JP2024516128A - 眼での導入遺伝子発現のための組成物および方法 - Google Patents

眼での導入遺伝子発現のための組成物および方法 Download PDF

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Abstract

生物製剤をコードする非天然起源の核酸配列を含む組成物および方法が本明細書で提供される。また、提供される組成物および方法を、さまざまな疾患および状態の予防および処置のための眼治療薬として利用する方法も提供される。【選択図】図１

Description

相互参照
[0001]本出願は、２０２１年４月９日に出願された米国仮特許出願第６３／１７３，２８０号の利益を主張するものであり、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
[0002]本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２２年４月８日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、５９５６１－７０３＿６０１＿ＳＬ．ｔｘｔという名前で、サイズは１５９，００２バイトである。
[0003]アフリベルセプト（ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ）は、血管内皮増殖因子サブタイプＡ（ＶＥＧＦ－Ａ）、ＶＥＧＦ－Ｂ、および胎盤増殖因子（ＰＩＧＦ）のデコイ受容体として作用する組換え融合タンパク質である。アフリベルセプトは、これらのリガンドに結合することにより、これらのリガンドが血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）であるＶＥＧＦＲ－１およびＶＥＧＦＲ－２に結合するのを妨げること、血管新生を抑制すること、および血管透過性を低下させることができる。アフリベルセプトは、ＶＥＧＦＲ－１のドメイン２およびＶＥＧＦＲ－２のドメイン３がＩｇＧ１のＦｃ断片と融合されたものである。アフリベルセプトは、ＥＹＬＥＡ（登録商標）（アフリベルセプト）の商品名で市販されており、これはアフリベルセプト融合タンパク質の眼科用硝子体内注射剤である。
[0004]アフリベルセプトを使用する現在の処置は、持続期間が短く、血管新生を抑制するために月１回の注射を繰り返すという問題がある。ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐをコードする配列を保有するＡＡＶベクターを使用したいくつかの遺伝子療法試験が、血管新生の長期処置に関して行われている。しかし、これらの試験は、薬剤の発現レベルが低く、それ故に処置の有効性が低いという問題を抱えている。したがって、この技術の完全な能力は、ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐおよび他の抗血管新生剤の送達および発現の改善のために修飾が行われた後にのみ実現されることが、ますます明らかになってきている。
[0005]一部の態様では、抗血管新生剤を含む生物製剤をコードする配列を含む単離された非天然起源の核酸が、本明細書に記載され、前記配列は、コード領域における修飾を欠くこと以外の点では同等な配列と比較して配列のコード領域における修飾を含み、前記修飾は、少なくとも４個の非ＡＧＧアルギニンコドンのＡＧＧによる置き換えを含む。一部の実施形態では、抗血管新生剤をコードする配列は、第２の修飾をさらに含む。一部の実施形態では、第２の修飾は、配列のコード領域の少なくとも１個のコドン内にあり、かつ、第２の修飾は、（ａ）少なくとも１個の非ＣＣＣプロリンコドンのＣＣＣによる置き換え、（ｂ）少なくとも１個の非ＴＣＣセリンコドンのＴＣＣによる置き換え、（ｃ）少なくとも１個の非ＣＣＧプロリンコドンのＣＣＧによる置き換え、および（ｄ）（ａ）～（ｃ）の任意の組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、第２の修飾は（ａ）を含む。一部の実施形態では、少なくとも１個の非ＣＣＣプロリンコドンはＣＣＴである。一部の実施形態では、第２の修飾は（ｂ）を含む。一部の実施形態では、少なくとも１個の非ＴＣＣセリンコドンはＡＧＣである。一部の実施形態では、第２の修飾は（ｃ）を含む。一部の実施形態では、少なくとも１個の非ＣＣＧプロリンコドンはＣＣＣである。一部の実施形態では、第２の修飾は（ｄ）を含む。一部の実施形態では、（ａ）の少なくとも１個の非ＣＣＣプロリンコドンはＣＣＴであり、（ｂ）の少なくとも１個の非ＴＣＣセリンコドンはＡＧＣであり、かつ、（ｃ）の少なくとも１個の非ＣＣＧプロリンコドンはＣＣＣである。一部の実施形態では、抗血管新生剤は、ＶＥＧＦ阻害剤、マルチチロシンキナーゼ阻害剤、受容体チロシンキナーゼ阻害剤、Ａｋｔリン酸化の阻害剤、ＰＤＧＦ－１阻害剤、ＰＤＧＦ－２阻害剤、ＮＰ－１阻害剤、ＮＰ－２阻害剤、Ｄｅｌ １阻害剤、およびインテグリン阻害剤からなる群から選択される。一部の実施形態では、抗血管新生剤はＶＥＧＦ阻害剤を含み、ＶＥＧＦ阻害剤は非抗体阻害剤である。一部の実施形態では、非抗体阻害剤は、ヒトＶＥＧＦ受容体１および２を含む融合タンパク質である。一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐまたはその修飾バージョンを含む。一部の実施形態では、単離された非天然起源の核酸は、シグナルペプチドをさらに含む。一部の実施形態では、シグナルペプチドは、ヒト抗体重鎖（Ｖｈ）、ヒト抗体軽鎖（Ｖｌ）、およびＶＥＧＦ－Ｔｒａｐからなる群から選択される。一部の実施形態では、シグナルペプチドは、ヒト抗体重鎖由来である。一部の実施形態では、シグナルペプチドは、ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐに由来する。一部の実施形態では、単離された非天然起源の核酸は、イントロン配列をさらに含む。一部の実施形態では、イントロン配列は、ｈＣＭＶイントロンＡ、アデノウイルス三要素リーダー配列イントロン、ＳＶ４０イントロン、ハムスターＥＦ－１α遺伝子イントロン１、介在配列イントロン、ヒト成長ホルモンイントロン、およびヒトβグロビンイントロンからなる群から選択される。一部の実施形態では、イントロン配列はＳＶ４０イントロンである。一部の実施形態では、単離された非天然起源の核酸は、プロモーターさらに含む。一部の実施形態では、プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、伸長因子１α（ＥＦ１α）プロモーター、サル空胞ウイルス（ＳＶ４０）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ１）プロモーター、ユビキチンＣ（Ｕｂｃ）プロモーター、ヒトβアクチンプロモーター、ＣＡＧプロモーター、テトラサイクリン応答エレメント（ＴＲＥ）プロモーター、ＵＡＳプロモーター、アクチン５ｃ（Ａｃ５）プロモーター、ポリへドロンプロモーター、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩａ）プロモーター、ＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ１０プロモーター、ＴＥＦ１プロモーター、グリセルアルデヒド３－リン酸（ｐｈｏｓｐｈａｇｅ）デヒドロゲナーゼ（ＧＤＳ）プロモーター、ＡＤＨ１プロモーター、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、Ｕｂｉプロモーター、ヒトポリメラーゼＩＩＩ ＲＮＡ（Ｈ１）プロモーター、Ｕ６プロモーター、それらのポリアデニル化構築物、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、プロモーターはＣＭＶプロモーターである。一部の実施形態では、配列は、配列のコード領域の少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、または少なくとも１６個のコドンにおいて、非ＡＧＧアルギニンコドンをＡＧＧで置き換えるように修飾されている。一部の実施形態では、配列は、配列のコード領域のすべての非ＡＧＧアルギニンコドンをＡＧＧで置き換えるように修飾されている。一部の実施形態では、配列は、配列番号７０と比較して、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、または少なくとも１６個のコドン位置において、非ＡＧＧアルギニンコドンをＡＧＧで置き換えるように修飾されている。一部の実施形態では、配列は、配列番号７０と比較して、すべての非ＡＧＧアルギニンコドンをＡＧＧで置き換えるように修飾されている。一部の実施形態では、非ＡＧＧアルギニンコドンは、ＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、またはＡＧＡを含む。一部の実施形態では、非ＡＧＧアルギニンコドンはＡＧＡである。一部の実施形態では、配列は、配列のコード領域の少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、または少なくとも１６個のコドンにおいて、ＡＧＡをＡＧＧで置き換えるように修飾されている。一部の実施形態では、配列は、配列のコード領域のすべてのＡＧＡをＡＧＧで置き換えるように修飾されている。一部の実施形態では、配列は、配列番号７０と比較して、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、または少なくとも１６個のコドン位置において、ＡＧＡをＡＧＧで置き換えるように修飾されている。一部の実施形態では、配列は、配列番号７０と比較して、すべてのＡＧＡをＡＧＧで置き換えるように修飾されている。一部の実施形態では、配列は、配列のコード領域の少なくとも３個、少なくとも６個、少なくとも９個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも１８個、少なくとも２１個、少なくとも２４個、少なくとも２７個、少なくとも２９個、または少なくとも３０個のコドンにおいて、非ＣＣＣプロリンコドンをＣＣＣで置き換えるように修飾されている。一部の実施形態では、配列は、配列のコード領域のすべての非ＣＣＣプロリンコドンをＣＣＣで置き換えるように修飾されている。一部の実施形態では、配列は、配列番号７０と比較して、少なくとも３個、少なくとも６個、少なくとも９個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも１８個、少なくとも２１個、少なくとも２４個、少なくとも２７個、少なくとも２９個、または最大で３０個のコドン位置において、非ＣＣＣプロリンコドンをＣＣＣで置き換えるように修飾されている。一部の実施形態では、配列は、配列番号７０と比較して、すべての非ＣＣＣプロリンコドンをＣＣＣで置き換えるように修飾されている。一部の実施形態では、非ＣＣＣプロリンコドンはＣＣＴまたはＣＣＡを含む。一部の実施形態では、非ＣＣＣプロリンコドンはＣＣＴである。一部の実施形態では、配列は、配列のコード領域の少なくとも３個、少なくとも６個、少なくとも９個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも１８個、少なくとも２１個、少なくとも２４個、少なくとも２７個、少なくとも２９個、または少なくとも３０個のコドンにおいて、ＣＣＴをＣＣＣで置き換えるように修飾されている。一部の実施形態では、配列は、配列のコード領域のすべてのＣＣＴをＣＣＣで置き換えるように修飾されている。一部の実施形態では、配列は、配列番号７０と比較して、少なくとも３個、少なくとも６個、少なくとも９個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも１８個、少なくとも２１個、少なくとも２４個、少なくとも２７個、少なくとも２９個、または少なくとも３０個のコドン位置において、ＣＣＴをＣＣＣで置き換えるように修飾されている。一部の実施形態では、配列は、配列番号７０と比較して、すべてのＣＣＴをＣＣＣで置き換えるように修飾されている。一部の実施形態では、配列は、配列のコード領域の少なくとも３個、少なくとも６個、少なくとも９個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも１８個、少なくとも２１個、少なくとも２４個、少なくとも２７個、少なくとも３０個、少なくとも３３個、または少なくとも３６個のコドンにおいて、非ＴＣＣセリンコドンをＴＣＣで置き換えるように修飾されている。一部の実施形態では、配列は、配列のコード領域のすべての非ＴＣＣセリンコドンをＴＣＣで置き換えるように修飾されている。一部の実施形態では、配列は、配列番号７０と比較して、少なくとも３個、少なくとも６個、少なくとも９個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも１８個、少なくとも２１個、少なくとも２４個、少なくとも２７個、少なくとも３０個、少なくとも３３個、または少なくとも３６個のコドン位置において、非ＴＣＣセリンコドンをＴＣＣで置き換えるように修飾されている。一部の実施形態では、配列は、配列番号７０と比較して、すべての非ＴＣＣセリンコドンをＴＣＣで置き換えるように修飾されている。一部の実施形態では、非ＴＣＣセリンコドンは、ＴＣＴ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧＴ、またはＡＧＣを含む。一部の実施形態では、非ＴＣＣセリンコドンはＡＧＣである。一部の実施形態では、配列は、配列のコード領域の少なくとも３個、少なくとも６個、少なくとも９個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも１８個、少なくとも２１個、少なくとも２４個、少なくとも２７個、少なくとも３０個、少なくとも３３個、または少なくとも３６個のコドンにおいて、ＡＧＣをＴＣＣで置き換えるように修飾されている。一部の実施形態では、配列は、配列のコード領域のすべてのＡＧＣをＴＣＣで置き換えるように修飾されている。一部の実施形態では、配列は、配列番号７０と比較して、少なくとも３個、少なくとも６個、少なくとも９個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも１８個、少なくとも２１個、少なくとも２４個、少なくとも２７個、少なくとも３０個、少なくとも３３個、または少なくとも３６個のコドン位置において、ＡＧＣをＴＣＣで置き換えるように修飾されている。一部の実施形態では、配列は、配列番号７０と比較して、すべてのＡＧＣをＴＣＣで置き換えるように修飾されている。一部の実施形態では、配列は、配列のコード領域の少なくとも３個、少なくとも６個、少なくとも９個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも１８個、少なくとも２１個、少なくとも２４個、少なくとも２７個、または少なくとも３０個のコドンにおいて、非ＣＣＧプロリンコドンをＣＣＧで置き換えるように修飾されている。一部の実施形態では、配列は、配列のコード領域のすべての非ＣＣＧプロリンコドンをＣＣＧで置き換えるように修飾されている。一部の実施形態では、配列は、配列番号７０と比較して、少なくとも３個、少なくとも６個、少なくとも９個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも１８個、少なくとも２１個、
少なくとも２４個、少なくとも２７個、少なくとも３０個のコドン位置において、非ＣＣＧプロリンコドンをＣＣＧで置き換えるように修飾されている。一部の実施形態では、配列は、配列番号７０と比較して、すべての非ＣＣＧプロリンコドンをＣＣＧで置き換えるように修飾されている。一部の実施形態では、非ＣＣＧプロリンコドンはＣＣＣまたはＣＣＡを含む。一部の実施形態では、非ＣＣＧプロリンコドンはＣＣＣである。一部の実施形態では、配列は、配列のコード領域の少なくとも３個、少なくとも６個、少なくとも９個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも１８個、少なくとも２１個、少なくとも２４個、少なくとも２７個、または少なくとも３０個のコドンにおいて、ＣＣＣをＣＣＧで置き換えるように修飾されている。一部の実施形態では、配列は、配列のコード領域のすべてのＣＣＣをＣＣＧで置き換えるように修飾されている。一部の実施形態では、配列は、配列番号７０と比較して、少なくとも３個、少なくとも６個、少なくとも９個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも１８個、少なくとも２１個、少なくとも２４個、少なくとも２７個、または少なくとも３０個のコドン位置において、ＣＣＣをＣＣＧで置き換えるように修飾されている。一部の実施形態では、配列は、配列番号７０と比較して、すべてのＣＣＣをＣＣＧで置き換えるように修飾されている。一部の実施形態では、核酸はウイルスベクター配列を含む。一部の実施形態では、ウイルスベクター配列はｓｃＡＡＶベクター配列である。一部の実施形態では、ＡＡＶベクター配列は、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、またはそれらの任意の組合せのものである。一部の実施形態では、ＡＡＶベクター配列は、ＡＡＶ２血清型のものである。一部の実施形態では、ウイルスベクター配列は、少なくとも２種のＡＡＶ血清型の配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも２種の血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１１、およびＡＡＶ１２から選択される。一部の実施形態では、単離された非天然起源の核酸は、配列番号１３～１９、２１～２７、３１、６２、６４、６６、または６８のうちのいずれか１つと少なくとも約６０％の配列同一性または類似性を含む。一部の実施形態では、配列同一性は、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％から、最大で約１００％である。一部の実施形態では、単離された非天然起源の核酸は、配列番号３１に対して約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、および最大で約１００％の配列同一性を含む。一部の実施形態では、単離された非天然起源の核酸は、配列番号３１の核酸配列を含む。一部の実施形態では、単離された非天然起源の核酸は、配列番号３１の核酸配列からなる。一部の実施形態では、単離された非天然起源の核酸は、配列番号６６に対して約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、および最大で約１００％の配列同一性を含む。一部の実施形態では、単離された非天然起源の核酸は、配列番号６６の核酸配列を含む。一部の実施形態では、単離された非天然起源の核酸は、配列番号６６の核酸配列からなる。一部の実施形態では、ウイルスベクター配列は一本鎖である。一部の実施形態では、ウイルスベクター配列は二本鎖である。一部の実施形態では、単離された非天然起源の核酸は一本鎖である。一部の実施形態では、単離された非天然起源の核酸は二本鎖である。一部の実施形態では、単離された非天然起源の核酸は、複数の細胞と接触した時に、同等な複数の細胞における修飾を欠くこと以外の点では同等な配列を欠くこと以外の点では同等な単離された非天然起源の核酸と比較して、複数の細胞においてトランスフェクション後または形質導入後の生物製剤の発現を増加させる。一部の実施形態では、増加した発現は、酵素結合免疫測定（ＥＬＩＳＡ）アッセイによる決定で、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２００倍、または少なくとも５００倍への増加を含む。
[0006]一部の態様では、配列番号１３～１９、２１～２７、３１、６２、６４、６６、または６８の核酸配列のうちのいずれか１つと少なくとも約６０％の配列同一性または類似性を含む単離された非天然起源の核酸が、本明細書に記載される。一部の実施形態では、単離された非天然起源の核酸は、配列番号３１の核酸配列を含む。一部の実施形態では、単離された非天然起源の核酸は、配列番号６６の核酸配列を含む。
[0007]一部の態様では、本明細書に記載の単離された非天然起源の核酸によってコードされる生物製剤が、本明細書に記載される。一部の実施形態では、生物製剤は、配列番号１２と少なくとも約６０％の配列同一性を含む。一部の実施形態では、配列同一性は、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％から、最大で約１００％である。
[0008]一部の態様では、本明細書に記載の単離された非天然起源の核酸を含む操作された細胞が、本明細書に記載される。
[0009]一部の態様では、本明細書に記載の単離された非天然起源の核酸を含む複数のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子が、本明細書に記載される。
[0010]一部の態様では、単位剤形中に本明細書に記載の複数のＡＡＶ粒子を含む組成物が、本明細書に記載される。一部の実施形態では、組成物は凍結保存されている。
[0011]一部の態様では、本明細書に記載の単離された非天然起源の核酸、本明細書に記載の生物製剤、本明細書に記載の操作された細胞、または本明細書に記載の複数のＡＡＶ粒子を含む容器が、本明細書に記載される。
[0012]一部の態様では、細胞を修飾する方法であって、（ａ）複数の細胞を、請求項１～８８のいずれか一項に記載の単離された非天然起源の核酸と接触させるステップ、（ｂ）複数の細胞を、請求項９３に記載の複数のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子と接触させるステップ、または（ｃ）（ａ）および（ｂ）の両方のステップを含む方法が、本明細書に記載される。
[0013]一部の態様では、本明細書に記載の単離された非天然起源の核酸、本明細書に記載の生物製剤、または本明細書に記載の複数のＡＡＶ粒子を含む医薬組成物が、本明細書に記載される。一部の実施形態では、医薬組成物は、眼の疾患または状態の処置用である。一部の実施形態では、眼の疾患または状態は、色覚異常、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、緑内障、バルデ・ビードル症候群、ベスト病、全脈絡膜萎縮、レーバー先天性黒内障、黄斑変性、ポリープ状脈絡膜血管症（ＰＣＶ）、網膜色素変性、レフサム病、スタルガルト病、アッシャー症候群、Ｘ連鎖性網膜分離症（ＸＬＲＳ）、桿体－錐体ジストロフィー、錐体－桿体ジストロフィー、小口病、レバンチン病（家族性優性ドルーゼン）、および青錐体一色型色覚異常からなる群から選択される。一部の実施形態では、眼の疾患または状態はＡＭＤである。
[0014]一部の態様では、疾患または状態の処置を必要とする対象において疾患または状態を処置する方法であって、本明細書に記載の医薬組成物の有効量を対象に投与し、それによって疾患を処置するステップを含む方法が、本明細書に記載される。
[0015]一部の態様では、疾患または状態の処置を必要とする対象において疾患または状態を処置するための方法であって、抗血管新生剤を含む生物製剤をコードする配列を含む単離された非天然起源の核酸を含む医薬組成物の治療有効量を投与するステップを含み、配列が、コード領域における修飾を欠くこと以外の点では同等な配列と比較して、配列のコード領域の少なくとも４個のコドンにおいて、非ＡＧＧアルギニンコドンをＡＧＧで置き換えるように修飾されており、それによって、疾患または状態の処置を必要とする対象において疾患または状態を処置する方法が、本明細書に記載される。
[0016]一部の態様では、疾患または状態の処置を必要とする対象において疾患または状態を処置するための方法であって、抗血管新生剤を含む生物製剤をコードする配列を含む単離された非天然起源の核酸を含む医薬組成物の治療有効量を投与するステップを含み、配列が、コード領域における修飾を欠くこと以外の点では同等な配列と比較して、配列のコード領域の少なくとも４個のコドンにおいて、非ＡＧＧアルギニンコドンをＡＧＧで置き換えるように修飾されており、修飾が、疾患または状態の処置を必要とする対象において、修飾を欠くこと以外の点では同等な単離された非天然起源の核酸を投与されたこと以外の点では同等な対象と比較して、生物製剤のレベルを増加させるのに有効である、方法が、本明細書に記載される。一部の実施形態では、対象における生物製剤の増加したレベルは、診断アッセイによる決定で、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２００倍、または少なくとも５００倍への増加である。一部の実施形態では、抗血管新生剤をコードする配列は、第２の修飾をさらに含む。一部の実施形態では、第２の修飾は、配列のコード領域の少なくとも１つのコドン内にあり、かつ、第２の修飾は、（ａ）少なくとも１個の非ＣＣＣプロリンコドンのＣＣＣによる置き換え、（ｂ）少なくとも１個の非ＴＣＣセリンコドンのＴＣＣによる置き換え、（ｃ）少なくとも１個の非ＣＣＧプロリンコドンのＣＣＧによる置き換え、および（ｄ）（ａ）～（ｃ）の任意の組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、第２の修飾は（ａ）を含む。一部の実施形態では、第２の修飾は（ｂ）を含む。一部の実施形態では、第２の修飾は（ｃ）を含む。一部の実施形態では、第２の修飾は（ｄ）を含む。
[0017]一部の態様では、疾患または状態の処置を必要とする対象において疾患または状態を処置するための方法であって、抗血管新生剤を含む生物製剤をコードする配列を含む単離された非天然起源の核酸を含む医薬組成物の治療有効量を投与するステップを含み、配列が、コード領域における修飾を欠くこと以外の点では同等な配列と比較して、配列のコード領域の少なくとも４個のコドンにおいて、ＡＧＡをＡＧＧで置き換えるように修飾されており、それによって、疾患または状態の処置を必要とする対象において疾患または状態を処置する方法が、本明細書に記載される。
[0018]一部の態様では、疾患または状態の処置を必要とする対象において疾患または状態を処置するための方法であって、抗血管新生剤を含む生物製剤をコードする配列を含む単離された非天然起源の核酸を含む医薬組成物の治療有効量を投与するステップを含み、配列が、コード領域における修飾を欠くこと以外の点では同等な配列と比較して、配列のコード領域の少なくとも４個のコドンにおいて、ＡＧＡをＡＧＧで置き換えるように修飾されており、修飾が、生物製剤のレベルの増加を必要とする対象において、修飾を欠くこと以外の点では同等な単離された非天然起源の核酸を投与されたこと以外の点では同等な対象と比較して、生物製剤のレベルを増加させるのに有効である、方法が、本明細書に記載される。一部の実施形態では、対象における生物製剤の増加したレベルは、診断アッセイによる決定で、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２００倍、または少なくとも５００倍への増加である。一部の実施形態では、抗血管新生剤をコードする配列は、第２の修飾をさらに含む。一部の実施形態では、第２の修飾は、配列のコード領域の少なくとも１つのコドン内にあり、かつ、第２の修飾は、（ａ）ＣＣＴがＣＣＣに、（ｂ）ＡＧＣがＴＣＣに、（ｃ）ＣＣＣがＣＣＧに、および（ｄ）（ａ）～（ｃ）の任意の組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、第２の修飾は（ａ）を含む。一部の実施形態では、第２の修飾は（ｂ）を含む。一部の実施形態では、第２の修飾は（ｃ）を含む。一部の実施形態では、第２の修飾は（ｄ）を含む。一部の実施形態では、抗血管新生剤は、ＶＥＧＦ阻害剤、マルチチロシンキナーゼ阻害剤、受容体チロシンキナーゼ阻害剤、またはＡｋｔリン酸化の阻害剤を含む。一部の実施形態では、抗血管新生剤はＶＥＧＦ阻害剤を含む。一部の実施形態では、ＶＥＧＦ阻害剤は非抗体阻害剤である。一部の実施形態では、非抗体阻害剤は、ヒトＶＥＧＦ受容体１および２を含む融合タンパク質を含み、融合タンパク質は、ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐまたはその修飾バージョンを含む。一部の実施形態では、単離された非天然起源の核酸は、配列番号１３～１９、２１～２７、３１、６２、６４、６６、または６８のうちのいずれか１つと少なくとも約６０％の配列同一性または類似性を含む。一部の実施形態では、配列同一性は、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％から、最大で約１００％である。一部の実施形態では、単離された非天然起源の核酸は、配列番号３１に対して約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、および最大で約１００％の配列同一性を含む。一部の実施形態では、単離された非天然起源の核酸は、配列番号３１の核酸配列を含む。一部の実施形態では、単離された非天然起源の核酸は、配列番号３１の核酸配列からなる。一部の実施形態では、単離された非天然起源の核酸は、配列番号６６に対して約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、および最大で約１００％の配列同一性を含む。一部の実施形態では、単離された非天然起源の核酸は、配列番号６６の核酸配列を含む。一部の実施形態では、単離された非天然起源の核酸は、配列番号６６の核酸配列からなる。一部の実施形態では、核酸はウイルスベクター配列を含む。一部の実施形態では、ウイルスベクター配列はｓｃＡＡＶベクター配列である。一部の実施形態では、ＡＡＶベクター配列は、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、またはそれらの任意の組合せのものである。一部の実施形態では、ＡＡＶベクター配列は、ＡＡＶ２血清型のものである。一部の実施形態では、投与は、硝子体内注射、網膜下注射、微量注入、または眼球上注射を介する。一部の実施形態では、投与は、硝子体内注射を介する。一部の実施形態では、眼の疾患または状態は、色覚異常、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、緑内障、バルデ・ビードル症候群、ベスト病、全脈絡膜萎縮、レーバー先天性黒内障、黄斑変性、ポリープ状脈絡膜血管症（ＰＣＶ）、網膜色素変性、レフサム病、スタルガルト病、アッシャー症候群、Ｘ連鎖性網膜分離症（ＸＬＲＳ）、桿体－錐体ジストロフィー、錐体－桿体ジストロフィー、小口病、レバンチン病（家族性優性ドルーゼン）、および青錐体一色型色覚異常からなる群から選択される。一部の実施形態では、眼の疾患または状態はＡＭＤである。一部の実施形態では、ＡＭＤは滲出型ＡＭＤである。一部の実施形態では、ＡＭＤは萎縮型ＡＭＤ（ｄｒｙ ＡＭＤ）である。一部の実施形態では、投与は、疾患もしくは状態の少なくとも症状を軽減するか、疾患もしくは状態を処置するか、および／または疾患もしくは状態を消失させるのに十分である。一部の実施形態では、投与は、約１．０×１０９ｖｇ、約１．０×１０１０ｖｇ、約１．０×１０１１ｖｇ、約３．０×１０１１ｖｇ、約６×１０１１ｖｇ、約８．０×１０１１ｖｇ、約１．０×１０１２ｖｇ、約１．０×１０１３ｖｇ、約１．０×１０１４ｖｇ、または約１．０×１０１５ｖｇの投与量の単離された非天然起源の核酸を送達するステップを含む。一部の実施形態では、投与は反復される。一部の実施形態では、投与は、１日２回、２日に１回、週２回、月２回、月３回、月１回、２か月に１回、年２回、年１回、または２年に１回行われる。一部の実施形態では、投与の前に、対象は遺伝子検査を受ける。一部の実施形態では、遺伝子検査は、他の点では同等な野生型配列と比較して、遺伝子配列における変異を検出する。一部の実施形態では、本方法は、二次療法を施すステップをさらに含む。一部の実施形態では、二次療法は、光線力学的療法（ＰＤＴ）、抗炎症剤、抗微生物剤、およびレーザー光凝固療法（ＬＰＴ）のうちの少なくとも１つを含む。
[0019]抗血管新生剤を含み得る生物製剤をコードする配列を含み得る単離された非天然起源の核酸が、本明細書に開示される。一部の実施形態では、配列は、コード領域における修飾を欠くこと以外の点では同等な配列と比較して、配列のコード領域の少なくとも１つのコドンにおいて、ＡＧＡをＡＧＧで置き換えるように修飾され得る。一部の実施形態では、抗血管新生剤をコードする配列は、第２の修飾をさらに含み得る。一部の実施形態では、第２の修飾は、配列のコード領域の少なくとも１つのコドン内にあることができる。一部の実施形態では、第２の修飾は、ａ）ＣＣＴからＣＣＣに、ｂ）ＡＧＣからＴＣＣに、ｃ）ＣＣＣからＣＣＧに、またはｄ）これらのいずれかの組合せを含む群から選択され得る。一部の実施形態では、第２の修飾は、ＣＣＴからＣＣＣにを含み得る。一部の実施形態では、第２の修飾は、ＡＧＣからＴＣＣにを含み得る。一部の実施形態では、第２の修飾は、ＣＣＣからＣＣＧにを含み得る。一部の実施形態では、第２の修飾は、ＣＣＴからＣＣＣに、ＡＧＣからＴＣＣに、またはＣＣＣからＣＣＧにの組合せを含み得る。一部の実施形態では、抗血管新生剤は、ＶＥＧＦ阻害剤、マルチチロシンキナーゼ阻害剤、受容体チロシンキナーゼ阻害剤、Ａｋｔリン酸化の阻害剤、ＰＤＧＦ－１阻害剤、ＰＤＧＦ－２阻害剤、ＮＰ－１阻害剤、ＮＰ－２阻害剤、Ｄｅｌ １阻害剤、またはインテグリン阻害剤を含み得る。一部の実施形態では、抗血管新生剤は、ＶＥＧＦ阻害剤を含み得、ＶＥＧＦ阻害剤は非抗体阻害剤であり得る。一部の実施形態では、非抗体阻害剤は、ヒトＶＥＧＦ受容体１および２を含み得る融合タンパク質であり得る。一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐまたはその修飾バージョンを含み得る。一部の実施形態では、単離された非天然起源の核酸は、シグナルペプチドをさらに含み得る。一部の実施形態では、シグナルペプチドは、ヒト抗体重鎖（Ｖｈ）、ヒト抗体軽鎖（Ｖｌ）、およびＶＥＧＦ－Ｔｒａｐからなる群から選択され得る。一部の実施形態では、シグナルペプチドは、ヒト抗体重鎖由来であり得る。一部の実施形態では、シグナルペプチドは、ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ由来であり得る。一部の実施形態では、単離された非天然起源の核酸は、イントロン配列をさらに含み得る。一部の実施形態では、イントロン配列は、ＣＭＶイントロンＡ、アデノウイルス三要素リーダー配列イントロン、ＳＶ４０イントロン、ハムスターＥＦ－１α遺伝子イントロン１、介在配列イントロン、ヒト成長ホルモンイントロン、およびヒトβグロビンイントロンからなる群から選択され得る。一部の実施形態では、イントロン配列はＳＶ４０イントロンであり得る。一部の実施形態では、単離された非天然起源の核酸は、プロモーターをさらに含み得る。一部の実施形態では、プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、伸長因子１α（ＥＦ１α）プロモーター、サル空胞ウイルス（ＳＶ４０）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ１）プロモーター、ユビキチンＣ（Ｕｂｃ）プロモーター、ヒトβアクチンプロモーター、ＣＡＧプロモーター、テトラサイクリン応答エレメント（ＴＲＥ）プロモーター、ＵＡＳプロモーター、アクチン５ｃ（Ａｃ５）プロモーター、ポリへドロンプロモーター、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩａ）プロモーター、ＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ１０プロモーター、ＴＥＦ１プロモーター、グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＳ）プロモーター、ＡＤＨ１プロモーター、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、Ｕｂｉプロモーター、ヒトポリメラーゼＩＩＩ ＲＮＡ（Ｈ１）プロモーター、Ｕ６プロモーター、それらのポリアデニル化構築物、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択され得る。一部の実施形態では、プロモーターはＣＭＶプロモーターであり得る。一部の実施形態では、配列は、配列のコード領域の少なくとも２個、少なくとも４個、少なくとも６個、少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１６個、少なくとも１８個、または最大で２０個のコドンにおいて、ＡＧＡをＡＧＧで置き換えるように修飾され得る。一部の実施形態では、配列は、配列のコード領域の１６個のコドンにおいて、ＡＧＡをＡＧＧで置き換えるように修飾され得る。
