KR20180134412A - 전사 인자 4에서 트라이뉴클레오타이드 반복부와 연관된 질환의 치료를 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

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Abstract

본 출원은 예컨대 푹스 내피 각막 이상증(FECD), PSC 및 조현병을 갖는 대상체에서 보이는, TCF4의 인트론 3 내에 함유된 트라이뉴클레오타이드 반복부(TNR)를 절제하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 콜라겐 VIII의 알파 2 아단위를 표적화하는 가이드 서열을 포함하는 조성물은 FECD.1에 기여할 수 있는 여기서의 돌연변이의 치료에 대해 또한 개시되어 있다.

Description

전사 인자 4에서 트라이뉴클레오타이드 반복부와 연관된 질환의 치료를 위한 조성물 및 방법
본 출원은 푹스 내피 각막 이상증(Fuchs endothelial corneal dystrophy: FECD), 후부 다형 각막 이상증(posterior polymorphous corneal dystrophy: PPCD), 원발성 경화성 담관염(primary sclerosing cholangitis: PSC) 및 조현병을 포함하는 전사 인자 4(TNF4) 유전자에서 트라이뉴클레오타이드 반복부와 연관된 질환의 치료를 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
푹스 이상증으로도 공지된 푹스 내피 각막 이상증(Fuchs endothelial corneal dystrophy: FECD)은 각막의 내부 내피 세포 단층에 영향을 미치는 퇴행성 질환이다. 각막 내피의 역할은 내피 장벽을 유지시키고 펌프 기능을 수행함으로써 각막 투명성을 보장하는 것이다. FECD에서, 각막 내피에서 중심 증식(방울(guttae)이라 칭함) 및 비정상 콜라겐의 축적이 있다. 각막 내피 및 실질 세포 중에 배치된 방울의 존재는 질환의 임상 특징으로 생각된다. 진행된 FECD는 광범위한 방울, 내피 세포 손실 및 실질 부종을 특징으로 한다.
FECD는 시각 소실을 발생시킬 수 있고, 진행된 FECD는 각막 이식에 의해 오직 치료 가능하다. 미국에서 중년의 코카시안종의 대략 5%가 FECD에 의해 이환되는 것으로 예상된다. 추가적으로, FECD가 매년 14,000건 초과의 각막 이식을 차지하는 것으로 예상된다. 각막 이식과 연관된 위험은 급성 거부, 만성 거부, 숙주 베드에 부착하는 이식편의 실패, 감염 및 숙주 눈의 손상을 포함한다. 대부분의 이식은 20/20 미만의 시각을 갖는 수혜자를 남기고, 6개월 이상의 회복 기간을 수반하고, 수술 후 2년 이상 동안 환자가 면역억제제 점안액을 사용할 것을 요한다. 면역억제제 점안액의 광범위한 사용은 백내장 또는 녹내장의 위험을 증가시킬 수 있다.
전사 인자 4(TCF4) 유전자에서의 단일 뉴클레오타이드 다형 및 트라이뉴클레오타이드 반복부(trinucleotide repeat: TNR) 연장을 포함하는, FECD에서의 유전적 인자에 대한 역할이 보고되었다. TCF4 유전자의 제3 인트론에서의 TNR은 FECD의 임상 진단과 연관된 50개 초과의 반복부의 반복 길이로 질환에 대한 대부분의 유전된 소인을 차지한다(Wieben et al., PLOS One, 7:11, e49083 (2012)). 최근의 연구는 이 TNR 연장이 이환된 TCF4 RNA의 응집 및 중요한 RNA 스플라이싱 인자의 봉쇄를 발생시킨다는 것을 제안한다(Mootha et al., Invest Ophthalmol Vis Sci . 55(1):33-42 (2014); Mootha et al., Invest Ophthalmol Vis Sci . 56(3):2003-11(2015); Vasanth, et al., Invest Ophthalmol Vis Sci . 56(8):4531-6 (2015); Soliman et al., JAMA Ophthalmol . 133(12):1386-91 (2015)). 이러한 봉쇄는 유전자 발현에서의 전반적인 변경을 발생시킬 수 있어서 세포사를 궁극적으로 발생시키는 세포 기능에서의 엄청난 변경을 유도한다(Du et al., J Biological Chem . 290:10, 5979-5990 (2015)). TCF4 돌연변이는 원발성 경화성 담관염(PSC) 및 조현병과 또한 연관되고, 문헌[Ellinghas et al., HEPATOLOGY, 58:3, 1074-1083 (2013) 및 Forrest et al., Trends in Molecular Medicine 20:6 (2014)]을 참조한다.
다른 반복부 연장 질환에서, RNA 독성이 제안되었다. RNA 독성의 경우에, 연장된 미소부수체 DNA 서열은 다양한 유전자의 비코딩 영역에서 발견될 수 있고, 반복적 유전요소는 독성 기능-이득 RNA 또는 독성 단백질 종으로 전사된다(문헌[Mohan et al., Brain Res. 1584, 3-14 (2014)] 참조). 최근에, RNA 독성은 FECD를 갖는 환자에서 또한 보였다(Du 2015 참조). 추가로, TCF4 TNR 전사체가 각막 내피에서 주로 축적되고, 이에 따라 FECD에 특징적인 발병을 발생시킨다는 것이 제안되었다. RNA 독성의 역할이 FECD에서의 잠재적인 질환 기전을 기술하는 것을 돕지만, 치료는 여전히 각막 이식으로 제한된다.
조기 발병 FECD의 다른 형태는 COL8A2에서의 돌연변이와 연관된다(문헌[Vedana et al., Clinical Ophthalmology 10 321-330 (2016)] 참조). 보통, (COL8A1 및 COL8A2를 포함하는) 콜라겐 VIII 또는 COL8은 각막의 데스메막에 규칙적으로 분포된다. 그러나, COL8A2에서의 돌연변이를 갖는 개인으로부터의 각막은 비조정된 방식으로 상이한 양의 COL8A1 및 COL8A2의 불규칙적인 모자이크 침착을 갖는다. COL8A2에서의 3개의 돌연변이(Gln455Lys, Gln455Val 및 Leu450Trp)는 돌연변이체 콜라겐 VIII 펩타이드의 세포내 축적을 발생시키고, 조기 발병 FECD, 및 관련 장애, 후부 다형 각막 이상증(PPCD)을 야기할 수 있다. PPCD는 각막의 데스메막 및 내피 층에서의 변화를 특징으로 한다. COL8A2 유전자에서의 돌연변이와 가장 흔히 연관된 PPCD의 형태는 PPCD2이다.
TCF4에서의 (CTG) n TNR 및 COL8A2에서의 점 돌연변이를 직접적으로 조정하는 수단은 FECD, PPCD, PSC 및 조현병을 발생시킨 유전자 돌연변이를 치료하도록 필요하다. 최근에 조사된 유전자 편집/파괴 기법은 박테리아 CRISPR(clustered regularly interspersed short palindromic repeats) 시스템에 기초한다. CRISPR 유전자 편집은 단일 뉴클레아제, 예컨대 DNA에서 부위 특이적 파괴를 유도할 수 있는 "CRISPR 연관된 단백질 9"(Cas9) 및 Cpf1에 의해 구현된 것에 의존한다. Cas 엔도뉴클레아제는 표적 유전자에 인접한 프로토스페이서 인접한 모티프(PAM)와 함께, trRNA 및 crRNA라 칭하는, 작은 RNA 분자에 의해 특이적 DNA 서열로 안내된다. trRNA 및 crRNA는 gRNA로도 공지된 가이드 RNA를 함께 형성한다. trRNA 및 crRNA는 Cas 단백질의 표적화를 수월하게 하도록 단일 가이드 RNA(sgRNA)로 조합될 수 있거나, 이중 가이드(dgRNA) 시스템으로서 조합되지는 않지만 동일한 시간에 사용될 수 있다. trRNA 및 crRNA와 조합된 Cas 엔도뉴클레아제는 Cas 리보핵단백질(ribonucleoprotein: RNP) 복합체라 불린다.
본 발명자들은 본 명세서에서 몇몇 실시형태에서 TNR 연장을 함유하는 TCF4 내의 영역의 일부 또는 전부를 절제하도록 설계된 CRISPR 조성물 및 이의 사용 방법을 기재한다. 몇몇 실시형태에서, 이 TNR 연장은 FECD에 의해 이환된 개인에서 발견된다. 이렇게 하는 것은 연장과 연관된 독성을 방지한다. TCF4 내의 TNR에서의 감소 또는 제거는 TNR의 하류 효과, 예컨대 RNA 독성을 감소시키고, 질환 과정을 개선할 수 있다. 따라서, TCF4의 인트론 3의 TNR을 플랭킹하는 표적 서열에 상보성인 가이드 RNA 및 뉴클레아제(또는 Cas RNP)의 다른 변형은 TCF4에서 TNR을 나타내는 FECD의 유전자 형태, 및 PSC 및 조현병에서 TNR을 치료하기 위한 수단일 수 있다. 추가적으로, 뉴클레아제와 함께 콜라겐 VIII의 알파 아단위에서 돌연변이를 나타내는 FECD 및 PPCD의 형태로 COL8A2를 넉아웃 또는 편집시키는 가이드 RNA를 설계하는 데 사용하기 위한 가이드 서열이 또한 개시되어 있다.
본 설명에 따르면, 몇몇 실시형태에서 TCF4 유전자에서 TNR 연장으로 5' 및 3'의 영역에 CRISPR/Cas 엔도뉴클레아제를 지향시키는 가이드 RNA의 조성물이 기재되어 있다. 조성물은 TCF4 유전자로부터의 TNR 연장을 절제할 뿐만 아니라, FECD, PPCD, PSC 및 조현병을 치료하는 데 있어서 유용하다. 다른 실시형태에서, FECD와 연관된 돌연변이체 대립유전자에 표적화하는 가이드를 포함하여 COL8A2 유전자의 영역에 표적화하는 가이드 RNA의 조성물이 또한 기재되어 있다. 이 가이드 RNA는 치료에서 사용된 방법 및 가이드 RNA의 설계에 따라 TNR을 절제하거나, 삽입-결실을 생성하거나, 이중 가닥 파괴를 통해 상동성 재조합(HR) 또는 상동성 지시된 보수(HDR)를 거쳐 유전자 수정을 유도하도록 CRISPR 뉴클레아제와 함께 사용될 것이다.
일 실시형태에서, 본 발명은 서열 번호 1 내지 1084로부터 선택된 표적 서열에 뉴클레아제를 지향시키는 가이드 서열을 포함하는 적어도 하나의 가이드 RNA를 포함하는 조성물을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 본 발명은 서열 번호 1089 내지 1278로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91% 또는 90% 동일한 가이드 서열을 포함하는 적어도 하나의 가이드 RNA를 포함하는 조성물을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 서열 번호 1089 내지 1278로부터 선택된 서열과 동일한 가이드 서열을 포함하는 적어도 하나의 가이드 RNA를 포함하는 조성물이 제공된다.
몇몇 실시형태에서, 가이드 RNA는 전사 인자 4(TCF4) 유전자에서 트라이뉴클레오타이드 반복부(TNR)를 표적화하고, 서열 번호 1 내지 190으로부터 선택된 표적 서열에 뉴클레아제를 지향시킨다. 몇몇 실시형태에서, 본 발명은 서열 번호 1089 내지 1278로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91% 또는 90% 동일한 가이드 서열을 포함하는 적어도 하나의 가이드 RNA를 포함한다.
하기 가이드 RNA 쌍 짓기로부터 선택된 2개의 가이드 RNA를 포함하는 조성물이 제공된다:
a. 서열 번호 83에 뉴클레아제를 지향시키는 제1 가이드 RNA 및 서열 번호 109에 뉴클레아제를 지향시키는 제2 가이드 RNA;
b. 서열 번호 85에 뉴클레아제를 지향시키는 제1 가이드 RNA 및 서열 번호 109에 뉴클레아제를 지향시키는 제2 가이드 RNA;
c. 서열 번호 86에 뉴클레아제를 지향시키는 제1 가이드 RNA 및 서열 번호 112에 뉴클레아제를 지향시키는 제2 가이드 RNA;
d. 서열 번호 85에 뉴클레아제를 지향시키는 제1 가이드 RNA 및 서열 번호 112에 뉴클레아제를 지향시키는 제2 가이드 RNA;
e. 서열 번호 86에 뉴클레아제를 지향시키는 제1 가이드 RNA 및 서열 번호 109에 뉴클레아제를 지향시키는 제2 가이드 RNA;
f. 서열 번호 85에 뉴클레아제를 지향시키는 제1 가이드 RNA 및 서열 번호 107에 뉴클레아제를 지향시키는 제2 가이드 RNA;
g. 서열 번호 83에 뉴클레아제를 지향시키는 제1 가이드 RNA 및 서열 번호 125에 뉴클레아제를 지향시키는 제2 가이드 RNA;
h. 서열 번호 86에 뉴클레아제를 지향시키는 제1 가이드 RNA 및 서열 번호 125에 뉴클레아제를 지향시키는 제2 가이드 RNA;
i. 서열 번호 86에 뉴클레아제를 지향시키는 제1 가이드 RNA 및 서열 번호 107에 뉴클레아제를 지향시키는 제2 가이드 RNA;
j. 서열 번호 64에 뉴클레아제를 지향시키는 제1 가이드 RNA 및 서열 번호 106에 뉴클레아제를 지향시키는 제2 가이드 RNA;
k. 서열 번호 85에 뉴클레아제를 지향시키는 제1 가이드 RNA 및 서열 번호 114에 뉴클레아제를 지향시키는 제2 가이드 RNA;
l. 서열 번호 86에 뉴클레아제를 지향시키는 제1 가이드 RNA 및 서열 번호 114에 뉴클레아제를 지향시키는 제2 가이드 RNA;
m. 서열 번호 83에 뉴클레아제를 지향시키는 제1 가이드 RNA 및 서열 번호 114에 뉴클레아제를 지향시키는 제2 가이드 RNA;
n. 서열 번호 53에 뉴클레아제를 지향시키는 제1 가이드 RNA 및 서열 번호 114에 뉴클레아제를 지향시키는 제2 가이드 RNA;
o. 서열 번호 83에 뉴클레아제를 지향시키는 제1 가이드 RNA 및 서열 번호 112에 뉴클레아제를 지향시키는 제2 가이드 RNA; 및
p. 서열 번호 74에 뉴클레아제를 지향시키는 제1 가이드 RNA 및 서열 번호 114에 뉴클레아제를 지향시키는 제2 가이드 RNA.
2개의 gRNA를 포함하는 몇몇 실시형태에서, 서열 번호 83에 뉴클레아제를 지향시키는 제1 가이드 RNA는 서열 번호 1177을 포함하고, 서열 번호 109에 뉴클레아제를 지향시키는 제2 가이드 RNA는 서열 번호 1197을 포함한다.
2개의 gRNA를 포함하는 몇몇 실시형태에서, 서열 번호 85에 뉴클레아제를 지향시키는 제1 가이드 RNA는 서열 번호 1173을 포함하고, 서열 번호 109에 뉴클레아제를 지향시키는 제2 가이드 RNA는 서열 번호 1197을 포함한다.
2개의 gRNA를 포함하는 몇몇 실시형태에서, 서열 번호 86에 뉴클레아제를 지향시키는 제1 가이드 RNA는 서열 번호 1174를 포함하고, 서열 번호 112 에 뉴클레아제를 지향시키는 제2 가이드 RNA는 서열 번호 1200을 포함한다.
2개의 gRNA를 포함하는 몇몇 실시형태에서, 서열 번호 85에 뉴클레아제를 지향시키는 제1 가이드 RNA는 서열 번호 1173을 포함하고, 서열 번호 112에 뉴클레아제를 지향시키는 제2 가이드 RNA는 서열 번호 1200을 포함한다.
2개의 gRNA를 포함하는 몇몇 실시형태에서, 서열 번호 86에 뉴클레아제를 지향시키는 제1 가이드 RNA는 서열 번호 1174를 포함하고, 서열 번호 109에 뉴클레아제를 지향시키는 제2 가이드 RNA는 서열 번호 1197을 포함한다.
2개의 gRNA를 포함하는 몇몇 실시형태에서, 서열 번호 85에 뉴클레아제를 지향시키는 제1 가이드 RNA는 서열 번호 1173을 포함하고, 서열 번호 107에 뉴클레아제를 지향시키는 제2 가이드 RNA는 서열 번호 1195를 포함한다.
2개의 gRNA를 포함하는 몇몇 실시형태에서, 서열 번호 83에 뉴클레아제를 지향시키는 제1 가이드 RNA는 서열 번호 1171을 포함하고, 서열 번호 125에 뉴클레아제를 지향시키는 제2 가이드 RNA는 서열 번호 1213을 포함한다.
2개의 gRNA를 포함하는 몇몇 실시형태에서, 서열 번호 86에 뉴클레아제를 지향시키는 제1 가이드 RNA는 서열 번호 1174를 포함하고, 서열 번호 125에 뉴클레아제를 지향시키는 제2 가이드 RNA는 서열 번호 1213을 포함한다.
2개의 gRNA를 포함하는 몇몇 실시형태에서, 서열 번호 86에 뉴클레아제를 지향시키는 제1 가이드 RNA는 서열 번호 1174를 포함하고, 서열 번호 107에 뉴클레아제를 지향시키는 제2 가이드 RNA는 서열 번호 1195를 포함한다.
2개의 gRNA를 포함하는 몇몇 실시형태에서, 서열 번호 64에 뉴클레아제를 지향시키는 제1 가이드 RNA는 서열 번호 1152를 포함하고, 서열 번호 106에 뉴클레아제를 지향시키는 제2 가이드 RNA는 서열 번호 1194를 포함한다.
2개의 gRNA를 포함하는 몇몇 실시형태에서, 서열 번호 85에 뉴클레아제를 지향시키는 제1 가이드 RNA는 서열 번호 1173을 포함하고, 서열 번호 114에 뉴클레아제를 지향시키는 제2 가이드 RNA는 서열 번호 1202를 포함한다.
2개의 gRNA를 포함하는 몇몇 실시형태에서, 서열 번호 86에 뉴클레아제를 지향시키는 제1 가이드 RNA는 서열 번호 1174를 포함하고, 서열 번호 114에 뉴클레아제를 지향시키는 제2 가이드 RNA는 서열 번호 1202를 포함한다.
2개의 gRNA를 포함하는 몇몇 실시형태에서, 서열 번호 83에 뉴클레아제를 지향시키는 제1 가이드 RNA는 서열 번호 1171을 포함하고, 서열 번호 114에 뉴클레아제를 지향시키는 제2 가이드 RNA는 서열 번호 1202를 포함한다.
2개의 gRNA를 포함하는 몇몇 실시형태에서, 서열 번호 53에 뉴클레아제를 지향시키는 제1 가이드 RNA는 서열 번호 1141을 포함하고, 서열 번호 114에 뉴클레아제를 지향시키는 제2 가이드 RNA는 서열 번호 1202를 포함한다.
2개의 gRNA를 포함하는 몇몇 실시형태에서, 서열 번호 83에 뉴클레아제를 지향시키는 제1 가이드 RNA는 서열 번호 1171을 포함하고, 서열 번호 112에 뉴클레아제를 지향시키는 제2 가이드 RNA는 서열 번호 1200을 포함한다.
2개의 gRNA를 포함하는 몇몇 실시형태에서, 서열 번호 74에 뉴클레아제를 지향시키는 제1 가이드 RNA는 서열 번호 1162를 포함하고, 서열 번호 114에 뉴클레아제를 지향시키는 제2 가이드 RNA는 서열 번호 1202를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 가이드 RNA는 콜라겐 VIII형 유전자의 알파 2 아단위(Col8A2)를 표적화하고, 서열 번호 191 내지 1063으로부터 선택된 표적 서열에 뉴클레아제를 지향시킨다. 몇몇 실시형태에서, 본 발명은 서열 번호 191 내지 1063으로부터 선택된 표적 서열(예를 들어, PAM이 부재한 표적 서열)의 처음의 20개의 뉴클레오타이드에 상보성이거나 이와 동일한 서열에 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91% 또는 90% 동일한 가이드 서열을 포함하는 적어도 하나의 가이드 RNA를 포함하고, 여기서 서열 번호 191 내지 1063의 처음의 20개의 뉴클레오타이드에서의 타이민은 유라실에 의해 대체된다.
몇몇 실시형태에서, 가이드 RNA는 Col8A2 유전자 산물의 Gln455Lys 돌연변이를 표적화하고, 서열 번호 1064 내지 1069로부터 선택된 표적 서열에 뉴클레아제를 지향시킨다. 몇몇 실시형태에서, 본 발명은 서열 번호 1064 내지 1069로부터 선택된 표적 서열(예를 들어, PAM이 부재한 표적 서열)의 처음의 20개의 뉴클레오타이드에 상보성이거나 이와 동일한 서열에 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91% 또는 90% 동일한 가이드 서열을 포함하는 적어도 하나의 가이드 RNA를 포함하고, 여기서 서열 번호 1064 내지 1069의 처음의 20개의 뉴클레오타이드에서의 타이민은 유라실에 의해 대체된다.
몇몇 실시형태에서, 가이드 RNA는 Col8A2 유전자 산물의 Gln455Val 돌연변이를 표적화하고, 서열 번호 1070 내지 1075로부터 선택된 표적 서열에 뉴클레아제를 지향시킨다. 몇몇 실시형태에서, 본 발명은 서열 번호 1070 내지 1075로부터 선택된 표적 서열(예를 들어, PAM이 부재한 표적 서열)의 처음의 20개의 뉴클레오타이드에 상보성이거나 이와 동일한 서열에 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91% 또는 90% 동일한 가이드 서열을 포함하는 적어도 하나의 가이드 RNA를 포함하고, 여기서 서열 번호 1070 내지 1075의 처음의 20개의 뉴클레오타이드에서의 타이민은 유라실에 의해 대체된다.
몇몇 실시형태에서, 가이드 RNA는 Col8A2 유전자 산물의 Leu450Trp 돌연변이를 표적화하고, 서열 번호 1076 내지 1084로부터 선택된 표적 서열에 뉴클레아제를 지향시킨다. 몇몇 실시형태에서, 본 발명은 서열 번호 1076 내지 1084로부터 선택된 표적 서열(예를 들어, PAM이 부재한 표적 서열)의 처음의 20개의 뉴클레오타이드에 상보성이거나 이와 동일한 서열에 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91% 또는 90% 동일한 가이드 서열을 포함하는 적어도 하나의 가이드 RNA를 포함하고, 여기서 서열 번호 1070 내지 1075의 처음의 20개의 뉴클레오타이드에서의 타이민은 유라실에 의해 대체된다.
몇몇 실시형태에서, 가이드 RNA는 이중 가이드이다. 몇몇 실시형태에서, 가이드 RNA는 단일 가이드이다. 몇몇 실시형태에서, 적어도 하나의 가이드 RNA는 crRNA, trRNA, 또는 crRNA 및 trRNA를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 적어도 하나의 가이드 서열은 벡터에서 코딩된다. 몇몇 실시형태에서, 제1 가이드 서열 및 제2 가이드 서열은 동일한 벡터에서 코딩된다. 몇몇 실시형태에서, 제1 가이드 서열 및 제2 가이드 서열은 상이한 벡터에서 코딩된다. 몇몇 실시형태에서, 제1 가이드 서열 및 제2 가이드 서열은 동일한 촉진자 및/또는 조절 서열에 의해 제어된다.
몇몇 실시형태에서, 가이드 서열은 표적 유전자의 양성 가닥에서 표적 서열에 상보성이다. 몇몇 실시형태에서, 가이드 서열은 표적 유전자의 음성 가닥에서 표적 서열에 상보성이다. 몇몇 실시형태에서, 제1 가이드 서열 및 제2 가이드 서열은 표적 유전자의 반대의 가닥에서 제1 표적 서열 및 제2 표적 서열(즉, 관심 대상의 영역, 예컨대 게놈 DNA에서 TCF4에서의 TNR)에 상보성이다.
몇몇 실시형태에서, 가이드 RNA는 화학적으로 변형된다. 몇몇 실시형태에서, 본 발명은 뉴클레아제를 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 뉴클레아제는 Cas 단백질 또는 이중 또는 단일 가닥 DNA를 절단하는 다른 뉴클레아제이다. 몇몇 실시형태에서, Cas 단백질은 타입-I, 타입-II, 또는 타입-III CRISPR/Cas 시스템 유래이다. 몇몇 실시형태에서, Cas 단백질은 Cas9 또는 Cpf1이다. 몇몇 실시형태에서, 뉴클레아제는 니카제(nickase)이다. 몇몇 실시형태에서, 뉴클레아제는 변형된다. 몇몇 실시형태에서, 변형된 뉴클레아제는 핵 국재화 신호(nuclear localization signal: NLS)를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 본 발명은 가이드 RNA 및 약제학적으로 허용 가능한 담체의 약제학적 제제를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 약제학적 제제는 하나 이상의 가이드 RNA 및 Cas 단백질을 코딩하는 mRNA를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 약제학적 제제는 하나 이상의 가이드 RNA 및 Cas 단백질을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 본 발명은 인간 대상체에서 전사 인자 4(TCF4) 유전자에서의 적어도 트라이뉴클레오타이드 반복부(TNR)의 부분을 절제하는 방법을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 2개의 가이드 RNA가 사용되고, 여기서 처음의 것은 TNR의 5'의 서열에 상보성이고, 둘째의 것은 TNR의 3'의 서열에 상보성이다. 2개의 가이드 서열이 사용될 때, 게놈 DNA의 표적화된 영역 사이의 DNA 서열을 절제한다.
몇몇 실시형태에서, TNR은 약 40개이거나 이들 초과의 트라이뉴클레오타이드 반복부이다. 몇몇 실시형태에서, TNR은 약 50개, 45개, 40개, 35개, 30개, 25개, 20개, 15개, 10개 또는 5개이거나 이들 초과의 트라이뉴클레오타이드 반복부이다. 몇몇 실시형태에서, TNR은 약 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 110개, 120개, 130개, 140개, 150개, 160개, 170개, 180개, 190개 또는 200개이거나 이들 초과의 트라이뉴클레오타이드 반복부이다.
몇몇 실시형태에서, 조성물 또는 약제학적 제제는 TNR의 적어도 일부를 절제하는 적어도 2개의 가이드를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 전체 TNR은 절제된다.
