CN111944814B - 寡核苷酸、病毒载体及其应用和RNAi药物制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医学领域，特别涉及寡核苷酸、病毒载体及其应用和RNAi药物制剂。该寡核苷酸为SEQ ID NO：4至SEQ ID NO：40中的一个序列；或者与SEQ ID NO：4至SEQ ID NO：40中的一个序列的一致性不低于80％的核酸序列。本发明提供的寡核苷酸、病毒载体和RNAi药物制剂能有效的治疗和预防COL8A2突变引起的角膜营养不良。

Description

寡核苷酸、病毒载体及其应用和RNAi药物制剂
技术领域
本发明涉及医学领域，特别涉及寡核苷酸、病毒载体及其应用和RNAi药物制剂。
背景技术
角膜营养不良（Corneal dystrophy，简称CD）是一组遗传的，通常进展性的眼科疾病原发于角膜，开始只侵犯角膜的某一层；晚期可波及邻近层次，甚至影响全层角膜；药物治疗无效。影响视力者可进行角膜移植手术治疗。依据解剖学位置分为前部、基质、后部三类。通常后部病症较重，患者比例最多（内皮角膜营养不良）。绝大多数CD都具有各种形状的角膜混浊。CD已有多年研究，但是发生机制仍然不清楚。TGFBI是已报道的较为常见的突变基因，但是TGFBI突变造成的前部CD，多数患者症状不太严重，治疗需求不高，相对而言内皮细胞CD病变程度较为严重。
Fuchs角膜内皮营养不良（福克斯角膜营养不良，Fuchs endothelial cornealdystrophy, FECD）是一种常见的与角膜滴状物的存在有关的遗传性角膜内皮变性疾病，角膜滴状物是角膜内皮层下方的微观胶原积聚。FECD是CD中最为常见的类型，疾病标志包括角膜内皮细胞的丢失，形成Descemet’s 膜的赘生物，晚期阶段涉及到角膜的所有细胞层。40岁以后，高达5%的美国成年人表现出角膜滴状物。滴状物的存在是FECD的指征，但通常表现为完全无症状的轻微疾病。晚期（严重）疾病发展于小部分患有滴状物的患者。晚期FECD的特征在于大量的滴状物、内皮细胞损失、角膜水肿、角膜混浊以及由于角膜水肿和混浊导致的视力丧失。角膜水肿、混浊和随后的视力丧失是内皮细胞变性和损失去肿胀的直接后果。最佳治疗方案是角膜移植，但是复发率较高。由于FECD引起的视力丧失是需要全厚度角膜移植（穿透性角膜移植术）的最常见指征，仅在美国每年占超过14,000次手术。对于FECD没有其它治疗可用。尽管角膜移植是一种在很大程度上很成功的治疗，但它也有缺点，它具有侵入性，并且与大约30%的排斥率相关，这与其它实体器官同种异体移植没有什么不同。也可以进行一种仅替换角膜内皮的替代方法（内皮角膜移植术），但只能由经验丰富的外科医生进行。两种干预均受限于供体材料（源自供体角膜的可移植角膜片或角膜衍生内皮细胞）的缺乏。FECD对于其他手术比如白内障手术也是一种风险，并且对于屈光手术比如激光辅助原位角膜磨镶术（LAISK）是禁忌，因为这些技术导致额外的角膜内皮细胞损失。
FECD分为早发型FECD和年龄相关型FECD，这可能是不同的疾病，因为在早发型FECD中通常不存在滴状物。早发型FECD很少见，并且与Col82A2等基因有关，该基因编码作为内皮基底膜组分的胶原蛋白VIII的α2-亚基。COL8A2是内皮下的大分子成分，角膜内皮细胞的Descemet膜（基底膜）的主要成分，也是血管内皮的组成部分。血管平滑肌细胞迁移和增殖所必需，因此，在维持血管壁完整性和结构，特别是在动脉粥样硬化中具有潜在作用。COL8A2 450号氨基酸和455号氨基酸突变会导致患者发病，并且在动物模型中表现出和FECD患者类似的病理变化。
RNA干扰(RNAi) 是近年来新发现的一种重要的基因表达调控方式，它是由内源产生或人为转染进入细胞的小干扰RNA诱导产生的一种转录后基因沉默现象。RNA干扰作用机制可分为2个部分：1）扩增与起始阶段，具有特异序列的dsRNA进入细胞后一方面在RNA依赖的聚合酶( RNA dependent RNA polymerase, RdRp) 作用下呈指数级扩增，得到大量针对靶序列的RNA。一方面在Dicer酶的作用下，形成21～23 nt的小干扰RNA( smallinterference RNAs , siRNA)，此siRNA含有2～3 nt 的3′突出端。2）效应阶段，siRNA 结合到核糖核苷酸酶复合物上形成RNA诱导的基因沉默复合体( RNA induced silencingcomplex , RISC)，该复合体依赖ATP释能而解聚siRNA双链成单链以激活RISC，RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位切割mRNA，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端，被切割后的断裂mRNA随即降解。
