JP2015226548A - 樹状細胞のワクチン処理用の、標的特異的な遺伝子輸送 - Google Patents

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Abstract

【課題】ｉｎ ｖｉｖｏにおける、ＤＣのターゲッティング、抗原ローディング及び活性化方法の提供。それにより、患者において好適な免疫反応を生じさせ、結果としてｉｎ ｖｉｖｏでの疾患治療をもたらす。
【解決手段】一態様は、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する樹状細胞にポリヌクレオチドを輸送する方法の提供。若干の実施形態では、上記方法は、組換えウイルスで樹状細胞を形質転換するステップを有してなり、当該組換えウイルスは、輸送しようとするポリヌクレオチドと、ＤＣ−ＳＩＧＮと結合するターゲッティング分子と、を含んでなる。若干の実施形態では、ターゲッティング分子はＤＣ−ＳＩＧＮに特異的である。
【選択図】なし

Description

本発明は、広義には遺伝子輸送、具体的には、ターゲッティング分子を含んでなり、樹状細胞と結合し、樹状細胞を標的とし、それにより樹状細胞へのワクチン処理に使用できる組換えウイルスの使用に関する。
免疫とは、現代の医療における最も生産的なツールのうちの１つであるが、幾つかの限界が依然存在する。特定の感染症（例えばＨＩＶ／エイズ、マラリア及び結核）は現在免疫によって全く抑制できないが、一方、他の感染症は複雑な免疫療法により制御される。癌は、免疫治療において有望な標的であるが、実験における臨床結果は理想とは程遠いものであった（非特許文献１：Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．ら、２００４．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１０：９０９−９１５、本発明に援用する）。例えば、確実に抗腫瘍性免疫を誘発するための、新規な免疫方法が求められている。
樹状細胞（ＤＣ）は、先天性及び適応性免疫において重要な役割を果たす。ＤＣは、抗原を補足して処理する固有の能力を有する、特化された抗原提示細胞であって、周辺組織からリンパ器官に移動し、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）−により制限された態様で、休止期のＴ細胞に抗原を提示する（非特許文献２：Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ，Ｊ．＆Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ｒ．Ｍ．１９９８．Ｎａｔｕｒｅ ３９２：２４５−２５２、非特許文献３：Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ｒ．Ｍ．，ら、２００３．Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２１：６８５−７１１、全開示内容を本発明に援用する）。これらの細胞は骨髄（ＢＭ）に由来し、樹枝状の形態及び高い移動性を有することを特徴とする。未成熟のＤＣは抗原摂取に適しており、生体全体において、末梢性組織の見張り役として存在している。しかしながら、効率的な免疫反応を生じさせるにはＤＣの成熟が必要である（Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ｒ．Ｍ．，ら、２００３．上記非特許文献３）。成熟ＤＣは、ＭＨＣ−抗原複合体及び他の共刺激分子（例えばＣＤ４０、Ｂ７−１、Ｂ７−２及びＣＤＩａ）を高レベルで発現する（非特許文献４：Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ｒ．Ｍ．１９９１．Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：２７１−２９６，、Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ，Ｊ．ａｎｄ Ｒ．Ｍ．Ｓｔｅｉｎｍａｎ．１９９８．上記非特許文献２、全開示内容を本発明に援用する）。これらの分子は、Ｔ細胞刺激において鍵となる役割を果たす。
特化された抗原提示細胞（ＡＰＣ）としてのＤＣの役割の発見により、ＤＣに特異性抗原をロードすることを伴う、ＤＣベースの免疫／ワクチン処理の試みに拍車がかかった（非特許文献５：Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ，Ｊ．＆Ｐａｌｕｃｋａ，Ａ．Ｋ．２００５．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：２９６−３０６、非特許文献６：Ｆｉｇｄｏｒ，ＣＧ．ら、２００４．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１０：４７５−４８０、全開示内容を本発明に援用する）。しかしながら、これらの試みは全て、特異性抗原によるＤＣへのｅｘ ｖｉｖｏでのロードを伴うものである。Ｅｘ ｖｉｖｏで調製されたＤＣをその後患者に投与する。各患者に投与するためのＤＣのＥｘ ｖｉｖｏ調製は、極めて手数のかかるものである。
Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．ら、２００４．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１０：９０９−９１５ Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ，Ｊ．＆Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ｒ．Ｍ．１９９８．Ｎａｔｕｒｅ ３９２：２４５−２５２ Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ｒ．Ｍ．，ら、２００３．Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２１：６８５−７１１ Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ｒ．Ｍ．１９９１．Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：２７１−２９６ Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ，Ｊ．＆Ｐａｌｕｃｋａ，Ａ．Ｋ．２００５．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：２９６−３０６ Ｆｉｇｄｏｒ，ＣＧ．ら、２００４．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１０：４７５−４８０
それらとは対照的に、本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける、ＤＣのターゲッティング、抗原ローディング及び活性化に関するものであり、それにより、患者において好適な免疫反応を生じさせ、結果としてｉｎ ｖｉｖｏでの疾患治療をもたらすものである。本発明はすなわち、免疫／ワクチン処理のための有効かつ効果的な治療計画に対する、それまで長期にわたり存在していたニーズに応えるものである。
本発明の一態様は、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する樹状細胞にポリヌクレオチドを輸送する方法の提供に関する。若干の実施形態では、上記方法は、組換えウイルスで樹状細胞を形質転換するステップを有してなり、当該組換えウイルスは、輸送しようとするポリヌクレオチドと、ＤＣ−ＳＩＧＮと結合するターゲッティング分子と、を含んでなる。若干の実施形態では、ターゲッティング分子はＤＣ−ＳＩＧＮに特異的である。
本発明の若干の実施形態では、上記組換えウイルスはレンチウイルスゲノム（例えばＨＩＶゲノム）由来の配列を含んでなる。
他の実施形態では、組換えウイルスは、ガンマレトロウイルスゲノム（例えばマウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）ゲノム又はマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）ゲノム由来の配列）由来の配列を含んでなる。
本発明の若干の実施形態では、上記方法は、以下からなる群から選択されるウイルスのうちの少なくとも１つに由来するウイルス糖タンパク質を含んでなるターゲッティング分子を利用する：シンドビスウイルス、インフルエンザウイルス、ラッサ熱ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、デングウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、狂犬病ウイルス、セムリキ森林ウイルス、ロスリバーウイルス、オーラウイルス、ボルナ病ウイルス、ハンターンウイルス及びＳＡＲＳ−ＣｏＶウイルス。より特定の実施形態では、上記ターゲッティング分子は、シンドビスウイルス（ＳＩＮ又はＳＶＧ）に由来する修飾ウイルス糖タンパク質を含んでなる。ある種の実施形態では、上記ターゲッティング分子は、ＳＩＮｍｕ、別名ＳＶＧｍｕ（配列番号１１）である。
幾つかの実施形態では、樹状細胞に輸送されるポリヌクレオチドは、以下のうちの少なくとも１つを含んでなる：目的のタンパク質をコードする遺伝子、ｓｉＲＮＡをコードする遺伝子及びマイクロＲＮＡをコードする遺伝子。目的のタンパク質をコードする上記遺伝子は、抗原（例えば腫瘍抗原又はＨＩＶ抗原）をコードしてもよい。
組換えウイルスは、輸送されるポリヌクレオチドを含んでなるウイルスベクターと、ターゲッティング分子をコードする遺伝子を含んでなるベクターと、で、パッケージング細胞株をトランスフェクションするステップと、トランスフェクションしたパッケージング細胞株を培養するステップと、パッケージング細胞株の培養液から組換えウイルスを回収するステップと、により調製してもよい。幾つかの実施形態では、パッケージング細胞株は２９３細胞株である。
本発明の若干の実施形態では、ポリヌクレオチドはｉｎ ｖｉｔｒｏで樹状細胞に輸送され、一方、他の実施形態では、ポリヌクレオチドはｉｎ ｖｉｖｏで患者の樹状細胞に輸送される。上記患者は、典型的には哺乳動物（例えばヒト、マウス又はモルモット）である。
別の態様では、目的のポリヌクレオチドと、ＤＣ−ＳＩＧＮと結合するターゲッティング分子と、を含んでなる組換えウイルスの提供に関する。若干の実施形態では、上記ターゲッティング分子は、ＤＣ−ＳＩＧＮと特異的に結合する。組換えウイルスは、レンチウイルスゲノム（例えばＨＩＶゲノム由来の配列）由来の配列を含んでなってもよい。他の実施形態では、上記組換えウイルスは、ガンマレトロウイルスゲノム（例えばマウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）ゲノム又はマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）ゲノム由来の配列）由来の配列を含んでなる。
ターゲッティング分子は、以下からなる群から選択されるウイルスの少なくとも１つに由来するウイルス糖タンパク質を含んでなってもよい：シンドビスウイルス、インフルエンザウイルス、ラッサ熱ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、デングウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、狂犬病ウイルス、セムリキ森林ウイルス、ロスリバーウイルス、オーラウイルス、ボルナ病ウイルス、ハンターンウイルス及びＳＡＲＳ−ＣｏＶウイルス。若干の実施形態では、上記ターゲッティング分子は、シンドビスウイルスに由来するウイルス糖タンパク質である。具体的実施形態では、上記ターゲッティング分子は、ＳＶＧｍｕ（配列番号１１）である。
ポリヌクレオチドは、例えば、以下のうちの少なくとも１つであってもよい：目的のタンパク質をコードする遺伝子、ｓｉＲＮＡをコードする遺伝子、及び目的のマイクロＲＮＡをコードする遺伝子。若干の実施形態では、上記ポリヌクレオチドは抗原（例えば腫瘍抗原又はＨＩＶ抗原）をコードする。
本発明の別の実施態様は、哺乳類の免疫反応を刺激する方法の提供に関する。免疫反応の対象としたい抗原をコードするポリヌクレオチドを、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する樹状細胞に輸送する際には、当該ポリヌクレオチドと、ＤＣ−ＳＩＧＮと結合するターゲッティング分子と、を含んでなる組換えウイルスを、樹状細胞と接触させる。若干の実施形態では、上記ターゲッティング分子は、ＤＣ−ＳＩＧＮに特異的であり、他の分子とは検出可能な程には結合しない。他の実施形態では、上記ターゲッティング分子は、優先的にＤＣ−ＳＩＧＮに結合する。
本発明の更なる実施形態は、ＤＣ−ＳＩＧＮと結合するターゲッティング分子をコードするベクターの提供に関する。幾つかの実施形態では、上記ターゲッティング分子は修飾ウイルス糖タンパク質である。更なる実施形態では、上記ターゲッティング分子はＳＶＧｍｕ（配列番号１１）である。上記ターゲッティング分子は、若干の実施形態では、特異的にＤＣ−ＳＩＧＮと結合する。上記ベクターは更に、１つ以上の目的遺伝子（例えば抗原をコードする遺伝子及び／又は樹状細胞成熟因子をコードする遺伝子）をコードしてもよい。
本発明の更なる実施形態では、疾患に罹患する患者を治療する方法の提供に関する。組換えウイルスが患者に投与されるが、上記組換えウイルスは疾患に関連する抗原をコードするポリヌクレオチドと、ＤＣ−ＳＩＧＮと結合するターゲッティング分子と、を含んでなる。上記ターゲッティング分子は、ウイルス糖タンパク質に由来してもよい。幾つかの実施形態では、上記ターゲッティング分子はＳＶＧｍｕ（配列番号１１）である。
治療対象の上記疾患は通常、抗原が公知であるか又は同定できるものである。本発明の若干の実施形態では、治療対象の上記疾患は癌である。他の実施形態では、上記疾患はＨＩＶ／エイズである。
また、組換えウイルスで形質転換される樹状細胞の提供にも関し、当該組換えウイルスは、目的のポリヌクレオチドと、ＤＣ−ＳＩＧＮと結合するターゲッティング分子と、を含んでなる。若干の実施形態では、以下からなる群から選択されるウイルスの少なくとも１つに由来するウイルス糖タンパク質を含んでなるターゲッティング分子の提供に関する：シンドビスウイルス、インフルエンザウイルス、ラッサ熱ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、デングウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、狂犬病ウイルス、セムリキ森林ウイルス、ロスリバーウイルス、オーラウイルス、ボルナ病ウイルス、ハンターンウイルス及びＳＡＲＳ−ＣｏＶウイルス。幾つかの実施形態では、上記ターゲッティング分子はＳＶＧｍｕ（配列番号１１）である。
本発明は更に、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する樹状細胞に抗原をコードするポリヌクレオチドを輸送することによる哺乳類のワクチン処理方法の提供に関し、当該方法は、樹状細胞を、抗原をコードするポリヌクレオチドと、ＤＣ−ＳＩＧＮと結合するターゲッティング分子と、を含んでなる組換えウイルスと、接触させるステップを有してなる。幾つかの実施形態では、上記樹状細胞を、組換えウイルスとｅｘ ｖｉｖｏで接触させる。他の実施形態では、上記樹状細胞を、ｉｎ ｖｉｖｏで組換えウイルスと接触させる。
ポリヌクレオチドと、ＤＣ−ＳＩＧＮと結合するターゲッティング分子と、を含んでなる組換えウイルスを使用して、本願明細書において開示される方法を実施することにより、抗原をコードするポリヌクレオチドが樹状細胞に輸送され、それにより、哺乳動物において、特異抗原に対する免疫反応を刺激することが可能となる。上記免疫反応は、更なるポリヌクレオチドを提供して、樹状細胞においてそれを発現させ、免疫反応を調節することにより更に調節してもよい。例えば、樹状細胞の成熟因子をコードするポリヌクレオチドを輸送してもよい。
標的樹状細胞（ＤＣ）に対する抗原輸送のための、一般的なストラテジーの概略図である。シンドビスウイルス野生型糖タンパク質をヘパラン硫酸結合部位で変異させ、その結合能力を喪失させる。得られる変異糖タンパク質（ＳＶＧｍｕ）はＤＣ−ＳＩＧＮと結合するが、硫酸ヘパリンとは結合しない（ＤＣ−ＳＩＧＮ：Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩＣＡＭ−３（細胞内接着分子３）−Ｇｒａｂｂｉｎｇ Ｎｏｎｉｎｔｅｇｒｉｎ）。 レンチウイルスベクター（ＧＦＰ−ｖｐｒ及びＳＶＧｍｕをコードするプラスミド）及び他の必要なパッケージング構築物でトランジェントにトランスフェクションしたウイルス産生細胞から回収したウイルス粒子を、レーザー共焦点顕微鏡イメージングした状態を示す。ウイルス粒子をＧＦＰ（緑）で標識している。ＳＶＧｍｕの表層への取り込みは、抗ＨＡタグ抗体（赤）による免疫染色によりＳＶＧｍｕを標識することにより検出した。「ＧＦＰ」スライドにおいては、ＧＦＰで標識したウイルス粒子は緑で示される。「ＳＶＧｍｕ」スライドにおいては、ＳＶＧｍｕの表層への取り込みを有するウイルス粒子は赤く染色される。「重なり」スライドにおいては、ＧＦＰだけが発現したウイルス粒子は緑であり、ＳＶＧｍｕだけが表面に取り込まれたウイルス粒子は赤であり、ＧＦＰが発現され、ＳＶＧｍｕを有するウイルス粒子は黄色である。緑及び赤色のオーバレイ（黄色）は、ＳＶＧｍｕを含んでなるウイルス粒子を示し、それは大部分の全体のウイルス粒子を示す。スケールバーは２μｍを示す。 ヒトＤＣ−ＳＩＧＮを発現する構築された標的細胞株２９３Ｔ．ｈＤＣＳＩＧＮ、及びマウスのＤＣ−ＳＩＧＮを発現する２９３Ｔ．ｍＤＣＳＩＧＮの、フローサイトメトリ分析を示す。実線：標的細胞株のＤＣ−ＳＩＧＮの発現を示す。陰影領域：２９３Ｔ細胞のバックグラウンド染色を示す。 野生型シンドビス糖タンパク質で覆われたレンチベクターで形質転換された２９３Ｔ細胞において発現するＧＦＰを検出したときの、フローサイトメトリ結果を示す（ＦＵＧＷ／ＳＶＧ、又は変異シンドビス糖タンパク質（ＦＵＧＷ／ＳＶＧｍｕ）。ＦＵＧＷ／ＳＶＧ及びＦＵＧＷ／ＳＶＧｍｕの１ｍＬの新鮮なウイルス上澄を用いて、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮ（２９３Ｔ．ｈＤＣＳＩＧＮ）又はマウスＤＣ−ＳＩＧＮ（２９３Ｔ．ｍＤＣＳＩＧＮ）を発現する２９３Ｔ細胞（２×１０５）を形質転換した。ＤＣ−ＳＩＧＮの発現をしない親２９３Ｔ細胞を、コントロールとして含めた。図示するように、変異シンドビスウイルス糖タンパク質（ＳＶＧｍｕ）で覆われたレンチベクターにより、ヒト又はマウスＤＣ−ＳＩＧＮを発現する２９３Ｔ細胞を特異的に形質転換することが可能である。ＦＵＧＷ／ＳＶＧｍｕの特定の形質導入タイターは、２９３Ｔ．ｈＤＣ−ＳＩＧＮの場合約１×１０６ＴＵ／ｍＬであり、２９３Ｔ．ｍＤＣ−ＳＩＧＮ．の場合約０．８×１０６ＴＵ／ｍＬであると推定された。 骨髄の混合初代培養液中でＤＣ−ＳＩＧＮを特異的に発現するマウス樹状細胞を形質転換する際の、変異シンドビス糖タンパク質（ＦＵＧＷ／ＳＶＧｍｕ）で覆われたＦＵＧＷレンチウイルスの能力を示すフローサイトメトリ結果を示す。Ｂ６マウスから分離した全骨髄細胞を、ＦＵＧＷ／ＳＶＧｍｕの新鮮なウイルス上澄に曝露した。同種志向性糖タンパク質（ＦＵＧＷ／Ｅｃｏ）でシュードタイプ化したＦＵＧＷ レンチベクターを、非ターゲッティングコントロールとして含ませた。ＧＦＰ陽性の細胞の表面抗原を、抗ＣＤ１１ｃ及び抗−ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体を用いた染色法により評価した。 変異シンドビス糖タンパク質（ＦＵＧＷ／ＳＶＧｍｕ）で覆われたＦＵＧＷレンチウイルスが、初代Ｔ細胞（ＣＤ３＋、上パネル）及びＢ細胞（ＣＤ１９＋、下パネル）などの他のタイプの細胞を形質転換しないことを示すフローサイトメトリ結果を示す。初代ＣＤ３＋Ｔ細胞及びＣＤ１９＋Ｂ細胞をマウス脾臓から分離し、ターゲッティングＦＵＧＷ／ＳＶＧｍｕ若しくは非ターゲッティングＦＵＧＷ／Ｅｃｏベクターを用い調製した新鮮なウイルス上澄で形質転換した。ＧＦＰ発現を、フローサイトメトリで分析した。実線：示されるレンチウイルスベクターで曝露した細胞を示す。陰影領域：形質導入を行わない細胞（陰性コントロール）。 骨髄に由来するＤＣ（ＢＭＤＣｓ）を特異的に形質転換するのに用いた、変異シンドビス糖タンパク質（ＦＵＧＷ／ＳＶＧｍｕ）で覆われたＦＵＧＷレンチウイルスの能力を示すフローサイトメトリ結果を示す。ＢＭＤＣを、６日間、サイトカインＧＭ−ＣＳＦの存在下で、単離直後の骨髄細胞を培養することによって調製した。細胞を更に、ターゲッティングＦＵＧＷ／ＳＶＧｍｕ若しくは非ターゲッティングＦＵＧＷ／Ｅｃｏベクターを用いて得た新鮮なウイルス上澄で形質転換した。ＧＦＰ及びＣＤ１１ｃ発現を、フローサイトメトリで測定した。 ＦＵＧＷ／ＳＶＧｍｕを用いた標的特異的な形質導入の後の、ＢＭＤＣの活性化を示す。ＤＣ活性化は、表面におけるＣＤ８６及びＩ−Ａｂの発現を、フローサイトメトリ分析することにより評価した。形質転換されたＢＭＤＣｓの活性化のための相乗的刺激物質として、ＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）を添加し、一晩インキュベートした。陰影領域：ＧＦＰネガティブ（非形質転換）。実線：ＧＦＰポジティブ（形質転換）。 図７Ａ、７Ｂ及び７Ｃは、ＦＵＧＷ／ＳＶＧｍｕレンチウイルスを用いた、ｉｎ ｖｉｖｏでのＤＣのターゲッティングを示す。Ｂ６マウスにＦＵＧＷ／ＳＶＧｍｕを５０×１０６ＴＵで注射し、３日後に分析した。ワクチン処理を受けていないマウスをコントロールとして含ませた。図７Ａは、注射部位の近くの側の、典型的な鼠径リンパ節のサイズを、注射部位から離れた側のリンパ節との比較において示したものである。図７Ｂは、図７Ａで示されたリンパ節における総細胞数カウントを示す。図７Ｃは、図７Ａに示される２つのリンパ節から得たＣＤ１１ｃ＋細胞の、典型的なフローサイトメトリ分析を示す。数値は、ＧＦＰ＋ＤＣの集団のフラクションを示す。 ＯＶＡ抗原（ＦＯＶＡ）をコードするレンチベクター（上部）、及びＧＦＰ（ＦＵＧＷ）をコードするコントロールとしてのレンチベクター（下部）の概略図を示す。 ＦＯＶＡ／ＳＶＧｍｕ（ＤＣ／ＦＯＶＡ）若しくはＦＵＧＷ／ＳＶＧｍｕ レンチベクター（ＤＣ／ＦＵＧＷ）で形質転換した樹状細胞、又はＯＶＡｐペプチド（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）でパルスした非形質転換したＢＭＤＣ（ＤＣ／ＯＶＡｐ）を用いた、ＣＤ８＋ＯＴ１ Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激を示す。ＢＭＤＣと共培養したＯＴ１ Ｔ細胞の表層活性化標識のパターンを、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ６２Ｌ及びＣＤ４４と反応する抗体による染色により評価した。陰影領域：トランスジェニック動物から回収した天然型のＯＴ１ Ｔ細胞。実線：示すＢＭＤＣで共培養したＯＴ１ Ｔ細胞。 ＦＯＶＡ／ＳＶＧｍｕ（■）、ＦＵＧＷ／ＳＶＧｍｕ（●）で形質転換された、又はＯＶＡｐペプチド（▲）でパルスされたＢＭＤＣを様々に希釈したものと混合し、３日間培養した後における、ＯＴ１ Ｔ細胞におけるＩＦＮ−γの、ＥＬＩＳＡによる測定値を示す。図１０Ｂは、図１０Ａのように処理されたＯＴ１ Ｔ細胞の増殖反応を、１２時間にわたる［３Ｈ］チミジン取り込みアッセイで測定した結果を示す。 ＦＯＶＡ／ＳＶＧｍｕ（ＤＣ／ＦＯＶＡ）又はＦＵＧＷ／ＳＶＧｍｕ レンチベクター（ＤＣ／ＦＵＧＷ）で形質転換した樹状細胞、又はＯＶＡｐ＊ペプチド（ＩＳＱＡＶＨＡＡＨＡＥＩＮＥＡＧＲ）（ＤＣ／ＯＶＡｐ＊）でパルスした非形質転換ＢＭＤＣを用いた、ＣＤ４＋ＯＴ２ Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激を示す。ＢＭＤＣと共培養したＯＴ２トランスジェニックＴ細胞の表層活性化標識のパターンを、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ６２Ｌ及びＣＤ４４と反応する抗体による染色により評価した。陰影領域：トランスジェニック動物から回収した天然型のＯＴ２ Ｔ細胞。実線：ＢＭＤＣで共培養されるＯＴ２ Ｔ細胞。 ＦＯＶＡ／ＳＶＧｍｕ（■）、ＦＵＧＷ／ＳＶＧｍｕ（●）で形質転換された、又はＯＶＡｐ＊ペプチド（▲）でパルスしたＢＭＤＣｓを様々に希釈したものと混合し、３日間培養した後における、ＯＴ２ Ｔ細胞におけるＩＦＮ−γの、ＥＬＩＳＡによる測定値を示す。 マウスの造血幹細胞（ＨＳＣ）の遺伝子組換えに使用するレトロウイルスベクターＭＩＧ−ＯＴ１の概略図を示す。図１３Ｂは、組換えマウスにおける、ＭＩＧ−ＯＴ１−修飾されたＨＳＣに由来するＣＤ８＋ＯＴ１ Ｔ細胞の、ＧＦＰとＴＣＲ Ｖα２若しくはＶβ５との共発現による同定方法を示す。Ｂ６マウスからのＨＳＣを、Ｅｃｏ（ＭＩＧ−ＯＴ１／Ｅｃｏ）でシュードタイプ化されたＭＩＧ−ＯＴ１で感染させ、照射を受けたＢ６受容マウスに導入した。導入後８週において、ＣＤ８＋ＯＴ１ Ｔ細胞をフローサイトメトリにより同定した。 組換え処理を受け、ワクチン処理されたマウスの脾臓から分離したＧＦＰ＋ＯＴ１＋Ｔ細胞上における、表層活性化標識のパターンを評価した結果を示す。ＭＩＧ−ＯＴ１修飾されたＨＳＣで組換えられたマウスを、ＦＯＶＡ／ＳＶＧｍｕ又はＦＵＧＷ／ＳＶＧｍｕ（コントロール）で、１０×１０６ＴＵの量で直接皮下注射してワクチン処理し、７日後に分析した。ＣＤ６９、ＣＤ６２Ｌ及びＣＤ４４による表層染色の検出を実施した。実線：ＦＯＶＡ／ＳＶＧｍｕ−免疫マウスからのＧＦＰ＋ＯＴ１＋Ｔ細胞。点線：制御ＦＵＧＷ／ＳＶＧｍｕ−免疫マウスからのＧＦＰ＋ＯＴ１＋Ｔ細胞。陰影領域：ワクチン処理を受けていないマウスからのＧＦＰ＋ＯＴ１＋Ｔ細胞。図１４Ｂは、ワクチン処理を受けていないマウス（ｉｍｍなし）、又はＦＵＧＷ／ＳＶＧｍｕ若しくはＦＯＶＡ／ＳＶＧｍｕによって、ワクチン処理をされるマウスのリンパ節（ＬＮ、□）又は脾臓（ＳＰ、■）から回収したＯＴ１細胞の合計数を示す。 ＤＣ−ターゲッティングレンチベクター ＦＯＶＡ／ＳＶＧｍｕを皮下注射した後の、野生型マウスにおける抗原特異的なＴ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ刺激及び抗体反応を示す。Ｂ６マウスを、ＦＯＶＡ／ＳＶＧｍｕ又はＦＵＧＷ／ＳＶＧｍｕ（コントロール）のいずれかで、５０×１０６ＴＵの量で皮下注射してワクチン処理した。免疫しないマウス（ｉｍｍなし）を、陰性コントロールとして含ませた。免疫後１４日で、脾臓細胞を回収し、Ｈ−２Ｋｂ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ−ＰＥ四量体及びＣＤ４４染色で測定して、ＯＶＡに特異的なＴ細胞の存在を解析した。示されたパーセンテージは、全ＣＤ８＋Ｔ細胞に対するパーセントである。 図１６Ａ及び１６Ｂは、ＦＯＶＡ／ＳＶＧｍｕの様々な投与量で皮下投与したマウスで示される、ｉｎ ｖｉｖｏでのＯＶＡに特異的なＴ細胞応答を示す。ＯＶＡに特異的なＴ細胞は、図１７と同様に四量体染色により同定した。図１６Ａは、１００×１０６ＴＵのＦＯＶＡ／ＳＶＧｍｕによる免疫後の、ＯＶＡに特異的なＴ細胞の測定値（パーセンテージ）を示す。図１６Ｂは、ＦＯＶＡ／ＳＶＧｍｕの示された投与量の注入後の、ＯＶＡに特異的なＴ細胞の用量応答を示す。 注射後２週目における、ＦＯＶＡ／ＳＶＧｍｕ免疫マウスから分離した、ＯＶＡに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞（四量体陽性細胞として同定）における、表層活性化標識のパターンを示す。表層活性化標識は、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ６２Ｌ及びＣＤ４４と反応する抗体による染色により評価した。実線：ＦＯＶＡ／ＳＶＧｍｕ免疫マウスからの四量体＋ＣＤ８＋Ｔ細胞。陰影領域：非免疫マウスからのＣＤ８＋Ｔ細胞。図１７Ｂは、５０×１０６ＴＵ ＦＯＶＡ／ＳＶＧｍｕによる免疫後の、Ｂ６マウスにおけるＯＶＡ−特異的血清ＩｇＧタイターを示す。血清は免疫後７日目及び１４日目に回収し、１：１００から始まる連続１０倍希釈系列により、ＯＶＡに特異的なＩｇＧのタイターを、ＥＬＩＳＡで分析した。タイター値は最高の希釈率のものを用いて測定した。その希釈率では、同じ希釈率のベースライン血清と比較し、光学密度が標準偏差の２倍よりも大きい数値となる。 Ｅ．Ｇ７腫瘍モデルマウスにおける腫瘍サイズを、時間の関数とし示す。Ｂ６マウスを、ＦＯＶＡ／ＳＶＧｍｕ（Ａ）又はモックベクターＦＵＷ／ＳＶＧｍｕ（●）で、５０ｘ１０６ＴＵの量で皮下注射し、ワクチン処理した。免疫なし（■）を、コントロールとして含ませた。各群あたり、４匹のマウスを用いた。免疫後１４日目で、マウスを、Ｅ．Ｇ７腫瘍細胞（ＯＶＡ抗原を発現する（左パネル））又は親ＥＬ４腫瘍細胞（ＯＶＡ抗原を欠く（コントロール、右パネル））で、５ｘ１０６の量で皮下注射した。腫瘍の成長を精密なキャリパで測定し、２つの最大垂直直径（ｍｍ２）の積として示した。 Ｅ．Ｇ７腫瘍根絶モデルマウスにおける、ｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍の成長動態を示す。アルビノ種のＢ６マウスに、安定的にホタルルシフェラーゼイメージング遺伝子（Ｅ．Ｇ７．ｌｕｃ）を発現するＥ．Ｇ７腫瘍細胞を、５×１０６の量でインプラントした。腫瘍インプラントを行わないマウス（＃１）を、コントロールとして含ませた。腫瘍を有するマウスを、免疫しない（＃２）か、又は腫瘍による曝露の３日及び１０日後（＃３、＃４）において、ＦＯＶＡ／ＳＶＧｍｕを５０ｘ１０６ＴＵで注射して免疫した。腫瘍の成長動態を、ＢＬＩを使用した生存動物のイメージングによってモニターした。ｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｒは、フォトン／秒／ｃｍ２／ステリジアン（立体角）を示す。 図１９のＥ．Ｇ７腫瘍から生じた発光シグナルの測定値を示す（マウス＃２（□）、マウス＃３（●）、マウス＃４（▲））。 アルビノ種のＢ６マウスへの、ＦＯＶＡ／ＳＶＧｍｕ １００×１０６ＴＵによる免疫後に存在する、ＯＶＡに特異的なＴ細胞のパーセンテージを示す。アルビノ種のＢ６マウスに、ＦＯＶＡ／ＳＶＧｍｕ ５０×１０６ＴＵによる皮下注射を行った。免疫しないマウス（ｉｍｍなし）を陰性コントロールとして含ませた。免疫後１４日目、脾臓細胞を回収し、Ｈ−２Ｋｂ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ−ＰＥ四量体及びＣＤ４４染色で測定し、ＯＶＡに特異的なＴ細胞の存在を解析した。示されたパーセンテージは、全ＣＤ８＋Ｔ細胞に対するパーセントである。 イメージング遺伝子であるホタルルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）をコードする、ＤＣをターゲットとするレンチベクターの概略図を提供する（Ｆｌｕｃ／Ｓ ＶＧｍｕとして示す）。図２２Ｂは、ＤＣ−ターゲッティングＦｌｕｃ／ＳＶＧｍｕ レンチベクター（図２５Ａに示す）又は非ターゲッティングＦｌｕｃ／ＶＳＶＧ レンチベクターを、５０×１０６ＴＵで皮下注射したマウスにける、生物発光イメージングを示す。典型的な画像を、ＩＶＩＳ２００（登録商標）（Ｘｅｎｏｇｅｎ）を用いて、注射後３０日目において得た。 組換えＤＣに特異的なレンチベクター ＦＯＶＡ／ＳＶＧｍｕの単回投与により、Ｂ６マウスにおけるＩＦＮ−γ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の産生が可能となることを示す。天然型のＢ６マウスを、ＦＯＶＡ／ＳＶＧｍｕ レンチベクター ５０×１０６ＴＵで、又はコントロールとして同じ投与量のＦＵＧＷ／ＳＶＧｍｕで皮下注射して免疫した。ワクチン処理を受けていないＢ６マウス（ｉｍｍなし）を陰性コントロールとして含ませた。２週後に、脾臓細胞を実験マウスから回収し、ＯＶＡｐペプチドの再刺激の有無において、フローサイトメトリを使用して、細胞内のＩＦＮ−γ産生を解析した。示されるパーセンテージは、全ＣＤ８＋Ｔ細胞に対する、ＩＦＮ−γ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセントである。 ＤＣターゲッティング組換えウイルスの調製用の、レンチウイルス構築物の概略図を示す。 ＨＩＶ／エイズのｉｎ ｓｉｔｕワクチン処理の実施態様の概略図を示す。