몇몇 실시형태에서, 조성물 또는 약제학적 제제는 바이러스 벡터를 통해 투여된다. 몇몇 실시형태에서, 조성물 또는 약제학적 제제는 지질 나노입자를 통해 투여된다. 당업자에게 공지된 임의의 지질 나노입자는 임의로 Cas 단백질을 코딩하는 mRNA와 함께 본 명세서에 제공된 하나 이상의 가이드 RNA를 전달하는 데 적합하다. 몇몇 실시형태에서, 3/30/3017에 제출된 PCT/US2017/024973에 기재된 지질 나노입자를 사용한다. 몇몇 실시형태에서, 지질 나노입자는 본 명세서에 제공된 하나 이상의 가이드 RNA 및 Cas 단백질을 코딩하는 mRNA를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 지질 나노입자는 Cas 단백질을 코딩하는 mRNA 없이 본 명세서에 제공된 하나 이상의 가이드 RNA를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 본 발명은 점안액 또는 안연고의 동시투여를 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 본 발명은 추가로 소프트 콘택트 렌즈의 사용을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 인간 대상체는 조현병을 갖는다.
몇몇 실시형태에서, 인간 대상체는 원발성 경화성 담관염(PSC)을 갖는다.
몇몇 실시형태에서, 본 발명은 인간 대상체에서 COL8A2 유전자의 돌연변이체 대립유전자, 예컨대 Gln455Lys, Gln455Val 또는 Leu450Trp의 발현을 감소시키거나, 상기 돌연변이체 대립유전자를 수정하도록 뉴클레오타이드 서열을 변경하는 방법을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 인간 대상체는 푹스 내피 각막 이상증(FECD) 또는 후부 다형 각막 이상증(PPCD)을 갖는다. 몇몇 실시형태에서, 인간 대상체는 FECD를 갖는다. 몇몇 실시형태에서, 대상체는 FECD의 가족 병력을 갖는다.
몇몇 실시형태에서, 대상체는 투여의 결과로서 시력의 감소의 개선, 안정화 또는 느려짐을 갖는다. 몇몇 실시형태에서, 대상체는 투여의 결과로서 각막 두께측정에 의해 측정된 바와 같은 개선, 안정화 또는 느려짐을 갖는다. 몇몇 실시형태에서, 대상체는 투여의 결과로서 반사 현미경검사에 기초하여 변화의 개선, 안정화 또는 느려짐을 갖는다. 몇몇 실시형태에서, 대상체는 투여의 결과로서 각막 이식이 필요할 때까지 시간의 지연을 갖는다.
몇몇 실시형태에서, 본 발명은 TCF4 유전자에서의 TNR 연장을 갖거나, 유전자 산물에서 Gln455Lys, Gln455Val 또는 Leu450Trp 돌연변이를 발생시키는 COL8A2 유전자에서의 돌연변이를 갖는 인간 대상체를 치료하기 위한 약제의 제조를 위한 조성물 또는 의약품의 용도를 포함한다.
추가적인 목적 및 이점은 하기하는 설명에서 부분적으로 기재될 것이고, 부분적으로 설명으로부터 명확할 것이거나, 실행에 의해 학습될 수 있다. 목적 및 이점은 특히 첨부된 청구항에 제시된 요소 및 조합의 조합에 의해 실현되고 획득될 것이다.
상기하는 일반 설명 및 하기하는 상세한 설명 둘 다가 오직 예시적이고 설명적이며 청구항을 제한하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서의 부분에 포함되거나 이의 일부를 구성하는 첨부된 도면은 하나(몇몇)의 실시형태(들)를 예시하고, 설명과 함께 본 명세서에 기재된 원칙을 설명하도록 작용한다.
도 1은 1개의 gRNA는 TNR의 5'인 인트론 3의 영역에 표적화하는 가이드 서열을 갖고, 다른 gRNA는 TNR의 3'인 인트론 3의 영역에 표적화하는 가이드 서열을 갖는, 한 쌍의 gRNA를 사용하여 TCF4의 인트론 3에서 TNR 연장 영역의 절제의 도식을 제공한다. 도면이 TNR의 정확한 경계에서 생기는 절제를 보여주지만, 실제는 절제는 더 크거나 더 작을 수 있고, 인트론의 상류 및/또는 하류를 포함한다.
도 2는 절제에 시험된 gRNA의 93 쌍에 대한 절제된 단편의 예측된 크기를 보여주는 도식을 제공한다. 번호는 시험된 가이드에 대한 각각의 표적 서열의 서열 번호에 상응한다. 쌍은 절제 퍼센트로 순서화된 순위이다(목록의 상부 쌍은 가장 높은 절제 순위를 갖는다). "0"은 TNR 영역의 중앙을 표시한다.
서열의 설명
표 1은 본 명세서에 언급된 소정의 서열의 목록을 제공한다.
Figure pct00001

Figure pct00002

Figure pct00003
정의
용어 "치료"는, 본 명세서에 사용된 바대로, 대상체에서의 질환을 위한 치료제의 임의의 투여 또는 적용을 포괄하고, 질환의 저해, 이의 진행의 정지, 질환의 하나 이상의 증상의 경감, 질환의 치유, 또는 질환의 하나 이상의 증상의 재발의 예방을 포함한다. 예를 들어, FECD의 치료는 FECD의 증상의 완화, 및 FECD의 증상의 경감, 질환 진행의 느려짐, 또는 질환의 증상의 재발의 치유/예방을 발생시키는 TCF4 유전자에서의 TNR의 수의 감소를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바대로, "FECD"는 푹스 이상증이라고도 칭하는 푹스 내피 각막 이상증을 의미한다. FECD는 증상이 없지만 유전적 장애, 예컨대 FECD의 발생 증가와 연관된 TCF4의 인트론 3에서의 TNR 연장을 갖는 개인을 또한 포함할 것이다. FECD는 증상이 없지만 FECD의 공지된 가족 병력 및 TCF4의 인트론 3에서의 TNR 연장을 갖는 개인을 또한 포함할 것이다.
본 명세서에 사용된 바대로, "TNR"은 트라이뉴클레오타이드 반복부를 의미한다. "미소부수체 반복부"는 2개 내지 9개의 염기 쌍의 세트의 다수의 반복부로 이루어진 DNA의 짧은 서열을 의미한다. 용어 미소부수체 반복부는 TNR을 포함한다. "TNR 연장"은 트라이뉴클레오타이드 반복부의 일반보다 더 높은 수를 의미한다. TCF4의 인트론 3을 위해, 예를 들어 TNR 연장은 약 50개 이상의 TNR을 특징으로 할 수 있다. 질환과 연관된 TNR 연장의 범위는 보통 50개 내지 1000개이지만, 1000개 초과의 반복부를 갖는 몇몇 환자가 확인되었다. TCF4의 인트론 3에서 50개 미만의 TNR을 갖는 환자는 일반적으로 TNR 연장 기전을 통해 질환의 위험 증가가 있는 것으로 생각되지 않지만, 이들은 여전히 TNR의 수의 감소로부터 이익을 얻을 수 있다.
TNR에 의해 생기고/생기거나, TNR의 존재를 특징으로 하는 질환은 "트라이뉴클레오타이드 반복 장애", "트라이뉴클레오타이드 반복 확장 장애", "삼중 반복 확장 장애" 또는 "코돈 반복 장애"라 칭해질 수 있다.
"가이드 RNA" 및 "gRNA"는 본 명세서에서 상호 교환 가능하게 사용된다. gRNA는 CRISPR RNA(crRNA) 및 trRNA(tracrRNA로도 공지됨)를 포함하거나 이들로 이루어진다. crRNA 및 trRNA는 하나의 RNA 분자(단일 가이드 RNA(sgRNA))에서 결합될 수 있거나, 별개의 RNA 분자(이중 가이드 RNA(dgRNA))에서 분해될 수 있다.
본 출원에 사용된 바대로, "가이드 서열"은 표적 서열에 상보성이고 뉴클레아제에 대한 절단에 대해 표적 서열에 가이드 RNA를 지향시키도록 작용하는 crRNA 또는 trRNA 내의 20개의 염기 쌍 서열을 의미한다. 약간 더 짧거나 더 긴 서열은 가이드, 예를 들어 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 21개, 22개, 23개, 24개 또는 25개 염기 쌍 길이로서 또한 사용될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 가이드 서열의 길이는 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 표적 서열의 길이에 상응한다.
본 명세서에 사용된 바대로, "표적 서열"은 가이드 RNA가 절단에 대해 뉴클레아제를 지향시키는 핵산의 서열을 의미한다. 표적 서열은 대상체의 게놈 DNA 내에 있다. 몇몇 실시형태에서, Cas 단백질은 표적 서열로 가이드 RNA에 의해 지향될 수 있고, 가이드 RNA는 표적 서열과 혼성화하고, 뉴클레아제는 표적 서열을 절단시킨다. Cas 단백질에 대한 핵산 기질이 이중 가닥 핵산이므로, 표적 서열은 게놈 DNA의 양성 및 음성 가닥(즉, 주어진 서열 및 서열의 역방향 보체) 둘 다를 포함한다. 따라서, 가이드 서열이 "표적 서열에 상보성"이라고 말해지는 경우, 가이드 서열이 본 명세서에 제공된 표적 서열의 역방향 보체에 결합하도록 (예를 들어, RNP에서) 가이드 RNA를 지향시킬 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 몇몇 실시형태에서, 가이드 서열이 표적 서열의 역방향 보체에 결합하는 경우, 가이드 서열은, 가이드 서열에서 T에 대한 U의 치환을 제외하고, 표적 서열의 처음의 20개의 뉴클레오타이드(예를 들어, PAM을 포함하지 않는 표적 서열)와 동일하다.
본 명세서에 사용된 바대로, "PAM" 또는 "프로토스페이서 인접한 모티프"는 표적 서열에 인접해야 하는 서열을 의미한다. 필요한 PAM은 특정한 CRISPR 시스템에 따라 변한다. 스트렙토코커스 피요게네스로부터 유래된 CRISPR/Cas 시스템에서, 표적 DNA는 최적 절단을 위해 5'-NGG PAM(여기서, "N"은 임의의 핵염기, 이어서 2개의 구아닌 핵염기)에 바로 선행해야 하는 한편, 다른 Cas9 오쏘로그는 상이한 PAM 요건을 갖는다. 스트렙토코커스 피요게네스 Cas9가 또한 5'-NAG PAM을 인식할 수 있지만, 이것이 이 PAM 부위에서 덜 효율적으로 절단하는 것으로 보인다. 표 2의 표적 서열은 PAM을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 가이드 RNA 및 Cas 단백질은 "리보핵단백질"(RNP)을 형성할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 가이드 RNA는 뉴클레아제, 예컨대 Cas9를 표적 서열로 가이드하고, 가이드 RNA는 표적 서열과 혼성화하고, 뉴클레아제는 표적 서열을 절단한다.
본 명세서에 사용된 바대로, "삽입-결실"은 핵산에서 이중 가닥 파괴(DSB)의 부위에서 삽입되거나 결실된 다수의 뉴클레오타이드로 이루어진 삽입/결실 돌연변이를 의미한다.
본 명세서에 사용된 바대로, "절제 단편(들)"은 2개 이상의 가이드 RNA가 Cas mRNA 또는 단백질과 함께 사용될 때 발생할 수 있는 뉴클레오타이드의 연속 수의 결실을 의미한다.
조성물
FECD의 치료에서 유용한 조성물이 기재되어 있다. 몇몇 양태에서, 조성물은 TCF4 유전자에서 TNR에 뉴클레아제를 지향시키는 가이드 RNA를 포함하여서, TNR을 절단하여서, FECD, PPCD, PSC 및 조현병을 포함하는 TCF4 유전자에서 TNR을 갖는 질환을 치료한다. 몇몇 실시형태에서, 조성물은 TCF4의 인트론 3에서 제1 위치 및 제2 위치에 뉴클레아제를 지향시키는 2개의 가이드 RNA를 포함하고, 여기서 뉴클레아제는 제1 위치 및 제2 위치에서 TCF4의 인트론 3을 절단하고, 제1 절단과 제2 절단 사이에 핵산의 단편을 절제하여서, TCF4의 인트론 3 내에 함유된 TNR의 일부 또는 전부를 절제하고, FECD, PPCD, PSC 및 조현병을 포함하는 TCF4 유전자에서 TNR을 갖는 질환을 치료한다. 다른 양태에서, 조성물은 DNA에서 표적 서열을 통해 COL8A2 유전자에 뉴클레아제를 지향시키는 가이드 RNA를 포함하여서, 서열의 절단을 위한 목적을 위해 NHEJ를 매개하고 삽입-결실의 도입을 발생시키거나, HR 또는 HDR을 매개하고, 여기서 DNA에서의 돌연변이는 주형의 사용 및 FECD 또는 PPCD의 치료에 의해 수정될 수 있다. 조성물의 실시형태는 하기 기재되어 있다.
가이드 RNA
몇몇 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 표적 DNA 서열에 뉴클레아제, 예컨대 Cas9를 지향시키는 가이드 서열(들)을 포함하는 가이드 RNA(gRNA)를 포함한다. gRNA는 crRNA 및 trRNA를 포함한다. 본 명세서에 기재된 각각의 조성물 및 방법 실시형태에서, crRNA 및 trRNA는 하나의 RNA(sgRNA)에서 결합될 수 있거나, 별개의 RNA(dgRNA)에서 분해될 수 있다.
본 명세서에 기재된 조성물 및 방법 실시형태의 각각에서, 가이드 RNA는 "이중 가이드 RNA" 또는 "dgRNA"로서 2개의 RNA 분자를 포함할 수 있다. dgRNA는 crRNA를 포함하는 제1 RNA 분자 및 trRNA를 포함하는 제2 RNA 분자를 포함한다. 제1 및 제2 RNA 분자는 공유로 연결되지 않지만, crRNA 및 trRNA에서 깃대 영역 사이에 염기 쌍 짓기를 통해 RNA 듀플렉스를 형성할 수 있다.
본 명세서에 기재된 조성물 및 방법 실시형태의 각각에서, 가이드 RNA는 "단일 가이드 RNA" 또는 "sgRNA"로서 단일 RNA 분자를 포함할 수 있다. sgRNA는 trRNA에 공유로 연결된 crRNA를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, crRNA 및 trRNA는 링커를 통해 공유로 연결된다. 몇몇 실시형태에서, sgRNA는 crRNA 및 trRNA에서 깃대 영역 사이의 염기 쌍 짓기를 통해 줄기-루프 구조를 형성한다.
몇몇 실시형태에서, trRNA는 천연 발생 CRISPR/Cas 시스템으로부터 야생형 trRNA 서열의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, trRNA는 절두된 또는 변형된 야생형 trRNA를 포함한다. trRNA의 길이는 사용된 CRISPR/Cas 시스템에 따라 달라진다. 몇몇 실시형태에서, trRNA는 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 25개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개 또는 100개 초과의 뉴클레오타이드를 포함하거나 이들로 이루어진다. 소정의 실시형태에서, trRNA는 적어도 26개의 뉴클레오타이드 길이이다. 추가적인 실시형태에서, trRNA는 적어도 40개의 뉴클레오타이드 길이이다. 몇몇 실시형태에서, trRNA는 예를 들어 하나 이상의 헤어핀 또는 줄기-루프 구조 또는 하나 이상의 벌지 구조와 같은 소정의 2차 구조를 포함할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, gRNA는 화학적으로 변형된다. 하나 이상의 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드를 포함하는 gRNA는 정준 A, G, C, 및 U 잔기 대신에 또는 이것 이외에 사용되는 하나 이상의 비천연 및/또는 천연 발생 성분 또는 구성의 존재를 기재하도록 "변형된" gRNA 또는 "화학적으로 변형된" gRNA라 불린다. 몇몇 실시형태에서, 변형된 gRNA는 비정준 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드에 의해 합성되고, 여기서 "변형된다"고 불린다. 변형된 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드는 (i) 비연결 포스페이트 산소의 하나 또는 둘 다 및/또는 포스포다이에스터 골격 연결에서의 하나 이상의 연결 포스페이트 산소의 변경, 예를 들어 대체(예시적인 골격 변형); (ii) 리보스 당에서의 2' 하이드록실의 리보스 당의 구성성분의 변경, 예를 들어 대체(예시적인 당 변형); (iii) "데포스포" 링커에 의한 포스페이트 모이어티의 대규모 대체(예시적인 골격 변형); (iv) 비정준 핵염기에 의한 것을 포함하는 천연 발생 핵염기의 변형 또는 대체(예시적인 염기 변형); (v) 리보스-포스페이트 골격의 대체 또는 변형(예시적인 골격 변형); (vi) 올리고뉴클레오타이드의 3' 말단 또는 5' 말단의 변형, 예를 들어 말단 포스페이트기의 제거, 변형 또는 대체 또는 모이어티, 캡 또는 링커의 접합(이러한 3' 또는 5' 캡 변형은 당 및/또는 골격 변형을 포함할 수 있음); 및 (vii) 당의 변형 또는 대체(예시적인 당 변형) 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
상기 기재된 변형은 2개, 3개, 4개 또는 이것 초과의 변형을 가질 수 있는 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드(총체적으로 "잔기")를 포함하는 변형된 gRNA를 제공하도록 조합될 수 있다. 예를 들어, 변형된 잔기는 변형된 당 및 변형된 핵염기를 가질 수 있다. 몇몇 실시형태에서, gRNA의 모든 염기는 변형되고, 예를 들어 모든 염기는 변형된 포스페이트기, 예컨대 포스포로티오에이트기를 갖는다. 소정의 실시형태에서, gRNA 분자의 포스페이트기의 전부 또는 실질적으로 전부는 포스포로티오에이트기에 의해 대체된다. 몇몇 실시형태에서, 변형된 gRNA는 RNA의 5' 말단에서 또는 그 근처에서 적어도 하나의 변형된 잔기를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 변형된 gRNA는 RNA의 3' 말단에서 또는 그 근처에서 적어도 하나의 변형된 잔기를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, gRNA는 1개, 2개 3개 또는 이것 초과의 변형된 잔기를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 변형된 gRNA에서의 위치의 적어도 5%(예를 들어, 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 약 100%)는 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드이다.
비변형된 핵산은 예를 들어 세포 뉴클레아제에 의해 분해가 되기 쉬울 수 있다. 예를 들어, 뉴클레아제는 핵산 포스포다이에스터 결합을 가수분해할 수 있다. 따라서, 일 양태에서, 본 명세서에 기재된 gRNA는 예를 들어 뉴클레아제에 대한 안정성을 도입하기 위해 하나 이상의 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드를 함유할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 gRNA 분자는 생체내 및 생체외 둘 다 세포의 집단으로 도입될 때 선천성 면역 반응의 감소를 나타낼 수 있다. 용어 "선천성 면역 반응"은 사이토카인 발현 및 방출의 유도를 수반하는 단일 가닥 핵산을 포함하는 외인성 핵산, 특히 인터페론에 대한 세포 반응, 및 세포사를 포함한다.
골격 변형의 몇몇 실시형태에서, 변형된 잔기의 포스페이트기는 하나 이상의 산소를 상이한 치환기에 의해 대체함으로써 변형될 수 있다. 추가로, 변형된 잔기, 예를 들어 변형된 핵산에 존재하는 변형된 잔기는 본 명세서에 기재된 바와 같은 변형된 포스페이트기에 의한 비변형된 포스페이트 모이어티의 대규모 대체를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 포스페이트 골격의 골격 변형은 비대칭 전하 분포를 갖는 비하전된 링커 또는 하전된 링커를 발생시키는 변경을 포함할 수 있다.
변형된 포스페이트기의 예는 포스포로티오에이트, 포스포로셀레네이트, 보라노 포스페이트, 보라노 포스페이트 에스터, 하이드로겐 포스포네이트, 포스포로아미데이트, 알킬 또는 아릴 포스포네이트 및 포스포트라이에스터를 포함한다. 비변형된 포스페이트기에서의 인 원자는 비키랄이다. 그러나, 상기 원자 또는 원자의 군 중 하나에 의한 비브릿징 산소 중 하나의 대체는 인 원자가 키랄이 되게 할 수 있다. 입체발생 인 원자는 "R" 구성(여기서 Rp) 또는 "S" 구성(여기서 Sp)을 보유할 수 있다. 골격은 질소(브릿징된 포스포로아미데이트), 황(브릿징된 포스포로티오에이트) 및 탄소(브릿징된 메틸렌포스포네이트)에 의한 브릿징 산소(즉, 포스페이트를 뉴클레오사이드에 연결하는 산소)의 대체에 의해 또한 변형될 수 있다. 대체는 연결 산소 중 어느 하나 또는 연결 산소의 둘 다에서 발생할 수 있다.
포스페이트기는 소정의 골격 변형에서 인 비함유 연결기에 의해 대체될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 하전된 포스페이트기는 천연 모이어티에 의해 대체될 수 있다. 포스페이트기를 대체할 수 있는 모이어티의 예는, 제한 없이, 예를 들어 메틸 포스포네이트, 하이드록실아미노, 실록산, 카보네이트, 카복시메틸, 카바메이트, 아마이드, 티오에터, 에틸렌 옥사이드 링커, 설포네이트, 설폰아마이드, 티오폼아세탈, 폼아세탈, 옥심, 메틸렌이미노, 메틸렌메틸이미노, 메틸렌하이드라조, 메틸렌다이메틸하이드라조 및 메틸렌옥시메틸이미노를 포함할 수 있다.
포스페이트 링커 및 리보스 당이 뉴클레아제 저항 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드 대리에 의해 대체된, 핵산을 모방할 수 있는 스캐폴드가 또한 작제될 수 있다. 이러한 변형은 골격 및 당 변형을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 핵염기는 대리 골격에 의해 테터링될 수 있다. 예는, 제한 없이, 모르폴리노, 사이클로뷰틸, 피롤리딘 및 펩타이드 핵산(PNA) 뉴클레오사이드 대리를 포함할 수 있다.
변형된 뉴클레오사이드 및 변형된 뉴클레오타이드는 당 기에 대한, 즉 당 변형에서 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 2' 하이드록실기(OH)는 다수의 상이한 "옥시" 또는 "데옥시" 치환기에 의해 변형, 예를 들어 대체될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 2' 하이드록실기에 대한 변형은 하이드록실이 2'-알콕사이드 이온을 형성하도록 더 이상 탈양성자화될 수 없으므로 핵산의 안정성을 증대시킬 수 있다.
2' 하이드록실기 변형의 예는 알콕시 또는 아릴옥시(OR, 여기서 "R"은 예를 들어 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴 또는 당일 수 있음); 폴리에틸렌글라이콜(PEG), O(CH2CH2O)nCH2CH2OR(여기서, R은 예를 들어 H 또는 임의로 치환된 알킬일 수 있고, n은 0 내지 20(예를 들어, 0 내지 4, 0 내지 8, 0 내지 10, 0 내지 16, 1 내지 4, 1 내지 8, 1 내지 10, 1 내지 16, 1 내지 20, 2 내지 4, 2 내지 8, 2 내지 10, 2 내지 16, 2 내지 20, 4 내지 8, 4 내지 10, 4 내지 16 및 4 내지 20)의 정수일 수 있음)을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 2' 하이드록실기 변형은 2'-O-Me일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 2' 하이드록실기 변형은 플루오라이드에 의해 2' 하이드록실기를 대체하는 2'-플루오로 변형일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 2' 하이드록실기 변형은 2' 하이드록실이 예를 들어 C1-6 알킬렌 또는 C1-6 헤테로알킬렌 브릿지에 의해 동일한 리보스 당의 4' 탄소에 연결될 수 있는 "잠긴 핵산(LNA)을 포함할 수 있고, 예시적인 브릿지는 메틸렌, 프로필렌, 에터, 또는 아미노 브릿지; O-아미노(여기서, 아미노는 예를 들어 NH2; 알킬아미노, 다이알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 다이아릴아미노, 헤테로아릴아미노 또는 다이헤테로아릴아미노, 에틸렌다이아민 또는 폴리아미노일 수 있음) 및 아미노알콕시, O(CH2)n-아미노(여기서, 아미노는 예를 들어 NH2; 알킬아미노, 다이알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 다이아릴아미노, 헤테로아릴아미노, 또는 다이헤테로아릴아미노, 에틸렌다이아민 또는 폴리아미노일 수 있음)를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 2' 하이드록실기 변형은 리보스 고리가 C2'-C3' 결합이 결여된 "비잠긴" 핵산(UNA)을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 2' 하이드록실기 변형은 메톡시에틸기(MOE), (OCH2CH2OCH3, 예를 들어 PEG 유도체)를 포함할 수 있다.
"데옥시" 2' 변형은 수소(즉, 예를 들어 부분적으로 dsRNA의 오보행 부분에서 데옥시리보스 당); 할로(예를 들어, 브로모, 클로로, 플루오로 또는 요오도); 아미노(여기서, 아미노는 예를 들어 NH2; 알킬아미노, 다이알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 다이아릴아미노, 헤테로아릴아미노, 다이헤테로아릴아미노 또는 아미노산일 수 있음); NH(CH2CH2NH)nCH2CH2- 아미노(여기서, 아미노는 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같을 수 있음), -NHC(O)R(여기서, R은 예를 들어 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴 또는 당일 수 있음), 사이아노; 머캅토; 알킬-티오-알킬; 티오알콕시; 및 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 알케닐 및 알키닐(본 명세서에 기재된 바와 같은 아미노에 의해 임의로 치환될 수 있음)을 포함할 수 있다.
당 변형은 리보스에서 상응하는 탄소의 것보다 반대의 입체화학 구성을 보유하는 하나 이상의 탄소를 또한 함유할 수 있는 당 기를 포함할 수 있다. 따라서, 변형된 핵산은 당으로서 예를 들어 아라비노스를 함유하는 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 변형된 핵산은 비염기성 당을 또한 포함할 수 있다. 이 비염기성 당은 하나 이상의 구성성분 당 원자에서 또한 추가로 변형될 수 있다. 변형된 핵산은 L 형태인 하나 이상의 당, 예를 들어 L- 뉴클레오사이드를 또한 포함할 수 있다.