RNAi具有以下优点：1）高特异性，siRNA与目的基因结合严格遵守碱基配对原则，具有严格的序列特异性。2）高效性，微量的siRNA即可使其编码致病基因产物下降90% 以上，达到敲除效果。3）高稳定性，siRNA 3′端突出的2个碱基使其不易被细胞内核酸酶降解。正是由于其特有的优越性，RNAi技术被迅速地应用于基础科研和临床应用。目前已有RNAi药物获批上市，还有部分RNAi药物处于临床试验阶段。但还未见针对COL8A2突变引起角膜营养不良的RNAi药物。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了寡核苷酸、病毒载体及其应用和RNAi药物制剂。该寡核苷酸、病毒载体和RNAi药物制剂能有效的治疗和预防COL8A2突变引起的角膜营养不良。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种寡核苷酸，该寡核苷酸选自如下核酸序列中的一种：
（a）核酸序列为SEQ ID NO：4至SEQ ID NO：40中的一个序列；
（b）与SEQ ID NO：4至SEQ ID NO：40中的一个序列的一致性不低于80%的核酸序列。
作为优选，（b）中核酸序列与SEQ ID NO：4至SEQ ID NO：40中的一个序列的一致性不低于85%。
优选地，（b）中核酸序列与SEQ ID NO：4至SEQ ID NO：40中的一个序列的一致性不低于90%。
更优选地，（b）中核酸序列与SEQ ID NO：4至SEQ ID NO：40中的一个序列的一致性不低于95%。
作为优选，寡核苷酸为化学修饰的寡核苷酸。
本发明还提供了一种病毒载体，病毒载体包含上述寡核苷酸。
作为优选，病毒载体为腺相关病毒、慢病毒、逆转录病毒或腺病毒中的一种。
作为优选，病毒载体含有U6、H1或tRNA启动子中的一种。
作为优选，腺相关病毒的血清型选自AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh10野生型或7M8、TYF突变型中的一种或多种。
本发明还提供了上述寡核苷酸或病毒载体在制备预防或治疗眼部疾病药物中的应用。
作为优选，眼部疾病为COL8A2突变引起的福克斯角膜营养不良（Fuchsendothelial corneal dystrophy, FECD）或后部多形性角膜营养不良（posteriorpolymorphous Corneal dystrophy, PPCD）。
在本发明提供的具体实施例中，眼部疾病为COL8A2基因Q455K突变所致疾病。
本发明还提供了一种RNAi药物制剂，药物制剂包含上述寡核苷酸或病毒载体，以及药学上可接受的载体和赋形剂。
作为优选，RNAi药物制剂的赋形剂为纳米载体或脂质体。
作为优选，RNAi药物制剂为液体制剂。
作为优选，RNAi药物制剂的给药方式为前房注射、玻璃体腔注射、结膜下注射或眼表滴药。
本发明提供了寡核苷酸、病毒载体及其应用和RNAi药物制剂。该寡核苷酸为SEQID NO：4至SEQ ID NO：40中的一个序列；或者与SEQ ID NO：4至SEQ ID NO：40中的一个序列的一致性不低于80%的核酸序列。本发明的技术效果如下：
本申请首先使用含有COL8A2野生型和突变型靶序列的荧光素酶报告质粒和候选的RNAi序列质粒进行共转，筛选高效的、突变序列特异性的RNAi靶序列，然后对野生型293细胞和COL8A2突变的293细胞进行AAV-RNAi药物处理，检测COL8A2的mRNA和蛋白水平的变化，发现RNAi药物可以显著降低突变的COL8A2的表达，但是对野生型COL8A2的表达没有影响。此外，对突变的COL8A2小鼠使用AAV-RNAi药物处理，发现此药物既可以治疗已经发生的角膜营养不良，也可以预防角膜营养不良的发生。总而言之，体外体内实验首次发现了本申请的RNAi药物制剂能有效的治疗和预防COL8A2突变引起的角膜营养不良，预示RNAi药物可以做为临床治疗或预防COL8A2突变引起的角膜营养不良而进一步研究开发。
附图说明
图1为COL8A2 Mut-1（A）和COL8A2 Mut-2(B) 特异性shRNA设计示意图；
图2为AAV-shRNA载体图谱：
A：载体包含AAV2 3’ITR，U6 启动子，不靶向COL8A2序列的shNC和AAV2 5’ITR；
B：载体包含AAV2 3’ITR，U6 启动子，靶向COL8A2 Mut-1序列的shRNA和AAV2 5’ITR；
C：载体包含AAV2 3’ITR，U6 启动子，靶向COL8A2 Mut-2序列的shRNA和AAV2 5’ITR；
