KR20230167100A - 안구 트랜스진 발현을 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

안구 트랜스진 발현을 위한 조성물 및 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20230167100A
KR20230167100A KR1020237038198A KR20237038198A KR20230167100A KR 20230167100 A KR20230167100 A KR 20230167100A KR 1020237038198 A KR1020237038198 A KR 1020237038198A KR 20237038198 A KR20237038198 A KR 20237038198A KR 20230167100 A KR20230167100 A KR 20230167100A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
nucleic acid
sequence
naturally occurring
occurring nucleic
isolated non
Prior art date
Application number
KR1020237038198A
Other languages
English (en)
Inventor
셩지앙 리우
하이펑 천
Original Assignee
에이버맥스 바이오파마 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 에이버맥스 바이오파마 인크. filed Critical 에이버맥스 바이오파마 인크.
Publication of KR20230167100A publication Critical patent/KR20230167100A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1858—Platelet-derived growth factor [PDGF]
    • A61K38/1866—Vascular endothelial growth factor [VEGF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0066—Manipulation of the nucleic acid to modify its expression pattern, e.g. enhance its duration of expression, achieved by the presence of particular introns in the delivered nucleic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/30—Animals modified by surgical methods
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/42—Vector systems having a special element relevant for transcription being an intron or intervening sequence for splicing and/or stability of RNA

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본원에는 생물제제를 코딩하는 비-자연 발생 핵산 서열을 포함하는 조성물 및 방법이 제공된다. 또한, 다양한 질환 및 병태의 예방 및 치료를 위한 안구 치료제로서 제공된 조성물 및 방법을 활용하는 방법이 제공된다.

Description

안구 트랜스진 발현을 위한 조성물 및 방법
상호 참조
본 출원은 2021년 4월 9일에 출원된 미국 가출원 번호 63/173,280을 우선권 주장하며, 그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출되었고 그의 전체 내용이 본원에 참조로 포함되는 서열 목록을 함유한다. 2022년 4월 8일에 생성된, 상기 ASCII 카피는 59561-703_601_SL.txt로 명명되고 그 크기가 159,002 바이트이다.
아플리베르셉트 (VEGF-트랩)는 혈관 내피 성장 인자 하위 유형 A (VEGF-A), VEGF-B 및 태반 성장 인자 (PIGF)에 대한 미끼 수용체로서 작용하는 재조합 융합 단백질이다. 아플리베르셉트는 이러한 리간드와 결합함으로써 이러한 리간드가 혈관 내피 성장 인자 수용체 (VEGFR), VEGFR-1 및 VEGFR-2와 결합하는 것을 방지하여, 신생혈관증식을 억제하고 혈관 투과성을 감소시킬 수 있다. 아플리베르셉트는 VEGFR-1의 도메인 2와 IgG1의 Fc 단편과 융합된 VEGFR-2의 도메인 3으로 이루어진다. 아플리베르셉트는 안과 유리체내 아플리베르셉트 융합 단백질 주사제인 아일레아(EYLEA)® (아플리베르셉트)라는 상표명으로 상업적으로 판매된다.
현재 아플리베르셉트를 이용하는 치료법은 신생혈관증식을 억제하기 위해 내구성이 짧고, 매달 반복적으로 주사해야 하는 문제점이 있다. VEGF-트랩에 대한 코딩 서열을 보유하는 AAV 벡터를 사용한 여러 유전자 요법 연구는 신생혈관증식의 장기간 치료를 위해 조사되었다. 그러나, 이러한 연구에서는 작용제의 발현 수준이 낮아 치료 효능이 감소하는 문제가 있다. 따라서, 이러한 기술의 전체 잠재력은 VEGF-트랩 및 기타 항혈관형성제의 전달 및 발현을 개선하기 위한 변형이 이루어진 후에만 실현될 것이라는 것이 점점 더 분명해지고 있다.
본원에는 일부 측면에서, 항혈관형성제를 포함하는 생물제제를 코딩하는 서열을 포함하는 단리된 비-자연 발생 핵산이 기재되어 있으며, 상기 서열은 코딩 영역에서의 변형이 결여된 그 외에는 필적하는 서열과 비교 시 서열의 코딩 영역에서의 변형을 포함하며, 상기 변형은 적어도 4개의 비-AGG 아르기닌 코돈을 AGG로 대체하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항혈관형성제를 코딩하는 서열은 제2 변형을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 변형은 서열의 코딩 영역의 적어도 하나의 코돈에 있으며, 여기서 제2 변형은 (a) 적어도 하나의 비-CCC 프롤린 코돈을 CCC로 대체하는 것; (b) 적어도 하나의 비-TCC 세린 코돈을 TCC로 대체하는 것; (c) 적어도 하나의 비-CCG 프롤린 코돈을 CCG로 대체하는 것; 및 (d) (a)-(c)의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 제2 변형은 (a)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 비-CCC 프롤린 코돈은 CCT이다. 일부 실시양태에서, 제2 변형은 (b)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 비-TCC 세린 코돈은 AGC이다. 일부 실시양태에서, 제2 변형은 (c)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 비-CCG 프롤린 코돈은 CCC이다. 일부 실시양태에서, 제2 변형은 (d)를 포함한다. 일부 실시양태에서, (a)의 적어도 하나의 비-CCC 프롤린 코돈은 CCT이고; (b)의 적어도 하나의 비-TCC 세린 코돈은 AGC이고; (c)의 적어도 하나의 비-CCG 프롤린 코돈은 CCC이다. 일부 실시양태에서, 항혈관형성제는 VEGF 억제제, 멀티-티로신 키나제 억제제, 수용체 티로신 키나제 억제제, Akt 인산화 억제제, PDGF-1 억제제, PDGF-2 억제제, NP-1 억제제, NP-2 억제제, Del 1 억제제 및 인테그린 억제제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 항혈관형성제는 VEGF 억제제를 포함하며, 여기서 VEGF 억제제는 비-항체 억제제이다. 일부 실시양태에서, 비-항체 억제제는 인간 VEGF 수용체 1 및 2를 포함하는 융합 단백질이다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 VEGF-트랩 또는 그의 변형된 버전을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 비-자연 발생 핵산은 신호 펩티드를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 신호 펩티드는 인간 항체 중쇄 (Vh), 인간 항체 경쇄 (Vl) 및 VEGF-트랩으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 신호 펩티드는 인간 항체 중쇄로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 신호 펩티드는 VEGF-트랩으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 단리된 비-자연 발생 핵산은 인트론 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 인트론 서열은 hCMV 인트론 A, 아데노바이러스 삼자 리더 서열 인트론, SV40 인트론, 햄스터 EF-1 알파 유전자 인트론 1, 개입 서열 인트론, 인간 성장 호르몬 인트론 및 인간 베타 글로빈 인트론으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 인트론 서열은 SV40 인트론이다. 일부 실시양태에서, 단리된 비-자연 발생 핵산은 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터, 신장 인자 1 알파 (EF1α) 프로모터, 원숭이 공포형성 바이러스 (SV40) 프로모터, 포스포글리세레이트 키나제 (PGK1) 프로모터, 유비퀴틴 C (Ubc) 프로모터, 인간 베타 액틴 프로모터, CAG 프로모터, 테트라시클린 반응 요소 (TRE) 프로모터, UAS 프로모터, 액틴 5c (Ac5) 프로모터, 폴리헤드론 프로모터, Ca2+/칼모듈린-의존성 단백질 키나제 II (CaMKIIa) 프로모터, GAL1 프로모터, GAL 10 프로모터, TEF1 프로모터, 글리세르알데히드 3-포스페이트 데히드로게나제 (GDS) 프로모터, ADH1 프로모터, CaMV35S 프로모터, Ubi 프로모터, 인간 폴리머라제 III RNA (H1) 프로모터, U6 프로모터, 그의 폴리아데닐화된 구축물, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 CMV 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 서열은 이러한 서열의 코딩 영역의 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 또는 적어도 16개의 코돈에서 비-AGG 아르기닌 코돈을 AGG로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 서열은 이러한 서열의 코딩 영역의 모든 비-AGG 아르기닌 코돈을 AGG로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 서열은 서열식별번호( SEQ ID NO): 70과 비교 시 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 또는 적어도 16개의 코돈 위치에서 비-AGG 아르기닌 코돈을 AGG로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 서열은 서열식별번호: 70과 비교 시 모든 비-AGG 아르기닌 코돈을 AGG로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 비-AGG 아르기닌 코돈은 CGT, CGC, CGA, CGG 또는 AGA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-AGG 아르기닌 코돈은 AGA이다. 일부 실시양태에서, 서열은 이러한 서열의 코딩 영역의 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 또는 적어도 16개의 코돈에서 AGA를 AGG로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 서열은 이러한 서열의 코딩 영역의 모든 AGA를 AGG로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 서열은 서열식별번호: 70과 비교 시 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 또는 적어도 16개의 코돈 위치에서 AGA를 AGG로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 서열은 서열식별번호: 70과 비교 시 모든 AGA를 AGG로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 서열은 이러한 서열의 코딩 영역의 적어도 3개, 적어도 6개, 적어도 9개, 적어도 12개, 적어도 15개, 적어도 18개, 적어도 21개, 적어도 24개, 적어도 27개, 적어도 29개, 또는 적어도 30개의 코돈에서 비-CCC 프롤린 코돈을 CCC로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 서열은 이러한 서열의 코딩 영역의 모든 비-CCC 프롤린 코돈을 CCC로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 서열은 서열식별번호: 70과 비교 시 적어도 3개, 적어도 6개, 적어도 9개, 적어도 12개, 적어도 15개, 적어도 18개, 적어도 21개, 적어도 24개, 적어도 27개, 적어도 29개, 또는 최대 30개의 코돈 위치에서 비-CCC 프롤린 코돈을 CCC로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 서열은 서열식별번호: 70과 비교 시 모든 비-CCC 프롤린 코돈을 CCC로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 비-CCC 프롤린 코돈은 CCT 또는 CCA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-CCC 프롤린 코돈은 CCT이다. 일부 실시양태에서, 서열은 이러한 서열의 코딩 영역의 적어도 3개, 적어도 6개, 적어도 9개, 적어도 12개, 적어도 15개, 적어도 18개, 적어도 21개, 적어도 24개, 적어도 27개, 적어도 29개, 또는 적어도 30개의 코돈에서 CCT를 CCC로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 서열은 이러한 서열의 코딩 영역의 모든 CCT를 CCC로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 서열은 서열식별번호: 70과 비교 시 적어도 3개, 적어도 6개, 적어도 9개, 적어도 12개, 적어도 15개, 적어도 18개, 적어도 21개, 적어도 24개, 적어도 27개, 적어도 29개, 또는 적어도 30개의 코돈 위치에서 CCT를 CCC로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 서열은 서열식별번호: 70과 비교 시 모든 CCT를 CCC로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 서열은 이러한 서열의 코딩 영역의 적어도 3개, 적어도 6개, 적어도 9개, 적어도 12개, 적어도 15개, 적어도 18개, 적어도 21개, 적어도 24개, 적어도 27개, 적어도 30개, 적어도 33개, 또는 적어도 36개의 코돈에서 비-TCC 세린 코돈을 TCC로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 서열은 이러한 서열의 코딩 영역의 모든 비-TCC 세린 코돈을 TCC로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 서열은 서열식별번호: 70과 비교 시 적어도 3개, 적어도 6개, 적어도 9개, 적어도 12개, 적어도 15개, 적어도 18개, 적어도 21개, 적어도 24개, 적어도 27개, 적어도 30개, 적어도 33개, 또는 적어도 36개의 코돈 위치에서 비-TCC 세린 코돈을 TCC로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 서열은 서열식별번호: 70과 비교 시 모든 비-TCC 세린 코돈을 TCC로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 비-TCC 세린 코돈은 TCT, TCA, TCG, AGT 또는 AGC를 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-TCC 세린 코돈은 AGC이다. 일부 실시양태에서, 서열은 이러한 서열의 코딩 영역의 적어도 3개, 적어도 6개, 적어도 9개, 적어도 12개, 적어도 15개, 적어도 18개, 적어도 21개, 적어도 24개, 적어도 27개, 적어도 30개, 적어도 33개, 또는 적어도 36개의 코돈에서 AGC를 TCC로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 서열은 이러한 서열의 코딩 영역의 모든 AGC를 TCC로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 서열은 서열식별번호: 70과 비교 시 적어도 3개, 적어도 6개, 적어도 9개, 적어도 12개, 적어도 15개, 적어도 18개, 적어도 21개, 적어도 24개, 적어도 27개, 적어도 30개, 적어도 33개, 또는 적어도 36개의 코돈 위치에서 AGC를 TCC로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 서열은 서열식별번호: 70과 비교 시 모든 AGC를 TCC로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 서열은 이러한 서열의 코딩 영역의 적어도 3개, 적어도 6개, 적어도 9개, 적어도 12개, 적어도 15개, 적어도 18개, 적어도 21개, 적어도 24개, 적어도 27개, 또는 적어도 30개의 코돈에서 비-CCG 프롤린 코돈을 CCG로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 서열은 이러한 서열의 코딩 영역의 모든 비-CCG 프롤린 코돈을 CCG로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 서열은 서열식별번호: 70과 비교 시 적어도 3개, 적어도 6개, 적어도 9개, 적어도 12개, 적어도 15개, 적어도 18개, 적어도 21개, 적어도 24개, 적어도 27개, 적어도 30개의 코돈 위치에서 비-CCG 프롤린 코돈을 CCG로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 서열은 서열식별번호: 70과 비교 시 모든 비-CCG 프롤린 코돈을 CCG로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 비-CCG 프롤린 코돈은 CCC 또는 CCA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-CCG 프롤린 코돈은 CCC이다. 일부 실시양태에서, 서열은 이러한 서열의 코딩 영역의 적어도 3개, 적어도 6개, 적어도 9개, 적어도 12개, 적어도 15개, 적어도 18개, 적어도 21개, 적어도 24개, 적어도 27개, 또는 적어도 30개의 코돈에서 CCC를 CCG로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 서열은 이러한 서열의 코딩 영역의 모든 CCC를 CCG로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 서열은 서열식별번호: 70과 비교 시 적어도 3개, 적어도 6개, 적어도 9개, 적어도 12개, 적어도 15개, 적어도 18개, 적어도 21개, 적어도 24개, 적어도 27개, 또는 적어도 30개의 코돈 위치에서 CCC를 CCG로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 서열은 서열식별번호: 70과 비교 시 모든 CCC를 CCG로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 바이러스 벡터 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터 서열은 scAAV 벡터 서열이다. 일부 실시양태에서, AAV 벡터 서열은 혈청형 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12 또는 그의 임의의 조합의 것이다. 일부 실시양태에서, AAV 벡터 서열은 AAV2 혈청형의 것이다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터 서열은 적어도 2개의 AAV 혈청형의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 2개의 혈청형은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV8, AAV9, AAV11 및 AAV12로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 단리된 비-자연 발생 핵산은 서열식별번호: 13-19, 21-27, 31, 62, 64, 66, 또는 68 중 어느 하나와 적어도 약 60%의 서열 동일성 또는 유사성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열 동일성은 약 70%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 및 최대 약 100%이다. 일부 실시양태에서, 단리된 비-자연 발생 핵산은 서열식별번호: 31과 약 70%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 및 최대 약 100%의 서열 동일성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 비-자연 발생 핵산은 서열식별번호: 31의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 비-자연 발생 핵산은 서열식별번호: 31의 핵산 서열로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 단리된 비-자연 발생 핵산은 서열식별번호: 66과 약 70%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 및 최대 약 100%의 서열 동일성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 비-자연 발생 핵산은 서열식별번호: 66의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 비-자연 발생 핵산은 서열식별번호: 66의 핵산 서열로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터 서열은 단일 가닥이다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터 서열은 이중 가닥이다. 일부 실시양태에서, 단리된 비-자연 발생 핵산은 단일 가닥이다. 일부 실시양태에서, 단리된 비-자연 발생 핵산은 이중 가닥이다. 일부 실시양태에서, 단리된 비-자연 발생 핵산은, 복수개의 세포와 접촉 시, 필적하는 복수개의 세포에서의 변형이 결여된 그 외에는 필적하는 서열이 결여된 그 외에는 필적하는 단리된 비-자연 발생 핵산과 비교 시, 복수개의 세포에서의 형질감염 후 또는 형질도입 후의 생물제제의 발현을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 증가된 발현은 효소 결합 면역검정 (ELISA) 검정에 의해 결정된 바와 같이 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 200배, 또는 적어도 500배 증가를 포함한다.
본원에는 일부 측면에서, 서열식별번호: 13-19, 21-27, 31, 62, 64, 66 또는 68의 핵산 서열 중 어느 하나와 적어도 약 60%의 서열 동일성 또는 유사성을 포함하는 단리된 비-자연 발생 핵산이 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 단리된 비-자연 발생 핵산은 서열식별번호: 31의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 비-자연 발생 핵산은 서열식별번호: 66의 핵산 서열을 포함한다.
본원에는 일부 측면에서, 본원에 기재된 단리된 비-자연 발생 핵산에 의해 코딩된 생물제제가 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 생물제제는 서열식별번호: 12와 적어도 약 60%의 서열 동일성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열 동일성은 약 70%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 및 최대 약 100%이다.
본원에는 일부 측면에서, 본원에 기재된 단리된 비-자연 발생 핵산을 포함하는 조작된 세포가 기재되어 있다.
본원에는 일부 측면에서, 본원에 기재된 단리된 비-자연 발생 핵산을 포함하는 복수개의 아데노-연관 바이러스 (AAV) 입자가 기재되어 있다.
본원에는 일부 측면에서, 단위 투여 형태로 본원에 기재된 복수개의 AAV 입자를 포함하는 조성물이 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 냉동보존된다.
본원에는 일부 측면에서, 본원에 기재된 단리된 비-자연 발생 핵산; 본원에 기재된 생물제제; 본원에 기재된 조작된 세포, 또는 본원에 기재된 복수개의 AAV 입자를 포함하는 용기가 기재되어 있다.
본원에는 일부 측면에서, 세포를 변형시키는 방법이 기재되어 있으며, 이러한 방법은 (a) 복수개의 세포를 제1항 내지 제88항 중 어느 한 항의 단리된 비-자연 발생 핵산과 접촉시키는 것; (b) 복수개의 세포를 제93항의 복수개의 아데노-연관 바이러스 (AAV) 입자와 접촉시키는 것; 또는 (c) (a)와 (b) 둘 다를 포함한다.
본원에는 일부 측면에서, 본원에 기재된 단리된 비-자연 발생 핵산; 본원에 기재된 생물제제; 또는 본원에 기재된 복수개의 AAV 입자를 포함하는 제약 조성물이 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 안구 질환 또는 병태를 치료하기 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 안구 질환 또는 병태는 완전색맹, 연령-관련 황반 변성 (AMD), 당뇨병성 망막병증 (DR), 녹내장, 바르데-비들 증후군, 베스트병, 맥락막결손, 레베르 선천성 흑암시, 황반 변성, 결절성 맥락막 혈관병증 (PCV), 색소성 망막염, 레프섬병, 스타르가르트병, 어셔 증후군, X-연관 망막층간분리 (XLRS), 간체-추체 이영양증, 추체-간체 이영양증, 오구치병, 말라티아 레벤티네스 (가족성 우성 드루젠) 및 청색 추체 단색형색각으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 안구 질환 또는 병태는 AMD이다.
본원에는 일부 측면에서, 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는 방법이 기재되어 있으며, 이러한 방법은 상기 대상체에게 본원에 기재된 제약 조성물의 유효량을 투여함으로써 질환을 치료하는 것을 포함한다.
본원에는 일부 측면에서, 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는 방법이 기재되어 있으며, 이러한 방법은 항혈관형성제를 포함하는 생물제제를 코딩하는 서열을 포함하는 단리된 비-자연 발생 핵산을 포함하며, 여기서 서열은 코딩 영역에서의 변형이 결여된 그 외에는 필적하는 서열과 비교 시 서열의 코딩 영역의 적어도 4개의 코돈에서 비-AGG 아르기닌 코돈을 AGG로 대체하도록 변형되는 것인 제약 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것, 및 그에 의해 상기 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는 것을 포함한다.
본원에는 일부 측면에서, 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는 방법이 기재되어 있으며, 이러한 방법은 항혈관형성제를 포함하는 생물제제를 코딩하는 서열을 포함하는 단리된 비-자연 발생 핵산을 포함하며, 여기서 서열은 코딩 영역에서의 변형이 결여된 그 외에는 필적하는 서열과 비교 시 서열의 코딩 영역의 적어도 4개의 코돈에서 비-AGG 아르기닌 코돈을 AGG로 대체하도록 변형되고, 여기서 변형은 이러한 변형이 결여된 그 외에는 필적하는 단리된 비-자연 발생 핵산이 투여된 그 외에는 필적하는 대상체와 비교 시 상기 치료를 필요로 하는 대상체에서 생물제제의 수준을 증가시키는데 유효한 것인 제약 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체에서 생물제제의 증가된 수준은 진단 검정에 의해 결정된 바와 같이, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 200배, 또는 적어도 500배 증가된다. 일부 실시양태에서, 항혈관형성제를 코딩하는 서열은 제2 변형을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 변형은 서열의 코딩 영역의 적어도 하나의 코돈 내에 있고, 여기서 제2 변형은 (a) 적어도 하나의 비-CCC 프롤린 코돈을 CCC로 대체하는 것; (b) 적어도 하나의 비-TCC 세린 코돈을 TCC로 대체하는 것; (c) 적어도 하나의 비-CCG 프롤린 코돈을 CCG로 대체하는 것; 및 (d) (a)-(c)의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 제2 변형은 (a)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 변형은 (b)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 변형은 (c)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 변형은 (d)를 포함한다.
본원에는 일부 측면에서, 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는 방법이 기재되어 있으며, 이러한 방법은 항혈관형성제를 포함하는 생물제제를 코딩하는 서열을 포함하는 단리된 비-자연 발생 핵산을 포함하며, 여기서 서열은 코딩 영역에서의 변형이 결여된 그 외에는 필적하는 서열과 비교 시 서열의 코딩 영역의 적어도 4개의 코돈에서 AGA를 AGG로 대체하도록 변형되는 것인 제약 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것, 및 그에 의해 상기 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는 것을 포함한다.
본원에는 일부 측면에서, 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는 방법이 기재되어 있으며, 이러한 방법은 항혈관형성제를 포함하는 생물제제를 코딩하는 서열을 포함하는 단리된 비-자연 발생 핵산을 포함하며, 여기서 서열은 코딩 영역에서의 변형이 결여된 그 외에는 필적하는 서열과 비교 시 서열의 코딩 영역의 적어도 4개의 코돈에서 AGA를 AGG로 대체하도록 변형되고, 여기서 변형은 이러한 변형이 결여된 그 외에는 필적하는 단리된 비-자연 발생 핵산이 투여된 그 외에는 필적하는 대상체와 비교 시 상기 치료를 필요로 하는 대상체에서 생물제제의 수준을 증가시키는데 유효한 것인 제약 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체에서 생물제제의 증가된 수준은 진단 검정에 의해 결정된 바와 같이, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 200배, 또는 적어도 500배 증가된다. 일부 실시양태에서, 항혈관형성제를 코딩하는 서열은 제2 변형을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 변형은 서열의 코딩 영역의 적어도 하나의 코돈 내에 있고, 여기서 제2 변형은 (a) CCT에서 CCC로의 변형; (b) AGC에서 TCC로의 변형; (c) CCC에서 CCG로의 변형; 및 (d) (a)-(c)의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 제2 변형은 (a)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 변형은 (b)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 변형은 (c)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 변형은 (d)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항혈관형성제는 VEGF 억제제, 멀티-티로신 키나제 억제제, 수용체 티로신 키나제 억제제, 또는 Akt 인산화 억제제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항혈관형성제는 VEGF 억제제를 포함한다. 일부 실시양태에서, VEGF 억제제는 비-항체 억제제이다. 일부 실시양태에서, 비-항체 억제제는 인간 VEGF 수용체 1 및 2를 포함하는 융합 단백질을 포함하고, 여기서 융합 단백질은 VEGF-트랩 또는 그의 변형된 버전을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 비-자연 발생 핵산은 서열식별번호: 13-19, 21-27, 31, 62, 64, 66 또는 68 중 어느 하나와 적어도 약 60%의 서열 동일성 또는 유사성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열 동일성은 약 70%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 및 최대 약 100%이다. 일부 실시양태에서, 단리된 비-자연 발생 핵산은 서열식별번호: 31과 약 70%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 및 최대 약 100%의 서열 동일성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 비-자연 발생 핵산은 서열식별번호: 31의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 비-자연 발생 핵산은 서열식별번호: 31의 핵산 서열로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 단리된 비-자연 발생 핵산은 서열식별번호: 66과 약 70%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 및 최대 약 100%의 서열 동일성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 비-자연 발생 핵산은 서열식별번호: 66의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 비-자연 발생 핵산은 서열식별번호: 66의 핵산 서열로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 핵산은 바이러스 벡터 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터 서열은 scAAV 벡터 서열이다. 일부 실시양태에서, AAV 벡터 서열은 혈청형 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, 또는 그의 임의의 조합의 것이다. 일부 실시양태에서, AAV 벡터 서열은 AAV2 혈청형의 것이다. 일부 실시양태에서, 투여는 유리체내 주사, 망막하 주사, 미세주사 또는 안구상 주사를 통해 이루어진다. 일부 실시양태에서, 투여는 유리체내 주사를 통해 이루어진다. 일부 실시양태에서, 안구 질환 또는 병태는 완전색맹, 연령-관련 황반 변성 (AMD), 당뇨병성 망막병증 (DR), 녹내장, 바르데-비들 증후군, 베스트병, 맥락막결손, 레베르 선천성 흑암시, 황반 변성, 결절성 맥락막 혈관병증 (PCV), 색소성 망막염, 레프섬병, 스타르가르트병, 어셔 증후군, X-연관 망막층간분리 (XLRS), 간체-추체 이영양증, 추체-간체 이영양증, 오구치병, 말라티아 레벤티네스 (가족성 우성 드루젠) 및 청색 추체 단색형색각으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 안구 질환 또는 병태는 AMD이다. 일부 실시양태에서, AMD는 습성 AMD이다. 일부 실시양태에서, AMD는 건성 AMD이다. 일부 실시양태에서, 투여는 질환 또는 병태의 적어도 특정 증상을 감소시키고/거나, 질환 또는 병태를 치료하고/거나 질환 또는 병태를 제거하기에 충분하다. 일부 실시양태에서, 투여는 약 1.0 x 109 vg, 약 1.0 x 1010, 약 1.0 x 1011 vg, 약 3.0 x 1011 vg, 약 6 x 1011 vg, 약 8.0 x 1011 vg, 약 1.0 x 1012 vg, 약 1.0 x 1013 vg, 약 1.0 x 1014 vg, 또는 약 1.0 x 1015 vg의 단리된 비-자연 발생 핵산의 투여량을 전달하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 투여는 반복된다. 일부 실시양태에서, 투여는 매일 2회, 격일로, 주 2회, 매달 2회, 매달 3회, 월 1회, 격월로, 반년마다, 매년 또는 2년마다 수행된다. 일부 실시양태에서, 투여 전에 대상체는 유전자 검사를 받는다. 일부 실시양태에서, 유전자 검사는 그 외에는 필적하는 야생형 서열과 비교 시 유전자 서열에서의 돌연변이를 검출한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 2차 요법을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 2차 요법은 광역학 요법 (PDT), 항염증제, 항미생물제 및 레이저 광응고 요법 (LPT) 중 적어도 하나를 포함한다.
본원에는 항혈관형성제를 포함할 수 있는 생물제제를 코딩하는 서열을 포함할 수 있는 단리된 비-자연 발생 핵산이 개시된다. 일부 실시양태에서, 서열은 코딩 영역에서의 변형이 결여된 그 외에는 필적하는 서열과 비교 시 서열의 코딩 영역의 적어도 하나의 코돈에서 AGA를 AGG로 대체하도록 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항혈관형성제를 코딩하는 서열은 제2 변형을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 변형은 서열의 코딩 영역의 적어도 하나의 코돈 내에 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 변형은 a) CCT에서 CCC로의 변형; b) AGC에서 TCC로의 변형; c) CCC에서 CCG로의 변형; 또는 d) 이들 중 임의의 것의 조합을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 변형은 CCT에서 CCC로의 변형을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 변형은 AGC에서 TCC로의 변형을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 변형은 CCC에서 CCG로의 변형을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 변형은 CCT에서 CCC로의 변형; AGC에서 TCC로의 변형; 또는 CCC에서 CCG로의 변형의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항혈관형성제는 VEGF 억제제, 멀티-티로신 키나제 억제제, 수용체 티로신 키나제 억제제, Akt 인산화 억제제, PDGF-1 억제제, PDGF-2 억제제, NP-1 억제제, NP-2 억제제, Del 1 억제제, 또는 인테그린 억제제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항혈관형성제는 VEGF 억제제를 포함할 수 있으며, VEGF 억제제는 비-항체 억제제일 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-항체 억제제는 인간 VEGF 수용체 1 및 2를 포함할 수 있는 융합 단백질일 수 있다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 VEGF-트랩 또는 그의 변형된 버전을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단리된 비-자연 발생 핵산은 신호 펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 신호 펩티드는 인간 항체 중쇄 (Vh), 인간 항체 경쇄 (Vl) 및 VEGF-트랩으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 신호 펩티드는 인간 항체 중쇄로부터의 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 신호 펩티드는 VEGF-트랩으로부터의 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 단리된 비-자연 발생 핵산은 인트론 서열을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 인트론 서열은 CMV 인트론 A, 아데노바이러스 삼자 리더 서열 인트론, SV40 인트론, 햄스터 EF-1 알파 유전자 인트론 1, 개입 서열 인트론, 인간 성장 호르몬 인트론 및 인간 베타 글로빈 인트론으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 인트론 서열은 SV40 인트론일 수 있다. 일부 실시양태에서, 단리된 비-자연 발생 핵산은 프로모터를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터, 신장 인자 1 알파 (EF1α) 프로모터, 원숭이 공포형성 바이러스 (SV40) 프로모터, 포스포글리세레이트 키나제 (PGK1) 프로모터, 유비퀴틴 C (Ubc) 프로모터, 인간 베타 액틴 프로모터, CAG 프로모터, 테트라시클린 반응 요소 (TRE) 프로모터, UAS 프로모터, 액틴 5c (Ac5) 프로모터, 폴리헤드론 프로모터, Ca2+/칼모듈린-의존성 단백질 키나제 II (CaMKIIa) 프로모터, GAL1 프로모터, GAL 10 프로모터, TEF1 프로모터, 글리세르알데히드 3-포스페이트 데히드로게나제 (GDS) 프로모터, ADH1 프로모터, CaMV35S 프로모터, Ubi 프로모터, 인간 폴리머라제 III RNA (H1) 프로모터, U6 프로모터, 그의 폴리아데닐화된 구축물, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 CMV 프로모터일 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열은 이러한 서열의 코딩 영역의 적어도 2개, 적어도 4개, 적어도 6개, 적어도 8개, 적어도 10개, 적어도 12개, 적어도 14개, 적어도 16개, 적어도 18개, 또는 최대 20개의 코돈에서 AGA를 AGG로 대체하도록 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열은 이러한 서열의 코딩 영역의 16개 코돈에서 AGA를 AGG로 대체하도록 변형될 수 있다.
일부 실시양태에서, 서열은 서열식별번호: 28과 비교 시 위치: X1-X16에서 AGA를 AGG로 대체하도록 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열은 이러한 서열의 코딩 영역의 적어도 3개, 적어도 6개, 적어도 9개, 적어도 12개, 적어도 15개, 적어도 18개, 적어도 21개, 적어도 24개, 적어도 27개, 적어도 29개, 또는 최대 30개의 코돈에서 CCT를 CCC로 대체하도록 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열은 이러한 서열의 코딩 영역의 30개의 코돈에서 CCT를 CCC로 대체하도록 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열은 서열식별번호: 28과 비교 시 위치: X1-X30에서 CCT를 CCC로 대체하도록 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열은 이러한 서열의 코딩 영역의 적어도 3개, 적어도 6개, 적어도 9개, 적어도 12개, 적어도 15개, 적어도 18개, 적어도 21개, 적어도 24개, 적어도 27개, 적어도 30개, 적어도 33개, 또는 최대 36개의 코돈에서 AGC를 TCC로 대체하도록 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열은 이러한 서열의 코딩 영역의 36개의 코돈에서 AGC를 TCC로 대체하도록 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열은 서열식별번호: 28과 비교 시 위치: X1-X36에서 AGC를 TCC로 대체하도록 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열은 이러한 서열의 코딩 영역의 적어도 3개, 적어도 6개, 적어도 9개, 적어도 12개, 적어도 15개, 적어도 18개, 적어도 21개, 적어도 24개, 적어도 27개, 적어도 29개, 또는 최대 30개의 코돈에서 CCC를 CCG로 대체하도록 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열은 이러한 서열의 코딩 영역의 29개의 코돈에서 CCC를 CCG로 대체하도록 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열은 서열식별번호: 28과 비교 시 위치: X1-X29에서 CCC를 CCG로 대체하도록 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산은 바이러스 벡터 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터 서열은 자기-상보적 AAV (scAAV) 벡터 서열일 수 있다. 일부 실시양태에서, AAV 벡터 서열은 혈청형 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, 또는 그의 임의의 조합의 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, AAV 벡터 서열은 AAV2 혈청형의 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터 서열은 적어도 2개의 AAV 혈청형의 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 2개의 혈청형은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV8, AAV9, AAV11 및 AAV12로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단리된 비-자연 발생 핵산은 서열식별번호: 13 - 서열식별번호: 19 중 어느 하나와 적어도 60%의 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열 동일성은 약 70%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 및 최대 약 100%일 수 있다. 일부 실시양태에서, 단리된 비-자연 발생 핵산은, 복수개의 세포와 접촉 시, 필적하는 복수개의 세포에서의 변형이 결여된 그 외에는 필적하는 서열이 결여될 수 있는 그 외에는 필적하는 단리된 비-자연 발생 핵산과 비교 시, 복수개의 세포에서의 형질감염 후 또는 형질도입 후의 생물제제의 발현이 증가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 증가된 발현은 효소 결합 면역검정 (ELISA) 검정에 의해 결정된 바와 같이, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 200배, 또는 적어도 500배 증가를 포함할 수 있다.
또한, 본원에는 서열식별번호: 13 - 서열식별번호: 19 또는 서열식별번호: 21 - 서열식별번호: 27의 핵산 서열 중 어느 하나와 적어도 60%의 서열 동일성 또는 유사성을 포함할 수 있는 단리된 비-자연 발생 핵산이 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 생물제제는 단리된 비-자연 발생 핵산에 의해 코딩될 수 있다. 일부 실시양태에서, 생물제제는 서열식별번호: 12와 적어도 60%의 서열 동일성을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열 동일성은 약 70%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 및 최대 약 100%일 수 있다.
또한, 본원에는 본원에 기재된 단리된 비-자연 발생 핵산을 포함하는 조작된 세포가 기재되어 있다.
또한 본원에는 조작된 세포로부터 단리될 수 있는 복수개의 아데노-연관 바이러스 (AAV) 입자가 기재되어 있다.
또한 본원에는 단위 투여 형태로 AAV 입자를 포함할 수 있는 조성물이 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 냉동보존될 수 있다.
또한 본원에는 a) 단리된 비-자연 발생 핵산; b) 생물제제; c) 조작된 세포, 또는 d) 복수개의 AAV 입자를 포함할 수 있는 용기가 기재되어 있다.
또한 본원에는 a) 복수개의 세포를 단리된 비-자연 발생 핵산과 접촉시키는 것; 및/또는 b) 복수개의 세포를 복수개의 아데노-연관 바이러스 (AAV) 입자와 접촉시키는 것을 포함할 수 있는, 세포를 변형시키는 방법이 기재되어 있다.
또한 본원에는 a) 단리된 비-자연 발생 핵산; b) 생물제제; 또는 c) 복수개의 AAV 입자를 포함할 수 있는 제약 조성물이 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 제약은 안구 질환 또는 병태를 치료하기 위한 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 안구 질환 또는 병태는 완전색맹, 연령-관련 황반 변성 (AMD), 당뇨병성 망막병증 (DR), 녹내장, 바르데-비들 증후군, 베스트병, 맥락막결손, 레베르 선천성 흑암시, 황반 변성, 결절성 맥락막 혈관병증 (PCV), 색소성 망막염, 레프섬병, 스타르가르트병, 어셔 증후군, X-연관 망막층간분리 (XLRS), 간체-추체 이영양증, 추체-간체 이영양증, 오구치병, 말라티아 레벤티네스 (가족성 우성 드루젠) 및 청색 추체 단색형색각으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 안구 질환 또는 병태는 AMD일 수 있다.
또한 본원에는 유효량의 제약 조성물을 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여함으로써 질환을 치료하는 것을 포함할 수 있는, 상기 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는 방법이 기재되어 있다.
또한 본원에는 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는 방법이 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 항혈관형성제를 포함할 수 있는 생물제제를 코딩하는 서열을 포함할 수 있는 단리된 비-자연 발생 핵산을 포함할 수 있는 제약 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열은 코딩 영역에서의 변형이 결여된 그 외에는 필적하는 서열과 비교 시 서열의 코딩 영역의 적어도 하나의 코돈에서 AGA를 AGG로 대체하도록 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 병태를 치료할 수 있다.
또한 본원에는 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는 방법이 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 항혈관형성제를 포함할 수 있는 생물제제를 코딩하는 서열을 포함할 수 있는 단리된 비-자연 발생 핵산을 포함할 수 있는 제약 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열은 코딩 영역에서의 변형이 결여된 그 외에는 필적하는 서열과 비교 시 서열의 코딩 영역의 적어도 하나의 코돈에서 AGA를 AGG로 대체하도록 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형은 이러한 변형이 결여된 그 외에는 필적하는 단리된 비-자연 발생 핵산이 투여된 그 외에는 필적하는 대상체와 비교 시, 생물제제의 수준 증가를 필요로 하는 대상체에서 생물제제의 수준을 증가시키는데 유효할 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체에서 생물제제의 증가된 수준은 진단 검정에 의해 결정된 바와 같이, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 200배, 또는 적어도 500배 증가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항혈관형성제를 코딩할 수 있는 서열은 제2 변형을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 변형은 서열의 코딩 영역의 적어도 하나의 코돈 내에 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 변형은 a) CCT에서 CCC로의 변형; b) AGC에서 TCC로의 변형; c) CCC에서 CCG로의 변형; 또는 d) 이들 중 임의의 것의 조합을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 변형은 CCT에서 CCC로의 변형을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 변형은 AGC에서 TCC로의 변형을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 변형은 CCC에서 CCG로의 변형을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 변형은 CCT에서 CCC로의 변형, AGC에서 TCC로의 변형, 또는 CCC에서 CCG로의 변형의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항혈관형성제는 VEGF 억제제, 멀티-티로신 키나제 억제제, 수용체 티로신 키나제 억제제, 또는 Akt 인산화 억제제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항혈관형성제는 VEGF 억제제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항혈관형성제는 VEGF 억제제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, VEGF 억제제는 비-항체 억제제일 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-항체 억제제는 인간 VEGF 수용체 1 및 2를 포함할 수 있는 융합 단백질을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질은 VEGF-트랩 또는 그의 변형된 버전을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단리된 비-자연 발생 핵산은 서열식별번호: 13 - 서열식별번호: 19 또는 서열식별번호: 21 - 서열식별번호: 27 중 어느 하나와 적어도 60%의 서열 동일성 또는 유사성을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열 동일성은 약 70%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 및 최대 약 100%일 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산은 바이러스 벡터 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터 서열은 scAAV 벡터 서열일 수 있다. 일부 실시양태에서, AAV 벡터 서열은 혈청형 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, 또는 그의 임의의 조합의 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, AAV 벡터 서열은 AAV2 혈청형의 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여는 유리체내 주사, 망막하 주사, 미세주사 또는 안구상 주사를 통해 이루어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여는 유리체내 주사를 통해 이루어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 안구 질환 또는 병태는 완전색맹, 연령-관련 황반 변성 (AMD), 당뇨병성 망막병증 (DR), 녹내장, 바르데-비들 증후군, 베스트병, 맥락막결손, 레베르 선천성 흑암시, 황반 변성, 결절성 맥락막 혈관병증 (PCV), 색소성 망막염, 레프섬병, 스타르가르트병, 어셔 증후군, X-연관 망막층간분리 (XLRS), 간체-추체 이영양증, 추체-간체 이영양증, 오구치병, 말라티아 레벤티네스 (가족성 우성 드루젠) 및 청색 추체 단색형색각으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 안구 질환 또는 병태는 AMD일 수 있다.
일부 실시양태에서, AMD는 습성 AMD일 수 있다. 일부 실시양태에서, AMD는 건성 AMD일 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여는 질환 또는 병태의 적어도 특정 증상을 감소시키고/거나, 질환 또는 병태를 치료하고/거나 질환 또는 병태를 제거하기에 충분할 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여는 약 1.0 x 109 vg, 약 1.0 x 1010, 약 1.0 x 1011 vg, 약 3.0 x 1011 vg, 약 6 x 1011 vg, 약 8.0 x 1011 vg, 약 1.0 x 1012 vg, 약 1.0 x 1013 vg, 약 1.0 x 1014 vg, 또는 약 1.0 x 1015 vg의 단리된 비-자연 발생 핵산의 투여량을 전달하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여는 반복될 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여는 매일 2회, 격일로, 주 2회, 매달 2회, 매달 3회, 월 1회, 격월로, 반년마다, 매년 또는 2년마다 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여 전에 대상체는 유전자 검사를 받을 수 있다. 일부 실시양태에서, 유전자 검사는 그 외에는 필적하는 야생형 서열과 비교 시 유전자 서열에서의 돌연변이를 검출할 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 2차 요법을 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 2차 요법은 광역학 요법 (PDT), 항염증제, 항미생물제 및 레이저 광응고 요법 (LPT) 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.
참조로 포함됨
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 참조로 포함되도록 구체적이고 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 신규 특색은 첨부된 청구범위에서 구체적으로 제시된다. 본 발명의 특색과 이점에 대한 더 나은 이해는 본 발명의 원리가 활용되는 예시적인 실시양태를 제시하는 하기의 상세한 설명과 첨부 도면을 참조하여 수득될 것이다:
도 1은 CMV 인핸서/프로모터, SV40 인트론 (INT), 코작 서열 (K), 원래의 (Af) 또는 인간 IgG1 중쇄 (Vh) 신호 펩티드 (Sig), 코딩 서열, 및 전체 AAV2 ITR (F-ITR) 및 말단절단된 AAV2 ITR (d-ITR)에 의해 플랭킹된 합성 폴리아데닐화 신호 (pA)를 보유하는 scAAV 구축물을 나타낸다. AMI059, AMI066, AMI067, AMI068, AMI119, AMI120, 및 AMI130은 상이한 신호 펩티드를 갖는 상이한 VEGF-트랩 코딩 서열을 나타낸다. AMI059는 Af 신호 펩티드 및 낮은 GC 함량 코딩 서열을 갖는다. AMI066은 Vh 신호 펩티드 및 낮은 GC 함량 코딩 서열을 갖는다. AMI067은 Af 신호 펩티드 및 높은 GC 함량 코딩 서열을 갖는다. AMI068은 Vh 신호 펩티드 및 높은 GC 함량 코딩 서열을 갖는다. AMI119는 Af 신호 펩티드; 및 AGA에서 AGG로의 16개의 Arg 코돈 변화와 CCC에서 CCT로의 29개의 Pro 코돈 변화를 함유하는 높은 GC 함량 코딩 서열을 갖는다. AMI120은 Af 신호 펩티드; 및 AGA에서 AGG로의 16개의 Arg 코돈 변화와 AGC에서 TCC로의 36개의 Ser 코돈 변화를 함유하는 높은 GC 함량 코딩 서열을 갖는다. AMI130은 Af 신호 펩티드; 및 AGA에서 AGG로의 16개의 Arg 코돈 변화와 CCC에서 CCG로의 29개의 Pro 코돈 변화를 함유하는 높은 GC 함량 코딩 서열을 갖는다.
도 2는 플라스미드 DNA로 형질감염된 HEK293 세포에서의 VEGF-트랩 발현의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. 레인 1-5는 비-환원 겔에 표시되고; 레인 6-10은 환원 겔에 표시되며; 레인 1 및 6에는 플라스미드 AMI059 형질감염된 세포로부터의 상청액이 로딩되었고; 레인 2 및 7에는 플라스미드 AMI066 형질감염된 세포로부터의 상청액이 로딩되었으며; 레인 3 및 8에는 플라스미드 AMI067 형질감염된 세포로부터의 상청액이 로딩되었고; 레인 4, 5, 9 및 10에는 플라스미드 AMI068 형질감염된 세포로부터의 상청액이 로딩되었다.
도 3a 및 3b는 Sf9 세포에서 낮은-GC 및 높은-GC AAV 벡터 생산의 SDS-PAGE 및 심플리 블루(Simply Blue) 염색 분석을 나타낸다. 두 도면 모두에서, M은 크기 마커가 로딩된 레인을 나타내고 크기는 킬로달톤으로 표시된다. 도 3a에서, 레인 1은 대조군으로서 로딩된 AAV5 벡터를 나타내고; 레인 2, 3, 4 및 5는 각각 AMI059, AMI066, AMI067 및 AMI068을 나타낸다. 도 3b에서, 레인 1은 대조군으로서 로딩된 AAV2 벡터를 나타내고; 레인 2, 3, 및 4는 각각 AMI119, AMI120, AMI130을 나타낸다.
도 4a 및 4b는 scAAV2 변이체 (AAV2.N53) 벡터 (AMI059, AMI066, AMI067, AMI068, AMI120, AMI119, AMI067 및 AMI130)로 형질도입된 HEK293 세포에서의 VEGF-트랩 발현의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. AAV2 변이체 형질도입된 HEK293 세포로부터의 20 마이크로리터의 상청액을 각각의 레인에 로딩하였다. 도 4a에서, 레인 1, 2, 3 및 4는 각각 AMI059, AMI066, AMI067 및 AMI068을 나타낸다. 도 4b에서, 레인 1, 2, 3 및 4는 각각 AMI120, AMI119, AMI067, 및 AMI130을 나타낸다.
도 5a는 scAAV2-AMI067 형질도입된 HEK293 세포의 상청액으로부터 정제된 VEGF-트랩의 SDS-PAGE 및 심플리 블루 염색 분석을 나타낸다. 상업적으로 입수가능한 아플리베르셉트 (A)를 대조군으로서 사용하였다. M은 크기 마커가 로딩된 레인을 나타내며 크기는 킬로달톤으로 표시된다. 1.5 μg/레인의 정제된 단백질을 V로 표지된 레인에 로딩하였다.
도 5b 및 도 5c는 VEGF-A165에 대한 AAV2.N54.120 (AVMX-110) 유래 VEGF-트랩의 결합 친화도를 예시한 것이다.
도 6은 AMI068-pFB-scCMV-SV40-인트론-코작-Vh-VEGF-트랩-GC의 아미노산 서열 (서열식별번호: 61) 및 핵산 서열 (서열식별번호: 62)을 나타낸다. 볼드체 문자는 인간 항체 중쇄 신호 펩티드를 나타낸다.
도 7은 AMI119-pFB-scCMV-SV40-인트론-코작-Af-VEGF-트랩-GCRP (CCT)의 아미노산 서열 (서열식별번호: 63) 및 핵산 서열 (서열식별번호: 64)을 나타낸다. 볼드체 문자는 VEGF-트랩 신호 펩티드를 나타내고, 밑줄은 16개의 AGA에서 AGG로의 변화를 나타내며 이탤릭체는 30개의 CCC에서 CCT로의 변화를 나타낸다.
도 8은 AMI120-pFB-scCMV-SV40-인트론-코작-Af-VEGF-트랩-GCRS (TCC)의 아미노산 서열 (서열식별번호: 65) 및 핵산 서열 (서열식별번호: 66)을 나타낸다. 볼드체 문자는 VEGF-트랩 신호 펩티드를 나타내고, 밑줄은 16개의 AGA에서 AGG로의 변화를 나타내고 이탤릭체는 36개의 AGC에서 TCC로의 변화를 나타낸다.
도 9는 AMI130-pFB-scCMV-SV40-인트론-코작-Af-VEGF-트랩-GCRP (CCG)의 아미노산 서열 (서열식별번호: 67) 및 핵산 서열 (서열식별번호: 68)을 나타낸다. 볼드체 문자는 VEGF-트랩 신호 펩티드를 나타내고, 밑줄은 16개의 AGA에서 AGG로의 변화를 나타내며 이탤릭체는 29개의 CCC에서 CCG로의 변화를 나타낸다.
도 10a는 AVMX-110 DNA 및 단백질 농도의 결정을 예시한다.
도 10b는 HEK93 세포 배양에서 AAV2.VEGF-트랩 발현 수준의 시간 경과 실험을 나타낸다.
도 11은 HEK293 세포 (상부 패널) 및 인간 망막 세포 (ARPE-19, 하단 패널)에서의 AAV2.N53-VEGF-트랩 및 AAV2.N54-VEGF-트랩 발현의 내구성을 나타낸다.
도 12는 AAV2.054-AMI120 유래 VEGF-트랩이 환원 또는 비-환원 겔 (환원 겔: PNGase F 처리 유무. 비-환원 겔: PNGase F 처리 유무)에서 아플리베르셉트와 유사하게 글리코실화되었다는 것을 나타낸다. 레인 1 및 3은 AAV2-VEGF-트랩을 나타내는 반면, 레인 2는 상업용 아플리베르셉트를 묘사한다. PNGase F 처리 레인 내의 다수의 밴드는 탈글리코실화가 완료되지 않았다는 것을 나타낸다.
도 13은 비아코어(Biacore) 검정에 의해 검출된 인간 VEGF-A165에 대한 AAV2.054-AMI120 유래 VEGF-트랩의 결합 친화도를 나타낸다.
도 14는 rhVEGF-A165에 대한 벡터 발현된 VEGF-트랩의 결합 친화도를 나타낸다.
도 15는 HUVEC 세포 증식의 억제에 있어서 벡터 유래 VEGF-트랩과 VEGF-트랩의 비교를 나타낸다.
도 16은 실시예 11에서 혈관조영술 이전 제7일의 GFP 안저 영상을 예시한다.
도 17은 실시예 11에서 제7일의 플루오레세인 혈관조영술을 예시한다. 각각의 군으로부터의 대표적인 영상이 표시된다.
도 18은 평균 (상단) 및 개별 값 (하단)으로서 플롯팅된 레이저 처리 후 제7일의 플루오레세인 누출의 정량화를 예시한다. *는 p=0.0113을 의미하고 ***는 p=0.0002를 의미한다.
도 19는 레이저 처리 후 제7일의 플랫마운트로부터의 대표적인 병변 영상을 예시한다.
도 20은 평균 (상단) 및 개별 값 (하단)으로서 플롯팅된 레이저 처리 후 제7일의 플랫마운트 병변 면적의 정량화를 예시한다.
도 21은 실시예 12에서의 안저 영상을 예시한다.
도 22는 실시예 12에서 선택된 구축물이 투여된 마우스 눈의 IHC 영상을 예시한다.
도 23은 연구를 위해 제24일에 수행된 선택된 AAV 구축물이 투여된 마우스 눈의 안저 영상화를 예시한다.
도 24는 실시예 12에서 선택된 구축물이 투여된 돼지 눈의 IHC 영상을 예시한다.
도 25는 주사 후 제24일에 수행된 선택된 구축물이 투여된 돼지 눈의 안저 영상화를 예시한다.
도 26은 돼지 연구 제28일의 면역조직화학 영상을 예시한다.
도 27은 AMI054와 V226 캡시드 침투성을 비교하는 공초점 현미경 영상을 예시한다.
도 28a는 AVMX-110/116에 대한 AAV 구축물 세부사항을 예시한다.
도 28b는 단일의 날카로운 분획 (화살표)으로 표시된 바와 같이 본원에 기재된 벡터 (AVMX-110)의 제조를 보여주는 예시적인 크로마토그램을 예시한다.
도 28c는 AAV VP1, VP2 및 VP3의 발현을 보여주는 예시적인 SDS-PAGE를 예시한다.
도 28d는 분리 칼럼 프로세스에서 빈 AAV와 전체 AAV의 체류 차이를 예시한다.
도 28e는 정제된 AVMX-110에 대한 빈 캡시드의 분리를 예시한다.
