BRPI0714495A2 - mÉtodo de liberaÇço de polinucleotÍdeo para cÉlula dendrÍtica que expressa dc-sign, vetor, vÍrus recombinantes e cÉlula dendrÍtica transduzida com os mesmos e seus usos - Google Patents

mÉtodo de liberaÇço de polinucleotÍdeo para cÉlula dendrÍtica que expressa dc-sign, vetor, vÍrus recombinantes e cÉlula dendrÍtica transduzida com os mesmos e seus usos Download PDF

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BRPI0714495A2
BRPI0714495A2 BRPI0714495-4A BRPI0714495A BRPI0714495A2 BR PI0714495 A2 BRPI0714495 A2 BR PI0714495A2 BR PI0714495 A BRPI0714495 A BR PI0714495A BR PI0714495 A2 BRPI0714495 A2 BR PI0714495A2
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BR
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cells
dendritic cell
recombinant
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Pin Wang
Lili Yang
David Baltimore
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California Inst Of Techn
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Abstract

MÉTODO DE LIBERAÇçO DE POLINUCLEOTÍDIO PARA CÉLULA DENDRÍTICA QUE EXPRESSA DC-SIGN, VETOR, VÍRUS RECOMBINANTES E CÉLULA DENDRÍTICA TRANSDUZIDA COM OS MESMOS E SEUS USOS. São proporcionados métodos e composições para a liberação de um polinucleotídio que codifica um gene de interesse, tipicamente um antígeno, para uma célula dendrítica (DC). O envelope de vírus compreende uma molécula alvo específica de DC-SIGN. Os métodos e composições relacionados podem ser usados para tratar pacientes que sofrem de uma grande variedade de condições, incluindo infecção, tal como HIV/AIDS e vários tipos de câncer.

Description

"Método de Liberação de Polinucleotídio para Célula Dendrítica que Expressa DC-SIGN, Vetor, Vírus Recombinantes e Célula Dendrítica Transduzida com os Mesmos e Seus Usos"
Relatório Descritivo Antecedentes da Invenção
A invenção refere-se em geral à liberação de gene diri- gido para alvo e, mais particularmente, ao uso de um vírus recombinan- te que compreende uma molécula direcionadora que localiza e se liga a células dendríticas e pode, assim, ser usado para vacinação em células dendríticas.
A imunização é uma das mais produtivas ferramentas na prática médica moderna, mas permanece sobrecarregada de limita- ções. Certas doenças infecciosas tais como HIV/AIDS, malária e tuber- culose não são atualmente de forma alguma controladas por imuniza- ção, enquanto outras doenças infecciosas são controladas por regimes de imunização complexos. O câncer é um objetivo promissor para tratamentos imuno-terapêuticos, mas as respostas clínicas de testes experimentais têm sido desapontadoras (Rosenberg, S.A. e colaborado- res, 2004, Nat. Med. 10:909-915, que é aqui incorporado neste docu- mento por referência em sua totalidade). Novos métodos de imunização são necessários, por exemplo, para com confiança induzir a imunidade antitumor.
As células dendríticas (DCs) têm um papel crítico em ambas a imunidade inata e adquirida. As DCs são células apresentado- ras de antígenos especializadas com a capacidade única de capturar e processar antígenos, migrar de um órgão periférico para um linfóide e apresentar os antígenos ao restante das células T de um modo restrito ao complexo principal de histocompatibilidade (MHC) (Banchereau, J. & Steinman, R. M., 1998, Nature 392:245-252; Steinman, R. M. e colabo- radores, 2003, Ann. Ver. Immunol., 21:685-711, cada um dos quais é aqui incorporado neste documento por referência em suas totalidades). Estas células são derivadas da medula óssea (BM) e são caracterizadas pela morfologia dendrítica e alta mobilidade. DCs imaturas são aptas à ingestão de antígenos e estão distribuídas como sentinelas no tecido periférico por todo o corpo. Todavia, a maturação das DCs é requerida de forma a se montar uma resposta imuno eficiente (Steinman, R. M. e colaboradores, 2003, supra). As DCs maduras expressam altos níveis do complexo antígeno MHC e outras moléculas de co-estimulação (tais como CD40, B7-1, B7-2 e CDla) (Steinman, R. M., 1991, Ann. Rev. Immunol, 9:271-296, que é aqui incorporado neste documento por referência em sua totalidade; Banchereau, J. & Steinman, R. M., 1998, supra). Estas moléculas têm um papel chave na estimulação de células T.
A descoberta do papel das DCS como células apresen-
tadoras de antígenos especializadas (APCs) tem levado a tentativas na vacinação/imunização baseada em DCs que envolve a carga de DCs com antígenos específicos (Banchereau, J. & Palucka, A.K., 2005, Nat. Rev. Immunol, 5:296-306; Figdor, C.G. e colaboradores, 2004, Nat. Med., 10:475-480, cada um dos quais é aqui incorporado neste docu- mento por referência em suas totalidades). Todavia, todas estas tentati- vas envolvem cargas ex vivo de DCs com antígenos específicos. DCs gerados ex vivo são então administrados ao paciente. A geração ex vivo de DCs para cada paciente é um processo intensivo extremamente trabalhoso.
Pelo contrário, a presente invenção é dirigida inter alia ao direcionamento, carga de antígeno e ativação das DCs in vivo, o que resulta no tratamento in vivo de doenças pela geração de uma resposta imuno benéfica no paciente. A invenção preenche, assim, uma necessi- dade de longo tempo de regimes eficientes e efetivos de vacina- ção / imunização. Sumário da Invenção
Em um aspecto da invenção, são proporcionados métodos da invenção de liberação de um polinucleotídeo a uma célula dendrítica expressando a DC-SIGN. Em algumas modalidades, os métodos com- preendem a transdução da célula dendrítica com um vírus recombinan- te, onde o vírus recombinante compreende o polinucleotídeo a ser liberado e uma molécula direcionadora que se liga à DC-SIGN. Em algumas modalidades, a molécula direcionadora é específica para a DC- SIGN.
Em algumas modalidades da invenção, o vírus recombinan-
te compreende seqüências de um genoma lentivírus, tal como um genoma de HIV.
Em outras modalidades, o vírus recombinante compreende seqüências de um genoma de gamaretrovírus, tal como as seqüências de um genoma de Vírus de Célula Tronco de Camundongo (MSCV) ou um genoma de Vírus de Leucemia Murina (MLV).
Em algumas modalidades da invenção, os métodos utilizam uma molécula direcionadora compreendendo uma glicoproteína viral derivada de pelo menos um vírus selecionado a partir do grupo de: vírus Sindbis, vírus influenza, vírus da febre de Lassa, vírus da encefalite transmitido por carrapatos, vírus da dengue, vírus da hepatite B, vírus Rabies, vírus Semliki Forest, vírus Ross River, vírus Aura, vírus da doença de Borna, vírus Hantaan e vírus SARS-CoV. Em modalidades mais particulares, uma molécula direcionadora compreende uma glicoproteína viral modificada derivada do vírus Sindbis (SIN ou SVG). Em certas modalidades, a molécula direcionadora é SINmu também conhecida como SVGmu (SEQ ID NO: 11).
Em algumas modalidades, o polinucleotídeo a ser liberado para uma célula dendrítica compreende pelo menos um dos seguintes: um gene codificando uma proteína de interesse, um gene que codifica um siRNA e um gene codificando um microRNA. O gene que codifica uma proteína de interesse pode codificar um antígeno, tal como um antígeno de tumor ou um antígeno de HIV.
O vírus recombinante pode ser produzido pela transfecção
de uma linhagem de células de empacotamento com um vetor viral compreendendo o polinucleotídeo a ser liberado e um vetor compreen- dendo um gene codificando a molécula direcionadora; cultura da linha- gem de célula de empacotamento transfectada e recuperação do vírus recombinante da cultura de célula de empacotamento. Em algumas modalidades, a linhagem de célula de empacotamento é uma linhagem de célula 293.
Em algumas modalidades da invenção, o polinucleotídeo é liberado para uma célula dendrítica in vitro, enquanto, em outras modalidades, o polinucleotídeo é liberado para uma célula dendrítica a um sujeito in vivo. O sujeito é tipicamente um mamífero, tal como uma Pessoa humana, camundongo ou porquinho da índia.
Em outro aspecto, são proporcionados um vírus recombi- nante que compreende: um polinucleotídeo de interesse e uma molécula direcionadora que se liga à DC-SIGN. Em algumas modalidades a molécula direcionadora especificamente se liga à DC-SIGN. O vírus recombinante pode compreender seqüências de um genoma de lentiví- rus, tais como as seqüências de um genoma de HIV. Em outras moda- lidades o vírus recombinante compreende seqüências de um genoma de gamaretrovírus, tais como seqüências de um genoma de Vírus de Célula Tronco de Camundongo (MSCV) ou genoma de um Vírus de Leucemia Murino (MLV).
A molécula direcionadora pode compreender uma glicopro- teína viral derivada de pelo menos um vírus selecionado do grupo de: vírus Sindbis, vírus influenza, vírus da febre de Lassa, vírus da encefali- te transmitido por carrapatos, vírus da dengue, vírus da hepatite B, vírus Rabies, vírus Semliki Forest, vírus Ross River, vírus Aura, vírus da doença de Borna, vírus Hantaan e vírus SARS-CoV. Em algumas modalidades a molécula direcionadora é uma glicoproteína viral deriva- da do vírus Sindbis. Em modalidades particulares, a molécula direcio- nadora é a SVGmu (SEQ ID NO: 11).
O polinucleotídeo pode ser, por exemplo, pelo menos um dos seguintes: um gene codificando uma proteína de interesse, um gene codificando um siRNA e um gene codificando um microRNA de interes- se. Em algumas modalidades o polinucleotídeo codifica um antígeno, tal como um antígeno de tumor ou um antígeno de HIV.
Em outro aspecto, são proporcionados métodos para esti- mular uma resposta imuno em um mamífero. Um polinucleotídeo que codifica um antígeno para o qual uma resposta imuno é desejada é liberado para células dendríticas expressando DC-SIGN pelo contato das células dendríticas com um vírus recombinante compreendendo o polinucleotídeo e uma molécula direcionadora que se liga à DC-SIGN. Em algumas modalidades, a molécula direcionadora é específica para DC-SIGN e não se liga apreciavelmente a outras moléculas. Em outras modalidades, a molécula direcionadora liga-se preferencialmente à DC- SIGN.
Num aspecto adicional, são providos vetores que codificam moléculas direcionadoras que se ligam à DC-SIGN. Em algumas moda- lidades, a molécula direcionadora é uma glicoproteína viral modificada. Em modalidades adicionais, a molécula direcionadora é SVGmu (SEQ ID NO: 11). A molécula direcionadora especificamente se liga à DC-SIGN em algumas modalidades. O vetor pode adicionalmente codificar um ou mais genes de interesse, tal como um gene codificando um antígeno e/ou um gene codificando um fator de maturação de célula dendrítica. Ainda num aspecto adicional, são proporcionados métodos de tratamento de paciente com uma doença. Um vírus recombinante é administrado ao paciente, onde o vírus recombinante compreende um polinucleotídeo codificando um antígeno associado com a doença e uma molécula direcionadora que se liga à DC-SIGN. A molécula direcionado- ra pode ser derivada de uma glicoproteína viral. Em algumas modalida- des, a molécula direcionadora é SVGmu (SEQ ID NO: 11).
A doença a ser tratada é geralmente uma para a qual o an- tígeno é conhecido ou pode ser identificado. Em algumas modalidades da invenção, a doença a ser tratada é câncer. Em outras modalidades, a doença é o HIV/AIDS.
São também proporcionadas células dendríticas transduzi- das com um vírus recombinante, em que o vírus recombinante compre- ende um polinucleotídeo de interesse e uma molécula direcionadora que se liga à DC-SIGN. Em algumas modalidades, a molécula direcionadora compreende uma glicoproteína viral derivada de pelo menos um vírus selecionado a partir do grupo de: vírus Sindbis, vírus influenza, vírus da febre de Lassa, vírus da encefalite transmitido por carrapatos, vírus da dengue, vírus da hepatite B, vírus Rabies, vírus Semliki Forest, vírus Ross River, vírus Aura, vírus da doença de Borna, vírus Hantaan e vírus SARS-CoV. Em algumas modalidades, a molécula direcionadora é SVGmu (SEQ ID NO:l 1).
São também providos métodos de imunização de um mamí- fero pela liberação de um polinucleotídeo que codifica um antígeno a células dendríticas expressando a DC-SIGN em que as células dendríti- cas são contatadas com um vírus recombinante compreendendo um polinucleotídeo codificando um antígeno e uma molécula direcionadora que se liga à DC-SIGN. Em algumas modalidades, as células dendríti- cas são contatadas com o vírus recombinante ex vivo. Em outras modalidades, as células dendríticas são contatadas com o vírus recom- binante in vivo.
Os métodos revelados aqui neste documento também po- dem ser usados para estimular uma resposta imuno a um antígeno específico em um mamífero pela liberação de um polinucleotídeo codiíl- cando o antígeno a células dendríticas usando um vírus recombinante compreendendo um polinucleotídeo e uma molécula direcionadora que se liga à DC-SIGN. A resposta imuno pode ser modulada ao fornecer um polinucleotídeo adicional cuja expressão na célula dendrítica modula a resposta imuno. Por exemplo, um polinucleotídeo codificando um fator de maturação dendrítico pode ser liberado.
Breve Descrição dos Desenhos
A Figura 1 é uma representação esquemática de uma estra- tégia geral células dendríticas (DCs) direcionadas para a liberação de antígeno. A glicoproteína do tipo selvagem do vírus Sindbis é levada à mutação no local de ligação do sulfato de heparana para abolir sua habilidade de se ligar. A glicoproteína mutante resultante (SVGmu) se liga à DC-SIGN mas não se liga ao sulfato de heparina. DC-SIGN: Não Integrina que se Prende ao ICAM-3 (Moléculas de Adesão Intracelular 3) Específicas de Célula Dendrítica.
A Figura 2 ilustra imagens de microscópio confocal a laser
de partículas de vírus coletadas de células produtoras de vírus transfec- tadas de forma transiente com o vetor lentiviral, plasmídeos codificando GFP-vpr e SVGmu e outros construtos de empacotamento necessários. As partículas do vírus são rotuladas com GFP (verde). A incorporação da superfície da SVGmu foi detectada por imunotingimento com um anticorpo de identificação anti-HA (vermelho) para rotular a SVGmu. No slide "GFF', partículas virais rotuladas com GFP são verdes. No slide "SVGmu", partículas virais com incorporação de superfície de SVGmu são tingidas de vermelho. No slide "Misturado", partículas virais em que apenas ο GFP e expresso sao verdes, particulas virais onde apenas a SVGmu e incorporada na superficie sao vermelhas e particulas virais expressando ambos GFP e SVGmu contida sao amarelas. A superposi- gao das cores verde e vermelha (amarelo) indica as particulas virais contendo SVGmu, as quais representam a maioria das particulas de virus total. A barra de escala representa 2 μπι.
A Figura 3A mostra uma analise citometrica de fluxo de Ii- nhagens de celulas alvo-dirigidas construidas 293T.hDCSIGN expres- sando DC-SIGN humano e 293T.mDCSIGN expressando DC-SIGN murino. A linha solida: expressao da DC-SIGN em linhagens de celulas alvo-dirigidas; area sombreada: fundo tingido em celulas 293T.
A Figura 3B mostra resultados da citometria de fluxo para detecgao do GFP expresso em celulas 293T transduzidas com lentivetor envelopado com glicoproteina Sindbis do tipo selvagem (FUGW/SVG) ou glicoproteina Sindbis mutante (FUGW/SVGmu). Um mililitro dos sobre- nadantes virais frescos de FUGW/SVG e FUGW/SVGmu foram usados para transdugao de celulas 293T (2 χ IO5) expressando DC-SIGN hu- mano (293T.hDCSIGN) ou DC-SIGN murino (293T.mDCSIGN). As celulas 293T originais sem a expressao da DC-SIGN foram incluidas como controles. Como ilustrado, lentivetor envelopado com a glicoprote- ina do virus Sindbis mutante (SVGmu) e capaz de especiflcamente transduzir celulas 293T expressando a DC-SIGN de humano ou de camundongo. O titulo da transdugao especifica da FUGW/SVGmu foi estimado ser aproximadamente 1 χ IO6 TU/ml para 293T.hDCSIGN e aproximadamente 0,8 χ IO6 TU/ml para a 293T.mDCSIGN.
A Figura 4A mostra os resultados da citometria de fluxo que ilustram a habilidade do lentivirus FUGW envelopado com ο a glicoproteina Sindbis mutante (FUGW/SVGmu) para especiflcamente transduzir celulas dendriticas de camundongos expressando DC-SIGN em uma cultura de medula ossea misturada primaria. A totalidade das celulas da medula ossea isoladas de camundongo B6 foram expostas ao sobrenadante viral fresco de FUGW/SVGmu. O lentivetor FUGW pseu- dotipado com a glicoproteina ecotropica (FUGW/Eco) foi incluido como um controle nao direcionador. Antigenos de superficie das celulas GFP- positivas foram acessadas pelo tingimento com anticorpos anti-CD 1 Ic e anti-DC-SIGN.