遺伝子工学は、樹状細胞（ＤＣ）を特殊な免疫細胞に形質転換して、抗原特異性免疫反応を誘発する際に、効率的かつ有力な手段であることが示されている。また癌、ＨＩＶ及び他の疾患のワクチン処理／免疫に用いられる、ＤＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ操作などに関して、多くの検討が行われている。しかしながらこれまで、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで、樹状細胞に対して目的の遺伝子（例えば抗原をコードする遺伝子）を特異的かつ能率的に輸送することが不可能であった。本発明者は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでの、ＤＣの効率的かつ特異的なターゲッティングのための新規な方法及び組成物を見出した。方法及び組成物は、例えば免疫療法など、抗原特異的な免疫反応を誘発するために使用できる。
本発明の一実施形態は、組換えウイルスを用いて樹状細胞（ＤＣ）をターゲッティングし、ＤＣにポリヌクレオチドを輸送するための方法及び組成物の提供に関する。これは好ましくは、ＤＣに特異的な表面分子であるＤＣ−ＳＩＧＮ（樹状細胞特異的なＩＣＡＭ−３（細胞内接着分子３）−グラッビング非インテグリン、別名ＣＤ２０９）をターゲッティングすることによって可能となる。ＤＣ−ＳＩＧＮは、異物と迅速に結合し、エンドサイトーシスを可能にする、Ｃ型レクチン様受容体である（Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋ，Ｔ．Ｂ．，ら、２００４．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：３３−５４、全開示内容を本発明に援用する）。他の好ましい実施形態では、組換えウイルスは、ＤＣ−ＳＩＧＮによる特異的な認識がなされるよう設計されたターゲッティング分子で覆われている。上記ポリヌクレオチドは、限定されないが、目的遺伝子、１つ以上のｓｉＲＮＡ及び／又は１つ以上のマイクロＲＮＡを含んでなってもよい。他の好ましい実施形態では、上記ポリヌクレオチドは抗原をコードする。幾つかの実施形態では、上記組換えウイルスはＤＣに１つ以上の遺伝子を輸送する。例えば、２個以上の抗原をコードする遺伝子を輸送させることもできる。上記１つ以上の遺伝子の輸送は、例えば、遺伝子を配列内リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、及び／又は２Ａ配列と連結し、単一のプロモータ／エンハンサを使用して発現を促進することにより実施できる。
以下に詳述するように、本発明の実施幾つかの実施形態は、組換えウイルス（例えばレンチウイルス及びガンマレトロウイルス）の使用に基づく。なぜなら、これらのウイルスは、ウイルス産生細胞の表面に生じる多数のタンパク質を、それらのエンベロープ中に包含することができるからである。しかしながら、後述するように、他のタイプのウイルスを使用してもよく、またその方法もそれにより改変されてもよい。基本的には、パッケージング細胞株を、目的のポリヌクレオチドをコードする（典型的には抗原をコードする）ウイルスベクター、と、ウイルスパッケージング成分（例えばｇａｇ及びｐｏｌ）と樹状細胞と結合しうるように設計したターゲッティング分子とをコードする、少なくとも１つのプラスミドと、でトランスフェクションする。他の好ましい実施形態では、上記ターゲッティング分子は、樹状細胞のＤＣ−ＳＩＧＮ細胞表面マーカーーと特異的に結合しうるように、遺伝子工学的手法により設計される。ウイルスの出芽（ｂｕｄｄｉｎｇ）の間、ターゲッティング分子（パッケージング細胞膜において、発現する）は、ウイルスエンベロープに組み込まれる。その結果、上記レトロウイルス粒子は、目的のポリヌクレオチドを含んでなる核と、表面上にターゲッティング分子を有するエンベロープと、を含んでなる。
上記ターゲッティング分子は樹状細胞上のＤＣ−ＳＩＧＮと結合でき、上記ウイルスは樹状細胞に目的遺伝子を輸送できる。理論に束縛されないが、上記の結合により、エンドサイトーシスが誘導され、エンドソーム内にウイルスが取り込まれ、膜融合が開始し、ウイルス核が細胞質ゾルに取り込まれるものと考えられる。逆転写及び核に対する生成物の移行の後に、ウイルスのゲノムが標的細胞ゲノムにインテグレートされ、標的細胞のゲノムに、目的のポリヌクレオチドが取り込まれる。ＤＣは更に、目的の（典型的には抗原をコードする）ポリヌクレオチドを発現する。抗原は更にプロセシングを受け、ＤＣによってＴ細胞及びＢ細胞に提示され、抗原特異的な免疫応答が生じる。樹状細胞が抗原特異的な免疫応答を刺激できる限り、上記した特定の経路が、必ずしも必要とは限らない。
本発明の一実施形態は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでの、ＤＣに対する目的遺伝子の直接ターゲッティングのための方法及び組成物の提供に関する。ｉｎ ｖｉｖｏでの幾つかの好ましい実施形態では、目的遺伝子は、ＤＣに対して、ＤＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ培養を経ることなく輸送される。例えば、生きている患者にターゲッティングウイルスを直接投与することにより、ＤＣに対して目的遺伝子を輸送することができる。上記目的遺伝子は、好ましくは免疫反応の対象となる抗原をコードする。典型的な抗原としては、腫瘍特異抗原、腫瘍関連抗原、組織特異抗原、細菌性抗原、ウイルス抗原、イースト抗原、真菌抗原、原生動物の抗原、寄生虫抗原、マイトジェンなどが挙げられる。他の抗原も当業者にとり自明であり、過度の実験を要さずに利用できる。
本願明細書において開示される方法により、ＤＣに特異的であるか、又は、所望の特異性を付与するために操作されうるターゲッティング分子を利用することができる。上記ターゲッティング分子は好ましくは、樹状細胞のＤＣ−ＳＩＧＮと結合し、樹状細胞への目的遺伝子の輸送を促進する改変型のウイルス糖タンパク質である。典型的なターゲッティング分子としては、限定はされないが、以下に由来する糖タンパク質が挙げられる：シンドビスウイルス、インフルエンザウイルス、ラッサ熱ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、デングウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、狂犬病ウイルス、セムリキ森林ウイルス、ロスリバーウイルス、オーラウイルス、ボルナ病ウイルス、ハンターンウイルス及びＳＡＲＳ−ＣｏＶウイルス。上記ターゲッティング分子は好ましくは膜結合型である。必要に応じて、組換えウイルス用に、ウイルス糖タンパク質から設計されたか又はそれに由来する、ＤＣ−ＳＩＧＮに特異的なターゲッティング分子を、膜結合型となるように修飾してもよい。
公知技術のいかなる方法を用いて、ターゲッティング分子を設計し、所望の特異性を付与してもよい。典型的な方法としては、限定されないが、理論的なタンパク質工学及びＤＮＡシャフリングが挙げられる。通常、ＤＣに特異的なターゲッティング分子を設計する際、樹状細胞に特異的な表面マーカーと相互作用するウイルス糖タンパク質を準備する。好ましくは、上記ウイルス糖タンパク質はＤＣ−ＳＩＧＮと相互作用する。上記ウイルス糖タンパク質は少なくとも１つの第二の細胞表面マーカー（例えばヘパリン硫酸（ＨＳ））と相互作用してもよい。なお、それはＤＣ以外のタイプの細胞において発現する。上記ウイルス糖タンパク質は、ＤＣに特異的な表面マーカーと相互作用する能力が維持されつつ、更なる細胞表面マーカーと相互作用する能力が減少又は除去されるように修飾される。上記の修飾は、ウイルス糖タンパク質のアミノ酸配列中の少なくとも１つの残基の変異であってもよい。上記変異は残基の欠失、付加又は置換であってもよく、公知の標準的な方法により実施できる。所望の特異性は容易に確認できる。例えば、ウイルス糖タンパク質を修飾した後、それを用いて、パッケージング細胞株を、リポーター遺伝子を含んでなるウイルスベクターと、ウイルスパッケージング要素をコードする少なくとも１つのプラスミドと、で同時トランスフェクションすることにより、組換えウイルスを調製することができる。上記糖タンパク質は、ウイルスでの出芽の間、ウイルスエンベロープに組み込まれる。上記ウイルスを用いて、純粋なＤＣ集団と、ＤＣを含んでなる細胞混合集団とのいずれをも、トランスフェクションすることができ、またウイルスによるＤＣへの形質導入の特異性は、細胞をアッセイして、リポーター遺伝子の発現が、ＤＣにおいて見られ、一方、他のタイプの細胞で有意に見られないことにより、確認することができる。特異性が十分にストリンジェントでない場合（例えば、他の細胞タイプにおける感染が、好ましくないレベルで観察された場合）には、所望の特異性が得られるまで、ウイルス糖タンパク質を更に修飾し、上記したようにアッセイすることができる。
本発明の一実施形態は、抗原との組み合わせでＤＣ活性化剤及び／又は成熟因子をＤＣに輸送する方法の提供に関する。典型的なＤＣ活性化剤及び成熟因子としては、限定されないが、刺激分子、サイトカイン、ケモカイン、抗体及びＦｌｔ−３リガンドなどの他の物質が挙げられる。例えば、ＤＣ成熟因子は、以下の少なくとも１つを含んでなってもよい：ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、ＴＮＦα、Ｂ７．１、Ｂ７．２、４−１ＢＢ、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）及び薬剤誘導性ＣＤ４０（ｉＣＤ４０）（Ｈａｎｋｓ，Ｂ．Ａ．，ら、２００５．Ｎａｔ Ｍｅｄ １１：１３０−１３７、全開示内容を本発明に援用する）。
本発明の他の実施形態は、上記の組換えウイルス、又は組換えウイルスに感染させたＤＣを患者に投与して、抗原特異的な免疫応答、例えばＴ細胞応答（細胞性免疫）及びＢ細胞応答（液性免疫）を刺激するための方法及び組成物の提供に関する。例えば、活性化されたＣＤ４ Ｔ細胞を、抗原特異的応答における、ＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞及びＢ細胞の調整及び組織化に利用できる。他の好ましい実施形態では、組換えウイルス及び／又は組換えウイルスに感染させたＤＣを用いて免疫応答を刺激し、疾患（例えば癌及びエイズ／ＨＩＶ）の予防及び治療を行う。限定されないが腫瘍性疾患、感染症及び免疫関連疾患などの、特定の抗原に対する免疫応答が有益である、あらゆる疾患の治療が可能となる。
本願明細書にて記載したように、鋭意研究の結果、組換えウイルスを用いて特異的な抗原をコードする遺伝子をＤＣに供給するための方法及び組成物を見出した。ＤＣを遺伝子組換えし、免疫応答を積極的に引き出すことにより、疾患の予防及び治療が可能となり、また効果的なＴ細胞免疫を誘導し、更に強力な抗体産生を誘導する方法が提供される。本願明細書において記載される方法及び組成物の使用により、所望の抗原を用いた有力な免疫方法の提供が可能となる。かかる免疫により、疾患（例えば癌及びエイズ／ＨＩＶ）の予防及び治療が可能となる。
定義
特に明記しない限り、本願明細書において用いられる専門用語及び技術用語は、本発明が属する分野の当業者に通常理解されているものと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ １９９４）、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ １９８９）を参照のこと。本願明細書において記載されているいかなる方法、装置及び材料と、類似するか若しくは均等のそれらを、本発明の実施において使用できる。
本発明の用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」及び「ヌクレオチド」は同義的に用いられ、ホスホジエステル結合、又は例えばリン酸トリエステル、ホスホロアミデート、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチルエステル、アセトアミデート、カルバメート、チオエーテル、架橋ホスホロアミデート、架橋メチレンホスホネート、架橋ホスホロアミデート、架橋ホスホロアミデート、架橋メチレンホスホネート、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオエート、架橋ホスホロチオエート及びスルトン結合、並びにかかる結合の組合せなどの、修飾された結合を含んでなる、いかなる核酸をも指す。
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」及び「ヌクレオチド」にはまた、生物学的に産生される５つの塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシン及びウラシル）以外の塩基を含んでなる核酸も包含される。
本発明の核酸分子は、その核酸分子が他のポリペプチドをコードする異なる核酸分子から実質的に分離されているとき、「分離された」と称される。
「免疫」とは、宿主に対して抗原を供給することをいう。幾つかの実施形態では、抗原は、抗原提示細胞（例えば樹状細胞）に提供される。後述するように、抗原をコードする遺伝子を含んでなる組換えウイルスは、樹状細胞上のＤＣ−ＳＩＧＮに対する特異的な親和性分子により、樹状細胞を標的とすることができる。このように、免疫応答に供される抗原を、樹状細胞に輸送することができる。他の免疫方法は公知技術である。
「免疫学的」若しくは「免疫」応答という用語は、受容者である患者における、アミロイドペプチドに対してなされる、有益な体液性（抗体により媒介）及び／又は細胞性（抗原特異性Ｔ細胞又はそれらの分泌物により媒介）応答が進行することを指す用語である。かかる反応は、免疫源の投与により誘導される能動的免疫反応であってもよく、又は抗体又は初回抗原刺激を受けたＴ細胞の投与により誘導される受動的免疫反応であってもよい。細胞免疫応答は、クラスＩ又はクラスＩＩ ＭＨＣ分子と結合したポリペプチドエピトープの提示により誘導され、抗原特異性ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞及び／又はＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞を活性化する。上記の応答は、単球、マクロファージ、ＮＫ細胞、塩基好性、樹状細胞、神経膠星状細胞、小膠細胞、好酸球又は他の先天性の免疫成分の活性化を伴ってもよい。細胞性免疫による応答の存在は、増殖アッセイ（ＣＤ４＋Ｔ細胞）又はＣＴＬ（細胞障害性リンパ球）アッセイ（Ｂｕｒｋｅら、Ｊ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．１７０，１１１０−１９（１９９４）、抗原依存性の殺傷（細胞障害性リンパ球アッセイ、Ｔｉｇｇｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６、３９０１−３９１０）又はサイトカイン分泌によって測定できる。免疫源の体液性及び細胞性応答の、生体防御又は治療への効果に対する相対的な寄与は、免疫された同系の動物からＩｇＧ及びＴ細胞を別々に単離し、第２の患者における防御又は治療効果を測定することにより、区別することができる。
「免疫物質」又は「免疫源」は、任意にアジュバントと組み合わせて、患者へ投与することにより、それ自体に対する免疫学的応答を誘導することができる物質である。
用語「アジュバント」とは、抗原と組み合わせて投与することにより、抗原に対する免疫応答を増加させ、強化し及び／又は増幅するが、それ単独で投与しても抗原に対する免疫応答を生じさせない化合物のことを指す。アジュバントは、単一の組成物として本発明の組換えウイルスと共に投与してもよく、又は本発明の組換えウイルスの投与の前、投与と同時若しくは投与の後に投与してもよい。アジュバントは、リンパ球補充、Ｂ細胞及び／又はＴ細胞の刺激、及びマクロファージ刺激などの幾つかの機構によって免疫応答を強化できる。
「抗体」（Ａｂ）及び「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、同様の構造特性を有する糖タンパク質である。抗体は、特異性抗原に対する結合特異性を示すが、一方免疫グロブリンは、抗原特異性を有さない抗体及び他の抗体様分子が包含される意味で、異なる。後者の種類のポリペプチドは例えば、リンパ系では低レベルで産生され、一方骨髄腫では高いレベルで産生される。
用語「抗体」は、所望の生物的活性を示す限り、最も幅広い意味において用いられ、特に、ヒト、ヒト以外（例えばマウス）、キメラ、及びヒト化モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、単鎖抗体及び抗体断片などが包含される。典型的には、当該断片は、抗原に対する特異的結合に関して、その断片が由来する完全長抗体と競合する。
「エピトープ」又は「抗原決定基」という用語は、Ｂ細胞及び／又はＴ細胞が反応する、抗原上の部位のことを意味する。Ｂ細胞エピトープは、連続するアミノ酸又はタンパク質の三次構造形成により近接する非隣接アミノ酸のいずれから形成されてもよい。連続するアミノ酸から形成されるエピトープは、典型的には変性溶媒への曝露を受けても保持されるが、三次構造形成により生じるエピトープの場合は典型的には、変性溶媒による処理により損なわれる。エピトープは典型的には、特有の三次元構造中に少なくとも３、より典型的には少なくとも５又は８〜１０個のアミノ酸を含んでなる。エピトープの三次元構造の決定方法としては、例えばＸ線結晶解析及び２次元核磁気共鳴法などが挙げられる。Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６，Ｇｌｅｎｎ Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｅｄ．（１９９６）を参照のこと。同じエピトープを認識する抗体は、ある１つの抗体の能力が、他の抗体の標的抗原に対する結合をブロッキングするか否かを解析する単純なイムノアッセイにおいて同定できる。Ｔ細胞は、ＣＤ８細胞では約９個のアミノ酸の連続エピトープを、又はＣＤ４細胞では約１３から１５個のアミノ酸の連続エピトープを認識する。エピトープを認識するＴ細胞は、初回抗原刺激を受けたＴ細胞によるエピトープ応答性の３Ｈ−チミジン取り込みによって測定できる、抗原依存性の増殖を測定するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにより同定できる（Ｂｕｒｋｅ上記、Ｔｉｇｇｅｓ上記を示す）。
「標的細胞」は、ポリヌクレオチドが輸送された、又は目的遺伝子の発現が望まれるあらゆる細胞のことを指す。好ましくは、上記標的細胞は樹状細胞（特にＤＣ−ＳＩＧＮを発現する樹状細胞）である。
用語「哺乳動物」は、哺乳動物門に属する個々の動物として定義され、限定されないが、ヒト、家畜及び牧畜用動物、動物園の動物、競技用動物及び愛玩動物（例えばヒツジ、イヌ、ウマ、ネコ及びウシ）などが挙げられる。
「患者」又は「被験者」という用語には、予防的若しくは治療的処置を受ける、ヒト及び他の哺乳類の患者（若しくは被験者）などが包含される。
本発明の「治療」とは、臨床的若しくは予防的な臨床的介入のことを指す。治療的な用途では、医薬組成物又は薬剤は、かかる疾患に罹患していると思われるか若しくは既に罹患している患者に、当該疾患の症状及びその合併症を、治療若しくは少なくとも部分的な抑制をなすのに十分な量で投与される。予防的な用途では、医薬組成物又は薬剤は、特定の疾患に罹患しやすい患者若しくはその危険のある患者に、その危険性を除去するか若しくは低下させ、又は疾患の開始を遅延させるのに十分な量で投与される。これらを達成するのに十分な量のことを、治療的有効量又は予防的有効量として定義する。かかる量は単回投与として投与されてもよく、又は効果的な投与計画に従い投与されてもよい。その量においても疾患を治療できるが、典型的には、疾患の症状を改善するか、又は疾患又は障害の進行を予防する程度の量において投与される。治療計画及び予防計画のいずれも場合も、充分な免疫応答が生じるまで、通常数回の投与に分けて投与される。典型的には、免疫応答をモニターし、免疫応答が弱まり始めた場合には反復投薬を行う。「治療」とは、必ずしも疾患を完全に排除するものでなくともよく、また患者が疾患又は障害に罹患するのを完全に予防するものでなくともよい。
本明細書で用いられる用語「腫瘍」とは、いかなる腫瘍細胞の成長及び増殖のことを指し、悪性若しくは良好であってもよく、いかなる前癌及び癌の細胞及び組織であってもよい。
「癌」という用語は、無秩序な細胞増殖を伴うことを特徴とする疾患又は障害を指す。癌の例としては、限定されないが癌腫、リンパ腫、芽球腫及び肉腫が挙げられる。具体的な癌の例としては、限定されないが肺癌、大腸癌、乳癌、精巣癌、胃癌、膵臓癌、卵嚢癌、肝癌、膀胱癌、結直腸癌及び前立腺癌などが挙げられる。それ以外の癌も当業者にとり周知であり、限定されないが、白血病、リンパ腫、子宮頸癌、神経膠腫腫瘍、腺癌及び皮膚癌などが挙げられる。典型的な癌としては、限定されないが膀胱腫瘍、乳房腫瘍、前立腺腫瘍、基底細胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脳及びＣＮＳ癌（例えば神経膠腫腫瘍）、子宮頸癌、絨毛上皮腫、結腸及び直腸癌、結合組織癌、消化器系癌、子宮内膜癌、食道癌、目癌、頭部及び頚部の癌、胃癌、上皮細胞間の新生物、腎臓癌、喉頭癌、白血病、肝癌、肺癌（例えば小細胞及び非小細胞癌）、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫などを含むリンパ腫、黒色腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、口腔癌（例えば唇、舌、口及び咽頭の癌）、卵嚢癌、膵臓癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、直腸癌、腎癌、呼吸器系癌、肉腫（皮膚癌）、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、子宮癌、泌尿器癌、並びに他の癌腫及び肉腫などが挙げられる。癌にはまた、公知の哺乳類の新形成及び悪性障害などが包含される。
「ベクター」とは、他の核酸を輸送できる核酸のことを指す。ベクターは例えば、プラスミド、コスミド又はバクテリオファージであってもよい。「発現ベクター」とは、適当な条件下で、ベクターが担持する１つ以上の遺伝子によってコードされる１つ以上のタンパク質の発現を誘導できるベクターのことを指す。
用語「調節因子」及び「発現調節因子」は同義的に用いられ、特定の条件下で、使用可能な状態で連結されたコード配列の転写及び／又は翻訳に影響を与えうる核酸分子のことを指す。これらの用語は、転写を促進又は制御する全ての因子を包含するものとして広義的に用いられ、例えば、ＲＮＡポリメラーゼと転写因子との基本的な相互作用に必要とされるプロモータ、コアエレメント、上流エレメント、エンハンサ及び反応エレメントなどが挙げられる（Ｌｅｗｉｎ，”Ｇｅｎｅｓ Ｖ”（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）ｐ８４７−８７３を参照のこと）。典型的な原核生物の調節エレメントとしては、プロモータ、オペレータ配列及びリボソーム結合部位などが挙げられる。真核細胞において用いられる調節エレメントとしては、プロモータ、エンハンサ、スプライシングシグナル及びポリアデニル化シグナルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
「トランスフェクション」という用語は、宿主細胞への核酸の導入のことを指す。
「レトロウイルス」とは、ＲＮＡゲノムを有するウイルスのことを指す。
「レンチウイルス」とは、分裂細胞及び非分裂細胞に感染できるレトロウイルス属のことを指す。レンチウイルスの幾つかの例としては、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス：ＨＩＶ １型及びＨＩＶ ２型を含む）（ヒト後天性免疫不全症候群（エイズ）の原因となるウイルス）、ビスナマエディ（ヒツジの脳炎（ビスナ）又は肺炎（マエディ）を生じさせる）、ヤギ関節炎−脳炎ウイルス（ヤギの免疫不全、関節炎及び脳症を生じさせる）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ウマの自己免疫性溶血性貧血、及び脳症を生じさせる）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）（ネコの免疫不全を生じさせる）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）（ウシのリンパ節症、リンパ球増加症及びおそらく中枢神経系の感染を生じさせる）、並びに、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）（ヒト以外の霊長類の免疫不全及び脳症を生じさせる）などが挙げられる。
レンチウイルスゲノムは通常、５’末端反復配列（ＬＴＲ）、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、ｅｎｖ遺伝子、アクセサリ遺伝子（ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ）及び３’ＬＴＲにより組織される。上記ウイルスのＬＴＲは、Ｕ３、Ｒ及びＵ５と呼ばれる３つの領域に分けられる。Ｕ３領域はエンハンサ及びプロモーターエレメントを有する。Ｕ５領域はポリアデニル化シグナルを有する。Ｒ（リピート）領域はＵ３領域とＵ５領域とを分離させ、Ｒ領域の転写された配列はウイルスＲＮＡの５’及び３’末端で生ずる。“ＲＮＡ Ｖｉｒｕｓｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ”（Ａｌａｎ Ｊ．Ｃａｎｎ，Ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，（２０００））、Ｏ Ｎａｒａｙａｎ及びＣｌｅｍｅｎｔｓ Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７０：１６１７−１６３９（１９８９）、Ｆｉｅｌｄｓら、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ．（１９９０）、Ｍｉｙｏｓｈｉ Ｈ，Ｂｌｏｍｅｒ Ｕ，Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｍ，Ｇａｇｅ ＦＨ，Ｖｅｒｍａ ＩＭ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７２（１０）：８１５０−７（１９９８）及び米国特許第６０１３５１６号を参照のこと。
「ガンマレトロウイルス」とは、レトロウイルス科のファミリーの属のことを指す。典型的なガンマレトロウイルスとしては、限定されないがマウス幹細胞ウイルス、マウス白血病ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ肉腫ウイルス及び鳥類細網内皮症ウイルスなどが挙げられる。
