は、ガイド配列、このガイド配列に部分的にハイブリダイズするｔｒａｃｒ配列、及びＰＡＭ配列によって決定される。ＣＲＩＳＰＲ系のさらなる態様は、Ｋａｒｇｉｎｏｖ及びＨａｎｎｏｎ，Ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ ｓｙｓｔｅｍ：ｓｍａｌｌ ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｄｅｆｅｎｃｅ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ ａｒｃｈａｅａ，Ｍｏｌｅ Ｃｅｌｌ ２０１０，Ｊａｎｕａｒｙ １５；３７（１）：７に記載されている。化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＳＦ３７０からのＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、及びＣｓｎ１の４つの遺伝子のクラスター、並びに２つの非コードＲＮＡエレメント、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及び短い長さの非反復配列（スペーサー、それぞれ約３０ｂｐ）が間に挿入された反復配列（直接反復）の特徴的なアレイを含む。この系では、標的ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）が、４つの連続ステップで行われる。第１に、２つの非コードＲＮＡ、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡアレイ、及びｔｒａｃｒＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される。第２に、ｔｒａｃｒＲＮＡが、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡの直接反復にハイブリダイズし、次いでこのハイブリダイズしたｐｒｅ−ｃｒＲＮＡが、個々のスペーサー配列を含む成熟ｃｒＲＮＡにプロセシングされる。第３に、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体が、Ｃａｓ９を、ｃｒＲＮＡのスペーサー領域とプロトスペーサーＤＮＡとの間のヘテロ二本鎖形成によってプロトスペーサー及び対応するＰＡＭからなるＤＮＡ標的に誘導する。最後に、Ｃａｓ９は、ＰＡＭの上流の標的ＤＮＡの切断を媒介してプロトスペーサー内にＤＳＢを生じさせる。２つの直接反復（ＤＲ）に隣接した単一スペーサーからなるｐｒｅ−ｃｒＲＮＡアレイもまた、「ｔｒａｃｒ−ｍａｔｅ配列」という語に包含される。特定の実施形態では、Ｃａｓ９は、構成的に存在し得る、又は誘導的に存在し得る、又は条件付きで存在し得る、又は投与され得る、又は送達され得る。Ｃａｓ９最適化を使用して、機能を促進する、又はキメラＣａｓ９タンパク質を作製できる新たな機能を開発することができる。そしてＣａｓ９は、一般的なＤＮＡ結合タンパク質として使用することができる。

典型的には、内因性ＣＲＩＳＰＲ系の文脈では、ＣＲＩＳＰＲ複合体（標的配列にハイブリダイズして１つ以上のＣａｓタンパク質と複合体を形成するガイド配列を含む）の形成により、標的配列中又はその近傍（例えば、標的配列からの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、２０、５０、又はそれよりも多い塩基対の範囲内）の一方又は両方の鎖が切断される。理論に拘束さることを望むものではないが、ｔｒａｃｒ配列は、野生型ｔｒａｃｒ配列の全て若しくは一部を含む又はこの全て若しくは一部（例えば、野生型ｔｒａｃｒ配列の約２０、約２６、約３２、約４５、約４８、約５４、約６３、約６７、約８５、若しくはそれよりも多い、又は約２０を超える、約２６を超える、約３２を超える、約４５を超える、約４８を超える、約５４を超える、約６３を超える、約６７を超える、約８５を超える、若しくはそれよりも多いヌクレオチド）からなり得、かつ、例えば、ｔｒａｃｒ配列の少なくとも一部に沿った、ガイド配列に機能的に連結されたｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列の全て又は一部へのハイブリダイゼーションによってＣＲＩＳＰＲ複合体の一部も形成し得る。

コドン最適化配列の一例は、この場合には、真核生物、例えば、ヒトでの発現が最適化された配列（即ち、ヒトでの発現が最適化されている）、又は本明細書に記載の別の真核生物、動物、又は哺乳動物での発現が最適化された配列である；例えば、国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７号明細書）のＳａＣａｓ９ヒトコドン最適化配列を参照されたい。これが好ましいが、他の例も可能であり、かつヒト以外の他の宿主種のコドン最適化、又は特定の生物のコドン最適化も知られていることを理解されたい。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列は、特定の細胞、例えば、真核細胞での発現が最適化されたコドンである。真核細胞は、特定の生物、例えば、限定されるものではないがヒトを含む哺乳動物、又は非ヒト真核生物、動物、又は本明細書に記載の哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、家畜、又は非ヒト哺乳動物若しくは霊長類であってもよいし、これらに由来するものでもよい。一部の実施形態では、ヒト又は動物に実質的な医学的利点が全くない、ヒト又は動物を苦しめる可能性の高い、ヒトの生殖細胞系の遺伝的同一性を変更するプロセス及び／又は動物の遺伝的同一性を変更するプロセス、並びにこのようなプロセスから生じる動物も排除することができる。一般に、コドン最適化は、天然配列の少なくとも１つのコドン（例えば、約１つ、約２つ、約３つ、約４つ、約５つ、約１０、約１５、約２０、約２５、約５０、若しくはそれよりも多い、又は約１つを超える、約２つを超える、約３つを超える、約４つを超える、約５つを超える、約１０を超える、約１５を超える、約２０を超える、約２５を超える、約５０を超える、それよりも多いコドン）を、その宿主細胞の遺伝子中で使用されるより高頻度に又は最も高頻度に使用されるコドンで置き換える一方で、天然アミノ酸配列を維持することにより目的の宿主細胞での発現の促進のために核酸配列を改変するプロセスを指す。様々な種は、特定のアミノ酸のあるコドンに対する特定のバイアスを示す。コドンバイアス（生物間のコドン使用頻度の差）は、しばしば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳の効率に相関し、これは、とりわけ、翻訳されるコドンの特性及び特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられる。細胞における選択されるｔＲＮＡの優位性は、一般に、ペプチド合成において最も高頻度で使用されるコドンの反映である。従って、遺伝子は、コドン最適化に基づいて所与の生物での最適な遺伝子発現のために調整することができる。コドン使用頻度表は、例えば、ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒｊｐ／ｃｏｄｏｎ／で入手できる「コドン使用頻度データベース」において容易に入手可能であり、これらの表は、多数の方法で適応させることができる。Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．“Ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｔａｂｕｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅｓ：ｓｔａｔｕｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｙｅａｒ ２０００”Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２９２（２０００）を参照されたい。特定の宿主細胞での発現のために特定の配列をコドン最適化するためのコンピュータアルゴリズムも入手可能であり、例えば、Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｇｅ（Ａｐｔａｇｅｎ；Ｊａｃｏｂｕｓ，ＰＡ）も入手可能である。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列の１つ以上のコドン（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、１０、１５、２０、２５、５０、若しくはそれよりも多い、又は全てのコドン）は、特定のアミノ酸に対して最も高頻度で使用されるコドンに対応する。

一部の実施形態では、ベクターは、１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）、例えば、約１つ、約２つ、約３つ、約４つ、約５つ、約６つ、約７つ、約８つ、約９つ、約１０、若しくはそれよりも多い、又は約１つを超える、約２つを超える、約３つを超える、約４つを超える、約５つを超える、約６つを超える、約７つを超える、約８つを超える、約９つを超える、約１０を超える、若しくはそれよりも多いＮＬＳを含むＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、アミノ末端又はその近傍に約１つ、約２つ、約３つ、約４つ、約５つ、約６つ、約７つ、約８つ、約９つ、約１０、若しくはそれよりも多い、又は約１つを超える、約２つを超える、約３つを超える、約４つを超える、約５つを超える、約６つを超える、約７つを超える、約８つを超える、約９つを超える、約１０を超える、若しくはそれよりも多いＮＬＳ、カルボキシ末端又はその近傍に約１つ、約２つ、約３つ、約４つ、約５つ、約６つ、約７つ、約８つ、約９つ、約１０、若しくはそれよりも多い、又は約１つを超える、約２つを超える、約３つを超える、約４つを超える、約５つを超える、約６つを超える、約７つを超える、約８つを超える、約９つを超える、約１０を超える、若しくはそれよりも多いＮＬＳ、又はこれらの組合せ（例えば、アミノ末端における０又は少なくとも１つ以上のＮＬＳ、及びカルボキシ末端における０又は１つ以上のＮＬＳ）を含む。２つ以上のＮＬＳが存在する場合、それぞれは、単一ＮＬＳが２つ以上のコピー中に存在し得るように他から独立して、及び／又は１つ以上のコピー中に存在する１つ以上の他のＮＬＳとの組合せで選択することができる。本発明の好ましい一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、最大で６つのＮＬＳを含む。一部の実施形態では、ＮＬＳは、このＮＬＳの最も近いアミノ酸が、Ｎ末端又はＣ末端からポリペプチド鎖に沿って約１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、又はそれよりも多いアミノ酸の中にある場合は、Ｎ末端又はＣ末端の近傍であると見なされる。ＮＬＳの非限定的な例としては、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶを有するＳＶ４０ウイルスラージＴ抗原のＮＬＳ；ヌクレオプラスミンからのＮＬＳ（例えば、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫを有するヌクレオプラスミン二部（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）ＮＬＳ）；アミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ又はＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰを有するｃ−ｍｙｃ ＮＬＳ；配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹを有するｈＲＮＰＡ１ Ｍ９ ＮＬＳ；インポーチンαからのＩＢＢドメインの配列ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ；筋腫Ｔタンパク質の配列ＶＳＲＫＲＰＲＰ及びＰＰＫＫＡＲＥＤ；ヒトｐ５３の配列ＰＯＰＫＫＫＰＬ；マウスｃ−ａｂｌ ＩＶの配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ；インフルエンザウイルスＮＳ１の配列ＤＲＬＲＲ及びＰＫＱＫＫＲＫ；肝炎ウイルスδ抗原の配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ；マウスＭｘ１タンパク質の配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ；ヒトポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼの配列ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ；並びにステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイドの配列ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫに由来するＮＬＳ配列が挙げられる。一般に、１つ以上のＮＬＳは、真核細胞の核内に検出可能な量のＣＲＩＳＰＲ酵素を蓄積させるのに十分な強度である。一般に、核局在化活性の強度は、ＣＲＩＳＰＲ酵素中のＮＬＳの数、使用される特定のＮＬＳ、又はそれらの因子の組合せから生じ得る。核内での蓄積の検出は、任意の好適な技術によって実施することができる。例えば、検出可能なマーカーをＣＲＩＳＰＲ酵素に融合させることができ、これにより、細胞内の位置を、例えば、核の位置を検出する手段（例えば、核に特異的な染色、例えば、ＤＡＰＩ）との組合せで可視化することができる。細胞核を細胞から単離することもでき、次いでその含有物を、タンパク質を検出する任意の好適なプロセス、例えば、免疫組織化学的分析、ウエスタンブロット、又は酵素活性アッセイによって分析することができる。核内での蓄積は、例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体形成の効果についてのアッセイ（例えば、標的配列におけるＤＮＡの切断若しくは突然変異についてのアッセイ、又はＣＲＩＳＰＲ複合体形成及び／若しくはＣＲＩＳＰＲ酵素活性の影響を受ける、変更された遺伝子発現活性についてのアッセイ）により、ＣＲＩＳＰＲ酵素にも複合体にも曝露されていない、又は１つ以上のＮＬＳが欠失したＣＲＩＳＰＲ酵素に曝露された対照と比較して、間接的に決定することもできる。

本発明の態様は、遺伝子産物の発現の減少、又は遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子にさらに導入される鋳型ポリヌクレオチド、又は２つの５’オーバーハングのリアニール及び結合を可能にすることによって正確に切断される介在配列、又は変更される遺伝子産物の活性若しくは機能、又は遺伝子産物の発現の増加に関する。本発明の一実施形態では、遺伝子産物はタンパク質である。ガイド配列間の重複が８ｂｐ未満の５’オーバーハング（−８ｂｐを超えるオフセット）を形成するｓｇＲＮＡ対のみが、検出可能な挿入欠失の発生を媒介することができた。重要なことに、これらのアッセイに使用される各ガイドは、野生型Ｃａｓ９と対を形成したときに挿入欠失を効率的に誘導することができ、ガイド対の相対位置が、二重ニッキング活性の予測において最も重要なパラメータであることを示唆する。Ｃａｓ９ｎ及びＣａｓ９Ｈ８４０ＡがＤＮＡの逆鎖に切れ目を入れるため、所与のｓｇＲＮＡ対を用いたＣａｓ９ｎのＣａｓ９Ｈ８４０Ａでの置換は、オーバーハング型の逆のはずであるが；Ｃａｓ９Ｈ８４０Ａと同様に挿入欠失の発生が観察されず、Ｃａｓ９Ｈ８４０Ａが、全ＤＮＡ切断活性が実質的に欠損しているＣＲＩＳＰＲ酵素であることを示唆する（これは、突然変異酵素のＤＮＡ切断活性が、非突然変異型の酵素のＤＮＡ切断活性の約２５％未満、約１０％未満、約５％未満、約１％未満、約０．１％未満、約０．０１％未満、又はそれ未満であるときであり；これにより、一例は、非突然変異型と比較して、突然変異型のＤＮＡ切断活性がゼロ又はごく僅かである場合、例えば、生化学系又は原核生物系とは対照的に真核生物系におけるＣａｓ９Ｈ８４０Ａと同様に挿入欠失の発生が観察されない場合であり得る）。とはいえ、Ｃａｓ９ｎで５’オーバーハングを形成するｓｇＲＮＡの対は、原則として、代わりに対応する３’オーバーハング及び二重ニッキングを形成するはずである。従って、Ｃａｓ９ｎでの３’オーバーハングの形成をもたらすｓｇＲＮＡ対を別の突然変異Ｃａｓ９と共に使用して、５’オーバーハング及び二重ニッキングを形成することができる。従って、一部の実施形態では、組換え鋳型も提供される。組換え鋳型は、本明細書に記載される、別個のベクターに含まれる又は別個のポリヌクレオチドとして提供される別のベクターの構成成分であり得る。一部の実施形態では、組換え鋳型は、例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体の一部としてＣＲＩＳＰＲ酵素によって切れ目が入れられる又は切断される標的配列内又はその近傍の相同組換えにおける鋳型として役立つように設計される。鋳型ポリヌクレオチドは、任意の適切な長さ、例えば、約１０、約１５、約２０、約２５、約５０、約７５、約１００、約１５０、約２００、約５００、約１０００、若しくはそれを超える、又は約１０を超える、約１５を超える、約２０を超える、約２５を超える、約５０を超える、約７５を超える、約１００を超える、約１５０を超える、約２００を超える、約５００を超える、約１０００を超える、若しくはそれを超えるヌクレオチド長であり得る。一部の実施形態では、鋳型ポリヌクレオチドは、標的配列を含むポリヌクレオチドの一部に相補的である。最適に整列されると、鋳型ポリヌクレオチドは、標的配列の１つ以上のヌクレオチド（例えば、約１、約５、約１０、約１５、約２０、若しくはそれよりも多い、又は約１を超える、約５を超える、約１０を超える、約１５を超える、約２０を超える、若しくはそれよりも多いヌクレオチド）と重複する可能性がある。一部の実施形態では、鋳型配列、及び標的配列を含むポリヌクレオチドが最適に整列されると、鋳型ポリヌクレオチドの最も近いヌクレオチドは、標的配列から約１つ以内、約５つ以内、約１０以内、約１５以内、約２０以内、約２５以内、約５０以内、約７５以内、約１００以内、約２００以内、約３００以内、約４００以内、約５００以内、約１０００以内、約５０００以内、約１００００以内、若しくはそれを超えるヌクレオチドの範囲内である。

一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントの発現を駆動する１つ以上のベクターを、ＣＲＩＳＰＲ系のエレメントの発現が１つ以上の標的部位でのＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を誘導するように宿主細胞に導入する。例えば、Ｃａｓ酵素、ｔｒａｃｒ−ｍａｔｅ配列に連結されたガイド配列、及びｔｒａｃｒ配列はそれぞれ、別個のベクターにおける調節エレメントを分離するために機能的に連結することができる。或いは、ＣＲＩＳＰＲ系のＲＮＡを、トランスジェニックＣａｓ９動物又は哺乳動物、例えば、Ｃａｓ９を構成的に、若しくは誘導的に、若しくは条件付きで発現する動物又は哺乳動物；或いは、他の方法、例えば、Ｃａｓ９をコードし、かつｉｎ ｖｉｖｏでＣａｓ９を発現する１つ又は複数のベクターの事前投与によりＣａｓ９を発現する、又はＣａｓ９を含む細胞を有する動物若しくは哺乳動物に送達することができる。別法では、同じ又は異なる調節エレメントから発現される２つ以上のエレメントを、単一ベクター中で、この第１のベクターに含まれていないＣＲＩＳＰＲ系のあらゆる構成成分を提供する１つ以上の追加のベクターを用いて組み合わせることができる。単一ベクター中で組み合わせられるＣＲＩＳＰＲ系のエレメントは、任意の適切な向き、例えば、１つのエレメントが、第２のエレメントに対して５’側（第２のエレメントの上流）に配置する、又は３’側（第２のエレメントの下流）に配置することができる。１つのエレメントのコード配列を、第２のエレメントのコード配列の同じ鎖又は反対の鎖上に配置し、かつ同じ方向又は反対の方向に向けることができる。一部の実施形態では、単一プロモーターが、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする転写物、並びに１つ以上のイントロン配列内に組み込まれた（例えば、それぞれが異なるイントロン内にある、２つ以上が少なくとも１つのイントロン内にある、又は全てが単一イントロン内にある）ガイド配列、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列（任意にガイド配列に機能的に連結される）、及びｔｒａｃｒ配列の１つ以上の発現を駆動する。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素、ガイド配列、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、及びｔｒａｃｒ配列は、同じプロモーターに機能的に連結され、この同じプロモーターから発現される。ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントの発現のための送達ビヒクル、ベクター、粒子、ナノ粒子、製剤、及びこれらの構成成分が、上述の文献、例えば、国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７号明細書）に記載されているように使用される。一部の実施形態では、ベクターは、１つ以上の挿入部位、例えば、制限エンドヌクレオチドアーゼ認識配列（「クローニング」部位とも呼ばれる）を含む。一部の実施形態では、１つ以上の挿入部位（例えば、約１つ、約２つ、約３つ、約４つ、約５つ、約６つ、約７つ、約８つ、約９つ、約１０、若しくはそれよりも多い、又は約１つを超える、約２つを超える、約３つを超える、約４つを超える、約５つを超える、約６つを超える、約７つを超える、約８つを超える、約９つを超える、約１０を超える、若しくはそれよりも多い挿入部位）が、１つ以上のベクターの１つ以上の配列エレメントの上流及び／又は下流に位置している。一部の実施形態では、ベクターは、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列の上流の挿入部位、及び任意に、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に機能的に連結された調節エレメントの下流の挿入部位を含み、これにより、ガイド配列の挿入部位への挿入後の発現時に、ガイド配列が、ＣＲＩＳＰＲ複合体の真核細胞内の標的配列への配列特異的結合を誘導する。一部の実施形態では、ベクターは、２つ以上の挿入部位を含む、各挿入部位は、各部位でのガイド配列の挿入が可能となるように２つのｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列間に位置する。このような配置では、２つ以上のガイド配列は、単一ガイド配列の２つ以上のコピー、２つ以上の異なるガイド配列、又はこれらの組み合わせを含み得る。複数の異なるガイド配列が使用される場合、単一発現構築物を使用して、細胞内の複数の異なる、対応する標的配列に対してＣＲＩＳＰＲ活性を標的とするようにすることができる。例えば、単一ベクターは、約１つ、約２つ、約３つ、約４つ、約５つ、約６つ、約７つ、約８つ、約９つ、約１０、約１５、約２０、若しくはそれよりも多い、又は約１つを超える、約２つを超える、約３つを超える、約４つを超える、約５つを超える、約６つを超える、約７つを超える、約８つを超える、約９つを超える、約１０を超える、約１５を超える、約２０を超える、若しくはそれよりも多いガイド配列を含み得る。一部の実施形態では、約１つ、約２つ、約３つ、約４つ、約５つ、約６つ、約７つ、約８つ、約９つ、約１０、若しくはそれよりも多い、又は約１つを超える、約２つを超える、約３つを超える、約４つを超える、約５つを超える、約６つを超える、約７つを超える、約８つを超える、約９つを超える、約１０を超える、若しくはそれよりも多いこのようなガイド配列を含むベクターを提供し、任意に細胞に送達することができる。一部の実施形態では、ベクターは、ＣＲＩＳＰＲ酵素、例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする酵素コード配列に機能的に連結された調節エレメントを含む。ＣＲＩＳＰＲ酵素、又はＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ、又はＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ若しくはＲＮＡを別個に送達することができ；そして有利なことに、これらの少なくとも１つが、ナノ粒子複合体によって送達される。ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ酵素が発現する時間を与えるために、ガイドＲＮＡの前に送達することができる。ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡは、ガイドＲＮＡの投与の１〜１２時間（好ましくは約２〜６時間）前に投与してもよい。別法では、ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡを一緒に投与することができる。有利なことに、ガイドＲＮＡの第２のブースター用量を、ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ＋ガイドＲＮＡの最初の投与から１〜１２時間（好ましくは、約２〜６時間）後に投与することができる。ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ及び／又はガイドＲＮＡの追加の投与は、最も効率の高いレベルのゲノム改変を達成するのに有用であろう。

一態様では、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントを使用するための方法を提供する。本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的ポリヌクレオチドを改変するための有効な手段を提供する。本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体は、複数の細胞型内で標的ポリヌクレオチドを改変（例えば、欠失、挿入、転座、不活性化、活性化）するステップを含む多種多様な有用性を有する。従って、本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体は、例えば、遺伝子療法、薬物スクリーニング、疾患診断、及び予後診断における広範囲の用途を有する。例示的なＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズしたガイド配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含む。ガイド配列は、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に連結され、このｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列は、ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズする。一実施形態では、本発明は、標的ポリヌクレオチドを切断する方法を提供する。この方法は、標的ポリヌクレオチドに結合して前記標的ポリヌクレオチドを切断するＣＲＩＳＰＲ複合体を用いて標的ポリヌクレオチドを改変するステップを含む。典型的には、本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体は、細胞内に導入されると、ゲノム配列に切断部（例えば、一本鎖又は二本鎖の切断部）を形成する。例えば、この方法を使用して細胞内の疾患遺伝子を切断することができる。ＣＲＩＳＰＲ複合体によって形成された切断部は、修復プロセス、例えば、修復ミスの多い非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路又は高忠実性相同組換え修復（ＨＤＲ）によって修復することができる。これらの修復プロセス中に、外因性ポリヌクレオチド鋳型をゲノム配列に導入することができる。一部の方法では、ＨＤＲプロセスを使用してゲノム配列が改変される。例えば、上流の配列及び下流の配列に隣接した組み込まれる配列を含む外因性ポリヌクレオチド鋳型が細胞内に導入される。上流配列及び下流配列は、染色体内の組み込み部位の両側と配列類似性を共有する。望ましい場合は、ドナーヌクレオチドは、ＤＮＡ、例えば、ＤＮＡプラスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、ウイルスベクター、ＤＮＡの線状断片、ＰＣＲ断片、裸の核酸、又は送達ビヒクル、例えば、リポソーム若しくはポロキサマーと複合体を形成した核酸であり得る。外因性ポリヌクレオチド鋳型は、組み込まれるべき配列（例えば、突然変異遺伝子）を含む。組み込みのための配列は、細胞に対して内因性の配列であってもよいし、又は外因性の配列であってもよい。組み込まれる配列の例として、タンパク質又は非コードＲＮＡ（例えば、ｍｉｃｒｏＲＮＡ）をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。従って、組み込みのための配列を、１つ又は複数の適切な制御配列に機能的に連結することができる。別法では、組み込まれるべき配列は、制御機能を提供することができる。外因性ポリヌクレオチド鋳型における上流配列及び下流配列は、目的の染色体配列とドナーポリヌクレオチドとの間の組換えを促進するように選択される。上流配列は、組み込みのための標的部位の上流のゲノム配列と配列類似性を共有する核酸配列である。同様に、下流配列は、組み込みの標的部位の下流の染色体配列と配列類似性を共有する核酸配列である。外因性ポリヌクレオチド鋳型における上流配列及び下流配列は、標的ゲノム配列と７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％の配列同一性を有し得る。好ましくは、外因性ポリヌクレオチド鋳型における上流配列及び下流配列は、標的ゲノム配列と約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％の配列同一性を有する。一部の方法では、外因性ポリヌクレオチド鋳型における上流配列及び下流配列は、標的ゲノム配列と約９９％又は約１００％の配列同一性を有する。上流配列又は下流配列は、約２０ｂｐ〜約２５００ｂｐ、例えば、約５０ｂｐ、約１００ｂｐ、約２００ｂｐ、約３００ｂｐ、約４００ｂｐ、約５００ｂｐ、約６００ｂｐ、約７００ｂｐ、約８００ｂｐ、約９００ｂｐ、約１０００ｂｐ、約１１００ｂｐ、約１２００ｂｐ、約１３００ｂｐ、約１４００ｂｐ、約１５００ｂｐ、約１６００ｂｐ、約１７００ｂｐ、約１８００ｂｐ、約１９００ｂｐ、約２０００ｂｐ、約２１００ｂｐ、約２２００ｂｐ、約２３００ｂｐ、約２４００ｂｐ、又は約２５００ｂｐを含み得る。一部の方法では、例示的な上流配列又は下流配列は、約２００ｂｐ〜約２０００ｂｐ、約６００ｂｐ〜約１０００ｂｐ、又は特に７００ｂｐ〜約１０００ｂｐを有する。一部の方法では、外因性ポリヌクレオチド鋳型は、マーカーをさらに含み得る。このようなマーカーは、標的の組み込みについてのスクリーニングを容易にすることができる。適切なマーカーの例として、制限部位、蛍光タンパク質、又は選択マーカーが挙げられる。本発明の外因性ポリヌクレオチド鋳型は、組換え技術を用いて作製することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１、及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９６を参照されたい）。外因性ポリヌクレオチド鋳型を組み込むことによって標的ポリヌクレオチドを改変する方法では、二本鎖の切断部をＣＲＩＳＰＲ複合体によってゲノム配列に導入し、この切断部は、外因性ポリヌクレオチド鋳型がゲノムに組み込まれるようにこの鋳型の相同組換えによって修復される。二本鎖切断部の存在は、鋳型の組み込みを促進する。他の実施形態では、本発明は、真核細胞でのポリヌクレオチドの発現を変更する方法を提供する。この方法は、標的ポリヌクレオチドに結合するＣＲＩＳＰＲ酵素の使用によってこの標的ポリヌクレオチドの発現を増加させる又は低下させるステップを含む。一部の方法では、標的ポリヌクレオチドを不活性化して、細胞内での発現を変更することができる。例えば、細胞内でＣＲＩＳＰＲ複合体が標的配列に結合すると、標的ポリヌクレオチドが不活性化され、これにより配列が転写されなくなる、コードタンパク質が産生されなくなる、又は配列が野生型配列のようには機能しなくなる。例えば、タンパク質又はｍｉｃｒｏＲＮＡコード配列を不活性化させて、このタンパク質又はｍｉｃｒｏＲＮ又はｐｒｅ−ｍｉｃｒｏＲＮＡの転写が行われないようにすることができる。一部の方法では、制御配列を不活性化させて、この制御配列が制御配列として機能しなくなるようにすることができる。本明細書で使用される「制御配列」という語は、核酸配列の転写、翻訳、又は接触性を実現する任意の核酸配列を指す。制御配列の例として、プロモーター、転写ターミネーター、及びエンハンサーが挙げられる。ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的ポリヌクレオチドは、真核細胞の内因性又は外因性のあらゆるポリヌクレオチドであり得る。例えば、標的ポリヌクレオチドは、真核細胞の核内に存在するポリヌクレオチドであり得る。標的ポリヌクレオチドは、遺伝子産物（例えば、タンパク質）をコードする配列、又は非コード配列（例えば、調節ポリヌクレオチド又はジャンクＤＮＡ）であり得る。標的ポリヌクレオチドの例として、シグナル伝達生化学経路に関連した配列、例えば、シグナル伝達生化学経路関連遺伝子又はポリヌクレオチドが挙げられる。標的ポリヌクレオチドの例として、疾患関連遺伝子又はポリヌクレオチドが挙げられる。「疾患関連」遺伝子又はポリヌクレオチドは、非疾患対照の組織又は細胞と比較して、疾患の影響を受けた組織に由来する細胞において異常なレベル又は異常な形態で転写産物又は翻訳産物を生じさせるあらゆる遺伝子又はポリヌクレオチドを指す。疾患関連遺伝子は、異常に高いレベルで発現されるようになる遺伝子であり得；疾患関連遺伝子は、異常に低いレベルで発現されるようになる遺伝子であり得、この発現の変更は、疾患の発症及び／又は進行に相関する。疾患関連遺伝子はまた、疾患の病因に直接関与する、又は疾患の病因に関与する遺伝子と連鎖不平衡である、突然変異又は遺伝的変異を有する遺伝子も指す。転写産物又は翻訳産物は、既知又は未知であり得、かつ正常レベル又は異常レベルであり得る。ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的ポリヌクレオチドは、真核細胞に対して内因性又は外因性のあらゆるポリヌクレオチドであり得る。例えば、標的ポリヌクレオチドは、真核細胞の核内に存在するポリヌクレオチドであり得る。標的ポリヌクレオチドは、遺伝子産物（例えば、タンパク質）をコードする配列、又は非コード配列（例えば、調節ポリヌクレオチド又はジャンクＤＮＡ）であり得る。理論に拘束されることを望むものではないが、標的配列がＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）に関連するはずであると考えられる；即ち、ＣＲＩＳＰＲ複合体によって認識される短い配列である。ＰＡＭにとっての正確な配列及び長さの要件は、使用されるＣＲＩＳＰＲ酵素によって異なるが、ＰＡＭは、典型的には、プロトスペーサーに近接した２〜５塩基対の配列（即ち、標的配列）である。ＰＡＭ配列の例として、以下の実施例のセクションに示され、当業者であれば、所与のＣＲＩＳＰＲ酵素に使用されるさらなるＰＡＭ配列を同定できるであろう。一部の実施形態では、この方法は、ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的ポリヌクレオチドへの結合を可能にして前記標的ポリヌクレオチドの切断をもたらし、これにより標的ポリヌクレオチドを改変するステップを含み、このＣＲＩＳＰＲ複合体が、前記標的ポリヌクレオチド中の標的配列にハイブリダイズしたガイド配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、前記ガイド配列が、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に連結され、このｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズする。一態様では、本発明は、真核細胞内でのポリヌクレオチドの発現を変更する方法を提供する。一部の実施形態では、この方法は、ＣＲＩＳＰＲ複合体のポリヌクレオチドへの結合を可能にし、前記結合により前記ポリヌクレオチドの発現が増加又は低下するステップを含み；このＣＲＩＳＰＲ複合体が、前記標的ポリヌクレオチド中の標的配列にハイブリダイズしたガイド配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、前記ガイド配列が、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に連結され、このｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズする。標的ポリヌクレオチドを変更する方法に、同様の考慮及び条件が上記のように当てはまる。実際、これらのサンプリング、培養、及び再導入の選択肢は、本発明の態様の全てに当てはまる。一態様では、本発明は、真核細胞で標的ポリヌクレオチドを改変する方法を提供し、この方法は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、又はｉｎ ｖｉｔｒｏで行うことができる。一部の実施形態では、この方法は、ヒト又は非ヒト動物から細胞又は細胞集団をサンプリングするステップ、及びこの１つ又は複数の細胞を改変するステップを含む。培養は、ｅｘ ｖｉｖｏで全ての段階を行うことができる。１つ又は複数の細胞を、非ヒト動物又は植物に再導入することさえできる。再導入された細胞では、細胞が幹細胞であることが特に好ましい。

実際、本発明のいずれの態様でも、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的配列にハイブリダイズしたガイド配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含むことができ、前記ガイド配列が、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に連結され得、このｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし得る。

本発明は、ナノ粒子担体により送達されるようなＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系及びその構成成分が関係する配列標的化を伴う遺伝子発現の制御、例えば、ゲノム摂動又は遺伝子編集のために使用される系、方法及び組成物のエンジニアリング及び最適化に関する。本方法の利点は、ＣＲＩＳＰＲ系の送達が、オフターゲット送達及びその結果生じる副作用を最小限にするように誘導され得ることである。これは、送達粒子製剤及び／又は系、好ましくはナノ粒子系を用いて達成される。

Ｃａｓ９
Ｃａｓ９最適化を使用して、機能を促進する、又はキメラＣａｓ９タンパク質を作製できる新たな機能を開発することができる。本出願人が作製した例は実施例４で提供される。キメラＣａｓ９タンパク質は、異なるＣａｓ９ホモログからの断片を組み合わせることによって作ることができる。例えば、Ｃａｓ９からの２つのキメラＣａｓ９タンパク質の例が本明細書に記載されている。例えば、本出願人は、Ｓｔ１Ｃａｓ９のＮ末端（このタンパク質の断片は保持される）をＳｐＣａｓ９のＣ末端と融合した。キメラＣａｓ９を作成する利点には、毒性の低減；真核細胞における発現の改善；特異性の増強；タンパク質の分子量の低下（例えば、異なるＣａｓ９ホモログからの最小ドメインを組み合わせることによりタンパク質をより小さくする）及び／又はＰＡＭ配列要求性の変更のいずれか又は全てが含まれる。

Ｃａｓ９は、一般的なＤＮＡ結合タンパク質として使用され得る。例えば、及び実施例５に示されるように、本出願人は、ＤＮＡ標的の両方の鎖の切断に関与している２つの触媒ドメイン（Ｄ１０及びＨ８４０）の突然変異によって、Ｃａｓ９を一般的なＤＮＡ結合タンパク質として使用した。標的遺伝子座における遺伝子転写を上方制御するために、本出願人は転写活性化ドメイン（ＶＰ６４）をＣａｓ９に融合した。他の転写活性化ドメインが知られている。実施例１５に示されるように、転写活性化が可能である。実施例１５に同様に示されるように、標的遺伝子配列に結合し、従ってその活性を抑制するＣａｓ９リプレッサー（ＤＮＡ結合ドメイン）を用いて、遺伝子抑制（この場合、β−カテニン遺伝子の）が可能である。

Ｃａｓ９及び１つ以上のガイドＲＮＡは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス、アデノウイルス、又は他のタイプのプラスミド若しくはウイルスベクターを用いて、特に、例えば、米国特許第８，４５４，９７２号明細書（アデノウイルス用の製剤、用量）、同第８，４０４，６５８号明細書（ＡＡＶ用の製剤、用量）、及び同第５，８４６，９４６号明細書（ＤＮＡプラスミドの製剤、用量）からの、並びに臨床試験やレンチウイルス、ＡＡＶ、及びアデノウイルスに関する臨床試験に関する出版物からの製剤及び用量を用いて送達することができる。例えば、ＡＡＶの場合は、投与経路、製剤、及び用量は、米国特許第８，４５４，９７２号明細書及びＡＡＶに関する臨床試験と同様にすることができる。アデノウイルスの場合は、投与経路、製剤、及び用量は、米国特許第８，４０４，６５８号明細書及びアデノウイルスに関する臨床試験と同様にすることができる。プラスミド送達の場合は、投与経路、製剤、及び用量は、米国特許第５，８４６，９４６号明細書及びプラスミドに関する臨床研究と同様にすることができる。用量は、平均７０ｋｇの人に基づく又は外挿することができ、かつ患者、対象、哺乳動物の様々な体重及び種に合わせて調整することができる。投与の頻度は、医学実施者又は獣医学実施者（例えば、医師、獣医師）の領域内であり、年齢、性別、全身の健康、患者又は対象の他の状態、及び対処される特定の状態又は症状を含む通常の因子によって決まる。

ウイルスベクターは、目的の組織に注入することができる。細胞型特異的ゲノム改変の場合は、Ｃａｓ９の発現は、細胞型特異的プロモーターによって駆動され得る。例えば、肝臓特異的発現はアルブミンプロモーターを使用することができ、ニューロン特異的発現はＳｙｎａｐｓｉｎ Ｉプロモーターを使用することができる。

トランスジェニック動物及び植物
トランスジェニック動物も提供される。好ましい例としては、Ｃａｓ９をコードするポリヌクレオチド又はタンパク質自体という観点から、Ｃａｓ９を含む動物が挙げられる。マウス、ラット及びウサギが好ましい。本明細書に例示されるような構築物によりトランスジェニックマウスを作成するために、偽妊娠メス、例えばＣＢ５６メス由来の接合体の前核に純粋な線状ＤＮＡを注入することができる。次に、ファウンダーが同定され、遺伝子型が決定され、ＣＢ５７マウスと戻し交配され得る。次に、構築物がクローニングされ、任意選択で、例えばＳａｎｇｅｒシークエンシングによって検証され得る。例えばモデルにおいて１つ以上の遺伝子がノックアウトされる場合、ノックアウトが想定される。しかしながら、ノックインも（単独で又は組み合わせで）想定される。ノックインＣａｓ９マウス例を作成した。そしてこれは例示されているが、Ｃａｓ９ノックインが好ましい。Ｃａｓ９ノックインマウスを作成するために、本明細書に記載される（図２２Ａ〜Ｂ及び２３）ように、同じ構成的及び条件的構築物をＲｏｓａ２６遺伝子座に標的化することができる。Ｒｏｓａ遺伝子座の標的化に関する米国特許出願公開第２０１２００１７２９０号明細書及び同第２０１１０２６５１９８号明細書（Ｓａｎｇａｍｏ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．に譲渡）の方法は、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系を利用するために修正され得る。別の実施形態では、Ｒｏｓａ遺伝子座の標的化に関する米国特許出願公開第２０１３０２３６９４６号明細書（Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓに譲渡）の方法も、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系を利用するために修正され得る。

条件的Ｃａｓ９マウスの有用性：本出願人は、２９３細胞において、Ｃｒｅとの同時発現によってＣａｓ９条件的発現構築物を活性化できることを示した。また本出願人は、Ｃｒｅが発現されると、正しく標的化されたＲ１ ｍＥＳＣが活性Ｃａｓ９を有し得ることも示す。Ｃａｓ９の後にＰ２Ａペプチド切断配列が続き、及び次にＥＧＦＰが続くため、本出願人は、ＥＧＦＰの観察により発現の成功を確認する。本出願人は、ｍＥＳＣにおけるＣａｓ９活性化を示した。この同じ概念は、条件的Ｃａｓ９マウスを非常に有用するものである。条件的Ｃａｓ９マウスと、Ｃｒｅを普遍的に発現するマウス（ＡＣＴＢ−Ｃｒｅ系統）との交配により、全ての細胞においてＣａｓ９を発現するマウスを得ることができる。キメラＲＮＡの送達は、胎仔又は成体マウスにおいてゲノム編集を誘導する。興味深いことに、条件的Ｃａｓ９マウスを組織特異的プロモーターの下でＣｒｅを発現するマウスと交配させると、Ｃｒｅも発現する組織においてのみＣａｓ９が存在し得る。このアプローチを使用して、キメラＲＮＡを同じ組織に送達することにより、正確な組織においてだけゲノムを編集することができる。

上記のように、トランスジェニック動物はまた、トランスジェニック植物、特に作物及び藻類であるように提供される。トランスジェニック植物は、疾患モデルの提供以外の用途で有用であり得る。これらには、例えば、野生型において通常見られるよりも高いタンパク質、炭水化物、栄養物又はビタミンレベルの発現による食物又は飼料の生産が含まれ得る。これに関して、トランスジェニック植物、特に豆類及び塊茎、並びに動物、特に家畜（雌ウシ、ヒツジ、ヤギ及びブタ）などの哺乳類、また家禽及び食用昆虫も好ましい。トランスジェニック藻類又はセイヨウアブラナなどの他の植物は、例えば植物油又はバイオ燃料、例えばアルコール（特に、メタノール及びエタノール）の生産において、特に有用であり得る。これらは、油又はバイオ燃料産業で使用するための高レベルの油又はアルコールを発現又は過剰発現するようにエンジニアリングされ得る。

粒子送達系及び／又は製剤：
いくつかの種類の粒子送達系及び／又は製剤は、幅広い生物医学的応用に有用であることが知られている。一般に、粒子は、その輸送及び特性に関して全体として１つの単位として挙動する小さい物体として定義される。粒子は直径に従いさらに分類される。粗粒子は２，５００〜１０，０００ナノメートルの範囲を包含する。微粒子は１００〜２，５００ナノメートルのサイズである。超微粒子、又はナノ粒子は、概してサイズが１〜１００ナノメートルである。この１００ｎｍの限界は、粒子をバルク材料と区別する新規特性が典型的には１００ｎｍ未満の臨界長さスケールで生じるという事実に基づく。

本明細書で使用されるとき、粒子送達系／製剤は、本発明に係る粒子を含む任意の生物学的送達系／製剤として定義される。本発明に係る粒子は、１００ミクロン（μｍ）未満の最大寸法（例えば直径）を有する任意の実体である。一部の実施形態では、本発明の粒子は１０μｍ未満の最大寸法を有する。一部の実施形態では、本発明の粒子は２０００ナノメートル（ｎｍ）未満の最大寸法を有する。一部の実施形態では、本発明の粒子は１０００ナノメートル（ｎｍ）未満の最大寸法を有する。一部の実施形態では、本発明の粒子は９００ｎｍ、８００ｎｍ、７００ｎｍ、６００ｎｍ、５００ｎｍ、４００ｎｍ、３００ｎｍ、２００ｎｍ、又は１００ｎｍ未満の最大寸法を有する。典型的には、本発明の粒子は５００ｎｍ以下の最大寸法（例えば直径）を有する。一部の実施形態では、本発明の粒子は２５０ｎｍ以下の最大寸法（例えば直径）を有する。一部の実施形態では、本発明の粒子は２００ｎｍ以下の最大寸法（例えば直径）を有する。一部の実施形態では、本発明の粒子は１５０ｎｍ以下の最大寸法（例えば直径）を有する。一部の実施形態では、本発明の粒子は１００ｎｍ以下の最大寸法（例えば直径）を有する。より小さい粒子、例えば５０ｎｍ以下の最大寸法を有する粒子が、本発明の一部の実施形態において使用される。一部の実施形態では、本発明の粒子は２５ｎｍ〜２００ｎｍの範囲の最大寸法を有する。

粒子の特徴付け（例えば、形態、寸法等を特徴付けることを含む）は、種々の異なる技法を用いて行われる。一般的な技法は、電子顕微鏡法（ＴＥＭ、ＳＥＭ）、原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）、動的光散乱（ＤＬＳ）、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）、粉末Ｘ線回折（ＸＲＤ）、フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、紫外・可視分光法、二重偏光干渉法及び核磁気共鳴（ＮＭＲ）である。特徴付け（寸法測定）は天然粒子（即ち、負荷前）に関して行われてもよく、又は本発明の任意のｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏ適用に対する送達に最適なサイズの粒子を提供するため、カーゴ（本明細書ではカーゴは、例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の１つ以上の構成成分、例えばＣＲＩＳＰＲ酵素又はｍＲＮＡ又はガイドＲＮＡ、又はそれらの任意の組み合わせを指し、さらなる担体及び／又は賦形剤を含み得る）の負荷後に行われてもよい。特定の好ましい実施形態において、粒子の寸法（例えば直径）の特徴付けは、動的レーザー散乱法（ＤＬＳ）を用いた測定に基づく。

本発明の範囲内の粒子送達系は、限定はされないが、固体、半固体、エマルション、又はコロイド粒子を含めた任意の形態で提供され得る。従って、本明細書に記載される任意の送達系が、限定はされないが、例えば、脂質ベースの系、リポソーム、ミセル、微小胞、エキソソーム、又は遺伝子銃を含め、本発明の範囲内にある粒子送達系として提供され得る。

ナノ粒子
本発明に関連して、ナノ粒子又は脂質エンベロープを用いて送達されるＣＲＩＳＰＲ複合体の１つ以上の構成成分、例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素又はｍＲＮＡ又はガイドＲＮＡを有することが好ましい。本明細書における他の送達系又はベクターに関する議論は、これらが本発明のナノ粒子の態様と併せて使用され得るからである。

一般に、「ナノ粒子」は、１０００ｎｍ未満の直径を有する任意の粒子を指す。特定の好ましい実施形態では、本発明のナノ粒子は、５００ｎｍ以下の最大寸法（例えば、直径）を有する。他の好ましい実施形態では、本発明のナノ粒子は、２５ｎｍ〜２００ｎｍの範囲の最大寸法を有する。他の好ましい実施形態では、本発明のナノ粒子は、１００ｎｍ以下の最大寸法を有する。他の好ましい実施形態では、本発明のナノ粒子は、３５ｎｍ〜６０ｎｍの範囲の最大寸法を有する。

本発明に包含されるナノ粒子は、様々な形態で、例えば、固体ナノ粒子（例えば、銀、金、鉄、チタンなどの金属）、非金属、脂質ベースの固体、ポリマー、ナノ粒子の懸濁液、又はこれらの組み合わせとして提供され得る。金属、誘電体、及び半導体ナノ粒子が調製され、ハイブリッド構造（例えば、コア−シェルナノ粒子）も調製され得る。半導体材料で作られたナノ粒子は、電子エネルギーレベルの量子化が起こるほどこれらが十分に小さければ（通常、１０ｎｍ未満）、標識量子ドットであり得る。このようなナノスケール粒子は生物医学的応用において薬物担体又は造影剤として使用され、本発明においても同様の目的で適合され得る。

半固体及び軟質のナノ粒子が製造されており、これらは本発明の範囲内に含まれる。半固体性のプロトタイプナノ粒子はリポソームである。種々のタイプのリポソームナノ粒子が現在、抗癌薬及びワクチンのための送達系として臨床的に使用されている。半分が親水性で残り半分が疎水性のナノ粒子はＪａｎｕｓ粒子と呼ばれ、エマルションの安定化のために特に有効である。これらは水／油界面で自己組織化し、固体界面活性剤の役割を果たすことができる。

例えば、Ｓｕ Ｘ，Ｆｒｉｃｋｅ Ｊ，Ｋａｖａｎａｇｈ ＤＧ，Ｉｒｖｉｎｅ ＤＪ（“Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｍＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｕｓｉｎｇ ｌｉｐｉｄ−ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ ｐＨ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｐｏｌｙｍｅｒ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ”Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ．２０１１ Ｊｕｎ ６；８（３）：７７４−８７．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｍｐ１００３９０ｗ．Ｅｐｕｂ ２０１１ Ａｐｒ １）は、リン脂質二重層シェルによって覆われたポリ（β−アミノエステル）（ＰＢＡＥ）コアを有する生分解性コアシェル構造ナノ粒子について記載している。これらは、ｉｎ ｖｉｖｏでのｍＲＮＡの送達のために開発された。ｐＨ応答性ＰＢＡＥ構成成分は、エンドソームの破壊を促進するために選択されたが、脂質表面層は、ポリカチオンコアの毒性を最小限にするために選択された。従って、これらは、本発明のＲＮＡの送達に好ましい。

一実施形態では、自己構築生体接着ポリマーに基づいたナノ粒子が企図され、このナノ粒子は、全て脳への送達であるペプチドの経口送達、ペプチドの静脈内送達、及びペプチドの経鼻送達に適用することができる。他の実施形態、例えば、疎水性薬物の経口吸収及び眼送達も企図される。分子エンベロープ技術は、保護された疾患部位に送達される改変ポリマーエンベロープを含む（例えば、Ｍａｚｚａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．ＡＣＳＮａｎｏ，２０１３．７（２）：１０１６−１０２６；Ｓｉｅｗ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ，２０１２．９（１）：１４−２８；Ｌａｌａｔｓａ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｏｎｔｒ Ｒｅｌ，２０１２．１６１（２）：５２３−３６；Ｌａｌａｔｓａ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ，２０１２．９（６）：１６６５−８０；Ｌａｌａｔｓａ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ，２０１２．９（６）：１７６４−７４；Ｇａｒｒｅｔｔ，Ｎ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｐｈｏｔｏｎｉｃｓ，２０１２．５（５−６）：４５８−６８；Ｇａｒｒｅｔｔ，Ｎ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｒａｍａｎ Ｓｐｅｃｔ，２０１２．４３（５）：６８１−６８８；Ａｈｍａｄ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ ２０１０．７：Ｓ４２３−３３；Ｕｃｈｅｇｂｕ，Ｉ．Ｆ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ，２００６．３（５）：６２９−４０；Ｑｕ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２００６．７（１２）：３４５２−９、及びＵｃｈｅｇｂｕ，Ｉ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ，２００１．２２４：１８５−１９９を参照されたい）。約５ｍｇ／ｋｇの用量が企図され、標的組織によって単回投与又は複数回投与である。マウスを伴う実験は２０ｇの哺乳類に関するものであり、投与は７０ｋｇのヒトまでスケールアップ可能であることが本明細書において言及される。

一実施形態では、ＭＩＴのＤａｎ Ａｎｄｅｒｓｏｎの研究室で開発された、ＲＮＡを癌細胞に送達して腫瘍の成長を停止させることができるナノ粒子を、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に使用することができ、かつ／又は適合させることができる。特に、Ａｎｄｅｒｓｏｎの研究室は、新たな生体材料及びナノ製剤の合成、精製、特徴付け、及び製剤を完全に自動化した組み合わせシステムを開発した。例えば、Ａｌａｂｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１３ Ａｕｇ ６；１１０（３２）：１２８８１−６；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｍａｔｅｒ．２０１３ Ｓｅｐ ６；２５（３３）：４６４１−５；Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．２０１３ Ｍａｒ １３；１３（３）：１０５９−６４；Ｋａｒａｇｉａｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｎａｎｏ．２０１２ Ｏｃｔ ２３；６（１０）：８４８４−７；Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｎａｎｏ．２０１２ Ａｕｇ ２８；６（８）：６９２２−９、及びＬｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１２ Ｊｕｎ ３；７（６）：３８９−９３を参照されたい。

米国特許出願公開第２０１１０２９３７０３号明細書は、ポリヌクレオチドの投与にも特に有用な脂質化合物に関し、この脂質化合物は、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系の送達に適用することができる。一態様では、アミノアルコール脂質化合物は、ナノ粒子を形成するために細胞又は対象に送達するべき作用物質と組み合わせられる。粒子によって送達するべき作用物質は、気体、液体、又は固体の形態であり得、この作用物質は、ポリヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、又は小分子であり得る。このアミノアルコール脂質化合物は、他のアミノアルコール脂質化合物、ポリマー（合成又は天然）、界面活性剤、コレステロール、炭水化物、タンパク質、脂質などと組み合わせて粒子を形成することができる。次いで、これらの粒子を、任意に医薬賦形剤と組み合わせて医薬組成物を形成することができる。

米国特許出願公開第０１１０２９３７０３号明細書はまた、アミノアルコール脂質化合物を調製する方法を提供する。アミンの１つ以上の等価物を、本発明のアミノアルコール脂質化合物を形成するのに適切な条件下でエポキシド末端化合物の１つ以上の等価物と反応させる。特定の実施形態では、アミンの全てのアミノ基は、エポキシド末端化合物と十分に反応して第３級アミンを形成する。他の実施形態では、アミンの全てのアミノ基が、エポキシド末端化合物と十分に反応して第３級アミンを形成するわけではなく、従ってアミノアルコール脂質化合物中に第１級アミン又は第２級アミンが形成される。これらの第１級アミン又は第２級アミンは、そのまま残る、又は別の求電子体、例えば、異なるエポキシド末端化合物と反応することができる。当業者には分かるように、アミンを過剰未満のエポキシド末端化合物と反応させると、様々な数の尾部を有する複数の異なるアミノアルコール脂質化合物が生じる。特定のアミンは、２つのエポキシド由来化合物尾部で十分に官能性を持たせることができるが、他の分子は、エポキシド由来化合物尾部では十分に官能性を持たない。例えば、ジアミン又はポリアミンは、分子の様々なアミノ部分から離れた１つ、２つ、３つ、又は４つのエポキシド由来化合物尾部を含み得、第１級アミン、第２級アミン、及び第３級アミンが形成される。特定の実施形態では、全てのアミノ基が、完全には官能性を持たない。特定の実施形態では、２つの同じタイプのエポキシド末端化合物が使用される。他の実施形態では、２つ以上の異なるエポキシド末端化合物が使用される。アミノアルコール脂質化合物の合成は、溶媒を用いて又は用いずに行われ、この合成は、３０〜１００℃の高温、好ましくは約５０〜９０℃で行うことができる。調製したアミノアルコール脂質化合物は、任意に精製することができる。例えば、アミノアルコール脂質化合物の混合物を精製して、特定の数のエポキシド由来化合物尾部を有するアミノアルコール脂質化合物を得ることができる。又は、この混合物を精製して特定の立体異性体又は位置異性体を得ることができる。アミノアルコール脂質化合物はまた、ハロゲン化アルキル（例えば、ヨウ化メチル）又は他のアルキル化剤を用いてアルキル化することもでき、かつ／又はアシル化することもできる。

米国特許出願公開第０１１０２９３７０３号明細書はまた、本発明の方法によって調製されたアミノアルコール脂質化合物のライブラリも提供する。これらのアミノアルコール脂質化合物は、液体ハンドラー、ロボット、マイクロタイタープレート、コンピューターなどを含む高スループット技術を用いて調製及び／又はスクリーニングすることができる。特定の実施形態では、アミノアルコール脂質化合物は、ポリヌクレオチド又は他の作用物質（例えば、タンパク質、ペプチド、小分子）を細胞内にトランスフェクトするその能力についてスクリーニングされる。

米国特許出願公開第２０１３０３０２４０１号明細書は、組み合わせ重合を用いて調製されたポリ（β−アミノアルコール）（ＰＢＡＡ）のクラスに関する。本発明のＰＢＡＡは、コーティング（例えば、医療器具又はインプラント用の薄膜又は多層薄膜のコーティング）、添加剤、材料、賦形剤、非生物付着剤、微細パターン化剤、及び細胞封入剤としてバイオテクノロジー及び医用用途に使用することができる。表面コーティングとして使用される場合、これらのＰＢＡＡは、その化学構造により、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方で異なるレベルの炎症を引き起こした。このクラスの材料の幅広い化学的多様性により、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのマクロファージの活性を阻害するポリマーコーティングを特定することができた。さらに、これらのコーティングは、炎症細胞のリクルートを低減し、かつカルボキシル化ポリスチレン微粒子の皮下注入後の線維症を軽減する。これらのポリマーを使用して、細胞封入のための高分子電解質複合カプセルを形成することができる。本発明はまた、例えば、抗菌コーティング、ＤＮＡ又はｓｉＲＮＡの送達、及び幹細胞組織のエンジニアリングなどの多くの他の生物学的用途も有し得る。米国特許出願公開第２０１３０３０２４０１号明細書の教示は、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に適用することができる。

別の実施形態では、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）も企図される。特に、脂質ナノ粒子内に封入された抗トランスサイレチン短鎖干渉ＲＮＡ（例えば、Ｃｏｅｌｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２０１３；３６９：８１９−２９を参照）が、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に適用することができる。静脈投与される体重１ｋｇ当たり約０．０１〜約１ｍｇの用量が企図される。注入に関連した反応のリスクを軽減する薬剤が企図され、例えば、デキサメタゾン、アセトアンピノフェン（ａｃｅｔａｍｐｉｎｏｐｈｅｎ）、ジフェンヒドラミン又はセチリジン、及びラニチジンが企図される。合計５回の４週間ごとの約０．３ｍｇ／ｋｇの複数回投与も企図される。

ＬＮＰは、ｓｉＲＮＡの肝臓への送達に極めて有効であることが示され（例えば、Ｔａｂｅｒｎｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ａｐｒｉｌ ２０１３，Ｖｏｌ．３，Ｎｏ．４，ｐａｇｅｓ ３６３−４７０を参照されたい）、従ってＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓの肝臓への送達が企図される。２週間毎のＬＮＰの６ｍｇ／ｋｇの約４回の投与が企図され得る。Ｔａｂｅｒｎｅｒｏらは、最初の２サイクルの０．７ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ投与後に腫瘍退縮が観察され、６サイクルの終了までに、患者が、リンパ節転移の完全な退縮及び肝腫瘍の実質的な縮小を含む部分反応を達成したことを実証した。完全反応が、この患者での４０回の投与後に得られ、この患者は、寛解期を維持し、２６か月に亘る投与後に処置を終了した。ＶＥＧＦ経路阻害剤での前治療の後に進行した、腎臓、肺、及びリンパ節を含む疾患の肝外部位及びＲＣＣを有する２人の患者は、約８〜１２か月間全ての部位で疾患が安定しており、ＰＮＥＴ及び肝転位を有する患者は、疾患が安定した状態で１８か月間（３６回の投与）の延長研究を続けた。

しかしながら、ＬＮＰの変化を考慮しなければならない。カチオン性脂質を、細胞内送達を促進する単層構造を誘導するために負に帯電した脂質と組み合わせる。帯電ＬＮＰは、静脈注射の後に循環から迅速に除去されるため、ｐＫａ値が７未満のイオン性カチオン性脂質を開発された（例えば、Ｒｏｓｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１９，ｎｏ．１２，ｐａｇｅｓ １２８６−２２００，Ｄｅｃ．２０１１を参照されたい）。負に帯電したポリマー、例えば、ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを低ｐＨ値（例えば、ｐＨ４）でＬＮＰに導入し、このイオン性脂質は正電荷を示すことができる。しかしながら、生理学的ｐＨ値では、ＬＮＰは、長い循環時間に適合する低い表面電荷を示す。４種類のイオン性カチオン性脂質、即ち、１，２−ジリネオイル（ｄｉｌｉｎｅｏｙｌ）−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２−ジリノレイオキシ（ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｌｏｘｙ）−３−Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡで）、１，２−ジリノレイオキシケト（ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｌｏｘｙｋｅｔｏ）−Ｎ、Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｉｎＫＤＭＡ）、及び１，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ）に集中した。これらの脂質を含むＬＮＰ ｓｉＲＮＡ系は、ｉｎ ｖｉｖｏでの肝細胞において著しく異なる遺伝子サイレンシング特性を示し、第ＶＩＩ因子遺伝子サイレンシングモデルを利用するシリーズＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ＞ＤＬｉｎＫＤＭＡ＞ＤＬｉｎＤＭＡ＞＞ＤＬｉｎＤＡＰに従って異なる効力を有することが示された（例えば、Ｒｏｓｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１９，ｎｏ．１２，ｐａｇｅｓ １２８６−２２００，Ｄｅｃ．２０１１を参照されたい）。特に、ＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡを含む製剤の場合は、１μｇ／ｍｌレベルの用量が企図され得る。

ＬＮＰ及びＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ封入の調製では、Ｒｏｓｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１９，ｎｏ．１２，ｐａｇｅｓ １２８６−２２００，Ｄｅｃ．２０１１を使用することができ、かつ／又はこの文献に合わせることができる。カチオン性脂質、１，２−ジリネオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２−ジリノレイオキシ−３−Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレイオキシケト−Ｎ、Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｉｎＫ−ＤＭＡ）、１，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ）、（３−Ｏ−［２’’−（メトキシポリエチレングリコール２０００）スクシノイル］−１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリコール（ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ）、及びＲ−３−［（ω−メトキシ−ポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル］−１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−アミン（ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ）は、Ｔｅｋｍｉｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）から与えられてもよいし、又は合成してもよい。コレステロールは、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入することができる。特定のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ ＲＮＡは、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎＫ−ＤＭＡ、及びＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ（４０：１０：４０：１０のモル比）のカチオン性脂質：ＤＳＰＣ：ＣＨＯＬ：ＰＥＧＳ−ＤＭＧ又はＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ）を含むＬＮＰに封入することができる。必要に応じて、０．２％ ＳＰ−ＤｉＯＣ１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，Ｃａｎａｄａ）を封入して、細胞の取り込み、細胞内送達、及び生体内分布を評価することができる。封入は、カチオン性脂質：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ（４０：１０：４０：１０のモル比）からなる脂質混合物をエタノール中で溶解して、１０ｍｍｏｌ／ｌの最終脂質濃度にすることによって行うことができる。この脂質のエタノール溶液を、５０ｍｍｏｌ／ｌ クエン酸塩、ｐＨ４．０に滴下して多重小胞を形成し、３０％エタノール（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の最終濃度にすることができる。押し出し機（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）を用いて二重の８０ｎｍ Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅポリカーボネートフィルターに多層小胞を通した後に、大きい単層小胞を形成することができる。この押し出されて事前に形成された大きい単層小胞に、３０％エタノール（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を含む５０ｍｍｏｌ／ｌ クエン酸塩、ｐＨ４．０に２ｍｇ／ｍｌに溶解したＲＮＡを滴下し、そして０．０６／１ ｗｔ／ｗｔの最終ＲＮＡ／脂質重量比となるように常に混合しながら３１℃で３０分間インキュベートすることによって封入を達成することができる。エタノールの除去及び製剤緩衝液の中和を、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ ２再生セルロース透析膜を用いたリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４に対する１６時間の透析によって行った。ナノ粒子のサイズ分布を、ＮＩＣＯＭＰ ３７０粒子選別機（Ｎｉｃｏｍｐ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｉｚｉｎｇ，Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）を小胞／強度モードで用いた動的光散乱、及びガウシアンフィッティングによって決定することができる。３つ全てのＬＮＰ系の粒子サイズは、直径が約７０ｎｍであり得る。ｓｉＲＮＡの封入効率は、ＶｉｖａＰｕｒｅＤ ＭｉｎｉＨカラム（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いた、透析の前及び後に収集されたサンプルからの遊離ｓｉＲＮＡの除去によって決定することができる。封入ＲＮＡは、溶出ナノ粒子から抽出することができ、２６０ｎｍで定量することができる。ｓｉＲＮＡの脂質に対する比は、Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ＵＳＡ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡ）のコレステロール酵素アッセイを用いた小嚢中のコレステロール含有量の測定によって決定した。

大きいＬＮＰの調製では、Ｒｏｓｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１９，ｎｏ．１２，ｐａｇｅｓ １２８６−２２００，Ｄｅｃ．２０１１を使用することができ、かつ／又はこの文献に合わせることができる。脂質プレミックス溶液（２０．４ｍｇ／ｍｌの全脂質濃度）を、５０：１０：３８．５のモル比でＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＳＰＣ、及びコレステロールを含むエタノール中で調製することができる。酢酸ナトリウムを、０．７５：１（酢酸ナトリウム：ＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ）のモル比で脂質プレミックスに添加することができる。続いて、この混合物を強く撹拌しながら１．８５倍量のクエン酸塩緩衝液（（１０ｍｍｏｌ／ｌ、ｐＨ３．０）と化合させることによって脂質を水和させることができ、これにより、３５％エタノールを含む水性緩衝液中に自然にリポソームが形成される。このリポソーム溶液を３７℃でインキュベートして、粒子サイズを時間依存性に増加させることができる。インキュベーション中の様々な時間にアリコートを取り出して、動的光散乱（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ））によってリポソームのサイズの変化を評価することができる。所望の粒子サイズが達成されたら、水性ＰＥＧ脂質溶液（ストック＝３５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）エタノール中、１０ｍｇ／ｍｌ ＰＥＧ−ＤＭＧ）をリポソーム混合物に添加して、全脂質の３．５％の最終ＰＥＧモル濃度にすることができる。ＰＥＧ−脂質の添加時に、リポソームは、そのサイズがさらに成長するのを効果的に停止するべきである。次いで、ＲＮＡを、ｓｉＲＮＡと全脂質との比が約１：１０（ｗｔ：ｗｔ）で空のリポソームに加え、次いで、３７℃で３０分間インキュベートして充填ＬＮＰを形成することができる。続いて、この混合物を、ＰＢＳ中で一晩透析し、０．４５−μｍシリンジフィルターでろ過することができる。

Ｓｐｈｅｒｉｃａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＳＮＡ^ＴＭ）構築物及び他のナノ粒子（特に、金ナノ粒子）も、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を目的の標的に送達するための手段として企図される。かなりのデータにより、核酸で機能化された金ナノ粒子に基づいたＡｕｒａＳｅｎｓｅ ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓのＳｐｈｅｒｉｃａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＳＮＡ^ＴＭ））構築物は、以下のような複数の重要な成功因子に基づいて、代替のプラットフォームよりも優れていることが示される：高ｉｎ ｖｉｖｏ安定性（これらの高密度の負荷のために、大部分のカーゴ（ＤＮＡ又はｓｉＲＮＡ）は細胞内部で構築物に結合したままであり、核酸安定性及び酵素分解に対する抵抗性が付与される）。送達性（研究した全ての細胞型（例えば、ニューロン、腫瘍細胞株など）について、構築物は担体又はトランスフェクション剤を必要とせずに９９％のトランスフェクション効率を実証する）。治療の標的化（構築物の独特の標的結合親和性及び特異性により、一致した標的配列に対する精巧な特異性が可能になる（即ち、オフターゲット効果が限定される））。優れた効力（構築物は、主要な従来のトランスフェクション試薬（リポフェクタミン２０００及びシトフェクチン（Ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎ））よりも性能が著しく優れている）。低毒性（構築物は、明らかな毒性を伴わずに様々な培養細胞、初代細胞、及び組織に侵入することができる）。顕著な免疫応答なし（構築物は、全ゲノムマイクロアレイ研究及びサイトカイン特異的タンパク質アッセイにより測定される際に、包括的な遺伝子発現の最小限の変化を起こす）。化学的な調整可能性（任意の数の単一又は組み合わせの薬剤（例えば、タンパク質、ペプチド、小分子）を用いて、構築物の表面を調整することができる）。核酸ベースの治療のためのこのプラットフォームは、炎症及び感染症、癌、皮膚障害及び心血管疾患を含む多数の病状に適用可能であり得る。引用可能な文献としては、Ｃｕｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１１１３３：９２５４−９２５７、Ｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｍａｌｌ．２０１１７：３１５８−３１６２、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｎａｎｏ．２０１１５：６９６２−６９７０、Ｃｕｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２ １３４：１３７６−１３９１、Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，．Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．２０１２ １２：３８６７−７１、Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２０１２ １０９：１１９７５−８０、Ｍｉｒｋｉｎ，Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１２ ７：６３５−６３８ Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２ １３４：１６４８８−１６９１、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｎａｔｕｒｅ ２０１３ ４９５：Ｓ１４−Ｓ１６、Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２０１３ １１０（１９）：７６２５−７６３０、Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．５，２０９ｒａ１５２（２０１３）、及びＭｉｒｋｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｍａｌｌ，ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１００２／ｓｍｌｌ．２０１３０２１４３が挙げられる。

ｓｉＲＮＡを含む自己構築ナノ粒子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の遠位端部に付着したＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチドリガンドでＰＥＧ化されたポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を、例えば、インテグリンを発現する腫瘍新生血管を標的とし、血管内皮成長因子受容体−２（ＶＥＧＦ Ｒ２）の発現を抑制するｓｉＲＮＡを送達し、これにより腫瘍の血管新生をもたらすために使用される手段として使用して形成することができる（例えば、Ｓｃｈｉｆｆｅｌｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４，Ｖｏｌ．３２，Ｎｏ．１９を参照されたい）。ナノプレックスは、等量のカチオン性ポリマーの水溶液と核酸を混合して、２〜６の範囲で正味モル過剰のイオン化窒素（ポリマー）をリン酸塩（核酸）に付与して調製することができる。カチオン性ポリマーと核酸との間の静電相互作用により、平均粒子サイズ分布が約１００ｎｍのポリプレックスが形成され、従って、本明細書ではナノプレックスと呼ばれる。約１００〜２００ｍｇの用量のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓが、Ｓｃｈｉｆｆｅｌｅｒｓらの自己構築ナノ粒子での送達のために考えられる。

Ｂａｒｔｌｅｔｔら（ＰＮＡＳ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２５，２００７，ｖｏｌ．１０４，ｎｏ．３９）のナノプレックスも本発明に適用することができる。Ｂａｒｔｌｅｔｔらのナノプレックスは、等量のカチオン性ポリマーの水溶液と核酸を混合して、２〜６の範囲で正味モル過剰のイオン化窒素（ポリマー）をリン酸塩（核酸）に加えて調製される。カチオン性ポリマーと核酸との間の静電相互作用により、平均粒子サイズ分布が約１００ｎｍのポリプレックスが形成され、従って、本明細書ではナノプレックスと呼ばれる。ＢａｒｔｌｅｔｔらのＤＯＴＡ−ｓｉＲＮＡを次のように合成した：１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸モノ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）（ＤＯＴＡ−ＮＨＳｅｓｔｅｒ）をＭａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ（Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ）で注文した。炭酸塩緩衝液（ｐＨ９）中のアミン修飾ＲＮＡセンス鎖及び１００倍モル過剰のＤＯＴＡ−ＮＨＳｅｓｔｅｒと共に微小遠心管に加えた。室温で４時間撹拌して内容物を反応させた。ＤＯＴＡ−ＲＮＡセンス鎖コンジュゲートをエタノール沈殿させ、水に再懸濁し、そして未修飾アンチセンス鎖にアニーリングさせてＤＯＴＡ−ｓｉＲＮＡを得た。微量の金属汚染物を除去するために全ての液体をＣｈｅｌｅｘ−１００（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）で処理した。Ｔｆ標的ｓｉＲＮＡナノ粒子及びＴｆ非標的ｓｉＲＮＡナノ粒子を、シクロデキストリン含有ポリカチオンを使用して形成することができる。典型的には、ナノ粒子は、３（±）の電荷比及び０．５ｇ／リットルのｓｉＲＮＡ濃度で、水中で形成された。標的ナノ粒子の表面上の１％のアダマンタン−ＰＥＧ分子をＴｆで修飾した（アダマンタン−ＰＥＧ−Ｔｆ）。このナノ粒子を、注入のために５％（ｗｔ／ｖｏｌ）グルコース担体溶液に懸濁した。

Ｄａｖｉｓら（Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ ４６４，１５ Ａｐｒｉｌ ２０１０）は、標的ナノ粒子送達系を用いるｓｉＲＮＡ臨床試験を行う（臨床試験登録番号ＮＣＴ００６８９０６５）。標準癌療法では効果がない固形癌の患者に、３０分間の静脈注射により２１日サイクルの１日目、３日目、８日目、及び１０日目に標的ナノ粒子が投与される。ナノ粒子は：（１）線状のシクロデキストリン系ポリマー（ＣＤＰ）、（２）癌細胞の表面のＴＦ受容体（ＴＦＲ）に結合するためにナノ粒子の外面に提示されるリガンドを標的とするヒトトランスフェリンタンパク質（ＴＦ）、（３）親水性ポリマー（生体液中でのナノ粒子の安定性を向上させるために使用されるポリエチレングリコール（ＰＥＧ））、及び（４）ＲＲＭ２の発現を抑制するように設計されたｓｉＲＮＡ（クリニックで使用される配列は、既にｓｉＲ２Ｂ＋５として示された）を含む合成送達系からなる。ＴＦＲは、悪性細胞で上方制御されることが以前から知られており、ＲＲＭ２は、確立された抗癌標的である。これらのナノ粒子（ＣＡＬＡＡ−０１として示される臨床型）は、非ヒト霊長類での複数回投与試験で十分に耐容性であることが示されている。一人の慢性骨髄性白血病患者に、リポソーム送達によってｓｉＲＮＡが投与されたが、Ｄａｖｉｓらの臨床試験は、標的送達系を用いてｓｉＲＮＡを全身に送達して、固形癌患者を治療する最初のヒト試験である。標的送達系が、機能的ｓｉＲＮＡをヒト腫瘍に有効に送達できるかを確認するために、Ｄａｖｉｓらは、３つの異なる投薬コホートを構成する３人の患者：それぞれが転移性黒色腫を有し、それぞれ１８、２４、及び３０ｍｇ／ｍ^２の用量のＣＡＬＡＡ−０１が投与された患者Ａ、Ｂ、及びＣからの生検を調べた。本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系でも同様の用量が企図され得る。本発明の送達は、線状のシクロデキストリン系ポリマー（ＣＤＰ）、癌細胞の表面のＴＦ受容体（ＴＦＲ）に結合するためにナノ粒子の外面に提示されるリガンドを標的とするヒトトランスフェリンタンパク質（ＴＦ）、及び／又は親水性ポリマー（例えば、生体液中でのナノ粒子の安定性を向上させるために使用されるポリエチレングリコール（ＰＥＧ））を含むナノ粒子で達成することができる。

Ｋａｎａｓｔｙ及びＡｎｄｅｒｓｏｎ（Ｎａｔｕｒｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｖｏｌ １２ Ｎｏｖ ２０１３）（２０１３年３月１１日に最初に提出され、２０１３年１０月２３日にオンラインで公開された）は、ＲＮＡｉの送達の概説を提供する。ＲＮＡｉとＣＲＩＳＰＲガイド配列との間の類似性のために、ＲＮＡｉに関するこの及び他の技術の教示は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系においてガイドを送達する機構にとって情報価値がある。記載される技術のいくつかは、Ｃａｓ９の送達にも同様に適している。一部の例では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系のガイドをＣａｓ９とは別個に送達することが有用であり得る。これは、二重ベクター送達系の一部としてであってもよく、ここで、ベクターは、最も広い観点から、具体的にウイルスベクターではなく、単に任意の送達手段であると考えられる。Ｃａｓ９はウイルスベクターによって送達されてもよく、及びゲノム標的に特異的なガイドは別個に送達されることが想定される。本明細書中で議論されるように、ガイドは、Ｃａｓ９と同じベクタータイプ、例えば二重ベクター系（Ｃａｓ９がＡＡＶベクターで送達され、ガイドが別のＡＡＶベクターで送達される）によって送達され得る。これは、実質的に同時に行われる（即ち、同時送達）が、別々の時点で、さらには数週間又は数カ月隔てて行われることも可能である。例えば、１回目のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系が送達されているが、続いてさらなるガイドを提供することが必要とされる場合、標的細胞内でできればまだ機能的である最初のＣａｓ９が再使用され得る。Ｃａｓ９が誘導性プロモーターの制御下にある場合には、標的細胞において新しいＣＡｓ９の転写の誘導が好ましい。同じように、本明細書で提供されるＣＡｓ９発現モデルが使用される場合、ガイドの送達だけが必要である。従って、ガイドの送達がＣａｓ９とは別個に必要とされる場合、ＲＮＡｉと大体同じ方法で送達され得る。従って、Ｋａｎａｓｔｙによる概説は、送達手段が一般的に幅広い細胞に適しているが、特に肝臓に焦点を合わせていくつかの適切な既知のアプローチを指摘する際に役立つ。例としては、が挙げられる：
・ 「リポソーム送達系、及び親油性分子にコンジュゲートしたｓｉＲＮＡは血清リポタンパク質と相互作用をし、続いてこれらのリポタンパク質を吸収する幹細胞内に入り込む」；
・ ペグ化；
・ 例えば次のようなコンジュゲート：
・ ＲＮＡｉを送達してＡｐｏＢを良好に抑制することが示さている動的ポリコンジュゲート（ＤＰＣ、１０ｎｍのナノ粒子）；及びトリアンテナ型（Ｔｒｉａｎｔｅｎｎａｒｙ）ＧａｌＮＡｃコンジュゲートは「両方とも非常に有効である」；
・ 以下のものを含む他のナノ粒子：
・ アダマンチン（ａｄａｍａｎｔｉｎｅ）−ＰＥＧ（ＡＤ−ＰＥＧ）及びアダマンチン−ＰＥＧ−トランスフェリン（ＡＤ−ＰＥＧ−Ｔｆ）などの付加的な製剤構成成分を含むシクロデキストリンポリマーナノ粒子（ＣＤＰ）；
・ カチオン性又はイオン性脂質、遮蔽（ｓｈｉｅｌｄｉｎｇ）脂質、コレステロール及び内因性又は外因性の標的リガンドを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）。内因性標的リガンドの一例は、ＲＢＰ受容体を発現する、肝臓及び膵臓星状細胞を標的化するのに有用なレチノール結合タンパク質（ＲＢＰ）である。外因性標的リガンドの一例は、肝細胞においてアシアロ糖タンパク質受容体を介して肝臓も標的とするＧａｌＮａｃである。結合したアプローチは、Ａｎｌｙｌａｍｓ ＡＬＮ−ＶＳＰにおいて見られる；
・ 「肝臓皮内の開窓は、直径１００〜２００ｎｍの分子が血流から拡散し、肝細胞及び他の肝臓細胞に近づくことを可能にする」；
ＧａｌＮＡｃなどのリガンドは、マンノース受容体を発現する肝臓非実質細胞への、及び肝細胞への送達に適しており、ここで、適切なｓｉＲＮＡのＧａｌＮＡｃリガンドへのコンジュゲーションは、ＰＣＳＫ９を良好に抑制することが示されており；及び
・ 予め定義された３Ｄ構造にハイブリダイズするように設計された相補的ＤＮＡ断片で構成されたオリゴヌクレオチドナノ粒子（ＯＮＰ）。適切な３’オーバーハンド（ｏｖｅｒｈａｎｄ）配列を使用すると、６ｓｉＲＮＡ鎖は特定の位置においても各粒子に取り付けられ得る。流体力学直径は約２９ｎｍであった。

これらのアプローチは、一部の実施形態において、少なくともＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系のガイドを送達するのに好ましい。特に好ましいのは、動的ポリコンジュゲーション又はレチノール結合タンパク質などの内因性標的リガンド又はＧａｌＮａｃなどの外因標的リガンドの使用である。

参照により本明細書に組み入れられる米国特許第８，７０９，８４３号明細書は、治療剤を含む粒子の組織、細胞、及び細胞内区画への標的送達用の薬物送達系を提供する。本発明は、界面活性剤、親水性ポリマー、又は脂質にコンジュゲートしたポリマーを含む標的粒子を提供する。参照により本明細書に組み入れられる米国特許第６，００７，８４５号明細書は、多官能化合物と１つ以上の疎水性ポリマー及び１つ以上の親水性ポリマーとの共有結合によって形成されたマルチブロックコポリマーのコアを有し、かつ生物学的に活性な材料を含む粒子を提供する。参照により本明細書に組み入れられる米国特許第５，８５５，９１３号明細書は、０．４ｇ／ｃｍ３未満のタップ密度及び５μｍ〜３０μｍの平均直径を有する空気力学的に軽い粒子を有し、かつその表面に肺系統への薬物送達用の界面活性剤を含む微粒子組成物を提供する。参照により本明細書に組み入れられる米国特許第５，９８５，３０９号明細書は、肺系統への送達用の界面活性剤及び／又は正若しくは負に帯電した治療薬若しくは診断薬と反対の電荷の荷電分子との親水性若しくは疎水性複合体を含む粒子を提供する。参照により本明細書に組み入れられる米国特許第５，５４３，１５８号明細書は、表面に生物学的に活性な材料及びポリ（アルキレングリコール）部分を含む生分解性固体コアを有する生分解性の注射用ナノ粒子を提供する。参照により本明細書に組み入れられる国際公開第２０１２１３５０２５号パンフレット（米国特許出願公開第２０１２０２５１５６０号明細書としても公開されている）は、コンジュゲートポリエチレンイミン（ＰＥＩ）ポリマー及びコンジュゲートアザ大員環（まとめて「コンジュゲートリポマー（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｌｉｐｏｍｅｒ）」又は「リポマー」と呼ばれる）を説明している。特定の実施形態では、コンジュゲートリポマーを、タンパク質の発現の調節を含む、遺伝子発現を調節するためにｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、及びｉｎ ｖｉｔｒｏでゲノム摂動を達成するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系との関連で使用できることが想定され得る。これらの特許文献の技術は、本発明の実施において適合され得る。

一実施形態では、ナノ粒子は、エポキシド修飾脂質ポリマー、有利に７Ｃ１であり得る（例えば、Ｊａｍｅｓ Ｅ．Ｄａｈｌｍａｎ ａｎｄ Ｃａｒｍｅｎ Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１４）オンラインで公表 １１ Ｍａｙ ２０１４，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｎａｎｏ．２０１４．８４を参照されたい）。Ｃ７１は、１４：１のモル比でＣ１５エポキシド終端脂質とＰＥＩ６００とを反応させて合成し、Ｃ１４ＰＥＧ２０００を用いて、少なくとも４０日間ＰＢＳ溶液中で安定なナノ粒子（３５〜６０ｎｍの直径）を製剤化した。エポキシド修飾脂質−ポリマーを利用して本発明のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を肺細胞、心血管細胞、又は腎細胞に送達することができるが、当業者であれば、他の標的器官に送達するためにこの系を適合させることができるであろう。約０．０５〜約０．６ｍｇ／ｋｇの用量が考えられる。総用量が約２ｍｇ／ｋｇである数日又は数週間に亘る投与も考えられる。

エキソソーム
エキソソームは、ＲＮＡ及びタンパク質を輸送する内因性ナノ−小胞であり、それは、低分子干渉（ｓｉ）ＲＮＡをマウスの脳に送達することができる。免疫原性を低減するために、Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉら（２０１１，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２９：３４１）は、エキソソームの作製に自己由来樹状細胞を使用した。標的とすることは、ニューロン特異的ＲＶＧペプチド３に融合したＬａｍｐ２ｂ、エキソソーム膜タンパク質を発現させるために樹状細胞をエンジニアリングすることによって達成した。精製エキソソームを、エレクトロポレーションによって外因性ｓｉＲＮＡに付加した。静脈注射されたＲＶＧ−標的エキソソームは、特に脳内のニューロン、小膠細胞、乏突起膠細胞にＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡを送達し、結果として特定の遺伝子ノックダウンが起きた。ＲＶＧエキソソームへの事前曝露は、ノックダウンを弱めず、他の組織への非特異的な取り込みは観察されなかった。エキソソーム媒介ｓｉＲＮＡ送達の治療可能性が、アルツハイマー病の治療標的であるＢＡＣＥ１の強力なｍＲＮＡ（６０％）及びタンパク質（６２％）のノックダウンによって実証された。

免疫学的に不活性なエキソソームのプールを得るために、Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉらは、同種主要組織適合複合体（ＭＨＣ）ハプロタイプの近交系Ｃ５７ＢＬ／６マウスから骨髄を採取した。未成熟樹状細胞は、Ｔ細胞活性化物質、例えば、ＭＨＣ−ＩＩ及びＣＤ８６を含まない大量のエキソソームを産生するため、Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉらは、７日間、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を用いて樹状細胞を選択した。翌日、十分に確立された超遠心分離プロトコルを用いて培養上清からエキソソームを精製した。得られたエキソソームは、物理的に均質であり、サイズ分布は、ナノ粒子トラッキング分析（ＮＴＡ）及び電子顕微鏡法によって決定される８０ｎｍの直径でピークであった。Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉらは、１０^６細胞当たり６〜１２μｇ（タンパク質濃度に基づいて測定）のエキソソームを得た。

次に、Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉらは、ナノスケールの適用例に適合されたエレクトロポレーションプロトコルを用いて、外因性カーゴが改変エキソソームに導入される可能性を調べた。ナノメートルスケールでの膜粒子のエレクトロポレーションが十分には特徴付けられていないため、非特異的Ｃｙ５標識ｓｉＲＮＡを、エレクトロポレーションのプロトコルの経験的な最適化に使用した。封入されるｓｉＲＮＡの量を、エキソソームの超遠心分離及び溶解の後に分析した。４００Ｖ及び１２５μＦでのエレクトロポレーションにより、ｓｉＲＮＡが最大に保持されたため、後の全ての実験にこれを使用した。

Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉらは、１５０μｇのＲＶＧエキソソーム中に封入された１５０μｇの各ＢＡＣＥ１ ｓｉＲＮＡを正常なＣ５７ＢＬ／６マウスに投与し、ノックダウン効率を４つの対照：未処置マウス、ＲＶＧエキソソームのみが注射されたマウス、ｉｎ ｖｉｖｏカチオン性リポソーム試薬と複合体を形成したＢＡＣＥ１ ｓｉＲＮＡが注射されたマウス、及びＲＶＧ−９Ｒ、即ち、ｓｉＲＮＡに静電結合する９Ｄ−アルギニンにコンジュゲートしたＲＶＧペプチドと複合体を形成したＢＡＣＥ１ ｓｉＲＮＡが注射されたマウスと比較した。皮質組織サンプルを、投与の３日後に分析し、ｓｉＲＮＡ−ＲＶＧ−９Ｒ処置マウス及びｓｉＲＮＡＲＶＧエキソソーム処置マウスの両方で有意なタンパク質ノックダウン（４５％、Ｐ＜０．０５、対６２％、Ｐ＜０．０１）が観察され、これは、ＢＡＣＥ１ ｍＲＮＡレベルの有意な低下（それぞれ６６％［＋又は−］１５％、Ｐ＜０．００１及び６１％［＋又は−］１３％、Ｐ＜０．０１）から生じた。さらに、本出願人らは、ＲＶＧ−エキソソーム処置動物において、アルツハイマー病の病理におけるアミロイドプラークの主成分である全［β］−アミロイド１〜４２のレベルの有意な低下（５５％、Ｐ＜０．０５）を実証した。観察された低下は、ＢＣＡＥ１阻害剤の脳室内注射後の正常なマウスで実証されたβ−アミロイド１〜４０の低下よりも大きかった。Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉらは、ＢＣＡＥ１切断産物におけるｃＤＮＡ末端（ＲＡＣＥ）の５’迅速増幅を行い、ｓｉＲＮＡによるＲＮＡｉ媒介ノックダウンのエビデンスを得た。

最後に、Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉらは、ＩＬ−６、ＩＰ−１０、ＴＮＦα、及びＩＦＮ−αの血清濃度を評価することによってｓｉＲＮＡ−ＲＶＧエキソソームがｉｎ ｖｉｖｏで免疫応答を誘導したか否かを調べた。ｓｉＲＮＡ−ＲＶＧエキソソーム処置の後、全てのサイトカインにおける有意でない変化が、ＩＬ−６の分泌を強力に刺激するｓｉＲＮＡ−ＲＶＧ−９Ｒとは対照的なｓｉＲＮＡトランスフェクション試薬処置と同様に記録され、エキソソーム処置の免疫学的に不活性なプロフィールが確認された。エキソソームがｓｉＲＮＡの２０％しか封入しないとすると、ＲＶＧエキソソームでの送達は、同等のｍＲＮＡのノックダウン及びより大きなタンパク質のノックダウンが、対応するレベルの免疫刺激無しで１／５のｓｉＲＮＡで達成されたため、ＲＶＧ−９Ｒ送達よりも効率的であると思われる。この実験は、ＲＶＧエキソソーム技術の治療の可能性を実証し、この治療は、神経変性疾患に関連した遺伝子の長期間のサイレンシングに適している可能性がある。Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉらのエキソソーム送達系は、本発明のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の治療標的、特に神経変性疾患への送達に適用することができる。本発明では、約１００〜１０００ｍｇのＲＶＧエキソソームに封入される約１００〜１０００ｍｇのＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓの用量が企図され得る。

Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉら（Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ７，２１１２−２１２６（２０１２））は、どのようにすれば培養細胞由来のエキソソームをｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでのｓｉＲＮＡの送達に利用できるかを開示している。このプロトコルはまず、ペプチドリガンドに融合したエキソソームタンパク質を含む発現ベクターのトランスフェクションによる標的エキソソームの作製を説明する。次に、Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉらは、トランスフェクト細胞の上清からのエキソソームの精製及び特徴付けの方法を説明する。次に、Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉらは、ｓｉＲＮＡをエキソソームに導入する重要なステップを詳述する。最後に、Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉらは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでマウスの脳にｓｉＲＮＡを効率的に送達するためにエキソソームをどのように使用するかを概説する。エキソソーム媒介ｓｉＲＮＡ送達が機能アッセイ及びイメージングによって評価される予想結果の例も示される。全プロトコルには、約３週間かかる。本発明による送達又は投与は、自己由来樹状細胞から産生されるエキソソームを用いて行うことができる。

別の実施形態では、Ｗａｈｌｇｒｅｎら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１２，Ｖｏｌ．４０，Ｎｏ．１７ ｅ１３０）の血漿エキソソームが企図される。エキソソームは、樹状細胞（ＤＣ）、Ｂ細胞、Ｔ細胞、肥満細胞、上皮細胞、及び腫瘍細胞を含む多くの細胞型で産生されるナノサイズの小胞（３０〜９０ｎｍのサイズ）である。これらの小胞は、後期エンドソームの内向き出芽によって形成され、次いで、血漿膜との融合時に細胞外環境に放出される。エキソソームは、自然に細胞間でＲＮＡを輸送するため、この特性は、遺伝子療法に有用であり得るであろう。

血漿からのエキソソームは、９００ｇでの２０分間の軟膜の遠心分離によって血漿を分離し、そして細胞上清を回収し、３００ｇでの１０分間の遠心分離によって細胞を除去し、そして１６５００ｇで３０分間遠心分離し、次いで０．２２ｍｍフィルターに通して濾過することによって調製する。１２００００ｇでの７０分間の超遠心分離によってエキソソームをペレット化する。ｓｉＲＮＡのエキソソームへの化学的トランスフェクションを、ＲＮＡｉ Ｈｕｍａｎ／Ｍｏｕｓｅ Ｓｔａｒｔｅｒ Ｋｉｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の製造者の取扱説明書に従って行う。ｓｉＲＮＡを１００ｍｌのＰＢＳに加えて、２ｍｍｏｌ／ｍｌの最終濃度にする。ＨｉＰｅｒＦｅｃｔトランスフェクション試薬の添加後、混合物をＲＴで１０分間インキュベートする。過剰なミセルを除去するために、アルデヒド／流酸塩ラテックスビーズを用いてエキソソームを再分離する。ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓのエキソソームへの化学的なトランスフェクションを、ｓｉＲＮＡと同様に行うことができる。エキソソームは、健康なドナーの末梢血から単離された単球及びリンパ球と共に培養することができる。従って、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓを含むエキソソームを単球及びリンパ球に導入して、ヒトに自己再導入できることが企図され得る。従って、本発明による送達又は投与は、血漿エキソソームを用いて行うことができる。

リポソーム
本発明による送達又は投与は、リポソームで行うことができる。リポソームは、内部の水性区画を取り囲んでいる単膜又は多重膜の脂質二重層及び比較的不浸透性の外側親油性リン脂質二重層から構成された球形小胞構造である。リポソームは、生体適合性かつ非毒性であり、親水性薬物分子及び親油性薬物分子の両方を送達することができ、そのカーゴを血漿酵素による分解から保護し、その充填物を生体膜を通過させて血液脳関門（ＢＢＢ）に輸送するため、薬物送達担体としてかなりの注目を集めた（例えば、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７（参照用）を参照されたい）。リポソームは、いくつかの異なる種類の脂質から形成することができるが；リン脂質が、薬物担体としてリポソームを形成するために最もよく使用される。リポソーム形成は、脂質膜が水溶液と混合されるときに自然に起こるが、ホモジナイザー、超音波処理器、又は押し出し機を用いることによって振蘯の形態で力を加えることによって促進することもできる（例えば、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９（参照用）を参照されたい）。

リポソームの構造及び特性を変更するために、いくつかの他の添加剤をリポソームに添加することができる。リポソーム構造を安定させて、リポソーム内部のカーゴの漏れを防止するために、例えば、コレステロール又はスフィンゴミエリンのいずれかをリポソーム混合物に添加することができる。さらに、リポソームは、水素化卵ホスファチジルコリン又は卵ホスファチジルコリン、コレステロール、及びジセチルリン酸から調製され、その平均小胞サイズが、約５０〜１００ｎｍに調整された（例えば、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９（参照用）を参照されたい）。従来のリポソーム製剤は、主に天然リン脂質及び脂質、例えば、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、スフィンゴミエリン、卵ホスファチジルコリン、及びモノシアロガングリオシドから構成される。この製剤は、リン脂質のみから調製されるため、リポソーム製剤は、多数の課題に直面し、その１つが血漿中での不安定性である。これらの課題を克服するためにいくつかの試み、特に脂質膜の処置が行われた。これらの試みの１つは、コレステロールの処置に重点を置いた。従来の製剤へのコレステロールの添加は、封入された生物活性化合物の血漿への急速な放出を低減する、又は１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファエタノールアミン（ＤＯＰＥ）が安定性を高める（例えば、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９（参照用）を参照されたい）。

特定の有利な実施形態では、トロイの木馬リポソーム（Ｔｒｏｊａｎ Ｈｏｒｓｅ ｌｉｐｏｓｏｍｅ）（分子トロイの木馬としても知られる）が望ましく、プロトコルをｈｔｔｐ：／／ｃｓｈｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．ｃｓｈｌｐ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／２０１０／４／ｐｄｂ．ｐｒｏｔ５４０７．ｌｏｎｇで確認することができる。これらの粒子は、血管注入後に脳全体に導入遺伝子を送達することができる。限定されるものではないが、特定の抗体が表面にコンジュゲートした中性脂質粒子は、エンドサイトーシスにより血液脳関門を通過できると考えられる。本出願人らは、トロイの木馬リポソームを利用して血管注入によってヌクレアーゼのＣＲＩＳＰＲファミリーを脳に送達すると仮定し、これにより、胎児を操作しなくても全脳トランスジェニック動物が可能となる。リポソームでの約１〜５ｇのＤＮＡのｉｎ ｖｉｖｏでの投与が企図され得る。