변형된 핵산으로 도입될 수 있는 본 명세서에 기재된 변형된 뉴클레오사이드 및 변형된 뉴클레오타이드는 핵염기라고도 불리는 변형된 염기를 포함할 수 있다. 핵염기의 예는 구아닌(A), 구아닌(G), 사이토신(C) 및 유라실(U)을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 이 핵염기는 변형된 핵산으로 도입될 수 있는 변형된 잔기를 제공하도록 변형되거나 완전히 대체될 수 있다. 뉴클레오타이드의 핵염기는 독립적으로 퓨린, 피리미딘, 퓨린 유사체 또는 피리미딘 유사체로부터 선택될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 핵염기는 예를 들어 천연 발생 염기 및 염기의 합성 유도체를 포함할 수 있다.
이중 가이드 RNA를 사용하는 실시형태에서, 각각의 crRNA 및 tracr RNA는 변형을 함유할 수 있다. 이러한 변형은 crRNA 및/또는 tracr RNA 중 하나의 말단 또는 양 말단에 있을 수 있다. sgRNA를 포함하는 실시형태에서, sgRNA의 하나의 말단 또는 양 말단에서의 하나 이상의 잔기는 화학적으로 변형될 수 있거나, 전체 sgRNA는 화학적으로 변형될 수 있다. 소정의 실시형태는 5' 말단 변형을 포함한다. 소정의 실시형태는 3' 말단 변형을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 가이드 RNA 분자의 단일 가닥 오버행에서 뉴클레오타이드 중 하나 이상 또는 전부는 데옥시뉴클레오타이드이다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 가이드 RNA는 발명의 명칭이 "Chemically Modified Guide RNAs"인 2016년 12월 8일에 출원된 US 62/431,756(이의 내용은 그 전문이 참고로 본 명세서에 포함됨)에 개시된 변형 패턴 중 하나를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 본 발명은 하나 이상의 변형을 포함하는 gRNA를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 변형은 2'-O-메틸(2'-O-Me) 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 변형은 뉴클레오타이드 사이에 포스포로티오에이트(PS) 결합을 포함한다.
용어 "mA", "mC", "mU" 또는 "mG"는 2'-O-Me에 의해 변형된 뉴클레오타이드를 나타내도록 사용될 수 있다.
2'-O-메틸의 변형은 하기와 같이 도시될 수 있다:
Figure pct00004
뉴클레오타이드 당 고리에 영향을 미치는 것으로 보이는 또 다른 화학 변형은 할로겐 치환이다. 예를 들어, 뉴클레오타이드 당 고리에서의 2'-플루오로(2'-F) 치환은 올리고뉴클레오타이드 결합 친화도 및 뉴클레아제 안정성을 증가시킬 수 있다.
본 출원에서, 용어 "fA", "fC", "fU" 또는 "fG"는 2'-F에 의해 치환된 뉴클레오타이드를 나타내도록 사용될 수 있다.
2'-F의 치환은 하기와 같이 도시될 수 있다:
Figure pct00005
포스포로티오에이트(PS) 연결 또는 결합은 예를 들어 뉴클레오타이드 염기 사이의 결합에서 포스포다이에스터 연결에서의 하나의 비브릿징 포스페이트 산소에 대해 황이 치환된 결합을 의미한다. 포스포로티오에이트가 올리고뉴클레오타이드를 생성하도록 사용될 때, 변형된 올리고뉴클레오타이드는 또한 S-올리고라 칭해질 수 있다.
"*"는 PS 변형을 도시하도록 사용될 수 있다. 본 출원에서, 용어 A*, C*, U* 또는 G*는 PS 결합에 의해 다음(예를 들어, 3') 뉴클레오타이드에 연결된 뉴클레오타이드를 나타내도록 사용될 수 있다.
본 출원에서, 용어 "mA*", "mC*", "mU*" 또는 "mG*"는 2'-O-Me에 의해 치환되고 PS 결합에 의해 다음(예를 들어, 3') 뉴클레오타이드에 연결된 뉴클레오타이드를 나타내도록 사용될 수 있다.
하기 다이어그램은 포스포다이에스터 결합 대신에 PS 결합을 생성하는 비브릿징 포스페이트 산소로의 S-의 치환을 보여준다:
Figure pct00006
비염기성 뉴클레오타이드는 질소성 염기가 결여된 것을 의미한다. 하기 도면은 염기가 결여된 비염기성(아프린이라고도 공지됨) 부위를 갖는 올리고뉴클레오타이드를 도시한다:
Figure pct00007
인버티드 염기는 일반 5'→3' 연결(즉, 5'→5' 연결 또는 3'→3' 연결 중 어느 하나)로부터 반전된 연결을 갖는 것을 의미한다. 예를 들어:
Figure pct00008
비염기성 뉴클레오타이드는 인버티드 연결에 의해 부착될 수 있다. 예를 들어, 비염기성 뉴클레오타이드는 5→5' 연결을 통해 말단 5' 뉴클레오타이드에 부착될 수 있거나, 비염기성 뉴클레오타이드는 3'→3' 연결을 통해 말단 3' 뉴클레오타이드에 부착될 수 있다. 말단 5' 또는 3' 뉴클레오타이드 중 어느 하나에서의 인버티드 비염기성 뉴클레오타이드는 인버티드 비염기성 말단 캡이라 또한 불릴 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 가이드 RNA의 5' 말단에서의 처음의 3개, 4개 또는 5개의 뉴클레오타이드 중 하나 이상 및 3' 말단에서의 마지막의 3개, 4개 또는 5개의 뉴클레오타이드 중 하나 이상은 변형된다. 몇몇 실시형태에서, 변형은 2'-O-Me, 2'-F, 인버티드 비염기성 뉴클레오타이드, PS 결합 또는 안정성 및/또는 성능을 증가시키는 것으로 당해 분야에 널리 공지된 다른 뉴클레오타이드 변형이다.
몇몇 실시형태에서, 5' 말단에서의 처음의 4개의 뉴클레오타이드 및 3' 말단에서의 마지막의 4개의 뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트(PS) 연결에 의해 연결된다.
몇몇 실시형태에서, 5' 말단에서의 처음의 3개의 뉴클레오타이드 및 3' 말단에서의 마지막 3개의 뉴클레오타이드는 2'-O-메틸(2'-O-Me) 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 5' 말단에서의 처음의 3개의 뉴클레오타이드 및 3' 말단에서의 마지막 3개의 뉴클레오타이드는 2'-플루오로(2'-F) 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 5' 말단에서의 처음의 뉴클레오타이드 및 3' 말단에서의 마지막 3개의 뉴클레오타이드는 반전된 비염기성 뉴클레오타이드를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 가이드 RNA는 변형된 sgRNA를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, sgRNA는 서열 번호 1086에 도시된 변형 패턴을 포함하고, 여기서, N은 임의의 천연 또는 비천연 뉴클레오타이드이고, N'의 전체는 TC4 표적 서열에 뉴클레아제를 지향시키는 본 명세서에 기재된 바와 같은 가이드 서열을 포함한다.
TCF4에 대한 가이드 RNA
몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1 내지 190의 임의의 하나의 핵산에 상보성인 가이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 적어도 하나의 가이드 RNA(gRNA)를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1 내지 190의 임의의 하나의 핵산에 뉴클레아제를 지향시키는 가이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 적어도 하나의 가이드 RNA(gRNA)를 포함한다. 일 양태에서, 조성물은 서열 번호 1 내지 190의 임의의 하나의 핵산과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91% 또는 90% 동일한 표적 서열에 상보성인 가이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 적어도 하나의 가이드 RNA를 포함한다. 일 양태에서, 조성물은 서열 번호 1 내지 190의 임의의 하나의 핵산과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91% 또는 90% 동일한 표적 서열에 뉴클레아제를 지향시키는 가이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 적어도 하나의 gRNA를 포함한다.
몇몇 양태에서, 조성물은 서열 번호 1089 내지 1278의 임의의 핵산과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91% 또는 90% 동일한 가이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 적어도 하나의 gRNA를 포함한다. 몇몇 양태에서, 조성물은 서열 번호 1089 내지 1278의 임의의 핵산과 동일한 가이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 적어도 하나의 gRNA를 포함한다.
다른 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1 내지 190의 임의의 2개 이상의 핵산으로부터 선택된 임의의 하나의 표적 서열에 상보성인 적어도 2개의 가이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 적어도 2개의 gRNA를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1 내지 190의 임의의 핵산과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91% 또는 90% 동일한 임의의 2개 이상의 핵산으로부터 선택된 임의의 하나의 표적 서열에 상보성인 적어도 2개의 가이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 적어도 2개의 gRNA를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, TCF4의 TNR의 5'의 서열을 표적화하는 gRNA는 TCF4의 TNR을 절제할 목적을 위해 TCF4의 TNR의 3'의 서열을 표적화하는 gRNA와 함께 사용된다. 몇몇 실시형태에서, 서열 번호 1 내지 93의 표적 서열에 상보성인 가이드 서열은 서열 번호 94 내지 190의 표적 서열에 상보성인 가이드 서열과 함께 사용된다.
몇몇 실시형태에서, TCF4의 TNR의 3'의 서열을 표적화하는 gRNA와 함께 TCF4의 TNR의 5'의 서열을 표적화하는 gRNA의 사용은 연장된 TNR 서열을 갖는 환자에서 TCF4의 인트론 3에서의 TNR의 완전한 서열을 절제한다. 예를 들어, 몇몇 실시형태에서, TNR 연장에 5' 및 3'의 서열을 표적화하는 gRNA의 조합은 적어도 40개, 적어도 50개, 적어도 60개, 적어도 70개, 적어도 80개, 적어도 90개, 적어도 100개, 적어도 150개, 적어도 200개, 적어도 250개, 적어도 300개, 적어도 400개, 적어도 500개, 적어도 600개, 적어도 700개, 적어도 800개, 적어도 900개 또는 적어도 1000개 또는 이것 초과의 반복부를 갖는 TNR을 절제한다. 몇몇 실시형태에서, 이 접근법은 40개 초과의 수의 TNR 연장을 절제하도록 사용된다. 몇몇 실시형태에서, TNR 반복부 내 표적화하는 gRNA와 함께 TCF4의 TNR의 5'의 서열을 표적화하는 gRNA의 사용, 또는 TCF4의 TNR의 3'의 서열을 표적화하는 gRNA와 함께 TNR 반복부 내 표적화하는 gRNA의 사용은 연장된 TNR 서열을 갖는 환자에서 TCF4의 인트론에서의 TNR의 연장된 TNR의 부분을 절제하여서, TNR의 길이를 짧게 한다. 몇몇 실시형태에서, 하나의 가이드 RNA는 TCF4의 TNR의 5'인 서열을 표적화하고, 다른 가이드 RNA는 TCF4의 TNR의 3'인 서열을 표적화하여서, TNR의 전부를 절제한다.
TCF4 를 표적화하는 2개 이상의 가이드 RNA의 조합
소정의 실시형태에서, 조성물은 하나 초과의 gRNA를 포함한다. 각각의 gRNA가 상이한 가이드 서열을 함유할 수 있어서, 연관된 뉴클레아제는 하나 초과의 표적 서열을 절단한다. 몇몇 실시형태에서, gRNA는 동일한 또는 상이한 특성, 예컨대 RNP 복합체 내에 활성 또는 안정성을 가질 수 있다. 하나 초과의 gRNA가 사용되는, 벡터를 수반하는 몇몇 실시형태에서, 각각의 gRNA는 동일한 또는 상이한 벡터에서 코딩될 수 있다. 하나 초과의 gRNA의 발현을 추진시키도록 사용된 촉진자는 동일하거나 상이할 수 있다. 지질 나노입자를 수반하는 소정의 실시형태에서, 2개 이상의 gRNA는 동일한 지질 나노입자 또는 별개의 지질 나노입자에서 제제화될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 각각의 gRNA의 가이드 서열은 TCF4 유전자의 동일한 가닥에서 표적 서열에 상보성이다. 몇몇 실시형태에서, 각각의 gRNA의 가이드 서열은 TCF4 유전자의 양성 가닥에서 표적 서열에 상보성이다. 몇몇 양태에서, 각각의 gRNA의 가이드 서열은 TCF4 유전자의 음성 가닥에서 표적 서열에 상보성이다. 몇몇 실시형태에서, gRNA의 가이드 서열은 TCF4 유전자의 반대의 가닥에서 표적 서열에 상보성이다.
몇몇 양태에서, 조성물은 적어도 2개의 gRNA를 포함하고, 적어도 2개의 gRNA는 2개의 상이한 위치로 뉴클레아제를 표적화하는 가이드 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 2개의 gRNA는 TCF4 유전자의 TNR을 플랭킹할 수 있다(즉, 2개의 gRNA는 TNR의 어느 한 부위에 있고; 달리 말하면, 하나의 gRNA는 TNR에 5'에 있고, 또 다른 gRNA는 TNR에 3'에 있다). 몇몇 실시형태에서, 하나의 gRNA는 TCF4 유전자의 TNR 내이고, 다른 gRNA는 TCF4 유전자의 TNR 밖이다(즉, TNR을 플랭킹). 몇몇 실시형태에서, 2개의 gRNA는 약 3000개, 2500개, 2000개, 1500개, 1000개, 500개, 400개, 300개, 200개, 150개, 100개, 50개 또는 30개의 뉴클레오타이드 떨어진 표적 서열로 뉴클레아제를 표적화한다. 몇몇 실시형태에서, 뉴클레아제는 각각의 위치를 절단시키고, TCF4의 인트론 3의 TNR 연장 영역을 포함하는 DNA 단편은 절제된다.
몇몇 실시형태에서, 오직 하나의 gRNA를 사용한다. 몇몇 실시형태에서, TCF4의 TNR의 5'의 서열을 표적화하는 gRNA를 사용한다. 몇몇 실시형태에서, 가이드 서열은 서열 번호 1 내지 93의 표적 서열에 상보성이다. 몇몇 실시형태에서, TCF4의 TNR의 3'의 서열을 표적화하는 gRNA를 사용한다. 몇몇 실시형태에서, 서열 번호 94 내지 190의 표적 서열에 상보성인 가이드를 사용한다. 몇몇 실시형태에서, TCF4에서의 TNR 반복부 연장 내에 서열을 표적화하는 gRNA를 사용한다. 몇몇 실시형태에서, 단일 가이드의 사용은 TNR 서열을 감소시키거나 제거하는 NHEJ 동안 삽입-결실 형성을 발생시킨다. 몇몇 실시형태에서, 단일 가이드의 사용은 한쌍의 TNR 서열을 감소시키거나 제거하는 NHEJ 동안 삽입-결실 형성을 발생시킨다.
COL8A2에 대한 가이드 RNA
몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 191 내지 1084의 임의의 핵산에 상보성인 가이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 적어도 하나의 가이드 RNA(gRNA)를 포함한다. 일 양태에서, 조성물은 서열 번호 191 내지 1084의 임의의 핵산과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91% 또는 90% 동일한 표적 서열에 상보성인 가이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 적어도 하나의 gRNA를 포함한다.
다른 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 191 내지 1084의 임의의 2개 이상의 핵산에 상보성인 적어도 2개의 가이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 적어도 2개의 gRNA를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 191 내지 1084의 핵산의 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91% 또는 90% 동일한 임의의 2개 이상의 핵산에 상보성인 적어도 2개의 가이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 적어도 2개의 gRNA를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 공지된 돌연변이 없이 야생형 COL8A2에서 서열로 표적화하는 gRNA를 사용한다. 몇몇 실시형태에서, 서열 번호 191 내지 1063의 표적 서열에 상보성인 가이드 서열을 사용한다.
몇몇 실시형태에서, Gln455Lys 돌연변이를 제조하는 것으로 공지된 COL8A2에서의 돌연변이에 상응하는 서열로 표적화하는 gRNA를 사용한다. 몇몇 실시형태에서, 예를 들어 c.1364C>A 뉴클레오타이드 변경에 의해 생긴 Gln455Lys 돌연변이를 선택적으로 편집하도록 서열 번호 1064 내지 1069의 표적 서열에 상보성인 가이드 서열을 사용한다.
몇몇 실시형태에서, Gln455Val 돌연변이를 제조하는 것으로 공지된 COL8A2에서의 돌연변이에 상응하는 서열로 표적화하는 gRNA를 사용한다. 몇몇 실시형태에서, 예를 들어 c.1363-1364CA>GT 뉴클레오타이드 변경에 의해 생긴 Gln455Val 돌연변이를 선택적으로 편집하도록 서열 번호 1070 내지 1075의 표적 서열에 상보성인 가이드 서열을 사용한다.
몇몇 실시형태에서, Leu450Trp 돌연변이를 제조하는 것으로 공지된 COL8A2에서의 돌연변이에 상응하는 서열로 표적화하는 gRNA를 사용한다. 몇몇 실시형태에서, 예를 들어 c.1349T>G 뉴클레오타이드 변경에 의해 생긴 Leu450Trp 돌연변이를 선택적으로 편집하도록 서열 번호 1076 내지 1084의 표적 서열에 상보성인 가이드 서열을 사용한다.
표적 서열
몇몇 실시형태에서, 가이드 RNA는 COL8A2 유전자로 뉴클레아제를 표적화한다. 몇몇 양태에서, crRNA는 TCF4 유전자에서 TNR을 플랭킹하는 표적 서열에 상보성이고 이것과 혼성화하는 가이드 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 2개의 gRNA를 사용한다. 이러한 실시형태에서, 2개의 gRNA는 TCF4 유전자의 TNR을 플랭킹할 수 있다(즉, 2개의 gRNA는 TNR의 어느 한 측에 있음). 몇몇 실시형태에서, 하나의 gRNA는 TCF4 유전자의 TNR 내이고, 다른 gRNA는 TCF4 유전자의 TNR의 밖이다(즉, TNR을 플랭킹). 몇몇 실시형태에서, crRNA는 trRNA의 부분에 상보성이고 이것과 혼성화하는 깃대 영역을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, crRNA는 박테리아의 CRISPR 유전좌위로부터 전사된 천연 발생 crRNA의 구조와 아주 유사할 수 있고, 여기서 가이드 서열은 CRISPR/Cas9 시스템의 "스페이서"로서 작용하고, 깃대는 CRISPR 유전좌위에서 스페이서를 플랭킹하는 반복부 서열의 부분에 상응한다.
TCF4 에 대한 표적 서열
본 발명의 조성물은 TCF4 유전자에서의 TNR을 플랭킹하는 또는 그것 내의 표적 서열에 지향되거나 이것을 절단할 수 있다. 예를 들어, TNR 표적 서열은 제공된 뉴클레아제에 의해 인식되고 절단될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, Cas 단백질은 TCF4 유전자에서 TNR을 플랭킹하는 표적 서열에 가이드 RNA에 의해 지향될 수 있고, 여기서 가이드 RNA의 가이드 서열은 표적 서열 또는 이의 역방향 보체과 혼성화하고, 표적 서열에 Cas 단백질을 지향시킨다. 몇몇 실시형태에서, Cas 단백질은 TCF4 유전자에서의 TNR 내에 표적 서열에 가이드 RNA에 의해 지향될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, Cas 단백질은 TCF4 유전자에서의 TNR을 플랭킹하는 2개의 표적 서열에 하나 초과의 가이드 RNA에 의해 지향될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, Cas 단백질은 2개의 표적 서열에 하나 초과의 가이드 RNA에 의해 지향될 수 있고, 여기서 하나는 TCF4 유전자에서 TNR을 플랭킹하고, 또 다른 것은 TCF4 유전자에서 TNR 내에 있다.
몇몇 실시형태에서, 하나 이상의 가이드 RNA의 선택은 TCF4 유전자에서 TNR 근처의 표적 서열에 기초하여 결정된다. 예를 들어, 몇몇 실시형태에서, 하나 이상의 가이드 RNA는 TCF4 유전자에서 TNR을 플랭킹하는 표적 서열에 상보성인 가이드를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 하나 이상의 가이드 RNA의 crRNA 서열은 서열 번호 1 내지 190으로부터 선택된 표적 서열에 상보성이고 이에 혼성화한다.
몇몇 실시형태에서, 표적 서열은 가이드 RNA의 가이드 서열에 상보성일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 가이드 RNA의 가이드 서열과 이의 상응하는 표적 서열 사이에 상보성 또는 동일성의 정도는 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, gRNA의 표적 서열 및 가이드 서열은 100% 상보성 또는 동일일 수 있다. 다른 실시형태에서, gRNA의 표적 서열 및 가이드 서열은 적어도 하나의 미스매치를 함유할 수 있다. 예를 들어, gRNA의 표적 서열 및 가이드 서열은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 미스매치를 함유할 수 있고, 여기서 가이드 서열의 전체 길이는 약 20개이다. 몇몇 실시형태에서, gRNA의 표적 서열 및 가이드 서열은 1개 내지 6개의 미스매치를 함유할 수 있고, 여기서 가이드 서열은 약 20개의 핵산이다. 몇몇 실시형태에서, gRNA의 표적 서열 및 가이드 서열은 1개 또는 2개의 미스매치를 함유할 수 있고, 여기서 가이드 서열은 약 20개의 핵산이다.
표적 서열의 길이는 사용된 뉴클레아제 시스템에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, CRISPR/Cas 시스템에 대한 표적 서열은 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 35개, 40개, 45, 50개 또는 50개 초과의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 표적 서열은 18개 내지 24개의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 표적 서열은 19개 내지 21개의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 표적 서열은 20개의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 니카제가 사용될 때, 표적 서열은 DNA 분자의 반대의 가닥에서 한 쌍의 니카제에 의해 인식된 한 쌍의 표적 서열을 포함할 수 있다.
COL8A2에 대한 표적 서열
본 발명의 조성물은 COL8A2 유전자에서 표적 서열에 지향될 수 있다. 예를 들어, COL8A2 표적 서열은 제공된 뉴클레아제에 의해 인식되고 절단될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, Cas 단백질은 COL8A2의 표적 서열에 가이드 RNA에 의해 지향될 수 있고, 여기서 가이드 RNA의 가이드 서열은 표적 서열과 혼성화하고 Cas 단백질은 이것을 절단한다.
몇몇 실시형태에서, 하나 이상의 가이드 RNA의 선택은 COL8A2 유전자에서의 표적 서열에 기초하여 결정된다. 몇몇 실시형태에서, 하나 이상의 가이드 RNA의 crRNA 서열은 서열 번호 191 내지 1084로부터 선택된 표적 서열에 상보성이고 이에 혼성화한다.
몇몇 실시형태에서, 하나 이상의 가이드 RNA의 선택은 콜라겐 VIII의 알파 아단위(COL8A2)의 비정상 기능을 발생시키는 공지된 돌연변이를 갖지 않는 야생형 COL8A2 유전자에서의 표적 서열에 기초하여 결정된다. 몇몇 실시형태에서, 하나 이상의 가이드 RNA의 crRNA 서열은 서열 번호 191 내지 1063으로부터 선택된 표적 서열에 상보성이고 이에 혼성화한다.
몇몇 실시형태에서, 하나 이상의 가이드 RNA의 선택은 c.1364C>A 뉴클레오타이드 변경에 의해 생긴 COL8A2 단백질에서의 Gln455Lys 돌연변이에 상응하는 COL8A2 유전자에서의 표적 서열에 기초하여 결정된다. 몇몇 실시형태에서, 하나 이상의 가이드 RNA의 crRNA 서열은 서열 번호 1064 내지 1069로부터 선택된 표적 서열에 상보성이고 이에 혼성화한다.
몇몇 실시형태에서, 하나 이상의 가이드 RNA의 선택은 c.1363-1364CA>GT 뉴클레오타이드 변경에 의해 생긴 COL8A2 단백질에서의 Gln455Val 돌연변이에 상응하는 COL8A2 유전자에서의 표적 서열에 기초하여 결정된다. 몇몇 실시형태에서, 하나 이상의 가이드 RNA의 crRNA 서열은 서열 번호 1070 내지 1075로부터 선택된 표적 서열에 상보성이고 이에 혼성화한다.
몇몇 실시형태에서, 하나 이상의 가이드 RNA의 선택은 c.1349T>G 뉴클레오타이드 변경에 의해 생긴 COL8A2 단백질에서의 Leu450Trp 돌연변이에 상응하는 COL8A2 유전자에서의 표적 서열에 기초하여 결정된다. 몇몇 실시형태에서, 하나 이상의 가이드 RNA의 crRNA 서열은 서열 번호 1076 내지 1084로부터 선택된 표적 서열에 상보성이고 이에 혼성화한다.
몇몇 실시형태에서, 표적 서열은 가이드 RNA의 가이드 서열에 상보성일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 가이드 RNA의 가이드 서열과 이의 상응하는 표적 서열 사이의 상보성 또는 동일성의 정도는 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, gRNA의 표적 서열 및 가이드 서열은 100% 상보성 또는 동일일 수 있다. 다른 실시형태에서, gRNA의 표적 서열 및 가이드 서열은 적어도 하나의 미스매치를 함유할 수 있다. 예를 들어, gRNA의 표적 서열 및 가이드 서열은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 미스매치를 함유할 수 있고, 여기서 가이드 서열의 전체 길이는 약 20개이다. 몇몇 실시형태에서, gRNA의 표적 서열 및 가이드 서열은 1개 내지 6개의 미스매치를 함유할 수 있고, 여기서 가이드 서열은 약 20개의 핵산이다. 몇몇 실시형태에서, gRNA의 표적 서열 및 가이드 서열은 1개 또는 2개의 미스매치를 함유할 수 있고, 여기서 가이드 서열은 약 20개의 핵산이다.
표적 서열의 길이는 사용된 뉴클레아제 시스템에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, CRISPR/Cas 시스템에 대한 표적 서열은 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 35개, 40개, 45, 50개 또는 50개 초과의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 표적 서열은 18개 내지 24개의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 표적 서열은 19개 내지 21개의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 표적 서열은 20개의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 표적 서열은 PAM을 포함할 수 있다. 니카제가 사용될 때, 표적 서열은 DNA 분자의 반대의 가닥에서 한 쌍의 니카제에 의해 인식된 한 쌍의 표적 서열을 포함할 수 있다.