A Figura 4B mostra os resultados da citometria de fluxo in- dicando que ο lentivirus FUGW envelopado com a glicoproteina Sindbis mutante (FUGW/SVGmu) nao transduz outros tipos de celulas incluin- do celulas T primarias (CD3+，painel de topo) e celulas B (CD 19+)，painel de fundo). As celulas T CD3+ primarias e celulas B CD 19+ foram isola- das a partir do bago de camundongo e transduzidas com ο sobrenadan- te viral fresco seja do vetor direcionador FUGW/SVGmu ou nao direcio- nador FUGW/Eco. A expressao GFP foi analisada por citometria de fluxo. Linha solida: celulas expostas ao vetor lentiviral indicado; area sombreada: celulas sem transdugao (como um controle negativo).
A Figura 5 mostra os resultados da citometria de fluxo que ilustra a habilidade do lentivirus FUGW envelopado com uma glicopro- teina Sindbis mutante (FUGW/SVGmu) para especificamente transduzir as DCs derivadas da medula ossea (BMDCs). As BMDCs foram geradas ao se por em cultura celulas da medula ossea isoladas frescas na presenga da citocina GM-CSF por 6 dias. As celulas foram entao trans- duzidas com ο sobrenadante viral fresco seja do vetor FUGW/SVGmu direcionador ou FUGW/Eco nao direcionador. As expressdes da GFP e CDl Ic foram medidas por citometria de fluxo.
A Figura 6 mostra a ativagao de BMDCs apos transdugao direcionada com FUGW/SVGmu. A ativagao DC foi acessada pela analise da expressao na superficie da CD86 e I-Ab usando citometria de fluxo. A adigao de LPS (1 Mg/ml) durante a noite foi usada como um estimulador sinergetico para a ativagao de BMDCs transduzidas. Area sombreada: GFP negativo (nao transduzido); linha solida: GFP positivo (transduzido).
As Figuras 7A, 7B e 7C ilustram ο direcionamento de DCs in vivo lentivirus FUGW/ SVGmu. Camundongos B6 foram injetados com 50 χ IO6 TU de FUGW/SVGmu e analisados dias depois. Camun- dongos nao imunizados foram incluidos como um controle. Na Figura 7A, as imagens mostram ο tamanho de um nodulo de linfa inguinal representative» proximo do local da injegao comparado com aquela do nodulo de linfa equivalente distante do local de injegao. A Figura 7B ilustra a contagem do niimero de celulas totais dos nodulos de linfa indicado na Figura 7A. A Figura 7C ilustra a analise de citometria de fluxo representativa de celulas CDllc+ de dois nodulos de linfa mostra- dos na Figura 7A. Os rnimeros indicam a fragao de populagoes de GFP+DC.
A Figura 8 fornece uma representagao esquematica de um
lentivetor codificando ο antigeno OVA (FOVA) (topo) e ο lentivetor codifi- cando GFP (FUGW) como um controle (fundo).
A Figura 9 ilustra a estimulagao in vitro de celulas T CD8+OT1 por celulas dendriticas que foram transduzidas com ο lentive- tor FOVA/SVGmu (DC/FOVA) ou FUGW/SVGmu (DC/FUGW) ou por BMDCs nao transduzidas pulsadas com peptideo OVAp (SIINFEKL) (DC/OVAp). Padrdes de marcadores de ativagao da superficie de celulas T OTl em co-cultura com BMDCs foram acessadas por tingimento de anticorpo para CD25, CD69, CD62L e CD44. Area sombreada: celulas T OTl nao tocadas coletadas de animais transgenicos; linha solida: celulas T OTl em co-cultura com as BMDCs indicadas.
A Figura IOA ilustra a medida de IFN-γ por ELISA em celu- las T OTl misturadas com varias diluigoes de BMDCs transduzidas com FOVA/SVGmu (■)，FUGW/SVGmu (·) ou pulsada com ο peptideo OVAp (▲) e em cultura por 3 dias.
A Figura IOB ilustra as respostas proliferativas de celulas T OTl tratadas a partir da Figura IOA medidas por um teste de incorpo- ragao de timidina [3H] por 12 horas.
A Figura 11 ilustra a estimulagao in vitro de celulas T OT2
CD4+ por celulas dendriticas que foram transduzidas com ο lentivetor FOVA/SVGmu (DC/FOVA) ou FUGW/SVGmu (DC/FUGW) ou por BMDCs nao transduzidas pulsadas com ο peptideo OVAp* (ISQAVHAA- HAEINEAGR) (DC/OVAp*). Padroes de marcadores de ativagao da superficie de celulas T transgenicas OT2 em co-cultura com BMDCs foram acessadas por tingimento de anticorpo para CD25, CD69, CD62L e CD44. Area sombreada: celulas T OT2 nao tocadas coletadas de animais transgenicos; linha solida: celulas T OTl em co-cultura com BMDCs.
A Figura 12 ilustra a medida de IFN-γ por ELISA em celulas
T OT2 misturadas com varias diluig5es de BMDCs transduzidas com FOVA/SVGmu (■)，FUGW/SVGmu (·) ou pulsada com ο peptideo OVAp (▲) e em cultura por 3 dias.
A Figura 13A proporciona uma representagao esquematica de um vetor retro viral MIG-OTl usado para modificagao genetica de celulas tronco hematopoieticas murinas (HSCs).
A Figura 13B ilustra como as celulas T OTl CD8+ de HSCs modificadas MIG-OTl em camundongos reconstituidos foram identifi- cadas pela co-expressao de GFP e TCR Va2 ou νβ5. HSCs de camun- dongos B6 foram infectadas com MIG-OTl pseudotipadas com Eco (MIG-OTl/Eco) e transferidas para dentro camundongos recipientes B6 irradiados. Oito semanas pos-transferencia, as celulas T OTl CD8+ foram identiilcadas por citometria de fluxo. A Figura 14A ilustra ο acesso de padrdes de marcadores de ativagao de superficie em celulas T GFP+OTl+ isoladas a partir de bagos de camundongos reconstituidos e imunizados. Camundongos reconsti- tuidos por HSCs modificadas MIG-OTl foram imunizados por injegao sub-cutanea direta de 10 χ IO6 TU seja de FOVA/SVGmu ou FUGW/ SVGmu (como um controle) e analisados sete dias depois. A detecgao do tingimento da superficie para CD69, CD62L e CD44 foi conduzida. Linha solida: celulas T GFP+OTl+ de camundongos imuniza- dos FOVA/SVGmu; linha pontilhada: celulas T GFP+OTl+ de camun- dongos imunizados FO VA/SVGmu camundongos imunizados FUGWSVGmu de controle; area sombreada: celulas T GFP+OTl+ de camundongos imunizados celulas T GFP+OTl+ de camundongos nao imunizados.
A Figura 14B ilustra ο niimero total de celulas OT 1 em co- letadas de nodulos da linfa (LN, □) ou bagos (SP, ■) de camundongos nao imunizados (nao imun) ou camundongos imunizados com FUGW/SVGmu ou FOVA/SVGmu.
A Figura 15 ilustra a estimulagao in vivo de respostas de celula T especiflca a antigeno e de anticorpo em camundongos do tipo normal apos uma injegao sub-cutanea do lentivetor FOVA/SVGmu direcionador a DC. Camundongos B6 foram imunizados de forma sub- cutanea com 50 χ IO6 TU seja de FOVA/SVGmu ou FUGW/SVGmu (como um controle). Camundongos sem imunizagao (nao imun.) foram incluidos como controle negativo. Quatorze dias pos-imunizagao. celulas do bago foram coletadas e analisadas para a presenga de celulas T OVA especificas medido por tetramero SIINFEKL-PE e tingimento CD44. As porcentagens indicadas sao a porcentagem total de celulas T CD8+.
As Figuras 16A e 16B ilustram respostas de celulas T OVA
especificas in vivo em camundongos recebendo diferentes doses sub- cutaneas de FOVA/ SVGmu. Celulas T OVA especificas foram identifi- cadas por tingimento com tetramero como na Figura 17. A Figura 16A mostra a porcentagem medida de celulas T OVA especificas apos a imunizagao com 100 χ IO6 TU de FOVA/SVGmu. A Figura 16B mostra as respostas das doses de celulas T OVA especificas apos injegao das doses indicadas de FOVA/ SVGmu.
A Figura 17A ilustra os padr5es dos marcadores de ativa- gao de superficie de celulas T CD8+ OVA especificas (identiflcadas como celulas positivas ao tetramero) isoladas de camundongos imunizados FOVA/SVGmu 2 semanas pos-injegao. Os marcadores de ativagao de superficie foram acessados por tingimento de anticorpo para CD25, CD69, CD62L e CD44. Linha solida: celulas T tetramero+CD8+ de camundongos imunizados FOVA/SVGmu; area sombreada: celulas T CD8+ nao tocadas de camundongos nao imunizados.
A Figura 17B ilustra ο titulo IgG de soro OVA especifico de
camundongos B6 apos imunizagao com 50 χ IO6 TU de FOVA/SVGmu. Os soros foram coletados no dia 7 e dia 14 pos-imunizagao e foram analisados para ο titulo de IgG OVA especifico usando ELISA em dilui- g5es seriais de IOx, comegando em 1:100. Os valores do titulo foram determinados pela diluigao mais alta na qual a densidade otica era 2x derivag5es padr5es maiores do que a linha base do soro numa diluigao equivalente.
A Figura 18 ilustra ο tamanho do tumor como uma fungao do tempo em um modelo de tumor E.G7 murino. Camundongos B6 foram imunizados com injegao subcutanea de 50 χ IO6 TU seja de FOVA/SVGmu (A) ou vetor imitagao FUW/SVGmu (·). Nenhuma imunizagao (■) foi incluida como um controle. Quatro camundongos foram incluidos em cada grupo. No dia 14 pos-imunizagao, os camun- dongos foram testados com 5 χ IO6 seja de celulas de tumor E.G7
(expressando ο antigeno OVA, painel esquerdo) ou celulas de tumor EL4 parental (sem ο antigeno OVA, como um controle, painel direito) de forma sub-cutanea. O crescimento do tumor foi medido com um com- passo de calibre fino e e mostrado como ο produto dos dois diametros perpendiculares maiores (mm2).
A Figura 19 ilustra ο crescimento cinetico in vivo de tumo-
res em um modelo de erradicagao de tumor E.G7 murino. Uma cepa albina de camundongos B6 foi implantada com 5 χ IO6 de celulas de tumor E.G7 estaveis expressando um gene imagem de luciferase de vaga-lume (E.G7.1uc). Um camundongo (# 1) com implante de tumor foi incluido como um controle. Camundongos com tumores foram tratados sem imunizagao (# 2) ou com imunizagao com injegao de 50 χ IO6 TU de FOVA/SVGmu nos dias 3 e 10 (# 3, # 4) pos teste do tumor. O cresci- mento cinetico dos tumores foi monitorado por imagem do animal vivo usando BLI. O p/s/cm2/sr representa fotons/seg/cm2/esteradiano.
A Figura 20 mostra a quantificagao de sinais de lumines-
cencia gerados pelos tumores E.G7 na Figura 19. (□) para ο camundon- go # 2; (·) para ο camundongo # 3; (▲) para ο camundongo # 4.
A Figura 21 ilustra a porcentagem de celulas T OVA especi- ficas presentes apos imunizagao com 100 χ IO6 TU de FOVA/ SVGmu na cepa albina dos camundongos B6. Os camundongos B6 albinos foram imunizados de forma sub-cutanea com 50 χ IO6 TU de FOVA/SVGmu. Camundongos sem imunizagao (nao imun.) foram incluidos como controle negativo. Quatorze dias pos-imunizagao, as celulas do bago foram coletadas e analisadas quanto a presenga de celulas T OVA especiflcas medidas pelo tetramero H-2Kb-SIINFEKL-PE e tingimento CD44. As porcentagens indicadas estao em porcentagem do total de celulas T CD8+.
A Figura 22A proporciona uma representagao esquematica de lentivetor DC direcionado codificando um gene imagem de luciferase de vaga-lume (Luc), designado como Fluc/SVGmu.
A Figura 22B ilustra a imagem de bioluminescencia de ca- mundongos injetados de forma sub-cutanea com 50 χ IO6 TU seja de lentivetor Fluc/ SVGmu DC direcionador (mostrado na Figura 25A) ou um lentivetor Fluc/VSVG nao direcionador. A imagem representativa foi obtida no dia 30 pos-injegao usando IVIS200® (Xenogenio).
A Figura 23 ilustra que a administragao de uma dose iinica de lentivetor FOVA/SVGmu DC especifico recombinante pode gerar celulas IFN-y+CD8+ em camundongos B6. Camundongos B6 nao toca- dos sao imunizados por injegao sub-cutanea de 50 χ IO6 TU de lentive- tor FOVA/SVGmu ou a mesma dose de FUGW/SVGmu como um controle. Os camundongos B6 nao imunizados (nao imun.) foram incluidos como um controle negativo. Duas semanas depois, celulas do bago foram coletadas dos camundongos experimentais e foram analisa- das quanto a produgao IFN-γ intracellular usando citometria de fluxo com ou sem re-estimulagao do peptideo OVAp. As porcentagens indi- cadas sao as porcentagens de celulas T IFN-y+CD8+ do total de celulas T CD8+.
A Figura 24 ilustra uma representagao esquematica de construtos lentivirais para a preparagao de virus recombinante DC direcionadores.
A Figura 25 mostra uma representagao esquematica de uma realizagao de vacinagao in situ contra HIV/AIDS.
Descri9ao Detalhada da Modalidade Preferida
A engenharia genetica tem se mostrado ser um meio eflcien- te e potente para converter celulas dendriticas (DCs) em celulas imuno especiais para induzir resposta imunos antigeno especificas. Uma grande quantidade de pesquisas envolvendo manipulagao in vitro para as DCs para vacinagao/ imunizagao contra ο cancer, HIV e outras doengas tem sido conduzidas. Todavia, ate agora, nao tem sido possivel liberagaor especiflcamente e eficientemente um gene de interesse, tal como um gene codificando um antigeno, a celulas dendriticas in vitro e in vivo. Os inventores tem descoberto novos metodos e composigoes eficientes e alvo-dirigidas especificas de DCs in vitro e in vivo. Os meto- dos e as composig5es podem ser usados para induzir respostas imuno especificas de antigenos, por exemplo, para a imunoterapia.
As modalidades da invengao incluem metodos e composi- g5es para celulas dendriticas direcionadoras (DCs) pelo uso de um virus recombinante para liberagaor um polinucleotideo as DCs. Isto e prefe- rivelmente efetuado atraves do direcionamento da molecula de superfi- cie DC-SIGN especifica de DC (Celula Dendritica Especifica ICAM-3 (Moleculas de Adesao Intracelular-3)-se prendendo a nao integrina; tambem conhecida como CD209). A DC-SIGN e um receptor tipo lectina tipo C capaz de rapida ligagao e endocitose de materials (Geijtenbeek, T.B. e colaboradores, 2004, Annu. Ver. Immunol, 22:33-54，que e aqui incorporado neste document。por referenda em sua totalidade). Em modalidades especificas, virus recombinantes sao envelopados com uma molecula direcionadora projetada que e especifica em seu reconhe- cimento pela DC-SIGN. O polinucleotideo pode incluir, mas nao esta limitado a um gene de interesse, siRNA(s) e/ou microRNA(s). Em modalidades preferidas, ο polinucleotideo codifica um antigeno. Em algumas modalidades, ο virus recombinante liberagao mais do que um gene as DCs. Por exemplo, genes codificando dois ou mais antigenos poderiam ser liberados. A liberagao de mais de um gene pode ser alcan- gada, por exemplo, ao ligar os genes com um Local de Entrada Interno no Ribossomo (IRES) e/ou com seqiiencias 2A e direcionando a expres-
sao usando um promo tor / aumentador ύηΐοο. Como discutido em mais detalhes abaixo, modalidades da invengao sao baseadas no uso de virus recombinantes, tais como lentivirus e gamaretrovirus, porque estes virus sao capazes de incorpo- rar sem seus envelopes um grande niimero de proteinas, sao encontra- dos na superficie de celulas produtoras de virus. Todavia, como tambem discutido abaixo, outros tipos de virus podem ser usados e os metodos modificados de acordo. Geralmente, uma linhagem de celula de empa- cotamento e transfectada com um vetor viral codificando um polinucleo- tideo de interesse (tipicamente codificando um antigeno), pelo menos um plasmideo codificando componentes de empacotamento de virus (tais como gag e pol) e uma molecula direcionadora que e projetada para se ligar a celulas dendriticas. Em modalidades preferidas, a molecula direcionadora e geneticamente projetada para especificamente se ligar ao marcador de superficie de celula DC-SIGN de celulas dendriticas. Durante ο enxerto do virus, a molecula direcionadora, a qual e expressa na membrana da celula de empacotamento, e incorporada no envelope viral. Como resultado, as particulas retro virais compreendem um niicleo incluindo ο polinucleotideo de interesse e um envelope compre- endendo a molecula direcionadora em sua superficie.