別の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系を、リポソーム、例えば、安定核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）で投与することができる（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．８，Ａｕｇｕｓｔ ２００５を参照されたい）。ＳＮＡＬＰ中の標的とされる特定のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓの約１ｍｇ／ｋｇ／日、３ｍｇ／ｋｇ／日、又は５ｍｇ／ｋｇ／日の毎日の静脈注射が企図される。毎日の処置を約３日間行い、次いで週１回の投与を５週間行うことができる。別の実施形態では、約１ｍｇ／ｋｇ又は２．５ｍｇ／ｋｇの用量で静脈注射によって投与されるＳＮＡＬＰに封入された特定のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓも企図される（例えば、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．４４１，４ Ｍａｙ ２００６を参照されたい）。ＳＮＡＬＰ製剤は、脂質３−Ｎ−［（ｗメトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル］−！，２−ジミリスチルオキシ−プロピルアミン（ＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ、Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、及びコレステロールを２：４０：１０：４８のモルパーセント比で含み得る（例えば、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．４４１，４ Ｍａｙ ２００６を参照されたい）。

別の実施形態では、安定核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）は、高度に血管新生されたＨｅｐＧ２由来肝腫瘍では効果的な分子の送達が証明されたが、血管新生が不十分なＨＣＴ−１１６由来肝腫瘍では証明されなかった（例えば、Ｌｉ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２０１２）１９，７７５−７８０を参照されたい）。ＳＮＡＬＰリポソームは、２５：１の脂質／ｓｉＲＮＡ比及びコレステロール／Ｄ−Ｌｉｎ−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／ＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡを４８／４０／１０／２モル比で、Ｄ−Ｌｉｎ−ＤＭＡ及びＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡをジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、及びｓｉＲＮＡと調合することによって調製することができる。得られたＳＮＡＬＰリポソームは、約８０〜１００ｎｍの大きさである。なお別の実施形態では、ＳＮＡＬＰは、合成コレステロール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ，ＵＳＡ）、３−Ｎ−［（ｗ−メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル］−１，２−ジミレスチルオキシプロピルアミン、及びカチオン性１，２−ジリノレオイルオキシ−３−Ｎ，Ｎジメチルアミノプロパンを含み得る（例えば、Ｇｅｉｓｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ２０１０；３７５：１８９６−９０５を参照されたい）。例えば、ボーラス静脈注入として、１投与当たり約２ｍｇ／ｋｇの用量の全ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓが企図され得る。

なお別の実施形態では、ＳＮＡＬＰは、合成コレステロール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ；Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．）、ＰＥＧ−ｃＤＭＡ、及び１，２−ジリノレイルオキシ−３−（Ｎ；Ｎ−ジメチル）アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）を含み得る（例えば、Ｊｕｄｇｅ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１９：６６１−６７３（２００９）を参照されたい）。ｉｎ ｖｉｖｏでの研究に使用される製剤は、約９：１の最終脂質／ＲＮＡ質量比を有し得る。

ＲＮＡｉナノ薬剤の安全性プロフィールが、Ａｌｎｙｌａｍ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓのＢａｒｒｏｓ及びＧｏｌｌｏｂによって再検討された（例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ６４（２０１２）１７３０−１７３７を参照されたい）。安定核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）は、４つの異なる脂質−ｐＨの低いカチオン性のイオン性脂質（ＤＬｉｎＤＭＡ）、中性ヘルパー脂質、コレステロール、及び拡散性ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−脂質から構成されている。この粒子は、直径が約８０ｎｍであり、生理学的ｐＨで中立電荷である。製剤中、イオン性脂質は、粒子形成中にアニオン性ｓｉＲＮＡで脂質を凝縮する役割を果たす。酸性が強まるエンドソーム条件下で正に帯電すると、イオン性脂質はまた、ＳＮＡＬＰとエンドソーム膜との融合を媒介し、ｓｉＲＮＡの細胞質への放出が可能となる。ＰＥＧ−脂質は、粒子を安定させ、かつ製剤中の凝集を軽減し、かつ薬物動態学的特性を改善する中性で親水性の外部を後に提供する。

今日まで、ＳＮＡＬＰ ｓｉＲＮＡ製剤を用いた２つの臨床プログラムが開始されている。Ｔｅｋｍｉｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓが、近年、ＬＤＬコレステロールの高い成人ボランティアでＳＮＡＬＰ−ＡｐｏＢの第１相単回投与試験を完了した。ＡｐｏＢは、主に肝臓及び空腸で発現され、ＶＬＤＬ及びＬＤＬの構築及び分泌に必須である。１７人の対象が、ＳＮＡＬＰ−ＡｐｏＢの単回投与を受けた（７つの用量レベルで用量を増加）。（前臨床試験に基づいて潜在的な用量制限毒性と予想された）肝臓毒性は見られなかった。最も高い用量の（２人のうちの）１人の対象が、免疫系の刺激に一致するインフルエンザに似た症状を示し、この試験を結論付ける決定がなされた。

Ａｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓは、同様にＡＬＮ−ＴＴＲ０１を進めた。ＡＬＮ−ＴＴＲ０１は、上記のＳＮＡＬＰ技術を利用し、突然変異型及び野生型ＴＴＲの両方の肝細胞産生を標的としてＴＴＲアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）を処置する。３つのＡＴＴＲ症状が説明されている：家族性アミロイド多発性ニューロパシー（ＦＡＰ）及び家族性アミロイド心筋症（ＦＡＣ）−共にＴＴＲにおける常染色体優性突然変異によって引き起こされる；及び野生型ＴＴＲによって引き起こされる老人性全身性アミロイドーシス（ＳＳＡ）。近年、ＡＬＮ−ＴＴＲ０１のプラセボ対照単回投与用量増加第１相試験がＡＴＲの患者で完了した。ＡＬＮ−ＴＴＲ０１は、０．０１〜１．０ｍｇ／ｋｇ（ｓｉＲＮＡを基準）の用量範囲で、３１人の患者（試験薬物の２３人とプラセボの８人）に１５分の静脈注入として投与された。処置は、肝機能試験で有意な増加が見られず、良好な耐容性を示した。注射関連反応は、０．４ｍｇ／ｋｇ以上で、２３人の患者のうち３人で見られ；全てが、注入速度の低下に応答し、全てで試験を継続した。血清サイトカインＩＬ−６、ＩＰ−１０、及びＩＬ−１ｒａの最小限及び一過性の上昇が、１ｍｇ／ｋｇの最高用量で２人の患者に見られた（これは前臨床及びＮＨＰ試験から予測された）。血清ＴＴＲの低下により、ＡＬＮ−ＴＴＲ０１の予想された薬力学的効果が、１ｍｇ／ｋｇで観察された。

なお別の実施形態では、ＳＮＡＬＰは、カチオン性脂質、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＰＥＧ−脂質を可溶化することによって行うことができ、これらはそれぞれ４０：１０：４０：１０のモル比で、エタノールで可溶化されている（Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｎｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ２８ Ｎｕｍｂｅｒ ２ Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１０，ｐｐ．１７２−１７７を参照されたい）。この脂質混合物を水性緩衝液（５０ｍＭ クエン酸塩、ｐＨ４）に添加し、混合して最終エタノール濃度及び脂質濃度をそれぞれ３０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）及び６．１ｍｇ／ｍｌにし、押し出しの前に２２℃で２分間平衡化した。この水和脂質を、動的光散乱分析によって決定される７０〜９０ｎｍの小胞直径が得られるまでＬｉｐｅｘ Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ）を用いて２２℃で、孔径が８０ｎｍの二層フィルター（Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ）に通して押し出した。これには、一般に、１〜３回の通過が必要である。（３０％エタノールを含む５０ｍＭ クエン酸塩、ｐＨ４の水溶液に可溶化された）ｓｉＲＮＡを、混合しながら約５ｍｌ／分の速度で、前平衡化した（３５℃）小胞に添加した。０．０６（ｗｔ／ｗｔ）の最終的な目標ｓｉＲＮＡ／脂質比に達したら、混合物を３５℃でさらに３０分間インキュベートして、小胞の再構築及びｓｉＲＮＡの封入を行った。次いで、エタノールを除去し、透析又は接線流透析濾過によって外部緩衝液をＰＢＳ（１５５ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、１ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、ｐＨ７．５）で置換した。ｓｉＲＮＡを、制御された段階希釈法のプロセスを用いてＳＮＡＬＰ中に封入した。ＫＣ２−ＳＮＡＬＰの脂質成分は、５７．１：７．１：３４．３：１．４のモル比で使用されるＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ（カチオン性脂質）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ；Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）、合成コレステロール（Ｓｉｇｍａ）、及びＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡであった。封入粒子が形成されたら、使用の前にＳＮＡＬＰをＰＢＳで透析し、０．２μｍフィルターに通して滅菌した。平均粒子サイズは、７５〜８５ｎｍであり、ｓｉＲＮＡの９０〜９５％が、脂質粒子内に封入された。ｉｎ ｖｉｖｏ試験に使用される製剤中の最終的なｓｉＲＮＡ／脂質比は、約０．１５（ｗｔ／ｗｔ）であった。第ＶＩＩ因子ｓｉＲＮＡを含むＬＮＰ−ｓｉＲＮＡ系を、使用の直前に滅菌ＰＢＳで適切な濃度に希釈し、この製剤を、１０ｍｌ／ｋｇの総量で外側尾静脈に静脈内投与した。この方法を、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に対して外挿することができる。

他の脂質
他のカチオン性脂質、例えば、アミノ脂質２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）は、ｓｉＲＮＡに類似したＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ（例えば、Ｊａｙａｒａｍａｎ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１２，５１，８５２９ −８５３３を参照されたい）を封入するために利用することができる。次の脂質組成物を含む予備成形小胞が企図され得る：それぞれ４０／１０／４０／１０のモル比のアミノ脂質、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、及び（Ｒ）−２，３ビス（オクタデシルオキシ）プロピル−１−（メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）プロピルカルバメート（ＰＥＧ−脂質）、並びに約０．０５（ｗ／ｗ）のＦＶＩＩ ｓｉＲＮＡ／全脂質比。７０〜９０ｎｍの狭い範囲の粒子サイズ分布及び０．１１＿０．０４（ｎ＝５６）の低い多分散指数にするために、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ ＲＮＡを添加する前に８０ｎｍの膜で粒子を最大３回押し出すことができる。極めて強力なアミノ脂質１６を含む粒子を、４つの脂質成分１６、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＰＥＧ−脂質を（５０／１０／３８．５／１．５）のモル比で使用することができ、このモル比は、ｉｎ ｖｉｖｏでの活性を促進するためにさらに最適化することができる。

Ｍｉｃｈａｅｌ Ｓ Ｄ Ｋｏｒｍａｎｎら（２０１１年１月９日でオンラインで公開された“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｆｔｅｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｍＲＮＡ ｉｎ ｍｉｃｅ：Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ：２９，Ｐａｇｅｓ：１５４−１５７（２０１１））は、脂質エンベロープを使用したＲＮＡの送達を説明している。脂質エンベロープの使用は、本発明でも好ましい。別の実施形態では、脂質を本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系で製剤化して脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を形成することができる。脂質は、限定されるものではないが、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ４、Ｃ１２−２００、及び共脂質ジステロイルホスファチジルコリン、コレステロールを含み、ＰＥＧ−ＤＭＧを、自然小胞形成手順を用いてｓｉＲＮＡの代わりにＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系で製剤化することができる（例えば、Ｎｏｖｏｂｒａｎｔｓｅｖａ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ（２０１２）１，ｅ４；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｎａ．２０１１．３を参照されたい）。成分モル比は、約５０／１０／３８．５／１．５（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ又はＣ１２−２００／ジステロイルホスファチジルコリン／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ）であり得る。最終的な脂質：ｓｉＲＮＡの重量比は、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ及びＣ１２−２００脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の場合にそれぞれ、約１２：１及び９：１とすることができる。製剤は、９０％を超える封入効率で、約８０ｎｍの平均粒子直径を有し得る。３ｍｇ／ｋｇの用量が企図され得る。Ｔｅｋｍｉｒａは、全てが本発明の実施に使用することができ、かつ／又は適合させることができる、ＬＮＰ及びＬＮＰ製剤の様々な態様に関連する、米国及び海外の約９５の対応特許のポートフォリオ（例えば、米国特許第７，９８２，０２７号明細書、同第７，７９９，５６５号明細書、同第８，０５８，０６９号明細書、同第８，２８３，３３３号明細書、同第７，９０１，７０８号明細書、同第７，７４５，６５１号明細書、同第７，８０３，３９７号明細書、同第８，１０１，７４１号明細書、同第８，１８８，２６３号明細書、同第７，９１５，３９９号明細書、同第８，２３６，９４３号明細書、及び同第７，８３８，６５８号明細書、並びに欧州特許第１７６６０３５号明細書、同第１５１９７１４号明細書、同第１７８１５９３号明細書、及び同第１６６４３１６号明細書を参照されたい）を有する。

ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系を、ＰＬＧＡマイクロスフェア中に封入して送達することができ、このＰＬＧＡマイクロスフェアは、例えば、タンパク質、タンパク質前駆体、又は部分的若しくは完全にプロセシングされた形態のタンパク質若しくはタンパク質前駆体をコードし得る改変核酸分子を含む組成物の製剤の態様に関する米国特許出願公開第２０１３０２５２２８１号明細書、同第２０１３０２４５１０７号明細書、及び同第２０１３０２４４２７９号明細書（Ｍｏｄｅｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓに譲渡）で詳述されているＰＬＧＡマイクロスフェアである。この製剤は、５０：１０：３８．５：１．５〜３．０（カチオン性脂質：融合脂質：コレステロール：ＰＥＧ脂質）のモル比を有し得る。ＰＥＧ脂質は、限定されるものではないが、ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ、ＰＥＧ−ＤＭＧから選択され得る。融合脂質は、ＤＳＰＣであり得る。また、Ｓｃｈｒｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ、米国特許出願公開第２０１２０２５１６１８号明細書を参照されたい。

Ｎａｎｏｍｅｒｉｃｓの技術は、低分子量の疎水性薬物、ペプチド、及び核酸ベースの治療（プラスミド、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）を含む広範囲の治療におけるバイオアベイラビリティの課題に取り組んでいる。この技術が明確な利点を実証した特定の投与経路として、経口経路、血液脳関門を通る輸送、固形腫瘍への送達、及び眼が挙げられる。例えば、Ｍａｚｚａ ｅｔ ａｌ．，２０１３，ＡＣＳ Ｎａｎｏ．２０１３ Ｆｅｂ ２６；７（２）：１０１６−２６；Ｕｃｈｅｇｂｕ ａｎｄ Ｓｉｅｗ，２０１３，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．１０２（２）：３０５−１０、及びＬａｌａｔｓａ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ．２０１２ Ｊｕｌ ２０；１６１（２）：５２３−３６を参照されたい。

米国特許出願公開第２００５００１９９２３号明細書は、生物活性分子、例えば、ポリヌクレオチド分子、ペプチド及びポリペプチド、及び／又は医薬品を哺乳動物の体に送達するためのカチオン性デンドリマーに関連する。デンドリマーは、例えば、肝臓、脾臓、肺、腎臓、又は心臓への生物活性分子の送達を目的とするのに適している。デンドリマーは、単一の分岐単量体単位から段階的に合成された合成３次元巨大分子であり、その性質及び機能性は、容易に制御でき、かつ変更することができる。デンドリマーは、多機能コアに対して（合成への発散型アプローチ）、又は多機能コアに向けて（合成への収束型アプローチ）ビルディングブロックを反復付加することにより合成され、ビルディングブロックが３次元シェルに付加される度に、高位世代のデンドリマーが形成される。ポリプロピレンイミンデンドリマーは、ジアミノブタンコアから出発し、１級アミンへのアクリロニトリルのダブルマイケル付加により、このジアミノブタンに２倍量のアミノ基が付加され、次に、ニトリルの水素化が行われる。この結果、アミノ基が２倍になる。ポリプロピレンイミンデンドリマーは、１００％プロトン化可能な窒素及び最大６４の末端アミノ基（世代５、ＤＡＢ６４）を含む。プロトン化可能な基は、通常、中性ｐＨでプロトンを受容できるアミノ基である。デンドリマーの遺伝子送達剤としての使用は、接合単位としてアミン／アミドの混合物又はＮ−Ｐ（Ｏ_２）Ｓと共にそれぞれ、ポリアミドアミン及びリン含有化合物を使用することに概ね集中しているが、低位世代のポリプロピレンイミンデンドリマーの遺伝子送達としての使用は報告されていない。ポリプロピレンイミンデンドリマーはまた、薬剤送達用のｐＨ感受性制御放出システムとして、及び抹消アミノ酸基によって化学的に修飾されたゲスト分子の封入用のｐＨ感受性制御放出システムとして研究されている。細胞毒性及びＤＮＡとポリプロピレンイミンデンドリマーとの相互作用、並びにＤＡＢ６４のトランスフェクション効力も研究されている。米国特許出願公開第２００５００１９９２３号明細書は、以前の報告に反して、カチオン性デンドリマー、例えば、ポリプロピレンイミンデンドリマーは、生物活性分子、例えば、遺伝物質の標的への送達に使用されると、適切な特性、例えば、特定の標的化及び低い毒性を示すという知見に基づいている。加えて、カチオン性デンドリマーの誘導体も、生物活性分子の標的への送達にとって適切な特性を示す。また、カチオン性ポリアミンポリマー及びデンドリマーポリマーを含む様々なポリマーについて述べている米国特許出願公開第２００８０２６７９０３号明細書の生物活性ポリマーを参照されたい。この生物活性ポリマーは、抗増殖活性を有することが示され、従って、不所望の細胞増殖によって特徴付けられる障害、例えば、新生物及び腫瘍、炎症障害（自己免疫障害を含む）、乾癬、及びアテローム性動脈硬化の処置に有用であり得る。これらのポリマーは、活性剤として単独で、又は他の治療薬、例えば、遺伝子療法用の薬物分子又は核酸の送達ビヒクルとして使用することができる。このような場合、ポリマー自体の固有の抗腫瘍活性は、送達されるべき作用物質の活性を補完し得る。これらの文献は、本発明の実施において適合され得る。

ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡ
ＣＲＩＳＰＲ酵素又はＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡは、別々に送達することもでき；及び有利には、これらのうちの少なくとも１つはナノ粒子複合体によって送達される。ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ酵素が発現される時間を与えるために、ガイドＲＮＡよりも前に送達することができる。ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡは、ガイドＲＮＡの投与の１〜１２時間（好ましくは、約２〜６時間）前に投与されてもよい。或いは、ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡは一緒に投与することができる。有利には、ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ＋ガイドＲＮＡの初期投与の１〜１２時間（好ましくは、約２〜６時間）後に、第２のブースター用量のガイドＲＮＡを投与することができる。ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ及び／又はガイドＲＮＡの追加の投与は、最も効率的なレベルのゲノム改変を達成するために有用であり得る。毒性及びオフターゲット効果を最小限にするために、送達されるＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡの濃度を制御することが重要であろう。ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡの最適濃度は、細胞又は動物モデルにおいて種々の濃度を試験し、潜在的なオフターゲットゲノム遺伝子座における改変の程度を分析するディープシークエンシングを用いることによって決定することができる。例えば、ヒトゲノムのＥＭＸ１遺伝子内の５’−ＧＡＧＴＣＣＧＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡ−３’を標的とするガイド配列の場合、ディープシークエンシングを用いて、以下の２つのオフターゲット遺伝子座、１：５’−ＧＡＧＴＣＣＴＡＧＣＡＧＧＡＧＡＡＧＡＡ−３’及び２：５’−ＧＡＧＴＣＴＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡ−３’における改変のレベルを評価することができる。オフターゲット改変のレベルが最低限でありながら最高レベルのオンターゲット改変を与える濃度がｉｎ ｖｉｖｏ送達のために選択されるべきである。或いは、毒性及びオフターゲット効果のレベルを最小限にするために、ＣＲＩＳＰＲ酵素ニッカーゼｍＲＮＡ（例えば、Ｄ１０Ａ突然変異を有する化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９）を、目的の部位を標的とするガイドＲＮＡの対と共に送達することができる。２つのガイドＲＮＡは、以下のように離間させる必要がある。それぞれ赤色（単一の下線）及び青色（二重の下線）のガイド配列（これらの例は、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９のＰＡＭ要求に基づく）。

この系のさらなる調査により、５’オーバーハングの証拠が得られた（例えば、Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１３ Ｓｅｐ １２；１５４（６）：１３８０−９及び２０１３年８月２８日出願の米国仮特許出願第６１／８７１，３０１号明細書を参照）。２つのガイドＲＮＡと組み合わせたときのＣａｓ９ニッカーゼ突然変異体による効率的な切断に関するパラメータも存在し、これらのパラメータには５’オーバーハングの長さが含まれるが、これに限定されない。本発明の実施形態では、５’オーバーハングは最大で２００塩基対、好ましくは最大で１００塩基対、又はより好ましくは最大で５０塩基対である。本発明の実施形態では、５’オーバーハングは少なくとも２６塩基対、好ましくは少なくとも３０塩基対又はより好ましくは３４〜５０塩基対又は１〜３４塩基対である。本発明の他の好ましい方法では、第１のガイド配列が第１の標的配列の近傍でＤＮＡ二重鎖の一方の鎖の切断を誘導し、第２のガイド配列が第２の標的配列の近傍で反対の鎖の切断を誘導することにより、平滑末端又は３’オーバーハングが生じる。本発明の実施形態では、３’オーバーハングは最大で１５０、１００又は２５塩基対又は少なくとも１５、１０又は１塩基対である。好ましい実施形態では、３’オーバーハングは１〜１００塩基対である（この場合、「塩基対」はヌクレオチド又はｎｔを意味し得る）。

本発明の態様は、遺伝子産物の発現を低下させること、又は遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子に鋳型ポリヌクレオチドがさらに導入されること、又は２つの５’オーバーハングのリアニーリング及びライゲーションを可能にすることにより介在配列が正確に切り出されること、又は遺伝子産物の活性又は機能を変化させること、又は遺伝子産物の発現を増加させることに関する。本発明の実施形態では、遺伝子産物はタンパク質である。

ガイド配列間の重複が８ｂｐ未満の５’オーバーハング（−８ｂｐを超えるオフセット）を形成するｓｇＲＮＡ対のみが、検出可能なインデル形成を媒介することができた。重要なことに、このアッセイで使用される各ガイドは、野生型Ｃａｓ９と対になったときにインデルを効率的に誘導することができ、ガイド対の相対位置は、二重ニッキング活性の予測において最も重要なパラメータであることが示される。

Ｃａｓ９ｎ及びＣａｓ９Ｈ８４０ＡはＤＮＡの逆鎖をニッキングするため、所与のｓｇＲＮＡ対を有するＣａｓ９Ｈ８４０ＡによりＣａｓ９ｎを置換すると、オーバーハング型の反転が生じるはずである。例えば、Ｃａｓ９ｎにより５’オーバーハングを生じ得るｓｇＲＮＡの対は、原則的に、対応する３’オーバーハングを代わりに生じるはずである。従って、Ｃａｓ９ｎにより３’オーバーハングの生成をもたらすｓｇＲＮＡ対は、別の突然変異Ｃａｓ９と共に使用されて、５’オーバーハングを生成することができ、従って二重ニッキングである。予想外に、本出願人は、５’及び３’オーバーハングの両方（−２７８〜＋５８ｂｐのオフセット範囲）を生成するように設計された一組のｓｇＲＮＡ対と共にＣａｓ９Ｈ８４０Ａを試験したが、インデル形成を観察することができなかった。Ｃａｓ９Ｈ８４０Ａによる二重ニッキングを可能にするためにｓｇＲＮＡの対形成のさらなる研究が必要であり得るが、データから、生化学系又は原核細胞株とは対照的に、真核細胞株では、Ｃａｓ９Ｈ８４０Ａ突然変異により、Ｃａｓ９ａが「死Ｃａｓ９」、即ち実質的に全てのＤＮＡ切断活性が欠けたＣＲＩＳＰＲ酵素にされ得ることは明らかである。（これは、突然変異酵素のＤＮＡ切断活性が、非突然変異型酵素のＤＮＡ切断活性の約２５％以下、１０％以下、５％以下、１％以下、０．１％以下、０．０１％以下、又はそれよりも低い場合であり；これにより、一例は、突然変異型のＤＮＡ切断活性が皆無である、又は非突然変異型と比べて無視できる場合、例えば、Ｃａｓ９Ｈ８４０Ａの場合と同様にインデル形成が全く観察されない場合であり得る）。

肝臓、プロタンパク質転換酵素サブチリシンケキシン９（ＰＣＳＫ９）
プロタンパク質転換酵素サブチリシンケキシン９（ＰＣＳＫ９）は、サブチリシンセリンプロテアーゼファミリーのメンバーである。ＰＣＳＫ９は主に肝臓により発現され、肝細胞ＬＤＬ受容体発現の下方制御のために重要である。血漿中のＬＤＬ−Ｃレベルは、ＰＣＳＫ９の機能獲得型突然変異を有する人では非常に高く、彼らは重度の高コレステロール血症を有するとして分類される。従って、ＰＣＳＫ９はＣＲＩＳＰＲの魅力的な標的である。ＰＣＳ９Ｋ標的化ＣＲＩＳＰＲは脂質粒子において処方することができ、例えば、約１５、４５、９０、１５０、２５０及び４００μｇ／ｋｇで静脈内投与され得る（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｌｎｙｌａｍ．ｃｏｍ／ｃａｐｅｌｌａ／ｗｐ−ｃｏｎｔｅｎｔ／ｕｐｌｏａｄｓ／２０１３／０８／ＡＬＮ−ＰＣＳ０２−００１−Ｐｒｏｔｏｃｏｌ−Ｌａｎｃｅｔ．ｐｄｆを参照）。

Ｂａｉｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ（Ｂｅｒｌ）．１９９９ Ｊａｎ；７７（１）：２４４−９）は、ｅｘ−ｖｉｖｏ体細胞遺伝子療法によるインスリン送達を開示し、これには、糖尿病患者から非Ｂ細胞体細胞（例えば、線維芽細胞）を除去し、インスリンを産生及び分泌するようにこれをｉｎ ｖｉｔｒｏで遺伝的に改変することが含まれる。細胞を培養下で成長させ、インスリン補充源としてドナーに戻すことができる。このようにして改変された細胞は、移植の前に評価され、予備ストックが凍結保存され得る。患者自身の細胞を使用することにより、この手順では、免疫抑制の必要がなくなり、組織供給の問題が解消される一方、細胞破壊の再発が回避されるはずである。ｅｘ−ｖｉｖｏでの体細胞遺伝子療法には、複数のトランスフェクションに適していると共に制御された増殖を受けやすい、利用しやすくロバストな細胞型が必要である。非Ｂ細胞体細胞の使用に関連する特別な問題には、プロインスリンからインスリンへのプロセシング、並びにグルコース刺激性プロインスリン生合成及び制御されたインスリン放出に対する感受性の付与が含まれる。線維芽細胞、下垂体細胞、腎臓（ＣＯＳ）細胞及び卵巣（ＣＨＯ）細胞を用いる予備的研究により、これらの難問が対処され得ること、及びｅｘ−ｖｉｖｏの体細胞遺伝子療法がインスリン補充療法に対する実行可能なアプローチを提供することが示される。Ｂａｉｌｅｙ ｅｔ ａｌ．のシステムは、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系の肝臓への送達のために使用及び／又は適合され得る。

Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ ２６ Ｎｕｍｂｅｒ ４ Ａｐｒｉｌ ２００８、Ｐａｇｅｓ ４３１−４４２）の方法は、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系の肝臓への送達に適用され得る。Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．は、ｓｉＲＮＡを保有するビタミンＡ結合リポソームによる処置が、本来致死性のジメチルニトロソアミンによって誘発された肝硬変を有するラットにおいて、用量依存的及び持続時間依存的に、肝線維症をほぼ完全に消散させて生存期間を延長することを見出した。カチオン性脂質としてのＯ，Ｏ’−ジテトラデカノイル−Ｎ−（ａ−トリメチルアンモニオアセチル）ジエタノールアミンクロリド（ＤＣ−６−１４）、コレステロール及びジオレオイルホスファチジルエタノールアミンを４：３：３のモル比で含有するカチオン性リポソーム（Ｌｉｐｏｔｒｕｓｔ）（ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子送達に関して血清添加条件下で高いトランスフェクション効率を示している）を北海道システム・サイエンス社（Ｈｏｋｋａｉｄｏ Ｓｙｓｔｅｍ Ｓｃｉｅｎｃｅ）から購入した。リポソームは凍結乾燥させた空のリポソーム方法を用いて製造され、使用前に凍結乾燥脂質混合物に再蒸留水（ＤＤＷ）をボルテックス下で添加することにより１ｍＭ（ＤＣ−１６−４）の濃度で調製された。ＶＡ結合リポソームを調製するために、１．５ｍｌチューブにおいて２５ １Ｃでボルテックスすることによって、ＤＭＳＯ中に溶解した２００ｎｍｏｌのビタミンＡ（レチノール、Ｓｉｇｍａ）をリポソーム懸濁液（ＤＣ−１６−４として１００ｎｍｏｌ）と混合した。ｓｉＲＮＡｇｐ４６を有するＶＡ結合リポソーム（ＶＡ−ｌｉｐ−ｓｉＲＮＡｇｐ４６）を調製するために、ｓｉＲＮＡｇｐ４６の溶液（ＤＤＷ中５８０ｐｍｏｌ／ｍｌ）を、２５Ｃで撹拌しながらレチノール結合リポソーム溶液に添加した。ｓｉＲＮＡとＤＣ−１６−４との比は１：１１．５（ｍｏｌ／ｍｏｌ）であり、ｓｉＲＮＡとリポソームとの比（ｗｔ／ｗｔ）は１：１であった。リポソームによって取り込まれなかった任意の遊離ビタミンＡ又はｓｉＲＮＡを、マイクロ分配システム（ＶＩＶＡＳＰＩＮ ２濃縮器３０，０００ＭＷＣＯ ＰＥＳ、ＶＩＶＡＳＣＩＥＮＣＥ）を用いてリポソーム調製物から分離した。リポソーム懸濁液をフィルターに添加し、２５ １Ｃにおいて１，５００ｇで５分間、３回遠心分離した。画分を捕集し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ使用のための所望の用量を達成するように、フィルターに捕捉された材料をＰＢＳにより再構成した。０．７５ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡの３回の注射が隔日でラットに与えられた。Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．のシステムは、Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．により記載されるようにリポソーム中約０．５〜１ｍｇ／ｋｇのＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ ＲＮＡをヒトに投与することによって、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系の肝臓への送達のために使用及び／又は適合される。

ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方でｓｉＲＮＡを肝細胞に送達するためのビヒクルについてのＲｏｚｅｍａ ｅｔ ａｌ．（ＰＮＡＳ、Ａｕｇｕｓｔ ７，２００７，ｖｏｌ．１０４，ｎｏ．３２）の方法（Ｒｏｚｅｍａ ｅｔ ａｌによりｓｉＲＮＡ Ｄｙｎａｍｉｃ ＰｏｌｙＣｏｎｊｕｇａｔｅと命名）も本発明に適用され得る。Ｄｙｎａｍｉｃ Ｐｏｌｙ−Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ技術の重要な特徴には、膜作用性ポリマー、このポリマーの活性をそれがエンドソームの酸性環境に達するまで可逆的に遮蔽する能力、及び単純な低圧静脈内注射後にｉｎ ｖｉｖｏでこの改変ポリマー及びそのｓｉＲＮＡカーゴを肝細胞に特異的に標的化させる能力が含まれる。ＳＡＴＡ改変ｓｉＲＮＡは、５’アミン改変ｓｉＲＮＡと、１重量当量（ｗｔ ｅｑ）のＮスクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）及び０．３６ｗｔ ｅｑのＮａＨＣＯ３とを水中において４℃で１６時間反応させることによって合成される。次に、９容積のエタノールの添加及び８０℃で２時間のインキュベーションによって改変ｓｉＲＮＡが沈殿される。沈殿物は１×ｓｉＲＮＡ緩衝液（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）中に再懸濁され、２６０ｎｍ波長で吸光度を計測することにより定量化される。１．５ｗｔ％のＳＭＰＴ（Ｐｉｅｒｃｅ）の添加によりＰＢＡＶＥ（５ｍＭＴＡＰＳ中３０ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ９）が改変される。１時間のインキュベーションの後、５ｍＭのＴＡＰＳ（ｐＨ９）を含有する４００μｌの等張グルコース溶液に０．８ｍｇのＳＭＰＴ−ＰＢＡＶＥを添加した。この溶液に５０μｇのＳＡＴＡ改変ｓｉＲＮＡを添加した。［ＰＢＡＶＥ］を一定にした用量反応実験について、種々の量のｓｉＲＮＡが添加される。次に、混合物は１６時間インキュベートされる。次に、この溶液に５．６ｍｇのＨｅｐｅｓ遊離塩基が添加され、その後３．７ｍｇのＣＤＭ−ＮＡＧ及び１．９ｍｇのＣＤＭ−ＰＥＧの混合物が添加される。次に、この溶液が室温で少なくとも１時間インキュベートされた後、注射される。ＣＤＭ−ＰＥＧ及びＣＤＭ−ＮＡＧは、塩化オキサリルを用いることにより生成された酸クロリドから合成される。酸クロリドに１．１モル当量のポリエチレングリコールモノメチルエーテル（分子量平均４５０）が添加されてＣＤＭ−ＰＥＧが生成されるか、或いは（アミノエトキシ）エトキシ−２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシドが添加されてＣＤＭ−ＮＡＧが生成される。最終生成物は、０．１％ＴＦＡ水／アセトニトリル勾配の逆相ＨＰＬＣを用いて精製される。約２５〜５０μｇのｓｉＲＮＡをマウスに送達した。Ｒｏｚｅｍａ ｅｔ ａｌ．のシステムは、例えば、ヒトへの送達のために約５０〜約２００ｍｇのＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓの投薬量を想定することによって、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系の肝臓への送達のために適用され得る。

骨
Ｏａｋｅｓ ａｎｄ Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ（Ｃｌｉｎ Ｏｒｔｈｏｐ Ｒｅｌａｔ Ｒｅｓ．２０００ Ｏｃｔ；（３７９ Ｓｕｐｐｌ）：Ｓ１０１−１２）は、骨への遺伝子の送達を考察している。特定の解剖学的部位にある細胞に遺伝子を移入させることにより、成長因子の骨誘導特性を生理的用量で長時間使用して、より有意な治癒反応を促進することができる。特定の解剖学的部位、骨質、及び軟部組織エンベロープが、局部遺伝子療法の標的細胞の選択に影響する。骨誘導性担体で治療部位に送達される遺伝子療法ベクターが、有望な結果をもたらしている。複数の研究者が、動物モデルにｅｘ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ局部遺伝子療法を用いて面白い結果を示している。かかる系は、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系の骨への送達に使用し及び／又は適合させることができる。

脳
脳のための送達の選択肢には、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれかの形態のＣＲＩＳＰＲ酵素及びガイドＲＮＡをリポソームに封入し、血液脳関門（ＢＢＢ）を越えた送達のために分子トロイの木馬にコンジュゲートすることが含まれる。分子トロイの木馬は、Ｂ−ｇａｌ発現ベクターを非ヒト霊長類の脳に送達するのに有効であることが示されている。同じアプローチを用いて、ＣＲＩＳＰＲ酵素及びガイドＲＮＡを含有するベクターを送達することができる。例えば、Ｘｉａ ＣＦ ａｎｄ Ｂｏａｄｏ ＲＪ，Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ ＷＭ（“Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｓｉＲＮＡ ｖｉａ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｕｓｉｎｇ ａｖｉｄｉｎ−ｂｉｏｔｉｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．”Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ．２００９ Ｍａｙ−Ｊｕｎ；６（３）：７４７−５１．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｍｐ８００１９４）は、受容体特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）及びアビジン−ビオチン技術の併用による、培養下及びｉｎ ｖｉｖｏでの細胞に対する低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の送達がどのようにして可能であるかを記載している。著者らは、標的化するｍＡｂとｓｉＲＮＡとの間の結合がアビジン−ビオチン技術により安定しているため、標的化ｓｉＲＮＡの静脈内投与後にｉｎ ｖｉｖｏで、脳などの遠隔部位におけるＲＮＡｉ効果が観察されることも報告している。

Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００３ Ｊａｎ；７（１）：１１−８．））は、ヒトインスリン受容体（ＨＩＲ）に対するモノクローナル抗体（ＭＡｂ）によってｉｎ ｖｉｖｏでアカゲザル脳に標的化された、８５ｎｍペグ化された免疫リポソームで構成された「人工ウイルス」の内部に、ルシフェラーゼなどのレポーターをコードする発現プラスミドがどのように封入されたかを記載している。ＨＩＲＭＡｂは、外因性遺伝子を保有するリポソームが、静脈内注射後に、血液脳関門を越えるトランスサイトーシス及びニューロン膜を越えるエンドサイトーシスを受けることを可能にする。脳におけるルシフェラーゼ遺伝子発現のレベルは、ラットと比較してアカゲザルにおいて５０倍高かった。組織化学及び共焦点顕微鏡法の両方によって、霊長類脳におけるベータ−ガラクトシダーゼ遺伝子の広範なニューロン発現が実証された。著者らは、このアプローチにより、可逆的なトランスジェニックが２４時間で実現可能になることを示す。従って、免疫リポソームの使用が好ましい。これらは、特定の組織又は細胞表面タンパク質を標的化するために抗体と共に使用され得る。

例えば、ナノ粒子を用いる（Ｃｈｏ，Ｓ．，Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｍ．，Ｓｏｎ，Ｓ．，Ｘｕ，Ｑ．，Ｙａｎｇ，Ｆ．，Ｍｅｉ，Ｙ．，Ｂｏｇａｔｙｒｅｖ，Ｓ．，Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．，Ｌｉｐｉｄ−ｌｉｋｅ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，１９：３１１２−３１１８，２０１０）、又はエキソソームを用いる（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ，Ａ．，Ｌｅｖｉｎｓ，Ｃ．，Ｃｏｒｔｅｚ，Ｃ．，Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．，ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．，Ｌｉｐｉｄ−ｂａｓｅｄ ｎａｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｆｏｒ ｓｉＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２６７：９−２１，２０１０，ＰＭＩＤ：２００５９６４１）などの、他の送達手段又はＲＮＡも好ましい。

実際、エキソソームは、ＣＲＩＳＰＲ系といくらか類似している系であるｓｉＲＮＡの送達において特に有用であることが示されている。例えば、Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ Ｓ，ｅｔ ａｌ．（“Ｅｘｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｓｉＲＮＡ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ．”Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２０１２ Ｄｅｃ；７（１２）：２１１２−２６．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１２．１３１．Ｅｐｕｂ ２０１２ Ｎｏｖ １５．）は、エキソソームが如何に種々の生物学的関門を越える薬物送達のために有望なツールであり、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでのｓｉＲＮＡの送達に利用され得るかを記載している。このアプローチは、ペプチドリガンドと融合したエキソソームタンパク質を含む、発現ベクターのトランスフェクションにより標的化エキソソームを生成することである。次にエキソソームはトランスフェクト細胞上清から精製及び特徴付けられ、次にｓｉＲＮＡがエキソソームに負荷される。本発明に従う送達又は投与は、限定はされないが特に脳に対して、エキソソームにより実施することができる。

例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を脳に送達するためにＵｎｏ ｅｔ ａｌ．（ＨＵＭＡＮ ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＹ ２２：７１１−７１９（Ｊｕｎｅ ２０１１））により成されたものと同様の方法で、ビタミンＥ（α−トコフェロール）はＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓとコンジュゲートされ、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）と共に脳に送達され得る。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）又は遊離ＴｏｃｓｉＢＡＣＥ又はＴｏｃ−ｓｉＢＡＣＥ／ＨＤＬが充填され、脳注入キット３（Ａｌｚｅｔ）と接続された浸透圧ミニポンプ（モデル１００７Ｄ；Ａｌｚｅｔ，Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ，ＣＡ）を用いてマウスに注入した。背側第三脳室への注入のために正中線においてブレグマの約０．５ｍｍ後側に脳注入カニューレを配置した。Ｕｎｏ ｅｔ ａｌ．は、ＨＤＬを伴ったわずか３ｎｍｏｌのＴｏｃ−ｓｉＲＮＡが、同じＩＣＶ注入方法によるものと同程度の標的の低減を誘導し得ることを見出した。α−トコフェロールにコンジュゲートされ、脳に標的化されたＨＤＬと共に同時投与されるＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓの同様の投薬量を本発明ではヒトに対して企図することができ、例えば、脳に標的化される約３ｎｍｏｌ〜約３μｍｏｌのＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓが企図され得る。

Ｚｏｕ ｅｔ ａｌ．（（ＨＵＭＡＮ ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＹ ２２：４６５−４７５（Ａｐｒｉｌ ２０１１））は、ラットの脊髄におけるｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子サイレンシングのためのＰＫＣγを標的化するショートヘアピンＲＮＡのレンチウイルス媒介性搬送方法を記載している。Ｚｏｕ ｅｔ ａｌ．は、くも膜下腔内カテーテルにより、１×１０^９形質導入単位（ＴＵ）／ｍｌの力価を有する約１０μｌの組換えレンチウイルスを投与した。脳に標的化されたレンチウイルスベクターにおいて発現されるＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓの同様の投薬量を本発明ではヒトに対して企図することができ、例えば、１×１０^９形質導入単位（ＴＵ）／ｍｌの力価を有するレンチウイルス内で脳に標的化された約１０〜５０ｍｌのＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓが企図され得る。

標的化した欠失、治療適用
遺伝子の標的化した欠失が好ましい。実施例１６に例を例示する。従って、数ある障害の中でも特に、コレステロール生合成、脂肪酸生合成、及び他の代謝障害に関与する遺伝子、アミロイド病及び他の疾患に関与する誤って折り畳まれたタンパク質をコードする遺伝子、細胞形質転換を生じさせる癌遺伝子、潜伏ウイルス遺伝子、及びドミナントネガティブな障害を生じさせる遺伝子が好ましい。ここに例示するとおり、出願者らによれば、ウイルス又はナノ粒子のいずれかの送達系を使用した、代謝障害、アミロイドーシス及びタンパク質凝集関連疾患、遺伝子突然変異及び転座によって生じる細胞形質転換、遺伝子突然変異のドミナントネガティブ効果、潜伏ウイルス感染、及び他の関連症状に罹患している、必要性がある対象又は患者の肝臓、脳、視覚、上皮、造血、又は別の組織に対するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の遺伝子送達が好ましい。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の治療適用には、限定はされないが、網膜色素変性症、色覚異常、黄斑変性症、緑内障等を含めた、遺伝性眼疾患（ｏｃｕｌａｒ ｄｉｅａｓｅ）が含まれる。

ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の治療適用には、緑内障、アミロイドーシス、及びハンチントン病が含まれる。これらは実施例１８において例証されており、そこに記載される特徴は単独又は組み合わせにおいて好ましい。

本発明により処置され得るポリグルタミン伸長病の別の例としては、脊髄小脳失調症１型（ＳＣＡ１）が挙げられる。ショートヘアピンＲＮＡを発現する組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、小脳内注入されると、運動協調性が大きく改善され、小脳形態が回復され、ＳＣＡ１マウスのプルキンエ細胞における特徴的なアタキシン−１封入体が消散される（例えば、Ｘｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．１０，Ｎｏ．８，Ａｕｇ．２００４を参照）。特に、ＡＡＶ１及びＡＡＶ５ベクターが好ましく、約１×１０^１２ベクターゲノム／ｍｌのＡＡＶ力価が望ましい。

例として、ＨＩＶ−１による慢性感染症が治療又は予防され得る。これを達成するため、有効範囲及び有効性を最大化するＨＩＶ−１株変異体を考慮しながら、大多数のＨＩＶ−１ゲノムを標的化するＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓガイドＲＮＡを作成し得る。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の送達は、従来どおりの宿主免疫系のアデノウイルス又はレンチウイルス媒介性感染により達成し得る。手法に応じて、宿主免疫細胞は、ａ）単離され、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓで形質導入され、選択され、及び宿主に再導入されてもよく、又はｂ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の全身送達によりｉｎ ｖｉｖｏで形質導入されてもよい。第１の手法は抵抗性免疫集団の作成を可能にする一方、第２の手法は宿主内の潜伏ウイルスリザーバを標的化する傾向が強い。これは実施例の節でさらに詳細に考察する。

別の例において、Ｓａｎｇａｍｏ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許出願公開第２０１３０１７１７３２号明細書は、ゲノムへの抗ＨＩＶトランス遺伝子の挿入に関し、この方法は本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に適用し得る。別の実施形態において、ＣＸＣＲ４遺伝子が標的化されてもよく、Ｓａｎｇａｍｏ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許出願公開第２０１００２９１０４８号明細書のＴＡＬＥ系を、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に合わせて改良し得る。Ｓａｎｇａｍｏ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許出願公開第２０１３０１３７１０４号明細書及び同第２０１３０１２２５９１号明細書並びにＣｅｌｌｅｃｔｉｓに譲渡された米国特許出願公開第２０１００１４６６５１号明細書の方法は、遺伝子改変頻度を増加させるためのヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）遺伝子座の改変に関するため、トランス遺伝子の発現にさらに一般的に適用可能であり得る。

また、本発明が遺伝子ノックアウト細胞ライブラリを作成することも想定される。各細胞が単一遺伝子ノックアウトを有し得る。これを実施例２１に例示する。

ＥＳ細胞のライブラリを作製してもよく、ここでは各細胞が単一遺伝子ノックアウトを有し、かつＥＳ細胞のライブラリ全体があらゆる遺伝子ノックアウトを有することになる。このライブラリは、細胞プロセス並びに疾患における遺伝子機能のスクリーニングに有用である。この細胞ライブラリを作製するには、誘導性プロモーター（例えばドキシサイクリン誘導性プロモーター）によって駆動されるＣａｓ９をＥＳ細胞に組み込み得る。加えて、特異的遺伝子を標的化するシングルガイドＲＮＡをＥＳ細胞に組み込み得る。ＥＳ細胞ライブラリを作製するには、単純に、ヒトゲノムにおける各遺伝子を標的化するガイドＲＮＡをコードする遺伝子のライブラリとＥＳ細胞を混合し得る。初めに単一のＢｘＢ１ ａｔｔＢ部位をヒトＥＳ細胞のＡＡＶＳ１遺伝子座に導入し得る。次にＢｘＢ１インテグラーゼを使用してＡＡＶＳ１遺伝子座のＢｘＢ１ ａｔｔＢ部位に対する個々のガイドＲＮＡ遺伝子の組込みを促進し得る。組込みを促進するため、各ガイドＲＮＡ遺伝子が、単一のａｔｔＰ部位を担持するプラスミド上に含まれてもよい。このようにしてＢｘＢ１がゲノムのａｔｔＢ部位をガイドＲＮＡ含有プラスミド上のａｔｔＰ部位と組み換え得る。細胞ライブラリを作成するため、組み込まれたシングルガイドＲＮＡを有しかつＣａｓ９発現を誘導する細胞のライブラリを取り得る。誘導後、ガイドＲＮＡによって指定された部位でＣａｓ９が二本鎖切断を媒介する。

タンパク質治療薬の慢性投与は、特定のタンパク質に対する許容し難い免疫応答を誘発し得る。タンパク質薬物の免疫原性は、いくつかの免疫優性ヘルパーＴリンパ球（ＨＴＬ）エピトープに起因し得る。これらのタンパク質内に含まれるこれらのＨＴＬエピトープのＭＨＣ結合親和性を低下させると、免疫原性がより低い薬物を作成することができる（Ｔａｎｇｒｉ Ｓ，ｅｔ ａｌ．（「免疫原性が低い合理的にエンジニアリングされた治療用タンパク質（Ｒａｔｉｏｎａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ｒｅｄｕｃｅｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）」Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５ Ｍａｒ １５；１７４（６）：３１８７−９６）。本発明において、特にＣＲＩＳＰＲ酵素の免疫原性は、当初Ｔａｎｇｒｉ ｅｔ ａｌにおいてエリスロポエチンに関連して示され、続いて展開された手法に従い低下させることができる。従って、定向進化又は合理的設計を用いて、宿主種（ヒト又は他の種）におけるＣＲＩＳＰＲ酵素（例えばＣａ９）の免疫原性を低下させることができる。

実施例２６において、本出願人は３つの目的のガイドＲＮＡを使用し、ごく一部の細胞においてのみ起こるｉｎ ｖｉｖｏでの効率的なＤＮＡ切断を可視化することができた。本質的に、本出願人がここで示しているものは、標的化されたかをｉｎ ｖｉｖｏ切断である。特に、これは、哺乳動物などの高等生物における特異的標的化も達成可能であるという概念の証明を提供する。またこれは、複数のガイド配列（即ち別個の標的）を同時に使用できる（同時送達という意味で）という点で多重的な態様も強調する。換言すると、本出願人は、いくつかの異なる配列が同時に、しかし独立して標的化される、複数のアプローチを使用した。

トリヌクレオチドリピート障害は、治療するのに好ましい状態である。これらも本明細書において例示される。

例えば、米国特許出願公開第２０１１００１６５４０号明細書は、トリヌクレオチドリピート伸長障害に関連する細胞、動物及びタンパク質を遺伝的に改変するためのジンクフィンガーヌクレアーゼの使用を記載する。トリヌクレオチドリピート伸長障害は、発生神経生物学に関与し、多くの場合に認知及び感覚運動機能に影響を及ぼす複合的な進行性障害である。

トリヌクレオチドリピート伸長タンパク質は、トリヌクレオチドリピート伸長障害の発症に対する感受性、トリヌクレオチドリピート伸長障害の存在、トリヌクレオチドリピート伸長障害の重症度、又はこれらの任意の組み合わせに関連する多様な一組のタンパク質である。トリヌクレオチドリピート伸長障害は、リピートのタイプにより決定される２つの種類に分けられる。最も一般的なリピートはトリプレットＣＡＧであり、これは、遺伝子のコード領域に存在するとき、アミノ酸グルタミン（Ｑ）をコードするものである。従って、これらの障害はポリグルタミン（ｐｏｌｙＱ）障害と称され、以下の疾患を含む：ハンチントン病（ＨＤ）；球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）；脊髄小脳失調症（ＳＣＡ１型、２型、３型、６型、７型、及び１７型）；及び歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）。残りのトリヌクレオチドリピート伸長障害はＣＡＧトリプレットに関与しないか、或いはＣＡＧトリプレットが遺伝子のコード領域に存在せず、従って非ポリグルタミン障害と称される。非ポリグルタミン障害は、脆弱Ｘ症候群（ＦＲＡＸＡ）；脆弱ＸＥ精神遅滞（ＦＲＡＸＥ）；フリードライヒ失調症（ＦＲＤＡ）；筋強直性ジストロフィー（ＤＭ）；及び脊髄小脳失調症（ＳＣＡ８型、及び１２型）を含む。

トリヌクレオチドリピート伸長障害に関連するタンパク質は、通常、トリヌクレオチドリピート伸長障害に関連するタンパク質とトリヌクレオチドリピート伸長障害との実験的関連性に基づいて選択される。例えば、トリヌクレオチドリピート伸長障害のない集団と比べてトリヌクレオチドリピート伸長障害を有する集団では、トリヌクレオチドリピート伸長障害に関連するタンパク質の産生速度又は循環中濃度が上昇又は低下し得る。タンパク質レベルの差は、ウエスタンブロット、免疫組織化学染色、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、及び質量分析を含むがこれらに限定されないプロテオミクス技術を用いて評価され得る。或いは、トリヌクレオチドリピート伸長障害に関連するタンパク質は、ＤＮＡマイクロアレイ分析、遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）、及び定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）を含むがこれらに限定されないゲノム技術を用いて、タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子発現プロファイルを得ることにより同定され得る。

トリヌクレオチドリピート伸長障害に関連するタンパク質の非限定的な例としては、ＡＲ（アンドロゲン受容体）、ＦＭＲ１（脆弱Ｘ精神遅滞１）、ＨＴＴ（ハンチンチン）、ＤＭＰＫ（筋強直性ジストロフィープロテインキナーゼ）、ＦＸＮ（フラタキシン）、ＡＴＸＮ２（アタキシン２）、ＡＴＮ１（アトロフィン１）、ＦＥＮ１（フラップ構造特異的エンドヌクレアーゼ１）、ＴＮＲＣ６Ａ（トリヌクレオチドリピート含有６Ａ）、ＰＡＢＰＮ１（ポリ（Ａ）結合タンパク質、核１）、ＪＰＨ３（ジャンクトフィリン３）、ＭＥＤ１５（メディエーター複合体サブユニット１５）、ＡＴＸＮ１（アタキシン１）、ＡＴＸＮ３（アタキシン３）、ＴＢＰ（ＴＡＴＡボックス結合タンパク質）、ＣＡＣＮＡ１Ａ（カルシウムチャネル、電位依存性、Ｐ／Ｑ型、α１Ａサブユニット）、ＡＴＸＮ８０Ｓ（ＡＴＸＮ８逆鎖（非タンパク質コード））、ＰＰＰ２Ｒ２Ｂ（タンパク質ホスファターゼ２、調節性サブユニットＢ、β）、ＡＴＸＮ７（アタキシン７）、ＴＮＲＣ６Ｂ（トリヌクレオチドリピート含有６Ｂ）、ＴＮＲＣ６Ｃ（トリヌクレオチドリピート含有６Ｃ）、ＣＥＬＦ３（ＣＵＧＢＰ、Ｅｌａｖ様ファミリーメンバー３）、ＭＡＢ２１Ｌ１（ｍａｂ−２１様１（Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）））、ＭＳＨ２（ｍｕｔＳホモログ２、結腸癌、非ポリポーシス１型（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）））、ＴＭＥＭ１８５Ａ（膜貫通タンパク質１８５Ａ）、ＳＩＸ５（ＳＩＸホメオボックス５）、ＣＮＰＹ３（キャノピー３ホモログ（ゼブラフィッシュ））、ＦＲＡＸＥ（脆弱部位、葉酸型、まれ、ｆｒａ（Ｘ）（ｑ２８）Ｅ）、ＧＮＢ２（グアニンヌクレオチド結合タンパク質（Ｇタンパク質）、βポリペプチド２）、ＲＰＬ１４（リボソームタンパク質Ｌ１４）、ＡＴＸＮ８（アタキシン８）、ＩＮＳＲ（インスリン受容体）、ＴＴＲ（トランスサイレチン）、ＥＰ４００（Ｅ１Ａ結合タンパク質ｐ４００）、ＧＩＧＹＦ２（ＧＲＢ１０相互作用ＧＹＦタンパク質２）、ＯＧＧ１（８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼ）、ＳＴＣ１（スタニオカルシン１）、ＣＮＤＰ１（カルノシンジペプチダーゼ１（メタロペプチダーゼＭ２０ファミリー））、Ｃ１０ｏｒｆ２（染色体１０オープンリーディングフレーム２）、ＭＡＭＬ３マスターマインド様３（ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ））、ＤＫＣ１（先天性角化異常症１、ジスケリン）、ＰＡＸＩＰ１（ＰＡＸ（転写活性化ドメインとの）相互作用タンパク質１）、ＣＡＳＫ（カルシウム／カルモジュリン依存性セリンプロテインキナーゼ（ＭＡＧＵＫファミリー））、ＭＡＰＴ（微小管関連タンパク質タウ）、ＳＰ１（Ｓｐ１転写因子）、ＰＯＬＧ（ポリメラーゼ（ＤＮＡ指向性）、γ）、ＡＦＦ２（ＡＦ４／ＦＭＲ２ファミリー、メンバー２）、ＴＨＢＳ１（トロンボスポンジン１）、ＴＰ５３（腫瘍タンパク質ｐ５３）、ＥＳＲ１（エストロゲン受容体１）、ＣＧＧＢＰ１（ＣＧＧトリプレットリピート結合タンパク質１）、ＡＢＴ１（基礎転写のアクチベーター１）、ＫＬＫ３（カリクレイン関連ペプチダーゼ３）、ＰＲＮＰ（プリオンタンパク質）、ＪＵＮ（ｊｕｎ癌遺伝子）、ＫＣＮＮ３（カリウム中間体／小コンダクタンスカルシウム活性化チャネル、サブファミリーＮ、メンバー３）、ＢＡＸ（ＢＣＬ２関連Ｘタンパク質）、ＦＲＡＸＡ（脆弱部位、葉酸型、まれ、ｆｒａ（Ｘ）（ｑ２７．３）Ａ（巨精巣症、精神遅滞））、ＫＢＴＢＤ１０（ケルヒリピート及びＢＴＢ（ＰＯＺ）ドメイン含有１０）、ＭＢＮＬ１（マッスルブラインド様（ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）））、ＲＡＤ５１（ＲＡＤ５１ホモログ（ＲｅｃＡホモログ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））（Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）））、ＮＣＯＡ３（核内受容体コアクチベーター３）、ＥＲＤＡ１（伸長リピートドメイン、ＣＡＧ／ＣＴＧ１）、ＴＳＣ１（結節性硬化症１）、ＣＯＭＰ（軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質）、ＧＣＬＣ（グルタミン酸−システインリガーゼ、触媒サブユニット）、ＲＲＡＤ（糖尿病に付随するＲａｓ関連）、ＭＳＨ３（ｍｕｔＳホモログ３（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）））、ＤＲＤ２（ドーパミン受容体Ｄ２）、ＣＤ４４（ＣＤ４４分子（インド人血液型））、ＣＴＣＦ（ＣＣＣＴＣ結合因子（ジンクフィンガータンパク質））、ＣＣＮＤ１（サイクリンＤ１）、ＣＬＳＰＮ（クラスピンホモログ（アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）））、ＭＥＦ２Ａ（筋細胞エンハンサー因子２Ａ）、ＰＴＰＲＵ（タンパク質チロシンホスファターゼ、受容体型、Ｕ）、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）、ＴＲＩＭ２２（トリパルタイトモチーフ含有２２）、ＷＴ１（ウィルムス腫瘍１）、ＡＨＲ（アリール炭化水素受容体）、ＧＰＸ１（グルタチオンペルオキシダーゼ１）、ＴＰＭＴ（チオプリンＳ−メチルトランスフェラーゼ）、ＮＤＰ（ノリエ病（偽膠腫））、ＡＲＸ（アリスタレス関連ホメオボックス）、ＭＵＳ８１（ＭＵＳ８１エンドヌクレアーゼホモログ（Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）））、ＴＹＲ（チロシナーゼ（眼皮膚白皮症ＩＡ））、ＥＧＲ１（初期増殖応答１）、ＵＮＧ（ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ）、ＮＵＭＢＬ（ｎｕｍｂホモログ（ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ））様）、ＦＡＢＰ２（脂肪酸結合タンパク質２、腸）、ＥＮ２（エングレイルドホメオボックス２）、ＣＲＹＧＣ（クリスタリン、γＣ）、ＳＲＰ１４（シグナル認識粒子１４ｋＤａ（相同Ａｌｕ ＲＮＡ結合タンパク質））、ＣＲＹＧＢ（クリスタリン、γＢ）、ＰＤＣＤ１（プログラム細胞死１）、ＨＯＸＡ１（ホメオボックスＡ１）、ＡＴＸＮ２Ｌ（アタキシン２様）、ＰＭＳ２（ＰＭＳ２減数分裂後分離増加型２（Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）））、ＧＬＡ（ガラクトシダーゼ、α）、ＣＢＬ（Ｃａｓ−Ｂｒ−Ｍ（マウス）エコトロピックレトロウイルス形質転換配列）、ＦＴＨ１（フェリチン、ヘビーポリペプチド１）、ＩＬ１２ＲＢ２（インターロイキン１２受容体、β２）、ＯＴＸ２（オルトデンティクルホメオボックス２）、ＨＯＸＡ５（ホメオボックスＡ５）、ＰＯＬＧ２（ポリメラーゼ（ＤＮＡ指向性）、γ２、アクセサリーサブユニット）、ＤＬＸ２（ディスタルレスホメオボックス２）、ＳＩＲＰＡ（シグナル調節タンパク質α）、ＯＴＸ１（オルトデンティクルホメオボックス１）、ＡＨＲＲ（アリール炭化水素受容体リプレッサー）、ＭＡＮＦ（中脳星状細胞由来神経栄養因子）、ＴＭＥＭ１５８（膜貫通タンパク質１５８（遺伝子／偽遺伝子））、並びにＥＮＳＧ００００００７８６８７が挙げられる。

トリヌクレオチドリピート伸長障害に関連する好ましいタンパク質には、ＨＴＴ（ハンチンチン）、ＡＲ（アンドロゲン受容体）、ＦＸＮ（フラタキシン）、Ａｔｘｎ３（アタキシン）、Ａｔｘｎ１（アタキシン）、Ａｔｘｎ２（アタキシン）、Ａｔｘｎ７（アタキシン）、Ａｔｘｎ１０（アタキシン）、ＤＭＰＫ（筋強直性ジストロフィープロテインキナーゼ）、Ａｔｎ１（アトロフィン１）、ＣＢＰ（ｃｒｅｂ結合タンパク質）、ＶＬＤＬＲ（超低密度リポタンパク質受容体）、及びこれらの任意の組み合わせが含まれる。

別の態様によると、ＣＦＴＲ遺伝子の突然変異を有する対象を治療するための遺伝子治療方法が提供され、この方法は、治療的に有効な量のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ遺伝子療法粒子を、任意選択で生体適合性の医薬品担体を介して、対象の細胞に投与することを含む。好ましくは、標的ＤＮＡは突然変異ΔＦ５０８を含む。一般に、突然変異は野生型に対して修復されることが好ましい。この場合、突然変異は、５０８位におけるフェニルアラニン（Ｆ）のコドンを含む３つのヌクレオチドの欠失である。従って、この場合における修復は、欠損したコドンを突然変異体に再導入することが必要である。

この遺伝子修復戦略を実現するために、宿主細胞、細胞又は患者にアデノウイルス／ＡＡＶベクター系が導入されることが好ましい。好ましくは、この系は、Ｃａｓ９（又はＣａｓ９ニッカーゼ）及びガイドＲＮＡを、Ｆ５０８残基を含有する相同性修復鋳型を含むアデノウイルス／ＡＡＶベクター系と共に含む。これは、先に考察した送達方法の１つによって対象に導入され得る。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系はＣＦＴＲΔ５０８キメラガイドＲＮＡによりガイドされ得る。これは、ニッキング又は切断されるＣＦＴＲゲノム遺伝子座の特定の部位を標的にする。切断後、修復鋳型は、嚢胞性線維症をもたらす、又は嚢胞性線維症関連症状を引き起こす欠失を修正する相同組換ええによって切断部位に挿入される。適切なガイドＲＮＡでＣＲＩＳＰＲ系の送達を誘導し、その全身的な導入を提供するこの戦略を用いて、遺伝子突然変異を標的化して、表Ｂにあるような代謝、肝臓、腎臓及びタンパク質の疾患及び障害を引き起こす遺伝子を編集又は他の方法で操作することができる。

ゲノム編集
本発明のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使用して、これまでＴＡＬＥＮ及びＺＦＮを用いて試みられたが成功は限られていた遺伝子突然変異を修正することができる。例えば、デューク大学の公開出願である国際公開第２０１３１６３６２８Ａ２号パンフレット（突然変異遺伝子の遺伝子修正（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｕｔａｔｅｄ Ｇｅｎｅｓ））は、例えば、ジストロフィン遺伝子の突然変異に起因して筋肉変性を生じる劣性遺伝の致死性Ｘ連鎖性障害であるデュシェンヌ型筋ジストロフィー（「ＤＭＤ」）に関与するものなどの、ヌクレアーゼ媒介性非相同末端結合により修正可能な未成熟終止コドン及びトランケート型遺伝子産物を生じさせるフレームシフト突然変異を修正する試みを記載している。ＤＭＤを引き起こすジストロフィン突然変異の大多数はエクソンの欠失であり、これがリーディングフレームを破壊し、ジストロフィン遺伝子の中途での翻訳終結を引き起こす。ジストロフィンは、筋細胞の完全性及び機能の調節に関与する細胞膜のジストログリカン複合体に構造的安定性を提供する細胞質内のタンパク質である。本明細書において互換的に使用されるジストロフィン遺伝子又は「ＤＭＤ遺伝子」は、遺伝子座Ｘｐ２１において２．２メガベースである。一次転写は約２，４００ｋｂあり、成熟ｍＲＮＡは約１４ｋｂである。７９個のエクソンがタンパク質をコードし、このタンパク質は３５００アミノ酸を上回る。エクソン５１はＤＭＤ患者においてフレーム破壊（ｆｒａｍｅ−ｄｉｓｒｕｐｔｉｎｇ）欠失に隣接することが多く、オリゴヌクレオチドベースのエクソンスキッピングについての臨床試験において標的化されている。エクソン５１スキッピング化合物エテプリルセンに関する臨床試験は、最近になって、４８週間にわたる有意な機能上の利益を報告しており、ベースラインと比較して平均４７％のジストロフィン陽性線維であった。エクソン５１の突然変異は、理想的にはＮＨＥＪベースのゲノム編集による永久的な修正に適している。

ヒトジストロフィン遺伝子（ＤＭＤ）から標的配列を切断するためのメガヌクレアーゼ変異体に関する、Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓに譲渡された米国特許出願公開第２０１３０１４５４８７号明細書の方法も本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系のために改変され得る。

血液
また本発明はＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の血液への送達も企図する。

Ｗａｈｌｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１２，Ｖｏｌ．４０，Ｎｏ．１７ ｅ１３０）の血漿エキソソームを改変して、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系を血液へ送達することができる。

また本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系は、異常ヘモグロビン症、例えばサラセミア及び鎌状赤血球症を治療することも企図される。例えば、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系により標的化され得る潜在的標的については、国際公開第２０１３／１２６７９４号パンフレットが参照される。

Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓに譲渡された米国特許出願公開第２０１１０２２５６６４号明細書、同第２０１１００９１４４１号明細書、同第２０１００２２９２５２号明細書、同第２００９０２７１８８１号明細書及び同第２００９０２２２９３７号明細書は、ＣＲＥＩ変異体に関し、ここでは２つのＩ−ＣｒｅＩ単量体のうちの少なくとも一方が、Ｉ−ＣｒｅＩのそれぞれ２６位〜４０位及び４４位〜７７位に位置するＬＡＧＬＩＤＡＤＧコアドメインの２つの機能性サブドメインの各々に１つずつ、少なくとも２つの置換を有し、前記変異体は、共通サイトカイン受容体γ鎖遺伝子又はγＣ遺伝子とも呼ばれるヒトインターロイキン−２受容体γ鎖（ＩＬ２ＲＧ）遺伝子からＤＮＡ標的配列を切断することができる。米国特許出願公開第２０１１０２２５６６４号明細書、同第２０１１００９１４４１号明細書、同第２０１００２２９２５２号明細書、同第２００９０２７１８８１号明細書及び同第２００９０２２２９３７号明細書に同定される標的配列を、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に利用することができる。

重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）は、リンパ球Ｂの機能的欠陥を常に伴うリンパ球Ｔ成熟の欠陥により生じる（Ｃａｖａｚｚａｎａ−Ｃａｌｖｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．，２００５，５６，５８５−６０２；Ｆｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，２００５，２０３，９８−１０９）。全発生率は出生７万５０００人につき１人と推定される。未治療のＳＣＩＤ患者は多重日和見微生物感染を起こし易く、概して１年を超えて生きることはない。ＳＣＩＤは、家族ドナーからの同種造血幹細胞移植によって治療することができる。ドナーとの組織適合性は幅広く異なり得る。ＳＣＩＤ形態の１つであるアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損症の場合、患者は組換えアデノシンデアミナーゼ酵素の注射によって治療することができる。

ＳＣＩＤ患者ではＡＤＡ遺伝子が突然変異することが明らかになって以来（Ｇｉｂｌｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，１９７２，２，１０６７−１０６９）、ＳＣＩＤに関与するいくつかの他の遺伝子が同定されている（Ｃａｖａｚｚａｎａ−Ｃａｌｖｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．，２００５，５６，５８５−６０２；Ｆｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，２００５，２０３，９８−１０９）。ＳＣＩＤには４つの主要な原因がある：（ｉ）最も高頻度の形態のＳＣＩＤ、ＳＣＩＤ−Ｘ１（Ｘ連鎖ＳＣＩＤ又はＸ−ＳＣＩＤ）はＩＬ２ＲＧ遺伝子の突然変異により引き起こされ、成熟Ｔリンパ球及びＮＫ細胞が存在しなくなる。ＩＬ２ＲＧは、少なくとも５つのインターロイキン受容体複合体に共通する構成成分であるγＣタンパク質をコードする（Ｎｏｇｕｃｈｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１９９３，７３，１４７−１５７）。これらの受容体はＪＡＫ３キナーゼを介していくつかの標的を活性化し（Ｍａｃｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９５，３７７，６５−６８）、その不活性化はγＣ不活性化と同じ症候群をもたらす；（ｉｉ）ＡＤＡ遺伝子の突然変異は、リンパ球前駆細胞にとって致死的なプリン代謝の欠損をもたらし、ひいてはＢ、Ｔ及びＮＫ細胞がほぼ存在しないことになる；（ｉｉｉ）Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えは、免疫グロブリン及びＴリンパ球受容体（ＴＣＲ）の成熟に必須のステップである。このプロセスに関与する３つの遺伝子、組換え活性化遺伝子１及び２（ＲＡＧ１及びＲＡＧ２）及びＡｒｔｅｍｉｓの突然変異は、成熟Ｔ及びＢリンパ球の欠如をもたらす；及び（ｉｖ）ＣＤ４５など、Ｔ細胞特異的シグナル伝達に関与する他の遺伝子の突然変異もまた報告されているが、それらは少数例に相当する（Ｃａｖａｚｚａｎａ−Ｃａｌｖｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．，２００５，５６，５８５−６０２；Ｆｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，２００５，２０３，９８−１０９）。

その遺伝的基礎が特定されて以来、主に２つの理由でこれらの種々のＳＣＩＤ形態が遺伝子療法手法のパラダイムとなっている（Ｆｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，２００５，２０３，９８−１０９）。第１に、全ての血液疾患と同様に、ｅｘ ｖｉｖｏ治療が想定される。造血幹細胞（ＨＳＣ）は骨髄から回収し、数回の細胞分裂にわたりその多能性特性を保つことができる。従って、ＨＳＣはｉｎ ｖｉｔｒｏで処理し、次に患者に再注入することができ、ＨＳＣは骨髄で再増殖する。第２に、ＳＣＩＤ患者ではリンパ球の成熟が損なわれているため、修正された細胞が選択的優位性を有する。従って、少数の修正された細胞が機能性の免疫系を回復することができる。この仮説は、（ｉ）ＳＣＩＤ患者における突然変異の復帰に伴う免疫機能の部分的回復（Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９６，１３，２９０−２９５；Ｓｔｅｐｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，１９９６，３３５，１５６３−１５６７；Ｂｏｕｓｓｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２０００，９７，２７４−２７８；Ｗａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００１，９８，８６９７−８７０２；Ｎｉｓｈｉｋｏｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２００４，１０３，４５６５−４５７２）、（ｉｉ）造血細胞におけるｉｎ ｖｉｔｒｏでのＳＣＩＤ−Ｘ１欠損の修正（Ｃａｎｄｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１９９６，８７，３０９７−３１０２；Ｃａｖａｚｚａｎａ−Ｃａｌｖｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１９９６，Ｂｌｏｏｄ，８８，３９０１−３９０９；Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１９９６，８７，３１０３−３１０７；Ｈａｃｅｉｎ−Ｂｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１９９８，９２，４０９０−４０９７）、（ｉｉｉ）動物モデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏでのＳＣＩＤ−Ｘ１（Ｓｏｕｄａｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２０００，９５，３０７１−３０７７；Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２００２，１００，７２−７９）、ＪＡＫ−３（Ｂｕｎｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１９９８，４，５８−６４；Ｂｕｎｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，２０００，１１，２３５３−２３６４）及びＲＡＧ２（Ｙａｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２００２，１００，３９４２−３９４９）欠損の修正により、及び（ｉｖ）遺伝子療法臨床試験の結果により（Ｃａｖａｚｚａｎａ−Ｃａｌｖｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０００，２８８，６６９−６７２；Ａｉｕｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，２００２；８，４２３−４２５；Ｇａｓｐａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，２００４，３６４，２１８１−２１８７）、数回にわたり検証された。

Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ及びＰｒｅｓｉｄｅｎｔ ａｎｄ Ｆｅｌｌｏｗｓ ｏｆ Ｈａｒｖａｒｄ Ｃｏｌｌｅｇｅに譲渡された米国特許出願公開第２０１１０１８２８６７号明細書は、ＲＮＡｉ及び抗体などの、ＢＣＬ１１Ａ発現又は活性の阻害剤によって造血前駆細胞における胎児ヘモグロビン発現（ＨｂＦ）を調節する方法及び使用に関する。米国特許出願公開第２０１１０１８２８６７号明細書に開示される標的、例えばＢＣＬ１１Ａは、胎児ヘモグロビン発現を調節するため本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系によって標的化し得る。さらなるＢＣＬ１１Ａ標的に関しては、Ｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ １１ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１３：Ｖｏｌ．３４２ ｎｏ．６１５５ ｐｐ．２５３−２５７）及びＸｕ ｅｔ ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ １８ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２０１１：Ｖｏｌ．３３４ ｎｏ．６０５８ ｐｐ．９９３−９９６）も参照のこと。

耳
本発明はまた、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を一方又は両方の耳に送達することも企図する。研究者は、遺伝子療法を用いて現在の難聴治療、即ち人工内耳を補助し得るかどうかを調べている。難聴は多くの場合に、有毛細胞が失われ又は損傷して信号を聴覚ニューロンに中継できないために引き起こされる。その場合、人工内耳を使用して音に反応し、電気信号を神経細胞に伝達し得る。しかしこれらのニューロンは、多くの場合に、損なわれた有毛による成長因子の放出が減ることに伴い変性し、蝸牛から後退している。米国特許出願公開第２０１２０３２８５８０号明細書は、シリンジ、例えば単回投与シリンジを例えば使用した、医薬組成物の耳への注入（例えば、耳介投与）、例えば蝸牛の管腔（例えば、中央階、前庭階、及び鼓室階）への注入に関連している。例えば、本明細書に記載される化合物の１つ以上を、鼓室内注入により（例えば中耳に）、及び／又は外耳、中耳、及び／又は内耳への注入により投与することができる。かかる方法は当該技術分野では常法として、例えばヒト耳に対するステロイド及び抗生物質の投与に用いられている。注入は、例えば、耳の正円窓からであっても、又は蝸牛嚢からであってもよい。当該技術分野において知られているこれら及び他の内耳投与方法（例えば、Ｓａｌｔ ａｎｄ Ｐｌｏｎｔｋｅ，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ，１０：１２９９−１３０６，２００５を参照）も本発明の実施に適合させることができる。

別の投与方法では、医薬組成物はカテーテル又はポンプを用いてインサイチュ投与することができる。カテーテル又はポンプは、例えば、医薬組成物を蝸牛管腔又は耳の正円窓及び／又は結腸の管腔に送り込むことができる。本明細書に記載される化合物の１つ以上を耳、例えばヒトの耳に投与するのに好適な例示的薬物送達器具及び方法が、ＭｃＫｅｎｎａ ｅｔ ａｌ．（米国特許出願公開第２００６／００３０８３７号明細書）及びＪａｃｏｂｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（米国特許第７，２０６，６３９号明細書）によって記載されている。一部の実施形態では、カテーテル又はポンプは外科手技中に例えば患者の耳（例えば、外耳、中耳、及び／又は内耳）に配置され得る。一部の実施形態では、カテーテル又はポンプは外科手技を必要とすることなく例えば患者の耳（例えば、外耳、中耳、及び／又は内耳）に配置され得る。これらの技術は、本発明の実施において適合され得る。

それに代えて又は加えて、本明細書に記載される化合物の１つ以上は、人工内耳又は補聴器などの、外耳に装着される機械的装置と組み合わせて投与することができる。本発明で使用するのに好適な例示的人工内耳が、Ｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ．（米国特許出願公開第２００７／００９３８７８号明細書）によって記載されている。一部の実施形態では、上記に記載する投与方法はいずれの順序で組み合わせてもよく、同時であっても又は分散させてもよい。それに代えて又は加えて、本発明は、例えばＣＤＥＲ Ｄａｔａ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｍａｎｕａｌ、第００４版（ｆｄａ．ｇｉｖｅ／ｃｄｅｒ／ｄｓｍ／ＤＲＧ／ｄｒｇ００３０１．ｈｔｍにおいて利用可能）に記載されるとおりの、食品医薬品局（Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）によって承認された方法のいずれかに従い投与されてもよい。

一般に、米国特許出願公開第２０１２０３２８５８０号明細書に記載される細胞治療方法を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで内耳の成熟細胞型（例えば有毛細胞）となる又はそれに向けた細胞の完全な又は部分的な分化を促進することができる。かかる方法によって得られる細胞を、次にかかる治療を必要とする患者に移植し又は植え込むことができる。このような方法を実施するために必要な細胞培養方法について、好適な細胞型の同定及び選択方法、選択された細胞の完全な又は部分的な分化を促進する方法、完全な又は部分的に分化した細胞型を同定する方法、及び完全な又は部分的に分化した細胞を植え込む方法を含め、本発明の実施において適合させることができる。

本発明での使用に好適な細胞としては、限定はされないが、本明細書に記載される化合物の１つ以上と例えばｉｎ ｖｉｔｒｏで接触させたときに、内耳の成熟細胞、例えば有毛細胞（例えば内有毛細胞及び／又は外有毛細胞）に完全に又は部分的に分化する能力を有する細胞が挙げられる。有毛細胞に分化する能力を有する例示的細胞としては、限定はされないが、幹細胞（例えば、内耳幹細胞、成体幹細胞、骨髄由来幹細胞、胚性幹細胞、間葉系幹細胞、皮膚幹細胞、ｉＰＳ細胞、及び脂肪由来幹細胞）、前駆細胞（例えば、内耳前駆細胞）、支持細胞（例えば、ダイテルス細胞、柱細胞、内指節細胞、視蓋細胞及びヘンゼン細胞）、及び／又は生殖細胞が挙げられる。内耳感覚細胞を補充するための幹細胞の使用が、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（米国特許出願公開第２００５／０２８７１２７号明細書）及びＬｉ ｅｔ ａｌ．（米国特許出願第１１／９５３，７９７号明細書）に記載されている。内耳感覚細胞を補充するための骨髄由来幹細胞の使用が、Ｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ．、ＰＣＴ／米国特許出願公開第２００７／０８４６５４号明細書に記載されている。ｉＰＳ細胞については、例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌｕｍｅ １３１，Ｉｓｓｕｅ ５，Ｐａｇｅｓ ８６１−８７２（２００７）；Ｔａｋａｈａｓｈｉ ａｎｄ Ｙａｍａｎａｋａ，Ｃｅｌｌ １２６，６６３−７６（２００６）；Ｏｋｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４４８，２６０−２６２（２００７）；Ｙｕ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８（５８５８）：１９１７−１９２０（２００７）；Ｎａｋａｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：１０１−１０６（２００８）；及びＺａｅｈｒｅｓ ａｎｄ Ｓｃｈｏｌｅｒ，Ｃｅｌｌ １３１（５）：８３４−８３５（２００７）に記載されている。

かかる好適な細胞は、１つ以上の組織特異的遺伝子の存在を（例えば定性的に又は定量的に）分析することにより同定し得る。例えば、１つ以上の組織特異的遺伝子のタンパク質産物を検出することにより、遺伝子発現を検出し得る。タンパク質検出技術には、適切な抗原に対する抗体を使用してタンパク質を（例えば細胞抽出物又は全細胞を使用して）染色することが含まれる。この場合、適切な抗原は、組織特異的遺伝子発現のタンパク質産物である。原則的には一次抗体（即ち、抗原と結合する抗体）を標識し得るが、一次抗体を標的とする二次抗体（例えば抗ＩｇＧ）を使用することがより一般的である（そして可視化が向上する）。この二次抗体は、蛍光色素とコンジュゲートされるか、或いは適切な酵素と比色反応用に、又は金ビーズ（電子顕微鏡法用に）、又はビオチン−アビジン系とコンジュゲートされ、これにより一次抗体、ひいては抗原の位置を認識できるようになる。

本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ分子は、米国特許出願公開第２０１１０１４２９１７号明細書から改良される組成物によって、医薬組成物を外耳に直接適用することにより耳に送達し得る。一部の実施形態では医薬組成物は外耳道に適用される。耳への送達は、耳送達（ａｕｒａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）又は耳送達（ｏｔｉｃ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）とも称され得る。

一部の実施形態では、本発明のＲＮＡ分子はリポソーム製剤又はリポフェクチン製剤などで送達され、当業者に周知の方法によって調製され得る。かかる方法は、例えば、米国特許第５，５９３，９７２号明細書、同第５，５８９，４６６号明細書及び同第５，５８０，８５９号明細書（これらは本明細書において参照により組み込まれる）に記載されている。

哺乳類細胞に対するｓｉＲＮＡの送達の亢進及び向上を特に目標とする送達系が開発されており（例えば、Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ ＦＥＢＳ Ｌｅｔ．２００３，５３９：１１１−１１４；Ｘｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２００２，２０：１００６−１０１０；Ｒｅｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｖｉｓｉｏｎ．２００３，９：２１０−２１６；Ｓｏｒｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００３，３２７：７６１−７６６；Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎ．２００２，３２：１０７−１０８及びＳｉｍｅｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，ＮＡＲ ２００３，３１，１１：２７１７−２７２４を参照のこと）、本発明に適用し得る。ｓｉＲＮＡは、最近、霊長類において遺伝子発現を阻害するための使用が成功している（例えばＴｏｌｅｎｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｔｉｎａ ２４（４）：６６０を参照されたく、これもまた本発明に適用することができる。

Ｑｉ ｅｔ ａｌ．は、タンパク質による（ｐｒｏｔｅｉｄｉｃ）新規送達技術によるインタクトな正円窓からの内耳に対する効率的なｓｉＲＮＡトランスフェクション方法を扱っており、これは本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に適用し得る（例えば、Ｑｉ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２０１３），１−９を参照のこと）。詳細には、ＴＡＴ二本鎖ＲＮＡ結合ドメイン（ＴＡＴ−ＤＲＢＤ）が（これは、内耳（例えば内有毛細胞及び外有毛細胞）、膨大部稜、卵形嚢斑及び球形嚢斑の細胞にＣｙ３標識ｓｉＲＮＡを、インタクトな正円窓を介した透過によってトランスフェクトすることができる）、種々の内耳の病気を治療し及び聴覚機能を維持するのための二本鎖ｓｉＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ送達に成功している。約４０μｌの１０ｍＭ ＲＮＡが、耳への投与についての投薬量として企図され得る。

Ｒｅｊａｌｉ ｅｔ ａｌ．（Ｈｅａｒ Ｒｅｓ．２００７ Ｊｕｎ；２２８（１−２）：１８０−７）によれば、インプラントによる電気刺激の標的であるらせん神経節ニューロンの良好な維持により人工内耳機能を改善することができ、実験的に聴覚を奪った耳において脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）がらせん神経節生存を増強することが以前示されている。Ｒｅｊａｌｉ ｅｔ ａｌ．は、ＢＤＮＦ遺伝子インサートを有するウイルスベクターによって形質導入された線維芽細胞のコーティングを含む改良型設計の人工内耳電極を試験した。この種のｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子導入を達成するため、Ｒｅｊａｌｉ ｅｔ ａｌ．は、ＢＤＮＦ遺伝子カセットインサートを有するアデノウイルスをモルモット線維芽細胞に形質導入し、これらの細胞がＢＤＮＦを分泌したことを決定し、次にアガロースゲルでＢＤＮＦ分泌細胞を人工内耳電極に取り付けて、その電極を鼓室階に植え込んだ。Ｒｅｊａｌｉ ｅｔ ａｌ．は、このＢＤＮＦを発現する電極が、植え込みの４８日後に対照電極と比較したとき有意に多いらせん神経節ニューロンを蝸牛の基底回転部に維持可能であったことを決定し、らせん神経節ニューロンの生存を増強するため人工内耳療法をｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子導入と組み合わせることの実現可能性を実証した。かかる系は、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系の耳への送達に適用することができる。

Ｍｕｋｈｅｒｊｅａ ｅｔ ａｌ．（Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ＆Ｒｅｄｏｘ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅ １３，Ｎｕｍｂｅｒ ５，２０１０）は、損傷からのＯＨＣの保護及び聴性脳幹反応（ＡＢＲ）における閾値シフトの低下から明らかなとおり、低分子干渉（ｓｉ）ＲＮＡを使用したＮＯＸ３のノックダウンがシスプラチン中毒性難聴を解消したことを報告している。種々の用量のｓｉＮＯＸ３（０．３、０．６、及び０．９μｇ）がラットに投与され、ＮＯＸ３発現がリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって評価された。用いられた最も低い用量（０．３μｇ）のＮＯＸ３ ｓｉＲＮＡは、スクランブルｓｉＲＮＡ又は未治療の蝸牛の経鼓室投与と比較したときＮＯＸ３ ｍＲＮＡのいかなる阻害も示さなかった。しかしながら、より高用量のＮＯＸ３ ｓｉＲＮＡ（０．６及び０．９μｇ）の投与は、対照のスクランブルｓｉＲＮＡと比較してＮＯＸ３発現を低下させた。かかる系は、ヒトに対する投与に関して約２ｍｇ〜約４ｍｇのＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓの投薬量による経鼓室投与について本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に適用し得る。

Ｊｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．２１ ｎｏ．４，８３４−８４１ ａｐｒ．２０１３）は、卵形嚢におけるＨｅｓ５レベルがｓｉＲＮＡの適用後に低下したこと、及びそれらの卵形嚢における有毛細胞の数が対照治療後と比べて有意に多かったことを実証している。このデータは、ｓｉＲＮＡ技術が内耳における修復及び再生の誘導に有用であり得ること、及びＮｏｔｃｈシグナル伝達経路が特異的遺伝子発現阻害に潜在的に有用な標的であることを示唆している。Ｊｕｎｇ ｅｔ ａｌ．は、凍結乾燥したｓｉＲＮＡに滅菌通常生理食塩水を添加することにより調製した２μｌ容積の８μｇのＨｅｓ５ ｓｉＲＮＡを、耳の前庭上皮に注入した。このような系は、ヒトに対する投与に関して約１〜約３０ｍｇのＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓの投薬量による耳の前庭上皮への投与について本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に適用し得る。

眼
本発明はまた、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を一方又は両方の眼に送達することも企図する。本発明のさらに別の態様では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を使用して、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｙｅ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，編者Ｅｌｉａｓ Ｉ．Ｔｒａｂｏｕｌｓｉ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０１２にさらに記載されるいくつかの遺伝子突然変異により生じる眼の異常が修正され得る。眼への投与には、レンチウイルスベクター、詳細にはウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）が特に好ましい。別の実施形態において、特に眼の遺伝子療法に対して、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）をベースとする最小非霊長類レンチウイルスベクターもまた企図される（例えば、Ｂａｌａｇａａｎ，Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ ２００６；８：２７５−２８５，２００５年１１月２１日オンライン発行，Ｗｉｌｅｙ ＩｎｔｅｒＳｃｉｅｎｃｅ（ｗｗｗ．ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ．ｗｉｌｅｙ．ｃｏｍ）．ＤＯＩ：１０．１００２／ｊｇｍ．８４５を参照のこと）。ベクターは、標的遺伝子の発現を駆動するサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを有することが企図される。前房内、網膜下、眼内及び硝子体内注射は全て企図される（例えば、Ｂａｌａｇａａｎ，Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ ２００６；８：２７５−２８５，２００５年１１月２１日オンライン発行，Ｗｉｌｅｙ ＩｎｔｅｒＳｃｉｅｎｃｅ（ｗｗｗ．ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ．ｗｉｌｅｙ．ｃｏｍ）．ＤＯＩ：１０．１００２／ｊｇｍ．８４５を参照のこと）。眼内注射は手術用顕微鏡の助けを借りて実施される。網膜下注射及び硝子体内注射に関しては、指で軽く押すことにより眼を脱出させ、ガラス製顕微鏡スライドカバースリップで覆った角膜上の一滴の伝播媒質溶液からなるコンタクトレンズ系を使用して眼底を可視化してもよい。網膜下注射に関しては、５μｌ Ｈａｍｉｌｔｏｎシリンジに取り付けられた１０ｍｍの３４ゲージ針の先端を、直接可視化しながら、網膜下腔に針の孔が見えるまで上方赤道強膜から接線方向に後極に向かって進めてもよい。次に、２μｌのベクター懸濁液を注入して上方胞状網膜剥離を生じさせ、そのようにして網膜下ベクター投与を確認し得る。この手法は自己閉鎖創強膜切開を作り出し、ベクター懸濁液がＲＰＥによって通常手技の４８時間以内に吸収されるまで網膜下腔に維持されることを可能にする。この手順を下半球に繰り返して下方網膜剥離を生じさせてもよい。この技法により、感覚神経網膜及びＲＰＥの約７０％がベクター懸濁液に曝露されることになる。硝子体内注射に関しては、針の先端を角膜強膜縁の１ｍｍ後方の強膜から進め、２μｌのベクター懸濁液を硝子体腔に注入してもよい。前房内注射に関しては、針の先端を角膜強膜縁穿刺によって進め、角膜中央部に向かって送り、及び２μｌのベクター懸濁液を注入してもよい。前房内注射に関しては、針の先端を角膜強膜縁穿刺によって進め、角膜中央部に向かって送り、及び２μｌのベクター懸濁液を注入してもよい。これらのベクターは１．０〜１．４×１０^１０又は１．０〜１．４×１０^９形質導入単位（ＴＵ）／ｍｌのいずれかの力価で注入され得る。別の実施形態において、湿潤型（ｗｅｂ ｆｏｒｍ）の加齢性黄斑変性症の治療に対する網膜下注入によって送達される血管新生抑制タンパク質エンドスタチン（ｅｎｄｏｓｔａｉｎ）及びアンジオスタチンを発現するウマ伝染性貧血ウイルスベースのレンチウイルス遺伝子治療ベクターであるＲｅｔｉｎｏＳｔａｔ（登録商標）もまた企図される（例えば、Ｂｉｎｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，ＨＵＭＡＮ ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＹ ２３：９８０−９９１（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１２）を参照のこと）。かかるベクターを本発明のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系用に改良し得る。各眼につき１．１×１０^５形質導入単位（ＴＵ／眼）の用量、総容積１００μｌのＲｅｔｉｎｏＳｔａｔ（登録商標）で各眼を治療し得る。

別の実施形態において、眼への送達にＥ１欠失、部分的Ｅ３欠失、Ｅ４欠失アデノウイルスベクターが企図され得る。２８人の進行性新生血管加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）患者に、ヒト色素上皮由来因子を発現するＥ１欠失、部分的Ｅ３欠失、Ｅ４欠失アデノウイルスベクター（ＡｄＰＥＤＦ．ｌｌ）の単回硝子体内注射が投与された（例えば、Ｃａｍｐｏｃｈｉａｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １７：１６７−１７６（Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２００６）を参照のこと）。１０^６〜１０^９．５粒子単位（ＰＵ）の範囲の用量が調べられ、ＡｄＰＥＤＦ．ｌｌに関連する重篤な有害事象及び用量制限毒性はなかった（例えば、Ｃａｍｐｏｃｈｉａｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １７：１６７−１７６（Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２００６）を参照のこと）。アデノウイルスベクター媒介性眼内遺伝子導入は、眼障害の治療に実行可能な手法であるものと見られ、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に適用し得る。

別の実施形態では、ＲＸｉ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓのｓｄ−ｒｘＲＮＡ（登録商標）系を、眼に対するＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓの送達に使用し及び／又は適合させることができる。この系では、３μｇのｓｄ−ｒｘＲＮＡの単回硝子体内投与が、１４日間にわたりＰＰＩＢ ｍＲＮＡレベルの配列特異的低下をもたらす。ｓｄ−ｒｘＲＮＡ（登録商標）系は、ヒトに約３〜２０ｍｇのＣＲＩＳＰＲの用量を投与することを企図して本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に適用し得る。

Ｍｉｌｌｉｎｇｔｏｎ−Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１９ ｎｏ．４，６４２−６４９ ａｐｒ．２０１１）は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）に基づくロドプシン抑制因子と、ＲＮＡｉ標的部位にわたる縮重位置のヌクレオチド変化に起因して抑制に抵抗性のコドン改変ロドプシン置換遺伝子とを送達するためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを記載する。６．０×１０^８ｖｐ又は１．８×１０^１０ｖｐ ＡＡＶのいずれかの注射が、Ｍｉｌｌｉｎｇｔｏｎ−Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．により眼内に網膜下注射された。Ｍｉｌｌｉｎｇｔｏｎ−Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．のＡＡＶベクターは、ヒトに約２×１０^１１〜約６×１０^１３ｖｐの用量を投与することを企図して本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に適用し得る。これらの技術は、本発明の実施において適合され得る。