벡터
본 발명의 소정의 실시형태에서, 조성물은 본 명세서에 기재된 임의의 가이드 RNA를 코딩하는 DNA 벡터를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 가이드 RNA 서열 이외에, 벡터는 가이드 RNA를 코딩하지 않는 핵산을 추가로 포함한다. 가이드 RNA를 코딩하지 않는 핵산은 촉진자, 인핸서, 조절 서열 및 뉴클레아제, 예컨대 Cas9를 코딩하는 핵산을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 몇몇 실시형태에서, 벡터는 crRNA, trRNA, 또는 crRNA 및 trRNA를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, crRNA, trRNA, 또는 crRNA 및 trRNA를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 천연 발생 CRISPR/Cas 시스템으로부터 반복부 서열의 전부 또는 일부에 의해 플랭킹된 가이드 서열을 포함하거나 이들로 이루어진다. crRNA, trRNA, 또는 crRNA 및 trRNA를 포함하거나 이들로 이루어진 핵산은 벡터 서열을 추가로 포함할 수 있고, 여기서 벡터 서열은 crRNA, trRNA, 또는 crRNA 및 trRNA에 의해 함께 천연에서 발견되지 않는 핵산을 포함하거나 이들로 이루어진다.
몇몇 실시형태에서, crRNA 및 trRNA는 하나의 벡터 내에 비인접 핵산에 의해 코딩된다. 다른 실시형태에서, crRNA 및 trRNA는 인접 핵산에 의해 코딩될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, crRNA 및 trRNA는 단일 핵산의 반대의 가닥에 의해 코딩된다. 다른 실시형태에서, crRNA 및 trRNA는 단일 핵산의 동일한 가닥에 의해 코딩된다. 몇몇 실시형태에서, 벡터는 하나 이상의 sgRNA를 코딩한다. 다른 실시형태에서, 벡터는 2개 이상의 sgRNA를 코딩한다.
뉴클레아제
몇몇 실시형태에서, 적어도 하나의 gRNA 이외에, 조성물은 뉴클레아제를 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 뉴클레아제와 함께 gRNA는 리보핵단백질 복합체(RNP)라 불린다. 몇몇 실시형태에서, 뉴클레아제는 Cas 단백질이다. 몇몇 실시형태에서, Cas 단백질과 함께 gRNA는 Cas RNP라 불린다. 몇몇 실시형태에서, Cas는 타입-I, 타입-II 또는 타입-III 성분을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, Cas 단백질은 타입-I CRISPR/Cas 시스템 유래이다. 몇몇 실시형태에서, Cas 단백질은 타입-II CRISPR/Cas 시스템 유래이다. 몇몇 실시형태에서, Cas 단백질은 타입-III CRISPR/Cas 시스템 유래이다. 몇몇 실시형태에서, Cas 단백질은 Cas9이다. 몇몇 실시형태에서, Cas 단백질은 Cpf1이다. 몇몇 실시형태에서, Cas 단백질은 타입-II CRISPR/Cas 시스템으로부터의 Cas9 단백질이다. 몇몇 실시형태에서, Cas9와 함께 gRNA는 Cas9 RNP라 불린다.
Cas 뉴클레아제를 포함하는 실시형태에서, Cas 뉴클레아제는 타입-IIA, 타입-IIB 또는 타입-IIC 시스템 유래일 수 있다. Cas 뉴클레아제 또는 다른 RNP 성분이 유래될 수 있는 비제한적인 예시적인 종은 스트렙토코커스 피요게네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코커스 써모필루스(Streptococcus thermophilus), 스트렙토코커스 종(Streptococcus sp .), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 리스테리아 이노쿠아(Listeria innocua), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 프란시셀라 노비시다(Francisella novicida), 볼리넬라 숙시노게네스(Wolinella succinogenes), 수테렐라 봐드스보텐시스(Sutterella wadsworthensis), 감마프로테오박테륨(Gammaproteobacterium), 네이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 파스퇴렐라 물토시다(Pasteurella multocida), 피브로박터 숙시노게네스(Fibrobacter succinogene), 로도스피릴륨 루브룸(Rhodospirillum rubrum), 노카르디옵시스 다손빌레이(Nocardiopsis dassonvillei), 스트렙토마이세스 프리스티나에스피랄리스(Streptomyces pristinaespiralis), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스, 스트렙토스포란기움 로세움(Streptosporangium roseum), 스트렙토스포란기움 로세움, 알리사이클로바실러스 액시도칼다리우스(Alicyclobacillus acidocaldarius), 바실러스 슈도마이코이데스(Bacillus pseudomycoides), 바실러스 셀레니티레두센스(Bacillus selenitireducens), 엑시구오박테륨 시비리쿰(Exiguobacterium sibiricum), 락토바실러스 델브루에키(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 락토바실러스 부흐네리(Lactobacillus buchneri), 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola), 미크로스시라 마리나(Microscilla marina), 부르크홀데리알레스 박테륨(Burkholderiales bacterium), 폴라로모나스 나프탈레니보란스(Polaromonas naphthalenivorans), 폴라로모나스 종(Polaromonas sp .), 크로코스파에라 왓소니(Crocosphaera watsonii), 사이아노테세 종(Cyanothece sp .), 마이크로사이스티스 아에루기노사(Microcystis aeruginosa), 사이네코코쿠스 종(Synechococcus sp .), 아세토할로븀 아라바티쿰(Acetohalobium arabaticum), 아모니펙스 데겐시(Ammonifex degensii), 칼디셀루로시루프터 베스시(Caldicelulosiruptor becscii), 칸디다투스 데술포루디스(Candidatus Desulforudis), 클로스트리듐 보톨리늄(Clostridium botulinum), 클로스트리듐 디피실(Clostridium difficile), 피네골디아 마그나(Finegoldia magna), 나트라나에로비우스 써모필루스(Natranaerobius thermophilus), 펠로토마쿨륨 써모프로피오니쿰(Pelotomaculum thermopropionicum), 액시디티오바실루스 칼두스(Acidithiobacillus caldus), 액시디티오바실루스 페로옥시단스(Acidithiobacillus ferrooxidans), 알로크로마튬 비노숨(Allochromatium vinosum), 마리노박터 종(Marinobacter sp .), 니트로소코쿠스 할로필루스(Nitrosococcus halophilus), 니트로소코쿠스 왓소니(Nitrosococcus watsoni), 슈도알테로모나스 할로플란크티스(Pseudoalteromonas haloplanktis), 크테도노박터 라세미페르(Ktedonobacter racemifer), 메타노할로븀 에베스티가툼(Methanohalobium evestigatum), 아나바에나 바리아빌리스(Anabaena variabilis), 노둘라리아 스푸미게나(Nodularia spumigena), 노스톡 종(Nostoc sp.), 아르트로스피라 막시마(Arthrospira maxima), 아르트로스피라 플레텐시스(Arthrospira platensis), 아르트로스피라 종(Arthrospira sp .), 리그비아 종(Lyngbya sp .), 마이크로콜레우스 크토노플라테스(Microcoleus chthonoplastes), 오스실라토리아 종(Oscillatoria sp .), 페트로토가 모빌리스(Petrotoga mobilis), 써모시포 아프리카누스(Thermosipho africanus), 스트렙토코커스 파스테우리아누스(Streptococcus pasteurianus), 네이세리아 시네레아(Neisseria cinerea), 캄필로박터 라리(Campylobacter lari), 파르비바쿨륨 라바멘티보란스(Parvibaculum lavamentivorans), 코리네박테륨 디프테리아(Corynebacterium diphtheria), 액시다미노코커스 종(Acidaminococcus sp .), 라크노스피라세아에 박테륨(Lachnospiraceae bacterium) ND2006 및 아카리오클로리스 마리나(Acaryochloris marina)를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, Cas 뉴클레아제는 스트렙토코커스 피요게네스로부터의 Cas9 단백질이다. 몇몇 실시형태에서, Cas 뉴클레아제는 스트렙토코커스 써모필루스로부터의 Cas9 단백질이다. 몇몇 실시형태에서, Cas 뉴클레아제는 네이세리아 메닌기티디스로부터의 Cas9 단백질이다. 몇몇 실시형태에서, Cas 뉴클레아제는 스타필로코커스 아우레우스로부터의 Cas9 단백질이다. 몇몇 실시형태에서, Cas 뉴클레아제는 프란시셀라 노비시다로부터의 Cpf1 단백질이다. 몇몇 실시형태에서, Cas 뉴클레아제는 액시다미노코커스 종으로부터의 Cpf1 단백질이다. 몇몇 실시형태에서, Cas 뉴클레아제는 라크노스피라세아에 박테륨 ND2006으로부터의 Cpf1 단백질이다.
야생형 Cas9는 RuvC 및 HNH의 2개의 뉴클레아제 도메인을 갖는다. RuvC 도메인은 비표적 DNA 가닥을 절단하고, HNH 도메인은 DNA의 표적 가닥을 절단한다. 몇몇 실시형태에서, Cas9 단백질은 하나 초과의 RuvC 도메인 및/또는 하나 초과의 HNH 도메인을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, Cas9 단백질은 야생형 Cas9이다. 조성물 및 방법 실시형태의 각각에서, Cas는 표적 DNA에서 이중 가닥 파괴를 유도한다.
불활성인 RuvC 또는 HNH 중 어느 하나인, 하나의 촉매 도메인을 갖는 Cas9의 변형된 버전은 "니카제"라 불린다. 니카제는 표적 DNA에서 오직 하나의 가닥을 절단하여서, 단일 가닥 파괴를 생성한다. 단일 가닥 파괴는 또한 "닉(nick)"으로 공지될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 조성물 및 방법은 니카제를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 조성물 및 방법은 표적 DNA에서 이중 가닥 파괴보다는 닉을 유도하는 니카제 Cas9를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, Cas 단백질은 오직 하나의 기능적 뉴클레아제 도메인을 함유하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, Cas 단백질은 뉴클레아제 도메인 중 하나가 이의 핵산 절단 활성을 감소시키도록 돌연변이되거나 완전히 또는 부분적으로 결실되도록 변형될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 감소된 활성을 갖는 RuvC 도메인을 갖는 니카제 Cas를 사용한다. 몇몇 실시형태에서, 불활성 RuvC 도메인을 갖는 니카제 Cas를 사용한다. 몇몇 실시형태에서, 감소된 활성을 갖는 HNH 도메인을 갖는 니카제 Cas를 사용한다. 몇몇 실시형태에서, 불활성 HNH 도메인을 갖는 니카제 Cas를 사용한다.
몇몇 실시형태에서, Cas 단백질 뉴클레아제 도메인 내의 보존된 아미노산은 뉴클레아제 활성을 감소시키거나 변경하도록 치환된다. 몇몇 실시형태에서, Cas 단백질은 RuvC 또는 RuvC 유사 뉴클레아제 도메인에서 아미노산 치환을 포함할 수 있다. RuvC 또는 RuvC 유사 뉴클레아제 도메인에서의 예시적인 아미노산 치환은 (에스. 피요게네스 Cas9 단백질에 기초한) D10A를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, Cas 단백질은 HNH 또는 HNH 유사 뉴클레아제 도메인에서 아미노산 치환을 포함할 수 있다. HNH 또는 HNH 유사 뉴클레아제 도메인에서의 예시적인 아미노산 치환은 (에스. 피요게네스 Cas9 단백질에 기초한) E762A, H840A, N863A, H983A 및 D986A를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 조성물은 니카제 및 한 쌍의 가이드 RNA를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 한 쌍의 가이드 RNA는 각각 표적 서열의 센스 및 안티센스 가닥에 상보성이다. 이 실시형태에서, 가이드 RNA는 표적 서열에 니카제를 지향시키고, 표적 서열의 반대의 가닥에서 닉을 생성함으로써 DSB를 도입한다(즉, 이중 닉킹). 몇몇 실시형태에서, 이중 닉킹의 사용은 특이성을 개선하고 오프-타깃 효과를 감소시킬 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 니카제 Cas는 표적 DNA에서 이중 닉을 생성하도록 DNA의 반대의 가닥을 표적화하는 2개의 별개의 가이드 RNA와 함께 사용된다. 몇몇 실시형태에서, 니카제 Cas는 표적 DNA에서 이중 닉을 생성하도록 매우 근접하게 있도록 선택된 2개의 별개의 가이드 RNA와 함께 사용된다.
몇몇 실시형태에서, 키메라 Cas 단백질을 사용하고, 여기서 하나의 도메인 또는 단백질의 영역은 상이한 단백질의 부분에 의해 대체된다. 몇몇 실시형태에서, Cas 뉴클레아제 도메인은 Fok1과 같은 상이한 뉴클레아제로부터의 도메인에 의해 대체될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, Cas 단백질은 변형된 뉴클레아제일 수 있다.
몇몇 실시형태에서, Cas9-탈아미노효소 융합을 사용하고, 여기서 Cas9는 이중 가닥 DNA(dCas9)를 절단할 수 없다. 용어 "탈아미노효소"는 탈아미노화 반응을 촉매화하는 효소를 의미한다. 몇몇 실시형태에서, 탈아미노효소는 사이티딘(C)을 유라실(U)로 전환시키고, 이후 세포에 의해 타이미딘(T)으로 전환되는 사이티딘 탈아미노효소이다. 몇몇 실시형태에서, 탈아미노효소는 구아닌(G)을 잔틴으로 전환시키고, 이후 세포에 의해 구아닌(A)으로 전환되는 구아닌 탈아미노효소이다. 몇몇 실시형태에서, 탈아미노효소는 APOBEC 1 패밀리 탈아미노효소, 활성화 유도된 사이티딘 탈아미노효소(AID) 및 아데노신 탈아미노효소, 예컨대 ADAT 패밀리 탈아미노효소 또는 RNA에 작용하는 아데노신 탈아미노효소(ADAR)(구아닌(A)을 하이폭산틴으로 전환시키고, 이후 세포에 의해 구아닌(G)으로 전환됨)이다.
다른 실시형태에서, Cas 단백질은 타입-I CRISPR/Cas 시스템 유래일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, Cas 단백질은 타입-I CRISPR/Cas 시스템의 캐스케이드 복합체의 성분일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, Cas 단백질은 Cas3 단백질일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, Cas 단백질은 타입-III CRISPR/Cas 시스템 유래일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, Cas 단백질은 RNA 절단 활성을 가질 수 있다.
PAM
몇몇 실시형태에서, 표적 서열은 PAM에 인접할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, PAM은 표적 서열의 3' 말단의, 1개, 2개, 3개 또는 4개의, 뉴클레오타이드에 인접하거나 이것 내일 수 있다. PAM의 길이 및 서열은 사용된 Cas 단백질에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, PAM은 Ran et al., Nature 520:186-191 (2015)(본 명세서에 참고로 포함됨)의 도 1에 개시된 것을 포함하는 특이적 Cas9 단백질 또는 Cas9 오쏘로그에 대한 공통 또는 특정한 PAM 서열로부터 선택될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, PAM은 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 뉴클레오타이드 길이를 포함할 수 있다. 비제한적인 예시적인 PAM 서열은 NGG, NAG, NGA, NGAG, NGCG, NNGRRT, TTN, NGGNG, NG, NAAAAN, NNAAAAW, NNNNACA, GNNNCNNA 및 NNNNGATT(여기서, N은 임의의 뉴클레오타이드로서 정의되고, W는 A 또는 T로 정의되고, R은 A 또는 G로 정의됨)를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, PAM 서열은 NGG일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, PAM 서열은 NGGNG일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, PAM 서열은 NNAAAAW일 수 있다.
TNR을 절제하는 방법
TCF4에서의 TNR은 FECD의 위험 증가와 상관된다. 추가적으로, TCF4에서의 돌연변이는 조현병 및 PSC와 연관된다. Cas 단백질(또는 Cas 단백질을 코딩하는 핵산)과 함께 가이드 RNA의 전달은 TCF4 유전자로부터의 예를 들어 TNR(또는 이의 부분)을 절제함으로써 이들 장애에 대한 치료로서 사용될 수 있다. 따라서, 본 명세서에 제공된 소정의 실시형태는 TCF4로부터 TNR을 절제하는 방법을 수반한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 본 명세서에서 표 2에 제공된 표적 서열에 뉴클레아제를 지향시키는 하나 이상의 gRNA를 포함하는 본 명세서에 제공된 CRISPR/Cas 조성물 중 임의의 하나를 세포에 전달하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 Cas 단백질(또는 Cas 단백질을 코딩하는 핵산)과 함께 2개의 gRNA를 세포에 전달하는 단계를 포함하고, 여기서 제1 gRNA는 TNR의 5'의 영역을 표적화하는 가이드 서열을 포함하고, 서열 번호 1089 내지 1181로 이루어진 군으로부터 선택되고, 제2 gRNA는 TNR의 3'의 영역을 표적화하는 가이드 서열을 포함하고, 서열 번호 1182 내지 1278로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 실시형태에서, 세포는 인간 세포, 예를 들어 인간 각막 내피 세포이다. 몇몇 실시형태에서, 상기 방법은 세포의 집단의 일부 분획이 TCF4 유전자로부터 절제된 TNR을 갖는 세포의 집단을 발생시킨다. 몇몇 실시형태에서, 집단 내의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 또는 이것 초과의 세포는 TCF4 유전자로부터 절제된 TNR을 갖는다. 세포의 집단 내에 절제의 퍼센트를 측정하는 방법이 공지되어 있고, 본 명세서에 제공된 것, 예를 들어 차세대 서열분석(NGS) 방법을 포함하고, 예를 들어 여기서 절제 백분율은 표적 영역을 중첩시킨 판독의 전체 수로 나눈 TNR의 결실을 함유하는 서열분석 판독의 수로서 정의된다.
CRISPR/Cas 시스템의 사용은 니카제 효소가 사용되는 경우 DNA에서 이중 가닥 파괴 또는 DNA에서 단일 가닥 파괴를 발생시킬 수 있다.
NHEJ는 DNA에서 이중 가닥 파괴(DSB)가 삽입/결실(삽입-결실) 돌연변이의 형태에서 오차를 생성할 수 있는 파괴 말단의 재결찰을 통해 복원되는 과정이다. 코딩 엑손 내에 생기는 삽입-결실이 프레임쉬프트 돌연변이 및 조기 중지 코돈을 발생시킬 수 있으므로, NHEJ는 이에 따라 특이적 유전자 산물의 수준을 넉아웃시키거나 감소시키는 수단일 수 있다.
HR 및 HDR은 외인성으로 도입된 보수 주형의 존재 하에 표적 유전좌위에서 정확한 한정된 변형을 생성하도록 레버리지될 수 있는 대안적인 주요 DNA 보수 경로이다. 이것은 단일 염기 변경, 결실, 삽입, 역위 및 다른 돌연변이를 수정하도록 사용될 수 있다. 몇몇 경우에, 보수 과정을 개시하도록 사용된 CRISPR 뉴클레아제에 의한 인식을 방지하여, 수정된 유전자 내에 삽입-결실 형성을 막는, DNA 내에 침묵(즉, 동의) 뉴클레오타이드 변경을 도입하는 보수 주형을 사용한다.
몇몇 실시형태에서, 주형은 예를 들어 표적 유전자, 예컨대 TCF4 및/또는 COL8A2를 변형시키도록 HR에서 사용될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, HR은 표적 핵산 분자로의 주형 서열 또는 주형 서열의 일부의 통합을 발생시킬 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 단일 주형이 제공될 수 있다. 다른 실시형태에서, 2개 이상의 주형이 제공될 수 있고, 단 HR은 2개 이상의 표적 부위에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 상이한 주형은 세포에서 단일 유전자 또는 세포에서 2개의 상이한 유전자를 보수하도록 제공될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 적어도 하나의 주형의 다수의 카피가 세포에 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 상이한 주형은 독립적인 카피수 또는 독립적인 양으로 제공될 수 있다.
다른 실시형태에서, 주형은 예를 들어 표적 유전자, 예컨대 TCF4 및/또는 COL8A2를 변형시키도록 HDR에서 사용될 수 있다. HDR은 핵산에서 절단의 부위에서 DNA 가닥 침입을 수반한다. 몇몇 실시형태에서, HDR은 편집된 표적 핵산 분자에서 주형 서열의 포함을 발생시킬 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 단일 주형이 제공될 수 있다. 다른 실시형태에서, 상이한 서열을 갖는 2개 이상의 주형은 HDR에 의해 2개 이상의 부위에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 상이한 주형은 세포에서 단일 유전자 또는 세포에서 2개의 상이한 유전자를 보수하도록 제공될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 적어도 하나의 주형의 다수의 카피가 세포에 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 상이한 주형은 독립적인 카피수 또는 독립적인 양으로 제공될 수 있다.
더욱 다른 실시형태에서, 주형은 예를 들어 표적 유전자, 예컨대 TCF4 및/또는 COL8A2를 변형시키도록 NHEJ에 의해 매개된 유전자 편집에서 사용될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 주형 서열은 절단 부위 근처의 핵산 서열에 대한 유사성을 갖지 않는다. 몇몇 실시형태에서, 주형 또는 주형 서열의 일부가 도입된다. 몇몇 실시형태에서, 단일 주형이 제공될 수 있다. 다른 실시형태에서, 상이한 서열을 갖는 2개 이상의 주형은 NHEJ에 의해 2개 이상의 부위에서 삽입될 수 있다. 예를 들어, 상이한 주형은 세포에서 단일 주형 또는 세포에서 2개의 상이한 주형을 삽입하도록 제공될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상이한 주형은 독립적인 카피수로 제공될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 주형은 플랭킹 인버티드 말단 반복부(inverted terminal repeat: ITR) 서열을 포함한다.
주형은 임의의 적합한 길이일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 주형은 10개, 15개, 20개, 25개, 50개, 75개, 100개, 150개, 200개, 500개, 1000개, 1500개, 2000개, 2500개, 3000개, 3500개, 4000개, 4500개, 5000개, 5500개, 6000개, 또는 이것 초과의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 주형은 단일 가닥 핵산일 수 있다. 주형은 이중 가닥 또는 부분적으로 이중 가닥 핵산일 수 있다. 소정의 실시형태에서, 단일 가닥 주형은 20개, 30개, 40개, 50개, 75개, 100개, 125개, 150개, 175개 또는 200개의 뉴클레오타이드 길이이다. 몇몇 실시형태에서, 주형은 표적 서열을 포함하는 표적 핵산 분자의 일부에 상보성인 뉴클레오타이드 서열(즉, "상동성 아암")을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 주형은 표적 핵산 분자에서 절단 부위의 상류 또는 하류에 위치한 서열에 상보성인 상동성 아암을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 주형은 각각 절단 부위의 상류 또는 하류에 위치한 서열에 상보성인 제1 상동성 아암 및 제2 상동성 아암(또한 제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열이라 칭함)을 포함할 수 있다. 주형이 2개의 상동성 아암을 함유하는 경우, 각각의 아암은 동일한 길이 또는 상이한 길이일 수 있고, 상동성 아암 사이의 서열은 상동성 아암 사이의 표적 서열에 실질적으로 유사하거나 동일할 수 있거나, 이것은 전부 비관련될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 주형에서의 제1 뉴클레오타이드 서열과 절단 부위의 상류의 서열 사이 및 주형에서의 제2 뉴클레오타이드 서열과 절단 부위의 하류의 서열 사이의 상보성의 정도는 예를 들어 주형과 표적 핵산 분자 사이의 고충실도 상동성 재조합과 같은 상동성 재조합을 허용할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상보성의 정도는 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100%일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상보성의 정도는 약 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100%일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상보성의 정도는 적어도 98%, 99% 또는 100%일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 상보성의 정도는 100%일 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 주형은 플랭킹 인버트 말단 반복부(ITR) 서열을 함유하는 ssDNA 또는 dsDNA를 함유한다. 몇몇 실시형태에서, 주형은 플라스미드, 미니서클, 나노서클 또는 PCR 산물로서 공급된다.
절제 단편
절제 단편의 생성은 이 표적 서열에 상보성인 2개의 가이드 RNA의 사용을 통해 2개의 표적 서열 사이에 DNA의 작은 영역을 정확히 제거하기 위해 CRISPR 기술의 파워를 활용하는 수단이다. 몇몇 실시형태에서, 2개의 가이드 RNA는 약 3000개, 2500개, 2000개, 1500개, 1000개, 500개, 400개, 300개, 200개, 150개, 100개, 50개 또는 30개의 뉴클레오타이드 떨어진 서열에 뉴클레아제를 표적화하여서, 표적 서열 사이에 DNA 단편의 절제를 발생시킨다.
CRISPR / Cas 조성물에 의한 FECD의 치료
본 명세서에 기재된 임의의 조성물은 FECD의 위험 증가를 발생시키는 유전자 돌연변이를 갖는 개인에서 FECD를 치료하기 위해 대상체에게 투여될 수 있다.
본 명세서에 기재된 임의의 조성물은 TCF4의 인트론 3에서 TNR 연장을 갖는 개인에서 FECD를 치료하기 위해 대상체에게 투여될 수 있다. 본 명세서에 기재된 임의의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 FECD를 치료하는 방법이 포함된다. 몇몇 양태에서, 조성물은 치료학적 유효량으로 투여된다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물의 하나 이상의 투여를 포함하는, TCF4의 TNR을 절제, 돌연변이, 이의 카피수의 감소, 완화 및/또는 근절시키는 방법이 포함된다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물의 하나 이상의 투여를 포함하는, 대상체에서 세포마다 TCF4의 하나의 카피 또는 카피 둘 다를 절제, 이의 카피수의 감소, 완화 및/또는 근절시키는 방법이 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 세포는 각막 내피 세포이다.
몇몇 양태에서, 본 명세서에 기재된 조성물의 하나 이상의 투여를 포함하는, TCF4의 RNA 독성을 감소시키거나 저해하거나 완화하는 방법이 포함된다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물의 하나 이상의 투여를 포함하는, RNA 독성을 저해하는 방법이 포함되고, TCF4의 독성 RNA 산물의 수준은 치료 후 투여 전 수준으로 돌아가지 않아서, 정상 기능을 각막 내피 세포로 돌려놓고 세포사를 방지한다.