本明細書で使用される「ハイブリッドウイルス」とは、１つ以上の他のウイルスベクター由来の構成要素（非レトロウイルスベクター由来の要素）を有するウイルス（例えばアデノウイルスレトロウイルスハイブリッドなど）のことを指す。本発明のレトロウイルス構成要素を有するハイブリッドベクターは、レトロウイルスの範囲内であるものとする。
本願明細書における「ビリオン」、「ウイルス粒子」及び「レトロウイルス粒子」とは、ＲＮＡゲノム、ｐｏｌ遺伝子由来タンパク質、ｇａｇ遺伝子由来タンパク質、及びエンベロープの（糖）タンパク質を提示する脂質二重層を含んでなる、単一のウイルスのことを指す。ＲＮＡゲノムは通常、組換えＲＮＡゲノムであり、そのため、天然のウイルスのゲノムに元々存在しないＲＮＡ配列を含んでなってもよい。ＲＮＡゲノムは、不完全な内因性のウイルス配列を含んでなってもよい。
「シュードタイプ化」したレトロウイルスとは、ＲＮＡゲノムが由来するウイルス以外のウイルスに由来するエンベロープタンパク質を有する、レトロウイルス粒子のことを指す。上記エンベロープタンパク質は、例えば、限定されないが、異なるレトロウイルス、又は非レトロウイルスに由来してもよい。上記エンベロープタンパク質は、天然のエンベロープタンパク質であってもよく、又は本願明細書に記載のように修飾、変異導入又は設計されたエンベロープタンパク質であってもよい。幾つかの実施形態では、上記エンベロープタンパク質は、以下のうちの１つが有する糖タンパク質に由来する、ＤＣ−ＳＩＧＮに特異的なウイルス糖タンパク質である：シンドビスウイルス、インフルエンザウイルス、ラッサ熱ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、デングウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、狂犬病ウイルス、セムリキ森林ウイルス、ロスリバーウイルス、オーラウイルス、ボルナ病ウイルス、ハンターンウイルス及びＳＡＲＳ−ＣｏＶウイルス。
本明細書で定義される「形質転換」とは、外因のＤＮＡを標的細胞に導入する方法のことを指す。形質転換は、外因の核酸配列を原核生物若しくは真核生物の宿主細胞へ導入するためのいかなる周知の方法で行ってもよく、例えばウイルス感染、エレクトロポレーション、ヒートショック、リポフェクション及びパーティクルガンなどの方法が挙げられるが、これらに限定されない。「形質転換」細胞とは、挿入された核酸が、自律複製するプラスミドとして、又は宿主染色体の一部として複製されうる、安定な形質転換細胞のことを指す。目的遺伝子がトランジェントに発現される細胞も含まれる。
本願明細書に記載の「融合性分子」とは、ウイルスの表面に存在するときに、膜融合を活性化し、ウイルス核を膜貫通させ、典型的には標的細胞の細胞質ゾルに導入させることができる、あらゆる分子のことを指す。融合性分子は、例えばウイルス糖タンパク質であってもよい。融合性の分子として挙げられる典型的なウイルス糖タンパク質としては、以下のウイルス由来のヘマグルチニン、変異ヘマグルチニン、ＳＥＳｆ及びウイルス糖タンパク質が存在するが、これらに限定されない。シンドビスウイルス、インフルエンザウイルス、ラッサ熱ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、デングウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、狂犬病ウイルス、セムリキ森林ウイルス、ロスリバーウイルス、オーラウイルス、ボルナ病ウイルス、ハンターンウイルス及びＳＡＲＳ−ＣｏＶウイルス。糖タンパク質は、天然型であってもよく、又は所望の活性を有するように修飾してもよい。
「導入遺伝子」とは、ヒトへの介入によって、例えば本発明の方法によって、宿主細胞の１つ以上の染色体に組み込まれる、あらゆるヌクレオチド配列（特にＤＮＡ塩基配列）のことを意味する。好ましくは、上記導入遺伝子には「目的遺伝子」が含まれている。
「目的遺伝子」はいかなる形であっても、いかなる核酸でもあってもよく、標的細胞に輸送され、インテグレートされ、転写され、翻訳され、及び／又は発現する限り、特に限定されない。上記目的遺伝子は、機能性生成物（例えばタンパク質又はＲＮＡ分子）をコードしてもよい。好ましくは、上記目的遺伝子は、標的細胞において発現させようとするタンパク質又は他の分子をコードする。上記目的遺伝子は通常、目的遺伝子の所望の発現を可能とするため、有用な他の配列（例えば転写性制御配列）と機能的に連結される。幾つかの実施形態では、上記目的遺伝子は好ましくは、免疫応答を生じさせようとする抗原をコードする。幾つかの実施形態では、使用できる他の目的遺伝子は、樹状細胞の活性化物質及び／又は成熟因子をコードする遺伝子である。
「機能的な関係」及び「機能的に連結」とは、目的遺伝子に関していえば、当該遺伝子がプロモータ及び／又はエンハンサに対して正しい位置及び方向において存在し、当該プロモータ及び／又はエンハンサが適当な分子と接触するとき、当該遺伝子の発現が影響を受けることを意味する。
「２Ａ配列」又はエレメントとは、２つのタンパク質間のリンカーとして導入される小分子のペプチドであり、その存在により、ポリタンパク質のリボソーム内部における自律的な自己プロセシングがなされる（ｄｅ Ｆｅｌｉｐｅ．Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒ．２：１３（２００４）、ｄｅＦｅｌｉｐｅら、Ｔｒａｆｆｉｃ ５：６１６−６２６（２００４））。当該短いペプチドの存在により、単一のベクターからの、複数のタンパク質の共発現（例えば同じベクターからの融合分子及び親和性分子の共発現）が可能となる。すなわち、幾つかの実施態様では、２Ａエレメントをコードするポリヌクレオチドを、ベクター中の、発現させるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの間に組み込む。
「ＤＣ成熟因子」（別名「ＤＣ活性化物質」）とは、ＤＣの活性化又は刺激を誘導しうる化合物のことを指し、その作用により、ＤＣが細胞性及び体液性の免疫応答の惹起が促進される。典型的なＤＣ成熟因子は、従来公知であり、刺激分子、サイトカイン、ケモカイン、抗体及び他の物質（例えばＦｌｔ−３リガンド）などが挙げられるが、これらに限定されない（Ｆｉｇｄｏｒ，Ｃ．Ｇ．，ら、２００４．Ｎａｔ Ｍｅｄ １０：４７５−４８０、Ｐｕｌｅｎｄｒａｎ，Ｂ．，ら、２０００．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６５：５６６−５７２、Ｍａｒａｓｋｏｖｓｋｙ，Ｅ．，ら、２０００．Ｂｌｏｏｄ ９６：８７８−８８４、全開示内容を本発明に援用する）。典型的なＤＣ成熟因子としては、限定されないがＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、ＴＮＦα、Ｂ７．１、Ｂ７．２、４−１ＢＢ、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）及び薬剤誘導性ＣＤ４０（ｉＣＤ４０）などが挙げられる。
ターゲッティング分子：
上記のように、ターゲッティング分子を組換えウイルスに組み込むことにより、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する樹状細胞に対してウイルスをターゲッティングすることができる。上記ターゲッティング分子はまた、好ましくは、細胞膜の融合、及び樹状細胞への効率的な形質導入及び所望の１つ以上のポリヌクレオチドの輸送を媒介する。すなわち、上記ターゲッティング分子は典型的には、所望の結合特異性を有する融合性の分子（ＦＭ）である。必要に応じて、上記ターゲッティング分子を修飾して、樹状細胞上のＤＣ−ＳＩＧＮに結合させてもよい。幾つかの実施形態では、上記ターゲッティング分子はＤＣ−ＳＩＧＮに特異的に結合する。すなわち、上記ターゲッティング分子は、他のタイプの細胞よりも、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する樹状細胞に対して優先的に上記組換えウイルスを導く。すなわち、幾つかの実施形態では、ターゲッティング分子は、他の標的（例えばヘマグルチニン）に結合するＦＭの特性を除去し、一方、ＤＣ−ＳＩＧＮと結合する能力を維持させることにより作製される。他の実施形態では、上記ターゲッティング分子を修飾することにより、非ＤＣ−ＳＩＧＮ分子及びその構成要素に対する固有の結合特異性を除去し、ＤＣ−ＳＩＧＮに対する結合特異性を付与又は改善することができる。ターゲッティング分子がＤＣ−ＳＩＧＮに特異的な場合であっても、他の分子及びすなわち他のタイプの細胞に対する若干の非特異的結合が生じうる。かかる場合には、充分な特異性を有するようにターゲッティング分子を適宜修飾し、好ましくない副作用（例えば所望の免疫応答を減少させうる副作用）を回避してもよい。
ターゲッティング分子は通常、ウイルスをシュードタイプ化できる分子であり、それにより、組換えウイルスのエンベロープに取り込まれ、樹状細胞をターゲッティングし、適切な条件下で膜融合を誘導し、樹状細胞への目的遺伝子導入を可能にする。好ましいターゲッティング分子は、ウイルス糖タンパク質である。更に、ターゲッティング分子は好ましくは濃縮する際の超遠心分離への抵抗性を有する。ｉｎ ｖｉｖｏでの遺伝子輸送にとり、それが重要であるからである。
ターゲッティング分子は、結合とは無関係に、低ｐＨで好ましくは膜融合を誘導する。すなわち、他の好ましい実施形態では、ターゲッティング分子により誘導される膜融合は、ターゲッティング分子を含んでなるウイルスが標的細胞のエンドソーム内部に存在し、ウイルスのコア成分（目的のポリヌクレオチドを含む）が細胞質ゾルに輸送された後に生じる。
幾つかの実施形態では、タグ配列をターゲッティング分子に組み込むことにより、ターゲッティング分子の発現の検出、及びウイルス粒子中におけるターゲッティング分子の存在を検出することができる。
ウイルスの融合性分子としては２種類が公知であり、両方ともターゲッティング分子として使用できる（Ｄ．Ｓ．Ｄｉｍｉｔｒｏｖ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．２，１０９（２００４））。クラスＩの融合性分子はらせん状のコイルドコイル構造を使用して膜融合を活性化するのに対し、クラスＩＩの融合性分子はβバレル構造により融合を活性化する。これらの２つの構造は、異なる機構及び動態により機能する（Ｄ．Ｓ．Ｄｉｍｉｔｒｏｖ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．２，１０９（２００４））。幾つかの実施形態では、クラスＩの融合性分子を用いる。他の実施形態では、クラスＩＩの融合性分子を用いる。更に他の実施形態では、クラスＩ及びクラスＩＩの融合性分子を用いる。
ターゲッティング分子（又は、ウイルス結合機能と融合機能が別々である実施形態では、融合性分子）として使用できる表層糖タンパク質の幾つかの非限定的な例としては、野生型又は修飾型を含めて、アルファウイルス（例えばセムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）及びオーラウイルス（ＡＶ））由来の糖タンパク質が挙げられ、それらは表層糖タンパク質（例えばＥ１、Ｅ２及びＥ３）を含んでなる。シンドビスウイルス（ＳＩＮ）及びインフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）に由来するＥ２糖タンパク質は、細胞表面上の特定の分子（Ｅ２の場合はヘパリン硫酸グリコサミノグリカン、ＨＡの場合はシアル酸）と特異的に結合する非レトロウイルス糖タンパク質であり、幾つかの実施形態では、ターゲッティング分子の作製に使用できる。それらの融合は比較的、受容体分子との結合からは独立に行われ、融合の活性化はエンドソームの酸性化によりなされる（Ｓｋｅｈｅｌ及びＷｉｌｅｙ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６９，５３１−５６９（２０００）、Ｓｍｉｔ，Ｊ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３，８４７６−８４８４（１９９９））。更にそれらは、特定の遺伝子組換えを許容でき、レトロウイルス表層に効率的に形成されうる（Ｍｏｒｉｚｏｎｏら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５，８０１６−８０２０）。
本発明の他の実施形態では、ラッサ熱ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、狂犬病ウイルス、ボルナ病ウイルス、ハンターンウイルス又はＳＡＲＳ−ＣｏＶウイルスの表層糖タンパク質を融合分子として利用できる。
本発明の他の実施形態では、フラビウイルスをベースとする表層糖タンパク質を、ターゲッティング分子のベースとして使用できる。アルファウイルスと同様、フラビウイルスはクラスＩＩ組織融合分子を使用して感染を媒介する（Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙら、（２００５） Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．３，１３−２２）。ｐｒＭ（約１６５のアミノ酸）及びＥ（約４９５のアミノ酸）は、フラビウイルスの糖タンパク質である。また、フラビウイルスの１種であるデングウイルス（ＤＶ）のリガンド結合ポケットの特性も公知である。興味深いことに、ＤＣ−ＳＩＧＮは、ＤＶのＥタンパク質上の炭水化物残基と特異的に相互作用して、ウイルスの侵入を促進することが示唆されている（Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙら、（２００５） Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．３，１３−２２）。すなわち、ＤＶのＥタンパク質のみ、又は修飾されたＤＶのＥタンパク質のみで覆われたレンチウイルスを、ＤＣのターゲッティングに使用できる。ＴＢＥ及びＤＶのＥタンパク質は、記載されている他の融合分子と同様に適宜設計し、所望の結合特異性を付与してもよく、又は必要に応じて、結合能を欠損させ、融合能を強化してもよい。
幾つかの実施形態では、インフルエンザＡ／家禽ペストウイルス／Ｒｏｓｔｏｃｋ／３４（ＦＰＶ）（クラスＩ融合性分子）からのヘマグルチニン（ＨＡ）の形成を使用する（Ｔ．Ｈａｔｚｉｉｏａｎｎｏｕ，Ｓ．Ｖａｌｓｅｓｉａ−Ｗｉｔｔｍａｎｎ，Ｓ．Ｊ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｆ．Ｌ．Ｃｏｓｓｅｔ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２，５３１３（１９９８））。幾つかの実施形態では、ＦＰＶ ＨＡの形成を使用する（Ａ．Ｈ．Ｌｉｎら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．１２，３２３（２００１））。ＨＡにより媒介される融合は通常、受容体結合からは独立していると考えられる（Ｄ．Ｌａｖｉｌｌｅｔｔｅ，Ｓ．Ｊ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｆ．Ｌ．Ｃｏｓｓｅｔ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２，４６１（２００１））。
他の実施形態では、クラスＩＩＦＭを使用する（好ましくは、本願明細書においてＳＶＧと称する、アルファウイルス属のシンドビスウイルスの糖タンパク質（Ｋ．Ｓ．Ｗａｎｇ，Ｒ．Ｊ．Ｋｕｈｎ，Ｅ．Ｇ．Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｓ．Ｏｕ，Ｊ．Ｈ．Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６，４９９２（１９９２）））。ＳＶＧは２つの膜貫通タンパク質、すなわち融合に関与する第１のタンパク質（Ｅ１）と、細胞結合に関与する第２のタンパク質（Ｅ２）（Ｓ．Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ，Ｒ．Ｊ．Ｋｕｈｎ，Ｍ．Ｇ．Ｒｏｓｓｍａｎｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．３，１３（２００５））とを含む。ＳＶＧは、腫瘍レトロウイルス及びレンチウイルスの両方をシュードタイプ化することが公知である。
後述するように、幾つかの好ましい実施形態では、ＤＣ−ＳＩＧＮと優先的に結合する修飾ＳＶＧを利用する。他の実施形態では、結合能を有さず、融合能が強化されたＳＶＧ（ＳＶＧｍｕ）を融合性分子として使用し、別のターゲッティング分子（例えばＤＣ−ＳＩＧＮに対する抗体又は他の樹状細胞に特異的なタンパク質）と組み合わせてもよい。例えば、ＳＶＧの融合性分子を用いてもよく、その際プロテインＡの免疫グロブリンＧ結合ドメイン（ＺＺドメイン）をＥ２タンパク質に組み込み、１つ以上の更なる変異を導入して受容体結合部位を不活性化してもよい（Ｋ．Ｍｏｒｉｚｏｎｏら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．１１，３４６（２００５））。
ターゲッティング分子をコードする遺伝子は好ましくは、発現ベクター（例えばｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社））にクローニングする。更にパッケージング細胞（２９３Ｔ細胞など）を、目的遺伝子をコードするウイルスベクター（典型的には抗原をコードする）と、ウイルスのパッケージング用コンポーネントをコードする少なくとも１つのプラスミドと、ターゲッティング分子の発現用のベクターと、でコトランスフェクションする。ターゲッティング機能が融合機能とは別である場合、親和性分子及び付随するコンポーネントをコードする１つ以上のベクターを準備してもよい。上記ターゲッティング分子はパッケージング細胞の膜上に発現され、組換えウイルスに組み込まれる。パッケージング細胞表面上におけるターゲッティング分子の発現は、例えばＦＡＣＳにより分析できる。
例えば構造解析及び分子モデリングから得られた情報に基づいて、変異誘導を実施して変異糖タンパク質を産生し、その融合能力を維持しつつ、結合能力に関しては所望の結合特異性及び／又はレベルを有する態様としてもよい。幾つかの変異を糖タンパク質ごとに導入し、後述する方法又は従来技術において公知の他の方法を使用してアッセイし、最も望ましい特性を有するＦＭを同定してもよい。例えば、ターゲッティング分子を、哺乳類において好ましくない副作用を生じさせることなく、免疫応答を刺激する能力を測定することにより、樹状細胞に対して抗原を特異的に輸送する能力に関する試験を行ってもよい。特に標的樹状細胞に対する能力を、後述するように、直接、例えば細胞培養において試験することもできる。
適切なターゲッティング分子（野生型若しくは変異型）を選択する際、ターゲッティング分子（及び必要に応じて親和性分子）を有するウイルスを調製し、標的細胞の細胞膜の透過を促進する際の選択性及び／又は能力を試験する。野生型糖タンパク質を提示するウイルスをコントロール用いることにより、変異体のタイターに対する効果を検討することができる。ターゲッティング分子（又は必要に応じて親和性分子）の結合パートナーを発現する細胞を、標準的な感染アッセイを使用して、ウイルスで形質転換する。所定の時間の後（例えばポスト形質導入後４８時間）、細胞を回収し、ターゲッティング分子（又は親和性分子及び融合性分子）を含んでなるウイルスで感染している細胞のパーセンテージを、例えばＦＡＣＳで測定することができる。その選択性は、ウイルスで感染している細胞のパーセンテージを算出することにより記録することができる。同様に、ウイルスタイターに対する突然変異の影響を、対応する野生型ターゲッティング分子を含んでなるウイルスで感染している細胞のパーセンテージで、変異ターゲッティング分子を含んでなるウイルスで感染している細胞のパーセンテージを除算することによって定量化できる。好ましい変異体は、選択性と伝染性タイターとの最高の組合せを有するものである。ターゲッティング分子を選択した後、ウイルス濃度をアッセイし、ＦＭで覆われたウイルスが濃縮されうることを確認してもよい。ウイルス上澄を回収し、超遠心分離によって濃縮する。ウイルスのタイターは、ウイルス保存溶液の限界希釈、及び親和性分子の結合パートナーを発現する細胞への形質転換により測定できる。
幾つかの実施形態では、ＢｌａＭ−Ｖｐｒ融合タンパク質を利用して、ウイルスの透過及びその際の融合分子（野生型又は変異）の有効性を評価してもよい。ウイルスは、例えば、ウイルスエレメント、ＢｌａＭ−Ｖｐｒ及び目的のＦＭ（及び適宜親和性分子）を含んでなる１つ以上のベクターによりパッケージング細胞をトランジェントにトランスフェクションすることにより調製できる。得られるウイルスを用いることにより、ターゲッティング分子（又は親和性分子）が、フリーの結合阻害剤（例えば抗体）の存在下若しくは非存在下で特異的に結合する分子を発現する細胞を、感染させることができる。細胞を更にＣＯ２非依存性培地で洗浄し、ＣＣＦ２色素（Ａｕｒｏｒａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）でロードすることができる。室温で培養して開裂反応を完了させた後、細胞をパラホルムアルデヒドで固定し、ＦＡＣＳ及び顕微鏡検査により分析することができる。青色の細胞の存在は、細胞質へのウイルスの透過を示し、ブロッキング抗体を添加した場合には、細胞の青色化が少ないことが予想される。
透過が低ｐＨに依存するか否かを試験し、所望のｐＨ依存性を有するターゲッティング分子（又は融合性分子）を選択する際、ｐＨを変化させるＮＨ４Ｃｌ又は他の化合物を、感染ステップ（ＮＨ４Ｃｌはエンドソーム内の酸性コンパートメントを中和する）において添加することができる。ＮＨ４Ｃｌの場合には、青色の細胞の消失は、ウイルスの透過が低ｐＨに依存することの指標となる。
更に、活性がｐＨ依存性であることを確認する際、リソソーム志向性（ｌｙｓｏｓｏｍｏｔｒｏｐｉｃ）剤（例えば塩化アンモニウム、リン酸クロロキン、コンカナマイシン、バフィロマイシンＡ１、モネンシン、ナイジェリシンなど）をインキュベーションバッファに添加してもよい。これらの物質は、エンドソームコンパートメント内のｐＨを上昇させうる（例えばＤｒｏｓｅ及びＡｌｔｅｎｄｏｒｆ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．２００、１−８、１９９７）。これらの物質の阻害効果は、ウイルスの融合及び浸入におけるｐＨの役割を明らかにするものである。異なる融合性分子を提示するウイルス間における異なる浸入の動態を比較し、最適なものを特定の用途のために選択してもよい。
ＰＣＲによる浸入のアッセイを利用して逆転写をモニターし、それにより、ウイルスＤＮＡ合成の動態を、ウイルス侵入の動態の指標として測定してもよい。例えば、特定のターゲッティング分子を含んでなるウイルス粒子を、ターゲッティング分子に対する適当な同族分子（又は幾つかの実施形態では別の親和性分子）を発現するパッケージング細胞（例えば２９３Ｔ細胞）と共にインキュベートしてもよい。インキュベーションと同時に又はインキュベーション後（感染させた後）に、未結合のウイルスを除去し、細胞のアリコートを分析する。ＤＮＡを更にこれらのアリコートから抽出し、ＬＴＲに特異的なプライマーを使用して半定量的測定を実施してもよい。ＬＴＲに特異的なＤＮＡ生成物の存在は、ウイルスの侵入及びアンコーティングが成功したことを示す。
ターゲッティング分子は、ウイルスの結合能及び融合能を発揮させることができるにもかかわらず、本発明の別の態様では、ウイルスの結合能と融合能とを、２つの別個の構成要素として分離してもよい。典型的には、組換えウイルスは、（ｉ）ウイルスの結合と、ウイルスの正確な樹状細胞へのターゲッティングを媒介する親和性分子、及び（ｉｉ）樹状細胞への所望のポリヌクレオチドの効率的な導入及び輸送を媒介する、別個の融合性分子（ＦＭ）、の両方を含んでなる。本願明細書において開示される方法を適宜用いることにより、様々な親和性分子及び融合性分子を利用することができる。本願明細書に記載されている以外の、他の典型的な融合性分子及び関連する方法は、例えば２００５年３月２日に出願の米国特許出願第１１／０７１７８５号（米国特許出願公開第２００５／０２３８６２６号として公開）、及び２００６年６月１日に出願の米国特許出願第１１／４４６３５３号（米国特許出願公開第２００７／００２０２３８号として公開）に記載されており、それらの全開示内容を本発明に援用する。
上記の親和性分子は、樹状細胞の表面マーカーと結合する。他の好ましい実施形態では、上記親和性分子はＤＣ−ＳＩＧＮと特異的に結合する。すなわち、ＤＣ−ＳＩＧＮに対する親和性分子の結合は、他のタイプの細胞上のマーカーとの相互作用に起因する望ましくない副作用を回避するのに十分な程に特異的であるのが好ましい。上記親和性分子は例えば、ＤＣ−ＳＩＧＮと特異的に結合する抗体であってもよい。
幾つかの好ましい実施形態では、上記融合分子は、好ましくはエンドソーム内の低ｐＨ環境に応答して、融合を媒介又はさもなければ樹状細胞への目的遺伝子の輸送を促進する、ウイルス糖タンパク質である。上記融合分子は好ましくは、ウイルスの内包物が、ウイルス粒子の分解の前に細胞質ゾル内に十分移動できる程の迅速な動態を示す。更に、上記融合分子を修飾することにより、結合活性を減少させ又は除去し、それにより、いかなる非特異的結合を減少させ又は除去することができる。すなわち、融合分子の結合能力を減少させることによって、標的細胞に対するウイルスの結合は、主に又は完全に、親和性分子により決定付けられ、それにより高い標的特異性が得られ、また望ましくない影響を減少させることができる。典型的な融合分子としては、以下のウイルスのうちの１つに由来するウイルス糖タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない：シンドビスウイルス、インフルエンザウイルス、ラッサ熱ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、デングウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、狂犬病ウイルス、セムリキ森林ウイルス、ロスリバーウイルス、オーラウイルス、ボルナ病ウイルス、ハンターンウイルス及びＳＡＲＳ−ＣｏＶウイルス。
本願明細書において開示される方法を用いて、ターゲッティング分子としての、又は親和性分子と組み合わせた融合性分子としての、様々な分子を利用することができる。本願明細書に記載されている以外の、他の典型的な分子及び関連する方法は、例えば、米国特許出願公開第２００５／０２３８６２６号及び米国特許出願公開第２００７／００２０２３８号に記載されている。
ベクター：
好ましい実施形態では、本願明細書に記載の１つ以上のベクターを用いて、ポリヌクレオチド配列をパッケージング細胞株に導入し、組換えウイルスの調製を実施する。ベクターは、ＤＣに特異的なターゲッティング分子などの各種コンポーネントを含んでなる組換えウイルス、１つ以上の目的（典型的には抗原をコードする）遺伝子、及びパッケージング細胞により提供されない、ウイルスの調製に必要なあらゆるコンポーネントをコードするポリヌクレオチド配列を含んでなってもよい。幾つかの実施形態では、ＤＣ特異的な親和性分子と別の融合性分子とをコードするポリヌクレオチド配列を含んでなるベクターは、ウイルスの調製において、ＤＣに特異的なターゲッティング分子をコードするベクターと置換される。真核細胞発現ベクターは公知であり、多くの市販品を入手できる。
本発明の一態様では、ＤＣ成熟因子をコードするポリヌクレオチド配列を含んでなるベクターもまた、ウイルスの調製において用いられる。これらのポリヌクレオチドは典型的には、必要に応じて、パッケージング細胞及び標的細胞においてコード配列の発現を誘導する１つ以上の調節エレメントの制御下に置かれる。ＤＣのワクチン処理の成功が、ＤＣの成熟状態に依存することを示す幾つかの証拠が開示されている（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ，Ｊ及びＰａｌｕｃｋａ，Ａ．Ｋ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：２９６−３０６（２００５）、Ｓｃｈｕｌｅｒ，Ｇ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：１３８−１４７（２００３）、Ｆｉｇｄｏｒ，ＣＧ．ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１０：４７５−４８０（２００４）、各々本願明細書に援用する）。ＤＣは、成熟することにより、能動的に抗原捕捉に関与する細胞から、Ｔ細胞プライミングのために特殊化した細胞に変化しうる。本発明の一態様では、上記ベクターは、所望のＤＣ成熟を生じさせるために、刺激分子をコードする遺伝子を含んでなる。かかる刺激分子は、成熟因子又は成熟刺激性因子と称することもある。