도 28f는 마우스 항-AAV2 항체로 검출된 예시적인 SDS-PAGE를 예시한다. 레인 1 및 2에서의 샘플은 CsCl 정제된 AVMX-110이고; 레인 3 및 4는 2 L 쉐이크로부터의 샘플이며; 5-8은 2 L 바이오리액터로부터의 샘플이고; 레인 9 및 10은 레인당 10 & 20 μL로 최종 정제된 약물 물질이었다. AAV2 특이적 항체 반응을 이용한 웨스턴 블롯은 AVMX-110이 AAV2 특이적 혈청형임을 입증해준다.
도 28g는 10% SDS-PAGE에 의해 분리된 AVMX-110의 예시적인 은 염색 영상을 예시한다. 레인 1 및 5: 포획 용출액의 샘플. 레인 2 및 6: 비어 있음. 레인 3 및 7: 칼럼 크로마토그래피의 피크 2로부터의 비-환원 샘플. AVMX-110 프로세스 중간체의 순도는 은 염색 겔로 염색된 SDS-PAGE에 의해 분석되었다. AAV VP1, VP2 및 VP3이 명확하게 시각화되었으며 4%보다 높은 단일 불순물은 발견되지 않았다.
도 29는 상이한 연구 군으로부터의 형광 혈관조영술 (FA) 데이터의 대표적인 영상 및 효능을 보여주는 막대 그래프를 예시한다. 통계 분석: 일원 ANOVA에 이어 터키(Tukey) 다중 비교 (* = 0.0332; *** = 0.0002).
도 30은 상이한 혈청형에서의 아플리베르셉트 발현에 대한 시험관내 세포 기반 검정을 예시한다.
도 31은 상이한 AAV 혈청형에 대한 FA 데이터를 예시한다. Δ아플리베르셉트는 단백질을 생성하지 않는 모의 벡터였다. 통계는 일원 ANOVA에 이어 던넷(Dunnett) 다중 비교에 의해 수행되었다 (* = 0.0332; ** = 0.0021; *** = 0.0002).
도 32는 안구 샘플 및 혈청 샘플에서의 아플리베르셉트 발현을 정량화하기 위한 ELISA를 예시한다. 통계는 일원 ANOVA에 이어 던넷 다중 비교를 사용하여 수행되었다 (*** = 0.0002; **** = <0.0001).
도 33은 상이한 AAV6.N54-아플리베르셉트 벡터를 사용한 마우스 CNV 연구에 대한 FA 데이터를 예시한다.
도 34는 IHC 영상을 사용한 AAV1, AAV2 및 AAV6-GFP 발현의 비교를 예시한다.
도 35는 돼지 눈에 주사된 상이한 혈청형에서의 GFP의 발현 비교를 예시한다.
도 36은 야생형 (wt) AAV2 및 N54-AAV2의 시험관내 비교를 예시한다.
도 37a는 상이한 로트의 N54-GFP로 형질도입된 HEK293 세포에서의 GFP 발현의 비교를 예시한다.
도 37b는 상이한 로트의 N54-GFP로 형질도입된 HEK293에서의 GFP 발현을 예시한다.
도 38a는 FA 측정 비교 및 통계 분석을 예시한다.
도 38b는 실시예 13에서 FA 대표적인 영상을 예시한다. 화살표는 레이저 병변 (버블)을 표시한다.
도 39a는 혈청 샘플 내의 VEGF-트랩 수준의 비교를 예시한다.
도 39b는 안구 샘플 내의 VEGF-트랩 수준의 비교를 예시한다.
도 40a는 VEGF-트랩 발현과 병변 면적 간의 상관관계를 예시한다.
도 40b는 안구 샘플 내의 AAV2 캡시드 단백질 수준의 비교를 예시한다.
도 41a는 모의 벡터 대조군으로 처리된 동물과 미처리된 동물에서의 아플리베르셉트 발현이 유사하였다는 것을 예시한다. AAV6.N54-아플리베르셉트를 주사한 군 3 동물에서는, 약 2.3 pg 아플리베르셉트/mg 안구 균질액이 측정되었다 (도 41a). AAV2 및 AAV6.N54-아플리베르셉트에 대한 중간 범위 수준은 각각 약 8.8 및 약 25 pg 아플리베르셉트/mg 안구 균질액을 가졌고, 이는 AAV6 처리된 동물에 대해 3배 상승된 발현이었다. 고용량 AAV6 처리된 동물은 약 400 pg 아플리베르셉트/mg 안구 균질액으로 가장 높은 수준의 아플리베르셉트를 나타냈다. 혈청 샘플은 안구 조직 샘플과 유사한 경향을 따랐다. 군 1 (모의), 2 (AAV2-아플리베르셉트) 및 3 (AAV6-저용량)에서는 검출가능한 아플리베르셉트가 없었다. 중간 용량 및 고용량 AAV6-아플리베르셉트 처리된 동물 둘 다는 혈청에서 2-3 ng/mL 아플리베르셉트를 나타냈다 (도 41b). 데이터는 일원 ANOVA에 이어 던넷 다중 비교를 사용하여 그래프패드 프리즘 소프트웨어에서 분석되었다 (** = 0.005 및 **** = <0.0001).
도 42는 제0일의 안저 영상화로부터의 대표적인 영상을 예시한다 (군 6-8).
도 43은 제7일의 플루오레세인 혈관조영술로부터의 대표적인 영상을 예시한다.
도 44는 제7일의 평균 플루오레세인 누출의 정량화를 예시한다.
도 45는 이소렉틴 병변 면적의 대표적인 영상을 예시한다.
도 46은 이소렉틴 면적 측정을 예시한다.
도 47은 제0일의 IHC의 대표적인 영상을 예시한다 (군 6-8 단독).
도 48a는 용량 반응 연구 (실시예 14)로부터 수득된 영상의 플랫마운트 분석을 예시한다.
도 48b는 용량 반응 연구 (실시예 14)로부터 수득된 영상의 FA 분석을 예시한다.
도 49a는 레이저 유발 병변 면적 및 AVMX-110 용량 반응 곡선을 예시한다.
도 49b는 AVMX-110 투여 연구로부터의 영상의 FA 분석을 예시한다.
도 50은 마우스 LCNV 모델에서 AVMX-110의 형광 혈관조영술 영상을 예시한다.
도 51a는 동물의 혈청 내의 VEGF-트랩 수준을 예시한다 (군당 n=6).
도 51b는 망막 조직 내의 VEGF-트랩 수준이 ELISA를 사용하여 망막 균질액에서도 측정되었다는 것을 예시한다. 망막 조직 현탁액에서, VEGF-트랩의 발현은 유리체내 주사된 AVMX-110에 대해 용량 의존적 방식이었다. 1.6e10 vg/눈의 고용량 군에서는 평균 13 ng/mL의 VEGF-트랩이 검출되었다. 가장 높은 발현 수준은 40 ng/mL 초과하여 도달되었다.
본원에는 안구 요법에 사용하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 한 측면에서, 본원에는 단리된 비-자연 발생 핵산이 제공된다. 핵산은 다양한 안구 질환 및 병태의 안구 요법에 사용하기 위한 조성물에 활용될 수 있다. 일부 경우에, 핵산은 비변형된 그 외에는 필적하는 핵산에 비해 특정 이점을 부여하는 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다.
한 측면에서, 생물제제를 코딩하는 단리된 비-자연 발생 핵산이 본원에 제공된다. 생물제제는 광범위한 산물, 예컨대 백신, 혈액 및 혈액 성분, 알레르기 유발제, 세포, 유전자 요법, 조직 및 재조합 치료 단백질을 포함한다. 생물제제는 당, 단백질, 또는 핵산 또는 이들 물질의 복합체 조합으로 구성될 수 있거나, 또는 세포 및 조직과 같은 살아있는 엔티티일 수 있다. 생물제제는 다양한 자연 공급원 (예를 들어, 인간, 동물, 미생물)으로부터 단리되며 다양한 방법을 사용하여 생산될 수 있다. 예를 들어, 유전자 기반 및 세포성 생물제제는 종종, 생물 의학 연구의 최전선에 있으며 다른 치료법이 이용가능하지 않은 다양한 의학적 병태를 치료하는데 사용될 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 생물제제는 항혈관형성제를 포함할 수 있다. 혈관형성은 새로운 혈관의 형성 및/또는 기존 혈관계의 유지를 지칭한다. 이러한 프로세스는 혈관 내벽을 구성하는 내피 세포의 이동, 성장 및/또는 분화를 수반한다. 이러한 혈관형성의 프로세스는 신체 내에서의 화학적 신호에 의해 적어도 부분적으로 조정된다. 이들 신호 중 일부, 예컨대 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)는 정상 내피 세포의 표면 상의 수용체와 결합한다. VEGF 및 기타 내피 성장 인자가 내피 세포 상의 수용체와 결합하면, 이들 세포 내에서의 신호가 시작되어 새로운 혈관의 성장과 생존을 촉진시킨다. 다른 화학적 신호, 예를 들어 항혈관형성제는 혈관 형성을 방해할 수 있다. 정상적으로, 이러한 신호의 혈관형성-자극 및 -억제 효과는 균형을 이루어 혈관이 성장 및 치유 과정과 같이 필요한 시간과 장소에서만 형성된다. 질환 또는 다양한 병태의 경우, 이러한 신호의 균형이 깨져, 증가되거나 비정상적인 혈관 성장이 유발되어 비정상적인 병태 또는 질환으로 이어질 수 있다. 예를 들어, 비정상적인 혈관형성은 습성 연령-관련 황반 변성의 원인이다.
항혈관형성제는 혈관증식을 감소시키거나 제거할 수 있다. 항혈관형성제는 신생혈관증식을 감소시키거나 제거할 수 있다. 항혈관형성제는 또한 기존 혈관계를 감소시키거나 제거할 수 있다. 혈관형성 억제제는 혈관 성장의 다양한 단계를 여러 방식으로 방해한다. 일부는 VEGF 및/또는 기타 항혈관형성제를 특이적으로 인식하고 이와 결합하는 모노클로날 항체와 같은 생물제제이다. 예를 들어, VEGF가 이러한 작용제와 결합하면, VEGF 수용체를 활성화시킬 수 없다. 다른 항혈관형성제는 VEGF 및/또는 그의 수용체뿐만 아니라 내피 세포의 표면 상의 다른 수용체 또는 하류 신호전달 경로에서의 다른 단백질과 결합하여 그의 활성을 차단한다. 일부 항혈관형성제는 항혈관형성 특성도 갖고 있는 면역조정 약물 (예를 들어, 면역 체계를 자극하거나 억제하는 작용제)이다.
한 실시양태에서, 항혈관형성제는 VEGF 신호전달 경로의 성분과 결합한다. VEGF 신호전달 경로의 성분은 PLC, VRAP, Sck, Src, PI3K, PIP3, Akt, Bad, 카스파제, eNOS, FAK, 팍실린, Cdc42, p38 MAPK, Hsp27, GRB2, SOS, SHC, Ras, Raf, MEK1/2, ERK1/2, PKC, cPLA2, PGI2, IP3, 및 그의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
한 실시양태에서, 생물제제는 거대분자, 예컨대 단백질, 펩티드, 압타머, 및/또는 비-번역된 RNA, 예컨대 안티센스 RNA, 리보자임, RNAi 및/또는 siRNA로부터 선택된다.
본원에 제공된 생물제제는 항혈관형성제를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 생물제제는 단백질 또는 폴리펩티드이다. 일부 경우에, 생물제제는 폴리펩티드를 포함한다. 폴리펩티드는 안구 세포, 예를 들어 간상체 또는 원추 광수용체 세포, 망막 신경절 세포, 뮬러 세포, 양극 세포, 무축삭 세포, 수평 세포, 및/또는 망막 색소 상피 세포의 하나 이상의 기능을 증강 및/또는 감소시킬 수 있다.
폴리펩티드의 예시적인 클래스는 신경보호 폴리펩티드 (예를 들어, GDNF, CNTF, NT4, NGF 및 NTN); 항혈관형성 폴리펩티드 (예를 들어, 가용성 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 수용체; VEGF-결합 항체; VEGF-결합 항체 단편 (예를 들어, 단일 쇄 항-VEGF 항체); 엔도스타틴; 텀스타틴; 안지오스타틴; 가용성 Flt 폴리펩티드 (문헌 [Lai et al. (2005) Mol . Ther. 12:659]); 가용성 Flt 폴리펩티드를 포함하는 Fc 융합 단백질 (예를 들어, 문헌 [Pechan et al. (2009) Gene Ther. 16:10] 참조); 색소 상피 유래 인자 (PEDF); 가용성 Tie-2 수용체 등); 메탈로프로테이나제-3의 조직 억제제 (TIMP-3); 광반응성 옵신, 예를 들어 로돕신; 항아폽토시스 폴리펩티드 (예를 들어, Bcl-2, Bcl-X1) 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 예시적인 폴리펩티드는 신경교 유래 신경영양 인자 (GDNF); 섬유모세포 성장 인자 2; 뉴르투린 (NTN); 섬모 신경영양 인자 (CNTF); 신경 성장 인자 (NGF); 뉴로트로핀-4 (NT4); 뇌 유래 신경영양 인자 (BDNF); 표피 성장 인자; 로돕신; X-연관 아폽토시스 억제제; 및 소닉 헤지호그를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 경우에, 폴리펩티드는 레티노쉬신, 색소성 망막염 GTPase 조절인자 (RGPR)-상호작용 단백질-1 (예를 들어, 젠뱅크 수탁 번호 Q96KN7, Q9EPQ2 및 Q9GLM3 참조), 페리페린-2 (Prph2) (예를 들어, 젠뱅크 수탁 번호 NP_000313 참조), 페리페린, 망막 색소 상피 특이적 단백질 (RPE65) (예를 들어, 젠뱅크 AAC39660; 및 문헌 [Morimura et al. (1998) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 95:3088] 참조), 결함이 있거나 누락된 경우 맥락막결손을 유발하는 폴리펩티드인 CHM (맥락막결손 (Rab 에스코트 단백질 1)) (예를 들어, 문헌 [Donnelly et al. (1994) Hum. Mol. Genet. 3:1017; and van Bokhoven et al. (1994) Hum. Mol . Genet. 3:1041] 참조); 및 결함이 있거나 누락된 경우, 레베르 선천성 흑암시 및 색소성 망막염을 유발하는 폴리펩티드인 크럼스(Crumbs) 상동체 1 (CRB1) (예를 들어, 문헌 [den Hollander et al. (1999) Nat. Genet. 23:217]; 및 젠뱅크 수탁 번호 CAM23328 참조)을 포함할 수 있다. 적합한 폴리펩티드는 또한, 결함이 있거나 누락된 경우 완전색맹을 유발하는 폴리펩티드를 포함하며, 이러한 폴리펩티드는, 예를 들어, 원추 광수용체 cGMP-게이트 채널 서브유닛 알파 (CNGA3) (예를 들어, 젠뱅크 수탁 번호 NP_001289; 및 문헌 [Booij et al. (2011) Ophthalmology 118:160-167] 참조); 원추 광수용체 cGMP-게이트 양이온 채널 베타-서브유닛 (CNGB3) (예를 들어, 문헌 [Kohl et al. (2005) Eur J Hum Genet. 13 (3):302] 참조); 구아닌 뉴클레오티드 결합 단백질 (G 단백질), 알파 변환 활성 폴리펩티드 2 (GNAT2) (ACHM4); 및 ACHM5; 및 결함이 있거나 결여된 경우 다양한 형태의 색맹을 유발하는 폴리펩티드를 포함한다.
일부 경우에, 생물제제는 유전자 기능의 부위 특이적 녹다운 또는 녹아웃을 제공하는 부위 특이적 엔도뉴클레아제를 코딩하는 단백질 또는 폴리펩티드를 포함하며, 예를 들어 여기서 엔도뉴클레아제가 망막 질환과 연관된 대립유전자를 녹아웃시킨다. 예를 들어, 우성 대립유전자가, 야생형인 경우 망막 구조 단백질이고/거나 정상적인 망막 기능을 제공하는 유전자의 결함 있는 카피를 코딩하는 경우, 부위 특이적 엔도뉴클레아제는 결함 있는 대립유전자를 표적으로 하여 결함 있는 대립유전자를 녹아웃시킬 수 있다. 결함 있는 대립유전자를 녹아웃시키는 것 외에도, 부위 특이적 뉴클레아제를 사용하여, 결함 있는 대립유전자에 의해 코딩된 단백질의 기능적 카피를 코딩하는 공여자 DNA와의 상동 재조합을 자극할 수도 있다. 따라서, 비-자연 발생 핵산은 결함 있는 대립유전자를 녹아웃시키는 부위 특이적 엔도뉴클레아제를 전달하는데 사용될 수 있고, 결함 있는 대립유전자의 기능적 카피를 전달하여 결함 있는 대립유전자를 복구하는데 사용될 수 있으며, 이에 의해 기능적 망막 단백질 (예를 들어, 기능적 레티노쉬신, 기능적 RPE65, 기능적 페리페린 등)의 생산을 제공한다. 예를 들어, 문헌 [Li et al. (2011) Nature 475:217]을 참조한다. 일부 실시양태에서, 비-자연 발생 핵산은 부위-특이적 엔도뉴클레아제를 코딩하는 트랜스진; 및 결함 있는 대립유전자의 기능적 카피를 코딩하는 이종 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 기능적 카피는 기능성 망막 단백질을 코딩한다.
예시적인 기능적 망막 단백질은, 예를 들어 레티노쉬신, RPE65, 색소성 망막염 GTPase 조절인자 (RGPR)-상호작용 단백질-1, 페리페린, 페리페린-2 등을 포함한다. 사용하기에 적합한 부위 특이적 엔도뉴클레아제는, 예를 들어 CRISPR, 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN); 및 전사 활성인자-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN)를 포함하며, 여기서 이러한 부위 특이적 엔도뉴클레아제는 비-자연 발생이며 특이적 유전자를 표적으로 하도록 변형된다. 이러한 부위 특이적 뉴클레아제는 게놈 내의 특이적 위치를 커팅하도록 조작될 수 있으며, 이어서 비상동 말단 결합은 여러 뉴클레오티드를 삽입하거나 결실하는 동안 파손부를 복구할 수 있다. 그런 다음, 이러한 부위 특이적 엔도뉴클레아제 ("INDEL"로서 지칭되기도 함)는 단백질을 프레임 밖으로 던져 효과적으로 유전자를 녹아웃시킨다. 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2011/0301073을 참조한다. 일부 경우에, 단백질 또는 폴리펩티드 생물제제는 지질단백질 리파제, 레티노이드 이소메로히드롤라제 RPE65, 또는 보체 H로부터 선택된다. 일부 경우에, 생물제제는 폴리펩티드, 예컨대 융합 단백질, 예컨대 아플리베르셉트이다.
한 측면에서, 생물제제는 아플리베르셉트이다. 아플리베르셉트는 VEGF 트랩-아이 (VTE) 및 아일레아®로서 공지되기도 하며, 본원에서 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 아플리베르셉트는 인간 IgG의 Fc 부분과 융합된 인간 VEGF 수용체 1 및 2의 세포외 도메인을 포함하는 재조합 융합 단백질이다. 라니비주맙 및 베바시주맙에 의해 사용되는 항체 기반 VEGF 결합 전략과 달리, 아플리베르셉트는 VEGFR-1 수용체의 제2 결합 도메인과 VEGFR-2 수용체의 제3 도메인을 혼입한다. 아플리베르셉트는 천연 수용체보다 더 큰 친화도로 VEGF-A 및 PDGF와 결합하는 가용성 미끼 수용체로서 작용한다. 서열식별번호 : 30은 아플리베르셉트에 대한 DNA 코딩 서열 (서열식별번호: 31)과 정렬된 아플리베르셉트 아미노산 서열을 예시한다. 서열식별번호: 31의 경우, 핵산은 Af 신호 펩티드; 및 서열식별번호: 70과 비교 시 AGA에서 AGG로의 16개의 Arg 코돈 변화 및 AGC에서 TCC로의 36개의 Ser 코돈 변화를 함유하는 높은 GC 함량 코딩 서열을 포함한다.
유리체내 아플리베르셉트 주사의 승인된 용량은 2.0 mg이며, 그의 투여량은 적응증에 따라 다르다. 아플리베르셉트는 신생혈관 (습성) 연령-관련 황반 변성, 망막 정맥 폐쇄에 따른 황반 부종, 당뇨병성 황반 부종, 및 당뇨병성 망막병증의 치료에 권고된다. 일부 경우에, 본원에 제공된 신호 펩티드는 아플리베르셉트로부터의 것이거나 아플리베르셉트로부터 유래될 수 있다. 한 실시양태에서, 신호 펩티드는 아플리베르셉트로부터의 서열 (예를 들어, 신호 펩티드 서열)과 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100% 동일성의 상동성 퍼센트를 포함한다. 한 실시양태에서, 신호 펩티드는 아플리베르셉트로부터의 인간 항체 중쇄로부터의 것이다. 한 실시양태에서, 신호 펩티드는 아플리베르셉트로부터의 인간 항체 경쇄로부터의 것이다.
일부 경우에, 생물제제는 압타머이다. 압타머는 DNA 압타머 또는 RNA 압타머일 수 있다. 압타머는 규정된 구조로 폴딩되고 단백질과 같은 표적과 결합하는 올리고뉴클레오티드 (단일 가닥 또는 이중 가닥)이다. 일부 단백질 기반 생물제제와 달리, 압타머는 일반적으로 변형된 당 (예를 들어, 2'-위치에서)을 함유하기 때문에 단백질 기반 생물제제와 비교 시 감소된 항체를 유도하거나 유도하지 않는다. 부가적으로, 톨-유사 수용체-매개 선천성 면역 반응이 또한 폐지되거나 감소된다. 압타머 치료제는 세포내, 세포외, 또는 세포 표면 표적을 위해 개발될 수 있다. 일부 측면에서, 생물제제 치료제는 압타머이다. 예시적인 관심 압타머는 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)에 대항한 압타머를 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Ng et al. (2006) Nat. Rev. Drug Discovery 5:123; and Lee et al. (2005) Proc . Natl . Acad. Sci . USA 102:18902]을 참조한다. 예를 들어, VEGF 압타머는 뉴클레오티드 서열 5'-cgcaaucagugaaugcuuauacauccg-3' (서열식별번호: 69)을 포함할 수 있다. PDGF 특이적 압타머, 예를 들어, E10030이 또한 사용하기에 적합하다 (예를 들어, 문헌 [Ni and Hui (2009) Ophthalmologica 223:401; and Akiyama et al. (2006) J. Cell Physiol . 207:407] 참조). 예시적인 압타머는 페갑타닙(Pegaptanib)을 포함한다. 페갑타닙은 VEGF165와 결합하는 특이적 핵산 리간드인 50 kDa 압타머이다. 예시적인 압타머는 페갑타닙 또는 포비스타(Fovista)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
한 실시양태에서, 생물제제는 핵산이다. 핵산은 비-번역된 RNA, 예컨대 안티센스 RNA, 리보자임, RNAi 및/또는 siRNA를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 한 실시양태에서, 생물제제 치료제는 간섭 RNA (RNAi)이다. 적합한 RNAi는 세포 내의 아폽토시스 또는 혈관형성 인자의 수준을 감소시킬 수 있는 RNAi를 포함한다. 예를 들어, RNAi는 세포에서 아폽토시스를 유도하거나 촉진시키는 유전자 산물의 수준을 감소시키는 shRNA 또는 siRNA일 수 있다. 아폽토시스를 유도하거나 촉진시키는 유전자 산물을 갖는 유전자는 본원에서 "아폽토시스촉진 유전자"로서 지칭되고, 이들 유전자의 산물 (mRNA; 단백질)은 "아폽토시스촉진 유전자 산물"로서 지칭된다. 아폽토시스촉진 유전자 산물은, 예를 들어 Bax, Bid, Bak 및 Bad 유전자 산물을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 번호 7,846,730을 참조한다. 간섭 RNA는 또한 혈관형성 산물, 예를 들어 VEGF (예를 들어, Cand5; 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2011/0143400; 미국 특허 공개 번호 2008/0188437; 및 문헌 [Reich et al. (2003) Mol. Vis. 9:210] 참조), VEGFR1 (예를 들어, Sirna-027; 예를 들어, 문헌 [Kaiser et al. (2010) Am. J. Ophthalmol. 150:33; and Shen et al. (2006) Gene Ther. 13:225] 참조), 또는 VEGFR2 (문헌 [Kou et al. (2005) Biochem. 44:15064])에 대항한 것일 수 있다. 또한, 미국 특허 번호 6,649,596, 6,399,586, 5,661,135, 5,639,872, 및 5,639,736; 및 미국 특허 번호 7,947,659 및 7,919,473을 참조한다.
일부 경우에, 생물제제는 VEGF-A를 표적으로 하는 siRNA, 예를 들어, 베바시라닙을 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포 유형 특이적 또는 조직 특이적 프로모터는, 유전자 산물이 특정한 세포 유형(들) 또는 조직(들)에서 선택적으로 또는 우선적으로 생산되도록 대상 치료제를 코딩하는 트랜스진에 작동가능하게 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 유도성 프로모터는 트랜스진 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 일부 경우에, 프로모터는 광수용체 특이적 조절 요소 (예를 들어, 광수용체 특이적 프로모터), 예를 들어 광수용체 세포에서 작동가능하게 연결된 유전자의 선택적 발현을 부여하는 조절 요소에 작동가능하게 연결될 수 있다. 적합한 광수용체 특이적 조절 요소는, 예를 들어, 로돕신 프로모터; 로돕신 키나제 프로모터 (문헌 [Young et al. (2003) Ophthalmol. Vis. Sci. 44:4076]); 베타 포스포디에스테라제 유전자 프로모터 (문헌 [Nicoud et al. (2007) J. Gene Med. 9:1015]); 색소성 망막염 유전자 프로모터 (상기 문헌 [Nicoud et al. (2007)] 참조); 광수용체간 레티노이드-결합 단백질 (IRBP) 유전자 인핸서 (상기 문헌 [Nicoud et al. (2007)] 참조); IRBP 유전자 프로모터 (문헌 [Yokoyama et al. (1992) Exp Eye Res. 55:225]) 등을 포함한다.
일부 실시양태에서, 대상 변형된 AAV에 의해 전달되는 생물제제는 혈관형성을 억제하는 작용을 할 수 있다. 한 실시양태에서, 생물제제는 항혈관형성제를 포함한다. 예시적인 항혈관형성제는 VEGF 억제제, 멀티-티로신 키나제 억제제, 수용체 티로신 키나제 억제제, Akt 인산화 억제제, PDGF-1 억제제, PDGF-2 억제제, NP-1 억제제, NP-2 억제제, Del 1 억제제, 또는/또는 인테그린 억제제를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 항혈관형성제는 VEGF 억제제를 포함한다. VEGF 억제제는 VEGF 또는 VEGF 수용체를 표적으로 할 수 있다.
VEGF 패밀리는 태반 성장 인자 (PLGF), VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D 및 VEGF-E를 포함한다. 이들 작용제는 혈관형성 및 혈관 투과성의 중요한 조절인자이며; 특히 VEGF-A는 병리학적 안구 혈관형성에 중추적인 역할을 한다. VEGF-A 유전자는 염색체 6p12.3에 위치하며 8개의 엑손과 8개의 중간체 인트론으로 구성된다. VEGF-A는 VEGF121, VEGF145, VEGF148, VEGF162, VEGF165, VEGF165b, VEGF183, VEGF189 및 VEGF206을 포함한 9개의 이소형을 갖는다. 이들 이소형은 아미노산의 수와 헤파린-결합 친화도가 서로 상이하다. 전술한 VEGF 패밀리 구성원 및/또는 그의 수용체 중 어느 것도 억제제를 사용하여 표적화될 수 있다.
특정의 바람직한 실시양태에서, 대상 변형된 AAV에 의해 전달되는 생물제제는 VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D 및/또는 PDGF로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 포유동물 VEGF 단백질의 활성을 억제하는 작용을 할 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에서, 대상 AAV 변이체에 의해 전달되는 생물제제는 VEGF-A의 활성을 억제한다. VEGF-A는 교대 스플라이싱에 의해 생성된 9개의 이소형을 가지며, 그 중 생리학적으로 가장 관련성이 높은 것은 VEGF 165이다. VEGF-A 수준은 습성 연령-관련 황반 변성, 당뇨병성 황반 부종 및 망막 정맥 폐쇄가 있는 환자의 유리체에서 상승하는 것으로 밝혀졌다. 눈에서 VEGF-A의 활성을 억제하므로 유리체 VEGF-A가 상승된 환자를 치료하는데 유효한 유전자 산물(들)은 아플리베르셉트, 라니비주맙, 브로루시주맙, 베바시주맙, 및 가용성 fms-유사 티로신 키나제 1 (sFLTl) (젠뱅크 수탁 번호 U01134)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, (i) 본원에 기재된 바와 같은 변이체 AAV 캡시드 단백질 및 (ii) VEGF 억제제를 포함하는 트랜스진을 포함하는 감염성 AAV 비리온이 제공된다. 한 실시양태에서, 트랜스진은 각각 별개의 VEGF-A 억제제를 코딩하는 다중 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 항혈관형성제는 라니비주맙이다. 라니비주맙은 VEGF-A의 모든 인간 이소형을 억제하는 인간화 모노클로날 항체 Fab 단편이다. 한 실시양태에서, 트랜스진은 아플리베르셉트일 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 제공된 단리된 비-자연 발생 핵산은 변형을 포함한다. 그 외에는 필적하는 생물제제와 비교 시 항혈관형성제를 포함하는 생물제제의 개선된 도입, 발현, 지속성, 및/또는 기능성을 위해 다양한 변형이 고려되고 이용될 수 있다. 일부 경우에, 그 외에는 필적하는 생물제제는 아플리베르셉트일 수 있다.
한 실시양태에서, 단리된 비-자연 발생 핵산은 항혈관형성제를 포함하는 생물제제의 증강된 발현을 부여하는 변형을 포함한다. 예를 들어, 관련 기술분야에 공지된 일부 생물제제는 천연 유전자 서열로부터 유래되며, 표적 세포에서의 도입 및 발현에 최적화되지 않은 비변형된 서열을 함유한다. 한 실시양태에서, 단리된 비-자연 발생 핵산은 코돈 최적화된다. 코돈 최적화는 세포 유형 특이적 코돈 사용 빈도에 대해 특이적일 수 있다. 상이한 유기체와 세포 유형은 동일한 아미노산에 대해 다른 코돈보다 특정 코돈을 사용하는 쪽으로 편향되어 있다. 일부 종은 특정 코돈을 거의 완전히 피하는 것으로 공지되어 있다. 유사하게, 특정 세포 유형은 동일한 아미노산에 대해 다른 코돈보다 특정 코돈을 사용하는 쪽으로 편향되어 있다. 한 실시양태에서, 비-자연 발생 핵산의 코돈을 최적화하는 방법은 표적 세포에서 각각의 코돈의 사용 빈도에 기초하여 코돈 사용 빈도를 재할당하는 것을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 표적 세포는 특정 조직 또는 기관의 것일 수 있다.
일부 경우에, 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함된 문헌 [Grzegorz Kudla, et al., High guanine and cytosine content increases mRNA levels in mammalian cells, PLoS Biol 4(6): e180. DOI: 10.1371/journal.pbio.0040180]에 제공된 바와 같이, 서열에서 구아닌 및/또는 시토신 함량을 증가시키기 위한 변형이 수행된다.
표 1. 핵산의 변형을 위해 상호교환될 수 있는 비-제한적 예시적인 코돈. 하기 코돈에서 티민은 우라실로 대체될 수 있다.
Figure pct00001
한 실시양태에서, 비-자연 발생 핵산 서열은 적어도 하나의 코돈을, 동일한 아미노산을 코딩하는 또 다른 코돈으로 대체하도록 변형될 수 있다. 일부 경우에, 코돈은 서열의 코딩 영역 내에서 변형된다. 일부 경우에, 코돈은 서열의 비-코딩 영역 내에서 변형된다. 일부 경우에, 코돈은 종결 코돈으로부터 약 100개, 약 50개, 약 25개, 약 15개 또는 약 5개 염기 내에서 변형된다. E-CAI는 문헌 [Puigbo, P., Bravo, I. G. & Garcia-Vallve, S. E-CAI: a novel server to estimate an expected value of Codon Adaptation Index (eCAI). BMC Bioinformatics 9, 65, doi:10.1186/1471-2105-9-65 (2008)]에 제공된 바와 같이 코돈 적응 지수의 값을 추정하는데 활용될 수 있다.
다양한 변형이 본원에서 고려된다. 일부 경우에, 코돈은 상호교환될 수 있다. 예를 들어, 서열은 AGA를 AGG로 대체하도록 변형될 수 있다. 다른 경우에, CCC는 CCT로 대체된다. 다른 경우에, AGC는 TCC로 대체된다. 다른 경우에, CCC는 CCG로 대체된다. 표 1에 제공된 비-제한적 대체 중 임의의 것을 적용하여 핵산을 변형시킬 수 있다. 핵산에서는 임의의 수의 코돈이 상호교환될 수 있다. 일부 경우에, 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 21개, 적어도 22개, 적어도 23개, 적어도 24개, 적어도 25개, 적어도 26개, 적어도 27개, 적어도 28개, 적어도 29개, 적어도 30개, 적어도 32개, 적어도 34개, 적어도 36개, 적어도 38개, 적어도 40개, 적어도 42개, 적어도 44개, 적어도 46개, 적어도 48개, 또는 최대 50개의 코돈이 대체될 수 있다. 한 실시양태에서, 비-자연 발생 핵산은 3개의 코돈 변형을 포함한다. 한 실시양태에서, 비-자연 발생 핵산은 16개의 코돈 변형을 포함한다. 한 실시양태에서, 비-자연 발생 핵산은 3-5, 5-10, 5-15, 10-15, 10-20, 15-20, 1-20, 12-20, 12-25, 15-30, 또는 15-25개의 코돈 변형을 포함한다. 한 실시양태에서, 비-자연 발생 핵산은 AGA에서 AGG로의 변형; 및 CCT에서 CCC로의 변형, AGC에서 TCC로의 변형, 또는 CCC에서 CCG로의 변형 중 적어도 하나인, 2개의 코돈 변형을 포함한다. 한 실시양태에서, 비-자연 발생 핵산은 AGA에서 AGG로의 변형; 및 CCT에서 CCC로의 변형, AGC에서 TCC로의 변형, 또는 CCC에서 CCG로의 변형 중 적어도 2개인, 3개의 코돈 변형을 포함한다. 한 실시양태에서, 비-자연 발생 핵산은 AGA에서 AGG로의 변형, CCT에서 CCC로의 변형, AGC에서 TCC로의 변형, 및 CCC에서 CCG로의 변형인 4개의 코돈 변형을 포함한다. 부가의 변형은 상기 코돈 중 임의의 것과 조합하여 표 1에 제공된 코돈 변형 중 임의의 것 및/또는 표 1로부터 가능한 임의의 부가의 변형을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, AGA가 AGG로 대체되고 CCT가 CCC로 대체되도록 핵산이 변형된다. 한 실시양태에서, AGA가 AGG로 대체되고 AGC가 TCC로 대체되도록 핵산이 변형된다. 한 실시양태에서, AGA가 AGG로 대체되고 CCC가 CCG로 대체되도록 핵산이 변형된다.
한 실시양태에서, 비-자연 발생 핵산 서열은 서열의 16개 코돈에서 AGA를 AGG로 대체하도록 변형된다. 한 실시양태에서, 비-자연 발생 핵산 서열은 코딩 서열의 16개 코돈에서 AGA를 AGG로 대체하도록 변형된다. 일부 경우에, 서열은 핵산 서열의 코딩 영역의 적어도 3개, 적어도 6개, 적어도 9개, 적어도 12개, 적어도 15개, 적어도 18개, 적어도 21개, 적어도 24개, 적어도 27개, 적어도 29개, 또는 최대 30개의 코돈에서 CCT를 CCC로 대체하도록 변형된다. 일부 경우에, 서열은 이러한 서열의 코딩 영역의 적어도 30개의 코돈에서 CCT를 CCC로 대체하도록 변형된다. 일부 경우에, 서열은 핵산 서열의 영역의 적어도 3개, 적어도 6개, 적어도 9개, 적어도 12개, 적어도 15개, 적어도 18개, 적어도 21개, 적어도 24개, 적어도 27개, 적어도 30개, 적어도 33개, 또는 최대 36개의 코돈에서 AGC를 TCC로 대체하도록 변형된다. 일부 경우에, 서열은 핵산 서열의 코딩 영역의 36개의 코돈에서 AGC를 TCC로 대체하도록 변형된다. 일부 경우에, 비-자연 발생 핵산 서열은 이러한 서열의 코딩 영역의 적어도 3개, 적어도 6개, 적어도 9개, 적어도 12개, 적어도 15개, 적어도 18개, 적어도 21개, 적어도 24개, 적어도 27개, 적어도 29개, 또는 최대 30개의 코돈에서 CCC를 CCG로 대체하도록 변형된다. 일부 경우에, 비-자연 발생 핵산 서열은 이러한 비-자연 발생 핵산 서열의 코딩 영역의 29개의 코돈에서 CCC를 CCG로 대체하도록 변형된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 단리된 비-자연 발생 핵산은 항혈관형성제를 포함하는 생물제제를 코딩하는 서열을 포함하며, 상기 서열은 코딩 영역에서의 변형이 결여된 그 외에는 필적하는 서열과 비교 시 서열의 코딩 영역에서의 변형을 포함하며, 상기 변형은 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 또는 적어도 4개의 비-AGG 아르기닌 코돈을 AGG로 대체하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 비-AGG 아르기닌 코돈은 AGA이다. 일부 실시양태에서, 서열은 이러한 서열의 코딩 영역의 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 또는 적어도 16개의 코돈에서 비-AGG 아르기닌 코돈을 AGG로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 서열은 이러한 서열의 코딩 영역의 16개의 코돈에서 비-AGG 아르기닌 코돈을 AGG로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 서열은 이러한 서열의 코딩 영역의 16개의 코돈 중 어느 하나에서 비-AGG 아르기닌 코돈을 AGG로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 서열은 서열식별번호: 70과 비교 시 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 또는 적어도 16개의 코돈 위치에서 비-AGG 아르기닌 코돈을 AGG로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 서열은 서열식별번호: 70과 비교 시 16개의 코돈 위치에서 비-AGG 아르기닌 코돈을 AGG로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 서열은 서열식별번호: 70과 비교 시 16개의 코돈 위치 중 어느 하나에서 비-AGG 아르기닌 코돈을 AGG로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 비-AGG 아르기닌 코돈은 AGA이다. 일부 실시양태에서, 서열은 이러한 서열의 코딩 영역의 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 또는 적어도 16개의 코돈에서 AGA를 AGG로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 서열은 이러한 서열의 코딩 영역의 16개의 코돈에서 AGA를 AGG로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 서열은 이러한 서열의 코딩 영역의 16개의 코돈 중 어느 하나에서 AGA를 AGG로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 서열은 서열식별번호: 70과 비교 시 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 또는 적어도 16개의 코돈 위치에서 AGA를 AGG로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 서열은 서열식별번호: 70과 비교 시 16개의 코돈 위치에서 AGA를 AGG로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 서열은 서열식별번호: 70과 비교 시 16개의 코돈 위치 중 어느 하나에서 AGA를 AGG로 대체하도록 변형된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 단리된 비-자연 발생 핵산은 항혈관형성제를 포함하는 생물제제를 코딩하는 서열을 포함하며, 상기 서열은 코딩 영역에서의 변형이 결여된 그 외에는 필적하는 서열과 비교 시 서열의 코딩 영역에서의 변형을 포함하며, 상기 변형은 적어도 하나의 비-CCC 프롤린 코돈을 CCC로 대체하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 비-CCC 프롤린 코돈은 CCT이다. 서열은 이러한 서열의 코딩 영역의 적어도 3개, 적어도 6개, 적어도 9개, 적어도 12개, 적어도 15개, 적어도 18개, 적어도 21개, 적어도 24개, 적어도 27개, 적어도 29개, 또는 최대 30개의 코돈에서 비-CCC 프롤린 코돈을 CCC로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 서열은 이러한 서열의 코딩 영역의 30개의 코돈에서 비-CCC 프롤린 코돈을 CCC로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 서열은 이러한 서열의 코딩 영역의 30개의 코돈 중 어느 하나에서 비-CCC 프롤린 코돈을 CCC로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 서열은 서열식별번호: 70과 비교 시 적어도 3개, 적어도 6개, 적어도 9개, 적어도 12개, 적어도 15개, 적어도 18개, 적어도 21개, 적어도 24개, 적어도 27개, 적어도 29개, 또는 최대 30개의 코돈 위치에서 비-CCC 프롤린 코돈을 CCC로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 서열은 서열식별번호: 70과 비교 시 30개의 코돈 위치에서 비-CCC 프롤린 코돈을 CCC로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 서열은 서열식별번호: 70과 비교 시 30개의 코돈 위치 중 어느 하나에서 비-CCC 프롤린 코돈을 CCC로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 비-CCC 프롤린 코돈은 CCT이다. 일부 실시양태에서, 서열은 이러한 서열의 코딩 영역의 적어도 3개, 적어도 6개, 적어도 9개, 적어도 12개, 적어도 15개, 적어도 18개, 적어도 21개, 적어도 24개, 적어도 27개, 적어도 29개, 또는 최대 30개의 코돈에서 CCT를 CCC로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 서열은 이러한 서열의 코딩 영역의 30개의 코돈에서 CCT를 CCC로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 서열은 이러한 서열의 코딩 영역의 30개의 코돈 중 어느 하나에서 CCT를 CCC로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 서열은 서열식별번호: 70과 비교 시 적어도 3개, 적어도 6개, 적어도 9개, 적어도 12개, 적어도 15개, 적어도 18개, 적어도 21개, 적어도 24개, 적어도 27개, 적어도 29개, 또는 최대 30개의 코돈 위치에서 CCT를 CCC로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 서열은 서열식별번호: 70과 비교 시 30개의 코돈 위치에서 CCT를 CCC로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 서열은 서열식별번호: 70과 비교 시 30개의 코돈 위치 중 어느 하나에서 CCT를 CCC로 대체하도록 변형된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 단리된 비-자연 발생 핵산은 항혈관형성제를 포함하는 생물제제를 코딩하는 서열을 포함하며, 상기 서열은 코딩 영역에서의 변형이 결여된 그 외에는 필적하는 서열과 비교 시 서열의 코딩 영역에서의 변형을 포함하며, 상기 변형은 적어도 하나의 비-TCC 세린 코돈을 TCC로 대체하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열은 이러한 서열의 코딩 영역의 적어도 3개, 적어도 6개, 적어도 9개, 적어도 12개, 적어도 15개, 적어도 18개, 적어도 21개, 적어도 24개, 적어도 27개, 적어도 30개, 적어도 33개, 또는 최대 36개의 코돈에서 비-TCC 세린 코돈을 TCC로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 서열은 이러한 서열의 코딩 영역의 36개의 코돈에서 비-TCC 세린 코돈을 TCC로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 서열은 이러한 서열의 코딩 영역의 36개의 코돈 중 어느 하나에서 비-TCC 세린 코돈을 TCC로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 서열은 서열식별번호: 70과 비교 시 적어도 3개, 적어도 6개, 적어도 9개, 적어도 12개, 적어도 15개, 적어도 18개, 적어도 21개, 적어도 24개, 적어도 27개, 적어도 30개, 적어도 33개, 또는 최대 36개의 코돈 위치에서 비-TCC 세린 코돈을 TCC로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 서열은 서열식별번호: 70과 비교 시 36개의 코돈 위치에서 비-TCC 세린 코돈을 TCC로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 서열은 서열식별번호: 70과 비교 시 36개의 코돈 위치 중 어느 하나에서 비-TCC 세린 코돈을 TCC로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 비-TCC 세린 코돈은 AGC이다. 일부 실시양태에서, 서열은 이러한 서열의 코딩 영역의 적어도 3개, 적어도 6개, 적어도 9개, 적어도 12개, 적어도 15개, 적어도 18개, 적어도 21개, 적어도 24개, 적어도 27개, 적어도 30개, 적어도 33개, 또는 최대 36개의 코돈에서 AGC를 TCC로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 서열은 이러한 서열의 코딩 영역의 36개의 코돈에서 AGC를 TCC로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 서열은 이러한 서열의 코딩 영역의 36개의 코돈 중 어느 하나에서 AGC를 TCC로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 서열은 서열식별번호: 70과 비교 시 적어도 3개, 적어도 6개, 적어도 9개, 적어도 12개, 적어도 15개, 적어도 18개, 적어도 21개, 적어도 24개, 적어도 27개, 적어도 30개, 적어도 33개, 또는 최대 36개의 코돈 위치에서 AGC를 TCC로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 서열은 서열식별번호: 70과 비교 시 36개의 코돈 위치에서 AGC를 TCC로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 서열은 서열식별번호: 70과 비교 시 36개의 코돈 위치 중 어느 하나에서 AGC를 TCC로 대체하도록 변형된다.
제3항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 서열이 이러한 서열의 코딩 영역의 적어도 3개, 적어도 6개, 적어도 9개, 적어도 12개, 적어도 15개, 적어도 18개, 적어도 21개, 적어도 24개, 적어도 27개, 또는 최대 30개의 코돈에서 비-CCG 프롤린 코돈을 CCG로 대체하도록 변형되는 것인 단리된 비-자연 발생 핵산.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 단리된 비-자연 발생 핵산은 항혈관형성제를 포함하는 생물제제를 코딩하는 서열을 포함하며, 상기 서열은 코딩 영역에서의 변형이 결여된 그 외에는 필적하는 서열과 비교 시 서열의 코딩 영역에서의 변형을 포함하며, 상기 변형은 적어도 하나의 비-CCG 프롤린 코돈을 CCG로 대체하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열은 이러한 서열의 코딩 영역의 30개의 코돈에서 비-CCG 프롤린 코돈을 CCG로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 서열은 이러한 서열의 코딩 영역의 30개의 코돈 중 어느 하나에서 비-CCG 프롤린 코돈을 CCG로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 서열은 서열식별번호: 70과 비교 시 적어도 3개, 적어도 6개, 적어도 9개, 적어도 12개, 적어도 15개, 적어도 18개, 적어도 21개, 적어도 24개, 적어도 27개, 또는 최대 30개의 코돈 위치에서 비-CCG 프롤린 코돈을 CCG로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 서열은 서열식별번호: 70과 비교 시 30개의 코돈 위치에서 비-CCG 프롤린 코돈을 CCG로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 서열은 서열식별번호: 70과 비교 시 30개의 코돈 위치 중 어느 하나에서 비-CCG 프롤린 코돈을 CCG로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 비-CCG 프롤린 코돈은 CCC이다. 일부 실시양태에서, 서열은 이러한 서열의 코딩 영역의 적어도 3개, 적어도 6개, 적어도 9개, 적어도 12개, 적어도 15개, 적어도 18개, 적어도 21개, 적어도 24개, 적어도 27개, 또는 최대 30개의 코돈에서 CCC를 CCG로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 서열은 이러한 서열의 코딩 영역의 30개의 코돈에서 CCC를 CCG로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 서열은 이러한 서열의 코딩 영역의 30개의 코돈 중 어느 하나에서 CCC를 CCG로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 서열은 서열식별번호: 70과 비교 시 적어도 3개, 적어도 6개, 적어도 9개, 적어도 12개, 적어도 15개, 적어도 18개, 적어도 21개, 적어도 24개, 적어도 27개, 또는 최대 30개의 코돈 위치에서 CCC를 CCG로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 서열은 서열식별번호: 70과 비교 시 30개의 코돈 위치에서 CCC를 CCG로 대체하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 서열은 서열식별번호: 70과 비교 시 30개의 코돈 위치 중 어느 하나에서 CCC를 CCG로 대체하도록 변형된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 비-자연 발생 핵산 서열은 서열식별번호: 13-19, 21-27, 31, 62, 64, 66 또는 68 중 어느 하나와 적어도 약 60%의 서열 동일성 또는 유사성인 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열 동일성은 약 70%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 및 최대 약 100%이다. 일부 실시양태에서, 단리된 비-자연 발생 핵산은 서열식별번호: 31과 약 70%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 및 최대 약 100%의 서열 동일성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 비-자연 발생 핵산은 서열식별번호: 31의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 비-자연 발생 핵산은 서열식별번호: 31의 핵산 서열과 100% 동일하다. 일부 실시양태에서, 단리된 비-자연 발생 핵산은 서열식별번호: 66과 약 70%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 및 최대 약 100%의 서열 동일성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 비-자연 발생 핵산은 서열식별번호: 66의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 비-자연 발생 핵산은 서열식별번호: 66의 핵산 서열과 100% 동일하다. 일부 실시양태에서, 단리된 비-자연 발생 핵산은 단일 가닥이다. 일부 실시양태에서, 단리된 비-자연 발생 핵산은 이중 가닥이다.
일부 실시양태에서, 비-자연 발생 핵산 서열은 서열식별번호: 70과 비교 시 위치: X1-X16에서 AGA를 AGG로 대체하도록 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-자연 발생 핵산 서열은 이러한 비-자연 발생 핵산 서열의 코딩 영역의 적어도 3개, 적어도 6개, 적어도 9개, 적어도 12개, 적어도 15개, 적어도 18개, 적어도 21개, 적어도 24개, 적어도 27개, 적어도 29개, 또는 최대 30개의 코돈에서 CCT를 CCC로 대체하도록 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-자연 발생 핵산 서열은 이러한 비-자연 발생 핵산 서열의 코딩 영역의 30개의 코돈에서 CCT를 CCC로 대체하도록 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-자연 발생 핵산 서열은 서열식별번호: 70과 비교 시 위치: X1-X30에서 CCT를 CCC로 대체하도록 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-자연 발생 핵산 서열은 이러한 비-자연 발생 핵산 서열의 코딩 영역의 적어도 3개, 적어도 6개, 적어도 9개, 적어도 12개, 적어도 15개, 적어도 18개, 적어도 21개, 적어도 24개, 적어도 27개, 적어도 30개, 적어도 33개, 또는 최대 36개의 코돈에서 AGC를 TCC로 대체하도록 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-자연 발생 핵산 서열은 이러한 비-자연 발생 핵산 서열의 코딩 영역의 36개의 코돈에서 AGC를 TCC로 대체하도록 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-자연 발생 핵산 서열은 서열식별번호: 70과 비교 시 위치: X1-X36에서 AGC를 TCC로 대체하도록 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-자연 발생 핵산 서열은 이러한 비-자연 발생 핵산 서열의 코딩 영역의 적어도 3개, 적어도 6개, 적어도 9개, 적어도 12개, 적어도 15개, 적어도 18개, 적어도 21개, 적어도 24개, 적어도 27개, 적어도 29개, 또는 최대 30개의 코돈에서 CCC를 CCG로 대체하도록 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-자연 발생 핵산 서열은 이러한 비-자연 발생 핵산 서열의 코딩 영역의 29개의 코돈에서 CCC를 CCG로 대체하도록 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-자연 발생 핵산 서열은 서열식별번호: 70과 비교 시 위치: X1-X29에서 CCC를 CCG로 대체하도록 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-자연 발생 핵산 서열은 서열식별번호: 28과 비교 시 위치: X1-X16에서 AGA를 AGG로 대체하도록 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-자연 발생 핵산 서열은 이러한 비-자연 발생 핵산 서열의 코딩 영역의 적어도 3개, 적어도 6개, 적어도 9개, 적어도 12개, 적어도 15개, 적어도 18개, 적어도 21개, 적어도 24개, 적어도 27개, 적어도 29개, 또는 최대 30개의 코돈에서 CCT를 CCC로 대체하도록 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-자연 발생 핵산 서열은 이러한 비-자연 발생 핵산 서열의 코딩 영역의 30개의 코돈에서 CCT를 CCC로 대체하도록 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-자연 발생 핵산 서열은 서열식별번호: 28과 비교 시 위치: X1-X30에서 CCT를 CCC로 대체하도록 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-자연 발생 핵산 서열은 이러한 비-자연 발생 핵산 서열의 코딩 영역의 적어도 3개, 적어도 6개, 적어도 9개, 적어도 12개, 적어도 15개, 적어도 18개, 적어도 21개, 적어도 24개, 적어도 27개, 적어도 30개, 적어도 33개, 또는 최대 36개의 코돈에서 AGC를 TCC로 대체하도록 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-자연 발생 핵산 서열은 이러한 비-자연 발생 핵산 서열의 코딩 영역의 36개의 코돈에서 AGC를 TCC로 대체하도록 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-자연 발생 핵산 서열은 서열식별번호: 28과 비교 시 위치: X1-X36에서 AGC를 TCC로 대체하도록 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-자연 발생 핵산 서열은 이러한 비-자연 발생 핵산 서열의 코딩 영역의 적어도 3개, 적어도 6개, 적어도 9개, 적어도 12개, 적어도 15개, 적어도 18개, 적어도 21개, 적어도 24개, 적어도 27개, 적어도 29개, 또는 최대 30개의 코돈에서 CCC를 CCG로 대체하도록 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-자연 발생 핵산 서열은 이러한 비-자연 발생 핵산 서열의 코딩 영역의 29개의 코돈에서 CCC를 CCG로 대체하도록 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-자연 발생 핵산 서열은 서열식별번호: 28과 비교 시 위치: X1-X29에서 CCC를 CCG로 대체하도록 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 비-자연 발생 핵산 서열은 바이러스 벡터 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터 서열은 scAAV 벡터 서열일 수 있다. 일부 실시양태에서, AAV 벡터 서열은 혈청형 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, 또는 그의 임의의 조합의 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, AAV 벡터 서열은 AAV2 혈청형의 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터 서열은 적어도 2개의 AAV 혈청형의 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 2개의 혈청형은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV8, AAV9, AAV11 및 AAV12로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단리된 비-자연 발생 핵산 서열은 서열식별번호: 13-19 또는 21-27 중 어느 하나와 적어도 약 60%의 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, AAV 벡터 서열은 단일 가닥이다. 일부 실시양태에서, AAV 벡터 서열은 이중 가닥이다.