몇몇 실시형태에서, 치료는 눈의 전방에 전달된 적절한 가이드 또는 가이드를 포함하는 벡터 및/또는 지질 나노입자에 의할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 치료는 눈의 후방에 전달된 적절한 가이드 또는 가이드를 포함하는 벡터 및/또는 지질 나노입자에 의할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 치료는 각막 자체에 전달된 적절한 가이드 또는 가이드를 포함하는 벡터 및/또는 지질 나노입자에 의할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 치료는 각막 실질에 전달된 적절한 가이드 또는 가이드를 포함하는 벡터 및/또는 지질 나노입자에 의할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 치료는 각막 윤부에 전달된 적절한 가이드 또는 가이드를 포함하는 벡터 및/또는 지질 나노입자에 의할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 치료는 각막의 상피 표면에 국소로 전달된 적절한 가이드 또는 가이드를 포함하는 벡터 및/또는 지질 나노입자에 의할 수 있다. 이 문단의 임의의 이전의 실시형태, 및 본 명세서에 기재된 다른 실시형태에서, 치료는 예를 들어 지질 나노입자를 사용한 Cas 단백질(예를 들어, Cas9)의 전달 또는 벡터 및/또는 지질 나노입자를 사용한 Cas 단백질을 코딩하는 핵산의 전달을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태, 예를 들어 지질 나노입자를 사용하는 것에서, Cas 단백질을 코딩하는 핵산은 mRNA이다. 몇몇 실시형태에서, Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 코딩하는 핵산은 적절한 가이드 또는 가이드를 전달하기 위해 사용된 동일한 벡터 및/또는 지질 나노입자를 통해 전달된다. 몇몇 실시형태에서, Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 코딩하는 핵산은 적절한 가이드 또는 가이드를 전달하기 위해 사용된 상이한 벡터 및/또는 지질 나노입자를 통해 전달된다.
몇몇 실시형태에서, 본 발명의 CRISPR 조성물의 단일 투여는 질환과 연관된 기초하는 유전자 결함 또는 돌연변이를 수정하기에 충분할 수 있다. 다른 실시형태에서, CRISPR 치료제의 하나 초과의 투여는 누적 효과를 통해 모든 표적 세포 및 모든 대립유전자에 걸쳐 편집을 최대화하기에 유리할 수 있다.
FECD를 치료하기 위한 약제의 제조를 위한 본 명세서에 기재된 조성물의 용도가 포함된다. 몇몇 실시형태에서, FECD, 가능한 FECD, 및/또는 FECD를 제시하는 가족 병력을 갖는 환자는 본 발명의 조성물에 의한 치료의 개시 전에 TCF4에서의 TNR에 대해 스크리닝된다. 몇몇 실시형태에서, 치료는 50개 이상의 TNR이 TCF4의 인트론 3에 존재하는 경우 환자에서 개시된다.
COL8A2에서의 돌연변이는 FECD 및 PPCD의 위험 증가와 상관된다. 본 명세서에 기재된 임의의 조성물은 아미노산 돌연변이를 갖는 유전자 산물을 발생시키는 COL8A2에서의 돌연변이를 갖는 개인에서 FECD를 치료하기 위해 대상체에게 투여될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 이 아미노산 돌연변이는 Gln455Lys, Gln455Val 또는 Leu450Trp이다.
본 명세서에 기재된 임의의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 FECD를 치료하는 방법이 포함된다. 몇몇 양태에서, 조성물은 치료학적 유효량으로 투여된다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물의 하나 이상의 투여를 포함하는, COL8A2에서 돌연변이를 절단, 돌연변이, 완화 및/또는 근절시키는 방법이 포함된다. 몇몇 실시형태에서, CRISPR/Cas 조성물의 사용은 삽입-결실의 생성 및 COL8A2 대립유전자의 소실을 발생시키는 NHEJ의 과정과 함께 수행된다. 몇몇 실시형태에서, CRISPR/Cas 조성물의 사용은, 콜라겐 VIII의 알파 2 아단위에서 아미노산 돌연변이를 발생시키는, 핵산 돌연변이를 수정할 목적을 위해, HR/HDR에 대한 외인성 주형과 함께 또는 HR/HDR에 대한 주형으로서 내인성 정상 대립유전자를 사용하여 수행된다. 몇몇 실시형태에서, 수정되는 COL8A2 유전자에서의 돌연변이는 c.1364C>A 뉴클레오타이드 변경에 의해 생긴 Gln455Lys 돌연변이이다. 몇몇 실시형태에서, 수정되는 COL8A2 유전자에서의 돌연변이는 c.1363-1364CA>GT 뉴클레오타이드 변경에 의해 생긴 Gln455Val 돌연변이이다. 몇몇 실시형태에서, 수정되는 COL8A2 유전자에서의 돌연변이는 c.1349T>G 뉴클레오타이드 변경에 의해 생긴 Leu450Trp 돌연변이이다. 몇몇 실시형태에서, Cas RNP와 함께 주형의 사용은 핵산 서열의 수정을 발생시켜서, 돌연변이는 더 이상 존재하지 않는다. 몇몇 실시형태에서, 세포는 각막 내피 세포이다.
몇몇 양태에서, 본 명세서에 기재된 조성물의 하나 이상의 투여를 포함하는, 돌연변이체 COL8A2에 의해 형성된 비정상 콜라겐을 감소시키거나 저해하거나 완화하는 방법이 포함된다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물의 하나 이상의 투여를 포함하는, 콜라겐 VIII의 비정상 알파 아단위(COL8A2)의 제조를 저해하는 방법이 포함되고, 비정상 COL8A2의 수준은 치료 후 투여 전 수준으로 돌아가지 않는다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물의 하나 이상의 투여를 포함하는, 오직 정상 콜라겐이 제조되도록 HR 또는 HDR에 의해 유전자 돌연변이를 수정하는 방법이 포함된다. 콜라겐의 돌연변이체 형태의 감소 또는 수정은 FECD 환자의 각막에서 보인 비정상 콜라겐 침착을 방지해야 한다.
FECD를 치료하기 위한 약제의 제조를 위한 본 명세서에 기재된 조성물의 용도가 포함된다. 몇몇 실시형태에서, FECD, 가능한 FECD, 및/또는 FECD를 제시하는 가족 병력을 갖는 환자는 본 발명의 조성물에 의한 치료의 개시 전에 COL8A2에서의 돌연변이에 대해 스크리닝된다. 몇몇 실시형태에서, PPCD, 가능한 PPCD, 및/또는 PPCD를 제시하는 가족 병력을 갖는 환자는 본 발명의 조성물에 의한 치료의 개시 전에 COL8A2에서의 돌연변이에 대해 스크리닝된다. 몇몇 실시형태에서, 치료는 돌연변이, 예컨대 c.1364C>A 뉴클레오타이드 변경에 의해 생긴 Gln455Lys 돌연변이, c.1363-1364CA>GT 뉴클레오타이드 변경에 의해 생긴 Gln455Val 돌연변이 또는 c.1349T>G 뉴클레오타이드 변경에 의해 생긴 Leu450Trp 돌연변이가 존재하는 경우 환자에서 개시된다.
몇몇 실시형태에서, 본 발명의 CRISPR 조성물의 단일 투여는 질환과 연관된 기초하는 유전자 결함 또는 돌연변이를 수정하기에 충분할 수 있다. 다른 실시형태에서, CRISPR 치료제의 하나 초과의 투여는 누적 효과를 통해 모든 표적 세포 및 모든 대립유전자에 걸쳐 편집을 최대화하기에 유리할 수 있다. 실시형태에서, 본 발명의 조성물에 의한 치료의 효율은 전달 후 1년, 2년, 3년, 4년, 5년 또는 10년에 보일 수 있다.
평가의 다수의 상이한 타입은 FECD에 대한 치료의 효율을 결정하도록 사용될 수 있고, 문헌[Eghrari and Gottsch, Expert Rev Ophthalmol. 5(2):147-159 (2010)]를 참조한다. 몇몇 실시형태에서, 조성물에 의한 치료의 효율은 시간에 따른 슬릿-램프 현미경검사에 의한 평가에 기초한다. 몇몇 실시형태에서, 조성물에 의한 치료의 효율은 시간에 따른 각막 두께의 각막 두께측정 측정에 의한 질환 진행의 정량적 측정에 기초한다. 몇몇 실시형태에서, 조성물에 의한 치료의 효율은 시간에 따른 각막 두께측정에서의 변경의 개선, 안정화 또는 느려짐에 기초한다.
몇몇 실시형태에서, 조성물에 의한 치료의 효율은 시간에 따른 시력의 평가에 기초한다. 몇몇 실시형태에서, 조성물에 의한 치료의 효율은 시간에 따른 시력의 감소의 개선, 안정화 또는 느려짐에 기초한다.
몇몇 실시형태에서, 조성물에 의한 치료의 효율은 반사 현미경검사에 기초한다. 몇몇 실시형태에서, 이 반사 현미경검사는 방울의 존재를 입증하도록 이용된다. 몇몇 실시형태에서, 조성물에 의한 치료의 효율은 새로운 방울의 형성의 감소에 기초한다. 몇몇 실시형태에서, 조성물에 의한 치료의 효율은 기존의 방울의 존재 하에 감소에 기초한다.
몇몇 실시형태에서, 조성물에 의한 치료의 효율은 허용 가능한 시력을 보유하고 각막 이식의 필요를 피하는 환자에 기초한다. 몇몇 실시형태에서, 조성물에 의한 치료의 효율은 각막 이식이 필요할 때까지 시간의 지연에 기초한다. 이 각막 이식은 완전한 각막 이식 또는 각막의 내부 층의 이식일 수 있다.
FECD와 연관되는 것 이외에, TCF4 유전자에서의 유전자 변이체는 2개의 다른 병태, 원발성 경화성 담관염(PSC) 및 조현병과 연관된다(문헌[Forrest MP et al., Trends Mol Med. 2014 Jun;20(6):322-31] 참조). TCF4 유전자에서의 비코딩 변이체가 어떻게 PSC 및 조현병에 대한 위험을 증가시키는지는 확실하지 않게 있다. 하나의 가능성은 이 변이체가 FECD에서 RNA 매개된 독성에 연관된 인트론 3 내에 동일한 TNR 영역에서 동시유전된 연장에 대한 마커로서 작용한다는 것이다. 이 가설이 증명되지 않은 채 있지만, PSC 및 조현병과 연관된 변이체는 인트론 3 내에 TNR 함유 영역에 물리적으로 및 단상형으로 가깝게 위치하여서, 이 이웃하는 영역에서 변이체의 동시유전을 제시한다. 더구나, PSC 및 조현병과 연관된 위험 변이체는 TCF4 유전자에서의 발현에서 변경과 연관되지 않아서, 인트론 3에서 TNR 연장을 갖는 환자에서 보인 RNA 독성과 같은 또 다른 기전이 수반된다는 것을 제안한다.
병용 치료
몇몇 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 FECD, PPCD, PSC, 및/또는 조현병의 치료를 위한 단일 물질로서 사용된다.
몇몇 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 FECD, PPCD, PSC, 및/또는 조현병을 위한 다른 치료제와 병용되어 사용된다. 몇몇 실시형태에서, 병용 치료는 소프트 콘택트 렌즈이다. 몇몇 실시형태에서, 이 소프트 콘택트 렌즈는 눈의 표면에서 미세한 부어오름을 편다. 몇몇 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 각막의 밖으로 유체를 배출시키는 점안액 또는 안연고와 병용되어 사용된다. 몇몇 실시형태에서, 이 점안액 또는 안연고는 Muro 128(등록상표) 5%(염화나트륨 고등장성 안과용 용액, 5%, Bausch and Lomb), Muro 128 5% 연고(염화나트륨 고등장성 안연고, 5%)(Bausch and Lomb), 또는 다른 식염수 또는 눈물 보충제이다.
몇몇 실시형태에서, 글루코코르티코이드 또는 코르티코스테로이드는 치료제에 대한 면역 반응을 감소시키도록 본 발명의 조성물과 함께 사용된다.
병용 치료는 치료의 개별 성분의 동시, 순차 또는 별개 투약에 의해 달성될 수 있다. 투여가 순차적 또는 별개인 경우, 제2 성분을 투여하는 것의 지연은 예컨대 병용의 유리한 효과를 손실시키지 않아야 한다.
CRISPR / Cas 조성물의 전달
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 CRISPR/Cas 조성물은 적절한 가이드 또는 가이드들을 포함하는 벡터 및/또는 지질 나노입자를 통해 투여될 수 있다.
바이러스 벡터
CRISPR/Cas 조성물은 벡터 시스템에 의해 전달될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, CRISPR/Cas 조성물은 하나 이상의 벡터에 제공될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 벡터는 DNA 벡터일 수 있다. 다른 실시형태에서, 벡터는 RNA 벡터일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 벡터는 원형일 수 있다. 다른 실시형태에서, 벡터는 선형일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 벡터는 지질 나노입자, 리포솜, 비지질 나노입자 또는 바이러스 캡시드에 의해 둘러싸일 수 있다. 비제한적인 예시적인 벡터는 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 인공 염색체, 미니염색체, 트랜스폰, 바이러스 벡터 및 발현 벡터를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 벡터는 바이러스 벡터일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 바이러스 벡터는 이의 야생형 대응물로부터 유전자 변형될 수 있다. 예를 들어, 바이러스 벡터는 벡터의 하나 이상의 특성이 변경되도록 또는 클로닝을 수월하게 하도록 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입, 결실 또는 치환을 포함할 수 있다. 이러한 특성은 패키징 역량, 형질도입 효율, 면역원성, 게놈 통합, 복제, 전사 및 번역을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 바이러스가 더 큰 크기를 갖는 외인성 서열을 패키징할 수 있도록 바이러스 게놈의 일부는 결실될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 바이러스 벡터는 증대된 형질도입 효율을 가질 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 숙주에서 바이러스에 의해 유도된 면역 반응은 감소할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 바이러스가 비통합이 되도록, 숙주 게놈으로의 바이러스 서열의 통합을 촉진하는 바이러스 유전자(예를 들어, 삽입효소 등)는 돌연변이될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 바이러스 벡터는 복제 결함일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 바이러스 벡터는 벡터에서 코딩 서열의 발현을 추진시키도록 외인성 전사 또는 번역 제어 서열을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 바이러스는 헬퍼 독립적일 수 있다. 예를 들어, 바이러스는 바이러스 입자로 벡터를 증폭시키고 패키징하는 데 필요한 바이러스 성분(예를 들어, 바이러스 단백질 등)을 공급하도록 하나 이상의 헬퍼 바이러스를 요할 수 있다. 이러한 경우에, 바이러스 성분을 코딩하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 하나 이상의 헬퍼 성분은 본 명세서에 기재된 벡터 시스템과 함께 숙주 세포로 도입될 수 있다. 다른 실시형태에서, 바이러스는 헬퍼 비함유일 수 있다. 예를 들어, 바이러스는 임의의 헬퍼 바이러스 없이 벡터를 증폭시키고 패키징할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 벡터 시스템은 바이러스 증폭 및 패키징에 필요한 바이러스 성분을 또한 코딩할 수 있다.
비제한적인 예시적인 바이러스 벡터는 아데노 연관된 바이러스(adeno-associated virus: AAV) 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 헬퍼 의존적 아데노바이러스 벡터(HDAd), 단순 포진 바이러스(HSV-1) 벡터, 박테리오파지 T4, 바큘로바이러스 벡터 및 레트로바이러스 벡터를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 바이러스 벡터는 AAV 벡터일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, AAV 벡터는 2, 3, 5, 7, 8, 9 또는 rh.10의 혈청형을 갖는다. 다른 실시형태에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 렌티바이러스는 비통합일 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 아데노바이러스는 고클로닝 역량 또는 "장이 없는(gutless)" 아데노바이러스일 수 있고, 여기서 5' 및 3' 인버티드 말단 반복부(ITR) 및 패키징 신호('I')로부터 먼 모든 코딩 바이러스 영역은 이의 패키징 역량을 증가시키도록 바이러스로부터 결실된다. 더욱 다른 실시형태에서, 바이러스 벡터는 HSV-1 벡터일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, HSV-1 기반 벡터는 헬퍼 독립적이고, 다른 실시형태에서 이것은 헬퍼 비독립적이다. 예를 들어, 패키징 서열을 오직 보유하는 앰플리콘 벡터는 패키징을 위한 구조 성분을 갖는 헬퍼 바이러스를 요하지만, 비필수 바이러스 기능을 제거한 30kb 결실된 HSV-1 벡터는 헬퍼 바이러스를 요하지 않는다. 추가적인 실시형태에서, 바이러스 벡터는 박테리오파지 T4일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 박테리오파지 T4는 바이러스의 머리가 비어있을 때 임의의 선형 또는 원형 DNA 또는 RNA 분자를 패키징할 수 있다. 추가의 실시형태에서, 바이러스 벡터는 바큘로바이러스 벡터일 수 있다. 훨씬 추가의 실시형태에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터일 수 있다. 더 적은 클로닝 역량을 갖는 AAV 또는 렌티바이러스 벡터를 사용한 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 벡터 시스템의 모든 성분을 전달하도록 하나 초과의 벡터를 사용하는 것이 필요할 수 있다. 예를 들어, 하나의 AAV 벡터는 Cas 단백질을 코딩하는 서열을 함유할 수 있는 한편, 제2 AAV 벡터는 하나 이상의 가이드 서열을 함유할 수 있다. 그러나, 몇몇 실시형태에서, 단일 AAV 벡터는 Cas 단백질을 코딩하는 서열 및 하나 이상의 가이드 서열을 함유할 수 있다. 본 명세서에 기재된 CRISPR/Cas 성분을 전달하도록 단일 AAV의 사용을 수반하는 몇몇 실시형태에서, 작은 Cas9 오쏘로그를 사용한다. 몇몇 실시형태에서, 작은 Cas9 오쏘로그는 네이세리아 메닌기티디스, 캄필로박터 제주니 또는 스타필로코커스 아우레우스로부터 유래된다.
몇몇 실시형태에서, 벡터는 세포에서 하나 이상의 코딩 서열의 발현을 추진할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 세포는 원핵 세포, 예를 들어 박테리아 세포 등일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 세포는 예를 들어 효모, 식물, 곤충 또는 포유류 세포와 같은 진핵 세포일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 진행 세포는 포유류 세포일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 진핵 세포는 설치류 세포일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 진핵 세포는 인간 세포일 수 있다. 세포의 상이한 타입에서 발현을 추진시키기에 적합한 촉진자는 당해 분야에 공지되어 있다. 몇몇 실시형태에서, 촉진자는 야생형일 수 있다. 다른 실시형태에서, 촉진자는 더 효율적인 또는 효과적인 발현을 위해 변형될 수 있다. 더욱 다른 실시형태에서, 촉진자는 절두되지만 이의 기능을 보유할 수 있다. 예를 들어, 촉진자는 일반 크기 또는 바이러스로 벡터의 적절한 패키징에 적합한 감소된 크기를 가질 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 벡터는 본 명세서에 기재된 뉴클레아제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 벡터에 의해 코딩된 뉴클레아제는 Cas 단백질일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 벡터 시스템은 뉴클레아제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 하나의 카피를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 벡터 시스템은 뉴클레아제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 하나 초과의 카피를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 뉴클레아제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 적어도 하나의 전사 또는 번역 제어 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 뉴클레아제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 적어도 하나의 촉진자에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 촉진자는 구성적, 유도성 또는 조직 특이적일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 촉진자는 구성적 촉진자일 수 있다. 비제한적인 예시적인 구성적 촉진자는 사이토메갈로바이러스 즉시 초기 촉진자(cytomegalovirus immediate early promoter: CMV), 유인원 바이러스(SV40) 촉진자, 아데노바이러스 주요 후기(MLP) 촉진자, 라우스 육종 바이러스(Rous sarcoma virus: RSV) 촉진자, 마우스 유방 종양 바이러스(mouse mammary tumor virus: MMTV) 촉진자, 포스포글라이세레이트 키나제(phosphoglycerate kinase: PGK) 촉진자, 연장 인자-알파(EF1a) 촉진자, 유비퀴틴 촉진자, 액틴 촉진자, 투불린 촉진자, 면역글로불린 촉진자, 이의 기능적 단편, 또는 임의의 상기의 조합을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 촉진자는 CMV 촉진자일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 촉진자는 절두된 CMV 촉진자일 수 있다. 다른 실시형태에서, 촉진자는 EF1a 촉진자일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 촉진자는 유도성 촉진자일 수 있다. 비제한적인 예시적인 유도성 촉진자는 열 충격, 광, 화학물질, 펩타이드, 금속, 스테로이드, 항생제 또는 알코올에 의해 유도성인 것을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 유도성 촉진자는 낮은 기본(비유도된) 발현 수준, 예를 들어 Tet-On(등록상표) 촉진자(Clontech)를 갖는 것 등일 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 촉진자는 조직 특이적 촉진자, 예를 들어 각막 내피에서의 발현에 특이적인 촉진자일 수 있다.
벡터는 본 명세서에 기재된 가이드 RNA를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 벡터는 가이드 RNA의 하나의 카피를 포함한다. 다른 실시형태에서, 벡터는 가이드 RNA의 하나 초과의 카피를 포함한다. 하나 초과의 가이드 RNA를 갖는 실시형태에서, 가이드 RNA는 이것이 상이한 표적 서열을 표적화하도록 비동일할 수 있거나, 이것이 동일한 표적 서열을 표적화한다는 점에서 동일할 수 있다. 벡터가 하나 초과의 가이드 RNA를 포함하는 몇몇 실시형태에서, 각각의 가이드는 RNA는 Cas RNP 복합체 내에 다른 상이한 특성, 예컨대 활성 또는 안정성을 가질 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 가이드 RNA를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 적어도 하나의 전사 또는 번역 제어 서열, 예컨대 촉진자, 3' UTR 또는 5' UTR에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 일 실시형태에서, 촉진자는 로트A 촉진자, 예를 들어 tRNALys3 또는 tRNA 키메라일 수 있다. 문헌[Mefferd et al., RNA. 2015 21:1683-9; Scherer et al., Nucleic Acids Res. 2007 35: 2620-2628]을 참조한다. 몇몇 실시형태에서, 촉진자는 RNA 중합효소 III(Pol III)에 의해 인식될 수 있다. Pol III 촉진자의 비제한적인 예는 U6 및 H1 촉진자를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 가이드 RNA를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 마우스 또는 인간 U6 촉진자에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 다른 실시형태에서, 가이드 RNA를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 마우스 또는 인간 H1 촉진자에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 하나 초과의 가이드 RNA를 갖는 실시형태에서, 발현을 추진시키도록 사용된 촉진자는 동일하거나 상이할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 가이드 RNA의 crRNA를 코딩하는 뉴클레오타이드 및 가이드 RNA의 trRNA를 코딩하는 뉴클레오타이드는 동일한 벡터에 제공될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, crRNA를 코딩하는 뉴클레오타이드 및 trRNA를 코딩하는 뉴클레오타이드는 동일한 촉진자에 의해 추진될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, crRNA 및 trRNA는 단일 전사체로 전사될 수 있다. 예를 들어, crRNA 및 trRNA는 이중 분자 가이드 RNA를 형성하도록 단일 전사체로부터 처리될 수 있다. 대안적으로, crRNA 및 trRNA는 단일 분자 가이드 RNA로 전사될 수 있다. 다른 실시형태에서, crRNA 및 trRNA는 동일한 벡터에서 이의 상응하는 촉진자에 의해 추진될 수 있다. 더욱 다른 실시형태에서, crRNA 및 trRNA는 상이한 벡터에 의해 코딩될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 가이드 RNA를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 Cas 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 동일한 벡터에 위치할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 가이드 RNA 및 Cas 단백질의 발현은 그 자체의 상응하는 촉진자에 의해 추진될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 가이드 RNA의 발현은 Cas 단백질의 발현을 추진시키는 동일한 촉진자에 의해 추진될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 가이드 RNA 및 Cas 단백질 전사체는 단일 전사체 내에 함유될 수 있다. 예를 들어, 가이드 RNA는 Cas 단백질 전사체의 비번역된 영역(UTR) 내에 있을 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 가이드 RNA는 Cas 단백질 전사체의 5' UTR 내에 있을 수 있다. 다른 실시형태에서, 가이드 RNA는 Cas 단백질 전사체의 3' UTR 내에 있을 수 있다. 몇몇 실시형태에서, Cas 단백질 전사체의 세포내 반감기는 이의 3' UTR 내에 가이드 RNA를 함유하고 이로써 이의 3' UTR의 길이를 짧게 함으로써 감소할 수 있다. 추가적인 실시형태에서, 가이드 RNA는 Cas 단백질 전사체의 인트론 내에 있을 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 적합한 스플라이스 부위는 가이드 RNA가 위치한 인트론에서 첨가될 수 있어서, 가이드 RNA는 전사체로부터 적절히 스플라이싱된다. 몇몇 실시형태에서, 동일한 벡터에서 가깝게 근접한 Cas 단백질 및 가이드 RNA의 발현은 CRISPR RNP 복합체의 더 효율적인 형성이 수월하게 할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 조성물은 벡터 시스템을 포함하고, 시스템은 하나 초과의 벡터를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 벡터 시스템은 1개의 단일 벡터를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 벡터 시스템은 2개의 벡터를 포함할 수 있다. 추가적인 실시형태에서, 벡터 시스템은 3개의 벡터를 포함할 수 있다. 상이한 가이드 RNA가 다중화에 사용될 때 또는 가이드 RNA의 다수의 카피가 사용될 때, 벡터 시스템은 3개 초과의 벡터를 포함할 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 벡터 시스템은 표적 세포에 전달된 후에만 발현을 시작하도록 유도성 촉진자를 포함할 수 있다. 비제한적인 예시적인 유도성 촉진자는 열 충격, 광, 화학물질, 펩타이드, 금속, 스테로이드, 항생제 또는 알코올에 의해 유도성인 것을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 유도성 촉진자는 낮은 기본(비유도된) 발현 수준, 예를 들어 Tet-On(등록상표) 촉진자(Clontech)를 갖는 것 등일 수 있다.
추가적인 실시형태에서, 벡터 시스템은 특이적 조직에 전달된 후에만 발현을 시작하도록 조직 특이적 촉진자를 포함할 수 있다.
벡터는 리포솜, 나노입자, 엑소좀 또는 마이크로베시클에 의해 전달될 수 있다. 벡터는 지질 나노입자에 의해 또한 전달될 수 있고; 예를 들어, 발명의 명칭이 "LIPID NANOPARTICLE FORMULATIONS FOR CRISPR/CAS COMPONENTS"이고, 2016년 3월 30일에 출원된 U.S.S.N. 62/315,602(이의 내용은 그 전문이 참고로 본 명세서에 포함됨)에 대한 우선권을 주장하는 2017년 3월 30일에 출원된 PCT/US2017/024973을 참조한다.
몇몇 실시형태에서, 벡터는 각막에 직접적으로 전달된 용액을 통해 전달될 수 있다. 전달은 국소 적용, 각막 자체로의 주사, 전방으로의 주사, 후방으로의 주사, 각막 윤부로의 주사, 또는 다른 수단을 통해 달성될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 벡터는 전신으로 전달될 수 있다.