幾つかの実施形態では、パッケージング細胞を、抗原をコードするウイルスベクターと、１つ以上の更なるベクターとで、コトランスフェクションする。例えば、抗原をコードするウイルスベクター以外の第２のベクターは、好ましくは、本願明細書の他の部分で記載されるように、樹状細胞と結合するターゲッティング分子（例えばＳＶＧｍｕ）をコードする遺伝子を有する。幾つかの好ましい実施例において、上記ターゲッティング分子は、ＤＣ−ＳＩＧＮに特異的な修飾ウイルス糖タンパク質をコードする。上記修飾ウイルス糖タンパク質は好ましくは、以下の少なくとも１つに由来する：シンドビスウイルス、インフルエンザウイルス、ラッサ熱ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、デングウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、狂犬病ウイルス、セムリキ森林ウイルス、ロスリバーウイルス、オーラウイルス、ボルナ病ウイルス、ハンターンウイルス及びＳＡＲＳ−ＣｏＶウイルス。幾つかの実施形態では、抗原をコードするウイルスベクターはまた、ＤＣ成熟因子をコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる。幾つかの実施形態では、抗原をコードするウイルスベクター及び１つ以上の更なるベクターと共にパッケージング細胞をコトランスフェクションするための、第３のベクター中に、ＤＣ成熟因子をコードするポリヌクレオチド配列が含まれる。
他の実施形態では、パッケージング細胞における所望の組換えウイルスの製造に必要なエレメント（例えばウイルス遺伝子、１つ以上の目的遺伝子、ターゲッティング分子、ＤＣ成熟因子）を２つ以上含む、１つ以上のマルチシストロン発現ベクターを利用する。マルチシストロンベクターの使用により、必要なベクターの数を減少させ、それにより、複数のベクターからの発現を調整することに関連する諸問題が生じるのを回避することができる。マルチシストロンベクター中では、発現させる様々なエレメントを、１つ以上のプロモータ（また必要に応じて他の発現調節エレメント）に機能的に連結する。他の実施形態では、目的遺伝子、リポーター遺伝子及びウイルスエレメントを含んでなるマルチシストロンベクターを用いる。目的遺伝子は典型的には、抗原、及び任意にＤＣ成熟因子をコードする。かかるベクターは例えば、ターゲッティング分子をコードするベクターとコトランスフェクションしてもよく、又は幾つかの実施形態では、ＦＭ及び親和性分子をコードするマルチシストロンベクターとコトランスフェクションしてもよい。幾つかの実施形態では、上記マルチシストロンベクターは、抗原をコードする遺伝子、ＤＣ成熟因子をコードする遺伝子及びウイルスエレメントを含んでなる。
マルチシストロン発現ベクターにおいて発現する各コンポーネントを例えば、ＩＲＥＳエレメント又はウイルス２Ａエレメントで分離させ、同じプロモータからの様々なタンパク質の別個の発現を可能にしてもよい。ＩＲＥＳエレメント及び２Ａエレメントは公知である（米国特許第４９３７１９０号、ｄｅ Ｆｅｌｉｐｅら、２００４．Ｔｒａｆｆｉｃ ５：６１６−６２６、各々の全開示内容を本発明に援用する）。一実施形態では、口蹄病ウイルス（ＦＭＤＶ）に由来する、ヒューリン開裂部位の配列（ＲＡＫＲ）に連結する２Ａ様配列（Ｆａｎｇら、２００５．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ ２３：５８４−５９０、全開示内容を本発明に援用する）、ウマの鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）、及びｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルス（ＴａＶ）（Ｓｚｙｍｃｚａｋら、２００４．ＪＶａ／．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：５８９−５９４、全開示内容を本発明に援用する）をコードするオリゴヌクレオチドを用いて、マルチシストロンベクター中の遺伝エレメントを分離する。所望の組換えウイルスの調製に用いられる特定のマルチシストロンベクターの有効性は、標準的なプロトコルを使用して、各々の遺伝子の発現を検出することによって、容易に試験することができる。
１つ以上のベクターの調製は、例えば公知のいかなる適切な遺伝子工学的手法（制限エンドヌクレアーゼ処理、ライゲーション、形質転換、プラスミド精製及びＤＮＡ塩基配列決定などの標準的技術を含むが、これらに限定されない）を使用して実施でき、かかる手法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．）、Ｃｏｆｆｉｎら（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９７））、及び”ＲＮＡ Ｖｉｒｕｓｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ”（Ａｌａｎ Ｊ．Ｃａｎｎ，Ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，（２０００）などに記載されており、これらの全開示内容を本発明に援用する。
上記の１つ以上のベクターには、いかなる周知の生物のゲノムに由来する配列を組み込まれていてもよい。上記の配列は、それらの天然型の状態で組み込まれてもよく、又は何らかの形で修飾されていてもよい。例えば、上記配列は挿入、欠失又は置換されていてもよい。
コンポーネントの発現の調整に使用できる発現調節エレメントは、従来技術において公知であり、誘導性プロモータ、構成的プロモータ、分泌シグナル、エンハンサ及び他の調節エレメントなどが挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態では、ベクターは原核生物のレプリコン（すなわち当該ベクターで形質転換された原核生物宿主細胞中（細菌宿主細胞など）における自律的複製を可能とし、染色体外での、組換えＤＮＡ分子の保持を可能にするＤＮＡ塩基配列）を含んでなってもよい。かかるレプリコンは公知である。更に、原核生物のレプリコンを含むベクターは、発現の検出を可能にする標識（例えば薬剤耐性）を付与する遺伝子を含んでもよい。代表的な細菌の薬剤耐性遺伝子は、アンピシリン又はテトラサイクリン耐性を付与する遺伝子である。
上記１つ以上のベクターは、真核細胞において効果的な選択マーカーをコードする１つ以上の遺伝子（例えば薬剤耐性選抜マーカー遺伝子）を含んでなってもよい。この遺伝子は、形質転換された宿主細胞が、選択培地において生存又は増殖するために必要となる因子をコードする。選抜遺伝子を含んでなるベクターで形質転換されない宿主細胞は、当該培地において生存できない。典型的な選抜遺伝子は抗生物質又は他の毒素（例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート又はテトラサイクリン）への耐性を付与するか、又は栄養要求性を補完するか、又は培地から除去された必須栄養分を供するためのタンパク質をコードする。選抜マーカーは、別のプラスミドに任意に存在させ、コトランスフェクションによって導入してもよい。
ベクターは通常、パッケージング細胞により認識され、ターゲッティング分子、ウイルスコンポーネントなどをコードする１つ以上のポリヌクレオチドと機能的に連結するプロモータを含んでなる。プロモータは、ＲＮＡポリメラーゼを結合させ、転写を開始できる核酸配列により形成される発現調節エレメントである。プロモータは、構造遺伝子の開始コドンの上流（５’）（通常約１００〜１０００塩基対）に位置する非翻訳配列であり、それらに機能的に連結する抗原特異性ポリヌクレオチド配列の転写及び翻訳を制御する。プロモータは誘導的であってもよく、構成的であってもよい。誘導的プロモータの活性は、生物的若しくは非生物的な因子の有無により誘導される。誘導的プロモータは、それに機能的に連結する遺伝子の発現が、生物体の、又は特定の組織における特定の発達段階でオン又はオフにされうるため、遺伝子工学における有用なツールといえる。誘導的プロモータは、化学的に制御されるプロモータと、物理的に制御されるプロモータとに分類できる。典型的な化学的制御プロモータとしては、限定されないが、アルコール制御プロモータ（例えばアルコール脱水素酵素Ｉ（ａｌｃＡ）遺伝子プロモータ）、テトラサイクリン制御プロモータ（例えばテトラサイクリン感受性プロモータ）、ステロイド制御プロモータ（例えばマウス糖質コルチコイド受容体（ＧＲ）ベースのプロモータ、ヒトエストロゲン受容体（ＥＲ）ベースのプロモータ、ガエクジソン受容体プロモータ、並びにステロイド／レチノイド／チロイド受容体スーパーファミリーをベースとするプロモータ）、金属制御プロモータ（例えばメタロチオネイン遺伝子ベースのプロモータ）、並びに病原体関連プロモータ（例えばアラビドプシス属及びトウモロコシの病原体関連（ＰＲ）タンパク質ベースのプロモータ）などが挙げられる。典型的な物理的制御プロモータとしては、温度制御プロモータ（例えばヒートショックプロモータ）、及び光制御プロモータ（例えば大豆ＳＳＵプロモータ）などが挙げられるが、これらに限定されない。他の典型的なプロモータは、例えば、ハイパーテキスト転送プロトコル：／／ｗｗｗ．ｐａｔｅｎｔｌｅｎｓ．ｎｅｔ／ｄａｉｓｙ／ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ／７６８／２７１．ｈｔｍｌなどに記載されており、その全開示内容を本発明に援用する。
当業者であれば、特定の状況に基づいて適当なプロモータを選択できる。多くのプロモータが公知であり、また、プロモータを、発現させる遺伝子に機能的に連結させる方法も公知である。天然型のプロモータ配列、及び様々な異種プロモータを用いて、パッケージング細胞及び標的細胞における発現を誘導することができる。しかしながら、通常、天然型のプロモータと比較し、転写及び所望のタンパク質の収率を増加させるために、異種プロモータの使用が好適である。
上記のプロモータは、例えばウイルスのゲノム（例えばポリオーマウイルス属、鶏痘ウイルス、アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、細胞拡大ウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス及びシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）から得ることができる。上記プロモータはまた、例えば異種の哺乳類プロモータ（アクチンプロモータ又は免疫グロブリンプロモータ）であってもよく、ヒートショックプロモータであってもよく、通常天然型配列を伴う又はプロモータでもよいが、かかるプロモータは、標的細胞との適合性を有する必要がある。一実施形態では、上記プロモータは、ウイルス発現システムにおいて天然に生じるウイルスプロモータである。幾つかの実施形態では、上記プロモータは樹状細胞に特異的なプロモータである。樹状細胞に特異的なプロモータとしては、例えばＣＤ１１ｃプロモータが挙げられる。
エンハンサ配列を１つ以上のベクターに挿入することにより、転写を増強できる。エンハンサは典型的にはＤＮＡのシス作用性エレメントであり、通常１０〜３００塩基対であり、プロモータに作用してその転写を増強する。多くの哺乳動物の遺伝子由来のエンハンサ配列が現在公知である（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、αフェトプロテイン及びインシュリン）。好ましくは、真核細胞ウイルス由来のエンハンサを用いる。例としては、複製開始点の後期側（１００−２７０塩基対）のＳＶ４０エンハンサ、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサ、複製開始点の後期側のポリオーマエンハンサ、及びアデノウイルスエンハンサなどが挙げられる。上記のエンハンサは、ベクター中の、抗原特異的ポリヌクレオチド配列の５’又は３’側の位置にスプライシングされてもよいが、プロモータの５’側の位置が好ましい。
発現ベクターはまた、転写の終結、及びｍＲＮＡの安定化のために必要な配列も含む。これらの配列は、真核生物であるかウイルスＤＮＡ又はｃＤＮＡの５’、あるいは３’側の非翻訳領域にしばしば存在し、公知である。
上記のコンポーネントの１つ以上を含んでなるプラスシドベクターは、公知の標準的な技術を使用して容易に構築できる。
構築されるプラスミドが正しい配列を有するか否かを確認する分析では、当該プラスミドを大腸菌において複製させ、精製し、制限エンドヌクレアーゼ処理することにより分析し、及び／又は従来法に従いシーエンシングする。
哺乳動物細胞中でのトランジェントな発現を行わせるベクターを使用してもよい。トランジェント発現では、宿主細胞において能率的に複製できる発現ベクターの使用を伴い、それにより、宿主細胞中に発現ベクターのコピーが蓄積し、次に、発現ベクター中の抗原特異的ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが高レベルで合成される。上記、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ｐｐ．１６．１７−１６．２２を参照のこと。
ウイルスポリペプチドの発現の調節に適する他のベクター及び方法は公知で、特定の状況に応じて容易に調節できる。
本発明において提供される教示から、当業者であれば、特定の発現システムの有効性を、リポータタンパク質をコードする遺伝子を含んでなるベクターを用いてパッケージング細胞を形質転換し、適切な技術（例えば緑色蛍光タンパク複合体からの蛍光の測定）を使用して発現を測定することにより試験できると認識するであろう。適切なリポーター遺伝子は公知である。
本発明のベクターによるパッケージング細胞の形質転換は、周知の方法により実施でき、使用する方法は特に限定されない。多くの非ウイルスデリバリーシステムが従来公知であり、例えばエレクトロポレーション、リポソームを含んでなる脂質ベースのデリバリー系、「裸の」ＤＮＡの輸送及びポリシクロデキストリン化合物を使用した輸送（例えば、Ｓｃｈａｔｚｌｅｉｎ ＡＧ．（２００１．Ｎｏｎ−Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｇｒｅｓｓｅｓ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓに記載、全開示内容を本発明に援用する）などが挙げられる。典型的にはカチオン脂質又は塩による処理方法が使用される（Ｇｒａｈａｍら、（１９７３．Ｖｉｒｏｌ．５２：４５６、Ｗｉｇｌｅｒら、（１９７９．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ ＵＳＡ ７６：１３７３−７６参照）全開示内容を本発明に援用する）。リン酸カルシウム沈殿法が好ましい。しかしながら、ベクターを細胞に導入するための他の方法（核へのマイクロインジェクションや細菌プロトプラスト融合など）を用いてもよい。
ウイルスベクター及びパッケージング細胞：
ベクターのうちの１つは、コアウイルス（「ウイルスベクター」）をコードする。例えばヒト遺伝子治療用途に用いられるものをはじめとする、本発明の用途への利用に適する多数のウイルスベクターが存在する（Ｐｆｅｉｆｅｒ及びＶｅｒｍａ（Ｐｆｅｉｆｅｒ，Ａ．ａｎｄ ＬＭ．Ｖｅｒｍａ．２００１．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．２：１７７−２１１（全開示内容を本発明に援用する）に記載のものなど）。適切なウイルスベクターとしては、ＲＮＡウイルス（例えばレトロウイルス由来ベクター）ベースのベクター（例えばマローニーマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）由来ベクター）や、より複雑なレトロウイルス由来ベクター（例えばレンチウイルスに由来するベクター）などが挙げられる。ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）由来ベクターはこのカテゴリに属する。他の例としては、ＨＩＶ−２、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）及びヒツジ慢性進行性肺炎／ビスナウイルスに由来するレンチウイルスベクターなどが挙げられる。
好ましくは、上記ウイルスベクターは、組換えウイルスのコンポーネントをコードする１つ以上の遺伝子、並びに、例えば１つ以上の目的遺伝子（例えば抗原及び／又はＤＣ成熟因子）を含んでなる。上記ウイルスベクターは、標的細胞における目的遺伝子の発現を促進する遺伝因子（例えばプロモータ及びエンハンサ配列）を含んでなってもよい。標的細胞の複製を防止するために、複製のために必要な内因性のウイルス遺伝子を取り除き、パッケージング細胞株に別に提供してもよい。
好ましい実施形態では、上記ウイルスベクターは、完全長レトロウイルス５’ＬＴＲ及び自己不活性化３’ＬＴＲを含んでなる。
公知のあらゆる方法を用いて、ウイルスベクターのＲＮＡコピーを含むゲノムを有する感染性のレトロウイルス粒子を調製してもよい。この目的においては、好ましくは、ウイルスベクター（目的遺伝子、ＤＣ特異的なターゲッティング分子、その他をコードする他のベクターとともに）を、（ウイルスベクターをベースとするウイルスゲノムＲＮＡをウイルス粒子にパッケージングする）パッケージング細胞株に導入する。
パッケージング細胞株は、ウイルス粒子へのウイルスゲノムＲＮＡのパッケージングにおいて必要とされるウイルスタンパクを、ｉｎ ｔｒａｎｓで提供する。パッケージング細胞株は、レトロウイルスタンパク質を発現できるいかなる細胞株であってもよい。好ましいパッケージング細胞株としては、２９３（ＡＴＣＣ ＣＣＬ Ｘ）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）、Ｄ１７（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １８３）、ＭＤＣＫ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１０）、及びＣｆ２Ｔｈ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４３０）が挙げられる。パッケージング細胞株は、必要なウイルスタンパクを安定的に発現できる。かかるパッケージング細胞株は例えば、米国特許第６２１８１８１号に記載されていおり、その全開示内容を本発明に援用する。あるいは、パッケージング細胞株を、１つ以上の必要なウイルスタンパク（ＤＣに特異的なターゲッティング分子（又はＤＣ−特異的な親和性分子及び融合性分子）を含む）をコードする核酸を含んでなるプラスミドで、目的遺伝子をコード（典型的には抗原をコードし、更にＤＣ成熟因子をコードしてもよい）するウイルスベクターと共にトランジェントにトランスフェクションしてもよい。
目的遺伝子を有するポリヌクレオチドと、樹状細胞に特異的であるターゲッティング分子とを含んでなるウイルス粒子を回収し、標的細胞を感染させることができる。幾つかの好ましい実施形態では、上記ウイルスをシュードタイプ化し、標的細胞特異性を付与する。シュードタイプ化の方法は、従来技術において公知であり、更に本願明細書においても記載されている。
一実施形態では、目的遺伝子の輸送に用いる組換えウイルスは修飾されたレンチウイルスであり、当該ウイルスベクターはレンチウイルスをベースとする。レンチウイルスは、分裂細胞及び非分裂細胞に感染できるため、本実施形態では、標的細胞が分裂する細胞であること（又は標的細胞の分裂を促進すること）は必要ない。
他の実施形態では、目的遺伝子の輸送に用いる組換えウイルスは修飾されたガンマレトロウイルスであり、当該ウイルスベクターはガンマレトロウイルスをベースとする。
他の実施形態では、上記ベクターはマウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）をベースとする（Ｈａｗｌｅｙ，Ｒ．Ｇ．，ら、（１９９６） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１０２９７−１０３０２、Ｋｅｌｌｅｒ，Ｇ．，ら、（１９９８） Ｂｌｏｏｄ ９２：８７７−８８７、Ｈａｗｌｅｙ，Ｒ．Ｇ．，ら、（１９９４） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１ ：１３６−１３８、各々の全開示内容を本発明に援用する）。ＭＳＣＶベクターは、標的細胞、特に造血前駆細胞及びそれらの分化した後継細胞における、長期的かつ安定的な発現を提供する。
他の実施形態では、上記ベクターは修飾されたマローニーウイルス（例えばマローニーマウス白血病ウイルス）をベースとする。上記ウイルスベクターはまた、Ｃｈｏｉ，Ｊ．Ｋ．，ら、（２００１．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ １９，Ｎｏ．３，２３６−２４６、全開示内容を本発明に援用する）に記載のようなハイブリッドウイルスをベースとしてもよい。
ＤＮＡウイルスベクターは、例えばアデノウイルスベースのベクター、及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベースのベクターなどを使用してもよい。同様に、レトロウイルス−アデノウイルスベクターも、本発明の方法に使用できる。
他のベクターとして、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）に由来するベクター（例えばアンプリコンベクター、複製不能ＨＳＶ及び弱毒化ＨＳＶなど）も、ポリヌクレオチド輸送の際に使用できる。（Ｋｒｉｓｋｙ ＤＭ，Ｍａｒｃｏｎｉ ＰＣ，Ｏｌｉｇｉｎｏ ＴＪ，Ｒｏｕｓｅ ＲＪ，Ｆｉｎｋ ＤＪ，ら、１９９８．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘウイルス ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｍｕｌｔｉｇｅｎｅ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：１５１７−３０、全開示内容を本発明に援用する）。
遺伝子治療用途のために最近開発された他のベクターを、本発明の方法に使用することもできる。かかるベクターとしては、バキュロウイルス及びα−ウイルスに由来するものが挙げられる（Ｊｏｌｌｙ ＤＪ．１９９９．Ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ，ｐｐ ２０９−４０ ｉｎ Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ Ｔ，ｅｄ．１９９９．Ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ、全開示内容を本発明に援用する）。
幾つかの好ましい実施形態では、上記ウイルス構築物は、レンチウイルスゲノム（例えばＨＩＶゲノム又はＳＩＶゲノム）由来の配列を含んでなる。上記ウイルス構築物は、レンチウイルスの５’及び３’ＬＴＲ由来の配列を有するのが好ましい。好ましくは、上記ウイルス構築物は、レンチウイルスの５’ＬＴＲからのＲ及びＵ５配列、並びにレンチウイルスからの不活性化若しくは自己不活性化３’ＬＴＲを含んでなる。ＬＴＲ配列は、いかなる種に由来するレンチウイルスのＬＴＲ配列でもあってもよい。例えば、それらはＨＩＶ、ＳＩＶ、ＦＩＶ又はＢＩＶに由来するＬＴＲ配列でもよい。好ましくは、ＬＴＲ配列はＨＩＶ ＬＴＲ配列である。
ウイルス構築物は好ましくは、不活性若しくは自己不活性化３’ＬＴＲを含んでなる。３’ＬＴＲは、公知のいかなる方法によって自己不活性化して作製してもよい。好ましい実施形態では、３’ＬＴＲのＵ３エレメントは、そのエンハンサ配列（好ましくはＴＡＴＡボックス、ＳｐＩ及びＮＦ−κＢ部位）が欠失している。３’ＬＴＲの自己不活性化の結果、宿主細胞ゲノムに組み込まれるプロウイルスは不活性５’ＬＴＲを含んでなる。
任意に、ウイルス構築物中において、レンチウイルス５’ＬＴＲからのＵ３配列を、プロモータ配列と置換してもよい。これにより、パッケージング細胞株から回収されるウイルスのタイターを増加させることができる。エンハンサ配列を含ませてもよい。パッケージング細胞株におけるウイルスＲＮＡゲノムの発現を増加させるいかなるエンハンサ／プロモータの組合せを使用してもよい。好ましい実施形態では、ＣＭＶエンハンサ／プロモータ配列を用いる。
幾つかの好ましい実施形態では、ウイルス構築物は、ガンマレトロウイルスゲノム（例えばマウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）ゲノム又はマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）ゲノム）由来の配列を含んでなる。上記ウイルス構築物は、ガンマレトロウイルスの５’及び３’ＬＴＲ由来の配列を有するのが好ましい。ＬＴＲ配列は、いかなる種からのいかなるガンマレトロウイルスに由来するＬＴＲ配列であってもよい。例えば、それらはマウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）、ネコ肉腫ウイルス（ＦＡＶ）及び鳥類細網内皮症ウイルス（ＡＲＶ）からのＬＴＲ配列でもよい。好ましくは、ＬＴＲ配列はＭＳＣＶ及びＭＬＶ ＬＴＲ配列である。
幾つかの実施形態では、ウイルス構築物は好ましくは不活性若しくは自己不活性化３’ＬＴＲを含んでなる。３’ＬＴＲは、公知のいかなる方法によって自己不活性化して作製してもよい。好ましい実施形態では、３’ＬＴＲのＵ３エレメントは、そのエンハンサ配列（好ましくはＴＡＴＡボックス、ＳｐＩ及びＮＦ−κＢ部位）が欠失している。３’ＬＴＲの自己不活性化の結果、宿主細胞ゲノムに組み込まれるプロウイルスは不活性５’ＬＴＲを含んでなる。
任意に、ガンマレトロウイルスの５’ＬＴＲからＵ３配列を、ウイルス構築物のプロモータ配列と置換してもよい。これにより、パッケージング細胞株から回収されるウイルスのタイターを増加させることができる。エンハンサ配列を含ませてもよい。パッケージング細胞株におけるウイルスＲＮＡゲノムの発現を増加させるいかなるエンハンサ／プロモータの組合せを使用してもよい。好ましい実施形態では、ＣＭＶエンハンサ／プロモータ配列を用いる。
ウイルス構築物は一般に、１つ以上の標的細胞において所望どおりに発現する抗原をコードする遺伝子を含んでなる。好ましくは、当該目的遺伝子は５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲ配列の間に位置する。更に、目的遺伝子は、好ましくは他の遺伝因子、例えば転写制御配列、例えばプロモータ及び／又はエンハンサと機能的に連携しており、それにより、遺伝子が標的細胞に組み込まれた後、特定の方法で目的遺伝子の発現が調整される。ある種の実施形態では、有用な転写制御配列は活性に関して、時間的及び空間的に制御される。
幾つかの実施形態では、上記目的遺伝子は、内部プロモータ／エンハンサ制御配列との機能的な関係を有する。「内部」プロモータ／エンハンサは、ウイルス構築物の５’ＬＴＲと３’ＬＴＲ配列の間に位置し、望ましくは発現させる遺伝子に機能的に連結している。
内部プロモータ／エンハンサは、機能的な関係を有する遺伝子の発現を増加させることが公知である、いかなるプロモータ、エンハンサ又はプロモータ／エンハンサの組合せでもあってもよい。「機能的な関係」及び「機能的に連結した」とは、限定されないが、遺伝子がプロモータ及び／又はエンハンサに対して適切な位置及び方向で存在し、プロモータ及び／又はエンハンサが適当な分子と接触したときに当該遺伝子の発現が影響を受けることを意味する。
内部プロモータ／エンハンサは好ましくは、目的遺伝子の所望の発現パターン及び周知のプロモータ／エンハンサの特異性に基づいて選択される。すなわち、内部プロモータは構成的プロモータでもよい。使用できる構成的プロモータの例としては、限定されないが、ユビキチンプロモータ、ＣＭＶ（Ｋａｒａｓｕｙａｍａら、１９８９．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６９：１３、全開示内容を本発明に援用する）、ベータ−アクチン（Ｇｕｎｎｉｎｇら、１９８９．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ ＵＳＡ ８４：４８３１−４８３５、全開示内容を本発明に援用する）、及びｐｇｋ（Ａｄｒａら、１９８７．Ｇｅｎｅ ６０：６５−７４、Ｓｉｎｇｅｒ−Ｓａｍら、１９８４．Ｇｅｎｅ ３２：４０９−４１７、及びＤｏｂｓｏｎら、１９８２．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０：２６３５−２６３７を参照、各々の開示内容を本発明に援用する）。
あるいは、プロモータは組織特異的プロモータでもよい。幾つかの好ましい実施形態では、上記プロモータは、標的細胞特異的なプロモータである。例えば、上記プロモータは樹状細胞特異的なプロモータＣＤ１１ｃであってもよい（Ｍａｓｏｏｄ，Ｒ．，ら、２００１．Ｉｎｔ Ｊ ＭｏＩ Ｍｅｄ ８：３３５−３４３、 Ｓｏｍｉａ，Ｎ．Ｖ．，ら、１９９５．Ｐｒｏｃ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９２：７５７０−７５７４、各々の開示内容を本発明に援用する）。更に、プロモータは、遺伝子の誘導発現を考慮に入れて選択してもよい。誘導発現のための多くのシステムは従来技術において公知であり、テトラサイクリン応答システム及びｌａｃオペレータ−リプレッサシステムなどが挙げられる。プロモータの組み合わせを用いて、目的遺伝子の所望の発現を得てもよいと考えられる。当業者であれば、生物体及び／又は目的の標的細胞の遺伝子の所望の発現パターンに基づいて、プロモータを選択できる。
幾つかの実施形態では、ウイルス構築物は、好ましくは少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼＩＩ又はＩＩＩのプロモータを含んでなる。ＲＮＡポリメラーゼＩＩ又はＩＩＩプロモータは、目的遺伝子に機能的に連結され、また終結配列に結合していてもよい。更に、１つ以上のＲＮＡポリメラーゼＩＩ又はＩＩＩプロモータを組み込んでもよい。