別の実施形態において、網膜色素変性症（ＲＰ）の治療にロドプシン遺伝子が標的化されてもよく、ここではＳａｎｇａｍｏ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許出願公開第２０１２０２０４２８２号明細書の系を、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に従い改良し得る。別の実施形態において、Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓに譲渡された、ヒトロドプシン遺伝子から標的配列を切断する方法に関する米国特許出願公開第２０１３０１８３２８２号明細書の方法もまた、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に合わせて改良し得る。Ａｃａｄｅｍｉａ Ｓｉｎｉｃａに譲渡された米国特許出願公開第２０１３０２０２６７８号明細書は、Ｐｕｆ−Ａ遺伝子（これは網膜神経節細胞及び眼組織の色素含有細胞で発現し、ユニークな抗アポトーシス活性を示す）を眼の網膜下腔又は硝子体内腔に送達することに関する網膜症及び視力を脅かす眼科学的障害の治療方法に関する。詳細には、望ましい標的は、ｚｇｃ：１９３９３３、ｐｒｄｍ１ａ、ｓｐａｔａ２、ｔｅｘ１０、ｒｂｂ４、ｄｄｘ３、ｚｐ２．２、Ｂｌｉｍｐ−１及びＨｔｒＡ２であり、これらは全て、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系により標的化し得る。Ｗｕ（Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，１３：６５９−６２，２０１３）は、マウスにおいて白内障を引き起こす単一塩基対突然変異にＣａｓ９を導くガイドＲＮＡを設計し、そこでＣａｓ９がＤＮＡ切断を誘導した。次に接合体修復機構に提供される他の野生型アレル又はオリゴのいずれかを使用して、変異マウスにおける壊れたアレルの配列が修正され、かつ白内障を引き起こす遺伝的欠陥が修正された。これは、本発明の実施において適合され得る。米国特許出願公開第２０１２０１５９６５３号明細書は、ジンクフィンガーヌクレアーゼを使用した黄斑変性症（ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｒａｔｉｏｎ）（ＭＤ）に関連する細胞、動物及びタンパク質の遺伝的改変を記載する。黄斑変性症（ＭＤ）は、高齢者における視力障害の主な原因であるが、また、スタルガルト病、ソーズビー眼底、及び致死性小児神経変性疾患などの、発症年齢が乳児期という若さである小児期疾患の顕著な症状でもある。黄斑変性症は網膜の損傷が原因となって視野中心（斑）の視力喪失をもたらす。現行の既存の動物モデルは、ヒトで観察されるとおりのこの疾患の主要な特徴を再現しない。ＭＤに関連するタンパク質をコードする突然変異遺伝子を含む利用可能な動物モデルはまた、極めて可変的な表現型も生じ、ヒト疾患に対する解釈及び治療法開発は困難となっている。米国特許出願公開第２０１２０１５９６５３号明細書の一態様は、ＭＤに関連するタンパク質をコードする任意の染色体配列を編集することに関し、これは本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に適用し得る。ＭＤに関連するタンパク質は、典型的にはＭＤに関連するタンパク質とＭＤ障害との実験的関連性に基づき選択される。例えば、ＭＤ障害を有する集団では、ＭＤ障害を有しない集団と比べて、ＭＤに関連するタンパク質の産生速度又は循環中濃度が上昇又は低下し得る。タンパク質レベルの差は、限定はされないが、ウエスタンブロット、免疫組織化学染色、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、及び質量分析を含むプロテオミクス技術を用いて評価し得る。或いは、ＭＤに関連するタンパク質は、限定はされないが、ＤＮＡマイクロアレイ解析、遺伝子発現連鎖解析（ＳＡＧＥ）、及び定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）を含むゲノミクス技術を用いて、それらのタンパク質をコードする遺伝子の遺伝子発現プロファイルを得ることにより同定し得る。非限定的な例として、ＭＤに関連するタンパク質としては、限定はされないが以下のタンパク質が挙げられる：（ＡＢＣＡ４）ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＡ（ＡＢＣ１）、メンバー４ ＡＣＨＭ１色覚異常（杆体一色型色覚異常）１ ＡｐｏＥ アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ） Ｃ１ＱＴＮＦ５（ＣＴＲＰ５） Ｃ１ｑ及び腫瘍壊死因子関連タンパク質５（Ｃ１ＱＴＮＦ５） Ｃ２ 補体成分２（Ｃ２） Ｃ３ 補体成分（Ｃ３） ＣＣＬ２ ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２（ＣＣＬ２） ＣＣＲ２ ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体２（ＣＣＲ２） ＣＤ３６ 表面抗原分類３６ ＣＦＢ 補体因子Ｂ ＣＦＨ 補体因子ＣＦＨ Ｈ ＣＦＨＲ１ 補体因子Ｈ関連１ ＣＦＨＲ３ 補体因子Ｈ関連３ ＣＮＧＢ３ 環状ヌクレオチド開口チャネルβ３ ＣＰ セルロプラスミン（ＣＰ） ＣＲＰ Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ） ＣＳＴ３ シスタチンＣ又はシスタチン３（ＣＳＴ３） ＣＴＳＤ カテプシンＤ（ＣＴＳＤ） ＣＸ３ＣＲ１ ケモカイン（Ｃ−Ｘ３−Ｃモチーフ）受容体１ ＥＬＯＶＬ４ 極長鎖脂肪酸の伸長４ ＥＲＣＣ６ 除去修復交差相補げっ歯類修復欠損、相補群６ ＦＢＬＮ５ フィビュリン５ ＦＢＬＮ５ フィビュリン５ ＦＢＬＮ６ フィビュリン６ ＦＳＣＮ２ ファスシン（ＦＳＣＮ２） ＨＭＣＮ１ ヘミセンチン（Ｈｅｍｉｃｅｎｔｒｉｎ）１ ＨＭＣＮ１ ヘミセンチン１ ＨＴＲＡ１ ＨｔｒＡセリンペプチダーゼ１（ＨＴＲＡ１） ＨＴＲＡ１ ＨｔｒＡセリンペプチダーゼ１ ＩＬ−６ インターロイキン６ ＩＬ−８ インターロイキン８ ＬＯＣ３８７７１５仮定タンパク質 ＰＬＥＫＨＡ１ プレクストリン相同ドメイン含有ファミリーＡメンバー１（ＰＬＥＫＨＡ１） ＰＲＯＭ１ プロミニン１（ＰＲＯＭ１又はＣＤ１３３） ＰＲＰＨ２ ペリフェリン−２ ＲＰＧＲ 網膜色素変性症ＧＴＰアーゼ調節因子 ＳＥＲＰＩＮＧ１ セルピンペプチダーゼ阻害因子、クレードＧ、メンバー１（Ｃ１−阻害因子） ＴＣＯＦ１ トリークル（Ｔｒｅａｃｌｅ） ＴＩＭＰ３ メタロプロテイナーゼ阻害因子３（ＴＩＭＰ３） ＴＬＲ３ Ｔｏｌｌ様受容体３。染色体配列が編集されるＭＤ関連タンパク質のアイデンティティは様々であってよく、かつ様々となる。好ましい実施形態において、染色体配列が編集されるＭＤ関連タンパク質に関して適用されるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、ＡＢＣＲ遺伝子によりコードされるＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＡ（ＡＢＣ１）メンバー４タンパク質（ＡＢＣＡ４）、ＡＰＯＥ遺伝子によりコードされるアポリポタンパク質Ｅタンパク質（ＡＰＯＥ）、ＣＣＬ２遺伝子によりコードされるケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２タンパク質（ＣＣＬ２）、ＣＣＲ２遺伝子によりコードされるケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体２タンパク質（ＣＣＲ２）、ＣＰ遺伝子によりコードされるセルロプラスミンタンパク質（ＣＰ）、ＣＴＳＤ遺伝子によりコードされるカテプシンＤタンパク質（ＣＴＳＤ）、又はＴＩＭＰ３遺伝子によりコードされるメタロプロテイナーゼ阻害因子３タンパク質（ＴＩＭＰ３）であり得る。例示的実施形態において、遺伝子改変を受ける動物はラットであり、及びＭＤ関連タンパク質をコードする編集される染色体配列は以下であり得る：（ＡＢＣＡ４）ＡＴＰ結合カセット、ＮＭ＿０００３５０ サブファミリーＡ（ＡＢＣ１）、メンバー４ ＡＰＯＥ アポリポタンパク質Ｅ ＮＭ＿１３８８２８（ＡＰＯＥ） ＣＣＬ２ケモカイン（Ｃ−Ｃ ＮＭ＿０３１５３０モチーフ）リガンド２（ＣＣＬ２） ＣＣＲ２ケモカイン（Ｃ−Ｃ ＮＭ＿０２１８６６モチーフ）受容体２（ＣＣＲ２） ＣＰ セルロプラスミン（ＣＰ） ＮＭ＿０１２５３２ ＣＴＳＤ カテプシンＤ（ＣＴＳＤ） ＮＭ＿１３４３３４ ＴＩＭＰ３メタロプロテイナーゼ ＮＭ＿０１２８８６ 阻害因子３（ＴＩＭＰ３）。動物又は細胞は、ＭＤ関連タンパク質をコードする１、２、３、４、５、６、７個又はそれ以上の破壊された染色体配列及び破壊されたＭＤ関連タンパク質をコードする０、１、２、３、４、５、６、７個又はそれ以上の染色体に組み込まれた配列を含み得る。編集され又は組み込まれる染色体配列は、変化したＭＤ関連タンパク質をコードするように改変され得る。ＭＤ関連染色体配列におけるいくつかの突然変異がＭＤと関連付けられている。ＭＤに関連する染色体配列における突然変異の非限定的な例としては、ＡＢＣＲタンパク質における、Ｅ４７１Ｋ（即ち４７１位のグルタミン酸がリジンに変わる）、Ｒ１１２９Ｌ（即ち１１２９位のアルギニンがロイシンに変わる）、Ｔ１４２８Ｍ（即ち１４２８位のスレオニンがメチオニンに変わる）、Ｒ１５１７Ｓ（即ち１５１７位のアルギニンがセリンに変わる）、Ｉ１５６２Ｔ（即ち１５６２位のイソロイシンがスレオニンに変わる）、及びＧ１５７８Ｒ（即ち１５７８位のグリシンがアルギニンに変わる）；ＣＣＲ２タンパク質における、Ｖ６４Ｉ（即ち１９２位のバリンがイソロイシンに変わる）；ＣＰタンパク質における、Ｇ９６９Ｂ（即ち９６９位のグリシンがアスパラギン又はアスパラギン酸に変わる）；ＴＩＭＰ３タンパク質における、Ｓ１５６Ｃ（即ち１５６位のセリンがシステインに変わる）、Ｇ１６６Ｃ（即ち１６６位のグリシンがシステインに変わる）、Ｇ１６７Ｃ（即ち１６７位のグリシンがシステインに変わる）、Ｙ１６８Ｃ（即ち１６８位のチロシンがシステインに変わる）、Ｓ１７０Ｃ（即ち１７０位のセリンがシステインに変わる）、Ｙ１７２Ｃ（即ち１７２位のチロシンがシステインに変わる）及びＳ１８１Ｃ（即ち１８１位のセリンがシステインに変わる）を含めた、ＭＤを引き起こすものが挙げられる。ＭＤ関連遺伝子及び疾患における遺伝的変異の他の関連性は当該技術分野において公知であり、例えば突然変異を修正するために、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系に関する標的とすることができる。

心臓
本発明はまた、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を心臓に送達することも企図する。心臓に関しては、心筋向性アデノ随伴（ａｄｅｎａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）ウイルス（ＡＡＶＭ）、詳細には心臓で優先的遺伝子導入を示したＡＡＶＭ４１が好ましい（例えば、Ｌｉｎ−Ｙａｎｇａ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，Ｍａｒｃｈ １０，２００９，ｖｏｌ．１０６，ｎｏ．１０を参照のこと）。投与は全身投与又は局所投与であってよい。全身投与には約１〜１０×１０^１４ベクターゲノムの投薬量が企図される。例えば、Ｅｕｌａｌｉｏ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｎａｔｕｒｅ ４９２：３７６及びＳｏｍａｓｕｎｔｈａｒａｍ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ３４：７７９０も参照のこと。

例えば、米国特許出願公開第２０１１００２３１３９号明細書は、ジンクフィンガーヌクレアーゼを使用した心血管疾患に関連する細胞、動物及びタンパク質の遺伝的改変を記載している。心血管疾患には、概して、高血圧、心臓発作、心不全、並びに脳卒中及びＴＩＡが含まれる。この開示に記載される方法においては、心血管疾患に関わる任意の染色体配列又は心血管疾患に関わる任意の染色体配列によってコードされるタンパク質が利用され得る。心血管関連タンパク質は、典型的には心血管関連タンパク質と心血管疾患の発症との実験的関連性に基づき選択される。例えば、心血管障害を有する集団では、心血管障害を有しない集団と比べて心血管関連タンパク質の産生速度又は循環中濃度が上昇又は低下し得る。タンパク質レベルの差は、限定はされないが、ウエスタンブロット、免疫組織化学染色、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、及び質量分析を含むプロテオミクス技術を用いて評価し得る。或いは、心血管関連タンパク質は、限定はされないが、ＤＮＡマイクロアレイ解析、遺伝子発現連鎖解析（ＳＡＧＥ）、及び定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）を含むゲノミクス技術を用いて、それらのタンパク質をコードする遺伝子の遺伝子発現プロファイルを得ることにより同定し得る。例として、染色体配列は、限定はされないが、ＩＬ１Ｂ（インターロイキン１、β）、ＸＤＨ（キサンチンデヒドロゲナーゼ）、ＴＰ５３（腫瘍タンパク質ｐ５３）、ＰＴＧＩＳ（プロスタグランジン１２（プロスタサイクリン）シンターゼ）、ＭＢ（ミオグロビン）、ＩＬ４（インターロイキン４）、ＡＮＧＰＴ１（アンギオポエチン１）、ＡＢＣＧ８（ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＧ（ＷＨＩＴＥ）、メンバー８）、ＣＴＳＫ（カテプシンＫ）、ＰＴＧＩＲ（プロスタグランジン１２（プロスタサイクリン）受容体（ＩＰ））、ＫＣＮＪ１１（カリウム内向き整流性チャネル、サブファミリーＪ、メンバー１１）、ＩＮＳ（インスリン）、ＣＲＰ（Ｃ反応性タンパク質、ペントラキシン関連）、ＰＤＧＦＲＢ（血小板由来成長因子受容体、βポリペプチド）、ＣＣＮＡ２（サイクリンＡ２）、ＰＤＧＦＢ（血小板由来成長因子βポリペプチド（サル肉腫ウイルス（ｖ−ｓｉｓ）癌遺伝子ホモログ））、ＫＣＮＪ５（カリウム内向き整流性チャネル、サブファミリーＪ、メンバー５）、ＫＣＮＮ３（カリウム中間体／小コンダクタンスカルシウム活性化チャネル、サブファミリーＮ、メンバー３）、ＣＡＰＮ１０（カルパイン１０）、ＰＴＧＥＳ（プロスタグランジンＥシンターゼ）、ＡＤＲＡ２Ｂ（アドレナリン作動性、α−２Ｂ−、受容体）、ＡＢＣＧ５（ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＧ（ＷＨＩＴＥ）、メンバー５）、ＰＲＤＸ２（ペルオキシレドキシン２）、ＣＡＰＮ５（カルパイン５）、ＰＡＲＰ１４（ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼファミリー、メンバー１４）、ＭＥＸ３Ｃ（ｍｅｘ−３ホモログＣ（Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）））、ＡＣＥアンジオテンシンＩ変換酵素（ペプチジルジペプチダーゼＡ）１）、ＴＮＦ（腫瘍壊死因子（ＴＮＦスーパーファミリー、メンバー２））、ＩＬ６（インターロイキン６（インターフェロン、β２））、ＳＴＮ（スタチン）、ＳＥＲＰＩＮＥ１（セルピンペプチダーゼ阻害因子、クレードＥ（ネキシン、プラスミノーゲンアクチベータ阻害因子１型）、メンバー１）、ＡＬＢ（アルブミン）、ＡＤＩＰＯＱ（アディポネクチン、Ｃ１Ｑ及びコラーゲンドメイン含有）、ＡＰＯＢ（アポリポタンパク質Ｂ（Ａｇ（ｘ）抗原を含む））、ＡＰＯＥ（アポリポタンパク質Ｅ）、ＬＥＰ（レプチン）、ＭＴＨＦＲ（５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素（ＮＡＤＰＨ））、ＡＰＯＡ１（アポリポタンパク質Ａ−Ｉ）、ＥＤＮ１（エンドセリン１）、ＮＰＰＢ（ナトリウム利尿ペプチド前駆体Ｂ）、ＮＯＳ３（一酸化窒素合成酵素３（内皮細胞））、ＰＰＡＲＧ（ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ）、ＰＬＡＴ（プラスミノーゲンアクチベータ、組織）、ＰＴＧＳ２（プロスタグランジンエンドペルオキシドシンターゼ２（プロスタグランジンＧ／Ｈシンターゼ及びシクロオキシゲナーゼ））、ＣＥＴＰ（コレステリルエステル転送タンパク質、血漿）、ＡＧＴＲ１（アンジオテンシンＩＩ受容体、１型）、ＨＭＧＣＲ（３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａ還元酵素）、ＩＧＦ１（インスリン様成長因子１（ソマトメジンＣ））、ＳＥＬＥ（セレクチンＥ）、ＲＥＮ（レニン）、ＰＰＡＲＡ（ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体α）、ＰＯＮ１（パラオキソナーゼ１）、ＫＮＧ１（キニノーゲン１）、ＣＣＬ２（ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２）、ＬＰＬ（リポタンパク質リパーゼ）、ＶＷＦ（フォン・ヴィレブランド因子）、Ｆ２（凝固第ＩＩ因子（トロンビン））、ＩＣＡＭ１（細胞間接着分子１）、ＴＧＦＢ１（形質転換成長因子、β１）、ＮＰＰＡ（ナトリウム利尿ペプチド前駆体Ａ）、ＩＬ１０（インターロイキン１０）、ＥＰＯ（エリスロポエチン）、ＳＯＤ１（スーパーオキシドジスムターゼ１、可溶性）、ＶＣＡＭ１（血管細胞接着分子１）、ＩＦＮＧ（インターフェロン、γ）、ＬＰＡ（リポタンパク質、Ｌｐ（ａ））、ＭＰＯ（ミエロペルオキシダーゼ）、ＥＳＲ１（エストロゲン受容体１）、ＭＡＰＫ１（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ１）、ＨＰ（ハプトグロビン）、Ｆ３（凝固第ＩＩＩ因子（トロンボプラスチン、組織因子））、ＣＳＴ３（シスタチンＣ）、ＣＯＧ２（オリゴマーゴルジ複合体の構成成分２）、ＭＭＰ９（マトリックスメタロペプチダーゼ９（ゼラチナーゼＢ、９２ｋＤａゼラチナーゼ、９２ｋＤａ ＩＶ型コラゲナーゼ））、ＳＥＲＰＩＮＣ１（セルピンペプチダーゼ阻害因子、クレードＣ（アンチトロンビン）、メンバー１）、Ｆ８（凝固第ＶＩＩＩ因子、凝固促進構成成分）、ＨＭＯＸ１（ヘムオキシゲナーゼ（デサイクリング）１）、ＡＰＯＣ３（アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩＩ）、ＩＬ８（インターロイキン８）、ＰＲＯＫ１（プロキネチシン１）、ＣＢＳ（シスタチオニンβ合成酵素）、ＮＯＳ２（一酸化窒素合成酵素２、誘導型）、ＴＬＲ４（Ｔｏｌｌ様受容体４）、ＳＥＬＰ（セレクチンＰ（顆粒膜タンパク質１４０ｋＤａ、抗原ＣＤ６２））、ＡＢＣＡ１（ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＡ（ＡＢＣ１）、メンバー１）、ＡＧＴ（アンジオテンシノーゲン（セルピンペプチダーゼ阻害因子、クレードＡ、メンバー８））、ＬＤＬＲ（低密度リポタンパク質受容体）、ＧＰＴ（グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（アラニンアミノトランスフェラーゼ））、ＶＥＧＦＡ（血管内皮増殖因子Ａ）、ＮＲ３Ｃ２（核内受容体サブファミリー３、Ｃ群、メンバー２）、ＩＬ１８（インターロイキン１８（インターフェロン−γ誘導因子））、ＮＯＳ１（一酸化窒素合成酵素１（神経型））、ＮＲ３Ｃ１（核内受容体サブファミリー３、Ｃ群、メンバー１（グルココルチコイド受容体））、ＦＧＢ（フィブリノゲンβ鎖）、ＨＧＦ（肝細胞成長因子（ヘパポエチンＡ；散乱因子））、ＩＬ１Ａ（インターロイキン１、α）、ＲＥＴＮ（レジスチン）、ＡＫＴ１（ｖ−ａｋｔマウス胸腺腫ウイルス癌遺伝子ホモログ１）、ＬＩＰＣ（リパーゼ、肝臓）、ＨＳＰＤ１（熱ショック６０ｋＤａタンパク質１（シャペロニン））、ＭＡＰＫ１４（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ１４）、ＳＰＰ１（分泌リンタンパク質１）、ＩＴＧＢ３（インテグリン、β３（血小板糖タンパク質１１１ａ、抗原ＣＤ６１））、ＣＡＴ（カタラーゼ）、ＵＴＳ２（ウロテンシン２）、ＴＨＢＤ（トロンボモジュリン）、Ｆ１０（凝固第Ｘ因子）、ＣＰ（セルロプラスミン（フェロキシダーゼ））、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー１１ｂ）、ＥＤＮＲＡ（エンドセリン受容体Ａ型）、ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体（赤芽球性白血病ウイルス性（ｖ−ｅｒｂ−ｂ）癌遺伝子ホモログ、トリ））、ＭＭＰ２（マトリックスメタロペプチダーゼ２（ゼラチナーゼＡ、７２ｋＤａゼラチナーゼ、７２ｋＤａ ＩＶ型コラゲナーゼ））、ＰＬＧ（プラスミノーゲン）、ＮＰＹ（神経ペプチドＹ）、ＲＨＯＤ（ｒａｓホモログ遺伝子ファミリー、メンバーＤ）、ＭＡＰＫ８（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ８）、ＭＹＣ（ｖ−ｍｙｃ骨髄球腫症ウイルス癌遺伝子ホモログ（トリ））、ＦＮ１（フィブロネクチン１）、ＣＭＡ１（キマーゼ１、マスト細胞）、ＰＬＡＵ（プラスミノーゲンアクチベータ、ウロキナーゼ）、ＧＮＢ３（グアニンヌクレオチド結合タンパク質（Ｇタンパク質）、βポリペプチド３）、ＡＤＲＢ２（アドレナリン作動性、β−２−、受容体、表面）、ＡＰＯＡ５（アポリポタンパク質Ａ−Ｖ）、ＳＯＤ２（スーパーオキシドジスムターゼ２、ミトコンドリア）、Ｆ５（凝固第Ｖ因子（プロアクセレリン、不安定因子））、ＶＤＲ（ビタミンＤ（１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３）受容体）、ＡＬＯＸ５（アラキドン酸塩５−リポキシゲナーゼ）、ＨＬＡ−ＤＲＢ１（主要組織適合遺伝子複合体、クラスＩＩ、ＤＲ β１）、ＰＡＲＰ１（ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ１）、ＣＤ４０ＬＧ（ＣＤ４０リガンド）、ＰＯＮ２（パラオキソナーゼ２）、ＡＧＥＲ（終末糖化産物特異的受容体）、ＩＲＳ１（インスリン受容体基質１）、ＰＴＧＳ１（プロスタグランジンエンドペルオキシドシンターゼ１（プロスタグランジンＧ／Ｈシンターゼ及びシクロオキシゲナーゼ））、ＥＣＥ１（エンドセリン変換酵素１）、Ｆ７（凝固第ＶＩＩ因子（血清プロトロンビン転化促進因子））、ＵＲＮ（インターロイキン１受容体拮抗薬）、ＥＰＨＸ２（エポキシドヒドロラーゼ２、細胞質）、ＩＧＦＢＰ１（インスリン様成長因子結合タンパク質１）、ＭＡＰＫ１０（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ１０）、ＦＡＳ（Ｆａｓ（ＴＮＦ受容体スーパーファミリー、メンバー６））、ＡＢＣＢ１（ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＢ（ＭＤＲ／ＴＡＰ）、メンバー１）、ＪＵＮ（ｊｕｎ癌遺伝子）、ＩＧＦＢＰ３（インスリン様成長因子結合タンパク質３）、ＣＤ１４（ＣＤ１４分子）、ＰＤＥ５Ａ（ホスホジエステラーゼ５Ａ、ｃＧＭＰ特異的）、ＡＧＴＲ２（アンジオテンシンＩＩ受容体、２型）、ＣＤ４０（ＣＤ４０分子、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー５）、ＬＣＡＴ（レシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ）、ＣＣＲ５（ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体５）、ＭＭＰ１（マトリックスメタロペプチダーゼ１（間質コラゲナーゼ））、ＴＩＭＰ１（ＴＩＭＰメタロペプチダーゼ阻害因子１）、ＡＤＭ（アドレノメデュリン）、ＤＹＴ１０（ジストニー１０）、ＳＴＡＴ３（シグナル伝達兼転写活性化因子３（急性期反応因子））、ＭＭＰ３（マトリックスメタロペプチダーゼ３（ストロメライシン１、プロゼラチナーゼ））、ＥＬＮ（エラスチン）、ＵＳＦ１（上流転写因子１）、ＣＦＨ（補体因子Ｈ）、ＨＳＰＡ４（熱ショック７０ｋＤａタンパク質４）、ＭＭＰ１２（マトリックスメタロペプチダーゼ１２（マクロファージエラスターゼ））、ＭＭＥ（膜メタロエンドペプチダーゼ）、Ｆ２Ｒ（凝固第ＩＩ因子（トロンビン）受容体）、ＳＥＬＬ（セレクチンＬ）、ＣＴＳＢ（カテプシンＢ）、ＡＮＸＡ５（アネキシンＡ５）、ＡＤＲＢ１（アドレナリン作動性、β−１−、受容体）、ＣＹＢＡ（シトクロムｂ−２４５、αポリペプチド）、ＦＧＡ（フィブリノゲンα鎖）、ＧＧＴ１（γ−グルタミルトランスフェラーゼ１）、ＬＩＰＧ（リパーゼ、内皮）、ＨＩＦ１Ａ（低酸素誘導因子１、αサブユニット（塩基性ヘリックス−ループ−ヘリックス転写因子））、ＣＸＣＲ４（ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体４）、ＰＲＯＣ（プロテインＣ（凝固第Ｖａ因子及び第ＶＩＩＩａ因子のインアクチベーター））、ＳＣＡＲＢ１（スカベンジャー受容体クラスＢ、メンバー１）、ＣＤ７９Ａ（ＣＤ７９ａ分子、免疫グロブリン関連α）、ＰＬＴＰ（リン脂質転移タンパク質）、ＡＤＤ１（アデュシン１（α））、ＦＧＧ（フィブリノゲンγ鎖）、ＳＡＡ１（血清アミロイドＡ１）、ＫＣＮＨ２（カリウム電位開口型チャネル、サブフ
ァミリーＨ（ｅａｇ関連）、メンバー２）、ＤＰＰ４（ジペプチジルペプチダーゼ４）、Ｇ６ＰＤ（グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）、ＮＰＲ１（ナトリウム利尿ペプチド受容体Ａ／グアニル酸シクラーゼＡ（心房性ナトリウム利尿ペプチド受容体Ａ））、ＶＴＮ（ビトロネクチン）、ＫＩＡＡ０１０１（ＫＩＡＡ０１０１）、ＦＯＳ（ＦＢＪマウス骨肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ）、ＴＬＲ２（ｔｏｌｌ様受容体２）、ＰＰＩＧ（ペプチジルプロリルイソメラーゼＧ（シクロフィリンＧ））、ＩＬ１Ｒ１（インターロイキン１受容体、Ｉ型）、ＡＲ（アンドロゲン受容体）、ＣＹＰ１Ａ１（シトクロムＰ４５０、ファミリー１、サブファミリーＡ、ポリペプチド１）、ＳＥＲＰＩＮＡ１（セルピンペプチダーゼ阻害因子、クレードＡ（α−１アンチプロテイナーゼ、アンチトリプシン）、メンバー１）、ＭＴＲ（５−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステインメチルトランスフェラーゼ）、ＲＢＰ４（レチノール結合タンパク質４、血漿）、ＡＰＯＡ４（アポリポタンパク質Ａ−ＩＶ）、ＣＤＫＮ２Ａ（サイクリン依存性キナーゼ阻害因子２Ａ（メラノーマ、ｐ１６、ＣＤＫ４を阻害））、ＦＧＦ２（線維芽細胞成長因子２（塩基性））、ＥＤＮＲＢ（エンドセリン受容体Ｂ型）、ＩＴＧＡ２（インテグリン、α２（ＣＤ４９Ｂ、ＶＬＡ−２受容体のα２サブユニット））、ＣＡＢＩＮ１（カルシニューリン結合タンパク質１）、ＳＨＢＧ（性ホルモン結合グロブリン）、ＨＭＧＢ１（高移動度群ボックス１）、ＨＳＰ９０Ｂ２Ｐ（熱ショックタンパク質９０ｋＤａ β（Ｇｒｐ９４）、メンバー２（偽遺伝子））、ＣＹＰ３Ａ４（シトクロムＰ４５０、ファミリー３、サブファミリーＡ、ポリペプチド４）、ＧＪＡ１（ギャップ結合タンパク質、α１、４３ｋＤａ）、ＣＡＶ１（カベオリン１、カベオラタンパク質、２２ｋＤａ）、ＥＳＲ２（エストロゲン受容体２（ＥＲ β））、ＬＴＡ（リンホトキシンα（ＴＮＦスーパーファミリー、メンバー１））、ＧＤＦ１５（成長分化因子１５）、ＢＤＮＦ（脳由来神経栄養因子）、ＣＹＰ２Ｄ６（シトクロムＰ４５０、ファミリー２、サブファミリーＤ、ポリペプチド６）、ＮＧＦ（神経成長因子（βポリペプチド））、ＳＰ１（Ｓｐ１転写因子）、ＴＧＩＦ１（ＴＧＦＢ誘導性因子ホメオボックス１）、ＳＲＣ（ｖ−ｓｒｃ肉腫（シュミット−ルピンＡ−２（Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｒｕｐｐｉｎ Ａ−２））ウイルス癌遺伝子ホモログ（トリ））、ＥＧＦ（上皮成長因子（β−ウロガストロン））、ＰＩＫ３ＣＧ（ホスホイノシチド−３−キナーゼ、触媒、γポリペプチド）、ＨＬＡ−Ａ（主要組織適合遺伝子複合体、クラスＩ、Ａ）、ＫＣＮＱ１（カリウム電位開口型チャネル、ＫＱＴ様サブファミリー、メンバー１）、ＣＮＲ１（カンナビノイド受容体１（脳））、ＦＢＮ１（フィブリリン１）、ＣＨＫＡ（コリンキナーゼα）、ＢＥＳＴ１（ベストロフィン１）、ＡＰＰ（アミロイドβ（Ａ４）前駆体タンパク質）、ＣＴＮＮＢ１（カテニン（カドヘリン関連タンパク質）、β１、８８ｋＤａ）、ＩＬ２（インターロイキン２）、ＣＤ３６（ＣＤ３６分子（トロンボスポンジン受容体））、ＰＲＫＡＢ１（プロテインキナーゼ、ＡＭＰ活性化、β１非触媒サブユニット）、ＴＰＯ（甲状腺ペルオキシダーゼ）、ＡＬＤＨ７Ａ１（アルデヒドデヒドロゲナーゼ７ファミリー、メンバーＡ１）、ＣＸ３ＣＲ１（ケモカイン（Ｃ−Ｘ３−Ｃモチーフ）受容体１）、ＴＨ（チロシンヒドロキシラーゼ）、Ｆ９（凝固第ＩＸ因子）、ＧＨ１（成長ホルモン１）、ＴＦ（トランスフェリン）、ＨＦＥ（ヘモクロマトーシス）、ＩＬ１７Ａ（インターロイキン１７Ａ）、ＰＴＥＮ（ホスファターゼ・テンシンホモログ）、ＧＳＴＭ１（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼμ１）、ＤＭＤ（ジストロフィン）、ＧＡＴＡ４（ＧＡＴＡ結合タンパク質４）、Ｆ１３Ａ１（凝固第ＸＩＩＩ因子、Ａ１ポリペプチド）、ＴＴＲ（トランスサイレチン）、ＦＡＢＰ４（脂肪酸結合タンパク質４、脂肪細胞）、ＰＯＮ３（パラオキソナーゼ３）、ＡＰＯＣ１（アポリポタンパク質Ｃ−Ｉ）、ＩＮＳＲ（インスリン受容体）、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー１Ｂ）、ＨＴＲ２Ａ（５−ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体２Ａ）、ＣＳＦ３（コロニー刺激因子３（顆粒球））、ＣＹＰ２Ｃ９（シトクロムＰ４５０、ファミリー２、サブファミリーＣ、ポリペプチド９）、ＴＸＮ（チオレドキシン）、ＣＹＰ１１Ｂ２（シトクロムＰ４５０、ファミリー１１、サブファミリーＢ、ポリペプチド２）、ＰＴＨ（副甲状腺ホルモン）、ＣＳＦ２（コロニー刺激因子２（顆粒球マクロファージ））、ＫＤＲ（キナーゼ挿入ドメイン受容体（ＩＩＩ型受容体チロシンキナーゼ））、ＰＬＡ２Ｇ２Ａ（ホスホリパーゼＡ２、グループＩＩＡ（血小板、滑液））、Ｂ２Ｍ（β−２−ミクログロブリン）、ＴＨＢＳ１（トロンボスポンジン１）、ＧＣＧ（グルカゴン）、ＲＨＯＡ（ｒａｓホモログ遺伝子ファミリー、メンバーＡ）、ＡＬＤＨ２（アルデヒドデヒドロゲナーゼ２ファミリー（ミトコンドリア））、ＴＣＦ７Ｌ２（転写因子７様２（Ｔ細胞特異的、ＨＭＧボックス））、ＢＤＫＲＢ２（ブラジキニン受容体Ｂ２）、ＮＦＥ２Ｌ２（核内因子（赤血球由来２）様２）、ＮＯＴＣＨ１（Ｎｏｔｃｈホモログ１、転座関連（ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）））、ＵＧＴ１Ａ１（ＵＤＰグルクロノシルトランスフェラーゼ１ファミリー、ポリペプチドＡ１）、ＩＦＮＡ１（インターフェロン、α１）、ＰＰＡＲＤ（ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体δ）、ＳＩＲＴ１（サーチュイン（サイレント交配型情報調節２ホモログ）１（Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）））、ＧＮＲＨ１（ゴナドトロピン放出ホルモン１（黄体形成放出ホルモン））、ＰＡＰＰＡ（妊娠関連血漿タンパク質Ａ、パパリシン１）、ＡＲＲ３（アレスチン３、レチナール（Ｘ−アレスチン））、ＮＰＰＣ（ナトリウム利尿ペプチド前駆体Ｃ）、ＡＨＳＰ（αヘモグロビン安定化タンパク質）、ＰＴＫ２（ＰＴＫ２プロテインチロシンキナーゼ２）、ＩＬ１３（インターロイキン１３）、ＭＴＯＲ（ラパマイシンの機構的標的（セリン／スレオニンキナーゼ））、ＩＴＧＢ２（インテグリン、β２（補体成分３受容体３及び４サブユニット））、ＧＳＴＴ１（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼθ１）、ＩＬ６ＳＴ（インターロイキン６シグナル伝達因子（ｇｐ１３０、オンコスタチンＭ受容体））、ＣＰＢ２（カルボキシペプチダーゼＢ２（血漿））、ＣＹＰ１Ａ２（シトクロムＰ４５０、ファミリー１、サブファミリーＡ、ポリペプチド２）、ＨＮＦ４Ａ（肝細胞核内因子４、α）、ＳＬＣ６Ａ４（溶質輸送担体ファミリー６（神経伝達物質輸送体、セロトニン）、メンバー４）、ＰＬＡ２Ｇ６（ホスホリパーゼＡ２、ＶＩ群（細胞質型、カルシウム非依存性））、ＴＮＦＳＦ１１（腫瘍壊死因子（リガンド）スーパーファミリー、メンバー１１）、ＳＬＣ８Ａ１（溶質輸送担体ファミリー８（ナトリウム／カルシウム交換体）、メンバー１）、Ｆ２ＲＬ１（凝固第ＩＩ因子（トロンビン）受容体様１）、ＡＫＲ１Ａ１（アルド−ケトレダクターゼファミリー１、メンバーＡ１（アルデヒドレダクターゼ））、ＡＬＤＨ９Ａ１（アルデヒドデヒドロゲナーゼ９ファミリー、メンバーＡ１）、ＢＧＬＡＰ（骨γ−カルボキシグルタミン酸（ｇｌａ）含有タンパク質）、ＭＴＴＰ（ミクロゾームトリグリセリド転移タンパク質）、ＭＴＲＲ（５−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステインメチルトランスフェラーゼレダクターゼ）、ＳＵＬＴ１Ａ３（スルホトランスフェラーゼファミリー、細胞質型、１Ａ、フェノール選択、メンバー３）、ＲＡＧＥ（腎腫瘍抗原）、Ｃ４Ｂ（補体成分４Ｂ（チド（Ｃｈｉｄｏ）血液型）、Ｐ２ＲＹ１２（プリン受容体Ｐ２Ｙ、Ｇタンパク質共役、１２）、ＲＮＬＳ（リナラーゼ、ＦＡＤ依存性アミンオキシダーゼ）、ＣＲＥＢ１（ｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質１）、ＰＯＭＣ（プロオピオメラノコルチン）、ＲＡＣ１（ｒａｓ関連Ｃ３ボツリヌス毒素基質１（ｒｈｏファミリー、低分子ＧＴＰ結合タンパク質Ｒａｃ１））、ＬＭＮＡ（ラミンＮＣ）、ＣＤ５９（ＣＤ５９分子、補体調節タンパク質）、ＳＣＮ５Ａ（ナトリウムチャネル、電位開口型、Ｖ型、αサブユニット）、ＣＹＰ１Ｂ１（シトクロムＰ４５０、ファミリー１、サブファミリーＢ、ポリペプチド１）、ＭＩＦ（マクロファージ遊走阻害因子（グリコシル化阻害因子））、ＭＭＰ１３（マトリックスメタロペプチダーゼ１３（コラゲナーゼ３））、ＴＩＭＰ２（ＴＩＭＰメタロペプチダーゼ阻害因子２）、ＣＹＰ１９Ａ１（シトクロムＰ４５０、ファミリー１９、サブファミリーＡ、ポリペプチド１）、ＣＹＰ２１Ａ２（シトクロムＰ４５０、ファミリー２１、サブファミリーＡ、ポリペプチド２）、ＰＴＰＮ２２（タンパク質チロシンホスファターゼ、非受容体型２２（リンパ球））、ＭＹＨ１４（ミオシン、重鎖１４、非筋肉性）、ＭＢＬ２（マンノース結合レクチン（プロテインＣ）２、可溶性（オプソニン欠損））、ＳＥＬＰＬＧ（セレクチンＰリガンド）、ＡＯＣ３（アミンオキシダーゼ、銅含有３（血管接着タンパク質１））、ＣＴＳＬ１（カテプシンＬ１）、ＰＣＮＡ（増殖細胞核抗原）、ＩＧＦ２（インスリン様成長因子２（ソマトメジンＡ））、ＩＴＧＢ１（インテグリン、β１（フィブロネクチン受容体、βポリペプチド、抗原ＣＤ２９はＭＤＦ２、ＭＳＫ１２を含む））、ＣＡＳＴ（カルパスタチン）、ＣＸＣＬ１２（ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１２（ストロマ細胞由来因子１））、ＩＧＨＥ（免疫グロブリン重鎖定常ε）、ＫＣＮＥ１（カリウム電位開口型チャネル、Ｉｓｋ関連ファミリー、メンバー１）、ＴＦＲＣ（トランスフェリン受容体（ｐ９０、ＣＤ７１））、ＣＯＬ１Ａ１（コラーゲン、Ｉ型、α１）、ＣＯＬ１Ａ２（コラーゲン、Ｉ型、α２）、ＩＬ２ＲＢ（インターロイキン２受容体、β）、ＰＬＡ２Ｇ１０（ホスホリパーゼＡ２、Ｘ群）、ＡＮＧＰＴ２（アンギオポエチン２）、ＰＲＯＣＲ（プロテインＣ受容体、内皮（ＥＰＣＲ））、ＮＯＸ４（ＮＡＤＰＨオキシダーゼ４）、ＨＡＭＰ（ヘプシジン抗菌ペプチド）、ＰＴＰＮ１１（タンパク質チロシンホスファターゼ、非受容体型１１）、ＳＬＣ２Ａ１（溶質輸送担体ファミリー２（促進性グルコーストランスポーター）、メンバー１）、ＩＬ２ＲＡ（インターロイキン２受容体、α）、ＣＣＬ５（ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド５）、ＩＲＦ１（インターフェロン調節因子１）、ＣＦＬＡＲ（ＣＡＳＰ８及びＦＡＤＤ様アポトーシス調節因子）、ＣＡＬＣＡ（カルシトニン関連ポリペプチドα）、ＥＩＦ４Ｅ（真核生物翻訳開始因子４Ｅ）、ＧＳＴＰ１（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼπ１）、ＪＡＫ２（ヤヌスキナーゼ２）、ＣＹＰ３Ａ５（シトクロムＰ４５０、ファミリー３、サブファミリーＡ、ポリペプチド５）、ＨＳＰＧ２（ヘパラン硫酸プロテオグリカン２）、ＣＣＬ３（ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド３）、ＭＹＤ８８（ミエロイド分化一次応答遺伝子（８８））、ＶＩＰ（血管作動性腸管ペプチド）、ＳＯＡＴ１（ステロールＯ−アシルトランスフェラーゼ１）、ＡＤＲＢＫ１（アドレナリン作動性、β、受容体キナーゼ１）、ＮＲ４Ａ２（核内受容体サブファミリー４、グループＡ、メンバー２）、ＭＭＰ８（マトリックスメタロペプチダーゼ８（好中球コラゲナーゼ））、ＮＰＲ２（ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｂ／グアニル酸シクラーゼＢ（心房性ナトリウム利尿ペプチド受容体Ｂ））、ＧＣＨ１（ＧＴＰシクロヒドロラーゼ１）、ＥＰＲＳ（グルタミル−プロリル−ｔＲＮＡシンテターゼ）、ＰＰＡＲＧＣ１Ａ（ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ、コアクチベーター１α）、Ｆ１２（凝固第ＸＩＩ因子（ハーゲマン因子））、ＰＥＣＡＭ１（血小板／内皮細胞接着分子）、ＣＣＬ４（ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド４）、ＳＥＲＰＩＮＡ３（セルピンペプチダーゼ阻害因子、クレードＡ（α−１アンチプロテイナーゼ、アンチトリプシン）、メンバー３）、ＣＡＳＲ（カルシウム感知受容体）、ＧＪＡ
５（ギャップ結合タンパク質、α５、４０ｋＤａ）、ＦＡＢＰ２（脂肪酸結合タンパク質２、腸）、ＴＴＦ２（転写終結因子、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ）、ＰＲＯＳ１（プロテインＳ（α））、ＣＴＦ１（カルジオトロフィン１）、ＳＧＣＢ（サルコグリカン、β（４３ｋＤａジストロフィン関連糖タンパク質））、ＹＭＥ１Ｌ１（ＹＭＥ１様１（Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）））、ＣＡＭＰ（カテリシジン抗菌ペプチド）、ＺＣ３Ｈ１２Ａ（ジンクフィンガーＣＣＣＨ型含有１２Ａ）、ＡＫＲ１Ｂ１（アルド−ケトレダクターゼファミリー１、メンバーＢ１（アルドースレダクターゼ））、ＤＥＳ（デスミン）、ＭＭＰ７（マトリックスメタロペプチダーゼ７（マトリライシン、子宮））、ＡＨＲ（アリール炭化水素受容体）、ＣＳＦ１（コロニー刺激因子１（マクロファージ））、ＨＤＡＣ９（ヒストン脱アセチル化酵素９）、ＣＴＧＦ（結合組織成長因子）、ＫＣＮＭＡ１（大コンダクタンスカルシウム活性化カリウムチャネル、サブファミリーＭ、αメンバー１）、ＵＧＴ１Ａ（ＵＤＰグルクロノシルトランスフェラーゼ１ファミリー、ポリペプチドＡ複合遺伝子座）、ＰＲＫＣＡ（プロテインキナーゼＣ、α）、ＣＯＭＴ（カテコール−β−メチルトランスフェラーゼ）、Ｓ１００Ｂ（Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ｂ）、ＥＧＲ１（初期増殖応答１）、ＰＲＬ（プロラクチン）、ＩＬ１５（インターロイキン１５）、ＤＲＤ４（ドーパミン受容体Ｄ４）、ＣＡＭＫ２Ｇ（カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩγ）、ＳＬＣ２２Ａ２（溶質輸送担体ファミリー２２（有機カチオントランスポーター）、メンバー２）、ＣＣＬ１１（ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド１１）、ＰＧＦ（Ｂ３２１胎盤成長因子）、ＴＨＰＯ（トロンボポエチン）、ＧＰ６（糖タンパク質ＶＩ（血小板））、ＴＡＣＲ１（タキキニン受容体１）、ＮＴＳ（ニューロテンシン）、ＨＮＦ１Ａ（ＨＮＦ１ホメオボックスＡ）、ＳＳＴ（ソマトスタチン）、ＫＣＮＤ１（カリウム電位開口型チャネル、Ｓｈａｌ関連サブファミリー、メンバー１）、ＬＯＣ６４６６２７（ホスホリパーゼ阻害因子）、ＴＢＸＡＳ１（トロンボキサンＡシンターゼ１（血小板））、ＣＹＰ２Ｊ２（シトクロムＰ４５０、ファミリー２、サブファミリーＪ、ポリペプチド２）、ＴＢＸＡ２Ｒ（トロンボキサンＡ２受容体）、ＡＤＨ１Ｃ（アルコールデヒドロゲナーゼ１Ｃ（クラスＩ）、γポリペプチド）、ＡＬＯＸ１２（アラキドン酸１２−リポキシゲナーゼ）、ＡＨＳＧ（α−２−ＨＳ−糖タンパク質）、ＢＨＭＴ（ベタイン−ホモシステインメチルトランスフェラーゼ）、ＧＪＡ４（ギャップ結合タンパク質、α４、３７ｋＤａ）、ＳＬＣ２５Ａ４（溶質輸送担体ファミリー２５（ミトコンドリア輸送担体；アデニンヌクレオチドトランスロケーター）、メンバー４）、ＡＣＬＹ（ＡＴＰクエン酸リアーゼ）、ＡＬＯＸ５ＡＰ（アラキドン酸５−リポキシゲナーゼ活性化タンパク質）、ＮＵＭＡ１（核有糸分裂装置タンパク質１）、ＣＹＰ２７Ｂ１（シトクロムＰ４５０、ファミリー２７、サブファミリーＢ、ポリペプチド１）、ＣＹＳＬＴＲ２（システイニルロイコトリエン受容体２）、ＳＯＤ３（スーパーオキシドジスムターゼ３、細胞外）、ＬＴＣ４Ｓ（ロイコトリエンＣ４シンターゼ）、ＵＣＮ（ウロコルチン）、ＧＨＲＬ（グレリン／オベスタチンプレプロペプチド）、ＡＰＯＣ２（アポリポタンパク質Ｃ−ＩＩ）、ＣＬＥＣ４Ａ（Ｃ型レクチンドメインファミリー４、メンバーＡ）、ＫＢＴＢＤ１０（ケルヒリピート及びＢＴＢ（ＰＯＺ）ドメイン含有１０）、ＴＮＣ（テネイシンＣ）、ＴＹＭＳ（チミジル酸シンテターゼ）、ＳＨＣｌ（ＳＨＣ（Ｓｒｃ相同性２ドメイン含有）形質転換タンパク質１）、ＬＲＰ１（低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１）、ＳＯＣＳ３（サイトカインシグナル伝達のサプレッサー３）、ＡＤＨ１Ｂ（アルコールデヒドロゲナーゼ１Ｂ（クラスＩ）、βポリペプチド）、ＫＬＫ３（カリクレイン関連ペプチダーゼ３）、ＨＳＤ１１Ｂ１（ヒドロキシステロイド（１１−β）デヒドロゲナーゼ１）、ＶＫＯＲＣ１（ビタミンＫエポキシドレダクターゼ複合体、サブユニット１）、ＳＥＲＰＩＮＢ２（セルピンペプチダーゼ阻害因子、クレードＢ（オボアルブミン）、メンバー２）、ＴＮＳ１（テンシン１）、ＲＮＦ１９Ａ（リングフィンガータンパク質１９Ａ）、ＥＰＯＲ（エリスロポエチン受容体）、ＩＴＧＡＭ（インテグリン、αＭ（補体成分３受容体３サブユニット））、ＰＩＴＸ２（ペアード様ホメオドメイン２）、ＭＡＰＫ７（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ７）、ＦＣＧＲ３Ａ（ＩｇＧのＦｃ断片、低親和性１１１ａ、受容体（ＣＤ１６ａ））、ＬＥＰＲ（レプチン受容体）、ＥＮＧ（エンドグリン）、ＧＰＸ１（グルタチオンペルオキシダーゼ１）、ＧＯＴ２（グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ２、ミトコンドリア（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ２））、ＨＲＨ１（ヒスタミン受容体Ｈ１）、ＮＲ１１２（核内受容体サブファミリー１、グループＩ、メンバー２）、ＣＲＨ（コルチコトロピン放出ホルモン）、ＨＴＲ１Ａ（５−ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体１Ａ）、ＶＤＡＣ１（電位依存性アニオンチャネル１）、ＨＰＳＥ（ヘパラナーゼ）、ＳＦＴＰＤ（サーファクタントタンパク質Ｄ）、ＴＡＰ２（トランスポーター２、ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＢ（ＭＤＲ／ＴＡＰ））、ＲＮＦ１２３（リングフィンガータンパク質１２３）、ＰＴＫ２Ｂ（ＰＴＫ２Ｂプロテインチロシンキナーゼ２β）、ＮＴＲＫ２（神経栄養チロシンキナーゼ、受容体、２型）、ＩＬ６Ｒ（インターロイキン６受容体）、ＡＣＨＥ（アセチルコリンエステラーゼ（Ｙｔ血液型））、ＧＬＰ１Ｒ（グルカゴン様ペプチド１受容体）、ＧＨＲ（成長ホルモン受容体）、ＧＳＲ（グルタチオンレダクターゼ）、ＮＱＯ１（ＮＡＤ（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼ、キノン１）、ＮＲ５Ａ１（核内受容体サブファミリー５、グループＡ、メンバー１）、ＧＪＢ２（ギャップ結合タンパク質、β２、２６ｋＤａ）、ＳＬＣ９Ａ１（溶質輸送担体ファミリー９（ナトリウム／水素交換体）、メンバー１）、ＭＡＯＡ（モノアミンオキシダーゼＡ）、ＰＣＳＫ９（プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型）、ＦＣＧＲ２Ａ（ＩｇＧのＦｃ断片、低親和性ＩＩａ、受容体（ＣＤ３２））、ＳＥＲＰＩＮＦ１（セルピンペプチダーゼ阻害因子、クレードＦ（α−２抗プラスミン、色素上皮由来因子）、メンバー１）、ＥＤＮ３（エンドセリン３）、ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）、ＧＡＳ６（成長停止特異的６）、ＳＭＰＤ１（スフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ１、酸性リソソーム）、ＵＣＰ２（脱共役タンパク質２（ミトコンドリア、プロトン担体））、ＴＦＡＰ２Ａ（転写因子ＡＰ−２α（活性化エンハンサー結合タンパク質２α））、Ｃ４ＢＰＡ（補体成分４結合タンパク質、α）、ＳＥＲＰＩＮＦ２（セルピンペプチダーゼ阻害因子、クレードＦ（α−２抗プラスミン、色素上皮由来因子）、メンバー２）、ＴＹＭＰ（チミジンホスホリラーゼ）、ＡＬＰＰ（アルカリホスファターゼ、胎盤（リーガン（Ｒｅｇａｎ）アイソザイム））、ＣＸＣＲ２（ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体２）、ＳＬＣ３９Ａ３（溶質輸送担体ファミリー３９（亜鉛トランスポーター）、メンバー３）、ＡＢＣＧ２（ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＧ（ＷＨＩＴＥ）、メンバー２）、ＡＤＡ（アデノシンデアミナーゼ）、ＪＡＫ３（ヤヌスキナーゼ３）、ＨＳＰＡ１Ａ（熱ショック７０ｋＤａタンパク質１Ａ）、ＦＡＳＮ（脂肪酸シンターゼ）、ＦＧＦ１（線維芽細胞成長因子１（酸性））、Ｆ１１（凝固第ＸＩ因子）、ＡＴＰ７Ａ（ＡＴＰアーゼ、Ｃｕ＋＋輸送、αポリペプチド）、ＣＲ１（補体成分（３ｂ／４ｂ）受容体１（Ｋｎｏｐｓ血液型））、ＧＦＡＰ（グリア線維性酸性タンパク質）、ＲＯＣＫ１（Ｒｈｏ関連、コイルドコイル含有プロテインキナーゼ１）、ＭＥＣＰ２（メチルＣｐＧ結合タンパク質２（レット症候群））、ＭＹＬＫ（ミオシン軽鎖キナーゼ）、ＢＣＨＥ（ブチリルコリンエステラーゼ）、ＬＩＰＥ（リパーゼ、ホルモン感受性）、ＰＲＤＸ５（ペルオキシレドキシン５）、ＡＤＯＲＡ１（アデノシンＡ１受容体）、ＷＲＮ（ウェルナー症候群、ＲｅｃＱヘリカーゼ様）、ＣＸＣＲ３（ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体３）、ＣＤ８１（ＣＤ８１分子）、ＳＭＡＤ７（ＳＭＡＤファミリーメンバー７）、ＬＡＭＣ２（ラミニン、γ２）、ＭＡＰ３Ｋ５（マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼキナーゼ５）、ＣＨＧＡ（クロモグラニンＡ（副甲状腺分泌タンパク質１））、ＩＡＰＰ（膵島アミロイドポリペプチド）、ＲＨＯ（ロドプシン）、ＥＮＰＰ１（エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ１）、ＰＴＨＬＨ（副甲状腺ホルモン様ホルモン）、ＮＲＧ１（ニューレグリン１）、ＶＥＧＦＣ（血管内皮増殖因子Ｃ）、ＥＮＰＥＰ（グルタミルアミノペプチダーゼ（アミノペプチダーゼＡ））、ＣＥＢＰＢ（ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質（Ｃ／ＥＢＰ）、β）、ＮＡＧＬＵ（Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、α−）、Ｆ２ＲＬ３（凝固第ＩＩ因子（トロンビン）受容体様３）、ＣＸ３ＣＬ１（ケモカイン（Ｃ−Ｘ３−Ｃモチーフ）リガンド１）、ＢＤＫＲＢ１（ブラジキニン受容体Ｂ１）、ＡＤＡＭＴＳ１３（トロンボスポンジン１型モチーフを有するＡＤＡＭメタロペプチダーゼ、１３）、ＥＬＡＮＥ（エラスターゼ、好中球発現）、ＥＮＰＰ２（エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ２）、ＣＩＳＨ（サイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質）、ＧＡＳＴ（ガストリン）、ＭＹＯＣ（ミオシリン、小柱網誘導性グルココルチコイド応答）、ＡＴＰ１Ａ２（ＡＴＰアーゼ、Ｎａ＋／Ｋ＋輸送、α２ポリペプチド）、ＮＦ１（ニューロフィブロミン１）、ＧＪＢ１（ギャップ結合タンパク質、β１、３２ｋＤａ）、ＭＥＦ２Ａ（筋細胞エンハンサー因子２Ａ）、ＶＣＬ（ビンキュリン）、ＢＭＰＲ２（骨形成タンパク質受容体、ＩＩ型（セリン／スレオニンキナーゼ））、ＴＵＢＢ（チューブリン、β）、ＣＤＣ４２（細胞分裂周期４２（ＧＴＰ結合タンパク質、２５ｋＤａ））、ＫＲＴ１８（ケラチン１８）、ＨＳＦ１（熱ショック転写因子１）、ＭＹＢ（ｖ−ｍｙｂ骨髄芽球症ウイルス癌遺伝子ホモログ（トリ））、ＰＲＫＡＡ２（プロテインキナーゼ、ＡＭＰ活性化、α２触媒サブユニット）、ＲＯＣＫ２（Ｒｈｏ関連、コイルドコイル含有プロテインキナーゼ２）、ＴＦＰＩ（組織因子経路阻害因子（リポタンパク質関連凝固阻害因子））、ＰＲＫＧ１（プロテインキナーゼ、ｃＧＭＰ依存性、Ｉ型）、ＢＭＰ２（骨形成タンパク質２）、ＣＴＮＮＤ１（カテニン（カドヘリン関連タンパク質）、δ１）、ＣＴＨ（シスタチオナーゼ（シスタチオニンγ−リアーゼ））、ＣＴＳＳ（カテプシンＳ）、ＶＡＶ２（ｖａｖ ２グアニンヌクレオチド交換因子）、ＮＰＹ２Ｒ（ニューロペプチドＹ受容体Ｙ２）、ＩＧＦＢＰ２（インスリン様成長因子結合タンパク質２、３６ｋＤａ）、ＣＤ２８（ＣＤ２８分子）、ＧＳＴＡ１（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼα１）、ＰＰＩＡ（ペプチジルプロリルイソメラーゼＡ（シクロフィリンＡ））、ＡＰＯＨ（アポリポタンパク質Ｈ（β−２−糖タンパク質Ｉ））、Ｓ１００Ａ８（Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ８）、ＩＬ１１（インターロイキン１１）、ＡＬＯＸ１５（アラキドン酸１５−リポキシゲナーゼ）、ＦＢＬＮ１（フィビュリン１）、ＮＲ１Ｈ３（核内受容体サブファミリー１、グループＨ、メンバー３）、ＳＣＤ（ステアロイル−ＣｏＡデサチュラーゼ（Δ−９−デサチュラーゼ））、ＧＩＰ（胃抑制ポリペプチド）、ＣＨＧＢ（クロモグラニンＢ（セクレトグラニン１））、ＰＲＫＣＢ（プロテインキナーゼＣ、β）、ＳＲＤ５Ａ１（ステロイド−５−アルファ−レダクターゼ、αポリペプチド１（３−オキソ−５α−ステロイドΔ４−デヒドロゲナーゼα１））、ＨＳＤ１１Ｂ２（ヒドロキシステロイド（１１−β）デヒドロゲナーゼ２）、ＣＡＬＣＲＬ
（カルシトニン受容体様）、ＧＡＬＮＴ２（ＵＤＰ−Ｎ−アセチル−α−Ｄ−ガラクトサミン：ポリペプチドＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ２（ＧａｌＮＡｃ−Ｔ２））、ＡＮＧＰＴＬ４（アンギオポエチン様４）、ＫＣＮＮ４（カリウム中間体／小コンダクタンスカルシウム活性化チャネル、サブファミリーＮ、メンバー４）、ＰＩＫ３Ｃ２Ａ（ホスホイノシチド−３−キナーゼ、クラス２、αポリペプチド）、ＨＢＥＧＦ（ヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子）、ＣＹＰ７Ａ１（シトクロムＰ４５０、ファミリー７、サブファミリーＡ、ポリペプチド１）、ＨＬＡ−ＤＲＢ５（主要組織適合遺伝子複合体、クラスＩＩ、ＤＲ β ５）、ＢＮＩＰ３（ＢＣＬ２／アデノウイルスＥ１Ｂ １９ｋＤａ相互作用タンパク質３）、ＧＣＫＲ（グルコキナーゼ（ヘキソキナーゼ４）調節因子）、Ｓ１００Ａ１２（Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ１２）、ＰＡＤＩ４（ペプチジルアルギニンデイミナーゼ、ＩＶ型）、ＨＳＰＡ１４（熱ショック７０ｋＤａタンパク質１４）、ＣＸＣＲ１（ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体１）、Ｈ１９（Ｈ１９、刷り込み母性発現転写物（非タンパク質コード））、ＫＲＴＡＰ１９−３（ケラチン関連タンパク質１９−３）、ＩＤＤＭ２（インスリン依存性真性糖尿病２）、ＲＡＣ２（ｒａｓ関連Ｃ３ボツリヌス毒素基質２（ｒｈｏファミリー、低分子ＧＴＰ結合タンパク質Ｒａｃ２））、ＲＹＲ１（リアノジン受容体１（骨格））、ＣＬＯＣＫ（時計ホモログ（マウス））、ＮＧＦＲ（神経成長因子受容体（ＴＮＦＲスーパーファミリー、メンバー１６））、ＤＢＨ（ドーパミンβ−ヒドロキシラーゼ（ドーパミンβ−モノオキシゲナーゼ））、ＣＨＲＮＡ４（コリン作動性受容体、ニコチン性、α４）、ＣＡＣＮＡ１Ｃ（カルシウムチャネル、電位依存性、Ｌ型、α１Ｃサブユニット）、ＰＲＫＡＧ２（プロテインキナーゼ、ＡＭＰ活性化、γ２非触媒サブユニット）、ＣＨＡＴ（コリンアセチルトランスフェラーゼ）、ＰＴＧＤＳ（プロスタグランジンＤ２シンターゼ２１ｋＤａ（脳））、ＮＲ１Ｈ２（核内受容体サブファミリー１、グループＨ、メンバー２）、ＴＥＫ（ＴＥＫチロシンキナーゼ、内皮）、ＶＥＧＦＢ（血管内皮増殖因子Ｂ）、ＭＥＦ２Ｃ（筋細胞エンハンサー因子２Ｃ）、ＭＡＰＫＡＰＫ２（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ活性化プロテインキナーゼ２）、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー１１ａ、ＮＦＫＢアクチベーター）、ＨＳＰＡ９（熱ショック７０ｋＤａタンパク質９（モルタリン））、ＣＹＳＬＴＲ１（システイニルロイコトリエン受容体１）、ＭＡＴ１Ａ（メチオニンアデノシルトランスフェラーゼＩ、α）、ＯＰＲＬ１（オピエート受容体様１）、ＩＭＰＡ１（イノシトール（ｍｙｏ）−１（又は４）−モノホスファターゼ１）、ＣＬＣＮ２（クロライドチャネル２）、ＤＬＤ（ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ）、ＰＳＭＡ６（プロテアソーム（プロソーム、マクロパイン（ｍａｃｒｏｐａｉｎ））サブユニット、α型、６）、ＰＳＭＢ８（プロテアソーム（プロソーム、マクロパイン）サブユニット、β型、８（大型多機能ペプチダーゼ７））、ＣＨＩ３Ｌ１（キチナーゼ３様１（軟骨糖タンパク質−３９））、ＡＬＤＨ１Ｂ１（アルデヒドデヒドロゲナーゼ１ファミリー、メンバーＢ１）、ＰＡＲＰ２（ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ２）、ＳＴＡＲ（ステロイド産生急性調節タンパク質）、ＬＢＰ（リポ多糖結合タンパク質）、ＡＢＣＣ６（ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＣ（ＣＦＴＲ／ＭＲＰ）、メンバー６）、ＲＧＳ２（Ｇタンパク質シグナル伝達の調節因子２、２４ｋＤａ）、ＥＦＮＢ２（エフリン−Ｂ２）、ＧＪＢ６（ギャップ結合タンパク質、β６、３０ｋＤａ）、ＡＰＯＡ２（アポリポタンパク質Ａ−ＩＩ）、ＡＭＰＤ１（アデノシン一リン酸デアミナーゼ１）、ＤＹＳＦ（ジスフェリン、肢帯型筋ジストロフィー２Ｂ（常染色体劣性遺伝））、ＦＤＦＴ１（ファルネシル二リン酸ファルネシルトランスフェラーゼ１）、ＥＤＮ２（エンドセリン２）、ＣＣＲ６（ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体６）、ＧＪＢ３（ギャップ結合タンパク質、β３、３１ｋＤａ）、ＩＬ１ＲＬ１（インターロイキン１受容体様１）、ＥＮＴＰＤ１（エクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ１）、ＢＢＳ４（バルデー−ビードル症候群４）、ＣＥＬＳＲ２（カドヘリン、ＥＧＦ ＬＡＧ７回膜貫通型Ｇ型受容体２（フラミンゴホモログ、ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）））、Ｆ１１Ｒ（Ｆ１１受容体）、ＲＡＰＧＥＦ３（Ｒａｐグアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）３）、ＨＹＡＬ１（ヒアルロノグルコサミニダーゼ１）、ＺＮＦ２５９（ジンクフィンガータンパク質２５９）、ＡＴＯＸ１（ＡＴＸ１抗酸化タンパク質１ホモログ（酵母））、ＡＴＦ６（活性化転写因子６）、ＫＨＫ（ケトヘキソキナーゼ（フルクトキナーゼ））、ＳＡＴ１（スペルミジン／スペルミンＮ１−アセチルトランスフェラーゼ１）、ＧＧＨ（γ−グルタミルヒドロラーゼ（コンジュガーゼ、ホリルポリγグルタミルヒドロラーゼ））、ＴＩＭＰ４（ＴＩＭＰメタロペプチダーゼ阻害因子４）、ＳＬＣ４Ａ４（溶質輸送担体ファミリー４、ナトリウム・炭酸水素イオン共輸送体、メンバー４）、ＰＤＥ２Ａ（ホスホジエステラーゼ２Ａ、ｃＧＭＰ刺激性）、ＰＤＥ３Ｂ（ホスホジエステラーゼ３Ｂ、ｃＧＭＰ阻害性）、ＦＡＤＳ１（脂肪酸デサチュラーゼ１）、ＦＡＤＳ２（脂肪酸デサチュラーゼ２）、ＴＭＳＢ４Ｘ（チモシンβ４、Ｘ連鎖）、ＴＸＮＩＰ（チオレドキシン相互作用タンパク質）、ＬＩＭＳ１（ＬＩＭ及び老化細胞抗原様ドメイン１）、ＲＨＯＢ（ｒａｓホモログ遺伝子ファミリー、メンバーＢ）、ＬＹ９６（リンパ球抗原９６）、ＦＯＸＯ１（フォークヘッドボックスＯ１）、ＰＮＰＬＡ２（パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有２）、ＴＲＨ（サイロトロピン放出ホルモン）、ＧＪＣ１（ギャップ結合タンパク質、γ１、４５ｋＤａ）、ＳＬＣ１７Ａ５（溶質輸送担体ファミリー１７（アニオン／糖輸送体）、メンバー５）、ＦＴＯ（体脂肪量及び肥満関連）、ＧＪＤ２（ギャップ結合タンパク質、δ２、３６ｋＤａ）、ＰＳＲＣ１（プロリン／セリンリッチコイルドコイル１）、ＣＡＳＰ１２（カスパーゼ１２（遺伝子／偽遺伝子））、ＧＰＢＡＲ１（Ｇタンパク質共役型胆汁酸受容体１）、ＰＸＫ（ＰＸドメイン含有セリン／スレオニンキナーゼ）、ＩＬ３３（インターロイキン３３）、ＴＲＩＢ１（トリブルズ（ｔｒｉｂｂｌｅｓ）ホモログ１（ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）））、ＰＢＸ４（プレＢ細胞白血病ホメオボックス４）、ＮＵＰＲ１（核タンパク質、転写調節因子、１）、１５−Ｓｅｐ（１５ｋＤａ セレノプロテイン）、ＣＩＬＰ２（軟骨中間層タンパク質２）、ＴＥＲＣ（テロメラーゼＲＮＡ構成成分）、ＧＧＴ２（γ−グルタミルトランスフェラーゼ２）、ＭＴ−ＣＯ１（ミトコンドリアにコードされたシトクロムｃオキシダーゼＩ）、及びＵＯＸ（尿酸オキシダーゼ、偽遺伝子）を含み得る。これらの配列はいずれも、例えば、突然変異に対処するために、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の標的であり得る。

さらなる実施形態において、染色体配列は、Ｐｏｎ１（パラオキソナーゼ１）、ＬＤＬＲ（ＬＤＬ受容体）、ＡｐｏＥ（アポリポタンパク質Ｅ）、ＡｐｏＢ−１００（アポリポタンパク質Ｂ−１００）、ＡｐｏＡ（アポリポタンパク質（ａ））、ＡｐｏＡ１（アポリポタンパク質Ａ１）、ＣＢＳ（シスタチオニン（ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｅ）Ｂ−シンターゼ）、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩｂ、ＭＴＨＲＦ（５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素（ＮＡＤＰＨ）、及びそれらの組み合わせからさらに選択され得る。１つの反復では、心血管疾患に関与する染色体配列及び染色体配列によりコードされるタンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の標的として、Ｃａｃｎａ１Ｃ、Ｓｏｄ１、Ｐｔｅｎ、Ｐｐａｒ（α）、ＡｐｏＥ、レプチン、及びそれらの組み合わせから選択され得る。

腎臓
本発明はまた、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を腎臓に送達することも企図する。治療用核酸の細胞取込みを誘導するための送達戦略には、物理的力又はベクター系、例えばウイルスベース、脂質ベース又は複合体ベースの送達、又はナノ担体が含まれる。核酸が流体力学的高圧注入で全身的に腎細胞に送られたとき見込まれる臨床的意義が低い初期の適用以降、種々の動物腎疾患モデルにおいてｉｎ ｖｉｖｏで転写後イベントを標的化するため幅広い遺伝子治療ウイルス及び非ウイルス担体が既に適用されている（Ｃｓａｂａ Ｒｅｖｅｓｚ ａｎｄ Ｐｅｔｅｒ Ｈａｍａｒ（２０１１）．Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｔｏ Ｔａｒｇｅｔ ＲＮＡｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｋｉｄｎｅｙ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｒｏｆ．Ｃｈｕｎｓｈｅｎｇ Ｋａｎｇ （Ｅｄ．），ＩＳＢＮ：９７８−９５３−３０７−５４１−９，ＩｎＴｅｃｈ，以下から入手可能：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｔｅｃｈｏｐｅｎ．ｃｏｍ／ｂｏｏｋｓ／ｇｅｎｅ−ｔｈｅｒａｐｙ−ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｄｅｌｉｖｅｒｙ−ｍｅｔｈｏｄｓ−ｔｏ−ｔａｒｇｅｔ−ｒｎａｓ−ｉｎ−ｔｈｅ−ｋｉｄｎｅｙ）。腎臓に対する送達方法は、以下のとおり要約される。

Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌ．（Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２９５：Ｆ６０５−Ｆ６１７，２００８）は、アラキドン酸代謝の１２／１５−リポキシゲナーゼ（１２／１５−ＬＯ）経路を標的にする低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）のｉｎ ｖｉｖｏ送達が、ストレプトゾトシンを注射した１型糖尿病マウスモデルにおいて腎損傷及び糖尿病性腎症（ＤＮ）を改善し得るかどうかを調べた。腎臓においてより多くのｉｎ ｖｉｖｏ到達及びｓｉＲＮＡ発現を達成するため、Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌ．は、コレステロールとコンジュゲートした二本鎖１２／１５−ＬＯ ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを使用した。約４００μｇのｓｉＲＮＡがマウスに皮下注入された。Ｙｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．の方法は、ヒトに対する腎臓への送達にコレステロールとコンジュゲートしたＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓの１〜２ｇの皮下注射を企図して本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に適用し得る。

Ｍｏｌｉｔｏｒｉｓ ｅｔ ａｌ．（Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ ２０：１７５４−１７６４，２００９）は、腎臓内におけるオリゴヌクレオチド再吸収部位として近位尿細管細胞（ＰＴＣ）を利用して、アポトーシス経路の中心的タンパク質であるｐ５３に標的化されたｓｉＲＮＡの腎損傷予防に対する有効性を試験した。虚血性傷害の４時間後に静脈内注射されたｐ５３に対するネイキッド合成ｓｉＲＮＡが、ＰＴＣ及び腎機能の両方を最大限保護した。Ｍｏｌｉｔｏｒｉｓ ｅｔ ａｌ．のデータは、静脈内投与後に近位尿細管細胞に対するｓｉＲＮＡの急速な送達が起こることを示している。用量反応分析のため、ラットに０．３３；１、３、又は５ｍｇ／ｋｇの用量のｓｉＰ５３を同じ４時点で与え、それぞれ１．３２；４、１２、及び２０ｍｇ／ｋｇの累積用量となるように注射した。試験した全てのｓｉＲＮＡ用量が１日目にＳＣｒ低下効果を生じ、より高い用量では、ＰＢＳ治療した虚血対照ラットと比較して約５日間にわたり有効であった。１２及び２０ｍｇ／ｋｇの累積用量が最良の保護効果をもたらした。Ｍｏｌｉｔｏｒｉｓ ｅｔ ａｌ．の方法は、ヒトに対する腎臓への送達に１２及び２０ｍｇ／ｋｇの累積用量を企図して本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に適用し得る。

Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｖｏｌｕｍｅ ２２，Ｎｕｍｂｅｒ ４，２０１２）は、げっ歯類及び非ヒト霊長類における静脈内投与後の合成低分子干渉ＲＮＡ Ｉ５ＮＰの毒性及び薬物動態特性を報告している。Ｉ５ＮＰは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路を介して作用することによりアポトーシス促進タンパク質ｐ５３の発現を一時的に阻害するように設計され、急性虚血／再灌流傷害、例えば大規模な心臓手術の間に起こり得る急性腎損傷及び腎移植後に起こり得る臓器移植後臓器機能障害などから細胞を保護するために開発されている。有害作用を誘発するにはげっ歯類で８００ｍｇ／ｋｇ Ｉ５ＮＰ、及び非ヒト霊長類で１，０００ｍｇ／ｋｇ Ｉ５ＮＰの用量が必要で、これはサルでは、相補体の準臨床的活性化及び凝固時間の僅かな増加を含む血液に対する効果を導くことが特定された。ラットでは、Ｉ５ＮＰのラット類似体でさらなる有害作用は観察されなかったことから、これらの作用が、Ｉ５ＮＰの意図される薬理活性に関連する毒性というよりむしろ、合成ＲＮＡ二重鎖のクラス作用に相当する可能性が高いことが示される。まとめると、これらのデータは、急性虚血／再灌流傷害後の腎機能の保全に対するＩ５ＮＰの静脈内投与の臨床試験を裏付けている。サルにおける無毒性量（ＮＯＡＥＬ）は５００ｍｇ／ｋｇであった。サルにおいて最大２５ｍｇ／ｋｇまでの用量レベルで静脈内投与した後、心血管、呼吸器、及び神経学的パラメータに対する作用は観察されなかった。従って、同程度の投薬量が、ヒトの腎臓に対するＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓの静脈内投与に企図され得る。

Ｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ．（Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ ２１：６２２−６３３，２０１０）は、ポリ（エチレングリコール）−ポリ（Ｌ−リジン）ベースのビヒクルによってｓｉＲＮＡを糸球体に標的送達するシステムを開発した。ｓｉＲＮＡ／ナノ担体複合体は直径が約１０〜２０ｎｍで、複合体が有窓内皮を通過してメサンギウムに到達することを可能にし得るサイズであった。蛍光標識ｓｉＲＮＡ／ナノ担体複合体を腹腔内注射した後、Ｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ．は血液循環中に長時間にわたりｓｉＲＮＡを検出した。マイトジェン活性化プロテインキナーゼ１（ＭＡＰＫ１）ｓｉＲＮＡ／ナノ担体複合体の反復腹腔内投与により、糸球体腎炎マウスモデルにおいて糸球体ＭＡＰＫ１ ｍＲＮＡ及びタンパク質発現が抑制された。ｓｉＲＮＡ蓄積を調べるため、ＰＩＣナノ担体と複合体化したＣｙ５標識ｓｉＲＮＡ（０．５ｍｌ、５ｎｍｏｌのｓｉＲＮＡ含有量）、ネイキッドＣｙ５標識ｓｉＲＮＡ（０．５ｍｌ、５ｎｍｏｌ）、又はＨＶＪ−Ｅに封入したＣｙ５標識ｓｉＲＮＡ（０．５ｍｌ、５ｎｍｏｌのｓｉＲＮＡ含有量）をＢＡＬＢ−ｃマウスに投与した。Ｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ．の方法は、ヒトに対する腎臓への腹腔内投与及び送達に約１〜２リットル中ナノ担体と複合体化した約１０〜２０μｍｏｌ ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓの用量を企図して本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に適用し得る。

肺
また本発明は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を一方又は両方の肺に送達することも企図する。当初はＡＡＶ−２ベースのベクターがＣＦ気道に対するＣＦＴＲ送達に提案されたが、他の血清型、例えばＡＡＶ−１、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、及びＡＡＶ−９が種々の肺上皮モデルにおいて遺伝子導入効率の向上を呈している（例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１７ ｎｏ．１２，２０６７−２０７７ Ｄｅｃ ２００９を参照のこと）。ＡＡＶ−１は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのヒト気道上皮細胞の形質導入効率がＡＡＶ−２及びＡＡＶ−５と比べて約１００倍高く５、しかしながらマウス気管気道上皮についてはＡＡＶ−１はｉｎ ｖｉｖｏでＡＡＶ−５と同等の効率で形質導入したことが実証された。他の試験では、ＡＡＶ−５はＡＡＶ−２と比べてｉｎ ｖｉｔｒｏでのヒト気道上皮（ＨＡＥ）に対する遺伝子送達の効率が５０倍高く、ｉｎ ｖｉｖｏでマウス肺気道上皮における効率が有意に高いことが示されている。ＡＡＶ−６もまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのヒト気道上皮細胞及びｉｎ ｖｉｖｏでのマウス気道における効率がＡＡＶ−２と比べて高いことが示されている８。最近の分離株ＡＡＶ−９は、ｉｎ ｖｉｖｏでマウス鼻上皮及び肺胞上皮においてＡＡＶ−５より高い遺伝子導入効率を呈することが示され、９ヶ月間にわたり遺伝子発現が検出されたことから、ＣＦＴＲ遺伝子送達ベクターにとって望ましい特性であるｉｎ ｖｉｖｏでの長期遺伝子発現がＡＡＶで実現し得ることが示される。さらに、ＡＡＶ−９は、ＣＦＴＲ発現の損失なしにかつ免疫学的帰結を最小限に抑えてマウス肺に再投与し得ることが実証された。ＣＦ及び非ＣＦ ＨＡＥ培養物の頂端表面に１００μｌのＡＡＶベクターを数時間接種し得る（例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１７ ｎｏ．１２，２０６７−２０７７ Ｄｅｃ ２００９を参照のこと）。ＭＯＩは、ウイルス濃度及び実験の目的に応じて１×１０^３から４×１０^５ベクターゲノム／細胞まで異なり得る。上記に引用したベクターは、本発明の送達及び／又は投与に企図される。

Ｚａｍｏｒａ ｅｔ ａｌ．（Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ Ｖｏｌ １８３．ｐｐ ５３１−５３８，２０１１）は、ヒト感染症の治療に対するＲＮＡ干渉治療薬の適用例、及びまた、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に感染した肺移植レシピエントにおける抗ウイルス薬の無作為化試験を報告した。Ｚａｍｏｒａ ｅｔ ａｌ．は、ＲＳＶ気道感染症のＬＴＸレシピエントにおける無作為化二重盲検プラセボ対照試験を実施した。患者はＲＳＶに対する標準治療を受けることが許された。エアロゾル化したＡＬＮ−ＲＳＶ０１（０．６ｍｇ／ｋｇ）又はプラセボが毎日、３日間にわたり投与された。この試験は、ＲＳＶを標的化するＲＮＡｉ治療薬をＲＳＶ感染症のＬＴＸレシピエントに安全に投与し得ることを実証している。ＡＬＮ−ＲＳＶ０１の３回の１日用量は、気道症状の増悪又は肺機能障害をもたらさず、かつサイトカイン又はＣＲＰの誘導などの全身性の炎症誘発効果を呈しなかった。薬物動態が吸入後に僅かな低い一過性の全身曝露を示したが、これは、静脈内投与されるか又は吸入により投与されたＡＬＮ−ＲＳＶ０１がエキソヌクレアーゼ媒介性の消化及び腎排泄によって循環から急速に消失することを示す前臨床動物データと一致している。Ｚａｍｏｒａ ｅｔ ａｌ．の方法は本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に適用することができ、本発明にはエアロゾル化したＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓを例えば０．６ｍｇ／ｋｇの投薬量で企図することができる。

ＣＦＴＲΔ５０８キメラガイドＲＮＡの例に関しては実施例２０が参照され、この実施例２０は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を使用した、嚢胞性線維症又は嚢胞性線維症（ＣＦ）関連症状に罹患している、必要性のある対象又は患者の気道におけるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の遺伝子導入又は遺伝子送達を実証する。詳細には、嚢胞性線維症ΔＦ５０８突然変異の修復戦略が例示される。この種の戦略は全生物にわたり適用されるはずである。特にＣＦに関連して、好適な患者には以下が含まれ得る：ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ及び他の家畜。この例では、本出願人はＣａｓ９酵素を含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を利用してΔＦ５０８又は他のＣＦＴＲ誘導突然変異を標的化した。

この例における治療対象は、自発呼吸下で各肺につき薬学的有効量のエアロゾル化ＡＡＶベクター系の気管支内送達を受ける。このように、エアロゾル化送達は、一般にＡＡＶ送達に好ましい。送達にはアデノウイルス又はＡＡＶ粒子が用いられ得る。各々が１つ以上の調節配列に機能的に連結している好適な遺伝子構築物を送達ベクターにクローニングし得る。この例では、以下の構築物が例として提供される：Ｃａｓ９に対するＣｂｈ又はＥＦ１ａプロモーター、キメラガイドＲＮＡに対するＵ６又はＨ１プロモーター）：好ましい構成は、ＣＦＴＲΔ５０８を標的化するキメラガイド、ΔＦ５０８突然変異の修復鋳型及びコドン最適化されたＣａｓ９酵素（好ましいＣａｓ９は、ヌクレアーゼ活性又はニッカーゼ活性を有するものである）を、場合により１つ以上の核局在化シグナル又は配列（ＮＬＳ）、例えば２つのＮＬＳを伴い使用することである。ＮＬＳを含まない構築物もまた想定される。

Ｃａｓ９標的部位を同定するため、出願者らはヒトＣＦＴＲゲノム遺伝子座を解析し、Ｃａｓ９標的部位を同定した。好ましくは、一般に、及びこのＣＦの場合、ＰＡＭはＮＧＧ又はＮＮＡＧＡＡＷモチーフを含み得る。

従って、ＣＦの場合、本方法は、組成物を発現させるため組成物を機能的にコードする１つ以上のウイルスベクターを含むウイルスベクター系を含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を、少なくとも１つのナノ粒子複合体によって送達するステップを含む目的のゲノム遺伝子座における標的配列の操作を含み、
ここでこの組成物は、
天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物であって、
Ｉ．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系キメラＲＮＡ（ｃｈｉＲＮＡ）ポリヌクレオチド配列に機能的に連結している第１の調節エレメントであって、ポリヌクレオチド配列が
（ａ）好適な哺乳類細胞におけるＣＦ標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、
（ｂ）ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、及び
（ｃ）ｔｒａｃｒ配列
を含む、第１の調節エレメント、及び
ＩＩ．少なくとも１つ以上の核局在化配列を含むＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に機能的に連結している第２の調節エレメント
［（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は５’から３’への方向に並び、
構成成分Ｉ及びＩＩは系の同じ又は異なるベクターに位置し、
転写されるとｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、かつガイド配列が標的配列に対するＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を誘導し、及び
ＣＲＩＳＰＲ複合体が、（１）標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、及び（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズ可能なｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含む］を含む１つ以上のベクターを含むベクター系を含む組成物を含む。ＣＦに関して、好ましい標的ＤＮＡ配列はＣＦＴＲΔ５０８突然変異を含む。好ましいＰＡＭは上記に記載される。好ましいＣＲＩＳＰＲ酵素は任意のＣａｓ（本明細書において記載されるが、特に実施例２０に記載されるもの）である。

ＣＦに代わるものとしては任意の遺伝的障害が挙げられ、その例は周知されている。本発明の別の好ましい方法又は使用は、ラフォラ病に関連することが特定されているＥＭＰ２Ａ及びＥＭＰ２Ｂ遺伝子の欠陥を修正するためのものである。

一部の実施形態では、「ガイド配列」は「ガイドＲＮＡ」と異なり得る。ガイド配列は、ガイドＲＮＡの範囲内にある、標的部位を特定する約２０ｂｐの配列を指し得る。

一部の実施形態では、Ｃａｓ９はＳｐＣａｓ９である（又はそれから誘導される）。かかる実施形態において、好ましい突然変異は、ＳｐＣａｓ９の１０位、７６２位、８４０位、８５４位、８６３位及び／又は９８６位又は他のＣａｓ９における対応する位置（これは例えば標準的な配列比較ツールによって確かめることができる）の一部又は全部にある。詳細には、ＳｐＣａｓ９において以下の突然変異の一部又は全部が好ましい：Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ及び／又はＤ９８６Ａ；並びに代替アミノ酸のいずれかの保存的置換も想定される。他のＣａｓ９の対応する位置におけるそれら（又はこれらの突然変異の保存的置換）もまた好ましい。特に、ＳｐＣａｓ９ではＤ１０及びＨ８４０が好ましい。しかしながら、他のＣａｓ９では、ＳｐＣａｓ９ Ｄ１０及びＨ８４０に対応する残基もまた好ましい。これらはニッカーゼ活性を提供するため有利である。かかる突然変異は、ＣＦの治療のみならず、本発明の全ての態様に適用し得る。

Ｓｃｈｗａｎｋ ｅｔ ａｌ．（Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，１３：６５３−５８，２０１３）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用してヒト幹細胞における嚢胞性線維症に関連する欠陥を修正した。このチームの標的は、イオンチャネル、嚢胞性線維症膜貫通コンダクター受容体（ＣＦＴＲ）の遺伝子であった。嚢胞性線維症患者においてはＣＦＴＲにおける欠失がタンパク質の誤った折り畳みを引き起こす。Ｓｃｈｗａｎｋ ｅｔ ａｌ．は、２人の嚢胞性線維症小児由来の細胞試料から生じさせた培養腸幹細胞を使用して、挿入しようとする修復配列を含有するドナープラスミドと共にＣＲＩＳＰＲを使用してこの欠陥を修正することができた。この研究者らは、次に細胞を腸の「オルガノイド」、即ち小型の腸に成長させ、それらが正常に機能することを示した。この例では、クローンオルガノイドの約半分に適切な遺伝的修正が起こった。

筋肉
本発明はまた、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を筋肉に送達することも企図する。Ｂｏｒｔｏｌａｎｚａ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ｖｏｌ．１９ ｎｏ．１１，２０５５−２０６４ Ｎｏｖ．２０１１）は、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）が発症した後のＦＲＧ１マウスにおけるＲＮＡ干渉発現カセットの全身送達が、毒性の徴候なしに用量依存的な長期ＦＲＧ１ノックダウンをもたらしたことを示している。Ｂｏｒｔｏｌａｎｚａ ｅｔ ａｌ．は、５×１０^１２ｖｇのｒＡＡＶ６−ｓｈ１ＦＲＧ１の単回静脈注射がＦＲＧ１マウスの筋組織病理及び筋機能をレスキューすることを見出した。詳細には、生理溶液中に２×１０^１２又は５×１０^１２ｖｇのベクターを含有する２００μｌを、２５ゲージＴｅｒｕｍｏシリンジを使用して尾静脈に注入した。Ｂｏｒｔｏｌａｎｚａ ｅｔ ａｌ．の方法を、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓを発現するＡＡＶに適用し、約２×１０^１５又は２×１０^１６ｖｇのベクターの投薬量でヒトに注射し得る。

Ｄｕｍｏｎｃｅａｕｘ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ｖｏｌ．１８ ｎｏ．５，８８１−８８７ Ｍａｙ ２０１０）は、ミオスタチン受容体ＡｃｖＲＩＩｂ ｍＲＮＡに対するＲＮＡ干渉（ｓｈ−ＡｃｖＲＩＩｂ）の技術を用いてミオスタチン経路を阻害する。ベクター化したＵ７エクソンスキッピング技法（Ｕ７−ＤＹＳ）により、擬似ジストロフィンの回復が媒介された。ｓｈ−ＡｃｖｒＩＩｂ構築物単独、Ｕ７−ＤＹＳ構築物単独、又は両方の構築物の組み合わせのいずれかを担持するアデノ随伴ベクターが、ジストロフィーｍｄｘマウスの前脛骨（ＴＡ）筋に注射された。注射は１０^１１個のＡＡＶウイルスゲノムで実施された。Ｄｕｍｏｎｃｅａｕｘ ｅｔ ａｌ．の方法を、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓを発現するＡＡＶに適用し、例えば約１０^１４〜約１０^１５ｖｇのベクターの投薬量でヒトに注射し得る。

Ｋｉｎｏｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００８）１５，１１２６−１１３０）は、アテロコラーゲン（ＡＴＣＯＬ）を含む化学的に改変されていないｓｉＲＮＡのナノ粒子製剤を用いた正常又は罹患マウスの骨格筋へのｉｎ ｖｉｖｏ ｓｉＲＮＡ送達の有効性を報告する。骨格筋成長の負の調節因子であるミオスタチンを標的とするｓｉＲＮＡをマウス骨格筋又は静脈内にＡＴＣＯＬの媒介によって局所適用すると、投与後数週間以内に筋量の顕著な増加が生じた。これらの結果は、ＡＴＣＯＬの媒介によるｓｉＲＮＡの適用が、筋萎縮症を含む疾患に対するさらなる治療用途の強力なツールであることを含意する。Ｍｓｔ−ｓｉＲＮＡ（終濃度１０ｍＭ）がＡＴＣＯＬ（局所投与用の終濃度０．５％）（ＡｔｅｌｏＧｅｎｅ、高研、東京、日本）と、製造者の指示に従い混合された。ネンブタール（２５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）によるマウス（２０週齢雄Ｃ５７ＢＬ／６）の麻酔後、Ｍｓｔ−ｓｉＲＮＡ／ＡＴＣＯＬ複合体が咀嚼筋及び大腿二頭筋に注射された。Ｋｉｎｏｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．の方法をＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓに適用し、ヒトに対して例えば約５００〜１０００ｍｌの４０μＭ溶液の投薬量で筋肉に注射し得る。

Ｈａｇｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｖｏｌ．１０，Ｎｏ．２，Ａｕｇｕｓｔ ２００４）は、哺乳動物の四肢筋全体にわたる筋細胞（筋線維）に対する効率的かつ反復可能な核酸送達を可能にする血管内非ウイルス方法を記載している。この手順には、ターニケット又は血圧測定用カフで一過性に遮断した肢の遠位静脈へのネイキッドプラスミドＤＮＡ又はｓｉＲＮＡの注射が含まれる。筋線維に対する核酸送達は、筋組織中への核酸溶液の溢出を可能にするのに十分な容積で急速注入することにより促進される。小型動物及び大型動物の両方において、最小毒性で骨格筋における高度なトランス遺伝子発現が達成された。四肢筋に対するｓｉＲＮＡ送達のエビデンスもまた得られた。アカゲザルに対するプラスミドＤＮＡ静脈内注射では、各々単一のシリンジが装填された２つのシリンジポンプ（モデルＰＨＤ ２０００；Ｈａｒｖａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に三方活栓が接続された。パパベリン注射後５分でｐＤＮＡ（４０〜１００ｍｌ生理食塩水中１５．５〜２５．７ｍｇ）が１．７又は２．０ｍｌ／秒の速度で注射された。これは、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓを発現するプラスミドＤＮＡ用にスケールアップして、ヒトについて８００〜２０００ｍｌ生理食塩水中約３００〜５００ｍｇの注射とし得る。ラットに対するアデノウイルスベクター注射では、３ｍｌの通常生理食塩水（ＮＳＳ）中２×１０^９個の感染粒子が注射された。これは、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓを発現するアデノウイルスベクター用にスケールアップして、ヒトについて１０リットルのＮＳＳ中約１×１０^１３個の感染粒子の注射とし得る。ｓｉＲＮＡに関しては、ラットは大伏在静脈に１２．５μｇのｓｉＲＮＡを注射され、霊長類は大伏在静脈に７５０μｇのｓｉＲＮＡを注射された。これは、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ用にスケールアップして、例えばヒトの大伏在静脈への約１５〜約５０ｍｇの注射とし得る。

