CN101516199A - 用于树突状细胞免疫的靶向基因输送 - Google Patents

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Abstract

本发明提供将编码感兴趣基因尤其是抗原的多核苷酸输送到树突状细胞(DC)的方法和组合物。病毒包膜包括DC－SIGN特异性靶向分子。所述方法和相关组合物可以用来治疗患有各种疾病(包括传染性疾病例如HIV/AIDS和各种类型的癌症)的患者。

Description

用于树突状细胞免疫的靶向基因输送
发明背景
本发明主要涉及靶向基因输送，更具体的是使用包括靶向分子的重组病毒，所述靶向分子靶向于树突状细胞并与其结合，从而可以用于树突状细胞的免疫。
免疫是现代医学的一种最有效的医疗措施，但是具有很多的局限性。有些传染性疾病例如HIV/AIDS，疟疾，和肺结核病不能通过免疫来完全控制，但是其他传染性疾病可以通过复杂的免疫来控制。癌症有望通过免疫来治疗，但是临床实验证明此方法效果不佳(Rosenberg，S.A.et al.2004.Nat.Med.10：909-915，其在此整体引入作为参考)。所以需要新的免疫方法例如能够稳定诱导抗癌的免疫方法。
树突状细胞(DCs)在先天性免疫和获得性免疫过程中都扮演重要的角色。树突状细胞是一种特化的抗原递呈细胞，具有以下独特的能力：捕获和加工抗原，从外周迁移到淋巴器官，并以主要组织相容性复合物(MHC)限制性方式将抗原递呈给静止T细胞(Banchereau，J.&Steinman，R.M.1998.Nature392：245-252；Steinman，R.M.，et al.2003.Ann Rev Immunol 21：685-711，其各自在此整体引入作为参考)。这些细胞起源于骨髓(BM)，它们的特点是具有树突状结构和高移动性。未成熟的树突状细胞可以吞噬抗原，它们像哨兵一样遍布于全身的外周组织。但是，树突状细胞的成熟对于引发有效的免疫应答非常重要。(Steinman，R.M.，et al.2003.上文)。成熟的树突状细胞能够表达高水平的MHC-抗原复合物和其它共刺激分子(例如CD40，B7-1，B7-2和CD1a)。(Steinman，R.M.1991.Ann Rev Immunol 9：271-296，其在此整体引入作为参考；Banchereau，J.and R.M.Steinman.1998.上文)。这些分子在激活T细胞时发挥重要作用。
树突状细胞作为特化抗原递呈细胞(APCs)的发现促使人们尝试基于DC的免疫/接种，这涉及用特异性抗原加载树突状细胞(Banchereau，J.&Palucka，A.K.2005.Nat.Rev.Immunol.5：296-306；Figdor，CG.et al.2004.Nat.Med.10：475-480，其各自在此整体引入作为参考)。但是所有这些尝试都涉及在体外用特异性抗原加载树突状细胞。然后将体外产生的树突状细胞给患者施用。为每位患者在体外产生树突状细胞是极度耗费劳力的过程。
相反，本发明尤其涉及体内的树突状细胞靶向、抗原加载和激活，这样就可以通过引发有益的体内免疫应答而有效的对患者进行治疗。本发明因此实现对于有效和有能力的免疫/接种法的长期需要。
发明概述
在本发明的一个方面，提供将多核苷酸输送到表达DC-SIGN的树突状细胞的方法。在一些实施方案中，所述方法包括用重组病毒转导树突状细胞，其中，重组病毒包含待输送的多核苷酸和结合DC-SIGN的靶向分子。在一些实施方案中，靶向分子对DC-SIGN是特异性的。
在本发明的一些实施方案中，重组病毒包括慢病毒基因组的序列，例如HIV基因组。
在其他实施方案中，重组病毒包括γ逆转录病毒基因组的序列，如小鼠干细胞病毒(MSCV)基因组或者小鼠白血病病毒(MLV)基因组的序列。
在本发明的某些实施方案中，所述方法利用包含衍生自至少一种病毒的病毒糖蛋白的靶向分子，所述病毒选自：辛德比斯病毒、流感病毒、拉沙热病毒，森林脑炎病毒，登革热病毒，乙肝病毒，狂犬病病毒，塞姆利基森林病毒，罗斯河(Ross River)病毒，Aura病毒，近东马脑脊髓炎病毒，汉坦病毒，和SARS-CoV病毒。在更具体的实施方案中，靶向分子包括经过修饰的源自辛德比斯病毒(SIN或SVG)的病毒糖蛋白。在某些实施方案中，靶向分子是SINmu，也可以被称作SVGmu(SEQ ID NO：11)。
在一些实施方案中，被输送到树突状细胞的多核苷酸包括下列至少一种：编码感兴趣的蛋白的基因，编码siRNA的基因，和编码microRNA的基因。所述编码感兴趣的蛋白的基因可以编码抗原，例如肿瘤抗原或者HIV抗原。
可以通过以下方法制备重组病毒：用包括待输送的多核苷酸的病毒载体和包括编码靶向分子的基因的载体转染包装细胞系；培养被转染的包装细胞系；并从包装细胞培养物回收重组病毒。在一些实施方案中，所述包装细胞系是293细胞系。
在本发明的一些实施方案中，多核苷酸在体外被输送到树突状细胞，但是在其他实施方案中，多核苷酸在体内被输送到受试者的树突状细胞。所述受试者通常是哺乳动物，诸如人类、小鼠或者豚鼠。
另一方面，提供重组病毒，其包含：感兴趣的多核苷酸；结合DC-SIGN的靶向分子。在一些实施方案中，靶向分子特异性结合树突状细胞。重组病毒可以包含慢病毒基因组的序列，例如HIV基因组的序列。在其他实施方式中，重组病毒包含γ逆转录病毒基因组的序列，例如来自小鼠干细胞病毒(MSCV)基因组或者小鼠白血病病毒(MLV)基因组的序列。
靶向分子可以包含源自至少一种病毒的病毒糖蛋白，所述病毒选自：辛德比斯病毒，流感病毒，拉沙热病毒，森林脑炎病毒，登革热病毒，肝炎病毒，狂犬病病毒，塞姆利基森林病毒，罗斯河，Aura病毒，近东马脑脊髓炎病毒，汉坦病毒，SARS-CoV病毒。在一些实施方式中靶向分子是源自辛德比斯病毒的病毒糖蛋白。在具体实施方案中，靶向分子是SVGmu(SEQ ID NO：11)。
例如，所述多核苷酸可能是下列至少一种：编码感兴趣蛋白的基因，编码siRNA的基因，编码感兴趣的microRNA的基因。在一些实施方案中，所述多核苷酸编码抗原，如肿瘤抗原或者HIV抗原。
在另一个方面，提供刺激哺乳动物免疫应答的方法。通过将重组病毒(包括多核苷酸和结合DC-SIGN的靶向分子)与树突状细胞接触，将编码免疫应答所需抗原的多核苷酸输送到表达DC-SIGN的树突状细胞。在一些实施方案中，所述靶向细胞对DC-SIGN是特异性的，基本不和其他分子结合。在其他实施方式中，靶向分子优先结合树突状细胞。
在另一方面，提供编码靶向分子的载体，所述靶向分子结合DC-SIGN。在一些实施方案中，靶向分子是经过修饰的糖蛋白。在进一步的实施方案中，靶向分子是SVGmu(SEQ ID NO：11)。在一些实施方案中，靶向分子特异性的结合DC-SIGN。所述载体还可以编码感兴趣的一个或者多个基因，例如编码抗原的基因或者编码树突细胞成熟因子的基因。
仍在另一方面，提供治疗患者的方法。将重组病毒给药患者，其中所述重组蛋白包括多核苷酸(编码和疾病相关的抗原)和靶向分子(结合DC-SIGN)。靶向分子可以源自病毒糖蛋白。在一些实施方案中，靶向分子是SVGmu(SEQ IDNO：11)。
被治疗的疾病通常是其抗原已知或者能够被鉴定的。在本发明的某些实施方案中，被治疗的疾病是癌症。在其他实施方案中，所述疾病是HIV/AIDS。
还提供用重组病毒转导树突状细胞的方法，其中所述重组病毒包含感兴趣的多核苷酸和结合DC-SIGN的靶向分子。在一些实施方案中，靶向分子包含源自至少一种病毒的病毒糖蛋白，所述病毒选自：辛德比斯病毒、流感病毒、拉沙热病毒、森林脑炎病毒、登革热病毒、肝炎病毒、狂犬病病毒、塞姆利基森林病毒、罗斯河病毒、Aura病毒、近东马脑脊髓炎病毒、汉坦病毒、SARS-CoV病毒。在一些实施方案中，靶向分子是SVGmu(SEQ ID NO：11)。
此外，提供免疫哺乳动物的方法，通过将编码抗原的多核苷酸输送到表达DC-SIGN的树突状细胞，其中所述树突状细胞接触重组病毒(包含编码抗原的多核苷酸和结合DC-SIGN的靶向分子)。在某些实施方案中，重组病毒在体外和树突状细胞接触。在其他实施方案中，重组病毒在体内与树突状细胞接触。
本文公开的方法可利用重组病毒(包括多核苷酸和结合DC-SIGN的靶向分子)将编码抗原的多核苷酸输送到树突状细胞，用于刺激针对特定抗原的免疫应答。可以通过提供其他多核苷酸(其在树突状细胞中的表达调节免疫应答)来调节免疫应答。例如，可以输送编码树突状细胞成熟因子的多核苷酸。
附图简述
图1是针对树突状细胞的抗原输送一般策略的示意图。通过在硫酸乙酰肝素结合位点对辛德比斯病毒野生型糖蛋白进行突变，去除其结合能力。所获突变型糖蛋白(SVGmu)可以结合DC-SIGN，却不能结合硫酸乙酰肝素。DC-SIGN：树突状细胞特异性ICAM-3(细胞内黏附分子3)-结合非整合素(GrabbingNonintegrin)。
图2显示从病毒制备细胞收集的病毒离子的激光共聚焦显微图像，所述细胞用慢病毒载体，编码GFP-vpr和SVGmu的质粒以及其他必需的包装构建体瞬时转染。病毒粒子用GFP(绿色)标记。通过抗-HA标签抗体(红色)标记SVGmu，检测SVGmu的表面掺入。在″GFP″载玻片上，标记″GFP″的病毒离子是绿色的。在″SVGmu″载玻片上，表面掺入″SVGmu″的病毒离子被染成红色。在″Merged″载玻片上，只表达GFP的病毒颗粒是绿色的，表面只掺入SVGmu的病毒颗粒是红色的，而表达GFP并包含SVGmu的病毒颗粒是黄色的。绿色和红色的叠加(黄色)指示病毒粒子包含SVGmu，其代表所有病毒颗粒的大部分。比例尺表示2微米。
图3A是构建的靶细胞系293T.hDCSIGN(表达人DC-SIGN)以及293T.mDCSIGN(表达小鼠DC-SIGN)的流式细胞分析。实线：靶细胞系中DC-SIGN的表达，阴影区域：293T细胞中的背景染色。
图3B显示用于检测293T细胞中表达的GFP的流式细胞结果，所述293T用包裹野生型辛德比斯糖蛋白(FUGW/SVG)突变型辛德比斯病毒糖蛋白(FUGW/SVGmu)的慢病毒载体转导。用一毫升新鲜的FUGW/SVG和FUGW/SVGmu上清转导表达人DC-SIGN(293T.hDCSIGN)或者小鼠DC-SIGN(293T.mDCSIGN)的293T细胞(2×105)。包括不表达DC-SIGN的亲代293T细胞作为对照。结果显示，包裹突变型辛德比斯病毒糖蛋白的慢病毒载体可以特异性转导表达人或者小鼠DC-SIGN的293T细胞。对于293T.hDC-SIGN来说，FUGW/SVGmu的具体转导滴度估计大约是1×106TU/ml，对于293T.mDC-SIGN来说大约是0.8×106TU/ml。
图4A是流式细胞结果，显示在混合的原代骨髓培养物中，包裹突变型辛德毕斯病毒糖蛋白(FUGW/SVFmu)的FUGW慢病毒载体特异性转导表达DC-SIGN的小鼠树突状细胞的能力。所有的骨髓细胞都从B6小鼠细胞分离，并且和新鲜的FUGW/SVGmu病毒上清混合。包括具有单嗜性糖蛋白(FUGW/Eco)的假型FUGW慢病毒载体作为非靶向对照。通过用抗CD11c和抗DC-SIGN抗体染色来检测GFP阳性细胞的表面抗原。
图4B是流式细胞结果，表明包裹突变型辛德毕斯病毒糖蛋白(FUGW/SVGmu)的FUGW慢病毒不转导其他细胞类型，包括T细胞(CD3+，顶栏)和B细胞(CD19+，底栏)。原代CD3+T细胞和CD19+B细胞从小鼠的脾脏分离，并用靶向型FUGW/SVGmu或者非靶向型FUGW/Eco载体的新鲜病毒上清转导。可以用流式细胞术分析GFP的表达。实线：与指定的慢病毒载体接触的细胞；阴影区域：没有被转导的细胞(作为阴性对照)。
图5是流式细胞结果，显示包裹突变型辛德毕斯病毒糖蛋白(FUGW/SVGmu)的FUGW慢病毒特异性转导来源于骨髓的DCs(BMDCs)的能力。在细胞因子GM-CSF存在的条件下培养新分离的骨髓细胞六天，得到BMDCs。然后用靶向型FUGW/SVGmu或者非靶向型FUGW/Ecove载体的新鲜病毒上清转导所述细胞。利用流式细胞术测量GFP和CD11c的表达。
图6显示用FUGW/SVGmu靶向转导之后的BMDCs活化。可以利用流式细胞术分析CD86和I-Ab的表面表达来评价DC活化。添加LPS(1μg/ml)过夜用来作为转导BMDCs的协同刺激物。阴影区域：GFP阴性(未经转导的)；实线：GFP阳性(转导的)。
图7A，7B和7C显示利用FUGW/SVGmu慢病毒的体内DC靶向。将50×106TU的FUGW/SVGmu注射入B6小鼠，三天后进行分析。没有经过免疫的小鼠作为空白对照。在图7A中，图像显示接近于注射部位的代表性腹股沟淋巴结的大小，与远离注射部位的等同淋巴结的大小比较。图7B显示在图7A所示淋巴结中所有细胞的数量。图7C显示图7A所示两个淋巴结中CD11c+的典型流式细胞分析。数字标明GFP+DC群的分数。
图8提供编码OVA抗原的慢病毒载体(FOVA)(顶部)和作为对照的编码GFP的慢病毒载体(FUGW)(底部)的示意图。
图9显示树突状细胞或者未经转导的BMDCs(用OVAp肽(SIINFEKL)(DC/OVAp)刺激)对CD8+OT1T细胞的体外刺激，所述树突状细胞用FOVA/SVGmu(DC/FOVA)或者FUGW/SVGmu慢病毒载体(DC/FUGW)转导。可以用针对CD25、CD69、CD62L和CD44抗体染色检测与BMDCs共培养的OT1T细胞表面活化标记物的模式。阴影区域：从转基因动物收集的未感染的OT1T细胞；实线：与指定的BMDCs共培养的OT1T细胞。
图10A显示用ELISA测量与不同稀释度的BMDCs混合的OT1T细胞中IFN-γ的量，所述BMDCs用FOVA/SVGmu(■)，FUGW/SVGmu(●)转导，或者用OVAp肽(▲)刺激并培养三天。
图10B显示来自图10A经处理的OT1T细胞的增殖应答，通过[3H]胸腺嘧啶掺入法分析测量12小时。
图11显示树突状细胞或者未经转导的BMDCs(用OVAp*肽(ISQAVHAAHAEINEAGR)(DC/OVAp*)刺激)对CD4+OT2T细胞的体外刺激，所述树突状细胞用FOVA/SVGmu(DC/FOVA)或者FUGW/SVGmu慢病毒载体(DC/FUGW)转导。可以用针对CD25、CD69、CD62L和CD44抗体染色检测与BMDCs共培养的OT2转基因T细胞表面活化标记物的模式。阴影区域：从转基因动物收集的未感染的OT2T细胞；实线：与BMDCs共培养的OT2T细胞。
图12显示用ELISA测量与不同稀释度的BMDCs混合的OT2T细胞中IFN-γ的量，所述BMDCs用FOVA/SVGmu(■)，FUGW/SVGmu(●)转导，或者用OVAp肽(▲)刺激并培养三天。
图13A提供用于小鼠造血干细胞(HSCs)的基因修饰的逆转录病毒载体MIG-OT1的示意图。
图13B显示如何通过GFP和TCRVα2或者Vβ5的共表达鉴定源自重建小鼠中MIG-OT1-修饰HSCs的CD8+OT1T细胞。用具有Eco(MIG-OT1/Eco)假型的MIG-OT1感染B6小鼠的HSCs，并将其转移到经过辐射的B6受体小鼠。转移八周后，通过流式细胞术鉴定CD8+OT1T细胞。
图14A显示从重建和免疫小鼠的脾脏中分离的GFP+OT1+T细胞表面活化标志物模式的分析。通过直接皮下注射10×106TU的FOVA/SVGmu或者FUGW/SVGmu(作为对照)免疫用MIG-OT1修饰的HSCs重建的小鼠，7天后进行分析。通过CD69，CD62L和CD44的表面染色进行检测。实线取自FOVA/SVGmu免疫小鼠的GFP+OT1+T细胞；虚线：取自FUGW/SVGmu免疫小鼠的GFP+OT1+T细胞；阴影区域：取自未经免疫的小鼠的GFP+OT1+T细胞
图14B显示取自非免疫小鼠(no imm)或经过FUGW/SVGmu或FOVA/SVGmu免疫的小鼠的淋巴结(LN，□)或者脾脏(SP，■)的OT1细胞总数。
图15显示皮下注射DC-靶向型慢病毒载体FOVA/SVGmu后，野生型小鼠中抗原特异性T细胞和抗体应答的体内刺激。B6小鼠通过皮下注射50×106TUFOVA/SVGmu或FUGW/SVGmu(作为对照)进行免疫。包括未经免疫的小鼠作为阴性对照。免疫14天后，收集脾细胞，用H-2Kb-SIINFEKL-PE四聚体和CD44染色分析OVA特异性T细胞的存在。标明的百分比是全部CD8+T细胞的百分比。
图16A和16B显示接受不同皮下注射剂量的FOVA/SVGmu的小鼠的体内OVA特异性T细胞应答。OVA特异性T细胞可以通过图17所示的四聚体染色来鉴定。图16A显示用100×106TU的FOVA/SVGmu免疫后OVA特异性T细胞的百分比。图16B显示注射指定剂量的FOVA/SVGmu后OVA特异性T细胞的剂量反应。
图17A显示注射后2周，从FOVA/SVGmu免疫小鼠分离的OVA特异性CD8+T细胞(被认为是四聚体阳性的细胞)的表面活化标志物的模式。这些表面活化标志物是通过针对CD25，CD69，CD62L和CD44的抗体染色鉴定出来的。实线：来自FOVA/SVGmu-免疫小鼠的四聚体+CD8+T细胞。阴影区域：未免疫小鼠的初始型CD8+T细胞。
图17B显示用50×106TU FOVA/SVGmu免疫后，B6小鼠的OVA特异性血浆IgG滴度。在免疫后第7天和第14天收集血浆，并利用ELISA从1∶100开始进行系列10×稀释分析OVA-特异性IgG的滴度。滴定度由最高稀释度确定，在最高稀释度时光密度比相同稀释度的基线血清的光密度高2x标准偏差。
图18显示在小鼠E.G7肿瘤模型中肿瘤大小与时间的函数。通过皮下注射50×106TU的FOVA/SVGmu(▲)或模拟载体FUW/SVGmu(●)免疫B6小鼠。包括没有免疫的(■)作为对照。每组四只小鼠。免疫后第14天，用5×106的E.G7肿瘤细胞(表达OVA抗原，左栏)，或亲代EL4肿瘤细胞(缺乏OVA抗原，作为对照，右栏)对小鼠进行皮下攻击。用精细卡尺测量肿瘤生长，并表示为两个最大垂直直径(毫米2)。
图19显示在E.G7小鼠肿瘤消除模型中肿瘤的体内生长动力学。将稳定表达萤火虫荧光素酶基因(E.G7.1uc)的5×106E.G7肿瘤细胞植入B6小鼠的白化株。没有植入肿瘤的小鼠(#1)列为对照。载有肿瘤的小鼠不经过免疫处理(#2)，或在肿瘤攻击后的第3天和10天(#3，#4)注射50×106TU的FOVA/SVGmu。利用BLI活体动物成像监测肿瘤的生长动力学。p/s/cm2/sr代表光子/秒/cm2/steridian。
图20显示图19中(□)小鼠#2；(●)小鼠#3；(▲)小鼠#4的E.G7肿瘤产生的荧光信号数量。
图21显示用100×106TU的FOVA/SVGmu免疫后，B6小鼠白化株中存在的OVA-特异性T细胞的百分比。用50×106TU的FOVA/SVGmu对白化B6小鼠进行皮下免疫。无免疫小鼠(no imm.)被作为阴性对照。免疫14天以后，采集脾细胞并用H-2Kb-SIINFEKL-PE四聚体和CD44染色分析OVA-特异性T细胞的存在。标明的百分比是CD8+T细胞所占的百分比。
图22A提供编码成像基因萤火虫荧光素酶(Luc)的DC靶向型慢病毒载体的示意图，被称为Fluc/SVGmu。
图22B显示皮下注射50×106TU的DC靶向型Fluc/SVGmu慢病毒载体(如图25A所示)或者非靶向型Fluc/VSVG慢病毒载体的小鼠的生物发光成像。利用
Figure A20078003424300171
(Xenogen)在注射后30天得到典型图像。
图23显示，施用单剂量的重组DC靶向型慢病毒载体FOVA/SVGmu可以在B6小鼠中产生IFN-γ+CD8+T细胞。皮下注射50×106TU的FOVA/SVGmu慢病毒载体免疫未感染的B6小鼠，或者皮下注射相同剂量的FUGW/SVGmu作为对照。没有经过免疫的小鼠(no imm.)作为阴性对照。两个星期后，从试验小鼠收集脾细胞，并用流式细胞术分析经过或者不经过OVAp肽再刺激的胞内IFN-γ生成。标明的百分比是IFN-γ+CD8+T细胞占全部CD8+T细胞的百分比。
图24显示用于制备DC靶向型重组病毒的慢病毒构建体的示意图。
图25显示抗HIV/AIDS的原位免疫的实施方案的示意图。
优选实施方案的详述
遗传工程已被证明是一种有效和有力的手段，它能够使树突状细胞(DC)转化为特殊的免疫细胞进而诱导抗原特异性免疫应答。大量的研究都涉及体外操纵树突状细胞用于抗癌、HIV和其他疾病的接种/免疫。然而，直至现在，它一直未能将感兴趣的基因，如编码抗原的基因，在体外或者体内环境中准确而有效的输送到树突状细胞。本发明人已经发现用于在体外和体内有效并特异的靶向DCs的新方法和组合物。该方法和组合物可以用来诱导抗原特异性免疫应答，例如用于免疫疗法。
本发明的实施方案包括靶向树突状细胞(DCs)的方法和组合物，通过利用重组病毒将多核苷酸输送到树突状细胞。这优选的通过靶向DC特异性表面分子DC-SIGN(树突状细胞特异性ICAM-3(细胞间黏附分子3)-结合非整合素；也称为CD209)来实现的。DC-SIGN是C型凝集素样受体，能快速结合和内吞材料(Geijtenbeek，T.B等.2004.Annu.Rev.Immunol.22：33-54，其在此整体引入作为参考)。在优选的实施方案中，重组病毒用设计的靶向分子包裹，所述靶向分子对识别DC-SIGN是特异性的。多核苷酸可以包括，但不限于，感兴趣的基因，siRNA(s)和/或microRNA(s)。在优选的实施方案中，所述多核苷酸编码抗原。在一些实施方案中，重组病毒将一个以上的基因输送到树突状细胞。例如，可以输送编码两个或两个以上抗原的基因。输送一个以上的基因是可以实现的，例如，通过将所述基因连接内部核糖体进入位点(IRES)，和/或连接2A型序列，并且使用单个启动子/增强子驱动表达。
下面将更详细的讨论，本发明的实施方案是基于对重组病毒的使用，如慢病毒和γ逆转录病毒，因为这些病毒能够在其包膜上整合大量蛋白，这些蛋白往往存在于产生病毒的细胞表面。然而，下面也将讨论，也可以使用其他类型的病毒，那么方法也会相应的修改。一般来说，用编码感兴趣的多核苷酸(通常编码抗原)的病毒载体，至少一种编码病毒包装组分(如gag和pol)和靶向分子(被设计为结合树突状细胞)的质粒，转染包装细胞系。在优选的实施方案中，靶向分子被基因改造为特异性结合树突状细胞的DC-SIGN细胞表面标志物。在病毒出芽过程中，在包装细胞表面表达的靶向分子被整合到病毒包膜。结果就是，该病毒粒子包括了核心(包含感兴趣的多核苷酸)和包膜(包含位于其表面的靶向分子)。
靶向分子能够结合树突状细胞的DC-SIGN，病毒可以将感兴趣的基因输送到树突状细胞。不希望受到理论约束，一般认为结合诱导内吞作用，将病毒包裹入内涵体，引发膜融合，使病毒核心进入胞浆。在逆转录和产物迁移入细胞核后，病毒的基因组整合到靶细胞基因组，从而将感兴趣的多核苷酸整合到靶细胞的基因组。树突状细胞表达感兴趣的多核苷酸(一般编码抗原)。然后所述抗原被树突状细胞加工并递呈给T和B细胞，从而引发抗原特异性的免疫应答。只要树突状细胞能够刺激抗原特异性的免疫应答，就不需要上文所述的特异性途径。
本发明的实施方案包括在体内和体外将感兴趣的基因直接靶向树突状细胞的方法和组合物。在一些优选的体内实施方案中，无需DCs的体外培养就可以将感兴趣的基因输送到树突状细胞。例如，可以通过给活受试者直接施用靶向病毒将感兴趣的基因输送到树突状细胞。感兴趣的基因优选的编码所需免疫应答针对的抗原。示例性的抗原包括：肿瘤特异性抗原，肿瘤相关抗原，组织特异性抗原，细菌抗原，病毒抗原，酵母抗原，真菌抗原，原生动物抗原，寄生虫抗原，有丝分裂原，等等。其他抗原对本领域技术人员来说是显而易见的，无需冗余的试验就可以使用。
可以容易的使用本文公开的方法使用靶向分子，所述靶向分子对树突状细胞特异，或者可以被操纵以提供所需特异性。靶向分子优选是改造的病毒糖蛋白，所述病毒糖蛋白结合树突细胞的DC-SIGN，从而有利于将感兴趣的基因输送到树突状细胞。示例性的靶向分子包括，但不限于，来自于下列病毒的糖蛋白：辛德毕斯病毒，流感病毒，拉沙热病毒，森林脑炎病毒，登革热病毒，乙型肝炎病毒，狂犬病病毒，塞姆利基森林病毒，罗斯河病毒，Aura病毒，博尔纳病病毒，汉坦病毒和SARS-CoV病毒。所述靶向分子优选是膜结合型的。如有必要，设计的或者源自病毒糖蛋白DC-SIGN特异性靶向分子(用于重组病毒)可以被改造为膜结合型。
可以使用本领域已知的任何方法改造靶向分子以提供所需要的特异性。示例性的方法包括，但不限于，合理的蛋白工程及DNA重组技术。一般来说，为将靶向分子改造为对树突状细胞特异的，提供与树突状细胞特异性表面标志物相互作用的病毒糖蛋白。优选的，所述病毒糖蛋白与DC-SIGN相互作用。病毒糖蛋白可能与至少第二种细胞表面标志物相互作用，例如，硫酸乙酰肝素(HS)，其在树突细胞以外的细胞类型中表达。必须对这种病毒糖蛋白进行改造，这样的话它与DC特异性表面标志物相互作用的能力被保持，而与其他细胞表面标志物相互作用的能力被减弱或清除。所述改造可以是病毒糖蛋白氨基酸序列中至少一个残基的突变。所述突变可以是残基的缺失，添加或替代，这可以用本领域已知的标准方法实现。可以很容易证实所需的特异性。例如，一旦病毒糖蛋白被改造，就可以通过与包含报告基因的病毒载体和至少一种编码病毒包装组分的质粒共转染包装细胞系来制备重组病毒。糖蛋白在病毒出芽期间整合到病毒包膜。该病毒可用于转染纯的树突状细胞群，以及含有DCs的混合细胞群，通过分析报告基因在DCs中的表达而在其他细胞类型中未达到显著程度可以证实病毒转导DCs的特异性。如果特异性不够严格(例如，如果观察到对其他细胞类型的感染达到不希望的水平)，可以对病毒糖蛋白进行进一步改造，直至达到理想的特异性。
本发明的实施方案包括将DC细胞活化剂和成熟因子与抗原一起输送到树突状细胞。示例性的树突状细胞活化剂和成熟因子包括，但不限于，刺激分子，细胞因子，趋化因子，抗体和其他分子如受体Flt-3配体。例如，DC的成熟因子包括下列至少一种：GM-CSF、IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-15、IL-21、IL-23、TNFα、B7.1、B7.2分子、4-1BB、CD40配体(CD40L)和药物诱导型CD40分子(iCD40)(Hanks，B.A.，et al.2005.Nat Med 11：130-137，其在此整体引入作为参考)。
本发明的实施方案还包括涉及给患者施用上述重组病毒或者用重组病毒感染的DCs的方法和组合物，以刺激抗原特异性免疫应答，例如，T细胞应答(细胞的免疫应答)和B细胞应答(体液免疫应答)。例如激活的CD4T细胞可以在抗原特异性应答中协调和统筹CD8+细胞毒性T细胞和B细胞。在优选的实施方案中，使用重组病毒和/或用重组病毒感染的树突状细胞刺激免疫应答从而预防和治疗某些疾病，例如，但并不限于癌症和AIDS/HIV。对于疾病来说只要针对特定抗原的免疫应答是有益的，其就可以被治疗，包括，但并不限于，肿瘤疾病，传染病以及免疫相关疾病.
