KR20220133941A - 안과 유전자 치료를 위한 변형 아데노-관련 바이러스 캡시드 단백질 및 이의 사용 방법 - Google Patents

안과 유전자 치료를 위한 변형 아데노-관련 바이러스 캡시드 단백질 및 이의 사용 방법 Download PDF

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Abstract

변형 아데노-관련 바이러스(AAV) 캡시드 단백질, 상기 캡시드 단백질을 포함하는 조성물(예를 들어, rAAV), 및 상기 캡시드 단백질을 코딩하는 핵산이 본원에서 제공된다. 본원에서 제공되는 AAV 캡시드는 망막 세포 지향성 및/또는 각막 세포 지향성을 부여하고, 광수용체 및/또는 각막 내피 세포와 같은 임상적으로 관련된 안구 세포 유형에서의 향상된 형질도입 효율을 매개한다. 상기 캡시드 단백질을 코딩하는 핵산, 및 상기 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 입자가 또한 제공된다.

Description

안과 유전자 치료를 위한 변형 아데노-관련 바이러스 캡시드 단백질 및 이의 사용 방법
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2020년 1월 29일자로 출원된 미국 가출원 제62/967,416호의 유익성을 주장하며, 이의 개시 내용은 본원에 그 전체가 참고로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출되었고 본원에 그 전체가 참고로 포함된 서열 목록을 포함한다(2021년 1월 27일자로 생성된 상기 ASCII 사본은 파일명이 "SA9-285PC_SL_ST25"이고 크기가 47,596 바이트임).
유전자 치료는 생물학적 기능을 회복하도록 유전자를 교정하거나, 또는 유전자(예를 들어, 돌연변이된 유전자)의 건강한 카피를 도입하하는 것을 포함할 수 있는 유전적 방법을 사용한 인간 질환의 치유적 치료를 약속한다. 비-병원성 및 비-외피 복제-결함 파보바이러스로부터 유래된 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터는 인간 유전자 전달을 위한 이상적인 비히클을 나타낸다. AAV 벡터 시스템의 한 가지 장점으로는 다양한 표적 세포에 대한 선택적 지향성을 제공하는 여러 자연 발생 혈청형의 이용가능성이 있다.
유전자 치료가 다양한 유전 질환을 치료하기 위한 전략으로 추구되고 있지만, 안과 장애는 유전자 치료에 대한 특히 매력적인 적응증이다. 다양한 안과 질환을 일으키는 유전적 특성 및 메커니즘이 확인되었다. 눈의 유사분열 후 세포, 예를 들어, 망막 세포 및 각막 내피 세포는 트랜스제닉 통합을 필요로 하지 않으면서 지속적인 유전자 발현을 허용한다. 눈은, 명확한 해부학적 특징과 커플링되어, 직접 볼 수 있고 접근가능한 조직을 제공하는데, 이는 국소 전달에 대한 장점을 제공한다. 또한, 혈액-안구 장벽은 면역 특권을 일으키고 눈 내로 전달되는 유전자 치료 제품에 대한 면역 반응을 제한한다. 안과 유전자 치료에 대한 다수의 진행 중인 임상 및 전임상 연구는 다양한 안과 병태를 교정하기 위한 효과적인 도구로서의 AAV 벡터의 유용성을 강조한다.
후방 망막 유전자 치료의 맥락에서 자연 발생 AAV 혈청형의 사용에 대한 한 가지 단점은 이들의 전달에 침습적 망막하 수술이 필요하다는 것이다. 따라서, 덜 침습적인 전달 경로에 대한 필요성을 해결하기 위해, 유리체내 주사 후 외측 망막(즉, 광수용체/망막 색소 상피(RPE))의 형질도입이 가능한 AAV 벡터를 개발하는 것이 당업계에서 필요하다. 더욱이, 눈의 전실, 구체적으로 각막 내피 세포에 유전자를 전달하기 위해 전방내 전달 또는 각막 천자보다 덜 침습적인 외과적 절차를 개발하는 것이 당업계에서 필요하다.
발명의 개요
변형 아데노-관련 바이러스(AAV) 캡시드 단백질, 상기 캡시드 단백질을 포함하는 조성물(예를 들어, rAAV), 및 상기 캡시드 단백질을 코딩하는 핵산이 본원에서 제공된다. 본원에서 제공되는 AAV 캡시드는 망막 세포 지향성 및/또는 각막 세포 지향성을 부여하고, 광수용체 및/또는 각막 내피 세포와 같은 임상적으로 관련된 안구 세포 유형에서 개선된 형질도입 효율을 매개한다. 본원에서 제공되는 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV는 유리체내 투여와 같은 비침습성 안구 전달 경로에 유용하고, 인간 대상체에게 투여될 때 내용성이 우수할 것으로 생각된다. 이와 같이, 제공된 조성물은 유전자 치료 응용(예를 들어, 안과 유전자 치료)에 특히 유용하다.
따라서, 특정 양태에서, 아미노산 S194, G474, N564, 및/또는 N573에 상응하는 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함하는 변형 아데노-관련 바이러스(AAV) 캡시드 단백질(여기서, 위치의 넘버링은 AAV5의 VP1 넘버링을 기반으로 함)이 제공된다.
특정한 예시적 실시 형태에서, 위치의 넘버링은 서열 번호 1에 기재된 야생형 AAV5 VP1의 아미노산 서열을 기반으로 한다.
특정한 예시적 실시 형태에서, 변형 캡시드 단백질은 AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVB1, AAVAnc80, AAV7m8, AAVrh10, AAV2(Y444F), AAV2(Y444+500+730), AAV2(Y252+272+444+500+700+704+730F), AAV8(Y733F), 및 이들의 임의의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 AAV 혈청형의 변형 캡시드 단백질이다. 특정한 예시적 실시 형태에서, 변형 캡시드 단백질은 AAV5의 변형 캡시드 단백질이다.
특정한 예시적 실시 형태에서, 변형 캡시드 단백질은 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정한 예시적 실시 형태에서, 변형 캡시드 단백질은 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정한 예시적 실시 형태에서, 변형 캡시드 단백질은 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
특정한 예시적 실시 형태에서, 아미노산 194에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G이다. 특정한 예시적 실시 형태에서, 변형 캡시드 단백질은 서열 번호 3에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서, 서열 번호 3의 아미노산 194에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G이다.
특정한 예시적 실시 형태에서, 아미노산 474에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이다. 특정한 예시적 실시 형태에서, 변형 캡시드 단백질은 서열 번호 5에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서, 서열 번호 5의 아미노산 474에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이다.
특정한 예시적 실시 형태에서, 아미노산 564에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이다. 특정한 예시적 실시 형태에서, 변형 캡시드 단백질은 서열 번호 7에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서, 서열 번호 7의 아미노산 564에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이다.
특정한 예시적 실시 형태에서, 아미노산 573에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이다. 특정한 예시적 실시 형태에서, 변형 캡시드 단백질은 서열 번호 9에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서, 서열 번호 9의 아미노산 573에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이다.
특정 양태에서, 아미노산 194에 상응하는 위치에서 G; 아미노산 474에 상응하는 위치에서 R; 아미노산 564에 상응하는 위치에서 R; 및/또는 아미노산 573에 상응하는 위치에서 R을 포함하는 변형 아데노-관련 바이러스(AAV) 캡시드 단백질이 제공되며, 여기서, 위치의 넘버링은 AAV5의 VP1 넘버링을 기반으로 한다.
특정 양태에서, 아미노산 194에 상응하는 위치에서 G를 포함하는 변형 아데노-관련 바이러스(AAV) 캡시드 단백질(여기서, 위치의 넘버링은 AAV5의 VP1 넘버링을 기반으로 함)이 제공된다.
특정 양태에서, 아미노산 474에 상응하는 위치에서 R을 포함하는 변형 아데노-관련 바이러스(AAV) 캡시드 단백질(여기서, 위치의 넘버링은 AAV5의 VP1 넘버링을 기반으로 함)이 제공된다.
특정 양태에서, 아미노산 564에 상응하는 위치에서 R을 포함하는 변형 아데노-관련 바이러스(AAV) 캡시드 단백질(여기서, 위치의 넘버링은 AAV5의 VP1 넘버링을 기반으로 함)이 제공된다.
특정 양태에서, 아미노산 573에 상응하는 위치에서 R을 포함하는 변형 아데노-관련 바이러스(AAV) 캡시드 단백질(여기서, 위치의 넘버링은 AAV5의 VP1 넘버링을 기반으로 함)이 제공된다.
특정 양태에서, 서열 번호 3, 5, 7 또는 9에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 변형 아데노-관련 바이러스(AAV) 캡시드 단백질이 제공된다.
특정 양태에서, 본원에 기술된 캡시드 단백질을 코딩하는 단리된 핵산이 제공된다.
특정 양태에서, 서열 번호 4, 6, 8, 또는 10에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산이 제공된다.
특정 양태에서, 본원에 기술된 핵산을 포함하는 벡터가 제공된다.
특정한 예시적 실시 형태에서, 벡터는 플라스미드 또는 헬퍼 바이러스 벡터이다. 특정한 예시적 실시 형태에서, 헬퍼 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 배큘로바이러스 벡터, 또는 아데노바이러스 벡터이다. 특정한 예시적 실시 형태에서, 벡터는 발현 벡터이다.
특정 양태에서, 본원에 기술된 핵산, 또는 본원에 기술된 벡터를 포함하는 재조합 세포가 제공된다.
특정 양태에서, AAV 캡시드 단백질의 생성 방법이 제공되며, 본 방법은 핵산이 발현되고 캡시드 단백질이 생성되게 하는 조건 하에 본원에 기술된 재조합 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
특정 양태에서, 다음을 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 입자가 제공된다: (a) 변형 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 캡시드로서, 변형 캡시드 단백질은 아미노산 194, 474, 564, 및/또는 573에 상응하는 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함하며, 위치의 넘버링은 AAV5의 VP1 넘버링을 기반으로 하는, rAAV 캡시드; 및 (b) 이종 핵산을 포함하는 rAAV 벡터.
특정한 예시적 실시 형태에서, 위치의 넘버링은 서열 번호 1에 기재된 야생형 AAV5 VP1의 아미노산 서열을 기반으로 한다.
특정한 예시적 실시 형태에서, 변형 캡시드 단백질은 AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVB1, AAVAnc80, AAV7m8, AAVrh10, AAV2(Y444F), AAV2(Y444+500+730), AAV2(Y252+272+444+500+700+704+730F), AAV8(Y733F), 및 이들의 임의의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 AAV 혈청형의 변형 캡시드 단백질이다. 특정한 예시적 실시 형태에서, 변형 캡시드 단백질은 AAV5의 변형 캡시드 단백질이다.
특정한 예시적 실시 형태에서, 변형 캡시드 단백질은 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정한 예시적 실시 형태에서, 변형 캡시드 단백질은 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정한 예시적 실시 형태에서, 변형 캡시드 단백질은 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
특정한 예시적 실시 형태에서, 아미노산 194에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G이다. 특정한 예시적 실시 형태에서, 변형 캡시드 단백질은 서열 번호 3에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서, 서열 번호 3의 아미노산 194에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G이다.
특정한 예시적 실시 형태에서, 아미노산 474에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이다. 특정한 예시적 실시 형태에서, 변형 캡시드 단백질은 서열 번호 5에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서, 서열 번호 5의 아미노산 474에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이다.
특정한 예시적 실시 형태에서, 아미노산 564에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이다. 특정한 예시적 실시 형태에서, 변형 캡시드 단백질은 서열 번호 7에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서, 서열 번호 7의 아미노산 564에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이다.
특정한 예시적 실시 형태에서, 아미노산 573에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이다. 특정한 예시적 실시 형태에서, 변형 캡시드 단백질은 서열 번호 9에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서, 서열 번호 9의 아미노산 573에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이다.
특정 양태에서, 다음을 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 입자가 제공된다: (a) 변형 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 캡시드로서, 변형 캡시드 단백질은 아미노산 194에 상응하는 위치에서 G; 아미노산 474에 상응하는 위치에서 R; 아미노산 564에 상응하는 위치에서 R; 및/또는 아미노산 573에 상응하는 위치에서 R을 포함하며, 위치의 넘버링은 AAV5의 VP1 넘버링을 기반으로 하는, rAAV 캡시드; 및 (b) 이종 핵산을 포함하는 rAAV 벡터.
특정 양태에서, 다음을 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 입자가 제공된다: (a) 아미노산 194에 상응하는 위치에서 G를 포함하는 rAAV 캡시드(여기서, 위치의 넘버링은 AAV5의 VP1 넘버링을 기반으로 함); 및 (b) 이종 핵산을 포함하는 rAAV 벡터.
특정 양태에서, 다음을 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 입자가 제공된다: (a) 아미노산 474에 상응하는 위치에서 R을 포함하는 rAAV 캡시드(여기서, 위치의 넘버링은 AAV5의 VP1 넘버링을 기반으로 함); 및 (b) 이종 핵산을 포함하는 rAAV 벡터.
특정 양태에서, 다음을 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 입자가 제공된다: (a) 아미노산 564에 상응하는 위치에서 R을 포함하는 rAAV 캡시드(여기서, 위치의 넘버링은 AAV5의 VP1 넘버링을 기반으로 함); 및 (b) 이종 핵산을 포함하는 rAAV 벡터.
특정 양태에서, 다음을 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 입자가 제공된다: (a) 아미노산 573에 상응하는 위치에서 R을 포함하는 rAAV 캡시드(여기서, 위치의 넘버링은 AAV5의 VP1 넘버링을 기반으로 함); 및 (b) 이종 핵산을 포함하는 rAAV 벡터.
특정한 예시적 실시 형태에서, 이종 핵산은 치료용 폴리펩티드 또는 치료용 핵산을 코딩한다. 특정한 예시적 실시 형태에서, 이종 핵산은 항산화제, 효소, 신경영양 인자, 항-아폽토시스 인자, 항-혈관신생 인자, 및 항-염증 인자로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 코딩한다. 특정한 예시적 실시 형태에서, 이종 핵산은 치료용 핵산을 코딩한다. 특정한 예시적 실시 형태에서, 치료용 핵산은 siRNA, shRNA, RNAi, miRNA, 안티센스 RNA, 리보자임 또는 DNA자임이다.
특정한 예시적 실시 형태에서, 이종 핵산은 항시성 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 특정한 예시적 실시 형태에서, 이종 핵산은 안구 조직에서의 치료용 폴리펩티드 또는 치료용 핵산의 발현에 적합한 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 특정한 예시적 실시 형태에서, 안구 조직은 망막이고, 프로모터는 광수용체 세포, 망막 색소 상피 세포, 양극성 세포, 수평 세포, 무축삭 세포, 뮐러 세포, 신경절 세포, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 망막 세포에서의 치료용 폴리펩티드 또는 치료용 핵산의 발현에 적합하다. 특정한 예시적 실시 형태에서, 안구 조직은 각막이고, 프로모터는 상피 세포, 케라토사이트, 내피 세포, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 각막 세포에서의 치료용 폴리펩티드 또는 치료용 핵산의 발현에 적합하다.
특정한 예시적 실시 형태에서, AAV 벡터는 역위 말단 반복체(inverted terminal repeat; ITR)를 추가로 포함한다.
특정한 예시적 실시 형태에서, rAAV 벡터는 자가-상보성 rAAV 벡터(scAAV)이다. 특정한 예시적 실시 형태에서, scAAV는 이종 핵산을 코딩하는 제1 핵산 및 제1 핵산의 상보체를 코딩하는 제2 핵산을 포함하며, 여기서, 제1 핵산은 그 길이의 대부분 또는 전부에 걸쳐 제2 핵산과 가닥내 염기쌍을 형성할 수 있다. 특정한 예시적 실시 형태에서, 제1 핵산 및 제2 핵산은 돌연변이 AAV ITR에 의해 연결되고, 돌연변이 AAV ITR은 D 영역의 결실을 포함하고 말단 분해 서열의 돌연변이를 포함한다.
특정 양태에서, 본원에 기술된 rAAV 입자를 포함하는 제약 조성물이 제공된다.
특정 양태에서, 필요로 하는 대상체의 안구 조직에 이종 핵산을 전달하는 방법으로서, 상기 방법은 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 입자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, rAAV 입자는 다음을 포함하는, 방법이 제공된다: (a) 변형 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 캡시드로서, 변형 캡시드 단백질은 아미노산 194, 474, 564, 및/또는 573에 상응하는 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함하며, 위치의 넘버링은 AAV5의 VP1 넘버링을 기반으로 하는, rAAV 캡시드; 및 (b) 이종 핵산을 포함하는 rAAV 벡터.
특정 양태에서, 필요로 하는 대상체의 망막에 이종 핵산을 전달하는 방법으로서, 상기 방법은 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 입자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, rAAV 입자는 다음을 포함하는, 방법이 제공된다: (a) 변형 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 캡시드로서, 변형 캡시드 단백질은 아미노산 194에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함하며, 위치의 넘버링은 AAV5의 VP1 넘버링을 기반으로 하는, rAAV 캡시드; 및 (b) 이종 핵산을 포함하는 rAAV 벡터.
특정 양태에서, 필요로 하는 대상체의 각막에 이종 핵산을 전달하는 방법으로서, 상기 방법은 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 입자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, rAAV 입자는 다음을 포함하는, 방법이 제공된다: (a) 변형 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 캡시드로서, 변형 캡시드 단백질은 아미노산 474, 564, 및/또는 573에 상응하는 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함하며, 위치의 넘버링은 AAV5의 VP1 넘버링을 기반으로 하는, rAAV 캡시드; 및 (b) 이종 핵산을 포함하는 rAAV 벡터.
특정 양태에서, 필요로 하는 대상체의 안구 조직에서 세포의 rAAV 형질도입을 향상시키는 방법으로서, 상기 방법은 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 입자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, rAAV 입자는 다음을 포함하는, 방법이 제공된다: (a) 변형 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 캡시드로서, 변형 캡시드 단백질은 아미노산 194, 474, 564, 및/또는 573에 상응하는 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함하며, 위치의 넘버링은 AAV5의 VP1 넘버링을 기반으로 하는, rAAV 캡시드; 및 (b) 이종 핵산을 포함하는 rAAV 벡터.
특정 양태에서, 필요로 하는 대상체의 망막에서 세포의 rAAV 형질도입을 향상시키는 방법으로서, 상기 방법은 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 입자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, rAAV 입자는 다음을 포함하는, 방법이 제공된다: (a) 변형 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 캡시드로서, 변형 캡시드 단백질은 아미노산 194에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함하며, 위치의 넘버링은 AAV5의 VP1 넘버링을 기반으로 하는, rAAV 캡시드; 및 (b) 이종 핵산을 포함하는 rAAV 벡터.
특정 양태에서, 필요로 하는 대상체의 각막에서 세포의 rAAV 형질도입을 향상시키는 방법으로서, 상기 방법은 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 입자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, rAAV 입자는 다음을 포함하는, 방법이 제공된다: (a) 변형 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 캡시드로서, 변형 캡시드 단백질은 아미노산 474, 564, 및/또는 573에 상응하는 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함하며, 위치의 넘버링은 AAV5의 VP1 넘버링을 기반으로 하는, rAAV 캡시드; 및 (b) 이종 핵산을 포함하는 rAAV 벡터.
특정 양태에서, 필요로 하는 대상체의 안구 조직에서 이종 핵산의 발현을 향상시키는 방법으로서, 상기 방법은 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 입자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, rAAV 입자는 다음을 포함하는, 방법이 제공된다: (a) 변형 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 캡시드로서, 변형 캡시드 단백질은 아미노산 194, 474, 564, 및/또는 573에 상응하는 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함하며, 위치의 넘버링은 AAV5의 VP1 넘버링을 기반으로 하는, rAAV 캡시드; 및 (b) 이종 핵산을 포함하는 rAAV 벡터.
특정 양태에서, 필요로 하는 대상체의 망막에서 이종 핵산의 발현을 향상시키는 방법으로서, 상기 방법은 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 입자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, rAAV 입자는 다음을 포함하는, 방법이 제공된다: (a) 변형 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 캡시드로서, 변형 캡시드 단백질은 아미노산 194에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함하며, 위치의 넘버링은 AAV5의 VP1 넘버링을 기반으로 하는, rAAV 캡시드; 및 (b) 이종 핵산을 포함하는 rAAV 벡터.
특정 양태에서, 필요로 하는 대상체의 각막에서 이종 핵산의 발현을 향상시키는 방법으로서, 상기 방법은 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 입자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, rAAV 입자는 다음을 포함하는, 방법이 제공된다: (a) 변형 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 캡시드로서, 변형 캡시드 단백질은 아미노산 474, 564, 및/또는 573에 상응하는 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함하며, 위치의 넘버링은 AAV5의 VP1 넘버링을 기반으로 하는, rAAV 캡시드; 및 (b) 이종 핵산을 포함하는 rAAV 벡터.
특정 양태에서, 필요로 하는 대상체에서 눈의 병태 또는 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 rAAV 입자를 포함하는 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, rAAV 입자는 다음을 포함하는, 방법이 제공된다: (a) 변형 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 캡시드로서, 변형 캡시드 단백질은 아미노산 194, 474, 564, 및/또는 573에 상응하는 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함하며, 위치의 넘버링은 AAV5의 VP1 넘버링을 기반으로 하는, rAAV 캡시드; 및 (b) 이종 핵산을 포함하는 rAAV 벡터.
특정한 예시적 실시 형태에서, 조성물은 유리체내 투여용으로 제형화된다.
특정한 예시적 실시 형태에서, 이종 핵산은 야생형 rAAV 캡시드를 포함하는 rAAV 입자의 이종 핵산의 발현 수준과 비교하여 증가된 발현 수준으로 발현된다.
특정한 예시적 실시 형태에서, 투여는 유리체내 투여를 포함한다.
본 발명의 상기 및 다른 특징 및 장점은 첨부 도면과 함께 아래의 예시적인 실시 형태의 상세한 설명으로부터 보다 충분히 이해될 것이다.
도 1a ~ 도 1b는 망막하 주사 후 6주 후 NHP 망막에서의 AAV2-HBKO 매개 GFP 발현을 도시한다. 도 1a는 GFP 발현을 위해 수집된 박편의 개략도를 보여준다. 청색 선은 천연 GFP 발현에 대해 분석된 박편 상의 영역을 나타낸다(중심와 앞, 중심와 관통, 및 중심와 뒤) 중심와와 수포를 관통한 박편만을 분석하였다. 도 1b는 AAV5 hOPS-eGFP로 형질도입된 망막하 수포의 경계에 있는 광수용체 층의 이미지를 보여준다. 우측의 형질도입 세포와 비교하여 좌측의 비-형질도입 세포에 주목한다. ONL: 외핵층, OPL: 외망상층.
도 2a ~ 도 2b는 자가형광 안저 촬영(fundus auto fluorescence; FAF)에 의한 NHP 눈에서의 AAV 매개 GFP 발현을 도시한다. FAF는 AAV5 hOPS-eGFP(도 2a) 또는 AAV2-HBKO-hOPS-eGFP(도 2b)로 처리된 수포 영역(원)에서의 GFP 형광을 보여준다. AAV 처리 후 4주째에 GFP 발현의 증가가 관찰되었다(도 2a 및 도 2b). AAV2-HBKO-eGFP 벡터는 망막하 수포의 주변부를 넘어 퍼진 반면 AAV5 벡터는 망막하 수포의 주변부 내에 머물렀다(도 2a 및 도 2b).
도 3a ~ 도 3b는 망막에서 AAV5에 비해 AAV2-HBKO의 탁월한 형질도입 능력을 보여주는 NHP의 망막하 주사를 도시한다. 간상 광수용체에서의 AAV5 및 AAV2-HBKO의 상대적 형질도입 효율을 망막하 주사 후 비교하였다. 파라핀 포매된 망막 박편은 eGFP(갈색) 및 로돕신(적색)의 검출을 위해 항-GFP 항체 및 항-로돕신 항체로 면역표지되었다. 수포 영역 주변의 면역조직화학 분석은 AAV5 벡터의 형질도입이 망막하 수포의 주변부로부터 퍼지는 것으로 보이지 않고 주변부에서의 변화가 급격함을 보여주었다(도 3a). AAV2HBKO-eGFP는 광수용체의 형질도입에 고도로 효율적이었고, 수포로부터 퍼지는 능력을 나타냈으며, 주사 과정에 의해 들어 올려지지 않은 영역에서 점점 적어진다(도 3b). AAV 형질도입은 간상 광수용체로 제한되었다. ONL-외핵층, INL-내핵층 RGL-망막 신경절 세포층.
도 4a ~ 도 4b는 AAV5와 AAV5 아르기닌 변이체 사이의 망막 및 각막 형질도입 효율의 비교를 도시한다. 도 4a는 야생형 마우스에게 유사한 용량의 AAV5, AAV5G474R, AAV5N564R 및 AAV5N573을 망막하 주사하였음을 보여준다. 형광 현미경 하에서 AAV 매개된 천연 GFP 발현에 대해 냉동박편을 분석하였다. 망막하 주사는 AAV5와 AAV5 아르기닌 변이체 사이에서 유사한 형질도입 효율을 보여주었다. 도 4b는 마우스 각막에서의 AAV5 및 AAV5 아르기닌 변이체의 형질도입 효율을 보여준다. AAV는 유리체내 주사에 의해 전달되었고 형질도입 후 4주에 분석되었다. 조직학적 박편은 AAV5 아르기닌 변이체의 형질도입 후 각막 내피 세포에서의 강렬한 GFP 발현을 보여주었다. AAV5 형질도입에 의해서는 거의 검출할 수 없는 GFP가 관찰되었다. ONL-외핵층, INL-내핵층, RGL-망막 신경절 세포층.
도 5는 야생형의 캡시드 단백질 발현 수준 및 벡터 수율을 유지하는 AAV5 아세틸화 돌연변이체를 도시한다. 도 5는 1x1010 AAV5 아세틸화 캡시드 돌연변이 벡터 게놈의 SDS-PAGE 겔 분석, 이어서 SYPRO Red 염색을 보여주며; 레인 1~6은 AAV5 S2G, S2P, S194G, S194P, S2G/S194G(빈 입자와 함께 공동 정제됨), S2P/S194P를 나타내며; VP1, VP2 및 VP3 AAV 캡시드 단백질이 라벨링된다. 레인 5는 빈 AAV 입자의 공동 정제를 보여준다.
도 6a ~ 도 6c는 광수용체 형질도입에 대한 AAV5 탈아세틸화의 영향을 도시한다. 도 6a는 AAV5와 AAV5 아세틸화 변이체(AAV5S2G, AAV5S194G, AAV5S2G/S194G, AAV5S2P, AAV5S194P, 및 AAV5S2P/S194P) 사이의 광수용체 형질도입 효율의 비교를 보여준다. 야생형 마우스에 동일 카피의 AAV5 및 AAV5 아세틸화 변이체를 주사하고, 눈을 주사 4주 후에 수집하고 냉동박편화를 위해 프로세싱하였다. 형광 현미경 분석은 모 AAV5 및 기타 변이체와 비교하여 AAV5S194G 주사된 망막의 ONL에서의 강력한 eGFP 발현을 보여주었다. ONL: 외핵층, INL: 내핵층, RGL: 망막 신경절 세포층. 도 6b는 EGFP를 코딩하는 AAV5 및 AAV5 아세틸화 변이체 벡터를 망막하 주사한지 4주 후 C57BL/6 마우스로부터의 망막의 ELISA에 의한 GFP의 정량화를 보여준다. 도 6c는 망막하 주사 후 형질도입된 망막에서의 AAV 게놈 카피의 qPCR 분석을 보여주며, 이는 단백질 1 ug당 바이러스 게놈으로 표현된다.
