KR101421312B1 - 수지상 세포 백신접종을 위한 표적화된 유전자의 전달 - Google Patents

수지상 세포 백신접종을 위한 표적화된 유전자의 전달 Download PDF

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Abstract

본 발명은 목적 유전자, 일반적으로 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 수지상 세포 (DC)에 전달하는 방법 및 조성물을 제공한다. 바이러스 외피는 DC-SIGN에 특이적 표적화 분자를 포함한다. 상기 방법들 및 관련 조성물들은 HIV/AIDS와 같은 감염 및 여러 종류의 암을 포함하는 광범위한 질환으로 고통받는 환자들을 치료하는 데 사용될 수 있다.
Figure R1020097003611
수지상 세포, 렌티바이러스, 신드비스 바이러스

Description

수지상 세포 백신접종을 위한 표적화된 유전자의 전달{TARGETED GENE DELIVERY FOR DENDRITIC CELL VACCINATION}
본 발명은 표적화된 유전자의 전달에 관한 것으로, 보다 상세하게는 수지상 세포들을 표적으로 하여 결합하는 표적화 분자를 포함하는 재조합 바이러스의 용도에 관한 것이며, 본 발명은 수지상 세포 백신접종용으로 사용될 수 있다.
면역요법은 현대 의료 행위에서 가장 효과적인 기술 중 하나이지만, 사용이 제한적이라는 문제가 있다. 다른 감염성 질환은 복합적 면역 요법에 의해 조절될 수 있지만, HIV/AIDS, 말라리아 및 결핵과 같은 특정 감염성 질환은 현재의 면역요법에 의해서는 조금도 조절되지 않는다. 암은 면역 치료에 있어 기대되는 표적이지만, 실험적 시도들의 임상 결과는 실망적이었다 (Rosenberg, S.A. et al. 2004. Nat. Med. 10:909-915, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 편입된다). 　예를 들어, 항-종양 면역성을 유도하기 위한 새로운 면역요법들이 요구된다.
수지상 세포 (DCs)는 선천성(innate) 및 적응 면역(adaptive immunity) 모두에서 중요한 역할을 한다. DCs는 항원을 포획하여 가공하고, 말초기관으로부터 림 프기관으로 이동시키고, 주요 조직적합성 복합체(MHC)-제한 방식으로 항원을 휴지기성 T 세포에 제시하는 고유한 능력을 갖는 특이적 항원-제시 세포(antigen-presenting cells)이다 (Banchereau, J. & Steinman, R.M. 1998. Nature 392:245-252; Steinman, R.M., et al. 2003. Ann Rev Immunol 21 : 685-711, 이들 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 편입된다). 이러한 세포는 골수(BM)에서 유래되며, 수지상 형태와 고이동성을 특징으로 한다. 미성숙 DCs는 항원 섭취에 능숙하고, 말초 조직에서 센티넬(sentinel)로 몸 전체에 걸쳐 분포된다. 　그러나, 효율적 면역 반응을 위해서는 성숙된 DCs가 요구된다 (상술한 Steinman, R.M., et al. 2003). 성숙된 DCs는 고농도의 MHC-항원 복합체 및 (CD40, B7-1, B7-2 및 CD1a와 같은) 다른 공자극 분자(costimulatory molecules)를 발현한다 (Steinman, R.M. 1991. Ann Rev Immunol 9: 271-296, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 편입된다; 상술한 Banchereau, J. 및 R.M. Steinman. 1998). 이러한 분자는 자극된 T 세포(stimulating T cells)에서 핵심 역할을 한다. 　
특이적 항원-제시 세포 (APCs)로서의 DCs의 역할의 발견은 특이적 항원을 갖는 DCs를 로딩하는 것을 포함하여 DC-계 면역/백신접종의 시도를 촉진하였다 (Banchereau, J. & Palucka, A.K. 2005. Nat. Rev. Immunol. 5:296-306; Figdor, CG. et al. 2004. Nat. Med. 10:475-480, 이들 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 편입된다). 　그러나, 모든 이러한 시도들은 먼저 생체 외(ex vivo)에서 DCs의 로딩을 특이적 항원들과 관련시킨다. 　이어서 생체 외에서 발생된 DCs가 환자에게 투여된다. 　이러한 각각의 환자에 대하여, 생체 외에서 DCs의 생성하는 일은 상당한 노 력이 요구되는 방법이다. 　
그와 달리, 본 발명은 그 중에서도 특히 생체 내에서의 표적화, 항원 로딩 및 DCs의 활성화에 관한 것으로, 생체 내에서 환자에게 유효한 면역 반응을 발생시킴으로써 질환의 치료가 가능하다. 따라서, 본 발명은 면역요법/백신접종을 위한 효과적이고 효율적인 치료법에 대한 오랜 요구를 충족시킬 수 있다.
<발명의 요약>
본 발명의 일 양상에서, DC-SIGN을 발현하는 수지상 세포에 폴리뉴클레오타이드를 전달하는 방법들이 제공된다. 몇몇 구현예들에서, 상기 방법들은 수지상 세포에 재조합 바이러스를 형질도입하는 단계를 포함하고, 상기 재조합 바이러스는 전달될 폴리뉴클레오타이드 및 DC-SIGN과 결합하는 표적화 분자를 포함한다. 몇몇 구현예들에서, 표적화 분자는 DC-SIGN에 특이적이다.
본 발명의 몇몇 구현예들에서, 재조합 바이러스는 HIV 게놈과 같은 렌티바이러스 게놈 유래의 서열들을 포함한다.
다른 구현예들에서, 재조합 바이러스는 마우스 줄기세포 바이러스 (MSCV) 게놈 또는 뮤린 백혈병 바이러스 (MLV) 게놈 유래의 서열들과 같은 감마레트로바이러스 게놈 유래의 서열들을 포함한다.
본 발명의 몇몇 구현예들에서, 방법들은 신드비스 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 라사열 바이러스, 진드기 매개 뇌염 바이러스, 뎅기 바이러스, B형 간염 바이러스, 광견병 바이러스, 셈리키 포레스트 바이러스, 로스 리버 바이러스, 아우라 바이러스, 보르나병 바이러스, 한탄 바이러스, 및 SARS-CoV 바이러스로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 바이러스로부터 유래된 바이러스 당단백질을 포함하는 표적화 분자를 이용할 수 있다. 보다 바람직한 구현예들에서, 표적화 분자는 신드비스 바이러스 (SIN 또는 SVG)로부터 유래된 변형된 바이러스 당단백질을 포함한다. 특정한 구현예들에서, 표적화 분자는 SVGmu (서열번호 11)로도 알려진 SINmu이다.
몇몇 구현예들에서, 수지상 세포에 전달될 폴리뉴클레오타이드는 목적 단백질을 인코딩하는 유전자, siRNA를 인코딩하는 유전자, 및 목적 마이크로RNA를 인코딩하는 유전자 중 적어도 하나를 포함한다. 목적 단백질을 인코딩하는 유전자는 종양 항원 또는 HIV 항원과 같은 항원을 인코딩할 수 있다.
재조합 바이러스는 전달될 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 바이러스 벡터 및 표적화 분자를 인코딩하는 유전자를 포함하는 벡터로 패키징 세포주를 형질감염시키는 단계; 상기 형질감염된 패키징 세포주를 배양하는 단계; 및 상기 패키징 세포 배양으로부터 재조합 바이러스를 회수하는 단계에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 몇몇 구현예들에서, 폴리뉴클레오타이드는 시험관 내(in vitro)에서 수지상 세포에 전달되나, 다른 구현예들에서, 폴리뉴클레오타이드는 생체 내(in vivo)에서 개체의 수지상 세포에 전달된다. 개체는 일반적으로 인간, 마우스 또는 기니피그와 같은 포유동물이다.
다른 양상에서, 본 발명은 목적 폴리뉴클레오타이드; 및 DC-SIGN과 결합하는 표적화 분자를 포함하는 재조합 바이러스를 제공한다. 몇몇 구현예들에서, 상기 표적화 분자는 특이적으로 DC-SIGN과 결합한다. 재조합 바이러스는 HIV 게놈 유래의 서열들과 같은 렌티바이러스 게놈 유래의 서열들을 포함할 수 있다. 다른 구현예들에서, 재조합 바이러스는 마우스 줄기세포 바이러스 (MSCV) 게놈 또는 뮤린 백혈병 바이러스 (MLV) 게놈 유래의 서열들과 같은 감마레트로바이러스 게놈 유래의 서열들을 포함할 수 있다.
표적화 분자는 신드비스 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 라사열 바이러스, 진드기 매개 뇌염 바이러스, 뎅기 바이러스, B형 간염 바이러스, 광견병 바이러스, 셈리키 포레스트 바이러스, 로스 리버 바이러스, 아우라 바이러스, 보르나병 바이러스, 한탄 바이러스, 및 SARS-CoV 바이러스로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 바이러스로부터 유래된 바이러스 당단백질을 포함할 수 있다. 몇몇 구현예들에서, 표적화 분자는 신드비스 바이러스로부터 유래된 바이러스 당단백질일 수 있다. 특정 구현예들에서, 표적화 분자는 SVGmu(서열번호 11)일 수 있다.
폴리뉴클레오타이드는 예를 들어, 목적 단백질을 인코딩하는 유전자, siRNA를 인코딩하는 유전자, 및 목적 마이크로RNA를 인코딩하는 유전자 중 적어도 하나일 수 있다. 몇몇 구현예들에서, 폴리뉴클레오타이드는 종양 항원 또는 HIV 항원과 같은 항원을 인코딩한다.
다른 양상에서, 본 발명은 포유동물의 면역반응을 자극하는 방법들을 제공한다. 수지상 세포들이 폴리뉴클레오타이드 및 DC-SIGN과 결합하는 표적화 분자를 포함하는 재조합 바이러스와 접촉함으로써 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 DC-SIGN을 발현하는 수지상 세포들에 전달되어 원하는 면역반응이 일어난다. 몇몇 구현예들에서, 표적화 분자는 DC-SIGN에 특이적이고, 다른 분자들과는 뚜렷하게 결합하지 않는다. 다른 구현예들에서, 표적화 분자는 우선적으로 DC-SIGN과 결합한다.
다른 양상에서, 본 발명은 DC-SIGN과 결합하는 표적화 분자를 인코딩하는 벡터들을 제공한다. 몇몇 구현예들에서, 표적화 분자는 변형된 바이러스 당단백질일 수 있다. 다른 구현예들에서, 표적화 분자는 SVGmu (서열번호 11)일 수 있다. 몇몇 구현예들에서, 표적화 분자는 특이적으로 DC-SIGN과 결합한다. 벡터는 추가로 항원을 인코딩하는 유전자 및/또는 수지상 세포 성숙 인자를 인코딩하는 유전자와 같은 하나 또는 그 이상의 목적 유전자를 인코딩할 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 질환을 갖는 환자의 치료방법들을 제공한다. 재조합 바이러스가 환자에게 투여되는데, 상기 재조합 바이러스는 질환과 관련된 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 DC-SIGN과 결합하는 표적화 분자를 포함한다. 표적화 분자는 바이러스 당단백질로부터 유래될 수 있다. 몇몇 구현예들에서, 표적화 분자는 SVGmu (서열번호 11)일 수 있다.
알려지거나 또는 동정될 수 있는 항원에 대하여 치료되는 질환은 일반적으로 하나이다. 본 발명의 몇몇 구현예들에서, 치료되는 질환은 암이다. 다른 구현예들에서, 질환은 HIV/AIDS이다.
또한, 본 발명은 목적 폴리뉴클레오타이드 및 DC-SIGN과 결합하는 표적화 분자를 포함하는 재조합 바이러스에 의해 형질도입된 수지상 세포들을 제공한다. 몇몇 구현예들에서, 상기 표적화 분자는 신드비스 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 라사열 바이러스, 진드기 매개 뇌염 바이러스, 뎅기 바이러스, B형 간염 바이러스, 광견병 바이러스, 셈리키 포레스트 바이러스, 로스 리버 바이러스, 아우라 바이러스, 보르나병 바이러스, 한탄 바이러스, 및 SARS-CoV 바이러스로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 바이러스로부터 유래된 바이러스 당단백질을 포함한다. 몇몇 구현예들에서, 표적화 분자는 SVGmu (서열번호 11)일 수 있다.
또한, 본 발명은 수지상 세포들이 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 DC-SIGN과 결합하는 표적화 분자를 포함하는 재조합 바이러스와 접촉하여 DC-SIGN을 발현하는 수지상 세포들에 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 전달함으로써 포유동물을 면역시키는 방법들을 제공한다. 몇몇 구현예들에서, 수지상 세포들은 생체 외(ex vivo)에서 재조합 바이러스와 접촉한다. 다른 구현예들에서, 수지상 세포들은 생체 내에서 재조합 바이러스와 접촉한다.
또한, 본 발명의 방법들은 폴리뉴클레오타이드 및 DC-SIGN과 결합하는 표적화 분자를 포함하는 재조합 바이러스를 사용하여 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 수지상 세포들에 전달함으로써 포유동물의 특이적 항원에 대한 면역반응을 자극하는 데 사용될 수 있다. 면역반응은 폴리뉴클레오타이드의 제공에 의해 조절될 수 있는데, 수지상 세포에서 발현되는 폴리뉴클레오타이드는 면역반응을 조절할 수 있다. 예를 들어, 수지상 성숙 인자를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 전달될 수 있다.
<발명의 상세한 설명>
유전공학은 수지상 세포들 (DCs)을 항원-특이적 면역반응들을 유도하는 특정 면역세포들로 전환하는 데 효율적이면서 강력한 수단으로 여겨져 왔다. 암, HIV 및 다른 질환들에 대한 백신접종/면역요법을 위해 DCs의 시험관 내 조작과 관련하여 많은 연구들이 수행되어 왔다. 그러나, 지금까지, 시험관 내 및 생체 내에서 항원을 인코딩하는 유전자와 같은 목적 유전자를 수지상 세포들에 특이적이면서도 효율적으로 전달하는 일은 쉽지 않았다. 본 발명자들은 시험관 내 및 생체 내에서 DCs를 효율적이면서도 특이적으로 표적화하는 신규한 방법 및 조성물을 발견하였다. 상기 방법 및 조성물은 예를 들어 면역치료를 위해 항원-특이적 면역반응들을 유도하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 구현예들은 폴리뉴클레오타이드를 DCs에 전달하는 재조합 바이러스를 사용함으로써 수지상 세포들 (DCs)을 표적화하는 방법 및 조성물을 포함한다. 이는 바람직하게 DC-특이적 표면분자인 DC-SIGN (Dendritic Cell Specific ICAM-3 (Intracellular Adhesion Molecules 3)-Grabbing Nonintegrin; CD209로도 알려짐)을 표적화함으로써 수행된다. DC-SIGN은 물질들과 빠르게 결합하여 엔도시토시스를 할 수 있는 C-형 렉틴-유사 수용체(C-type lectin-like receptor)이다 (Geijtenbeek, T.B., et al. 2004. Annu. Rev. Immunol. 22: 33-54, 이는 그 전체가 본원에 참고로 편입된다). 바람직한 구현예들에서, 재조합 바이러스들은 DC-SIGN을 특이적으로 인식하도록 설계된 표적화 분자에 의해 싸여 있다. 폴리뉴클레오타이드는 목적 유전자, siRNA(들), 및/또는 마이크로RNA(들)를 포함할 수 있으나, 반드시 이들로 제한되는 것은 아니다. 바람직한 구현예들에서, 폴리뉴클레오타이드는 항원을 인코딩한다. 몇몇 구현예들에서, 재조합 바이러스는 하나 이상의 유전자를 DCs에 전달한다. 예를 들어, 둘 이상의 항원들을 인코딩하는 유전자들이 전달될 수 있다. 하나의 유전자보다 많은 전달이 예를 들어, 내부 리보좀 엔트리 부위 (Internal Ribosome Entry Site, IRES), 및/또는 2A 서열들로 유전자들을 연결하고 단일 프로모터/인핸서를 사용하여 발현을 유발함으로써 달성될 수 있다.
하기에서 보다 상세히 기술하는 바와 같이, 본 발명의 구현예들은 렌티바이러스들 및 감마레트로바이러스들과 같은 재조합 바이러스들의 사용과 관련되는데, 이는 이러한 바이러스들이 그들의 외피 내로 바이러스-생산 세포들(virus-producing cells)의 표면에 있는 많은 단백질들을 삽입할 수 있기 때문이다. 그러나, 하기에서 기술하는 바와 같이, 다른 유형의 바이러스들도 사용될 수 있으며, 그에 따라 방법들도 변형될 수 있다. 일반적으로, 패키징 세포주(packaging cell line)는 목적 폴리뉴클레오타이드를 인코딩하는 바이러스 벡터 (일반적으로, 항원을 인코딩하는), 바이러스 패키징 요소들을 인코딩하는 적어도 하나의 플라스미드 (gag 및 pol과 같은) 및 수지상 세포들과 결합하도록 설계된 표적화 분자에 의해 형질감염된다. 바람직한 구현예들에서, 표적화 분자는 수지상 세포들의 세포 표면 마커인 DC-SIGN과 특이적으로 결합하도록 유전적으로 설계된다. 바이러스가 버딩(budding)하는 동안, 패키징 세포막에서 발현되는 표적화 분자는 바이러스 외피 내로 삽입된다. 결과적으로, 레트로바이러스 입자들은 목적 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 코어 및 그의 표면에 표적화 분자를 포함하는 외피를 포함한다.
표적화 분자는 수지상 세포 상의 DC-SIGN과 결합 가능하고, 바이러스는 수지상 세포에 목적 유전자를 전달할 수 있다. 이론에 의해 뒷받침되는 것은 아니지만, 상기 결합은 엔도시토시스를 유도하여, 바이러스를 엔도좀으로 만들고, 막 융합을 일으켜서 바이러스 코어가 사이토졸(cytosol)로 들어가는 것으로 여겨진다. 이어서 역전사가 일어나서 생성물이 핵으로 이동하고, 바이러스의 게놈이 표적 세포 게놈 내로 통합되어, 목적 폴리뉴클레오타이드가 표적 세포의 게놈 내로 삽입된다. 이어서 DC는 목적 폴리뉴클레오타이드를 발현한다 (일반적으로 항원을 인코딩). 이어서 상기 항원은 가공되고, DCs에 의해 T 및 B 세포들에 제시되어, 항원-특이적 면역반응을 일으킨다. 수지상 세포가 항원-특이적 면역반응을 자극할 수 있는 동안은 상술한 특이적 경로가 요구되지 않는다.
본 발명의 구현예들은 시험관 내 및 생체 내 둘 다에서 DCs에 목적 유전자를 직접적으로 표적화하기 위한 방법 및 조성물을 포함한다. 몇몇 바람직한 생체 내 구현예들에서, 목적 유전자는 시험관 내에서 DCs를 배양하지 않고 DCs에 전달된다. 예를 들어, 목적 유전자는 살아있는 개체에게 표적 바이러스를 직접 투여함으로써 DCs에 전달될 수 있다. 목적 유전자는 바람직하게 원하는 면역반응에 대한 항원을 인코딩한다. 항원들의 예로는 종양 특이적 항원들, 종양-관련 항원들, 조직-특이적 항원들, 박테리아 항원들, 바이러스 항원들, 이스트 항원들, 진균성 항원들, 원생동물 항원들, 기생충 항원들 및 미토겐 등을 들 수 있다. 다른 항원들은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 명백할 것이며, 과도한 실험 없이 사용될 수 있다.
본원에 개시된 방법들이 DCs에 특이적이거나 또는 원하는 특이성을 제공하도록 조작될 수 있는 표적화 분자들을 사용하는데 쉽게 선택될 수 있다. 표적화 분자는 바람직하게 수지상 세포들이 DC-SIGN과 결합하고, 수지상 세포들 내로 목적 유전자의 전달을 용이하게 하는 설계된 바이러스 당단백질이다. 표적화 분자들의 예는 신드비스 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 라사열 바이러스, 진드기 매개 뇌염 바이러스, 뎅기 바이러스, B형 간염 바이러스, 광견병 바이러스, 셈리키 포레스트 바이러스, 로스 리버 바이러스, 아우라 바이러스, 보르나병 바이러스, 한탄 바이러스, 및 SARS-CoV 바이러스에서 유래된 당단백질들을 포함하나, 반드시 이들로 제한되는 것은 아니다. 표적화 분자는 바람직하게 막 결합(membrane bound)된다. 필요 시, 재조합 바이러스에 사용하기 위해 바이러스 당단백질로부터 유래되거나 설계된 DC-SIGN-특이적 표적화 분자는 막 결합 형태로 변형될 수 있다.
본 발명이 속하는 기술 분야에 알려진 임의의 방법들이 표적화 분자가 원하는 특이성을 갖도록 설계하는데 사용될 수 있다. 방법들의 예는 래이셔널 단백질 가공(rational protein engineering) 및 DNA 셔플링(DNA shuffling)을 포함하나, 반드시 이들로 제한되는 것은 아니다. 일반적으로, DCs에 특이적으로 표적화 분자를 설계하기 위해, 수지상 세포-특이적 표면 마커와 상호작용하는 바이러스 당단백질이 제공된다. 바람직하게, 바이러스 당단백질은 DC-SIGN과 상호작용한다. 바이러스 당단백질은 적어도 DCs 이외의 다른 세포 유형에서 발현되는 예를 들어, 헤파린 설페이트 (HS)와 같은 제2 세포 표면 마커와 상호작용할 수 있다. 바이러스 당단백질은 C-특이적 표면 마커와 상호작용하는 능력이 유지되면서도 추가의 세포 표면 마커들과 상호작용하는 능력이 감소되거나 제거되도록 변형된다. 변형은 바이러스 당단백질 아미노산 서열의 적어도 하나의 잔기가 돌연변이(mutation)될 수 있다. 돌연변이는 잔기의 결실(deletion), 부가(addition) 또는 치환일 수 있고, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에 알려진 표준 방법들에 의해 수행될 수 있다. 원하는 특이성이 쉽게 확인될 수 있다. 예를 들어, 바이러스 당단백질이 변형되면, 리포터 유전자를 포함하는 바이러스 벡터 및 적어도 하나의 바이러스 패키징 요소들을 인코딩하는 플라스미드를 패키징 세포주 내로 공형질감염(co-transfection)시켜 재조합 바이러스를 제조하는 데 사용될 수 있다. 바이러스가 버딩(budding)하는 동안, 당단백질은 바이러스 외피 내로 삽입된다. 바이러스는 DCs를 포함하는 세포들의 혼합 집단과 마찬가지로 DCs의 양쪽 순수한 집단을 형질감염시키는데 사용될 수 있고, DCs의 바이러스 형질 도입의 특이성은 다른 세포 유형들의 상당한 범위는 아니나 DCs의 리포터 유전자의 발현에 대해서 세포들을 분석함으로써 확인될 수 있다. 특이성이 충분히 스트린전트(stringent)하지 않은 경우 (예를 들어, 다른 세포 유형들의 원하지 않는 감염 수준이 관찰되는 경우), 바이러스 당단백질은 원하는 특이성이 달성될 때까지 추가로 변형되고 기술된 바와 같이 분석될 수 있다.
본 발명의 구현예들은 항원들과 관련하여 DC 활성인자들 및/또는 성숙 인자들의 DCs로의 전달을 포함한다. DC 활성인자들 및 성숙 인자들의 예는 자극 분자, 시토카인, 케모카인, 항체와 Flt-3 리간드와 같은 다른 작용제를 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 　예를 들면, DC 성숙 인자는 다음 중 적어도 하나를 포함할 수 있다: GM-CSF, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15, IL-21, IL-23, TNFα, B7.1, B7.2, 4-1BB, CD40 리간드 (CD40L) 및 약물-유도성 CD40 (iCD40) (Hanks, B.A., et al. 2005. Nat Med 11:130-137, 이는 참조로서 본원에 포함된다).
본 발명의 구현예들은 또한 상술한 바와 같이 예를 들어, T 세포반응들 (세포성 면역반응들) 및 B 세포반응들 (체액성 면역반응들)과 같은 항원-특이적 면역반응들을 자극하도록 재조합 바이러스 또는 재조합 바이러스에 의해 감염된 DCs를 환자에게 투여하는 것과 관련된 방법 및 조성물을 포함한다. 예를 들어, 활성화 CD4 T 세포들은 항원-특이적 반응에서 CD8+ 세포독성 T 세포들 및 B 세포들을 조절하고 조정할 수 있다. 바람직한 구현예들에서, 재조합 바이러스 및/또는 재조합 바이러스에 의해 감염된 DCs는 암과 AIDS/HIV와 같은 질환 (이에 한정되는 것은 아님)의 예방과 치료를 위해 면역 반응을 자극하는데 사용된다. 신생물 질환, 전염병 및 면역 관련 질환 (이에 한정되는 것은 아님)을 포함하는 어떤 질환도 특정 항원에 대한 면역 반응으로 효과적으로 치료될 수 있다.
본원에서 기술된 것처럼, DCs 안으로 특정 항원들을 인코딩하는 유전자들을 제공하기 위한 재조합 바이러스를 지시하는데 사용될 수 있는 방법 및 조성물의 발견의 결과가 된 연구가 수행되었다. 　생산적 면역 반응을 도출하기 위한 DCs의 유전자 변형은 질환의 예방과 치료에 사용될 수 있고, 강력한 항체 생산뿐 아니라 효과적 T 세포 면역을 유도하는 효과적인 방법을 제공한다. 본원에서 기술된 방법 및 조성물은 원하는 항원으로 면역화하는 강력한 수단을 제공할 수 있다. 그러한 면역요법은 암과 AIDS/HIV와 같은 질환을 예방하고 치료할 수 있다. 　
정의
본원에 달리 규정하지 않는 한, 본원에 사용된 기술 및 과학 용어는 일반적으로 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 이해된 것과 동일한 의미를 가진다. 　예를 들어, Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 1994); Sambrook et al, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, NY 1989) 참조. 　 본원에서 기술된 임의의 방법, 장치 및 그와 비슷하거나 동등한 물질은 본 발명의 실시에 이용될 수 있다. 　
본원에 사용된, 용어 핵산, 폴리뉴클레오타이드 및 뉴클레오타이드는 호환되며, 포스포디에스테르 링키지(linkage) 또는 포스포트리에스테르, 포스포라미데이트, 실록산, 카보네이트, 카르복시메틸에스테르, 아세트아미데이트, 카르바메이트, 티오에테르, 브릿지된(bridged) 포스포라미데이트, 브릿지된 메틸렌 포스포네이트, 브릿지된 포스포라미데이트, 브릿지된 포스포라미데이트, 브릿지된 메틸렌 포스포네이트, 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트, 포스포로디티오에이트, 브릿지된 포스포로티오에이트와 같은 변형된 링키지 및 상기 링키지들의 조합으로 구성된 임의의 핵산을 의미한다.
용어 핵산, 폴리뉴클레오타이드 및 뉴클레오타이드는 또한 특이적으로 다섯 개의 생물학적 발생 염기 (아데닌, 구아닌, 티민, 시토신 및 우라실) 이외의 염기들로 구성되는 핵산을 포함한다.
본원에서는 핵산 분자가 실질적으로 다른 폴리펩타이드들을 인코딩하는 불순(contaminant) 핵산 분자들로부터 분리된 경우의 핵산 분자를 "고립된(isolated)"이라고 한다.
"면역(Immunization)"은 숙주에 대한 항원의 제공을 의미한다. 몇몇 구현예들에서, 항원은 수지상 세포들과 같은 항원-제시 세포들에 제공된다. 후술하는 바와 같이, 항원을 인코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 바이러스는 수지상 세포들 상의 DC-SIGN에 특이적인 친화 분자를 가지며, 수지상 세포들을 표적화할 수 있다. 따라서 면역 반응이 원하는 항원이 수지상 세포들에게 전달될 수 있다. 다른 면역요법들은 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있다. 　
용어 "면역학적(immunological)" 또는 "면역(immune)" 반응은 수용 환자의 아밀로이드 펩타이드에 대항하여 지시된 유용한 체액성 (항체 매개) 및/또는 세포성 (항원-특이적 T 세포 또는 그들의 분비 산물에 의해 매개) 반응의 경과이다. 그러한 반응은 면역원의 투여에 의해 유도되는 활성 반응 또는 항체 또는 프라이밍된(primed) T-세포의 투여에 의해 유도되는 수동 반응(passive response)일 수 있다. 세포성 면역 반응은 항원-특이적 CD4+ T 헬퍼 세포 및/또는 CD8+ 세포독성 T 세포를 활성화하기 위해 Class I 또는 Class II MHC 분자와 관련된 폴리펩타이드 에피토프의 제시에 의해 도출된다. 반응은 또한 단핵구, 마크로파지, NK 세포, 호염기구(basophils), 수지상 세포, 성상 세포(astrocytes), 소교 세포(microglia cell), 호산구(eosinophils) 또는 선천적 면역계의 다른 성분의 활성화를 포함할 수 있다. 세포 매개 면역학적 반응의 존재는 증식 분석(CD4+ T 세포) 또는 CTL (cytotoxic T lymphocyte) 분석 (Burke et al., J. Inf. Dis. 170, 1110-19 (1994))에 의하거나, 항원-의존적 킬링(antigen-dependent killing)에 의하거나(cytotoxic T lymphocyte assay, Tigges et al., J. Immunol. 156, 3901-3910), 또는 사이토킨 분비에 의해 결정될 수 있다. 면역원의 예방 또는 치료 효과에 대한 체액성 및 세포성 반응의 상대적인 기여의 정도는 면역화된 유전적으로 동일한 동물로부터 IgG 및 T-세포들을 개별적으로 고립시키고 제2 개체에서 예방 또는 치료 효과를 측정함으로써 구별될 수 있다. 　
"면역원성 약제(immunogenic agent)" 또는 "면역원(immunogen)"은 선택적으로 아쥬반트(adjuvant)와 함께, 환자에게 투여 시 그 자체에 대하여 면역학적 반응을 유도할 수 있다. 　
용어 "아쥬반트(adjuvant)"는 항원과 함께 투여 시에는 항원에 대한 면역반응을 증대시키고, 개선시키고/거나 상승시키지만, 단독으로 투여 시에는 항원에 대한 면역 반응을 일으키지 않는 화합물을 의미한다. 아쥬반트는 단일 조성물로서 본 발명의 재조합 바이러스와 함께 투여되거나, 본 발명의 재조합 바이러스의 투여 전에 투여되거나, 본 발명의 재조합 바이러스의 투여와 동시에 투여되거나, 본 발명의 재조합 바이러스가 투여된 후에 투여될 수 있다. 아쥬반트는 림프구 모집(lymphocyte recruitment), B 및/또는 T 세포의 자극, 그리고 마크로파지의 자극을 포함하여 여러 메커니즘에 의해 면역 반응을 개선할 수 있다. 　
"항체들(Antibodies)" (Abs) 및 "면역글로불린들(immunoglobulins)" (Igs)은 동일한 구조적인 특성을 갖는 당단백질이다. 　항체가 특이적 면역원에 대해 결합 특이성을 나타내면서도, 면역글로불린은 항원 특이성이 결여된 항체 및 다른 항체-유사 분자 모두를 포함한다. 　후자의 폴리펩타이드는 예를 들어, 림프계에서는 저농도, 그리고 골수종에서는 고농도로 생산된다.
용어 "항체(antibody)"는 가장 광범위한 의미로 사용되고, 구체적으로 인간, 비-인간 (예컨대, 뮤린), 키메릭, 및 인간화 단일클론항체들 (전장 단일클론항체들 포함), 다클론항체들, 다중-특이적 항체들 (예컨대, 양특이적 항체들), 단일-사슬 항체들, 및 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 항체의 단편들을 포함한다.
용어 "에피토프(epitope)" 또는 "항원 결정기(antigenic determinant)"는 B 및/또는 T 세포들이 반응하는 항원 상의 부위를 의미한다. B-세포 에피토프들은 단백질의 3차 폴딩(tertiary folding)에 의해 병렬된 연속 아미노산(contiguous amino acids) 또는 불연속 아미노산(noncontiguous amino acids) 모두로부터 형성될 수 있다. 　3차 폴딩(tertiary folding)에 의해 형성된 에피토프들은 일반적으로 변성 용매로 처리하는 것이 효과가 없는 반면, 연속 아미노산으로부터 형성된 에피토프들은 일반적으로 변성 용매에 노출 시 유지된다. 에피토프는 일반적으로 고유한 공간 구조(spatial conformation)에 적어도 3, 및 통상적으로, 적어도 5 또는 8-10 아미노산들을 포함한다. 에피토프들의 공간 구조 결정 방법은 예를 들어, X-레이 결정학(x-ray crystallography)과 2-차원 핵자기공명(2-dimensional nuclear magnetic resonance)을 포함한다. 　예컨대, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed. (1996) 참조. 동일한 에피토프를 인식하는 항체들은 표적 항원에 또 다른 항체의 결합을 차단하도록 하나의 항체의 능력을 보여주는 단순 면역 검정방법(simple immunoassay)에서 확인될 수 있다. T-세포는 CD8 세포에 대해 약 9 아미노산 또는 CD4 세포에 대해 약 13-15 아미노산의 연속 에피토프를 인식한다. 에피토프에 대한 반응에서 프라이밍된 T 세포에 의해 3H-티미딘 편입(3H-thymidine incorporation)에 결정된 것처럼, 　에피토프를 인식하는 T 세포는 항원-의존적 증식(antigen-dependent proliferation)을 측정하는 시험관 내 분석에 의해 확인될 수 있다 (상술한 Burke 및 Tiggesm 참조). 　
"표적 세포들(Target cells)"은 폴리뉴클레오타이드를 거기에 전달하거나 또는 원하는 목적 유전자를 그 안에서 발현하게 하는 임의의 세포들이다. 바람직하게, 표적 세포들은 수지상 세포들이고, DC-SIGN을 발현하는 특정의 수지상 세포들이다.
용어 "포유동물(mammal)"은 포유동물문(class Mammalia)에 속하는 개체로 정의되며, 인간, 가축 및 농장 동물, 및 양, 개, 말, 고양이와 암소와 같은 동물원, 스포츠 및 애완동물을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
용어 "개체(subject)" 또는 "환자(patient)"는 예방 또는 치료를 받는 인간 및 다른 포유동물의 개체들을 포함한다.
본원에서 사용된, "치료(treatment)"는 치료 또는 예방될 수 있는 임상 개입(clinical intervention)을 의미한다. 　치료에 이용 시, 약제학적 조성물 또는 약제는 그러한 질환으로 의심되거나 또는 고통받는 환자에게 그러한 질환과 그의 합병증의 증상을 치료하거나, 또는 적어도 부분적으로 그러한 증상을 저지하기에 충분한 양으로 투여된다. 예방에 이용 시, 약제학적 조성물 또는 약제는 특정 질환에 영향받기 쉽거나 또는 어떤 다른 위험이 있는 환자에게 그러한 위험을 제거하거나 감소시키거나 또는 그러한 질환의 시작을 지연시키기에 충분한 양으로 투여된다. 이를 수행하기에 적절한 양은 치료학적으로 또는 약제학적으로 효과적 투여량으로 제한된다. 　그러한 양은 단일 용량으로서 투여되거나, 또는 효과적인 투여 계획에 따라 투여될 수 있다. 　그러한 양은 질환을 치료할 수 있지만, 일반적으로 질환의 증상을 개선하거나 또는 질환 또는 장애의 예방을 초래하도록 투여된다. 치료 및 예방 모두의 투여 계획에서, 약제는 보통 충분한 면역 반응이 달성될 때까지 여러 용량으로 투여된다. 일반적으로, 면역 반응이 모니터링되고, 반복 용량은 면역 반응이 감소되기 시작하면 주어진다. 　"치료(Treatment)"는 완전히 질환을 제거할 필요도 없으며, 개체가 질환 또는 장애로 병이 드는 것을 완전히 막을 필요도 없다.
