JP7226801B2 - 標的遺伝子導入のための方法および組成物 - Google Patents

Description

［優先権の陳述］
本出願は、合衆国法典第３５巻第１１９条（ｅ）の下で、２０１６年８月１６日に出願された米国仮出願番号６２／３７５，６６６の利益を主張し、その内容全体は本明細書中に参照により援用される。

［政府支援の陳述］
本発明は、国立衛生研究所により授けられた助成金番号５１０３７５７の下での政府支援でなされた。政府は本発明における特定の権限を有する。
［本発明の分野］
本発明は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）およびウイルスキャプシド由来の改変されたキャプシドタンパク質、およびそれを含むウイルスベクターに関する。特に、本発明は、改変されたＡＡＶキャプシドタンパク質およびそれを含むキャプシド（目的の標的組織に関して望ましい形質導入プロファイルを与えるためにウイルスベクターに組み込まれ得る）に関する。

［本発明の背景］
動物組織およびアデノウイルスストックから単離された新規のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）株は、治療的遺伝子導入の適用に利用可能なＡＡＶベクターのパネルを拡張している。動物モデルにおけるこれらのＡＡＶ単離株の組織向性をマップする総合的な試みは、現在進行中である。ＡＡＶベクターのホーミングを選択臓器へ向ける能力は、遺伝子療法および他の治療的適用に有用である。

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、ウイルス遺伝子導入のための選択ベクターとなっていて、臨床試験における大きな見込みを示している。重要なのは、網膜下送達による網膜の成功的な治療である。より侵襲性でない注入経路の開発は、硝子体内送達によって満たされているが、この経路によるＡＡＶの送達は、乏しい形質導入の成果をもたらす。内境界膜（ＩＬＭ）は、硝子体と網膜を分離するバリアを作る。

本発明は、望ましい標的化特性を有する核酸送達ベクターに関する当該分野における必要性を対処する。

本発明は、ＡＡＶ４キャプシドタンパク質を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型４（ＡＡＶ４）ベクターを硝子体内に投与するステップを含む、対象の網膜および／または網膜色素上皮の細胞に核酸分子を導入する方法を提供し、ＡＡＶ４キャプシドタンパク質は、アミノ酸残基Ｋ５３０において置換を含み、および／または、アミノ酸残基Ｓ５８４、Ｎ５８５、Ｓ５８６およびＮ５８７の１つまたは複数において任意の組み合わせで置換をさらに含み、残基のナンバリングは、配列番号４（ＡＡＶ４キャプシドタンパク質のアミノ酸配列）のアミノ酸配列に基づく。

また、本発明は、ＡＡＶ５キャプシドタンパク質を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型５（ＡＡＶ５）ベクターを硝子体内に投与するステップを含む、対象の網膜および／または網膜色素上皮の細胞に核酸分子を導入する方法も提供し、ＡＡＶ５キャプシドタンパク質は、アミノ酸残基Ｋ５１７において置換を含み、および／または、アミノ酸残基Ｓ５７５、Ｓ５７６、Ｔ５７７およびＴ５７８の１つまたは複数において任意の組み合わせで置換をさらに含み、残基のナンバリングは、配列番号５（ＡＡＶ５キャプシドタンパク質のアミノ酸配列）のアミノ酸配列に基づく。

さらに本明細書において提供されるのは、ＡＡＶ７キャプシドタンパク質を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型７（ＡＡＶ７）ベクターを硝子体内に投与するステップを含む、対象の網膜および／または網膜色素上皮の細胞に核酸分子を導入する方法であり、ＡＡＶ７キャプシドタンパク質は、アミノ酸残基Ｋ５３３において置換を含み、および／または、アミノ酸残基Ａ５８７、Ａ５８８、Ｎ５８９およびＲ５９０の１つまたは複数において任意の組み合わせで置換をさらに含み、残基のナンバリングは、配列番号７（ＡＡＶ７キャプシドタンパク質のアミノ酸配列）のアミノ酸配列に基づく。

本発明は、ＡＡＶ８キャプシドタンパク質を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型８（ＡＡＶ８）ベクターを硝子体内に投与するステップを含む、対象の網膜および／または網膜色素上皮の細胞に核酸分子を導入する方法をさらに提供し、ＡＡＶ８キャプシドタンパク質は、アミノ酸残基Ｋ５３３において置換を含み、および／または、アミノ酸残基Ｑ５８７、Ｑ５８８、Ｎ５８９およびＴ５９０の１つまたは複数において任意の組み合わせで置換をさらに含み、残基のナンバリングは、配列番号８（ＡＡＶ８キャプシドタンパク質のアミノ酸配列）のアミノ酸配列に基づく。

また、本明細書において、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型９（ＡＡＶ９）ベクターを硝子体内に投与するステップを含む、対象の網膜および／または網膜色素上皮の細胞に核酸分子を導入する方法も提供されて、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質は、アミノ酸残基Ｋ５３１において置換を含み、および／または、アミノ酸残基Ｑ５８７、Ａ５８８、Ｎ５８９およびＴ５９０の１つまたは複数において任意の組み合わせで置換をさらに含み、残基のナンバリングは、配列番号９（ＡＡＶ９キャプシドタンパク質のアミノ酸配列）のアミノ酸配列に基づく。

さらに、本発明は、対象における眼の障害または欠陥を治療する方法を提供し、対象に、本発明のウイルスベクターを硝子体内に投与するステップを含み、ウイルスベクターは、対象における眼の障害または欠陥を治療するに効果的な治療的タンパク質または治療的ＤＮＡをコードする核酸分子を含む。

本発明のこれらおよび他の態様は、以下に示される本発明の説明においてより詳細に扱われる。

ｒＡＡＶ２ベクターの硝子体内送達後のグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）蛍光、および、注入後１２週のそのＨＳ結合欠損変異体。眼底画像の定量化は、ｒＡＡＶ２（ＨＳ結合）とｒＡＡＶ２ｉ８（切断されたＨＳ結合）との間の発現において、３００倍の低減を示した。ｒＡＡＶ２が注入された網膜の免疫組織化学（ＩＨＣ）は、主にＲＧＣにおいて蛍光を示し、ＩＮＬにおいては、ＧＦＰ陽性細胞体はより少ない。グラフは、標準誤差平均（ＳＥＭ）を示すエラーバーによって示されて、有意性は、ノンパラメトリックｔ検定によって検出される（^＊＊ｐ＜０．０１）。 硝子体内送達後のｒＡＡＶのトラフィッキングを示す、網膜の概要。 エクスビボでのヒト網膜へのウイルス結合のｑＰＣＲ分析。結果は、細胞ゲノムあたりのベクターゲノムとして定量化される。ｒＡＡＶ２（ＨＳ結合）ベクターは、網膜において最大の存在を示し、他のところではほとんど導入遺伝子は見られない。ｒＡＡＶ２ｉ８（切断されたＨＳ結合）によって送達された導入遺伝子の存在は、集められた組織の全てにおいて低かったが、脈絡膜および強膜の両方において、ｒＡＡＶ２によって送達された導入遺伝子と比較して有意な増大を示した。エラーバーは標準偏差を示した。 注入後８週の、ｒＡＡＶ１のＨＳ結合変異体の硝子体内送達後のＧＦＰ蛍光。眼底画像の定量化は、ｒＡＡＶ１（非ＨＳ結合）キャプシドと比較してｒＡＡＶ１－Ｅ５３１Ｋ（ＨＳ結合）キャプシドによって３倍の増大を示す。グラフは、ＳＥＭを示すエラーバーおよびノンパラメトリックｔ検定による有意性（^＊ｐ＜０．０５）で示される。 キメラキャプシドは、向性が、ＨＳ結合ではない他のモチーフによって影響を受けることを示唆する。キメラｒＡＡＶ２．５キャプシドを用いてｒＡＡＶ１のエレメンツをｒＡＡＶ２に適用して、硝子体内送達に関して撮像した。キャプシドの収集に関する眼底蛍光の定量化。エラーバーはＳＥＭを表わす。 ＨＥＫ２９３細胞のｒＡＡＶの形質導入をブロックするための可溶性ヘパリンを用いたインビトロ競合アッセイ。ウイルスは、増加する投与量の可溶性ヘパリンとともにインキュベートされて、細胞あたり１０，０００ｖｇの感染多重度で細胞培養に加えられた。ｒＡＡＶ２は、形質導入において用量依存的な低減を示し、それはｒＡＡＶ１またはｒＡＡＶ１－Ｅ５３１Ｋでは観察されなかった。ｒＡＡＶ１－Ｅ５３１Ｋの形質導入の量は、全ての条件においてｒＡＡＶ１よりも少なかった。エラーバーは、ＳＥＭとして示される。

本発明はここで、本発明の代表的な実施態様が示される付随する図面に関して説明される。本発明はしかしながら、異なる形態において具現化され得て、本明細書において示される実施態様に制限されると解釈されるべきでない。むしろこれらの実施態様は、本開示が徹底的かつ完全であり、本発明の範囲を当業者に完全に伝えるように提供される。

別段の定義がない限り、本明細書において用いられる全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者の一人によって一般に理解されるのと同一の意味を有する。本明細書において本発明の説明に用いられる専門用語は、特定の実施態様を説明する目的のみのためであり、本発明の制限を意図しない。

本発明は、網膜および／または網膜色素上皮の細胞の硝子体内形質導入が、ＡＡＶキャプシド上のヘパラン硫酸結合モチーフの付加によって高められ得るという予期されない発見に基づく。したがって、一実施態様では、本発明は、ＡＡＶ４キャプシドタンパク質を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型４（ＡＡＶ４）ベクターを硝子体内に投与するステップを含む、対象の網膜および／または網膜色素上皮の細胞に核酸分子を導入する方法を提供し、ＡＡＶ４キャプシドタンパク質は、アミノ酸残基Ｋ５３０において置換を含み、および／または、アミノ酸残基Ｓ５８４、Ｎ５８５、Ｓ５８６およびＮ５８７の１つまたは複数において任意の組み合わせで置換をさらに含み、残基のナンバリングは、配列番号４（ＡＡＶ４キャプシドタンパク質のアミノ酸配列）のアミノ酸配列に基づく。

また、本発明は、ＡＡＶ５キャプシドタンパク質を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型５（ＡＡＶ５）ベクターを硝子体内に投与するステップを含む、対象の網膜および／または網膜色素上皮の細胞に核酸分子を導入する方法も提供し、ＡＡＶ５キャプシドタンパク質は、アミノ酸残基Ｋ５１７において置換を含み、および／または、アミノ酸残基Ｓ５７５、Ｓ５７６、Ｔ５７７およびＴ５７８の１つまたは複数において任意の組み合わせで置換をさらに含み、残基のナンバリングは、配列番号５（ＡＡＶ５キャプシドタンパク質のアミノ酸配列）のアミノ酸配列に基づく。

さらに本明細書において提供されるのは、ＡＡＶ７キャプシドタンパク質を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型７（ＡＡＶ７）ベクターを硝子体内に投与するステップを含む、対象の網膜および／または網膜色素上皮の細胞に核酸分子を導入する方法であり、ＡＡＶ７キャプシドタンパク質は、アミノ酸残基Ｋ５３３において置換を含み、および／または、アミノ酸残基Ａ５８７、Ａ５８８、Ｎ５８９およびＲ５９０の１つまたは複数において任意の組み合わせで置換をさらに含み、残基のナンバリングは、配列番号７（ＡＡＶ７キャプシドタンパク質のアミノ酸配列）のアミノ酸配列に基づく。

本発明は、ＡＡＶ８キャプシドタンパク質を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型８（ＡＡＶ８）ベクターを硝子体内に投与するステップを含む、対象の網膜および／または網膜色素上皮の細胞に核酸分子を導入する方法をさらに提供し、ＡＡＶ８キャプシドタンパク質は、アミノ酸残基Ｋ５３３において置換を含み、および／または、アミノ酸残基Ｑ５８７、Ｑ５８８、Ｎ５８９およびＴ５９０の１つまたは複数において任意の組み合わせで置換をさらに含み、残基のナンバリングは、配列番号８（ＡＡＶ８キャプシドタンパク質のアミノ酸配列）のアミノ酸配列に基づく。

また、本明細書において、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型９（ＡＡＶ９）ベクターを硝子体内に投与するステップを含む、対象の網膜および／または網膜色素上皮の細胞に核酸分子を導入する方法も提供されて、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質は、アミノ酸残基Ｋ５３１において置換を含み、および／または、アミノ酸残基Ｑ５８７、Ａ５８８、Ｎ５８９およびＴ５９０の１つまたは複数において任意の組み合わせで置換をさらに含み、残基のナンバリングは、配列番号９（ＡＡＶ９キャプシドタンパク質のアミノ酸配列）のアミノ酸配列に基づく。

さらに、本発明は、対象における眼の障害または欠陥を治療する方法を提供し、対象に、本発明のウイルスベクターを硝子体内に投与するステップを含み、ウイルスベクターは、対象における眼の障害または欠陥を治療するのに効果的な治療的タンパク質または治療的ＤＮＡをコードする核酸分子を含む。

さらなる実施態様では、本発明の方法は、以下に説明されるように改変されているキャプシドタンパク質を含むＡＡＶベクターによって行われ得る。具体的には、一部の実施態様では、ヘパラン硫酸結合モチーフ（ＡＡＶ２ナンバリング：４８４Ｒ、４８５Ｑ、４８６Ｑ、４８７Ｒ、４８８Ｖ、４８９Ｓ、４９０Ｋ、４９１Ｔ、５２７Ｋ、５２８Ｄ、５２９Ｄ、５３０Ｅ、Ｄ５３１Ｅ、５３２Ｋ、Ｓ５８５Ｒ、Ｓ５８６Ｇ、Ｓ５８７Ｎ、Ｔ５８８Ｒ）は、ＡＡＶ１キャプシドタンパク質上にグラフ化（ｇｒａｐｈｅｄ ｏｎｔｏ）されてよく、および／または、ＡＡＶ１キャプシドタンパク質は、Ｔｙｒ突然変異（ＡＡＶ２ナンバリング：Ｙ２５２Ｆ、Ｙ２７２Ｆ、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ５００Ｆ、Ｙ７００Ｆ、Ｙ７０４Ｆ、Ｙ７３０Ｆ、）、ガラクトースモチーフ（ＡＡＶ２ナンバリング：Ｇ４６９Ｎ、４７０Ｍ、Ｓ４７１Ａ、４７２Ｖ、Ｐ４７４Ｇ、５００Ｆ） アミノ酸略称ＬＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（ＡＡＶ２ナンバリング：５８７）によるペプチドの挿入、または、欠失突然変異（ＡＡＶ２ナンバリング：Ｔ２６５）を、任意の組み合わせで含んでよい。アミノ酸残基ナンバリングは、ＡＡＶ２（配列番号２）のアミノ酸配列に基づく。

一部の実施態様では、ヘパラン硫酸結合モチーフ（ＡＡＶ２ナンバリング：４８４Ｒ、４８５Ｑ、４８６Ｑ、４８７Ｒ、４８８Ｖ、４８９Ｓ、４９０Ｋ、４９１Ｔ、５２７Ｋ、５２８Ｄ、５２９Ｄ、５３０Ｅ、５３１Ｅ、５３２Ｋ、５８５Ｒ、５８６Ｇ、５８７Ｎ、５８８Ｒ）は、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質上にグラフ化されてよく、および／または、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質は、Ｔｙｒ突然変異（ＡＡＶ２ナンバリング：Ｙ２５２Ｆ、Ｙ２７２Ｆ、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ５００Ｆ、Ｙ７００Ｆ、Ｙ７０４Ｆ、Ｙ７３０Ｆ）、ガラクトースモチーフ（ＡＡＶ２ナンバリング：Ｄ４６９Ｎ、Ｉ４７０Ｍ、Ｒ４７１Ａ、Ｄ４７２Ｖ、Ｓ４７４Ｇ、Ｙ５００Ｆ）、アミノ酸略称ＬＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（ＡＡＶ２ナンバリング：５８７）によるペプチドの挿入、または、挿入突然変異（ＡＡＶ２ナンバリング：２６５）を、任意の組み合わせで含んでよい。アミノ酸残基ナンバリングは、ＡＡＶ２（配列番号２）のアミノ酸配列に基づく。

一部の実施態様では、ヘパラン硫酸結合モチーフ（ＡＡＶ２ナンバリング：４８４Ｒ、４８５Ｑ、４８６Ｑ、４８７Ｒ、Ｌ４８８Ｖ、４８９Ｓ、４９０Ｋ、４９１Ｔ、５２７Ｋ、５２８Ｄ、５２９Ｄ、５３０Ｅ、５３１Ｅ、５３２Ｋ、Ｓ５８５Ｒ、Ｓ５８６Ｇ、Ｎ５８７Ｎ、Ｔ５８８Ｒ）は、ＡＡＶ３Ｂキャプシドタンパク質上にグラフ化されてよく、および／または、ＡＡＶ３Ｂキャプシドタンパク質は、Ｔｙｒ突然変異（ＡＡＶ２ナンバリング：Ｙ２５２Ｆ、Ｙ２７２Ｆ、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ５００Ｆ、Ｙ７００Ｆ、Ｙ７０４Ｆ、Ｙ７３０Ｆ、）、ガラクトースモチーフ（ＡＡＶ２ナンバリング：Ｓ４６９Ｎ、４７０Ｍ、Ｓ４７１Ａ、Ｎ４７２Ｖ、Ａ４７４Ｇ、５００Ｆ） アミノ酸略称ＬＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（ＡＡＶ２ナンバリング：５８７）によるペプチドの挿入、または、挿入突然変異（ＡＡＶ２ナンバリング：２６５）を、任意の組み合わせで含んでよい。アミノ酸残基ナンバリングは、ＡＡＶ２（配列番号２）のアミノ酸配列に基づく。

一部の実施態様では、ヘパラン硫酸結合モチーフ（ＡＡＶ２ナンバリング：Ｋ４８４Ｒ、４８５Ｑ、４８６Ｑ、Ｇ４８７Ｒ、Ｆ４８８Ｖ、４８９Ｓ、４９０Ｋ、４９１Ｔ、Ｇ５２７Ｋ、Ｐ５２８Ｄ、Ａ５２９Ｄ、Ｄ５３０Ｅ、Ｓ５３１Ｅ、５３２Ｋ、Ｓ５８５Ｒ、Ｎ５８６Ｇ、Ｓ５８７Ｎ、Ｎ５８８Ｒ）は、ＡＡＶ４キャプシドタンパク質上にグラフ化されてよく、および／または、ＡＡＶ４キャプシドタンパク質は、Ｔｙｒ突然変異（ＡＡＶ２ナンバリング：Ｙ２５２Ｆ、Ｙ２７２Ｆ、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ５００Ｆ、Ｙ７００Ｆ、Ｙ７０４Ｆ、Ｙ７３０Ｆ）、ガラクトースモチーフ（ＡＡＶ２ナンバリング：４６９Ｎ、Ｆ４７０Ｍ、Ｓ４７１Ａ、Ｎ４７２Ｖ、Ｋ４７４Ｇ、Ｓ５００Ｆ）、アミノ酸略称ＬＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（ＡＡＶ２ナンバリング：５８７）によるペプチドの挿入、または、挿入突然変異（ＡＡＶ２ナンバリング：２６５）を、任意の組み合わせで含んでよい。アミノ酸残基ナンバリングは、ＡＡＶ２（配列番号２）のアミノ酸配列に基づく。