일부 경우에, 변형은 또한 화학적 변형을 포함할 수 있다. 변형된 핵산은 백본, 당 또는 핵염기의 변형, 및 심지어 새로운 염기 또는 염기쌍의 변형을 포함할 수 있다. 변형된 핵산은 개선된 화학적 및/또는 생물학적 안정성을 가질 수 있다. 다양한 화학적 치환기 (예를 들어, 소수성 기)로 장식하면 개선된 특성과 기능성, 예컨대 새로운 구조적 모티프 및 증강된 표적 결합이 산출될 수도 있다.
예시적인 화학적 변형은 2'F, 2'-플루오로; 2'OMe, 2'-O-메틸; LNA, 잠금 핵산; FANA, 2'-플루오로 아라비노스 핵산; HNA, 헥시톨 핵산; 2'MOE, 2'-O-메톡시에틸; 리불로NA, (1'-3')-β-L-리불로 핵산; TNA, α-L-트레오스 핵산; tPhoNA, 3'-2' 포스포노메틸-트레오실 핵산; dXNA, 2'-데옥시크실로핵산; PS, 포스포로티오에이트; phNA, 알킬 포스포네이트 핵산; 및 PNA, 펩티드 핵산을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 경우에, 핵산은 부가의 특색을 포함한다. 부가의 특색은 태그, 신호 펩티드, 인트론 서열, 프로모터, 스터퍼 서열 등과 같은 서열을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 핵산은 신호 펩티드를 포함한다. 신호 펩티드는 때때로 신호 서열, 표적화 신호, 국재화 신호, 국재화 서열, 수송 펩티드, 리더 서열 또는 리더 펩티드로서 지칭되고, 분비 경로를 향하는 대부분의 새로 합성된 단백질의 N-말단에 존재하는 짧은 펩티드이다. 이들 단백질은 특정 소기관 (소포체, 골지 또는 엔도솜) 내부에 상주하거나, 세포로부터 분비되거나, 또는 대부분의 세포막에 삽입되는 단백질을 포함한다. 일부 경우에, 본원에 제공된 핵산은 신호 펩티드를 포함할 수 있다. 신호 펩티드는 임의의 길이일 수 있지만, 전형적으로 15-30개의 아미노산 길이이다. 신호 펩티드는 약 10-15, 10-20, 10-30, 15-20, 15-25, 15-30, 20-30 또는 25-30개의 아미노산 길이일 수 있다. 다양한 신호 펩티드가 활용될 수 있으며, 이는 인간 항체 중쇄 (Vh), 인간 항체 경쇄 (Vl), 및 아플리베르셉트를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 경우에, 핵산은 인트론 서열을 포함한다. 인트론은 최종 RNA 산물이 성숙되는 동안 RNA 스플라이싱에 의해 제거될 수 있는 서열 내의 임의의 뉴클레오티드 서열이다. 달리 말하자면, 인트론은 번역 전 스플라이싱에 의해 제거되는 RNA 전사체의 비-코딩 영역, 또는 이를 코딩하는 DNA이다. 인트론은 단백질 산물을 코딩하지 않지만, 유전자 발현 조절에 관여한다. 일부 인트론 자체는 스플라이싱 후 비-코딩 RNA 분자를 생성하는 추가의 프로세싱을 통해 기능적 RNA를 코딩한다. 교대 스플라이싱은 단일 유전자로부터 여러 단백질을 생성하는데 널리 사용된다. 더욱이, 일부 인트론은 광범위한 유전자 발현 조절 기능, 예컨대 넌센스 매개 붕괴 및 mRNA 외수송에서 필수적인 역할을 한다. 한 실시양태에서, 인트론 서열은 본 개시내용의 핵산에 포함되고, hCMV 인트론 A, 아데노바이러스 삼자 리더 서열 인트론, SV40 인트론, 햄스터 EF-1 알파 유전자 인트론 1, 개입 서열 인트론, 인간 성장 호르몬 인트론, 및/또는 인간 베타 글로빈 인트론으로부터 선택될 수 있다. 임의의 수의 인트론 서열이 고려된다. 한 실시양태에서, 인트론 서열은 SV40이다. 일부 경우에, 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 또는 최대 10개의 인트론 서열이 핵산에 포함될 수 있다.
한 실시양태에서, 부가의 특색은 프로모터를 포함한다. 프로모터는 단백질과 결합하여 그의 하류의 DNA로부터 단일 RNA의 전사를 시작하는 DNA 서열이다. 이러한 RNA는 단백질을 코딩할 수 있거나, 또는 그 안에서 및 그 자체의 기능을 가질 수 있으며, 예컨대 tRNA, mRNA 또는 rRNA이다. 프로모터는 DNA 상의 상류 (센스 가닥의 5' 영역 방향)에 있는 유전자의 전사 출발 부위 근처에 위치한다. 프로모터는 약 100-1000개 염기쌍 길이일 수 있다. 다양한 프로모터가 고려되며 본 개시내용의 비-자연 발생 핵산에 이용될 수 있다. 한 실시양태에서, 프로모터는 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터, 신장 인자 1 알파 (EF1α) 프로모터, 원숭이 공포형성 바이러스 (SV40) 프로모터, 포스포글리세레이트 키나제 (PGK1) 프로모터, 유비퀴틴 C (Ubc) 프로모터, 인간 베타 액틴 프로모터, CAG 프로모터, 테트라시클린 반응 요소 (TRE) 프로모터, UAS 프로모터, 액틴 5c (Ac5) 프로모터, 폴리헤드론 프로모터, Ca2+/칼모듈린-의존성 단백질 키나제 II (CaMKIIa) 프로모터, GAL1 프로모터, GAL 10 프로모터, TEF1 프로모터, 글리세르알데히드 3-포스페이트 데히드로게나제 (GDS) 프로모터, ADH1 프로모터, CaMV35S 프로모터, Ubi 프로모터, 인간 폴리머라제 III RNA (H1) 프로모터, U6 프로모터, 그의 폴리아데닐화된 구축물, 및 그의 임의의 조합이다. 일부 경우에, 프로모터는 CMV 프로모터이다.
제공된 핵산 서열 중 임의의 것은 바이러스 벡터 서열을 포함할 수 있다. 바이러스 벡터는 렌티바이러스, 레트로바이러스, 또는 아데노-연관 바이러스일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 바이러스 벡터는 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터일 수 있다. 일부 경우에, 바이러스 벡터는 아데노-연관 바이러스 벡터이다. AAV 벡터의 많은 혈청형이 고려되며 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, 및/또는 AAV12를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이러한 초기 혈청형을 기반으로, 각각의 혈청형의 AAV 캡시드를 조작하여 생물학적 기능, 조직 또는 세포 선택에 더 적합하게 만들 수 있다. 일부 실시양태에서, AAV 벡터는 본 발명의 실시에에서 사용되는 AAV2 및 변이체 AAV2.N53 및 AAV2.N54이다. 적어도 2개의 AAV 혈청형을 함유할 수 있는 키메라 AAV 벡터가 또한 고려된다. 일부 경우에, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 또는 최대 8개의 상이한 혈청형이 키메라 AAV 벡터에서 조합된다. 일부 경우에, AAV의 일부분만이 키메라이다. 예를 들어, 적합한 부분은 캡시드, VP1, VP2 또는 VP3 도메인 및/또는 Rep를 포함한 수 있다. 일부 경우에, VP1, VP2 및 VP3 중 적어도 하나는 그 외에는 필적하는 야생형 AAV 캡시드 단백질과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 경우에, VP1과 VP2, VP1과 VP3, VP2와 VP3, 또는 VP1, VP2, 및 VP3에서 돌연변이가 발생할 수 있다. 일부 실시양태에서, VP1, VP2 및 VP3 중 적어도 하나는 야생형 AAV VP1, VP2 및 VP3과 비교하여 1 내지 약 25개의 아미노산 치환, 예를 들어, 야생형 AAV VP1, VP2 및 VP3과 비교하여 약 1 내지 약 5, 약 5 내지 약 10, 약 10 내지 약 15, 약 15 내지 약 20, 또는 약 20 내지 약 25개의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 경우에, VP는 제거될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서 돌연변이체 AAV는 VP1, VP2 또는 VP3 중 적어도 하나를 포함하지 않는다.
일부 경우에, AAV 벡터는 변형될 수 있다. 예를 들어, AAV 벡터는 삽입, 결실, 화학적 변경, 또는 합성 변형과 같은 변형을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 단일 뉴클레오티드가 AAV 벡터에 삽입된다. 다른 경우에, 여러 개의 뉴클레오티드가 벡터에 삽입된다. 삽입될 수 있는 뉴클레오티드는 약 1개 뉴클레오티드 내지 약 5 kb의 범위일 수 있다.
일부 경우에, 이전에 언급한 AAV 캡시드 위치 중 임의의 것에서 돌연변이가 발생할 수 있으며 임의의 수의 돌연변이가 포함될 수 있다. 일부 경우에, 하나의 아미노산에서 또 다른 아미노산으로의 돌연변이가 발생할 수 있다. 표준 아미노산의 임의의 조합 또는 순열이 수행될 수 있다. VP1, VP2 및 VP3 중 임의의 것에서 하기 아미노산 변형 중 임의의 것이 이루어질 수 있다: A에서 R로의 변형, A에서 N으로의 변형, A에서 D로의 변형, A에서 C로의 변형, A에서 Q로의 변형, A에서 E로의 변형, A에서 G로의 변형, A에서 H로의 변형, A에서 I로의 변형, A에서 L로의 변형, A에서 K로의 변형, A에서 M으로의 변형, A에서 F로의 변형, A에서 P로의 변형, A에서 S로의 변형, A에서 T로의 변형, A에서 W로의 변형, A에서 Y로의 변형, A에서 V로의 변형, R에서 N으로의 변형, R에서 D로의 변형, R에서 C로의 변형, R에서 Q로의 변형, R에서 E로의 변형, R에서 G로의 변형, R에서 H로의 변형, R에서 I로의 변형, R에서 L로의 변형, R에서 K로의 변형, R에서 M으로의 변형, R에서 F로의 변형, R에서 P로의 변형, R에서 S로의 변형, R에서 T로의 변형, R에서 W로의 변형, R에서 Y로의 변형, R에서 V로의 변형, N에서 D로의 변형, N에서 C로의 변형, N에서 Q로의 변형, N에서 E로의 변형, N에서 G로의 변형, N에서 H로의 변형, N에서 I로의 변형, N에서 L로의 변형, N에서 K로의 변형, N에서 M으로의 변형, N에서 F로의 변형, N에서 P로의 변형, N에서 S로의 변형, N에서 T로의 변형, N에서 W로의 변형, N에서 Y로의 변형, N에서 V로의 변형, D에서 C로의 변형, D에서 Q로의 변형, D에서 E로의 변형, D에서 G로의 변형, D에서 H로의 변형, D에서 I로의 변형, D에서 L로의 변형, D에서 K로의 변형, D에서 M으로의 변형, D에서 F로의 변형, D에서 P로의 변형, D에서 S로의 변형, D에서 T로의 변형, D에서 W로의 변형, D에서 Y로의 변형, D에서 V로의 변형, C에서 Q로의 변형, C에서 E로의 변형, C에서 G로의 변형, C에서 H로의 변형, C에서 I로의 변형, C에서 L로의 변형, C에서 K로의 변형, C에서 M으로의 변형, C에서 F로의 변형, C에서 P로의 변형, C에서 S로의 변형, C에서 T로의 변형, C에서 W로의 변형, C에서 Y로의 변형, C에서 V로의 변형, Q에서 E로의 변형, Q에서 G로의 변형, Q에서 H로의 변형, Q에서 I로의 변형, Q에서 L로의 변형, Q에서 K로의 변형, Q에서 M으로의 변형, Q에서 F로의 변형, Q에서 P로의 변형, Q에서 S로의 변형, Q에서 T로의 변형, Q에서 W로의 변형, Q에서 Y로의 변형, Q에서 V로의 변형, E에서 G로의 변형, E에서 H로의 변형, E에서 I로의 변형, E에서 L로의 변형, E에서 K로의 변형, E에서 M으로의 변형, E에서 F로의 변형, E에서 P로의 변형, E에서 S로의 변형, E에서 T로의 변형, E에서 W로의 변형, E에서 Y로의 변형, E에서 V로의 변형, G에서 H로의 변형, G에서 I로의 변형, G에서 L로의 변형, G에서 K로의 변형, G에서 M으로의 변형, G에서 F로의 변형, G에서 P로의 변형, G에서 S로의 변형, G에서 T로의 변형, G에서 W로의 변형, G에서 Y로의 변형, G에서 V로의 변형, H에서 I로의 변형, H에서 L로의 변형, H에서 K로의 변형, H에서 M으로의 변형, H에서 F로의 변형, H에서 P로의 변형, H에서 S로의 변형, H에서 T로의 변형, H에서 W로의 변형, H에서 Y로의 변형, H에서 V로의 변형, I에서 L로의 변형, I에서 K로의 변형, I에서 M으로의 변형, I에서 F로의 변형, I에서 P로의 변형, I에서 S로의 변형, I에서 T로의 변형, I에서 W로의 변형, I에서 Y로의 변형, I에서 V로의 변형, L에서 K로의 변형, L에서 M으로의 변형, L에서 F로의 변형, L에서 P로의 변형, L에서 S로의 변형, L에서 T로의 변형, L에서 W로의 변형, L에서 Y로의 변형, L에서 V로의 변형, K에서 M으로의 변형, K에서 F로의 변형, K에서 P로의 변형, K에서 S로의 변형, K에서 T로의 변형, K에서 W로의 변형, K에서 Y로의 변형, K에서 V로의 변형, M에서 F로의 변형, M에서 P로의 변형, M에서 S로의 변형, M에서 T로의 변형, M에서 W로의 변형, M에서 Y로의 변형, M에서 V로의 변형, F에서 P로의 변형, F에서 S로의 변형, F에서 T로의 변형, F에서 W로의 변형, F에서 Y로의 변형, F에서 V로의 변형, P에서 S로의 변형, P에서 T로의 변형, P에서 W로의 변형, P에서 Y로의 변형, P에서 V로의 변형, S에서 T로의 변형, S에서 W로의 변형, S에서 Y로의 변형, S에서 V로의 변형, T에서 W로의 변형, T에서 Y로의 변형, T에서 V로의 변형, W에서 Y로의 변형, W에서 V로의 변형, Y에서 V로의 변형, 및 이전에 기재된 돌연변이 중 임의의 것의 역순.
돌연변이는 보존적 돌연변이 또는 대체일 수 있다. 예를 들어, 20개의 자연 발생 아미노산은 유사한 특징을 공유할 수 있다. 지방족 아미노산은 글리신, 알라닌, 발린, 류신 또는 이소류신일 수 있다. 히드록실 또는 황/셀레늄 함유 아미노산은 세린, 시스테인, 셀레노시스테인, 트레오닌 또는 메티오닌일 수 있다. 시클릭 아미노산은 프롤린일 수 있다. 방향족 아미노산은 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판일 수 있다. 염기성 아미노산은 히스티딘, 리신, 및 아르기닌일 수 있다. 산성 아미노산은 아스파르테이트, 글루타메이트, 아스파라긴 또는 글루타민일 수 있다. 보존적 돌연변이는 세린에서 글리신으로, 세린에서 알라닌으로, 세린에서 세린으로, 세린에서 트레오닌으로, 세린에서 프롤린으로의 돌연변이일 수 있다. 보존적 돌연변이는 아르기닌에서 아스파라긴으로, 아르기닌에서 리신으로, 아르기닌에서 글루타민으로, 아르기닌에서 아르기닌으로, 아르기닌에서 히스티딘으로의 돌연변이일 수 있다. 보존적 돌연변이는 류신에서 페닐알라닌으로, 류신에서 이소류신으로, 류신에서 발린으로, 류신에서 류신으로, 류신에서 메티오닌으로의 돌연변이일 수 있다. 보존적 돌연변이는 프롤린에서 글리신으로, 프롤린에서 알라닌으로, 프롤린에서 세린으로, 프롤린에서 트레오닌으로, 프롤린에서 프롤린으로의 돌연변이일 수 있다. 보존적 돌연변이는 트레오닌에서 글리신으로, 트레오닌에서 알라닌으로, 트레오닌에서 세린으로, 트레오닌에서 트레오닌으로, 트레오닌에서 프롤린으로의 돌연변이일 수 있다. 보존적 돌연변이는 알라닌에서 글리신으로, 알라닌에서 트레오닌으로, 알라닌에서 프롤린으로, 알라닌에서 알라닌으로, 알라닌에서 세린으로의 돌연변이일 수 있다. 보존적 돌연변이는 발린에서 메티오닌으로, 발린에서 페닐알라닌으로, 발린에서 이소류신으로, 발린에서 류신으로, 발린에서 발린으로의 돌연변이일 수 있다. 보존적 돌연변이는 글리신에서 알라닌으로, 글리신에서 트레오닌으로, 글리신에서 프롤린으로, 글리신에서 세린으로, 글리신에서 글리신으로의 돌연변이일 수 있다. 보존적 돌연변이는 이소류신에서 페닐알라닌으로, 이소류신에서 이소류신으로, 이소류신에서 발린으로, 이소류신에서 류신으로, 이소류신에서 메티오닌으로의 돌연변이일 수 있다. 보존적 돌연변이는 페닐알라닌에서 트립토판으로, 페닐알라닌에서 페닐알라닌으로, 페닐알라닌에서 티로신으로의 돌연변이일 수 있다. 보존적 돌연변이는 티로신에서 트립토판으로, 티로신에서 페닐알라닌으로, 티로신에서 티로신으로의 돌연변이일 수 있다. 보존적 돌연변이는 시스테인에서 세린으로, 시스테인에서 트레오닌으로, 시스테인에서 시스테인으로의 돌연변이일 수 있다. 보존적 돌연변이는 히스티딘에서 아스파라긴으로, 히스티딘에서 리신으로, 히스티딘에서 글루타민으로, 히스티딘에서 아르기닌으로, 히스티딘에서 히스티딘으로의 돌연변이일 수 있다. 보존적 돌연변이는 글루타민에서 글루탐산으로, 글루타민에서 아스파라긴으로, 글루타민에서 아스파르트산으로, 글루타민에서 글루타민으로의 돌연변이일 수 있다. 보존적 돌연변이는 아스파라긴에서 글루탐산으로, 아스파라긴에서 아스파라긴으로, 아스파라긴에서 아스파르트산으로, 아스파라긴에서 글루타민으로의 돌연변이일 수 있다. 보존적 돌연변이는 리신에서 아스파라긴으로, 리신에서 리신으로, 리신에서 글루타민으로, 리신에서 아르기닌으로, 리신에서 히스티딘으로의 돌연변이일 수 있다. 보존적 돌연변이는 아스파르트산에서 글루탐산으로, 아스파르트산에서 아스파라긴으로, 아스파르트산에서 아스파르트산으로, 아스파르트산에서 글루타민으로의 돌연변이일 수 있다. 보존적 돌연변이는 글루타민에서 글루타민으로, 글루타민에서 아스파라긴으로, 글루타민에서 아스파르트산으로, 글루타민에서 글루타민으로의 돌연변이일 수 있다. 보존적 돌연변이는 메티오닌에서 페닐알라닌으로, 메티오닌에서 이소류신으로, 메티오닌에서 발린으로, 메티오닌에서 류신으로, 메티오닌에서 메티오닌으로의 돌연변이일 수 있다. 보존적 돌연변이는 트립토판에서 트립토판으로, 트립토판에서 페닐알라닌으로, 트립토판에서 티로신으로의 돌연변이일 수 있다.
일부 실시양태에서, 변형된 AAV 벡터는 변형된 AAV2 혈청형 벡터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 AAV 벡터는 변형된 VP1, VP2, VP3, 또는 그의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 AAV2 혈청형 벡터는 변형된 VP1, VP2, VP3, 또는 그의 조합을 포함한다.
한 측면에서, 단리된 비-자연 발생 핵산은 서열식별번호: 13-19 중 어느 하나와 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 및 최대 약 100%의 서열 동일성 또는 유사성을 포함한다. 한 실시양태에서, 단리된 비-자연 발생 핵산은 서열식별번호: 13-19 중 어느 하나와 적어도 약 60%의 서열 동일성 또는 유사성을 포함한다. 일부 경우에, 단리된 비-자연 발생 핵산은 서열식별번호: 13-19 중 어느 하나이다. 한 측면에서, 단리된 비-자연 발생 핵산은 서열식별번호: 21 - 서열식별번호: 27 중 어느 하나와 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 및 최대 약 100%의 서열 동일성 또는 유사성을 포함한다. 한 실시양태에서, 단리된 비-자연 발생 핵산은 서열식별번호: 21 - 서열식별번호: 27 중 어느 하나와 적어도 60%의 서열 동일성 또는 유사성을 포함한다. 일부 경우에, 단리된 비-자연 발생 핵산은 서열식별번호: 21 - 서열식별번호: 27 중 어느 하나이다. 일부 경우에, 핵산은 서열식별번호: 12와 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩한다. 일부 경우에, 핵산은 서열식별번호: 12의 폴리펩티드를 코딩한다.
한 측면에서, 본원에는 세포를 변형시킴으로써 조작된 세포를 생성하는 방법이 또한 제공된다. 세포는 1차 세포, 재조합 세포 또는 세포주를 지칭할 수 있다. 일부 경우에, 세포는 패키징 세포이다. 패키징 세포의 몇 가지 예를 들어, HEK 293 세포, HeLa 세포, 및 Vero 세포 중 어느 하나일 수 있다. 조작된 세포는 1차 세포일 수 있다. 일부 경우에, 조작된 세포가 안구 세포일 수 있다. 적합한 안구 세포는 광수용체, 신경절 세포, RPE 세포, 무축삭 세포, 수평 세포, 뮬러 세포 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 경우에, 세포는 바이러스 입자를 생성하는데 활용되는 패키징 세포이다. AAV 비리온 또는 바이러스 입자를 생성하기 위해, AAV 발현 벡터가 공지된 기술, 예컨대 형질감염을 사용하여 적합한 숙주 세포에 도입된다. 일부 경우에, 형질감염 기술, 예를 들어 CaPO4 형질감염 또는 전기천공, 및/또는 하이브리드 아데노바이러스/AAV 벡터에 의한 세포주, 예컨대 인간 배아 신장 세포주 HEK 293 (트랜스-작용 E1 단백질을 제공하는 기능적 아데노바이러스 E1 유전자를 함유하는 인간 신장 세포주)로의 감염이 사용된다. 형질감염 기술은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Graham et al. (1973) Virology, 52:456, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Davis et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, and Chu et al. (1981) Gene 13:197]을 참조한다. 적합한 형질감염 방법은 인산칼슘 공동-침전, 직접 미세주사, 전기천공, 리포솜 매개 유전자 전달, 및 고속 미세발사체를 사용한 핵산 전달을 포함하며, 이는 관련 기술분야에 공지되어 있다.
세포를 조작하기 위해, 복수개의 세포를 단리된 비-자연 발생 핵산과 접촉시킬 수 있다. 접촉은 임의의 시간을 포함할 수 있으며 약 5분 내지 약 5일을 포함할 수 있다. 접촉은 약 5분, 약 10분, 약 15분, 약 20분, 약 25분, 약 30분, 약 35분, 약 40분, 약 45분, 약 50분, 약 55분 또는 약 60분 동안 지속될 수 있다. 일부 경우에, 접촉은 1시간, 3시간, 5시간, 10시간, 15시간, 20시간, 1일, 2일, 3일, 4일 또는 최대 약 5일 동안 지속될 수 있다.
일부 경우에, 패키징 세포주의 상청액을 PEG 침전으로 처리하여 바이러스를 농축시킨다. 다른 경우에, 원심분리 단계를 사용하여 바이러스를 농축시킬 수 있다. 예를 들어, 원심분리 동안 바이러스를 농축시키기 위해 칼럼을 사용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 침전은 약 4℃ 이하 (예를 들어 약 3℃, 약 2℃, 약 1℃, 또는 약 1℃)에서 적어도 약 2시간, 적어도 약 3시간, 적어도 약 4시간, 적어도 약 6시간, 적어도 약 9시간, 적어도 약 12시간, 또는 적어도 약 24시간 동안 발생한다. 일부 실시양태에서, 재조합 AAV는 저속 원심분리에 이어 CsCl 구배에 의해 PEG-침전된 상청액으로부터 단리된다. 저속 원심분리는 약 20분, 약 30분, 약 40분, 약 50분 또는 약 60분 동안 약 4000 rpm, 약 4500 rpm, 약 5000 rpm, 또는 약 6000 rpm일 수 있다. 일부 경우에, 재조합 AAV는 약 5000 rpm에서 약 30분 동안 원심분리한 후 CsCl 구배를 수행하여 PEG-침전된 상청액으로부터 단리된다. 일부 경우에, CsCl 정제를 IDX 구배 초원심분리로 대체할 수 있다. 형질감염 후 약 12시간, 약 24시간, 약 36시간, 약 48시간, 약 72시간, 약 96시간, 약 120시간, 또는 이들 두 시점 중 임의의 것 사이의 시간에 상청액을 수집할 수 있다. 상청액은 또한 정제되거나, 농축되거나, 또는 그의 조합일 수 있다. 예를 들어, 농도 또는 바이러스 역가는 qPCR 또는 은 염색에 의해 결정될 수 있다.
한 측면에서, 조작된 세포로부터 단리된 복수개의 AAV 입자가 또한 제공된다. 바이러스 역가는 약 102 vp/mL, 약 103 vp/mL, 약 104 vp/mL, 약 105 vp/mL, 약 106 vp/mL, 약 107 vp/mL, 약 108 vp/mL, 또는 최대 약 109 vp/mL일 수 있다. 바이러스 역가는 약 102 GC/mL, 약 103 GC/mL, 약 104 GC/mL, 약 105 GC/mL, 약 106 GC/mL, 약 107 GC/mL, 약 108 GC/mL, 또는 최대 약 109 GC/mL일 수 있다. 일부 경우에, 바이러스 역가는 약 102 TU/mL, 약 103 TU/mL, 약 104 TU/mL, 약 105 TU/mL, 약 106 TU/mL, 약 107 TU/mL, 108 TU/mL, 또는 최대 약 109 TU/mL일 수 있다. 최적의 바이러스 역가는 형질도입될 세포 유형에 따라 달라질 수 있다. 바이러스의 범위는 약 1000 MOI 내지 약 2000 MOI, 약 1500 MOI 내지 약 2500 MOI, 약 2000 MOI 내지 약 3000 MOI, 약 3000 MOI 내지 약 4000 MOI, 약 4000 MOI 내지 약 5000 MOI, 약 5000 MOI 내지 약 6000 MOI, 약 6000 MOI 내지 약 7000MOI, 약 7000 MOI 내지 약 8000 MOI, 약 8000 MOI 내지 약 9000 MOI, 약 9000 MOI 내지 약 10,000 MOI일 수 있다. 예를 들어, 10,000의 MOI를 사용하여 100만 개의 세포를 감염시키려면 10,000 x 1,000,000 = 1010 GC가 필요하다.
일부 경우에, 복수개의 AAV 입자가 단위 투여 형태로 제형화될 수 있다. 다양한 제형이 성인 또는 소아 전달을 위해 고려되며, 0.5 x 109 vg, 1.0 x 109 vg, 1.0 x 1010, 1.0 x 1011 vg, 3.0 x 1011 vg, 6 x 1011 vg, 8.0 x 1011 vg, 1.0 x 1012 vg, 1.0 x 1013 vg, 1.0 x 1014 vg, 1.0 x 1015 vg, 또는 최대 1.5 x 1015 vg를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 바이러스 입자의 조성물은 냉동보존되거나 적합한 용기에 달리 저장될 수 있다.
본원에 제공된 조성물 및 방법은 그 외에는 필적하는 비변형된 핵산보다 적어도 약 3%, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 최대 100%만큼 더 많이 대상 생물제제의 전달 및/또는 발현을 증강시키는데 충분할 수 있다. 일부 경우에, 그 외에는 필적하는 비변형된 핵산은 VEGF-트랩을 코딩하는 핵산이다. 일부 경우에, 변형은 그 외에는 필적하는 비변형된 핵산보다 적어도 약 1배, 약 6배, 약 11배, 약 16배, 약 21배, 약 26배, 약 31배, 약 36배, 약 41배, 약 46배, 약 51배, 약 56배, 약 61배, 약 66배, 약 71배, 약 76배, 약 81배, 약 86배, 약 91배, 약 96배, 약 101배, 약 106배, 약 111배, 약 116배, 약 121배, 약 126배, 약 131배, 약 136배, 약 141배, 약 146배, 약 151배, 약 156배, 약 161배, 약 166배, 약 171배, 약 176배, 약 181배, 약 186배, 약 191배, 약 196배, 약 201배, 약 206배, 약 211배, 약 216배, 약 221배, 약 226배, 약 231배, 약 236배, 약 241배, 약 246배, 약 251배, 약 256배, 약 261배, 약 266배, 약 271배, 약 276배, 약 281배, 약 286배, 약 291배, 약 296배, 약 301배, 약 306배, 약 311배, 약 316배, 약 321배, 약 326배, 약 331배, 약 336배, 약 341배, 약 346배, 또는 약 350배만큼 더 많이 대상 생물제제의 전달 및/또는 발현을 증강시키는데 충분할 수 있다. 한 실시양태에서, 증가된 발현은 시험관내 검정에 의해 결정된 바와 같이 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 200배, 또는 적어도 500배의 증가를 포함한다. 적합한 시험관내 검정은 ELISA, 웨스턴 블롯, 루미넥스, 현미경 검사, 영상화 및/또는 유동 세포계수법을 포함한다.
대상 AAV 비리온은 그 외에는 필적하는 WT AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 비리온에 의한 망막 세포 (광수용체, 신경절 세포, RPE 세포, 무축삭 세포, 수평 세포, 뮬러 세포 등)의 감염성과 비교하여 망막 세포의 적어도 1배, 적어도 6배, 적어도 10배, 적어도 15배, 적어도 20배, 적어도 25배, 적어도 50배, 또는 50배 초과하여 증가된 감염성을 나타낼 수 있다.
본원에는 질환 또는 병태를 치료하는 방법이 또한 제공된다. 치료 방법은 본원에 제공된 생물제제를 코딩하는 비리온 또는 벡터를, 이를 필요로 하는 대상체에게 도입하는 것을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 치료 방법은 항혈관형성제를 포함하는 생물제제를 코딩하는 복수개의 비리온 또는 벡터를 도입하는 것을 포함한다. 또한, 질환 치료를 필요로 하는 대상체에게 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 질환을 치료하는 방법이 제공된다. 제약 조성물은 항혈관형성제를 포함하는 생물제제를 코딩하는 서열 및/또는 항혈관형성제를 코딩하는 비리온을 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 치료 방법은 항혈관형성제를 포함하는 생물제제를 코딩하는 서열을 포함하는 단리된 비-자연 발생 핵산을 포함하는 제약 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 서열은 본원에 제공된 핵산 중 임의의 것일 수 있거나 이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 서열은 서열식별번호: 13-19, 21-27, 31, 62, 64, 66, 또는 68 중 어느 하나와 적어도 약 60%의 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 서열 동일성은 약 70%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 및 최대 약 100%이다. 일부 실시양태에서, 서열은 서열식별번호: 31과 약 70%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 및 최대 약 100%의 서열 동일성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열은 서열식별번호: 31의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열은 서열식별번호: 31의 핵산 서열과 100% 동일하다. 일부 실시양태에서, 서열은 서열식별번호: 66과 약 70%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 및 최대 약 100%의 서열 동일성을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열은 서열식별번호: 66의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열은 서열식별번호: 66의 핵산 서열과 100% 동일하다. 일부 실시양태에서, 서열은 단일 가닥이다. 일부 실시양태에서, 서열은 이중 가닥이다.
일부 경우에, 서열은 본 개시내용에 따라 변형되며, 예를 들어 서열은 코딩 영역에서의 변형이 결여된 그 외에는 필적하는 서열과 비교 시 서열의 코딩 영역의 적어도 하나의 코돈에서 AGA를 AGG로 대체하도록 변형된다. 본원에 제공된 바와 같이, 본 개시내용의 변형은 변형이 결여된 그 외에는 필적하는 단리된 비-자연 발생 핵산이 투여된 그 외에는 필적하는 대상체와 비교 시 대상체에서 생물제제의 수준을 증가시키는 것과 같은 특정한 혜택을 가질 수 있다. 대상체에서 생물제제의 수준을 증가시키는 것은 치료 효과를 가질 수 있으며 본원에 제공된 질환 또는 병태 중 임의의 것을 감소시키거나 제거할 수 있다.
일부 경우에, 대상체에서 생물제제의 증가된 수준은 진단 검정에 의해 결정된 바와 같이, 적어도 5배, 10배, 20배, 50배, 100배, 200배 또는 500배 증가된다.
적합한 진단 검정은 안구 진단 검정을 포함할 수 있다. 안구 진단 검정은 안과 검사, 예컨대 굴절 검사, 안구 스캔, 안구 간섭 단층 촬영, 판스워스-먼셀(Farnworth-Munsell) 100 색조 시험, 컴퓨터 광학 디스크 영상화 및 신경 섬유층 분석 (GDX, HRT, OCT), 각막 형태검사법, 망막전위조영술 (ERG), 전기안구조영술 (EOG), 시각 유발 전위 (VEP), 시각 유발 반응 (VER), 플루오레세인 혈관조영술, 안구 간섭 단층 촬영 (OCT), 망막 사진 촬영, 안저 사진 촬영, 정반사 현미경 검사, 골드만, 험프리, FDT, 옥토퍼스, 생체 측정/IOL 계산, A-스캔, B-스캔, 및 그의 조합을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 망막 검사가 활용될 수 있다. 망막 기능 및 그의 변화를 평가하는 비제한적 방법은 시력 평가 (예를 들어, 최대 교정 시력 [BCVA], 보행, 탐색, 물체 검출 및 식별), 시야 평가 (예를 들어, 정적 및 운동 시야 주변 측정), 임상 검사 수행 (예를 들어, 눈의 앞부분과 뒷부분의 세극등 검사), 모든 명암의 파장에 대한 전기생리학적 반응 평가 (예를 들어, 모든 형태의 망막전위조영술 (ERG) [전시야, 다초점 및 패턴], 모든 형태의 시각 유발 전위 (VEP), 전기 안과 조영술 (EOG), 색각, 암순응 및/또는 대비 민감도)를 포함한다. 해부학적 구조와 망막 건강 및 그의 변화를 평가하는 비제한적 방법은 광학 간섭 단층 촬영 (OCT), 안저 사진 촬영, 적응형 광학 스캐닝 레이저 검안경 검사 (AO-SLO), 형광 및/또는 자가형광; 안구 운동성과 눈 운동 측정 (예를 들어, 안구진탕, 고정 선호도, 및 안정성), 보고된 결과 측정 (시각적 및 비-시각적-유도 행동 및 활동에서의 환자 보고된 변화, 환자 보고된 결과 [PRO], 삶의 질에 대한 설문지 기반 평가, 일상 활동 및 신경 기능 측정 (예를 들어, 기능적 자기 공명 영상화 (MRI))을 포함한다.
관련 안구 질환 및 병태는 실명, 완전색맹, 연령-관련 황반 변성 (AMD), 당뇨병성 망막병증 (DR), 녹내장, 바르데-비들 증후군, 베스트병, 맥락막결손, 레베르 선천성 흑암시, 황반 변성, 결절성 맥락막 혈관병증 (PCV), 색소성 망막염, 레프섬병, 스타르가르트병, 어셔 증후군, X-연관 망막층간분리 (XLRS), 간체-추체 이영양증, 추체-간체 이영양증, 오구치병, 말라티아 레벤티네스 (가족성 우성 드루젠) 및 청색 추체 단색형색각을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 한 실시양태에서, 안구 질환 또는 병태는 AMD이다. AMD는 습성 AMD 또는 건성 AMD일 수 있다.
일부 경우에, 제약의 투여는 질환 또는 병태의 적어도 특정 증상을 감소시키고/거나, 질환 또는 병태를 치료하고/거나 질환 또는 병태를 제거하는데 충분한다. 일부 경우에, 제공된 진단 검정 중 임의의 것을 통해 질환 또는 병태의 개선을 확인할 수 있다. 다른 경우에, 개선은 치료받은 대상체와의 인터뷰를 통해 수득될 수 있다. 예를 들어, 대상체는 대상 제약을 투여하기 전의 시력과 비교 시 시력이 개선되었다는 사실을 주치의와 소통할 수 있다. 다른 경우에, 치료 후 질환 또는 병태의 감소를 확인하기 위해 생체내 동물 모델을 사용할 수 있다. 적합한 동물 모델은 마우스 모델, 영장류 모델, 래트 모델, 개과 모델 등을 포함한다.
제약 조성물은 다양한 기술, 예컨대 유리체내, 근육내, 정맥내, 피하 및/또는 복강내 주사를 사용하여 대상체에게 투여될 수 있다.
생체내 전달을 위해, 대상 핵산 및/또는 AAV 비리온은 제약 조성물로 제형화될 수 있으며 일반적으로 유리체내 또는 비경구 (예를 들어, 근육내, 피하, 종양내, 경피, 척수강내 등의 투여 경로를 통해 투여됨)로 투여될 것이다. 일부 측면에서, 제약 조성물은 치료를 필요로 하는 대상체, 예컨대 인간 또는 포유동물을 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 경우에, 대상체는 질환, 예를 들어 안구 질환으로 진단될 수 있다. 일부 측면에서, 대상 제약 조성물은 2차 요법과 공동 투여된다. 2차 요법은 안구 사용을 위한 임의의 요법을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 2차 요법은 영양 요법, 비타민, 레이저 치료, 예컨대 레이저 광응고, 광역학 요법, 비수다인(Visudyne), 항-VEGF 요법, 안경류, 안약, 마비제, 시력 교정 요법, 행동/지각 시력 요법 등을 포함한다. 일부 측면에서, 이전에 기재된 생물제제 중 임의의 것이 2차 요법으로 간주될 수 있다.
제약 조성물 중 임의의 것은 또한 부형제를 포함할 수 있다. 이러한 부형제, 담체, 희석제 및 완충제는 과도한 독성 없이 투여될 수 있는 임의의 의약품을 포함한다. 제약상 허용되는 부형제는 액상물, 예컨대 물, 식염수, 글리세롤 및 에탄올을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 제약상 허용되는 염, 예를 들어 무기산 염, 예컨대 염산염, 브로민화수소산, 인산염, 황산염 등; 및 유기산의 염, 예컨대 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트, 벤조에이트 등이 그 안에 포함될 수 있다. 부가적으로, 보조 물질, 예컨대 습윤제 또는 유화제, pH 완충 물질 등이 이러한 비히클에 존재할 수 있다. 상당히 다양한 제약상 허용되는 부형제는 관련 기술분야에 공지되어 있으며 본원에서는 자세히 논의할 필요가 없다. 제약상 허용되는 부형제는 예를 들어, 문헌 [A. Gennaro (2000) "Remington: The Science and Practice of Pharmacy," 20th edition, Lippincott, Williams, & Wilkins; Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999) H. C. Ansel et al., eds., 7th ed., Lippincott, Williams, & Wilkins; and Handbook of Pharmaceutical Excipients (2000) A. H. Kibbe et al., eds., 3rd ed. Amer. Pharmaceutical Assoc]을 포함한 다양한 간행물에 충분히 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 대상 rAAV 비리온의 유효량은 망막 기능, 해부학적 완전성, 또는 망막 건강의 상실률에서의 감소, 예를 들어 상실률 및 이에 따른 질환 진행에서의 2배, 3배, 4배, 또는 5배 또는 그 초과의 감소, 예를 들어 상실률 및 이에 따른 질환 진행에서의 10배 이상의 감소를 초래한다. 일부 실시양태에서, 대상 rAAV 비리온의 유효량은 시각 기능, 망막 기능의 향상, 망막 해부학 또는 건강의 개선, 및/또는 안구 운동성의 개선 및/또는 신경 기능의 개선, 예를 들어, 망막 기능, 망막 해부학 또는 건강의 2배, 3배, 4배, 또는 5배 또는 그 초과의 개선, 및/또는 안구 운동성의 개선, 예를 들어, 망막 기능, 망막 해부학 또는 건강의 10배 이상의 개선, 및/또는 안구 운동성의 개선을 초래한다. 통상의 기술자에 의해 용이하게 인식되는 바와 같이, 원하는 치료 효과를 달성하는데 필요한 용량은 전형적으로 1 x 108 내지 약 1 x 1015 재조합 비리온의 범위일 것이며, 전형적으로 통상의 기술자에 의해 1 x 108 내지 약 1 x 1015 "벡터 게놈"으로서 지칭된다.
일부 측면에서, 본원에 제공된 조성물, 예컨대 제약 조성물이, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 일부 경우에, 투여는 약 0.5 x 109 vg, 1.0 x 109 vg, 1.0 x 1010, 1.0 x 1011 vg, 3.0 x 1011 vg, 6 x 1011 vg, 8.0 x 1011 vg, 1.0 x 1012 vg, 1.0 x 1013 vg, 1.0 x 1014 vg, 1.0 x 1015 vg, 1.5 x 1015 vg의 AAV 벡터 투여량을 전달하는 것을 포함한다. 예를 들어, 생체내 주사, 즉 눈에 직접 주사하는 경우, 치료 유효 용량은 약 106 내지 약 1015의 대상 AAV 비리온, 예를 들어 약 108 내지 1012의 조작된 AAV 비리온일 수 있다. 시험관내 형질도입의 경우, 세포에 전달될 조작된 AAV 비리온의 유효량은 조작된 AAV 비리온 약 108 내지 약 1013 정도일 것이다. 다른 유효 투여량은 용량 반응 곡선을 확립하는 일상적인 시도를 통해 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 쉽게 확립될 수 있다.
투여는 임의의 시간 동안 반복될 수 있다. 일부 측면에서, 투여는 매일 2회, 격일로, 주 2회, 매달 2회, 매달 3회, 월 1회, 격월로, 반년마다, 매년, 또는 2년마다 수행된다.
투여량 치료는 단일 투여 스케줄 또는 다중 투여 스케줄일 수 있다. 더욱이, 대상체에게 적절한 만큼 많은 용량이 투여될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 적절한 용량 수를 쉽게 결정할 수 있다. 일부 측면에서, 제약 조성물은 유리체내 주사, 망막하 주사, 미세주사, 또는 안구상 주사를 통해 투여된다.
일부 측면에서, 대상체는 본원에 제공된 제약 조성물의 투여 전, 투여 동안, 및/또는 투여 후에 돌연변이에 대한 유전자 검사를 통해 스크리닝될 수 있다. 돌연변이에 대해 스크리닝될 수 있는 관련 유전자는 RPE65, CRB1, AIPL1, CFH, 또는 RPGRIP를 포함한다.
또한, 본원에 제공된 조성물 중 임의의 것을 포함하는 키트가 제공된다. 또한, a) 대상 변형된 아데노-연관 바이러스 (AAV) 캡시드; b) 대상 벡터; 또는 c) 대상 조작된 비리온을 포함하는 용기가 제공된다. 한 측면에서, 용기는 바이알, 시린지 또는 바늘이다. 일부 경우에, 용기는 안구 전달용으로 구성된다.
키트는 적합하게 분취된 조성물을 포함할 수 있다. 키트의 성분은 수성 매질 또는 동결건조 형태로 패키징될 수 있다. 키트의 용기 수단은 일반적으로, 성분이 배치될 수 있고, 바람직하게는 적합하게 분취될 수 있는 적어도 하나의 바이알, 시험관, 플라스크, 병, 시린지, 또는 또 다른 용기 수단을 포함할 것이다. 키트에 하나 초과의 성분이 있는 경우, 키트는 또한 일반적으로 부가의 성분을 별도로 배치할 수 있는 제2, 제3 또는 기타 부가의 용기를 함유할 것이다. 그러나, 성분의 다양한 조합이 바이알에 포함될 수 있다. 키트는 또한 전형적으로, 상업적 판매를 위해 성분을 밀폐된 상태로 함유하기 위한 수단을 포함한다. 이러한 용기는 원하는 바이알이 보관되는 사출 또는 블로우 성형 플라스틱 용기를 포함할 수 있다.
일부 경우에, 본원에 기재된 조성물을 포함하는 패키징된 제품에 적당하게 라벨링될 수 있다. 일부 경우에, 본원에 기재된 제약 조성물은 우수 제조 관리 기준 (cGMP) 및 라벨링 규정에 따라 제조될 수 있다. 일부 경우에, 본원에 개시된 제약 조성물은 무균일 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태가 본원에 제시되고 기재되었지만, 이러한 실시양태는 단지 예로서 제공된다는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 이제 본 발명으로부터 벗어나지 않으면서 수많은 변이, 변화 및 치환을 발생시킬 수 있을 것이다. 본원에 기재된 본 발명의 실시양태에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실시하는데 이용될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 하기 청구범위는 본 발명의 범위를 규정하고, 이들 청구범위 및 그의 등가물의 범위 내의 방법 및 구조가 이에 의해 포괄되도록 의도된다.
실시예
실시예 1: 핵산 구축물의 코돈 최적화 및 클로닝
SV40 인트론-VEGF-트랩 오픈 리딩 프레임 (ORF)-합성 폴리 A 신호를 함유하는 DNA 서열은 VEGF-트랩 ORF 내의 40% GC-함량을 함유하도록 서비스 회사 [트위스트 바이오사이언스 (Twist Bioscience; 미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코)]에 의해 합성되었다. DNA 서열은 정방향 프라이머 A024 및 역방향 프라이머 A025를 사용하여 PCR 증폭되었으며 NEBuilder HiFi DNA 어셈블리 키트 [뉴잉글랜드 바이오랩스 (New England Biolabs; 미국 매사추세츠주 입스위치)]를 사용하여 pFB-scCMV-MIF의 XbaI 및 SphI 부위에 클로닝되어, 도 1에 나타낸 바와 같이 AMI059-pFB-scCMV-SV40-인트론-Af-VEGF-트랩을 생성하였다. 하나의 전체 AAV ITR과 자기-상보적 AAV (scAAV)에 대한 하나의 말단절단된 ITR을 함유하는 pFB-scCMV-MIF 플라스미드는 Bac-to-Bac 바큘로바이러스 발현 시스템 [인비트로젠(Invitrogen)]으로부터의 pFastBac 셔틀 플라스미드의 유도체이다. 클로닝 프로세스에서, MIF는 VEGF-트랩 유전자로 대체되었다. VEGF-트랩 유전자는 그의 원래의 신호 펩티드 (Af)를 함유한다. Af를 인간 항체 중쇄 신호 펩티드 (Vh)로 대체하기 위해, SV40-인트론-Vh-단편을 정방향 프라이머 A024 및 역방향 프라이머 A082, 및 템플릿으로서 SV40-인트론-Vh 서열을 함유하는 플라스미드 AMI060을 사용하여 PCR 증폭시켰다. VEGF-트랩 ORF는 정방향 프라이머 A085 및 역방향 프라이머 A025, 및 템플릿으로서 플라스미드 AMI059-pFB-scCMV-SV40-인트론-코작-VEGF-트랩을 사용하여 증폭되었다. 이들 2개의 PCR 단편은 도 1에 나타낸 바와 같이 NEBuilder HiFi DNA 어셈블리 키트를 사용하여 AMI059의 XbaI 및 SphI 부위에 클로닝되어 AMI066-pFB-scCMV-SV40-인트론-Vh-VEGF-트랩을 생성하였다.
VEGF-트랩 ORF를 최적화하기 위해, 호모 사피엔스 선호 코돈 출력을 선택함으로써 SnapGene 소프트웨어 [GSL 바이오테크 (GSL Biotech; 미국 캘리포니아주 샌디에이고)]를 사용하여 VEGF-트랩 단백질 서열의 DNA로의 역번역을 수행하였다. 이러한 서열은 트위스트 바이오사이언스에 의해 합성되었으며 정방향 프라이머 A086 및 역방향 프라이머 A087을 사용하여 PCR 증폭되었다. PCR 단편은 도 1에 나타낸 바와 같이 HiFi 반응을 통해 AMI059의 StuI 및 BstBI 부위에 클로닝되어 AMI067-pFB-scCMV-SV40-인트론-코작-Af-VEGF-트랩-GC를 생성하였다. AMI067 내의 신호 펩티드 Af를 Vh로 대체하기 위해, SV40-인트론-Vh-단편을 정방향 프라이머 A024 및 역방향 프라이머 A089, 및 템플릿으로서 SV40-인트론-Vh 서열을 함유하는 플라스미드 AMI060을 사용하여 PCR 증폭시켰다. 트위스트 합성된 VEGF-트랩 ORF를 정방향 프라이머 A088 및 역방향 프라이머 A090을 사용하여 PCR 증폭시켰다. 이들 2개의 PCR 단편은 도 1 및 도 6에 나타낸 바와 같이 NEBuilder HiFi DNA 어셈블리 키트를 사용하여 AMI059의 XbaI 및 BstBI 부위에 클로닝되어 AMI068-pFB-scCMV-SV40-인트론-코작-Vh-VEGF-트랩-GC를 생성하였다.
VEGF-트랩 DNA 코돈의 추가 최적화를 수행하기 위해, DNA 서열을 수동으로 조정하여 변이체 VEGF-트랩 DNA 분자의 3가지 이상의 버전을 만들었다. 버전 1에서는, 16개의 Arg 코돈이 AGA에서 AGG로 변화되었고, 29개의 Pro 코돈이 CCC에서 CCT로 변화되어 AMI119-pFB-scCMV-SV40-인트론-코작-Af-VEGF-트랩-GCRP (CCT)를 생성하였다 (도 1 및 도 7 참조). 버전 2에서는, 16개의 Arg 코돈 변화 외에도, 36개의 Ser 코돈이 AGC에서 TCC로 추가로 변화되어 AMI120-pFB-scCMV-SV40-인트론-코작-Af-VEGF-트랩-GCRS (TCC)를 생성하였다 (도 1 및 도 8 참조). 버전 3에서는, 16개의 Arg 코돈 변화 외에도, 29개의 Pro 코돈이 CCC에서 CCG로 추가로 변화되어 AMI130-pFB-scCMV-SV40-인트론-코작-Af-VEGF-트랩-GCRP (CCG)를 생성하였다 (도 1 및 도 9 참조). VEGF-트랩 DNA 서열의 모든 변이체 버전은 먼저 트위스트 바이오사이언스에 의해 합성된 다음, 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 PCR 증폭되었으며, 마지막으로 NEBuilder HiFi DNA 어셈블리 키트를 사용하여 AMI067 플라스미드의 BstBI 및 StuI 부위에 클로닝되었다. 플라스미드 구축물은 표 2에 열거되어 있으며 PCR 증폭에 사용된 프라이머의 정보는 표 3 및 표 4에 열거되어 있다.