皮膚
本発明はまた、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を皮膚に送達することも企図する。Ｈｉｃｋｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ（２０１３）２，ｅ１２９）は、ヒト及びマウス皮膚にセルフデリバリー（ｓｄ）ｓｉＲＮＡを送達するための電動マイクロニードルアレイ皮膚送達装置に関する。ｓｉＲＮＡベースの皮膚治療薬を臨床に移行させる際の主な課題は、有効な送達システムの開発である。種々の皮膚送達技術に多くの試みが投じられてきたが、成功は限られている。皮膚がｓｉＲＮＡで治療された臨床試験では、皮下針注射に伴う激痛のために試験におけるさらなる患者の登録が不可能となっており、改良された、より「患者に優しい」（即ち痛みがほとんど又は全くない）送達手法の必要性が浮き彫りとなっている。マイクロニードルは、ｓｉＲＮＡを含む大型の荷電カーゴを、最大の障壁である角質層を越えて送達する効率的な方法であり、概して従来の皮下針より痛みが少ないと考えられる。電動「スタンプ型」マイクロニードル装置は、Ｈｉｃｋｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．によって使用された電動マイクロニードルアレイ（ＭＭＮＡ）装置を含め、無毛マウス試験で安全性が示されており、かつ（ｉ）化粧品業界での広範な使用、及び（ｉｉ）限られた試験でほぼ全てのボランティアがこの装置の使用はインフルエンザの予防接種と比べてはるかに痛みが少ないと認めたことからも明らかなとおり、痛みをほとんど又は全く引き起こさないため、この装置を使用したｓｉＲＮＡ送達により、皮下針注射を使用した先行臨床試験で経験されたものと比べて痛みがはるかに少なくなることが示唆される。ＭＭＮＡ装置（Ｂｏｍｔｅｃｈ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｃｏ、ソウル、韓国からＴｒｉｐｌｅ−Ｍ又はＴｒｉ−Ｍとして市販されている）は、マウス及びヒト皮膚に対するｓｉＲＮＡの送達用に構成された。０．１ｍｍの深さに設定された、使い捨てＴｒｉ−Ｍ針カートリッジ（Ｂｏｍｔｅｃｈ）のチャンバに、ｓｄ−ｓｉＲＮＡ溶液（最大３００μｌの０．１ｍｇ／ｍｌ ＲＮＡ）が導入された。ヒト皮膚の治療に関しては、処置前に不特定の皮膚（外科手技後直ちに入手）が手で伸ばされ、コルク製プラットフォームにピンで留められた。皮内注射は全て、２８ゲージ０．５インチ針を備えるインスリンシリンジを使用して実施された。Ｈｉｃｋｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．のＭＭＮＡ装置及び方法は、例えば皮膚に対して最大３００μｌの０．１ｍｇ／ｍｌ ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓの投薬量で、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓの送達に使用し及び／又は適合させることができる。Ｌｅａｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１８ ｎｏ．２，４４２−４４６ Ｆｅｂ．２０１０）は、第１の低分子干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）ベースの皮膚用治療薬を利用した、生活に支障をきたす程の足底角皮症を含む常染色体優性症候群であるまれな皮膚障害の先天性爪肥厚症（ＰＣ）の治療に関する第Ｉｂ相臨床試験に関する。ＴＤ１０１と呼ばれるこのｓｉＲＮＡは、野生型Ｋ６ａ ｍＲＮＡには影響を及ぼすことなくケラチン６ａ（Ｋ６ａ）Ｎ１７１Ｋ突然変異ｍＲＮＡを特異的かつ強力に標的化する。以下に用量漸増スケジュールを提供する。

最初に、ＴＤ１０１又はビヒクル単独（カルシウム又はマグネシウム不含ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水）の０．１ｍｌの１．０ｍｇ／ｍｌ溶液が対称性の胼胝に投与された。６つの漸増用量容積が完了し、増加に対する有害反応はなかった：注射１回当たり０．１、０．２５、０．５、１．０、１．５、及び２．０ｍｌのＴＤ１０１溶液の１．０ｍｇ／ｍｌ溶液。計画された最大容積（２．０ｍｌ）で十分な忍容性が示されたため、次にＴＤ１０１の濃度を１ｍｇ／ｍｌから８．５ｍｇ／ｍｌの最終濃度に至るまで毎週増加させた。同様の投薬量が、ケラチン６ａ（Ｋ６ａ）Ｎ１７１Ｋ突然変異ｍＲＮＡを特異的かつ強力に標的化するＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓの投与に企図される。

Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（ＰＮＡＳ，Ｊｕｌｙ ２４，２０１２，ｖｏｌ．１０９，ｎｏ．３０，１１９７５−１１９８０）は、金コアが高配向の共有結合的に固定化されたｓｉＲＮＡの高密度シェルに取り囲まれている球状核酸ナノ粒子コンジュゲート（ＳＮＡ−ＮＣ）が、適用後数時間以内にｉｎ ｖｉｔｒｏのケラチノサイト、マウス皮膚、及びヒト表皮のほぼ１００％を自在に通り抜けることを示している。Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．が実証したところによれば、６０時間にわたる２５ｎＭ上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）ＳＮＡ−ＮＣの単回適用がヒト皮膚における有効な遺伝子ノックダウンを実証する。同様の投薬量が、皮膚に対する投与についてＳＮＡ−ＮＣに固定化されたＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓに企図される。

肝炎ウイルス
本発明はまた、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の治療にも適用することができる。しかしながら、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系は、内因性低分子ＲＮＡ経路が過飽和になるリスクなどのＲＮＡｉの欠点を回避するように、例えば用量及び配列を最適化するなどして適合させなければならない（例えば、Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ｖｏｌ．４４１，２６ Ｍａｙ ２００６を参照のこと）。例えば、ヒト当たり約１〜１０×１０^１４粒子などの低用量が企図される。別の実施形態では、ＨＢＶに向けられるＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系は、リポソーム、例えば、安定核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）において投与され得る（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．８，Ａｕｇｕｓｔ ２００５を参照）。ＳＮＡＬＰ中のＨＢＶ ＲＮＡに標的化されたＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓを約１、３又は５ｍｇ／ｋｇ／日で毎日静脈注射することが企図される。毎日の処置が約３日間にわたり、次に毎週の処置が約５週間にわたり得る。別の実施形態において、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．のシステム（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００７）１４，１１−１９）を本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に使用し及び／又は適合させることができる。Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．は二本鎖アデノ随伴ウイルス８型偽型ベクター（ｄｓＡＡＶ２／８）を使用してｓｈＲＮＡを送達する。ＨＢＶ特異的ｓｈＲＮＡを担持するｄｓＡＡＶ２／８ベクターの単回投与（マウス当たり１×１０^１２ベクターゲノム）が、ＨＢＶトランスジェニックマウスの肝臓における安定したレベルのＨＢＶタンパク質、ｍＲＮＡ及び複製ＤＮＡを有効に抑制し、循環中ＨＢＶ負荷の最大２〜３ｌｏｇ_１０の低下がもたらされた。有意なＨＢＶ抑制はベクター投与後少なくとも１２０日間持続した。ｓｈＲＮＡの治療効果は配列依存的で、インターフェロンの活性化は伴わなかった。本発明には、ＨＢＶを指向するＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系をＡＡＶ２／８ベクターなどのＡＡＶベクターにクローニングし、例えばヒト当たり約１×１０^１５ベクターゲノム〜約１×１０^１６ベクターゲノムの投薬量でヒトに投与し得る。別の実施形態において、Ｗｏｏｄｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．の方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ｖｏｌ．２１ ｎｏ．５，９７３−９８５ Ｍａｙ ２０１３）を、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に使用し及び／又は適合させることができる。Ｗｏｏｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．は、肝細胞標的化Ｎ−アセチルガラクトサミンコンジュゲートメリチン様ペプチド（ＮＡＧ−ＭＬＰ）と、凝固第ＶＩＩ因子（Ｆ７）を標的化する肝臓向性コレステロールコンジュゲートｓｉＲＮＡ（ｃｈｏｌ−ｓｉＲＮＡ）との単純な同時注入が、マウス及び非ヒト霊長類において臨床化学の変化又はサイトカインの誘導なしに効率的なＦ７ノックダウンをもたらすことを示す。Ｗｏｏｄｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．は、ＨＢＶ感染症の一過性のトランスジェニックマウスモデルを使用して、ＮＡＧ−ＭＬＰと、保存されたＨＢＶ配列を標的化する強力なｃｈｏｌ−ｓｉＲＮＡとの単回同時注入が、ウイルスＲＮＡ、タンパク質、及びウイルスＤＮＡのマルチログ（ｍｕｌｔｉｌｏｇ）抑制をもたらし、効果が長時間にわたったことを示す。本発明には、例えば約６ｍｇ／ｋｇのＮＡＧ−ＭＬＰと６ｍｇ／ｋｇのＨＢＶ特異的ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓとの静脈内（ｉｎｔｒａｖｅｉｎｏｕｓ）同時注入が想定され得る。代替例では、１日目に約３ｍｇ／ｋｇのＮＡＧ−ＭＬＰ及び３ｍｇ／ｋｇのＨＢＶ特異的ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓが送達され、続いて２週間後に約２〜３ｍｇ／ｋｇのＮＡＧ〜ＭＬＰ及び２〜３ｍｇ／ｋｇのＨＢＶ特異的ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓが投与されてもよい。

本発明はまた、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の治療にも適用され得る。Ｒｏｅｌｖｉｎｋｉ ｅｔ ａｌ．の方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ｖｏｌ．２０ ｎｏ．９，１７３７−１７４９ Ｓｅｐ ２０１２）をＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に適用することができる。例えば、ＡＡＶ８などのＡＡＶベクターが企図されるベクターであってよく、例えばキログラム体重当たり約１．２５×１０^１１〜１．２５×１０^１３ベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）の投薬量が企図され得る。

同様の方法で他の疾患の宿主を治療し得ることは直ちに明らかであろう。突然変異によって引き起こされる遺伝性疾患のいくつかの例が本明細書に提供されるが、さらに多くが知られている。上記の戦略はそれらの疾患に適用することができる。

ハンチントン病（ＨＤ）
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、ハンチントン病の疾患原因遺伝子であるＨＴＴの発現を低下させることによってこの障害に対する治療可能性を提供し（例えば、ＭｃＢｒｉｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ｖｏｌ．１９ ｎｏ．１２ Ｄｅｃ．２０１１，ｐｐ．２１５２−２１６２を参照のこと）、従って本出願人は、それをＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系に使用し及び／又は適合させることができると仮定する。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、アンチセンス配列のオフターゲットの可能性を低下させるアルゴリズムを使用して生成され得る。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ配列は、マウス、アカゲザル又はヒトハンチンチンのいずれのエクソン５２にある配列も標的とし、かつＡＡＶなどのウイルスベクターで発現し得る。ヒトを含めた動物に、半球当たり約３回のマイクロインジェクション（合計６回の注入）：最初は前交連から１ｍｍ吻側に（１２μｌ）及び残りの２回の注入（それぞれ１２μｌ及び１０μｌ）は最初の注入から３及び６ｍｍ尾側に離して、１ｅ１２ｖｇ／ｍｌのＡＡＶによって約１μｌ／分の速度で注入されてもよく、注入液を針先端から拡散させるため、針はその場にさらに５分間残された。ＤｉＦｉｇｌｉａ ｅｔ ａｌ．（ＰＮＡＳ，Ｏｃｔｏｂｅｒ ２３，２００７，ｖｏｌ．１０４，ｎｏ．４３，１７２０４−１７２０９）は、Ｈｔｔを標的化するｓｉＲＮＡの成体線条体への単回投与が突然変異体Ｈｔｔをサイレンシングし、神経病変を減弱させ、及び急激発症型のウイルストランスジェニックマウスＨＤモデルで観察された異常行動表現型を遅延させ得ることを観察した。ＤｉＦｉｇｌｉａは、２μｌのＣｙ３標識ｃｃ−ｓｉＲＮＡ−Ｈｔｔ又は非コンジュゲートｓｉＲＮＡ−Ｈｔｔを１０μＭでマウスに線条体内注入した。Ｈｔｔに標的化されたＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓの同様の投薬量を本発明においてヒトに企図することができ、例えば、Ｈｔｔに標的化された約５〜１０ｍｌの１０μＭ ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓが線条体内注入されてもよい。

別の例において、Ｂｏｕｄｒｅａｕ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ｖｏｌ．１７ ｎｏ．６ ｊｕｎｅ ２００９）は、ｈｔｔ特異的ＲＮＡｉウイルスを発現する５μｌの組換えＡＡＶ血清型２／１ベクターを（４×１０^１２ウイルスゲノム／ｍｌで）線条体（ｓｔｒａｉａｔｕｍ）に注入する。Ｈｔｔに標的化されたＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓの同様の投薬量を本発明においてヒトに企図することができ、例えば、Ｈｔｔに標的化された約１０〜２０ｍｌの４×１０^１２ウイルスゲノム／ｍｌ）ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓが線条体内注入されてもよい。別の例において、ＨＴＴに標的化されたＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓが連続投与され得る（例えば、Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １５０，８９５−９０８，Ａｕｇｕｓｔ ３１，２０１２を参照のこと）。Ｙｕ ｅｔ ａｌ．は、０．２５ｍｌ／時を送達する浸透圧ポンプ（モデル２００４）を利用して３００ｍｇ／日のｓｓ−ｓｉＲＮＡ又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を２８日間送達すると共に、０．５μｌ／時を送達するように設計されたポンプ（モデル２００２）を使用して７５ｍｇ／日の陽性対照ＭＯＥ ＡＳＯを１４日間送達した。ポンプ（Ｄｕｒｅｃｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）は滅菌ＰＢＳ中に希釈されたｓｓ−ｓｉＲＮＡ又はＭＯＥが充填され、次に植え込みの２４時間前又は４８時間前（モデル２００４）に３７℃でインキュベートされた。マウスが２．５％イソフルラン（ｉｓｏｆｌｕｏｒａｎｅ）で麻酔をかけられ、頭蓋底に正中切開が設けられた。定位固定ガイドを使用して右側脳室にカニューレが植え込まれ、Ｌｏｃｔｉｔｅ接着剤で固定された。Ａｌｚｅｔ浸透圧ミニポンプに取り付けられたカテーテルがカニューレに取り付けられ、ポンプが肩甲骨中央領域に皮下留置された。切開は５．０ナイロン縫合糸で閉じられた。Ｈｔｔに標的化されたＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓの同様の投薬量を本発明においてヒトに企図することができ、例えば、Ｈｔｔに標的化された約５００〜１０００ｇ／日のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓが投与されてもよい。持続注入の別の例において、Ｓｔｉｌｅｓ ｅｔ ａｌ．（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２３３（２０１２）４６３−４７１）は、チタン針先端を有する実質内カテーテルを右被殻に植え込んだ。カテーテルが腹部の皮下に植え込まれたＳｙｎｃｈｒｏＭｅｄ（登録商標）ＩＩポンプ（Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）に接続された。６μＬ／日でリン酸緩衝生理食塩水を７日間注入した後、ポンプに被験物質が再充填され、７日間の連続送達がプログラムされた。約２．３〜１１．５２ｍｇ／日のｓｉＲＮＡが約０．１〜０．５μＬ／分の種々の注入速度で注入された。Ｈｔｔに標的化されたＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓの同様の投薬量を本発明においてヒトに企図することができ、例えば、Ｈｔｔに標的化された約２０〜２００ｍｇ／日のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓが投与されてもよい。別の例において、Ｓａｎｇａｍｏに譲渡された米国特許出願公開第２０１３０２５３０４０号明細書の方法もまた、ハンチントン病の治療用にＴＡＬＥＳから本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に適合させることができる。

核酸、アミノ酸、及びタンパク質
本発明は、標的ＤＮＡ配列に結合する核酸を使用する。これは、核酸がタンパク質よりも作製するのが遥かに容易で安価であるため有利であり、特異性は、相同性が求められる伸長の長さによって異なり得る。例えば、複数のフィンガーの複雑な３Ｄ位置決めを行う必要がない。

「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」、及び「オリゴヌクレオチド」という語は、互換的に使用される。これらの語は、任意の長さのデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド、又はその類似体のポリマー形態のヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチドは、任意の３次元構造を有し得、かつ既知又は未知の任意の機能を果たし得る。次に示すのは、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子又は遺伝子断片のコード領域又は非コード領域、連鎖解析によって決定される複数の遺伝子座（１つの遺伝子座）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマー。この語はまた、合成主鎖を有する核酸様構造も包含する。例えば、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，１９９１；Ｂａｓｅｒｇａ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｍｉｌｌｉｇａｎ，１９９３；国際公開第９７／０３２１１号パンフレット；同第９６／３９１５４号パンフレット；Ｍａｔａ，１９９７；Ｓｔｒａｕｓｓ−Ｓｏｕｋｕｐ，１９９７；及びＳａｍｓｔａｇ，１９９６を参照されたい。ポリヌクレオチドは、１つ以上の修飾ヌクレオチド、例えば、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体を含み得る。存在する場合は、ヌクレオチド構造の修飾は、ポリマーの構築の前又は後で行うことができる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成成分で中断することができる。ポリヌクレオチドは、ヌクレオチドの重合の後に、例えば、標識構成成分との接合によりさらに修飾することができる。

本明細書で使用される「野生型」という語は、当業者によって理解される語であり、突然変異型又は変異型とは区別される、天然に存在する典型的な形態の生物、菌株、遺伝子、又は特徴を意味する。

本明細書で使用される「変異体」という語は、天然に存在するものから逸脱したパターンを有する質の提示を意味すると解釈するべきである。

「天然に存在しない」又は「エンジニアリングされた」という語は、互換的に使用され、人間の手が加えられていることを示す。この語は、核酸分子又はポリペプチドについてである場合、核酸分子又はポリペプチドが、自然では自然に結合し、かつ自然で見られる少なくとも１つの他の構成成分から少なくとも実質的に解放されていることを意味する。

「相補性」とは、従来のワトソン−クリック塩基対形成又は他の非従来型によって核酸が別の核酸配列と水素結合を形成する能力のことである。パーセント相補性は、第２の核酸配列と水素結合（例えば、ワトソン−クリック塩基対形成）を形成することができる核酸分子中の残基のパーセンテージを示す（例えば、１０のうちの５、６、７、８、９、１０がそれぞれ、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％の相補性）。「完全に相補的」とは、核酸配列の全ての連続する残基が、第２の核酸配列の同じ数の連続する残基と水素結合することを意味する。本明細書で使用される「実質的に相補的」という語は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、又はそれ以上のヌクレオチドの領域に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である相補性の程度を指す、又はストリンジェントな条件下でハイブリダイズする２つの核酸を指す。

本明細書で使用される、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェントな条件」とは、標的配列に対して相補性を有する核酸が標的配列に優先的にハイブリダイズし、かつ非標的配列とは実質的にハイブリダイズしない条件のことである。ストリンジェントな条件は、一般に、配列依存性であり、因子の数によって異なる。一般に、配列が長ければ長いほど、配列がその標的配列に特異的にハイブリダイズする温度が高くなる。ストリンジェントな条件の非限定的な例が、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３），Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ Ｐａｒｔ Ｉ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｃｈａｐｔｅｒ“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．に詳述されている。ポリヌクレオチド配列について述べられる場合、相補的な配列又は部分的に相補的な配列も想定される。これらは、好ましくは、高ストリンジェントな条件下で基準配列とハイブリダイズすることができる。一般に、ハイブリダイゼーション率を最大化するために、比較的低いストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が選択される：熱融点（Ｔ_ｍ）よりも低い約２０〜２５℃。このＴ_ｍは、特定の標的配列の５０％が、規定イオン強度及びｐＨで、溶液中で完全に相補的なプローブにハイブリダイズする温度である。一般に、ハイブリダイズした配列の少なくとも約８５％のヌクレオチド相補性を必要とするため、高ストリンジェントな洗浄条件が、Ｔ_ｍよりも低い約５〜１５℃であるように選択される。ハイブリダイズした配列の少なくとも約７０％のヌクレオチド相補性を必要とするため、中ストリンジェントな洗浄条件が、Ｔ_ｍよりも低い約１５〜３０℃であるように選択される。高い許容の（非常に低いストリンジェントな）洗浄条件は、Ｔ_ｍよりも低い５０℃であり得、ハイブリダイズした配列間の高レベルのミスマッチが許容される。当業者であれば、ハイブリダイゼーション段階及び洗浄段階における他の物理的及び化学的なパラメータも、標的配列とプローブ配列との間の特定のレベルの相同性からの検出可能なハイブリダイゼーションシグナルの結果に影響を与えるように変更できることが分かるであろう。好ましい高ストリンジェントな条件は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、及び１％ ＳＤＳ中、４２℃でのインキュベーション、又は５×ＳＳＣ及び１％ ＳＤＳ中、６５℃でのインキュベーションと、０．２×ＳＳＣ及び０．１％ ＳＤＳでの６５℃の洗浄を含む。

「ハイブリダイゼーション」とは、１つ以上のポリヌクレオチドが、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合により安定した複合体を形成する反応のことである。水素結合は、ワトソン−クリック塩基対形成、Ｈｏｏｇｓｔｅｉｎ結合、又はその他の配列特異的な方法によって起こり得る。この複合体は、二重鎖構造を形成する２つの鎖、多数鎖複合体を形成する３つ以上の鎖、単一の自己ハイブリダイズ鎖、又はこれらの任意の組合せを含み得る。ハイブリダイゼーション反応は、より広範囲のプロセス、例えば、ＰＣＲの開始、又は酵素によるポリヌクレオチドの切断における１つのステップを構成し得る。所与の配列にハイブリダイズし得る配列は、所与の配列の「相補体」と呼ばれる。

本明細書で使用される「ゲノム遺伝子座」又は「遺伝子座」（複数形も含む）という語は、染色体上の遺伝子又はＤＮＡ配列の特定の位置である。「遺伝子」は、ポリペプチドをコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡの伸長、又は生物において機能的役割を果たし、従って生体における分子単位の遺伝であるＲＮＡ鎖のことである。本発明の目的のために、遺伝子は、遺伝子産物の産生を調節する領域がコード配列及び／又は転写配列に隣接しているか否かにかかわらず、このような調節配列を含むと見なすことができる。従って、遺伝子は、必ずしも限定されるものではないが、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳調節配列、例えば、リボソーム結合部位及び内部リボソーム進入部位、エンハンサー、サイレンサー、インシュレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス付着部位、及び遺伝子座調節領域を含む。

本明細書で使用される「ゲノム遺伝子座の発現」又は「遺伝子発現」は、遺伝子からの情報が機能的遺伝子産物の合成に使用されるプロセスである。遺伝子発現の産物は、多くの場合タンパク質であるが、非タンパク質コード遺伝子、例えば、ｒＲＮＡ遺伝子又はｔＲＮＡ遺伝子の場合は、産物は機能的ＲＮＡである。遺伝子発現のプロセスは、全ての既知の生命−真核生物（多細胞生物を含む）、原核生物（細菌及び古細菌）、及び生存する機能的産物を産生するウイルスによって使用される。本明細書で使用される遺伝子又は核酸の「発現」は、細胞での遺伝子発現だけではなく、クローニング系及びその他の関連における核酸の転写及び翻訳も包含する。本明細書で使用される「発現」はまた、ポリヌクレオチドがＤＮＡ鋳型から（例えば、ｍＲＮＡ又は他のＲＮＡ転写物に）転写されるプロセス、及び／又は転写されたｍＲＮＡが続いてペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質に翻訳されるプロセスである。転写物及びコードされたポリペプチドは、まとめて「遺伝子産物」と呼ぶことができる。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核細胞でのｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。

「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために本明細書では互換的に使用される。ポリマーは、線状又は分岐であり得、修飾アミノ酸を含み得、かつ非アミノ酸によって中断され得る。この語はまた、修飾；例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又はその他の処置、例えば、標識成分との接合がなされたアミノ酸ポリマーも包含する。本明細書で使用される「アミノ酸」という語は、グリシン及びＤ又はＬ光学異性体の両方、アミノ酸類似体、及びペプチド模倣体を含む、天然及び／又は天然に存在しない若しくは合成アミノ酸を含む。

本明細書で使用される「ドメイン」又は「タンパク質ドメイン」という語は、タンパク質鎖の残りの部分とは独立に存在して機能し得るタンパク質配列の部分を指す。

本発明の態様で説明されるように、配列同一性は、配列相同性に関連する。相同性の比較は、肉眼で、より一般的には容易に入手できる配列比較プログラムの支援で行うことができる。これらの市販のコンピュータープログラムは、２つ以上の配列間のパーセント（％）相同性を計算することができ、かつ２つ以上のアミノ酸配列又は核酸配列によって共有される配列同一性を計算することもできる。一部の好ましい実施形態では、本明細書に記載されるｄＴＡＬＥのキャッピング領域は、本明細書で提供されるキャッピング領域アミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性又は共有同一性である配列を有する。

配列相同性は、当該技術分野で公知の多数のコンピュータープログラムのいずれか、例えば、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡなどによって作成することができる。このようなアラインメントを実施するのに適したコンピュータープログラムは、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ；Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２：３８７）である。配列の比較を行うことができる他のソフトウェアの例として、限定されるものではないが、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９ ｉｂｉｄ−Ｃｈａｐｔｅｒ １８を参照されたい）、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４０３−４１０）、及び比較ツールのＧＥＮＥＷＯＲＫＳ一式が挙げられる。ＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡは共に、オフライン及びオンライン検索で利用可能である（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９ ｉｂｉｄ，ｐａｇｅｓ ７−５８ ｔｏ ７−６０を参照されたい）。しかしながら、ＧＣＧ Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用することが好ましい。

パーセンテージ（％）配列相同性は、連続する配列に対して計算することができる、即ち、一方の配列を他方の配列と整列させて、一方の配列における各アミノ酸又はヌクレオチドが、他方の配列における対応するアミノ酸又はヌクレオチドと、一度に１つの残基が直接比較される。これは、「無ギャップ（ｕｎｇａｐｐｅｄ）」アラインメントと呼ばれる。典型的には、このような無ギャップアラインメントは、比較的少数の残基に対してのみ行われる。

これは、非常に単純で一貫した方法であるが、例えば、その他が同一の配列の対でも、１つの挿入又は欠失によって続くアミノ酸残基がアラインメントから外れ、従って全アラインメントが行われたときに相同性（％）が大幅に低下する可能性があることを考慮できない。結果として、殆どの配列比較法は、起こり得る挿入及び欠失を、全体の相同性又は同一性スコアに著しいペナルティーを課すことなく考慮する最適なアラインメントとなるように設計されている。これは、局所相同性又は同一性を最大にするように配列アラインメントに「ギャップ」を挿入することによって達成される。

しかしながら、これらのより複雑な方法は、アラインメントで生じる各ギャップに「ギャップペナルティー」を割り当てて、同数の同一アミノ酸の場合、ギャップが最少の配列アラインメントは、２つの比較される配列間の高い関連性を反映し、ギャップが多い配列よりも高いスコアを獲得することができる。典型的には、ギャップの存在に対して比較的高いコストを付与し、ギャップにおける各連続する残基に小さいペナルティーを付与する「親和性ギャップコスト」が使用される。これは、最も一般的に使用されているギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティーは、もちろん、ギャップの少ない最適化アラインメントを作成することができる。殆どのアラインメントプログラムは、ギャップペナルティーを変更することが可能である。しかしながら、配列の比較にこのようなソフトウェアを使用する場合は、デフォルト値を使用することが好ましい。例えば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージを使用する場合、アミノ酸配列のデフォルトのギャップペナルティーは、１つのギャップが−１２、各伸長が−４である。従って、

最大％相同性の計算はまず、ギャップペナルティーを考慮した最適なアラインメントの作成を必要とする。このようなアラインメントを行うのに適したコンピュータープログラムは、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，１９８４ Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２ ｐ３８７）である。配列の比較を行うことができる他のソフトウェアの例として、限定されるものではないが、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４^ｔｈ Ｅｄ．−Ｃｈａｐｔｅｒ １８を参照されたい）、ＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０３−４１０）、及び比較ツールのＧＥＮＥＷＯＲＫＳ一式が挙げられる。ＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡは共に、オフライン及びオンライン検索で利用可能である（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐａｇｅｓ ７−５８ ｔｏ ７−６０を参照されたい）。しかしながら、一部の適用例では、ＧＣＧ Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用することが好ましい。ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓと呼ばれる新しいツールも、タンパク質配列及びヌクレオチド配列の比較に利用可能である（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．１９９９ １７４（２）：２４７−５０；ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．１９９９ １７７（１）：１８７−８、及び米国の国立衛生研究所のウェブサイトに記載のＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのウェブサイトを参照されたい）。

最終％相同性は、同一性に関して測定することができるが、アラインメントプロセス自体が、典型的には、オール・オア・ナッシングの対比較に基づくものではない。むしろ、一般に、化学的類似性又は進化距離に基づいて各対比較にスコアを割り当てるスケールド類似性スコアマトリックス（ｓｃａｌｅｄ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｓｃｏｒｅ ｍａｔｒｉｘ）が使用される。一般的に使用されるこのようなマトリックスの一例は、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス−プログラムのＢＬＡＳＴ一式のデフォルトマトリックスである。ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムは、一般に、パブリックデフォルト値、又はカスタム記号比較表が提供される場合はこれを使用する（さらなる詳細についてはユーザーマニュアルを参照されたい）。一部の適用例では、ＧＣＧパッケージにはパブリックデフォルト値、又は他のソフトウェアでは、デフォルトマトリックス、例えば、ＢＬＯＳＵＭ６２を使用することが好ましい。

別法として、パーセンテージ相同性は、ＣＬＵＳＴＡＬ（Ｈｉｇｇｉｎｓ ＤＧ ＆ Ｓｈａｒｐ ＰＭ（１９８８），Ｇｅｎｅ ７３（１），２３７−２４４）に類似のアルゴリズムに基づいて、ＤＮＡＳＩＳ（商標）（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）における複数のアラインメントの特徴を用いて計算することができる。このソフトウェアが、最適なアラインメントを作成したら、％相同性、好ましくは、％配列同一性を計算することが可能である。このソフトウェアは、典型的には、これを配列比較の一部として、数値結果を出す。

配列は、サイレント変化を生じさせて機能的に同等の物質にする、アミノ酸残基の欠失、挿入、又は置換も有し得る。計画的なアミノ酸置換を、アミノ酸特性の類似性（例えば、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性）に基づいて行うことができ、従って、この計画的なアミノ酸置換は、アミノ酸を官能基に分類するのに有用である。アミノ酸は、その側鎖のみの特性に基づいて分類することができる。しかしながら、突然変異のデータも含めるとより有用である。従って、このように得られたアミノ酸のセットは、構造的理由から保存される可能性が高い。これらのセットは、ベン図の形式で示すことができる（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ Ｃ．Ｄ．ａｎｄ Ｂａｒｔｏｎ Ｇ．Ｊ．（１９９３）“Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ：ａ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｓｉｄｕｅ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ”Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．９：７４５−７５６）（Ｔａｙｌｏｒ Ｗ．Ｒ．（１９８６）“Ｔｈｅ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ”Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．１１９；２０５−２１８）。保存的な置換は、例えば、一般に許容されるアミノ酸分類のベン図を示す下表に従って行うことができる。

本発明の実施形態は、相同置換（本明細書では、置換及び交換は共に、既存のアミノ酸残基又はヌクレオチドの別のアミノ酸残基又はヌクレオチドでの置き換えを指すために用いられる）を含み得る配列（ポリヌクレオチド又はポリペプチドの両方）を含み、この相同置換は、即ち、アミノ酸の場合は同種置換、例えば、塩基性の塩基性での置換、酸性の酸性での置換、極性の極性での置換などが起こり得る。非相同置換、即ち、あるクラスの残基から別のクラスの残基への置換、或いは天然に存在しないアミノ酸、例えば、オルニチン（以降、Ｚと呼ぶ）、ジアミノ酪酸オルニチン（以降、Ｂと呼ぶ）、ノルロイシンオルニチン（以降、Ｏと呼ぶ）、ピリイルアラニン、チエニルアラニン、ナフチルアラニン、及びフェニルグリシンの取り込みを伴う置換も起こり得る。

変異アミノ酸配列は、配列のいずれか２つのアミノ酸残基間に適切なスペーサー基を含み得、このスペーサー基には、アミノ酸スペーサー、例えば、グリシン又はβ−アラニン残基に加えて、アルキル基、例えば、メチル基、エチル基、又はプロピル基が含まれる。ペプトイド形態の１つ以上のアミノ酸残基の存在を伴う変異のさらなる形態は、当業者には十分に理解されよう。誤解を避けるために、「ペプトイド形態」は、α−炭素置換基がα−炭素上ではなくその残基の窒素原子上にある変異アミノ酸残基を指すために用いられる。ペプトイド形態のペプチドの調製プロセスは、当技術分野で公知であり、例えば、Ｓｉｍｏｎ ＲＪ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ（１９９２）８９（２０），９３６７−９３７１、及びＨｏｒｗｅｌｌ ＤＣ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９５）１３（４），１３２−１３４を参照されたい。

本発明の実施は、特に記載のない限り、当業者の技能の範囲内である免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクス及び組換えＤＮＡの従来の技術を用いる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）；ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，（１９８７））；シリーズＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ ２：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ ｅｄｓ．（１９９５））、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．（１９８８）ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、及びＡＮＩＭＡＬ ＣＥＬＬ ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８７））参照。

ベクター
一態様では、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のエンジニアリング及び最適化において使用されるベクターを提供する。

本明細書で使用される「ベクター」は、ある環境から別の環境への実体の移送を可能にする又は促進するツールである。レプリコン、例えば、プラスミド、ファージ、又はコスミドは、別のＤＮＡセグメントが挿入されて、この挿入されたセグメントを複製することができる。一般に、ベクターは、適切な制御エレメントに結合されると複製を行うことができる。一般に、「ベクター」という語は、結合した別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。ベクターは、限定されるものではないが、一本鎖、二本鎖、又は部分的に二本鎖の核酸分子；１つ以上の遊離末端を含む核酸分子、遊離末端のない（例えば、環状の）核酸分子；ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は両方を含む核酸分子；及び当該技術分野で公知の他の様々なポリヌクレオチドを含む。１つのタイプのベクターは「プラスミド」であり、プラスミドとは、例えば、標準的な分子クローニング技術によって追加のＤＮＡセグメントを挿入することができる環状の二本鎖ＤＮＡループのことである。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、ウイルスベクターでは、ウイルス（例えば、レトロウイルス、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠損アデノウイルス、及びアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ））へのパッケージングのためにウイルス由来ＤＮＡ又はＲＮＡ配列がベクター中に存在する。ウイルスベクターは、宿主細胞へのトランスフェクションのためにウイルスによって運ばれるポリヌクレオチドも含む。あるベクターは、導入された宿主細胞で自己複製することができる（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞に導入されるとこの宿主細胞のゲノムに組み込まれ、これにより宿主ゲノムと共に複製される。さらに、あるベクターは、機能的に連結された遺伝子の発現を誘導することができる。このようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。組換えＤＮＡ技術に有用な一般的な発現ベクターは、プラスミドの形態である場合が多い。

組換え発現ベクターは、宿主細胞での核酸の発現に適した形態で本発明の核酸を含むことができる、即ち、組換え発現ベクターは、発現される核酸配列に機能的に連結された、発現に使用される宿主細胞に基づいて選択できる、１つ以上の調節エレメントを含む。組換え発現ベクターにおいて、「機能的に連結された」とは、目的のヌクレオチド配列が、（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系において、又はベクターが導入された宿主細胞において）ヌクレオチド配列の発現を可能にするように調節エレメントに連結されたことを意味するものとする。組換え法及びクローニング法については、参照により全開示内容が本明細書に組み入れられる、２００４年９月２日に米国特許出願公開第２００４−０１７１１５６ Ａ１号として公開された米国特許出願第１０／８１５，７３０号明細書に記載されている。

本発明の態様は、キメラＲＮＡ及びＣａｓ９用のバイシストロン性ベクターに関する。キメラＲＮＡ及びＣａｓ９用のバイシストロン性発現ベクターが好ましい。一般に、そして特にこの実施形態では、Ｃａｓ９が、好ましくは、ＣＢｈプロモーターによって駆動される。キメラＲＮＡは、好ましくは、Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、例えば、Ｕ６プロモーターによって駆動され得る。理想的には、この２つのプロモーターが組み合わせられる。キメラガイドＲＮＡは、典型的には、２０ｂｐのガイド配列（Ｎｓ）からなり、これは、ｔｒａｃｒ配列（下鎖の最初の「Ｕ」から転写物の末端まで延びている）に接続することができる。ｔｒａｃｒ配列は、示されているように様々な位置で切断することができる。ガイド配列及びｔｒａｃｒ配列は、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡであり得るｔｒａｃｒ−ｍａｔｅ配列によって分離されている。このｔｒａｃｒ配列には、図示されているループ配列ＧＡＡＡが続き得る。これらは共に、好ましい例である。本出願人らは、ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイによってヒトＥＭＸ１及びＰＶＡＬＢ遺伝子座におけるＣａｓ９媒介挿入欠失を実証している。ＣｈｉＲＮＡは、その「＋ｎ」指定によって示され、ｃｒＲＮＡは、ガイド配列及びｔｒａｃｒ配列が別個の転写物として発現されるハイブリッドＲＮＡを指す。本出願全体において、キメラＲＮＡは、単一ガイド、又は合成ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）とも呼ばれることがある。ループは、好ましくはＧＡＡＡであるが、この配列、又は僅か４ｂｐの長さに限定されるものではない。実際、ヘアピン構造に使用される好ましいループ形成配列は、４ヌクレオチド長であり、最も好ましくは、配列ＧＡＡＡを有する。しかしながら、これよりも長い又は短いループ配列を使用することができ、これらは代替の配列とすることができる。この配列は、好ましくは、ヌクレオチドトリプレット（例えば、ＡＡＡ）及び追加のヌクレオチド（例えば、Ｃ又はＧ）を含む。ループ形成配列の例として、ＣＡＡＡ及びＡＡＡＧが挙げられる。

「調節エレメント」という語は、プロモーター、エンハンサー、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、及び他の発現制御エレメント（例えば、転写終結シグナル、例えば、ポリアデニル化シグナル及びポリ−Ｕ配列）を含むものとする。このような調節エレメントは、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）で説明されている。調節エレメントは、多数の種類の宿主細胞におけるヌクレオチド配列の構成的な発現を誘導する調節エレメント、及び特定の宿主細胞のみでのヌクレオチド配列の発現を誘導する調節エレメント（例えば、組織特異的調節配列）を含む。組織特異的プロモーターは、主として所望の目的の組織、例えば、筋肉、ニューロン、骨、皮膚、血液、特定の臓器（例えば、肝臓、膵臓）、又は特定の細胞型（例えば、リンパ球）での発現を誘導し得る。調節エレメントはまた、時間依存的に、例えば、細胞周期依存的に、又は発生段階依存的に発現を誘導することができ、この誘導は、組織特異的又は細胞型特異的であってもよいし、又はこのように特異的でなくてもよい。一部の実施形態では、ベクターは、１つ以上のｐｏｌ ＩＩＩプロモーター（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又はそれ以上のｐｏｌ ＩＩＩプロモーター）、１つ以上のｐｏｌ ＩＩプロモーター（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又はそれ以上のｐｏｌ ＩＩプロモーター）、１つ以上のｐｏｌ Ｉプロモーター（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又はそれ以上のｐｏｌ Ｉプロモーター）、又はこれらの組み合わせを含む。ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの例として、限定されるものではないが、Ｕ６プロモーター及びＨ１プロモーターが挙げられる。ｐｏｌ ＩＩプロモーターの例として、限定されるものではないが、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意にＲＳＶエンハンサーを含む）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（任意にＣＭＶエンハンサーを含む）［例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ，４１：５２１−５３０（１９８５）を参照されたい］、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β−アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、及びＥＦ１αプロモーターが挙げられる。また、「調節エレメント」という語には、エンハンサーエレメント、例えば、ＷＰＲＥ；ＣＭＶエンハンサー；ＨＴＬＶ−ＩのＬＴＲにおけるＲ−Ｕ５’セグメント（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．８（１），ｐ．４６６−４７２，１９８８）；ＳＶ４０エンハンサー；及びウサギβ−グロビンのエクソン２と３との間のイントロン配列（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，Ｖｏｌ．７８（３），ｐ．１５２７−３１，１９８１）も包含される。当業者であれば、発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細の選択などの因子、望ましい発現レベルなどによって異なり得ることを理解されよう。ベクターを宿主細胞に導入し、これにより、本明細書に記載の核酸によってコードされる、融合タンパク質又は融合ペプチドを含む転写物、タンパク質、又はペプチド（例えば、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）転写物、タンパク質、酵素、これらの突然変異型、これらの融合タンパク質など）を産生することができる。調節配列に関して、参照によりその全開示内容が本明細書に組み入れられる米国特許出願第１０／４９１，０２６号明細書に記載されている。プロモーターに関しては、それぞれ参照により全開示内容が本明細書に組み入れられるＰＣＴ公開の国際公開第２０１１／０２８９２９号パンフレット及び米国特許出願第１２／５１１，９４０号明細書に記載されている。

ベクターは、原核細胞又は真核細胞でのＣＲＩＳＰＲ転写物（例えば、核酸転写物、タンパク質、又は酵素）の発現用に設計することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ転写物は、細菌細胞、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用）、酵母細胞、又は哺乳動物細胞で発現させることができる。適切な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に詳述されている。別法として、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列及びＴ７ポリメラーゼを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで転写して翻訳することができる。

ベクターは、原核生物又は原核細胞に導入して増殖させることができる。一部の実施形態では、原核生物は、真核細胞に導入されるベクターのコピーを増幅するため、又は真核細胞に導入されるベクターの産生における中間ベクター（例えば、ウイルスベクターパッケージングシステムの一部としてプラスミドを増幅する）として使用される。一部の実施形態では、原核生物は、ベクターのコピーを増幅して１つ以上の核酸を発現させるため、例えば、宿主細胞又は宿主生物に送達するための１つ以上のタンパク質の供給源を提供するために使用される。原核生物でのタンパク質の発現は、融合タンパク質又は非融合タンパク質の発現を誘導する構成的プロモーター又は誘導プロモーターを含むベクターを用いて大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）で行われる場合が殆どである。融合ベクターは、多数のアミノ酸を、その中でコードされたタンパク質、例えば、組換えタンパク質のアミノ末端に付加する。このような融合ベクターは、１つ以上の目的、例えば：（ｉ）組換えタンパク質の発現を増加させること；（ｉｉ）組換えタンパク質の溶解度を高めること；及び（ｉｉｉ）親和性精製におけるリガンドとして作用することによって組換えタンパク質の精製を助けることに役立ち得る。しばしば、融合発現ベクターでは、タンパク質分解切断部位は、融合タンパク質の精製の後に組換えタンパク質と融合部分との分離を可能にするために、融合部分と組換えタンパク質との接合部に導入される。このような酵素及びその同族認識配列は、因子Ｘａ、トロンビン、及びエンテロキナーゼを含む。融合発現ベクターの例として、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ，１９８８．Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）、及びｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）が挙げられ、これらはそれぞれ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、又はプロテインＡを標的組換えタンパク質に融合させる。

適切な誘導性非融合大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターの例として、ｐＴｒｃ（Ａｍｒａｎｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｇｅｎｅ ６９：３０１−３１５）及びｐＥＴ １１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）６０−８９）が挙げられる。一部の実施形態では、ベクターは酵母発現ベクターである。酵母サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｉｖｉｓａｅ）での発現用のベクターの例として、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉ，ｅｔ ａｌ．，１９８７．ＥＭＢＯ Ｊ．６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（Ｋｕｉｊａｎ ａｎｄ Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，１９８２．Ｃｅｌｌ ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９８７．Ｇｅｎｅ ５４：１１３−１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、及びｐｉｃＺ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。一部の実施形態では、ベクターは、バキュロウイルス発現ベクターを用いて昆虫細胞でのタンパク質の発現を駆動する。培養昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）でのタンパク質の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターとして、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．，１９８３．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６−２１６５）及びｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓ，１９８９．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１−３９）が挙げられる。

一部の実施形態では、ベクターは、哺乳動物発現ベクターを用いて哺乳動物細胞での１つ以上の配列の発現を駆動することができる。哺乳動物発現ベクターの例として、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，１９８７．Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０）及びｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，１９８７．ＥＭＢＯ Ｊ．６：１８７−１９５）が挙げられる。哺乳動物細胞で使用される場合、発現ベクターの制御機能は、典型的には、１つ以上の調節エレメントによって提供される。例えば、一般的に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、シミアン・ウイルス４０、及び本明細書に開示され当該技術分野で公知の他のウイルスに由来する。原核細胞及び真核細胞の両方の他の適切な発現系については、例えば、Ｃｈａｐｔｅｒｓ １６ ａｎｄ １７ ｏｆ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ．２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９を参照されたい。

一部の実施形態では、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型で優先的に核酸の発現を誘導することができる（例えば、組織特異的調節エレメントが、核酸の発現に使用される）。組織特異的調節エレメントは当該技術分野で公知である。適切な組織特異的プロモーターの非限定的な例として、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔ，ｅｔ ａｌ．，１９８７．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１：２６８−２７７）、リンパ特異的プロモーター（Ｃａｌａｍｅ ａｎｄ Ｅａｔｏｎ，１９８８．Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５−２７５）、特に、Ｔ細胞受容体のプロモーター（Ｗｉｎｏｔｏ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８９．ＥＭＢＯ Ｊ．８：７２９−７３３）及び免疫グロブリンのプロモーター（Ｂａｎｅｉｊｉ，ｅｔ ａｌ．，１９８３．Ｃｅｌｌ ３３：７２９−７４０；Ｑｕｅｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８３．Ｃｅｌｌ ３３：７４１−７４８）、ニューロン特異的プロモーター（例えば、ｔｈｅ ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ ｐｒｏｍｏｔｅｒ；Ｂｙｒｎｅ ａｎｄ Ｒｕｄｄｌｅ，１９８９．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：５４７３−５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄ，ｅｔ ａｌ．，１９８５．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：９１２−９１６）、及び哺乳動物腺特異的プロモーター（例えば、ｍｉｌｋ ｗｈｅｙ ｐｒｏｍｏｔｅｒ；米国特許第４，８７３，３１６号明細書、及び欧州特許出願第２６４，１６６号明細書）が挙げられる。発生的に調節されるプロモーターは、例えば、ネズミｈｏｘプロモーター（Ｋｅｓｓｅｌ ａｎｄ Ｇｒｕｓｓ，１９９０．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３７４−３７９）及びαフェトプロテインプロモーター（Ｃａｍｐｅｓ ａｎｄ Ｔｉｌｇｈｍａｎ，１９８９．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．３：５３７−５４６）も包含する。これらの原核生物ベクター及び真核生物ベクターに関しては、参照によりその全開示内容が本明細書に組み入れられる米国特許第６，７５０，０５９号明細書に記載されている。本発明の他の実施形態は、ウイルスベクターの使用に関連することがあり、このようなウイルスベクターについては、参照によりその全開示内容が本明細書に組み入れられる米国特許出願第１３／０９２，０８５号明細書に記載されている。組織特異的調節エレメントは、当該技術分野で公知であり、これに関しては、参照によりその全開示内容が本明細書に組み入れられる米国特許第７，７７６，３２１号明細書に記載されている。

調節エレメント
一部の実施形態では、調節エレメントは、ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントの発現を駆動するためにＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントに機能的に連結される。一般に、ＳＰＩＤＲ（ＳＰａｃｅｒ Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ Ｄｉｒｅｃｔ Ｒｅｐｅａｔｓ）としても知られるＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）は、通常は特定の細菌種に特異的であるＤＮＡ遺伝子座のファミリーを構成する。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に見られる短鎖散在配列反復（ＳＳＲ：ｓｈｏｒｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔ）の異なるクラス（Ｉｓｈｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９：５４２９−５４３３［１９８７］；及びＮａｋａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７１：３５５３−３５５６［１９８９］）及び関連する遺伝子を含む。類似の散在ＳＳＲが、ハロフェラックス・メディテラネイ（Ｈａｌｏｆｅｒａｘ ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）、及び結核菌でも同定された（Ｇｒｏｅｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１０：１０５７−１０６５［１９９３］；Ｈｏｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，５：２５４−２６３［１９９９］；Ｍａｓｅｐｏｈｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １３０７：２６−３０［１９９６］；及びＭｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１７：８５−９３［１９９５］を参照されたい）。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、典型的には、反復の構造が他のＳＳＲとは異なり、短鎖規則的間隔反復（ＳＲＳＲ：ｓｈｏｒｔ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｓｐａｃｅｄ ｒｅｐｅａｔｓ）と呼ばれる（Ｊａｎｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＯＭＩＣＳ Ｊ．Ｉｎｔｅｇ．Ｂｉｏｌ．，６：２３−３３［２００２］；及びＭｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３６：２４４−２４６［２０００］）。一般に、この反復は、実質的に一定の長さのユニークな介在配列によって規則的に間隔が空いたクラスターで生じる短鎖エレメントである（Ｍｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．，［２０００］、上記）。反復配列は、株間で高度に保存されているが、散在反復の数及びスペーサー領域の配列は、典型的には、株毎に異なる（ｖａｎ Ｅｍｂｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８２：２３９３−２４０１［２０００］）。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、限定されるものではないが、アエロピュルム属（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ）、ピュロバクルム属（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ）、スルフォロブス属（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）、アルカエオグロブス属（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）、ハロアオーキュラ属（Ｈａｌｏｃａｒｃｕｌａ）、メタノバクテリウム属（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、メタノコックス属（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）、メタノサルキナ属（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ）、メタノピュルス属（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ）、ピュロコックス属（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ピクロフィルス属（Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ）、テルモプラズマ属（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、アクウィフェクス門（Ａｑｕｉｆｅｘ）、ポルフィロモナス属（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）、クロロビウム属（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ）、テルムス属（Ｔｈｅｒｍｕｓ）、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、サーモアナエロバクター属（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、フソバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アゾアルカス属（Ａｚａｒｃｕｓ）、クロモバクテリウム属（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）、デスルフォビブリオ属（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）、ジオバクター属（Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ）、ミキソコッカス属（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、ウォリネラ属（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、メチロコッカス属（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、フォトバクテリウム属（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、及びテルモトガ門（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）を含む４０を超える原核生物で同定された（例えば、Ｊａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４３：１５６５−１５７５［２００２］；及びＭｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．，［２００５］を参照されたい）。

一般に、「ＣＲＩＳＰＲ系」は、集合的に、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の発現又はその活性の誘導に関与する転写物及び他のエレメント、例として、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列、ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ又は活性部分ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒ−ｍａｔｅ配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系に関して「直接反復」及びｔｒａｃｒＲＮＡによりプロセシングされる部分直接反復を包含）、ガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系に関して「スペーサー」とも称される）、又はＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からの他の配列及び転写物を指す。本発明の実施形態において用語のガイド配列とガイドＲＮＡとは同義的に用いられる。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントは、Ｉ型、ＩＩ型、又はＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系に由来する。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントは、内因性ＣＲＩＳＰＲ系を含む特定の生物、例えば、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来する。一般に、ＣＲＩＳＰＲ系は、標的配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系に関してプロトスペーサーとも称される）におけるＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するエレメントを特徴とする。ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成に関して、「標的配列」は、ガイド配列が相補性を有するように設計される配列を指し、標的配列とガイド配列との間のハイブリダイゼーションがＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。標的配列は、任意のポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡポリヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態において、標的配列は、細胞の核又は細胞質中に局在している。

一部の実施形態では、直接反復は、以下の基準のいずれか又は全てを満たす反復モチーフを検索することによってコンピューター内で同定され得る：１．ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に隣接するゲノム配列の２Ｋｂウィンドウに存在する；２．２０〜５０ｂｐに及ぶ；及び３．２０〜５０ｂｐの間隔が置かれている。一部の実施形態では、これらの基準のうちの２つ、例えば、１及び２、２及び３、又は１及び３が使用され得る。一部の実施形態では、３つ全ての基準が使用され得る。

一部の実施形態では、候補ｔｒａｃｒＲＮＡは、続いて、以下の基準のいずれか又は全てを満たす配列によって予測され得る：１．直接反復に対する配列相同性（最大１８ｂｐのミスマッチでのＧｅｎｅｉｏｕｓにおけるモチーフの検索）；２．転写方向における予測Ｒｈｏ依存性転写ターミネーターの存在；及び３．ｔｒａｃｒＲＮＡと直接反復との間の安定なヘアピン二次構造。一部の実施形態では、これらの基準のうちの２つ、例えば、１及び２、２及び３、又は１及び３が使用され得る。一部の実施形態では、３つ全ての基準が使用され得る。

一部の実施形態では、キメラ合成ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の設計は、直接反復とｔｒａｃｒＲＮＡと間に少なくとも１２ｂｐの二重鎖構造を組み込むことができる。

本発明の好ましい実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ系はＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系であり、Ｃａｓ酵素は、ＤＮＡ切断を触媒するＣａｓ９である。化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来するＣａｓ９又は任意の近縁のＣａｓ９による酵素作用は、ガイド配列の２０ヌクレオチドにハイブリダイズしかつ標的配列の２０ヌクレオチドに続いてプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列（例としては、ＮＧＧ／ＮＲＧ又は本明細書に記載されるとおり決定され得るＰＡＭが挙げられる）を有する標的部位配列に二本鎖切断を生じさせる。部位特異的ＤＮＡ認識及び切断のためのＣａｓ９を介したＣＲＩＳＰＲ活性は、ガイド配列、一部がガイド配列にハイブリダイズするｔｒａｃｒ配列及びＰＡＭ配列によって規定される。ＣＲＩＳＰＲ系のさらなる態様が、Ｋａｒｇｉｎｏｖ ａｎｄ Ｈａｎｎｏｎ，「ＣＲＩＳＰＲ系：細菌及び古細菌における低分子ＲＮＡガイド防御（Ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ ｓｙｓｔｅｍ：ｓｍａｌｌ ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｄｅｆｅｎｃｅ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ ａｒｃｈａｅａ）」，Ｍｏｌｅ Ｃｅｌｌ ２０１０，Ｊａｎｕａｒｙ １５；３７（１）：７に記載される。

化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＳＦ３７０由来のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座、これは、４つの遺伝子Ｃａｓ９、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、及びＣｓｎ１のクラスター、並びに２つの非コードＲＮＡエレメント、ｔｒａｃｒＲＮＡ及び短い一続きの非反復配列（スペーサー、各約３０ｂｐ）が間に置かれた反復配列（直接反復）の特徴的アレイを含む。この系では、標的化されたＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）が４段階の逐次的なステップで作成される（図２Ａ）。第１に、２つの非コードＲＮＡ、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡアレイ及びｔｒａｃｒＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される。第２に、ｔｒａｃｒＲＮＡがｐｒｅ−ｃｒＲＮＡの直接反復にハイブリダイズし、次にはこれがプロセシングされて、個々のスペーサー配列を含む成熟ｃｒＲＮＡとなる。第３に、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体が、ｃｒＲＮＡのスペーサー領域とプロトスペーサーＤＮＡとの間のヘテロ二重鎖形成によって、プロトスペーサー及び対応するＰＡＭからなるＤＮＡ標的にＣａｓ９を仕向ける。最後に、Ｃａｓ９がＰＡＭの上流で標的ＤＮＡの切断を媒介することにより、プロトスペーサー内にＤＳＢが作り出される（図２Ａ）。図２Ｂは、コドン最適化Ｃａｓ９の核局在を実証する。正確な転写開始を促進するため、ｔｒａｃｒＲＮＡの発現の駆動にＲＮＡポリメラーゼＩＩＩベースのＵ６プロモーターが選択された（図２Ｃ）。同様に、単一のスペーサーと、それに隣接する２つの直接反復（ＤＲ、用語「ｔｒａｃｒ−ｍａｔｅ配列」にも包含される；図２Ｃ）からなるｐｒｅ−ｃｒＲＮＡアレイを発現させるため、Ｕ６プロモーターベースの構築物が開発された。初期のスペーサーは、大脳皮質の発生に重要な遺伝子であるヒトＥＭＸ１遺伝子座における３３塩基対（ｂｐ）の標的部位（３０ｂｐプロトスペーサー＋Ｃａｓ９のＮＧＧ認識モチーフを満たす３ｂｐ ＣＲＩＳＰＲモチーフ（ＰＡＭ）配列）をターゲティングするように設計された（図２Ｃ）。

典型的には、内因性ＣＲＩＳＰＲ系に関連して、ＣＲＩＳＰＲ複合体（標的配列にハイブリダイズして１つ以上のＣａｓタンパク質と複合体を形成するガイド配列を含む）の形成により、標的配列中又はその近傍（例えば、標的配列からの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、２０、５０、又はそれよりも多い塩基対の範囲内）の一方又は両方の鎖が切断される。理論に拘束さることを望むものではないが、ｔｒａｃｒ配列は、野生型ｔｒａｃｒ配列の全て若しくは一部を含む又はこの全て若しくは一部（例えば、野生型ｔｒａｃｒ配列の約２０、約２６、約３２、約４５、約４８、約５４、約６３、約６７、約８５、若しくはそれよりも多い、又は約２０を超える、約２６を超える、約３２を超える、約４５を超える、約４８を超える、約５４を超える、約６３を超える、約６７を超える、約８５を超える、若しくはそれよりも多いヌクレオチド）からなり得、かつ、例えば、ｔｒａｃｒ配列の少なくとも一部に沿った、ガイド配列に機能的に連結されたｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列の全て又は一部へのハイブリダイゼーションによってＣＲＩＳＰＲ複合体の一部も形成し得る。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントの発現を駆動する１つ以上のベクターを、ＣＲＩＳＰＲ系のエレメントの発現が１つ以上の標的部位でのＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を誘導するように宿主細胞に導入する。例えば、Ｃａｓ酵素、ｔｒａｃｒ−ｍａｔｅ配列に連結されたガイド配列、及びｔｒａｃｒ配列はそれぞれ、別個のベクターにおける別個の調節エレメントに機能的に連結され得る。或いは、同じ又は異なる調節エレメントから発現される２つ以上のエレメントを、単一ベクター中で、この第１のベクターに含まれていないＣＲＩＳＰＲ系のあらゆる構成成分を提供する１つ以上の追加のベクターを用いて組み合わせることができる。単一ベクター中で組み合わせられるＣＲＩＳＰＲ系のエレメントは、任意の適切な向き、例えば、１つのエレメントが、第２のエレメントに対して５’側（第２のエレメントの上流）に配置する、又は３’側（第２のエレメントの下流）に配置することができる。１つのエレメントのコード配列を、第２のエレメントのコード配列の同じ鎖又は反対の鎖上に配置し、かつ同じ方向又は反対の方向に向けることができる。一部の実施形態では、単一プロモーターが、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする転写物、並びに１つ以上のイントロン配列内に組み込まれた（例えば、それぞれが異なるイントロン内にある、２つ以上が少なくとも１つのイントロン内にある、又は全てが単一イントロン内にある）ガイド配列、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列（任意にガイド配列に機能的に連結される）、及びｔｒａｃｒ配列の１つ以上の発現を駆動する。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素、ガイド配列、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、及びｔｒａｃｒ配列は、同じプロモーターに機能的に連結され、この同じプロモーターから発現される。

一部の実施形態では、ベクターは、１つ以上の挿入部位、例えば、制限エンドヌクレオチドアーゼ認識配列（「クローニング」部位とも呼ばれる）を含む。一部の実施形態では、１つ以上の挿入部位（例えば、約１つ、約２つ、約３つ、約４つ、約５つ、約６つ、約７つ、約８つ、約９つ、約１０、若しくはそれよりも多い、又は約１つを超える、約２つを超える、約３つを超える、約４つを超える、約５つを超える、約６つを超える、約７つを超える、約８つを超える、約９つを超える、約１０を超える、若しくはそれよりも多い挿入部位）が、１つ以上のベクターの１つ以上の配列エレメントの上流及び／又は下流に位置している。一部の実施形態では、ベクターは、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列の上流の挿入部位、及び任意に、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に機能的に連結された調節エレメントの下流の挿入部位を含み、これにより、ガイド配列の挿入部位への挿入後の発現時に、ガイド配列が、ＣＲＩＳＰＲ複合体の真核細胞内の標的配列への配列特異的結合を誘導する。一部の実施形態では、ベクターは、２つ以上の挿入部位を含む、各挿入部位は、各部位でのガイド配列の挿入が可能となるように２つのｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列間に位置する。このような配置では、２つ以上のガイド配列は、単一ガイド配列の２つ以上のコピー、２つ以上の異なるガイド配列、又はこれらの組み合わせを含み得る。複数の異なるガイド配列が使用される場合、単一発現構築物を使用して、細胞内の複数の異なる、対応する標的配列に対してＣＲＩＳＰＲ活性を標的とするようにすることができる。例えば、単一ベクターは、約１つ、約２つ、約３つ、約４つ、約５つ、約６つ、約７つ、約８つ、約９つ、約１０、約１５、約２０、若しくはそれよりも多い、又は約１つを超える、約２つを超える、約３つを超える、約４つを超える、約５つを超える、約６つを超える、約７つを超える、約８つを超える、約９つを超える、約１０を超える、約１５を超える、約２０を超える、若しくはそれよりも多いガイド配列を含み得る。一部の実施形態では、約１つ、約２つ、約３つ、約４つ、約５つ、約６つ、約７つ、約８つ、約９つ、約１０、若しくはそれよりも多い、又は約１つを超える、約２つを超える、約３つを超える、約４つを超える、約５つを超える、約６つを超える、約７つを超える、約８つを超える、約９つを超える、約１０を超える、若しくはそれよりも多いこのようなガイド配列を含むベクターを提供し、任意に細胞に送達することができる。

一部の実施形態では、ベクターは、Ｃａｓタンパク質などのＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に機能的に連結された調節エレメントを含む。Ｃａｓタンパク質の非限定的な例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２としても知られている）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、これらのホモログ、又はこれらの修飾型が挙げられる。一部の実施形態では、非修飾ＣＲＩＳＰＲ酵素、例えば、Ｃａｓ９は、ＤＮＡ切断活性を有する。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の位置、例えば、標的配列内及び／又は標的配列の相補体内の一方又は両方の鎖の切断を誘導する。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の最初又は最後のヌクレオチドから、約１つ、約２つ、約３つ、約４つ、約５つ、約６つ、約７つ、約８つ、約９つ、約１０、約１５、約２０、約２５、約５０、約１００、約２００、約５００、又はそれよりも多い塩基対以内の一方又は両方の鎖の切断を誘導する。一部の実施形態では、ベクターは、突然変異ＣＲＩＳＰＲ酵素が標的配列を含む標的ポリヌクレオチドの一方又は両方の鎖を切断する能力を喪失するように、対応する野生型酵素に対して突然変異したＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする。例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９のＲｕｖＣ Ｉ触媒ドメインにおけるアスパラギン酸のアラニンへの置換（Ｄ１０Ａ）は、Ｃａｓ９を両方の鎖を切断するヌクレアーゼからニッカーゼ（一本鎖を切断する）に変換する。Ｃａｓ９をニッカーゼにする突然変異の他の例として、限定されるものではないが、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、及びＮ８６３Ａが挙げられる。さらなる例として、Ｃａｓ９の２つ以上の触媒ドメイン（ＲｕｖＣ Ｉ、ＲｕｖＣ ＩＩ、及びＲｕｖＣ ＩＩＩ、又はＨＮＨドメイン）は、全てのＤＮＡ切断活性を実質的に失った突然変異Ｃａｓ９を作製するために突然変異させることができる。一部の実施形態では、Ｄ１０Ａ突然変異を、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、又はＮ８６３Ａ突然変異の１つ以上と組み合わせて、全てのＤＮＡ切断活性を実質的に失ったＣａｓ９酵素を作製する。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、突然変異酵素のＤＮＡ切断活性が、その非突然変異型のＤＮＡ切断活性の約２５％未満、約１０％未満、約５％未満、約１％未満、約０．１％未満、約０．０１％未満、又はそれよりも低い場合に、全てのＤＮＡ切断活性を実質的に喪失していると見なされる；例えば、突然変異酵素のＤＮＡ切断活性がその酵素の非突然変異型のＤＮＡ切断活性の￥約２５％以下、約１０％以下、約５％以下、約１％以下、約０．１％以下、約０．０１％以下、又はそれより低い場合であり；一例は、突然変異型のＤＮＡ切断活性が皆無である、又は非突然変異型と比べて無視できる場合、例えば、本明細書で議論されるようにＣａｓ９Ｈ８４０Ａの場合と同様にインデル形成が全く観察されない場合であり得る。酵素がＳｐＣａｓ９でない場合は、突然変異は、ＳｐＣａｓ９の１０位、７６２位、８４０位、８５４位、８６３位、及び／又は９８６位に対応するいずれか又は全ての残基において生じ得る（例えば、標準的な配列比較ツールによって確認され得る）。特に、以下の突然変異のいずれか又は全ては、ＳｐＣａｓ９において好ましい：Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ及び／又はＤ９８６Ａ；及び置換アミノ酸のいずれかの保存的置換も想定される。他のＣａｓ９の対応する位置でのこれらの突然変異の同じ置換（又はこれらの突然変異の保存的な置換）も好ましい。特に好ましいのは、ＳｐＣａｓ９におけるＤ１０及びＨ８４０である。しかしながら、他のＣａｓ９では、ＳｐＣａｓ９Ｄ１０及びＨ８４０に対応する残基が同様に好ましい。

ＳｐＣａｓ９のＲｕｖＣ Ｉ触媒ドメインにおけるアスパラギン酸からアラニンへの置換（Ｄ１０Ａ）をエンジニアリングしてヌクレアーゼをニッカーゼに変換し（ＳｐＣａｓ９ｎ）（例えば、Ｓａｐｒａｎａｕｓｋａｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３９：９２７５；Ｇａｓｉｕｎａｓ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０９：Ｅ２５７９を参照）、ニッキングされたゲノムＤＮＡが高忠実性相同組換え修復（ＨＤＲ）を起こすようにした。Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイにより、ＳｐＣａｓ９ｎがＥＭＸ１プロトスペーサー標的にインデルを生成しないことが確認された。ＥＭＸ１ターゲティングキメラｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ構成成分も同様に有する）をＳｐＣａｓ９と同時発現させると標的部位にインデルが生じたが、ＳｐＣａｓ９ｎとの同時発現では生じなかった（ｎ＝３）。さらに、３２７個のアンプリコンのシークエンシングでは、ＳｐＣａｓ９ｎによって誘導されたインデルは検出されなかった。同じ遺伝子座を選択して、ＥＭＸ１を標的とするキメラＲＮＡ、ｈＳｐＣａｓ９又はｈＳｐＣａｓ９ｎ、並びに制限部位（ＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｈｅＩ）の対をプロトスペーサー近傍に導入するためのＨＲ鋳型をＨＥＫ２９３ＦＴ細胞にコトランスフェクトすることにより、ＣＲＩＳＰＲ媒介性ＨＲを試験した。

好ましいオルソログは以下で議論される。Ｃａｓ酵素は、これがＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系からの複数のヌクレアーゼドメインを有する最大ヌクレアーゼに対する相同性を共有する一般的なクラスの酵素を指すことができるときにＣａｓ９と同定され得る。最も好ましくは、Ｃａｓ９酵素はｓｐＣａｓ９（化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９）又はｓａＣａｓ９（黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９）からのものである、或いはこれらに由来する。由来とは、本出願人によると、由来酵素が、野生型酵素と高度の配列相同性を有するという意味で大部分は野生型酵素に基づいているが、本明細書に記載されるように何らかの方法で突然変異（改変）されていることを意味する。

他に明白でない限り、Ｃａｓ及びＣＲＩＳＰＲ酵素という用語が一般に本明細書では互換的に使用されることは認識されるであろう。上述のように、本明細書で使用される残基の付番の多くは化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座由来のＣａｓ９酵素を参照する。しかしながら、本発明がＳｐＣａｓ９、ＳａＣａ９、Ｓｔ１Ｃａｓ９など、他の微生物種由来のさらに多くのＣａｓ９を含むことは認識されるであろう。

コドン最適化
コドン最適化配列の一例は、この場合にはヒトに最適化されている（即ち、ヒトでの発現に最適化されている）が、本明細書において提供されている（ＳａＣａｓ９ヒトコドン最適化配列を参照）。これが好ましいが、他の例も可能であることは認識されるであろう。そして、ヒト以外の宿主種に対するコドン最適化、又は脳などの特定の臓器に対するコドン最適化は既知である。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列は、特定の細胞、例えば真核細胞での発現が最適化されたコドンである。真核細胞は、ヒトを含むがこれらに限定されない哺乳類、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、又は非ヒト哺乳類又は霊長類などの特定の生物のものであるか、或いはこれらに由来し得る。一部の実施形態では、ヒト又は動物に対する実質的な医学的利点を伴わずにヒト又は動物を苦しませる可能性の高い、ヒトの生殖細胞株の遺伝的同一性を変更するプロセス及び／又は動物の遺伝的同一性を変更するプロセス、並びにこのようなプロセスから生じる動物も排除され得る。

一般に、コドン最適化は、天然アミノ酸配列を維持しながら、天然配列の少なくとも１つのコドン（例えば、約１つ、約２つ、約３つ、約４つ、約５つ、約１０、約１５、約２０、約２５、約５０、若しくはそれよりも多い、又は約１つを超える、約２つを超える、約３つを超える、約４つを超える、約５つを超える、約１０を超える、約１５を超える、約２０を超える、約２５を超える、約５０を超える、それよりも多いコドン）を、その宿主細胞の遺伝子中でより高頻度に又は最も高頻度に使用されるコドンで置き換えことにより、目的の宿主細胞での発現を高めるために核酸配列を改変するプロセスを指す。様々な種は、特定のアミノ酸のあるコドンに対して特定のバイアスを示す。コドンバイアス（生物間のコドン使用頻度の差）は、しばしば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳の効率に相関し、次にこれは、とりわけ、翻訳されるコドンの特性及び特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられる。細胞における選択されるｔＲＮＡの優位性は、一般に、ペプチド合成において最も高頻度で使用されるコドンの反映である。従って、遺伝子は、コドン最適化に基づいて所与の生物での最適な遺伝子発現のために調整することができる。コドン使用頻度表は、例えば、ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒｊｐ／ｃｏｄｏｎ／（２００２年７月９日に訪問）で得られる「コドン使用頻度データベース」において入手可能であり、これらの表は、多数の方法で適合させることができる。Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．“Ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｔａｂｕｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅｓ：ｓｔａｔｕｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｙｅａｒ ２０００”Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２９２（２０００）を参照されたい。特定の宿主細胞での発現のために特定の配列をコドン最適化するためのコンピュータアルゴリズムも入手可能であり、例えば、Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｇｅ（Ａｐｔａｇｅｎ；Ｊａｃｏｂｕｓ，ＰＡ）も入手可能である。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列の１つ以上のコドン（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、１０、１５、２０、２５、５０、若しくはそれよりも多い、又は全てのコドン）は、特定のアミノ酸に対して最も高頻度で使用されるコドンに対応する。

核局在化配列（ＮＬＳ）
一部の実施形態では、ベクターは、１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）、例えば、約１つ、約２つ、約３つ、約４つ、約５つ、約６つ、約７つ、約８つ、約９つ、約１０、若しくはそれよりも多い、又は約１つを超える、約２つを超える、約３つを超える、約４つを超える、約５つを超える、約６つを超える、約７つを超える、約８つを超える、約９つを超える、約１０を超える、若しくはそれよりも多いＮＬＳを含むＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、アミノ末端又はその近傍に約１つ、約２つ、約３つ、約４つ、約５つ、約６つ、約７つ、約８つ、約９つ、約１０、若しくはそれよりも多い、又は約１つを超える、約２つを超える、約３つを超える、約４つを超える、約５つを超える、約６つを超える、約７つを超える、約８つを超える、約９つを超える、約１０を超える、若しくはそれよりも多いＮＬＳ、カルボキシ末端又はその近傍に約１つ、約２つ、約３つ、約４つ、約５つ、約６つ、約７つ、約８つ、約９つ、約１０、若しくはそれよりも多い、又は約１つを超える、約２つを超える、約３つを超える、約４つを超える、約５つを超える、約６つを超える、約７つを超える、約８つを超える、約９つを超える、約１０を超える、若しくはそれよりも多いＮＬＳ、又はこれらの組合せ（例えば、アミノ末端における０又は少なくとも１つ以上のＮＬＳ、及びカルボキシ末端における０又は１つ以上のＮＬＳ）を含む。２つ以上のＮＬＳが存在する場合、それぞれは、単一ＮＬＳが２つ以上のコピー中に存在し得るように他から独立して、及び／又は１つ以上のコピー中に存在する１つ以上の他のＮＬＳとの組合せで選択することができる。本発明の好ましい一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、最大で６つのＮＬＳを含む。一部の実施形態では、ＮＬＳは、このＮＬＳの最も近いアミノ酸が、Ｎ末端又はＣ末端からポリペプチド鎖に沿って約１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、又はそれよりも多いアミノ酸の中にある場合に、Ｎ末端又はＣ末端の近傍であると見なされる。ＮＬＳの非限定的な例としては、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶを有するＳＶ４０ウイルスラージＴ抗原のＮＬＳ；ヌクレオプラスミンからのＮＬＳ（例えば、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫを有するヌクレオプラスミン二部（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）ＮＬＳ）；アミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ又はＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰを有するｃ−ｍｙｃ ＮＬＳ；配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹを有するｈＲＮＰＡ１ Ｍ９ ＮＬＳ；インポーチンαからのＩＢＢドメインの配列ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ；筋腫Ｔタンパク質の配列ＶＳＲＫＲＰＲＰ及びＰＰＫＫＡＲＥＤ；ヒトｐ５３の配列ＰＯＰＫＫＫＰＬ；マウスｃ−ａｂｌ ＩＶの配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ；インフルエンザウイルスＮＳ１の配列ＤＲＬＲＲ及びＰＫＱＫＫＲＫ；肝炎ウイルスΔ抗原の配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ；マウスＭｘ１タンパク質の配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ；ヒトポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼの配列ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ；並びにステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイドの配列ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫに由来するＮＬＳ配列が挙げられる。

一般に、１つ以上のＮＬＳは、真核細胞の核内に検出可能な量のＣＲＩＳＰＲ酵素を蓄積させるのに十分な強度である。一般に、核局在化活性の強度は、ＣＲＩＳＰＲ酵素中のＮＬＳの数、使用される特定のＮＬＳ（複数可）、又はそれらの因子の組合せから生じ得る。核内での蓄積の検出は、任意の好適な技術によって実施することができる。例えば、検出可能なマーカーをＣＲＩＳＰＲ酵素に融合させることができ、これにより、細胞内の位置を、例えば、核の位置を検出する手段（例えば、核に特異的な染色、例えば、ＤＡＰＩ）との組合せで可視化することができる。細胞核を細胞から単離することもでき、次いでその含有物を、タンパク質を検出する任意の好適なプロセス、例えば、免疫組織化学的分析、ウエスタンブロット、又は酵素活性アッセイによって分析することができる。核内での蓄積は、例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体形成の効果についてのアッセイ（例えば、標的配列におけるＤＮＡの切断若しくは突然変異についてのアッセイ、又はＣＲＩＳＰＲ複合体形成及び／若しくはＣＲＩＳＰＲ酵素活性の影響を受ける、変更された遺伝子発現活性についてのアッセイ）により、ＣＲＩＳＰＲ酵素にも複合体にも曝露されていない、又は１つ以上のＮＬＳが欠失したＣＲＩＳＰＲ酵素に曝露された対照と比較して、間接的に決定することもできる。

ガイド配列
一般に、ガイド配列は、標的配列とハイブリダイズし、標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を誘導するために標的ポリヌクレオチド配列との十分な相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列である。一部の実施形態において、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、好適なアラインメントアルゴリズムを使用して最適に整列された場合、約又は約５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％、又はそれよりも大きい数を超える。最適なアラインメントは、配列をアラインするための任意の好適なアルゴリズムを使用して決定することができ、その非限定的な例としては、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍをベースとするアルゴリズム（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ）、ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；ｗｗｗ．ｎｏｖｏｃｒａｆｔ．ｃｏｍにおいて入手可能）、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎにおいて入手可能）、及びＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔにおいて入手可能）が挙げられる。一部の実施形態において、ガイド配列は、約又は約５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５、又はそれよりも大きい数を超えるヌクレオチド長である。一部の実施形態において、ガイド配列は、約７５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１２、又はそれよりも小さい数未満のヌクレオチド長である。標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を誘導するガイド配列の能力は、任意の好適なアッセイにより評価することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するために十分なＣＲＩＳＰＲ系の構成成分、例として、試験すべきガイド配列は、対応する標的配列を有する宿主細胞に、例えば、ＣＲＩＳＰＲ配列の構成成分をコードするベクターによるトランスフェクションにより提供することができ、次いで標的配列内の優先的切断を例えば本明細書に記載のＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイにより評価する。同様に、標的ポリヌクレオチド配列の切断は、試験管中で標的配列、ＣＲＩＳＰＲ複合体の構成成分、例として、試験すべきガイド配列及び試験ガイド配列とは異なる対照ガイド配列を提供し、試験及び対照ガイド配列反応間の標的配列における結合又は切断の比率を比較することにより評価することができる。他のアッセイが考えられ、当業者はそれを認識する。

ガイド配列は、任意の標的配列をターゲティングするように選択することができる。一部の実施形態において、標的配列は、細胞のゲノム内の配列である。例示的な標的配列としては、標的ゲノム中でユニークなものが挙げられる。例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９について、ゲノム中のユニーク標的配列としては、フォームＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧのＣａｓ９標的部位を挙げることができ、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧ（Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｔ、又はＣであり；Ｘは、いずれでもよい）は、ゲノム中の単一発生を有する。ゲノム中のユニーク標的配列としては、フォームＭＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧの化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９標的部位を挙げることができ、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧ（Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｔ、又はＣであり；Ｘは、いずれであってもよい）は、ゲノム中の単一発生を有する。サーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ１Ｃａｓ９について、ゲノム中のユニーク標的配列としては、フォームＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＸＡＧＡＡＷのＣａｓ９標的部位を挙げることができ、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＸＡＧＡＡＷ（Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｔ、又はＣであり；Ｘは、いずれであってもよく；Ｗは、Ａ又はＴである）は、ゲノム中の単一発生を有する。ゲノム中のユニーク標的配列としては、フォームＭＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＸＡＧＡＡＷのサーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ１Ｃａｓ９標的部位を挙げることができ、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＸＡＧＡＡＷ（Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｔ、又はＣであり；Ｘは、いずれであってもよく；Ｗは、Ａ又はＴである）は、ゲノム中の単一発生を有する。化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９について、ゲノム中のユニーク標的配列としては、フォームＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧＸＧのＣａｓ９標的部位を挙げることができ、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧＸＧ（Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｔ、又はＣであり；Ｘは、いずれであってもよい）は、ゲノム中の単一発生を有する。ゲノム中のユニーク標的配列としては、フォームＭＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧＸＧの化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９標的部位を挙げることができ、ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧＸＧ（Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｔ、又はＣであり；Ｘは、いずれであってもよい）は、ゲノム中の単一発生を有する。これらの配列のそれぞれにおいて、「Ｍ」は、Ａ、Ｇ、Ｔ、又はＣであり得、配列をユニークと同定するにあたり考慮する必要はない。

一部の実施形態において、ガイド配列は、ガイド配列内の二次構造の程度を低減させるように選択される。一部の実施形態では、最適に折り畳まれたとき、ガイド配列のヌクレオチドの約７５％前後又はそれ未満、５０％、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、１％、又はそれ未満が、自己相補的塩基対合に関与する。最適な折り畳みは任意の好適なポリヌクレオチド折り畳みアルゴリズムによって決定され得る。一部のプログラムは、最小ギブズ自由エネルギーを計算することに基づく。１つのかかるアルゴリズムの例は、Ｚｕｋｅｒ ａｎｄ Ｓｔｉｅｇｌｅｒ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９（１９８１），１３３−１４８）により記載されるとおりのｍＦｏｌｄである。別の例示的な折り畳みアルゴリズムは、重心構造予測アルゴリズムを使用した、ウィーン大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｖｉｅｎｎａ）のＩｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙで開発されたオンラインウェブサーバーＲＮＡｆｏｌｄである（例えば、Ａ．Ｒ．Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｃｅｌｌ １０６（１）：２３−２４；及びＰＡ Ｃａｒｒ ａｎｄ ＧＭ Ｃｈｕｒｃｈ，２００９，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２７（１２）：１１５１−６２を参照）。

Ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列
一般に、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列は、（１）対応するｔｒａｃｒ配列を含有する細胞中でｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列により隣接されているガイド配列の切り出し；及び（２）標的配列におけるＣＲＩＳＰＲ複合体の形成（ＣＲＩＳＰＲ複合体は、ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列を含む）の１つ以上を促進するためにｔｒａｃｒ配列との十分な相補性を有する任意の配列を含む。一般に、相補性の程度は、２つの配列の短い方の長さに沿うｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列及びｔｒａｃｒ配列の最適なアラインメントに準拠する。最適なアラインメントは、任意の好適なアラインメントアルゴリズムにより決定することができ、二次構造、例えばｔｒａｃｒ配列又はｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列内の自己相補性をさらに説明し得る。一部の実施形態において、２つの短い方の長さに沿ったｔｒａｃｒ配列とｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列との間の相補性の程度は、最適に整列された場合、約又は約２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７．５％、９９％、又はそれよりも大きい数を超える。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒ配列は、約又は約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、又はそれよりも大きい数を超えるヌクレオチド長である。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒ配列及びｔｒａｃｔメイト配列は、単一転写物内に含有され、その結果、２つの間のハイブリダイゼーションが二次構造、例えば、ヘアピンを有する転写物を産生する。本発明の一実施形態において、転写物又は転写されるポリヌクレオチド配列は、少なくとも２つ以上のヘアピンを有する。好ましい実施形態において、転写物は、２、３、４又は５つのヘアピンを有する。本発明の別のさらなる実施形態において、転写物は、多くとも５つのヘアピンを有する。ヘアピン構造において、最後の「Ｎ」及びループの上流の５’側の配列の部分は、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に対応し、ループの３’側の配列の部分は、ｔｒａｃｒ配列に対応する。ガイド配列、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、及びｔｒａｃｒ配列を含む単一ポリヌクレオチドのさらなる非限定的な例は、以下のとおりであり（５’から３’に列記）、「Ｎ」は、ガイド配列の塩基を表し、第１の小文字のブロックは、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列を表し、第２の小文字のブロックは、ｔｒａｃｒ配列を表し、最後のポリＴ配列は、転写ターミネーターを表す：
（１）ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮｇｔｔｔｔｔｇｔａｃｔｃｔｃａａｇａｔｔｔａＧＡＡＡｔａａａｔｃｔｔｇｃａｇａａｇｃｔａｃａａａｇａｔａａ ｇｇｃｔｔｃａｔｇｃｃｇａａａｔｃａａｃａｃｃｃｔｇｔｃａｔｔｔｔａｔｇｇｃａｇｇｇｔｇｔｔｔｔｃｇｔｔａｔｔｔａａＴＴＴＴＴＴ；（２）ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮｇｔｔｔｔｔｇｔａｃｔｃｔｃａＧＡＡＡｔｇｃａｇａａｇｃｔａｃａａａｇａｔａａｇｇｃｔｔｃａｔｇｃｃｇ ａａａｔｃａａｃａｃｃｃｔｇｔｃａｔｔｔｔａｔｇｇｃａｇｇｇｔｇｔｔｔｔｃｇｔｔａｔｔｔａａＴＴＴＴＴＴ；（３）ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮｇｔｔｔｔｔｇｔａｃｔｃｔｃａＧＡＡＡｔｇｃａｇａａｇｃｔａｃａａａｇａｔａａｇｇｃｔｔｃａｔｇｃｃｇ ａａａｔｃａａｃａｃｃｃｔｇｔｃａｔｔｔｔａｔｇｇｃａｇｇｇｔｇｔＴＴＴＴＴＴ；（４）ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａＧＡＡＡｔａｇｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａａｃｔｔ ｇａａａａａｇｔｇｇｃａｃｃｇａｇｔｃｇｇｔｇｃＴＴＴＴＴＴ；（５）ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａＧＡＡＡＴＡＧｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａａｃ ｔｔｇａａａａａｇｔｇＴＴＴＴＴＴＴ；及び（６）ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａｇＡＡＡＴＡＧｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａＴＴ ＴＴＴＴＴＴ。一部の実施形態において、配列（１）から（３）は、サーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ１からのＣａｓ９との組合せで使用される。一部の実施形態において、配列（４）から（６）は、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９との組合せで使用される。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒ配列は、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列を含む転写物と別個の転写物である。

組換え鋳型
一部の実施形態では、組換え鋳型も提供される。組換え鋳型は、別個のベクターに含まれる又は別個のポリヌクレオチドとして提供される、本明細書に記載される別のベクターの構成成分であり得る。一部の実施形態では、組換え鋳型は、例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体の一部としてＣＲＩＳＰＲ酵素によってニッキング又は切断される標的配列内又はその近傍の相同組換えにおける鋳型として役立つように設計される。鋳型ポリヌクレオチドは、任意の適切な長さ、例えば、約１０、約１５、約２０、約２５、約５０、約７５、約１００、約１５０、約２００、約５００、約１０００、若しくはそれを超える、又は約１０を超える、約１５を超える、約２０を超える、約２５を超える、約５０を超える、約７５を超える、約１００を超える、約１５０を超える、約２００を超える、約５００を超える、約１０００を超える、若しくはそれを超えるヌクレオチド長であり得る。一部の実施形態では、鋳型ポリヌクレオチドは、標的配列を含むポリヌクレオチドの一部に相補的である。最適に整列されると、鋳型ポリヌクレオチドは、標的配列の１つ以上のヌクレオチド（例えば、約１、約５、約１０、約１５、約２０、若しくはそれよりも多い、又は約１を超える、約５を超える、約１０を超える、約１５を超える、約２０を超える、若しくはそれよりも多いヌクレオチド）と重複する可能性がある。一部の実施形態では、鋳型配列と、標的配列を含むポリヌクレオチドとが最適に整列されると、鋳型ポリヌクレオチドの最も近いヌクレオチドは、標的配列から約１つ以内、約５つ以内、約１０以内、約１５以内、約２０以内、約２５以内、約５０以内、約７５以内、約１００以内、約２００以内、約３００以内、約４００以内、約５００以内、約１０００以内、約５０００以内、約１００００以内、若しくはそれを超えるヌクレオチドの範囲内である。

融合タンパク質
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、１つ以上のヘテロタンパク質ドメイン（例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素に加えて、約１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、若しくはそれ以上の、又は約１つを超える、２つを超える、３つを超える、４つを超える、５つを超える、６つを超える、７つを超える、８つを超える、９つを超える、１０を超える、ドメイン）を含む融合タンパク質の一部である。ＣＲＩＳＰＲ酵素融合タンパク質は、任意の追加のタンパク質配列、及び任意の２つのドメイン間のリンカー配列を含み得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素に融合し得るタンパク質ドメインの例として、限定されるものではないが、エピトープタグ、受容体遺伝子配列、並びに次の活性：メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ開裂活性、及び核酸結合活性の１つ以上を有するタンパク質ドメインが挙げられる。エピトープタグの非限定的な例としては、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ−Ｇタグ、及びチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグが挙げられる。レポーター遺伝子の例としては、限定されるものではないが、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、及び青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を含む自己蛍光タンパク質が挙げられる。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ−タグ、Ｌｅｘ Ａ ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）融合体、ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメイン融合体、及び単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＢＰ１６タンパク質融合体を含む、ＤＮＡ分子又は他の細胞分子に結合するタンパク質又はタンパク質の断片をコードする遺伝子配列に融合させることができる。ＣＲＩＳＰＲ酵素を含む融合タンパク質の一部を形成し得る追加のドメインは、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２０１１００５９５０２号明細書に記載されている。一部の実施形態では、タグ化ＣＲＩＳＰＲ酵素を使用して標的配列の局在を同定する。

誘導系
一部の態様では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、誘導系の構成成分を形成し得る。この系の誘導性は、あるエネルギー形態を用いて遺伝子編集又は遺伝子発現の時空制御を可能にするであろう。このエネルギー形態には、限定されるものではないが、電磁放射線、音波エネルギー、化学エネルギー、及び熱エネルギーが含まれ得る。誘導系の例として、テトラサイクリン誘導プロモーター（Ｔｅｔ−Ｏｎ又はＴｅｔ−Ｏｆｆ）、小分子２ハイブリッド転写活性化系（ＦＫＢＰ、ＡＢＡなど）、又は光誘導系（ファイトクロム、ＬＯＶドメイン、又はクリプトクロム）が挙げられる。一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、配列特異的に転写活性に変化を誘導する光誘導性転写エフェクター（ＬＩＴＥ）の一部であり得る。光の構成成分は、ＣＲＩＳＰＲ酵素、光応答性シトクロムヘテロ二量体（例えば、シロイヌナズナからの）、及び転写活性化／抑制ドメインを含み得る。誘導性ＤＮＡ結合タンパク質及びその使用方法のさらなる例は、それぞれ参照により全開示内容が本明細書に組み入れられる米国仮特許出願第６１／７３６４６５号明細書及び同第６１／７２１，２８３号明細書に記載されている。

送達
本発明は、少なくとも１つのナノ粒子複合体によって送達されるＣＲＩＳＰＲ複合体の少なくとも１つの構成成分、例えばＲＮＡを伴う。一部の態様では、本発明は、１つ以上のポリヌクレオチド、例えば、又は本明細書に記載の１つ以上のベクター、１つ以上のその転写物、及び／又はそれから転写された１つ又はタンパク質を宿主細胞に送達することを含む方法を提供する。一部の態様において、本発明は、そのような細胞により産生された細胞、及びそのような細胞を含み、又はそれから産生された動物をさらに提供する。一部の実施形態において、ガイド配列との組合せの（及び場合によりそれと複合体形成している）ＣＲＩＳＰＲ酵素を細胞に送達する。従来のウイルス及び非ウイルスベース遺伝子導入法を使用して核酸を哺乳動物細胞又は標的組織中に導入することができる。このような方法を使用してＣＲＩＳＰＲ系の構成成分をコードする核酸を培養物中の細胞に、又は宿主生物中に投与することができる。非ウイルスベクター送達系としては、ＤＮＡプラスミド、ＲＮＡ（例えば、本明細書に記載のベクターの転写物）、ネイキッド核酸、及び送達ビヒクル、例えば、リポソームと複合体形成している核酸が挙げられる。ウイルスベクター送達系としては、細胞への送達後にエピソーム性又は組み込まれるゲノムを有するＤＮＡ及びＲＮＡウイルスが挙げられる。遺伝子療法手順の概要については、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：８０８−８１３（１９９２）；Ｎａｂｅｌ＆Ｆｅｌｇｎｅｒ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：２１１−２１７（１９９３）；Ｍｉｔａｎｉ＆Ｃａｓｋｅｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６２−１６６（１９９３）；Ｄｉｌｌｏｎ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６７−１７５（１９９３）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５−４６０（１９９２）；Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６（１０）：１１４９−１１５４（１９８８）；Ｖｉｇｎｅ，Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ８：３５−３６（１９９５）；Ｋｒｅｍｅｒ＆Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ５１（１）：３１−４４（１９９５）；Ｈａｄｄａｄａ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｄｏｅｒｆｌｅｒ ａｎｄ Ｂｏｅｈｍ（ｅｄｓ）（１９９５）；及びＹｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：１３−２６（１９９４）が参照される。

核酸の非ウイルス送達の方法としては、リポフェクション、マイクロインジェクション、遺伝子銃、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオン又は脂質：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、及び薬剤により向上されるＤＮＡの取り込みが挙げられる。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号明細書、同第４，９４６，７８７号明細書；及び同第４，８９７，３５５号明細書）に記載されており、リポフェクション試薬は、市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ^ＴＭ及びＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ^ＴＭ）。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに好適なカチオン及び中性脂質としては、Ｆｅｌｇｎｅｒ、国際公開第９１／１７４２４号パンフレット；国際公開第９１／１６０２４号パンフレットのものが挙げられる。送達は、細胞（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏ投与）又は標的組織（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ投与）に対するものであり得る。

免疫脂質複合体などの標的リポソームを含む脂質：核酸複合体の調製は、当業者に周知である（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４０４−４１０（１９９５）；Ｂｌａｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：２９１−２９７（１９９５）；Ｂｅｈｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：３８２−３８９（１９９４）；Ｒｅｍｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：６４７−６５４（１９９４）；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７１０−７２２（１９９５）；Ａｈｍａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：４８１７−４８２０（１９９２）；米国特許第４，１８６，１８３号明細書、同第４，２１７，３４４号明細書、同第４，２３５，８７１号明細書、同第４，２６１，９７５号明細書、同第４，４８５，０５４号明細書、同第４，５０１，７２８号明細書、同第４，７７４，０８５号明細書、同第４，８３７，０２８号明細書、及び同第４，９４６，７８７号明細書を参照）。

核酸の送達のためのＲＮＡ又はＤＮＡウイルスベース系の使用は、ウイルスを体内の規定の細胞にターゲティングし、ウイルスペイロードを核に輸送する高度に進化したプロセスを利用する。ウイルスベクターは、患者に直接投与することができ（ｉｎ ｖｉｖｏ）、又はそれらを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞を治療することができ、場合により、改変された細胞を患者に投与することができる（ｅｘ ｖｉｖｏ）。従来のウイルスベース系としては、遺伝子導入のためのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴及び単純ヘルペスウイルスベクターを挙げることができる。宿主ゲノム中の組込みは、レトロウイルス、レンチウイルス、及びアデノ随伴ウイルス遺伝子導入法について考えられ、挿入された導入遺伝子の長期発現をもたらすことが多い。さらに、高い形質導入効率が多くの異なる細胞タイプ及び標的組織において観察されている。