[0020]一部の実施形態では、配列は、配列番号２８と比較して位置：Ｘ１～Ｘ１６で、ＡＧＡをＡＧＧで置き換えるように修飾され得る。一部の実施形態では、配列は、配列のコード領域の少なくとも３個、少なくとも６個、少なくとも９個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも１８個、少なくとも２１個、少なくとも２４個、少なくとも２７個、少なくとも２９個、または最大で３０個のコドンにおいて、ＣＣＴをＣＣＣで置き換えるように修飾され得る。一部の実施形態では、配列は、配列のコード領域の３０個のコドンにおいて、ＣＣＴをＣＣＣで置き換えるように修飾され得る。一部の実施形態では、配列は、配列番号２８と比較して位置：Ｘ１～Ｘ３０で、ＣＣＴをＣＣＣで置き換えるように修飾され得る。一部の実施形態では、配列は、配列のコード領域の少なくとも３個、少なくとも６個、少なくとも９個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも１８個、少なくとも２１個、少なくとも２４個、少なくとも２７個、少なくとも３０個、少なくとも３３個、または最大で３６個のコドンにおいて、ＡＧＣをＴＣＣで置き換えるように修飾され得る。一部の実施形態では、配列は、配列のコード領域の３６個のコドンにおいて、ＡＧＣをＴＣＣで置き換えるように修飾され得る。一部の実施形態では、配列は、配列番号２８と比較して位置：Ｘ１～Ｘ３６で、ＡＧＣをＴＣＣで置き換えるように修飾され得る。一部の実施形態では、配列は、配列のコード領域の少なくとも３個、少なくとも６個、少なくとも９個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも１８個、少なくとも２１個、少なくとも２４個、少なくとも２７個、少なくとも２９個、または最大で３０個のコドンにおいて、ＣＣＣをＣＣＧで置き換えるように修飾され得る。一部の実施形態では、配列は、配列のコード領域の２９個のコドンにおいて、ＣＣＣをＣＣＧで置き換えるように修飾され得る。一部の実施形態では、配列は、配列番号２８と比較して位置：Ｘ１～Ｘ２９で、ＣＣＣをＣＣＧで置き換えるように修飾され得る。一部の実施形態では、核酸は、ウイルスベクター配列を含み得る。一部の実施形態では、ウイルスベクター配列は、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ベクター配列であり得る。一部の実施形態では、ＡＡＶベクター配列は、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、またはそれらの任意の組合せのものであり得る。一部の実施形態では、ＡＡＶベクター配列は、ＡＡＶ２血清型のものであり得る。一部の実施形態では、ウイルスベクター配列は、少なくとも２種のＡＡＶ血清型の配列を含み得る。一部の実施形態では、少なくとも２種の血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１１、およびＡＡＶ１２から選択され得る。一部の実施形態では、単離された非天然起源の核酸は、配列番号１３～配列番号１９のうちのいずれか１つと少なくとも６０％の配列同一性または類似性を有する配列を含み得る。一部の実施形態では、配列同一性は、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％から、および最大で約１００％であり得る。一部の実施形態では、単離された非天然起源の核酸は、複数の細胞と接触した時に、同等な複数の細胞における修飾を欠くこと以外の点では同等な配列を欠き得ること以外の点では同等な単離された非天然起源の核酸と比較して、複数の細胞においてトランスフェクション後または形質導入後の生物製剤の発現を増加させ得る。一部の実施形態では、増加した発現は、酵素結合免疫測定（ＥＬＩＳＡ）アッセイによる決定で、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２００倍、または少なくとも５００倍への増加を含み得る。
[0021]配列番号１３～配列番号１９または配列番号２１～配列番号２７の核酸配列のうちのいずれか１つと少なくとも６０％の配列同一性または類似性を含み得る、単離された非天然起源の核酸も、本明細書に記載される。一部の実施形態では、生物製剤は、単離された非天然起源の核酸によってコードされ得る。一部の実施形態では、生物製剤は、配列番号１２と少なくとも６０％の配列同一性を含み得る。一部の実施形態では、配列同一性は、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％から、および最大で約１００％であり得る。
[0022]本明細書に記載の単離された非天然起源の核酸を含む操作された細胞も、本明細書に記載される。
[0023]操作された細胞から単離され得る複数のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子も、本明細書に記載される。
[0024]単位剤形中にＡＡＶ粒子を含み得る組成物も、本明細書に記載される。一部の実施形態では、組成物は凍結保存され得る。
[0025]ａ）単離された非天然起源の核酸、ｂ）生物製剤、ｃ）操作された細胞、またはｄ）複数のＡＡＶ粒子を含み得る容器も、本明細書に記載される。
[0026]ａ）複数の細胞を、単離された非天然起源の核酸と接触させるステップ、および／またはｂ）複数の細胞を、複数のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子と接触させるステップを含み得る、細胞を修飾する方法も、本明細書に記載される。
[0027]ａ）単離された非天然起源の核酸、ｂ）生物製剤、またはｃ）複数のＡＡＶ粒子を含み得る医薬組成物も、本明細書に記載される。一部の実施形態では、医薬品は、眼の疾患または状態の処置用であり得る。一部の実施形態では、眼の疾患または状態は、色覚異常、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、緑内障、バルデ・ビードル症候群、ベスト病、全脈絡膜萎縮、レーバー先天性黒内障、黄斑変性、ポリープ状脈絡膜血管症（ＰＣＶ）、網膜色素変性、レフサム病、スタルガルト病、アッシャー症候群、Ｘ連鎖性網膜分離症（ＸＬＲＳ）、桿体－錐体ジストロフィー、錐体－桿体ジストロフィー、小口病、レバンチン病（家族性優性ドルーゼン）、および青錐体一色型色覚異常からなる群から選択され得る。一部の実施形態では、眼の疾患または状態はＡＭＤであり得る。
[0028]疾患または状態の処置を必要とする対象において疾患または状態を処置する方法であって、医薬組成物の有効量を対象に投与し、それによって疾患を処置するステップを含み得る方法も、本明細書に記載される。
[0029]疾患または状態の処置を必要とする対象において疾患または状態を処置するための方法も、本明細書に記載される。一部の実施形態では、方法は、抗血管新生剤を含み得る生物製剤をコードする配列を含み得る単離された非天然起源の核酸を含み得る医薬組成物の治療有効量を投与するステップを含み得る。一部の実施形態では、配列は、コード領域における修飾を欠くこと以外の点では同等な配列と比較して、配列のコード領域の少なくとも１つのコドンにおいて、ＡＧＡをＡＧＧで置き換えるように修飾され得る。一部の実施形態では、方法は、疾患または状態の処置を必要とする対象において、疾患または状態を処置し得る。
[0030]疾患または状態の処置を必要とする対象において疾患または状態を処置するための方法も、本明細書に記載される。一部の実施形態では、方法は、抗血管新生剤を含み得る生物製剤をコードする配列を含み得る単離された非天然起源の核酸を含み得る医薬組成物の治療有効量を投与するステップを含み得る。一部の実施形態では、配列は、コード領域における修飾を欠くこと以外の点では同等な配列と比較して、配列のコード領域の少なくとも１つのコドンにおいて、ＡＧＡをＡＧＧで置き換えるように修飾され得る。一部の実施形態では、修飾は、生物製剤のレベルの増加を必要とする対象において、修飾を欠くこと以外の点では同等な単離された非天然起源の核酸を投与されたこと以外の点では同等な対象と比較して、生物製剤のレベルを増加させるのに有効であり得る。一部の実施形態では、対象における生物製剤の増加したレベルは、診断アッセイによる決定で、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２００倍、または少なくとも５００倍への増加であり得る。一部の実施形態では、抗血管新生剤をコードし得る配列は、第２の修飾をさらに含み得る。一部の実施形態では、第２の修飾は、配列のコード領域の少なくとも１つのコドン内にあることができる。一部の実施形態では、第２の修飾は、ａ）ＣＣＴからＣＣＣに、ｂ）ＡＧＣからＴＣＣに、ｃ）ＣＣＣからＣＣＧに、またはｄ）これらのいずれかの組合せを含む群から選択され得る。一部の実施形態では、第２の修飾は、ＣＣＴからＣＣＣにを含み得る。一部の実施形態では、第２の修飾は、ＡＧＣからＴＣＣにを含み得る。一部の実施形態では、第２の修飾は、ＣＣＣからＣＣＧにを含み得る。一部の実施形態では、第２の修飾は、ＣＣＴからＣＣＣに、ＡＧＣからＴＣＣに、またはＣＣＣからＣＣＧにの任意の組合せを含み得る。一部の実施形態では、抗血管新生剤は、ＶＥＧＦ阻害剤、マルチチロシンキナーゼ阻害剤、受容体チロシンキナーゼ阻害剤、またはＡｋｔリン酸化の阻害剤を含み得る。一部の実施形態では、抗血管新生剤はＶＥＧＦ阻害剤を含み得る。一部の実施形態では、抗血管新生剤はＶＥＧＦ阻害剤を含み得る。一部の実施形態では、ＶＥＧＦ阻害剤は非抗体阻害剤であり得る。一部の実施形態では、非抗体阻害剤は、ヒトＶＥＧＦ受容体１および２を含み得る融合タンパク質を含み得る。一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐまたはその修飾バージョンを含み得る。一部の実施形態では、単離された非天然起源の核酸は、配列番号１３～配列番号１９または配列番号２１～配列番号２７のうちのいずれか１つと少なくとも６０％の配列同一性または類似性を含み得る。一部の実施形態では、配列同一性は、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％から、および最大で約１００％であり得る。一部の実施形態では、核酸はウイルスベクター配列を含み得る。一部の実施形態では、ウイルスベクター配列はｓｃＡＡＶベクター配列であり得る。一部の実施形態では、ＡＡＶベクター配列は、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、またはそれらの任意の組合せのものであり得る。一部の実施形態では、ＡＡＶベクター配列は、ＡＡＶ２血清型のものであり得る。一部の実施形態では、投与は、硝子体内注射、網膜下注射、微量注入、または眼球上注射を介し得る。一部の実施形態では、投与は硝子体内注射を介し得る。一部の実施形態では、眼の疾患または状態は、色覚異常、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、緑内障、バルデ・ビードル症候群、ベスト病、全脈絡膜萎縮、レーバー先天性黒内障、黄斑変性、ポリープ状脈絡膜血管症（ＰＣＶ）、網膜色素変性、レフサム病、スタルガルト病、アッシャー症候群、Ｘ連鎖性網膜分離症（ＸＬＲＳ）、桿体－錐体ジストロフィー、錐体－桿体ジストロフィー、小口病、レバンチン病（家族性優性ドルーゼン）、および青錐体一色型色覚異常からなる群から選択され得る。一部の実施形態では、眼の疾患または状態はＡＭＤであり得る。
[0031]一部の実施形態では、ＡＭＤは滲出型ＡＭＤであり得る。一部の実施形態では、ＡＭＤは萎縮型ＡＭＤであり得る。一部の実施形態では、投与は、疾患もしくは状態の少なくとも症状を軽減するか、疾患もしくは状態を処置するか、および／または疾患もしくは状態を消失させるのに十分であり得る。一部の実施形態では、投与は、約１．０×１０９ｖｇ、約１．０×１０１０ｖｇ、約１．０×１０１１ｖｇ、約３．０×１０１１ｖｇ、約６×１０１１ｖｇ、約８．０×１０１１ｖｇ、約１．０×１０１２ｖｇ、約１．０×１０１３ｖｇ、約１．０×１０１４ｖｇ、または約１．０×１０１５ｖｇの投与量の単離された非天然起源の核酸を送達するステップを含み得る。一部の実施形態では、投与は反復され得る。一部の実施形態では、投与は、１日２回、２日に１回、週２回、月２回、月３回、月１回、２か月に１回、年２回、年１回、または２年に１回行われ得る。一部の実施形態では、投与の前に、対象は遺伝子検査を受けることができる。一部の実施形態では、遺伝子検査は、他の点では同等な野生型配列と比較して、遺伝子配列における変異を検出することができる。一部の実施形態では、方法は、二次療法を施すステップをさらに含み得る。一部の実施形態では、二次療法は、光線力学的療法（ＰＤＴ）、抗炎症剤、抗微生物剤、またはレーザー光凝固療法（ＬＰＴ）のうちの少なくとも１つを含み得る。
参照による組込み
[0032]本明細書中で言及されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願が、参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されている場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
[0033]本発明の新規な特徴は、特に添付の特許請求の範囲に示される。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を示す以下の詳細な説明、およびその添付の図面を参照することによって得られるであろう。
[0034]図１は、ＣＭＶエンハンサー／プロモーター、ＳＶ４０イントロン（ＩＮＴ）、Ｋｏｚａｋ配列（Ｋ）、元の（Ａｆ）またはヒトＩｇＧ１重鎖（Ｖｈ）シグナルペプチド（Ｓｉｇ）、コード配列、および合成ポリアデニリル化シグナル（ｐＡ）を保有し、全長ＡＡＶ２ ＩＴＲ（Ｆ－ＩＴＲ）および切断型ＡＡＶ２ ＩＴＲ（ｄ－ＩＴＲ）によって挟まれたｓｃＡＡＶ構築物を示す。ＡＭＩ０５９、ＡＭＩ０６６、ＡＭＩ０６７、ＡＭＩ０６８、ＡＭＩ１１９、ＡＭＩ１２０、およびＡＭＩ１３０は、異なるシグナルペプチドを有する異なるＶＥＧＦ－Ｔｒａｐコード配列を示す。ＡＭＩ０５９は、Ａｆシグナルペプチドおよび低ＧＣ含量のコード配列を有する。ＡＭＩ０６６は、Ｖｈシグナルペプチドおよび低ＧＣ含量のコード配列を有する。ＡＭＩ０６７は、Ａｆシグナルペプチドおよび高ＧＣ含量のコード配列を有する。ＡＭＩ０６８は、Ｖｈシグナルペプチドおよび高ＧＣ含量のコード配列を有する。ＡＭＩ１１９は、Ａｆシグナルペプチド、ならびにＡＧＡからＡＧＧへの１６個のＡｒｇコドン変化およびＣＣＣからＣＣＴへの２９個のＰｒｏコドン変化を含有する高ＧＣ含量のコード配列を有する。ＡＭＩ１２０は、Ａｆシグナルペプチド、ならびにＡＧＡからＡＧＧへの１６個のＡｒｇコドン変化およびＡＧＣからＴＣＣへの３６個のＳｅｒコドン変化を含有する高ＧＣ含量のコード配列を有する。ＡＭＩ１３０は、Ａｆシグナルペプチド、ならびにＡＧＡからＡＧＧへの１６個のＡｒｇコドン変化およびＣＣＣからＣＣＧへの２９個のＰｒｏコドン変化を含有する高ＧＣ含量のコード配列を有する。 [0035]図２は、プラスミドＤＮＡがトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞におけるＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ発現のウェスタンブロット分析を示す。レーン１～５は非還元ゲル上に示され、レーン６～１０は還元ゲル上に示されており、レーン１および６にはプラスミドＡＭＩ０５９がトランスフェクトされた細胞からの上清をロードし、レーン２および７にはプラスミドＡＭＩ０６６がトランスフェクトされた細胞からの上清をロードし、レーン３および８にはプラスミドＡＭＩ０６７がトランスフェクトされた細胞からの上清をロードし、レーン４、５、９および１０にはプラスミドＡＭＩ０６８がトランスフェクトされた細胞からの上清をロードした。 [0036]図３Ａおよび３Ｂは、Ｓｆ９細胞における低ＧＣおよび高ＧＣのＡＡＶベクター産生のＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＳｉｍｐｌｙ Ｂｌｕｅ染色分析を示す。両方の図において、Ｍはサイズマーカーをロードしたレーンを示し、サイズはキロダルトンで示される。図３Ａにおいて、レーン１は対照としてロードしたＡＡＶ５ベクターを示し、レーン２、３、４および５はそれぞれＡＭＩ０５９、ＡＭＩ０６６、ＡＭＩ０６７、およびＡＭＩ０６８を示す。図３Ｂにおいて、レーン１は対照としてロードしたＡＡＶ２ベクターを示し、レーン２、３、４および４はそれぞれＡＭＩ１１９、ＡＭＩ１２０、およびＡＭＩ１３０を示す。 [0037]図４Ａおよび４Ｂは、ｓｃＡＡＶ２バリアント（ＡＡＶ２．Ｎ５３）ベクター（ＡＭＩ０５９、ＡＭＩ０６６、ＡＭＩ０６７、ＡＭＩ０６８、ＡＭＩ１２０、ＡＭＩ１１９、ＡＭＩ０６７、およびＡＭＩ１３０）による形質導入を受けたＨＥＫ２９３細胞におけるＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ発現のウェスタンブロット分析を示す。ＡＡＶ２バリアントが形質導入されたＨＥＫ２９３細胞からの上清２０マイクロリットルを、各レーンにロードした。図４Ａにおいて、レーン１、２、３および４はそれぞれＡＭＩ０５９、ＡＭＩ０６６、ＡＭＩ０６７、およびＡＭＩ０６８を示す。図４Ｂにおいて、レーン１、２、３および４はそれぞれＡＭＩ１２０、ＡＭＩ１１９、ＡＭＩ０６７、およびＡＭＩ１３０を示す。 [0038]図５Ａは、ｓｃＡＡＶ２－ＡＭＩ０６７が形質導入されたＨＥＫ２９３細胞の上清から精製されたＶＥＧＦ－ＴｒａｐのＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＳｉｍｐｌｙ Ｂｌｕｅ染色分析を示す。市販のアフリベルセプト（Ａ）を対照として使用した。Ｍはサイズマーカーをロードしたレーンを示し、サイズはキロダルトンで示される。１．５μｇ／レーンの精製タンパク質を、Ｖと表示したレーンにロードした。 [0039]図５Ｂおよび図５Ｃは、ＡＡＶ２．Ｎ５４．１２０（ＡＶＭＸ－１１０）由来のＶＥＧＦ－ＴｒａｐのＶＥＧＦ－Ａ１６５への結合親和性を図示する。 図５Ｂおよび図５Ｃは、ＡＡＶ２．Ｎ５４．１２０（ＡＶＭＸ－１１０）由来のＶＥＧＦ－ＴｒａｐのＶＥＧＦ－Ａ１６５への結合親和性を図示する。 [0040]図６は、ＡＭＩ０６８－ｐＦＢ－ｓｃＣＭＶ－ＳＶ４０－イントロン－ｋｏｚａｋ－Ｖｈ－ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ－ＧＣのアミノ酸配列（配列番号６１）および核酸配列（配列番号６２）を示す。太字はヒト抗体重鎖シグナルペプチドを示す。 [0041]図７は、ＡＭＩ１１９－ｐＦＢ－ｓｃＣＭＶ－ＳＶ４０－イントロン－ｋｏｚａｋ－Ａｆ－ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ－ＧＣＲＰ（ＣＣＴ）のアミノ酸配列（配列番号６３）および核酸配列（配列番号６４）を示す。太字はＶＥＧＦ－Ｔｒａｐシグナルペプチドを示し、下線部はＡＧＡからＡＧＧへの１６個の変化を示し、斜体はＣＣＣからＣＣＴへの３０個の変化を示す。 [0042]図８は、ＡＭＩ１２０－ｐＦＢ－ｓｃＣＭＶ－ＳＶ４０－イントロン－ｋｏｚａｋ－Ａｆ－ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ－ＧＣＲＳ（ＴＣＣ）のアミノ酸配列（配列番号６５）および核酸配列（配列番号６６）を示す。太字はＶＥＧＦ－Ｔｒａｐシグナルペプチドを示し、下線部はＡＧＡからＡＧＧへの１６個の変化を示し、斜体はＡＧＣからＴＣＣへの３６個の変化を示す。 [0043]図９は、ＡＭＩ１３０－ｐＦＢ－ｓｃＣＭＶ－ＳＶ４０－イントロン－ｋｏｚａｋ－Ａｆ－ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ－ＧＣＲＰ（ＣＣＧ）のアミノ酸配列（配列番号６７）および核酸配列（配列番号６８）を示す。太字はＶＥＧＦ－Ｔｒａｐシグナルペプチドを示し、下線部はＡＧＡからＡＧＧへの１６個の変化を示し、斜体はＣＣＣからＣＣＧへの２９個の変化を示す。 [0044]図１０Ａは、ＡＶＭＸ－１１０ ＤＮＡおよびタンパク質濃度の測定を図示する。 [0045]図１０Ｂは、ＨＥＫ９３細胞培養物におけるＡＡＶ２．ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ発現レベルの経時的実験を示す。 [0046]図１１は、ＨＥＫ２９３細胞（上のパネル）およびヒト網膜細胞（ＡＲＰＥ－１９、下のパネル）におけるＡＡＶ２．Ｎ５３－ＶＥＧＦ－ＴｒａｐおよびＡＡＶ２．Ｎ５４－ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ発現の持続性を示す。 [0047]図１２は、ＡＡＶ２．０５４－ＡＭＩ１２０由来のＶＥＧＦ－Ｔｒａｐが、還元または非還元ゲル（還元ゲル：ＰＮＧアーゼＦによる処理ありまたは処理なし。非還元ゲル：ＰＮＧアーゼＦによる処理ありまたは処理なし）上でアフリベルセプトと同様にグリコシル化されたことを示す。レーン１および３はＡＡＶ２－ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐを示し、レーン２は市販のアフリベルセプトを表す。ＰＮＧアーゼＦ処理レーンにおける複数のバンドは、脱グリコシル化が完全ではなかったことを示す。 [0048]図１３は、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイによって検出されたＡＡＶ２．０５４－ＡＭＩ１２０由来のＶＥＧＦ－ＴｒａｐのヒトＶＥＧＦ－Ａ１６５への結合親和性を示す。 [0049]図１４は、ベクターにより発現させたＶＥＧＦ－ＴｒａｐのｒｈＶＥＧＦ－Ａ１６５への結合親和性を示す。 [0050]図１５は、ＨＵＶＥＣ細胞増殖の阻害におけるベクター由来のＶＥＧＦ－ＴｒａｐとＶＥＧＦ－Ｔｒａｐとの比較を示す。 [0051]図１６は、実施例１１における眼底造影前の第７日のＧＦＰ眼底画像を図示する。 [0052]図１７は、実施例１１における第７日のフルオレセイン眼底造影を図示する。各群からの代表的画像が示される。 [0053]図１８は、レーザー処置後の第７日のフルオレセイン漏出の定量化を、平均（上）および個々の値（下）としてプロットしたものを図示する。＊はｐ＝０．０１１３を表し、＊＊＊はｐ＝０．０００２を表す。 [0054]図１９は、レーザー処置後の第７日のフラットマウントからの代表的な病変画像を図示する。 [0055]図２０は、レーザー処置後の第７日のフラットマウント病変面積の定量化を、平均（上）および個々の値（下）としてプロットしたものを図示する。 [0056]図２１は、実施例１２における眼底画像を図示する。 [0057]図２２は、実施例１２において選択された構築物が投与されたマウス眼のＩＨＣ画像を図示する。 [0058]図２３は、試験のために第２４日に実施された選択されたＡＡＶ構築物を投与されたマウス眼の眼底画像を図示する。 [0059]図２４は、実施例１２において選択された構築物を投与されたブタ眼のＩＨＣ画像を図示する。 [0060]図２５は、注射後の第２４日に行われた、選択された構築物を投与されたブタ眼の眼底画像を図示する。 [0061]図２６は、ブタ試験の第２８日の免疫組織化学画像を図示する。 [0062]図２７は、ＡＭＩ０５４およびＶ２２６のカプシド浸透性を比較した共焦点顕微鏡画像を図示する。 [0063]図２８Ａは、ＡＶＭＸ－１１０／１１６に関するＡＡＶ構築物の詳細を図示する。 [0064]図２８Ｂは、単一の鋭い画分（矢印）によって示されるような、本明細書に記載のベクター（ＡＶＭＸ－１１０）の製造を示す例示的なクロマトグラムを図示する。 [0065]図２８Ｃは、ＡＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３の発現を示す例示的なＳＤＳ－ＰＡＧＥを図示する。 [0066]図２８Ｄは、分離カラムプロセスにおける空のＡＡＶと充填ＡＡＶの保持の違いを図示する。 [0067]図２８Ｅは、精製されたＡＶＭＸ－１１０に関する空のカプシドの分離を図示する。 [0068]図２８Ｆは、マウス抗ＡＡＶ２抗体により検出された例示的なＳＤＳ－ＰＡＧＥを図示する。レーン１および２における試料はＣｓＣｌ精製ＡＶＭＸ－１１０ｌであり、レーン３および４は２Ｌ振盪物からの試料であり、５～８は２Ｌバイオリアクターからの試料であり、レーン９および１０はレーン当たり１０μＬおよび２０μＬの最終精製原薬であった。ＡＡＶ２特異的抗体反応によるウェスタンブロットは、ＡＶＭＸ－１１０がＡＡＶ２特異的血清型であることを実証している。 [0069]図２８Ｇは、１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離されたＡＶＭＸ－１１０の例示的な銀染色画像を図示する。レーン１および５：捕捉溶出液の試料。レーン２および６：空。レーン３および７：カラムクロマトグラフィーのピーク２からの非還元試料。ＡＶＭＸ－１１０プロセス中間体の純度を、銀染色ゲルにより染色したＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。ＡＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３は明瞭に可視化され、４％を上回る単一の不純物は見出されなかった。 [0070]図２９は、種々の試験群からのフルオレセンス眼底造影（ＦＡ）データの代表的画像、および有効性を示す棒グラフを図示する。統計分析：一元配置ＡＮＯＶＡおよびその後のＴｕｋｅｙの多重比較（＊＝０．０３３２；＊＊＊＝０．０００２）。 [0071]図３０は、種々の血清型におけるアフリベルセプト発現に関するインビトロの細胞ベースのアッセイを図示する。 [0072]図３１は、種々のＡＡＶ血清型に関するＦＡデータを図示する。Δアフリベルセプトは、タンパク質を産生しないシャムベクターであった。統計は、一元配置ＡＮＯＶＡおよびその後のＤｕｎｎｅｔの多重比較によって行った（＊＝０．０３３２；＊＊＝０．００２１；＊＊＊＝０．０００２）。 [0073]図３２は、眼試料および血清試料におけるアフリベルセプト発現を定量化するためのＥＬＩＳＡを図示する。統計は、一元配置ＡＮＯＶＡおよびその後のＤｕｎｎｅｔの多重比較を使用して行った（＊＊＊＝０．０００２；＊＊＊＊≦０．０００１）。 [0074]図３３は、種々のＡＡＶ６．Ｎ５４－アフリベルセプトベクターによるマウスＣＮＶ試験に関するＦＡデータを図示する。 [0075]図３４は、ＩＨＣ画像を使用したＡＡＶ１、ＡＡＶ２およびＡＡＶ６－ＧＦＰ発現の比較を図示する。 [0076]図３５は、ブタの眼に注射された種々の血清型におけるＧＦＰの発現の比較を図示する。 [0077]図３６は、野生型（ｗｔ）ＡＡＶ２およびＮ５４－ＡＡＶ２のインビトロでの比較を図示する。 [0078]図３７Ａは、種々のロットのＮ５４－ＧＦＰによる形質導入を受けたＨＥＫ２９３細胞におけるＧＦＰ発現の比較を図示する。 [0079]図３７Ｂは、種々のロットのＮ５４－ＧＦＰによる形質導入を受けたＨＥＫ２９３におけるＧＦＰ発現を図示する。 [0080]図３８Ａは、ＦＡ測定の比較および統計分析を図示する。 [0081]図３８Ｂは、実施例１３におけるＦＡの代表的画像を図示する。矢印はレーザー（ｌｅａｓｅｒ）病変（気泡）を示す。 [0082]図３９Ａは、血清試料におけるＶＥＧＦ－Ｔｒａｐレベルの比較を図示する。 [0083]図３９Ｂは、眼試料におけるＶＥＧＦ－Ｔｒａｐレベルの比較を図示する。 [0084]図４０Ａは、ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ発現と病変面積との相関を図示する。 [0085]図４０Ｂは、眼試料におけるＡＡＶ２カプシドタンパク質レベルの比較を図示する。 [0086]図４１Ａは、シャムベクター対照により処置した動物および処置しなかった動物におけるアフリベルセプトの発現が同程度であったことを図示する。ＡＡＶ６．Ｎ５４－アフリベルセプトが注射された第３群の動物では、約２．３ｐｇ／眼ホモジネートｍｇのアフリベルセプトが測定された（図４１Ａ）。ＡＡＶ２およびＡＡＶ６．Ｎ５４－アフリベルセプトに関する中間範囲レベルは、それぞれ約８．８および約２５ｐｇ／眼ホモジネートｍｇのアフリベルセプトを有し、ＡＡＶ６で処置された動物では発現が３倍に増加した。高用量ＡＡＶ６で処置された動物では、アフリベルセプトのレベルが最も高く、約４００ｐｇ／眼ホモジネートｍｇのアフリベルセプトであった。血清試料は、眼組織試料と同様の傾向であった。第１群（シャム）、第２群（ＡＡＶ２－アフリベルセプト）および第３群（ＡＡＶ６－低用量）は、検出可能なアフリベルセプトを有しなかった。中用量および高用量のＡＡＶ６－アフリベルセプトで処置された動物では、血清中に２～３ｎｇ／ｍＬのアフリベルセプトが認められた（図４１Ｂ）。データは、一元配置ＡＮＯＶＡおよびその後にＤｕｎｎｅｔｔの多重比較を使用して、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアで解析した（＊＊＝０．００５および＊＊＊＊≦０．０００１）。 [0087]図４２は、第０日の眼底画像（第６群～第８群）からの代表的画像を図示する。 [0088]図４３は、第７日のフルオレセイン眼底造影からの代表的画像を図示する。 [0089]図４４は、第７日の平均フルオレセイン漏出の定量化を図示する。 [0090]図４５は、イソレクチン病変領域の代表的画像を図示する。 [0091]図４６は、イソレクチン面積の測定値を図示する。 [0092]図４７は、第０日のＩＨＣの代表的画像を図示する（第６群～第８群のみ）。 [0093]図４８Ａは、用量反応試験（実施例１４）から得られた画像のフラットマウント分析を図示する。 [0094]図４８Ｂは、用量反応試験（実施例１４）から得られた画像のＦＡ分析を図示する。 [0095]図４９Ａは、レーザーにより引き起こされた病変面積およびＡＶＭＸ－１１０線量反応曲線を図示する。 [0096]図４９Ｂは、ＡＶＭＸ－１１０投薬試験からの画像のＦＡ分析を図示する。 [0097]図５０は、マウスＬＣＮＶモデルにおけるＡＶＭＸ－１１０の蛍光眼底造影画像を図示する。 [0098]図５１Ａは、動物（１群当たりｎ＝６）の血清中のＶＥＧＦ－Ｔｒａｐレベルを図示する。 [0099]図５１Ｂは、網膜組織におけるＶＥＧＦ－Ｔｒａｐレベルも、ＥＬＩＳＡを使用して網膜ホモジネート中で測定したことを図示する。網膜組織懸濁液において、ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐの発現は、硝子体内注射したＡＶＭＸ－１１０に対して用量依存的な様式であった。１．６ｅ１０ｖｇ／眼の高用量群では、平均１３ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ－Ｔｒａｐが検出された。最高発現レベルは４０ｎｇ／ｍＬ超に達した。
[0100]眼療法に使用するための組成物および方法が、本明細書で提供される。一態様では、単離された非天然起源の核酸が、本明細書で提供される。核酸は、さまざまな眼の疾患および状態の眼療法に使用するための組成物中に利用され得る。一部の場合には、核酸は、修飾されていないこと以外の点では同等な核酸を上回る特定の利点を付与する１つまたは複数の修飾を含み得る。
[0101]一態様では、生物製剤をコードする単離された非天然起源の核酸が、本明細書で提供される。生物製剤には、広範囲にわたる製品、例えば、ワクチン、血液および血液成分、アレルギー誘発物質、細胞、遺伝子療法薬、組織、および組換え治療用タンパク質が含まれる。生物製剤は、糖、タンパク質、核酸、もしくはこれらの物質の複雑な組合せから構成され得、または生きた実体、例えば、細胞および組織であってもよい。生物製剤は、種々の天然供給源（例えば、ヒト、動物、微生物）から単離され、さまざまな方法を使用して生産することができる。遺伝子ベースおよび細胞ベースの生物製剤は、例えば、往々にして生物医学研究の最前線にあり、他の処置が利用可能でない種々の医学的状態を処置するために使用することができる。
[0102]本明細書に開示される生物製剤は、抗血管新生剤を含み得る。血管新生は、新たな血管の形成および／または既存の脈管構造の維持を指す。このプロセスは、血管の内壁を覆う内皮細胞の移動、増殖、および／または分化を含む。血管新生のプロセスは、少なくとも一部には、体内の化学シグナルによって調節される。これらのシグナルのいくつか、例えば、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、正常内皮細胞の表面にある受容体に結合する。ＶＥＧＦおよび他の内皮増殖因子が内皮細胞上の受容体に結合すると、これらの細胞内で新たな血管の成長および生存を促進するシグナルが開始される。他の化学シグナル、例えば、抗血管新生剤は、血管形成を妨害することができる。通常、これらのシグナルの血管新生刺激作用および血管新生阻害作用は均衡しており、その結果、血管は、必要な時に必要な場所でのみ、例えば、成長および治癒の間に形成される。疾患またはさまざまな状態の場合、これらのシグナルは不均衡になり、異常な状態または疾患につながる可能性のある血管成長の増加または異常を引き起こす可能性がある。例えば、異常な血管新生は、滲出型加齢黄斑変性の一因である。
[0103]抗血管新生剤は、血管形成を減少または消失させることができる。抗血管新生剤は、血管新生を減少または消失させることができる。抗血管新生剤はまた、既存の脈管構造を減少または消失させることもできる。血管新生阻害剤は、血管成長におけるさまざまな段階をいくつかの方法で妨害する。そのいくつかは、ＶＥＧＦおよび／または他の抗血管新生剤を特異的に認識してそれらに結合するモノクローナル抗体などの生物製剤である。例えば、ＶＥＧＦがこれらの薬剤に結合すると、ＶＥＧＦ受容体を活性化することができなくなる。他の抗血管新生剤は、ＶＥＧＦおよび／またはその受容体、ならびに内皮細胞表面の他の受容体、または下流シグナル伝達経路における他のタンパク質に結合して、それらの活性を遮断する。いくつかの抗血管新生剤は、抗血管新生特性も有する免疫調節薬（例えば、免疫系を刺激するかまたは抑制する薬剤）である。
[0104]一実施形態では、抗血管新生剤は、ＶＥＧＦシグナル伝達経路の構成要素に結合する。ＶＥＧＦシグナル伝達経路の構成要素には、ＰＬＣ、ＶＲＡＰ、Ｓｃｋ、Ｓｒｃ、ＰＩ３Ｋ、ＰＩＰ３、Ａｋｔ、Ｂａｄ、カスパーゼ、ｅＮＯＳ、ＦＡＫ、パキシリン、Ｃｄｃ４２、ｐ３８ ＭＡＰＫ、Ｈｓｐ２７、ＧＲＢ２、ＳＯＳ、ＳＨＣ、Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＭＥＫ１／２、ＥＲＫ１／２、ＰＫＣ、ｃＰＬＡ２、ＰＧＩ２、ＩＰ３、およびこれらの組合せが含まれるが、これらに限定されない。
[0105]一実施形態では、生物製剤は、タンパク質、ペプチド、アプタマーなどの高分子、ならびに／またはアンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ＲＮＡｉおよび／もしくはｓｉＲＮＡなどの非翻訳ＲＮＡから選択される。
[0106]本明細書で提供される生物製剤は、抗血管新生剤を含み得る。一部の場合には、生物製剤はタンパク質またはポリペプチドである。一部の場合には、生物製剤はポリペプチドを含む。ポリペプチドは、眼細胞、例えば、桿体もしくは錐体視細胞、網膜神経節細胞、ミュラー細胞、双極細胞、アマクリン細胞、水平細胞、および／または網膜色素上皮細胞の１つまたは複数の機能を強化および／または低下させることができる。
[0107]例示的なクラスのポリペプチドには、神経保護ポリペプチド（例えば、ＧＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＮＴ４、ＮＧＦ、およびＮＴＮ）、抗血管新生ポリペプチド（例えば、可溶性血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体、ＶＥＧＦ結合抗体、ＶＥＧＦ結合抗体断片（例えば、単鎖抗ＶＥＧＦ抗体）、エンドスタチン、タムスタチン、アンジオスタチン、可溶性Ｆｌｔポリペプチド（Ｌａｉら（２００５）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１２：６５９ページ）、可溶性Ｆｌｔポリペプチドを含むＦｃ融合タンパク質（例えば、Ｐｅｃｈａｎら（２００９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１６：１０ページを参照）、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）、可溶性Ｔｉｅ－２受容体など）、メタロプロテイナーゼ－３の組織阻害剤（ＴＩＭＰ－３）、光応答性オプシン、例えば、ロドプシン、抗アポトーシスポリペプチド（例えば、Ｂｃｌ－２、Ｂｃｌ－Ｘ１）などが含まれるが、これらに限定されない。例示的なポリペプチドには、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、線維芽細胞増殖因子２、ニュールツリン（ＮＴＮ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン－４（ＮＴ４）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ、上皮増殖因子、ロドプシン、Ｘ連鎖アポトーシス阻害因子、およびソニックヘッジホッグが含まれるが、これらに限定されない。
[0108]一部の場合には、ポリペプチドは、レチノシシン、網膜色素変性ＧＴＰアーゼ調節因子（ＲＧＰＲ）相互作用タンパク質－１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｑ９６ＫＮ７、Ｑ９ＥＰＱ２、およびＱ９ＧＬＭ３、ペリフェリン－２（Ｐｒｐｈ２）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００３１３、ペリフェリン、網膜色素上皮特異的タンパク質（ＲＰＥ６５）、（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ ＡＡＣ３９６６０、およびＭｏｒｉｍｕｒａら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：３０８８ページを参照）、欠損または欠失した場合に全脈絡膜萎縮を引き起こすポリペプチドであるＣＨＭ（全脈絡膜萎縮（ｃｈｏｒｏｉｄｅｒｍｉａ）、（Ｒａｂエスコートタンパク質１））（例えば、Ｄｏｎｎｅｌｌｙら（１９９４）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．３：１０１７ページ、およびｖａｎ Ｂｏｋｈｏｖｅｎら（１９９４）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．３：１０４１ページを参照）、および欠損または欠失した場合にレーバー先天性黒内障および網膜色素変性を引き起こすポリペプチドであるＣｒｕｍｂｓホモログ１（ＣＲＢ１）（例えば、ｄｅｎ Ｈｏｌｌａｎｄｅｒら（１９９９）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２３：２１７ページ、およびＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＡＭ２３３２８を参照）を含み得る。好適なポリペプチドにはまた、欠損または欠失した場合に色覚異常を引き起こすポリペプチドが含まれ、そのようなポリペプチドには、例えば、錐体光受容器ｃＧＭＰ感受性チャネルサブユニットα（ＣＮＧＡ３）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１２８９、およびＢｏｏｉｊら（２０１１）Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ １１８：１６０～１６７ページを参照）、錐体光受容器ｃＧＭＰ感受性カチオンチャネルβサブユニット（ＣＮＧＢ３）（例えば、Ｋｏｈｌら（２００５）Ｅｕｒ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．１３（３）：３０２ページを参照）、グアニンヌクレオチド結合タンパク質（Ｇタンパク質）、α形質導入活性ポリペプチド２（ＧＮＡＴ２）（ＡＣＨＭ４）、およびＡＣＨＭ５、ならびに欠損または欠失した場合にさまざまな形態の色覚異常を引き起こすポリペプチドが含まれる。