A molecula direcionadora e capaz de se ligar a DC-SIGN em
uma celula dendritica e ο virus e capaz de liber ο gene de interesse para a celula dendritica. Sem desejar ficar limitado a teoria, acredita-se que a ligagao induz a endocitose, trazendo ο virus para dentro de um endos- soma, disparando a fusao da membrana e permitindo ο niicleo do virus de entrar no citosol. Seguindo a transcrigao reversa e migragao do produto para ο niicleo, ο genoma do virus integra-se no genoma da celula alvo, incorporando ο polinucleotideo de interesse no genoma da celula alvo. A DC, entao, expressa ο polinucleotideo de interesse (tipi- camente codificando um antigeno).,O antigeno e, entao, processado e apresentado as celulas TeB pelas DCs, gerando uma resposta imuno
antigeno especifica. O caminho especifico descrito acima nao e requeri- do desde que a celula dendritica seja capaz de estimular uma resposta imuno antigeno especiflca.
Modalidades da presente invengao incluem metodos e com- posigoes para direcionamento direto de um gene de interesse as DCs ambos in vitro e in vivo. Em algumas modalidades preferidas in vivo, ο gene de interesse e liberado as DCs sem cultura in vitro das DCs. Por exemplo, ο gene de interesse pode ser liberado as DCs via uma adminis- tragao direta do virus direcionador em um sujeito vivo. O gene de interesse preferivelmente codiilca um antigeno contra ο qual uma resposta imuno e desejada. Antigenos exemplares incluem: antigenos de tumores especiilcos, antigenos associados a tumores, antigenos especi- flcos de tecidos, antigenos bacteriais, antigenos virais, antigenos de leveduras, antigenos de fungos, antigenos de protozoarios, antigenos de parasitas, mitogenos e semelhantes. Outros antigenos serao aparentes para uma pessoa versada na tecnica e podem ser utilizados sem expe- rimentagao indevida.
Os metodos revelados aqui neste documento podem ser prontamente adotados para utilizar moleculas direcionadoras que sao especiflcas para DCs ou que podem ser manipuladas para fornecer a especiflcidade desejada. A molecula direcionadora e preferivelmente uma glicoproteina viral projetada que se Iiga a DC-SIGN em celulas dendriticas e que facilita a liberagao do gene de interesse nas celulas dendriticas. Moleculas direcionadoras exemplares incluem, mas nao estao limitadas, a glicoproteinas derivadas dos seguintes: virus Sindbis, virus influenza, virus da febre de Lassa, virus da encefalite transmitido por carrapatos, virus da dengue, virus da hepatite B, virus Rabies, virus Semliki Forest, virus Ross River, virus Aura, virus da doenga de Borna, virus Hantaan e virus SARS-CoV. A molecula direcionadora e preferi- velmente ligada a membrana. Se necessario, a molecula direcionadora DC-SIGN especiflca que e designada ou derivada de uma glicoproteina viral para uso em um virus recombinante pode ser modiflcada para uma forma de ligagao de membrana.
Qualquer metodo conhecido na tecnica pode ser usado para projetar a molecula direcionadora para fornecer a especificidade deseja- da. Os metodos exempliflcativos incluem, mas, sem limitagao, a enge- nharia de proteina racional e embaralhamento de DNA. Geralmente, para projetar uma molecula direcionadora especiilca para as DCs, e proporcionada uma glicoproteina viral que interage com um marcador de superficie especifico da celula dendritica. De preferencia, a glicopro- teina viral interage com a DC-SIGN. A glicoproteina viral pode tambem interagir com pelo menos um segundo marcador de superficie celular tal como, por exemplo, sulfato de heparina (HS), que e expressa em outras celulas que nao as DCs. A glicoproteina viral e modificada de forma que sua habilidade de interagir com ο marcador de superficie DC especifico e mantida enquanto sua habilidade de interagir com marca- dores celulares adicionais e diminuida ou eliminada. A modificagao pode ser uma mutagao em pelo menos um residuo da sequencia de aminoacido da glicoproteina viral. A mutagao pode ser uma delegao, adigao ou substituigao do residuo e ela pode ser levada a termo por metodos padrdes conhecidos na tecnica. A especificidade desejada pode ser prontamente confirmada. Por exemplo, uma vez que a glicoproteina viral seja modificada, ela pode ser usada para preparar um virus re- combinante por co-transfecgao com um vetor viral contendo um gene relator e pelo menos um plasmideo codificando componentes de empa- cotamento do virus em uma linhagem de celulas de empacotamento. A glicoproteina e incorporada no envelope viral durante enxerto do virus. O virus pode ser usada para transfectar ambas uma populagao pura de DCs bem como uma populagao mista de celulas contendo DCs e a especificidade da transdugao viral das DCs pode ser confirmada testan- do as celulas para expressao do gene relator nas DCs e nao em uma extensao signiflcativa em outros tipos de celulas. Se a especificidade nao e suflcientemente rigorosa (por exemplo, se niveis indesejados de infecgao de outros tipos de celulas e observado), a glicoproteina viral pode ser modificada ainda mais e testada como descrito ate que a especificidade desejada seja alcangada.
As modalidades da presente invengao incluem a liberagao as DCs de ativadores e/ou fatores de maturagao de DC em conjunto com antigenos. Ativadores e fatores de maturagao de DC exemplares incluem, mas, sem limitagao, a moleculas de estimulagao, citocinas, quimiocinas, anticorpos e outros agentes tais como os ligantes Fit-3. Por exemplo，os fatores de maturagao de DC podem incluir pelo menos um dos seguintes: GM-CSF, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15，IL-21, IL-23, TNF-α, B7.1，B7.2, 4-1BB, ligante CD40 (CD40L) e CD40 droga indutor (iCD40) (Hanks, e colaboradores, 2005，Nat. Med. 11:130-137，ο qual e aqui incorporado neste documento por referencia em sua totalidade).
As modalidades da presente invengao tambem podem inclu- ir metodos e composig5es relacionados a administragao de virus recom- binante como descrito acima ou DCs infectadas com virus recombinan- te em pacientes para estimular respostas imunos antigeno especificas, tais como, por exemplo, respostas de celulas T (respostas imuno celula- res) e respostas de celulas B (respostas imunos humorais). Por exemplo, celulas T CD4 ativadas podem coordenar e orquestrar celulas T citotoxi- cas CD8+ e as celulas B em uma resposta antigeno especiilca. Em modalidades preferidas, ο virus recombinante e/ou DCs infectadas com virus recombinantes sao usados para estimular respostas imunos para a prevengao e tratamento de doengas tais como, mas nao limitadas, ao cancer e AIDS/HIV. Qualquer doenga pode ser tratada para a qual uma resposta imuno a um antigeno em particular e benefica, incluindo, mas nao limitada, a doenga neoplastica, doengas infecciosa e doengas relacionadas a imunidade.
Com aqui descrito neste documento, foram conduzidos es- tudos que resultaram na descoberta de metodos e composigdes que podem ser usados para direcionar virus recombinantes a fornecer genes codiflcando antigenos particulares em DCs. A modiflcagao genetica das DCs de forma a extrair respostas imunos produtivas pode ser usada na prevengao e tratamento de doengas e fornece um metodo efetivo de induzir imunidade em celulas T efetiva bem como forte produgao de anticorpos. Os metodos e composig5es descritos aqui neste documento podem fornecer potentes meios para a imunizagao com antigenos desejados. Tal imunizagao pode prevenir e tratar doengas tais como, por exemplo, cancer e AIDS/HIV.
Definigdes
A menos que de outra forma deflnido, os termos tecnicos e cientificos usados aqui neste documento tem ο mesmo signiflcado como comumente compreendido por uma pessoa versada na tecnica ao qual esta invengao pertence. Veja, por exemplo, Singleton e colaboradores, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2a ed·，J. Wiley & Sons (New York, NY 1994); Sambrook e colaboradores, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, NY, 1989). Quaisquer metodos, dispositivos e materials similares ou equivalentes aqueles descritos aqui neste documento podem ser usados na pratica desta invengao.
Com aqui usado neste documento, os termos acido nuclei- co, polinucleotideo e nucleotideo sao intercambiaveis e referem-se a qualquer acido nucleico, se composto de liga?5es fosfodiesteres ou ligag5es modiflcadas tais como fosfotriester, fosforamidato, siloxano, carbonato, carboximetilester, acetamidato, carbamato, tioeter, fosfora- midato em ponte, metileno fosfonato em ponte，fosforamidato em ponte, fosforotioato, metilfosfonato, fosforoditioato, fosforotioato em ponte ou ligagdes sulfonas e combinagoes de tais ligagdes.
Os termos acido nucleico, polinucleotideo e nucleotideo in- cluem tambem especificamente acidos nucleicos compostos de bases outras que as cinco bases que ocorrem biologicamente (adenina, guani- na, timina, citosina e uracila).
Como aqui usado neste document。，uma molecula de acido nucleico e dita ser "isolada" quando a molecula de acido nucleico e substancialmente separada de moleculas de acido nucleico contami- nantes codificando outros polipeptideos.
"Imunizagao" refere-se a provisao de antigen。a um hospe- deiro. Em algumas modalidades, e proporcionado ο antigeno a celulas que apresentam antigeno, tais como as celulas dendriticas. Como descrito abaixo, ο virus recombinante compreendendo um gene codifi- cando um antigeno pode ser direcionado a celulas dendriticas com uma molecula de aflnidade especifica para a DC-SIGN nas celulas dendriti- cas. Assim, ο antigeno para ο qual uma resposta imuno e desejada pode ser liberado as celulas dendriticas. Outros metodos de imunizagao sao bem conhecidos na tecnica.
O termo resposta "imunologica" ou "imuno" e ο desenvolvi- mento de uma resposta humoral (mediada por anticorpo) e/ou celular (mediada por celulas T antigeno especificas ou seus produtos de secre- ς§.ο) benefica direcionada contra um peptideo amiloide em um paciente recipiente. Essa resposta pode ser uma resposta ativa induzida pela administragao de imunogeno ou uma resposta passiva induzida pela administragao de anticorpo ou celulas T condicionadas. Uma resposta imuno celular e induzida pela apresentagao de epitopes de polipeptideo em associagao com moleculas MHC da Classe I ou Classe II para ativar celulas T auxiliares CD4+ e/ou celulas T citotoxicas CD8+. A resposta pode tambem envolver a ativagao de monocitos, macrofagos, celulas NK, basofilos, celulas dendriticas, astrocitos, celulas microglias, eosinofllos ou outros componentes da imunidade inata. A presenga de uma res- posta imunologica mediada pela celula pode ser determinada por testes de proliferagao (celulas T CD4+) ou testes CTL (linfocito T citotoxico) (Burke e colaboradores, J. Inf. Dis., 170，1110-19 (1994)), por morte dependente do antigeno (teste de linfocito T citotoxico, Tigges e colabo- radores, J. Immunol, 156，3901-3910) ou por secregao de citocina. As contribuigdes relativas das respostas humoral e celular ao efeito prote- tor ou terapeutico de um imunogeno podem ser distinguidas ao isola- damente separar celulas T e IgG de um animal singeneico imunizado e medindo ο efeito protetor ou terapeutico em um segundo sujeito.
Um "agente imunogenico" ou "imunogeno" e capaz de indu- zir uma resposta imunologica contra ele mesmo na administragao a um paciente, opcionalmente em conjunto com um adjuvante.
O termo "adjuvante" se refere a um composto que quando administrado em conjunto com um antigeno aumenta, melhora e/ou implementa a resposta imuno para ο antigeno, mas quando adminis- trado sozinho nao gera uma resposta imuno para ο antigeno. Um adjuvante pode ser administrado com ο virus recombinante da invengao como uma composigao iinica ou pode ser administrado antes, concor- rentemente com ou apos a administragao do virus recombinante da invengao. Adjuvantes podem aumentar uma resposta imuno por diver- sos mecanismos incluindo recrutamento de linfocito, estimulagao de celulas B e/ou T e estimulagao de macrofagos.
"Anticorpos" (Abs) e "imunoglobulinas" (Igs) sao glicoprotei- nas tendo as mesmas caracteristicas estruturais. Enquanto os anticor- pos exibem especificidade de ligagao a um antigeno especifico, as imunoglobulinas incluem ambos os anticorpos e outras moleculas semelhantes a anticorpos que nao possuem especificidade a um antige- no. Os polipeptideos do Ultimo tipo sao, por exemplo, produzidos em baixos niveis pelo sistema linfatico e em niveis aumentados pelo mielo- mas. O termo “anticorpo” e usado em seu sentido mais amplo e especificamente cobre anticorpos humanos, nao humanos (por exemplo, murinos), quimericos e anticorpos monoclonais humanizados (incluindo anticorpos monoclonais completos), anticorpos policlonais, anticorpos multi-especiflcos (por exemplo, anticorpos bi-especificos), anticorpos de cadeia simples e fragmentos de anticorpos desde que eles exibam a atividade biologica desejada. Tipicamente, os fragmentos competem com ο anticorpo intacto do qual eles foram derivados para ligagao especifica a um antigeno.
O termo "epitope" ou “determinante antigenico" se refere a
um local em um antigeno ao qual as celulas B e/ou T respondem. Os epitopes de celulas B podem ser formados de ambos os aminoacidos contiguos ou aminoacidos nao contiguos justapostos pela estrutura terciaria de uma proteina. Os epitopes formados de aminoacidos contiguos sao tipicamente retidos na exposigao a solventes desnaturan- tes enquanto epitopes formados pelo enovelamento terciario sao tipica- mente perdidos no tratamento com solventes desnaturantes. Um epito- pe tipicamente inclui pelo menos 3 e mais usualmente, pelo menos 5 ou 8-10 aminoacidos em uma conformagao especial iinica. Metodos de determinagao da conformagao espacial de epitopes incluem, por exem- plo, cristalografia de raio-X e ressonancia magnetica nuclear bi- dimensional. Veja, por exemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, vol. 66, Glenn E. Morris, Ed. (1996). Anticorpos que reconhecem ο mesmo epitope podem ser identiilcados em um imuno teste simples mostrando a habilidade de um anticorpo de bloquear a ligagao de outro anticorpo a um antigeno alvo. As celulas T reconhecem epitopes continuos de cerca de nove aminoacidos para celulas CD8 ou cerca de 13-15 aminoacidos para celulas CD4. As celulas T que reco- nhecem ο epitope podem ser identiflcadas por testes in vitro que medem a proliferagao antigeno dependente, como determinado pela incorpora-
gao de 3H-timidina por celulas T condicionadas em resposta a um epitope (ver Burke, supra·, Tigges, supra).
"Celulas alvo" sao quaisquer celulas para as quais a libera- gao de um polinucleotideo ou nas quais a expressao de um gene de interesse e desejada. Preferivelmente, celulas alvo sao celulas dendriti- cas, particularmente celulas dendriticas que expressam a DC-SIGN.
O termo "mamifero" e definido como um individuo perten- cendo a classe Mammalia e inclui, sem limitagao, pessoas humanas, animais domesticos e de fazenda e animais de zoologico, esportes e animais de estimagao, tais como ovelhas, cachorros, cavalos, gatos e vacas.
O termo “sujeito，，ou "paciente" inclui sujeitos humanos e outros mamiferos que recebem seja ο tratamento profilatico ou terapeu- tico.
Como aqui usado neste documento, "tratamento" e uma in- tervengao clinica que pode ser terapeutica ou profilatica. Em aplicag5es terapeuticas, composig5es farmaceuticas ou medicamentos sao admi- nistrados a um paciente suspeito, ou ja sofrendo de tal doenga em uma quantidade suflciente para curar ou pelo menos parcialmente parar os sintomas da doenga e suas complicag5es. Em aplicag5es profilaticas, composig5es farmaceuticas ou medicamentos sao administrados a um paciente suscetivel de, ou de outra forma em risco de, uma doenga particular em uma quantidade suficiente para eliminar ou reduzir ο risco ou atrasar ο inicio da doenga. Uma quantidade adequada para efetuar isto e definida como uma dose efetiva terapeuticamente ou farmaceuticamente. Essa quantidade pode ser administrada com uma dose iinica ou pode ser administrada de acordo com um regime, por meio do qual ela e efetiva. A quantidade pode curar uma doen?a, mas, tipicamente, e administrada de forma a melhorar os sintomas de uma doenga ou afetar a profilaxia de uma doenga ou desordem de se desen- volver. Em ambos os regimes terapeutico e profllatico, os agentes sao usualmente administrados em diversas dosagens ate que uma resposta imuno suflciente tenha sido alcangada. Tipicamente, a resposta imuno e monitorada e repetidas dosagens sao dadas se a resposta imuno comega a enfraquecer. O "tratamento" nao precisa eliminar completa- mente a doenga, nem precisa prevenir completamente que um sujeito ilque doente com a doenga ou desordem.
"Tumor", como aqui usado neste documento, se refere a to- do crescimento e proliferagao celular neo-plastico, se maligno ou benig- no e todas as celulas pre-cancerosas e celulas e tecidos cancerosos.