ＲＮＡポリメラーゼＩＩ及びＩＩＩプロモータは当業者に周知である。適切なＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータの種類は、例えばＰａｕｌｅ及びＷｈｉｔｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．，Ｖｏｌ２８，ｐｐ１２８３−１２９８（２０００）に記載されており、その開示内容を本発明に援用する。ＲＮＡポリメラーゼＩＩ又はＩＩＩプロモータの定義には、それぞれ、下流のＲＮＡコード配列を転写するように、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ又はＩＩＩそれぞれに指示できる、いかなる合成若しくは設計されたＤＮＡ断片も包含される。更に、ウイルスベクターの一部として使用する１つ以上のＲＮＡポリメラーゼＩＩ又はＩＩＩ（ＰｏｌＩＩ又はＩＩＩ）プロモータは、誘導的であってもよい。いかなる適切な誘導的なＰｏｌＩＩ又はＩＩＩプロモータも、本発明の方法に使用できる。特に適するＰｏｌＩＩ又はＩＩＩプロモータとしては、Ｏｈｋａｗａ及びＴａｉｒａ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌ．１１，ｐｐ５７７−５８５（２０００）、及びＭｅｉｓｓｎｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．２９，ｐｐ １６７２−１６８２（２００１）（各々の全開示内容を本発明に援用する）に記載のテトラサイクリン応答性プロモータなどが挙げられる。
目的遺伝子の発現を増加させるために、内部エンハンサをウイルス構築物に存在させてもよい。例えばＣＭＶエンハンサを使用できる（Ｋａｒａｓｕｙａｍａら、１９８９．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６９：１３、全開示内容を本発明に援用する）。幾つかの実施形態では、ＣＭＶエンハンサを、チキンβ−アクチンプロモータと組み合わせて使用できる。当業者であれば、所望の発現パターンに基づいて、適切なエンハンサを選択できる。
目的のポリヌクレオチド又は遺伝子はいかなる形にも限定されず、標的細胞において当業者がインテグレートさせ、転写させ、翻訳させ及び／又は発現させようとするいかなる核酸であってもよい。幾つかの実施形態では、上記ポリヌクレオチドは、免疫応答をさせようとする抗原をコードする遺伝子であってもよい。幾つかの実施形態では、上記ポリヌクレオチドは、小分子阻害ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、又は分子の発現を下方制御する目的のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードする遺伝子であってもよい。例えば、ｓｉＲＮＡ又はマイクロＲＮＡをコードする遺伝子を使用して、細胞内での負のレギュレータ（樹状細胞の活性化又は成熟を阻害するものを含む）の発現を下方制御することができる。ｓｉＲＮＡｓ及びマイクロＲＮＡは、従来技術において公知であり、多くの報告がなされている（Ｓｈｅｎ，Ｌ．ら、２００４．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２２（１２）：１５４６−１５５３、Ｚｈｏｕ，Ｈ．ら、２００６．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ３４７：２００−２０７、Ｓｏｎｇ，Ｘ−Ｔ．，ら、２００６．ＰＬｏＳ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３（１）：ｅ１１、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｔ．及びＡ．Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ．２００５．ＴＲＥＮＤＳ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２６（４）：１７７−１７９、Ｔａｇａｎｏｖ，Ｋ．，ら、２００７．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２６：１３３−１３７、Ｄａｈｌｂｅｒｇ，Ｉ．Ｅ．及びＥ．Ｌｕｎｄ．２００７．Ｓｄ．ＳＴＫＥ ３８７：ｐｅ２５、各々の全開示内容を本発明に援用する）。
更に、幾つかの実施形態では、上記ポリヌクレオチドは１つ以上の目的遺伝子を含んでなってもよく、それはウイルスプロモータとの機能的な関係で配置されてもよい。上記目的遺伝子は、タンパク質、ｓｉＲＮＡ又はマイクロＲＮＡをコードできる。幾つかの実施形態では、輸送されるポリヌクレオチドは、少なくとも１つのタンパク質、少なくとも１つのｓｉＲＮＡ、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ又はそれらのあらゆる組み合わせをコードする多数の遺伝子を含んでなってもよい。例えば、輸送されるポリヌクレオチドは、免疫応答を生じさせようとする１つ以上の抗原をコードする１つ以上の遺伝子を含んでなってもよい。上記１つ以上抗原は、単一の疾患若しくは障害に関連してもよく、又は、多数の疾患及び／又は障害に関連してもよい。幾つかの実施形態では、免疫調節タンパクをコードする遺伝子を、免疫応答を生じさせようとする抗原をコードする主要な遺伝子と共に構築し、その組合せにより、免疫応答を所望の方向及び規模で生じさせ、制御することができる。幾つかの実施形態では、ｓｉＲＮＡ又はマイクロＲＮＡをコードする遺伝子を、免疫応答を生じさせようとする抗原をコードする主要な遺伝子と共に構築し、その組合せにより、免疫応答の規模を調整できる。（配列番号９及び配列番号１０の付随配列をそれぞれ有する、図２４ｃ及び図２４ｄのポリヌクレオチドの実施形態を参照）。幾つかの実施形態では、マーカータンパク質をコードする遺伝子を、目的の主要な遺伝子の後に配置することにより、所望のタンパク質を発現する細胞を識別することができる。一実施形態では、蛍光マーカータンパク質、好ましくは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を、目的（典型的には抗原をコードする）遺伝子に加えて、構築物に組み込む。１つ以上の遺伝子が含まれる場合、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）配列又は２Ａエレメントを含ませ、リポーター遺伝子及び／又は目的の他のいかなる遺伝子から、目的の主要な遺伝子を分離するのも好ましい。ＩＲＥＳ又は２Ａ配列は、リポーター遺伝子又は他の遺伝子の発現を促進してもよい。
ウイルス構築物は、更なる遺伝因子を含んでもよい。構築物に含まれてもよいエレメントのタイプは、いかなる形であれ限定されず、特定の結果を生じさせるために当業者により適宜選択される。例えば、標的細胞のウイルスのゲノムの核内への侵入を促進するシグナルを含めてもよい。かかるシグナルの例は、ＨＩＶ−１ ｆｌａｐシグナルである。
更に、標的細胞のプロウイルスインテグレート部位の解析を促進するエレメントを含めてもよい。例えば、ｔＲＮＡアンバーサプレッサ配列を構築物に含めてもよい。
更に、上記構築物は、目的遺伝子の発現を強化するように設計された１つ以上の遺伝因子を含んでなってもよい。例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス応答エレメント（ＷＲＥ）を構築物に配置してもよい（Ｚｕｆｆｅｒｅｙら、１９９９．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：３６６８−３６８１、Ｄｅｇｌｏｎら、２０００．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１１：１７９−１９０、全開示内容を本発明に援用する）。
チキンβ−グロビンインスレータをウイルス構築物に含めてもよい。このエレメントは、メチル化及びヘテロクロマチン効果による、標的細胞中にインテグレートされたプロウイルスのサイレンシングを減少させることが示されている。更に、上記インスレータは、染色体上のインテグレート部位における、ＤＮＡの包囲によるポジティブ若しくはネガティブな位置的効果から、内部エンハンサ、プロモータ及び外因の遺伝子を保護することができる。
他のあらゆる付加的な遺伝因子を、好ましくは目的遺伝子の３’側に挿入してもよい。
特定の実施形態では、ウイルスベクターは以下を含んでなる：サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサ／プロモータ配列、ＨＩＶ ５’ＬＴＲ由来のＲ及びＵ５配列、ＨＩＶ−Ｉ ｆｌａｐシグナル、内部エンハンサ、内部プロモータ、目的遺伝子、ウッドチャック肝炎ウイルス応答配列、転移ＲＮＡアンバーサプレッサ配列、エンハンサ配列が欠失したＵ３エレメント、チキンβグロビンインスレータ、並びに３’ＨＩＶ ＬＴＲのＲ及びＵ５配列。
好ましくはウイルス構築物を、パッケージング細胞株をトランスフェクションすることができるプラスミドにクローニングする。好適なプラスミドは、好ましくはバクテリアにおけるプラスミドの複製のために有用な配列を含んでなる。
ウイルスの輸送：
目的のポリヌクレオチドを輸送しようとする標的樹状細胞（ＤＣ）とウイルスとを接触させることができるあらゆる方法により、ウイルスを標的細胞に輸送することができる。他の好ましい実施形態では、適当量のウイルスを直接（ｉｎ ｖｉｖｏで）動物に、例えば生体への注射により導入する。幾つかの好ましい実施形態では、ウイルス粒子を哺乳類の抹消血流中に注入する。他の好ましい実施形態では、ウイルス粒子を、皮内注射、皮下注射、腹腔内注射又は静脈注射により哺乳類に注入する。ウイルスは、以下の文献で開示される装置のような皮下注射装置を使用して輸送することができる米国特許第７２４１２７５号、第７１１５１０８号、第７１０８６７９号、第７０８３５９９号、第７０８３５９２号、第７０４７０７０号、第６９７１９９９号、第６８０８５０６号、第６７８０１７１号、第６７７６７７６号、第６６８９１１８号、第６６７０３４９号、第６５６９１４３号、第６４９４８６５号、第５９９７５０１号、第５８４８９９１号、第５３２８４８３号、第５２７９５５２号、第４８８６４９９号（各々の全開示内容を本発明に援用する）。例えば直接標的細胞を含む器官などの、他の注入部位の使用も適切である。例えば、リンパ節内注入、脾臓内注入又は骨髄内注入を、それぞれリンパ節、脾臓及び骨髄へのウイルスの輸送に用いることができる。特定の事情及び標的細胞の性質に応じて、例えば吸入又は上皮組織（例えば目、口又は皮膚の当該組織）との直接接触などの、他の手段で導入を実施できる。
他の実施形態では、標的細胞を、例えば培養組織プレートで準備し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでウイルスと接触させる。標的細胞は典型的には、治療を必要とする健常者又は患者から得られる樹状細胞である。好ましくは、標的細胞は、抗原に対する免疫応答を刺激することが望ましい患者から得られた樹状細胞である。患者から細胞を得る方法は公知技術である。ウイルスを培地中に懸濁させ、培養組織プレート、チューブ又は他の容器のウェルに添加してもよい。ウイルスを含んでなる培地は、細胞のプレーティングの前、又は細胞のプレーティングの後に添加してもよい。好ましくは、細胞を適当量の培地中でインキュベートして生存させ、培地中のウイルス濃度を適当なレベルにし、宿主細胞の感染を生じさせる。
細胞を好ましくは、充分な時間ウイルスとインキュベートし、ウイルスを細胞に感染させる。好ましくは、細胞を少なくとも１時間ウイルスとインキュベートし、より好ましくは少なくとも５時間、更に好ましくは少なくとも１０時間インキュベートする。
ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏでの輸送の実施形態では、所望の標的細胞を感染させるのに十分な、任意の濃度のウイルスを使用することができ、または当業者であれば容易に決定できる。標的細胞を培養するとき、ウイルス粒子の濃度は少なくとも１ＰＦＵ／μｌ、好ましくは少なくとも１０ＰＦＵ／μｌ、更により好ましくは少なくとも４００ＰＦＵ／μｌ、及び更により好ましくは少なくとも１×１０４ＰＦＵ／μｌである。
幾つかの実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのウイルス感染の後、標的細胞を動物に導入（又は再導入）することができる。幾つかの実施形態では、細胞を真皮中、真皮下、又は末梢血流中に導入することができる。動物に導入される細胞は好ましくは、その動物に由来する細胞であり、望ましくない免疫応答を回避する。同様の免疫バックグラウンドを有するドナー動物に由来する細胞を使用してもよい。望ましくない免疫反応を回避するように設計された細胞などの、他の細胞を使用してもよい。
標的細胞を、例えば１つ以上の目的のポリヌクレオチド又は遺伝子のインテグレート、転写及び／又は発現、インテグレートされた遺伝子のコポー数、及びインテグレートされた位置に関して分析してもよい。かかる分析は任意のタイミングで実施してもよく、公知のあらゆる方法で実施できる。
組換えウイルス又はウイルス感染したＤＣが投与される患者を、感染した細胞の位置、ウイルスで輸送された目的のポリヌクレオチド又は遺伝子の発現、免疫応答の刺激に関して分析し、また公知のあらゆる方法で疾患又は障害に伴う症状をモニターしてもよい。
上記で開示した、細胞を感染させる方法は、個々の細胞の具体的な特性には依存しない。それにより、それらの方法は全ての哺乳動物に対して広く適用できる。幾つかの実施形態では、組換えウイルスをヒトに、又はヒト樹状細胞に輸送する。他の実施形態では、組換えウイルスをマウスに、又はマウス樹状細胞に輸送する。更に他の実施形態では、組換えウイルスを、ヒト若しくはマウス以外の動物に、又はヒト若しくはマウス以外の動物由来の樹状細胞に輸送する。
上記のように、標的細胞特異性のみならず広範囲の宿主にも適用できるよう、組換えウイルスをシュードタイプ化することができる。当業者であれば、特定の動物種における目的ポリヌクレオチド又は遺伝子の所望の発現を実施するため、適当な内部プロモータを使用することを想起するであろう。すなわち当業者であれば、いかなる種に由来する樹状細胞を感染させるために、上記の方法を改変できる。
上記組換えウイルスを評価することにより、樹状細胞を標的とするウイルスに組み込んだターゲッティング分子の特異性を測定することができる。例えば、骨髄細胞の混合集団を患者から採取し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養する。更に上記組換えウイルスを骨髄細胞の混合集団に投与し、ウイルスに組み込まれたリポーター遺伝子の発現を、培養細胞においてアッセイすることができる。幾つかの実施形態では、混合細胞集団の少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、７０％、８０％若しくは９０％、更に好ましくは少なくとも９５％の形質導入された細胞が、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する樹状細胞である。
治療：
本発明の方法は、多様な疾患又は障害（特に患者の免疫応答の活性化が有益である疾患又は障害）の予防若しくは治療に使用できる。かかる多数の疾患は、従来技術において公知である。例えば、本発明の方法によって治療若しくは予防できる疾患又は障害としては癌、自己免疫疾患及び感染が挙げられるが、これらに限定されず、その他ウイルス、細菌、菌類及び寄生虫による感染症も包含される。本発明の実施形態では、疾患は、組換えウイルスを用いて樹状細胞に目的遺伝子を輸送することにより治療され、その際、当該遺伝子の発現により疾患特異的な抗原を生じさせ、抗原特異的な細胞性免疫応答及び体液性免疫応答が刺激される。
本発明の実施形態では、組換えウイルスを用いて、樹状細胞に対して、免疫応答を生じさせようとする抗原をコードするポリヌクレオチドを輸送する。幾つかの実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏで組換えウイルスと樹状細胞とを接触させることにより輸送を実施することができ、その後で、形質転換した樹状細胞を患者に提供する。幾つかの実施形態では、ウイルスを患者に輸送し、ｉｎ ｖｉｖｏでの樹状細胞との接触をさせる、輸送形態を実施することもできる。樹状細胞は更に、患者の抗原特異的なＴ細胞又はＢ細胞を刺激し、発現された抗原に対する細胞性及び体液性の免疫応答を誘導する。かかる実施形態では、疾患又は障害に罹患する患者を、所望の特異性を有する免疫細胞を生成させることにより治療する。
疾患又は障害に関与するいかなる抗原も、本願明細書に記載の組換えウイルスを使用して、樹状細胞に輸送することができる。疾患又は障害に関与する抗原を同定し、樹状細胞をターゲッティングする組換えウイルスの調製に利用できる。疾患及び障害に関与する多くの抗原が公知である。抗原は、疾患又は障害に関与することが既に公知であるものであってもよく、又は公知技術の任意の方法で同定してもよい。例えば、腫瘍関連抗原などの、患者が罹患しているある種の癌の抗原については、公知になっているものもある。１つの態様では、本発明は、設計された組換えレンチウイルスを用いて、ＤＣに対して、腫瘍抗原及び他の必要なタンパク質をコードする遺伝子をｉｎ ｖｉｖｏで輸送する方法の提供に関する。他の実施形態では、疾患又は障害に関連する抗原を、治療しようとする患者から同定する。例えば、腫瘍に関与する抗原を、公知の任意の方法により、腫瘍自体から同定してもよい。腫瘍関連抗原は、いかなる形であれ限定されず、例えば治療しようとする患者由来の癌細胞において同定された抗原などが挙げられる。
腫瘍関連抗原は、例えば前立腺癌及び乳癌などの、様々な癌に関するものが知られている。幾つかの乳癌において、例えばＨｅｒ−２受容体が、癌細胞の表面に過剰発現する。典型的な腫瘍抗原としては：ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ及びＮＹ−ＥＳＯ（精巣の免疫特権的な領域において、及び様々な腫瘍細胞において発現する非変異抗原）、メラノサイト−黒色腫系統の抗原ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ｇｐ１００、ｇｐ７５、ｍｄａ−７、チロシナーゼ及びチロシナーゼ関連タンパク質、又は前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）のような系統特異的な腫瘍抗原、並びに前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）（同じ組織に由来する健常細胞及び腫瘍細胞において発現する抗原）、腫瘍細胞において突然変異した遺伝子か、又は腫瘍において、標準細胞と比較して格段のレベルで転写される遺伝子に由来する、エピトープタンパク質／ペプチド（例えば変異ｒａｓ癌遺伝子、ｂｃｒ／ａｂｌ再編成、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、変異又は野生型ｐ５３、チトクロームＰ４５０ １Ｂ１及び異常に発現されたイントロン配列（例えばＮ−Ｖ−アセチルグルコサミン転移酵素−Ｖ））、骨髄腫及びＢ細胞リンパ腫のユニークなイディオタイプを生成させている免疫グロブリン遺伝子のクローンの再編成、腫瘍ウイルスプロセスに由来するエピトープタンパク質／ペプチド（例えばヒト乳頭腫ウイルスタンパク質Ｅ６及びＥ７）、腫瘍選択的な発現による非変異癌胎児性タンパク（例えば胎児性癌抗原及びアルファフェトプロテイン）などが挙げられる。多くの腫瘍関連抗原がレビューされている（”Ｔｕｍｏｒ−Ａｎｔｉｇｅｎｓ Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ Ｂｙ Ｔ−Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，”Ｂｏｏｎ Ｔ，Ｃｅｒｏｔｔｉｎｉ Ｊ Ｃ，Ｖａｎｄｅｎｅｙｎｄｅ Ｂ，Ｖａｎｄｅｒｂｒｕｇｇｅｎ Ｐ，Ｖａｎｐｅｌ Ａ，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １２：３３７−３６５，１９９４、”Ａ ｌｉｓｔｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ，”Ｒｅｎｋｖｉｓｔ Ｎ，Ｃａｓｔｅｌｌｉ Ｃ，Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｐ Ｆ，Ｐａｒｍｉａｎｉ Ｇ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ５０：（１）３−１５ ＭＡＲ ２００１を参照。全開示内容を本発明に援用する）。
抗原は、感染症（例えばＨＩＶ／エイズ）に関連する抗原であってもよい。上記抗原は例えばｇｐ１２０であってもよい（Ｋｌｉｍｓｔｒａ，Ｗ．Ｂ．，ら、２００３．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７７：１２０２２−１２０３２、Ｂｅｒｎａｒｄ，Ｋ．Ａ．，ら、２０００．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２７６：９３−１０３、Ｂｙｒｎｅｓ，Ａ．Ｐ．，ら、１９９８．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７２：７３４９−７３５６、各々の全開示内容を本発明に援用する）。その他の抗原の例としては、限定されないが、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｔａｔ、ｎｅｆ及びｒｅｖなどが挙げられる（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｊ．ら、１９９７．ＡＩＤＳ Ｒｅｓ Ｈｕｍ Ｒｅｔｒｏｔｉｒｕｓｅｓ １３（５）：３８３−３９２、Ｍｅｎｅｎｄｅｚ−Ａｒｉａｓ，Ｌ．ら、１９９８．Ｖｉｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １１（４）：１６７−１８１、全開示内容を本発明に援用する）。
ウイルス抗原の例としては限定されないが、以下のものが挙げられる：アデノウイルスポリペプチド、アルファウイルスポリペプチド、ネコカリチウイルスポリペプチド（例えばネコカリチウイルスカプシド抗原）、コロナウイルスポリペプチド、ジステンパーウイルスポリペプチド、エボラウイルスポリペプチド、エンテロウイルスポリペプチド、フラビウイルスポリペプチド、肝炎ウイルス（ＡＥ）ポリペプチド（例えばＢ型肝炎の核又は表面抗原）、ヘルペスウイルスポリペプチド（例えば単純疱疹ウイルス又は水痘帯状疱疹ウイルス糖タンパク質）、免疫不全ウイルスポリペプチド（例えばヒト免疫不全ウイルスエンベロープ又はプロテアーゼ）、感染性の腹膜炎ウイルスポリペプチド、インフルエンザウイルスポリペプチド（例えばインフルエンザＡ型ヘマグルチニン、ノイラミニダーゼ又は核タンパク質）、白血病ウイルスポリペプチド、マルブルクウイルスポリペプチド、オルトミクソウイルスポリペプチド、乳頭腫ウイルス属ポリペプチド、パラインフルエンザウイルスポリペプチド（例えばヘマグルチニン／ノイラミニダーゼ）、パラミクソウイルスポリペプチド、パルボウイルスポリペプチド、ペスチウイルスポリペプチドピコルナウイルスポリペプチド（例えばポリオウイルスカプシドポリペプチド）、ポックスウイルスポリペプチド（例えばワクシニアウイルスポリペプチド）、狂犬病ウイルスポリペプチド（例えば狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｇ）、レオウイルスポリペプチド、レトロウイルスポリペプチド及びロタウイルスポリペプチド。
細菌抗原の例としては、限定されないが、以下のものが挙げられる：放線菌ポリペプチド、バシラス属ポリペプチド、バクテロイデスポリペプチド、ボルデテラ属ポリペプチド、バルトネラ属ポリペプチド、ボレリア属ポリペプチド（例えばＢ．ブルグドルフェリＯｓｐＡ）、ブルセラ属ポリペプチド、カンピロバクター属ポリペプチド、キャプノサイトファーガ属ポリペプチド、クラミジア属ポリペプチド、クロストリジウム属ポリペプチド、コリネバクテリウム属ポリペプチド、コクシエラ属ポリペプチド、デルマトフィルス属ポリペプチド、エンテロコッカス属ポリペプチド、エールリッヒア属ポリペプチド、エシェリヒア属ポリペプチド、フランキセラ属ポリペプチド、フゾバクテリウム属ポリペプチド、ヘモバルトネラ属ポリペプチド、ヘモフィルス属ポリペプチド（例えばインフルエンザ菌タイプｂ外膜タンパク質）、ヘリコバクター属ポリペプチド、クレブシエラ属ポリペプチド、Ｌ型バクテリアポリペプチド、レプトスピラ属ポリペプチド、リステリア属ポリペプチド、マイコバクテリウム属ポリペプチド、ミコプラスマ属ポリペプチド、ナイセリア属ポリペプチド、ネオリケッチア属ポリペプチド、ノカルジア属ポリペプチド、パスツレラ属ポリペプチド、ペプトコッカス属ポリペプチド、ペプトストレプトコッカス属ポリペプチド、ニューモコッカス属ポリペプチド、プロテウス属ポリペプチド、シュードモナス属ポリペプチド、リケッチア属ポリペプチド、ロシャリメア属ポリペプチド、サルモネラ属ポリペプチド、シゲラ属ポリペプチド、スタフィロコッカス属ポリペプチド、ストレプトコッカス属ポリペプチド（例えばＳ．パイロジェンのＭタンパク質）、トレポネーマ属ポリペプチド及びエルシニア属ポリペプチド（例えばＹ．ペスティスのＦ１及びＶ抗原）。
真菌抗原の例としては、限定されないが、以下のものが挙げられる：アブシディア属ポリペプチド、アクレモニウム属ポリペプチド、アルテルナリア属ポリペプチド、アスペルギルス属ポリペプチド、バシディオボールス属ポリペプチド、ビポラリス属ポリペプチド、ブラストミセス属ポリペプチド、カンジダ属ポリペプチド、コクシジオイデス属ポリペプチド、コニディオボルス属ポリペプチド、クリプトコックス属ポリペプチド、クルバラリア属ポリペプチド、表皮菌ポリペプチド、エキソフィアラ属ポリペプチド、ジオトリカム属ポリペプチド、ヒストプラズマ属ポリペプチド、マズレラ属ポリペプチド、マラセジア属ポリペプチド、小胞子菌ポリペプチド、モニリエラ属ポリペプチド、モルティエレラ属ポリペプチド、ケカビ属ポリペプチド、ペシロミセス属ポリペプチド、アオカビ属ポリペプチド、フィアレモニウム属ポリペプチド、フィアロフォラ属ポリペプチド、プロトセカ属ポリペプチド、シュードアレシェリア属ポリペプチド、シュードミクロドキウム属ポリペプチド、フハイカビ属ポリペプチド、リノスポリジウム属ポリペプチド、リゾープス属ポリペプチド、スコレコバシジウム属ポリペプチド、スポロトリクス属ポリペプチド、ストレムフィリウム属ポリペプチド、白癬菌ポリペプチド、トリコスポロン属ポリペプチド及びキシロヒファ属ポリペプチド。
原虫・寄生虫抗原の例としては、限定されないが、以下のものが挙げられる：バベシア属ポリペプチド、バランチジウム属ポリペプチド、ベスノイチア属ポリペプチド、クリプトスポリジウム属ポリペプチド、アイメリア属ポリペプチド、脳炎性胞子虫ポリペプチド、エントアメーバ属ポリペプチド、ギアリダ属ポリペプチド、ハモニジア属ポリペプチド、ヘパトゾーン属ポリペプチド、イソスポラ属ポリペプチド、リーシュマニア属ポリペプチド、微胞子虫類ポリペプチド、ネオスポラ属ポリペプチド、ノセマ属ポリペプチド、ペンタトリコモナス属ポリペプチド、プラスモディウム属ポリペプチド（例えばＰ．ファルシパルムサーカムスポロゾイト（ＰｆＣＳＰ）のスポロゾイト表面タンパク質２（ＰｆＳＳＰ２）、肝臓病抗原１のカルボキシル末端（ＰｆＬＳＡ１ ｃ末端）及び輸送されたタンパク質１（ＰｆＥｘｐ−１）、ニューモシスティス属ポリペプチド、肉胞子虫属ポリペプチド、住血吸虫ポリペプチド、タイレリア属ポリペプチド、トキソプラズマ属ポリペプチド及びトリパノソーマ属ポリペプチド。
蠕虫寄生虫抗原の例としては、限定されないが、以下のものが挙げられる：アカントケイロネマ属ポリペプチド、ネコ円虫ポリペプチド、鉤虫属ポリペプチド、住血線虫属ポリペプチド、回虫属ポリペプチド、ブルギア属ポリペプチド、ブノストムム属ポリペプチド、毛細線虫属ポリペプチド、チャベルティア属ポリペプチド、クーペリア属ポリペプチド、クレノゾマ属ポリペプチド、ディクチオカウルス属ポリペプチド、ジオクトフィメ属ポリペプチド、ジペタロネーマ属ポリペプチド、広節裂頭条虫属ポリペプチド、ジプリジウム属ポリペプチド、イヌ糸状虫属ポリペプチド、ドラクンクルス属ポリペプチド、蟯虫属ポリペプチド、フィラロイデス属ポリペプチド、捻転胃虫属ポリペプチド、ラゴチラスカリス属ポリペプチド、ロア糸状虫属ポリペプチド、マンソネラ属ポリペプチド、ムエレリウス属ポリペプチド、ナノフィエタス属ポリペプチド、アメリカ鉤虫属ポリペプチド、ネマトディラス属ポリペプチド、腸結筋虫属ポリペプチド、オンコセルカ属ポリペプチド、オピストルキス属ポリペプチド、オステルタジア属ポリペプチド、パラフィラリア属ポリペプチド、肺臓ジストマ属ポリペプチド、パラスカリス属ポリペプチド、フィサロプテラ属ポリペプチド、プロストロンギラス属ポリペプチド、セタリア属ポリペプチド、スピロセルカ属ポリペプチド、スピロメトラ属ポリペプチド、ステファノフィラリア属ポリペプチド、糞線虫属ポリペプチド、ストロンギルス属ポリペプチド、テラジア属ポリペプチド、トキサスカリス属ポリペプチド、トキソカラ属ポリペプチド、旋毛虫属ポリペプチド、毛様線虫属ポリペプチド、鞭虫属ポリペプチド、ウンシナリア属ポリペプチド及びブケレリア属ポリペプチド。
外部寄生虫抗原の例としては、限定されないが、以下のものが挙げられる：ノミのポリペプチド（アレルゲンと同様に感染防御抗原を含む）、ダニ（例えばマダニ及びヒメダニ）、ハエ（例えばユスリカ、蚊、サシチョウバエ、黒バエ、アブ、ツノサシバエ、アブ、ツェツェバエ、サシバエ、ハエウジ病を生じさせるハエ及びブヨ）、アリ、クモ、シラミ、コダニ及び昆虫（例えばトコジラミ及びサシガメ）。