图3示有效的RNAi序列筛选：将含有COL8A2野生型（WT）或突变(Mut)靶序列的荧光素酶报告基因和候选shRNA质粒共转293细胞，48小时后检测荧光素酶活性，筛选对靶序列有干扰效果的shRNA；
A：1号位点特异性shRNA对1号突变位点靶序列干扰效果的筛选；
B：1号位点特异性shRNA对1号突变位点和1号野生型位点差异性筛选；
C：2号位点特异性shRNA对2号突变位点靶序列干扰效果的筛选；
D：2号位点特异性shRNA对2号突变位点和2号野生型位点差异性筛选；
图4示RNAi药物转染，感染后对野生型和突变型COL8A2 mRNA表达水平的影响：
A：在野生型293细胞和COL8A2基因1号位点突变的293细胞中转染化学合成的si-RNAi对照或药物，24小时后检测COL8A2 mRNA表达水平；
B：在野生型293细胞和COL8A2基因2号位点突变的293细胞中转染化学合成的si-RNAi对照或药物，24小时后检测COL8A2 mRNA表达水平；
C：在野生型293细胞和COL8A2基因1号位点突变的293细胞中感染AAV-RNAi对照或药物，24小时后检测COL8A2 mRNA表达水平；
D：在野生型293细胞和COL8A2基因2号位点突变的293细胞中感染AAV-RNAi对照或药物，24小时后检测COL8A2 mRNA表达水平；
图5示RNAi药物对野生型和突变型COL8A2 蛋白表达水平的影响：
A：在野生型293细胞和COL8A2基因1号位点突变的293细胞中感染AAV-RNAi对照或药物，48小时后检测COL8A2 蛋白表达水平；
B：在野生型293细胞和COL8A2基因2号位点突变的293细胞中感染AAV-RNAi对照或药物，48小时后检测COL8A2 蛋白表达水平；
图6示AAV-RNAi药物对COL8A2突变导致的角膜营养不良的治疗作用：在6月龄的COL8A2基因1号位点突变(A)、2号位点突变（B）或者野生型小鼠中前房注射AAV-RNAi药物，6个月后检测小鼠的角膜内皮细胞数量；
图7示AAV-RNAi药物对COL8A2突变导致的角膜营养不良的预防作用：在1月龄的COL8A2基因1号位点突变(A)、2号位点突变（B）或者野生型小鼠中前房注射AAV-RNAi药物，11个月后检测小鼠的角膜内皮细胞数量。
具体实施方式
本发明公开了寡核苷酸、病毒载体及其应用和RNAi药物制剂，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
术语解释：
角膜内皮简介：角膜内皮是角膜内表面上的非再生性细胞单层，将角膜基质与前房液分开。角膜内皮通过如下持续的过程来负责保持角膜透明，该持续的过程防止角膜因阳离子和水分子流入胶原性角膜基质而过量水合，通常称为“去肿胀（deturgescence）”。
本发明使用化学合成的siRNA和AAV表达的shRNA进行了治疗，预防COL8A2突变的引起的角膜营养不良有效性的验证。依据RNAi技术的原理，本领域技术人员可以合理推断，依据不同病毒载体的特点，本领域技术人员可以合理推断，不同类型的病毒载体表达的shRNA有相似的治疗效果。
本发明提供了一种用于预防和/或治疗遗传疾病的药物，该药物可以是病毒载体如AAV、lentivirus等，或者是非病毒载体如小干扰RNA(siRNA)、反义寡核苷酸(ΑOΝ)等，优选地在患有遗传疾病、或具有患遗传疾病的风险的人受试者中，其中寡核苷酸与靶RNA分子至少部分互补。通过使用本发明的AAV、lentivirus、siRNA、ΑOΝ治疗和/或预防的优选的遗传疾病是人的角膜营养不良、更优选由COL8A2基因突变引起的称为Fuchs角膜内皮营养不良(FECD)的疾病。本发明用体外以及小鼠体内实验证明RNAi药物具有治疗和预防COL8A2突变引起角膜营养不良的作用，并探讨了RNAi药物发挥作用的机制是通过特异性抑制或降解突变的COL8A2的mRNA。
与FECD发展相关的COL8A2基因L450W、Q455K突变的存在是本领域公知的，但是目前没有任何公开的防止或治疗FECD发展或缓解其症状的方法。依据COL8A2突变导致FECD患者发病的致病机理，使用RNAi的方法抑制或降解COL8A2的mRNA，从而降低COL8A2的蛋白产生，减少COL8A2蛋白的累积，从而预防或者缓解FECD患者的病情。本发明使用AAV、lentivirus、siRNA或ΑOΝ将COL8A2的干扰RNA或者反义核苷酸表达于患者眼部前房或者角膜中。本领域的技术人员应该理解，如果AAV、lentivirus、siRNA或ΑOΝ中的一种方法有效，其他的方法也具有相似的效果。
本发明提供的寡核苷酸、病毒载体及其应用和RNAi药物制剂中所用试剂或仪器均可由市场购得。