본원에 사용된, "종양(Tumor)"은 모든 신생물성 세포 성장(neoplastic cell growth)과 증식, 악성이든지 양성이든지, 모든 전구암(pre-cancerous) 및 암세포 및 조직을 의미한다.
용어 "암(cancer)"은 조절되지 않은 세포 성장(unregulated cell growth)을 특징으로 하는 질환 또는 장애를 의미한다. 　암의 예는 암종(carcinoma), 림프종(lymphoma), 모세포종(blastoma) 및 육종(sarcoma)을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 구체적인 암의 예는 폐암, 대장암, 유방암, 고환암, 위암, 췌장암, 난소암, 간암, 방광암, 직장결장암 및 전립선암을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 추가로 암은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 잘 알려진 다음의 것들을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다: 백혈병, 림프종, 자궁 경부암, 신경교종 종양, 선암과 피부암. 　암의 예는 다른 암종 및 육종뿐 아니라, 방광 종양, 가슴 종양, 전립선 종양, 기저 세포 암종, 담도암, 방광암, 골암, 뇌와 CNS 암 (예컨대, 신경교종 종양), 자궁 경부암, 융모암, 결장 및 직장암, 결합조직암, 소화계의 암; 내막암, 식도암; 안암; 머리와 목의 암; 위암; 상피 내 종양; 신장암; 후두암; 백혈병; 간암; 폐암 (예컨대, 작은 세포와 비 작은 세포); Hodgkin과 Non-Hodgkin의 림프종을 포함한 림프종; 흑생종; 골수종, 신경모세포종, 구강암 (예컨대, 입술, 혀, 입, 및 인두); 난소암; 췌장암, 망막모세포종; 횡문근육종; 직장암, 신암, 호흡계의 암; 육종, 피부암; 위암, 고환암, 갑상선암; 자궁암, 비뇨기계의 암을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 암은 또한 본 발명이 속하는 기술분야에 알려진 포유 동물의 종양 신생과 악성 질환을 포함한다. 　
"벡터(vector)"는 또 다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산이다. 　벡터는 예를 들어 플라스미드, 코스미드 또는 파지일 수 있다. 　 "발현 백터(expression vector)"는 그것이 적절한 환경에 존재할 때 벡터에 의해 옮겨진 하나 이상의 유전자에 의해 인코딩된 단백질 또는 단백질들의 발현을 지시할 수 있는 벡터이다. 　
용어 "조절 요소(regulatory element)"와 "발현 조절 요소(expression control element)"는 호환하여 사용되고, 특별한 환경에서 작동 가능하게 연결된 코딩서열의 전사 및/또는 번역에 영향을 미칠 수 있는 핵산 분자들을 의미한다. 이러한 용어는 넓게 사용되고, 프로모터, RNA 중합 효소 및 전사 인자의 기본 상호 작용에 필요한 핵심 요소들, 업스트림 요소들, 인핸서, 및 반응 요소들을 포함하여, 전사를 촉진하거나 또는 조절하는 모든 요소들을 포함한다 (예컨대, Lewin, "Genes V" (Oxford University Press, Oxford) pages 847-873 참조). 원핵생물의 조절 요소의 예는 프로모터, 오퍼레이터 서열(operator sequences) 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 　진핵 세포에 사용되는 조절 요소는, 프로모터, 인핸서, 스플라이싱 신호(splicing signals) 및 폴리아데닐화 신호(polyadenylation signals)를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 　
용어 "형질감염(transfection)"은 숙주 세포 안으로 핵산의 도입을 의미한다.
"레트로바이러스들(Retroviruses)"은 RNA 게놈을 갖는 바이러스들이다.
"렌티바이러스(Lentivirus)"는 분열 및 비분열 세포를 감염시킬 수 있는 레트로바이러스 속을 의미한다. 렌티바이러스의 여러 예는 HIV (인간 면역결핍 바이러스 : HIV 타입 1 및 HIV 타입 2를 포함), 인간 후천성 면역 결핍증 (AIDS)의 병인체(etiologic agent); 양에서 뇌염 (비즈나) 또는 폐렴 (메디)의 원인이 되는 비즈나-마에디(visna-maedi), 염소에서 면역 결핍, 관절염과 뇌질환의 원인이 되는 카프린 관절염-뇌염 바이러스(caprine arthritis-encephalitis virus); 말에서 자가 면역성 용혈성 빈혈 및 뇌질환의 원인이 되는 말 전염성 빈혈 바이러스(equine infectious anemia virus); 고양이에서 면역계 결핍의 원인이 되는 고양이 면역 부전 바이러스 (feline immunodeficiency virus, FIV); 소에서 림프절증(lymphadenopathy), 림프구증가증(lymphocytosis)과 가능한 중추 신경계 감염의 원인이 되는 소 면역계 결핍 바이러스 (bovine immune deficiency virus, BIV); 및 인간 이하 영장류에서 면역계 결핍과 뇌질환의 원인이 되는 유인원의 면역 결핍 바이러스 (simian immunodeficiency virus, SIV)를 포함한다.
렌티바이러스 게놈은 일반적으로 5' 장말단반복체 (LTR), gag 유전자, pol 유전자, env 유전자, 부가의 유전자들 (nef, vif, vpr, vpu)과 3' LTR로 구성된다. 바이러스 LTR은 U3, R와 U5로 불리는 3개 영역으로 구획된다. 　U3 영역은 인핸서와 프로모터 요소를 포함한다. 　U5 영역은 폴리아데닐레이션 신호를 포함한다. R (반복) 영역은 U3과 U5 영역을 분리하고, 전사된 R 영역의 서열은 바이러스 RNA의 5' 및 3' 말단 모두에 나타난다. 예를 들어, "RNA Viruses: A Practical Approach" (Alan J. Cann, Ed., Oxford University Press, (2000)), O Narayan and Clements J. Gen. Virology 70:1617-1639 (1989), Fields et al. Fundamental Virology Raven Press. (1990), Miyoshi H, Blomer U, Takahashi M, Gage FH, Verma IM. J Virol. 72(10):8150-7 (1998), 및 미국특허 제6,013,516호 참조.
"감마레트로바이러스(Gammaretrovirus)"는 레트로바이러스과의 하나의 속을 의미한다. 감마레트로바이러스의 예는 마우스 줄기 세포 바이러스, 뮤린 백혈병 바이러스, 고양이 백혈병 바이러스, 고양이 사코마바이러스, 및 조류 세망내피증 바이러스를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 　
본원에 사용된 "하이브리드 바이러스(hybrid virus)"는 비-레트로바이러스 벡터들, 예를 들어, 아데노바이러스-레트로바이러스 하이브리드의 요소들을 포함하여, 하나 이상의 다른 바이러스 벡터의 요소들을 갖는 바이러스를 의미한다. 본원에서 사용된 레트로바이러스 요소를 갖는 하이브리드 벡터는 레트로바이러스의 범위 내의 것으로 고려된다.
본원에서 사용된 "비리온(Virion)", "바이러스 입자(viral particle)" 및 "레트로바이러스 입자(retroviral particle)"는 RNA 게놈, pol 유전자 유래 단백질, gag 유전자 유래 단백질 및 외피(당) 단백질을 나타내는 지질 이중층을 포함하는 하나의 바이러스를 의미한다. RNA 게놈은 보통 재조합 RNA 게놈이므로, 본래 바이러스성 게놈에 외인성인 RNA 서열을 포함할 수 있다. 　RNA 게놈은 또한 결함이 있는 내인성 바이러스 서열(defective endogenous viral sequence)을 포함할 수 있다. 　
"슈도타입화된(pseudotyped)" 레트로바이러스는 RNA 게놈 유래의 바이러스 이외의 바이러스로부터 유래된 외피 단백질을 갖는 레트로바이러스 입자이다. 외피 단백질은 예를 들어, 다양한 레트로바이러스로부터 또는 비레트로바이러스성 근원으로부터 유래될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 외피 단백질은 본원에서 기술된 바와 같이, 본래 외피 단백질 또는 변형되거나 돌연변이되거나 설계된 외피 단백질일 수 있다. 　몇몇 구현예들에서, 외피 단백질은 다음 중 하나의 당단백질에서 유래된 DC-SIGN-특이적 바이러스 당단백질이다: 신드비스 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 라사열 바이러스, 진드기 매개 뇌염 바이러스, 뎅기 바이러스, B형 간염 바이러스, 광견병 바이러스, 셈리키 포레스트 바이러스, 로스 리버 바이러스, 아우라 바이러스, 보르나병 바이러스, 한탄 바이러스, 및 SARS-CoV 바이러스.
본원에서 사용된 "형질전환(Transformation)"은 외인성 DNA가 표적 세포로 들어가는 과정을 의미한다. 　형질전환은 원핵 또는 진핵 숙주 세포 내로 외래 핵산 서열을 삽입하는 임의의 알려진 방법에 의하고, 바이러스의 감염, 일렉트로포레이션(electroporation), 열 충격, 리포펙션(lipofection), 및 입자 충격(particle bombardment)을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. "형질전환된(Transformed)" 세포는 삽입된 핵산이 자율적으로 복제 플라스미드로서 또는 숙주 염색체의 일부로서 복제될 수 있는 안정하게 형질전환된 세포를 포함한다. 　또한, 일시적으로 목적 유전자를 발현하는 세포들도 포함된다. 　
본원에서 사용된 "융합생성 분자(fusogenic molecule)"는 바이러스의 표면 위에 존재 시 막 융합을 일으킬 수 있고, 바이러스 코어가 막을 통과하고, 일반적으로 표적 세포의 사이토졸로 들어가게 하는 임의의 분자이다. 융합생성 분자는 예를 들어, 바이러스 당단백질일 수 있다. 　융합생성 분자로 고려될 수 있는 바이러스 당단백질의 예는 다음과 같은 바이러스로부터 유래된 헤마글루티닌, 돌연변이에 의한 헤마글루티닌, SIN 및 바이러스 당단백질을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다: 신드비스 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 라사열 바이러스, 진드기 매개 뇌염 바이러스, 뎅기 바이러스, B형 간염 바이러스, 광견병 바이러스, 셈리키 포레스트 바이러스, 로스 리버 바이러스, 아우라 바이러스, 보르나병 바이러스, 한탄 바이러스, 및 SARS-CoV 바이러스.　 당단백질은 자연형이거나 원하는 활성을 갖도록 변형될 수 있다. 　
"트랜스유전자(transgene)"는 본 발명의 방법에 의해서와 같이, 인간 개입에 의해 숙주 세포의 하나 이상의 염색체에 통합된 임의의 뉴클레오타이드 서열, 특히 DNA 서열을 의미한다. 　트랜스유전자는 바람직하게는 "목적 유전자(gene of interest)"를 포함한다.
"목적 유전자(gene of interest)"는 임의의 방식으로 제한되지 않고, 표적 세포에서 전달되고, 통합되고, 전사되고, 번역되고/거나 발현되는 임의의 핵산일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 목적 유전자는 단백질 또는 RNA 분자와 같은, 기능적 산물을 인코딩할 수 있다. 　바람직하게는 목적 유전자는 표적 세포에서 발현이 요구되는 단백질 또는 다른 분자를 인코딩한다. 목적 유전자는 일반적으로 전사 조절 서열과 같은, 목적 유전자의 원하는 발현을 획득하기에 유용한 다른 서열에 작동 가능하게 연결된다. 　몇몇 구현예들에서, 목적 유전자는 바람직하게는 원하는 면역 반응에 대한 항원을 인코딩하는 것이다. 몇몇 구현예들에서 사용되는 다른 목적 유전자는 수지상 세포 활성인자들 및/또는 성숙 인자들을 인코딩하는 유전자이다. 　
목적 유전자와 관련하여, "기능적 관계(functional relationship)" 및 "작동 가능하게 연결된(operably linked)"은 유전자가 프로모터 및/또는 인핸서에 관하여 정확한 위치 및 배향에 있고, 유전자의 발현이 프로모터 및/또는 인핸서가 적절한 분자와 접촉될 때 영향을 받음을 의미한다.
"2A 서열들(2A sequences)" 또는 요소들은 다단백질의 자율적 리보솜 내 자가-가공(autonomous intraribosomal self-processing)을 하게 하는, 두 개의 단백질 사이의 링커로서 도입되는 작은 펩타이드이다 (de Felipe. Genetic Vaccines and Ther. 2:13 (2004); deFelipe et al. Traffic 5:616-626 (2004)). 짧은 펩타이드는 동일한 벡터의 융합생성 분자와 친화 분자의 공-발현(co-expression)과 같은, 단일 벡터로부터 다중 단백질의 공-발현을 하게 한다. 　따라서, 몇몇 구현예들에서, 2A 요소들을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 발현될 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드들 사이의 벡터 내로 통합된다. 　
"DC 성숙 인자들(DC maturation factors)" (또한 "DC 활성인자(DC activators)"로도 알려짐)은 DCs가 세포성 및 체액성 면역 반응의 도출을 용이하게 하도록 DCs의 활성화 또는 자극을 유도할 수 있는 화합물이다. 　전형적인 DC 성숙 인자는 본 발명이 속하는 기술분야에 알려져 있고, 자극 분자, 시토카인, 케모카인, 항체 및 Flt-3 리간드와 같은 다른 작용제를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다 (Figdor, C.G., et al. 2004. Nat Med 10:475-480; Pulendran, B., et al. 2000. J Immunol 165: 566-572; Maraskovsky, E., et al. 2000. Blood 96:878-884, 이들 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 편입된다). DC 성숙 인자들의 예는 GM-CSF, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL- 15, IL-21, IL-23, TNFα, B7.1, B7.2, 4-1BB, CD40 리간드 (CD40L) 및 약물-유도성 CD40 (iCD40)을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 　
표적화 분자들
상술한 바와 같이, 표적화 분자는 DC-SIGN을 발현하는 수지상 세포들에 바이러스를 표적화하도록 재조합 바이러스에 삽입된다. 표적화 분자는 바람직하게 또한 세포막과의 융합, 효율적인 형질 도입 및 수지상 세포로의 원하는 폴리뉴클레오티드(들)의 전달을 조정한다. 　그러므로, 표적화 분자는 일반적으로 원하는 결합 특이성을 갖는 융합성 분자 (FM) 이다. 　 표적화 분자는 그것이 수지상 세포들 상의 DC-SIGN과 결합하도록 필요하다면, 변형된다. 　몇몇 구현예들에서, 표적화 분자는 특이적으로 DC-SIGN과 결합한다. 즉, 표적화 분자는 다른 세포 유형들에 비해 우선적으로 DC-SIGN을 발현하는 수지상 세포들에 재조합 바이러스를 지시한다. 따라서, 몇몇 구현예들에서, 표적화 분자들은 DC-SIGN과 결합하는 능력을 보유하면서도, 헤마글루티닌과 같은, 다른 표적과 결합하는 FM의 능력을 제거함으로써 만들어진다. 　다른 구현예들에서, 표적화 분자는 비-DC-SIGN 분자와 그의 요소들에 대한 본래의 결합 특이성을 제거하고 DC-SIGN에 대한 결합 특이성을 추가하거나 향상시키기 위해 변형될 수 있다. 표적화 분자가 DC-SIGN에 특이적일지라도 다른 분자 및 다른 세포 유형들과 결합하는 약간의 비특이성이 발생할 수도 있지만, 표적화 분자들은 원하는 면역 반응을 감소시킬 수 있는 부작용과 같은, 원하지 않는 부작용을 회피하기 위해 충분한 특이성을 갖도록 변형된다
표적화 분자들은 일반적으로 바이러스를 슈도타입화할 수 있고, 재조합 바이러스의 외피에 삽입되어, 수지상 세포를 표적화하고, 적절한 조건 아래서, 수지상 세포에 막 융합을 유도하고, 목적 유전자의 도입을 허용하는 분자이다. 　바람직한 표적화 분자들은 바이러스성 당단백질이다. 　또한, 표적화 분자들은 생체 내에서 유전자의 전달에 중요한 농도를 허용하도록 바람직하게는 초원심력에 대한 내성이 있다.
표적화 분자들은 바람직하게 개별적으로 결합 시, 낮은 pH에서 막 융합을 유도한다. 　 따라서, 바람직한 구현예들에서, 표적화 분자-유도 막 융합이 발생하고 표적화 분자를 포함하는 바이러스가 표적 세포의 엔도좀 내부에 있으면서 목적 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 바이러스 코어 요소가 사이토졸로 전달된다. 　
몇몇 구현예들에서, tag 서열이 표적화 분자에 삽입되어 표적화 분자의 발현과 바이러스 입자들에 표적화 분자의 존재를 검출하게 한다.
두 개의 클래스의 바이러스 푸소젠들(fusogens)이 있고 둘다 표적화 분자로서 이용될 수 있다(D. S. Dimitrov, Nature Rev. Microbio. 2, 109 (2004)). 클래스 I 푸소젠들은 나선형의 감은 코일 구조(helical coiled-coil structures)를이용하여 막 융합을 유발하는 반면, 클래스 II 푸소젠들은 β 배럴(barrel)로 융합을 유발한다. 이러한 두 개의 구조는 다양한 메카닉스와 역학을 가진다(D. S. Dimitrov, Nature Rev. Microbio. 2, 109 (2004)). 몇몇 구현예들에서, 클래스 I 푸소젠들이 사용된다. 다른 구현예들에서, 클래스 II 푸소젠들이 사용된다. 또 다른 구현예들에서는, 클래스 I 및 클래스 II 푸소젠들이 둘 다 사용된다.
야생형 또는 변형된 형태에서, 표적화 분자들 (또는 바이러스 결합 및 융합 기능이 분리된 구현예들에서 융합생성분자들)로 사용될 수 있는 표면 당단백질들의 몇 가지 비제한적인 예들은 El, E2, 및 E3과 같은 표면 당단백질들을 포함하는, 셈리키 포레스트 바이러스 (SFV), 로스 리버 바이러스 (RRV) 및 아우라 바이러스 (AV)와 같은 알파바이러스들 유래의 당단백질들을 포함한다. 신드비스 바이러스 (SIN) 유래의 E2 당단백질들 및 인플루엔자 바이러스 유래의 헤마글루티닌 (HA)은 세포 표면의 특정 분자들 (E2에 대해서는 헤파린 설페이트 글리코스아미노글리칸, HA에 대해서는 시알산)과 특이적으로 결합하는 비-레트로바이러스 당단백질들이고, 몇몇 구현예들에서, 이들은 표적화 분자들을 만드는 데 사용될 수 있다. 그들의 융합은 수용체 분자들에 대한 결합과는 상대적으로 독립적이고, 융합의 활성화는 엔도좀의 산성화를 통해 달성된다 (Skehel 및 Wiley, Annu. Rev. Biochem. 69, 531-569 (2000); Smit, J. et al. J. Virol. 73, 8476-8484 (1999)). 또한, 그들은 특정 유전적 변형을 수용하고, 레트로바이러스 표면에 효율적으로 조립된 채로 있을 수 있다 (Morizono et al. J. Virol. 75, 8016-8020).
본 발명의 다른 구현예들에서, 라사열 바이러스, B형 간염 바이러스, 광견병 바이러스, 보르나병 바이러스, 한탄 바이러스, 또는 SARS-CoV 바이러스의 표면 당단백질들은 융합 분자들로 활용될 수 있다. 　
본 발명의 다른 구현예들에서, 플라비바이러스-유래의 표면 당단백질들은 표적화 분자들의 기초로서 사용될 수 있다. 알파바이러스들과 같이, 플라비바이러스들은 감염을 조정하기 위해 클래스 II 융합 분자를 사용한다 (Mukhopadhyay et al. (2005) Rev. Microbio. 3, 13-22). prM (약 165 아미노산들) 및 E (약 495 아미노산들)는 플라비바이러스들의 당단백질들이다. 또한, 플라비바이러스 중 하나인, 뎅기 바이러스 (DV)의 리간드-결합 포켓은 특성이 잘 규정된다. 　흥미롭게도, DC-SIGN은 바이러스 엔트리를 개선하기 위해 DV E 단백질 상의 탄수화물 잔기들과 특이적으로 상호작용하도록 제안되었다 (Mukhopadhyay et al. (2005) Nat. Rev. Microbio. 3, 13-22). 따라서, DV E 단백질, 또는 변형된 DV E 단백질에 의해 싸인 렌티바이러스들은, DCs를 표적화하는 데 사용될 수 있다. 다른 융합 분자들과 마찬가지로 TBE 및 DV E 단백질들은, 원하는 결합 특이성을 제공하거나 필요 시에는 결합 결핍(binding deficient) 및 융합 컴피턴트(fusion competent)가 되도록 설계될 수 있다.
몇몇 구현예들에서, 인플루엔자 A/파울 플레이그 바이러스(fowl plague virus)/Rostock/34 (FPV) 유래의 헤마글루티닌 (HA) 형태, 클래스 I 푸소젠이 이용된다 (T. Hatziioannou, S. Valsesia-Wittmann, S. J. Russell, F. L. Cosset, J. Virol. 72, 5313 (1998)). 몇몇 구현예들에서, FPV HA의 형태가 이용된다 (A. H. Lin et al., Hum. 유전자. Ther. 12, 323 (2001)). HA-매개 융합은 수용체 결합과 관계없는 것으로 여겨진다 (D. Lavillette, S. J. Russell, F. L. Cosset, Curr. Opin. Biotech. 12, 461 (2001)).
다른 구현예들에서, 클래스 II FM이 사용되는데, 바람직하게는 SVG로도 불리는 알파바이러스 과의 신드비스 바이러스 당단백질이 사용된다 (K. S. Wang, R. J. Kuhn, E. G. Strauss, S. Ou, J. H. Strauss, J. Virol. 66, 4992 (1992)). SVG는 융합과 관련된 제1 단백질 (El), 및 세포 결합과 관련된 제2 단백질 (E2)의 두 개의 트랜스멤브레인 단백질들을 포함한다 (S. Mukhopadhyay, R. J. Kuhn, M. G. Rossmann, Nature Rev. Microbio. 3, 13 (2005)). SVG는 온코레트로바이러스들 및 렌티바이러스들 모두를 슈도타입화하는 것으로 알려져 있다.
후술하는 바와 같이, 몇몇 바람직한 구현예들에서, 우선적으로 DC-SIGN과 결합하는 변형된 SVG가 이용된다. 다른 구현예들에서, 결합-결핍 및 융합-컴피턴트 SVG, SVGmu는 DC-SIGN 또는 다른 수지상 세포 특이적 단백질에 대한 항체와 같은 분리된 표적화 분자와 함께 융합생성 분자로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 단백질 A의 면역글로불린 G 결합 도메인 (ZZ 도메인)이 E2 단백질 내로 삽입되고, 하나 이상의 추가적 돌연변이가 수용체 결합 부위를 불활성화시키게 된 SVG 융합생성 분자가 이용될 수 있다 (K. Morizono et al., Nature Med. 11, 346 (2005)).
표적화 분자를 인코딩하는 유전자는 바람직하게 pcDNA3 (Invitrogen)과 같은 발현 벡터로 클로닝된다. 293T 세포들과 같은 패키징 세포들이 목적 유전자를 인코딩하는 바이러스 벡터 (일반적으로 항원을 인코딩함), 바이러스 패키징 요소들을 인코딩하는 적어도 하나의 플라스미드, 및 표적화 분자의 발현을 위한 벡터에 의해 공-형질감염된다. 표적화 기능이 융합생성 기능에서 분리되면, 친화 분자(affinity molecule) 및 임의의 관련 요소들을 인코딩하는 하나 이상의 벡터들이 또한 제공된다. 표적화 분자는 패키징 세포의 막 위에서 발현되고 재조합 바이러스로 삽입된다. 패키징 세포 표면 상의 표적화 분자들의 발현은 예를 들어, FACS에 의해 분석될 수 있다.
예를 들어, 구조 연구 및 분자모델링으로부터 획득된 정보를 기반으로, 돌연변이 생성은 그들의 융합성 능력을 유지하지만, 원하는 결합 특이성 및/또는 결합 수준을 갖는 당단백질들의 돌연변이체 형태를 생성하는 데 사용될 수 있다. 　가장 바람직한 특성을 갖는 FMs를 동정하기 위해, 여러 돌연변이체들이 각 당단백질에 대해 만들어질 수 있고, 후술하는 방법들 또는 본 발명이 속하는 기술분야에 알려진 다른 방법들을 사용하여 분석될 수 있다. 예를 들어, 표적화 분자들은 포유동물에서 원하지 않는 부작용을 일으키지 않고 면역반응을 자극하는 그들의 능력을 결정함으로써 수지상 세포들에 항원들을 특이적으로 전달하는 능력에 대하여 시험될 수 있다. 　수지상 세포들을 특이적으로 표적화하는 능력은 또한 후술하는 바와 같이, 예를 들어, 세포 배양에서 직접적으로 시험될 수 있다. 　
적절한 표적화 분자들 (각각 야생형 또는 돌연변이체)을 선택하기 위해, 표적화 분자 (그리고 적당한 친화 분자)를 함유하는 바이러스들이 준비되고, 그들의 선택도 및/또는 표적 세포막을 용이하게 침투하는 그들의 능력이 시험된다. 야생형 당단백질을 나타내는 바이러스들이 돌연변이체들에서 타이터 효과(titer effects)를 시험하기 위한 대조군으로서 이용될 수 있다. 표적화 분자 (또는 적당한 친화 분자)의 결합 파트너를 발현하는 세포들이 표준 감염 분석을 이용하여 바이러스에 의해 형질도입된다. 지정된 시간, 예를 들어 형질도입된 후 48 시간 이후에, 세포들이 수집되고, 표적화 분자 (또는 친화 분자 및 융합생성 분자)를 포함하는 바이러스에 감염된 세포의 퍼센트는 예를 들어, FACS에 의해 결정될 수 있다. 선택도(selectivity)는 바이러스에 감염된 세포의 퍼센트를 계산함으로써 기록될 수 있다. 유사하게, 바이러스 타이터 위의 돌연변이들의 효과는 상응하는 야생형 표적화 분자를 포함하는 바이러스에 감염된 세포들의 퍼센트에 의해 돌연변이체 표적화 분자를 포함하는 바이러스에 감염된 세포들의 퍼센트를 나눔으로써 측량될 수 있다. 　바람직한 돌연변이체는 선택도와 감염 타이터(infectious titer)의 최고 조합을 줄 것이다. 　표적화 분자가 선택되면, 바이러스 농도 분석은 FM에 의해 싸인 바이러스들이 결집될 수 있음을 확인하기 위해 수행될 수 있다. 바이러스 상등액은 초원심력에 의해 수집되고 결집된다. 　바이러스들의 타이터가 바이러스 원료 용액의 제한된 희석과 친화 분자의 결합 파트너를 발현하는 세포들의 형질도입에 의해 결정될 수 있다. 　
몇몇 구현예들에서, BlaM-Vpr 융합 단백질은 바이러스 침투, 및 융합 분자 (야생형 또는 돌연변이체)의 효능을 평가하기 위해 이용될 수 있다. 바이러스는 예를 들어, 바이러스의 요소들, BlaM-Vpr, 및 목적 FM (및 적당한 경우 친화 분자)를 포함하는 하나 이상의 벡터들을 가진 패키징 세포들의 일과성 형질감염에 의해 준비될 수 있다. 수득된 바이러스들은 (항체와 같은) 결합의 유리 저해제가 없거나 있는 가운데 특이적으로 결합하는 표적화 분자 (또는 친화 분자)를 발현하는 세포들을 감염시키는데 사용될 수 있다. 이어서, 세포들은 CO2-비의존적 배지에 의해 세척되고 CCF2 염료 (Aurora Bioscience)로 로딩될 수 있다. 절단 반응(cleavage reaction)의 완료를 위해 상온에서 인큐베이션한 후, 세포들을 파라포름알데히드로 고정하고 FACS 및 현미경에 의해 분석할 수 있다. 　파랑색 세포들은 세포질 안으로 바이러스의 침투를 보여준다; 항체를 차단하는 단계가 추가될 때 보다 적은 수의 파랑색 세포들이 예상될 것이다.
침투가 낮은 pH에 의존할지에 대해 연구하고, 원하는 pH 의존성으로 표적화 분자들 (또는 융합성 분자들)을 선택하기 위해, pH를 변경한 NH4Cl 또는 다른 화합물이 감염 단계에 추가될 수 있다 (NH4Cl이 엔도좀의 산성 구획을 중립화할 것이다). NH4Cl의 경우, 파랑색 세포의 소멸이 바이러스들의 침투가 낮은 pH-의존적임을 나타낼 것이다.
또한, 활성이 pH-의존적임을 확인하기 위해 암모늄 클로라이드, 클로로퀸, 콘카나마이신, 바필로마이신 Al, 모넨신, 니제리신, 기타 등등과 같은, 리소소모트로픽 작용제(lysosomotropic agents)가 인큐베이션 버퍼에 첨가될 수 있다. 　이러한 작용제는 엔도좀 구획 내에 pH를 올릴 수 있다 (예컨대, Drose and Altendorf, J. Exp. Biol. 200, 1-8, 1997). 　이러한 작용제의 저해 효능은 바이러스 융합 및 엔트리를 위한 pH의 역할을 밝힐 것이다. 　다양한 융합생성 분자들을 나타내는 바이러스들 사이에 다양한 엔트리 역학은 특정한 적용을 위해 비교되고 가장 적절하게 선택될 수 있다.
PCR 엔트리 분석은 바이러스 엔트리의 역학의 표시로서 역전사를 모니터링하고 바이러스 DNA 합성의 역학을 측정하기 위해 이용될 수 있다. 　예를 들어, 특정 표적화 분자들을 포함하는 바이러스성 입자들은 표적화 분자 (또는 몇몇 구현예들에서는, 분리된 친화 분자)에 대한 적당한 동족체를 발현하는, 293T 세포와 같은, 패키징 세포들로 인큐베이팅될 수 있다. 또한 바로, 또는 인큐베이션 후에 (감염이 발생하게 하기 위해) 결합되지 않은 바이러스들은 제거되고 세포들의 분취량(aliquot)이 분석된다. 　이어서 DNA는 이러한 분취량으로부터 추출되고, LTR-특이적 프라이머들을 사용하여 반정량(semi-quantitative)이 수행될 수 있다. LTR-특이적 DNA 산물의 외양은 바이러스 엔트리와 코팅되지 않은 상태를 보여줄 것이다. 　
본 발명의 다른 양상에서, 표적화 분자가 바이러스 결합과 융합 기능 모두를 가질 수 있으나, 바이러스 결합과 융합 기능은 2가지 특징적인 요소들로 분리된다. 일반적으로, 재조합 바이러스는 둘 다 포함한다 : (i) 수지상 세포들에 바이러스 결합을 매개하고, 정확하게 바이러스를 표적화하는 친화 분자, 및 ; (ii) 수지상 세포들 안으로 효율적인 형질 도입과 원하는 폴리뉴클레오타이드의 전달을 매개하는 특징적인 융합생성 분자 (FM). 본원에서 기술된 방법은 어떤 다양한 친화 분자들과 융합생성 분자들을 이용하기 위해 용이하게 채택될 수 있다. 　 본원에서 기술된 것들뿐만 아니라, 다른 예시적인 융합생성 분자들 및 관련된 방법은 예를 들어, 2005년 3월 2일에 출원된 미국특허출원 제11/071,785호(미국특허출원공개 제2005-0238626호로 공개)에서 개시되어 있고, 2006년 6월 1일에 출원된 미국특허출원 제11/446,353호(미국특허출원공개 제2007/0020238호로 공개)을 개시되어 있으며, 이들 각각은 참조로서 그 전체가 본원에 완전히 편입된다.
친화 분자는 수지상 세포 표면 마커와 결합하는 것이다. 　바람직한 구현예들에서, 친화 분자는 DC-SIGN과 특이적으로 결합한다. 즉, DC-SIGN과 친화 분자의 결합은 다른 세포 유형들 위의 마커와의 상호작용 때문에 원하지 않는 부작용을 회피하기에 충분하도록 적절하게 특정된다. 　친화 분자는 예를 들어, DC-SIGN과 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다. 　
몇몇 바람직한 구현예들에서, 융합 분자는 바람직하게는 엔도좀의 낮은 pH 환경에 반응하여, 수지상 세포에 융합을 매개하거나 다른 목적 유전자의 전달을 용이하게 하는 바이러스 당단백질이다. 　융합 분자는 바람직하게 바이러스 함유물이 바이러스 입자의 열화 전에 사이토졸로 흘러들 수 있도록 빠르고 충분한 역학을 나타낸다. 　또한 융합 분자는 어떤 결합 활성을 감소시키거나 제거하고, 어떤 비특이성 결합을 감소시키거나 제거하도록 변형될 수 있다. 즉, 융합 분자들의 결합 능력을 감소시킴으로써, 표적 세포와 바이러스의 결합이 높은 표적 특이성을 갖고, 원하지 않는 효과를 감소시키도록 친화 분자에 의해 우선적으로 또는 전적으로 결정된다. 　융합 분자들의 예는 다음의 바이러스들 중 하나에서 유래된 바이러스 당단백질들을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다: 신드비스 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 라사열 바이러스, 진드기 매개 뇌염 바이러스, 뎅기 바이러스, B형 간염 바이러스, 광견병 바이러스, 셈리키 포레스트 바이러스, 로스 리버 바이러스, 아우라 바이러스, 보르나병 바이러스, 한탄 바이러스, 및 SARS-CoV 바이러스.
본원에서 기술된 방법은 친화 분자들과 함께 표적화 분자들로서, 또는 융합생성 분자들로서 어떤 다양한 분자들을 이용하기 위해 쉽게 채택될 수 있다. 본원에서 기술된 것들뿐만 아니라, 다른 전형적인 분자 및 관련된 방법은 예를 들어, 미국특허출원공개 제2005/0238626호 및 미국특허출원공개 제2007/0020238호에 개시되어 있다.
벡터들
바람직한 구현예에서, 하나 이상 벡터들은 본원에서 기술된 바와 같이 재조합 바이러스의 제조를 위해 폴리뉴클레오타이드 서열을 패키징 세포주에 도입하는데 사용된다. 　벡터들은 DC-특이적 표적화 분자, 목적 유전자(들)(일반적으로 항원을 인코딩함), 및 패키징 세포로 제공되지 않는 바이러스의 생산을 위해 필요한 어떤 성분들을 포함하는 재조합 바이러스의 다양한 성분들을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열들을 포함할 수 있다. 몇몇 구현예들에서, DC-특이적 친화 분자와 분리된 융합생성 분자를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터는 바이러스의 제조시 DC-특이적 표적화 분자를 인코딩하는 벡터로 치환된다. 진핵 세포 발현 벡터는 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있고, 수많은 상업적인 소스로부터 이용가능하다. 　