レトロウイルスの向性は、外来エンベロープタンパク質を取り込むことにより変え、標的細胞の潜在的な標的集団を拡大することができる。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞に形質導入又は感染し、通常は高ウイルス力価を産生し得るレトロウイルスベクターである。従って、レトロウイルス遺伝子導入系の選択は、標的組織に依存し得る。レトロウイルスベクターは、６〜１０ｋｂまでの外来配列のためのパッケージング能を有するシス作用性の長い末端反復配列で構成される。ベクターの複製及びパッケージングには、最小のシス作用性ＬＴＲが十分であり、次にこれを使用して治療遺伝子を標的細胞中に組み込んで、永続的な導入遺伝子発現を提供する。広く使用されるレトロウイルスベクターとしては、ネズミ白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）をベースとするもの、及びこれらの組合せが挙げられる（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２７３１−２７３９（１９９２）；Ｊｏｈａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１６３５−１６４０（１９９２）；Ｓｏｍｍｎｅｒｆｅｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．１７６：５８−５９（１９９０）；Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４−２３７８（１９８９）；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０−２２２４（１９９１）；国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００号明細書を参照）。

別の実施形態において、コーカル（Ｃｏｃａｌ）ベシクロウイルスエンベロープ偽型レトロウイルスベクター粒子が企図される（例えば、フレッド・ハッチンソン癌研究センター（Ｆｒｅｄ Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ）に譲渡された米国特許出願公開第２０１２０１６４１１８号明細書を参照のこと）。コーカルウイルスはベシクロウイルス属（Ｖｅｓｉｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）であり、哺乳動物における水疱性口内炎の原因病原体である。コーカルウイルスは、当初はトリニダードでダニから分離されたもので（Ｊｏｎｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．２５：２３６−２４２（１９６４））、トリニダード、ブラジル、及びアルゼンチンで昆虫、ウシ、及びウマから感染が同定されている。哺乳動物に感染するベシクロウイルスの多くは、自然感染した節足動物から分離されており、それがベクター媒介性であることが示唆される。ベシクロウイルスに対する抗体は農村地域に住む人々によく見られ、そこではこのウイルスが地方病性であり、実験室内感染性である；ヒトにおける感染は、通常はインフルエンザ様症状をもたらす。コーカルウイルスエンベロープ糖タンパク質はアミノ酸レベルでＶＳＶ−Ｇインディアナと７１．５％の同一性を共有し、ベシクロウイルスのエンベロープ遺伝子の系統発生学的比較では、ベシクロウイルスの中でコーカルウイルスがＶＳＶ−Ｇインディアナ株と血清学的には異なるが、最も近縁であることが示される。Ｊｏｎｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．２５：２３６−２４２（１９６４）及びＴｒａｖａｓｓｏｓ ｄａ Ｒｏｓａ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｍｅｄ．＆ Ｈｙｇｉｅｎｅ ３３：９９９−１００６（１９８４）。コーカルベシクロウイルスエンベロープ偽型レトロウイルスベクター粒子には、例えば、レトロウイルスのＧａｇ、Ｐｏｌ、及び／又は１つ以上のアクセサリータンパク質及びコーカルベシクロウイルスエンベロープタンパク質を含み得るレンチウイルス、アルファレトロウイルス、ベータレトロウイルス、ガンマレトロウイルス、デルタレトロウイルス、及びイプシロンレトロウイルスベクター粒子が含まれ得る。これらの実施形態の特定の態様の範囲内において、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、及びアクセサリータンパク質はレンチウイルス及び／又はガンマレトロウイルスのものである。

一過的発現が好ましい用途では、アデノウイルスベースの系を使用することができる。アデノウイルスベースのベクターは、多くの細胞タイプにおいて極めて高い形質導入効率を示すことができ、細胞分裂を要求しない。このようなベクターについて、高い力価及び発現のレベルが得られている。このベクターは、比較的単純な系で大量に産生することができる。

例えば、核酸及びペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ産生において、並びにｉｎ ｖｉｖｏ及びｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子療法手順のためにアデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターを使用して細胞に標的核酸を形質導入することもできる（例えば、Ｗｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６０：３８−４７（１９８７）；米国特許第４，７９７，３６８号明細書；国際公開第９３／２４６４１号パンフレット；Ｋｏｔｉｎ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３−８０１（１９９４）；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１３５１（１９９４）を参照されたい。組換えＡＡＶベクターの構築は、多数の刊行物、例として、米国特許第５，１７３，４１４号明細書；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１−３２６０（１９８５）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２−２０８１（１９８４）；Ｈｅｒｍｏｎａｔ＆Ｍｕｚｙｃｚｋａ，ＰＮＡＳ ８１：６４６６−６４７０（１９８４）；及びＳａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：０３８２２−３８２８（１９８９）に記載されている。

パッケージング細胞は、典型的には、宿主細胞に感染することができるウイルス粒子を形成するために使用される。このような細胞としては、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、及びレトロウイルスをパッケージングするΨ２細胞又はＰＡ３１７細胞が挙げられる。遺伝子療法において使用されるウイルスベクターは、通常、核酸ベクターをウイルス粒子中にパッケージングする細胞株を産生することにより生成される。ベクターは、典型的には、パッケージング及びそれに続く宿主中への組込みに要求される最小ウイルス配列を含有し、他のウイルス配列は、発現させるべきポリヌクレオチドのための発現カセットにより置き換えられている。欠損ウイルス機能は、典型的には、パッケージング細胞株によりトランスで供給する。例えば、遺伝子療法において使用されるＡＡＶベクターは、典型的には、宿主ゲノム中へのパッケージング及び組込みに要求されるＡＡＶゲノムからのＩＴＲ配列のみを有する。ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子、即ち、ｒｅｐ及びｃａｐをコードするが、ＩＴＲ配列を欠くヘルパープラスミドを含有する細胞株中にパッケージングされる。細胞株は、ヘルパーとしてのアデノウイルスにより感染させることもできる。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製及びヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列の欠如に起因して顕著な量でパッケージングされない。アデノウイルスによる汚染は、例えば、アデノウイルスがＡＡＶよりも感受性である熱処理により低減させることができる。

従って、ＡＡＶは形質導入ベクターとして使用するのに理想的な候補と考えられる。かかるＡＡＶ形質導入ベクターは、トランスに提供されるアデノウイルス又はヘルペスウイルス又はポックスウイルス（例えば、ワクシニアウイルス）ヘルパー機能の存在下で複製するのに十分なシス作用性機能を含み得る。組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を使用して種々の系統の細胞に外来性遺伝子を運び込むことができる。これらのベクターでは、ＡＡＶ ｃａｐ及び／又はｒｅｐ遺伝子がウイルスゲノムから欠失され、選択のＤＮＡセグメントに置き換える。現在のＡＡＶベクターは、最大４３００塩基の挿入ＤＮＡを収容し得る。

ｒＡＡＶの作製方法は数多あり、本発明はｒＡＡＶ及びｒＡＡＶの調製方法を提供する。例えば、所望のウイルス構築物を含む又はそれから本質的になる１つ又は複数のプラスミドが、ＡＡＶ感染細胞にトランスフェクトされる。加えて、第２の又は追加のヘルパープラスミドがこれらの細胞にコトランスフェクトされ、組換えウイルス構築物の複製及びパッケージングに必須のＡＡＶ ｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子が提供される。これらの条件下で、ＡＡＶのｒｅｐ及び／又はｃａｐタンパク質はトランスに作用してｒＡＡＶ構築物の複製及びパッケージングを刺激する。トランスフェクション後２〜３日でｒＡＡＶは回収される。従来、ｒＡＡＶはアデノウイルスと共に細胞から回収される。次に汚染アデノウイルスが熱処理によって不活性化される。本発明では、ｒＡＡＶは有利には、細胞それ自体からではなく、細胞上清から回収される。従って、最初の態様では本発明はｒＡＡＶを調製することを提供し、及び前述に加えて、以下を含む又はそれから本質的になる方法によりｒＡＡＶを調製することができる：発現用ＤＮＡを含む外来性ＤＮＡと、ヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスなどのポックスウイルス）とを含有するｒＡＡＶを感受性細胞に感染させるステップであって、ｒＡＡＶが機能性ｃａｐ及び／又はｒｅｐを欠損している（及びヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスなどのポックスウイルス）はｒＡＡＶに欠損しているｃａｐ及び／又はｒｅｖ機能を提供する）ステップ；又は発現用ＤＮＡを含む外来性ＤＮＡを含有するｒＡＡＶを感受性細胞に感染させ（組換え体は機能性ｃａｐ及び／又はｒｅｐを欠損している）、及びｒＡＡＶに欠損しているｃａｐ及び／又はｒｅｐ機能を提供するプラスミドを前記細胞にトランスフェクトするステップ；又は発現用ＤＮＡを含む外来性ＤＮＡを含有するｒＡＡＶを感受性細胞に感染させるステップであって、組換え体が機能性ｃａｐ及び／又はｒｅｐを欠損しており、前記細胞が、組換え体に欠損しているｃａｐ及び／又はｒｅｐ機能を提供するステップ；又は機能性ｃａｐ及び／又はｒｅｐを欠損しているＡＡＶと、外来性ＤＮＡが組換え体によって発現されるように外来性ＤＮＡを組換え体に挿入するための、かつｒｅｐ及び／又はｃａｐ機能を提供するためのプラスミドとを感受性細胞にトランスフェクトするステップであって、従ってトランスフェクションにより、機能性ｃａｐ及び／又はｒｅｐが欠損した、発現用ＤＮＡを含む外来性ＤＮＡを含有するｒＡＡＶがもたらされるステップ。

ｒＡＡＶは、本明細書に記載されるとおりＡＡＶ由来であってもよく、有利には、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５又はそれらの任意の組み合わせを含み得るハイブリッド又はカプシドを有するｒＡＡＶ１、ｒＡＡＶ２、ＡＡＶ５又はｒＡＡＶであり得る。ｒＡＡＶのＡＡＶは、ｒＡＡＶが標的とする細胞に関連して選択することができる；例えば、脳又は神経細胞の標的化には、ＡＡＶ血清型１、２、５又はハイブリッド若しくはカプシドＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５又はそれらの任意の組み合わせを選択することができ；及び心臓組織のターゲティングには、ＡＡＶ４を選択することができる。２９３細胞に加えて、本発明の実施に用いることのできる他の細胞及びそれらの細胞に関するｉｎ ｖｉｔｒｏでの特定のＡＡＶ血清型の相対的感染力（Ｇｒｉｍｍ，Ｄ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８２：５８８７−５９１１（２００８）を参照）は以下のとおりである。

本発明は、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復）系をコードする外来性核酸分子、例えば、プロモーターと、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質（推定ヌクレアーゼ又はヘリカーゼタンパク質）、例えばＣａｓ９をコードする核酸分子と、ターミネーターとを含む又はそれから本質的になる第１のカセット、及びプロモーターと、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする核酸分子と、ターミネーターとを含む又はそれから本質的になる２つ、又はそれ以上の、有利にはベクターのパッケージングサイズ限界に至るまでの、例えば合計で（第１のカセットを含めて）５つのカセット（例えば、各カセットは概略的に、プロモーター−ｇＲＮＡ１−ターミネーター、プロモーター−ｇＲＮＡ２−ターミネーター．．．プロモーター−ｇＲＮＡ（Ｎ）−ターミネーター（式中、Ｎは、ベクターのパッケージングサイズ限界の上限である挿入可能な数である）と表される）を含む又はそれからなる複数のカセットを含む又はそれから本質的になるｒＡＡＶ、又は２つ以上の個々のｒＡＡＶであって、各々がＣＲＩＳＰＲ系の１つ又は２つ以上のカセットを含み、例えば、第１のｒＡＡＶが、プロモーターと、Ｃａｓ、例えばＣａｓ９をコードする核酸分子と、ターミネーターとを含む又はそれから本質的になる第１のカセットを含み、及び第２のｒＡＡＶが、プロモーターと、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする核酸分子と、ターミネーターとを含む又はそれから本質的になる複数の４つのカセット（例えば、各カセットは概略的に、プロモーター−ｇＲＮＡ１−ターミネーター、プロモーター−ｇＲＮＡ２−ターミネーター．．．プロモーター−ｇＲＮＡ（Ｎ）−ターミネーター（式中、Ｎは、ベクターのパッケージングサイズ限界の上限である挿入可能な数である）と表される）を含むｒＡＡＶを提供する。ｒＡＡＶはＤＮＡウイルスであるため、ＡＡＶ又はｒＡＡＶに関する本明細書の考察における核酸分子は、有利にはＤＮＡである。プロモーターは、一部の実施形態では有利にはヒトシナプシンＩプロモーター（ｈＳｙｎ）である。核酸を細胞に送達する追加の方法は、当業者に公知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００３００８７８１７号明細書が参照される。

一部の実施形態では、宿主細胞は、本明細書に記載の１つ以上のベクターにより一過的に又は非一過的にトランスフェクトされる。一部の実施形態では、細胞は、それが対象において天然に存在するとおりにトランスフェクトされる。一部の実施形態では、トランスフェクトする細胞は対象から採取される。一部の実施形態において、細胞は、対象から採取された細胞、例えば、細胞株に由来する。組織培養のための広範な細胞株は、当技術分野において公知である。細胞株の例としては、限定されないが、Ｃ８１６１、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＭＯＬＴ、ｍＩＭＣＤ−３、ＮＨＤＦ、ＨｅＬａ−Ｓ３、Ｈｕｈ１、Ｈｕｈ４、Ｈｕｈ７、ＨＵＶＥＣ、ＨＡＳＭＣ、ＨＥＫｎ、ＨＥＫａ、ＭｉａＰａＣｅｌｌ、Ｐａｎｃ１、ＰＣ−３、ＴＦ１、ＣＴＬＬ−２、Ｃ１Ｒ、Ｒａｔ６、ＣＶ１、ＲＰＴＥ、Ａ１０、Ｔ２４、Ｊ８２、Ａ３７５、ＡＲＨ−７７、Ｃａｌｕ１、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、ＳＫＯＶ３、ＳＫ−ＵＴ、ＣａＣｏ２、Ｐ３８８Ｄ１、ＳＥＭ−Ｋ２、ＷＥＨＩ−２３１、ＨＢ５６、ＴＩＢ５５、Ｊｕｒｋａｔ、Ｊ４５．０１、ＬＲＭＢ、Ｂｃｌ−１、ＢＣ−３、ＩＣ２１、ＤＬＤ２、Ｒａｗ２６４．７、ＮＲＫ、ＮＲＫ−５２Ｅ、ＭＲＣ５、ＭＥＦ、Ｈｅｐ Ｇ２、ＨｅＬａ Ｂ、ＨｅＬａ Ｔ４、ＣＯＳ、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−６、ＣＯＳ−Ｍ６Ａ、ＢＳ−Ｃ−１サル腎臓上皮、ＢＡＬＢ／３Ｔ３マウス胚線維芽細胞、３Ｔ３Ｓｗｉｓｓ、３Ｔ３−Ｌ１、１３２−ｄ５ヒト胎児線維芽細胞；１０．１マウス線維芽細胞、２９３−Ｔ、３Ｔ３、７２１、９Ｌ、Ａ２７８０、Ａ２７８０ＡＤＲ、Ａ２７８０ｃｉｓ、Ａ１７２、Ａ２０、Ａ２５３、Ａ４３１、Ａ−５４９、ＡＬＣ、Ｂ１６、Ｂ３５、ＢＣＰ−１細胞、ＢＥＡＳ−２Ｂ、ｂＥｎｄ．３、ＢＨＫ−２１、ＢＲ２９３、ＢｘＰＣ３、Ｃ３Ｈ−１０Ｔ１／２、Ｃ６／３６、Ｃａｌ−２７、ＣＨＯ、ＣＨＯ−７、ＣＨＯ−ＩＲ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｋ２、ＣＨＯ−Ｔ、ＣＨＯ Ｄｈｆｒ−／−、ＣＯＲ−Ｌ２３、ＣＯＲ−Ｌ２３／ＣＰＲ、ＣＯＲ−Ｌ２３／５０１０、ＣＯＲ−Ｌ２３／Ｒ２３、ＣＯＳ−７、ＣＯＶ−４３４、ＣＭＬ Ｔ１、ＣＭＴ、ＣＴ２６、Ｄ１７、ＤＨ８２、ＤＵ１４５、ＤｕＣａＰ、ＥＬ４、ＥＭ２、ＥＭ３、ＥＭＴ６／ＡＲ１、ＥＭＴ６／ＡＲ１０．０、ＦＭ３、Ｈ１２９９、Ｈ６９、ＨＢ５４、ＨＢ５５、ＨＣＡ２、ＨＥＫ−２９３、ＨｅＬａ、Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７、ＨＬ−６０、ＨＭＥＣ、ＨＴ−２９、Ｊｕｒｋａｔ、ＪＹ細胞、Ｋ５６２細胞、Ｋｕ８１２、ＫＣＬ２２、ＫＧ１、ＫＹＯ１、ＬＮＣａｐ、Ｍａ−Ｍｅｌ１−４８、ＭＣ−３８、ＭＣＦ−７、ＭＣＦ−１０Ａ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＭＤＣＫ ＩＩ、ＭＤＣＫ ＩＩ、ＭＯＲ／０．２Ｒ、ＭＯＮＯ−ＭＡＣ６、ＭＴＤ−１Ａ、ＭｙＥｎｄ、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＣＰＲ、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＬＸ１０、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＬＸ２０、ＮＣＩ−Ｈ６９／ＬＸ４、ＮＩＨ−３Ｔ３、ＮＡＬＭ−１、ＮＷ−１４５、ＯＰＣＮ／ＯＰＣＴ細胞株、Ｐｅｅｒ、ＰＮＴ−１Ａ／ＰＮＴ２、ＲｅｎＣａ、ＲＩＮ−５Ｆ、ＲＭＡ／ＲＭＡＳ、Ｓａｏｓ−２細胞、Ｓｆ−９、ＳｋＢｒ３、Ｔ２、Ｔ−４７Ｄ、Ｔ８４、ＴＨＰ１細胞株、Ｕ３７３、Ｕ８７、Ｕ９３７、ＶＣａＰ、Ｖｅｒｏ細胞、ＷＭ３９、ＷＴ−４９、Ｘ６３、ＹＡＣ−１、ＹＡＲ、及びそれらのトランスジェニック変種が挙げられる。細胞株は、当業者に公知の種々のソースから入手可能である（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓｕｓ，Ｖａ．）参照）。一部の実施形態において、本明細書に記載の１つ以上のベクターによりトランスフェクトされた細胞を使用して１つ以上のベクター由来配列を含む新たな細胞株を樹立する。一部の実施形態において、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ系の構成成分により一過的にトランスフェクトされ（例えば、１つ以上のベクターの一過性トランスフェクション、又はＲＮＡによるトランスフェクションにより）、ＣＲＩＳＰＲ複合体の活性を通して改変された細胞を使用して改変を含有するがあらゆる他の外因性配列を欠く細胞を含む新たな細胞株を樹立する。一部の実施形態において、本明細書に記載の１つ以上のベクターにより一過性又は非一過性にトランスフェクトされた細胞、又はそのような細胞に由来する細胞株を、１つ以上の試験化合物の評価において使用する。

一部の実施形態において、本明細書に記載の１つ以上のベクターを使用して非ヒトトランスジェニック動物又はトランスジェニック植物を産生する。一部の実施形態において、トランスジェニック動物は、哺乳動物、例えば、マウス、ラット、又はウサギである。トランスジェニック動物及び植物を産生する方法は、当技術分野において公知であり、一般に、例えば、本明細書に記載の細胞トランスフェクションの方法から出発する。別の実施形態において、針のアレイを備える流体送達装置（例えば、フレッド・ハッチンソン癌研究センター（Ｆｒｅｄ Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ）に譲渡された米国特許出願公開第２０１１０２３０８３９号明細書を参照のこと）が、固形組織に対するＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓの送達に企図され得る。流体を固形組織に送達するための米国特許出願公開第２０１１０２３０８３９号明細書の装置は、アレイ状に配置された複数の針と；各々が複数の針のそれぞれ１つと流体連通している複数のリザーバと；複数のリザーバのそれぞれ１つに動作可能に結合されかつリザーバ内の流体圧力を制御するように構成された複数のアクチュエータとを含み得る。特定の実施形態では、複数のアクチュエータの各々が複数のプランジャの１つを含むことができ、複数のプランジャの各々の第１の端部が複数のリザーバのそれぞれ１つに受け入れられ、及び特定のさらなる実施形態では複数のプランジャのプランジャがそれぞれの第２の端部で一体に動作可能に結合され、同時に押し下げることが可能である。特定のさらに別の実施形態は、複数のプランジャの全てを選択的に変更可能な速度で押し下げるように構成されたプランジャ駆動装置を含み得る。他の実施形態では、複数のアクチュエータの各々が、第１の端部と第２の端部とを有する複数の流体送出路の１つを含むことができ、複数の流体送出路の各々の第１の端部が複数のリザーバのそれぞれ１つに結合される。他の実施形態では、この装置は流体圧力源を含むことができ、及び複数のアクチュエータの各々が流体圧力源と複数のリザーバのそれぞれ１つとの間の流体継手を含む。さらなる実施形態では、流体圧力源は、圧縮機、真空アキュムレータ、蠕動ポンプ、マスターシリンダー、マイクロ流体ポンプ、及びバルブのうちの少なくとも１つを含み得る。別の実施形態において、複数の針の各々は、その長さに沿って配置された複数のポートを含み得る。

標的の改変
一部の実施形態では、本方法は、ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的ポリヌクレオチドへの結合を可能にして前記標的ポリヌクレオチドの切断をもたらし、これにより標的ポリヌクレオチドを改変するステップを含み、ここで、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、前記標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズするガイド配列と複合体を形成するＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、前記ガイド配列はｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に連結され、次にｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズする。一態様では、本発明は、真核細胞においてポリヌクレオチドの発現を変更する方法を提供する。一部の実施形態では、この方法は、ＣＲＩＳＰＲ複合体のポリヌクレオチドへの結合を可能にし、前記結合により前記ポリヌクレオチドの発現が増大又は低下するステップを含み、ここで、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、前記標的ポリヌクレオチド中の標的配列にハイブリダイズするガイド配列と複合体を形成するＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、前記ガイド配列はｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に連結され、次にｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズする。標的ポリヌクレオチドを変更する方法に対して、上記のように同様の考慮及び条件が当てはまる。実際、これらのサンプリング、培養、及び再導入の選択肢は、本発明の態様の全てに当てはまる。一態様では、本発明は、真核細胞において標的ポリヌクレオチドを改変する方法を提供し、この方法は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、又はｉｎ ｖｉｔｒｏであり得る。一部の実施形態では、この方法は、ヒト若しくは非ヒト動物又は植物から細胞又は細胞集団をサンプリングするステップ、及びこの１つ又は複数の細胞を改変するステップを含む。培養は、ｅｘ ｖｉｖｏにおいて全ての段階で行うことができる。１つ又は複数の細胞を、非ヒト動物又は植物に再導入することさえできる。再導入された細胞では、細胞が幹細胞であることが特に好ましい。実際、本発明のいずれの態様でも、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的配列にハイブリダイズするガイド配列と複合体を形成するＣＲＩＳＰＲ酵素を含むことができ、前記ガイド配列はｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に連結され、次にｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし得る。標的ポリヌクレオチドを変更する方法に対して、上記のように同様の考慮及び条件が当てはまる。

キット
一態様では、本発明は、上記の方法で開示されるいずれか１つ以上の要素、及び組成物を含むキットを提供する。要素は、個別に又は組み合わせて提供することができ、かつ任意の適切な容器、例えば、バイアル、瓶、又は管に入れて提供することができる。一部の実施形態では、キットは、１つ以上の言語、例えば、２つ以上の言語の取扱説明書を含む。

一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載の１つ以上の要素を利用するプロセスに使用される１つ以上の試薬を含む。試薬は、任意の適切な容器に入れて提供することができる。例えば、キットは、１つ以上の反応緩衝液又は保存緩衝液を提供することができる。試薬は、特定のアッセイにおいて使用可能形態で、又は使用の前に１つ以上の他の成分の添加を必要とする形態（例えば、濃縮形態又は凍結乾燥形態）で提供することができる。緩衝液は、限定されるものではないが、炭酸ナトリウム緩衝液、重炭酸ナトリウム緩衝液、ホウ酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、及びこれらの組み合わせを含む任意の緩衝液とすることができる。一部の実施形態では、緩衝液はアルカリ性である。一部の実施形態では、緩衝液は、約７〜約１０のｐＨを有する。一部の実施形態では、キットは、ガイド配列及び調節エレメントを機能的に連結するようにベクターに挿入されるガイド配列に一致する１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、キットは、相同組換え鋳型ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載の１つ以上のベクター及び／又は１つ以上のポリヌクレオチドを含む。キットは、本発明の系の全ての要素を提供できると有利であろう。

ＣＲＩＳＰＲ複合体
一態様では、本発明はＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントを使用するための方法を提供する。本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的ポリヌクレオチドを改変するための有効な手段を提供する。本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体は、多様な細胞型の標的ポリヌクレオチドの改変（例えば、欠失、挿入、転座、不活性化、活性化）を含む様々な種類の有用性を有する。従って、本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体は、例えば、遺伝子療法、薬物スクリーニング、疾患診断、及び予後診断における広範囲の用途を有する。例示的なＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズするガイド配列と複合体を形成するＣＲＩＳＰＲ酵素を含む。ガイド配列はｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に連結され、次にｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズする。

一実施形態では、本発明は、標的ポリヌクレオチドを切断する方法を提供する。この方法は、標的ポリヌクレオチドに結合して前記標的ポリヌクレオチドの切断をもたらすＣＲＩＳＰＲ複合体を用いて標的ポリヌクレオチドを改変するステップを含む。通常、本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体は、細胞内に導入されると、ゲノム配列に切断（例えば、一本鎖切断又は二本鎖切断）を引き起こす。例えば、この方法を使用して、細胞内の疾患遺伝子を切断することができる。

ＣＲＩＳＰＲ複合体によって生じた切断は、修復プロセス、例えば、エラープローン非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路又は高忠実性相同組換え修復（ＨＤＲ）によって修復することができる（図２５）。これらの修復プロセス中に、外因性ポリヌクレオチド鋳型をゲノム配列に導入することができる。一部の方法では、ＨＤＲプロセスを使用してゲノム配列が改変される。例えば、上流配列及び下流配列に隣接した組み込まれる配列を含む外因性ポリヌクレオチド鋳型が細胞内に導入される。上流配列及び下流配列は、染色体内の組み込み部位の両側と配列類似性を共有する。

所望される場合には、ドナーポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、例えば、ＤＮＡプラスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、ウイルスベクター、ＤＮＡの線状断片、ＰＣＲ断片、ネイキッド核酸、又は送達ビヒクル（例えば、リポソーム又はポロキサマー）と複合体を形成する核酸であり得る。

外因性ポリヌクレオチド鋳型は、組み込まれるべき配列（例えば、突然変異遺伝子）を含む。組み込みのための配列は、細胞に対して内因性の配列であってもよいし、又は外因性の配列であってもよい。組み込まれる配列の例として、タンパク質をコードするポリヌクレオチド又は非コードＲＮＡ（例えば、ｍｉｃｒｏＲＮＡ）が挙げられる。従って、組み込みのための配列は、１つ又は複数の適切な制御配列に機能的に連結され得る。或いは、組み込まれるべき配列は、制御機能を提供することができる。

外因性ポリヌクレオチド鋳型における上流配列及び下流配列は、目的の染色体配列とドナーポリヌクレオチドとの間の組換えを促進するように選択される。上流配列は、組み込みのための標的部位の上流のゲノム配列と配列類似性を共有する核酸配列である。同様に、下流配列は、組み込みの標的部位の下流の染色体配列と配列類似性を共有する核酸配列である。外因性ポリヌクレオチド鋳型における上流配列及び下流配列は、標的ゲノム配列と７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％の配列同一性を有し得る。好ましくは、外因性ポリヌクレオチド鋳型における上流配列及び下流配列は、標的ゲノム配列と約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％の配列同一性を有する。一部の方法では、外因性ポリヌクレオチド鋳型における上流配列及び下流配列は、標的ゲノム配列と約９９％又は約１００％の配列同一性を有する。

上流配列又は下流配列は、約２０ｂｐ〜約２５００ｂｐ、例えば、約５０ｂｐ、約１００ｂｐ、約２００ｂｐ、約３００ｂｐ、約４００ｂｐ、約５００ｂｐ、約６００ｂｐ、約７００ｂｐ、約８００ｂｐ、約９００ｂｐ、約１０００ｂｐ、約１１００ｂｐ、約１２００ｂｐ、約１３００ｂｐ、約１４００ｂｐ、約１５００ｂｐ、約１６００ｂｐ、約１７００ｂｐ、約１８００ｂｐ、約１９００ｂｐ、約２０００ｂｐ、約２１００ｂｐ、約２２００ｂｐ、約２３００ｂｐ、約２４００ｂｐ、又は約２５００ｂｐを含み得る。一部の方法では、例示的な上流配列又は下流配列は、約２００ｂｐ〜約２０００ｂｐ、約６００ｂｐ〜約１０００ｂｐ、又はより具体的には７００ｂｐ〜約１０００ｂｐを有する。

一部の方法では、外因性ポリヌクレオチド鋳型は、マーカーをさらに含み得る。このようなマーカーは、標的の組み込みについてのスクリーニングを容易にすることができる。適切なマーカーの例としては、制限部位、蛍光タンパク質、又は選択マーカーが挙げられる。本発明の外因性ポリヌクレオチド鋳型は、組換え技術を用いて作製することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１、及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９６を参照）。

外因性ポリヌクレオチド鋳型を組み込むことによって標的ポリヌクレオチドを改変するための例示的な方法では、ＣＲＩＳＰＲ複合体によって二本鎖切断がゲノム配列に導入され、この切断部は、外因性ポリヌクレオチド鋳型がゲノムに組み込まれるようにこの鋳型の相同組換えによって修復される。二本鎖切断の存在は、鋳型の組み込みを促進する。

他の実施形態では、本発明は、真核細胞においてポリヌクレオチドの発現を変更する方法を提供する。この方法は、標的ポリヌクレオチドに結合するＣＲＩＳＰＲ複合体の使用によってこのポリヌクレオチドの発現を増大又は低下させるステップを含む。

一部の方法では、標的ポリヌクレオチドを不活性化して、細胞内での発現を変更することができる。例えば、細胞内でＣＲＩＳＰＲ複合体が標的配列に結合すると、標的ポリヌクレオチドが不活性化され、これにより配列が転写されなくなる、コードタンパク質が産生されなくなる、又は配列が野生型配列のようには機能しなくなる。例えば、タンパク質又はｍｉｃｒｏＲＮＡコード配列は、このタンパク質又はｍｉｃｒｏＲＮ又はｐｒｅ−ｍｉｃｒｏＲＮＡの転写物が産生されないように不活性化され得る。

一部の方法では、制御配列は、制御配列として機能しなくなるように不活性化することができる。本明細書で使用される場合、「制御配列」という語は、核酸配列の転写、翻訳、又は接触性をもたらす任意の核酸配列を指す。制御配列の例としては、プロモーター、転写ターミネーター、及びエンハンサーが挙げられる。

不活性化された標的配列は、欠失突然変異（即ち、１つ以上のヌクレオチドの欠失）、挿入突然変異（即ち、１つ以上のヌクレオチドの挿入）、又はナンセンス突然変異（即ち、終止コドンが導入されるような別のヌクレオチドによる単一のヌクレオチドとの置換）を含み得る。一部の方法では、標的配列の不活性化は標的配列の「ノックアウト」をもたらす。

疾患モデル
本発明の方法を用いて、疾患モデルとして使用し得る植物、動物又は細胞を作り出すことができる。本明細書で使用される場合、「疾患」は、対象における疾患、障害、又は徴候を指す。例えば、本発明の方法を用いて、疾患に関連する１つ以上の核酸配列に改変を含む動物若しくは細胞、又は疾患に関連する１つ以上の核酸配列の発現が変化している植物、動物若しくは細胞を作り出すことができる。このような核酸配列は疾患関連タンパク質配列をコードしてもよく、又は疾患関連制御配列であってもよい。従って、本発明の実施形態において植物、対象、患者、生物又は細胞は、非ヒトの対象、患者、生物又は細胞であり得ることが理解される。従って、本発明は、本方法により作製された植物、動物若しくは細胞、又はその子孫を提供する。子孫は、作製された植物又は動物のクローンであってもよく、又はさらに望ましい形質をその子孫に遺伝子移入させるため同じ種の他の個体と交配させることによる有性生殖から生じてもよい。細胞は、多細胞生物、特に動物又は植物の場合にｉｎ ｖｉｖｏ又はエキソビボであってよい。細胞が培養下にある例では、適切な培養条件が満たされる場合、かつ好ましくは細胞がこの目的に好適に適合する場合（例えば幹細胞）、細胞株が樹立され得る。本発明によって作製される細菌細胞株もまた想定される。ひいては細胞株もまた想定される。

一部の方法では、疾患モデルを使用することにより、疾患の研究で一般的に用いられる手段を用いて突然変異が動物又は細胞及び疾患の発症及び／又は進行に及ぼす効果を研究することができる。或いは、このような疾患モデルは、薬学的に活性な化合物が疾患に及ぼす効果の研究に有用である。

一部の方法では、疾患モデルを使用して、見込みのある遺伝子治療戦略の有効性を評価することができる。即ち、疾患の発症及び／又は進行が阻害又は軽減されるように疾患関連遺伝子又はポリヌクレオチドを改変することができる。詳細には、本方法は、変化したタンパク質が産生され、結果として動物又は細胞が変化した反応を有するように疾患関連遺伝子又はポリヌクレオチドを改変することを含む。従って、一部の方法では、遺伝子治療イベントの効果を評価し得るように、遺伝子改変を受けた動物が、疾患を発症する素因のある動物と比較され得る。

別の実施形態において、本発明は、疾患遺伝子に関連する細胞シグナル伝達イベントを調節する生物学的に活性な薬剤を開発する方法を提供する。本方法は、ＣＲＩＳＰＲ酵素、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に連結されたガイド配列、及びｔｒａｃｒ配列の１つ以上の発現を駆動する１つ以上のベクターを含む細胞に試験化合物を接触させるステップ；及び例えば細胞に含まれる疾患遺伝子の突然変異に関連する細胞シグナル伝達イベントの減少又は増加を示す読み取り値の変化を検出することを含む。

細胞機能の変化をスクリーニングするため本発明の方法と組み合わせて細胞モデル又は動物モデルを構築することができる。このようなモデルを使用して、本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体により改変されたゲノム配列が目的の細胞機能に及ぼす効果を研究し得る。例えば、細胞機能モデルを使用して、改変ゲノム配列が細胞内シグナル伝達又は細胞外シグナル伝達に及ぼす効果を研究することができる。或いは、細胞機能モデルを使用して、改変ゲノム配列が感覚認知に及ぼす効果を研究することができる。一部のこのようなモデルにおいては、モデルにおける生化学的シグナル伝達経路に関連する１つ以上のゲノム配列が改変される。

いくつかの疾患モデルが特に研究されている。それらには、デノボ自閉症リスク遺伝子ＣＨＤ８、ＫＡＴＮＡＬ２、及びＳＣＮ２Ａ；並びに症候性自閉症（アンジェルマン症候群）遺伝子ＵＢＥ３Ａが含まれる。これらの遺伝子及び得られる自閉症モデルは当然ながら好ましいが、遺伝子及び対応するモデル全体にわたる本発明の広範な適用性を明らかにすることに役立つ。

生化学的シグナル伝達経路に関連する１つ以上のゲノム配列の発現の変化は、候補薬剤に接触させたときの試験モデル細胞と対照細胞との間における対応する遺伝子のｍＲＮＡレベルの差をアッセイすることにより決定され得る。或いは、生化学的シグナル伝達経路に関連する配列の発現差異は、コードされたポリペプチド又は遺伝子産物のレベルの差を検出することにより決定される。

ｍＲＮＡ転写物又は対応するポリヌクレオチドのレベルの薬剤により引き起こされた変化をアッセイするため、初めにサンプル中に含まれる核酸が当該技術分野の標準方法に従い抽出される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）に示される手順に従い種々の溶菌酵素又は化学溶液を使用してｍＲＮＡを単離することができ、又は製造者により提供される付属の説明書に従い核酸結合樹脂で抽出することができる。抽出した核酸サンプルに含まれるｍＲＮＡは、次に当該技術分野において広く知られている方法に従うか又は本明細書に例示する方法に基づき、増幅手順又は従来のハイブリダイゼーションアッセイ（例えばノーザンブロット分析）により検出される。

本発明の目的上、増幅は、妥当な忠実性で標的配列を複製する能力を有するプライマー及びポリメラーゼを用いる任意の方法を意味する。増幅は、天然又は組換えＤＮＡポリメラーゼ、例えば、ＴａｑＧｏｌｄ^ＴＭ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片、及び逆転写酵素によって行われ得る。好ましい増幅方法はＰＣＲである。詳細には、単離されたＲＮＡが、生化学的シグナル伝達経路に関連する配列の発現レベルを定量化するため定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）と組み合わされた逆転写アッセイに供され得る。

遺伝子発現レベルの検出は、増幅アッセイ中にリアルタイムで行うことができる。一態様では、増幅産物が、蛍光ＤＮＡ結合剤、例えば限定はされないがＤＮＡインターカレート剤及びＤＮＡ溝結合剤で直接可視化され得る。二本鎖ＤＮＡ分子に組み込まれるインターカレート剤の量は、典型的には増幅されたＤＮＡ産物の量に比例するため、好都合には、当該技術分野における従来の光学的システムを使用してインターカレート色素の蛍光を定量化することにより、増幅産物の量を決定することができる。この適用に好適なＤＮＡ結合色素としては、ＳＹＢＲグリーン、ＳＹＢＲブルー、ＤＡＰＩ、プロピジウムヨウ素、Ｈｏｅｓｔｅ、ＳＹＢＲゴールド、臭化エチジウム、アクリジン、プロフラビン、アクリジンオレンジ、アクリフラビン、蛍光クマリン（ｆｌｕｏｒｃｏｕｍａｎｉｎ）、エリプチシン、ダウノマイシン、クロロキン、ジスタマイシンＤ、クロモマイシン、ホミジウム、ミトラマイシン、ルテニウムポリピリジル、アントラマイシンなどが挙げられる。

別の態様では、配列特異的プローブなどの他の蛍光標識を増幅反応に用いて増幅産物の検出及び定量化を促進し得る。プローブベースの定量的増幅は、所望の増幅産物の配列特異的検出に頼る。この増幅は、特異性及び感度の増加をもたらす蛍光性の標的特異的プローブ（例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ）を利用する。プローブベースの定量的増幅を実施する方法は当該技術分野で十分に確立されており、米国特許第５，２１０，０１５号明細書に教示される。

さらに別の態様では、生化学的シグナル伝達経路に関連する配列と配列相同性を共有するハイブリダイゼーションプローブを使用して従来のハイブリダイゼーションアッセイを実施し得る。典型的には、プローブは、被験対象から得られた生体サンプル内に含まれる生化学的シグナル伝達経路に関連する配列と安定した複合体をハイブリダイゼーション反応で形成することが可能である。アンチセンスがプローブ核酸として使用される場合、サンプル中に提供される標的ポリヌクレオチドがアンチセンス核酸の配列と相補的であるように選択されることは、当業者に理解されるであろう。逆に、ヌクレオチドプローブがセンス核酸である場合、標的ポリヌクレオチドはセンス核酸の配列と相補的であるように選択される。

ハイブリダイゼーションは、種々のストリンジェンシーの条件下で実施することができる。本発明の実施に好適なハイブリダイゼーション条件は、プローブと生化学的シグナル伝達経路に関連する配列との間の認識相互作用が十分に特異的であると共に十分に安定しているものである。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーが増加する条件は当該技術分野で広く知られており、発表されている。例えば、（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，（１９８９）；Ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ）を参照のこと。ハイブリダイゼーションアッセイは、限定はされないが、ニトロセルロース、ガラス、ケイ素、及び種々の遺伝子アレイを含めた任意の固体支持体上に固定化されたプローブを使用して形成され得る。好ましいハイブリダイゼーションアッセイは、米国特許第５，４４５，９３４号明細書に記載されるような高密度遺伝子チップで実施される。

ハイブリダイゼーションアッセイ中に形成されるプローブ−標的複合体を好都合に検出するため、ヌクレオチドプローブが検出可能標識にコンジュゲートされる。本発明における使用に好適な検出可能標識には、光化学的、生化学的、分光学的、免疫化学的、電気的、光学的又は化学的手段で検出可能な任意の組成物が含まれる。幅広い種類の適切な検出可能標識が当該技術分野において公知であり、それには、蛍光又は化学発光標識、放射性同位元素標識、酵素又は他のリガンドが含まれる。好ましい実施形態では、ジゴキシゲニン、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼ又はペルオキシダーゼ、アビジン／ビオチン複合体など、蛍光標識又は酵素タグを用いることが所望されるものと思われる。

ハイブリダイゼーション強度の検出又は定量化に用いられる検出方法は、典型的には上記で選択される標識に依存することになる。例えば、放射標識は、写真フィルム又はホスフォイメージャー（ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ）を使用して検出し得る。蛍光マーカーは、放出される光を検出するため光検出器を使用して検出及び定量化し得る。酵素標識は、典型的には酵素に基質を提供し、基質に対する酵素の作用によって産生された反応産物を計測することにより検出される；及び最後に、比色標識は、単純に、着色した標識を可視化することにより検出される。

薬剤により引き起こされる、生化学的シグナル伝達経路に関連する配列の発現の変化はまた、対応する遺伝子産物を調べることによっても決定し得る。タンパク質レベルの決定には、典型的には、ａ）生体サンプル中に含まれるタンパク質を、生化学的シグナル伝達経路に関連するタンパク質に特異的に結合する薬剤と接触させること；及び（ｂ）そのようにして形成された任意の薬剤：タンパク質複合体を同定することが関わる。この実施形態の一態様において、生化学的シグナル伝達経路に関連するタンパク質に特異的に結合する薬剤は、抗体、好ましくはモノクローナル抗体である。

反応は、薬剤と生化学的シグナル伝達経路に関連するタンパク質との間で複合体が形成されることを可能にする条件下で、試験サンプルから得られた生化学的シグナル伝達経路に関連するタンパク質のサンプルに薬剤を接触させることにより実施される。複合体の形成は、当該技術分野の標準的手順に従い直接的又は間接的に検出することができる。直接的な検出方法では、薬剤に検出可能な標識が提供され、複合体から未反応薬剤が除去され得る；従って残る標識の量が、形成された複合体の量を示す。このような方法には、ストリンジェントな洗浄条件の中にあっても薬剤に結合したまま留まる標識を選択することが好ましい。標識は結合反応を妨げないことが好ましい。代替として、間接的な検出手順では、化学的に、或いは酵素的に導入された標識を含む薬剤を使用し得る。望ましい標識は、概して得られる薬剤：ポリペプチド複合体の結合又は安定性を妨げない。しかしながら、標識は典型的には、有効な結合、ひいては検出可能なシグナルの生成のため抗体に接触可能であるように設計される。

タンパク質レベルの検出に好適な幅広い種類の標識が当該技術分野において公知である。非限定的な例としては、放射性同位元素、酵素、コロイド金属、蛍光化合物、生物発光化合物、及び化学発光化合物が挙げられる。

結合反応中に形成された薬剤：ポリペプチド複合体の量は、標準的な定量アッセイにより定量化することができる。上記に説明したとおり、薬剤：ポリペプチド複合体の形成は、結合部位に残る標識の量によって直接計測することができる。代替例では、生化学的シグナル伝達経路に関連するタンパク質が、特定の薬剤上の結合部位に関して標識類似体と競合するその能力に関して試験される。この競合アッセイでは、捕捉される標識の量は、試験サンプル中に存在する生化学的シグナル伝達経路に関連するタンパク質配列の量に反比例する。

上記に概説した一般的原理に基づくいくつかのタンパク質分析技術は、当該技術分野において利用可能である。これには、限定はされないが、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノラジオメトリックアッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、インサイチューイムノアッセイ（例えば、コロイド金、酵素又は放射性同位元素標識を使用する）、ウエスタンブロット分析、免疫沈降アッセイ、免疫蛍光アッセイ、及びＳＤＳ−ＰＡＧＥが含まれる。

前述のタンパク質分析の実施には、生化学的シグナル伝達経路に関連するタンパク質を特異的に認識し又は結合する抗体が好ましい。望ましい場合、特定のタイプの翻訳後改変（例えば、生化学的シグナル伝達経路誘導性改変）を認識する抗体を使用することができる。翻訳後改変としては、限定はされないが、グリコシル化、脂質化、アセチル化、及びリン酸化が挙げられる。これらの抗体は、商業的な供給業者から購入してもよい。例えば、チロシンリン酸化タンパク質を特異的に認識する抗ホスホチロシン抗体が、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ及びＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒを含む多くの供給業者から入手可能である。抗ホスホチロシン抗体は、ＥＲストレスに応答してそのチロシン残基で別様にリン酸化されるタンパク質の検出において特に有用である。このようなタンパク質としては、限定はされないが、真核生物翻訳開始因子２α（ｅＩＦ−２α）が挙げられる。或いは、これらの抗体は、従来のポリクローナル又はモノクローナル抗体技術を用いて、所望の翻訳後改変を呈する標的タンパク質で宿主動物又は抗体産生細胞を免疫することにより作成し得る。

主題の方法の実施において、異なる体組織、異なる細胞型、及び／又は異なる細胞内構造における生化学的シグナル伝達経路に関連するタンパク質の発現パターンを識別することが望ましいこともある。こうした試験は、特定の組織、細胞型、又は細胞内構造で優先的に発現するタンパク質マーカーと結合する能力を有する組織特異的、細胞特異的又は細胞内構造特異抗体を使用して実施することができる。

生化学的シグナル伝達経路に関連する遺伝子の発現の変化はまた、対照細胞と比べた遺伝子産物の活性の変化を調べることにより決定し得る。薬剤により引き起こされる、生化学的シグナル伝達経路に関連するタンパク質の活性の変化に関するアッセイは、調べている生物学的活性及び／又はシグナル伝達経路に依存し得る。例えば、タンパク質がキナーゼである場合、下流の１つ又は複数の基質をリン酸化するその能力の変化を当該技術分野において公知の種々のアッセイにより決定することができる。代表的なアッセイとしては、限定はされないが、リン酸化タンパク質を認識する抗ホスホチロシン抗体などの抗体による免疫ブロット及び免疫沈降が挙げられる。加えて、キナーゼ活性は、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ^ＴＭ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒから入手可能）及びｅＴａｇ^ＴＭアッセイ（Ｃｈａｎ−Ｈｕｉ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １１１：１６２−１７４）などのハイスループット化学発光アッセイにより検出することができる。

生化学的シグナル伝達経路に関連するタンパク質が細胞内ｐＨ条件の変動をもたらすシグナル伝達カスケードの一部である場合、蛍光ｐＨ色素などのｐＨ感受性分子をレポーター分子として使用することができる。生化学的シグナル伝達経路に関連するタンパク質がイオンチャネルである別の例では、膜電位及び／又は細胞内イオン濃度の変動をモニターすることができる。多くの市販キット及びハイスループット装置が、イオンチャネルの修飾因子に関する迅速かつロバストなスクリーニングに特に適している。代表的な機器としては、ＦＬＩＰＲ^ＴＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ．）及びＶＩＰＲ（Ａｕｒｏｒａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）が挙げられる。これらの機器は、マイクロプレートの１０００個を超えるサンプルウェルで同時に反応を検出し、かつ１秒又はさらには１ミリ秒以内にリアルタイムの計測値及び機能データを提供する能力を有する。

本明細書に開示される任意の方法の実施においては、限定なしに、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ソノポレーション、微粒子銃、リン酸カルシウム媒介性トランスフェクション、カチオン性トランスフェクション、リポソームトランスフェクション、デンドリマートランスフェクション、熱ショックトランスフェクション、ヌクレオフェクショントランスフェクション、マグネトフェクション、リポフェクション、インペイルフェクション（ｉｍｐａｌｅｆｅｃｔｉｏｎ）、光学的トランスフェクション、有標の薬剤により増強される核酸取り込み、及びリポソーム、免疫リポソーム、ビロソーム、又は人工ビリオンを介した送達を含めた当該技術分野で公知の１つ以上の方法によって細胞又は胚に好適なベクターを導入することができる。一部の方法では、ベクターはマイクロインジェクションにより胚に導入される。１つ又は複数のベクターが胚の核又は細胞質に微量注入され得る。一部の方法では、１つ又は複数のベクターはヌクレオフェクションにより細胞に導入され得る。

ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的ポリヌクレオチドは、真核細胞に対して内因性又は外因性のあらゆるポリヌクレオチドであり得る。例えば、標的ポリヌクレオチドは、真核細胞の核内に存在するポリヌクレオチドであり得る。標的ポリヌクレオチドは、遺伝子産物（例えば、タンパク質）をコードする配列、又は非コード配列（例えば、調節ポリヌクレオチド又はジャンクＤＮＡ）であり得る。

標的ポリヌクレオチドの例として、シグナル伝達生化学経路に関連した配列、例えば、シグナル伝達生化学経路関連遺伝子又はポリヌクレオチドが挙げられる。標的ポリヌクレオチドの例として、疾患関連遺伝子又はポリヌクレオチドが挙げられる。「疾患関連」遺伝子又はポリヌクレオチドは、非疾患対照の組織又は細胞と比較して、疾患の影響を受けた組織に由来する細胞において異常なレベル又は異常な形態で転写産物又は翻訳産物を生じさせるあらゆる遺伝子又はポリヌクレオチドを指す。疾患関連遺伝子は、異常に高いレベルで発現されるようになる遺伝子のこともあるし、疾患関連遺伝子は、異常に低いレベルで発現されるようになる遺伝子のこともあり、この発現の変更は、疾患の発症及び／又は進行に相関する。また疾患関連遺伝子は、疾患の病因に直接関与するか或いは疾患の病因に関与する遺伝子（複数可）と連鎖不平衡である、突然変異（複数可）又は遺伝的変異を有する遺伝子を指す。転写産物又は翻訳産物は既知であっても未知であってもよく、かつ正常レベル又は異常レベルであり得る。

ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的ポリヌクレオチドは、真核細胞に対して内因性又は外因性のあらゆるポリヌクレオチドであり得る。例えば、標的ポリヌクレオチドは、真核細胞の核内に存在するポリヌクレオチドであり得る。標的ポリヌクレオチドは、遺伝子産物（例えば、タンパク質）をコードする配列、又は非コード配列（例えば、調節ポリヌクレオチド又はジャンクＤＮＡ）であり得る。理論に拘束されることを望むものではないが、標的配列は、ＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）；即ち、ＣＲＩＳＰＲ複合体によって認識される短い配列に関連するはずであると考えられる。ＰＡＭにとっての正確な配列及び長さの要件は、使用されるＣＲＩＳＰＲ酵素によって異なるが、ＰＡＭは、典型的には、プロトスペーサーに近接した２〜５塩基対の配列（即ち、標的配列）である。ＰＡＭ配列の例は以下の実施例のセクションに示され、当業者であれば、所与のＣＲＩＳＰＲ酵素に使用されるさらなるＰＡＭ配列を同定できるであろう。

ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的ポリヌクレオチドとしては、Ｂｒｏａｄ参照番号ＢＩ−２０１１／００８／ＷＳＧＲ整理番号４４０６３−７０１．１０１及びＢＩ−２０１１／００８／ＷＳＧＲ整理番号４４０６３−７０１．１０２をそれぞれ有する米国仮特許出願第６１／７３６，５２７号明細書及び同第６１／７４８，４２７号明細書（両方とも、標題ＳＹＳＴＥＭＳ ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮ、それぞれ２０１２年１２月１２日及び２０１３年１月２日に出願、これらの全ての内容は参照により全体として本明細書に組み込まれる）に列記の多数の疾患関連遺伝子及びポリヌクレオチド並びに生化学的シグナル伝達経路関連遺伝子及びポリヌクレオチドを挙げることができる。

標的ポリヌクレオチドの例としては、生化学的シグナル伝達経路に関連する配列、例えば、生化学的シグナル伝達経路関連遺伝子又はポリヌクレオチドが挙げられる。標的ポリヌクレオチドの例としては、疾患関連遺伝子又はポリヌクレオチドが挙げられる。「疾患関連」遺伝子又はポリヌクレオチドとは、罹患組織に由来する細胞において非疾患対照の組織又は細胞と比較して異常なレベルで又は異常な形態で転写又は翻訳産物を産生している任意の遺伝子又はポリヌクレオチドを指す。それは異常に高いレベルで発現するようになる遺伝子であってもよく；異常に低いレベルで発現するようになる遺伝子であってもよく、ここで発現の変化は疾患の発生及び／又は進行と相関する。疾患関連遺伝子はまた、疾患の原因に直接関与するか又はそれに関与する１つ又は複数の遺伝子との連鎖不平衡がある１つ又は複数の突然変異又は遺伝的変異を有する遺伝子も指す。転写又は翻訳された産物は既知であっても又は未知であってもよく、及び正常レベルであっても又は異常レベルであってもよい。

疾患関連遺伝子及びポリヌクレオチドの例を表Ａ及びＢに列記する。疾患特異的情報は、ＭｃＫｕｓｉｃｋ−Ｎａｔｈａｎｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ （Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．）及びＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）から入手可能であり、ワールドワイドウェブから入手可能である。生化学的シグナル伝達経路関連遺伝子及びポリヌクレオチドの例を表Ｃに列記する。

これらの遺伝子及び経路中の突然変異は、不適切なタンパク質又は機能に影響する不適切な量のタンパク質の産生をもたらし得る。遺伝子、疾患及びタンパク質のさらなる例は、２０１２年１２月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／７３６，５２７号明細書から本明細書によって参照により組み入れられる。このような遺伝子、タンパク質及び経路は、ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的ポリヌクレオチドとなり得る。

本発明の実施形態はまた、遺伝子のノックアウト、遺伝子の増幅並びにＤＮＡリピート不安定性及び神経学的疾患に関連する特定の突然変異の修復に関係する方法及び組成物にも関する（Ｒｏｂｅｒｔ Ｄ．Ｗｅｌｌｓ，Ｔｅｔｓｕｏ Ａｓｈｉｚａｗａ，Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｉｅｓ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｃｔ １３，２０１１−Ｍｅｄｉｃａｌ）。タンデムリピート配列の特定の側面が２０を超えるヒト疾患に関与することが分かっている（「リピート不安定性に関する新しい洞察：ＲＮＡ・ＤＮＡハイブリッドの役割（Ｎｅｗ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｒｅｐｅａｔ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ：ｒｏｌｅ ｏｆ ＲＮＡ・ＤＮＡ ｈｙｂｒｉｄｓ）」．ＭｃＩｖｏｒ ＥＩ，Ｐｏｌａｋ Ｕ，Ｎａｐｉｅｒａｌａ Ｍ．ＲＮＡ Ｂｉｏｌ．２０１０ Ｓｅｐ−Ｏｃｔ；７（５）：５５１−８）。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を利用してゲノム不安定性のこれらの欠陥を修正することができる。

本発明のさらなる態様は、ラフォラ病に関連することが同定されているＥＭＰ２Ａ及びＥＭＰ２Ｂ遺伝子の欠陥を修正するためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の利用に関する。ラフォラ病は、青年期に癲癇性発作として始まり得る進行性ミオクローヌス癲癇を特徴とする常染色体劣性病態である。この疾患の数例は、未だ同定されていない遺伝子の突然変異により引き起こされ得る。この疾患は、発作、筋痙攣、歩行困難、認知症、及び最終的に死亡を引き起こす。現在、疾患進行に対して有効であることが証明されている治療は存在しない。癲癇に関連する他の遺伝子異常もまた、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系によって標的化することができ、基礎となる遺伝学は、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｅｐｉｌｅｐｓｙ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｐｉｌｅｐｓｉｅｓ，編者Ｇｉｕｌｉａｎｏ Ａｖａｎｚｉｎｉ，Ｊｅｆｆｒｅｙ Ｌ．Ｎｏｅｂｅｌｓ，Ｍａｒｉａｎｉ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｐａｅｄｉａｔｒｉｃ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ：２０；２００９）にさらに記載されている。

Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子を不活性化させることに関するＳａｎｇａｍｏ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許出願公開第２０１１０１５８９５７号明細書の方法もまた、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に合わせて改良し得る。別の例では、両方ともにグルタミンシンテターゼ遺伝子発現遺伝子を不活性化させることに関するＳａｎｇａｍｏ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．に譲渡された米国特許出願公開第２０１００３１１１２４号明細書及びＣｅｌｌｅｃｔｉｓに譲渡された米国特許出願公開第２０１１０２２５６６４号明細書の方法もまた、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に合わせて改良し得る。

本発明のいくつかのさらなる態様は、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）のウェブサイトのトピック小節Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ（ｈｅａｌｔｈ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｔｏｐｉｃ／ＧｅｎｅｔｉｃＤｉｓｏｒｄｅｒｓにあるウェブサイト）にさらに記載されている広範な遺伝子疾患に関連する欠陥の修正に関する。遺伝子脳疾患としては、限定されるものではないが、副腎白質ジストロフィー、脳梁欠損症、アイカルディ症候群、アルパース病、アルツハイマー病、バース症候群、バッテン病、ＣＡＤＡＳＩＬ、小脳変性症、ファブリー病、ゲルストマン−ストロイスラー−シャインカー病、ハンチントン病及び他のトリプレットリピート病、リー病、レッシュ−ナイハン症候群、メンケス病、ミトコンドリアミオパチー及びＮＩＮＤＳコルポセファリーを挙げることができる。これらの疾患は、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）のウェブサイトの小節Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｂｒａｉｎ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓにさらに記載されている。

一部の実施形態において、病態は新形成であり得る。病態が新形成である一部の実施形態において、標的化する遺伝子は、表Ａに掲載するもののいずれかであり得る（この場合、ＰＴＥＮなど）。一部の実施形態において、病態は加齢黄斑変性症であり得る。一部の実施形態において、病態は統合失調症であり得る。一部の実施形態において、病態はトリヌクレオチドリピート障害であり得る。一部の実施形態において、病態は脆弱Ｘ症候群であり得る。一部の実施形態において、病態はセクレターゼ関連障害であり得る。一部の実施形態において、病態はプリオン関連障害であり得る。一部の実施形態において、病態はＡＬＳであり得る。一部の実施形態において、病態は薬物嗜癖であり得る。一部の実施形態において、病態は自閉症であり得る。一部の実施形態において、病態はアルツハイマー病であり得る。一部の実施形態において、病態は炎症であり得る。一部の実施形態において、病態はパーキンソン病であり得る。

例えば、米国特許出願公開第２０１１００２３１４５号明細書は、ジンクフィンガーヌクレアーゼを使用した自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）に関連する細胞、動物及びタンパク質の遺伝的改変を記載している。自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）は、社会的相互作用及びコミュニケーションの質的障害、並びに限定された反復的かつ常同的様式の行動、興味、及び活動によって特徴付けられる一群の障害である。３つの障害、自閉症、アスペルガー症候群（ＡＳ）及び特定不能の広汎性発達障害（ＰＤＤ−ＮＯＳ）は、種々の重症度、関連する知的機能及び医学的状態を伴う一連の同じ障害である。ＡＳＤは主に遺伝的に決定される障害であり、遺伝率は約９０％である。

米国特許出願公開第２０１１００２３１４５号明細書は、ＡＳＤに関連するタンパク質をコードする任意の染色体配列を編集することを含み、これは本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に適用し得る。ＡＳＤに関連するタンパク質は、典型的にはＡＳＤに関連するタンパク質とＡＳＤの発生率又は徴候との実験的関連性に基づき選択される。例えば、ＡＳＤを有する集団では、ＡＳＤを有しない集団と比べてＡＳＤに関連するタンパク質の産生速度又は循環中濃度が上昇又は低下し得る。タンパク質レベルの差は、限定はされないが、ウエスタンブロット、免疫組織化学染色、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、及び質量分析を含むプロテオミクス技術を用いて評価し得る。或いは、ＡＳＤに関連するタンパク質は、限定はされないが、ＤＮＡマイクロアレイ解析、遺伝子発現連鎖解析（ＳＡＧＥ）、及び定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）を含むゲノミクス技術を用いて、それらのタンパク質をコードする遺伝子の遺伝子発現プロファイルを得ることにより同定し得る。

ＡＳＤに関連するタンパク質に関連し得る疾患状態又は障害の非限定的な例には、自閉症、アスペルガー症候群（ＡＳ）、特定不能の広汎性発達障害（ＰＤＤ−ＮＯＳ）、レット症候群、結節性硬化症、フェニルケトン尿症、スミス・レムリ・オピッツ症候群及び脆弱Ｘ症候群が含まれる。非限定的な例として、ＡＳＤに関連するタンパク質には、限定はされないが以下のタンパク質が含まれる：ＡＴＰ１０Ｃ アミノリン脂質− ＭＥＴ ＭＥＴ受容体 輸送ＡＴＰアーゼ チロシンキナーゼ（ＡＴＰ１０Ｃ） ＢＺＲＡＰ１ ＭＧＬＵＲ５（ＧＲＭ５）代謝型グルタミン酸受容体５（ＭＧＬＵＲ５） ＣＤＨ１０ カドヘリン１０ ＭＧＬＵＲ６（ＧＲＭ６）代謝型グルタミン酸受容体６（ＭＧＬＵＲ６） ＣＤＨ９ カドヘリン９ ＮＬＧＮ１ ニューロリジン１ ＣＮＴＮ４ コンタクチン４ ＮＬＧＮ２ ニューロリジン２ ＣＮＴＮＡＰ２ コンタクチン関連 ＳＥＭＡ５Ａ ニューロリジン３ タンパク質様２（ＣＮＴＮＡＰ２） ＤＨＣＲ７ ７−デヒドロコレステロール ＮＬＧＮ４Ｘ ニューロリジン４ Ｘ− レダクターゼ（ＤＨＣＲ７） 連鎖性 ＤＯＣ２Ａ二重Ｃ２様ドメイン− ＮＬＧＮ４Ｙ ニューロリジン４ Ｙ− 含有タンパク質α 連鎖性 ＤＰＰ６ ジペプチジル ＮＬＧＮ５ ニューロリジン５ アミノペプチダーゼ様タンパク質６ ＥＮ２ エングレイルド２（ＥＮ２） ＮＲＣＡＭ 神経細胞接着分子（ＮＲＣＡＭ） ＭＤＧＡ２ 脆弱Ｘ精神遅滞 ＮＲＸＮ１ ニューレキシン１ １（ＭＤＧＡ２） ＦＭＲ２（ＡＦＦ２）ＡＦ４／ＦＭＲ２ファミリーメンバー２ ＯＲ４Ｍ２ 嗅覚受容体 （ＡＦＦ２） ４Ｍ２ ＦＯＸＰ２ フォークヘッドボックスタンパク質Ｐ２ ＯＲ４Ｎ４ 嗅覚受容体 （ＦＯＸＰ２） ４Ｎ４ ＦＸＲ１ 脆弱Ｘ精神 ＯＸＴＲ オキシトシン受容体 遅滞、常染色体性 （ＯＸＴＲ） ホモログ１（ＦＸＲ１） ＦＸＲ２ 脆弱Ｘ精神 ＰＡＨ フェニルアラニン 遅滞、常染色体性 水酸化酵素（ＰＡＨ） ホモログ２（ＦＸＲ２） ＧＡＢＲＡ１ γ−アミノ酪酸 ＰＴＥＮ ホスファターゼ及び 受容体サブユニットα−１ テンシンホモログ （ＧＡＢＲＡ１） （ＰＴＥＮ） ＧＡＢＲＡ５ ＧＡＢＡＡ（γ−アミノ酪 ＰＴＰＲＺ１ 受容体型 酸）受容体α５ チロシンタンパク質 サブユニット（ＧＡＢＲＡ５） ホスファターゼζ（ＰＴＰＲＺ１） ＧＡＢＲＢ１ γ−アミノ酪酸 ＲＥＬＮ リーリン 受容体サブユニットβ−１（ＧＡＢＲＢ１） ＧＡＢＲＢ３ ＧＡＢＡＡ（γ−アミノ酪 ＲＰＬ１０ ６０Ｓリボソーム 酸）受容体β３サブユニットタンパク質Ｌ１０（ＧＡＢＲＢ３） ＧＡＢＲＧ１ γ−アミノ酪酸 ＳＥＭＡ５Ａ セマフォリン−５Ａ 受容体サブユニットγ−１ （ＳＥＭＡ５Ａ） （ＧＡＢＲＧ１） ＨＩＲＩＰ３ ＨＩＲＡ相互作用タンパク質３ ＳＥＺ６Ｌ２ 発作関連６ホモログ（マウス）様２ ＨＯＸＡ１ ホメオボックスタンパク質Ｈｏｘ−Ａ１ ＳＨＡＮＫ３ ＳＨ３及び複数の（ＨＯＸＡ１）アンキリンリピートドメイン３（ＳＨＡＮＫ３） ＩＬ６ インターロイキン６ ＳＨＢＺＲＡＰ１ ＳＨ３及び複数のアンキリンリピートドメイン３（ＳＨＢＺＲＡＰ１） ＬＡＭＢ１ ラミニンサブユニットβ−１ ＳＬＣ６Ａ４ セロトニン （ＬＡＭＢ１）トランスポーター（ＳＥＲＴ） ＭＡＰＫ３ マイトジェン活性化タンパク質 ＴＡＳ２Ｒ１ 味覚受容体キナーゼ３ タイプ２ メンバー１ ＴＡＳ２Ｒ１ ＭＡＺ Ｍｙｃ関連ジンクフィンガー ＴＳＣ１ 結節性硬化症 タンパク質 タンパク質１ ＭＤＧＡ２ ＭＡＭドメイン含有 ＴＳＣ２ 結節性硬化症 グリコシルホスファチジルイノシトール タンパク質２ アンカー２（ＭＤＧＡ２） ＭＥＣＰ２ メチルＣｐＧ結合 ＵＢＥ３Ａ ユビキチンタンパク質 タンパク質２（ＭＥＣＰ２） リガーゼＥ３Ａ（ＵＢＥ３Ａ） ＭＥＣＰ２ メチルＣｐＧ結合 ＷＮＴ２ ウィングレス型 タンパク質２（ＭＥＣＰ２） ＭＭＴＶ組込み部位ファミリー、メンバー２（ＷＮＴ２）。

その染色体配列が編集されるＡＳＤに関連するタンパク質のアイデンティティは様々であってよく、かつ様々となる。好ましい実施形態において、その染色体配列が編集されるＡＳＤに関連するタンパク質は、ＢＺＲＡＰ１遺伝子によりコードされるベンゾジアゼピン（ｂｅｎｚｏｄｉａｚａｐｉｎｅ）受容体（末梢）関連タンパク質１（ＢＺＲＡＰ１）、ＡＦＦ２遺伝子（ＭＦＲ２とも称される）によりコードされるＡＦ４／ＦＭＲ２ファミリーメンバー２タンパク質（ＡＦＦ２）、ＦＸＲ１遺伝子によりコードされる脆弱Ｘ精神遅滞常染色体性ホモログ１タンパク質（ＦＸＲ１）、ＦＸＲ２遺伝子によりコードされる脆弱Ｘ精神遅滞常染色体性ホモログ２タンパク質（ＦＸＲ２）、ＭＤＧＡ２遺伝子によりコードされるＭＡＭドメイン含有グリコシルホスファチジルイノシトールアンカー２タンパク質（ＭＤＧＡ２）、ＭＥＣＰ２遺伝子によりコードされるメチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）、ＭＧＬＵＲ５−１遺伝子（ＧＲＭ５とも称される）によりコードされる代謝型グルタミン酸受容体５（ＭＧＬＵＲ５）、ＮＲＸＮ１遺伝子によりコードされるニューレキシン１タンパク質、又はＳＥＭＡ５Ａ遺伝子によりコードされるセマフォリン５Ａタンパク質（ＳＥＭＡ５Ａ）であり得る。例示的実施形態において、遺伝子改変を受ける動物はラットであり、ＡＳＤに関連するタンパク質をコードする編集される染色体配列を以下に列挙する：ＢＺＲＡＰ１ ベンゾジアゼピン（ｂｅｎｚｏｄｉａｚａｐｉｎｅ）受容体 ＸＭ＿００２７２７７８９、（末梢）関連 ＸＭ＿２１３４２７、タンパク質１（ＢＺＲＡＰ１） ＸＭ＿００２７２４５３３、ＸＭ＿００１０８１１２５ ＡＦＦ２（ＦＭＲ２）ＡＦ４／ＦＭＲ２ファミリーメンバー２ ＸＭ＿２１９８３２、（ＡＦＦ２） ＸＭ＿００１０５４６７３ ＦＸＲ１ 脆弱Ｘ精神 ＮＭ＿００１０１２１７９ 遅滞、常染色体性ホモログ１（ＦＸＲ１）ＦＸＲ２ 脆弱Ｘ精神 ＮＭ＿００１１００６４７ 遅滞、常染色体性ホモログ２（ＦＸＲ２） ＭＤＧＡ２ＭＡＭ ドメイン含有 ＮＭ＿１９９２６９ グリコシルホスファチジルイノシトールアンカー２（ＭＤＧＡ２） ＭＥＣＰ２ メチルＣｐＧ結合 ＮＭ＿０２２６７３ タンパク質２（ＭＥＣＰ２） ＭＧＬＵＲ５ 代謝型グルタミン酸 ＮＭ＿０１７０１２ （ＧＲＭ５） 受容体５（ＭＧＬＵＲ５） ＮＲＸＮ１ ニューレキシン１ ＮＭ＿０２１７６７ ＳＥＭＡ５Ａ セマフォリン−５Ａ（ＳＥＭＡ５Ａ） ＮＭ＿００１１０７６５９。

例示的動物又は細胞は、ＡＳＤに関連するタンパク質をコードする１、２、３、４、５、６、７、８、又は９個又はそれ以上の不活性化染色体配列、及びＡＳＤに関連するタンパク質をコードする０、１、２、３、４、５、６、７、８、９個又はそれ以上の染色体に組み込まれた配列を含み得る。編集され又は組み込まれる染色体配列は、変化したＡＳＤ関連タンパク質をコードするように改変され得る。ＡＳＤに関連するタンパク質における突然変異の非限定的な例としては、１８位のロイシンがグルタミンに置換されているニューレキシン１におけるＬ１８Ｑ突然変異、４５１位のアルギニンがシステインに置換されているニューロリジン３におけるＲ４５１Ｃ突然変異、８７位のアルギニンがトリプトファンに置換されているニューロリジン４におけるＲ８７Ｗ突然変異、及び４２５位のイソロイシンがバリンに置換されているセロトニントランスポーターにおけるＩ４２５Ｖ突然変異が挙げられる。ＡＳＤ関連染色体配列における他の多くの突然変異及び染色体再配列がＡＳＤと関連付けられており、当該技術分野において公知である。例えば、Ｆｒｅｉｔａｇ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｅｕｒ．Ｃｈｉｌｄ．Ａｄｏｌｅｓｃ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ １９：１６９−１７８、及びＢｕｃａｎ ｅｔ ａｌ．（２００９）ＰＬｏＳ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ５：ｅ１０００５３６（これらの開示は参照により全体として本明細書に組み入れられる）を参照のこと。

パーキンソン病に関連するタンパク質の例としては、限定されるものではないが、α−シヌクレイン、ＤＪ−１、ＬＲＲＫ２、ＰＩＮＫ１、パーキン、ＵＣＨＬ１、シンフィリン−１、及びＮＵＲＲ１が挙げられる。

嗜癖関連タンパク質の例としては、例えば、ＡＢＡＴを挙げることができる。

炎症関連タンパク質の例としては、例えば、Ｃｃｒ２遺伝子によりコードされる単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ１）、Ｃｃｒ５遺伝子によりコードされるＣ−Ｃケモカイン受容体５型（ＣＣＲ５）、Ｆｃｇｒ２ｂ遺伝子によりコードされるＩｇＧ受容体ＩＩＢ（ＦＣＧＲ２ｂ、ＣＤ３２とも称される）、又はＦｃｅｒ１ｇ遺伝子によりコードされるＦｃイプシロンＲ１ｇ（ＦＣＥＲ１ｇ）タンパク質を挙げることができる。

心血管疾患関連タンパク質の例としては、例えば、ＩＬ１Ｂ（インターロイキン１、ベータ）、ＸＤＨ（キサンチンデヒドロゲナーゼ）、ＴＰ５３（腫瘍タンパク質ｐ５３）、ＰＴＧＩＳ（プロスタグランジンＩ２（プロスタサイクリン）シンターゼ）、ＭＢ（ミオグロビン）、ＩＬ４（インターロイキン４）、ＡＮＧＰＴ１（アンジオポエチン１）、ＡＢＣＧ８（ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＧ（ＷＨＩＴＥ）、メンバー８）、又はＣＴＳＫ（カテプシンＫ）を挙げることができる。

例えば、米国特許出願公開第２０１１００２３１５３号明細書は、ジンクフィンガーヌクレアーゼを使用したアルツハイマー病に関連する細胞、動物及びタンパク質の遺伝子改変を記載している。一たび改変された細胞及び動物は、ＡＤの試験で一般的に用いられる尺度−例えば、限定なしに、学習及び記憶、不安、抑欝、嗜癖、及び感覚運動機能を使用して、標的突然変異がＡＤの発症及び／又は進行に及ぼす効果を研究するための公知の方法、並びに行動的、機能的、病理学的、代謝的（ｍｅｔａｂｏｌｏｉｃ）及び生化学的機能を計測するアッセイを用いてさらに試験し得る。

本開示は、ＡＤに関連するタンパク質をコードする任意の染色体配列を編集することを含む。ＡＤ関連タンパク質は、典型的にはＡＤ関連タンパク質とＡＤ障害との実験的関連性に基づき選択される。例えば、ＡＤ障害を有する集団では、ＡＤ障害を有しない集団と比べてＡＤ関連タンパク質の産生速度又は循環中濃度が上昇又は低下し得る。タンパク質レベルの差は、限定はされないが、ウエスタンブロット、免疫組織化学染色、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、及び質量分析を含むプロテオミクス技術を用いて評価し得る。或いは、ＡＤ関連タンパク質は、限定はされないが、ＤＮＡマイクロアレイ解析、遺伝子発現連鎖解析（ＳＡＧＥ）、及び定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）を含むゲノミクス技術を用いて、それらのタンパク質をコードする遺伝子の遺伝子発現プロファイルを得ることにより同定し得る。

アルツハイマー病関連タンパク質の例としては、例えば、ＶＬＤＬＲ遺伝子によりコードされる超低密度リポタンパク質受容体タンパク質（ＶＬＤＬＲ）、ＵＢＡ１遺伝子によりコードされるユビキチン様修飾因子活性化酵素１（ＵＢＡ１）、又はＵＢＡ３遺伝子によりコードされるＮＥＤＤ８活性化酵素Ｅ１触媒サブユニットタンパク質（ＵＢＥ１Ｃ）を挙げることができる。

非限定的な例として、ＡＤに関連するタンパク質には、限定はされないが、以下のとおり列挙されるタンパク質が含まれる：染色体配列によりコードされるタンパク質ＡＬＡＳ２ Δ−アミノレブリン酸シンターゼ２（ＡＬＡＳ２） ＡＢＣＡ１ ＡＴＰ結合カセットトランスポーター（ＡＢＣＡ１） ＡＣＥ アンジオテンシンＩ変換酵素（ＡＣＥ） ＡＰＯＥ アポリポタンパク質Ｅ前駆体（ＡＰＯＥ） ＡＰＰ アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ） ＡＱＰ１ アクアポリン１タンパク質（ＡＱＰ１） ＢＩＮ１ Ｍｙｃボックス依存性相互作用タンパク質１又は架橋インテグレータ（ｂｒｉｄｇｉｎｇ ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ）１タンパク質（ＢＩＮ１） ＢＤＮＦ 脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ） ＢＴＮＬ８ ブチロフィリン様タンパク質８（ＢＴＮＬ８） Ｃ１ＯＲＦ４９ 染色体１オープンリーディングフレーム４９ ＣＤＨ４ カドヘリン４ ＣＨＲＮＢ２ ニューロンアセチルコリン受容体サブユニットβ−２ ＣＫＬＦＳＦ２ ＣＫＬＦ様ＭＡＲＶＥＬ膜貫通ドメイン含有タンパク質２（ＣＫＬＦＳＦ２） ＣＬＥＣ４Ｅ Ｃ型レクチンドメインファミリー４、メンバーｅ（ＣＬＥＣ４Ｅ） ＣＬＵ クラスタリンタンパク質（アポリポタンパク質（ａｐｏｐｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）Ｊとしても知られる） ＣＲ１ 赤血球補体受容体１（ＣＲ１、またＣＤ３５、Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ受容体及び免疫粘着受容体としても知られる） ＣＲ１Ｌ 赤血球補体受容体１（ＣＲ１Ｌ） ＣＳＦ３Ｒ 顆粒球コロニー刺激因子３受容体（ＣＳＦ３Ｒ） ＣＳＴ３ シスタチンＣ又はシスタチン３ ＣＹＰ２Ｃ シトクロムＰ４５０ ２Ｃ ＤＡＰＫ１ 細胞死関連プロテインキナーゼ１（ＤＡＰＫ１） ＥＳＲ１ エストロゲン受容体１ ＦＣＡＲ ＩｇＡ受容体のＦｃ断片（ＦＣＡＲ、またＣＤ８９としても知られる） ＦＣＧＲ３Ｂ ＩｇＧのＦｃ断片、低親和性ＩＩＩｂ、受容体（ＦＣＧＲ３Ｂ又はＣＤ１６ｂ） ＦＦＡ２ 遊離脂肪酸受容体２（ＦＦＡ２） ＦＧＡ フィブリノゲン（因子Ｉ） ＧＡＢ２ ＧＲＢ２関連結合タンパク質２（ＧＡＢ２） ＧＡＢ２ ＧＲＢ２関連結合タンパク質２（ＧＡＢ２） ＧＡＬＰ ガラニン様ペプチド ＧＡＰＤＨＳ グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、精子形成（ＧＡＰＤＨＳ） ＧＭＰＢ ＧＭＢＰ ＨＰハプトグロビン（ＨＰ） ＨＴＲ７ ５−ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体７（アデニル酸シクラーゼ共役型） ＩＤＥ インスリン分解酵素 ＩＦ１２７ ＩＦ１２７ ＩＦＩ６インターフェロン、α−誘導性タンパク質６（ＩＦＩ６） ＩＦＩＴ２ テトラトリコペプチドリピートを有するインターフェロン誘導タンパク質２（ＩＦＩＴ２） ＩＬ１ＲＮ インターロイキン−１受容体拮抗薬（ＩＬ−１ＲＡ） ＩＬ８ＲＡ インターロイキン８受容体、α（ＩＬ８ＲＡ又はＣＤ１８１） ＩＬ８ＲＢ インターロイキン８受容体、β（ＩＬ８ＲＢ） ＪＡＧ１ジャグド１（ＪＡＧ１） ＫＣＮＪ１５ カリウム内向き整流性チャネル、サブファミリーＪ、メンバー１５（ＫＣＮＪ１５） ＬＲＰ６ 低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質６（ＬＲＰ６） ＭＡＰＴ 微小管結合タンパク質τ（ＭＡＰＴ） ＭＡＲＫ４ ＭＡＰ／微小管親和性調節キナーゼ４（ＭＡＲＫ４） ＭＰＨＯＳＰＨ１ Ｍ期リンタンパク質１ ＭＴＨＦＲ ５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素 ＭＸ２ インターフェロン誘導ＧＴＰ結合タンパク質 Ｍｘ２ ＮＢＮ ニブリン、ＮＢＮとしても知られる ＮＣＳＴＮ ニカストリン ＮＩＡＣＲ２ ナイアシン受容体２（ＮＩＡＣＲ２、またＧＰＲ１０９Ｂとしても知られる） ＮＭＮＡＴ３ ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ３ ＮＴＭ ニューロトリミン（又はＨＮＴ） ＯＲＭ１ オロソムコイド（Ｏｒｏｓｍｕｃｏｉｄ）１（ＯＲＭ１）又はα−１−酸糖タンパク質１ Ｐ２ＲＹ１３ Ｐ２Ｙ プリン受容体１３（Ｐ２ＲＹ１３） ＰＢＥＦ１ プレＢ細胞コロニー増強因子１（ＰＢＥＦ１）又はビスファチンとしても知られるニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡｍＰＲＴアーゼ又はＮａｍｐｔ） ＰＣＫ１ ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ ＰＩＣＡＬＭ ホスファチジルイノシトール結合クラスリン集合タンパク質（ＰＩＣＡＬＭ） ＰＬＡＵ ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベータ（ＰＬＡＵ） ＰＬＸＮＣ１ プレキシンＣ１（ＰＬＸＮＣ１） ＰＲＮＰ プリオンタンパク質 ＰＳＥＮ１ プレセニリン１タンパク質（ＰＳＥＮ１） ＰＳＥＮ２ プレセニリン２タンパク質（ＰＳＥＮ２） ＰＴＰＲＡ タンパク質チロシンホスファターゼ受容体Ａ型タンパク質（ＰＴＰＲＡ） ＲＡＬＧＰＳ２ ＰＨドメイン及びＳＨ３結合モチーフを有するＲａｌ ＧＥＦ２（ＲＡＬＧＰＳ２） ＲＧＳＬ２ Ｇタンパク質シグナル伝達様の調節因子２（ＲＧＳＬ２） ＳＥＬＥＮＢＰ１ セレン結合タンパク質１（ＳＥＬＮＢＰ１） ＳＬＣ２５Ａ３７ ミトフェリン１ ＳＯＲＬ１ ソルチリン関連受容体Ｌ（ＤＬＲクラス）Ａリピート含有タンパク質（ＳＯＲＬ１） ＴＦ トランスフェリン ＴＦＡＭ ミトコンドリア転写因子Ａ ＴＮＦ 腫瘍壊死因子 ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ 腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１０Ｃ（ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ） ＴＮＦＳＦ１０ 腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、（ＴＲＡＩＬ）メンバー１０ａ（ＴＮＦＳＦ１０） ＵＢＡ１ ユビキチン様モディファイヤー活性化酵素１（ＵＢＡ１） ＵＢＡ３ ＮＥＤＤ８活性化酵素Ｅ１触媒サブユニットタンパク質（ＵＢＥ１Ｃ） ＵＢＢ ユビキチンＢタンパク質（ＵＢＢ） ＵＢＱＬＮ１ ユビキリン１ ＵＣＨＬ１ ユビキチンカルボキシル末端エステラーゼＬ１タンパク質（ＵＣＨＬ１） ＵＣＨＬ３ ユビキチンカルボキシル末端ヒドロラーゼアイソザイムＬ３タンパク質（ＵＣＨＬ３） ＶＬＤＬＲ 超低密度リポタンパク質受容体タンパク質（ＶＬＤＬＲ）。

例示的実施形態において、その染色体配列が編集されるＡＤに関連するタンパク質は、ＶＬＤＬＲ遺伝子によりコードされる超低密度リポタンパク質受容体タンパク質（ＶＬＤＬＲ）、ＵＢＡ１遺伝子によりコードされるユビキチン様モディファイヤー活性化酵素１（ＵＢＡ１）、ＵＢＡ３遺伝子によりコードされるＮＥＤＤ８活性化酵素Ｅ１触媒サブユニットタンパク質（ＵＢＥ１Ｃ）、ＡＱＰ１遺伝子によりコードされるアクアポリン１タンパク質（ＡＱＰ１）、ＵＣＨＬ１遺伝子によりコードされるユビキチンカルボキシル末端エステラーゼＬ１タンパク質（ＵＣＨＬ１）、ＵＣＨＬ３遺伝子によりコードされるユビキチンカルボキシル末端ヒドロラーゼアイソザイムＬ３タンパク質（ＵＣＨＬ３）、ＵＢＢ遺伝子によりコードされるユビキチンＢタンパク質（ＵＢＢ）、ＭＡＰＴ遺伝子によりコードされる微小管結合タンパク質τ（ＭＡＰＴ）、ＰＴＰＲＡ遺伝子によりコードされるタンパク質チロシンホスファターゼ受容体Ａ型タンパク質（ＰＴＰＲＡ）、ＰＩＣＡＬＭ遺伝子によりコードされるホスファチジルイノシトール結合クラスリン集合タンパク質（ＰＩＣＡＬＭ）、ＣＬＵ遺伝子によりコードされるクラスタリンタンパク質（アポリポタンパク質（ａｐｏｐｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）Ｊとしても知られる）、ＰＳＥＮ１遺伝子によりコードされるプレセニリン１タンパク質、ＰＳＥＮ２遺伝子によりコードされるプレセニリン２タンパク質、ＳＯＲＬ１遺伝子によりコードされるソルチリン関連受容体Ｌ（ＤＬＲクラス）Ａリピート含有タンパク質（ＳＯＲＬ１）タンパク質、ＡＰＰ遺伝子によりコードされるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、ＡＰＯＥ遺伝子によりコードされるアポリポタンパク質Ｅ前駆体（ＡＰＯＥ）、又はＢＤＮＦ遺伝子によりコードされる脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）であり得る。例示的実施形態において、遺伝子改変を受ける動物はラットであり、及びＡＤに関連するタンパク質をコードする編集される染色体配列は以下のとおりである：ＡＰＰ アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ） ＮＭ＿０１９２８８ ＡＱＰ１ アクアポリン１タンパク質（ＡＱＰ１） ＮＭ＿０１２７７８ ＢＤＮＦ 脳由来神経栄養因子 ＮＭ＿０１２５１３ ＣＬＵ クラスタリンタンパク質（ＮＭ＿０５３０２１ アポリポタンパク質（ａｐｏｐｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）Ｊとしても知られる） ＭＡＰＴ 微小管結合タンパク質 ＮＭ＿０１７２１２ τ（ＭＡＰＴ） ＰＩＣＡＬＭ ホスファチジルイノシトール結合 ＮＭ＿０５３５５４ クラスリン集合タンパク質（ＰＩＣＡＬＭ） ＰＳＥＮ１ プレセニリン１タンパク質（ＰＳＥＮ１） ＮＭ＿０１９１６３ ＰＳＥＮ２ プレセニリン２タンパク質（ＰＳＥＮ２） ＮＭ＿０３１０８７ ＰＴＰＲＡ タンパク質チロシンホスファターゼ ＮＭ＿０１２７６３ 受容体Ａ型タンパク質（ＰＴＰＲＡ） ＳＯＲＬ１ ソルチリン関連受容体Ｌ（ＤＬＲ ＮＭ＿０５３５１９、クラス）Ａリピート含有 ＸＭ＿００１０６５５０６、タンパク質 （ＳＯＲＬ１） ＸＭ＿２１７１１５ ＵＢＡ１ ユビキチン様モディファイヤー活性化 ＮＭ＿００１０１４０８０ 酵素１（ＵＢＡ１） ＵＢＡ３ ＮＥＤＤ８活性化酵素Ｅ１ ＮＭ＿０５７２０５ 触媒サブユニットタンパク質（ＵＢＥ１Ｃ） ＵＢＢ ユビキチンＢタンパク質（ＵＢＢ） ＮＭ＿１３８８９５ ＵＣＨＬ１ ユビキチンカルボキシル末端 ＮＭ＿０１７２３７ エステラーゼＬ１タンパク質（ＵＣＨＬ１） ＵＣＨＬ３ ユビキチンカルボキシル末端 ＮＭ＿００１１１０１６５ ヒドロラーゼアイソザイムＬ３タンパク質（ＵＣＨＬ３） ＶＬＤＬＲ 超低密度リポタンパク質 ＮＭ＿０１３１５５ 受容体タンパク質（ＶＬＤＬＲ）。

動物又は細胞は、ＡＤに関連するタンパク質をコードする１、２、３、４、５、６、７、８、９，１０、１１、１２、１３、１４、１５個又はそれ以上の破壊された染色体配列、及びＡＤに関連するタンパク質をコードする０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個又はそれ以上の染色体に組み込まれた配列を含み得る。

編集される又は組み込まれる染色体配列は、変化したＡＤ関連タンパク質をコードするように改変され得る。ＡＤ関連染色体配列における数多くの突然変異がＡＤと関連付けられている。例えば、ＡＰＰにおけるＶ７１７１（即ち７１７位のバリンがイソロイシンに変わる）ミスセンス突然変異は家族性ＡＤを引き起こす。プレセニリン１タンパク質における複数の突然変異、例えばＨ１６３Ｒ（即ち１６３位のヒスチジンがアルギニンに変わる）、Ａ２４６Ｅ（即ち２４６位のアラニンがグルタミン酸に変わる）、Ｌ２８６Ｖ（即ち２８６位のロイシンがバリンに変わる）及びＣ４１０Ｙ（即ち４１０位のシステインがチロシンに変わる）は家族性アルツハイマー３型を引き起こす。プレセニリン２タンパク質における突然変異、例えばＮ１４１Ｉ（即ち１４１位のアスパラギンがイソロイシンに変わる）、Ｍ２３９Ｖ（即ち２３９位のメチオニンがバリンに変わる）、及びＤ４３９Ａ（即ち４３９位のアスパラギン酸がアラニンに変わる）は家族性アルツハイマー４型を引き起こす。ＡＤ関連遺伝子の遺伝的変異と疾患との他の関連性は当該技術分野において公知である。例えば、Ｗａｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．６５：３２９−３３４（この開示は参照により全体として本明細書に組み込まれる）を参照のこと。

自閉症スペクトラム障害に関連するタンパク質の例としては、例えば、ＢＺＲＡＰ１遺伝子によりコードされるベンゾジアゼピン受容体（末梢性）関連タンパク質１（ＢＺＲＡＰ１）、ＡＦＦ２遺伝子（ＭＦＲ２とも称される）によりコードされるＡＦ４／ＦＭＲ２ファミリーメンバー２タンパク質（ＡＦＦ２）、ＦＸＲ１遺伝子によりコードされる脆弱性Ｘ精神遅滞常染色体ホモログ１タンパク質（ＦＸＲ１）、又はＦＸＲ２遺伝子によりコードされる脆弱性Ｘ精神遅滞常染色体ホモログ２タンパク質（ＦＸＲ２）を挙げることができる。

黄斑変性症に関連するタンパク質の例としては、例えば、ＡＢＣＲ遺伝子によりコードされるＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）メンバー４タンパク質（ＡＢＣＡ４）、ＡＰＯＥ遺伝子によりコードされるアポリポタンパク質Ｅタンパク質（ＡＰＯＥ）、又はＣＣＬ２遺伝子によりコードされるケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２タンパク質（ＣＣＬ２）を挙げることができる。

統合失調症に関連するタンパク質の例としては、ＮＲＧ１、ＥｒｂＢ４、ＣＰＬＸ１、ＴＰＨ１、ＴＰＨ２、ＮＲＸＮ１、ＧＳＫ３Ａ、ＢＤＮＦ、ＤＩＳＣ１、ＧＳＫ３Ｂ、及びそれらの組合せを挙げることができる。

腫瘍抑制に関与するタンパク質の例としては、例えば、ＡＴＭ（毛細血管拡張性運動失調症変異）、ＡＴＲ（毛細血管拡張性運動失調症及びＲａｄ３関連）、ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）、ＥＲＢＢ２（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ２）、ＥＲＢＢ３（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ３）、ＥＲＢＢ４（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ４）、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、又はＮｏｔｃｈ４を挙げることができる。

セクレターゼ障害に関連するタンパク質の例としては、例えば、ＰＳＥＮＥＮ（プレセニリンエンハンサー２ホモログ（線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）））、ＣＴＳＢ（カテプシンＢ）、ＰＳＥＮ１（プレセニリン１）、ＡＰＰ（アミロイドベータ（Ａ４）前駆体タンパク質）、ＡＰＨ１Ｂ（咽頭前部欠損１ホモログＢ（線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）））、ＰＳＥＮ２（プレセニリン２（アルツハイマー病４））、又はＢＡＣＥ１（ベータ部位ＡＰＰ切断酵素１）を挙げることができる。

例えば、米国特許出願公開第２０１１００２３１４６号明細書は、ジンクフィンガーヌクレアーゼを使用したセクレターゼ関連障害に関連する細胞、動物及びタンパク質の遺伝子改変を記載している。セクレターゼは、プレタンパク質をその生物学的に活性な形態にプロセシングするために必須である。セクレターゼ経路の種々の構成成分の欠陥は、多くの障害、特に、アルツハイマー病（ＡＤ）など、顕著な特徴であるアミロイド形成又はアミロイド斑を伴う障害に寄与する。

セクレターゼ障害及びそれらの障害に関連するタンパク質は、数多くの障害に対する感受性、障害の存在、障害の重症度、又はそれらの任意の組み合わせをもたらすタンパク質の多様な集合である。本開示は、セクレターゼ障害に関連するタンパク質をコードする任意の染色体配列を編集することを含む。セクレターゼ障害に関連するタンパク質は、典型的にはセクレターゼ関連タンパク質とセクレターゼ障害の発症との実験的関連性に基づき選択される。例えば、セクレターゼ障害を有する集団では、セクレターゼ障害を有しない集団と比べてセクレターゼ障害に関連するタンパク質の産生速度又は循環中濃度が上昇又は低下し得る。タンパク質レベルの差は、限定はされないが、ウエスタンブロット、免疫組織化学染色、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、及び質量分析を含むプロテオミクス技術を用いて評価し得る。或いは、セクレターゼ障害に関連するタンパク質は、限定はされないが、ＤＮＡマイクロアレイ解析、遺伝子発現連鎖解析（ＳＡＧＥ）、及び定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）を含むゲノミクス技術を用いて、それらのタンパク質をコードする遺伝子の遺伝子発現プロファイルを得ることにより同定し得る。