抗原を及び／又は選択した後、所望の抗原をコードするポリヌクレオチドを同定する。好ましくは、上記ポリヌクレオチドはｃＤＮＡを含んでなる。抗原をコードする上記ポリヌクレオチドは好ましくは、上記のＤＣ−ＳＩＧＮと結合するターゲッティング分子を含む、組換えウイルス、好ましくは組換えレンチウイルス又はガンマレトロウイルスを使用して標的樹状細胞に導入される。組換えウイルスはＤＣ−ＳＩＧＮターゲッティング分子を介して最初に樹状細胞膜に結合し、その後抗原をコードするポリヌクレオチドを含んでなるウイルス核が細胞質ゾルに入る。ポリヌクレオチド（例えば抗原をコードする）は更に、好ましくは細胞のゲノムにインテグレートされ、発現する。ｅｘ ｖｉｖｏで接触する場合、標的樹状細胞は更に、例えば注入により患者へ戻され、それにより、所望の抗原に対する免疫応答を生じさせることのできる免疫細胞と相互作用する。他の好ましい実施形態では、組換えウイルスを患者に注入し、ｉｎ ｓｉｔｕで標的とされた樹状細胞を形質転換する。樹状細胞は更に、治療対象の疾患又は障害に関連する特定の抗原を発現し、患者において疾患又は障害に対して有効な免疫応答が生じる。
幾つかの実施形態では、組換えウイルスは１つ以上の抗原をコードするポリヌクレオチド配列を含んでなり、標的の樹状細胞への導入により、細胞に輸送される複数の抗原に対する免疫応答が生じる。幾つかの実施形態では、上記抗原は単一の疾患又は障害に関連する。他の実施形態では、上記抗原は複数の疾患又は障害に関連する。
本発明の実施形態では、ＤＣの成熟を活性化及び／又は刺激するＤＣ成熟因子を、目的のポリヌクレオチド又は遺伝子を担持する組換えウイルスと組み合わせて輸送する。幾つかの実施形態では、ＤＣはウイルスの輸送の前に、ＤＣ成熟因子の輸送によって活性化される。幾つかの実施形態では、ＤＣはウイルスの輸送の後、ＤＣ成熟因子の輸送によって活性化される。幾つかの実施形態では、ＤＣはウイルスの輸送と同時に、ＤＣ成熟因子の輸送によって活性化される。幾つかの実施形態では、ＤＣ成熟因子はウイルスと共投与される。他の実施形態では、ＤＣ成熟因子はウイルスとは別に投与される。
ある種の実施形態では、ウイルス中に含まれ、ウイルスが樹状細胞を形質転換した後で発現する、１つ以上のＤＣ成熟因子をコードする１つ以上の遺伝子を用いてもよい。幾つかの実施形態では、ＤＣ成熟因子をコードする１つ以上の遺伝子を、抗原をコードするウイルスベクター中に含めてもよい。更なる実施形態では、ＤＣ成熟因子をコードする１つ以上の遺伝子を、１つ以上の抗原をコードするウイルスベクター中に含めてもよい。幾つかの実施形態では、ＤＣ成熟因子をコードする１つ以上の遺伝子を、１つ以上の抗原をコードしているウイルスベクターとは別々のベクターを用いて、パッケージング細胞株をコトランスフェクションして提供してもよい。
幾つかの実施形態では、本発明の方法が、患者の養子免疫療法に使用できる。上述の通り、免疫応答を生じさせようとする抗原を同定する。所望の上記抗原をコードするポリヌクレオチドを得、組換えウイルスにパッケージングする。標的樹状細胞を患者から得、所望の抗原をコードするポリヌクレオチドを含んでなる組換えウイルスで形質転換する。次に樹状細胞を患者に戻す。
ワクチン処理：
上記のように、ＤＣ−ＳＩＧＮ表層樹状細胞マーカーと結合する様々な設計されたターゲッティング分子が、ＤＣに抗原をコードする遺伝子を輸送する組換えウイルスの調製に使用される。上記ウイルスを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏｄｅＤＣを形質転換することにより、疾患又は障害の予防を実施できる。例えば、シンドビスウイルスエンベロープ糖タンパク質を設計することにより、優先的にＤＣ−ＳＩＧＮに結合させることができ、またそれを用いて組換えウイルスをシュードタイプ化できる。免疫応答を生じさせようとする抗原をコードする遺伝子（例えば癌（例えばＭａｒｔ−１）又は他の疾患／障害（例えばウイルス感染））を、本願明細書に記載されている方法を使用してＤＣに輸送できる。幾つかの実施形態では、多数の抗原をコードする多数の遺伝子を、複数のウイルスベクターを用いて、本願明細書に記載されている方法、又は好ましくはマルチシストロンベクター系を用いてＤＣに輸送できる。１つ以上の抗原に対応する１つ以上の遺伝子には、刺激性分子（例えばＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、ＴＮＦα、Ｂ７．１、Ｂ７．２、４−１ＢＢ、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、薬剤誘導性ＣＤ４０（ｉＣＤ４０）など、及び／又はリポーター分子（例えばＧＦＰ、ルシフェラーゼなど）をコードする遺伝子を、複数のベクター、好ましくはマルチシストロンベクター系を使用して連結させてもよい。
本発明の幾つかの実施形態では、ＣＤ３４α＋にヒト造血薬原種を得て、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養することによって、ヒトＤＣを調製してもよい（例えばＢａｎｃｈｅｒｅａｕら、Ｃｅｌｌ １０６，２７１−２７４（２００１）に記載の方法）。免疫応答をさせようとする抗原をコードする遺伝子を含み、ＤＣ−ＳＩＧＮと結合するターゲッティング分子を有するウイルスを調製し、ヒトＤＣの形質転換に用いる。形質導入の特異性及び効率は、ＦＡＣＳによって定量化できる。ＤＣの成熟は、表面マーカー（例えばＭＨＣ ＩＩ）の上方制御のＦＡＣＳ分析によって解析できる。
他の実施形態では、ウイルスをｉｎ ｖｉｖｏで注射してもよく、それにより、天然のＤＣと接触し、目的のポリヌクレオチド（典型的には抗原をコードする遺伝子）が輸送される。ウイルス粒子の量は、少なくとも５０×１０６ＴＵ、少なくとも１×１０７ＴＵ、少なくとも２×１０７ＴＵ、少なくとも３×１０７、少なくとも４×１０７ＴＵ又は少なくとも５×１０７ＴＵであってもよい。選択されたインターバルで、受容者のリンパ器官からのＤＣを用い、例えば発現マーカー（例えばＧＦＰ又はルシフェラーゼ）を観察することにより、発現を測定できる。ウイルス処置された受容者のリンパ節及び脾臓からのＴ細胞を、抗原刺激に対する反応の規模及び期間に関して測定してもよい。ＤＣ以外の組織の細胞（例えば上皮性細胞及びリンパ系細胞）を用いて、ｉｎ ｖｉｖｏでの遺伝子輸送の特異性に関して分析してもよい。
エイズ感染（及び他のウイルス病）を抑止する最も有効な方法がワクチンであることについては、一般的な同意が得られている。しかしながら現在まで、ＨＩＶに対するワクチン処置方法で、第３フェーズ試験を通過するものはなかった。ゆえに、新規かつ有効なワクチン処理ストラテジーに対する切実なニーズが存在する。本発明の幾つかの実施形態では、ＤＣへのワクチン処理を行う。まず、ウイルスタンパク（例えば上記のそれら）をコードする遺伝子を、ウイルスベクターにクローニングする。ＤＣ中のＤＣ−ＳＩＧＮに（好ましくは特異的に）結合するターゲッティング分子を含んでなるウイルスを患者に投与して感染させ、好ましくは望ましくない副作用を回避する。上記ターゲッティング分子は、例えば設計されたシンドビスウイルスエンベロープ糖タンパク質であってもよく、上記ウイルスの投与は例えば注射により実施してもよい。動物モデルにおいては、分子的にクローニングされたＨＩＶリポータウイルス（ＮＦＮＳＺ−ｒ−ＨＳＡＳ、ＮＬ−ｒ−ＨＳＡＳ）及び臨床的分離株を用いて、尾静脈注入によって動物に投与してもよい。感染しているか否かは、脾細胞、リンパ節及び末梢血を、一定時間にわたるモニターにより確認できる。ＨＩＶ−ｇａｇタンパク質の場合はＰＣＲ、及びリポータウイルスにおけるＨＡＳの場合はＦＡＣＳを使用して、ウイルスのインテグレート及び複製を試験できる。生産的なｉｎ ｓｉｔｕのＤＣワクチン処理により、ＨＩＶチャレンジに対する抵抗性を増強することができる。実施例１７から２０を参照。
幾つかの実施形態では、本願明細書に記載の組換えウイルスによって形質転換した樹状細胞を、疾患又は障害の予防又は治療に用いる。他の好ましい実施形態では、樹状細胞は免疫応答の基となる抗原を発現する。上記抗原は典型的には、樹状細胞においては通常発現しないが、抗原をコードするポリヌクレオチドを含んでなる組換えウイルスにより標的細胞を形質転換した後で発現するものである。幾つかの実施形態では、樹状細胞は更に、本願明細書に記載の組換えウイルスによって樹状細胞に提供されるＤＣ成熟因子を発現する。
本発明の幾つかの態様では、アジュバントを、本発明の組換えウイルスと組み合わせて投与する。アジュバントは、組換えウイルスと共に、組換えウイルスの前、又は組換えウイルスの後に投与してもよい。
様々なアジュバントを本発明の組換えウイルスと組み合わせて使用して、組換えウイルスにコードされる抗原に対する免疫応答を強化してもよい。好ましいアジュバントを使用により、免疫応答に質的に影響を及ぼすようや抗原の立体構造変化を生じさせることなく、抗原への固有の反応を強化できる。好ましいアジュバントとしては、ミョウバン、３Ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ、（ＭＰＬ）（ＧＢ２２２０２１１を参照）などが挙げられる。ＱＳ２１は、南アメリカのキラジャ サポナリア モリナ木の樹皮から分離されるトリテルペン配糖体又はサポニンである（Ｋｅｎｓｉｌら、ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ（ｅｄｓ．Ｐｏｗｅｌｌ＆Ｎｅｗｍａｎ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９９５、米国特許第５０５７５４０号を参照）。他のアジュバントとしては水中油エマルジョン（例えばスクアレン又は落花生油）が挙げられ、任意に免疫刺激剤（例えばモノホスホリルリピドＡ）と組み合わせてもよい（Ｓｔｏｕｔｅら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３６，８６−９１（１９９７）を参照）。他のアジュバントはＣｐＧである（Ｂｉｏｗｏｒｌｄ Ｔｏｄａｙ，Ｎｏｖ．１５，１９９８）。あるいは、Ａβをアジュバントと組み合わせてもよい。例えば、Ａβのリポペプチドのバージョンは、ＨＢ抗原ワクチン処理に関する記載と同様（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９，１３８３−１３９２（１９９７））、直接パルミチン酸又は他の脂質をＡβのＮ末端基と結合することにより調製できる。しかしながら、かかるカップリングは、Ａβのコンフォメーションを、免疫応答の特性に影響を及ぼす程に、実質的に変化させるべきではない。アジュバントは、活性薬剤を含んでなる治療組成物の成分として投与することもでき、又は治療薬とは別に、その投与の前、その投与と同時に、若しくはその投与の後に投与してもよい。
好適なアジュバントの種類は、アルミニウム塩（ミョウバン）（例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム）である。かかるアジュバントは、ＭＰＬ又は３−ＤＭＰなどの他の特異的免疫賦活性化剤、ＱＳ２１、ポリグルタミン酸又はポリリジンなどのポリマー若しくはモノマーアミノ酸の有無にかかわらず使用できる。他の種類のアジュバントは、水中油型エマルジョン製剤である。かかるアジュバントは、他の特定の免疫賦活性化剤（例えばムラミルペプチド）（例えばＮ−アセチルムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（ｒ−２’ジパルミトイル−ステーヌ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌ−Ｄ−ｉｓｏｇｌｕ−Ｌ−Ａｌａ−ジパルミトキシプロピルアミド、ＤＴＰ−ＤＰＰ）テラミド（商標）、又は他の細菌細胞壁成分の有無にかかわらず、使用できる。水中油エマルジョンとしては、以下のものが挙げられる。（ａ）ＭＦ５９（国際公開第９０／１４８３７号）：５％のスクアレン、０．５％のツウィーン８０及び０．５％のＳｐａｎ ８５（任意にＭＴＰ−ＰＥを適当量）を含有。マイクロフリューダイザ（例えばモデルＨＯＹマイクロフリューダイザ（Ｍｉｃｒｏｆｉｕｉｄｉｃｓ社、ニュートンＭＡ）を使用してミクロン以下の粒子に調製。（ｂ）ＳＡＦ：１０％のスクアレン、０．４％のツウィーン８０、５％のプルロニックブロックされたポリマーＬ１２１及びｔｈｒ−ＭＤＰを含有。サブミクロンサイズのエマルジョンにマイクロ流動化するか、又はボルテックスして大きな粒度のエマルジョンを調製。（ｃ）Ｒｉｂｉ（商標）アジュバントシステム（ＰｖＡＳ）（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ社、ハミルトン、ＭＴ）：２％のスクアレン、０．２％のツウィーン８０及び１つ以上の細菌細胞壁成分（モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコール酸（ＴＤＭ）及び細胞壁骨格（ＣＷＳ）（好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ、Ｄｅｔｏｘ、商標））からなる群から選択される）。好ましい他の種類のアジュバントは、サポニンアジュバント（例えばＳｔｉｍｕｌｏｎ（商標）（ＱＳ２１、Ａｑｕｉｌａ社、ウスター、ＭＡ）、又はそこから発生する粒子（ＩＳＣＯＭ（免疫賦活複合体）及びＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ）である。他のアジュバントとしては、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）及び不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）が挙げられる。他のアジュバントとしては、サイトカイン（例えばインターロイキン（ＩＬ−１ＪＬ−２及びＩＬ−１２））、マクロファージコロニー形成刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などが挙げられる。
アジュバントは、単一の組成物として本発明の組換えウイルスと共に投与してもよく、又は本発明の組換えウイルスの投与の前、同時又は後に投与してもよい。免疫源及びアジュバントをパッケージし、同じバイアル中に添加してもよく、又は別々のバイアルパッケージし、使用前に混合してもよい。典型的には免疫源及びアジュバントを、意図された治療的用途を示すラベルと共にパッケージする。免疫源及びアジュバントを別にパッケージする場合、当該パッケージは典型的には、使用前に混合する際の取り扱い説明書を含んでなる。アジュバント及び／又はキャリアの選択は、アジュバントを含んでなるワクチンの安定性、投与経路、投与計画、ワクチン接種を受ける種におけるアジュバントの有効性などに依存し、ヒトの場合、薬理学的に許容できるアジュバントは、関連する行政機関により、ヒトへの投与が承認された、又は承認されうるものである。例えば、完全フロイントアジュバントはヒト投与に適していない。ミョウバン、ＭＰＬ及びＱＳ２１が好適である。任意に二種類以上のアジュバントを同時に使用してもよい。好ましい組合せとしては、ミョウバンとＭＰＬ、ミョウバンとＱＳ２１、ＭＰＬとＱＳ２１、ミョウバンとＱＳ２１とＭＰＬなどが挙げられる。また、不完全フロイントアジュバントを、任意にミョウバン、ＱＳ２１及びＭＰＬのいずれか、及びそれらの全てと組み合わせと共に使用してもよい（Ｃｈａｎｇら、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ３２，１７３−１８６（１９９８））。
医薬組成物及びキット：
また、本発明に係る医薬組成物及びキットは、本発明において提供される組換えウイルス及び１つ以上のコンポーネントを含んでなる。上記医薬組成物は、本発明において提供される組換えウイルス及び医薬用担体を含んでなってもよい。キットは、医薬組成物、及び／又は本発明において提供される組合せ、及び１つ以上のコンポーネント（例えば取扱説明書、患者に化合物を投与する装置）を含んでなってもよい。
本発明は、本発明において提供されるウイルス及び適切な薬剤担体を含んでなる医薬組成物の提供に関する。本発明において提供される医薬組成物は、固体、液体、粉末などの様々な形態であってもよく、例えば水溶液、又は凍結乾燥品であってもよい。適切な薬剤担体の例は、従来技術において公知である。かかる担体及び／又は添加剤は従来公知の方法で、適切な投与量で患者に投与することができる。安定化剤（例えば脂質）、ヌクレアーゼ阻害剤、ポリマー及びキレート剤の使用により、生体内での組成物の分解を防止できる。
本発明において提供される組換えウイルスを、キットとしてパッケージすることができる。キットは、取扱説明書、装置及び更なる試薬及び他のコンポーネント（例えば上記方法を実施するためのチューブ、容器及びシリンジ）など、１つ以上のコンポーネント任意に含んでなってもよい。典型的なキットは、本発明において提供されるウイルスを含んでなってもよく、任意に、取扱説明書、患者におけるウイルスの検出装置、患者へウイルスを投与する装置、及び患者に化合物を投与する装置を含んでなってもよい。
本発明はまた、目的遺伝子（典型的には抗原）をコードするポリヌクレオチドを含んでなるキットの提供に関する。幾つかの実施形態では、上記キットは、ウイルスパッケージングコンポーネントをコードする少なくとも１つのプラスミドと、樹状細胞と好ましくは特異的に結合するために設計されたターゲッティング分子をコードするベクターとを含んでなる。幾つかの実施形態では、上記キットは、ウイルスパッケージングコンポーネントをコードする少なくとも１つのプラスミドと、樹状細胞との結合のために設計されたターゲッティング分子をコードするベクターと、少なくとも１つのＤＣ成熟因子をコードするベクターと、を含んでなる。
本発明はまた、目的遺伝子（典型的には抗原）をコードするウイルスベクターと、任意にＤＣ成熟因子をコードするポリヌクレオチド配列と、を含んでなるキットの提供に関する。幾つかの実施形態では、上記キットは、ウイルスパッケージングコンポーネントをコードする少なくとも１つのプラスミドと、樹状細胞との結合のために設計されたターゲッティング分子をコードするベクターと、を含んでなる。
１つの例として、キットは取り扱い説明書を含んでなってもよい。取り扱い説明書には典型的には、ウイルス、任意にキット中に含まれる他成分、及び投与方法に関する詳細な説明（患者の適当な状態を決定する方法、ウイルスを投与する際の適当な投与量及び適当な投与方法など）が記載されている。取り扱い説明書には、治療期間にわたり患者をモニターするためのガイダンスが含まれていてもよい。
また、本発明において提供されるキットは、患者にウイルスを投与する装置を含んでなってもよい。薬剤又はワクチンを投与するための、公知のあらゆる装置を、本発明で提供されるキットに含めてもよい。典型的な装置としては、限定されないが、皮下注射用のニードル、静脈注射用のニードル、カテーテル、ニードルのないイ注入装置、吸入装置、及び点眼器などの液体ディスペンサなどが挙げられる。典型的には、キットのウイルスを投与する装置は、キットのウイルスとの適合性を有し、例えば、高圧注入装置などのニードルのないインジェクション装置を、高圧注入によって損傷を受けないウイルスと共にキット中に含めてもよいが、典型的には、高圧注入によって損傷を受けるウイルスと共にはキットには含めない。
また、本発明において提供されるキットは、患者に化合物（例えばＤＣ活性化物質又は刺激物質）を投与する装置を含んでなってもよい。患者に薬剤を投与するための、公知のあらゆる装置を、本発明で提供されるキットに含めてもよい。典型的な装置としては、皮下注射用のニードル、静脈注射用のニードル、カテーテル、ニードルのない注入装置が挙げられ、制限されないが、皮下注射用ニードル、静脈注射用ニードル、カテーテル、ニードルのないインジェクション装置、吸入装置及び液体ディスペンサ（例えば点眼器）などが挙げられる。典型的には、キット中の化合物投与用の装置は、化合物を投与する所望の方法との適合性を有する
以下に実施例を示すが、それらは例示のみを目的とするものであり、いかなる形であれ本発明の範囲を限定するものではない。実際、本願明細書において開示・記載されるもの以外の、本発明の様々な修飾を、これらの説明から当業者が想起することは自明であり、本願明細書に添付した特許請求の範囲に含まれる。
本願明細書中の全ての特許文献及び非特許文献は、それらの全開示内容を本願明細書に援用する。
実施例１：ＤＣ特異的なターゲッティング分子の設計
レンチウイルスベクターを高利的に設計して、それらを細胞に導入することにより、特異的な態様でＤＣを形質転換することができる。ＤＣの特定のサブセットがそれらの表面に産生される。すなわちＤＣ−ＳＩＧＮタンパク質（Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋ，Ｔ．Ｂ．，ら、２０００、Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋ，Ｔ．Ｂ．，ら、２０００，上記）、異物との迅速な結合及びエンドサイトーシスを生じさせることができるＣ型レクチン様受容体（Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋ，Ｔ．Ｂ．，ら、２００４，上記。）であり、それらはＤＣ上のターゲッティング受容体として使用できる。アルファウイルス属のシンドビスウイルス（ＳＶ）、及びトガウイルス科のファミリーは、ＤＣ−ＳＩＧＮを介してＤＣに感染することができる（Ｋｌｉｍｓｔｒａ，Ｗ．Ｂ．，ら、２００３．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：１２０２２−１２０３２、全開示内容を本発明に援用する）。しかしながら、ＳＶの実験室株に用いられる標準的なウイルス受容体は、細胞表面ヘパラン硫酸（ＨＳ）であり、それは多くのタイプの細胞において発現される（Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｊ．Ｈ．，ら、１９９４．Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．９：４７３−４８４、Ｂｙｒｎｅｓ，Ａ．Ｐ．，ａｎｄ Ｄ．Ｅ．Ｇｒｉｆｆｉｎ．１９９８．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：７３４９−７３５６、全開示内容を本発明に援用する）。ＳＶエンベロープ糖タンパク質（以後ＳＶＧと称する）上の２つの受容体結合部位の物理的が分離を利用し、その標準的な標的ＨＳに対する結合を損なわせ、またＤＣ−ＳＩＧＮと相互作用する能力は維持させるよう、受容体を設計した（図１）。ウイルス表面上に組み込んだ場合、この変異糖タンパク質は、ＤＣへの感染は媒介できるが、他の細胞への感染は媒介できない。
野生型ＳＶＧのｃＤＮＡは、カリフォルニア工科大学のＪ．Ｈ．シュトラウス博士の研究室から得、ＰＣＲによってｐｃＤＮＡ３ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にクローニングして、プラスミドｐＳＶＧを得た。ＰＣＲを用いた変異導入によって、１０残基のタグ配列（ＭＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）を、Ｅ２タンパク質のアミノ酸７１及び７４の間に挿入し、ＨＳ結合部位を崩壊させた。（Ｋａｒａｖａｎｓ，Ｇ．，ら、１９９８．Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｏｎｃｏｌ Ｈｅｍａｔ ２８：７−３０、Ｌａｖｉｌｌｅｔｅ，Ｄ．，ら、２００１．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ １２：４６１−４６６、Ｒｕｓｓｅｌｌ，ＳＪ．ａｎｄ Ｆ．Ｌ．Ｃｏｓｓｅｔ．１９９９．Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ １：３００−３１１、 Ｓａｎｄｒｉｎ，Ｖ．，ら、２００３．Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２８１：１３７−１７８、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ，Ｅ．ａｎｄ Ｆ．Ｌ．Ｃｏｓｓｅｔ．２００４．Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ ６：Ｓ８３−Ｓ９４、全開示内容を本発明に援用する）。挿入されたタグ配列に対する抗体を作製し、修飾されたＳＶＧの発現のモニターを可能にした。更にＨＳ特異的な感染を減少させるため、幾つかの重要な残基を、ＨＳ分子への結合に関与する残基として同定した（Ｃｏｆｆｉｎ，Ｊ．Ｍ．，ら、１９９７．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｂａｔｔｉｎｉ，Ｊ．Ｌ．，ら、１９９８．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７２：４２８−４３５、Ｖａｌｓｅｓｉａｗｉｔｔｍａｎｎ，Ｓ．，ら、１９９４．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６８：４６０９−４６１９、Ｗｕ，Ｂ．Ｗ．，ら、２０００．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２６９：７−１７、Ｃｏｓｓｅｔ，Ｆ．Ｌ．，ら、１９９５．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６９：６３１４−６３２２、Ｋａｙｍａｎ，Ｓ．Ｃ．，ら、１９９９．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７３：１８０２−１８０８、Ｌｏｒｉｍａｒ，Ｉ．Ａ．Ｊ．ａｎｄ ＳＪ．Ｌａｖｉｃｔｏｉｒｅ．２０００．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３７：１４７−１５７、Ｂａｒｎｅｔｔ，Ａ．Ｌ．，ら、２００１．Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９８：４１１３−４１１８、Ｂｅｎｅｄｉｃｔ，Ｃ．Ａ．，ら、２００２．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １０：５４５−５５７、Ｇｏｌｌａｎ，ＴＪ．ａｎｄ Ｍ．Ｒ．Ｇｒｅｅｎ．２００２．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７６：３５５８−３５６３，ｅａｃｈ、全開示内容を本発明に援用する）。かかる２つの残基をアラニン（１５７ＫＥ１５８→１５７ＡＡ１５８）に変異させた。
ＳＶＧのＥ３糖タンパク質から、更にアミノ酸６１−６４を除去し、欠失変異体を作製した。この修飾ＳＶＧをＳＶＧｍｕ（配列番号１１）と称する。ＳＶＧｍｕのｃＤＮＡを、ｐｃＤＮＡ３ベクターのＣＭＶプロモータの下流にクローニングした（ｐＳＶＧｍｕ（配列番号３）と称する）。
実施例２：ＤＣ特異的ターゲッティング分子を含んでなる組み換えウイルスの調製
組換えＳＶＧｍｕでシュードタイプ化されたレンチウイルスの調製は、レンチウイルスベクターＦＵＧＷ（配列番号１）又はその誘導体を、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｒｅｖ遺伝子をコードするパッケージング構築物、及びｐＳＶＧｍｕ（例１）を用いて、２９３Ｔ細胞の標準的なリン酸カルシウムによるトランジェントなトランスフェクションにより実施した。ＦＵＧＷは、ＧＦＰリポーター遺伝子の発現を促進するためのヒトユビキチン−Ｃプロモータを担持している自己不活性化レンチウイルスベクターである（Ｌｏｉｓ，Ｃ，ら、２００２．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９５：８６８−８７２，ｗｈｉｃｈ、全開示内容を本発明に援用する）。これらの試験において使用するレンチウイルス導入ベクター（ＦＵＧＷ及びその誘導体）は第三世代のＨＩＶベースのレンチウイルスベクターであり、３’ＬＴＲの大部分のＵ３領域が欠失し、その結果、自動不活性化３’−ＬＴＲ（ＳＩＮ）となる。
２９３Ｔ細胞のトランジェントなトランスフェクションの場合、６ｃｍの組織培養シャーレ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社又はＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で培養した２９３Ｔ細胞を、各々２．５μｇのエンベローププラスミド（ＳＶＧ、ＳＶＧｍｕ、Ｅｃｏ又はＶＳＶＧ）及びパッケージングプラスミド（ｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥ及びｐＲＳＶ−Ｒｅｖ）とともに、適当なレンチウイルス導入ベクタープラスミド（５μｇ）でトランスフェクションした。形質転換後４８及び７２時間においてウイルス上澄を回収し、０．４５μｍフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）で濾過した。ｉｎ ｖｉｖｏでの試験用の濃縮ウイルスベクターを調製するため、ウイルス上澄を５０，０００×ｇで９０分間、超遠心分離した（Ｏｐｔｉｍａ Ｌ−８０Ｋ 分離用超遠心機、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社）。次にペレットを、適当量の冷却したＰＢＳで再懸濁した。
ＳＶＧｍｕによってシュードタイプ化されるウイルスを、以下ＦＵＧＷ／ＳＶＧｍｕと記載する。野生型ＳＶＧ糖タンパク質で覆われたコントロールウイルスを、以下ＦＵＧＷ／ＳＶＧと記載する。
実施例３：パッケージングされた組み換えウイルスの共焦点イメージング