[0109]一部の場合には、生物製剤は、遺伝子機能の部位特異的ノックダウンまたはノックアウトをもたらす部位特異的エンドヌクレアーゼをコードするタンパク質またはポリペプチドを含み、例えば、このエンドヌクレアーゼは、網膜疾患に関連するアレルをノックアウトする。例えば、顕性アレルが、野生型の場合に網膜構造タンパク質である、および／または正常な網膜機能をもたらす遺伝子の欠損コピーをコードする場合、部位特異的エンドヌクレアーゼを欠損アレルに標的化して、欠損アレルをノックアウトすることができる。欠損アレルをノックアウトすることに加えて、部位特異的ヌクレアーゼを使用して、欠損アレルによってコードされるタンパク質の機能的コピーをコードするドナーＤＮＡとの相同組換えを刺激することもできる。したがって、非天然起源の核酸を使用して、欠損アレルをノックアウトする部位特異的エンドヌクレアーゼを送達することができ、さらに欠損アレルの機能的コピーを送達して、欠損アレルの修復をもたらし、それによって機能的網膜タンパク質（例えば、機能的レチノシシン、機能的ＲＰＥ６５、機能的ペリフェリンなど）の産生をもたらすことができる。例えば、Ｌｉら（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ ４７５：２１７ページを参照。一部の実施形態では、非天然起源の核酸は、部位特異的エンドヌクレアーゼをコードする導入遺伝子、および欠損アレルの機能的コピーをコードする異種ヌクレオチド配列を含み、ここで機能的コピーは機能的網膜タンパク質をコードする。
[0110]例示的な機能的網膜タンパク質には、例えば、レチノシシン、ＲＰＥ６５、網膜色素変性ＧＴＰアーゼ調節因子（ＲＧＰＲ）相互作用タンパク質－１、ペリフェリン、ペリフェリン－２などが含まれる。使用に好適な部位特異的エンドヌクレアーゼには、例えば、ＣＲＩＳＰＲ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、および転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）が含まれ、そのような部位特異的エンドヌクレアーゼは非天然起源であり、特定の遺伝子を標的とするように修飾されている。そのような部位特異的ヌクレアーゼは、ゲノム内の特定の位置を切断するように操作することができ、続いて非相同末端結合により、いくつかのヌクレオチドを挿入したりまたは欠失させたりしながら切断部を修復することができる。そのような部位特異的エンドヌクレアーゼ（「ＩＮＤＥＬ」とも称される）は、続いてタンパク質をフレームから追い出して、遺伝子を効果的にノックアウトする。例えば、米国特許出願公開第２０１１／０３０１０７３号を参照。一部の場合には、タンパク質またはポリペプチドの生物製剤は、リポタンパク質リパーゼ、レチノイドイソメロヒドロラーゼＲＰＥ６５、または補体Ｈから選択される。一部の場合には、生物製剤は、アフリベルセプトなどの融合タンパク質などのポリペプチドである。
[0111]一態様では、生物製剤はアフリベルセプトである。アフリベルセプトは、ＶＥＧＦ Ｔｒａｐ－ｅｙｅ（ＶＴＥ）およびＥＹＬＥＡ（登録商標）としても知られており、本明細書で互換的に使用することができる。アフリベルセプトは、ヒトＶＥＧＦ受容体１および２の細胞外ドメインをヒトＩｇＧのＦｃ部分に融合させたものを含む組換え融合タンパク質である。ラニビズマブおよびベバシズマブで使用されている抗体ベースのＶＥＧＦ結合戦略とは対照的に、アフリベルセプトにはＶＥＧＦＲ－１受容体の第２の結合ドメインおよびＶＥＧＦＲ－２受容体の第３のドメインが組み込まれている。アフリベルセプトは、ネイティブ受容体よりも高い親和性でＶＥＧＦ－ＡおよびＰＤＧＦに結合する可溶性デコイ受容体として作用する。配列番号３０は、アフリベルセプトのＤＮＡコード配列（配列番号３１）と整列させたアフリベルセプトのアミノ酸配列を図示する。配列番号３１について、核酸は、Ａｆシグナルペプチド、ならびに配列番号７０と比較して、ＡＧＡからＡＧＧへの１６個のＡｒｇコドン変化およびＡＧＣからＴＣＣへの３６個のＳｅｒコドン変化を含む高ＧＣ含量のコード配列を含む。
[0112]アフリベルセプト硝子体内注射の承認用量は２．０ｍｇであり、その投薬は適応症によって異なる。アフリベルセプトは、血管新生（滲出型）加齢黄斑変性、網膜静脈閉塞症に伴う黄斑浮腫、糖尿病性黄斑浮腫、および糖尿病性網膜症の処置に適応がある。一部の場合には、本明細書で提供されるシグナルペプチドは、アフリベルセプトからのものでもよく、またはアフリベルセプトに由来するものでもよい。一実施形態では、シグナルペプチドは、アフリベルセプト由来の配列（例えば、シグナルペプチド配列）に対して約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、約９９％から、または約１００％同一であるパーセント相同性を含む。一実施形態では、シグナルペプチドは、アフリベルセプトからのヒト抗体重鎖由来である。一実施形態では、シグナルペプチドは、アフリベルセプトからのヒト抗体軽鎖由来である。
[0113]一部の場合には、生物製剤はアプタマーである。アプタマーは、ＤＮＡアプタマーまたはＲＮＡアプタマーであり得る。アプタマーは、規定の構造に折り畳まれて、タンパク質などの標的に結合するオリゴヌクレオチド（一本鎖または二本鎖）である。いくつかのタンパク質ベースの生物製剤とは異なり、アプタマーは一般に修飾された糖を（例えば、それらの２’位に）含有するため、アプタマーはタンパク質ベースの生物製剤と比較して抗体を誘発しないか、またはより少なく抗体を誘発する。さらに、Ｔｏｌｌ様受容体媒介性の自然免疫応答もまた、抑止されるかまたは減少する。アプタマー治療薬は、細胞内、細胞外、または細胞表面の標的に対して開発することができる。一部の態様では、生物製剤治療薬はアプタマーである。例示的な目的のアプタマーには、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に対するアプタマーが含まれる。例えば、Ｎｇら（２００６）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ５：１２３ページ、およびＬｅｅら（２００５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０２：１８９０２ページを参照。例えば、ＶＥＧＦアプタマーは、ヌクレオチド配列５’－ｃｇｃａａｕｃａｇｕｇａａｕｇｃｕｕａｕａｃａｕｃｃｇ－３’（配列番号６９）を含み得る。同じく使用に好適なのは、ＰＤＧＦ特異的アプタマー、例えば、Ｅ１００３０であり、例えば、ＮｉおよびＨｕｉ（２００９）Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｉｃａ ２２３：４０１ページ、ならびにＡｋｉｙａｍａら（２００６）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０７：４０７ページを参照）。例示的なアプタマーには、ペガプタニブが含まれる。ペガプタニブは、ＶＥＧＦ１６５に結合する特異的な核酸リガンドである５０ｋＤａのアプタマーである。例示的なアプタマーには、ペガプタニブまたはフォビスタが含まれるが、これらに限定されない。
[0114]一実施形態では、生物製剤は核酸である。核酸には、非翻訳ＲＮＡ、例えば、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ＲＮＡｉおよび／またはｓｉＲＮＡなどが含まれ得るが、これらに限定されない。一実施形態では、生物製剤治療薬は干渉性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）である。好適なＲＮＡｉには、細胞内のアポトーシス因子または血管新生因子のレベルを低下させることができるＲＮＡｉが含まれる。例えば、ＲＮＡｉは、細胞内でアポトーシスを誘導または促進する遺伝子産物のレベルを低下させるｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡであり得る。その遺伝子産物がアポトーシスを誘導または促進する遺伝子は、本明細書で「アポトーシス促進遺伝子」と称され、それらの遺伝子の産物（ｍＲＮＡ、タンパク質）は「アポトーシス促進遺伝子産物」と称される。アポトーシス促進遺伝子産物には、例えば、Ｂａｘ、Ｂｉｄ、Ｂａｋ、およびＢａｄ遺伝子産物が含まれる。例えば、米国特許第７，８４６，７３０号を参照。干渉性ＲＮＡはまた、血管新生産物、例えば、ＶＥＧＦ（例えば、Ｃａｎｄ５、例えば、米国特許公開第２０１１／０１４３４００号、米国特許公開第２００８／０１８８４３７号、およびＲｅｉｃｈら（２００３）Ｍｏｌ．Ｖｉｓ．９：２１０ページ）、ＶＥＧＦＲ１（例えば、Ｓｉｒｎａ－０２７、例えば、Ｋａｉｓｅｒら（２０１０）Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１５０：３３ページ、およびＳｈｅｎら（２００６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１３：２２５ページ）、またはＶＥＧＦＲ２（Ｋｏｕら（２００５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．４４：１５０６４ページ）に対するものであり得る。また、米国特許第６，６４９，５９６号、同第６，３９９，５８６号、同第５，６６１，１３５号、同第５，６３９，８７２号、および同第５，６３９，７３６号、ならびに米国特許第７，９４７，６５９号および同第７，９１９，４７３号を参照。
[0115]一部の場合には、生物製剤は、ＶＥＧＦ－Ａを標的とするｓｉＲＮＡ、例えば、ベバシラニブを含む。
[0116]一部の実施形態では、細胞型特異的または組織特異的プロモーターは、遺伝子産物が特定の細胞型または組織において選択的または優先的に産生されるように、主題治療薬をコードする導入遺伝子に動作可能に連結され得る。一部の実施形態では、誘導性プロモーターは、導入遺伝子配列に動作可能に連結され得る。一部の場合には、プロモーターは、光受容器特異的調節エレメント（例えば、光受容器特異的プロモーター）、例えば、視細胞において動作可能に連結された遺伝子の選択的発現を与える調節エレメントに動作可能に連結され得る。好適な光受容器特異的調節エレメントには、例えば、ロドプシンプロモーター、ロドプシンキナーゼプロモーター（Ｙｏｕｎｇら（２００３）Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．４４：４０７６ページ）、β－ホスホジエステラーゼ遺伝子プロモーター（Ｎｉｃｏｕｄら（２００７）Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．９：１０１５ページ）、網膜色素変性遺伝子プロモーター（Ｎｉｃｏｕｄら（２００７）上記）、光受容器間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）遺伝子エンハンサー（Ｎｉｃｏｕｄら（２００７）上記）、ＩＲＢＰ遺伝子プロモーター（Ｙｏｋｏｙａｍａら（１９９２）Ｅｘｐ Ｅｙｅ Ｒｅｓ．５５：２２５ページ）などが含まれる。
[0117]一部の実施形態では、主題修飾ＡＡＶによって送達される生物製剤は、血管新生を阻害するように作用し得る。一部の実施形態では、生物製剤は抗血管新生剤を含む。例示的な抗血管新生剤は、ＶＥＧＦ阻害剤、マルチチロシンキナーゼ阻害剤、受容体チロシンキナーゼ阻害剤、Ａｋｔリン酸化の阻害剤、ＰＤＧＦ－１阻害剤、ＰＤＧＦ－２阻害剤、ＮＰ－１阻害剤、ＮＰ－２阻害剤、Ｄｅｌ １阻害剤、および／またはインテグリン阻害剤を含み得る。一実施形態では、抗血管新生剤はＶＥＧＦ阻害剤を含む。ＶＥＧＦ阻害剤は、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ受容体を標的とすることができる。
[0118]ＶＥＧＦファミリーには、胎盤増殖因子（ＰＬＧＦ）、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－ＤおよびＶＥＧＦ－Ｅが含まれる。これらの薬剤は血管新生および血管透過性の重要な調節因子であり、特にＶＥＧＦ－Ａは、病的な眼の血管新生において重要な役割を果たす。ＶＥＧＦ－Ａ遺伝子は染色体６ｐ１２．３に局在し、８個のエキソンと８個の中間イントロンで構成される。ＶＥＧＦ－Ａには、ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１４５、ＶＥＧＦ１４８、ＶＥＧＦ１６２、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１６５ｂ、ＶＥＧＦ１８３、ＶＥＧＦ１８９およびＶＥＧＦ２０６を含む９種類のアイソフォームが存在する。これらのアイソフォームは、アミノ酸の数およびヘパリン結合親和性が互いに異なる。前述のＶＥＧＦファミリーメンバーおよび／またはそれらの受容体の任意のものを、阻害剤によって標的化することができる。
[0119]ある特定の好ましい実施形態では、主題修飾ＡＡＶによって送達される生物製剤は、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、および／またはＰＤＧＦからなる群から選択される１つまたは複数の哺乳動物ＶＥＧＦタンパク質の活性を阻害するように作用し得る。特に好ましい実施形態では、主題ＡＡＶバリアントによって送達される生物製剤は、ＶＥＧＦ－Ａの活性を阻害する。ＶＥＧＦ－Ａには、選択的スプライシングによって生成される９種類のアイソフォームがあり、その中で最も生理学的に関連性があるのはＶＥＧＦ１６５である。ＶＥＧＦ－Ａレベルは、滲出型加齢黄斑変性、糖尿病性黄斑浮腫および網膜静脈閉塞症の患者の硝子体中で上昇することが見出されている。眼におけるＶＥＧＦ－Ａの活性を阻害し、それ故に硝子体ＶＥＧＦ－Ａが増加している患者を処置するのに有効な遺伝子産物には、アフリベルセプト、ラニビズマブ、ブロルシズマブ、ベバシズマブ、および可溶性ｆｍｓ様チロシンキナーゼ１（ｓＦＬＴｌ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ０１１３４）が含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、（ｉ）本明細書に記載されるようなバリアントＡＡＶカプシドタンパク質および（ｉｉ）ＶＥＧＦ阻害剤を含む導入遺伝子を含む感染性ＡＡＶビリオンが提供される。一実施形態では、導入遺伝子は複数の配列を含み、そのそれぞれが異なるＶＥＧＦ－Ａ阻害剤をコードする。一実施形態では、抗血管新生剤はラニビズマブである。ラニビズマブは、ＶＥＧＦ－Ａのすべてのヒトアイソフォームを阻害するヒト化モノクローナル抗体Ｆａｂ断片である。一実施形態では、導入遺伝子はアフリベルセプトであり得る。
[0120]さらに別の実施形態では、本明細書で提供される単離された非天然起源の核酸は、修飾を含む。さまざまな修飾が想定され、他の点では同等な生物製剤と比較して、抗血管新生剤を含む生物製剤の導入、発現、持続性、および／または機能を改善するために使用することができる。一部の場合には、他の点では同等な生物製剤はアフリベルセプトであり得る。
[0121]一実施形態では、単離された非天然起源の核酸は、抗血管新生剤を含む生物製剤の発現の強化を付与する修飾を含む。例えば、当技術分野で公知のいくつかの生物製剤は、天然の遺伝子配列に由来し、標的細胞における導入および発現のために最適化されていない未修飾の配列を含有する。一実施形態では、単離された非天然起源の核酸は、コドン最適化されている。コドン最適化は、細胞型特異的なコドンの使用に対して特異的であり得る。種々の生物および細胞種が、同じアミノ酸に対して他のものよりも特定のコドンを使用する傾向があるバイアスを示す。いくつかの種は、特定のコドンをほぼ完全に回避することが知られている。同様に、ある細胞種は、同じアミノ酸に対して他のものよりも特定のコドンを使用する傾向があるというバイアスがある。一実施形態では、非天然起源の核酸のコドンを最適化する方法は、標的細胞における各コドンの使用に基づいて、コドン使用を再び割り当てることを含み得る。一部の場合には、標的細胞は、特定の組織または器官のものであり得る。
[0122]一部の場合には、修飾は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｒｚｅｇｏｒｚ Ｋｕｄｌａら、「Ｈｉｇｈ ｇｕａｎｉｎｅ ａｎｄ ｃｙｔｏｓｉｎｅ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｍＲＮＡ ｌｅｖｅｌｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ」、ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ ４（６）：ｅ１８０．ＤＯＩ：１０．１３７１ページ／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｂｉｏ．００４０１８０に記載されているように、配列中のグアニンおよび／またはシトシンの含量を増加させるために行われる。
[0123]一実施形態では、非天然起源の核酸配列は、少なくとも１個のコドンを、同一のアミノ酸をコードする別のコドンで置き換えるように修飾され得る。一部の場合には、コドンは、配列のコード領域内で修飾される。一部の場合には、コドンは、配列の非コード領域において修飾される。一部の場合には、コドンは、終止コドンから約１００、約５０、約２５、約１５、または約５塩基以内で修飾される。Ｅ－ＣＡＩを、Ｐｕｉｇｂｏ，Ｐ．、Ｂｒａｖｏ，Ｉ．Ｇ．およびＧａｒｃｉａ－Ｖａｌｌｖｅ，Ｓ．「Ｅ－ＣＡＩ：ａ ｎｏｖｅｌ ｓｅｒｖｅｒ ｔｏ ｅｓｔｉｍａｔｅ ａｎ ｅｘｐｅｃｔｅｄ ｖａｌｕｅ ｏｆ Ｃｏｄｏｎ Ａｄａｐｔａｔｉｏｎ Ｉｎｄｅｘ（ｅＣＡＩ）」、ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ９、６５、ｄｏｉ：１０．１１８６ページ／１４７１－２１０５－９－６５（２００８）に提供されるように利用して、コドン適応指標の値を推定することができる。
[0124]さまざまな修正が本明細書において想定される。一部の場合には、コドンは交換され得る。例えば、配列は、ＡＧＡをＡＧＧで置き換えるように修飾され得る。他の場合には、ＣＣＣはＣＣＴで置き換えられる。他の場合には、ＡＧＣはＴＣＣで置き換えられる。他の場合には、ＣＣＣはＣＣＧで置き換えられる。表１に提供される非限定的な置き換えのいずれかを適用して、核酸を修飾することができる。核酸において任意の数のコドンを交換することができる。一部の場合には、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２１個、少なくとも２２個、少なくとも２３個、少なくとも２４個、少なくとも２５個、少なくとも２６個、少なくとも２７個、少なくとも２８個、少なくとも２９個、少なくとも３０個、少なくとも３２個、少なくとも３４個、少なくとも３６個、少なくとも３８個、少なくとも４０個、少なくとも４２個、少なくとも４４個、少なくとも４６個、少なくとも４８個、または最大で５０個のコドンが置き換えられ得る。一実施形態では、非天然起源の核酸は、３個のコドン修飾を含む。一実施形態では、非天然起源の核酸は、１６個のコドン修飾を含む。一実施形態では、非天然起源の核酸は、３～５個、５～１０個、５～１５個、１０～１５個、１０～２０個、１５～２０個、１～２０個、１２～２０個、１２～２５個、１５～３０個、または１５～２５個のコドン修飾を含む。一実施形態では、非天然起源の核酸は２個のコドン修飾を含み、これはＡＧＡからＡＧＧに、および以下のうちの少なくとも１個である：ＣＣＴからＣＣＣに、ＡＧＣからＴＣＣに、またはＣＣＣからＣＣＧに。一実施形態では、非天然起源の核酸は３個のコドン修飾を含み、これはＡＧＡからＡＧＧに、および以下のうちの少なくとも２個である：ＣＣＴからＣＣＣに、ＡＧＣからＴＣＣに、またはＣＣＣからＣＣＧに。一実施形態では、非天然起源の核酸は４個のコドン修飾を含み、これはＡＧＡからＡＧＧに、ＣＣＴからＣＣＣに、ＡＧＣからＴＣＣに、およびＣＣＣからＣＣＧにである。さらなる修飾は、表１に提示されたコドン修飾のいずれかと、上記のコドンのいずれかおよび／または表１から可能なさらなる修飾のいずれかとの組合せを含み得る。一実施形態では、核酸は、ＡＧＡがＡＧＧで置き換えられ、ＣＣＴがＣＣＣで置き換えられるように修飾される。一実施形態では、核酸は、ＡＧＡがＡＧＧで置き換えられ、ＡＧＣがＴＣＣで置き換えられるように修飾される。一実施形態では、核酸は、ＡＧＡがＡＧＧで置き換えられ、ＣＣＣがＣＣＧで置き換えられるように修飾される。
[0125]一実施形態では、非天然起源の核酸配列は、配列の１６個のコドンにおいて、ＡＧＡをＡＧＧで置き換えるように修飾される。一実施形態では、非天然起源の核酸配列は、コード配列の１６個のコドンにおいて、ＡＧＡをＡＧＧで置き換えるように修飾される。一部の場合には、配列は、核酸配列のコード領域の少なくとも３個、少なくとも６個、少なくとも９個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも１８個、少なくとも２１個、少なくとも２４個、少なくとも２７個、少なくとも２９個、または最大で３０個のコドンにおいて、ＣＣＴをＣＣＣで置き換えるように修飾される。一部の場合には、配列は、配列のコード領域の少なくとも３０個のコドンにおいて、ＣＣＴをＣＣＣで置き換えるように修飾される。一部の場合には、配列は、核酸配列の領域の少なくとも３個、少なくとも６個、少なくとも９個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも１８個、少なくとも２１個、少なくとも２４個、少なくとも２７個、少なくとも３０個、少なくとも３３個、または最大で３６個のコドンにおいて、ＡＧＣをＴＣＣで置き換えるように修飾される。一部の場合には、配列は、核酸配列のコード領域の３６個のコドンにおいて、ＡＧＣをＴＣＣで置き換えるように修飾される。一部の場合には、非天然起源の核酸配列は、配列のコード領域の少なくとも３個、少なくとも６個、少なくとも９個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも１８個、少なくとも２１個、少なくとも２４個、少なくとも２７個、少なくとも２９個、または最大で３０個のコドンにおいて、ＣＣＣをＣＣＧで置き換えるように修飾される。一部の場合には、非天然起源の核酸配列は、非天然起源の核酸配列のコード領域の２９個のコドンにおいて、ＣＣＣをＣＣＧで置き換えるように修飾される。
[0126]一部の実施形態では、本明細書に記載の単離された非天然起源の核酸は、抗血管新生剤を含む生物製剤をコードする配列を含み、前記配列は、コード領域における修飾を欠くこと以外の点では同等な配列と比較して、配列のコード領域における修飾を含み、前記修飾は、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、または少なくとも４個の非ＡＧＧアルギニンコドンのＡＧＧによる置き換えを含む。一部の実施形態では、非ＡＧＧアルギニンコドンはＡＧＡである。一部の実施形態では、配列は、配列のコード領域の少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、または少なくとも１６個のコドンにおいて、非ＡＧＧアルギニンコドンをＡＧＧで置き換えるように修飾される。一部の実施形態では、配列は、配列のコード領域の１６個のコドンにおいて、非ＡＧＧアルギニンコドンをＡＧＧで置き換えるように修飾される。一部の実施形態では、配列は、配列のコード領域の１６個のコドンのいずれか１つにおいて、非ＡＧＧアルギニンコドンをＡＧＧで置き換えるように修飾される。一部の実施形態では、配列は、配列番号７０と比較して、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、または少なくとも１６個のコドン位置において、非ＡＧＧアルギニンコドンをＡＧＧで置き換えるように修飾される。一部の実施形態では、配列は、配列番号７０と比較して、１６個のコドン位置において、非ＡＧＧアルギニンコドンをＡＧＧで置き換えるように修飾される。一部の実施形態では、配列は、配列番号７０と比較して、１６個のコドン位置のいずれか１つにおいて、非ＡＧＧアルギニンコドンをＡＧＧで置き換えるように修飾される。一部の実施形態では、非ＡＧＧアルギニンコドンはＡＧＡである。一部の実施形態では、配列は、配列のコード領域の少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、または少なくとも１６個のコドンにおいて、ＡＧＡをＡＧＧで置き換えるように修飾される。一部の実施形態では、配列は、配列のコード領域の１６個のコドンにおいて、ＡＧＡをＡＧＧで置き換えるように修飾される。一部の実施形態では、配列は、配列のコード領域の１６個のコドンのいずれか１つにおいて、ＡＧＡをＡＧＧで置き換えるように修飾される。一部の実施形態では、配列は、配列番号７０と比較して、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、または少なくとも１６個のコドン位置において、ＡＧＡをＡＧＧで置き換えるように修飾される。一部の実施形態では、配列は、配列番号７０と比較して、１６個のコドン位置において、ＡＧＡをＡＧＧで置き換えるように修飾される。一部の実施形態では、配列は、配列番号７０と比較して、１６個のコドン位置のいずれか１つにおいて、ＡＧＡをＡＧＧで置き換えるように修飾される。
[0127]一部の実施形態では、本明細書に記載の単離された非天然起源の核酸は、抗血管新生剤を含む生物製剤をコードする配列を含み、前記配列は、コード領域における修飾を欠くこと以外の点では同等な配列と比較して、配列のコード領域における修飾を含み、前記修飾は、少なくとも１個の非ＣＣＣプロリンコドンのＣＣＣによる置き換えを含む。一部の実施形態では、少なくとも１個の非ＣＣＣプロリンコドンはＣＣＴである。配列は、配列のコード領域の少なくとも３個、少なくとも６個、少なくとも９個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも１８個、少なくとも２１個、少なくとも２４個、少なくとも２７個、少なくとも２９個、または最大で３０個のコドンにおいて、非ＣＣＣプロリンコドンをＣＣＣで置き換えるように修飾される。一部の実施形態では、配列は、配列のコード領域の３０個のコドンにおいて、非ＣＣＣプロリンコドンをＣＣＣで置き換えるように修飾される。一部の実施形態では、配列は、配列のコード領域の３０個のコドンのいずれか１つにおいて、非ＣＣＣプロリンコドンをＣＣＣで置き換えるように修飾される。一部の実施形態では、配列は、配列番号７０と比較して、少なくとも３個、少なくとも６個、少なくとも９個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも１８個、少なくとも２１個、少なくとも２４個、少なくとも２７個、少なくとも２９個、または最大で３０個のコドン位置において、非ＣＣＣプロリンコドンをＣＣＣで置き換えるように修飾される。一部の実施形態では、配列は、配列番号７０と比較して、３０個のコドン位置において、非ＣＣＣプロリンコドンをＣＣＣで置き換えるように修飾される。一部の実施形態では、配列は、配列番号７０と比較して、３０個のコドン位置のいずれか１つにおいて、非ＣＣＣプロリンコドンをＣＣＣで置き換えるように修飾される。一部の実施形態では、非ＣＣＣプロリンコドンはＣＣＴである。一部の実施形態では、配列は、配列のコード領域の少なくとも３個、少なくとも６個、少なくとも９個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも１８個、少なくとも２１個、少なくとも２４個、少なくとも２７個、少なくとも２９個、または最大で３０個のコドンにおいて、ＣＣＴをＣＣＣで置き換えるように修飾される。一部の実施形態では、配列は、配列のコード領域の３０個のコドンにおいて、ＣＣＴをＣＣＣで置き換えるように修飾される。一部の実施形態では、配列は、配列のコード領域の３０個のコドンのいずれか１つにおいて、ＣＣＴをＣＣＣで置き換えるように修飾される。一部の実施形態では、配列は、配列番号７０と比較して、少なくとも３個、少なくとも６個、少なくとも９個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも１８個、少なくとも２１個、少なくとも２４個、少なくとも２７個、少なくとも２９個、または最大で３０個のコドン位置において、ＣＣＴをＣＣＣで置き換えるように修飾される。一部の実施形態では、配列は、配列番号７０と比較して、３０個のコドン位置において、ＣＣＴをＣＣＣで置き換えるように修飾される。一部の実施形態では、配列は、配列番号７０と比較して、３０個のコドン位置のいずれか１つにおいて、ＣＣＴをＣＣＣで置き換えるように修飾される。
[0128]一部の実施形態では、本明細書に記載の単離された非天然起源の核酸は、抗血管新生剤を含む生物製剤をコードする配列を含み、前記配列は、コード領域における修飾を欠くこと以外の点では同等な配列と比較して、配列のコード領域における修飾を含み、前記修飾は、少なくとも１個の非ＴＣＣセリンコドンのＴＣＣによる置き換えを含む。一部の実施形態では、配列は、配列のコード領域の少なくとも３個、少なくとも６個、少なくとも９個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも１８個、少なくとも２１個、少なくとも２４個、少なくとも２７個、少なくとも３０個、少なくとも３３個、または最大で３６個のコドンにおいて、非ＴＣＣセリンコドンをＴＣＣで置き換えるように修飾される。一部の実施形態では、配列は、配列のコード領域の３６個のコドンにおいて、非ＴＣＣセリンコドンをＴＣＣで置き換えるように修飾される。一部の実施形態では、配列は、配列のコード領域の３６個のコドンのいずれか１つにおいて、非ＴＣＣセリンコドンをＴＣＣで置き換えるように修飾される。一部の実施形態では、配列は、配列番号７０と比較して、少なくとも３個、少なくとも６個、少なくとも９個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも１８個、少なくとも２１個、少なくとも２４個、少なくとも２７個、少なくとも３０個、少なくとも３３個、または最大で３６個のコドン位置において、非ＴＣＣセリンコドンをＴＣＣで置き換えるように修飾される。一部の実施形態では、配列は、配列番号７０と比較して、３６個のコドン位置において、非ＴＣＣセリンコドンをＴＣＣで置き換えるように修飾される。一部の実施形態では、配列は、配列番号７０と比較して、３６個のコドン位置のいずれか１つにおいて、非ＴＣＣセリンコドンをＴＣＣで置き換えるように修飾される。一部の実施形態では、非ＴＣＣセリンコドンはＡＧＣである。一部の実施形態では、配列は、配列のコード領域の少なくとも３個、少なくとも６個、少なくとも９個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも１８個、少なくとも２１個、少なくとも２４個、少なくとも２７個、少なくとも３０個、少なくとも３３個、または最大で３６個のコドンにおいて、ＡＧＣをＴＣＣで置き換えるように修飾される。一部の実施形態では、配列は、配列のコード領域の３６個のコドンにおいて、ＡＧＣをＴＣＣで置き換えるように修飾される。一部の実施形態では、配列は、配列のコード領域の３６個のコドンのいずれか１つにおいて、ＡＧＣをＴＣＣで置き換えるように修飾される。一部の実施形態では、配列は、配列番号７０と比較して、少なくとも３個、少なくとも６個、少なくとも９個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも１８個、少なくとも２１個、少なくとも２４個、少なくとも２７個、少なくとも３０個、少なくとも３３個、または最大で３６個のコドン位置において、ＡＧＣをＴＣＣで置き換えるように修飾される。一部の実施形態では、配列は、配列番号７０と比較して、３６個のコドン位置において、ＡＧＣをＴＣＣで置き換えるように修飾される。一部の実施形態では、配列は、配列番号７０と比較して、３６個のコドン位置のいずれか１つにおいて、ＡＧＣをＴＣＣで置き換えるように修飾される。
[0129]配列が、配列のコード領域の少なくとも３個、少なくとも６個、少なくとも９個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも１８個、少なくとも２１個、少なくとも２４個、少なくとも２７個、または最大で３０個のコドンにおいて、非ＣＣＧプロリンコドンをＣＣＧで置き換えるように修飾される、請求項３～３８のいずれか一項に記載の単離された非天然起源の核酸。
[0130]一部の実施形態では、本明細書に記載の単離された非天然起源の核酸は、抗血管新生剤を含む生物製剤をコードする配列を含み、前記配列は、コード領域における修飾を欠くこと以外の点では同等な配列と比較して、配列のコード領域における修飾を含み、前記修飾は、少なくとも１個の非ＣＣＧプロリンコドンのＣＣＧによる置き換えを含む。一部の実施形態では、配列は、配列のコード領域の３０個のコドンにおいて、非ＣＣＧプロリンコドンをＣＣＧで置き換えるように修飾される。一部の実施形態では、配列は、配列のコード領域の３０個のコドンのいずれか１つにおいて、非ＣＣＧプロリンコドンをＣＣＧで置き換えるように修飾される。一部の実施形態では、配列は、配列番号７０と比較して、少なくとも３個、少なくとも６個、少なくとも９個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも１８個、少なくとも２１個、少なくとも２４個、少なくとも２７個、または最大で３０個のコドン位置において、非ＣＣＧプロリンコドンをＣＣＧで置き換えるように修飾される。一部の実施形態では、配列は、配列番号７０と比較して、３０個のコドン位置において、非ＣＣＧプロリンコドンをＣＣＧで置き換えるように修飾される。一部の実施形態では、配列は、配列番号７０と比較して、３０個のコドン位置のいずれか１つにおいて、非ＣＣＧプロリンコドンをＣＣＧで置き換えるように修飾される。一部の実施形態では、非ＣＣＧプロリンコドンはＣＣＣである。一部の実施形態では、配列は、配列のコード領域の少なくとも３個、少なくとも６個、少なくとも９個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも１８個、少なくとも２１個、少なくとも２４個、少なくとも２７個、または最大で３０個のコドンにおいて、ＣＣＣをＣＣＧで置き換えるように修飾される。一部の実施形態では、配列は、配列のコード領域の３０個のコドンにおいて、ＣＣＣをＣＣＧで置き換えるように修飾される。一部の実施形態では、配列は、配列のコード領域の３０個のコドンのいずれか１つにおいて、ＣＣＣをＣＣＧで置き換えるように修飾される。一部の実施形態では、配列は、配列番号７０と比較して、少なくとも３個、少なくとも６個、少なくとも９個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも１８個、少なくとも２１個、少なくとも２４個、少なくとも２７個、または最大で３０個のコドン位置において、ＣＣＣをＣＣＧで置き換えるように修飾される。一部の実施形態では、配列は、配列番号７０と比較して、３０個のコドン位置において、ＣＣＣをＣＣＧで置き換えるように修飾される。一部の実施形態では、配列は、配列番号７０と比較して、３０個のコドン位置のいずれか１つにおいて、ＣＣＣをＣＣＧで置き換えるように修飾される。
[0131]一部の実施形態では、本明細書に記載の非天然起源の核酸配列は、配列番号１３～１９、２１～２７、３１、６２、６４、６６、または６８のうちのいずれか１つと少なくとも約６０％の配列同一性または類似性を有する核酸配列を含む。一部の実施形態では、配列同一性は、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％から、最大で約１００％である。一部の実施形態では、単離された非天然起源の核酸は、配列番号３１に対して約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％から、最大で約１００％である配列同一性を含む。一部の実施形態では、単離された非天然起源の核酸は、配列番号３１の核酸配列を含む。一部の実施形態では、単離された非天然起源の核酸は、配列番号３１の核酸配列に対して１００％同一である。一部の実施形態では、単離された非天然起源の核酸は、配列番号６６に対して約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％から、最大で約１００％である配列同一性を含む。一部の実施形態では、単離された非天然起源の核酸は、配列番号６６の核酸配列を含む。一部の実施形態では、単離された非天然起源の核酸は、配列番号６６の核酸配列に対して１００％同一である。一部の実施形態では、単離された非天然起源の核酸は一本鎖である。一部の実施形態では、単離された非天然起源の核酸は二本鎖である。