O termo "cancer" se refere a uma doenga ou desordem que e caracterizada pelo crescimento celular desregulado. Exemplos de cancer incluem, mas, sem limitagao, a carcinoma, linfoma, blastoma e sarco- ma. Exemplos de canceres especiflcos incluem, mas, sem limitagao, a cancer do pulmao, cancer do colo, cancer do seio, cancer testicular, cancer do estomago, cancer pancreatico, cancer ovariano, cancer do figado, cancer de bexiga, cancer colo-retal e cancer de prostata. Cance- res adicionais sao bem conhecidos por aqueles versados na tecnica e incluem, mas, sem limitagao, a leucemia, linfoma, cancer cervical, tumores de glioma, adenocarcinomas e cancer de pele. Canceres exem- plares incluem, mas, sem limitagao, a tumor na bexiga, tumor no seio, tumor na prostata, carcinoma celular basal, cancer do trato biliar, cancer de bexiga, cancer de osso, cancer no cerebro e CNS (por exem- plo, tumor de glioma), cancer cervical, coriocarcinoma, cancer do colo e re to, cancer do tecido conectivo, cancer do sistema digestivo, cancer endometrial, cancer do esofago, cancer do olho, cancer da cabega e pescogo, cancer gastrico, neoplasma intraepitelial, cancer de rim, cancer de laringe, leucemia, cancer do figado, cancer do pulmao (por exemplo, celulas pequenas e celulas nao pequenas), linfoma, incluindo linfoma de Hodgkin e nao Hodgkin, melanoma, mieloma, neuroblasto- ma, cancer da cavidade oral (por exemplo, labio, lingua, boca e faringe), cancer no ovario, cancer no pancreas, retinoblastoma, rabdomiossar- coma, cancer retal, cancer renal, cancer do sistema respiratorio, sarco- ma, cancer de pele, cancer do estomago, cancer dos testiculos, cancer da tireoide, cancer uterino, cancer do sistema urinario, bem como outros carcinomas e sarcomas. O cancer tambem inclui neoplasias e desordens malignas em mamiferos que sao bem conhecidas da tecnica.
Um "vetor" e um acido nucleico que e capaz de transportar outro acido nucleico. Os vetores podem ser，por exemplo, plasmideos, cosmideos ou fagos. Um "vetor expressao" e um vetor que e capaz de direcionar a expressao de uma proteina ou proteinas codificadas por um ou mais genes carregados pelo vetor quando ele esta presente no ambiente apropriado.
Os termos "elemento regulatorio" e "elemento de controle de expressao" sao usados de forma intercambiavel e se referem a molecu- las de acido nucleicos que podem influenciar a transcrigao e/ou trans- lagao de uma seqiiencia codificadora ligada operacionalmente em um ambiente particular. Estes termos sao usados largamente e cobrem todos os elementos que promovem ou regulam a transcrigao, incluindo promotores, elementos niicleos requeridos para a interagao basica da RNA polimerase e fatores de transcrigao, elementos a montante, aumen- tadores e elementos de resposta (ver, por exemplo, Lwein, “Genes V” (Oxford University Press, Oxford) paginas 847-873). Elementos regula- torio s exemplares em procariotas incluem promotores, sequencias operadoras e locais de ligagao de ribossomo. Elementos regulatorios que sao usados em celulas eucarioticas podem incluir, sem limitagao, promotores, aumentadores, sinais de "splicing" e sinais de poliadenila- gao.
O termo "transfecgao" se refere a introdugao de um acido nucleico em uma celula hospedeira. "Retrovirus" sao virus tendo um genoma de RNA.
"Lentivirus" se refere a um genero de retrovirus que sao ca- pazes de infectar celulas que se dividem e que nao se dividem. Diversos exemplos de lentivirus incluem HIV (virus da imunodeilciencia humana: incluindo HIV tipo 1 e HIV tipo 2)，ο agente etiologico da sindrome da imunodeficiencia adquirida humana (AIDS); visna-maedi, que causa encefalite (visna) ou pneumonia (maedi) em ovelhas, ο virus da encefali- te-artrite caprina, que causa deficiencia imuno, artrite e encefalopatia em bodes, virus da anemia infecciosa equina, que causa anemia hemoli- tica auto-imuno e encefalopatia em cavalos, virus da imunodeficiencia felina (FIV), que causa deficiencia imuno em gatos, virus da deficiencia imuno bovina (BIV), que causa linfadenopatia, linfocitose e possivel- mente infecgao no sistema nervoso central no gado e virus da imuno deficiencia simiana (SIV), que causa deficiencia imuno e encefalopatia em primatas sub-humanos.
Um genoma lentiviral e geralmente organizado em um ter- minal repetido longo 5’（LTR)，ο gene gag, ο gene pol, ο gene env, os genes acessorios (nef, vif, vpr, vpu) e um LTR 3，· O LTR viral e dividido em tres regi5es chamadas U3, R e U5. A regiao U3 contem os elementos aumentadores e promo tores. A regiao U5 contem os sinais de poliadeni- lagao. A regiao R (repetido) separa as regi5es U3 e U5 e seqiiencias transcritas da regiao R aparecem em ambas as extremidades 5，e 3，do RNA viral. Veja, por exemplo, "RNA Viruses: A Practical Approachf (Alan J. Cann., Ed, Oxford University Press, (2000)), O Narayan e Clements J. Gen. Virology 70:1617-1639 (1989), Fields e colaboradores, Fundamen- tal Virology Raven Press., (1990)，Miyoshi H., Blomer U., Takahashi, M.， Gage, F.H., Verma I.M., J. Virol, 72(10):8150-7, (1998) e Patente US 6.013.516.
"Gamaretrovirus" refere-se a um genero de uma familia de retrovirus. Gamaretrovirus exemplares incluem, mas, sem limitagao, a virus de celula tronco de camundongo, virus de leucemia de murino， virus de leucemia felino, virus de sarcoma felino e virus reticuloendote- liose aviario.
Um "virus hibrido" como aqui usado neste documento refe- re-se a um virus tendo componentes de um ou mais outros vetores virais, incluindo element。de vetores nao retrovirais, por exemplo, hibridos adenoviral-retroviral. Como aqui usado neste documento vetores hibridos tendo um componente retro viral sao para serem considerados dentro do escopo dos retrovirus.
"Virion", "particula viral" e "particula retro viral" sao usados
aqui neste documento para se referir a um virus iinico compreendendo um genoma de RNA, proteinas derivadas de genes pol, proteinas deriva- das de genes gag e uma camada dupla de lipideo mostrando uma (glico) proteina de envelope. O genoma de RNA e usualmente um genoma de RNA recombinante e assim pode conter uma seqiiencia de RNA que e exogena ao genoma viral nativo. O genoma de RNA pode tambem com- preender uma seqiiencia viral endogena defeituosa.
Um retrovirus "pseudotipado" e uma particula retro viral tendo uma proteina de envelope que e de um virus diferente do virus do qual ο genoma de RNA e derivado. A proteina de envelope pode ser, por exemplo, e sem limitagao, de um retrovirus diferente ou de uma origem nao retro viral. A proteina de envelope pode ser uma proteina de enve- lope nativa ou uma proteina d envelope que e modiflcada, que sofreu mutagao ou projetada como descrita aqui neste documento. Em algu- mas modalidades, uma proteina de envelope e uma glicoproteina viral DC-SIGN especiflca que e derivada de uma glicoproteina de uma dos seguintes: virus Sindbis, virus influenza, virus da febre de Lassa, virus da encefalite transmitido por carrapatos, virus da dengue, virus da hepatite B, virus Rabies, virus Semliki Forest, virus Ross River, virus
Aura, virus da doenga de Borna, virus Hantaan e virus SARS-CoV. "Transformagao", como aqui definido, descreve um processo pelo qual ο DNA exogeno entra em uma celula alvo. A transformagao pode repousar em qualquer metodo conhecido para a insergao de seqiiencias de acido nucleico estranhas em uma celula hospedeira procariotica ou eucariotica e pode incluir, mas nao esta limitado a, infecgao viral, eletroporagao, choque por calor, lipofecgao e bombarde- amento de particula. Celulas "transformadas" incluem celulas trans- formadas estaveis na quais ο acido nucleico inserido e capaz de replica- gao mesmo como um plasmideo replicante de forma autonoma ou como parte de um cromossomo hospedeiro. Tambem incluidas sao celulas que de forma transiente expressam um gene de interesse.
Uma molecula "fusogenica", como aqui descrita neste do- cumento, e qualquer molecula que pode disparar a fusao da membrana quando presente na superficie de um virus e permite um niicleo do virus de passar atraves da membrana e, tipicamente, entrar no citosol de uma celula alvo. Moleculas fusogenicas podem ser, por exemplo, glicoproteinas virais. Glicoproteinas virais exemplares contempladas como moleculas fusogenicas incluem, mas, sem limitagao, hemaglutini- na, hemaglutinina mutante, glicoproteinas SIN e viral dos seguintes virus: virus Sindbis, virus influenza, virus da febre de Lassa, virus da encefalite transmitido por carrapatos, virus da dengue, virus da hepati- te B, virus Rabies, virus Semliki Forest, virus Ross River, virus Aura, virus da doenga de Borna, virus Hantaan e virus SARS-CoV. Glicoprote- inas podem ser nativas ou modiflcadas para ter a atividade desejada.
Por "transgene" entende-se qualquer sequencia de nucleoti-
deo, particularmente uma sequencia de DNA, que e integrada em um ou mais cromossomos de uma celula hospedeira por intervengao humana, tal como por metodos da presente invengao. O transgene preferivelmen- te compreende um “gene de interesse".
Um "gene de interesse" nao e limitado de qualquer modo e pode ser qualquer acido nucleico, sem limitagao, que e desejado ser liberado, integrado, transcrito, traduzido e/ou expresso em uma celula alvo. O gene de interesse pode codificar um produto funcional, tal como uma proteina ou uma molecula de RNA. Preferivelmente ο gene de interesse codiflca uma proteina ou outra molecula, a expressao da qual e desejada na celula alvo. O gene de interesse e geralmente ligado operacionalmente a outras seqiiencias que sao iiteis para obter a expressao desejada do gene de interesse, tal como seqiiencias regulato- rias transcricionais. Em algumas modalidades um gene de interesse e preferivelmente um que codifica um antigeno para ο qual uma resposta imuno e desejada. Outros genes de interesse que podem ser usados em algumas modalidades sao genes que codiilcam ativadores e/ou fatores de maturagao de celula dendritica.
Um "relacionamento funcional" e “ligado operacionalmente" signiflca, com respeito ao gene de interesse, que ο gene esta na localiza- ςάο e orientagao corretas com respeito ao promotor e/ou aumentador que a expressao do gene sera afetada quando ο promotor e/ou aumen- tador e contatado com as moleculas apropriadas.
“Seqiiencias 2A" ou elementos sao peptideos pequenos in- troduzidos como um ligante entre duas proteinas, permitindo ο auto- processamento intraribossomal autonomo de poliproteinas (de Felipe, Genetic Vaccines and Ther., 2:13 (2004); de Felipe e colaboradores, Traffic, 5:616-626， (2004)). Os peptideos curtos permitem a co- expressao de mialtiplas proteinas a partir de um vetor iinico, tal como co-expressao de uma molecula fusogenica e molecula de afinidade a partir de um mesmo vetor. Assim, em algumas modalidades, polinucleo- tideos codiflcando os elementos 2A sao incorporados em um vetor entre polinucleotideos codiflcando proteinas a serem expressas.
"Fatores de maturagao de DC" (tambem conhecido como "a- tivadores de DC") sao compostos que podem induzir a ativagao ou estimulagao de DCs de forma que as DCs facilitam a agao de extragao de respostas imunos celular e humoral. Fatores de maturagao de DC tipicos sao conhecidos na tecnica e incluem, mas, sem limitagao, mole- culas de estimulagao, citocinas, quimiocinas, anticorpos e outros agentes tais como ligantes Fit-3 (Figdor, C.G. e colaboradores, 2004， Nat. Med., 10:475-480; Pulendran, B. e colaboradores, 2000 J. Immu- nol, 165:566-572; Maraskovsky, E. e colaboradores, 2000, Blood, 96:878-884，cada um dos quais e aqui incorporado neste document。 em sua totalidade). Fatores de maturagao de DC exemplares podem incluir, mas, sem limitagao, GM-CSF, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15，IL-21, IL-23, TNF-α, B7.1, B7.2, 4-IBB, ligante CD40 (CD40L) e CD40 droga indutor (iCD40).
Moleculas Direcionadoras
Como discutido acima，uma molecula direcionadora e in- corporada em um virus recombinante para direcionar ο virus as celulas dendriticas que expressam a DC-SIGN. A molecula direcionadora preferivelmente tambem media a fusao com a membrana da celula e eflciente transdugao e liberagao do(s) polinucleotideo(s) desejado(s) na celula dendritica. Assim, a molecula direcionadora e tipicamente uma molecula fusogenica (FM) com a desejada especiilcidade de ligagao. A molecula direcionadora e modificada, se necessario, de forma que ela se Iiga a DC-SIGN em celulas dendriticas. Em algumas modalidades, a molecula direcionadora especificamente se Iiga a DC-SIGN. Isto e, a molecula direcionadora preferencialmente direciona ο virus recombi- nante para as celulas dendriticas que expressam a DC-SIGN em relagao aos outros tipos de celulas. Assim, em algumas modalidades, moleculas direcionadoras sao criadas pela eliminagao da habilidade de uma FM de se ligar a outros alvos, tais como hemaglutinina, enquanto retem a habilidade de se ligar a DC-SIGN. Em outras modalidades, a molecula direcionadora pode ser modificada para eliminar a especiilcidade de
ligagao nativa a moleculas nao DC-SIGN e componentes da mesma e adicionar ou melhorar a especificidade de ligagao a DC-SIGN. Enquanto algumas ligagdes nao especiflcas a outras moleculas, e assim a outros tipos de celulas, podem ocorrer mesmo se a molecula direcionadora e especiflca para a DC-SIGN, moleculas direcionadoras sao modificadas para ter suficiente especificidade para evitar efeitos colaterais indeseja- dos, tais como efeitos colaterais que possam reduzir a resposta imuno desejada.
As moleculas direcionadoras sao geralmente moleculas que sao capazes de pseudotipagem e assim serem incorporadas no envelope de virus recombinante, celulas dendriticas alvo e, sob as condigdes apropriadas, induzir a fusao da membrana e permitir a entrada de um gene de interesse para as celulas dendriticas. Moleculas direcionadoras preferidas sao glicoproteinas virais. Alem disso, moleculas direcionado- ras sao preferivelmente resistentes a ultra centrifugagao para permitir a concentragao, ο que pode ser importante para liberagao de gene in vivo.
As moleculas direcionadoras preferivelmente induzem a fu- sao de membranas em baixo pH, independentemente de ligagao. Assim, em modalidades preferidas, a fusao da membrana induzida pela mole- cula direcionadora ocorre uma vez que ο virus compreendendo a mole- cula direcionadora esta dentro do endossoma de uma celula alvo e ο componente micleo viral, incluindo um polinucleotideo de interesse, e liberado para ο citosol.
Em algumas modalidades, uma sequencia de identificagao e incorporada em uma molecula direcionadora para permitir a detec9ao da expressao da molecula direcionadora e a presenga da molecula direcionadora nas particulas virais.
Existem duas classes reconhecidas de fusogenos virais e ambos podem ser usados como moleculas direcionadoras (D.S. Dimi- trov, Nature Rev.. Microbio., 2，109 (2004)). Os fusogenos da classe I disparam a fusao da membrana usando estruturas de rolo em espiral helicoidais enquanto os fusogenos da classe II disparam a fusao com barris β. Estas duas estruturas tem diferentes mecanismos e cineticas (D.S. Dimitrov, Nature Rev. Microbio., 2，109 (2004)). Em algumas modalidades, os fusogenos de classe I sao usados. Em outras modali- dades, fusogenos da classe II sao usados. Ainda noutras modalidades, ambos os fusogenos da classe I e classe II sao usados.
Alguns exemplos nao limitantes de glicoproteinas de super- ficie que podem ser usadas como moleculas direcionadoras (ou como moleculas fusogenicas em modalidades onde a ligagao viral e fungoes de fusao sao separadas), seja no tipo original ou na forma modiflcada, incluem glicoproteinas de alfavirus, tais como virus Semliki Forest (SFV), virus Ross River (RRV) e virus Aura (AV), que compreendem glicoproteinas de superficie tais como El, E2 e E3. A glicoproteinas E2 derivada do virus Sindbis (SIN) e a hemaglutinina (HA) do virus influen- za sao glicoproteinas nao virais que especificamente se ligam a molecu- las particulares nas superficies das celulas (sulfato de heparina glico- saminoglicano para E2, acido sialico para HA) e podem ser usadas para criar moleculas direcionadoras em algumas modalidades. A fusao delas e relativamente independente da ligagao as moleculas receptoras e a ativagao da fusao e efetuada atraves da acidificagao no endossoma (Skehel e Wiley, Annu. Ver. Biochem., 69，531-569 (2000); Smit, J. e colaboradores, J. Virol, 73, 8476-8484 (1999)). Alem disso, elas podem tolerar certas modiflcagdes geneticas e permanecerem eflcientemente montadas na superficie retro viral (Morizono e colaboradores, J. Virol, 75，8016-8020).