ＧＦＰ−ｖｐｒで標識されたレンチベクターを、ＦＵＷレンチベクター（ＧＦＰリポーター遺伝子を含まない）及び、ＧＦＰ−ｖｐｒ（２．５μｇ）をコードする別々のプラスミドを用いた以外は、実施例２にて説明したとおりに調製した。新鮮なウイルス上澄を、ポリリジンコートでコーティングした６ウェル培養ディッシュのカバースリップ上に重層し、Ｓｏｒｖａｌｌ Ｌｅｇｅｎｄ ＲＴ遠心分離機を使用して４℃、３，７００×ｇで２時間の遠心分離した。カバースリップを、冷却したＰＢＳで二回洗浄し、抗−ＨＡ−ビオチン抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）及びＣｙ５−ストレプトアビジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で免疫染色した。Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ５１０ レーザースキャニング共焦点顕微鏡（フィルタ組を備えた）を用いて、フルオレセイン及びＣｙ５に関する蛍光イメージを得た。プラン−アポクロマート油浸レンズ（６３ｘ／１．４）を、イメージングに使用した。
図２は、上記プロトコルによって行った組換えウイルスの共焦点イメージングの結果を示す（スケールバーは２μｍを示す）。「ＧＦＰ」スライドの粒子は緑に染色され、「ＳＶＧｍｕ」スライドの粒子は赤く染色され、「重なり」スライドの粒子は、ＧＦＰのみが発現するときは緑、ＳＶＧｍｕのみが発現するときは赤、並びにＧＦＰ及びＳＶＧｍｕ両方が発現するときは黄色／黄橙色である。ＧＦＰで標識された粒子の９０％以上は、ＳＶＧｍｕを含んでいだ。すなわち、ＳＶＧｍｕを提示するレンチウイルス粒子の産生が、共焦点イメージングにより確認された。
実施例４：ＤＣ−ＳＩＧＮ細胞株の調製
ターゲッティングによる形質導入の試験を容易にするため、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮ（以下２９３Ｔ．ｈＤＣＳＩＧＮと記載する）及びマウスＤＣ−ＳＩＧＮ（以下２９３Ｔ．ｍＤＣＳＩＧＮと記載する）を発現するＤＣ−ＳＩＧＮ細胞株を構築した。２９３Ｔ．ｈＤＣＳＩＧＮ及び２９３Ｔ．ｍＤＣＳＩＧＮ細胞株は、ＶＳＶＧでシュードタイプ化されたレンチベクターを用いた、親２９３Ｔ細胞への安定形質導入によって作製した。ヒトＤＣ−ＳＩＧＮ及びマウスのＤＣ−ＳＩＧＮのｃＤＮＡは、プラスミドｐＵＮＯ−ｈＤＣＳＩＧＮＩＡａ及びｐＵＮＯ−ｍＤＣＳＩＧＮ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎｅ）から増幅し、それぞれレンチウイルスプラスミドＦＵＷのヒトユビキチン−Ｃプロモータの下流にクローニングし、ＦＵＷ−ｈＤＣＳＩＧＮ（配列番号５）及びＦＵＷ−ｍＤＣＳＩＧＮ（配列番号６）として構築した。レンチベクターを更にＶＳＶＧでシュードタイプ化し、２９３Ｔ細胞を形質転換するために用いた。得られる細胞を、抗体染色（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製の抗ヒトＤＣ−ＳＩＧＮ抗体、及びｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製の抗マウスＤＣ−ＳＩＧＮ）及び細胞選別に供し、ＤＣ−ＳＩＧＮ＋２９３Ｔ．ｈＤＣＳＩＧＮ及びｍＤＣ−ＳＩＧＮ＋２９３Ｔ．ｍＤＣＳＩＧＮ細胞株の均一な集団を得た。
フローサイトメトリでは、ＤＣ−ＳＩＧＮが実質的に全ての２９３Ｔ．ｈＤＣＳＩＧＮ及び２９３Ｔ．ｍＤＣＳＩＧＮ細胞株（図３Ａ）において発現することが示された。各ダイアグラムにおいて、実線（塗られていない領域）は２９３ＴＤＣ−ＳＩＧＮ細胞株のＤＣ−ＳＩＧＮの発現を表し、陰影領域は非形質転換２９３Ｔ細胞のバックグラウンド染色を示す。
実施例５：ＤＣ−ＳＩＧＮ細胞株の形質転換による、ＤＣ−ＳＩＧＮ特異的な組み換えウイルスの評価
ＦＵＧＷ／ＳＶＧ又はＦＵＧＷ／ＳＶＧｍｕの形質導入効率及び特異性を評価するため（例２）、上記ウイルスを用いて２９３Ｔ．ｈＤＣＳＩＧＮ及び２９３Ｔ．ｍＤＣＳＩＧＮ細胞株（例４）を形質転換した。形質導入効率は、細胞株内のＧＦＰ発現により測定した。
標的細胞（２９３Ｔ．ｈＤＣＳＩＧＮ、２９３Ｔ．ｍＤＣＳＩＧＮ又は２９３Ｔ細胞、ウェルあたり０．２×１０６）を、２４穴培養シャーレ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社又はＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に播き、Ｓｏｒｖａｌｌ Ｌｅｇｅｎｄ遠心分離機を用いて３０℃、２，５００回転／分で９０分間、ウイルス上澄（１ウェルにつき１ｍｌ）とスピンさせ、感染させた。その後、上澄を新しい培地と置換し、５％のＣＯ２、３７℃で３日間インキュベートした。ＧＦＰ＋細胞のパーセンテージを、フローサイトメトリで測定した。形質導入タイターを希釈範囲で作成した結果、線形の反応を表していた。
フローサイトメトリでは、ＦＵＧＷ／ＳＶＧ（野生型ＳＶＧエンベロープ糖タンパク質を含む）が、３つの標的細胞株（２９３Ｔ、２９３Ｔ．ｈＤＣＳＩＧＮ及び２９３Ｔ．ｍＤＣＳＩＧＮ）に対して同程度の形質導入効率（１１〜１６％の形質導入）を有することが示された（図３Ｂ）。これはすなわち、ＳＶＧが広い特異性を有することを示し、また細胞表面上のＤＣ−ＳＩＧＮの存在により、ＳＶＧでシュードタイプ化されたレンチウイルスベクターの形質導入能力が顕著に変化しないことを示す。対照的に、ＦＵＧＷ／ＳＶＧｍｕベクター（変異ＳＶＧエンベロープ糖タンパク質を含む）は実際、２９３Ｔ．ｈＤＣＳＩＧＮ及び２９３Ｔ．ｍＤＣＳＩＧＮ細胞に対してそれぞれ４２％及び３４％の形質導入効率での形質転換を示したが、２９３Ｔ細胞では示さなかった（図３Ｂ）。これらの結果は、ＳＶＧｍｕを示しているシュードタイプ化レンチウイルスベクターが、ヒト若しくはマウスのＤＣ−ＳＩＧＮを発現する細胞を特異的に形質転換できることを証明するものである。更に、変異ＳＶＧは、野生型ＳＶＧよりＤＣ−ＳＩＧＮを発現する細胞において、より効率的な形質導入を示した。
形質導入された細胞におけるＦＵＧＷレンチウイルスベクターの安定なインテグレートが、ＧＦＰリポーター遺伝子のゲノムインテグレートに関するＰＣＲ分析により確認された。特定の形質導入がＤＣ−ＳＩＧＮにより媒介されたことを証明するため、２９３Ｔ．ｈＤＣＳＩＧＮ細胞に対する曝露前のＦＵＧＷ／ＳＶＧｍｕウイルス上澄への可溶性抗ヒトＤＣ−ＳＩＧＮ抗体を添加した。その結果、形質導入効率（データ示さず）が低下した。２９３Ｔ．ｍＤＣＳＩＧＮへのＦＵＧＷ／ＳＶＧｍｕの特異的なタイターは、１×１０６ＴＵ（形質導入単位）／ｍｌであると推定された。２９３Ｔ．ｈＤＣＳＩＧＮへのＦＵＧＷ／ＳＶＧｍｕのタイターは、１〜２×１０６ＴＵ／ｍＬであると推定された。
実施例６：ｉｎ ｖｉｔｒｏでの組み換えウイルスの評価
ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する樹状細胞（ＤＣ）の形質導入用に設計されたレンチベクターの特異性を解析するため、全骨髄（ＢＭ）細胞をマウスから分離し、ＦＵＧＷ／ＳＶＧｍｕウイルスベクター（実施例２）で直接形質転換した。ＢＭ培養液で増殖させた原種からマウスＤＣを得るプロトコルを、実験用にアレンジした（Ｂｕｃｈｈｏｌｚ，ＣＪ．，ら、１９９８．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ １６：９５１−９５４、全開示内容を本発明に援用する）。
全骨髄細胞をＢ６メスマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）から回収し、以下の文献に記載のようにＢＭＤＣとして発生させた（Ｙａｎｇ，Ｌ．ａｎｄ Ｄ．Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ．２００５．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０２：４５１８−４５２３、全開示内容を本発明に援用する）。全ＢＭ細胞若しくはＢＭＤＣを２４穴培養シャーレ（ウェルあたり２×１０６細胞）でプレーティングし、ウイルス上澄（１ウェルあたり１ｍｌ）と共に、Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＴ７を使用して、３０℃、２，５００回転／分で９０分間遠心分離し、スピンにより感染させた。スピンの後、上澄を除去し、１０％のＦＢＳ及びＧＭ−ＣＳＦを含んでなる新しいＲＰＭＩ培地（１：２０ Ｊ５５８Ｌ調整培地）と置換した。細胞を３日間培養し、フローサイトメトリを用い、ＧＦＰの発現を分析した。
マウスから分離したＢＭ細胞を、ＦＵＧＷ／ＳＶＧｍｕウイルスベクター、又はコントロールベクターで直接形質転換した。コントロールの場合、同種志向性マウス白血病ウイルス糖タンパク質（Ｅｃｏ）で覆われたレンチベクター（ＦＵＧＷ／Ｅｃｏ）を用いた。Ｅｃｏで覆われたベクターは広い特異性でげっ歯類細胞に感染できる。感染後３日における形質導入効率を、フローサイトメトリ（図４Ａ）で分析した。混合ＢＭ培養液中の細胞の約９％はＤＣ（ＣＤ１１ｃの発現を指標とする）であり、そのほとんど（約８０％）がＤＣ−ＳＩＧＮ高発現の細胞（データ示さず）であった。観察の結果、全ＢＭ細胞に対する１２％がＦＵＧＷ／ＳＶＧｍｕ形質導入（図４Ａ）によるＧＦＰ陽性（ＧＦＰ＋）であった。ＧＦＰ＋細胞に限った場合、観察の結果、形質導入された細胞の最高９５％がＤＣ−ＳＩＧＮ及びＣＤ１１ｃの二重陽性（ＤＣ−ＳＩＧＮ＋ＣＤ１１ｃ＋）であった。すなわちＦＵＧＷ／ＳＶＧｍｕは特異的にＤＣ−ＳＩＧＮを発現するＤＣを形質転換し、骨髄の他のタイプの細胞は形質導入しないことを示す。対照的に、全ＢＭ細胞の６８％が、ＦＵＧＷ／Ｅｃｏへの曝露の後ＧＦＰ陽性であったにもかかわらず、形質導入された細胞のわずか９％がＤＣであり、その中では、６．５％がＤＣ−ＳＩＧＮ＋であった。
ＦＵＧＷ／ＳＶＧｍｕの安定な形質導入は、レンチベクターバックボーンのＬＴＲの、ゲノムへのインテグレートに関する、Ａｌｕ ＰＣＲ分析により解析した（Ｂｕｔｌｅｒ，Ｓ．Ｌ．，ら、２００１．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．７：６３１−６３４、全開示内容を本発明に援用する）。更に、ＦＵＧＷ／ＳＶＧｍｕを使用して、マウス脾臓から回収した初代Ｔ細胞及びＢ細胞を形質導入した結果、実質的な形質導入が検出できず（図４Ｂ）、すなわち顕著な形質導入特異性が示された。
ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した骨髄（ＢＭ）−由来ＤＣ（ＢＭＤＣｓ）への、ＳＶＧｍｕを有するレンチベクターによる形質導入効率も試験した。顆粒白血球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の存在下で６日間培養することによって、骨髄（ＢＭ）由来ＤＣ（ＢＭＤＣｓ）を、上記の通り調製した。細胞を更に、ＦＵＧＷ／ＳＶＧｍｕ若しくはＦＵＧＷ／Ｅｃｏレンチベクターに曝露させた。形質導入の３日後に実施したＢＭＤＣｓのフローサイトメトリの結果、ＦＵＧＷ／ＥｃｏがＣＤ１１ｃ＋ ＤＣ（３３％）及びＣＤ１１ｃ−細胞（７．６％）の両方を形質転換しており、Ｅｃｏの広い向性と一致することを示していた（図５）。逆に、ＦＵＧＷ／ＳＧＶｍｕはＣＤ１１ｃ＋ ＤＣｓ（３２．７％）を形質転換するだけであり、ＧＦＰ＋細胞はＣＤ１１ｃ−細胞（図５）中で検出されなかった。すなわちＦＵＧＷ／ＳＶＧｍｕがＢＭＤＣｓを特異的に修飾できることが示された。
これらの結果を総合すると、ＳＶＧｍｕを有する設計された組換えレンチベクターが、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＤＣを特異的に形質転換でき、標的特異的な形質導入が、ＤＣの表面上におけるＤＣ−ＳＩＧＮの発現と相関していることが証明された。
実施例７：ｉｎ ｖｉｔｒｏでの、樹状細胞の活性化に対する組み換えウイルスの効果
組換えレンチウイルスを更に検討し、それが特異的にＤＣをターゲッティングし、形質転換し、成熟したＤＣに活性化できるか否かを解析した。細胞表面における、共刺激分子Ｂ７．２（ＣＤ８６）及びＭＨＣクラスＩＩ分子Ｉ−Ａｂの、上方制御（ＤＣ活性化の指標と考慮される）を、組換えウイルスで曝露したＤＣにおいて測定した（Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ｒ．Ｍ．，ら、２００３．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：６８５−７１１、全開示内容を本発明に援用する）。ＢＭＤＣｓを調製し、実施例６で説明したようにＦＵＧＷ／ＳＶＧｍｕで感染させた。１μｇ／ｍＬの濃度のＬＰＳを添加して一晩インキュベートし、形質導入したＢＭＤＣを更に活性化させた。
形質導入の３日後のＢＭＤＣのフローサイトメトリの結果、ＦＵＧＷ／ＳＶＧｍｕによる処理により、ＧＦＰ陽性のＤＣでは、ＧＦＰ陰性ＤＣと比較して、ＤＣ活性化の標識であるＣＤ８６及びＩ−Ａｂの発現が上昇することが明らかとなった（図６、上パネル）。陰影領域はＧＦＰ陰性細胞（形質転換されない）を示し、実線（陰影なし領域）はＧＦＰ陽性の細胞（形質転換される）を示す。ＢＭＤＣの標的特異的な形質導入は更に、リポ多糖（ＬＰＳ）による処理により、ＤＣの成熟が相乗的に高められることが観察された（図６、下パネル）。これは、標的特異的な形質導入は、ＤＣ活性化の誘導の際、単独でも機能し、又は他のＤＣ成熟因子との組み合わせでも機能しうることを示す。
実施例８：組み換えウイルスによるｉｎ ｖｉｖｏでの樹状細胞のターゲッティング
この方法論がワクチン処理に使用できるか否かは、ｉｎ ｖｉｖｏでの実験により解析できる。設計されたＳＶＧｍｕを有するレンチベクターがｉｎ ｖｉｖｏでＤＣをターゲッティングできるか否かを試験するため、組換え及び濃縮レンチベクターＦＵＧＷ／ＳＶＧｍｕ（２００μｌ ＰＢＳの中に再懸濁、５０×１０６ＴＵ）を、Ｃ５７ＢＬ／６メスマウス（Ｂ６、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）の左側鼠径リンパ節（１ｃｍの範囲）の付近に皮下注射した。左鼠径リンパ節及び逆の同じリンパ節を分離し、注射後３日におけるサイズを試験した。これらのリンパ節から細胞を回収し、それらの合計数を計測した。ＧＦＰ＋ ＤＣｓのパーセンテージは、抗ＣＤ１１ｃ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で染色した細胞のフローサイトメトリで分析した。
３日目に、注射部位の近くの左鼠径リンパ節の顕著な肥大が観察され（図７Ａ、左イメージ）、反対側の同じリンパ節又は健常マウスのリンパ節と比較し、このリンパ節の細胞数は１０倍以上増加していた（図７Ｂ）。これは、ベクター投与により、輸送及び近くのリンパ節のリンパ球の激増を促進できることを示す。
フローサイトメトリの結果、左鼠径リンパ節細胞中の全ＣＤ１１ｃ＋細胞の約３．８％がＧＦＰ＋ ＤＣｓ（図７Ｃ）であることが示され、すなわち注射部位から移動したものと考えられる。これにより、１回のベクターの皮下注射により、著しく大きい効果が生じると考えられ、すなわち組換えウイルスがｉｎ ｖｉｖｏでＤＣに効果的に感染することが証明された。
実施例９：ｉｎ ｖｉｖｏ形質導入による、組み換えウイルスの特異性の評価
ＤＣを標的とするレンチベクターのｉｎ ｖｉｖｏでの特異性を検討するため、ホタルルシフェラーゼをコードするレンチウイルスベクターを構築した。ホタルルシフェラーゼのｃＤＮＡを、ｐＧＬ４．２ＬｕｃＰ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）から増幅し、ＦＵＧＷ（Ｌｏｉｓ，Ｃ．ら、２００２．上記．）にクローニングし、ＧＦＰに置換し、構築物Ｆｌｕｅを得た（配列番号４）（図２２Ａ）。ルシフェラーゼレポーター遺伝子を更に用いて、組織細胞へのｉｎ ｖｉｖｏの形質導入を、生物発光イメージング（ＢＬＩ）に関する標準的なプロトコルを使用してイメージングした。
組換えレンチベクター（以下Ｆｌｕｃ／ＳＶＧｍｕと記載する）を、マウスの左脇腹の皮下に注射した。他のマウスでは、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（以下Ｆｌｕｃ／ＶＳＶＧと記載する）を有するシュードタイプレンチベクターを、非特異的ベクターコントロールとして注射した。ベクターを治療されたマウスを更に、ＢＬＩを使用して非侵襲的にイメージングした。Ｆｌｕｃ／ＶＳＶＧ−処置マウスでは、注射部位で強力かつ長期にわたるシグナルを示し、非特異的に組織が形質導入され、ルシフェラーゼが発現することが示された（図２２Ｂ）。これは、ＶＳＶＧで覆われたウイルスが広い特異性を有するという事実に合致する。対照的に、顕著なシグナルがＦｌｕｃ／ＳＶＧｍｕ−処理されたマウス（図２２Ｂ）の注射部位では検出されず、ＳＶＧｍｕを含むレンチベクターが比較的ストリンジェントな標的特異性を有することが示された。目標とされたマウスにおいては、検出可能な発光シグナルがみられなかった。おそらくＤＣの分布が少なくまばらであり、現在のＢＬＩ法の感度以下では検出できなかったと考えられる。
１ヵ月後に、Ｆｌｕｃ／ＳＶＧｍｕを注射したマウスを用いて、定量的ＲＴ−ＰＣＲによる、体内分布に関するアッセイを行った。その結果、全ての単離された器官（心臓、肝臓、脾臓、腎、性腺、肺、皮膚、リンパ節）において、検出可能な程のレンチベクターのコピーが観察されなかった。すなわち動物において非特異的な感染が起こらず、ＤＣを標的とするベクターの特異性を示唆するものであった。
実施例１０：組み換えウイルスによるｉｎ ｖｉｔｒｏ抗原輸送
組換えレンチベクターによるＤＣの標的特異的な形質導入が、抗原特異的なＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞の応答の刺激を目的とする、ＤＣへの効果的な抗原遺伝子の輸送に使用できるか否かを解析するため、モデル抗原、チキンオボアルブミン（ＯＶＡ）を発現するレンチベクターを構築した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ６）マウスにおいては、ＯＶＡは、ＣＤ８＋Ｔ細胞受容体ＯＴｌ（ＯＶＡ２５７−２６９（ＯＶＡｐに指定される）と特異的に結合する）のための、並びにＣＤ４＋Ｔ細胞受容体ＯＴ２（ＯＶＡ３２３−３３９（ＯＶＡｐ＊に指定される）と特異的に結合する）のための、周知の標的抗原である（Ｙａｎｇ，Ｌ．ａｎｄ Ｄ．Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ．２００５．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０２：４５１８−４５２３、全開示内容を本発明に援用する）。レンチベクターを発現するＯＶＡ（ＦＯＶＡ（配列番号２）図８、上部）は、ＦＵＧＷ（図８、底部）から、ＧＦＰをチキンオボアルブミンのｃＤＮＡで置換することによって構築した。
ＢＭＤＣを、組換えレンチウイルスＦＯＶＡ／ＳＶＧｍｕ又はコントロールの組換えレンチウイルスＦＵＧＷ／ＳＶＧｍｕ（異なるリポーター遺伝子ＧＦＰをコードする）を用いて、培養６日目に形質転換した（実施例６）。６日目にＢＭＤＣをウイルス上澄と共にスピンして感染させ、更に３日間培養した。９日目に非接着細胞を回収し、１０％のＦＢＳ、ＧＭ−ＣＳＦ（１：２０ Ｊ５５８Ｌ調整培地）及び１μｇ／ｍＬ ＬＰＳ（シグマ）を含有するＲＰＭＩ培地で再度培養した。１０日目に細胞を回収し、Ｔ細胞刺激に用いた。修飾されたＢＭＤＣをＤＣ／ＦＯＶＡ及びＤＣ／ＦＵＧＷとした（形質導入に使用したレンチベクターにより若干異なる）。並行して、非接着細胞を、９日目の非形質転換ＢＭＤＣ培養液から回収し、同じ培地（１０％のＦＢＳ、ＧＭ−ＣＳＦ及びＬＰＳを含んでなるＲＰＭＩ）で再度培養した。１０日目に細胞を回収し、ＯＶＡｐ（ＯＶＡ２Ｓ７−２６９（以下ＤＣ／ＯＶＡｐと記載する、ＯＴｌ Ｔ細胞受容体と特異的に結合する）若しくはＯＶＡｐ＊（ＯＶＡ３２３−３３９（以下ＤＣ／ＯＶＡｐ＊と記載する、ＯＴ２ Ｔ細胞受容体と特異的に結合する）を添加し、Ｔ細胞刺激のための陽性コントロールとして用いた。ベクターで形質転換されたＢＭＤＣの、遺伝子移入されたＯＶＡ抗原をプロセシングし、提示する能力を試験するため、脾臓細胞をＯＴ１及びＯＴ２トランスジェニックマウスから回収し、レンチベクター形質転換したＢＭＤＣは、又は所定の比率でＯＶＡｐ若しくはＯＶＡｐ＊をロードされたＢＭＤＣと共に培養した。３日後に、上澄を回収し、ＥＬＩＳＡを用いたＩＦＮ−γ産生をアッセイし、細胞を回収し、フローサイトメトリを用いたそれらの表層の活性化マーカーの存在をアッセイした。Ｔ細胞増殖は、［３Ｈ］チミジン取り込みを使用してアッセイした。
遺伝子移入したＴ細胞と、様々な比率のＤＣ／ＦＯＶＡとを用いた３日間の共培養の後、ＩＦＮ−γ（図１０Ａ）の放出及びＴ細胞増殖（図１０Ｂ）を測定した結果、ＯＴ１ Ｔ細胞における顕著な応答が見られた。ＤＣ／ＦＵＧＷ（図１０Ａ及び１０Ｂ）を使用した場合、予想通り、明確なＯＶＡ反応が検出されなかった。遺伝子移入によるＯＶＡの発現は、ＯＴ１ Ｔ細胞応答を刺激するためのペプチド−ローディングよりも効率的であることが明らかとなり、それはすなわち、ＭＨＣクラスＩが内因的に産生されたペプチドの提示を促進するという理論に合致する。フローサイトメトリの結果、活性化されたＯＴ１ Ｔ細胞がＤＣ／ＦＯＶＡ又はＤＣ／０ＶのＡｐ（図９）の刺激の後、典型的なエフェクタ細胞障害性のＴ細胞表現型（ＣＤ２５＋ＣＤ６９＋ＣＤ６２ＬＩｏｗＣＤ４４ｈｉｇｈ）を示した。
ＤＣをＯＴ２ ＣＤ４＋Ｔ細胞と共培養するとき、表層マーカー（図１１）の変化及びＩＦＮ−γの産生（図１２）で示されるように、Ｔ細胞の活性化も観察された。しかしながら、おそらくＭＨＣクラスＩＩ分子に対する内因性の抗原ペプチドの提示が効率的でなかったため、ＣＤ４＋細胞の刺激はＣＤ８＋細胞のそれほど明白でなかった。ＯＶＡ抗原の細胞局在化を改変して、それをＭＨＣクラスＩＩ提示経路に向けることにより、ＣＤ４刺激の強化がなされ、ペプチドでパルスされたＤＣ（データ示ず）の場合よりも強化されるに至った。
これらの結果は、レンチベクター感染によるＤＣのターゲッティング方法が、ＤＣへの効果的な抗原の輸送を可能にし、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞応答を刺激できることを示す。
実施例１１：組み換えウイルスによるｉｎ ｖｉｖｏでの抗原輸送
レンチベクターによって、標的とされるＤＣが、ｉｎ ｖｉｖｏで抗原特異的なＴ細胞を活性化できるか否かを解析するため、以下の文献に記載のように、マウスの造血幹細胞（ＨＳＣ）へのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子の移入方法を用いて、マウスにおける抗原特異的かつＴＣＲ改変型のＴ細胞を作製した（Ｙａｎｇ，Ｌ．ａｎｄ Ｄ．Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｄ．２００５．上記．）。ＧＦＰ標識（図１３Ａ）に加えて、ＯＴ１ ＴＣＲα及びＴＣＲβを共発現するトリシストロンレトロウイルスベクターＭＩＧ−ＯＴ１を構築した。
簡潔には、Ｂ６メスマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｂｒｅｅｄｌｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を、２５０μｇの５−フルオロウラシル（Ｓｉｇｍａ社）で処理した。５日後に、ＨＳＣリッチな骨髄（ＢＭ）細胞を、脛骨及び大腿骨から回収し、ＢＭ培地（１０％のＦＢＳ、２０ｎｇ／ｍｌのｒｍＩＬ−３、５０ｎｇ／ｍｌのｒｍＩＬ−６及び５０ｎｇ／ｍｌのｒｍＳＣＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）を含有するＲＰＭＩ）中で、２４穴培養プレート（ウェルあたり２×１０６細胞）を用いて培養した。培養の１日目及び２日目に、Ｅｃｏ（ウェルあたり２ｍｌのウイルス上澄）とシュードタイプＭＩＧ−ＯＴ１レトロウイルスベクターとで、３０℃、２，５００回転／分で９０分、細胞をスピンさせて感染させた。各スピンの後、上澄を除去し、新しいＢＭ培地と交換した。３日目に形質転換したＢＭ細胞を回収し、１，２００ｒａｄｓで全身照射したＢ６レシピエントマウスに導入した。導入後８週目に、マウスをｉｎ ｖｉｖｏでの免疫試験に供した。各マウスに、ターゲッティングレンチベクター１０×１０６ＴＵを、皮下注射により単回投与した。７日後に、脾臓及びリンパ節細胞を回収し、フローサイトメトリを使用して、ＯＴ１ Ｔ細胞及びその表層における活性化標識の存在に関してアッセイした。
導入後８週目に、再作製したマウスのＴ細胞を分析した結果、ＣＤ８＋Ｔ細胞の約５％がＧＦＰ＋ＯＴ１＋（図１３Ｂ）であることが明らかとなった。再作製されたマウスの幾つかを、ＦＯＶＡ／ＳＶＧｍｕ（実施例１０）又はＦＵＧＷ／ＳＶＧｍｕ（実施例２）で、同じ投与量（１０ｘ１０６ＴＵ）で皮下注射により免疫した。７日後に末梢リンパ系器官から回収したＧＦＰ＋ＯＴ１＋Ｔ細胞の分析の結果、ＦＯＶＡ／ＳＶＧｍｕによるＤＣへの標的特異的な免疫により、コントロールマウス（免疫しなかったか又はＦＵＧＷ／ＳＶＧｍｕ（図１４Ｂ）で免疫しなかった）と比較してＯＴ１ Ｔ細胞の数を２倍にすることが示された。ＦＯＶＡ／ＳＶＧｍｕ−免疫マウスに由来するＧＦＰ＋ＯＴ１＋Ｔ細胞は、エフェクタ記憶表現型（ＣＤ６９ｌｏｗＣＤ６２ｈｉｇｈＣＤ４４ｈｉｇｈ）を示し、これらの細胞が積極的な免疫応答（図１４Ａ）を行ったことが示された。
これらの結果は、表面ＳＶＧｍｕを有する組換えレンチベクターが、ｉｎ ｖｉｖｏでＤＣをターゲッティングし、効率的に抗原特異性Ｔ細胞を刺激し、強い免疫応答を誘導することを証明するものである。
実施例１２：組み換えウイルスの直接投与による、ｉｎ ｖｉｖｏＣＴＬ及び抗体反応の誘導
天然型（野生型）マウスへのターゲッティングレンチベクターの投与に基づく、抗原特異的ＣＤ８＋細胞障害性リンパ球（ＣＴＬ）の反応及び抗体の反応を誘導する際の、ｉｎ ｖｉｖｏでのＤＣターゲッティングの有効性を試験した。
野生型Ｂ６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を、所定の投与量で、右脇腹の皮下に、ターゲッティングレンチベクター（ＦＵＧＷ／ＳＶＧ又はＦＯＶＡ／ＳＶＧｍｕを５０×１０６ＴＵ）を単回投与した。免疫後７日目及び１４日目に、免疫マウスから血液を尾部出血により回収し、血清中の抗ＯＶＡ ＩｇＧを、ＥＬＩＳＡを使用して測定した。１４日目に、脾臓及びリンパ節細胞を回収し、ＯＶＡに特異的なＴ細胞及びその表層における活性化標識の存在を、フローサイトメトリを使用して分析した。
ＯＶＡに特異的なＴ細胞の存在を、サイトカイン分泌及び四量体染色を測定することにより測定した。注射後１４日目に、末梢リンパ系器官から回収したＴ細胞を分析した。未変性ＤＣに対するレンチベクターターゲッティングにより、リンパ節（データ示さず）及び脾臓（図２３）において、ＯＶＡに反応するＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導することが可能となった。組換えＦＯＶＡ／ＳＶＧｍｕの単回投与は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の産生にとり十分であり、それは初回抗原刺激を受けることにより、ＯＶＡｐによる再刺激でＩＦＮ−γを分泌することができる（図２３）。コントロールベクターＦＵＧＷ／ＳＶＧｍｕの投与で、ＯＶＡｐ−特異的な反応が何ら生じなかった（図２３）。更に反応の規模を評価するため、ＯＶＡｐに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＭＨＣクラスＩ四量体染色で測定した。ＯＶＡｐに特異的なＴ細胞（＞６％）が単回投与（図１５）の後に頻繁に得られたが、四量体陽性の細胞は、ＦＵＧＷ／ＳＶＧｍｕ（図１５）で処理したマウスにおいては検出されなかった。四量体測定によって得られるデータは、細胞内のＩＦＮ−γ染色によりアッセイによるＣＤ８＋エフェクタ細胞の分析結果と相関していた（図２３）。これらのＯＶＡｐ陽性のＴ細胞の表現型分析により、これらの細胞が、エフェクタ記憶Ｔ細胞（ＣＤ２５ｌｏｗＣＤ６９ｌｏｗＣＤ６２ＬｈｉｇｈＣＤ４４ｈｉｇｈ）（図１７Ａ）の表面特性を有することが示された。
レンチベクター投与の用量応答性を試験するために、１００×１０６ＴＵ〜３×１０６ＴＵの範囲のＦＯＶＡ／ＳＶＧｍｕを皮下注射し、脾臓におけるＯＶＡｐに特異的なＴ細胞を、注射後１４日目に測定した。１００×１０６ＴＵ（図１６Ａ）の投与量で、非常に高い頻度（１２％）でＯＶＡｐに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞が検出された。ＯＶＡｐに特異的な細胞のパーセンテージは、投与される組換えベクターの量と比例していた（図１６Ｂ）。用量応答のプラトーは、試験した投与量では見られず、それはすなわち、注射する際のベクターの量及び／又は注入の頻度を増加させることによって、更なる強化が可能であることが示された。
更に、マウスにおける、ＯＶＡに特異的な血清ＩｇＧレベルを、ＦＯＶＡ／ＳＶＧｍｕ（５０×１０６ＴＵ）による免疫の後、７日目及び１４日目に試験した。ＩｇＧ血清タイターは、７日目では１：１０，０００、及び１４日目では１：３０，０００であった（図１７Ｂ）。これは追加的なアジュバント又は他の刺激のない単回注射ではむしろ意外な抗体反応であり、標的特異的なレンチベクターによる免疫処置が、顕著な抗原特異的抗体のＢ細胞からの分泌を誘導できることを示す。
これらの結果は、ＤＣ−ターゲッティングレンチベクターのｉｎ ｖｉｖｏでの投与が、輸送された抗原に対する細胞性及び体液性の免疫応答を誘導できることを示す。
実施例１３：抗腫瘍性免疫の発生：抑止的防御
ＤＣを標的とするレンチベクターのｉｎ ｖｉｖｏ投与の後に発生する抗腫瘍性免疫を評価した。Ｅ．Ｇ７腫瘍モデル（Ｗａｎｇ、Ｌ．及びＤ．Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ．２００５、上記）（ＯＶＡが腫瘍抗原として機能する）を用いた。