표 2. 상이한 코돈을 갖는 VEGF -트랩 유전자를 함유하는 pFB 셔틀 플라스미드의 목록
Figure pct00002
표 3. 클로닝 프로세스를 위한 PCR 단편을 생성하는데 사용되는 클론 번호 및 상응하는 PCR 프라이머의 목록
Figure pct00003
표 4. PCR 반응 및 DNA 시퀀싱 분석에 사용되는 프라이머의 서열
Figure pct00004
인간 세포에서 코돈 최적화와 단백질 발현 수준 간의 관계를 결정하기 위해, 동일한 발현 카세트를 함유하나 VEGF-트랩 DNA 코딩 서열의 변이를 갖는 4개의 플라스미드를 구축하였다. 코딩 서열 중 2개는 낮은 GC-함량과 2개의 높은 GC-함량을 갖는다. 각각의 낮은 GC-함량 및 높은 GC-함량 코딩 서열 중 하나에서, 인간 항체 중쇄 (Vh) 분비 신호 펩티드를 사용하여 VEGF-트랩 분비 신호 펩티드 (Af)를 대체하였다. 4개의 플라스미드 모두는 VEGF-트랩 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 제외하고 동일한 DNA 서열을 갖는다. 발현 카세트는 CMV 프로모터, SV40 인트론, VEGF-트랩 ORF의 출발 코돈의 상류에 위치한 코작 서열, 및 정지 코돈 하류에 위치한 합성 폴리아데닐화 신호를 함유한다. VEGF-트랩 코돈의 더 많은 변이를 만들기 위해, VEGF-트랩 코돈을 변화시키고 AMI119, AMI120 및 AMI130 플라스미드를 클로닝하였다. 전체 AAV2 ITR과 말단절단된 AAV2 ITR에 의해 플랭킹된 이들 발현 카세트의 다이어그램이 도 1에 나타나 있다. 각각의 발현 카세트의 전체 DNA 서열은 서열식별번호: 13 - 서열식별번호: 19 또는 서열식별번호: 21 - 서열식별번호: 27이다 (서열식별번호: 20은 대조군 플라스미드 서열이고, 서열식별번호: 28 또는 서열식별번호: 70은 참조 VEGF-트랩에 대한 대조군 코딩 서열이다).
인간 세포에 대한 각각의 ORF의 추정 eCAI 값 및 그와 GC 함량과의 관계가 결정되었다. 예상 코돈 적응 지수 (eCAI) 값은 웹 기반 무료 E-CAI 서버를 기반으로 추정되었다. 간단히 언급하면, 표적 DNA 코딩 서열을 각각 대화 상자에 붙여 넣었다. 인간 코돈 사용 빈도 표는 동일한 서버에서의 "코돈 사용 빈도 데이터베이스"로부터 선택하여 그 다음 대화 상자에 붙여 넣었다. 푸아송 방법이 선택되었고 (마르코프 방법은 매우 유사한 결과를 제공하였다) "표준" 유전 코드가 선택되었다. eCAI 값은 "수락" 버튼을 눌러 추정되었다. 그 결과가 표 5에 나타나 있다. GC 함량은 eCAI 값과 양의 상관관계가 있으며, GC 함량이 더 높을수록 eCAI 값도 더 높아진다. AMI059와 AMI066 둘 다는 40%의 낮은 GC 함량과 각각 0.723 및 0.722의 eCAI를 함유하였다. AMI067과 AMI068 둘 다는 62%의 높은 GC와 각각 0.867 및 0.864의 eCAI 값을 함유하였다. VEGF-트랩의 천연 cDNA 서열은 NM_001160031의 자연 발생 mRNA 서열로부터의 분비 신호 펩티드 서열 및 FLT1 도메인, NM_002252.3으로부터의 자연 발생 mRNA KDR 도메인, 및 자연 발생 mRNA AK129809.1의 인간 항체 IgG1 Fc 도메인을 사용하여 컴파일되었다. 이러한 컴파일된 자연 발생 VEGF-트랩은 52% GC를 함유하고 AMI067 및 AMI068의 최적화된 코돈보다 훨씬 낮은 0.790의 eCAI를 갖는 것으로 추정되었다. VEGF-트랩 코돈의 추가 변화는 표 5에 나타낸 바와 같이 GC 함량과 eCAI 값을 약간 변화시켰다. eCAI 값이 더 높을수록 더 통상적으로 사용되는 코돈이 ORF 내에 있다는 것을 나타내기 때문에, 이는 그러한 발현 카세트에서의 단백질 발현 수준이 더 높다는 것을 시사할 수 있다.
표 5. 인간 세포에서 GC 함량과 예상 코돈 적응 지수 ( eCAI )의 상관관계
Figure pct00005
실시예 2: GC -함량 수준의 증가는 일시적으로 형질감염된 포유동물 세포에서 VEGF-트랩 발현을 증강시킨다
포유동물 세포에서 VEGF-트랩의 발현에 대한 GC-함량의 영향을 결정하기 위해, 4개의 플라스미드 (AMI059, AMI066, AMI067 및 AMI068)를 정제하고 HEK 293 세포에 형질감염시켰다. 형질감염을 위해, 세포를 10 mL 배지 중 약 2 x 106개의 세포/접시로 밤새 100 mm 세포 배양 접시 [코닝 (Corning; 미국 뉴욕주)]에 시딩하였다. 14 μg 플라스미드 DNA 및 22 μL의 리포펙타민 3000 [써모 피셔(Thermo fisher)]을 각각 0.5 mL의 옵티-미디움 (써모 피셔)에 희석하고 함께 혼합하였다. 혼합물을 세포에 적가하고 세포를 CO2 인큐베이터에서 37℃에서 48시간 동안 인큐베이션하였다. 배지를 수거하였다.
형질감염 후 48시간에, 배지를 수거하여 직접 로딩하거나 (비-환원) 또는 로딩 완충액과 혼합하고 90℃에서 5분간 가열 (환원)한 후 SDS-겔에 로딩하였다. PVDF 막 위로 블로팅한 후, VEGF-트랩 단백질을 항-인간 IgG Fc 항체로 검출하였다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 코딩 서열의 높은 GC-함량은 낮은 GC-함량 코딩 서열보다 더 높은 단백질 발현을 나타냈다. 레인 1 내지 5는 비-환원 겔에 표시되고 레인 6 내지 10은 환원 겔에 표시된다. 레인 3, 4, 5, 8, 9 및 10은 높은 GC-함량 (플라스미드 AMI067, 레인 3 및 8, 및 AMI068, 레인 4, 5, 9 및 10)을 나타내고 레인 1, 2, 6 및 7은 낮은 GC-함량 (플라스미드 AMI059, 레인 1 및 6, 및 AMI066, 레인 2 및 7)을 나타낸다. ImageJ (무료 소프트웨어, NIH)로 측정한 웨스턴 블롯 영상의 강도를 기준으로 볼 때, 높은 GC-함량 ORF는 낮은 GC-함량 ORF에 비해 단백질 발현이 9배 내지 11배 증가한 것으로 나타났다. 상이한 분비 신호 펩티드는 단백질이 배지로 분비되는데 미미한 영향을 미치는 것으로 보인다. 낮은 GC-함량 ORF에서는, 원래의 VEGF-트랩 분비 펩티드가 인간 항체 중쇄 분비 신호 펩티드보다 약간 더 높은 발현을 나타낸 반면, 높은 GC-함량 ORF에서는 이들 두 분비 펩티드 간에 단백질 분비에 있어서의 차이는 없었다.
실시예 3: GC- 함량 수준은 AAV2.N53 및 AAV2.N54 벡터 생산에 영향을 미치지 않는다
발현 카세트를 scAAV 셔틀 플라스미드 백본에 클로닝하고 rBV를 생성하여 Sf9 세포의 공동 감염에 의해 AAV2, AAV2.53 및 AAV2.N54 벡터를 생산하였다.
Sf9 세포 [익스프레션 시스템즈(Expression Systems)]를 코닝 병에 담긴 100 단위/mL 페니실린과 100 μg/mL 스트렙토마이신 [써모 피셔 사이언티픽 (미국 캘리포니아주 플레젠튼)]을 함유한 ESF AF 배지 (익스프레션 시스템즈)에서 150 rpm 및 28℃에서 부드럽게 진탕시키면서 배양하였다. 일단 세포가 ~1e+7개 세포/mL로 성장하면, 신선한 배지에서 1:4로 분할하여 새로운 병에 넣고 유지 관리 목적으로 지속적으로 배양하였다.
제조업체의 지침 (인비트로젠; 미국 캘리포니아주 칼즈배드))에 따라 Bac-to-Bac 바큘로바이러스 발현 시스템을 사용하여 재조합 바큘로바이러스 (rBV)를 생성하였다. 간단히 언급하면, 표적 유전자를 함유하는 pFB 셔틀 플라스미드를 TE 완충액에 각각 1 ng/uL로 희석시키고, 각각의 DNA 2 ng을, 카텝신 유전자가 결실된 백미드 DNA 분자를 함유하는 Δcath-DH10Bac 적격 박테리아 20 μL [비로벡 (Virovek; 미국 캘리포니아주 해이워드)]와 혼합하고 얼음 위에서 30분 동안 인큐베이션한 다음, 42°C에서 30초 동안 열 충격을 가하였다. 얼음 위에서 2분 동안 인큐베이션한 후, 박테리아를 37℃에서 4시간 동안 배양하여 회수한 다음, 카나마이신 50 μg/mL, 겐타마이신 7 μg/mL, 테트라시클린 10 μg/mL, IPTG 40 μg/mL, 및 X-gal 100 μg/mL를 함유하는 한천 플레이트 상에 플레이팅하였다. 37℃에서 48시간 동안 인큐베이션한 후, 재조합 백미드 DNA를 함유하는 백색 콜로니를 골라내고, 미니프렙 백미드 DNA를 멸균 조건에서 정제하였다. 각각의 백미드 DNA 약 5μg 및 진젯(GeneJet) 시약 [시그나젠 래보러토리즈 (SignaGen Laboratories; 미국 메릴랜드주 프레드릭)] 10 μL를 각각 100 μL ESFAF 배지 (익스프레션 시스템즈; 미국 캘리포니아주 데이비스)에 희석한 다음, 약 30분 동안 함께 혼합하여 형질감염 혼합물을 형성하였다. Sf9 세포를 28℃에서 약 30분 동안 2 mL ESFAF 배지 중의 1.5e+6개 세포/웰로 6-웰 플레이트에 플레이팅하였다. Sf9 세포로부터 기존 배지를 제거한 후, 각각의 형질감염 혼합물을 800 uL ESFAF 배지에 희석한 다음 Sf9 세포에 부가하였다. 28℃에서 밤새 인큐베이션한 후, 각각의 웰에 부가의 ESFAF 배지 1 mL를 부가하였다. 총 4일의 인큐베이션 시간 후, rBV를 함유하는 배지를 수집하고 1:200 비로 증폭하여 AAV 생산 프로세스에 즉시 사용하기에 충분한 양의 rBV를 생성하였다.
본원에 기재된 변형 (예를 들어, 적어도 하나의 코돈 변형)을 포함하는 비-자연 발생 핵산을 포함하는 AAV 벡터를 생산 및 정제하기 위해, AAV2 Rep 및 캡시드 유전자를 보유하는 rBV (rBV-Cap2-Rep, rBV-Cap2.N53-Rep, rBV-Cap2.N54-Rep), 및 VEGF-트랩 발현 카세트를 보유하는 rBV (rBV-VEGF-트랩)를 사용하여 AAV 생산을 위해 Sf9 세포를 공동 감염시켰다. 간단히 언급하면, rBV-Cap2-Rep (또는 rBV-Cap2.N53-Rep 또는 rBV-Cap2.N54-Rep)의 감염 다중도 (moi) 10 및 rBV-VEGF-트랩의 5 moi를 사용하여, 진탕 인큐베이터에서 분당 180회전 (rpm)의 진탕 속도로 28℃에서 3일 동안 50% 신선한 ESFAF 배지를 사용하여 약 5e+6개 세포/mL의 밀도로 Sf9 세포주를 공동 감염시켰다. 감염이 끝나면, 3,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 세포 펠릿을 수집하였다. 세포를 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2 mM MgCl2, 1% 사르코실, 1% 트리톤 X-100, 및 125 단위/mL 벤조나제를 함유하는 Sf9 용해 완충액에서 격렬하게 와동시킨 다음 350 rpm, 37℃에서 1시간 동안 진탕시킴으로써 용해시켰다. 진탕이 끝나면, 와동을 통해 염 농도를 500 밀리몰 (mM)로 증가시키고, 4℃에서 20분 동안 8,000 rpm으로 원심분리시킴으로써 용해물을 청정하게 하였다. 이와 같이 청정해진 용해물을 5 mL의 1.50 g/cc 및 10 mL의 1.30 g/cc 염화세슘 용액을 함유하는 SW28 스윙 버킷 로터용 초투명 원심분리 튜브로 옮겼다. 28,000 rpm, 15℃에서 약 18시간 동안 원심분리한 후, AAV 밴드를 시린지로 수집하여 70 Ti 원심분리 로터용 초투명 원심분리 튜브에 옮겼다. 원심분리 튜브를 1.38 g/cc 염화세슘 용액으로 채우고 열 밀봉하였다. AAV 샘플을 65,000 rpm, 15℃에서 약 18시간 동안 2차 초원심분리를 수행하고, 시린지를 이용하여 AAV 밴드를 수집하였다. 정제된 AAV 샘플을 0.001% 플루로닉(Pluronic) F-68을 함유하는 PBS 완충액으로 완충액 교환하고 0.22 μm 시린지 필터로 필터 멸균하였다. 멸균된 AAV 샘플은 한 달 이내에 4℃에서 저장한 다음, 장기간 저장을 위해 -80℃로 옮겼다. AAV 역가는 퀀트스튜디오(QuantStudio) 7 플렉스 실시간 PCR 시스템 (인비트로젠)을 사용하여 실시간 PCR 방법으로 결정되었다.
AAV2, AAV2.53 및 AAV2.N54 벡터 역가는 하기 표 6에 열거되어 있다. AAV2.53 벡터의 순도는 도 3에 나타나 있으며, 이는 Sf9 세포에서 낮은-GC 및 높은-GC AAV 벡터 생산의 심플리 블루 염색을 사용한 SDS-PAGE를 나타낸다. M은 겔에 대한 크기 마커를 나타낸다. 도 3a는 레인 2에 로딩된 AMI059 (5e+10 vg/레인 로딩됨), 레인 3에 로딩된 AMI066 (5e+10 vg/레인 로딩됨), 레인 4에 로딩된 AMI067 (5e+10 vg/레인 로딩됨), 및 레인 5에 로딩된 AMI068 (5e+10 vg/레인 로딩됨)과 비교한 대조군으로서 로딩된 AAV5 벡터 (1e+11 바이러스 게놈 (vg)/레인 로딩됨)를 나타낸다. 도 3b는 레인 2에 로딩된 AMI119 (1e+11 vg/레인 로딩됨), 레인 3에 로딩된 AMI120 (1e+11 vg/레인 로딩됨), 및 레인 4에 로딩된 AMI130 (1e+11 vg/레인 로딩됨)과 비교한 대조군으로서 로딩된 AAV2 벡터 (1e+11 vg/레인 로딩됨)를 나타낸다. 모든 AAV 벡터는 정상 범위에서 생산되었으며 GC-함량 관련 차이는 관찰되지 않았다.
표 6. 낮은 GC DNA 함량 및 높은 GC DNA 함량을 함유하는 구축물 간의 AAV2.N53 생산 수율의 비교
Figure pct00006
실시예 4: GC -함량 수준의 증가는 scAAV2.N53 형질도입된 포유동물 세포에서의 VEGF-트랩 발현을 증강시킨다
VEGF-트랩 발현 카세트를 보유하는 scAAV2.N53 벡터를 생산하고 정제하였다. 이를 HEK293 세포에 형질도입하는데 사용하였고, VEGF-트랩의 발현 수준을 염소 항-인간 IgG-Fc 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석 및 ELISA 검정으로 결정하였다.
세포 배양을 위해, 인간 HEK293 세포를 37℃에서 시리즈 II 워터 재킷 CO2 인큐베이터 [써모 포르마(Thermo Forma)] 중 5% FBS (ATCC; 미국 버지니아주 매너서스)가 포함된 DMEM 배지 (써모 피셔)에서 배양하였다. 유지 관리를 위해, 세포를 1주에 한 번 1:10으로 분할하였다.
AAV 벡터 형질도입을 위해, HEK293 세포 (도 10) 또는 hARPE-19 세포 (도 11)를 100 mm 접시에 2 x 106개의 세포 밀도로 시딩하고 37℃ CO2 인큐베이터에서 약 80% 융합도로 밤새 성장시켰다. 그 다음날 아침 AAV 벡터를 1.0 x 104 vg/세포의 MOI로 세포에 부가하고 37℃에서 48시간 동안 형질도입을 수행하였다. 세포 없이 상청액을 수집하고 웨스턴 블롯으로 단백질 발현을 분석하거나 ELISA로 단백질 수준을 분석하였다. 모든 형질도입은 적어도 3번의 독립적인 실험을 수행하였다.
ELISA의 경우, 일시적 형질감염 또는 AAV 형질도입으로부터 수거된 배지를 10,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 임의의 미립자를 제거하고 검정에 사용하였다. 96-웰 플레이트를 먼저, 코팅 완충액 중 100 μL/웰의 재조합 인간 내피 성장 인자-A (rhVEGF-A)로 실온에서 밤새 코팅하였다. 코팅 완충액을 제거한 후, 플레이트를 200 μL/웰의 세척 완충액 (PBS 중 0.05% Tween-20, pH 7.3 ± 0.1)로 3회 세척하고, 200 μL/웰의 차단 완충액 (PBS 중 1% BSA, pH 7.3 ± 0.1)으로 실온에서 최소 1시간 동안 차단하였다. 차단 완충액을 제거한 후, 플레이트를 세척 완충액으로 3회 세척하였다. 세척 완충액의 잔류물을 제거한 후, 차단 완충액에 희석된 시험 샘플 100 μL/웰을 실온에서 2시간 동안 플레이트에 부가하였다. 시험 샘플을 제거한 후, 플레이트를 세척 완충액으로 다시 3회 세척하였다. 세척 완충액의 잔류물을 제거한 후, 비오티닐화된 마우스 모노클로날 (H2) 항-인간 IgG Fc (비오틴) 검출 항체 [압캠 (Abcam; 미국 매사추세츠주 케임브리지)] 100 μL/웰을 플레이트에 부가하고 직사광선으로부터 보호하며 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션이 끝나면, 플레이트를 3회 세척하고, 100 μL/웰의 1X HRP-스트렙타비딘 용액을 플레이트에 부가하며 실온에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션이 끝나면, 플레이트를 3회 세척하고 기질 용액 (테트라메틸벤지딘) 200 μL/웰을 플레이트에 부가하였다. 실온에서 약 10분 내지 약 15분 동안 인큐베이션하여 색상을 현상한 후, 50 μL/웰의 정지 용액 (2 N 황산)을 플레이트에 부가하고 멀티모드 플레이트 판독기 엔비젼 [퍼킨엘머 (PerkinElmer; 미국 캘리포니아주 산타 클라라)]을 사용하여 파장 450 nm에서 광학 밀도 값을 결정하였다.
웨스턴 블롯을 위해, 형질감염 후 48시간에 HEK293 세포 상청액을 수집하였다. 총 20 μl의 상청액을 로딩 완충액과 혼합하고, 95℃에서 5분 동안 가열하며, NuPAGE 10% 트리스-글리신 겔 (인비트로젠)에 로딩하여 전기영동하였다. 비-환원 겔의 경우, 상청액을 비-환원 로딩 완충액과 혼합한 후 겔에 로딩하였다. X 셀 II™ 블롯 모듈 (인비트로젠; 미국 캘리포니아주 칼즈배드)을 사용하여 겔 상의 단백질을 PVDF 막으로 옮겼다. 막을 PBS 중 카세인 차단제 (써모 사이언티픽; 미국 매사추세츠주 월섬)로 실온에서 적어도 1시간 동안 처리하고 적절한 1차 항체로 프로빙한 다음, 서양고추냉이 퍼옥시다제 [아머샴 바이오사이언시즈 (Amersham Biosciences; 스웨덴 웁살라)]와 접합된 적절한 항-토끼 또는 항-마우스 IgG와 함께 인큐베이션하였다. ECL™ 웨스턴 블롯팅 시약 (아머샴)을 사용하여 단백질을 검출하였다.
그 결과가 도 4 및 표 7에 나타나 있다. 도 4a에서, 레인 1-4에는 각각 AMI059, AMI066, AMI067 및 AMI068이 로딩되었다. 도 4b에서, 레인 1-4에는 각각 AMI120, AMI119, AMI067 및 AMI130이 로딩되었다. 나타난 바와 같이, 도 4a에서 각각 AMI067 및 AMI068에 상응하는 레인 3 및 4에서는, VEGF-트랩 ORF에서의 GC 함량의 증가가 VEGF-트랩 단백질의 발현을 증가시켰다. VEGF-트랩 ORF의 낮은 GC 함량에서는, Af 신호 펩티드가 표 6에 표시된 바와 같이 인간 Vh 신호 펩티드보다 더 높은 발현을 산출하였다 (7배 차이). 그러나, VEGF-트랩 ORF의 높은 GC 함량에서는, 표 7에 나타낸 바와 같이 Af와 인간 Vh 신호 펩티드 간에 차이가 없으며, 이는 도 4a 레인 3 (Af 신호 펩티드)과 도 4a 레인 4 및 도 4b 레인 1, 2, 3 및 4 (Vh 신호 펩티드)를 비교함으로써 알 수 있다.
표 7. AAV2 벡터 형질도입된 HEK293 세포의 배지에서의 VEGF -트랩 발현 수준의 ELISA 측정
Figure pct00007
실시예 5: HEK293 세포 배지로부터 정제된 고순도의 VEGF -트랩
500 mL 배양 상청액을 AAV2-VEGF-트랩 (AMI067) 형질도입된 HEK293 세포로부터 수거하고 연동 펌프에 의해 0.2 μm 옵티스케일(OptiScale) 필터 [밀리포어(Millipore)]를 통해 여과하였다. HiTrap™ 1 mL MabSelect™ 프리즘A 단백질 A 칼럼 [지이 헬스 케어 라이프사이언시즈(GE Health Care Lifesciences)]을 먼저, 평형 완충액 (Tris-HCl pH 7.2, 150 mM NaCl)을 사용하여 5 칼럼 용적 (CV)으로 1 mL/분의 유속으로 평형화시켰다. 그 후, 이와 같이 여과된 상청액을 지침 매뉴얼에 따라 AKTA 익스플로러 100 시스템을 사용하여 동일한 유속으로 칼럼에 로딩하였다. 용출 전에 칼럼을 동일한 유속의 10 CV용 평형 완충액으로 세척하였다. AAV-아일레아 단백질을 용출 완충액 (0.1 M 시트르산 나트륨 2수화물 pH 3.0) [피셔 케미칼(Fisher Chemical)] 6 CV를 사용하여 0.5 mL/분 유속으로 용출시켰다. 0.1 용적의 중화 완충액 (1 M Tris/HCl 완충액 pH 9.0)을 함유하는 튜브에 분획을 수집하였다. 용출된 수집물은 원심분리 필터 (밀리포어, 아미코 울트라-4)를 사용하여 1xPBS로 탈염되었다.
AAV2.53-AMI067로 형질도입된 HEK293 세포로부터의 배지에 칼럼 크로마토그래피 정제를 실시하였다. scAAV2.53-AMI067 형질도입된 HEK293 세포로부터 수거된 약 500 mL의 배지로부터 총 약 4.3 mg의 순수 VEGF-트랩을 수득하였다. SDS-PAGE와 심플리블루 염색을 통해, 단백질은 순수하고 도 5에 표시된 상업용 제품 [리제너론 (Regeneron; 미국 뉴욕주 태리타운)]과 겔 내 동일한 크기로서 66.5 kDa의 정확한 분자량을 가진 것으로 나타났다.
정제된 AAV2.VEGF-트랩 벡터를 사용하여 세포당 500,000 벡터 게놈 (vg)의 MOI로 HEK293 세포를 형질도입하였다. 생산되어 세포 배양 상청액으로 방출된 VEGF-트랩을 코팅 항원으로서 상업용 VEGF-A165를 사용하는 작동 프로토콜을 사용하여 매일 분석하였다. VEGF-A165는 HEK293 세포에서 발현되었고 균질하게 정제되었으며 [진스크립트(GeneScript), Cat# Z03073], 멸균 Milli-Q 물에 100 μg/mL로 재구성되었다. ELISA 절차는 50 μL 용적의 코팅 완충액에서 웰당 0.1 μg/mL의 VEGF 최종 농도로 96-웰 플레이트를 코팅하는 것; 밀봉으로 플레이트를 덮는 것; 및 플레이트를 밤새 4℃에 두는 것이었다. 그 다음날의 ELISA 절차는 플레이트를 제거하는 것; 용액을 폐기하는 것; 플레이트를 종이 타월로 태핑하여 과잉 용액을 제거하는 것; 및 세척 완충액 (300 μL)으로 플레이트를 3회 세척하는 것이었다. 마지막 세척 후, 플레이트를 신선한 종이 타월로 다시 태핑하여 가능한 한 많은 완충액을 제거하였다. 멀티채널 피펫을 사용하여 300 μL의 차단 완충액을 각각의 웰에 부가하였다. 플레이트를 밀봉 커버로 덮고 37℃ 인큐베이터에 2시간 동안 두었다. 인큐베이션 후, 차단 완충액을 버리고, 플레이트를 종이 타월로 태핑하여 과잉 완충액을 제거하였다. 실험 계획에 따라 각각의 웰에 50 μL를 부가함으로써 차단 완충액에서 샘플 희석액을 제조하였다. 플레이트를 밀봉 커버로 덮고 인큐베이터에 다시 1시간 (hr) 동안 두었다. 1시간 후, 용액을 버리고 플레이트를 300 μL의 세척 완충액으로 6회 세척하였다. 상기 기재된 바와 같이 종이 타월을 태핑하여 과잉 용액을 제거하였다. 포획 항체를 차단 완충액에 1:40,000 희석도로 부가하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 용액을 버리고, 필요에 따라 세척 절차를 반복하였다. 검출 항체를 차단 완충액에 1:40,000 희석도로 37℃에서 1시간 동안 부가하였다. 용액을 버리고, 마지막 세척을 위해 부가의 인큐베이션을 통해 플레이트를 세척하였다 (세척 완충액에서 5분). 그런 다음 세척 완충액을 버리고 PBS로 1회 부가의 세척을 수행하였다. 50 μL TMB를 부가하였다. 플레이트를 15-20분 동안 (15분 미만일 수 있음) 또는 신호의 포화가 최고 농도 웰에서 관찰될 때까지 직접 광원으로부터 유지하였다. 그런 다음 50 μL 정지 용액을 부가하고, 15분 이내에 참조로서 620 nm를 사용하여 플레이트를 450 nm에서 판독하였다.
도 10으로부터 볼 수 있는 바와 같이, AAV2.054-AMI120으로 형질도입된 HEK293 세포로부터 수거된 세포 배양 상청액은 VEGF-트랩을 대략 800 ng/mL로 분비한 반면, 비형질도입된 HEK93 세포는 VEGF-트랩을 분비하지 않았다. 세포가 노화되기 전에 배양 날짜가 길어짐에 따라 생산이 계속된다 (도 11).
AAV2.N53-VEGF-트랩 벡터를 사용한 HEK293 세포의 형질도입에 의해 발현된 VEGF-트랩을 단백질 A 친화성 칼럼 크로마토그래피로 정제하였다. 칼럼 용출액을 중화하고 완충액을 10 mM 인산염 완충액 (pH 7.0; 150 mM NaCl)으로 변화시켰다. 벡터 유래 VEGF-트랩의 순도는 1.5 μg/레인을 SDS-PAGE 겔 (10%)에 로딩하고 쿠마시 블루 R-250으로 염색함으로써 결정되었고, 66.5 kDa에서의 단일 밴드가 겔에서 보인다. 크기는 상업용 VEGF-트랩의 크기와 동일하였다 (도 5a).
AVMX-110 유래 VEGF-트랩 결합 친화도는 VEGF-A165에 대한 AVMX-110 유래 VEGF-트랩 결합의 분석을 위한 2가지 방법: ELISA 및 표면 플라스몬 공명 (SPR)으로 측정되었다. ELISA를 위해, VEGF-A165에 대한 AVMX-110 유래 VEGF-트랩과 상업용 아플리베르셉트 (리제너론; 미국 뉴욕주 태리타운)의 결합을 동일한 조건 하에서 나란히 수행하였다. 그 결과는 도 5b 및 도 5c에 나타난 바와 같이 AVMX-110 유래 VEGF-트랩 (a) 및 아플리베르셉트 (b)에 대한 IC50이 각각 159.1 ng/mL 및 158.8 ng/mL로, 둘 다 결합에서 동일하였다는 것을 보여주었다. 결합 상수 (Kd)는 115000 Da의 분자량을 사용하여 나노몰 농도로 계산되었다. AVMX-110 유래 VEGF-트랩의 친화도는 상업용 아플리베르셉트의 친화도와 동일하였다 (AVMX-110 유래 VEGF-트랩과 상업용 아플리베르셉트 둘 다에 대해 1.38 nM). 따라서, 정제된 산물은 AAV2.VEGF-트랩으로부터의 것과 동일하게 기능하였다.
AVMX-110은 생화학적 및 생물학적 특징 규명을 기반으로, HEK293 및 망막 세포 ARPE-19를 포함한 인간 세포의 형질도입을 위한 VEGF-트랩 유전자를 보유하는 적격한 AAV 벡터이다. AAV2.N54-VEGF-트랩 제품은 현재 시판 중인 아플리베르셉트와 유사한 생체내에서 VEGF-트랩을 생산할 수 있다. 따라서, AVMX-110 (AAV2.N54-VEGF-트랩)은 생체내 신생혈관성 망막 장애의 치료를 위한 장기간 발현에 사용될 수 있다.
AVMX-110 유래 VEGF-트랩과 인간 VEGF-A165 간의 상호작용은 표면 플라스몬 공명 (SPR) 방법으로 분석되었다. 0.01% Tween 20 (PBS-T)이 포함된 인산염 완충 식염수 중의 200 nM의 AVMX-110 유래 VEGF-트랩 또는 아플리베르셉트 15 μl를 센서 칩 단백질 A와 결합시켰다. AVMX-110 VEGF-트랩 및 아플리베르셉트는 각각 33 pM 및 55 pM의 Kd로 HEK293 발현된 인간 VEGF-A165와 단단히 결합하였다 (도 13 및 표 8).
HUVEC 세포의 증식 억제를 사용하여 시험관 내에서 AVMX-110의 효능을 결정하였다. 간단히 언급하면, AVMX-110은 먼저, HEK293 세포를 형질도입하기 위해 사용되었으며, 이를 37℃에서 4일 동안 배양하였다. 세포 배양 상청액을 수거하고 친화성 칼럼 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 인간 VEGF-A165 유도된 HUVEC 세포 증식을 차단하기 위해, 정제된 VEGF-트랩을 상업용 아플리베르셉트 [아일레아, 리제너론 파마슈티칼즈 (Regeneron Pharmaceuticals; 미국 뉴욕주 태리타운)]와 비교하였다. 검정을 이중으로 반복하였다. 간단히 언급하면, 96-웰 마이크로플레이트에서 HUVEC 세포 (ATCC, Cat#. CRL-1730; 미국 버지니아주 매너서스)를 100 μL 세포 배양 배지에 5000개 세포/웰로 시딩하고 5% CO2 및 90% 습도의 CO2 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 세포를 24시간 동안 부착시키고, 세포 배양 배지를 제거하며, 20 ng/mL 인간 VEGF-A165를 함유하는 100 mL/웰 신선한 검정 배지 (1% dFBS를 갖는 혈관 세포 기저 배지)로 대체하고, 이어서 정제된 VEGF-트랩을 1/0, 1:2, 1:5, 1:10 및 1:100의 몰비 (VEGF-A165/VEGF-트랩)로 개별적으로 또는 각각 0, 101, 253, 506 및 5060 ng/mL로 하였다. 상업용 아플리베르셉트 (40 mg/mL)와 AAV2.VEGF-트랩 둘 다를 동일한 비율로 희석시켰다. 플레이트를 72시간 동안 인큐베이션한 후 측정 절차를 따랐다. 각각의 웰 중의 검정 배지를 제거하고 10 μL의 WST-8 [도진도 몰레큘라 테크놀로지스, 인크. (Dojindo Molecular Technologies, Inc.) Cat. # CK04-11; 미국 메릴랜드주 록빌]과 함께 신선한 검정 배지 (90 μL)를 부가하였다. 플레이트는 부가 후 매시간마다 판독되었다. 데이터는 HUVEC 세포 증식의 AAV2.VEGF-트랩 억제가 VEGF-트랩 농도 의존적임을 입증해주었다. 효능은 아플리베르셉트와 동일하게 효과적이다 (도 12).
실시예 6: AAV2 유래 VEGF -트랩의 글리코실화의 결정
MOI 100,000에서 AVMX-110으로 형질도입된 HEK293의 세포 배양 상청액으로부터 정제된 AAV2.N54-AMI120 유래 VEGF-트랩 단백질을 친화성 칼럼 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 정제된 VEGF-트랩은 당단백질로부터 모든 N-연결된 탄수화물을 제거하는데 이상적인 재조합 에프. 메닌고셉티쿰(F. meningosepticum) PNGase F 효소로 처리되었다. 이러한 처리는 상업용 아플리베르셉트를 사용하여 수행되었다. 처리 혼합물을 SDS-PAGE 겔 변위 분석으로 분리하였다. NPGase F의 존재 하에서, 탄수화물은 N-결합을 통해 당단백질로부터 제거된 다음, 탈글리코실화된 단백질은 감소된 분자량으로 인해 더 빠르게 이동하였다 (도 12).
실시예 7: 벡터 발현된 VEGF -트랩 및 아플리베르셉트 ( 아일레아 )와 VEGF -A 165 의 결합 친화도 (KD)에 대한 비아코어 결합 검정
VEGF-트랩 단백질은 발현 벡터 AAV2.N54-AMI120으로 형질감염된 HEK293 세포에 의해 발현되었고, 단백질 A 친화성 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제되었다. 용출액을 중화시키고 4.31 mg/ml의 농도로 농축하였다. 아플리베르셉트는 상업용 제품이며, 4 mg/ml로 희석되었다. VEGF-A165는 진스크립트 (진스크립트, Cat# Z03073; 중국 난징)로부터 수득되었으며, 이는 1 mg/ml로 재구성되었다. 각각의 스톡 단백질의 작업 용액은 실험 전에 200 nM로 제조되었다. 몰 농도는 VEGF-트랩 및 아플리베르셉트의 경우 MW: 115 kDa를 사용하고, VEGF-A165의 경우 45 kDa를 사용하여 계산되었다. 비아코어 작동은 5 μL/min으로 15 μL를 주사함으로써 200 nM에서 VEGF-트랩 또는 아플리베르셉트로 단백질 A 센서 칩을 코팅한 다음, 90 μL의 연속 희석된 VEGF-A165 용액을 200, 100, 50, 25, 12.5 및 0 nM의 30 μL/분의 유속으로 주사하는 것으로 시작되었다. 비아코어 평가 소프트웨어를 사용하여 결합 동역학 시뮬레이션을 분석하였다. AAV2.N54-AMI120 유래 VEGF-트랩의 KD는 VEGF-A165와의 결합에 대해 33 pM이다. 아플리베르셉트의 KD는 VEGF-A165와의 결합에 대해 55 pM이었다. 표 8 및 도 13에 제시된 결합 동역학 파라미터는 AAV2.N54-AMI120 유래 VEGF-트랩이 아플리베르셉트의 것과 유사하다는 것을 입증해준다.
표 8. 비아코어 검정에 의해 결정된 동역학 결합 친화도
Figure pct00008
실시예 8. rhVEGF -A 165 와 벡터 발현된 VEGF -트랩의 결합 친화도
결합 친화도를 결정하기 위한 검정을 수행하였다. 간단히 언급하면, AAV2.N54-VEGF-트랩 발현된 VEGF-트랩으로부터 정제된 것을 rhVEGF와의 결합 친화도에 대해 검정하였다. 96-웰 플레이트를 rhVEGF-A165 0.1 μg/mL로 2-8℃에서 밤새 코팅하였다. 플레이트를 세척 완충액 (PBS 중 0.05% Tween-20, pH 7.3 ± 0.1)으로 3x 300 μL로 세척하고 120분 동안 1% 카제인을 함유한 차단 완충액으로 차단하였다. 200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25 및 3.1 ng/mL에서 연속 희석된 VEGF-트랩 또는 아플리베르셉트 (상기 언급된 것과 동일한 로트)를 100 μL/웰로 각각의 웰에 개별적으로 부가하고 37±1℃에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 희석된 (1:40,000) 비오티닐화된 토끼 항-인간 IgG1 Fc 항체 용액을 3 x 300 μL/웰의 세척 완충액 후에 100 μL/웰로 부가하였다. 37±1℃에서 60분 동안 추가 인큐베이션하고, 3 x 300 μL/웰의 세척 완충액으로 세척하였다. 마지막으로, 각각의 웰에 스트렙타비딘-HRP, 1:40,000을 100 μL/웰로 부가하고 37±1℃에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 3x300 μL/웰로 세척한 후 기질 TMB 용액을 부가하고 37±1℃에서 15분 동안 인큐베이션한 후 정지 용액 100 μL/웰로 정지시켰다. 플레이트는 마이크로플레이트 판독기 [몰레큘라 디바이스 (Molecular Device; 미국 캘리포니아주 서니베일)]에서 600 nm 파장 하에 판독되었다. 검정 결과, rhVEGF-A165에 대한 VEGF-트랩 및 아플리베르셉트의 결합 친화도는 각각 75 pM 및 60 pM으로 나타났으며, 이는 두 단백질 모두 rhVEGF-A165와 결합하는 것이 유사하다는 것을 입증해준다 (도 14 및 표 9).
표 9. 비아코어 검정을 사용한 결합 친화도 분석
Figure pct00009
실시예 9. VEGF -A 165 에 의해 자극된 HUVEC 세포 증식의 억제
정제된 VEGF-트랩을 인간 VEGF-A 유도된 HUVEC 세포 증식을 차단하기 위한 상업용 아플리베르셉트 (아일레아) (리제너론 파마슈티칼즈; 미국 뉴욕주 태리타운)와 비교하였다. 검정을 이중으로 반복하였다. 간단히 언급하면, 96-웰 마이크로플레이트에서 HUVEC 세포 (ATCC, Cat#. CRL-1730; 미국 버지니아주 매너서스)를 100 μL 세포 배양 배지 중 5000개 세포/웰로 시딩하고 5% CO2 및 90% 습도의 CO2 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 24시간 동안 배양한 후, 세포 배양 배지를 제거하고, 20 ng/mL 인간 VEGF-A165를 함유하는 100 mL/웰의 신선한 검정 배지로 대체한 다음, 개별적으로 1:0, 1:2, 1:5, 1:10, 및 1:100의 몰비 (VEGF-A165/VEGF-트랩) 또는 각각 0, 101, 253, 506, 및 5060 ng/mL로 정제된 VEGF-트랩으로 대체하였다. 상업용 아플리베르셉트 (40 mg/mL)와 AAV.VEGF-트랩을 동일한 비율로 희석하였다. 검정 배지는 1% dFBS를 함유한 혈관 기저 배지였으며, 플레이트를 72시간 동안 인큐베이션한 후 측정 절차를 수행하였다. 각각의 웰 중의 검정 배지를 제거하고, WST-8 (도진도 몰레큘라 테크놀로지스, 인크., Cat. # CK04-11; 미국 메릴랜드주 록빌) 10 μL와 함께 신선한 검정 배지 (90 μL)를 부가하였다. 플레이트는 부가 후 매시간마다 판독되었다. 데이터는 AAV.VEGF-트랩이 VEGF-트랩 농도 의존적으로 HUVEC 세포 증식을 억제하였다는 것을 입증해주었다. 효능은 아플리베르셉트와 동일하게 효과적이었다 (도 15).
실시예 10. 레이저 유도된 신생혈관증식에 의해 유발된 맥락막 손상의 AAV2.N54-AMI120VEGF-트랩 보호의 생체내 평가
AAV2.N54-AMI120-VEGF-트랩의 효능 및 약동학을 마우스 LCNV 모델을 사용하여 시험하였다. 코호트에 대한 연구는 표 10에 나타나 있다.
표 10. 마우스 레이저 맥락막 신생혈관증식에서 AAV2.N54 - AMI120 - VEGF -트랩의 실험 설계
Figure pct00010
8-12주령의 마우스 [무스 무스쿨루스(Mus Musculus)]/C57BL/6 [찰스 리버(Charles River) 또는 타코믹 팜스(Tacomic Farms)], 각각 15-25그램이 본 연구에 사용된다. 동물은 무작위로 여러 군으로 나뉘며, 군당 5마리의 동물이 사용된다. 각각의 동물에게 레이저 시술 28일 전에 시험 물품을 유리체내 (IVT)로 군당 10개의 눈에 양측 주사한다. AAV2.N54AMI120의 시험 물품은 마이크로리터 (μL)당 높은 용량 (1.6e+10), 중간 용량 (4e+8) 및 낮은 용량 (2e+7)의 3가지 용량으로 시험되었다. 대조군으로서, AAV2.N54-GFP를 벡터 전송 대조군으로서 사용하였다. AAV2.N54-AMI120 제형 완충액 (비히클)을 음성 대조군으로서 사용하였다. 마우스에게 레이저 손상 28일 전에 시험 물품 및 대조군을 투여하고 (IVT 투여), 대조군 동물에게는 아플리베르셉트 및 비히클에 대한 레이저 시술 3일 전에 투여하였다. 레이저 시술 후 7일에, 모든 군에서 형광 혈관조영술, 혈청 내 VEGF-트랩 수준 및 안배에 대해 분석한다. VEGF-트랩 농도는 ELISA를 사용하여 검출된다. 상기 언급된 시험관내 효능 결과에 따르면, AAV2.N54-AMI120을 투여한 동물은 염증 및 상처 치유 반응성 신생혈관증식으로부터 보호를 얻을 수 있는 반면, AAV2.N54-GFP 및 비히클 대조군은 어떠한 보호도 받지 못할 수 있다.
실시예 11. 마우스의 레이저 유도 맥락막 신생혈관증식 ( CNV ) 모델에서 아플리베르셉트 ( AVMX - 110)를 코딩하는 변형된 아데노 -연관 바이러스 ( AAV2 )의 효능
본 연구의 목적은 아데노-연관 바이러스 (AAV2) 벡터를 사용하여 마우스에서 레이저 유도 맥락막 신생혈관증식 (CNV) 모델에서 신생혈관증식의 억제를 평가하는 것이었다. 표 11은 본 연구를 위한 실험 설계를 예시한다.
표 11. 마우스에서 CNV를 검사하기 위한 실험 설계
Figure pct00011
약어: CNV - 맥락막 신생혈관증식; IVT - 유리체내; OU - 양쪽 눈; N/A - 해당 사항 없음.
이러한 레이저 맥락막 신생혈관증식 (CNV) 연구는 마우스 (무스 무스쿨루스) C57BL/6 계통에서 시행되었다. 본 연구는 유효한 비-GLP 상태 연구에 대한 승인 기준을 충족하였으며, 이는 플루오레세인 혈관조영술 (FA) 및 플랫마운트 면역형광을 통해 평가된 평균 CNV 병변 크기가, IVT 주사 후 제형 완충액 또는 대조군 벡터 (GFP-AAV2)와 비교할 때 아플리베르셉트 처리된 동물에서 크게 감소되었기 때문이다.
시험 물품은 즉시 주사가능한 형식으로 제공되었으며 사용될 때까지 < -70℃에서 저장되었다. 냉장 저장된 (2-8℃) 아플리베르셉트는 희석하지 않고 그대로 주사하였다. 주사 30분 전에, 각각의 시험 물품을 37℃ 수조에서 20분 동안 해동시키고 와동시켜 바이러스 응집을 감소시켰다.
주사 전 제-28일 (군 3-6) 및 제-3일 (군 1 및 2)에, 마우스에게 부프레노르핀 0.01-0.05 mg/kg을 피하 (SQ) 투여하였다. 그런 다음, 흡입된 이소플루란과 함께 유리체내 주사하기 위해 동물을 진정시키고 0.5% 프로파라카인 HCL 한 방울을 양쪽 눈에 도포하였다. 듀몬트(Dumont) #4 겸자를 사용하여 결막을 가볍게 잡고 33 G 바늘과 해밀턴 시린지를 사용하여 주사하였다. 시린지 내용물을 투여한 후, 시린지 바늘을 천천히 빼냈다. 주사 절차 후, 오플록사신 안과용 용액 한 방울을 눈 윤활제와 함께 안구 표면에 국소적으로 도포하였다.
제0일에, 마우스에게 부프레노르핀 0.01-0.05 mg/kg을 SQ 투여하였다. 국소 산동제 (1.0% 트로피카미드 HCL 및 2.5% 페닐에프린 HCL)를 레이저 시술 전 적어도 15분에 도포하였다. 케타민/크실라진을 복강내 (IP) 주사하여 마우스를 진정시켰다. 국소 안약을 사용하여 각막을 촉촉하게 유지하고 핫 패드를 사용하여 체온을 유지하였다. 세극등을 통해 전달된 532 nm 다이오드 레이저를 사용하여 시신경 주변에 4개의 단일 레이저 지점을 만들었다. 마우스의 양쪽 눈 모두는 미리 결정된 시간 간격으로 레이저 처리되었다. 레이저 후 안구 윤활제를 점안하였다 (OU).
이환율과 사망률은 케이지 측면 관찰과 함께 매일 관찰되었으며, 특히 양쪽 눈에 주의를 기울였다. 군 2 (# 210, 212 및 216) 및 근 4 (# 432)에서는 4마리의 동물이 투여 후이긴 하지만 레이저 시술 전에 사망하였다. 군 4 (#430) 및 군 6 (#644)에서는 2마리의 부가 동물이 최종 조직 수집 전이긴 하지만 레이저 시술 후에 사망하였다.
안저 영상화
컬러 및 코발트 블루 (EGFP 발현) 안저 영상화 둘 다는 레이저 후 제7일 및 플루오레세인 혈관조영술 (FA) 이전에 군 3 (AAV2-GFP; 1.6e10 vg/눈) 동물의 양쪽 눈에 대해 수행되었다. 눈을 확장하고 돌출시키기 위해 동물에게 트로피카미드 (1.0%)와 페닐에프린 (2.5%)의 칵테일을 국소적으로 투여하고, 국소 눈 마취제를 눈에 도포하였다 (프로파라카인 0.5% 또는 유사물). 컬러 안저 사진 촬영에 이어 코발트 블루 사진 촬영이 이어졌다. 획득하는 동안 동물 간에 강도 설정이 일정하게 유지되었다. 도 16에 나타난 바와 같이, 안저 영상화를 방해하는 백내장이 있는 318 OS를 제외한 모든 눈에서 GFP가 관찰되었다. 관찰된 백내장은 IVT 주사 동안 수정체의 외상으로 인해 발생했을 수 있다.
플루오레세인 혈관조영술 (FA)
FA는 레이저 후 제7일에 양쪽 눈에 수행되었다. FA에 대한 산동증은 검사 15분 전에 각각의 눈에 국소 점안제 (1.0% 트로피카미드 HCL 및 2.5% 페닐에프린 HCL)을 사용하여 달성되었다. 케타민/크실라진의 IP 주사로 마우스를 진정시켰다. 망막 사진 촬영은 플루오레세인 나트륨 정맥 주사 (1% 원액; 12 mg/kg) 후 대략 1분에 수행되었다. 플루오레세인 누출은 ImageJ 소프트웨어로 분석되었고; 대표적인 영상이 도 17에 표시되어 있으며, 이는 제7일 플루오레세인 혈관조영술을 예시한다. 각각의 군으로부터의 대표적인 영상이 표시된다. AAV 배제 분석에 의해 표현된 GFP로서 군 3의 병변 측정은 실행가능하지 않았다. 혈관조영상을 사용하여 병변 면적을 픽셀 ± 표준 편차 (SD)로서 정량화하였으며, 그 결과가 도 18에 표시되어 있다. 레이저 처리 후 연구 제7일에, 군 6 (AVMX110, 1.6e10 vg/눈)은 평균 병변 면적이 가장 작은 반면, 비히클 군은 병변 면적이 가장 컸다.
안구 조직 수집 및 프로세싱
제7일에, 동물을 인도적으로 안락사시키고, 눈을 적출한 후 즉시 인산염 완충 식염수 (PBS) 중 4% 파라포름알데히드 (PFA)에 4℃에서 밤새 고정시켰다. 해부 현미경을 사용하여 각각의 눈의 외부 조직을 트리밍하고 안구 앞부분과 수정체를 제거하였다. 망막을 박리하고 미세한 곡선 가위를 사용하여 시신경 두부로부터 제거하였다. 안배를 차가운 면역세포화학 (ICC) 완충액 (PBS + 0.5% BSA 및 0.2% Tween 20)으로 세정하고 ICC 완충액에서 적어도 6시간 동안 차단하였다. 그런 다음 안배를 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI; 핵), 팔로이딘 디라이트(Phalloidin DyLight) 550 (액틴 세포골격) 및 이소렉틴 IB4-디라이트 649 (혈관)를 함유하는 차가운 ICC 완충액에 넣고 2.5시간 동안 부드럽게 회전시키면서 4℃에서 인큐베이션하였다. 조직을 세척하고, 병변을 피하면서 시신경 두부 쪽으로 방사상 커팅을 가하고, 조직을 편평하게 장착하였다. 2차원 (2D) 형광 현미경 영상은 올림푸스 Bx63 형광 스코프에서 획득했으며, 신생 혈관은 이소렉틴 IB4 신호 면적 (μm2) 및 셀센스(CellSens) 소프트웨어를 사용하여 정량화되었다. 대표적인 영상이 도 19에 나타나 있다. 이소렉틴 면적의 정량화가 도 20에 나타나 있다. 아플리베르셉트 주사로 병변 면적이 감소되었다. 군 3 눈은 가장 큰 병변 면적을 가졌으나, 이는 AAV2 구축물에 의해 구동된 GFP에 의해 부분적으로 영향을 받았을 수 있다. 군 3으로부터의 AAV2-GFP와 비교했을 때, AVMX-110은 시험된 모든 용량에서 병변 크기를 감소시켰다 (군 4-6).
본 연구는 마우스에서 시험 물품 (군 3-6) 및 양성 대조군 (아플리베르셉트, 군 2)의 IVT 투여 후 망막 혈관 누출의 억제를 결정하기 위해 시행되었다. 레이저 CNV의 유도 전에 적절한 발현을 보장하기 위해 AAV2 벡터 (군 3-6)를 제28일에 주사하였으며; 비히클 및 아플리베르셉트 (군 1 및 2)를 제3일에 주사하였다. 수행된 시험과 본 연구의 목적에 기초하여, 아플리베르셉트 대조군은 비히클과 비교했을 때 레이저 후 제7일에 병변 크기가 감소하였다. 아플리베르셉트 (양성 대조군; 플루오레세인 면적 40.5% 감소)과 비교하여, 군 5 및 6의 시험 물품은 적어도 하나의 종말점 분석에 의해 동등성 또는 우월성을 입증했으며, 최고 용량의 AVMX-110 (1.6e10 vg/눈)에서는 혈관조영술 종말점에 대한 혈관 누출이 68% 감소되었다. 플랫마운트에서의 병변 크기 분석에 따르면, AAV2 제제를 주사한 모든 눈은 비히클 또는 아플리베르셉트를 주사한 눈보다 병변이 더 큰 것으로 밝혀졌다. 그러나, AVMX-110을 AAV2-GFP와 비교했을 때, 3가지 AVMX-110 용량 수준 모두에서 병변 크기가 감소했으며, 최고 용량의 AVMX-100에서는 이소렉틴 면적이 40% 감소하였다.
실시예 12. AVMX -110 및 AVMX -116의 분석
실시예 12는 AVMX-110 및 AVMX-116에 대한 후보 선택으로 이어지는 데이터의 포괄적인 분석을 예시한다. 그 전략은 구축물 설계, 클로닝, 시퀀싱, 생산, 정제 및 바이오 분석학을 수반하였다. 데이터는 일원 ANOVA 방법을 사용하여 분석되었다. 최상의 발현, 효능 및 침투성 (생체내)을 가진 후보를 하기 기준: 관심 유전자 (GOI); 캡시드; 및 AAV 혈청형에 따라 선택하였다.