一部の実施態様では、ヘパラン硫酸結合モチーフ（ＡＡＶ２ナンバリング：４８４Ｒ、Ｔ４８５Ｑ、Ｇ４８７Ｒ、Ｗ４８８Ｖ、Ｎ４８９Ｓ、Ｌ４９０Ｋ、Ｇ４９１Ｔ、Ｌ５２７Ｋ、Ｑ５２８Ｄ、Ｇ５２９Ｄ、Ｓ５３０Ｅ、Ｎ５３１Ｅ、Ｔ５３２Ｋ、Ｓ５８５Ｒ、Ｓ５８６Ｇ、Ｔ５８７Ｎ、Ｔ５８８Ｒ）は、ＡＡＶ５キャプシドタンパク質上にグラフ化されてよく、および／または、ＡＡＶ５キャプシドタンパク質は、Ｔｙｒ突然変異（ＡＡＶ２ナンバリング：Ｙ２５２Ｆ、Ｙ２７２Ｆ、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ５００Ｆ、Ｙ７００Ｆ、Ｙ７０４Ｆ、Ｙ７３０Ｆ）、ガラクトースモチーフ（ＡＡＶ２ナンバリング：Ｒ４６９Ｎ、Ｙ４７０Ｍ、４７１Ａ、Ｎ４７２Ｖ、Ｙ４７４Ｇ、Ｓ５００Ｆ）、アミノ酸略称ＬＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（ＡＡＶ２ナンバリング：５８７）によるペプチドの挿入、または、挿入突然変異（ＡＡＶ２ナンバリング：２６５）を、任意の組み合わせで含んでよい。アミノ酸残基ナンバリングは、ＡＡＶ２（配列番号２）のアミノ酸配列に基づく。

一部の実施態様では、ヘパラン硫酸結合モチーフ（ＡＡＶ２ナンバリング：４８４Ｒ、４８５Ｑ、４８６Ｑ、４８７Ｒ、４８８Ｖ、４８９Ｓ、４９０Ｋ、４９１Ｔ、５２７Ｋ、５２８Ｄ、５２９Ｄ、５３０Ｅ、５３１Ｅ、Ｒ５３２Ｋ、Ａ５８５Ｒ、Ａ５８６Ｇ、５８７Ｎ、Ｔ５８８Ｒ）は、ＡＡＶ７キャプシドタンパク質上にグラフ化されてよく、および／または、ＡＡＶ７キャプシドタンパク質は、Ｔｙｒ突然変異（ＡＡＶ２ナンバリング：Ｙ２５２Ｆ、Ｙ２７２Ｆ、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ５００Ｆ、Ｙ７００Ｆ、Ｙ７０４Ｆ、Ｙ７３０Ｆ、）、ガラクトースモチーフ（ＡＡＶ２ナンバリング：Ｔ４６９Ｎ、４７０Ｍ、４７１Ａ、Ｅ４７２Ｖ、Ａ４７４Ｇ、５００Ｆ） アミノ酸略称ＬＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（ＡＡＶ２ナンバリング：５８７）によるペプチドの挿入、または、挿入突然変異（ＡＡＶ２ナンバリング：２６５）を、任意の組み合わせで含んでよい。アミノ酸残基ナンバリングは、ＡＡＶ２（配列番号２）のアミノ酸配列に基づく。

一部の実施態様では、ヘパラン硫酸結合モチーフ（ＡＡＶ２ナンバリング：４８４Ｒ、４８５Ｑ、４８６Ｑ、４８７Ｒ、４８８Ｖ、４８９Ｓ、Ｔ４９０Ｋ、４９１Ｔ、５２７Ｋ、５２８Ｄ、５２９Ｄ、５３０Ｅ、５３１Ｅ、Ｒ５３２Ｋ、Ｑ５８５Ｒ、Ｑ５８６Ｇ、Ｎ５８７Ｎ、Ｔ５８８Ｒ）は、ＡＡＶ８キャプシドタンパク質上にグラフ化されてよく、および／または、ＡＡＶ８キャプシドタンパク質は、Ｔｙｒ突然変異（ＡＡＶ２ナンバリング：Ｙ２５２Ｆ、Ｙ２７２Ｆ、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ５００Ｆ、Ｙ７００Ｆ、Ｙ７０４Ｆ、Ｙ７３０Ｆ、）、ガラクトースモチーフ（ＡＡＶ２ナンバリング：Ｔ４６９Ｎ、４７０Ｍ、４７１Ａ、Ｎ４７２Ｖ、Ａ４７４Ｇ、５００Ｆ） アミノ酸略称ＬＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（ＡＡＶ２ナンバリング：５８７）によるペプチドの挿入、または、置換突然変異（ＡＡＶ２ナンバリング：Ｓ２６５）を、任意の組み合わせで含んでよい。アミノ酸残基ナンバリングは、ＡＡＶ２（配列番号２）のアミノ酸配列に基づく。

一部の実施態様では、ヘパラン硫酸結合モチーフ（ＡＡＶ２ナンバリング：４８４Ｒ、４８５Ｑ、４８６Ｑ、４８７Ｒ、４８８Ｖ、４８９Ｓ、Ｔ４９０Ｋ、４９１Ｔ、５２７Ｋ、Ｅ５２８Ｄ、Ｇ５２９Ｄ、５３０Ｅ、Ｄ５３１Ｅ、Ｒ５３２Ｋ、Ｓ５８５Ｒ、Ａ５８６Ｇ、Ｑ５８７Ｎ、Ａ５８８Ｒ）は、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質上にグラフ化されてよく、および／または、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質は、Ｔｙｒ突然変異（ＡＡＶ２ナンバリング：Ｙ２５２Ｆ、Ｙ２７２Ｆ、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ５００Ｆ、Ｙ７００Ｆ、Ｙ７０４Ｆ、Ｙ７３０Ｆ）、ガラクトースモチーフ（ＡＡＶ２ナンバリング：４６９Ｎ、４７０Ｍ、４７１Ａ、４７２Ｖ、４７４Ｇ、５００Ｆ） アミノ酸略称ＬＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（ＡＡＶ２ナンバリング：５８７）によるペプチドの挿入、または置換突然変異（ＡＡＶ２ナンバリング：Ｓ２６５）を、任意の組み合わせで含んでよい。アミノ酸残基ナンバリングは、ＡＡＶ２（配列番号２）のアミノ酸配列に基づく。

一部の実施態様では、ヘパラン硫酸結合モチーフ（ＡＡＶ２ナンバリング：４８４Ｒ、４８５Ｑ、４８６Ｑ、４８７Ｒ、４８８Ｖ、４８９Ｓ、Ｔ４９０Ｋ、４９１Ｔ、５２７Ｋ、５２８Ｄ、５２９Ｄ、５３０Ｅ、５３１Ｅ、Ｒ５３２Ｋ、Ｑ５８５Ｒ、Ａ５８６Ｇ、５８７Ｎ、Ｔ５８８Ｒ）は、ＡＡＶ１０キャプシドタンパク質上にグラフ化されてよく、および／または、ＡＡＶ１０キャプシドタンパク質は、Ｔｙｒ突然変異（ＡＡＶ２ナンバリング：Ｙ２５２Ｆ、Ｙ２７２Ｆ、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ５００Ｆ、Ｙ７００Ｆ、Ｙ７０４Ｆ、Ｙ７３０Ｆ、）、ガラクトースモチーフ（ＡＡＶ２ナンバリング：４６９Ｎ、４７０Ｍ、Ｓ４７１Ａ、Ａ４７２Ｖ、Ａ４７４Ｇ、５００Ｆ） アミノ酸略称ＬＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（ＡＡＶ２ナンバリング：５８７）によるペプチドの挿入、または、置換突然変異（ＡＡＶ２ナンバリング：Ｓ２６５）を、任意の組み合わせで含んでよい。アミノ酸残基ナンバリングは、ＡＡＶ２（配列番号２）のアミノ酸配列に基づく。

一部の実施態様では、ヘパラン硫酸結合モチーフ（ＡＡＶ２ナンバリング：Ｋ４８４Ｒ、４８５Ｑ、４８６Ｑ、４８７Ｒ、Ｆ４８８Ｖ、４８９Ｓ、４９０Ｋ、４９１Ｔ、Ｇ５２７Ｋ、Ｐ５２８Ｄ、Ｓ５２９Ｄ、Ｄ５３０Ｅ、Ｇ５３１Ｅ、Ｄ５３２Ｋ、Ｎ５８５Ｒ、Ａ５８６Ｇ、Ｔ５８７Ｎ、Ｔ５８８Ｒ）は、任意の組み合わせでＡＡＶ１１キャプシドタンパク質上にグラフ化されてよく、および／または、ＡＡＶ１１キャプシドタンパク質は、Ｔｙｒ突然変異（ＡＡＶ２ナンバリング：Ｙ２５２Ｆ、Ｙ２７２Ｆ、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ５００Ｆ、Ｙ７００Ｆ、Ｙ７０４Ｆ、Ｙ７３０Ｆ）、ガラクトースモチーフ（ＡＡＶ２ナンバリング：Ｄ４６９Ｎ、Ｆ４７０Ｍ、４７１Ａ、Ｆ４７２Ｖ、Ｒ４７４Ｇ、Ａ５００Ｆ） アミノ酸略称ＬＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（ＡＡＶ２ナンバリング：５８７）によるペプチドの挿入、または、挿入突然変異（ＡＡＶ２ナンバリング：２６５）を、任意の組み合わせで含んでよい。アミノ酸残基ナンバリングは、ＡＡＶ２（配列番号２）のアミノ酸配列に基づく。

一部の実施態様では、ヘパラン硫酸結合モチーフ（ＡＡＶ２ナンバリング：Ｋ４８４Ｒ、４８５Ｑ、４８６Ｑ、Ｋ４８７Ｒ、Ｆ４８８Ｖ、４８９Ｓ、４９０Ｋ、Ｎ４９１Ｔ、Ｇ５２７Ｋ、Ａ５２８Ｄ、Ｇ５２９Ｄ、Ｄ５３０Ｅ、Ｓ５３１Ｅ、Ｄ５３２Ｋ、Ｎ５８５Ｒ、Ａ５８６Ｇ、Ｔ５８７Ｎ、Ｔ５８８Ｒ）は、ＡＡＶ１２キャプシドタンパク質上にグラフ化されてよく、および／または、ＡＡＶ１２キャプシドタンパク質は、Ｔｙｒ突然変異（ＡＡＶ２ナンバリング：Ｙ２５２Ｆ、Ｙ２７２Ｆ、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ５００Ｆ、Ｙ７００Ｆ、Ｙ７０４Ｆ、Ｙ７３０Ｆ）、ガラクトースモチーフ（ＡＡＶ２ナンバリング：Ｄ４６９Ｎ、Ｆ４７０Ｍ、４７１Ａ、Ｆ４７２Ｖ、Ｒ４７４Ｇ、Ａ５００Ｆ） アミノ酸略称ＬＡＬＧＥＴＴＲＰＡ（ＡＡＶ２ナンバリング：５８７）によるペプチドの挿入、または、挿入突然変異（ＡＡＶ２ナンバリング：２６５）を、任意の組み合わせで含んでよい。アミノ酸残基ナンバリングは、ＡＡＶ２（配列番号２）のアミノ酸配列に基づく。

本発明の方法では、ウイルスベクターは、治療的タンパク質および／または治療的ＤＮＡをコードする核酸分子を含んでよい。

本発明は、対象における眼の障害または欠陥を治療する方法をさらに提供し、対象における眼の障害または欠陥を治療するのに効果的な治療的タンパク質または治療的ＤＮＡを受け取っている対象に、本発明のウイルスベクターを硝子体内に投与するステップを含む。

本発明の方法によって治療され得る眼の障害または欠陥の非限定的な例は、加齢黄斑変性、レーバー先天性黒内障（ａｍａｒｏｕｓｉｓ）タイプ１、レーバー先天性黒内障タイプ２、網膜色素変性症、網膜分離症（ｒｅｔｉｎｏｓｃｈｏｓｉｓ）、色覚異常、色盲、先天性停止性夜盲症、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

定義
以下の用語は、本明細書における説明および添付の特許請求の範囲において用いられる：

単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別段の提示をしない限り、複数形も同様に含むことが意図される。

さらに、本明細書において用いられる用語「約」は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の長さ、投与量、時間、温度などの量のような測定可能な値を指す場合、規定される量の±２０％、±１０％、±５％、±１％、±０．５％、または実に±０．１％の変動を包含することが意味される。

また、本明細書において用いられる「および／または」は、関係がある列挙された項目の１つまたは複数の任意および全てのあり得る組み合わせ、ならびに、代替（「または」）と解釈された場合は組み合わせの欠失を指し、および包含する。

本明細書において用いられる移行句「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」（および文法上の変形）は、請求項の範囲が、請求項に列挙された規定の材料またはステップ、および、特許請求の範囲に記載された発明の「基礎的かつ新規の特徴（単数または複数）に実質的に影響を及ぼさないもの」を包含すると解釈されるべきであることを意味する。したがって、用語「から本質的になる」は、本発明の請求項において用いられる場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と同等であると解釈されることを意図しない。

文脈が別段の提示をしない限り、本明細書において説明される本発明の様々な特性は、任意の組み合わせで用いられ得ることが明確に意図される。

さらに、本発明は、本発明の一部の実施態様では、本明細書において示される任意の特性または特性の組み合わせは、除外または省略され得ることも検討する。

さらに説明すると、仮に、例えば、本明細書が、特定のアミノ酸は、Ａ、Ｇ、Ｉ、Ｌおよび／またはＶから選択され得ることを示す場合、この言い回しは、あたかもそれぞれのそのようなサブコンビネーションが本明細書中に明示的に示されるかのように、アミノ酸は、これらのアミノ酸（単数または複数）の任意のサブセット、例えばＡ、Ｇ、ＩまたはＬ；Ａ、Ｇ、ＩまたはＶ；ＡまたはＧ；Ｌのみ；などから選択され得ることも示す。さらに、そのような言い回しは、規定のアミノ酸の１つまたは複数が否認され得ることも示す。例えば、特定の実施態様では、アミノ酸は、あたかもそれぞれのそのようなあり得る否認が本明細書中に明示的に示されるかのように、Ａ、ＧまたはＩではなく；Ａではなく；ＧまたはＶではない；などである。

本明細書において用いられる用語「減少する（ｒｅｄｕｃｅ）」、「減少する（ｒｅｄｕｃｅｓ）」、「減少（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）」および同様の用語は、少なくとも約２５％、３５％、５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％またはそれよりも多くの低減を意味する。

本明細書において用いられる用語「上昇する（ｅｎｈａｎｃｅ）」、「上昇する（ｅｎｈａｎｃｅｓ）」、「上昇（ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ）」および同様の用語は、少なくとも約５％、１０％、２０％、２５％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％またはそれよりも多くの増大を示す。これらの用語は、倍増、例えば、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍などに対する言及において用いられてもよい。

本明細書において用いられる用語「パルボウイルス」は、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅファミリーを包含し、自律複製するパルボウイルスおよびディペンドウイルスを含む。自律的パルボウイルスは、パルボウイルス、エリスロウイルス、デンソウイルス、イテラウイルス、および、コントラウイルス（Ｃｏｎｔｒａｖｉｒｕｓ）属のメンバーを含む。例示的な自律的パルボウイルスは、限定されないが、マウスの微小ウイルス、ウシのパルボウイルス、イヌのパルボウイルス、ニワトリのパルボウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ネコのパルボウイルス、ガチョウのパルボウイルス、Ｈ１パルボウイルス、バリケンのパルボウイルス、Ｂ１９ウイルス、および、現在知られまたは後に発見される任意の他の自律的パルボウイルスを含む。他の自律的パルボウイルスは、当業者に公知である。例えば、ＢＥＲＮＡＲＤ Ｎ．ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ、第２巻、第６９章（第４版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）を参照。

本明細書において用いられる用語「アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）」は、制限されないが、ＡＡＶタイプ１、ＡＡＶタイプ２、ＡＡＶタイプ３（タイプ３Ａおよび３Ｂを含む）、ＡＡＶタイプ４、ＡＡＶタイプ５、ＡＡＶタイプ６、ＡＡＶタイプ７、ＡＡＶタイプ８、ＡＡＶタイプ９、ＡＡＶタイプ１０、ＡＡＶタイプ１１、ＡＡＶタイプ１２、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、および、現在知られまたは後に発見される任意の他のＡＡＶを含む。例えば、ＢＥＲＮＡＲＤ Ｎ．ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ、第２巻、第６９章（第４版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓを参照）。多くの相対的に新しいＡＡＶ血清型およびクレードが同定され得ている（例えば、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７８：６３８１－６３８８；Ｍｏｒｉｓ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３３－：３７５－３８３；および表１を参照）。

様々な血清型のＡＡＶおよび自律的パルボウイルスのゲノム配列、ならびに、ネイティブの末端反復（ＴＲ）、Ｒｅｐタンパク質、およびキャプシドサブユニットの配列は、当技術分野で知られている。そのような配列は、文献またはＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）データベースのような公共データベースにおいて見られ得る。例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０４４９２７、ＮＣ－＿００２０７７、ＮＣ＿００１４０１、ＮＣ＿００１７２９、ＮＣ＿００１８６３、ＮＣ＿００１８２９、ＮＣ＿００１８６２、ＮＣ＿０００８８３、ＮＣ＿００１７０１、ＮＣ＿００１５１０、ＮＣ＿００６１５２、ＮＣ＿００６２６１、ＡＦ０６３４９７、Ｕ８９７９０、ＡＦ０４３３０３、ＡＦ０２８７０５、ＡＦ０２８７０４、Ｊ０２２７５、Ｊ０１９０１、Ｊ０２２７５、Ｘ０１４５７、ＡＦ２８８０６１、ＡＨ００９９６２、ＡＹ０２８２２６、ＡＹ０２８２２３、ＮＣ＿００１３５８、ＮＣ＿００１５４０、ＡＦ５１３８５１、ＡＦ５１３８５２、ＡＹ５３０５７９を参照；その開示は、パルボウイルスおよびＡＡＶ核酸およびアミノ酸配列を教示するために本明細書において参照により援用される。また、例えば、Ｓｒｉｖｉｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４５：５５５；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７１：６８２３；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：１３０９；Ｂａｎｔｅｌ－Ｓｃｈａａｌ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：９３９；Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：３９９４；Ｍｕｒａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２２１：２０８；Ｓｈａｄｅ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５８：９２１；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：１１８５４；Ｍｏｒｉｓ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３３－：３７５－３８３；国際特許公報ＷＯ００／２８０６１、ＷＯ９９／６１６０１、ＷＯ９８／１１２４４；および米国特許第６，１５６，３０３号も参照；その開示は、パルボウイルスおよびＡＡＶ核酸およびアミノ酸配列を教示するために本明細書において参照により援用される。表１も参照。

自律的パルボウイルスおよびＡＡＶのキャプシド構造は、ＢＥＲＮＡＲＤ Ｎ．ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，第２巻、第６９＆７０章（第４版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）においてより詳細に説明される。また、ＡＡＶ２（Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９９：１０４０５－１０）、ＡＡＶ４（Ｐａｄｒｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：５０４７－５８）、ＡＡＶ５（Ｗａｌｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：３３６１－７１）、および、ＣＰＶ（Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６：４９７－５２０およびＴｓａｏ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１４５６－６４）の結晶構造の説明も参照。