본 발명의 일 양상에서, DC 성숙 인자를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터는 또한 바이러스의 제조 시 이용된다. 　적절하게, 이러한 폴리뉴클레오타이드는 일반적으로 패키징 세포와 표적 세포에서 코딩 서열들의 발현을 지시하는 하나 이상의 조절성 요소들의 제어 아래 있다. 　여러 증거들은 DC 백신접종의 성공이 DCs의 성숙 상태에 의존한다는 것을 보여줬다 (Banchereau, J and Palucka, A.K. Nat. Rev. Immunol. 5:296-306 (2005); Schuler, G. et al. Curr. Opin. ImmunolΛ5:?3S-147 (2003); Figdor, CG. et al. Nat. Med. 10:475-480 (2004), 이들 각각은 본원에서 참조로서 편입된다). 　성숙은 활발히 항원 포획에 관련된 세포들로부터 DCs를 T 세포 프라이밍에 특이적인 세포들로 형질전환시킬 수 있다. 　본 발명의 일 양상에서, 벡터는 원하는 DC 성숙을 일으키기 위해 자극성 분자들을 인코딩하는 유전자를 포함한다. 그와 같은 자극성 분자는 또한 성숙 인자 또는 성숙 자극 인자로도 언급된다. 　
몇몇 구현예들에서, 패키징 세포들은 항원과 하나 이상의 추가적 벡터를 인코딩하는 바이러스 벡터로 공-형질감염된다. 　예를 들어, 본원에 여러 기술된 바와 같이, 제2 벡터는 바람직하게 SVGmu와 같은 수지상 세포들과 결합하는 표적화 분자를 인코딩하는 유전자를 항원을 인코딩하는 바이러스 벡터로 운반한다. 몇몇 바람직한 구현예들에서, 표적화 분자는 DC-SIGN에 특이적인 변형된 바이러스 당단백질을 인코딩한다. 　변형된 바이러스 당단백질은 바람직하게는 다음 바이러스 중 적어도 하나로부터 유래된다: 신드비스 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 라사열 바이러스, 진드기 매개 뇌염 바이러스, 뎅기 바이러스, B형 간염 바이러스, 광견병 바이러스, 셈리키 포레스트 바이러스, 로스 리버 바이러스, 아우라 바이러스, 보르나병 바이러스, 한탄 바이러스, 및 SARS-CoV 바이러스. 　몇몇 구현예들에서, 또한 항원을 인코딩하는 바이러스 벡터는 DC 성숙 인자를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 　몇몇 구현예들에서, DC 성숙 인자를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 항원을 인코딩하는 바이러스 벡터와 하나 이상의 추가적 벡터들이 패키징 세포로 공-형질감염된 제3 벡터에 포함된다. 　
다른 구현예들에서, 패키징 세포들에서 원하는 재조합 바이러스의 생산을 위해 필요한 둘 이상의 성분 (예컨대, 바이러스 유전자들, 목적 유전자(들), 표적화 분자, DC 성숙 인자들)을 포함하는 하나 이상의 멀티시스트론 발현 백터(multicistronic expression vectors)가 이용된다. 　멀티시스트론 벡터의 사용은 요구된 벡터의 전체 수를 감소시키고, 그에 따라 다중 벡터로부터 발현을 조정하는 것과 관련된 가능한 어려움을 회피한다. 멀티시스트론 벡터에서 발현되기 위한 다양한 성분이 하나 이상의 프로모터 (그리고 필요한 경우 다른 발현 조절 성분)에 실시가능하게 연결된다. 　다른 구현예들에서, 목적 유전자, 리포터 유전자, 및 바이러스 요소들을 포함하는 멀티시스트론 벡터가 이용된다. 　목적 유전자는 일반적으로 항원을, 선택적으로, DC 성숙 인자를 인코딩한다. 　그러한 벡터는 표적화 분자를 인코딩하는 벡터 또는, 몇몇 구현예들에서, FM과 친화 분자 모두를 인코딩하는 멀티시스트론 벡터와 함께 예를 들어 공-형질감염될 수 있다. 몇몇 구현예들에서, 멀티시스트론 벡터는 항원 인코딩하는 유전자, DC 성숙 인자와 바이러스의 요소들 인코딩하는 유전자를 포함한다.
멀티시스트론 발현 백터에서 발현된 각각 성분은 동일한 프로모터로부터 다양한 단백질의 분리된 발현을 고려하기 위해, 예를 들어, IRES 요소 또는 바이러스 2A 요소에 의해 분리될 수 있다. 　IRES 요소들과 2A 요소들은 본 발명이 속하는 기술분야에 알려져 있다 (미국특허 제4,937,190호; de Felipe et al. 2004. Traffic 5: 616-626, 이들 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 편입된다). 　일 구현예에서, 구제역 질환 바이러스 (FMDV), 말의 비염 바이러스 (ERAV), 및 토시아 어사인바이러스 (TaV) 유래의 2A-유사 서열들 (Szymczak et al. 2004. JVa/. Biotechnol. 22: 589-594, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 편입된다)과 연결된 푸린 절단 부위 서열들 (RAKR)을 인코딩하는 올리고뉴클레오타이드들 (Fang et al. 2005. Nat. Biotech 23: 584-590, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 편입된다)은 멀티시스트론 벡터의 유전적 요소를 분리하는데 사용된다. 원하는 재조합 바이러스를 합성하기 위한 특정 멀티시스트론 벡터의 효능은 표준 프로토콜을 사용하는 각각의 유전자의 발현을 검출함으로써 쉽게 시험될 수 있다. 　
벡터(들)의 생성은 예를 들어, Sambrook et al. (1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y.), Coffin et al. (Retroviruses. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. (1997)) 및 "RNA Viruses: A Practical Approach" (Alan J. Cann, Ed., Oxford University Press, (2000), 이들 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 편입된다)에 기술된 바와 같이, 제한 없이, 제한 엔도뉴클레아제 분해(restriction endonuclease digestion), 라이게이션, 형질전환, 플라스미드 정제 및 DNA 시퀀싱의 표준 기법을 포함하여, 본 발명이 속하는 기술분야에 알려진 어떠한 적절한 유전 공학 기법을 이용하여 달성될 수 있다.
벡터(들)은 어떠한 알려진 유기체의 게놈으로부터 서열들을 삽입시킬 수 있다. 　서열들은 그들의 원래 형태(native form)로 삽입시킬 수 있거나, 또는 임의의 방식으로 변형될 수 있다. 　예를 들어, 서열들은 삽입, 결실 또는 치환을 포함할 수 있다. 　
요소들의 발현을 조절하기 위해 이용될 수 있는 발현 조절 요소들은 본 발명이 속하는 기술분야에 알려져 있고, 유도성 프로모터들, 구조 프로모터, 분비 신호, 인핸서와 다른 조절성 요소들을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 　
일 구현예에서, 벡터는 원핵 생물 레플리콘(replicon) 즉, 그것과 함께 형질전환되는 박테리아성 숙주 세포와 같은, 원핵 숙주 세포에서 염색체 밖에서 재조합 DNA 분자의 자율적 복제와 보전을 지시할 수 있는 능력을 갖는 DNA 서열을 포함할 수 있다. 　그러한 레플리콘은 본 발명이 속하는 기술분야에 알려져 있다. 　또한, 원핵 생물 레플리콘을 포함하는 벡터들은 또한 그의 발현이 약물 내성과 같은 검출 마커를 공여하는 유전자를 포함할 수 있다. 전형적 박테리아 약물 내성 유전자들은 암피실린 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 공여하는 것들이다.
벡터(들)은 약물 내성 선택 마커에 대한 유전자와 같은, 진핵 세포에서 효과적인 선택 마커에 대한 하나 이상 유전자를 포함할 수 있다. 　이 유전자는 선택 배양 배지에서 배양된 형질전환된 숙주 세포의 생존 또는 성장을 위해 필요한 인자를 인코딩한다. 선택 유전자를 포함하는 벡터에 의해 형질전환되지 않은 숙주 세포는 배양 배지에서 생존하지 않을 것이다. 　전형적 선택 유전자는 항생물질 또는 다른 독소, 예를 들어, 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 공여하거나, 영양 요구 결핍을 보충하거나, 또는 배지로부터 보류된 주요 영양소를 공급하는 단백질을 인코딩한다. 선택 마커는 선택적으로 분리된 플라스미드에 존재하고 공-형질감염에 의해 도입될 수 있다. 　
벡터들은 통상적으로 패키징 세포들에 의해 인식되고 표적화 분자, 바이러스 성분과 기타 등등을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드(들)과 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함할 것이다. 　프로모터는 RNA 중합 효소가 결합하여 전사가 발생하도록 하는, 핵산 서열에 의해 형성된 발현 조절 요소이다. 프로모터들은 구조 유전자의 개시 코돈(일반적으로 100 ~ 1000 bp)에 대해 업스트림 (5')에 위치하고, 그들이 작동 가능하게 연결된 항원-특이적 폴리뉴클레오타이드 서열의 전사 및 번역을 조절하는 비번역 서열들이다. 프로모터들은 유도성이거나 구성적일 수 있다. 유도성 프로모터들의 활성은 생물성 또는 비생물성 인자의 존재 또는 부재에 의해 유도된다. 　유도성 프로모터들은 그들이 작동 가능하게 연결된 유전자의 발현이 유기체 또는 특정 조직에서 발달의 일정한 단계에서 시작되거나 종결될 수 있기 때문에 유전공학에서 유용한 도구일 수 있다. 　유도성 프로모터들은 화학적-조절 프로모터들, 및 물리적-조절 프로모터들로 분류될 수 있다. 　전형적 화학적-조절 프로모터들은 알콜-조절 프로모터 (예컨대, 알콜 디하이드로게나제 I (alcA) 유전자 프로모터), 테트라사이클린-조절 프로모터 (예컨대, 테트라사이클린-반응성 프로모터), 스테로이드-조절 프로모터 (예컨대, 랫트 글루코코르티코이드 수용체 (GR)-기반 프로모터, 인간 에스트로겐 수용체 (ER)-기반 프로모터, 나방 엑디손 수용체-기반 프로모터, 및 스테로이드/레티노이드/갑상선 수용체 수퍼패밀리를 기초로 하는 프로모터들), 금속-조절 프로모터 (예컨대, 메탈로티오네인 유전자-기반 프로모터), 및 병인-관련 프로모터 (예컨대, 애기장대와 옥수수 병원체 관련 (PR) 단백질- 기반 프로모터)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 전형적인 물리적-조절 프로모터들은 온도-관련 프로모터 (예컨대, 열 충격 프로모터) 및 빛-조절 프로모터 (예컨대, 콩 SSU 프로모터)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 다른 플로모터의 예들은 예를 들어, hyper text transfer protocol://www.patentlens.net/daisy/promoters/768/271.html에 개시되어 있으며, 이는 그 전체가 참조로서 편입된다.
본 발명이 속하는 기술분야의 당업자들은 특이적 상황을 기반으로 적절한 프로모터를 선택할 수 있을 것이다. 유전자가 발현되도록 프로모터를 유전자에 작동 가능하게 연결하기 위한 방법들에서, 많은 다양한 프로모터가 본 발명이 속하는 기술분야에 알려져 있다. 　자연형 프로모터 서열들과 많은 이종 기원 프로모터들 모두가 패키징 세포와 표적 세포에서 발현을 지시하는 데 사용될 수 있다. 그러나, 일반적으로 자연형 프로모터와 비교하여 더 큰 전사와 원하는 단백질의 더 높은 수득률을 갖기 때문에, 이종 기원 프로모터가 선호된다. 　
프로모터는 예를 들어, 폴리오마 바이러스, 포울폭스 바이러스, 아데노바이러스, 소 파필로마 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, 간염-B바이러스와 시미안 바이러스 40 (SV40)과 같은 바이러스의 게놈으로부터 수득될 수 있다. 　프로모터는 또한 예를 들어, 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터와 같은 이종 포유동물성 프로모터, 열 충격 프로모터 또는 정상적으로 네이티브 서열과 관련된 프로모터일 수 있고, 그와 같은 프로모터가 표적 세포와의 적합성(compatible)이 제공된다. 일 구현예에서, 프로모터는 바이러스성 발현 시스템에서 자연적으로 발생하는 바이러스 프로모터이다. 　몇몇 구현예들에서, 프로모터는 수지상 세포-특이적 프로모터이다. 　수지상 세포-특이적 프로모터는 예를 들어, CDl Ic 프로모터일 수 있다. 　
전사는 인핸서 서열을 벡터(들)에 삽입함으로써 증가될 수 있다. 　인핸서는 일반적으로 그것의 전사를 증가시키기 위해 프로모터에 작용하는 DNA, 길이는 보통 약 10에서 300 bp의 시스-작용 요소들(cis-acting elements)이다. 　많은 인핸서 서열은 포유동물성 유전자(글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-페토단백질, 및 인슐린)로부터 유래됨이 알려져 있다. 바람직하게 진핵 세포 바이러스로부터의 인핸서가 이용될 것이다. 　예는 복제원점 (bp 100-270)의 레이트 사이드(late side) 상의 SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스 프라이머리 프로모터 인핸서, 복제원점의 레이트 사이드 상의 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 　인핸서는 항원-특이적 폴리뉴클레오타이드 서열의 위치 5' 또는 3'에서 벡터 내로 스플라이싱될 수 있지만, 바람직하게는 프로모터로부터 사이트 5'에 위치한다. 　
발현 백터는 또한 전사의 종결을 위해 그리고 mRNA를 안정시키기 위해 필요한 서열을 포함할 것이다. 　이러한 서열은 진핵 또는 바이러스 DNAs 또는 cDNAs의 비번역 영역의 종종 5' 및 때때로 3'에서 발견되고, 본 발명이 속하는 기술분야에 알려져 있다. 　
상술한 요소들의 하나 이상을 포함하는 플라스미드 벡터는 본 발명이 속하는 기술분야에 알려진 표준 기법을 이용하여 쉽게 제조된다. 　
제조된 플라스미드에서 정확한 서열을 확인하기 위한 분석에서, 플라스미드는 E. coli에서 복제되고, 정제되고, 제한 엔도뉴클레아제 분해에 의해 분석되고/거나, 일반적인 방법에 의해 서열화될 수 있다. 　
포유동물 세포에서 일과성 발현을 제공하는 벡터들도 또한 이용될 수 있다. 숙주 세포가 발현 백터의 많은 카피를 누산하고, 발현 백터에서 항원-특이적 폴리 뉴클레오타이드에 의해 인코딩된 그 폴리펩타이드의 높은 수준을 차례로 합성하도록, 일과성 발현은 숙주 세포에서 효율적으로 복제할 수 있는 발현 백터의 사용을 포함한다 (상기에서 언급한 Sambrook et al., pp. 16.17 - 16.22 참조). 　
바이러스 폴리펩타이드의 발현에 적합하도록 개조된 다른 벡터들 및 방법들이 본 발명이 속하는 기술분야에 알려져 있고, 특이적 상황에 따라 쉽게 개조된다. 　
본원에서 제공된 교시를 사용하여, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 특정 발현 시스템의 효능이 리포터 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함하는 벡터로 패키징 세포를 형질전환시키고, 예를 들어 그린 형광 단백질 콘쥬게이트로부터 형광을 측정하는 것과 같은 적절한 기술을 이용하여 발현을 측정함으로써 시험될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 　적절한 리포터 유전자들은 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있다. 　
본 발명의 벡터로 패키징 세포들을 형질전환하는 것은 공지된 방법에 의해 달성되고, 이용되는 방법은 임의의 방식으로 제한되지 않는다. 　수많은 비-바이러스 전달 시스템은 본 발명이 속하는 기술분야에 알려져 있으며, Schatzlein AG. (2001. Non- Viral Vectors in Cancer Gene Therapy: Principles and Progresses. Anticancer Drugs, 이들 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 편입된다)에 개시된 것과 같은 예를 들어, 일렉트로포레이션, 리포솜을 포함하는 지질계 전달 시스템, "노출된" DNA의 전달, 및 폴리사이클로덱스트린 화합물을 이용하는 전달을 포함한다. 예를 들어, Graham 등(1973. Virol. 52:456; Wigler et al. (1979. Proc. Natl. Acad. ScL USA 76:1373-76), 이들 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 편입된다)에 개시된 바와 같이, 양 이온성 지질 또는 염처리 방법들이 일반적으로 사용된다. 칼슘 포스페이트-침전법이 바람직하다. 　그러나, 핵 마이크로주입 및 박테리아 원형질체 융합을 포함하여, 벡터를 세포에 도입하기 위한 다른 방법들도 또한 이용될 수 있다. 　
바이러스 벡터 및 패키징 세포들
벡터들 중 하나는 코어 바이러스 ("바이러스 벡터")를 인코딩한다. 　Pfeifer와 Verma (Pfeifer, A. and LM. Verma. 2001. Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2:177-211, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 편입된다)에 의해 기술된 것들과 같은, 인간 유전자 치료에의 응용으로 확인된 것들을 포함하여, 본 발명에 대한 용도로 적절한 수많은 이용 가능한 바이러스 벡터가 있다. 　적절한 바이러스 벡터는 레트로바이러스 유래 벡터, 예컨대, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 (MLV)-유래 벡터들과 같은 RNA 바이러스에 기초한 벡터들을 포함하고, 예컨대, 렌티바이러스-유래 벡터들과 같은 더 복합적인 레트로바이러스 유래 벡터들을 포함한다. 인간 면역결핍 바이러스 (HIV-l)-유래 벡터는 이 범주에 속한다. 　다른 예들은 HIV-2, 고양이 면역결핍 바이러스 (FIV), HIV-2, 유인원의 면역 결핍 바이러스 (SIV) 및 메디/비즈나 바이러스에서 유래된 렌티바이러스 벡터들을 포함한다.
바이러스 벡터는 바람직하게는 항원 및/또는 DC 성숙 인자와 같은, 하나 이상의 목적 유전자와 마찬가지로 재조합 바이러스의 요소들을 인코딩하는 하나 이상 유전자를 포함한다. 　바이러스 벡터는 또한 프로모터 및 인핸서 서열들과 같은, 표적 세포에서 목적 유전자의 발현을 용이하게 하는 유전적 요소를 포함할 수 있다. 표적 세포에서 복제를 막기 위해, 복제에 요구되는 내인성 바이러스 유전자들이 패키징 세포주에서 개별적으로 제거되어 제공될 수 있다. 　
바람직한 구현예에서, 바이러스 벡터는 온전한(intact) 레트로바이러스 5' LTR 및 자가-불활성화 3' LTR을 포함한다.
본 발명이 속하는 기술분야에 알려진 임의의 방법이 게놈이 바이러스 벡터의 RNA 카피를 포함하는 감염성 레트로바이러스 입자들을 생산하는데 사용될 수 있다. 이 때문에, 바이러스 벡터 (중요한 유전자, 분자, 기타 등등 목표로 하는 DC-비를 인코딩하는 다른 벡터와 함께는)는 바람직하게는 바이러스 입자들 안으로 바이러스 벡터를 기초로 하는 바이러스 게놈 RNA를 일괄하는 패키징 세포주에 도입된다. 　
패키징 세포주는 바이러스 입자들 안으로 바이러스 게놈 RNA의 패키징을 위한 트랜스에서 요구되는 바이러스 단백질들을 제공한다. 　패키징 세포주는 레트로바이러스 단백질들을 발현할 수 있는 임의의 세포주일 수 있다. 　바람직한 패키징 세포주는 293 (ATCC CCL X), HeLa (ATCC CCL 2), Dl7 (ATCC CCL 183), MDCK (ATCC CCL 34), BHK (ATCC CCL-10) 및 Cf2Th (ATCC CRL 1430)를 포함한다. 패키징 세포주는 필요한 바이러스 단백질들을 안정하게 발현할 수 있다. 　그러한 패키징 세포주는 예를 들어, 미국특허 제6,218,181호에 개시되어 있으며, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 편입된다. 선택적으로 패키징 세포주는 목적 유전자를 인코딩, 일반적으로 항원을 그리고, 추가로 DC 성숙 인자를 인코딩하는 바이러스 벡터와 함께 DC-특이적 표적화 분자 (또는 선택적으로, DC-특이적 친화 분자 및 융합생성 분자)를 포함하는 하나 이상의 필요한 바이러스 단백질들을 인코딩하는 핵산을 포함하는 플라스미드로 일과적으로 형질감염될 수 있다. 　
목적 유전자와 수지상 세포에 특이적인 표적화 분자를 가진 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 바이러스 입자들은 표적 세포를 감염시키기 위해 수집되고 허용된다. 몇몇 바람직한 구현예들에서, 바이러스는 표적 세포 특이성을 달성하기 위해 슈도타입화된다. 　슈도 타이핑을 위한 방법들은 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있고 또한 본원에서 기술된다. 　
일 구현예에서, 목적 유전자를 전달시키는데 사용된 재조합 바이러스는 변형된 렌티바이러스이고, 바이러스 벡터는 렌티바이러스를 기초로 한다. 　렌티바이러스들이분열 및 비분열 세포 모두를 감염시킬 수 있는 것처럼, 본 구현예에서 표적 세포가 분할하는 것(또는 표적 세포를 분할하도록 자극하는 것)이 필요하지 않다. 　
또 다른 구현예에서, 목적 유전자를 전달시키는데 사용된 재조합 바이러스는 변형된 감마레트로바이러스이고, 바이러스 벡터는 감마레트로바이러스를 기초로 한다. 　
또 다른 구현예에서, 벡터는 마우스 줄기세포 바이러스를 기초로 한다 (MSCV; (Hawley, R. G., et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10297-10302; Keller, G., et al. (1998) Blood 92:877-887; Hawley, R. G., et al. (1994) 유전자 Ther. 1 :136-138, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 편입된다). 　MSCV 벡터는 표적 세포, 특히 조혈 전구 세포와 그들의 분화된 후대(progeny)에서 장기간의 안정된 발현을 제공한다. 　
또 다른 구현예에서, 벡터는 몰로니 바이러스, 예를 들어 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스를 기초로 한다. 바이러스 벡터는 또한 Choi, J.K., et al (2001. Stem Cells 19, No. 3, 236-246, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 편입된다)에 개시되 바와 같은 하이브리드 바이러스를 기초로 할 수 있다.
DNA 바이러스 벡터는 예를 들어, 아데노바이러스계 벡터와 아데노- 바이러스 (AAV)계 벡터를 포함하여, 이용될 수 있다. 　마찬가지로, 레트로 바이러스-아데노바이러스 벡터들도 또한 본 발명의 방법들과 함께 사용될 수 있다. 　
다른 벡터들은 또한 암플리콘 벡터, 복제 결함이 있는 HSV 및 약독화된 HSV를 포함하여, 단순 포진 바이러스 (HSVs)에서 유래된 벡터를 포함하여 폴리뉴클레오타이드 전달에 사용될 수 있다 (Krisky DM, Marconi PC, Oligino TJ, Rouse RJ, Fink DJ, et al. 1998. Development of herpes simplex virus replication-defective multigene vectors for combination gene therapy applications. Gene Ther. 5: 1517-30, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 편입된다). 　
최근에 유전자 요법 때문에 개발된 다른 벡터들도 또한 본 발명의 방법과 함께 사용될 수 있다. 　그와 같은 벡터는 베큘로바이러스와 알파 바이러스에서 유래된 것들을 포함한다 (Jolly DJ. 1999. Emerging viral vectors, pp 209-40 in Friedmann T, ed. 1999. The development of human gene therapy. New York: Cold Spring Harbor Lab, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 편입된다). 　
몇몇 바람직한 구현예들에서, 바이러스의 구조체는 HIV 게놈 또는 SIV 게놈과 같은, 렌티바이러스 게놈 유래의 서열을 포함한다. 　바이러스의 구조체는 바람직하게는 렌티바이러스의 5'과 3' LTRs 유래의 서열을 포함한다. 　보다 바람직하게는 바이러스의 구조체는 렌티바이러스의 5' LTR 유래의 R 및 U5 서열들 및 렌티바이러스의 불활성화 또는 자가-불활성화 3' LTR을 포함한다. LTR 서열은 임의의 종으로부터 임의의 렌티바이러스 유래의 LTR 서열일 수 있다. 　예를 들어, 그들은 HIV, SIV, FIV 또는 BIV 유래의 LTR 서열일 수 있다. 바람직하게는 LTR 서열은 HIV LTR 서열들이다. 　
바이러스의 구조체는 바람직하게는 불활성화되거나 자가-불활성화 3' LTR를 포함한다. 　3' LTR는 본 발명이 속하는 기술분야에 알려진 임의의 방법에 의해 자가-불활성화될 수 있다. 　바람직한 구현예에서, 3' LTR의 U3 요소는 그것의 인핸서 서열, 바람직하게는 TATA 박스, SpI와 NF-캅파 B 부위의 결실을 포함한다. 　자가-불활성화 3' LTR의 결과로서, 숙주 세포 게놈에 통합된 프로 바이러스는 불활성화된 5' LTR를 포함할 것이다. 　
선택적으로, 렌티바이러스 5' LTR 유래의 U3 서열은 바이러스의 구조체에서 프로모터 서열로 대체될 수 있다. 　이것은 패키징 세포주로부터 회수된 바이러스의 타이터를 증가시킬 수 있다. 　인핸서 서열도 또한 포함될 수 있다. 　패키징 세포주에서 바이러스 RNA 게놈의 발현을 증가시키는 임의의 인핸서/프로모터 조합이 이용될 수 있다. 　바람직한 구현예에서, CMV 인핸서/프로모터 서열이 이용된다. 　
몇몇 바람직한 구현예들에서, 바이러스의 구조체는 마우스 줄기 세포 바이러스 (MSCV) 게놈 또는 뮤린 백혈병 바이러스 (MLV) 게놈과 같은, 감마레트로바이러스 게놈 유래의 서열을 포함한다. 　바이러스의 구조체는 바람직하게는 감마레트로바이러스의 5' 및 3' LTRs 유래의 서열을 포함한다. 　LTR 서열은 임의의 종의 임의의 감마레트로바이러스 유래의 LTR 서열일 수 있다. 　예를 들어, 그들은 마우스 줄기 세포 바이러스 (MSCV), 뮤린 백혈병 바이러스 (MLV), 고양이 백혈병 바이러스 (FLV), 고양이 사코마바이러스 (FAV) 그리고 조류 세망내피증 바이러스 (ARV) 유래의 LTR 서열일 수 있다. 　바람직하게는 LTR 서열은 MSCV 및 MLV LTR 서열이다. 　
몇몇 구현예들에서, 바이러스의 구조체는 바람직하게는 불활성화되거나 자가-불활성화 3' LTR를 포함한다. 　3' LTR는 본 발명이 속하는 기술분야에 알려진 임의의 방법에 의해 자가-불활성화될 수 있다. 　바람직한 구현예에서, 3' LTR의 U3 요소는 그것의 인핸서 서열, 바람직하게는 TATA 박스, SpI와 NF-캅파 B 부위의 결실을 포함한다. 　자가-불활성화 3' LTR의 결과로서, 숙주 세포 게놈에 통합된 프로 바이러스는 불활성화된 5' LTR를 포함할 것이다. 　
선택적으로, 감마레트로바이러스 5' LTR 유래의 U3 서열은 바이러스의 구조체에서 프로모터 서열로 대체될 수 있다. 　이것은 패키징 세포주로부터 회수한 바이러스의 타이터를 증가시킬 수 있다. 　인핸서 서열도 또한 포함될 수 있다. 패키징 세포주에서 바이러스 RNA 게놈의 발현을 증가시키는 임의의 인핸서/프로모터 조합이 이용될 수 있다. 　바람직한 구현예에서, CMV 인핸서/프로모터 서열이 이용된다. 　
바이러스의 구조체는 일반적으로 하나 이상의 표적 세포에서 발현된 항원을 인코딩하는 유전자를 포함한다. 　바람직하게는 목적 유전자는 5' LTR 및 3' LTR 서열 사이에 위치한다. 　또한, 목적 유전자는 바람직하게는 유전자가 표적 세포에 삽입되면 특정 방법으로 목적 유전자의 발현을 조절하기 위해, 다른 유전적 요소들, 예를 들어, 프로모터 및/또는 인핸서와 같은 전사 조절 서열과 기능적 관계에 있다. 특정한 구현예들에서, 유용한 전사 조절 서열들은 둘다 시간적으로 그리고 공간적으로 활성에 관하여 높게 조절된 것들이다. 　
몇몇 구현예들에서, 목적 유전자는 내부 프로모터/인핸서 조절 서열과의 기능적 관계에 있다. 　"내부(internal)" 프로모터/인핸서는 바이러스의 구조체에서 5' LTR와 3' LTR 서열 사이에 위치하고, 바람직하게는 발현되는 유전자에 작동 가능하게 연결된다. 　
내부 프로모터/인핸서는 그것이 기능적 관계에 있는 유전자의 발현을 증가시킨다는 것으로 알려진 어떤 프로모터, 인핸서 또는 프로모터/인핸서 조합일 수 있다. 　"기능적 관계(functional relationship)" 및 "작동 가능하게 연결된(operably linked)"이라 함은 제한되지는 않으나, 유전자가 유전자의 발현이 프로모터 및/또는 인핸서가 적절한 분자와 접촉될 때 영향을 받을 프로모터 및/또는 인핸서에 관하여 정확한 위치 및 배향에 있는 것을 의미한다.
내부 프로모터/인핸서는 바람직하게는 목적 유전자의 원하는 발현 패턴과 알려진 프로모터/인핸서의 특이성에 기초하여 선택된다. 　따라서, 내부 프로모터는 구성적 프로모터일 수 있다. 　이용될 수 있는 구성적 프로모터의 비제한적인 예들은 유비퀴틴, CMV (Karasuyama et al. 1989. J. Exp. Med. 169:13, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 편입된다), beta-actin (Gunning et al. 1989. Proc. Natl. Acad. ScL USA 84:4831-4835, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 편입된다) 및 pgk (예를 들어, Adra et al. 1987. Gene 60:65-74; Singer-Sam et al. 1984. Gene 32:409-417; and Dobson et al. 1982. Nucleic Acids Res. 10:2635-2637, 이들 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 편입된다)에 대한 프로모터를 포함한다.
선택적으로, 프로모터는 조직 특이적 프로모터일 수 있다. 　몇몇 바람직한 구현예들에서, 프로모터는 표적 세포-특이적 프로모터다. 　예를 들어, 프로모터는 수지상 세포-특이적 프로모터 CDl Ic일 수 있다 (Masood, R., et al. 2001. Int J MoI Med 8:335-343; Somia, N.V., et al. 1995. Proc Acad Sci USA 92:7570-757 '4, 이들 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 편입된다). 　또한, 프로모터는 유전자의 유도성 발현을 허용하기 위해 선택될 수 있다. 　테트라사이클린 반응성 시스템(tetracycline responsive system)과 lac 작동 유전자 억제자 시스템(lac operator-repressor system)을 포함하여, 유도성 발현을 위한 수많은 시스템이 본 발명이 속하는 기술분야에 알려져 있다. 　프로모터들의 조합이 목적 유전자의 원하는 발현을 획득하는데 사용될 수 있다는 것도 또한 상정할 수 있다. 　당업자는 유기체 및/또는 목적 표적 세포의 유전자의 원하는 발현 패턴을 기초로 프로모터를 선택할 수 있을 것이다. 　
몇몇 구현예들에서, 바이러스의 구조체는 바람직하게는 적어도 하나의 RNA 중합효소 II 또는 III 프로모터를 포함한다. 　RNA 중합효소 II 또는 III 프로모터는 작동 가능하게 목적 유전자에 연결되고, 또한 종결 서열에 연결될 수 있다. 또한, 하나 이상의 RNA 중합효소 II 또는 III 프로모터들도 합체시킬 수 있다. 　
RNA 중합 효소 II 및 III 프로모터는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 잘 알려져 있다. 　RNA 중합 효소 III 프로모터의 적절한 범위는 예를 들어, Paule and White. Nucleic Acids Research., VoI 28, pp 1283-1298 (2000)에서 찾을 수 있는데, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 편입된다. 　RNA 중합 효소 II 또는 III 프로모터의 정의는 각각 또한 그것의 다운스트림 RNA 코딩 서열을 전사하기 위해 각각 RNA 중합 효소 II 또는 III를 지시할 수 있는 어떠한 합성 또는 설계된 DNA 단편을 포함한다. 　또한, 바이러스 벡터의 일부로 이용된 RNA 중합 효소 II 또는 III (Pol II 또는 III) 프로모터 또는 프로모터들은 유도성일 수 있다. 　임의의 적절한 유도성 Pol II 또는 III 프로모터는 본 발명의 방법과 함께 사용될 수 있다. 특히, 적절한 Pol II 또는 III 프로모터들은 그 전체가 참조로서 본원에 편입되는 Ohkawa and Taira Human Gene Therapy, Vol. 11, pp 577-585 (2000) 및 Meissner et al. Nucleic Acids Research, Vol. 29, pp 1672-1682 (2001)에 제공된 테트라사이클린 반응성 프로모터를 포함한다. 　
내부 인핸서는 또한 목적 유전자의 발현을 증가시키도록 바이러스의 구조체에 존재할 수 있다. 　예를 들어, CMV 인핸서 (Karasuyama et al. 1989. J. Exp. Med. 169:13, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 편입된다)가 이용될 수 있다. 　몇몇 구현예들에서, CMV 인핸서는 치킨 β-액틴 프로모터와 함께 사용될 수 있다. 　본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 원하는 발현 패턴을 기초로 적절한 인핸서를 선택할 수 있을 것이다. 　
목적 폴리뉴클레오타이드 또는 유전자는 임의의 방식으로 제한되지 않고, 당업자가 요구하는 표적 세포에서 통합되고, 전사되고, 번역되고/거나 발현되는 임의의 핵산을 포함한다. 　몇몇 구현예들에서, 폴리뉴클레오타이드는 면역 반응이 원하는 항원을 인코딩하는 유전자일 수 있다. 　몇몇 구현예들에서, 폴리뉴클레오타이드는 분자의 발현을 하향-조절하는 목적 마이크로RNA (miRNA) 또는 작은 간섭 RNA (siRNA)를 인코딩하는 유전자일 수 있다. 　예를 들어, siRNA 또는 microRNA를 인코딩하는 유전자는 수지상 세포의 활성화 또는 성숙을 저해하는 그것들을 포함하여, 세포에서 음성적 조절자의 발현을 하향-조절하는데 사용될 수 있다. 　siRNAs와 microRNAs는 본 발명이 속하는 기술분야에 알려져 있고, 여러 곳에 기술되어 있다 (Shen, L. et al. 2004. Nat Biotech 22(12): 1546-1553; Zhou, H. et al. 2006. Biochemical and Biophysical Research Communications 347:200-207; Song, X-T., et al. 2006. PLoS Medicine 3(l):el l; Kobayashi, T. and A. Yoshimura. 2005. TRENDS in Immunology 26(4):177-179; Taganov, K., et al. 2007. Immunity 26:133-137; Dahlberg, I.E. and E. Lund. 2007. Sd. STKE 387:pe25, 이들 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 편입된다). 　