RNAi药物可以结合到突变的COL8A2 mRNA，从而抑制或降解RNA，降低突变COL8A2蛋白的表达，下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例一荧光素酶报告系统筛选高效的RNAi药物
一、哺乳动物细胞(贴壁)的培养
1、细胞复苏
1) 预先准备好37℃-38℃温水，从液氮罐中取出需要复苏的细胞，用眼科手术镊子固定，迅速置于水中，保证冻存管完全浸没于水中，使其均匀受热，直到冻存管内的细胞完全融化；
2) 用酒精消毒冻存管；
3) 用吸管预先吸取5mL细胞培养基于T25细胞培养瓶中，再用新的吸管将融化的细胞转移到细胞瓶中并轻轻吹打一遍；
4) 盖好细胞瓶盖，将细胞瓶放置于细胞培养箱中，37℃、5%CO2静置培养；
5) 约6-8小时后(取决于不同的细胞)，更换新鲜培养基以消除细胞冻存液中存留的DMSO对细胞生长的影响。
2、细胞的传代和冻存
1) 当细胞长满T25细胞瓶后，用吸管吸取培养基并弃去；
2) 加入10 mL的PBS，轻柔洗涤细胞后用吸管吸取并弃去；
3) 用吸管吸取1-1.5 mL胰酶，使其覆盖住细胞瓶底部，将细胞瓶放入37℃、5%CO2细胞培养箱静止3-5 min (消化时间的长短取决于细胞种类)；
4) 显微镜观察，贴壁细胞变圆并且全部从细胞瓶壁脱离；
5) 在细胞操作台内，用吸管吸取约4 mL培养基，加入细胞瓶内，轻柔的吹打，以吹散细胞和中和胰酶的消化效果；
6) 用吸管吸取吹匀的细胞悬液(体积约1/3-2/3)到另一新的细胞瓶，再补加5 mL的培养基，放置于细胞培养箱中，37℃，5%CO2的环境下继续静置培养。
二、293细胞转染
1．转染前一天（约24h）用胰蛋白酶消化细胞后计数。按照对应的孔板取相应的细胞量进行接板，使其在转染时的细胞覆盖率为70-90%。
2．转染前将所有质粒、试剂置于室温，计算所需要质粒及PEI max的体积。
3．在一定体积的DMEM中分别加入对应体积的质粒，混匀，形成A液，用一定体积的DMEM加入对应体积的PEI max，混匀，形成B液。
4．将B液快速加入A液，混匀，静止20 min，形成转染复合物。将转染复合物缓慢加入细胞培养基中，轻轻混合。
5．在37℃、5％的CO2 中培养48 h，即可进行双荧光素酶活性检测。
三、荧光素酶活性检测
在转染48h后，检测步骤按照Dual-GloTM luciferase assay system （Promega，美国）使用说明进行，具体实验操作如下：
1) 从培养箱中取出细胞培养板，吸除培养基，加入PBS清洗一次，按照对应的孔板加入对应体积PLB裂解细胞，在水平摇床室温孵育15min。
2) 取20μL细胞裂解液至96孔酶标板中，加入100μL LAR
Figure DEST_PATH_IMAGE001
，混匀，用酶标仪检测luciferase化学发光信号。
3) 检测完毕后每孔加入100μL Stop Substrate，混匀，用酶标仪检测Renilla化学发光信号。
四、试验结果
临床上FECD患者COL8A2发生Q455K的DNA序列突变有两种类型：Mut-1: 1363号C-A突变，CAG-AAG。Mut-2: 1363，1364号CA-GT突变，CAG-GTG。本申请也对应设计了野生型序列（SEQ ID NO：1）两种相应的突变靶序列（SEQ ID NO：2，3）和突变特异性shRNA（SEQ ID4-40）的载体(图1，2)。在293细胞中共转染含有野生型COL8A2序列或突变型COL8A2序列的荧光素酶质粒与RNAi对照（不靶向COL8A2的随机序列，下同）或候选RNAi药物（突变特异性shRNA）。转染48小时后检测荧光素酶活性，发现和转染RNAi对照相比，候选RNAi药物对野生型COL8A2的荧光素酶活性基本无影响；发现和转染RNAi对照相比，Mut-1靶向的15、19号药物对Mut-1突变型COL8A2的荧光素酶活性有显著抑制作用；Mut-2靶向的12、15号药物对Mut-2突变型COL8A2的荧光素酶活性有显著抑制作用（图3)。这提示，这四种RNAi药物可能对突变COL8A2表达有特异性的抑制作用。
SEQ ID NO：1-40序列如下：
SEQ ID NO：1：野生型COL8A2靶序列
GGCAGAAAGGTGACTTGGGGCTCCCTGGGCAGCCTGGCCTGAGGGGTCCCTCAGGAATCCCAG
SEQ ID NO：2：Mut-1型COL8A2靶序列
GGCAGAAAGGTGACTTGGGGCTCCCTGGGAAGCCTGGCCTGAGGGGTCCCTCAGGAATCCCAG
SEQ ID NO：3：Mut-2型COL8A2靶序列
GGCAGAAAGGTGACTTGGGGCTCCCTGGGGTGCCTGGCCTGAGGGGTCCCTCAGGAATCCCAG
SEQ ID NO：4-22：Mut-1型特异性COL8A2 shRNA序列