本明細書において用いられる用語「向性」は、特定の細胞または組織へのウイルスの選択的な侵入を指し、任意選択で、細胞においてウイルスゲノムによって保有される配列（単数または複数）の発現（例えば、転写、任意選択で翻訳）、例えば、組み換えウイルスについては、目的の異種核酸（単数または複数）の発現が続く。当業者は、ウイルスゲノム由来の異種核酸配列の転写は、例えば誘導性プロモーターまたは他の方法で調節される核酸配列に関するトランス作用因子の不存在下では開始され得ないことを理解している。ｒＡＡＶゲノムの場合では、ウイルスゲノム由来の遺伝子発現は、安定的に組み込まれたプロウイルス、非組込みのエピソーム、ならびに、ウイルスが細胞内で取り得る任意の他の形態由来であってよい。

別段の指示がない限り、「効率的な形質導入」または「効率的な向性」または同様の用語は、適切なコントロールに対する参照によって決定され得る（例えば、コントロールの形質導入または向性の、それぞれ少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％またはそれよりも多い）。適切なコントロールは、所望の向性プロファイルを含む様々な因子に依存する。

本明細書において用いられる用語「ポリペプチド」は、別段の指示がない限り、ペプチドおよびタンパク質の両方を包含する。

「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド塩基の配列であり、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド配列（天然起源および非天然起源の両方のヌクレオチドを含む）であってよいが、代表的な実施態様では、一本鎖または二本鎖のいずれかのＤＮＡ配列である。

本明細書において用いられる「単離された」ポリヌクレオチド（例えば、「単離されたＤＮＡ」または「単離されたＲＮＡ」）は、天然起源の生物またはウイルスの他の構成要素の少なくとも一部、例えば、細胞またはウイルスの構造的構成要素、または、ポリヌクレオチドと関連して一般に見られる他のポリペプチドまたは核酸から、少なくとも部分的に分離されたポリヌクレオチドを意味する。代表的な実施態様では、「単離された」ヌクレオチドは、出発原料と比較して少なくとも約１０倍、１００倍、１０００倍、１０，０００倍またはそれよりも多く濃縮される。

同様に、「単離された」ポリペプチドは、天然起源の生物またはウイルスの他の構成要素の少なくとも一部、例えば、細胞またはウイルスの構造的構成要素、または、ポリペプチドと関連して一般に見られる他のポリペプチドまたは核酸から、少なくとも部分的に分離されたポリペプチドを意味する。代表的な実施態様では、「単離された」ポリペプチドは、出発原料と比較して少なくとも約１０倍、１００倍、１０００倍、１０，０００倍またはそれよりも多く濃縮される。

本明細書において用いられる、ウイルスベクターを「単離する」または「精製する」（または文法上の等価物）によって、ウイルスベクターが、出発原料内の他の構成要素の少なくとも一部から少なくとも部分的に分離されることを意味する。代表的な実施態様では、「単離された」または「精製された」ウイルスベクターは、出発原料と比較して少なくとも約１０倍、１００倍、１０００倍、１０，０００倍またはそれよりも多く濃縮される。

「治療的タンパク質」は、細胞または対象におけるタンパク質の不存在または欠陥に起因する症候を緩和、減少、防止、遅延、および／または安定化することのできるタンパク質であり、および／または、その他の方法で対象に利益を与えるタンパク質である。

本明細書において用いられる「治療的ＲＮＡ分子」または「機能性ＲＮＡ分子」は、アンチセンス核酸、リボザイム（例えば、米国特許第５，８７７，０２２号に記載）、スプライセオソームが介在するトランス－スプライシングに作用するＲＮＡ（Ｐｕｔｔａｒａｊｕ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：２４６；米国特許第６，０１３，４８７号；米国特許第６，０８３，７０２号を参照）、遺伝子サイレンシングを仲介するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡを含む干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）（Ｓｈａｒｐ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：２４３１を参照）、および、当技術分野で知られている任意の他の非翻訳ＲＮＡ、例えば「ガイド」ＲＮＡ（Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：４９２９；Ｙｕａｎらの米国特許第５，８６９，２４８号）などであってよい。

用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「の治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆ）」（およびそれらの文法上の変形）によって、対象の状態の重症度が、減少、少なくとも部分的に改善または安定化されること、および／または、少なくとも１つの臨床症候における一部の軽減、緩和、低減または安定化が達成され、および／または、疾患または障害の進行に遅延があることを意味する。

用語「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」、「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」および「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」（およびそれらの文法上の変形）は、対象における疾患、障害および／または臨床症候（単数または複数）の発症の予防および／または遅延、および／または、本発明の方法の不存在下で生じるであろうものと比較した疾患、障害および／または臨床症候（単数または複数）の発症の重症度の減少を指す。予防は、疾患、障害および／または臨床症候（単数または複数）の全体的な不存在のように、完全であってよい。また、予防は、対象における疾患、障害および／または臨床症候（単数または複数）の発生および／または発症の重症度が、本発明の不存在下で生じるであろうものよりも低いような、部分的であってもよい。

本明細書において用いられる「治療効果的な」量は、対象に何らかの改善または利益を与えるのに十分な量である。別の言い方をすると、「治療効果的な」量は、対象における少なくとも１つの臨床症候における何らかの軽減、緩和、低減または安定化を提供する量である。当業者は、何らかの利益が対象に与えられる限り、治療的効果は完全または治癒的である必要はないことを理解している。

本明細書において用いられる「予防効果的な」量は、対象における疾患、障害および／または臨床症候の発症を予防および／または遅延させるのに十分な、および／または、本発明の方法の不存在下で生じるであろうものと比較して対象における疾患、障害および／または臨床症候の発症の重症度を減少および／または遅延させるのに十分な量である。当業者は、何らかの利益が対象に与えられる限り、予防のレベルは、完全である必要はないことを理解している。

用語「異種ヌクレオチド配列」および「異種核酸分子」は、本明細書において相互交換可能に用いられ、ウイルスにおいて天然起源でない核酸分子および／またはヌクレオチド配列を指す。一般に、異種核酸は、目的のタンパク質、タンパク質フラグメント、ペプチドまたは非翻訳ＲＮＡ（例えば、細胞または対象への送達のため）をコードするオープンリーディングフレームを含む。

本明細書において用いられる用語「ウイルスベクター」、「ベクター」または「遺伝子送達ベクター」は、核酸送達ビヒクルとして機能するウイルス（例えば、ＡＡＶ）粒子を指し、ビリオン内にパッケージされたベクターゲノム（例えば、ウイルスＤＮＡ［ｖＤＮＡ］）を含む。あるいは、一部の文脈では、用語「ベクター」は、ベクターゲノム／ｖＤＮＡのみを指すために用いられてよい。

「ｒＡＡＶベクターゲノム」または「ｒＡＡＶゲノム」は、１つまたは複数の異種核酸配列を含むＡＡＶゲノム（すなわち、ｖＤＮＡ）である。ｒＡＡＶベクターは一般に、ウイルスを生産するために、シスで末端反復（単数または複数）（ＴＲ（単数または複数））のみを必要とする。全ての他のウイルス配列は不必要であり、トランスで供給されてよい（Ｍｕｚｙｃｚｋａ（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７）。典型的に、ｒＡＡＶベクターゲノムは、ベクターによって効率的にパッケージされ得る導入遺伝子のサイズを最大化するように１つまたは複数のＴＲ配列のみを保有する。構造的および非構造的タンパク質コード配列は、（例えば、プラスミドのようなベクターから、または、パッケージング細胞へ配列を安定的に組み込むことによって）トランスで提供されてよい。本発明の実施態様では、ｒＡＡＶベクターゲノムは、少なくとも１つの末端反復（ＴＲ）配列（例えば、ＡＡＶ ＴＲ配列）、任意選択で２つのＴＲ（例えば、２つのＡＡＶ ＴＲ）を含み、それは典型的にベクターゲノムの５’および３’末端であり、異種核酸配列に隣接するが、それに連続している必要はない。ＴＲは、同一または互いに異なってよい。

用語「末端反復」または「ＴＲ」は、ヘアピン構造を形成して、逆位末端配列として機能する（すなわち、複製、ウイルスパッケージング、組込みおよび／またはプロウイルスレスキューなどの所望の機能を仲介する）、任意のウイルス末端反復または合成配列を含む。ＴＲは、ＡＡＶ ＴＲまたは非ＡＡＶ ＴＲであってよい。例えば、他のパルボウイルス（例えば、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）、マウスパルボウイルス（ＭＶＭ）、ヒトパルボウイルスＢ－１９）のもののような非ＡＡＶ ＴＲ配列、または、任意の他の適切なウイルス配列（例えば、ＳＶ４０複製起点として作用するＳＶ４０ヘアピン）がＴＲとして用いられてよく、それは、トランケーション、置換、欠失、挿入および／または付加によってさらに改変されてよい。さらに、ＴＲは、部分的または完全に合成されてよく、たとえば、Ｓａｍｕｌｓｋｉらの米国特許第５，４７８，７４５号に記載の「ダブル－Ｄ配列」であってよい。

「ＡＡＶ末端反復」または「ＡＡＶ ＴＲ」は、制限されないが、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１または現在知られまたは後に発見される任意の他のＡＡＶ（例えば、表１を参照）を含む、任意のＡＡＶ由来であってよい。ＡＡＶ末端反復は、末端反復が、例えば、複製、ウイルスパッケージング、組込み、および／またはプロウイルスレスキューなどの所望の機能を仲介する限り、ネイティブの末端反復配列を有する必要はない（例えば、ネイティブのＡＡＶ ＴＲ配列は、挿入、欠失、トランケーションおよび／またはミスセンス突然変異によって変更されてよい）。

本発明のウイルスベクターは、さらに、「標的化された」ウイルスベクター（例えば、方向付けられた向性を有する）および／または国際特許公報ＷＯ００／２８００４およびＣｈａｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：６１９に記載の「ハイブリッド」パルボウイルス（すなわち、ウイルスＴＲおよびウイルスキャプシドは、異なるパルボウイルス由来である）であってよい。

本発明のウイルスベクターは、さらに、国際特許公報ＷＯ０１／９２５５１に記載の二重パルボウイルス粒子であってよい（その開示は、その全体で参照により本明細書中に援用される）。したがって、一部の実施態様では、二本鎖（二重）ゲノムが、本発明のウイルスキャプシド内にパッケージされ得る。

さらに、ウイルスキャプシドまたはゲノムエレメントは、挿入、欠失および／または置換を含む他の改変を含んでよい。

本明細書において用いられる用語「アミノ酸」は、任意の天然起源アミノ酸、それらの改変された形態、および合成アミノ酸を包含する。

天然起源の、左旋性（Ｌ－）アミノ酸を表２に示す。

あるいは、アミノ酸は、改変されたアミノ酸残基（非限定的な例を表３に示す）であってよく、および／または、翻訳後修飾（例えば、アセチル化、アミド化、ホルミル化、ヒドロキシル化、メチル化、リン酸化または硫酸化）によって改変されたアミノ酸であってよい。

さらに、非天然起源アミノ酸は、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｔｒｕｃｔ．３５：２２５－４９（２００６））によって記載される「非天然」アミノ酸であってよい。これらの非天然アミノ酸は、目的分子をＡＡＶキャプシドタンパク質に化学的に結合するために有利に用いられ得る。

改変されたＡＡＶキャプシドタンパク質およびウイルスキャプシド、および、それを含むウイルスベクター

本発明は、ウイルスキャプシドおよびアミノ酸配列内に突然変異（すなわち、改変）を含むＡＡＶキャプシドタンパク質、および、改変されたＡＡＶキャプシドタンパク質を含むウイルスベクターを提供する。本発明者らは、本明細書に記載のアミノ酸位置での置換のような改変は、制限されずに、表面上にヘパリン硫酸を有する細胞の選択的形質導入および網膜および／または網膜色素上皮の細胞の高い形質導入を含む、改変されたＡＡＶキャプシドタンパク質を含むウイルスベクターに１つまたは複数の望ましい特性を与えることができることを見いだした。

特定の実施態様では、本発明の改変されたＡＡＶキャプシドタンパク質は、ネイティブのＡＡＶ４キャプシドタンパク質のアミノ酸配列、または、制限されないがＡＡＶ５．ＡＡＶ７、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９を含む別のＡＡＶ由来のキャプシドタンパク質の対応する領域において、１つまたは複数の突然変異（例えば、置換）を含む。

本明細書において用いられるアミノ酸配列における「突然変異」または「改変」は、置換、挿入および／または欠失を含み、それぞれ、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれよりも多くのアミノ酸が関与し得る。特定の実施態様では、改変は置換である。例えば、特定の実施態様では、ＡＡＶ４キャプシドタンパク質配列は、アミノ酸位置５３０、５８４、５８５、５８６および／または５８７において、任意の組み合わせで改変される。

本明細書に記載される特定の実施態様では、アミノ酸残基ナンバリングは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０４４９２７（配列番号４）を有するＡＡＶ４キャプシドタンパク質のアミノ酸配列に基づく：
ＭＴＤＧＹＬＰＤＷＬＥＤＮＬＳＥＧＶＲＥＷＷＡＬＱＰＧＡＰＫＰＫＡＮＱＱＨＱＤＮＡＲＧＬＶＬＰＧＹＫＹＬＧＰＧＮＧＬＤＫＧＥＰＶＮＡＡＤＡＡＡＬＥＨＤＫＡＹＤＱＱＬＫＡＧＤＮＰＹＬＫＹＮＨＡＤＡＥＦＱＱＲＬＱＧＤＴＳＦＧＧＮＬＧＲＡＶＦＱＡＫＫＲＶＬＥＰＬＧＬＶＥＱＡＧＥＴＡＰＧＫＫＲＰＬＩＥＳＰＱＱＰＤＳＳＴＧＩＧＫＫＧＫＱＰＡＫＫＫＬＶＦＥＤＥＴＧＡＧＤＧＰＰＥＧＳＴＳＧＡＭＳＤＤＳＥＭＲＡＡＡＧＧＡＡＶＥＧＧＱＧＡＤＧＶＧＮＡＳＧＤＷＨＣＤＳＴＷＳＥＧＨＶＴＴＴＳＴＲＴＷＶＬＰＴＹＮＮＨＬＹＫＲＬＧＥＳＬＱＳＮＴＹＮＧＦＳＴＰＷＧＹＦＤＦＮＲＦＨＣＨＦＳＰＲＤＷＱＲＬＩＮＮＮＷＧＭＲＰＫＡＭＲＶＫＩＦＮＩＱＶＫＥＶＴＴＳＮＧＥＴＴＶＡＮＮＬＴＳＴＶＱＩＦＡＤＳＳＹＥＬＰＹＶＭＤＡＧＱＥＧＳＬＰＰＦＰＮＤＶＦＭＶＰＱＹＧＹＣＧＬＶＴＧＮＴＳＱＱＱＴＤＲＮＡＦＹＣＬＥＹＦＰＳＱＭＬＲＴＧＮＮＦＥＩＴＹＳＦＥＫＶＰＦＨＳＭＹＡＨＳＱＳＬＤＲＬＭＮＰＬＩＤＱＹＬＷＧＬＱＳＴＴＴＧＴＴＬＮＡＧＴＡＴＴＮＦＴＫＬＲＰＴＮＦＳＮＦＫＫＮＷＬＰＧＰＳＩＫＱＱＧＦＳＫＴＡＮＱＮＹＫＩＰＡＴＧＳＤＳＬＩＫＹＥＴＨＳＴＬＤＧＲＷＳＡＬＴＰＧＰＰＭＡＴＡＧＰＡＤＳＫＦＳＮＳＱＬＩＦＡＧＰＫＱＮＧＮＴＡＴＶＰＧＴＬＩＦＴＳＥＥＥＬＡＡＴＮＡＴＤＴＤＭＷＧＮＬＰＧＧＤＱＳＮＳＮＬＰＴＶＤＲＬＴＡＬＧＡＶＰＧＭＶＷＱＮＲＤＩＹＹＱＧＰＩＷＡＫＩＰＨＴＤＧＨＦＨＰＳＰＬＩＧＧＦＧＬＫＨＰＰＰＱＩＦＩＫＮＴＰＶＰＡＮＰＡＴＴＦＳＳＴＰＶＮＳＦＩＴＱＹＳＴＧＱＶＳＶＱＩＤＷＥＩＱＫＥＲＳＫＲＷＮＰＥＶＱＦＴＳＮＹＧＱＱＮＳＬＬＷＡＰＤＡＡＧＫＹＴＥＰＲＡＩＧＴＲＹＬＴＨＨＬ．

本明細書に記載される特定の実施態様では、アミノ酸残基ナンバリングは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＹＰ＿６８０４２６（配列番号２）を有するＡＡＶ２キャプシドタンパク質のアミノ酸配列に基づく：
ＭＡＡＤＧＹＬＰＤＷＬＥＤＴＬＳＥＧＩＲＱＷＷＫＬＫＰＧＰＰＰＰＫＰＡＥＲＨＫＤＤＳＲＧＬＶＬＰＧＹＫＹＬＧＰＦＮＧＬＤＫＧＥＰＶＮＥＡＤＡＡＡＬＥＨＤＫＡＹＤＲＱＬＤＳＧＤＮＰＹＬＫＹＮＨＡＤＡＥＦＱＥＲＬＫＥＤＴＳＦＧＧＮＬＧＲＡＶＦＱＡＫＫＲＶＬＥＰＬＧＬＶＥＥＰＶＫＴＡＰＧＫＫＲＰＶＥＨＳＰＶＥＰＤＳＳＳＧＴＧＫＡＧＱＱＰＡＲＫＲＬＮＦＧＱＴＧＤＡＤＳＶＰＤＰＱＰＬＧＱＰＰＡＡＰＳＧＬＧＴＮＴＭＡＴＧＳＧＡＰＭＡＤＮＮＥＧＡＤＧＶＧＮＳＳＧＮＷＨＣＤＳＴＷＭＧＤＲＶＩＴＴＳＴＲＴＷＡＬＰＴＹＮＮＨＬＹＫＱＩＳＳＱＳＧＡＳＮＤＮＨＹＦＧＹＳＴＰＷＧＹＦＤＦＮＲＦＨＣＨＦＳＰＲＤＷＱＲＬＩＮＮＮＷＧＦＲＰＫＲＬＮＦＫＬＦＮＩＱＶＫＥＶＴＱＮＤＧＴＴＴＩＡＮＮＬＴＳＴＶＱＶＦＴＤＳＥＹＱＬＰＹＶＬＧＳＡＨＱＧＣＬＰＰＦＰＡＤＶＦＭＶＰＱＹＧＹＬＴＬＮＮＧＳＱＡＶＧＲＳＳＦＹＣＬＥＹＦＰＳＱＭＬＲＴＧＮＮＦＴＦＳＹＴＦＥＤＶＰＦＨＳＳＹＡＨＳＱＳＬＤＲＬＭＮＰＬＩＤＱＹＬＹＹＬＳＲＴＮＴＰＳＧＴＴＴＱＳＲＬＱＦＳＱＡＧＡＳＤＩＲＤＱＳＲＮＷＬＰＧＰＣＹＲＱＱＲＶＳＫＴＳＡＤＮＮＮＳＥＹＳＷＴＧＡＴＫＹＨＬＮＧＲＤＳＬＶＮＰＧＰＡＭＡＳＨＫＤＤＥＥＫＦＦＰＱＳＧＶＬＩＦＧＫＱＧＳＥＫＴＮＶＤＩＥＫＶＭＩＴＤＥＥＥＩＲＴＴＮＰＶＡＴＥＱＹＧＳＶＳＴＮＬＱＲＧＮＲＱＡＡＴＡＤＶＮＴＱＧＶＬＰＧＭＶＷＱＤＲＤＶＹＬＱＧＰＩＷＡＫＩＰＨＴＤＧＨＦＨＰＳＰＬＭＧＧＦＧＬＫＨＰＰＰＱＩＬＩＫＮＴＰＶＰＡＮＰＳＴＴＦＳＡＡＫＦＡＳＦＩＴＱＹＳＴＧＱＶＳＶＥＩＥＷＥＬＱＫＥＮＳＫＲＷＮＰＥＩＱＹＴＳＮＹＮＫＳＶＮＶＤＦＴＶＤＴＮＧＶＹＳＥＰＲＰＩＧＴＲＹＬＴＲＮＬ