Em outras modalidades da invengao, as glicoproteinas de superficie do virus da febre de Lassa, virus da hepatite B, virus Rabies, virus da doenga de Borna, virus Hantaan ou virus SARS-CoV podem ser
utilizados como moleculas de fusao. Em outras modalidades da invengao, glicoproteinas de su- perficie baseadas em flavi-virus podem ser usadas como a base para moleculas direcionadoras. Como os alfavirus, os flavi-virus usam a molecula de fusao de classe II para mediar a infecgao (Mukhopadhyay e colaboradores, (2005) Rev. Microbio., 3, 13-22). A prM (cerca de 165 aminoacidos) e E (cerca de 495 aminoacidos) sao as glicoproteinas dos flavi-virus. Tambem, a bolsa ligagao-ligante para um flavi-virus, virus da Dengue (DV), tem sido bem caracterizado. De interesse, a DC-SIGN tem sido sugerida a interagir especificamente com os residuos carboi- dratos na proteina DV E para aumentar a entrada viral (Mukhopadhyay e colaboradores, (2005) Nat. Rev. Microbio., 3，13-22). Assim, lentivirus envelopados apenas pela proteina DV E ou pela proteina DV E modifl- cada, pode ser usado para direcionar DCs. As proteinas DV E e TB E, bem como outras moleculas de fusao descritas, podem ser projetadas para fornecer a especificidade de ligagao desejada ou ser deilciente em ligagao e competente em fusao se necessario.
Em algumas modalidades, uma forma de hemaglutinina (HA) da influenza A/virus da praga de aves/ Rosotcki/34 (FPV), um fusogeno classe I，e usado (T. Hatziioannou, S. Valsecia-Wittmann, S. J. Russel, F. L. Cosset, J. Virol, 72，5313 (1998)). Em algumas modalida- des, uma forma do FPV HA e usada (A. H. Lin e colaboradores, Hum. Gene. Ther., 12, 323 (2001)). A fusao mediada por HA e geralmente considerada ser independente da IigaQao do receptor (D. Lavillette, S.J. Russel, F.L. Cosset, Curr. Opin. Biotech., 12，461 (2001)).
Em outras modalidades, uma FM da classe II e usada, pre-
ferivelmente a glicoproteina do virus Sindbis da familia alfavirus (K.S. Wang, R.J. Kuhn, E.G. Strauss, S. Ou, J.H. Strauss, J. Virol.，66，4992 (1992)), aqui tambem referido neste documento como SVG. A SVG inclui duas proteinas trans-membrana (S. Mukhopadhyay, R.J. Kuhn, M.G. Rossmann, Nature Rev. Microbio., 3，13 (2005)), a primeira protei-
na responsavel pela fusao (El) e uma segunda proteina pela ligagao da celula (E2). A SVG e conhecida pseudotipar ambos os oncoretrovirus e lentivirus.
Como discutido abaixo, em algumas modalidades preferi- das, uma SVG modiflcada que preferencialmente se Iiga a DC-SIGN e utilizada. Em outras modalidades, uma SVG deficiente em ligagao e competente em fusao, SVGmu, pode ser usada como a molecula fuso- genica em combinagao com uma molecula direcionadora separada, tal como um anticorpo para a DC-SIGN ou outra proteina especiflca da celula dendritica. Por exemplo, uma molecula fusogenica SVG pode ser usada na qual ο dominio de ligagao G da imunoglobulina da proteina A (dominio ZZ) e incorporado na proteina E2 e um ou mais mutag5es sao feitas para desativar os locais de ligagao dos receptores (K. Morizono e colaboradores, Nature Med., 11，346 (2005)).
O gene codificando a molecula direcionadora e preferivel- mente clonado em um vetor de expressao, tal como pcDNA3 (Invitro- gen). Celulas de empacotamento, tais como as celulas 293T sao entao co-transfectadas com ο vetor viral codificando um gene de interesse (tipicamente codificando um antigeno), pelo menos um plasmideo codificando componentes de empacotamento de virus e um vetor para a expressao da molecula direcionadora. Se a fungao direcionadora e separada da fungao fusogenica, sao tambem proporcionados um ou mais vetores que codiilcam uma molecula de afinidade e quaisquer componentes associados. A molecula direcionadora e expressa na membrana da celula de empacotamento e incorporada no virus recom- binante. A expressao das moleculas direcionadoras na superficie da celula de empacotamento pode ser analisada, por exemplo, por FACS.
Baseado na informagao obtida, por exemplo, dos estudos estruturais e modelagem molecular, a mutagenese pode ser empregada para gerar formas mutantes de glicoproteinas que mantenham suas habilidades fusogenicas, mas tem a especiflcidade de ligagao desejada e/ou nivel de ligagao. Diversos mutantes podem ser criados para cada glicoproteina e testados usando os metodos descritos abaixo ou outros metodos conhecidos na tecnica, para identiflcar FMs com as caracteris- ticas mais desejaveis. Por exemplo, moleculas direcionadoras podem ser testadas quanto a habilidade de especiflcamente liberagaor antige- nos a celulas dendriticas pela determinagao de suas habilidades de estimular uma resposta imuno sem causar efeitos colaterais indeseja- veis em um mamifero. A capacidade de direcionar especiflcamente celulas dendriticas pode tambem ser testada diretamente, por exemplo, em cultura de celula como descrito abaixo.
Para selecionar moleculas direcionadoras apropriadas (seja do tipo original ou mutante), os virus contendo a molecula direcionado- ra (e uma molecula de afinidade quando apropriado) sao preparados e testados quanto a suas seletividades e/ou suas habilidades para facili- tar a penetragao da membrana da celula alvo. Os virus que exibem uma glicoproteina do tipo original podem ser usados como controles para examinar efeitos de titulo em mutantes. As celulas expressando ο parceiro de ligagao da molecula direcionadora (ou molecula de afinida- de, quando apropriado) sao transduzidas pelo virus usando um teste de infecgao padrao. Apos um periodo de tempo especiflcado, por exemplo, 48 horas pos-transdugao, as celulas podem ser coletadas e a percenta- gem das celulas infectadas pelo virus compreendendo a molecula direcionadora (ou molecula de afinidade e fusogenica) podem ser deter- minadas, por exemplo, por FACS. A seletividade pode ser contada ao calcular a percentagem de celulas infectadas pelo virus. Similarmente, ο efeito das mutag5es no titulo viral pode ser quantificado ao dividir a percentagem de celulas infectadas pelo virus compreendendo uma molecula direcionadora mutante pela porcentagem de celulas infectadas pelo virus compreendendo a correspondente molecula direcionadora do tipo original. Um mutante preferido dara a melhor combinagao de
seletividade e titulo infeccioso. Uma vez sem a molecula direcionadora selecionada, testes de concentragao viral podem ser efetuados para conflrmar que os virus envelopados pela FM podem ser concentrados. Os sobrenadantes virais sao coletados e concentrados por ultracentrifu- gagao. Os titulos dos virus podem ser determinados pela diluigao limitada de solugao estoque viral e transdugao de celulas expressando ο parceiro de ligagao da molecula de aflnidade.
Em algumas modalidades, a proteina de fusao BlaM-Vpr pode ser utilizada para avaliar a penetragao viral e assim a eflcacia de uma molecula de fusao (do tipo original ou mutante). O virus pode ser preparado, por exemplo, por transfecgao transiente de celulas empaco- tadoras com um ou mais vetores compreendendo os elementos virais, BlaM-Vpr, e a FM de interesse (e uma molecula de aflnidade, se apro- priado). Os virus resultantes podem ser usados para infectar celulas expressando uma molecula, a molecula direcionadora (ou molecula de aflnidade) especiilcamente se Iiga na ausencia ou presenga do inibidor livre de ligagao (tal como um anticorpo). As celulas podem entao ser lavadas com meio livre de CO2 e carregadas com corante CCF2 (Aurora Bioscience). Apos incubagao na temperatura ambiente para permitir a reagao de clivagem de se completar, a celulas podem se fixas com paraformaldeido e analisadas por FACS e microscopia. A presenga de celulas azuis indica a penetragao do virus no citoplasma; poucas celu- las azuis seriam esperadas quando anticorpo de bloqueio e adicionado.
Para investigar se a penetragao e dependente de um baixo pH, e moleculas direcionadoras selecionadas (ou moleculas fusogenicas) com a dependencia do pH desejada, NH4CI ou outro composto que altera ο pH pode ser adicionado na etapa de infecgao (NH4CI neutraliza- ra os compartimentos acidos dos endossomas). No caso do NH4CI, seu desaparecimento das celulas azuis indicara que a penetragao dos virus e pouco dependente do pH.
Alem disso, para conflrmar que a atividade e dependente do pH, agentes lisossomotropicos, tais como cloreto de amonio, cloroquina, concanamicina, bafilomicina Al, monensina，nigericina, etc., podem ser adicionados no tampao de incubagao. Estes agentes podem elevar ο pH dentro dos compartimentos endossomais (por exemplo, Drose e Alten- dorf, J. Exp. Biol, 200, 1-8，1997). O efeito inibitorio destes agentes revelara ο papel do pH para a fusao e entrada viral. As diferentes cineti- cas de entrada entre os virus mostrando diferentes moleculas fusogeni- cas podem ser comparadas e a mais apropriada selecionada para uma aplicagao particular.
Testes de entrada PCR podem ser utilizados para monitorar
a transcrigao reversa e assim medir a cinetica da sintese do DNA viral como uma indicagao da cinetica da entrada viral. Por exemplo, particu- Ias virais compreendendo uma molecula direcionadora particular podem ser incubadas com celulas empacotadoras, tais como as celulas 293T, expressando ο cognato apropriado para a molecula direcionadora (ou uma molecula de afinidade separada em algumas modalidades). Seja imediatamente ou apos a incubagao (para permitir a infecgao de ocorrer) virus nao ligados sao removidos e aliquotas das celulas sao analisadas. O DNA pode entao ser extraido destas aliquotas e semi- quantitativa efetuada usando iniciadores LTR especificos. O apareci- mento de produtos de DNA LTR especificos indicara ο sucesso da entrada viral e nao revestimento.
Embora a molecula direcionadora possa ter ambas as fun- goes de ligagao e fusao virais, em outro aspect。da invengao, as fung5es de ligagao e fusao virais sao separadas em dois componentes distintos. Tipicamente, ο virus recombinante compreende ambas (i) a molecula de afinidade que media a ligagao viral e precisamente direciona ο virus para celulas dendriticas, e (ii) uma molecula fusogenica distinta (FM) que media a transdugao eficiente e liberagao ο polinucleotideo desejado para dentro das celulas dendriticas. Os metodos revelados aqui neste
documento podem ser prontamente adotados para utilizar qualquer de uma variedade de moleculas de aflnidade e moleculas fusogenicas. Em adigao aquelas descritas aqui neste documento, outras moleculas fusogenicas exemplares e metodos relacionados sao descritos, por exemplo, na aplicagao de Patente US 11/071.785，depositada em 2 de margo de 2005 (publicada como Publicagao de Pedido de Patente Ameri- cana 2005-0238626) e na aplicagao de Patente US 11/446.353，deposi- tada em 1 de junho de 2006 (publicada como Publicagao de Pedido de Patente Americana 2007/0020238)，cada uma das quais e incorporada aqui neste documento por referencia em sua totalidade.
A molecula de aflnidade e uma que se Iiga a um marcador
de superficie de celula dendritica. Em modalidades preferidas, a mole- cula de afinidade se Iiga a DC-SIGN com especiflcidade. Isto e, a ligagao da molecula de afinidade a DC-SIGN e preferivelmente especifica ο bastante para evitar efeitos colaterais indesejados devido a interagao com marcadores em outros tipos de celulas. A molecula de afinidade pode ser, por exemplo, um anticorpo que especificamente se Iiga a DC- SIGN.
Em algumas modalidades preferidas, a molecula de fusao e uma glicoproteina viral que media a fusao ou de outra forma facilita a liberagao do gene de interesse a celula dendritica, preferivelmente em resposta ao baixo pH do ambiente do endossoma. A molecula de fusao preferivelmente exibe cinetica rapida ο bastante que ο conteiido viral pode ser descarregado para dentro do citosol antes da degradagao da particula viral. Alem disso, a molecula de fusao pode ser modiflcada para reduzir ou eliminar qualquer atividade de ligagao e assim reduzir ou eliminar qualquer ligagao nao especifica. Isto e, pela redugao da habilidade de ligagao das moleculas de fusao, a ligagao do virus a celula alvo e determinada predominantemente ou inteiramente pela molecula de afinidade, permitindo alta especiflcidade de alvo e reduzindo efeitos indesejaveis. As moleculas de fusao exemplares incluem, mas, sem
limitagao, glicoproteinas virais derivadas de um dos seguintes virus: virus Sindbis, virus influenza, virus da febre de Lassa, virus da encefali- te transmitido por carrapatos, virus da dengue, virus da hepatite B, virus Rabies, virus Semliki Forest, virus Ross River, virus Aura, virus da doenga de Borna, virus Hantaan e virus SARS-CoV.
Os metodos revelados aqui neste document。podem ser
prontamente adaptados para utilizar qualquer uma de uma variedade de moleculas como moleculas direcionadoras ou como moleculas fuso- genicas em combinagao com moleculas de afinidade. Em adigao aquelas descritas aqui neste documento, outras moleculas exemplares e meto- dos relacionados sao descritos, por exemplo, na Publicagao da Aplica- ?ao da Patente Americana 2005/0238626 e na Publicagao da Aplicagao da Patente Americana 2007/0020238.
Vetores
Numa modalidade preferida，um ou mais vetores sao usa- dos para introduzir seqiiencias de polinucleotideos em uma linhagem de celula de empacotamento para a preparagao de um virus recombinante como descrito aqui neste documento. Os vetores podem conter seqiien- cias de polinucleotideos codificando os varios componentes do virus recombinante incluindo a molecula direcionadora DC especiflca, gene(s) de interesse (tipicamente codificando um antigeno) e quaisquer compo- nentes necessarios para a produgao do virus que nao sao fornecidos pela celula de empacotamento. Em algumas modalidades, vetores contendo seqiiencias de polinucleotideos que codificam a molecula de afinidade DC especiflca e uma molecula fusogenica separada sao subs- tituidos por um vetor que codifica uma molecula direcionadora DC especiflca na preparagao do virus. Vetores de expressao de celulas eucarioticas sao bem conhecidos na tecnica e estao disponiveis a partir de um niimero de fontes comerciais.
Num aspecto da invengao, vetores contendo seqiiencias de polinucleotideos que codiflcam fatores de maturagao de DC sao tambem usados na preparagao do virus. Estes polinucleotideos estao tipicamen- te sob controle de um ou mais elementos regulatorios que direcionam a expressao das sequencias codiflcantes na celula de empacotamento e na celula alvo, como apropriado. Diversas linhas de evidencia tem mostrado ο sucesso da vacinagao DC e dependente do estado de matu- ragao das DCs (Banchereau, J. e Palucka, A.K., Nat. Rev. Immunol, 5:296-306，(2005); Schuler, G. e colaboradores, Curr. Opin. Immunol, 15:138-147, (2003); Figdor, C.G. e colaboradores, Nat. Med., 10:475- 480, (2004)，cada um dos quais e aqui incorporado neste documento por referencia). A maturagao pode transformar DCs de celulas ativa- mente envolvidas na captura de antigeno em celulas especializadas pela iniciagao de celulas T. Em um aspect。da invengao, ο vetor inclui genes que codiflcam as moleculas estimulatorias para disparar a maturaQao da DC desejada. Tais moleculas estimulatorias sao tambem referidas como fatores de maturagao ou fatores estimulatorios de maturagao.
Em algumas modalidades, celulas de empacotamento sao co-transfectadas com um vetor viral codiflcando um antigeno e um ou mais vetores adicionais. Por exemplo, em adigao ao vetor viral codifl- cando um antigeno, um segundo vetor preferivelmente carrega um gene codiflcando uma molecula direcionadora que se Iiga as celulas dendriti- cas, tais como SVGmu, como descrito em outra parte na aplicagao. Em algumas modalidades preferidas, a molecula direcionadora codiflca uma glicoproteina viral modificada que e especiflca para a DC-SIGN. A glicoproteina modificada viral e preferivelmente uma derivada de pelo menos uma das seguintes: virus Sindbis, virus influenza, virus da febre de Lassa, virus da encefalite transmitido por carrapatos，virus da dengue, virus da hepatite B, virus Rabies, virus Semliki Forest, virus Ross River, virus Aura, virus da doenga de Borna, virus Hantaan e virus SARS-CoV. Em algumas modalidades, ο vetor viral codiflcando um antigeno tambem inclui uma seqiiencia de polinucleotideo codiflcando um fator de maturagao de DC. Em algumas modalidades, a sequencia de polinucleotideo codiflcando um fator de maturagao de DC esta contida em um terceiro vetor que e co-transfectado com ο vetor viral codiflcando um antigeno e um ou mais vetores adicionais dentro das celulas de empacotamento.