SEQ ID NO：4 GACCCCTCAGGCCAGGCTT
SEQ ID NO：5 ACCCCTCAGGCCAGGCTTC
SEQ ID NO：6 CCCCTCAGGCCAGGCTTCC
SEQ ID NO：7 CCCTCAGGCCAGGCTTCCC
SEQ ID NO：8 CCTCAGGCCAGGCTTCCCA
SEQ ID NO：9 CTCAGGCCAGGCTTCCCAG
SEQ ID NO：10 TCAGGCCAGGCTTCCCAGG
SEQ ID NO：11 CAGGCCAGGCTTCCCAGGG
SEQ ID NO：12 AGGCCAGGCTTCCCAGGGA
SEQ ID NO：13 GGCCAGGCTTCCCAGGGAG
SEQ ID NO：14 GCCAGGCTTCCCAGGGAGC
SEQ ID NO：15 CCAGGCTTCCCAGGGAGCC
SEQ ID NO：16 CAGGCTTCCCAGGGAGCCC
SEQ ID NO：17 AGGCTTCCCAGGGAGCCCC
SEQ ID NO：18 GGCTTCCCAGGGAGCCCCA
SEQ ID NO：19 GCTTCCCAGGGAGCCCCAA
SEQ ID NO：20 CTTCCCAGGGAGCCCCAAG
SEQ ID NO：21 TTCCCAGGGAGCCCCAAGT
SEQ ID NO：22 TCCCAGGGAGCCCCAAGTC
SEQ ID NO：23-40：Mut-2型特异性COL8A2 shRNA序列
SEQ ID NO：23 GACCCCTCAGGCCAGGCAC
SEQ ID NO：24 ACCCCTCAGGCCAGGCACC
SEQ ID NO：25 CCCCTCAGGCCAGGCACCC
SEQ ID NO：26 CCCTCAGGCCAGGCACCCC
SEQ ID NO：27 CCTCAGGCCAGGCACCCCA
SEQ ID NO：28 CTCAGGCCAGGCACCCCAG
SEQ ID NO：29 TCAGGCCAGGCACCCCAGG
SEQ ID NO：30 CAGGCCAGGCACCCCAGGG
SEQ ID NO：31 AGGCCAGGCACCCCAGGGA
SEQ ID NO：32 GGCCAGGCACCCCAGGGAG
SEQ ID NO：33 GCCAGGCACCCCAGGGAGC
SEQ ID NO：34 CCAGGCACCCCAGGGAGCC
SEQ ID NO：35 CAGGCACCCCAGGGAGCCC
SEQ ID NO：36 AGGCACCCCAGGGAGCCCC
SEQ ID NO：37 GGCACCCCAGGGAGCCCCA
SEQ ID NO：38 GCACCCCAGGGAGCCCCAA
SEQ ID NO：39 CACCCCAGGGAGCCCCAAG
SEQ ID NO：40 ACCCCAGGGAGCCCCAAGT
实施例二 RNAi药物处理抑制突变特异性的COL8A2基因表达
一、293细胞转染：
方法同前所述。
二、逆转录荧光定量PCR检测COL8A2 RNA的水平
1、逆转录反应体系如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
逆转录反应条件：37℃ 1 h，75℃ 10 min。
2、Real-time 反应体系
1) 目的基因的检测引物和内参引物
COL8A2: 5’-TCCGGCAGCCGCGAG-3’ (sense)
5’-GCATTTCCAGGTACTGGCCT-3’ (antisense)
GAPDH: 5’-GGAAGGTGAAGGTCGGAGTCAACGG-3’ (sense)
5’-CTCGCTCCTGGAAGATGGTGATGGG-3’ (antisense)
2) 反应体系
Figure DEST_PATH_IMAGE003
3）反应程序：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
三、AAV感染293细胞
1．准备好AAV RNAi对照病毒和RNAi药物病毒。
2. 将重组病毒以MOI为1×104的感染复数感染293细胞。
3. 感染48h后，检测COL8A2的RNA表达水平。
四、Western Blot
1. 蛋白样品制备
1) 使用裂解液裂解细胞，提取细胞蛋白，测定蛋白浓度。
2) 计算上样所需蛋白的溶液体积，加入SDS-PAGE上样缓冲液，混匀100℃金属浴5min，充分变性蛋白。
2．电泳
1) 根据所检测蛋白大小配制相应的分离胶，待分离胶凝固后，配制5%的浓缩胶，加满玻璃板，插入梳子。
2) 将胶板装入电泳槽，长板在外侧，短板在内侧，倒入电泳缓冲液。