本明細書に記載される特定の実施態様では、アミノ酸残基ナンバリングは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＳ９９２６４（配列番号９）を有するＡＡＶ９キャプシドタンパク質のアミノ酸配列に基づく：
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本明細書に記載される特定の実施態様では、アミノ酸残基ナンバリングは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＹＰ＿０６８４０９（配列番号５）を有するＡＡＶ５キャプシドタンパク質のアミノ酸配列に基づく：
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本明細書に記載される特定の実施態様では、アミノ酸ナンバリングは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０４９５４２（配列番号１）を有するＡＡＶ１キャプシドタンパク質のアミノ酸配列に基づく：
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本明細書に記載される特定の実施態様では、アミノ酸残基ナンバリングは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＹＰ＿０７７１７８（配列番号７）を有するＡＡＶ７キャプシドタンパク質のアミノ酸配列に基づく：
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本明細書に記載される特定の実施態様では、アミノ酸残基ナンバリングは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＹＰ＿０７７１８０（配列番号８）を有するＡＡＶ８キャプシドタンパク質のアミノ酸配列に基づく：
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本明細書に記載される特定の実施態様では、アミノ酸残基ナンバリングは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＴ４６３３７（配列番号１０）を有するＡＡＶ１０キャプシドタンパク質のアミノ酸配列に基づく：
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本明細書に記載される特定の実施態様では、アミノ酸残基ナンバリングは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＴ４６３３９（配列番号１１）を有するＡＡＶ１１キャプシドタンパク質のアミノ酸配列に基づく：
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本明細書に記載される特定の実施態様では、アミノ酸残基ナンバリングは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１８６３（配列番号３）を有するＡＡＶ３Ｂキャプシドタンパク質のアミノ酸配列に基づく：
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本明細書に記載される特定の実施態様では、アミノ酸残基ナンバリングは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＩ１６６３９（配列番号１２）を有するＡＡＶ１２キャプシドタンパク質のアミノ酸配列に基づく：
ＭＡＡＤＧＹＬＰＤＷ ＬＥＤＮＬＳＥＧＩＲ ＥＷＷＡＬＫＰＧＡＰ ＱＰＫＡＮＱＱＨＱＤ ＮＧＲＧＬＶＬＰＧＹ ＫＹＬＧＰＦＮＧＬＤ ＫＧＥＰＶＮＥＡＤＡ ＡＡＬＥＨＤＫＡＹＤ ＫＱＬＥＱＧＤＮＰＹ ＬＫＹＮＨＡＤＡＥＦ ＱＱＲＬＡＴＤＴＳＦ ＧＧＮＬＧＲＡＶＦＱ ＡＫＫＲＩＬＥＰＬＧ ＬＶＥＥＧＶＫＴＡＰ ＧＫＫＲＰＬＥＫＴＰ ＮＲＰＴＮＰＤＳＧＫ ＡＰＡＫＫＫＱＫＤＧ ＥＰＡＤＳＡＲＲＴＬ ＤＦＥＤＳＧＡＧＤＧ ＰＰＥＧＳＳＳＧＥＭ ＳＨＤＡＥＭＲＡＡＰ ＧＧＮＡＶＥＡＧＱＧ ＡＤＧＶＧＮＡＳＧＤ ＷＨＣＤＳＴＷＳＥＧ ＲＶＴＴＴＳＴＲＴＷ ＶＬＰＴＹＮＮＨＬＹ ＬＲＩＧＴＴＡＮＳＮ ＴＹＮＧＦＳＴＰＷＧ ＹＦＤＦＮＲＦＨＣＨ ＦＳＰＲＤＷＱＲＬＩ ＮＮＮＷＧＬＲＰＫＳ ＭＲＶＫＩＦＮＩＱＶ ＫＥＶＴＴＳＮＧＥＴ ＴＶＡＮＮＬＴＳＴＶ ＱＩＦＡＤＳＴＹＥＬ ＰＹＶＭＤＡＧＱＥＧ ＳＦＰＰＦＰＮＤＶＦ ＭＶＰＱＹＧＹＣＧＶ ＶＴＧＫＮＱＮＱＴＤ ＲＮＡＦＹＣＬＥＹＦ ＰＳＱＭＬＲＴＧＮＮ ＦＥＶＳＹＱＦＥＫＶ ＰＦＨＳＭＹＡＨＳＱ ＳＬＤＲＭＭＮＰＬＬ ＤＱＹＬＷＨＬＱＳＴ ＴＴＧＮＳＬＮＱＧＴ ＡＴＴＴＹＧＫＩＴＴ ＧＤＦＡＹＹＲＫＮＷ ＬＰＧＡＣＩＫＱＱＫ ＦＳＫＮＡＮＱＮＹＫ ＩＰＡＳＧＧＤＡＬＬ ＫＹＤＴＨＴＴＬＮＧ ＲＷＳＮＭＡＰＧＰＰ ＭＡＴＡＧＡＧＤＳＤ ＦＳＮＳＱＬＩＦＡＧ ＰＮＰＳＧＮＴＴＴＳ ＳＮＮＬＬＦＴＳＥＥ ＥＩＡＴＴＮＰＲＤＴ ＤＭＦＧＱＩＡＤＮＮ ＱＮＡＴＴＡＰＨＩＡ ＮＬＤＡＭＧＩＶＰＧ ＭＶＷＱＮＲＤＩＹＹ ＱＧＰＩＷＡＫＶＰＨ ＴＤＧＨＦＨＰＳＰＬ ＭＧＧＦＧＬＫＨＰＰ ＰＱＩＦＩＫＮＴＰＶ ＰＡＮＰＮＴＴＦＳＡ ＡＲＩＮＳＦＬＴＱＹ ＳＴＧＱＶＡＶＱＩＤ ＷＥＩＱＫＥＨＳＫＲ ＷＮＰＥＶＱＦＴＳＮ ＹＧＴＱＮＳＭＬＷＡ ＰＤＮＡＧＮＹＨＥＬ ＲＡＩＧＳＲＦＬＴＨ ＨＬ．

本発明の改変されたウイルスキャプシドタンパク質は、限定されないが、一方のＡＡＶキャプシドタンパク質由来のアミノ酸が他方のＡＡＶキャプシドタンパク質へ置換されるＡＡＶキャプシドタンパク質であってよく、置換および／または挿入アミノ酸は、任意の由来であってよく、さらに、天然起源または部分的または完全に合成であってよい。さらに、本発明のＡＡＶキャプシドタンパク質は、ネイティブのアミノ酸配列または合成のアミノ酸配列を有してよい。

本明細書に記載される、多くのＡＡＶ由来のキャプシドタンパク質の核酸およびアミノ酸配列は、当技術分野で知られている。したがって、例えば、参照ＡＡＶ４キャプシドタンパク質のアミノ酸位置５３０、５８４、５８５、５８６および５８７に「対応する」アミノ酸（単数または複数）は、例えば、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９を含む任意の他のＡＡＶキャプシドタンパク質に関して容易に決定され得る（例えば、当技術分野でよく知られている配列アライメントを用いることにより）。ネイティブのＡＡＶ４キャプシドタンパク質におけるこれらの位置「に対応する」他のＡＡＶ血清型または改変されたＡＡＶキャプシドにおけるアミノ酸位置は、当業者に明らかであり、配列アライメント技術（例えば、ＷＯ２００６／０６６０６６の図７を参照）および／または結晶構造分析（Ｐａｄｒｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：５０４７－５８）を用いて容易に決定され得る。他のＡＡＶ血清型におけるこれらのそれぞれの位置でネイティブのアミノ酸に関して置換され得るアミノ酸残基の例を、表２および表３に示す。

本発明は、本発明の改変されたキャプシドタンパク質は、現在知られまたは後に発見される任意のＡＡＶのキャプシドタンパク質を改変することによって生産され得ることを検討する。さらに、改変されるＡＡＶキャプシドタンパク質は、天然起源ＡＡＶキャプシドタンパク質（例えば、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９キャプシドタンパク質または表１に示される任意のＡＡＶ）であってよいが、そのように制限されない。当業者は、ＡＡＶキャプシドタンパク質に対する様々な操作が当技術分野で知られていることを理解していて、本発明は、天然起源ＡＡＶキャプシドタンパク質の改変に制限されない。例えば、改変されるキャプシドタンパク質は、天然起源ＡＡＶと比較して既に変更を有してよい（例えば、天然起源ＡＡＶキャプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ａ、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１および／またはＡＡＶ１２または現在知られまたは後に発見される任意の他のＡＡＶ血清型に由来する）。そのようなＡＡＶキャプシドタンパク質もまた、本発明の範囲内である。

したがって、特定の実施態様では、改変されるＡＡＶキャプシドタンパク質は、天然起源ＡＡＶに由来してよいが、キャプシドタンパク質内に挿入および／または置換された、および／または、１つまたは複数のアミノ酸の欠失によって変更されている、１つまたは複数の外来配列（例えば、ネイティブのウイルスにとって外因性であるもの）をさらに含む。

したがって、本明細書において、特定のＡＡＶキャプシドタンパク質（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１またはＡＡＶ１２キャプシドタンパク質または表１に示される任意のＡＡＶ由来の任意のキャプシドタンパク質など）に対して言及する場合、ネイティブのキャプシドタンパク質ならびに本発明の改変以外の変更を有するキャプシドタンパク質を包含することが意図される。そのような変更は、置換、挿入および／または欠失を含む。特定の実施態様では、キャプシドタンパク質は、ネイティブのＡＡＶキャプシドタンパク質配列と比較して、その中に挿入された１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０、２０未満、３０未満、４０未満、５０未満、６０未満、または７０未満のアミノ酸（本発明の挿入以外）を含む。本発明の実施態様では、キャプシドタンパク質は、ネイティブのＡＡＶキャプシドタンパク質配列と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０、２０未満、３０未満、４０未満、５０未満、６０未満、または７０未満のアミノ酸置換（本発明によるアミノ酸置換以外）を含む。本発明の実施態様では、キャプシドタンパク質は、ネイティブのＡＡＶキャプシドタンパク質配列と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０、２０未満、３０未満、４０未満、５０未満、６０未満、または７０未満のアミノ酸の欠失（本発明のアミノ酸欠失以外）を含む。

したがって、例えば、用語「ＡＡＶ４キャプシドタンパク質」は、ネイティブのＡＡＶ４キャプシドタンパク質配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０４４９２７を参照）を有するＡＡＶキャプシドタンパク質、ならびに、ネイティブのＡＡＶ４キャプシドタンパク質配列内に置換、挿入および／または欠失（本明細書に記載）を含むものを含む。

特定の実施態様では、ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ネイティブのＡＡＶキャプシドタンパク質配列を有し、または、ネイティブのＡＡＶキャプシドタンパク質配列と少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％または９９％類似または同一であるアミノ酸配列を有する。例えば、特定の実施態様では、「ＡＡＶ４」キャプシドタンパク質は、ネイティブのＡＡＶ４キャプシドタンパク質配列、ならびに、ネイティブのＡＡＶ４キャプシドタンパク質配列と少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％または９９％類似または同一である配列を包含する。

２以上のアミノ酸配列間の配列類似性または同一性を決定する方法は、当技術分野で知られている。配列類似性または同一性は、制限されないが、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２，４８２（１９８１）の局所配列同一性アルゴリズムを含む当技術分野で知られている標準的な技術を用いて、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３（１９７０）の配列同一性アライメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５，２４４４（１９８８）の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピューター化された実行によって（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおける、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２，３８７－３９５（１９８４）により記載されるＢｅｓｔ Ｆｉｔ配列プログラム、または調査によって、決定され得る。

別の適切なアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３－４１０，（１９９０）およびＫａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０，５８７３－５７８７（１９９３）に記載されるＢＬＡＳＴアルゴリズムである。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２６６，４６０－４８０（１９９６）から得られたＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２プログラム；ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ／ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ／ＲＥＡＤＭＥ．ｈｔｍｌである。ＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２は、いくつかの検索パラメーターを用いて、それらは任意選択でデフォルト値に設定される。パラメーターは、動的な値であり、特定の配列の構成および目的の配列が検索されている特定のデータベースの構成に応じて、プログラム自体によって確立されるが；感度を増大させるために値は調節され得る。

さらに、さらなる有用なアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５，３３８９－３４０２によって報告されるギャップ化ＢＬＡＳＴである。

改変されたウイルスキャプシドは、例えば、米国特許第５，８６３，５４１号において説明されている、「キャプシドビヒクル」として用いられ得る。改変されたウイルスキャプシドによってパッケージされ得て細胞へ移行され得る分子は、異種ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド、有機小分子、金属、またはその組み合わせを含む。

異種分子は、ＡＡＶ感染において天然に見られないもの、例えば、野生型ＡＡＶゲノムによってコードされないものとして定義される。さらに、治療的に有用な分子は、宿主標的細胞への分子の移行に関して、キメラウイルスキャプシドの外側と関連し得る。そのような関係がある分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、有機小分子、金属、炭水化物、脂質および／またはポリペプチドを含んでよい。本発明の一実施態様では、治療的に有用な分子は、キャプシドタンパク質に共有結合（すなわち、コンジュゲートまたは化学結合）される。分子を共有結合させる方法は、当業者によって知られている。

他の実施態様では、ウイルスキャプシドは、目的の機能性ＲＮＡまたはポリペプチドをコードする核酸を送達するウイルスベクターの投与の前および／または同時（例えば、互いに分または時間以内）に、特定の細胞の部位をブロックするために投与され得る。例えば、本発明のキャプシドは、特定の細胞上の細胞の受容体をブロックするために送達されてよく、送達ベクターは、その後または同時に投与されてよく、それは、ブロックされた細胞の形質導入を減少させ得て、他の標的（例えば、ＣＮＳ前駆細胞および／または神経芽細胞）の形質導入を高める。

代表的な実施態様によれば、改変されたウイルスキャプシドは、本発明に係る改変されたウイルスベクターの前および／または同時に対象に投与され得る。さらに、本発明は、本発明の改変されたウイルスキャプシドを含む組成物および医薬製剤を提供し；任意選択で、組成物は本発明の改変されたウイルスベクターを含んでもよい。

さらに本明細書において提供されるのは、本明細書に記載のＡＡＶキャプシドタンパク質を含むＡＡＶキャプシドならびにＡＡＶキャプシドを含むウイルスベクターである。また、本発明において、薬学的に許容できる担体内に本発明のウイルスベクターを含む組成物も提供される。

また、本発明は、本発明のキャプシドタンパク質および改変されたウイルスキャプシドをコードする核酸分子（任意選択で、単離された核酸分子）も提供する。さらに提供されるのは、核酸分子を含むベクター、および、本発明の核酸分子および／またはベクターを含む細胞（インビボまたは培地中）である。適切なベクターは、制限されずに、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ、ヘルペスウイルス、ワクシニア、ポックスウイルス、バキュロウイルスなど）、プラスミド、ファージ、ＹＡＣ、ＢＡＣなどを含む。そのような核酸分子、ベクターおよび細胞は、例えば、本明細書に記載の改変されたウイルスキャプシドまたはウイルスベクターの生産のための試薬（例えば、構築物をパッケージまたは細胞をパッケージするヘルパー）として用いられ得る。

本発明に係るウイルスキャプシドは、当技術分野で知られている任意の方法を用いて、例えば、バキュロウイルスからの発現によって（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９８：４７７－４８８）生産され得る。

本発明に係るＡＡＶキャプシドタンパク質の改変は、「選択的」改変である。この手法は、ＡＡＶ血清型間の全体的なサブユニットまたは大きなドメインの交換による以前の研究とは対照的である（例えば、国際特許公報ＷＯ００／２８００４およびＨａｕｃｋ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７７：２７６８－２７７４を参照）。特定の実施態様では、「選択的」改変は、約２０、１８、１５、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１個よりも少ない連続アミノ酸の挿入および／または置換および／または欠失をもたらす。

本発明の改変されたキャプシドタンパク質およびキャプシドは、現在知られまたは後に同定される任意の他の改変をさらに含んでよい。

例えば、本発明のＡＡＶキャプシドタンパク質およびウイルスキャプシドは、例えば、国際特許公報ＷＯ００／２８００４に記載されるように、別のウイルス、任意選択で別のパルボウイルスまたはＡＡＶ由来のキャプシドサブユニットの全てまたは一部を含むことができるという点で、キメラであり得る。

ウイルスキャプシドは、所望の標的組織（単数または複数）上に存在する細胞表面分子と相互作用するようにウイルスキャプシドを方向付ける、標的化配列を含む標的化ウイルスキャプシドであってよい（例えば、ウイルスキャプシドにおいて置換または挿入される）（例えば、国際特許公報ＷＯ００／２８００４およびＨａｕｃｋ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７７：２７６８－２７７４）；Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １７：３５３－３６１（２００６）［ＡＡＶキャプシドサブユニットの５２０位および／または５８４位におけるインテグリン受容体結合モチーフＲＧＤの挿入を記載］；および米国特許第７，３１４，９１２号［ＡＡＶ２キャプシドサブユニットのアミノ酸位置４４７、５３４、５７３および５８７に続くＲＧＤモチーフを含むＰ１ペプチドの挿入を記載］を参照）。挿入を許容するＡＡＶキャプシドサブユニット内の他の位置は、当技術分野で知られている（例えば、Ｇｒｉｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：９６４－９７５（２００１）によって記載される４４９位および５８８位）。

代表的な実施態様では、標的化配列は、特定の細胞型（単数または複数）に感染を方向付ける、ウイルスキャプシド配列（例えば、自律的パルボウイルスキャプシド配列、ＡＡＶキャプシド配列、または任意の他のウイルスキャプシド配列）であってよい。

別の非限定的な例として、ヘパリン結合ドメイン（例えば、呼吸器合胞体ウイルスヘパリン結合ドメイン）が、ＨＳ受容体に典型的に結合しないキャプシドサブユニット（例えば、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５）に挿入または置換されて、生じる突然変異体にヘパリン結合を与え得る。