또한, 몇몇 구현예들에서, 폴리뉴클레오타이드는 바이러스 프로모터와의 기능적 관계에 위치할 수 있는 하나 이상의 목적 유전자를 포함할 수 있다. 　목적 유전자는 단백질, siRNA 또는 microRNA를 인코딩할 수 있다. 　몇몇 구현예들에서, 전달되는 폴리뉴클레오타이드는 적어도 하나의 단백질, 적어도 하나의 siRNA, 적어도 하나의 microRNA 또는 그의 임의의 조합을 인코딩하는 다중 유전자를 포함할 수 있다. 　예를 들어, 전달되는 폴리뉴클레오타이드는 면역 반응이 원하는 하나 이상의 항원을 인코딩하는 하나 이상의 유전자를 포함할 수 있다. 　하나 이상의 항원은 단일 질환 또는 장애와 관련되거나, 또는 다중 질환 및/또는 장애와 관련될 수 있다. 　몇몇 구현예들에서, 면역 조절 단백질을 인코딩하는 유전자는 면역 반응이 원하는 항원을 인코딩하는 프라이머리 유전자로 구성될 수 있고, 조합은 원하는 방향과 크기에 대한 면역 반응을 도출하고 조절할 수 있다. 　몇몇 구현예들에서, siRNA 또는 microRNA를 인코딩하는 유전자는 면역 반응이 원하는 항원을 인코딩하는 프라이머리 유전자로 구성될 수 있고 조합은 면역 반응의 범위를 조절할 수 있다 (예를 들어, 도 24c와 도 24d에서 각각 서열번호 9 및 서열번호 10의 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드의 실시예 참고). 　몇몇 구현예들에서, 마커 단백질을 인코딩하는 유전자는 원하는 단백질을 발현하는 세포의 확인을 위한 프라이머리 목적 유전자 뒤에 위치될 수 있다. 일 구현예에서, 형광성 마커 단백질, 바람직하게는 그린 형광 단백질 (GFP)은 목적 유전자와 함께 구조체에 통합된다 (일반적으로 항원을 인코딩한다). 　하나 이상의 유전자가 포함되는 경우, 내부 리보솜 엔트리 부위(IRES), 또는 2A 요소들도 또한 바람직하게는 포함되고, 목적 리포터 유전자 및/또는 임의의 유전자로부터 프라이머리 목적 유전자를 분리한다. 　IRES 또는 2A 서열은 리포터 유전자 또는 다른 유전자의 발현을 용이하게 할 수 있다. 　
바이러스의 구조체는 또한 추가의 유전적 요소들을 포함할 수 있다. 　구조체에 포함될 수 있는 요소들의 타입은 임의의 방식으로 제한되지 않고, 특정 결과를 달성하기 위해 당업자에 의해 선택될 것이다. 　예를 들어, 표적 세포에서 바이러스 게놈의 핵 엔트리를 용이하게 한 신호가 포함될 수 있다. 　그러한 신호의 예는 HIV-I 플랩 신호(HIV-I flap signal)이다. 　
또한, 표적 세포에서 프로바이러스 통합 부위(provirus integration site)의 특성화를 용이하게 하는 요소들이 포함될 수 있다. 　예를 들어, tRNA 암버 억제 서열(tRNA amber suppressor sequence)이 구조체에 포함될 수 있다. 　
또한 구조체는 목적 유전자의 발현을 개선하기 위해 설계된 하나 이상의 유전적 요소를 포함할 수 있다. 　예를 들어, 우드척 간염 바이러스 반응성 요소 (woodchuck hepatitis virus responsive element, WRE)가 구조체에 배치될 수 있다 (Zufferey et al. 1999. J. Virol. 74:3668-3681; Deglon et al. 2000. Hum. Gene Ther. 11 :179-190, 이들 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 편입된다).
치킨 β-글로빈 인슐레이터가 또한 바이러스의 구조체에 포함될 수 있다. 　이 요소는 메틸화와 이염색질 형성 효과 때문에 표적 세포에서 통합된 프로바이러스를 사일런싱(silencing)하는 기회를 감소시킨다는 것을 보여주었다. 　또한 인슐레이터는 염색체 상의 통합 부위에 DNA를 둘러싸는 것으로부터 양성적이거나 음성적 위치상 효과로부터 내부 인핸서, 프로모터 그리고 외인성 유전자를 보호할 수 있다. 　
임의의 추가의 유전적 요소는 바람직하게는 삽입 3' 목적 유전자이다. 　
특정한 구현예에서, 바이러스 벡터는 다음을 포함한다: 사이토메갈로바이러스 (CMV) 인핸서/프로모터 서열; HIV 5' LTR 유래의 R와 U5 서열; HIV-I 플랩 신호; 내부 인핸서; 내부 프로모터; 목적 유전자; 우드척 간염 바이러스 반응성 요소; tRNA 암버 억제자 서열; 그것의 인핸서 서열의 결실을 갖는 U3 요소; 치킨 베타-글로빈 인슐레이터; 및 3' HIV LTR의 R와 U5 서열. 　
바이러스의 구조체는 바람직하게는 패키징 세포주로 형질감염될 수 있는 플라스미드로 클로닝된다. 　바람직한 플라스미드는 바람직하게는 박테리아에서 플라스미드의 복제를 위해 유용한 서열을 포함한다. 　
바이러스의 전달
바이러스는 바이러스가 목적 폴리뉴클레오타이드의 전달이 원하는 표적 수지상 세포 (DCs)를 접촉시키게 하는 임의의 방식으로 표적 세포에게 전달될 수 있다. 　바람직한 구현예들에서, 예를 들어, 몸체로의 주입일지라도, 바이러스의 적절한 양 (생체 내에서)이 직접적으로 동물에 도입된다. 　몇몇 바람직한 구현예들에서, 바이러스 입자들은 포유 동물의 말초혈액 스트림에 주입된다. 　다른 바람직한 구현예들에서, 바이러스 입자들은 피부 내 주입(intradermal injection), 피하 주입(subcutaneous injection), 내부-복막 캐비티 주입(intra-peritoneal cavity injection) 또는 정맥 내 주입(intra-venal injection)을 통하여 포유 동물에 주입된다. 바이러스는 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로서 편입되는 미국특허 제7,241,275호, 제7,115,108호, 제7,108,679호, 제7,083,599호, 제7,083,592호, 제7,047,070호, 제6,971,999호, 제6,808,506호, 제6,780,171호, 제6,776,776호, 제6,689,118호, 제6,670,349호, 제6,569,143호, 제6,494,865호, 제5,997,501호, 제5,848,991호, 제5,328,483호, 제5,279,552호, 제4,886,499호에 개시된 장치들과 같은 피하 주입 장치를 이용하여 전달될 수 있다. 또한, 직접적으로 표적 세포를 포함하는 기관 안과 같은 다른 주입 위치들도 적절하다. 예를 들어, 림프절 내 주입(intra-lymph node injection), 비장 내 주입(intra-spleen injection) 또는 골수 내 주입(intra-bone marrow injection)은 각각 바이러스를 림프절, 비장과 골수로 전달하는데 사용될 수 있다. 　특별한 환경과 표적 세포의 성질에 따라서, 예를 들어, 흡입 또는 예를 들어, 눈, 입 또는 피부에서의 상피 조직과의 직접 접촉을 포함하는 다른 수단을 통해 도입이 이루어질 수 있다. 　
다른 구현예들에서, 표적 세포가 제공되고 배양 플레이트에서와 같이, 시험관 내에서 바이러스와 접촉된다. 　표적 세포는 일반적으로 건강한 개체 또는 치료를 필요로 하는 개체로부터 수득된 수지상 세포들다. 　바람직하게는, 표적 세포는 항원에 대한 면역 반응을 자극하여 원하는 개체로부터 수득된 수지상 세포들이다. 　개체로부터 세포를 수득하기 위한 방법들은 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있다. 　바이러스는 배지에서 부유할 수 있고, 배양 플레이트, 튜브 또는 다른 컨테이너의 웰에 추가될 수 있다. 　바이러스를 포함하는 배지가 세포의 플레이팅 이전에 또는 세포가 플레이팅된 이후에 추가될 수 있다. 　바람직하게는 세포는 숙주 세포의 감염이 발생하도록 배지에서 생존력을 제공하고 바이러스의 적절한 농도를 고려한 적절한 양의 배지 내에서 배양된다. 　
세포들은 바람직하게는 바이러스가 세포를 감염시키게 하기 위해 충분한 정도의 시간 동안 바이러스와 함께 인큐베이팅된다. 　세포는 바람직하게 적어도 1 시간, 보다 바람직하게는 적어도 5 시간, 가장 바람직하게는 적어도 10 시간 동안 바이러스와 함께 인큐베이팅된다.
생체 내 및 시험관 내 둘다의 전달 구현예들에서, 쉽게 당업자에 의해 결정될 수 있는 것처럼, 원하는 표적 세포를 감염시키기에 충분한 바이러스의 임의의 농도가 이용될 수 있다. 　표적 세포가 배양될 때, 바이러스 입자들의 농도는 적어도 1 PFU/μl, 보다 바람직하게는 적어도 10 PFU/μl, 보다 더 바람직하게는 적어도 400 PFU/μl, 가장 바람직하게는 적어도 1 x 104 PFU/μl이다.　
몇몇 구현예들에서, 시험관 내에서 바이러스의 감염 이후에, 표적 세포는 동물 안으로 도입(또는 재도입)될 수 있다. 　몇몇 구현예들에서, 세포는 진피 안으로, 진피 아래, 또는 말초 혈류 안으로 도입될 수 있다. 　동물 내에 도입되는 세포들은 바람직하게는 부 면력반응(adverse immune response)을 피하도록 그 동물로부터 유래된 세포들이다. 유사한 면역 배경을 가지고 있는 공여 동물에서 유래된 세포들도 또한 이용될 수 있다. 　부 면역원성 반응(adverse immunogenic response)을 피하기 위해 설계된 것들을 포함하는 다른 세포들도 또한 이용될 수 있다. 　
표적 세포는 통합된 유전자의 카피의 수, 및 통합 위치 예를 들어, 목적 폴리뉴클레오타이드 또는 유전자(들)의 통합, 전사 및/또는 발현을 위해 분석될 수 있다. 그와 같은 분석은 언제든지 실행될 수 있고, 본 발명이 속하는 기술분야에 알려진 임의의 방법에 의해 실행될 수 있다. 　
재조합 바이러스 또는 바이러스에 감염된 DCs가 투여된 개체들은 감염 세포들의 위치, 목적 바이러스-전달 폴리뉴클레오타이드 또는 유전자의 발현, 면역 반응의 자극에 대해 분석될 수 있고, 본 발명이 속하는 기술분야에 알려진 임의의 방법에 의해 질환 또는 장애와 관련된 증상에 대해 모니터링될 수 있다. 　
상술한 세포를 감염시키는 방법은 세포들 개개의 특이적 특성에 달려 있지 않다. 그 결과, 그들은 쉽게 모든 포유 동물로 확장된다. 몇몇 구현예들에서, 재조합 바이러스는 인간 또는 인간 수지상 세포들에 전달된다. 　다른 구현예들에서, 재조합 바이러스는 마우스 또는 마우스 수지상 세포들에 전달된다. 　또 다른 구현예들에서, 재조합 바이러스는 인간 또는 마우스 이외의 동물 또는 인간 또는 마우스 이외의 동물의 수지상 세포들에 전달된다. 　
상술한 바와 같이, 재조합 바이러스는 표적 세포 특이성뿐 아니라, 폭 넓은 숙주 범위를 주기 위해 슈도타입화될 수 있다. 　본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 또한 목적 유전자 또는 폴리뉴클레오타이드의 원하는 발현을 달성하기 위해 적절한 내부 프로모터를 인식할 것이다. 따라서, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 임의의 종에서 유래된 수지상 세포를 감염시키는 방법을 변형할 수 있을 것이다. 　
재조합 바이러스는 수지상 세포를 표적화화는 바이러스에 삽입된 표적화 분자의 특이성을 결정하도록 평가받을 수 있다. 　예를 들어, 골수 세포의 혼합 집단은 개체로부터 수득하여 시험관 내에서 배양될 수 있다. 　재조합 바이러스는 골수 세포의 혼합 집단에 투여될 수 있고, 바이러스에 삽입된 리포터 유전자의 발현은 배양 세포에서 분석될 수 있다. 몇몇 구현예들에서, 혼합 세포 집단의 형질도입된 세포들 중 바람직하게는 적어도 약 50%, 보다 바람직하게는 적어도 약 60%, 70%, 80% 또는 90%, 가장 바람직하게는 적어도 약 95%가 DC-SIGN을 발현하는 수지상 세포들이다. 　
치료
본 발명의 방법들은 폭 넓게 다양한 질환 또는 장애를 예방하거나 치료하는 데 사용될 수 있으며, 특히 환자의 면역 반응의 활성화에 도움이 될 수 있다. 많은 그러한 질환은 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있다. 　본 발명의 방법들에 의해 치료 또는 예방 가능한 질환들 또는 장애들은 암, 자가 면역 질환들, 및 바이러스, 박테리아, 진균성 및 기생충성 감염을 포함하는 감염을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 구현예들에서, 질환은 목적 유전자를 수지상 세포로 전달하는 재조합 바이러스를 이용하여 치료되며, 유전자의 발현은 질환 특이적 항원을 생산하고, 이는항원-특이적 세포성 면역반응들 및 체액성 면역반응들의 자극으로 이어진다. 　
본 발명의 구현예들에서, 재조합 바이러스는 원하는 면역 반응에 대한 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 수지상 세포들에 전달시키는데 사용된다. 몇몇 구현예들에서, 전달이 시험관 내에서 재조합 바이러스와 수지상 세포들을 접촉시킴으로써 달성되고, 형질도입된 수지상 세포들이 환자에게 전달된다. 몇몇 구현예들에서, 전달이 생체 내에서 수지상 세포들을 접촉시켜 개체에게 바이러스를 전달함으로써 달성될 수 있다. 이어서 수지상 세포는 환자의 항원-특이적 T 세포들 또는 B 세포들을 자극하여 발현된 항원에 대한 세포성 및 체액성 면역반응들을 유도한다. 그러한 구현예들에서, 질환 또는 장애로 고통받는 환자는 원하는 특이성을 갖는 면역 세포를 생성함으로써 치료된다. 　
질환 또는 장애와 관련된 임의의 항원은 본원에서 기술된 것처럼 재조합 바이러스를 이용하여 수지상 세포에게 전달될 수 있다. 　질환 또는 장애와 관련된 항원은 수지상 세포를 표적화한 재조합 바이러스의 제조를 통해 확인된다. 　많은 질환 및 장애와 관련된 항원들이 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있다. 　항원은 이전에 질환 또는 장애와 관련되는 것으로 알려지거나, 또는 본 발명이 속하는 기술분야에 알려진 임의의 방법에 의해 확인될 수 있다. 　예를 들어, 환자가 고통받고 있는 한 유형의 암에 대한 항원이 종양 관련 항원과 같이, 알려질 수 있다. 　일 양상에서, 본 발명은 설계된 재조합 렌티바이러스를 이용하여 생체 내에서 종양 항원과 다른 필수 단백질을 인코딩하는 유전자를 DCs로 전달하는 방법을 제공한다. 　다른 구현예들에서, 질환 또는 장애와 관련된 항원은 치료될 환자로부터 동정된다. 　예를 들어, 종양과 관련된 항원은 본 발명이 속하는 기술분야에 알려진 임의의 방법에 의해 종양 자체로부터 동정될 수 있다. 종양 관련 항원들은 임의의 방식으로 제한되지 않고, 예를 들어, 치료될 환자의 암세포에서 동정된 항원들을 포함한다. 　
종양 관련 항원들은 예를 들어, 전립선암과 유방암을 포함하는 다양한 암으로 알려져 있다. 　몇몇 유방암에서, 예를 들어, Her-2 수용체는 암세포의 표면에 과발현된다. 　종양 항원의 예들은 다음을 포함하나, 이에 한정되지 않는다: 고환의 면역 특전 지역(immune-privileged area) 및 다양한 종양 세포에서 발현되는 비돌연변이성 항원들인 MAGE, BAGE, RAGE와 NY-ESO; 동일한 조직에서 유래된 정상 세포 및 신생 세포에서 발현된 항원들인　멜라노사이트-멜라노마 계통 항원 MART-1/Melan-A, gplOO, gp75, mda-7, 티로시나아제 및 티로시나아제-연관 단백질과 같은 계통-특이성 종양 항원들, 또는 전립선 특이성 막 항원 (PSMA) 및 전립선 특이 항원 (PSA); 돌연변이된 ras, bcr/abl 재배열, Her2/neu, 돌연변이되거나 야생형 p53, 사이토크롬 P450 1B1 및 N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라제-V와 같은 비정상적으로 발현된 인트론 서열과 같은, 정상 세포와 비교하여 종양의 다양한 수준에 전사되는 유전자 또는 종양 세포에서 돌연변이된 유전자로부터 유래된 에피토프 단백질/펩타이드; 골수종(myeloma)과 B-세포 림프종(B-세포 lymphomas)에서 유일한 이디오타입(idiotype)을 생성하는 면역글로불린 유전자의 클론 재배열 (clonal rearrangement); 인간 파필로마 바이러스 단백질 E6과 E7과 같은, 종양바이러스 과정에서 유래된 에피토프 단백질/펩타이드; 암종태아성 항원(carcinoembryonic antigen)과 알파 페토단백질(alpha-fetoprotein)과 같은, 종양-선택적 발현을 갖는 비돌연변이성 태아 종양 단백질(nonmutated oncofetal protein). 수많은 종양 관련 항원들이 재검토되었다 (예를 들어, "Tumor- Antigens Recognized By T- Lymphocytes," Boon T, Cerottini J C, Vandeneynde B, Vanderbruggen P, Vanpel A, Annual Review Of Immunology 12: 337-365, 1994; "A listing of human tumor antigens recognized by T cells," Renkvist N, Castelli C, Robbins P F, Parmiani G. Cancer Immunology Immunotherapy 50: (1) 3-15 MAR 2001, 이들 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 편입된다). 　
항원은 또한 예를 들어, HIV/AIDS와 같은, 감염성 질환과 관련된 항원일 수 있다. 　항원은 예를 들어, gpl20 일 수 있다 (Klimstra, W.B., et al. 2003. J Virol 77:12022-12032; Bernard, K.A., et al. 2000. Virology 276:93-103; Byrnes, A.P., et al. 1998. J Virol 72: 7349-7356, 이들 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 편입된다). 　다른 대표적 항원들은 gag, pol, env, tat, nef 및 rev를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다 (Lieberman, J. et al. 1997. AIDS Res Hum Retroviruses 13(5): 383-392; Menendez-Arias, L. et al. 1998. Viral Immunol 11(4): 167-181, 이들 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 편입된다). 　
바이러스 항원의 예들은 아데노바이러스 폴리펩타이드, 알파바이러스 폴리펩타이드, 칼리시바이러스 폴리펩타이드, 예컨대, 칼리시바이러스 캡시드 항원, 코로나바이러스 폴리펩타이드, 디스템퍼 바이러스 폴리펩타이드, 에볼라 바이러스 폴리펩타이드, 엔테로바이러스 폴리펩타이드, 플라비바이러스 폴리펩타이드, 간염 바이러스 (AE) 폴리펩타이드, 예컨대, B 형 간염 코어 또는 표면 항원, 헤르페스 바이러스 폴리펩타이드, 예컨대, 단순 헤르페스 바이러스 또는 수두 대상포진 바이러스 당단백질, 면역결핍 바이러스 폴리펩타이드, 예컨대, 인간 면역결핍 바이러스 엔벨로프 또는 프로테아제, 전염성 복막염 바이러스 폴리펩타이드, 인플루엔자 바이러스 폴리펩타이드, 예컨대, 인플루엔자 A 헤마글루티닌, 뉴라미니다아제, 또는 핵산단백질, 백혈병 바이러스 폴리펩타이드, 마르부르그 바이러스 폴리펩타이드, 오르토믹소바이러스 폴리펩타이드, 파필로마 바이러스 폴리펩타이드, 파라인플루엔자 바이러스 폴리펩타이드, 예컨대, 헤마글루티닌/뉴라미니다아제, 파라믹소바이러스 폴리펩타이드, 파르보바이러스 폴리펩타이드, 페스티바이러스 폴리펩타이드, 피코나 바이러스 폴리펩타이드, 예컨대, 폴리오바이러스 캡시드 폴리펩타이드, 폭스 바이러스 폴리펩타이드, 예컨대, 백시니아 바이러스 폴리펩타이드, 광견병 바이러스 폴리펩타이드, 예컨대, 광견병 바이러스 당단백질 G, 레오바이러스 폴리펩타이드, 레트로바이러스 폴리펩타이드, 및 로타바이러스 폴리펩타이드를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
박테리아 항원들의 예는 액티노마이시스 폴리펩타이드들, 바실러스 폴리펩타이드들, 박테로이데스 폴리펩타이드들, 보르데텔라 폴리펩타이드들, 바르토넬라 폴리펩타이드들, 보렐리아 폴리펩타이드들, 예컨대, B. 버그도르페리 OspA, 부루셀라 폴리펩타이드들, 캄필로박터 폴리펩타이드들, 카프노시토파가 폴리펩타이드들, 클라미디아 폴리펩타이드들, 클로스트리디움 폴리펩타이드들, 코리네박테리움 폴리펩타이드들, 콕시엘라 폴리펩타이드들, 데르마토필루스 폴리펩타이드들, 엔테로코커스 폴리펩타이드들, 에르리키아 폴리펩타이드들, 에스케리키아 폴리펩타이드들, 프란시셀라 폴리펩타이드들, 푸소박테리움 폴리펩타이드들, 헤모바르토넬라 폴리펩타이드들, 헤모필루스 폴리펩타이드들, 예컨대, H. 인플루엔자 타입 b 외부막 단백질, 헬리코박터 폴리펩타이드들, 클레브시엘라 폴리펩타이드들, L-형 박테리아 폴리펩타이드들, 렙토스피라 폴리펩타이드들, 리스테리아 폴리펩타이드들, 마이코박테리아 폴리펩타이드들, 마이코플라즈마 폴리펩타이드들, 나이세리아 폴리펩타이드들, 네오리케트시아 폴리펩타이드들, 노카르디아 폴리펩타이드들, 파스튜렐라 폴리펩타이드들, 펩토코커스 폴리펩타이드들, 펩토스트렙토코커스 폴리펩타이드들, 뉴모코커스 폴리펩타이드들, 프로테우스 폴리펩타이드들, 슈도모나스 폴리펩타이드들, 리케챠 폴리펩타이드들, 로칼리메이아 폴리펩타이드들, 살모넬라 폴리펩타이드들, 쉬겔라 폴리펩타이드들, 스테필로코커스 폴리펩타이드들, 스트렙토코커스 폴리펩타이드들, 예컨대, S. 파이오유전자들 M 단백질들, 트레포네마 폴리펩타이드들, 및 예르시니아 폴리펩타이드들, 예컨대, Y. 페스티스 F1 및 V 항원들을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
진균성 항원들의 예는 엡시디아 폴리펩타이드들, 아크레모니움 폴리펩타이드들, 알터나리아 폴리펩타이드들, 아스퍼질러스 폴리펩타이드들, 바시디오볼러스 폴리펩타이드들, 바이폴라리스 폴리펩타이드들, 블라스토마이시스 폴리펩타이드들, 칸디다 폴리펩타이드들, 콕시디오이데스 폴리펩타이드들, 코니디오볼루스 폴리펩타이드들, 크립토코커스 폴리펩타이드들, 커르발라리아 폴리펩타이드들, 에피더모파이톤 폴리펩타이드들, 엑소피알라 폴리펩타이드들, 지오트리쿰 폴리펩타이드들, 히스토플라즈마 폴리펩타이드들, 마듀렐라 폴리펩타이드들, 말레세지아 폴리펩타이드들, 마이크로스포룸 폴리펩타이드들, 모닐리엘라 폴리펩타이드들, 모르티에렐라 폴리펩타이드들, 무코르 폴리펩타이드들, 페실로마이세스 폴리펩타이드들, 페니실리움 폴리펩타이드들, 피알레모니움 폴리펩타이드들, 피알로포라 폴리펩타이드들, 프로토테카 폴리펩타이드들, 슈달레스케리아 폴리펩타이드들, 슈도마이크로도키움 폴리펩타이드들, 피시움 폴리펩타이드들, 리노스포리디움 폴리펩타이드들, 리조푸스 폴리펩타이드들, 스콜레코바시디움 폴리펩타이드들, 스포로트릭스 폴리펩타이드들, 스템필리움 폴리펩타이드들, 트라이코피톤 폴리펩타이드들, 트라이코스포론 폴리펩타이드들, 및 자일로하이파 폴리펩타이드들을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
원생동물 기생충 항원들의 예는 바베시아 폴리펩타이드들, 발란티듐 폴리펩타이드들, 베스노이티아 폴리펩타이드들, 크립토스포리디움 폴리펩타이드들, 아이메리아 폴리펩타이드들, 엔케팔리토준 폴리펩타이드들, 엔타모에바 폴리펩타이드들, 기아르디아 폴리펩타이드들, 함모니아 폴리펩타이드들, 헤파토준 폴리펩타이드들, 아이소포라 폴리펩타이드들, 리슈마니아 폴리펩타이드들, 마이크로스포리디아 폴리펩타이드들, 네오스포라 폴리펩타이드들, 노세마 폴리펩타이드들, 펜타트리코모나스 폴리펩타이드들, 플라스모디움 폴리펩타이드들, 예컨대, 플라스모디움 팔시파룸 서컴스포로조이트 (PfCSP), 스포로조이트 표면 단백질 2 (PfSSP2), 리버 스테이트 항원 1의 카르복실 말단 (PfLSAl c-term), 및 엑스포티드 단백질 1 (PfExp-1), 뉴모시스티스 폴리펩타이드들, 사르코시스티스 폴리펩타이드들, 키스토소마 폴리펩타이드들, 테일레리아 폴리펩타이드들, 톡소플라즈마 폴리펩타이드들, 및 트리파노소마 폴리펩타이드을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
연충 항원들의 예는 아칸소케일로네마 폴리펩타이드들, 아엘루로스트롱길러스(Aelurostrongylus) 폴리펩타이드들, 안실로스토마(Ancylostoma) 폴리펩타이드들, 안지오스트롱길러스(Angiostrongylus) 폴리펩타이드들, 아스카리스(Ascaris) 폴리펩타이드들, 브루기아(Brugia) 폴리펩타이드들, 부노스토뮴(Bunostomum) 폴리펩타이드들, 카필라리아(Capillaria) 폴리펩타이드들, 카베르티아(Chabertia) 폴리펩타이드들, 쿠페리아(Cooperia) 폴리펩타이드들, 크레노소마(Crenosoma) 폴리펩타이드들, 딕시토카울루스(Dictyocaulus) 폴리펩타이드들, 디옥토파임(Dioctophyme) 폴리펩타이드들, 디페탈로네마(Dipetalonema) 폴리펩타이드들, 디파일로보트리움(Diphyllobothrium) 폴리펩타이드들, 디플라이디움(Diplydium) 폴리펩타이드들, 디로필라리아(Dirofilaria) 폴리펩타이드들, 드라쿤쿨러스(Dracunculus) 폴리펩타이드들, 엔테로비우스(Enterobius) 폴리펩타이드들, 필라로이데스(Filaroides) 폴리펩타이드들, 하에몬쿠스(Haemonchus) 폴리펩타이드들, 라고킬라스카리스(Lagochilascaris) 폴리펩타이드들, 로아(Loa) 폴리펩타이드들, 만소넬라(Mansonella) 폴리펩타이드들, 뮤엘레리우스(Muellerius) 폴리펩타이드들, 나노파이에투스(Nanophyetus) 폴리펩타이드들, 네카토르(Necator) 폴리펩타이드들, 네마토디루스(Nematodirus) 폴리펩타이드들, 오에소파고스토뮴(Oesophagostomum) 폴리펩타이드들, 온코세르카(Onchocerca) 폴리펩타이드들, 오피스토르키스(Opisthorchis) 폴리펩타이드들, 오스테르태기아 폴리펩타이드들, 파라필라리아(Parafilaria) 폴리펩타이드들, 파라고니무스(Paragonimus) 폴리펩타이드들, 파라스카리스(Parascaris) 폴리펩타이드들, 파이살로프테라(Physaloptera) 폴리펩타이드들, 프로토스트롱길러스(Protostrongylus) 폴리펩타이드들, 세타리아(Setaria) 폴리펩타이드들, 스피로세르카(Spirocerca) 폴리펩타이드들, 스피로메트라(Spirometra) 폴리펩타이드들, 스테파노필라리아(Stephanofilaria) 폴리펩타이드들, 스트롱길로이데스(Strongyloides) 폴리펩타이드들, 스트롱길러스(Strongylus) 폴리펩타이드들, 텔라지아(Thelazia) 폴리펩타이드들, 톡사스카리스(Toxascaris) 폴리펩타이드들, 톡소카라(Toxocara) 폴리펩타이드들, 트리키넬라 폴리펩타이드들, 트리코스트롱길러스 폴리펩타이드들, 트리쿠리스 폴리펩타이드들, 운시나리아(Uncinaria) 폴리펩타이드들, 및 우케레리아(Wuchereria) 폴리펩타이드들을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
외부기생충(ectoparasite) 항원들의 예는 벼룩 유래의 폴리펩타이드들 (알레르기항원들 뿐 아니라 보호 항원들을 포함); 참진드기 및 공주진드기를 포함하는 진드기; 깔따구, 모기, 모래파리, 먹파리, 말파리, 호른 플라이(horn flies), 디어 플라이(deer flies), 체체파리(tsetse flies), 침파리(stable flies), 구더기증-원인 파리(myiasis-causing flies)와 같은 파리 및 바이팅 나트(biting gnats); 개미; 거미, 이; 치즈벌레(mites); 및 홍줄노린재(true bugs), 빈대(bed bugs) 및 키싱 버그(kissing bugs)와 같은 홍줄노린재(true bugs)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
일단 항원이 확인되고/거나 선택되면, 원하는 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 동정된다. 　바람직하게는 폴리뉴클레오타이드는 cDNA를 포함한다. 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 상술한 바와 같이 DC-SIGN과 결합하는 표적화 분자를 포함하는 바람직하게는 재조합 바이러스, 보다 바람직하게는 재조합 렌티바이러스 또는 감마레트로바이러스를 이용하여 표적 수지상 세포들 내로 도입된다. 재조합 바이러스는 우선 DC-SIGN 표적화 분자에 의해 수지상 세포막에 결합하고, 이어서 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 바이러스 코어가 사이토졸로 들어간다. 이어서 폴리뉴클레오타이드 (예컨대, 항원을 인코딩함)는 바람직하게는 세포의 게놈에 통합되고 발현된다. 　생체 외에서 접촉된 경우, 표적 수지상 세포는 예를 들어, 주입에 의해, 환자에게 돌아가서 이동되며, 거기서 원하는 항원에 대하여 면역 반응을 일으킬 수 있는 면역 세포와 상호 작용한다. 바람직한 구현예들에서, 재조합 바이러스는 그것이 in situ에서 표적화된 수지상 세포를 형질도입하여 환자에 주입된다. 　이어서 수지상 세포는 치료될 질환 또는 장애와 관련된 특정 항원을 발현하고, 환자는 질환 또는 장애에 대하여 유효한 면역의 반응을 일으킬 수 있다. 　
몇몇 구현예들에서, 재조합 바이러스는 하나 이상의 항원을 포함하고, 표적 수지상 세포로의 형질도입은 세포에 전달된 다수의 항원들에 대한 면역 반응을 일으킨다. 몇몇 구현예들에서, 항원은 단일 질환 또는 장애와 관련된다. 　다른 구현예들에서, 항원은 다중 질환 또는 장애와 관련된다. 　
본 발명의 구현예들에서, DCs의 성숙을 활성화하고/거나 자극하는 DC 성숙 인자들이 목적 폴리뉴클레오타이드 또는 유전자를 옮기는 재조합 바이러스와 함께 전달된다. 　몇몇 구현예들에서, DCs는 바이러스의 전달 전에 DC 성숙 인자의 전달에 의해 활성화된다. 　몇몇 구현예들에서, DCs는 바이러스의 전달 이후에 DC 성숙 인자의 전달에 의해 활성화된다. 　몇몇 구현예들에서, DCs는 바이러스의 전달과 동시에 DC 성숙 인자의 전달에 의해 활성화된다. 　몇몇 구현예들에서, DC 성숙 인자는 바이러스의 투여와 함께 제공된다. 　다른 구현예들에서, DC 성숙 인자는 바이러스의 투여로부터 분리되어 제공된다. 　
특정한 구현예들에서, 하나 이상의 DC 성숙 인자는 바이러스에 포함되고, 바이러스가 수지상 세포를 형질도입한 후 발현된 하나 이상의 유전자에 의해 인코딩될 수 있다. 　몇몇 구현예들에서, DC 성숙 인자를 인코딩하는 하나 이상의 유전자는 항원을 인코딩하는 바이러스 벡터에 포함될 수 있다. 　추가의 구현예들에서, DC 성숙 인자를 인코딩하는 하나 이상의 유전자는 하나 이상의 항원을 인코딩하는 바이러스 벡터에 포함될 수 있다. 　몇몇 구현예들에서, DC 성숙 인자를 인코딩하는 하나 이상의 유전자는 패키징 세포주에서 하나 이상의 항원을 인코딩하는 바이러스 벡터로 공-형질감염된 분리 벡터에 제공될 수 있다. 　
몇몇 구현예들에서, 본 발명의 방법은 환자의 입양면역요법(adoptive immunotherapy)에 사용될 수 있다. 　상술한 바와 같이, 면역 반응이 원하는 항원이 동정된다. 　원하는 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 수득되고 재조합 바이러스에 패키징된다. 표적 수지상 세포는 환자로부터 수득되고, 원하는 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 바이러스에 의해 형질도입된다. 이어서 수지상 세포는 환자 안으로 다시 이동된다. 　
백신접종
상술한 바와 같이, DC-SIGN 표면 수지상 세포 마커를 결합하는 다양하게 설계된 표적화 분자들이 항원을 인코딩하는 유전자를 DCs로 전달하는 재조합 바이러스를 생산하는 데 사용됨을 상정할 수 있다. 　바이러스는 질환 또는 장애의 예방을 위해 시험관 내에서 또는 생체 내에서 DCs를 형질도입하는데 사용될 수 있다. 　예를 들어, 신드비스 바이러스 외피 당단백질은 우선적으로 DC-SIGN과 결합하도록 설계될 수 있고, 재조합 바이러스를 슈도타입화하는 데 사용될 수 있다. 　암 (예를 들어, Mart-1) 또는 (바이러스의 감염과 같은) 다른 질환/장애와 같은 면역 반응이 원하는 항원을 인코딩하는 유전자가 본원에서 기술된 방법을 이용하여 DCs에게 전달될 수 있다. 몇몇 구현예들에서, 다중 항원을 인코딩하는 다중 유전자는 다중 바이러스 벡터 또는 바람직하게는 멀티시스트론 벡터 시스템을 통해, 본원에서 기술된 방법을 이용하여 DCs에 전달될 수 있다. 　하나 이상의 항원에 대한 하나 이상의 유전자는 다중 벡터 또는 바람직하게는 멀티시스트론 벡터 시스템을 이용하여 자극성 분자 (GM-CSF, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15, IL-21, IL-23, TNFα, B7.1, B7.2, 4-1BB, CD40 리간드 (CD40L), 약물-유도성 CD40 (iCD40), 및 기타 등등과 같은) 및/또는 리포터 분자 (GFP, 루시페라제와 기타 등등과 같은)를 인코딩하는 유전자에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 몇몇 구현예들에서, 인간 DCs는 임의의 다른 데에서 기술된 것처럼(예컨대, Banchereau et al. Cell 106, 271-274 (2001)), CD34α+ 인간 조혈 전구세포를 수득하고 시험관 내의 배양 방법을 이용함으로써 생성된다. 　DC-SIGN과 결합하는 표적화 분자를 갖는 바이러스는 면역 반응이 원하는 항원을 인코딩하는 유전자를 포함하여 생성되고, 인간 DCs를 형질도입하는 데 사용된다. 형질도입 특이성 및 효능은 FACS에 의해 정량될 수 있다. DCs의 성숙은 MHC II와 같은 표면 마커의 상향-조절의 FACS 분석에 의해 특성화될 수 있다. 　