正如本文所述，进行的研究发现用于指导重组病毒为DCs提供编码特定抗原的基因的方法和组合物。DCs的基因修饰(为引发有效的免疫应答)可用于疾病的预防和治疗，并提供诱导有效T细胞免疫以及大量抗体生成的有效方法。本文所述的方法和组合物提供用所需抗原免疫的高效方法。这种免疫可以预防和治疗疾病，如癌症，AIDS/HIV。
定义
除非另有定义，本文使用的技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的具有相同的含义。参见，例如，见辛格尔顿等，Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology(微生物学和分子生物学词典)第2版，美国Wiley&Sons出版公司(纽约1994年)；萨姆布鲁克等，分子克隆，实验室手册，冷泉港出版社(冷泉港，美国纽约1989年)。与本文所述类似或者等同的任何方法，设备和材料都可以在实施本发明时应用。
本文使用的术语核酸、多核苷酸和核苷酸可以互换，表示任何核酸，不管是否由磷酸二酯键或修饰的键组成，如磷酸三酯，氨基磷酸酯，有机硅，碳酸钙，羧基甲脂，氨基乙酸酯(acetamidate)，氨基甲酸酯，硫醚，桥连氨基磷酸酯，桥连甲基膦，桥连磷酰胺酯，桥连磷酰胺酯，桥连亚甲基膦酸，硫代磷酸，甲基膦酸，二硫代磷酸酯，桥连硫代磷酸或磺酸内酯键，以及这些键的组合。
术语核酸，多核苷酸和核苷酸还具体包括由五个生物存在的碱基(腺嘌呤，鸟嘌呤，胸腺嘧啶，胞嘧啶和尿嘧啶)之外的碱基组成的核酸。
如本文使用的，当所述核酸分子与编码其它多肽的污染核酸分子基本分离时，核酸分子被认为是“分离的”。
“免疫”是指为宿主提供抗原。在一些实施方案中，是将抗原提供给抗原递呈细胞，如树突状细胞。如下所述，通过对树突状细胞上DC-SIGN特异的亲和分子将重组病毒(包括编码抗原的基因)靶向树突状细胞。因此，免疫应答所需的抗原可以被输送到树突状细胞。其他的免疫方法是本领域公知的。
术语“免疫学”或“免疫”应答是在患者体内建立的针对淀粉样肽的有利体液(抗体介导)和/或细胞(抗原特异性T细胞或其分泌产物介导)免疫应答。这种反应可以是通过给药免疫原诱导的主动应答或通过给药抗体或激发的T细胞诱导的被动应答。通过递呈多肽表位以及MHC I型或II型分子以激活抗原特异性CD4+T辅助细胞和/或CD8+细胞毒性T细胞，引发细胞免疫应答。免疫应答也可能涉及激活单核细胞，巨噬细胞，NK细胞，嗜碱性粒细胞，树突状细胞，星形胶质细胞，小胶质细胞，嗜酸性粒细胞或先天免疫的其他组分。细胞介导的免疫应答的存在可通过增殖分析(CD4+T细胞)或CTL(细胞毒性T淋巴细胞)分析(Burke et al.，J.Inf.Dis.170，1110-19(1994)))，通过抗原依赖的杀伤(细胞毒性T淋巴细胞检测，Tiggesetal.，J.Immunol.156，3901-3910)，或通过细胞因子分泌来确定。通过从免疫的同基因动物分别分离IgG和T细胞并测量第二个受试者的保护或治疗效果，区分体液和细胞应答对免疫原的保护或治疗效果的相对贡献。
“免疫剂”或“免疫原”能够在给患者施用时(可选的与佐剂联用)诱导针对其自身的免疫应答。
术语“佐剂”是指一种化合物，当它与抗原一起应用的时候能够增强、提高和/或促进抗原的免疫应答，但当佐剂单独应用的时候并不能产生针对抗原的免疫应答。佐剂可以与本发明的重组病毒作为单一组合物施用，或者在施用本发明的重组病毒之前、同时或者之后施用。佐剂可通过数种机制增强免疫应答，包括淋巴细胞募集，B和/或T细胞的刺激，和巨噬细胞的刺激。
“抗体”(ABs)的和“免疫球蛋白”(IGs)是具有相同结构特点的糖蛋白。虽然抗体显示对特定抗原的结合特异性，免疫球蛋白实际上包括抗体和缺乏抗原特异性的其他抗体样分子。后一类型的多肽，例如，在淋巴系统中表达水平较低但是在骨髓瘤中表达量增加。
术语“抗体”具有最广泛的含义，特别包括人类，非人类(如小鼠)，嵌合，和人源化的单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)，多克隆抗体，多特异性抗体(如，双特异性抗体)，单链抗体，和抗体片段(只要其表现出理想的生物学活性)。通常情况下，片段会与作为其来源的完整抗体竞争与抗原的特异性结合。
术语“表位”或“抗原决定簇”是抗原上B和/或T细胞应答的位点。B细胞表位可以由相邻氨基酸或者不相邻的氨基酸(通过蛋白的三级折叠并列)形成。由相邻氨基酸构成的抗原决定簇在接触变性溶剂后通常依然存在，而通过三级折叠形成的表位通常用变性溶剂处理后消失。抗原表位通常包括采用独特空间构像的至少3个，更常见的，至少5或8-10个氨基酸。测定表位空间构象的方法包括，例如，X射线晶体学和二维核磁共振。参见，例如，Epitope mappingProtocols in Methods in Molecular Biology(分子生物学方法中的表位绘制方法)，第66卷，Glenn E.Morris，Ed.(1996年)。识别相同表位的抗体可以通过简单的免疫测定来鉴定，所述免疫测定显示一种抗体阻止另一抗体与靶抗原结合的能力。对于CD8细胞来说，T细胞识别大约9个氨基酸连续表位，或者对CD4细胞来说，约13-15个氨基酸的连续表位。识别表位的T细胞可以通过测量抗原依赖性增殖的体外分析鉴定，这通过对表位应答的激发T细胞的3H-TdR掺入法来确定(参见Burke，上文；Tigges，上文)。
“靶细胞”是希望向其输送多核苷酸或者感兴趣的基因在其中表达的任何细胞。优选的，靶细胞是树突状细胞，尤其是表达DC-SIGN的树突状细胞。
术语“哺乳动物”被定义为属于哺乳动物纲的个体，包括但不限于人，家畜和农场动物，动物园动物，体育动物，宠物，如羊，狗，马，猫，奶牛。
术语“受试者”或“患者”，包括接受预防性或者治疗性治疗的人和其他哺乳动物受试者。
本文使用的“治疗”是治疗或预防的临床解释。在治疗性应用中，给怀疑或者已经患有疾病的患者施用足够量的药物组合物或者药物以治愈，或者至少部分阻止疾病的症状和其并发症。在预防性应用中，给怀疑患特定疾病或者具有患病风险的患者施用足够量的药物组合物或药物以消除或降低风险或延迟疾病的发生。足以实现这一目的的量被称为治疗-或者药物-有效量。这种量可以作为单一剂量给药，或者根据治疗方案给药，只要保证其有效。所述量可以治愈疾病，但通常情况下，被施用以缓解疾病的症状，或预防疾病或者病症的发展。在治疗和预防方案中，经常会施用数种剂量，直到获得足够的免疫应答。通常情况下，监测免疫应答，如果免疫应答开始减弱，则反复给药。“治疗”不需要完全消除疾病，也不需要完全防止患者患有所述疾病或病症。
本文使用的“肿瘤”指的是所有肿瘤细胞的生长和增殖(无论是恶性还是良性的)，和所有的癌前细胞和组织以及癌细胞和组织。
术语“癌症”是指疾病或病症，特点是不受调节的细胞生长。癌症的例子包括，但不限于：癌、淋巴瘤、母细胞瘤和肉瘤。特定癌症的例子包括，但不限于：肺癌、结肠癌、乳腺癌、睾丸癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、大肠癌、前列腺癌。其他癌症是本领域技术人员公知的，包括但不限于：白血病、淋巴瘤、子宫颈癌、脑瘤、腺癌和皮肤癌。示例性的癌症包括但不限于膀胱肿瘤、乳腺肿瘤、前列腺肿瘤、基底细胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脑和中枢神经系统癌症(例如，脑胶质瘤)、子宫颈癌、绒膜癌、结肠和直肠癌、结缔组织肿瘤、消化系统的癌症；子宫内膜癌、食道癌；眼癌；头部及颈部癌症；胃癌；上皮内肿瘤；肾癌；喉癌；白血病；肝癌；肺癌(如小细胞癌和非小细胞癌)；淋巴瘤包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤；黑色素瘤；骨髓瘤、神经母细胞瘤、口腔癌(如唇、舌、口和咽)；卵巢癌；胰腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤；直肠癌、肾癌、呼吸系统的癌症；肉瘤、皮肤癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、泌尿系统的癌症、以及其他癌及肉瘤。癌症也包括本领域已知的哺乳动物中瘤形成和恶性病症。
“载体”是能够运送另一核酸的核酸。载体可以是，例如，质粒、粘粒或噬菌体。“表达载体”是一种载体，能够在合适的环境中指导载体所携带的一个或者多个基因编码的蛋白的表达。
术语“调控元件”和“表达控制元件”可以互换使用，指在特定环境中能够影响可操作连接的编码序列的转录和/或翻译的核酸分子。这些术语被广泛使用，包括所有促进或调节转录的元件，包括启动子，RNA聚合酶与转录因子基础相互作用所需的核心元件，上游元件，增强子，和应答元件(参见，例如，Lewin，“Gene V“(牛津大学出版社，牛津)847-873页)。原核生物的示例性调节元件包括启动子，操纵子序列和核糖体结合位点。用于真核细胞的调控元件包括但不限于，启动子，增强子，剪接信号和多聚腺苷酸化信号。
术语“转染”是指将核酸导入宿主细胞。
“逆转录酶病毒”是具有RNA基因组的病毒。
“慢病毒”是指能够转染分裂和非分裂细胞的一类逆转录病毒。慢病毒的几个例子包括HIV(人免疫缺陷病毒：包括HIV1型和HIV2型)，人获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的病原体；梅迪-维斯纳病，会导致绵羊的脑炎(维思纳)或肺炎(梅迪)，山羊关节炎-脑炎病毒，其造成山羊的免疫缺陷，关节炎，以及脑病；马传染性贫血病毒，会导致马的自身免疫型溶血性贫血，以及脑病；猫科动物的免疫缺陷病毒(FIV)，从而导致猫的免疫缺陷症；牛免疫缺陷病毒(BIV)，导致牛的淋巴腺肿大，淋巴细胞增多症，并有可能导致中枢神经系统感染；和猿免疫缺陷病毒(SIV)，会导致类人猿的免疫缺陷症和脑病。
慢病毒基因组一般由以下方式组成：5′端长末端重复序列(LTP)，gag基因，pol基因，env基因，附件基因(nef，vif，vpr，vpu)和3′端LTR。病毒的LTR序列被分为三个区域，分别称为U3，R和U5。U3区域包含增强子和启动子元件。U5区域包含多聚腺苷酸化信号。R(重复)区域将U3区和U5区分开，并且R区的转录序列在RNA病毒的5′和3′末端都有出现。参见，例如，“RNA病毒：实用方法”(Alan J.Cann，Ed.牛津大学出版社，(2000))，O Narayanand Clements J.Gen.Virology 70：1617-1639(1989)，Fields et al.Fundamental Virology Raven Press.(1990)，Miyosh iH，Blomer U，TakahashiM，Gage FH，Verma IM.J Virol.72(10)：8150-7(1998)，和美国专利号6013516。
“γ逆转录病毒”是指一类逆转录病毒家族。示例性的γ逆转录病毒包括，但不限于，小鼠干细胞病毒，小鼠白血病病毒，猫白血病病毒，猫肉瘤病毒，和禽类网状内皮组织增殖病毒。
本文使用的“杂交病毒”是指具有来自一种或多种其他病毒载体的组分的病毒，包括来自非逆转录病毒载体的元件，如腺病毒-逆转录病毒杂交体。本文使用的具有逆转录病毒组分的杂交载体被认为属于逆转录病毒的范畴。
“病毒粒子”、“病毒颗粒”和“逆转录病毒颗粒”在本文中是指单一病毒，其包括RNA基因组，po1基因产生的蛋白，gag基因产生的蛋白和展示包膜(糖)蛋白的脂双层。RNA基因组通常是重组RNA基因组，因此可能包含相对天然病毒基因组来说是外源性的RNA序列。RNA基因组还可以包括缺陷型内源性病毒序列。
“假型”逆转录病毒是一种逆转录病毒颗粒，它的包膜蛋白来自RNA基因组所属病毒之外的病毒。包膜蛋白可以来自，例如但不受限制，不同的逆转录病毒或非逆转录病毒来源。包膜蛋白可以是天然的包膜蛋白或经过本文所述的修饰、突变或者基因工程改造的包膜蛋白。在一些实施方案中，包膜蛋白是DC-SIGN特异性病毒糖蛋白，源自下列病毒之一的糖蛋白：辛德毕斯病毒，流感病毒，拉沙热病毒，森林脑炎病毒，登革热病毒，乙型肝炎病毒，狂犬病毒，塞姆利基森林病毒罗斯河病毒Aura病毒博尔纳病病毒汉坦病毒和SARS-CoV病毒。
本文定义的“转化”描述外源DNA进入靶细胞的过程。转化可以依靠任何已知的方法将外源性核酸序列插入原核或真核宿主细胞，这些方法可以包括但不限于：病毒感染，电穿孔，热休克，脂质体，和粒子轰击。“转化的”细胞包括稳定转化的细胞，其中插入的核酸能够复制，无论是作为自主复制质粒或作为宿主染色体的一部分。还包括瞬时表达感兴趣基因的细胞。
本文所述的“融合分子”是指当存在于病毒表面时能引发膜融合，允许病毒核心穿过膜，并通常进入靶细胞的胞浆。融合分子可以是，例如，病毒糖蛋白。示例性的预期可作为融合分子的病毒糖蛋白包括，但不限于红细胞凝集素，突变的红细胞凝集素，SIN以及来以下病毒的糖蛋白：辛德毕斯病毒，流感病毒，拉沙热病毒，森林脑炎病毒，登革热病毒，乙型肝炎病毒，狂犬病毒，塞姆利基森林病毒，罗斯河病毒，Aura病毒，博尔纳病病毒，汉坦病毒和SARS-CoV病毒。糖蛋白可以是天然的或者被改造为具有需要的活性。
“转基因”是指任何核苷酸序列，尤其是DNA序列，通过人为干预的方法整合到宿主细胞的一个或多个染色体，例如通过本发明的方法。转基因优选包含“感兴趣的基因”
“感兴趣的基因”不受任何限制，可以是希望被输送、整合到靶细胞，在靶细胞中转录、翻译和/或表达的任何核酸。感兴趣的基因可以编码功能产物，如蛋白或RNA分子。优选的感兴趣的基因编码需要在靶细胞中表达的蛋白或其他分子。通常感兴趣的基因与其他序列(如转录调控序列)可操作的连接，所述序列用于获得感兴趣基因的所需表达。在一些实施方案中感兴趣的基因优选的编码所需免疫应答针对的抗原。在一些实施方案中可使用的其他感兴趣的基因是编码树突状细胞活化因子和/或成熟因子的基因。
“功能关系”和“可操作的连接”表示，对于感兴趣的基因来说，所述基因相对启动子和/或增强子位于正确的位置和方向，当启动子和/或增强子与相应分子接触时所述基因的表达受到影响。
“2A序列”或元件是被引入作为两个蛋白之间的连接子的小肽，允许多蛋白的自发核糖体内自我加工(de Felipe.Genetic Vaccines andTher.2：13(2004)；de Felipe et al.Traffic 5：616-626(2004))。该短肽允许来自单个载体的多种蛋白共表达，如来自相同载体的融合分子与亲和分子的共表达。因此，在一些实施方案中编码2A元件的多核苷酸被整合到载体的多核苷酸(编码待表达的蛋白)之间。
“DC成熟因子”(也称为“DC活化因子”)是可以诱导树突状细胞的活化或者刺激的化合物，这样的话DCs促进细胞或者体液免疫应答的引发。典型的DC成熟因子包括，但不限于，刺激分子，细胞因子，趋化因子，抗体和其它试剂，如Flt-3配体((Figdor，C.G.，et al.2004.Nat Med 10：475-480；Pulendran，B.，et al.2000.J Immunol 165：566-572；Maraskovsky，E.，et al.2000.Blood 96：878-884，其各自在此整体引入作为参考)。示例性的DC成熟因子可以包括，但不限于，GM-CSF，IL-2，IL4，IL-6，IL-7，IL-15，IL-21，IL-23，TNFα，B7.1，B7.2，4-1BB，CD40配体(CD40L)和药物诱导型CD40分子(iCD40)。
靶向分子
如上文所述，靶向分子被整合入重组病毒从而将病毒靶向于表达DC-SIGN的树突状细胞。靶向分子优选的还介导与细胞膜的融合以及有效转导，并将所需多核苷酸输送到树突状细胞。因此，靶向分子通常是融合分子(FM)，具有所期望的结合特异性。如果需要的话，靶向分子可以被修饰，这样的话它能够结合树突状细胞的DC-SIGN。在一些实施方案中，靶向分子特异性结合DC-SIGN。也就是说，相对于其他细胞类型，靶向分子优选的指导重组病毒结合表达DC-SIGN的树突状细胞。因此，在一些实施方案中，靶向分子被制备为消除FM结合其他目标(如血凝素)的能力，同时保留结合DC-SIGN的能力。在其他实施方案中，靶向分子可以被修饰，以消除它天然的对非DC-SIGN分子的结合特异性及其组分，并增加或者提高对DC-SIGN的结合特异性。即使靶向分子对DC-SIGN特异，也可能存在对其他分子从而对其他细胞类型的一些非特异性结合，可以对靶分子进行修饰使其具有足够的特异性以避免不期望的副作用，例如减弱所需免疫应答的副作用。
靶向分子通常是能够假型病毒的分子，因此被整合到重组病毒的包膜，靶向树突状细胞，在适当的条件下诱导膜融合并允许感兴趣的基因进入树突状细胞。优选的靶向分子是病毒糖蛋白。另外，靶向分子优选的耐受超速离心以进行浓缩，这对体内基因输送非常重要。
靶向分子优选在低pH值环境下诱导不依赖于结合的膜融合。因此，在优选的实施方案中，一旦包含靶向分子的病毒进入靶细胞的内涵体，靶向分子就会诱导膜融合，包括感兴趣多核苷酸的病毒核心组分从而被输送到胞浆。
在一些实施方案中，标签序列被整合入靶向分子，从而可以检测靶向分子的表达情况，以及靶向分子在病毒粒子中的存在情况。
有两类公认的病毒融合剂，它们都可以作为靶向分子(D.S.Dimitrov，Nature Rev.Microbio.2，109(2004))。I型融合剂利用螺旋状的卷曲螺旋结构引发膜融合，而II型融合剂用β桶引发融合。这两个结构具有有不同的机制和动力学(D.S.Dimitrov，Nature Rev.Microbio.2，109(2004))。在一些实施方案中，使用I型融合剂。在其他实施方案中，使用II型融合剂。仍在其他实施方案中，I型及II型融合剂均被使用。
可用作靶向分子(或者在一些实施方案中作为融合分子，其中病毒结合和融合功能是分离的)的表面糖蛋白的一些非限制性例子，不论是野生型或修饰型，包括来自α病毒的糖蛋白，如塞姆利基森林病毒(SFV)，罗斯河病毒(RRV)和Aura病毒(AV)，它们包括表面病毒例如E1，E2和E3。来自辛德毕斯病毒(SIB)的E2糖蛋白和流感病毒的血凝素(HA)都是非逆转录病毒糖蛋白，能够特异性的结合细胞表面的特定分子(对于E2来说是硫酸乙酰肝素糖胺聚糖，对于HA来说是唾液酸)，可以在一些实施方案中用作靶向分子。他们的融合与结合受体分子是相对独立的过程，并且通过使内涵体酸化的方法来实现融合的激活(Skehel and Wiley，Annu.Rev.Biochem.69，531-569(2000)；Smit，J.et al.J.Virol.73，8476-8484(1999))。此外，它们能够耐受某些基因修饰并仍能有效地在逆转录病毒表面进行组装(Morizono et al.J.Virol.75，8016-8020)。
在本发明的其他实施方案中，拉沙热病毒，乙型肝炎病毒，狂犬病病毒，博尔纳病病毒，汉坦病毒，或SARS-CoV病毒的表面糖蛋白可以用作融合分子。
在本发明的其他实施方案中，基于黄病毒的表面糖蛋白可用作靶向分子的基础。与α病毒一样，黄病毒利用II型融合分子介导感染(Mukhopadhyay et al.(2005)Rev.Microbio.3，13-22)。prM(约165个氨基酸)和E(约495个氨基酸)是黄病毒的糖蛋白。此外，一种黄病毒(登革热病毒)的配体结合口袋已经被良好表征。让人感兴趣的是，DC-SIGN特异性与DV E蛋白上的糖类相互作用，从而增强病毒进入(Mukhopadhyay et al.(2005)Nat.Rev.Microbio.3，13-22)。因此，只有包裹DV E蛋白或者修饰的DV E的慢病毒才能够用于靶向DCs。TBE和DV E蛋白，以及所述其他融合分子，可以被改造为提供期望的结合特异性，或者如果需要的话，是结合缺陷和具有融合活性的。
在一些实施方案中，使用来自流感病毒A/鸡瘟病毒/Rostock/34(FPV)的血凝素(HA)形式。其属于I型融合剂(T.Hatziioannou，S.Valsesia-Wittmann，S.J.Russell，F.L.Cosset，J.Virol.72，5313(1998))。在一些实施方案中，使用FPV HA形式(A.H.Lin et al.，Hum.Gene.Ther.12，323(2001))。HA介导的融合通常被认为不依赖于受体结合(D.Lavillette，S.J.Russell，F.L.Cosset，Curr.Opin.Biotech.12，461(2001))。
在其他实施方案中，使用II型FM，优选的是来自α病毒家族的辛德毕斯病毒糖蛋白(K.S.Wang，R.J.Kuhn，E.G.Strauss，S.Ou，J.H.Strauss，J.Virol.66，4992(1992))，在本文中也被称为SVG的。SVG包括两个跨膜蛋白(S.Mukhopadhyay，R.J.Kuhn，M.G.Rossmann，Nature Rev.Microbio.3，13(2005))，第一个蛋白负责融合(E1)，第二个蛋白负责细胞结合(E2)。已知SVG假型癌逆转录病毒和慢病毒。
正如下面所讨论的，在一些优选的实施方案中，使用修饰的SVG，其优先结合DC-SIGN。在其他实施方案中，使用结合缺陷和具有融合活性的SVG、SVGmu作为融合分子，并与不同的靶向分子联用，如针对DC-SIGN或其他树突状细胞特异性蛋白的抗体。例如，可以使用SVG融合分子，其中蛋白A的免疫球蛋白G结合结构域(ZZ结构域)被整合入E2蛋白，并进行一个或者多个另外突变以灭活受体结合位点(K.Morizono et al.，Nature Med.11，346(2005))。
优选的将编码靶向分子的基因克隆到表达载体，诸如pcDNA3(Invitrogen)。然后用编码感兴趣基因(通常编码抗原)的病毒载体，至少一种编码病毒包装组分的质粒和表达靶向分子的载体共转染包装细胞，例如293T细胞。如果靶向功能与融合功能分离，则还将提供一个或多个编码亲和分子以及任何相关组分的载体。靶向分子在包装细胞的膜上表达，并被整合入重组病毒。可以通过例如FACS分析包装细胞表面靶向分子的表达。
基于已有的信息，例如来自于结构研究和分子建模，诱变可以用来产生突变型糖蛋白，这种糖蛋白可以维持融合能力，同时还具有想要的结合特异性和/或想要的结合水平。可以制备每种糖蛋白的数种突变体，并利用下面描述的方法或者本领域已知的其他方法进行分析，鉴定具有最需要特征的FMs。例如，这通过测定它刺激哺乳动物体内的免疫应答而不引起不良副作用的能力，可以检测靶向分子特异性输送抗原到树突状细胞的能力。例如还可以在下文所述的细胞培养物中直接检测特异性靶向树突状细胞的能力。