代表的な実施態様では、外因性の標的化配列は、改変されたＡＡＶキャプシドタンパク質を含むウイルスベクターまたはウイルスキャプシドの向性を変更するペプチドをコードする任意のアミノ酸配列であってよい。特定の実施態様では、標的化ペプチドまたはタンパク質は、天然起源であってよく、または代わりに、完全または部分的に合成であってよい。例示的な標的化配列は、細胞表面受容体および糖タンパク質に結合するリガンドおよび他のペプチド、例えば、ＲＧＤペプチド配列、ブラジキニン、ホルモン、ペプチド増殖因子（例えば、上皮増殖因子、神経増殖因子、線維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、インスリン様増殖因子ＩおよびＩＩなど）、サイトカイン、メラニン形成細胞刺激ホルモン（例えば、α、βまたはγ）、神経ペプチドおよびエンドルフィンなど、および、細胞をそれらの同起源受容体に標的化する能力を保持するそれらのフラグメントを含む。他の例示的なペプチドおよびタンパク質は、サブスタンスＰ、ケラチノサイト増殖因子、神経ペプチドＹ、ガストリン放出ペプチド、インターロイキン２、ニワトリ卵白リゾチーム、エリスロポエチン、ゴナドリベリン、コルチコスタチン（ｃｏｒｔｉｃｏｓｔａｔｉｎ）、β－エンドルフィン、ロイシンエンケファリン、リモルフィン、α－ネオ－エンケファリン、アンジオテンシン、ニューマジン（ｐｎｅｕｍａｄｉｎ）、血管作動性ペプチド、ニューロテンシン、モチリン、および、上述のそれらのフラグメントを含む。またさらなる代替として、毒素（例えば、破傷風毒素またはヘビ毒素、例えばα－ブンガロトキシンなど）由来の結合ドメインは、標的化配列としてキャプシドタンパク質内に置換され得る。また、さらなる代表的な実施態様では、ＡＡＶキャプシドタンパク質は、Ｃｌｅｖｅｓ（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ７：Ｒ３１８（１９９７））によって説明されるように、ＡＡＶキャプシドタンパク質への、「非古典的な」インポート／エキスポートシグナルペプチド（例えば、線維芽細胞増殖因子－１および－２、インターロイキン１、ＨＩＶ－１ Ｔａｔタンパク質、ヘルペスウイルスＶＰ２２タンパク質など）の置換によって改変され得る。特定の細胞による取り込みを方向付けるペプチドモチーフも包含されて、例えば、ＦＶＦＬＰペプチドモチーフは、肝臓細胞による取り込みをトリガーする。

任意の目的の細胞型を認識するペプチドを同定するために、ファージディスプレイ技術、ならびに、当技術分野で知られている他の技術が用いられ得る。

標的化配列は、受容体を含む細胞表面結合部位に対して標的化する任意のペプチドをコードしてよい（例えば、タンパク質、炭水化物、糖タンパク質またはプロテオグリカン）。細胞表面結合部位の例は、限定されないが、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、および他のグリコサミノグリカン、シアル酸部分、ポリシアル酸部分、糖タンパク質、およびガングリオシド、ＭＨＣＩ糖タンパク質、膜糖タンパク質上に見られる炭水化物成分（マンノース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン、フコース、ガラクトースなどを含む）を含む。

またさらなる代替として、標的化配列は、細胞内への侵入を標的化する別の分子に対する化学的結合のために用いられ得るペプチドであってよい（例えば、それらのＲ基を通して化学的に結合され得るアルギニンおよび／またはリジン残基を含んでよい）。

本発明の前述の実施態様は、本明細書において記載されるように、異種核酸を細胞または対象に送達するために用いられ得る。したがって、一実施態様では、本発明は、核酸分子を細胞内に導入する方法を提供し、本発明のウイルスベクターおよび／または組成物と細胞を接触させるステップを含む。

本明細書においてさらに提供されるのは、核酸分子を対象に送達する方法であり、本発明のウイルスベクターおよび／または本発明の組成物を対象に投与するステップを含む。一部の実施態様では、ウイルスベクターまたは組成物は、対象の中枢神経系に投与される。

さらに本明細書において提供されるのは、表面上にヘパラン硫酸を有する細胞を選択的に形質導入する方法であり、本発明のウイルスベクターおよび／または本発明の組成物と細胞を接触させるステップを含む。

本発明は、目的の核酸分子を、網膜および／または網膜色素上皮の細胞に送達する方法をさらに提供し、本発明のウイルスベクターと細胞を接触させるステップを含み、ここで、ウイルスベクターは、目的の核酸分子を含む。この方法の一部の実施態様では、目的の核酸分子は、治療的タンパク質または治療的ＲＮＡをコードする。

上述の方法の一部の実施態様では、網膜および／または網膜色素上皮の細胞は、対象内であってよく、一部の実施態様では、対象はヒト対象であってよい。

本発明は、対象の眼における障害または欠陥を治療する方法をさらに提供し、対象に、本発明のウイルスベクターを硝子体内に投与するステップを含み、ウイルスベクターは、対象の眼における障害または欠陥を治療するのに効果的な治療的タンパク質または治療的ＲＮＡをコードする核酸分子を含む。

さらなる実施態様では、本発明は、網膜および／または網膜色素上皮の細胞を選択的に形質導入する方法を提供し、本明細書に記載のＡＡＶキャプシドタンパク質を含むウイルスベクターと細胞を接触させるステップを含む。

当業者は、一部のＡＡＶキャプシドタンパク質については、対応するアミノ酸位置がウイルスにおいて部分的または完全に存在するかどうか、またはあるいは完全に不存在であるかどうかに応じて、対応する改変が挿入および／または置換であることを理解している。同様に、ＡＡＶ４以外のＡＡＶを改変する場合、特定のアミノ酸位置（単数または複数）は、ＡＡＶ４における位置とは異なってよい（例えば、ＡＡＶ４におけるＳ２５７に対応するアミノ酸残基の代表的な例を示す表４を参照）。本明細書における他のどこかに議論されるように、対応するアミノ酸位置（単数または複数）は、当業者公知の技術を用いて当業者に容易に明らかである。

上述の改変は、互いにおよび／または現在知られまたは後に発見される任意の他の改変と組み合わせて、本発明のキャプシドタンパク質またはキャプシド内へ組み込まれ得る。

また、本発明は、本発明の改変されたキャプシドタンパク質およびキャプシドを含むウイルスベクターも包含する。特定の実施態様では、ウイルスベクターは、パルボウイルスベクター（例えば、パルボウイルスキャプシドおよび／またはベクターゲノムを含む）、例えば、ＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶキャプシドおよび／またはベクターゲノムを含む）である。代表的な実施態様では、ウイルスベクターは、ベクターゲノムおよび本発明の改変されたキャプシドサブユニットを含む改変されたＡＡＶキャプシドを含む。

例えば、代表的な実施態様では、ウイルスベクターは、（ａ）本発明の改変されたキャプシドタンパク質を含む、改変されたウイルスキャプシド（例えば、改変されたＡＡＶキャプシド）；および（ｂ）末端反復配列（例えば、ＡＡＶ ＴＲ）を含む核酸、を含み、末端反復配列を含む核酸は、改変されたウイルスキャプシドによってキャプシド形成される。核酸は、任意選択で２つの末端反復（例えば、２つのＡＡＶ ＴＲ）を含んでよい。

代表的な実施態様では、ウイルスベクターは、目的のタンパク質、ペプチドおよび／または機能性ＲＮＡをコードする異種核酸分子を含む、組み換えウイルスベクターである。

本発明の改変されたキャプシドタンパク質、ウイルスキャプシドおよびウイルスベクターは、それらのネイティブの状態で示されたアミノ酸を既定の位置に有する（すなわち、突然変異体ではない）キャプシドタンパク質、キャプシドおよびウイルスベクターを除外することが、当業者によって理解される。

組み換えウイルスベクター
本発明のウイルスベクターは、インビトロ、エクスビボ、およびインビボでの細胞への核酸の送達に有用である。特に、ウイルスベクターは、哺乳類を含む動物の細胞に核酸を送達または移行するために有利に用いられ得る。

任意の目的の異種核酸配列（単数または複数）は、本発明のウイルスベクターにおいて送達され得る。目的の核酸は、治療的（例えば、医療または獣医用途のため）または免疫原性（例えば、ワクチンのため）タンパク質および／または機能性または治療的ＲＮＡ分子を含む、ポリペプチドをコードする核酸を含む。

ポリペプチドをコードする異種核酸配列は、レポーターポリペプチド（例えば、酵素）をコードするものを含む。レポーターポリペプチドは、当技術分野で知られていて、限定されないが、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、β－ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ルシフェラーゼ、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を含む。

任意選択で、異種核酸は、分泌型ポリペプチド（例えば、そのネイティブの状態で分泌型ポリペプチドであるポリペプチド、または、例えば当技術分野で知られている分泌型シグナル配列との動作可能な関連性によって分泌されるように改変されているポリペプチド）をコードする。

あるいは、本発明の特定の実施態様では、異種核酸は、アンチセンス核酸、リボザイム（例えば、米国特許第５，８７７，０２２号に記載される）、スプライセオソームが介在するトランス－スプライシングに作用するＲＮＡ（Ｐｕｔｔａｒａｊｕ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：２４６；米国特許第６，０１３，４８７号；米国特許第６，０８３，７０２号を参照）、遺伝子サイレンシングを仲介するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡを含む干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）（Ｓｈａｒｐ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：２４３１を参照）、および、他の非翻訳ＲＮＡ、例えば、「ガイド」ＲＮＡ（Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：４９２９；Ｙｕａｎらの米国特許第５，８６９，２４８号）などをコードしてよい。例示的な非翻訳ＲＮＡは、多剤耐性（ＭＤＲ）遺伝子産物に対するＲＮＡｉ（例えば、腫瘍を治療および／または予防するため、および／または、化学療法による損傷を防ぐために心臓へ投与するため）、ミオスタチンに対するＲＮＡｉ（例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィーのため）、ＶＥＧＦに対するＲＮＡｉ（例えば、腫瘍を治療および／または予防するため）、ホスホランバンに対するＲＮＡｉ（例えば、心血管系の疾患を治療するため、例えば、Ａｎｄｉｎｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．１０：１３２－１４２（２００８）およびＬｉ ｅｔ ａｌ．Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｉｎ．２６：５１－５５（２００５）を参照）；ホスホランバン阻害またはドミナントネガティブ分子、例えばホスホランバンＳ１６Ｅ（例えば、心血管系の疾患を治療するため、例えば、Ｈｏｓｈｉｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：８６４－８７１（２００２）を参照）、アデノシンキナーゼに対するＲＮＡｉ（例えば、てんかんのため）、および、病原生物およびウイルスに対して方向付けられるＲＮＡｉ（例えば、肝炎Ｂおよび／またはＣウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ＣＭＶ、単純ヘルペスウイルス、ヒト乳頭腫ウイルスなど）を含む。

さらに、選択的スプライシングに方向付ける核酸配列が送達され得る。説明すると、ジストロフィンエクソン５１の５’および／または３’スプライス部位に相補のアンチセンス配列（または他の阻害配列）は、Ｕ１またはＵ７核内低分子（ｓｎ）ＲＮＡプロモーターとともに送達されて得て、このエクソンのスキッピングを誘導する。例えば、アンチセンス／阻害配列（単数または複数）の５’に位置するＵ１またはＵ７ ｓｎＲＮＡプロモーターを含むＤＮＡ配列は、本発明の改変されたキャプシドにおいてパッケージおよび送達され得る。

また、ウイルスベクターは、宿主染色体上の遺伝子座とホモロジーを共有して組み換える異種核酸を含んでもよい。この手法は、例えば、宿主細胞における遺伝的欠陥を修正するために使用され得る。

さらなる代替として、異種核酸は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで細胞において望ましく生産される任意のポリペプチドをコードしてよい。例えば、ウイルスベクターは、培養細胞へ導入され得て、発現された遺伝子産物はそこから単離される。

目的の異種核酸（単数または複数）は、適切な制御配列と動作可能に関連され得ることが当業者によって理解される。例えば、異種核酸は、発現制御配列、例えば、転写／翻訳制御シグナル、複製起点、ポリアデニル化シグナル、内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）、プロモーター、および／またはエンハンサーなどと動作可能に関連され得る。

さらに、目的の異種核酸（単数または複数）の調節された発現は、転写後レベルで、例えば、特定の部位でのスプライシング活性を選択的にブロックするオリゴヌクレオチド、小分子および／または他の化合物の存在または不存在によって異なるイントロンの選択的スプライシングを調節することによって、達成され得る（例えば、ＷＯ２００６／１１９１３７に記載される）。

当業者は、様々なプロモーター／エンハンサーエレメントが、所望のレベルおよび組織特異的な発現に応じて用いられ得ることを理解している。プロモーター／エンハンサーは、所望の発現パターンに応じて構成的または誘導性であってよい。プロモーター／エンハンサーは、ネイティブまたは外来であってよく、天然または合成の配列であってよい。外来によって、転写開始領域が導入される野生型宿主には転写開始領域が見られないことが意図される。

特定の実施態様では、プロモーター／エンハンサーエレメントは、標的細胞または治療される対象に対してネイティブであってよい。代表的な実施態様では、プロモーター／エンハンサーエレメントは、異種核酸配列に対してネイティブであってよい。プロモーター／エンハンサーエレメントは、一般に、目的の標的細胞（単数または複数）において機能するように選択される。さらに、特定の実施態様では、プロモーター／エンハンサーエレメントは、哺乳類のプロモーター／エンハンサーエレメントである。プロモーター／エンハンサーエレメントは、構成的または誘導性であってよい。

誘導性発現制御エレメントは、典型的に、異種核酸配列（単数または複数）の発現に対して制御を提供することが望ましい適用において有利である。遺伝子送達のための誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントは、組織特異的または好適プロモーター／エンハンサーエレメントであってよく、筋肉特異的または好適（心筋、骨格筋および／または平滑筋特異的または好適を含む）、神経組織特異的または好適（脳特異的または好適を含む）、眼特異的または好適（網膜特異的および角膜特異的を含む）、肝臓特異的または好適、骨髄特異的または好適、膵臓特異的または好適、脾臓特異的または好適、および肺特異的または好適プロモーター／エンハンサーエレメントを含む。他の誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントは、ホルモン誘導性および金属誘導性エレメントを含む。例示的な誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントは、限定されないが、Ｔｅｔ ｏｎ／ｏｆｆエレメント、ＲＵ４８６誘導性プロモーター、エクジソン誘導性プロモーター、ラパマイシン誘導性プロモーター、および、メタロチオネインプロモーターを含む。

異種核酸配列（単数または複数）が転写されて、それから、標的細胞内で翻訳される実施態様では、特異的な開始シグナルが、挿入されたタンパク質コード配列の効率的な翻訳のために一般的に含まれる。これらの外因性の翻訳制御配列は、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含んでよく、天然および合成の両方の様々な起源であってよい。

本発明に係るウイルスベクターは、分裂および非分裂細胞を含む広範な細胞に異種核酸を送達するための手段を提供する。ウイルスベクターは、目的の核酸を細胞にインビトロで送達するため、例えば、ポリペプチドをインビトロで生産するため、または、エクスビボの遺伝子療法のために、用いられ得る。ウイルスベクターは、例えば、免疫原性または治療的ポリペプチドまたは機能性ＲＮＡを発現するために、それを必要とする対象に、核酸を送達する方法においてさらに有用である。このようにして、ポリペプチドまたは機能性ＲＮＡは、対象においてインビボで生産され得る。対象は、ポリペプチドが不足しているのでポリペプチドを必要とし得る。さらに、当該方法は、対象におけるポリペプチドまたは機能性ＲＮＡの生産が何らかの有益な効果を与え得るので実行され得る。

またウイルスベクターは、培養細胞または対象において目的のポリペプチドまたは機能性ＲＮＡを生産するために用いられてもよい（例えば、ポリペプチドを生産するため、または、例えばスクリーニング方法と組み合わせて対象に対する機能性ＲＮＡの効果を観察するため、バイオリアクターとして対象を用いる）。

一般に、本発明のウイルスベクターは、治療的ポリペプチドまたは機能性ＲＮＡを送達することが有益であり得る任意の病状を治療および／または予防するために、ポリペプチドまたは機能性ＲＮＡをコードする異種核酸を送達するために用いられ得る。本発明の例示的な病状は、限定されないが、加齢黄斑変性、レーバー先天性黒内障タイプ１、レーバー先天性黒内障タイプ２、網膜色素変性症、網膜分離症、色覚異常、色盲、先天性停止性夜盲症、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

遺伝子導入は、病状のための治療を理解および提供するための実質的な潜在的使用を有する。欠損遺伝子が知られていてクローニングされている多くの遺伝性疾患が存在する。一般に、上記の病状は、２つのクラス：一般に劣性の遺伝性である、通常は酵素の不足状態、および、調節または構成的タンパク質に関わり得て、典型的に優性の遺伝性である非平衡状態に分けられる。不足状態の疾患については、遺伝子導入は、影響を受けた組織内に補充療法のために正常遺伝子を運ぶために、ならびに、アンチセンス突然変異を用いた疾患に関する動物モデルを作製するために、用いられてよい。非平衡病状については、遺伝子導入は、モデル系における病状を作製するために用いられてよく、それから、病状に対抗しようとする試みにおいて用いられてよい。したがって、本発明に係るウイルスベクターは、遺伝性疾患の治療および／または予防を可能にする。

また、本発明に係るウイルスベクターは、機能性ＲＮＡを細胞にインビトロまたはインビボで提供するために用いられてもよい。細胞内での機能性ＲＮＡの発現は、例えば、細胞による特定の標的タンパク質の発現を減少させることができる。したがって、機能性ＲＮＡは、それを必要とする対象において特定のタンパク質の発現を低減させるために投与され得る。また、機能性ＲＮＡは、遺伝子発現および／または細胞生理機能を調節するために、例えば、細胞または組織培養系を最適化するために、細胞にインビトロで、またはスクリーニング方法において、投与されてもよい。

加えて、本発明に係るウイルスベクターは、診断およびスクリーニング方法での使用を見いだし、それにより、目的の核酸は、細胞培養系、またはあるいはトランスジェニック動物モデルにおいて一時的または安定的に発現される。

一部の実施態様では、本発明のウイルスベクターは、対象において免疫応答を誘導するために用いられ得て、ウイルスベクターは、免疫原をコードするヌクレオチド配列を含んでよい。

また、本発明のウイルスベクターは、当業者に明らかなように、制限されないが、遺伝子ターゲッティング、クリアランス、転写、翻訳などを評価するためのプロトコルでの使用を含む様々な非治療的目的のためにも用いられ得る。ウイルスベクターは、安全性（拡散、毒性、免疫原性など）を評価する目的のために用いられてもよい。そのようなデータは、例えば、臨床有効性の評価の前に規制上の承認プロセスの一部として米国食品医薬品局によって考慮される。

あるいは、ウイルスベクターは、細胞にエクスビボで投与されてよく、変更された細胞が、対象に投与される。異種核酸を含むウイルスベクターは、細胞内に導入されて、細胞が対象に投与されて、異種核酸は対象において発現され得る。

対象、医薬製剤、および投与モード
本発明に係るウイルスベクターおよびキャプシドは、獣医および医療用途の両方において使用を見いだす。適切な対象は、鳥類および哺乳類の両方を含む。本明細書において用いられる用語「鳥類」は、制限されないが、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、ターキー、キジ、オウム、インコなどを含む。本明細書において用いられる用語「哺乳類」は、制限されないが、ヒト、非ヒト霊長類、齧歯類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギなどを含む。ヒト対象は、新生児、幼児、青少年、成人および老人対象を含む。

代表的な実施態様では、対象は、本発明の方法を「必要とする」。

特定の実施態様では、本発明は、薬学的に許容できる担体内に、本発明のウイルスベクターおよび／またはキャプシド、および任意選択で、他の医療薬剤、医薬品、安定化剤、バッファー、担体、アジュバン、希釈剤などを含む、医薬組成物を提供する。注入のために、担体は典型的に液体である。他の投与方法のために、担体は、固体または液体のいずれかであってよい。吸入投与のために、担体は呼吸用であり、任意選択で固体または液体の微粒子形態であってよい。

「薬学的に許容できる」によって、毒性または他の方法で望ましくないようなものでない材料を意味し、すなわち、材料は、いかなる望ましくない生物学的効果も引き起こさずに対象に投与され得る。

本発明の一態様は、核酸を細胞にインビトロで移行する方法である。ウイルスベクターは、特定の標的細胞に適切な標準的な形質導入方法に従って、適切な感染多重度で細胞へ導入され得る。投与するウイルスベクターの力価は、標的細胞のタイプおよび数、および特定のウイルスベクターに応じて変化し得て、過度の実験をせずに当業者によって決定され得る。代表的な実施態様では、少なくとも約１０^３感染単位、任意選択で少なくとも約１０^５感染単位が細胞に導入される。