[0132]一部の実施形態では、非天然起源の核酸配列は、配列番号７０と比較して位置：Ｘ１～Ｘ１６で、ＡＧＡをＡＧＧで置き換えるように修飾され得る。一部の実施形態では、非天然起源の核酸配列は、非天然起源の核酸配列のコード領域の少なくとも３個、少なくとも６個、少なくとも９個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも１８個、少なくとも２１個、少なくとも２４個、少なくとも２７個、少なくとも２９個、または最大で３０個のコドンにおいて、ＣＣＴをＣＣＣで置き換えるように修飾され得る。一部の実施形態では、非天然起源の核酸配列は、非天然起源の核酸配列のコード領域の３０個のコドンにおいて、ＣＣＴをＣＣＣで置き換えるように修飾され得る。一部の実施形態では、非天然起源の核酸配列は、配列番号７０と比較して位置：Ｘ１～Ｘ３０で、ＣＣＴをＣＣＣで置き換えるように修飾され得る。一部の実施形態では、非天然起源の核酸配列は、非天然起源の核酸配列のコード領域の少なくとも３個、少なくとも６個、少なくとも９個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも１８個、少なくとも２１個、少なくとも２４個、少なくとも２７個、少なくとも３０個、少なくとも３３個、または最大で３６個のコドンにおいて、ＡＧＣをＴＣＣで置き換えるように修飾され得る。一部の実施形態では、非天然起源の核酸配列は、非天然起源の核酸配列のコード領域の３６個のコドンにおいて、ＡＧＣをＴＣＣで置き換えるように修飾され得る。一部の実施形態では、非天然起源の核酸配列は、配列番号７０と比較して位置：Ｘ１～Ｘ３６で、ＡＧＣをＴＣＣで置き換えるように修飾され得る。一部の実施形態では、非天然起源の核酸配列は、非天然起源の核酸配列のコード領域の少なくとも３個、少なくとも６個、少なくとも９個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも１８個、少なくとも２１個、少なくとも２４個、少なくとも２７個、少なくとも２９個、または最大で３０個のコドンにおいて、ＣＣＣをＣＣＧで置き換えるように修飾され得る。一部の実施形態では、非天然起源の核酸配列は、非天然起源の核酸配列のコード領域の２９個のコドンにおいて、ＣＣＣをＣＣＧで置き換えるように修飾され得る。一部の実施形態では、非天然起源の核酸配列は、配列番号７０と比較して位置：Ｘ１～Ｘ２９で、ＣＣＣをＣＣＧで置き換えるように修飾され得る。一部の実施形態では、非天然起源の核酸配列は、配列番号２８と比較して位置：Ｘ１～Ｘ１６で、ＡＧＡをＡＧＧで置き換えるように修飾され得る。一部の実施形態では、非天然起源の核酸配列は、非天然起源の核酸配列のコード領域の少なくとも３個、少なくとも６個、少なくとも９個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも１８個、少なくとも２１個、少なくとも２４個、少なくとも２７個、少なくとも２９個、または最大で３０個のコドンにおいて、ＣＣＴをＣＣＣで置き換えるように修飾され得る。一部の実施形態では、非天然起源の核酸配列は、非天然起源の核酸配列のコード領域３０個のコドンにおいて、ＣＣＴをＣＣＣで置き換えるように修飾され得る。一部の実施形態では、非天然起源の核酸配列は、配列番号２８と比較して位置：Ｘ１～Ｘ３０で、ＣＣＴをＣＣＣで置き換えるように修飾され得る。一部の実施形態では、非天然起源の核酸配列は、非天然起源の核酸配列のコード領域少なくとも３個、少なくとも６個、少なくとも９個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも１８個、少なくとも２１個、少なくとも２４個、少なくとも２７個、少なくとも３０個、少なくとも３３個、または最大で３６個のコドンにおいて、ＡＧＣをＴＣＣで置き換えるように修飾され得る。一部の実施形態では、非天然起源の核酸配列は、非天然起源の核酸配列のコード領域の３６個のコドンにおいて、ＡＧＣをＴＣＣで置き換えるように修飾され得る。一部の実施形態では、非天然起源の核酸配列は、配列番号２８と比較して位置：Ｘ１～Ｘ３６で、ＡＧＣをＴＣＣで置き換えるように修飾され得る。一部の実施形態では、非天然起源の核酸配列は、非天然起源の核酸配列のコード領域の少なくとも３個、少なくとも６個、少なくとも９個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも１８個、少なくとも２１個、少なくとも２４個、少なくとも２７個、少なくとも２９個、または最大で３０個のコドンにおいて、ＣＣＣをＣＣＧで置き換えるように修飾され得る。一部の実施形態では、非天然起源の核酸配列は、非天然起源の核酸配列のコード領域の２９個のコドンにおいて、ＣＣＣをＣＣＧで置き換えるように修飾され得る。一部の実施形態では、非天然起源の核酸配列は、配列番号２８と比較して位置：Ｘ１～Ｘ２９で、ＣＣＣをＣＣＧで置き換えるように修飾され得る。一部の実施形態では、非天然起源の核酸配列は、ウイルスベクター配列を含み得る。一部の実施形態では、ウイルスベクター配列は、ｓｃＡＡＶベクター配列であり得る。一部の実施形態では、ＡＡＶベクター配列は、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、またはそれらの任意の組合せのものであり得る。一部の実施形態では、ＡＡＶベクター配列は、ＡＡＶ２血清型のものであり得る。一部の実施形態では、ウイルスベクター配列は、少なくとも２種のＡＡＶ血清型の配列を含み得る。一部の実施形態では、少なくとも２種の血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１１、およびＡＡＶ１２から選択され得る。一部の実施形態では、単離された非天然起源の核酸配列は、配列番号１３～１９または２１～２７のうちのいずれか１つと少なくとも約６０％の配列同一性または類似性を有する配列を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶベクター配列は一本鎖である。一部の実施形態では、ＡＡＶベクター配列は二本鎖である。
[0133]一部の場合には、修飾は、化学修飾も含み得る。修飾された核酸は、それらの骨格、糖、または核酸塩基の修飾、さらには新規な塩基または塩基対を含み得る。修飾された核酸は、改善された化学的および／または生物学的安定性を有し得る。多様な化学置換基（例えば、疎水性基）による装飾もまた、改善された特性および機能、例えば、新たな構造モチーフおよび標的結合の強化を生じさせることができる。
[0134]例示的な化学修飾には、２’Ｆ、２’－フルオロ、２’ＯＭｅ、２’－Ｏ－メチル、ＬＮＡ、ロックト核酸、ＦＡＮＡ、２’－フルオロアラビノース核酸、ＨＮＡ、ヘキシトール核酸、２’ＭＯＥ、２’－Ｏ－メトキシエチル、リブロＮＡ、（１’－３’）－β－Ｌ－リブロ核酸、ＴＮＡ、α－Ｌ－トレオース核酸、ｔＰｈｏＮａ、３’－２’ホスホノメチル－トレオシル核酸、ｄＸＮＡ、２’－デオキシキシロ核酸、ＰＳ、ホスホロチオエート、ｐｈＮＡ、アルキルホスホネート核酸、ＰＮＡ、およびペプチド核酸が含まれるが、これらに限定されない。
[0135]一部の場合には、核酸はさらなる特徴を含む。さらなる特徴には、タグ、シグナルペプチド、イントロン配列、プロモーター、スタッファー配列などの配列が含まれ得る。
[0136]一部の場合には、核酸はシグナルペプチドを含む。シグナルペプチドは、シグナル配列、標的化シグナル、局在化シグナル、局在化配列、移行ペプチド、リーダー配列またはリーダーペプチドと称されることがあり、分泌経路に向かう運命にある新たに合成されたタンパク質の大部分でＮ末端に存在する短いペプチドである。これらのタンパク質には、特定の細胞小器官（小胞体、ゴルジ体、エンドソーム）内に存在するもの、細胞外に分泌されるもの、またはほとんどの細胞膜に挿入されるものが含まれる。一部の場合には、本明細書で提供される核酸は、シグナルペプチドを含み得る。シグナルペプチドは、任意の長さのものであり得るが、典型的には１５～３０アミノ酸長であり得る。シグナルペプチドは、約１０～１５、１０～２０、１０～３０、１５～２０、１５～２５、１５～３０、２０～３０、または２５～３０アミノ酸長であり得る。さまざまなシグナルペプチドを利用することができ、これには、ヒト抗体重鎖（Ｖｈ）、ヒト抗体軽鎖（Ｖｌ）、およびアフリベルセプトが含まれるが、これらに限定されない。
[0137]一部の場合には、イントロンはイントロン配列を含む。イントロンは、最終的なＲＮＡ産物の成熟の間にＲＮＡスプライシングによって除去され得る、配列内の任意のヌクレオチド配列である。換言すると、イントロンは、翻訳の前にスプライシングによって除去される、ＲＮＡ転写物またはそれをコードするＤＮＡの非コード領域である。イントロンはタンパク質産物をコードしないが、遺伝子発現の調節には関与する。イントロンの中にはそれ自体が機能的ＲＮＡをコードし、スプライシング後にさらにプロセシングを受けて非コードＲＮＡ分子を生成するものもある。選択的スプライシングは、単一の遺伝子から複数のタンパク質を生成するために広く使用される。さらに、いくつかのイントロンは、広範囲にわたる遺伝子発現調節機能、例えば、ナンセンス変異依存分解機構およびｍＲＮＡ輸出に必須の役割を果たす。一実施形態では、イントロン配列は本開示の核酸に含まれ、ｈＣＭＶイントロンＡ、アデノウイルス三要素リーダー配列イントロン、ＳＶ４０イントロン、ハムスターＥＦ－１α遺伝子イントロン１、介在配列イントロン、ヒト成長ホルモンイントロン、および／またはヒトβグロビンイントロンから選択され得る。任意の数のイントロン配列が想定される。一実施形態では、イントロン配列はＳＶ４０である。一部の場合には、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、または最大で１０個のイントロン配列が、核酸に含まれ得る。
[0138]一実施形態では、さらなる特徴にはプロモーターが含まれる。プロモーターは、その下流のＤＮＡから単一のＲＮＡの転写を開始させるタンパク質が結合するＤＮＡの配列である。このＲＮＡはタンパク質をコードすることもあれば、またはｔＲＮＡ、ｍＲＮＡもしくはｒＲＮＡのようにそれ自体が機能を有することもある。プロモーターは、遺伝子の転写開始部位の近くで、ＤＮＡの上流に（センス鎖の５’領域に向けて）位置する。プロモーターの長さは約１００～１０００塩基対である。さまざまなプロモーターが想定され、本開示の非天然起源の核酸に使用することができる。一実施形態では、プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、伸長因子１α（ＥＦ１α）プロモーター、サル空胞ウイルス（ＳＶ４０）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ１）プロモーター、ユビキチンＣ（Ｕｂｃ）プロモーター、ヒトβアクチンプロモーター、ＣＡＧプロモーター、テトラサイクリン応答エレメント（ＴＲＥ）プロモーター、ＵＡＳプロモーター、アクチン５ｃ（Ａｃ５）プロモーター、ポリへドロンプロモーター、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩａ）プロモーター、ＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ１０プロモーター、ＴＥＦ１プロモーター、グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＳ）プロモーター、ＡＤＨ１プロモーター、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、Ｕｂｉプロモーター、ヒトポリメラーゼＩＩＩ ＲＮＡ（Ｈ１）プロモーター、Ｕ６プロモーター、それらのポリアデニル化構築物、およびそれらの任意の組合せである。一部の場合には、プロモーターはＣＭＶプロモーターである。
[0139]提供される核酸配列の任意のものが、ウイルスベクター配列を含み得る。ウイルスベクターは、レンチウイルス、レトロウイルス、またはアデノ随伴ウイルスであり得るが、これらに限定されない。ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであり得る。一部の場合には、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクターである。ＡＡＶベクターの多くの血清型が想定され、これにはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、および／またはＡＡＶ１２が含まれるが、これらに限定されない。これらの最初の血清型に基づいて、各血清型のＡＡＶカプシドを、生物学的機能、組織または細胞選択により好適なものとなるように操作することができる。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２ならびにバリアントＡＡＶ２．Ｎ５３およびＡＡＶ２．Ｎ５４であり、これらは本発明の実施例において使用される。少なくとも２種のＡＡＶ血清型を含有し得るキメラＡＡＶベクターも想定される。一部の場合には、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、または最大で８種の血清型が、キメラＡＡＶベクター内で組み合わされる。一部の場合には、ＡＡＶの一部分のみがキメラである。例えば、好適な部分は、カプシド、ＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３ドメインおよび／またはＲｅｐを含み得る。一部の場合には、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３のうちの少なくとも１つは、他の点では同等な野生型ＡＡＶカプシドタンパク質と比較して、少なくとも１個のアミノ酸置換を有する。一部の場合には、変異が、ＶＰ１およびＶＰ２、ＶＰ１およびＶＰ３、ＶＰ２およびＶＰ３、またはＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３に生じ得る。一部の実施形態では、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３のうちの少なくとも１つは、野生型ＡＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３と比較して、約１個から約２５個のアミノ酸置換、例えば、野生型ＡＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３と比較して、約１個から約５個、約５個から約１０個、約１０個から約１５個、約１５個から約２０個、または約２０個から約２５個のアミノ酸置換を有する。一部の場合には、ＶＰは除去され得る。例えば、一部の実施形態では、変異体ＡＡＶは、ＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３のうちの少なくとも１つを含まない。
[0140]一部の場合には、ＡＡＶベクターは修飾され得る。例えば、ＡＡＶベクターは、修飾、例えば、挿入、欠失、化学的改変、または合成修飾を含み得る。一部の場合には、単一のヌクレオチドがＡＡＶベクターに挿入される。他の場合には、複数のヌクレオチドがベクターに挿入される。挿入され得るヌクレオチドは、約１ヌクレオチドから約５ｋｂの範囲であり得る。
[0141]一部の場合には、変異は、前述のＡＡＶカプシド位置のいずれかで生じ得、任意の数の変異が含まれ得る。一部の場合には、変異は、あるアミノ酸から別のアミノ酸への変異であり得る。標準的アミノ酸の任意の組合せまたは並べ替えを行うことができる。以下のアミノ酸修飾のうちの任意のものを、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３のうちのいずれかで行うことができる：ＡからＲに、ＡからＮに、ＡからＤに、ＡからＣに、ＡからＱに、ＡからＥに、ＡからＧに、ＡからＨに、ＡからＩに、ＡからＬに、ＡからＫに、ＡからＭに、ＡからＦに、ＡからＰに、ＡからＳに、ＡからＴに、ＡからＷに、ＡからＹに、ＡからＶに、ＲからＮに、ＲからＤに、ＲからＣに、ＲからＱに、ＲからＥに、ＲからＧに、ＲからＨに、ＲからＩに、ＲからＬに、ＲからＫに、ＲからＭに、ＲからＦに、ＲからＰに、ＲからＳに、ＲからＴに、ＲからＷに、ＲからＹに、ＲからＶに、ＮからＤに、ＮからＣに、ＮからＱに、ＮからＥに、ＮからＧに、ＮからＨに、ＮからＩに、ＮからＬに、ＮからＫに、ＮからＭに、ＮからＦに、ＮからＰに、ＮからＳに、ＮからＴに、ＮからＷに、ＮからＹに、ＮからＶに、ＤからＣに、ＤからＱに、ＤからＥに、ＤからＧに、ＤからＨに、ＤからＩに、ＤからＬに、ＤからＫに、ＤからＭに、ＤからＦに、ＤからＰに、ＤからＳに、ＤからＴに、ＤからＷに、ＤからＹに、ＤからＶに、ＣからＱに、ＣからＥに、ＣからＧに、ＣからＨに、ＣからＩに、ＣからＬに、ＣからＫに、ＣからＭに、ＣからＦに、ＣからＰに、ＣからＳに、ＣからＴに、ＣからＷに、ＣからＹに、ＣからＶに、ＱからＥに、ＱからＧに、ＱからＨに、ＱからＩに、ＱからＬに、ＱからＫに、ＱからＭに、ＱからＦに、ＱからＰに、ＱからＳに、ＱからＴに、ＱからＷに、ＱからＹに、ＱからＶに、ＥからＧに、ＥからＨに、ＥからＩに、ＥからＬに、ＥからＫに、ＥからＭに、ＥからＦに、ＥからＰに、ＥからＳに、ＥからＴに、ＥからＷに、ＥからＹに、ＥからＶに、ＧからＨに、ＧからＩに、ＧからＬに、ＧからＫに、ＧからＭに、ＧからＦに、ＧからＰに、ＧからＳに、ＧからＴに、ＧからＷに、ＧからＹに、ＧからＶに、ＨからＩに、ＨからＬに、ＨからＫに、ＨからＭに、ＨからＦに、ＨからＰに、ＨからＳに、ＨからＴに、ＨからＷに、ＨからＹに、ＨからＶに、ＩからＬに、ＩからＫに、ＩからＭに、ＩからＦに、ＩからＰに、ＩからＳに、ＩからＴに、ＩからＷに、ＩからＹに、ＩからＶに、ＬからＫに、ＬからＭに、ＬからＦに、ＬからＰに、ＬからＳに、ＬからＴに、ＬからＷに、ＬからＹに、ＬからＶに、ＫからＭに、ＫからＦに、ＫからＰに、ＫからＳに、ＫからＴに、ＫからＷに、ＫからＹに、ＫからＶに、ＭからＦに、ＭからＰに、ＭからＳに、ＭからＴに、ＭからＷに、ＭからＹに、ＭからＶに、ＦからＰに、ＦからＳに、ＦからＴに、ＦからＷに、ＦからＹに、ＦからＶに、ＰからＳに、ＰからＴに、ＰからＷに、ＰからＹに、ＰからＶに、ＳからＴに、ＳからＷに、ＳからＹに、ＳからＶに、ＴからＷに、ＴからＹに、ＴからＶに、ＷからＹに、ＷからＶに、ＹからＶに、および前述の変異のいずれかを逆にしたもの。
[0142]変異は、保存的変異または置き換えであり得る。例えば、２０種の天然に存在するアミノ酸は、類似の特性を共有し得る。脂肪族アミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、またはイソロイシンであり得る。ヒドロキシルまたは硫黄／セレン含有アミノ酸は、セリン、システイン、セレノシステイン、トレオニン、またはメチオニンであり得る。環状アミノ酸はプロリンであり得る。芳香族アミノ酸は、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンであり得る。塩基性アミノ酸は、ヒスチジン、リジン、およびアルギニンであり得る。酸性アミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、またはグルタミンであり得る。保存的変異は、セリンからグリシンに、セリンからアラニンに、セリンからセリンに、セリンからトレオニンに、セリンからプロリンにであり得る。保存的変異は、アルギニンからアスパラギンに、アルギニンからリジンに、アルギニンからグルタミンに、アルギニンからアルギニンに、アルギニンからヒスチジンにであり得る。保存的変異は、ロイシンからフェニルアラニンに、ロイシンからイソロイシンに、ロイシンからバリンに、ロイシンからロイシンに、ロイシンからメチオニンにであり得る。保存的変異は、プロリンからグリシンに、プロリンからアラニンに、プロリンからセリンに、プロリンからトレオニンに、プロリンからプロリンにであり得る。保存的変異は、トレオニンからグリシンに、トレオニンからアラニンに、トレオニンからセリンに、トレオニンからトレオニンに、トレオニンからプロリンにであり得る。保存的変異は、アラニンからグリシンに、アラニンからトレオニンに、アラニンからプロリンに、アラニンからアラニンに、アラニンからセリンにであり得る。保存的変異は、バリンからメチオニンに、バリンからフェニルアラニンに、バリンからイソロイシンに、バリンからロイシンに、バリンからバリンにであり得る。保存的変異は、グリシンからアラニンに、グリシンからトレオニンに、グリシンからプロリンに、グリシンからセリンに、グリシンからグリシンにであり得る。保存的変異は、イソロイシンからフェニルアラニンに、イソロイシンからイソロイシンに、イソロイシンからバリンに、イソロイシンからロイシンに、イソロイシンからメチオニンにであり得る。保存的変異は、フェニルアラニンからトリプトファンに、フェニルアラニンからフェニルアラニンに、フェニルアラニンからチロシンにであり得る。保存的変異は、チロシンからトリプトファンに、チロシンからフェニルアラニンに、チロシンからチロシンにであり得る。保存的変異は、システインからセリンに、システインからトレオニンに、システインからシステインにであり得る。保存的変異は、ヒスチジンからアスパラギンに、ヒスチジンからリジンに、ヒスチジンからグルタミンに、ヒスチジンからアルギニンに、ヒスチジンからヒスチジンにであり得る。保存的変異は、グルタミンからグルタミン酸に、グルタミンからアスパラギンに、グルタミンからアスパラギン酸に、グルタミンからグルタミンにであり得る。保存的変異は、アスパラギンからグルタミン酸に、アスパラギンからアスパラギンに、アスパラギンからアスパラギン酸に、アスパラギンからグルタミンにであり得る。保存的変異は、リジンからアスパラギンに、リジンからリジンに、リジンからグルタミンに、リジンからアルギニンに、リジンからヒスチジンにであり得る。保存的変異は、アスパラギン酸からグルタミン酸に、アスパラギン酸からアスパラギンに、アスパラギン酸からアスパラギン酸に、アスパラギン酸からグルタミンにであり得る。保存的変異は、グルタミンからグルタミンに、グルタミンからアスパラギンに、グルタミンからアスパラギン酸に、グルタミンからグルタミンにであり得る。保存的変異は、メチオニンからフェニルアラニンに、メチオニンからイソロイシンに、メチオニンからバリンに、メチオニンからロイシンに、メチオニンからメチオニンにであり得る。保存的変異は、トリプトファンからトリプトファンに、トリプトファンからフェニルアラニンに、トリプトファンからチロシンにであり得る。
[0143]一部の実施形態では、修飾されたＡＡＶベクターは、修飾されたＡＡＶ２血清型ベクターを含む。一部の実施形態では、修飾されたＡＡＶベクターは、修飾されたＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、またはそれらの組合せを含む。一部の実施形態では、修飾されたＡＡＶ２血清型ベクターは、修飾されたＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、またはそれらの組合せを含む。
[0144]一態様では、単離された非天然起源の核酸は、配列番号１３～１９のうちのいずれか１つと、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、および最大で約１００％の配列同一性または類似性を含む。一実施形態では、単離された非天然起源の核酸は、配列番号１３～１９のうちのいずれか１つと、少なくとも約６０％の配列同一性または類似性を含む。一部の場合には、単離された非天然起源の核酸は、配列番号１３～１９のうちのいずれか１つである。一態様では、単離された非天然起源の核酸は、配列番号２１～配列番号２７のうちのいずれか１つと、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、および最大で約１００％の配列同一性または類似性を含む。一実施形態では、単離された非天然起源の核酸は、配列番号２１～配列番号２７のうちのいずれか１つと、少なくとも６０％の配列同一性または類似性を含む。一部の場合には、単離された非天然起源の核酸は、配列番号２１～配列番号２７のうちのいずれか１つである。一部の場合には、核酸は、配列番号１２と６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するポリペプチドをコードする。一部の場合には、核酸は、配列番号１２のポリペプチドをコードする。
[0145]一態様では、細胞を修飾し、それによって操作された細胞を作製する方法もまた、本明細書で提供される。細胞は、初代細胞、組換え細胞、または細胞株を指すことができる。一部の場合には、細胞はパッケージング細胞である。パッケージング細胞は、いくつかを挙げるなら、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、およびＶｅｒｏ細胞のうちのいずれか１つであり得る。操作された細胞は、初代細胞であり得る。一部の場合には、操作された細胞は、眼細胞であり得る。好適な眼細胞には、視細胞、神経節細胞、ＲＰＥ細胞、アマクリン細胞、水平細胞、ミュラー細胞などが含まれるが、これらに限定されない。
[0146]一部の場合には、細胞は、ウイルス粒子を生成させるために利用されるパッケージング細胞である。ＡＡＶビリオンまたはウイルス粒子を生成させるためには、ＡＡＶ発現ベクターが、既知の手法、例えば、トランスフェクションを使用して、好適な宿主細胞に導入される。一部の場合には、トランスフェクション手法、例えば、ＣａＰＯ４トランスフェクションもしくはエレクトロポレーション、および／またはハイブリッド型アデノウイルス／ＡＡＶベクターによるヒト胎児腎細胞株ＨＥＫ２９３（トランス作用性Ｅ１タンパク質を提供する機能的アデノウイルスＥ１遺伝子を含有するヒト腎細胞株）などの細胞株への感染が使用される。トランスフェクション手法は、当技術分野で公知である。例えば、Ｇｒａｈａｍら（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、５２：４５６ページ、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｄａｖｉｓら（１９８６）「Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、およびＣｈｕら（１９８１）Ｇｅｎｅ １３：１９７ページを参照。好適なトランスフェクション方法には、リン酸カルシウム共沈、直接微量注入、エレクトロポレーション、リポソーム媒介遺伝子移入、および高速微粒子銃を使用する核酸送達が含まれ、これらは当技術分野で公知である。
[0147]細胞を操作するために、複数の細胞を、単離された非天然起源の核酸と接触させることができる。接触は、任意の長さの時間を含むことができ、約５分間から約５日間を含み得る。接触は、約５分間、約１０分間、約１５分間、約２０分間、約２５分間、約３０分間、約３５分間、約４０分間、約４５分間、約５０分間、約５５分間、または約６０分間持続することができる。一部の場合には、接触は、１時間、３時間、５時間、１０時間、１５時間、２０時間、１日間、２日間、３日間、４日間、または最大で約５日間持続することができる。
[0148]一部の場合には、パッケージング細胞株の上清をＰＥＧ沈殿によって処理して、ウイルスを濃縮する。他の場合には、遠心分離の工程を使用して、ウイルスを濃縮することができる。例えば、カラムを使用して、遠心分離中にウイルスを濃縮することができる。一部の実施形態では、沈殿は、約４℃以下（例えば、約３℃、約２℃、約１℃、または約１℃）で、少なくとも約２時間、少なくとも約３時間、少なくとも約４時間、少なくとも約６時間、少なくとも約９時間、少なくとも約１２時間、または少なくとも約２４時間かけて生じる。一部の実施形態では、組換えＡＡＶは、低速遠心分離および続いてのＣｓＣｌ勾配によって、ＰＥＧ沈殿上清から単離される。低速遠心分離は、約４０００ｒｐｍ、約４５００ｒｐｍ、約５０００ｒｐｍ、または約６０００ｒｐｍで、約２０分間、約３０分間、約４０分間、約５０分間、または約６０分間であり得る。一部の場合には、組換えＡＡＶは、約５０００ｒｐｍで約３０分間の遠心分離および続いてのＣｓＣｌ勾配によって、ＰＥＧ沈殿上清から単離される。一部の場合には、ＣｓＣｌ精製をＩＤＸ勾配超遠心分離で置き換えることができる。上清は、トランスフェクション後の約１２時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間、約７２時間、約９６時間、約１２０時間、またはこれらのうちのいずれか２つの時点の間に回収することができる。また、上清を精製すること、濃縮すること、またはそれらの組合せを行うこともできる。例えば、濃度またはウイルス力価を、ｑＰＣＲまたは銀染色によって決定することができる。
[0149]一態様では、操作された細胞から単離された複数のＡＡＶ粒子も提供される。ウイルス力価は、約１０２ｖｐ／ｍＬ、約１０３ｖｐ／ｍＬ、約１０４ｖｐ／ｍＬ、約１０５ｖｐ／ｍＬ、約１０６ｖｐ／ｍＬ、約１０７ｖｐ／ｍＬ、約１０８ｖｐ／ｍＬから、または最大で約１０９ｖｐ／ｍＬであり得る。ウイルス力価は、約１０２ＧＣ／ｍＬ、約１０３ＧＣ／ｍＬ、約１０４ＧＣ／ｍＬ、約１０５ＧＣ／ｍＬ、約１０６ＧＣ／ｍＬ、約１０７ＧＣ／ｍＬ、約１０８ＧＣ／ｍＬから、または最大で約１０９ＧＣ／ｍＬであり得る。一部の場合には、ウイルス力価は、約１０２ＴＵ／ｍＬ、約１０３ＴＵ／ｍＬ、約１０４ＴＵ／ｍＬ、約１０５ＴＵ／ｍＬ、約１０６ＴＵ／ｍＬ、約１０７ＴＵ／ｍＬ、１０８ＴＵ／ｍＬから、または最大で約１０９ＴＵ／ｍＬであり得る。最適なウイルス力価は、形質導入される細胞種に依存して異なり得る。ウイルスの範囲は、約１，０００ＭＯＩから約２０００ＭＯＩまで、約１５００ＭＯＩから約２５００ＭＯＩまで、約２０００ＭＯＩから約３０００ＭＯＩまで、約３０００ＭＯＩから約４０００ＭＯＩまで、約４０００ＭＯＩから約５０００ＭＯＩまで、約５０００ＭＯＩから約６０００ＭＯＩまで、約６０００ＭＯＩから約７０００ＭＯＩまで、約７０００ＭＯＩから約８０００ＭＯＩまで、約８０００ＭＯＩから約９０００ＭＯＩまで、約９０００ＭＯＩから約１０，０００ＭＯＩまでであり得る。例えば、１０，０００のＭＯＩを使用して１００万個の細胞を感染させるためには、１０，０００×１，０００，０００＝１０１０ＧＣが必要である。
[0150]一部の場合には、複数のＡＡＶ粒子を単位剤形に製剤化することができる。さまざまな製剤が、成人または小児への送達のために想定され、これには、０．５×１０９ｖｇ、１．０×１０９ｖｇ、１．０×１０１０ｖｇ、１．０×１０１１ｖｇ、３．０×１０１１ｖｇ、６×１０１１ｖｇ、８．０×１０１１ｖｇ、１．０×１０１２ｖｇ、１．０×１０１３ｖｇ、１．０×１０１４ｖｇ、１．０×１０１５ｖｇ、または最大で１．５×１０１５ｖｇが含まれるが、これらに限定されない。ウイルス粒子の組成物は凍結保存することができ、または別様式で好適な容器内で貯蔵することができる。
[0151]本明細書で提供される組成物および方法は、主題生物製剤の送達および／または発現を、他の点では同等な修飾されていない核酸よりも、少なくとも約３％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または最大で１００％、強化するのに十分であり得る。一部の場合には、他の点では同等な修飾されていない核酸は、ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐをコードするものである。一部の場合には、修飾は、主題生物製剤の送達および／または発現を、他の点では同等な修飾されていない核酸よりも、少なくとも約１倍、約６倍、約１１倍、約１６倍、約２１倍、約２６倍、約３１倍、約３６倍、約４１倍、約４６倍、約５１倍、約５６倍、約６１倍、約６６倍、約７１倍、約７６倍、約８１倍、約８６倍、約９１倍、約９６倍、約１０１倍、約１０６倍、約１１１倍、約１１６倍、約１２１倍、約１２６倍、約１３１倍、約１３６倍、約１４１倍、約１４６倍、約１５１倍、約１５６倍、約１６１倍、約１６６倍、約１７１倍、約１７６倍、約１８１倍、約１８６倍、約１９１倍、約１９６倍、約２０１倍、約２０６倍、約２１１倍、約２１６倍、約２２１倍、約２２６倍、約２３１倍、約２３６倍、約２４１倍、約２４６倍、約２５１倍、約２５６倍、約２６１倍、約２６６倍、約２７１倍、約２７６倍、約２８１倍、約２８６倍、約２９１倍、約２９６倍、約３０１倍、約３０６倍、約３１１倍、約３１６倍、約３２１倍、約３２６倍、約３３１倍、約３３６倍、約３４１倍、約３４６倍、または約３５０倍に強化するのに十分であり得る。一実施形態では、増加した発現は、インビトロアッセイによる決定で、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２００倍、または少なくとも５００倍への増加を含む。好適なインビトロアッセイには、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、Ｌｕｍｉｎｅｘ、顕微鏡検査、画像検査、および／またはフローサイトメトリーが含まれる。
[0152]主題ＡＡＶビリオンは、他の点では同等なＷＴ ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる網膜細胞（視細胞、神経節細胞、ＲＰＥ細胞、アマクリン細胞、水平細胞、ミュラー細胞など）の感染性と比較して、網膜細胞の感染性の、少なくとも１倍、少なくとも６倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超への増加を示すことができる。
[0153]疾患または状態を処置する方法も、本明細書で提供される。処置の方法は、本明細書で提供される生物製剤をコードするビリオンまたはベクターを、必要とする対象に導入するステップを含み得る。一部の場合には、処置の方法は、抗血管新生剤を含む生物製剤をコードする複数のビリオンまたはベクターを導入するステップを含む。疾患を処置する方法であって、疾患の処置を必要とする対象に医薬組成物を投与するステップを含む方法も提供される。医薬組成物は、抗血管新生剤を含む生物製剤をコードする配列、および／または抗血管新生剤をコードするビリオンを含み得る。
[0154]一実施形態では、処置の方法は、抗血管新生剤を含む生物製剤をコードする配列を含む単離された非天然起源の核酸を含む医薬組成物の治療有効量を投与するステップを含む。配列は、本明細書で提供される核酸のいずれかであり得るか、またはいずれかを含み得る。例えば、配列は、配列番号１３～１９、２１～２７、３１、６２、６４、６６、または６８のうちのいずれか１つと少なくとも約６０％の配列同一性または類似性を有する核酸配列を含み得る。一部の実施形態では、配列同一性は、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％から、最大で約１００％である。一部の実施形態では、配列は、配列番号３１に対して約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％から、最大で約１００％である配列同一性を含む。一部の実施形態では、配列は、配列番号３１の核酸配列を含む。一部の実施形態では、配列は、配列番号３１の核酸配列に対して１００％同一である。一部の実施形態では、配列は、配列番号６６に対して約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％から、最大で約１００％である配列同一性を含む。一部の実施形態では、配列は、配列番号６６の核酸配列を含む。一部の実施形態では、配列は、配列番号６６の核酸配列に対して１００％同一である。一部の実施形態では、配列は一本鎖である。一部の実施形態では、配列は二本鎖である。
[0155]一部の場合には、配列は本開示に従って修飾され、例えば、配列は、コード領域における修飾を欠くこと以外の点では同等な配列と比較して、配列のコード領域の少なくとも１個のコドンにおいてＡＧＡをＡＧＧで置き換えるように修飾される。本明細書に提供されるように、本開示の修飾は、修飾を欠くこと以外の点では同等な単離された非天然起源の核酸を投与されたこと以外の点では同等な対象と比較して、対象における生物製剤のレベルを増加させることなどの特定の利点を有し得る。対象における生物製剤のレベルを増加させることは治療効果を有し得、本明細書で提供される疾患または状態のいずれかを軽減するかまたは消失させることができる。
[0156]一部の場合には、対象における生物製剤のレベルの増加は、診断アッセイによる決定で、少なくとも５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、２００倍、または５００倍への増加である。
[0157]好適な診断アッセイには、眼診断アッセイが含まれ得る。眼診断アッセイには、眼科検査、例えば、屈折試験、眼スキャン、眼コヒーレンストモグラフィー、ファルンウォース・マンセル１００色相検査、コンピュータによる視神経乳頭画像法および網膜視神経層解析（ＧＤＸ、ＨＲＴ、ＯＣＴ）、角膜トポグラフィー、網膜電図（ＥＲＧ）、眼電図（ＥＯＧ）、視覚誘発電位（ＶＥＰ）、視覚誘発反応（ＶＥＲ）、フルオレセイン眼底造影、眼コヒーレンストモグラフィー（ＯＣＴ）、網膜写真、眼底写真、スペキュラーマイクロスコープ、Ｇｏｌｄｍａｎｎ、Ｈｕｍｐｈｒｅｙ、ＦＤＴ、Ｏｃｔｏｐｕｓの生物計測法／ＩＯＬ計算、Ａ－スキャン、Ｂ－スキャン、およびそれらの組合せが含まれ得る。
[0158]一部の場合には、網膜検査を利用することができる。網膜機能およびその変化を評価するための非限定的な方法には、視力の評価（例えば、最良矯正視力［ＢＣＶＡ］、歩行、ナビゲーション、物体の検出および識別）、視野の評価（例えば、静的および動的視野測定）、診察の実施（例えば、眼の前部および後部の細隙灯検査）、あらゆる波長の明暗に対する電気生理学的反応性の評価（例えば、あらゆる形態の網膜電図（ＥＲＧ）［全視野、多焦点およびパターン］、あらゆる形態の視覚誘発電位（ＶＥＰ）、眼電図（ＥＯＧ）、色覚、暗順応および／または対比感度）が含まれる。解剖学的構造および網膜の健康状態およびその変化を評価するための非限定的な方法には、光コヒーレンストモグラフィー（ＯＣＴ）、眼底写真、補償光学走査レーザー検眼鏡検査（ＡＯ－ＳＬＯ）、蛍光および／または自己蛍光、眼能動性および眼球運動の測定（例えば、眼振、固視優先性、および安定性）、報告アウトカムの測定（視覚的および非視覚的に導かれる行動および活動における患者報告による変化、患者報告アウトカム［ＰＲＯ］、生活の質、日常活動の質問票に基づく評価、および神経学的機能の測定（例えば、機能的磁気共鳴画像法（ＭＲＩ））が含まれる。
[0159]関連する眼の疾患および状態には、失明、色覚異常、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、緑内障、バルデ・ビードル症候群、ベスト病、全脈絡膜萎縮、レーバー先天性黒内障、黄斑変性、ポリープ状脈絡膜血管症（ＰＣＶ）、網膜色素変性、レフサム病、スタルガルト病、アッシャー症候群、Ｘ連鎖性網膜分離症（ＸＬＲＳ）、桿体－錐体ジストロフィー、錐体－桿体ジストロフィー、小口病、レバンチン病（家族性優性ドルーゼン）、および青錐体一色型色覚異常が含まれ得るが、これらに限定されない。一実施形態では、眼の疾患または状態はＡＭＤである。ＡＭＤは、滲出型ＡＭＤまたは萎縮型ＡＭＤであり得る。
[0160]一部の場合には、医薬品の投与は、少なくとも疾患もしくは状態の症状を軽減し、疾患もしくは状態を処置し、および／または疾患もしくは状態を消失させるのに十分である。一部の場合には、疾患または状態の改善は、提供される診断アッセイのいずれかによって確認することができる。他の場合には、改善は、処置された対象との問診を介して得ることができる。例えば、対象は、主治医に対して、対象の視力が、主題医薬品の投与前の視力と比較して改善されていることを伝えることができる。他の場合には、インビボ動物モデルを使用して、処置後の疾患または状態の軽減を確認することができる。好適な動物モデルには、マウスモデル、霊長類モデル、ラットモデル、イヌモデルなどが含まれる。
[0161]医薬組成物は、種々の手法、例えば、硝子体内、筋肉内、静脈内、皮下、および／または腹腔内注射を使用して、対象に投与され得る。
[0162]インビボ送達のために、主題核酸および／またはＡＡＶビリオンを医薬組成物中に製剤化することができ、これは一般に、硝子体内または非経口的に投与される（例えば、筋肉内投与、皮下投与、腫瘍内投与、経皮投与、髄腔内投与等の投与経路を介して投与される）と考えられる。一部の態様では、医薬組成物は、処置を必要とするヒトまたは哺乳動物などの対象を処置するために使用することができる。一部の場合には、対象は、疾患、例えば、眼疾患と診断され得る。一部の態様では、主題医薬組成物は、二次療法と同時に施すことができる。二次療法は、眼に使用するための任意の療法を含み得る。一部の場合には、二次療法は、栄養療法、ビタミン、レーザー光凝固術などのレーザー療法、光力学療法、ビズダイン、抗ＶＥＧＦ療法、眼帯、点眼薬、麻痺剤、矯正視力療法、行動／知覚視覚療法などを含む。一部の態様では、以前に記載された生物製剤の任意のものを、二次療法とみなすことができる。