为选择合适的靶向分子(不管是野生型还是突变型)，制备载有靶向分子(当合适时，以及亲和分子)的病毒，并检测它们的选择性和/或它们促进穿过靶细胞膜的能力。展示野生型糖蛋白的病毒可以用作检测突变型滴度效果的对照。利用标准的感染方法，将病毒转导表达靶向分子(当合适时，亲和分子)结合伴侣的细胞。在特定时间之后，例如转导48小时之后，收集细胞，通过例如FACS计算被含有靶向分子(或者亲和分子和融合分子)的病毒感染的细胞所占的百分比。可以通过计算被病毒感染细胞的百分比对选择性进行评分。同样，通过将被包括突变型靶向分子的病毒感染的细胞百分比除以被包括相应野生型靶向分子的病毒感染的细胞百分比，可以定量突变对病毒滴度的影响。优选的突变将给出选择性和感染性的最佳组合。一旦选定靶向分子，可以进行病毒浓度分析，以确认包裹FM的病毒可以被浓缩。收集病毒上清并通过超速离心进行浓缩。可以通过病毒储液的有限稀释法和表达亲和分子结合伴侣的细胞转导来确定病毒滴度。
在一些实施方案中，BlaM-Vpr融合蛋白可以用来评估病毒的穿膜能力，以及融合分子(野生型或者突变型)的效果。病毒可以这样制备，例如，用瞬时转染的方法将一个或者多个含有病毒组分、BlaM-Vpr和感兴趣的FM(如果合适的话，以及亲和分子)的载体转染到包装细胞内。得到的病毒可以用来感染细胞，这个细胞表达靶向分子(或者亲和分子)特异性结合的分子(无论是否存在结合的游离抑制剂(例如抗体))。然后细胞用不依赖二氧化碳的培养基冲洗，并加载CCF2染料(Aurora Bioscience)。经过室温培养以完成切割反应后，细胞被多聚甲醛固定并用FACS和显微镜分析。蓝色细胞的出现表明病毒进入细胞质，当加入封闭抗体时，预期蓝色细胞的数量可能会减少。
为研究穿透力是否依赖于低pH，选择具有所需pH依赖性的靶向分子(或融合分子)，在感染步骤中添加改变pH的NH4Cl或其他化合物(NH4Cl将会中和内涵体的酸性小室)。对NH4Cl来说，蓝色细胞的消失表明病毒的渗透力是低PH值依赖的。
另外，为确定活性是pH依赖的，可以向孵育缓冲液添加向溶酶体剂，例如氯化铵，氯喹，吉他霉素，巴佛洛霉素A1，莫能霉素，尼日利亚菌素等。这些试剂可以提高胞内体小室的pH值(例如，Drose and Altendorf，J.Exp.Biol.200，1-8，1997)。这些试剂的抑制效果可以解释pH对病毒融合和进入细胞的作用。可以比较展示不同融合分子的病毒间不同的进入动力学，选择最合适的用于特定应用。
可以利用PCR进入分析检测逆转录，从而测量病毒DNA合成的动力学，作为病毒进入动力学的指示。例如，含有某个特殊靶向分子的病毒粒子可以和包装细胞一起孵育，例如293T细胞，其表达与靶向分子(或者在一些实施方案中分离的亲和分子)的相应同源物。然后立即或者在孵育后(让感染发生)，清除未结合的病毒，并分析细胞组分。然后从这些组分提取DNA，利用LTR-特异性引物进行半定量测试。LTR特异性DNA产物的出现表明病毒成功进入和脱壳。
尽管靶向分子可以同时具有病毒结合和融合功能，在本发明的另一方面，病毒的结合和融合功能被分到两个不同的组分。一般来说，重组病毒包含(i)介导病毒结合并将病毒精确靶向树突状细胞的亲和分子，和(ii)介导有效转导并将所需多核苷酸输送到树突状细胞的不同融合分子(FM)。可以利用各种亲和分子和融合分子中的任意一种轻易的实施本文公开的方法。除本文公开的这些以外，其他示例性的融合分子和相关方法也被描述，例如，2005年3月2日提交的美国专利申请号11/071,785，(公开为美国专利申请公开号2005-0238626)，和2006年6月1日提交的美国专利申请号11/446,353(公开为美国专利申请公开号2007/0020238)，其各自在此整体引入作为参考。
亲和分子是结合树突状细胞表面标志物的分子。在优选的实施方案中，亲和分子特异性结合DC-SIGN。也就是说，优选的亲和分子结合DC-SIGN的特异性足以避免由于和其他类型的细胞表面标志物相互作用而出现不良副作用。亲和分子可以是，例如，特异性结合DC-SIGN的抗体。
在一些优选的实施方案中，融合分子是病毒糖蛋白，介导融合或者促进感兴趣的基因输送到树突状细胞，优选的对胞内体的低PH环境做出应答。融合分子优选的展现出足够快的动力学使得病毒内含物在病毒粒子被降解前就已经进入胞浆。另外，融合分子可以经过修饰以减少或者消除任何结合活性，从而减少或者消除任何非特异性的结合。就是说，通过降低融合分子的结合能力，使病毒与靶细胞的结合主要或者完全由亲和分子决定，这样可以获得高靶向特异性并减少不良作用。示例性的融合分子包括，但不限于来自于下列病毒之一的病毒糖蛋白：辛德毕斯病毒，流感病毒，拉沙热病毒，森林脑炎病毒，登革热病毒，乙型肝炎病毒，狂犬病病毒，塞姆利基森林病毒，罗斯河病毒，Aura病毒，博尔纳病病毒，汉坦病毒和SARS-CoV病毒。
可以使用各种分子中的任意一种作为靶向分子，或者作为融合分子与亲和分子联用，轻易的实施本文公开的方法。除本文描述的那些，其它示例性的分子和相关方法也被描述，例如，在美国专利申请公开号2005/0238626和美国专利申请公开号2007/0020238。
载体
在优选的实施方案中，一个或更多的载体用于将多核苷酸序列导入包装细胞系以制备本文描述的重组病毒。载体可以包含编码重组病毒各种组分的多核苷酸序列，所述重组病毒包括树突状细胞特异性靶向分子，感兴趣的基因(通常编码抗原)，以及任何在病毒产生过程中必需但是包装细胞不能提供的组分。在一些实施方案的病毒制备中，用包含多核苷酸序列(编码DC特异性亲和分子和分离的融合分子)的载体替换编码DC特异性靶向分子的载体。真核细胞表达载体是本领域公知的，可以从众多的商业途径获取。
在本发明的一个方面，还使用包含编码DC成熟因子的多核苷酸序列的载体制备病毒。这些多核苷酸通常处于一个或多个调节元件(合适的话，指导编码序列在包装细胞和靶细胞中的表达)的控制下。数个证据证明DC免疫的成功取决于DCs的成熟状态(Banchereau，J and Palucka，A.K.Nat.Rev.Immunol.5：296-306(2005)；Schuler，G.et al.Curr.Opin.Immunol 15：138-147(2003)；Figdor，CG.et al.Na t.Med.10：475-480(2004)，其各自在此引入作为参考)。成熟过程可以将DCs从具有抗原捕获活性的细胞转化为专一用于T细胞激发的细胞。在本发明的另一方面，载体包括编码刺激分子的基因以引发所需DC细胞成熟。这类刺激分子也被称为成熟因子或成熟刺激因子。
在一些实施方案中，用编码抗原的病毒载体以及一个或多个其他载体共转染包装细胞。例如，除编码抗原的病毒载体外，第二载体优选的携带编码结合树突状细胞的靶向分子的基因，比如SVGmu，如本申请其它部分所述。在一些优选的实施方案中，靶向分子编码对DC-SIGN特异的修饰病毒糖蛋白。所述修饰的病毒糖蛋白优选是来自下列病毒至少之一的病毒糖蛋白：辛德毕斯病毒，流感病毒，拉沙热病毒，森林脑炎病毒，登革热病毒，乙型肝炎病毒，狂犬病病毒，塞姆利基森林病毒，罗斯河病毒，Aura病毒，博尔纳病病毒，汉坦病毒和SARS-CoV病毒。在一些实施方案中，编码抗原的病毒载体还包括编码DC成熟因子的多核苷酸序列。在一些实施方案中，编码DC成熟因子的多核苷酸序列被包括在第三载体中，所述载体与编码抗原的病毒载体以及一个或多个其他载体共转染包装细胞。
在其他实施方案中，可以使用一个或多个多顺反子表达载体，其包括包装细胞中所需重组病毒产生必需的两个或多个元件(例如病毒基因，感兴趣的基因，靶向分子，DC成熟因子)。多顺反子载体的应用减少所需载体的总数，从而避免可能会出现的与协调多个载体的表达有关的困难。在多顺反子载体中，各种待表达的元件被可操作的连接到一个或多个启动子(如果需要，和其它表达控制元件)。在其他实施方案中，使用包含感兴趣的基因、报告基因和病毒元件的多顺反子载体。感兴趣的基因通常编码抗原和，任选的，DC成熟因子。这种载体可以与例如编码靶向分子的载体共转染，或者在一些实施方案中，与编码FM以及亲和分子的多顺反子载体共转染。在一些实施方案中，多顺反子载体包含编码抗原的基因，编码DC成熟因子和病毒元件的基因。
在多顺反子表达载体中表达的各个组分可以被例如IRES元件或病毒2A元件分离，这样可以允许来自相同启动子的不同蛋白的分别表达。IRES元件和2A元件是本领域已知的(美国专利号4,937,190；de Felipe et al.2004.Traffic5：616-626，其各自在此整体引入作为参考)。在一些实施方案中，编码弗林蛋白酶切割位点序列(RAKR)的寡核苷酸(Fang et al.2005.Nat.Biotech 23：584-590，其在此整体引入作为参考)与来自口蹄疫病毒(FMDV)，马动脉炎病毒(ERAV)和thosea asigna病毒(TaV)的2A样序列连接(Szymczak et al.2004.Nat.Biotechnol.22：589-594，其在此整体引入作为参考)，可用于分隔多顺反子载体中的遗传元件。利用标准实验步骤，通过检测各个基因的表达，可以很容易的检测特定多顺反子载体在合成所需重组病毒中的效率。
载体的制备可以通过本领域已知的任何合适的基因工程方法来实现，包括，但不限于，以下标准技术：限制性内切酶消化，连接，转化，质粒纯化以及DNA测序，例如以下描述，Sambrook等(1989.Molecular Cloning：ALaboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press，N.Y.)，Coffin等(Retroviruses.Cold Spring Harbor Laboratory Press，N.Y.(1997))和″RNA Viruses：A Pratical Approach″(Alan J.Cann，Ed.，Oxford UniversitvPress，(2000))，其各自在此整体引入作为参考。
载体可以包括来自任何已知生物的基因组的序列。所述序列可以采取它们的天然形式或者采用任何方式进行修饰。例如，所述序列可以包括插入，缺失或者替代。
用于调节组分表达的表达控制元件是本领域已知的，包括，但不限于，诱导型启动子，组成型启动子，分泌信号，增强子和其它调控元件。
在一个实施方案中，载体可以包括原核复制子，即，具有以下能力的DNA序列：在原核宿主细胞(诸如细菌宿主细胞，其被转化)中指导自主复制并且在染色体外维持重组DNA分子。这类复制子是本领域公知的。另外，包含原核复制子的载体还可以包含基因，所述基因的表达提供可检测的标志物，例如抗药性。典型的细菌抗药性基因是提供对氨基苄青霉素或者四环素抗性的那些基因。
载体可以包含一个或者多个可选择标志物的基因，这些标志物在真核细胞中是有效的，例如抗药性选择标志物的基因。这种基因编码在选择性培养基中培养的转化宿主细胞生存或生长必需的因子。宿主细胞如果没有转化包含选择基因的载体，就不能在培养基中存活。典型的选择基因编码的蛋白可以赋予细胞对抗生素或者其它毒素(例如，氨苄青霉素，新霉素，甲氨蹀呤或者四环素)的抗性，补充营养缺陷，或者供应培养基中去除的重要营养物。选择性的标志物可以任选的出现于分离的质粒，并通过共转染导入。
载体通常包含启动子，所述启动子被包装细胞识别，并且与编码靶向分子、病毒组分等等的多核苷酸可操作的连接。启动子是表达控制元件，由允许RNA聚合酶结合和转录发生的核酸序列组成。启动子是非翻译序列，位于结构基因(一般在大约100到1000bp)起始密码子的上游(5′)，控制与其可操作连接的抗原特异性多核苷酸序列的转录和翻译。启动子可以是诱导型或者组成型的。诱导型启动子的活性可以由于生物或非生物因子的存在或缺失来诱导。诱导型启动子可以作为基因工程的有用工具，因为可以在生物体发育的某一阶段或在特定组织中开启或关闭与所述启动子可操作连接的基因的表达。诱导型启动子可以被分为化学调节启动子和物理调节启动子。典型的化学调节启动子包括，但是不限于，酒精调控的启动子(例如酒精脱氢酶I(alcA)基因启动子)，四环素调节的启动子(例如四环素应答启动子)，固醇类调节的启动子(例如基于大鼠糖皮质激素受体(GR)的启动子，基于人雌激素受体(ER)的启动子，基于蛾蜕皮素受体的启动子、和基于类固醇、类视色素、甲状腺受体超家族的启动子，金属调节的启动子(例如，基于金属硫蛋白基因的启动子)，和发病相关启动子(例如，基于拟南芥和玉蜀黍病原体相关(PR)蛋白的启动子)。典型的物理调节的启动子包括，但不限于，温度调节的启动子(例如，热休克启动子)，和光调节的启动子(例如，大豆SSU启动子)。其他示例性的启动子在别处有描述，例如，超文本传送协议：//www.patentlens.net/daisy/promoters/768/271.html，其在此整体引入作为参考。
本领域技术人员能够基于特殊的环境选择合适的启动子。很多不同的启动子是本领域公知的，将启动子与待表达的基因可操作连接的方法同样也是公知的。天然启动子序列和很多异源启动子都可用于指导包装细胞和靶细胞中的表达。然而，优选异源启动子，因为和天然启动子相比，它们一般都允许更强的转录以及所需蛋白更高的产量。
启动子可以例如从病毒基因组获得，例如，多瘤病毒，鸡痘病毒，腺病毒，牛乳头瘤病毒，鸟肉瘤病毒，巨细胞病毒，逆转录病毒，乙型肝炎病毒，和类人猿病毒40(SV40)。启动子还可以是，例如异源哺乳动物启动子，例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子，热休克启动子，或者通常与天然序列结合的启动子，前提是这种启动子可以和靶细胞相容。在一个实施方案中，启动子是病毒表达系统中天然存在的启动子。在一些实施方案中，启动子是树突状细胞特异性启动子。树突状细胞特异性启动子可以是，例如，CD11c启动子。
通过将增强子序列插入载体可以增强转录。增强子是典型的DNA顺式作用元件，通常长约10到300bp，作用于启动子以增强其转录。现在很多已知的增强子序列都是来自哺乳动物基因(珠蛋白，弹性蛋白酶，清蛋白，α-胎儿球蛋白和胰岛素)。优选使用来自真核细胞病毒的增强子。实例包括位于复制起点后侧的SV40增强子(bp 100-270)，巨细胞病毒早期启动增强子，位于复制起点后侧的多瘤病毒增强子和腺病毒增强子。增强子可以被剪接到载体上抗原特异性多核苷酸序列的5′或者3′端，但优选的位于启动子的5′端。
表达载体还包含转录终止和稳定mRNA必需的序列。这些序列常常位于真核或者病毒DNAs或cDNAs的非翻译区的5′端，有时是3′端，并且是本领域公知的。
包含上述一个或多个组分的质粒载体都很容易应用本领域公知的标准技术来制备。
为分析确认构建的质粒中有正确的序列，质粒可以在E.coli中复制，纯化，用限制性内切酶消化分析，和/或用传统方法测序。
也可以应用在哺乳动物细胞中瞬时表达的载体。瞬时表达包括使用能够在宿主细胞中高效复制的表达载体，这样宿主细胞中积累很多表达载体的拷贝，从而合成高水平的多肽，所述多肽由表达载体中的抗原特异性多核苷酸编码。参见Sambrook et al.，上文，16.17-16.22页。
其他适用于表达病毒多肽的载体和方法是公知的，并且很容易适应特殊的环境。
应用本文提供的教导，本领域技术人员将认识到，通过用包括基因(编码报告蛋白)的载体转化包装细胞，并利用合适的技术测量表达，例如，测量绿色荧光蛋白偶联物的荧光，可以检测特定表达系统的效果。合适的报告基因是本领域公知的。
用本发明的载体转化包装细胞的方法可以通过公知的方法来完成，这些使用的方法没有任何限制。许多非病毒输送系统是本领域已知的，包括例如，电穿孔，基于脂类的输送系统包括脂质体，“裸”DNA的输送，以及利用聚环糊精化合物的输送，诸如SchatzleinAG描述的那些(2001.Non-Viral Vectors inCancer Gene Therapy：Principles and Progresses.Anticancer Drugs，其在此整体引入作为参考)。通常使用阳离子脂质或者盐处理方法，参见，例如Graham et al.(1973.Virol.52：456；Wigler et al.(1979.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76：1373-76)，前述各自在此整体引入作为参考。优选磷酸钙沉淀法。但是，也可以使用其他将载体导入细胞的方法，包括核显微注射和细菌原生质体融合。
病毒载体和包装细胞
载体中的一种编码核心病毒(″病毒载体″)。存在大量适用于本发明的病毒载体，包括那些确定用于人类基因疗法应用的病毒载体，例如Pfeifer和Verma描述的那些(Pfeifer，A.and LM.Vcrma.2001.Annu.Rev.Genomics Hum.Genet.2：177-211，其在此整体引入作为参考)。合适的病毒载体包括基于RNA病毒的载体，例如逆转录病毒来源的载体，例如，莫洛尼鼠白血病病毒(MLV)来源的载体，并包括更复杂的逆转录病毒来源的载体，例如慢病毒来源的载体。人免疫缺陷病毒(HIV-1)来源的载体属于这个范畴。其他例子包括以下来源的慢病毒载体：HIV-2，猫科动物免疫缺陷病毒(FIV)，马传染性贫血症病毒，猿免疫缺陷病毒(SIV)和羊慢性进行性肺病病毒/绵羊脱髓鞘性脑白质炎病毒。
病毒载体优选包含一个或多个编码重组病毒组分的基因以及一个或多个感兴趣的基因，例如，抗原和/或DC成熟因子。病毒载体还可以包含有利于感兴趣的基因在靶细胞中表达的遗传元件，例如启动子和增强子序列。为防止在靶细胞中的复制，可以去除复制所需的内源性病毒基因，并在包装细胞系中单独提供。
在优选的实施方案中，病毒载体包含完整的逆转录5′LTR和自灭活3′LTR。
可以使用本领域已知的任何方法产生传染性逆转录病毒粒子，它的基因组包含病毒载体的RNA副本。为此，病毒载体(和其他编码感兴趣基因的载体，DC特异性靶向分子，等等)优选的被导入包装细胞系，其将基于病毒载体的病毒基因组RNA包装入病毒粒子。
包装细胞系提供将病毒基因组RNA包装入病毒粒子必需的病毒蛋白。包装细胞系是任何能够表达逆转录病毒蛋白的细胞系。优选的包装细胞系包括293(ATCC CCL X)，HeLa(ATCC CCL 2)，D17(ATCC CCL 183)，MDCK(ATCC CCL 34)，BHK(ATCC CCL-10)和Cf2Th(ATCC CRL 1430)。包装细胞系可以稳定表达必需的病毒蛋白。这类包装细胞系已经被描述于，例如，美国专利号6,218,181，其在此整体引入作为参考。可选择的可以用包含核酸的质粒瞬时转染包装细胞系，所述核酸编码一个或多个必需病毒蛋白，包括DC细胞特异性靶向分子(或者可选择的，DC特异性亲和分子和融合分子)以及编码感兴趣基因的病毒载体，其通常编码抗原，此外还可以编码DC成熟因子。
收集病毒粒子，其包含具有编码感兴趣基因的多核苷酸和靶向分子(对树突状细胞特异)，并用其感染靶细胞。在一些优选的实施方案中，病毒被假型以获得靶细胞特异性。假型方法是本领域公知的，并且在本文中也有描述。
在一个实施方案中，用来输送感兴趣基因的重组病毒是经过修饰的慢病毒，并且病毒载体是基于慢病毒的。因为慢病毒能够感染分裂和非分裂细胞，在这个实施方案中无需靶细胞是分裂的(或者刺激靶细胞分裂)。
在另外的实施方案中，用来输送感兴趣基因的重组病毒是经过修饰的γ逆转录病毒，并且病毒载体是基于γ逆转录病毒的。
在另一实施方案中，载体基于小鼠干细胞病毒(MSCV；(Hawley，R.G.，et al.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：10297-10302；Keller，G.，et al.(1998)Blood 92：877-887；Hawley，R.G.，et al.(1994)Gene Ther.1：136-138，前述各自在此整体引入作为参考)。MSCV载体在靶细胞中提供长期稳定的表达，尤其是造血前体细胞和它们的分化后代。
在另一个实施方案中，载体基于经过修饰的莫洛尼病毒，例如莫洛尼小鼠白血病病毒。病毒载体还可以基于杂交病毒例如Choi，J.K.，et al.所述(2001.Stem Cells19，No.3，236-246，其在此整体引入作为参考)。
可以使用DNA病毒载体，包括，例如基于腺病毒的载体和基于腺相关病毒(AAV)的载体。同样的，逆转录病毒-腺病毒载体也可用于本发明的方法。
另一些载体也可用于多核苷酸输送，包括来自单纯疱疹病毒(HSVS)的载体，包括扩增载体，复制缺陷型HSV和减毒的HSV(Krisky DM，Marconi PC，Oligino TJ，Rouse RJ，Fink DJ，et al.1998.Development of herpes simplexvirus replication-defective multigene vectors for combination genetherapy applications.Gene Ther.5：1517-30，其在此整体引入作为参考)。
最近开发用于基因治疗用途的其他载体也可以运用到本发明的方法中。这类载体包括来自杆状病毒和阿尔法病毒的载体(Jolly DJ.1999.Emergingviral vectors，pp209-40inFriedmann T，ed.1999.The development of humangene therapy.New York：Cold Spring Harbor Lab，其在此整体引入作为参考)。
在一些优选的实施方案中，病毒构建体包含来自慢病毒基因组的序列，例如HIV基因组或者SIV基因组病毒构建体优选包含来自慢病毒5′和3′LTRs的序列。更优选的病毒构建体包括来自慢病毒5′LTR的R和U5序列以及来自慢病毒的灭活或自灭活3′LTR。LTR序列可以是来自任何物种的任意慢病毒的LTR序列。例如，它们可以是来自HIV、SIV、FIV或者BIV的LTR序列。优选的LTR序列是HIV LTR序列。
病毒构建体优选包含灭活或者自灭活的3′LTR。可以使用本领域已知的任何方法使3′LTR自灭活。在优选的实施方案中，3′LTR的U3元件包含其增强子序列的缺失，优选是TATA盒、Sp1和NF-kappa B位点。作为自灭活3′LTR的结果，整合入宿主细胞基因组的前病毒将包含灭活的5′LTR。
任选的，在病毒构建体中，来自慢病毒5′LTR的U3序列可以被启动子序列取代。这样可以增加从包装细胞系中回收的病毒的滴度。还可以包含增强子序列。任何可以增加病毒RNA基因组在包装细胞系中表达的增强子/启动子组合都可以使用。在优选的实施方案中，使用CMV增强子/启动子序列。
在一些优选的实施方案中，病毒构建体包含来自γ逆转录病毒基因组的序列，例如小鼠干细胞病毒(MSCV)基因组或者小鼠白血病病毒(MLV)基因组。病毒构建体优选包括来自γ逆转录病毒的5′和3′LTRs的序列。LTRs序列可以是来自任何物种的γ逆转录病毒的LTR序列。例如，它们可以是来自小鼠干细胞病毒(MSCV)，小鼠白血病病毒(MLV)，猫科白血病病毒(FLV)，猫科肉瘤病毒(FAV)和鸟网状内皮组织增殖病毒(ARV)的LTR序列。优选的LTR序列是MSCV和MLV的LTR序列。
在一些实施方案中，病毒构建体优选包含灭活或者自灭活的3′LTR。可以使用本领域已知的任意方法使3′LTR自灭活。在优选的实施方案中，3′LTR的U3元件包含其增强子序列的缺失，优选TATA盒、Sp1和NF-kappaB位点。作为自灭活3′LTR的结果，整合入宿主细胞基因组的前病毒将包含灭活的5′LTR.