캡시드 조작 및 선택
야생형 AAV2 캡시드는 GOI의 침투성 또는 발현을 증가시키기 위해 특이적 부위에 돌연변이를 도입하도록 방법론적으로 조작되었다. 발현 및 침투성을 확인하기 위해 하기 돌연변이 목록을 마우스 및/또는 돼지 모델에 도입하고 스크리닝하였다 (표 12). 서열 및 위치는 AAV2-VP1의 루프 4에 짧은 펩티드 단편으로 삽입되었으며 (표 12), 플라스미드 명칭은 표 13에 열거되어 있다.
표 12. 변형된 캡시드 영역을 갖는 AAV 구축물
Figure pct00012
표 13. 동물 모델에서 스크리닝된 상이한 AAV2 캡시드 돌연변이의 목록
Figure pct00013
2E+10 vg/눈의 상이한 구축물을 마우스 모델에 주사하였다. 도 21은 모든 군의 안저 영상을 나타낸다. 이러한 영상은 구축물 주사 후 제23일에 기록되었다. V226은 양성 대조군이었으며 좋은 발현을 보였다. 각각의 군으로부터의 한쪽 눈을 면역조직화학으로 추가 분석하였고 (도 22), 구축물 AMI-053, AMI-054, AMI104 및 V226이 주사된 눈은 밝은 GFP 발현을 보여주었다. AMI054는 특히 신경절 세포 층 (GCL), 내부 망상 층 (IPL), 및 외부 핵 층 (ONL)에서 균일하게 발현되는 것으로 나타났다. 다른 마우스 연구에서는, 이전에 언급된 나머지 구축물을 분석하였다. 20-AVI-002와 유사하게, 2E+10 vg/눈 구축물을 마우스 눈에 주사하였다. 안저 영상화는 제24일에 이루어졌다 (도 23).
AMI101, AMI104 및 AMI105는 제28일에 면역조직화학을 실시하였고 (도 24), AMI104는 GCL, IPL, 내부 핵 층 (INL), 외부 망상 층 (OPL), ONL, 내부 세그먼트 (IS), 및 외부 세그먼트 (OS)에서 GFP 발현의 균일한 분포를 보여주었다. 마우스 연구로부터, 부가의 돼지 연구를 위해 여러 후보 (AMI053, AMI054, AMI101, AMI104, AMI105 및 V226)가 선택되었다. 각각의 돼지 눈에는 1E+11 vg/눈을 주사하였다. 도 25는 돼지 연구에서 동물의 안저 영상을 나타낸다. AMI053은 마우스 연구에서 관찰된 결과와 유사한 희미한 GFP 발현을 보여주었다. AMI054는 V226과 유사하게 균일하고 밝은 발현을 보여주었다. 구축물의 발현 및 침투성을 추가로 확인하기 위해, 마우스 연구와 유사하게 주사 후 제28일에 생성된 냉동절편에 대해 면역조직화학 (IHC)을 수행하였다 (도 6). IHC 데이터에 따르면, AMI054와 V226은 가장 밝고 가장 넓은 일관된 GFP 발현을 보여주었다. V226은 주로 GCL에서 강렬한 GFP 발현을 보였고 AMI054는 INL에서 강렬한 GFP 신호를 보여주었다. 마우스 및 돼지 연구로부터, AMI054는 가장 밝고 가장 넓은 일관된 결과를 나타냈다는 결론을 내릴 수 있다. 따라서, AMI054는 AVMX-110의 삽입 및 스크리닝을 위한 AAV 캡시드로서 선택 및 확정되었다. 눈의 상이한 층을 더 잘 시각화하기 위해 공초점 현미경 영상도 문서화되었다. 이들 영상은 상이한 안구 층으로의 캡시드의 침투성을 예시하였다 (도 27). AMI054는 더 낮은 GFP 발현에도 불구하고 INL에 대한 더 깊은 침투성을 보여주었다. V226은 RGC 층에서 더 많은 발현을 보였다.
GOI 스크리닝
후보를 확정하기 전에 여러 구축물을 설계하고 스크리닝하였다. 모든 구축물의 발현 프로파일을 인간 배아 신장 세포 (HEK293) 세포에서 확인하였다. 구축물 중 일부는 ARPE-19 세포 (인간 망막 색소 상피 세포) 및 hTERT-rpe 1 (인간 텔로머라제 역전사 효소 - 망막 색소 세포)에서도 확인되었다. hTERT-rpe 1 세포는 RPE-340 세포주 (1차 인간 RPE 세포주)를 pGRN145 hTERT-발현 플라스미드로 형질감염시킴으로써 유래되었다. 이는 1차 RPE 세포를 모방하는데 사용되었다. 표 14는 상이한 세포주에서의 이들 구축물의 발현을 나타낸다. 예를 들어, AAV2.N54.120 바이러스 입자 (AVMX-110으로 명명되기도 함)는 높은 GC 함량 ("GCRS"에서 "GC"로 표시됨); 아르기닌을 코딩하기 위한 코돈 AGG ("GCRS"에서 "R"로 표시됨); 및 세린을 코딩하기 위한 코돈 TCC ("GCRS"에서 "S"로 표시됨)를 포함하는 AAV2.N54 캡시드 내부에 패키징된 비-자연 발생 핵산을 포함한다. 또 다른 예를 들어, AAV6.N54.120 바이러스 입자 (AVMX-116으로 명명되기도 함)는 높은 GC 함량 ("GCRS"에서 "GC"로 표시됨); 아르기닌을 코딩하기 위한 코돈 AGG ("GCRS"에서 "R"로 표시됨); 및 세린을 코딩하기 위한 코돈 TCC ("GCRS"에서 "S"로 표시됨)을 포함하는 AAV6.N54 캡시드 내부에 패키징된 비-자연 발생 핵산을 포함한다.
표 14. AVMX -110/116 프로젝트에 대해 스크리닝된 구축물
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
표 14에 열거된 3가지 구축물 (N54.120, N54.190 및 N54.221)은 다른 구축물과 비교하여 더 높은 아플리베르셉트 발현을 나타냈다. 이들 3가지 후보에 대한 AAV 구축물 백본이 도 28a에 나타나 있다. 제조 프로세스 동안, 프로세스의 정확한 제어를 달성하기 위해 다양한 시험 목적으로 프로세스 단계의 다양한 지점에서 샘플을 채취하였다. 두 번의 제조 실행에 대한 예시적인 샘플 프로세스 크로마토그램이 도 28b에 나타나 있다. 포획 단계를 통해, 프로세스 동안 AVMX-110 벡터의 단일하고 날카로운 분획을 수득하였다 (화살표). 본 발명자들의 포획 프로세스에 의해 거의 100%의 AVMX-110 입자가 포획되었으며, 80% 초과가 프로세스 중간체 풀에서 용출되었다. 도 28c는 용출된 AVMX-110 프로세스 중간체 순도를 SDS-PAGE로 분석한 결과이다. AAV VP1, VP2 및 VP3은 명확하게 시각화되었으며 다른 주요 불순물 단백질은 보이지 않았다. 캡시드 충전 차이로부터, 빈 AAV와 전체 AAV의 성능 프로파일이 칼럼 프로세스에서 확립되었다. 이러한 조건하에, 빈 캡시드는 전체 캡시드보다 더 빠르게 칼럼 내부로 이동하였다. 차등 체류 시간은 전체 캡시드로부터 빈 캡시드를 분리하는데 충분하였다 (도 28d). 빈 캡시드의 일부분을 분리하기 위해 포획 단계의 용출액 풀을 프로세싱하였다. 분리 곡선은 도 28e에 나타나 있다. 이러한 분리 모델을 사용하여, AVMX-110을 정제하고 전체 캡시드 함량을 강화하였다. 분리 크로마토그램에서는, 2개의 별도의 피크가 수득되었다. 칼럼 크로마토그래피 후의 전체 용량 강화된 분획은 농축 및 완충액 교환에 성공하여 추가 평가를 위한 약물 물질을 만들었다. AVMX-110 제조 중간체 및 약물 물질 샘플은 각각의 개발 로트에 대해 AAV2 항체 웨스턴 블롯으로 검출된 특이 사항을 분석하였다. AAV2 VP1, VP2 및 VP3에 대한 항체는 겔 및 웨스턴 블롯에서 보이는 유일한 단백질 밴드였다 (도 28f). AVMX-110 순도는 은 염색 방법으로 염색된 겔 전기영동에 의해 분석되었다. 첫 번째 피크는 비어 있었고, 두 번째 피크는 가득 찬 캡시드였다. 산물은 VP1, VP2 및 VP3을 함유하는 AAV 입자였다. AVMX-110 프로세스 중간체의 순도는 은 염색 겔로 염색된 SDS-PAGE에 의해 분석되었다 (도 28g). AAV VP1, VP2 및 VP3가 명확하게 시각화되었으며 4%보다 더 높은 단일 불순물은 발견되지 않았다.
숙주 세포 오염물질
AVMX-110 개발 제품 내의 Sf9 숙주 세포 단백질 오염물질은 ELISA로 측정되었다. 숙주 세포 단백질 오염물질의 예시적인 측정이 표 15에 나타나 있다. 숙주 단백질 수준은 매우 낮았다 (≤170 ng/1012 vg). 정제 프로세스는 출발 세포 배양 용해물로부터 숙주 단백질의 1.5+10배를 제거했기 때문에 GOI에 대해 매우 특이적이었다. 숙주 단백질의 수준은 산물 방출을 위한 ≤100 ng/용량의 요구 사항을 초과하였다. 이러한 로트의 경우, 용량이 2e+11 vg인 경우, 숙주 세포 단백질 수준은 용량당 4 ng였다. 또 다른 배치의 숙주 세포 DNA 검출 한계의 PCNA는 ≤46.12 pg/1e+12 vg였다. 숙주 세포 단백질 및 DNA 시험 결과, AVMX-110은 고도로 정제되었으며 규제 요건을 초과하는 것으로 나타났다.
표 15. 숙주 세포 단백질 및 숙주 세포 DNA 정량화
Figure pct00017
Sf9 세포 게놈 DNA를 퀴아젠(Qiagen) 게놈 DNA 정제 키트로 정제하고, DNA를 1000, 250, 63, 16, 4, 및 1 ng/mL로 희석하여 표준으로서 사용하였다. AVMX-110 프로세스 샘플을 QPCR 희석 완충액에서 2배 및 10배 희석하고 Sf9 세포에 대한 qPCR 프라이머 및 프로브에 사용하였다. AVMX-110 프로세스 샘플로 수행된 모든 시험은 ≤10 pg/반응에서의 Sf9 세포 DNA에서는 검출가능하지 않았으며, 이는 1 ng/mL ≤300 pg/용량에 상응한다.
바큘로바이러스 및 기타 플라스미드 DNA 오염물질의 결정
바큘로바이러스 DNA는 퀴아젠 게놈 DNA 정제 키트에 의해 제공되는 프로토콜에 따라 약간의 변형을 거쳐 정제되었다. 간단히 언급하면, 배지 내 7.5 mL 바큘로바이러스를 1 N NaCl 중의 동일한 용적의 차가운 20% PEG 8000과 혼합하고 실온에서 30분 동안 방치시켜 두었다. 바큘로바이러스 입자를 10,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 펠렛화하고 5 mL G2 완충액에 용해시켰다. 95 μL 프로테이나제 K를 부가하여 단백질 캡시드를 50℃에서 60분 동안 소화시켰다. 칼럼이 평형화되었고 샘플이 로딩되었다. 세척 후, 바큘로바이러스 DNA를 용출시키고, 바큘로바이러스 게놈의 GP64 유전자에 상보적인 프라이머 및 프로브를 사용하여 qPCR을 시험하였다. DNA를 1000, 250, 63, 16, 4, 및 1 ng/mL로 희석하여 표준으로서 사용하였다. AVMX-110 샘플을 qPCR 희석 완충액 (DNase 소화 없음)에서 2배 및 10배 희석하고 qPCR 검정에 사용하였다. 바큘로바이러스 DNA 수준은 표 16에 나타난 바와 같이 AVMX-110 벡터 1012 vg당 8.58e+5였다.
표 16. 플라스미드 유전자 1e+12 vg당 바큘로바이러스 및 플라스미드 DNA 카피의 수준
Figure pct00018
AVMX-110 벡터 카피 수. PCNA는 SF9 세포의 하우스 키핑 유전자였다. Bac IE1은 SF9 세포에 클로닝된 DNA 단편이었다. GP64는 바큘로바이러스 DNA의 유전자였다. Rep는 헬퍼 바큘로바이러스의 DNA 단편이었다.
기타 플라스미드 선택 마커 유전자, 예컨대 젠틀맨, 암피실린 (AMP), Rep, 숙주 세포 DNA 마커, PCNA, BacIE1 DNA 오염물질은 규제 요건보다 낮았으며, 이는 AVMX-110이 순수하고 규제 안전성 요건을 충족했다는 것을 나타낸다. 이렇게 평가된 DNA 마커의 수준은 규제 요건보다 대략 10배 더 낮았다.
내독소 수준
AVMX-110 샘플 내의 내독소 수준은 상업용 키트를 사용하여 발색성 리물루스 아메바세포 용해물 (LAL) 방출 검정으로 측정되었다. 내독소의 존재하에, 피로크롬 LAL의 무색 발색 기질이 단백질 분해적 절단되어 pNA가 방출되며, 이는 황색 용액을 생산하고 405 nm에서 흡수된다. AVMX-110 제제 내의 내독소 수준 결과가 표 17에 나타나 있다. AVMX-110 샘플 내의 내독소 수준은 0.0154 EU/mL 또는 0.005 EU/용량이었다.
표 17. AVMX -110 샘플의 내독소 수준
Figure pct00019
무균
AVMX-110의 각각의 배치에서 바이오버든을 검정한 결과, 동물 시험에 사용된 약물 물질에 대해서는 미생물학적 오염이 검출되지 않았다.
복제 적격한 AAV 수준
플라스미드 형질감염 또는 바이러스 감염을 통해 AAV 벡터를 생산하기 위해 포유동물 세포를 사용하는 전통적인 방법은 일반적으로, AAV 게놈과 AAV rep-cap 플라스미드 간의 비상동 재조합으로 인해 일부 복제 적격한 AAV (rcAAV) 바이러스 입자를 생산한다. rcAAV의 오염은 GMP 제조에서 바람직하지 않으며 오염량을 FDA에 보고해야 한다. 본원에 기재된 AAV 시스템은 AAV 프로모터를 제거 및 파괴하고, 이를 포유동물 세포에서 활성이 아닌 곤충 세포 프로모터로 대체하였다. 제조 프로세스 동안 Bac-to-AAV 시스템에서는 rcAAV가 생성될 수 없다. rcAAV를 모니터링하기 위한 검정을 확립하기 위해, 100개의 야생형 (wt) AAV 입자를 1e+12 vg AAV 샘플에 스파이크하였다. rcAAV 검정이 수행되었다. 간단히 언급하면, 1e+12 vg AAV 샘플을 아데노바이러스 유형 헬퍼의 존재 하에 100 vg의 wtAAV2 입자와 혼합하고 3일 동안 HEK293 세포에 형질도입하였다. 세포를 수거하고, 용해물을 제조하였다. 아데노바이러스를 불활성화하기 위해 56℃에서 30분 동안 열 불활성화시킨 후, 용해물의 50%를 사용하여 아데노바이러스 유형 5의 존재하에 HEK293 세포를 형질도입하여 rcAAV 또는 스파이크된 wtAAV를 3일 동안 증폭시켰다. 세포를 수거하고, rcAAV 신호에 대한 qPCR 검출을 위해 용해물을 제조하였다. 그 결과는 wtAAV2에서의 스파이크 없이는 rcAAV의 양성 신호가 없다는 것을 보여주었다. 1e+12 vg AAV 샘플에 100 vg wtAAV를 스파이크했을 때, 양성 신호가 검출되었다 (표 18).
표 18. AVMX -110 약물 물질에서 복제 적격한 AAV의 검출
Figure pct00020
빈/전체 캡시드 추정
벡터 특이적 qPCR 및 AAV2 특이적 항체 ELISA를 사용하여 각각의 로트의 전체 캡시드와 빈 캡시드의 비를 추정하였다. 칼럼 크로마토그래피의 산물 분획을 벡터 카피 수 및 단백질 수준에 대해 분석하였다. 빈 캡시드는 벡터 DNA 수준이 없거나 매우 낮고 캡시드 단백질만 있는 반면, 전체 벡터에는 벡터 DNA와 단백질 함량이 모두 포함되어 있다. 데이터는 폴리시 단계의 용출 1에 관심 유전자가 없거나 극히 낮은 것으로 나타났다. 피크 1의 용출액은 단백질을 제외하고 AAV2.N54-VEGF-트랩 DNA에 대해서는 매우 낮거나 심지어 검출 불가능할 정도로 낮았다. 프로파일의 두 번째 피크 (피크 2)는 벡터 DNA와 단백질을 모두 보여주었다. 그 결과는 정제된 AVMX-110 및 UFDF 풀이 모두 전체 입자임을 입증해주었다 (도 10a).
AVMX -110 감염성
AVMX-110 감염성은 TCID50 검정 (조직 배양 감염성 용량 50%/mL)에 의해 결정되었으며, 이는 접종물이 표적 배양물의 50%를 감염시키는 희석으로부터 결정된 접종물 내 감염성 유기체의 농도였다 (즉, 출발 샘플을 TCID50/mL와 동일한 양으로 희석한 경우, 감염을 위해 여러 표적 배양물에 1 mL 분취량을 부가했으며, 평균적으로 배양물의 50%이다). TCID50 검정을 사용하여 제조업체의 프로토콜 (ATCC)을 기반으로 AAV 벡터의 효능을 결정하였다. 간단히 언급하면, 연속 희석된 AAV 샘플을 사용하여 96-웰 플레이트에서 3일 동안 아데노바이러스 5 헬퍼의 존재 하에 HelaRC32 세포를 형질도입하였다. 세포 용해물을 제조하고 qPCR 방법으로 양성 신호를 검출하였다. TCID50 값은 스피어만-카버(Spearman-Karber) 공식을 기반으로 계산되었다. 그 결과가 표 19에 나타나 있다.
표 19. AVMX -110 TCID 50 의 검출
Figure pct00021
HEK293 세포에서의 VEGF -트랩의 AVMX -110 발현 ( AAV2.VEGF -트랩)
정제된 AAV2-VEGF-트랩 벡터를 사용하여 세포당 100,000 벡터 게놈 (vg)의 MOI로 HEK293 세포를 형질도입하였다. 생산되어 세포 배양 상청액으로 방출된 VEGF-트랩을 코팅 항원으로서 상업용 VEGF-A165를 사용하는 내부 표준 작동 프로토콜 (21-AD-VEGF-ELISA.01)을 사용하여 매일 분석하였다. VEGF-A165는 HEK293 세포에서 발현되었고, 균질하게 정제되었으며 (진스크립트, Cat# Z03073), 100 μg/mL의 멸균 Milli-Q 물로 재구성되었다. ELISA 절차는 하기와 같다. VGEF-A165를 96-웰 ELISA 플레이트 상에 코팅하고 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 그 다음날 플레이트를 세척 완충액으로 3회 세척하고, 각각의 웰에 차단 완충액을 부가하였다. 플레이트를 덮고 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 덮고 1시간 동안 인큐베이터에 다시 넣었다. 그 후, 플레이트를 세척하고 항-인간 Fc 항체를 플레이트에 부가한 후 다시 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고, 스트렙타비딘-HRP를 부가하여 45분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고 TMB 기질을 부가하였다. 약 15분 후, 정지 용액을 부가하였다. 웰은 마이크로플레이트 판독기에서 450 nm에서 판독되었다. 도 10b로부터 볼 수 있는 바와 같이, AMVX-110 (AAV2·N53-VEGF-트랩)으로 형질도입된 HEK293 세포로부터 수거된 세포 배양 상청액은 VEGF-트랩을 대략 800 ng/mL로 분비한 반면, 형질도입이 없는 HEK293 세포는 VEGF-트랩을 분비하지 않았다. 세포가 노화되기 전에 배양하는 동안 생산은 매일 증가하면서 계속되었다.
시험관 내에서 AAV2.VEGF -트랩 발현의 내구성
HEK293 및 ARPE-19 (인간 망막 색소 상피) 세포를 10% FBS와 함께 배양하고 세포당 MOI 100,000에서 AAV2·N53-VEGF-트랩 및 AAV2·N54-VEGF-트랩으로 형질도입하였다. VEGE-트랩 발현의 ELISA 정량화를 위해 샘플을 채취하였다. AAV2·N54-VEGF-트랩은 AAV2·N53-VEGF-트랩과 비교했을 때 더 나은 발현을 나타냈다 (도 11). 이러한 변이는 HEK293 세포에서보다 ARPE19 세포에서 현저히 더 낮게 관찰되었다. ARPE19 세포에서, 20일 후 N53-VEGF-트랩 구축물의 형질도입으로 인한 VEGF-트랩 발현은 무시할 수 있었다. 반대로, N54-VEGF-트랩 구축물의 형질도입으로 인한 VEGF-트랩 발현은 정량화할 수 있는 양으로 여전히 존재하였다. VEGF-트랩 발현은 ARPE19 세포와 비교하여 HEK293 세포에서 더 높았다.
마우스 효능 연구
효능을 확인하기 위해 구축물 AAV2.N54.120 (AVMX-110)을 3가지 상이한 용량으로 마우스에 투여하도록 선택하였다. 간단히 언급하면, 이러한 연구에는 6개의 군, 즉 비히클 (제형 완충액), 상업용 아일레아 (단백질), 1.6E+10 vg/눈으로 투여된 AAV2.N54-GFP (-), AVMX-110 낮은 용량 (2.0E+07 vg/눈), 중간 용량 (4.8E+08 vg/눈) 및 높은 용량 (1.6E+10 vg/눈)이 있었다. 도 29는 형광 혈관조영술 (FA) 데이터를 나타낸다. AAV2.N54-120의 중간 용량은 40 μg/눈으로 투여된 상업용 아플리베르셉트 (아일레아) 단백질과 비교하여 유사한 효능을 나타냈다.
아플리베르셉트 ELISA를 사용하여 안구 샘플 (국소 발현) 및 혈청 샘플 (전신 수준)에서의 아플리베르셉트의 발현 수준을 정량화하였다. 높은 용량의 구축물이 주사된 안구 샘플에서의 아플리베르셉트 발현은 검출가능한 발현을 보여주었다. 그러나, 다른 군에서는 검출가능한 아플리베르셉트 발현이 매우 낮거나 전혀 검출가능하지 않았다.
혈청형 선택
AAV (특히 AAV2) 중화 항체가 인간에게 널리 존재한다는 것은 널리 공지되어 있다. AAV2를 사용할 때의 또 다른 과제는 지향성 결여이다. 따라서, AAV1 및 AAV6 혈청형을 발현 수준에 대해 시험관 내에서 스크리닝하였고 (도 30 및 표 30), 효능 (FA 데이터, 도 31) 및 안구 조직에서의 아플리베르셉트 발현 (도 32 및 표 20)에 대해 생체 내에서 스크리닝하였다.
표 20. 안구 및 혈청 샘플에서의 아플리베르셉트 발현을 표 형식으로 표현함
Figure pct00022
LoQ = 정량화의 한계
아플리베르셉트 ELISA 방법을 수행했으며, 그러한 검정에 대한 LoQ는 2 ng/mL인 것으로 결정되었다. 2 ng/mL 미만인 값은 >LoQ로서 표시되었다. 표 20으로부터, 혈청 샘플에는 검출가능한 아플리베르셉트가 전혀 없었다는 결론을 내릴 수 있었다. 그러나, AAV6 및 AAV1은 안구 샘플에서 검출가능한 수준의 아플리베르셉트를 가지고 있었다.
AAV6.N54-아플리베르셉트를 마우스에 2.0E+07 (낮은 용량), 4.8E+08 (중간 용량) 및 1.6E+10 높은 용량으로 투여한 용량 반응 연구가 설계되고 시행되었다. 도 33은 상이한 군을 비교하기 위한 막대 그래프로서 FA 데이터를 나타낸다.
동물에게 5E+09 vg/눈의 AAV2, AAV1 및 AAV6-GFP를 주사하여 발현 및 침투성을 확인하였다. 이들 동물은 AAV2.N54-GFP에 비해 어떠한 우월성을 나타내지 않았다 (도 34).
상이한 혈청형을 비교하기 위해, 돼지에게 1E+11 vg/눈의 AAV1, AAV2 및 AAV6-GFP를 주사한 돼지 연구를 수행하였다. 이전 돼지 연구와 유사하게, V226 (+ 대조군)이 또한 포함되었다. 도 35는 대표적인 안저 및 IHC 영상을 나타낸다. 안저 영상화는 AAV1, AAV2 및 AAV6-GFP 주사된 동물에서 상대적으로 낮은 GFP 신호로 인해 제21일, 제28일 및 제34일에 수행되었다. 마지막으로, 제34일에 동물을 희생시키고, 선택된 눈에 대해 IHC를 수행하였다. GFP에 대한 시험관내 ELISA 검정은 AAV2.wt-GFP와 비교했을 때 AAV2.N54-GFP에서 GFP의 더 높은 발현을 나타내지 않았다 (도 36).
GOI 스크리닝 동안, AAV 구축물에서의 로트 간 가변성이 검출되었다. 예를 들어, N54.120 구축물을 여러 번 정제하고 -80℃에 저장하였다. 정제 프로세스는 상이한 용적의 출발 세포 배양물을 사용하는 것, 2주기의 초원심분리 (UC) 또는 AAVx 친화성 칼럼을 사용하여 정제하는 것, 세포 생육력 및 기타 배양 조건 변동 등 다양하였다. 표 21은 N54.120의 소수 로트에 대한 요약을 나타낸다.
표 21. N54.120 구축물에서의 로트 간 가변성의 비교
Figure pct00023
하기에는 형광 현미경 영상에서 포획된 예시적인 GFP 발현이 있으며 (도 37a) 또한 로트 간 가변성을 보여주는 GFP 정량화 ELISA (도 37b 및 표 22)를 사용하여 분석되었다. GFP 로트#20-147의 강도는 20-06-30-N54 로트보다 더 낮았지만, ELISA에서는 시험관 내에서의 GFP 발현에 있어 유의미한 차이를 보이지 않았다.
표 22. 상이한 N54- GFP 로트에 대해 GFP ELISA에 의해 결정된 GFP 농도
Figure pct00024
마우스 및 돼지 연구 후에, 캡시드 N54가 선택되고 AMI120 최적화된 GOI가 선택되었다. 동물 효능 연구에서는 상업용 아플리베르셉트와 필적하는 AAV 벡터 처리로 인한 상당한 레이저 손상 회복이 나타났다. AAV2 혈청형은 AAV6 혈청형보다 마우스 효능 CNV 모델에서 더 일관된 것으로 나타났다.
실시예 13. 동물 연구에 대한 바이오 분석 비교 결과
실시예 13은 모델의 재현성을 확인하기 위한 2가지 상이한 연구로부터 비롯된 마우스 안구 맥락막 신생혈관증식 (CNV) 또는 황반 신생혈관증식 (MNV) 효능 모델의 바이오 분석 비교를 예시한다. 두 연구 모두 유리체내 (IVT) 주사를 위해 동일한 역가와 용적의 비-GLP, AAV2 구축물을 사용하였다. 연구 프로토콜 또한 유사하였다 (표 23). AAV2 캡시드 정량화는 상업용 AAV2 캡시드 단백질 키트 [프로젠(Progen), Cat#: PRAAV2R 및 로트#: A20008]를 사용하여 수행되었다. 통계 분석을 위해서는, 그래프패드 프리즘 (v9.0.1)이 사용되었다.
표 23. 실시예 13에 대한 프로토콜 비교
Figure pct00025
비히클 = AAV 제형 완충액; AVMX-110 = AAV2.N54-120.
1: 1X PBS pH 8.0, 0.1 mM 시트르산나트륨, 0.001% 플루로닉 F-68
2: 150 mM NaCl, 20 mM 인산나트륨, pH 7.3, 0.01% 플루로닉 F-68
재료 및 방법
표 24는 마우스 연구로부터 수득된 혈청 및 안구 샘플의 수를 나타낸다.
표 24. 안락사 후 수득된 혈청 및 안구 샘플의 수 요약
Figure pct00026
532 nm 다이오드 레이저를 사용하여 시신경 주위에 4개의 단일 레이저 지점을 만들었다. 구축물 주사 또는 비히클로 인해 임의의 염증 반응이 유발된 경우, 레이저 시술로 인해 병변 (버블)이 생성되지 않는다. 버블이 없으면, 이러한 지점은 분석에 사용되지 않는다. 모든 눈에 대해, 4개의 레이저 지점이 유도되었고, 레이저 처리 후 7일에 병변의 크기를 추정하였다. 병변은 다양한 구축물의 유전자 산물의 효과로 인한 상처 치유에 상응한다. 모든 군에는 8마리의 동물이 사용되었으며, 각각의 눈당 4개의 레이저 지점이 있는 16개의 눈에 상응하여 총 64개의 레이저 지점이 생성되었다. 표 25는 AVMX-110 또는 비히클 대조군을 주사한 각각의 군에서 버블 없음의 수를 요약한 것이다.
표 25. 생성된 총 64개의 레이저 지점 중 버블 없음의 수
Figure pct00027
망막/RPE/맥락막/공막으로 이루어진 안배 샘플을, 상기 연구 둘 다에 대한 연구 프로토콜에 기재된 바와 같이, 프로테아제 억제제가 없는 1X PBS 및 BSA를 사용하여 균질화시켰다. 각각의 안구 샘플은 초음파처리기를 21초 펄스 및 30초 간격으로 5-6회 반복 사용하여 추가로 균질화시켰다. 육안으로 볼 수 있는 청정한 상청액이 수득되면, 샘플을 13,000 rpm에서 3분 동안 원심분리하였다. 그런 다음 상청액을 수집하여 VEGF-트랩 수준을 결정하는데 사용하였다.
FA 분석 비교
레이저 손상 7일 후, 각각의 마우스의 양쪽 눈을 FA로 병변 면적에 대해 분석하였다. 처리된 마우스에서 AVMX-110의 유전자 산물은 비히클 대조군 처리된 마우스와 비교 시 레이저 손상을 감소시킬 것으로 예상되었다. 도 38 및 표 26은 레이저 병변 회복에서 AVMX-110의 효능의 비교를 나타낸다. 두 연구 모두에서, AVMX-110 처리된 마우스는 동일한 레이저 상처 회복을 보였다. 두 연구에 대한 면적 기준선에서의 변동이 있었지만, AVMX-110 처리된 동물은 거의 동일한 병변 회복을 보였다. FA 영상 분석으로부터의 대표적인 영상 또한 도 39 병변 면적에서의 유사한 감소를 나타낸다.
표 26. 병변 면적의 표 형식 비교
Figure pct00028
혈청 샘플 중의 VEGF -트랩 수준 비교
혈청 샘플을 희석하지 않고 96-웰 플레이트에 직접 넣었다. 도 39a는 혈청 샘플 중의 VEGF-트랩 수준을 나타낸다. 혈청 샘플 중의 VEGF-트랩 수준은 적격한 VEGF-트랩 ELISA의 정량 한계보다 낮았다.
안구 샘플 중의 VEGF -트랩 수준
안구 샘플 중의 VEGF-트랩은 ELISA로 정량화되었으며 ng/mL로서 직접 플롯팅되었다. 조직 중량 mg당 VEGF-트랩 농도는 ELISA로 결정된 VEGF-트랩의 절대량을 결정하고, 이를 안구 조직이 균질화된 용적으로 나눔으로써 계산되었다. 그런 다음 계산된 양을 조직 중량으로 나누어 안배당 VEGF-트랩의 pg를 결정하였다. VEGF-트랩 데이터를 플롯팅하였고 (도 39b), 혈청 및 안구 샘플에 대한 VEGF-트랩 수준을 표 31에 기록하였다 (그 값이 LoQ 미만이었기 때문에 비히클 샘플은 표로부터 제외되었다). 전반적으로, 모든 혈청 및 안구 샘플에서의 VEGF-트랩 발현은 매우 낮았고, 대부분의 동물은 VEGF-트랩 ELISA의 정량 한계 미만이었다.
표 31. 안구 샘플 중의 VEGF -트랩 수준
Figure pct00029
VEGF -트랩 농도와 레이저 처리 후 회복된 면적 간의 상관관계 분석
병변의 존재는 픽셀 단위의 면적으로서 측정되었다. 병변 픽셀 데이터를 안배당 VEGF-트랩의 pg에 대항하여 플롯팅하고, 상관관계는 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 사용하여 95% 신뢰 구간에서 양측 p 값 추정과 피어슨(Pearson) 상관관계를 사용하여 계산되었다. 도 40a는 두 실험 간의 비교를 나타낸다. 두 분석 모두 VEGF-트랩 농도와 병변 픽셀 면적의 음의 상관관계를 보여주었다. 이러한 데이터는 더 낮은 병변 면적 (픽셀)이 더 높은 VEGF-트랩 농도와 연관되어 있다는 것을 나타낸다. 두 연구 모두에 대한 상관관계 계수 및 p 값이 표 32에 기록되어 있다.
표 32. 상관관계 계수 및 p 값
Figure pct00030
두 연구에서의 AAV2 캡시드 단백질 수준 비교
AAV2 캡시드 검정은 AAV2 캡시드 ELISA 키트를 사용하여 수행되었다. 또한 두 연구 모두에서 AAV2 캡시드 단백질 수준은 필적하였다 (도 40b). 그러나, 두 연구 모두에서 안구 샘플의 용적이 샘플마다 크게 다르며 전반적인 캡시드 단백질 추정에 영향을 미친다는 점에 유의하는 것이 중요하였다.
FA 영상과 병변 면적 분석 결과는 두 연구 간에 일관성을 보였다. 비히클 군에서는 "버블 없음"이 더 많았다. 안구 샘플 중의 VEGF-트랩 수준의 경우, 많은 데이터 포인트가 정량 한계 미만이었다. 상기 검정의 LoQ는 ~2 ng/mL였다. 이러한 LoQ 값은 상업적으로 입수가능한 키트 (~5-6 ng/mL)보다 더 낮았다. 이들 연구에서, 안구 샘플은 전체 눈이 아닌 안배로 이루어졌으며, 이는 샘플 중의 VEGF-트랩의 용적과 수준에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 향후 연구에는 눈 전체를 포함하기로 결정하였다. VEGF-트랩과 유사하게, AAV2 캡시드 단백질 ELISA도 샘플의 용적에 영향을 받았다. 상업용 아플리베르셉트 (40 μg/눈)를 참조 및 양성 대조군으로서 주사하였다. 4.0E+08 vg/눈의 AVMX-110은 상업용 아플리베르셉트와 유사한 병변 회복을 보여주었다. 이들 두 연구 결과가 유사했기 때문에, 이러한 AVMX-110 용량은 상업용 아플리베르셉트와 유사한 결과를 보였다고 결론 내릴 수 있었다. 전반적으로, 마우스 MNV 모델은 더 큰 동물 모델, 예컨대 NHP로 진행하기 전 초기 구축물 스크리닝을 위한 관련 모델이었다.
실시예 14. 레이저 유도 맥락막 신생혈관증식 ( CNV ) 모델에서 아플리베르셉 트 (AVMX-116)를 코딩하는 변형된 아데노-연관 바이러스 (AAV6.N54-120)의 효능
실시예 14는 군 1-5에서 아데노-연관 바이러스 벡터의 상이한 혈청형을 사용하여 마우스에서 레이저 유도 맥락막 신생혈관증식 모델 (LCNV)에서 신생혈관증식의 억제를 평가하고, 군 6-8에서 마우스 망막 조직에서의 AAV6-N54-GFP, AAV1-N54-GFP 및 AAV2.N54-GFP의 분포를 평가하는 것을 예시하며; 두 마리의 나이브 동물 (군 9)이 방법 개발 및 바이오 분석 노력에 포함되었다. 표 33은 실험 설계를 예시한다.
표 33. 실험 설계
Figure pct00031
Figure pct00032
약어: CNV - 맥락막 신생혈관증식; IVT - 유리체내; OU - 양쪽 눈. 군 1-5의 경우, n=8마리 마우스/군은 제-28일에 시험 물질의 IVT 주사를 받은 후, 레이저 유도 맥락막 신생혈관증식을 겪을 것이며; n=2마리 동물/군은 IVT 주사만 받고 약동학적 ELISA 분석을 위해 프로세싱된다. 모의 벡터는 GOI (아플리베르셉트)의 오픈 리딩 프레임 (ORF)이 붕괴된 AVMX-110의 비-발현 벡터이다.
방법
제28일에, 마우스에게 부프레노르핀 0.01-0.05 mg/kg을 피하 (SQ) 투여하였다. 그런 다음 흡입된 이소플루란을 유리체내 주사하기 위해 동물을 진정시키고 0.5% 프로파라카인 HCl 한 방울을 양쪽 눈에 도포하였다. 듀몬트 #4 겸자를 사용하여 결막을 가볍게 잡고, 33 G 바늘과 해밀턴 시린지를 사용하여 주사하였다. 시린지 내용물을 투여한 후, 시린지 바늘을 천천히 빼냈다. 주사 절차 후, 오플록사신 안과용 용액 한 방울을 눈 윤활제와 함께 안구 표면에 국소적으로 도포하였다.
제0일에, 마우스에게 부프레노르핀 0.01-0.05 mg/kg을 SQ 투여하였다. 국소 산동제 (1.0% 트로피카미드 HCl 및 2.5% 페닐에프린 HCl)를 레이저 시술 전 적어도 15분에 도포하였다. 케타민/크실라진을 복강내 (IP) 주사하여 마우스를 진정시켰다. 국소 안약을 사용하여 각막을 촉촉하게 유지하고, 핫 패드를 사용하여 체온을 유지하였다. 세극등을 통해 전달된 532 nm 다이오드 레이저를 사용하여 시신경 주변에 4개의 단일 레이저 지점을 만들었다. 실험 설계의 스케줄에 따라 마우스의 양쪽 눈 모두 레이저 처리되었다. 레이저 후에 눈 윤활제를 놓았다 (OU). 이환율과 사망률은 케이지 측면 관찰과 함께 매일 관찰되었으며, 특히 양쪽 눈에 주의를 기울였다. 동물 436번 (군 4)은 영상화 절차 전 제7일에 사망하였다. 모든 동물의 기준선 체중은 25.1 ± 1.5 g이었다. 모든 군의 동물은 연구 과정 동안 정상적인 체중 증가가 있었다.
군 1-5 및 9로부터의 샘플은 드라이 아이스 위에서 배송되거나 저장되었다. 약동학적 분석을 위해 할당된 동물 (n=2마리/군)은 아플리베르셉트 정량화를 위한 LCNV 유도를 거치지 않았다. 안구 샘플 (즉, 안구 전체)을 적출하고, 단리한 후 동결시키고 무게를 측정하였다. 표 34는 균질화 전에 각각의 샘플에 부가된 프로테아제 억제제 (PI)가 포함된 1X PBS의 용적와 조직 중량에 대한 자세한 문서를 나타낸다. 샘플을 얼음 위에 놓고 초음파 분쇄기를 사용하여 20초 펄스 후 20초 휴지기를 사용하여 3주기 동안 균질화하였다. 초음파 처리 후, 샘플을 얼음 위에 두었다.
표 34. 조직 중량 및 PBS 용적
Figure pct00033
안구 (눈 전체) 및 혈청 샘플에서의 아플리베르셉트 발현은 아플리베르셉트 ELISA를 사용하여 정량화되었다. 간단히 언급하면, 0.1 μg/mL VEGF를 96-웰 플레이트 상에 코팅하고 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척 완충액으로 세척하고 차단 완충액으로 차단하였다. 안구 및 혈청 샘플은 군 5 샘플 (1:5, 1:10 및 1:100 희석도)을 제외하고 어떠한 희석도 없이 지정된 웰에 직접 전달되었다. 샘플을 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고 검출 항체를 1:40,000 희석도로 각각의 웰에 부가하였다. 1시간 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 세척하고 스트렙타비딘-서양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)를 1:40,000 희석도로 부가하였다. 45분 동안 인큐베이션한 후, 플레이트를 세척하고, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB) 기질을 부가하여 아플리베르셉트를 검출하였다. 정지 용액을 부가하여 반응을 정지시키고, 플레이트를 참조 파장 600 nm와 함께 450 nm에서 즉시 판독하였다.
모의 벡터 대조군으로 처리된 동물과 미처리된 동물에서의 아플리베르셉트 발현은 유사하였다. 군 3에서, AAV6.N54-아플리베르셉트를 주사한 동물에서는 약 2.3 pg 아플리베르셉트/mg 안구 균질액이 측정되었다 (도 41a). AAV2 및 AAV6.N54-아플리베르셉트에 대한 중간 범위 수준은 각각 약 8.8 및 약 25 pg 아플리베르셉트/mg 안구 균질액을 가졌고, 이는 AAV6 처리된 동물에 대해 3배 상승된 발현이었다. 높은 용량 AAV6-처리된 동물은 약 400 pg 아플리베르셉트/mg 안구 균질액으로 가장 높은 수준의 아플리베르셉트를 나타냈다. 혈청 샘플은 안구 조직 샘플과 유사한 경향을 따랐다. 군 1 (모의), 2 (AAV2-아플리베르셉트) 및 3 (AAV6-낮은 용량)에서는 검출가능한 아플리베르셉트가 없었다. 중간 및 높은 용량 AAV6-아플리베르셉트 처리된 동물 모두는 혈청에서 2-3 ng/mL 아플리베르셉트를 나타냈다 (도 41b). 데이터는 일원 ANOVA에 이어 던넷 다중 비교를 사용하여 그래프패드 프리즘 소프트웨어에서 분석되었다 (** = 0.005 및 **** = <0.0001). 아플리베르셉트 발현은 표 35 (AAV1.N54-아플리베르셉트 및 AAV6.N54-아플리베르셉트가 AAV2.N54-아플리베르셉트보다 30배 더 높은 아플리베르셉트를 발현했다는 것을 나타냄) 및 표 36에 나와 있다.
표 35. 3개의 AAV 벡터에 의한 마우스에서의 아플리베르셉트 발현 수준
Figure pct00034
표 36. 안구 균질액 및 혈청 샘플에서의 아플리베르셉트 발현
Figure pct00035
*≤LoQ=2 ng/mL
안저 영상화 (군 6-8, 제0일)
EGFP에 대한 컬러 및 코발트 블루 안저 영상화를 군 6-8에 등록된 동물로부터의 양쪽 눈에 대해 수행하였다. 눈을 확장하고 안위시키기 위해 동물에게 국소 산동제 (1.0% 트로피카미드 HCl 및 2.5% 페닐에프린 HCl)를 투여하고 눈에 국소 마취제 (프로파라카인 0.5%)를 도포하였다. 컬러 안저 사진 촬영에 이어 코발트 블루 사진 촬영이 이어졌다. 획득 설정은 군 7 (양성 대조군)로 설정되었으며 군 6 및 8에 걸쳐 일관되게 유지되었다. 대표적인 영상이 도 42에 있다. 3개 군 모두에서 GFP 신호가 관찰되었다. 군 7 (양성 대조군)에서 가장 강하고 밝았으며, 그 다음은 군 8이고, 그 다음은 군 6이었다. 모든 연구에 걸쳐 노출 시간을 일관되게 유지했음에도 불구하고 이전 연구에서 관찰된 것보다 발현이 더 제한되었다.
플루오레세인 혈관조영술 (FA)
FA는 레이저 후 제7일에 양쪽 눈에 수행되었다. FA에 대한 산동증은 검사 15분 전에 각각의 눈에 국소 점안제를 사용하여 달성되었다 (1.0% 트로피카미드 HCl 및 2.5% 페닐에프린 HCl). 케타민/크실라진의 IP 주사로 마우스를 진정시켰다. 망막 사진 촬영은 플루오레세인 나트륨 정맥내 주사 (1% 원액; 12 mg/kg) 후 대략 1분에 수행되었다. 플루오레세인 누출은 ImageJ 소프트웨어로 분석되었으며; 병변을 보여주는 대표적인 영상은 하기 도 43에 나와 있다. 혈관조영상을 사용하여 병변 면적을 픽셀, 2.5 표준 편차 (SD)로서 정량화했으며, 그 결과를 도 44에 표시하였다. 이소렉틴 면적 크기를 분석할 때, 브루크막이 파열되지 않은 병변, 유리체 출혈이 관찰된 병변, 또는 데이터 포인트가 평균으로부터 2.5 표준 편차 초과인 병변은 제외되었다. 군 5 (AVMX-116의 최고 용량) 시험 물질은 군 2 AVMX-110 (양성 대조군)보다 성능이 우수하여, 모든 군 중 병변 면적이 가장 낮았다. 통계 분석은 그래프패드 프리즘 소프트웨어 상에서 일원 ANOVA에 이어 던넷 다중 비교를 통해 수행되었다 (* = 0.0138).
본 연구로부터의 데이터를 이전 연구와 비교했을 때, 눈 전체의 균질화가, 안배 단독과 비교했을 때 아플리베르셉트 발현 추정에 있어 우수하여 정량화의 정확도를 높였다. AAV6.아플리베르셉트로부터의 안구 샘플은 바이러스 벡터 용량의 20배 증가와 함께 단백질 발현의 약 10배 증가를 나타냈고, AAV2와 비교했을 때 AAV6 구축물은 아플리베르셉트 발현에 있어서 3배 증강을 보여주었다. 중간 용량 또는 높은 용량 AAV6.아플리베르셉트를 투여받은 동물은 혈청 샘플에서 상당한 아플리베르셉트 발현을 명확하게 보여주었다. 이러한 연구에 따르면, 양성 대조군인 AVMX-110을 IVT 주사한 동물에서 플루오레세인 혈관조영술 (FA)을 통해 평가한 평균 CNV 병변 크기가 크게 감소한 것으로 나타났으며, 이는 동일한 구축물을 활용한 다른 연구와 일치한다.
안구 조직 수집 및 프로세싱
제7일에, 동물을 이산화탄소 질식을 통해 인도적으로 안락사시켰으며, 경추 탈구로 사망을 확인하였다.
플랫마운트 분석을 위한 조직 수집 (군 1-5 단독)
눈을 적출하고 즉시 인산염 완충 식염수 (PBS) 중의 4% 파라포름알데히드에 고정시키며, 4℃에서 밤새 저장하였다. 그 다음날, 프로세싱될 때까지 눈을 차가운 면역세포화학 (ICC) 완충액 (0.5% BSA 및 0.2% Tween 20을 함유하는 PBS)으로 옮겼다. 해부 현미경을 사용하여, 눈에서 외부 조직을 조심스럽게 트리밍하고, 안구 앞부분과 수정체를 제거하였다. 망막을 박리하고 미세한 곡선 가위를 사용하여 시신경 두부로부터 제거하였다. 안배를 차가운 ICC 완충액으로 세정하였다. 안배를 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI; 핵 염색) 이소렉틴 IB4 알렉사플루오르(AlexaFluor) 649 [혈관; 벡터 랩스(Vector Labs) cat# DL-1208-.5] 및 팔로이딘 알렉사플루오르 555 (f-액틴; 써모피셔 A34055)를 함유하는 차가운 ICC에 놓아 두었다. 안배를 4℃에서 4시간 동안 부드럽게 회전하면서 인큐베이션하고 차가운 ICC 완충액으로 세척하였다. 그런 다음 병변을 피하면서 시신경 두부 방향으로 방사상 커팅을 하고, 공막-맥락막/RPE 복합체를 편평하게 장착하고, 덮은 다음 밀봉하였다. 2차원 (2D) 형광 현미경 영상을 획득하고, 디지털화하며, 올림푸스 Bx63 직립 형광 현미경 및 셀센스 (올림푸스) 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 획득 후 분석은 셀센스 소프트웨어를 사용하여 수행되었다. 새로 형성된 혈관을 정량화하기 위해, 이소렉틴 IB4 면적을 μm2 단위로 측정하였다. 이소렉틴 병변 면적 측정으로부터의 대표적인 영상이 도 45에 있다.
이소렉틴 면적 크기를 분석할 때 (도 46), 브루크 막이 파열되지 않은 병변, 유리체 출혈이 관찰된 병변, 또는 데이터 포인트가 평균으로부터 2.5 표준 편차 초과인 병변은 제외되었다. 군 1 동물은 60,900 ± 38,500 μm2로 가장 큰 병변 면적을 보인 반면, 군 5는 18,700 ± 7,200 μm2로 가장 작은 병변 면적을 보였으며, 이는 병변 면적이 70% 감소하였다. 양성 대조군은 다른 연구와 유사하게 수행되었으며, 병변 면적은 모의 벡터 대조군보다 30% 더 작았다. 통계 분석은 일원 ANOVA에 이어 던넷 다중 비교를 사용하여 수행되었다 (*** = 0.0001 및 **** = <0.0001).
면역조직화학을 위한 조직 수집 (군 6-8 단독)
면역조직화학 (IHC)을 위해 지정된 모든 눈을 적출하고, 대략적인 주사 부위를 표시한 후, 조직을 1x PBS에 넣었다. 눈을 별도 라벨이 붙은 바이알에 담긴 4% 파라포름알데히드에 밤새 4℃에서 고정시켰다. 그런 다음 눈을 0.1 M 인산염 완충액 (PB)으로 옮기고, 순차적인 수크로스 구배 (10-30%, 각각 1시간)를 거친 후, OCT 배지에 포매하고 드라이 아이스에서 동결시켰다. 전체 눈을 냉동절편화하고 (14 μm 절편), 하기 항체: 1/250 닭 항-GFP, 1/250 토끼 항-RPE65, 및 이어서 1/200 항-닭 Cy2, 1/200 항-토끼 Cy3, 1/100 PNA 렉틴 Cy5, 및 1/1,000 DAPI로 염색하였다.
군 6과 7은 가장 밝고 가장 넓은 GFP 신호를 가졌으나, 군 8도 GFP 신호를 가졌다. 모든 군에서, GFP 발현은 시신경 근처 망막 중앙 부분에 국한되는 경향이 있었지만, 약간의 지리적 가변성이 있었다. 발현은 신경절 세포층으로부터 내부 세그먼트를 통해 일관되게 관찰되었으며, 외부 세그먼트와 망막 색소 상피에서는 덜 일관되게 나타났다. 염색된 냉동절편에서 보이는 GFP 신호는 안저 영상화에서 보이는 GFP 신호와 일치하였다. 856 OD에서 나타난 RPE 염색은 표준 IVT 주사 후 RPE로의 AAV의 형질도입으로 인한 것인 반면, 마우스 652 OS의 RPE에서 관찰된 GFP 발현은 유리체내 공간이 아닌 망막하 공간으로의 AAV의 의도하지 않은 전달로 인해 증강되었을 수 있다. 제0일 IHC의 대표적인 영상이 도 47에 나와 있다. 도 48a는 실시예 14의 용량 반응 연구로부터 수득된 영상의 플랫마운트 분석을 예시한다. 도 48b는 실시예 14의 용량 반응 연구로부터 수득된 영상의 형광 혈관조영술 (FA) 분석을 예시한다.
실시예 15. AVMX 제형 및 효능 연구
AVMX-110은 액상 혼합 멸균 바이알 내로 제형화되었다. IVT 주사용 용액을 위한 AVMX-110 의약품 농축물은 13 mm 회색 브로모부틸 마개와 13 mm 플립-오프 알루미늄 씰이 있는 1 mL의 13 mm 시클릭 올레핀 공중합체 (COC) 바이알에 저장된 멸균 동결된 액상 제형으로서 제조되었다. 각각의 바이알은 적어도 50 μL (밀도 1.01 g/mL)의 추출 용적을 허용하기 위해 100 μL의 표적 중량이 되도록 채워졌다. 상기 의약품은 ≥4.0 x 1012 vg/mL의 농도로 공급되었다. 임상 사용을 위해, 의약품을 해동하고 제공된 필터 바늘을 사용하여 무균적으로 회수하고, 망막 전문의가 IVT를 통해 환자에게 전달하였다.
AVMX-110: AAV2·N54-VEGF-트랩을 사용한 효능 연구는 표 37에 제시된 프로토콜을 기반으로 수행되었다. 마우스에서 AVMX-110의 효능은 레이저 유도 맥락막 신생혈관증식 (LCNV) 모델을 사용하여 평가되었다.