도 7a ~ 도 7c는 용량 의존적 방식으로 AAV5 탈아세틸화 변이체의 망막하 전달 후 GFP 발현을 비교한 것을 도시한다. 도 7a는 상이한 용량(저 1x108, 중간 5x108 및 고 1x109)의 AAV5, AAV5 S194G, AAV5 S194P를 주사한 눈에서의 형질도입 비교(천연 GFP 발현은 녹색으로 예시됨)를 보여주는 주사 후 4주에서의 망막 냉동박편의 대표적인 형광 이미지를 보여준다. 핵은 DAPI(청색)로 염색되었다. ONL: 외핵층, INL: 내핵층, RGL: 망막 신경절 세포층. 도 7b는 EGFP를 코딩하는 AAV5 및 AAV5 탈아세틸화 변이체 벡터를 망막하 주사한지 4주 후 C57BL/6 마우스로부터의 망막의 ELISA에 의한 GFP의 정량화를 보여준다. 도 7c는 망막하 주사 후 형질도입된 망막에서의 AAV 게놈 카피의 qPCR 분석을 보여주며, 이는 단백질 1 ug당 바이러스 게놈으로 표현된다.
도 8a ~ 도 8c는 캡시드 단백질 발현 또는 벡터 수율에 영향을 미치지 않지만 잠재적으로 효력에 영향을 미치는 AAV2 VP1의 PLA2 도메인 내의 탈아미드화 수준의 변경을 도시한다. 도 8a는 AAV2의 VP1 N 말단 내에 위치하는 단백질 서열 모티프를 보여준다. A35는 tVP1의 N 말단 아미노산이다. 57NG58은 PLA2 도메인 내에 위치하는 표준적 탈아미드화 모티프이다. 도 8b는 삼중 형질감염 생성 방법(TTx) 또는 생산 세포주 생성 방법(PCL)에 의해 생성된 1x1010 AAV2 벡터의 SDS-PAGE 분석을 보여준다. 도 8c는 1x1010 AAV2 탈아미드화 캡시드 돌연변이 벡터 게놈의 SDS-PAGE 겔 분석, 이어서 SYPRO Red 염색을 보여준다.
도 9a ~ 도 9c는 망막 형질도입에 대한 AAV2 캡시드 탈아미드화의 영향을 도시한다. 도 9a는 EGFP를 코딩하는 AAV2 및 AAV2 탈아미노화 변이체를 유리체내 주사한지 4주 후 야생형 마우스로부터의 망막의 ELISA에 의한 GFP의 정량화를 보여준다. 도 9b는 유리체내 주사 후 형질도입된 망막에서의 AAV 게놈 카피의 qPCR 분석을 보여주며, 이는 단백질 1 ug당 바이러스 게놈으로 표현된다. 도 9c는 AAV2 및 AAV2 탈아미노화 돌연변이체의 유리체내 주사 후 야생형 마우스에서의 천연 GFP 발현 패턴을 나타내는 형광 분석을 보여준다. ONL: 외핵층, INL: 내핵층, RGL: 망막 신경절 세포층.
도 10a ~ 도 10b는 NHP 망막 조직에서 AAV5 및 AAV5 아세틸화 변이체의 생체 외 투여 후 천연 GFP 형광의 비교를 도시한다. 도 10a는 사후(postmortem) NHP 눈으로부터 수득된 신경 망막 조직을 보여준다. 생검 펀치를 만들고, 6웰 플레이트에서 막에서 배양하고, GFP를 코딩하는 상이한 AAV 변이체들로 형질도입하였다. 상기 조직을 형질도입 후 6일 후에 수확하고, 고정하고, 천연 GFP 발현에 대해 이미지화하였다. ONL, INL 및 RGL 각각에서 세포 유형의 형질도입을 분석하여 AAV 혈청형들의 효력을 비교하였다. 도 10b는 광수용체의 형질도입에 있어서 AAV5 변이체 AAV5S194G가 천연 AAV5보다 더 높은 효력을 나타냈음을 보여준다. GFP 발현은 AAV5 S194G를 사용한 ONL에서 주로 관찰된 반면, GFP 발현은 AAV5(a 및 b)를 사용한 모든 층에서 관찰되었다. ONL: 외핵층, INL: 내핵층, RGL: 망막 신경절 세포층.
안구 조직에서 개선된 형질도입 효율을 부여하는 변형된 AAV 캡시드 단백질이 본원에서 제공된다. 또한, AAV 캡시드 단백질, 및 AAV 캡시드 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 조성물(예를 들어, rAAV)이 제공된다. 또한, 안구 조직 내로 이종 핵산을 전달하기 위해 본원에 기술된 조성물을 사용하는 방법, 및 안구 조직의 형질도입을 향상시키는 방법, 및 안구 조직에서 이종 핵산의 발현을 향상시키는 방법이 제공된다. 또한 안과 장애 및 병태를 치료하는 방법이 본원에서 제공된다.
일반적으로, 본원에서 기술된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 생물물리학, 면역학, 미생물학, 유전학, 그리고 단백질 및 핵산 화학과 관련하여 사용되는 명명법은 당업계에 잘 공지되어 있고 일반적으로 사용된다. 본원에서 제공된 방법 및 기술은 일반적으로, 달리 지시되지 않는 한 본 명세서 전체에 걸쳐 인용 및 논의되는 다양한 일반적이고 보다 구체적인 참고문헌에 기술된 바와 같이, 그리고 당업계에 잘 공지된 통상적인 방법에 따라 수행된다. 효소 반응 및 정제 기술은 제조사의 사양서에 따라 수행되거나, 당업계에서 일반적으로 달성되는 바와 같이, 또는 본원에 기술된 바와 같이 수행된다. 본원에서 기술된 분석 화학, 합성 유기 화학, 그리고 의약 및 약학 화학과 관련하여 이용되는 명명법 및 이의 실험실 절차 및 기술은 당업계에서 잘 공지되어 있고 일반적으로 사용된다. 화학 합성, 화학 분석, 제약 제제, 제형화 및 전달 및 환자의 치료를 위해 표준 기술이 사용된다.
본원에 기술되거나 언급된 기술 및 절차는 예를 들어, 하기 문헌에 기술된 널리 이용되는 방법과 같이, 당업자에 의해 일반적으로 잘 이해되어 있고 종래의 방법을 사용하여 통상적으로 이용된다: 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook et al., 4th　ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2012)]; 문헌[Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., 2003)]; 시리즈인 문헌[Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds., 1995)]; 문헌[Antibodies, A Laboratory Manual (Harlow and Lane, eds., 1988)]; 문헌[Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications (R.I. Freshney, 6th　ed., J. Wiley and Sons, 2010)]; 문헌[Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984)]; 문헌[Methods in Molecular Biology, Humana Press]; 문헌[Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., Academic Press, 1998)]; 문헌[Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, Plenum Press, 1998)]; 문헌[Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., J. Wiley and Sons, 1993-8)]; 문헌[Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds., 1996)]; 문헌[Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987)]; 문헌[PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994)]; 문헌[Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991)]; 문헌[Short Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., J. Wiley and Sons, 2002)]; 문헌[Immunobiology (C.A. Janeway et al., 2004)]; 문헌[Antibodies (P. Finch, 1997)]; 문헌[Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989)]; 문헌[Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000)]; 문헌[Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)]; 문헌[The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)]; 및 문헌[Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 2011)].
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 과학 및 기술 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다. 임의의 잠재적인 모호성이 있는 경우, 본원에 제공된 정의가 임의의 사전 또는 외부 정의보다 우선한다. 맥락상 달리 요구되지 않는 한, 단수형 용어는 복수형을 포함하고, 복수형 용어는 단수형을 포함한다. "또는"의 사용은 달리 언급하지 않는 한, "및/또는"을 의미한다. 용어 "포함하는"과, "포함하다" 및 "포함하였다"와 같은 다른 형태의 사용은 제한적이지 않다.
본 발명을 보다 쉽게 이해할 수 있도록, 소정 용어가 우선 정의된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "벡터"는 숙주 세포로의 핵산의 운반 및/또는 클로닝을 위한 임의의 비히클을 지칭한다. 벡터는 부착된 절편의 복제를 일으키기 위해 다른 핵산 절편이 부착될 수 있는 레플리콘일 수 있다. "레플리콘"은 생체 내 복제의 자율 단위로서의 기능을 하는, 즉 그 자체의 제어 하에 복제할 수 있는 임의의 유전 요소(예를 들어, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)를 지칭한다. 용어 "벡터"는 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내에서 세포로 핵산을 도입하기 위한 바이러스 비히클 및 비바이러스 비히클 둘 모두를 포함한다. 많은 수의 벡터는 당업계에서 공지되고 사용되며, 이는 예를 들어 플라스미드, 변형된 진핵생물 바이러스 또는 변형된 박테리아 바이러스를 포함한다. 적합한 벡터 내로의 폴리뉴클레오티드의 삽입은 적절한 폴리뉴클레오티드 단편을 상보성 돌출(cohesive) 말단을 갖는 선택된 벡터 내에 라이게이션시킴으로써 달성될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 임의의 길이의 중합체 형태의 뉴클레오티드(리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드)를 지칭한다. 따라서, 이 용어는 단일-, 이중-, 또는 다중-가닥 DNA 또는 RNA, 게놈 DNA, cDNA, DNA-RNA 하이브리드, 또는 퓨린 및 피리미딘 염기를 포함하는 중합체, 또는 기타 천연의, 화학적, 또는 생화학적으로 변형된, 비천연적인, 또는 유도체화된 뉴클레오티드 염기를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 폴리뉴클레오티드의 백본은 당 및 포스페이트 기(일반적으로 RNA 또는 DNA에서 발견될 수 있음), 또는 변형되거나 치환된 당 또는 포스페이트 기를 포함할 수 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오티드의 백본은 포스포르아미데이트와 같은 합성 서브유닛의 중합체를 포함할 수 있고, 따라서 올리고데옥시뉴클레오시드 포스포르아미데이트(P-NH2) 또는 혼합된 포스포르아미데이트-포스포디에스테르 올리고머일 수 있다. 또한, 상보성 가닥을 합성하고 적절한 조건에서 가닥들을 어닐링함으로써, 또는 적절한 프라이머를 이용하여 DNA 중합체라아제를 사용하여 상보성 가닥을 드노보(de novo)로 합성함으로써 화학적 합성의 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 산물로부터 이중-가닥 폴리뉴클레오티드가 수득될 수 있다.
용어 "폴리펩티드"와 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위해 상호교환가능하게 사용되며, 최소 길이로 제한되지 않는다. 이러한 아미노산 잔기의 중합체는 천연 또는 비천연 아미노산 잔기를 포함할 수 있고, 펩티드, 올리고펩티드, 아미노산 잔기의 이량체, 삼량체, 및 다량체를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 전장 단백질 및 이의 단편이 모두 상기 정의에 포함된다. 이 용어는 또한 폴리펩티드의 발현후 변형, 예를 들어, 글리코실화, 시알릴화, 아세틸화, 인산화 등을 포함한다. 또한, 본 발명의 목적상, "폴리펩티드"는 단백질이 목적하는 활성을 유지하는 한, 천연 서열에 대한 결실, 부가, 및 치환(일반적으로 자연적으로 보존적)과 같은 변형을 포함하는 단백질을 지칭한다. 이러한 변형은 부위-지정 돌연변이유발을 통해서와 같이 의도적일 수 있거나, 단백질을 생성하는 숙주의 돌연변이 또는 PCR 증폭으로 인한 오류를 통해서와 같이 우연적일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "재조합 바이러스 벡터"는 하나 이상의 이종 서열(즉, 바이러스 기원이 아닌 핵산 서열)을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드 벡터를 지칭한다. 재조합 AAV 벡터의 경우, 재조합 핵산은 적어도 하나의 역위 말단 반복 서열(ITR)이 측접한다. 일부 실시 형태에서, 재조합 핵산은 2개의 ITR이 측접한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "재조합 AAV 벡터(rAAV 벡터)"는 적어도 하나의 AAV 역위 말단 반복 서열(ITR)이 측접하는 하나 이상의 이종 서열(즉, AAV 기원이 아닌 핵산 서열)을 포함하는 폴리뉴클레오티드 벡터를 지칭한다. 이러한 rAAV 벡터는 적합한 헬퍼 바이러스로 감염되었고(또는 적합한 헬퍼 기능을 발현하고 있고) AAV rep 및 cap 유전자 생성물(즉, AAV Rep 및 Cap 단백질)을 발현하고 있는 숙주 세포에 존재할 때 복제될 수 있고 감염성 바이러스 입자로 패키징될 수 있다. rAAV 벡터가 더 큰 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 염색체, 또는 클로닝이나 형질감염에 사용되는 플라스미드와 같은 다른 벡터)에 통합되는 경우, rAAV 벡터는 AAV 패키징 기능 및 적합한 헬퍼 기능의 존재 하에서 복제 및 캡시드화에 의해 "회수"될 수 있는 "프로-벡터(pro-vector)"로 지칭될 수 있다. rAAV 벡터는 지질과 복합체화되고, 리포솜 내에 캡슐화되고, 바이러스 입자, 예를 들어, AAV 입자 내에 캡시드화된 플라스미드, 선형 인공 염색체를 포함하지만 이에 한정되지 않는 다수의 형태 중 임의의 형태로 존재할 수 있다. rAAV 벡터는 AAV 바이러스 캡시드에 패키징되어 "재조합 아데노-관련 바이러스 입자(rAAV 입자)"를 생성할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "rAAV 바이러스" 또는 "rAAV 바이러스 입자"는 적어도 하나의 AAV 캡시드 단백질 및 캡시드화된 rAAV 벡터 게놈으로 구성된 바이러스 입자를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "이종"은 비교 대상이 되거나 내부에 도입 또는 통합되는 엔티티의 나머지와는 유전자형으로 구분되는 엔티티로부터 유래된 것을 의미한다. 예를 들어, 유전 공학 기술에 의해 상이한 세포 유형에 도입된 폴리뉴클레오티드는 이종 폴리뉴클레오티드이다(그리고 발현되는 경우, 이종 폴리펩티드를 코딩할 수 있다). 이와 유사하게, 바이러스 벡터로 통합된 세포 서열(예를 들어, 유전자 또는 이의 일부)은 벡터와 관련하여 이종 뉴클레오티드 서열이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "트랜스진"은 세포에 도입되어 RNA로 전사될 수 있고, 선택적으로, 적절한 조건 하에서 번역 및/또는 발현될 수 있는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 양태들에서, 이는 도입된 세포에 요구되는 특성을 제공하거나, 요구되는 치료적 또는 진단적 결과를 유도한다. 또 다른 양태에서, 이는 RNA 간섭을 매개하는 분자, 예를 들어, miRNA, siRNA, 또는 shRNA로 전사될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 바이러스 역가와 관련하여 사용된 용어 "게놈 입자(gp)", "게놈 당량", 또는 "게놈 카피"는 감염성 또는 기능성과 무관하게, 재조합 AAV DNA 게놈을 포함하는 비리온의 수를 지칭한다. 특정 벡터 제제 중 게놈 입자의 수는 본원의 실시예에 기술되거나, 예를 들어, 문헌[Clark et al. (1999) Hum. Gene Ther., 10: 1031- 1039]; 문헌[Veldwijk et al. (2002) Mol. Ther., 6:272-278]에 기술된 바와 같은 절차에 의해 측정될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "벡터 게놈(vg)"은 벡터, 예를 들어 바이러스 벡터의 한 세트의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 지칭할 수 있다. 벡터 게놈은 바이러스 입자에 캡시드화될 수 있다. 특정 바이러스 벡터에 따라, 벡터 게놈은 단일-가닥 DNA, 이중-가닥 DNA, 또는 단일-가닥 RNA, 또는 이중-가닥 RNA를 포함할 수 있다. 벡터 게놈은 특정 바이러스 벡터와 관련된 내인성 서열 및/또는 재조합 기술을 통해 특정 바이러스 벡터에 삽입되는 임의의 이종 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 재조합 AAV 벡터 게놈은 프로모터에 측접한 적어도 하나의 ITR 서열, 스터퍼, 관심 서열(예컨대, RNAi), 및 폴리아데닐화 서열을 포함할 수 있다. 완전한 벡터 게놈은 벡터의 폴리뉴클레오티드 서열의 완전한 세트를 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 바이러스 벡터의 핵산 역가는 vg/ml 단위로 측정될 수 있다. 이러한 역가를 측정하는 데 적합한 방법은 당업계에 알려져 있다(예컨대, 정량적 PCR).
본원에서 사용되는 바와 같이, 바이러스 역가와 관련하여 사용되는 용어 "감염 단위(iu)", "감염성 입자" 또는 "복제 단위"는, 예를 들어, 문헌[McLaughlin et al. (1988) J. Virol., 62: 1963-1973]에 기술된 바와 같은 복제 중심 분석으로도 공지된 감염 중심 분석에 의해 측정되는 감염성 및 복제-적격 재조합 AAV 벡터 입자의 수를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 바이러스 역가와 관련하여 사용된 용어 "형질도입 단위(tu)"는 본원의 실시예, 또는 예를 들어 문헌[Xiao et al. (1997) Exp. Neurobiol., 144:113-124]; 또는 문헌[Fisher et al. (1996) J. Virol., 70:520-532](LFU 분석)에 기술된 것과 같은 기능성 분석으로 측정되는 기능성 트랜스진 산물의 생성을 초래하는 감염성 재조합 AAV 벡터 입자의 수를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "역위 말단 반복" 또는 "ITR" 서열은 당업계에서 널리 이해되는 용어로, 반대 방향의 바이러스 게놈들의 말단에서 발견되는 상대적으로 짧은 서열을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 당업계에서 널리 이해되는 용어인 "AAV 역위 말단 반복(ITR)" 서열은 천연 단일-가닥 AAV 게놈의 양 말단에 존재하는 대략 145개 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. ITR의 가장 바깥쪽 125개 뉴클레오티드는 두 가지 대안적인 방향 중 하나로 존재할 수 있어, 상이한 AAV 게놈들 사이에, 그리고 단일 AAV 게놈의 양 말단 사이에 이질성을 초래한다. 가장 바깥쪽의 125개 뉴클레오티드는 또한 자기-상보성의 여러 개의 더 짧은 영역(A, A', B, B', C, C 및 D 영역으로 명명됨)을 포함하며, 이는 가닥내 염기쌍 형성이 ITR의 상기 부분 내에서 발생하는 것을 가능케 한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "말단 분해 서열" 또는 "trs"는 바이러스 DNA 복제 중에 AAV rep 단백질에 의해 절단되는 AAV ITR의 D 영역 내의 서열을 지칭한다. 돌연변이 말단 분해 서열은 AAV rep 단백질에 의한 절단에 불응한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, AAV에 대한 "헬퍼 바이러스"라는 용어는 (결함이 있는 파보바이러스인) AAV가 숙주 세포에 의해 복제되어 패키징될 수 있게 하는 바이러스를 지칭한다. 아데노바이러스, 헤르페스바이러스 및 폭스바이러스, 예컨대 백시니아를 포함하는, 이러한 많은 헬퍼 바이러스가 확인되어 있다. 아데노바이러스는 많은 상이한 서브그룹을 포함하지만, 서브그룹 C의 아데노바이러스 5형(Ad5)이 가장 흔히 사용된다. 인간, 비인간 포유류, 및 조류 기원의 여러 아데노바이러스가 알려져 있으며, ATCC와 같은 기탁기관으로부터 입수 가능하다. ATCC와 같은 기탁기관으로부터 또한 입수 가능한 헤르페스 패밀리의 바이러스는, 예를 들어 단순 헤르페스 바이러스(HSV), 엡스타인 바 바이러스(EBV), 사이토메갈로바이러스(CMV), 및 가성 광견병 바이러스(PRV)를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 기준 폴리펩티드 또는 핵산 서열과 관련된 "서열 동일성 퍼센트(%)"는 서열을 정렬하고, 최대 서열 동일성 퍼센트를 달성하기 위해, 필요한 경우 갭을 도입한 후, 기준 폴리펩티드 또는 핵산 서열 내의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드와 동일한, 후보 서열 내의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 백분율로서 정의되며, 임의의 보존적 치환은 서열 동일성의 일부분으로 고려하지 않는다. 아미노산 또는 핵산 서열 동일성 퍼센트 결정의 목적을 위한 정렬은, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어를 포함하여, 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어 프로그램, 예를 들어 문헌[Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1987), Supp. 30, 섹션 7.7.18, 표 7.7.1]에 기술된 것들을 사용하여, 당업계의 기술 내에 있는 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 정렬 프로그램의 예로는 ALIGN Plus(Scientific and Educational Software, 미국 펜실베이니아주 소재)가 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전체 길이에 대해 최대 정렬을 달성하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 포함하는, 정렬 측정을 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다. 본원의 목적상, 주어진 아미노산 서열 B에 대해, 이와, 또는 이에 대하여, 주어진 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 %(이는 대안적으로는 주어진 아미노산 서열 B에 대해, 이와, 또는 이에 대하여, 특정 %의 아미노산 서열 동일성을 가지거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A라고 표현될 수 있음)는 다음과 같이 계산된다: 100 x 분율 X/Y(X는 A 및 B의 서열 정렬 프로그램에 의한 프로그램 정렬시, 동일한 매칭으로 스코어링된 아미노산 잔기의 수이며, Y는 B의 총 아미노산 잔기 수임). 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, A 대 B의 아미노산 서열 동일성 %는 B 대 A의 아미노산 서열 동일성 %와 동일하지 않을 것임이 이해될 것이다. 본원의 목적상, 주어진 핵산 서열 D에 대해, 이와, 또는 이에 대하여, 주어진 핵산 서열 C의 핵산 서열 동일성 %(대안적으로는, 주어진 핵산 서열 D에 대해, 이와, 또는 이에 대하여, 특정 %의 핵산 서열 동일성을 가지거나 포함하는 주어진 핵산 서열 C로서 표현될 수 있음)는 다음과 같이 계산된다: 100 x 분율 W/Z(W는 C 및 D의 서열 정렬 프로그램에 의한 프로그램 정렬시, 동일한 매칭으로 스코어링된 뉴클레오티드의 수이며, Z는 D의 총 뉴클레오티드 수임). 핵산 서열 C의 길이가 핵산 서열 D의 길이와 동일하지 않은 경우, C 대 D의 핵산 서열 동일성 %는 D 대 C의 핵산 서열 동일성 %와 동일하지 않을 것임이 이해될 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "단리된" 분자(예를 들어, 핵산 또는 단백질) 또는 세포는 천연 환경 성분으로부터 확인되고, 분리되고/분리되거나 회수되었음을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유효량"은 임상 결과(예를 들어, 증상의 개선, 임상 평가변수의 달성 등)를 포함하여 유익하거나 요망되는 결과를 가져오기에 충분한 양이다. 유효량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다. 질환 상태의 측면에서, 유효량은 질환을 개선하거나, 안정화하거나, 또는 진행을 지연시키기에 충분한 양이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "개체" 또는 "대상체"는 포유동물이다. 포유동물은 가축(예를 들어, 소, 양, 고양이, 개, 및 말), 영장류(예를 들어, 인간 및 비-인간 영장류, 예를 들어, 원숭이), 토끼, 및 설치류(예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 특정 실시 형태에서, 개체 또는 대상체는 인간이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료"는 유익하거나 요망되는 임상 결과를 얻기 위한 접근법을 지칭한다. 본 발명의 목적상, 유익하거나 요망되는 임상 결과는 검출 가능하든지 검출 가능하지 않든지 간에, 증상의 경감, 질환 정도의 감소, 질환의 안정화된(예를 들어, 악화되지 않는) 상태, 질환의 확산(예를 들어, 전이) 방지, 질환 진행의 지연 또는 둔화, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 관해(부분적 또는 전체적)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 또한, "치료"는 치료를 받지 않을 경우 예상되는 생존에 비해 연장되는 생존을 의미할 수 있다. "치료하다"라는 용어는 "치료"의 동사 형태이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "예방적 치료"는 개체가 장애를 갖거나 장애를 가질 위험이 있는 것으로 알려지거나 의심되지만 장애의 증상을 나타내지 않거나 장애의 최소 증상을 나타낸 치료를 지칭한다. 예방적 치료를 받는 개체는 증상의 발생 전에 치료될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "치료"제(예를 들어, 치료용 폴리펩티드, 핵산, 또는 트랜스진)는 유익하거나 요망되는 임상 결과, 예를 들어, 상기 기술된 예시적 임상 결과를 제공하는 것이다. 이와 같이, 치료제는 상기 기술된 바와 같은 치료에서 이용될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "중심 망막"은 외측 황반 및/또는 내측 황반 및/또는 중심와를 지칭한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "망막 중심 세포 유형"은, 예를 들어 망막 색소 상피(RPE) 및 광수용체 세포와 같은 망막 중심의 세포 유형을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "황반"은 말초 망막과 비교하여 상대적으로 더 높은 농도의 광수용체 세포, 구체적으로 간상체 및 추상체를 포함하는 영장류의 망막 중심의 영역을 지칭한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "외측 황반"은 "말초 황반"으로도 지칭될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "내측 황반"은 "중심 황반"으로도 지칭될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "중심와(fovea)"는, 말초 망막 및 황반과 비교하여 상대적으로 더 높은 농도의 광수용체 세포, 구체적으로 추상체를 포함하는, 직경이 대략 0.5 mm 이하인 영장류의 중심 망막에 있는 작은 영역을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "망막하 공간"은 광수용체 세포와 망막 색소 상피 세포 사이의 망막 내 위치를 지칭한다. 망막하 공간은 유체의 임의의 망막하 주사 전과 같이 잠재적 공간일 수 있다. 망막하 공간은 또한 잠재적 공간 내로 주사되는 유체를 포함할 수 있다. 이 경우, 유체는 "망막하 공간과 접촉"한다. "망막하 공간과 접촉"하는 세포는 RPE 및 광수용체 세포와 같이 망막하 공간에 접하는 세포를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "수포"는 눈의 망막하 공간 내의 유체 공간을 지칭한다. 본 발명의 수포는 단일 공간 내로의 유체의 단회 주사에 의해, 동일 공간 내로의 하나 이상의 유체의 다중 주사에 의해, 또는 다중 공간 내로의 다중 주사에 의해 생성될 수 있는데, 이는 재위치화되는 경우 망막하 공간의 원하는 부분에 걸쳐 치료적 효과를 달성하기 위해 유용한 전체 유체 공간을 생성한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "각막"은 홍채, 동공 및 전실을 덮는 눈의 투명한 전방 부분을 지칭한다.
변형된 AAV 캡시드 단백질
눈의 장애에 대한 유전자 치료 프로토콜은 눈 내의 세포(예를 들어, 망막의 세포)로의 벡터의 국소화된 전달을 필요로 한다. 이들 질환에서 치료 표적이 될 세포는 특히 눈의 하나 이상의 세포(예를 들어, 광수용체, 각막 내피 세포 등)를 포함할 수 있다. 본원에 기술된 방법은 적어도 부분적으로, AAV 캡시드 단백질(예를 들어, 하나 이상의 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 AAV 캡시드 단백질)에 대한 특정 변형의 발견을 기반으로 하며, 안구 세포 사이에서의 광범위한 벡터 분포를 허용한다. 이와 같이, 이들 캡시드는 개체의 눈으로 이종 핵산을 전달하고/하거나, 개체의 눈으로의 rAAV 입자의 전달 후의 세포의 rAAV 형질도입을 개선하고/하거나, 개체의 눈으로의 rAAV 입자의 전달 후의 이종 핵산의 발현을 개선하고/하거나, rAAV 입자를 이용하여 개체의 눈의 장애를 치료하는 데 특히 유리할 수 있다.