任选的，在病毒构建体中，来自慢病毒5′LTR的U3序列可以被启动子序列取代。这样可以增加从包装细胞系中回收的病毒的滴度。还可以包含增强子序列。任何可以增加病毒RNA基因组在包装细胞系中表达的增强子/启动子组合都可以使用。在优选的实施方案中，使用CMV增强子/启动子序列。
病毒构建体一般包含编码抗原的基因，期望所述抗原在一个或多个靶细胞中表达。优选的感兴趣的基因位于5′LTR和3′LTR序列之间。此外，感兴趣的基因优选与其他遗传元件(例如转录调节序列如启动子和/或增强子)功能性相关，以便在所述基因被掺入靶细胞后以特定方式调节感兴趣基因的表达。在某些实施方案中，有用的转录调节序列是那些根据活性进行时间和空间高度调节的序列。
在一些实施方案中，感兴趣的基因与内部启动子/增强子调节序列功能性相关。“内部”启动子/增强子位于病毒构建体的5′LTR和3′LTR序列之间，与需要表达的基因可操作的链接。
内部启动子/增强子可以是任何已知增加基因表达的启动子，增强子或者启动子/增强子组合，它们与所述基因功能性相关。“功能性相关”和“可操作的连接”的意思是，但不受限制，基因相对启动子和/或增强子位于正确的位置和方向，这样的话当启动子和/或增强子与相应分子接触时，影响所述基因的表达。
优选基于感兴趣基因要求的表达模式和已知启动子/增强子的具体性质来选择内部启动子/增强子。因此，内部启动子可以是组成型启动子。组成型启动子的非限制性例子包括泛素的启动子CMV(Karasuyama et al.1989.J.Exp.Med.169：13，其在此整体引入作为参考)，beta-肌动蛋白(Gunning et al.1989.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：4831-4835，其在此整体引入作为参考)和pgk(参见，例如，Adra et al.1987.Gene 60：65-74；Singer-Sametal.1984.Gene32：409-417；和Dobson et al.1982.Nucleic Acids Res.10：2635-2637，以上各自在此整体引入作为参考)。
可选择的，启动子可以是组织特异性启动子。在一些优选实施方案中，启动子是靶细胞特异性启动子。例如，启动子可以是树突状细胞特异性启动子CD11c(Masood，R.，et al.2001.Int J Mol Med 8：335-343；Somia，N.V.，et al.1995.Proc Acad Sci USA 92：7570-7574，其各自在此整体引入作为参考)。另外，还可以选择可诱导基因表达的启动子。本领域已知很多诱导表达的系统，包括四环素应答系统和乳糖操纵子系统。还预期启动子的组合可用于实现感兴趣基因的所需表达。技术人员能够基于在感兴趣的组织和/或靶细胞中需要的基因表达模式选择启动子。
在一些实施方案中，病毒构建体优选包含至少一个RNA聚合酶II或者III启动子。RNA聚合酶II或者III启动子与感兴趣的基因可操作的连接，也可以被连接到终止序列上。另外，还可以包含不止一个RNA聚合酶II或者III启动子。
RNA聚合酶II或者III启动子是本领域技术人员公知的。可以找到一系列合适的RNA聚合酶III启动子，例如，如Paule和White.Nucleic AcidsResearch，Vol 28，pp1283-1298(2000)，其在此整体引入作为参考。RNA聚合酶II或III启动子的定义分别还包括任意合成或改造的DNA片段，其能够分别指导RNA聚合酶II或III转录其下游RNA编码序列。此外，作为病毒载体一部分的RNA聚合酶II或III(Po1 II或III)启动子可以是诱导型的。任何合适的诱导型RNA聚合酶II或III启动子可以用于本发明的方法。尤其合适的Po1 II或III启动子包括四环素应答启动子，来自Ohkawa and Taira，Human GeneTherapy，Vol.11，pp577-585(2000)和Meissner et al.NucleicAcidsResearch，Vol.29，pp 1672-1682(2001)，其各自在此整体引入作为参考。
内部增强子也可以出现在病毒构建体中以增强感兴趣基因的表达。例如，可以使用CMV增强子(Karasuyama et al.1989.J.Exp.Med.169：13，其在此整体引入作为参考)。在一些实施方案中，CMV增强子可以和鸡β-肌动蛋白启动子联用。本领域技术人员将能够基于所需表达模式选择合适的增强子。
感兴趣的多核苷酸或者基因不受任何限制，包括技术人员想在靶细胞中整合、转录、翻译、和/或表达的任意核酸。在一些实施方案中，多核苷酸可以是编码所需免疫应答针对的抗原的基因。在一些实施方案中，多核苷酸可以是编码感兴趣的小抑制RNA(siRNA)或者microRNA(miRNA)的基因，它们可以下调分子的表达。例如，编码siRNA或者microRNA的基因可以用于下调细胞中负调控因子(包括抑制树突状细胞的活化或成熟)的表达。siRNAs和microRNAs是本领域已知的，在其他地方有描述(Shen，L.et al.2004.Nat Biotech 2(12)：1546-1553；Zhou，H.et al.2006.Biochemical and Biophysical ResearchCommunications 347：200-207；Song，X-T.，et al.2006.PloS Medicine3(1)：e11；Kobayashi，T.and A.Yoshimura.2005.TREND inImmunology 26(4)：177-179；Taganov，K.，et al.2007.Immunity 26：133-137；Dahlberg，I.E.and E.Lund.2007.Sci.STKE 387：pe25，其各自在此整体引入作为参考)。
另外，在一些实施方案中，多核苷酸可以包含不止一个感兴趣的基因，其可以被置于和病毒启动子功能性相关。感兴趣基因可以编码蛋白，siRNA或者microRNA。在一些实施方案中，待输送的多核苷酸可以包含多个基因，编码至少一个蛋白，至少一个siRNA，至少一个microRNA，或者其任意组合。例如，待输送的多核苷酸可以包括一个或多个基因，编码所需免疫应答针对的一个或多个抗原。一个或者多个抗原可能与单一的疾病或病症有关，或者可能与多种疾病和/或病症有关。在一些实施方案中，编码免疫调节蛋白的基因可以和编码所需免疫应答针对的抗原的主要基因一起构建，这个组合能够引发并调节免疫应答朝向所需方向和程度。在一些实施方案中，编码siRNA或者microRNA的基因可以和编码所需免疫应答针对的抗原的主要基因一起构建，这个组合能够调节免疫应答的范围。(参见，例如，图24c和图24d中多核苷酸的实施方案，分别伴有SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10的序列。)在一些实施方案中，编码标志蛋白的基因可以放置在感兴趣的主要基因后面，从而允许检测细胞是否表达所需蛋白。在一个实施方案中，荧光标志蛋白，优选是绿色荧光蛋白(GFP)，与感兴趣的基因(通常编码抗原)一起被掺入构建体。如果包含不止一个基因，还优选包含内源核糖体进入位点(IRES)序列，或者2A元件，将感兴趣的主要基因与报告基因和/或任何其他感兴趣的基因分开。IRES或者2A序列可以促进报告基因或其他基因的表达。
病毒构建体也可以包括另外的遗传元件。构建体中包括的遗传元件的类型不受任何限制，将由技术人员选择以实现特定结果。例如，可以包括促使病毒基因组进入靶细胞核的信号。这种信号的例子就是HIV-1侧翼(HIV-1 flap)信号。
此外，可以包含促进靶细胞中前病毒整合位点的特征化的元件。例如，tRNA琥珀抑制因子序列可以包含在构建体中。
另外，构建体还可以包括设计用来提高感兴趣基因的表达的一个或多个遗传元件。例如，可以将旱獭肝炎病毒应答元件(WRE)放到构建体中(Zufferey etal.1999.J.Virol.74：3668-3681；Deglon et al.2000.Hum.Gene Ther.11：179-190，其各自在此整体引入作为参考)。
鸡β-球蛋白隔离子也可以包含在病毒构建体中。已知这个元件减弱沉默靶细胞中整合的前病毒的几率，这种沉默是由甲基化作用和异染色质化作用造成的。另外，隔离子可以遮蔽内源增强子、启动子和外源基因免受染色体上整合位点周围DNA积极或消极的位置影响。
任何另外的遗传元件优选插入感兴趣基因的3′端。
在一个特殊的实施方案中，病毒载体包含：巨细胞病毒(CMV)增强子/启动子序列；HIV 5′LTR的R和U5序列；HIV-1 flap序列；内源增强子；内源启动子；感兴趣的基因；旱獭肝炎病毒应答元件；tRNA琥珀抑制因子序列；增强子序列缺失的U3元件；鸡β-球蛋白隔离子；和3′HIV LTR的R和U5序列。
优选将病毒构建体克隆入可以转染包装细胞系的质粒。优选的质粒优选包含对于质粒在细菌中复制有用的序列。
病毒的输送
可以采用任何允许病毒接触靶树突状细胞(DCs)的方法将病毒输送到靶细胞，在所述树突状细胞中需要输送感兴趣的多核苷酸。在优选的实施方案中，将合适数量的病毒直接导入动物(体内)，例如通过注射到身体中。在一些优选的实施方案中，病毒粒子被注射入哺乳动物的外周血。在其他优选的实施方案中，通过真皮内注射、皮下注射，腹腔注射或者静脉注射将病毒粒子注射入哺乳动物。病毒可以通过真皮下注射装置输送，所述装置公开于美国专利号7,241,275、7,115,108、7,108,679、7,083,599、7,083,592、7,047,070、6,971,999、6,808,506、6,780,171、6,776,776、6,689,118、6,670,349、6,569,143、6,494,865、5,997,501、5,848,991、5,328,483、5,279,552、4,886,499，为了全部目的所有这些均在此整体引入作为参考。其他注射部位也合适，例如直接注射入包含靶细胞的器官。例如可以使用淋巴结内注射，脾内注射，或者骨髓内注射将病毒分别输送到淋巴结，脾和骨髓。基于靶细胞的特定环境和性质，导入也可以通过其他途径进行，例如，吸入或者直接接触上皮组织，例如眼睛，嘴或者皮肤的那些上皮组织。
在其他实施方案中，提供靶细胞并且在体外与病毒接触，例如培养皿。靶细胞通常是来自健康受试者或者需要治疗的受试者的树突状细胞。优选的，靶细胞取自受试者的树突状细胞，在所述受试者中需要刺激针对抗原的免疫应答。从受试者获得细胞的方法是本领域公知的。病毒可以悬浮在培养基中，并添加到培养皿的孔、试管或其他容器中。可以在种入细胞前或种入细胞后添加含有病毒的培养基。优选的细胞在合适剂量的培养基中孵育以保持活性，并且允许合适浓度的病毒浓度存在于培养基中，这样才能发生宿主细胞的感染。
细胞优选和病毒一起培养足够长的时间允许病毒感染细胞。优选的细胞和病毒一起培养至少1个小时，更优选的至少5个小时，和甚至更优选的至少10个小时。
无论在体内还是体外的输送实施方案，可以使用足以感染所需靶细胞的任何病毒浓度，这可以由技术人员很容易的确定。当培养靶细胞时，病毒粒子的浓度是至少1PFU/μl，更优选的是至少10PFU/μl，甚至更优选的是至少400PFU/μl，和甚至更优选的是至少1×104PFU/μl。
在一些实施方案中，在用病毒体外感染后，将靶细胞导入(或重新导入)动物。在一些实施方案中，可以将细胞导入真皮、真皮下或者外周血。导入动物的细胞优选的来自该动物，这样可以避免不利的免疫应答。还可以使用来自具有相似免疫背景的供体动物的细胞。也可以使用其他细胞，包括那些设计用来避免不利免疫应答的细胞。
可以分析靶细胞，例如感兴趣多核苷酸或者基因的整合，转录和/或表达，整合基因的拷贝数目以及整合的位置。这样的分析可以在任何时间，使用本领域已知的任意方法来进行。
可以使用本领域已知的任意方法分析施用重组病毒或病毒感染DCs的受试者的感染细胞的定位，病毒输送的感兴趣的多核苷酸或者基因的表达，免疫应答的刺激，并监控与疾病或病症相关的症状。
上文公开的感染细胞的方法并不依赖于细胞的个体特殊性质。结果就是它们很容易扩展到所有哺乳动物。在一些实施方案中，重组病毒被输送给人或人树突状细胞。在其他实施方案中，重组病毒被输送给小鼠或者小鼠树突状细胞。仍在其他实施方案中，重组病毒被输送给除人或小鼠之外的动物，或者除人或小鼠之外的动物的树突状细胞。
正如以上讨论的，重组病毒可以被假型使其具有广泛的宿主范围和靶细胞特异性。本领域技术人员也清楚合适的内源启动子以便在特定的动物物种中实现感兴趣的多核苷酸或基因的所需表达。因此，本领域技术人员能够改变感染任意物种的树突状细胞的方法。
可以评估重组病毒以确定靶向分子的特异性，所述靶向分子被整合到靶向树突状细胞的病毒。例如，从受试者获取骨髓细胞的混合群，并在体外培养。可以将重组病毒给药骨髓细胞的混合群，并分析培养细胞中整合到病毒的报告基因的表达。在一些实施方案中，混合细胞群中至少50％，更优选的至少60％、70％、80％或者90％，仍然更优选的至少95％的转导细胞是表达DC-SIGN的树突状细胞。
治疗
本发明的方法可以用来预防或者治疗各种疾病或病症，尤其是在所述疾病或病症中活化患者的免疫应答是有益的。很多这类疾病是本领域公知的。例如，可以通过本发明方法治疗或者预防的疾病包括，但不局限于，癌症，自身免疫性疾病，和传染病，包括病毒的，细菌的，真菌的和寄生虫的传染。在本发明的实施方案中，通过重组病毒将感兴趣的基因输送到树突状细胞来治疗疾病，其中所述基因的表达产生疾病特异性的抗原，从而导致激活抗原特异性的细胞免疫应答和体液免疫应答。
在本发明的实施方案中，使用重组病毒将编码能够所需免疫应答针对的抗原的多核苷酸输送到树突状细胞。在一些实施方案中，通过在体外将重组病毒接触树突状细胞来实现输送，然后将感染的树突状细胞提供给患者。在一些实施方案中，通过将病毒输送给受试者以便在体内与树突状细胞接触来实现输送。然后树突状细胞刺激患者体内的抗原特异性T细胞或者B细胞来引发针对表达抗原的细胞或者体液免疫应答。在这样的实施方案中，通过产生具有所需特异性的免疫细胞来治疗患有疾病或者病症的患者。
利用本文描述的重组病毒，可以将任何疾病和病症相关抗原输送到树突状细胞。鉴定与疾病或者病症相关的抗原以制备靶向树突状细胞的重组病毒。与很多疾病和病症相关的抗原是本领域公知的。抗原可以是先前已知与疾病或者病症有关，或者可以通过本领域已知的任意方法鉴定。例如，某种折磨患者的癌症的抗原可能是已知的，如肿瘤相关抗原。在一方面，本发明提供一种方法，用基因工程重组慢病毒在体内将编码肿瘤抗原和其他必需蛋白的基因输送到DCs。在其他实施方案中，与疾病或病症相关的抗原可以从需要治疗的患者体内鉴定。例如，和肿瘤相关的抗原可以用本领域已知的任何方法从所述肿瘤自身鉴定。肿瘤相关抗原不受任何限制，包括例如从需要治疗患者的癌细胞鉴定的抗原。
已知大量癌症的肿瘤相关抗原，所述癌症包括例如，前列腺癌和乳腺癌。在一些乳腺癌中，例如，Her-2受体在癌细胞表面过表达。典型的肿瘤抗原包括，但不限于：MAGE，BAGE，RAGE和NY-ESO，它们是在睾丸的免疫赦免区和各种肿瘤细胞中表达的未突变抗原；谱系特异的肿瘤抗原，例如黑色素瘤系抗原MART-1/Melan-A，gp100，gp75，mda-7，酪氨酸酶和酪氨酸酶相关蛋白，或者前列腺特异的膜抗原(PSMA)或者前列腺特异抗原(PSA)，它们是在来自相同组织的正常细胞和肿瘤细胞上表达的抗原；表位蛋白/肽，来自肿瘤细胞中突变的基因或是相对于正常细胞在肿瘤中以不同水平转录的基因，例如突变的ras，bcr/abl重排，Her2/neu，突变或者野生型p53，细胞色素P4501B1，和异常表达的内含子序列例如N-乙酰氨基葡萄糖转移酶V；免疫球蛋白基因的克隆重排，引发骨髓瘤和B-细胞淋巴瘤的独特型；源自癌病毒加工的表位蛋白/肽，例如人乳头瘤病毒蛋白E6和E7；具有肿瘤选择性表达的未突变癌胚蛋白，例如癌胚抗原和阿尔法-胎儿球蛋白。很多肿瘤相关抗原已经被综述过(参见，例如，″Tumor-Antigens Recognized By T-Lymphocytes，″Boon T，Cerottini JC，Vandeneynde B，Vanderbruggen P，VanpelA，Annual Review Of Immunology 12：337-365，1994；″Alisting of human tumor antigens recognized by Tcells，″Renkvist N，Castelli C，Robbins PF，Parmiani G.Cancer Immunology Immunotherapy 50：(1)3-15MAR 2001，其各自在此整体引入作为参考。)
抗原还可以是和传染病相关的抗原，例如，HIV/AIDS。抗原可能是，例如gp120(Klimstra，W.B.，et al.2003.J Virol 77：12022-12032；Bernard，K.A.，et al.2000.Virology 276：93-103；Byrnes，A.P.，et al.1998.JVirol 72：7349-7356，其各自在此整体引入作为参考)。其它典型的抗原包括，但是不限于：gag，pol，env，tat，nef和rev(Lieberman，J.et al.1997.AIDS Res Hum Retroviruses 13(5)：383-392；Menendez-Arias，L.et al.1998.Vira1 Immunol 11(4)：167-181，其各自在此整体引入作为参考)。
病毒抗原的例子包括，但不限于，腺病毒多肽，α病毒多肽，萼状病毒多肽，例如，萼状病毒衣壳抗原，冠状病毒多肽，瘟热病毒多肽，埃博拉病毒多肽，肠道病毒多肽，黄病毒多肽，肝炎病毒(AE)多肽，例如乙肝的核心或表面抗原，疱疹病毒多肽，例如，单纯疱疹病毒或者水痘带状疱疹病毒糖蛋白，免疫缺陷病毒多肽，例如人免疫缺陷病毒包膜或者蛋白酶，传染性腹膜炎病毒多肽，流感病毒多肽，例如流感A血球凝集素，神经氨酸苷酶或核蛋白，白血病病毒多肽，马伯格氏病毒多肽，正粘液病毒多肽，乳头瘤病毒多肽，副流感病毒多肽，例如血细胞凝集素/神经氨酸苷酶，副粘液病毒多肽，细小病毒多肽，昆虫病毒多肽，微小RNA病毒多肽，例如脊髓灰质炎病毒衣壳多肽，痘病毒多肽，例如，牛痘病毒多肽，狂犬病病毒多肽，例如狂犬病病毒糖蛋白G，呼肠病毒多肽，逆转录病毒多肽，和轮状病毒多肽。
细菌抗原的例子包括，但不限于：放线菌属(Actinomyces)多肽、芽胞杆菌属(Bacillus)多肽、类杆菌属(Bacteroids)多肽、博德特氏(Bordetella)病毒、巴尔通体(Bartonella)多肽、包柔氏螺旋体(Borrelia)多肽、例如、博氏疏螺旋体(B.burgdorferi)Osp A、布鲁氏杆菌属(Brucella)多肽、弯曲杆菌属(Campylobacter)多肽、产琥珀酸弯曲菌属(Capnocytophaga)多肽、衣原体属(Chlamydia)多肽、梭状芽胞杆菌属(Clostridium)多肽、棒状杆菌属(Corynebacterium)多肽、柯克斯氏体(Coxiella)多肽、嗜皮菌属(Dermatophilus)多肽、肠道球菌属(Enterococcus)多肽、埃利希氏体(Ehrlichia)多肽、埃希氏杆菌属(Escherichia)多肽、弗朗西斯氏菌属(Francisella)多肽、梭杆菌属(Fusobacterium)多肽、血巴尔通氏体(Haemobartonella)多肽、嗜血杆菌属(Haemophilus)多肽、例如流感嗜血杆菌属(H.influenzae)b型外膜蛋白、螺杆菌属(Helicobacter)多肽、克雷伯氏菌属(Klebsiella)多肽、L型细菌属(L-formbacteria)多肽、钩端螺旋体属(Leptospira)多肽、李斯特菌属(血Listeria细胞凝集抑制、分枝杆菌属(Mycobacteria)多肽、支原体属(Mycoplasma)多肽、淋球菌属(Neisseria)多肽、新立克次氏体属(Neorickettsia)多肽、诺卡氏菌属(Nocardia)多肽、巴斯德氏菌属(Pasteurella)多肽、消化球菌属(Peptococcus)多肽、消化链球菌属(Peptostreptococcus)多肽、肺炎球菌属(Pneumococcus)多肽、变形杆菌属(Proteus)多肽、假单胞菌属(Pseudomonas)多肽、立克次氏体属(Rickettsia)多肽、罗克利马体菌属(Rochalimaea)多肽、沙门氏菌属(Salmonella)多肽、志贺氏菌属(Shigella)多肽、葡萄球菌属(Staphylococcus)多肽、链球菌属(Streptococcus)多肽、例如化脓性链球菌属(S.pyogenes)M蛋白、密螺旋体属(Treponema)多肽、和耶尔森菌属(Yersinia)多肽例如鼠疫(Y.pestis)F1和V抗原。
真菌抗原的实例包括，但不限于犁头霉属(Absidia)多肽、支顶孢属(Acremonium)多肽、链格孢属(Alternaria)多肽、曲霉Aspergillus)多肽、蛙粪霉属(Basidiobolus)多肽、双极霉属(Bipolaris)多肽、芽生菌属(Blastomyces)多肽、假丝酵母属(Candida)多肽、球孢子菌属(Coccidioides)多肽、耳霉属(Conidiobolus)多肽、隐球酵母属(Cryptococcus)多肽、Curvalaria)多肽、表皮癣菌属(Epidermophyton)多肽、外小杯菌属(Exophiala)多肽、地丝菌属(Geotrichum)多肽、组织胞浆菌属(Histoplasma)多肽、马杜拉分支菌属(Madurella)多肽、马拉色氏霉菌属(Malassezia)多肽、小孢子菌属(Microsporum)多肽、丛梗孢科Moniliella)多肽、被孢霉属(Mortierella)多肽、毛霉属(Mucor)多肽、拟青霉属(Paecilomyces)多肽、青霉属(Penicillium)多肽、单胞瓶霉属(Phialemonium)多肽、瓶霉属(Phialophora)多肽、原壁菌属(Prototheca)多肽、假霉样真菌属(Pseudallescheria)多肽、假小托菌属(Pseudomicrodochium)多肽、腐霉菌属(Pythium)多肽、鼻孢子虫属(Rhinosporidium)多肽、酒曲菌属(Rhizopus)多肽、线状担子菌属(Scolecobasidium)多肽、孢子丝菌属(Sporothrix)多肽、葡柄霉属(Stemphylium)多肽、发癣菌属(Trichophyton)多肽、毛孢子菌属(Trichosporon)多肽及木丝霉属(Xylohypha)多肽。
原生动物寄生物抗原的实例包括、但不限于Babesia巴贝虫属(、肠袋虫属(Balantidium)多肽、贝诺孢子虫属(Besnoitia)多肽、隐孢子虫属(Cryptosporidium)多肽、艾美虫属(Eimeria)多肽、脑胞内原虫属(Encephalitozoon)多肽、内阿米巴属(Entamoeba)多肽、贾第鞭毛虫属(Giardia)多肽、哈蒙德虫属(Hammondia)多肽、肝簇虫属(Hepatozoon)多肽、等孢子球虫属(Isospora)多肽、利什曼虫属(Leishmania)多肽、小孢子虫目Microsporidia)多肽、新孢子虫属(Neospora)多肽、龙船草属(Nosema)多肽、五鞭毛滴虫属(Pentatrichomonas)多肽、疟原虫属(Plasmodium)多肽，例如恶性疟原虫环子孢子蛋白(P.falciparum circumsporozoite)(PfCSP)，子孢子表面蛋白2(PfSSP2)，肝静止抗原1的羧基末端(PfLSA1c-末端)及输出蛋白1(PfExp-1)，肺孢子虫属(Pneumocystis)多肽，肉孢子虫属(Sarcocystis)多肽，血吸虫属(Schistosoma)多肽，泰来虫属(Theileria)多肽，弓型属(Toxoplasma)多肽及锥虫属(Trypanosoma)多肽。
蠕虫寄生物抗原的实例包括，但不限于棘唇线虫属(Acanthocheilonema)多肽，猫圆线虫属(Aelurostrongylus)多肽，钩口属(Ancylostoma)多肽，管圆线虫属(Angiostrongylus)多肽，蛔虫属(Ascaris)多肽，布鲁格丝虫属(Brugia)多肽，仰口属(Bunostomum)多肽，毛细线虫属(Capillaria)多肽，夏柏线虫属(Chabertia)多肽，古柏线虫属(Cooperia)多肽，环体线虫属(Crenosoma)多肽，网尾属(Dictyocaulus)多肽，Dioctophyme)多肽，双板线虫属(Dipetalonema)多肽，裂头属(Diphyllobothrium)多肽，Diplydium)多肽，恶丝虫属(Dirofilaria)多肽，龙线属(Dracunculus)多肽，蛲虫属(Enterobius)多肽，丝状虫属(Filaroides)多肽，血矛线虫属(Haemonchus)多肽，兔唇蛔属(Lagochilascaris)多肽，罗阿丝虫属(Loa)多肽，曼森线虫属(Mansonella)多肽，缪勒线虫属(Muellerius)多肽，侏形吸虫属(Nanophyetus)多肽，线虫属(Necator)多肽，细颈线虫属(Nematodirus)多肽，结节线虫属(Oesophagostomum)多肽，盘尾属(Onchocerca)多肽，后睾吸虫属(Opisthorchis)多肽，棕色胃虫Ostertagia)多肽，副丝虫属(Parafilaria)多肽，并殖吸虫属(Paragonimus)多肽，副蛔虫属(Parascaris)多肽，泡翼线虫属(Physaloptera)多肽，原圆属(Protostrongylus)多肽，狗尾草属(Setaria)多肽，旋毛线虫属(Spirocerca)多肽，刺猬绦虫属(Spirometra)多肽，冠丝虫属(Stephanofilaria)多肽，类圆线虫属(Strongyloides)多肽，圆线虫属(Strongylus)多肽，吸吮线虫属(Thelazia)多肽，弓蛔线虫属(Toxascaris)多肽，弓蛔虫属(Toxocara)多肽，毛线虫属(Trichinella)多肽，毛圆线虫属(Trichostrongylus)多肽，鞭虫属(Trichuris)多肽，钩虫属(Uncinaria)多肽及吴策线虫属(Wuchereria)多肽。
外寄生物抗原的实例包括，但不限于来自跳蚤多肽(包括保护性抗原以及变应原)；蜱，包括硬体蜱和软体蜱；苍蝇，例如蠓、蚊子、沙蝇、黑蝇、马蝇、角蝇、斑虻、采采蝇、厩螫蝇、引起蝇蛆病的蝇和biting gnats；蚂蚁；蜘蛛；虱；螨；及蝽类如臭虫和猎蝽。