다른 구현예들에서, 바이러스는 생체 내에서 주입될 수 있으며, 천연 DCs와 접촉하고 목적 폴리뉴클레오타이드, 전형적으로 항원을 인코딩하는 유전자를 전달한다. 바이러스 입자들의 양은 적어도 5O x 106 TU 이고, 적어도 1 x 107 TU, 적어도 2 x 107 TU, 적어도 3 x 107, 적어도 4 x 107 TU 또는 적어도 5 x 107 TU일 수 있다. 　 선택된 간격에, 수용자의 림프기관의 DCs는 예를 들어, GFP 또는 루시페라제와 같은, 마커 발현을 관찰함으로써 발현을 측정하는데 사용될 수 있다. 바이러스-치료 수용자의 림프절과 비장으로부터 수득한 T 세포는 항원 자극에 대한 반응의 크기와 지속성으로부터 측정될 수 있다. 　상피 세포와 림프 세포와 같은, DCs 이외의 다른 조직 세포들도 생체 내에서 유전자 전달의 특이성에 대해 분석될 수 있다.
AIDS (및 다른 바이러스 질환) 유행성을 종결시키기 위한 가장 효과적 방법이 백신임은 넓게 동의되어 오고 있다. 현재까지, HIV에 대한 어떤 백신접종 방법도 성공적으로 단계 III 시행을 통과하지 않았다. 　따라서, 신규하고 효과적인 백신접종 방법이 절실히 요구되고 있다. 본 발명의 몇몇 구현예들에서, DC 백신접종이 이용된다. 　유전자는 바이러스 벡터 안으로, 상술한 것들과 같은, 바이러스 단백질들을 인코딩하여 클로닝된다. 　환자는 원하지 않는 부작용을 피하도록 바람직하게는 특이성으로 DCs에 DC-SIGN을 결합시키는 표적화 분자를 포함하는 바이러스에 의해 감염된다. 　표적화 분자는 예를 들어, 설계된 신드비스 바이러스 외피 당단백질일 수 있고, 바이러스의 투여는 예를 들어, 주입에 의해 수행될 수 있다. 　동물 모델에서, 분자적으로 클로닝된 HIV 리포터 바이러스 (NFNSZ-r-HSAS, NL-r-HSAS)와 임상적 고립(clinical isolates)은 꼬리 정맥 주사(tail vein injection)에 의해 동물에게 시험감염(challenge) 시킬 수 있다. 감염의 증거는 비장세포, 림프절과 말초혈액에서 시간의 경가에 따라 모니터링될 수 있다. 　HIV-gag 단백질에 대한 PCR 및 리포터 바이러스의 HAS에 대한 FACS는 바이러스 통합과 복제를 시험하는데 사용될 수 있다. 　in situ 생산적인 DC 백신접종은 HIV 시험감염에 대한 내성을 증가시킬 수 있다. 실시예 17-20 참고. 　
몇몇 구현예들에서, 본원에서 기술된 재조합 바이러스로 형질도입된 수지상 세포는 질환 또는 장애의 예방 또는 치료에 제공된다. 　바람직한 구현예들에서, 수지상 세포는 면역 반응이 원하는 항원을 발현한다. 　항원은 전형적으로 정상적으로 수지상 세포에서 발현되지 않지만, 표적 세포가 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 바이러스로 형질도입된 후에 발현된다. 　몇몇 구현예들에서, 수지상 세포는 또한 본원에서 기술된 재조합 바이러스에 의해 수지상 세포에게 제공된 DC 성숙 인자를 발현한다. 　
본 발명의 몇몇 양상에서, 아쥬반트(adjuvant)는 본 발명의 재조합 바이러스와 함께 투여된다. 　아쥬반트는 재조합 바이러스와 함께, 재조합 바이러스의 투여 전에, 또는 재조합 바이러스의 투여 후에 투여될 수 있다. 　
다양한 아쥬반트가 재조합 바이러스에 인코딩된 항원에 대한 면역 반응을 도출하기 위해 본 발명의 재조합 바이러스와 함께 사용될 수 있다. 　바람직한 아쥬반트는 반응의 질적 형태에 영향을 미치는 항원의 구조 변경(conformational change)의 원인이 되지 않고 항원에 대한 진성 반응(intrinsic response)을 증가시킨다. 바람직한 아쥬반트는 알룸(alum), 3 De-o-아실레이트 모노포스포릴 지질 A (MPL)를 포함한다 (GB 2220211 참조). QS21은 남미에서 발견된 퀼라자 사포나리아 몰리나 나무(Quillaja Saponaria Molina tree)의 바크(bark)로부터 분리된 트라이테르펜 글리코시드 또는 사포닌이다 (Kensil et al., in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman, Plenum Press, NY, 1995); 미국특허 제5,057,540호 참조). 　다른 아쥬반트는 선택적으로 모노포스포릴 지질 A와 같은, 면역 자극제(immune stimulants)와 함께, (스쿠알렌 또는 땅콩유와 같은) 물 에멀젼의 오일이다 (Stoute et al., N. Engl. J. Med. 336, 86-91 (1997) 참조). 　또 다른 아쥬반트는 CpG 이다 (Bioworld Today, Nov. 15, 1998). 　선택적으로, Aβ는 아쥬반트에 결합될 수 있다. 　예를 들어, Aβ의 리포펩타이드 버전은 B 형 간염 항원 백신접종에 대해 기술된 바와 같이, 직접적으로 팔미트산 또는 다른 지질을 Aβ의 N-말단에 연결함으로써 제조될 수 있다. 　그러나, 그와 같은 연결은 거기에 면역 반응의 성질에 영향을 미치도록 본질적으로 Aβ의 입체구조를 변경하여서는 안 된다. 　아쥬반트는 활성제를 갖는 치료용 조성물의 성분으로서 투여될 수 있거나, 또는 치료제와 분리하여, 전에 투여되거나 병행하여, 또는 치료제가 투여된 후에 투여될 수 있다.
아쥬반트의 바람직한 클래스는 알루니늄 하이드록사이드, 알루미늄 포스페이트, 알루니늄 설페이트와 같은, 알루미늄 염(알룸)이다. 그러한 아쥬반트들은 MPL 또는 3-DMP와 같은 다른 특이적 면역 자극제, QS21, 폴리글루타민산 또는 폴리리신과 같은 폴리머 또는 모노머 아미노산과 함께 또는 그들 없이 이용될 수 있다. 아쥬반트의 또 다른 클래스는 수중유형 이멀젼(oil-in-water emulsion) 제형이다. 그와 같은 아쥬반트는 무라밀 펩타이드(예컨대, N-아세틸무라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민 (thr-MDP), N-아세틸-노르무라밀-L-알라닐-D-이소글루타민 (nor-MDP), N-아세틸무라밀-L-알라닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-(1'-2'디팔미토일-sn-글리세로-3-하이드록시포스포릴옥시)-에틸아민 (MTP-PE), N-아세틸글루코사미닐-N-아세틸무라밀-L-Al-D-이소글루-L-Ala-디팔미톡시 프로필아미드 (DTP-DPP) 테르아미드™)와 같은 다른 특정 면역 자극제, 또는 다른 박테리아 세포벽 요소들과 함께 또는 그들 없이 이용될 수 있다. 수중유형 이멀젼은 (a) Model 110Y microfluidizer (Microfiuidics, Newton MA)와 같은 마이크로플루다이저를 사용하여 서브마이크론 입자들로 제형되고, 5% Squalene, 0.5% Tween 80, 및 0.5% Span 85 (선택적으로 다양한 양의 MTP-PE 함유)을 함유한 MF59 (WO 90/14837), (b) 각각 서브마이크론 이멀젼으로 마이크로플루다이징되거나 또는 볼텍싱되어 큰 입자 크기의 이멀젼을 생성하는 10% Squalane, 0.4% Tween 80, 5% pluronic-blocked polymer L121, 및 thr-MDP를 함유한 SAF, 및 (c) 2% squalene, 0.2% Tween 80, 및 모노포스포릴리피드 A (MPL), 트레할로스 디마이코레이트 (TDM), 및 세포벽 스켈레톤 (CWS), 바람직하게 MPL + CWS (Detox™)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 박테리아 세포벽 요소들을 함유한 Ribi™ 아쥬반트 시스템 (PvAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, MT)을 포함한다. 바람직한 아쥬반트의 다른 클래스는 Stimulon™ (QS21, Aquila, Worc에스테르, MA) 또는 그로부터 생성된 입자들, ISCOMs (immunostimulating complexes) 및 ISCOMATRIX와 같은 사포닌 아쥬반트들이다. 다른 아쥬반트들은 CFA(Complete Freund's Adjuvant) 및 IFA(Incomplete Freund's Adjuvant)를 포함한다. 다른 아쥬반트들은 인터루킨 (IL-1, IL-2, 및 IL-12), 마크로파지 콜로니 자극인자 (M-CSF), 종양괴사인자 (TNF)와 같은 사이토카인을 포함한다.
아쥬반트는 단일 조성물로서 본 발명의 재조합 바이러스와 함께 투여되거나, 또는 본 발명의 재조합 바이러스의 투여 이전에, 투여와 동시에, 또는 투여 이후에 투여될 수 있다. 　면역원(면역원)과 아쥬반트는 동일한 바이알에서 패키징되어 공급되거나, 분리된 바이알에서 패키징되고 사용 전에 혼합될 수 있다. 면역원과 아쥬반트는 의도된 치료법 적용을 보여주는 라벨로 일반적으로 패키징된다. 　면역원과 아쥬반트가 개별적으로 패키징되면, 상기 패키징은 일반적으로 사용 전에 혼합하라는 설명서를 포함한다. 아쥬반트 및/또는 담체의 선택은 아쥬반트를 포함하는 백신의 안정성, 투여의 경로, 투여 스케줄, 백신접종을 받는 종에 대한 아쥬반트의 효능, 및 인간의 경우, 적절한 규제 당국에 의해 인간 투여가 승인되거나 승인될 수 있는 약제학적으로 허용 가능한 아쥬반트에 의존한다. 예를 들어, 완전 프로인트 아쥬반트(Complete Freund's Adjuvant)는 인간 투여에 적합하지 않다. 알룸, MPL과 QS21이 바람직하다. 　선택적으로, 둘 이상의 다양한 아쥬반트가 동시에 이용될 수 있다. 　바람직한 조합은 알룸과 MPL, 알룸과 QS21, MPL과 QS21, 및 알룸, QS21과 MPL을 포함한다. 또한, 불완전 프로인트 아쥬반트(Incomplete Freund's Adjuvant)가 사용(Chang et al., Advanced Drug Delivery Reviews 32, 173-186 (1998)))될 수 있고, 선택적으로 알룸, QS21과 MPL 및 그들의 조합과 함께 사용될 수 있다.
약제학적 조성물 및 키트
본원에서 제공된 재조합 바이러스 및 하나 이상의 요소들을 포함하는 약제학적 조성물 및 키트도 또한 본원에서 고려될 수 있다. 　약제학적 조성물은 본원에서 제공된 재조합 바이러스와 약제학적 담체를 포함할 수 있다. 　키트는 약제학적 조성물 및/또는 본원에 제공된 조합제제, 사용 설명서와 같은 하나 이상의 요소들, 및 개체에게 화합물을 투여하는 장치를 포함할 수 있다.
본원에서 제공된 바이러스 및 적절한 약제학적 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 본원에서 제공된다. 본원에서 제공된 약제학적 조성물은 다양한 형태로, 예컨대, 고체, 액체, 파우더, 수성 또는 동결 건조 형태(lyophilized form)일 수 있다. 　적절한 약제학적 담체의 예들이 본 발명이 속하는 기술분야에 알려져 있다. 　그와 같은 담체 및/또는 첨가제는 종래의 방법에 의해 제형될 수 있고, 적절한 투여량으로 개체에게 투여될 수 있다. 　지질, 뉴클레아제 저해제, 폴리머, 및 킬레이트화제와 같은 안정화제가 몸체 내의 분해로부터 조성물을 보존할 수 있다.
본원에서 제공된 재조합 바이러스는 키트로 패키징될 수 있다. 　키트는 선택적으로 사용 설명서, 장치와 추가적 시약과 같은 하나 이상의 요소들, 및 방법의 실시에 사용되는 튜브, 컨테이너 및 주사기와 같은 요소들을 포함할 수 있다. 　전형적인 키트는 본원에서 제공된 바이러스를 포함할 수 있고, 선택적으로 사용 설명서, 개체에서 바이러스를 검출하는 장치, 개체에게 바이러스를 투여하는 장치, 및 개체에게 화합물을 투여하는 장치를 포함할 수 있다. 　
목적 유전자(일반적으로 항원)를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 키트도 또한 본원에서 상정될 수 있다. 　몇몇 구현예들에서, 키트는 적어도 하나의 바이러스 패키징 요소들을 인코딩하는 플라스미드 및 바람직하게는 특이적으로, 수지상 세포에 결합하도록 설계된 표적화 분자를 인코딩하는 벡터를 포함한다. 몇몇 구현예들에서, 키트는 적어도 하나의 바이러스 패키징 요소들을 인코딩하는 플라스미드, 수지상 세포에 결합하도록 설계된 표적화 분자를 인코딩하는 벡터 및 적어도 하나의 DC 성숙 인자를 인코딩하는 벡터를 포함한다. 　
목적 유전자(일반적으로 항원)를 인코딩하는 바이러스 벡터 및 선택적으로, DC 성숙 인자를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 키트도 또한 본원에서 상정될 수 있다. 몇몇 구현예들에서, 키트는 적어도 하나의 바이러스 패키징 요소들을 인코딩하는 플라스미드 및 수지상 세포에 결합하도록 설계된 표적화 분자를 인코딩하는 벡터를 포함한다. 　
일 구현예에서, 키트는 설명서를 포함할 수 있다. 　설명서는 바이러스, 선택적으로 키트 내에 포함된 다른 요소들을 기술하는 실체적 표현, 및 바이러스를 투여하기에 개체의 적절한 상태, 적절한 투여량과 적절한 투여 방법을 포함하여, 투여 방법을 일반적으로 포함한다. 설명서는 또한 치료시간의 지속시간 동안 개체를 모니터링하기 위한 안내를 포함할 수 있다. 　
또한 본원에서 제공된 키트는 바이러스를 개체에게 투여하기 위한 장치를 포함할 수 있다. 　본 발명이 속하는 기술분야에서 알려진 약제 또는 백신을 투여하는 많은 장치가 본원에서 제공된 키트에 포함될 수 있다. 　장치의 예는 피하 주사기(hypodermic needle), 정맥 주사기(intravenous needle), 카테터(catheter), 니들-리스 주입 장치(needle-less injection device), 흡입기(inhaler), 및 점안기(eyedropper)와 같은 액체 디스펜서(liquid dispenser)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 일반적으로, 키트의 바이러스를 투여하는 장치는 키트의 바이러스와 적합성(compatible)이 있을 것이다; 예를 들어, 고압 주입 장치와 같은 니들-리스 주입 장치는 고압 주입에 의해 손상되지 않는 바이러스를 갖는 키트에는 포함될 수 있지만, 일반적으로 고압 주입에 의해 손상된 바이러스를 갖는 키트에는 포함되지 않는다. 　
또한, 본원에서 제공된 키트는 개체에, DC 활성화제 또는 자극제와 같은, 화합물을 투여하는 장치를 포함할 수 있다. 　본 발명이 속하는 기술분야에서 알려진 약제를 투여하는 많은 장치가 본원에서 제공된 키트에 포함될 수 있다. 장치의 예는 피하 주사기, 정맥 주사기, 카테터, 니들-리스 주입 장치, 흡입기, 및 점안기와 같은 액체 디스펜서를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 일반적으로, 키트의 화합물을 투여하는 장치는 화합물의 원하는 투여방법과 친화 가능(compatible)할 것이다.
하기의 실시예는 단지 설명의 목적으로 제공되는 것으로, 임의의 방식으로 본 발명의 범위를 제한할 의도가 아님을 이해해야 할 것이다. 또한, 본원에서 보여지고 기술된 것 이외의 본 발명의 다양한 변형들은 본 발명의 상세한 설명과 청구항에 기재된 발명의 범위 내에 있음이 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자들에게 명백할 것이다.
본원에서 인용한 모든 특허 및 참고문헌들은 그 전체가 참조로서 본 명세서에 편입된다.
도 1은 항원 전달을 위해 수지상 세포(dentritic cells, DC)를 표적화하는 일반적인 방법의 개략도이다. 신드비스 바이러스(Sindbis virus)의 야생형(wild- type) 당단백질은 헤파란 설페이트(heparan sulfate) 결합 부위를 돌연변이시켜서, 상기 결합능력을 파괴하였다. 수득된 돌연변이 당단백질(SVGmu)은 DC-SIGN과는 결합하나, 헤파란 설페이트(heparin sulfate)와는 결합하지 못한다. DC-SIGN: 수지상 세포 특이적 ICAM-3 (Intracellular Adhesion Molecules 3)-Grabbing Nonintegrin.
도 2는 렌티바이러스 벡터, GFP-vpr 및 SVGmu를 인코딩하는 플라스미드들, 및 다른 필요한 패키징 구조체들(packaging constructs)로 일과적으로 형질감염(transient transfection)된, 바이러스 생산 세포로부터 수득한 바이러스 입자(virus particle)들의 공초점 레이저 현미경(laser confocal microscope) 이미지를 도시한다. 바이러스 입자들을 GFP로 표지하였다(녹색). SVGmu의 표면 삽입(surface incorporation)은 항-HA-태그 항체(anti-HA tag antibody)(빨간색)로 SVGmu를 표지하여, 면역염색법으로 검출하였다. "GFP"슬라이드에서, 바이러스 입자가 GFP로 표지된 것은 녹색이다. "SVGmu"슬라이드에서, SVGmu가 표면 삽입된 바이러스 입자는 빨간색이다. "병합된(Merged)"슬라이드에서, GFP만 발현되는 곳의 바이러스 입자는 녹색이고, SVGmu만 표면으로 삽입된 곳의 바이러스 입자는 빨간색이고, GFP 및 SVGmu 둘 다 발현하는 바이러스 입자는 노란색이다. 녹색과 빨간색의 오버레이(overlay)(노란색)는 바이러스 입자가 SVGmu를 갖고 있다는 것을 나타내고, 이는 총 바이러스 입자의 대부분을 나타낸다. 스케일 바(scale bar)는 2㎛를 나타낸다.
도 3A는 인간 DC-SIGN을 발현하는 293T.hDCSIGN 및 뮤린 DC-SIGN을 발현하는 293T.mDCSIGN로 구성된 표적 세포주들의 유세포 분석 결과를 나타낸다. 실선; 표적 세포주의 DC-SIGN의 발현을 나타냄; 음영 부분: 293T 세포에서의 배경염색(background staining)을 나타냄.
도 3B는 야생형 신드비스(Sindbis) 당단백질로 외피가 둘러싸인 렌티벡터(FUGW/SVG) 또는 돌연변이 신드비스(Sindbis) 당단백질로 외피가 둘러싸인 렌티벡터(FUGW/SVGmu)에 의해 형질도입된 293T세포에서, GFP 발현의 검출 결과를 보여주는 유세포 분석결과를 나타낸다. FUGW/SVG 및 FUGW/SVGmu의 신선한 바이러스 상등액 1㎖을 인간 DC-SIGN을 발현하는 293T 세포(293T.hDCSIGN) 또는 뮤린 DC-SIGN을 발현하는 293T 세포(293T.mDCSIGN)의 형질도입에 사용하였다(2 x 105 세포). DC-SIGN의 발현이 결손된 모세포인 293T 세포는 대조군으로 삼았다. 도시된 바와 같이, 돌연변이 신드비스 바이러스(Sindbis virus) 당단백질(SVGmu)로 외피가 둘러싸인 렌티벡터는 인간 또는 뮤린 DC-SIGN을 발현하는 293T 세포를 특이적으로 형질도입시킬 수 있다. FUGW/SVGmu의 특이적 형질도입 타이터(titer)는 293T.hDC-SIGN은 대략 1x106 TU/㎖ , 293T.mDC-SIGN은 대략 0.8x106 TU/㎖ 로 계산하였다.
도 4A는 돌연변이 신드비스(Sindbis) 당단백질로 외피가 둘러싸인 FUGW 렌티바이러스(FUGW/SVGmu)가 혼합된 초대 골수세포 배양(primary mixed bone marrow culture)에서 DC-SIGN을 발현하는 뮤린 수지상 세포(dentritic cell)를 특이적으로 형질도입시키는 능력을 보여주는 유세포 분석 결과를 나타낸다. B6 마우스들로부터 분리한 총 골수세포는 FUGW/SVGmu의 신선한 바이러스 상등액에 노출시켰다. 에 코트로픽 당단백질(ecotropic glycoprotein)로 슈도타입화된 FUGW 렌티벡터(FUGW/Eco)는 비표적(non-targeting) 대조군으로 삼았다. GFP-양성 세포는 항-CD11c 항체 및 항-DC-SIGN 항체 염색으로 평가하였다.
도 4B는 돌연변이 신드비스(Sindbis) 당단백질로 외피가 둘러싸인 FUGW 렌티바이러스(FUGW/SVGmu)가 1차 T 세포(CD3+, 윗쪽 패널) 및 1차 B 세포(CD19+, 아랫쪽 패널)를 포함하는 다른 세포유형들은 형질도입시키지 않는다는 결과를 보여주는 유세포 분석 결과를 나타낸다. 마우스 지라(splee)로부터 분리한 1차 CD3+ T 세포 및 1차 CD19+ B 세포는 표적 FUGW/SVGmu 벡터 또는 비표적(non-targeting) FUGW/Eco 벡터의 신선한 바이러스 상등액으로 형질도입하였다. GFP 발현은 유세포 분석으로 분석하였다. 실선: 지시된 렌티바이러스 벡터에 노출시킴; 음영 부분: 형질도입되지 않은 세포(음성 대조군).
도 5는 돌연변이 신드비스(Sindbis) 당단백질로 외피가 둘러싸인 FUGW 렌티바이러스(FUGW/SVGmu)가 골수에서 유래된 DC(BMDC)를 특이적으로 형질도입시킬 수 있는 능력을 보여주는 유세포 분석 결과를 나타낸다. BMDC는 골수 세포에서 신선하게 분리하여, 6일 동안 시토카인(cytokine) GM-CSF의 존재하에서 배양하여 생성하였다. 이 후, 세포는 표적 FUGW/SVGmu 벡터 또는 비표적(non-targeting) FUGW/Eco 벡터의 신선한 바이러스 상등액으로 형질도입시켰다. GFP 및 CDl1c 발현은 유세포 분석으로 측정하였다.
도 6은 FUGW/SVGmu의 표적화된 형질도입 후, BMDC의 활성화를 나타낸다. DC 활성화는 유세포 분석으로 CD86 및 I-Ab 의 표면 발현 분석으로 평가하였다. LPS (1㎍/㎖)의 하룻밤 동안 추가는 형질도입된 BMDC의 활성화를 공동상승시키는 자극제로 사용하였다. 음영 부분: GFP 음성(형질도입되지 않음); 실선: GFP 양성(형질도입됨).
도 7A, 7B 및 7C는 생체 내에서 FUGW/SVGmu 렌티바이러스를 사용한 DC의 표적화를 나타낸다. B6 마우스들에게 5OxIO6 TU의 FUGW/SVGmu를 주입하고, 3 일후 분석하였다. 비면역화된(non-immunized) 마우스들을 대조군으로 삼았다. 도 7A에서, 이미지는 주입 부위에서 멀리 있는 대응되는 부위와 대비하여, 대표적인 주사부위에서 가까운 서혜 림프절(inguinal lymph node)의 크기를 나타낸다. 도 7B는 도 7A에서 지시된 림프절(lymph node)의 총 세포수를 도시한다. 도 7C는 도 7A에 나타낸 두 개의 림프절(lymph node)들로부터 CD 11c+ 세포들의 대표적인 유세포 분석 결과를 나타낸다. 숫자는 GFP+ DC군의 프랙션(fraction)을 나타낸다.
도 8은 OVA 항원을 코딩하는 렌티벡터(FOVA)(윗쪽) 및 GFP를 코딩하는 대조군인 렌티벡터(FUGW)(아랫쪽)의 개략도이다.
도 9는 FOVA/SVGmu 렌티벡터로 형질도입한 수지상 세포(DC/FOVA) 또는 FUGW/SVGmu 렌티벡터로 형질도입한 수지상 세포(DC/FUGW), 또는 OVAp 펩티드(SIINFEKL)를 결합시킨(pulsed) 형질도입하지 않은 BMDC(DC/0VAp)에 의해 CD8+ OTl T 세포의 시험관 내에서의 자극을 도시한다. BMDC와 공동배양한 OTl T 세포의 표면 활성화 마커(surface activation markers)의 패턴은 CD25, CD69, CD62L 및 CD44에 대한 항체로 염색하여 평가하였다. 음영 부분: 트랜스제닉(transgenic) 동물들로부터 수득한 나이브(naive) OTl T 세포; 실선: 지시된 BMDC와 공동배양한 OTl T 세포.
도 1OA는 FOVA/SVGmu (■) 및 FUGW/SVGmu (●)로 형질도입한 BMDC 또는 OVAp 펩티드를 결합한(pulsed)(▲) BMDC를 다양한 희석비율로 OTl T 세포와 혼합하여 3일간 배양하고, ELISA로 IFN-γ를 측정한 것을 나타낸다.
도 1OB는 12시간 동안 [3H]-티미딘 편입(thymidine incorporation) 분석으로 측정한, 도 1OA의 처리된 OTl T세포의 증식 반응(proliferative response)을 나타낸다.
도 11은 FOVA/SVGmu 렌티벡터로 형질도입한 수지상 세포(DC/FOVA) 또는 FUGW/SVGmu 렌티벡터로 형질도입한 수지상 세포(DC/FUGW), 또는 OVAp* 펩티드(ISQAVHAAHAEINEAGR)를 결합시킨(pulsed) 형질도입하지 않은 BMDC(DC/0VAp*)에 의해 CD4+ OT2 T 세포의 시험관 내에서의 자극을 나타낸다. BMDC와 공동배양한 OT2 트랜스제닉(transgenic) T 세포의 표면 활성화 마커들(surface activation markers)의 패턴은 CD25, CD69, CD62L 및 CD44의 항체 염색으로 평가하였다. 음영 부분: 트랜스제닉(transgenic) 동물들로부터 수득한 나이브(naive) OT2 T 세포; 실선: BMDC와 공동배양한 OT2 T 세포.
도 12는 FOVA/SVGmu (■) 및 FUGW/SVGmu (●)로 형질도입한 BMDC 또는 OVAp* 펩티드를 결합한(pulsed)(▲) BMDC를 다양한 희석비율로 OT2 T 세포와 혼합하여 3일간 배양하고, ELISA로 IFN-γ를 측정한 것을 나타낸다.
도 13A는 쥐 조혈모세포(hematopoietic stem cells, HSC)의 유전적인 변형을 사용한 MIG-OTl 레트로바이러스 벡터(retroviral vector)의 개략도이다.
도 13B는 재구성된( reconstituted ) 마우스에서, MIG-OTl-변형된 HSC로부터 어떻게 CD8+ OT1 T 세포가 유래 되는지를 GFP 및 TCR Vα2 또는 Vβ5의 공동 발현으로 확인하는 것을 나타낸다. Eco로 슈도타입화된 MIG-OTl(MIG-OTl/Eco)로 감염시킨 B6 마우스들로부터 분리한 HSC를 방사선 조사한 B6 수용자 마우스들(recipient mice)로 이식하였다. 이식 8주 후, CD8+ OTl T 세포는 유세포 분석으로 확인하였다.
도 14A는 재구성되고 면역화된 마우스들의 지라(spleen)로부터 분리한 GFP+OTl+ T 세포의 표면 활성화 마커(surface activation marker)들의 패턴의 평가를 도시한다. MIG-OTl로 변형된 HSC에 의해 재구성된 마우스들은 10x106 TU의 FOVA/SVGmu 또는 FUGW/SVGmu(대조군)의 직접적인 피하주사로 면역화시키고, 7일 후에 분석하였다. CD69, CD62L 및 CD44의 표면 염색 검출하였다. 실선: FOVA/SVGmu로 면역화된 쥐의 GFP+OTl+ T 세포; 점선: 대조군 FUGW/SVGmu로 면역화된 쥐의 GFP+OTl+ T 세포; 음영 부분: 비면역화된 쥐의 GFP+OTl+ T 세포.
도 14B 는 비면역화된(no imm) 마우스들 또는, FUGW/SVGmu 또는 FOVA/SVGmu로 면역화된 마우스들의 림프절(lymph node)(LN, □) 또는 지라(spleen)(SP,■)로부터 수득한 OT 1 세포의 총 수를 도시한다.
도 15는 DC-표적 렌티벡터인 FOVA/SVGmu의 피하 주사 후, 야생형 마우스들의 항원 특이적인 T 세포 및 항체 반응들의 생체 내에서 자극을 도시한다. B6 마우스들은 5OxIO6 TU의 FOVA/SVGmu 또는 FUGW/SVGmu(대조군)를 피하 주사로 면역화시켰다. 면역화되지 않은(no imm.) 마우스들은 음성대조군으로 삼았다. 면역화 14일 후, 지라(spleen)세포를 수득하고, H-2Kb-SIINFEKL-PE 테트라머(tetramer) 및 CD44 염색으로 측정한 OVA-특이적인 T 세포의 존재를 분석하였다. 도시된 백분율은 총 CD8+ T 세포의 비율이다.
도 16A 및 16B는 FOVA/SVGmu의 다른 투여량(dose)으로 피하 주사를 맞은 마우스의 생체 내에서 OVA-특이적인 T 세포 반응을 도시한다. OVA-특이적인 T 세포는 도 17에 도시된 바와 같이 테트라머(tetramer) 염색으로 확인하였다. 도 16A는 100x106 TU의 FOVA/SVGmu로 면역화 후, OVA-특이적인 T 세포의 백분율을 도시한다. 도 16B는 지시된 투여량(dose)의 FOVA/SVGmu 주사 후, OVA-특이적 T 세포의 투여량 반응을 나타낸다.
도 17A는 주사하고 2주 후, FOVA/SVGmu로 면역화시킨 쥐로부터 분리한 OVA- 특이적인 CD8+ T 세포(테트라머 양성 세포로 확인)의 표면 활성화 마커(surface activation marker)들의 패턴을 도시한 것이다. 표면 활성화 마커(surface activation marker)들은 CD25, CD69, CD62L 및 CD44의 항체 염색으로 평가하였다. 실선: FOVA/SVGmu로 면역화된 쥐의 테트라머+CD8+ T 세포; 음영 부분: 비면역화된 쥐의 나이브(naive) CD8+ T 세포.
도 17B는 5OxIO6 TU의 FOVA/SVGmu로 면역화한 B6 마우스들의 OVA-특이적인 혈청(serum) IgG 타이터(titer)를 도시한다. 면역화 후 7일 및 14일째에, 혈청을 수집하여, 1 :100에서 시작하여 연속적인 10x 희석을 하여 ELISA로 OVA-특이적인 IgG의 타이터(titer)를 분석하였다. 타이터 값(titer value)은 흡광도(optical density)의 표준편차가 동등한 희석(equivalent dilution)에서, 기준선(baseline) 혈청보다 2배 더 높은 것을 가장 높은 희석으로 결정하였다.
도 18은 뮤린 E.G7 종양모델에서 종양의 크기를 시간함수로 도시한다. B6 마우스들은 5OxIO6 TU의 FOVA/SVGmu(▲) 또는 가장(mock) 벡터인 FUW/SVGmu(●)로 피하 주사로 면역화시켰다. 비면역화(■)는 대조군으로 삼았다. 4마리 마우스들을 각 그룹으로 하였다. 면역화 14일 후, 마우스들은 5x106 의 E.G7 종양세포(OVA 항원 발현, 왼쪽 패널) 또는 모세포인 EL4 종양세포(OVA 항원 결손, 대조군, 오른쪽 패널)를 피하에 시험 감염(challenge)한다. 종양의 성장은 가는 캘리퍼스(fine calipers)로 측정하고, 두 개의 가장 큰 수직 직경을 표시한다(mm2).
도 19는 뮤린 E.G7 종양 박멸(tumor eradication) 모델에서의 생체 내의 종양 성장 속도론(kinetic growth of tumors)을 도시한다. B6 마우스들의 알비노주(albino strain)에 개똥벌레 루시퍼라아제(luciferase) 이미지 유전자(imaging gene)를 안정적으로 발현하는, 5x106 E.G7 종양 세포(E.G7.1uc)를 이식하였다. 종양 이식을 안 한 쥐(#1) 를 대조군으로 삼았다. 종양을 갖고 있는 마우스들은 면역화 치료를 하니 않은 마우스(#2), 또는 종양 시험 감염(tumor challenge)후, 3일(#3) 및 10일(#4)째에 5OxIO6 TU의 FOVA/SVGmu 주사로 면역화 치료한 마우스들이다. 종양의 성장 속도론(kinetic growth)은 BLI로 살아있는 동물의 이미지를 모니터하였다. p/s/cm2/sr은 광자(photons)/sec/cm2/steridian을 나타낸다.
도 20은 도 19의 E.G7종양에서 생성되는 발광시그널(luminescence signal)의 정량을 나타낸다. (□) #2 마우스; (●)#3 마우스; (▲) #4 마우스.
도 21은 B6 마우스들의 알비노주(albino strain)를 100x106 TU의 FOVA/SVGmu로 면역화시킨 후, OVA-특이적인 T 세포의 백분율을 나타낸다. 알비노(Albino) B6 마우스들은 5OxIO6 TU의 FOVA/SVGmu로 피하에 면역화시켰다. 면역화 안된 마우스(no imm.)는 음성대조군으로 삼았다. 면역화 14일 후, 지라(spleen)세포들을 수득하고, H-2Kb-SIINFEKL-PE 테트라머(tetramer)및 CD44 염색으로 측정한 OVA-특이 적인 T 세포들의 존재를 분석하였다. 표시된 백분율은 총 CD8+ T 세포들의 비율이다.
도 22A는 이미지 유전자인 개똥벌레 루시퍼라아제(luciferase)(Luc)를 코딩하는 DC-표적화된 렌티벡터의 개략도이다. 상기 벡터는 Fluc/SVGmu이라 명명한다.
도 22B는 5OxIO6 TU의 DC-표적 Fluc/SVGmu 렌티벡터(도 25A에 나타냄) 또는 비표적(non-targeting) Fluc/VSVG 렌티벡터로 피하에 주사한 마우스들의 생체발광(bioluminescence) 이미지를 도시한 것이다. 대표적인 이미지는 주사 후 30일째에 IVIS200®(Xenogen)로 얻었다.
도 23은 1회 투여량(dose)의 재조합 DC-특이적인 렌티벡터인 FOVA/SVGmu 투여가 B6 마우스들에서 IFN-γ+CD8+ T 세포들의 생성을 할 수 있음을 도시한다. 나이브(naive) B6 마우스들은 5OxIO6 TU의 FOVA/SVGmu 렌티벡터 또는 대조군인 같은 투여량(dose)의 FUGW/SVGmu 를 피하에 주사하여 면역화 시켰다. 비면역화된 B6 마우스들(비면역, no imm.)을 음성대조군으로 삼았다. 2주 후, 실험마우스들로부터 지라(spleen)세포들을 수득하고, OVAp 펩티드의 재자극이 있거나 없을 경우에, 유세포 분석으로 세포내 IFN-γ 생성을 분석하였다. 표시된 백분율은 총 CD8+ T 세포들 중 IFN-γ+CD8+ T 세포들의 비율이다.