표 37. 마우스 LCNV의 실험 설계
Figure pct00036
동물을 최소 3일 동안 연구 환경에 순응시켰다. 순응 기간이 끝나면, 연구 참여에 대한 적합성을 결정하기 위해 실험실 동물 기술자가 각각의 동물을 물리적으로 검사하였다. 검사는 피부 및 외부 귀, 눈, 복부, 거동, 및 일반적인 신체 상태를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 건강 상태가 양호하다고 판단된 동물을 연구에 투입하였다. 동물 무작위 배정, 유리체내 주사, 레이저 유도 CNV 절차, 동물 검사, 플루오레세인 혈관조영술 (FA), 안구 조직 수집 및 플랫 마운트 (n=6마리 마우스/군)가 프로토콜에 설명되어 있다. 또한, 모든 마우스는 형광 혈관조영술 (FA)로 관찰하고 플랫 마운트를 수집한 후 혈청과 망막 조직을 수집하기 위해 말기 채혈을 하였다.
FA 분석에서, 아플리베르셉트를 40 μg/눈으로 투여받았거나 또는 AVMX-110이 IVT 주사된 동물은 병변 면적이 유의미하게 감소된 것으로 나타났다 (도 49a). AVMX-110 군의 경우, 병변 면적 감소 값은 벡터 게놈 카피 (vg)의 용량과 역의 상관관계가 있었고 (4e+8 vg/눈의 경우 P<0.01이고, 1.6e+10 vg/눈의 경우 P<0.001이다), 벡터가 더 많이 주사될수록 레이저 샤이닝 후 7일에 관찰된 손상된 면적은 더 작아졌다 (표 38). 1.6e+10 vg/눈의 경우에는, 레이저 손상의 완전한 치유가 달성되었다. 도 49b는 AVMX-110 투여 연구로부터의 영상의 FA 분석을 예시한다.
표 38. LCNM에서 AVMX -110 효능의 통계 분석
Figure pct00037
안락사 후, 군 1-5 및 군 9의 동물은 혈청 단리를 위해 혈액을 수집하고, 눈을 적출하고 급속 동결시켰다. 눈을 미리 무게가 측정된 적절히 라벨링된 분석 바이알에 놓아두고, 즉시 무게를 다시 측정하여 샘플 중량을 결정하고, 냉동고로 옮길 때까지 드라이 아이스 위에 두었다. 소수점 이하 4자리까지 측정할 수 있는 저울로 샘플의 무게를 측정하였다. 급속 동결 및 칭량 후, 샘플을 -80℃ 냉동고에 다시 넣었다. 혈청 및 망막 조직 중의 VEFG-트랩 농도를 ELISA 검정으로 시험하였다. 눈을 적출하고 망막 및 RPE/맥락막 세그먼트를 신선한 눈으로부터 절개하고 급속 동결시켰다. 조직을 미리 무게가 측정된 적절히 라벨링된 분석 바이알에 놓아두고, 즉시 무게를 다시 측정하여 샘플 중량을 결정하고, 냉동고로 옮길 때까지 드라이 아이스 위에 두었다. 소수점 이하 4자리까지 측정할 수 있는 저울로 샘플의 무게를 측정하였다.
샘플은 ELISA를 사용하여 검정되었다. VEGF-트랩은 아플리베르셉트 대조군의 경우 ~50 ng/mL였으며, 높은 용량 군 (1.6e10 vg/눈)의 혈청에서는 ~2 ng/mL의 낮은 수준의 VEGF-트랩이 검출되었으며, 낮은 용량 및 중간 용량 군에서는 검출가능하지 않았다 (도 51a). 망막 조직 중의 VEGF-트랩 수준은 또한 ELISA를 사용하여 망막 균질액에서 측정되었다 (도 51b). 망막 조직 현탁액에서, VEGF-트랩의 발현은 유리체내로 주사된 AVMX-110에 대해 우수한 용량 의존적 방식으로 나타났다. 1.6e10 vg/눈의 높은 용량 군에서는 평균 13 ng/mL의 VEGF-트랩이 검출되었다. 가장 높은 발현 수준은 40 ng/mL 초과에 도달하였다.
전술한 개시내용은 명확성 및 이해를 위해 일부 상세히 기재되었지만, 본 개시내용의 판독으로부터 관련 기술분야의 통상의 기술자에게는, 본 개시의 진정한 범위를 벗어나지 않으면서 형태 및 세부사항에 있어서 다양한 변화가 이루어질 수 있음이 명백할 것이다. 예를 들어, 상기 기재된 모든 기술과 장치는 다양한 조합으로 사용될 수 있다. 본 출원에 인용된 모든 간행물, 특허, 특허 출원 및/또는 기타 문헌은, 각각의 개별 간행물, 특허, 특허 출원 및/또는 기타 문서가 모든 목적을 위해 참조로 포함되도록 개별적으로 및 별도로 표시된 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해 그 전체 내용이 참조로 포함된다.
서열 표
Figure pct00038
Figure pct00039
Figure pct00040
Figure pct00041
Figure pct00042
Figure pct00043
Figure pct00044
Figure pct00045
Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
Figure pct00049
Figure pct00050
Figure pct00051
Figure pct00052
Figure pct00053
Figure pct00054
Figure pct00055
Figure pct00056
Figure pct00057
Figure pct00058
Figure pct00059
Figure pct00060
Figure pct00061
Figure pct00062
Figure pct00063
Figure pct00064
Figure pct00065
Figure pct00066
Figure pct00067
Figure pct00068
Figure pct00069
Figure pct00070
Figure pct00071
Figure pct00072
Figure pct00073
Figure pct00074
Figure pct00075
Figure pct00076
SEQUENCE LISTING <110> AVIRMAX, INC. <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR OCULAR TRANSGENE EXPRESSION <130> 59561-703.601 <140> <141> <150> 63/173,280 <151> 2021-04-09 <160> 70 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 1 atccagcctc cggactctag agttaactgg taagtttagt 40 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 2 tggggttgat ctctccccag catgccacac aaaaaaccaa 40 <210> 3 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 3 tacatttcta caaaaggtct accagtatcg cactgcacgc ccttaagga 49 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 4 gatactggta gaccttttgt ag 22 <210> 5 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 5 gttgccttta cttctaggcc tgccgccacc atggtgagct actgggac 48 <210> 6 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 6 taatgaaaat aaagatattt tattttcgaa tcacttgccg gggctcagg 49 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 7 gacaccggca gacccttcgt gg 22 <210> 8 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 8 acgaagggtc tgccggtgtc gcactgcacg cccttaagga 40 <210> 9 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 9 taatgaaaat aaagatattt tattttcgaa tcacttgccg gggctcagg 49 <210> 10 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 10 taatgaaaat aaagatattt tattttcgaa tcacttgcca gggctcagg 49 <210> 11 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 11 taatgaaaat aaagatattt tattttcgaa tcacttgccg ggggacagg 49 <210> 12 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 12 Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser 1 5 10 15 Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser Ser Gly Ser Asp Thr Gly Arg Pro 20 25 30 Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu 35 40 45 Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr 50 55 60 Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys 65 70 75 80 Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr 85 90 95 Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His 100 105 110 Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile 115 120 125 Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu 130 135 140 Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile 145 150 155 160 Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu 165 170 175 Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe 180 185 190 Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu 195 200 205 Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr 210 215 220 Phe Val Arg Val His Glu Lys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 225 230 235 240 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 245 250 255 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 260 265 270 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 275 280 285 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 290 295 300 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 305 310 315 320 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 325 330 335 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 340 345 350 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 355 360 365 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 370 375 380 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 385 390 395 400 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 405 410 415 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 420 425 430 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 435 440 445 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 <210> 13 <211> 6971 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 13 cattcgccat tcaggctgca aataagcgtt gatattcagt caattacaaa cattaataac 60 gaagagatga cagaaaaatt ttcattctgt gacagagaaa aagtagccga agatgacggt 120 ttgtcacatg gagttggcag gatgtttgat taaaaacata acaggaagaa aaatgccccg 180 ctgtgggcgg acaaaatagt tgggaactgg gaggggtgga aatggagttt ttaaggatta 240 tttagggaag agtgacaaaa tagatgggaa ctgggtgtag cgtcgtaagc taatacgaaa 300 attaaaaatg acaaaatagt ttggaactag atttcactta tctggttcgg atctcctagg 360 ctcaagcagt gatcagatcc agacatgata agatacattg atgagtttgg acaaaccaca 420 actagaatgc agtgaaaaaa atgctttatt tgtgaaattt gtgatgctat tgctttattt 480 gtaaccatta taagctgcaa taaacaagtt aacaacaaca attgcattca ttttatgttt 540 caggttcagg gggaggtgtg ggaggttttt taaagcaagt aaaacctcta caaatgtggt 600 atggctgatt atgatcctct agtacttctc gacaagctcg gatcctggcg cgctcgctcg 660 ctcactgagg ccgcccgggc aaagcccggg cgtcgggcga cctttggtcg cccggcctca 720 gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg gccaactcca tcactagggg ttcctaggaa 780 gctgatctga attcggtacc cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg 840 cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata 900 gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta 960 catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc 1020 gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac 1080 gtattagtca tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga 1140 tagcggtttg actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg 1200 ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg 1260 caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctcg tttagtgaac 1320 cgtcagatcg cctggagacg ccatccacgc tgttttgacc tccatagaag acaccgggac 1380 cgatccagcc tccggactct agagttaact ggtaagttta gtctttttgt cttttatttc 1440 aggtcccgga tccggtggtg gtgcaaatca aagaactgct cctcagtgga tgttgccttt 1500 acttctaggc ctgccgccac catggtatcc tattgggata cgggtgttct cttgtgtgca 1560 ctcctttcct gtctcctgct cactggatct tcttctgggt ctgatactgg tagacctttt 1620 gtagaaatgt attcagaaat tccggaaata attcatatga cagaaggacg agaactcgtt 1680 ataccatgtc gcgtcacgtc ccctaatatt actgttacgc tcaagaagtt tcctctcgat 1740 acacttattc cagatgggaa acgcataatt tgggattcac gcaaagggtt tattattagt 1800 aacgcaacgt ataaagaaat tgggctgctc acatgtgaag ctacggtaaa tgggcatctt 1860 tataaaacaa attatttgac tcatcggcaa actaatacta ttatcgatgt agtactctcc 1920 ccatcccatg gtattgaatt gtcagttggg gagaagttgg tattgaattg tactgcacgg 1980 acagaactca acgttggtat tgattttaat tgggaatatc catcatctaa acatcagcat 2040 aagaagttgg taaatcgtga tctcaaaact caaagtgggt ccgaaatgaa gaagtttctg 2100 tccacactta cgattgatgg ggtcactaga agtgatcaag ggctctatac gtgtgcagca 2160 tctagtgggt tgatgacaaa gaagaattca acttttgttc gtgtccatga aaaggataaa 2220 acacatactt gtccaccgtg tcctgcgcca gaacttctcg gtggtccatc cgtctttctc 2280 tttccaccta aaccaaaaga tactttgatg atttcacgga ctccagaagt aacatgtgtt 2340 gtcgttgatg tatcacacga agatccagaa gtcaaattta attggtatgt tgatggtgta 2400 gaagttcata atgcgaagac aaaaccacga gaagaacaat acaatagtac atatcgggta 2460 gtatccgtct tgactgtact tcaccaagat tggcttaatg ggaaagaata caaatgtaaa 2520 gtttctaata aagctcttcc tgcgccgatc gaaaagacaa tttccaaagc aaaaggtcaa 2580 cctcgggaac ctcaagttta tacgctccca ccatcacggg atgaactcac taagaatcaa 2640 gtatccttga cttgtctcgt aaaagggttt tatccttcag atattgctgt agaatgggaa 2700 tccaatgggc aaccagaaaa taattataaa acaacaccac ctgttcttga ttcagatggt 2760 tcattctttc tctattccaa acttactgtc gataaatcac gctggcaaca aggtaatgtt 2820 ttctcttgtt ccgtcatgca tgaagcactc cataatcact atacgcaaaa gtctctctct 2880 ctctcaccag gtaaataata attcgaaaat aaaatatctt tattttcatt acatctgtgt 2940 gttggttttt tgtgtggcat gctggggaga gatcaacccc actccctctc tgcgcgctcg 3000 ctcgctcact gaggccgggc gaccaaaggt cgcccgacgc ccgggctttg cccgggcggc 3060 ctcagtgagc gagcgagcgc gcagcaagct gtagccaacc actagaacta tagctagagt 3120 cctgggcgaa caaacgatgc tcgccttcca gaaaaccgag gatgcgaacc acttcatccg 3180 gggtcagcac caccggcaag cgccgcgacg gccgaggtct tccgatctcc tgaagccagg 3240 gcagatccgt gcacagcacc ttgccgtaga agaacagcaa ggccgccaat gcctgacgat 3300 gcgtggagac cgaaaccttg cgctcgttcg ccagccagga cagaaatgcc tcgacttcgc 3360 tgctgcccaa ggttgccggg tgacgcacac cgtggaaacg gatgaaggca cgaacccagt 3420 tgacataagc ctgttcggtt cgtaaactgt aatgcaagta gcgtatgcgc tcacgcaact 3480 ggtccagaac cttgaccgaa cgcagcggtg gtaacggcgc agtggcggtt ttcatggctt 3540 gttatgactg tttttttgta cagtctatgc ctcgggcatc caagcagcaa gcgcgttacg 3600 ccgtgggtcg atgtttgatg ttatggagca gcaacgatgt tacgcagcag caacgatgtt 3660 acgcagcagg gcagtcgccc taaaacaaag ttaggtggct caagtatggg catcattcgc 3720 acatgtaggc tcggccctga ccaagtcaaa tccatgcggg ctgctcttga tcttttcggt 3780 cgtgagttcg gagacgtagc cacctactcc caacatcagc cggactccga ttacctcggg 3840 aacttgctcc gtagtaagac attcatcgcg cttgctgcct tcgaccaaga agcggttgtt 3900 ggcgctctcg cggcttacgt tctgcccagg tttgagcagc cgcgtagtga gatctatatc 3960 tatgatctcg cagtctccgg cgagcaccgg aggcagggca ttgccaccgc gctcatcaat 4020 ctcctcaagc atgaggccaa cgcgcttggt gcttatgtga tctacgtgca agcagattac 4080 ggtgacgatc ccgcagtggc tctctataca aagttgggca tacgggaaga agtgatgcac 4140 tttgatatcg acccaagtac cgccacctaa caattcgttc aagccgagat cggcttcccg 4200 gccgcggagt tgttcggtaa attgtcacaa cgccgcgaat atagtcttta ccatgccctt 4260 ggccacgccc ctctttaata cgacgggcaa tttgcacttc agaaaatgaa gagtttgctt 4320 tagccataac aaaagtccag tatgcttttt cacagcataa ctggactgat ttcagtttac 4380 aactattctg tctagtttaa gactttattg tcatagttta gatctatttt gttcagttta 4440 agactttatt gtccgcccac acccgcttac gcagggcatc catttattac tcaaccgtaa 4500 ccgattttgc caggttacgc ggctggtctg cggtgtgaaa taccgcacag atgcgtaagg 4560 agaaaatacc gcatcaggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc 4620 gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa 4680 tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt 4740 aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa 4800 aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt 4860 ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg 4920 tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcaat gctcacgctg taggtatctc 4980 agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc 5040 gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta 5100 tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct 5160 acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc 5220 tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa 5280 caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa 5340 aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa 5400 aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt 5460 ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac 5520 agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc 5580 atagttgcct gactccccgt cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc 5640 cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata 5700 aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc 5760 cagtctatta attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc 5820 aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca 5880 ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa 5940 gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca 6000 ctcatggtta tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt 6060 tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt 6120 tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg 6180 ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga 6240 tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc 6300 agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg 6360 acacggaaat gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag 6420 ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg 6480 gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca cctgaaattg taaacgttaa tattttgtta 6540 aaattcgcgt taaatttttg ttaaatcagc tcatttttta accaataggc cgaaatcggc 6600 aaaatccctt ataaatcaaa agaatagacc gagatagggt tgagtgttgt tccagtttgg 6660 aacaagagtc cactattaaa gaacgtggac tccaacgtca aagggcgaaa aaccgtctat 6720 cagggcgatg gcccactacg tgaaccatca ccctaatcaa gttttttggg gtcgaggtgc 6780 cgtaaagcac taaatcggaa ccctaaaggg agcccccgat ttagagcttg acggggaaag 6840 ccggcgaacg tggcgagaaa ggaagggaag aaagcgaaag gagcgggcgc tagggcgctg 6900 gcaagtgtag cggtcacgct gcgcgtaacc accacacccg ccgcgcttaa tgcgccgcta 6960 cagggcgcgt c 6971 <210> 14 <211> 6947 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 14 cattcgccat tcaggctgca aataagcgtt gatattcagt caattacaaa cattaataac 60 gaagagatga cagaaaaatt ttcattctgt gacagagaaa aagtagccga agatgacggt 120 ttgtcacatg gagttggcag gatgtttgat taaaaacata acaggaagaa aaatgccccg 180 ctgtgggcgg acaaaatagt tgggaactgg gaggggtgga aatggagttt ttaaggatta 240 tttagggaag agtgacaaaa tagatgggaa ctgggtgtag cgtcgtaagc taatacgaaa 300 attaaaaatg acaaaatagt ttggaactag atttcactta tctggttcgg atctcctagg 360 ctcaagcagt gatcagatcc agacatgata agatacattg atgagtttgg acaaaccaca 420 actagaatgc agtgaaaaaa atgctttatt tgtgaaattt gtgatgctat tgctttattt 480 gtaaccatta taagctgcaa taaacaagtt aacaacaaca attgcattca ttttatgttt 540 caggttcagg gggaggtgtg ggaggttttt taaagcaagt aaaacctcta caaatgtggt 600 atggctgatt atgatcctct agtacttctc gacaagctcg gatcctggcg cgctcgctcg 660 ctcactgagg ccgcccgggc aaagcccggg cgtcgggcga cctttggtcg cccggcctca 720 gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg gccaactcca tcactagggg ttcctaggaa 780 gctgatctga attcggtacc cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg 840 cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata 900 gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta 960 catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc 1020 gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac 1080 gtattagtca tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga 1140 tagcggtttg actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg 1200 ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg 1260 caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctcg tttagtgaac 1320 cgtcagatcg cctggagacg ccatccacgc tgttttgacc tccatagaag acaccgggac 1380 cgatccagcc tccggactct agagttaact ggtaagttta gtctttttgt cttttatttc 1440 aggtcccgga tccggtggtg gtgcaaatca aagaactgct cctcagtgga tgttgccttt 1500 acttctaggc ctgccgccac catggagttc ggcctgagct ggctgttcct ggtggccatc 1560 cttaagggcg tgcagtgcga tactggtaga ccttttgtag aaatgtattc agaaattccg 1620 gaaataattc atatgacaga aggacgagaa ctcgttatac catgtcgcgt cacgtcccct 1680 aatattactg ttacgctcaa gaagtttcct ctcgatacac ttattccaga tgggaaacgc 1740 ataatttggg attcacgcaa agggtttatt attagtaacg caacgtataa agaaattggg 1800 ctgctcacat gtgaagctac ggtaaatggg catctttata aaacaaatta tttgactcat 1860 cggcaaacta atactattat cgatgtagta ctctccccat cccatggtat tgaattgtca 1920 gttggggaga agttggtatt gaattgtact gcacggacag aactcaacgt tggtattgat 1980 tttaattggg aatatccatc atctaaacat cagcataaga agttggtaaa tcgtgatctc 2040 aaaactcaaa gtgggtccga aatgaagaag tttctgtcca cacttacgat tgatggggtc 2100 actagaagtg atcaagggct ctatacgtgt gcagcatcta gtgggttgat gacaaagaag 2160 aattcaactt ttgttcgtgt ccatgaaaag gataaaacac atacttgtcc accgtgtcct 2220 gcgccagaac ttctcggtgg tccatccgtc tttctctttc cacctaaacc aaaagatact 2280 ttgatgattt cacggactcc agaagtaaca tgtgttgtcg ttgatgtatc acacgaagat 2340 ccagaagtca aatttaattg gtatgttgat ggtgtagaag ttcataatgc gaagacaaaa 2400 ccacgagaag aacaatacaa tagtacatat cgggtagtat ccgtcttgac tgtacttcac 2460 caagattggc ttaatgggaa agaatacaaa tgtaaagttt ctaataaagc tcttcctgcg 2520 ccgatcgaaa agacaatttc caaagcaaaa ggtcaacctc gggaacctca agtttatacg 2580 ctcccaccat cacgggatga actcactaag aatcaagtat ccttgacttg tctcgtaaaa 2640 gggttttatc cttcagatat tgctgtagaa tgggaatcca atgggcaacc agaaaataat 2700 tataaaacaa caccacctgt tcttgattca gatggttcat tctttctcta ttccaaactt 2760 actgtcgata aatcacgctg gcaacaaggt aatgttttct cttgttccgt catgcatgaa 2820 gcactccata atcactatac gcaaaagtct ctctctctct caccaggtaa ataataattc 2880 gaaaataaaa tatctttatt ttcattacat ctgtgtgttg gttttttgtg tggcatgctg 2940 gggagagatc aaccccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc 3000 aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag 3060 caagctgtag ccaaccacta gaactatagc tagagtcctg ggcgaacaaa cgatgctcgc 3120 cttccagaaa accgaggatg cgaaccactt catccggggt cagcaccacc ggcaagcgcc 3180 gcgacggccg aggtcttccg atctcctgaa gccagggcag atccgtgcac agcaccttgc 3240 cgtagaagaa cagcaaggcc gccaatgcct gacgatgcgt ggagaccgaa accttgcgct 3300 cgttcgccag ccaggacaga aatgcctcga cttcgctgct gcccaaggtt gccgggtgac 3360 gcacaccgtg gaaacggatg aaggcacgaa cccagttgac ataagcctgt tcggttcgta 3420 aactgtaatg caagtagcgt atgcgctcac gcaactggtc cagaaccttg accgaacgca 3480 gcggtggtaa cggcgcagtg gcggttttca tggcttgtta tgactgtttt tttgtacagt 3540 ctatgcctcg ggcatccaag cagcaagcgc gttacgccgt gggtcgatgt ttgatgttat 3600 ggagcagcaa cgatgttacg cagcagcaac gatgttacgc agcagggcag tcgccctaaa 3660 acaaagttag gtggctcaag tatgggcatc attcgcacat gtaggctcgg ccctgaccaa 3720 gtcaaatcca tgcgggctgc tcttgatctt ttcggtcgtg agttcggaga cgtagccacc 3780 tactcccaac atcagccgga ctccgattac ctcgggaact tgctccgtag taagacattc 3840 atcgcgcttg ctgccttcga ccaagaagcg gttgttggcg ctctcgcggc ttacgttctg 3900 cccaggtttg agcagccgcg tagtgagatc tatatctatg atctcgcagt ctccggcgag 3960 caccggaggc agggcattgc caccgcgctc atcaatctcc tcaagcatga ggccaacgcg 4020 cttggtgctt atgtgatcta cgtgcaagca gattacggtg acgatcccgc agtggctctc 4080 tatacaaagt tgggcatacg ggaagaagtg atgcactttg atatcgaccc aagtaccgcc 4140 acctaacaat tcgttcaagc cgagatcggc ttcccggccg cggagttgtt cggtaaattg 4200 tcacaacgcc gcgaatatag tctttaccat gcccttggcc acgcccctct ttaatacgac 4260 gggcaatttg cacttcagaa aatgaagagt ttgctttagc cataacaaaa gtccagtatg 4320 ctttttcaca gcataactgg actgatttca gtttacaact attctgtcta gtttaagact 4380 ttattgtcat agtttagatc tattttgttc agtttaagac tttattgtcc gcccacaccc 4440 gcttacgcag ggcatccatt tattactcaa ccgtaaccga ttttgccagg ttacgcggct 4500 ggtctgcggt gtgaaatacc gcacagatgc gtaaggagaa aataccgcat caggcgctct 4560 tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca 4620 gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac 4680 atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt 4740 ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg 4800 cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc 4860 tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc 4920 gtggcgcttt ctcaatgctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc 4980 aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac 5040 tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt 5100 aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct 5160 aactacggct acactagaag gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc 5220 ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt 5280 ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg 5340 atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc 5400 atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa 5460 tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag 5520 gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg 5580 tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga 5640 gacccacgct caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag 5700 cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa 5760 gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc 5820 atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca 5880 aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg 5940 atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat 6000 aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc 6060 aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg 6120 gataataccg cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg 6180 gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt 6240 gcacccaact gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca 6300 ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata 6360 ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac 6420 atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa 6480 gtgccacctg aaattgtaaa cgttaatatt ttgttaaaat tcgcgttaaa tttttgttaa 6540 atcagctcat tttttaacca ataggccgaa atcggcaaaa tcccttataa atcaaaagaa 6600 tagaccgaga tagggttgag tgttgttcca gtttggaaca agagtccact attaaagaac 6660 gtggactcca acgtcaaagg gcgaaaaacc gtctatcagg gcgatggccc actacgtgaa 6720 ccatcaccct aatcaagttt tttggggtcg aggtgccgta aagcactaaa tcggaaccct 6780 aaagggagcc cccgatttag agcttgacgg ggaaagccgg cgaacgtggc gagaaaggaa 6840 gggaagaaag cgaaaggagc gggcgctagg gcgctggcaa gtgtagcggt cacgctgcgc 6900 gtaaccacca cacccgccgc gcttaatgcg ccgctacagg gcgcgtc 6947 <210> 15 <211> 6968 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 15 cattcgccat tcaggctgca aataagcgtt gatattcagt caattacaaa cattaataac 60 gaagagatga cagaaaaatt ttcattctgt gacagagaaa aagtagccga agatgacggt 120 ttgtcacatg gagttggcag gatgtttgat taaaaacata acaggaagaa aaatgccccg 180 ctgtgggcgg acaaaatagt tgggaactgg gaggggtgga aatggagttt ttaaggatta 240 tttagggaag agtgacaaaa tagatgggaa ctgggtgtag cgtcgtaagc taatacgaaa 300 attaaaaatg acaaaatagt ttggaactag atttcactta tctggttcgg atctcctagg 360 ctcaagcagt gatcagatcc agacatgata agatacattg atgagtttgg acaaaccaca 420 actagaatgc agtgaaaaaa atgctttatt tgtgaaattt gtgatgctat tgctttattt 480 gtaaccatta taagctgcaa taaacaagtt aacaacaaca attgcattca ttttatgttt 540 caggttcagg gggaggtgtg ggaggttttt taaagcaagt aaaacctcta caaatgtggt 600 atggctgatt atgatcctct agtacttctc gacaagctcg gatcctggcg cgctcgctcg 660 ctcactgagg ccgcccgggc aaagcccggg cgtcgggcga cctttggtcg cccggcctca 720 gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg gccaactcca tcactagggg ttcctaggaa 780 gctgatctga attcggtacc cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg 840 cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata 900 gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta 960 catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc 1020 gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac 1080 gtattagtca tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga 1140 tagcggtttg actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg 1200 ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg 1260 caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctcg tttagtgaac 1320 cgtcagatcg cctggagacg ccatccacgc tgttttgacc tccatagaag acaccgggac 1380 cgatccagcc tccggactct agagttaact ggtaagttta gtctttttgt cttttatttc 1440 aggtcccgga tccggtggtg gtgcaaatca aagaactgct cctcagtgga tgttgccttt 1500 acttctaggc ctgccgccac catggtgagc tactgggaca ccggcgtgct gctgtgcgcc 1560 ctgctgagct gcctgctgct gaccggcagc agcagcggca gcgacaccgg cagacccttc 1620 gtggagatgt acagcgagat ccccgagatc atccacatga ccgagggcag agagctggtg 1680 atcccctgca gagtgaccag ccccaacatc accgtgaccc tgaagaagtt ccccctggac 1740 accctgatcc ccgacggcaa gagaatcatc tgggacagca gaaagggctt catcatcagc 1800 aacgccacct acaaggagat cggcctgctg acctgcgagg ccaccgtgaa cggccacctg 1860 tacaagacca actacctgac ccacagacag accaacacca tcatcgacgt ggtgctgagc 1920 cccagccacg gcatcgagct gagcgtgggc gagaagctgg tgctgaactg caccgccaga 1980 accgagctga acgtgggcat cgacttcaac tgggagtacc ccagcagcaa gcaccagcac 2040 aagaagctgg tgaacagaga cctgaagacc cagagcggca gcgagatgaa gaagttcctg 2100 agcaccctga ccatcgacgg cgtgaccaga agcgaccagg gcctgtacac ctgcgccgcc 2160 agcagcggcc tgatgaccaa gaagaacagc accttcgtga gagtgcacga gaaggacaag 2220 acccacacct gccccccctg ccccgccccc gagctgctgg gcggccccag cgtgttcctg 2280 ttccccccca agcccaagga caccctgatg atcagcagaa cccccgaggt gacctgcgtg 2340 gtggtggacg tgagccacga ggaccccgag gtgaagttca actggtacgt ggacggcgtg 2400 gaggtgcaca acgccaagac caagcccaga gaggagcagt acaacagcac ctacagagtg 2460 gtgagcgtgc tgaccgtgct gcaccaggac tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag 2520 gtgagcaaca aggccctgcc cgcccccatc gagaagacca tcagcaaggc caagggccag 2580 cccagagagc cccaggtgta caccctgccc cccagcagag acgagctgac caagaaccag 2640 gtgagcctga cctgcctggt gaagggcttc taccccagcg acatcgccgt ggagtgggag 2700 agcaacggcc agcccgagaa caactacaag accacccccc ccgtgctgga cagcgacggc 2760 agcttcttcc tgtacagcaa gctgaccgtg gacaagagca gatggcagca gggcaacgtg 2820 ttcagctgca gcgtgatgca cgaggccctg cacaaccact acacccagaa gagcctgagc 2880 ctgagccccg gcaagtgatt cgaaaataaa atatctttat tttcattaca tctgtgtgtt 2940 ggttttttgt gtggcatgct ggggagagat caaccccact ccctctctgc gcgctcgctc 3000 gctcactgag gccgggcgac caaaggtcgc ccgacgcccg ggctttgccc gggcggcctc 3060 agtgagcgag cgagcgcgca gcaagctgta gccaaccact agaactatag ctagagtcct 3120 gggcgaacaa acgatgctcg ccttccagaa aaccgaggat gcgaaccact tcatccgggg 3180 tcagcaccac cggcaagcgc cgcgacggcc gaggtcttcc gatctcctga agccagggca 3240 gatccgtgca cagcaccttg ccgtagaaga acagcaaggc cgccaatgcc tgacgatgcg 3300 tggagaccga aaccttgcgc tcgttcgcca gccaggacag aaatgcctcg acttcgctgc 3360 tgcccaaggt tgccgggtga cgcacaccgt ggaaacggat gaaggcacga acccagttga 3420 cataagcctg ttcggttcgt aaactgtaat gcaagtagcg tatgcgctca cgcaactggt 3480 ccagaacctt gaccgaacgc agcggtggta acggcgcagt ggcggttttc atggcttgtt 3540 atgactgttt ttttgtacag tctatgcctc gggcatccaa gcagcaagcg cgttacgccg 3600 tgggtcgatg tttgatgtta tggagcagca acgatgttac gcagcagcaa cgatgttacg 3660 cagcagggca gtcgccctaa aacaaagtta ggtggctcaa gtatgggcat cattcgcaca 3720 tgtaggctcg gccctgacca agtcaaatcc atgcgggctg ctcttgatct tttcggtcgt 3780 gagttcggag acgtagccac ctactcccaa catcagccgg actccgatta cctcgggaac 3840 ttgctccgta gtaagacatt catcgcgctt gctgccttcg accaagaagc ggttgttggc 3900 gctctcgcgg cttacgttct gcccaggttt gagcagccgc gtagtgagat ctatatctat 3960 gatctcgcag tctccggcga gcaccggagg cagggcattg ccaccgcgct catcaatctc 4020 ctcaagcatg aggccaacgc gcttggtgct tatgtgatct acgtgcaagc agattacggt 4080 gacgatcccg cagtggctct ctatacaaag ttgggcatac gggaagaagt gatgcacttt 4140 gatatcgacc caagtaccgc cacctaacaa ttcgttcaag ccgagatcgg cttcccggcc 4200 gcggagttgt tcggtaaatt gtcacaacgc cgcgaatata gtctttacca tgcccttggc 4260 cacgcccctc tttaatacga cgggcaattt gcacttcaga aaatgaagag tttgctttag 4320 ccataacaaa agtccagtat gctttttcac agcataactg gactgatttc agtttacaac 4380 tattctgtct agtttaagac tttattgtca tagtttagat ctattttgtt cagtttaaga 4440 ctttattgtc cgcccacacc cgcttacgca gggcatccat ttattactca accgtaaccg 4500 attttgccag gttacgcggc tggtctgcgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga 4560 aaataccgca tcaggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt 4620 cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca 4680 ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa 4740 aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat 4800 cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc 4860 cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc 4920 gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcaatgct cacgctgtag gtatctcagt 4980 tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac 5040 cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg 5100 ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca 5160 gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc 5220 gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa 5280 accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa 5340 ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac 5400 tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta 5460 aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt 5520 taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata 5580 gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc 5640 agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac 5700 cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag 5760 tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac 5820 gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc 5880 agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg 5940 gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc 6000 atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct 6060 gtgactggtg agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc 6120 tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc 6180 atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc 6240 agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc 6300 gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca 6360 cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt 6420 tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt 6480 ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gaaattgtaa acgttaatat tttgttaaaa 6540 ttcgcgttaa atttttgtta aatcagctca ttttttaacc aataggccga aatcggcaaa 6600 atcccttata aatcaaaaga atagaccgag atagggttga gtgttgttcc agtttggaac 6660 aagagtccac tattaaagaa cgtggactcc aacgtcaaag ggcgaaaaac cgtctatcag 6720 ggcgatggcc cactacgtga accatcaccc taatcaagtt ttttggggtc gaggtgccgt 6780 aaagcactaa atcggaaccc taaagggagc ccccgattta gagcttgacg gggaaagccg 6840 gcgaacgtgg cgagaaagga agggaagaaa gcgaaaggag cgggcgctag ggcgctggca 6900 agtgtagcgg tcacgctgcg cgtaaccacc acacccgccg cgcttaatgc gccgctacag 6960 ggcgcgtc 6968 <210> 16 <211> 6944 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 16 cattcgccat tcaggctgca aataagcgtt gatattcagt caattacaaa cattaataac 60 gaagagatga cagaaaaatt ttcattctgt gacagagaaa aagtagccga agatgacggt 120 ttgtcacatg gagttggcag gatgtttgat taaaaacata acaggaagaa aaatgccccg 180 ctgtgggcgg acaaaatagt tgggaactgg gaggggtgga aatggagttt ttaaggatta 240 tttagggaag agtgacaaaa tagatgggaa ctgggtgtag cgtcgtaagc taatacgaaa 300 attaaaaatg acaaaatagt ttggaactag atttcactta tctggttcgg atctcctagg 360 ctcaagcagt gatcagatcc agacatgata agatacattg atgagtttgg acaaaccaca 420 actagaatgc agtgaaaaaa atgctttatt tgtgaaattt gtgatgctat tgctttattt 480 gtaaccatta taagctgcaa taaacaagtt aacaacaaca attgcattca ttttatgttt 540 caggttcagg gggaggtgtg ggaggttttt taaagcaagt aaaacctcta caaatgtggt 600 atggctgatt atgatcctct agtacttctc gacaagctcg gatcctggcg cgctcgctcg 660 ctcactgagg ccgcccgggc aaagcccggg cgtcgggcga cctttggtcg cccggcctca 720 gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg gccaactcca tcactagggg ttcctaggaa 780 gctgatctga attcggtacc cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg 840 cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata 900 gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta 960 catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc 1020 gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac 1080 gtattagtca tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga 1140 tagcggtttg actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg 1200 ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg 1260 caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctcg tttagtgaac 1320 cgtcagatcg cctggagacg ccatccacgc tgttttgacc tccatagaag acaccgggac 1380 cgatccagcc tccggactct agagttaact ggtaagttta gtctttttgt cttttatttc 1440 aggtcccgga tccggtggtg gtgcaaatca aagaactgct cctcagtgga tgttgccttt 1500 acttctaggc ctgccgccac catggagttc ggcctgagct ggctgttcct ggtggccatc 1560 cttaagggcg tgcagtgcga caccggcaga cccttcgtgg agatgtacag cgagatcccc 1620 gagatcatcc acatgaccga gggcagagag ctggtgatcc cctgcagagt gaccagcccc 1680 aacatcaccg tgaccctgaa gaagttcccc ctggacaccc tgatccccga cggcaagaga 1740 atcatctggg acagcagaaa gggcttcatc atcagcaacg ccacctacaa ggagatcggc 1800 ctgctgacct gcgaggccac cgtgaacggc cacctgtaca agaccaacta cctgacccac 1860 agacagacca acaccatcat cgacgtggtg ctgagcccca gccacggcat cgagctgagc 1920 gtgggcgaga agctggtgct gaactgcacc gccagaaccg agctgaacgt gggcatcgac 1980 ttcaactggg agtaccccag cagcaagcac cagcacaaga agctggtgaa cagagacctg 2040 aagacccaga gcggcagcga gatgaagaag ttcctgagca ccctgaccat cgacggcgtg 2100 accagaagcg accagggcct gtacacctgc gccgccagca gcggcctgat gaccaagaag 2160 aacagcacct tcgtgagagt gcacgagaag gacaagaccc acacctgccc cccctgcccc 2220 gcccccgagc tgctgggcgg ccccagcgtg ttcctgttcc cccccaagcc caaggacacc 2280 ctgatgatca gcagaacccc cgaggtgacc tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaggac 2340 cccgaggtga agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcacaacgc caagaccaag 2400 cccagagagg agcagtacaa cagcacctac agagtggtga gcgtgctgac cgtgctgcac 2460 caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag tgcaaggtga gcaacaaggc cctgcccgcc 2520 cccatcgaga agaccatcag caaggccaag ggccagccca gagagcccca ggtgtacacc 2580 ctgcccccca gcagagacga gctgaccaag aaccaggtga gcctgacctg cctggtgaag 2640 ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca acggccagcc cgagaacaac 2700 tacaagacca ccccccccgt gctggacagc gacggcagct tcttcctgta cagcaagctg 2760 accgtggaca agagcagatg gcagcagggc aacgtgttca gctgcagcgt gatgcacgag 2820 gccctgcaca accactacac ccagaagagc ctgagcctga gccccggcaa gtgattcgaa 2880 aataaaatat ctttattttc attacatctg tgtgttggtt ttttgtgtgg catgctgggg 2940 agagatcaac cccactccct ctctgcgcgc tcgctcgctc actgaggccg ggcgaccaaa 3000 ggtcgcccga cgcccgggct ttgcccgggc ggcctcagtg agcgagcgag cgcgcagcaa 3060 gctgtagcca accactagaa ctatagctag agtcctgggc gaacaaacga tgctcgcctt 3120 ccagaaaacc gaggatgcga accacttcat ccggggtcag caccaccggc aagcgccgcg 3180 acggccgagg tcttccgatc tcctgaagcc agggcagatc cgtgcacagc accttgccgt 3240 agaagaacag caaggccgcc aatgcctgac gatgcgtgga gaccgaaacc ttgcgctcgt 3300 tcgccagcca ggacagaaat gcctcgactt cgctgctgcc caaggttgcc gggtgacgca 3360 caccgtggaa acggatgaag gcacgaaccc agttgacata agcctgttcg gttcgtaaac 3420 tgtaatgcaa gtagcgtatg cgctcacgca actggtccag aaccttgacc gaacgcagcg 3480 gtggtaacgg cgcagtggcg gttttcatgg cttgttatga ctgttttttt gtacagtcta 3540 tgcctcgggc atccaagcag caagcgcgtt acgccgtggg tcgatgtttg atgttatgga 3600 gcagcaacga tgttacgcag cagcaacgat gttacgcagc agggcagtcg ccctaaaaca 3660 aagttaggtg gctcaagtat gggcatcatt cgcacatgta ggctcggccc tgaccaagtc 3720 aaatccatgc gggctgctct tgatcttttc ggtcgtgagt tcggagacgt agccacctac 3780 tcccaacatc agccggactc cgattacctc gggaacttgc tccgtagtaa gacattcatc 3840 gcgcttgctg ccttcgacca agaagcggtt gttggcgctc tcgcggctta cgttctgccc 3900 aggtttgagc agccgcgtag tgagatctat atctatgatc tcgcagtctc cggcgagcac 3960 cggaggcagg gcattgccac cgcgctcatc aatctcctca agcatgaggc caacgcgctt 4020 ggtgcttatg tgatctacgt gcaagcagat tacggtgacg atcccgcagt ggctctctat 4080 acaaagttgg gcatacggga agaagtgatg cactttgata tcgacccaag taccgccacc 4140 taacaattcg ttcaagccga gatcggcttc ccggccgcgg agttgttcgg taaattgtca 4200 caacgccgcg aatatagtct ttaccatgcc cttggccacg cccctcttta atacgacggg 4260 caatttgcac ttcagaaaat gaagagtttg ctttagccat aacaaaagtc cagtatgctt 4320 tttcacagca taactggact gatttcagtt tacaactatt ctgtctagtt taagacttta 4380 ttgtcatagt ttagatctat tttgttcagt ttaagacttt attgtccgcc cacacccgct 4440 tacgcagggc atccatttat tactcaaccg taaccgattt tgccaggtta cgcggctggt 4500 ctgcggtgtg aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag gcgctcttcc 4560 gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct 4620 cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg 4680 tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc 4740 cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga 4800 aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct 4860 cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg 4920 gcgctttctc aatgctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag 4980 ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat 5040 cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac 5100 aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac 5160 tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc 5220 ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt 5280 tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc 5340 ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg 5400 agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca 5460 atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca 5520 cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag 5580 ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac 5640 ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc 5700 agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct 5760 agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc 5820 gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg 5880 cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc 5940 gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat 6000 tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag 6060 tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat 6120 aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg 6180 cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca 6240 cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga 6300 aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc 6360 ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata 6420 tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg 6480 ccacctgaaa ttgtaaacgt taatattttg ttaaaattcg cgttaaattt ttgttaaatc 6540 agctcatttt ttaaccaata ggccgaaatc ggcaaaatcc cttataaatc aaaagaatag 6600 accgagatag ggttgagtgt tgttccagtt tggaacaaga gtccactatt aaagaacgtg 6660 gactccaacg tcaaagggcg aaaaaccgtc tatcagggcg atggcccact acgtgaacca 6720 tcaccctaat caagtttttt ggggtcgagg tgccgtaaag cactaaatcg gaaccctaaa 6780 gggagccccc gatttagagc ttgacgggga aagccggcga acgtggcgag aaaggaaggg 6840 aagaaagcga aaggagcggg cgctagggcg ctggcaagtg tagcggtcac gctgcgcgta 6900 accaccacac ccgccgcgct taatgcgccg ctacagggcg cgtc 6944 <210> 17 <211> 6968 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 17 cattcgccat tcaggctgca aataagcgtt gatattcagt caattacaaa cattaataac 60 gaagagatga cagaaaaatt ttcattctgt gacagagaaa aagtagccga agatgacggt 120 ttgtcacatg gagttggcag gatgtttgat taaaaacata acaggaagaa aaatgccccg 180 ctgtgggcgg acaaaatagt tgggaactgg gaggggtgga aatggagttt ttaaggatta 240 tttagggaag agtgacaaaa tagatgggaa ctgggtgtag cgtcgtaagc taatacgaaa 300 attaaaaatg acaaaatagt ttggaactag atttcactta tctggttcgg atctcctagg 360 ctcaagcagt gatcagatcc agacatgata agatacattg atgagtttgg acaaaccaca 420 actagaatgc agtgaaaaaa atgctttatt tgtgaaattt gtgatgctat tgctttattt 480 gtaaccatta taagctgcaa taaacaagtt aacaacaaca attgcattca ttttatgttt 540 caggttcagg gggaggtgtg ggaggttttt taaagcaagt aaaacctcta caaatgtggt 600 atggctgatt atgatcctct agtacttctc gacaagctcg gatcctggcg cgctcgctcg 660 ctcactgagg ccgcccgggc aaagcccggg cgtcgggcga cctttggtcg cccggcctca 720 gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg gccaactcca tcactagggg ttcctaggaa 780 gctgatctga attcggtacc cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg 840 cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata 900 gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta 960 catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc 1020 gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac 1080 gtattagtca tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga 1140 tagcggtttg actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg 1200 ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg 1260 caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctcg tttagtgaac 1320 cgtcagatcg cctggagacg ccatccacgc tgttttgacc tccatagaag acaccgggac 1380 cgatccagcc tccggactct agagttaact ggtaagttta gtctttttgt cttttatttc 1440 aggtcccgga tccggtggtg gtgcaaatca aagaactgct cctcagtgga tgttgccttt 1500 acttctaggc ctgccgccac catggtgagc tactgggaca ccggcgtgct gctgtgcgcc 1560 ctgctgagct gcctgctgct gaccggcagc agcagcggca gcgacaccgg caggcctttc 1620 gtggagatgt acagcgagat ccctgagatc atccacatga ccgagggcag ggagctggtg 1680 atcccttgca gggtgaccag ccctaacatc accgtgaccc tgaagaagtt ccctctggac 1740 accctgatcc ctgacggcaa gaggatcatc tgggacagca ggaagggctt catcatcagc 1800 aacgccacct acaaggagat cggcctgctg acctgcgagg ccaccgtgaa cggccacctg 1860 tacaagacca actacctgac ccacaggcag accaacacca tcatcgacgt ggtgctgagc 1920 cctagccacg gcatcgagct gagcgtgggc gagaagctgg tgctgaactg caccgccagg 1980 accgagctga acgtgggcat cgacttcaac tgggagtacc ctagcagcaa gcaccagcac 2040 aagaagctgg tgaacaggga cctgaagacc cagagcggca gcgagatgaa gaagttcctg 2100 agcaccctga ccatcgacgg cgtgaccagg agcgaccagg gcctgtacac ctgcgccgcc 2160 agcagcggcc tgatgaccaa gaagaacagc accttcgtga gggtgcacga gaaggacaag 2220 acccacacct gccctccttg ccctgcccct gagctgctgg gcggccctag cgtgttcctg 2280 ttccctccta agcctaagga caccctgatg atcagcagga cccctgaggt gacctgcgtg 2340 gtggtggacg tgagccacga ggaccctgag gtgaagttca actggtacgt ggacggcgtg 2400 gaggtgcaca acgccaagac caagcctagg gaggagcagt acaacagcac ctacagggtg 2460 gtgagcgtgc tgaccgtgct gcaccaggac tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag 2520 gtgagcaaca aggccctgcc tgcccctatc gagaagacca tcagcaaggc caagggccag 2580 cctagggagc ctcaggtgta caccctgcct cctagcaggg acgagctgac caagaaccag 2640 gtgagcctga cctgcctggt gaagggcttc taccctagcg acatcgccgt ggagtgggag 2700 agcaacggcc agcctgagaa caactacaag accacccctc ctgtgctgga cagcgacggc 2760 agcttcttcc tgtacagcaa gctgaccgtg gacaagagca ggtggcagca gggcaacgtg 2820 ttcagctgca gcgtgatgca cgaggccctg cacaaccact acacccagaa gagcctgagc 2880 ctgagccctg gcaagtgatt cgaaaataaa atatctttat tttcattaca tctgtgtgtt 2940 ggttttttgt gtggcatgct ggggagagat caaccccact ccctctctgc gcgctcgctc 3000 gctcactgag gccgggcgac caaaggtcgc ccgacgcccg ggctttgccc gggcggcctc 3060 agtgagcgag cgagcgcgca gcaagctgta gccaaccact agaactatag ctagagtcct 3120 gggcgaacaa acgatgctcg ccttccagaa aaccgaggat gcgaaccact tcatccgggg 3180 tcagcaccac cggcaagcgc cgcgacggcc gaggtcttcc gatctcctga agccagggca 3240 gatccgtgca cagcaccttg ccgtagaaga acagcaaggc cgccaatgcc tgacgatgcg 3300 tggagaccga aaccttgcgc tcgttcgcca gccaggacag aaatgcctcg acttcgctgc 3360 tgcccaaggt tgccgggtga cgcacaccgt ggaaacggat gaaggcacga acccagttga 3420 cataagcctg ttcggttcgt aaactgtaat gcaagtagcg tatgcgctca cgcaactggt 3480 ccagaacctt gaccgaacgc agcggtggta acggcgcagt ggcggttttc atggcttgtt 3540 atgactgttt ttttgtacag tctatgcctc gggcatccaa gcagcaagcg cgttacgccg 3600 tgggtcgatg tttgatgtta tggagcagca acgatgttac gcagcagcaa cgatgttacg 3660 cagcagggca gtcgccctaa aacaaagtta ggtggctcaa gtatgggcat cattcgcaca 3720 tgtaggctcg gccctgacca agtcaaatcc atgcgggctg ctcttgatct tttcggtcgt 3780 gagttcggag acgtagccac ctactcccaa catcagccgg actccgatta cctcgggaac 3840 ttgctccgta gtaagacatt catcgcgctt gctgccttcg accaagaagc ggttgttggc 3900 gctctcgcgg cttacgttct gcccaggttt gagcagccgc gtagtgagat ctatatctat 3960 gatctcgcag tctccggcga gcaccggagg cagggcattg ccaccgcgct catcaatctc 4020 ctcaagcatg aggccaacgc gcttggtgct tatgtgatct acgtgcaagc agattacggt 4080 gacgatcccg cagtggctct ctatacaaag ttgggcatac gggaagaagt gatgcacttt 4140 gatatcgacc caagtaccgc cacctaacaa ttcgttcaag ccgagatcgg cttcccggcc 4200 gcggagttgt tcggtaaatt gtcacaacgc cgcgaatata gtctttacca tgcccttggc 4260 cacgcccctc tttaatacga cgggcaattt gcacttcaga aaatgaagag tttgctttag 4320 ccataacaaa agtccagtat gctttttcac agcataactg gactgatttc agtttacaac 4380 tattctgtct agtttaagac tttattgtca tagtttagat ctattttgtt cagtttaaga 4440 ctttattgtc cgcccacacc cgcttacgca gggcatccat ttattactca accgtaaccg 4500 attttgccag gttacgcggc tggtctgcgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga 4560 aaataccgca tcaggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt 4620 cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca 4680 ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa 4740 aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat 4800 cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc 4860 cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc 4920 gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcaatgct cacgctgtag gtatctcagt 4980 tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac 5040 cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg 5100 ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca 5160 gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc 5220 gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa 5280 accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa 5340 ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac 5400 tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta 5460 aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt 5520 taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata 5580 gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc 5640 agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac 5700 cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag 5760 tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac 5820 gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc 5880 agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg 5940 gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc 6000 atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct 6060 gtgactggtg agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc 6120 tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc 6180 atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc 6240 agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc 6300 gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca 6360 cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt 6420 tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt 6480 ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gaaattgtaa acgttaatat tttgttaaaa 6540 ttcgcgttaa atttttgtta aatcagctca ttttttaacc aataggccga aatcggcaaa 6600 atcccttata aatcaaaaga atagaccgag atagggttga gtgttgttcc agtttggaac 6660 aagagtccac tattaaagaa cgtggactcc aacgtcaaag ggcgaaaaac cgtctatcag 6720 ggcgatggcc cactacgtga accatcaccc taatcaagtt ttttggggtc gaggtgccgt 6780 aaagcactaa atcggaaccc taaagggagc ccccgattta gagcttgacg gggaaagccg 6840 gcgaacgtgg cgagaaagga agggaagaaa gcgaaaggag cgggcgctag ggcgctggca 6900 agtgtagcgg tcacgctgcg cgtaaccacc acacccgccg cgcttaatgc gccgctacag 6960 ggcgcgtc 6968 <210> 18 <211> 6968 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 18 cattcgccat tcaggctgca aataagcgtt gatattcagt caattacaaa cattaataac 60 gaagagatga cagaaaaatt ttcattctgt gacagagaaa aagtagccga agatgacggt 120 ttgtcacatg gagttggcag gatgtttgat taaaaacata acaggaagaa aaatgccccg 180 ctgtgggcgg acaaaatagt tgggaactgg gaggggtgga aatggagttt ttaaggatta 240 tttagggaag agtgacaaaa tagatgggaa ctgggtgtag cgtcgtaagc taatacgaaa 300 attaaaaatg acaaaatagt ttggaactag atttcactta tctggttcgg atctcctagg 360 ctcaagcagt gatcagatcc agacatgata agatacattg atgagtttgg acaaaccaca 420 actagaatgc agtgaaaaaa atgctttatt tgtgaaattt gtgatgctat tgctttattt 480 gtaaccatta taagctgcaa taaacaagtt aacaacaaca attgcattca ttttatgttt 540 caggttcagg gggaggtgtg ggaggttttt taaagcaagt aaaacctcta caaatgtggt 