지질 나노입자( LNP )
몇몇 실시형태에서, 단독의 또는 하나 이상의 벡터에서 코딩된 본 명세서에 기재된 가이드 RNA 조성물은 지질 나노입자를 통해 투여되고; 예를 들어 발명의 명칭이 "LIPID NANOPARTICLE FORMULATIONS FOR CRISPR/CAS COMPONENTS"인 2016년 3월 30일에 출원된 U.S.S.N. 62/315,602(이의 내용은 그 전문이 참고로 본 명세서에 포함됨)에 대한 우선권을 주장하는 2017년 3월 30일에 출원된 PCT/US2017/024973을 참조한다. 대상체에게 뉴클레오타이드를 전달할 수 있는 당업자에게 공지된 임의의 지질 나노입자는 본 명세서에 기재된 가이드 RNA, 및 Cas 또는 Cas-탈아미노효소 융합 단백질을 코딩하는 mRNA 또는 Cas9 또는 Cas9-탈아미노효소 융합 단백질 자체 중 어느 하나를 투여하도록 사용될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, LNP는 (i) 캡슐화 및 엔도솜 도피를 위한 CCD 지질, (ii) 안정화를 위한 천연 지질, (iii) 또한 안정화를 위한 헬퍼 지질, 및 (iv) 스텔스 지질을 포함한다. LNP는 하기 중 임의의 또는 모두를 포함할 수 있는 카고를 운반한다: Cas 뉴클레아제 또는 Cas-탈아미노효소, 예컨대 Cas9 또는 Cas9-탈아미노효소를 코딩하는 mRNA; 하나 이상의 가이드 RNA 또는 하나 이상의 가이드 RNA를 코딩하는 핵산; 및 Cas9 또는 Cas9-탈아미노효소를 코딩하는 하나 이상의 바이러스 벡터, 하나 이상의 가이드 RNA, 또는 Cas9/Cas9-탈아미노효소 및 가이드 RNA 둘 다. 일 실시형태에서, LNP는 CCD 지질, 예컨대 지질 A, 지질 B, 지질 C 또는 지질 D를 포함한다. 몇몇 양태에서, CCD 지질은 지질 A이다. 몇몇 양태에서, CCD 지질은 지질 B이다. 몇몇 실시형태에서, LNP는 CCD 지질, 천연 지질, 헬퍼 지질 및 스텔스 지질을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 헬퍼 지질은 콜레스테롤이다. 소정의 실시형태에서, 천연 지질은 DSPC이다. 몇몇 실시형태에서, 스텔스 지질은 PEG2k-DMG이다. 추가적인 실시형태에서, LNP는 지질 A 또는 지질 B, 콜레스테롤, DSPC 및 PEG2k-DMG로부터 선택된 CCD 지질을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 적합한 LNP 제제는 헬퍼 지질, 천연 지질 및 스텔스 지질과 함께 CCD 지질을 포함한다. "지질 나노입자"란 분자간 힘에 의해 서로와 물리적으로 연관된 복수의(즉, 하나 이상) 지질 분자를 포함하는 입자를 의미한다. LNP는 예를 들어, 마이크로구(단일층 및 다중층 베시클, 예를 들어 "리포솜"-라멜라 상 지질 이중층(몇몇 실시형태에서 실질적으로 구형이고, 더 특정한 실시형태에서, 예를 들어 RNA 분자의 실질적인 부분을 포함하는 수성 코어를 포함할 수 있음) 포함), 에멀션 중의 분산된 상, 마이셀 또는 현탁액 중의 내부 상일 수 있다. 에멀션, 마이셀 및 현탁액은 국부 및/또는 국소 전달에 적합한 조성물일 수 있다.
몇몇 실시형태에서, CCD 지질은 3-((4,4-비스(옥틸옥시)뷰타노일)옥시)-2-((((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카보닐)옥시)메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트라고도 칭하는 (9Z,12Z)-3-((4,4-비스(옥틸옥시)뷰타노일)옥시)-2-((((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카보닐)옥시)메틸)프로필 옥타데카-9,12-다이에노에이트인 지질 A이다. 지질 A는 하기한 바대로 도시될 수 있다:
Figure pct00009
.
지질 A는 WO2015/095340(예를 들어, pp. 84-86)(그 전문이 참고로 포함됨)에 따라 합성될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, CCD 지질은 ((5-((다이메틸아미노)메틸)-1,3-페닐렌)비스(옥시))비스(옥탄-8,1-다이일) 비스(데카노에이트)라고도 칭하는 ((5-((다이메틸아미노)메틸)-1,3-페닐렌)비스(옥시))비스(옥탄-8,1-다이일)비스(데카노에이트)인 지질 B이다. 지질 B는 하기한 바대로 도시될 수 있다:
Figure pct00010
.
지질 B는 WO2014/136086(예를 들어, pp. 107-09)(그 전문이 참고로 포함됨)에 따라 합성될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, CCD 지질은 2-((4-(((3-(다이메틸아미노)프로폭시)카보닐)옥시)헥사데카노일)옥시)프로판-1,3-다이일(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-비스(옥타데카-9,12-다이에노에이트)인 지질 C이다. 지질 C는 하기한 바대로 도시될 수 있다:
Figure pct00011
.
몇몇 실시형태에서, CCD 지질은 3-(((3-(다이메틸아미노)프로폭시)카보닐)옥시)-13-(옥타노일옥시)트라이데실 3-옥틸운데카노에이트인 지질 D이다.
지질 D는 하기한 바대로 도시될 수 있다:
Figure pct00012
.
지질 C 및 지질 D는 WO2015/095340(그 전문이 참고로 포함됨)에 따라 합성될 수 있다.
지질 조성물에서 사용하기에 적합한 "천연 지질"은 예를 들어 다양한 천연, 비하전 또는 쌍성이온 지질을 포함한다. 본 개시내용에서 사용하기에 적합한 천연 인지질의 예는 5-헵타데실벤젠-1,3-다이올(레소르시놀), 다이팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 다이스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 포스포콜린(DOPC), 다이미리스토일포스파티딜콜린(DMPC), 포스파티딜콜린(PLPC), 1,2-다이스테아로일-sn-글라이세로-3-포스포콜린(DAPC), 포스파티딜에탄올아민(PE), 난 포스파티딜콜린(EPC), 다이라우릴로일포스파티딜콜린(DLPC), 다이미리스토일포스파티딜콜린(DMPC), 1-미리스토일-2-팔미토일 포스파티딜콜린(MPPC), 1-팔미토일-2-미리스토일 포스파티딜콜린(PMPC), 1-팔미토일-2-스테아로일 포스파티딜콜린(PSPC), 1,2-다이아라키도일-sn-글라이세로-3-포스포콜린(DBPC), 1-스테아로일-2-팔미토일 포스파티딜콜린(SPPC), 1,2-다이에이코세노일-sn-글라이세로-3-포스포콜린(DEPC), 팔미토일올레오일 포스파티딜콜린(POPC), 라이소포스파티딜 콜린, 다이올레오일 포스파티딜에탄올아민(DOPE), 다이리놀레오일포스파티딜콜린 다이스테아로일포스파티딜에탄올아민(DSPE), 다이미리스토일 포스파티딜에탄올아민(DMPE), 다이팔미토일 포스파티딜에탄올아민(DPPE), 팔미토일올레오일 포스파티딜에탄올아민(POPE), 라이소포스파티딜에탄올아민 및 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 일 실시형태에서, 천연 인지질은 다이스테아로일포스파티딜콜린(DSPC) 및 다이미리스토일 포스파티딜 에탄올아민(DMPE)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 천연 인지질은 다이스테아로일포스파티딜콜린(DSPC)일 수 있다. 천연 지질은 LNP을 안정화시키고 이의 처리를 개선하도록 작용한다.
"헬퍼 지질"은 형질주입(예를 들어, 생물학적 활성제를 포함하는 나노입자의 형질주입)을 증대시키는 지질이다. 헬퍼 지질이 형질주입을 증대시키는 기전은 입자 안정성을 증대시키는 것을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 헬퍼 지질은 막 융합생성을 증대시킨다. 헬퍼 지질은 스테로이드, 스테롤 및 알킬 레소르시놀을 포함한다. LNP에서 사용하기에 적합한 헬퍼 지질은 콜레스테롤, 5-헵타데실레소르시놀 및 콜레스테롤 헤미숙시네이트를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 일 실시형태에서, 헬퍼 지질은 콜레스테롤일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 헬퍼 지질은 콜레스테롤 헤미숙시네이트일 수 있다.
"스텔스 지질"은 나노입자가 생체내(예를 들어, 혈액에서) 존재할 수 있는 시간의 길이를 변경하는 지질이다. 스텔스 지질은 예를 들어 입자 응집을 감소시키고 입자 크기를 제어함으로써 제제 공정을 도울 수 있다. 본 명세서에 사용된 스텔스 지질은 LNP의 약동학적 특성을 조정할 수 있다. 지질 조성물에서 사용하기에 적합한 스텔스 지질은 지질 모이어티에 연결된 친수성 헤드 기를 갖는 스텔스 지질을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 본 개시내용의 지질 조성물에서 사용하기에 적합한 스텔스 지질 및 이러한 지질의 생화학에 관한 정보는 문헌[Romberg et al., Pharmaceutical Research, Vol. 25, No. 1, 2008, pg. 55-71 및 Hoekstra et al., Biochimica et Biophysica Acta 1660 (2004) 41-52]에서 발견될 수 있다. 추가적인 적합한 PEG 지질은 예를 들어 WO 2006/007712에 개시되어 있다.
일 실시형태에서, 스텔스 지질의 친수성 헤드 기는 PEG에 기초한 중합체(때때로 폴리(에틸렌 옥사이드)라 칭함), 폴리(옥사졸린), 폴리(비닐 알코올), 폴리(글라이세롤), 폴리(N-비닐피롤리돈), 폴리아미노산 및 폴리[N-(2-하이드록시프로필)메타크릴아마이드]로부터 선택된 중합체 모이어티를 포함한다.
스텔스 지질은 지질 모이어티를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 스텔스 지질의 지질 모이어티는 다이아실글라이세롤 또는 다이아실글라이카미드, 예를 들어 독립적으로 약 C4 내지 약 C40 포화 또는 불포화 탄소 원자를 포함하는 알킬 사슬 길이를 갖는 다이알킬글라이세롤 또는 다이알킬글라이카미드기를 포함하는 것(여기서, 사슬은 하나 이상의 작용기, 예를 들어 아마이드 또는 에스터 등을 포함할 수 있음)으로부터 유래될 수 있다. 다이알킬글라이세롤 또는 다이알킬글라이카미드기는 하나 이상의 치환된 알킬기를 추가로 포함할 수 있다.
달리 표시되지 않는 한, 용어 "PEG"는, 본 명세서에 사용된 바대로, 임의의 폴리에틸렌 글라이콜 또는 다른 폴리알킬렌 에터 중합체를 의미한다. 몇몇 실시형태에서, PEG는 에틸렌 글라이콜 또는 에틸렌 옥사이드의 임의로 치환된 선형 또는 분지형 중합체이다. 몇몇 실시형태에서, PEG는 비치환된다. 몇몇 실시형태에서, PEG는 예를 들어 하나 이상의 알킬, 알콕시, 아실, 하이드록시 또는 아릴기에 의해 치환된다. 몇몇 실시형태에서, 상기 용어는 PEG 공중합체, 예컨대 PEG-폴리우레판 또는 PEG-폴리프로필렌(예를 들어, 문헌[J. Milton Harris, Poly(ethylene glycol) chemistry: biotechnical and biomedical applications (1992)] 참조)을 포함하거나; 또 다른 실시형태에서, 상기 용어는 PEG 공중합체를 포함하지 않는다. 몇몇 실시형태에서, PEG는 약 130 내지 약 50,000, 하위실시형태에서, 약 150 내지 약 30,000, 하위실시형태에서, 약 150 내지 약 20,000, 하위실시형태에서 약 150 내지 약 15,000, 하위실시형태에서, 약 150 내지 약 10,000, 하위실시형태에서, 약 150 내지 약 6,000, 하위실시형태에서, 약 150 내지 약 5,000, 하위실시형태에서, 약 150 내지 약 4,000, 하위실시형태에서, 약 150 내지 약 3,000, 하위실시형태에서, 약 300 내지 약 3,000, 하위실시형태에서, 약 1,000 내지 약 3,000, 및 하위실시형태에서, 약 1,500 내지 약 2,500의 분자량을 갖는다.
소정의 실시형태에서, PEG(예를 들어, 지질, 예컨대 스텔스 지질에 접합됨)는 약 2,000달톤의 평균 분자량을 갖는 "PEG 2000"이라고도 칭하는 "PEG-2K"이다. PEG-2K는 본 명세서에서 하기 식 (I)(식 중, n은 45이고, 이는 수 평균 중합도가 약 45개의 아단위를 포함한다는 것을 의미함)에 의해 표시된다
Figure pct00013
. 그러나, 예를 들어 수 평균 중합도가 약 23개의 아단위(n=23), 및/또는 68개의 아단위(n=68)를 포함하는 것을 포함하는, 당해 분야에 공지된 다른 PEG 실시형태를 사용할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, n은 약 30 내지 약 60의 범위일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, n은 약 35 내지 약 55의 범위일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, n은 약 40 내지 약 50의 범위일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, n은 약 42 내지 약 48의 범위일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, n은 45일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, R은 H, 치환된 알킬 및 비치환된 알킬로부터 선택될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, R은 비치환된 알킬일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, R은 메틸일 수 있다.
본 명세서에 기재된 임의의 실시형태에서, 스텔스 지질은 PEG-다이라우로일글라이세롤, PEG-다이미리스토일글라이세롤(PEG-DMG)(NOF(일본 도쿄)로부터의 카탈로그 GM-020호), PEG-다이팔미토일글라이세롤, PEG-다이스테아로일글라이세롤(PEG-DSPE)(카탈로그 DSPE-020CN호, NOF(일본 도쿄)), PEG-다이라우릴글라이카미드, PEG-다이미리스틸글라이카미드, PEG-다이팔미토일글라이카미드 및 PEG-다이스테아로일글라이카미드, PEG-콜레스테롤(1-[8'-(콜레스트-5-엔-3[베타]-옥시)카복사미도-3',6'-다이옥사옥타닐]카바모일-[오메가]-메틸-폴리(에틸렌 글라이콜), PEG-DMB(3,4-다이테트라데콕실벤질-[오메가]-메틸-폴리(에틸렌 글라이콜)에터), 1,2-다이미리스토일-sn-글라이세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글라이콜)-2000](PEG2k-DMG)(Avanti Polar Lipids(미국 알라바마주 알라바스터)로부터의 카탈로그 880150P호), 1,2-다이스테아로일-sn-글라이세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글라이콜)-2000](PEG2k-DSPE)(Avanti Polar Lipids(미국 알라바마주 알라바스터)로부터의 카탈로그 880120C호), 1,2-다이스테아로일-sn-글라이세롤, 메톡시폴리에틸렌 글라이콜(PEG2k-DSG; GS-020, NOF(일본 도쿄)), 폴리(에틸렌 글라이콜)-2000-다이메타크릴레이트(PEG2k-DMA) 및 1,2-다이스테아릴옥시프로필-3-아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글라이콜)-2000](PEG2k-DSA)로부터 선택될 수 있다. 일 실시형태에서, 스텔스 지질은 PEG2k-DMG일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 스텔스 지질은 PEG2k-DSG일 수 있다. 일 실시형태에서, 스텔스 지질은 PEG2k-DSPE일 수 있다. 일 실시형태에서, 스텔스 지질은 PEG2k-DMA일 수 있다. 일 실시형태에서, 스텔스 지질은 PEG2k-DSA일 수 있다. 일 실시형태에서, 스텔스 지질은 PEG2k-C11일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 스텔스 지질은 PEG2k-C14일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 스텔스 지질은 PEG2k-C16일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 스텔스 지질은 PEG2k-C18일 수 있다.
본 개시내용의 실시형태는 또한 제제에서의 성분 지질의 각각의 몰비에 따라 기재된 지질 조성을 제공한다. 일 실시형태에서, CCD 지질의 ㏖%는 약 30㏖% 내지 약 60㏖%일 수 있다. 일 실시형태에서, CCD 지질의 ㏖%는 약 35㏖% 내지 약 55㏖%일 수 있다. 일 실시형태에서, CCD 지질의 ㏖%는 약 40㏖% 내지 약 50㏖%일 수 있다. 일 실시형태에서, CCD 지질의 ㏖%는 약 42㏖% 내지 약 47㏖%일 수 있다. 일 실시형태에서, CCD 지질의 ㏖%는 약 45%일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, LNP 배취의 CCD 지질 ㏖%는 표적 ㏖%의 ±30%, ±25%, ±20%, ±15%, ±10%, ±5% 또는 ±2.5%일 것이다. 소정의 실시형태에서, LNP 로트간 변동성은 15% 미만, 10% 미만 또는 5% 미만일 것이다.
일 실시형태에서, 헬퍼 지질의 ㏖%는 약 30㏖% 내지 약 60㏖%일 수 있다. 일 실시형태에서, 헬퍼 지질의 ㏖%는 약 35㏖% 내지 약 55㏖%일 수 있다. 일 실시형태에서, 헬퍼 지질의 ㏖%는 약 40㏖% 내지 약 50㏖%일 수 있다. 일 실시형태에서, 헬퍼 지질의 ㏖%는 약 41㏖% 내지 약 46㏖%일 수 있다. 일 실시형태에서, 헬퍼 지질의 ㏖%는 약 44㏖%일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, LNP 배취의 헬퍼 ㏖%는 표적 ㏖%의 ±30%, ±25%, ±20%, ±15%, ±10%, ±5% 또는 ±2.5%일 것이다. 소정의 실시형태에서, LNP 로트간 변동성은 15% 미만, 10% 미만 또는 5% 미만일 것이다.
일 실시형태에서, 천연 지질의 ㏖%는 약 1㏖% 내지 약 20㏖%일 수 있다. 일 실시형태에서, 천연 지질의 ㏖%는 약 5㏖% 내지 약 15㏖%일 수 있다. 일 실시형태에서, 천연 지질의 ㏖%는 약 7㏖% 내지 약 12㏖%일 수 있다. 일 실시형태에서, 천연 지질의 ㏖%는 약 9㏖%일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, LNP 배취의 천연 지질 ㏖%는 표적 ㏖%의 ±30%, ±25%, ±20%, ±15%, ±10%, ±5% 또는 ±2.5%일 것이다. 소정의 실시형태에서, LNP 로트간 변동성은 15% 미만, 10% 미만 또는 5% 미만일 것이다.
일 실시형태에서, 스텔스 지질의 ㏖%는 약 1㏖% 내지 약 10㏖%일 수 있다. 일 실시형태에서, 스텔스 지질의 ㏖%는 약 1㏖% 내지 약 5㏖%일 수 있다. 일 실시형태에서, 스텔스 지질의 ㏖%는 약 1㏖% 내지 약 3 ㏖%일 수 있다. 일 실시형태에서, 스텔스 지질의 ㏖%는 약 2㏖%일 수 있다. 일 실시형태에서, 스텔스 지질의 ㏖%는 약 1㏖%일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, LNP 배취의 스텔스 지질 ㏖%는 표적 ㏖%의 ±30%, ±25%, ±20%, ±15%, ±10%, ±5% 또는 ±2.5%일 것이다. 소정의 실시형태에서, LNP 로트간 변동성은 15% 미만, 10% 미만 또는 5% 미만일 것이다.
투여 위치
몇몇 실시형태에서, 조성물은 눈의 전방에 전달된다. 몇몇 실시형태에서, 조성물은 눈의 후방에 전달된다. 몇몇 실시형태에서, 조성물은 각막 자체로 전달된다. 몇몇 실시형태에서, 조성물은 각막 실질로 전달된다. 몇몇 실시형태에서, 조성물은 각막 윤부로 전달된다. 몇몇 실시형태에서, 조성물은 각막의 상피 표면으로 전달된다. 이 문단의 임의의 이전의 실시형태, 및 본 명세서에 기재된 다른 실시형태에서, 치료는 예를 들어 지질 나노입자를 사용한 Cas 단백질(예를 들어, Cas9)의 전달 또는 벡터 및/또는 지질 나노입자를 사용한 Cas 단백질을 코딩하는 핵산의 전달을 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태, 예를 들어 지질 나노입자를 사용하는 것에서, Cas 단백질을 코딩하는 핵산은 mRNA이다. 몇몇 실시형태에서, Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 코딩하는 핵산은 적절한 가이드 또는 가이드를 전달하도록 사용된 동일한 벡터 및/또는 지질 나노입자를 통해 전달된다. 몇몇 실시형태에서, Cas 단백질 또는 Cas 단백질을 코딩하는 핵산은 적절한 가이드 또는 가이드를 전달하도록 사용된 상이한 벡터 및/또는 지질 나노입자를 통해 전달된다.
본 명세서에 기재된 임의의 조성물은 TCF4의 인트론 3에서 TNR 연장의 일부 또는 전부를 절제하도록 대상체에게 투여될 수 있다. 본 명세서에 기재된 임의의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 FECD를 치료하는 방법이 포함된다. 몇몇 양태에서, 조성물은 치료학적 유효량으로 투여된다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 하나 이상의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, TCF4의 TNR을 절제, 돌연변이, 이의 카피수의 감소, 경감 및/또는 근절시키는 방법이 포함된다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 하나 이상의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 세포마다 TCF4의 하나의 카피 또는 카피 둘 다의 TNR을 절제, 돌연변이, 이의 카피수의 감소, 경감 및/또는 근절시키는 방법이 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 세포는 각막 내피 세포이다.
몇몇 실시형태에서, 2개의 gRNA는 TCF4에서 모든 TNR을 절제하도록 사용된다. 몇몇 실시형태에서, TNR에 5'인 제1 가이드는 TNR에 3'인 제2 가이드에 의해 제공되거나 그 반대이다. 2개의 gRNA가 고려되는 경우, 임의의 가이드의 하기 조합을 포함하는 조성물이 제공된다:
조합 01: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1089를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 02: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1090을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 03: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1091을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 04: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1092를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 05: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1093을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 06: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호1094를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 07: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호1095를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 08: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1096을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 09: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1097을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 10: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1098을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 11: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1099를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 12: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1100을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 13: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1101을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 14: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1102를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 15: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1103을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 16: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1104를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 17: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1105를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 18: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1106을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 19: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1107을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 20: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1108을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 21: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1109를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 22: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1110을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 23: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1111을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 24: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1112를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 25: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1113을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 26: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1114를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 27: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1115를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 28: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1116을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 29: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1117을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 30: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1118을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 31: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1119를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 32: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1120을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 33: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1121을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 34: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1122를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 35: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1123을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 36: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1124를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 37: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1125를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 38: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1126을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 39: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1127을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 40: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1128을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 41: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1129를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 42: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1130을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 43: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1131을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 44: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1132를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 45: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1133을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 46: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1134를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 47: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1135를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 48: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1136을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 49: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1137을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 50: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1138을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 51: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1139를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 52: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1140을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 53: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1141을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 54: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1142를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 55: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1143을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 56: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1144를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 57: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1145를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 58: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1146을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 59: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1147을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 60: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1148을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 61: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1149를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 62: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1150을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 63: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1151을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 64: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1152를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 65: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1153을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 66: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1154를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 67: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1155를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 68: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1156을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 69: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1157를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 70: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1158을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 71: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1159를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 72: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1160을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 73: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1161을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 74: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1162를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 75: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1163을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 76: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1164를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 77: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1165를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 78: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1166을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 79: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1167을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 80: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1168을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 81: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1169를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 82: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1170을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 83: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1171을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 84: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1172를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 85: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1173을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 86: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1174를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 87: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1175를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 88: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1176을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 89: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1177을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 90: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1178을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 91: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1179를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 92: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1180을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 93: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1181을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1182 내지 1278로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 94: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1182를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 95: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1183을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 96: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1184를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 97: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1185를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 98: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1186을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 99: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1187을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 100: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1188을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 101: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1189를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 102: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1190을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 103: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1191을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 104: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1192를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 105: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1193을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 106: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1194를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 107: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1195를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 108: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1196을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 109: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1197을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 110: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1198을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 111: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1199를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 112: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1200을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 113: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1201을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 114: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1202를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 115: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1203을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 116: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1204를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 117: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1205를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 118: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1206을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 119: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1207을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 120: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1208을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 121: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1209를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 122: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1210을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 123: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1211을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 124: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1212를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 125: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1213을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 126: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1214를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 127: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1215를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 128: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1216을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 129: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1217을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 130: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1218을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 131: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1219를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 132: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1220을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 133: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1221을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 134: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1222를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 135: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1223을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 136: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1224를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 137: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1225를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 138: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1226을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 139: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1227을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 140: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1228을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 141: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1229를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 142: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1230을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 143: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1231을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 144: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1232를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 145: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1233을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 146: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1234를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 147: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1235를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 148: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1236을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 149: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1237을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 150: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1238을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 151: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1239를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 152: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1240을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 153: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1241을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 154: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1242를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 155: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1243을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 156: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1244를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 157: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1245를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 158: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1246을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 159: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1247을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 160: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1248을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 161: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1249를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 162: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1250을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 163: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1251을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 164: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1252를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 165: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1253을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 166: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1254를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 167: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1255를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 168: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1256을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 169: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1257을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 170: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1258을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 171: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1259를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 172: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1260을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 173: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1261을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 174: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1262를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 175: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1263을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 176: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1264를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 177: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1265를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 178: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1266을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 179: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1267을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 180: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1268을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 181: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1269를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 182: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1270을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 183: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1271을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 184: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1272를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 185: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1273을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 186: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1274를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 187: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1275를 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 188: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1276을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 189: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1277을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
조합 190: 몇몇 실시형태에서, 조성물은 서열 번호 1278을 포함하는 제1 gRNA 및 서열 번호 1089 내지 1181로부터 선택된 서열을 포함하는 제2 gRNA를 포함하는 2개의 gRNA를 포함한다.