非限定的な例として、セクレターゼ障害に関連するタンパク質には、ＰＳＥＮＥＮ（プレセニリンエンハンサー２ホモログ（Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）））、ＣＴＳＢ（カテプシンＢ）、ＰＳＥＮ１（プレセニリン１）、ＡＰＰ（アミロイドβ（Ａ４）前駆体タンパク質）、ＡＰＨ１Ｂ（前咽頭不全１ホモログＢ（Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）））、ＰＳＥＮ２（プレセニリン２（アルツハイマー病４））、ＢＡＣＥ１（β部位ＡＰＰ切断酵素１）、ＩＴＭ２Ｂ（内在性膜タンパク質２Ｂ）、ＣＴＳＤ（カテプシンＤ）、ＮＯＴＣＨ１（Ｎｏｔｃｈホモログ１、転座関連（ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）））、ＴＮＦ（腫瘍壊死因子（ＴＮＦスーパーファミリー、メンバー２））、ＩＮＳ（インスリン）、ＤＹＴ１０（ジストニー１０）、ＡＤＡＭ１７（ＡＤＡＭメタロペプチダーゼドメイン１７）、ＡＰＯＥ（アポリポタンパク質Ｅ）、ＡＣＥ（アンジオテンシンＩ変換酵素（ペプチジルジペプチダーゼＡ）１）、ＳＴＮ（スタチン）、ＴＰ５３（腫瘍タンパク質ｐ５３）、ＩＬ６（インターロイキン６（インターフェロン、β２））、ＮＧＦＲ（神経成長因子受容体（ＴＮＦＲスーパーファミリー、メンバー１６））、ＩＬ１Ｂ（インターロイキン１、β）、ＡＣＨＥ（アセチルコリンエステラーゼ（Ｙｔ血液型））、ＣＴＮＮＢ１（カテニン（カドヘリン関連タンパク質）、β１、８８ｋＤａ）、ＩＧＦ１（インスリン様成長因子１（ソマトメジンＣ））、ＩＦＮＧ（インターフェロン、γ）、ＮＲＧ１（ニューレグリン１）、ＣＡＳＰ３（カスパーゼ３、アポトーシス関連システインペプチダーゼ）、ＭＡＰＫ１（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ１）、ＣＤＨ１（カドヘリン１、１型、Ｅ−カドヘリン（上皮））、ＡＰＢＢ１（アミロイドβ（Ａ４）前駆体タンパク質結合、ファミリーＢ、メンバー１（Ｆｅ６５））、ＨＭＧＣＲ（３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ還元酵素）、ＣＲＥＢ１（ｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質１）、ＰＴＧＳ２（プロスタグランジンエンドペルオキシドシンターゼ２（プロスタグランジンＧ／Ｈシンターゼ及びシクロオキシゲナーゼ））、ＨＥＳ１（ヘアリー及びエンハンサー・オブ・スプリット１、（ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）））、ＣＡＴ（カタラーゼ）、ＴＧＦＢ１（形質転換成長因子、β１）、ＥＮＯ２（エノラーゼ２（γ、ニューロン））、ＥＲＢＢ４（ｖ−ｅｒｂ−ａ赤芽球性白血病ウイルス性癌遺伝子ホモログ４（トリ））、ＴＲＡＰＰＣ１０（輸送タンパク質粒子複合体１０）、ＭＡＯＢ（モノアミンオキシダーゼＢ）、ＮＧＦ（神経成長因子（βポリペプチド））、ＭＭＰ１２（マトリックスメタロペプチダーゼ１２（マクロファージエラスターゼ））、ＪＡＧ１（ジャグド１（アラジール症候群））、ＣＤ４０ＬＧ（ＣＤ４０リガンド）、ＰＰＡＲＧ（ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ）、ＦＧＦ２（線維芽細胞成長因子２（塩基性））、ＩＬ３（インターロイキン３（コロニー刺激因子、多重））、ＬＲＰ１（低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１）、ＮＯＴＣＨ４（Ｎｏｔｃｈホモログ４（ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）））、ＭＡＰＫ８（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ８）、ＰＲＥＰ（プロリルエンドペプチダーゼ）、ＮＯＴＣＨ３（Ｎｏｔｃｈホモログ３（ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）））、ＰＲＮＰ（プリオンタンパク質）、ＣＴＳＧ（カテプシンＧ）、ＥＧＦ（上皮成長因子（β−ウロガストロン））、ＲＥＮ（レニン）、ＣＤ４４（ＣＤ４４分子（インド人血液型））、ＳＥＬＰ（セレクチンＰ（顆粒膜タンパク質１４０ｋＤａ、抗原ＣＤ６２））、ＧＨＲ（成長ホルモン受容体）、ＡＤＣＹＡＰ１（アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド１（下垂体））、ＩＮＳＲ（インスリン受容体）、ＧＦＡＰ（グリア線維性酸性タンパク質）、ＭＭＰ３（マトリックスメタロペプチダーゼ３（ストロメライシン１、プロゼラチナーゼ））、ＭＡＰＫ１０（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ１０）、ＳＰ１（Ｓｐ１転写因子）、ＭＹＣ（ｖ−ｍｙｃ骨髄球腫症ウイルス癌遺伝子ホモログ（トリ））、ＣＴＳＥ（カテプシンＥ）、ＰＰＡＲＡ（ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体α）、ＪＵＮ（ｊｕｎ癌遺伝子）、ＴＩＭＰ１（ＴＩＭＰメタロペプチダーゼ阻害因子１）、ＩＬ５（インターロイキン５（コロニー刺激因子、好酸球））、ＩＬ１Ａ（インターロイキン１、α）、ＭＭＰ９（マトリックスメタロペプチダーゼ９（ゼラチナーゼＢ、９２ｋＤａゼラチナーゼ、９２ｋＤａ ＩＶ型コラゲナーゼ））、ＨＴＲ４（５−ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体４）、ＨＳＰＧ２（ヘパラン硫酸プロテオグリカン２）、ＫＲＡＳ（ｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ）、ＣＹＣＳ（シトクロムｃ、体細胞性）、ＳＭＧ１（ＳＭＧ１ホモログ、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ関連キナーゼ（Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）））、ＩＬ１Ｒ１（インターロイキン１受容体、Ｉ型）、ＰＲＯＫ１（プロキネチシン１）、ＭＡＰＫ３（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ３）、ＮＴＲＫ１（神経栄養チロシンキナーゼ、受容体、１型）、ＩＬ１３（インターロイキン１３）、ＭＭＥ（膜メタロエンドペプチダーゼ）、ＴＫＴ（トランスケトラーゼ）、ＣＸＣＲ２（ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体２）、ＩＧＦ１Ｒ（インスリン様成長因子１受容体）、ＲＡＲＡ（レチノイン酸受容体、α）、ＣＲＥＢＢＰ（ＣＲＥＢ結合タンパク質）、ＰＴＧＳ１（プロスタグランジンエンドペルオキシドシンターゼ１（プロスタグランジンＧ／Ｈシンターゼ及びシクロオキシゲナーゼ））、ＧＡＬＴ（ガラクトース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ）、ＣＨＲＭ１（コリン作動性受容体、ムスカリン作動性１）、ＡＴＸＮ１（アタキシン１）、ＰＡＷＲ（ＰＲＫＣ、アポトーシス、ＷＴ１、調節因子）、ＮＯＴＣＨ２（Ｎｏｔｃｈホモログ２（ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）））、Ｍ６ＰＲ（マンノース−６−リン酸受容体（カチオン依存性））、ＣＹＰ４６Ａ１（シトクロムＰ４５０、ファミリー４６、サブファミリーＡ、ポリペプチド１）、ＣＳＮＫ１ Ｄ（カゼインキナーゼ１、δ）、ＭＡＰＫ１４（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ１４）、ＰＲＧ２（プロテオグリカン２、骨髄（ナチュラルキラー細胞アクチベーター、好酸球顆粒主要塩基性タンパク質））、ＰＲＫＣＡ（プロテインキナーゼＣ、α）、Ｌ１ ＣＡＭ（Ｌ１細胞接着分子）、ＣＤ４０（ＣＤ４０分子、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー５）、ＮＲ１Ｉ２（核内受容体サブファミリー１、グループＩ、メンバー２）、ＪＡＧ２（ジャグド２）、ＣＴＮＮＤ１（カテニン（カドヘリン関連タンパク質）、δ１）、ＣＤＨ２（カドヘリン２、１型、Ｎ−カドヘリン（神経型））、ＣＭＡ１（キマーゼ１、マスト細胞）、ＳＯＲＴ１（ソルチリン１）、ＤＬＫ１（δ様１ホモログ（ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）））、ＴＨＥＭ４（チオエステラーゼスーパーファミリーメンバー４）、ＪＵＰ（結合プラコグロビン）、ＣＤ４６（ＣＤ４６分子、補体調節タンパク質）、ＣＣＬ１１（ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド１１）、ＣＡＶ３（カベオリン３）、ＲＮＡＳＥ３（リボヌクレアーゼ、ＲＮアーゼＡファミリー、３（好酸球カチオン性タンパク質））、ＨＳＰＡ８（熱ショック７０ｋＤａタンパク質８）、ＣＡＳＰ９（カスパーゼ９、アポトーシス関連システインペプチダーゼ）、ＣＹＰ３Ａ４（シトクロムＰ４５０、ファミリー３、サブファミリーＡ、ポリペプチド４）、ＣＣＲ３（ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体３）、ＴＦＡＰ２Ａ（転写因子ＡＰ−２α（活性化エンハンサー結合タンパク質２α））、ＳＣＰ２（ステロールキャリアタンパク質２）、ＣＤＫ４（サイクリン依存性キナーゼ４）、ＨＩＦ１Ａ（低酸素誘導因子１、αサブユニット（塩基性ヘリックス−ループ−ヘリックス転写因子））、ＴＣＦ７Ｌ２（転写因子７様２（Ｔ細胞特異的、ＨＭＧボックス））、ＩＬ１Ｒ２（インターロイキン１受容体、ＩＩ型）、Ｂ３ＧＡＬＴＬ（β １，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ様）、ＭＤＭ２（Ｍｄｍ２ ｐ５３結合タンパク質ホモログ（マウス））、ＲＥＬＡ（ｖ−ｒｅｌ細網内皮症ウイルス癌遺伝子ホモログＡ（トリ））、ＣＡＳＰ７（カスパーゼ７、アポトーシス関連システインペプチダーゼ）、ＩＤＥ（インスリン分解酵素）、ＦＡＢＰ４（脂肪酸結合タンパク質４、脂肪細胞）、ＣＡＳＫ（カルシウム／カルモジュリン依存性セリンプロテインキナーゼ（ＭＡＧＵＫファミリー））、ＡＤＣＹＡＰ１Ｒ１（アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド１（下垂体）受容体Ｉ型）、ＡＴＦ４（活性化転写因子４（ｔａｘ応答性エンハンサーエレメントＢ６７））、ＰＤＧＦＡ（血小板由来成長因子αポリペプチド）、Ｃ２１又はｆ３３（染色体２１オープンリーディングフレーム３３）、ＳＣＧ５（セクレトグラニンＶ（７Ｂ２タンパク質））、ＲＮＦ１２３（リングフィンガータンパク質１２３）、ＮＦＫＢ１（Ｂ細胞内κ軽鎖ポリペプチド遺伝子エンハンサーの核内因子１）、ＥＲＢＢ２（ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ２、神経／膠芽腫由来癌遺伝子ホモログ（トリ））、ＣＡＶ１（カベオリン１、カベオラタンパク質、２２ｋＤａ）、ＭＭＰ７（マトリックスメタロペプチダーゼ７（マトリライシン、子宮））、ＴＧＦＡ（形質転換成長因子、α）、ＲＸＲＡ（レチノイドＸ受容体、α）、ＳＴＸ１Ａ（シンタキシン１Ａ（脳））、ＰＳＭＣ４（プロテアソーム（プロソーム、マクロパイン）２６Ｓサブユニット、ＡＴＰアーゼ、４）、Ｐ２ＲＹ２（プリン受容体Ｐ２Ｙ、Ｇタンパク質共役、２）、ＴＮＦＲＳＦ２１（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー２１）、ＤＬＧ１（ディスク、ラージホモログ１（ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）））、ＮＵＭＢＬ（ｎｕｍｂホモログ（ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ））様）、ＳＰＮ（シアロホリン）、ＰＬＳＣＲ１（リン脂質スクランブラーゼ１）、ＵＢＱＬＮ２（ユビキリン２）、ＵＢＱＬＮ１（ユビキリン１）、ＰＣＳＫ７（プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン７型）、ＳＰＯＮ１（スポンジン１、細胞外マトリックスタンパク質）、ＳＩＬＶ（シルバーホモログ（マウス））、ＱＰＣＴ（グルタミニルペプチドシクロトランスフェラーゼ）、ＨＥＳＳ（ヘアリー及びエンハンサー・オブ・スプリット５（ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）））、ＧＣＣ１（ＧＲＩＰ及びコイルドコイルドメイン含有１）、及びそれらの任意の組み合わせが含まれる。

遺伝子改変を受ける動物又は細胞は、セクレターゼ障害に関連するタンパク質をコードする１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上の破壊された染色体配列、及び破壊されたセクレターゼ障害関連タンパク質をコードする０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上の染色体に組み込まれた配列を含み得る。

筋萎縮性側索硬化症に関連するタンパク質の例には、ＳＯＤ１（スーパーオキシドジスムターゼ１）、ＡＬＳ２（筋萎縮性側索硬化症２）、ＦＵＳ（肉腫融合）、ＴＡＲＤＢＰ（ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質）、ＶＡＧＦＡ（血管内皮増殖因子Ａ）、ＶＡＧＦＢ（血管内皮増殖因子Ｂ）、及びＶＡＧＦＣ（血管内皮増殖因子Ｃ）、及びそれらの任意の組み合わせが含まれ得る。

例えば、米国特許出願公開第２０１１００２３１４４号明細書は、ジンクフィンガーヌクレアーゼを使用した筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｙｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）（ＡＬＳ）疾患に関連する細胞、動物及びタンパク質の遺伝子改変を記載している。ＡＬＳは、随意運動に関わる皮質、脳幹、及び脊髄における特定の神経細胞の漸進的で確実な変性によって特徴付けられる。

運動ニューロン障害及びそれらの障害に関連するタンパク質は、運動ニューロン障害の発症に対する感受性、運動ニューロン障害の存在、運動ニューロン障害の重症度又はそれらの任意の組み合わせをもたらすタンパク質の多様な集合である。本開示は、特定の運動ニューロン障害であるＡＬＳ疾患に関連するタンパク質をコードする任意の染色体配列を編集することを含む。ＡＬＳに関連するタンパク質は、典型的にはＡＬＳ関連タンパク質とＡＬＳとの実験的関連性に基づき選択される。例えば、ＡＬＳを有する集団では、ＡＬＳを有しない集団と比べてＡＬＳに関連するタンパク質の産生速度又は循環中濃度が上昇又は低下し得る。タンパク質レベルの差は、限定はされないが、ウエスタンブロット、免疫組織化学染色、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、及び質量分析を含むプロテオミクス技術を用いて評価し得る。或いは、ＡＬＳに関連するタンパク質は、限定はされないが、ＤＮＡマイクロアレイ解析、遺伝子発現連鎖解析（ＳＡＧＥ）、及び定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）を含むゲノミクス技術を用いて、それらのタンパク質をコードする遺伝子の遺伝子発現プロファイルを得ることにより同定し得る。

非限定的な例として、ＡＬＳに関連するタンパク質としては、限定はされないが以下のタンパク質が挙げられる：ＳＯＤ１ スーパーオキシドジスムターゼ１、ＡＬＳ３ 筋萎縮性側索 可溶性 硬化症３ ＳＥＴＸ セナタキシン ＡＬＳ５ 筋萎縮性側索硬化症５ ＦＵＳ 肉腫融合 ＡＬＳ７ 筋萎縮性側索硬化症７ ＡＬＳ２ 筋萎縮性側索 ＤＰＰ６ ジペプチジルペプチダーゼ６ 硬化症２ ＮＥＦＨ ニューロフィラメント、ヘビー ＰＴＧＳ１ プロスタグランジン− ポリペプチド エンドペルオキシドシンターゼ１ ＳＬＣ１Ａ２ 溶質輸送担体ファミリー１ ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ 腫瘍壊死因子 （グリア高親和性 受容体スーパーファミリー、グルタミン酸トランスポーター）、 メンバー１０ｂ メンバー２ ＰＲＰＨ ペリフェリン ＨＳＰ９０ＡＡ１ 熱ショックタンパク質９０ｋＤａ α（細胞質型）、クラスＡ メンバー１ ＧＲＩＡ２ グルタミン酸受容体、ＩＦＮＧ インターフェロン、γ イオンチャネル型、ＡＭＰＡ ２ Ｓ１００Ｂ Ｓ１００カルシウム結合 ＦＧＦ２ 線維芽細胞成長因子２ タンパク質Ｂ ＡＯＸ１ アルデヒドオキシダーゼ１ ＣＳ クエン酸シンターゼ ＴＡＲＤＢＰ ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質 ＴＸＮ チオレドキシン ＲＡＰＨ１ Ｒａｓ関連 ＭＡＰ３Ｋ５ マイトジェン活性化プロテイン （ＲａＩＧＤＳ／ＡＦ−６）及び キナーゼ５ プレクストリン相同ドメイン１ ＮＢＥＡＬ１ ニューロビアクチン様１ ＧＰＸ１ グルタチオンペルオキシダーゼ１ ＩＣＡ１Ｌ 膵島細胞自己抗原 ＲＡＣ１ ｒａｓ関連Ｃ３ボツリヌス １．６９ｋＤａ様 毒素基質１ ＭＡＰＴ 微小管関連 ＩＴＰＲ２ イノシトール１，４，５− タンパク質τ 三リン酸受容体、２型 ＡＬＳ２ＣＲ４ 筋萎縮性側索 ＧＬＳ グルタミナーゼ 硬化症２（若年性）染色体領域、候補４ ＡＬＳ２ＣＲ８ 筋萎縮性側索 ＣＮＴＦＲ 毛様体神経栄養因子 硬化症２（若年性） 受容体 染色体領域、候補８ ＡＬＳ２ＣＲ１１ 筋萎縮性側索 ＦＯＬＨ１ 葉酸ヒドロラーゼ１ 硬化症２（若年性）染色体領域、候補１１ ＦＡＭ１１７Ｂ 配列を有するファミリー Ｐ４ＨＢ プロリル４−ヒドロキシラーゼ、 類似性１１７、メンバーＢ βポリペプチド ＣＮＴＦ 毛様体神経栄養因子 ＳＱＳＴＭ１ セクエストソーム１ ＳＴＲＡＤＢ ＳＴＥ２０関連キナーゼ ＮＡＩＰ ＮＬＲファミリー、アポトーシス アダプターβ 阻害タンパク質 ＹＷＨＡＱ チロシン３− ＳＬＣ３３Ａ１ 溶質輸送担体ファミリー３３ モノオキシゲナーゼ／トリプトフ （アセチル−ＣｏＡトランスポーター）、 ァン５−モノオキシゲナーゼ メンバー１ 活性化タンパク質、θポリペプチド ＴＲＡＫ２ 輸送タンパク質、ＦＩＧ．４ ＦＩＧ．４ホモログ、ＳＡＣ１ キネシン結合２ 脂質ホスファターゼドメイン含有 ＮＩＦ３Ｌ１ ＮＩＦ３ ＮＧＧ１相互作用 ＩＮＡ インターネキシンニューロン 因子３様１ 中間径フィラメントタンパク質、α ＰＡＲＤ３Ｂ ｐａｒ−３分配 ＣＯＸ８Ａ シトクロムｃオキシダーゼ 欠損３ホモログＢ サブユニットＶＩＩＩＡ ＣＤＫ１５ サイクリン依存性キナーゼ ＨＥＣＷ１ ＨＥＣＴ、Ｃ２及びＷＷ １５ ドメイン含有Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼ１ ＮＯＳ１ 一酸化窒素合成酵素１ ＭＥＴ ｍｅｔ癌原遺伝子 ＳＯＤ２ スーパーオキシドジスムターゼ２、ＨＳＰＢ１ 熱ショック２７ｋＤａ ミトコンドリア タンパク質１ ＮＥＦＬ ニューロフィラメント、ライト ＣＴＳＢ カテプシンＢ ポリペプチド ＡＮＧ アンジオゲニン、ＨＳＰＡ８ 熱ショック７０ｋＤａ リボヌクレアーゼ、ＲＮアーゼＡ タンパク質８ ファミリー、５ ＶＡＰＢ ＶＡＭＰ（小胞− ＥＳＲ１ エストロゲン受容体１ 関連膜タンパク質）関連タンパク質Ｂ及びＣ ＳＮＣＡ シヌクレイン、α ＨＧＦ 肝細胞成長因子 ＣＡＴ カタラーゼ ＡＣＴＢ アクチン、β ＮＥＦＭ ニューロフィラメント、ミディアム ＴＨ チロシンヒドロキシラーゼ ポリペプチド ＢＣＬ２ Ｂ細胞ＣＬＬ／リンパ腫２ ＦＡＳ Ｆａｓ（ＴＮＦ受容体スーパーファミリー、メンバー６） ＣＡＳＰ３ カスパーゼ３、アポトーシス− ＣＬＵ クラスタリン 関連システインペプチダーゼ ＳＭＮ１ 運動ニューロン生存 Ｇ６ＰＤ グルコース−６−リン酸 １、テロメア デヒドロゲナーゼ ＢＡＸ ＢＣＬ２関連Ｘ ＨＳＦ１ 熱ショック転写 タンパク質 因子１ ＲＮＦ１９Ａ リングフィンガータンパク質１９Ａ ＪＵＮ ｊｕｎ癌遺伝子 ＡＬＳ２ＣＲ１２ 筋萎縮性側索 ＨＳＰＡ５ 熱ショック７０ｋＤａ 硬化症２（若年性） タンパク質５ 染色体領域、候補１２ ＭＡＰＫ１４ マイトジェン活性化タンパク質 ＩＬ１０ インターロイキン１０ キナーゼ１４ ＡＰＥＸ１ ＡＰＥＸヌクレアーゼ ＴＸＮＲＤ１ チオレドキシンレダクターゼ１ （多機能性ＤＮＡ修復酵素）１ ＮＯＳ２ 一酸化窒素合成酵素２、ＴＩＭＰ１ ＴＩＭＰ メタロペプチダーゼ 誘導性 阻害因子１ ＣＡＳＰ９ カスパーゼ９、アポトーシス− ＸＩＡＰ のＸ連鎖阻害因子 関連システイン アポトーシス ペプチダーゼ ＧＬＧ１ ゴルジ糖タンパク質１ ＥＰＯ エリスロポエチン ＶＥＧＦＡ 血管内皮 ＥＬＮ エラスチン 成長因子Ａ ＧＤＮＦ グリア細胞由来 ＮＦＥ２Ｌ２ 核内因子（赤血球− 神経栄養因子 由来２）様２ ＳＬＣ６Ａ３ 溶質輸送担体ファミリー６ ＨＳＰＡ４ 熱ショック７０ｋＤａ （神経伝達物質 タンパク質４ トランスポーター、ドーパミン）、メンバー３ ＡＰＯＥ アポリポタンパク質Ｅ ＰＳＭＢ８ プロテアソーム（プロソーム、マクロパイン）サブユニット、β型、８ ＤＣＴＮ１ ダイナクチン１ ＴＩＭＰ３ ＴＩＭＰメタロペプチダーゼ阻害因子３ ＫＩＦＡＰ３ キネシン関連 ＳＬＣ１Ａ１ 溶質輸送担体ファミリー１ タンパク質３ （ニューロン／上皮高親和性グルタミン酸トランスポーター、系Ｘａｇ）、メンバー１ ＳＭＮ２ 運動ニューロン生存 ＣＣＮＣ サイクリンＣ ２、セントロメア ＭＰＰ４ 膜タンパク質、ＳＴＵＢ１ ＳＴＩＰ１ 相同性及びＵ− パルミトイル化４ ボックス含有タンパク質１ ＡＬＳ２ アミロイドβ（Ａ４） ＰＲＤＸ６ ペルオキシレドキシン６ 前駆体タンパク質 ＳＹＰ シナプトフィジン ＣＡＢＩＮ１ カルシニューリン結合タンパク質１ ＣＡＳＰ１ カスパーゼ１、アポトーシス− ＧＡＲＴ ホスホリボシルグリシンアミ 関連システイン ド ホルミルトランスフェラーゼ、 ペプチダーゼ ホスホリボシルグリシンアミ ド シンテターゼ、ホスホリボシルアミノイミ ダゾール シンテターゼ ＣＤＫ５ サイクリン依存性キナーゼ５ ＡＴＸＮ３ アタキシン３ ＲＴＮ４ レティキュロン４ Ｃ１ＱＢ 補体成分１、ｑサブ構成成分、Ｂ鎖 ＶＥＧＦＣ 神経成長因子 ＨＴＴ ハンチンチン受容体 ＰＡＲＫ７ パーキンソン病７ ＸＤＨ キサンチンデヒドロゲナーゼ ＧＦＡＰ グリア線維性酸性 ＭＡＰ２ 微小管結合 タンパク質 タンパク質２ ＣＹＣＳ シトクロムｃ、体細胞型、ＦＣＧＲ３Ｂ ＩｇＧのＦｃ断片、低親和性ＩＩＩｂ、ＣＣＳ の銅シャペロン ＵＢＬ５ ユビキチン様５ スーパーオキシドジスムターゼ ＭＭＰ９ マトリックスメタロペプチダーゼ ＳＬＣ１８Ａ３ 溶質輸送担体ファミリー１８ ９（（小胞アセチルコリン）、メンバー３ ＴＲＰＭ７ 一過性受容体 ＨＳＰＢ２ 熱ショック２７ｋＤａ 電位カチオンチャネル、 タンパク質２ サブファミリーＭ、メンバー７ ＡＫＴ１ ｖ−ａｋｔマウス胸腺腫 ＤＥＲＬ１ Ｄｅｒ１様ドメインファミリー、ウイルス癌遺伝子ホモログ１ メンバー１ ＣＣＬ２ ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ） ＮＧＲＮ ノイグリン、神経突起 リガンド２ 伸長関連 ＧＳＲ グルタチオンレダクターゼ ＴＰＰＰ３ チューブリン重合促進タンパク質ファミリーメンバー３ ＡＰＡＦ１ アポトーシスペプチダーゼ ＢＴＢＤ１０ ＢＴＢ（ＰＯＺ）ドメイン 活性化因子１ 含有１０ ＧＬＵＤ１ グルタミン酸 ＣＸＣＲ４ ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ） デヒドロゲナーゼ１ 受容体４ ＳＬＣ１Ａ３ 溶質輸送担体ファミリー１ ＦＬＴ１ ｆｍｓ関連チロシン （グリア高親和性グルタミン酸トランスポーター）、メンバー３ キナーゼ１ ＰＯＮ１ パラオキソナーゼ１ ＡＲ アンドロゲン受容体 ＬＩＦ 白血病抑制因子 ＥＲＢＢ３ ｖ−ｅｒｂ−ｂ２赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ３ ＬＧＡＬＳ１ レクチン、ガラクトシド− ＣＤ４４ ＣＤ４４分子 結合、可溶性、１ ＴＰ５３ 腫瘍タンパク質ｐ５３ ＴＬＲ３ Ｔｏｌｌ様受容体３ ＧＲＩＡ１ グルタミン酸受容体、ＧＡＰＤＨ グリセルアルデヒド−３− イオンチャネル型、ＡＭＰＡ １ リン酸デヒドロゲナーゼ ＧＲＩＫ１ グルタミン酸受容体、ＤＥＳ デスミン イオンチャネル型、カイニン酸１ ＣＨＡＴ コリンアセチルトランスフェラーゼ ＦＬＴ４ ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ４ ＣＨＭＰ２Ｂ クロマチン改変 ＢＡＧ１ ＢＣＬ２関連 タンパク質２Ｂ アタノ遺伝子 ＭＴ３ メタロチオネイン３ ＣＨＲＮＡ４ コリン作動性受容体、ニコチン性、α４ ＧＳＳ グルタチオンシンテターゼ ＢＡＫ１ ＢＣＬ２−アンタゴニスト／キラー１ ＫＤＲ キナーゼ挿入ドメイン ＧＳＴＰ１ グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ 受容体（ＩＩＩ型 π１ 受容体チロシンキナーゼ） ＯＧＧ１ ８−オキソグアニンＤＮＡ ＩＬ６ インターロイキン６（インターフェロン、グリコシラーゼ β２）。

動物又は細胞は、ＡＬＳに関連するタンパク質をコードする１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上の破壊された染色体配列、及び破壊されたＡＬＳ関連タンパク質をコードする０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上の染色体に組み込まれた配列を含み得る。好ましいＡＬＳ関連タンパク質には、ＳＯＤ１（スーパーオキシドジスムターゼ１）、ＡＬＳ２（筋萎縮性側索硬化症２）、ＦＵＳ（肉腫融合）、ＴＡＲＤＢＰ（ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質）、ＶＡＧＦＡ（血管内皮増殖因子Ａ）、ＶＡＧＦＢ（血管内皮増殖因子Ｂ）、及びＶＡＧＦＣ（血管内皮増殖因子Ｃ）、及びそれらの任意の組み合わせが含まれる。

プリオン疾患に関連するタンパク質の例としては、ＳＯＤ１（スーパーオキシドジスムターゼ１）、ＡＬＳ２（筋萎縮性側索硬化症２）、ＦＵＳ（ｆｕｓｅｄ ｉｎ ｓａｒｃｏｍａ）、ＴＡＲＤＢＰ（ＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質）、ＶＡＧＦＡ（血管内皮成長因子Ａ）、ＶＡＧＦＢ（血管内皮成長因子Ｂ）、及びＶＡＧＦＣ（血管内皮成長因子Ｃ）、及びそれらの任意の組合せを挙げることができる。

プリオン障害における神経変性病態に関連するタンパク質の例としては、例えば、Ａ２Ｍ（アルファ−２−マクログロブリン）、ＡＡＴＦ（アポトーシス拮抗転写因子）、ＡＣＰＰ（前立腺酸性ホスファターゼ）、ＡＣＴＡ２（大動脈平滑筋アクチンアルファ２）、ＡＤＡＭ２２（ＡＤＡＭメタロペプチダーゼドメイン）、ＡＤＯＲＡ３（アデノシンＡ３受容体）、又はＡＤＲＡ１Ｄ（アルファ−１Ｄアドレナリン受容体についてのアルファ−１Ｄアドレナリン作動性受容体）を挙げることができる。

免疫不全症に関連するタンパク質の例としては、例えば、Ａ２Ｍ［アルファ−２−マクログロブリン］；ＡＡＮＡＴ［アリールアルキルアミンＮ−アセチルトランスフェラーゼ］；ＡＢＣＡ１［ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）、メンバー１］；ＡＢＣＡ２［ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）、メンバー２］；又はＡＢＣＡ３［ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）、メンバー３］を挙げることができる。

トリヌクレオチドリピート障害に関連するタンパク質の例としては、例えば、ＡＲ（アンドロゲン受容体）、ＦＭＲ１（脆弱性Ｘ精神遅滞１）、ＨＴＴ（ハンチントン）、又はＤＭＰＫ（筋緊張性異栄養症タンパク質キナーゼ）、ＦＸＮ（フラタキシン）、ＡＴＸＮ２（アタキシン２）が挙げられる。

神経伝達障害に関連するタンパク質の例としては、例えば、ＳＳＴ（ソマトスタチン）、ＮＯＳ１（一酸化窒素シンターゼ１（神経型））、ＡＤＲＡ２Ａ（アドレナリン作動性アルファ−２Ａ受容体）、ＡＤＲＡ２Ｃ（アドレナリン作動性アルファ−２Ｃ受容体）、ＴＡＣＲ１（タキキニン受容体１）、又はＨＴＲ２ｃ（５−ヒドロキシトリプタミン（セロトニン）受容体２Ｃ）が挙げられる。

神経発達関連配列の例としては、例えば、Ａ２ＢＰ１［アタキシン２結合タンパク質１］、ＡＡＤＡＴ［アミノアジピン酸アミノトランスフェラーゼ］、ＡＡＮＡＴ［アリールアルキルアミンＮ−アセチルトランスフェラーゼ］、ＡＢＡＴ［４−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ］、ＡＢＣＡ１［ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）メンバー１］、又はＡＢＣＡ１３［ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣ１）メンバー１３］が挙げられる。

本発明の系により治療可能な好ましい病態のさらなる例としては以下が挙げられ、以下から選択することができる：アルカルディ−グティエール症候群；アレキサンダー病；アラン−ハーンドン−ダッドリー症候群；ＰＯＬＧ関連障害；アルファ−マンノシドーシス（ＩＩ及びＩＩＩ型）；アルストレム症候群；アンジェルマン症候群；毛細血管拡張性運動失調症；神経セロイドリポフスチン症；ベータ−セラサミア；両側性視神経委縮症及び（幼児型）視神経委縮症１型；網膜芽腫（両側性）；カナバン病；脳・眼・顔・骨格症候群１［ＣＯＦＳ１］；脳腱黄色腫症；コルネリア・デ・ラング症候群；ＭＡＰＴ関連障害；遺伝性プリオン病；ドラベ症候群；早期発症型家族性アルツハイマー病；フリードライヒ運動失調症［ＦＲＤＡ］；フリンス症候群；フコシドーシス；福山型先天性筋ジストロフィー；ガラクトシアリドーシス；ゴーシェ病；有機酸血症；血球貪食性リンパ組織球症；ハッチンソン−ギルフォード早老症候群；ムコリピドーシスＩＩ型；幼児遊離シアル酸蓄積症；ＰＬＡ２Ｇ６関連神経変性症；ジャーベル・ランゲ−ニールセン症候群；接合型表皮水疱症；ハンチントン病；クラッベ病（幼児型）；ミトコンドリアＤＮＡ関連リー症候群及びＮＡＲＰ；レッシュ−ナイハン症候群；ＬＩＳ１関連滑脳症；ロウ症候群；メープルシロップ尿症；ＭＥＣＰ２重複症候群；ＡＴＰ７Ａ関連銅輸送障害；ＬＡＭＡ２関連筋ジストロフィー；アリールスルファターゼＡ欠損症；ムコ多糖症Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩ型；ペルオキシソーム形成異常症、ツェルウェーガー症候群スペクトラム；脳の鉄蓄積症を伴う神経変性症；酸性スフィンゴミエリナーゼ欠損症；ニーマン−ピック病Ｃ型；グリシン脳症；ＡＲＸ関連障害；尿素サイクル異常症；ＣＯＬ１Ａ１／２関連骨形成不全症；ミトコンドリアＤＮＡ欠失症候群；ＰＬＰ１関連障害；ペリー症候群；フェラン−マクダーモット症候群；グリコーゲン蓄積症ＩＩ型（ポンペ病）（幼児型）；ＭＡＰＴ関連障害；ＭＥＣＰ２関連障害；肢根型点状軟骨異形成症１型；ロバーツ症候群；サンドホフ病；シンドラー病１型；アデノシンデアミナーゼ欠損症；スミス−レムリ−オピッツ症候群；脊髄性筋萎縮症；幼児期発症型脊髄小脳失調症；ヘキソサミニダーゼＡ欠損症；致死性異形成１型；コラーゲンＶＩ型関連障害；アッシャー症候群Ｉ型；先天性筋ジストロフィー；ウォルフ−ヒルシュホーン症候群；リソソーム酸リパーゼ欠損症；及び色素性乾皮症。

明らかなとおり、本発明の系は任意の目的ポリヌクレオチド配列の標的化に使用し得ることが想定される。本発明の系を使用して有用に治療し得るであろう病態又は疾患の一部の例は上記の表に掲載し、それらの病態に現在関連付けられている遺伝子の例もそれらの表に提供する。しかしながら、例示される遺伝子は排他的なものではない。

例えば、「野生型ＳｔＣａｓ９」はサーモフィラス菌（Ｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来の野生型Ｃａｓ９を指し、そのタンパク質配列は、ｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースにおいて受託番号Ｇ３ＥＣＲ１として提供される。同様に、化膿連鎖球菌（Ｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔに受託番号Ｑ９９ＺＷ２として含まれる。

ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を使用して効率的かつ費用対効果の高い遺伝子編集及び操作を実施できることにより、産生の改善及び形質の増強のためにこのようなゲノムを形質転換するために、単一及び多重化された遺伝子操作の迅速な選択及び比較が可能になり得る。ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ系は、タバコモザイクウイルス由来の系又はアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）Ｔｉ又はＲｉプラスミドにより植物で発現され得る。これに関連して、米国特許及び出願公開：米国特許第６，６０３，０６１号明細書（アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介性の植物の形質転換方法）；米国特許第７，８６８，１４９号明細書（植物ゲノム配列及びその使用）、及び米国特許出願公開２００９／０１００５３６号明細書（農業形質が増強されたトランスジェニック植物）が参照され、これらの各々の内容及び開示は全て、全体として参照により本明細書中に組み込まれる。本発明の実施においては、Ｍｏｒｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ“Ｃｒｏｐ ｇｅｎｏｍｉｃｓ：ａｄｖａｎｃｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ．２０１１ Ｄｅｃ ２９；１３（２）：８５−９６の内容及び開示もまた、本明細書に全体として参照により組み込まれる。

以下の実施例は、本発明の様々な実施形態を例示するために記載するものであり、本発明を限定することを一切意図するものではない。本実施例は、本明細書に記載の方法と共に、現在好ましい実施形態の代表であり、例示であり、そして本発明の範囲を限定することを意図するものではない。当業者であれば、特許請求の範囲によって規定される本発明の精神の範囲内に包含される本発明における変化及び他の使用に想到するであろう。

実施例１：真核細胞の核中のＣＲＩＳＰＲ複合体活性
例示的なＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系は、４つの遺伝子Ｃａｓ９、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、及びＣｓｎ１のクラスター、並びに２つの非コードＲＮＡエレメント、ｔｒａｃｒＲＮＡ及び非反復配列の短いストレッチ（スペーサー、それぞれ約３０ｂｐ）により間隔が空いている反復配列の特徴的アレイ（直接反復）を含有する化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＳＦ３７０からのＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座である。この系において、ターゲティングされるＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を４つの連続ステップにおいて生成する（図２Ａ）。第１に、２つの非コードＲＮＡ、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡアレイ及びｔｒａｃｒＲＮＡがＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される。第２に、ｔｒａｃｒＲＮＡがｐｒｅ−ｃｒＲＮＡの直接反復にハイブリダイズし、次いでそれが個々のスペーサー配列を含有する成熟ｃｒＲＮＡにプロセシングされる。第３に、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体がＣａｓ９を、ｃｒＲＮＡのスペーサー領域とプロトスペーサーＤＮＡとの間のヘテロ二本鎖形成を介してプロトスペーサー及び対応するＰＡＭからなるＤＮＡ標的に誘導する。最後に、Ｃａｓ９は、ＰＡＭの上流の標的ＤＮＡの切断を媒介してプロトスペーサー内でＤＳＢを創成する（図２Ａ）。この例は、このＲＮＡプログラマブルヌクレアーゼ系を適応させて真核細胞の核中にＣＲＩＳＰＲ複合体活性を誘導する例示プロセスを記載する。

細胞培養及びトランスフェクション
ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞株ＨＥＫ２９３ＦＴ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、１０％のウシ胎仔血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンが補給されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で３７℃において５％のＣＯ２インキュベーションで維持した。マウスｎｅｕｒｏ２Ａ（Ｎ２Ａ）細胞株（ＡＴＣＣ）を、５％のウシ胎仔血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンが補給されたＤＭＥＭにより、３７℃、５％のＣＯ_２で維持した。

ＨＥＫ２９３ＦＴ又はＮ２Ａ細胞を２４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中に、トランスフェクション１日前に１ウェル当たり２００，０００個の細胞の密度において播種した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造業者の推奨プロトコルに従って使用して細胞をトランスフェクトした。２４ウェルプレートのそれぞれのウェルについて、合計８００ｎｇのプラスミドを使用した。

ゲノム改変についてのＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイ及びシークエンシング分析
ＨＥＫ２９３ＦＴ又はＮ２Ａ細胞を、上記プラスミドＤＮＡによりトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞を３７℃において７２時間インキュベートしてからゲノムＤＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡは、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔＤＮＡ抽出キット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を製造業者のプロトコルに従って使用して抽出した。手短に述べると、細胞をＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ溶液中で再懸濁させ、６５℃において１５分間及び９８℃において１０分間インキュベートした。抽出されたゲノムＤＮＡを直ちに処理又は−２０℃において貯蔵した。

それぞれの遺伝子についてのＣＲＩＳＰＲ標的部位周囲のゲノム領域をＰＣＲ増幅し、ＱｉａＱｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者のプロトコルに従って使用して産物を精製した。合計４００ｎｇの精製ＰＣＲ産物を２μｌの１０×ＴａｑポリメラーゼＰＣＲ緩衝液（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）と混合し、超純水で２０μｌの最終容量とし、リアニーリングプロセスに供してヘテロ二本鎖形成を可能とした：９５℃において１０分間、−２℃／秒における傾斜で９５℃から８５℃、−０．２５℃／秒における８５℃から２５℃、及び２５℃において１分間維持。リアニーリング後、産物をＳｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼ及びＳｕｒｖｅｙｏｒエンハンサーＳ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃｓ）により製造業者の推奨プロトコルに従って処理し、４〜２０％のＮｏｖｅｘ ＴＢＥポリアクリルアミドゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で分析した。ゲルをＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ ＤＮＡ染色（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により３０分間染色し、Ｇｅｌ Ｄｏｃゲルイメージングシステム（Ｂｉｏ−ｒａｄ）によりイメージングした。定量は、切断したＤＮＡの率の尺度としての相対バンド強度に基づくものであった。図７は、このＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイの模式的説明を提供する。

相同組換えの検出のための制限断片長多型アッセイ
ＨＥＫ２９３ＦＴ及びＮ２Ａ細胞を、プラスミドＤＮＡによりトランスフェクトし、３７℃において７２時間インキュベートしてから上記のとおりゲノムＤＮＡを抽出した。相同組換え（ＨＲ）鋳型の相同性アーム外側のプライマーを使用して標的ゲノム領域をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物を１％のアガロースゲル上で分離し、ＭｉｎＥｌｕｔｅ ＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）により抽出した。精製産物をＨｉｎｄＩＩＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）により消化し、６％のＮｏｖｅｘ ＴＢＥポリアクリルアミドゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で分析した。

ＲＮＡ二次構造予測及び分析
ＲＮＡ二次構造予測は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｔ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｖｉｅｎｎａにおいて開発されたオンラインウェブサーバーＲＮＡｆｏｌｄを使用し、セントロイド構造予測アルゴリズムを使用して実施した（例えば、Ａ．Ｒ．Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｃｅｌｌ １０６（１）：２３−２４；及びＰＡ Ｃａｒｒ ａｎｄ ＧＭ Ｃｈｕｒｃｈ，２００９，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２７（１２）：１１５１−６２参照）。

ＲＮＡ精製
ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を上記のとおり維持及びトランスフェクトした。細胞をトリプシン処理により回収し、次いでリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄した。トータル細胞ＲＮＡをＴＲＩ試薬（Ｓｉｇｍａ）により製造業者のプロトコルに従って抽出した。抽出されたトータルＲＮＡをＮａｏｎｏｄｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して定量し、同一濃度に基準化した。

哺乳動物細胞中のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ発現のノーザンブロット分析
ＲＮＡを等容量の２×ローディング緩衝液（Ａｍｂｉｏｎ）と混合し、９５℃に５分間加熱し、氷上で１分間冷蔵し、次いで８％の変性ポリアクリルアミドゲル（ＳｅｑｕａＧｅｌ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）上に、少なくとも３０分間のゲルのプレラン後にロードした。サンプルを４０Ｗ限界において１．５時間電気泳動した。その後、ＲＮＡをＨｙｂｏｎｄ Ｎ＋メンブレン（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に３００ｍＡにおいてセミドライ転写装置（Ｂｉｏ−ｒａｄ）中で室温において１．５時間転写した。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＵＶ ＣｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒのＳｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）上のオートクロスリンクボタンを使用してＲＮＡをメンブレンに架橋させた。メンブレンをＵＬＴＲＡｈｙｂ−オリゴハイブリダイゼーション緩衝液（Ａｍｂｉｏｎ）中で回転させながら４２℃において３０分間プレハイブリダイズさせ、次いでプローブを添加し、一晩ハイブリダイズさせた。プローブはＩＤＴに発注し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて［ガンマ−^３２Ｐ］ＡＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）により標識した。メンブレンを予備加温（４２℃）された２×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳにより１分間１回洗浄し、次いで４２℃において３０分間２回洗浄した。メンブレンを蛍光スクリーンに室温において１時間又は一晩曝露させ、次いでｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ（Ｔｙｐｈｏｏｎ）によりスキャンした。

細菌ＣＲＩＳＰＲ系の構築及び評価
ｔｒａｃｒＲＮＡ、Ｃａｓ９、及びリーダーを含むＣＲＩＳＰＲ遺伝子座エレメントを、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＳＦ３７０ゲノムＤＮＡから、ギブソン・アセンブリ（Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ）のための隣接する相同性アームを用いてＰＣＲ増幅した。２つのＢｓａＩ ＩＩＳ型部位を２つの直接反復間に導入してスペーサーの容易な挿入を促進した（図８）。Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＮＥＢ）を使用してＰＣＲ産物をＥｃｏＲＶ消化ｐＡＣＹＣ１８４中にｔｅｔプロモーターの下流でクローニングした。Ｃｓｎ２の最後の５０ｂｐは除き、他の内因性ＣＲＩＳＰＲ系エレメントは除外した。相補的オーバーハングを有するスペーサーをコードするオリゴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）をＢｓａＩ消化ベクターｐＤＣ０００（ＮＥＢ）中にクローニングし、次いでＴ７リガーゼ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ）によりライゲートしてｐＣＲＩＳＰＲプラスミドを生成した。哺乳類細胞におけるＰＡＭ発現を有するスペーサーを含有するチャレンジプラスミド（発現構築物は、図６Ｂに示すＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイの結果により決定されるとおりの機能と共に図６Ａに示す）。転写開始部位を＋１として標識し、転写ターミネーター及びノーザンブロットによりプロ―ビングされる配列も示す。プロセシングされたｔｒａｃｒＲＮＡの発現もノーザンブロットにより確認した。図６Ｃは、長鎖又は短鎖ｔｒａｃｒＲＮＡ、並びにＳｐＣａｓ９及びＤＲ−ＥＭＸ１（１）−ＤＲを担持するＵ６発現構築物によりトランスフェクトされた２９３ＦＴ細胞から抽出されたトータルＲＮＡのノーザンブロット分析の結果を示す。左及び右側のパネルは、それぞれＳｐＲＮａｓｅ ＩＩＩを用いず、又は用いてトランスフェクトされた２９３ＦＴ細胞からのものである。Ｕ６は、ヒトＵ６ｓｎＲＮＡをターゲティングするプローブによりブロットされたローディング対照を示す。短鎖ｔｒａｃｒＲＮＡ発現構築物のトランスフェクションは、十分なレベルのプロセシング形態のｔｒａｃｒＲＮＡ（約７５ｂｐ）をもたらした。極めて少量の長鎖ｔｒａｃｒＲＮＡがノーザンブロット上で検出される。

正確な転写開始を促進するため、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩベースＵ６プロモーターを選択してｔｒａｃｒＲＮＡの発現を駆動した（図２Ｃ）。同様に、Ｕ６プロモーターベース構築物を開発して２つの直接反復（ＤＲ、用語「ｔｒａｃｒ−ｍａｔｅ配列」にも包含される；図２Ｃ）により隣接されている単一スペーサーからなるｐｒｅ−ｃｒＲＮＡアレイを発現させた。最初のスペーサーは、大脳皮質の発達におけるキー遺伝子であるヒトＥＭＸ１遺伝子座中の３３塩基対（ｂｐ）標的部位（３０ｂｐのプロトスペーサーと、Ｃａｓ９のＮＧＧ認識モチーフを満たす３ｂｐのＣＲＩＳＰＲモチーフ（ＰＡＭ）配列）をターゲティングするように設計した（図２Ｃ）。

哺乳動物細胞中のＣＲＩＳＰＲ系（ＳｐＣａｓ９、ＳｐＲＮａｓｅ ＩＩＩ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及びｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ）の異種発現がターゲティングされる哺乳動物染色体の切断を達成し得るか否かを試験するため、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞をＣＲＩＳＰＲ構成成分の組合せによりトランスフェクトした。哺乳動物核中のＤＳＢは部分的には、インデルの形成をもたらす非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路により修復されるため、Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイを使用して標的ＥＭＸ１遺伝子座における潜在的な切断活性を検出した（図７）（例えば、Ｇｕｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ６４９：２４７参照）。４つ全てのＣＲＩＳＰＲ構成成分のコトランスフェクションは、プロトスペーサーの最大５．０％の切断を誘導し得た（図２Ｄ参照）。ＳｐＲＮａｓｅ ＩＩＩを除く全てのＣＲＩＳＰＲ構成成分のコトランスフェクションも、プロトスペーサーの最大４．７％のインデルを誘導し、このことはｃｒＲＮＡ成熟を支援し得る内因性哺乳動物ＲＮａｓｅ、例えば、関連Ｄｉｃｅｒ及びＤｒｏｓｈａ酵素などが存在し得ることを示唆した。残り３つの構成成分のいずれかを除去すると、ＣＲＩＳＰＲ系のゲノム切断活性は停止する（図２Ｄ）。標的遺伝子座を含有するアンプリコンのＳａｎｇｅｒシークエンシングにより切断活性を確認し；４３個のシークエンシングされたクローンのうち５つの突然変異アレル（１１．６％）が見出された。種々のガイド配列を使用する同様の実験は、２９％と高いインデル割合を生じさせた（図３〜６、１０、及び１１参照）。これらの結果は、哺乳動物細胞中の効率的なＣＲＩＳＰＲ媒介ゲノム改変のための３成分系を定義する。切断効率を最適化するため、本出願人は、ｔｒａｃｒＲＮＡの異なるアイソフォームが切断効率に影響するか否かも試験し、この例示的系において、短鎖（８９ｂｐ）転写物形態のみがヒトＥＭＸ１ゲノム遺伝子座の切断を媒介し得ることを見出した（図６Ｂ）。

図１２は、哺乳動物細胞中のｃｒＲＮＡプロセシングの追加のノーザンブロット分析を提供する。図１２Ａは、２つの直接反復により隣接されている単一スペーサー（ＤＲ−ＥＭＸ１（１）−ＤＲ）についての発現ベクターを示す模式図を説明する。ヒトＥＭＸ１遺伝子座プロトスペーサー１をターゲティングする３０ｂｐのスペーサー（図６参照）及び直接反復配列を、図１２Ａの下方の配列中に示す。線は、逆相補配列を使用してＥＭＸ１（１）ｃｒＲＮＡ検出のためのノーザンブロットプローブを生成する領域を示す。図１２Ｂは、ＤＲ−ＥＭＸ１（１）−ＤＲを担持するＵ６発現構築物によりトランスフェクトされた２９３ＦＴ細胞から抽出されたトータルＲＮＡのノーザンブロット分析を示す。左及び右側のパネルは、それぞれＳｐＲＮａｓｅ ＩＩＩを用いず、又は用いてトランスフェクトされた２９３ＦＴ細胞からのものである。ＤＲ−ＥＭＸ１（１）−ＤＲは、ＳｐＣａｓ９が存在する場合のみ成熟ｃｒＲＮＡにプロセシングされ、短鎖ｔｒａｃｒＲＮＡはＳｐＲＮａｓｅ ＩＩＩの存在に依存的でなかった。トランスフェクト２９３ＦＴトータルＲＮＡから検出された成熟ｃｒＲＮＡは、約３３ｂｐであり、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からの３９〜４２ｂｐの成熟ｃｒＲＮＡよりも短かった。これらの結果は、ＣＲＩＳＰＲ系を真核細胞中に移植し、リプログラミングして内因性哺乳動物標的ポリヌクレオチドの切断を促進することができることを実証する。

図２は、本実施例に記載の細菌ＣＲＩＳＰＲ系を説明する。図２Ａは、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＳＦ３７０からのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座１及びこの系によるＣＲＩＳＰＲ媒介ＤＮＡ切断の提案される機序を示す模式図を説明する。直接反復−スペーサーアレイからプロセシングされた成熟ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ９を、相補的プロトスペーサー及びプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）からなるゲノム標的に誘導する。標的−スペーサー塩基対形成時、Ｃａｓ９は標的ＤＮＡ中の二本鎖切断を媒介する。図２Ｂは、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）及びＲＮａｓｅ ＩＩＩ（ＳｐＲＮａｓｅ ＩＩＩ）の、哺乳動物核中への輸送を可能とするための核局在化シグナル（ＮＬＳ）によるエンジニアリングを説明する。図２Ｃは、構成的ＥＦ１ａプロモーターにより駆動されるＳｐＣａｓ９及びＳｐＲＮａｓｅ ＩＩＩ並びに正確な転写開始及び終結を促進するためのＲＮＡＰｏｌ３プロモーターＵ６により駆動されるｔｒａｃｒＲＮＡ及びｐｒｅ−ｃｒＲＮＡアレイ（ＤＲ−スペーサー−ＤＲ）の哺乳動物発現を説明する。十分なＰＡＭ配列を有するヒトＥＭＸ１遺伝子座からのプロトスペーサーを、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡアレイ中のスペーサーとして使用する。図２Ｄは、ＳｐＣａｓ９媒介性の少数挿入及び欠失についてのｓｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼアッセイを説明する。ＳｐＣａｓ９を、ＳｐＲＮａｓｅ ＩＩＩ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及びＥＭＸ１標的スペーサーを担持するｐｒｅ−ｃｒＲＮＡアレイを用いて又は用いずに発現させた。図２Ｅは、標的遺伝子座とＥＭＸ１ターゲティングｃｒＲＮＡとの間の塩基対形成の模式的表示、並びにＳｐＣａｓ９切断部位に隣接する微小欠失を示す例示的クロマトグラムを説明する。図２Ｆは、種々の微小挿入及び欠失を示す４３個のクローンアンプリコンのシークエンシング分析から同定された突然変異アレルを説明する。点線は、欠失塩基を示し、アラインされず、又はミスマッチの塩基は挿入又は突然変異を示す。スケールバー＝１０μｍ。

３成分系をさらに簡略化するため、ステム−ループを介して成熟ｃｒＲＮＡ（ガイド配列を含む）を部分ｔｒａｃｒＲＮＡに融合させて天然ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二本鎖を模倣するキメラｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッド設計を適応させた。同時送達効率を増加させるため、トランスフェクション細胞中のキメラＲＮＡ及びＳｐＣａｓ９の同時発現を駆動するバイシストロン性発現ベクターを創成した。並行して、バイシストロン性ベクターを使用してｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ（ＤＲ−ガイド配列−ＤＲ）をＳｐＣａｓ９と共に発現させてｃｒＲＮＡへのプロセシングを誘導し、ｔｒａｃｒＲＮＡを別個に発現させた（図１１Ｂの上図及び下図を比較）。図８は、ｈＳｐＣａｓ９を有するｐｒｅ−ｃｒＲＮＡアレイ（図８Ａ）又はキメラｃｒＲＮＡ（図８Ｂ中のガイド配列挿入部位の下流及びＥＦ１αプロモーターの上流の短い線により表わされる）のためのバイシストロン性発現ベクターの模式的説明を提供し、種々のエレメントの局在及びガイド配列挿入の場所を示す。図８Ｂ中のガイド配列挿入部位の局在周囲の拡大された配列は、部分ＤＲ配列（ＧＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡ）及び部分ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（ＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＴＴＴ）も示す。ガイド配列は、アニールされたオリゴヌクレオチドを使用してＢｂｓＩ部位間に挿入することができる。オリゴヌクレオチドについての配列設計を図８の模式的説明の下方に示し、適切なライゲーションアダプターを示す。ＷＰＲＥは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメントを表す。キメラＲＮＡ媒介切断の効率を、上記の同一のＥＭＸ１遺伝子座をターゲティングすることにより試験した。Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイ及びアンプリコンのＳａｎｇｅｒシークエンシングの両方を使用して、本出願人は、キメラＲＮＡ設計がヒトＥＭＸ１遺伝子座の切断を約４．７％の改変比率で促進することを確認した（図３）。

真核細胞中のＣＲＩＳＰＲ媒介切断の一般化可能性を、ヒトＥＭＸ１及びＰＶＡＬＢ、並びにマウスＴｈ遺伝子座中の複数部位をターゲティングするキメラＲＮＡを設計することによりヒト及びマウス細胞の両方において追加のゲノム遺伝子座をターゲティングすることにより試験した。図１３は、いくつかの追加のターゲティングされるヒトＰＶＡＬＢ（図１３Ａ）及びマウスＴｈ（図１３Ｂ）遺伝子座中のプロトスペーサーの選択を説明する。遺伝子座及びそれぞれの最後のエクソン内の３つのプロトスペーサーの局在の模式図を提供する。下線付き配列は、３０ｂｐのプロトスペーサー配列及びＰＡＭ配列に対応する３’末端における３ｂｐを含む。センス及びアンチセンス鎖上のプロトスペーサーを、それぞれＤＮＡ配列の上方及び下方に示す。ヒトＰＶＡＬＢ及びマウスＴｈ遺伝子座についてそれぞれ６．３％及び０．７５％の改変比率が達成され、このことは複数の生物にわたる異なる遺伝子座の改変におけるＣＲＩＳＰＲ系の幅広い適用可能性を実証した（図５）。切断はキメラ構築物を使用してそれぞれの遺伝子座について３つのスペーサーのうち１つについてのみ検出された一方、同時発現されるｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ配置を使用した場合、全ての標的配列が２７％に達するインデル生成の効率で切断された（図６及び１３）。

図１１は、ＳｐＣａｓ９をリプログラミングして哺乳動物細胞中の複数のゲノム遺伝子座をターゲティングすることができることのさらなる説明を提供する。図１１Ａは、下線付き配列により示される５つのプロトスペーサーの局在を示すヒトＥＭＸ１遺伝子座の模式図を提供する。図１１Ｂは、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの直接反復領域間のハイブリダイゼーションを示すｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ／ｔｒｃｒＲＮＡ複合体の模式図（上図）及び２０ｂｐのガイド配列、並びにヘアピン構造にハイブリダイズしている部分直接反復及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列からなるｔｒａｃｒ ｍａｔｅ及びｔｒａｃｒ配列を含むキメラＲＮＡ設計の模式図（下図）を提供する。ヒトＥＭＸ１遺伝子座中の５つのプロトスペーサーにおけるＣａｓ９媒介切断の効力を比較するＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイの結果を、図１１Ｃに説明する。プロセシングされたｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体（ｃｒＲＮＡ）又はキメラＲＮＡ（ｃｈｉＲＮＡ）のいずれかを使用してそれぞれのプロトスペーサーをターゲティングする。

ＲＮＡの二次構造は分子間相互作用に重要であり得るため、最小自由エネルギー及びボルツマン加重構造アンサンブルに基づく構造予測アルゴリズムを使用してゲノムターゲティング実験に使用される全てのガイド配列の推定二次構造を比較した（例えば、Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３６：Ｗ７０参照）。分析により、ほとんどの場合、キメラｃｒＲＮＡコンテクスト中の有効なガイド配列は二次構造モチーフを実質的に含まない一方、無効なガイド配列は標的プロトスペーサーＤＮＡとの塩基対形成を妨害し得る内部二次構造を形成する可能性がより高いことが明らかになった。従って、スペーサー二次構造の変動性は、キメラｃｒＲＮＡを使用する場合にＣＲＩＳＰＲ媒介干渉の効率に影響し得ることが考えられる。

ＳｐＣａｓ９のためのさらなるベクター設計を図１９に示し、それはガイドオリゴのための挿入部位に結合しているＵ６プロモーター、及びＳｐＣａｓ９コード配列に結合しているＣｂｈプロモーターを取り込む単一発現ベクターを説明する。図１９ｂに示されるベクターは、Ｈ１プロモーターに結合しているｔｒａｃｒＲＮＡコード配列を含む。

細菌アッセイでは、全てのスペーサーが効率的なＣＲＩＳＰＲ干渉を促進した（図３Ｃ）。これらの結果は、哺乳類細胞におけるＣＲＩＳＰＲ活性の効率に影響を与えるさらなる因子が存在し得ることを示唆している。

ＣＲＩＳＰＲ媒介切断の特異性を調査するため、哺乳動物ゲノム中のプロトスペーサー切断に対するガイド配列中の単一ヌクレオチド突然変異の効果を、単一点突然変異を有する一連のＥＭＸ１ターゲティングキメラｃｒＲＮＡを使用して分析した（図３Ａ）。図３Ｂは、異なる突然変異体キメラＲＮＡと対形成した場合のＣａｓ９の切断効率を比較するＳｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼアッセイの結果を説明する。ＰＡＭの５’側の最大１２ｂｐの単一塩基ミスマッチは、ＳｐＣａｓ９によるゲノム切断を実質的に停止させた一方、さらなる上流位置に突然変異を有するスペーサーは元のプロトスペーサー標的に対する活性を保持した（図３Ｂ）。ＰＡＭの他、ＳｐＣａｓ９は、スペーサーの最後の１２ｂｐ内の単一塩基特異性を有する。さらに、ＣＲＩＳＰＲは、同一ＥＭＸ１プロトスペーサーをターゲティングするＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）のペアと同程度に効率的にゲノム切断を媒介し得る。図３Ｃは、ＥＭＸ１をターゲティングするＴＡＬＥＮの設計を示す模式図を提供し、図３Ｄは、ＴＡＬＥＮ及びＣａｓ９の効率を比較するＳｕｒｖｅｙｏｒゲルを示す（ｎ＝３）。

エラープローンＮＨＥＪ機序を通した哺乳動物細胞中のＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子編集を達成するための構成成分のセットを樹立したため、相同組換え（ＨＲ）、ゲノム中の正確な編集を作製するための高忠実性遺伝子修復経路を刺激するＣＲＩＳＰＲの能力を試験した。野生型ＳｐＣａｓ９は、ＮＨＥＪ及びＨＲの両方を通して修復され得る部位特異的ＤＳＢを媒介し得る。さらに、ＳｐＣａｓ９のＲｕｖＣ Ｉ触媒ドメイン中のアスパラギン酸からアラニンへの置換（Ｄ１０Ａ）をエンジニアリングしてヌクレアーゼをニッカーゼに変換し（ＳｐＣａｓ９ｎ；図４Ａに説明）（例えば、Ｓａｐｒａｎａｕｓａｋｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３９：９２７５；Ｇａｓｉｕｎａｓ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０９：Ｅ２５７９参照）、その結果、ニッキングされたゲノムＤＮＡが高忠実性相同組換え修復（ＨＤＲ）を受ける。Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイにより、ＳｐＣａｓ９ｎはＥＭＸ１プロトスペーサー標的におけるインデルを生成しないことを確認した。図４Ｂに説明されるとおり、ＥＭＸ１ターゲティングキメラｃｒＲＮＡとＳｐＣａｓ９との同時発現は標的部位中のインデルを生じさせた一方、ＳｐＣａｓ９ｎとの同時発現は生じさせなかった（ｎ＝３）。さらに、３２７個のアンプリコンのシークエンシングは、ＳｐＣａｓ９ｎにより誘導されるいかなるインデルも検出しなかった。同一の遺伝子座を選択し、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞をＥＭＸ１をターゲティングするキメラＲＮＡ、ｈＳｐＣａｓ９又はｈＳｐＣａｓ９ｎ、及びプロトスペーサー付近に制限部位のペア（ＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｈｅＩ）を導入するためのＨＲ鋳型によりコトランスフェクトすることによりＣＲＩＳＰＲ媒介ＨＲを試験した。図４Ｃは、ＨＲ方針の模式的説明を、組換え場所の相対局在及びプライマーアニーリング配列（矢印）と共に提供する。ＳｐＣａｓ９及びＳｐＣａｓ９ｎは、実際、ＥＭＸ１遺伝子中へのＨＲ鋳型の組込みを触媒した。標的領域のＰＣＲ増幅とそれに続くＨｉｎｄＩＩＩによる制限消化により、予測断片サイズ（図４Ｄに示される制限断片長多型ゲル分析中の矢印）に対応する切断産物が明らかになり、ＳｐＣａｓ９及びＳｐＣａｓ９ｎは類似レベルのＨＲ効率を媒介した。本出願人は、ゲノムアンプリコンのＳａｎｇｅｒシークエンシングを使用してＨＲをさらに確認した（図４Ｅ）。これらの結果は、哺乳動物ゲノム中のターゲティングされる遺伝子挿入を促進するためのＣＲＩＳＰＲの有用性を実証する。野生型ＳｐＣａｓ９の１４ｂｐ（スペーサーからの１２ｂｐ及びＰＡＭからの２ｂｐ）の標的特異性を考慮すると、ニッカーゼの利用可能性は、一本鎖分解物がエラープローンＮＨＥＪ経路のための基質でないため、オフターゲット改変の可能性を顕著に低減させ得る。

アレイスペーサーを有するＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の天然アーキテクチャーを模倣する発現構築物（図２Ａ）を構築して多重化配列ターゲティングの可能性を試験した。ＥＭＸ１及びＰＶＡＬＢターゲティングスペーサーのペアをコードする単一のＣＲＩＳＰＲアレイを使用して、両方の遺伝子座における効率的な切断が検出された（図４Ｆ、ｃｒＲＮＡアレイの模式的設計及び切断の効率的な媒介を示すＳｕｒｖｅｙｏｒブロットの両方を示す）。１１９ｂｐにより間隔が空いているＥＭＸ１内の２つの標的に対するスペーサーを使用する同時ＤＳＢを通したより大きいゲノム領域の標的化した欠失も試験し、１．６％の欠失効力（１８２個のアンプリコンのうち３つ；図４Ｇ）が検出された。このことは、ＣＲＩＳＰＲ系が単一ゲノム内の多重化編集を媒介し得ることを実証する。

実施例２：ＣＲＩＳＰＲ系の改変及び代替例
配列特異的ＤＮＡ切断をプログラミングするためにＲＮＡを使用する技能は、種々の研究及び産業用途のための新たなクラスのゲノムエンジニアリングツールを定義する。ＣＲＩＳＰＲ系のいくつかの態様は、ＣＲＩＳＰＲターゲティングの効率及び多用途性を増加させるようにさらに改善することができる。最適なＣａｓ９活性は、哺乳動物核中に存在するものよりも高いレベルにおけるフリーＭｇ^２＋の利用可能性に依存し得（例えば、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７：８１６参照）、プロトスペーサーのすぐ下流のＮＧＧモチーフについての優先性は、ヒトゲノム中で平均１２ｂｐごとにターゲティング能を制限する（図９、ヒト染色体配列のプラス及びマイナス鎖の両方を評価）。これらの拘束の一部は、微生物メタゲノムにわたるＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の多様性を利用することにより克服することができる（例えば、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，９：４６７参照）。他のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を、実施例１に記載のものと同様の方法により哺乳動物細胞環境中に移植することができる。例えば、図１０は、ＣＲＩＳＰＲ媒介ゲノム編集を達成するための哺乳動物細胞中の異種発現のためのサーモフィラス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＬＭＤ−９のＣＲＩＳＰＲ１からのＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系の適応を説明する。図１０Ａは、サーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＬＭＤ−９のＣＲＩＳＰＲ１の模式的説明を提供する。図１０Ｂは、サーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ系のための発現系の設計を説明する。ヒトコドン最適化ｈＳｔＣａｓ９を、構成的ＥＦ１αプロモーターを使用して発現させる。ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡの成熟バージョンを、Ｕ６プロモーターを使用して発現させて正確な転写開始を促進する。成熟ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡからの配列を説明する。ｃｒＲＮＡ配列中の小文字「ａ」により示される単一塩基を使用してＲＮＡｐｏｌＩＩＩ転写ターミネーターとして機能するポリＵ配列を除去する。図１０Ｃは、ヒトＥＭＸ１遺伝子座ターゲティングするガイド配列を示す模式図を提供する。図１０Ｄは、Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイを使用する標的遺伝子座中のｈＳｔＣａｓ９媒介切断の結果を示す。ＲＮＡガイドスペーサー１及び２は、それぞれ１４％及び６．４％を誘導した。これらの２つのプロトスペーサー部位における生物学的複製物にわたる切断活性の統計分析も図５に提供する。図１４は、ヒトＥＭＸ１遺伝子座中のサーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ系の追加のプロトスペーサー及び対応するＰＡＭ配列標的の模式図を提供する。２つのプロトスペーサー配列を強調し、ＮＮＡＧＡＡＷモチーフを満たすそれらの対応するＰＡＭ配列を対応する強調配列に対して３’側で下線を付けることにより示す。両方のプロトスペーサーは、アンチセンス鎖をターゲティングする。

実施例３：Ｃａｓ９多様性
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、細菌から古細菌にわたる多様な種により用いられる侵入外因性ＤＮＡに対する適応免疫機序である。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座中への外来ＤＮＡの「獲得」を担うタンパク質をコードする遺伝子のセット、及びＤＮＡ切断機序の「実行」をコードする遺伝子のセットからなり；これらは、ＤＮＡヌクレアーゼ（Ｃａｓ９）、非コードトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、及び直接反復により隣接されている外来ＤＮＡ由来スペーサーのアレイ（ｃｒＲＮＡ）を含む。Ｃａｓ９による成熟時、ｔｒａｃＲＮＡ及びｃｒＲＮＡ二本鎖は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをスペーサーガイド配列により規定される標的ＤＮＡ配列にガイドし、切断に要求され、それぞれのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系に特異的な標的ＤＮＡ中の短鎖配列モチーフ付近のＤＮＡの二本鎖切断を媒介する。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、細菌界全体にわたり見出されており、Ｃａｓ９タンパク質配列及びサイズ、ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡ直接反復配列、それらのエレメントのゲノム構成、及び標的切断のためのモチーフ要件は高度に多様である。ある種は、複数の区別されるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を有し得る。

本出願人は、公知のＣａｓ９との配列相同性及び公知のサブドメイン、例として、ＨＮＨエンドヌクレアーゼドメイン及びＲｕｖＣエンドヌクレアーゼドメイン［Ｅｕｇｅｎｅ Ｋｏｏｎｉｎ及びＫｉｒａ Ｍａｋａｒｏｖａからの情報］とオルソロガスな構造に基づき同定された細菌種から２０７個の推定Ｃａｓ９を評価した。このセットのタンパク質配列保存に基づく系統発生分析により、大型Ｃａｓ９（約１４００アミノ酸）の３つの群及び小型Ｃａｓ９（約１１００アミノ酸）の２つの群を含むＣａｓ９の５つのファミリーが明らかになった（図１６及び１７Ａ〜Ｆ）。

Ｃａｓ９及びニッカーゼ又はＤＮＡ結合タンパク質に転換するＣａｓ９酵素の突然変異及び変化した機能を有するそれの使用のさらなる詳細は、米国仮特許出願第６１／８３６，１０１号明細書及び同第６１／８３５，９３６号明細書（それぞれ代理人整理番号４４７９０．０９．２０２２及び４７９０．０７．２０２２及びＢｒｏａｄ参照番号ＢＩ−２０１３／００４Ｅ及びＢＩ−２０１３／００４Ｆ）（参照により本明細書に組み込まれる）を参照することができる。

実施例４：Ｃａｓ９オルソログ
本出願人は、関連性のあるＰＡＭ配列及び対応するキメラガイドＲＮＡを同定するためＣａｓ９オルソログを分析した。拡張したＰＡＭセットを有することにより、全ゲノムにわたるより幅広いターゲティングが提供され、またユニークな標的部位の数が大幅に増加し、かつゲノムにおいて高い特異性レベルで新規Ｃａｓ９を同定できる可能性がもたらされる。

Ｃａｓ９オルソログの特異性は、各Ｃａｓ９がガイドＲＮＡとそのＤＮＡ標的との間のミスマッチを許容する能力を試験することにより評価し得る。例えば、ガイドＲＮＡにおける突然変異が切断効率に及ぼす効果を試験することにより、ＳｐＣａｓ９の特異性が特徴付けられている。ガイド配列と標的ＤＮＡとの間の単一又は複数のミスマッチを含むガイドＲＮＡのライブラリが作製された。これらの知見に基づき、以下の指針に基づきＳｐＣａｓ９の標的部位を選択することができる：
特定の遺伝子の編集に対するＳｐＣａｓ９の特異性を最大化するため、目的の遺伝子座内の標的部位は、潜在的な「オフターゲット」ゲノム配列が以下の４つの制約条件に従うように選択しなければならない：まず第１に、それらの配列の後に５’−ＮＧＧ又はＮＡＧ配列のいずれかを有するＰＡＭが続いてはならない。第２に、標的配列とのそれらの配列の大域的な配列類似性が最小化されなければならない。第３に、最大数のミスマッチがＰＡＭ−オフターゲット部位の近位領域内になければならない。最後に、最大数のミスマッチが連続しているか又は離れていても４塩基未満でなければならない。

同様の方法を用いて他のＣａｓ９オルソログの特異性を評価し、標的種のゲノム内にある特定の標的部位を選択するための基準を確立することができる。既述のとおり、このセットのタンパク質配列保存に基づく系統発生解析から、３群の大型Ｃａｓ９（約１４００アミノ酸）及び２群の小型Ｃａｓ９（約１１００アミノ酸）を含む５つのＣａｓ９ファミリーが明らかとなった（図１６及び図１７Ａ〜図１７Ｆを参照）。Ｃａｓオルソログに関するさらなる詳細は、参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６１／８３６，１０１号明細書及び同第６１／８３５，９３６号明細書（それぞれ代理人整理番号４４７９０．０９．２０２２及び４７９０．０７．２０２２及びＢｒｏａｄ参照番号ＢＩ−２０１３／００４Ｅ及びＢＩ−２０１３／００４Ｆ）を参照することができる。

実施例５：クローニング及び送達を単純化する方法論的改良。
プラスミド上のＵ６プロモーター及びガイドＲＮＡをコードするよりむしろ、本出願人はＵ６プロモーターをＤＮＡオリゴと共に増幅してガイドＲＮＡを付加した。得られたＰＣＲ産物を細胞にトランスフェクトしてガイドＲＮＡの発現を駆動することができる。

Ｕ６−プロモーター：：ヒトＥｍｘ１遺伝子座を標的とするガイドＲＮＡからなるＰＣＲ産物の生成を可能にするプライマー対の例：
フォワードプライマー：ＡＡＡＣＴＣＴＡＧＡｇａｇｇｇｃｃｔａｔｔｔｃｃｃａｔｇａｔｔｃ
リバースプライマー（下線が引かれたガイドＲＮＡを保有する）：ａｃｃｔｃｔａｇＡＡＡＡＡＡＡＧＣＡＣＣＧＡＣＴＣＧＧＴＧＣＣＡＣＴＴＴＴＴＣＡＡＧＴＴＧＡＴＡＡＣＧＧＡＣＴＡＧＣ ＣＴＴＡＴＴＴＴＡＡＣＴＴＧＣＴＡＴＧＣＴＧＴＴＴＴＧＴＴＴＣＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＴＡＧＣＴＣＴＡＡＡＡＣＣＣＣ ＴＡＧＴＣＡＴＴＧＧＡＧＧＴＧＡＣＧＧＴＧＴＴＴＣＧＴＣＣＴＴＴＣＣＡＣａａｇ

実施例６：活性を向上させる方法論的改良：
真核細胞でガイドＲＮＡを発現させるためにｐｏｌ３プロモーター、詳細にはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（例えばＵ６又はＨ１プロモーター）を使用するよりむしろ、本出願人は真核細胞でＴ７ポリメラーゼを発現させることにより、Ｔ７プロモーターを使用してガイドＲＮＡの発現を駆動する。

この系の一例は、３つのＤＮＡ断片の導入を伴い得る。
１．Ｃａｓ９の発現ベクター
２．Ｔ７ポリメラーゼの発現ベクター
３．Ｔ７プロモーターと融合したガイドＲＮＡを含む発現ベクター

実施例７：Ｃａｓ９の毒性を低下させる方法論的改良：ｍＲＮＡ形態のＣａｓ９の送達。
Ｃａｓ９をｍＲＮＡの形態で送達することにより、細胞でのＣａｓ９の一過性発現が可能となり、毒性が低下する。例えば、ヒト化ＳｐＣａｓ９は、以下のプライマー対を用いて増幅され得る。
フォワードプライマー（ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のためにＴ７プロモーターを付加するため）：ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＡＡＧＴＧＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＣＣＡＡＡＧＡＡＧＡＡＧＣＧＧ
リバースプライマー（ポリＡテールを付加するため）：ＧＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴｔｔｃｔｔａＣＴＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴＴＧＣＣＴＧＧＣＣＧ

本出願人は、真核細胞におけるガイドＲＮＡ発現を駆動するようにＲＮＡ又はＤＮＡカセットの形態のいずれかのガイドＲＮＡと共にＣａｓ９ ｍＲＮＡを細胞にトランスフェクトする。

実施例８：実施例１０：Ｃａｓ９の毒性を低下させる方法論的改良：誘導性プロモーターの使用
本出願人は、ゲノム改変を実行するのに必要となった場合に限りＣａｓ９発現を一過性にオンにする。誘導性システムの例には、テトラサイクリン誘導性プロモーター（Ｔｅｔ−Ｏｎ又はＴｅｔ−Ｏｆｆ）、小分子２ハイブリッド転写活性化システム（ＦＫＢＰ、ＡＢＡ等）、又は光誘導性システム（フィトクロム、ＬＯＶドメイン、又はクリプトクロム）が含まれる。

実施例９：ｉｎ ｖｉｖｏ適用のためのＣａｓ９系の改良
本出願人は、低分子量のＣａｓ９に対してメタゲノム検索を行った。多くのＣａｓ９ホモログはかなり大きい。例えばＳｐＣａｓ９は約１３６８アミノ酸長であり、これは大き過ぎるため送達用のウイルスベクターへのパッケージングが容易でない。ＧｅｎＢａｎｋに寄託されている配列からＣａｓ９ホモログの長さ分布を表すグラフが作成される（図２０）。配列の中には誤って注釈されているものもあり、従って各長さについての正確な度数は必ずしも正しいとは限らない。それでもなお、これによりＣａｓ９タンパク質の分布の概観が得られ、より短いＣａｓ９ホモログの存在が示唆される。

本出願人は、コンピューター解析により、細菌株カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）に１０００アミノ酸未満のＣａｓ９タンパク質が２つあることを見出した。カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）由来の１つのＣａｓ９の配列を以下に提供する。この長さでは、ＣｊＣａｓ９は、初代細胞への及び動物モデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏでのロバストな送達のためＡＡＶ、レンチウイルス、アデノウイルス、及び他のウイルスベクターに容易にパッケージングすることができる。本発明の好ましい実施形態では、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）由来のＣａｓ９タンパク質が使用される。

＞カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）Ｃａｓ９（ＣｊＣａｓ９）

このＣｊＣａｓ９に対する推定ｔｒａｃｒＲＮＡエレメントは以下である。
ＴＡＴＡＡＴＣＴＣＡＴＡＡＧＡＡＡＴＴＴＡＡＡＡＡＧＧＧＡＣＴＡＡＡＡＴＡＡＡＧＡＧＴＴＴＧＣＧ ＧＧＡＣＴＣＴＧＣＧＧＧＧＴＴＡＣＡＡＴＣＣＣＣＴＡＡＡＡＣＣＧＣＴＴＴＴＡＡＡＡＴＴ

直接反復配列は以下である。
ＡＴＴＴＴＡＣＣＡＴＡＡＡＧＡＡＡＴＴＴＡＡＡＡＡＧＧＧＡＣＴＡＡＡＡＣ

ＣｊＣａｓ９に対するキメラガイドＲＮＡの例は以下である。
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＵＣＣＣＧＡＡＡＧＧＧＡＣＵＡＡＡＡＵ ＡＡＡＧＡＧＵＵＵＧＣＧＧＧＡＣＵＣＵＧＣＧＧＧＧＵＵＡＣＡＡＵＣＣＣＣＵＡＡＡＡＣＣＧＣＵＵＵＵ

実施例１０：Ｃａｓ９最適化
機能強化のため又は新規機能を開発するため、本出願人は異なるＣａｓ９ホモログの断片を組み合わせることにより、キメラＣａｓ９タンパク質を作成する。例えば、２つの例示的なキメラＣａｓ９タンパク質：
例えば、本出願人は、Ｓｔ１Ｃａｓ９（このタンパク質からの断片は太字とする）のＮ末端を、ＳｐＣａｓ９（このタンパク質からの断片には下線を引く）のＣ末端と融合した。

＞Ｓｔ１（Ｎ）Ｓｐ（Ｃ）Ｃａｓ９

＞Ｓｐ（Ｎ）Ｓｔ１（Ｃ）Ｃａｓ９

キメラＣａｓ９を作製することの利益には、以下が含まれる：
毒性が低下する、
真核細胞における発現が向上する、
特異性が強化される、
タンパク質の分子量が低下し、異なるＣａｓ９ホモログからの最も小さいドメインを組み合わせることによりタンパク質が小さくなる、
ＰＡＭ配列要件の変更。

実施例１１：一般的なＤＮＡ結合タンパク質としてのＣａｓ９の利用
本出願人は、ＤＮＡ標的の両方の鎖の切断に関与している２つの触媒ドメイン（Ｄ１０及びＨ８４０）の突然変異によって、Ｃａｓ９を一般的なＤＮＡ結合タンパク質として使用した。標的遺伝子座における遺伝子転写を上方制御するために、本出願人は転写活性化ドメイン（ＶＰ６４）をＣａｓ９に融合した。本出願人は、転写因子活性化強度が標的で費やされる時間の関数であるため、Ｃａｓ９−ＶＰ６４融合タンパク質の強力な核局在を認めることが重要であるという仮説を立てた。従って、本出願人は一組のＣａｓ９−ＶＰ６４−ＧＦＰ構築物をクローニングし、それらを２９３細胞にトランスフェクトし、トランスフェクション後１２時間でその局在を蛍光顕微鏡下で評価した。

嵩高いＧＦＰの存在が妨げとなることなく構築物を機能的に試験するため、同じ構築物を、直接的な融合ではなく、２Ａ−ＧＦＰとしてクローニングした。Ｓｏｘ２遺伝子座は細胞の再プログラム化に有用となり得ると共に、この遺伝子座はＴＡＬＥ−ＴＦ媒介性転写活性化の標的として既に検証されているため、本出願人はＳｏｘ２遺伝子座をＣａｓ９トランス活性化因子による標的とすることにした。Ｓｏｘ２遺伝子座について、本出願人は転写開始部位（ＴＳＳ）近傍の８つの標的を選んだ。各標的は２０ｂｐ長であり、隣接するＮＧＧプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を有した。各Ｃａｓ９−ＶＰ６４構築物を各ＰＣＲ生成キメラｃｒｉｓｐｒ ＲＮＡ（ｃｈｉＲＮＡ）と２９３細胞にコトランスフェクトした。トランスフェクション後７２時間でＲＴ−ｑＰＣＲを使用して転写活性化を評価した。

転写活性化因子をさらに最適化するため、本出願人は、ｃｈｉＲＮＡ（Ｓｏｘ２．１及びＳｏｘ２．５）とＣａｓ９（ＮＬＳ−ＶＰ６４−ＮＬＳ−ｈＳｐＣａｓ９−ＮＬＳ−ＶＰ６４−ＮＬＳ）との比率を滴定し、２９３細胞にトランスフェクトし、及びＲＴ−ｑＰＣＲを使用して定量化した。これらの結果は、Ｃａｓ９を一般的なＤＮＡ結合ドメインとして使用して標的遺伝子座における遺伝子転写を上方制御し得ることを示している。

本出願人は、第２世代の構築物を設計した（下表）。

本出願人はこれらの構築物を使用して転写活性化（ＶＰ６４融合構築物）及び抑制（Ｃａｓ９のみ）をＲＴ−ｑＰＣＲにより評価する。本出願人は抗Ｈｉｓ抗体を使用して各構築物の細胞局在を評価し、Ｓｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼアッセイを使用してヌクレアーゼ活性を評価し、及びゲルシフトアッセイを使用してＤＮＡ結合親和性を評価する。本発明の好ましい実施形態において、ゲルシフトアッセイはＥＭＳＡゲルシフトアッセイである。

実施例１２：Ｃａｓ９トランスジェニック及びノックインマウス
Ｃａｓ９ヌクレアーゼを発現するマウスを作成するため、本出願人は２つの一般的戦略、トランスジェニックとノックインとを提示する。これらの戦略は、目的とする任意の他のモデル生物の作成、例えばラットに適用し得る。これらの一般的戦略の各々について、本出願人は、構成的に活性なＣａｓ９と、条件的に発現する（Ｃｒｅリコンビナーゼ依存性の）Ｃａｓ９とを作製する。構成的に活性なＣａｓ９ヌクレアーゼは以下のコンテクストで発現する：ｐＣＡＧ−ＮＬＳ−Ｃａｓ９−ＮＬＳ−Ｐ２Ａ−ＥＧＦＰ−ＷＰＲＥ−ｂＧＨｐｏｌｙＡ。ｐＣＡＧはプロモーターであり、ＮＬＳは核局在化シグナルであり、Ｐ２Ａはペプチド切断配列であり、ＥＧＦＰは高感度緑色蛍光タンパク質であり、ＷＰＲＥはウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメントであり、及びｂＧＨｐｏｌｙＡはウシ成長ホルモンポリＡシグナル配列である（図２２Ａ〜図２２Ｂ）。条件的バージョンは、プロモーターの後ろ及びＮＬＳ−Ｃａｓ９−ＮＬＳの前に１つのさらなる停止カセットエレメント、ｌｏｘＰ−ＳＶ４０ ｐｏｌｙＡ ｘ３−ｌｏｘＰを有する（即ち ｐＣＡＧ−ｌｏｘＰ−ＳＶ４０ｐｏｌｙＡｘ３−ｌｏｘＰ−ＮＬＳ−Ｃａｓ９−ＮＬＳ−Ｐ２Ａ−ＥＧＦＰ−ＷＰＲＥ−ｂＧＨｐｏｌｙＡ）。重要な発現エレメントは図２３のとおり可視化することができる。構成的構築物は開発全体を通して全ての細胞型で発現しなければならないが、条件的構築物は、同じ細胞がＣｒｅリコンビナーゼを発現するときに限りＣａｓ９発現を可能にし得る。この後者のバージョンは、Ｃｒｅが組織特異的プロモーターの発現下にあるときＣａｓ９の組織特異的発現を可能にし得る。さらに、ＣｒｅをＴＥＴ ｏｎ又はｏｆｆシステムなどの誘導性プロモーターの発現下に置くことにより、Ｃａｓ９発現を成体マウスで誘導することができる。

Ｃａｓ９構築物の検証：各プラスミドを３つの方法で機能検証した：１）２９３細胞における一過性トランスフェクションと、続くＧＦＰ発現の確認；２）２９３細胞における一過性トランスフェクションと、続くＰ２Ａ配列を認識する抗体を使用した免疫蛍光法；及び３）一過性トランスフェクションと、続くＳｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼアッセイ。２９３細胞は、目的の細胞に応じて２９３ＦＴ細胞又は２９３ Ｔ細胞であってもよい。好ましい実施形態では、細胞は２９３ＦＴ細胞である。Ｓｕｒｖｅｙｏｒの結果は、条件的及び構成的構築物についてゲルのそれぞれ最上列及び最下列で実施した。各々を、ｈＥＭＸ１遺伝子座を標的にするキメラＲＮＡ（キメラＲＮＡ ｈＥＭＸ１．１）の存在下及び非存在下で試験した。結果は、この構築物がキメラＲＮＡ（及び条件的の場合にはＣｒｅ）の存在下においてのみｈＥＭＸ１遺伝子座のターゲティングに成功し得ることを示している。ゲルを定量化した。結果は３サンプルの平均切断効率及び標準偏差として提供する。

トランスジェニックＣａｓ９マウス：構築物を有するトランスジェニックマウスを作成するため、本出願人は純粋な線状ＤＮＡを偽妊娠ＣＢ５６雌由来の接合体の前核に注入する。ファウンダーを同定し、遺伝子型を決定し、ＣＢ５７マウスと戻し交配させる。構築物がクローニングが成功し、これはＳａｎｇｅｒシークエンシングによって確認された。

ノックインＣａｓ９マウス：Ｃａｓ９ノックインマウスを作成するため、本出願人は同じ構成的及び条件的構築物をＲｏｓａ２６遺伝子座にターゲティングする。本出願人はこれを、以下のエレメントを有するＲｏｓａ２６ターゲティングベクターに各々をクローニングすることにより行った：Ｒｏｓａ２６ショート相同性アーム−構成的／条件的Ｃａｓ９発現カセット−ｐＰＧＫ−Ｎｅｏ−Ｒｏｓａ２６ロング相同性アーム−ｐＰＧＫ−ＤＴＡ。ｐＰＧＫは、ＰＧＫにより駆動される、ネオマイシンに対する耐性を付与するポジティブ選択マーカーＮｅｏ、１ｋｂショートアーム、４．３ｋｂロングアーム、及びネガティブ選択ジフテリア毒素（ＤＴＡ）に対するプロモーターである。

２つの構築物をＲ１ ｍＥＳＣにエレクトロポレートし、２日間成長させておいた後、ネオマイシン選択を適用した。５〜７日目まで生存していた個々のコロニーを取り、個別のウェルで成長させた。５〜７日後にコロニーを回収し、半分は凍結し、残りの半分は遺伝子型同定に使用した。遺伝子型同定はゲノムＰＣＲにより行い、ここでは一方のプライマーをドナープラスミド（ＡｔｔｐＦ）内にアニールし、他方のプライマーをショート相同性アーム（Ｒｏｓａ２６−Ｒ）の外側にアニールした。条件的ケース用に回収した２２個のコロニーのうち、７個が陽性であった（左）。構成的ケース用に回収した２７個のコロニーのうち、陽性は０個であった（右）。Ｃａｓ９がｍＥＳＣにおいてあるレベルの毒性を引き起こし、そのため陽性クローンがなかったものと思われる。これを試験するため、本出願人は正しくターゲティングされる条件的Ｃａｓ９細胞にＣｒｅ発現プラスミドを導入し、培養下で何日も経った後にも極めて低毒性であることを認めた。正しくターゲティングされる条件的Ｃａｓ９細胞におけるＣａｓ９のコピー数の低下（細胞当たり１〜２コピー）は、安定発現及び相対的な無細胞毒性を可能にするのに十分である。さらに、このデータはＣａｓ９コピー数が毒性を決定することを示している。エレクトロポレーション後、各細胞は数コピーのＣａｓ９を得るはずで、これが、構成的Ｃａｓ９構築物の場合に陽性コロニーが認められなかった理由であると思われる。これは、条件的Ｃｒｅ依存戦略を利用すると毒性の低下が示されるはずであるという強力なエビデンスを提供する。本出願人は、正しくターゲティングされる細胞を胚盤胞に注入して雌マウスに移植する。キメラを同定し、戻し交配させる。ファウンダーを同定し、遺伝子型を決定する。

条件的Ｃａｓ９マウスの有用性：本出願人は、２９３細胞において、Ｃｒｅとの同時発現によってＣａｓ９条件的発現構築物を活性化できることを示した。また本出願人は、Ｃｒｅが発現されると、正しく標的化されたＲ１ ｍＥＳＣが活性Ｃａｓ９を有し得ることも示す。Ｃａｓ９の後にＰ２Ａペプチド切断配列が続き、及び次にＥＧＦＰが続くため、本出願人は、ＥＧＦＰの観察により発現の成功を確認する。この同じ概念は、条件的Ｃａｓ９マウスを非常に有用にするものである。本出願人はそれらの条件的Ｃａｓ９マウスを、Ｃｒｅを遍在的に発現するマウス（ＡＣＴＢ−Ｃｒｅ系統）と交配させることができ、あらゆる細胞でＣａｓ９を発現するマウスが得られ得る。胎仔又は成体マウスにおいてゲノム編集を誘導するために必要なことはキメラＲＮＡの送達のみであるはずである。興味深いことに、条件的Ｃａｓ９マウスを組織特異的プロモーターの制御下でＣｒｅを発現するマウスと交配させる場合、同様にＣｒｅを発現する組織にのみＣａｓ９が存在するはずである。この手法を用いて正確な組織に限ったゲノムの編集を、同組織にキメラＲＮＡを送達することにより行い得る。