600 atggctgatt atgatcctct agtacttctc gacaagctcg gatcctggcg cgctcgctcg 660 ctcactgagg ccgcccgggc aaagcccggg cgtcgggcga cctttggtcg cccggcctca 720 gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg gccaactcca tcactagggg ttcctaggaa 780 gctgatctga attcggtacc cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg 840 cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata 900 gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta 960 catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc 1020 gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac 1080 gtattagtca tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga 1140 tagcggtttg actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg 1200 ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg 1260 caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctcg tttagtgaac 1320 cgtcagatcg cctggagacg ccatccacgc tgttttgacc tccatagaag acaccgggac 1380 cgatccagcc tccggactct agagttaact ggtaagttta gtctttttgt cttttatttc 1440 aggtcccgga tccggtggtg gtgcaaatca aagaactgct cctcagtgga tgttgccttt 1500 acttctaggc ctgccgccac catggtgagc tactgggaca ccggcgtgct gctgtgcgcc 1560 ctgctgagct gcctgctgct gaccggcagc agcagcggca gcgacaccgg caggcccttc 1620 gtggagatgt actccgagat ccccgagatc atccacatga ccgagggcag ggagctggtg 1680 atcccctgca gggtgacctc ccccaacatc accgtgaccc tgaagaagtt ccccctggac 1740 accctgatcc ccgacggcaa gaggatcatc tgggactcca ggaagggctt catcatctcc 1800 aacgccacct acaaggagat cggcctgctg acctgcgagg ccaccgtgaa cggccacctg 1860 tacaagacca actacctgac ccacaggcag accaacacca tcatcgacgt ggtgctgtcc 1920 ccctcccacg gcatcgagct gtccgtgggc gagaagctgg tgctgaactg caccgccagg 1980 accgagctga acgtgggcat cgacttcaac tgggagtacc cctcctccaa gcaccagcac 2040 aagaagctgg tgaacaggga cctgaagacc cagtccggct ccgagatgaa gaagttcctg 2100 tccaccctga ccatcgacgg cgtgaccagg tccgaccagg gcctgtacac ctgcgccgcc 2160 tcctccggcc tgatgaccaa gaagaactcc accttcgtga gggtgcacga gaaggacaag 2220 acccacacct gccccccctg ccccgccccc gagctgctgg gcggcccctc cgtgttcctg 2280 ttccccccca agcccaagga caccctgatg atctccagga cccccgaggt gacctgcgtg 2340 gtggtggacg tgtcccacga ggaccccgag gtgaagttca actggtacgt ggacggcgtg 2400 gaggtgcaca acgccaagac caagcccagg gaggagcagt acaactccac ctacagggtg 2460 gtgtccgtgc tgaccgtgct gcaccaggac tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag 2520 gtgtccaaca aggccctgcc cgcccccatc gagaagacca tctccaaggc caagggccag 2580 cccagggagc cccaggtgta caccctgccc ccctccaggg acgagctgac caagaaccag 2640 gtgtccctga cctgcctggt gaagggcttc tacccctccg acatcgccgt ggagtgggag 2700 tccaacggcc agcccgagaa caactacaag accacccccc ccgtgctgga ctccgacggc 2760 tccttcttcc tgtactccaa gctgaccgtg gacaagtcca ggtggcagca gggcaacgtg 2820 ttctcctgct ccgtgatgca cgaggccctg cacaaccact acacccagaa gtccctgtcc 2880 ctgtcccccg gcaagtgatt cgaaaataaa atatctttat tttcattaca tctgtgtgtt 2940 ggttttttgt gtggcatgct ggggagagat caaccccact ccctctctgc gcgctcgctc 3000 gctcactgag gccgggcgac caaaggtcgc ccgacgcccg ggctttgccc gggcggcctc 3060 agtgagcgag cgagcgcgca gcaagctgta gccaaccact agaactatag ctagagtcct 3120 gggcgaacaa acgatgctcg ccttccagaa aaccgaggat gcgaaccact tcatccgggg 3180 tcagcaccac cggcaagcgc cgcgacggcc gaggtcttcc gatctcctga agccagggca 3240 gatccgtgca cagcaccttg ccgtagaaga acagcaaggc cgccaatgcc tgacgatgcg 3300 tggagaccga aaccttgcgc tcgttcgcca gccaggacag aaatgcctcg acttcgctgc 3360 tgcccaaggt tgccgggtga cgcacaccgt ggaaacggat gaaggcacga acccagttga 3420 cataagcctg ttcggttcgt aaactgtaat gcaagtagcg tatgcgctca cgcaactggt 3480 ccagaacctt gaccgaacgc agcggtggta acggcgcagt ggcggttttc atggcttgtt 3540 atgactgttt ttttgtacag tctatgcctc gggcatccaa gcagcaagcg cgttacgccg 3600 tgggtcgatg tttgatgtta tggagcagca acgatgttac gcagcagcaa cgatgttacg 3660 cagcagggca gtcgccctaa aacaaagtta ggtggctcaa gtatgggcat cattcgcaca 3720 tgtaggctcg gccctgacca agtcaaatcc atgcgggctg ctcttgatct tttcggtcgt 3780 gagttcggag acgtagccac ctactcccaa catcagccgg actccgatta cctcgggaac 3840 ttgctccgta gtaagacatt catcgcgctt gctgccttcg accaagaagc ggttgttggc 3900 gctctcgcgg cttacgttct gcccaggttt gagcagccgc gtagtgagat ctatatctat 3960 gatctcgcag tctccggcga gcaccggagg cagggcattg ccaccgcgct catcaatctc 4020 ctcaagcatg aggccaacgc gcttggtgct tatgtgatct acgtgcaagc agattacggt 4080 gacgatcccg cagtggctct ctatacaaag ttgggcatac gggaagaagt gatgcacttt 4140 gatatcgacc caagtaccgc cacctaacaa ttcgttcaag ccgagatcgg cttcccggcc 4200 gcggagttgt tcggtaaatt gtcacaacgc cgcgaatata gtctttacca tgcccttggc 4260 cacgcccctc tttaatacga cgggcaattt gcacttcaga aaatgaagag tttgctttag 4320 ccataacaaa agtccagtat gctttttcac agcataactg gactgatttc agtttacaac 4380 tattctgtct agtttaagac tttattgtca tagtttagat ctattttgtt cagtttaaga 4440 ctttattgtc cgcccacacc cgcttacgca gggcatccat ttattactca accgtaaccg 4500 attttgccag gttacgcggc tggtctgcgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga 4560 aaataccgca tcaggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt 4620 cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca 4680 ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa 4740 aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat 4800 cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc 4860 cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc 4920 gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcaatgct cacgctgtag gtatctcagt 4980 tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac 5040 cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg 5100 ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca 5160 gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc 5220 gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa 5280 accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa 5340 ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac 5400 tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta 5460 aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt 5520 taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata 5580 gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc 5640 agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac 5700 cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag 5760 tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac 5820 gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc 5880 agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg 5940 gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc 6000 atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct 6060 gtgactggtg agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc 6120 tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc 6180 atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc 6240 agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc 6300 gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca 6360 cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt 6420 tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt 6480 ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gaaattgtaa acgttaatat tttgttaaaa 6540 ttcgcgttaa atttttgtta aatcagctca ttttttaacc aataggccga aatcggcaaa 6600 atcccttata aatcaaaaga atagaccgag atagggttga gtgttgttcc agtttggaac 6660 aagagtccac tattaaagaa cgtggactcc aacgtcaaag ggcgaaaaac cgtctatcag 6720 ggcgatggcc cactacgtga accatcaccc taatcaagtt ttttggggtc gaggtgccgt 6780 aaagcactaa atcggaaccc taaagggagc ccccgattta gagcttgacg gggaaagccg 6840 gcgaacgtgg cgagaaagga agggaagaaa gcgaaaggag cgggcgctag ggcgctggca 6900 agtgtagcgg tcacgctgcg cgtaaccacc acacccgccg cgcttaatgc gccgctacag 6960 ggcgcgtc 6968 <210> 19 <211> 6968 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 19 cattcgccat tcaggctgca aataagcgtt gatattcagt caattacaaa cattaataac 60 gaagagatga cagaaaaatt ttcattctgt gacagagaaa aagtagccga agatgacggt 120 ttgtcacatg gagttggcag gatgtttgat taaaaacata acaggaagaa aaatgccccg 180 ctgtgggcgg acaaaatagt tgggaactgg gaggggtgga aatggagttt ttaaggatta 240 tttagggaag agtgacaaaa tagatgggaa ctgggtgtag cgtcgtaagc taatacgaaa 300 attaaaaatg acaaaatagt ttggaactag atttcactta tctggttcgg atctcctagg 360 ctcaagcagt gatcagatcc agacatgata agatacattg atgagtttgg acaaaccaca 420 actagaatgc agtgaaaaaa atgctttatt tgtgaaattt gtgatgctat tgctttattt 480 gtaaccatta taagctgcaa taaacaagtt aacaacaaca attgcattca ttttatgttt 540 caggttcagg gggaggtgtg ggaggttttt taaagcaagt aaaacctcta caaatgtggt 600 atggctgatt atgatcctct agtacttctc gacaagctcg gatcctggcg cgctcgctcg 660 ctcactgagg ccgcccgggc aaagcccggg cgtcgggcga cctttggtcg cccggcctca 720 gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg gccaactcca tcactagggg ttcctaggaa 780 gctgatctga attcggtacc cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg 840 cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata 900 gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta 960 catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc 1020 gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac 1080 gtattagtca tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga 1140 tagcggtttg actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg 1200 ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg 1260 caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctcg tttagtgaac 1320 cgtcagatcg cctggagacg ccatccacgc tgttttgacc tccatagaag acaccgggac 1380 cgatccagcc tccggactct agagttaact ggtaagttta gtctttttgt cttttatttc 1440 aggtcccgga tccggtggtg gtgcaaatca aagaactgct cctcagtgga tgttgccttt 1500 acttctaggc ctgccgccac catggtgagc tactgggaca ccggcgtgct gctgtgcgcc 1560 ctgctgagct gcctgctgct gaccggcagc agcagcggca gcgacaccgg caggccgttc 1620 gtggagatgt acagcgagat cccggagatc atccacatga ccgagggcag ggagctggtg 1680 atcccgtgca gggtgaccag cccgaacatc accgtgaccc tgaagaagtt cccgctggac 1740 accctgatcc cggacggcaa gaggatcatc tgggacagca ggaagggctt catcatcagc 1800 aacgccacct acaaggagat cggcctgctg acctgcgagg ccaccgtgaa cggccacctg 1860 tacaagacca actacctgac ccacaggcag accaacacca tcatcgacgt ggtgctgagc 1920 ccgagccacg gcatcgagct gagcgtgggc gagaagctgg tgctgaactg caccgccagg 1980 accgagctga acgtgggcat cgacttcaac tgggagtacc cgagcagcaa gcaccagcac 2040 aagaagctgg tgaacaggga cctgaagacc cagagcggca gcgagatgaa gaagttcctg 2100 agcaccctga ccatcgacgg cgtgaccagg agcgaccagg gcctgtacac ctgcgccgcc 2160 agcagcggcc tgatgaccaa gaagaacagc accttcgtga gggtgcacga gaaggacaag 2220 acccacacct gcccgccgtg cccggccccg gagctgctgg gcggcccgag cgtgttcctg 2280 ttcccgccga agccgaagga caccctgatg atcagcagga ccccggaggt gacctgcgtg 2340 gtggtggacg tgagccacga ggacccggag gtgaagttca actggtacgt ggacggcgtg 2400 gaggtgcaca acgccaagac caagccgagg gaggagcagt acaacagcac ctacagggtg 2460 gtgagcgtgc tgaccgtgct gcaccaggac tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag 2520 gtgagcaaca aggccctgcc ggccccgatc gagaagacca tcagcaaggc caagggccag 2580 ccgagggagc cgcaggtgta caccctgccg ccgagcaggg acgagctgac caagaaccag 2640 gtgagcctga cctgcctggt gaagggcttc tacccgagcg acatcgccgt ggagtgggag 2700 agcaacggcc agccggagaa caactacaag accaccccgc cggtgctgga cagcgacggc 2760 agcttcttcc tgtacagcaa gctgaccgtg gacaagagca ggtggcagca gggcaacgtg 2820 ttcagctgca gcgtgatgca cgaggccctg cacaaccact acacccagaa gagcctgagc 2880 ctgagccccg gcaagtgatt cgaaaataaa atatctttat tttcattaca tctgtgtgtt 2940 ggttttttgt gtggcatgct ggggagagat caaccccact ccctctctgc gcgctcgctc 3000 gctcactgag gccgggcgac caaaggtcgc ccgacgcccg ggctttgccc gggcggcctc 3060 agtgagcgag cgagcgcgca gcaagctgta gccaaccact agaactatag ctagagtcct 3120 gggcgaacaa acgatgctcg ccttccagaa aaccgaggat gcgaaccact tcatccgggg 3180 tcagcaccac cggcaagcgc cgcgacggcc gaggtcttcc gatctcctga agccagggca 3240 gatccgtgca cagcaccttg ccgtagaaga acagcaaggc cgccaatgcc tgacgatgcg 3300 tggagaccga aaccttgcgc tcgttcgcca gccaggacag aaatgcctcg acttcgctgc 3360 tgcccaaggt tgccgggtga cgcacaccgt ggaaacggat gaaggcacga acccagttga 3420 cataagcctg ttcggttcgt aaactgtaat gcaagtagcg tatgcgctca cgcaactggt 3480 ccagaacctt gaccgaacgc agcggtggta acggcgcagt ggcggttttc atggcttgtt 3540 atgactgttt ttttgtacag tctatgcctc gggcatccaa gcagcaagcg cgttacgccg 3600 tgggtcgatg tttgatgtta tggagcagca acgatgttac gcagcagcaa cgatgttacg 3660 cagcagggca gtcgccctaa aacaaagtta ggtggctcaa gtatgggcat cattcgcaca 3720 tgtaggctcg gccctgacca agtcaaatcc atgcgggctg ctcttgatct tttcggtcgt 3780 gagttcggag acgtagccac ctactcccaa catcagccgg actccgatta cctcgggaac 3840 ttgctccgta gtaagacatt catcgcgctt gctgccttcg accaagaagc ggttgttggc 3900 gctctcgcgg cttacgttct gcccaggttt gagcagccgc gtagtgagat ctatatctat 3960 gatctcgcag tctccggcga gcaccggagg cagggcattg ccaccgcgct catcaatctc 4020 ctcaagcatg aggccaacgc gcttggtgct tatgtgatct acgtgcaagc agattacggt 4080 gacgatcccg cagtggctct ctatacaaag ttgggcatac gggaagaagt gatgcacttt 4140 gatatcgacc caagtaccgc cacctaacaa ttcgttcaag ccgagatcgg cttcccggcc 4200 gcggagttgt tcggtaaatt gtcacaacgc cgcgaatata gtctttacca tgcccttggc 4260 cacgcccctc tttaatacga cgggcaattt gcacttcaga aaatgaagag tttgctttag 4320 ccataacaaa agtccagtat gctttttcac agcataactg gactgatttc agtttacaac 4380 tattctgtct agtttaagac tttattgtca tagtttagat ctattttgtt cagtttaaga 4440 ctttattgtc cgcccacacc cgcttacgca gggcatccat ttattactca accgtaaccg 4500 attttgccag gttacgcggc tggtctgcgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga 4560 aaataccgca tcaggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt 4620 cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca 4680 ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa 4740 aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat 4800 cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc 4860 cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc 4920 gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcaatgct cacgctgtag gtatctcagt 4980 tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac 5040 cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg 5100 ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca 5160 gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc 5220 gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa 5280 accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa 5340 ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac 5400 tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta 5460 aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt 5520 taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata 5580 gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc 5640 agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac 5700 cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag 5760 tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac 5820 gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc 5880 agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg 5940 gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc 6000 atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct 6060 gtgactggtg agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc 6120 tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc 6180 atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc 6240 agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc 6300 gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca 6360 cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt 6420 tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt 6480 ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gaaattgtaa acgttaatat tttgttaaaa 6540 ttcgcgttaa atttttgtta aatcagctca ttttttaacc aataggccga aatcggcaaa 6600 atcccttata aatcaaaaga atagaccgag atagggttga gtgttgttcc agtttggaac 6660 aagagtccac tattaaagaa cgtggactcc aacgtcaaag ggcgaaaaac cgtctatcag 6720 ggcgatggcc cactacgtga accatcaccc taatcaagtt ttttggggtc gaggtgccgt 6780 aaagcactaa atcggaaccc taaagggagc ccccgattta gagcttgacg gggaaagccg 6840 gcgaacgtgg cgagaaagga agggaagaaa gcgaaaggag cgggcgctag ggcgctggca 6900 agtgtagcgg tcacgctgcg cgtaaccacc acacccgccg cgcttaatgc gccgctacag 6960 ggcgcgtc 6968 <210> 20 <211> 6968 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 20 cattcgccat tcaggctgca aataagcgtt gatattcagt caattacaaa cattaataac 60 gaagagatga cagaaaaatt ttcattctgt gacagagaaa aagtagccga agatgacggt 120 ttgtcacatg gagttggcag gatgtttgat taaaaacata acaggaagaa aaatgccccg 180 ctgtgggcgg acaaaatagt tgggaactgg gaggggtgga aatggagttt ttaaggatta 240 tttagggaag agtgacaaaa tagatgggaa ctgggtgtag cgtcgtaagc taatacgaaa 300 attaaaaatg acaaaatagt ttggaactag atttcactta tctggttcgg atctcctagg 360 ctcaagcagt gatcagatcc agacatgata agatacattg atgagtttgg acaaaccaca 420 actagaatgc agtgaaaaaa atgctttatt tgtgaaattt gtgatgctat tgctttattt 480 gtaaccatta taagctgcaa taaacaagtt aacaacaaca attgcattca ttttatgttt 540 caggttcagg gggaggtgtg ggaggttttt taaagcaagt aaaacctcta caaatgtggt 600 atggctgatt atgatcctct agtacttctc gacaagctcg gatcctggcg cgctcgctcg 660 ctcactgagg ccgcccgggc aaagcccggg cgtcgggcga cctttggtcg cccggcctca 720 gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg gccaactcca tcactagggg ttcctaggaa 780 gctgatctga attcggtacc cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg 840 cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata 900 gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta 960 catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc 1020 gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac 1080 gtattagtca tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga 1140 tagcggtttg actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg 1200 ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg 1260 caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctcg tttagtgaac 1320 cgtcagatcg cctggagacg ccatccacgc tgttttgacc tccatagaag acaccgggac 1380 cgatccagcc tccggactct agagttaact ggtaagttta gtctttttgt cttttatttc 1440 aggtcccgga tccggtggtg gtgcaaatca aagaactgct cctcagtgga tgttgccttt 1500 acttctaggc ctgcgctcac catggtcagc tactgggaca ccggggtcct gctgtgcgcg 1560 ctgctcagct gtctgcttct cacaggatct agttcaggtt cagatacagg tagacctttc 1620 gtagagatgt acagtgaaat ccccgaaatt atacacatga ctgaaggaag ggagctcgtc 1680 attccctgcc gggttacgtc acctaacatc actgttactt taaaaaagtt tccacttgac 1740 actttgatcc ctgatggaaa acgcataatc tgggacagta gaaagggctt catcatatca 1800 aatgcaacgt acaaagaaat agggcttctg acctgtgaag caacagtcaa tgggcatttg 1860 tataagacaa actatctcac acatcgacaa accaatacaa tcatagatgt cgttctgagt 1920 ccgtctcatg gaattgaact atctgttgga gaaaagcttg tcttaaattg tacagcaaga 1980 actgaactaa atgtggggat tgacttcaac tgggaatacc cttcttcgaa gcatcagcat 2040 aagaaacttg taaaccgaga cctaaaaacc cagtctggga gtgagatgaa gaaatttttg 2100 agcaccttaa ctatagatgg tgtaacccgg agtgaccaag gattgtacac ctgtgcagca 2160 tccagtgggc tgatgaccaa gaagaacagc acatttgtca gggtccatga aaaagacaaa 2220 actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc 2280 ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg 2340 gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg 2400 gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg 2460 gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag 2520 gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 2580 ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg atgagctgac caagaaccag 2640 gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag 2700 agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 2760 tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 2820 ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 2880 ctgtctccgg gtaaatgatt cgaaaataaa atatctttat tttcattaca tctgtgtgtt 2940 ggttttttgt gtggcatgct ggggagagat caaccccact ccctctctgc gcgctcgctc 3000 gctcactgag gccgggcgac caaaggtcgc ccgacgcccg ggctttgccc gggcggcctc 3060 agtgagcgag cgagcgcgca gcaagctgta gccaaccact agaactatag ctagagtcct 3120 gggcgaacaa acgatgctcg ccttccagaa aaccgaggat gcgaaccact tcatccgggg 3180 tcagcaccac cggcaagcgc cgcgacggcc gaggtcttcc gatctcctga agccagggca 3240 gatccgtgca cagcaccttg ccgtagaaga acagcaaggc cgccaatgcc tgacgatgcg 3300 tggagaccga aaccttgcgc tcgttcgcca gccaggacag aaatgcctcg acttcgctgc 3360 tgcccaaggt tgccgggtga cgcacaccgt ggaaacggat gaaggcacga acccagttga 3420 cataagcctg ttcggttcgt aaactgtaat gcaagtagcg tatgcgctca cgcaactggt 3480 ccagaacctt gaccgaacgc agcggtggta acggcgcagt ggcggttttc atggcttgtt 3540 atgactgttt ttttgtacag tctatgcctc gggcatccaa gcagcaagcg cgttacgccg 3600 tgggtcgatg tttgatgtta tggagcagca acgatgttac gcagcagcaa cgatgttacg 3660 cagcagggca gtcgccctaa aacaaagtta ggtggctcaa gtatgggcat cattcgcaca 3720 tgtaggctcg gccctgacca agtcaaatcc atgcgggctg ctcttgatct tttcggtcgt 3780 gagttcggag acgtagccac ctactcccaa catcagccgg actccgatta cctcgggaac 3840 ttgctccgta gtaagacatt catcgcgctt gctgccttcg accaagaagc ggttgttggc 3900 gctctcgcgg cttacgttct gcccaggttt gagcagccgc gtagtgagat ctatatctat 3960 gatctcgcag tctccggcga gcaccggagg cagggcattg ccaccgcgct catcaatctc 4020 ctcaagcatg aggccaacgc gcttggtgct tatgtgatct acgtgcaagc agattacggt 4080 gacgatcccg cagtggctct ctatacaaag ttgggcatac gggaagaagt gatgcacttt 4140 gatatcgacc caagtaccgc cacctaacaa ttcgttcaag ccgagatcgg cttcccggcc 4200 gcggagttgt tcggtaaatt gtcacaacgc cgcgaatata gtctttacca tgcccttggc 4260 cacgcccctc tttaatacga cgggcaattt gcacttcaga aaatgaagag tttgctttag 4320 ccataacaaa agtccagtat gctttttcac agcataactg gactgatttc agtttacaac 4380 tattctgtct agtttaagac tttattgtca tagtttagat ctattttgtt cagtttaaga 4440 ctttattgtc cgcccacacc cgcttacgca gggcatccat ttattactca accgtaaccg 4500 attttgccag gttacgcggc tggtctgcgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga 4560 aaataccgca tcaggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt 4620 cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca 4680 ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa 4740 aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat 4800 cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc 4860 cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc 4920 gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcaatgct cacgctgtag gtatctcagt 4980 tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac 5040 cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg 5100 ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca 5160 gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc 5220 gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa 5280 accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa 5340 ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac 5400 tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta 5460 aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt 5520 taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata 5580 gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc 5640 agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac 5700 cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag 5760 tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac 5820 gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc 5880 agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg 5940 gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc 6000 atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct 6060 gtgactggtg agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc 6120 tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc 6180 atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc 6240 agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc 6300 gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca 6360 cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt 6420 tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt 6480 ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gaaattgtaa acgttaatat tttgttaaaa 6540 ttcgcgttaa atttttgtta aatcagctca ttttttaacc aataggccga aatcggcaaa 6600 atcccttata aatcaaaaga atagaccgag atagggttga gtgttgttcc agtttggaac 6660 aagagtccac tattaaagaa cgtggactcc aacgtcaaag ggcgaaaaac cgtctatcag 6720 ggcgatggcc cactacgtga accatcaccc taatcaagtt ttttggggtc gaggtgccgt 6780 aaagcactaa atcggaaccc taaagggagc ccccgattta gagcttgacg gggaaagccg 6840 gcgaacgtgg cgagaaagga agggaagaaa gcgaaaggag cgggcgctag ggcgctggca 6900 agtgtagcgg tcacgctgcg cgtaaccacc acacccgccg cgcttaatgc gccgctacag 6960 ggcgcgtc 6968 <210> 21 <211> 1377 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 21 atggtatcct attgggatac gggtgttctc ttgtgtgcac tcctttcctg tctcctgctc 60 actggatctt cttctgggtc tgatactggt agaccttttg tagaaatgta ttcagaaatt 120 ccggaaataa ttcatatgac agaaggacga gaactcgtta taccatgtcg cgtcacgtcc 180 cctaatatta ctgttacgct caagaagttt cctctcgata cacttattcc agatgggaaa 240 cgcataattt gggattcacg caaagggttt attattagta acgcaacgta taaagaaatt 300 gggctgctca catgtgaagc tacggtaaat gggcatcttt ataaaacaaa ttatttgact 360 catcggcaaa ctaatactat tatcgatgta gtactctccc catcccatgg tattgaattg 420 tcagttgggg agaagttggt attgaattgt actgcacgga cagaactcaa cgttggtatt 480 gattttaatt gggaatatcc atcatctaaa catcagcata agaagttggt aaatcgtgat 540 ctcaaaactc aaagtgggtc cgaaatgaag aagtttctgt ccacacttac gattgatggg 600 gtcactagaa gtgatcaagg gctctatacg tgtgcagcat ctagtgggtt gatgacaaag 660 aagaattcaa cttttgttcg tgtccatgaa aaggataaaa cacatacttg tccaccgtgt 720 cctgcgccag aacttctcgg tggtccatcc gtctttctct ttccacctaa accaaaagat 780 actttgatga tttcacggac tccagaagta acatgtgttg tcgttgatgt atcacacgaa 840 gatccagaag tcaaatttaa ttggtatgtt gatggtgtag aagttcataa tgcgaagaca 900 aaaccacgag aagaacaata caatagtaca tatcgggtag tatccgtctt gactgtactt 960 caccaagatt ggcttaatgg gaaagaatac aaatgtaaag tttctaataa agctcttcct 1020 gcgccgatcg aaaagacaat ttccaaagca aaaggtcaac ctcgggaacc tcaagtttat 1080 acgctcccac catcacggga tgaactcact aagaatcaag tatccttgac ttgtctcgta 1140 aaagggtttt atccttcaga tattgctgta gaatgggaat ccaatgggca accagaaaat 1200 aattataaaa caacaccacc tgttcttgat tcagatggtt cattctttct ctattccaaa 1260 cttactgtcg ataaatcacg ctggcaacaa ggtaatgttt tctcttgttc cgtcatgcat 1320 gaagcactcc ataatcacta tacgcaaaag tctctctctc tctcaccagg taaataa 1377 <210> 22 <211> 1353 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 22 atggagttcg gcctgagctg gctgttcctg gtggccatcc ttaagggcgt gcagtgcgat 60 actggtagac cttttgtaga aatgtattca gaaattccgg aaataattca tatgacagaa 120 ggacgagaac tcgttatacc atgtcgcgtc acgtccccta atattactgt tacgctcaag 180 aagtttcctc tcgatacact tattccagat gggaaacgca taatttggga ttcacgcaaa 240 gggtttatta ttagtaacgc aacgtataaa gaaattgggc tgctcacatg tgaagctacg 300 gtaaatgggc atctttataa aacaaattat ttgactcatc ggcaaactaa tactattatc 360 gatgtagtac tctccccatc ccatggtatt gaattgtcag ttggggagaa gttggtattg 420 aattgtactg cacggacaga actcaacgtt ggtattgatt ttaattggga atatccatca 480 tctaaacatc agcataagaa gttggtaaat cgtgatctca aaactcaaag tgggtccgaa 540 atgaagaagt ttctgtccac acttacgatt gatggggtca ctagaagtga tcaagggctc 600 tatacgtgtg cagcatctag tgggttgatg acaaagaaga attcaacttt tgttcgtgtc 660 catgaaaagg ataaaacaca tacttgtcca ccgtgtcctg cgccagaact tctcggtggt 720 ccatccgtct ttctctttcc acctaaacca aaagatactt tgatgatttc acggactcca 780 gaagtaacat gtgttgtcgt tgatgtatca cacgaagatc cagaagtcaa atttaattgg 840 tatgttgatg gtgtagaagt tcataatgcg aagacaaaac cacgagaaga acaatacaat 900 agtacatatc gggtagtatc cgtcttgact gtacttcacc aagattggct taatgggaaa 960 gaatacaaat gtaaagtttc taataaagct cttcctgcgc cgatcgaaaa gacaatttcc 1020 aaagcaaaag gtcaacctcg ggaacctcaa gtttatacgc tcccaccatc acgggatgaa 1080 ctcactaaga atcaagtatc cttgacttgt ctcgtaaaag ggttttatcc ttcagatatt 1140 gctgtagaat gggaatccaa tgggcaacca gaaaataatt ataaaacaac accacctgtt 1200 cttgattcag atggttcatt ctttctctat tccaaactta ctgtcgataa atcacgctgg 1260 caacaaggta atgttttctc ttgttccgtc atgcatgaag cactccataa tcactatacg 1320 caaaagtctc tctctctctc accaggtaaa taa 1353 <210> 23 <211> 1377 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 23 atggtgagct actgggacac cggcgtgctg ctgtgcgccc tgctgagctg cctgctgctg 60 accggcagca gcagcggcag cgacaccggc agacccttcg tggagatgta cagcgagatc 120 cccgagatca tccacatgac cgagggcaga gagctggtga tcccctgcag agtgaccagc 180 cccaacatca ccgtgaccct gaagaagttc cccctggaca ccctgatccc cgacggcaag 240 agaatcatct gggacagcag aaagggcttc atcatcagca acgccaccta caaggagatc 300 ggcctgctga cctgcgaggc caccgtgaac ggccacctgt acaagaccaa ctacctgacc 360 cacagacaga ccaacaccat catcgacgtg gtgctgagcc ccagccacgg catcgagctg 420 agcgtgggcg agaagctggt gctgaactgc accgccagaa ccgagctgaa cgtgggcatc 480 gacttcaact gggagtaccc cagcagcaag caccagcaca agaagctggt gaacagagac 540 ctgaagaccc agagcggcag cgagatgaag aagttcctga gcaccctgac catcgacggc 600 gtgaccagaa gcgaccaggg cctgtacacc tgcgccgcca gcagcggcct gatgaccaag 660 aagaacagca ccttcgtgag agtgcacgag aaggacaaga cccacacctg ccccccctgc 720 cccgcccccg agctgctggg cggccccagc gtgttcctgt tcccccccaa gcccaaggac 780 accctgatga tcagcagaac ccccgaggtg acctgcgtgg tggtggacgt gagccacgag 840 gaccccgagg tgaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcacaa cgccaagacc 900 aagcccagag aggagcagta caacagcacc tacagagtgg tgagcgtgct gaccgtgctg 960 caccaggact ggctgaacgg caaggagtac aagtgcaagg tgagcaacaa ggccctgccc 1020 gcccccatcg agaagaccat cagcaaggcc aagggccagc ccagagagcc ccaggtgtac 1080 accctgcccc ccagcagaga cgagctgacc aagaaccagg tgagcctgac ctgcctggtg 1140 aagggcttct accccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaacggcca gcccgagaac 1200 aactacaaga ccaccccccc cgtgctggac agcgacggca gcttcttcct gtacagcaag 1260 ctgaccgtgg acaagagcag atggcagcag ggcaacgtgt tcagctgcag cgtgatgcac 1320 gaggccctgc acaaccacta cacccagaag agcctgagcc tgagccccgg caagtga 1377 <210> 24 <211> 1353 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 24 atggagttcg gcctgagctg gctgttcctg gtggccatcc ttaagggcgt gcagtgcgac 60 accggcagac ccttcgtgga gatgtacagc gagatccccg agatcatcca catgaccgag 120 ggcagagagc tggtgatccc ctgcagagtg accagcccca acatcaccgt gaccctgaag 180 aagttccccc tggacaccct gatccccgac ggcaagagaa tcatctggga cagcagaaag 240 ggcttcatca tcagcaacgc cacctacaag gagatcggcc tgctgacctg cgaggccacc 300 gtgaacggcc acctgtacaa gaccaactac ctgacccaca gacagaccaa caccatcatc 360 gacgtggtgc tgagccccag ccacggcatc gagctgagcg tgggcgagaa gctggtgctg 420 aactgcaccg ccagaaccga gctgaacgtg ggcatcgact tcaactggga gtaccccagc 480 agcaagcacc agcacaagaa gctggtgaac agagacctga agacccagag cggcagcgag 540 atgaagaagt tcctgagcac cctgaccatc gacggcgtga ccagaagcga ccagggcctg 600 tacacctgcg ccgccagcag cggcctgatg accaagaaga acagcacctt cgtgagagtg 660 cacgagaagg acaagaccca cacctgcccc ccctgccccg cccccgagct gctgggcggc 720 cccagcgtgt tcctgttccc ccccaagccc aaggacaccc tgatgatcag cagaaccccc 780 gaggtgacct gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaggacc ccgaggtgaa gttcaactgg 840 tacgtggacg gcgtggaggt gcacaacgcc aagaccaagc ccagagagga gcagtacaac 900 agcacctaca gagtggtgag cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaag 960 gagtacaagt gcaaggtgag caacaaggcc ctgcccgccc ccatcgagaa gaccatcagc 1020 aaggccaagg gccagcccag agagccccag gtgtacaccc tgccccccag cagagacgag 1080 ctgaccaaga accaggtgag cctgacctgc ctggtgaagg gcttctaccc cagcgacatc 1140 gccgtggagt gggagagcaa cggccagccc gagaacaact acaagaccac cccccccgtg 1200 ctggacagcg acggcagctt cttcctgtac agcaagctga ccgtggacaa gagcagatgg 1260 cagcagggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 1320 cagaagagcc tgagcctgag ccccggcaag tga 1353 <210> 25 <211> 1377 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 25 atggtgagct actgggacac cggcgtgctg ctgtgcgccc tgctgagctg cctgctgctg 60 accggcagca gcagcggcag cgacaccggc aggcctttcg tggagatgta cagcgagatc 120 cctgagatca tccacatgac cgagggcagg gagctggtga tcccttgcag ggtgaccagc 180 cctaacatca ccgtgaccct gaagaagttc cctctggaca ccctgatccc tgacggcaag 240 aggatcatct gggacagcag gaagggcttc atcatcagca acgccaccta caaggagatc 300 ggcctgctga cctgcgaggc caccgtgaac ggccacctgt acaagaccaa ctacctgacc 360 cacaggcaga ccaacaccat catcgacgtg gtgctgagcc ctagccacgg catcgagctg 420 agcgtgggcg agaagctggt gctgaactgc accgccagga ccgagctgaa cgtgggcatc 480 gacttcaact gggagtaccc tagcagcaag caccagcaca agaagctggt gaacagggac 540 ctgaagaccc agagcggcag cgagatgaag aagttcctga gcaccctgac catcgacggc 600 gtgaccagga gcgaccaggg cctgtacacc tgcgccgcca gcagcggcct gatgaccaag 660 aagaacagca ccttcgtgag ggtgcacgag aaggacaaga cccacacctg ccctccttgc 720 cctgcccctg agctgctggg cggccctagc gtgttcctgt tccctcctaa gcctaaggac 780 accctgatga tcagcaggac ccctgaggtg acctgcgtgg tggtggacgt gagccacgag 840 gaccctgagg tgaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcacaa cgccaagacc 900 aagcctaggg aggagcagta caacagcacc tacagggtgg tgagcgtgct gaccgtgctg 960 caccaggact ggctgaacgg caaggagtac aagtgcaagg tgagcaacaa ggccctgcct 1020 gcccctatcg agaagaccat cagcaaggcc aagggccagc ctagggagcc tcaggtgtac 1080 accctgcctc ctagcaggga cgagctgacc aagaaccagg tgagcctgac ctgcctggtg 1140 aagggcttct accctagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaacggcca gcctgagaac 1200 aactacaaga ccacccctcc tgtgctggac agcgacggca gcttcttcct gtacagcaag 1260 ctgaccgtgg acaagagcag gtggcagcag ggcaacgtgt tcagctgcag cgtgatgcac 1320 gaggccctgc acaaccacta cacccagaag agcctgagcc tgagccctgg caagtga 1377 <210> 26 <211> 1377 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 26 atggtgagct actgggacac cggcgtgctg ctgtgcgccc tgctgagctg cctgctgctg 60 accggcagca gcagcggcag cgacaccggc aggcccttcg tggagatgta ctccgagatc 120 cccgagatca tccacatgac cgagggcagg gagctggtga tcccctgcag ggtgacctcc 180 cccaacatca ccgtgaccct gaagaagttc cccctggaca ccctgatccc cgacggcaag 240 aggatcatct gggactccag gaagggcttc atcatctcca acgccaccta caaggagatc 300 ggcctgctga cctgcgaggc caccgtgaac ggccacctgt acaagaccaa ctacctgacc 360 cacaggcaga ccaacaccat catcgacgtg gtgctgtccc cctcccacgg catcgagctg 420 tccgtgggcg agaagctggt gctgaactgc accgccagga ccgagctgaa cgtgggcatc 480 gacttcaact gggagtaccc ctcctccaag caccagcaca agaagctggt gaacagggac 540 ctgaagaccc agtccggctc cgagatgaag aagttcctgt ccaccctgac catcgacggc 600 gtgaccaggt ccgaccaggg cctgtacacc tgcgccgcct cctccggcct gatgaccaag 660 aagaactcca ccttcgtgag ggtgcacgag aaggacaaga cccacacctg ccccccctgc 720 cccgcccccg agctgctggg cggcccctcc gtgttcctgt tcccccccaa gcccaaggac 780 accctgatga tctccaggac ccccgaggtg acctgcgtgg tggtggacgt gtcccacgag 840 gaccccgagg tgaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcacaa cgccaagacc 900 aagcccaggg aggagcagta caactccacc tacagggtgg tgtccgtgct gaccgtgctg 960 caccaggact ggctgaacgg caaggagtac aagtgcaagg tgtccaacaa ggccctgccc 1020 gcccccatcg agaagaccat ctccaaggcc aagggccagc ccagggagcc ccaggtgtac 1080 accctgcccc cctccaggga cgagctgacc aagaaccagg tgtccctgac ctgcctggtg 1140 aagggcttct acccctccga catcgccgtg gagtgggagt ccaacggcca gcccgagaac 1200 aactacaaga ccaccccccc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct gtactccaag 1260 ctgaccgtgg acaagtccag gtggcagcag ggcaacgtgt tctcctgctc cgtgatgcac 1320 gaggccctgc acaaccacta cacccagaag tccctgtccc tgtcccccgg caagtga 1377 <210> 27 <211> 1377 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 27 atggtgagct actgggacac cggcgtgctg ctgtgcgccc tgctgagctg cctgctgctg 60 accggcagca gcagcggcag cgacaccggc aggccgttcg tggagatgta cagcgagatc 120 ccggagatca tccacatgac cgagggcagg gagctggtga tcccgtgcag ggtgaccagc 180 ccgaacatca ccgtgaccct gaagaagttc ccgctggaca ccctgatccc ggacggcaag 240 aggatcatct gggacagcag gaagggcttc atcatcagca acgccaccta caaggagatc 300 ggcctgctga cctgcgaggc caccgtgaac ggccacctgt acaagaccaa ctacctgacc 360 cacaggcaga ccaacaccat catcgacgtg gtgctgagcc cgagccacgg catcgagctg 420 agcgtgggcg agaagctggt gctgaactgc accgccagga ccgagctgaa cgtgggcatc 480 gacttcaact gggagtaccc gagcagcaag caccagcaca agaagctggt gaacagggac 540 ctgaagaccc agagcggcag cgagatgaag aagttcctga gcaccctgac catcgacggc 600 gtgaccagga gcgaccaggg cctgtacacc tgcgccgcca gcagcggcct gatgaccaag 660 aagaacagca ccttcgtgag ggtgcacgag aaggacaaga cccacacctg cccgccgtgc 720 ccggccccgg agctgctggg cggcccgagc gtgttcctgt tcccgccgaa gccgaaggac 780 accctgatga tcagcaggac cccggaggtg acctgcgtgg tggtggacgt gagccacgag 840 gacccggagg tgaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcacaa cgccaagacc 900 aagccgaggg aggagcagta caacagcacc tacagggtgg tgagcgtgct gaccgtgctg 960 caccaggact ggctgaacgg caaggagtac aagtgcaagg tgagcaacaa ggccctgccg 1020 gccccgatcg agaagaccat cagcaaggcc aagggccagc cgagggagcc gcaggtgtac 1080 accctgccgc cgagcaggga cgagctgacc aagaaccagg tgagcctgac ctgcctggtg 1140 aagggcttct acccgagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaacggcca gccggagaac 1200 aactacaaga ccaccccgcc ggtgctggac agcgacggca gcttcttcct gtacagcaag 1260 ctgaccgtgg acaagagcag gtggcagcag ggcaacgtgt tcagctgcag cgtgatgcac 1320 gaggccctgc acaaccacta cacccagaag agcctgagcc tgagccccgg caagtga 1377 <210> 28 <211> 1377 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 28 atggtcagct actgggacac cggggtcctg ctgtgcgcgc tgctcagctg tctgcttctc 60 acaggatcta gttcaggttc agatacaggt agacctttcg tagagatgta cagtgaaatc 120 cccgaaatta tacacatgac tgaaggaagg gagctcgtca ttccctgccg ggttacgtca 180 cctaacatca ctgttacttt aaaaaagttt ccacttgaca ctttgatccc tgatggaaaa 240 cgcataatct gggacagtag aaagggcttc atcatatcaa atgcaacgta caaagaaata 300 gggcttctga cctgtgaagc aacagtcaat gggcatttgt ataagacaaa ctatctcaca 360 catcgacaaa ccaatacaat catagatgtc gttctgagtc cgtctcatgg aattgaacta 420 tctgttggag aaaagcttgt cttaaattgt acagcaagaa ctgaactaaa tgtggggatt 480 gacttcaact gggaataccc ttcttcgaag catcagcata agaaacttgt aaaccgagac 540 ctaaaaaccc agtctgggag tgagatgaag aaatttttga gcaccttaac tatagatggt 600 gtaacccgga gtgaccaagg attgtacacc tgtgcagcat ccagtgggct gatgaccaag 660 aagaacagca catttgtcag ggtccatgaa aaagacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc 720 ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 780 accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 840 gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 900 aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 960 caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 1020 gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 1080 accctgcccc catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 1140 aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 1200 aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 1260 ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 1320 gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaatga 1377 <210> 29 <400> 29 000 <210> 30 <211> 431 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 30 Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile 1 5 10 15 Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr 20 25 30 Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu 35 40 45 Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile 50 55 60 Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala 65 70 75 80 Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln 85 90 95 Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu 100 105 110 Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu 115 120 125 Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His 130 135 140 Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser 145 150 155 160 Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg 165 170 175 Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr 180 185 190 Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Asp Lys Thr His 195 200 205 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 210 215 220 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 225 230 235 240 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 245 250 255 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 260 265 270 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 275 280 285 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 290 295 300 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 305 310 315 320 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 325 330 335 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 340 345 350 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 355 360 365 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 370 375 380 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 385 390 395 400 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 405 410 415 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 420 425 430 <210> 31 <211> 1296 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> CDS <222> (1)..(1293) <400> 31 gac acc ggc agg ccc ttc gtg gag atg tac tcc gag atc ccc gag atc 48 Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile 1 5 10 15 atc cac atg acc gag ggc agg gag ctg gtg atc ccc tgc agg gtg acc 96 Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr 20 25 30 tcc ccc aac atc acc gtg acc ctg aag aag ttc ccc ctg gac acc ctg 144 Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu 35 40 45 atc ccc gac ggc aag agg atc atc tgg gac tcc agg aag ggc ttc atc 192 Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile 50 55 60 atc tcc aac gcc acc tac aag gag atc ggc ctg ctg acc tgc gag gcc 240 Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala 65 70 75 80 acc gtg aac ggc cac ctg tac aag acc aac tac ctg acc cac agg cag 288 Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln 85 90 95 acc aac acc atc atc gac gtg gtg ctg tcc ccc tcc cac ggc atc gag 336 Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu 100 105 110 ctg tcc gtg ggc gag aag ctg gtg ctg aac tgc acc gcc agg acc gag 384 Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu 115 120 125 ctg aac gtg ggc atc gac ttc aac tgg gag tac ccc tcc tcc aag cac 432 Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His 130 135 140 cag cac aag aag ctg gtg aac agg gac ctg aag acc cag tcc ggc tcc 480 Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser 145 150 155 160 gag atg aag aag ttc ctg tcc acc ctg acc atc gac ggc gtg acc agg 528 Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg 165 170 175 tcc gac cag ggc ctg tac acc tgc gcc gcc tcc tcc ggc ctg atg acc 576 Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr 180 185 190 aag aag aac tcc acc ttc gtg agg gtg cac gag aag gac aag acc cac 624 Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Asp Lys Thr His 195 200 205 acc tgc ccc ccc tgc ccc gcc ccc gag ctg ctg ggc ggc ccc tcc gtg 672 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 210 215 220 ttc ctg ttc ccc ccc aag ccc aag gac acc ctg atg atc tcc agg acc 720 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 225 230 235 240 ccc gag gtg acc tgc gtg gtg gtg gac gtg tcc cac gag gac ccc gag 768 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 245 250 255 gtg aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cac aac gcc aag 816 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 260 265 270 acc aag ccc agg gag gag cag tac aac tcc acc tac agg gtg gtg tcc 864 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 275 280 285 gtg ctg acc gtg ctg cac cag gac tgg ctg aac ggc aag gag tac aag 912 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 290 295 300 tgc aag gtg tcc aac aag gcc ctg ccc gcc ccc atc gag aag acc atc 960 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 305 310 315 320 tcc aag gcc aag ggc cag ccc agg gag ccc cag gtg tac acc ctg ccc 1008 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 325 330 335 ccc tcc agg gac gag ctg acc aag aac cag gtg tcc ctg acc tgc ctg 1056 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 340 345 350 gtg aag ggc ttc tac ccc tcc gac atc gcc gtg gag tgg gag tcc aac 1104 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 355 360 365 ggc cag ccc gag aac aac tac aag acc acc ccc ccc gtg ctg gac tcc 1152 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 370 375 380 gac ggc tcc ttc ttc ctg tac tcc aag ctg acc gtg gac aag tcc agg 1200 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 385 390 395 400 tgg cag cag ggc aac gtg ttc tcc tgc tcc gtg atg cac gag gcc ctg 1248 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 405 410 415 cac aac cac tac acc cag aag tcc ctg tcc ctg tcc ccc ggc aag tga 1296 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 420 425 430 <210> 32 <400> 32 000 <210> 33 <400> 33 000 <210> 34 <400> 34 000 <210> 35 <400> 35 000 <210> 36 <400> 36 000 <210> 37 <400> 37 000 <210> 38 <400> 38 000 <210> 39 <400> 39 000 <210> 40 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 40 Thr Pro Ser Gly Leu Ala Leu Gly Glu Thr Thr Arg Pro Ala Thr Thr 1 5 10 15 Thr Gln <210> 41 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 41 Gln Arg Gly Asn Leu Ala Leu Gly Glu Thr Thr Lys Pro Ala Arg Gln 1 5 10 15 Ala Ala <210> 42 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 42 Asn Thr Pro Ser Ala Leu Gly Glu Thr Thr Lys Pro Gly Thr Thr Thr 1 5 10 15 <210> 43 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 43 Asn Thr Pro Ser Ala Leu Gly Glu Thr Thr Lys Pro Gly Thr Thr Thr 1 5 10 15 <210> 44 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 44 Gln Arg Gly Asn Leu Lys Leu Gly Gln Thr Thr Lys Pro Lys Arg Gln 1 5 10 15 Ala Ala <210> 45 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 45 Gln Arg Gly Asn Leu Ala Leu Gly Gln Thr Thr Lys Pro Lys Arg Gln 1 5 10 15 Ala Ala <210> 46 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 46 Gln Arg Gly Asn Leu Lys Leu Gly Gln Thr Thr Lys Pro Ala Arg Gln 1 5 10 15 Ala Ala <210> 47 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 47 Gln Arg Gly Asn Leu Ala Leu Gly Gln Thr Thr Lys Pro Ala Arg Gln 1 5 10 15 Ala Ala <210> 48 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 48 Thr Pro Ser Gly Leu Ala Leu Gly Gln Thr Thr Lys Pro Ala Thr Thr 1 5 10 15 Thr Gln <210> 49 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 49 Gln Arg Gly Asn Leu Ala Leu Gly Gln Thr Thr Glu Pro Ala Arg Gln 1 5 10 15 Ala Ala <210> 50 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 50 Arg Gly Asn Arg Leu Ala Leu Gly Gln Thr Thr Lys Pro Ala Gln Ala 1 5 10 15 Ala Thr <210> 51 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 51 Asn Leu Gln Arg Leu Ala Leu Gly Gln Thr Thr Lys Pro Ala Gly Asn 1 5 10 15 Arg Gln <210> 52 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 52 Gln Arg Gly Asn Val Ala Leu Gly Gln Thr Thr Lys Pro Ala Arg Gln 1 5 10 15 Ala Ala <210> 53 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 53 Leu Gln Arg Gly Leu Ala Leu Gly Glu Ser Thr Ala Arg Gly Asn Arg 1 5 10 15 Gln Ala <210> 54 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 54 Leu Gln Arg Gly Leu Ala Leu Gly Glu Thr Ser Lys Arg Ala Asn Arg 1 5 10 15 Gln Ala <210> 55 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 55 Leu Gln Arg Gly Leu Ala Leu Gly Gln Ser Thr Lys Pro Ala Asn Arg 1 5 10 15 Gln Ala <210> 56 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 56 Asn Thr Pro Ser Leu Ala Leu Gly Gln Thr Thr Lys Pro Ala Gly Thr 1 5 10 15 Thr Thr <210> 57 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 57 Thr Pro Ser Gly Leu Ala Leu Gly Gln Thr Thr Lys Pro Ala Thr Thr 1 5 10 15 Thr Gln <210> 58 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 58 Gln Arg Gly Asn Leu Ala Leu Gly Gln Thr Thr Lys Pro Ala Leu Ala 1 5 10 15 Leu Gly Gln Thr Thr Lys Pro Ala Arg Gln Ala Ala 20 25 <210> 59 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 59 Gln Arg Gly Asn Val Lys Leu Gly Gln Thr Thr Lys Pro Ala Arg Gln 1 5 10 15 Ala Ala <210> 60 <400> 60 000 <210> 61 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 61 Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly Val 1 5 10 15 Gln Cys Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro 20 25 30 Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg 35 40 45 Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp 50 55 60 Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly 65 70 75 80 Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys 85 90 95 Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His 100 105 110 Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly 115 120 125 Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg 130 135 140 Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser 145 150 155 160 Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser 165 170 175 Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val 180 185 190 Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu 195 200 205 Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 62 <211> 1353 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> CDS <222> (4)..