도 24는 DC-표적 재조합 바이러스의 제조용 렌티바이러스 구조체의 개략도이 다.
도 25는 HIV/ AIDS에 대한 in situ에서 백신접종 실시예의 개략도이다.
실시예 1: DC -특이적인 표적화 분자의 설계( ENGINEERING OF A DC - SPECIFIC TARGETING MOLECULE )
세포 특이적인 방법으로 수지상세포(DC)들을 형질도입 (transduction)할 수 있도록 렌티바이러스 벡터(lentiviral vector)가 설계될 수 있다. DC들 중 어떤 하위조합들은 그들의 표면에 DC-SINE 단백질인(Geijtenbeek, T.B., et al. 2000; Geijtenbeek, T.B., et al. 2000, 상기), 물질들과 빠르게 결합하여 엔도시토시스(endocytosis)를 할 수 있는 C-형 렉틴-유사 수용체(lectin-like receptor)를 가지는데(Geijtenbeek, T.B., et al. 2004, 상기), 이는 DC들의 표적 수용체(receptor)로 사용될 수 있다. 신드비스 바이러스(Sindbis virus (이하 SV))는 알파바이러스(Alphavirus)속, 토가비리다에(Togaviridae)과에 속하며, DC-SINE을 통해 DC들을 감염시킬 수 있다(Klimstra, W.B., et al. 2003. J. Virol. 77: 12022-12032. 이 각각의 참고문헌은 그 전체가 본원에 참고로 편입된다). 그러나, SV의 실험실 바이러스주(laboratory strain)의 일반적인 바이러스 수용체는 많은 세포타입들에서 발현되는 세포 표면의 헤파란 설페이트(heparan sulfate (이하 HS))이다(Strauss, J.H., et al. 1994. Arch. Virol. 9: 473-484; Byrnes, A.P., and D.E. Griffin. 1998. J. Virol. 72: 7349-7356, 이 각각의 참고문헌은 그 전체 가 본원에 참고로 편입된다). SV의 외피당단백질(envelope glycoprotein, 이하 SVG)상의 두 개의 수용체 결합부위가 물리적으로 분리된다는 점에 기초하여, 일반적인 결합 표적인 HS는 인식하지 않으면서, DC-SIGN과의 상호작용능력은 그대로 보유하도록 수용체를 설계하였다(도 1). 바이러스 표면에 삽입된 후엔, 이 당단백질의 돌연변이체는 DC들의 감염을 매개할 수 있으나, 다른 세포들의 감염은 매개할 수 없다.
야생형(wild-type)의 SVG의 cDNA는 캘리포니아 공과대학교 (California Institute of Technology)의 스트라우스박사(Dr. J.H. Strauss)의 실험실로부터 얻었고, 중합효소연쇄반응(PCR)을 통해 pcDNA3 벡터(Invitrogen)로 클로닝하여 플라스미드 pSVG를 제조하였다. 돌연변이 유발 중합효소연쇄반응(PCR mutagenesis)을 통해 10개의 잔기 태그 서열(MYPYDVPDYA)을 아미노산 71과 74 사이의 E2 단백질 사이에 삽입하여 HS 결합부위를 손상시켰다(Karavans, G., et al. 1998. Crit Rev Oncol Hemat 28: 7-30; Lavillete, D., et al. 2001. Curr Opin Biotech 12: 461-466; Russell, SJ. and F.L. Cosset. 1999. J Gene Med 1 : 300-311; Sandrin, V., et al. 2003. Curr Top Microbiol 281 : 137-178; Verhoeyen, E. and F. L. Cosset. 2004. J Gene Med 6: S83-S94, 이 각각의 참고문헌은 그 전체가 본원에 참고로 편입된다). 삽입된 태그서열에 대한 이용할 수 있는 항체는 변형된 SVG의 발현을 모니터 할 수 있는 능력을 제공하였다. HS 특이적인 감염을 더욱더 줄이기 위해서, 수개의 결정적인 잔기들이 HS 분자와의 결합에 관련됨이 확인되었다(Coffin, J. M., et al. 1997. Retroviruses. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press; Battini, J.L., et al. 1998. J Virol 72:428-435; Valsesiawittmann, S., et al. 1994. J Virol 68:4609-4619; Wu, B.W., et al. 2000. Virology 269: 7-7; Cosset, F.L., et al. 1995. J Virol 69:6314-6322; Kayman, S.C., et al. 1999. J. Virol 73: 1802-1808; Lorimar, I.A.J. and SJ. Lavictoire. 2000. J Immunol Methods 237:147-157; Barnett, A.L., et al. 2001. Proc Nat Acad Sci USA 98: 4113-4118; Benedict, C.A., et al. 2002. Hum Gene Ther 10:545- 557; Gollan, TJ. and M.R. Green. 2002. J Virol 76:3558-3563,이 각각의 참고문헌은 그 전체가 본원에 참고로 편입된다). 두 개의 이런 잔기들은 알라닌(alanine)으로 돌연변이 시켰다(157KE158를 157AA158로).
아미노산 61에서 64까지를 제거하여, SVG의 E3 당단백질에 추가의 결실(deletion)을 유도하였다. 이러한 변형된 SVG를 SVGmu로 명명하였다(서열번호 11). SVGmu의 cDNA는 pcDNA3 벡터의 CMV 프로모터의 다운스트림(downstream)에 클로닝하였다(pSVGmu로 명명, 서열번호 3).
실시예 2: DC -특이적인 표적화 분자를 포함하는 재조합바이러스의 제조( PREPARATION OF RECOMBINANT VIRUS CONTAINING THE DC - SPECIFIC TARGETING MOLECULE )
293T 세포에 렌티바이러스 벡터인 FUGW(서열번호 1) 또는 이의 유도체, gag , pol 및 rev 유전자를 코딩하는 패키징구조체(pakaging construct) 및 pSVGmu(실시예 1)를 표준 칼슘 포스페이트-매개 일시적인 형질감염(transient transfection)에 의해 SVGmu-슈도타입화된 재조합 렌티바이러스(lentivirus)를 제조하였다. FUGW는 자가-불활성화(self-inactvating)된 렌티바이러스 벡터로서, GFP 리포터 유전자(reporter gene)의 발현을 이끄는 인간 유비퀴틴-C(ubiquitine-C) 프로모터를 갖고 있다(Lois, C, et al. 2002. Science 295: 868-872, 이 참고문헌은 그 전체가 본원에 참고로 편입된다). 본 실시예에서 사용된 렌티바이러스 전달 벡터(FUGH 및 이의 유도체)는 3세대 HIV에서 유래된 렌티바이러스 벡터(HIV-based rentiviral vector)로서, 이 벡터는 3' LTR의 U3부위의 대부분이 결실되어 있어, 3' LTR을 자가-불활성화(self-inactivating, SIN)시킨다.
293T 세포의 일시적인 형질감염(transient trandfection)을 위하여, 6-cm조직배양디쉬(Corning 또는 BD Biosciences)에서 배양된 293T세포에 적절한 렌티바이러스 전달 벡터 플라스미드(lentiviral transfer vector plasmid) 5㎍, 외피 플라스미드(SVG, SVGmu, Eco 또는 VSVG) 2.5㎍ 및 패키징 플라스미드(pMDLg/pRRE 및 pRSV-Rev) 2.5㎍으로 형질감염(transfection)시켰다. 바이러스 상등액은 형질감염(transfection) 후 48시간 및 72시간 후 수득하여, 0.45-㎛ 필터(Corning)를 통해 여과시켰다. 생체 내실험용으로 농축된 바이러스 벡터를 제조하기 위해서, 상기 바이러스 상등액은 50,000 x g에서 90분 동안 초원심분리(Optima L-80 K preparative ultracentrifuge, Beckman Coulter)하였다. 그 후 펠릿(pellet)을 적절한 양의 차가운 PBS로 재현탁하였다.
이하, SVGmu로 슈도타입화된 바이러스를 FUGW/SVGmu로 명명한다. 이하, 대조군 바이러스로서, 외피단백질이 야생형의 SVG 당단백질인 바이러스를 FUGW/SVG 로 명명한다.
실시예 3: 패키징된 재조합바이러스의 공초점 이미지 분석( CONFOCAL IMAGING OF PACKAGED RECOMBINANT VIRUS )
FUW 렌티바이러스 벡터(GFP 리포터 유전자를 포함하고 있지 않음)의 사용과, 별개의 GFP-vpr을 코딩하고 있는 플라스미드(2.5㎍)를 함께 사용하는 것을 제외하고는 실시예 2에서 설명한 바와 같이, GFP-vpr로 표지시킨 렌티바이러스 벡터를 제조하였다. 신선한 바이러스 상등액을 6웰 배양디쉬의 폴리라이신(polylysin)으로 코팅된 커버슬립 위에 도말한 후 4℃, 3,700 x g에서 Sorvall Legend RT 원심분리기를 사용하여 2시간 동안 원심분리하였다. 상기 커버슬립을 차가운 PBS로 두번 씻은 후, 항-HA-바이오틴 항체(Miltenyi Biotec) 및 Cy5-스트렙트아비딘(Invitrogen)으로 면역염색을 하였다. 형광물질(fluorescein)과 Cy5에 대한 필터 셋트가 장착된 Zeiss사의 LSM 510 공초점 레이저 단절 현미경(laser scanning confocal microscope)을 사용하여 형광이미지를 얻었다. 이미지를 얻기 위해 플랜-아포크로멧 오일 이머젼 대물렌즈(plan-apochromat oil immersion objective)(63x/l.4)를 사용하였다.
도 2는 프로토콜에 의해 제조된 재조합 바이러스의 공초점 이미지의 결과를 나타낸다(스케일바(scale bar)는 2 μm를 나타낸다). "GFP" 슬라이드의 입자는 녹색으로 염색되고, "SVGmu"슬라이드의 입자는 빨간색으로 염색되며, "병합된(merged)" 슬라이드의 입자는 GFP만 발현될 때는 녹색으로 염색되고, SVGmu만 발 현될 때에는 빨간색으로 염색되고, GFP 및 SVGmu 둘 다 발현될 때에는 노란색/노란-오렌지색으로 염색된다. GFP로 표지된 입자의 90%이상이 SVGmu를 포함하였다. 따라서, SVGmu를 나타내는 렌티바이러스 입자의 생성물은 공초점 이미지를 통해 확인할 수 있다.
실시예 4: DC - SIGN 세포주의 제조( PREPARATION OF DC - SIGN CELL LINES )
표적 형질도입의 실험을 용이하게 하기 위해, 인간 DC-SIGN을 발현하는 DC-SIGN 세포주(이하, 293T.hDCSIGN이라 함) 및 쥐 DC-SIGN을 발현하는 DC-SIGN 세포주(이하, 293T.mDCSIGN이라 함)를 제작하였다. VSVG-슈도타입화된 렌티벡터(lentivector)를 모세포인 293T 세포에 안정적으로 형질도입하여 293T.hDCSIGN 세포주 및 293T.mDCSIGN 세포주를 제조하였다. 인간 DC-SIGN 및 쥐 DC-SIGN의 cDNA는 각각 플라스미드 pUNO-hDCSIGNIAa 및 pUNO-mDCSIGN(InvivoGene)으로부터 증폭하고, 렌티바이러스 플라스미드인 FUW의 인간 유비퀴틴-C 프로모터(ubiquitin-C promoter)의 다운스트림(downstream)에 클로닝하여 각각 FUW-hDCSIGN(서열번호 5) 및 FUW-mDCSIGN(서열번호 6)을 제조하였다. 이어서, 렌티벡터(lentivector)를 VSVG로 슈도타입화하여, 293T 세포의 형질도입에 사용하였다. 생성된 세포를 항체염색(항-인간 DC-SIGN 항체(BD Biosciences) 및 항-쥐 DC-SIGN 항체(eBioscience)) 및 세포 분류(cell sorting)를 통해 단일한 집단군인 DC-SIGN+ 293T.hDCSIGN 세포주 및 mDC-SIGN+ 293T.mDCSIGN 세포주로 수득하였다.
유세포 분석(flow cytometry)에서, 사실상 세포주의 모든 293T.hDCSIGN 및 293T.mDCSIGN세포들이 DC-SIGN을 발현함을 확인하였다(도 3A). 각 도표에서, 실선(비워진 부분)은 293T DC-SIGN 세포주에서 DC-SIGN의 발현을 나타내고, 음영부분은 형질도입이 되지 않은 293T 세포의 배경염색(background staining)을 나타낸다.
실시예 5: DC - SIGN 세포주의 형질도입을 통한 DC - SIGN 특이적인 재조합 바이러스의 평가( EVALUATION OF THE DC - SIGN SPECIFIC RECOMBINANT VIRUS BY TRANSDUCTION OF DC - SIGN CELL LINES )
FUGW/SVG 또는 FUGW/SVGmu(실시예 2)의 형질도입 효율 및 특이성을 평가하기 위해, 상기 바이러스들을 293T.hDCSIGN 및 293T.mDCSIGN 세포주를 형질도입하는데 사용하였다(실시예 4). 형질도입효율은 상기 세포주 안에서의 GFP 발현정도로 측정하였다.
표적세포(293T.hDCSIGN, 293T.mDCSIGN 또는 293T 세포; 웰당 0.2x106세포)를 24웰 배양디쉬(Corning or BD Biosciences)에 심고, 바이러스 상등액(웰당 1㎖)으로 Sorvall Legend 원심분리기를 사용하여, 2,500rpm, 30℃에서 90분 동안 원심분리를 실시하여 스핀-감염(spin-infection)을 시켰다. 그 후, 상등액은 신선한 배양 배지로 교체한 후, 37℃의 5% CO2 배양기에서 3일 동안 배양하였다. GFP+ 세포의 비율은 유세포 분석(flow cytometry)을 통해 측정하였다. 형질도입 타이터(titer)를 직선 반응(linear response)을 보이는 희석비율에 의해 결정하였다.
유세포 분석 결과는 FUGW/SVG(야생형의 SVG 외피당단백질을 포함하고 있음)이 세개의 표적 세포주(293T, 293T.hDCSIGN 및 293T.mDCSIGN)에 대해 비슷한 형질도입 효율(11-16%)을 갖고 있음을 보여주었다(도 3B). 이는 SVG가 넓은 특이성을 가지며, 세포 표면의 DC-SIGN의 존재가 슈도타입화된 SVG-렌티바이러스 벡터의 형질도입능력을 눈에 띄게 변화시키지 않음을 의미한다. 이와 반대로, FUGW/SVGmu 벡터(돌연변이된 SVG외피 당단백질을 포함하고 있음)는 293T.hDCSIGN 세포 및 293T.mDCSIGN 세포를 각각 42% 및 34%의 형질도입효율로 특이적으로 형질도입시켰으나, 293T 세포는 그렇지 않았다(도 3B). 이런 결과는 SVGmu를 나타내는 슈도타입화된 렌티바이러스 벡터가 인간이나 쥐의 DC-SIGN을 발현하는 세포들을 특이적으로 형질도입시킬 수 있다는 것을 보여준다. 더욱이, 돌연변이된 SVG는 야생형의 SVG에 비해 보다 효율적으로 DC-SIGN을 발현하는 세포를 형질도입시켰다.
형질도입된 세포로의 FUGW 렌티바이러스 벡터의 안정적인 도입은 GFP 리포터 유전자의 게놈 내 도입의 PCR 분석을 통해 확인하였다. DC-SIGN을 통해 매개되는 특이한 형질도입을 보여주기 위해, 293T.hDCSIGN 세포에 노출시키기 전에 FUGW/SVGmu 바이러스 상등액에 수용성 항-인간-DC-SIGN 항체를 가했고, 그 결과 형질도입 효율이 떨어졌다(데이터는 제시하지 않음). 293T.mDCSIGN에 대한 FUGW/SVGmu의 특정 타이터를 1x106 TU(Transduction Units)/ml로 개산하였다. 293T.hDCSIGN에 대한 FUGW/SVGmu의 특정 타이터를 l-2xlO6 TU/ml로 개산하였다.
실시예 6: 시험관 내에서 재조합바이러스의 평가( EVALUATION OF THE RECOMBINANT VIRUS in vitro )
DC-SIGN을 발현하는 수지상세포(dentric cell, DC)의 형질도입을 위해 설계된 렌티벡터(lentivector)의 특이성을 조사하기 위해, 쥐로부터 총 골수(bone marrow, BM)세포를 분리하고, 즉각적으로 FUGW/SVGmu 바이러스 벡터를 형질도입시켰다(실시예 2). 골수세포 배양에서 자라난 전구체(progenitor)로부터 쥐 DC를 만들어 내는 프로토콜을 실험에 맞도록 적용하였다(Buchholz, CJ. , et al. 1998. Nat Biotech 16:951-954 이 참고문헌은 그 전체가 본원의 참고문헌으로 편입된다).
총 골수세포를 B6 암컷쥐(Charles River Breeding Laboratories)로부터 수득하고, BMDC를 여러 문헌에서 기술된 방법으로 제조하였다(Yang, L. and D. Baltimore. 2005. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 4518-4523, 이 참고문헌은 그 전체가 본원의 참고문헌으로 편입된다). 총 골수세포 또는 BMDC를 24웰 배양디쉬에 심고(웰당 2x106세포), Sorvall RT7 원심분리기를 사용하여 바이러스 상등액(웰당 1㎖)과 함께 2,500rpm, 30℃에서 90분간 원심분리하여 스핀-감염(spin-infection)시켰다. 스핀 후에, 상등액을 제거하고, 10% FBS 및 GM-CSF가 첨가된 신선한 RPMI 배지(1:20 J558L 적정화배지(conditioned medium))로 교체하였다. 3일간 배양 후, 유세포 분석(flow cytometry)으로 GFP 발현을 분석하였다.
쥐로부터 분리한 골수세포를 바이러스 벡터인 FUGW/SVGmu 또는 대조군 벡터로 즉각적으로 형질도입을 하였다. 대조군으로, 에코트로픽 쥐백혈병바이러스 당단 백질인 Eco로 외피가 둘러싸인 렌티벡터(ecotropic murine leukemia virus glycoprotein(Eco)-enveloped lentivector)(FUGW/Eco)를 사용하였다; Eco로 외피가 둘러싸인 바이러스는 넓은 특이성을 가지며 설치류 세포를 감염시킬 수 있다. 감염된 지 3일 후, 유세포 분석(flow cytometry)을 이용해 형질도입효율을 분석하였다(도 4A). 혼합된 골수세포 배양의 대략 9%가 DC였고(이는 CD11c의 발현으로 나타남), 그중 대부분(대략 80%)이 DC-SIGN이 높았다(데이터는 제시하지 않음). FUGW/SVGmu의 형질도입에 대해 총 골수세포 중 12%가 GFP 양성(GFP+)으로 관찰되었다(도 4A). GFP+ 세포에 있어서, 형질도입된 세포의 95% 까지는 DC-SIGN 및 CD11c가 둘 다 양성(DC-SIGN+ CDl1c+)인 것으로 관찰되었는데, 이는 FUGW/SVGmu가 골수에서 DC-SIGN을 발현하는 DC를 특이적으로 형질도입시키고, 다른 세포 유형은 형질도입시키지 않는다는 것을 보여주는 것이다. 이와 반대로, FUGW/Eco에 노출된 후, 총 골수세포의 68% 가 GFP 양성이었으나, 형질도입된 세포의 9%만이 DC 였고, 그 중 6.5% 가 DC-SIGN+ 였다.
FUGW/SVGmu의 안정적인 형질도입은 렌티벡터(lentivector)의 골격(backbone)의 LTR이 게놈 내로 삽입되었는지 Alu PCR 분석을 통해 확인하였다(Butler, S. L., et al. 2001. Nat. Med. 7: 631-634, 이 참고문헌은 그 전체가 본원에 참고로 편입된다). 또한, 쥐의 지라(spleen)로부터 수득한 1차 T세포 및 B 세포에 FUGW/SVGmu 을 형질도입시키면 실질적으로 형질도입이 검출되지 않았는데, 이는 놀란 만한 형 질도입효율을 나타내는 결과이다(도 4B).
또한, 시험관 내에서 배양한 골수에서 유래된 DC (이하, BMDC라 함)에의 SVGmu를 함유하고 있는 렌티벡터(lentivector)의 형질도입 효율도 검사하였다. BMDC는 상기에서 설명한 바와 같이, 과립구대식세포집락자극인자(granulocyte - macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF)의 존재 하에 6일 동안 배양하여 제조하였다. 이어서 상기 세포들을, FUGW/SVGmu 또는 FUGW/Eco 렌티벡터(lentivector)에 노출시켰다. 형질도입하고 3일 후, BMDC의 유세포 분석 결과는 FUGW/Eco 가 CDl1c+ DC 세포(33%) 및 CDl1c- 세포(7.6%) 둘 다에 형질도입된 것을 보여주었다(도 5). 이는 Eco가 넓은 트로피즘(tropism)을 갖고 있음과 일치한다. 이와 반대로, FUGW/SGVmu는 단지 CDl1c+ DC 세포만(32.7%) 형질도입시켰고, CDl1c- 세포에서는 GFP+ 세포는 검출되지 않았다(도 5). 이는 FUGW/SVGmu가 특이적으로 BMDC를 변형시킴을 의미한다.
따라서, 이러한 결과들은 SVGmu를 갖도록 설계된 재조합 렌티벡터(lentivector)가 시험관 내 서 특이적으로 DC를 형질도입시킬 수 있고, DC 표면의 DC-SIGN의 발현과 표적 형질도입(targeted transduction)이 서로 관련이 있다는 것을 증명하는 것이다.
실시예 7 시험관 내 서 수지상세포(dentric cell)의 활성화에 대한 재조합 바이러스의 효과( EFFECT OF RECOMBINANT VIRUS ON ACTIVATION OF DENDRITIC CELLS in vitro )
재조합 렌티바이러스가 특이적으로 DC를 표적(target)하고, 형질도입시키고, 성숙한 DC로 DC를 활성화 시킬 수 있는지 결정하기 위해 더 실험을 수행하였다. 공동-자극 분자(co-stimulatory molecule)로서의 B7.2(CD86) 및 MHC 클래스 II 분자인 I-Ab의 표면의 상향 조절(up-regulation)은 DC 활성화의 표지로 알려져있다(Steinman, R.M., et al. 2003. Annu. Rev. Immunol. 21 : 685-711, 이 참고문헌은 그 전체가 본원의 참고로 편입된다). 상기 표면의 상향 조절은 DC를 재조합 바이러스에 노출시켜서 측정하였다. 실시예 6에서 설명한 방법으로, BMDC를 제조하고, FUGW/SVGmu로 형질도입시켰다. 또 한, 1㎍/㎖의 LPS를 하루밤 동안 추가하여 형질도입된 BMDC를 더욱 활성화시켰다.
상기 BMDC의 형질도입 3일 후, 유세포 분석 결과는 FUGW/SVGmu의 처리가 DC 활성화 마커(activation marker)인 CD86 및 I-Ab 를 GFP 음성인 DC에 비해서, GFP 양성인 DC에서 향상시키는 것을 보여주었다(도 6, 위쪽 패널). 음영 부분은 GFP 음성 세포(형질도입되지않음)를 가리키고, 실선(빈부분)은 GFP 양성 세포(형질도입되었음)를 가리킨다. 상기 BMDC의 표적 형질도입(targeted transduction)에서 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS)의 처리가 공동상승작용을 하여서, DC를 더욱 성숙시킨다는 것이 관찰되었다(도 6, 아래쪽 패널). 이는 표적 형질도입은 혼자 작용하거나 또는 DC 활성화를 유도하는 다른 DC 성숙 인자(maturation factor)와 결합하여 작용할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 8: 생체 내에서 재조합 바이러스에 의한 수지상 세포의 표적( TARGETING OF DENDRITIC CELLS 생체 내 BY RECOMBINANT VIRUS )
상기 방법론이 백신접종(vaccination)에 사용될 수 있을 지의 증명은 생체 내에서의 실험으로 시험할 수 있다. SVGmu를 갖도록 설계된 렌티벡터(lentivector)가 생체 내에서 DC를 표적할 수 있는지 알아보기 위해, 농축된 재조합 렌티벡터(lentivector)인 FUGW/SVGmu(200㎕의 PBS로 5OxIO6 TU 가 되게 재현탁함)를 암컷 쥐인 C57BL/6(B6, Charles River Breeding Laboratories)의 서혜림프절(inguinal lymph node)에서 가까운(1cm 범위 안), 왼쪽 옆구리의 피하에 주사를 놓았다. 상기 주사를 놓은 3일 후, 왼쪽 서혜림프절(inguinal lymph node)과 이에 대응되는 반대쪽 림프절(lymph node)을 분리하여 그 크기를 관찰하였다. 상기 림프절들에서 세포를 수득하여, 총 세포수를 세었다. GFP+ 인 DC의 비율은 항-CDl1c 항체(BD Biosciences)로 세포를 염색하여 유세포 분석(flow cytometry)으로 분석하였다.
3일째에, 상기 주사 맞은 부위에 가까운 왼쪽 서혜림프절(inguinal lymph node)의 크기가 현저하게 커졌다(도 7A, 왼쪽 그림). 그리고 상기 림프절(lymph node)의 세포수도 이에 대응되는 반대쪽 림프절(lymph node) 또는 주사를 맞지않은 쥐의 림프절(lymph node)의 세포수에 비해 10배 이상 증가하였다(도 7B). 이 결과는 림프절(lymph node) 가까이에 벡터의 투여는 림프구(lymphocyte)의 이 동(trafficking) 및 증식(proliferation)을 높인다는 것을 나타낸다.
유세포 분석 결과는 왼쪽 서혜림프절(inguinal lymph node)의 총 CD11c+ 세포의 대략 3.8% 가 GFP+ DC 임을 나타내었다(도 7C). 이는 주사 맞은 부위로부터의 이동이 일어났음을 나타낸다. 이 결과는 한 번의 벡터의 피하주사가 현저하게 커다란 효과가 있음을 나타내고, 상기 재조합 바이러스가 생체 내에서 효과적으로 DC를 감염시킨다는 것을 보여준다.
실시예 9: 생체 내에서의 형질도입에 의한 재조합 바이러스의 특이성 평가( EVALUATION OF THE SPECIFICITY OF RECOMBINANT VIRUS BY 생체 내 TRANSDUCTION )
생체 내에서의 DC-표적 렌티벡터(lentivector)의 특이성을 실험하기 위해서, 개똥벌레 루시퍼라아제(luciferase)를 코딩하고 있는 렌티바이러스 벡터를 제작하였다. 개똥벌레 루시퍼라아제(luciferase)의 cDNA는 pGL4.2LucP (Promega)로부터 증폭하고, GFP를 대체하여 FUGW(Lois, C. et al. 2002. 상기)로클로닝하여, Fluc(서열번호 4) 구조체를 제작하였다(도22A). 이 후, 생체발광이미지(bioluminescence image, BLI)의 표준 프로토콜을 사용하여 상기 루시퍼라아제 리포터 유전자(luciferase repoter gene)를 생체 내에서 조직세포의 형질도입이 눈에 보일 수 있게 하도록 사용하였다.
재조합 렌티벡터(lentivector)(이하, Fluc/SVGmu이라 함)를 쥐의 왼쪽 옆구 리의 피하에 주사를 놓았다. 또 다른 쥐는, 대조군인 비특이적 벡터로서 수포성구내염(vesicular stomatitis)의 바이러스 당단백질로 슈도타입화된 렌티벡터(lentivector)(이하, Fluc/VSVG이라 함)를 주사를 놓았다. 이 후, 상기 벡터를 처리한 마우스들은 BLI를 사용하여, 비침습적으로(non-invasively) 이미지를 볼 수 있었다. 상기 Fluc/VSVG를 처리한 마우스들은 주사 맞은 부위에서 강하고 영구적인 시그널이 나타났고, 이는 비특이적인 조직이 형질도입되어 루시퍼라아제(luciferase)를 발현한다는 것을 나타낸다(도 22B). 이 결과는 VSVG-외피로 둘러싸인(enveloped) 바이러스가 넓은 특이성을 갖는다는 사실과 일치한다. 이와 반대로, 상기 Fluc/SVGmu를 처리한 쥐에서는 주사 맞은 부위에서 눈에 띄는 시그널이 검출되지 않았고(도 22B), 이는 SVGmu를 갖고 있는 렌티벡터(lentivector)가 상대적으로 엄격한 표적특이성을 갖는다는 것을 나타낸다. 발광시그널이 표적 마우스들에선 검출되지 않았는데, 이는 DC의 드물고 산재한 분포 때문일 것이고, 이런 분포는 현재의 BLI방법의 감도를 넘어선다.
한달 후, 상기 Fluc/SVGmu를 주사 맞은 마우스들을 정량 RT-PCR(quantitative RT-PCR)로 생체분포(biodistribution)분석을 하였고, 분리한 모든 조직(심장, 간, 지라, 신장, 생식샘(gonad), 허파, 피부, 림프절)에서 검출될 만한 렌티벡터(lentivector)의 카피(copy)가 관찰되지 않았다. 이는 상기 동물들에서 비특이적인 감염이 부족함을 나타내고, 따라서 DC 표적 벡터(targeted vector)의 특이성을 입증하는 것이다.
실시예 10: 시험관 내에서의 재조합 바이러스에 의한 항원 전달( In vitro ANTIGEN DELIVERY BY RECOMBINANT VIRUS )
재조합 렌티벡터(lentivector)의 DC로의 표적 형질도입이 항원을 DC에 효과적으로 전달시켜서, 항원 특이적인 CD8+ 및 CD4+ T 세포 반응을 자극 시킬 수 있는지 결정하기 위해, 모델 항원인 닭의 난알부민(ovalbumin, OVA)을 발현하는 렌티벡터(lentivector)를 제작하였다. C57BL/6J(B6) 마우스들에서, OVA는 CD8+ T-세포 수용체인 OTl 및 CD4+ T-세포 수용체인 OT2에 대한 표적 항원으로서 특성이 잘 기술되어 있다. OT1은 특이적으로 OVA257 -269(이하 OVAp)에 결합하고, OT2는 특이적으로 OVA323-339(이하 OVAp*)에 결합한다(Yang, L. and D. Baltimore. 2005. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 4518-4523, 이 참고문헌은 그 전체가 본원에 참고로 편입된다). OVA를 발현하는 렌티벡터(lentivector)(FOVA(서열번호 2), 도 8, 위쪽)는 닭의 난알부민(ovalbumin) cDNA로 GFP를 대체시켜서 FUGW(도 8, 아래쪽)로부터 제작하였다.
BMDC(실시예 6)는 배양 6일 후, 재조합 렌티바이러스인 FOVA/SVGmu 또는 대조군으로 재조합 렌티바이러스인 FUGW/SVGmu(비상응하는 GFP 리포터 유전자를 코딩하고 있음)으로 형질도입시켰다. 상기 6일 째의 BMDC는 상기 바이러스 상등액으로 스핀-감염(spin-infection)시키고, 3일간을 더 배양하였다. 9일째에, 비부착성(non-adherent) 세포들을 수득하고, 10%의 FBS, GM-CSF(1:20 J558L 적정화배지 (conditional medium)) 및 l㎍/ml의 LPS(Sigma)가 함유된 RPMI배지에서 재배양하였다. 10일째에, 상기 세포들을 수득하여 T 세포의 자극에 사용하였다. 상기 변형된 BMDC들을 형질도입에 사용한 렌티벡터(lentivector)에 따라 DC/FOVA 및 DC/FUGW로 명명하였다. 이와 병행하여, 형질도입하지 않은 9일째의 BMDC 배양의 비부착(non-adherent) 세포들을 수득하여, 같은 배지로 재배양하였다(10% FBS, GM-CSF 및 LPS를 포함하는 RPMI배지). 10일째에, 상기 세포들을 수득하고, OVAp(OVA257 -269, T 세포 수용체인 OT1에 의해 특이적으로 결합함, 이하, DC/OVAp이라 함) 또는 OVAp*(OVA323-339, T 세포 수용체인 OT2에 특이적으로 결합함, 이하, DC/OVAp* 이라 함)와 함께 심고, T 세포자극의 양성대조군으로 사용하였다. 상기 벡터가 형질도입된 BMDC의 트랜스제닉(transgenic) OVA항원의 처리(process) 및 항원 제시(presentation) 능력을 실험하기 위해서, OTl 및 OT2 트랜스제닉(transgenic) 마우스들로부터 지라세포(spleen cell)를 수득하여 렌티벡터(lentivector)가 형질도입된 BMDC와 함께 배양하거나, 또는 지시된 비율에 따라, OVAp 또는 OVAp* 와 같이 BMDC를 심었다. 3일 후, 상등액을 수득하여 ELISA로 IFN-γ의 생산양을 분석하고, 상기 세포들을 수득하여 유세포 분석(flow cytometry)으로 세포들 표면의 활성화 마커(activation marker)를 분석하였다. T 세포 증식(proliferation)은 [3H]-티미딘 편입(thymidine incorporation)으로 검사하였다.
트랜스제닉(transgenic) T 세포에 대한 상기 DC/FOVA의 비율을 다양하게 하 여 공동 배양한 3일 후, IFN-γ의 분비(도 10A) 및 T 세포 증식(proliferation)(도 10B)에 의해 측정된 바와 같이 OTl T 세포가 강력하게 반응하였다. 기대했던 바와 같이, DC/FUGW를 사용한 군에서는 명백한 OVA 반응이 검출되지 않았다(도 1OA 및 10B). 또한, 트랜스제닉(transgenic) OVA의 발현이 OT1 T 세포 반응의 자극을 위해 펩티드(peptide)를 접종(loading)하는 것보다 훨씬 더 효율적인 것으로 나타났다. 이는 MHC 클래스 I이 내생적으로(endogenously) 생성된 펩티드의 제시(presentation)를 더 좋아한다는 견해와 일치한다. 유세포 분석은 DC/FOVA 또는 DC/0VAp에 의해 자극을 받은 후, 활성화된 OTl T 세포들이 전형적인 작동 세포독성 T 세포(effector cytotoxic T cell)의 표현형(phenotype)(CD25+CD69+CD62LIowCD44high)을 보인다는 것을 나타냈다(도 9).
또한, DC를 OT2 CD4+ T 세포와 공동배양하였을 때, 표면 마커(도 11) 및 IFN-γ(도 12) 생산양의 변화에서 나타난 결과와 같이, T 세포 활성화가 나타났다. 그러나, 상기 CD4+ 세포들의 자극은 CD8+ 세포들만큼은 아닌데, 이는 아마 MHC 클래스 II 분자의 내생적인 펩티드 항원(endogenous antigen peptide) 제시가 덜 효율적이기 때문이다. OVA항원의 세포내 위치의 변형은 항원을 MHC 클래스 II의 제시 경로(presentation pathway)로 이끌고, CD4자극의 증대를 이루었다. 이는 펩티드를 DC에 결합시키는 것(peptide-pulsed DC)보다 더 좋았다(데이터는 제시하지 않음).