Em outras modalidades, um ou mais vetores de expressao multicistronico sao utilizados que incluem dois ou mais dos elementos (por exemplo, genes virais, genes de interesse, molecula direcionadora, fatores de maturagao DC) necessarios para a produgao do virus recom- binante desejado nas celulas de empacotamento. O uso de vetores multicistronicos reduz ο numero total de vetores requeridos e assim evita as possiveis dificuldades associadas com a coordenagao da ex- pressao a partir de miiltiplos vetores. Em um vetor multicistronico os varios elementos a serem expressos sao operacionalmente ligados a um ou mais promotores (e outros elementos de controle de expressao como necessario). Em outras modalidades, um vetor multicistronico compre- endendo um gene de interesse, um gene relator e elementos virais sao usados. O gene de interesse tipicamente codifica um antigeno e, opcio- nalmente, um fator de maturagao de DC. Tal vetor pode ser co- transfectado, por exemplo, junto com um vetor codiflcando uma mole- cula direcionadora ou, em algumas modalidades, um vetor multicistro- nico codiflcando ambas as moleculas FM e uma molecula de aflnidade. Em algumas modalidades, ο vetor multicistronicos compreende um gene codiflcando um antigeno, um gene codiflcando um fator de matu- ragao de DC e elementos virais.
Cada componente para ser expresso em um vetor de ex- pressao multicistronico pode ser separado, por exemplo, por um ele- mento IRES ou um element。2A viral, para permitir expressao separada das varias proteinas a partir do mesmo promotor. Elementos IRES e elementos 2A sao conhecidos na tecnica (Patente US 4.937.190; de
Felipe e colaboradores, 2004，Traffic, 5:616-626，cada um dos quais e aqui incorporado neste documento por referencia em sua totalidade). Em uma realizagao, oligonucleotideos codificando sequencias de local de clivagem de furina (RAKR) (Fang e colaboradores, 2005，Nat. Biotech., 23:584-590，ο qual e aqui incorporado neste documento por referencia em sua totalidade) ligado com sequencias semelhantes a 2A do virus de doengas (FMDV) do pe e da boca, virus da rinite equina A (ERAV) e virus da thosea asigna (TaV) (Szymezak e colaboradores, 2004, Nat. Biotech., 22:589-594, ο qual e aqui incorporado neste documento por referencia em sua totalidade) sao usados para separar elementos geneticos em um vetor multicistronico. A eflcacia de um vetor multicistronico para uso na sintese do virus recombinante desejado pode prontamente se testado pela detecgao da expressao de cada um dos genes usando protocolos padrdes.
A geragao de vetor(es) pode ser efetuada usando quaisquer tecnicas de engenharia genetica apropriadas conhecidas na tecnica, incluindo, sem limitagao, as tecnicas padr5es de restrigao com endonu- clease de restrigao, ligagao, transformagao, purificagao de plasmideo e seqiienciamento de DNA, por exemplo，como descrito em Sambrook e colaboradores, (1989，Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press NY), Coffin e colaboradores, (Retroviruses. Cold Spring Harbor Press, N.Y. (1997)) e "RNA Viruses: A Practical Approach" (Alan J. Cann., Ed. Oxford University Press, (2000)，cada um dos acima citados os quais sao incorporados aqui neste documento por referencia em suas totalidade s.
O(s) vetor(es) pode(m) incorporar sequencias do genoma de
qualquer organismo conhecido. As sequencias podem ser incorporadas em suas formas nativas ou podem ser modiflcadas de qualquer modo. Por exemplo, as sequencias podem compreender inserg5es, deleg5es ou substituig5es.
Os elementos de controle de expressao que podem ser usa- dos para regular a expressao de componentes sao conhecidos na tecni- ca e incluem, mao nao sao limitados a, promotores induziveis, promoto- res constitutivos, sinais de secregao, aumentadores e outros elementos regulatorios.
Em uma realizagao, um vetor pode incluir um replicon pro-
cariotico, isto e, uma sequencia de DNA tendo a habilidade de direcio- nar a replicagao autonoma e manutengao da molecula de DNA recom- binante extra-cromossomicamente em uma celula hospedeira procario- tica，tal como uma celula hospedeira de bateria, transformada com isso. Tais replicons sao bem conhecidos na tecnica. Alem disso, vetores que incluem um replicon procariotico podem tambem incluir um gene cuja expressao confere um marcador detectavel tal como uma resistencia a droga. Genes de resistencia a droga de bacteria tipicos sao aqueles que conferem resistencia a ampicilina ou tetraciclina.
O(s) vetor(es) pode incluir um ou mais genes de marcadores
selecionaveis que sao efetivos em uma celula eucariotica, tal como um gene para um marcador de selegao de resistencia a droga. Este gene codifica um fator necessario para a sobrevivencia ou crescimento de celulas hospedeiras transformadas crescendo em um meio de cultura seletivo. Celulas hospedeiras transformadas com ο vetor contendo ο gene de selegao nao sobreviverao no meio de cultura. Genes de selegao tipicos codiflcam proteinas que conferem resistencia a antibioticos ou outras toxinas, por exemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato ou tetraciclina, deflciencias auxotroficas de complemento ou suprir nutri- entes criticos mantidos do meio, O marcador selecionavel pode opcio- nalmente estar presente em um plasmideo separado e introduzido por co-transfecgao.
Os vetores usualmente conterao um promotor que e reco- nhecido pela celula de empacotamento e que e operacionalmente ligado ao polinucleotideo(s) codificando a molecula direcionadora, componen- tes virais e semelhantes. Um promotor e um elemento de controle de expressao formado por uma seqiiencia de acido nucleico que permite a ligagao da polimerase do RNA e transcrigao de ocorrer. Os promotores sao sequencias nao traduzidas que sao localizadas a montante (5) do codon de partida de um gene estrutural (geralmente dentro de cerca de 100 a 1000 bp) e controlam a transcrigao e translagao da sequencia de polinucleotideo antigeno especiflca a qual eles estao operacionalmente ligados. Os promotores podem ser induziveis ou constitutivos. A ativi- dade dos promotores induziveis e induzida pela presenga ou ausencia de fatores bioticos ou abioticos. Promotores induziveis podem ser uma ferramenta ύΐϋ na engenharia genetica por que a expressao dos genes aos quais eles estao operacionalmente ligados pode ser ligada e desliga- da em certos estagios do desenvolvimento de um organismo ou em um tecido particular. Promotores induziveis podem ser agrupados com promotores regulados quimicamente e promotores regulados fisicamen- te. Promotores regulados quimicamente tipicos incluem, mas, sem limitagao, promotores regulados por alcool (por exemplo, promotor do gene (alcA) alcool dehidrogenase I), promotores regulados por tetracicli- na (por exemplo, promotor que responde a tetraciclina), promotor regulado por esteroide (por exemplo, promotor baseado no receptor glucocorticoide (GR) de rato, promotor baseado no receptor estrogenic» (ER) humano, promotor baseado no receptor ecdisona da boca e os promotores baseados na super familia de receptores esteroi- de / retinoide/tiroide), promotores regulados por metais (por exemplo, promotores baseados no gene metalotioneina) e promotores relaciona- dos a patogeneses (por exemplo, promotores baseado em proteina relacionada a patogeno (PR) de milho e arabidopsis). Promotores regula- dos flsicamente tipicamente incluem, mas, sem limitagao, promotores regulados por temperatura (por exemplo, promotores de choque termi- co) e promotores regulados pela Iuz (por exemplo, promotor SSU da soja). Outros promotores exemplares sao descritos em outros lugares, por exemplo, no protocolo de transferencia de hipertexto: //www.patentlens.net/daisy/promoters/768/271.html， que e aqui incorporado neste documento em sua totalidade.
Um tecnico no assunto sera capaz de selecionar um promo- tor apropriado baseado nas circunstancias especificas. Muitos promoto- res diferentes sao bem conhecidos na tecnica, como sao os metodos para operacionalmente ligar ο promotor ao gene a ser expresso. Ambas as sequencias de promotores nativos e muitos promotores heterologos podem ser usados para direcionar a expressao na celula de empacota- mento e celula alvo. Todavia, promotores heterologos sao preferidos, uma vez que eles geralmente permitem maior transcrigao e maiores rendimentos da proteina desejada quando comparados com os promoto- res nativos.
O promotor pode ser obtido, por exemplo, de genomas de vi- rus tais como ο virus polioma, virus fowlpox, adenovirus, virus de papiloma bo vino, virus de sarcoma de aves, citomegalovirus, um retro- virus, virus da hepatite B e virus Simian 40 (SV40). O promotor pode tambem ser, por exemplo, um promotor mamifero heterologo, por exemplo, ο promotor de actina ou um promotor de imunoglobulina, um promotor de choque termico ou um promotor normalmente associado com a seqiiencia nativa, desde que tais promotores sejam compativeis com a celula alvo. Numa realizagao, ο promotor e ο promotor viral que ocorre naturalmente em um sistema de expressao viral. Em algumas modalidades, ο promotor e um promotor especifico para celula dendriti- ca. O promotor especifico para celula dendritica pode ser, por exemplo, ο promotor CDl lc.
A transcrigao pode ser aumentada pela insergao de uma se- quencia aumentadora no(s) vetor(es). As aumentadoras sao tipicamente elementos de agao cis de DNA, usualmente cerca de 10 a 300 bp em comprimento, que agem no promotor para aumentar sua transcrigao. Muitas sequencias de aumentadoras sao agora conhecidas de genes de mamiferos (globina, elastase, albumina, α-fetoproteina e insulina). Preferivelmente uma aumentadora de um virus de celula eucariotica sera usada. Exemplos incluem a aumentadora SV40 no Ciltimo Iado da origem de replicagao (bp 100-270)，a aumentadora promotora precoce de citomegalovirus, a aumentadora de polioma no iiltimo Iado da origem de replicagao e aumentadoras de adenovirus. A aumentadora pode ser inserida no vetor em uma posigao 5' ou 3' para a seqiiencia de polinu- cleotideo antigeno especifica, mas e preferivelmente localizada no sitio 5' do promotor.
Os vetores de expressao tambem conterao seqiiencias ne-
cessarias para ο termino da transcrigao e para estabilizagao do mRNA. Estas seqiiencias sao frequentemente encontradas nas regioes 5' e, ocasionalmente 3，，nao traduzidas de DNAs ou cDNAs eucarioticos ou virais e sao bem conhecidos na tecnica.
Os vetores de plasmideos contendo um ou mais dos compo-
nentes descritos acima sao prontamente construidos usando tecnicas padrdes bem conhecidas na tecnica.
Para analise para conflrmar seqiiencias corretas construi- das em plasmideos, ο plasmideo pode ser replicado em E. coli, puriflca- da e analisada por digestao de endonuclease de restrigao e/ou sequen- ciada por metodos convencionais.
Os vetores que fornecem expressao transiente em celulas de mamiferos podem tambem ser usados. Expressao transiente envolve ο uso de um vetor de expressao que seja capaz de replicar eficientemente em uma celula hospedeira, de forma que a celula hospedeira acumula muitas copias do vetor de expressao e, desta forma, sintetiza altos niveis de um polipeptideo codiflcado pelo polinucleotideo antigeno especiflco em um vetor de expressao. Veja Sambrook e colaboradores, supra, pag. 16.17-16.22. Outros vetores e metodos apropriados para adaptagao para a expressao de polipeptideos virais sao bem conhecidos na tecnica e sao
Usando os ensinamentos providos aqui neste document。， um tecnico no assunto reconhecera que a eficacia de um sistema de expressao particular pode ser testada por celulas de empacotamento de transformagao com um vetor compreendendo um gene codificando uma proteina relatora e medindo a expressao usando uma tecnica apropria- da, por exemplo, medindo a fluorescencia de um conjugado de proteina fluorescente verde. Genes relatores apropriados sao conhecidos na tecnica.
A transformagao de celulas de empacotamento com vetores da presente invengao e efetuada por metodos bem conhecidos e ο metodo a ser usado nao e limitado de qualquer modo. Um ηύπιεΓΟ de sistemas de liberagao nao viral e conhecido na tecnica, incluindo, por exemplo, eletroporagao, sistema de liberagao baseado em lipideos incluindo lipossomas, liberagao de DNA "desprotegido" e liberagao usando compostos de policiclodextrina, tais como aqueles descritos em Schatzlein AG. (2001，Non-Viral Vectors in Cancer Gene Therapy: Principles and Progresses, Anticancer Drugs, ο qual e aqui incorporado neste documento por referencia em sua totalidade). Metodos de trata- mentos com lipideos cationicos ou sal sao tipicamente empregados，ver, por exemplo, Graham e colaboradores, (1973，Virol, 52:456; Wigler e colaboradores, (1979, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 76:1373-76)，cada um dos previamente citados os quais sao incorporados aqui neste docu- mento por referencia em suas totalidades. O metodo de precipitagao com fosfato de calcio e ο preferido. Todavia, outros metodos para intro- dugao do vetor em celulas podem tambem ser usados, incluindo micro injegao nuclear e fusao protoplast。bacteriana.
Vetor Viral e Celulas de Empacotamento Um dos vetores codifica ο virus rnicleo (ο "vetor viral”). Exis- te um grande niimero de vetores virais disponiveis que sao apropriados para uso com a invengao, incluindo aqueles identificados para aplica- goes em terapia de genes para pessoas humanas, tais como aqueles descritos por Pfeifer e Verma (Pfeifer, A. e I.M. Verma, 2001，Annu. Rev. Genomics Hum. Genet., 2:177-211, ο qual e aqui incorporado neste documento por referencia em sua totalidade). Vetores virais apropriados incluem vetores baseados nos virus RNA，tais como vetores derivados de retrovirus, por exemplo, vetores derivados do virus da leucemia murina de Moloney (MLV) e incluem vetores derivados de retrovirus mais com- plexos，por exemplo, vetores derivados de lentivirus. Vetores derivados do virus da imunodeflciencia humana (HIV-I) pertencem a esta catego- ria. Outros exemplos incluem vetores de lentivirus derivados da HIV-2, virus da imunodeflciencia felina (FIV), virus da anemia infecciosa equina, virus da imunodeflciencia de simio (SIV) e virus maedi/visna.
O vetor viral preferivelmente compreende um ou mais genes codiflcando componentes de um virus recombinante bem como um ou mais genes de interesse, tais como, por exemplo, um antigeno e/ou um fator de maturagao de DC. O vetor viral pode tambem compreender elementos geneticos que facilitam a expressao do gene de interesse em uma celula alvo, tais como seqiiencias promotoras e aumentadoras. De forma a prevenir a replicagao na celula alvo, podem ser removidos e fornecidos separadamente genes virais endogenos requeridos para a replicagao na linhagem de celulas de empacotamento.
Numa realizagao preferida, ο vetor viral compreende um
LTR retro viral intacto 5，e um LTR auto-inativante 3，.
Qualquer metodo conhecido na tecnica pode ser usado para produzir particulas retrovirais infecciosas cujo genoma compreende uma copia de RNA do vetor viral. Para este ilm, ο vetor viral (junto com outros vetores codiflcando ο gene de interesse, a molecula direcionadora DC especiflca, etc.) e preferivelmente introduzido em uma linhagem de celulas de empacotamento que empacota ο RNA genomico viral baseado no vetor viral em particulas virais.
A linhagem de celulas de empacotamento fornece as protei- nas virais que sao requeridas em trans para ο empacotamento do RNA genomico viral em particulas virais. A linhagem de celulas de empaco- tamento pode qualquer celula que e capaz de expressar proteinas retro virais. Linhagens de celulas de empacotamento preferidas incluem a 293 (ATCC CCL X)，HeLa (ATCC CCL 2)，D17 (ATCC CCL 183)，MDCK (ATCC CCL 34)，BHK (ATCC CCL-10) e Cf2Th (ATCC CRL 1430). A linhagem de celulas de empacotamento pode estavelmente expressar as proteinas virais necessarias. Tal linhagem de celulas empacotadas e descrita, por exemplo, na Patente US 6.218.181，que e aqui incorporada neste document。por referencia em sua totalidade. Alternativamente uma linhagem de celulas de empacotamento pode ser transientemente transfectada com plasmideos compreendendo acido nucleico que codifi- ca uma ou mais das proteinas virais necessarias, incluindo a molecula direcionadora DC especiflca (ou alternativamente, a molecula de afini- dade DC especiflca e molecula fusogenica) junto com os vetores virais codiflcando ο gene de interesse, ο qual tipicamente codifica um antigeno e pode adicionalmente codificar um fator de maturagao de DC.
Particulas virais compreendendo um polinucleotideo com ο gene de interesse e uma molecula direcionadora que e especiflca para celulas dendriticas sao coletadas e permitidas infectar a celula alvo. Em algumas modalidades preferidas, ο virus e pseudotipado para alcangar a especiflcidade da celula alvo. Os metodos de pseudotipagem sao bem conhecidos na tecnica e tambem descritos aqui neste documento.
Em uma realizagao, ο virus recombinante usado para Iibe- ragaor ο gene de interesse e um lentivirus modiflcado e ο vetor viral e
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baseado em um lentivirus. Como lentivirus sao capazes de infectar ambas as celulas que se dividem e nao se dividem, nesta realizagao nao e necessario para celulas alvo serem celulas que se dividem (ou estimu- Iar celulas alvo a se dividirem).
Em outra realizagao, ο virus recombinante usado para Iibe- ragaor ο gene de interesse e um gamaretrovirus modiflcado e ο vetor viral e baseado em um gamaretrovirus.