一旦鉴定和/或选定一个抗原，编码所需抗原的多核苷酸也就被确定。优选的所述多核苷酸包含cDNA。优选的用重组病毒将编码抗原的多核苷酸导入靶树突状细胞，更优选的用重组慢病毒或者γ逆转录病毒，其包含上文所述的结合DC-SIGN的靶向分子。重组病毒首先通过DC-SIGN靶向分子结合树突状细胞的细胞膜，随后包含编码抗原序列的多核苷酸的病毒核心进入胞浆。然后多核苷酸(例如，编码抗原)优选的整合入细胞的基因组中并且表达。如果在体外接触，靶树突状细胞随后被回输给患者，例如通过注射，在患者体内树突状细胞可以和免疫细胞相互作用，能够引发针对所需抗原的免疫应答。在优选的实施方案中，将重组病毒注射到患者体内，在那里病毒可以原位转导靶树突状细胞。然后树突状细胞表达与需要治疗的疾病或者病症相关的特定抗原，从而患者能够产生针对所述疾病或者病症的有效免疫应答。
在一些实施方案中，重组病毒包含编码不止一个抗原的多核苷酸，并且在转导靶树突状细胞时，对输送到细胞的大量抗原产生免疫应答。在一些实施方案中，所述抗原和疾病或者病症相关。在其他实施方案中，所述抗体则和多种疾病或者病症相关。
在本发明的实施方案中，活化和/或激活DCs成熟的DC成熟因子与载有感兴趣的多核苷酸或基因的重组病毒一起输送。在一些实施方案中，在病毒输送前DCs通过DC成熟因子的输送被激活。在一些实施方案中，在病毒输送后DCs通过DC成熟因子的输送被激活。在一些实施方案中，病毒输送的同时DCs通过DC成熟因子的输送被激活。在其他实施方案中，DC成熟因子的提供和病毒的施用分别进行。
在某些实施方案中，一个或多个DC成熟因子由病毒包含的一个或多个基因编码，并在病毒转导树突状细胞之后表达。在某些实施方案中，一个或多个编码DC成熟因子的基因可以包含在编码抗原的病毒载体中。在更进一步的实施方案中，一个或多个编码DC成熟因子的基因可以包含在编码多个抗原的病毒载体中。在某些实施方案中，一个或多个编码DC成熟因子的基因可以提供在不同的载体中，所述载体与编码一个或多个抗原的病毒载体共转染包装细胞系。
在一些实施方案中，本发明的方法可以用于患者的过继免疫治疗。如上面所描述的，确定所需免疫应答针对的抗原。获得编码所需抗原的多核苷酸，将其包装入重组病毒。用含有多核苷酸(编码所需抗原)的重组病毒转导从患者得到的靶树突状细胞。随后将树突状细胞回输给患者。
免疫
正如上面讨论的，各种改造的用来结合DC-SIGN树突状细胞表面标志物的靶向分子预期可用于制备将编码抗原的基因输送到DC细胞的重组病毒。病毒可以用来在体内或体外转导DCs来预防疾病或病症。例如，可以将辛德巴斯病毒包膜糖蛋白改造为优先结合DC-SIGN，以及用于假型重组病毒。可以利用本文描述的方法将编码所需免疫应答针对抗原的基因输送到DCs，例如针对癌症(例如Mar-1)，或其他疾病/病症(例如病毒感染)。在一些实施方案中，可以使用本文描述的方法，通过使用多病毒载体，或者，优选的多顺反子载体系统将编码多种抗原的多基因输送到DCs。使用多载体或者，优选的多顺反子载体系统，使一个或多个编码一个或多个抗原的基因伴随编码刺激分子(如GM-CSF，IL-2，IL-4，IL-6，IL-7，IL-15，IL-21，IL-23，TNFα，B7.1，B7.2，4-1BB，CD40配体(CD40L)，药物诱导型CD40(iCD40)等等)和/或受体分子(如GFP，萤光素酶等)和/或报告分子(例如GFP，荧光素酶及其类似物)的基因。
在本发明的一些实施方案中，通过获得CD34α+人造血祖细胞并利用其他地方(例如，Banchereau et al.Cell 106，271-274(2001))描述的体外培养方法，产生人DCs。产生载有结合DC-SIGN的靶向分子的病毒，其包含编码所需免疫应答针对的抗原的基因，所述病毒用来转染人DCs。转导的特异性和效果可以通过FACS来检测。DCs的成熟能够通过使用FACS分析表面标志物例如MHCII的上调来进行表征。
在其他实施方案中，病毒可以注射入体内，在那里病毒接触到天然DCs并输送感兴趣的多核苷酸，通常是编码抗原的基因。病毒粒子的量至少是50×106TU，也可以至少是1×107TU，至少2×107TU，至少3×107，至少4×107TU，或者至少5×107TU。在挑选的间期，使用受体淋巴器官的DCs检测表达，例如，通过观察标志物的表达，例如GFP或者荧光素酶。检测来自病毒治疗受体的淋巴结和脾脏的T细胞对抗原刺激应答的大小和持续时间。可以分析DCs之外的组织细胞(例如上皮细胞和淋巴细胞)中体内基因输送的特异性。
受到广泛认同的最有效结束AIDS流行(或其他病毒性疾病)的方法是免疫接种。到目前为止，没有针对HIV的免疫方法能够成功的进入临床III期。因此，迫切的需要新的有效的免疫接种策略。在本发明的一些实施方案中，使用DC免疫接种。将编码病毒蛋白的基因(例如上面提到过的)克隆入病毒载体。用包含靶向分子(结合DCs上的DC-SIGN)的病毒感染患者，所述病毒优选的具有特异性以避免不良副作用。靶向分子可以是，例如，改造的辛德巴斯病毒包膜糖蛋白，并且可以例如通过注射施用病毒。在动物模型中，通过尾静脉注射，使用分子克隆的HIV报告病毒(NFNSZ-r-HSAS，NL-r-HSAS)和临床分离物攻击动物。可以随时间监测脾细胞，淋巴结和外周血中的感染证据。可以使用HIV-gag蛋白的PCR和报告病毒中HAS的FACS检测病毒的整合和复制。有效的原位DC免疫可以增加对HIV攻击的抵抗力。参见实施例17-20
在一些实施方案中，提供本文描述的转导重组病毒的树突状细胞用来预防或治疗疾病或者病症。在优选的实施方案中，树突状细胞表达所需免疫应答针对的抗原。通常所述抗原在树突状细胞中一般不表达，但在靶细胞用包含多核苷酸(编码抗原)的重组病毒转导之后表达。在一些实施方案中，树突状细胞还表达通过如本文所述的重组病毒导入树突状细胞的DC成熟因子。
在本发明的一些方面，将佐剂和本发明的重组蛋白共同施用。佐剂可以和重组病毒一起使用，或者在重组病毒之前使用，或者在重组病毒之后使用。
很多种类的佐剂可以和重组病毒一起使用来诱发针对重组病毒编码的抗原的免疫应答。优选的佐剂增强针对抗原的内在免疫应答，而不会引起影响应答性质的抗原构象变化。优选的佐剂包括明矾，3De-O-酰化单磷酰脂A(MPL)(参见GB2220211)。QS21是三萜烯葡萄糖苷或者从南美洲皂荚树树皮提取的皂角苷(参见Kensil et al.，Vaccine Design：The Subunit and Adjuvant Approach(eds.Powell&Newman，Plenum Press，NY，1995)；美国专利号5,057,540)。其他佐剂是水包油型乳剂(例如角鲨烯或者花生油)，任选的和免疫刺激物结合在一起，例如单磷酰脂A(参见Stoute et al.，N.Engl.J.Med.336，86-91(1997))。另一种佐剂是CpG(Bioworld Today，Nov.15，1998)。可以选择的，将Aβ与佐剂偶联。例如，就像关于乙型肝炎抗原免疫描述的那样(Livingston，J.Immunol.159，1383-1392(1997))，将棕榈酸或其他脂与Aβ的N-端直接偶联，制备Aβ的脂肽形式。但是，这种偶联应该基本上不改变Aβ的构象，从而不影响其免疫应答的性质。佐剂可以作为包含活性剂的治疗组合物的组分施用，或者单独的在治疗试剂使用之前，同时或者之后使用。
优选的一类佐剂是铝盐(alum)，例如氢氧化铝，磷酸铝，硫酸铝。这样的佐剂可以与或不与其他特异免疫刺激剂一起使用，所述免疫刺激剂例如MPL或者3-DMP，QS21，氨基酸的单体或聚合物例如多聚谷氨酸或多聚赖氨酸。另外一类佐剂是水包油型乳剂。这样的佐剂可以与或不与免疫刺激剂一起使用，所述免疫刺激剂诸如胞壁酰肽(例如，N-乙酰基胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷酰胺(thr-MDP)，N-乙酰基-非胞壁酰-L-内氨酰-D-异谷酰胺(非-MDP)、N-乙酰基胞壁酰-L-内氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(r-2′二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰基氧)-乙胺(MTP-PE)，N-乙酰基葡糖胺-N-乙酰基胞壁酰-L-Al-D-isoglu-L-Ala-二棕榈酰丙胺(DTP-DPP)theramideTM)或者其他细菌细胞壁组分。水包油型乳剂包括(a)MF59(WO90/14837)，含有5％角鲨烯，0.5％吐温80，和0.5％Span85(任选的包括各种量的MTP-PE)，用微流化器诸如Model HOY微流化器(Microfiuidics，NewtonMA)制成亚微粒。(b)SAF，包含10％角鲨烷，0.4％吐温80，5％pluronic-封闭聚合物L121，和thr-MDP，既可以微流化成为亚粒子乳剂也可以搅拌产生更大粒子的乳化剂，和(c)RibiTM佐剂系统(RAS)，(Ribi Immunochem，Hamilton，MT)包含2％角鲨烯，0.2％吐温80，和一个或多个细菌细胞壁组分，选自单磷酰脂A(MPL)，二霉酸海藻糖(TDM)，和细胞壁骨架(CWS)，优选是MPL+CWS(DetoxTM)。另外一类优选的佐剂是皂角甙佐剂，例如StimulonTM(QS21，Aquila，Worcester，MA)或者从其产生的粒子例如ISCOMs(免疫刺激复合物)和ISCOMMATRIX。其他佐剂包括弗氏完全佐剂(CFA)和弗氏不完全佐剂(IFA)。其他佐剂包括细胞因子，例如白介素(IL-1，IL-2和IL-12)，巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)，肿瘤坏死因子(TNF)。
佐剂可以和本发明的重组病毒作为单一组合物施用，或者可以在施用本发明的重组病毒之前，同时或之后施用。免疫原和佐剂可以包装在相同的病毒中，或者包装在不同的病毒中并在使用前混合。免疫原和佐剂通常与标明指定治疗应用的标签一起包装。如果免疫原和佐剂是单独包装的，则所述包装通常包括指导使用前混合的说明书。佐剂和/或载体的选择取决于包含佐剂的疫苗的稳定性，施用途径，剂量安排，在接受接种的物种体内佐剂的效果，并且对人来说，药学上可接受的佐剂是相关管理机构批准给人施用的佐剂。例如，弗氏完全佐剂不适用于人的施用。明矾，MPL和QS21是优选的。任选的，两个或多个不同的佐剂可以一起使用。优选的组合包括明矾和MPL，明矾和QS21，MPL和QS21，以及明矾、QS21和MPL一起使用。还可以使用弗氏不完全佐剂(Chang et al.，Advanced Drug Delivery Reviews 32，173-186(1998))，任选的与明矾、QS21和MPL中的任一种组合，以及其全部组合。
药物组合物和试剂盒
本文还涉及药物组合物和试剂盒，包含本文提供的重组病毒和一种或多种组分。药物组合物可以包括本文提供的重组病毒和药物载体。试剂盒可以包括药物组合物和/或本文提供的组合，以及一种或多种组分，例如使用说明书，以及将化合物给药受试者的装置。
本文涉及包含本文提供的病毒和合适药物载体的药物组合物。本文提供的药物组合物可以采用不同形式，例如，固体，液体，粉末，水性的，或者低压冻干的形式。合适药物载体的实例是本领域公知的。这种载体和/或添加剂可以通过常规方法制备，可以采用合适的剂量给药受试者。稳定剂诸如脂质，核酸酶抑制剂，聚合物和螫合剂可以防止组合物在体内降解。
本文提供的重组病毒可以被包装为试剂盒。试剂盒可以任选的包括一个或多个组分，例如使用说明书，装置，和其他试剂，以及组件，例如试管、容器和注射器。典型的试剂盒可以包括本文提供的病毒，并且可以任选的包括使用说明书，检测受试者中病毒的装置，将病毒给药受试者的装置，以及将化合物给药受试者的装置。
本文还涉及包括编码感兴趣基因(通常是抗原)的多核苷酸的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒至少包括一个编码病毒包装组分的质粒和编码靶向分子(被改造为优选特异性结合树突状细胞)的载体。在一些实施方案中，试剂盒包括至少一个编码病毒包装组分的质粒，编码靶向分子(被改造为结合树突状细胞)的载体，以及编码至少一种DC成熟因子的载体。
本文还涉及包含编码感兴趣基因(通常是抗原)，和任选的，编码DC成熟因子的多核苷酸序列的病毒载体。在一些实施方案中，试剂盒包括至少一个编码病毒包装组分的质粒和编码靶向分子(被改造为结合树突状细胞)的载体。
在一个实施例中，试剂盒可以包含说明书。说明书通常包括明确表述，描述病毒和，任选的，试剂盒包括的其他组分，以及给药方法，包括确定受试者准确状态的方法，用于给药病毒的正确给药剂量和正确给药方法。说明书还可以包括在治疗的过程中监测受试者的指导。
本文提供的试剂盒还可以包括将病毒给药受试者的装置。任何本领域已知的用于施用药物或疫苗的装置都可以包括到本文提供的试剂盒中。典型的装置包括，但不限于，皮下注射针，静脉注射针，导管，无针注射装置，吸入器，和液体分配器，例如滴管。通常，试剂盒中给药病毒的装置应该和试剂盒中的病毒兼容；例如，无针注射装置诸如高压注射装置可以和不会因高压注射受损的病毒一起包含在试剂盒中，但是一般不和会被高压注射损坏的病毒一起包括在试剂盒中。
本文提供的试剂盒还包括将化合物(例如DC活化剂或者刺激剂)给受试者施用的装置。任何本领域已知的将药物给受试者施用的装置都可以包括在本文提供的试剂盒中。典型的装置包括皮下注射针，静脉注射针，导管，无针注射装置，但是并不限于，皮下注射针，静脉注射针，导管，无针注射装置，吸入器，和液体分配器例如滴管。试剂盒中用来给药化合物的装置通常会和化合物给药需要的方法兼容。
提供下列实施例仅仅是为说明目的，并不是想以任何方式限制本发明的范围。实际上，除在本文显示和描述的那些之外，本发明的多种改变根据上述的说明书对于本领域技术人员将变得显而易见，并落入所附权利要求的范围。
本说明书引用的全部专利和文献在此整体引入作为参考。
实施例1
DC特异性靶向分子的改造
慢病毒载体能够被合理的改造为使它们能够以细胞特异性的方式转导DCs。某些DCs亚群在表面含有DC-SIGN蛋白(Geijtenbeek，T.B.，et al.2000；Geijtenbeek，T.B.，et al.2000，上文)，这是一种C型凝集素样受体，能够快速结合并且内吞一些材料(Geijtenbeek，T.B.，et al.2004，上文)，其可以用作DCs的靶向受体。辛德巴斯病毒(SV)--甲病毒属和披膜病毒家族的成员--可以通过DC-SIGN(Klimstra，W.B.，et al.2003.J.Virol.77：12022-12032，其在此整体引入作为参考)感染DCs。然而，SV实验室株的典型病毒受体是细胞表面硫酸乙酰肝素(HS)，其在很多细胞类型中表达(Strauss，J.H.，et al.1994.Arch.Virol.9：473-484；Byrnes，A.P.，和D.E.Griffin.1998.J.Virol.72：7349-7356，其各自在此整体引入作为参考)。利用SV包膜糖蛋白(此后称为SVG)上两个受体结合位点物理分隔的优点，受体被改造为不结合其典型的结合靶分子HS，但完整保留其与DC-SIGN相互作用的能力(图1)。一旦它被整合到病毒表面，这个突变糖蛋白就能够介导DCs而不是其它细胞的感染。
从加州理工学院J.H.Strauss博士的实验室获得野生型SVG的cDNA，并将其通过PCR的方法克隆入pcDNA3载体(Invitrogen)以产生质粒pSVG。通过PCR诱变将10-残基标签(MYPYDVPDYA)序列插入E2蛋白的氨基酸71和74之间，以破坏HS结合位点(Karavans，G.，et al.1998.Crit Rev Oncol Hemat28：7-30；Lavillete，D.，et al.2001.Curr Opin Biotech 12：461-466；Russell，SJ.和F.L.Cosset.1999.J Gene Med 1：300-311；Sandrin，V.，et al.2003.Curr Top Microbiol 281：137-178；Verhoeyen，E.和F.L.Cosset.2004.J Gene Med 6：S83-S94，其各自在此整体引入作为参考)。抗所述插入标签序列的现有抗体能够监测修饰SCG的表达。为进一步降低HS-特异性感染，鉴定出参与结合HS分子的数个关键残基(Coffin，J.M.，et al.1997.Retroviruses.NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press；Battini，J.L.，et al.1998.J Virol 72：428-435；Valsesiawittmann，S.，et al.1994.J Viro 168：4609-4619；Wu，B.W.，et al.2000.Virology 269：7-17；Cosset，F.L.，et al.1995.J Viro 169：6314-6322；Kayman，S.C.，et al.1999.J.Viro 173：1802-1808；Lorimar，I.A.J.and SJ.Lavictoire.2000.J ImmunolMethods 237：147-157；Barnett，A.L.，et al.2001.Proc Nat Acad Sci USA98：4113-4118；Benedict，C.A.，et al.2002.Hum Gene Ther 10：545-557；Gollan，TJ.and M.R.Green.2002.J Virol 76：3558-3563，其各自在此整体引入作为参考)。将两个这样的残基突变为丙氨酸(157KE158到157AA158)。
向SVG的E3糖蛋白引入额外的缺失，以去除氨基酸61-64。这个经过修饰的SVG被称为SVGmu(SEQ ID NO：11)。将SVGmu的cDNA克隆到pcDNA 3载体中CMV启动子的下游(被称为pSVGmu，SEQ ID NO：3)。
实施例2
含有DC特异性靶向分子的重组病毒的制备
利用慢病毒载体FUGW(SEQ ID NO：1)或其衍生物，编码gag、pol和rev基因的包装构建体，以及pSVGmu(实施例1)，通过标准磷酸钙介导的293T细胞瞬时转染，制备重组SVGmu-假型慢病毒。FUGW是自灭活型慢病毒载体，载有人泛素C启动子以驱动GFP报告基因的表达(Lois，C，et al.2002.Science 295：868-872，其在此整体引入作为参考)。这些研究中使用的慢病毒转染载体(FUGW和其衍生物)是以HIV为基础的第三代慢病毒载体，其中大部分3′LTR的U3区已经缺失，导致自灭活的3′-LTR(SIN)。
为进行293T细胞的瞬时转染，用合适的慢病毒转移载体质粒(5μg)，以及包膜质粒(SVG，SVGmu，Eco或VSVG)和包装质粒(pMDLg/pRRE和pRSV-Rev)各2.5μg转染在6-厘米组织培养皿(Corning或者BD Biosciences)中培养的293T细胞。在转染后48和72小时收集病毒上清，用0.45-μm的过滤器(Corning)过滤。为制备体内研究用的浓缩病毒载体，将病毒上清进行超速离心(Optima L-80K制备型超速离心，Beckman Coulter)50,000xg 90分钟。然后将沉淀悬浮在合适体积的冷PBS中。
产生的用SVGmu假型的病毒此后被称为FUGW/SVGmu。包裹野生型SVG糖蛋白的对照病毒此后被称为FUGW/SVG。
实施例3
包装重组病毒的共聚焦成像
除使用FUW慢病毒载体(其不包含GFP报告基因)和不同的编码GFP-vpr的质粒(2.5μg)之外，如实施例2所述制备GFP-vpr标记的慢病毒载体。将新鲜的病毒上清铺在六孔细胞培养板中包裹多聚赖氨酸的盖玻片上，利用SorvallLegend RT离心机在3,700xg 4℃离心2小时。盖玻片用冷的PBS冲洗两次，然后用抗-HA生物素抗体(Miltenyi Biotec)和Cy5链霉亲和素(Invitrogen)免疫染色。用装有针对荧光素和Cy5的滤波器组的Zeiss LSM 510激光扫描共聚焦显微镜进行荧光成像。使用平场复消色差油浸物镜(63×/1.4)成像。
图2显示按照所述实验步骤制备的重组病毒的共聚焦成像结果。(比例尺表示2μm。)″GFP″载玻片上的颗粒被染成绿色，″SVGmu″载玻片上的颗粒被染成红色，而对″Merged″载波片上的颗粒来说，当只有GFP表达时被染成绿色，只有SVGmu表达时是红色，GFP和SVGmu均表达时是黄色或者橙黄色。超过90％的GFP标记的颗粒包含SVGmu。因此，展示SVGmu的慢病毒颗粒的产生能够通过共聚焦成像来确认。
实施例4
DC-SIGN细胞系的制备
为促进靶向转导的研究，构建表达人DC-SIGN(此后被称为293T.hDCSIGN)和小鼠DC-SIGN(此后被称为293T.mDCSIGN)的DC-SIGN细胞系。用VSVG假型慢病毒稳定转染亲代293T细胞，产生293T.hDCSIGN和293T.mDCSIGN细胞系。从质粒pUNO-hDCSIGN1Aa和pUNO-mDCSIGN(InvivoGene)扩增人DC-SIGN和小鼠DC-SIGN的cDNAs，并将它们克隆入慢病毒质粒FUW中人泛素C启动子的下游序列，分别产生FUW-hDCSIGN(SEQ ID NO：5)和FUW-mDCSIGN(SEQ ID NO：6)。所述慢病毒载体用VSVG假型，并转导293T细胞。得到的细胞用于抗体染色(来自BD Biosciences的抗-人DC-SIGN抗体和来自Bioscience的抗-小鼠DC-SIGN)和细胞分选，得到DC-SIGN+293ThDCSIGN和mDC-SIGN+293TmDCSIGN细胞系的均一群。
流式细胞分析表明DC-SIGN在几乎所述细胞系的全部293T.hDCSIGN和293T.mDCSIGN细胞中表达(图3A)。在每个图表中，实线(未填充的区域)代表293TDC-SIGN细胞系中DC-SIGN的表达，阴影区域代表未转导293T细胞的背景染色。
实施例5
通过DC-SIGN细胞系的转导评估DC-SIGN特异性重组病毒
为评估FUGW/SVG或FUGW/SVGmu(实施例2)的转导效率和特异性，用病毒转染293T.hDCSIGN和293T.mDCSIGN细胞系(实施例4)。通过细胞系中GFP的表达测量转染效率。
将靶细胞(293T.hDCSIGN，293T.mDCSIGN，或293Tcells；0.2×106每孔)接种到24孔细胞培养皿(Corning或BD Biosciences)中，并通过Sorvall Legend离心机利用病毒上清(1ml每孔)在2,500rpm 30℃条件下旋转感染90分钟。随后，用新鲜的培养基取代上清，并在37℃5％CO2的条件下孵育3天。使用流式细胞仪测量GFP+细胞的百分比。通过显示线性反应的稀释范围确定转染滴度。
流式细胞分析表明FUGW/SVG(包含野生型SVG包膜糖蛋白)对三个靶细胞系(293T，293T.hDCSIGN和293T.mDCSIGN)具有相似的转导效率(11-16％转导)(图3B)。这表明SVG具有广泛的特异性，并且细胞表面DC-SIGN的存在并不会明显的改变SVG-假型慢病毒载体的转导能力。相反，FUGW/SVGmu载体(包含突变型SVG包膜糖蛋白)能够分别以42％和34％的转导率特异性转导293T.hDCSIGN和293T.mDCSIGN细胞，但是不能转导293T细胞(图3B)。这些结果表明展示SVGmu的假型慢病毒载体可以特异性的转导表达人或者小鼠DC-SIGN的细胞。此外，突变型SVG转导DC-SIGN-表达细胞的效率高于野生型SVG。
通过PCR分析GFP报告基因的基因组整合，证实转导细胞中FUGW慢病毒载体的稳定整合。为证明所述特异性转导是由DC-SIGN介导的，在FUGW/SVGmu病毒上清接触293T.hDCSIGN细胞前，向病毒上清中添加可溶性抗人DC-SIGN抗体，降低了转导效率(数据未显示)。针对293T.mDCSIGN的FUGW/SVGmu的特定滴度估计是1×106TU(转导单位)/ml。针对293T.hDCSIGN的FUGW/SVGmu的特定滴度估计是1-2×106TU/ml。
实施例6
重组病毒的体外评估
为研究改造的慢病载体转导表达DC-SIGN的树突状细胞(DCs)的特异性，从小鼠分离全骨髓(BM)细胞，并直接用FUGW/SVGmu病毒载体转导(实施例2)。将从BM培养物中生长的祖细胞产生小鼠DCs的方法进行改造，用于本实验(Buchholz，CJ.，et al.1998.Nat Biotech 16：951-954，其在此整体引入作为参考)。
全骨髓细胞从B6雌鼠(Charles River Breeding Laboratories)中收集，按照他处所述的方法(Yang，L.and D.Baltimore.2005.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：4518-4523，其在此整体引入作为参考)制备BMDCs。将全BM细胞或者BMDCs种于24孔培养皿中(2×106个细胞每孔)，并通过Sorvall RT7离心机利用病毒上清(1ml每空)在30℃ 2,500rpm条件下旋转感染90分钟。在旋转后，去除上清，用添加10％FBS和GM-CSF的新鲜RPMI培养基(1∶20J558L条件培养基)取代。培养细胞三天，并用流式细胞仪分析GFP的表达。
用FUGW/SVGmu病毒载体或者对照载体直接转导从小鼠分离的BM细胞。作为对照，使用单嗜性小鼠白血病病毒糖蛋白(Eco)-包裹的慢病毒载体(FUGW/Eco)；包裹Eco的载体可以广泛特异性转导啮齿目动物细胞。感染三天后，转染效率可以通过流式细胞仪检测(图4A)。在混合BM培养物中，大概有9％的细胞是DCs(可以通过CD11c的表达来表明)，其中大部分(将近80％)是DC-SIGN高表达的(数据未显示)。观测到经FUGW/SVGmu转导时，12％的全BM细胞是GFP阳性的(GFp+)(图4A)。当对GFP+细胞设门时，观察到将近95％的转导细胞是DC-SIGN和CD11双阳性的(DC-SIGN+CD11c+)，表明FUGW/SVGmu特异性的转导表达DC-SIGN的DCs而不是骨髓中其他细胞类型。相反，尽管在接触FUGW/Eco后68％的全BM细胞是GFP阳性的，只有9％的转导细胞是DCs，其中6.5％是DC-SIGN+。
通过Alu PCR分析(Butler，S.L.，et al.2001.Nat.Med.7：631-634，其在此整体引入作为参考)慢病毒骨架LTR的基因组整合，确认FUGW/SVGmu的稳定转导。另外，用FUGW/SVGm转导取自小鼠脾的原代T和B细胞，检测到确实没有转染(图4B)，表明显著的转导特异性。