ウイルスベクターが導入される細胞（単数または複数）は、制限されないが、眼の細胞（網膜細胞、網膜色素上皮、および角膜細胞を含む）を含む、任意のタイプであってよい。

ウイルスベクターは、改変された細胞を対象に投与する目的のために、インビトロで細胞内に導入され得る。特定の実施態様では、細胞は対象から取り出されていて、ウイルスベクターがその中に導入されて、それから、細胞は元の対象内に投与される。エクスビボでの操作のために対象から細胞を取り出して、その後に元の対象に導入する方法は、当技術分野で知られている（例えば、米国特許第５，３９９，３４６号を参照）。あるいは、組み換えウイルスベクターは、ドナー対象から細胞内に、培養細胞内に、または、任意の他の適切な由来の細胞内に導入され得て、細胞は、それを必要とする対象（すなわち、「レシピエント」対象）に投与される。

エクスビボでの核酸送達に適切な細胞は、上述されるとおりである。対象へ投与する細胞の用量は、対象の年齢、症状および種、細胞のタイプ、細胞によって発現される核酸、投与モードなどによって変化する。典型的に、少なくとも約１０^２～約１０^８細胞または少なくとも約１０^３～約１０^６細胞が、薬学的に許容できる担体において投与量あたり投与される。特定の実施態様では、ウイルスベクターを用いて形質導入された細胞は、調剤担体と組み合わせて治療有効量または予防有効量で対象に投与される。

本発明のさらなる態様は、対象にウイルスベクターおよび／またはウイルスキャプシドを投与する方法である。それを必要とするヒト対象または動物への本発明に係るウイルスベクターおよび／またはキャプシドの投与は、当技術分野で知られている任意の手段によるものであってよいが、特定の実施態様では、投与は硝子体内である。任意選択で、ウイルスベクターおよび／またはキャプシドは、薬学的に許容できる担体において治療効果的または予防効果的な投与量で送達される。

対象に投与されるウイルスベクターおよび／またはキャプシドの用量は、投与モード、治療および／または予防されるべき疾患または症状、個々の対象の症状、特定のウイルスベクターまたはキャプシド、および、送達されるべき核酸などに依存し、日常的な様式で決定され得る。治療的効果を達成するための例示的な投与量は、少なくとも約１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^３、１０^１４、１０^１５形質導入単位、任意選択で、約１０^８～１０^１３形質導入単位の力価である。

特定の実施態様では、１よりも多い投与（例えば、２、３、４またはそれよりも多い投与）が、様々な間隔、例えば、毎日、毎週、毎月、毎年などの期間にわたって、所望のレベルの遺伝子発現を達成するために用いられ得る。

注入剤は、従来の形態で、液体の溶液または懸濁液のいずれかとして、注入前の液体中の溶液または懸濁液に適切な固体形態、またはエマルションとして、調製され得る。あるいは、本発明のウイルスベクターおよび／またはウイルスキャプシドは、全身性よりむしろ局所的に、例えば、デポーまたは徐放性製剤において投与してよい。さらに、ウイルスベクターおよび／またはウイルスキャプシドは、外科的に移植可能なマトリックス（例えば、米国特許公報番号ＵＳ－２００４－００１３６４５－Ａ１に記載）に付着されて送達され得る。

ＣＮＳの障害は、網膜、後方管（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ｔｒａｃｔ）および視神経に関わる眼の障害を含む（例えば、網膜色素変性症、糖尿病性網膜症および他の網膜変性疾患、ブドウ膜炎、加齢黄斑変性、緑内障）。

全てでないにしてもほとんどの眼の疾患および障害は、３つのタイプ：（１）血管新生、（２）炎症、および（３）変性の示度の１つまたは複数と関連する。本発明の送達ベクターは、抗－血管新生因子；抗－炎症性因子；細胞変性を遅れさせる、細胞スペアリング（ｓｐａｒｉｎｇ）を促進する、または細胞増殖を促進する因子を送達する、および前述の組み合わせのために用いられ得る。

糖尿病性網膜症は、例えば、血管新生によって特徴付けられる。糖尿病性網膜症は、１つまたは複数の抗－血管新生因子を、眼内（例えば、硝子体内）または眼周囲（例えば、テノン嚢下領域内）のいずれかに送達することによって治療され得る。１つまたは複数の神経栄養因子は、眼内（例えば、硝子体内）または眼周囲のいずれかに、共送達されてもよい。

ブドウ膜炎は、炎症を含む。１つまたは複数の抗－炎症性因子は、本発明の送達ベクターの眼球内（例えば、硝子体または前房）投与によって投与され得る。

網膜色素変性症は、比較により、網膜変性によって特徴付けられる。代表的な実施態様では、網膜色素変性症は、１つまたは複数の神経栄養因子をコードする送達ベクターの眼球内（例えば、硝子体投与）によって治療され得る。

加齢黄斑変性は、血管新生および網膜変性の両方を含む。この障害は、１つまたは複数の神経栄養因子をコードする本発明の送達ベクターを眼内（例えば、硝子体内）に、および／または、１つまたは複数の抗－血管新生因子を眼内にまたは眼周囲（例えば、テノン嚢下領域内）に、投与することによって治療され得る。

緑内障は、眼圧の増大および網膜神経節細胞の喪失によって特徴付けられる。緑内障のための治療は、本発明の送達ベクターを用いて興奮毒性損傷から細胞を保護する１つまたは複数の神経保護剤の投与を含む。そのような薬剤は、眼内に、任意選択で硝子体内に送達される、Ｎ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）拮抗薬、サイトカイン、および神経栄養因子を含む。

特定の実施態様では、ベクターは、米国特許第７，０７１，１７２号に記載の分泌型シグナルを含んでよい。

また、ウイルスベクターおよび／またはキャプシドは、網膜、角膜および／または視神経のような、眼の異なる領域に投与され得る。

特定の実施態様では、ウイルスベクターおよび／またはキャプシドは、液体製剤において、ＣＮＳ内の所望の領域または区画へ直接注入（例えば、定位的注入）によって投与される。他の実施態様では、ウイルスベクターおよび／またはキャプシドは、所望の領域への局所適用によって、またはエアロゾル製剤の経鼻内投与によって、提供され得る。眼への投与は、液滴の局所適用によるものであってよい。さらなる代替として、ウイルスベクターおよび／またはキャプシドは、固体の徐放製剤として投与され得る（例えば、米国特許第７，２０１，８９８号を参照）。

本発明を説明したが、同じものが以下の実施例においてより詳細に説明されて、それは、説明目的のみのために本明細書中に含まれて、本発明に対する制限を意図しない。

実施例１
組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）は、網膜の遺伝子導入のための好ましいベクターとなっている。硝子体を通した網膜へのｒＡＡＶの送達は、網膜を効率的に形質導入する少数の血清型をもたらす。これらの少数の血清型は、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）に結合するキャプシドタンパク質を有する。キャプシドと受容体との間の相互作用は、改変された受容体の相互作用を有するｒＡＡＶキャプシドを用いて評価された。ウイルスは、成体マウスにおいて硝子体内に送達されて、８週後に評価された。ｒＡＡＶ２のヘパラン硫酸（ＨＳ）結合残基における突然変異は、内側網膜の形質導入を劇的に低減させた。非ＨＳ結合ｒＡＡＶ１のエレメントを、デザイナーキメラキャプシド、ｒＡＡＶ２．５を用いてｒＡＡＶ２に付加した。ｒＡＡＶ２．５は、網膜血管に沿って形質導入して、ミューラーグリア細胞においてより多い発現を示した。ｒＡＡＶ１へのＨＳ結合の付加は、ｒＡＡＶ２．５で観察される発現パターンに似た蛍光の増大を示した。ＨＳおよびガラクトースの二重受容体相互作用を、最近になって設計されたキメラキャプシド、ｒＡＡＶ２Ｇ９を用いて評価して、ガラクトース結合の付加がキャプシド形質導入を高めるかどうかを決定した。ｒＡＡＶ２Ｇ９は、ｒＡＡＶ２と比較して、眼底による変更された蛍光パターンを明らかにした。ｒＡＡＶ２Ｇ９の形質導入プロファイルは、ミューラーグリアに対する向性におけるシフトを示した。合わせると、ＨＳ結合は、成功的な硝子体内形質導入に必須であり、この形質導入は、ガラクトース結合の付加によって特定の網膜細胞に曲げられ得る。

実施例２．ヘパラン硫酸結合は、高い形質導入のために、硝子体内送達されたアデノ随伴ウイルスベクターの網膜における蓄積を促進する
多くのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型は、網膜下の空間に送達された場合に網膜を効率的に形質導入するが、内境界膜（ＩＬＭ）に起因して、硝子体に送達された場合は制限された成功を示す。ｒＡＡＶ２の網膜下送達およびそのＨＳ結合欠損キャプシドは、ＨＳ非依存性のメカニズムによって引き起こされる外側網膜のｒＡＡＶ２形質導入を示した。しかしながら、ＨＳ切断されたｒＡＡＶ２の硝子体内送達は、ｒＡＡＶ２と比較して形質導入において３００倍の低減をもたらす。ＡＡＶ網膜トラフィッキングの蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）は、ＩＬＭにおけるＡＡＶ２蓄積のメカニズムが、ＨＳ結合によって影響を受けることを明らかにした。このメカニズムは、エクスビボでヒト網膜に対して試験されて、ＨＳ結合ＡＡＶ２キャプシドでのみ同様の蓄積を示した。ＨＳ結合が他のＡＡＶ血清型に適合してそれらの形質導入を高めることができるかどうか評価するために、ＡＡＶ１およびＡＡＶ８を、単一アミノ酸突然変異によってＨＳに結合するように改変して、マウスにおいて試験した。ＡＡＶ１およびＡＡＶ８の両方のＨＳ結合突然変異体は、それらの非ＨＳ結合の親キャプシドよりも高い硝子体内形質導入を有した。ＨＳ結合がＡＡＶ２向性に対して有する影響を理解するために、二重グリカン使用（ｄｕａｌ ｇｌｙｃａｎ ｕｓａｇｅ）のキメラキャプシドを、マウスにおいて硝子体内で試験した。ＨＳ結合のみと比較して、これらのキメラキャプシドは、向性における変化に相関する高い形質導入を示した。合わせると、これは、ＨＳ結合が、硝子体からＩＬＭへＡＡＶキャプシドを隔離する役割を果たすが、向性に影響しないことを示す。ＨＳ結合キャプシドの高い網膜形質導入は、硝子体内送達に関する種を超えたキャプシド工学のための合理的な設計戦略を提供する。

本研究は、ＨＳＰＧ結合が、網膜におけるより多い蓄積および形質導入と関連することを示す。我々は、この蓄積が、マウスおよびヒト網膜において保存されることを確認した。任意のＡＡＶキャプシドに対するＨＳＰＧ結合の付加は、効率的な硝子体内形質導入を示す血清型の数を増大させることができる。

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、遺伝子導入適用のためのベクターとして広く研究されている、小さな（２５ｎｍ）非病原ウイルスである。ウイルスは、２つの部分：ウイルスゲノムおよびタンパク質キャプシドからなる。ウイルスゲノムを所望の導入遺伝子によって大きく置き換えて、遺伝子送達に用いられる組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターを作製することができる。タンパク質キャプシドは、様々なグリカンおよび細胞表面受容体を介した細胞の付着および侵入を担う。１１個の天然起源のＡＡＶ血清型が存在し、ＡＡＶ１～ＡＡＶ１１と表わされる。グリカンおよび受容体は、いくつかのＡＡＶ血清型に関して説明されている。ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）は、ｒＡＡＶ２およびｒＡＡＶ３の両方の細胞侵入に用いられることが示されている。ｒＡＡＶ６は、ＨＳＰＧおよびシアル酸との二重グリカン相互作用を示すが；ＨＳＰＧ結合のみでは細胞侵入に不十分である。シアル酸の様々な結合は、ｒＡＡＶ１、ｒＡＡＶ４、およびｒＡＡＶ５血清型の形質導入に重要である。Ｎ結合ガラクトースは、ｒＡＡＶ９血清型の形質導入に用いられる。細胞表面上に発現されたグリカンは、様々なＡＡＶキャプシドで観察される組織および細胞の向性を指示する。これらのグリカンに対する付着に加えて、ＡＡＶ血清型は、ヒト増殖因子受容体、インテグリン、およびラミニン受容体を含む、侵入のための細胞受容体と相互作用する。

ｒＡＡＶは、網膜遺伝子導入に関する見込みを示している。上述のキャプシドの影響に加えて、網膜への投与経路は、導入遺伝子の発現プロファイルおよび有効性を決定する。網膜下（ＳＲ）送達は、ベクターを外顆粒層（ＯＮＬ）と網膜色素上皮（ＲＰＥ）との間に沈着させて、それは、これらの２つの層の分離を生じさせて、注入された溶液を収容する。多くの血清型は、ＯＮＬおよびＲＰＥ層において形質導入を示し、一部の血清型は、制限された向性を示す。天然の血清型のうち、ｒＡＡＶ８は、その迅速な導入遺伝子発現および全ての網膜層の形質導入に基づき、ＳＲ送達に関する最も良いものの１つである。ＳＲ送達に加えて、ベクターは、硝子体に投与され得る。ｒＡＡＶベクターの硝子体内送達は、１）注入の技術的容易性、２）網膜のより大きな領域にベクターを送達する潜在性、および３）網膜に対してより損傷が低いことを含むいくつかの理由のため、網膜下への好ましい経路になっている。臨床適用については、硝子体内送達は、外来患者の手順として行なわれ得て、網膜の破壊が、重度の網膜変性を有する患者に対する適用可能性を除外し得るのを回避する。しかしながら、少数の血清型は、この経路によって効率的な形質導入を示す。ｒＡＡＶ２は、多数の動物モデルにおいて試験された少数の血清型の１つであり、典型的に、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）の形質導入をもたらす。齧歯類モデルでは、この血清型による形質導入は、時折のミューラーグリア、アマクリン、および水平細胞で見られている。加えて、ＲＧＣおよび内顆粒層（ＩＮＬ）におけるｒＡＡＶ６発現は、齧歯類モデルで見られている。効率的な硝子体内形質導入に対するウイルスのトラフィッキングおよびバリアの理解は、現在の制限を克服するためのキャプシドを合理的に設計する機会を提供する。

硝子体網膜接合部において、内境界膜（ＩＬＭ）は、ほとんどのｒＡＡＶベクターが網膜を形質導入できないことの要因であるバリアとして暗示されている。制限された形質導入にもかかわらず、いくつかのＡＡＶ血清型は、送達後、硝子体網膜接合部において蓄積することが可能である。成体齧歯類の硝子体への、蛍光標識されたキャプシド（ｒＡＡＶ１、２、５、８、および９）の注入は、ｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶ８、およびｒＡＡＶ９が、ＩＬＭにおいて蓄積するが、ｒＡＡＶ２のみが形質導入をもたらすことを示した。変性されたＩＬＭによって、全てのこれらのＡＡＶ血清型は、網膜を形質導入することができた。ＩＬＭは、他の基底膜に似たグリカンの整列を示すミューラーグリアエンドフィートの細胞外マトリックスからなり、ＡＡＶ形質導入に必要とされる細胞へのアクセスを防ぐ。ｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶ８、およびｒＡＡＶ９の結合は、ラミニン相互作用によって同様に説明されるが；ラミニンによる蓄積は、ｒＡＡＶ８およびｒＡＡＶ９の形質導入に十分でない。ＨＳＰＧは、ｒＡＡＶ２形質導入を説明するように見えるが、ＨＳＰＧの酵素消化は、網膜におけるｒＡＡＶ２の形質導入および透過性を増大させる。ｒＡＡＶ２は、他の組織においてＨＳＰＧ非依存性の形質導入を示しているので、ｒＡＡＶ２は網膜形質導入のためにＨＳＰＧ結合を必要としないこと、および、ＨＳＰＧは外側網膜へのｒＡＡＶ２粒子の拡散を防ぎ得ることがあり得る。この目的を達成するために、ＩＬＭにおけるＨＳＰＧとのｒＡＡＶ２キャプシド相互作用は、網膜の効率的な硝子体内形質導入に律速ステップを持ちかけ（ｐｏｓｅ）、これらの相互作用を理解することは、より効率的な硝子体内送達のためのベクターの合理的な設計を導くのを助ける。

我々は、最適化された導入遺伝子性能のために自己相補ＣＢｈ－ＧＦＰカセットを用いた。ＣＢｈプロモーターは、潜在的サイレンシング問題がなく、ＣＭＶまたはＣＢＡプロモーター活性と比較して、他のニューロン組織において並外れた活性を示していて、その小さなサイズは、ｒＡＡＶの制限された導入遺伝子能力を最大化するのに有益である。導入遺伝子の自己相補形態は、古典的な一本鎖形態よりも力強い、より迅速な発現を促進する。この自己相補形態は、第二の鎖合成を提供しない細胞における導入遺伝子産物の生産も促進し得る。ＧＦＰ生産を最適化することに加えて、我々は、硝子体内送達後のｒＡＡＶキャプシドをトラックするためにＦＩＳＨを用いて、トラフィッキングの正確な絵を得た。ＩＬＭ構造を改変せずにマウス網膜のｒＡＡＶ形質導入に対するＨＳ結合の役割を理解するために、遺伝子キャプシド突然変異を用いた。我々は、ＨＳ結合を切断するために、ｒＡＡＶ２のＨＳ結合フットプリントにおける公知のキャプシド突然変異を用いた。ｒＡＡＶ２キャプシド上のモチーフは、３倍スパイクの基礎において（ａｔ ｔｈｅ ｂａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ－ｆｏｌｄ ｓｐｉｋｅ）、残基（Ｒ４８４、Ｒ４８７、Ｋ５３２、Ｒ５８５、およびＲ５８８）の基礎パッチ（ｂａｓｉｃ ｐａｔｃｈ）からなる。キャプシド突然変異体は、ｒＡＡＶ２ｉ８のように、残基５８５Ｑおよび５８８Ｔを置き換えて、ＨＳリッチな肝臓組織から向性を変更して、静脈内に送達された場合により全身性になる。このキャプシドを用いて、我々は、網膜形質導入のためのＨＳ結合に関する一方的な必要性を研究した。

ベクター生産および精製。ユビキタスＣＢｈプロモーターの制御下でＧＦＰ遺伝子を保有する自己相補ｒＡＡＶを、ポリエチレンイミンを用いた三重トランスフェクション方法によって生産した。ウイルスを回収した。溶解物を、６２００×ｇで遠心分離により浄化して、４０２，０００×ｇにて１時間、イオジキサノール勾配超遠心分離によって精製した。ウイルスを４０％／６０％界面から引っ張り、１－ｍｌ Ｑ ＨｙｐｅｒＤ Ｆカラム（Ｐａｌｌ）上でイオン交換クロマトグラフィーによって精製して、２００ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ［ｐＨ９．０］を用いて溶出した。ＡＡＶ８－Ｅ５３３Ｋベクターは、イオジキサノールによって有意な収率で生産することが困難であった。したがって、ＡＡＶ８およびＡＡＶ８－Ｅ５３３ＫをＣｓＣｌによって、それからスクロースによって精製して、純粋なベクターを得た。等分される前に、ウイルスを３５０ｍＭ ＮａＣｌ、５％ソルビトール（１×ＰＢＳ中）に対して透析して、－８０℃で冷凍した。ウイルス力価は、ウイルス標準と比較して、ＤＮａｓｅ耐性ベクターゲノムの野生型ＩＴＲに対するｑＰＣＲによって決定した。ウイルスは、１％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲル（Ｎｏｖｅｘ）上で電気泳動および銀染色（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を受けて、純度を評価した。