(1350) <400> 62 atg gag ttc ggc ctg agc tgg ctg ttc ctg gtg gcc atc ctt aag ggc 48 Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 gtg cag tgc gac acc ggc aga ccc ttc gtg gag atg tac agc gag atc 96 Val Gln Cys Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile 20 25 30 ccc gag atc atc cac atg acc gag ggc aga gag ctg gtg atc ccc tgc 144 Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys 35 40 45 aga gtg acc agc ccc aac atc acc gtg acc ctg aag aag ttc ccc ctg 192 Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu 50 55 60 gac acc ctg atc ccc gac ggc aag aga atc atc tgg gac agc aga aag 240 Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys 65 70 75 ggc ttc atc atc agc aac gcc acc tac aag gag atc ggc ctg ctg acc 288 Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr 80 85 90 95 tgc gag gcc acc gtg aac ggc cac ctg tac aag acc aac tac ctg acc 336 Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr 100 105 110 cac aga cag acc aac acc atc atc gac gtg gtg ctg agc ccc agc cac 384 His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His 115 120 125 ggc atc gag ctg agc gtg ggc gag aag ctg gtg ctg aac tgc acc gcc 432 Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala 130 135 140 aga acc gag ctg aac gtg ggc atc gac ttc aac tgg gag tac ccc agc 480 Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser 145 150 155 agc aag cac cag cac aag aag ctg gtg aac aga gac ctg aag acc cag 528 Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln 160 165 170 175 agc ggc agc gag atg aag aag ttc ctg agc acc ctg acc atc gac ggc 576 Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly 180 185 190 gtg acc aga agc gac cag ggc ctg tac acc tgc gcc gcc agc agc ggc 624 Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly 195 200 205 ctg atg acc aag aag aac agc acc ttc gtg aga gtg cac gag aag gac 672 Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Asp 210 215 220 aag acc cac acc tgc ccc ccc tgc ccc gcc ccc gag ctg ctg ggc ggc 720 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 ccc agc gtg ttc ctg ttc ccc ccc aag ccc aag gac acc ctg atg atc 768 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 240 245 250 255 agc aga acc ccc gag gtg acc tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gag 816 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 gac ccc gag gtg aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cac 864 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 aac gcc aag acc aag ccc aga gag gag cag tac aac agc acc tac aga 912 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 gtg gtg agc gtg ctg acc gtg ctg cac cag gac tgg ctg aac ggc aag 960 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 gag tac aag tgc aag gtg agc aac aag gcc ctg ccc gcc ccc atc gag 1008 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 320 325 330 335 aag acc atc agc aag gcc aag ggc cag ccc aga gag ccc cag gtg tac 1056 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 acc ctg ccc ccc agc aga gac gag ctg acc aag aac cag gtg agc ctg 1104 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 acc tgc ctg gtg aag ggc ttc tac ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg 1152 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 gag agc aac ggc cag ccc gag aac aac tac aag acc acc ccc ccc gtg 1200 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 ctg gac agc gac ggc agc ttc ttc ctg tac agc aag ctg acc gtg gac 1248 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 400 405 410 415 aag agc aga tgg cag cag ggc aac gtg ttc agc tgc agc gtg atg cac 1296 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 gag gcc ctg cac aac cac tac acc cag aag agc ctg agc ctg agc ccc 1344 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 ggc aag tga 1353 Gly Lys <210> 63 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 63 Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser 1 5 10 15 Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser Ser Gly Ser Asp Thr Gly Arg Pro 20 25 30 Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu 35 40 45 Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr 50 55 60 Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys 65 70 75 80 Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr 85 90 95 Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His 100 105 110 Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile 115 120 125 Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu 130 135 140 Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile 145 150 155 160 Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu 165 170 175 Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe 180 185 190 Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu 195 200 205 Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr 210 215 220 Phe Val Arg Val His Glu Lys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 225 230 235 240 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 245 250 255 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 260 265 270 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 275 280 285 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 290 295 300 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 305 310 315 320 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 325 330 335 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 340 345 350 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 355 360 365 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 370 375 380 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 385 390 395 400 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 405 410 415 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 420 425 430 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 435 440 445 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 <210> 64 <211> 1377 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> CDS <222> (1)..(1374) <400> 64 atg gtg agc tac tgg gac acc ggc gtg ctg ctg tgc gcc ctg ctg agc 48 Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser 1 5 10 15 tgc ctg ctg ctg acc ggc agc agc agc ggc agc gac acc ggc agg cct 96 Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser Ser Gly Ser Asp Thr Gly Arg Pro 20 25 30 ttc gtg gag atg tac agc gag atc cct gag atc atc cac atg acc gag 144 Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu 35 40 45 ggc agg gag ctg gtg atc cct tgc agg gtg acc agc cct aac atc acc 192 Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr 50 55 60 gtg acc ctg aag aag ttc cct ctg gac acc ctg atc cct gac ggc aag 240 Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys 65 70 75 80 agg atc atc tgg gac agc agg aag ggc ttc atc atc agc aac gcc acc 288 Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr 85 90 95 tac aag gag atc ggc ctg ctg acc tgc gag gcc acc gtg aac ggc cac 336 Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His 100 105 110 ctg tac aag acc aac tac ctg acc cac agg cag acc aac acc atc atc 384 Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile 115 120 125 gac gtg gtg ctg agc cct agc cac ggc atc gag ctg agc gtg ggc gag 432 Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu 130 135 140 aag ctg gtg ctg aac tgc acc gcc agg acc gag ctg aac gtg ggc atc 480 Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile 145 150 155 160 gac ttc aac tgg gag tac cct agc agc aag cac cag cac aag aag ctg 528 Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu 165 170 175 gtg aac agg gac ctg aag acc cag agc ggc agc gag atg aag aag ttc 576 Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe 180 185 190 ctg agc acc ctg acc atc gac ggc gtg acc agg agc gac cag ggc ctg 624 Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu 195 200 205 tac acc tgc gcc gcc agc agc ggc ctg atg acc aag aag aac agc acc 672 Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr 210 215 220 ttc gtg agg gtg cac gag aag gac aag acc cac acc tgc cct cct tgc 720 Phe Val Arg Val His Glu Lys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 225 230 235 240 cct gcc cct gag ctg ctg ggc ggc cct agc gtg ttc ctg ttc cct cct 768 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 245 250 255 aag cct aag gac acc ctg atg atc agc agg acc cct gag gtg acc tgc 816 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 260 265 270 gtg gtg gtg gac gtg agc cac gag gac cct gag gtg aag ttc aac tgg 864 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 275 280 285 tac gtg gac ggc gtg gag gtg cac aac gcc aag acc aag cct agg gag 912 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 290 295 300 gag cag tac aac agc acc tac agg gtg gtg agc gtg ctg acc gtg ctg 960 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 305 310 315 320 cac cag gac tgg ctg aac ggc aag gag tac aag tgc aag gtg agc aac 1008 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 325 330 335 aag gcc ctg cct gcc cct atc gag aag acc atc agc aag gcc aag ggc 1056 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 340 345 350 cag cct agg gag cct cag gtg tac acc ctg cct cct agc agg gac gag 1104 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 355 360 365 ctg acc aag aac cag gtg agc ctg acc tgc ctg gtg aag ggc ttc tac 1152 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 370 375 380 cct agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aac ggc cag cct gag aac 1200 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 385 390 395 400 aac tac aag acc acc cct cct gtg ctg gac agc gac ggc agc ttc ttc 1248 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 405 410 415 ctg tac agc aag ctg acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggc aac 1296 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 420 425 430 gtg ttc agc tgc agc gtg atg cac gag gcc ctg cac aac cac tac acc 1344 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 435 440 445 cag aag agc ctg agc ctg agc cct ggc aag tga 1377 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 <210> 65 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 65 Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser 1 5 10 15 Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser Ser Gly Ser Asp Thr Gly Arg Pro 20 25 30 Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu 35 40 45 Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr 50 55 60 Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys 65 70 75 80 Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr 85 90 95 Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His 100 105 110 Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile 115 120 125 Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu 130 135 140 Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile 145 150 155 160 Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu 165 170 175 Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe 180 185 190 Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu 195 200 205 Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr 210 215 220 Phe Val Arg Val His Glu Lys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 225 230 235 240 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 245 250 255 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 260 265 270 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 275 280 285 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 290 295 300 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 305 310 315 320 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 325 330 335 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 340 345 350 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 355 360 365 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 370 375 380 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 385 390 395 400 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 405 410 415 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 420 425 430 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 435 440 445 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 <210> 66 <211> 1377 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> CDS <222> (1)..(1374) <400> 66 atg gtg agc tac tgg gac acc ggc gtg ctg ctg tgc gcc ctg ctg agc 48 Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser 1 5 10 15 tgc ctg ctg ctg acc ggc agc agc agc ggc agc gac acc ggc agg ccc 96 Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser Ser Gly Ser Asp Thr Gly Arg Pro 20 25 30 ttc gtg gag atg tac tcc gag atc ccc gag atc atc cac atg acc gag 144 Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu 35 40 45 ggc agg gag ctg gtg atc ccc tgc agg gtg acc tcc ccc aac atc acc 192 Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr 50 55 60 gtg acc ctg aag aag ttc ccc ctg gac acc ctg atc ccc gac ggc aag 240 Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys 65 70 75 80 agg atc atc tgg gac tcc agg aag ggc ttc atc atc tcc aac gcc acc 288 Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr 85 90 95 tac aag gag atc ggc ctg ctg acc tgc gag gcc acc gtg aac ggc cac 336 Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His 100 105 110 ctg tac aag acc aac tac ctg acc cac agg cag acc aac acc atc atc 384 Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile 115 120 125 gac gtg gtg ctg tcc ccc tcc cac ggc atc gag ctg tcc gtg ggc gag 432 Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu 130 135 140 aag ctg gtg ctg aac tgc acc gcc agg acc gag ctg aac gtg ggc atc 480 Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile 145 150 155 160 gac ttc aac tgg gag tac ccc tcc tcc aag cac cag cac aag aag ctg 528 Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu 165 170 175 gtg aac agg gac ctg aag acc cag tcc ggc tcc gag atg aag aag ttc 576 Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe 180 185 190 ctg tcc acc ctg acc atc gac ggc gtg acc agg tcc gac cag ggc ctg 624 Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu 195 200 205 tac acc tgc gcc gcc tcc tcc ggc ctg atg acc aag aag aac tcc acc 672 Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr 210 215 220 ttc gtg agg gtg cac gag aag gac aag acc cac acc tgc ccc ccc tgc 720 Phe Val Arg Val His Glu Lys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 225 230 235 240 ccc gcc ccc gag ctg ctg ggc ggc ccc tcc gtg ttc ctg ttc ccc ccc 768 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 245 250 255 aag ccc aag gac acc ctg atg atc tcc agg acc ccc gag gtg acc tgc 816 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 260 265 270 gtg gtg gtg gac gtg tcc cac gag gac ccc gag gtg aag ttc aac tgg 864 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 275 280 285 tac gtg gac ggc gtg gag gtg cac aac gcc aag acc aag ccc agg gag 912 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 290 295 300 gag cag tac aac tcc acc tac agg gtg gtg tcc gtg ctg acc gtg ctg 960 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 305 310 315 320 cac cag gac tgg ctg aac ggc aag gag tac aag tgc aag gtg tcc aac 1008 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 325 330 335 aag gcc ctg ccc gcc ccc atc gag aag acc atc tcc aag gcc aag ggc 1056 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 340 345 350 cag ccc agg gag ccc cag gtg tac acc ctg ccc ccc tcc agg gac gag 1104 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 355 360 365 ctg acc aag aac cag gtg tcc ctg acc tgc ctg gtg aag ggc ttc tac 1152 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 370 375 380 ccc tcc gac atc gcc gtg gag tgg gag tcc aac ggc cag ccc gag aac 1200 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 385 390 395 400 aac tac aag acc acc ccc ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc 1248 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 405 410 415 ctg tac tcc aag ctg acc gtg gac aag tcc agg tgg cag cag ggc aac 1296 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 420 425 430 gtg ttc tcc tgc tcc gtg atg cac gag gcc ctg cac aac cac tac acc 1344 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 435 440 445 cag aag tcc ctg tcc ctg tcc ccc ggc aag tga 1377 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 <210> 67 <211> 458 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 67 Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser 1 5 10 15 Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser Ser Gly Ser Asp Thr Gly Arg Pro 20 25 30 Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu 35 40 45 Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr 50 55 60 Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys 65 70 75 80 Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr 85 90 95 Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His 100 105 110 Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile 115 120 125 Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu 130 135 140 Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile 145 150 155 160 Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu 165 170 175 Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe 180 185 190 Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu 195 200 205 Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr 210 215 220 Phe Val Arg Val His Glu Lys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 225 230 235 240 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 245 250 255 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 260 265 270 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 275 280 285 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 290 295 300 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 305 310 315 320 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 325 330 335 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 340 345 350 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 355 360 365 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 370 375 380 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 385 390 395 400 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 405 410 415 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 420 425 430 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 435 440 445 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 <210> 68 <211> 1377 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> CDS <222> (1)..(1374) <400> 68 atg gtg agc tac tgg gac acc ggc gtg ctg ctg tgc gcc ctg ctg agc 48 Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser 1 5 10 15 tgc ctg ctg ctg acc ggc agc agc agc ggc agc gac acc ggc agg ccg 96 Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser Ser Gly Ser Asp Thr Gly Arg Pro 20 25 30 ttc gtg gag atg tac agc gag atc ccg gag atc atc cac atg acc gag 144 Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu 35 40 45 ggc agg gag ctg gtg atc ccg tgc agg gtg acc agc ccg aac atc acc 192 Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr 50 55 60 gtg acc ctg aag aag ttc ccg ctg gac acc ctg atc ccg gac ggc aag 240 Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys 65 70 75 80 agg atc atc tgg gac agc agg aag ggc ttc atc atc agc aac gcc acc 288 Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr 85 90 95 tac aag gag atc ggc ctg ctg acc tgc gag gcc acc gtg aac ggc cac 336 Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His 100 105 110 ctg tac aag acc aac tac ctg acc cac agg cag acc aac acc atc atc 384 Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile 115 120 125 gac gtg gtg ctg agc ccg agc cac ggc atc gag ctg agc gtg ggc gag 432 Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu 130 135 140 aag ctg gtg ctg aac tgc acc gcc agg acc gag ctg aac gtg ggc atc 480 Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile 145 150 155 160 gac ttc aac tgg gag tac ccg agc agc aag cac cag cac aag aag ctg 528 Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu 165 170 175 gtg aac agg gac ctg aag acc cag agc ggc agc gag atg aag aag ttc 576 Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe 180 185 190 ctg agc acc ctg acc atc gac ggc gtg acc agg agc gac cag ggc ctg 624 Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu 195 200 205 tac acc tgc gcc gcc agc agc ggc ctg atg acc aag aag aac agc acc 672 Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr 210 215 220 ttc gtg agg gtg cac gag aag gac aag acc cac acc tgc ccg ccg tgc 720 Phe Val Arg Val His Glu Lys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 225 230 235 240 ccg gcc ccg gag ctg ctg ggc ggc ccg agc gtg ttc ctg ttc ccg ccg 768 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 245 250 255 aag ccg aag gac acc ctg atg atc agc agg acc ccg gag gtg acc tgc 816 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 260 265 270 gtg gtg gtg gac gtg agc cac gag gac ccg gag gtg aag ttc aac tgg 864 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 275 280 285 tac gtg gac ggc gtg gag gtg cac aac gcc aag acc aag ccg agg gag 912 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 290 295 300 gag cag tac aac agc acc tac agg gtg gtg agc gtg ctg acc gtg ctg 960 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 305 310 315 320 cac cag gac tgg ctg aac ggc aag gag tac aag tgc aag gtg agc aac 1008 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 325 330 335 aag gcc ctg ccg gcc ccg atc gag aag acc atc agc aag gcc aag ggc 1056 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 340 345 350 cag ccg agg gag ccg cag gtg tac acc ctg ccg ccg agc agg gac gag 1104 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 355 360 365 ctg acc aag aac cag gtg agc ctg acc tgc ctg gtg aag ggc ttc tac 1152 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 370 375 380 ccg agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aac ggc cag ccg gag aac 1200 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 385 390 395 400 aac tac aag acc acc ccg ccg gtg ctg gac agc gac ggc agc ttc ttc 1248 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 405 410 415 ctg tac agc aag ctg acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggc aac 1296 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 420 425 430 gtg ttc agc tgc agc gtg atg cac gag gcc ctg cac aac cac tac acc 1344 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 435 440 445 cag aag agc ctg agc ctg agc ccc ggc aag tga 1377 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 <210> 69 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 69 cgcaaucagu gaaugcuuau acauccg 27 <210> 70 <211> 1353 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 70 atgtacagaa tgcagctgct gctgctgatc gccctgagcc tggccctggt gaccaacagc 60 agcgacaccg gcagaccctt cgtggagatg tacagcgaga tccccgagat catccacatg 120 accgagggca gagagctggt gatcccctgc agagtgacca gccccaacat caccgtgacc 180 ctgaagaagt tccccctgga caccctgatc cccgacggca agagaatcat ctgggacagc 240 agaaagggct tcatcatcag caacgccacc tacaaggaga tcggcctgct gacctgcgag 300 gccaccgtga acggccacct gtacaagacc aactacctga cccacagaca gaccaacacc 360 atcatcgacg tggtgctgag ccccagccac ggcatcgagc tgagcgtggg cgagaagctg 420 gtgctgaact gcaccgccag aaccgagctg aacgtgggca tcgacttcaa ctgggagtac 480 cccagcagca agcaccagca caagaagctg gtgaacagag acctgaagac ccagagcggc 540 agcgagatga agaagttcct gagcaccctg accatcgacg gcgtgaccag aagcgaccag 600 ggcctgtaca cctgcgccgc cagcagcggc ctgatgacca agaagaacag caccttcgtg 660 agagtgcacg agaaggacaa gacccacacc tgccccccct gccccgcccc cgagctgctg 720 ggcggcccca gcgtgttcct gttccccccc aagcccaagg acaccctgat gatcagcaga 780 acccccgagg tgacctgcgt ggtggtggac gtgagccacg aggaccccga ggtgaagttc 840 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcac aacgccaaga ccaagcccag agaggagcag 900 tacaacagca cctacagagt ggtgagcgtg ctgaccgtgc tgcaccagga ctggctgaac 960 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtgagcaac aaggccctgc ccgcccccat cgagaagacc 1020 atcagcaagg ccaagggcca gcccagagag ccccaggtgt acaccctgcc ccccagcaga 1080 gacgagctga ccaagaacca ggtgagcctg acctgcctgg tgaagggctt ctaccccagc 1140 gacatcgccg tggagtggga gagcaacggc cagcccgaga acaactacaa gaccaccccc 1200 cccgtgctgg acagcgacgg cagcttcttc ctgtacagca agctgaccgt ggacaagagc 1260 agatggcagc agggcaacgt gttcagctgc agcgtgatgc acgaggccct gcacaaccac 1320 tacacccaga agagcctgag cctgagcccc ggc 1353

Claims (150)

  1. 항혈관형성제를 포함하는 생물제제를 코딩하는 서열을 포함하는 단리된 비-자연 발생 핵산으로서, 상기 서열은 코딩 영역에서의 변형이 결여된 그 외에는 필적하는 서열과 비교 시 서열의 코딩 영역에서의 변형을 포함하며, 상기 변형은 적어도 4개의 비-AGG 아르기닌 코돈을 AGG로 대체하는 것을 포함하는 것인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  2. 제1항에 있어서, 항혈관형성제를 코딩하는 서열이 제2 변형을 추가로 포함하는 것인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  3. 제2항에 있어서, 제2 변형이 서열의 코딩 영역의 적어도 하나의 코돈 내에 있으며, 제2 변형이 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단리된 비-자연 발생 핵산:
    (a) 적어도 하나의 비-CCC 프롤린 코돈을 CCC로 대체하는 것;
    (b) 적어도 하나의 비-TCC 세린 코돈을 TCC로 대체하는 것;
    (c) 적어도 하나의 비-CCG 프롤린 코돈을 CCG로 대체하는 것; 및
    (d) (a)-(c)의 임의의 조합.
  4. 제3항에 있어서, 제2 변형이 (a)를 포함하는 것인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  5. 제4항에 있어서, 적어도 하나의 비-CCC 프롤린 코돈이 CCT인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  6. 제3항에 있어서, 제2 변형이 (b)를 포함하는 것인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  7. 제6항에 있어서, 적어도 하나의 비-TCC 세린 코돈이 AGC인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  8. 제3항에 있어서, 제2 변형이 (c)를 포함하는 것인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  9. 제8항에 있어서, 적어도 하나의 비-CCG 프롤린 코돈이 CCC인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  10. 제3항에 있어서, 제2 변형이 (d)를 포함하는 것인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  11. 제10항에 있어서, (a)의 적어도 하나의 비-CCC 프롤린 코돈이 CCT이고; (b)의 적어도 하나의 비-TCC 세린 코돈이 AGC이고; (c)의 적어도 하나의 비-CCG 프롤린 코돈이 CCC인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 항혈관형성제가 VEGF 억제제, 멀티-티로신 키나제 억제제, 수용체 티로신 키나제 억제제, Akt 인산화 억제제, PDGF-1 억제제, PDGF-2 억제제, NP-1 억제제, NP-2 억제제, Del 1 억제제 및 인테그린 억제제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  13. 제12항에 있어서, 항혈관형성제가 VEGF 억제제를 포함하며, 여기서 VEGF 억제제는 비-항체 억제제인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  14. 제13항에 있어서, 비-항체 억제제가 인간 VEGF 수용체 1 및 2를 포함하는 융합 단백질인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  15. 제14항에 있어서, 융합 단백질이 VEGF-트랩 또는 그의 변형된 버전을 포함하는 것인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 비-자연 발생 핵산이 신호 펩티드를 추가로 포함하는 것인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  17. 제16항에 있어서, 신호 펩티드가 인간 항체 중쇄 (Vh), 인간 항체 경쇄 (Vl) 및 VEGF-트랩으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  18. 제17항에 있어서, 신호 펩티드가 인간 항체 중쇄로부터의 것인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  19. 제16항에 있어서, 신호 펩티드가 VEGF-트랩으로부터 유래되는 것인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 비-자연 발생 핵산이 인트론 서열을 추가로 포함하는 것인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  21. 제20항에 있어서, 인트론 서열이 hCMV 인트론 A, 아데노바이러스 삼자 리더 서열 인트론, SV40 인트론, 햄스터 EF-1 알파 유전자 인트론 1, 개입 서열 인트론, 인간 성장 호르몬 인트론 및 인간 베타 글로빈 인트론으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  22. 제21항에 있어서, 인트론 서열이 SV40 인트론인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 비-자연 발생 핵산이 프로모터를 추가로 포함하는 것인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  24. 제23항에 있어서, 프로모터가 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터, 신장 인자 1 알파 (EF1α) 프로모터, 원숭이 공포형성 바이러스 (SV40) 프로모터, 포스포글리세레이트 키나제 (PGK1) 프로모터, 유비퀴틴 C (Ubc) 프로모터, 인간 베타 액틴 프로모터, CAG 프로모터, 테트라시클린 반응 요소 (TRE) 프로모터, UAS 프로모터, 액틴 5c (Ac5) 프로모터, 폴리헤드론 프로모터, Ca2+/칼모듈린-의존성 단백질 키나제 II (CaMKIIa) 프로모터, GAL1 프로모터, GAL 10 프로모터, TEF1 프로모터, 글리세르알데히드 3-포스페이트 데히드로게나제 (GDS) 프로모터, ADH1 프로모터, CaMV35S 프로모터, Ubi 프로모터, 인간 폴리머라제 III RNA (H1) 프로모터, U6 프로모터, 그의 폴리아데닐화된 구축물, 및 그의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  25. 제24항에 있어서, 프로모터가 CMV 프로모터인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 서열이 이러한 서열의 코딩 영역의 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 또는 적어도 16개의 코돈에서 비-AGG 아르기닌 코돈을 AGG로 대체하도록 변형되는 것인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  27. 제26항에 있어서, 서열이 이러한 서열의 코딩 영역의 모든 비-AGG 아르기닌 코돈을 AGG로 대체하도록 변형되는 것인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 서열이 서열식별번호: 70과 비교 시 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 또는 적어도 16개의 코돈 위치에서 비-AGG 아르기닌 코돈을 AGG로 대체하도록 변형되는 것인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 서열이 서열식별번호: 70과 비교 시 모든 비-AGG 아르기닌 코돈을 AGG로 대체하도록 변형되는 것인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 비-AGG 아르기닌 코돈이 CGT, CGC, CGA, CGG 또는 AGA를 포함하는 것인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  31. 제30항에 있어서, 비-AGG 아르기닌 코돈이 AGA인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  32. 제31항에 있어서, 서열이 이러한 서열의 코딩 영역의 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 또는 적어도 16개의 코돈에서 AGA를 AGG로 대체하도록 변형되는 것인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  33. 제32항에 있어서, 서열이 이러한 서열의 코딩 영역의 모든 AGA를 AGG로 대체하도록 변형되는 것인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  34. 제31항에 있어서, 서열이 서열식별번호: 70과 비교 시 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 또는 적어도 16개의 코돈 위치에서 AGA를 AGG로 대체하도록 변형되는 것인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  35. 제34항에 있어서, 서열이 서열식별번호: 70과 비교 시 모든 AGA를 AGG로 대체하도록 변형되는 것인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  36. 제3항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 서열이 이러한 서열의 코딩 영역의 적어도 3개, 적어도 6개, 적어도 9개, 적어도 12개, 적어도 15개, 적어도 18개, 적어도 21개, 적어도 24개, 적어도 27개, 적어도 29개, 또는 적어도 30개의 코돈에서 비-CCC 프롤린 코돈을 CCC로 대체하도록 변형되는 것인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  37. 제36항에 있어서, 서열이 이러한 서열의 코딩 영역의 모든 비-CCC 프롤린 코돈을 CCC로 대체하도록 변형되는 것인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  38. 제3항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 서열이 서열식별번호: 70과 비교 시 적어도 3개, 적어도 6개, 적어도 9개, 적어도 12개, 적어도 15개, 적어도 18개, 적어도 21개, 적어도 24개, 적어도 27개, 적어도 29개, 또는 최대 30개의 코돈 위치에서 비-CCC 프롤린 코돈을 CCC로 대체하도록 변형되는 것인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  39. 제38항에 있어서, 서열이 서열식별번호: 70과 비교 시 모든 비-CCC 프롤린 코돈을 CCC로 대체하도록 변형되는 것인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  40. 제3항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 비-CCC 프롤린 코돈이 CCT 또는 CCA를 포함하는 것인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  41. 제40항에 있어서, 비-CCC 프롤린 코돈이 CCT인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  42. 제41항에 있어서, 서열이 이러한 서열의 코딩 영역의 적어도 3개, 적어도 6개, 적어도 9개, 적어도 12개, 적어도 15개, 적어도 18개, 적어도 21개, 적어도 24개, 적어도 27개, 적어도 29개, 또는 적어도 30개의 코돈에서 CCT를 CCC로 대체하도록 변형되는 것인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  43. 제42항에 있어서, 서열이 이러한 서열의 코딩 영역의 모든 CCT를 CCC로 대체하도록 변형되는 것인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  44. 제41항에 있어서, 서열이 서열식별번호: 70과 비교 시 적어도 3개, 적어도 6개, 적어도 9개, 적어도 12개, 적어도 15개, 적어도 18개, 적어도 21개, 적어도 24개, 적어도 27개, 적어도 29개, 또는 적어도 30개의 코돈 위치에서 CCT를 CCC로 대체하도록 변형되는 것인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  45. 제44항에 있어서, 서열이 서열식별번호: 70과 비교 시 모든 CCT를 CCC로 대체하도록 변형되는 것인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  46. 제3항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 서열이 이러한 서열의 코딩 영역의 적어도 3개, 적어도 6개, 적어도 9개, 적어도 12개, 적어도 15개, 적어도 18개, 적어도 21개, 적어도 24개, 적어도 27개, 적어도 30개, 적어도 33개, 또는 적어도 36개의 코돈에서 비-TCC 세린 코돈을 TCC로 대체하도록 변형되는 것인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  47. 제46항에 있어서, 서열이 이러한 서열의 코딩 영역의 모든 비-TCC 세린 코돈을 TCC로 대체하도록 변형되는 것인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  48. 제3항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 서열이 서열식별번호: 70과 비교 시 적어도 3개, 적어도 6개, 적어도 9개, 적어도 12개, 적어도 15개, 적어도 18개, 적어도 21개, 적어도 24개, 적어도 27개, 적어도 30개, 적어도 33개, 또는 적어도 36개의 코돈 위치에서 비-TCC 세린 코돈을 TCC로 대체하도록 변형되는 것인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  49. 제48항에 있어서, 서열이 서열식별번호: 70과 비교 시 모든 비-TCC 세린 코돈을 TCC로 대체하도록 변형되는 것인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  50. 제3항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 비-TCC 세린 코돈이 TCT, TCA, TCG, AGT 또는 AGC를 포함하는 것인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  51. 제50항에 있어서, 비-TCC 세린 코돈이 AGC인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  52. 제51항에 있어서, 서열이 이러한 서열의 코딩 영역의 적어도 3개, 적어도 6개, 적어도 9개, 적어도 12개, 적어도 15개, 적어도 18개, 적어도 21개, 적어도 24개, 적어도 27개, 적어도 30개, 적어도 33개, 또는 적어도 36개의 코돈에서 AGC를 TCC로 대체하도록 변형되는 것인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  53. 제52항에 있어서, 서열이 이러한 서열의 코딩 영역의 모든 AGC를 TCC로 대체하도록 변형되는 것인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  54. 제51항에 있어서, 서열이 서열식별번호: 70과 비교 시 적어도 3개, 적어도 6개, 적어도 9개, 적어도 12개, 적어도 15개, 적어도 18개, 적어도 21개, 적어도 24개, 적어도 27개, 적어도 30개, 적어도 33개, 또는 적어도 36개의 코돈 위치에서 AGC를 TCC로 대체하도록 변형되는 것인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  55. 제54항에 있어서, 서열이 서열식별번호: 70과 비교 시 모든 AGC를 TCC로 대체하도록 변형되는 것인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  56. 제3항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 서열이 이러한 서열의 코딩 영역의 적어도 3개, 적어도 6개, 적어도 9개, 적어도 12개, 적어도 15개, 적어도 18개, 적어도 21개, 적어도 24개, 적어도 27개, 또는 적어도 30개의 코돈에서 비-CCG 프롤린 코돈을 CCG로 대체하도록 변형되는 것인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  57. 제56항에 있어서, 서열이 이러한 서열의 코딩 영역의 모든 비-CCG 프롤린 코돈을 CCG로 대체하도록 변형되는 것인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  58. 제3항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 서열이 서열식별번호: 70과 비교 시 적어도 3개, 적어도 6개, 적어도 9개, 적어도 12개, 적어도 15개, 적어도 18개, 적어도 21개, 적어도 24개, 적어도 27개, 적어도 30개의 코돈 위치에서 비-CCG 프롤린 코돈을 CCG로 대체하도록 변형되는 것인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  59. 제58항에 있어서, 서열이 서열식별번호: 70과 비교 시 모든 비-CCG 프롤린 코돈을 CCG로 대체하도록 변형되는 것인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  60. 제3항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 비-CCG 프롤린 코돈이 CCC 또는 CCA를 포함하는 것인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  61. 제60항에 있어서, 비-CCG 프롤린 코돈이 CCC인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  62. 제61항에 있어서, 서열이 이러한 서열의 코딩 영역의 적어도 3개, 적어도 6개, 적어도 9개, 적어도 12개, 적어도 15개, 적어도 18개, 적어도 21개, 적어도 24개, 적어도 27개, 또는 적어도 30개의 코돈에서 CCC를 CCG로 대체하도록 변형되는 것인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  63. 제62항에 있어서, 서열이 이러한 서열의 코딩 영역의 모든 CCC를 CCG로 대체하도록 변형되는 것인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  64. 제61항에 있어서, 서열이 서열식별번호: 70과 비교 시 적어도 3개, 적어도 6개, 적어도 9개, 적어도 12개, 적어도 15개, 적어도 18개, 적어도 21개, 적어도 24개, 적어도 27개, 또는 적어도 30개의 코돈 위치에서 CCC를 CCG로 대체하도록 변형되는 것인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  65. 제64항에 있어서, 서열이 서열식별번호: 70과 비교 시 모든 CCC를 CCG로 대체하도록 변형되는 것인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  66. 제1항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산이 바이러스 벡터 서열을 포함하는 것인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  67. 제66항에 있어서, 바이러스 벡터 서열이 scAAV 벡터 서열인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  68. 제67항에 있어서, AAV 벡터 서열이 혈청형 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12 또는 그의 임의의 조합의 것인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  69. 제68항에 있어서, AAV 벡터 서열이 AAV2 혈청형의 것인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  70. 제66항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 벡터 서열이 적어도 2개의 AAV 혈청형의 서열을 포함하는 것인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  71. 제70항에 있어서, 적어도 2개의 혈청형이 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV8, AAV9, AAV11 및 AAV12로부터 선택되는 것인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  72. 제1항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 비-자연 발생 핵산이 서열식별번호: 13-19, 21-27, 31, 62, 64, 66, 또는 68 중 어느 하나와 적어도 약 60%의 서열 동일성 또는 유사성을 포함하는 것인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  73. 제72항에 있어서, 서열 동일성이 약 70%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 및 최대 약 100%인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  74. 제72항에 있어서, 단리된 비-자연 발생 핵산이 서열식별번호: 31과 약 70%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 및 최대 약 100%의 서열 동일성을 포함하는 것인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  75. 제72항에 있어서, 단리된 비-자연 발생 핵산이 서열식별번호: 31의 핵산 서열을 포함하는 것인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  76. 제72항에 있어서, 단리된 비-자연 발생 핵산이 서열식별번호: 31의 핵산 서열로 이루어진 것인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  77. 제72항에 있어서, 단리된 비-자연 발생 핵산이 서열식별번호: 66과 약 70%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 및 최대 약 100%의 서열 동일성을 포함하는 것인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  78. 제72항에 있어서, 단리된 비-자연 발생 핵산이 서열식별번호: 66의 핵산 서열을 포함하는 것인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  79. 제72항에 있어서, 단리된 비-자연 발생 핵산이 서열식별번호: 66의 핵산 서열로 이루어진, 단리된 비-자연 발생 핵산.
  80. 제66항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 벡터 서열이 단일 가닥인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  81. 제66항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 벡터 서열이 이중 가닥인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  82. 제1항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 비-자연 발생 핵산이 단일 가닥인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  83. 제1항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 비-자연 발생 핵산이 이중 가닥인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  84. 제1항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 비-자연 발생 핵산이, 복수개의 세포와 접촉 시, 필적하는 복수개의 세포에서의 변형이 결여된 그 외에는 필적하는 서열이 결여된 그 외에는 필적하는 단리된 비-자연 발생 핵산과 비교 시, 복수개의 세포에서의 형질감염 후 또는 형질도입 후의 생물제제의 발현을 증가시키는 것인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  85. 제84항에 있어서, 증가된 발현이 효소 결합 면역검정 (ELISA) 검정에 의해 결정된 바와 같이 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 200배, 또는 적어도 500배 증가를 포함하는 것인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  86. 서열식별번호: 13-19, 21-27, 31, 62, 64, 66 또는 68의 핵산 서열 중 어느 하나와 적어도 약 60%의 서열 동일성 또는 유사성을 포함하는 단리된 비-자연 발생 핵산.
  87. 제86항에 있어서, 단리된 비-자연 발생 핵산이 서열식별번호: 31의 핵산 서열을 포함하는 것인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  88. 제86항에 있어서, 단리된 비-자연 발생 핵산이 서열식별번호: 66의 핵산 서열을 포함하는 것인 단리된 비-자연 발생 핵산.
  89. 제86항 내지 제88항 중 어느 한 항의 단리된 비-자연 발생 핵산에 의해 코딩된 생물제제.
  90. 제89항에 있어서, 생물제제가 서열식별번호: 12와 적어도 약 60%의 서열 동일성을 포함하는 것인 생물제제.
  91. 제90항에 있어서, 서열 동일성이 약 70%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 및 최대 약 100%인 생물제제.
  92. 제1항 내지 제88항 중 어느 한 항의 단리된 비-자연 발생 핵산을 포함하는 조작된 세포.
  93. 제1항 내지 제88항 중 어느 한 항의 단리된 비-자연 발생 핵산을 포함하는 복수개의 아데노-연관 바이러스 (AAV) 입자.
  94. 단위 투여 형태로 제93항의 복수개의 AAV 입자를 포함하는 조성물.
  95. 제106항에 있어서, 조성물이 냉동보존되는 것인 조성물.
  96. (a) 제1항 내지 제88항 중 어느 한 항의 단리된 비-자연 발생 핵산; (b) 제89항 내지 제91항 중 어느 한 항의 생물제제; (c) 제92항의 조작된 세포, 또는 (d) 제93항의 복수개의 AAV 입자를 포함하는 용기.
  97. 하기를 포함하는, 세포를 변형시키는 방법:
    (a) 복수개의 세포를 제1항 내지 제88항 중 어느 한 항의 단리된 비-자연 발생 핵산과 접촉시키는 것;
    (b) 복수개의 세포를 제93항의 복수개의 아데노-연관 바이러스 (AAV) 입자와 접촉시키는 것; 또는
    (c) (a)와 (b) 둘 다.
  98. (a) 제1항 내지 제88항 중 어느 한 항의 단리된 비-자연 발생 핵산; (b) 제89항 내지 제91항 중 어느 한 항의 생물제제; 또는 (c) 제93항의 복수개의 AAV 입자를 포함하는 제약 조성물.
  99. 제98항에 있어서, 조성물이 안구 질환 또는 병태를 치료하기 위한 것인 제약 조성물.
  100. 제98항 또는 제99항에 있어서, 안구 질환 또는 병태가 완전색맹, 연령-관련 황반 변성 (AMD), 당뇨병성 망막병증 (DR), 녹내장, 바르데-비들 증후군, 베스트병, 맥락막결손, 레베르 선천성 흑암시, 황반 변성, 결절성 맥락막 혈관병증 (PCV), 색소성 망막염, 레프섬병, 스타르가르트병, 어셔 증후군, X-연관 망막층간분리 (XLRS), 간체-추체 이영양증, 추체-간체 이영양증, 오구치병, 말라티아 레벤티네스 (가족성 우성 드루젠) 및 청색 추체 단색형색각으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제약 조성물.
  101. 제100항에 있어서, 안구 질환 또는 병태가 AMD인 제약 조성물.
  102. 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에게 제98항 내지 제101항 중 어느 한 항의 제약 조성물의 유효량을 투여하는 것, 및 그에 의해 질환을 치료하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는 방법.
  103. 항혈관형성제를 포함하는 생물제제를 코딩하는 서열을 포함하는 단리된 비-자연 발생 핵산을 포함하며, 여기서 서열은 코딩 영역에서의 변형이 결여된 그 외에는 필적하는 서열과 비교 시 서열의 코딩 영역의 적어도 4개의 코돈에서 비-AGG 아르기닌 코돈을 AGG로 대체하도록 변형되는 것인 제약 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것, 및 그에 의해 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는 방법.
  104. 항혈관형성제를 포함하는 생물제제를 코딩하는 서열을 포함하는 단리된 비-자연 발생 핵산을 포함하며, 여기서 서열은 코딩 영역에서의 변형이 결여된 그 외에는 필적하는 서열과 비교 시 서열의 코딩 영역의 적어도 4개의 코돈에서 비-AGG 아르기닌 코돈을 AGG로 대체하도록 변형되고, 여기서 변형은 이러한 변형이 결여된 그 외에는 필적하는 단리된 비-자연 발생 핵산이 투여된 그 외에는 필적하는 대상체와 비교 시 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 생물제제의 수준을 증가시키는데 유효한 것인 제약 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는 방법.
  105. 제104항에 있어서, 대상체에서 생물제제의 증가된 수준이, 진단 검정에 의해 결정된 바와 같이, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 200배, 또는 적어도 500배 증가되는 것인 방법.
  106. 제102항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 항혈관형성제를 코딩하는 서열이 제2 변형을 추가로 포함하는 것인 방법.
  107. 제106항에 있어서, 제2 변형이 서열의 코딩 영역의 적어도 하나의 코돈 내에 있으며, 제2 변형이 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법:
    (a) 적어도 하나의 비-CCC 프롤린 코돈을 CCC로 대체하는 것;
    (b) 적어도 하나의 비-TCC 세린 코돈을 TCC로 대체하는 것;
    (c) 적어도 하나의 비-CCG 프롤린 코돈을 CCG로 대체하는 것; 및
    (d) (a)-(c)의 임의의 조합.
  108. 제107항에 있어서, 제2 변형이 (a)를 포함하는 것인 방법.
  109. 제107항에 있어서, 제2 변형이 (b)를 포함하는 것인 방법.
  110. 제107항에 있어서, 제2 변형이 (c)를 포함하는 것인 방법.
  111. 제107항에 있어서, 제2 변형이 (d)를 포함하는 것인 방법.
  112. 항혈관형성제를 포함하는 생물제제를 코딩하는 서열을 포함하는 단리된 비-자연 발생 핵산을 포함하며, 여기서 서열은 코딩 영역에서의 변형이 결여된 그 외에는 필적하는 서열과 비교 시 서열의 코딩 영역의 적어도 4개의 코돈에서 AGA를 AGG로 대체하도록 변형되는 것인 제약 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것, 및 그에 의해 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는 방법.
  113. 항혈관형성제를 포함하는 생물제제를 코딩하는 서열을 포함하는 단리된 비-자연 발생 핵산을 포함하는 제약 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 서열은 코딩 영역에서의 변형이 결여된 그 외에는 필적하는 서열과 비교 시 서열의 코딩 영역의 적어도 4개의 코돈에서 AGA를 AGG로 대체하도록 변형되고, 여기서 변형은 이러한 변형이 결여된 그 외에는 필적하는 단리된 비-자연 발생 핵산이 투여된 그 외에는 필적하는 대상체와 비교 시 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 생물제제의 수준을 증가시키는데 유효한 것인, 상기 대상체에서 질환 또는 병태를 치료하는 방법.
  114. 제113항에 있어서, 대상체에서 생물제제의 증가된 수준이, 진단 검정에 의해 결정된 바와 같이, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 200배, 또는 적어도 500배 증가된 것인 방법.
  115. 제112항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, 항혈관형성제를 코딩하는 서열이 제2 변형을 추가로 포함하는 것인 방법.
  116. 제115항에 있어서, 제2 변형이 서열의 코딩 영역의 적어도 하나의 코돈 내에 있으며, 제2 변형이 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법:
    (a) CCT에서 CCC로의 변형;
    (b) AGC에서 TCC로의 변형;
    (c) CCC에서 CCG로의 변형; 및
    (d) (a)-(c)의 임의의 조합.
  117. 제116항에 있어서, 제2 변형이 (a)를 포함하는 것인 방법.
  118. 제116항에 있어서, 제2 변형이 (b)를 포함하는 것인 방법.
  119. 제116항에 있어서, 제2 변형이 (c)를 포함하는 것인 방법.
  120. 제116항에 있어서, 제2 변형이 (d)를 포함하는 것인 방법.
  121. 제102항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 항혈관형성제가 VEGF 억제제, 멀티-티로신 키나제 억제제, 수용체 티로신 키나제 억제제, 또는 Akt 인산화 억제제를 포함하는 것인 방법.
  122. 제121항에 있어서, 항혈관형성제가 VEGF 억제제를 포함하는 것인 방법.
  123. 제122항에 있어서, VEGF 억제제가 비-항체 억제제인 방법.
  124. 제123항에 있어서, 비-항체 억제제가 인간 VEGF 수용체 1 및 2를 포함하는 융합 단백질을 포함하며, 여기서 융합 단백질은 VEGF-트랩 또는 그의 변형된 버전을 포함하는 것인 방법.
  125. 제102항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 단리된 비-자연 발생 핵산이 서열식별번호: 13-19, 21-27, 31, 62, 64, 66 또는 68 중 어느 하나와 적어도 약 60%의 서열 동일성 또는 유사성을 포함하는 것인 방법.
  126. 제125항에 있어서, 서열 동일성이 약 70%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 및 최대 약 100%인 방법.
  127. 제125항에 있어서, 단리된 비-자연 발생 핵산이 서열식별번호: 31과 약 70%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 및 최대 약 100%의 서열 동일성을 포함하는 것인 방법.
  128. 제125항에 있어서, 단리된 비-자연 발생 핵산이 서열식별번호: 31의 핵산 서열을 포함하는 것인 방법.
  129. 제125항에 있어서, 단리된 비-자연 발생 핵산이 서열식별번호: 31의 핵산 서열로 이루어지는 것인 방법.
  130. 제125항에 있어서, 단리된 비-자연 발생 핵산이 서열식별번호: 66과 약 70%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 및 최대 약 100%의 서열 동일성을 포함하는 것인 방법.
  131. 제125항에 있어서, 단리된 비-자연 발생 핵산이 서열식별번호: 66의 핵산 서열을 포함하는 것인 방법.
  132. 제125항에 있어서, 단리된 비-자연 발생 핵산이 서열식별번호: 66의 핵산 서열로 이루어지는 것인 방법.
  133. 제102항 내지 제132항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산이 바이러스 벡터 서열을 포함하는 것인 방법.
  134. 제133항에 있어서, 바이러스 벡터 서열이 scAAV 벡터 서열인 방법.
  135. 제134항에 있어서, AAV 벡터 서열이 혈청형 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, 또는 그의 임의의 조합의 것인 방법.
  136. 제135항에 있어서, AAV 벡터 서열이 AAV2 혈청형의 것인 방법.
  137. 제102항 내지 제136항 중 어느 한 항에 있어서, 투여가 유리체내 주사, 망막하 주사, 미세주사 또는 안구상 주사를 통해 이루어지는 것인 방법.
  138. 제137항에 있어서, 투여가 유리체내 주사를 통해 이루어지는 것인 방법.
  139. 제102항 내지 제138항 중 어느 한 항에 있어서, 안구 질환 또는 병태가 완전색맹, 연령-관련 황반 변성 (AMD), 당뇨병성 망막병증 (DR), 녹내장, 바르데-비들 증후군, 베스트병, 맥락막결손, 레베르 선천성 흑암시, 황반 변성, 결절성 맥락막 혈관병증 (PCV), 색소성 망막염, 레프섬병, 스타르가르트병, 어셔 증후군, X-연관 망막층간분리 (XLRS), 간체-추체 이영양증, 추체-간체 이영양증, 오구치병, 말라티아 레벤티네스 (가족성 우성 드루젠) 및 청색 추체 단색형색각으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  140. 제139항에 있어서, 안구 질환 또는 병태가 AMD인 방법.
  141. 제140항에 있어서, AMD가 습성 AMD인 방법.
  142. 제140항에 있어서, AMD가 건성 AMD인 방법.
  143. 제102항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, 투여가 질환 또는 병태의 적어도 특정 증상을 감소시키고/거나, 질환 또는 병태를 치료하고/거나 질환 또는 병태를 제거하기에 충분한 것인 방법.
  144. 제102항 내지 제143항 중 어느 한 항에 있어서, 투여가 약 1.0 x 109 vg, 약 1.0 x 1010, 약 1.0 x 1011 vg, 약 3.0 x 1011 vg, 약 6 x 1011 vg, 약 8.0 x 1011 vg, 약 1.0 x 1012 vg, 약 1.0 x 1013 vg, 약 1.0 x 1014 vg, 또는 약 1.0 x 1015 vg의 단리된 비-자연 발생 핵산의 투여량을 전달하는 것을 포함하는 것인 방법.
  145. 제102항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서, 투여가 반복되는 것인 방법.
  146. 제145항에 있어서, 투여가 매일 2회, 격일로, 주 2회, 매달 2회, 매달 3회, 월 1회, 격월로, 반년마다, 매년 또는 2년마다 수행되는 것인 방법.
  147. 제102항 내지 제146항 중 어느 한 항에 있어서, 투여 전에 대상체가 유전자 검사를 받는 것인 방법.
  148. 제147항에 있어서, 유전자 검사가 그 외에는 필적하는 야생형 서열과 비교 시 유전자 서열에서의 돌연변이를 검출하는 것인 방법.
  149. 제102항 내지 제148항 중 어느 한 항에 있어서, 방법이 2차 요법을 투여하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  150. 제149항에 있어서, 2차 요법이 광역학 요법 (PDT), 항염증제, 항미생물제 및 레이저 광응고 요법 (LPT) 중 적어도 하나를 포함하는 것인 방법.
KR1020237038198A 2021-04-09 2022-04-08 안구 트랜스진 발현을 위한 조성물 및 방법 KR20230167100A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202163173280P 2021-04-09 2021-04-09
US63/173,280 2021-04-09
PCT/US2022/024101 WO2022217110A1 (en) 2021-04-09 2022-04-08 Compositions and methods for ocular transgene expression

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20230167100A true KR20230167100A (ko) 2023-12-07

Family

ID=83545763

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237038198A KR20230167100A (ko) 2021-04-09 2022-04-08 안구 트랜스진 발현을 위한 조성물 및 방법

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20240092866A1 (ko)
EP (1) EP4320240A1 (ko)
JP (1) JP2024516128A (ko)
KR (1) KR20230167100A (ko)
CN (1) CN117460830A (ko)
AU (1) AU2022253065A1 (ko)
BR (1) BR112023020490A2 (ko)
CA (1) CA3210368A1 (ko)
WO (1) WO2022217110A1 (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2023540464A (ja) * 2020-07-21 2023-09-25 インスピラール リミテッド 眼疾患の処置のための組成物および方法
AU2022332896A1 (en) * 2021-08-23 2024-03-28 Avirmax Biopharma Inc. Compositions and methods for transgene expression

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6723551B2 (en) * 2001-11-09 2004-04-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of adeno-associated virus in insect cells
US10717975B2 (en) * 2016-06-03 2020-07-21 Trustees Of Boston College Universal platform for genetic code expansion
CR20200282A (es) * 2017-11-27 2021-02-18 4D Molecular Therapeutics Inc Cápsides variantes de virus adenoasociados y su uso para inhibir la angiogénesis
CA3125511A1 (en) * 2019-02-08 2020-08-13 Curevac Ag Coding rna administered into the suprachoroidal space in the treatment of ophthalmic diseases
CN113817775B (zh) * 2020-08-25 2023-02-17 南京吉迈生物技术有限公司 修饰的阿柏西普、组合物、方法及其在基因治疗中的应用
CN114250227A (zh) * 2020-09-25 2022-03-29 北京安龙基因医药技术有限公司 用于高水平表达外源基因的表达载体

Also Published As

Publication number Publication date
BR112023020490A2 (pt) 2023-11-21
CN117460830A (zh) 2024-01-26
WO2022217110A1 (en) 2022-10-13
AU2022253065A1 (en) 2023-09-28
US20240092866A1 (en) 2024-03-21
JP2024516128A (ja) 2024-04-12
CA3210368A1 (en) 2022-10-13
AU2022253065A9 (en) 2024-01-25
EP4320240A1 (en) 2024-02-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20230167100A (ko) 안구 트랜스진 발현을 위한 조성물 및 방법
KR102240180B1 (ko) 다중 벡터 시스템 및 이의 용도
KR20200074988A (ko) 아데노바이러스 벡터 및 이의 용도
KR20180097629A (ko) 아데노-관련 바이러스를 지시하기 위한 타겟팅 펩타이드
BRPI0714495A2 (pt) mÉtodo de liberaÇço de polinucleotÍdeo para cÉlula dendrÍtica que expressa dc-sign, vetor, vÍrus recombinantes e cÉlula dendrÍtica transduzida com os mesmos e seus usos
CN101553506A (zh) Lingo结合分子及其制药用途
CN112574964A (zh) 用于治疗淀粉状蛋白沉积的方法和组合物
JP2022529775A (ja) 硝子体内送達のためのバリアントａａｖキャプシド
TW202221018A (zh) 基因療法
KR20200083510A (ko) 아데노바이러스 및 이의 용도
CN114616000A (zh) 载体组合物及其用于治疗溶酶体贮积症的方法
CN113631033A (zh) 与enpp1或enpp3缺乏有关的疾病的治疗
KR102545070B1 (ko) 안구 장애에 대한 유전자 치료
KR20200107990A (ko) 신경 생존 인자를 포함하는 컨스트럭트 및 이의 용도
KR20220139344A (ko) 신경변성 질환을 치료하기 위한 조성물 및 방법
WO2022219200A1 (en) Casrx/cas13d systems targeting c9orf72
CA3195071A1 (en) Liver specific production of enpp1 or enpp3
CN101516199A (zh) 用于树突状细胞免疫的靶向基因输送
KR20230039669A (ko) eEF1A2용 유전자 요법 벡터 및 이의 용도
RU2823437C2 (ru) Лечение и/или профилактика заболевания или синдрома, связанного с вирусной инфекцией
CN110312803B (zh) 编辑核酸序列的组合物及方法
CN117813321A (zh) 视网膜病症
KR20230005965A (ko) 바이러스 감염 관련 질환 또는 증후군의 치료 및/또는 예방
US20240263143A1 (en) Baby Hamster Kidney (BHK) Cells Transformed with the Adenoviral E1 Gene for Production of Recombinant Adeno-Associated Virus
KR102721254B1 (ko) 형질전환시킨 중국햄스터난소 세포를 활용하여 시시엔5 단백질을 제조하는 방법