AAV 캡시드(예를 들어, AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 등)는 3개의 구조 단백질 VP1, VP2 및 VP3으로 구성되며, 이들은 VP2 및 VP3에 대한 대안적인 시작 코돈을 이용하여 1:1:10의 대략적인 화학량론으로 동일 오픈 리딩 프레임으로부터 발현된다. 캡시드 단백질들은 아미노산 서열의 대부분을 공유하며; VP1 및 VP2는 약 65개 아미노산의 공유된 N-말단 확장이 VP3과 다르며, 혈청형에 따라, VP1은 추가로 약 135개의 고유한 아미노산을 포함한다(문헌[McPherson & Rose. J Virol (1983) 46: 523-529]). VP1은, 부분적으로 고도 보존 N 말단 포스포리파아제 A2(sPLA2) 상동성 도메인(아미노산 52~97)의 존재로 인해 바이러스 감염에 필요한데, 상기 도메인은 캡시드 내부에 묻혀 있지만 산성 엔도솜 구획의 구조적 변화 후 5-폴드(fold) 대칭 축에서 발견되는 기공을 통해 외부화된다. VP2는 바이러스의 캡시드 조립 및 감염성에 필수적이지만, 포스포리파아제 A2(PLA2) 촉매 도메인 및 그 활성의 손실을 초래하는 VP1의 임의의 결실 또는 돌연변이는 유의하게 감소된 AAV 감염성을 초래한다(문헌[Girod et al. Journal of General Virology (2002), 83: 973-9]).
또한, 감염성에 영향을 미치는 다른 신호가 AAV-2의 VP1-고유 영역에 위치할 수 있다고 가정되었으며, 이는 여러 자율 파보바이러스 캡시드 단백질에 대해 보고되었다. 바이러스 캡시드 단백질을 특성화하기 위한 직접 액체 크로마토그래피/질량 분석법(LC/MS)에 의한 무손상 단백질 분석. 이 방법을 사용하여 서열 및 번역 후 변형(PTM)을 포함한 여러 AAV 벡터의 구성 바이러스 캡시드 단백질의 완전한 특성이 결정될 수 있다. 분석된 6가지 혈청형(AAV1, 2, 5, 7, 9 및 rh10)의 모든 VP의 N 말단은 AAV7의 VP3을 제외하고는 DNA 서열을 기반으로 한 예측된 N 말단 이후 하나의 잔기에서 시작하는 것으로 확인되었다. 또한, AAV 혈청형 1, 2, 5, 7, 9 및 rh10의 VP1 및 VP3은 N 말단 아세틸화를 포함하는 것으로 나타났다. 단백질의 N 말단 아세틸화는 널리 알려진 현상이지만, 바이러스 캡시드 단백질의 N 말단 아세틸화의 생물학적 중요성은 잘 알려져 있지 않다. PCT 공개 번호 WO2018/035059를 참조하는데, 이의 개시 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
일 양태에서, 망막 세포에서 개선된 형질도입을 부여하는 치환을 포함하는 변형된 AAV 캡시드 단백질이 본원에서 제공된다. 예를 들어, VP1 N 말단 아세틸화를 보존하고 VP3 N 말단 아세틸화를 감소시키는 치환은 모 AAV 캡시드 단백질과 비교하여 망막 형질도입의 유의한 개선을 초래한다. 따라서, 어떠한 이론에도 구애됨이 없이, 그러한 치환(예를 들어, VP1 N 말단 아세틸화를 보존하고 VP3 N 말단 아세틸화를 감소시키는 것)은 모 AAV 캡시드 단백질과 비교하여 AAV 캡시드 단백질의 망막 형질도입의 유의한 개선을 부여할 것으로 믿어진다.
특정 실시 형태에서, VP1 N 말단 아세틸화를 보존하고 VP3 N 말단 아세틸화를 감소시키는 AAV5 캡시드 단백질에서의 치환은 모 AAV5 캡시드 단백질과 비교하여 망막 형질도입의 유의한 개선을 초래한다. 특정 실시 형태에서, 변형된 AAV5 캡시드 단백질은 VP1 넘버링에 따른 위치 S194에서 아미노산 치환을 포함한다. 특정 실시 형태에서, VP1 넘버링에 따른 아미노산 위치 194에서 세린(S)을 치환하는 글리신(G)(S194G)을 포함하는 변형된 AAV5 캡시드 단백질이 본원에서 제공된다. 이러한 치환이 임의의 AAV 혈청형의 캡시드 단백질로 전달될 수 있고, 부여된 형질도입 품질이 다른 AAV 혈청형의 캡시드 단백질로 전달될 것으로 예상된다는 것이 당업자에 의해 용이하게 이해된다. 당업자는 예를 들어 서열 정렬에 의해 당업계에 공지된 방법을 사용하여 다른 AAV 혈청형에서 상응하는 아미노산 위치를 확인할 수 있을 것이다.
예를 들어, AAV 수용체 결합, 표면 전하 및 캡시드 단백질 번역 후 변형에 대한 변형은 특정 세포 유형의 신규한 지향성 및 형질도입을 부여할 수 있다. 예를 들어, 마우스 망막 및 CNS의 맥락에서 AAV2HBKO 변이체의 개선된 형질도입 성능이 나타났다. 문헌[Sullivan et al. (2018) Gen. Ther. 25: 205-219]를 참조한다. AAV2HBKO 변이체는 AAV2가 동족 수용체인 헤파린 술페이트 프로테오글리칸에 결합하는 것을 촉진하는 캡시드의 영역에서 돌연변이된 주요 표면 아르기닌을 갖는다. 이 헤파린 결합 녹아웃 변이체는 마우스 CNS 및 망막에서 신규한 형질도입 패턴을 보여주었다. PCT 공개 번호 WO2015/168666을 참조하는데, 이의 개시 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 따라서, AAV2HBKO 변이체는 아르기닌의 중요성을 보여주며, 확장 캡시드 표면 전하에 의해, 망막의 형질도입 활성에 대한 아르기닌의 중요성을 보여주었다.
일 양태에서, 각막 내피 세포에서 신규한 지향성 및 개선된 형질도입 활성을 부여하는 치환을 포함하는 변형된 AAV 캡시드 단백질이 본원에서 제공된다. 예를 들어, 아르기닌(R) 잔기의 부가는 AAV2에 비해 상대적으로 적은 표면 아르기닌을 갖는 AAV5의 지향성 및 형질도입 활성에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 따라서, 어떠한 이론에도 구애됨이 없이, 주요 표면 잔기에 아르기닌을 도입하면 모 AAV 캡시드 단백질과 비교하여 AAV 캡시드 단백질의 각막 내피 세포 형질도입의 유의한 개선을 부여할 것으로 믿어진다.
특정 실시 형태에서, 주요 표면 잔기에 아르기닌을 도입하는 AAV5 캡시드 단백질에서의 치환은 모 AAV5 캡시드 단백질과 비교하여 각막 내피 세포 형질도입의 유의한 개선을 초래한다. 특정 실시 형태에서, 변형된 AAV5 캡시드 단백질은 VP1 넘버링에 따른 위치 G474, N564, 및/또는 N573에서 아미노산 치환을 포함한다. 특정 실시 형태에서, VP1 넘버링에 따른 아미노산 위치 474에서 글리신(G)을 치환하는 아르기닌(R)(G474R)을 포함하는 변형된 AAV5 캡시드 단백질이 본원에서 제공된다. 특정 실시 형태에서, VP1 넘버링에 따른 아미노산 위치 564에서 아스파라긴(N)을 치환하는 아르기닌(R)(N564R)을 포함하는 변형된 AAV5 캡시드 단백질이 본원에서 제공된다. 특정 실시 형태에서, VP1 넘버링에 따른 아미노산 위치 573에서 아스파라긴(N)을 치환하는 아르기닌(R)(N573R)을 포함하는 변형된 AAV5 캡시드 단백질이 본원에서 제공된다. 이러한 치환이 임의의 AAV 혈청형의 캡시드 단백질로 전달될 수 있고, 부여된 형질도입 품질이 다른 AAV 혈청형의 캡시드 단백질로 전달될 것으로 예상된다는 것이 당업자에 의해 용이하게 이해된다. 당업자는 예를 들어 서열 정렬에 의해 당업계에 공지된 방법을 사용하여 다른 AAV 혈청형에서 상응하는 아미노산 위치를 확인할 수 있을 것이다.
따라서, 일 양태에서, 아미노산 S194, G474, N564, 및/또는 N573에 상응하는 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩티드(예를 들어, AAV 캡시드 단백질)가 본원에서 제공되며, 여기서, 위치의 넘버링은 AAV5의 VP1 넘버링을 기반으로 한다. 특정 실시 형태에서, 위치의 넘버링은 서열 번호 1에 기재된 야생형 AAV5 VP1의 아미노산 서열을 기반으로 한다. 이와 같이, 특정 실시 형태에서, 아미노산 S194, G474, N564, 및/또는 N573에 상응하는 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩티드(예를 들어, AAV 캡시드 단백질)가 본원에서 제공되며, 여기서, 위치의 넘버링은 서열 번호 1에 기재된 야생형 AAV5 VP1의 아미노산 서열을 기반으로 한다. 특정 실시 형태에서, 아미노산 S194, G474, N564, 및/또는 N573에 상응하는 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함하는 변형 캡시드 단백질이 본원에서 제공되며, 여기서, 위치의 넘버링은 AAV5의 VP1 넘버링을 기반으로 한다. 특정 실시 형태에서, 위치의 넘버링은 서열 번호 1에 기재된 야생형 AAV5 VP1의 아미노산 서열을 기반으로 한다. 이와 같이, 특정 실시 형태에서, 아미노산 S194, G474, N564, 및/또는 N573에 상응하는 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함하는 변형 캡시드 단백질이 본원에서 제공되며, 여기서, 위치의 넘버링은 서열 번호 1에 기재된 야생형 AAV5 VP1의 아미노산 서열을 기반으로 한다.
특정 실시 형태에서, 변형 캡시드 단백질은 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정한 실시 형태에서, 변형 캡시드 단백질은 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정한 실시 형태에서, 변형 캡시드 단백질은 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시 형태에서, 아미노산 S194에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함하는 변형 캡시드 단백질이 본원에서 제공되며, 여기서, 위치의 넘버링은 서열 번호 1에 기재된 야생형 AAV5 VP1의 아미노산 서열을 기반으로 한다. 특정 실시 형태에서, 아미노산 194에 상응하는 변형 캡시드 단백질의 아미노산은 G이다. 특정 실시 형태에서, 변형 캡시드 단백질은 서열 번호 3에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서, 서열 번호 3의 아미노산 194에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G이다. 특정 실시 형태에서, 변형 캡시드 단백질은 서열 번호 3에 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 변형 캡시드 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 3에 기재된 아미노산 서열로 이루어진다.
특정 실시 형태에서, 아미노산 G474에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함하는 변형 캡시드 단백질이 본원에서 제공되며, 여기서, 위치의 넘버링은 서열 번호 1에 기재된 야생형 AAV5 VP1의 아미노산 서열을 기반으로 한다. 특정 실시 형태에서, 아미노산 474에 상응하는 변형 캡시드 단백질의 아미노산은 R이다. 특정 실시 형태에서, 변형 캡시드 단백질은 서열 번호 5에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서, 서열 번호 5의 아미노산 474에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이다. 특정 실시 형태에서, 변형 캡시드 단백질은 서열 번호 5에 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 변형 캡시드 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 5에 기재된 아미노산 서열로 이루어진다.
특정 실시 형태에서, 아미노산 N564에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함하는 변형 캡시드 단백질이 본원에서 제공되며, 여기서, 위치의 넘버링은 서열 번호 1에 기재된 야생형 AAV5 VP1의 아미노산 서열을 기반으로 한다. 특정 실시 형태에서, 아미노산 564에 상응하는 변형 캡시드 단백질의 아미노산은 R이다. 특정 실시 형태에서, 변형 캡시드 단백질은 서열 번호 7에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서, 서열 번호 7의 아미노산 564에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이다. 특정 실시 형태에서, 변형 캡시드 단백질은 서열 번호 7에 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 변형 캡시드 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 7에 기재된 아미노산 서열로 이루어진다.
특정 실시 형태에서, 아미노산 N573에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함하는 변형 캡시드 단백질이 본원에서 제공되며, 여기서, 위치의 넘버링은 서열 번호 1에 기재된 야생형 AAV5 VP1의 아미노산 서열을 기반으로 한다. 특정 실시 형태에서, 아미노산 573에 상응하는 변형 캡시드 단백질의 아미노산은 R이다. 특정 실시 형태에서, 변형 캡시드 단백질은 서열 번호 9에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서, 서열 번호 9의 아미노산 573에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이다. 특정 실시 형태에서, 변형 캡시드 단백질은 서열 번호 9에 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 변형 캡시드 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 9에 기재된 아미노산 서열로 이루어진다.
따라서, 특정 실시 형태에서, 아미노산 194에 상응하는 위치에서 G; 아미노산 474에 상응하는 위치에서 R; 아미노산 564에 상응하는 위치에서 R; 및/또는 아미노산 573에 상응하는 위치에서 R을 포함하는 변형 아데노-관련 바이러스(AAV) 캡시드 단백질이 본원에서 제공되며, 여기서, 위치의 넘버링은 AAV5의 VP1 넘버링을 기반으로 한다(예를 들어, 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 VP1 번호를 기반으로 한다). 특정 실시 형태에서, 변형 캡시드 단백질은 아미노산 194에 상응하는 위치에서 G를 포함하며, 여기서, 위치의 넘버링은 AAV5의 VP1 넘버링을 기반으로 한다(예를 들어, 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 VP1 번호를 기반으로 한다). 특정 실시 형태에서, 변형 캡시드 단백질은 아미노산 474에 상응하는 위치에서 R을 포함하며, 여기서, 위치의 넘버링은 AAV5의 VP1 넘버링을 기반으로 한다(예를 들어, 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 VP1 번호를 기반으로 한다). 특정 실시 형태에서, 변형 캡시드 단백질은 아미노산 564에 상응하는 위치에서 R을 포함하며, 여기서, 위치의 넘버링은 AAV5의 VP1 넘버링을 기반으로 한다(예를 들어, 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 VP1 번호를 기반으로 한다). 특정 실시 형태에서, 변형 캡시드 단백질은 아미노산 573에 상응하는 위치에서 R을 포함하며, 여기서, 위치의 넘버링은 AAV5의 VP1 넘버링을 기반으로 한다(예를 들어, 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 VP1 번호를 기반으로 한다).
특정 실시 형태에서, 서열 번호 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드(예를 들어, 변형 아데노-관련 바이러스 캡시드 단백질)가 본원에서 제공된다. 특정 실시 형태에서, 서열 번호 3에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드(예를 들어, 변형 아데노-관련 바이러스 캡시드 단백질)가 본원에서 제공된다. 특정 실시 형태에서, 서열 번호 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드(예를 들어, 변형 아데노-관련 바이러스 캡시드 단백질)가 본원에서 제공된다. 특정 실시 형태에서, 서열 번호 5에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드(예를 들어, 변형 아데노-관련 바이러스 캡시드 단백질)가 본원에서 제공된다. 특정 실시 형태에서, 서열 번호 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드(예를 들어, 변형 아데노-관련 바이러스 캡시드 단백질)가 본원에서 제공된다. 특정 실시 형태에서, 서열 번호 7에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드(예를 들어, 변형 아데노-관련 바이러스 캡시드 단백질)가 본원에서 제공된다. 특정 실시 형태에서, 서열 번호 9에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드(예를 들어, 변형 아데노-관련 바이러스 캡시드 단백질)가 본원에서 제공된다. 특정 실시 형태에서, 서열 번호 9에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드(예를 들어, 변형 아데노-관련 바이러스 캡시드 단백질)가 본원에서 제공된다.
[표 1]
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
표 1에서, AA는 아미노산 서열을 지칭하며, NA는 표시된 바와 같은 AAV 캡시드 단백질의 핵산 서열을 지칭한다.
특정 실시 형태에서, 본원에 제공된 변형 캡시드 단백질은 AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVB1, AAVAnc80, AAV7m8, AAVrh10, AAV2(Y444F), AAV2(Y444+500+730), AAV2(Y252+272+444+500+700+704+730F), AAV8(Y733F), 및 이들의 임의의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 AAV 혈청형의 변형 캡시드 단백질이다. 임의의 AAV 혈청형의 캡시드 단백질은 본원에 기술된 치환에 따라 변형될 수 있다. 당업자는 본원에 기술된 아미노산 치환(예를 들어, S194, G474, N564, 및/또는 N573에서의 치환(여기서, 위치의 넘버링은 AAV5의 VP1 넘버링을 기반으로 함)을 도입하기에 적합한 임의의 다른 AAV 혈청형을 쉽게 확인할 수 있을 것이다. 특정 실시 형태에서, 변형 캡시드 단백질은 AAV5의 변형 캡시드 단백질이다. 특정 실시 형태에서, 변형 캡시드 단백질은 AAV1의 변형 캡시드 단백질이다. 특정 실시 형태에서, 변형 캡시드 단백질은 AAV2의 변형 캡시드 단백질이다. 특정 실시 형태에서, 변형 캡시드 단백질은 AAV4의 변형 캡시드 단백질이다. 특정 실시 형태에서, 변형 캡시드 단백질은 AAV6의 변형 캡시드 단백질이다. 특정 실시 형태에서, 변형 캡시드 단백질은 AAV7의 변형 캡시드 단백질이다. 특정 실시 형태에서, 변형 캡시드 단백질은 AAV8의 변형 캡시드 단백질이다. 특정 실시 형태에서, 변형 캡시드 단백질은 AAV9의 변형 캡시드 단백질이다. 특정 실시 형태에서, 변형 캡시드 단백질은 AAVB1의 변형 캡시드 단백질이다. 문헌[Choudhury et al. (2016) Mol. Ther., 24(7): 1247-1257]을 참조하며, 이의 개시 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 특정 실시 형태에서, 변형 캡시드 단백질은 Anc80L65, Anc80L27, 및 Anc80L121을 비롯한 AAVAnc80의 변형 캡시드 단백질이다. 문헌[Carvalho et al. (2018) Human Gene Therapy, 29(7): 771-784]을 참조하며, 이의 개시 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 특정 실시 형태에서, 변형 캡시드 단백질은 AAV7m8의 AAVB1의 변형 캡시드 단백질이다. 문헌[Dalkara et al. (2013) Sci. Transl. Med., 5(189): 189ra76]을 참조하며, 이의 개시 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 특정 실시 형태에서, 변형 캡시드 단백질은 AAVrh10의 변형 캡시드 단백질이다. 문헌[Gao et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99(18): 11854-11859]를 참조하며, 이의 개시 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 특정 실시 형태에서, 변형 캡시드 단백질은 AAV2(Y444F)의 변형 캡시드 단백질, 예를 들어, 위치 444에서 페닐알라닌(F)을 포함하는 AAV2의 변형 캡시드 단백질이다. 특정 실시 형태에서, 변형 캡시드 단백질은 AAV2(Y444+500+730)의 변형 캡시드 단백질, 예를 들어, 위치 444, 500, 및 730에서 페닐알라닌(F)을 포함하는 AAV2의 변형 캡시드 단백질이다. 특정 실시 형태에서, 변형 캡시드 단백질은 AAV2(Y252+272+444+500+700+704+730F)의 변형 캡시드 단백질, 예를 들어, 위치 252, 272, 444, 500, 700, 704 및 730에서 페닐알라닌(F)을 포함하는 AAV2의 변형 캡시드 단백질이다. 특정 실시 형태에서, 변형 캡시드 단백질은 AAV8(Y733F)의 변형 캡시드 단백질이다. 문헌[Bogner et al. (2015) PLoS One, 10(6): e0128759 (1-16)], 및 미국 특허 제8,445,267호를 참조하며, 이들의 개시 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 특정 실시 형태에서, 변형 캡시드 단백질은 본원에 기술된 임의의 AAV 혈청형의 변이체의 변형 캡시드 단백질이다.
핵산, 벡터 및 생성 방법
본원에 기술된 바와 같은 폴리펩티드(예를 들어, AAV 캡시드 단백질)를 코딩하는 핵산(예를 들어, 단리된 핵산)이 본원에서 제공된다.
따라서, 일 양태에서, 아미노산 S194, G474, N564, 및/또는 N573에 상응하는 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩티드(예를 들어, AAV 캡시드 단백질)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산이 본원에서 제공되며, 여기서, 위치의 넘버링은 AAV5의 VP1 넘버링을 기반으로 한다. 특정 실시 형태에서, 위치의 넘버링은 서열 번호 1에 기재된 야생형 AAV5 VP1의 아미노산 서열을 기반으로 한다. 이와 같이, 특정 실시 형태에서, 아미노산 S194, G474, N564, 및/또는 N573에 상응하는 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함하는 폴리펩티드(예를 들어, AAV 캡시드 단백질)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산이 본원에서 제공되며, 여기서, 위치의 넘버링은 서열 번호 1에 기재된 야생형 AAV5 VP1의 아미노산 서열을 기반으로 한다.
특정 실시 형태에서, 핵산은 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변형 캡시드 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 핵산은 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변형 캡시드 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 핵산은 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변형 캡시드 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변형 캡시드 단백질은 서열 번호 2에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 의해 코딩된다.
특정 실시 형태에서, 아미노산 S194에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함하는 변형 캡시드 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산이 본원에서 제공되며, 여기서, 위치의 넘버링은 서열 번호 1에 기재된 야생형 AAV5 VP1의 아미노산 서열을 기반으로 한다. 특정 실시 형태에서, 아미노산 194에 상응하는 변형 캡시드 단백질의 아미노산은 G이다. 특정 실시 형태에서, 핵산은 서열 번호 3에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변형 캡시드 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서, 서열 번호 3의 아미노산 194에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G이다. 특정 실시 형태에서, 핵산은 서열 번호 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 변형 캡시드 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 핵산은 변형 캡시드 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서, 변형 캡시드 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 3에 기재된 아미노산 서열로 이루어진다. 특정 실시 형태에서, 서열 번호 3에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변형 캡시드 단백질(여기서, 서열 번호 3의 아미노산 194에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G임)은 서열 번호 4에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 의해 코딩된다. 특정 실시 형태에서, 서열 번호 4에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산이 본원에서 제공된다. 특정 실시 형태에서, 서열 번호 4에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 단리된 핵산이 본원에서 제공된다.
특정 실시 형태에서, 아미노산 G474에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함하는 변형 캡시드 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산이 본원에서 제공되며, 여기서, 위치의 넘버링은 서열 번호 1에 기재된 야생형 AAV5 VP1의 아미노산 서열을 기반으로 한다. 특정 실시 형태에서, 아미노산 474에 상응하는 변형 캡시드 단백질의 아미노산은 R이다. 특정 실시 형태에서, 핵산은 서열 번호 5에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변형 캡시드 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서, 서열 번호 5의 아미노산 474에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이다. 특정 실시 형태에서, 핵산은 서열 번호 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 변형 캡시드 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 핵산은 변형 캡시드 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서, 변형 캡시드 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 5에 기재된 아미노산 서열로 이루어진다. 특정 실시 형태에서, 서열 번호 5에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변형 캡시드 단백질(여기서, 서열 번호 5의 아미노산 474에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R임)은 서열 번호 6에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 의해 코딩된다. 특정 실시 형태에서, 서열 번호 6에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산이 본원에서 제공된다. 특정 실시 형태에서, 서열 번호 6에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 단리된 핵산이 본원에서 제공된다.
특정 실시 형태에서, 아미노산 N564에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함하는 변형 캡시드 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산이 본원에서 제공되며, 여기서, 위치의 넘버링은 서열 번호 1에 기재된 야생형 AAV5 VP1의 아미노산 서열을 기반으로 한다. 특정 실시 형태에서, 아미노산 564에 상응하는 변형 캡시드 단백질의 아미노산은 R이다. 특정 실시 형태에서, 핵산은 서열 번호 7에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변형 캡시드 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서, 서열 번호 7의 아미노산 564에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이다. 특정 실시 형태에서, 핵산은 서열 번호 7에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 변형 캡시드 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 핵산은 변형 캡시드 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서, 변형 캡시드 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 7에 기재된 아미노산 서열로 이루어진다. 특정 실시 형태에서, 서열 번호 7에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변형 캡시드 단백질(여기서, 서열 번호 7의 아미노산 564에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R임)은 서열 번호 8에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 의해 코딩된다. 특정 실시 형태에서, 서열 번호 8에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산이 본원에서 제공된다. 특정 실시 형태에서, 서열 번호 8에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 단리된 핵산이 본원에서 제공된다.
특정 실시 형태에서, 아미노산 N573에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함하는 변형 캡시드 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산이 본원에서 제공되며, 여기서, 위치의 넘버링은 서열 번호 1에 기재된 야생형 AAV5 VP1의 아미노산 서열을 기반으로 한다. 특정 실시 형태에서, 아미노산 573에 상응하는 변형 캡시드 단백질의 아미노산은 R이다. 특정 실시 형태에서, 핵산은 서열 번호 9에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변형 캡시드 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서, 서열 번호 9의 아미노산 573에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R이다. 특정 실시 형태에서, 핵산은 서열 번호 9에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 변형 캡시드 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 핵산은 변형 캡시드 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서, 변형 캡시드 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 9에 기재된 아미노산 서열로 이루어진다. 특정 실시 형태에서, 서열 번호 9에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 변형 캡시드 단백질(여기서, 서열 번호 9의 아미노산 573에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R임)은 서열 번호 10에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산에 의해 코딩된다. 특정 실시 형태에서, 서열 번호 10에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산이 본원에서 제공된다. 특정 실시 형태에서, 서열 번호 10에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어진 단리된 핵산이 본원에서 제공된다.
특정 실시 형태에서, 핵산은 예를 들어, 캡시드 단백질의 발현을 개선하기 위해, 예를 들어 코돈 최적화, 특정 요소의 대체 및/또는 제거를 사용하여 최적화될 수 있다. 핵산 서열을 최적화하는 다양한 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 유전자 코드의 축퇴성을 이용하여 핵산 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열을 변경하지 않고서도 핵산의 특정 뉴클레오티드를 돌연변이시킬 수 있다. 예를 들어, 동일 아미노산에 대한 대안적인 코돈을 사용하여 핵산을 최적화할 수 있다. 특정 실시 형태에서, 최적화 방법은 코딩된 캡시드 단백질의 발현을 최적화되지 않은 핵산 서열에 의해 코딩된 캡시드의 발현에 비해 증가시킬 수 있다.