腫瘍株ＥＬ４（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｈ−２ｂ、胸腺腫）及びＥ．Ｇ７（安定にチキンＯＶＡ ｃＤＮＡを１コピー発現するＥＬ４細胞）を使用し、マウス腫瘍に投与した。腫瘍防御試験において、Ｂ６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）の右脇腹にターゲッティングレンチベクター（ＦＯＶＡ／ＳＶＧｍｕ又はＦＵＧＷ／ＳＶＧｍｕ）を５０×１０６ＴＵで単回注射した。２週後に、５×１０６個のＥＬ４又はＥ．Ｇ７細胞を、マウスの左脇腹に皮下注射した。腫瘍サイズを、精密なキャリパを使用して一日おきに測定し、２つの最も大きい垂直直径の積、ａ×ｂ（ｍｍ２）として示した。腫瘍が４００ｍｍ２に至ったとき、マウスは死んだ。
５０×１０６ＴＵ ＦＯＶＡ／ＳＶＧｍｕによるワクチン処理により、Ｅ．Ｇ７腫瘍による曝露から完全にマウスが保護され（図１８、左）、一方、腫瘍はＯＶＡ導入遺伝子、を欠くレンチベクターを有する擬ワクチン処理を受けたマウスにおいては急速に増殖した（図１８、左）。免疫に使用したレンチベクターに関係なく、ワクチン処理をされたマウスでは、ＯＶＡの発現がないコントロールＥＬ４腫瘍の増殖が見られたため、この防御はＯＶＡに特異的であったといえる（図１８、右）。
実施例１４：抗腫瘍性免疫の発生：腫瘍治療
腫瘍細胞がレンチベクターの投与前に導入された場合の、ＤＣを標的とするレンチベクターのｉｎ ｖｉｖｏでの投与後に発生する抗腫瘍性免疫を評価した。腫瘍の注入及びレンチベクター投与のステップは、実施例１３の場合とは逆の順序であり、確立した腫瘍が除去されうるか否かを解析するための「治療的ワクチン処理」の試験ということになる。この際、ホタルルシフェラーゼ遺伝子（Ｅ．Ｇ７．１ｕｃ）を発現するＥ．Ｇ７腫瘍細胞を用いてマウスに投与することにより、生存する動物の腫瘍増殖の動態に関するモニタリングを、ＢＬＩを使用して行うことが可能となった。イメージングを容易にするため、Ｂ６マウス（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）のアルビノ種を用いた。これらのマウスは色素沈着がないため、低いバックグラウンドの発光シグナルを吸収する。ＦＯＶＡ／ＳＶＧｍｕを１００×１０６ＴＵでこれらのマウスに注入（実施例１０）した結果、標準的なＢ６マウス（図２１）において、同様の反応が観察された。Ｅ．Ｇ７．１ｕｃ腫瘍細胞（５×１０６）を、アルビノ種のＢ６マウスに皮下移植した。上記のマウスを、腫瘍の移植後３日目及び１０日目に、ＦＯＶＡ／ＳＶＧｍｕ（１回あたりマウスあたり５０×１０６ＴＵ）を皮下注射により二回免疫した。同様の実験を、図１９及び２０に例示される実験手法に従い３回繰り返した。
ＤＣ−ターゲッティングレンチベクターで免疫されたマウスでは、９日目から腫瘍増殖の低下が示され、続いて１１日目では、検出レベル以下にまで、腫瘍退縮及び発光の減少が見られた（図１９及び２０）。ＦＯＶＡ／ＳＶＧｍｕで処理されたマウスでは、若干の腫瘍再発が１２日目から１６日目までに観察されたにもかかわらず、１８日目の終わり、及びその後においても疾患が生じず、実験期間中（＞６０日）腫瘍再発は観察されなかった。対照的に、処置を受けないマウスにおいて腫瘍は次第に増殖し、腫瘍の大型化のため、１６日目以降、マウスを実験から除外することを余儀なくされた。レンチベクター免疫の７日後に腫瘍退縮が開始されたことが観察できたのは興味深い。腫瘍退縮のタイミングは、ワクチン処理により誘導される抗原特異的な免疫応答の動態と相関している。
実施例１５：組み換えウイルスによる、抗原及び成熟因子のｉｎ ｖｉｔｒｏ輸送
ＤＣワクチン処理の成功は、ＤＣの成熟状態に依存しうる（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ，Ｊ．ａｎｄ Ａ．Ｋ．Ｐａｌｕｃｋａ．２００５．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ５：２９６−３０６、Ｓｃｈｕｌｅｒ，Ｇ．，ら、２００３．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５：１３８−１４７、Ｆｉｇｄｏｒ，Ｃ．Ｇ．，ら、２００４．Ｎａｔ Ｍｅｄ １０：４７５−４８０、各々の全開示内容を本発明に援用する）。ゆえに、所望のＤＣ−成熟を活性化するために、刺激性分子をコードする遺伝子を、レンチウイルスベクターに含めることができる。使用できるサイトカインとしては、限定されないが、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＴＮＦα、ＩＬ−６などが挙げられる。幾つかの実施形態では、用いられる成熟因子はＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）であり、それはＣＤ４ Ｔ細胞で典型的に発現し、ＤＣ上のＣＤ４０受容体のためのリガンドとして機能する（Ｍａｔａｎｏ，Ｔ．，ら、１９９５．Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ７６：３１６５−３１６９、Ｎｇｕｙｅｎ，Ｔ．Ｈ．，ら、１９９８．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ９：２４６９−２４７９、各々の全開示内容を本発明に援用する）。更に、ＤＣを操作して治療にとり強力なワクチンとするため、薬剤誘導性ＣＤ４０受容体（ｉＣＤ４０）を、幾つかの実施態様において、遺伝子輸送システムに導入した。以下の文献に記載のように、リガンド−結合ドメインと、膜ターゲッティング配列と融合するＣＤ４０の細胞質領域とからなる、ｉＣＤ４０を設計した（Ｈａｎｋｓ，Ｂ．Ａ．，ら、２００５．Ｎａｔ Ｍｅｄ １１：１３０−１３７、全開示態様を参照により本願明細書に援用する）。ｉＣＤ４０が発現するとき、ＤＣの成熟及び活性化が、脂質透過性を有する二量化物質により制御される。
ＤＣ成熟因子を含むことによる効果を検討するため、オボアルブミン（ＯＶＡ、実施例１０にて説明したように）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＴＮＦα、ＩＬ−６及びＣＤ４０ＬのｃＤＮＡを得た。文献に記載のように、ｉＣＤ４０を構築した（Ｈａｎｋｓ，Ｂ．Ａ．，ら、２００５．上記）。ＩＲＥＳ及び２Ａ−様配列を使用し、能率的に最高４つのタンパク質を翻訳できるマルチシストロンレンチウイルスベクターを構築した。このシステムは、以下の遺伝子を共発現するレンチウイルスベクターの構築に適している：ＯＶＡ及び成熟因子である分子（ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＴＮＦａ、ＩＬ−６、ＣＤ４０Ｌ又はｉＣＤ４０）（図２４ａ、「ＦＵＯＩＭ」と表示する）。ベクターの典型的な配列を、配列番号７で示す。ＳＶＧｍｕで覆われたレンチウイルスを実施例２にて説明したように調製し、レンチウイルスを、培養したマウスＢＭＤＣ（実施例６にて説明したように調製）にｉｎ ｖｉｔｒｏで導入し、これらの遺伝子を上記細胞に特異的に輸送した。Ｔ細胞刺激のプロセスで不可欠な役割を発揮する、幾つかの鍵となる分子の上方制御をＦＡＣＳ分析し、ＢＭＤＣｓの成熟を測定した。典型的なマーカーは、ＩＣＡＭ−Ｉ（ＣＤ５４）、Ｂ７．１（ＣＤ８０）、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ及び内因性ＣＤ４０であった。ＯＶＡ及びＧＦＰ遺伝子のみをコードするレンチウイルスで形質転換したＢＭＤＣを、実験におけるコントロールとして用いた。ｉＣＤ４０で修飾されたＤＣを有効量のダイマー物質ＡＰ２０１８７で曝露したとき、成熟マーカーの上方制御がなされた。
更に、成熟ＤＣの２つの特徴は、エンドサイトーシスの低いキャパシティ及び改良されたＴ細胞活性化能である。ＦＩＴＣタグを有するデキストランの取り込みにより、形質導入されたＤＣのエンドサイトーシスを定量化した。また成熟したＤＣを用いて、ＯＴ１ Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）（実施例１０にて説明）を発現するＴ細胞を刺激し、それにより免疫応答を生じさせるそれらの能力を評価した。ｉＣＤ４０で修飾されたＤＣを、有効量のダイマー物質ＡＰ２０１８７に曝露したとき、ＦＩＴＣタグを有するデキストランの取り込みが、ｉＣＤ４０で修飾されないＤＣのそれよりも減少していることが観察された。更に、ＯＴｌ Ｔ細胞を、遺伝子移入されたＴ細胞：ｉＣＤ４０修飾ＤＣ（ダイマー物質で処理）の様々な比率で調製して共培養したとき、ｉＣＤ４０修飾されないＤＣと共培養した場合と比較し、ＩＦＮ−γの放出及びＴ細胞増殖での測定で、より顕著に反応したことが観察された。
ＤＣの寿命は、Ｔ細胞依存性の免疫性を決定する、もう１つのパラメータである。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの血清飢餓アッセイを使用した、ＤＣの生存に対する刺激物質分子の効果を、ハンクスその他に記載の方法を使用して比較した（Ｈａｎｋｓ，Ｂ．Ａ．，ら、２００５．上記）。
必要に応じて、標的とされたＤＣに、２つの成熟因子分子を、レンチウイルスベクターにより輸送できる。なぜなら、ベクターの構成が４つのタンパク質を発現する能力を有するからである。
実施例１６：組み換えウイルスによるｉｎ ｖｉｖｏでの抗原及び成熟因子の輸送
ＦＵＯＩＭレンチウイルスベクター（配列番号７）によりパッケージングされた組換えウイルスを、実施例１５にて説明したように調製した。上記ウイルスを野生型のＢ６マウスに投与し、ＤＣにＯＶＡ抗原及び成熟因子分子を輸送し、ウイルスの段階的投与量に対する、免疫応答の誘導を、実施例１１にて説明したように評価した。
ｉＣＤ４０含有レンチウイルスの標的とされたＤＣ免疫では、免疫されない、ＯＶＡを含まないレンチウイルス（例えばＦＵＧＷ／ＳＶＧｍｕ）で免疫された、又はｉＣＤ４０を含まないレンチウイルス（例えばＦＯＶＡ／ＳＶＧｍｕ）で免疫された、コントロールマウスと比較し、ＯＶＡに応答したＴ細胞数の増加が観察された。
更に、実施例１３にて説明したように、腫瘍曝露に対する動物の抵抗性を、ｉＣＤ４０含有レンチベクターにより評価した。腫瘍曝露実験において、マウスに以下のレンチベクターを注射した：ＦＵＯＩＭ／ＳＶＧｍｕ、ＦＯＶＡ／ＳＶＧｍｕ又はＦＵＧＷ／ＳＶＧｍｕ。以下の細胞株を、腫瘍曝露に使用した：ＥＬ４（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｈ−２ｂ、胸腺腫）、及びＥ．Ｇ７（安定にチキンＯＶＡ ｃＤＮＡの１コピーを発現するＥＬ４細胞）。ＤＣ−ターゲッティングレンチベクターＦＵＯＩＭ／ＳＶＧｍｕ及びＦＯＶＡ／ＳＶＧｍｕで免疫したマウスにおいて、腫瘍曝露に対する防御が観察された。対照的に、ＯＶＡ導入遺伝子（ＦＵＧＷ／ＳＶＧｍｕ）を欠くレンチベクターによる擬ワクチン処理を受けたマウスでは、腫瘍の急速な増殖が確認された。免疫の際に使用するレンチベクターに関係なく、ワクチン処理をされたマウスにおいてＯＶＡの発現をしないコントロールＥＬ４腫瘍が増殖するため、この保護はＯＶＡに特異的であることが示された。
最後に、実施例１４にて説明したように、確立した腫瘍を排除するこの方法の能力を、ｉＣＤ４０含有レンチベクターを用いて評価した。当該試験において、以下のレンチベクターを免疫処理に用いた：ＦＵＯＩＭ／ＳＶＧｍｕ及びＦＯＶＡ／ＳＶＧｍｕ。以下の細胞株を、腫瘍治療に用いた：ＥＬ４及びＥ．Ｇ７．ＤＣ−ターゲッティングレンチベクター（ＦＵＯＩＭ／ＳＶＧｍｕ及びＦＯＶＡ／ＳＶＧｍｕ）で免疫した、腫瘍細胞を注射されたマウスにおいて、腫瘍増殖の低下が観察され、更に腫瘍退縮及び検出レベル以下への発光減少が観察された。更に、実験期間中（＞６０日）、腫瘍再発が観察されなかった。対照的に、処置を受けないマウスにおいては、腫瘍が次第に増殖した。
実施例１７：組み換えウイルスによる、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＩＶ／エイズ抗原の提示
ＨＩＶ／エイズを治療するため、上記の遺伝子輸送ストラテジーに基づいて「二重機能的」ＤＣを作製した。「二重機能的」ＤＣは、中和抗体（Ｎａｂｓ）を引き出す能力、及びＴ細胞免疫を誘導する能力を有する（図２５）。効率的にＮＡｂｓを引き出すため、キメラの膜結合型ｇｐ１２０（ｇｐ１２０ｍ）をコードする遺伝子をＤＣに輸送した。Ｇｐ１２０はＨＩＶのエンベロープ糖タンパク質であり、最も強力な免疫源であると考えられる（Ｋｌｉｍｓｔｒａ，Ｗ．Ｂ．，ら、２００３．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７７：１２０２２−１２０３２、Ｂｅｒｎａｒｄ，Ｋ．Ａ．，ら、２０００．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２７６：９３−１０３、Ｂｙｒｎｅｓ，Ａ．Ｐ．，ら、１９９８．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７２：７３４９−７３５６、全開示内容を本発明に援用する）。文献に記載されるように、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質の膜貫通領域と融合するｇｐ１２０を三量体の形で細胞表面に発現させることができ、ＨＩＶビリオン面上において成熟した三重体を模倣する（Ｋｌｉｍｓｔｒａ，Ｗ．Ｂ．，ら、１９９８．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７２：７３５７−７３６６、全開示内容を本発明に援用する）。この形の免疫源は、ＤＣ面に提示される。表面での発現に加え、ＤＣはまた、ＭＨＣにより制限された態様で、ｇｐ１２０に由来するエピトープペプチドを、Ｔ細胞に提示できる。
ＨＩＶ感染は、ＣＤ４ Ｔ細胞の減少を介してＤＣ機能を顕著に弱めるため、Ｔ細胞とは独立に機能するＤＣを設計するのが望ましい。ＣＤ４０Ｌ又はｉＣＤ４０の発現により、ＣＤ４ Ｔ細胞の非存在下で、ＤＣの成熟及び活性化がもたらされる。ゆえに、設計されたＣＤ４０Ｌ又はｉＣＤ４０（成熟及び刺激性分子として機能する）を、実施例１６にて説明したようにＤＣ−ターゲッティングウイルスに組み込む。
遺伝的にＤＣを修飾するためのレンチウイルス構築物を図２４ｂに示し、ＦＵＧｍＩＤ（配列番号８）として称する。ＮＩＨ ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＡＮＤ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍから、コドンを最適化されたｇｐ１２０のｃＤＮＡを得た。コドンを最適化された配列では、ＨＩＶ−１ゲノムの外部で、例外的に高いレベルの遺伝子発現がなされた。水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク質の膜貫通領域とｇｐ１２０との融合により、構築物を調製した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ分析を実施し、遺伝子修飾ＤＣによる、ＮＡｂｓを引き出す能力を評価した。抗ＣＤ１９ミクロビーズ（ＭｉＨｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、オーバーン、ＣＡ）を使用してＣＤ１９＋Ｂ細胞を野生型Ｂ６マウスの脾臓から単離し、ＩＬ−４及びＩＬ−６の存在下で、修飾ＤＣと共培養した。レンチウイルスベクターＦＵｍＧＩＤを、細胞株にＳＶＧｍｕと共にコトランスフェクションし、実施例２にて説明したようにＦＵｍＧＩＤ／ＳＶＧｍｕウイルスを調製した。得られるウイルスを、骨髄由来ＤＣ（ＢＭＤＣ）で形質導入した。形質導入したＤＣを照射し（３，０００ｒａｄ）、Ｂ細胞との共培養において、抗原提示細胞（ＡＰＣ）として使用した。形質導入したＢＭＤＣに応答するＢ細胞の増加を、時間経過と共に測定した。Ｂ細胞は、形質導入したＢＭＤＣとの共培養により、偽形質導入したＢＭＤＣとの共培養した場合よりも顕著に高い程度で増殖することが観察された。
Ｂ細胞の、特定の免疫グロブリン分泌細胞への分化に対する、遺伝子組換えＤＣの効果を調査するために、ＤＣを照射しなかったことを除き、上記と同様に共培養を行った。１４日後に、培養上澄中のＨＩＶに特異的な抗体の様々なアイソタイプのタイターを、抗原として組換えｇｐ１２０（ＮＩＢから入手可能：ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＡＮＤ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ）を使用して、ＥＬＩＳＡで測定した。形質導入したＢＭＤＣと共培養したＢ細胞における、ＨＩＶに特異的な抗体の様々なアイソタイプの発現は、で偽形質転換したＢＭＤＣｓと共培養した場合よりもレベルが高かった。
遺伝子組換えＤＣのｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴ細胞の活性化能を評価するため、ＣＤ３＋Ｔ細胞を野生型Ｂ６マウスから単離し、レンチウイルスで感染させ、照射したＤＣと共培養した。時間経過に伴うＴ細胞増殖を測定した。形質導入され、照射を受けたＤＣと共培養したＴ細胞培養では、Ｔ細胞増殖は、偽形質導入されＤＣと共培養した場合よりも顕著にレベルが高かった。
結果を総合すると、ＦＵｍＧＩＤ／ＳＶＧｍｕ レンチベクターで形質導入したＢＭＤＣは、Ｂ細胞を刺激し中和抗体（Ｎａｂｓ）を生じさせること、及びＨＩＶ／エイズに対するＴ細胞免疫を誘導することの両方において効果的であることが示されたと考えられる。
実施例１８：組み換えウイルスによる、ｉｎ ｖｉｖｏでのＨＩＶ／エイズ抗原の提示
ｉｎ ｖｉｖｏでのＢ細胞の活性化を評価するため、実施例１７にて説明したように調製した組換えレンチウイルスを、Ｂ６マウスに、皮下注射によってワクチン処理した。コントロールを、抗原をコードするレンチウイルス単独を注射したマウス、成熟分子をコードするレンチウイルス単独注射されるマウス、及び無処置の野生型マウスとした。ウイルス注入の２週後、ＨＩＶに対する血清中抗体をＥＬＩＳＡで測定した。抗体のタイターは、レンチウイルスをコードする抗原を単独で注射した群と同様に、ＦＵｍＧＩＤ／ＳＶＧｍｕウイルスを注射したマウスにおいて高かった。対照的に、抗体のタイターは、成熟分子を単独でコードするレンチウイルスでワクチン処理したマウス、及び野生型マウスにおいて比較的低かった。
Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの活性化のため、上記の組換えウイルスをＢ６マウスに注射した。７日後にＴ細胞を単離し、遺伝子組換えＤＣによるｉｎ ｖｉｔｒｏ再刺激の後、実施例１２にて説明したように、それらの増殖及びサイトカイン分泌を測定した。エフェクタＴ細胞応答の期間もモニターした。野生型ＤＣに対するレンチベクターのターゲッティングにより、リンパ節及び脾臓における、ＨＩＶに反応するＴ細胞を引き出すことが可能となる。組換えＦＵｍＧＩＤ／ＳＶＧｍｕの投与は、ＩＦＮ−γを分泌するＴ細胞を生じさせるのに十分である。対照的に、モックコントロールベクター（例えばＦＵＧＷ／ＳＶＧｍｕ）の投与では、ＨＩＶ−特異的な反応が引き出されなかった。
実施例１９：組み換えウイルスによる、ｉｎ ｓｉｔｕのＨＩＶ／エイズワクチン処理：ＨＩＶ曝露に対する防御
ＨＩＶに対処するためのｉｎ ｓｉｔｕのＤＣワクチン処理方法を試験するため、ヒト／マウスキメラを含んでなる新規なＨＩＶ疾患マウスモデルを開発した。文献に記載のように、ＲＡＧ２−／−γｃ −／−マウスをヒト適応免疫系によって再構成することができる（Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｊ．Ｈ．，ら、１９９４．Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ９：４７３−４８４、全開示内容を本発明に援用する）。ＲＡＧ２−／−γｃ −／−マウスは、Ｂ、Ｔ及びＮＫ細胞を欠く（Ｍｏｒｉｚｏｎｏ，Ｋ．，ら、２００１．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７５：８０１６−８０２０、全開示内容を本発明に援用する）。一日齢の、部分的に照射を受けたマウスの肝臓へのＣＤ３４＋ヒト臍帯血の注射により、多様な機能のヒトＤＣ、Ｂ細胞及びヒトＭＨＣ拘束されたＴ細胞の生成及び成熟が生じた。更に、このモデルは、初代及び二次リンパ器官の発達を指示し、ウイルス曝露に対する機能的なＣＤ８＋Ｔ細胞の免疫応答を生じさせた。更に、ＩｇＭからＩｇＧへ切り替えているＩｇアイソタイプが観察されたことから、機能的なＣＤ４＋Ｔ細胞免疫の存在が示唆された。
ＤＣを標的とする免疫による、ＨＩＶに対する抑制的防御の効果を測定するため、ヒト／マウスキメラに、ＳＶＧｍｕで覆われた投与された組換えウイルスを注射した。組換えウイルスは成熟刺激物質（例えば実施例１５のようなＣＤ４０Ｌ又はＩＣＤ４０）との組み合わせでｇｐ１２０ｍ抗原（例１７）をコードしており、それらを実施例２にて説明したように調製し濃縮した。免疫マウスを更に、例えば、腹腔内若しくは静脈ルートを介して、公知技術の方法に従いＨＩＶを接種した。再構成されたマウスはヒトＣＤ４ Ｔ細胞を維持するため、この動物を、分子的にクローニングしたＨＩＶリポータウイルス、ＮＦＮＳＸ−ｒ−ＨＳＡＳ（ＣＣＲ５向性）、ＮＬ−ｒ−ＨＳＡＳ（ＣＸＣＲ４向性）及び臨床分離株で曝露した（Ｂａｅｎｚｉｇｅｒ，ら、２００６．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０３：１５９５１−１５９５６、全開示内容を本発明に援用する）。複製能のあるリポータウイルスはまた、ｖｐｒ領域に熱安定性の抗原（ＨＳＡ）を有する。更に、接種前に生産的な感染を確立するため、感染させた同系の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、再構成したヒト／マウスキメラの腹膜に注射した。
ＨＩＶ感染を、脾臓、リンパ節、ＰＢＭＣ及び末梢血の、時間経過に伴うモニタリングで確認した。ＨＩＶリポータウイルス中のＨＳＡに関するＦＡＣＳを用いて、ＨＩＶウイルスのインテグレート及び複製を試験した。またＨＩＶウイルスのロードを、ＲＴ−ＰＣＲを使用して血漿から測定した。これらの方法によるＨＩＶ感染の評価によって、ｉｎ ｓｉｔｕでの生産的なＤＣワクチン処理により、免疫マウスが、ワクチン処理を受けない群よりもＨＩＶ曝露に対する抵抗性を示すことが明らかとなった。
実施例２０：組み換えウイルスによるｉｎ ｓｉｔｕでのＨＩＶ／エイズワクチン処理：ＨＩＶ感染のクリアランス
ｉｎ ｓｉｔｕでのＤＣワクチン処理方法の、活性ＨＩＶ感染をクリアする能力を試験するため、ヒト／マウスキメラを、実施例１９にて説明したように、分子クローニングしたＨＩＶリポータウイルス、ＮＦＮＳＸ−ｒ−ＨＳＡＳ（ＣＣＲ５向性）で最初に曝露した。活性ＨＩＶ感染を、ヒトＣＤ４ Ｔ細胞におけるＨＳＡ発現のＦＡＣＳ分析によってモニターした。ＨＩＶ感染の成功を確認した後、設計された組換えウイルス（実施例１９）を、皮下注射により、又は当業者により決定される最適経路（例えばｓ．ｃ、ｉ．ｄ．、ｉ．ｖ．又はｉ．ｐ．）によって動物に注射した。ＨＩＶウイルスのロードを更に、ＲＴ−ＰＣＲによってモニターし、更に末梢ＣＤ４を計測した。ＤＣワクチン処理がＨＩＶウイルスのロードを低下させ、ワクチン接種を受けないコントロールと比較し、免疫マウスにおいて確立されたＨＩＶ感染をクリアすることが可能であることが示された。
高活性抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）（３薬剤ストラテジーを利用）により、エイズ罹患率及び死亡率が大幅に改善された。以上に概説したストラテジーを、設計された組換えウイルスを用いてｉｎ ｖｉｖｏでＤＣ細胞を同時に形質転換することにより、この方法に適合させることができる。ＨＡＡＲＴとの組み合わせにより、上記の試験を繰り返し、ＨＩＶ曝露（実施例１９）の後、感染を防御若しくは減少させ、また活性ＨＩＶ感染をクリアする能力を評価することができる。
実施例２１：組み換えウイルスを用いた、ヒトにおける悪性腫瘍の治療
ヒト患者は、悪性腫瘍と診断された。腫瘍に特異的な抗原をコードする遺伝子を含み、ＤＣ−ＳＩＧＮ特異的なターゲッティング分子（例えばＳＶＧｍｕ）で覆われた組換えウイルスを、上記患者に適当量で投与した。実施例１５にて説明したように、上記ウイルスは、任意にＤＣ成熟因子をコードする遺伝子を含む。治療期間中、上記ウイルスを毎週、静脈内注射により投与した。治療計画の間及び後において、定期的に、腫瘍負担を磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）により評価した。腫瘍サイズの顕著な減少が、治療の進展として観察された。
実施例２２：組み換えウイルスを用いた、ヒトにおける腫瘍形成の予防
一グループのヒト患者に、腫瘍細胞に共通に、特異的に関連する抗原をコードする少なくとも１つの遺伝子と、任意に、実施例１５にて説明したようなＤＣ成熟因子をコードする遺伝子とを含む組換えウイルスを、適当量で投与した。上記ウイルスを、ＤＣ−ＳＩＧＮに特異的なターゲッティング分子（例えばＳＶＧｍｕ）（実施例２）で覆わせた。試験群及び対照群の患者を、腫瘍成長に関して周期的にモニターした。ウイルス投与した患者においては、悪性腫瘍形成の発生率が、対照群よりも低いことが観察された。
実施例２３：組み換えウイルスを用いた、ヒトのＡＩＤＳ／ＨＩＶの治療
ヒト患者は、ＨＩＶ／エイズと診断された。上記患者に、Ｇｐ１２０（例１７）をコードする遺伝子を含み、ＤＣ−ＳＩＧＮに特異的なターゲッティング分子（例えばＳＶＧｍｕ、実施例２）で覆われた組換えウイルスを、適当量で投与した。実施例１５にて説明したように、上記ウイルスは、任意にＤＣ成熟因子をコードする遺伝子を含む。上記ウイルスを、治療期間中、毎週、静脈内注射により投与した。治療計画の間と後において、定期的に、ＨＩＶウイルスのロードを、ＥＬＩＳＡを使用して、患者の血液中のＨＩＶに対する抗体を測定することにより評価した。患者のＴ細胞数も評価した。ＨＩＶウイルスのロードの顕著な減少が、治療の進展として観察された。更に、患者のＴ細胞数の減少の抑止が、治療の進展として観察された。
実施例２４：組み換えウイルスを用いた、ヒトのＨＩＶ／エイズの予防
ＨＩＶ感染の危険があるとみなされる一グループのヒト患者に、ＧＰ１２０をコードする遺伝子（実施例１７）を含み、任意にＤＣ成熟因子をコードする遺伝子を含む組換えウイルス（実施例１５にて説明）を適当量で投与した。ウイルスを、ＤＣ−ＳＩＧＮに特異的なターゲッティング分子（例えばＳＶＧｍｕ、実施例２）で覆わせた。試験群及び対照群の患者に、ＨＩＶ感染に関して６ヵ月毎に検査を受けさせ、陽性の場合、ＨＩＶウイルスロード及びＴ細胞数をモニターした。ワクチン接種を受けたグループ内の、感染が陽性であった患者においては、対照群の感染陽性患者と比較し、ＨＩＶウイルスロードが低くとどまり、Ｔ細胞数は高いままであった。
本発明の理解を容易にするために、上記において詳細に説明したが、添付の特許請求の範囲内で特定の改変を実施できることは明白である。本願明細書において引用される全ての刊行物及び特許文献は、あたかも各々が実際に記載されているかのように、同じ範囲で、全ての目的において、それらの全開示内容が本願明細書に援用される。

Claims (16)

  1. 感染症の治療薬の製造のための、レンチウイルスベクターを含む組換えウイルスの使用であって、前記治療薬は、前記レンチウイルスベクターを樹状細胞に輸送し、抗原特異的な免疫応答を誘導するように使用され、
    前記レンチウイルスベクターは、前記感染症に関連する抗原をコードするポリヌクレオチドを含み、前記ウイルスはターゲッティング分子を含み、
    前記ターゲッティング分子は、ヘパラン硫酸結合部位に変異を有し、ヘパラン硫酸に対する結合が減少しているか、又は損なわれており、かつ、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する細胞を標的とするシンドビスウイルスＥ２糖タンパク質を含む、使用。
  2. 前記組換えウイルスが、ガンマレトロウイルスゲノム由来の配列を含んでなる、請求項１記載の使用。
  3. 前記組換えウイルスが、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）ゲノム又はマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）ゲノム由来の配列を含んでなる、請求項２記載の使用。
  4. 前記ターゲッティング分子が、ＳＶＧｍｕ（配列番号１１）である、請求項１記載の使用。
  5. 前記組換えウイルスが、シュードタイプ化されている、請求項１記載の使用。
  6. 前記感染症に関連する抗原が、ウイルス抗原である、請求項１記載の使用。
  7. 前記感染症に関連する抗原が、細菌抗原である、請求項１記載の使用。
  8. 前記感染症に関連する抗原が、真菌抗原である、請求項１記載の使用。
  9. 前記感染症に関連する抗原が、原虫・寄生虫抗原である、請求項１記載の使用。
  10. 前記組換えウイルスは下記のステップによって得られる請求項１記載の使用：腫瘍抗原をコードするポリヌクレオチドを含んでなるウイルスベクターと、シンドビスウイルスＥ２糖タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターと、で、パッケージング細胞株をトランスフェクションするステップと、トランスフェクションした前記パッケージング細胞株を培養するステップと、前記パッケージング細胞株の培養液から組換えウイルスを回収するステップ。
  11. 前記パッケージング細胞株が、２９３細胞株である、請求項１０記載の使用。
  12. 前記ポリヌクレオチドが、ｉｎ ｖｉｔｒｏで樹状細胞に輸送される、請求項１０記載の使用。
  13. 前記ポリヌクレオチドが、ｉｎ ｖｉｖｏで患者の樹状細胞に輸送される、請求項１０記載の使用。
  14. 前記患者が、哺乳動物である、請求項１３記載の使用。
  15. 前記患者が、ヒトである、請求項１３記載の使用。
  16. 前記患者が、マウスである、請求項１３記載の使用。
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