動物注入。成体Ｃ５７ＢＬ／６マウスをこの試験に用いた。全ての動物は、ノースカロライナ大学の実験動物医学施設の区分において１２／１２時間の明／暗サイクル下で収容されて、ノースカロライナ大学における動物実験委員会のガイドラインに従って扱われた。ベクター送達の前に、動物は、ケタミン（７５ｍｇ／ｋｇ）、キシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）、アセプロマジン（１．５ｍｇ／ｋｇ）を用いて麻酔されて、１％トロピカミドおよび２．５％フェニレフリンを用いて拡張された。プロパラカイン－ＨＣｌを局所麻酔薬として眼に適用した。眼球内ニードルを、水で満たされたチューブを介してＨａｍｉｌｔｏｎシリンジに接続された３２Ｇカニューレを用いて組み立てた。気泡は水をウイルス懸濁液から分離させた。解凍されたばかりのウイルスを作業ストック（ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｔｏｃｋ）に希釈して、注入前に室温で１０分間、眼球内ニードル内でインキュベートした。ニードルを抜いて、新鮮な懸濁液をローディングした。ウイルス懸濁液をフルオレセインナトリウム塩（Ｓｉｇｍａ）と混合して、成功した注入を確認した。全ての注入は、同一の外科医によって行われた。硝子体内注入については、角膜輪部に対しておよそ０．５ｍｍ後方の眼の上部分において、ベベル付き３０Ｇニードルの先端によってパイロットホールを作製した。顕微鏡を通した直接的な観察下で、この穴を通して硝子体へ眼球内ニードルを挿入した。シリンジポンプを用いて３０秒にわたって一定速度で１マイクロリットルの容量を送達した。ニードルは、所定の位置に２０秒間保たれて、除去前の眼圧平衡化を可能にした。網膜下注入については、眼球内ニードルを眼に対して接線方向で挿入した。流体の送達は即時であり、Ｍｉｃｒｏｎ ＩＶ（Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いた眼底検査および光干渉断層撮影（ＯＣＴ）によって、成功に関して特徴付けられた。角膜乾燥を防ぐためにＧＥＮＴＥＡＬ点眼液を眼に適用して、マウスは、温熱パッド上で回復を可能にされた。

インビボイメージング。眼底画像およびＯＣＴを、本明細書に記載のように動物を拡張および鎮静させることによって行なった。全ての蛍光画像は、Ｍｉｃｒｏｎ ＩＶを用いて、同一の設定下かつ同様の網膜位置で撮られた。蛍光眼底画像のグリーンチャネルを単離して、グレースケールに変換して、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（国立衛生研究所）を用いて統合された密度測定によって定量化した。

核摘出および組織学。１ユニットのヘパリン／ｍｌを含むＰＢＳを用いて動物を鎮静および灌流させて、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を続けた。眼を核摘出して、４％ＰＦＡ中１０分間のインキュベート前に１８Ｇニードルを用いて角膜輪部の前部に刺した。前眼部、筋肉組織、およびレンズを取り出して、洗眼用コップを４℃で１０％スクロース中に一晩置いて、２０％および３０％スクロースインキュベーションを続けた。洗眼用コップを、ＯＣＴ切断媒体（ｃｕｔｔｉｎｇ ｍｅｄｉａ）（Ｓａｋｕｒａ）中に埋めて、－２０℃で凍結させて、－８０℃で保管した。１０ミクロンの横断面を事前に浄化されたＳｕｐｅｒｆｒｏｓｔ Ｐｌｕｓスライド（Ｆｉｓｈｅｒ）上に集めて、さらなる処理まで－８０℃で保管した。

免疫組織化学および分析。０．３％Ｔｗｅｅｎ－２０（ＴＢＳ－Ｔ）を含むＴＢＳ中で断面を洗浄して、湿潤チャンバー内でブロッキングバッファー（１０％正常ヤギ血清、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－ｘ １００、ＰＢＳ中）において１時間インキュベートした。スライドを、湿潤チャンバー内で一次抗体を含む抗体溶液（３％ ＮＧＳ、０．１％ ＴＲＩＴＯＮ－Ｘ１００、ＰＢＳ中）において室温で一晩インキュベートした。用いられた一次抗体は、ウサギ抗－ＧＦＰ（１：５００；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、マウス抗－グルタミン合成酵素（１：１００；Ａｂｃａｍ）、マウス抗－ヘパラン硫酸１０Ｅ４エピトープ（１：７０；Ａｍｓｂｉｏ）、マウス抗－ロドプシン（１：１００；Ｒｏｃｋｌａｎｄ）、およびマウス抗－ＰＫＣα［Ｈ－７］（１：２５０；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）であった。ＴＢＳ－Ｔによる３回の洗浄後、湿潤チャンバー内で２時間、抗体溶液において二次蛍光抗体を加えた。二次抗体は、Ａｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ ４８８ヤギ抗－ウサギ（１：１０００；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、Ａｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ ５６８ヤギ抗－マウス（１：１０００；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、または、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８ウサギ抗－ヤギ（１：１０００；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）であった。製造元のプロトコルによって記載されるとおりにスライドをＤＡＰＩ含有Ｐｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）内にマウントした。画像は、ＬｅｉｃａＳＰ２ ＡＯＢＳ直立レーザー走査型共焦点顕微鏡またはＯｌｙｍｐｕｓ ＩＸ８３蛍光顕微鏡で撮られた。

可溶性ＨＳアナログアッセイ。インビトロ試験のために、ＨＥＫ２９３細胞を２４ウェル皿において１０^５細胞／ウェルの密度でプレーティングして、３７℃、５％ＣＯ_２で一晩付着させた。ウイルスを、１０、０００ｖｇ／細胞の濃度で、細胞への添加の前に１時間、規定濃度で可溶性ヘパリンとともに事前インキュベートした。細胞を４８時間後に採取して、フローサイトメトリーによって定量化した。

蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション。ＧＦＰ遺伝子をｐＳＰＴ１８ベクター（Ｒｏｃｈｅ ＲＮＡインビトロ転写キット）中にＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ部位でクローニングして、確認のためにシーケンスした。これらの制限酵素を用いてプラスミドを線状化して、フェノール－クロロホルム抽出／エタノール沈殿によって精製して、水中に再懸濁させた。線状化されたプラスミドを分光測定によって定量化して、アンチセンスのインビトロ転写の前にゲル電気泳動によって確認して、製造元（Ｒｏｃｈｅ）によって説明されるとおりにセンスリボプローブが保有された（ｃａｒｒｉｅｄ）。リボプローブのアリコートを水中で凍らせて、製造元によって説明されるとおりに定量化して、ゲル電気泳動およびＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって分析した。正に帯電したニトロセルロース膜（Ｒｏｃｈｅ）に対するウイルスコントロールのドットブロットによって、リボプローブの機能性を感度および選択性について分析した。センスおよびアンチセンスプローブの両方とも、同等にウイルスＧＦＰ導入遺伝子を検出することができた。

冷凍スライドを５５℃に１０分間加熱して、事前処理した。それから、スライドを、６５℃のハイブリダイゼーション温度で２～４時間、プローブ無しで、ハイブリダイゼーションバッファー（５０％ホルムアミド、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ［ｐＨ７．６］、２００μｇ／ｍｌ酵母ｔＲＮＡ、１×デンハート液、１０％デキストラン硫酸、６００ｍＭ ＮａＣｌ、０．２５％ ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ［ｐＨ８］）中でインキュベートした。スライドを、５０ｎｇ／ｍｌのセンスリボプローブを含むプレハイブリダイゼーションバッファーに移して、ｍＲＮＡ転写産物ではなくＤＮＡを特異的に検出した。スライドを８０℃に２０分間加熱して、氷上で即座に冷やして（ｓｎａｐ ｃｈｉｌｌｅｄ）、６５℃で一晩インキュベートした。スライドを、５０％ホルムアミド／２×ＳＳＣ中６５℃で３０分間、２×ＳＳＣ中５５℃で２０分間洗浄して、５５℃で２０分間の０．２×ＳＳＣ洗浄を２回した。スライドを１×洗浄バッファー（Ｒｏｃｈｅ）中で洗浄して、湿潤チャンバーにおいて１時間、１×ブロッキングバッファー中で１０％ヒツジ血清のインキュベーションを続けた。ヒツジ抗－ＤＩＧ－ＡＰ抗体（１：１０００；Ｒｏｃｈｅ）を加えて、湿潤チャンバーにおいて２～３時間インキュベートした。スライドを洗浄バッファー中で１０分間穏やかに撹拌しながら３回洗浄して、検出バッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２［ｐＨ８．０］）中で１０分間、２回のインキュベーションを続けた。ＨＮＰＰ／Ｆａｓｔ Ｒｅｄ検出基質を調製して、２～３適用について製造元（Ｒｏｃｈｅ）によって指示されるとおりに加えた。検出反応後、スライドを蒸留水中でリンスして、ＤＡＰＩ含有Ｐｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌｄ褪色防止試薬を用いてカバーグラスを乗せた。画像をＬｅｉｃａＳＰ２ＡＯＢＳ直立レーザー走査型共焦点顕微鏡またはＯｌｙｍｐｕｓ ＩＸ８３蛍光顕微鏡で撮った。

エクスビボのヒト網膜の結合アッセイ。ヒトの眼球全体を死亡直後に取得して、４日間、氷上の湿潤チャンバー内に置いた。前房、虹彩、およびレンズを取り出して、一部の硝子体を網膜に付着させたまま眼球を四等分した。１０μｌのベクターを２×１０^９ｖｇ／μｌの力価で硝子体に加えて、４℃で２時間、網膜に結合させた。四分割された網膜は培地の外に維持されて、ベクター溶液の分散を防いだ。インキュベーション後に、組織上でＰＢＳを洗浄して集めて、－８０℃で保管した。硝子体、網膜、脈絡膜、および強膜を別々に集めて、－８０℃で保管した。ＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて組織サンプルを消化および精製した。集められたサンプル中のウイルスを、ＧＦＰおよびｈＧＡＰＤＨハウスキーピング遺伝子に対するプライマーを用いてｑＰＣＲによって定量化した。

ｒＡＡＶ２に対するＨＳ結合は、網膜下形質導入に必要ではない。様々なＡＡＶ血清型は、ＨＳ結合および非ＨＳ結合の両方とも、網膜下に送達された場合、網膜形質導入において効果的に作用する。ｒＡＡＶ２が外側網膜の形質導入においてＨＳ結合を必要とするかどうかを決定するために、ＨＳ欠損ｒＡＡＶ２ｉ８およびｒＡＡＶ２を網膜下に送達した。それらの間の形質導入は、眼底検査によって同様であった。ｒＡＡＶ２ｉ８によるＧＦＰ蛍光の最も強いシグナルは、分離した領域内で見られたが、発現は、ブレブ領域の外側で見ることができた。同様に、ｒＡＡＶ２が注入された眼は、形質導入が分離領域において主に生じることを示した。両方のベクターは、ＲＰＥであると考えられる大きな領域の形質導入をもたらした。ｒＡＡＶ２については、神経節細胞の形質導入は、注入部位から視頭（ｏｐｔｉｃ ｈｅａｄ）へ導く蛍光軸索によって明らかであった。

免疫組織化学（ＩＨＣ）を用いて、両方のベクターの細胞向性を評価した。ＲＰＥおよびＯＮＬは、両方のベクターによって形質導入された主な細胞層であった。ＯＮＬ形質導入は低いが高いＲＰＥ形質導入が生じる領域が見られ、ＲＰＥが、形質導入される優勢な細胞型であり得ることを示唆した。ＯＮＬの形質導入は、ｒＡＡＶ２およびｒＡＡＶ２ｉ８キャプシドの両方について、桿体において優勢に生じた。ＩＮＬにおける細胞のｒＡＡＶ２ｉ８形質導入は、桿体双極性細胞およびミューラーグリアとして同定された。これらの結果は、ＨＳ欠損ｒＡＡＶ２キャプシドが、網膜下送達によって網膜において広がりやすいことを確認する。

ｒＡＡＶ２のＨＳ結合は、硝子体内形質導入に必要である。ＨＳ結合が硝子体内形質導入に必要であるかどうかを評価するために、ＡＡＶ２およびＡＡＶ２ｉ８キャプシドを成体マウスに１０^８ｖｇの力価で送達した。ｒＡＡＶ２が注入された眼は、２週の最初のイメージング時点において蛍光であったが、一方で、ｒＡＡＶ２ｉ８は発現を示さなかった。より遅い発現カイネティクスの可能性について１２週まで眼を評価した。その期間中、ｒＡＡＶ２蛍光は増加し続けたが、ｒＡＡＶ２ｉ８では蛍光は検出されなかった。１２週までに、ｒＡＡＶ２キャプシドは、眼底イメージングによって見られるように、神経網膜にわたって蛍光の拡散パターンをもたらす。ｒＡＡＶ２ｉ８キャプシドは、眼底検査によって、観察できるＧＦＰ蛍光を生じず、ＧＦＰ蛍光の３００倍の減少をもたらした（図１）。我々は、硝子体は、網膜下に注入する前に硝子体およびウイルスを混合することによって、ＨＳが切断されたｒＡＡＶ２キャプシドの形質導入に対して阻害しないことを確認した。再度、ｒＡＡＶ２およびｒＡＡＶ２ｉ８は、眼底検査で観察された網膜の大部分にわたって強烈な発現を有した。両方のキャプシドに関する形質導入細胞は、ＲＰＥであると考えられたが、ＲＧＣの付加がｒＡＡＶ２で見ることができた。

ｒＡＡＶが硝子体内に注入された眼を、ＩＨＣによってさらに評価した。ｒＡＡＶ２形質導入は、ＲＧＣおよびＩＮＬにおいて主に検出されて、一部の断面において、光受容体の形質導入を観察することができた。ＨＳが切断されたｒＡＡＶ２キャプシドの組織学は、非常に少ないＧＦＰ陽性の桿体を明らかにしたが、網膜の大部分はネガティブのままであった。我々はより高い力価の２×１０^９ｖｇをｒＡＡＶ２およびそのＨＳ結合突然変異体の両方について試して、発現を観察する機会を最大化した。発現は、より低い力価が注入された眼で観察されたものと比較して、より高い力価のｒＡＡＶ２ウイルスでさらにより多かったが、形質導入のパターンは変化しなかった。

蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を用いて、硝子体内送達後の２つのキャプシド間の導入遺伝子の分配を決定した。網膜下に注入されたウイルスの試験は、ウイルス分配および導入遺伝子発現が同義でないことを示していて；したがって我々は、ＨＳ結合が、発現に関係なくｒＡＡＶ２分配にどのように影響するのか決定しようとした。ＩＨＣ発現と同様に、ｒＡＡＶ２によって送達された導入遺伝子に関するＦＩＳＨシグナルは、ＲＧＣおよびＩＮＬにおいて主に検出されて、ＯＮＬには導入遺伝子がより少なかった。ｒＡＡＶ２ｉ８が注入された眼は、ＯＮＬ内に存在するＧＦＰ導入遺伝子を示したが、ＲＧＣまたはＩＮＬではいずれも検出されなかった。組織学は注入の何ヶ月も後に行なわれたので、これらの導入遺伝子は、硝子体内送達によって網膜に侵入した後に安定であるエピソームを表わすことが最もあり得る。

ＨＳ結合は、マウスでのＩＬＭにおけるｒＡＡＶ２の硝子体蓄積に必要である。硝子体内送達後のキャプシド間のトラフィッキングの違いをより良く理解するために、ＦＩＳＨ分析のために注入後すぐに眼を核摘出した。我々は、キャプシド表面上の荷電残基の曝露が形質導入に重要であることを実証しているので、トラフィッキング実験のために蛍光粒子によってキャプシドを改変する代替としてＦＩＳＨを用いた。ＡＡＶ粒子がＩＬＭにおいて注入後２４時間に蓄積することを、我々のＦＩＳＨプロトコルを用いて確認して、このことは、依然として無傷のキャプシドによって保有される導入遺伝子を検出することができることを示唆した。タイムポイントを注入後３日まで延長して、ＩＬＭにおけるキャプシド蓄積のために十分な時間を許容して、ｒＡＡＶ２キャプシドおよびそのＨＳ結合突然変異体の間のトラフィッキングの違いを観察した。様々な投与量を用いて、蓄積における任意の濃度効果を捕えて、より多くのダイナミックレンジを与えるためにＦＩＳＨシグナルのための酵素時間を短縮した。ＰＢＳが注入された眼は、最小限のバックグラウンド標識を有するネガティブコントロールとしての役割を果たした。短縮された検出時間によって、１×１０^８ｖｇの投与量は、ｒＡＡＶ２およびＨＳ欠損ｒＡＡＶ２－Ｒ５８５Ｅキャプシドの両方に関して、網膜において弱いシグナルのみを有した。５×１０^８ｖｇの投与量では、ｒＡＡＶ２によって送達された導入遺伝子は、ＩＬＭにおける蓄積を示し、全ての網膜層にも存在した。ＨＳ結合がないと、ｒＡＡＶ２－Ｒ５８５Ｅは、最小のシグナルのみを有した。試験された最大投与量である２×１０^９ｖｇでは、ｒＡＡＶ２は、多数の網膜層において検出される散在する導入遺伝子により、ＩＬＭにおいてさらにより強いシグナル強度をもたらした。同じ投与量では、より少数のｒＡＡＶ２－Ｒ５８５Ｅによって送達された導入遺伝子が網膜において検出されたが、ＩＬＭにおいて蓄積をもたらさなかった。

合わせると、これらの結果は、１）ｒＡＡＶ２上のＨＳ結合が、ＩＬＭにおいてベクターが蓄積するのを助けること、２）この蓄積が、網膜内に存在する導入遺伝子の数を増大させること、３）キャプシドが、ＨＳに結合せずに硝子体から網膜を通ることができるが、はるかにより低い程度であること、および、４）ベクターが網膜下送達される場合、網膜のｒＡＡＶ２形質導入にＨＳ結合は必要でないことを示す。ＦＩＳＨデータは、ＩＬＭバリアを迅速に通過するキャプシドのものを示し、それらは、外側網膜の遠位層へ急速にトラフィッキングすることが可能であるように見える（図２）。このことは、網膜の効率的な硝子体内形質導入に対するｒＡＡＶの律速ステップは、キャプシドとＩＬＭとの間の相互作用次第であることを強調する。

ＨＳ結合は、ヒト網膜のｒＡＡＶ２の硝子体蓄積に必要である。ＩＬＭにおける大量のＨＳＰＧ染色は、ヒトを含む多くの動物モデルに存在する。このことは、このメカニズムがヒト臨床適用のために種を超えて移行し得ることを示唆する。ウイルス結合アッセイが、眼を四等分して、少量の硝子体を網膜に付着したままにしてＩＬＭを維持することよって、エクスビボでヒト網膜に対して行なわれた。ベクターを硝子体へ適用して、それから、様々な網膜層を採取した。ｒＡＡＶ２によって運ばれた導入遺伝子は、ｒＡＡＶ２ｉ８キャプシドのものとは異なり、網膜に結合された。ＨＳ欠損ｒＡＡＶ２ｉ８は、集められた組織のいずれにおいても相対的に低いベクター結合を有したが、ｒＡＡＶ２と比較して脈絡膜および強膜に対する結合において有意な増大を示した（図３）。マウスデータと合わせると、これらの結果は、ＨＳ結合が、硝子体の外およびＩＬＭ上のＡＡＶベクターの蓄積を促進して、その後に網膜における形質導入を高める役割を果たすメカニズムを確証する。