형질감염, 안정한 세포주 생산, 및 아데노바이러스-AAV 하이브리드, 헤르페스바이러스-AAV 하이브리드(문헌[Conway, JE et al., (1997). Virology 71(11):8780-8789]) 및 배큘로바이러스-AAV 하이브리드를 포함하는 감염성 하이브리드 바이러스 생산 시스템을 포함하는 rAAV 벡터의 생성을 위한 수많은 방법이 당업계에 공지되어 있다. rAAV 바이러스 입자의 생산을 위한 rAAV 생산 배양은 모두 다음을 필요로 한다: 1) 예를 들어 HeLa, A549 또는 293 세포와 같은 인간 유래 세포주, 또는 배큘로바이러스 생산 시스템의 경우 SF-9와 같은 곤충 유래 세포주를 포함하는 적합한 숙주 세포; 2) 야생형 또는 돌연변이 아데노바이러스(예컨대 온도 민감성 아데노바이러스), 헤르페스 바이러스, 배큘로바이러스, 또는 헬퍼 기능을 제공하는 플라스미드 구축물에 의해 제공되는 적합한 헬퍼 바이러스 기능(예를 들어, 레트로바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 배큘로바이러스 벡터, 또는 아데노바이러스 벡터 발현 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는 헬퍼 바이러스 벡터(여기서, 벡터는 발현 벡터임); 3) AAV rep 및 cap 유전자 및 유전자 산물; 4) 적어도 하나의 AAV ITR 서열이 측접한 트랜스진(예컨대 치료용 트랜스진); 및 5) rAAV 생산을 지원하기 위한 적합한 배지 및 배지 성분. 당업계에 알려진 적합한 배지를 rAAV 벡터의 생성에 사용할 수 있다. 이러한 배지는 변형 이글 배지(Modified Eagle Medium, MEM), 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium, DMEM), 미국 특허 6,566,118호에 기술된 것과 같은 주문제조형 제형, 및 미국 특허 6,723,551호에 기술된 것과 같은 Sf- 900 II SFM 배지를 비롯하여, Hyclone Laboratories 및 JRH에서 제조된 배지를 제한없이 포함한다(상기 미국 특허 각각은, 특히 재조합 AAV 벡터의 생성에 사용하기 위한 주문제조형 배지 제형과 관련하여, 그 전체가 본원에 참고로 포함됨).
rAAV 입자는 당업계에 알려진 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제6,566,118호; 미국 특허 제6,989,264호; 및 미국 특허 제6,995,006호를 참조한다. 본 발명의 실시에서, rAAV 입자를 생성하기 위한 숙주 세포는 포유류 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 미생물 및 효모를 포함한다. 숙주 세포는 또한, AAV rep 및 cap 유전자가 숙주 세포에서 안정적으로 유지되는 패키징 세포 또는 AAV 벡터 게놈이 안정적으로 유지되는 생산자 세포일 수 있다. 예시적인 패키징 및 생산자 세포는 293, A549 또는 HeLa 세포로부터 유래된다. AAV 벡터는 당업계에 알려진 표준 기술을 사용하여 정제되고 제형화된다.
일부 실시 형태에서, rAAV 입자는 삼중 형질감염법, 예를 들어 하기 제공되는 예시적인 삼중 형질감염법에 의해 생성될 수 있다. 간략하게 말하면, 헬퍼 아데노바이러스 플라스미드와 함께 rep 유전자 및 캡시드 유전자를 함유하는 플라스미드로 (예를 들어, 칼슘 포스페이트법을 사용하여) 세포주(예를 들어, HEK-293 세포)를 형질감염시킬 수 있고, 바이러스를 수집하고 선택적으로 정제할 수 있다.
일부 실시 형태에서, rAAV 입자는 생산자 세포주 방법, 예를 들어 하기 제공되는 예시적인 생산자 세포주 방법(또한, 문헌[Martin et al., (2013) Human Gene Therapy Methods 24:253-269]에서 언급된 방법 참조)에 의해 생성될 수 있다. 간략하게 말하면, 세포주(예를 들어, HeLa 세포주)는 rep 유전자, 캡시드 유전자, 및 프로모터-트랜스진 서열을 함유하는 플라스미드로 안정적으로 형질감염될 수 있다. 세포주는 rAAV 생성을 위한 선도 클론을 선택하기 위해 스크리닝될 수 있고, 이는 이후 생산용 생물반응기로 확장될 수 있고, rAAV 생성을 개시하도록 헬퍼로서 아데노바이러스(예를 들어, 야생형 아데노바이러스)로 감염될 수 있다. 이후 바이러스는 수확될 수 있고, 아데노바이러스가 (예를 들어, 열에 의해) 불활성화되고/불활성화되거나 제거될 수 있고, rAAV 입자가 정제될 수 있다.
본 발명의 적합한 rAAV 생성 배양 배지는 0.5~20(v/v 또는 w/v)의 수준의 혈청 또는 혈청-유래 재조합 단백질로 보충될 수 있다. 대안적으로, 당업계에 알려진 바와 같이, rAAV 벡터는 동물-유래 생성물이 없는 배지로도 언급될 수 있는 무혈청 조건에서 생성될 수 있다. 당업자는 생성 배양물에서 rAAV의 역가를 높이기 위해, rAAV 벡터의 생성을 지원하도록 설계된 상용 또는 주문제조형 배지에, 글루코스, 비타민, 아미노산, 및/또는 성장 인자를 제한 없이 포함하는 당업계에 알려진 하나 이상의 세포 배양 성분이 또한 보충될 수 있음을 이해할 수 있다.
rAAV 생성 배양물은 이용되는 특정 숙주 세포에 적합한 다양한 조건(넓은 온도 범위, 다양한 기간 등)에서 성장될 수 있다. 당업계에 알려진 바와 같이, rAAV 생성 배양물은 적합한 부착-의존성 용기, 예를 들어, 회전병, 중공 섬유 필터, 미세담체, 및 패킹된 베드(packed-bed) 또는 유체화된-베드 생물반응기에서 배양될 수 있는 부착-의존성 배양물을 포함한다. rAAV 벡터 생성 배양물은 또한, 예를 들어, 회전 플라스크, 교반 탱크 생물반응기, 및 일회용 시스템, 예를 들어, 웨이브 백(Wave bag) 시스템을 포함하는 다양한 방식으로 배양될 수 있는 현탁-적합화 숙주 세포, 예를 들어, HeLa, 293, 및 SF-9 세포를 포함할 수 있다.
본원에 기술된 바와 같은 rAAV 벡터 입자는 생성 배양물의 숙주 세포의 용해 또는 생성 배양물로부터 소모된 배지의 수확에 의해 rAAV 생성 배양물로부터 수확될 수 있으며, 단, 상기 세포는 미국 특허 제6,566,118호에 더욱 충분히 기술된 바와 같이 온전한 세포로부터 배지로 rAAV 입자를 방출시키는 당업계에 알려진 조건에서 배양된다. 특정 실시 형태에서, 본원에 기술된 바와 같은 rAAV 벡터 입자는 핵산이 발현되고 캡시드 단백질이 생성되게 하는 조건 하에 재조합 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는 방법에 의해 생성된다. 또한, 세포를 용해하는 적합한 방법은 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어, 다수의 동결/해동 사이클, 초음파처리, 미세유체화, 및 화학물질, 예컨대 세제 및/또는 프로테아제를 이용한 처리를 포함한다.
추가 실시 형태에서, rAAV 입자는 정제된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "정제"는 rAAV 입자가 자연 발생하는 장소나 최초 제조된 장소에 또한 존재할 수 있는 다른 성분 중 적어도 일부가 없는 rAAV 입자의 제제를 포함한다. 따라서, 예를 들어, 단리된 rAAV 입자는 배양 용해물 또는 생성 배양 상청액과 같은 공급원 혼합물로부터 상기 입자를 농축시키는 정제 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 농축은 예를 들어, 용액 내에 존재하는 DNase-저항성 입자(DRP) 또는 게놈 카피(gc)의 비율, 또는 감염력에 의해서와 같이 다양한 방법으로 측정될 수 있거나, 생성 배양 오염물 또는, 헬퍼 바이러스, 배지 성분 등을 비롯한 공정 중 오염물을 포함하는 오염물과 같은, 공급원 혼합물에 존재하는 제2의 잠재적 간섭 물질과 관련하여 측정될 수 있다.
일부 실시 형태에서, rAAV 생성 배양 수확물은 숙주 세포 파편을 제거하기 위해 청징된다. 일부 실시 형태에서, 생성 배양 수확물은, 예를 들어 등급 DOHC Millipore Millistak+ HC Pod 필터, 등급 A1HC Millipore Millistak+ HC Pod 필터, 및 0.2 μm Filter Opticap XL 10 Millipore Express SHC 친수성 막 필터를 포함하는 일련의 심층 필터를 통한 여과에 의해 청징된다. 청징은 또한 당업계에 알려진 다양한 다른 표준 기술, 예를 들어, 원심분리 또는 당업계에 알려진 0.2 μm 이상의 기공 크기의 임의의 셀룰로오스 아세테이트 필터를 통한 여과에 의해 달성될 수 있다.
일부 실시 형태에서, rAAV 생성 배양물 수확물은 생성 배양물에 존재하는 임의의 고분자량 DNA를 분해하기 위해 Benzonase®로 추가로 처리된다. 일부 실시 형태에서, Benzonase® 분해는, 예를 들어, 30분 내지 수 시간의 기간 동안 주위 온도 내지 37℃의 범위의 온도에서 1 내지 2.5 단위/ml의 최종 농도의 Benzonase®을 포함하는 당업계에 공지된 표준 조건 하에서 수행된다.
rAAV 입자는 다음 정제 단계 중 하나 이상을 이용하여 단리되거나 정제될 수 있다: 평형 원심분리; 플로우-쓰루 음이온 교환 여과; rAAV 입자의 농축을 위한 접선류 여과(TFF); 아파타이트 크로마토그래피에 의한 rAAV 포획; 헬퍼 바이러스의 열 불활성화; 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의한 rAAV 포획; 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의한 완충액 교환; 나노여과; 및 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 또는 친화성 크로마토그래피에 의한 rAAV 포획. 이들 단계는 단독으로, 다양한 조합으로, 또는 다양한 순서로 이용될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 방법은 하기 기술된 순서대로 모든 단계를 포함한다. rAAV 입자의 정제 방법은, 예를 들어 문헌[Xiao et al., (1998) Journal of Virology 72:2224-2232; 미국 특허 제6,989,264호 및 미국 특허 제8,137,948호; 및 WO 2010/148143]에서 발견된다.
일부 실시 형태에서, 본원에 기술된 rAAV 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 제약 조성물은 인간에 투여하기에 적합하다. 이러한 담체는 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Edition, pp. 1035-1038 및 1570-1580] 참조). 일부 실시 형태에서, 본원에 기술된 rAAV 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 제약 조성물은 눈 주사에 적합하다. 이러한 제약상 허용가능한 담체는 물 그리고, 낙화생유, 대두유, 광유 등과 같은, 석유, 동물, 식물, 또는 합성 유래의 것들을 포함하는 오일과 같은 살균 액체일 수 있다. 식염수 및 수성 덱스트로스, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 글리세롤 용액이 또한 액체 담체로서, 특히 주사 가능한 용액을 위한 액체 담체로서 이용될 수 있다. 제약 조성물은 추가적인 성분, 예를 들어, 보존제, 완충제, 장성제, 항산화제 및 안정화제, 비이온성 습윤제 또는 청징제, 증점제 등을 더 포함할 수 있다. 본원에 기술된 제약 조성물은 단일 단위 투여형 또는 다중투여 형태로 패키징될 수 있다. 조성물은 일반적으로 살균되고 실질적으로 등장성인 용액으로 제형화된다.
AAV 조성물 및 사용 방법
일 양태에서, 본원에 기술된 폴리펩티드(예를 들어, 변형 캡시드 단백질)를 포함하는 rAAV 캡시드, 및 이종 핵산을 포함하는 rAAV 벡터를 포함하는 rAAV 입자가 본원에서 제공된다.
rAAV는 치료용 핵산 및/또는 폴리펩티드(예를 들어, 치료용 또는 진단용 폴리펩티드)를 코딩하는 이종 핵산을 포함할 수 있다. 치료용 핵산 및/또는 치료용 또는 진단용 폴리펩티드를 코딩하는 이종 핵산은 표준 합성 및 재조합 방법을 이용하여 당업계에 공지된 방법을 이용하여 생성될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 이종 핵산은 치료용 폴리펩티드를 코딩한다. 일부 실시 형태에서, 이종 핵산은 진단용 폴리펩티드를 코딩한다. 치료용 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 비제한적인 예는 망막 질환을 야기하는 것으로 공지된 결손 또는 돌연변이 유전자, 예를 들어, Prph2, RPE65, MERTK, RPGR, RP2, RPGRIP, CNGA3, CNGB3, 및 GNAT2의 대체를 위한 핵산을 포함한다. 치료용 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 다른 비제한적인 예는 신경영양 인자(예를 들어, GDNF, CNTF, FGF2, PEDF, EPO), 항-아폽토시스 유전자(예를 들어, BCL2, BCL-X, NFKB), 항-혈관신생 인자(예를 들어, 엔도스타틴, 안지오스타틴, sFlt), 및 항-염증 인자(예를 들어, IL10, ILl-ra, TGFfi, IL4)를 코딩하는 핵산을 포함한다. 안과 장애에 대한 다른 치료용 폴리펩티드는 Myo7a, ABCA4, REP1, GUCY2D, PDE6C, RSI, RPGRIP, Lpcatl, AIPL1, RDH12, CHM을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 일부 실시 형태에서, 코딩된 폴리펩티드는 폴리펩티드의 인간 변이체이다.
이종 핵산은 세포내 단백질이거나, 세포막에 고정되거나, 세포 내에 남아있거나, 본원에 기술된 바와 같은 벡터로 형질도입된 세포에 의해 분비되는 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 벡터를 수용한 세포에 의해 분비되는 폴리펩티드에 있어서, 폴리펩티드는 가용성(즉, 세포에 부착되지 않음)일 수 있다. 예를 들어, 가용성 폴리펩티드는 막관통 영역이 없고 세포로부터 분비된다. 막관통 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 확인 및 제거하기 위한 기술은 당업계에 알려져 있다.
벡터의 핵산으로부터 전사되는 경우 본 발명의 질환 상태와 관련된 비정상적 또는 과잉 단백질의 번역 또는 전사를 방해함으로써 안구 장애를 치료할 수 있는 RNA(예를 들어, RNAi, 리보자임, miRNA, siRNA, 안티센스 RNA)를 코딩하는 이종 핵산을 포함하는 벡터가 또한 본원에서 제공된다. 예를 들어, 본원에 기술된 이종 핵산은 비정상적 및/또는 과잉 단백질을 코딩하는 mRNA의 고도로 특이적인 제거 또는 감소에 의해 질환을 치료하는 RNA를 코딩할 수 있다. 치료용 RNA 서열은 비정상적 및/또는 과잉 단백질, 예를 들어, 유전성 망막 변성의 다양한 형태에서 발생하는 단백질을 코딩하는 mRNA의 고도로 특이적인 제거 또는 감소에 의해 질환을 치료할 수 있는 RNAi, 작은 억제성 RNA(siRNA), 마이크로 RNA(miRNA), 및/또는 리보자임(예를 들어, 해머헤드 및 헤어핀 리보자임)을 포함한다. 치료용 RNA 서열에 의해 치료될 수 있는 안과 장애의 비제한적인 예는, 예를 들어, 상염색체 우성 색소성 망막염(ADRP) 및 당뇨성 망막병증을 포함한다. 본 발명에서 사용될 수 있는 치료용 RNA 서열 및 이들 서열을 코딩하는 핵산의 예는 예를 들어, 미국 특허 제6,225,291호에 기술된 것을 포함하며, 이의 개시 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 일부 실시 형태에서, 치료용 RNA 서열은 miR-708이다. 일부 실시 형태에서, miR- 708은 상기 rAAV 벡터의 일부로서 또는 제2 rAAV 벡터의 일부로서 야생형 로돕신을 코딩하는 핵산과 조합되어 이용된다. 일부 실시 형태에서, 야생형 로돕신을 코딩하는 핵산은 로돕신 유전자의 3'비번역 영역에 위치된 miR-708 표적 서열이 결여되어 있다. miR-708 및/또는 로돕신을 코딩하는 rAAV 벡터는 전체가 본원에 참고로 포함된 미국 가출원 제61/969,027호에 의해 제공된다.
이종 핵산은 세포내 단백질이거나, 세포막에 고정되거나, 세포 내에 남아있거나, 본원에 기술된 바와 같은 벡터로 형질도입된 세포에 의해 분비되는 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 벡터를 수용한 세포에 의해 분비되는 폴리펩티드에 있어서, 폴리펩티드는 가용성(즉, 세포에 부착되지 않음)일 수 있다. 예를 들어, 가용성 폴리펩티드는 막관통 영역이 없고 세포로부터 분비된다. 막관통 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 확인 및 제거하기 위한 기술은 당업계에 알려져 있다.
일부 실시 형태에서, 이종 핵산은 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 예시적인 프로모터는 사이토메갈로바이러스(CMV) 극초기 프로모터, RSV LTR, MoMLV LTR, 포스포글리세레이트 키나아제-1(PGK) 프로모터, 시미안 바이러스 40(SV40) 프로모터 및 CK6 프로모터, 트랜스티레틴 프로모터(TTR), TK 프로모터, 테트라사이클린 반응성 프로모터(TRE), HBV 프로모터, hAAT 프로모터, LSP 프로모터, 키메라 간 특이적 프로모터(LSP), E2F 프로모터, 텔로머라아제(hTERT) 프로모터; 사이토메갈로바이러스 인핸서/닭 베타-액틴/토끼 β-글로빈 프로모터(CAG 프로모터; 문헌[Niwa et al., Gene, 1991, 108(2):193-9]) 및 신장 인자 1-알파 프로모터(EFl-알파) 프로모터(문헌[Kim et al., Gene, 1990, 91(2):217-23] 및 문헌[Guo et al., Gene Ther., 1996, 3(9):802-10])를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 일부 실시 형태에서, 프로모터는 인간 β-글루쿠로니다아제 프로모터 또는 닭 β-액틴(CBA) 프로모터에 연결된 사이토메갈로바이러스 인핸서를 포함한다. 프로모터는 항시성, 유도성 또는 억제성 프로모터일 수 있다. 일부 실시 형태에서, CBA 프로모터에 작동가능하게 연결된 본 발명의 이종 트랜스진을 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터가 본원에서 제공된다. 예시적 프로모터 및 설명은, 예를 들어, 미국 PG 공개 20140335054에서 발견될 수 있다.
항시성 프로모터의 예는 제한 없이 레트로바이러스 라우스 육종 바이러스(RSV) LTR 프로모터(선택적으로 RSV 인핸서를 가짐), 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터(선택적으로 CMV 인핸서를 가짐)[예를 들어, 문헌[Boshart et al, Cell, 41:521-530 (1985)] 참조], SV40 프로모터, 디히드로폴레이트 리덕타아제 프로모터, 13-액틴 프로모터, 포스포글리세롤 키나아제(PGK) 프로모터 및 EFla 프로모터[Invitrogen]를 포함한다.
유도성 프로모터는 유전자 발현의 조절을 가능하게 하며, 외인적으로 공급된 화합물, 환경 요인, 예를 들어 온도, 또는 특정 생리학적 상태의 존재, 예를 들어, 급성기, 세포의 특정 분화 상태에 의해, 또는 복제 중인 세포에서만 조절될 수 있다. 유도성 프로모터 및 유도성 시스템은, 제한 없이 Invitrogen, Clontech 및 Ariad를 포함하는 다양한 상업적 공급처로부터 입수가능하다. 많은 다른 시스템이 기술되었으며 당업자에 의해 용이하게 선택될 수 있다. 외인성으로 제공된 프로모터에 의해 조절되는 유도성 프로모터의 예는 아연-유도성 양 메탈로티오닌(MT) 프로모터, 덱사메타손(Dex)-유도성 마우스 유선 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, T7 폴리머라아제 프로모터 시스템(WO 98/10088); 엑디손 곤충 프로모터(문헌[No et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:3346-3351 (1996)]), 테트라사이클린 억제성 시스템(문헌[Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)]), 테트라사이클린-유도성 시스템(문헌[Gossen et al., Science, 268:1766-1769 (1995)], 또한 문헌[Harvey et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 2:512-518 (1998)] 참조), RU486-유도성 시스템(문헌[Wang et al., Nat. Biotech., 15:239-243 (1997)] 및 문헌[Wang et al., Gene Ther., 4:432-441 (1997)]), 및 라파마이신-유도성 시스템(문헌[Magari et al., J. Clin. Invest., 100:2865-2872 (1997)])을 포함한다. 이와 관련하여 유용할 수 있는 유도성 프로모터의 또 다른 유형으로는 특정 생리학적 상태, 예를 들어 온도, 급성기, 세포의 특정 분화 상태에 의해, 또는 복제 중인 세포에서만 조절되는 프로모터가 있다.
특정 실시 형태에서, 이종 핵산은 안구 조직에서의 발현에 적합한 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 특정 실시 형태에서, 이종 핵산은 망막에서의 발현에 적합한 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 특정 실시 형태에서, 이종 핵산은 광수용체 세포, 망막 색소 상피 세포, 양극성 세포, 수평 세포, 무축삭 세포, 뮐러 세포, 신경절 세포, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 망막 세포에서의 발현에 적합한 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 특정 실시 형태에서, 이종 핵산은 각막에서의 발현에 적합한 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 특정 실시 형태에서, 이종 핵산은 상피 세포, 케라토사이트, 내피 세포, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 각막 세포에서의 발현에 적합한 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 다른 망막 및 각막 세포 유형은 당업계에 공지되어 있고, 숙련된 기술자는 이러한 세포 유형에서의 발현에 적합한 프로모터를 결정할 수 있을 것이다.
본원에 기술된 rAAV 조성물의 사용 방법이 본원에서 제공된다. 특정 실시 형태에서, 대상체에게 rAAV 입자를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체의 안구 조직에 이종 핵산을 전달하는 방법이 제공된다. 특정 실시 형태에서, rAAV 입자는 다음을 포함한다: 변형 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 캡시드로서, 변형 캡시드 단백질은 아미노산 194, 474, 564, 및/또는 573에 상응하는 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함하며, 위치의 넘버링은 AAV5의 VP1 넘버링을 기반으로 하는 캡시드; 및 이종 핵산을 포함하는 rAAV 벡터. 특정 실시 형태에서, 방법은 대상체의 망막에 이종 핵산을 전달하기 위한 것이다. 이러한 실시 형태에서, rAAV 입자는 다음을 포함한다: 변형 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 캡시드로서, 변형 캡시드 단백질은 아미노산 194에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함하며, 위치의 넘버링은 AAV5의 VP1 넘버링을 기반으로 하는 캡시드; 및 이종 핵산을 포함하는 rAAV 벡터. 특정 실시 형태에서, 방법은 대상체의 각막에 이종 핵산을 전달하기 위한 것이다. 이러한 실시 형태에서, rAAV 입자는 다음을 포함한다: 변형 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 캡시드로서, 변형 캡시드 단백질은 아미노산 474, 564, 및/또는 573에 상응하는 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함하며, 위치의 넘버링은 AAV5의 VP1 넘버링을 기반으로 하는 캡시드; 및 이종 핵산을 포함하는 rAAV 벡터.
특정 실시 형태에서, rAAV 입자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체의 안구 조직에서 세포의 rAAV 형질도입을 향상시키는 방법이 제공된다. 특정 실시 형태에서, rAAV 입자는 다음을 포함한다: 변형 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 캡시드로서, 변형 캡시드 단백질은 아미노산 194, 474, 564, 및/또는 573에 상응하는 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함하며, 위치의 넘버링은 AAV5의 VP1 넘버링을 기반으로 하는 캡시드; 및 이종 핵산을 포함하는 rAAV 벡터. 특정 실시 형태에서, 방법은 대상체의 망막에서 세포의 rAAV 형질도입을 향상시키기 위한 것이다. 이러한 실시 형태에서, rAAV 입자는 다음을 포함한다: 변형 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 캡시드로서, 변형 캡시드 단백질은 아미노산 194에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함하며, 위치의 넘버링은 AAV5의 VP1 넘버링을 기반으로 하는 캡시드; 및 이종 핵산을 포함하는 rAAV 벡터. 특정 실시 형태에서, 방법은 대상체의 각막에서 세포의 rAAV 형질도입을 향상시키기 위한 것이다. 이러한 실시 형태에서, rAAV 입자는 다음을 포함한다: 변형 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 캡시드로서, 변형 캡시드 단백질은 아미노산 474, 564, 및/또는 573에 상응하는 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함하며, 위치의 넘버링은 AAV5의 VP1 넘버링을 기반으로 하는 캡시드; 및 이종 핵산을 포함하는 rAAV 벡터.
특정 실시 형태에서, rAAV 입자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체의 안구 조직에서 이종 핵산의 발현을 향상시키는 방법이 제공된다. 특정 실시 형태에서, rAAV 입자는 다음을 포함한다: 변형 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 캡시드로서, 변형 캡시드 단백질은 아미노산 194, 474, 564, 및/또는 573에 상응하는 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함하며, 위치의 넘버링은 AAV5의 VP1 넘버링을 기반으로 하는 캡시드; 및 이종 핵산을 포함하는 rAAV 벡터. 특정 실시 형태에서, 방법은 대상체의 망막에서 이종 핵산의 발현을 향상시키기 위한 것이다. 이러한 실시 형태에서, rAAV 입자는 다음을 포함한다: 변형 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 캡시드로서, 변형 캡시드 단백질은 아미노산 194에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함하며, 위치의 넘버링은 AAV5의 VP1 넘버링을 기반으로 하는 캡시드; 및 이종 핵산을 포함하는 rAAV 벡터. 특정 실시 형태에서, 방법은 대상체의 각막에서 이종 핵산의 발현을 향상시키기 위한 것이다. 이러한 실시 형태에서, rAAV 입자는 다음을 포함한다: 변형 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 캡시드로서, 변형 캡시드 단백질은 아미노산 474, 564, 및/또는 573에 상응하는 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함하며, 위치의 넘버링은 AAV5의 VP1 넘버링을 기반으로 하는 캡시드; 및 이종 핵산을 포함하는 rAAV 벡터.
대상체에서 눈의 병태 또는 장애를 치료하는 방법이 또한 본원에서 제공되며, 본 방법은 rAAV 입자를 포함하는 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서, rAAV 입자는 변형 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 캡시드(여기서, 변형 캡시드 단백질은 아미노산 194, 474, 564, 및/또는 573에 상응하는 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함하며, 위치의 넘버링은 AAV5의 VP1 넘버링을 기반으로 함); 및 이종 핵산을 포함하는 rAAV 벡터를 포함한다.
본원에 기술된 다양한 방법에서, 이종 핵산은 야생형 rAAV 캡시드를 포함하는 rAAV 입자의 이종 핵산의 발현 수준과 비교하여 증가된 발현 수준으로 발현된다.
투여 방법
망막하 전달 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 본원에 참고로 포함된 WO 2009/105690을 참조한다. 간략하게 말하면, rAAV 입자(예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 변형 rAAV2 입자)를 중심와 및 황반의 망막하로 전달하기 위한 일반적인 방법은 다음의 간략한 개요로 예시될 수 있다. 이 예시는 단지 이 방법의 특정 특징을 예시함을 의미하고, 어떤 방식으로도 한정을 의미하지 않는다.
일반적으로, rAAV 벡터는 수술 현미경을 사용하는 직접적 관찰 하에 안내로(망막하로) 주사되는 조성물의 형태로 전달될 수 있다. 일부 실시 형태에서 벡터는 rAAV 입자에 캡시드화되어 있고, 여기서, rAAV 입자는 본원에 기술된 바와 같은 rAAV 캡시드, 및 이종 핵산 및 적어도 하나의 AAV 역위 말단 반복체를 포함하는 rAAV 벡터를 포함한다. 이 절차는 유리체절제에 이어서, 망막하 공간으로 하나 이상의 작은 망막절개를 통해 미세 캐뉼라를 사용하여 rAAV 벡터 현탁액을 주사하는 것을 포함할 수 있다.