3) 上样：将5μL 预染蛋白质分子marker SDS-PAGE与蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。使用1x的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液10μL上样到样品孔边上的空白加样孔内。
4) 电泳：上层胶时使用80V的低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用120V高电压恒压电泳。
3．转膜
按照对应的转膜装置装好转模夹板，放入装有转膜缓冲液的电泳槽，100V恒压转膜80-90min。
4．封闭
转膜完毕后，漂洗1-2min，用滴管吸尽缓冲液，加入5%的脱脂奶粉，在侧摆摇床上缓慢摇动，室温封闭45-60min。加入TBS洗涤液洗涤5min。共洗涤3次。
5．抗体孵育
按照说明书推荐稀释比例使用PBS+2% BSA稀释适量的一抗，4℃缓慢摇动孵育过夜或室温在侧摆摇床上缓慢摇动孵育2h。孵育后洗涤。按照说明书推荐稀释比例加入稀释好的二抗，室温侧摆摇床上缓慢摇动孵育40min-1h。孵育后洗涤。
6. 蛋白检测
使用ECL类试剂来检测蛋白，各取1mL混匀后，滴加在蛋白膜表面，避光孵育1-2min。用镊子将蛋白膜整齐的摆放在塑料纸上，放入凝胶成像仪上曝光。
五、试验结果
首先本实施例使用CRISPR-Cas9的方法构建了293-COL8A2突变的稳定细胞系。在野生型和COL8A2突变型细胞中转染了化学合成的siRNA对照及siRNA药物或者感染了AAV-shRNA对照及AAV-shRNA药物（MOI=10000）。在感染后24小时，收细胞样提取RNA检测COL8A2的表达。发现和对照相比，不论是化学合成的siRNA，还是AAV-shRNA，本发明的RNAi药物都可以显著抑制突变的COL8A2的RNA表达，但是对野生型COL8A2的RNA表达无明显影响（图4）。在感染后48小时，收细胞样提取蛋白检测COL8A2的表达，发现和对照AAV-shRNA相比，AAV-shRNA药物可以显著抑制突变的COL8A2的蛋白表达，但是对野生型COL8A2蛋白表达无明显影响（图5）。
实施例三 RNAi药物可治疗和预防人源化突变COL8A2小鼠角膜营养不良疾病
一、AAV-RNAi病毒感染小鼠及分析
1、构建人源化的COL8A2突变的转基因小鼠。
2、准备好5*10E12 vg/mL的AAV RNAi对照病毒和RNAi药物病毒。
3、将1μL/眼的对照RNAi或者药物组RNAi病毒通过前房注射进入1月龄或者6月龄小鼠眼内体内。
4、在小鼠12月龄时，处死小鼠，将小鼠角膜组织分离出，染色检测角膜内皮层细胞数量以及COL8A2总蛋白含量。
二、试验结果
1月龄的小鼠尚未发病，角膜组织细胞形态正常，6月龄的小鼠已经可见角膜后弹力层有赘生物，内皮细胞丢失。本实施例中对6月龄小鼠前房注射5*10E9 vg/眼的RNAi药物。6个月后检测角膜内皮细胞数量，发现和对照RNAi相比，RNAi药物治疗组的角膜内皮细胞丢失显著减少（图6A，6B）。说明RNAi药物可以有效治疗COL8A2突变导致的角膜营养不良。本实施例中对1月龄小鼠前房注射5*10E9 vg/眼的RNAi药物和RNAi对照。11个月后检测角膜内皮细胞数量，发现和对照RNAi相比，RNAi药物治疗组的角膜内皮细胞数量相对稳定。（图7A，7B）说明RNAi药物可以有效预防COL8A2突变导致的角膜营养不良。
至此，可以确定本发明的RNAi药物可有效、特异性地抑制突变COL8A2的表达，并发挥治疗，预防COL8A2突变导致的角膜营养不良。这一新发现为研制角膜营养不良药物提供了理论和事实基础。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 武汉纽福斯生物科技有限公司
<120> 寡核苷酸、病毒载体及其应用和RNAi药物制剂
<130> MP2018046
<160> 40
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggcagaaagg tgacttgggg ctccctgggc agcctggcct gaggggtccc tcaggaatcc 60
cag 63
<210> 2
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggcagaaagg tgacttgggg ctccctggga agcctggcct gaggggtccc tcaggaatcc 60
cag 63
<210> 3
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggcagaaagg tgacttgggg ctccctgggg tgcctggcct gaggggtccc tcaggaatcc 60