Em outra realizagao, ο vetor e baseado no virus de celula tronco de murino (MSCV; (Hawley, R.G. e colaboradores, (1996), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 93:10297-10302; Keller G. e colaboradores, (1998), Blood, 92: 877-887; Hawley, R.G. e colaboradores, (1994), Gene Ther., 1:136-138，cada um dos precedentes os quais sao incorporados aqui neste documento em suas totalidades). O vetor MSCV fornece expressao estavel de longa duragao em celulas alvo, particularmente celula precursoras hematopoieticas e suas progenias diferenciadas.
Em outra realizagao, ο vetor e baseado em um virus de Mo-
loney modiflcado, por exemplo, um Virus de Leucemia Murina de Moloney. O vetor viral pode tambem ser baseado em um virus hibrido tal como aquele descrito em Choi, J.K. e colaboradores, (2001，Stem Cells, 19, n° 3，236-246，ο qual e aqui incorporado neste documento por referencia em sua totalidade).
Um vetor viral de DNA pode ser usado, incluindo, por e- xemplo, vetores baseados em adenovirus e vetores baseados em virus adeno associados (AAV). De forma semelhante, vetores retro virais tambem podem ser usados com os metodos da invengao.
Outros vetores tambem podem ser usados para a liberagao
de polinucleotideos incluindo vetores derivados dos virus do herpes simplex (HSVs)，incluindo vetores amplicon, HSV defeituosos em repli- cagao e HDV atenuado (Krisky, D.M., Marconi P.C., Oligino T.J., Rouse R.J., Fink D.J. e colaboradores, 1998. Development of herpes simplex virus replication-defective multigene vectors for combination gene therapy applications, Gene Ther., 5:1517-30，ο qual e aqui incorporado neste documento em sua totalidade).
Outros vetores que tem sido recentemente desenvolvidos para usos na terapia de gene podem tambem ser usados com os meto- dos da invengao. Tais vetores incluem aqueles derivados de baculovirus e alfavirus. (Jolly D.J., 1999，Emerging viral vectors, pag. 209-40，em Friedmann T., ed. 1999. The development of human gene therapy. New York: Col Spring Harbor Lab, ο qual e aqui incorporado neste documen- to por referencia em sua totalidade).
Em algumas modalidades preferidas, ο construto viral com- preende sequencias de um genoma de lentivirus, tal como um genoma de HIV ou ο genoma de SIV. O construto viral preferivelmente compre- ende sequencias de LTRs 5' e 3' de um lentivirus. Mais preferivelmente ο construto viral compreende as sequencias R e U5 do LTR 5' de um lentivirus e um LTR desativado ou auto-desativante 3，de um lentivirus. As sequencias LTR podem ser sequencias LTR de qualquer lentivirus de qualquer especie. Por exemplo, elas podem ser sequencias de LTR de HIV, SIV, FIV ou BIV. Preferivelmente as sequencias LTR sao sequencias LTR de HIV.
O construto viral preferivelmente compreende um LTR 3' desativado ou auto-desativante. O LTR 3，pode ser feito auto- desativante por qualquer metodo conhecido na tecnica. Na realizagao preferida ο elemento U3 do LTR 3' contem uma delegao de sua seqiien- cia aumentadora, preferivelmente a caixa TATA, locais Spl e NF-kapa. Como um resultado do LTR 3' auto-desativante, ο pro-virus que e integrado no genoma da celula hospedeira compreende um LTR 5' desativado.
Opcionalmente, a seqiiencia U3 de um LTR 5' lentiviral po- de ser substituida com uma seqiiencia do promotor no construto viral. Isto pode aumentar ο titulo do virus recuperado da linhagem de celulas empacotadoras. Uma seqiiencia aumentadora pode tambem ser inclui- da. Qualquer combinagao aumentadora/promotora que aumente a expressao do genoma do RNA viral na linhagem de celulas empacotado- ras pode ser usada. Em uma realizagao preferida, a seqiiencia aumen- tadora/ promotora CMV e usada.
Em algumas modalidades preferidas, ο construto viral com- preende seqiiencias de um genoma de gamaretrovirus, tais como ο genoma do virus de celula tronco de camundongo (MSCV) ou ο genoma do virus de leucemia murina (MLV). O construto viral preferivelmente compreende seqiiencias de LTRs 5’ e 3' de um gamaretrovirus. As seqiiencias LTR podem ser seqiiencias LTR de qualquer gamaretrovirus de qualquer especie. Por exemplo, elas podem ser seqiiencias LTR de virus de celula tronco de camundongo (MSCV), virus de leucemia murina (MLV)，virus de leucemia felina (FLV), virus de sarcoma felino (FAV) e virus reticuloendoteliose aviaria (ARV). Preferivelmente, as seqiiencias LTR sao seqiiencias LTR MSCV e MLV.
Em algumas modalidades, ο construto viral preferivelmente compreende um LTR desativado ou auto-desativante 3，. O LTR 3，pode ser feito auto-desativante por qualquer metodo conhecido na tecnica. Na realizagao preferida ο elemento U3 do LTR 3，contem uma delegao de sua seqiiencia aumentadora, preferivelmente a caixa TATA, locais Spl e NF-kapa. Como um resultado do LTR 3' auto-desativante, ο pro-virus que e integrado no genoma da celula hospedeira compreendera um LTR 5' desativado.
Opcionalmente, a seqiiencia U3 de um LTR 5，gamaretrovi- ral pode ser substituida com uma seqiiencia do promotor no construto viral. Isto pode aumentar ο titulo do virus recuperado da linhagem de
celulas empacotadoras. Uma seqiiencia aumentadora pode tambem ser incluida. Qualquer combinagao incrementadora/promotora que aumen- te a expressao do genoma do RNA viral na linhagem de celulas empaco- tadoras pode ser usada. Em uma realizagao preferida, a seqiiencia aumentadora/promo tora CMV e usada.
O construto viral geralmente compreende um gene que co-
difica um antigeno que e desej avelmente expresso em uma ou mais celulas alvo. Preferivelmente ο gene de interesse esta localizado entre as seqiiencias LTR 5' e LTR 3'. Ainda, ο gene de interesse esta preferivel- mente em uma relagao funcional com outros elementos geneticos, por exemplo, seqiiencias regulatorias de transcrigao, tais como promotores e/ou aumentadores, para regular a expressao do gene de interesse de um modo particular uma vez que ο gene e incorporado na celula alvo. Em certas modalidades, ο gene de interesse esta em uma relagao fun- cional com seqiiencias regulatorias promotoras/ incrementadoras internas. Uma promotora/ aumentadora “interna” e uma que esta localizada entre as seqiiencias LTR5' e LTR 3' no construto viral e esta operacionalmente ligada ao gene que e desej ado expressar.
A promotora/ incrementadora pode ser qualquer promotora, aumentadora ou combinagao promotora/ aumentadora conhecida para aumentar a expressao de um gene com ο qual esta em uma relagao funcional. Uma "relagao funcional" e “ligada operacionalmente" signifi- ca, sem limitagao, que ο gene esta na localizagao e orientagao correta com respeito a promotora e/ou aumentadora que a expressao do gene sera afetada quando a promotora e/ou aumentadora e contatada com as moleculas apropriadas.
O promotor/ incrementador interno e preferivelmente sele- cionado baseado no padrao de expressao desej ado para ο gene de interesse e as propriedades especiflcas dos promotores/ aumentadores conhecidos. Assim, ο promotor interno pode ser um promotor constitu- tivo. Exemplos nao limitantes de promotores constitutivos que podem ser usados incluem ο promotor para ubiquitina, CMV (Karasuyama e colaboradores, 1989，J. Exp. Med., 169:13，ο qual e aqui incorporado neste documento por referencia em sua totalidade), beta-actinia (Gun- ning e colaboradores, 1989，Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84:4831-4835， o qual e aqui incorporado neste documento por referencia em sua totalidade) e pgk (ver, por exemplo, Adra e colaboradores, 1987，Gene 60:65-74; Singer-Sam e colaboradores, 1984, Gene, 32:409-417; e Dobson e colaboradores, 1982，Nucleic Acids Res., 10:2635-2637, cada um dos precedentes os quais sao incorporados aqui neste documento em suas totalidades).
Alternativamente, ο promotor pode ser um promotor especi- flco de tecido. Em algumas modalidades preferidas, ο promotor e um promotor especifico de celula. Por exemplo, ο promotor pode ser ο promotor CDllc especifico de celula dendritica (Massod, R. e colabora- dores, 2001，Int. J. Mol Med., 8:335-343; Somia, N.V. e colaboradores, 1995, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 92:7570-7574, cada um do qual e aqui incorporado neste documento por referencia em sua totalidade). Alem disso, promotores podem ser selecionados para permitir a expres- sao induzivel do gene. Um niimero de sistemas para a expressao indu- zivel e conhecido na tecnica, incluindo ο sistema responsivo da tetraci- clina e ο sistema operador-repressor lac. E tambem contemplado que a combinagao de promotores pode ser usada para obter a expressao desejada do gene de interesse. O tecnico no assunto sera capaz de selecionar um promotor baseado no padrao de expressao desejado do gene no organismo e/ou celula alvo de interesse.
Em algumas modalidades, ο construto viral preferivelmente compreende pelo menos um promotor de RNA polimerase II ou III. O promotor de RNA polimerase II ou III e operacionalmente ligado ao gene de interesse e pode tambem ser ligado a uma sequencia de terminagao. Alem disso, mais do que um promotor de RNA polimerase II ou III pode
serincorporado. Promotores de RNA polimerase II ou III são bem conhecidos para o técnico no assunto. Uma faixa apropriada de promotores de RNA polimerase III pode ser encontrada, por exemplo, em Paule e White, Nucleic Acids Research, vol. 28, pág. 1283-1298 (2000), o qual é aqui incorporado neste documento por referência em sua totalidade. A definição de promotores de RNA polimerase II ou III, respectivamente, também inclui qualquer fragmento de DNA sintético ou projetado que possa direcionar a RNA polimerase II ou III, respectivamente, para transcrever suas seqüências de codificação de RNA a jusante. Ainda, o promotor de RNA polimerase II ou III (Pol II ou III) ou promotores usa- dos com parte do vetor viral pode ser induzível. Qualquer promotor Pol II ou III induzível apropriado pode ser usado com os métodos da inven- ção. Promotores Pol II ou III particularmente apropriados incluem os promotores responsivos da tetraciclina fornecidos em Ohkawa e Taira, Human Gene Therapy, vol. 11, pág 577-585 (2000) e em Meissner e colaboradores, Nueleie Acids Research, vol. 29, pág. 1672-1682 (2001), cada um do qual é aqui incorporado neste documento por referência em sua totalidade.
Um aumentador interno pode também estar presente no construto viral para aumentar a expressão do gene de interesse. Por exemplo, o aumentar CMV (Karasuyama e colaboradores, 1989, J. Exp. Med., 169:13, o qual é aqui incorporado neste documento por referên- cia em sua totalidade) pode ser usado. Em algumas modalidades, o aumentador CMV pode ser usado em combinação com o promotor β- actina de frango. Uma pessoa versada na técnica será capaz de selecio- nar o aumentador apropriado baseado no padrão de expressão apropri- ado.
O polinucleotídeo ou gene de interesse não é limitado de qualquer modo e inclui qualquer ácido nucléico que o técnico no assun- to deseje ter integrado, transcrito, traduzido e/ou expresso na célula alvo. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo pode ser um gene que codifica um antígeno contra o qual uma resposta imuno é desejada. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo pode ser um gene codificando um Rna de inibição pequeno (siRNA) ou microRNA (miRNA) de interesse que regula para baixo a expressão de uma molécula, por exemplo, o gene codificando um siRNA ou microRNA pode ser usado para regular para baixo a expressão de reguladores negativos em uma célula, inclu- indo aqueles que inibem a ativação ou maturação de células dendríti- cas. siRNAs e microRNAs são conhecidos na técnica e descritos em qualquer lugar (Shen, L. e colaboradores, 2004, Nat Biotech, 22(12): 1546-1553; Zhou, H. e colaboradores, 2006, Biochemical and Biophysi- cal Research Communications, 347:200-207; Song, X-T. e colaborado- res, 2006, PLoS Medicine 3(l):ell; Kobayashi, T. e A. Yoshimura, 2005, TRENDS in Immunology, 26(4): 177-179; Taganov, K. e colaboradores, 2007, Immunity, 26:133-137; Dahlberg, J.E. e E. Lund, 2007, Sei. STKE, 287:pg. 25, cada um dos quais é aqui incorporado neste docu- mento por referência em suas totalidades).
Além disso, em algumas modalidades, o polinucleotídeo po- de conter mais do que um gene de interesse, o qual pode ser colocado em relação funcional com o promotor viral. O gene de interesse pode codificar uma proteína, um siRNA ou um microRNA. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo a ser liberado pode compreender múlti- plos genes codificando pelo menos uma proteína, pelo menos um siRNA, pelo menos um micro RNA ou combinações dos mesmos. Por exemplo, o polinucleotídeo a ser liberado pode incluir um ou mais genes que codificam um ou mais antígenos contra os quais uma resposta imuno é desejada. O um ou mais antígenos podem ser associados com uma doença ou desordem única, ou ele pode estar associado com múltiplas doenças e/ou desordens. Em algumas modalidades, um gene codifican- do uma proteína regulatória imuno pode ser construído com um gene primário codificando um antígeno contra o qual uma resposta imuno é desejada e a combinação pode extrair e regular a resposta imuno para a desejada direção e magnitude. Em algumas modalidades, um gene codificando um siRNA ou microRNA pode ser construído com um gene primário codificando um antígeno contra o qual uma resposta imuno é desejada e a combinação pode regular o escopo da resposta imuno.
(Veja, por exemplo, modalidades, de polinucleotídeos na Figura 24c e Figura 24d, com as seqüências que as acompanham SEQ ID NO:9 e SEQ ID NO: 10, respectivamente). Em algumas modalidades, um gene codificando uma proteína marcadora pode ser colocado após um gene primário de interesse para permitir a identificação de células que estão expressando a proteína desejada. Em uma realização, uma proteína marcadora fluorescente, preferencialmente proteína fluorescente verde (GFP), é incorporada no construto junto com o gene de interesse (tipi- camente codificando um antígeno). Se mais do que um gene é incluído, seqüências de local de entrada interno no ribossomo (IRES), ou elemen- tos 2A são também preferivelmente incluídos, separando o gene primá- rio de interesse de um gene relator e/ou qualquer outro gene de inte- resse. As seqüências IRES ou 2A podem facilitar a expressão do gene relator ou outros genes.
O construto viral pode também conter elementos genéticos adicionais. Os tipos de elementos que podem ser incluídos no construto não são limitados de qualquer modo e serão escolhidos pelo técnico no assunto para alcançar um resultado particular. Por exemplo, um sinal que facilita a entrada nuclear do genoma viral na célula alvo pode ser incluído. Um exemplo de tal sinal é o sinal "flap" de HIV-1.
Ainda, elementos podem ser incluídos que facilitam a carac-
terização do local de integração do pró-vírus na célula alvo. Por exem- plo, uma seqüência supressora âmbar tRNA pode ser incluída no construto.
Além disso, o construto pode conter um ou mais elementos genéticos projetados para aumentar a expressão do gene de interesse. Por exemplo, um elemento responsivo de vírus de hepatite da marmota (WRE) pode ser colocado no construto (Zufferey e colaboradores, 1999, J. Virol., 74:3668-3681; Deglon e colaboradores, 2000, Hum. Gene Ther., 11:179-190, cada um dos quais é aqui incorporado neste docu- mento por referência em suas totalidades).
Um isolante β-globina de frango pode também ser incluído no construto viral. Este elemento tem sido mostrado reduzir a chance de silenciar o pró-vírus integrado na célula alvo devido à metilação e efeitos de heterocromatinização. Além disso, o isolante pode proteger o aumentador interno, promotor e gene exógeno de efeitos posicionais positivos e negativos do DNA envolvente na local de integração do cromossomo.
Quaisquer elementos genéticos adicionais são preferivel- mente inseridos 3' do gene de interesse.
Em uma realização específica, o vetor viral compreende:
uma seqüência incrementadora/promotora (CMV) de citomegalovírus; as seqüências R e U% do LTR 5' HIV; o sinal "flap" HIV-1; um aumenta- dor interno; um promotor interno; um gene de interesse; o elemento responsivo do vírus da hepatite da marmota; uma seqüência supressora âmbar tRNA; um elemento U3 com uma deleção de sua seqüência aumentadora; o isolante beta-globina de frango e as seqüências R e U5 do LTR 3' HIV.
O construto viral é preferivelmente clonado no plasmídeo que pode ser transfectado na linhagem de célula de empacotamento. O plasmídeo preferido preferivelmente compreende seqüências úteis para replicação do plasmídeo na bactéria.