간략하게 말하면, 주입 캐뉼라는 수술 전체에 걸친 주입(예를 들어, 식염수의 주입)에 의해 정상의 구형 부피를 유지시키기 위해 적소에 봉합될 수 있다. 유리체절제는 적절한 구멍 크기(예를 들어 20 내지 27 게이지)의 캐뉼라를 사용하여 수행되며, 여기서, 제거되는 유리체 겔의 부피는 주입 캐뉼라로부터 식염수 또는 다른 등장성 용액의 주입에 의해 대체된다. 유리하게는 유리체절제가 수행되며, 그 이유는 (1) 유리체 피질(후유리체막)의 제거가 캐뉼라에 의한 망막의 침투를 촉진하고, (2) 유리체의 제거 및 유체(예를 들어, 식염수)에 의한 대체가 벡터의 안내 주사를 수용하는 공간을 생성하고, (3) 유리체의 조절된 제거가 망막 열공 및 계획되지 않은 망막 박리의 가능성을 감소시키기 때문이다.
일부 실시 형태에서, rAAV 조성물은 적절한 구멍 크기(예를 들어, 27 내지 45 게이지)의 캐뉼라를 이용하여, 이에 따라 망막하 공간내 수포를 생성함으로써 중심 망막 외부의 망막하 공간으로 직접 주사된다. 다른 실시 형태에서, rAAV 조성물의 망막하 주사는 중심 망막 외부의 망막하 공간으로 작은 부피(예를 들어, 약 0.1 내지 약 0.5 ml)의 적절한 유체(예컨대 식염수 또는 링거액)의 망막하 주사 다음에 온다. 망막하 공간으로의 이러한 초기 주사는 망막하 공간 내에 초기 유체 수포를 확립하여, 초기 수포의 위치에서 국재화된 망막 박리를 야기한다. 이러한 초기 유체 수포는 망막하 공간으로의 rAAV 조성물의 표적화된 전달을 용이하게 하고(rAAV 전달 전 주사 평면을 한정함으로써), 맥락막 내로의 가능한 rAAV 투여 및 유리체강 내로의 rAAV 주사 또는 역류 가능성을 최소화할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 이러한 초기 액체 수포에 하나 이상의 rAAV 조성물 및/또는 하나 이상의 추가 치료제를 포함하는 유체를 추가로 주사할 수 있으며, 이는 동일 또는 추가의 미세 구멍 캐뉼라로 초기 유체 수포에 이들 유체를 직접적으로 투여하는 것에 의한 것이다.
rAAV 조성물　및/또는 초기 작은 부피의 유체의 안내 투여는 시린지에 부착된 미세 구멍 캐뉼라(예를 들어, 27 내지 45 게이지)를 사용하여 수행될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 이 시린지의 플런저는 발 페달을 누르는 것과 같은 기계화된 장치에 의해 구동될 수 있다. 미세 구멍 캐뉼라는 표적으로 하는 망막의 영역(그러나 중심 망막의 외부)에 따라 각각의 대상체에서 사전-결정된 부위에서 유리체강을 가로질러 망막 내로 공막절개를 통해 진행된다. 직접적인 시각화 하에서 벡터 현탁액은 감각신경 망막 아래 기계적으로 주사되어, 자가-밀봉 비-확장 망막절개로 국재화된 망막 박리를 야기한다. 위에서 언급한 바와 같이, rAAV 조성물은 망막하 공간으로 직접적으로 주사되어 중심 망막 외부에 수포를 생성할 수 있거나, 벡터가 중심 망막 외부에서 초기 수포 내로 주사되어, 이의 확장(및 망막 박리 영역의 확장)을 야기할 수 있다. 일부 실시 형태에서, rAAV 조성물의 주사에 이어 다른 유체의 수포 내로의 주사가 뒤따른다.
이론에 구애받지 않고, 망막하 주사(들)의 속도 및 위치는 황반, 중심와 및/또는 아래의 RPE 세포를 손상시킬 수 있는 국재화된 전단력을 초래할 수 있다. 망막하 주사는 전단력을 최소화 또는 회피하는 속도로 수행될 수 있다. 당업자는 소포의 주사 속도 및 시간이 예를 들어 중심 망막의 세포에 접근하기에 충분한 망막 박리를 생성하는 데 필요한 rAAV 조성물의 부피 또는 소포의 크기, rAAV 조성물을 전달하는 데 사용되는 캐뉼라의 크기, 및 캐뉼라의 위치를 안전하게 유지하는 능력에 의해 지시될 수 있음을 인식할 것이다.
일부 실시 형태에서, 본 방법은 이종 핵산을 코딩하는 벡터를 포함하는 재조합 바이러스 입자의 유효량을 눈에 투여(예를 들어, 망막하 및/또는 유리체내 투여에 의함)하는 단계를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 본원에 기술된 방법은 망막의 rAAV 형질도입을 초래한다. 특정 실시 형태에서, 본원에 기술된 방법은 망막 세포의 rAAV 형질도입을 초래한다. 특정 실시 형태에서, 본원에 기술된 방법은 각막의 rAAV 형질도입을 초래한다. 특정 실시 형태에서, 본원에 기술된 방법은 각막 세포의 rAAV 형질도입을 초래한다.
수포의 본래 위치 가장자리 외부의 표적 망막의 영역(예를 들어, 중심 망막)의 안전하고 효과적인 형질도입을 위해, 수포는 형질도입을 위한 표적 영역으로 수포가 재위치하도록 조작될 수 있다. 수포의 조작은 수포의 부피에 의해 생성되는 수포의 의존도, 수포를 포함하는 눈의 재배치, 하나 이상의 수포를 함유하는 눈 또는 눈들이 있는 인간의 두부의 재배치, 및/또는 유체-공기 교환에 의해 일어날 수 있다. 이것은 특히 중심 망막과 관련되는데, 그 이유는 이 영역이 전형적으로 망막하 주사에 의한 박리에 저항하기 때문이다. 일부 실시 형태에서 유체-공기 교환이 수포의 재배치에 이용되며; 주입 캐뉼라로부터의 유체는 공기에 의해, 예를 들어, 망막의 표면으로 공기를 불어서, 일시적으로 교체된다. 공기의 부피가 유리체강 유체를 망막의 표면으로부터 몰아내므로, 유리체강의 유체는 캐뉼라 밖으로 흐를 수 있다. 유리체강 유체로부터의 일시적인 압력의 결여는 수포가 이동하여 의존적 눈 부분으로 내려가도록 한다. 안구를 적절히 배치시킴으로써 망막하 rAAV 조성물의 수포는 인접 영역(예를 들어, 황반 및/또는 중심와)을 포함하도록 조작된다. 일부 경우에, 수포의 질량은 유체-공기 교환의 사용 없이도 이것이 아래로 내려가도록 하기에 충분하다. 원하는 위치로의 수포의 이동은 대상체의 두부의 위치를 변경시키는 것에 의해 더욱 용이하게 되어, 수포가 눈에서 원하는 위치로 내려가도록 할 수 있다. 일단 수포의 원하는 배치가 달성되면, 유체는 유리체강으로 돌아간다. 유체는 적절한 유체, 예를 들어, 신선한 식염수이다. 일반적으로, 망막하 rAAV 조성물은 망막유착 내지 망막절개 없이, 그리고 안내 탐폰 없이도 원위치에 남아있을 수 있고, 망막은 약 48 시간 이내에 자발적으로 재부착될 것이다.
치료용 폴리펩티드 또는 RNA 서열을 포함하는 벡터로 안구 세포(예를 들어, RPE 및/또는 광수용체 세포, 예를 들어, 황반 및/또는 중심와의 RPE 및/또는 광수용체 세포)를 안전하고 효과적으로 형질도입시킴으로써, 본원에 기술된 방법은 안과 장애를 갖는 개체, 예를 들어, 인간을 치료하는 데 이용될 수 있으며, 여기서, 형질도입된 세포는 안과 장애를 치료하기에 충분한 양의 치료용 폴리펩티드 또는 RNA 서열을 생성한다. 일부 실시 형태에서, 안구 세포의 형질도입은 본원에 기술된 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 입자(예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 변형 rAAV 입자)를 사용함으로써 개선된다.
rAAV(일부 실시 형태에서는 입자 형태)의 유효량은 치료 목적에 따라 투여된다. 예를 들어, 낮은 백분율의 형질도입이 원하는 치료 효과를 달성할 수 있는 경우, 치료의 목적은 일반적으로 이러한 수준의 형질도입을 충족시키거나 초과하는 것이다. 일부 경우에, 이러한 수준의 형질도입은 표적 세포의 약 1 내지 5%만을, 일부 실시 형태에서는 원하는 조직 유형의 세포의 약 20% 이상을, 일부 실시 형태에서는 약 50% 이상을, 일부 실시 형태에서는 약 80% 이상을, 일부 실시 형태에서는 약 95% 이상을, 일부 실시 형태에서는 원하는 조직 유형의 세포의 약 99% 이상을 형질도입하여 달성될 수 있다. 위에 논의된 바와 같이, 본원에 기술된 바와 같은 rAAV 캡시드의 하나 이상의 아미노산의 치환은 rAAV 형질도입을 개선한다. rAAV 조성물은 하나 이상의 망막하 또는 유리체내 주사에 의해, 동일 절차 동안 또는 수일, 수주, 수개월, 또는 수년 간격으로 투여될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 인간을 치료하기 위해 다중 벡터가 사용될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 본원에 기술된 rAAV 캡시드를 포함하는 유효량의 rAAV 바이러스 입자의 망막으로의 투여는 투여 부위의 또는 그 근처의 광수용체 세포를 형질도입시킨다. 일부 실시 형태에서, 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% 또는 100% 중의 임의의 것 이상의 광수용체 세포들이 형질도입된다. 일부 실시 형태에서, 약 5% 내지 약 100%, 약 10% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 30%, 약 25% 내지 약 75%, 약 25% 내지 약 50%, 또는 약 30% 내지 약 50%의 광수용체 세포들이 형질도입된다. 본원에 기술된 바와 같은 rAAV 캡시드를 포함하는 AAV 바이러스 입자에 의해 형질도입된 광수용체 세포를 확인하는 방법은 당업계에 알려져 있으며; 예를 들어, 면역조직화학 또는 증진된 녹색 형광 단백질과 같은 마커의 사용이 본원에 기술된 바와 같은 rAAV 캡시드를 포함하는 바이러스 입자의 형질도입을 검출하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 본 방법은 안과 장애를 갖는 개체, 예를 들어, 안과 장애를 갖는 인간을 치료하기 위한 본원에 기술된 바와 같은 rAAV 캡시드를 포함하는 바이러스 입자, AAV 바이러스 입자의 유효량을 포유동물의 망막하(예를 들어, 망막하 공간)에 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 조성물은 광수용체 세포에서의 이종 핵산의 발현을 가능케 하도록 망막하의 하나 이상의 위치로 주사된다. 일부 실시 형태에서, 조성물은 망막하의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 10개 초과의 위치 중 어느 하나로 주사된다.
일부 실시 형태에서 본원에 기술된 바와 같은 rAAV 캡시드를 포함하는 rAAV 바이러스 입자는 하나보다 많은 위치에 동시에 또는 순차적으로 투여된다. 일부 실시 형태에서, rAAV 바이러스 입자의 다수의 주사는 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 9시간, 12시간 또는 24시간 이하의 간격으로 주사된다.
유리체내 주사를 위한 일반적 방법은 다음의 간략한 개요에 의해 예시될 수 있다. 이 예시는 단지 이 방법의 특정 특징을 예시함을 의미하고, 어떤 방식으로도 한정을 의미하지 않는다. 유리체내 주사를 위한 절차는 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Peyman, G.A., et al. (2009) Retina 29(7):875-912] 및 문헌[Fagan, X.J. and Al-Qureshi, S. (2013) Clin. Experiment. Ophthalmol. 41(5):500-7] 참조).
간략하게 말하면, 유리체내 주사를 위한 대상체는 동공 확장, 눈의 살균, 및 마취제 투여에 의해 절차에 대해 준비될 수 있다. 당업계에 알려진 임의의 적절한 산동제가 동공 확장에 사용될 수 있다. 적절한 동공 확장은 처치 전에 확인될 수 있다. 살균은 눈 살균 처치, 예를 들어, 포비돈-요오드(BETADINE®)와 같은 요오드-함유 용액의 적용에 의해 달성될 수 있다. 유사한 용액이 눈꺼풀, 속눈썹, 및 임의의 다른 근처 조직(예를 들어, 피부)을 세정하기 위해 또한 사용될 수 있다. 리도카인 또는 프로파라카인과 같은 임의의 적절한 마취제가 임의의 적절한 농도로 사용될 수 있다. 마취제는 국소 점안제, 겔 또는 젤리, 및 마취제의 결막하 적용을 포함하지만 이에 한정되지 않는 당업계에 알려진 임의의 방법에 의해 투여될 수 있다.
주사 전에, 상기 영역으로부터 속눈썹을 치우기 위해 살균된 눈꺼풀 검경을 사용할 수 있다. 주사 부위는 시린지로 표시될 수 있다. 주사 부위는 환자의 수정체를 기반으로 선택될 수 있다. 예를 들어, 주사 부위는 인공수정체 또는 무수정체 환자에서 가장자리로부터 3 내지 3.5 mm, 그리고 유수정체 환자에서 가장자리로부터 3.5 내지 4 mm일 수 있다. 환자는 주사 부위 반대 방향으로 볼 수 있다.
주사 중에, 바늘은 공막에 수직으로 눈의 중심을 향해 삽입될 수 있다. 바늘은 끝이 망막하 공간보다는 유리체 공간에서 끝나도록 삽입될 수 있다. 주사를 위한 당업계에 알려진 임의의 적합한 부피가 사용될 수 있다. 주사 후, 눈을 항생제와 같은 살균제로 처치할 수 있다. 눈은 또한 과량의 살균제를 제거하기 위해 린스될 수 있다.
망막은 다수의 층을 함유하는 것으로 공지되어 있다. 망막 내의 세포층은 내경계막, 신경 섬유, 신경절 세포, 내망상, 내핵, 외망상, 외핵, 외경계막, 광수용체, 및 망막 색소 상피 층을 포함할 수 있다. 유리체에 대해 가장 가까운 층은 내경계막이다. 이러한 층은 신경아교세포의 한 부류인 뮐러 세포(Mueller cells 또는 Muller cells)를 함유할 수 있다. 신경 섬유층은 시각 신경을 형성하는 신경절 세포로부터의 축삭을 함유할 수 있다. 신경절 세포층은 신경절 세포 및 무축삭 세포를 포함할 수 있다. 내망상층은 신경절의 수상돌기와 무축삭 세포 및 두극 세포의 축삭 사이의 시냅스를 함유할 수 있다. 내핵층은 무축삭 세포, 두극 세포, 및 수평 세포의 세포핵을 함유할 수 있다. 외망상층은 수평 세포 수상돌기와 광수용체 세포 돌기 사이에 시냅스를 함유할 수 있다. 외핵층은 광수용체 세포체를 함유할 수 있다. 외경계막은 뮐러 세포 첨단 프로세스 사이 및 이러한 프로세스와 광수용체 세포 내부 세그먼트 사이에 세포 연결부, 예를 들어 유착 접합부 및 데스모솜을 포함할 수 있다. 간상체 및 추상체 및 재콥막의 층으로도 공지된 광수용체 층은 간상체 및 추상체를 포함하는 광수용체 세포를 함유할 수 있다. 유리체에 대해 가장 멀리 있는 망막 층은 색소 과립을 함유하는 육각 상피 세포의 층을 포함할 수 있는 망막 색소 상피(RPE)이다.
망막은 또한 많은 상이한 세포 유형을 함유하는 것으로 공지되어 있다. 망막 뉴런은 광수용체 세포, 두극 세포, 신경절 세포, 무축삭 세포, 및 수평 세포를 포함할 수 있다. 광수용체 세포는 빛에 민감하다. 이들은 빛을 감지할 수 있고, 두극 세포 및 신경절 세포를 통해 시각 신경으로 신호를 전달함으로써 반응할 수 있다. 광수용체 세포는 일반적으로 빛이 적은 조건에서 빛을 감지하는 간상 세포, 및 일반적으로 색 및 더 밝은 빛 지각을 감지하는 추상 세포를 포함할 수 있다. 두극 세포는 광수용체 세포 및 시냅스로부터 무축삭 세포 또는 신경절 세포로의 입력을 수용할 수 있다. 신경절 세포는 무축삭 세포 또는 수평 세포로부터의 정보를 수용할 수 있고, 이들의 축삭은 시각 신경을 형성한다. 수평 세포는 다수의 광수용체로부터의 입력을 통합시킬 수 있고, 빛 수준에 대한 조정을 도울 수 있다. 무축삭 세포는 두극 세포를 조절하는 것을 돕고, 신경절 세포로의 입력을 제공하는 연합뉴런(interneuron)이다. 망막의 신경아교세포는 뮐러 세포, 성상아교세포, 및 미세아교세포를 포함할 수 있다.
각막은 다수의 층을 함유하는 것으로 공지되어 있다. 각막의 세포층은 각막 상피층, 보우만층, 각막 기질층, 데스메막층 및 각막 내피층을 포함할 수 있다. 각막 상피는 빠르고 쉽게 재생되는 세포를 포함하는 얇은 다세포 상피 조직 층을 구성하는 비-각질화 중층 편평 상피이다. 전방 경계막 또는 보우만층은 각막 기질을 보호하는 역할을 하는 콜라겐(예를 들어 I형 콜라겐 원섬유), 펄레칸, 니도겐, 라미닌 및 기타 헤파린 술페이트 프로테오글리칸으로 구성된 층이다. 보우만층은 첨단 기질의 무세포 영역으로 알려져 있다. 각막 기질층 또는 고유질은 규칙적으로 배열된 콜라겐 원섬유와 전체에 걸쳐 분포된 상호연결된 케라토사이트를 포함하는 층이다. 후방 경계막으로도 알려진 데스메막은 주로 콜라겐(예를 들어 콜라겐 IV형 원섬유)으로 구성된다. 각막 내피는 미토콘드리아가 풍부한 각막 내피 세포를 포함하는 단순한 편평 또는 저 입방체 단층이다.
망막하 또는 유리체내 주사에 의한 rAAV 전달의 효과는 본원에 기술된 바와 같은 여러 기준에 의해 모니터될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 방법을 이용한 대상체의 치료 후, 대상체는, 예를 들어, 본원에 기술된 것을 포함하는 하나 이상의 임상 파라미터에 의해 질환 상태의 하나 이상의 징후 또는 증상의 개선 및/또는 안정화 및/또는 진행의 지연에 대해 평가될 수 있다. 이러한 테스트의 예는 당업계에 알려져 있고, 객관적 및 주관적(예를 들어, 대상체가 보고하는) 측정을 포함한다. 예를 들어, 대상체의 시각 기능에 대한 처치의 효과를 측정하기 위해, 다음 중 하나 이상이 평가될 수 있다: 대상체의 주관적인 시력의 질 또는 개선된 중추 시각 기능(예를 들어, 술술 읽고 안면을 인식하는 대상체의 능력의 개선), 대상체의 시각 이동(예를 들어, 미로를 통과하는 데 필요한 시간의 감소), 시력(예를 들어, 대상체의 LogMAR 스코어의 개선), 미세시야검사(예를 들어, 대상체의 dB 스코어의 개선), 암-순응 시야검사(예를 들어, 대상체의 dB 스코어의 개선), 미세 매트릭스 맵핑(fine matrix mapping)(예를 들어, 대상체의 dB 스코어의 개선), 골드만 시야검사(Goldmann perimetry)(예를 들어, 암점성 영역(즉, 시각상실 영역)의 감소된 크기 및 더 작은 표적을 분리하는 능력의 개선), 플리커 민감성(예를 들어, 헤르츠의 개선), 자가형광, 및 전기생리학 측정(예를 들어, ERG의 개선). 일부 실시 형태에서, 시각 기능은 대상체의 시각 이동성에 의해 측정된다. 일부 실시 형태에서, 시각 기능은 대상체의 시력에 의해 측정된다. 일부 실시 형태에서, 시각 기능은 미세시야검사에 의해 측정된다. 일부 실시 형태에서, 시각 기능은 암-순응 시야검사에 의해 측정된다. 일부 실시 형태에서, 시각 기능은 ERG에 의해 측정된다. 일부 실시 형태에서, 시각 기능은 대상체의 주관적인 시력의 질에 의해 측정된다.
진행성인 변성 시각 기능을 초래하는 질환의 경우, 이른 연령에 대상체를 치료하는 것은 질환의 진행의 둔화 또는 정지를 초래할 수 있을 뿐만 아니라, 이는 또한 후천성 약시로 인한 시각 기능 상실을 개선하거나 예방할 수 있다. 약시는 2개 유형의 약시가 존재할 수 있다. 출생으로부터 심지어 수 개월의 연령까지 완전히 어두운 곳에서 유지되는 비인간 영장류 및 새끼고양이의 연구에서, 이후에 빛에 노출되는 경우에도 상기 동물은 망막이 기능적 신호를 보냄에도 불구하고 기능적으로 비가역적으로 실명 상태이다. 상기 실명은 자극 정지로 인해 신경 연결 및 피질의 "교육"이 출생으로부터 발달적으로 정지되기 때문에 발생한다. 이러한 기능이 회복될 수 있는지의 여부는 공지되어 있지 않다. 망막 변성의 질환의 경우, 정상 시각 피질 회로는 처음에는 "학습"되거나, 변성이 유의한 기능이상을 발생시키는 시점까지 발달적으로 적절하였다. 기능이상 눈에서의 신호전달과 관련한 시각 자극의 상실은 "후천성" 또는 "학습된" 기능이상("후천성 약시")을 발생시키고, 이는 뇌가 신호를 해석하거나, 눈을 "이용"하지 못하게 한다. 약시 눈의 유전자 치료의 결과로서 망막으로부터의 개선된 신호전달이 질환 상태의 진행의 둔화 또는 안정화에 더하여 더욱 정상의 기능의 획득을 초래할 수 있는지의 여부는 상기 "후천성 약시"의 경우에서 공지되어 있지 않다. 일부 실시 형태에서, 치료받는 인간은 30세 미만 연령이다. 일부 실시 형태에서, 치료받는 인간은 20세 미만 연령이다. 일부 실시 형태에서, 치료받는 인간은 18세 미만 연령이다. 일부 실시 형태에서, 치료받는 인간은 15세 미만 연령이다. 일부 실시 형태에서, 치료받는 인간은 14세 미만 연령이다. 일부 실시 형태에서, 치료받는 인간은 13세 미만 연령이다. 일부 실시 형태에서, 치료받는 인간은 12세 미만 연령이다. 일부 실시 형태에서, 치료받는 인간은 10세 미만 연령이다. 일부 실시 형태에서, 치료받는 인간은 8세 미만 연령이다. 일부 실시 형태에서, 치료받는 인간은 6세 미만 연령이다.
일부 안과 장애에서, 한 유형의 세포의 기능을 개선하는 것이 또 다른 유형의 세포의 기능을 개선하는 "너스 세포(nurse cell)" 현상이 존재한다. 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 rAAV에 의한 중심 망막의 RPE의 형질도입은 다음에 간상체의 기능을 개선할 수 있고, 차례로 개선된 간상체 기능은 개선된 추상체 기능을 초래한다. 따라서, 한 유형의 세포의 처치는 다른 것의 개선된 기능을 초래할 수 있다.
특정 rAAV 벡터 및 조성물의 선택은, 개인의 병력 및 치료되는 개체 및 병태의 특징을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 많은 상이한 요인에 의존한다. 이러한 특징의 평가 및 적절한 치료 요법의 디자인은 궁극적으로 처방 의사의 책임이다. 일부 실시 형태에서, 치료받는 인간은 유전적 안과 장애를을 갖지만, 임상 징후 또는 증상이 아직 나타나지 않았다. 일부 실시 형태에서, 치료받는 인간은 안과 장애를 갖는다. 일부 실시 형태에서, 치료받는 인간은 안과 장애의 하나 이상의 징후 또는 증상을 나타낸다.
본원에 기술된 시스템 및 방법에 의해 치료될 수 있는 안과 장애의 비제한적 예는 다음을 포함한다: 상염색체 열성 중증 조기 발병 망막 변성(레베르 선천성 흑암시), 선천성 색맹, 스타가르트병(Stargardt's disease), 베스트병(Best's disease), 도인병(Doyne's disease), 추상체 이영양증, 추상체-간상체 이영양증, 색소성 망막염, X-연관 망막 층간분리증, 어셔 증후군(Usher's syndrome), 연령 관련 황반 변성, 황반 이영양증, 위축성 연령 관련 황반 변성, 신생혈관성 AMD, 당뇨병성 황반병증, 증식성 당뇨병성 망막병증(PDR), 낭포성 황반 부종, 중심 장액성 망막병증, 망막 박리, 안내 염증, 녹내장, 후포도막염, 맥락막 결손, 레베르 유전성 시신경병증, 녹내장(개방각 녹내장, 폐쇄각 녹내장, 정상 안압 녹내장 및 색소성 녹내장 포함), 및 푹스 각막 이영양증(푹스 이영양증으로도 알려짐).
실시예
실시예 1 - 재료 및 방법
AAV 벡터 생성 및 정제
AAV 벡터는 이전에 기술된 바와 같이 일시적 삼중 형질감염 방법을 사용하여 생성하였다. 문헌[Nass et al. (2017) Mol. Ther. Methods Clin. Dev., 9:33-4]을 참조하며, 이의 개시 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 간략하게 말하면, 폴리에틸렌이민, PEI, 및 1:1:1 비의 3개의 플라스미드(ITR 벡터, AAV rep/cap 및 Ad 헬퍼 플라스미드)를 사용하여 HEK293 세포를 형질감염시켰다. 벡터 플라스미드는 AAV2 유래의 벡터 게놈 CBA-EGFP 및 ITR 서열을 포함하였다. EGFP 발현을 기술된 바와 같이 CMV 인핸서, 닭 베타 액틴 하이브리드 프로모터(CBA)에 의해 유도하였다. 문헌[Miyazaki et al(1989) Gene, 79(2):269-277]을 참조하며, 이의 개시 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. AAV rep/cap 헬퍼는 AAV2 유래의 rep 서열과 rep2/cap2, rep2/cap5, rep2/cap7 등의 명칭을 가진 혈청형 특이적 캡시드 서열을 포함하였다. 사용된 pAd 헬퍼는 pHelper(Stratagene/Agilent Technologies, 미국 캘리포니아주 산타클라라 소재)였다. AAV 벡터를 이전에 기술된 바와 같이 친화성 컬럼 크로마토그래피(AVB Sepharose High Performance medium; GE Healthcare)에 의해 정제하였다(문헌[Nass et al. (2017) Mol. Ther. Methods Clin. Dev., 9:33-46).
SYPRO Ruby Protein Gel Stain을 사용한 rAAV 벡터 순도 분석
정제된 벡터로부터의 샘플을 NuPage 4~12% 비스-트리스 겔(Invitrogen)에 로딩하였다. 전형적으로 1~5 x 1010 vg의 정제된 벡터를 분석하였다. 겔을 SYPRO Ruby Protein Gel Stain(Life Technologies)으로 염색하였다.