[0163]医薬組成物の任意のものが、賦形剤も含み得る。そのような賦形剤、担体、希釈剤、および緩衝液には、過度の毒性なしに投与することができる任意の医薬薬剤が含まれる。薬学的に許容される賦形剤には、水、生理食塩水、グリセロールおよびエタノールなどの液体が含まれるが、これらに限定されない。薬学的に許容される塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの鉱酸塩、および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸の塩を、そのようなビヒクル中に含めることができる。さらに、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などの補助物質が、そのようなビヒクル中に存在してもよい。多種多様な薬学的に許容される賦形剤が当技術分野で公知であり、ここで詳細に考察する必要はない。薬学的に許容される賦形剤は、例えば、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ」、第２０版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ、およびＷｉｌｋｉｎｓ、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ」（１９９９）Ｈ．Ｃ．Ａｎｓｅｌら編、第７版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ、およびＷｉｌｋｉｎｓ、ならびに「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ」（２０００）Ａ．Ｈ．Ｋｉｂｂｅら編、第３版、Ａｍｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃ．を含む、さまざまな刊行物に十分に記載されている。
[0164]一部の実施形態では、主題ｒＡＡＶビリオンの有効量は、網膜機能、解剖学的完全性、または網膜の健康状態の損失速度の低下、例えば、損失速度、それ故に疾患の進行速度の、２分の１、３分の１、４分の１、または５分の１もしくはそれを上回る低下、例えば、損失速度、それ故に疾患の進行速度の１０分の１を上回る低下をもたらす。一部の実施形態では、主題ｒＡＡＶビリオンの有効量は、視覚機能、網膜機能の獲得、網膜の解剖学的構造もしくは健康状態の改善、ならびに／または眼能動性の改善および／もしくは神経機能の改善、例えば、網膜機能、網膜の解剖学的構造もしくは健康状態の２倍、３倍、４倍、もしくは５倍もしくはそれを上回る改善、ならびに／または眼能動性の改善、例えば、網膜機能、網膜の解剖学的構造もしくは健康状態の１０倍もしくはそれを上回る改善、および／もしくは眼能動性の改善をもたらす。当業者によって容易に理解されるであろうが、所望の処置効果を達成するために必要とされる用量は、典型的には、１×１０８個から約１×１０１５個の組換えビリオンの範囲であり、これは典型的には、当業者によって１×１０８個から約１×１０１５個の「ベクターゲノム」と称される。
[0165]一部の態様では、本明細書で提供される組成物、例えば、医薬組成物は、組成物を必要とする対象に投与される。一部の場合には、投与は、ベクターが約０．５×１０９ｖｇ、１．０×１０９ｖｇ、１．０×１０１０ｖｇ、１．０×１０１１ｖｇ、３．０×１０１１ｖｇ、６×１０１１ｖｇ、８．０×１０１１ｖｇ、１．０×１０１２ｖｇ、１．０×１０１３ｖｇ、１．０×１０１４ｖｇ、１．０×１０１５ｖｇ、１．５×１０１５ｖｇであるＡＡＶベクターの投与量を送達することを含む。例えば、インビボ注射、すなわち、眼への直接注射の場合、治療有効用量は、約１０６個から約１０１５個の主題ＡＡＶビリオンのオーダー、例えば、約１０８個から１０１２個の操作されたＡＡＶビリオンであり得る。インビトロ形質導入の場合、細胞に送達される操作されたＡＡＶビリオンの有効量は、約１０８個から約１０１３個の操作されたＡＡＶビリオンのオーダーである。他の有効な投与量は、用量反応曲線を確立するルーチンの試験を通じて、当業者によって容易に確立され得る。
[0166]投与は任意の間隔で反復することができる。一部の態様では、投与は、１日２回、２日に１回、週２回、月２回、月３回、月１回、２か月に１回、年２回、年１回、または２年に１回行われる。
[0167]投薬処置は、単回投与スケジュールまたは複数回投与スケジュールであり得る。さらに、対象には、必要に応じて多くの用量が投与されてもよい。当業者は、適切な投与回数を容易に決定することができる。一部の態様では、医薬組成物は、硝子体内注射、網膜下注射、微量注入、または眼球上注射を介して投与される。
[0168]一部の態様では、対象は、本明細書で提供される医薬組成物の投与前、投与の間、および／または投与後に、変異に関する遺伝子検査を介してスクリーニングされ得る。変異に関してスクリーニングすることができる関連遺伝子には、ＲＰＥ６５、ＣＲＢ１、ＡＩＰＬ１、ＣＦＨ、またはＲＰＧＲＩＰが含まれる。
[0169]本明細書で提供される組成物のいずれかを含むキットも提供される。また、ａ）主題修飾されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシド、ｂ）主題ベクター、またはｃ）主題操作されたビリオンを含む容器も提供される。一態様では、容器は、バイアル、シリンジ、または針である。一部の場合には、容器は、眼内送達用に構成される。
[0170]キットは、好適に分注された組成物を含み得る。キットの構成成分は、水性媒体または凍結乾燥形態のいずれかでパッケージ化され得る。キットの容器手段は一般に、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ、または別の容器手段を含み、その中に構成成分を入れ、好ましくは好適に分注することができる。キット中に複数の構成成分が存在する場合、キットはまた一般に、第２、第３または他の追加の容器を含むと考えられ、その中に追加の構成成分を別々に入れることができる。しかし、構成成分のさまざまな組合せをバイアル中に含めてもよい。キットはまた、典型的には、市販のために構成成分を密閉して収容する手段も含む。そのような容器は、所望のバイアルが保持される射出成形またはブロー成形されたプラスチック容器を含み得る。
[0171]いくつかの場合には、本明細書に記載の組成物を含むパッケージ化された製品には、適切にラベルを付けることができる。いくつかの場合には、本明細書に記載の医薬組成物は、適正製造基準（ｃＧＭＰ）およびラベリング規則に従って製造され得る。一部の場合には、本明細書に開示される医薬組成物は無菌性であり得る。
[0172]本発明の好ましい実施形態を本明細書に示し、説明してきたが、そのような実施形態が例としてのみ提供されることは、当業者には明らかであろう。本発明から逸脱することなく、当業者には、多数の変形、変更、および置換が今や想起されることとなる。本明細書に記載される本発明の実施形態に対するさまざまな代替案が、本発明を実施する際に使用され得ることが理解されるべきである。以下の特許請求の範囲は、本発明の範囲を定義していること、およびこれらの特許請求の範囲およびそれらの均等物の範囲内にある方法および構造は、それによってカバーされることが意図される。
実施例１：コドン最適化および核酸構築物のクローニング
[0173]ＳＶ４０イントロン－ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）－合成ポリＡシグナルを含有するＤＮＡ配列を、ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ ＯＲＦ中に４０％のＧＣ含量を含有するように、サービス会社（Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）により合成させた。このＤＮＡ配列を、順方向プライマーＡ０２４および逆方向プライマーＡ０２５によりＰＣＲ増幅し、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡアセンブリキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を使用して、ｐＦＢ－ｓｃＣＭＶ－ＭＩＦのＸｂａＩおよびＳｐｈＩ部位にクローニングし、図１に示すように、ＡＭＩ０５９－ｐＦＢ－ｓｃＣＭＶ－ＳＶ４０－イントロン－Ａｆ－ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐを作製した。１つの全長ＡＡＶ ＩＴＲ、および自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）のための１つの切断型ＩＴＲを含有するｐＦＢ－ｓｃＣＭＶ－ＭＩＦプラスミドは、Ｂａｃ－ｔｏ－Ｂａｃバキュロウイルス発現システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）由来のｐＦａｓｔＢａｃシャトルプラスミドの誘導体である。クローニングプロセスにおいて、ＭＩＦをＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ遺伝子で置き換えた。ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ遺伝子は、その元のシグナルペプチド（Ａｆ）を含有する。Ａｆをヒト抗体重鎖シグナルペプチド（Ｖｈ）で置き換えるために、ＳＶ４０－イントロン－Ｖｈ－断片を、順方向プライマーＡ０２４および逆方向プライマーＡ０８２、ならびにテンプレートとしてＳＶ４０－イントロン－Ｖｈ配列を含有するプラスミドＡＭＩ０６０によりＰＣＲ増幅した。ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ ＯＲＦを、順方向プライマーＡ０８５および逆方向プライマーＡ０２５、ならびにテンプレートとしてのプラスミドＡＭＩ０５９－ｐＦＢ－ｓｃＣＭＶ－ＳＶ４０－イントロン－ｋｏｚａｋ－ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐにより増幅させた。これらの２種のＰＣＲ断片を、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡアセンブリキットを使用してＡＭＩ０５９のＸｂａＩおよびＳｐｈＩ部位にクローニングし、図１に示すように、ＡＭＩ０６６－ｐＦＢ－ｓｃＣＭＶ－ＳＶ４０－イントロン－Ｖｈ－ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐを作製した。
[0174]ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ ＯＲＦを最適化するために、ＳｎａｐＧｅｎｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＳＬ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用してヒト（ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）の好ましいコドン出力を選択することによって、ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐタンパク質配列のＤＮＡへの逆翻訳を行った。この配列は、Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅによって合成され、順方向プライマーＡ０８６および逆方向プライマーＡ０８７によりＰＣＲ増幅された。このＰＣＲ断片を、ＨｉＦｉ反応を介してＡＭＩ０５９のＳｔｕＩおよびＢｓｔＢＩ部位にクローニングして、図１に示すように、ＡＭＩ０６７－ｐＦＢ－ｓｃＣＭＶ－ＳＶ４０－イントロン－ｋｏｚａｋ－Ａｆ－ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ－ＧＣを作製した。ＡＭＩ０６７中のシグナルペプチドＡｆをＶｈで置き換えるために、ＳＶ４０－イントロン－Ｖｈ－断片を、順方向プライマーＡ０２４および逆方向プライマーＡ０８９、ならびにテンプレートとしてのＳＶ４０－イントロン－Ｖｈ配列を含有するプラスミドＡＭＩ０６０によりＰＣＲ増幅した。Ｔｗｉｓｔで合成したＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ ＯＲＦを、順方向プライマーＡ０８８および逆方向プライマーＡ０９０によりＰＣＲ増幅した。これらの２種のＰＣＲ断片を、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡアセンブリキットを使用してＡＭＩ０５９のＸｂａＩおよびＢｓｔＢＩ部位にクローニングして、図１および図６に示すように、ＡＭＩ０６８－ｐＦＢ－ｓｃＣＭＶ－ＳＶ４０－イントロン－ｋｏｚａｋ－Ｖｈ－ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ－ＧＣを作製した。
[0175]ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ ＤＮＡコドンのさらなる最適化を行うために、ＤＮＡ配列を手作業で調整して、さらに３つのバージョンのバリアントＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ ＤＮＡ分子を作製した。バージョン１では、１６個のＡｒｇコドンをＡＧＡからＡＧＧに、２９個のＰｒｏコドンをＣＣＣからＣＣＴに変更して、ＡＭＩ１１９－ｐＦＢ－ｓｃＣＭＶ－ＳＶ４０－イントロン－ｋｏｚａｋ－Ａｆ－ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ－ＧＣＲＰ（ＣＣＴ）を作製した（図１および図７参照）。バージョン２では、１６個のＡｒｇコドンの変更に加えて、３６個のＳｅｒコドンをＡＧＣからＴＣＣにさらに変更して、ＡＭＩ１２０－ｐＦＢ－ｓｃＣＭＶ－ＳＶ４０－イントロン－ｋｏｚａｋ－Ａｆ－ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ－ＧＣＲＳ（ＴＣＣ）を作製した（図１および図８参照）。バージョン３では、１６個のＡｒｇコドンの変更に加えて、２９個のＰｒｏコドンをＣＣＣからＣＣＧにさらに変更して、ＡＭＩ１３０－ｐＦＢ－ｓｃＣＭＶ－ＳＶ４０－イントロン－ｋｏｚａｋ－Ａｆ－ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ－ＧＣＲＰ（ＣＣＧ）を作製した（図１および図９参照）。ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ ＤＮＡ配列のすべてのバリアントバージョンは、まずＴｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社によって合成され、続いて順方向および逆方向プライマーによりＰＣＲ増幅され、最後にＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡアセンブリキットを使用して、ＡＭＩ０６７プラスミドのＢｓｔＢＩおよびＳｔｕＩ部位にクローニングされた。プラスミド構築物を表２に列挙し、ＰＣＲ増幅に使用したプライマーの情報を表３および表４に列挙する。
[0176]ヒト細胞におけるコドン最適化とタンパク質発現レベルとの関係を明らかにするために、同じ発現カセットを含有するが、ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ ＤＮＡコード配列についてはバリアントを有する４種のプラスミドを構築した。コード配列のうちの２つはＧＣ含量が低く、２つはＧＣ含量が高い。低および高ＧＣ含量コード配列のそれぞれ１つにおいて、ヒト抗体重鎖（Ｖｈ）分泌シグナルペプチドを使用して、ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ分泌シグナルペプチド（Ａｆ）を置き換えた。４種のプラスミドはすべて、ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）以外は同一のＤＮＡ配列を有する。発現カセットは、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０イントロン、ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ ＯＲＦの開始コドンの上流に位置するＫｏｚａｋ配列、および終止コドンの下流に位置する合成ポリアデニル化シグナルを含有する。ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐコドンのより多くのバリアントを作製するために、ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐコドンを変更して、ＡＭＩ１１９、ＡＭＩ１２０、およびＡＭＩ１３０プラスミドをクローニングした。全長ＡＡＶ２ ＩＴＲおよび切断型ＡＡＶ２ ＩＴＲによって挟まれたこれらの発現カセットの略図を図１に示す。各発現カセットの全長ＤＮＡ配列は、配列番号１３～配列番号１９または配列番号２１～配列番号２７である（配列番号２０は対照プラスミド配列であり、配列番号２８または配列番号７０は基準（ｒｅｆｅｎｃｅ）ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐの対照コード配列である）。
[0177]ヒト細胞に対する各ＯＲＦの推定ｅＣＡＩ値とＧＣ含量との関係を明らかにした。Ｗｅｂベースの無料Ｅ－ＣＡＩサーバに基づいて、予測コドン適応指標（ｅＣＡＩ）値を推定した。手短に述べると、標的ＤＮＡコード配列をそれぞれダイアログボックスに対してペーストした。同じサーバ内の「コドン使用データベース」からヒトのコドン使用テーブルを選択し、次のダイアログボックスにペーストした。ポワソン法を選択し（マルコフ法からも非常に類似した結果が得られた）、「標準」遺伝暗号を選択した。ｅＣＡＩ値は「許可」ボタンを押して推定した。結果を表５に示す。ＧＣ含量はｅＣＡＩ値と正の相関を示し、ＧＣ含量が高いほどｅＣＡＩ値は高かった。ＡＭＩ０５９およびＡＭＩ０６６は両方とも４０％という低いＧＣ含量を含有し、０．７２３および０．７２２のｅＣＡＩを含んだ。ＡＭＩ０６７およびＡＭＩ０６８は両方とも６２％という高いＧＣ含量を含有し、０．８６７と０．８６４のｅＣＡＩ値を含んだ。ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐの天然ｃＤＮＡ配列を、ＮＭ＿００１１６００３１の天然ｍＲＮＡ配列からの分泌シグナルペプチド配列およびＦＬＴ１ドメイン、ＮＭ＿００２２５２．３の天然ｍＲＮＡ ＫＤＲドメイン、ならびに天然ｍＲＮＡ ＡＫ１２９８０９．１のヒト抗体ＩｇＧ１ Ｆｃドメインを使用してコンパイルした。このコンパイルされた天然ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐは、ＧＣを５２％含み、ＡＭＩ０６７およびＡＭＩ０６８の最適化コドンよりもはるかに低い０．７９０のｅＣＡＩを有すると推定された。ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐコドンのさらなる変化により、表５に示すように、ＧＣ含量およびｅＣＡＩ値はわずかに変化した。ｅＣＡＩ値は高いほど、より一般的に使用されるコドンがＯＲＦ中に存在することを示すことから、これらの発現カセットにおけるより高いタンパク質発現レベルを示唆し得る。
実施例２：ＧＣ含量レベルの増加は、一過性にトランスフェクトされた哺乳動物細胞におけるＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ発現を強化する
[0178]哺乳動物細胞におけるＶＥＧＦ－Ｔｒａｐの発現に対するＧＣ含量の影響を明らかにするために、４種のプラスミド（ＡＭＩ０５９、ＡＭＩ０６６、ＡＭＩ０６７、およびＡＭＩ０６８）を精製して、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションのためには、細胞を１００ｍｍ細胞培養皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）上に、１０ｍＬ培地中で細胞約２×１０６個／皿で一晩播種した。１４μｇのプラスミドＤＮＡおよび２２μＬのリポフェクタミン３０００（Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ）をそれぞれ０．５ｍＬのＯｐｔｉ－ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ）で希釈して一緒に混合した。混合物を細胞に滴下し、細胞をＣＯ２インキュベーター内にて３７℃で４８時間インキュベートした。培地を採取した。
[0179]トランスフェクションの４８時間後に培地を採取し、直接ロードするか（非還元）、またはローディング緩衝液と混合し、９０℃で５分間加熱した後に（還元）、ＳＤＳ－ゲルにロードした。ＰＶＤＦ膜にブロットした後、ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐタンパク質を抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体により検出した。
[0180]図２に示すように、コーディング配列のＧＣ含量が高いと、ＧＣ含量の低いコーディング配列よりもタンパク質発現が高度であった。レーン１～５は非還元ゲルに対して示し、レーン６～１０は還元ゲルに対して示す。レーン３、４、５、８、９および１０は高いＧＣ含量を示し（プラスミドＡＭＩ０６７、レーン３および８、ならびにＡＭＩ０６８、レーン４、５、９および１０）、レーン１、２、６および７は低いＧＣ含量を示す（プラスミドＡＭＩ０５９、レーン１および６、ならびにＡＭＩ０６６、レーン２および７）。ＩｍａｇｅＪ（フリーソフトウェア、ＮＩＨ）で測定したウェスタンブロット画像の強度に基づけば、高いＧＣ含量のＯＲＦは、低いＧＣ含量のＯＲＦよりもタンパク質発現の９～１１倍への増加を示した。分泌シグナルペプチドの違いは、培地へのタンパク質の分泌にわずかな影響のみ及ぼすように思われた。低いＧＣ含量のＯＲＦでは、元のＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ分泌ペプチドは、ヒト抗体重鎖分泌シグナルペプチドよりもわずかに高い発現を示したが、高いＧＣ含量のＯＲＦでは、これら２種の分泌ペプチド間のタンパク質分泌に差はなかった。
実施例３：ＧＣ含量レベルはＡＡＶ２．Ｎ５３およびＡＡＶ２．Ｎ５４ベクターの産生に影響を及ぼさない
[0181]発現カセットをｓｃＡＡＶシャトルプラスミド骨格にクローニングし、Ｓｆ９細胞の同時感染によって、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２．５３およびＡＡＶ２．Ｎ５４ベクターを産生するようにｒＢＶを作製した。
[0182]Ｓｆ９細胞（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、１００単位／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ、ＣＡ）を含有するＥＳＦ ＡＦ培地（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ）中で、コーニングボトル内にて、２８℃で、１５０ｒｐｍで穏やかに振盪しながら培養した。細胞が、細胞約１ｅ＋７個／ｍＬに増殖した時点で、それらを新鮮な培地中で１：４に分割して新しいボトルに入れ、維持目的で連続的に培養した。
[0183]組換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）は、Ｂａｃ－ｔｏ－Ｂａｃバキュロウイルス発現系を使用して、製造元（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）の指示に従って作製した。手短に述べると、標的遺伝子を含有するｐＦＢシャトルプラスミドを、それぞれＴＥ緩衝液中に１ｎｇ／ｕＬに希釈し、各ＤＮＡの２ｎｇを、カテプシン遺伝子を欠失させたバクミドＤＮＡ分子を含有する２０μＬのΔｃａｔｈ－ＤＨ１０Ｂａｃコンピテントバクテリア（Ｖｉｒｏｖｅｋ、Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ）と混合し、氷上で３０分間インキュベートした後に、４２℃で３０秒間熱ショックを与えた。氷上で２分間インキュベートした後に、この細菌を３７℃で４時間培養して回収し、続いて５０μｇ／ｍＬカナマイシン、７μｇ／ｍＬゲンタマイシン、１０μｇ／ｍＬテトラサイクリン、４０μｇ／ｍＬ ＩＰＴＧ、および１００μｇ／ｍＬ Ｘ－ｇａｌを含有する寒天プレート上にプレーティングした。３７℃で４８時間インキュベートした後に、組換えバクミドＤＮＡを含有する白色コロニーを採取し、無菌条件下でミニプレップバクミドＤＮＡを精製した。約５μｇの各バクミドＤＮＡおよび１０μＬのＧｅｎｅＪｅｔ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＳｉｇｎａＧｅｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｆｒｅｄｒｉｃｋ、ＭＤ）を、それぞれ１００μＬのＥＳＦＡＦ培地（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｄａｖｉｓ、ＣＡ）で希釈し、続いて約３０分間一緒に混合して、トランスフェクション混合物を形成させた。Ｓｆ９細胞を、２ｍＬのＥＳＦＡＦ培地中で細胞１．５ｅ＋６個／ウェルで、６ウェルプレートにプレーティングし、２８℃で約３０分間置いた。Ｓｆ９細胞から古い培地を除去した後に、各トランスフェクション混合物を８００ｕＬのＥＳＦＡＦ培地で希釈し、続いてＳｆ９細胞に添加した。２８℃で一晩インキュベートした後に、各ウェルにさらに１ｍＬのＥＳＦＡＦ培地を添加した。合計４日間のインキュベーション時間の後に、ｒＢＶを含有する培地を収集し、１：２００の比率で増幅させて、ＡＡＶ産生プロセスに使用するのに十分な数量のｒＢＶを作製した。
[0184]本明細書に記載の修飾（例えば、少なくとも１個のコドン修飾）を含む非天然起源の核酸を含むＡＡＶベクターを産生させて精製するために、ＡＡＶ２ Ｒｅｐ遺伝子およびカプシド遺伝子を保有するｒＢＶ（ｒＢＶ－Ｃａｐ２－Ｒｅｐ、ｒＢＶ－Ｃａｐ２．Ｎ５３－Ｒｅｐ、ｒＢＶ－Ｃａｐ２．Ｎ５４－Ｒｅｐ）、ならびにＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ発現カセットを保有するｒＢＶ（ｒＢＶ－ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ）を使用して、ＡＡＶ産生のためにＳｆ９細胞を同時感染させた。手短に述べると、１０感染多重度（ｍｏｉ）のｒＢＶ－Ｃａｐ２－Ｒｅｐ（またはｒＢＶ－Ｃａｐ２．Ｎ５３－ＲｅｐまたはｒＢＶ－Ｃａｐ２．Ｎ５４－Ｒｅｐ）および５ｍｏｉのｒＢＶ－ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐを使用して、Ｓｆ９細胞株を５０％の新鮮ＥＳＦＡＦ培地とともに約５ｅ＋６個／ｍＬの細胞密度で、２８℃で３日間、振盪インキュベーター内で１８０回転／分（ｒｐｍ）の振盪速度で共感染させた。感染の最後に、３，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって細胞ペレットを回収した。この細胞を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１％サルコシル、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、および１２５単位／ｍＬのベンゾナーゼを含有するＳｆ９溶解緩衝液中で、激しいボルテックス処理によって溶解した後に、３５０ｒｐｍ、３７℃で１時間振盪させた。振盪の最後に、塩濃度をボルテックス処理によって５００ミリモル（ｍＭ）に増加させ、溶解物を４℃で２０分間、８，０００ｒｐｍで遠心分離することによって清澄化した。清澄化した溶解物を、５ｍＬの１．５０ｇ／ｃｃおよび１０ｍＬの１．３０ｇ／ｃｃ塩化セシウム溶液を含有するＳＷ２８スイングバケットローター用の超透明遠心管に移した。２８，０００ｒｐｍ、１５℃で約１８時間の遠心分離の後、ＡＡＶバンドをシリンジで収集し、７０Ｔｉ遠心分離ローター用の超透明遠心管に移した。遠心管に１．３８ｇ／ｃｃの塩化セシウム溶液を充填し、ヒートシールした。このＡＡＶ試料を６５，０００ｒｐｍ、１５℃で約１８時間の２回目の超遠心分離に供し、ＡＡＶバンドをシリンジで収集した。精製したＡＡＶ試料を、０．００１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８を含有するＰＢＳ緩衝液への緩衝液交換を行い、０．２２μｍシリンジフィルターにより濾過滅菌した。滅菌したＡＡＶ試料を１か月以内、４℃で保存した後に、長期貯蔵のために－８０℃に移した。ＡＡＶ力価は、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ７ Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用するリアルタイムＰＣＲ法を用いて決定した。
[0185]ＡＡＶ２、ＡＡＶ２．５３、およびＡＡＶ２．Ｎ５４ベクターの力価を、以下の表６に列挙する。ＡＡＶ２．５３ベクターの純度を図３に示し、これはＳｆ９細胞における低ＧＣおよび高ＧＣ ＡＡＶベクター産生のＳｉｍｐｌｙ Ｂｌｕｅ染色によるＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。Ｍはゲルのサイズマーカーを示す。図３Ａは、対照としてロードしたＡＡＶ５ベクター（１ｅ＋１１ｖｇ／レーンをロード）を、レーン２にロードしたＡＭＩ０５９（５ｅ＋１０ウイルスゲノム（ｖｇ）／レーンをロード）、レーン３にロードしたＡＭＩ０６６（５ｅ＋１０ｖｇ／レーンをロード）、レーン４にロードしたＡＭＩ０６７（５ｅ＋１０ｖｇ／レーンをロード）、およびレーン５にロードしたＡＭＩ０６８（５ｅ＋１０ｖｇ／レーンをロード）と比較して示す。図３Ｂは、対照としてロードしたＡＡＶ２ベクター（１ｅ＋１１ｖｇ／レーンをロード）を、レーン２にロードしたＡＭＩ１１９（１ｅ＋１１ｖｇ／レーンをロード）、レーン３にロードしたＡＭＩ１２０（１ｅ＋１１ｖｇ／レーンをロード）およびレーン４にロードしたＡＭＩ１３０（１ｅ＋１１ｖｇ／レーンをロード）と比較して示す。ＡＡＶベクターはすべて正常範囲で産生され、ＧＣ含量に関連した差は観察されなかった。
実施例４：ＧＣ含量レベルの増加は、ｓｃＡＡＶ２．Ｎ５３が形質導入された哺乳動物細胞におけるＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ発現を強化する
[0186]ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ発現カセットを有するｓｃＡＡＶ２．Ｎ５３ベクターを作製して精製した。それらを使用してＨＥＫ２９３細胞に形質導入し、ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐの発現レベルを、ウェスタンブロット分析およびヤギ抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ抗体を使用するＥＬＩＳＡアッセイにより決定した。
[0187]細胞培養のためには、ヒトＨＥＫ２９３細胞を、５％ＦＢＳ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を有するＤＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ）中で、Ｓｅｒｉｅｓ ＩＩウォータージャケット付きＣＯ２インキュベーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｏｒｍａ）内で、３７℃で培養した。維持のために、細胞を週１回、１：１０に分割した。
[0188]ＡＡＶベクター形質導入のためには、ＨＥＫ２９３細胞（図１０）またはｈＡＲＰＥ－１９細胞（図１１）を、１００ｍｍディッシュ中に２×１０６個の密度で播種し、３７℃のＣＯ２インキュベーター中で約８０％の集密度まで一晩増殖させた。翌朝、ＡＡＶベクターを１．０×１０４ｖｇ／細胞のＭＯＩで細胞に添加し、形質導入を３７℃で４８時間実施した。細胞を含まない上清を収集し、ウェスタンブロットによってタンパク質発現、またはＥＬＩＳＡによってタンパク質レベルについて分析した。形質導入はすべて、少なくとも３回の独立した実験を行った。
[0189]ＥＬＩＳＡでは、一過性トランスフェクションまたはＡＡＶ形質導入から採取した培地を１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して微粒子を除去し、アッセイに使用した。まず、９６ウェルプレートを、コーティング緩衝液中で１００μＬ／ウェルの組換えヒト内皮増殖因子－Ａ（ｒｈＶＥＧＦ－Ａ）により室温で一晩コーティングした。コーティング緩衝液を除去した後に、プレートを２００μＬ／ウェルの洗浄緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０／ＰＢＳ、ｐＨ７．３±０．１）で３回洗浄し、２００μＬ／ウェルのブロッキング緩衝液（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ、ｐＨ７．３±０．１）により室温で最低１時間ブロックした。ブロッキング緩衝液を除去した後に、プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄した。洗浄緩衝液の残留物を除去した後に、ブロッキング緩衝液で希釈した１００μＬ／ウェルの試験試料をプレートに添加して、室温で２時間置いた。試験試料を除去した後に、プレートを洗浄緩衝液で再び３回洗浄した。洗浄緩衝液の残留物を除去した後に、１００μＬ／ウェルのビオチン化マウスモノクローナル（Ｈ２）抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（ビオチン）検出抗体（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）をプレートに添加し、直接光から保護して室温で１時間インキュベートした。インキュベーションの終了後に、プレートを３回洗浄し、１００μＬ／ウェルの１Ｘ ＨＲＰ－ストレプトアビジン溶液をプレートに添加し、室温で４５分間インキュベートした。インキュベーションの終了後に、プレートを３回洗浄し、２００μＬ／ウェルの基質溶液（テトラメチルベンジジン）をプレートに添加した。室温で約１０分間から約１５分間インキュベートして発色させた後に、５０μＬ／ウェルの停止溶液（２Ｎ硫酸）をプレートに添加し、Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ ＥｎＶｉｓｉｏｎ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を使用して、波長４５０ｎｍで光学密度値を決定した。
[0190]ウェスタンブロットのためには、トランスフェクションから４８時間後にＨＥＫ２９３細胞上清を収集した。合計２０μｌの上清をローディング緩衝液と混合し、９５℃で５分間加熱し、電気泳動のためにＮｕＰＡＧＥ １０％Ｔｒｉｓ－Ｇｌｙｃｉｎｅゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にロードした。非還元ゲルについては、上清を非還元ローディング緩衝液と混合し、続いてゲルにロードした。ゲル上のタンパク質を、Ｘ Ｃｅｌｌ ＩＩ（商標）Ｂｌｏｔ Ｍｏｄｕｌｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用してＰＶＤＦ膜に移行させた。膜をＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）中のカゼインブロッカーにより室温で少なくとも１時間処理し、適切な一次抗体でプロービングした後に、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させた適切な抗ウサギまたは抗マウスＩｇＧ（Ａｍｅｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）とインキュベートした。タンパク質は、ＥＣＬ（商標）ウェスタンブロッティング試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して検出した。
[0191]結果を図４および表７に示す。図４Ａでは、レーン１～４に、それぞれＡＭＩ０５９、ＡＭＩ０６６、ＡＭＩ０６７、およびＡＭＩ０６８をロードした。図４Ｂでは、レーン１～４に、それぞれＡＭＩ１２０、ＡＭＩ１１９、ＡＭＩ０６７、およびＡＭＩ１３０をロードした。図４Ａに示すように、それぞれＡＭＩ０６７およびＡＭＩ０６８に対応するレーン３および４において、ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ ＯＲＦ中のＧＣ含量の増加は、ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐタンパク質の発現を増加させた。ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ ＯＲＦの低ＧＣ含量では、表６に示すように、ＡｆシグナルペプチドはヒトＶｈシグナルペプチドよりも高い発現を生じた（７倍の差）。しかし、ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ ＯＲＦの高ＧＣ含量では、表７に示すように、ＡｆシグナルペプチドとヒトＶｈシグナルペプチドとの間に差はなく、図４Ａのレーン３（Ａｆシグナルペプチド）を図４Ａのレーン４ならびに図４Ｂのレーン１、２、３および４（Ｖｈシグナルペプチド）と比較することによっても、ＡｆシグナルペプチドとヒトＶｈシグナルペプチドとの間に差はない。
実施例５：ＨＥＫ２９３細胞培地から精製した高純度のＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ
[0192]５００ｍＬの培養上清を、ＡＡＶ２－ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ（ＡＭＩ０６７）が形質導入されたＨＥＫ２９３細胞から採取し、蠕動ポンプによって０．２μｍのＯｐｔｉＳｃａｌｅフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して濾過した。ＨｉＴｒａｐＴＭ １ｍＬ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＰｒｉｓｍＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、まず５カラム容量（ＣＶ）の平衡化緩衝液（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）により１ｍＬ／分の流速で平衡化させた。その後、濾過した上清を、指示マニュアルに従って、ＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ １００システムを使用して、同じ流速でカラムにロードした。カラムを溶出前に同じ流速で１０ＣＶの平衡化緩衝液で洗浄した。ＡＡＶ－Ｅｙｌｅａタンパク質を、溶出緩衝液（０．１Ｍクエン酸ナトリウム二水和物ｐＨ３．０）（Ｆｉｓｈｅｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）の６ＣＶを使用して、０．５ｍＬ／分の流速で溶出させた。画分を、０．１容量の中和緩衝液（１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ９．０）を含有するチューブに収集した。溶出した回収物を、遠心フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ａｍｉｃｏ Ｕｌｔｒａ－４）を使用して１×ＰＢＳにより脱塩した。
[0193]ＡＡＶ２．５３－ＡＭＩ０６７による形質導入を受けたＨＥＫ２９３細胞からの培地をカラムクロマトグラフィー精製に供した。ｓｃＡＡＶ２．５３－ＡＭＩ０６７が形質導入されたＨＥＫ２９３細胞から採取した約５００ｍＬの培地から、合計約４．３ｍｇの純粋なＶＥＧＦ－Ｔｒａｐが得られた。ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ染色により、タンパク質が純粋であり、図５に示す市販製品（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ、ＮＹ）とゲル中で同じサイズである６６．５ｋＤａという正しい分子量を有したことが示される。
[0194]精製したＡＡＶ２．ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐベクターを使用して、細胞当たり５００，０００ベクターゲノム（ｖｇ）のＭＯＩでＨＥＫ２９３細胞に形質導入した。産生され、細胞培養上清中に放出されたＶＥＧＦ－Ｔｒａｐを、コーティング抗原として市販のＶＥＧＦ－Ａ１６５を使用する操作プロトコールを使用して毎日分析した。ＶＥＧＦ－Ａ１６５をＨＥＫ２９３細胞内で発現させ、均一に精製し（ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ、カタログ番号Ｚ０３０７３）、滅菌Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水中に１００μｇ／ｍＬで再構成した。ＥＬＩＳＡ手順は以下の通りとした：９６ウェルプレートを、５０μＬ容量のコーティング緩衝液中で、ウェル当たり最終濃度０．１μｇ／ｍＬのＶＥＧＦによりコーティングし、プレートを密封して覆い、プレートを４℃で一晩置いた。翌日のＥＬＩＳＡの手順は以下の通りとした：プレートを取り出して溶液を廃棄し、プレートをペーパータオルの上で軽くたたいて余分な溶液を除去し、プレートを洗浄緩衝液（３００μＬ）で３回洗浄した。最後の洗浄の後、プレートを新しいペーパータオルの上で再び軽くたたいて、可能な限り多くの緩衝液を除去した。３００μＬのブロッキング緩衝液を、マルチチャネルピペットを使用して各ウェルに添加した。プレートを密閉カバーで覆い、３７℃のインキュベーター内に２時間置いた。インキュベーション後に、ブロッキング緩衝液を廃棄し、プレートをペーパータオルの上で軽くたたいて余分な緩衝液を除去した。実験のスキームに従って各ウェルに５０μＬを添加することにより、ブロッキング緩衝液中に試料希釈液を調製した。プレートを密閉カバーで覆い、インキュベーター内に戻して１時間（ｈｒ）置いた。１時間後、溶液を廃棄し、プレートを３００μＬの洗浄緩衝液で６回洗浄した。余分な溶液を、上記のようにペーパータオル上で軽くたたくことにより除去した。捕捉抗体をブロッキング緩衝液中に１：４０，０００希釈で添加し、３７℃で１時間インキュベートした。溶液を廃棄し、必要に応じて洗浄手順を繰り返した。検出抗体をブロッキング緩衝液中に１：４０，０００希釈で添加し、３７℃で１時間置いた。溶液を廃棄し、最後の洗浄として、プレートをさらに（洗浄緩衝液中で５分間）インキュベートして洗浄した。続いて、洗浄緩衝液を廃棄し、ＰＢＳでさらに１回洗浄した。５０μＬのＴＭＢを添加した。プレートを、直接光源を避けて１５～２０分間（１５分未満であってもよい）、またはシグナルの飽和が最高濃度のウェルで観察されるまで維持した。続いて、５０μＬの停止溶液を添加し、プレートを１５分以内に６２０ｎｍを基準として４５０ｎｍで読み取った。
[0195]図１０から見てとれるように、ＡＡＶ２．０５４－ＡＭＩ１２０による形質導入を受けたＨＥＫ２９３細胞から採取した細胞培養上清は、およそ８００ｎｇ／ｍＬまでＶＥＧＦ－Ｔｒａｐを分泌したが、形質導入されていないＨＥＫ９３細胞はＶＥＧＦ－Ｔｒａｐを分泌しなかった。生産は、培養日数を増やしても細胞が老化するまで継続する（図１１）。
[0196]ＡＡＶ２．Ｎ５３－ＶＥＧＦ－ＴｒａｐベクターによるＨＥＫ２９３細胞の形質導入によって発現させたＶＥＧＦ－Ｔｒａｐを、プロテインＡアフィニティカラムクロマトグラフィーにより精製した。カラム溶出液を中和し、緩衝液を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）に変更した。ベクター由来ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐの純度を、１．５μｇ／レーンをＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（１０％）にロードし、クーマシーブルーＲ－２５０で染色して決定したところ、ゲル中に６６．５ｋＤａの単一バンドが認められる。その大きさは市販のＶＥＧＦ－Ｔｒａｐと同一であった（図５Ａ）。
[0197]ＡＶＭＸ－１１０由来ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐの結合親和性は、ＡＶＭＸ－１１０由来ＶＥＧＦ－ＴｒａｐのＶＥＧＦ－Ａ１６５への結合を分析するための２つの方法、すなわちＥＬＩＳＡおよび表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した。ＥＬＩＳＡについては、ＡＶＭＸ－１１０由来ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐと市販のアフリベルセプト（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ、Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ、ＮＹ）のＶＥＧＦ－Ａ１６５への結合を、同じ条件下で並行して実施した。その結果、図５Ｂおよび図５Ｃに示すように、両者の結合は同じであることが示され、ＡＶＭＸ－１１０由来ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ（Ａ）およびアフリベルセプト（Ｂ）に対するＩＣ５０はそれぞれ１５９．１ｎｇ／ｍＬおよび１５８．８ｎｇ／ｍＬであった。結合定数（Ｋｄ）は、分子量１１５０００Ｄａを使用してナノモル濃度で算出された。ＡＶＭＸ－１１０由来ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐの親和性は、市販のアフリベルセプトと同一であった（ＡＶＭＸ－１１０由来ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐおよび市販のアフリベルセプトともに１．３８ｎＭ）。したがって、精製産物はＡＡＶ２．ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ由来のものと同じように機能した。
[0198]生化学的および生物学的特性に基づけば、ＡＶＭＸ－１１０は、ＨＥＫ２９３および網膜細胞ＡＲＰＥ－１９を含むヒト細胞の形質導入のためのＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ遺伝子を保有する適格なＡＡＶベクターである。ＡＡＶ２．Ｎ５４－ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐの産物は、現在市販されているアフリベルセプトと同様に、インビボでＶＥＧＦ－Ｔｒａｐを産生することができる。したがって、ＡＶＭＸ－１１０（ＡＡＶ２．Ｎ５４－ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ）は、インビボでの新生血管網膜障害の処置のための長期発現に使用することができる。
[0199]ＡＶＭＸ－１１０由来ＶＥＧＦ－ＴｒａｐとヒトＶＥＧＦ－Ａ１６５との間の相互作用を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法により分析した。０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳ－Ｔ）を含むリン酸緩衝生理食塩水中にある２００ｎＭのＡＶＭＸ－１１０由来ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐまたはアフリベルセプト１５μＬを、センサーチップタンパク質Ａに結合させた。ＡＶＭＸ－１１０ ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐおよびアフリベルセプトは、ヒトＶＥＧＦ－Ａ１６５を発現させたＨＥＫ２９３にそれぞれ３３ｐＭおよび５５ｐＭのＫｄで強固に結合した（図１３および表８）。
[0200]ＨＵＶＥＣ細胞の増殖阻害を使用して、インビトロでのＡＶＭＸ－１１０の効力を決定した。手短に述べると、ＡＶＭＸ－１１０をまず使用してＨＥＫ２９３細胞に形質導入し、３７℃で４日間培養した。細胞培養上清を採取し、アフィニティカラムクロマトグラフィーを介して精製した。精製したＶＥＧＦ－Ｔｒａｐを、ヒトＶＥＧＦ－Ａ１６５により誘導されるＨＵＶＥＣ細胞増殖を遮断することについて、市販のアフリベルセプト（Ｅｙｌｅａ、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ、ＮＹ）と比較した。アッセイは２回繰り返した。手短に述べると、９６ウェルマイクロプレート中で、ＨＵＶＥＣ細胞（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＲＬ－１７３０、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を１００μＬの細胞培養培地中に細胞５０００個／ウェルで播種し、５％ＣＯ２および湿度９０％のＣＯ２インキュベーター中でインキュベートした。細胞を２４時間かけて接着させ、細胞培養培地を除去し、２０ｎｇ／ｍＬのヒトＶＥＧＦ－Ａ１６５を含有する１００ｍＬ／ウェルの新鮮なアッセイ培地（１％ｄＦＢＳを含む血管細胞基礎培地）で置き換え、続いて個別に１／０、１：２、１：５、１：１０および１：１００のモル比（ＶＥＧＦ－Ａ１６５／ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ）またはそれぞれ０、１０１、２５３、５０６および５０６０ｎｇ／ｍＬの精製ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ（ＶＥＧＦ－Ａ／ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ）で置き換えた。市販のアフリベルセプト（４０ｍｇ／ｍＬ）およびＡＡＶ２．ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐの両方を同じ比率に希釈した。プレートを７２時間インキュベートした後に、測定手順を実施した。各ウェル中のアッセイ培地を除去し、新鮮なアッセイ培地（９０μＬ）を１０μＬのＷＳＴ－８（Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、カタログ番号ＣＫ０４－１１、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）とともに添加した。添加後に１時間毎にプレートを読み取った。データにより、ＡＡＶ２．ＶＥＧＦ－ＴｒａｐによるＨＵＶＥＣ細胞増殖の阻害は、ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐの濃度に依存することが実証された。その効力はアフリベルセプトと等しく有効である（図１２）。
実施例６：ＡＡＶ２由来ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐのグリコシル化の測定
[0201]ＡＡＶ２．Ｎ５４－ＡＭＩ１２０由来ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐタンパク質を、１００，０００のＭＯＩでＡＶＭＸ－１１０による形質導入を受けたＨＥＫ２９３の細胞培養上清から精製し、アフィニティカラムクロマトグラフィーにより精製した。精製したＶＥＧＦ－Ｔｒａｐを、糖タンパク質からすべてのＮ結合型炭水化物を除去するのに理想的である組換えフラボバクテリウム・メニンゴセプチカム（Ｆ．ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）ＰＮＧアーゼＦ酵素で処理した。処理は市販のアフリベルセプトを使用して実施した。処理混合物をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルシフト分析により分離した。ＮＰＧアーゼＦの存在下では、炭水化物はＮ結合を介して糖タンパク質から除去され、すると脱グリコシル化されたタンパク質は分子量の減少のためにより速く移動した（図１２）。
実施例７：ベクター発現ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐおよびアフリベルセプト（Ｅｌｙｅａ）を使用したＶＥＧＦ－Ａ１６５の結合親和性（ＫＤ）に関するＢｉａｃｏｒｅ結合アッセイ
[0202]ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐタンパク質を、発現ベクターＡＡＶ２．Ｎ５４－ＡＭＩ１２０をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞で発現させ、プロテインＡアフィニティカラムクロマトグラフィーにより精製した。溶出液を中和し、４．３１ｍｇ／ｍｌの濃度まで濃縮した。アフリベルセプトは市販品であり、４ｍｇ／ｍｌに希釈した。ＶＥＧＦ－Ａ１６５はＧｅｎｅｓｃｒｉｐｔ（ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ、カタログ番号Ｚ０３０７３、Ｎａｎｊｉｎｇ Ｃｈｉｎａ）から入手し、１ｍｇ／ｍｌに再構成した。各ストックタンパク質の使用液を、実験前に２００ｎＭで調製した。モル濃度はＭＷを使用して計算した：ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐおよびアフリベルセプトについては１１５ｋＤａ、ＶＥＧＦ－Ａ１６５については４５ｋＤａであった。Ｂｉａｃｏｒｅ操作は、プロテインＡセンサーチップをＶＥＧＦ－Ｔｒａｐまたはアフリベルセプトで２００ｎＭでコーティングし、１５μＬを５μＬ／分間で注射した後に、連続希釈した２００、１００、５０、２５、１２．５および０ｎＭのＶＥＧＦ－Ａ１６５溶液の９０μＬを３０μＬ／分の流速で注射することにより開始した。結合動態シミュレーションは、Ｂｉａｃｏｒｅ評価ソフトウェアを使用して解析した。ＡＡＶ２．Ｎ５４－ＡＭＩ１２０由来ＶＥＧＦ－ＴｒａｐのＫＤは、ＶＥＧＦ－Ａ１６５との結合について３３ｐＭであった。アフリベルセプトのＫＤは、ＶＥＧＦ－Ａ１６５との結合について５５ｐＭであった。表８および図１３に示した結合動態パラメータから、ＡＡＶ２．Ｎ５４－ＡＭＩ１２０由来ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐはアフリベルセプトと類似していることが示される。
実施例８．ベクター発現ＶＥＧＦ－ＴｒａｐのｒｈＶＥＧＦ－Ａ１６５との結合親和性
[0203]結合親和性を決定するためのアッセイを実施した。手短に述べると、ＡＡＶ２．Ｎ５４－ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐにより発現させたＶＥＧＦ－Ｔｒａｐから精製したものを、ｒｈＶＥＧＦへの結合親和性についてアッセイした。９６ウェルプレートを、０．１μｇ／ｍＬのｒｈＶＥＧＦ－Ａ１６５で２～８℃で一晩コーティングした。プレートを洗浄緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０／ＰＢＳ、ｐＨ７．３±０．１）により３回×３００μＬの洗浄を行い、１％カゼインを含有するブロッキング緩衝液で１２０分間かけてブロックした。ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐまたはアフリベルセプト（上記と同じロット）を２００、１００、５０、２５、１２．５、６．２５および３．１ｎｇ／ｍＬで連続的に希釈し、各ウェルに１００μＬ／ウェルで個別に添加して、３７±１℃で６０分間インキュベートした。希釈した（１：４０，０００）ビオチン化ウサギ抗ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ抗体溶液を、３回×３００μＬ／ウェルの洗浄緩衝液の後に、１００μＬ／ウェルで添加した。さらに、３７±１℃で６０分間インキュベートし、３回×３００μＬ／ウェルの洗浄緩衝液で洗浄した。最後に、各ウェルに、ストレプトアビジン－ＨＲＰ、１：４０，０００を１００μＬ／ウェルで添加し、３７±１℃で６０分間インキュベートした。３×３００μＬ／ウェルの洗浄後に、基質ＴＭＢ溶液を添加し、３７±１℃で１５分間インキュベートした後に、１００μＬ／ウェルの停止溶液で停止させた。プレートを、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）により６００ｎｍの波長で読み取った。アッセイの結果、ｒｈＶＥＧＦ－Ａ１６５へのＶＥＧＦ－Ｔｒａｐおよびアフリベルセプトの結合親和性は、それぞれ７５ｐＭおよび６０ｐＭであり、ｒｈＶＥＧＦ－Ａ１６５への結合は両タンパク質とも同程度であることが実証された（図１４および表９）。
実施例９．ＶＥＧＦ－Ａ１６５により刺激されるＨＵＶＥＣ細胞増殖の阻害
[0204]精製したＶＥＧＦ－Ｔｒａｐを、ヒトＶＥＧＦ－Ａにより誘導されるＨＵＶＥＣ細胞増殖を遮断することに関して、市販のアフリベルセプト（Ｅｙｌｅａ）（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ、ＮＹ）と比較した。アッセイは２回繰り返した。手短に述べると、９６ウェルマイクロプレート中で、ＨＵＶＥＣ細胞（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＲＬ－１７３０、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を１００μＬの細胞培養培地中に細胞５０００個／ウェルで播種し、５％ＣＯ２および湿度９０％のＣＯ２インキュベーター内でインキュベートした。２４時間の培養後に、細胞培養培地を除去し、２０ｎｇ／ｍＬのヒトＶＥＧＦ－Ａ１６５を含有する１００ｍＬ／ウェルの新鮮なアッセイ培地で置き換え、続いて個別に１：０、１：２、１：５、１：１０および１：１００のモル比（ＶＥＧＦ－Ａ１６５／ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ）またはそれぞれ０、１０１、２５３、５０６および５０６０ｎｇ／ｍＬの精製ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐで置き換えた。市販のアフリベルセプト（４０ｍｇ／ｍＬ）およびＡＡＶ．ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐを同じ比率で希釈した。アッセイ培地は、１％ｄＦＢＳを含む血管基礎培地であり、プレートを７２時間インキュベートした後に、測定手順を実施した。各ウェル中のアッセイ培地を除去し、新鮮なアッセイ培地（９０μＬ）を、１０μＬのＷＳＴ－８（Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、カタログ番号ＣＫ０４－１１、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）とともに添加した。添加後の１時間毎にプレートを読み取った。データにより、ＡＡＶ．ＶＥＧＦ－ＴｒａｐがＨＵＶＥＣ細胞増殖をＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ濃度依存性に阻害することが実証された。その効力はアフリベルセプトと等しく有効であった（図１５）。
実施例１０．レーザー誘発血管新生によって引き起こされた脈絡膜損傷のＡＡＶ２．Ｎ５４－ＡＭＩ１２０ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ保護のインビボ評価
[0205]マウスＬＣＮＶモデルを使用して、ＡＡＶ２．Ｎ５４－ＡＭＩ１２０－ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐの有効性および薬物動態を検討した。コホートの試験を表１０に示す。
[0206]８～１２週齢で各１５～２５ｇのマウス（Ｍｕｓ Ｍｕｓｃｕｌｕｓ）／Ｃ５７ＢＬ／６（Ｃｈａｒｌｅｓ ＲｉｖｅｒまたはＴａｃｏｍｉｃ Ｆａｒｍｓ）を試験に使用する。動物をランダムに１群５匹ずつの群に分ける。レーザー照射の２８日前に、各動物に両側性に、１群当たり１０個の眼に、試験物を硝子体内（ＩＶＴ）に注射する。ＡＡＶ２．Ｎ５４ＡＭＩ１２０の試験物を、マイクロリットル（μＬ）当たり高用量（１．６ｅ＋１０）、中用量（４ｅ＋８）および低用量（２ｅ＋７）の３つの用量で試験する。対照として、ＡＡＶ２．Ｎ５４－ＧＦＰをベクター伝達対照として使用する。ＡＡＶ２．Ｎ５４－ＡＭＩ１２０製剤緩衝液（ビヒクル）を陰性対照として使用する。レーザー損傷の２８日前にマウスに試験物および対照を投与（ＩＶＴ投与）し、対照動物にはアフリベルセプトおよびビヒクルをレーザー照射の３日前に投与する。レーザー照射の７日後に、全群を蛍光眼底造影、血清および眼杯のＶＥＧＦ－Ｔｒａｐレベルについて分析する。ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ濃度はＥＬＩＳＡを使用して検出する。上述のインビトロ効力試験の結果によれば、ＡＡＶ２．Ｎ５４－ＡＭＩ１２０が投与された動物は、炎症および創傷治癒に反応する血管新生による保護を得ることができるが、一方、ＡＡＶ２．Ｎ５４－ＧＦＰおよびビヒクル対照は何ら保護を得られない可能性がある。
実施例１１：マウスのレーザー誘発脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）モデルにおけるアフリベルセプト（ＡＶＭＸ－１１０）をコードする修飾アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ２）の有効性
[0207]本試験の目的は、マウスの脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）のレーザー誘発モデルにおいて、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ２）ベクターを使用する血管新生の阻害を評価することとした。表１１は、本試験の実験デザインを図示する。
[0208]このレーザー脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）試験は、マウス（Ｍｕｓ Ｍｕｓｃｕｌｕｓ）Ｃ５７ＢＬ／６系統を使用して実施した。本試験は有効なＧＬＰ非準拠試験の合格基準を満たすが、これはＩＶＴ注射後のアフリベルセプトで処置された動物において、フルオレセイン眼底造影（ＦＡ）およびフラットマウント免疫蛍光法を介して評価したＣＮＶ病変の平均サイズが、製剤緩衝液または対照ベクター（ＧＦＰ－ＡＡＶ２）と比較して大幅に減少したためである。
[0209]試験物は注射可能な状態で提供され、使用するまで－７０℃未満で保存した。アフリベルセプトは冷蔵（２～８℃）で保存し、希釈せずにそのまま注射した。注射の３０分前に、各試験物を３７℃水浴中で２０分間解凍させ、ウイルス凝集を減少させるためにボルテックス処理により撹拌した。
[0210]注射前の－第２８日（第３群～第６群）および－第３日（第１群および第２群）に、マウスにブプレノルフィン０．０１～０．０５ｍｇ／ｋｇを皮下（ＳＱ）投与した。その後、硝子体内注射のためにイソフルレン吸入により動物を鎮静させ、０．５％プロパラカインＨＣＬ １滴を両眼に適用した。結膜をＤｕｍｏｎｔ＃４鉗子で穏やかに把持し、３３Ｇ針およびＨａｍｉｌｔｏｎ Ｓｙｒｉｎｇｅを使用して注射を行った。シリンジ内容物を分注した後に、シリンジ針をゆっくりと抜去した。注射手順の後に、オフロキサシン点眼液１滴を眼用潤滑剤とともに眼表面に局所的に適用した。
[0211]第０日に、マウスにブプレノルフィン０．０１～０．０５ｍｇ／ｋｇをＳＱ投与し、レーザー処置の少なくとも１５分前に局所散瞳薬（１．０％トロピカミドＨＣＬおよび２．５％フェニレフリンＨＣＬ）を適用した。マウスにケタミン／キシラジンを腹腔内（ＩＰ）注射して鎮静させた。局所洗眼液を使用して角膜を湿らせ、ホットパッドを使用して体温を維持した。細隙灯を通して届く５３２ｎｍダイオードレーザーを使用して、視神経を囲む４個の単一レーザースポットを作成した。マウスの両眼に、所定の時間間隔でレーザー処置を行った。レーザー後に眼用潤滑剤を適用した（ＯＵ）。
[0212]病的状態および死亡について毎日観察するとともに、ケージ外部からの観察を行い、特に両眼に注意を払った。第２群（番号２１０、２１２および２１６）および第４群（番号４３２）では、４匹が投薬後、レーザー照射前に死亡した。第４群（番号４３０）および第６群（番号６４４）では、さらに２匹が最終組織採取前に死亡したが、これはレーザー照射後であった。
眼底撮影
[0213]第３群（ＡＡＶ２－ＧＦＰ、１．６ｅ１０ｖｇ／眼）の動物の両眼について、レーザー後第７日およびフルオレセイン眼底造影（ＦＡ）前に、カラーおよびコバルトブルー（ＥＧＦＰ発現）の両方の眼底撮影を実施した。動物にトロピカミド（１．０％）およびフェニレフリン（２．５％）のカクテルを局所投与して、眼を散大させて突出させ、眼に局所眼麻酔薬（０．５％プロパラカインまたは類似物）を適用した。カラー眼底写真に続いてコバルトブルー写真を撮影した。強度設定は、取得中は動物の間で一定に保った。図１６に示すように、ＧＦＰは、眼底の撮影を妨げる白内障を有した３１８ ＯＳを除き、すべての眼で観察された。観察された白内障は、ＩＶＴ注射中の水晶体への外傷によって引き起こされた可能性がある。
フルオレセイン眼底造影（ＦＡ）
[0214]レーザー後第７日に両眼にＦＡを行った。ＦＡのための散瞳は、検査の１５分前に各眼に局所点眼薬（１．０％トロピカミドＨＣＬおよび２．５％フェニレフリンＨＣＬ）を使用して達成した。マウスはケタミン／キシラジンのＩＰ注射で鎮静させた。静脈内フルオレセインナトリウム注射（１％貯蔵液、１２ｍｇ／ｋｇ）の約１分後に網膜写真の撮影を行った。フルオレセイン漏出をＩｍａｇｅＪソフトウェアで解析した。代表的画像を図１７に示し、これは第７日のフルオレセイン眼底造影を図示する。各群の代表的画像を示す。第３群の病変の測定は、ＡＡＶによって発現されたＧＦＰが分析を妨げたために実施できなかった。眼底造影図を使用して、病変領域をピクセル±標準偏差（ＳＤ）として定量化し、その結果を図１８に提示する。レーザー後第７日の試験では、第６群（ＡＶＭＸ１１０、１．６ｅ１０ｖｇ／眼）の平均病変面積が最も小さく、ビヒクル群の病変面積が最も大きかった。
眼組織の採取および処理
[0215]第７日に動物を人道的に安楽死させ、眼球を摘出して、直ちにリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）により４℃で一晩固定した。解剖顕微鏡を使用して、各眼から無関係な組織を取り除き、前眼部および水晶体を除去した。網膜を剥離させ、微細な湾曲ハサミにより視神経頭部から取り出した。眼杯を冷免疫細胞化学（ＩＣＣ）緩衝液（ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡおよび０．２％Ｔｗｅｅｎ２０）ですすぎ洗い、ＩＣＣ緩衝液中で少なくとも６時間かけてブロックした。続いて、眼杯を、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ、核）、ファロイジンＤｙＬｉｇｈｔ ５５０（アクチン細胞骨格）およびイソレクチンＩＢ４－ＤｙＬｉｇｈｔ ６４９（血管）を含有する冷ＩＣＣ緩衝液中に入れ、４℃で穏やかに回転させながら２．５時間インキュベートした。組織を洗浄し、病変を避けて視神経頭部に向かって放射状に切断し、組織をフラットマウントした。二次元（２Ｄ）蛍光顕微鏡画像をＯｌｙｍｐｕｓ Ｂｘ６３蛍光スコープで取得し、イソレクチンＩＢ４シグナル面積（μｍ２）およびＣｅｌｌＳｅｎｓソフトウェアを使用して、新たに形成された血管を定量化した。代表的画像を図１９に示す。イソレクチン面積の定量化を図２０に示す。アフリベルセプトの注射により病変面積は減少した。第３群の眼は最大の病変面積を有したが、これはＡＡＶ２構築物によって動員されたＧＦＰによって部分的に影響を受けた可能性がある。第３群からのＡＡＶ２－ＧＦＰと比較して、ＡＶＭＸ－１１０は試験したすべての用量で病変サイズを減少させた（第４群～第６群）。
[0216]本試験は、マウスに試験物（第３群～第６群）および陽性対照（アフリベルセプト、第２群）をＩＶＴ投与した後の網膜血管漏出の阻害を明らかにするために実施した。レーザーＣＮＶによる誘発前に十分な発現が確保されるように、第２８日にＡＡＶ２ベクター（第３群～第６群）を注射し、第３日にビヒクルおよびアフリベルセプト（第１群および第２群）を注射した。実施する検査および本試験の目的に基づき、アフリベルセプト対照群ではレーザー後第７日に、ビヒクル群と比較して病変サイズが縮小した。アフリベルセプト（陽性対照、フルオレセイン面積の４０．５％減少）と比較して、第５群および第６群の試験物では、少なくとも１つのエンドポイント解析で同等性または優越性が示され、ＡＶＭＸ－１１０の最高用量（１．６ｅ１０ｖｇ／眼）では、造影検査のエンドポイントで血管漏出が６８％減少した。フラットマウントにおける病変サイズの解析では、ＡＡＶ２調製物を注射したすべての眼が、ビヒクルまたはアフリベルセプトを注射した眼よりも大きな病変を有した。しかし、ＡＶＭＸ－１１０をＡＡＶ２－ＧＦＰと比較した場合には、ＡＶＭＸ－１１０の３つの用量レベルすべてで病変サイズが縮小し、ＡＶＭＸ－１００の最高用量ではイソレクチン面積の４０％の減少がもたらされた。
実施例１２．ＡＶＭＸ－１１０およびＡＶＭＸ－１１６の分析
[0217]実施例１２は、ＡＶＭＸ－１１０およびＡＶＭＸ－１１６の候補選択につながるデータの包括的分析を示す。この戦略は、構築物の設計、クローニング、配列決定、生産、精製および生物分析を含んだ。データは一元配置ＡＮＯＶＡ法を使用して分析した。最も優れる発現、効力および浸透性（インビボ）を有する候補を、以下の基準に基づいて選択した：目的の遺伝子（ＧＯＩ）、カプシド、およびＡＡＶ血清型。
カプシドの操作および選択
[0218]野生型ＡＡＶ２カプシドは、ＧＯＩの浸透性または発現を増加させるために、特定の部位に変異を導入するように秩序立った方法で操作されている。以下の変異のリストを導入し、マウスおよび／またはブタモデルにおいてスクリーニングして、発現および浸透性を調べた（表１２）。配列および位置は、ＡＡＶ２－ＶＰ１のループ４に短いペプチド断片とともに挿入され（表１２）、プラスミド名は表１３に列挙されている。
[0219]２Ｅ＋１０ｖｇ／眼の種々の構築物をマウスモデルに注射した。図２１は、すべての群の眼底画像を示す。これらの画像は、構築物の注射後第２３日に記録した。Ｖ２２６は陽性対照であり、良好な発現を示した。各群の眼の１個をさらに免疫組織化学によって分析したところ（図２２）、構築物ＡＭＩ－０５３、ＡＭＩ－０５４、ＡＭＩ１０４およびＶ２２６を注射した眼は高輝度のＧＦＰ発現を示した。ＡＭＩ０５４は特に神経節細胞層（ＧＣＬ）、内網状層（ＩＰＬ）および外核層（ＯＮＬ）において均一な発現を示した。他のマウス試験では、前述の構築物のうちの残りについて分析した。２０－ＡＶＩ－００２と同様に、２Ｅ＋１０ｖｇ／眼の構築物をマウスの眼に注射した。第２４日に眼底撮影を行った（図２３）。
[0220]ＡＭＩ１０１、ＡＭＩ１０４およびＡＭＩ１０５を第２８日に免疫組織化学（図２４）に供したところ、ＡＭＩ１０４はＧＣＬ、ＩＰＬ、内核層（ＩＮＬ）、外網状層（ＯＰＬ）、ＯＮＬ、内節（ＩＳ）および外節（ＯＳ）においてＧＦＰ発現の均一な分布を示した。これらのマウス試験から、いくつかの候補（ＡＭＩ０５３、ＡＭＩ０５４、ＡＭＩ１０１、ＡＭＩ１０４、ＡＭＩ１０５およびＶ２２６）を追加のブタ試験のために選択した。各ブタ眼に１Ｅ＋１１ｖｇ／眼を注射した。図２５は、ブタ試験における動物の眼底画像を示す。ＡＭＩ０５３は、マウス試験で観察された結果と同様にわずかなＧＦＰ発現を示した。ＡＭＩ０５４は、Ｖ２２６と同様に均一で高輝度の発現を示した。構築物の発現および浸透性をさらに確認するために、マウス試験と同様に、注射後第２８日に作製した凍結切片（図６）に対して免疫組織化学（ＩＨＣ）を実施した。ＩＨＣデータによれば、ＡＭＩ０５４およびＶ２２６は、最も輝度が高く、最も広く、かつ一貫したＧＦＰ発現を示した。Ｖ２２６は主としてＧＣＬで強いＧＦＰ発現を示し、ＡＭＩ０５４はＩＮＬで強いＧＦＰシグナルを示した。マウスおよびブタの試験から、ＡＭＩ０５４は最も輝度が高く、最も広く、かつ一貫した結果を示したと結論付けることができる。このため、ＡＭＩ０５４を選択し、ＡＶＭＸ－１１０の挿入およびスクリーニングのためのＡＡＶカプシドとして最終的に決定した。眼の異なる層をより良く描出するために、共焦点顕微鏡画像も記録した。これらの画像により、異なる眼層へのカプシドの浸透性が示された（図２７）。ＡＭＩ０５４はＧＦＰ発現についてはより少なかったが、ＩＮＬ内へのより深い浸透性を示した。Ｖ２２６はＲＧＣ層での発現がより多かった。
ＧＯＩスクリーニング
[0221]候補を最終的に決定する前に、いくつかの構築物を設計してスクリーニングした。すべての構築物の発現プロファイルを、ヒト胎児腎細胞（ＨＥＫ２９３）細胞で調べた。構築物のいくつかは、ＡＲＰＥ－１９細胞（ヒト網膜色素上皮細胞）およびｈＴＥＲＴ－ｒｐｅ１（ヒトテロメラーゼ逆転写酵素－網膜色素上皮細胞）でも調べた。ｈＴＥＲＴ－ｒｐｅ１細胞は、ＲＰＥ－３４０細胞株（初代ヒトＲＰＥ細胞株）にｐＧＲＮ１４５ ｈＴＥＲＴ発現プラスミドをトランスフェクトすることによって導き出した。これを使用して、初代ＲＰＥ細胞を模した。表１４は、種々の細胞株におけるこれらの構築物の発現を示す。例えば、ＡＡＶ２．Ｎ５４．１２０ウイルス粒子（ＡＶＭＸ－１１０とも命名される）は、ＡＡＶ２．Ｎ５４カプシド内にパッケージングされた非天然起源の核酸を含み、高ＧＣ含量（「ＧＣＲＳ」中の「ＧＣ」によって示される）、アルギニンをコードするコドンＡＧＧ（「ＧＣＲＳ」中の「Ｒ」によって示される）、およびセリンをコードするコドンＴＣＣ（「ＧＣＲＳ」中の「Ｓ」によって示される）を含む。別の例として、ＡＡＶ６．Ｎ５４．１２０ウイルス粒子（ＡＶＭＸ－１１６とも呼ばれる）は、ＡＡＶ２．Ｎ５４カプシド内にパッケージングされた非天然起源の核酸を含み、高ＧＣ含量（「ＧＣＲＳ」中の「ＧＣ」によって示される）、アルギニンをコードするコドンＡＧＧ（「ＧＣＲＳ」中の「Ｒ」によって示される）、およびセリンをコードするコドンＴＣＣ（「ＧＣＲＳ」中の「Ｓ」によって示される）を含む。
[0222]表１４に列挙された３種の構築物（Ｎ５４．１２０、Ｎ５４．１９０およびＮ５４．２２１）は、他の構築物と比較して、より高度なアフリベルセプトの発現を示した。これらの３種の候補についてＡＡＶ構築物の骨格を図２８Ａに示す。製造プロセス中に、プロセスの正確な制御を達成することを目的として、さまざまな検査の目的のために、プロセス段階のさまざまな時点で試料を採取した。２回の製造実行について例示的な試料プロセスクロマトグラムを図２８Ｂに示す。捕捉段階を通して、ＡＶＭＸ－１１０ベクターの単一でかつ鋭い画分がプロセス（矢印）中に得られた。ＡＶＭＸ－１１０のほぼ１００％の粒子が捕捉プロセスによって捕捉され、プロセス中間プールに８０％超が溶出した。図２８Ｃ ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる溶出したＡＶＭＸ－１１０プロセス中間体の純度の分析。ＡＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３は明瞭に描出され、他の主要な不純タンパク質は見られなかった。カプシド電荷の違いにより、カラムプロセスにおける空および充填ＡＡＶのパフォーマンスプロファイルが確立された。この条件下では、空のカプシドは充填カプシドよりも速くカラム中を移動した。保持時間の差異は、充填カプシドから空のカプシドを分離するのに十分であった（図２８Ｄ）。捕捉段階の溶出液プールを処理して、空のカプシドの一部を分離した。分離曲線を図２８Ｅに示す。この分離モデルを使用して、ＡＶＭＸ－１１０を精製し、充填カプシド含量を濃縮した。分離クロマトグラムにおいて、２つの別々のピークが得られた。濃縮および緩衝液交換を行って最大能力濃縮画分ポストカラムクロマトグラフィーを成功させて、さらなる評価のための原薬を作製した。各開発ロットについて、ＡＡＶ２抗体のウェスタンブロット法による検出で、ＡＶＭＸ－１１０の製造中間体および原薬の試料を特異性について分析した。ＡＡＶ２ ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３に対する抗体は、ゲルおよびウェスタンブロットで認められた唯一のタンパク質バンドであった（図２８Ｆ）。ＡＶＭＸ－１１０の純度を、銀染色法によって染色したゲル電気泳動によって分析した。最初のピークは空カプシドであり、第２のピークは充填カプシドであった。産物はＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３を含有するＡＡＶ粒子であった。ＡＶＭＸ－１１０プロセス中間体の純度を、銀染色ゲルで染色したＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した（図２８Ｇ）。ＡＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３は明瞭に描出され、４％を上回る単一不純物は見出されなかった。