ＨＳ結合は、他のｒＡＡＶ血清型の硝子体内形質導入を増大させる。他の血清型の硝子体内形質導入は、ＨＳ結合モチーフの付加による恩恵を受け得て、マウスにおいてこの選択を成し遂げた。ｒＡＡＶ１およびｒＡＡＶ６血清型は、６個のアミノ酸のみ異なり、単一の残基がＨＳＰＧ結合におけるそれらの違いの要因となる。硝子体内形質導入に関するｒＡＡＶ１およびｒＡＡＶ６網膜形質導入の間のＨＳ結合の影響を評価するために、単一の残基の突然変異体キャプシドを硝子体内で試験した。ｒＡＡＶ１およびＨＳ結合ｒＡＡＶ１－Ｅ５３１Ｋは同様の発現パターンを有したが、ｒＡＡＶ１－Ｅ５３１Ｋは、ｒＡＡＶ１と比較して３倍、より多くのＧＦＰ蛍光を有した（図４）。ｒＡＡＶ６－Ｋ５３１Ｅキャプシドを用いたｒＡＡＶ６におけるＨＳ結合の除去は、眼底検査によって、網膜の蛍光の減少をもたらした。ｒＡＡＶ１およびｒＡＡＶ６キャプシドの両方とも、網膜血管の周りに点状の発現パターンを示した。ｒＡＡＶ１およびｒＡＡＶ６の間のホモロジーのため、ｒＡＡＶ１およびｒＡＡＶ１－Ｅ５３１Ｋのみを、細胞向性における可能性のある違いに関してさらに評価した。免疫組織化学は、ＧＦＰおよびグルタミン合成酵素の共局在によって、両方のキャプシドに関して主にミューラーグリアの形質導入を示したが、ＩＮＬのさらなる細胞が形質導入されるようである。加えて、ｒＡＡＶ１およびｒＡＡＶ１－Ｅ５３１Ｋの両方とも、少しのＲＧＣおよび光受容体の形質導入を示した。ｒＡＡＶ１およびｒＡＡＶ１－Ｅ５３１Ｋの同様の形質導入パターンは、ＨＳ結合がｒＡＡＶ１の向性を変更していないことを示す。

ｒＡＡＶ１に対するＨＳ結合突然変異が、形質導入に関してＨＳＰＧの使用を伝えない（ｄｏｅｓ ｎｏｔ ｃｏｎｖｅｙ ｕｓｅ）ことを確認するために、可溶性ヘパリンをキャプシドと混合して、インビトロ競合アッセイのために細胞に加えた。ｒＡＡＶ２は、インビトロ形質導入のためにＨＳＰＧを必要として、用量依存的な形質導入の低減を示した。ｒＡＡＶ１とｒＡＡＶ１－Ｅ５３１Ｋ形質導入のいずれも、いかなるヘパリン投与量においても影響を受けず、ｒＡＡＶ１－Ｅ５３１Ｋキャプシドは形質導入のためにＨＳ結合に依存しないことを示唆した（図６）。平均して、ｒＡＡＶ１－Ｅ５３１Ｋによる形質導入は、ｒＡＡＶ１と比較してより少ないＧＦＰ陽性細胞をもたらし、単一のアミノ酸変更のみでは形質導入の上昇を提供しないことを示唆した。単一のアミノ酸突然変異体は、ＨＳ結合能力を提供するｒＡＡＶ８に対して同定されている。ｒＡＡＶ８およびｒＡＡＶ８－Ｅ５３３Ｋの力価は、１×１０^８ｖｇと一致して、硝子体内に注入された。投与後８週において、注入された眼の眼底画像を撮った。ｒＡＡＶ８の形質導入は非常に低かった。ｒＡＡＶ８－Ｅ５３３Ｋが注入された眼は、網膜にわたってかすんだ蛍光をもたらし、定量すると、非結合の血清型と比較してより高かった。我々は、ＦＩＳＨ分析を用いて注入直後のトラフィッキングの違いを観察して、ＨＳ結合が、ＩＬＭにおいて、および網膜内で、ベクターの蓄積を促進することが再度分かった。これらの結果は、ＨＳ結合が単独で、網膜上に蓄積するベクターの量を増大させることによって、硝子体内に送達されるＡＡＶキャプシドの形質導入を高めるのに十分であることを示唆する。

ｒＡＡＶ２．５Ｇ９キャプシドの二重キメラを用いて、ｒＡＡＶ１またはｒＡＡＶ９キャプシドエレメントのどちらが優勢であるかを決定した。ｒＡＡＶ２．５Ｇ９の硝子体内送達は、眼底検査によって撮像された場合、ｒＡＡＶ２．５親と同様の発現をもたらした。網膜血管の周りの蛍光は、血管の周りに見られる点状の発現によって非常に明らかであった。この発現の定量化は、全てを一緒に比較した場合、ｒＡＡＶ２．５およびｒＡＡＶ２．５Ｇ９が最も高い形質導入を有することを示し、非ＨＳ結合キャプシドは、最も低い形質導入を示した（図５）。

全てを合わせると、ＩＬＭにおけるＨＳＰＧへの結合は、硝子体から網膜上へのｒＡＡＶ蓄積を促進するが、網膜形質導入パターンに影響を及ぼすために、他の非ＨＳ結合キャプシド由来のモチーフが用いられ得る。このことは、ＨＳ結合を有するにもかかわらず、ｒＡＡＶ１－Ｅ５３１ＫがｒＡＡＶ１の形質導入プロファイルをどのように維持したかを説明する。ｒＡＡＶ２をｒＡＡＶ１－Ｅ５３１Ｋと正確に比較することは、これらの２つのキャプシドは残基組成およびＨＳに対する親和性が異なるので困難である。したがって、硝子体内形質導入に対してｒＡＡＶ１が有することのできる影響を評価するために、我々はｒＡＡＶ２．５キメラキャプシドを用いた。このキャプシドは、いずれかの親よりも大きな形質導入を示した。そして、ガラクトース結合の付加によりミューラーグリアを形質導入することに偏り得る。網膜のグリカン染色は向性を容易に示唆しないが、これらのキメラキャプシドは、網膜における標的化された形質導入のための試薬である。ＨＳＰＧは、いくつかの動物モデルでＩＬＭにおいて大量であるので、このメカニズムは、ヒトを含む多種にわたって適用され得る。ＩＬＭに到達した時点で（ｏｎｃｅ ａｔ ｔｈｅ ＩＬＭ）、ｒＡＡＶキャプシドと他のグリカン相互作用は、様々なキャプシド突然変異体によって観察される向性プロファイルを促進する。

ＩＬＭとｒＡＡＶキャプシドの相互作用は、律速ステップを網膜のトラフィッキングにもたらす。ＦＩＳＨの使用を通して、少数のキャプシドがＩＬＭを通過して、ＯＮＬおよび外側のセグメントに急速に移動する。外側網膜に入った時点で、これらのベクターは、光受容体を形質導入することができるが、この形質導入は非常に稀である。おそらく網膜へ入るキャプシドの大部分は、潜在を確立するために細胞内に入った時点で、核へ成功的に移動しない。ウイルス濃度の増大は、硝子体の空間は網膜下の空間のように免疫特権されないので、免疫応答を引き起こす可能性がより高い。核に対してさせる（ｍａｋｉｎｇ ｉｔ ｔｏ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｕｓ）導入遺伝子の数は、より高い力価を用いることによって増大され得る。この高い細胞内トラフィッキングは、硝子体内に送達されるｒＡＡＶ２ｉ８およびｒＡＡＶ２－Ｒ５８５Ｅキャプシドの導入遺伝子発現を増大させるのを助け得る。ＩＬＭにおける蓄積は、高い投与量のベクターはＩＬＭにおいておよび網膜内で見られる増大された導入遺伝子をもたらすことができるという点で、ベクター濃度の関数であり得る。網膜構造をうまく利用するために、ＩＬＭに対する結合を用いて、形質導入のために網膜においてベクターを蓄積させることができる。これは、ｒＡＡＶ２が硝子体内の網膜形質導入において成功的であった理由と似ている。

帯電した硫酸基は、形質導入のためにｒＡＡＶ２キャプシドとＨＳＰＧの相互作用を促進する。ＦＩＳＨによって観察される導入遺伝子は、ＨＳ欠損ｒＡＡＶ２粒子が網膜の遠位層に移動可能であることを示し、それは、キャプシド上のこれらの帯電した残基の変更は、ベクターが網膜に入るのを妨げないが、網膜上に蓄積するベクターの数を制限するだけであることを示す。これはまた、ＨＳ欠損キャプシドによる桿体の稀な形質導入によっても示される。硫酸とのキャプシド相互作用が必要であるかどうか試験するために、我々は、硫酸化および非硫酸化ＨＳとｒＡＡＶ２を混合して、硝子体内で試験した。我々は、両方の形態が、硫酸化ヘパリンによる形質導入を阻害し得て、より大きな阻害をもたらすことを見いだした。この実験は、硝子体内形質導入に対する、ヘパリン鎖との相互作用の重要性を示唆するだけである。遺伝子キャプシド突然変異体は、この化学的阻害アッセイを確証すると考えられるが、再度、ＨＳＰＧ結合に関与する残基の基礎パッチを破壊する単一および二重のアミノ酸改変は、電荷の相互作用に依存する。特定の帯電した製剤によってコーティングされたナノ粒子は、カチオン性の電荷（塩基性）が、硝子体からの網膜における透過性を促進するのに成功的であることを示唆した。これは、ＯＮＬに存在するグリカンが、硝子体内に送達されるｒＡＡＶベクターの形質導入に、どのように影響を及ぼし得るか説明するのを助け得る。

ＳＲによって送達されたｒＡＡＶ２およびｒＡＡＶ２ｉ８の同様の形質導入プロファイルは、ｒＡＡＶ２が、網膜形質導入のためにＨＳ結合を必要としないことを示す。網膜下送達は、ベクターを効果的に濃縮し得て、それにより、キャプシドを発現に向けて化学量論的に歪める。受容体が介在するエンドサイトーシスによる形質導入に加えて、ＳＲは、大量のｒＡＡＶベクターを食細胞ＲＰＥに提供して、なぜＲＰＥがｒＡＡＶ２およびｒＡＡＶ２ｉ８の両方による主な細胞標的であると考えられるのか説明し得る。任意の特定の細胞型に向かう親和性にもかかわらず、ｒＡＡＶ２およびｒＡＡＶ２ｉ８ベクターは、ＲＰＥ、桿体、錐体、桿体双極性細胞、およびミューラーグリアの形質導入をもたらす。これらの形質導入細胞の大部分は、注入ブレブ内に位置するが、ＲＰＥの形質導入は、分離した領域のはるかに外側に見られ得る。ＦＩＳＨは、ＳＲによって送達されるベクターのトラフィッキングをマップするために用いられ得る。

ＩＬＭ構造は、多種にわたって見られて、ｒＡＡＶキャプシドを硝子体の外に引き付けて濃縮する役割を果たし得る。実際に、ＨＳ結合は、注入直後にＦＩＳＨによって評価した場合、親キャプシドと比較して網膜における導入遺伝子のより多くの存在をもたらした。非ＨＳ結合ｒＡＡＶ１およびｒＡＡＶ８の導入遺伝子は、網膜において依然として検出され得るが、ｒＡＡＶ２およびｒＡＡＶ２－Ｒ５８５Ｅキャプシドの間に見られるデータと同様に、より少ない程度であった。硝子体内に注入された場合のＨＳ結合ｒＡＡＶ３による発現の欠如が予期された（この血清型は、ほとんどの細胞型の形質導入において非効率であり、細胞の効率的な形質導入のためのさらなるバリアに遭遇し得るので）。ｒＡＡＶ６は、網膜形質導入のための目的の血清型であり、ＳｈＨ１０キャプシドを用いてミューラーグリアの特異的な形質導入を増大するように改変されている。ＨＳ結合がないと、ＳｈＨ１０ベクターは、さらにより弱い蛍光を明らかにし得る。ｒＡＡＶ６およびｒＡＡＶ１－Ｅ５３１Ｋの両方とも、ＨＳＰＧが介在する形質導入に依存しないので、ＨＳへ結合する能力を任意のキャプシド血清型に単に与えることは、その導入遺伝子発現を高め得る。我々は、ｒＡＡＶ８－Ｅ５３３Ｋ突然変異体キャプシドを用いることによってこれを試験した。ＨＳ結合の付加は、硝子体内送達に用いられるＡＡＶのより大きなブレス（ｂｒｅａｔｈ）に関する他の血清型に適用され得る。

ＨＳＰＧはＩＬＭにおいて大量であるが、他の受容体が、硝子体から網膜の形質導入に関与し得る。ｒＡＡＶ１およびｒＡＡＶ６による形質導入は、その領域における染色の欠如にもかかわらず、ＩＬＭにおける２，３－または２，６－Ｎ結合シアル酸の存在を示唆する。眼底によって観察される形質導入のパターンは、組織学によっては見ることができずフラットマウントによって見られ得る網膜におけるこのシアル酸の特徴的なパターンを示し得る。ｒＡＡＶ４およびｒＡＡＶ５と相互作用することが知られるシアル酸の他の形態は、ＩＬＭにおいて豊富に発現され得ず、または他のグリカンによってマスクされ得る。このことは、正常なマウス網膜において比較した場合に、これらの血清型による形質導入の欠如を説明する。シアル酸に加えて、ラミニン染色がＩＬＭにおいて大量であり、血管に制限される。ラミニン受容体は、ｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ｒＡＡＶ８、およびｒＡＡＶ９血清型と相互作用することが知られる。これらのキャプシドは、硝子体網膜の接合部においてラミニン受容体と相互作用することができるが、この相互作用は、効率的な硝子体内の網膜形質導入を促進するには不十分であると考えられる。

マウスモデルで観察された形質導入は、他のモデルに対する指標となり得ないことを思い出すことが重要である。マウスは網膜の遺伝子導入に関する標準的なモデルとなっているが、特定のサイズおよび解剖学的違いが、それらと霊長類との間に存在する。ウサギまたはブタのような他のモデルは、霊長類と比較して同様のサイズの眼球および硝子体容積を有する。加えて、マウスおよび霊長類の間のＩＬＭの厚さの違いは、種を超えて効率的でないキャプシドの選択をもたらし得る。鳥類、齧歯類、ウサギ、霊長類、およびヒトを含む多数の動物種でのＩＬＭにおけるＨＳＰＧの過剰な豊富さのため、ＨＳとのキャプシド相互作用の影響を研究することは、硝子体内の網膜遺伝子導入のための効率的なベクターの合理的な設計のために重要である。

前述したものは本発明の例示であり、その制限と解釈されるべきでない。本発明は、以下の特許請求の範囲によって定義されて、特許請求の範囲の等価物はその中に含められる。

本明細書において言及される全ての刊行物、特許出願、特許、配列および他の参考文献は、それらの全体で本明細書中に参照により援用される。

Claims (9)

1. 対象の網膜細胞および／または網膜色素上皮細胞に核酸分子を導入するための医薬組成物であって、
   アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含み、
   前記ＡＡＶベクターは：
   ａ）前記核酸分子；および
   ｂ）ＡＡＶ８のキャプシドタンパク質、またはそれを由来とするキメラキャプシドタンパク質であって、ヘパラン硫酸結合を増大する、配列番号８の５３３位におけるグルタミン酸のリジンへのアミノ酸置換（Ｅ５３３Ｋ）を含む、キャプシドタンパク質；を含み、それにより、前記核酸分子を前記細胞に導入し、
   前記ＡＡＶベクターは、前記対象へ硝子体内投与される、
   医薬組成物。
2. 対象における眼の障害または欠陥を治療するための医薬組成物であって、
   アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含み、
   前記ＡＡＶベクターは：
   ａ）ＡＡＶ８のキャプシドタンパク質、またはそれを由来とするキメラキャプシドタンパク質であって、ヘパラン硫酸結合を増大する、配列番号８の５３３位におけるグルタミン酸のリジンへのアミノ酸置換（Ｅ５３３Ｋ）を含む、キャプシドタンパク質；および
   ｂ）発現可能な形態で、前記の眼の障害または欠陥を治療するのに効果的な治療的タンパク質または治療的ＲＮＡをコードする核酸分子；
   を含み、それにより、前記の障害または欠陥を治療し、
   前記ＡＡＶベクターは、前記対象へ硝子体内投与される、
   医薬組成物。
3. 請求項２の医薬組成物であって、
   前記の眼の障害または欠陥は、加齢黄斑変性、レーバー先天性黒内障タイプ１、レーバー先天性黒内障タイプ２、網膜色素変性症、網膜分離症、色覚異常、色盲、先天性停止性夜盲症、またはそれらの任意の組み合わせである、
   医薬組成物。
4. 対象の網膜細胞および／または網膜色素上皮細胞に核酸分子を導入するための医薬組成物であって、
   アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含み、
   前記ＡＡＶベクターは：
   ａ）前記核酸分子；および
   ｂ）ＡＡＶ８のキャプシドタンパク質、またはそれを由来とするキメラキャプシドタンパク質であって、ヘパラン硫酸結合を増大する、配列番号８の５３３位におけるグルタミン酸のリジンへのアミノ酸置換（Ｅ５３３Ｋ）を含む、キャプシドタンパク質；
   を含み、
   前記ＡＡＶベクターは、前記対象へ硝子体内投与され、それにより、前記核酸分子を前記細胞に導入する、
   医薬組成物。
5. 対象における眼の障害または欠陥を治療するための医薬組成物であって、
   アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含み、
   前記ＡＡＶベクターは：
   ａ）ＡＡＶ８のキャプシドタンパク質、またはそれを由来とするキメラキャプシドタンパク質であって、ヘパラン硫酸結合を増大する、配列番号８の５３３位におけるグルタミン酸のリジンへのアミノ酸置換（Ｅ５３３Ｋ）を含む、キャプシドタンパク質；および
   ｂ）発現可能な形態で、前記の眼の障害または欠陥を治療するのに効果的な治療的タンパク質または治療的ＲＮＡをコードする核酸分子；
   を含み、
   前記ＡＡＶベクターは、前記対象へ硝子体内投与され、それにより、前記障害または欠陥を治療する、
   医薬組成物。
6. 請求項５の医薬組成物であって、
   前記の眼の障害または欠陥は、加齢黄斑変性、レーバー先天性黒内障タイプ１、レーバー先天性黒内障タイプ２、網膜色素変性症、網膜分離症、色覚異常、色盲、先天性停止性夜盲症またはそれらの任意の組み合わせである、
   医薬組成物。
7. 請求項１または４の医薬組成物であって、
   前記核酸分子は、治療的タンパク質または治療的ＲＮＡをコードする、
   医薬組成物。
8. 請求項１から６のいずれか一項の医薬組成物であって、
   前記対象はヒトである、
   医薬組成物。
9. アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドの使用であって、
   前記ＡＡＶキャプシドは、ＡＡＶ８のキャプシドタンパク質、またはそれを由来とするキメラキャプシドタンパク質であって、ヘパラン硫酸結合を増大する、配列番号８の５３３位におけるグルタミン酸のリジンへのアミノ酸置換（Ｅ５３３Ｋ）によって改変されている、キャプシドタンパク質を含み、
   前記ＡＡＶキャプシドを含むＡＡＶベクターの硝子体内投与によって、プロモーターに動作可能に連結された導入遺伝子の核酸カセットを網膜に送達するための医薬組成物の製造のための、
   使用。

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