LC/MS 무손상 단백질 분석
이전에 기술된 바와 같이(문헌[Jin et al. (2017) Hum. Gene Ther. Methods, 28(5): 255-267], 이의 개시 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함됨), AAV 비리온을 먼저 Amicon 초원심분리 필터(0.5 mL, 10 kDa MWCO)를 사용하여 농축한 다음 25 mM 트리스 pH 7.1로 3회 세척하였다. 농축된 AAV 비리온을 10% 아세트산으로 변성시키고 볼텍싱하고 동일한 부피의 HPLC 물로 추가로 희석하였다. 최종 아세트산 농도는 5%였다. 50 μL의 AAV 용액(대략 2~5μg의 단백질)을 Xevo G2-XS QTOF MS 기기(Waters, 미국 매사추세츠주 밀포드 소재)와 결합된 Acquity UPLC에 주입하였다. BEH C8 컬럼(2.1 x 100 mm)에서 250 μL/min의 유속으로 분리를 수행하였다. 이동상 A 및 이동상 B는 각각 물 중 0.1% 포름산 및 및 아세토니트릴이었다. C8 컬럼의 최종 구배는 다음과 같았다: 6분에 걸쳐 10% B에서 20% B까지, 10분에 걸쳐 20% B에서 30% B까지, 그 후 40분에 걸쳐 30% B에서 38% B까지. 질량분석기의 모세관 전압 및 샘플링 콘 전압을 각각 3.5 kV 및 45 V로 설정하였다. 질량 스펙트럼을 m/z 500~4000에 걸쳐 포지티브 감도 모드에서 획득하였다. 단백질 디콘볼루션에 MassLynx 소프트웨어 버전 4.1의 MaxEnt1을 사용하였다.
AAV1 및 AAV2 VP의 효소 분해
삼중 형질감염 및 생산 세포주 공정으로부터 생성된 AAV2-EGFP(대략 10 ㎍의 캡시드 단백질)를 Amicon 초원심분리 필터(10 kDa MWCO)를 사용하여 먼저 농축하고, 6 M 구아니딘-HCl, 50 mM 트리스 pH 8.5로 변성시켰다. 단백질을 암소에서 60℃에서 30분 동안 5 mM DTT로 환원시킨 다음 실온에서 30분 동안 15 mM 요오도아세트아미드로 알킬화시켰다. 샘플은 Bio-Spin® 30 트리스 컬럼을 사용하여 분해를 위한 25 mM 트리스 pH 7.1로 완충액 교환하였다. 완충액 교환 후, 샘플을 2개의 분취물로 분할하였다. 각각의 분취물을 각각 효소:단백질 비(wt/wt) 1:25의 트립신 또는 1:50의 Asp-N으로 37℃에서 2시간 동안 절단시켰다.
UPLC/MS/MS 펩티드 맵핑
단백질 분해물은 Acquity UPLC-Xevo G2-XS qTOF 질량 분광계 시스템(Waters, 미국 매사추세츠주 밀포드 소재)을 사용하여 UPLC/MS/MSE에 의해 분석하였다. BEH300 C18 컬럼(2.1 x 150 mm)을 사용하여 250 μL/min의 유속에서 68분에 걸쳐 2%에서 40%까지의 B(아세토니트릴 중 0.1% 포름산)의 선형 구배로 분리를 달성하였다. MS의 경우, 모세관 전압 및 샘플링 콘 전압을 각각 3.0 kV 및 30 V로 설정하였다. 질량 스펙트럼을 500~2000의 m/z 범위에서 포지티브 감도 MSE 모드에서 획득하였다.
AAV VP에서의 탈아미드화 수준 측정
펩티드 및 이들의 상응하는 탈아미드화 종의 추출 이온 크로마토그램(extracted ion chromatogram; XIC)을 탈아미드화 수준의 계산에 사용하였다.
AAV 캡시드 변이체의 생성
탈아미드화 변이체 N57D 및 G58D는 AAV2로부터의 rep 및 cap 서열 둘 다를 함유하는 AAV 헬퍼 플라스미드인 pim45BD-cap2를 기반으로 하였다. 지정된 돌연변이를 포함하는 단편을 합성하고(Genscript) pim45BD-cap2에 서브클로닝하였다. 돌연변이를 DNA 시퀀싱(Genewiz)에 의해 확인하였다. 모 플라스미드로서 AAV2 유래의 rep 및 AAV5 유래의 cap을 포함하는 헬퍼 플라스미드인 pHLP19-cap5.2를 사용하여 아세틸화 변이체를 상기와 같이 구축하였다. AAV2-HBKO 및 AAV5 아르기닌 돌연변이 캡시드 플라스미드를 제조업체의 프로토콜에 따라 QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis 키트(Agilent Technologies, 미국 캘리포니아주 산타클라라 소재)를 사용하여 부위 지정 돌연변이에 의해 생성하였다. pIM45BD 플라스미드를 사용하여 VP3 상의 아르기닌 585 및 588을 코딩하는 코돈을 알라닌으로 변경하도록 설계된 PCR 돌연변이유발 프라이머를 사용하여 AAV2-HBKO를 생성하였다. R585A 및 R588A 돌연변이를 생성하기 위해 사용된 돌연변이유발 프라이머의 서열은 TATCTACCAACCTCCAGGCAGGCAACGCACAAGCAGCTACCGCAG (서열 번호 11)였다. AAV5-G474R, AAV5-N564R 및 AAV5-N573R 돌연변이체는 AAV5 rep/cap 플라스미드(pHLPcap5.2)를 주형으로 사용하고 각각의 아르기닌을 알라닌으로 변경하도록 설계된 PCR 돌연변이 유발 프라이머를 사용하여 생성하였다. G474R 돌연변이를 도입하는 데 사용된 돌연변이유발 프라이머의 서열은 CCAGGTTCCAGCGCTGGGTTCGGCC (서열 번호 12)였다. N564R 돌연변이를 도입하기 위해 사용된 돌연변이유발 프라이머의 서열은 CCGCGTGGCGTACCGCGTCGGCGGGCAG (서열번호 13)였다. N573R 돌연변이를 도입하기 위해 사용된 돌연변이유발 프라이머의 서열은 CAGTGGTGGAGCTCTGTCTGTTGGTGGCCATCTG (서열 번호 14)였다. 모든 돌연변이를 DNA 시퀀싱에 의해 확인하였다.
NHP 연구
4마리의 성체 수컷 시노몰구스 원숭이(마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis))를 이전에 기술된 바와 같이 수술 전에 AAV5 및 AAV2에 대한 중화 항체에 대해 스크리닝하였다. 혈청 음성으로 간주되는 동물(혈청 역가 ≤ 1:4)을 연구에 포함시켰다. 시노몰구스 원숭이를 두 군에 할당하고 AAV2-HBKOEGFP 또는 AAV5GFP를 투여하였다. 동물은 120 μL/눈의 부피로 투약 단계 제1일에 양쪽 눈에 1회 망막하 주사를 통해 투약하였다. 희석제는 0.014% 폴리소르베이트 20이 포함된 Alcon® BSS®였다. 층류 후드 하에 무균 절차를 사용하여 투약 당일에 투약 주사기(1.0 mL Luer Lok™ Becton Dickinson Product 309628 또는 등가물)를 채우고 확장 가능한 41 게이지 망막하 주사 바늘이 있는 DORC 23 게이지 바늘에 부착하였다. 주사는 DORC 인젝터를 채운지 30분 이내에 투여하였다. 각 동물의 양쪽 눈(OU)에 투약을 수행하였다. 동물을 아트로핀(0.01 mg/kg), 케타민(2 내지 10 mg/kg) 및 덱스메데토미딘(0.25 mg/kg)의 근육내 주사로 마취시켰다. 상기 절차 후, 마취를 아티파메졸(0.25 mg/kg)로 역전시켰다. 마취 요법은 동물의 반응성을 기반으로 하여 그리고 Covance 수의사 직원에 따라 조정하였다. 눈을 대략 1% 포비돈 요오드 용액(살균 식염수와 5% 포비돈 요오드로 제조)으로 세정하고 살균 식염수로 린스하였다. 주사 전에 투약 부위에 대략 2.5% 포비돈 요오드 용액을 사용하였다. 주사는 다음과 같이 간략하게 기술된 연구별 절차에 따라 수행하였다. 동공을 국소 산동제로 확장시켰다. DORC 일회용 이중 구멍 주사 바늘(23 게이지)은 각막 윤부 약 3 mm 후방의 안구의 상측두 사분면에서 공막을 통해 직접 도입시키고 확장된 동공을 통해 관찰하면서 외과 현미경을 사용하여 시각적 제어 하에 유리체를 통해 이동시키고, 이때 변형된 안저 관찰 렌즈를 각막 상에 위치시킨다. 41 게이지 캐뉼라 팁을 23 게이지 바늘로부터 전진시켜 망막 표면에 부드럽게 닿게 하였다. 용량을 신경 망막을 통해 망막하 공간으로 주사하여 망막하 수포를 생성하였다. 41 게이지 캐뉼라 팁을 철회하고 23 게이지 바늘을 제거하였다. 국소 항생제 및 스테로이드 연고(Neo-poly-dex)를 다른 모든 투약 후 안과 절차에 따라 각 눈에 점적주입하였다. 주사는 중앙 아케이드 영역의 망막의 작은 부분에서 발생하였다.
안저 자가형광 이미징
안저 자가형광 이미징을 투약 전 단계 동안 및 투약 단계의 제2주, 제4주 및 제6주 동안 1회 수행하였다. 안저 자가형광 이미징을 위해 동물을 마취시켰다(투약을 위해 사용된 마취 하에 유지). 산동제(1% 트로피카미드)로 눈을 확장시켰다. 망막하 투여 부위와 중심와를 포함하도록 각 눈의 안저 자가형광 이미지를 촬영하였다. 이미지를 Heidelberg SPECTRALIS® 기기로 촬영하였다.
NHP 망막의 조직 프로세싱
투약 단계의 제43일에, 밤새 금식시킨 모든 동물을 나트륨 펜토바르비탈로 마취시키고, 방혈하고, 부검하였다. 각 동물의 눈에 냉각된 4% 파라포름알데히드를 주사하고 상기 눈을 상기 파라포름알데히드에 침지시키고, 2~8℃로 유지하도록 설정된 냉장고에 48 내지 72시간 동안 보관하였다. 그런 다음 눈을 파라핀에 포매하고, 박편화하고, IHC 분석을 위해 슬라이드를 제조하였다. 측두 칼로트로부터, 20개의 연속 박편을 중심와로부터 취하였다. 또한, 나머지 측두 칼로트에서 250 μm마다 총 8단계에 대해 20개의 연속 박편을 취하였다. 중심와로부터의 하나의 슬라이드와 측두 칼로트의 8단계 각각으로부터의 하나의 슬라이드를 헤마톡실린과 에오신으로 염색하였다.
면역조직화학 분석
각 눈의 중심와 관통 단일 슬라이드를 명시야 현미경으로 검사하였다. 관찰시에 GFP 발현 광수용체의 유무를 기록하였다. GFP를 식별하는 항체는 갈색 침전물을 생성하는 발색체로 태그하였다. 로돕신을 식별하는 항체는 적색 침전물을 생성하는 발색체로 태그하였다. GFP를 발현한 간상 광수용체의 유무를 기록하였다. 선택된 대표 이미지를 기록하였다. GFP 발현을 평가하기 위해, 면역조직화학을 수행하였다. 간략하게 말하면, 박편을 자일렌으로 3회 각각 5분 동안 세척하였다. 박편을 등급이 매겨진 일련의 알코올에서 세척하여 재수화하고, 증류수에서 재수화하였다. 항원 회수 후, 내인성 과산화효소 활성은 과산화수소 및 정상 염소 혈청과의 비특이적 단백질 결합에 의해 방해되었다. 박편을 GFP 및 로돕신 항체와 함께 인큐베이션하였다. 세척 후, 박편을 ChromoPlex 1 Dual Detection for bond(Leica, 독일 베츨라어 소재)와 함께 인큐베이션하여 제조업체의 지침에 따라 이중 조직화학 염색의 시각화에 사용하였다. 박편을 헤마톡실린으로 대조염색한 다음, 장착하기 전에 에탄올로 탈수하였다. 파라핀 포매된 박편을 탈파라핀화하고 등급이 매겨진 에탄올에서 재수화하였다. 항원 회수를 수행하고, 단백질 차단 무혈청 시약(Dako)으로 박편을 차단하였다. 그 후 박편을 마우스 항 GFP와 함께 인큐베이션하고 4℃에서 밤새 인큐베이션한 후 세척하고 항-마우스 Alexa Fluor 488 이차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 박편을 PBS로 세척하고, 마운팅 용액을 사용하여 커버 슬립 처리하고 현미경을 사용하여 이미지화하였다.
면역형광
나머지 슬라이드를 GFP 및 DAPI(면역형광)에 대해 표지하였다. 슬라이드를 GFP의 면역형광 검출을 위해 염색하고 DAPI로 공동 염색하여 핵을 시각화하였다.
광수용체 세포 계수 및 형질도입 정량화
각 눈에서 단계적으로 박편화한 슬라이드 세트를 검토하고 분석을 위해 중심와를 포함한 슬라이드를 선택하였다. 광수용체 층을 망막하 수포의 한 경계에서 다른 경계까지 이미지화하였다. NIH ImageJ(버전 1.49t)를 사용하여 형태측정 분석을 수행하여 망막하 수포의 경계 내에서 GFP 트랜스진을 발현하는 광수용체의 백분율을 결정하였다.
망막하 및 유리체내 주사
출생 후 제P45일에, 마우스를 케타민(90 mg/kg)/자일라진(9 mg/kg)의 복강내 주사로 전신 마취 하에 두었다. 1% 트로피카미드(Akorn Pharmaceuticals, 미국 일리노이주 레이크 포레스트 소재)의 국소 도포로 동공을 확장시켰다. 망막하 주사를 수행하기 위해, AAV의 분취물을 얼음 위에서 해동하고, AAV 전달의 가시성을 돕기 위해 Fluorescein(AK-FLUOR, 10% - Akorn Pharmaceuticals, 미국 일리노이주 레이크 포레스트 소재)을 바이러스 제제에 첨가하였다. 외과 수술용 현미경(PSMT5N, World Precision Instruments, 미국 플로리다주 새러소타 소재)을 사용하여 시각화하면서, 경사진 30 게이지 바늘을 사용하여 비강 윤부 바로 뒤쪽의 공막을 통해 절개를 가하였다. 이 절개를 통해, NanoFil 주사기에 연결된 SilFlex 튜브에 장착된 35 게이지 무딘 바늘(NF35BL, World Precision Instruments, 미국 플로리다주 새러소타 소재)을 망막하 공간에 넣었다. 바이러스 현탁액을 풋 페달 컨트롤을 갖춘 프로그래밍 가능한 마이크로 주사기 펌프(UMP3, UltraMicroPump, World Precision Instruments, 미국 플로리다주 새러소타 소재)를 사용하여 망막하 공간에 20초에 걸쳐 주사하였다. 주사 완료 후 적어도 20초 동안 바늘을 적소에 유지하였다. 주사 후 안저 및 OCT 검사를 수행하여 주사 위치를 시각화하여 AAV 벡터가 망막하 공간에 주사됨을 보장하였다. 3.5% Akten(리도카인 염산염 안과용 겔, Akron Pharmaceuticals, 미국 일리노이주 레이크 포레스트 소재) 안과용 겔을 국소 마취제로서 각막에 도포하였다. 소량의 네오마이신/폴리믹신 B/덱사메타손 안연고(Alcon Laboratories Inc., 미국 텍사스주 포트워스 소재)를 눈 위에 도포한 후 마취에서 회복시키기 위해 동물을 37℃ 인큐베이터에 두었다. 유리체내 주사를 위해, 마우스를 마취시키고, 상기 기술된 바와 같이 눈을 확장시켰다. 1 ul의 AAV 현탁액을 SilFlex 튜브(World Precision Instruments, 미국 플로리다주 새러소타 소재)를 통해 10 μL Nanofil 주사기에 부착된 35G 경사 팁 바늘을 사용하여 윤부에서 1 mm 떨어진 공막을 통해 유리체에 주사하였다. 주사 후 임의의 망막 손상을 체크하기 위해 OCT를 즉시 수행하였다. 소량의 Akten 및 삼중 항생제 안연고를 눈에 도포한 후 37℃에 두었다.
마우스 망막 용해물에서의 rAAV 형질도입의 정량화
안락사 후, 눈을 수집하고, 드라이아이스 상에서 즉시 동결시키고, 향후 해부를 위해 -80℃에서 보관하였다. 모든 해부 단계는 해부 중에 눈을 동결된 상태로 유지하면서 저온 기구를 사용하여 해부 현미경 하에 수행하였다. 면도날을 사용하여 전안부를 제거하고, 필요에 따라 눈 뒤쪽에서 과잉 조직을 제거한 다음 수정체를 제거하였다. 동결된 유리체액, 망막 및 안배를 EGFP ELISA 키트의 세포 용해 완충액 200 μl에 넣어 망막 용해물을 생성하고 4℃에서 균질화하였다(Fisher Bead Mill). EGFP 단백질은 EGFP ELISA 키트(Abcam 카탈로그 #ab171581)를 사용하여 정량화하였다. BCA 단백질 분석 키트(Pierce)를 사용하여 총 단백질 수준을 정량화하였다. eGFP의 수준을 총 단백질에 대해 정규화하였다. 게놈 역가는 폴리아데닐화 신호에 특이적인 프라이머를 포함하는 TaqMan Universal Master Mix(Thermo Fisher)를 사용하여 qRT-PCR(7500 Real-Time PCR System; Applied Biosystems)에 의해 결정하였다. 벡터 수준을 단백질 μg당 게놈으로 표현하였다.
NHP 망막 외식편
모든 동물 절차는 동물 복지법, 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 지침, 실험 동물 복지국에 따라, 그리고 안과 및 시력 연구에서의 동물 사용에 대한 ARVO 성명서에 따라 수행하였다. 알려진 안과 질환이 없는 신선한 원숭이 눈을 Biomere(Biomere, 미국 매사추세츠주 우스터 소재)에서 입수하였으며, 여기서, 상기 눈은 동물을 희생시킨지 15분 후에 적출하였다. 눈을 Neurobasal 배지에 넣고 즉시 얼음 상에서 옮겼다. 무균 조건에서, 모든 안외 결합 조직을 제거하고, 눈을 70% 에탄올로 소독한 후 PBS로 세척하였다. 실험을 시작하기 전에, 6웰 트랜스웰 배양 플레이트를 트랜스웰 삽입물 아래 1% N-2 보충제(Thermo Fisher Scientific; 카탈로그 번호 17502048), 2% B-27 보충제(Thermo Fisher Scientific; 카탈로그 번호 17504044), 1% GlutaMAX 보충제(Thermo Fisher Scientific; 카탈로그 번호 35050-061), 0.2 μg/mL의 재조합 인간 베타-NGF(R&D Systems, 미국 미네소타주 미니애폴리스 소재; 카탈로그 번호 256-GF-100), 및 0.4 μg/mL 재조합 인간 EGF(R&D Systems; 카탈로그 번호 236-EG-200))가 보충된 2 ml의 완전 Neurobasal 배지(Neurobasal Medium(Thermo Fisher Scientific, 미국 매사추세츠주 월섬 소재; 카탈로그 번호 21103049)) 및 트랜스웰 삽입물에서 0.5 ml을 이용하여, 가습된 세포 배양 인큐베이터에서 37℃ 및 5% CO2에서 사전 인큐베이션하였다. 윤부 아래 약 5 mm에 18G 바늘로 절개를 가하였다. 이 절개를 가위의 진입점으로 사용하여, 전안부, 각막, 수정체 및 유리체를 각 눈에서 제거하여 손상되지 않은 신경 망막, 맥락막, 및 공막으로 이루어진 후방 안배를 남겼다. 다음으로, 시신경 유두를 향해 3번 절개하여 3개의 플랩을 만들어 안배를 열었다. 전체 안배를 완전 Neurobasal 완전 배지에 침지하면서, 8 mm 생검 펀치를 사용하여 적도의 전체 두께의 후안부 외식편을 절단하였다. 이어서 신경절 세포층에 건조 살균 여과지를 부드럽게 적용하고 신경 망막을 들어올리고 망막이 부착된 여과지를 광수용체가 아래로 향하게 하여 배양 삽입물에 놓음으로써 망막을 박리하고 여과지를 정밀 포셉으로 부드럽게 제거하였다. 24시간 후, 배지를 새로운 완전 Neurobasal 배지로 교체하고 AAV의 절반을 각 망막 외식편 바로 아래에 주사하여 치료적 망막하 주사를 수행할 때 생체 내에서 형성된 것과 유사한 수포를 생성하였다. 바이러스의 추가 절반을 트랜스웰 삽입물 아래에 놓인 배양 배지에 첨가하였다. 마지막으로, 외식편을 37℃ 및 5% CO2에서 인큐베이션한다. 각 외식편에 1.8x1011 총 게놈 카피의 용량의 AAV 벡터를 사용하였다. 배지를 격일로 교체하고 배양물을 형질도입 후 6일 동안 유지하였다. 배양 7일 후, 망막 외식편을 1X 인산 완충 식염수(PBS)로 세척하고 4% 파라포름알데히드(PFA)에서 3시간 동안 고정하였다. 외식편을 PBS로 3회 세척하여 잔류 PFA를 제거하고 등급이 매겨진 수크로오스 10~30%로 동결보호한 후 -80℃의 최적 절단 온도 화합물에서 동결하였다. 저온 유지 장치(CryoStar NX70 저온 유지 장치, Thermo Fisher Scientific, 미국 매사추세츠주 월섬 소재)를 사용하여 13 um 두께의 박편을 절단하고 벡터 쉴드 DAPI(Vector Lab, 영국 피터버러 소재)를 장착하였다. 천연 EGFP 발현을 관찰하고 적절한 여기 및 검출 설정을 사용하여 도립 형광 현미경(Axio Observer Z1; Carl Zeiss, Inc., 독일 오버코헨 소재)을 사용하여 이미지를 캡처하였다.
실시예 2 - NHP 망막에서 AAV2HBKO의 번역 충실도
마우스 망막에서 신규 AAV2 캡시드 변이체의 형질도입 활성은 이전에 보고되었다(문헌[Sullivan et al., 2018]). AAV2 변이체는 AAV2-HBKO로 지칭되는 변이체를 생성하기 위해 그의 수용체인 헤파린 술페이트 프로테오글리칸에 결합하는 데 필요한 돌연변이된 아미노산 R585A 및 R588A를 가졌다. 모 AAV2와 비교하여, AAV2-HBKO 벡터는 마우스 눈에 유리체내 전달 후 낮은 형질도입 활성을 나타냈지만; 망막하 전달 후, AAV2-HBKO는 유의하게 더 큰 광수용체 형질도입을 초래하였다. 어떤 이론에도 구속되지 않고, 마우스에서의 AAV 형질도입 프로파일이 항상 NHP에서의 형질도입 잠재력을 예측하는 것은 아니므로, NHP 망막에서 AAV2HBKO의 성능을 평가하여 이 신규 변이체가 이 종에서의 망막 형질도입에서 유사한 개선을 나타냈는지를 결정하였다. 연구의 목적은 수컷 시노몰구스 원숭이에게 망막하 주사를 통해 단회 용량으로 투여되었을 때 AAV5 및 AAV2HBKO 벡터로부터의 광수용체에서의 향상된 녹색 형광 단백질(eGFP) 발현을 비교하는 것이었다. 수컷 시노몰구스 원숭이(마카카 파시쿨라리스)를 2개의 군에 할당하고, AAV5 eGFP 또는 AAV2-HBKO-eGFP를 표 2에 기술된 바와 같이 1x 1012 vg/눈의 용량으로 투여하였다. 벡터 제제는 품질을 확인하기 위한 일련의 최적화된 분석을 사용하여 분석하였다.
[표 2]
Figure pct00006
표 2에서 OU는 양쪽 눈 주사를 나타내며; a 각 동물의 양쪽 눈에 투여하였다. 동물에게 120 μL/눈의 부피로 투여하였으며; b 용량 농도는 제공된 테스트 물품을 기준으로 하였다.
벡터 투여 6주 후, 동물을 안락사시키고 조직학적 박편화를 위해 눈을 프로세싱하였다. 분석을 위해 중심와를 통과한 박편을 선택하였다(도 1a). 광수용체에서 eGFP 발현의 평가는 AAV5 eGFP 또는 AAV2-HBKO-eGFP의 투여 후 FA(안저 자가 형광) 및 IHC에 의해 평가하였다. 두 벡터 모두 eGFP의 발현을 유도하는 인간 로돕신 프로모터를 보유하였다. 벡터를 투여한지 대략 6주 후에 동물을 안락사시키고 눈을 파라핀 포매 및 조직학적 박편화를 위해 프로세싱하였다. eGFP의 면역형광 검출을 위해 슬라이드를 염색하였고(도 1b), 이미지는 망막하 수포의 한쪽 가장자리에서 다른 쪽 가장자리로 순차적으로 수집하였다. eGFP 트랜스진의 발현은 망막하 수포에 걸쳐 균일한 것으로 나타났다. 어떤 이론에도 구속되지 않고, 간상 광수용체가 더 적은 영역(중심와에 인접하고 중심와 내)에서 트랜스진 발현이 감소되었으며, 이로써 간상 광수용체로의 발현의 제한에 있어서의 인간 로돕신 프로모터의 충실도를 확인하였다. 이전에, AAV5는 트랜스진 발현이 편재성 프로모터의 제어 하에 있을 때 추상 광수용체를 형질도입하는 것으로 나타났다. 수포 아래의 광수용체 형질도입의 백분율의 정량화는 AAV5 및 AAV2-HBKO가 NHP 망막에서 동일한 광수용체 형질도입 활성을 보여줌을 나타냈다(광수용체의 평균 61%가 AAV5 및 AAV2-HBKO 둘 다에 의해 형질도입됨)(표 3).
[표 3]
Figure pct00007
표 3에서 PR은 광수용체를 나타내고, OD는 오른쪽 눈을 나타내고, OS는 왼쪽 눈을 나타낸다.
추가로, eGFP의 발현은 자가형광 이미징 능력이 있는 sdOCT를 사용하여 모니터링하였다. eGFP는 벡터를 투여한지 2주 및 4주 후에 관찰하였다. eGFP 신호의 강도는 시간이 지남에 따라 증가하였고 AAV5eGFP로 처리된 눈의 망막하 수포의 주변부 내에서 망막에 국한되었다(도 2a). AAV2-HBKOeGFP로 처리된 눈으로부터의 eGFP의 발현은 망막하 수포의 주변부를 훨씬 지나 확장되었다(도 2b). 별개의 슬라이드를 eGFP 및 로돕신의 면역조직화학적 검출을 위해 항-eGFP 항체 및 항-로돕신 항체로 공동 염색하여 간상 광수용체만 형질도입되었음을 확인하였다. 도 3은 망막하 수포의 조직학적 조사를 나타낸다. 어떠한 이론에도 구속되지 않고, 파라핀 포매 조직에서 로돕신(적색) 및 eGFP(갈색)에 대한 면역조직화학은 AAV5 벡터의 형질도입이 망막하 수포의 주변부로부터 퍼지지 않았고; 주변부에서의 전이가 급격함을 나타냈다(도 3a). 형질도입은 AAV2HBKO-eGFP 수포로부터 퍼지고 주사 과정에 의해 들어 올려지지 않은 영역에서 점점 적어진다(도 3b). eGFP와 로돕신의 동시 국소화는 형질도입된 세포가 간상 광수용체임을 나타냈다. 비대, 색소 변위, 및 세포 변위를 포함하여 RPE에 변화가 있었지만 망막의 전체 구조는 보존되었다.