宿主細胞混入物
[0223]ＡＶＭＸ－１１０開発製品におけるＳｆ９宿主細胞タンパク質混入物をＥＬＩＳＡによって測定した。宿主細胞タンパク質混入物の例示的な測定値を表１５に示す。宿主タンパク質レベルは非常に低かった（≦１７０ｎｇ／１０１２ｖｇ）。精製プロセスは、出発細胞培養溶解物から１．５＋１０倍の宿主タンパク質が除去されたことから、ＧＯＩに対して非常に特異的であった。宿主タンパク質のレベルは、製品のリリースに必要な≦１００ｎｇ／用量という要件に勝った。このロットについては、用量が２ｅ＋１１ｖｇであった場合、宿主細胞のタンパク質レベルは４ｎｇ／用量であった。別のバッチの宿主細胞ＤＮＡ検出限界（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｔｈｅ ｌｉｍｉｔｓ）のＰＣＮＡは、≦４６．１２ｐｇ／１ｅ＋１２ｖｇであった。宿主細胞タンパク質およびＤＮＡ検査により、ＡＶＭＸ－１１０は高度に精製されており、規制要件に勝ることが示された。
[0224]Ｓｆ９細胞ゲノムＤＮＡをＱｉａｇｅｎゲノムＤＮＡ精製キットで精製し、ＤＮＡを１，０００、２５０、６３、１６、４、および１ｎｇ／ｍＬに希釈し、標準物質として使用した。ＡＶＭＸ－１１０プロセス試料をＱＰＣＲ希釈緩衝液で２倍および１０倍に希釈し、Ｓｆ９細胞に対するｑＰＣＲプライマーおよびプローブに使用した。ＡＶＭＸ－１１０プロセス試料を使用して実施したすべての検査で、Ｓｆ９細胞ＤＮＡは≦１０ｐｇ／反応で検出できず、これは１ｎｇ／ｍＬ≦３００ｐｇ／用量に相当する。
バキュロウイルスおよび他のプラスミドＤＮＡ混入物の判定
[0225]バキュロウイルスＤＮＡを、ＱｉａｇｅｎゲノムＤＮＡ精製キットによって提供されるプロトコールに従って、わずかに変更を加えた上で精製した。手短に述べると、培地中の７．５ｍＬのバキュロウイルスを、１Ｎ ＮａＣｌ中の等量の冷２０％ＰＥＧ８０００と混合し、室温で３０分間静置した。このバキュロウイルス粒子を、１０，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によってペレット化し、５ｍＬのＧ２緩衝液中に溶解させた。９５μＬのプロテイナーゼＫを添加して、５０℃で６０分間かけてプロテインカプシドを消化させた。カラムを平衡化して、試料をロードした。洗浄後に、バキュロウイルスＤＮＡを溶出させ、バキュロウイルスゲノムのＧＰ６４遺伝子に相補的なプライマーおよびプローブを用いてｑＰＣＲ検査を行った。ＤＮＡを１０００、２５０、６３、１６、４、および１ｎｇ／ｍＬに希釈し、標準物質として使用した。ＡＶＭＸ－１１０試料をｑＰＣＲ希釈緩衝液（ＤＮアーゼ消化なし）で２倍および１０倍に希釈し、ｑＰＣＲアッセイに使用した。バキュロウイルスＤＮＡレベルは、表１６に示すように、ＡＶＭＸ－１１０ベクターの１０１２ｖｇ当たり８．５８ｅ＋５であった。
[0226]他のプラスミド選択マーカー遺伝子、例えば、ｇｅｎｔｌｅｍｅｎ、アンピシリン（ＡＭＰ）、Ｒｅｐ、宿主細胞ＤＮＡマーカー、ＰＣＮＡ、ＢａｃＩＥ１ ＤＮＡ混入物は規制要件を下回っており、これはＡＶＭＸ－１１０の純度が高く、規制上の安全要件を満たすことを示した。評価したこれらのＤＮＡマーカーのレベルは、規制要件よりも約１０分の１の低さであった。
エンドトキシンレベル
[0227]ＡＶＭＸ－１１０試料におけるエンドトキシンレベルを、市販キットを使用する発色性リムルスアメーバ様細胞溶解物（ＬＡＬ）放出アッセイによって測定した。エンドトキシンが存在すると、ピロクロムＬＡＬ中の無色の発色基質のタンパク質分解による開裂によってｐＮＡが放出され、これにより黄色の溶液が生じ、それは４０５ｎｍに吸収を有する。ＡＶＭＸ－１１０調製物中のエンドトキシンレベルの結果を表１７に示す。ＡＶＭＸ－１１０試料におけるエンドトキシンレベルは０．０１５４ＥＵ／ｍＬまたは０．００５ＥＵ／用量であった。
無菌性
[0228]ＡＶＭＸ－１１０の各バッチについて生物汚染度をアッセイした結果、動物試験に使用した原薬について微生物汚染は検出されなかった。
複製可能ＡＡＶのレベル
[0229]プラスミドのトランスフェクションまたはウイルス感染によってＡＡＶベクターを産生させるために哺乳動物細胞を使用する従来の方法では、一般に、ＡＡＶゲノムとＡＡＶ ｒｅｐ－ｃａｐプラスミドとの間の非相同組換えが理由で、複製可能ＡＡＶ（ｒｃＡＡＶ）ウイルス粒子がある程度生じる。ｒｃＡＡＶの混入はＧＭＰ製造において望ましくなく、混入量をＦＤＡに報告する必要がある。本明細書に記載のＡＡＶシステムは、ＡＡＶプロモーターを除去および破壊し、それらを哺乳動物細胞において活性でない昆虫細胞プロモーターで置き換えた。Ｂａｃ－ｔｏ－ＡＡＶシステムでは、製造工程においてｒｃＡＡＶは産生され得ない。ｒｃＡＡＶをモニターするためのアッセイを確立するために、１００個の野生型（ｗｔ）ＡＡＶ粒子を１ｅ＋１２ｖｇのＡＡＶ試料中に添加した。ｒｃＡＡＶアッセイを行った。手短に述べると、１ｅ＋１２ｖｇのＡＡＶ試料を、アデノウイルス型ヘルパーの存在下で１００ｖｇのｗｔＡＡＶ２粒子と混合し、ＨＥＫ２９３細胞に３日間かけて形質導入を行った。細胞を採取し、溶解物を調製した。アデノウイルスを失活させるために５６℃で３０分間の熱不活化を行った後に、溶解物の５０％を使用して、アデノウイルス５型の存在下でＨＥＫ２９３細胞の形質導入を行い、ｒｃＡＡＶまたは添加したｗｔＡＡＶを３日間増幅させた。細胞を採取し、溶解物をｒｃＡＡＶシグナルのｑＰＣＲ検出のために調製した。その結果、ｗｔＡＡＶ２の添加がなければｒｃＡＡＶの陽性シグナルは存在しないことが示された。１ｅ＋１２ｖｇのＡＡＶ試料に１００ｖｇのｗｔＡＡＶを添加した場合には、陽性シグナルが検出された（表１８）。
空／充填カプシドの推定
[0230]各ロットの充填カプシドと空カプシドとの比率を、ベクター特異的なｑＰＣＲおよびＡＡＶ２特異抗体ＥＬＩＳＡを使用して推定した。カラムクロマトグラフィーの産物画分について、ベクターコピー数およびタンパク質レベルを分析した。空のカプシドは、ベクターＤＮＡを全く有しないまたは非常に低いレベルでのみ有し、カプシドタンパク質のみを有し、一方、充填ベクターは、ベクターＤＮＡおよびタンパク質含量の両方を有した。このデータは、ポリッシュ段階の溶出物１が、目的の遺伝子を全く有しないまたはわずかにのみ有することを示した。ピーク１の溶出液は、ＡＡＶ２．Ｎ５４－ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ ＤＮＡに関して極めて低値であるかまたは検出不能ですらあったが、タンパク質ではそうではなかった。プロファイルにおける第２のピーク（ピーク２）は、ベクターＤＮＡおよびタンパク質の両方を示した。これらの結果により、精製されたＡＶＭＸ－１１０およびＵＦＤＦプールがすべて充填粒子であることが実証された（図１０Ａ）。
ＡＶＭＸ－１１０の感染性
[0231]ＡＶＭＸ－１１０の感染性を、ＴＣＩＤ５０アッセイ（組織培養感染量５０％／ｍＬ）によって決定した。これは、接種材料が標的培養物の５０％を感染させる希釈度（すなわち、出発試料をＴＣＩＤ５０／ｍＬに等しい量で希釈した場合、１ｍＬのアリコートを複数の標的培養物に添加すると平均して培養物の５０％が感染）から決定される接種材料中の感染性微生物の濃度である。ＴＣＩＤ５０アッセイを使用して、製造元のプロトコール（ＡＴＣＣ）に基づいてＡＡＶベクターの効力を決定した。手短に述べると、一連の希釈ＡＡＶ試料を使用して、９６ウェルプレート中で３日間、アデノウイルス５ヘルパーの存在下でＨｅｌａＲＣ３２細胞に形質導入を行った。細胞溶解液を調製し、陽性シグナルをｑＰＣＲ法で検出した。ＴＣＩＤ５０値はスピアマン・カーバー式に基づいて算出した。結果を表１９に示す。
ＨＥＫ２９３細胞におけるＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ（ＡＡＶ２．ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ）のＡＶＭＸ－１１０発現
[0232]精製したＡＡＶ２－ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐベクターを使用して、１細胞当たり１００，０００ベクターゲノム（ｖｇ）のＭＯＩを使用して、ＨＥＫ２９３細胞に形質導入を行った。産生されて細胞培養上清中に放出されたＶＥＧＦ－Ｔｒａｐを、市販のＶＥＧＦ－Ａ１６５をコーティング抗原として使用する内部標準操作プロトコール（２１－ＡＤ－ＶＥＧＦ－ＥＬＩＳＡ．０１）を使用して毎日分析した。ＶＥＧＦ－Ａ１６５をＨＥＫ２９３細胞内で発現させ、均一になるまで精製し（ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ、カタログ番号Ｚ０３０７３）、滅菌Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水で１００μｇ／ｍＬとして再構成した。ＥＬＩＳＡ手順は以下の通りとした：ＶＧＥＦ－Ａ１６５を９６ウェルＥＬＩＳＡプレート上にコーティングし、４℃でＯ／Ｎでインキュベートした。翌日にプレートを洗浄緩衝液で３回洗浄し、ブロッキング緩衝液を各ウェルに添加した。プレートを覆い、３７℃で２時間インキュベートした。プレートを覆い、インキュベーターに戻して１時間置いた。その後、プレートを洗浄し、抗ヒトＦｃ抗体をプレートに添加し、再び３７℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ストレプトアビジン－ＨＲＰを添加して４５分間インキュベートした。プレートを洗浄し、ＴＭＢ基質を添加した。約１５分後に、停止溶液を添加した。ウェルを、マイクロプレートリーダーにより４５０ｎｍで読み取った。図１０Ｂから見てとれるように、ＡＭＶＸ－１１０（ＡＡＶ２・Ｎ５３－ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ）による形質導入を受けたＨＥＫ２９３細胞から採取した細胞培養上清は、ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐを約８００ｎｇ／ｍＬ分泌したが、形質導入していないＨＥＫ２９３細胞はＶＥＧＦ－Ｔｒａｐを分泌しなかった。細胞が老化するまで産生は培養中に毎日増加し続けた。
インビトロでのＡＡＶ２．ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ発現の持続性
[0233]ＨＥＫ２９３およびＡＲＰＥ－１９（ヒト網膜色素上皮）細胞を１０％ＦＢＳとともに培養し、ＡＡＶ２・Ｎ５３－ＶＥＧＦ－ＴｒａｐおよびＡＡＶ２・Ｎ５４－ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐを細胞当たり１００，０００のＭＯＩで形質導入させた。ＶＥＧＥ－ｔｒａｐ発現のＥＬＩＳＡ定量のために試料を採取した。ＡＡＶ２・Ｎ５４－ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐは、ＡＡＶ２・Ｎ５３－ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐと比較して良好な発現を示した（図１１）。この差異は、ＨＥＫ２９３細胞よりもＡＲＰＥ１９細胞で有意に低いことが観察された。ＡＲＰＥ１９細胞では、第２０日以降は、Ｎ５３－ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ構築物の形質導入に由来するＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ発現は無視できる程度であった。対照的に、Ｎ５４－ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ構築物の形質導入に由来するＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ発現は、依然として定量可能な量で存在していた。ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ発現は、ＡＲＰＥ１９細胞と比較してＨＥＫ２９３細胞でより高度であった。
マウスにおける有効性試験
[0234]構築物ＡＡＶ２．Ｎ５４．１２０（ＡＶＭＸ－１１０）を選択し、３種類の用量でマウスに投与して有効性を検討した。手短に述べると、本試験では、ビヒクル（製剤緩衝液）、市販のＥｙｌｅａ（タンパク質）、１．６Ｅ＋１０ｖｇ／眼で投与したＡＡＶ２．Ｎ５４－ＧＦＰ（－）、ＡＶＭＸ－１１０の低用量（２．０Ｅ＋０７ｖｇ／眼）、中用量（４．８Ｅ＋０８ｖｇ／眼）および高用量（１．６Ｅ＋１０ｖｇ／眼）の６群を設定した。図２９にフルオレセンス眼底造影（ＦＡ）データを示す。ＡＡＶ２．Ｎ５４－１２０の中用量は、４０μｇ／眼で投与した市販のアフリベルセプト（Ｅｙｌｅａ）タンパク質と同程度の有効性を有した。
[0235]アフリベルセプトＥＬＩＳＡを使用して、眼試料（局所発現）および血清試料（全身レベル）におけるアフリベルセプトの発現量を定量した。高用量の構築物を注射した眼試料ではアフリベルセプトの発現が検出された。しかし、他の群ではアフリベルセプトの発現が非常に低いか、または検出されなかった。
血清型の選択
[0236]ＡＡＶ（特にＡＡＶ２）中和抗体がヒトに広く存在することは周知である。ＡＡＶ２の使用におけるもう１つの難題は、向性の欠如である。このため、ＡＡＶ１およびＡＡＶ６の血清型を、インビトロでの発現レベル（図３０および表３０）、インビボでの有効性（ＦＡデータ、図３１）および眼組織におけるアフリベルセプトの発現（図３２および表２０）についてスクリーニングした。
[0237]アフリベルセプトＥＬＩＳＡ法を行ったところ、そのアッセイのＬｏＱは２ｎｇ／ｍＬであると決定された。２ｎｇ／ｍＬ未満の値は＞ＬｏＱと示された。表２０から、血清試料中にアフリベルセプトは検出されないと結論付けることができた。しかし、ＡＡＶ６およびＡＡＶ１では眼試料中にアフリベルセプトが検出された。
[0238]マウスにＡＡＶ６．Ｎ５４－アフリベルセプトを２．０Ｅ＋０７（低用量）、４．８Ｅ＋０８（中用量）および１．６Ｅ＋１０高用量で投与する用量反応試験を計画し、実施した。図３３は、異なる群を比較するためのＦＡデータを棒グラフとして示している。
[0239]動物にＡＡＶ２、ＡＡＶ１およびＡＡＶ６－ＧＦＰを５Ｅ＋０９ｖｇ／眼で注射し、発現および浸透性を調べた。これらの動物はＡＡＶ２．Ｎ５４－ＧＦＰに対する優位性を示さなかった（図３４）。
[0240]種々の血清型を比較するために、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２およびＡＡＶ６－ＧＦＰを１Ｅ＋１１ｖｇ／眼でブタに注射するブタでの試験を行った。以前のブタ試験と同様に、Ｖ２２６（＋対照）も含めた。図３５は、代表的な眼底画像およびＩＨＣ画像を示す。ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、およびＡＡＶ６－ＧＦＰを注射した動物ではＧＦＰシグナルが比較的低かったため、第２１日、第２８日、および第３４日に眼底画像を撮影した。最後に第３４日に動物を屠殺し、選択した眼に対してＩＨＣを行った。ＧＦＰに対するインビトロＥＬＩＳＡアッセイでは、ＡＡＶ２．ｗｔ－ＧＦＰと比較した場合、ＡＡＶ２．Ｎ５４－ＧＦＰにおけるＧＦＰのより高度の発現は示されなかった（図３６）。
[0241]ＧＯＩスクリーニングにおいて、ＡＡＶ構築物のロット間変動が検出された。例えば、Ｎ５４．１２０構築物を複数回精製し、－８０℃で保存した。精製プロセスを、異なる容量の出発細胞培養物を使用すること、２サイクルの超遠心分離（ＵＣ）またはＡＡＶｘアフィニティカラムのいずれかを使用して精製すること、細胞生存度、および他の培養条件の変動によって変化させた。表２１は、Ｎ５４．１２０の少数ロットの概要を示す。
[0242]以下は、蛍光顕微鏡画像（図３７Ａ）で捕捉され、またＧＦＰ定量化ＥＬＩＳＡ（図３７Ｂおよび表２２）を使用して分析された例示的なＧＦＰ発現であり、ロット間の変動を示す。ＧＦＰロット番号２０－１４７の強度は２０－０６－３０－Ｎ５４ロットよりも低かったが、ＥＬＩＳＡではインビトロでのＧＦＰ発現に有意差が示されなかった。
[0243]マウスおよびブタでの試験の後、カプシドＮ５４を選択し、ＡＭＩ１２０最適化ＧＯＩを選択した。動物での有効性試験では、ＡＡＶベクター処置による有意なレーザー損傷の回復が示され、これは市販のアフリベルセプトと同等であった。マウス有効性ＣＮＶモデルでは、ＡＡＶ２血清型の方がＡＡＶ６血清型よりも一貫性が高いように思われた。
実施例１３．動物実験に関する生物分析比較の結果
[0244]実施例１３は、モデルの再現性を調べるための、２つの異なる研究から得られたマウス眼の脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）または黄斑血管新生（ＭＮＶ）有効性モデルの生物分析比較を示す。どちらの試験も、硝子体内注射（ＩＶＴ）には同じ力価および量のＧＬＰ非準拠ＡＡＶ２構築物を使用した。試験プロトコールも同様であった（表２３）。ＡＡＶ２カプシドの定量は、市販のＡＡＶ２カプシドタンパク質キット（Ｐｒｏｇｅｎ、カタログ番号：ＰＲＡＡＶ２Ｒおよびロット番号：Ａ２０００８）を使用して行った。統計分析にはＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ｖ９．０．１）を使用した。
材料および方法
[0245]表２４は、マウスの試験から得た血清試料および眼試料の数を示す。
[0246]５３２ｎｍダイオードレーザーを使用して、視神経を囲む４個の単一レーザースポットを作成した。構築物の注射またはビヒクルが何らかの炎症反応を引き起こした場合には、レーザー照射は病変（気泡）を形成しない。気泡が存在しない場合、このスポットは分析に使用しない。すべての眼に対して、４個ずつのレーザースポットを誘発させ、レーザー処置の７日後に病変の大きさを推定した。病変は、さまざまな構築物の遺伝子産物の効果による創傷治癒に対応した。各群８匹の動物を使用して、各眼について４個ずつのレーザースポットを有する１６個の眼に対応させ、合計６４のレーザースポットを得た。表２５は、ＡＶＭＸ－１１０またはビヒクル対照を注射した各群により形成されなかった気泡の数をまとめる。
[0247]網膜／ＲＰＥ／脈絡膜／強膜からなる眼杯試料を、両試験の試験プロトコールに記載された通りに、プロテアーゼ阻害剤を含まない１×ＰＢＳおよびＢＳＡを使用してホモジナイズした。各眼試料をさらに、ソニケーターを使用して、２１秒間のパルスおよび３０秒間の間隔で５～６回繰り返してホモジナイズした。肉眼で見える透明な上清が得られた時点で、試料を１３，０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。続いて上清を収集し、ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐレベルを測定するために使用した。
ＦＡ分析の比較
[0248]レーザー損傷の７日後に、各マウスの両眼の病変領域をＦＡで分析した。処置マウスにおけるＡＶＭＸ－１１０の遺伝子産物は、ビヒクル対照処置マウスと比較して、レーザー損傷を減少させることが期待された。図３８および表２６は、レーザー病変の回復におけるＡＶＭＸ－１１０の有効性の比較を示す。両試験において、ＡＶＭＸ－１１０処置マウスは等しいレーザー創傷回復を示した。２つの試験では面積のベースラインにばらつきがあったが、ＡＶＭＸ－１１０で処置された動物はほぼ同一の病変回復を示した。ＦＡ画像解析による代表的画像もまた、図３９の病変面積について同様の減少を示す。
血清試料におけるＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ濃度の比較
[0249]血清試料を希釈せずに９６ウェルプレートに直接入れた。図３９Ａは、血清試料におけるＶＥＧＦ－Ｔｒａｐレベルを示す。血清試料におけるＶＥＧＦ－Ｔｒａｐレベルは、適格なＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ ＥＬＩＳＡの定量限界未満であった。
眼試料におけるＶＥＧＦ－Ｔｒａｐレベル
[0250]眼試料におけるＶＥＧＦ－ＴｒａｐをＥＬＩＳＡで定量し、ｎｇ／ｍＬとして直接プロットした。組織重量１ｍｇ当たりのＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ濃度を、ＥＬＩＳＡで測定したＶＥＧＦ－Ｔｒａｐの絶対量を、眼組織をホモジナイズした容積で除算して算出した。続いて、算出された量を組織重量で除算して、眼杯当たりのＶＥＧＦ－Ｔｒａｐのｐｇを求めた。ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐデータをプロットし（図３９Ｂ）、血清試料および眼試料のＶＥＧＦ－Ｔｒａｐレベルを表３１に記録した（ビヒクル試料については、値がＬｏＱ未満であったため、表から除外した）。総合すると、すべての血清試料および眼試料におけるＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ発現は非常に低く、ほとんどの動物はＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ ＥＬＩＳＡの定量限界未満であった。
ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ濃度とレーザー処置後の回復面積との相関分析
[0251]病変の存在を、ピクセル単位の面積として測定した。病変ピクセルデータを眼杯当たりのＶＥＧＦ－Ｔｒａｐのｐｇ数に対してプロットし、Ｐｅａｒｓｏｎ相関を使用して相関を計算し、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して両側ｐ値を９５％信頼区間について推定した。図４０Ａは、２つの実験間の比較を図示する。いずれの分析でも、ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ濃度と病変ピクセル面積との間に負の相関が認められた。このデータは、病変面積（ピクセル）が小さいほどＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ濃度が高いことを示す。両試験の相関係数およびｐ値を表３２に示す。
両試験におけるＡＡＶ２カプシドタンパク質量の比較
[0252]ＡＡＶ２カプシドアッセイを、ＡＡＶ２カプシドＥＬＩＳＡキットを使用して行った。両試験におけるＡＡＶ２カプシドタンパク質量も同程度であった（図４０Ｂ）。しかし、（両試験における）眼試料の量は試料間で有意に異なり、カプシドタンパク質の全体的な推定値に影響を及ぼしたことに留意することが重要であった。
[0253]ＦＡ画像および病変面積解析の結果は、両試験間で一貫性を示した。「気泡なし」はビヒクル群の方が多かった。眼試料におけるＶＥＧＦ－Ｔｒａｐ濃度については、多くのデータポイントが定量限界未満であった。アッセイのＬｏＱは約２ｎｇ／ｍＬであった。このＬｏＱ値は市販キット（約５～６ｎｇ／ｍＬ）よりも低かった。これらの試験では、眼試料は眼球全体ではなく眼杯からなっており、そのことが試料におけるＶＥＧＦ－Ｔｒａｐの量および濃度に影響を及ぼした可能性がある。このため、今後の試験では眼球全体を含めることとした。ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐと同様に、ＡＡＶ２カプシドタンパク質ＥＬＩＳＡも試料量の影響を受けた。対照および陽性対照として、市販のアフリベルセプト（４０μｇ／眼）を注射した。４．０Ｅ＋０８ｖｇ／眼のＡＶＭＸ－１１０は、市販のアフリベルセプトと同程度の病変回復を示した。これらの２つの試験の結果が類似していたことから、このＡＶＭＸ－１１０用量は市販のアフリベルセプトと同程度の結果を示したと結論付けることができた。総合すると、マウスＭＮＶモデルは、ＮＨＰのようなより大きな動物モデルに進む前の最初の構築物スクリーニングに適したモデルであった。
実施例１４．レーザー誘発脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）モデルにおけるアフリベルセプト（ＡＶＭＸ－１１６）をコードする修飾アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ６．Ｎ５４－１２０）の有効性
[0254]実施例１４は、第１群～第５群において異なる血清型のアデノ随伴ウイルスベクターを使用して、マウスの脈絡膜血管新生（ＬＣＮＶ）のレーザー誘発モデルにおける血管新生の阻害を評価し、第６群～第８群でマウス網膜組織におけるＡＡＶ６－Ｎ５４－ＧＦＰ、ＡＡＶ１－Ｎ５４－ＧＦＰ、およびＡＡＶ２．Ｎ５４－ＧＦＰの分布を評価したことを示す。２匹の未処置動物（第９群）を、方法の開発および生物分析の取り組みのために含めた。表３３は実験計画を示す。
方法
[0255]第２８日に、マウスにブプレノルフィン０．０１～０．０５ｍｇ／ｋｇを皮下（ＳＱ）投与した。その後、硝子体内注射のためにイソフルレン吸入により動物を鎮静させ、０．５％プロパラカインＨＣｌ １滴を両眼に適用した。結膜をＤｕｍｏｎｔ＃４鉗子で穏やかに把持し、３３Ｇ針およびＨａｍｉｌｔｏｎ Ｓｙｒｉｎｇｅを使用して注射を行った。シリンジ内容物を分注した後に、シリンジ針をゆっくりと抜去した。注射手順の後に、オフロキサシン点眼液１滴を眼用潤滑剤とともに眼表面に局所的に適用した。
[0256]第０日に、マウスにブプレノルフィン０．０１～０．０５ｍｇ／ｋｇをＳＱ投与し、レーザー処置の少なくとも１５分前に局所散瞳薬（１．０％トロピカミドＨＣｌおよび２．５％フェニレフリンＨＣｌ）を適用した。マウスにケタミン／キシラジンを腹腔内（ＩＰ）注射して鎮静させた。局所洗眼液を使用して角膜を湿らせ、ホットパッドを使用して体温を維持した。細隙灯を通して届く５３２ｎｍダイオードレーザーを使用して、視神経を囲む４個の単一レーザースポットを作成した。マウスの両眼に、実験計画のスケジュールに従ってレーザー処置を行った。レーザー後に眼用潤滑剤を適用した（ＯＵ）。病的状態および死亡について毎日観察するとともに、ケージ外部からの観察を行い、特に両眼に注意を払った。動物４３６（第４群）は、第７日に画像検査手順前に死亡した。全動物のベースライン体重は２５．１±１．５ｇであった。すべての群において動物の体重増加は試験期間を通じて正常な量であった。
[0257]第１群～第５群および第９群の試料は、搬送するかまたはドライアイス上で保存した。薬物動態解析に割り付けられた動物（ｎ＝２匹／群）では、アフリベルセプト定量のためのＬＣＮＶ誘発を受けなかった。眼試料（すなわち、眼球全体）を摘出し、分離の後に凍結して秤量した。表３４は、組織重量、およびホモジナイゼーション前に各試料に添加したプロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）を含む１×ＰＢＳの量の詳細な記録を示す。試料を氷上に置き、超音波処理器を使用して２０秒間のパルスの後に２０秒間休止することを３サイクル行ってホモジナイズした。超音波処理の後に、試料を氷上に静置した。
[0258]眼（全眼）試料および血清試料におけるアフリベルセプトの発現を、アフリベルセプトＥＬＩＳＡを使用して定量化した。手短に述べると、０．１μｇ／ｍＬのＶＥＧＦを９６ウェルプレート上にコーティングし、４℃でＯ／Ｎでインキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で洗浄し、ブロッキング緩衝液でブロックした。眼試料および血清試料は、第５群の試料（１：５、１：１０、および１：１００希釈）を除いて、希釈せずに特定のウェルに直接送達した。試料を１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、検出用抗体を１：４０，０００希釈で各ウェルに添加した。１時間のインキュベーションの後に、プレートを洗浄し、ストレプトアビジン－西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を１：４０，０００希釈で添加した。４５分間のインキュベーションの後に、プレートを洗浄し、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質の添加によってアフリベルセプトを検出した。停止溶液を添加して反応を停止させ、プレートを６００ｎｍの参照波長とともに４５０ｎｍで直ちに読み取った。
[0259]シャムベクター対照により処置した動物および処置しなかった動物におけるアフリベルセプトの発現は同程度であった。ＡＡＶ６．Ｎ５４－アフリベルセプトが注射された第３群の動物では、約２．３ｐｇ／眼ホモジネートｍｇのアフリベルセプトが測定された（図４１Ａ）。ＡＡＶ２およびＡＡＶ６．Ｎ５４－アフリベルセプトに関する中間範囲レベルは、それぞれ約８．８および約２５ｐｇ／眼ホモジネートｍｇのアフリベルセプトを有し、ＡＡＶ６で処置された動物では発現が３倍に増加した。高用量ＡＡＶ６で処置された動物では、アフリベルセプトのレベルが最も高く、約４００ｐｇ／眼ホモジネートｍｇのアフリベルセプトであった。血清試料は、眼組織試料と同様の傾向であった。第１群（シャム）、第２群（ＡＡＶ２－アフリベルセプト）および第３群（ＡＡＶ６－低用量）は、検出可能なアフリベルセプトを有しなかった。中用量および高用量のＡＡＶ６－アフリベルセプトで処置された動物ではいずれも、血清中に２～３ｎｇ／ｍＬのアフリベルセプトが認められた（図４１Ｂ）。データは、一元配置ＡＮＯＶＡおよびその後にＤｕｎｎｅｔｔの多重比較を使用して、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアで解析した（＊＊＝０．００５および＊＊＊＊≦０．０００１）。アフリベルセプトの発現は、表３５（ＡＡＶ１．Ｎ５４－アフリベルセプトおよびＡＡＶ６．Ｎ５４－アフリベルセプトは、ＡＡＶ２．Ｎ５４－アフリベルセプトと比較して３０倍の高さでアフリベルセプトを発現したことを示す）および表３６の通りであった。
眼底撮影（第６群～第８群、第０日）
[0260]第６群～第８群に登録した動物の両眼に対して、ＥＧＦＰに関してカラーおよびコバルトブルー眼底撮影を行った。動物に局所散瞳剤（１．０％トロピカミドＨＣｌおよび２．５％フェニレフリンＨＣｌ）を投与して眼を散大させて突出させ、局所麻酔薬（プロパラカイン０．５％）を眼に適用した。カラー眼底写真撮影に続いてコバルトブルー写真撮影を行った。取得設定は第７群（陽性対照）に対して設定し、第６群および第８群でも一貫して維持した。代表的画像を図４２に示す。ＧＦＰシグナルは３群すべてで観察された。ＧＦＰシグナルは第７群（陽性対照）で最も強く高輝度であり、続いて第８群、第６群の順であった。すべての試験を通じて曝露時間は一定に維持したにもかかわらず、発現は以前の試験で観察されたよりも限定的であった。
フルオレセイン眼底造影（ＦＡ）
[0261]レーザー後第７日に両眼にＦＡを行った。ＦＡのための散瞳は、検査の１５分前に各眼に局所点眼薬（１．０％トロピカミドＨＣｌおよび２．５％フェニレフリンＨＣｌ）を使用して達成した。マウスはケタミン／キシラジンのＩＰ注射で鎮静させた。静脈内フルオレセインナトリウム注射（１％貯蔵液、１２ｍｇ／ｋｇ）の約１分後に網膜写真の撮影を行った。フルオレセイン漏出をＩｍａｇｅＪソフトウェアで解析した。病変を示す代表的画像を以下の図４３に示す。眼底造影図を使用して、病変領域をピクセル、２．５標準偏差（ＳＤ）として定量化し、その結果を図４４に提示する。イソレクチン面積のサイズを分析する場合に、ブルッフ膜が破裂しなかった病変、硝子体出血が認められた病変、または平均から２．５標準偏差を超えるデータポイントを有する病変は除外した。第５群（ＡＶＭＸ－１１６の最高用量）の試験材料は、第２群のＡＶＭＸ－１１０（陽性対照）よりも優れた成績であり、全群の中で病変面積が最も小さかった。統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアでの一元配置ＡＮＯＶＡおよびその後のＤｕｎｎｅｔｔ多重比較によって行った（＊＝０．０１３８）。
[0262]本試験によるデータを以前の試験と比較すると、眼球全体のホモジナイゼーションは、眼杯のみと比較した場合、アフリベルセプト発現の推定に優れており、定量の精度が向上した。ＡＡＶ６．アフリベルセプトによる眼試料は、ウイルスベクター用量の２０倍への増加に伴ってタンパク質発現の約１０倍への増加を示し、ＡＡＶ２と比較した場合、ＡＡＶ６構築物はアフリベルセプト発現の３倍への強化を示した。中用量または高用量のＡＡＶ６．アフリベルセプトを投与された動物では、血清試料中にかなりのアフリベルセプト発現が示された。この試験により、陽性対照であるＡＶＭＸ－１１０をＩＶＴ注射した動物では、フルオレセイン眼底造影（ＦＡ）で評価したＣＮＶ病変の平均サイズが大幅に縮小したことが示され、これは同じ構築物を利用した他の試験と一致していた。
眼組織の採取および処理
[0263]第７日に動物を二酸化炭素窒息により人道的に安楽死させ、頸椎脱臼により死亡を確認した。
フラットマウント分析のための組織採取（第１群～第５群のみ）
[0264]眼球を摘出して、直ちにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の４％パラホルムアルデヒドで固定し、４℃で一晩保存した。翌日に、眼球を冷免疫細胞化学（ＩＣＣ）緩衝液（０．５％ＢＳＡおよび０．２％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）に移し、処理を行うまで入れておいた。解剖顕微鏡を使用して、眼から無関係な組織を注意深く取り除き、前眼部および水晶体を除去した。網膜を剥離させ、微細な湾曲ハサミにより視神経頭部から取り出した。眼杯を冷ＩＣＣ緩衝液で洗浄した。眼杯を、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ、核染色）、イソレクチンＩＢ４ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４９（血管、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓカタログ番号ＤＬ－１２０８－．５）およびファロイジンＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５（ｆ－アクチン、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ａ３４０５５）を含む冷ＩＣＣ中に入れた。眼杯を４℃で穏やかに回転させながら４時間インキュベートし、冷ＩＣＣ緩衝液で洗浄した。続いて、病変を避けて視神経頭部に向かって放射状に切断し、強膜－脈絡膜／ＲＰＥ複合体をフラットマウントし、カバーをかけた上で密封した。二次元（２Ｄ）蛍光顕微鏡画像を取得し、デジタル化して、Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｂｘ６３直立蛍光顕微鏡およびＣｅｌｌＳｅｎｓ（Ｏｌｙｍｐｕｓ）ソフトウェアを使用して解析した。取得後の解析はＣｅｌｌＳｅｎｓソフトウェアを使用して行った。新たに形成された血管を定量化するために、イソレクチンＩＢ４面積をμｍ２単位で測定した。イソレクチン病変面積測定による代表的画像を図４５に示す。
[0265]イソレクチン面積のサイズを分析する場合に（図４６）、ブルッフ膜が破裂しなかった病変、硝子体出血が認められた病変、または平均から２．５標準偏差を超えるデータポイントを有する病変は除外した。ブルッフ膜が断裂していない病変、硝子体出血が認められた病変、または平均値から２．５標準偏差を超えるデータポイントを除外した。第１群の動物では病変面積が６０，９００±３８，５００μｍ２と最も大きく、一方、第５群では病変面積が１８，７００±７，２００μｍ２と最も小さく、病変面積が７０％小さかった。陽性対照は他の試験と同様に実施したところ、病変面積はシャムベクター対照よりも３０％小さかった。統計分析は、一元配置ＡＮＯＶＡおよびその後にＤｕｎｎｅｔｔの多重比較を使用して行った（＊＊＊＝０．０００１および＊＊＊＊≦０．０００１）。
免疫組織化学のための組織採取（第６群～第８群のみ）
[0266]免疫組織化学（ＩＨＣ）用に指定されたすべての眼球を摘出し、おおよその注射部位に印を付けた後に、組織を１×ＰＢＳ中に入れた。眼球を、別々にラベルを付けたバイアル中で４％パラホルムアルデヒドにより４℃で一晩固定した。続いて、眼球を０．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＢ）に移し、連続スクロース勾配（１０～３０％、各１時間）に供した後に、ＯＣＴ培地中に包埋し、ドライアイス上で凍結させた。眼球全体を凍結切片（１４μｍ切片）にして、以下の抗体で染色した：１／２５０ニワトリ抗ＧＦＰ、１／２５０ウサギ抗ＲＰＥ６５、その後に１／２００抗ニワトリＣｙ２、１／２００抗ウサギＣｙ３、１／１００ ＰＮＡレクチンＣｙ５、および１／１，０００ ＤＡＰＩ。
[0267]第６群および第７群は、最も輝度が高く、最も広いＧＦＰシグナルを有したが、第８群も同様にＧＦＰシグナルを有した。すべての群において、ＧＦＰ発現は視神経近くの網膜中央部に局在する傾向があったが、位置によるばらつきがあった。発現は、神経節細胞層から内節を通して一貫して観察され、外節および網膜色素上皮で認められる一貫性はより低かった。染色した凍結切片で認められたＧＦＰシグナルは、眼底画像で認められたＧＦＰシグナルと一致した。８５６ ＯＤで認められたＲＰＥ染色は、標準的なＩＶＴ注射後のＲＰＥへのＡＡＶの形質導入によるものであったが、マウス６５２ ＯＳのＲＰＥで観察されたＧＦＰ発現は、ＡＡＶが硝子体腔ではなく網膜下腔に意図せずに送達されたために強化された可能性がある。第０日のＩＨＣの代表的画像を図４７に示す。図４８Ａは、実施例１４の用量反応試験から得られた画像のフラットマウント分析を図示する。図４８Ｂは、実施例１４の用量反応試験から得られた画像のフルオレセンス眼底造影（ＦＡ）分析を図示する。
実施例１５．ＡＶＭＸの製剤化および有効性試験
[0268]ＡＶＭＸ－１１０を、液体組成（ｃｏｍｐｏｔａｔｉｏｎ）で滅菌バイアル中に製剤化した。ＩＶＴ注射用溶液用のＡＶＭＸ－１１０医薬品製剤濃縮物を、１３ｍｍのグレーのブロモブチル製栓および１３ｍｍのフリップオフ式アルミニウムシールを備えた１ｍＬの１３ｍｍ環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）バイアル中に保存された滅菌凍結液体製剤として製造した。各バイアルは、少なくとも５０μＬ（密度１．０１ｇ／ｍＬ）の吸引容量を可能にするために目標重量１００μＬまで充填された。産物は、４．０×１０１２ｖｇ／ｍＬ以上の濃度で供給された。臨床的使用のためには、医薬品製剤を解凍し、提供されたフィルター針を使用して無菌的に吸引した上で、網膜専門医がＩＶＴを介して患者に送達した。