还检测载有SVGmu的慢病毒载体转导体外培养的骨髓(BM)来源的DCs(BMDCs)的效率。骨髓(BM)-来源的DC(BMDCs)可以用上文所述方法获得，在粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)存在的情况下培养细胞6天。细胞然后接触FUGW/SVGmu或者FUGW/Eco慢病毒载体。转导3天后BMDCs细胞的流式细胞分析表明FUGW/Eco转导CD11c+DCs(33％)和CD11c+细胞(7.6％)(图5)，这和Eco的广泛取向性是一致的。相反，FUGW/SGVmu只转导CD11c+DCs(32.7％)，而在CD11c-细胞中未检测到GFP+细胞(图5)，表明FUGW/SVGmu可以特异性改变BMDCs。
因此这些结果综合起来证明改造的载有SVGmu的重组慢病毒载体能够在体外特异性转导DCs，以及所述靶向转导和DCs细胞表面DC-SIGN的表达有关。
实施例7
重组病毒体外活化树突状细胞的效果
进一步检测重组慢病毒来确定它是否能够特异性靶向、转导和活化DCs成为成熟的DCs。检测接触重组病毒的DCs中共刺激分子B7.2(CD86)和MHC II型分子I-Ab的表面上调，这被认为是DC活化的信号(Steinman，R.M.，et al.2003.Annu.Rev.Immunol.21：685-711，其在此整体引入作为参考)。如实施例6所述，制备BMDCs并用FUGW/SVGmu感染。也可以加入浓度为1μg/ml的LPS过夜，进一步活化转导的BMDCs。
转导后三天BMDCs的流式细胞分析结果显示，与GFP阴性DCs相比，用FUGW/SVGmu处理提高GFP阳性DCs上DC活化标志物(CD86和I-Ab)的表达(图6，顶栏)。阴影部分指示GFP阴性(未转导)细胞，而实线(空白区)指示GFP阳性(转导的)细胞。观察到，BMDCs的靶向转导与脂多糖(LPS)处理联用可以促使DCs的进一步成熟(图6，底栏)。这表明靶向转导既可以单独起作用，也可以和其他DC成熟因子组合以诱导DC活化。
实施例8
重组病毒对树突状细胞的体内靶向
这个方法能否用来作为免疫的证据可以通过体内试验来检测。为检测载有SVGmu的改造慢病毒载体是否能够在体内靶向DCs，将重组和浓缩的慢病毒载体FUGW/SVGmu(50×106TU，悬浮在200μl PBS)皮下注射到C57BL/6雌性小鼠(B6，Charles River Breeding Laboratories)的左肋靠近腹股沟淋巴结的位置(在1厘米范围内)。注射3天后，分离左股沟淋巴结和对侧相应淋巴结，测量大小。从这些淋巴结收集细胞并计算它们的总数。通过抗-CD11c抗体(BD Biosciences)染色对细胞进行流式细胞分析，检测GFP+DCs的百分比。
在第三天观察到，与对侧相应淋巴结或未感染小鼠的淋巴结(图7B)相比，临近注射位点的左侧腹股沟淋巴结有明显的增大(图7A，左图)，而且这个淋巴结中细胞的数量增加超过10倍。这表明载体施用能够增强附近淋巴结中淋巴细胞的运输和增殖。
流式细胞分析表明左侧腹股沟淋巴结细胞中总CD11c+细胞的大约3.8％是GFP+DCs(图7C)，其看起来是从注射位点迁移的。这被认为是一次皮下注射载体后的明显效果，表明重组病毒在体内有效的感染DCs。
实施例9
重组蛋白在体内转导特异性的评估
为检测DC靶向的慢病毒载体在体内的特异性，可以构建编码萤火虫荧光素酶的慢病毒载体。萤火虫荧光素酶的cDNA可以从pGL4.2LucP(Promega)扩增，并被克隆入FUGW(Lois，C.et al.2002.上文)以取代GFP，产生构建体Flue(SEQID NO：4)(图22A)。然后通过生物荧光成像(BLI)的标准方法，利用荧光素酶报告基因显示组织细胞中的体内转导。
将重组慢病毒载体(此后被称为Fluc/SVGmu)注射入鼠的左肋。在另一只鼠中，注射用疱疹性口炎病毒糖蛋白假型的慢病毒载体(此后被称为Fluc/VSVG)作为非特异性载体对照。然后利用BLI非侵入性的对用载体处理的小鼠成像。Fluc/VSVG处理小鼠在注射部位具有强大和持久的信号，表明非特异性组织被转导表达荧光素酶(图22B)。这和VSVG包裹的病毒具有广泛的特异性这一事实相一致。相反，在Fluc/SVGmu处理小鼠的注射部位没有检测到明显的信号(图22B)，表明载有SVGmu的慢病毒载体具有相对严格的靶向特异性。在目标小鼠中一直没有检测到荧光信号，可能是因为DCs的稀少和分散分布，这超出了现有BLI方法的灵敏度。
一个月后，注射Fluc/SVGmu的小鼠接受通过定量RT-PCR进行的生物分布分析，在所有分离的器官(心，肝，脾，肾，性腺，肺，皮肤，淋巴结)中都没有观察到慢病毒载体的可检测拷贝，证明动物中没有非特异性的感染，因此证实了靶向载体对DCs的特异性。
实施例10
重组病毒的体外抗原输送
为检测重组慢病毒载体对DCs的靶向转导是否能够有效输送抗原基因到DCs，从而刺激抗原特异性的CD8+和CD4+T细胞应答，构建表达模式抗原(鸡卵清蛋白(OVA))的慢病毒载体。在C57BL/6J(B6)小鼠中，OVA是被良好表征的靶抗原，其针对CD8+T-细胞的受体OT1(它特异性结合OVA257-269(称为OVAp)，和针对CD4+T-细胞受体OT2(它特异性结合OVA323-339(称为OVAp*)(Yang，L.and D.Baltimore.2005.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：4518-4523，其在此整体引入作为参考)。表达OVA的慢病毒载体(FOVA(SEQ ID NO：2)，图8，顶部)是通过用鸡血清蛋白的cDNA取代GFP，从FUGW(图8，底部)构建得到的。
在培养第6天，用重组慢病毒载体FOVA/SVGmu或者对照重组慢病毒FUGW/SVGmu(编码无关报告基因GFP)转导BMDCs(实施例6)。第六天的BMDCs用病毒上清旋转感染，再培养3天。在第9天，收集没有附着的细胞，并在含有10％FBS、GM-CSF和1μg/ml LPS(Sigma)的RPMI培养基(1∶20J558L条件培养基)中重新培养。在第10天，收集细胞用来进行T细胞刺激。根据用于转导的慢病毒载体，被修饰的BMDCs被称为DC/FOVA和DC/FUGW。
同时，从没有转导的第9天BMDC培养物中收集没有附着的细胞，然后在相同的培养基(RPMI，包含10％FBS、GM-CSF和LPS)中重新培养。在第10天，收集细胞并加载OVAp(OVA2S7-269，被OT1T-细胞受体特异性结合，此后被称为DC/OVAp)或OVAp*(OVA323-339，被OT2T-细胞受体特异性结合，此后被称为DC/OVAp*)，并且当作T细胞刺激的阳性对照。为了检测载体转导的BMDCs加工和递呈转基因OVA抗原的能力，收集OT1和OT2转基因小鼠的脾细胞，并和慢病毒载体转导的BMDCs或者加载OVAp或者OVAp*的BMDCs一起按指定比例培养。三天后收集上清，用ELISA分析IFN-γ生成，并收集细胞用流式细胞仪分析它们的表面活化标志物。利用[3H]胸腺嘧啶掺入法分析T细胞的增殖。
用不同比例的DC/FOVA和转基因T细胞共培养三天后，通过测量IFN-γ的释放(图10A)和T细胞的增殖(图10B)，显示OT1T细胞应答强烈。就如预期的那样，使用DC/FUGW没有检测到明显的OVA应答(图10A和10B)。还观察到，对于OT1T细胞应答的刺激来说，OVA的转基因表达甚至比肽加载更有效，这和以下观点一致，即MHC I型更喜欢递呈内生肽。流式细胞分析表明在用DC/FOVA或者DC/OVAp刺激后，活化的OT1T细胞表现出典型的效应细胞毒性T细胞表型(CD25+CD69+CD62L低CD44高)(图9)。
当DCs和OT2CD4+T细胞共培养时，还观察到T细胞活化，这由表面标志物的变化(图11)和IFN-γ的生成(图12)指示。然而，CD4+细胞的刺激不如CD8+细胞的刺激细胞那么明显，可能是由于对MHCII型分子来说递呈内源性抗原肽的效率较低。通过改变OVA抗原的细胞定位，使其指向MHC II型递呈途径，实现对CD4刺激的增强，其甚至优于肽激发的DCs(数据未显示)。
这些结果表明通过慢病毒载体感染的DCs靶向能够有效地将抗原输送到DCs并且刺激CD8+和CD4+T细胞应答。
实施例11
重组病毒的体内抗原输送
为检测用慢病毒载体靶向的DCs是否能够在体内活化抗原特异性T细胞，使用将T细胞受体(TCR)基因转入小鼠造血干细胞(HSCs)的方法在小鼠中产生抗原特异性和TCR-改造的T细胞，如其它地方所述(Yang，L.and D.Baltimore，D.2005.上文)。构建共表达OT1TCRα和TCRβ以及GFP标志物的顺反子逆转录病毒载体MIG-OT1(图13A)。
简单来讲，用250μg的氟脲嘧啶(Sigma)处理B6雌性小鼠(Charles RiverBreedling Laboratories)。五天后，从胫骨和股骨收集富含HSCs的骨髓(BM)细胞，并在含有BM培养基(RPMI，包含10％FBS，20ng/ml rmIL-3,50ng/ml rmIL-6和50ng/ml rmSCF(Pepro Tech))的24孔培养皿(2×106细胞每孔)中培养。在培养的第1天和第2天，细胞用MIG-OT1逆转录病毒载体(用Eco假型)(2ml病毒上清每孔)在2,500rpm和30℃条件下旋转感染90分钟。每次旋转后，去除病毒上清，用新鲜的BM培养基替换。在第3天，收集转导的BM细胞，并将其移植到接受1,200rads全身辐射的B6受体小鼠。移植8周后，使用小鼠进行体内免疫研究。每只小鼠接受一次剂量的皮下注射，为10×106TU靶向慢病毒载体。七天后，收集脾脏和淋巴结细胞，用流式细胞术分析OT1T细胞的存在和它们的表面活化标志物。
移植八周后，对重建小鼠外周T细胞的分析显示大概5％的CD8+T细胞是GFP+OT1+(图13B)。一些重建小鼠通过皮下注射相同剂量(10×106TU)的FOVA/SVGmu(实施例10)或者FUGW/SVGmu(实施例2)进行免疫。7天后收集外周淋巴器官的GFP+OT1+T细胞进行分析，表明与对照小鼠(其没有被免疫或者没用FUGW/SVGmu免疫)相比，利用FOVA/SVGmu的靶DC免疫使OT1T细胞数量加倍(图14B)。来自FOVA/SVGmu免疫小鼠的GFP+OT1+ T细胞表现出效应记忆表型(CD69低CD62高CD44高)，表明这些细胞已经进行了有效的免疫应答(图14A)。
这些结果表明，载有表面SVGmu的重组慢病毒载体可以在体内靶向DCs，从而有效的刺激抗原特异性T细胞并诱导强烈的免疫应答。
实施例12
通过重组病毒的直接施用诱导体内CTL和抗体应答
通过将靶向慢病毒载体给药未感染的野生型小鼠，研究体内DC靶向诱导抗原特异性CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答和抗体应答的效率。
在右肋给野生型B6小鼠(Charles River Breeding Laboratories)单次皮下注射指定剂量的靶慢病毒载体(50×106TU FUGW/SVG或FOVA/SVGmu)。在免疫后第7天和第14天，从免疫小鼠的尾部采集血液，用ELISA的方法测量血浆抗-OVA IgG。在第14天，收集脾脏和淋巴结细胞，并利用流式细胞术分析OVA-特异性T细胞的存在以及它们的表面活化标志物。
通过测量细胞因子分泌和四聚体染色，检测OVA-特异性T细胞的存在。在注射后第14天，分析从外周淋巴器官收集的T细胞。靶向未感染DCs的慢病毒载体能够在淋巴结(数据未显示)和脾脏(图23)中引发OVA-反应性CD8+T细胞。施用单次剂量的重组FOVA/SVGmu足以产生CD8+T细胞，其在OVAp再刺激时被激发分泌IFN-γ(图23)。对照载体FUGW/SVGmu的施用不能产生任何OVAp-特异性的应答(图23)。为进一步评估应答强度，通过MHC I型四聚体染色检测OVAp-特异性CD8+T细胞。单次剂量注射后收获高频率的OVAp-特异性T细胞(＞6％)(图15)；用FUGW/SVGmu处理的小鼠中没有检测到四聚体阳性的细胞(图15)。依据四聚体定量获得的数据和用细胞内IFN-γ染色分析得到CD8+效应细胞的数据相一致(图23)。这些OVAp-阳性T表型分析显示这些细胞表现出效应记忆性T细胞(CD25低CD69低CD62L高CD44高)的表面特征(图17A)。
为研究慢病毒施用的剂量反应，皮下注射剂量范围从100×106TU到3×106TU的FOVA/SVGmu，注射14天后测量脾脏中OVAp特异性T细胞的数量。在剂量为100×106TU的时候检测到异常高频率(12％)的OVAp-特异性CD8+T细胞(图16A)。OVAp-特异性细胞的百分比与施用重组病毒的数量成正比(图16B)。在测试的剂量中并没有达到剂量反应的平台期，说明通过增加注射的载体数量和/或提高注射频率可以获得进一步的增强。
此外，在用FOVA/SVGmu(50×106TU)免疫后第7天和第14天检测小鼠中对OVA特异的血清IgG水平。IgG血清滴度在第7天是1∶10,000，在第14天是1∶30,000(图17B)。对于没有其他佐剂或其它刺激物的单剂量注射来说这是一个让人印象深刻的抗体应答，表明靶向慢病毒载体免疫也可以引发B细胞显著分泌抗原特异性抗体。
这些结果表明，DC靶向型慢病毒载体的体内施用能够引发针对所输送抗体的细胞和体液免疫应答。
实施例13
抗肿瘤免疫的产生：预防性保护
评价体内施用DC靶向型慢病毒载体后产生的抗肿瘤免疫应答。使用以OVA为肿瘤抗原的E.G7肿瘤模型(Wang，L.and D.Baltimore.2005.上文)
使用肿瘤细胞系EL4(C57BL/6J，H-2b，胸腺瘤)和E.G7(稳定表达一个鸡OVAcDNA拷贝的EL4细胞)进行小鼠的肿瘤攻击。在肿瘤保护实验中，将50×106TU的靶向型慢病毒载体(FOVA/SVGmu或FUGW/SVGmu)单次注射到B6小鼠(CharlesRiverBreeding Laboratories)的右肋。两周以后，5×106EL4或E.G7被皮下注射到小鼠的左肋。用精确的测径器隔天测量肿瘤大小，结果显示为两个最大的垂直直径a×b(mm2)。当肿瘤到达400mm2的时候杀死小鼠。
50×106TU的FOVA/SVGmu免疫能够完全保护小鼠受到E.G7肿瘤攻击(图18，左)，如果小鼠接受的是缺少OVA转基因的慢病毒载体的模拟疫苗，肿瘤就会迅速生长(图18，左)。这种保护是OVA-特异性的，因为免疫小鼠长出对照EL4肿瘤(缺少OVA的表达)(图18，右)，与用于免疫的慢病毒载体无关。
实施例14
抗肿瘤免疫的产生：肿瘤治疗
评价体内施用DC靶向型慢病毒载体后产生的抗肿瘤免疫应答，其中在施用慢病毒载体前先导入肿瘤细胞。在“治疗性免疫”试验中，肿瘤注射和慢病毒载体施用的相对实施例13是颠倒过来的，以便检测建立的肿瘤是否能够被消除。因此，用表达萤火虫荧光素酶基因(E.G7.1uc)的E.G7肿瘤细胞攻击小鼠，这样可以用BLI密切关注活体动物体内肿瘤的生长动力学。为便于成像，使用的是B6小鼠的白化株(The Jackson Laboratory)。这些小鼠缺少色素沉着，因此对荧光信号具有低的背景吸收。给这些小鼠注射100×106TU的FOVA/SVGmu(实施例10)，显示与在典型B6小鼠(图21)中观察到的相似应答。将E.G7.luc肿瘤细胞(5×106)皮下移植到白化B6小鼠体内。肿瘤攻击后第3天和第10天，小鼠用通过皮下注射FOVA/SVGmu(50×106TU每只鼠每次)免疫两次。实验重复三次，得到代表性的实验结果见图19和20。
接受DC靶向型慢病毒载体免疫的小鼠从第9天开始表现出肿瘤生长的衰退，随后是肿瘤消退，在第11天的时候荧光降低到检测水平以下(图19和20)。尽管从第12到16天观察到小量肿瘤复发，用FOVA/SVGmu处理的小鼠在第18天结束时就无疾病症状；在实验进行的过程中(＞60天)没有观察到肿瘤复发。相反，在没有接受处理的小鼠体内肿瘤逐渐生长，由于肿瘤体积过大，16天后小鼠不得不退出实验。有趣的是肿瘤消退从用慢病毒载体免疫后第7天开始能够观察到。肿瘤消退的时间顺序和疫苗引发的抗原特异性的免疫应答的动力学吻合。
实施例15
通过重组病毒在体外输送抗原和成熟因子
DC疫苗的成功取决于DCs的成熟状态(Banchereau，J.和A.K.Palucka.2005.Nat Rev Immunol 5：296-306；Schuler，G.，et al.2003.Curr Opin Immunol15：138-147；Figdor，C.G.，et al.2004.Nat Med 10：475-480，其各自在此整体引入作为参考)。因此，慢病毒载体可以包括编码刺激分子的基因，所述刺激分子引发需要的DC成熟。可以使用的细胞因子包括，但是不限于GM-CSF，IL-4，TNFα，IL-6等等。在一些实施方案中，使用的成熟剂是CD40配体(CD40L)，它通常在CD4T细胞中表达，并且在DCs上作为CD40的配体使用(Matano，T.，et al.1995.J Gen Virol 76：3165-3169；Nguyen，T.H.，et al.1998.HumGene Ther 9：2469-2479，其各自在此整体引入作为参考)。为进一步操纵DCs成为治疗的强有力疫苗，在一些实施方案中，将药物诱导型CD40受体(iCD40)加入基因输送系统。就如其它地方所述，iCD40经过设计，包含与配体结合区以及膜靶向序列融合的CD40细胞质结构域(Hanks，B.A.，et al.2005.Nat Med11：130-137，其在此全文引入作为参考)。当iCD40表达以后，利用脂溶性二聚体药物调节DCs的成熟和活化。
为检测包括DC成熟因子的效果，获取卵清蛋白(OVA，如实施例10所述)，GM-CSF，IL-4，TNFα，IL-6和CD40L的cDNAs。按其它地方所述构建iCD40(Hanks，B.A.，et al.2005.上文)。利用IRES和2A-样序列，构建能够有效转导多达四种蛋白的多顺反子慢病毒载体。这个系统适合于共表达以下基因的慢病毒载体：OVA和成熟因子(GM-CSF，IL-4，TNFα，IL-6，CD40L或iCD40)(图24a，标记为″FUOIM″)。典型的载体序列如SEQ ID NO：7所示。制备包裹SVGmu的慢病毒(如实施例2所述)，在体外用慢病毒载体转导培养的小鼠BMDCs(制备方法见实施例6)从而将这些基因特异性输送入细胞。通过FACS分析几个关键分子的上调来检测BMDCs的成熟，这些分子在T细胞激活过程中有重要作用。典型的代表分子是ICAM-1(CD54)，B7.1(CD80)，MHCI型，MHCII型和内源性CD40。用仅编码OVA和GFP基因的慢病毒载体转导BMDCs作为实验对照。观察到当iCD40-修饰的DCs接触有效量的二聚体药物AP20187后，就能实现成熟标志物的上调。
另外，成熟DCs的两个典型特征是内吞能力的降低和T细胞活化能力的提高。通过FITC标记的葡聚糖的摄入定量转导DCs的内吞作用。成熟DCs还可以用来刺激表达OT1T细胞受体(TCRs)的T细胞(如实施例10所述)，以评估它们引发免疫应答的能力。观察到当iCD40修饰的DCs接触有效量的二聚药物AP20187后，相对于无CD40修饰的DCs，FITC-标记的葡聚糖的摄入减少。此外，观察到将转基因T细胞与不同比例的iCD40-修饰的DCs(用二聚体药物处理)共培养后，OT1T细胞出现比与无iCD40-修饰的DCs共培养的那些细胞更强的应答，这通过IFN-γ的释放和T细胞的增殖来测量。
DCs的寿命是决定T细胞依赖性免疫的另一个参数。利用Hanks等描述的方法(Hanks，B.A.，et al.2005.上文)，比较利用体外血清饥饿法测定的刺激分子对DC存活的影响。
如果需要的话，两个成熟因子可以通过慢病毒载体输送到DCs，因为载体结构具有表达四种蛋白的能力。
实施例16
在体内用重组病毒输送抗原和成熟因子
如实施例15所述，制备用FUOIM慢病毒载体(SEQ ID NO：7)包装的重组病毒。将病毒给未感染的B6小鼠施用从而将OVA抗原和成熟因子分子输送到DCs，并如实施例11所述，评价不同剂量的病毒对免疫的诱导。
观察到，与未经免疫的或者用不包含OVA的慢病毒载体(例如FUGW/SVGmu)免疫或者用不包含iCD40的慢病毒载体(例如FOVA/SVGmu)免疫的对照老鼠相比，通过包含iCD40-的慢病毒载体的靶向DC免疫增加OVA应答T细胞的数量。
另外，如实施例13中叙述的那样，利用包含iCD40的慢病毒载体评价动物对肿瘤攻击的抗性。在肿瘤攻击试验中老鼠被注射以下慢病毒载体：FUOIM/SVGmu，FOVA/SVGmu，或者FUGW/SVGmu。如下细胞系用于肿瘤攻击：EL4(C57BL/6J，H-2b，胸腺瘤)和E.G7(稳定表达鸡OVAcDNA的EL4细胞)。观测到接受DC靶向型慢病毒载体FUOIM/SVGmu和FOVA/SVGmu免疫的老鼠可以免受肿瘤攻击。相反，观察到接受缺乏OVA转基因的慢病毒载体(FUGW/SVGmu)模拟免疫的小鼠体内肿瘤生长迅速。这种保护是OVA-特异性的，因为免疫小鼠长出对照EL4肿瘤(缺少OVA的表达)，与用于免疫的慢病毒载体无关。
最后，利用包含iCD40的慢病毒载体评价该方法清除已经生成的肿瘤的能力。如下慢病毒系统可用于实验中的免疫：FUOIM/SVGmu和FOVA/SVGmu。如下细胞系可用于肿瘤的治疗：EL4和E.G7。观察到注射肿瘤细胞的小鼠接受DC靶向型慢病毒载体(FUOIM/SVGmu和FOVA/SVGmu)免疫后表现出肿瘤生长衰减，随后是肿瘤衰退和荧光降低到可检测水平以下。相反，肿瘤在未接受治疗的小鼠中迅速生长。
实施例17
体外通过重组病毒的HIV/AIDS抗原递呈
为治疗HIV/AIDS，基于描述的基因输送策略制备“双功能”DCs。“双功能”DCs既可以有效的诱导中和抗体(Nabs)，也可以诱导T细胞免疫(图25)。为有效的诱导NAbs，将编码嵌合体膜结合型gp120(gp120m)的基因输送到DCs。Gp120是HIV的包膜糖蛋白，被认为是最有效的免疫原(Klimstra，W.B.，et al.2003.J Viro 177：12022-12032；Bernard，K.A.，et al.2000.Virology276：93-103；Byrnes，A.P.，et al.1998.J Virol 72：7349-7356，其各自在此整体引入作为参考)。如其他地方所述，可以在细胞表面以三聚体形式表达与口腔炎病毒糖蛋白的跨膜区融合的gp120，模拟HIV病毒表面的成熟三聚体(Klimstra，W.B.，et al.1998.J Virol 72：7357-7366，其在此整体引入作为参考)。这种形式的免疫原将在DC表面表达。除表面表达外，DCs还能以MHC限制性方式将源自gp120的表位肽递呈到T细胞。
因为HIV感染通过去除CD4T细胞而明显削弱DC功能，所以期望将DCs改造为其功能不依赖于T细胞。CD40L或者iCD40的表达可以在没有CD4T细胞的情况下导致DC细胞的成熟或者活化。这样，改造的CD40L或者iCD40，如实施例16所述，它们的功能是作为成熟或者刺激分子，被整合到DC靶向型病毒。
图24b显示基因修饰的DCs的慢病毒构建体，将其标记为FUGmID(SEQ IDNO：8)。获得经过密码子优化的gp120的cDNAs，来自NIH AIDS Research&Reference Reagent Program。在HIV-1基因组范围外密码子优化的序列可以获得非常高水平的基因表达。通过将gp120和口腔炎病毒糖蛋白的跨膜区融合来制备构建体。
进行体外分析来检测基因修饰的DCs引发NAbs的效率。利用抗-CD19微珠(MiHenyi Biotech，Auburn，CA)从未感染的B6鼠脾脏分离CD19+B细胞，并在IL-4和IL-6存在条件下与修饰的DCs共培养。慢病毒载体FUmGID和SVGmu共转染细胞系以制备FUmGID/SVGmu病毒，如实施例2所述。用所获病毒转导骨髓来源的DCs(BMDCs)。转导的DCs用射线照射(3,000rad)，并用作抗原递呈细胞(APCs)和B细胞共培养。测量转导BMDCs引发的B细胞增殖的时间进程。已观察到，与模拟转导BMDCs共培养的B细胞相比，与转导BMDCs共培养的B细胞增殖程度更高。
为研究经过基因修饰的DCs对B细胞分化为特异性免疫球蛋白分泌细胞的影响，使用前述共培养方法，但是DCs不接受辐射。14天后，利用重组gp120(购自NIB：AIDS Research&Reference Reagent Program)作为抗原通过ELISA检测培养上清中HIV-特异性抗体各种同种型的滴度。与模拟转导BMDCs共培养的B细胞相比，与转导BMDCs共培养的B细胞中HIV-特异性抗体各种同种型的表达更高。
为评估基因修饰的DCs在体外激活T细胞的效果，从未感染的B6小鼠分离CD3+T细胞，并与慢病毒感染和辐射的DCs共培养。测量T细胞增殖的时间进程。与模拟转导DCs共培养的T细胞相比，与转导和辐射DCs共培养的T细胞中发现T细胞的增殖更高。
这些结果综合起来表明转导FUmGID/SVGmu慢病毒载体的BMDCs既能有效刺激B-细胞产生中和抗体(Nabs)，也能诱发针对HIV/AIDS的T细胞免疫。
实施例18
体内通过重组病毒的HIV/AIDS抗原递呈
为评估体内B细胞的活化，通过皮下注射慢病毒载体免疫B6小鼠，所述慢病毒载体如实施例17所示制备。对照包括注射只编码抗原的慢病毒，或者只编码成熟因子的慢病毒的小鼠，以及未经任何处理的未感染小鼠。注射病毒两个星期以后，通过ELISA检测针对HIV的血清抗体。在注射FUmGID/SVGmu病毒的小鼠以及那些注射只编码抗原的慢病毒的小鼠中发现抗体滴度更高。相反，在那些注射只编码成熟分子的慢病毒的小鼠以及未感染的小鼠中，抗体滴度相对较低。
对于T细胞的体内激活，将描述的重组病毒注射B6小鼠。七天后，分离T细胞，在用基因修饰的DCs体外重新刺激后，按照实施例12所述测量T细胞的增殖和细胞因子分泌。还检测T细胞应答的持续时间。靶向天然DCs的慢病毒载体能够在淋巴结和脾脏中引发HIV应答性T细胞。重组FUmGID/SVGmu的施用足以产生分泌IFN-γ的T细胞。相反，模拟对照载体(例如FUGW/SVGmu)的施用不能引发HIV特异性的应答。
实施例19
通过重组病毒的原位HIV/AIDS免疫：抗HIV攻击的保护
为了检测原位DC免疫治疗HIV的效果，建立一个新的HIV发病机理的小鼠模型，涉及人/鼠嵌合体。如其他地方所述，用人获得性免疫系统重建RAG2-/-γc -/-小鼠(Strauss，J.H.，et al.1994.Archives of Virology 9：473-484，其在此整体引入作为参考)。RAG2-/-γc -/-小鼠缺少B、T和NK细胞(Morizono，K.，et al.2001.J Virol 75：8016-8020，其在此整体引入作为参考)。向经过部分辐射的一天龄小鼠的肝脏中注射CD34+人脐带血，能够导致具有MHC限制的功能各异的人DCs、B细胞、T细胞的产生和成熟。另外，该模型指导初级和次级淋巴器官的发育，以及抗病毒攻击的功能性CD8+T细胞的产生。此外，观察到Ig同种型从IgM转变为IgG，表明功能性CD4+T细胞免疫的存在。