실시예 3 - 망막에서의 AAV5 아르기닌 변이체의 형질도입 잠재력의 평가
AAV2HBKO 변이체는 망막의 형질도입 활성에 대한 아르기닌, 및 확장에 의한 표면 전하의 중요성을 보여주었다. 표면 아르기닌을 추가하는 효과는 망막하로 전달될 때 광수용체에 대해 높은 친화도를 갖는 혈청형인 또 다른 캡시드인 AAV5를 사용하여 추가로 조사하였다. AAV5 변이체 AAV5G474R, AAV5N564R 및 AAV5N573R을 생성하고 유리체내 및 망막하 전달 후 마우스 망막에서 이들의 지향성을 평가하였다. AAV2의 표면 지도를 AAV5의 표면 지도와 비교하였으며, 이는 아르기닌이 풍부한 AAV5 변이체의 생성을 위해 AAV5 캡시드에서 돌연변이시킬 아미노산의 선택을 안내하는 데 도움이 되었다. AAV5 변이체는 모 AAV5로 달성된 수율보다 2~3배 적은 수율로 생산되었지만, 변이체는 모 AAV5와 동일한 캡시드 단백질 비를 유지하였다. 먼저, AAV5 아르기닌 변이체의 망막하 전달을 야생형 마우스 망막에서 평가하고 이들의 형질도입 활성을 모 AAV5 캡시드의 것과 비교하였다. 도 4a는 동일한 CBA-eGFP 발현 카세트를 보유하는 각 벡터의 1 x 109 vg의 망막하 전달 후 AAV5, AAV5G474R, AAV5N564R 및 AAV5N573R의 성능을 보여준다. 모 AAV5와 비교할 때 망막을 형질도입하는 AAV5 아르기닌 변이체의 능력에는 유의한 차이가 없었다. 천연 eGFP 형광 분석은 AAV5G474R, AAV5N564R 및 AAV5N573R 변이체가 모 AAV5-eGFP와 동일한 수준으로 ONL 및 RPE 세포를 형질도입함을 보였다(도 4a). 또한, AAV5 아르기닌 변이체는 눈당 1 x 109 vg의 동일한 벡터 용량으로 마우스 망막에 유리체내 전달 후 추가로 평가하였다. 형질도입된 망막의 EGFP 형광 분석(도 4b)은 모든 AAV5 아르기닌 변이체, AAV5G474R, AAV5N564R 및 AAV5N573R이 각막 내피 세포에 대한 새로운 지향성을 획득했음을 확인시켜 주었다. 모 AAV5는 유리체내 전달에 의해서는 형질도입 활성을 나타내지 않았다(도 4b). AAV5 변이체는 유리체내 전달 후 광수용체 및 RPE를 포함한 외망막에서 형질도입을 나타내지 않았으며, 이때 매우 낮은 수준의 eGFP 발현이 INL 및 뮐러 세포에서 관찰되었다.
실시예 4 - AAV 형질도입에 대한 아세틸화의 역할 조사
AAV2HBKO 및 AAV5 아르기닌 변이체는 각각 수용체 결합 및 표면 전하에 대한 지식을 이용하여 합리적인 설계 접근법을 이용하여 생성하였다. 새로운 번역 후 변형, PTM을 식별한 AAV 캡시드의 LC/MS 분석에서 얻은 지식(문헌[Jin et al., 2017])을 이용하여 추가 변이체를 생성하였다. VP1 및 VP3 캡시드 단백질에 대한 N-말단 아세틸화는 이전에 보고되었다(문헌[Jin et al., 2017]). 이 속성을 추가로 탐색하기 위해, 일련의 AAV5 아세틸화 변이체를 생성하여 망막에서 AAV5 생물학에 대한 PTM의 역할을 설명하였다. AAV5 캡시드 서열 내로 도입된 돌연변이는 표 4에 기술되어 있으며, 이는 개시 메티오닌 뒤의 아미노산을, 아세틸화 빈도가 높은 아미노산(알라닌 또는 세린)에서 아세틸화 빈도가 낮은 아미노산(글리신 또는 프롤린)으로 변경하는 것을 포함하였다. 이러한 변경은 AAV5 VP1 및 VP3 캡시드 단백질에 대해 별개로 수행하였다. 또한, 상기 두 AAV 캡시드 단백질에서 조합된 변경이 이루어졌다. AAV 캡시드 단백질 VP2는 이전 연구(문헌[Jin et al 2017])에서 아세틸화의 증거를 나타내지 않았으므로, VP2 서열은 모 서열로부터의 변화 없이 유지하였다. AAV5 탈아세틸화 변이체를 LC/MS로 분석하여 아세틸화 상태를 확인하고 그 결과를 표 4에 나타낸다.
[표 4]
Figure pct00008
표 4는 AAV5 아세틸화 변이체에서 VP1, VP2 및 VP3의 질량을 확인하기 위한 LC/MS 분석을 보여주며(AAV5S2G 및 AAV5S194G의 VP1은 캡시드 단백질의 불완전한 크로마토그래피 분리로 인해 질량 분석기에 의해 검출되지 않았음); nd는 검출 불가를 나타낸다. 레인은 도 5에 나타낸 것에 상응한다.
아미노산 변화, 즉 글리신 또는 프롤린과 관계없이, 모든 AAV5 탈아세틸화 돌연변이체는 아세틸화가 감소된 것으로 확인되었다. LC/MS 분석은 각 AAV5 캡시드 단백질 돌연변이체에 대한 정확한 분자량을 확인하였다. S에서 P로의 돌연변이체에서는 아세틸화가 관찰되지 않은 반면 S에서 G로의 돌연변이체에서는 10% 아세틸화가 관찰되었다. 아세틸화 돌연변이체는 야생형 AAV5와 비교하여 동등한 패키징 효율을 보였으며, 이는 새로운 아미노산 변화가 AAV 벡터 생성 또는 캡시드 단백질 비에 부정적인 영향을 미치지 않았음을 시사한다(도 5).
AAV5 아세틸화 변이체의 형질도입 효율을 마우스에 망막하 주사후 생체 내에서 야생형 AAV5와 비교하였다. 야생형 마우스에 1 x 109 vg AAV5-CBA eGFP 또는 동일한 CBA-eGFP 발현 카세트를 보유하는 각각의 AAV5 아세틸화 돌연변이체 중 하나를 주사하였다. 이전에 나타낸 바와 같이(도 4a), AAV5-eGFP의 망막하 주사는 외망막에서 강력한 eGFP 발현을 초래하였다(도 6a). 아세틸화 돌연변이체 AAV5S2G, AAV5S2P, AAV5S194P, AAV5S2G/S194G 및 AAV5S2P/S194P는 주사된 망막의 eGFP 형광(도 6a) 및 EGFP 단백질 수준(ELISA)(도 6b)에 의해 입증된 바와 같이 망막에서 감소된 수준의 eGFP 발현을 나타냈다. 아세틸화 돌연변이체 AAV5S194G-eGFP는 모 AAV5-eGFP와 비교하여 광수용체 세포에서 eGFP 발현의 유의한 증가를 나타냈다(도 6a 및 도 6b). 이것은 형질도입된 망막의 eGFP ELISA 및 eGFP 형광에 의해 단백질 수준에서 입증되었다. ug 망막 단백질당 벡터 게놈 카피 수의 분석은 망막 형질도입의 증가가 AAV5S194G-eGFP 벡터의 망막 세포로의 증가된 흡수의 함수가 아님을 밝혀냈고, 모든 아세틸화 변이체에 대한 벡터 게놈 카피 수/ug 망막 단백질은 처리된 망막에서 모 AAV5 eGFP 벡터보다 낮은 경향이 있었다(도 6c).
아세틸화 돌연변이체 AAV5-S194G-eGFP 및 AAV5-S194P-eGFP의 형질도입 특성을 용량 반응 연구에서 추가로 평가하고 이들의 성능을 AAV5-eGFP와 비교하였다. 증가하는 용량, 1x108~1x109 vg의 AAV5-S194G-eGFP, AAV5-S194P-eGFP 또는AAV5-eGFP를 야생형 마우스에 망막하 투여하였다. 1x109 vg의 용량 수준에서, AAV5 벡터는 광수용체 세포의 강력한 형질도입을 보여주었다. 이전 결과에서 볼 수 있는 바와 같이 아세틸화된 돌연변이체 AAV5S194P는 AAV5에 비해 유의하게 감소된 발현을 보이는 반면, AAV5-S194G 변이체는 광수용체 세포 형질도입의 유의한 증가를 나타냈다(도 7a). 더 낮은 용량의 벡터, 5 x 108 및 1 x 108 vg에서, AAV5-eGFP 벡터를 받은 망막에서 eGFP 발현이 현저하게 감소한 반면, AV5-S194G-eGFP로 형질도입된 망막은 1x108 vg만큼 낮은 용량에서도 광수용체에서 강력한 eGFP 발현을 보였다. AAV5S194P-eGFP는 평가된 모든 용량에서 광수용체의 형질도입을 거의 나타내지 않았다(도 7a). EGFP 단백질 수준은 평가된 모든 용량에서 AAV5-eGFP와 비교하여 AAV5S194G-eGFP로 처리된 망막에서 더 높은 것으로 확인되었으며, 그 차이는 더 낮은 용량에서 더 유의하였다. 어떤 이론에도 구속되지 않고, 이것은 더 높은 벡터 용량에서 eGFP 발현의 포화 때문일 수 있다(도 7b). ug 망막 조직당 벡터 게놈 카피 수의 분석은 평가된 모든 벡터에 대해 용량 반응을 나타냈고; AAV5-eGFP 벡터로 형질도입된 망막은 AAV5S194G-eGFP 또는 AAV5S194P-eGFP 아세틸화 변이체로 처리된 망막과 유사한 벡터 게놈 카피/ug 망막 단백질을 보였다(도 7c). 어떠한 이론에도 구속되지 않고, VP1 N 말단 아세틸화가 보존되고 VP3 N-말단 아세틸화가 감소될 때, 모 AAV5와 비교하여 망막 형질도입의 유의한 개선이 있었다.
실시예 5 - 망막에서 AAV2 형질도입에 대한 탈아미드화의 역할 평가
AAV 캡시드 단백질에 대한 번역 후 변형을 포함하는 생산 세포주 생성 플랫폼을 사용하여 생성된 AAV 벡터의 품질 속성의 분석은 여러 관찰결과를 나타냈다. 구체적으로, AAV2 벡터의 맥락에서 생산 세포주 공정은 삼중 형질감염 생산 플랫폼을 통해 생성된 유사한 AAV2 벡터와 비교하여 일관되게 VP1 미만의 단백질 러닝(running)을 갖는 AAV 벡터 제제를 생성하였다(도 8b). LC/MS 분석은 상기 단백질이 처음 34개 아미노산이 결여된 절두된 형태의 VP1 단백질(tVP1)임을 나타냈으며, 이때 아세틸화된 A35는 N 말단 아미노산인 것으로 확인되었다. 어떤 이론에도 구속되지 않고, tVP1은 이웃하는 아스파라긴 N57에서의 탈아미드화의 결과일 수 있으며, 그 결과 아세틸화된 A35에서 VP1이 단백질분해적으로 절단되어 tVP1이 생성될 수 있다(도 8a). LC/MS 분석은 AAV2 PCL 유래 벡터의 맥락에서 N57의 탈아미드화 상태가 삼중 형질감염에 의해 생성된 비슷한 AAV2 벡터의 경우의 6.7%와 비교하여 18.4%로 더 높음을 확인시켜 주었다(표 5).
[표 5]
Figure pct00009
표 5에서 TTx는 삼중 형질감염 생성 플랫폼을 나타내며; PCL은 생산 세포주 생성 플랫폼을 나타낸다.
N511 또는 N717을 포함하는 AAV2 캡시드 서열의 다른 잠재적인 NG 탈아미드화 부위에서의 탈아미드화의 차이가 측정되지 않았다. AAV2 PCL 벡터의 감염성은 분석적 시험관 내 분석에서 더 낮은 경향이 있었고(표 5), 따라서 망막에서 AAV2 감염성에 대한 탈아미드화의 역할을 추가로 조사하기 위해 탈아미드화 돌연변이체를 생성하였다. 이를 위해, N57 탈아미드화 부위를 아스파르트산으로 돌연변이시켜(N57D) 완전히 탈아미드화되는 캡시드를 생성하였다. 또한, AAV2 캡시드 서열의 이 영역에 아스파르트산을 도입하는 효과를 대조하기 위해 변이체 G58D를 생성하였다. 삼중 형질감염 생성 방법을 사용하여 AAV2N57D-eGFP 및 AAV2G58D-eGFP 변이체를 생성 및 생산하였으며, 변이체는 모 AAV2 캡시드와 유사한 패키징 효율 및 캡시드 단백질 프로파일을 갖는다(도 8c 및 표 6). 탈아미드화 변이체의 LC/MS 분석은 N57 부위에서 AAV2G58D-eGFP가 1.1% 탈아미드화되고(아스파르트산이 되도록), 야생형 AAV2-eGFP가 5.7% 탈아미드화된 반면, AAV2N57D-eGFP는 아스파르트산으로 100% 돌연변이되었음을 확인시켜 주었다(표 6).
[표 6]
Figure pct00010
다음으로 탈아미드화 변이체를 생체 내에서 평가하여 AAV2 형질도입 활성에 대한 이러한 번역 후 변형의 역할을 평가하였다. 야생형 마우스로의 AAV2 eGFP 벡터의 유리체내 전달은 망막 신경절 세포의 유의한 형질도입을 초래하였다. AAV2G58D-eGFP 변이체에서도 유사한 결과가 관찰되었다. AAV2N57D-eGFP의 유리체내 전달은 EGFP 형광(도 9c) 또는 ELISA(도 9a)에 의해 측정된 바와 같이 불량한 망막 형질도입을 초래하였다. AV2N57D-eGFP 변이체로 측정된 감소된 트랜스진 발현은 감소된 세포 진입과 상관관계가 있었으며; AAV2N57D-eGFP 변이체로 형질도입된 망막 조직의 ug당 벡터 게놈 카피는 비변형 AAV2eGFP 또는 AAV2G58DeGFP로 측정된 수준보다 낮은 경향이 있었다(도 9b).
실시예 6 - NHP 망막 외식편에서의 AAV2 및 AAV5 캡시드 변이체의 평가
신규 변이체의 형질도입 효율 및 지향성을 테스트하고 종 간의 AAV 변이체의 번역 충실도를 평가하기 위해 생체 외 NHP 기관형 외식편 시스템의 사용을 평가하였다. NHP로부터의 망막 외식편을 확립하고 탈아세틸화 변이체 AAV5S194G 및 AAV5S194P의 형질도입 효율을 평가하였다. 플레이팅한지 7일 후, 배양된 망막은 온전한 간상 및 추상 광수용체 내절 및 외절, 완전한 ONL 및 외부에서 내부로의 망막 연결을 포함한 정상적인 구조를 유지하였다(도 10a). 망막 외식편에서 AAV5 및 AAV5 탈아세틸화 변이체의 형질도입 효율은 마우스 망막에서 관찰된 형질도입 효율을 모방하고(도 6a), 비변형 AAV5의 경우 NHP 망막에서도 관찰되는 형질도입 활성을 모방하였다(도 3a). 마우스 망막에서 관찰된 것을 확인하면(도 7), AAV5S194G 변이체가 AAV5 모 벡터와 비교하여 ONL에서 우수한 형질도입 효율을 나타냈다(도 10a 및 도 10b). 모 AAV5와 비교하여, AAV5S194P 변이체는 마우스 연구에서의 성능과 유사하게 NHP 망막 외식편에서 감소된 형질도입 효율을 나타냈다(도 7 및 도 8). 기관형 배양물의 진위는 NHP 망막으로의 AAV5-eGFP 벡터의 망막하 전달에서 관찰되는 형질도입 성능(도 3a)과 유사하게, ONL의 강력한 형질도입을 입증한(도 10a 및 도 10b) AAV5-eGFP 모 벡터의 성능에 의해 확인하였다. NHP 망막 외식편 모델에서 탈아세틸화 돌연변이체의 평가는 비변형 AAV5에 비해 AAV5S194G 변이체에 대한 추가 이점을 보여주었다: 이 캡시드 변이체는 광수용체 세포를 선택적으로 형질도입하였으며, 이때 망막 신경절 세포층에서는 형질도입이 거의 관찰되지 않았다(도 10a 및 도 10b).
SEQUENCE LISTING <110> Frederick, Amy Jin, Xiaoying Liu, Lin O'Riordan, Catherine Sullivan, Jennifer <120> MODIFIED ADENO-ASSOCIATED VIRAL CAPSID PROTEINS FOR OCULAR GENE THERAPY AND METHODS OF USE THEREOF <130> 714495: SA9-285PC <150> US 62/967,416 <151> 2020-01-29 <160> 14 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 724 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Adeno-associated virus 5 <400> 1 Met Ser Phe Val Asp His Pro Pro Asp Trp Leu Glu Glu Val Gly Glu 1 5 10 15 Gly Leu Arg Glu Phe Leu Gly Leu Glu Ala Gly Pro Pro Lys Pro Lys 20 25 30 Pro Asn Gln Gln His Gln Asp Gln Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro Gly 35 40 45 Tyr Asn Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Arg Gly Glu Pro Val 50 55 60 Asn Arg Ala Asp Glu Val Ala Arg Glu His Asp Ile Ser Tyr Asn Glu 65 70 75 80 Gln Leu Glu Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala Asp 85 90 95 Ala Glu Phe Gln Glu Lys Leu Ala Asp Asp Thr Ser Phe Gly Gly Asn 100 105 110 Leu Gly Lys Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro Phe 115 120 125 Gly 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900 tccctcagag tcaaaatctt caacattcaa gtcaaagagg tcacggtgca ggactccacc 960 accaccatcg ccaacaacct cacctccacc gtccaagtgt ttacggacga cgactaccag 1020 ctgccctacg tcgtcggcaa cgggaccgag ggatgcctgc cggccttccc tccgcaggtc 1080 tttacgctgc cgcagtacgg ttacgcgacg ctgaaccgcg acaacacaga aaatcccacc 1140 gagaggagca gcttcttctg cctagagtac tttcccagca agatgctgag aacgggcaac 1200 aactttgagt ttacctacaa ctttgaggag gtgcccttcc actccagctt cgctcccagt 1260 cagaacctgt tcaagctggc caacccgctg gtggaccagt acttgtaccg cttcgtgagc 1320 acaaataaca ctggcggagt ccagttcaac aagaacctgg ccgggagata cgccaacacc 1380 tacaaaaact ggttcccggg gcccatgggc cgaacccagg gctggaacct gggctccggg 1440 gtcaaccgcg ccagtgtcag cgccttcgcc acgaccaata ggatggagct cgagggcgcg 1500 agttaccagg tgcccccgca gccgaacggc atgaccaaca acctccaggg cagcaacacc 1560 tatgccctgg agaacactat gatcttcaac agccagccgg cgaacccggg caccaccgcc 1620 acgtacctcg agggcaacat gctcatcacc agcgagagcg agacgcagcc ggtgaaccgc 1680 gtggcgtaca acgtcggcgg gcagatggcc accaacaacc agagctccac cactgccccc 1740 gcgaccggca cgtacaacct ccaggaaatc gtgcccggca gcgtgtggat ggagagggac 1800 gtgtacctcc aaggacccat ctgggccaag atcccagaga cgggggcgca ctttcacccc 1860 tctccggcca tgggcggatt cggactcaaa cacccaccgc ccatgatgct catcaagaac 1920 acgcctgtgc ccggaaatat caccagcttc tcggacgtgc ccgtcagcag cttcatcacc 1980 cagtacagca ccgggcaggt caccgtggag atggagtggg agctcaagaa ggaaaactcc 2040 aagaggtgga acccagagat ccagtacaca aacaactaca acgaccccca gtttgtggac 2100 tttgccccgg acagcaccgg ggaatacaga accaccagac ctatcggaac ccgatacctt 2160 acccgacccc tt 2172 <210> 3 <211> 724 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 3 Met Ser Phe Val Asp His Pro Pro Asp Trp Leu Glu Glu Val Gly Glu 1 5 10 15 Gly Leu Arg Glu Phe Leu Gly Leu Glu Ala Gly Pro Pro Lys Pro Lys 20 25 30 Pro Asn Gln Gln His Gln Asp Gln Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro Gly 35 40 45 Tyr Asn Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Arg Gly Glu Pro Val 50 55 60 Asn Arg Ala Asp Glu Val Ala Arg Glu His Asp Ile Ser Tyr Asn Glu 65 70 75 80 Gln Leu Glu Ala Gly 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720 agctacaaca accaccagta ccgagagatc aaaagcggct ccgtcgacgg aagcaacgcc 780 aacgcctact ttggatacag caccccctgg gggtactttg actttaaccg cttccacagc 840 cactggagcc cccgagactg gcaaagactc atcaacaact actggggctt cagaccccgg 900 tccctcagag tcaaaatctt caacattcaa gtcaaagagg tcacggtgca ggactccacc 960 accaccatcg ccaacaacct cacctccacc gtccaagtgt ttacggacga cgactaccag 1020 ctgccctacg tcgtcggcaa cgggaccgag ggatgcctgc cggccttccc tccgcaggtc 1080 tttacgctgc cgcagtacgg ttacgcgacg ctgaaccgcg acaacacaga aaatcccacc 1140 gagaggagca gcttcttctg cctagagtac tttcccagca agatgctgag aacgggcaac 1200 aactttgagt ttacctacaa ctttgaggag gtgcccttcc actccagctt cgctcccagt 1260 cagaacctgt tcaagctggc caacccgctg gtggaccagt acttgtaccg cttcgtgagc 1320 acaaataaca ctggcggagt ccagttcaac aagaacctgg ccgggagata cgccaacacc 1380 tacaaaaact ggttcccggg gcccatgggc cgaacccagg gctggaacct gggctccggg 1440 gtcaaccgcg ccagtgtcag cgccttcgcc acgaccaata ggatggagct cgagggcgcg 1500 agttaccagg tgcccccgca gccgaacggc atgaccaaca acctccaggg cagcaacacc 1560 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ctttcaggcc 360 aagaaaaggg ttctcgaacc ttttggcctg gttgaagagg gtgctaagac ggcccctacc 420 ggaaagcgga tagacgacca ctttccaaaa agaaagaagg ctcggaccga agaggactcc 480 aagccttcca cctcgtcaga cgccgaagct ggacccagcg gatcccagca gctgcaaatc 540 ccagcccaac cagcctcaag tttgggagct gatacaatgt ctgcgggagg tggcggccca 600 ttgggcgaca ataaccaagg tgccgatgga gtgggcaatg cctcgggaga ttggcattgc 660 gattccacgt ggatggggga cagagtcgtc accaagtcca cccgaacctg ggtgctgccc 720 agctacaaca accaccagta ccgagagatc aaaagcggct ccgtcgacgg aagcaacgcc 780 aacgcctact ttggatacag caccccctgg gggtactttg actttaaccg cttccacagc 840 cactggagcc cccgagactg gcaaagactc atcaacaact actggggctt cagaccccgg 900 tccctcagag tcaaaatctt caacattcaa gtcaaagagg tcacggtgca ggactccacc 960 accaccatcg ccaacaacct cacctccacc gtccaagtgt ttacggacga cgactaccag 1020 ctgccctacg tcgtcggcaa cgggaccgag ggatgcctgc cggccttccc tccgcaggtc 1080 tttacgctgc cgcagtacgg ttacgcgacg ctgaaccgcg acaacacaga aaatcccacc 1140 gagaggagca gcttcttctg cctagagtac tttcccagca agatgctgag aacgggcaac 1200 aactttgagt ttacctacaa ctttgaggag gtgcccttcc actccagctt cgctcccagt 1260 cagaacctgt tcaagctggc caacccgctg gtggaccagt acttgtaccg cttcgtgagc 1320 acaaataaca ctggcggagt ccagttcaac aagaacctgg ccgggagata cgccaacacc 1380 tacaaaaact ggttcccggg gcccatgggc cgaacccagg gctggaacct gggctccggg 1440 gtcaaccgcg ccagtgtcag cgccttcgcc acgaccaata ggatggagct cgagggcgcg 1500 agttaccagg tgcccccgca gccgaacggc atgaccaaca acctccaggg cagcaacacc 1560 tatgccctgg agaacactat gatcttcaac agccagccgg cgaacccggg caccaccgcc 1620 acgtacctcg agggcaacat gctcatcacc agcgagagcg agacgcagcc ggtgaaccgc 1680 gtggcgtacc gcgtcggcgg gcagatggcc accaacaacc agagctccac cactgccccc 1740 gcgaccggca cgtacaacct ccaggaaatc gtgcccggca gcgtgtggat ggagagggac 1800 gtgtacctcc aaggacccat ctgggccaag atcccagaga cgggggcgca ctttcacccc 1860 tctccggcca tgggcggatt cggactcaaa cacccaccgc ccatgatgct catcaagaac 1920 acgcctgtgc ccggaaatat caccagcttc tcggacgtgc ccgtcagcag cttcatcacc 1980 cagtacagca ccgggcaggt caccgtggag atggagtggg agctcaagaa ggaaaactcc 2040 aagaggtgga acccagagat ccagtacaca aacaactaca acgaccccca gtttgtggac 2100 tttgccccgg acagcaccgg ggaatacaga accaccagac ctatcggaac ccgatacctt 2160 acccgacccc tt 2172 <210> 9 <211> 724 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 9 Met Ser Phe Val Asp His Pro Pro Asp Trp Leu Glu Glu Val Gly Glu 1 5 10 15 Gly Leu Arg Glu Phe Leu Gly Leu Glu Ala Gly Pro Pro Lys Pro Lys 20 25 30 Pro Asn Gln Gln His Gln Asp Gln Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro Gly 35 40 45 Tyr Asn Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Arg Gly Glu Pro Val 50 55 60 Asn Arg Ala Asp Glu Val Ala Arg Glu His Asp Ile Ser Tyr Asn Glu 65 70 75 80 Gln Leu Glu Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala Asp 85 90 95 Ala Glu Phe Gln Glu Lys Leu Ala Asp Asp Thr Ser Phe Gly Gly Asn 100 105 110 Leu Gly Lys Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Val Leu Glu Pro Phe 115 120 125 Gly Leu Val Glu Glu Gly Ala Lys Thr Ala Pro Thr Gly Lys Arg Ile 130 135 140 Asp Asp His Phe Pro Lys Arg Lys Lys Ala Arg Thr Glu Glu Asp Ser 145 150 155 160 Lys Pro Ser Thr Ser Ser Asp Ala Glu Ala Gly Pro Ser Gly Ser Gln 165 170 175 Gln Leu Gln Ile Pro Ala Gln Pro Ala Ser Ser Leu Gly Ala Asp Thr 180 185 190 Met Ser Ala Gly Gly Gly Gly Pro Leu Gly Asp Asn Asn Gln Gly Ala 195 200 205 Asp Gly Val Gly Asn Ala Ser Gly Asp Trp His Cys Asp Ser Thr Trp 210 215 220 Met Gly Asp Arg Val Val Thr Lys Ser Thr Arg Thr Trp Val Leu Pro 225 230 235 240 Ser Tyr Asn Asn His Gln Tyr Arg Glu Ile Lys Ser Gly Ser Val Asp 245 250 255 Gly Ser Asn Ala Asn Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr 260 265 270 Phe Asp Phe Asn Arg Phe His Ser His Trp Ser Pro Arg Asp Trp Gln 275 280 285 Arg Leu Ile Asn Asn Tyr Trp Gly Phe Arg Pro Arg Ser Leu Arg Val 290 295 300 Lys Ile Phe Asn Ile Gln Val Lys Glu Val Thr Val Gln Asp Ser Thr 305 310 315 320 Thr Thr Ile Ala Asn Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp 325 330 335 Asp Asp Tyr Gln Leu Pro Tyr Val Val Gly Asn Gly Thr Glu Gly Cys 340 345 350 Leu Pro Ala Phe Pro Pro Gln Val Phe Thr Leu Pro Gln Tyr Gly Tyr 355 360 365 Ala Thr Leu Asn Arg Asp Asn Thr Glu Asn Pro Thr Glu Arg Ser Ser 370 375 380 Phe Phe Cys Leu Glu Tyr Phe Pro Ser Lys Met Leu Arg Thr Gly Asn 385 390 395 400 Asn Phe Glu Phe Thr Tyr Asn Phe Glu Glu Val Pro Phe His Ser Ser 405 410 415 Phe Ala Pro Ser Gln Asn Leu Phe Lys Leu Ala Asn Pro Leu Val Asp 420 425 430 Gln Tyr Leu Tyr Arg Phe Val Ser Thr Asn Asn Thr Gly Gly Val Gln 435 440 445 Phe Asn Lys Asn Leu Ala Gly Arg Tyr Ala Asn Thr Tyr Lys Asn Trp 450 455 460 Phe Pro Gly Pro Met Gly Arg Thr Gln Gly Trp Asn Leu Gly Ser Gly 465 470 475 480 Val Asn Arg Ala Ser Val Ser Ala Phe Ala Thr Thr Asn Arg Met Glu 485 490 495 Leu Glu Gly Ala Ser Tyr Gln Val Pro Pro Gln Pro Asn Gly Met Thr 500 505 510 Asn Asn Leu Gln Gly Ser Asn Thr Tyr Ala Leu Glu Asn Thr Met Ile 515 520 525 Phe Asn Ser Gln Pro Ala Asn Pro Gly Thr Thr Ala Thr Tyr Leu Glu 530 535 540 Gly Asn Met Leu Ile Thr Ser Glu Ser Glu Thr Gln Pro Val Asn Arg 545 550 555 560 Val Ala Tyr Asn Val Gly Gly Gln Met Ala Thr Asn Arg Gln Ser Ser 565 570 575 Thr Thr Ala Pro Ala Thr Gly Thr Tyr Asn Leu Gln Glu Ile Val Pro 580 585 590 Gly Ser Val Trp Met Glu Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp 595 600 605 Ala Lys Ile Pro Glu Thr Gly Ala His Phe His Pro Ser Pro Ala Met 610 615 620 Gly Gly Phe Gly Leu Lys His Pro Pro Pro Met Met Leu Ile Lys Asn 625 630 635 640 Thr Pro Val Pro Gly Asn Ile Thr Ser Phe Ser Asp Val Pro Val Ser 645 650 655 Ser Phe Ile Thr Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Thr Val Glu Met Glu 660 665 670 Trp Glu Leu Lys Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln 675 680 685 Tyr Thr Asn Asn Tyr Asn Asp Pro Gln Phe Val Asp Phe Ala Pro Asp 690 695 700 Ser Thr Gly Glu Tyr Arg Thr Thr Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu 705 710 715 720 Thr Arg Pro Leu <210> 10 <211> 2172 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 10 atgtcttttg ttgatcaccc tccagattgg ttggaagaag ttggtgaagg tcttcgcgag 60 tttttgggcc ttgaagcggg cccaccgaaa ccaaaaccca atcagcagca tcaagatcaa 120 gcccgtggtc ttgtgctgcc tggttataac tatctcggac ccggaaacgg tctcgatcga 180 ggagagcctg tcaacagggc agacgaggtc gcgcgagagc acgacatctc gtacaacgag 240 cagcttgagg cgggagacaa cccctacctc aagtacaacc acgcggacgc cgagtttcag 300 gagaagctcg ccgacgacac atccttcggg ggaaacctcg gaaaggcagt ctttcaggcc 360 aagaaaaggg ttctcgaacc ttttggcctg gttgaagagg gtgctaagac ggcccctacc 420 ggaaagcgga tagacgacca ctttccaaaa agaaagaagg ctcggaccga agaggactcc 480 aagccttcca cctcgtcaga cgccgaagct ggacccagcg gatcccagca gctgcaaatc 540 ccagcccaac cagcctcaag tttgggagct gatacaatgt ctgcgggagg tggcggccca 600 ttgggcgaca ataaccaagg tgccgatgga gtgggcaatg cctcgggaga ttggcattgc 660 gattccacgt ggatggggga cagagtcgtc accaagtcca cccgaacctg ggtgctgccc 720 agctacaaca accaccagta ccgagagatc aaaagcggct ccgtcgacgg aagcaacgcc 780 aacgcctact ttggatacag caccccctgg gggtactttg actttaaccg cttccacagc 840 cactggagcc cccgagactg gcaaagactc atcaacaact actggggctt cagaccccgg 900 tccctcagag tcaaaatctt caacattcaa gtcaaagagg tcacggtgca ggactccacc 960 accaccatcg ccaacaacct cacctccacc gtccaagtgt ttacggacga cgactaccag 1020 ctgccctacg tcgtcggcaa cgggaccgag ggatgcctgc cggccttccc tccgcaggtc 1080 tttacgctgc cgcagtacgg ttacgcgacg ctgaaccgcg acaacacaga aaatcccacc 1140 gagaggagca gcttcttctg cctagagtac tttcccagca agatgctgag aacgggcaac 1200 aactttgagt ttacctacaa ctttgaggag gtgcccttcc actccagctt cgctcccagt 1260 cagaacctgt tcaagctggc caacccgctg gtggaccagt acttgtaccg cttcgtgagc 1320 acaaataaca ctggcggagt ccagttcaac aagaacctgg ccgggagata cgccaacacc 1380 tacaaaaact ggttcccggg gcccatgggc cgaacccagg gctggaacct gggctccggg 1440 gtcaaccgcg ccagtgtcag cgccttcgcc acgaccaata ggatggagct cgagggcgcg 1500 agttaccagg tgcccccgca gccgaacggc atgaccaaca acctccaggg cagcaacacc 1560 tatgccctgg agaacactat gatcttcaac agccagccgg cgaacccggg caccaccgcc 1620 acgtacctcg agggcaacat gctcatcacc agcgagagcg agacgcagcc ggtgaaccgc 1680 gtggcgtaca acgtcggcgg gcagatggcc accaacagac agagctccac cactgccccc 1740 gcgaccggca cgtacaacct ccaggaaatc gtgcccggca gcgtgtggat ggagagggac 1800 gtgtacctcc aaggacccat ctgggccaag atcccagaga cgggggcgca ctttcacccc 1860 tctccggcca tgggcggatt cggactcaaa cacccaccgc ccatgatgct catcaagaac 1920 acgcctgtgc ccggaaatat caccagcttc tcggacgtgc ccgtcagcag cttcatcacc 1980 cagtacagca ccgggcaggt caccgtggag atggagtggg agctcaagaa ggaaaactcc 2040 aagaggtgga acccagagat ccagtacaca aacaactaca acgaccccca gtttgtggac 2100 tttgccccgg acagcaccgg ggaatacaga accaccagac ctatcggaac ccgatacctt 2160 acccgacccc tt 2172 <210> 11 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 11 tatctaccaa cctccaggca ggcaacgcac aagcagctac cgcag 45 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 12 ccaggttcca gcgctgggtt cggcc 25 <210> 13 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 13 ccgcgtggcg taccgcgtcg gcgggcag 28 <210> 14 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 14 cagtggtgga gctctgtctg ttggtggcca tctg 34

Claims (75)

  1. 변형 아데노-관련 바이러스(adeno-associated virus; AAV) 캡시드 단백질로서, 상기 변형 캡시드 단백질은 아미노산 S194, G474, N564, 및/또는 N573에 상응하는 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함하며, 위치의 넘버링은 AAV5의 VP1 넘버링을 기반으로 하는, 변형 캡시드 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 위치의 넘버링은 서열 번호 1에 기재된 야생형 AAV5 VP1의 아미노산 서열을 기반으로 하는, 변형 캡시드 단백질.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 변형 캡시드 단백질은 AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVB1, AAVAnc80, AAV7m8, AAVrh10, AAV2(Y444F), AAV2(Y444+500+730), AAV2(Y252+272+444+500+700+704+730F), AAV8(Y733F), 및 이들의 임의의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 AAV 혈청형의 변형 캡시드 단백질인, 변형 캡시드 단백질.