[0269]ＡＶＭＸ－１１０：ＡＡＶ２・Ｎ５４－ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐを用いる有効性試験は、表３７に示すプロトコールに基づいて行った。マウスにおけるＡＶＭＸ－１１０の有効性は、レーザー誘発脈絡膜血管新生（ＬＣＮＶ）モデルを使用することによって評価した。
[0270]動物を最低３日間、試験環境に順化させた。順化期間の終了時に、試験参加への適合性を判定するために、実験動物技師が各動物について身体検査を行った。検査には、皮膚および外耳、眼、腹部、行動および全身の状態が含まれたが、これらに限定されない。健康状態が良好であると判断された動物は試験に加えられた。動物のランダム化、硝子体内注射、レーザー誘発ＣＮＶ処置、動物検査、フルオレセイン眼底造影（ＦＡ）、眼組織採取およびフラットマウント（ｎ＝６匹／群）は、プロトコールに記載された。さらに、蛍光眼底造影（ＦＡ）による観察およびフラットマウントの採取後に、すべてのマウスから最終採血を行って血清および網膜組織を採取した。
[0271]ＦＡ分析では、４０μｇ／眼のアフリベルセプトの投与またはＡＶＭＸ－１１０ ＩＶＴ注射を受けた動物は、病変面積の有意な減少を示した（図４９Ａ）。ＡＶＭＸ－１１０群については、病変面積の減少値はベクターゲノムコピー（ｖｇ）の用量と逆相関し（４ｅ＋８ｖｇ／眼でＰ＜０．０１、１．６ｅ＋１０ｖｇ／眼でＰ＜０．００１）、より多くのベクターが注射されるほど、レーザー照射の７日後に観察された損傷面積は小さかった（表３８）。１．６ｅ＋１０ｖｇ／眼の場合、レーザー損傷の完全治癒が達成された。図４９Ｂは、ＡＶＭＸ－１１０投薬試験からの画像のＦＡ分析を図示する。
[0272]安楽死の後に、第１群～第５群および第９群の動物から血清分離のために血液を採取し、眼球を摘出して急速凍結した。眼球は適切な、あらかじめ秤量したラベル付きの分析用バイアルに入れ、直ちに再秤量して試料の重量を求め、冷凍庫に移すまでドライアイス上に置いた。試料は、小数点以下４桁まで測定できる天秤で秤量した。急速凍結および秤量の後に、試料を－８０℃の冷凍庫に戻した。血清および網膜組織中のＶＥＦＧ－Ｔｒａｐ濃度をＥＬＩＳＡアッセイによって検査した。眼球を摘出し、新鮮な眼球から網膜およびＲＰＥ／脈絡膜の切片を解離させて急速凍結した。組織は適切な、あらかじめ秤量したラベル付きの分析用バイアルに入れ、直ちに再秤量して試料の重量を求め、冷凍庫に移すまでドライアイス上に置いた。試料は、小数点以下４桁まで測定できる天秤で秤量した。
[0273]試料はＥＬＩＳＡを使用してアッセイした。ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐはアフリベルセプト対照群では約５０ｎｇ／ｍＬであったが、高用量群（１．６ｅ１０ｖｇ／眼）の血清では、ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐは約２ｎｇ／ｍＬと低レベルで検出され、低用量群および中用量群では検出されなかった（図５１Ａ）。網膜組織中のＶＥＧＦ－Ｔｒａｐレベルも、網膜ホモジネートにおいてＥＬＩＳＡを使用して測定した（図５１Ｂ）。網膜組織懸濁液において、ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐの発現は、硝子体内注射したＡＶＭＸ－１１０に対して良好な用量依存的様式であった。１．６ｅ１０ｖｇ／眼の高用量群では平均１３ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ－Ｔｒａｐが検出された。最高発現レベルは４０ｎｇ／ｍＬ超に達した。
[0274]前述の開示は、明確性および理解のためにある程度詳細に説明されてきたが、本開示の真の範囲から逸脱することなく、形態および詳細にさまざまな変更を加え得ることは、本開示を読んだ当業者には明らかであろう。例えば、上記のすべての手法および装置は、さまざまな組合せで使用することができる。本出願に引用されるすべての刊行物、特許、特許出願、および／または他の文書は、あたかも個々の刊行物、特許、特許出願、および／または他の文書が、すべての目的のために参照により組み込まれることが個別にかつ別個に示されているのと同じ程度に、すべての目的のためにそれらの全体が参照により組み込まれる。

Claims (150)

  1. 抗血管新生剤を含む生物製剤をコードする配列を含む単離された非天然起源の核酸であって、前記配列が、コード領域における修飾を欠くこと以外の点では同等な配列と比較して、配列のコード領域における修飾を含み、前記修飾が、少なくとも４個の非ＡＧＧアルギニンコドンのＡＧＧによる置き換えを含む、単離された非天然起源の核酸。
  2. 抗血管新生剤をコードする配列が、第２の修飾をさらに含む、請求項１に記載の単離された非天然起源の核酸。
  3. 第２の修飾が、配列のコード領域の少なくとも１個のコドン内にあり、かつ、第２の修飾が、
    （ａ）少なくとも１個の非ＣＣＣプロリンコドンのＣＣＣによる置き換え、
    （ｂ）少なくとも１個の非ＴＣＣセリンコドンのＴＣＣによる置き換え、
    （ｃ）少なくとも１個の非ＣＣＧプロリンコドンのＣＣＧによる置き換え、および
    （ｄ）（ａ）～（ｃ）の任意の組合せ
    からなる群から選択される、請求項２に記載の単離された非天然起源の核酸。
  4. 第２の修飾が（ａ）を含む、請求項３に記載の単離された非天然起源の核酸。
  5. 少なくとも１個の非ＣＣＣプロリンコドンがＣＣＴである、請求項４に記載の単離された非天然起源の核酸。
  6. 第２の修飾が（ｂ）を含む、請求項３に記載の単離された非天然起源の核酸。
  7. 少なくとも１個の非ＴＣＣセリンコドンがＡＧＣである、請求項６に記載の単離された非天然起源の核酸。
  8. 第２の修飾が（ｃ）を含む、請求項３に記載の単離された非天然起源の核酸。
  9. 少なくとも１個の非ＣＣＧプロリンコドンがＣＣＣである、請求項８に記載の単離された非天然起源の核酸。
  10. 第２の修飾が（ｄ）を含む、請求項３に記載の単離された非天然起源の核酸。
  11. （ａ）の少なくとも１個の非ＣＣＣプロリンコドンがＣＣＴであり、（ｂ）の少なくとも１個の非ＴＣＣセリンコドンがＡＧＣであり、かつ、（ｃ）の少なくとも１個の非ＣＣＧプロリンコドンがＣＣＣである、請求項１０に記載の単離された非天然起源の核酸。
  12. 抗血管新生剤が、ＶＥＧＦ阻害剤、マルチチロシンキナーゼ阻害剤、受容体チロシンキナーゼ阻害剤、Ａｋｔリン酸化の阻害剤、ＰＤＧＦ－１阻害剤、ＰＤＧＦ－２阻害剤、ＮＰ－１阻害剤、ＮＰ－２阻害剤、Ｄｅｌ １阻害剤、およびインテグリン阻害剤からなる群から選択される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の単離された非天然起源の核酸。
  13. 抗血管新生剤がＶＥＧＦ阻害剤を含み、ＶＥＧＦ阻害剤が非抗体阻害剤である、請求項１２に記載の単離された非天然起源の核酸。
  14. 非抗体阻害剤が、ヒトＶＥＧＦ受容体１および２を含む融合タンパク質である、請求項１３に記載の単離された非天然起源の核酸。
  15. 融合タンパク質が、ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐまたはその修飾バージョンを含む、請求項１４に記載の単離された非天然起源の核酸。
  16. 単離された非天然起源の核酸が、シグナルペプチドをさらに含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の単離された非天然起源の核酸。
  17. シグナルペプチドが、ヒト抗体重鎖（Ｖｈ）、ヒト抗体軽鎖（Ｖｌ）、およびＶＥＧＦ－Ｔｒａｐからなる群から選択される、請求項１６に記載の単離された非天然起源の核酸。
  18. シグナルペプチドが、ヒト抗体重鎖由来である、請求項１７に記載の単離された非天然起源の核酸。
  19. シグナルペプチドが、ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐに由来する、請求項１６に記載の単離された非天然起源の核酸。
  20. イントロン配列をさらに含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の単離された非天然起源の核酸。
  21. イントロン配列が、ｈＣＭＶイントロンＡ、アデノウイルス三要素リーダー配列イントロン、ＳＶ４０イントロン、ハムスターＥＦ－１α遺伝子イントロン１、介在配列イントロン、ヒト成長ホルモンイントロン、およびヒトβグロビンイントロンからなる群から選択される、請求項２０に記載の単離された非天然起源の核酸。
  22. イントロン配列がＳＶ４０イントロンである、請求項２１に記載の単離された非天然起源の核酸。
  23. プロモーターをさらに含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の単離された非天然起源の核酸。
  24. プロモーターが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、伸長因子１α（ＥＦ１α）プロモーター、サル空胞ウイルス（ＳＶ４０）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ１）プロモーター、ユビキチンＣ（Ｕｂｃ）プロモーター、ヒトβアクチンプロモーター、ＣＡＧプロモーター、テトラサイクリン応答エレメント（ＴＲＥ）プロモーター、ＵＡＳプロモーター、アクチン５ｃ（Ａｃ５）プロモーター、ポリへドロンプロモーター、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩａ）プロモーター、ＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ１０プロモーター、ＴＥＦ１プロモーター、グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＳ）プロモーター、ＡＤＨ１プロモーター、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、Ｕｂｉプロモーター、ヒトポリメラーゼＩＩＩ ＲＮＡ（Ｈ１）プロモーター、Ｕ６プロモーター、それらのポリアデニル化構築物、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項２３に記載の単離された非天然起源の核酸。
  25. プロモーターがＣＭＶプロモーターである、請求項２４に記載の単離された非天然起源の核酸。
  26. 配列が、配列のコード領域の少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、または少なくとも１６個のコドンにおいて、非ＡＧＧアルギニンコドンをＡＧＧで置き換えるように修飾されている、請求項１～２５のいずれか一項に記載の単離された非天然起源の核酸。
  27. 配列が、配列のコード領域のすべての非ＡＧＧアルギニンコドンをＡＧＧで置き換えるように修飾されている、請求項２６に記載の単離された非天然起源の核酸。
  28. 配列が、配列番号７０と比較して、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、または少なくとも１６個のコドン位置において、非ＡＧＧアルギニンコドンをＡＧＧで置き換えるように修飾されている、請求項１～２７のいずれか一項に記載の単離された非天然起源の核酸。
  29. 配列が、配列番号７０と比較して、すべての非ＡＧＧアルギニンコドンをＡＧＧで置き換えるように修飾されている、請求項１～２８のいずれか一項に記載の単離された非天然起源の核酸。
  30. 非ＡＧＧアルギニンコドンが、ＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、またはＡＧＡを含む、請求項１～２９のいずれか一項に記載の単離された非天然起源の核酸。
  31. 非ＡＧＧアルギニンコドンがＡＧＡである、請求項３０に記載の単離された非天然起源の核酸。
  32. 配列が、配列のコード領域の少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、または少なくとも１６個のコドンにおいて、ＡＧＡをＡＧＧで置き換えるように修飾されている、請求項３１に記載の単離された非天然起源の核酸。
  33. 配列が、配列のコード領域のすべてのＡＧＡをＡＧＧで置き換えるように修飾されている、請求項３２に記載の単離された非天然起源の核酸。
  34. 配列が、配列番号７０と比較して、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、または少なくとも１６個のコドン位置において、ＡＧＡをＡＧＧで置き換えるように修飾されている、請求項３１に記載の単離された非天然起源の核酸。
  35. 配列が、配列番号７０と比較して、すべてのＡＧＡをＡＧＧで置き換えるように修飾されている、請求項３４に記載の単離された非天然起源の核酸。
  36. 配列が、配列のコード領域の少なくとも３個、少なくとも６個、少なくとも９個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも１８個、少なくとも２１個、少なくとも２４個、少なくとも２７個、少なくとも２９個、または少なくとも３０個のコドンにおいて、非ＣＣＣプロリンコドンをＣＣＣで置き換えるように修飾されている、請求項３～３５のいずれか一項に記載の単離された非天然起源の核酸。
  37. 配列が、配列のコード領域のすべての非ＣＣＣプロリンコドンをＣＣＣで置き換えるように修飾されている、請求項３６に記載の単離された非天然起源の核酸。
  38. 配列が、配列番号７０と比較して、少なくとも３個、少なくとも６個、少なくとも９個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも１８個、少なくとも２１個、少なくとも２４個、少なくとも２７個、少なくとも２９個、または最大で３０個のコドン位置において、非ＣＣＣプロリンコドンをＣＣＣで置き換えるように修飾されている、請求項３～３５のいずれか一項に記載の単離された非天然起源の核酸。
  39. 配列が、配列番号７０と比較して、すべての非ＣＣＣプロリンコドンをＣＣＣで置き換えるように修飾されている、請求項３８に記載の単離された非天然起源の核酸。
  40. 非ＣＣＣプロリンコドンがＣＣＴまたはＣＣＡを含む、請求項３～３５のいずれか一項に記載の単離された非天然起源の核酸。
  41. 非ＣＣＣプロリンコドンがＣＣＴである、請求項４０に記載の単離された非天然起源の核酸。
  42. 配列が、配列のコード領域の少なくとも３個、少なくとも６個、少なくとも９個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも１８個、少なくとも２１個、少なくとも２４個、少なくとも２７個、少なくとも２９個、または少なくとも３０個のコドンにおいて、ＣＣＴをＣＣＣで置き換えるように修飾されている、請求項４１に記載の単離された非天然起源の核酸。
  43. 配列が、配列のコード領域のすべてのＣＣＴをＣＣＣで置き換えるように修飾されている、請求項４２に記載の単離された非天然起源の核酸。
  44. 配列が、配列番号７０と比較して、少なくとも３個、少なくとも６個、少なくとも９個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも１８個、少なくとも２１個、少なくとも２４個、少なくとも２７個、少なくとも２９個、または少なくとも３０個のコドン位置において、ＣＣＴをＣＣＣで置き換えるように修飾されている、請求項４１に記載の単離された非天然起源の核酸。
  45. 配列が、配列番号７０と比較して、すべてのＣＣＴをＣＣＣで置き換えるように修飾されている、請求項４４に記載の単離された非天然起源の核酸。
  46. 配列が、配列のコード領域の少なくとも３個、少なくとも６個、少なくとも９個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも１８個、少なくとも２１個、少なくとも２４個、少なくとも２７個、少なくとも３０個、少なくとも３３個、または少なくとも３６個のコドンにおいて、非ＴＣＣセリンコドンをＴＣＣで置き換えるように修飾されている、請求項３～３５のいずれか一項に記載の単離された非天然起源の核酸。
  47. 配列が、配列のコード領域のすべての非ＴＣＣセリンコドンをＴＣＣで置き換えるように修飾されている、請求項４６に記載の単離された非天然起源の核酸。
  48. 配列が、配列番号７０と比較して、少なくとも３個、少なくとも６個、少なくとも９個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも１８個、少なくとも２１個、少なくとも２４個、少なくとも２７個、少なくとも３０個、少なくとも３３個、または少なくとも３６個のコドン位置において、非ＴＣＣセリンコドンをＴＣＣで置き換えるように修飾されている、請求項３～３５のいずれか一項に記載の単離された非天然起源の核酸。
  49. 配列が、配列番号７０と比較して、すべての非ＴＣＣセリンコドンをＴＣＣで置き換えるように修飾されている、請求項４８に記載の単離された非天然起源の核酸。
  50. 非ＴＣＣセリンコドンが、ＴＣＴ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧＴ、またはＡＧＣを含む、請求項３～３５のいずれか一項に記載の単離された非天然起源の核酸。
  51. 非ＴＣＣセリンコドンがＡＧＣである、請求項５０に記載の単離された非天然起源の核酸。
  52. 配列が、配列のコード領域の少なくとも３個、少なくとも６個、少なくとも９個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも１８個、少なくとも２１個、少なくとも２４個、少なくとも２７個、少なくとも３０個、少なくとも３３個、または少なくとも３６個のコドンにおいて、ＡＧＣをＴＣＣで置き換えるように修飾されている、請求項５１に記載の単離された非天然起源の核酸。
  53. 配列が、配列のコード領域のすべてのＡＧＣをＴＣＣで置き換えるように修飾されている、請求項５２に記載の単離された非天然起源の核酸。
  54. 配列が、配列番号７０と比較して、少なくとも３個、少なくとも６個、少なくとも９個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも１８個、少なくとも２１個、少なくとも２４個、少なくとも２７個、少なくとも３０個、少なくとも３３個、または少なくとも３６個のコドン位置において、ＡＧＣをＴＣＣで置き換えるように修飾されている、請求項５１に記載の単離された非天然起源の核酸。
  55. 配列が、配列番号７０と比較して、すべてのＡＧＣをＴＣＣで置き換えるように修飾されている、請求項５４に記載の単離された非天然起源の核酸。
  56. 配列が、配列のコード領域の少なくとも３個、少なくとも６個、少なくとも９個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも１８個、少なくとも２１個、少なくとも２４個、少なくとも２７個、または少なくとも３０個のコドンにおいて、非ＣＣＧプロリンコドンをＣＣＧで置き換えるように修飾されている、請求項３～３５のいずれか一項に記載の単離された非天然起源の核酸。
  57. 配列が、配列のコード領域のすべての非ＣＣＧプロリンコドンをＣＣＧで置き換えるように修飾されている、請求項５６に記載の単離された非天然起源の核酸。
  58. 配列が、配列番号７０と比較して、少なくとも３個、少なくとも６個、少なくとも９個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも１８個、少なくとも２１個、少なくとも２４個、少なくとも２７個、少なくとも３０個のコドン位置において、非ＣＣＧプロリンコドンをＣＣＧで置き換えるように修飾されている、請求項３～３５のいずれか一項に記載の単離された非天然起源の核酸。
  59. 配列が、配列番号７０と比較して、すべての非ＣＣＧプロリンコドンをＣＣＧで置き換えるように修飾されている、請求項５８に記載の単離された非天然起源の核酸。
  60. 非ＣＣＧプロリンコドンが、ＣＣＣまたはＣＣＡを含む、請求項３～３５のいずれか一項に記載の単離された非天然起源の核酸。
  61. 非ＣＣＧプロリンコドンがＣＣＣである、請求項６０に記載の単離された非天然起源の核酸。
  62. 配列が、配列のコード領域の少なくとも３個、少なくとも６個、少なくとも９個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも１８個、少なくとも２１個、少なくとも２４個、少なくとも２７個、または少なくとも３０個のコドンにおいて、ＣＣＣをＣＣＧで置き換えるように修飾されている、請求項６１に記載の単離された非天然起源の核酸。
  63. 配列が、配列のコード領域のすべてのＣＣＣをＣＣＧで置き換えるように修飾されている、請求項６２に記載の単離された非天然起源の核酸。
  64. 配列が、配列番号７０と比較して、少なくとも３個、少なくとも６個、少なくとも９個、少なくとも１２個、少なくとも１５個、少なくとも１８個、少なくとも２１個、少なくとも２４個、少なくとも２７個、または少なくとも３０個のコドン位置において、ＣＣＣをＣＣＧで置き換えるように修飾されている、請求項６１に記載の単離された非天然起源の核酸。
  65. 配列が、配列番号７０と比較して、すべてのＣＣＣをＣＣＧで置き換えるように修飾されている、請求項６４に記載の単離された非天然起源の核酸。
  66. ウイルスベクター配列を含む、請求項１～６５のいずれか一項に記載の単離された非天然起源の核酸。
  67. ウイルスベクター配列がｓｃＡＡＶベクター配列である、請求項６６に記載の単離された非天然起源の核酸。
  68. ＡＡＶベクター配列が、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、またはそれらの任意の組合せのものである、請求項６７に記載の単離された非天然起源の核酸。
  69. ＡＡＶベクター配列が、ＡＡＶ２血清型のものである、請求項６８に記載の単離された非天然起源の核酸。
  70. ウイルスベクター配列が、少なくとも２種のＡＡＶ血清型の配列を含む、請求項６６～６９のいずれか一項に記載の単離された非天然起源の核酸。
  71. 少なくとも２種の血清型が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１１、およびＡＡＶ１２から選択される、請求項７０に記載の単離された非天然起源の核酸。
  72. 配列番号１３～１９、２１～２７、３１、６２、６４、６６、または６８のうちのいずれか１つと少なくとも約６０％の配列同一性または類似性を含む、請求項１～７１のいずれか一項に記載の単離された非天然起源の核酸。
  73. 配列同一性が、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％から、最大で約１００％である、請求項７２に記載の単離された非天然起源の核酸。
  74. 配列番号３１に対して約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、および最大で約１００％の配列同一性を含む、請求項７２に記載の単離された非天然起源の核酸。
  75. 配列番号３１の核酸配列を含む、請求項７２に記載の単離された非天然起源の核酸。
  76. 配列番号３１の核酸配列からなる、請求項７２に記載の単離された非天然起源の核酸。
  77. 配列番号６６に対して約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、および最大で約１００％の配列同一性を含む、請求項７２に記載の単離された非天然起源の核酸。
  78. 配列番号６６の核酸配列を含む、請求項７２に記載の単離された非天然起源の核酸。
  79. 配列番号６６の核酸配列からなる、請求項７２に記載の単離された非天然起源の核酸。
  80. ウイルスベクター配列が一本鎖である、請求項６６～７９のいずれか一項に記載の単離された非天然起源の核酸。
  81. ウイルスベクター配列が二本鎖である、請求項６６～７９のいずれか一項に記載の単離された非天然起源の核酸。
  82. 一本鎖である、請求項１～７９のいずれか一項に記載の単離された非天然起源の核酸。
  83. 二本鎖である、請求項１～７９のいずれか一項に記載の単離された非天然起源の核酸。
  84. 複数の細胞と接触した時に、同等な複数の細胞における修飾を欠くこと以外の点では同等な配列を欠くこと以外の点では同等な単離された非天然起源の核酸と比較して、複数の細胞においてトランスフェクション後または形質導入後の生物製剤の発現を増加させる、請求項１～８３のいずれか一項に記載の単離された非天然起源の核酸。
  85. 増加した発現が、酵素結合免疫測定（ＥＬＩＳＡ）アッセイによる決定で、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２００倍、または少なくとも５００倍への増加を含む、請求項８４に記載の単離された非天然起源の核酸。
  86. 配列番号１３～１９、２１～２７、３１、６２、６４、６６、または６８の核酸配列のうちのいずれか１つと少なくとも約６０％の配列同一性または類似性を含む単離された非天然起源の核酸。
  87. 配列番号３１の核酸配列を含む、請求項８６に記載の単離された非天然起源の核酸。
  88. 配列番号６６の核酸配列を含む、請求項８６に記載の単離された非天然起源の核酸。
  89. 請求項８６～８８のいずれか一項に記載の単離された非天然起源の核酸によってコードされる生物製剤。
  90. 配列番号１２と少なくとも約６０％の配列同一性を含む、請求項８９に記載の生物製剤。
  91. 配列同一性が、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％から、最大で約１００％である、請求項９０に記載の生物製剤。
  92. 請求項１～８８のいずれか一項に記載の単離された非天然起源の核酸を含む、操作された細胞。
  93. 請求項１～８８のいずれか一項に記載の単離された非天然起源の核酸を含む、複数のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子。
  94. 単位剤形中に請求項９３に記載の複数のＡＡＶ粒子を含む組成物。
  95. 凍結保存されている、請求項１０６に記載の組成物。
  96. （ａ）請求項１～８８のいずれか一項に記載の単離された非天然起源の核酸、（ｂ）請求項８９～９１のいずれか一項に記載の生物製剤、（ｃ）請求項９２に記載の操作された細胞、または（ｄ）請求項９３に記載の複数のＡＡＶ粒子を含む容器。
  97. 細胞を修飾する方法であって、
    （ａ）複数の細胞を、請求項１～８８のいずれか一項に記載の単離された非天然起源の核酸と接触させるステップ、
    （ｂ）複数の細胞を、請求項９３に記載の複数のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子と接触させるステップ、または
    （ｃ）（ａ）および（ｂ）の両方のステップ
    を含む方法。
  98. （ａ）請求項１～８８のいずれか一項に記載の単離された非天然起源の核酸、（ｂ）請求項８９～９１のいずれか一項に記載の生物製剤、（ｃ）または請求項９３に記載の複数のＡＡＶ粒子を含む医薬組成物。
  99. 眼の疾患または状態の処置用である、請求項９８に記載の医薬組成物。
  100. 眼の疾患または状態が、色覚異常、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、緑内障、バルデ・ビードル症候群、ベスト病、全脈絡膜萎縮、レーバー先天性黒内障、黄斑変性、ポリープ状脈絡膜血管症（ＰＣＶ）、網膜色素変性、レフサム病、スタルガルト病、アッシャー症候群、Ｘ連鎖性網膜分離症（ＸＬＲＳ）、桿体－錐体ジストロフィー、錐体－桿体ジストロフィー、小口病、レバンチン病（家族性優性ドルーゼン）、および青錐体一色型色覚異常からなる群から選択される、請求項９８または９９に記載の医薬組成物。
  101. 眼の疾患または状態がＡＭＤである、請求項１００に記載の医薬組成物。
  102. 疾患または状態の処置を必要とする対象において疾患または状態を処置する方法であって、請求項９８～１０１のいずれか一項に記載の医薬組成物の有効量を対象に投与し、それによって疾患を処置するステップを含む方法。
  103. 疾患または状態の処置を必要とする対象において疾患または状態を処置するための方法であって、抗血管新生剤を含む生物製剤をコードする配列を含む単離された非天然起源の核酸を含む医薬組成物の治療有効量を投与するステップを含み、配列が、コード領域における修飾を欠くこと以外の点では同等な配列と比較して、配列のコード領域の少なくとも４個のコドンにおいて、非ＡＧＧアルギニンコドンをＡＧＧで置き換えるように修飾されており、それによって疾患または状態の処置を必要とする対象において疾患または状態を処置する方法。
  104. 疾患または状態の処置を必要とする対象において疾患または状態を処置するための方法であって、抗血管新生剤を含む生物製剤をコードする配列を含む単離された非天然起源の核酸を含む医薬組成物の治療有効量を投与するステップを含み、配列が、コード領域における修飾を欠くこと以外の点では同等な配列と比較して、配列のコード領域の少なくとも４個のコドンにおいて、非ＡＧＧアルギニンコドンをＡＧＧで置き換えるように修飾されており、修飾が、疾患または状態の処置を必要とする対象において、修飾を欠くこと以外の点では同等な単離された非天然起源の核酸を投与されたこと以外の点では同等な対象と比較して、生物製剤のレベルを増加させるのに有効である、方法。
  105. 対象における生物製剤の増加したレベルが、診断アッセイによる決定で、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２００倍、または少なくとも５００倍への増加である、請求項１０４に記載の方法。
  106. 抗血管新生剤をコードする配列が、第２の修飾をさらに含む、請求項１０２～１０５のいずれか一項に記載の方法。
  107. 第２の修飾が、配列のコード領域の少なくとも１個のコドン内にあり、かつ、第２の修飾が、
    （ａ）少なくとも１個の非ＣＣＣプロリンコドンのＣＣＣによる置き換え、
    （ｂ）少なくとも１個の非ＴＣＣセリンコドンのＴＣＣによる置き換え、
    （ｃ）少なくとも１個の非ＣＣＧプロリンコドンのＣＣＧによる置き換え、および
    （ｄ）（ａ）～（ｃ）の任意の組合せ
    からなる群から選択される、請求項１０６に記載の方法。
  108. 第２の修飾が（ａ）を含む、請求項１０７に記載の方法。
  109. 第２の修飾が（ｂ）を含む、請求項１０７に記載の方法。
  110. 第２の修飾が（ｃ）を含む、請求項１０７に記載の方法。
  111. 第２の修飾が（ｄ）を含む、請求項１０７に記載の方法。
  112. 疾患または状態の処置を必要とする対象において疾患または状態を処置するための方法であって、抗血管新生剤を含む生物製剤をコードする配列を含む単離された非天然起源の核酸を含む医薬組成物の治療有効量を投与するステップを含み、配列が、コード領域における修飾を欠くこと以外の点では同等な配列と比較して、配列のコード領域の少なくとも４個のコドンにおいて、ＡＧＡをＡＧＧで置き換えるように修飾されており、それによって疾患または状態の処置を必要とする対象において疾患または状態を処置する方法。
  113. 疾患または状態の処置を必要とする対象において疾患または状態を処置するための方法であって、抗血管新生剤を含む生物製剤をコードする配列を含む単離された非天然起源の核酸を含む医薬組成物の治療有効量を投与するステップを含み、配列が、コード領域における修飾を欠くこと以外の点では同等な配列と比較して、配列のコード領域の少なくとも４個のコドンにおいて、ＡＧＡをＡＧＧで置き換えるように修飾されており、修飾が、生物製剤のレベルの増加を必要とする対象において、修飾を欠くこと以外の点では同等な単離された非天然起源の核酸を投与されたこと以外の点では同等な対象と比較して、生物製剤のレベルを増加させるのに有効である、方法。
  114. 対象における生物製剤の増加したレベルが、診断アッセイによる決定で、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２００倍、または少なくとも５００倍への増加である、請求項１１３に記載の方法。
  115. 抗血管新生剤をコードする配列が、第２の修飾をさらに含む、請求項１１２～１１４のいずれか一項に記載の方法。
  116. 第２の修飾が、配列のコード領域の少なくとも１個のコドン内にあり、かつ、第２の修飾が、
    （ａ）ＣＣＴからＣＣＣに、
    （ｂ）ＡＧＣからＴＣＣに、
    （ｃ）ＣＣＣからＣＣＧに、および
    （ｄ）（ａ）～（ｃ）の任意の組合せ
    からなる群から選択される、請求項１１５に記載の方法。
  117. 第２の修飾が（ａ）を含む、請求項１１６に記載の方法。
  118. 第２の修飾が（ｂ）を含む、請求項１１６に記載の方法。
  119. 第２の修飾が（ｃ）を含む、請求項１１６に記載の方法。
  120. 第２の修飾が（ｄ）を含む、請求項１１６に記載の方法。
  121. 抗血管新生剤が、ＶＥＧＦ阻害剤、マルチチロシンキナーゼ阻害剤、受容体チロシンキナーゼ阻害剤、またはＡｋｔリン酸化の阻害剤を含む、請求項１０２～１２０のいずれか一項に記載の方法。
  122. 抗血管新生剤がＶＥＧＦ阻害剤を含む、請求項１２１に記載の方法。
  123. ＶＥＧＦ阻害剤が非抗体阻害剤である、請求項１２２に記載の方法。
  124. 非抗体阻害剤が、ヒトＶＥＧＦ受容体１および２を含む融合タンパク質を含み、融合タンパク質が、ＶＥＧＦ－Ｔｒａｐまたはその修飾バージョンを含む、請求項１２３に記載の方法。
  125. 単離された非天然起源の核酸が、配列番号１３～１９、２１～２７、３１、６２、６４、６６、または６８のうちのいずれか１つと少なくとも約６０％の配列同一性または類似性を含む、請求項１０２～１２４のいずれか一項に記載の方法。
  126. 配列同一性が、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％から、最大で約１００％である、請求項１２５に記載の方法。
  127. 単離された非天然起源の核酸配列が、配列番号３１に対して約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、および最大で約１００％の配列同一性を含む、請求項１２５に記載の方法。
  128. 単離された非天然起源の核酸が、配列番号３１の核酸配列を含む、請求項１２５に記載の方法。
  129. 単離された非天然起源の核酸が、配列番号３１の核酸配列からなる、請求項１２５に記載の方法。
  130. 単離された非天然起源の核酸が、配列番号６６に対して約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、および最大で約１００％の配列同一性を含む、請求項１２５に記載の方法。
  131. 単離された非天然起源の核酸が、配列番号６６の核酸配列を含む、請求項１２５に記載の方法。
  132. 単離された非天然起源の核酸が、配列番号６６の核酸配列からなる、請求項１２５に記載の方法。
  133. 核酸がウイルスベクター配列を含む、請求項１０２～１３２のいずれか一項に記載の方法。
  134. ウイルスベクター配列がｓｃＡＡＶベクター配列である、請求項１３３に記載の方法。
  135. ＡＡＶベクター配列が、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、またはそれらの任意の組合せのものである、請求項１３４に記載の方法。
  136. ＡＡＶベクター配列が、ＡＡＶ２血清型のものである、請求項１３５に記載の方法。
  137. 投与が、硝子体内注射、網膜下注射、微量注入、または眼球上注射を介する、請求項１０２～１３６のいずれか一項に記載の方法。
  138. 投与が、硝子体内注射を介する、請求項１３７に記載の方法。
  139. 眼の疾患または状態が、色覚異常、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、緑内障、バルデ・ビードル症候群、ベスト病、全脈絡膜萎縮、レーバー先天性黒内障、黄斑変性、ポリープ状脈絡膜血管症（ＰＣＶ）、網膜色素変性、レフサム病、スタルガルト病、アッシャー症候群、Ｘ連鎖性網膜分離症（ＸＬＲＳ）、桿体－錐体ジストロフィー、錐体－桿体ジストロフィー、小口病、レバンチン病（家族性優性ドルーゼン）、および青錐体一色型色覚異常からなる群から選択される、請求項１０２～１３８のいずれか一項に記載の方法。
  140. 眼の疾患または状態がＡＭＤである、請求項１３９に記載の方法。
  141. ＡＭＤが滲出型ＡＭＤである、請求項１４０に記載の方法。
  142. ＡＭＤが萎縮型ＡＭＤである、請求項１４０に記載の方法。
  143. 投与が、疾患もしくは状態の少なくとも症状を軽減するか、疾患もしくは状態を処置するか、および／または疾患もしくは状態を消失させるのに十分である、請求項１０２～１４２のいずれか一項に記載の方法。
  144. 投与が、約１．０×１０９ｖｇ、約１．０×１０１０ｖｇ、約１．０×１０１１ｖｇ、約３．０×１０１１ｖｇ、約６×１０１１ｖｇ、約８．０×１０１１ｖｇ、約１．０×１０１２ｖｇ、約１．０×１０１３ｖｇ、約１．０×１０１４ｖｇ、または約１．０×１０１５ｖｇの投与量の単離された非天然起源の核酸を送達するステップを含む、請求項１０２～１４３のいずれか一項に記載の方法。
  145. 投与が反復される、請求項１０２～１４４のいずれか一項に記載の方法。
  146. 投与が、１日２回、２日に１回、週２回、月２回、月３回、月１回、２か月に１回、年２回、年１回、または２年に１回行われる、請求項１４５に記載の方法。
  147. 投与の前に、対象が遺伝子検査を受ける、請求項１０２～１４６のいずれか一項に記載の方法。
  148. 遺伝子検査が、他の点では同等な野生型配列と比較して、遺伝子配列における変異を検出する、請求項１４７に記載の方法。
  149. 二次療法を施すステップをさらに含む、請求項１０２～１４８のいずれか一項に記載の方法。
  150. 二次療法が、光線力学的療法（ＰＤＴ）、抗炎症剤、抗微生物剤、およびレーザー光凝固療法（ＬＰＴ）のうちの少なくとも１つを含む、請求項１４９に記載の方法。
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