cag 63
<210> 4
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gacccctcag gccaggctt 19
<210> 5
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
acccctcagg ccaggcttc 19
<210> 6
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cccctcaggc caggcttcc 19
<210> 7
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccctcaggcc aggcttccc 19
<210> 8
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cctcaggcca ggcttccca 19
<210> 9
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ctcaggccag gcttcccag 19
<210> 10
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tcaggccagg cttcccagg 19
<210> 11
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
caggccaggc ttcccaggg 19
<210> 12
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aggccaggct tcccaggga 19
<210> 13
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ggccaggctt cccagggag 19
<210> 14
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gccaggcttc ccagggagc 19
<210> 15
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ccaggcttcc cagggagcc 19
<210> 16
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
caggcttccc agggagccc 19
<210> 17
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
aggcttccca gggagcccc 19
<210> 18
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ggcttcccag ggagcccca 19
<210> 19
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gcttcccagg gagccccaa 19
<210> 20
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cttcccaggg agccccaag 19
<210> 21
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ttcccaggga gccccaagt 19
<210> 22
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
tcccagggag ccccaagtc 19
<210> 23
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gacccctcag gccaggcac 19
<210> 24
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
acccctcagg ccaggcacc 19
<210> 25
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
cccctcaggc caggcaccc 19
<210> 26
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
ccctcaggcc aggcacccc 19
<210> 27
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