이러한 결과들은 렌티벡터(lentivector)의 감염을 통한 DC 표적방법은 DC로 항원을 효율적으로 전달할 수 있고, CD8+ 및 CD4+ T 세포들의 반응을 자극할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 11: 생체 내에서의 재조합 바이러스의 항원전달(생체 내 ANTIGEN DELIVERY BY RECOMBINANT VIRUS )
렌티벡터(lentivector)로 표적화된(targeted) DC가 생체 내에서 항원 특이적인 T 세포를 활성화시킬 수 있는지 알아보기 위해서, 쥐에서 T-세포 수용체 유전자(TCR gene)를 쥐의 조혈모세포(hematopoietic stem cell, HSC)로 전달하는 방법을 사용하여 항원특이적이고, TCR이 설계된 T 세포(TCR-engineered T cell)를 제작하였다. 이는 여러 곳에서 설명된 방법과 같다(Yang, L. and D. Baltimore, D. 2005. 상기). 트리시스트로닉 레트로바이러스 벡터(tricistronic retroviral vector)인 MIG-OTl 를 OTl TCRα및 TCRβ를 공동으로 발현하고, GFP 마커가 있도록 제조하였다(도 13A).
간단히, B6 암컷쥐(Charles River Breedling Laboratories)에 250 ㎍의 5-플루오르유라실(flurouracil)(Sigma)를 처리하였다. 5일 후, HSC가 풍부해진 골수세포(이하 BM)를 경골(tibia) 및 넙다리뼈(femur)로부터 수득하여, 24 웰 배양플레이트(웰당 2x106 세포)에 BM 배양 배지(10%의 FBS, 20ng/ml의 rmIL-3, 50ng/ml 의 rmIL-6 및 50ng/ml rmSCF (PeproTech)를 함유하고 있는 RPMI배지)에서 배양하였다. 배양 1일째와 2일째에, 상기 세포들을 Eco로 슈도타입화된 레트로바이러스 벡터인 MIG-OTl로 2,500rpm, 30℃에서 90분 동안 스핀-감염(spin-infection)(웰당 2 ml의 바이러스 상등액)시켰다. 각각의 스핀 후, 상등액은 제거하고 신선한 BM 배양배지로 교체하였다. 3일째에, 상기 형질도입된 BM세포들을 수득하여, 온 몸에 1,200 rads로 방사선 조사를 받은 B6 수용자 마우스들(recipient mice)에 이식하였다. 이식 8주후, 상기 마우스들은 생체 내에서 면역화연구에 사용하였다. 각각의 마우스들은 1회 투여량(dose)으로 10x106 TU 의 표적 렌티벡터(lentivector)를 피하에 주사를 놓았다. 7일후, 지라(spleen) 및 림프절(lymph node)의 세포들을 수득하고, 유세포 분석(flow cytometry)을 이용하여 OTl T세포 및 OTl T세포의 활성화 마커(activation marker)의 존재를 분석하였다.
이식하고 8주후, 상기 재구성된 마우스들(reconstituted mice)의 말초(peripheral) T 세포의 분석은 대략 5%의 CD8+ T 세포가 GFP+OTl+임을 나타냈다(도 13B). 상기 재구성된 쥐의 약간은 같은 투여량(10x106 TU)으로 FOVA/SVGmu(실시예 10) 또는 FUGW/SVGmu(실시예 2)를 피하에 주사를 놓아 면역화시켰다. 7일 후에, 말초 림프계 기관(peripheral lymphoid organ)으로부터 수득한 GFP+OTl+ T 세포 분석 결과는 FOVA/SVGmu로 표적화된 DC의 면역화는 대조군 마우스들에 비해서, OTl T 세포들의 수가 두배가 되었음을 보여주었다(도 14B). 상기 대조군 마우스들은 면역화되지 않거나 또는 FUGW/SVGmu로 면역화된 쥐를 말한다. 상기 FOVA/SVGmu로 면역화된 쥐로부터 유래된 GFP+OTl+ T 세포들은 작동기억표현형(effector memory phenotype) (CD69lowCD62highCD44high)을 나타냈고, 이는 상기 세포들이 생산적인 면역반응을 거쳐갔음을 시사하는 것이다(도 14A).
이런 결과들은 표면에 SVGmu를 갖고 있는 재조합 렌티벡터(lentivector)가 생체 내에서 DC를 표적하여, 항원 특이적인 T 세포를 효율적으로 자극시키고 강한 면역반응을 유도한다는 것을 증명한다.
실시예 12: 직접적인 재조합 바이러스의 투여를 통한 생체 내에서 CTL 및 항원반응 유도( INDUCTION OF 생체 내 CTL AND ANTIBODY RESPONSES BY DIRECT ADMINISTRATION OF RECOMBINANT VIRUS )
본 실시예는 표적 렌티벡터(lentivector)를 야생형(wild-type)의 나이브(naive) 마우스들에 투여하여, 항원특이적인 CD8+ 세포독성T림프구(cytotoxic T lymphocyte, CTL)반응 및 항체 반응 유도에 있어서 생체 내에서 표적 DC의 효능에 대해 실험을 수행하였다.
야생형 B6 마우스들(Charles River Breeding Laboratories)의 오른쪽 옆구리 피하에 한 번의 지시된 투여량에 따라 표적 렌티벡터(lentivector)(FUGW/SVG 또는 FOVA/SVGmu의 5Ox1O6 TU)를 주사를 놓았다. 상기 면역화 후 7일째 및 14일째에, 면역화된 마우스들의 꼬리에서 채혈하여, ELISA로 혈청(serum)의 항-OVA IgG 를 측정하였다. 14일째에, 상기 마우스들의 지라(spleen) 및 림프절(lymph node) 세포를 수득하여 유세포 분석(flow cytometry)을 사용하여 OVA 특이적인 T 세포와 그들의 표면 활성마커의 존재를 분석하였다.
상기 OVA 특이적인 T 세포의 존재는 시토카인(cytokine)분비 및 테트라머(tetramer)염색을 측정하여 판단하였다. 상기 주사 후 14일째에, T세포는 말초 림프계 기관(peripheral lymphoid organ)으로부터 수득하여 분석하였다. 선천(native) DC 표적 렌티벡터(lentivector)는 림프절(lymph node)(데이터는 제시하지 않음) 및 지라(spleen)(도 23) 양쪽에서 OVA에 반응하는 CD8+ T세포를 유발할 수 있었다. 재조합 FOVA/SVGmu의 1회 투여량(dose)은 상기 CD8+ T세포를 생성하는 데 충분하였고, 이는 OVAp의 재자극에 IFN-γ분비를 하는 프라임드(primed)가 가능하였다(도 23). 대조군 벡터인 FUGW/SVGmu의 투여는 어떠한 OVAp 특이적인 반응도 보이지 못했다(도 23). OVAp-특이적인 CD8+ T세포는 MHC 클래스 I의 테트라머 (tetramer)염색을 측정하여, 반응의 크기를 더 평가하였다. 상기 OVAp-특이적인 T 세포의 높은 빈도(>6%)는 1회 투여량의 주사 다음에 얻어졌다(도 15); 테트라머(tetramer) 양성세포는 FUGW/SVGmu로 처리한 쥐에서는 검출되지 않았다(도 15). 테트라머(tetramer) 정량데이터는 세포내 IFN-γ염색으로 분석한 CD8+ 작동세포(effector cell)분석과 잘 연관되어 있다(도 23). 이런 OVAp-양성 T 세포의 표현형(phenotype) 분석은 상기 세포들이 작동 기억 T 세포(effector memory T cell)의 표면 특징(CD25lowCD69lowCD62LhighCD44high)을 나타내고 있음을 보여주었다(도 17A).
렌티벡터(lentivector) 투여의 투여량(dose) 반응을 조사하기 위해서, 100x106 TU 부터 3x106 TU 까지의 범위의 투여량(dose)으로 FOVA/SVGmu 을 피하에 주사하고, 주사 후 14일째에 지라(spleen)에서 OVAp-특이적인 T 세포를 측정하였다. 예외적으로 높은 빈도(12%)의 OVAp-특이적인 CD8+ T세포가 100x106 TU의 투여량(dose)에서 검출되었다(도 16A). 상기 OVAp-특이적인 세포의 백분율은 재조합 벡터 투여양과 비례하여 관련되어 있었다(도 16B). 투여량(dose) 반응에서 고원(platau)은 실험을 한 투여량에서 얻지 못하였고, 이는 더한 증대는 주입하는 벡터의 양 및/또는 빈도의 증가에 의해 얻을 수 있음을 시사한다.
더 나아가, 마우스들에서 OVA에 특이적인 혈청 IgG의 수준은 FOVA/SVGmu (5OxIO6 TU)로 면역화한 후, 7일 및 14일째에 조사하였다. 상기 IgG 혈청 타이터는 7일째에 1:10,000 이고, 14일째는 1:30,000이었다(도 17B). 이는 추가적인 항원보강(adjuvant) 또는 다른 자극 없이 1회 투여량의 주사에 대한 항체 반응으로는 꽤 인상적이고, 또한 표적화된 렌티벡터(lentivector)에 의한 면역화는 B 세포가 항원 특이적인 항체를 현저하게 분비하도록 유발할 수 있다는 점을 시사한다.
이런 결과들은 DC-표적 렌티벡터(lenti vector)의 생체 내투여가 전달된 항원에 대항해서 세포성 면역 및 체액성 면역 둘 다를 유도할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 13: 항종양 면역의 생성: 예방적인 방어( GENERATION OF ANTI - TUMOR IMMUNITY: PREVENTIVE PROTECTION )
생체 내에서 DC-표적화된 렌티벡터(lentivector)의 투여후, 생성된 항암면역을 평가하였다. E.G7 종양모델(Wang, L. and D. Baltimore. 2005. 상기)을 사용하였고, OVA를 종양 항원으로 사용하였다.
종양 세포주인 EL4(C57BL/6J, H-2b, 흉선종(thymoma)) 및 E.G7 (닭의 OVA cDNA의 한 카피(copy)를 안정적으로 발현하는 EL4 세포)를 마우스들의 종양 시험 감염(tumor challenge)을 위해 사용하였다. 종양방어실험을 위해서, 1회 투여량인 50xl06 TU의 표적 렌티벡터(lentivector)(FOVA/SVGmu 또는 FUGW/SVGmu)를 B6 마우스들(Charles River Breeding Laboratories)의 오른쪽 옆구리에 주사를 놓았다. 2주후, 5x106 의 EL4 세포 또는 5x106 의 E.G7 세포를 상기 마우스들 왼쪽 옆구리의 피하에 주사를 놓았다. 종양의 크기를 하루걸러 가는 캘리퍼스(fine calipers)로 측정하고, 두개의 가장 큰 수직 직경의 결과를 a x b (mm2 )로 나타냈다. 종양의 크기가 400mm2 에 달했을 때 쥐를 죽였다.
상기 5Ox1O6 TU 의 FOVA/SVGmu 백신접종(vaccination)은 완벽하게 E.G7 종양 시험감염(tumor challege)으로부터 마우스들을 방어하였다(도 18, 왼쪽). 반면에 OVA 트랜스진(transgene)이 결손된 렌티백터(lentivector)로 가장(mock) 백신접종한 쥐는 종양이 급속히 자랐다(도 18, 왼쪽). 상기의 방어는 OVA-특이적이었다. 왜냐하면 백신접종된 마우스들은 면역화에 렌티벡터(lentivector)가 사용되었는지에 상 관없이, OVA 발현이 결손된 대조군인 EL4 종양이 자랐기 때문이다(도 18, 오른쪽).
실시예 14: 항종양 면역의 생성: 종양치료( GENERATION OF ANTI - TUMOR IMMUNITY: TUMOR TREATMENT )
생체 내에서 DC-표적화된 렌티벡터(lentivector)를 투여후 생성된 항암면역은 렌티벡터(lentivector)의 투여 전 종양세포가 도입된 곳을 평가하였다. "치료상의 백신접종(therapeutic vaccination)"의 실험에서, 종양의 주입과 렌티벡터(lentivector)의 투여 단계를 실시예 13의 방법의 역으로 수행하여 확립된 종양이 제거될 수 있는지를 실험하였다. 마지막에는, 개똥벌레 루시퍼라아제(luciferase)유전자를 발현하는 E.G7 종양세포(E.G7.1uc)를 마우스들의 시험 감염(challenge)에 사용하였고, 이는 살아있는 동물에서 BLI를 사용하여 종양성장 속도론(tumor growth kinetics)을 면밀히 관찰할 수 있게 하였다. 이미지화를 쉽게 하기 위해 B6 쥐(The Jackson Laboratory)의 알비노 주(albino strain)를 사용하였다. 상기 마우스들은 색소형성이 결손되어서 발광시그널(luminescence signal)의 배경흡수(background absorption)가 낮다. 상기 마우스들에 lOOxlO6 TU 의 FOVA/SVGmu의 주사는(실시예 10) 일반적인 B6 쥐에서 관찰되는 반응과 유사한 반응을 나타내었다(도 21). 상기 E.G7.luc 종양세포(5xlO6)는 알비노(albino) B6 쥐의 피하에 이식하였다. 종양 시험 감염(tumor challenge)된 후 3일 째와 10일째에, 두 번 FOVA/SVGmu (쥐당, 시간당, 5OxIO6 TU)를 피하에 주사를 놓아서 쥐를 면역화시켰다. 실험은 도 19 및 도 20에 나타난 대표적인 실험과 같이 3번씩 반복하였다.
상기 DC-표적 렌티벡터(lentivector)로 면역화된 마우스들은 9일째부터 종양의 성장이 줄어들었고, 11일째는 검출 수준의 아래로 발광(luminescence)이 줄었고, 종양의 퇴행이 뒤따랐다(도 19 및 도 20). 비록 작은 종양의 재발이 12일째부터 16일째에 관찰되었지만, 상기 FOVA/SVGmu를 처리한 마우스들은 18일째의 끝에서는 질병으로 부터 자유로워졌다. 그리고 그 후로는, 실험기간 동안 종양의 재발이 관찰되지 않았다(60일 이상). 이와 반대로, 아무런 치료도 받지 않은 마우스들은 종양이 점차적으로 자랐고, 종양의 커다란 크기 때문에 16일째 후엔 실험에서 제거해야 했다. 상기 렌티벡터(lentivector) 면역화 후 7일째의 종양의 퇴행은 흥미로운 특징이었다. 종양의 퇴행 시간은 백신접종에 의해 유도된 항원특이적인 면역반응의 속도론(kinetics)과 잘 관련된다.
실시예 15: 시험관 내에서 재조합 바이러스에 의한 항원과 성숙 인자의 전달( In vitro DELIVERY OF ANTIGEN AND MATURATION FACTORS BY A RECOMBINANT VIRUS)
DC의 백신접종의 성공은 DC의 성숙상태에 달려있다(Banchereau, J. and A.K. Palucka. 2005. Nat Rev Immunol 5:296-306; Schuler, G., et al. 2003. Curr Opin Immunol 15: 138-147; Figdor, C.G., et al. 2004. Nat Med 10: 475-480, 이 각각의 참고문헌은 그 전체가 본원에 참고로 편입된다). 그러므로, 렌티바이러스 벡터에는 원하는 DC의 성숙을 유도하는 자극 분자(stimulatory molecule)를 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 시토카인(Cytokine), GM-CSF, IL-4, TNFα 및 IL-6등이 포함될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 다른 실시예에서는, CD4 T 세포에서 전형적으로 발현되고, DC의 CD40 수용체의 리간드(ligand)로 사용되는 CD40 리간드(ligand)(CD40L)가 성숙 인자로 사용된다(Matano, T., et al. 1995. J Gen Virol 76: 3165-3169; Nguyen, T.H., et al. 1998. Hum Gene Ther). 또 다른 실시예에서는, 약을 유도할 수 있는(drug-inducible) CD40 수용체(이하 iCD40)를 유전자 전달 시스템에 적합하게 만들어서, DC가 치료를 위한 강력한 백신이 되도록 더 조작하였다. 여러 곳에서 설명된 바와 같이, iCD40은 리간드 결합 영역(ligand-binding domains)에 융합한 CD40의 세포질영역(cytoplasmic domain) 및 막 표적 서열(membrane-targeting sequence)로 구성되게 설계하였다(Hanks, B.A., et al. 2005. Nat Med 11 : 130-137, 이 참고문헌은 그 전체가 본원에 참고로 편입된다). iCD40가 발현할 때, DC의 성숙과 활성이 지질이 침투할 수 있고(lipid-permeable), 이합체를 형성하는 약(dimerizing drug)에 의해 조절된다.
DC 성숙 인자(maturation factor)가 포함된 효과를 조사하기 위해서, 난알부민(ovalbumin)(이하 OVA, 실시예 10에서 설명한 바와 같음), GM-CSF, IL-4, TNFα, IL-6 및 CD40L 의 각각의 cDNA를 확보하였다. iCD40는 여러 곳에서 설명된 방법으로 제조하였다(Hanks, B. A., et al. 2005. 상기). IRES 및 2A-유사한 서열(2A-like sequence)을 사용하여, 효율적으로 4개의 단백질까지 번역(translation)할 수 있는 멀티시스트론(multicistron)을 가진 렌티바이러스 벡터를 제조하였다. 렌티바이러스벡터를 다음의 유전자들을 동시에 발현할 수 있게 상기 시스템을 적용하여 제조하였다: OVA 및 성숙 인자 분자(maturation factor molecule)(GM-CSF, IL-4, TNFa, IL-6및 CD40L 또는 iCD40) (도 24a, "FUOIM"로 표지하였음). 모범적인 실시예로, 벡터서열은 서열번호 7에 의한다. SVGmu-외피로 둘러싸인 렌티바이러스를 제조하고(실시예 2에서 설명한 바와 같음), 상기 렌티바이러스를 시험관 내에서 배양된 마우스들의 BMDC로 형질도입하여서, 특이적으로 상기 유전자들을 세포로 전달한다(실시예 6에서 설명한 바와 같이 제작함). 상기 BMDC의 성숙은 T세포의 자극의 처리과정에서 중요한 역할을 하는 몇몇 중요 분자들의 상향 조절(up-regulation)을 FACS 분석으로 측정하였다. 전형적인 대표 마커들은 ICAM-I(CD54), B7.1(CD80), MHC 클래스 I, MHC 클래스 II 및 내생적인(endogenous) CD40이다. OVA 및 GFP 유전자들만을 코딩하는 렌티바이러스가 형질도입된 BMDC을 실험의 대조군으로 삼는다. iCD40-변형된 DC를 효과를 줄 수 있는 양만큼의 이합체약(dimeric drug)인 AP20187에 노출시키면, 성숙 마커(maturation marker)들의 상향 조절이 관찰된다.
또한, 성숙된 상기 DC들은 엔도시토시스(endocytosis)의 감소된 능력 및 T 세포 활성화의 향상된 잠재성이라는 두가지 특징정인 특색을 갖는다. FITC로 태그된 덱스트란(dextran)의 섭취(uptake)는 형질도입된 상기 DC의 엔도시토시스(endocytosis)의 정량에 사용한다. 또한, 면역반응을 넘어서는 능력을 평가하기 위해서, 상기 성숙한 DC는 OTl T 세포 수용체(TCR)를 발현하는 T 세포 자극에 사용된다(실시예 10에 설명한 바와 같음). iCD40-변형된 DC를 효과를 나타내는 양만큼의 이합체 약(dimeric drug)인 AP20187에 노출시키면, FITC로 태그된 덱스트 란(dextran)의 섭취가 비-iCD40-변형된 DC에 비해 감소하는 것을 관찰할 수 있다. 게다가, 트랜스제닉(transgenic) T 세포에 대한 iCD40-변형된 DC(이합체 약(dimeric drug)을 처리함)의 비율을 다양하게 하여 공동배양한 후, OTl T 세포의 반응이 비-iCD40-변형된 DC와 공동배양한 것보다 더 격렬한 것이 관찰된다. OTl T 세포의 반응은 IFN-γ의 분비 및 T 세포 증식(proliferation)으로 측정하였다.
DC의 수명은 T 세포에 의존적인 면역을 결정하는 또 다른 지표이다. 시험관 내 서 혈청 결핍 분석(serum-starvation assay)으로 측정한, DC의 생존에 있어서, 상기 자극 분자(stimulator molecule)들의 효과는 Hanks et al.에서 설명한 방법을 사용한 것과 비교될 것이다(Hanks, B.A., et al. 2005. 상기).
만약 필요하면, 표적 DC로 렌티바이러스벡터에 의해 두 개의 성숙 인자 분자들이 전달될 수 있는데, 이는 벡터의 구성이 4개의 단백질들을 발현할 수 있는 용량을 갖고 있어서이다.
실시예 16: 생체 내에서 재조합 바이러스에 의한 항원 및 성숙 인자의 전달( In vivo DELIVERY OF ANTIGEN AND MATURATION FACTORS BY A RECOMBINANT VIRUS )
렌티바이러스 벡터인 FUOIM(서열번호 7)로 패키징된 재조합 바이러스 는 실시예 15에서 설명한 방법으로 제조하였다. 나이브(naive) B6 쥐에 바이러스를 투여하여, DC로 OVA 항원 및 성숙 인자 분자들을 전달한다. 바이러스의 점진적인 투여량에 대한 면역유도는 실시예 11에서 설명한 바와 같이 평가한다.
iCD40를 갖고 있는 렌티바이러스에 의한 표적 DC의 면역화는 대조군 마우스 들과 비교하여, OVA에 반응하는 T 세포의 수가 증가하는 것이 관찰되었다. 상기 대조군 마우스들은 면역화되지 않거나, OVA를 갖고 있지 않은 렌티바이러스(예를 들어 FUGW/SVGmu) 또는 iCD40을 갖고 있지 않은 렌티바이러스에 의해 면역화 된(예를 들어 FOVA/SVGmu) 마우스들이다.
게다가, 동물의 종양 시험 감염(tumor challenge)에 대한 내성은 상기 iCD40 를 갖고 있는 렌티벡터(lentivector)로 실시예 13에서 설명한 바와 같이 평가하였다. 다음의 렌티벡터(lentivector)들을 종양 시험 감염(tumor challenge) 실험에서 마우스들에 주사한다: FUOIM/SVGmu, FOVA/SVGmu, 또는 FUGW/SVGmu. 다음의 세포주들은 종양 시험 감염(tumor challenge)에 사용한다: EL4(C57BL/6J, H-2b, 흉선종(thymoma)) 및 E.G7 (닭의 OVA cDNA의 한 카피(copy)를 안정적으로 발현하는 EL4 세포). DC 표적 렌티벡터(lentivector)인 FUOIM/SVGmu 및 FOVA/SVGmu에 의해 면역화된 마우스들에선 종양 시험 감염(tumor challenge)으로부터 방어가 되는 것이 관찰된다. 이와 반대로, OVA 트랜스진(transgene)이 결손된 렌티벡터(lentivector) (FUGW/SVGmu)로 가장(mock) 백신접종(vaccination)을 한 쥐는 종양이 빠르게 자라는 것이 관찰된다. 상기 방어는 OVA 특이적인데, 이는 면역화에 사용하는 렌티벡터(lentivector)와 상관 없이 백신접종(vaccination)된 마우스들은 OVA 발현이 결손된 대조군인 EL4 종양들이 자랐기 때문이다.
마지막으로, 확립된 종양을 근절하는 상기 방법의 잠재성은 실시예 14에서 설명한 바와 같이 iCD40를 갖고 있는 렌티벡터(lentivector)로 평가하였다. 다음 의 렌티벡터(lentivector)들이 실험에서 면역화에 사용된다: FUOIM/SVGmu 및 FOVA/SVGmu. 다음의 세포주들이 종양의 치료에 사용된다: EL4 및 E.G7. 종양을 주사한 마우스들로, DC 표적 렌티벡터(lentivector)(FUOIM/SVGmu 및 FOVA/SVGmu)로 면역화된 마우스들은 종양의 성장이 줄고, 종양의 퇴행이 뒤따르고 발광(luminescence)이 검출수준의 아래로 떨어진다. 게다가, 실험이 계속되는 동안(60일이상) 종양의 재발이 관찰되지 않는다. 이와 반대로, 아무 치료도 받지 않은 마우스들은 종양이 점진적으로 자란다.
실시예 17: 시험관 내에서 재조합 바이러스에 의한 HIV / AIDS 항원의 제시( HIV / AIDS ANTIGEN PRESENTATION BY RECOMBINANT VIRUS in vitro )
HIV/AIDS를 치료하기 위해 유전자 전달 전략에 설명된 바를 기반으로 "두가지 기능의(dual-functional)" DC를 제조하였다. "두가지 기능의(dual-functional)" DC 는 중화 항체(neutralizing antibodies, Nabs)의 유발 및 T 세포 면역의 유도 둘 다에 효능이 있다(도 25). 효율적으로 NAbs를 유발하기 위해 카이메릭(chimeric) 막-결합 gpl20(membrane-bound gp120, gpl20m)를 코딩하는 유전자를 DC에 전달한다. gp120은 HIV의 외피 당단백질로 가장 강력한 면역원(immunogen)으로 여겨지고 있다(Klimstra, W.B., et al. 2003. J Virol 77:12022-12032; Bernard, K.A., et al. 2000. Virology 276:93-103; Byrnes, A.P., et al. 1998. J Virol 72: 7349-7356, 이 각각의 참고문헌은 그 전체가 본원에 참고로 편입된다). 여러 문헌에서 설명된 바와 같이, gpl20을 수포성 구막염 바이러스(vesicular stomatitis virus)의 당단백질의 막통과영역(transmembrane domain)과 융합하면, 세포표면에서 삼량체(trimeric)형태로 발현되고, HIV 비리온(virion)표면의 성숙한 삼량체(trimer)를 미미킹(mimicking)한다(Klimstra, W.B., et al. 1998. J Virol 72: 7357-7366,이 참고문헌은 그 전체가 본원에 참고로 편입된다 ). 면역원(immunogen)의 상기 형태는 DC의 표면에서 제시될 것이다. 표면 발현에 더해서, 또한, 상기 DC는 gp120으로부터 유래된 에피토프(epitope) 펩티드들을 T 세포에 MHC 제한(MHC restriction) 방식으로 제시할 수 있다.
HIV 감염은 현저하게 CD4 T 세포의 결핍에 의해 DC의 기능을 악화시킬 수 있어서, T 세포와는 독립적으로 기능을 수행하는 DC를 설계하는 것이 바람직하다. CD40L 또는 iCD40의 발현은 CD4 T 세포의 부재하에서 DC의 성숙과 활성을 가져올 수 있다. 따라서, 실시예 16에서 설명한 대로, 성숙 및 자극 분자의 기능을 갖는 설계된 CD40L 또는 iCD40를 DC 표적 바이러스로 삽입한다.
유전적으로 변형된 DC를 위한 렌티바이러스 구조체는 도 24b에 도시하였고, FUGmID(서열번호 8)로 표지한다. gpl20의 최적화된 코돈(codon)을 가진 cDNA는 미국국립위생연구소(NIH)의 AIDS Research & Reference Reagent Program으로부터 확보한다. 최적화된 코돈의 서열(codon-optimized sequence)은 HIV-I 게놈의 문맥(context) 바깥부분에서 특별히 높은 수준의 유전자 발현을 할 수 있다. 구조체는 수포성 구막염 바이러스(vesicular stomatitis virus) 당단백질의 막통과 영역(transmembrane domain)과 gpl20을 융합하여 제조한다.
유전자가 변형된 상기 DC가 NAbs를 유발하는 효능을 평가하기 위해 시험관 내분석을 행한다. 나이브(naieve) B6 쥐의 지라(spleen)로부터 항-CD19 마이크로비드(microbead(MiHenyi Biotech, Auburn, CA))를 사용하여, CD19+ B 세포를 분리하여 IL-4 및 IL-6의 존재하에서 변형된 상기 DC와 공동배양한다. 실시예 2에서 설명한 방법으로, 렌티바이러스 벡터인 FUmGID를 SVGmu 와 함께 세포주에 형질감염(transfection)시켜서, FUmGID/SVGmu 바이러스를 제조한다. 생성된 상기 바이러스를 골수로부터 유래된 DC(bone marrow-derived DC, BMDC)로 형질도입한다. 상기 형질도입된 DC를 방사선조사하고(3,000rad), B 세포와의 공동배양에서 항원제시세포들(antigen presenting cells, APCs)로 사용한다. 상기 형질도입된 BMDC에 대해 반응하는 B 세포의 증식(prolferation)의 시간 과정(time course)을 측정한다. B 세포의 증식(prolferation)은 가장(mock)으로 형질도입된 BMDC보다 상기 형질도입된 BMDC와 공동배양 할 때 더 많은 양으로 된다는 것이 관찰된다.
B 세포를 특이적인 면역글로불린(immunoglobulin) 분비 세포로 분화시킬 때 유전적으로 변형된 DC의 효과를 조사하기 위해서, DC를 방사선 조사하지 않는 것만을 제외하고는 상기에서 설명한 바와 같은 공동배양방법을 사용한다. 14일 후, 배양 상등액에서, HIV-특이적인 항체의 다양한 동종형(isotype)들의 타이터는 재조합 gp120(미국국립위생연구소(NIH)의 AIDS Research & Reference Reagent Program로 부터 얻음)을 항원으로 하여 ELISA를 사용하여 결정한다. HIV-특이적인 항체의 다양한 동종형(isotype)들의 발현은 가장(mock)으로 형질도입된 BMDC보다 형질도입된 BMDC와 B 세포를 공동배양할 때 더 크다.
유전적으로 변형된 DC의 시험관 내에서 T 세포의 활성화의 효율을 평가하기 위해, CD3+ T 세포를 나이브(naive) B6 쥐로부터 분리하여, 렌티바이러스가 감염되고 방사선 조사된 DC와 공동배양한다. T 세포의 증식(proliferation)의 시간과정(time course)을 측정한다. T 세포의 증식(prolferation)은 가장(mock)으로 형질도입된 DC보다 형질도입되고 방사선조사된 DC와 공동배양 할 때 더 많이 된다.
상기 결과들은 렌티벡터(lenti vector)인 FUmGID/SVGmu로 형질도입된 BMDC가 B-세포의 중화항체(neutralizing antibodies, Nabs) 생성을 자극시키고, T 세포의 HIV/AIDS에 대한 면역의 유도시키는 둘 다에 효과적이란 것을 보여주는 것으로 기대된다.
실시예 18: 생체 내에서의 재조합 바이러스에 의한 HIV / AIDS 항원의 제시( HIV / AIDS ANTIGEN PRESENTATION BY RECOMBINANT VIRUS in vivo )
생체 내에서의 B 세포의 활성을 평가하기 위해서, B6 쥐에 실시예 17에서 설명한 방법으로 제조한 재조합 렌티바이러스를 피하주사를 놓아서 면역화시킨다. 항원만을 코딩하는 렌티바이러스를 주사한 쥐, 성숙 분자(maturation molecule)만을 코딩하는 렌티바이러스를 주사한 쥐 및 아무 치료도 하지 않은 마우스들을 대조군으로 삼았다. 상기 바이러스를 주사하고 2주 후, HIV에 대한 혈청 항체를 ELISA로 측정한다. 항체 타이터는 FUmGID/SVGmu 바이러스를 주사한 쥐에서 뿐만 아니라 항원만을 코딩하는 렌티바이러스를 주사한 쥐에서도 높은 것이 발견된다. 이와 반 대로, 항체 타이터는 성숙 분자(maturation molecule)만을 코딩하는 렌티바이러스로 면역화 된 쥐 및 나이브(naive) 쥐에서는 상대적으로 낮았다.
T 세포의 생체 내에서의 활성화를 위해서, 상기 설명된 재조합 바이러스를 B6 쥐에 주사한다. 7일 후, T 세포를 분리하고, 시험관 내 서 유전적으로 변형된 DC로 재자극후, 증식(proliferation) 및 시토카인(cytokine) 분비를 실시예 12에서 설명된 바와 같이 측정한다. 또한, 작동(effector) T 세포반응의 내구성(durability) 모니터한다. 선천(native)의 DC 표적 렌티벡터(lentivector)는 림프절(lymph node) 및 지라(spleen) 양쪽에서 HIV에 반응하는 T 세포들을 유발할 수 있다. 재조합 FUmGID/SVGmu의 투여는 IFN-γ를 분비하는 T 세포를 생성하는 데 충분하다. 이와 반대로, 가장(mock) 대조군 벡터(예를 들어 FUGW/SVGmu)의 투여는 HIV-특이적인 반응을 유발하지 못한다.
실시예 19: in situ 에서 재조합 바이러스에 의한 HIV / AIDS 백신접종: HIV 시험 감염에 대한 방어( In situ HIV / AIDS VACCINATION BY RECOMBINANT VIRUS : PROTECTION AGAINST HIV CHALLENGE )
in situ에서 HIV와 관련된 DC 백신접종을 시험하기 위해서 HIV 발병기전의 새로운 쥐 모델로 인간/쥐 키메라(chimera)를 포함하는 모델을 개발한다. 여러곳에서 설명된 바와 같이, RAG2-/-γc -/- 쥐는 인간 후천성 면역계로 재구성할 수 있다(Strauss, J. H., et al. 1994. Archives of Virology 9:473-484, 이 참고문헌은 그 전체가 본원에 참고로 편입된다). RAG2-/-γc -/- 쥐는 B 세포, T 세포 및 NK세포가 결손되어 있다(Morizono, K., et al. 2001. J Virol 75: 8016-8020, 이 참고문헌은 그 전체가 본원에 참고로 편입된다). 인간 제대혈(cord blood)의 CD34+를 부분적으로 방사선 조사한 1일 령(one-day-old) 마우스들의 간으로 주입하고, 이는 기능적으로 다양한 인간 DC, B 세포 및 MHC 제한(MHC restriction)을 가진 T 세포의 생성과 성숙을 이끈다. 게다가, 상기 모델은 일차 및 이차의 림프계 기관(lymphoid organs)의 발달을 이끌고, 바이러스 시험 감염(challenge)에 대해 면역반응을 할 수 있는 기능적인 CD8+ T 세포를 생성한다. 더욱이, Ig의 동종형(isotype)이 IgM에서 IgG로 전환되는 관찰은 기능적인 CD4+ T 세포 면역이 존재한다는 것을 시사한다.
표적 DC 면역화에 의해 HIV에 대한 예방적인 방어의 효율을 결정하기 위해, 인간/쥐 키메라(chimera)에 SVGmu 외피로 둘러싸인 재조합 바이러스를 주사로 투여한다. gpl20m 항원을 코딩하는 재조합 바이러스(실시예 17)들을 성숙 자극인자(maturation stimulator)(예를 들어, 실시예 15에서 설명한 CD40L 또는 iCD40)와 결합하여 제조하여, 실시예 2에서 설명한 바와 같이 농축한다. 상기 면역화된 마우스들은 그 후, 당업자에게 자명한 여러 방법에 의해 예를 들면, 복강내 또는 정맥내 등과 같은 방법으로 HIV를 예방 접종(inoculation)한다. 재구성된 마우스들은 인간의 CD4 T 세포를 유지하고 있어서, 상기 동물들은 분자적으로 클로닝된 HIV 리포터 바이러스들인 NFNSX-r-HSAS (CCR5-속성(tropic)), NL-r-HSAS (CXCR4-속성(tropic)) 및 임상학적인 분리체(clinical isolate)로 시험 감염(challenge)한다(Baenziger, et al. 2006. Proc Natl Acad Sci USA 103:15951-15956, 이 참고문헌은 그 전체가 본원에 참고로 편입된다). 또한, 복제능력이 있는 리포터 바이러스(replication-competent reporter viruses)들은 vpr 부위에 열에 안정한 항원(heat-stable antigen, HSA)을 갖고 있다. 더욱이, 예방접종(inoculation)에 앞서 생산감염(productive infection)을 확립하기 위해, 감염된 동종동계(syngeneic)의 말초단핵혈액세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)를 재구성된 인간/쥐 키메라(chimera)의 복강안에 주사한다.