  4. 제3항에 있어서, 상기 변형 캡시드 단백질은 AAV5의 변형 캡시드 단백질인, 변형 캡시드 단백질.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형 캡시드 단백질은 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 변형 캡시드 단백질.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형 캡시드 단백질은 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 변형 캡시드 단백질.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형 캡시드 단백질은 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 변형 캡시드 단백질.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 194에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G인, 변형 캡시드 단백질.
  9. 제8항에 있어서, 상기 변형 캡시드 단백질은 서열 번호 3에 기재된 아미노산 서열과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 서열 번호 3의 아미노산 194에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G인, 변형 캡시드 단백질.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 474에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R인, 변형 캡시드 단백질.
  11. 제10항에 있어서, 상기 변형 캡시드 단백질은 서열 번호 5에 기재된 아미노산 서열과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 서열 번호 5의 아미노산 474에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R인, 변형 캡시드 단백질.
  12. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 564에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R인, 변형 캡시드 단백질.
  13. 제12항에 있어서, 상기 변형 캡시드 단백질은 서열 번호 7에 기재된 아미노산 서열과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 서열 번호 7의 아미노산 564에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R인, 변형 캡시드 단백질.
  14. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 573에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R인, 변형 캡시드 단백질.
  15. 제14항에 있어서, 상기 변형 캡시드 단백질은 서열 번호 9에 기재된 아미노산 서열과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 서열 번호 9의 아미노산 573에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R인, 변형 캡시드 단백질.
  16. 변형 아데노-관련 바이러스(AAV) 캡시드 단백질로서, 상기 변형 아데노-관련 바이러스(AAV) 캡시드 단백질은 아미노산 194에 상응하는 위치에서 G; 아미노산 474에 상응하는 위치에서 R; 아미노산 564에 상응하는 위치에서 R; 및/또는 아미노산 573에 상응하는 위치에서 R을 포함하며, 위치의 넘버링은 AAV5의 VP1 넘버링을 기반으로 하는, 변형 아데노-관련 바이러스(AAV) 캡시드 단백질.
  17. 변형 아데노-관련 바이러스(AAV) 캡시드 단백질로서, 상기 변형 아데노-관련 바이러스(AAV) 캡시드 단백질은 아미노산 194에 상응하는 위치에서 G를 포함하는며, 위치의 넘버링은 AAV5의 VP1 넘버링을 기반으로 하는, 변형 아데노-관련 바이러스(AAV) 캡시드 단백질.
  18. 변형 아데노-관련 바이러스(AAV) 캡시드 단백질로서, 상기 변형 아데노-관련 바이러스(AAV) 캡시드 단백질은 아미노산 474에 상응하는 위치에서 R을 포함하며, 위치의 넘버링은 AAV5의 VP1 넘버링을 기반으로 하는, 변형 아데노-관련 바이러스(AAV) 캡시드 단백질.
  19. 변형 아데노-관련 바이러스(AAV) 캡시드 단백질로서, 상기 변형 아데노-관련 바이러스(AAV) 캡시드 단백질은 아미노산 564에 상응하는 위치에서 R을 포함하며, 위치의 넘버링은 AAV5의 VP1 넘버링을 기반으로 하는, 변형 아데노-관련 바이러스(AAV) 캡시드 단백질.
  20. 변형 아데노-관련 바이러스(AAV) 캡시드 단백질로서, 상기 변형 아데노-관련 바이러스(AAV) 캡시드 단백질은 아미노산 573에 상응하는 위치에서 R을 포함하며, 위치의 넘버링은 AAV5의 VP1 넘버링을 기반으로 하는, 변형 아데노-관련 바이러스(AAV) 캡시드 단백질.
  21. 변형 아데노-관련 바이러스(AAV) 캡시드 단백질로서, 상기 변형 아데노-관련 바이러스(AAV) 캡시드 단백질은 서열 번호 3, 5, 7 또는 9에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 변형 아데노-관련 바이러스(AAV) 캡시드 단백질.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 캡시드 단백질을 코딩하는 단리된 핵산.
  23. 서열 번호 4, 6, 8 또는 10에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산.
  24. 제22항 또는 제23항의 핵산을 포함하는 벡터.
  25. 제24항에 있어서, 상기 벡터는 플라스미드 또는 헬퍼 바이러스 벡터인, 벡터.
  26. 제25항에 있어서, 헬퍼 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 배큘로바이러스 벡터, 또는 아데노바이러스 벡터인, 벡터.
  27. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 발현 벡터인, 벡터.
  28. 제22항 또는 제23항의 핵산, 또는 제24항 내지 제27항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 재조합 세포.
  29. AAV 캡시드 단백질을 생성하는 방법으로서, 상기 방법은 핵산이 발현되고 캡시드 단백질이 생성되게 하는 조건 하에 제28항의 재조합 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
  30. 다음을 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 입자:
    (a) 변형 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 캡시드로서, 상기 변형 캡시드 단백질은 아미노산 194, 474, 564, 및/또는 573에 상응하는 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함하며, 위치의 넘버링은 AAV5의 VP1 넘버링을 기반으로 하는, rAAV 캡시드; 및
    (b) 이종 핵산을 포함하는 rAAV 벡터.
  31. 제30항에 있어서, 위치의 넘버링은 서열 번호 1에 기재된 야생형 AAV5 VP1의 아미노산 서열을 기반으로 하는, rAAV 입자.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 변형 캡시드 단백질은 AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVB1, AAVAnc80, AAV7m8, AAVrh10, AAV2(Y444F), AAV2(Y444+500+730), AAV2(Y252+272+444+500+700+704+730F), AAV8(Y733F), 및 이들의 임의의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 AAV 혈청형의 변형 캡시드 단백질인, rAAV 입자.
  33. 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형 캡시드 단백질은 AAV5의 변형 캡시드 단백질인, rAAV 입자.
  34. 제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형 캡시드 단백질은 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, rAAV 입자.
  35. 제30항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형 캡시드 단백질은 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, rAAV 입자.
  36. 제30항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형 캡시드 단백질은 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, rAAV 입자.
  37. 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 194에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G인, rAAV 입자.
  38. 제37항에 있어서, 상기 변형 캡시드 단백질은 서열 번호 3에 기재된 아미노산 서열과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 서열 번호 3의 아미노산 194에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 G인, rAAV 입자.
  39. 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 474에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R인, rAAV 입자.
  40. 제39항에 있어서, 상기 변형 캡시드 단백질은 서열 번호 5에 기재된 아미노산 서열과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 서열 번호 5의 아미노산 474에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R인, rAAV 입자.
  41. 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 564에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R인, rAAV 입자.
  42. 제41항에 있어서, 상기 변형 캡시드 단백질은 서열 번호 7에 기재된 아미노산 서열과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 서열 번호 7의 아미노산 564에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R인, rAAV 입자.
  43. 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 573에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R인, rAAV 입자.
  44. 제43항에 있어서, 상기 변형 캡시드 단백질은 서열 번호 9에 기재된 아미노산 서열과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 서열 번호 9의 아미노산 573에 상응하는 캡시드 단백질의 아미노산은 R인, rAAV 입자.
  45. 다음을 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 입자:
    (a) 변형 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 캡시드로서, 변형 캡시드 단백질은 아미노산 194에 상응하는 위치에서 G; 아미노산 474에 상응하는 위치에서 R; 아미노산 564에 상응하는 위치에서 R; 및/또는 아미노산 573에 상응하는 위치에서 R을 포함하며, 위치의 넘버링은 AAV5의 VP1 넘버링을 기반으로 하는, rAAV 캡시드; 및
    (b) 이종 핵산을 포함하는 rAAV 벡터.
  46. 다음을 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 입자:
    (a) 아미노산 194에 상응하는 위치에서 G를 포함하는 rAAV 캡시드(여기서, 위치의 넘버링은 AAV5의 VP1 넘버링을 기반으로 함); 및
    (b) 이종 핵산을 포함하는 rAAV 벡터.
  47. 다음을 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 입자:
    (a) 아미노산 474에 상응하는 위치에서 R을 포함하는 rAAV 캡시드(여기서, 위치의 넘버링은 AAV5의 VP1 넘버링을 기반으로 함); 및
    (b) 이종 핵산을 포함하는 rAAV 벡터.
  48. 다음을 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 입자:
    (a) 아미노산 564에 상응하는 위치에서 R을 포함하는 rAAV 캡시드(여기서, 위치의 넘버링은 AAV5의 VP1 넘버링을 기반으로 함); 및
    (b) 이종 핵산을 포함하는 rAAV 벡터.
  49. 다음을 포함하는 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 입자:
    (a) 아미노산 573에 상응하는 위치에서 R을 포함하는 rAAV 캡시드(여기서, 위치의 넘버링은 AAV5의 VP1 넘버링을 기반으로 함); 및
    (b) 이종 핵산을 포함하는 rAAV 벡터.
  50. 제30항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 핵산은 치료용 폴리펩티드 또는 치료용 핵산을 코딩하는, rAAV 입자.
  51. 제50항에 있어서, 이종 핵산은 항산화제, 효소, 신경영양 인자, 항-아폽토시스 인자, 항-혈관신생 인자, 및 항-염증 인자로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 코딩하는, rAAV 입자.
  52. 제30항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 핵산은 치료용 핵산을 코딩하는, rAAV 입자.
  53. 제52항에 있어서, 치료용 핵산은 siRNA, shRNA, RNAi, miRNA, 안티센스 RNA, 리보자임 또는 DNA자임인, rAAV 입자.
  54. 제30항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 핵산은 항시성 프로모터에 작동가능하게 연결된, rAAV 입자.
  55. 제30항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 핵산은 안구 조직에서의 치료용 폴리펩티드 또는 치료용 핵산의 발현에 적합한 프로모터에 작동가능하게 연결된, rAAV 입자.
  56. 제55항에 있어서, 안구 조직은 망막이며, 프로모터는 광수용체 세포, 망막 색소 상피 세포, 양극성 세포, 수평 세포, 무축삭 세포, 뮐러 세포, 신경절 세포, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 망막 세포에서의 치료용 폴리펩티드 또는 치료용 핵산의 발현에 적합한, rAAV 입자.
  57. 제56항에 있어서, 안구 조직은 각막이며, 프로모터는 상피 세포, 케라토사이트, 내피 세포, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 각막 세포에서의 치료용 폴리펩티드 또는 치료용 핵산의 발현에 적합한, rAAV 입자.
  58. 제30항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, AAV 벡터는 역위 말단 반복체(inverted terminal repeat; ITR)를 추가로 포함하는, rAAV 입자.
  59. 제30항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, rAAV 벡터는 자가-상보성 rAAV 벡터(self-complementary rAAV vector; scAAV)인, rAAV 입자.
  60. 제59항에 있어서, scAAV는 이종 핵산을 코딩하는 제1 핵산 및 제1 핵산의 상보체를 코딩하는 제2 핵산을 포함하며, 제1 핵산은 그 길이의 대부분 또는 전부에 걸쳐 제2 핵산과 가닥내 염기쌍을 형성할 수 있는, rAAV 입자.
  61. 제60항에 있어서, 제1 핵산과 제2 핵산은 돌연변이 AAV ITR에 의해 연결되며, 돌연변이 AAV ITR은 D 영역의 결실을 포함하고 말단 분해(resolution) 서열의 돌연변이를 포함하는, rAAV 입자.
  62. 제30항 내지 제61항 중 어느 한 항의 rAAV 입자를 포함하는 제약 조성물.
  63. 필요로 하는 대상체의 안구 조직에 이종 핵산을 전달하는 방법으로서, 상기 방법은 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 입자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, rAAV 입자는 다음을 포함하는, 방법:
    (a) 변형 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 캡시드로서, 상기 변형 캡시드 단백질은 아미노산 194, 474, 564, 및/또는 573에 상응하는 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함하며, 위치의 넘버링은 AAV5의 VP1 넘버링을 기반으로 하는, rAAV 캡시드; 및
    (b) 이종 핵산을 포함하는 rAAV 벡터.
  64. 필요로 하는 대상체의 망막에 이종 핵산을 전달하는 방법으로서, 상기 방법은 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 입자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, rAAV 입자는 다음을 포함하는, 방법:
    (a) 변형 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 캡시드로서, 변형 캡시드 단백질은 아미노산 194에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함하며, 위치의 넘버링은 AAV5의 VP1 넘버링을 기반으로 하는, rAAV 캡시드; 및
    (b) 이종 핵산을 포함하는 rAAV 벡터.
  65. 필요로 하는 대상체의 각막에 이종 핵산을 전달하는 방법으로서, 상기 방법은 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 입자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, rAAV 입자는 다음을 포함하는, 방법:
    (a) 변형 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 캡시드로서, 변형 캡시드 단백질은 아미노산 474, 564, 및/또는 573에 상응하는 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함하며, 위치의 넘버링은 AAV5의 VP1 넘버링을 기반으로 하는, rAAV 캡시드; 및
    (b) 이종 핵산을 포함하는 rAAV 벡터.
  66. 필요로 하는 대상체의 안구 조직에서 세포의 rAAV 형질도입을 향상시키는 방법으로서, 상기 방법은 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 입자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, rAAV 입자는 다음을 포함하는, 방법:
    (a) 변형 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 캡시드로서, 상기 변형 캡시드 단백질은 아미노산 194, 474, 564, 및/또는 573에 상응하는 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함하며, 위치의 넘버링은 AAV5의 VP1 넘버링을 기반으로 하는, rAAV 캡시드; 및
    (b) 이종 핵산을 포함하는 rAAV 벡터.
  67. 필요로 하는 대상체의 망막에서 세포의 rAAV 형질도입을 향상시키는 방법으로서, 상기 방법은 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 입자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, rAAV 입자는 다음을 포함하는, 방법:
    (a) 변형 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 캡시드로서, 변형 캡시드 단백질은 아미노산 194에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함하며, 위치의 넘버링은 AAV5의 VP1 넘버링을 기반으로 하는, rAAV 캡시드; 및
    (b) 이종 핵산을 포함하는 rAAV 벡터.
  68. 필요로 하는 대상체의 각막에서 세포의 rAAV 형질도입을 향상시키는 방법으로서, 상기 방법은 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 입자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, rAAV 입자는 다음을 포함하는, 방법:
    (a) 변형 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 캡시드로서, 변형 캡시드 단백질은 아미노산 474, 564, 및/또는 573에 상응하는 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함하며, 위치의 넘버링은 AAV5의 VP1 넘버링을 기반으로 하는, rAAV 캡시드; 및
    (b) 이종 핵산을 포함하는 rAAV 벡터.
  69. 필요로 하는 대상체의 안구 조직에서 이종 핵산의 발현을 향상시키는 방법으로서, 상기 방법은 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 입자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, rAAV 입자는 다음을 포함하는, 방법:
    (a) 변형 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 캡시드로서, 상기 변형 캡시드 단백질은 아미노산 194, 474, 564, 및/또는 573에 상응하는 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함하며, 위치의 넘버링은 AAV5의 VP1 넘버링을 기반으로 하는, rAAV 캡시드; 및
    (b) 이종 핵산을 포함하는 rAAV 벡터.
  70. 필요로 하는 대상체의 망막에서 이종 핵산의 발현을 향상시키는 방법으로서, 상기 방법은 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 입자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, rAAV 입자는 다음을 포함하는, 방법:
    (a) 변형 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 캡시드로서, 변형 캡시드 단백질은 아미노산 194에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 포함하며, 위치의 넘버링은 AAV5의 VP1 넘버링을 기반으로 하는, rAAV 캡시드; 및
    (b) 이종 핵산을 포함하는 rAAV 벡터.
  71. 필요로 하는 대상체의 각막에서 이종 핵산의 발현을 향상시키는 방법으로서, 상기 방법은 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV) 입자를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, rAAV 입자는 다음을 포함하는, 방법:
    (a) 변형 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 캡시드로서, 변형 캡시드 단백질은 아미노산 474, 564, 및/또는 573에 상응하는 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함하며, 위치의 넘버링은 AAV5의 VP1 넘버링을 기반으로 하는, rAAV 캡시드; 및
    (b) 이종 핵산을 포함하는 rAAV 벡터.
  72. 필요로 하는 대상체에서 눈의 병태 또는 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 rAAV 입자를 포함하는 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, rAAV 입자는 다음을 포함하는, 방법:
    (a) 변형 캡시드 단백질을 포함하는 rAAV 캡시드로서, 상기 변형 캡시드 단백질은 아미노산 194, 474, 564, 및/또는 573에 상응하는 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함하며, 위치의 넘버링은 AAV5의 VP1 넘버링을 기반으로 하는, rAAV 캡시드; 및
    (b) 이종 핵산을 포함하는 rAAV 벡터.
  73. 제72항에 있어서, 상기 조성물은 유리체내 투여용으로 제형화되는, 방법.
  74. 제63항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 핵산은 야생형 rAAV 캡시드를 포함하는 rAAV 입자의 이종 핵산의 발현 수준과 비교하여 증가된 발현 수준으로 발현되는, 방법.
  75. 제63항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 투여는 유리체내 투여를 포함하는, 방법.
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU722624B2 (en) 1996-09-06 2000-08-10 Trustees Of The University Of Pennsylvania, The An inducible method for production of recombinant adeno-associated viruses utilizing T7 polymerase
NZ500427A (en) 1997-04-21 2002-12-20 Univ Florida The use of ribozyme treatment for retinal diseases
US6989264B2 (en) 1997-09-05 2006-01-24 Targeted Genetics Corporation Methods for generating high titer helper-free preparations of released recombinant AAV vectors
US6566118B1 (en) 1997-09-05 2003-05-20 Targeted Genetics Corporation Methods for generating high titer helper-free preparations of released recombinant AAV vectors
US6723551B2 (en) 2001-11-09 2004-04-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of adeno-associated virus in insect cells
ATE490307T1 (de) 2003-05-21 2010-12-15 Genzyme Corp Verfahren zur herstellung von präparationen rekombinanter aav-virionen, die weitgehend frei von leeren capsiden sind
EP2623605B1 (en) 2007-04-09 2018-11-28 University of Florida Research Foundation, Inc. RAAV vector compositions having tyrosine-modified capsid proteins and methods for use
WO2009105690A2 (en) 2008-02-21 2009-08-27 Targeted Genetics Corporation Devices and methods for delivering polynucleotides into retinal cells of the macula and fovea
SG10201403290SA (en) 2009-06-16 2014-10-30 Genzyme Corp Improved methods for purification of recombinant aav vectors
EP2826860B1 (en) 2010-04-23 2018-08-22 University of Massachusetts CNS targeting AAV vectors and methods of use thereof
WO2012109570A1 (en) * 2011-02-10 2012-08-16 The University Of North Carolina At Chapel Hill Viral vectors with modified transduction profiles and methods of making and using the same
GB201403684D0 (en) * 2014-03-03 2014-04-16 King S College London Vector
US10982228B2 (en) 2014-05-02 2021-04-20 Genzyme Corporation AAV vectors for retinal and CNS gene therapy
CN107073051B (zh) * 2014-10-21 2021-08-24 马萨诸塞大学 重组aav变体及其用途
JP7021191B2 (ja) 2016-08-15 2022-02-16 ジェンザイム・コーポレーション Ａａｖを検出するための方法
JP7226801B2 (ja) * 2016-08-16 2023-02-21 ザ ユニバーシティ オブ ノース カロライナ アット チャペル ヒル 標的遺伝子導入のための方法および組成物
JP2021522840A (ja) * 2018-05-15 2021-09-02 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 改善された遺伝子送達特性を示すウイルスベクター

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