cctcaggcca ggcacccca 19
<210> 28
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
ctcaggccag gcaccccag 19
<210> 29
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
tcaggccagg caccccagg 19
<210> 30
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
caggccaggc accccaggg 19
<210> 31
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
aggccaggca ccccaggga 19
<210> 32
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
ggccaggcac cccagggag 19
<210> 33
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
gccaggcacc ccagggagc 19
<210> 34
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
ccaggcaccc cagggagcc 19
<210> 35
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 19
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
aggcacccca gggagcccc 19
<210> 37
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
ggcaccccag ggagcccca 19
<210> 38
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
gcaccccagg gagccccaa 19
<210> 39
<211> 19
<212> DNA/RNA
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<400> 39
caccccaggg agccccaag 19
<210> 40
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
accccaggga gccccaagt 19

Claims (11)

1.一种寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸选自如下核酸序列中的一种：
(a)核酸序列为SEQ ID NO: 18；
(b)核酸序列为SEQ ID NO: 37。
2.根据权利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸为化学修饰的寡核苷酸。
3.一种病毒载体，其特征在于，所述病毒载体包含权利要求1或2所述的寡核苷酸。
4.根据权利要求3所述的病毒载体，其特征在于，所述病毒载体为腺相关病毒、慢病毒、逆转录病毒或腺病毒中的一种。
5.根据权利要求3或4所述的病毒载体，其特征在于，所述病毒载体含有U6、H1或tRNA启动子中的一种。
6.根据权利要求4所述的病毒载体，其特征在于，所述腺相关病毒的血清型选自AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh10野生型或7M8、TYF突变型中的一种或多种。
7.如权利要求1至2中任一项所述的寡核苷酸或权利要求3至6中任一项所述的病毒载体在制备治疗眼部疾病药物中的应用，所述眼部疾病为COL8A2突变引起的福克斯角膜营养不良或后部多形性角膜营养不良。
8.一种RNAi药物制剂，其特征在于，所述药物制剂包含权利要求1至2中任一项所述的寡核苷酸或权利要求3至6中任一项所述的病毒载体，以及药学上可接受的载体和赋形剂。
9.根据权利要求8所述的RNAi药物制剂，其特征在于，所述RNAi药物制剂的赋形剂为纳米载体或脂质体。
10.根据权利要求8所述的RNAi药物制剂，其特征在于，所述RNAi药物制剂为液体制剂。
11.根据权利要求8至10中任一项所述的RNAi药物制剂，其特征在于，所述RNAi药物制剂的给药方式为前房注射、玻璃体腔注射、结膜下注射或眼表滴药。
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