実施例１３：Ｃａｓ９の多様性及びキメラＲＮＡ
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、細菌及び古細菌にわたる多様な種により用いられる侵入外来性ＤＮＡに対する適応免疫機構である。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座への外来ＤＮＡの「獲得」に関与するタンパク質をコードする一組の遺伝子、並びにＤＮＡ切断機構の「遂行」をコードする一組の遺伝子からなる；これらには、ＤＮＡヌクレアーゼ（Ｃａｓ９）、非コードトランス活性化ｃｒ−ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、及び外来ＤＮＡ由来のスペーサーに直接反復が隣接したアレイ（ｃｒＲＮＡ）が含まれる。Ｃａｓ９による成熟時、ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡ二重鎖が、スペーサーガイド配列により特定されるＣａｓ９ヌクレアーゼを標的ＤＮＡ配列にガイドし、切断に必要でかつ各ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系に特異的な、標的ＤＮＡの短鎖配列モチーフ近傍でのＤＮＡの二本鎖切断を媒介する。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は細菌界全体にわたり見られ、Ｃａｓ９タンパク質配列及びサイズ、ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡ直接反復配列、これらのエレメントのゲノム構成、及び標的切断のモチーフ要件の点で高度に多様である。１つの種が複数の異なるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を有し得る。

本出願人は、既知のＣａｓ９との配列相同性及び既知のサブドメイン、例えばＨＮＨエンドヌクレアーゼドメイン及びＲｕｖＣエンドヌクレアーゼドメイン［Ｅｕｇｅｎｅ Ｋｏｏｎｉｎ及びＫｉｒａ Ｍａｋａｒｏｖａからの情報］とオルソロガスな構造に基づき同定された細菌種から２０７個の推定Ｃａｓ９を評価した。このセットのタンパク質配列保存に基づく系統発生解析から、３群の大型Ｃａｓ９（約１４００アミノ酸）及び２群の小型Ｃａｓ９（約１１００アミノ酸）を含む５つのＣａｓ９ファミリーが明らかとなった（図１６Ａ〜図１６Ｄ及び図１７Ａ〜図１７Ｆ）。

本出願人はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏ方法を用いてＣａｓ９ガイドＲＮＡの最適化も行っている。

実施例１４：Ｃａｓ９突然変異
本実施例において、本出願人は、以下の突然変異がＳｐＣａｓ９をニッキング酵素に変換し得ることを示す：Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ、Ｄ９８６Ａ。

本出願人は、突然変異点がＳｐＣａｓ９遺伝子内のどこに局在するかを示す配列を提供する（図２１Ａ〜Ｍ）。本出願人は、ニッカーゼが相同組換えを依然として媒介し得ることも示す。さらに、本出願人は、これらの突然変異を有するＳｐＣａｓ９が（個々に）二本鎖切断を誘導しないことを示す。

Ｃａｓ９オルソログは全て、３〜４のＲｕｖＣドメイン及びＨＮＨドメインの一般的構成を共有する。最も５’側のＲｕｖＣドメインは非相補鎖を切断し、ＨＮＨドメインは相補鎖を切断する。全ての表記はガイド配列を参照する。

５’ＲｕｖＣドメイン内の触媒残基は、目的のＣａｓ９と、他のＣａｓ９オルソログ（化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座、サーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座１、サーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座３、及びフランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｃｉｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ）ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に由来するもの）との相同性比較によって同定され、保存Ａｓｐ残基がアラニンに突然変異されて、Ｃａｓ９が相補鎖ニッキング酵素に転換される。同様に、ＨＮＨドメイン内の保存Ｈｉｓ及びＡｓｎ残基はアラニンに突然変異され、Ｃａｓ９が非相補鎖ニッキング酵素に転換される。

実施例１５：Ｃａｓ９転写活性化及びＣａｓ９リプレッサー
Ｃａｓ９転写活性化
第２世代の構築物を設計して試験した（表１）。これらの構築物を使用して転写活性化（ＶＰ６４融合構築物）及び抑制（Ｃａｓ９のみ）をＲＴ−ｑＰＣＲにより評価する。本出願人は、抗Ｈｉｓ抗体を使用して各構築物の細胞局在を評価し、Ｓｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼアッセイを使用してヌクレアーゼ活性を評価し、及びゲルシフトアッセイを使用してＤＮＡ結合親和性を評価する。

Ｃａｓリプレッサー
ｄＣａｓ９を一般的なＤＮＡ結合ドメインとして使用して遺伝子発現を抑制し得ることがこれまでに示されている。本出願人は、改良されたｄＣａｓ９設計並びにリプレッサードメインＫＲＡＢ及びＳＩＤ４ｘに対するｄＣａｓ９融合を報告する。表１におけるＣａｓ９を使用して転写を調節するため作成されたプラスミドライブラリから、以下のリプレッサープラスミドがｑＰＣＲにより機能的に特徴付けられた：ｐＸＲＰ２７、ｐＸＲＰ２８、ｐＸＲＰ２９、ｐＸＲＰ４８、ｐＸＲＰ４９、ｐＸＲＰ５０、ｐＸＲＰ５１、ｐＸＲＰ５２、ｐＸＲＰ５３、ｐＸＲＰ５６、ｐＸＲＰ５８、ｐＸＲＰ５９、ｐＸＲＰ６１、及びｐＸＲＰ６２。

各ｄＣａｓ９リプレッサープラスミドを、β−カテニン遺伝子のコード鎖にターゲティングされた２つのガイドＲＮＡと共にコトランスフェクトした。トランスフェクション後７２時間でＲＮＡを単離し、ＲＴ−ｑＰＣＲによって遺伝子発現を定量化した。内在性対照遺伝子はＧＡＰＤＨであった。２つのバリデートされたｓｈＲＮＡを陽性対照として使用した。陰性対照はｇＲＮＡなしにトランスフェクトした特定のプラスミド（これらは「ｐＸＲＰ＃＃対照」と表される）であった。プラスミドｐＸＲＰ２８、ｐＸＲＰ２９、ｐＸＲＰ４８、及びｐＸＲＰ４９は、指定される標的化戦略を用いるときβ−カテニン遺伝子を抑制することができた。このようなプラスミドは、機能ドメインを有しないｄＣａｓ９（ｐＸＲＰ２８及びｐＸＲＰ２８）、及びＳＩＤ４ｘに融合したｄＣａｓ９（ｐＸＲＰ４８及びｐＸＲＰ４９）に対応する。

さらなる研究では以下を調べる：上記の実験の反復、種々の遺伝子のターゲティング、他のｇＲＮＡを利用した最適なターゲティング位置の決定、及び多重抑制。

実施例１６：コレステロール生合成、脂肪酸生合成、及び他の代謝障害に関与する遺伝子、アミロイド病及び他の疾患に関与する誤って折り畳まれたタンパク質をコードする遺伝子、細胞形質転換を引き起こす癌遺伝子、潜伏ウイルス遺伝子、並びにドミナントネガティブ障害を引き起こす遺伝子（数ある障害の中でも特に）の標的化した欠失
本出願人は、ウイルス送達系或いはナノ粒子送達系を用いた、代謝疾患、アミロイドーシス及びタンパク質凝集関連疾患、遺伝子突然変異及び転座により生じる細胞形質転換、遺伝子突然変異のドミナントネガティブ効果、潜伏ウイルス感染、及び他の関連症状に罹患した、必要性のある対象又は患者における肝組織、脳組織、眼組織、上皮組織、造血組織、又は別の組織でのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の遺伝子送達を実証する。

研究設計：代謝障害、アミロイドーシス及びタンパク質凝集関連疾患に罹患した、必要性のある対象又は患者としては、限定はされないが、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、他の家畜及び関連哺乳動物が含まれる。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系はキメラガイドＲＮＡにガイドされ、切断しようとするヒトゲノム遺伝子座の特定の部位を標的にする。切断及び非相同末端結合媒介性修復の後、フレームシフト突然変異により遺伝子のノックアウトがもたらされる。

本出願人は、上述の障害に関わる遺伝子を標的にするガイドＲＮＡを、最小限のオフターゲット活性で内因性遺伝子座に特異的であるように選択する。２つ以上のガイドＲＮＡを単一のＣＲＩＳＰＲアレイにコードすることによりＤＮＡに同時の二本鎖切断を誘導し、罹患した遺伝子又は染色体領域の微小欠失を生じさせてもよい。

遺伝子標的の同定及び設計
各候補疾患遺伝子について、本出願人は目的のＤＮＡ配列を選択し、それにはタンパク質コードエクソン、既知のドミナントネガティブ突然変異部位を含みかつそれに隣接する配列、病的反復配列を含みかつそれに隣接する配列が含まれる。遺伝子ノックアウト手法に関して、開始コドンに最も近接した初期コードエクソンが、完全なノックアウトを達成し、かつ部分的な機能を保持するトランケート型タンパク質産物となる可能性を最小限に抑えるのに最良の選択肢を提供する。

本出願人は、ＮＧＧモチーフ（ＳｐＣａｓ９系について）又はＮＮＡＧＡＡＷ（Ｓｔ１Ｃａｓ９系について）の直ちに５’側にある可能な全てのターゲティング可能な２０ｂｐ配列に関して目的の配列を分析する。本出願人は、特異性を決定する計算アルゴリズムに基づきオフターゲット効果が最小限に抑えられるように、ゲノムにおけるＲＮＡによってガイドされるユニークな単一のＣａｓ９認識用配列を選択する。

送達系へのガイド配列のクローニング
ガイド配列は二本鎖２０〜２４ｂｐオリゴヌクレオチドとして合成される。オリゴを５’−リン酸化処理し、アニーリングにより二重鎖を形成した後、オリゴを送達方法に応じた好適なベクターにライゲートする：
ウイルスベースの送達方法
ＡＡＶベースのベクター（ＰＸ２６０、３３０、３３４、３３５）が他の部分に記載されている。

レンチウイルスベースのベクターは、Ｕ６プロモーターによって駆動されるキメラＲＮＡ足場と、ＥＦ１ａプロモーターによって駆動されるＣａｓ９又はＣａｓ９ニッカーゼとを担持する単一のベクターにガイド配列を直接ライゲートする同様のクローニング戦略を用いる。

ウイルス産生については他の部分に記載される。

ナノ粒子ベースのＲＮＡ送達方法
１．Ｔ７プロモーター−ガイド配列キメラＲＮＡをコードするオリゴヌクレオチド二重鎖としてガイド配列を合成する。Ｔ７プロモーターをＣａｓ９の５’にＰＣＲ方法によって付加する。

２．Ｔ７により駆動されるＣａｓ９及びガイドキメラＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏで転写し、市販のキットを使用してＣａｓ９ ｍＲＮＡをさらにキャッピングし、Ａテールを付加する。キットの説明書に従いＲＮＡ産物を精製する。

流体力学的尾静脈送達方法（マウスに対して）
ガイド配列を、上記及び本出願の他の部分に記載するとおりＡＡＶプラスミドにクローニングする。

細胞株に関するｉｎ ｖｉｔｒｏ検証
トランスフェクション
１．ＤＮＡプラスミドトランスフェクション
ガイド配列を担持するプラスミドをヒト胎児腎臓（ＨＥＫ２９３Ｔ）細胞又はヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞、他の関連性のある細胞型に、脂質ベース、化学ベース又はエレクトロポレーションベースの方法を使用してトランスフェクトする。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の２４ウェルトランスフェクション（約２６０，０００細胞）に対しては、５００ｎｇの総ＤＮＡを、リポフェクタミン２０００を使用して各ウェルにトランスフェクトする。ｈＥＳ細胞の１２ウェルトランスフェクションに対しては、１ｕｇの総ＤＮＡを、Ｆｕｇｅｎｅ ＨＤを使用して単一のウェルにトランスフェクトする。

２．ＲＮＡトランスフェクション
上記に記載する精製ＲＮＡを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞へのトランスフェクションに使用する。１〜２ｕｇのＲＮＡを、製造者の指示に従いリポフェクタミン２０００を使用して約２６０，０００個にトランスフェクトし得る。Ｃａｓ９及びキメラＲＮＡのＲＮＡ送達を図２４に示す。

ｉｎ ｖｉｔｒｏインデル形成アッセイ
トランスフェクション後７２時間で細胞を回収し、二本鎖切断の指標としてのインデル形成に関してアッセイする。

簡潔に言えば、標的配列の周りのゲノム領域を、高忠実性ポリメラーゼを使用してＰＣＲ増幅する（約４００〜６００ｂｐアンプリコンサイズ）。産物を精製し、等濃度に標準化し、９５℃から４℃まで徐々にアニーリングしてＤＮＡヘテロ二本鎖を形成させる。アニーリング後、Ｃｅｌ−Ｉ酵素を使用してヘテロ二本鎖を切断し、得られた産物をポリアクリルアミドゲル上で分離し、インデル効率を計算する。

動物におけるｉｎ ｖｉｖｏ原理証明
送達機構
ＡＡＶ又はレンチウイルス作製については他の部分に記載される。

ナノ粒子製剤：ナノ粒子製剤にＲＮＡを混合する。

市販のキットを使用して、マウスにおけるＤＮＡプラスミドの流体力学的尾静脈注射を実施する。

Ｃａｓ９及びガイド配列は、ウイルス、ナノ粒子コーティングＲＮＡ混合物、又はＤＮＡプラスミドとして送達され、被験動物に注射される。並行する一組の対照動物に、滅菌生理食塩水、Ｃａｓ９及びＧＦＰ、又はガイド配列及びＧＦＰ単独を注射する。

注射後３週間で症状の改善に関して動物を調べて犠牲にする。関係する臓器系のインデル形成を分析する。表現型アッセイには、ＨＤＬ、ＬＤＬ、脂質の血中濃度が含まれる。

インデル形成のアッセイ
市販キットを使用して組織からＤＮＡを抽出する；インデルアッセイは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実証について記載されるとおり実施し得る。

ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の治療適用は、候補疾患遺伝子の組織特異的かつ時間的に制御された、標的化した欠失の達成に適している。例としては、数ある障害の中でも特に、コレステロール及び脂肪酸代謝、アミロイド病、ドミナントネガティブ疾患、潜伏ウイルス感染症に関与する遺伝子が挙げられる。

遺伝子座に標的インデルを導入するためのシングルガイドＲＮＡの例

遺伝子座に染色体微小欠失を導入するためのガイドＲＮＡ対の例

実施例１７：疾患原因突然変異を有する遺伝子に対する修復の標的組込み；酵素欠損症及び他の関連疾患の再現
研究設計
Ｉ．遺伝子標的の同定及び設計
・実施例２０に記載される
ＩＩ．送達系に対するガイド配列及び修復鋳型のクローニング
・上記の実施例２０に記載される
・本出願人は、罹患アレルを含む相同性アームを含めるためのＤＮＡ修復鋳型並びに野生型修復鋳型をクローニングする
ＩＩＩ．細胞株に関するｉｎ ｖｉｔｒｏ検証
ａ．トランスフェクションについては、上記の実施例２０に記載される；Ｃａ９、ガイドＲＮＡ、及び修復鋳型を関連性のある細胞型にコトランスフェクトする。
ｂ．ｉｎ ｖｉｔｒｏ修復アッセイ
ｉ．本出願人はトランスフェクション後７２時間で細胞を回収し、修復に関してアッセイする
ｉｉ．簡潔に言えば、本出願人は修復鋳型の周りのゲノム領域を、高忠実性ポリメラーゼを使用してＰＣＲ増幅する。本出願人は突然変異体アレルの発生率の低下に関して産物を配列決定する。
ＩＶ．動物におけるｉｎ ｖｉｖｏ原理証明
ａ．送達機構については、本明細書において記載される。
ｂ．ｉｎ ｖｉｖｏ修復アッセイ
ｉ．本出願人は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実証に記載するとおり修復アッセイを実施する。
Ｖ．治療適用
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、候補疾患遺伝子の組織特異的かつ時間的に制御された標的欠失の達成に適している。例としては、数ある障害の中でも特に、コレステロール及び脂肪酸代謝、アミロイド病、ドミナントネガティブ疾患、潜伏ウイルス感染症に関与する遺伝子が挙げられる。

修復鋳型による１つの単一ミスセンス突然変異の例：

実施例１８：緑内障、アミロイドーシス、及びハンチントン病におけるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の治療適用
緑内障：本出願人は、ミオシリン（ｍｙｃｉｌｉｎ）（ＭＹＯＣ）遺伝子の第１のエクソンをターゲティングするガイドＲＮＡを設計する。本出願人はアデノウイルスベクター（Ａｄ５）を使用してＣａｓ９並びにＭＹＯＣ遺伝子をターゲティングするガイドＲＮＡの両方をパッケージングする。本出願人はこのアデノウイルスベクターを、細胞が緑内障の病態生理に関係付けられている小柱網に注入する。本出願人は、初めにこれを、突然変異ＭＹＯＣ遺伝子を有するマウスモデルで試験して、アデノウイルスベクターが視力を改善し、及び眼圧を低下させるかどうかを見る。ヒトにおける治療適用も同様の戦略を用いる。

アミロイドーシス：本出願人は、肝臓におけるトランスサイレチン（ＴＴＲ）遺伝子の第１のエクソンをターゲティングするガイドＲＮＡを設計する。本出願人はＡＡＶ８を使用してＣａｓ９並びにＴＴＲ遺伝子の第１のエクソンをターゲティングするガイドＲＮＡをパッケージングする。ＡＡＶ８は、効率的に肝臓をターゲティングすることが示されており、静脈内投与され得る。Ｃａｓ９は、アルブミンプロモーターなどの肝臓特異的プロモーターを使用するか、或いは構成的プロモーターを使用して駆動することができる。ｐｏｌ３プロモーターがガイドＲＮＡを駆動する。

或いは、本出願人は、プラスミドＤＮＡの流体力学的送達を利用してＴＴＲ遺伝子をノックアウトする。本出願人は、Ｃａｓ９とＴＴＲのエクソン１をターゲティングするガイドＲＮＡとをコードするプラスミドを送達する。

さらなる代替的な手法として、本出願人はＲＮＡの組み合わせ（Ｃａｓ９のｍＲＮＡ、及びガイドＲＮＡ）を投与する。ＲＮＡはＬｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＩｎｖｉｖｏｆｅｃｔａｍｉｎｅなどのリポソームを使用してパッケージングし、静脈内送達することができる。ＲＮＡによって誘発される免疫原性を低下させ、Ｃａｓ９発現レベル及びガイドＲＮＡの安定性を高めるため、本出願人は５’キャッピングを用いてＣａｓ９ ｍＲＮＡを改変する。本出願人はまた、改変されたＲＮＡヌクレオチドをＣａｓ９ ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡに組み込むことにより、それらの安定性を高め、免疫原性を低下させる（例えばＴＬＲの活性化）。効率を高めるため、本出願人は複数回用量のウイルス、ＤＮＡ、又はＲＮＡを投与する。

ハンチントン病：本出願人は、患者のＨＴＴ遺伝子におけるアレル特異的突然変異に基づきガイドＲＮＡを設計する。例えば、ＣＡＧリピートが伸長したＨＴＴがヘテロ接合の患者において、本出願人は、突然変異体ＨＴＴアレルに特有のヌクレオチド配列を同定し、それを使用してガイドＲＮＡを設計する。本出願人は、突然変異体塩基がガイドＲＮＡの最後の９ｂｐの範囲内に位置することを確実にする（これは標的サイズとガイドＲＮＡとの間の単一のＤＮＡ塩基ミスマッチ間を識別する能力を有することが、本出願人により確認されている）。

本出願人は、突然変異体ＨＴＴアレル特異的ガイドＲＮＡ及びＣａｓ９をＡＡＶ９にパッケージングし、ハンチントン病患者の線条体内に送達する。ウイルスは開頭術によって定位的に線条体に注入する。ＡＡＶ９は、ニューロンを効率的に形質導入することが知られる。本出願人はヒトシナプシンＩなどのニューロン特異的プロモーターを使用してＣａｓ９を駆動する。

実施例１９：ＨＩＶにおけるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の治療適用
慢性ウイルス感染症は、有意な罹患率及び死亡率の原因である。これらのウイルスの多くに関しては、ウイルス複製の種々の側面を有効にターゲティングする従来の抗ウイルス治療薬が存在するが、現在の治療モダリティは、通常、「ウイルス潜伏」に起因して非治癒的な性質のものである。その性質上、ウイルス潜伏は、活性のあるウイルス産生のないウイルスのライフサイクルにおける休眠期により特徴付けられる。この期間中、ウイルスは大部分が免疫監視機構及び従来の治療薬の両方を回避することができるため、ウイルスが宿主内に長期にわたるウイルスリザーバを構築することが可能となり、続いてそこから再活性化し、ウイルスの伝播及び伝染を続行することができる。ウイルス潜伏の鍵は、ウイルスゲノムを安定的に維持する能力であり、これは、それぞれウイルスゲノムを細胞質に貯えるか又はそれを宿主ゲノムに組み込むものであるエピソーム潜伏又はプロウイルス潜伏のいずれかによって達成される。初感染を防ぐ有効なワクチン接種がない場合、潜伏リザーバ及び溶菌作用のエピソードにより特徴付けられる慢性ウイルス感染症は重大な影響を及ぼし得る：ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）は子宮頸癌をもたらすことがあり、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は肝細胞癌の原因となり、及びヒト免疫不全ウイルスは最終的には宿主免疫系を破壊して日和見感染に対する感受性をもたらす。このように、これらの感染症では、現在利用可能な抗ウイルス治療薬の生涯にわたる使用が必要となる。さらに問題を複雑にしているのは、これらのウイルスゲノムの多くの高い変異性であり、これが有効な治療の存在しない耐性株の進化につながっている。

ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、多重的能力のある配列特異的な方法で二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）を誘導することが可能な細菌性適応免疫系であり、最近になって哺乳類細胞株内で再構成されている。１つ又は多数のガイドＲＮＡによってＤＮＡをターゲティングすると、介在配列にそれぞれインデル及び欠失の両方がもたらされ得ることが示されている。このように、この新規技術は、高効率及び高特異性で単一細胞内における標的化されかつ多重化されたＤＮＡ突然変異作成を達成し得る手段に相当する。結果的に、ウイルスＤＮＡ配列に対するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の送達は、進行中のウイルス産生がない場合であっても、潜伏ウイルスゲノムの標的化した破壊及び欠失を可能にし得る。

例として、ＨＩＶ−１による慢性感染症は、３３００万人の感染者を抱え、毎年２６０万人の感染が発生している世界的な健康問題である。ウイルス複製の複数の側面を同時にターゲティングする集学的高活性抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）の使用により、ＨＩＶ感染の大部分を、末期的でない慢性の病気として管理することが可能となっている。治療しなければ、通常９〜１０年以内にＨＩＶからＡＩＤＳへの進行が起こり、宿主免疫系の枯渇及び日和見感染症の発生がもたらされ、通常はその後間もなく死亡に至る。ウイルス潜伏に続発して、ＨＡＡＲＴの中断は必然的にウイルスのリバウンドを引き起こす。さらに、一時的ではあっても治療の寸断により、利用可能な手段では制御不可能なＨＩＶ耐性株が選択され得る。加えて、ＨＡＡＲＴ治療のコストは著しく高い：１年に１人当たり１０，０００〜１５，００００米国ドルの範囲内である。このように、ウイルス複製のプロセスではなしに、ＨＩＶゲノムを直接ターゲティングする治療手法は、潜伏リザーバの根絶による治癒的な治療選択肢を可能にし得る手段に相当する。

ＨＩＶ−１標的化ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の開発及び送達は、既存の標的ＤＮＡ突然変異生成手段、即ちＺＦＮ及びＴＡＬＥＮとは区別され得るユニークな手法に相当し、数多くの治療的関連性を有する。ＨＡＡＲＴと併せたＣＲＩＳＰＲ媒介性ＤＳＢ及びインデルによるＨＩＶ−１ゲノムの標的破壊及び欠失は、宿主内での活性なウイルス産生並びに潜伏ウイルスリザーバの枯渇を同時に防ぐことを可能にし得る。

宿主免疫系に組み込まれると、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系によりＨＩＶ−１抵抗性亜集団の生成が可能となり、この亜集団は、ウイルスが完全には根絶されていない場合であっても、宿主免疫活性の維持及び再構成を可能にし得る。これは、ウイルスゲノムの破壊によりウイルスの産生及び組込みを妨げることで潜在的に初感染を予防するもので、「ワクチン接種」の手段に相当し得る。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の多重化した性質により、個々の細胞内においてゲノムの複数の側面を同時に標的化することが可能となる。

ＨＡＡＲＴなどでは、複数の適応突然変異を同時に獲得する必要があるため、突然変異生成によるウイルスのエスケープが最小限に抑えられる。複数のＨＩＶ−１株を同時にターゲティングすることができ、従って重感染の可能性が最小限に抑えられ、かつ続く新規組換え株の作成が妨げられる。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の、タンパク質媒介性よりむしろヌクレオチド媒介性の配列特異性により、送達機構を大幅に変更することなく治療薬を迅速に作成することが可能となる。

これを達成するため、本出願人は、有効範囲及び有効性を最大化するためのＨＩＶ−１株変異体を考慮しながら大多数のＨＩＶ−１ゲノムを標的とするＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓガイドＲＮＡを作成する。ＨＩＶ−１サブタイプと変異体との間のゲノム保存の配列解析から、介在するウイルス配列を欠失させるか又はウイルスの遺伝子機能を破壊し得るフレームシフト突然変異を導入することを目的としたゲノムの隣接保存領域のターゲティングが可能になるはずである。

本出願人は、従来どおり宿主免疫系のアデノウイルス又はレンチウイルス媒介性感染によるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の送達を達成する。手法に応じて、宿主免疫細胞は、ａ）単離され、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓが形質導入され、選択され、及び宿主に再導入されてもよく、又はｂ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の全身送達によりｉｎ ｖｉｖｏで形質導入されてもよい。第１の手法は、抵抗性免疫集団の作成を可能にする一方、第２の手法は宿主内の潜伏ウイルスリザーバを標的にする傾向が強い。

実施例２０：嚢胞性線維症におけるΔＦ５０８又は他の突然変異の標的補修
本発明の態様は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ遺伝子治療粒子と生体適合性医薬担体とを含み得る医薬組成物を提供する。別の態様によれば、ＣＦＴＲ遺伝子に突然変異を有する対象を治療するための遺伝子治療方法は、対象の細胞に治療有効量のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ遺伝子治療粒子を投与することを含む。

本実施例は、嚢胞性線維症又は嚢胞性線維症関連症状に罹患した、必要性がある対象又は患者の気道における、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を使用したＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の遺伝子導入又は遺伝子送達を実証する。

研究設計：必要性がある対象又は患者：関連するヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ及び他の家畜。この研究は、ＡＡＶベクターによるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の遺伝子導入の有効性を試験する。本出願人は、遺伝子発現に十分な導入遺伝子レベルを決定し、Ｃａｓ９酵素を含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を利用してΔＦ５０８又は他のＣＦＴＲ誘導突然変異をターゲティングする。

治療対象は、自発呼吸下に各肺につき薬学的に有効な量のエアロゾル化したＡＡＶベクター系の気管支内送達を受ける。対照対象は、内在性の対照遺伝子を含む同量の偽型ＡＡＶベクター系の投与を受ける。ベクター系は、薬学的に許容可能な又は生体適合性の医薬担体と共に送達され得る。ベクター投与後３週間又は適切なインターバルを置いて、嚢胞性線維症関連症状の改善に関して治療対象を調べる。

本出願人は、アデノウイルス又はＡＡＶ粒子を使用する。

本出願人は、各々が１つ以上の調節配列（Ｃａｓ９用のＣｂｈ又はＥＦ１ａプロモーター、キメラガイドＲＮＡ用のＵ６又はＨ１プロモーター）に機能的に連結している以下の遺伝子構築物を、１つ以上のアデノウイルス又はＡＡＶベクター又は任意の他の適合性ベクターにクローニングする：ＣＦＴＲΔ５０８ターゲティングキメラガイドＲＮＡ（図２７Ｂ）、ΔＦ５０８突然変異の修復鋳型（図２７Ｃ）及び場合により１つ以上の核局在化シグナル又は配列（ＮＬＳ）、例えば２つのＮＬＳを有するコドン最適化Ｃａｓ９酵素。

Ｃａｓ９標的部位の同定
本出願人はヒトＣＦＴＲゲノム遺伝子座を解析し、Ｃａｓ９標的部位を同定した（図２７Ａ）。（ＰＡＭはＮＧＧ又はＮＮＡＧＡＡＷモチーフを含み得る）。

遺伝子修復戦略
本出願人は、Ｃａｓ９（又はＣａｓ９ニッカーゼ）及びガイドＲＮＡを含むアデノウイルス／ＡＡＶベクター系を、Ｆ５０８残基を含有する相同性修復鋳型を含むアデノウイルス／ＡＡＶベクター系と共に対象に、先に考察した送達方法の１つによって導入する。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系はＣＦＴＲΔ５０８キメラガイドＲＮＡによりガイドされ、ニッキング又は切断されるＣＦＴＲゲノム遺伝子座の特定の部位を標的にする。切断後、嚢胞性線維症をもたらし又は嚢胞性線維症関連症状を引き起こす欠失を補修する相同組換えによって切断部位に修復鋳型が挿入される。適切なガイドＲＮＡでＣＲＩＳＰＲ系を直接送達し、その全身性の導入を提供するこの戦略を用いて遺伝子突然変異をターゲティングし、表Ｂにあるような代謝、肝臓、腎臓及びタンパク質の疾患及び障害を引き起こす遺伝子を編集又は他の方法で操作することができる。

実施例２１：種々の疾患型をターゲティングするためのＣａｓ９の使用
タンパク質コード配列の突然変異が関与する疾患：
優性障害は、ドミナントネガティブアレルを不活性化することによりターゲティングされ得る。本出願人は、Ｃａｓ９を使用してドミナントネガティブアレルにおけるユニーク配列をターゲティングし、ＮＨＥＪによって突然変異を導入する。ＮＨＥＪによって誘導されるインデルは、ドミナントネガティブアレルにフレームシフト突然変異を導入してドミナントネガティブタンパク質を除去することが可能であり得る。これは遺伝子がハプロ不全でない（ｈａｐｌｏ−ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ）場合に機能し得る（例えばＭＹＯＣ突然変異によって生じる緑内障及びハンチントン病）。

劣性遺伝疾患は、両方のアレルで疾患突然変異を修復することによりターゲティングされ得る。分裂細胞について、本出願人はＣａｓ９を使用して突然変異部位の近傍に二本鎖切断を導入し、外来性組換え鋳型を使用して相同組換え速度を増加させる。分裂細胞について、これは多重ニッカーゼ活性を用いて達成されてもよく、それにより、相補的なオーバーハングを有する外来性ＤＮＡ断片のＮＨＥＪ媒介性ライゲーションによる両方のアレルの突然変異配列の置換が触媒される。

本出願人はまた、Ｃａｓ９を使用して保護突然変異も導入する（例えばＨＩＶ感染を防ぐためのＣＣＲ５の不活性化、コレステロールを減少させるためのＰＣＳＫ９の不活性化、又はアルツハイマー病の可能性を低下させるＡＰＰへのＡ６７３Ｔの導入）。

非コード配列が関与する疾患
本出願人は、Ｃａｓ９を使用してプロモーター領域の非コード配列を破壊し、転写因子結合部位を変化させ、及びエンハンサー又はリプレッサーエレメントを変化させる。例えば、Ｃａｓ９を使用して造血幹細胞のＫｌｆ１エンハンサーＥＨＳ１を切り出すことにより、ＢＣＬ１１ａレベルを低下させ、分化した赤血球における胎児グロビン遺伝子発現を再活性化し得る。

本出願人はまた、Ｃａｓ９を使用して５’又は３’非翻訳領域の機能性モチーフを破壊する。例えば、筋強直性ジストロフィーの治療のため、Ｃａｓ９を使用してＤＭＰＫ遺伝子のＣＴＧリピート伸長を除去し得る。

実施例２２：多重化ニッカーゼ
本出願に詳説されるＣａｓ９の最適化の態様及び教示を使用してＣａｓ９ニッカーゼもまた作成し得る。本出願人は、Ｃａｓ９ニッカーゼをガイドＲＮＡのペアと組み合わせて使用して、規定のオーバーハングを有するＤＮＡ二本鎖切断を作成する。ガイドＲＮＡの２つのペアが使用されるとき、介在するＤＮＡ断片を切り出すことが可能である。２つのガイドＲＮＡペアで外来性ＤＮＡ断片を切断することによってゲノムＤＮＡと適合性のオーバーハングを作成する場合、外来性ＤＮＡ断片をゲノムＤＮＡにライゲートして切り出された断片を置き換え得る。例えば、これを用いてハンチンチン（ｈｕｎｔｉｎｔｉｎ）（ＨＴＴ）遺伝子のトリヌクレオチドリピート伸長を除去し、ハンチントン病を治療し得る。

より少数のＣＡＧリピートを有する外来性ＤＮＡが提供される場合、同じオーバーハングを有するＤＮＡ断片を作成することが可能であり得ると共に、ＨＴＴゲノム遺伝子座にライゲートして、切り出された断片を置き換えることができる。

ゲノムへの外来性ＤＮＡ断片のライゲーションに相同組換え機構は必須ではなく、従ってこの方法はニューロンなどの分裂終了細胞で用いられてもよい。

実施例２３：ＣＲＩＳＰＲ系の送達
本発明の態様は、１つ以上のナノ粒子複合体によるＣＲＩＳＰＲ複合体の送達、又は少なくとも１つのナノ粒子複合体によるＣＲＩＳＰＲ複合体の少なくとも１つの構成成分、例えばそのＲＮＡの送達であるが、例えば、Ｃａｓ９を送達する、又はそれを発現させるために、この系のナノ粒子送達と併せて他の送達系を使用することもできる。Ｃａｓ９及びそのキメラガイドＲＮＡ、又はｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡとの組み合わせは、ＤＮＡとしても、或いはＲＮＡとしても送達することができる。Ｃａｓ９及びガイドＲＮＡを両方ともにＲＮＡ（普通の又は塩基若しくは骨格改変を含む）分子として送達することを用いて、Ｃａｓ９タンパク質が細胞内に留まる時間を低減することができる。これにより標的細胞におけるオフターゲット切断活性のレベルが低下し得る。ｍＲＮＡとしてのＣａｓ９の送達はタンパク質に翻訳されるまでに時間がかかるため、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡを送達した数時間後にガイドＲＮＡを送達して、Ｃａｓ９タンパク質との相互作用に利用可能なガイドＲＮＡのレベルを最大化することが有利であり得る。

ガイドＲＮＡの量が限られている状況では、Ｃａｓ９をｍＲＮＡとして導入し、かつガイドＲＮＡを、ガイドＲＮＡの発現を駆動するプロモーターを含むＤＮＡ発現カセットの形態で導入することが望ましい場合もある。このようにして利用可能なガイドＲＮＡの量を転写によって増幅し得る。

Ｃａｓ９（ＤＮＡ又はＲＮＡ）及びガイドＲＮＡ（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を宿主細胞に導入するため種々の送達系を導入することができる。これには、リポソーム、ウイルスベクター、エレクトロポレーション、ナノ粒子、ナノワイヤ（Ｓｈａｌｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２０１２）、エキソソームの使用が含まれる。分子トロイの木馬リポソーム（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｒｏｔｏｃ；２０１０；ｄｏｉ：１０．１１０１／ｐｄｂ．ｐｒｏｔ５４０７）を使用して、Ｃａｓ９及びガイドＲＮＡを血液脳関門を越えて送達してもよい。

実施例２４：迅速多重ゲノム編集用のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ
本発明の態様は、標的設計後３〜４日以内に遺伝子改変の効率及び特異性を試験することができ、かつ２〜３週間以内に改変されたクローン細胞株を得ることができるプロトコル及び方法に関する。

プログラム可能なヌクレアーゼは、ゲノムエンジニアリングを高精度で媒介するのに強力な技術である。微生物ＣＲＩＳＰＲ適応免疫系由来のＲＮＡガイドＣａｓ９ヌクレアーゼを使用して、単純にそのガイドＲＮＡにおいて２０ｎｔターゲティング配列を指定することにより真核細胞における効率的なゲノム編集を促進することができる。本出願人は、哺乳類細胞における効率的なゲノム編集を促進し、かつ下流機能性研究用の細胞株を作成するためＣａｓ９を応用する一組のプロトコルを記載する。標的設計から始めて３〜４日以内に効率的かつ特異的な遺伝子改変を達成することができ、かつ２〜３週間以内に改変されたクローン細胞株を得ることができる。

生体系及び生物をエンジニアリングする能力は、基礎科学、医薬、及びバイオテクノロジー全域にわたる非常に大きな適用可能性を有している。ここで、内在性ゲノム遺伝子座の正確な編集を促進するプログラム可能な配列特異的エンドヌクレアーゼが、これまで遺伝学的に扱い易くなかったものを含め、広範囲の種における遺伝的エレメント及び原因遺伝子変異の体系的調査を可能にする。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びＲＮＡガイドＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓヌクレアーゼシステムを含め、いくつかのゲノム編集技術が近年出現している。最初の２つの技術は、エンドヌクレアーゼ触媒ドメインをモジュール式ＤＮＡ結合タンパク質にテザー係留して、特定のゲノム遺伝子座に標的ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導するという共通した戦略を用いる。対照的に、Ｃａｓ９は、標的ＤＮＡとのワトソン・クリック型塩基対合を介して小さいＲＮＡにガイドされるヌクレアーゼであり、設計が容易で効率的な、かつ種々の細胞型及び生物のハイスループットの多重化した遺伝子編集に良く適したシステムを呈する。ここで本出願人は、最近開発されたＣａｓ９ヌクレアーゼを応用して哺乳類細胞における効率的なゲノム編集を促進し、かつ下流機能性研究用の細胞株を作成する一組のプロトコルを記載する。

ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮと同様に、Ｃａｓ９は標的ゲノム遺伝子座におけるＤＳＢを刺激することによりゲノム編集を促進する。Ｃａｓ９によって切断されると、標的遺伝子座は２つの主要なＤＮＡ損傷修復経路であるエラープローン非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路又は高忠実性相同組換え修復（ＨＤＲ）経路のうちの一方を経る。いずれの経路を利用しても所望の編集結果を達成し得る。

ＮＨＥＪ：修復鋳型が存在しない場合、ＮＨＥＪプロセスはＤＳＢを再びライゲートし直し、これによりインデル突然変異の形態の傷跡が残り得る。コードエクソン内に現れるインデルはフレームシフト突然変異及び未成熟終止コドンをもたらし得るため、このプロセスを利用して遺伝子ノックアウトを達成することができる。ゲノムにおいて大きい欠失を媒介するため複数のＤＳＢも利用し得る。

ＨＤＲ：相同組換え修復は、ＮＨＥＪの代替となる主要なＤＮＡ修復経路である。ＨＤＲは典型的にはＮＨＥＪと比べて起こる頻度が低いが、ＨＤＲを利用すると、外因的に導入された修復鋳型の存在下で標的遺伝子座に正確な定義付けられた改変を作成し得る。修復鋳型は、二本鎖ＤＮＡの形態であって、挿入配列に隣接する相同性アームを含む従来のＤＮＡターゲティング構築物と同様に設計されてもよく、或いは一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）の形態であってもよい。後者は、原因遺伝子変異を探索するための単一のヌクレオチド突然変異の導入など、ゲノムに小さい編集を作製するための有効かつ単純な方法を提供する。ＮＨＥＪと異なり、ＨＤＲは概して分裂細胞においてのみ活性であり、その効率は細胞型及び細胞状態に応じて変化する。

ＣＲＩＳＰＲの概要：ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、対照的に、Ｃａｓ９ヌクレアーゼと低分子ガイドＲＮＡとからなる最小でも二成分系である。Ｃａｓ９を異なる遺伝子座にターゲティングし直し、又は複数の遺伝子を同時に編集するために必要なことは、単純に、異なる２０ｂｐオリゴヌクレオチドのクローニングである。Ｃａｓ９ヌクレアーゼの特異性は未だ完全には解明されていないが、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の単純なワトソン・クリック型塩基対合はＺＦＮ又はＴＡＬＥＮドメインのそれより予測可能性が高いように思われる。

ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ（クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復）は、Ｃａｓ９を使用して外来性遺伝子エレメントを切断する細菌適応免疫系である。Ｃａｓ９は、可変的ｃｒＲＮＡと必須の補助的ｔｒａｃｒＲＮＡとの非コードＲＮＡのペアによりガイドされる。ｃｒＲＮＡは、ワトソン・クリック型塩基対合で標的ＤＮＡの位置を特定することにより特異性を決定する２０ｎｔガイド配列を含む。天然の細菌系では複数のｃｒＲＮＡが共転写され、Ｃａｓ９を種々の標的に向けさせる。化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系では、標的ＤＮＡが５’−ＮＧＧ／ＮＲＧプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）（他のＣＲＩＳＰＲ系については異なり得る）の直前になければならない。

ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓは、哺乳類細胞ではヒトコドン最適化Ｃａｓ９及び必須のＲＮＡ構成成分の異種発現により再構成される。さらに、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとを融合してキメラの合成ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を作り出すことができる。このように、ｓｇＲＮＡ内の２０ｎｔガイド配列を変えることにより、目的とするいかなる標的にもＣａｓ９を仕向け直すことができる。

その実現の容易さ及び多重化可能性を所与として、Ｃａｓ９は、ＮＨＥＪ及びＨＤＲの両方による特定の突然変異を担持するエンジニアリングされた真核細胞の作成に用いられてきた。加えて、ｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９をコードするｍＲＮＡの胚への直接注入が、複数の改変アレルを有するトランスジェニックマウスの迅速な作成を可能にしている；これらの結果は、本来遺伝的に扱いが困難な生物の編集に有望である。

その触媒ドメインの１つに破壊を有する突然変異体Ｃａｓ９が、ＤＮＡを切断するというよりむしろそれにニックを入れるようにエンジニアリングされており、一本鎖切断及びＨＤＲによる優先的修復が可能となって、オフターゲットＤＳＢによる望ましくないインデル突然変異が潜在的に改良されている。加えて、突然変異したＤＮＡ切断触媒残基を両方ともに有するＣａｓ９突然変異体が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における転写調節を可能にするように適合されており、多様な適用に合わせてＣａｓ９を機能性にし得る可能性を実証している。本発明の特定の態様は、ヒト細胞の多重編集用Ｃａｓ９の構築及び適用に関する。

本出願人は、真核生物遺伝子編集を促進するため核局在化配列が隣接するヒトコドン最適化Ｃａｓ９を提供している。本出願人は、２０ｎｔガイド配列を設計するに当たっての考慮点、ｓｇＲＮＡの迅速な構築及び機能検証プロトコル、及び最後に、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを使用したヒト胎児腎臓系（ＨＥＫ−２９３ＦＴ）及びヒト幹細胞株（ＨＵＥＳ９）におけるＮＨＥＪベース及びＨＤＲベースの両方のゲノム改変の媒介を記載する。このプロトコルは他の細胞型及び生物にも同様に適用することができる。

ｓｇＲＮＡの標的選択：遺伝子ターゲティング用の２０ｎｔガイド配列の選択には、２つの主な考慮点がある：１）化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９については標的配列が５’−ＮＧＧ ＰＡＭの前になければならず、及び２）ガイド配列はオフターゲット活性を最小限に抑えるように選択されなければならない。本出願人は、目的の入力配列を取り込み好適な標的部位を同定するオンラインＣａｓ９ターゲティング設計ツールを提供した。各ｓｇＲＮＡについてオフターゲット改変を実験的に評価するため、本出願人はまた、塩基対合ミスマッチの同一性、位置、及び分布の効果に関する本出願人の定量的特異性分析に従い順位が付けられた、意図する各標的についての計算的に予測されたオフターゲット部位も提供する。

計算的に予測されたオフターゲット部位に関する詳細情報は以下のとおりである：
オフターゲット切断活性の考慮点：他のヌクレアーゼと同様に、Ｃａｓ９は低い頻度でゲノムにおけるオフターゲットＤＮＡ標的を切断し得る。所与のガイド配列がオフターゲット活性を呈する程度は、酵素濃度、用いられる特定のガイド配列の熱力学、及び標的ゲノムにおける同様の配列の存在量を含めた複合的な要因に依存する。Ｃａｓ９の常法の適用については、オフターゲット切断の程度を最小限に抑えると共に、オフターゲット切断の存在を検出可能である方法を考慮することが重要である。

オフターゲット活性の最小化：細胞株における適用について、本出願人は、以下の２ステップでオフターゲットゲノム改変の程度を低下させることを推奨する。第１に、本発明者らのオンラインＣＲＩＳＰＲ標的選択ツールを使用して、所与のガイド配列がオフターゲット部位を有する可能性を計算的に評価することが可能である。このような分析は、ガイド配列と同様の配列であるオフターゲット配列に関してゲノムを網羅的に検索することにより実施される。ｓｇＲＮＡとその標的ＤＮＡとの間のミスマッチ塩基の効果の包括的な実験研究から、ミスマッチの許容範囲は、１）位置依存性−ガイド配列の３’末端側８〜１４ｂｐは、５’塩基と比べてミスマッチに対する許容度が低い、２）数量依存性−一般に３個より多いミスマッチは許容されない、３）ガイド配列依存性−一部のガイド配列は他と比べてミスマッチに対する許容度が低い、及び４）濃度依存性−オフターゲット切断はトランスフェクトされたＤＮＡの量に対する感度が極めて高いことが明らかになった。本出願人の標的部位分析ウェブツール（ウェブサイトｇｅｎｏｍｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓで利用可能）は、これらの基準を統合し、標的ゲノムにおける推定オフターゲット部位の予測を提供する。第２に、本出願人は、Ｃａｓ９及びｓｇＲＮＡ発現プラスミドの量を滴定してオフターゲット活性を最小限に抑えることを推奨する。

オフターゲット活性の検出：本出願人のＣＲＩＳＰＲターゲティングウェブツールを使用して、最も可能性の高いオフターゲット部位並びにそれらの部位のＳＵＲＶＥＹＯＲ又はシークエンシング分析を実施するプライマーのリストを作成することが可能である。Ｃａｓ９を使用して作成されるアイソジェニッククローンについて、本出願人は、これらの候補オフターゲット部位のシークエンシングにより任意の望ましくない突然変異を調べることを強く推奨する。予測された候補リストに含まれない部位にオフターゲット改変があり得ることは注記に値し、完全なゲノム配列を実施してオフターゲット部位がないことを完全に確かめるべきである。さらに、同じゲノム内にいくつかのＤＳＢが誘導される多重アッセイでは、低率の転座イベントがあり得、ディープシークエンシングなどの種々の技法を用いて評価され得る。

本オンラインツールは、１）ｓｇＲＮＡ構築物の調製、２）標的改変効率のアッセイ、及び３）潜在的なオフターゲット部位における切断の評価に必要なあらゆるオリゴ及びプライマーの配列を提供する。ｓｇＲＮＡの発現に使用されるＵ６ ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、その転写物の最初の塩基としてグアニン（Ｇ）ヌクレオチドを好むため、２０ｎｔガイド配列がＧから始まらないｓｇＲＮＡの５’に追加のＧが付加されることは注記に値する。

ｓｇＲＮＡの構築及び送達手法：所望の適用に応じて、ｓｇＲＮＡは、１）発現カセットを含有するＰＣＲアンプリコン、又は２）ｓｇＲＮＡ発現プラスミドのいずれかとして送達され得る。ＰＣＲベースのｓｇＲＮＡ送達は、Ｕ６プロモーター鋳型の増幅に使用されるリバースＰＣＲプライマーにカスタムのｓｇＲＮＡ配列を付加する。得られるアンプリコンが、Ｃａｓ９含有プラスミド（ＰＸ１６５）とコトランスフェクトされ得る。この方法は、ｓｇＲＮＡコードプライマーを得て僅か数時間後に機能性試験用の細胞トランスフェクションを実施することができるため、複数の候補ｓｇＲＮＡの迅速スクリーニングに最適である。この単純な方法ではプラスミドベースのクローニング及び配列検証が不要となるため、大規模なノックアウトライブラリの作成又は他のスケールに影響される適用のため多数のｓｇＲＮＡを試験し又はコトランスフェクトすることに良く適している。プラスミドベースのｓｇＲＮＡ送達に必要な約２０ｂｐオリゴと比較して、ｓｇＲＮＡコードプライマーが１００ｂｐを超える点は留意すべきである。

ｓｇＲＮＡ用の発現プラスミドの構築もまた単純かつ高速であり、部分的に相補的なオリゴヌクレオチドのペアによる単一のクローニングことを含む。オリゴペアのアニーリング後、得られるガイド配列が、Ｃａｓ９及びｓｇＲＮＡ配列の残り部分を有する不変の足場の両方を有するプラスミド（ＰＸ３３０）に挿入され得る。トランスフェクションプラスミドもまた、ｉｎ ｖｉｖｏ送達用のウイルス産生を可能にするように改変され得る。

ＰＣＲ及びプラスミドベースの送達に加え、Ｃａｓ９及びｓｇＲＮＡの両方をＲＮＡとして細胞に導入することができる。

修復鋳型の設計：従来、標的ＤＮＡ改変は、変化させる部位に隣接する相同性アームを含むプラスミドベースのドナー修復鋳型を使用する必要があった。両側の相同性アームの長さは様々であってもよいが、典型的には５００ｂｐより長い。この方法を使用して、蛍光タンパク質又は抗生物質耐性マーカーなどのレポーター遺伝子の挿入を含む大きい改変を作成することができる。ターゲティングプラスミドの設計及び構築は、他の部分に記載されている。

最近になって、クローニングを含まない定義付けられた遺伝子座の範囲内の短い改変には、ターゲティングプラスミドの代わりに一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）が使用されている。高いＨＤＲ効率を達成するため、ｓｓＯＤＮは標的領域と相同の少なくとも４０ｂｐの隣接配列を両側に含み、標的遺伝子座に対してセンス方向にも、又はアンチセンス方向にも向くことができる。

機能性試験
ＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼアッセイ：本出願人は、ＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼアッセイ（又はＰＣＲアンプリコンシークエンシングのいずれかによりインデル突然変異を検出した。本出願人のオンラインＣＲＩＳＰＲ標的設計ツールは、両方の手法に推奨されるプライマーを提供する。しかしながら、ＳＵＲＶＥＹＯＲ又はシークエンシングプライマーはまた、ゲノムＤＮＡから目的の領域を増幅し、かつ非特異的なアンプリコンを回避するようにＮＣＢＩプライマーＢｌａｓｔを使用して手動で設計されてもよい。ＳＵＲＶＥＹＯＲプライマーは、ゲル電気泳動による切断バンドの明確な可視化を可能にするため、Ｃａｓ９標的の両側で３００〜４００ｂｐ（６００〜８００ｂｐの総アンプリコンに対して）を増幅するように設計されなければならない。過剰なプライマー二量体形成を防ぐため、ＳＵＲＶＥＹＯＲプライマーは、典型的には融解温度が約６０℃の２５ｎｔ長未満であるように設計されなければならない。本出願人は、特定のＰＣＲアンプリコンに対する候補プライマーの各ペアを試験し、並びにＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼ消化プロセスの間に非特異的な切断が存在しないことについても試験することを推奨する。

プラスミド媒介性又はｓｓＯＤＮ媒介性ＨＤＲ：ＨＤＲは改変領域のＰＣＲ増幅及びシークエンシングにより検出することができる。この目的上、ＰＣＲプライマーは、残存する修復鋳型（ＨＤＲ Ｆｗｄ及びＲｅｖ、図２６）の誤検出を回避するため相同性アームが広がる領域の外側にアニールしなければならない。ｓｓＯＤＮ媒介性ＨＤＲはＳＵＲＶＥＹＯＲ ＰＣＲプライマーを使用することができる。

シークエンシングによるインデル又はＨＤＲの検出：本出願人は、Ｓａｎｇｅｒ法又は次世代ディープシークエンシング（ＮＧＳ）のいずれかにより標的ゲノム改変を検出した。前者については、ＳＵＲＶＥＹＯＲプライマー又はＨＤＲプライマーのいずれかを使用して改変領域からゲノムＤＮＡを増幅することができる。アンプリコンは、形質転換のためｐＵＣ１９などのプラスミドにサブクローニングしなければならない；個々のコロニーをシークエンシングすることによりクローン遺伝子型を明らかにすることができる。

本出願人は、より短いアンプリコン用の次世代シークエンシング（ＮＧＳ）プライマーを、典型的には１００〜２００ｂｐのサイズ範囲で設計した。ＮＨＥＪ突然変異の検出には、より長いインデルの検出が可能であるように、プライミング領域とＣａｓ９標的部位との間が少なくとも１０〜２０ｂｐのプライマーを設計することが重要である。本出願人は、多重ディープシークエンシング用のバーコード付きアダプターを取り付ける二段階ＰＣＲ法に関する指針を提供する。本出願人は、偽陽性インデルレベルが全般的に低いことから、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォームを推奨する。次に、ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ、又は単純な配列解析スクリプトなどのリードアラインメントプログラムを用いてオフターゲット分析（先述した）を実施することができる。

材料及び試薬
ｓｇＲＮＡ調製：
超高純度ＤＮアーゼＲＮａｓｅ不含蒸留水（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１０９７７−０２３）
Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ融合ポリメラーゼ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号６００６７９）
重要。標準Ｔａｑポリメラーゼ、これは３’−５’エキソヌクレアーゼ校正活性を欠いており、忠実性が低く、増幅エラーをもたらし得る。Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩは高忠実性ポリメラーゼ（Ｐｆｕと同等の忠実性）であり、最小限の最適化で高収率のＰＣＲ産物を生じる。他の高忠実性ポリメラーゼに代えてもよい。
Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ反応緩衝液（５×；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ポリメラーゼと同梱）
ｄＮＴＰ溶液ミックス（各２５ｍＭ；Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ、カタログ番号Ｎ２０５Ｌ）
ＭｇＣｌ２（２５ｍＭ；ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｒ０９７１）
ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２８７０４）
ＱＩＡｐｒｅｐ ｓｐｉｎミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２７１０６）
超高純度ＴＢＥ緩衝液（１０×；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１５５８１−０２８）
ＳｅａＫｅｍ ＬＥアガロース（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号５０００４）
ＳＹＢＲ Ｓａｆｅ ＤＮＡ染色（１０，０００×；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ｓ３３１０２）
１ｋｂ Ｐｌｕｓ ＤＮＡラダー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１０７８７−０１８）
ＴｒａｃｋＩｔ ＣｙａｎＯｒａｎｇｅローディング緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１０４８２−０２８）
ＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ ＢｂｓＩ（ＢｐｉＩ）（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ／ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＦＤ１０１４）
Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ Ｔａｎｇｏ緩衝液（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ／ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＢＹ５）
ＤＬ−ジチオスレイトール（ＤＴＴ；Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ／ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｒ０８６２）
Ｔ７ ＤＮＡリガーゼ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ、カタログ番号Ｌ６０２Ｌ）
重要：より一般的に用いられるＴ４リガーゼを代用しないこと。Ｔ７リガーゼは付着末端で平滑末端と比べて１，０００倍高い活性を有し、かつ市販の高濃度Ｔ４リガーゼと比べて全体的な活性が高い。
Ｔ７ ２×迅速ライゲーション緩衝液（Ｔ７ ＤＮＡリガーゼと同梱、Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ、カタログ番号Ｌ６０２Ｌ）
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号Ｍ０２０１Ｓ）
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ反応緩衝液（１０×；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号Ｂ０２０２Ｓ）
アデノシン５’−三リン酸（１０ｍＭ；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号Ｐ０７５６Ｓ）
ＰｌａｓｍｉｄＳａｆｅ ＡＴＰ依存性ＤＮアーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、カタログ番号Ｅ３１０１Ｋ）
Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ Ｓｔｂｌ３化学的コンピテント大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ｃ７３７３−０３）
ＳＯＣ培地（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号Ｂ９０２０Ｓ）
ＬＢ培地（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｌ３０２２）
ＬＢ寒天培地（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｌ２８９７）
アンピシリン、滅菌ろ過済み（１００ｍｇ ｍｌ−１；Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ５３５４）

哺乳類細胞培養：
ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ｒ７００−０７）
ダルベッコ最小イーグル培地（ＤＭＥＭ、１×、高グルコース；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１０３１３−０３９）
ダルベッコ最小イーグル培地（ＤＭＥＭ、１×、高グルコース、フェノールレッド不含；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号３１０５３−０２８）
ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ、１×；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１４１９０−２５０）
ウシ胎仔血清、適格品（ｑｕａｌｉｆｉｅｄ）かつ熱失活済み（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１０４３８−０３４）
Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ低血清培地（ＦＢＳ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１１０５８−０２１）
ペニシリン−ストレプトマイシン（１００×；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１５１４０−１６３）
ＴｒｙｐＬＥ^ＴＭＥｘｐｒｅｓｓ（１×、フェノールレッド不含；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１２６０４−０１３）
リポフェクタミン２０００トランスフェクション試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１１６６８０２７）
Ａｍａｘａ ＳＦ細胞株４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）ＸキットＳ（３２ ＲＣＴ；Ｌｏｎｚａ、カタログ番号Ｖ４ＸＣ−２０３２）
ＨＵＥＳ ９細胞株（ＨＡＲＶＡＲＤ ＳＴＥＭ ＣＥＬＬ ＳＣＩＥＮＣＥ）
Ｇｅｌｔｒｅｘ ＬＤＥＶ不含低成長因子基底膜マトリックス（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ａ１４１３２０１）
ｍＴｅＳＲ１培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号０５８５０）
Ａｃｃｕｔａｓｅ細胞剥離液（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号０７９２０）
ＲＯＣＫ阻害薬（Ｙ−２７６３２；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＳＣＭ０７５）
Ａｍａｘａ Ｐ３初代細胞４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）ＸキットＳ（３２ ＲＣＴ；Ｌｏｎｚａカタログ番号Ｖ４ＸＰ−３０３２）

遺伝子型解析：
ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ ＤＮＡ抽出溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、カタログ番号ＱＥ０９０５０）
ＳＵＲＶＥＹＯＲ、ＲＦＬＰ分析、又はシークエンシング用のＰＣＲプライマー（プライマー表参照）
Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ融合ポリメラーゼ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号６００６７９）
重要。Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイは一塩基ミスマッチの感度を有するため、高忠実性ポリメラーゼを使用することが特に重要である。他の高忠実性ポリメラーゼに代えてもよい。
Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ反応緩衝液（５×；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ポリメラーゼと同梱）
ｄＮＴＰ溶液ミックス（各２５ｍＭ；Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ、カタログ番号Ｎ２０５Ｌ）
ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２８７０４）
Ｔａｑ緩衝液（１０×；Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、カタログ番号Ｂ０００５）
標準ゲル電気泳動用のＳＵＲＶＥＹＯＲ突然変異検出キット（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ、カタログ番号７０６０２５）
超高純度ＴＢＥ緩衝液（１０×；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１５５８１−０２８）
ＳｅａＫｅｍ ＬＥアガロース（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号５０００４）
４〜２０％ＴＢＥゲル １．０ｍｍ、１５ウェル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＥＣ６２２５５ＢＯＸ）
Ｎｏｖｅｘ（登録商標）高密度ＴＢＥサンプル緩衝液（５×；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＬＣ６６７８）
ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ核酸ゲル染色（１０，０００×；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ｓ−１１４９４）
１ｋｂ Ｐｌｕｓ ＤＮＡラダー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１０７８７−０１８）
ＴｒａｃｋＩｔ ＣｙａｎＯｒａｎｇｅローディング緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１０４８２−０２８）
ＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ／ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＦＤ０５０４）

機器
フィルター付き滅菌ピペットチップ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）
標準１．５ｍｌ微量遠心管（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、カタログ番号００３０ １２５．１５０）
Ａｘｙｇｅｎ９６ウェルＰＣＲプレート（ＶＷＲ、カタログ番号ＰＣＲ−９６Ｍ２−ＨＳＣ）
Ａｘｙｇｅｎ ８ストリップＰＣＲチューブ（Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１４−２２２−２５０）
Ｆａｌｃｏｎチューブ、ポリプロピレン、１５ｍｌ（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ、カタログ番号３５２０９７）
Ｆａｌｃｏｎチューブ、ポリプロピレン、５０ｍｌ（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ、カタログ番号３５２０７０）
細胞ストレーナーキャップ付き丸底チューブ、５ｍｌ（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ、カタログ番号３５２２３５）
ペトリ皿（６０ｍｍ×１５ｍｍ；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号３５１００７）
組織培養プレート（２４ウェル；ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ、カタログ番号３５３０４７）
組織培養プレート（９６ウェル、平底；ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ、カタログ番号３５３０７５）
組織培養皿（１００ｍｍ；ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ、３５３００３）
プログラム可能な温度ステッピング機能付き９６ウェルサーモサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｖｅｒｉｔｉ、カタログ番号４３７５７８６）。
卓上微量遠心機５４２４、５８０４（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）
ゲル電気泳動システム（ＰｏｗｅｒＰａｃ ｂａｓｉｃ ｐｏｗｅｒ ｓｕｐｐｌｙ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カタログ番号１６４−５０５０、及びＳｕｂ−Ｃｅｌｌ ＧＴシステムゲルトレー、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カタログ番号１７０−４４０１）
Ｎｏｖｅｘ ＸＣｅｌｌ ＳｕｒｅＬｏｃｋ Ｍｉｎｉ−Ｃｅｌｌ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＥＩ０００１）
デジタルゲルイメージングシステム（ＧｅｌＤｏｃ ＥＺ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カタログ番号１７０−８２７０、及び青色サンプルトレー、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カタログ番号１７０−８２７３）
青色光トランスイルミネーター及びオレンジフィルターゴーグル（ＳａｆｅＩｍａｇｅｒ ２．０；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｇ６６００）
ゲル定量化ソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＩｍａｇｅＬａｂ、ＧｅｌＤｏｃ ＥＺと同梱、又は国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）のオープンソースＩｍａｇｅＪ、ウェブサイトｒｓｂｗｅｂ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／で利用可能）
紫外分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００ｃ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）

試薬セットアップ
トリス−ホウ酸ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）電気泳動溶液 ＴＢＥ緩衝液を蒸留水に希釈し、アガロースゲルをキャスティングするため及びゲル電気泳動用緩衝液として使用するための１×ワーキング溶液とする。緩衝液は室温（１８〜２２℃）で少なくとも１年間保存しておくことができる。

・ ＡＴＰ、１０ｍＭ １０ｍＭ ＡＴＰを５０μｌアリコートに分け、−２０℃で最長１年間保存する；凍結−融解サイクルを繰り返すことは避ける。

・ ＤＴＴ、１０ｍＭ 蒸留水中に１０ｍＭ ＤＴＴ溶液を調製し、２０μｌアリコートとして−７０℃で最長２年間保存する；ＤＴＴは酸化し易いため、反応毎に新しいアリコートを使用する。

・ Ｄ１０培養培地 ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を培養するため、ＤＭＥＭに１× ＧｌｕｔａＭＡＸ及び１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ウシ胎仔血清を補給することによりＤ１０培養培地を調製する。プロトコルに示すとおり、この培地はまた１×ペニシリン−ストレプトマイシンを補給してもよい。Ｄ１０培地は前もって作製しておき、４℃で最長１ヶ月間保存することができる。

・ ｍＴｅＳＲ１培養培地 ヒト胚性幹細胞の培養のため、５×サプリメント（ｍＴｅＳＲ１基本培地と同梱）、及び１００ｕｇ／ｍｌ Ｎｏｒｍｏｃｉｎを補給してｍＴｅＳＲ１培地を調製する。

手順
ターゲティング構成成分の設計及びオンラインツールの使用・タイミング１日
１｜標的ゲノムＤＮＡ配列を入力する。本出願人は、目的の入力配列を受け取り、好適な標的部位を同定してそれに順位を付け、及び意図する標的毎にオフターゲット部位を計算的に予測するオンラインＣａｓ９ターゲティング設計ツールを提供する。或いは、任意の５’−ＮＧＧの直ちに上流で２０ｂｐ配列を同定することにより、ガイド配列を手動で選択してもよい。

２｜オンラインツールによって特定されるとおりの必要なオリゴ及びプライマーを注文する。部位を手動で選択する場合、オリゴ及びプライマーを設計しなければならない。

ｓｇＲＮＡ発現構築物の調製
３｜ｓｇＲＮＡ発現構築物を作成するため、ＰＣＲベース又はプラスミドベースのいずれのプロトコルも用いることができる。

（Ａ）ＰＣＲ増幅による・タイミング２時間
（ｉ）本出願人は希釈Ｕ６ ＰＣＲ鋳型を調製する。本出願人はＰＸ３３０をＰＣＲ鋳型として使用することを推奨するが、任意のＵ６含有プラスミドを同様にＰＣＲ鋳型として使用することができる。本出願人は鋳型を１０ｎｇ／ｕｌの濃度となるようにｄｄＨ２Ｏで希釈した。Ｕ６によって駆動されるｓｇＲＮＡを既に含んでいるプラスミド又はカセットが鋳型として使用される場合、ゲル抽出を実施して、産物が意図したｓｇＲＮＡのみを含み、鋳型からのｓｇＲＮＡキャリーオーバーの痕跡を含まないことを確実にする必要がある点に留意されたい。

（ｉｉ）本出願人は希釈ＰＣＲオリゴを調製した。Ｕ６−Ｆｗｄ及びＵ６−ｓｇＲＮＡ−Ｒｅｖプライマーは、ｄｄＨ２Ｏ中１０ｕＭの最終濃度に希釈される（１０ｕｌの１００ｕＭプライマーを９０ｕｌ ｄｄＨ２Ｏに添加する）。

（ｉｉｉ）Ｕ６−ｓｇＲＮＡ ＰＣＲ反応。本出願人は、各Ｕ６−ｓｇＲＮＡ−Ｒｅｖプライマー及び必要に応じてマスターミックスに対して以下の反応をセットアップした。

（ｉｖ）本出願人は、ステップ（ｉｉｉ）の反応物に対し、以下のサイクル条件を使用してＰＣＲ反応を実施した。

（ｖ）反応の完了後、本出願人は産物をゲル上で泳動させて、シングルバンドの増幅の成功を確かめた。１×ＳＹＢＲ Ｓａｆｅ色素を含む１×ＴＢＥ緩衝液に２％（ｗｔ／ｖｏｌ）アガロースゲルをキャスティングする。５ｕｌのＰＣＲ産物をゲル中１５Ｖｃｍ−１で２０〜３０分間泳動させる。成功したアンプリコンは、１つのシングル３７０ｂｐ産物を生じるはずであり、鋳型は見えないはずである。ＰＣＲアンプリコンをゲル抽出する必要はないはずである。

（ｖｉ）本出願人は、製造者の指示に従いＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットを使用してＰＣＲ産物を精製した。３５ｕｌの緩衝液ＥＢ又は水中にＤＮＡを溶出させる。精製したＰＣＲ産物は４℃又は−２０℃で保存しておくことができる。

（Ｂ）Ｃａｓ９含有バイシストロン性発現ベクターへのｓｇＲＮＡのクローニング・タイミング３日
（ｉ）ｓｇＲＮＡオリゴインサートを調製する。本出願人は、各ｓｇＲＮＡ設計について、１００ｕＭの最終濃度となるようにオリゴの上部鎖及び下部鎖を再懸濁した。オリゴを以下のとおりリン酸化及びアニーリングする。

（ｉｉ）以下のパラメータを使用してサーモサイクラーでアニーリングする：
３７℃で３０分
９５℃で５分
毎分５℃で２５℃まで下降させる。

（ｉｉｉ）本出願人は、１ｕｌのオリゴを１９９ｕｌの室温ｄｄＨ２Ｏに添加することにより、リン酸化及びアニーリングしたオリゴを１：２００希釈した。

（ｉｖ）ｓｇＲＮＡオリゴをＰＸ３３０にクローニングする。本出願人は、各ｓｇＲＮＡについてＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ反応をセットアップする。本出願人は、インサートのない、ＰＸ３３０のみの陰性対照を設定することを推奨する。

（ｖ）Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ反応物を合計１時間インキュベートする。
サイクル数 条件
１−６ ３７℃で５分、２１℃で５分

（ｖｉ）本出願人はＰｌａｓｍｉｄＳａｆｅエキソヌクレアーゼでＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ反応物を処理することにより、任意の残留する線状ＤＮＡを消化させた。このステップは任意選択であるものの、強く推奨される。

（ｖｉｉ）本出願人はＰｌａｓｍｉｄＳａｆｅ反応物を３７℃で３０分間インキュベートし、続いて７０℃で３０分間不活性化した。休題：完了後、反応物を凍結させて後に続行してもよい。環状ＤＮＡは少なくとも１週間安定しているはずである。

（ｖｉｉｉ）形質転換。本出願人はＰｌａｓｍｉｄＳａｆｅ処理したプラスミドを、細胞と共に提供されるプロトコルに従いコンピテントな大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株に形質転換した。本出願人は迅速な形質転換のためＳｔｂｌ３を推奨する。簡潔に言えば、本出願人は、ステップ（ｖｉｉ）からの５ｕｌの産物を２０ｕｌの化学的にコンピテントな氷冷Ｓｔｂｌ３細胞に添加した。次にこれを氷上で１０分間インキュベートし、４２℃で３０秒間熱ショックを与え、直ちに氷上に２分間戻し、１００ｕｌのＳＯＣ培地を添加し、これを１００ｕｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢプレートにプレーティングして３７℃で一晩インキュベートする。

（ｉｘ）２日目：本出願人はコロニーの成長に関してプレートを調べた。典型的には、陰性対照プレート（ＢｂｓＩ消化ＰＸ３３０のみのライゲーション、アニーリングされたｓｇＲＮＡオリゴなし）にはコロニーはなく、ＰＸ３３０−ｓｇＲＮＡクローニングプレートには数十個ないし数百個のコロニーがある。

（ｘ）本出願人は各プレートから２〜３個のコロニーを取り、ｓｇＲＮＡが正しく挿入されていることを確かめた。本出願人は、滅菌ピペットチップを使用して単一のコロニーを１００ｕｇ／ｍｌアンピシリン含有ＬＢ培地の３ｍｌ培養液に接種した。３７℃で一晩インキュベートし、振盪する。

（ｘｉ）３日目：本出願人はＱｉＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎミニプレップキットを製造者の指示に従い使用して、一晩培養物からプラスミドＤＮＡを単離した。

（ｘｉｉ）ＣＲＩＳＰＲプラスミドを配列検証する。本出願人はＵ６プロモーターからＵ６−Ｆｗｄプライマーを使用してシークエンシングすることにより各コロニーの配列を検証した。任意選択：以下のプライマー表に掲載するプライマーを使用してＣａｓ９遺伝子を配列決定する。

本出願人はシークエンシングの結果をＰＸ３３０クローニングベクター配列と照合し、Ｕ６プロモーターとｓｇＲＮＡ足場の残り部分との間に２０ｂｐガイド配列が挿入されたことを確かめた。ＧｅｎＢａｎｋベクターマップフォーマット（＊．ｇｂ ｆｉｌｅ）でのＰＸ３３０マップの詳細及び配列を、ウェブサイトｃｒｉｓｐｒ．ｇｅｎｏｍｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．ｏｒｇで見ることができる。

（任意選択）ｓｓＯＤＮ鋳型の設計・タイミング３日 事前計画
３｜ｓｓＯＤＮを設計及び注文する。センス又はアンチセンスのいずれかのｓｓＯＤＮを供給業者から直接購入することができる。本出願人は、両側に少なくとも４０ｂｐ及び最適なＨＤＲ効率のためには９０ｂｐの相同性アームを設計することを推奨する。本出願人の経験上、改変効率はアンチセンスオリゴの方がやや高い。

４｜本出願人はｓｓＯＤＮウルトラマー（ｕｌｔｒａｍｅｒ）を１０ｕＭの最終濃度となるように再懸濁して希釈した。センスｓｓＯＤＮとアンチセンス ｓｓＯＤＮとを組み合わせない、又はアニーリングしないこと。−２０℃で保存する。

５｜ＨＤＲ適用に関する注記として、本出願人はｓｇＲＮＡをＰＸ３３０プラスミドにクローニングすることを推奨する。

ｓｇＲＮＡの機能検証：細胞培養及びトランスフェクション・タイミング３〜４日
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は多くの哺乳類細胞株で使用されている。細胞株毎に条件が異なり得る。以下のプロトコルは、ＨＥＫ２３９ＦＴ細胞のトランスフェクション条件を詳説する。ｓｓＯＤＮ媒介性ＨＤＲトランスフェクションに関する注記として、ｓｓＯＤＮの最適な送達のためＡｍａｘａ ＳＦ細胞株Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキットが使用される。これは次節に記載する。

７｜ＨＥＫ２９３ＦＴの維持。細胞は製造者の推奨に従い維持される。簡潔に言えば、本出願人は、Ｄ１０培地（１０％ウシ胎仔血清を補給したＧｌｕｔａＭａｘ ＤＭＥＭ）中、３７℃及び５％ＣＯ２で細胞を培養した。

８｜継代のため、本出願人は培地を取り出し、細胞を押し退けないようＤＰＢＳを容器の側面に穏やかに加えることにより１回リンスした。本出願人はＴ７５フラスコに２ｍｌのＴｒｙｐＬＥを添加し、３７℃で５分間インキュベートした。１０ｍｌの温Ｄ１０培地を添加して失活させ、５０ｍｌ Ｆａｌｃｏｎチューブに移した。本出願人は細胞を穏やかに粉砕することにより解離させ、必要に応じて新しいフラスコに播種し直した。本出願人は、典型的には２〜３日毎に１：４又は１：８の分割比で細胞を継代し、細胞を７０％を超えるコンフルエンシーに至らせることが絶対にないようにする。細胞株は継代数が１５に達したところで再出発する。

９｜トランスフェクション用細胞の調製。本出願人は、トランスフェクションの１６〜２４時間前に、十分に解離した細胞を２４ウェルプレートの抗生物質不含Ｄ１０培地にウェル当たり１．３×１０^５細胞の播種密度及び５００ｕｌの播種容積でプレーティングした。必要に応じて製造者のマニュアルに従いスケールアップ又はスケールダウンする。推奨される密度より多い細胞をプレーティングすることは、そうすることによってトランスフェクション効率が低下し得るため勧められない。

１０｜トランスフェクション当日、細胞は７０〜９０％コンフルエンシーで最適である。細胞は、リポフェクタミン２０００又はＡｍａｘａ ＳＦ細胞株Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキットで製造者のプロトコルに従いトランスフェクトし得る。

（Ａ）ＰＸ３３０にクローニングされるｓｇＲＮＡについては、本出願人は５００ｎｇの配列検証したＣＲＩＳＰＲプラスミドをトランスフェクトした；２つ以上のプラスミドをトランスフェクトする場合、等モル比及び合計５００ｎｇ以下で混合する。

（Ｂ）ＰＣＲによって増幅するｓｇＲＮＡについては、本出願人は以下を混合した。
ＰＸ１６５（Ｃａｓ９のみ） ２００ｎｇ
ｓｇＲＮＡアンプリコン（各） ４０ｎｇ
ｐＵＣ１９ 総ＤＮＡが５００ｎｇになるまで補充

本出願人は、信頼のおける定量化のため技術的トリプリケートでトランスフェクトすること及びトランスフェクション対照（例えばＧＦＰプラスミド）を入れてトランスフェクション効率をモニターすることを推奨する。加えて、下流機能アッセイの陰性対照としてＰＸ３３０クローニングプラスミド及び／又はｓｇＲＮＡアンプリコンを単独でトランスフェクトしてもよい。

１１｜本出願人はリポフェクタミン複合体を細胞に添加し、ここでＨＥＫ２９３ＦＴ細胞はプレートから容易に剥がれ易く、トランスフェクション効率の低下がもたらされ得るため、穏やかに添加した。

１２｜本出願人は、蛍光顕微鏡を使用して対照（例えばＧＦＰ）トランスフェクションにおける蛍光細胞の割合を推定することにより、トランスフェクション後２４時間の細胞の効率を調べた。典型的には７０％を超える細胞がトランスフェクトされる。

１３｜本出願人は、培養培地にさらに５００ｕｌの温Ｄ１０培地を補給した。細胞が容易に剥がれ得るため、Ｄ１０はウェルの側面に極めてゆっくりと加え、低温の培地は使用しないこと。

１４｜細胞はトランスフェクション後合計４８〜７２時間インキュベートしてからインデル分析のため回収する。４８時間以降はインデル効率の著しい増加はない。

（任意選択）ＨＲ用のＣＲＩＳＰＲプラスミドとｓｓＯＤＮ又はターゲティングプラスミドとのコトランスフェクション・タイミング３〜４日
１５｜ターゲティングプラスミドを線状化する。ターゲティングベクターは、可能な場合には、相同性アームの一方の近傍又はいずれかの相同性アームの遠位端におけるベクター骨格中の制限部位で１回切断することにより線状化する。

１６｜本出願人は、少量の線状化プラスミドを切断されていないプラスミドと共に０．８〜１％アガロースゲル上で泳動させて、線状化の成功を確認した。線状化プラスミドはスーパーコイルプラスミドより上に泳動するはずである。

１７｜本出願人はＱＩＡＱｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットで線状化プラスミドを精製した。

１８｜トランスフェクション用の細胞を調製する。本出願人はＴ７５又はＴ２２５フラスコでＨＥＫ２９３ＦＴを培養した。トランスフェクション当日までに十分な細胞数が計画される。Ａｍａｘａストリップキュベットフォーマットには、トランスフェクション当たり２×１０^６細胞が使用される。

１９｜トランスフェクション用のプレートを調製する。本出願人は１２ウェルプレートの各ウェルに１ｍｌの温Ｄ１０培地を添加した。プレートはインキュベーターに置かれ、培地が温かいまま保たれる。

２０｜ヌクレオフェクション。本出願人は、以下のステップに適合させて、Ａｍａｘａ ＳＦ細胞株Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ４Ｄキットの製造者の指示に従いＨＥＫ２９３ＦＴ細胞をトランスフェクトした。

ａ．ｓｓＯＤＮとＣＲＩＳＰＲとのコトランスフェクションについては、ＰＣＲチューブに以下のＤＮＡを予め混合する。
ｐＣＲＩＳＰＲプラスミド（Ｃａｓ９＋ｓｇＲＮＡ） ５００ｎｇ
ｓｓＯＤＮ鋳型（１０ｕＭ） １ｕｌ

ｂ．ＨＤＲターゲティングプラスミドとＣＲＩＳＰＲとのコトランスフェクションについては、ＰＣＲチューブに以下のＤＮＡを予め混合する。
ＣＲＩＳＰＲプラスミド（Ｃａｓ９＋ｓｇＲＮＡ） ５００ｎｇ
直線化標的プラスミド ５００ｎｇ

トランスフェクション対照に関しては前節を参照されたい。加えて、本出願人は、陰性対照としてｓｓＯＤＮ又はターゲティングプラスミドを単独でトランスフェクトすることを推奨する。

２１｜単一細胞に解離する。本出願人は培地を取り出し、細胞を押し退けないよう注意しながらＤＰＢＳで１回穏やかにリンスした。２ｍｌのＴｒｙｐＬＥをＴ７５フラスコに添加し、３７℃で５分間インキュベートする。１０ｍｌの温Ｄ１０培地を添加して失活させ、５０ｍｌ Ｆａｌｃｏｎチューブにおいて穏やかに粉砕する。細胞は穏やかに粉砕して単一細胞に解離することが推奨される。大きい凝集塊はトランスフェクション効率を低下させ得る。本出願人は懸濁液から１０ｕｌアリコートを取り、カウントのため９０ｕｌのＤ１０培地に希釈した。本出願人は細胞をカウントし、トランスフェクションに必要な細胞数及び懸濁液の容積を計算した。本出願人は、典型的にはＡｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅストリップを使用して条件当たり２×１０^５細胞をトランスフェクトしたと共に、後続のピペッティングステップでの容積損失を調整するため所要数より２０％多い細胞を計算することを推奨する。必要な容積を新しいＦａｌｃｏｎチューブに移す。

２３｜本出願人はこの新しいチューブを２００×ｇで５分間スピンダウンした。

本出願人は、ＳＦ溶液とＳ１サプリメントとをＡｍａｘａが推奨するとおり混合してトランスフェクション溶液を調製した。Ａｍａｘａストリップキュベットについては、トランスフェクション当たり合計２０ｕｌの補給ＳＦ溶液が必要である。同様に、本出願人は、所要量より２０％多い容積を計算することを推奨する。

２５｜本出願人は、ステップ２３のペレット化した細胞から培地を完全に取り除き、適切な容積（２×１０^５細胞当たり２０ｕｌ）のＳ１補給ＳＦ溶液に穏やかに再懸濁した。細胞をＳＦ溶液中に長時間置いたままにしないこと。

２６｜２０ｕｌの再懸濁した細胞をステップ２０の各ＤＮＡプレミックスにピペッティングする。穏やかにピペッティングして混合し、Ｎｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅストリップチャンバに移す。これをトランスフェクション条件毎に繰り返す。

Ａｍａｘａが推奨するＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ４ＤプログラムＣＭ−１３０を使用して細胞をエレクトロポレートする。

２８｜本出願人は、１００ｕｌの温Ｄ１０培地を各Ｎｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅストリップチャンバに穏やかにかつゆっくりとピペッティングし、全容積をステップ１９の予め温めたプレートに移す。重要。この段階で細胞は極めて脆弱であり、苛酷なピペッティングは細胞死を引き起こし得る。２４時間インキュベートする。この時点で、陽性トランスフェクション対照における蛍光細胞の割合からトランスフェクション効率を推定することができる。ヌクレオフェクションは、典型的には７０〜８０％より高いトランスフェクション効率をもたらす。本出願人は、各ウェルに１ｍｌの温Ｄ１０培地を、細胞を押し退けないようにしてゆっくりと添加した。細胞を合計７２時間インキュベートする。

ヒト胚性幹細胞（ＨＵＥＳ ９）培養及びトランスフェクション・タイミング３〜４日
ｈＥＳＣ（ＨＵＥＳ９）株の維持。本出願人はＨＵＥＳ９細胞株をｍＴｅＳＲ１培地による無フィーダー条件に常法で維持する。本出願人は、基本培地と同梱の５×サプリメント及び１００ｕｇ／ｍｌ Ｎｏｒｍｏｃｉｎを添加することによりｍＴｅＳＲ１培地を調製した。本出願人は、１０ｕＭ Ｒｏｃｋ阻害薬をさらに補給したｍＴｅＳＲ１培地の１０ｍｌアリコートを調製した。組織培養プレートをコーティングする。冷ＧｅｌＴｒｅｘを冷ＤＭＥＭに１：１００希釈し、１００ｍｍ組織培養プレートの表面全体をコーティングする。

プレートをインキュベーターに３７℃で少なくとも３０分間置く。細胞のバイアルを１５ｍｌ Ｆａｌｃｏｎチューブにおいて３７℃で解凍し、５ｍｌのｍＴｅＳＲ１培地を添加し、及び２００×ｇで５分間ペレット化する。ＧｅｌＴｒｅｘコーティングを吸い取り、Ｒｏｃｋ阻害薬を含有する１０ｍｌ ｍＴｅＳＲ１培地に約１×１０^６細胞を播種する。トランスフェクション後２４時間で通常のｍＴｅＳＲ１培地に交換し、毎日リフィードする。細胞を継代する。細胞に新鮮なｍＴｅＳＲ１培地を毎日リフィードし、７０％のコンフルエンシーに達するまで継代する。ｍＴｅＳＲ１培地を吸い取り、細胞をＤＰＢＳで１回洗浄する。２ｍｌのＡｃｃｕｔａｓｅを添加して３７℃で３〜５分間インキュベートすることにより細胞を解離する。１０ｍｌ ｍＴｅＳＲ１培地を添加して細胞を剥がし、１５ｍｌ Ｆａｌｃｏｎチューブに移して穏やかに再懸濁する。ＧｅｌＴｒｅｘをコーティングしたプレートの１０ｕＭ Ｒｏｃｋ阻害薬含有ｍＴｅＳＲ１培地に改めてプレーティングする。プレーティング後２４時間で通常のｍＴｅＳＲ１培地に交換する。

トランスフェクション。本出願人は、解凍後少なくとも１週間細胞を培養した後にＡｍａｘａ Ｐ３初代細胞４−Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキット（Ｌｏｎｚａ）を使用してトランスフェクトすることを推奨する。対数期増殖細胞に新鮮培地を２時間リフィードした後トランスフェクトする。ａｃｃｕｔａｓｅで単一細胞又は１０細胞以下の小さいクラスターに解離し、穏やかに再懸濁する。ヌクレオフェクションに必要な細胞の数をカウントし、２００×ｇで５分間スピンダウンする。培地を完全に取り除き、推奨される容積のＳ１補給Ｐ３ヌクレオフェクション溶液に再懸濁する。１×Ｒｏｃｋ阻害薬の存在下で、コーティングされたプレートにエレクトロポレートした細胞を穏やかにプレーティングする。

トランスフェクションの成功を確かめ、通常のｍＴｅＳＲ１培地を毎日、ヌクレオフェクション後２４時間目から始めてリフィードする。典型的には、本出願人はＡｍａｘａヌクレオフェクションで７０％より高いトランスフェクション効率を観察する。ＤＮＡを回収する。トランスフェクション後４８〜７２時間でａｃｃｕｔａｓｅを使用して細胞を解離し、５倍容積のｍＴｅＳＲ１を添加することにより失活させる。細胞を２００×ｇで５分間スピンダウンする。ペレット化した細胞はＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ溶液によるＤＮＡ抽出用に直接処理することができる。細胞をａｃｃｕｔａｓｅを用いずに機械的に解離することは推奨されない。ａｃｃｕｔａｓｅを失活させずに又は推奨速度より高速で細胞をスピンダウンすることは推奨されない；それを行うと細胞の溶解が引き起こされ得る。

ＦＡＣＳによるクローン細胞株の単離。タイミング・２〜３時間ハンズオン；２〜３週間拡大
トランスフェクション後２４時間でＦＡＣＳによるか又は段階希釈によりクローン単離を実施し得る。

５４｜ＦＡＣＳ緩衝液を調製する。有色の蛍光を使用して選別する必要のない細胞は、１×ペニシリン／ストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）を補給した通常のＤ１０培地で選別し得る。有色の蛍光選別もまた必要である場合、フェノール不含ＤＭＥＭ又はＤＰＢＳが通常のＤＭＥＭに代用される。１×ペニシリン／ストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）を補給し、０．２２ｕｍ Ｓｔｅｒｉｆｌｉｐフィルターでろ過する。

５５｜９６ウェルプレートを調製する。本出願人は、各ウェルにつき１×ペニシリン／ストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）を補給した１００ｕｌのＤ１０培地を添加し、所望の数のクローンに必要なとおりのプレート数を調製した。

５６｜ＦＡＣＳ用の細胞を調製する。本出願人は培地を完全に吸い取り、２４ウェルプレートのウェル当たり１００ｕｌ ＴｒｙｐＬＥを添加することにより、細胞を解離した。５分間インキュベートし、４００ｕｌの温Ｄ１０培地を添加した。

５７｜再懸濁した細胞を１５ｍｌ Ｆａｌｃｏｎチューブに移し、２０回穏やかに粉砕する。確実に単一細胞に解離したことを顕微鏡下で確かめることが推奨される。

５８｜細胞を２００×ｇで５分間スピンダウンする。

５９｜本出願人は培地を吸引し、細胞を２００ｕｌのＦＡＣＳ培地に再懸濁した。

６０｜細胞を３５ｕｍメッシュフィルターでろ過し、ラベルを付したＦＡＣＳチューブに入れる。本出願人は、ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ細胞ストレーナーキャップ付き１２×７５ｍｍチューブを使用することを推奨する。選別時まで細胞を氷上に置く。

６１｜本出願人は単一細胞を、ステップ５５で調製した９６ウェルプレートに選別した。本出願人は、各プレート上の１つの単一の指定されたウェルに１００細胞を陽性対照として選別することを推奨する。

注。残りの細胞をとっておき、集団レベルでの遺伝子型同定に使用して全体的な改変効率を評価し得る。

６２｜本出願人は細胞をインキュベーターに戻して２〜３週間拡大させた。選別後５日で１００ｕｌの温Ｄ１０培地を添加する。必要に応じて３〜５日おきに１００ｕｌの培地を交換する。

６３｜選別後１週間でコロニーの「クローンのような」外観、即ち中心点から放射状に広がる丸いコロニーについて調べる。空のウェル、又はダブレット又はマルチプレットが播種された可能性のあるウェルに印を付ける。

６４｜細胞が６０％を上回ってコンフルエントになったとき、本出願人は、継代用に一組のレプリカ平板を調製した。レプリカ平板の各ウェルに１００ｕｌのＤ１０培地を添加する。本出願人は上下に激しく２０回ピペッティングすることにより細胞を直接解離した。調製したレプリカ平板に再懸濁容積の２０％をプレーティングしてクローン株を維持した。その後培地を２〜３日おきに交換し、それに従い継代する。

６５｜残りの８０％の細胞はＤＮＡ単離及び遺伝子型同定に使用する。

任意選択：希釈によるクローン細胞株の単離。タイミング・２〜３時間ハンズオン；２〜３週間拡大
６６｜本出願人は上記に記載したとおり２４ウェルプレートから細胞を解離した。確実に単一細胞に解離する。細胞ストレーナーを使用して細胞の凝集を防ぐことができる。

６７｜条件毎に細胞の数をカウントする。各条件を１００ｕｌ当たり０．５細胞の最終濃度となるようにＤ１０培地に段階稀釈する。各９６ウェルプレートについて、本出願人は、１２ｍｌのＤ１０中６０細胞の最終カウントとなるように希釈することを推奨する。適切なクローン希釈のため細胞数を正確にカウントすることが推奨される。正確を期すため細胞を段階希釈の中間段階で再度カウントしてもよい。

６８｜マルチチャンネルピペットを使用して１００ｕｌの希釈細胞を９６ウェルプレートの各ウェルにピペッティングした。

注。残りの細胞をとっておき、集団レベルでの遺伝子型同定に使用して全体的な改変効率を評価し得る。

６９｜本出願人は、プレーティング後約１週間でコロニーの「クローンのような」外観、即ち中心点から放射状に広がる丸いコロニーについて調べた。ダブレット又はマルチプレットが播種された可能性のあるウェルに印を付ける。

７０｜本出願人は細胞をインキュベーターに戻して２〜３週間拡大させた。前節に詳説したとおり必要に応じて細胞にリフィードする。

ＣＲＩＳＰＲ切断効率のＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイ。タイミング・５〜６時間
７１｜ＤＮＡ用の細胞を回収する。細胞を解離し、２００×ｇで５分間スピンダウンする。注。トランスフェクション細胞株をとっておく必要に応じてこの段階でレプリカ平板を作製する。

７２｜上清を完全に吸引する。

トランスフェクション細胞の切断効率をアッセイする前に、本出願人は、以下に記載するプロトコルを使用するＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼ消化のステップにより陰性（トランスフェクトされていない）対照サンプルでそれぞれの新規ＳＵＲＶＥＹＯＲプライマーを試験することを推奨する。時折、シングルバンドのクリーンなＳＵＲＶＥＹＯＲ ＰＣＲ産物であっても非特異的ＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼ切断バンドを生じ、正確なインデル分析を妨げる可能性がある。

７３｜本出願人はＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ ＤＮＡ抽出溶液を製造者の指示に従い使用した。本出願人は典型的には２４ウェルプレートの各ウェルに５０ｕｌの溶液を使用し、及び９６ウェルプレートについては１０ｕｌを使用した。

７４｜本出願人は抽出ＤＮＡをｄｄＨ２Ｏで１００〜２００ｎｇ／ｕｌの最終濃度となるように標準化した。休題：抽出ＤＮＡは−２０℃で数ヶ月間保存しておくことができる。

７５｜ＳＵＲＶＥＹＯＲ ＰＣＲをセットアップする。本出願人のオンライン／コンピュータアルゴリズムツールによって提供されるＳＵＲＶＥＹＯＲプライマーを使用して以下をマスターミックスする。

７６｜本出願人は、各反応について１００〜２００ｎｇのステップ７４からの標準化ゲノムＤＮＡ鋳型を添加した。

７７｜３０回以下の増幅サイクルに対し、以下のサイクル条件を使用してＰＣＲ反応を実施した。

７８｜本出願人は２〜５ｕｌのＰＣＲ産物を１％ゲル上で泳動させてシングルバンド産物を確認した。これらのＰＣＲ条件は多くのＳＵＲＶＥＹＯＲプライマー対で機能するように設計されているが、一部のプライマーは、鋳型濃度、ＭｇＣｌ_２濃度、及び／又はアニーリング温度を調整することによるさらなる最適化が必要になり得る。

７９｜本出願人はＱＩＡＱｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットを使用してＰＣＲ反応物を精製し、溶離液を２０ｎｇ／ｕｌに標準化した。休題：精製したＰＣＲ産物は−２０℃で保存しておくことができる。

８０｜ＤＮＡヘテロ二重鎖形成。アニーリング反応を以下のとおりセットアップした。

８１｜以下の条件を用いて反応物をアニーリングする。

８２｜ＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼＳ消化。本出願人はマスターミックスを調製し、氷上で以下の構成成分を添加して、２５ｕｌの総最終容積についてステップ８１のヘテロ二本鎖をアニーリングした。