상기 HIV의 감염의 증거는 시간에 따라 지라(spleens), 림프절(lymph nodes), 말초단핵혈액세포(PBMC) 및 말초혈액(peripheral blood)에서 모니터한다. HIV 바이러스가 삽입 및 복제가 되는지의 실험은 HIV 리포터 바이러스들에서의 HSA에 대한 FACS로 측정한다. 또한, HIV 바이러스의 부하(load)는 RT-PCR로 혈장(plasma)에서 측정한다. 상기 방법들에 의한 HIV 감염 평가는, 생산적인 in situ DC 백신접종이 면역화되지 않은 마우스들보다 면역화된 마우스들을 HIV 시험 감염(challenge)에 내성이 더 있게 만들어 준다는 것이 관찰된다.
실시예 20: In situ 재조합 바이러스에 의한 HIV / AIDS 백신접종: HIV 감염의 제거( In situ HIV / AIDS VACCINATION BY RECOMBINANT VIRUS : CLEARANCE OF HIV INFECTION )
HIV 활성 감염의 제거에 대한 in situ DC 백신접종의 능력을 실험하기 위해, 인간/쥐 키메라(chimera)에 실시예 19에서 설명한 대로, 처음엔 분자적으로 클로닝된 HIV 리포터 바이러스인 NFNSX-r-HSAS (CCR5-속성(tropic))를 시험 감염(challenge)한다. 상기 HIV 활성 감염은 인간 CD4 T 세포에서 발현되는 HSA의 FACS 분석으로 모니터한다. 성공적인 HIV의 감염이 확인되면, 설계된 재조합 바이러스(실시예 19)를 피하주사나 당업자에게 자명한 어떤 방법이든지, 적절한 루트로 주사를 놓는다(예를 들어, 피하주사(s.c.), 피내주사(i.d.), 정맥내주사(i.v.) 또는 복강내주사(i.p.)). 그 후, HIV 바이러스 로드(viral load)를 RT-PCR로 모니터하고, 그 후엔 말초의 CD4의 수를 센다. 상기 DC 백신접종(vaccination)은 백신접종 안 한 대조군와 비교하여 HIV 바이러스 로드(viral load)를 낮출 수 있고, 확립된 HIV 감염을 제거할 수 있음을 보여준다.
고활성 항레트로바이러스 요법(Highly active antiretroviral therapy, HAART)은 세 가지 약의 전략(three-drug strategy)을 사용하여 AIDS의 이환율(morbidity) 및 사망율(mortality)을 현저하게 향상시켰다. 상기 전략의 개요는 생체 내에서 설계된 재조합 바이러스로 DC를 형질도입시키는 것과 동시에 사용하여 본 실시예의 패러다임에 맞도록 적용할 수 있다. HIV 시험 감염(challenge) 이 후, 감염을 방어하거나 줄일 수 있는 능력(실시예 19) 및 HIV 활성감염의 제거능력을 평가하기 위해 , HAART와 결합하여 상기의 실험을 반복실시 한다.
실시예 21: 재조합 바이러스를 사용하여 인간의 악성종양의 치료( TREATMENT OF A MALIGNANT TUMOR IN A HUMAN USING A RECOMBINANT VIRUS )
인간환자는 악성종양으로 진단된다. 상기 환자에게 적절한 양의 재조합 바이러스로서, 종양 특이적인 항원을 코딩하는 유전자를 갖고 있고 표적 분자(targeting molecule)에 특이적인 DC-SIGN인, 예를 들어 SVGmu등과 같은 외피로 둘러싸인 재조합 바이러스를 투여한다. 상기 바이러스는 실시예 15에서 설명한대로, DC 성숙 인자(maturation factor)를 코딩하는 유전자를 선택적으로 갖는다. 치료기간동안 일주일마다 정맥내 주사로 상기 바이러스를 투여한다. 치료요법 동안 및 후의 주기적으로, 종양 덩어리(tumor buren)는 자기공명영상(magnetic resonance imaging, MRI)으로 평가한다. 상기 치료가 진행됨에 따라 종양의 크기가 현저하게 축소된다.
실시예 22: 재조합 바이러스를 사용하여 인간의 종양 형성의 예방( PREVENTION OF TUMOR FORMATION IN A HUMAN USING A RECOMBINANT VIRUS )
적어도 하나 이상의 항원을 코딩하는 유전자를 갖고 있는 재조합 바이러스를 적절한 양으로 인간환자그룹에 투여한다. 상기 항원은 종양세포들과 보편적이고 특이적으로 관련이 있고, 선택적으로는 실시예 15에서 설명한 대로, DC 의 성숙 인자(maturation factor)를 코딩하는 유전자를 포함한다. 상기 바이러스는 예를 들어 SVGmu등과 같은(실시예 2) DC-SIGN 특이적인 표적화 분자(targeting molecule)로 외피가 둘러 싸여있다. 상기 실험군의 환자들과 대조군의 환자들의 종양의 성장을 주기적으로 모니터한다. 악성종양 형성의 발생이 대조군 보다 상기 바이러스 를 투여한 환자들에서 낮아지는 것이 관찰된다.
실시예 23: 재조합 바이러스를 사용한 AIDS / HIV 의 치료( TREATMENT OF AIDS/HIV IN A HUMAN USING A RECOMBINANT VIRUS )
인간 환자는 HIV/AIDS로 진단된다. Gp120(실시예 17)을 코딩하는 유전자를 갖고 있고, 예를 들어 SVGmu등과 같은(실시예 2) DC-SIGN 특이적인 표적화 분자(targeting molecule)로 외피가 둘러 싸여있는 재조합 바이러스의 적절한 양을 환자에게 투여한다. 상기 바이러스는 실시예 15에서 설명한 대로, DC 성숙 인자(maturation factor)를 코딩하는 유전자를 선택적으로 갖는다. 치료기간 동안 바이러스를 주마다 정맥내 주사로 투여한다. 상기 치료요법 동안 또는 후에 주기적으로, HIV 바이러스 로드(viral load)를 ELISA를 사용하여 환자 피안의 HIV에 대한 항체를 측정하여 평가한다. 또한, 환자의 T 세포 개수도 평가한다. 상기 치료가 진행됨에 따라 HIV 바이러스 로드(viral load)가 눈에 띄게 감소 되는 것이 관찰된다. 더욱이, 치료가 진행됨에 따라 환자의 T 세포의 수의 감소가 멈추는 것이 관찰된다.
실시예 24: 재조합 바이러스를 사용한 HIV / AIDS 의 예방( PREVENTION OF HIV/AIDS IN A HUMAN USING A RECOMBINANT VIRUS )
HIV 감염의 위험이 있다고 염려되는 인간환자의 그룹에 적절한 양의 재조합 바이러스를 투여한다. 상기 재조합 바이러스는 GP120(실시예 17)을 코딩하는 유전 자를 갖고 있고, 선택적으로는 실시예 15에서 설명한 대로, DC 성숙 인자(maturation factor)를 코딩하는 유전자를 갖고 있는 재조합 바이러스이다. 바이러스는 예를 들어 SVGmu등과 같은(실시예 2) DC-SIGN 특이적인 표적화 분자(targeting molecule)로 외피가 둘러 싸여있다. 실험군의 환자들과 대조군의 환자들을 6개월마다 HIV 감염여부를 조사하고, 만약 양성이면 HIV 바이러스 로드(viral load) 및 T 세포의 수를 모니터한다. 백신접종한 그룹 중의 양성으로 감염된 환자는 대조군의 양성으로 감염된 환자에 비해 HIV 바이러스 로드(viral load)가 낮게 유지되고, T-세포 수도 높게 유지되고 있음이 관찰된다.
비록 본원 발명에서 이해의 명쾌함을 위해 자세히 기술하고 있으나, 첨부한 청구항 범위의 범주 안에서 어떠한 변형을 수행하는 것은 자명할 것이다. 상기에 인용된 모든 논문과 특허 문헌은 각각 개별적으로 지시되는 것 같을지라도 모든 목적을 위해 같은 정도로 그 전체가 본원에 참고로서 편입된다.
<110> CALIFORNIA INSTITUTE OF TECHNOLOGY <120> TARGETED GENE DELIVERY FOR DENDRITIC CELL VACCINATION <130> IPA090025 <150> U.S. 60/832,497 <151> 2006-07-21 <150> U.S. 60/920,260 <151> 2007-03-27 <160> 11 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 9941 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Constructed plasmid vector <400> 1 gtcgacggat cgggagatct cccgatcccc tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg 60 atgccgcata gttaagccag tatctgctcc ctgcttgtgt gttggaggtc gctgagtagt 120 gcgcgagcaa aatttaagct acaacaaggc aaggcttgac cgacaattgc atgaagaatc 180 tgcttagggt taggcgtttt gcgctgcttc gcgatgtacg ggccagatat acgcgttgac 240 attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg gtcattagtt catagcccat 300 atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg 360 acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt 420 tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag 480 tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc 540 attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag 600 tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacat caatgggcgt ggatagcggt 660 ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt caatgggagt ttgttttggc 720 accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactc cgccccattg acgcaaatgg 780 gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagcgc gttttgcctg tactgggtct 840 ctctggttag accagatctg agcctgggag ctctctggct aactagggaa cccactgctt 900 aagcctcaat aaagcttgcc ttgagtgctt caagtagtgt gtgcccgtct gttgtgtgac 960 tctggtaact agagatccct cagacccttt tagtcagtgt ggaaaatctc tagcagtggc 1020 gcccgaacag ggacttgaaa gcgaaaggga aaccagagga gctctctcga cgcaggactc 1080 ggcttgctga agcgcgcacg gcaagaggcg aggggcggcg actggtgagt acgccaaaaa 1140 ttttgactag cggaggctag aaggagagag atgggtgcga gagcgtcagt attaagcggg 1200 ggagaattag atcgcgatgg gaaaaaattc ggttaaggcc agggggaaag aaaaaatata 1260 aattaaaaca tatagtatgg gcaagcaggg agctagaacg attcgcagtt aatcctggcc 1320 tgttagaaac atcagaaggc tgtagacaaa tactgggaca gctacaacca tcccttcaga 1380 caggatcaga agaacttaga tcattatata 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caagggctgt agtctgggtc cgcgagcaag 3120 gttgccctga actgggggtt ggggggagcg cacaaaatgg cggctgttcc cgagtcttga 3180 atggaagacg cttgtaaggc gggctgtgag gtcgttgaaa caaggtgggg ggcatggtgg 3240 gcggcaagaa cccaaggtct tgaggccttc gctaatgcgg gaaagctctt attcgggtga 3300 gatgggctgg ggcaccatct ggggaccctg acgtgaagtt tgtcactgac tggagaactc 3360 gggtttgtcg tctggttgcg ggggcggcag ttatgcggtg ccgttgggca gtgcacccgt 3420 acctttggga gcgcgcgcct cgtcgtgtcg tgacgtcacc cgttctgttg gcttataatg 3480 cagggtgggg ccacctgccg gtaggtgtgc ggtaggcttt tctccgtcgc aggacgcagg 3540 gttcgggcct agggtaggct ctcctgaatc gacaggcgcc ggacctctgg tgaggggagg 3600 gataagtgag gcgtcagttt ctttggtcgg ttttatgtac ctatcttctt aagtagctga 3660 agctccggtt ttgaactatg cgctcggggt tggcgagtgt gttttgtgaa gttttttagg 3720 caccttttga aatgtaatca tttgggtcaa tatgtaattt tcagtgttag actagtaaag 3780 cttctgcagg tcgactctag aaaattgtcc gctaaattct ggccgttttt ggcttttttg 3840 ttagacagga tccccgggta ccggtcgcca ccatggtgag caagggcgag gagctgttca 3900 ccggggtggt gcccatcctg gtcgagctgg acggcgacgt aaacggccac aagttcagcg 3960 tgtccggcga gggcgagggc gatgccacct acggcaagct gaccctgaag ttcatctgca 4020 ccaccggcaa gctgcccgtg ccctggccca ccctcgtgac caccctgacc tacggcgtgc 4080 agtgcttcag ccgctacccc gaccacatga agcagcacga cttcttcaag tccgccatgc 4140 ccgaaggcta cgtccaggag cgcaccatct tcttcaagga cgacggcaac tacaagaccc 4200 gcgccgaggt gaagttcgag ggcgacaccc tggtgaaccg catcgagctg aagggcatcg 4260 acttcaagga ggacggcaac atcctggggc acaagctgga gtacaactac aacagccaca 4320 acgtctatat catggccgac aagcagaaga acggcatcaa ggtgaacttc aagatccgcc 4380 acaacatcga ggacggcagc gtgcagctcg ccgaccacta ccagcagaac acccccatcg 4440 gcgacggccc cgtgctgctg cccgacaacc actacctgag cacccagtcc gccctgagca 4500 aagaccccaa cgagaagcgc gatcacatgg tcctgctgga gttcgtgacc gccgccggga 4560 tcactctcgg catggacgag ctgtacaagt aaagcggccg cgactctaga attcgatatc 4620 aagcttatcg ataatcaacc tctggattac aaaatttgtg aaagattgac tggtattctt 4680 aactatgttg ctccttttac gctatgtgga tacgctgctt taatgccttt gtatcatgct 4740 attgcttccc gtatggcttt cattttctcc tccttgtata aatcctggtt gctgtctctt 4800 tatgaggagt tgtggcccgt tgtcaggcaa cgtggcgtgg tgtgcactgt gtttgctgac 4860 gcaaccccca ctggttgggg cattgccacc acctgtcagc tcctttccgg gactttcgct 4920 ttccccctcc ctattgccac ggcggaactc atcgccgcct gccttgcccg ctgctggaca 4980 ggggctcggc tgttgggcac tgacaattcc gtggtgttgt cggggaaatc atcgtccttt 5040 ccttggctgc tcgcctgtgt tgccacctgg attctgcgcg ggacgtcctt ctgctacgtc 5100 ccttcggccc tcaatccagc ggaccttcct tcccgcggcc tgctgccggc tctgcggcct 5160 cttccgcgtc ttcgccttcg ccctcagacg agtcggatct ccctttgggc cgcctccccg 5220 catcgatacc gtcgacctcg agacctagaa aaacatggag caatcacaag tagcaataca 5280 gcagctacca atgctgattg tgcctggcta gaagcacaag aggaggagga ggtgggtttt 5340 ccagtcacac ctcaggtacc tttaagacca atgacttaca aggcagctgt agatcttagc 5400 cactttttaa aagaaaaggg gggactggaa gggctaattc actcccaacg aagacaagat 5460 atccttgatc tgtggatcta ccacacacaa ggctacttcc ctgattggca gaactacaca 5520 ccagggccag ggatcagata tccactgacc tttggatggt gctacaagct agtaccagtt 5580 gagcaagaga aggtagaaga agccaatgaa ggagagaaca cccgcttgtt acaccctgtg 5640 agcctgcatg ggatggatga cccggagaga gaagtattag agtggaggtt tgacagccgc 5700 ctagcatttc atcacatggc ccgagagctg catccggact gtactgggtc tctctggtta 5760 gaccagatct gagcctggga gctctctggc taactaggga acccactgct taagcctcaa 5820 taaagcttgc cttgagtgct tcaagtagtg tgtgcccgtc tgttgtgtga ctctggtaac 5880 tagagatccc tcagaccctt ttagtcagtg tggaaaatct ctagcagggc ccgtttaaac 5940 ccgctgatca gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc 6000 cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga 6060 aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga 6120 cagcaagggg gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat 6180 ggcttctgag gcggaaagaa ccagctgggg ctctaggggg tatccccacg cgccctgtag 6240 cggcgcatta agcgcggcgg gtgtggtggt tacgcgcagc gtgaccgcta cacttgccag 6300 cgccctagcg cccgctcctt tcgctttctt cccttccttt ctcgccacgt tcgccggctt 6360 tccccgtcaa gctctaaatc gggggctccc tttagggttc cgatttagtg ctttacggca 6420 cctcgacccc aaaaaacttg attagggtga tggttcacgt agtgggccat cgccctgata 6480 gacggttttt cgccctttga cgttggagtc cacgttcttt aatagtggac tcttgttcca 6540 aactggaaca acactcaacc ctatctcggt ctattctttt gatttataag ggattttgcc 6600 gatttcggcc tattggttaa aaaatgagct gatttaacaa aaatttaacg cgaattaatt 6660 ctgtggaatg tgtgtcagtt agggtgtgga aagtccccag gctccccagc aggcagaagt 6720 atgcaaagca tgcatctcaa ttagtcagca accaggtgtg gaaagtcccc aggctcccca 6780 gcaggcagaa gtatgcaaag catgcatctc aattagtcag caaccatagt cccgccccta 6840 actccgccca tcccgcccct aactccgccc agttccgccc attctccgcc ccatggctga 6900 ctaatttttt ttatttatgc agaggccgag gccgcctctg cctctgagct attccagaag 6960 tagtgaggag gcttttttgg aggcctaggc ttttgcaaaa agctcccggg agcttgtata 7020 tccattttcg gatctgatca gcacgtgttg acaattaatc atcggcatag tatatcggca 7080 tagtataata cgacaaggtg aggaactaaa ccatggccaa gttgaccagt gccgttccgg 7140 tgctcaccgc gcgcgacgtc gccggagcgg tcgagttctg gaccgaccgg ctcgggttct 7200 cccgggactt cgtggaggac gacttcgccg gtgtggtccg ggacgacgtg accctgttca 7260 tcagcgcggt ccaggaccag gtggtgccgg 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tttggcacca aaatcaacgg 7680 gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta 7740 cggtgggagg tctatataag cagagctggt ttagtgaacc gtcagatccg ctagcgctac 7800 cggctagaaa attgtccgct aaattctggc cgtttttggc ttttttgtta gacaggatcc 7860 gttatcacaa gtttgtacaa aaaagcaggc tctttaaagg aaccaattca gtcgactgga 7920 tccggtaccg aattcaaaga caactcagag ttcaccatgg gctccatcgg ngcagcaagc 7980 atggaatttt gttttgatgt attcaaggag ctcaaagtcc accatgccaa tgagaacatc 8040 ttctactgcc ccattgccat catgtcagct ctagccatgg tatacctggg tgcaaaagac 8100 agcaccagga cacaaataaa taaggttgtt cgctttgata aacttccagg attcggagac 8160 agtattgaag ctcagtgtgg cacatctgta aacgttcact cttcacttag agacatcctc 8220 aaccaaatca ccaaaccaaa tgatgtttat tcgttcagcc ttgccagtag actttatgct 8280 gaagagagat acccaatcct gccagaatac ttgcagtgtg tgaaggaact gtatagagga 8340 ggcttggaac ctatcaactt tcaaacagct gcagatcaag ccagagagct catcaattcc 8400 tgggtagaaa gtcagacaaa tggaattatc agaaatgtcc ttcagccaag ctccgtggat 8460 tctcaaactg caatggttct ggttaatgcc attgtcttca aaggactgtg ggagaaaaca 8520 tttaaggatg aagacacaca agcaatgcct ttcagagtga ctgagcaaga aagcaaacct 8580 gtgcagatga tgtaccagat tggtttattt agagtggcat caatggcttc tgagaaaatg 8640 aagatcctgg agcttccatt tgccagtggg acaatgagca tgttggtgct gttgcctgat 8700 gaagtctcag gccttgagca gcttgagagt ataatcaact ttgaaaaact gactgaatgg 8760 accagttcta atgttatgga agagaggaag atcaaagtgt acttacctcg catgaagatg 8820 gaggaaaaat acaacctcac atctgtctta atggctatgg gcattactga cgtgtttagc 8880 tcttcagcca atctgtctgg catctcctca gcagagagcc tgaagatatc tcaagctgtc 8940 catgcagcac atgcagaaat caatgaagca ggcagagagg tggtagggtc agcagaggct 9000 ggagtggatg ctgcaagcgt ctctgaagaa tttagggctg accatccatt cctcttctgt 9060 atcaagcaca tcgcaaccaa cgccgttctc ttctttggca gatgtgtttc cccttaaaaa 9120 gaagaaagct gaaaaactct gtcccttcca acaagaccca gagcactgta gtatcagggg 9180 taaaatgaaa agtatgttct ctgctgcatc cagacttcat aaaagctgga gcttaatcta 9240 gactggaggc ttgctgaagg ctgtatgctg tgagaactga attccatggg ttgttttggc 9300 cactgactga caacccatga ttcagttctc acaggacaca aggcctgtta ctagcactca 9360 catggaacaa atggcccatc tagacccagc tttc 9394 <210> 11 <211> 986 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutated Sindbis virus glycoprotein <400> 11 Met Ser Ala Ala Pro Leu Val Thr Ala Met Cys Leu Leu Gly Asn Val 1 5 10 15 Ser Phe Pro Cys Asp Arg Pro Pro Thr Cys Tyr Thr Arg Glu Pro Ser 20 25 30 Arg Ala Leu Asp Ile Leu Glu Glu Asn Val Asn His Glu Ala Tyr Asp 35 40 45 Thr Leu Leu Asn Ala Ile Leu Arg Cys Gly Ser Ser Gly Ser Val Ile 50 55 60 Asp Asp Phe Thr Leu Thr Ser Pro Tyr Leu Gly Thr Cys Ser Tyr Cys 65 70 75 80 His His Thr Val Pro Cys Phe Ser Pro Val Lys Ile Glu Gln Val Trp 85 90 95 Asp Glu Ala Asp Asp Asn Thr Ile Arg Ile Gln Thr Ser Ala Gln Phe 100 105 110 Gly Tyr Asp Gln Ser Gly Ala Ala Ser Ala Asn Lys Tyr Arg Tyr Met 115 120 125 Ser Leu Lys Gln Met Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Thr Val 130 135 140 Lys Glu Gly Thr Met Asp Asp Ile Lys Ile Ser Thr Ser Gly Pro Cys 145 150 155 160 Arg Arg Leu Ser Tyr Lys Gly Tyr Phe Leu Leu Ala Lys Cys Pro Pro 165 170 175 Gly Asp Ser Val Thr Val Ser Ile Val Ser Ser Asn Ser Ala Thr Ser 180 185 190 Cys Thr Leu Ala Arg Lys Ile Lys Pro Lys Phe Val Gly Arg Glu Lys 195 200 205 Tyr Asp Leu Pro Pro Val His Gly Lys Lys Ile Pro Cys Thr Val Tyr 210 215 220 Asp Arg Leu Ala Ala Thr Thr Ala Gly Tyr Ile Thr Met His Arg Pro 225 230 235 240 Arg Pro His Ala Tyr Thr Ser Tyr Leu Glu Glu Ser Ser Gly Lys Val 245 250 255 Tyr Ala Lys Pro Pro Ser Gly Lys Asn Ile Thr Tyr Glu Cys Lys Cys 260 265 270 Gly Asp Tyr Lys Thr Gly Thr Val Ser Thr Arg Thr Glu Ile Thr Gly 275 280 285 Cys Thr Ala Ile Lys Gln Cys Val Ala Tyr Lys Ser Asp Gln Thr Lys 290 295 300 Trp Val Phe Asn Ser Pro Asp Leu Ile Arg His Asp Asp His Thr Ala 305 310 315 320 Gln Gly Lys Leu His Leu Pro Phe Lys Leu Ile Pro Ser Thr Cys Met 325 330 335 Val Pro Val Ala His Ala Pro Asn Val Ile His Gly Phe Lys His Ile 340 345 350 Ser Leu Gln Leu Asp Thr Asp His Leu Thr Leu Leu Thr Thr Arg Arg 355 360 365 Leu Gly Ala Asn Pro Glu Pro Thr Thr Glu Trp Ile Val Gly Lys Thr 370 375 380 Val Arg Asn Phe Thr Val Asp Arg Asp Gly Leu Glu Tyr Ile Trp Gly 385 390 395 400 Asn His Glu Pro Val Arg Val Tyr Ala Gln Glu Ser Ala Pro Gly Asp 405 410 415 Pro His Gly Trp Pro His Glu Ile Val Gln His Tyr Tyr His Arg His 420 425 430 Pro Val Tyr Thr Ile Leu Ala Val Ala Ser Ala Thr Val Ala Met Met 435 440 445 Ile Gly Val Thr Val Ala Val Leu Cys Ala Cys Lys Ala Arg Arg Glu 450 455 460 Cys Leu Thr Pro Tyr Ala Leu Ala Pro Asn Ala Val Ile Pro Thr Ser 465 470 475 480 Leu Ala Leu Leu Cys Cys Val Arg Ser Ala Asn Ala Glu Thr Phe Thr 485 490 495 Glu Thr Met Ser Tyr Leu Trp Ser Asn Ser Gln Pro Phe Phe Trp Val 500 505 510 Gln Leu Cys Ile Pro Leu Ala Ala Phe Ile Val Leu Met Arg Cys Cys 515 520 525 Ser Cys Cys Leu Pro Phe Leu Val Val Ala Gly Ala Tyr Leu Ala Lys 530 535 540 Val Asp Ala Tyr Glu His Ala Thr Thr Val Pro Asn Val Pro Gln Ile 545 550 555 560 Pro Tyr Lys Ala Leu Val Glu Arg Ala Gly Tyr Ala Pro Leu Asn Leu 565 570 575 Glu Ile Thr Val Met Ser Ser Glu Val Leu Pro Ser Thr Asn Gln Glu 580 585 590 Tyr Ile Thr Cys Lys Phe Thr Thr Val Val Pro Ser Pro Lys Ile Lys 595 600 605 Cys Cys Gly Ser Leu Glu Cys Gln Pro Ala Ala His Ala Gly Tyr Thr 610 615 620 Cys Lys Val Phe Gly Gly Val Tyr Pro Phe Met Trp Gly Gly Ala Gln 625 630 635 640 Cys Phe Cys Asp Ser Glu Asn Ser Gln Met Ser Glu Ala Tyr Val Glu 645 650 655 Leu Ser Ala Asp Cys Ala Ser Asp His Ala Gln Ala Ile Lys Val His 660 665 670 Thr Ala Ala Met Lys Val Gly Leu Arg Ile Val Tyr Gly Asn Thr Thr 675 680 685 Ser Phe Leu Asp Val Tyr Val Asn Gly Val Thr Pro Gly Thr Ser Lys 690 695 700 Asp Leu Lys Val Ile Ala Gly Pro Ile Ser Ala Ser Phe Thr Pro Phe 705 710 715 720 Asp His Lys Val Val Ile His Arg Gly Leu Val Tyr Asn Tyr Asp Phe 725 730 735 Pro Glu Tyr Gly Ala Met Lys Pro Gly Ala Phe Gly Asp Ile Gln Ala 740 745 750 Thr Ser Leu Thr Ser Lys Asp Leu Ile Ala Ser Thr Asp Ile Arg Leu 755 760 765 Leu Lys Pro Ser Ala Lys Asn Val His Val Pro Tyr Thr Gln Ala Ser 770 775 780 Ser Gly Phe Glu Met Trp Lys Asn Asn Ser Gly Arg Pro Leu Gln Glu 785 790 795 800 Thr Ala Pro Phe Gly Cys Lys Ile Ala Val Asn Pro Leu Arg Ala Val 805 810 815 Asp Cys Ser Tyr Gly Asn Ile Pro Ile Ser Ile Asp Ile Pro Asn Ala 820 825 830 Ala Phe Ile Arg Thr Ser Asp Ala Pro Leu Val Ser Thr Val Lys Cys 835 840 845 Glu Val Ser Glu Cys Thr Tyr Ser Ala Asp Phe Gly Gly Met Ala Thr 850 855 860 Leu Gln Tyr Val Ser Asp Arg Glu Gly Gln Cys Pro Val His Ser His 865 870 875 880 Ser Ser Thr Ala Thr Leu Gln Glu Ser Thr Val His Val Leu Glu Lys 885 890 895 Gly Ala Val Thr Val His Phe Ser Thr Ala Ser Pro Gln Ala Asn Phe 900 905 910 Ile Val Ser Leu Cys Gly Lys Lys Thr Thr Cys Asn Ala Glu Cys Lys 915 920 925 Pro Pro Ala Asp His Ile Val Ser Thr Pro His Lys Asn Asp Gln Glu 930 935 940 Phe Gln Ala Ala Ile Ser Lys Thr Ser Trp Ser Trp Leu Phe Ala Leu 945 950 955 960 Phe Gly Gly Ala Ser Ser Leu Leu Ile Ile Gly Leu Met Ile Phe Ala 965 970 975 Cys Ser Met Met Leu Thr Ser Thr Arg Arg 980 985

Claims (53)

  1. 수지상 세포에 전달될 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 DC-SIGN (Dendritic Cell Specific ICAM-3 (Intracellular Adhesion Molecules 3)-Grabbing Nonintegrin)과 결합하는 표적화 분자를 포함하는 재조합 렌티바이러스를 형질도입하는 단계를 포함하고, 상기 표적화 분자가 알파바이러스 유래 바이러스 당단백질인 것인, DC-SIGN을 발현하는 수지상 세포에 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 시험관 내(in vitro)에서 전달하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 재조합 렌티바이러스는 렌티바이러스 게놈 유래의 서열들을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 재조합 렌티바이러스는 HIV 게놈 유래의 서열들을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 삭제
  5. 삭제
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  7. 제1항에 있어서, 상기 표적화 분자는 신드비스 바이러스(Sindbis virus), 셈리키 포레스트 바이러스(Semliki Forest virus), 로스 리버 바이러스(Ross River virus), 및 아우라 바이러스(Aura virus)로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 바이러스로부터 유래된 바이러스 당단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 표적화 분자는 신드비스 바이러스로부터 유래된 변형된 바이러스 당단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 표적화 분자는 SVGmu (서열번호 11)인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 재조합 렌티바이러스는 슈도타입화된 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 제1항에 있어서, 상기 항원은 종양 항원인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 항원은 HIV 항원인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 방법은 전달될 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 렌티바이러스 벡터 및 알파바이러스 유래 바이러스 당단백질인 표적화 분자를 인코딩하는 유전자를 포함하는 벡터로 패키징 세포주를 형질감염시키는 단계;
    상기 형질감염된 패키징 세포주를 배양하는 단계; 및
    상기 패키징 세포 배양으로부터 재조합 렌티바이러스를 회수하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 패키징 세포주는 293 세포주인 것을 특징으로 하는 방법.
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  22. 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 및 DC-SIGN (Dendritic Cell Specific ICAM-3 (Intracellular Adhesion Molecules 3)-Grabbing Nonintegrin)과 결합하는 표적화 분자를 포함하고, 상기 표적화 분자가 알파바이러스 유래 바이러스 당단백질인 것인 재조합 렌티바이러스.
  23. 제22항에 있어서, 상기 재조합 렌티바이러스는 렌티바이러스 게놈 유래의 서열들을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 렌티바이러스.
  24. 제23항에 있어서, 상기 재조합 렌티바이러스는 HIV 게놈 유래의 서열들을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 렌티바이러스.
  25. 삭제
  26. 삭제
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  28. 제22항에 있어서, 상기 표적화 분자는 신드비스 바이러스, 셈리키 포레스트 바이러스, 로스 리버 바이러스, 및 아우라 바이러스로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 바이러스로부터 유래된 바이러스 당단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 렌티바이러스.
  29. 제28항에 있어서, 상기 표적화 분자는 신드비스 바이러스로부터 유래된 바이러스 당단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 렌티바이러스.
  30. 제29항에 있어서, 상기 표적화 분자는 SVGmu(서열번호 11)인 것을 특징으로 하는 재조합 렌티바이러스.
  31. 제22항에 있어서, 상기 재조합 렌티바이러스는 슈도타입화된 것임을 특징으로 하는 재조합 렌티바이러스.
  32. 삭제
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  34. 제22항에 있어서, 상기 항원은 종양 항원인 것을 특징으로 하는 재조합 렌티바이러스.
  35. 제22항에 있어서, 상기 항원은 HIV 항원인 것을 특징으로 하는 재조합 렌티바이러스.
  36. 리포터 유전자(reporter gene)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 DC-SIGN (Dendritic Cell Specific ICAM-3 (Intracellular Adhesion Molecules 3)-Grabbing Nonintegrin)과 결합하는 표적화 분자를 포함하고, 상기 표적화 분자가 알파바이러스 유래 바이러스 당단백질인 것인 재조합 렌티바이러스.
  37. 삭제
  38. DC-SIGN (Dendritic Cell Specific ICAM-3 (Intracellular Adhesion Molecules 3)-Grabbing Nonintegrin)에 특이적으로 결합하는 표적화 분자를 인코딩하는 벡터로서, 상기 표적화 분자가 알파바이러스 유래 바이러스 당단백질인 것인 벡터.
  39. 제38항에 있어서, 상기 표적화 분자는 신드비스 바이러스, 셈리키 포레스트 바이러스, 로스 리버 바이러스, 및 아우라 바이러스로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 바이러스로부터 유래된 바이러스 당단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  40. 제39항에 있어서, 상기 표적화 분자 SVGmu (서열번호 11)인 것을 특징으로 하는 벡터.
  41. 제22항의 재조합 렌티바이러스를 유효성분으로 포함하는, 암 또는 감염성 질환을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
  42. 제41항에 있어서, 상기 재조합 렌티바이러스는 목적하는 제2 유전자를 인코딩하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  43. 제42항에 있어서, 상기 목적하는 제2 유전자는 성숙 인자를 인코딩하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  44. 제43항에 있어서, 상기 성숙 인자는 GM-CSF, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15, IL-21, IL-23, TNFα, B7.1, B7.2, 4-1BB, CD40 리간드 (CD40L) 및 약물-유도성 CD40 (iCD40)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  45. 제41항에 있어서, 상기 표적화 분자는 신드비스 바이러스, 셈리키 포레스트 바이러스, 로스 리버 바이러스, 및 아우라 바이러스로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 바이러스로부터 유래된 바이러스 당단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  46. 제45항에 있어서, 상기 표적화 분자는 SVGmu (서열번호 11)인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  47. 삭제
  48. 제41항에 있어서, 상기 감염성 질환은 HIV/AIDS인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  49. 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 DC-SIGN (Dendritic Cell Specific ICAM-3 (Intracellular Adhesion Molecules 3)-Grabbing Nonintegrin)과 결합하는 표적화 분자를 포함하고, 상기 표적화 분자가 알파바이러스 유래 바이러스 당단백질인 것인 재조합 렌티바이러스가 형질도입된 수지상 세포.
  50. 삭제
  51. 제49항에 있어서, 상기 표적화 분자는 신드비스 바이러스, 셈리키 포레스트 바이러스, 로스 리버 바이러스, 및 아우라 바이러스로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나의 바이러스로부터 유래된 바이러스 당단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 수지상 세포.
  52. 제49항에 있어서, 상기 표적화 분자는 SVGmu (서열번호 11)인 것을 특징으로 하는 수지상 세포.
  53. 제22항의 재조합 렌티바이러스를 유효성분으로 포함하는, DC-SIGN (Dendritic Cell Specific ICAM-3 (Intracellular Adhesion Molecules 3)-Grabbing Nonintegrin)을 발현하는 수지상 세포들에 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 전달함으로써 포유동물을 면역시키기 위한 약제학적 조성물.
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