실시예
실시예 1. TCF4 로부터 TNR 연장을 절제하기 위한 gRNA의 쌍의 용도
TCF4로부터 TNR을 제거하고 독성 RNA의 제조를 제한하기 위해, CRISPR 가이드는 특이적 표적 서열을 이용하여 확장의 어느 한 측에서 동시에 절단하도록 설계되었다. 이 gRNA는 야생형 에스. 피요게네스 Cas9("Spy Cas9")와 작업하도록 설계되었다. 다른 CRISPR 뉴클레아제와 사용하기에 적합한 다른 gRNA는 유사한 방식으로 설계될 수 있다.
표적 서열은 플랭킹 엑손을 갖는 TCF4 인트론 3 서열의 서열(서열 번호 1085)을 사용하여 선택되었다. 이 서열은 UCSC Genome browser, Human(2009년 2월)(GRCh37/hg19) 어셈블리에 기초한다. 이 서열은 인트론 위치 chr18:53252584-53254275 내에 범위 53253387-53253458에서 일련의 24개의 CTG 반복부(TNR)를 함유한다. 이 인트론에서의 CTG 반복부의 정확한 범위는 반복부의 수에 기초하여 변할 것이고, 여기서 40개의 초과의 다수의 반복부는 발생하는 질환에 대한 위험 증가와 연관된다. hg38 빌드에서, 반복부는 chr18:55,585,280-55,587,136에 이르는 인트론 내에 chr18:55,586,156-55,586,228에 위치한다. 표적 서열 및 상응하는 가이드 서열은 표 2(서열 번호 1 내지 190(표적 서열) 및 서열 번호 1089 내지 1278(가이드 서열))에 기재되어 있다. 이 실시예 1에서 사용된 crRNA 및 trRNA의 특정한 형태는 각각 서열 번호 1087 및 서열 번호 1088로서 표 1에 제공된다. 5' 가이드 서열(서열 번호 1089 내지 1181)에 대한 표적 서열은 Chr18:55,585,285-55,586,153 사이에 위치하고, TNR의 위치의 상류이다. 3' 가이드 서열(서열 번호 94 내지 190)에 대한 표적 서열은 Chr18:55586225-55587203 사이에 위치하고, TNR의 위치의 하류이다. 표 2는 서열 번호 1 내지 190(표적 서열) 및 서열 번호 1089 내지 1278(상응하는 표적 서열에 뉴클레아제를 지향시키고 표적 서열의 역방향 보체에 결합하는 가이드 서열)을 기재한다. 절단 빈도 결정(Cutting Frequency Determination: CFD) 점수는 Doench 등에 의해 보고된 방법론(Nat Biotechnol. 2016 Feb; 34(2): 184-191)에 따라 인 실리코로 각각의 가이드 서열에 대해 생성되었다. (Doench 등이 점수를 어떻게 보고하는지와 비교되는 소수로 전환하기 위해 100의 인수를 곱한) 이 점수는 소정의 gRNA에 대한 오프-타깃 가능성의 측정치를 제공한다.
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표 2에 제공된 가이드 서열을 갖는 gRNA는 이의 편집(예를 들어, 삽입-결실 형성) 효율을 결정하도록 96웰 포맷에서 스크리닝되었다. 이를 위해, Spy Cas9("HEK293_Cas9")를 구성적으로 발현하는 HEK293 세포주는 10% 소 태아 혈청 및 500㎍/㎖의 G418이 보충된 DMEM 배지에서 배양되었다. 세포를 형질주입 20시간 전에 96웰 플레이트에서 10,000개의 세포/웰의 밀도로 플레이팅하였다. 세포를 제조사의 프로토콜에 따라 리포펙타민 RNAiMAX(ThermoFisher, 카탈로그 13778150)에 의해 형질주입하였다. 세포를 개별 crRNA(25nM), trRNA(25nM), 리포펙타민 RNAiMAX(0.3㎕/웰) 및 OptiMem을 함유하는 리포플렉스(lipoplex)에 의해 형질주입하였다. 게놈 DNA를 제조사의 프로토콜에 따라 50㎕/웰의 BuccalAmp DNA 추출 용액(Epicentre, 카탈로그 QE09050)을 사용하여 각각의 웰로부터 추출하였다.
게놈에서 표적 위치에서의 편집의 효율을 정량적으로 결정하기 위해, 딥 서열분석을 이용하여 유전자 편집에 의해 도입된 삽입 및 결실("삽입-결실")의 존재를 확인하였다. PCR 프라이머를 표적 부위 주위에 설계하고, 관심 대상의 게놈 부위를 증폭시켰다. 추가적인 PCR을 서열분석에 필요한 화학물질을 첨가하도록 제조사의 프로토콜(Illumina)에 따라 수행하였다. 앰플리콘을 Illumina MiSeq 장치에서 서열분석하였다. 판독을 낮은 품질 점수를 갖는 것을 제거한 후 인간 기준 게놈에 정렬하였다. 판독을 함유하는 생성된 파일을 기준 게놈(BAM 파일)에 맵핑하고, 여기서 관심 대상의 표적 영역을 중첩시킨 판독을 선택하고, 삽입, 치환 또는 결실을 함유하는 판독의 수에 대한 야생형 판독의 수를 계산하였다. 편집 백분율(예를 들어, "편집 효율" 또는 "퍼센트 편집")은 야생형을 포함하는 서열 판독의 전체 수에 대한 삽입 또는 결실을 갖는 서열 판독의 전체 수로서 정의된다. 사용된 각각의 gRNA에 대한 편집 효율 수는 표 2에 보고되어 있다.
최적 편집 효율을 갖는 것을 확인하기 위한 상기 초기 평가를 완료한 후, gRNA의 쌍을 스크리닝하여, 도 1에 도시된 바대로, TNR을 함유하는 DNA의 개재하는 섹션을 제거할 수 있는 쌍을 결정하였다. 개재하는 섹션의 절제 후, 브레이크는 이후 각막 내피에서의 것과 같은 비분열 세포에서도 매우 효율적인 비상동성 말단 결합(non-homologous end joining: NHEJ) DNA 보수 경로를 통해 세포에 의해 보수될 것이다. 이 과정은, 가이드 서열이 3000개 초과의 뉴클레오타이드로 떨어져 있을 때에도, 높은 빈도로 발생할 수 있는 2개의 가이드 서열 사이의 DNA 단편의 절제가 후행한다. 추가적인 상동성 주형 DNA는 이 편집 접근법에 필요하지 않아서, 이 과정을 크게 단순화한다. 결실된 범위가 인트론 내에 함유되면서, 인트론이 최종 mRNA 산물 또는 단백질 산물에 영향을 미치지 않으면서, TCF4의 유전자 산물에 대한 효과는 예상되지 않을 것이다.
TNR 반복부의 제거 후, TCF4 RNA 전사체는 세포 내에 더 이상 응집하지 않고, 정상 세포 기능에 필요한 스플라이싱 인자를 봉쇄하지 않는다. 이 인트론이 최종 RNA 산물의 성숙 동안 RNA 스플라이싱에 의해 보통 제거되지 않으므로, 인트론 3 내의 관련 영역의 제거는 TCF4 유전자 자체의 발현 또는 RNA 안정성에 임의의 해로운 효과를 갖지 않을 것이다. 따라서, 인트론 3 내의 DNA의 영역은 TCF4 단백질의 번역에 이용된 최종 RNA 산물 내에 함유되지 않는다. TNR 없이는, TCF4의 유전자 산물 및 mRNA는 최소 TNR 연장을 갖는 정상 대립유전자와 훨씬 동일하게 정상으로 기능해야 한다. 더구나, 각막 내피 세포가 본질적으로 비분열이므로, 세포의 수정은 일단 영구적인 질환 경감을 발생시켜야 한다. 치료는 질환에 특징적인 비정상 콜라겐 침착(즉, 방울)을 중지시켜야 하고, 시간이 지나면서 기존의 방울의 재흡수를 발생시킬 수 있다. 이 기술을 이용한 질환의 가족 병력을 갖고, TCF4의 인트론 3의 TNR 연장을 갖는 것으로 확인된 FECD에 대한 공지된 소인을 갖는 개인의 치료는 질환의 발생을 방지할 수 있는 것으로 또한 제안된다.
TNR의 절제를 입증하기 위해, 각각 TNR의 일 측을 표적화하는 gRNA를 갖는, RNP의 쌍을 형성하였다. 간단히 말하면, 예비 어닐링된 gRNA(예를 들어, crRNA 및 trRNA를 갖는 dgRNA)의 50μM 용액을 2분 동안 95℃에서 물 중에 동일 몰 양의 crRNA 및 trRNA를 가열하고, 이들이 실온에서 냉각되게 함으로써 제조하였다. 예비 어닐링된 gRNA를 (50μM 농도에서) Spy Cas9 단백질에 첨가하고, 10분 동안 실온에서 항온처리하여, 3.33μM에서 gRNA 및 1.66μM에서 Cas9 단백질을 갖는 최종 RNP 용액을 제공한다. Cas9를 구성적으로 발현하지 않는 HEK293 세포를 20㎕의 용적에서 약 50,000개의 세포/웰로 96웰 포맷에서 SF 전기천공 완충제(Lonza) 중에 플레이팅하였다. (예를 들어, 시험되는 각각의 쌍에 대해) 5㎕의 각각의 RNP 용액을 웰에 첨가하고, 세포를 Lonza Amaxa 장치를 사용하여 전기천공하였다. 전기천공 후, 80㎕의 세포 배양 배지를 웰에 첨가하고, 세포를 96웰 평평 바닥 조직 배양 플레이트로 옮기고, 37℃에서 24시간 동안 항온처리하였다. 이후, 세포를 용해시키고, 게놈 DNA를 상기 기재한 바대로 추출하였다.
TNR 절제의 효율을 결정하기 위해, 편집 효율에 대해 상기 기재된 바대로 유사한 NGS 분석을 수행하였다. 간단히 말하면, TNR을 플랭킹하는 2개의 위치의 유전자 편집에 의해 생긴 결실을 확인하도록 딥 서열분석을 수행하였다. PCR 프라이머를 표적 부위(TCF4의 인트론 3에서의 TNR) 주위에 설계하고, 관심 대상의 게놈 부위를 증폭시켰다. 추가적인 PCR을 서열분석에 필요한 화학물질을 첨가하도록 제조사의 프로토콜(Illumina)에 따라 수행하였다. 생성된 앰플리콘을 Illumina MiSeq 장치에서 서열분석하였다. 판독을 여과시켜 낮은 품질 점수를 갖는 것을 제거하고, 생성된 판독을 기준 게놈에 맵핑하였다. 표적 영역을 중첩시킨 판독을 추가로 여과시키고, 국부로 재정렬하여 큰 결실을 확인하였다. 2개의 표적화된 영역에 이르는 결실을 함유하는 판독의 수를 계산하였다. 절제 백분율은 표적 영역을 중첩시킨 판독의 전체 수로 나눈 TNR의 결실을 함유하는 서열분석 판독의 수로서 정의된다. 시험된 각각의 쌍에 대한 절제 백분율은 표 7에 보고되어 있다.
표 7 및 도 2에 도시된 바대로, gRNA의 93개의 쌍을 시험하고, 몇몇 쌍은 80% 초과의 절제를 달성하고, 특히 하나의 쌍은 88% 초과의 절제를 달성하였다(예를 들어, 서열 번호 83 및 서열 번호 109를 포함하는 표적 서열에 뉴클레아제를 지향시키는 가이드 서열을 갖는 gRNA를 사용; 각각 서열 번호 1177 및 서열 번호 1197을 포함하는 가이드 RNA에 상응).
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실시예 2. COL8A2 에서 돌연변이를 처리하기 위한 gRNA의 용도
COL8A2, Gln455Lys, Gln455Val 및 Leu450Trp에서의 3개의 돌연변이는 조기 발병 FECD 및 후부 다형 각막 이상증(PPDC)과 연관되고, 넉인 동물 연구는 인간 조기 발병 FECD와 일치하는 병리학을 보여주었다. 이 모델은 삼중 나선 구조의 변경된 안정성을 갖는 돌연변이체 콜라겐 VIII 펩타이드의 비정상 세포내 축적과 연관되었다. 따라서, COL8A2에서의 돌연변이의 진단 또는 가족 병력을 갖는 환자에서 감소하는 돌연변이체 콜라겐 VIII는 질환 과정을 개선할 수 있다. 대안적으로, Gln455Lys, Gln455Val 또는 Leu450Trp 중 어느 하나에서 돌연변이를 갖는 COL8A2의 수준을 선택적으로 감소시키는 것은 돌연변이체 콜라겐 VIII 펩타이드의 수준을 감소시키고 질환 과정을 개선할 수 있다. 또 다른 접근법은 콜라겐 VIII의 알파 아단위 2(COL8A2)에서 아미노산 돌연변이를 발생시키는 DNA에서 돌연변이를 수정하고 이에 따라 비정상 유전자 산물을 제거하는 것일 것이다.
표적 서열은 COL8A2 유전자의 전사체 변이체 1의 NCBI 기준 서열 NM_005202.3을 사용하여 Cas RNP 치료를 개발하는 데 선택되었다. 이 서열은 콜라겐 VIII 유전자 산물의 아미노산 서열에서 455번 및 450번 위치에서 발생하는 것으로 공지된 돌연변이를 함유하지 않고, "야생형 COL8A2 서열"이라 칭해질 수 있다. 표적 서열은 표 3(서열 번호 191 내지 1063)에 기재된 바대로 Chr1:36097532-36100270(hg38 버전) 사이에 선택되었다. 표적 서열에 상보성인 가이드 서열은 COL8A2를 표적화하도록 RNP와 사용하기 위해 gRNA를 생성하도록 사용될 수 있다.
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서열 번호 191 내지 1063에 상보성인 가이드 서열을 포함하거나, 서열 번호 191 내지 1063의 역방향 보체에 결합하는 gRNA의 사용은 COL8A2의 서열에 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 또는 Cas9 RNP)를 표적화하는 것으로 예상될 것이다. COL8A2의 이형접합성 돌연변이체가 조기 발병 FECD에서 규명되면서, 서열 번호 191 내지 1063의 표적 서열에 상보성인 가이드 서열을 포함하는 gRNA에 의해 Cas RNP를 표적화하는 것은 NHEJ를 통해 삽입-결실의 생성을 발생시킬 수 있다. 삽입-결실의 생성은 COL8A2의 발현을 감소시킬 수 있어서, 콜라겐-8 단백질의 생성된 독성 알파-2 아단위를 감소시킨다. 콜라겐의 다른 형태가 알파-2 아단위의 자리를 차지할 수 있으므로, 독성 COL8A2 산물의 감소는 조기 발병 FECD의 질환 과정을 개선할 수 있다. 소정의 가이드는 또한 공지된 질환 연관된 돌연변이를 함유하는 COL8A2 유전자의 영역을 절제하거나, 이러한 돌연변이를 함유하지 않는 동형을 선호하는 스플라이싱 패턴을 변경시키기에 유용할 수 있다. 소정의 가이드를 이용한 COL8A2 유전자의 넉아웃은 야생형 COL8A2 대체 전략과 함께 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 야생형 COL8A2 코딩 서열은 내인성 우성 음성 돌연변이체 형태의 발현을 제거한 후 형질전환 수단을 통해 발현될 수 있다.
돌연변이체 대립유전자에 대한 뉴클레오타이드 서열의 차이에 기초하여, 돌연변이체 대립유전자에 특이적인 표적 서열이 또한 확인되었다.
표 4는 c.1364C>A 뉴클레오타이드 변경에 의해 생긴 Gln455Lys를 발생시키는 돌연변이에 특이적인 표적 서열을 기재한다. 서열 번호 1064 내지 1069에 상보성인 가이드 서열을 포함하는 gRNA의 사용은, 효율적으로 야생형 대립유전자를 표적화하지 않거나 덜 표적화하면서, 돌연변이체 대립유전자를 표적화할 것이다. Gln455Lys 돌연변이를 갖는 개인이 보통 오직 하나의 영향 받은 대립유전자를 가지므로, COL8A2의 돌연변이체 대립유전자에 표적화된 Cas RNP에 의해 매개된 NHEJ로 인한 삽입-결실의 선택적 생성은, 다른 야생형 COL8A2 대립유전자를 보존하면서, 이 대립유전자의 손실을 오직 발생시키는 것으로 예상될 것이다. 대안적으로, 서열 번호 1064 내지 1069에 상보성인 가이드 서열, 또는 서열 번호 1064 내지 1069의 역방향 보체에 결합하는 가이드 서열을 포함하는 gRNA는 또한 돌연변이의 수정을 매개하도록 주형과 함께 또한 사용될 수 있다.
Figure pct00051
표 5는 c.1363-1364CA>GT 뉴클레오타이드 변경에 의해 생긴 Gln455Val를 발생시키는 점 돌연변이에 특이적인 표적 서열을 기재한다. 서열 번호 1070 내지 1075에 뉴클레아제를 지향시키는 가이드 서열을 포함하는 gRNA의 사용은, 효율적으로 야생형 대립유전자를 표적화하지 않거나 덜 표적화하면서, 돌연변이체 대립유전자를 표적화할 것이다. Gln455Val 돌연변이를 갖는 개인이 보통 오직 하나의 영향 받은 대립유전자를 가지므로, COL8A2의 돌연변이체 대립유전자에 표적화된 뉴클레아제(예를 들어, Cas RNP)에 의해 매개된 NHEJ로 인한 삽입-결실의 선택적 생성은, 다른 야생형 COL8A2 대립유전자를 보존하면서, 이 대립유전자의 손실을 오직 발생시키는 것으로 예상될 것이다. 대안적으로, 서열 번호 1070 내지 1075에 상보성인 가이드 서열을 포함하는 gRNA는 또한 돌연변이의 수정을 매개하도록 주형과 함께 또한 사용될 수 있다.
Figure pct00052
표 6은 c.1349T>G 뉴클레오타이드 변경에 의해 생긴 Leu450Trp를 발생시키는 점 돌연변이에 특이적인 표적 서열을 기재한다. 서열 번호 1076 내지 1084에 상보성인 가이드 서열을 포함하는 gRNA의 사용은, 효율적으로 야생형 대립유전자를 표적화하지 않거나 덜 표적화하면서, 돌연변이체 대립유전자를 표적화할 것이다. Leu450Trp 돌연변이를 갖는 개인이 보통 오직 하나의 영향 받은 대립유전자를 가지므로, COL8A2의 돌연변이체 대립유전자에 표적화된 Cas RNP에 의해 매개된 NHEJ로 인한 삽입-결실의 선택적 생성은, 다른 야생형 COL8A2 대립유전자를 보존하면서, 이 대립유전자의 손실을 오직 발생시키는 것으로 예상될 것이다. 대안적으로, 서열 번호 1076 내지 1084에 상보성인 가이드 서열을 포함하는 gRNA는 또한 돌연변이의 수정을 매개하도록 주형과 함께 또한 사용될 수 있다.
Figure pct00053
주형은 Gln455Lys, Gln455Val 또는 Leu450Trp 돌연변이 중 어느 하나를 갖는 콜라겐 VIII의 생성을 발생시키는 뉴클레오타이드 돌연변이를 수정하도록 Cas RNP와 함께 사용될 수 있다. 이러한 방식으로, Cas RNP는 돌연변이를 표적화하고, NHEJ를 개시시키고, 이후 외인성 주형에 기초하여 돌연변이의 수정을 매개할 수 있다. Gln455Lys 산물의 발현을 발생시키는 돌연변이를 수정하기 위한 Cas RNP의 표적화는 주형과 함께 서열 번호 1064 내지 1069의 표적 서열에 상보성인 가이드 서열을 포함하는 gRNA를 사용하여 수행될 수 있다. Gln455Val 산물의 발현을 발생시키는 돌연변이를 수정하기 위한 Cas RNP의 표적화는 주형과 함께 서열 번호 1070 내지 1075의 표적 서열에 상보성인 가이드 서열을 포함하는 gRNA를 사용하여 수행될 수 있다. Leu450Trp 유전자 산물의 발현을 발생시키는 돌연변이를 수정하기 위한 Cas RNP의 표적화는 주형과 함께 서열 번호 1076 내지 1084의 표적 서열에 상보성인 가이드 서열을 포함하는 gRNA를 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 방식으로, 돌연변이체 대립유전자의 선택적 편집은 Gln455Lys, Gln455Val 또는 Leu450Trp 중 어느 하나에 의해 생긴 결함성 콜라겐 VIII를 수정하기 위해 수행될 수 있다.
따라서, COL8A2의 표적 서열에 상보성인 가이드 서열을 포함하는 gRNA를 포함하는 Cas RNP의 사용은 FECD 또는 PPCD를 치료하기 위한 신규한 수단일 수 있다. 표적 서열은 야생형 COL8A2에 대한 것, 및 COL8A2의 돌연변이체 대립유전자를 발생시키고 Gln455Lys, Gln455Val 또는 Leu450Trp 돌연변이를 갖는 유전자 산물을 발생시킬 수 있는 돌연변이에 특이적인 표적 서열을 포함한다. 표 4, 표 5 및 표 6에 기재된 돌연변이 특이적 표적 서열은, 이의 기능을 제거하거나, 대안적으로 COL8A2에서의 원인이 되는 뉴클레오타이드 돌연변이를 수정하기 위해 주형과 함께 사용하도록 돌연변이체 대립유전자에서 추가의 돌연변이를 도입하기 위한 특이성으로, (예를 들어, Cas RNP에서) Cas와 사용하기 위한 가이드 RNA를 개발하기 위해 사용될 수 있다.
균등물
상기 작성된 명세서는 실시형태를 당해 분야의 당업자가 실행하기에 충분한 것으로 생각된다. 상기 설명 및 실시예는 소정의 실시형태를 기재하고, 본 발명자들에 의해 최고로 고려되는 최고의 방식을 기재한다. 그러나, 이상의 내용이 본문에서 아무리 상세히 보일 수 있더라도, 실시형태가 많은 방식으로 실행될 수 있고, 첨부된 청구항 및 임의의 이의 균등물과 함께 구성되어야 하는 것으로 이해될 것이다.