８３｜十分にボルテックスし、スピンダウンする。反応物を４２℃で１時間インキュベートする。

８４｜任意選択：ＳＵＲＶＥＹＯＲキットの停止液２ｕｌを添加してもよい。休題。消化産物は、後の分析のため−２０℃で保存しておくことができる。

８５｜ＳＵＲＶＥＹＯＲ反応を可視化する。２％アガロースゲル上でＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼ消化産物を可視化し得る。分解能を良くするため、産物を４〜２０％勾配ポリアクリルアミドＴＢＥゲル上で泳動させてもよい。本出願人は推奨されるローディング緩衝液で１０ｕｌの産物をロードし、製造者の指示に従いゲルを泳動させた。典型的には、本出願人はブロモフェノールブルー色素が移動してゲルの底に達するまで泳動させる。同じゲル上にＤＮＡラダー及び陰性対照を含める。

８６｜本出願人は、ＴＢＥ中に希釈した１×ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ色素でゲルを染色した。ゲルを１５分間穏やかに揺り動かした。

８７｜本出願人は、バンドを過度に露光することなく定量的イメージングシステムを使用してゲルをイメージングした。陰性対照は、ＰＣＲ産物のサイズに対応する１つのバンドのみを有するはずであるが、時折、他のサイズの非特異的な切断バンドを有し得る。これらは、標的の切断バンドとサイズが異なる場合には分析を妨げない。本出願人のオンライン／コンピュータアルゴリズムツールによって提供される標的切断バンドのサイズの合計は、ＰＣＲ産物のサイズと等しいはずである。

８８｜切断強度を推定する。本出願人はＩｍａｇｅＪ又は他のゲル定量化ソフトウェアを使用して各バンドの面積強度を定量化した。

８９｜各レーンについて、本出願人は、以下の式を使用して切断されたＰＣＲ産物の割合（ｆ_ｃｕｔ）を計算した：ｆ_ｃｕｔ＝（ｂ＋ｃ）／（ａ＋ｂ＋ｃ）（式中、ａは消化されなかったＰＣＲ産物の面積強度であり、ｂ及びｃは各切断産物の面積強度である）。９０｜切断効率は、二重鎖形成の二項確率分布に基づき、以下の式を使用して推定し得る。

ＣＲＩＳＰＲ切断効率を評価するためのＳａｎｇｅｒシークエンシング。タイミング・３日
最初のステップは、ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイのステップ７１〜７９と同じである。注：フォワード及びリバースプライマーに適切な制限部位が付加される場合、ＳａｎｇｅｒシークエンシングにＳＵＲＶＥＹＯＲプライマーを用い得る。推奨されるｐＵＣ１９骨格へのクローニングに関しては、ＦｗｄプライマーにＥｃｏＲＩ及びＲｅｖプライマーにＨｉｎｄＩＩＩを用い得る。

９２｜アンプリコン消化。消化反応を以下のとおりセットアップする。

９３｜ｐＵＣ１９骨格消化。消化反応を以下のとおりセットアップする。

９４｜本出願人は、ＱＩＡＱｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットを使用して消化反応物を精製した。休題：精製したＰＣＲ産物は−２０℃で保存しておくことができる。

９５｜本出願人は、消化したｐＵＣ１９骨格及びＳａｎｇｅｒアンプリコンを１：３のベクター：インサート比で以下のとおりライゲートした。

９６｜形質転換。本出願人は、細胞と共に供給されるプロトコルに従いＰｌａｓｍｉｄＳａｆｅ処理したプラスミドをコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株に形質転換した。本出願人は迅速な形質転換のためＳｔｂｌ３を推奨する。簡潔に言えば、５ｕｌのステップ９５の産物を２０ｕｌの氷冷化学コンピテントＳｔｂｌ３細胞に添加し、氷上で１０分間インキュベートし、４２℃で３０秒間熱ショックを与え、直ちに氷に２分間戻し、１００ｕｌのＳＯＣ培地を添加し、１００ｕｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢプレートにプレーティングする。これを３７℃で一晩インキュベートする。

９７｜２日目：本出願人はプレートのコロニー成長を調べた。典型的には、陰性対照プレート（ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化ｐＵＣ１９のみのライゲーション、Ｓａｎｇｅｒアンプリコンインサート無し）にはコロニーがなく、ｐＵＣ１９−Ｓａｎｇｅｒアンプリコンクローニングプレートには数十個ないし数百個のコロニーがある。

９８｜３日目：本出願人は、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎミニプレップキットを製造者の指示に従い使用して、一晩培養物からプラスミドＤＮＡを単離した。

９９｜Ｓａｎｇｅｒシークエンシング。本出願人は、ｐＵＣ１９骨格からｐＵＣ１９−フォワードプライマーを使用してシークエンシングすることにより各コロニーの配列を確かめた。本出願人はシークエンシング結果を予想ゲノムＤＮＡ配列と照合し、Ｃａｓ９誘発性のＮＨＥＪ突然変異の存在を調べた。％編集効率＝（改変クローン数）／（総クローン数）。正確な改変効率を得るには、妥当な数のクローン（＞２４）を選ぶことが重要である。

微小欠失のための遺伝子型同定。タイミング・２〜３日ハンズオン；２〜３週間拡大
１００｜上記に記載したとおり、欠失させる領域を標的にするｓｇＲＮＡのペアを細胞にトランスフェクトした。

１０１｜トランスフェクション後２４時間で、クローン株を上記に記載したとおりＦＡＣＳ又は段階希釈によって単離する。

１０２｜細胞を２〜３週間拡大させる。

１０３｜本出願人は上記に記載したとおり１０ｕｌ ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ溶液を使用してクローン株からＤＮＡを回収し、ゲノムＤＮＡを５０〜１００ｎｇ／ｕｌの最終濃度となるようにｄｄＨ２Ｏで標準化した。

１０４｜改変領域をＰＣＲ増幅する。ＰＣＲ反応を以下のとおりセットアップする。

注：欠失サイズが１ｋｂより大きい場合、Ｉｎ−Ｆｗｄプライマー及びＩｎ−Ｒｅｖプライマーを含む並行する一組のＰＣＲ反応をセットアップし、野生型アレルの存在についてスクリーニングする。

１０５｜逆位についてスクリーニングするため、ＰＣＲ反応を以下のとおりセットアップする。

注：プライマーは、Ｏｕｔ−Ｆｗｄ＋Ｉｎ Ｆｗｄ、又はＯｕｔ−Ｒｅｖ＋Ｉｎ−Ｒｅｖのいずれかとしてペアにされる。

１０６｜本出願人は、各反応について１００〜２００ｎｇのステップ１０３の標準化ゲノムＤＮＡ鋳型を添加した。

１０７｜以下のサイクル条件を使用してＰＣＲ反応を実施した。

１０８｜本出願人は２〜５ｕｌのＰＣＲ産物を１〜２％ゲル上で泳動させて産物を確認した。これらのＰＣＲ条件は多くのプライマーで機能するように設計されるが、一部のプライマーは、鋳型濃度、ＭｇＣｌ２濃度、及び／又はアニーリング温度を調整することによるさらなる最適化が必要となり得る。

ＨＤＲによる標的改変のための遺伝子型同定。タイミング・２〜３日、２〜３時間ハンズオン
１０９｜本出願人は上記に記載したとおりＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ溶液を使用してＤＮＡを回収し、ゲノムＤＮＡを１００〜２００ｎｇ／ｕｌの最終濃度となるようにＴＥで標準化した。

１１０｜改変領域をＰＣＲ増幅する。ＰＣＲ反応を以下のとおりセットアップする。

１１１｜本出願人は各反応について１００〜２００ｎｇのステップ１０９のゲノムＤＮＡ鋳型を添加し、以下のプログラムを実行した。

１１２｜本出願人は５ｕｌのＰＣＲ産物を０．８〜１％ゲル上で泳動させてシングルバンド産物を確認した。プライマーは、鋳型濃度、ＭｇＣｌ２濃度、及び／又はアニーリング温度を調整することによるさらなる最適化が必要となり得る。

１１３｜本出願人はＱＩＡＱｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットを使用してＰＣＲ反応物を精製した。

１１４｜ＨＤＲの例では、ＥＭＸ１遺伝子にＨｉｎｄＩＩＩ制限部位が挿入される。これらの制限部位はＰＣＲアンプリコンの制限酵素消化により検出される。

ｉ．ＤＮＡを３７℃で１０分間消化する：
ｉｉ．本出願人は、ローディング色素を含む１０ｕｌの消化産物を、４〜２０％勾配ポリアクリルアミドＴＢＥゲル上でキシレンシアノールバンドが移動してゲルの底に達するまで泳動させた。
ｉｉｉ．本出願人は１５分間揺り動かしながら１×ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ色素でゲルを染色した。
ｉｖ．上記でＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイの節に記載したとおり切断産物をイメージングして定量化する。ＨＤＲ効率は以下の式により推定される：（ｂ＋ｃ）／（ａ＋ｂ＋ｃ）（式中、ａは消化されなかったＨＤＲ ＰＣＲ産物の面積強度であり、ｂ及びｃはＨｉｎｄＩＩＩ切断断片の面積強度である）。

１１５｜或いは、ステップ１１３の精製ＰＣＲアンプリコンをクローニングし、Ｓａｎｇｅｒシークエンシング又はＮＧＳを用いて遺伝子型を決定してもよい。

ディープシークエンシング及びオフターゲット分析・タイミング１〜２日
オンラインＣＲＩＳＰＲ標的設計ツールは、同定された標的部位のそれぞれについて候補ゲノムオフターゲット部位を作成する。これらの部位でのオフターゲット分析は、ＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼアッセイ、Ｓａｎｇｅｒシークエンシング、又は次世代ディープシークエンシングにより実施することができる。これらの部位の多くで改変率が低い又は検出不能である可能性を考えると、本出願人は、高感度及び高精度のためのＩｌｌｕｍｉｎａ Ｍｉｓｅｑプラットフォームによるディープシークエンシングを推奨する。プロトコルはシークエンシングプラットフォームによって異なり得る；ここで本出願人は、シークエンシングアダプターをつなぎ合わせるための融合ＰＣＲ方法について簡単に記載する。

１１６｜ディープシークエンシングプライマーを設計する。次世代シークエンシング（ＮＧＳ）プライマーは、典型的には１００〜２００ｂｐサイズ範囲の、より短いアンプリコン向けに設計される。プライマーはＮＣＢＩプライマーＢｌａｓｔを使用して手動で設計されてもよく、又はオンラインＣＲＩＳＰＲ標的設計ツール（ｇｅｎｏｍｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓにあるウェブサイト）で生成されてもよい。

１１７｜Ｃａｓ９標的細胞からゲノムＤＮＡを回収する。ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔゲノムＤＮＡをｄｄＨ２Ｏで１００〜２００ｎｇ／ｕｌに標準化する。

１１８｜初期ライブラリ調製ＰＣＲ。ステップ１１６のＮＧＳプライマーを使用して初期ライブラリ調製ＰＣＲを調製する。

１１９｜各反応につき１００〜２００ｎｇの標準化したゲノムＤＮＡ鋳型を加える。

１２０｜２０回以下の増幅サイクルについて、以下のサイクル条件を使用してＰＣＲ反応を実施する。

１２１｜２〜５ｕｌのＰＣＲ産物を１％ゲル上で泳動させてシングルバンド産物を確認する。あらゆるゲノムＤＮＡ ＰＣＲと同様に、ＮＧＳプライマーは、鋳型濃度、ＭｇＣｌ_２濃度、及び／又はアニーリング温度を調整することによるさらなる最適化が必要となり得る。

１２２｜ＰＣＲ反応物をＱＩＡＱｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットを使用して精製し、溶離液を２０ｎｇ／ｕｌに標準化する。休題：精製したＰＣＲ産物は−２０℃で保存しておくことができる。

１２３｜Ｎｅｘｔｅｒａ ＸＴ ＤＮＡサンプル調製キット。製造者のプロトコルに従い、各サンプルに対するユニークバーコードでＭｉｓｅｑシークエンシング準備ライブラリを作成する。

１２４｜シークエンシングデータを分析する。ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ、又は単純な配列解析スクリプトなどのリードアラインメントプログラムにより、オフターゲット分析を実施し得る。

タイミング
ステップ１〜２ ｓｇＲＮＡオリゴ及びｓｓＯＤＮの設計及び合成：１〜５日、供給業者によって変動
ステップ３〜５ ＣＲＩＳＰＲプラスミド又はＰＣＲ発現カセットの構築：２時間〜３日
ステップ６〜５３ 細胞株へのトランスフェクション：３日（１時間のハンズオン時間）
ステップ５４〜７０ 任意選択のクローン株誘導：１〜３週間、細胞型によって変動
ステップ７１〜９１ ＳＵＲＶＥＹＯＲによるＮＨＥＪの機能検証：５〜６時間
ステップ９２〜１２４ Ｓａｎｇｅｒ法又は次世代ディープシークエンシングによる遺伝子型同定：２〜３日（３〜４時間のハンズオン時間）

実施例２５：ＮＬＳ
Ｃａｓ９転写修飾因子：本出願人は、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ ＣＲＩＳＰＲ系を、ＤＮＡ切断の域を越える機能が遂行され得る一般的なＤＮＡ結合システムに転換しようと試みた。例えば、１つ又は複数の機能ドメインを触媒的に不活性なＣａｓ９と融合することにより、本出願人は新規機能、例えば転写活性化／抑制、メチル化／脱メチル化、又はクロマチン改変を付与している。この目標を達成するため、本出願人は、ヌクレアーゼ活性に必須の２つの残基Ｄ１０及びＨ８４０をアラニンに変えることにより、触媒的に不活性なＣａｓ９突然変異体を作製した。これらの２つの残基を突然変異させることにより、Ｃａｓ９のヌクレアーゼ活性を消失させ、一方で標的ＤＮＡとの結合能は維持する。本出願人が自らの仮説を検証するため着目することに決めた機能ドメインは、転写活性化因子ＶＰ６４並びに転写リプレッサーＳＩＤ及びＫＲＡＢである。

ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓは容易に多重化し得るため、いくつかの遺伝子の同時改変が促進され、かつ高効率で染色体微小欠失が媒介される。本出願人は２つのｓｇＲＮＡを使用することにより、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞において最大６８％の効率でのヒトＧＲＩＮ２Ｂ及びＤＹＲＫ１Ａ遺伝子座の同時標的化を実証した。同様に、ｓｇＲＮＡのペアを使用することによりエクソンの切り出しなどの微小欠失を媒介することができ、これはクローンレベルでＰＣＲにより遺伝子型決定され得る。エクソン接合部の正確な位置は異なり得ることに留意されたい。本出願人はまた、ｓｓＯＤＮ及びターゲティングベクターを使用したＨＥＫ ２９３ＦＴ細胞及びＨＵＥＳ９細胞におけるＣａｓ９の野生型及びニッカーゼ突然変異体の両方によるＨＤＲの媒介も実証した（図２６）。本出願人はＣａｓ９ニッカーゼを使用したＨＵＥＳ９細胞でのＨＤＲを検出できていないことに留意されたく、これはＨＵＥＳ９細胞における修復活性の低い効率又は潜在的な違いに起因し得る。これらの値は典型的であるが、所与のｓｇＲＮＡの切断効率にはいくらかのばらつきがあり、まれにある種のｓｇＲＮＡは、未だ解明されていない理由により機能しないこともある。本出願人は、各遺伝子座につき２つのｓｇＲＮＡを設計し、かつ意図される細胞型におけるそれらの効率を試験することを推奨する。

Ｃａｓ９核局在：本出願人は、最も有効なＣａｓ９転写修飾因子が、転写に対してその最も大きい影響を及ぼし得るところである核に強力に局在し得るという仮説を立てた。さらに、細胞質内に残る任意のＣａｓ９が望ましくない効果を有する可能性がある。本出願人は、野生型Ｃａｓ９が核に局在せず、複数の核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含まないことを決定した（ＣＲＩＳＰＲ系が１つ以上のＮＬＳを有する必要はないが、有利には少なくとも１つ以上のＮＬＳを有する）。複数のＮＬＳ配列が必要であったため、Ｃａｓ９を核に入れるのが困難であることは妥当であったと共に、Ｃａｓ９と融合する任意のさらなるドメインが核局在を破壊する可能性があった。従って、本出願人は、異なるＮＬＳ配列（ｐＸＲＰ０２−ｐＬｅｎｔｉ２−ＥＦ１ａ−ＮＬＳ−ｈＳｐＣｓｎ１（１０Ａ，８４０Ａ）−ＮＬＳ−ＶＰ６４−ＥＧＦＰ、ｐＸＲＰ０４−ｐＬｅｎｔｉ２−ＥＦ１ａ−ＮＬＳ−ｈＳｐＣｓｎ１（１０Ａ，８４０Ａ）−ＮＬＳ−ＶＰ６４−２Ａ−ＥＧＦＰ−ＮＬＳ、ｐＸＲＰ０６−ｐＬｅｎｔｉ２−ＥＦ１ａ−ＮＬＳ−ＥＧＦＰ−ＶＰ６４−ＮＬＳ−ｈＳｐＣｓｎ１（１０Ａ，８４０Ａ）−ＮＬＳ、ｐＸＲＰ０８−ｐＬｅｎｔｉ２−ＥＦ１ａ−ＮＬＳ−ＶＰ６４−ＮＬＳ−ｈＳｐＣｓｎ１（１０Ａ，８４０Ａ）−ＮＬＳ−ＶＰ６４−ＥＧＦＰ−ＮＬＳ）を有する４つのＣａｓ９−ＶＰ６４−ＧＦＰ融合構築物を作製した。これらの構築物をヒトＥＦ１ａプロモーターの発現下にあるレンチ骨格にクローニングした。よりロバストなタンパク質発現のため、ＷＰＲＥエレメントもまた加えた。各構築物を、リポフェクタミン２０００（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｅ ２０００）を使用してＨＥＫ２９３ＦＴ細胞にトランスフェクトし、トランスフェクション後２４時間でイメージングした。融合タンパク質が融合タンパク質のＮ末端及びＣ末端の両方にＮＬＳ配列を有するとき、最良の核局在が得られる。観察された最も高い核局在は、４つのＮＬＳエレメントを有する構築物で起こった。

Ｃａｓ９に対するＮＬＳエレメントの影響をさらに確実に理解するため、本出願人は同じαインポーチンＮＬＳ配列を、０〜３個のタンデムリピートを見てＮ末端又はＣ末端のいずれかに付加することにより、１６個のＣａｓ９−ＧＦＰ融合物を作製した。各構築物を、リポフェクタミン２０００（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｅ ２０００）を使用してＨＥＫ２９３ＦＴ細胞にトランスフェクトし、トランスフェクション後２４時間でイメージングした。顕著なことに、ＮＬＳエレメントの数は核局在の程度と直接相関しない。Ｃ末端にＮＬＳを付加する方が、Ｎ末端への付加と比べて核局在により大きい影響を及ぼす。

Ｃａｓ９転写活性化因子：本出願人は、Ｓｏｘ２遺伝子座を標的にしてＲＴ−ｑＰＣＲで転写活性化を定量化することにより、Ｃａｓ９−ＶＰ６４タンパク質の機能試験を行った。Ｓｏｘ２のプロモーターに跨るように８個のＤＮＡ標的部位を選択した。各構築物を、リポフェクタミン２０００（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｅ ２０００）を使用してＨＥＫ２９３ＦＴ細胞にトランスフェクトし、トランスフェクション後７２時間で細胞から全ＲＮＡを抽出した。１ｕｇのＲＮＡを４０ｕｌ反応物でｃＤＮＡに逆転写した（ｑＳｃｒｉｐｔ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ）。単一の２０ｕｌ ＴａｑＭａｎアッセイｑＰＣＲ反応に２ｕｌの反応産物を加えた。各実験は生物学的及び技術的トリプリケートで実施した。ＲＴ対照反応及び鋳型対照反応はいずれも増幅を示さなかった。強力な核局在を示さない構築物ｐＸＲＰ０２及びｐＸＲＰ０４は、活性化が起こらない。実に強力な核局在を示した構築物、ｐＸＲＰ０８については、中程度の活性化が観察された。ガイドＲＮＡＳｏｘ２．４及びＳｏｘ２．５の場合に統計的に有意な活性化が観察された。

実施例２６：Ｉｎ Ｖｉｖｏマウスデータ
この例は、ｉｎ ｖｉｖｏで送達されるＣＲＩＳＰＲ複合体が目的どおりに機能することを実証する。

材料及び試薬
Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ融合ポリメラーゼ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号６００６７９）
１０× ＮＥ緩衝液 ４（ＮＥＢ、カタログ番号Ｂ７００４Ｓ）
ＢｓａＩ ＨＦ（ＮＥＢ、カタログ番号Ｒ３５３５Ｓ）
Ｔ７ ＤＮＡリガーゼ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ、カタログ番号Ｌ６０２Ｌ）
Ｆａｓｔ Ｄｉｇｅｓｔ緩衝液、１０×（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｂ６４）
ＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ ＮｏｔＩ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＦＤ０５９４）
ＦａｓｔＡＰアルカリホスファターゼ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＥＦ０６５１）
リポフェクタミン２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１１６６８−０１９）
トリプシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１５４０００５４）
鉗子＃４（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｚ１６８７７７−１ＥＡ）
鉗子＃５（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｆ６５２１−１ＥＡ）
１０× ハンクス平衡塩類溶液（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｈ４６４１−５００ＭＬ）
ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ｐ４３３３）
Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号２１１０３０４９）
Ｂ２７サプリメント（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１７５０４０４４）
Ｌ−グルタミン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号２５０３００８１）
グルタミン酸塩（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＲＥＳ５０６３Ｇ−Ａ７）
β−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｍ６２５０−１００ＭＬ）
ＨＡウサギ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ番号３７２４Ｓ）
ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）細胞イメージングキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ｒ３７６０１）
３０Ｇ Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔシリンジ（Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、カタログ番号ＮＡＮＯＦＩＬ）
定位固定装置（Ｋｏｐｆ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）
ＵｌｔｒａＭｉｃｒｏＰｕｍｐ３（Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、カタログ番号ＵＭＰ３−４）
スクロース（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｓ７９０３）
塩化カルシウム（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｃ１０１６）
酢酸マグネシウム（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｍ０６３１）
トリス−ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｔ５９４１）
ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｅ６７５８）
ＮＰ−４０（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＮＰ４０）
フェニルメタンスルホニルフルオリド（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号７８８３０）
塩化マグネシウム（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｍ８２６６）
塩化カリウム（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ９３３３）
β−グリセロリン酸（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｇ９４２２）
グリセロール（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｇ９０１２）
Ｖｙｂｒａｎｔ（登録商標）ＤｙｅＣｙｃｌｅ^ＴＭＲｕｂｙ染色（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号Ｓ４９４２）
ＦＡＣＳ Ａｒｉａ Ｆｌｕ−ａｃｔ−細胞選別機（Ｋｏｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ ＭＩＴ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、米国）
ＤＮＡｅａｓｙ血液及び組織キット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号６９５０４）

手順
ｉｎ ｖｉｖｏで脳において使用されるｇＲＮＡ多重体の構築
本出願人は、マウスＴＥＴ及びＤＮＭＴファミリーメンバーを標的にする単一のｇＲＮＡを設計し、ＰＣＲ増幅した（本明細書に記載されるとおり）。標的化効率をＮ２ａ細胞株で評価した（図２８）。ｉｎ ｖｉｖｏでいくつかの遺伝子の同時改変を達成するため、効率的なｇＲＮＡをＡＡＶパッケージングベクターに多重化した（図２９）。系の効率のさらなる分析を促進するため、本出願人は、ヒトシナプシンＩプロモーターの制御下にあるＧＦＰ−ＫＡＳＨドメイン融合タンパク質からなる発現カセットを系に加えた（図２９）。この改変により、ニューロン集団における系の効率のさらなる分析が可能になる（さらに詳細な手順は「核の選別及びｉｎ ｖｉｖｏ結果」の節にある）。

系の４つ全ての部分を、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ融合ポリメラーゼを使用し、以下のプライマーを使用してＰＣＲ増幅した。
（ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮは、標的ゲノム配列の逆相補体である）

本出願人は、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ戦略を用いて単一ステップ反応で系の全てのパーツを組み立てた（１：１分子比）。

Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ反応産物を、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ ＩＩ融合ポリメラーゼ及び以下のプライマーを使用してＰＣＲ増幅した。

ＰＣＲ産物を、ＮｏｔＩ制限部位を使用してＡＡＶ骨格のＩＴＲ配列間にクローニングした。
ＰＣＲ産物消化：

ＡＡＶ骨格消化：

３７℃で２０分間インキュベートした後、ＱＩＡＱｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットを使用してサンプルを精製した。標準化したサンプルを１：３のベクター：インサート比で以下のとおりライゲートした。

細菌をライゲーション反応産物で形質転換した後、本出願人は、得られたクローンをＳａｎｇｅｒシークエンシングで確認した。

Ｃａｓ９構築物とのコトランスフェクション後に陽性ＤＮＡクローンをＮ２ａ細胞で試験した（図３１及び図３２）。

例えば、ＡＡＶ又は他のベクター（例えば、ナノ粒子複合体により送達され得るプラスミドなど）のパッケージングに対応するためにサイズが低下された、ベクター送達のための新しいＣａｓ９構築物の設計
ＡＡＶ送達系は、そのユニークな特徴にも関わらず、パッキングに限界がある−ｉｎ ｖｉｖｏでの発現カセットの送達を成功させるには、４．７ｋｂ未満のサイズでなければならない。ＳｐＣａｓ９発現カセットのサイズを小さくして送達を促進するため、本出願人はいくつかの変更を試験した：異なるプロモーター、より短いポリＡシグナル及び最後により小さいバージョンの黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）（図３３及び図３４）。試験した全てのプロモーターが、マウスＭｅｃｐ２（Ｇｒａｙ ｅｔ ａｌ．，２０１１）、ラットＭａｐ１ｂ及びトランケート型ラットＭａｐ１ｂ（Ｌｉｕ ａｎｄ Ｆｉｓｃｈｅｒ，１９９６）を含め、以前試験され、ニューロンにおいて活性であることが発表されたものである。代替的な合成ポリＡ配列は、同様に機能性であることが以前示されたものである（Ｌｅｖｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９８９；Ｇｒａｙ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。クローニングした全ての構築物を、リポフェクタミン２０００によるトランスフェクション後にＮ２ａ細胞で発現させ、ウエスタンブロッティング法で試験した（図３５）。

初代ニューロンでＡＡＶ多重系の試験
開発した系のニューロンにおける機能性を確認するため、本出願人はｉｎ ｖｉｔｒｏで初代ニューロン培養物を使用する。Ｂａｎｋｅｒ ａｎｄ Ｇｏｓｌｉｎ（Ｂａｎｋｅｒ ａｎｄ Ｇｏｓｌｉｎ，１９８８）により既発表のプロトコルに従いマウス皮質ニューロンを調製した。

神経細胞は１６日目の胚から得られる。安楽死させた妊娠中の雌から胚を摘出し、断頭し、頭部を氷冷ＨＢＳＳに置く。次に頭蓋から鉗子（＃４及び＃５）で脳を摘出し、別の交換した氷冷ＨＢＳＳに移す。氷冷ＨＢＳＳで満たしたペトリ皿において実体顕微鏡及び＃５鉗子の助けを借りてさらなるステップを実施する。半球を互いに分離し、脳幹から髄膜を取り除く。次に海馬を極めて慎重に解剖し、氷冷ＨＢＳＳで満たした１５ｍｌの円錐管に入れる。海馬解剖後に残る皮質を、脳幹の残りの部分及び嗅球を取り除いた後に類似のプロトコルを用いたさらなる細胞単離に使用することができる。単離された海馬は１０ｍｌ氷冷ＨＢＳＳで３回洗浄し、ＨＢＳＳ中トリプシン（海馬当たり１０μｌ ２．５％トリプシンを添加した４ｍｌ ＨＢＳＳ）と共に３７℃で１５分間インキュベートして解離する。トリプシン処理後、海馬を３７℃に予熱したＨＢＳＳで３回極めて慎重に洗浄して痕跡量のトリプシンを取り除き、温ＨＢＳＳ中に解離する。本出願人は、通常、１ｍｌ ＨＢＳＳ中の１０〜１２個の胚から１ｍｌピペットチップを使用して細胞を解離し、解離した細胞を４ｍｌに至るまで希釈する。細胞を２５０細胞／ｍｍ２の密度でプレーティングし、３７℃及び５％ＣＯ２で最長３週間培養する。

ＨＢＳＳ
４３５ｍｌ Ｈ２Ｏ
５０ｍｌ １０×ハンクス平衡塩類溶液
１６．５ｍｌ ０．３Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．３
５ｍｌ ペニシリン−ストレプトマイシン溶液
ろ過（０．２μｍ）及び保存４℃

ニューロンプレーティング培地（１００ｍｌ）
９７ｍｌ Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ
２ｍｌ Ｂ２７サプリメント
１ｍｌ ペニシリン−ストレプトマイシン溶液
２５０μｌ グルタミン
１２５μｌ グルタミン酸

ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞のろ過培地からの濃縮ＡＡＶ１／２ウイルス又はＡＡＶ１ウイルスを、培養下で４〜７日間ニューロンに形質導入し、送達された遺伝子を発現させるため形質導入後少なくとも１週間培養下に保つ。

系のＡＡＶ駆動発現
本出願人は、ＡＡＶ送達後のニューロン培養物におけるＳｐＣａｓ９及びＳａＣａｓ９の発現を、ウエスタンブロット法を用いて確認した（図３７）。形質導入後１週間でニューロンをβ−メルカプトエタノール含有ＮｕＰａｇｅ ＳＤＳローディング緩衝液に回収し、タンパク質を９５℃で５分間変性させた。サンプルをＳＤＳ ＰＡＧＥゲル上で分離し、ＷＢタンパク質検出用のＰＶＤＦ膜に移した。ＨＡ抗体でＣａｓ９タンパク質を検出した。

ｇＲＮＡ多重ＡＡＶからのＳｙｎ−ＧＦＰ−ｋａｓｈの発現が蛍光顕微鏡法で確認された（図４５）。

毒性
ＣＲＩＳＰＲ系を含むＡＡＶの毒性を評価するため、本出願人はウイルス形質導入後１週間のニューロンの全体的な形態を調べた（図４０）。加えて、本出願人は、設計した系の潜在的毒性を、培養下の生細胞と死細胞との区別を可能にするＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）細胞イメージングキットで調べた。これは、細胞内エステラーゼ活性の存在（非蛍光カルセインＡＭから強度に緑色の蛍光カルセインへの酵素変換により決定されるとおりの）に基づく。他方で、キットの赤色の細胞不透過性構成成分は、破損した膜を有する細胞に限り侵入し、ＤＮＡに結合して死細胞で蛍光を生じる。両方のフルオロフォアとも、生細胞では蛍光顕微鏡法で容易に可視化され得る。初代皮質ニューロンにおけるＣａｓ９タンパク質及び多重ｇＲＮＡ構築物のＡＡＶ駆動発現は十分な忍容性を有し、非毒性であった（図３８及び図３９）ことから、設計されたＡＡＶ系がｉｎ ｖｉｖｏ試験に好適であることを示している。

ウイルス産生
ＭｃＣｌｕｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０１１に記載される方法により濃縮ウイルスを作製した。ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞において上清ウイルス産生が生じた。

脳手術
ウイルスベクター注入のため、１０〜１５週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスをケタミン／キシラジンカクテル（１００ｍｇ／ｋｇのケタミン用量及び１０ｍｇ／ｋｇのキシラジン用量）で腹腔内注射により麻酔した。先制鎮痛薬（１ｍｇ／ｋｇ）としてブプレネックス（Ｂｕｐｒｅｎｅｘ）の腹腔内（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｉａｌ）投与を使用した。動物を、耳内位置決めスタッド及びトゥースバーを使用してＫｏｐｆ定位固定装置に固定化し、固定された頭蓋を維持した。ハンドヘルドドリルを使用して、ブレグマの−３．０ｍｍ後方及び３．５ｍｍ側方に、海馬のＣＡ１野における注入用の穴（１〜２ｍｍ）を開けた。３０Ｇ Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔシリンジを２．５ｍｍの深さで使用して、総容積１ｕｌのＡＡＶウイルス粒子の溶液を注入した。注入は「Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＵｌｔｒａＭｉｃｒｏＰｕｍｐ３」注入ポンプにより０．５ｕｌ／分の流量でモニターして組織損傷を防いだ。注入が完了した時点で注射針をゆっくりと、０．５ｍｍ／分の速度で取り出す。注入後、６−０ Ｅｔｈｉｌｏｎ縫合糸で皮膚を閉じた。動物を術後に１ｍＬの乳酸リンゲル液（皮下）で水分補給させ、歩行可能な回復に達するまで温度制御された（３７℃）環境に収容した。術後３週間で深麻酔により動物を安楽死させ、続いて核選別のため組織を摘出するか、又は免疫化学のため４％パラホルムアルデヒドを灌流させた。

核の選別及びｉｎ ｖｉｖｏ結果
本出願人は、標識した細胞核の蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）並びにＤＮＡ、ＲＮＡ及び核タンパク質の下流処理のためｇＲＮＡ標的神経細胞核をＧＦＰで特異的に遺伝的にタグ標識する方法を設計した。そのために、本出願人の多重ターゲティングベクターが、ＧＦＰとマウス核膜タンパク質ドメインＫＡＳＨ（Ｓｔａｒｒ ＤＡ，２０１１，Ｃｕｒｒｅｎｔ ｂｉｏｌｏｇｙ）との間の融合タンパク質及び目的の特異的遺伝子座を標的にする３つのｇＲＮＡの両方を発現するように設計された（図３９）。ＧＦＰ−ＫＡＳＨはヒトシナプシンプロモーターの制御下で発現してニューロンを特異的に標識した。融合タンパク質ＧＦＰ−ＫＡＳＨのアミノ酸は以下であった。

脳へのＡＡＶ１／２媒介性送達後１週間でＧＦＰ−ＫＡＳＨのロバストな発現が観察された。標識された核のＦＡＣＳ及び下流処理のため、術後３週間で海馬を解剖し、勾配遠心ステップを用いて細胞核精製用に処理した。そのために、３２０ｍＭ スクロース、５ｍＭ ＣａＣｌ、３ｍＭ Ｍｇ（Ａｃ）２、１０ｍＭ トリス ｐＨ７．８、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ＮＰ４０、０．１ｍＭ フェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、１ｍＭ β−メルカプトエタノール中で２ｍｌ Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザー（Ｓｉｇｍａ）を使用して組織をホモジナイズした。ホモジナイズ処理物を、２５％〜２９％のＯｐｔｉｐｒｅｐ（登録商標）勾配で製造者のプロトコルに従い３０分間３．５００ｒｐｍ、４℃で遠心した。核ペレットを、３４０ｍＭ スクロース、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ ＫＣｌ、６５ｍＭ グリセロリン酸、５％グリセロール、０．１ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｍＭ β−メルカプトエタノール中に再懸濁し、Ｖｙｂｒａｎｔ（登録商標）ＤｙｅＣｙｃｌｅ^ＴＭＲｕｂｙ染色（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加して細胞核を標識した（ＤＮＡに近赤外放射を提供する）。標識し精製した核を、Ａｒｉａ Ｆｌｕ−ａｃｔ細胞選別機及びＢＤＦＡＣＳ Ｄｉｖａソフトウェアを使用してＦＡＣＳにより選別した。選別されたＧＦＰ＋核及びＧＦＰ−核を最終的に使用することにより、標的ゲノム領域のＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイ分析のためＤＮＡｅａｓｙ血液及び組織キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してゲノムＤＮＡを精製した。同じ手法を、下流処理のための標的細胞からの核ＲＮＡ又はタンパク質の精製に容易に用いることができる。本出願人がこの手法で用いているのが２ベクター系（図３９）であることに起因して、脳のごく一部の細胞（多重ターゲティングベクター及びＣａｓ９コードベクターの両方を同時感染させた細胞）においてのみ効率的なＣａｓ９媒介性ＤＮＡ切断が起こることが予想された。ここに記載する方法は、本出願人が目的の３つのｇＲＮＡを発現する細胞集団からＤＮＡ、ＲＮＡ及び核タンパク質を特異的に精製することを可能にし、従ってＣａｓ９媒介性ＤＮＡ切断を起こすはずである。この方法を用いることにより、本出願人は、ごく一部の細胞においてのみ起こるｉｎ ｖｉｖｏでの効率的なＤＮＡ切断を可視化することができた。

本質的に、本出願人がここで示したものは、標的ｉｎ ｖｉｖｏ切断である。さらに本出願人は多重的手法を使用し、ここではいくつかの異なる配列が同時に、但し独立してターゲティングされる。提供される系は、脳の病的状態（遺伝子ノックアウト、例えばパーキンソン病）の研究に応用することができ、また脳におけるゲノム編集ツールのさらなる開発分野も切り開くことができる。ヌクレアーゼ活性を遺伝子転写制御因子又は後成的制御因子に置き換えることにより、病的状態のみならず、学習及び記憶形成のような生理学的過程における遺伝子調節及び脳の後成的変化の役割に関するあらゆる種類の科学的問題に答えることが可能になる。最後に、提供される技術は、霊長類のようなより複雑な哺乳類系において応用することができ、これにより現在の技術の限界を乗り越えることが可能となる。

実施例２７：効率的なｅｘ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｖｏゲノム編集のためのＣｒｅ依存的ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ノックイントランスジェニックマウス
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９はゲノム編集のための強力な技術であり、その効率性及び多用途性のために広く採用されている。Ｃａｓ９媒介性ゲノム編集用途は魅力的であるが、一般に使用される送達系は非効率的であり、かつ利用できる細胞型に制限があるために、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｅｘ ｖｉｖｏにおけるこれらの適用は困難である。Ｃａｓ９の用途を拡大するために、本出願人はＣｒｅ依存的Ｒｏｓａ２６化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ノックインマウを確立しており、ｓｇＲＮＡ発現カセットのＡＡＶ媒介性送達により脳でのｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子編集、及びナノ粒子媒介性ｓｇＲＮＡ送達による内皮細胞でのｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子編集を含む多様な用途におけるその有用性を実証する。また本出願人により、重要な制御因子の効率的なｅｘ ｖｉｖｏ編集は、初代免疫細胞をトランスフェクト／形質導入して免疫応答の変更をもたらすのは困難であることも実証される。条件的Ｃａｓ９マウスにおけるｅｘ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでの多様な実験系でにおいて遺伝子を効率的に編集する能力は、多数の生物学分野のための価値ある資源であり得る。

ゲノム工学の主要な潜在的利益は、ｉｎ ｖｉｖｏで遺伝子機能に、又はｅｘ ｖｉｖｏで初代細胞に直接摂動を与える能力である（Ｘｕｅ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ａｄｖａｎｃｅ ｏｎ，（２０１４）；Ｙｉｎ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３２，５５１−３（２０１４）；Ｈｅｃｋｌ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．ａｄｖａｎｃｅ ｏｎ，（２０１４））。しかしながら、遺伝的に摂動を受けた細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで多数の細胞型において、又はｅｘ ｖｉｖｏで初代細胞において調査され得る前に、まず生殖系列においてゲノム改変が行われなければならず、次にこれを使用して、実験のための安定したトランスジェニック株を作製することができる。このプロセスは時間がかかると共に、技術的に困難であり、これらはゲノム改変の数及び複雑さが増大するにつれて指数関数的に高まり得る。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）及び転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）媒介性ゲノム工学（主に、ウィルス媒介性送達による）はｉｎ ｖｉｖｏ及びｅｘ ｖｉｖｏで遺伝子を編集するための使用に成功しており、さらには治療的に適用されている（Ｐｅｒｅｚ，Ｅ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６，８０８−１６（２００８）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２９，１４３−８（２０１１））。しかしながら、これらの技術はほとんどは非効率的であり、各所望の標的それぞれに対して完全に新しいタンパク質構築物の作成及び検証を必要とする。

最近になって、ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を効率的に容易にすることにより、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復）に関連された、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のエンドヌクレアーゼＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９、本明細書全体を通してＣａｓ９と省略される）が哺乳類ゲノムの編集に適用されている（Ｃｏｎｇ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１３）；ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２３１１４３；Ｍａｌｉ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９，８２３−６（２０１３））。標的化されたＤＳＢは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）媒介性修復による遺伝子のノックアウトのため、及び修復鋳型の存在下の相同組換え修復（ＨＤＲ）による相同組換えの刺激のために有効な手段を提供する。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ又は単一のガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の対のいずれかによって特定配列に標的化される（Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４７１，６０２−７（２０１１）；Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７，８１６−２１（２０１２）；Ｇａｓｉｕｎａｓ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０９，Ｅ２５７９−８６（２０１２））。ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮに対するＣａｓ９の顕著な利点は、新しい配列の標的化がｓｇＲＮＡの設計だけを必要とし、新しいタンパク質は必要でないことである。さらに、Ｃａｓ９を複数のｓｇＲＮＡと組み合わせて、同時に複数の遺伝子に摂動を与えることができ（Ｃｏｎｇ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１３）；ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２３１１４３；Ｍａｌｉ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９，８２３−６（２０１３）；Ｘｉａｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４１，ｅ１４１（２０１３））、機能性ゲノムの選別のためにｓｇＲＮＡのライブラリ或いはと組み合わせることができる（Ｓｈａｌｅｍ，Ｏ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４３，８４−７（２０１４）；Ｓａｎｊａｎａ，Ｎ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １１，７８３−７８４（２０１４））。

Ｃａｓ９媒介性ゲノム編集用途は魅力的であるが、主としてその大きい導入遺伝子サイズ（４．１ｋｂ）のために、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｅｘ ｖｉｖｏにおけるこれらの適用は挑戦的である。ウイルスベクターなどの一般的に使用される送達系は厳密なパッケージング制限を有し、従って、導入遺伝子サイズが増大するにつれて、送達のために利用可能な選択肢は低減する（Ｋｕｍａｒ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２，１８９３−９０５（２００１））。さらに、導入遺伝子サイズが増大するにつれて、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｅｘ ｖｉｖｏで細胞を効率的に形質転換するために必須である高力価ウイルスを作成する能力も著しく低下する（Ｋｕｍａｒ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２，１８９３−９０５（２００１））。その結果、Ｃａｓ９含有ウイルスベクターは、付加的な遺伝子エレメント（即ち、ｓｇＲＮＡ、相同組換えドナー鋳型、蛍光タンパク質、修飾因子など）を単一のベクター内に包含する能力が限られおり、低力価の欠点があり、同時に様々な細胞型における遺伝子編集の柔軟性が限られている。

Ｃａｓ９のより広範な適用を容易にするために、本出願人は、Ｃｒｅ依存的Ｒｏｓａ２６ ３ｘＦＬＡＧタグ化Ｃａｓ９−Ｐ２Ａ−ＥＧＦＰノックイントランスジェニックマウス（図４６ａ）を作製した。これは、著しいＣａｓ９送達負荷を除去し、遺伝子編集を達成するためにＣｒｅ及びｓｇＲＮＡの送達を必要とするだけである。しかしながら、顕著な問題は、Ｃａｓ９発現が誘発されると、非特異的なヌクレアーゼ活性のために毒性が発生し得ることであった。従って、これを試験するための広範な方法として、本出願人は、Ｃｒｅ依存的Ｃａｓ９マウスをβアクチンＣｒｅドライバー株に交配することによって全ての細胞において構成的Ｃａｓ９発現を有する亜株を作製した（Ｌｅｗａｎｄｏｓｋｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．６２，１５９−６８（１９９７））。得られたこの交配の子孫は生存可能であり、全臓器レベル（図４６ｂ及び４９）及び全脳ライセート中のタンパク質レベル（図４６ｃ）でＣａｓ９発現が観察された。これは、Ｃｒｅ依存的Ｃａｓ９マウス（図５０）又は野生型対照（図４６ｂ、ｃ及び４９、５０）では観察されなかった。さらに、構成的Ｃａｓ９発現動物は繁殖性であり、正常な産子数を有し、形態学的異常は示さず、ホモ接合性に繁殖することができた。細胞レベルにおいて、本出願人は、形態学的異常又はＤＮＡ損傷及びアポトーシスマーカーの上方制御がないことも見出した（図５１及び５２）。まとめると、これらのデータは、Ｃａｓ９発現がＣｒｅ依存的Ｃａｓ９マウスでは厳重に制御されており、いくつかの測定基準を用いて検出可能な毒性を生じることなく構成的な発現が保持され得ることを示唆する。

ゲノム内のＣａｓ９導入遺伝子が機能性であるかどうかを決定するために、本出願人は、ＨＡタグ付きＣｒｅ及びｓｇＲＮＡのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介性送達が、ｉｎ ｖｉｖｏで脳においてインデル形成を媒介し得るかどうかを試験した。本出願人は、高発現のニューロン特異的ＲＮＡ−スプライシング因子ＮｅｕＮに標的化されたｓｇＲＮＡ（ｓｇＮｅｕＮ）（図４６ｅ）を含有するＡＡＶ−Ｕ６−ｓｇＲＮＡ−Ｃｒｅベクター（ＡＡＶ−ｓｇＲＮＡ）構築し（図４６ｄ）、Ｃｒｅ依存的Ｃａｓ９マウスの前頭前野に定位的に注入することにより送達するために、ＡＡＶ血清型１及び２（ＡＡＶ１／２）を用いてベクターをパッケージングした（図４６ｆ）。注射の３週間後に、本出願人は、注入した脳領域を鋭く切開し、下流アッセイのために組織を使用した。ＮｅｕＮ遺伝子座ディープシークエンシングにより予測切断部位の近くでインデル形成が示され（図４６ｅ）；Ｃａｓ９は機能性であり、ＤＳＢを容易にした。さらに、これらの同じサンプルで、本出願人は、注入領域でのみＮｅｕＮタンパク質が枯渇結合されることを観察し（図４６ｇ、ｈ）、対照（非注入及びＬａｃＺ標的化ｓｇＲＮＡ、ｓｇＬａｃＺと呼ばれる）では観察されなかった（図４６ｉ）。この効果を定量化するために、本出願人は、３匹のマウスからの組織において免疫ブロット及びディープシークエンシングを実施し、ＮｅｕＮタンパク質発現がほぼ８０％低減されたことを見出した（図４６ｊ）が、標的部位においてインデルはシークエンシング読取りの８５％で見出された（図４６ｋ）。

免疫ブロット及び全組織インデル分析はＣａｓ９によるゲノム編集の全体的な見解を提供するが、単一の細胞レベルでの改変の度合いは捕らえられない。例えば、単一の細胞を単離しなければ、本出願人は、本戦略における遺伝的異質性の理解のために重要である、１つ又は両方のアレルが個々の細胞内で編集されてよいことを確認することができない。しかしながら、その複雑なモルホロジーのために、脳内の個々のインタクトなニューロンの単離は困難である。これを克服するため、及び単一細胞の遺伝分析を容易にするために、本出願人は、以前に示されていた（Ｏｋａｄａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２２６，５５２−８（２０１１））個々のニューロン核の単離を試みた。Ｃａｓ９−Ｐ２Ａ−ＥＧＦＰ導入遺伝子に由来のＥＧＦＰの細胞質発現は個々の核を単離するために不十分不であり、従って、本出願人は、単一のベクター（ＡＡＶ−ｓｇＲＮＡ−ｈＳｙｎ−Ｃｒｅ−Ｐ２Ａ−ＥＧＦＰ−ＫＡＳＨ）を作製し、ｓｇＲＮＡ、Ｃｒｅ、及びＫＡＳＨ（Ｋｌａｒｓｉｃｈｔ，ＡＮＣ−１，Ｓｙｎｅ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ）核膜貫通ドメインに融合したＥＧＦＰを発現させた。下流分析のために、本出願人は蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用して、単一のＥＧＦＰ陽性核を単離した。１６７個の単一の核のシークエンシングにより、形質導入細胞の８４％（ｎ＝１４１）は両方のアレルが編集（ホモ接合性）されており、わずか９％（ｎ＝１５）の核は単一のアレルの改変を有し、及び７％（ｎ＝１１）は改変されないままであることが示された（図４６ｌ）。１５個のヘテロ接合核のうち改変アレルは全てミスセンス（ｍｉｓ）突然変異を含有し、１４１個のホモ接合核はミスセンス（ｍｉｓ）及びセンス（ｓｅｎ）突然変異の両方を含有した（図４６ｍ）。

Ｃａｓ９ウイルス媒介性発現は、注入された組織内の不均一な細胞を標的とするために効率的であり、様々な用途のために有用である。しかしながら、細胞サブタイプの広い多様性は生物学的プロセスにおいて基本的な役割を果たし、個々に摂動されることが必要であり、これは多くの場合、ウイルスベクターを用いて行うことができない。異種発現のための組織特異的及び細胞型特異的プロモーターが存在するが、これらは多くの場合、大きいか、或いは厳密に制御されず、特異性の低下が生じる（Ｌｅｗａｎｄｏｓｋｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．６２，１５９−６８（１９９７））。組織特異的又は細胞型特異的な発現を達成するための強力な方法は、Ｃｒｅドライバー株の使用によるものである。Ｃｒｅ依存的Ｃａｓ９マウスと様々な種類の利用可能なＣｒｅドライバー株とを結合することにより、特定の細胞型におけるＣａｓ９発現、及びその後、これらの細胞におけるｉｎ ｖｉｖｏのゲノム編集を達成するための強力な手段が提供され得る。従って、本出願人は、２つのＣｒｅドライバー株、即ち、ドーパミン作動性ニューロンに対するチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ−ＩＲＥＳ−Ｃｒｅ）ドライバー、及び抑制性介在ニューロンのサブタイプに対するパルブアルブミン（ＰＶ−Ｃｒｅ）ドライバーによりＣｒｅ依存的Ｃａｓ９マウスを交配させ、本出願人がニューロンサブタイプ特異的Ｃａｓ９発現を達成できたかどうかを決定した。予想どおりに、Ｃａｓ９発現はＴＨ又はＰＶ陽性細胞に制限された（図４７ａ、ｂ）。

Ｃａｓ９発現ニューロンのモルホロジーは野生型対照と全く違いはなかったが、ニューロンは特にトランス遺伝子発現に特に敏感であり、従って、異常な生理学的特性を有し得る。従って構成的Ｃａｓ９発現が細胞の健康及び生理機能に悪影響を与えないことを保証するために、本出願人は電気生理学的測定パネルを用いて、Ｃａｓ９発現ニューロンの基礎機能を検査した。本出願人は発火（ｆｉｒｉｎｇ）しきい値（図４７ｃ、ｄ）、及び基電流（図４７ｅ）を調査するために、急性海馬切片からのＣＡ１錐体ニューロンにおける全細胞パッチクランプ記録を実施し、対照と構成的Ｃａｓ９発現マウスとの間に有意な変化がないことを見出した（補表２）。さらに、入力抵抗（図４７ｆ）、全細胞容量（図４７ｇ）、又は膜静止電位（図４７ｈ）において有意な変化はなかった。まとめると、これらのデータは、ニューロン、特に感受性細胞型の基本的な特性がＣａｓ９の異種発現によって変更されていないことを示唆する。

Ｃｒｅドライバーの使用により達成される細胞型特異性は価値があるが、細胞型特異的プロモーターが同定されている場合にだけ可能である。実際、特異的プロモーターがなければ、特定の細胞における遺伝子摂動は困難である。従って、遺伝的交雑又はウイルス送達を実施することなく本出願人が細胞型特異性を達成できたかどうかを決定するために、本出願人は、本出願人がＣａｓ９マウスの構成的発現と、ｉｎ ｖｉｖｏのｓｇＲＮＡ送達のための他のターゲティング方法とを結合できたかどうかを試験することを試みた。

本出願人は、ｉｎ ｖｉｖｏで内皮細胞に対して特異的である低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の送達を媒介するために開発された内皮特異的ナノ粒子（Ｄａｈｌｍａｎ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．９，６４８−６５５（２０１４））７Ｃ１を適合させた。７Ｃ１は、ほとんどのナノ粒子と同様に、ｓｇＲＮＡよりも５倍を超えて小さいｓｉＲＮＡなどの特定のカーゴを送達するために最適化された。７Ｃ１がｓｇＲＮＡと共に処方され得るかどうかを決定するために、本出願人は７Ｃ１ナノ粒子とｓｇＲＮＡとを結合し、多重膜構造を観察した（図４８ｂ）（Ｄａｈｌｍａｎ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．９，６４８−６５５（２０１４））。驚くことに、ｓｉＲＮＡと比べてより大きいサイズのｓｇＲＮＡは、ナノ粒子製剤に有意な影響を与えなかった。次に、ｉｎ ｖｉｖｏでのｓｇＲＮＡナノ粒子媒介性送達の可能性を試験するために、本出願人は、内皮特異的遺伝子細胞間接着分子２（ＩＣＡＭ２）を標的とする２０個の独特のｓｇＲＮＡを設計した。マウス由来Ｎ２ａ細胞株におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ切断アッセイで２つの最も強力なｓｇＲＮＡを決定した（図５３）後、ｓｇＩＣＡＭ２−１及びｓｇＩＣＡＭ２−２０と命名した２つの最も強力なｓｇＲＮＡを７Ｃ１ナノ粒子と一緒に配合した（７Ｃ１：ｓｇＩＣＡＭ２−１＋２０）。続いてこれらを、０日目、３日目、７日目、１０日目、及び１３日目に尾静脈注射により１．５ｍｇ／ｋｇで構成的Ｃａｓ９発現マウスに投与した。

標的内皮細胞におけるＣａｓ９媒介性ゲノム編集効率を試験するために、２１日目にマウス犠牲にし、ＦＡＣＳを用いて肺及び心血管の内皮細胞（ＣＤ３１^＋及びＣＤ４５⁻）を単離した。ｓｇＩＣＡＭ２−１＋２０で処置したマウスについて、本出願人は、肺及び心血管内皮細胞の両方において両方の標的部位でインデル形成を観察した（図４８ｃ、ｄ、ｅ）が、対照では観察されなかった。これらの結果と一致して、本出願人は、肺（６０％）（図４８ｆ）及び心血管（７０％）（図４８ｇ）内皮細胞におけるＩＣＡＭ２タンパク質発現レベルの低下も観察した。全般的な健康の肉眼的測定（Ｄａｈｌｍａｎ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．９，６４８−６５５（２０１４））として、本出願人は、本出願人の研究の過程にわたって、注射した動物の体重も追跡し、有意な変化は見られなかった（図４８ｈ）。これらのデータは、ｓｉＲＮＡ送達に最適化された送達ビヒクルを構成的Ｃａｓ９発現マウスへのｓｇＲＮＡ送達にも利用することができ、非ウイルス細胞型特異的ゲノム編集が可能になり、ｉｎ ｖｉｖｏでのＣａｓ９による編集のために新しい細胞型が利用できるようになることを広く実証する。

本出願人がＣａｓ９の有用性を拡大し得るかどうかを決定するために、さらに、本出願人が、トランスフェクト及び形質導入するのが特に困難である初代細胞を遺伝的改変することを試みた。初代免疫細胞は、送達の課題、培養下での短い生存期間、又はその両方のために、多くの場合遺伝子操作に利用できない。例えば、自然免疫樹状細胞（ＤＣ）は、適応性免疫細胞への迅速なサイトカイン及び抗原提示により病原体の検出及び適切な免疫応答の開始を特定化する（Ｍｅｌｌｍａｎ，Ｉ．＆ Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ｒ．Ｍ．Ｃｅｌｌ １０６，２５５−８（２００１））。現存する細胞株はＤＣ生物学を十分に模倣しないため、多くの研究は、骨髄（ＢＭＤＣ）から単離された前駆体にｅｘ ｖｉｖｏで由来する初代細胞を用いて実施され、これは、ｉｎ ｖｉｖｏのＤＣの多くの重要な特性を保持している（Ａｍｉｔ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６，２５７−６３（２００９）；Ｃｈｅｖｒｉｅｒ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １４７，８５３−６７（２０１１）；Ｇａｒｂｅｒ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ４７，８１０−２２（２０１２）；Ｓｈａｌｅｋ，Ａ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４９８，２３６−４０（２０１３））。主にレンチウイルス送達によるショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）媒介性遺伝子摂動は、遺伝子発現に摂動を与えるために良好にかつ高度に多重化された方法で使用されており、ＤＣの調節及びシグナル伝達経路を切断する（Ａｍｉｔ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６，２５７−６３（２００９）；Ｃｈｅｖｒｉｅｒ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １４７，８５３−６７（２０１１））。しかしながら、ノックダウンは多くの場合不十分であり、潜在的なオフターゲット効果のために詳細な検証が必要とされる。

ゲノム編集アプローチは魅力的であるが、ＢＭＤＣはトランスフェクトするのが難しく、培養中で数日しか保持することができないため、これらをＢＭＤＣに適用することは困難である。実際に、Ｃａｓ９の細胞への導入は顕著な技術的障害であった；Ｃａｓ９を含有するレンチウイルスベクターは必ずしも大きくなく、低ウイルス力価をもたらしこのアプローチの適用性は決定的に低下される。多くの他の初代細胞、特に免疫細胞は、同程度又はそれ以上に困難である（Ｓｈａｌｅｋ，Ａ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．１２，６４９８−５０４（２０１２））。従って、本出願人は、遺伝子編集に必要とされるであろう全てのものは、レンチウイルス内に効率的にパッケージングされ得るｓｇＲＮＡの付加的な形質導入であるため、構成的Ｃａｓ９発現マウスに由来するに由来する細胞におけるＣａｓ９の構成的発現がこのような用途を容易にし得ると判断した。

この研究では、本出願人は、Ｃｒｅ依存的及び構成的Ｃａｓ９発現マウスを導入し、これはさらに、Ｃａｓ９媒介性ゲノム編集の範囲がｉｎ ｖｉｖｏ及びｅｘ ｖｉｖｏの特定の細胞型を含む。本出願人は、Ｃａｓ９マウスを使用して、脳内の遺伝子を改変し、Ｃａｓ９発現を細胞のサブタイプに限定し、ナノ粒子媒介性ｓｇＲＮＡ送達により内皮細胞を特異的に編集し、また初代免疫細胞においても遺伝子を編集して、免疫応答の変更が生じ得ることを実証した。これらの用途はそれぞれＣａｓ９の有用性を拡大し、そのｉｎ ｖｉｖｏ及びｅｘ ｖｉｖｏ用途が直面される著しい困難に対処する。Ｃａｓ９発現の誘導及びｓｇＲＮＡの送達のための柔軟性は、ＡＡＶ及びレンチウイルスの形質導入、ナノ粒子媒介性送達、及びＣｒｅドライバー株との遺伝的交雑を含む様々な種類の標的化方法を用いて実証した。ここで実証される適用例は、これらのＣａｓ９トランスジェニックマウス株を伴う、より広範囲の生物学的実験を可能にする。

倫理の記述。全ての実験プロトコルは、ＭＩＴのＣＡＣ（Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ）により承認されたものであり、実験動物のケア及び使用（ＣＡＲＥ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ）（Ｅｉｇｈｔｈ版、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｉｅｓ）のガイドラインに従った。

Ｃｒｅ依存的Ｃａｓ９マウスの作製。Ｃｒｅ依存的Ｃａｓ９ノックインマウスをＲ１胚幹細胞における相同組換えにより作製し、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２１１−２４８（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ，２０１０）；ｄｏｉ：１０．１００２／９７８０４７０７１１６７５．ｃｈ１０においてＨｅｙｅｒ，Ｍ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．により以前に記載されたような標準的な手順を用いてＣ５７ＢＬ６／Ｊ胚盤胞に移植した。簡単に言うと、コドン最適化３ｘＦＬＡＧ−ＮＬＳ−ＳｐＣａｓ９−ＮＬＳ−Ｐ２Ａ−ＥＧＦＰ発現カセットをＡｉ９Ｒｏａｓ２６ターゲティングベクターにクローニングし（Ｍａｄｉｓｅｎ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１３，１３３−４０（２０１０））、シークエンシングによってさらに検証した。直線化ターゲティングベクターをＲ１胚幹細胞に電気穿孔した後、一週間Ｇ４１８及びＤＴＡを選択した。両方の組換えアームを増幅するプライマーによりＰＣＲによって、標的とされる単一のＥＳ細胞コロニーを選別し、ＰＣＲ産物をシークエンシングして、正しい挿入をさらに検証した。キメラマウスを作製するために、正しく標的化されたコロニーをＣ５７ＢＬ６／Ｊ胚盤胞に注入した。高い割合のオスのキメラマウスをＣ５７ＢＬ６／Ｊメスマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）と交配させ、生殖系列伝達ファウンダーを確立した。Ｃａｓ９マウスの遺伝子型は、精製マウステールＤＮＡから４．５ｋｂ産物を増幅することにより決定した（フォワードプライマー：ＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＴＴＣＣＡＣＡＴＡＣＡＣ；リバースプライマー：ＡＣＣＡＴＴＣＴＣＡＧＴＧＧＣＴＣＡＡＣＡＡ）。

ＤＮＡベクター及びｓｇＲＮＡの設計。マウス脳への定位位注入に使用したＡＡＶベクターはＡＡＶ血清型２ＩＴＲの間にクローニングされ、ｓｇＲＮＡ転写の非コードのためのヒトＵ６プロモーター、遍在性Ｃｂｈプロモーター、ｌｏｘＰ−ＳＶ４０ポリＡ−ＬｏｘＰの組換えのためのＨＡタグ付きＣｒｅリコンビナーゼ、ＷＰＲＥ、おｙびヒト成長ホルモンポリＡ配列も含有した。核選別のために、同様のプラスミドはＡＡＶ血清型２ＩＴＲの間にクローニングされ、ｓｇＲＮＡ転写の非コードのためのヒトＵ６プロモーター、遍在性ｈＳｙｎプロモーター、ｌｏｘＰ−ＳＶ４０ｐｏｌｙＡ−ＬｏｘＰの組換えのためのＨＡタグ付きＣｒｅリコンビナーゼ、Ｐ２Ａ、核標識のためのＥＧＦＰ−ＫＡＳＨ融合体、ＷＰＲＥ、及びヒト成長ホルモンポリＡ配列も含有した。ｓｇＲＮＡは、潜在的なオフターゲット効果を最小限にするようにＣＲＩＳＰＲｔｏｏｌ（ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕ）を用いて設計した。ｓｇＲＮＡ配列及びゲノムプライマーは補表Ｓ１に記載される。ｓｇＲＮＡは、Ｃａｓ９を構成的に発現するプラスミドによるＮ２ａマウス細胞株への一過性にコトランスフェクト（リポフェクタミン２０００、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によりｉｎ ｖｉｔｒｏで検証した。ゲノムＤＮＡはトランスフェクションの７２時間後に回収した。

ＡＡＶ１／２の産生。ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから、１０５６９−０１０）において、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を目的のプラスミド、ｐＡＡＶ１プラスミド、ｐＡＡＶ２プラスミド、ヘルパープラスミドｐＤＦ６、及びＰＥＩ Ｍａｘ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．２４７６５−２）によりトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後に、細胞培地を廃棄した。次に、細胞を洗浄し、低速遠心分離によりペレット化した。その後、ウイルスをＨｉＴｒａｐヘパリンカラム（ＧＥ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ １７−０４０６−０１）に適用し、モル濃度の増大を伴う一連の塩溶液で洗浄した。最終段階の間に、Ａｍｉｃｏｎ ｕｌｔｒａ−１５遠心ろ過装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＵＦＣ９１００２４）を用いてヘパリンカラムからの溶出液を濃縮した。カスタムＣｒｅ標的Ｔａｑｍａｎプローブ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いる定量ＰＣＲにより、ウイルス粒子の滴定を行った。

ＡＡＶの定位注入。手術を開始する前に、術前、手術、及び術後領域を画定した。本出願人は、全てのツールがオートクレーブされており、試薬は滅菌であることを保証した。本出願人は、ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）の混合物を麻酔のために腹腔内投与した。角膜反射の不在、足蹠への加圧後の足逃避の不在、及び尾を挟んだときの驚愕の不在により、麻酔レベルをモニターした。また本出願人は、先制鎮痛薬としてブプレノルフィンＨＣｌ（０．１ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与した。

対象マウスが深く麻酔されたら、頭蓋を固定化するために耳内位置決めスタッド及びトゥースバーを使用して、Ｋｏｐｆ定位固定装置にそれらを固定化した。保温のために標準的な加熱パッドにより熱が提供される。次に、本出願人は認可された開頭手術を進めた。本出願人は、ブレグマの１．９４ｍｍ前側及び０．３９ｍｍ側方おいて、前頭前野への注入のために頭蓋骨表面にドリルで穴を開けた。３３Ｇ Ｎａｎｏｆｉｌニードル及びＷｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｎａｎｏｆｉｌシリンジを−２．９５ｍｍの深さで用いて、本出願人は１ｕＬのＡＡＶを脳の右半球に注入した。Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＵｌｔｒａＭｉｃｒｏＰｕｍｐ３により注入速度をモニターした。注入の後、本出願人は、６−０Ｅｔｈｉｌｏｎ縫合糸（Ｅｔｈｉｃｏｎ ｂｙ Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ）で切開部位を閉鎖した。手術後に１ｍＬの乳酸リンゲル液（皮下）で動物を水分補給させ、歩行可能な回復に達するまで温度制御された（３７℃）環境に収容した。術後の痛みを軽減するために、手術直後にメロキシカム（１〜２ｍｇ／ｋｇ）も皮下投与した。

電気生理学。データ獲得及び分析は、以前の報告（Ｈａｎ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５０３，７２−７（２０１３）；Ｐｅｃａ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ，４７２（７３４４），４３７−４２）に記載されるように実験者にマウス遺伝子型を知らせずに実施した。８〜１０週齢の同腹子対の成体野生型及びホモ接合性構成的Ｃａｓ９発現マウスから切片を作製した。アベルチン（１．２５％、ｖ／ｖ）の腹腔内注射によりマウスに深く麻酔をかけ、３０のＮａＣｌ、１９４のスクロース、４．５のＫＣｌ、１０のグルコース、２６のＮａＨＣＯ_３、１．２のＮａＨ_２ＰＯ_４、０．２のＣａＣｌ_２及び８のＭｇＣｌ_２を（ｍＭ単位で）含有するカルボゲン化（ｃａｒｂｏｇｅｎａｔｅｄ）（９５％Ｏ２、５％ＣＯ２）氷冷カッティング溶液を経心的に灌流した。氷冷スクロースベースのカッティング溶液を充填したチャンバ内でビブラトーム（ｌｅｉｃａ ＶＴ １２００Ｓ）を用いて、メディア（ｍｅｄｉａ）海馬の典型的なＣＡ１層を含有する急性冠状脳切片を作製した。スクロースカッティング溶液中で３００μｍの切片を切断し、次に、ＡＣＳＦ中３２℃で１２分間、回収チャンバに移した。ＡＣＳＦは、１１９のＮａＣｌ、２．３のＫＣｌ、１１のグルコース、２６．２のＮａＨＣＯ_３、１のＮａＨ_２ＰＯ_４、２．５のＣａＣｌ_２及び１．３のＭｇＳＯ_４を（ｍＭ単位で）含有した。回収の後、切片を室温（２５℃）で少なくとも１時間ＡＣＳＦに移した後、記録した。ＣＡ１錐体ニューロンの全細胞記録は、ＭｕｌｔｉＣｌａｍｐ ７００Ａ増幅器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ，ＵＳＡ）を用いて、ＤＩＣ正立顕微鏡（ＢＸ５１ＷＩ、Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｊａｐａｎ）下で行った。Ｆｌａｍｉｎｇ／Ｂｒｏｗｎマイクロピペットプラー（モデルＰ−９７、Ｓｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，ＵＳＡ）を用いて、３〜４ＭΩの抵抗を有する記録電極をガラス毛管（Ｋｉｎｇ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｇｌａｓｓ、ガラスタイプ８２５０）から引き出し、以下を（ｍＭ単位で）含有する内部溶液を充填した：１３１のＫ−グルコン酸、１７．５のＫＣｌ、１のＭｇＣｌ_２、１．１のＥＧＴＡ、１０のＨＥＰＥＳ、９のＮａＣｌ、２のＡＴＰ、０．２のＧＴＰ、１０のホスホクレアチン（ｐＨ７．２）及び容量オスモル濃度２８０−２９０ｍＯｓｍ／Ｌ。通常は１０〜２０ＭΩの範囲内である直列抵抗をモニターし、記録中は補償しなかった。Ｄｉｇｉｄａｔａ−１４４０Ａインターフェース（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）によりｐＣｌａｍｐソフトウェア（Ｃｌａｍｐｅｘ １０．２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を用いて、シグナルを１０Ｋ Ｈｚの頻度でサンプリングし、２Ｋ Ｈｚでフィルタリングした。データは平均±Ｓ．Ｅ．Ｍで表した。統計学的有意性は、対応のない両側Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ検定を用いて検査した。

ゲノムＤＮＡ抽出、キャプチャード（ｃａｐｔｕｒｅｄ）シークエンシング、及びインデル分析。推奨されるプロトコルに従い、Ｑｕｉｃｋ Ｅｘｔｒａｃｔ ＤＮＡ抽出溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を用いて、細胞及び組織の両方からゲノムＤＮＡを抽出した。以前記載された（Ｈｓｕ，Ｐ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１，８２７−３２（２０１３））ように、高忠実性ポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、キャプチャードシークエンシング及びＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼアッセイの両方について、処置細胞及び組織をＰＣＲの鋳型として使用した。低サイクルの第１回目のＰＣＲは、標的部位を増幅するために使用した。第２回目のＰＣＲは一般的なアダプターを追加するために実施し、これは次に第サンプルバーコーディングのための３回目のＰＣＲに使用した。サンプルを同量で貯蔵し、ＱｉａＱｕｉｃｋ ＰＣＲＣｌｅａｎｕｐ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、Ｑｕｂｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて定量化し、ＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）においてシークエンシングした。インデル分析は、以前に記載された（Ｈｓｕ，Ｐ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１，８２７−３２（２０１３））ように、カスタムスクリプトを用いて実施した。データは平均±Ｓ．Ｅ．Ｍで表した。統計学的有意性は、対応のない両側Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ検定を用いて検査した。

ＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼアッセイ。標的部位のＰＣＲ増幅を精製し、ＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼアッセイ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃｓ）への入力として使用した。製造業者の推奨プロトコルに従った。ＳＵＲＶＥＹＯＲヌクレアーゼアッセイ処理産物を４〜１２％ＰＡ−ＴＢＥゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において実行し、Ｓｙｂｒ Ｇｏｌｄ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により染色し、ゲルイメージャー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）において画像形成した。インデルパーセントは関連バンド強度を用いて定量化した。

ウエスタンブロット分析。ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてタンパク質ライセートを定量化し、４〜２０％Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ Ｇｅｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上に等しく負荷した。タンパク質をＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上、ブロック（ｂｌｏｃｋｅｄ）溶液（ＴＢＳ−Ｔ（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を有するｔｒｉｓｐ緩衝生理食塩水）中５％のＢＬＯＴ−ＱｕｉｃｋＢｌｏｃｋｅｒ（Ｇ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））に移し、オービタルシェーカーにおいて、以下の一次抗体を用いて４℃で一晩染色した：抗ＦＬＡＧ（１：１０００、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｆ１８０４）、ＨＲＰ結合抗Ｇａｐｄｈ（１：５０００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３６８３）、抗β−チューブリン（１：１０００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２１２８）、及び抗ＨＡ（１：１０００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３７２４及び２３６７）。膜をＴＢＳ−Ｔで３回洗浄し、室温で１時間二次抗体により染色した。本出願人は、ＨＲＰ結合二次抗体（１：１００００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、７０７４及び７０７６）を使用した。染色した膜をＴＢＳ−Ｔ中で３回洗浄し、次にＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｐｔｏ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて現像し、ゲルイメージャー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）において画像形成した。

免疫染色及び画像形成。脳組織の採取に備えてマウスに致死量のケタミン／キシラジンを与えた。マウスにぜん動ポンプ（Ｇｉｌｓｏｎ）を用いて０．９％生理食塩水、及びその後に４％パラホルムアルデヒドを経心的に灌流した。採取した脳組織を一晩固定し、翌日にリン酸緩衝食塩水に移した。ビブラトーム（Ｌｅｉｃａ ＶＴ１０００Ｓ）において４０μｍの厚さで組織の切片作製を実施した。０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（ＰＢＳ−Ｔｘ）を含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で切片３回を洗浄した。ＰＢＳ−Ｔｘ中で１時間、５％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）により切片をブロックした。オービタルシェーカーにおいて４℃で一晩、５％ＮＧＳを含むＰＢＳ−Ｔｘ中に希釈した一次抗体と共に切片をインキュベートした。以下は、利用した一次抗体のリストである：抗切断カスパーゼ３（ＣＣ３）（１：１０００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９６６４）、抗ｙＨ２ＡＸ（１：１０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、０５−６３６）抗ＮｅｕＮ（１：８００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１２９４３）、抗ＧＦＰ（１：１６００、Ｎａｃａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ、ＧＦ０９０Ｒ）、抗パルブアルブミン（１：１０００、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐ３０８８）及び抗チロシンヒドロキシラーゼ（１：１０００、Ｉｍｍｕｎｏｓｔａｒ、２２９４１）。翌日、切片をＰＢＳ−Ｔｘ中で３回洗浄する。次に、オービタルシェーカーにおいて、適切なＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４０５、４８８、５６８及び／又は６４７二次抗体（１：４００、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むＰＢＳ−Ｔｘ中、室温で３時間、切片をインキュベートする。インキュベーションの後、切片をＰＢＳ−Ｔｘで３回洗浄し、次にスーパーフロスト顕微鏡スライド（ＶＷＲ）に載せる。次に、ＤＡＰＩを伴うＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ ＨａｒｄＳｅｔ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ（ＶＥＣＴＯＲ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により切片にカバースリップを載せ、共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ７１０、Ａｘ１０ＩｍａｇｅｒＺ２、Ｚｅｎ２０１２Ｓｏｆｔｗａｒｅ）下で可視化する。

単一ニューロン核の精製及びＦＡＣＳ。ニューロン核を標識化するために、本出願人は、ＡＡＶ−Ｕ６−ｓｇＲＮＡ−ｈＳｙｎ−Ｃｒｅ−Ｐ２Ａ−ＥＧＦＰ−ＫＡＳＨベクターを作製した。注射の３週間後に、本出願人は、前頭前野の注入部位の急性切開を実施した。２ｍｌ加圧型細胞破砕装置（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）（乳棒Ａで２５回、及びその後乳棒Ｂで２５回）を用いて、２ｍｌの氷冷均質化緩衝液（ＨＢ）（３２０ｍＭのスクロース、５ｍＭのＣａＣｌ、３ｍＭのＭｇ（Ａｃ）_２、１０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．８、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＮＰ４０、０．１ｍＭのＰＭＳＦ、１ｍＭのβ−メルカプトエタノール）中で組織を穏やかに均質化した。さらに３ｍｌのＨＢを添加し、混合物を５分間氷上に置いた。５ｍＭのＣａＣｌ、３ｍＭのＭｇ（Ａｃ）_２、１０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．８、０．１ｍＭのＰＭＳＦ、１ｍＭのβ−メルカプトエタノールを含有する、５ｍｌの５０％ＯｐｔｉＰｒｅｐ^ＴＭ密度勾配媒体（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて、勾配遠心分離を実施した。円錐３０ｍｌ遠心管（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、ＳＷ２８ローター）内の２９％等浸透圧性（ｉｓｏ−ｏｓｍｏｌａｒ）ＯｐｔｉＰｒｅｐ溶液の上部に、核含有混合物（ｍｉｓｔｕｒｅ）を穏やかに添加した。サンプルを４℃において１０１００ｘｇ（７，５００ｒｐｍ）で３０分間遠心分離した。上清を除去し、６５ｍＭのβ−グリセロリン酸（ｐＨ７）、２ｍＭのＭｇＣｌ_２、２５ｍＭのＫＣｌ、３４０ｍＭのスクロース及び５％のグリセロール中に核ペレットを穏やかに再懸濁させた。Ｖｙｂｒａｎｔ ＤｙｅＣｙｃｌｅ^ＴＭＲｕｂｙ Ｓｔａｉｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてインタクトな核を標識化し、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩＩを用いて選別した。５μｌのＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を含有する９６ウェルプレートの個々のウェルの中にＥＧＦＰ^＋核を選別した。

７Ｃ１ナノ粒子製剤。Ｄａｈｌｍａｎ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．９，６４８−６５５（２０１４）から適合された手順で、７Ｃ１ナノ粒子を合成し、精製し、処方し、及び特徴付けした。具体的には、１００％ＥｔＯＨ中でＣ１５エポキシド末端脂質を低分子量（ＭＷ＝６００）ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）に４８時間混合することによって７Ｃ１を合成した。次に、７Ｃ１をシリカカラムで精製した後、純粋な７Ｃ１をマイクロ流体チャネル中でＣ１４ＰＥＧ２０００及びｓｇＲＮＡと混合して、粒子を形成した。以前に記載されたように、粒子をＰＢＳ中に０．０１ｍｇ／ｍＬの濃度まで希釈した後、動的光散乱により粒径を特徴付け、粒子の内部構造はｃｒｙｏＴＥＭにより画像形成した。

肺及び心臓内皮細胞の単離。０日目、３日目、７日目、１０日目、及び１３日目に、マウスに１．５ｍｇ／ｋｇの総ｓｇＲＮＡを静脈内注射した。最後の注射の８日後に、Ｄａｈｌｍａｎ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．９，６４８−６５５（２０１４）から適合されるように、肺及び心血管内皮細胞を単離した。より具体的には、犠牲にした後すぐにマウスに滅菌１ｘＰＢＳを直ちに灌流させた後、１ｘＰＢＳ、デオキシリボヌクレアーゼ、コラゲナーゼＩ、及びコラゲナーゼＸＩ中、３７℃で３０分間、肺及び心臓を消化した。消化した組織を７０μｍセルストレーナーに通し、単一細胞懸濁液を生成した。ＲＢＣの溶解の後、フローサイトメトリー染色緩衝液（０．５％ＢＳＡ及び２ｍＭのＥＤＴＡを含有するＰＢＳ）中４℃で２０分間、１：３００希釈において、抗ＩＣＡＭ２（クローン３Ｃ４）、抗ＣＤ３１（クローン３９０）及び抗ＥＰＣＡＭ（クローンＧ８．８）（全て、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡから）で細胞を染色した。４℃、３５０ｇにおける遠心分離により抗体を洗い流した。次に細胞をヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ）で染色し、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩＩを用いて選別した。１００μｌのＲＮｅａｓｙ溶解緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）を含有する個々のチューブにＣＤ３１^＋細胞（約１００，０００）を選別し、さらなる分析まで−８０℃で貯蔵した。選別中にＩＣＡＭ２タンパク質発現データも集め、ＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ Ｉｎｃ．）を用いて分析した。

マウス樹状細胞。全てのＤＣ実験について６〜８週齢の構成的Ｃａｓ９発現メスマウスを用いた。大腿骨及び脛骨から骨髄細胞を採取し、１０％ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｌ−グルタミン（Ｃｅｌｌｇｒｏ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｃｅｌｌｇｒｏ）、ＭＥＭ非必須アミノ酸（Ｃｅｌｌｇｒｏ）、ＨＥＰＥＳ（Ｃｅｌｌｇｒｏ）、ピルビン酸ナトリウム（Ｃｅｌｌｇｒｏ）、β−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）、及びＧＭ−ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍＬ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を補充したＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中２ｘ１０^５／ｍｌの濃度で非処理の組織培養皿にプレーティングした。２日目に、細胞にガイドＲＮＡをコードするレンチウイルスを感染させた。細胞をＧＭ−ＣＳＦの存在下で拡大させた。７日目に、５μｇ／ｍＬのピューロマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）添加することにより感染細胞を選択した。９日目に、タンパク質分析の３０分前（図４６ｃ）、又はｍＲＮＡ発現のプロファイリングの３時間前（図４６ｃ、ｅ）に、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を添加した。ＧＦＰ検出のためのフローサイトメトリーをＢＤ Ａｃｃｕｒｉ ｃ６により実施した。ウエスタンブロットは、抗Ｍｙｄ８８（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＡＦ３１０９）及び抗アクチン（Ａｂｃａｍ、ａｂ６２７６）抗体を用いて実行した。

Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ ｎＣｏｕｎｔｅｒ発現測定。以前に記載された（Ａｍｉｔ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６，２５７−６３）ように、ＤＣをプロセッシングし、分析した。簡単に言うと、β−メルカプトエタノールを補充したＴＣＬ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）中で、５ｘ１０^４細胞を溶解させた。ライセートの５％を、以前に記載されたＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＣｏｄｅＳｅｔ（Ｇｅｉｓｓ，Ｇ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６、３１７−２５（２００８））により１６時間ハイブリダイズし、ｎＣｏｕｎｔｅｒ Ｐｒｅｐ Ｓｔａｔｉｏｎに負荷した後、ｎＣｏｕｎｔｅｒ Ｄｉｇｉｔａｌ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて定量化を実行した。以前に記載された（Ａｍｉｔ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６，２５７−６３（２００９））ように、対照遺伝子を用いてカウントを基準化し、ＧＦＰを標的とするｓｇＲＮＡが形質導入する細胞及び非標的化対照に対して変化倍率を計算した。ＧＥＮＥ−Ｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｃａｎｃｅｒ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＧＥＮＥ−Ｅ／）を用いてヒートマップを作成した。

実施例２８：ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９構成成分の造血幹細胞（ＨＳＣ）への粒子媒介性送達
本出願人は、粒子によってＣａｓ９が細胞へ送達され得ることを実証した。この例において、多くの核治療法は１つ以上のｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９ヌクレアーゼの両方を同時に送達することを必要とし得るということから、本出願者らは、このような方法で送達できることを実証した。

複合体全体を粒子に処方する前に、ｓｇＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質と予め複合体を形成させた。２０個の異なる粒子製剤を作製し、細胞へのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９の送達効率について試験した。各製剤は、核酸の細胞への送達を促進することが知られている４つの構成成分を異なるモル比で用いて作製した：１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジテトラデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びコレステロール（例えば、ＤＯＴＡＰ：ＤＭＰＣ：ＰＥＧ：コレステロールモル比；製剤番号１＝ＤＯＴＡＰ １００、ＤＭＰＣ ０、ＰＥＧ ０、コレステロール ０；製剤番号２＝ＤＯＴＡＰ ９０、ＤＭＰＣ ０、ＰＥＧ １０、コレステロール ０；製剤番号３＝ＤＯＴＡＰ ９０、ＤＭＰＣ ０、ＰＥＧ ５、コレステロール ５）。

効率的な多段階プロセスを用いて粒子を形成した。第１に、滅菌ヌクレアーゼ不含１ｘＰＢＳ中、室温で３０分間、Ｃａｓ９タンパク質と、遺伝子ＥＭＸ１又は対照遺伝子ＬａｃＺを標的とするｓｇＲＮＡとを１：１のモル比で一緒に混合した。別個に、ＤＯＴＡＰ、ＤＭＰＣ、ＰＥＧ、及びコレステロールを１００％エタノール中に溶解する。２つの溶液を一緒に混合して、Ｃａｓ９−ｓｇＲＮＡ複合体を含有する粒子を形成する。粒子を形成した後、９６ウェルプレート中のＨＳＣに、ウェル当たり１５ｕｇのＣａｓ９タンパク質をトランスフェクトした。トランスフェクションの３日後に、ＨＳＣを回収し、ＥＭＸ１遺伝子座における挿入及び欠失（インデル）の数を定量化した。

本発明の好ましい実施形態を本明細書に示して説明してきたが、当業者には、このような実施形態が単なる例として示されることは明白であろう。当業者であれば、本発明から逸脱することなく様々なバリエーション、変形形態、及び置換形態にすぐに想到するであろう。本明細書に記載の本発明の実施形態の様々な変更形態を本発明の実施に利用できることを理解されたい。

Claims (50)

1. ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系ＲＮＡポリヌクレオチド配列を含む送達粒子製剤を含む組成物であって、前記ポリヌクレオチド配列が、
   （ａ）真核細胞内の標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列と、
   （ｂ）ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と、
   （ｃ）ｔｒａｃｒ配列と
   を含み、
   （ａ）、（ｂ）及び（ｃ）が５’から３’への方向に並び、
   転写されると前記ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列が前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、かつ前記ガイド配列がＣＲＩＳＰＲ複合体と前記標的配列との配列特異的結合を誘導する、組成物。
2. 任意選択で少なくとも１つ以上の核局在化配列を含む、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含み、前記ＣＲＩＳＰＲ複合体が、（１）前記標的配列にハイブリダイズする前記ガイド配列、及び（２）前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズする前記ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成する前記ＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、及び前記ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする前記ポリヌクレオチド配列がＤＮＡ又はＲＮＡである、請求項１に記載の組成物。
3. 前記ポリヌクレオチド配列が、１つ以上のベクターを含むベクター系内に含まれる、請求項２に記載の組成物。
4. 前記ＣＲＩＳＰＲ酵素がＣａｓ９である、請求項２に記載の組成物。
5. 前記ガイド配列、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列又はｔｒａｃｒ配列がＲＮＡであり、かつ１つ以上のベクターを含むベクター系内に含まれる、請求項１に記載の組成物。
6. 送達粒子製剤が、リポソーム、ナノ粒子、エキソソーム、微小胞、又は遺伝子銃を含む、請求項１に記載の組成物。
7. 送達粒子が直径５００ｎｍ未満である、請求項６に記載の組成物。
8. 送達粒子が直径２５０ｎｍ未満である、請求項６に記載の組成物。
9. 送達粒子が直径１００ｎｍ未満である、請求項６に記載の組成物。
10. 送達粒子が直径約３５ｎｍ〜約６０ｎｍである、請求項６に記載の組成物。
11. 前記送達粒子製剤がナノ粒子製剤である、請求項６に記載の組成物。
12. 前記ナノ粒子製剤が脂質ベースのナノ粒子を含む、請求項１１に記載の組成物。
13. 前記脂質ベースのナノ粒子がエポキシド修飾脂質ポリマーを含む、請求項１２に記載の組成物。
14. （ａ）、（ｂ）、及び／又は（ｃ）のうちの２つ以上を含む、請求項１に記載の組成物。
15. 前記標的配列が内皮標的配列である、請求項１に記載の組成物。
16. 前記標的配列が肺又は皮膚標的配列である、請求項１に記載の組成物。
17. 前記標的配列が心臓又は筋肉標的配列である、請求項１に記載の組成物。
18. 前記送達粒子製剤が医薬組成物として提供される、請求項１に記載の組成物。
19. 前記送達粒子製剤が医薬組成物として提供される、請求項２に記載の組成物。
20. ｅｘ ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏ投与のための薬学的に許容可能な賦形剤及び／又は担体をさらに含む、請求項１８に記載の組成物。
21. ｅｘ ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏ投与のための薬学的に許容可能な賦形剤及び／又は担体をさらに含む、請求項１９に記載の組成物。
22. Ｉ．ポリヌクレオチドであって、
    （ａ）真核細胞内の標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、及び
    （ｂ）少なくとも１つ以上のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列
    を含むポリヌクレオチドと、
    ＩＩ．ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列と、
    ＩＩＩ．ｔｒａｃｒ配列を含むポリヌクレオチド配列と
    を含む送達粒子製剤を含む組成物であって、
    転写されると前記ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列が前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、かつ前記ガイド配列がＣＲＩＳＰＲ複合体と前記標的配列との配列特異的結合を誘導し、
    前記ＣＲＩＳＰＲ複合体が、（１）前記標的配列にハイブリダイズする前記ガイド配列、及び（２）前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズする前記ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成する前記ＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、及び前記ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする前記ポリヌクレオチド配列がＤＮＡ又はＲＮＡであり、
    送達粒子が直径２５０ｎｍ未満である、組成物。
23. 前記送達粒子製剤が、リポソーム、ナノ粒子、エキソソーム、微小胞、又は遺伝子銃を含む、請求項２２に記載の組成物。
24. 前記標的配列が内皮標的配列である、請求項２２に記載の組成物。
25. ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系ＲＮＡポリヌクレオチド配列を含む送達粒子製剤を投与することを含む組成物を投与するステップを含む、目的のゲノム遺伝子座における標的配列の操作により生物又は非ヒト生物を改変する方法であって、前記ポリヌクレオチド配列が、
    （ａ）真核細胞内の標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列と、
    （ｂ）ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と、
    （ｃ）ｔｒａｃｒ配列と
    を含み、
    （ａ）、（ｂ）及び（ｃ）が５’から３’への方向に並び、
    転写されると前記ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列が前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、かつ前記ガイド配列がＣＲＩＳＰＲ複合体と前記標的配列との配列特異的結合を誘導する、方法。
26. 任意選択で少なくとも１つ以上の核局在化配列を含む、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列を投与するステップをさらに含み、前記ＣＲＩＳＰＲ複合体が、（１）前記標的配列にハイブリダイズする前記ガイド配列、及び（２）前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズする前記ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成する前記ＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、及びＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする前記ポリヌクレオチド配列がＤＮＡ又はＲＮＡである、請求項２５に記載の方法。
27. 前記ＣＲＩＳＰＲ酵素がＣａｓ９である、請求項２６に記載の方法。
28. 前記ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする前記ポリヌクレオチド又は酵素コード配列が、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするｍＲＮＡを前記細胞に送達することによって前記細胞に送達される、請求項２６に記載の方法。
29. 前記送達粒子製剤が、リポソーム、ナノ粒子、エキソソーム、微小胞、又は遺伝子銃を含む、請求項２５に記載の方法。
30. 送達粒子が直径２５０ｎｍ未満である、請求項２９に記載の方法。
31. 送達粒子が直径１００ｎｍ未満である、請求項２９に記載の方法。
32. 送達粒子が直径約３５ｎｍ〜約６０ｎｍである、請求項２９に記載の方法。
33. 前記送達粒子製剤がナノ粒子製剤である、請求項２９に記載の方法。
34. 前記ナノ粒子製剤が脂質ベースのナノ粒子を含む、請求項３３に記載の方法。
35. 前記脂質ベースのナノ粒子がエポキシド修飾脂質ポリマーを含む、請求項３４に記載の方法。
36. ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、及び／又はｉｎ ｖｉｖｏで実行される、請求項２６に記載の方法。
37. 前記生物又は対象が真核生物である、請求項２６に記載の方法。
38. 前記生物又は対象が哺乳類又は非ヒト哺乳類である、請求項２６に記載の方法。
39. 前記改変が機能的遺伝子サイレンシングを含む、請求項２６に記載の方法。
40. 前記機能的遺伝子サイレンシングが、標的遺伝子のｍＲＮＡ及び／又はタンパク質レベルの低下を含む、請求項３９に記載の方法。
41. 前記標的遺伝子が内皮細胞において発現される、請求項４０に記載の方法。
42. 前記標的遺伝子が肺又は皮膚において発現される、請求項４０に記載の方法。
43. 前記標的遺伝子が心臓又は筋肉において発現される、請求項４０に記載の方法。
44. 前記機能的遺伝子サイレンシングが治療効果を提供する、請求項４０に記載の方法。
45. 目的のゲノム遺伝子座における標的配列の操作により生物又は非ヒト生物を改変する方法であって
    Ｉ．ポリヌクレオチドであって、
    （ａ）真核細胞内の標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、及び
    （ｂ）少なくとも１つ以上のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列
    を含むポリヌクレオチドと、
    ＩＩ．ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列と、
    ＩＩＩ．ｔｒａｃｒ配列を含むポリヌクレオチド配列と
    を含む送達粒子製剤を含む組成物を投与するステップを含み、
    転写されると前記ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列が前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、かつ前記ガイド配列がＣＲＩＳＰＲ複合体と前記標的配列との配列特異的結合を誘導し、
    前記ＣＲＩＳＰＲ複合体が、（１）前記標的配列にハイブリダイズする前記ガイド配列、及び（２）前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズする前記ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成する前記ＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、及びＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする前記ポリヌクレオチド配列がＤＮＡ又はＲＮＡであり、
    送達粒子が直径２５０ｎｍ未満である、方法。
46. 前記送達粒子製剤が、リポソーム、ナノ粒子、エキソソーム、微小胞、又は遺伝子銃を含む、請求項４５に記載の方法。
47. 前記標的配列が内皮標的配列である、請求項４５に記載の方法。
48. ｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質混合物と、界面活性剤、リン脂質、生分解性ポリマー、リポタンパク質及びアルコールを含む、又は本質的にこれらからなる、又はこれらからなる混合物とを混合するステップを含む、ｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質含有粒子を調製する方法。
49. 請求項４８に記載の方法から得られるｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質含有粒子。
50. 請求項４９に記載の粒子の使用であって、目的のゲノム遺伝子座を改変するか、又は目的のゲノム遺伝子座における標的配列の操作により生物若しくは非ヒト生物を改変する方法であって、前記目的のゲノム遺伝子座を含有する細胞を前記粒子と接触させるステップを含み、ｓｇＲＮＡが前記目的のゲノム遺伝子座を標的とする方法における、或いは目的のゲノム遺伝子座を改変するか、又は目的のゲノム遺伝子座における標的配列の操作により生物若しくは非ヒト生物を改変する方法であって、前記目的のゲノム遺伝子座を含有する細胞を前記粒子と接触させるステップを含み、ｓｇＲＮＡが前記目的のゲノム遺伝子座を標的とする方法における、使用。