为确定通过DC靶向免疫引发的抗HIV预防性保护的效力，通过注射给人/小鼠嵌合体施用包裹SVGmu的重组病毒。重组体编码gp120m抗原(实施例17)和成熟刺激剂(例如，实施例15的CD40L或iCD40)，按照实施例2所述制备和浓缩。然后按照本领域公知的方法给免疫小鼠接种HIV，如通过腹膜内或静脉注射途径。因为重建的小鼠保留人CD4T细胞，用分子克隆的HIV报告病毒NFNSX-r-HSAS(CCR5-tropic)、NL-r-HSAS(CXCR4-tropic)和临床分离物(Baenziger，et al.2006.Proc Natl Acad Sci USA 103：15951-15956，其在此整体引入作为参考)对动物进行攻击。具有复制能力的报告病毒在vpr区还含有热稳定抗原(HSA)。此外，为在接种之前建立有效感染，将感染的同基因型外周血液单核细胞(PBMCs)注射入重建的人/小鼠嵌合体的腹膜腔。
随时间监测脾、淋巴结、PBMCs和外周血中HIV感染的证据。使用HIV报告病毒中HAS的FACS检测HIV病毒整合和复制。还使用RT-PCR测量血浆中的HIV病毒载量。通过这些方法评价HIV感染，观察到有效的原位DC免疫使免疫小鼠较没有免疫的那些更耐HIV攻击。
实施例20
通过重组病毒的原位HIV/AIDS免疫：HIV感染的清除
为检测原位DC免疫方法清除活性HIV感染的能力，按实施例19所述，首先用分子克隆的HIV报告病毒NFNSX-r-HSAS(CCR5-tropic)攻击人/小鼠嵌合体。活性HIV感染通过人CD4T细胞中HAS表达的FACS分析进行监测。一旦证实成功的HIV感染，将改造的重组病毒(实施例19)通过皮下注射或通过本领域技术人员确定的最佳途径(例如，s.c、i.d.、i.v.或i.p.)注射入动物。然后通过RT-PCR监测HIV病毒载量，接着是外周CD4计数。观察到，与未免疫对照相比，DC免疫能够降低免疫小鼠的HIV病毒载量并清除建立的HIV感染。
利用三种药物策略的高活性抗逆转病毒治疗(HAART)，具有显著改善AIDS发病率和死亡率。以上列出的策略可以适用于这个范例，通过在体内与改造的重组病毒同时转导DC细胞。联合HAART，重复以上研究以评估在HIV攻击(实施例19)之后预防或降低感染以及清除活性HIV感染的能力。
实施例21
使用重组病毒治疗人恶性肿瘤
一位患者被诊断患有恶性肿瘤。给患者施用合适量的重组病毒，所述重组病毒含有编码对所述肿瘤特异的抗原的基因，并包裹DC-SIGN特异性靶向分子如SVGmu。此病毒任选含有编码DC成熟因子的基因，如实施例15所述。治疗期间，通过每周静脉注射给药所述病毒。在治疗期间和之后的周期性时间，通过磁共振成象(MRI)评估肿瘤负荷。随着治疗进行，发现肿瘤大小显著降低。
实施例22
使用重组病毒预防人的肿瘤形成
给一组患者施用合适量的重组病毒，所述重组病毒含有至少一种编码抗原(与肿瘤细胞普遍和特异性的相关)的基因，并任选的含有编码DC成熟因子的基因，如实施例15所述。所述病毒包裹DC-SIGN特异性靶向分子如SVGmu(实施例2)。周期性监测实验组和对照组患者的肿瘤生长。观察到，与对照组相比，施用病毒的患者中恶性肿瘤形成的发病率更低。
实施例23
用重组病毒治疗人的AIDS/HIV
一位患者被诊断患有HIV/AIDS。给该患者施用合适量的重组病毒，所述病毒含有编码Gp120的基因(实施例17)并用DC-SIGN特异性靶向分子如SVGmu(实施例2)包裹。病毒任选含有编码DC成熟因子的基因，如实施例15所述。治疗期间，此病毒是通过每周静脉注射给药。在治疗期间和之后通过使用ELISA测量患者血液中抗HIV的抗体，周期性检测HIV病毒载量。还评价患者的T-细胞量。观察到随着治疗进行，HIV病毒载量显著降低。此外，还观察到，随着治疗进行，患者的T-细胞量停止降低。
实施例24
使用重组病毒预防人的HIV/AIDS
给一组被认为具有HIV感染风险的患者施用合适量的重组病毒，所述重组病毒含编码GP120的基因(实施例17)及任选的含有编码DC成熟因子的基因，如实施例15所述。病毒用DC-SIGN特异性靶向分子如SVGmu(实施例2)包裹。每6个月检测实验组和对照组患者的HIV感染，如果呈阳性，检测HIV病毒载量及T-细胞数量。相对于对照组的阳性感染患者而言，观察到免疫组的阳性感染患者中HIV病毒载量保持低水平，且T-细胞量保持高水平。
尽管为了清楚理解的目的已经详细描述了上述发明，但显而易见的是可以在附加权利要求的范围内可以进行某些修改。为了全部目的，本文引用的全部出版物和专利文件均在此整体引入作为参考，就像每篇是单独标引的一样。
序列表
<110>王斌
杨丽丽
大卫·巴尔的摩
<120>用于树突状细胞免疫的靶向基因输送
<130>CALTE.035A
<150>U.S.60/832,497
<151>2006-07-21
<150>U.S.60/920,260
<151>2007-03-27
<160>11
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>9941
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>构建的质粒载体
<400>1
gtcgacggat cgggagatct cccgatcccc tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg 60
atgccgcata gttaagccag tatctgctcc ctgcttgtgt gttggaggtc gctgagtagt 120
gcgcgagcaa aatttaagct acaacaaggc aaggcttgac cgacaattgc atgaagaatc 180
tgcttagggt taggcgtttt gcgctgcttc gcgatgtacg ggccagatat acgcgttgac 240
attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg gtcattagtt catagcccat 300
atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg 360
acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt 420
tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag 480
tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc 540
attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag 600
tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacat caatgggcgt ggatagcggt 660
ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt caatgggagt ttgttttggc 720
accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactc cgccccattg acgcaaatgg 780
gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagcgc gttttgcctg tactgggtct 840
ctctggttag accagatctg agcctgggag ctctctggct aactagggaa cccactgctt 900
aagcctcaat aaagcttgcc ttgagtgctt caagtagtgt gtgcccgtct gttgtgtgac 960
tctggtaact agagatccct cagacccttt tagtcagtgt ggaaaatctc tagcagtggc 1020
gcccgaacag ggacttgaaa gcgaaaggga aaccagagga gctctctcga cgcaggactc 1080
ggcttgctga agcgcgcacg gcaagaggcg aggggcggcg actggtgagt acgccaaaaa 1140
ttttgactag cggaggctag aaggagagag atgggtgcga gagcgtcagt attaagcggg 1200
ggagaattag atcgcgatgg gaaaaaattc ggttaaggcc agggggaaag aaaaaatata 1260
aattaaaaca tatagtatgg gcaagcaggg agctagaacg attcgcagtt aatcctggcc 1320
tgttagaaac atcagaaggc tgtagacaaa tactgggaca gctacaacca tcccttcaga 1380
caggatcaga agaacttaga tcattatata atacagtagc aaccctctat tgtgtgcatc 1440
aaaggataga gataaaagac accaaggaag ctttagacaa gatagaggaa gagcaaaaca 1500
aaagtaagac caccgcacag caagcggccg ctgatcttca gacctggagg aggagatatg 1560
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cgggcgcccc cctcctcacg gcgagcgctg ccacgtcaga cgaagggcgc aggagcgttc 2700
ctgatccttc cgcccggacg ctcaggacag cggcccgctg ctcataagac tcggccttag 2760
aaccccagta tcagcagaag gacattttag gacgggactt gggtgactct agggcactgg 2820
ttttctttcc agagagcgga acaggcgagg aaaagtagtc ccttctcggc gattctgcgg 2880
agggatctcc gtggggcggt gaacgccgat gattatataa ggacgcgccg ggtgtggcac 2940
agctagttcc gtcgcagccg ggatttgggt cgcggttctt gtttgtggat cgctgtgatc 3000
gtcacttggt gagttgcggg ctgctgggct ggccggggct ttcgtggccg ccgggccgct 3060
cggtgggacg gaagcgtgtg gagagaccgc caagggctgt agtctgggtc cgcgagcaag 3120
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ttagacagga tccccgggta ccggtcgcca ccatggtgag caagggcgag gagctgttca 3900
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ccaccggcaa gctgcccgtg ccctggccca ccctcgtgac caccctgacc tacggcgtgc 4080
agtgcttcag ccgctacccc gaccacatga agcagcacga cttcttcaag tccgccatgc 4140
ccgaaggcta cgtccaggag cgcaccatct tcttcaagga cgacggcaac tacaagaccc 4200
gcgccgaggt gaagttcgag ggcgacaccc tggtgaaccg catcgagctg aagggcatcg 4260
acttcaagga ggacggcaac atcctggggc acaagctgga gtacaactac aacagccaca 4320
acgtctatat catggccgac aagcagaaga acggcatcaa ggtgaacttc aagatccgcc 4380
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gcgacggccc cgtgctgctg cccgacaacc actacctgag cacccagtcc gccctgagca 4500
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tcactctcgg catggacgag ctgtacaagt aaagcggccg cgactctaga attcgatatc 4620
aagcttatcg ataatcaacc tctggattac aaaatttgtg aaagattgac tggtattctt 4680
aactatgttg ctccttttac gctatgtgga tacgctgctt taatgccttt gtatcatgct 4740
attgcttccc gtatggcttt cattttctcc tccttgtata aatcctggtt gctgtctctt 4800
tatgaggagt tgtggcccgt tgtcaggcaa cgtggcgtgg tgtgcactgt gtttgctgac 4860
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ggggctcggc tgttgggcac tgacaattcc gtggtgttgt cggggaaatc atcgtccttt 5040
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cactttttaa aagaaaaggg gggactggaa gggctaattc actcccaacg aagacaagat 5460
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ccagggccag ggatcagata tccactgacc tttggatggt gctacaagct agtaccagtt 5580
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ctagcatttc atcacatggc ccgagagctg catccggact gtactgggtc tctctggtta 5760
gaccagatct gagcctggga gctctctggc taactaggga acccactgct taagcctcaa 5820
taaagcttgc cttgagtgct tcaagtagtg tgtgcccgtc tgttgtgtga ctctggtaac 5880
tagagatccc tcagaccctt ttagtcagtg tggaaaatct ctagcagggc ccgtttaaac 5940
ccgctgatca gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc 6000
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aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaat gtatcttatc 7740
atgtctgtat accgtcgacc tctagctaga gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc 7800
ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt 7860
gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc 7920
ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg 7980
ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct 8040
cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca 8100
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gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga 8820
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<223>构建的质粒载体
<400>2
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<210>3
<211>8435
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>3
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<210>5
<211>10401
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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cctgac                                                            11586
<210>8
<211>11893
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>构建的质粒载体
<400>8
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<210>9
<211>9569
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>构建的质粒载体
<220>
<221>misc_feature
<222>4189
<223>n＝a，t，c或者g
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aatcacacga cctggatgga gtgggacaga gaaattaaca attacacaag cttaatacac 6120
tccttaattg aagaatcgca aaaccagcaa gaaaagaatg aacaagaatt attggaatta 6180
gataaatggg caagtttgtg gaattggttt aacataacaa attggctgtg gtatataaaa 6240
ttattcataa tgatagtagg aggcttggta ggtttaagaa tagtttttgc tgtactttct 6300
atagtgaata gagttaggca gggatattca ccattatcgt ttcagaccca cctcccaacc 6360
ccgaggggac ccgacaggcc cgaaggaata gaagaagaag gtggagagag agacagagac 6420
agatccattc gattagtgaa cggatcggca ctgcgtgcgc caattctgca gacaaatggc 6480
agtattcatc cacaatttta aaagaaaagg ggggattggg gggtacagtg caggggaaag 6540
aatagtagac ataatagcaa cagacataca aactaaagaa ttacaaaaac aaattacaaa 6600
aattcaaaat tttcgggttt attacaggga cagcagagat ccagtttggt tagtaccggg 6660
cccggtgctt tgctctgagc cagcccacca gtttggaatg actccttttt atgacttgaa 6720
ttttcaagta taaagtctag tgctaaattt aatttgaaca actgtatagt ttttgctggt 6780
tgggggaagg aaaaaaaatg gtggcagtgt ttttttcaga attagaagtg aaatgaaaat 6840
tgttgtgtgt gaggatttct aatgacatgt ggtggttgca tactgagtga agccggtgag 6900
cattctgcca tgtcaccccc tcgtgctcag taatgtactt tacagaaatc ctaaactcaa 6960
aagattgata taaaccatgc ttcttgtgta tatccggtct cttctctggg tagtctcact 7020
cagcctgcat ttctgccagg gcccgctcta gtcgaggtcg acggtatcga taagctcgct 7080
tcacgagatt ccagcaggtc gagggaccta ataacttcgt atagcataca ttatacgaag 7140
ttatattaag ggttccaagc ttaagcggcc gcgtggataa ccgtattacc gccatgcatt 7200
agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc 7260
gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg 7320
acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa 7380
tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca 7440
agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac 7500
atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc 7560
atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga 7620
tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg 7680
gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta 7740
cggtgggagg tctatataag cagagctggt ttagtgaacc gtcagatccg ctagcgctac 7800
cggctagaaa attgtccgct aaattctggc cgtttttggc ttttttgtta gacaggatcc 7860
gttatcacaa gtttgtacaa aaaagcaggc tctttaaagg aaccaattca gtcgactgga 7920
tccggtaccg aattcaaaga caactcagag ttcaccatgg gctccatcgg ngcagcaagc 7980
atggaatttt gttttgatgt attcaaggag ctcaaagtcc accatgccaa tgagaacatc 8040
ttctactgcc ccattgccat catgtcagct ctagccatgg tatacctggg tgcaaaagac 8100
agcaccagga cacaaataaa taaggttgtt cgctttgata aacttccagg attcggagac 8160
agtattgaag ctcagtgtgg cacatctgta aacgttcact cttcacttag agacatcctc 8220
aaccaaatca ccaaaccaaa tgatgtttat tcgttcagcc ttgccagtag actttatgct 8280
gaagagagat acccaatcct gccagaatac ttgcagtgtg tgaaggaact gtatagagga 8340
ggcttggaac ctatcaactt tcaaacagct gcagatcaag ccagagagct catcaattcc 8400
tgggtagaaa gtcagacaaa tggaattatc agaaatgtcc ttcagccaag ctccgtggat 8460
tctcaaactg caatggttct ggttaatgcc attgtcttca aaggactgtg ggagaaaaca 8520
tttaaggatg aagacacaca agcaatgcct ttcagagtga ctgagcaaga aagcaaacct 8580
gtgcagatga tgtaccagat tggtttattt agagtggcat caatggcttc tgagaaaatg 8640
aagatcctgg agcttccatt tgccagtggg acaatgagca tgttggtgct gttgcctgat 8700
gaagtctcag gccttgagca gcttgagagt ataatcaact ttgaaaaact gactgaatgg 8760
accagttcta atgttatgga agagaggaag atcaaagtgt acttacctcg catgaagatg 8820
gaggaaaaat acaacctcac atctgtctta atggctatgg gcattactga cgtgtttagc 8880
tcttcagcca atctgtctgg catctcctca gcagagagcc tgaagatatc tcaagctgtc 8940