본 명세서에 사용된 바대로, 용어 약은, 명확히 기재되든 또는 아니든, 예를 들어 정수, 분수 및 백분율을 포함하는 숫자 값을 의미한다. 용어 약은 일반적으로 당해 분야의 당업자가 (예를 들어, 동일한 기능 또는 결과를 갖는) 인용된 값과 동일하다고 생각하는 숫자 값의 범위(예를 들어, 인용된 범위의 ± 5 내지 10%)를 의미한다. 적어도 및 약과 같은 용어가 숫자 값 또는 범위의 목록의 앞에 있을 때, 용어는 목록에 제공된 값 또는 범위의 모두를 변형시킨다. 몇몇 경우에, 용어 약은 가장 가까운 유효 숫자로 반올림되는 숫자 값을 포함할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> INTELLIA THERAPEUTICS, INC. <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATMENT OF DISEASES ASSOCIATED WITH TRINUCLEOTIDE REPEATS IN TRANSCRIPTION FACTOR FOUR <130> 01155-0007-00PCT <140> PCT/US2017/028981 <141> 2017-04-21 <150> US 62/326,700 <151> 2016-04-22 <160> 1278 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Target sequence (including PAM) <400> 1 ttggcaagtg gacattttac tgg 23 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Target sequence (including PAM) <400> 2 tgtccacttg ccaaagaagt tgg 23 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Target sequence (including PAM) <400> 3 ggaccaactt ctttggcaag tgg 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Target sequence (including PAM) <400> 4 gaaaaatgga ccaacttctt tgg 23 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Target sequence (including 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Target sequence (including PAM) <400> 46 aatcctatac gagatggaaa tgg 23 <210> 47 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Target sequence (including PAM) <400> 47 caggcaaatc ctatacgaga tgg 23 <210> 48 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Target sequence (including PAM) <400> 48 tatttgggtt cacatatgac agg 23 <210> 49 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Target sequence (including PAM) <400> 49 tggcactttt atttttattt ggg 23 <210> 50 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Target sequence (including PAM) <400> 50 gtggcacttt tatttttatt tgg 23 <210> 51 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Target sequence (including PAM) <400> 51 aaatgagaat ttagtgcagg tgg 23 <210> 52 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Target sequence (including PAM) <400> 52 acgaaatgag aatttagtgc agg 23 <210> 53 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Target sequence (including PAM) <400> 53 attctcattt cgtctctaac agg 23 <210> 54 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Target sequence (including PAM) <400> 54 aaataaatgc tggagagaga ggg 23 <210> 55 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Target sequence (including PAM) <400> 55 gaaataaatg ctggagagag agg 23 <210> 56 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Target sequence (including PAM) <400> 56 attagggtcg aaataaatgc tgg 23 <210> 57 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Target sequence (including PAM) <400> 57 gcatttattt cgaccctaat tgg 23 <210> 58 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Target sequence (including PAM) <400> 58 aagaagaggg aaaccaatta ggg 23 <210> 59 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Target sequence (including PAM) <400> 59 gaagaagagg gaaaccaatt agg 23 <210> 60 <211> 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(including PAM) <400> 73 ggctgcaaag ctgcctgcct agg 23 <210> 74 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Target sequence (including PAM) <400> 74 gctgcaaagc tgcctgccta ggg 23 <210> 75 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Target sequence (including PAM) <400> 75 caggaaacgt agccctaggc agg 23 <210> 76 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Target sequence (including PAM) <400> 76 ctgcctaggg ctacgtttcc tgg 23 <210> 77 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Target sequence (including PAM) <400> 77 ttgccaggaa acgtagccct agg 23 <210> 78 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Target sequence (including PAM) <400> 78 tggctttcgg aagttttgcc agg 23 <210> 79 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Target sequence (including PAM) <400> 79 tcttttggag aaatggcttt cgg 23 <210> 80 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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sequence (including PAM) <400> 127 taactaggag gtaagatgta agg 23 <210> 128 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Target sequence (including PAM) <400> 128 ggaggtaaga tgtaaggaac agg 23 <210> 129 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Target sequence (including PAM) <400> 129 taatgatgct ttggattggt agg 23 <210> 130 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Target sequence (including PAM) <400> 130 aagctaatga tgctttggat tgg 23 <210> 131 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Target sequence (including PAM) <400> 131 gttttaagct aatgatgctt tgg 23 <210> 132 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Target sequence (including PAM) <400> 132 taaaacttta aagagacaac tgg 23 <210> 133 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Target sequence (including PAM) <400> 133 aaaactttaa agagacaact ggg 23 <210> 134 <211> 23 <212> DNA <213> 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(including PAM) <400> 147 gtctattttt gctttccact ggg 23 <210> 148 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Target sequence (including PAM) <400> 148 tctatttttg ctttccactg ggg 23 <210> 149 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Target sequence (including PAM) <400> 149 ataatggaat ctcaccccag tgg 23 <210> 150 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Target sequence (including PAM) <400> 150 tggggtgaga ttccattatt tgg 23 <210> 151 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Target sequence (including PAM) <400> 151 ggggtgagat tccattattt ggg 23 <210> 152 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Target sequence (including PAM) <400> 152 gggtgagatt ccattatttg ggg 23 <210> 153 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Target sequence (including PAM) <400> 153 ccattatttg gggtaatcag tgg 23 <210> 154 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Target sequence (including PAM) <400> 154 ccactgatta ccccaaataa tgg 23 <210> 155 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Target sequence (including PAM) <400> 155 cattatttgg ggtaatcagt ggg 23 <210> 156 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Target sequence (including PAM) <400> 156 atttggggta atcagtgggt agg 23 <210> 157 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Target sequence (including PAM) <400> 157 tttggggtaa tcagtgggta ggg 23 <210> 158 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Target sequence (including PAM) <400> 158 atcagtgggt agggaattga agg 23 <210> 159 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Target sequence (including PAM) <400> 159 ttttttttga gttttattac tgg 23 <210> 160 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Target sequence (including PAM) <400> 160 tgtggtgtga tggaagattc agg 23 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PAM) <400> 167 actgtccttt agattcctac tgg 23 <210> 168 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Target sequence (including PAM) <400> 168 agaaaccagt aggaatctaa agg 23 <210> 169 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Target sequence (including PAM) <400> 169 cacttcagct agaaaccagt agg 23 <210> 170 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Target sequence (including PAM) <400> 170 tggtttctag ctgaagtgtt tgg 23 <210> 171 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Target sequence (including PAM) <400> 171 ggtttctagc tgaagtgttt ggg 23 <210> 172 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Target sequence (including PAM) <400> 172 agtgcggtaa gaaagaacgg tgg 23 <210> 173 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Target sequence (including PAM) <400> 173 ttcagtgcgg taagaaagaa cgg 23 <210> 174 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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1191 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1191 uuuuuaaugc cagaugaguu 20 <210> 1192 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1192 auucauucuc cugacauguc 20 <210> 1193 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1193 uucauucucc ugacaugucu 20 <210> 1194 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1194 cuccugacau gucugggacu 20 <210> 1195 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1195 aaccaagucc cagacauguc 20 <210> 1196 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1196 acaugucugg gacuugguuu 20 <210> 1197 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1197 cugggacuug guuuaggaaa 20 <210> 1198 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1198 gguuuaggaa aaggaagcaa 20 <210> 1199 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1199 guuuaggaaa aggaagcaaa 20 <210> 1200 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1200 aggaaaagga agcaaaggga 20 <210> 1201 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1201 aggaagcaaa gggauggaga 20 <210> 1202 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1202 uggaguuuua cggcuguacu 20 <210> 1203 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1203 gacacacuug uggaguuuua 20 <210> 1204 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1204 agcggaacuu gacacacuug 20 <210> 1205 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1205 gucguaggau cagcacaaag 20 <210> 1206 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1206 uugguaaauu ucguagucgu 20 <210> 1207 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1207 auuuaccaaa acaguccaaa 20 <210> 1208 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1208 uagaaccuuu uggacuguuu 20 <210> 1209 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1209 auacauucuu uagaaccuuu 20 <210> 1210 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1210 uaggauucuu aaaacuagua 20 <210> 1211 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1211 auacuaguuu uaagaauccu 20 <210> 1212 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1212 uccuaggaaa agauguaacu 20 <210> 1213 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1213 uccuaguuac aucuuuuccu 20 <210> 1214 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1214 uaggaaaaga uguaacuagg 20 <210> 1215 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1215 uaacuaggag guaagaugua 20 <210> 1216 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1216 ggagguaaga uguaaggaac 20 <210> 1217 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1217 uaaugaugcu uuggauuggu 20 <210> 1218 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1218 aagcuaauga ugcuuuggau 20 <210> 1219 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1219 guuuuaagcu aaugaugcuu 20 <210> 1220 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1220 uaaaacuuua aagagacaac 20 <210> 1221 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1221 aaaacuuuaa agagacaacu 20 <210> 1222 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1222 ggaaauggaa aauagaaaau 20 <210> 1223 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1223 uuauuuauug uuuuuggaaa 20 <210> 1224 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1224 uucguuuuau uuauuguuuu 20 <210> 1225 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1225 guagucucag uguucagaca 20 <210> 1226 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1226 uucagacaug gccaaguuuu 20 <210> 1227 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1227 ucagacaugg ccaaguuuua 20 <210> 1228 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1228 cagacauggc caaguuuuag 20 <210> 1229 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1229 acauggccaa guuuuagggg 20 <210> 1230 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1230 acuaaaccac cccuaaaacu 20 <210> 1231 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1231 uuuaggggug guuuaguuuu 20 <210> 1232 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1232 uuaggggugg uuuaguuuua 20 <210> 1233 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1233 uagggguggu uuaguuuuag 20 <210> 1234 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1234 ugucuauuuu ugcuuuccac 20 <210> 1235 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1235 gucuauuuuu gcuuuccacu 20 <210> 1236 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1236 ucuauuuuug cuuuccacug 20 <210> 1237 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1237 auaauggaau cucaccccag 20 <210> 1238 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1238 uggggugaga uuccauuauu 20 <210> 1239 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1239 ggggugagau uccauuauuu 20 <210> 1240 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1240 gggugagauu ccauuauuug 20 <210> 1241 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1241 ccauuauuug ggguaaucag 20 <210> 1242 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1242 ccacugauua ccccaaauaa 20 <210> 1243 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1243 cauuauuugg gguaaucagu 20 <210> 1244 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1244 auuuggggua aucagugggu 20 <210> 1245 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1245 uuugggguaa ucagugggua 20 <210> 1246 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1246 aucagugggu agggaauuga 20 <210> 1247 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1247 uuuuuuuuga guuuuauuac 20 <210> 1248 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1248 ugugguguga uggaagauuc 20 <210> 1249 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1249 acuauaauuu ugugguguga 20 <210> 1250 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1250 aguuuuuaac uauaauuuug 20 <210> 1251 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1251 aaagaccuuc auauuuacca 20 <210> 1252 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1252 ugaauccuug guaaauauga 20 <210> 1253 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1253 uuuuuaauug gcugaauccu 20 <210> 1254 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1254 ggacaguaau aauuuuuaau 20 <210> 1255 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1255 acuguccuuu agauuccuac 20 <210> 1256 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1256 agaaaccagu aggaaucuaa 20 <210> 1257 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1257 cacuucagcu agaaaccagu 20 <210> 1258 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1258 ugguuucuag cugaaguguu 20 <210> 1259 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1259 gguuucuagc ugaaguguuu 20 <210> 1260 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1260 agugcgguaa gaaagaacgg 20 <210> 1261 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1261 uucagugcgg uaagaaagaa 20 <210> 1262 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1262 ugauuuacug gauuucagug 20 <210> 1263 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1263 caaagagcug agugauuuac 20 <210> 1264 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1264 cagcucuuug uccgucccua 20 <210> 1265 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1265 gcgaauggcu gccuuaggga 20 <210> 1266 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1266 aacagcgaau ggcugccuua 20 <210> 1267 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1267 caacagcgaa uggcugccuu 20 <210> 1268 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1268 cuaaggcagc cauucgcugu 20 <210> 1269 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1269 aaugcaucac caacagcgaa 20 <210> 1270 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1270 aucacacaaa ccuagaaaca 20 <210> 1271 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1271 gcgguuauuu ccauguuucu 20 <210> 1272 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1272 gggacuggau uuucugauug 20 <210> 1273 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1273 gaaaauccag ucccaauccu 20 <210> 1274 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1274 uuuucuccaa ggauugggac 20 <210> 1275 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1275 uuguguuuuc uccaaggauu 20 <210> 1276 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1276 auuguguuuu cuccaaggau 20 <210> 1277 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1277 auccuuggag aaaacacaau 20 <210> 1278 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: Guide Sequence <400> 1278 auccgauugu guuuucucca 20

Claims (79)

  1. 서열 번호 1 내지 1084로부터 선택된 표적 서열에 뉴클레아제를 지향시키는 가이드 서열을 포함하는 적어도 하나의 가이드 RNA를 포함하는 조성물.
  2. 서열 번호 1089 내지 1278로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91% 또는 90% 동일한 가이드 서열을 포함하는 적어도 하나의 가이드 RNA를 포함하는 조성물.
  3. 서열 번호 1089 내지 1278로부터 선택된 서열과 동일한 가이드 서열을 포함하는 적어도 하나의 가이드 RNA를 포함하는 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 전사 인자 4(TCF4) 유전자에서 트라이-뉴클레오타이드 반복부(tri-nucleotide repeat: TNR)에서 또는 근처에서 서열을 표적화하고, 서열 번호 1 내지 190으로부터 선택된 표적 서열에 뉴클레아제를 지향시키는, 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 서열 번호 1089 내지 1278로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91% 또는 90% 동일한 가이드 서열을 포함하는 적어도 하나의 가이드 RNA를 포함하는, 조성물.
  6. 하기 a. 내지 p.의 가이드 RNA 쌍 짓기로부터 선택된 2개의 가이드 RNA를 포함하는 조성물:
    a. 서열 번호 83에 뉴클레아제를 지향시키는 제1 가이드 RNA 및 서열 번호 109에 뉴클레아제를 지향시키는 제2 가이드 RNA;
    b. 서열 번호 85에 뉴클레아제를 지향시키는 제1 가이드 RNA 및 서열 번호 109에 뉴클레아제를 지향시키는 제2 가이드 RNA;
    c. 서열 번호 86에 뉴클레아제를 지향시키는 제1 가이드 RNA 및 서열 번호 112에 뉴클레아제를 지향시키는 제2 가이드 RNA;
    d. 서열 번호 85에 뉴클레아제를 지향시키는 제1 가이드 RNA 및 서열 번호 112에 뉴클레아제를 지향시키는 제2 가이드 RNA;
    e. 서열 번호 86에 뉴클레아제를 지향시키는 제1 가이드 RNA 및 서열 번호 109에 뉴클레아제를 지향시키는 제2 가이드 RNA;
    f. 서열 번호 85에 뉴클레아제를 지향시키는 제1 가이드 RNA 및 서열 번호 107에 뉴클레아제를 지향시키는 제2 가이드 RNA;
    g. 서열 번호 83에 뉴클레아제를 지향시키는 제1 가이드 RNA 및 서열 번호 125에 뉴클레아제를 지향시키는 제2 가이드 RNA;
    h. 서열 번호 86에 뉴클레아제를 지향시키는 제1 가이드 RNA 및 서열 번호 125에 뉴클레아제를 지향시키는 제2 가이드 RNA;
    i. 서열 번호 86에 뉴클레아제를 지향시키는 제1 가이드 RNA 및 서열 번호 107에 뉴클레아제를 지향시키는 제2 가이드 RNA;
    j. 서열 번호 64에 뉴클레아제를 지향시키는 제1 가이드 RNA 및 서열 번호 106에 뉴클레아제를 지향시키는 제2 가이드 RNA;
    k. 서열 번호 85에 뉴클레아제를 지향시키는 제1 가이드 RNA 및 서열 번호 114에 뉴클레아제를 지향시키는 제2 가이드 RNA;
    l. 서열 번호 86에 뉴클레아제를 지향시키는 제1 가이드 RNA 및 서열 번호 114에 뉴클레아제를 지향시키는 제2 가이드 RNA;
    m. 서열 번호 83에 뉴클레아제를 지향시키는 제1 가이드 RNA 및 서열 번호 114에 뉴클레아제를 지향시키는 제2 가이드 RNA;
    n. 서열 번호 53에 뉴클레아제를 지향시키는 제1 가이드 RNA 및 서열 번호 114에 뉴클레아제를 지향시키는 제2 가이드 RNA;
    o. 서열 번호 83에 뉴클레아제를 지향시키는 제1 가이드 RNA 및 서열 번호 112에 뉴클레아제를 지향시키는 제2 가이드 RNA; 및
    p. 서열 번호 74에 뉴클레아제를 지향시키는 제1 가이드 RNA 및 서열 번호 114에 뉴클레아제를 지향시키는 제2 가이드 RNA.
  7. 제6항에 있어서, 서열 번호 83에 뉴클레아제를 지향시키는 제1 가이드 RNA는 서열 번호 1177을 포함하고, 서열 번호 109에 뉴클레아제를 지향시키는 제2 가이드 RNA는 서열 번호 1197을 포함하는, 조성물.
  8. 제6항에 있어서, 서열 번호 85에 뉴클레아제를 지향시키는 제1 가이드 RNA는 서열 번호 1173을 포함하고, 서열 번호 109에 뉴클레아제를 지향시키는 제2 가이드 RNA는 서열 번호 1197을 포함하는, 조성물.
  9. 제6항에 있어서, 서열 번호 86에 뉴클레아제를 지향시키는 제1 가이드 RNA는 서열 번호 1174를 포함하고, 서열 번호 112에 뉴클레아제를 지향시키는 제2 가이드 RNA는 서열 번호 1200을 포함하는, 조성물.
  10. 제6항에 있어서, 서열 번호 85에 뉴클레아제를 지향시키는 제1 가이드 RNA는 서열 번호 1173을 포함하고, 서열 번호 112에 뉴클레아제를 지향시키는 제2 가이드 RNA는 서열 번호 1200을 포함하는, 조성물.
  11. 제6항에 있어서, 서열 번호 86에 뉴클레아제를 지향시키는 제1 가이드 RNA는 서열 번호 1174를 포함하고, 서열 번호 109에 뉴클레아제를 지향시키는 제2 가이드 RNA는 서열 번호 1197을 포함하는, 조성물.
  12. 제6항에 있어서, 서열 번호 85에 뉴클레아제를 지향시키는 제1 가이드 RNA는 서열 번호 1173을 포함하고, 서열 번호 107에 뉴클레아제를 지향시키는 제2 가이드 RNA는 서열 번호 1195를 포함하는, 조성물.
  13. 제6항에 있어서, 서열 번호 83에 뉴클레아제를 지향시키는 제1 가이드 RNA는 서열 번호 1171을 포함하고, 서열 번호 125에 뉴클레아제를 지향시키는 제2 가이드 RNA는 서열 번호 1213을 포함하는, 조성물.
  14. 제6항에 있어서, 서열 번호 86에 뉴클레아제를 지향시키는 제1 가이드 RNA는 서열 번호 1174를 포함하고, 서열 번호 125에 뉴클레아제를 지향시키는 제2 가이드 RNA는 서열 번호 1213을 포함하는, 조성물.
  15. 제6항에 있어서, 서열 번호 86에 뉴클레아제를 지향시키는 제1 가이드 RNA는 서열 번호 1174를 포함하고, 서열 번호 107에 뉴클레아제를 지향시키는 제2 가이드 RNA는 서열 번호 1195를 포함하는, 조성물.
  16. 제6항에 있어서, 서열 번호 64에 뉴클레아제를 지향시키는 제1 가이드 RNA는 서열 번호 1152를 포함하고, 서열 번호 106에 뉴클레아제를 지향시키는 제2 가이드 RNA는 서열 번호 1194를 포함하는, 조성물.
  17. 제6항에 있어서, 서열 번호 85에 뉴클레아제를 지향시키는 제1 가이드 RNA는 서열 번호 1173을 포함하고, 서열 번호 114에 뉴클레아제를 지향시키는 제2 가이드 RNA는 서열 번호 1202를 포함하는, 조성물.
  18. 제6항에 있어서, 서열 번호 86에 뉴클레아제를 지향시키는 제1 가이드 RNA는 서열 번호 1174를 포함하고, 서열 번호 114에 뉴클레아제를 지향시키는 제2 가이드 RNA는 서열 번호 1202를 포함하는, 조성물.
  19. 제6항에 있어서, 서열 번호 83에 뉴클레아제를 지향시키는 제1 가이드 RNA는 서열 번호 1171을 포함하고, 서열 번호 114에 뉴클레아제를 지향시키는 제2 가이드 RNA는 서열 번호 1202를 포함하는, 조성물.
  20. 제6항에 있어서, 서열 번호 53에 뉴클레아제를 지향시키는 제1 가이드 RNA는 서열 번호 1141을 포함하고, 서열 번호 114에 뉴클레아제를 지향시키는 제2 가이드 RNA는 서열 번호 1202를 포함하는, 조성물.
  21. 제6항에 있어서, 서열 번호 83에 뉴클레아제를 지향시키는 제1 가이드 RNA는 서열 번호 1171을 포함하고, 서열 번호 112에 뉴클레아제를 지향시키는 제2 가이드 RNA는 서열 번호 1200을 포함하는, 조성물.
  22. 제6항에 있어서, 서열 번호 74에 뉴클레아제를 지향시키는 제1 가이드 RNA는 서열 번호 1162를 포함하고, 서열 번호 114에 뉴클레아제를 지향시키는 제2 가이드 RNA는 서열 번호 1202를 포함하는, 조성물.
  23. 제1항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 콜라겐 VIII형 유전자의 알파 2 아단위(Col8A2)를 표적화하고, 서열 번호 191 내지 1063으로부터 선택된 표적 서열에 뉴클레아제를 지향시키는, 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 서열 번호 191 내지 1063으로부터 선택된 표적 서열의 처음의 20개의 뉴클레오타이드에 상보성이거나 이와 동일한 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91% 또는 90% 동일한 가이드 서열을 포함하는 적어도 하나의 가이드 RNA를 포함하고, 서열 번호 191 내지 1063의 처음의 20개의 뉴클레오타이드에서의 타이민은 유라실에 의해 대체된, 조성물.
  25. 제1항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 Col8A2 유전자 산물에서 Gln455Lys 돌연변이를 표적화하고, 서열 번호 1064 내지 1069로부터 선택된 표적 서열에 뉴클레아제를 지향시키는, 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 서열 번호 1064 내지 1069로부터 선택된 표적 서열의 처음의 20개의 뉴클레오타이드에 상보성이거나 이와 동일한 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91% 또는 90% 동일한 가이드 서열을 포함하는 적어도 하나의 가이드 RNA를 포함하고, 서열 번호 1064 내지 1069의 처음의 20개의 뉴클레오타이드에서의 타이민은 유라실에 의해 대체된, 조성물.
  27. 제1항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 Col8A2 유전자 산물에서 Gln455Val 돌연변이를 표적화하고, 서열 번호 1070 내지 1075로부터 선택된 표적 서열에 뉴클레아제를 지향시키는, 조성물.
  28. 제27항에 있어서, 서열 번호 1070 내지 1075로부터 선택된 표적 서열의 처음의 20개의 뉴클레오타이드에 상보성이거나 이와 동일한 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91% 또는 90% 동일한 가이드 서열을 포함하는 적어도 하나의 가이드 RNA를 포함하고, 서열 번호 1070 내지 1075의 처음의 20개의 뉴클레오타이드에서의 타이민은 유라실에 의해 대체된, 조성물.
  29. 제1항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 Col8A2 유전자 산물에서 Leu450Trp 돌연변이를 표적화하고, 서열 번호 1076 내지 1084로부터 선택된 표적 서열에 뉴클레아제를 지향시키는, 조성물.
  30. 제29항에 있어서, 서열 번호 1076 내지 1084로부터 선택된 표적 서열의 처음의 20개의 뉴클레오타이드에 상보성이거나 이와 동일한 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91% 또는 90% 동일한 가이드 서열을 포함하는 적어도 하나의 가이드 RNA를 포함하고, 서열 번호 1076 내지 1084의 처음의 20개의 뉴클레오타이드에서의 타이민은 유라실에 의해 대체된, 조성물.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 이중 가이드인, 조성물.
  32. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 단일 가이드인, 조성물.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 가이드 RNA는 crRNA, trRNA, 또는 crRNA 및 trRNA를 포함하는, 조성물.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 가이드 서열은 벡터에서 코딩된, 조성물.
  35. 제34항에 있어서, 상기 벡터는 제1 가이드 서열 및 제2 가이드 서열을 포함하는, 조성물.
  36. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 가이드 서열 및 제2 가이드 서열은 상이한 벡터에서 코딩된, 조성물.
  37. 제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 제1 가이드 서열 및 상기 제2 가이드 서열은 동일한 촉진자 및/또는 조절 서열에 의해 제어되는, 조성물.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 서열은 표적 유전자의 양성 가닥에서 표적 서열에 상보성인, 조성물.
  39. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 서열은 표적 유전자의 음성 가닥에서 표적 서열에 상보성인, 조성물.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 가이드 서열 및 제2 가이드 서열은 표적 유전자의 반대의 가닥에서 제1 표적 서열 및 제2 표적 서열에 상보성인, 조성물.
  41. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 화학적으로 변형된, 조성물.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레아제를 추가로 포함하는, 조성물.
  43. 제42항에 있어서, 상기 뉴클레아제는 Cas 단백질인, 조성물.
  44. 제43항에 있어서, 상기 Cas 단백질은 타입-I, 타입-II, 또는 타입-III CRISPR/Cas 시스템 유래인, 조성물.
  45. 제43항에 있어서, 상기 Cas 단백질은 Cas9인, 조성물.
  46. 제43항에 있어서, 상기 Cas 단백질은 Cpf1인, 조성물.
  47. 제42항에 있어서, 상기 뉴클레아제는 니카제(nickase)인, 조성물.
  48. 제42항에 있어서, 상기 뉴클레아제는 변형된, 조성물.
  49. 제48항에 있어서, 상기 변형된 뉴클레아제는 핵 국재화 신호(nuclear localization signal: NLS)를 포함하는, 조성물.
  50. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 따른 조성물 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 제제.
  51. 인간 대상체에서 전사 인자 4(TCF4) 유전자에서 적어도 트라이뉴클레오타이드 반복부(TNR)의 일부를 절제하는 방법으로서, 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항의 조성물, 또는 제50항의 약제학적 제제를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  52. 제51항에 있어서, 2개의 가이드 RNA가 사용되고, 상기 제1 가이드 RNA는 TNR의 5'의 서열에 뉴클레아제를 지향시키고, 상기 제2 가이드 RNA는 TNR의 3'의 서열에 뉴클레아제를 지향시키는, 방법.
  53. 제51항에 있어서, 상기 인간 대상체는 푹스 내피 각막 이상증(Fuchs endothelial corneal dystrophy: FECD)을 갖는, 방법.
  54. 제53항에 있어서, 상기 대상체는 FECD의 가족 병력을 갖는, 방법.
  55. 제51항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 투여의 결과로서 시력 감소의 개선, 안정화 또는 느려짐을 갖는, 방법.
  56. 제51항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 투여의 결과로서 각막 두께측정에 의해 측정된 바와 같은 변화의 개선, 안정화 또는 느려짐을 갖는, 방법.
  57. 제51항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 투여의 결과로서 반사 현미경검사에 기초한 변화의 개선, 안정화 또는 느려짐을 갖는, 방법.
  58. 제51항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 투여의 결과로서 각막 이식이 필요할 때까지 시간의 지연을 갖는, 방법.
  59. 제51항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TNR은 약 40개 이상의 트라이뉴클레오타이드 반복부인, 방법.
  60. 제51항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전체 TNR은 절제된, 방법.
  61. 제51항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물 또는 약제학적 제제는 바이러스 벡터를 통해 투여되는, 방법.
  62. 제51항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물 또는 약제학적 제제는 지질 나노입자를 통해 투여되는, 방법.
  63. 제51항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 점안액 또는 안연고의 동시투여를 추가로 포함하는, 방법.
  64. 제51항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 소프트 콘택트 렌즈의 사용을 추가로 포함하는, 방법.
  65. 제51항에 있어서, 상기 인간 대상체는 조현병을 갖는, 방법.
  66. 제51항에 있어서, 상기 인간 대상체는 원발성 경화성 담관염(primary sclerosing cholangitis: PSC)을 갖는, 방법.
  67. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 조성물, 또는 제51항의 약제학적 제제를 투여하는 단계를 포함하는, 인간 대상체에서 COL8A2 유전자의 돌연변이체 대립유전자, 예컨대 Gln455Lys, Gln455Val 또는 Leu450Trp의 발현을 감소시키거나, 상기 돌연변이체 대립유전자를 수정하도록 뉴클레오타이드 서열을 변경하는 방법.
  68. 제67항에 있어서, 상기 인간 대상체는 푹스 내피 각막 이상증(FECD) 또는 후부 다형 각막 이상증(posterior polymorphous corneal dystrophy: PPCD)을 갖는, 방법.
  69. 제68항에 있어서, 상기 대상체는 FECD의 가족 병력을 갖는, 방법.
  70. 제67항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 투여의 결과로서 시력 감소의 개선, 안정화 또는 느려짐을 갖는, 방법.
  71. 제67항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 투여의 결과로서 각막 두께측정에 의해 측정된 바와 같은 변화의 개선, 안정화 또는 느려짐을 갖는, 방법.
  72. 제67항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 투여의 결과로서 반사 현미경검사에 기초한 변화의 개선, 안정화 또는 느려짐을 갖는, 방법.
  73. 제67항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 투여의 결과로서 각막 이식이 필요할 때까지 시간의 지연을 갖는, 방법.
  74. 제67항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, Gln455Lys, Gln455Val 또는 Leu450Trp 유전자 산물의 발현을 발생시키는 돌연변이는 각각 c.1364C>A, c.1363-1364CA>GT 또는 c.1349T>G인, 방법.
  75. 제67항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물 또는 약제학적 제제는 바이러스 벡터를 통해 투여되는, 방법.
  76. 제67항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물 또는 약제학적 제제는 지질 나노입자를 통해 투여되는, 방법.
  77. 제67항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 점안액 또는 안연고의 동시투여를 추가로 포함하는, 방법.
  78. 제67항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 소프트 콘택트 렌즈의 사용을 추가로 포함하는, 방법.
  79. TCF4 유전자에서의 TNR 연장을 갖거나, Gln455Lys, Gln455Val 또는 Leu450Trp 돌연변이를 갖는 유전자 산물을 발생시키는 COL8A2 유전자에서의 돌연변이를 갖는 인간 대상체를 치료하기 위한 약제의 제조에서의, 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 조성물, 또는 제51항의 약제학적 제제의 용도.
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