catgcagcac atgcagaaat caatgaagca ggcagagagg tggtagggtc agcagaggct 9000
ggagtggatg ctgcaagcgt ctctgaagaa tttagggctg accatccatt cctcttctgt 9060
atcaagcaca tcgcaaccaa cgccgttctc ttctttggca gatgtgtttc cccttaaaaa 9120
gaagaaagct gaaaaactct gtcccttcca acaagaccca gagcactgta gtatcagggg 9180
taaaatgaaa agtatgttct ctgctgcatc cagacttcat aaaagctgga gcttaatcta 9240
gactggaggc ttgctgaagg ctgtatgctg tgagaactga attccatggg ttgttttggc 9300
cactgactga caacccatga ttcagttctc acaggacaca aggcctgtta ctagcactca 9360
catggaacaa atggcccatc tagacccagc tttc    9394
<210>11
<211>986
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变的辛德比斯病毒糖蛋白
<400>11
Met Ser Ala Ala Pro Leu Val Thr Ala Met Cys Leu Leu Gly Asn Val
 1                  5                     10                     15
Ser Phe Pro Cys Asp Arg Pro Pro Thr Cys Tyr Thr Arg Glu Pro Ser
              20                     25                     30
Arg Ala Leu Asp Ile Leu Glu Glu Asn Val Asn His Glu Ala Tyr Asp
         35                     40                     45
Thr Leu Leu Asn Ala Ile Leu Arg Cys Gly Ser Ser Gly Ser Val Ile
     50                     55                     60
Asp Asp Phe Thr Leu Thr Ser Pro Tyr Leu Gly Thr Cys Ser Tyr Cys
65                     70                     75                     80
His His Thr Val Pro Cys Phe Ser Pro Val Lys Ile Glu Gln Val Trp
                   85                     90                     95
Asp Glu Ala Asp Asp Asn Thr Ile Arg Ile Gln Thr Ser Ala Gln Phe
              100                     105                     110
Gly Tyr Asp Gln Ser Gly Ala Ala Ser Ala Asn Lys Tyr Arg Tyr Met
         115                     120                     125
Ser Leu Lys Gln Met Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Thr Val
     130                     135                     140
Lys Glu Gly Thr Met Asp Asp Ile Lys Ile Ser Thr Ser Gly Pro Cys
145                     150                     155                     160
Arg Arg Leu Ser Tyr Lys Gly Tyr Phe Leu Leu Ala Lys Cys Pro Pro
                   165                     170                     175
Gly Asp Ser Val Thr Val Ser Ile Val Ser Ser Asn Ser Ala Thr Ser
              180                     185                     190
Cys Thr Leu Ala Arg Lys Ile Lys Pro Lys Phe Val Gly Arg Glu Lys
         195                     200                     205
Tyr Asp Leu Pro Pro Val His Gly Lys Lys Ile Pro Cys Thr Val Tyr
    210                     215                     220
Asp Arg Leu Ala Ala Thr Thr Ala Gly Tyr Ile Thr Met His Arg Pro
225                     230                     235                     240
Arg Pro His Ala Tyr Thr Ser Tyr Leu Glu Glu Ser Ser Gly Lys Val
                   245                      250                    255
Tyr Ala Lys Pro Pro Ser Gly Lys Asn Ile Thr Tyr Glu Cys Lys Cys
               260                     265                    270
Gly Asp Tyr Lys Thr Gly Thr Val Ser Thr Arg Thr Glu Ile Thr Gly
          275                    280                      285
Cys Thr Ala Ile Lys Gln Cys Val Ala Tyr Lys Ser Asp Gln Thr Lys
    290                      295                      300
Trp Val Phe Asn Ser Pro Asp Leu Ile Arg His Asp Asp His Thr Ala
305                     310                     315                    320
Gln Gly Lys Leu His Leu Pro Phe Lys Leu Ile Pro Ser Thr Cys Met
                   325                     330                     335
Val Pro Val Ala His Ala Pro Asn Val Ile His Gly Phe Lys His Ile
               340                     345                     350
Ser Leu Gln Leu Asp Thr Asp His Leu Thr Leu Leu Thr Thr Arg Arg
          355                     360                     365
Leu Gly Ala Asn Pro Glu Pro Thr Thr Glu Trp Ile Val Gly Lys Thr
    370                     375                     380
Val Arg Asn Phe Thr Val Asp Arg Asp Gly Leu Glu Tyr Ile Trp Gly
385                     390                     395                     400
Asn His Glu Pro Val Arg Val Tyr Ala Gln Glu Ser Ala Pro Gly Asp
                    405                     410                     415
Pro His Gly Trp Pro His Glu Ile Val Gln His Tyr Tyr His Arg His
               420                     425                     430
Pro Val Tyr Thr Ile Leu Ala Val Ala Ser Ala Thr Val Ala Met Met
          435                     440                     445
Ile Gly Val Thr Val Ala Val Leu Cys Ala Cys Lys Ala Arg Arg Glu
    450                     455                     460
Cys Leu Thr Pro Tyr Ala Leu Ala Pro Asn Ala Val Ile Pro Thr Ser
465                     470                     475                     480
Leu Ala Leu Leu Cys Cys Val Arg Ser Ala Asn Ala Glu Thr Phe Thr
                  485                     490                     495
Glu Thr Met Ser Tyr Leu Trp Ser Asn Ser Gln Pro Phe Phe Trp Val
             500                     505                     510
Gln Leu Cys Ile Pro Leu Ala Ala Phe Ile Val Leu Met Arg Cys Cys
         515                     520                     525
Ser Cys Cys Leu Pro Phe Leu Val Val Ala Gly Ala Tyr Leu Ala Lys
    530                     535                     540
Val Asp Ala Tyr Glu His Ala Thr Thr Val Pro Asn Val Pro Gln Ile
545                     550                     555                     560
Pro Tyr Lys Ala Leu Val Glu Arg Ala Gly Tyr Ala Pro Leu Asn Leu
                   565                     570                     575
Glu Ile Thr Val Met Ser Ser Glu Val Leu Pro Ser Thr Asn Gln Glu
               580                     585                     590
Tyr Ile Thr Cys Lys Phe Thr Thr Val Val Pro Ser Pro Lys Ile Lys
        595                    600                    605
Cys Cys Gly Ser Leu Glu Cys Gln Pro Ala Ala His Ala Gly Tyr Thr
    610                    615                    620
Cys Lys Val Phe Gly Gly Val Tyr Pro Phe Met Trp Gly Gly Ala Gln
625                    630                    635                    640
Cys Phe Cys Asp Ser Glu Asn Ser Gln Met Ser Glu Ala Tyr Val Glu
                   645                    650                    655
Leu Ser Ala Asp Cys Ala Ser Asp His Ala Gln Ala Ile Lys Val His
               660                    665                    670
Thr Ala Ala Met Lys Val Gly Leu Arg Ile Val Tyr Gly Asn Thr Thr
         675                    680                    685
Ser Phe Leu Asp Val Tyr Val Asn Gly Val Thr Pro Gly Thr Ser Lys
    690                    695                    700
Asp Leu Lys Val Ile Ala Gly Pro Ile Ser Ala Ser Phe Thr Pro Phe
705                    710                    715                    720
Asp His Lys Val Val Ile His Arg Gly Leu Val Tyr Asn Tyr Asp Phe
                    725                    730                    735
Pro Glu Tyr Gly Ala Met Lys Pro Gly Ala Phe Gly Asp Ile Gln Ala
               740                    745                    750
Thr Ser Leu Thr Ser Lys Asp Leu Ile Ala Ser Thr Asp Ile Arg Leu
          755                    760                    765
Leu Lys Pro Ser Ala Lys Asn Val His Val Pro Tyr Thr Gln Ala Ser
    770                    775                    780
Ser Gly Phe Glu Met Trp Lys Asn Asn Ser Gly Arg Pro Leu Gln Glu
785                    790                    795                    800
Thr Ala Pro Phe Gly Cys Lys Ile Ala Val Asn Pro Leu Arg Ala Val
                   805                    810                    815
Asp Cys Ser Tyr Gly Asn Ile Pro Ile Ser Ile Asp Ile Pro Asn Ala
               820                    825                    830
Ala Phe Ile Arg Thr Ser Asp Ala Pro Leu Val Ser Thr Val Lys Cys
          835                    840                    845
Glu Val Ser Glu Cys Thr Tyr Ser Ala Asp Phe Gly Gly Met Ala Thr
    850                    855                    860
Leu Gln Tyr Val Ser Asp Arg Glu Gly Gln Cys Pro Val His Ser His
865                    870                    875                    880
Ser Ser Thr Ala Thr Leu Gln Glu Ser Thr Val His Val Leu Glu Lys
                    885                    890                    895
Gly Ala Val Thr Val His Phe Ser Thr Ala Ser Pro Gln Ala Asn Phe
               900                    905                    910
Ile Val Ser Leu Cys Gly Lys Lys Thr Thr Cys Asn Ala Glu Cys Lys
          915                    920                    925
Pro Pro Ala Asp His Ile Val Ser Thr Pro His Lys Asn Asp Gln Glu
    930                    935                    940
Phe Gln Ala Ala Ile Ser Lys Thr Ser Trp Ser Trp Leu Phe Ala Leu
945                     950                    955                    960
Phe Gly Gly Ala Ser Ser Leu Leu IleIle Gly Leu Met Ile Phe Ala
                    965                    970                     975
Cys Ser Met Met Leu Thr Ser Thr Arg Arg
             980                     985

Claims (53)

1、一种将多核苷酸输送到表达DC-SIGN的树突状细胞的方法，所述方法包括：
用重组病毒转导树突状细胞，
其中重组病毒包括待输送的多核苷酸和结合DC-SIGN的靶向分子。
2、权利要求1的方法，其特征在于所述重组病毒包含来自慢病毒基因组的序列。
3、权利要求2的方法，其特征在于所述重组病毒包含来自HIV基因组的序列。
4、权利要求1的方法，其特征在于所述重组病毒包含来自γ逆转录病毒基因组的序列。
5、权利要求4的方法，其特征在于所述重组病毒包含来自小鼠干细胞病毒(MSCV)基因组或小鼠白血病病毒(MLV)基因组的序列。
6、权利要求1的方法，其特征在于所述靶向分子包含源自病毒家族中病毒的病毒糖蛋白，所述病毒家族选自：披膜病毒科、黄病毒科、冠状病毒科、纤丝病毒科和疱疹病毒科。
7、权利要求1的方法，其特征在于所述靶向分子包含源自以下至少一种病毒的病毒糖蛋白：辛德巴斯病毒、流感病毒、沙拉热病毒、森林脑炎病毒、登革热病毒、乙肝病毒、狂犬病病毒、塞姆利基森林病毒、罗斯河病毒、Aura病毒、博纳病病毒、汉坦病毒和SARS-CoV病毒。
8、权利要求7的方法，其特征在于所述靶向分子包含来自辛德巴斯病毒的经过修饰的病毒糖蛋白。
9、权利要求8的方法，其特征在于所述靶向分子是SVGmu(SEQ ID NO：11)。
10、权利要求1的方法，其特征在于所述重组病毒是假型的。
11、权利要求1的方法，其特征在于所述多核苷酸包含下列至少一种：编码感兴趣蛋白的基因、编码siRNA的基因和编码感兴趣的microRNA的基因。
12、权利要求11的方法，其特征在于所述编码感兴趣蛋白的基因编码抗原。
13、权利要求12的方法，其特征在于所述抗原是肿瘤抗原。
14、权利要求12的方法，其特征在于所述抗原是HIV抗原。
15、权利要求1的方法，还包括以下步骤：
用包含待输送多核苷酸的病毒载体和包含编码靶向分子的基因的载体转染包装细胞系；
培养被转染的包装细胞系；
从包装细胞培养物中回收重组病毒。
16、权利要求15的方法，其特征在于所述包装细胞系是293细胞系。
17、权利要求15的方法，其特征在于所述多核苷酸在体外被输送到树突状细胞。
18、权利要求15的方法，所述多核苷酸在体内被输送到受试者的树突状细胞。
19、权利要求18的方法，其特征在于所述受试者是哺乳动物。
20、权利要求19的方法，其特征在于所述受试者是人。
21、权利要求19的方法，其特征在于所述受试者是鼠。
22、一种重组病毒，包含：
感兴趣的多核苷酸；和
优先结合DC-SIGN的靶向分子。
23、权利要求22的重组病毒，其特征在于所述重组病毒包括来自慢病毒基因组的序列。
24、权利要求23的重组病毒，其特征在于所述重组病毒包括来自HIV基因组的序列。
25、权利要求22的重组病毒，其特征在于所述重组病毒包含来自γ逆转录病毒基因组的序列。
26、权利要求25的重组病毒，其特征在于所述重组病毒包含来自小鼠干细胞病毒(MSCV)基因组或小鼠白血病病毒(MLV)基因组的序列。
27、权利要求22的重组病毒，其特征在于所述靶向分子包含源自病毒家族中病毒的病毒糖蛋白，所述病毒家族选自：披膜病毒科、黄病毒科、冠状病毒科、纤丝病毒科和疱疹病毒科。
28、权利要求22的重组病毒，其特征在于所述靶向分子包含源自以下至少一种病毒的病毒糖蛋白：辛德巴斯病毒、流感病毒、沙拉热病毒、森林脑炎病毒、登革热病毒、乙肝病毒、狂犬病病毒、塞姆利基森林病毒、罗斯河病毒、Aura病毒、博纳病病毒、汉坦病毒和SARS-CoV病毒。
29、权利要求28的重组病毒，其特征在于所述靶向分子包含来自辛德巴斯病毒的病毒糖蛋白。
30、权利要求29的重组病毒其特征在于所述靶向分子是SVGmu(SEQ ID NO：11)。
31、权利要求22的重组病毒，其特征在于所述重组病毒是假型的。
32、权利要求22的重组病毒其特征在于所述多核苷酸包含下列至少一种：编码感兴趣蛋白的基因、编码siRNA的基因和编码感兴趣的microRNA的基因。
33、权利要求30的重组病毒，其特征在于所述感兴趣的蛋白是抗原。
34、权利要求33的重组病毒，其特征在于所述抗原是肿瘤抗原。
35、权利要求33的重组病毒，其特征在于所述抗原是HIV抗原。
36、权利要求21的重组病毒，其特征在于所述感兴趣的多核苷酸编码报告基因。
37、重组病毒在制备刺激哺乳动物免疫应答的药物中的用途，通过将编码抗原的多核苷酸输送到表达DC-SIGN的树突状细胞，其中所述重组病毒包含所述多核苷酸和特异性结合DC-SIGN的靶向分子。
38、一种编码特异性结合DC-SIGN的靶向分子的载体。
39、权利要求38的载体，其特征在于所述靶向分子源自病毒糖蛋白。
40、权利要求39的载依其特征在于所述靶向分子是SVGmu(SEQ ID NO：11)。
41、重组病毒在制备用于治疗患有疾病的患者的药物中的用途，通过给患者施用重组病毒，其中所述重组病毒包含至少一种感兴趣的基因和结合DC-SIGN的靶向分子，所述基因编码与所述疾病相关的抗原。
42、权利要求41的用途，其特征在于所述重组病毒编码第二种感兴趣的基因。
43、权利要求42的用途，其特征在于所述第二种感兴趣的基因编码成熟因子。
44、权利要求43的用途，其特征在于所述成熟因子选自：GM-CSF，IL-2，IL-4，IL-6，IL-7，IL-15，IL-21，IL-23，TNFα，B7.1，B7.2，4-1BB，CD40配体(CD40L)和药物诱导型CD40(iCD40)。
45、权利要求41的用途，其特征在于所述靶向分子源自病毒糖蛋白。
46、权利要求45的用途其特征在于所述靶向分子是SVGmu(SEQ ID NO：11)。
47、权利要求41的用途，其特征在于所述疾病是癌症。
48、权利要求41的用途，其特征在于所述疾病是HIV/AIDS。
49、用重组病毒转导的树突状细胞，其特征在于所述重组病毒包含感兴趣的多核苷酸和结合DC-SIGN的靶向分子。
50、权利要求49的树突状细胞，其特征在于所述靶向分子包含源自病毒家族中病毒的病毒糖蛋白，所述病毒家族选自：披膜病毒科、黄病毒科、冠状病毒科、纤丝病毒科和疱疹病毒科。
51、权利要求49的树突状细胞，其特征在于所述靶向分子包含源自以下至少一种病毒的病毒糖蛋白：辛德巴斯病毒、流感病毒、沙拉热病毒、森林脑炎病毒、登革热病毒、乙肝病毒、狂犬病病毒、塞姆利基森林病毒、罗斯河病毒、Aura病毒、博纳病病毒、汉坦病毒和SARS-CoV病毒。
52、权利要求49的树突状细胞，其特征在于靶向分子是SVGmu(SEQ IDNO：11)。
53、重组病毒在制备用于免疫动物的药物中的用途，通过将编码抗原的多核苷酸输送到表达DC-SIGN的树突状细胞，其中所述重组病毒包含编码抗原的多核苷酸和结合DC-SIGN的靶向分子。
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