Liberação do Vírus
O vírus pode ser liberado para uma célula alvo de qualquer modo que permita o vírus a contatar as células dendríticas alvo (DCs) nas quais a liberação de um polinucleotídeo de interesse é desejada. Em modalidades preferidas, uma quantidade apropriada de vírus é introdu- zida no animal diretamente (in vivo), por exemplo, através de injeção no corpo. Em algumas modalidades preferidas, as partículas virais são injetadas na corrente sangüínea periférica de um mamífero. Em outras modalidades preferidas, as partículas virais são injetadas no mamífero através de injeção intradermal, injeção subcutânea, injeção na cavidade intraperitoneal ou injeção intravenal. O vírus pode ser liberado usando um dispositivo de injeção sub-dermal tais como os dispositivos revela- dos nas Patentes US 7.241.275, 7.115.108, 7.108.679, 7.083.599, 7.083.592, 7.047.070, 6.971.999, 6.808.506, 6.780.171, 6.776.776, 6.689.118, 6.670.349, 6.569.143, 6.494.865, 5.997.501, 5.848.991, 5.328.483, 5.279.552, 4.886.499, todas as quais são incorporadas por referência em suas totalidades para todos os propósitos. Outros locais de injeção são também apropriados, tais como diretamente nos órgãos compreendendo células alvo. Por exemplo, injeção de nódulo intralinfa, injeção intrabaço ou injeção intramedula óssea podem ser usadas para liberaçãor o vírus ao nódulo da linfa, o baço e a medula óssea, respecti- vãmente. Dependendo das circunstâncias em particular e natureza das células alvo, a introdução pode ser efetuada através de outros meios incluindo, por exemplo, inalação ou contato direto com tecidos epiteli- ais, por exemplo, aqueles no olho, boca e pele.
Em outras modalidades, são providas células alvo e conta- tadas com o vírus in vitro, tal como em placas de cultura. As células alvo são tipicamente células dendríticas obtidas de um sujeito saudável ou um sujeito em necessidade de tratamento. Preferivelmente, as células alvo são células dendríticas obtidas de um sujeito em quem é desejado estimular uma resposta imuno a um antígeno. Métodos de obter células de um sujeito são bem conhecidos na técnica. O vírus pode ser suspenso em meio e adicionado aos poços de uma placa de cultura, tubo ou outro recipiente. O meio contendo o vírus pode ser adicionado à placa das células ou após as células terem sido colocadas na placa. Preferivelmente, as células são incubadas em uma quantidade apropriada do meio para fornecer viabilidade e para permitir concentra- ções apropriadas do vírus no meio de forma que a infecção das células hospedeiras ocorre.
As células são preferivelmente incubadas com o vírus pro uma quantidade suficiente de tempo para permitir ao vírus infectar as células. Preferivelmente, as células são incubadas com vírus por pelo menos 1 hora, mais preferivelmente por pelo menos 5 horas e ainda mais preferivelmente por pelo menos 10 horas.
Em ambas as modalidades de liberação in vivo e in vitro, qualquer concentração de vírus que é suficiente para infectar as células alvo desejadas pode ser usada, como pode ser prontamente determina- is do pelo técnico no assunto. Quando a célula alvo é para ser em cultura, a concentração de partículas virais é de pelo menos 1 PFU^L, mais preferivelmente de pelo menos 10 PFU/μι,, ainda mais preferivelmente pelo menos 400 PFU/μΐ, e ainda mais preferivelmente pelo menos 1 χ IO4 PFU/μΐ,.
Em algumas modalidades, após a infecção com o vírus in vi-
tro, as células alvo podem ser introduzidas (ou re-introduzidas) no animal. Em algumas modalidades, as células podem ser introduzidas na derme, sob a derme ou na corrente sangüínea periférica. As células introduzidas no animal são preferivelmente células derivadas daquele animal, para evitar uma resposta imuno adversa. As células que podem também ser usadas são derivadas de um animal doador tendo um antecedente imuno similar. Outras células também podem ser usadas, incluindo aquelas projetadas para evitar uma resposta imunogênica adversa. As células alvo podem ser analisadas, por exemplo, por in- tegração, transcrição e/ou expressão do polinucleotídeo ou gene(s) de interesse, o número de cópias do gene integrado e a localização da integração. Tais análises podem ser efetuadas a qualquer tempo e podem ser efetuadas por quaisquer métodos conhecidos na técnica.
Sujeitos nos quais um vírus recombinante ou DCs infecta- das com vírus são administrados podem ser analisados para localização das células infectadas, expressão do polinucleotídeo de liberação do vírus ou gene de interesse, estímulo de uma resposta imuno e monito- rado quanto aos sintomas associados com uma doença ou desordem por quaisquer métodos conhecidos na técnica.
Os métodos de infecção de células revelados acima não de- pendem das características específicas individuais das células. Como um resultado, eles são prontamente estendidos para todos os mamífe- ros. Em algumas modalidades, o vírus recombinante é liberado para uma pessoa humana ou células dendríticas de pessoa humana. Em outras modalidades, o vírus recombinante é liberado para um camun- dongo ou célula dendríticas de um camundongo. Em ainda outras modalidades, o vírus recombinante é liberado para um animal diferente de uma pessoa humana ou um camundongo, ou a células dendríticas de um animal diferente de uma pessoa humana ou camundongo.
Como discutido acima, o vírus recombinante pode ser pseudotipado para conferir a ele uma faixa de hospedeiro ampla bem como a especificidade da célula alvo.Uma pessoa versada na técnica também estaria avisada de promotores internos apropriados para alcançar a expressão desejada de um polinucleotídeo ou gene de inte- resse em uma espécie animal em particular. Assim, uma pessoa versa- da na técnica será capaz de modificar o método de infecção de células dendríticas derivadas de qualquer espécie.
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20 O vírus recombinante pode ser avaliado para determinar a especificidade da molécula direcionadora incorporada no vírus que se direciona a células dendríticas. Por exemplo, uma população misturada de células de medula óssea pode ser obtida de um sujeito e postas em cultura in vitro. O vírus recombinante pode ser administrado à popula- ção misturada de células de medula óssea, e a expressão de um gene relator incorporada no vírus pode ser testada nas células em cultura. Em algumas modalidades, pelo menos cerca de 50%, mais preferivel- mente pelo menos cerca de 60%, 70%, 80% ou 90%, ainda mais preferi- velmente pelo menos cerca de 95% de células transduzidas na popula- ção de células misturadas são células dendrítica que expressam a DC- SIGN.
Terapia
Os métodos da presente invenção podem ser usados para prevenir ou tratar uma ampla variedade de doenças ou desordens, particularmente aquelas nas quais uma resposta imuno em um pacien- te seria benéfica. Muitas de tais doenças são bem conhecidas na técni- ca. Por exemplo, doenças e desordens que são sensíveis ao tratamento ou prevenção pelos métodos da presente invenção incluem, sem limita- ção, cânceres, doenças auto-imunos e infecções, incluindo infecções virais, bacterianas, fúngicas e parasíticas. Em modalidades da inven- ção, uma doença é tratada ao usar vírus recombinantes para liberaçãor um gene de interesse às células dendríticas, onde a expressão do gene produz um antígeno específico para a doença e comanda o estímulo de respostas imunos celulares antígeno específicas e respostas imuno humorais.
Em modalidades da invenção, um vírus recombinante é u- sado para liberaçãor polinucleotídeos codificando um antígeno contra o qual uma resposta imuno é desejada para as células dendríticas. Em algumas modalidades, a liberação pode ser atingida ao contatar as células dendríticas com o vírus recombinante in vitro, depois do que as células dendríticas transduzidas são fornecidas a um paciente. Em algumas modalidades, a liberação pode ser alcançada ao se liberaçãor o vírus a um sujeito por contato com células dendríticas in vivo. As células dendríticas então estimulam células T ou células B antígeno específicas em um paciente para introduzir respostas imunos celulares e humorais para o antígeno expresso. Em tais modalidades, um pacien- te que está sofrendo de uma doença ou desordem é tratado pela geração de células imunos com uma especificidade desejada.
Qualquer antígeno que é associado com uma doença ou de-
sordem pode ser liberado às células dendríticas usando vírus recombi- nantes como descrito aqui neste documento. Um antígeno que é associ- ado com uma doença ou desordem é identificado para a preparação de um vírus recombinante que se direciona para células dendríticas.
Antígenos associados com muitas doenças e desordens são bem conhe- cidos na técnica. Um antígeno pode ser previamente conhecido para ser associado com a doença ou desordem, ou pode ser identificado por qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, um antígeno para um tipo de câncer do qual um paciente está sofrendo pode ser conheci-
do, tal como um antígeno associado a um tumor. Em um aspecto, a invenção fornece um método para liberação de genes codificando antí- genos de tumores e outras proteínas necessárias para DCs in vivo usando lentivírus recombinante projetado. Em outras modalidades, um antígeno relacionado à doença ou desordem é identificado do paciente a
ser tratado. Por exemplo, um antígeno associado com um tumor pode ser identificado do próprio tumor por qualquer método conhecido na técnica. Antígenos associados a tumores não são limitados de qualquer modo e incluem, por exemplo, antígenos que são identificados em células cancerígenas do paciente a ser tratado.
Antígenos associados a tumores são conhecidos para uma
variedade de cânceres, incluindo, por exemplo, câncer de próstata e câncer de seio. Em alguns cânceres de seio, por exemplo, o receptor Her-2 é superexpresso na superfície de células cancerosas. Antígenos de tumores exemplares incluem, mas, sem limitação: MAGE, BAGE, RAGE e NY-ESO, os quais são antígenos que não sofreram mutação expressos nas áreas imuno privilegiadas dos testes e em uma variedade de células de tumor; antígenos de tumor específico de linhagem tais como os antígenos da linhagem melanócito-melanoma MART-I/Melan- A, gplOO, gp75, mda-7, tirosinase e proteína relacionada a tirosinase ou o antígeno de membrana específico da próstata (PSMA) e antígeno específico da próstata (PSA), os quais são antígenos expressos em células normais e neoplásticas derivadas do mesmo tecido; epítope proteínas/peptídeos derivados de genes com mutação em células tumo- rais ou genes transcritos em diferentes níveis no tumor comparado à células normais, tal como ras com mutação, re-arranjo bcr/abl, Os exemplos Her2/neu, p53 com mutação ou do tipo original, citocromo P450 IBl e seqüências intron expressas anormalmente tal como a N- acetilglu-cosaminiltransferase-V; re-arranjos clonais de genes de imu- noglobulina gerando idiotipos únicos em mieloma e linfoma de célula B; epítope proteínas/peptídeos derivados de processos oncovirais, tal como proteínas E6 e E7 do vírus papiloma humano; proteínas oncofetais que não sofreram mutação com uma expressão seletiva a tumor, tal como o antígeno carcinoembriônico e alfa-fetoproteína. Um número de antíge- nos associados a tumor tem sido revisto (ver, por exemplo, "Tumor- Antigens Recognized By T-Lymphocytes", Boon, T, Cerottini, J C, Van- deneyde, B., Vanderbruggen, P., Vanpel, A., Annual Review of Immuno- logy, 12:337-365, 1994; "A listing of human tumor antigens recognized by Tcellsf, Renkvist, N., Castelli, C., Robbins, P.F., Parmiani, G., Cân- cer Immunology Immunotherapy, 50(1), 3-15, março de 2001, cada um dos quais é aqui incorporado neste documento por referência em sua totalidade).
O antígeno pode também ser um antígeno associado com uma doença infecciosa, tal como, por exemplo, HIV/AIDS. O antígeno pode ser, por exemplo, gpl20 (Klimstra, W.B. e colaboradores, 2003, J Virol, 77:12022-12032; Bernard, K.A. e colaboradores, 2000, Virology, 276:93-103; Byrnes, A.P. e colaboradores, 1998, J. Virol, 72:7349- 7356, cada um do qual é aqui incorporado neste documento por refe- rência em sua totalidade). Outros exemplos de antígenos incluem, mas, sem limitação: gag, pol, env, tat, nef e rev (Liebermann, J. e colaborado- res, 1997, AIDS Res Hum Retroviruses, 13(5): 383-392; Menendez-Arias, L. e colaboradores, 1998, Viral Immunol., 11(4): 167-181, cada um dos quais é aqui incorporado neste documento por referência em sua totali- dade) .
Exemplos de antígenos virais incluem, mas, sem limitação, polipeptídeos de adenovirus, polipeptídeos de alfavirus, polipeptídeos de calicivirus, por exemplo, um antígeno capsídeo calicivirus, polipeptídeos de coronavirus, polipeptídeos de virus de cinomose, polipeptídeos de vírus Ebola, polipeptídeos de enterovirus, polipeptídeos de flavivirus, polipeptídeos de vírus da hepatite (AE), por exemplo, um antígeno de superfície ou núcleo de hepatite B, polipeptídeos de vírus do herpes, por exemplo, um vírus simplex do herpes ou glicoproteína de vírus zoster varicela, polipeptídeos de vírus de imunodeficiência, por exemplo, envelope ou protease de vírus da imunodeficiência humana, polipeptí- deos do vírus de peritonite infecciosa, polipeptídeos de virus de influen- za, por exemplo, uma hemaglutinina influenza A, neuraminidase ou nucleoproteína, polipeptídeos de virus da leucemia, polipeptídeos do vírus de Marbug, polipeptídeos de ortomixovirus, polipeptídeos de vírus de papiloma, polipeptídeos de vírus parainfluenza, por exemplo, a hemaglutinina/neuraminidase, polipeptídeos de paramixovirus, poli- peptídeos de parvovirus, polipeptídeos de pestivirus, polipeptídeos de vírus picorna, por exemplo, um polipeptídeo capsídeo de poliovirus, polipeptídeos de vírus pox, por exemplo, um polipeptídeo de vírus vaccinia, polipeptídeos de vírus rabies, por exemplo, glicoproteína G de virus rabies, polipeptídeos de reovirus, polipeptídeos de retrovirus e polipeptídeos de rotavirus.
Os exemplos de antígenos bacterianos incluem, mas, sem limitação, polipeptídeos Actinomyces, polipeptídeos Bacillus, polipeptí- deos Bacteroides, polipeptídeos Bordetella, polipeptídeos Bartonella, polipeptídeos Borrelia, por exemplo, B. burgdorferi OspA, polipeptídeos Brucella, polipeptídeos Campilobacter, polipeptídeos Capnocitofaga, polipeptídeos Clamidia, polipeptídeos Clostridium, polipeptídeos Cori- nebacterium, polipeptídeos Coxiella, polipeptídeos Dermatofilus, poli- peptídeos Enterococus, polipeptídeos Ehrlichia, polipeptídeos Escheri- chia, polipeptídeos Francisella, polipeptídeos Fusobacterium, polipeptí- deos Hemobartonella, polipeptídeos Hemófilus, por exemplo, proteína da membrana externa tipo b H. influenzae, polipeptídeos Helicobacter, polipeptídeos Klebsiella, polipeptídeos de bactéria em forma de L, polipeptídeos Leptospira, polipeptídeos Listeria, polipeptídeos de Mico- bacteria, polipeptídeos de Micoplasma, polipeptídeos de Neisseria, polipeptídeos de Neorickettsia, polipeptídeos de Nocardia, polipeptídeos de Pasteurella, polipeptídeos de Peptococus, polipeptídeos de Peptos- treptococus, polipeptídeos de Pneumococcus, polipeptídeos de Proteus, polipeptídeos de Pseudomonas, polipeptídeos de Rickettsia, polipeptí- deos de Rochalimea, polipeptídeos de Salmonela, polipeptídeos de Sigela, polipeptídeos de Stafilococus, polipeptídeos de Streptococus, por exemplo, proteínas M de S. piogenes, polipeptídeos de Treponema e polipeptídeos de Iersinia, por exemplo, antígenos VeFl de Y. pestis.
Os exemplos de antígenos fúngicos incluem, mas, sem limi- tação, polipeptídeos Absidia, polipeptídeos Acremonio, polipeptídeos Alternaria, polipeptídeos de Aspergilus, polipeptídeos de Basidiobolus, polipeptídeos de Bipolares, polipeptídeos de Blastomices, polipeptídeos de Candida, polipeptídeos de Cocidioides, polipeptídeos de Conidiobo- lus, polipeptídeos de Criptococus, polipeptídeos de Curvalaria, polipep- tídeos de Epidermofiton, polipeptídeos de Exofiala, polipeptídeos Geotri- chum, polipeptídeos de Histoplasma, polipeptídeos de Madurela, poli- peptídeos de Malassezia, polipeptídeos de Microsporum, polipeptídeos de Moniliela, polipeptídeos de Mortierela, polipeptídeos de Mucor, polipeptídeos de Paecilomices, polipeptídeos de Penicilium, polipeptí- deos de Fialemonio, polipeptídeos de Fialofora, polipeptídeos de Protote- ca, polipeptídeos de Pseudalescheria, polipeptídeos de Pseudomicrodo- chium, polipeptídeos de Pitium, polipeptídeos de Rinosporidium, poli- peptídeos de Rizopus, polipeptídeos de Scolecobasidium, polipeptídeos de Sporotrix, polipeptídeos de Stemfilium, polipeptídeos de Tricofiton, polipeptídeos de Tricosporon e polipeptídeos de Xilohifa.
Os exemplos de antígenos de parasitas protozoários inclu- em, mas, sem limitação, polipeptídeos Babesia, polipeptídeos Balantidi- um, polipeptídeos Besnoitia, polipeptídeos Criptosporidium, polipeptí- deos Eimeria, polipeptídeos Encefalitozoon, polipeptídeos Entamoeba, polipeptídeos Giardia, polipeptídeos Hammondia, polipeptídeos Hepato- zoon, polipeptídeos Isospora, polipeptídeos Leishmania, polipeptídeos Microsporidia, polipeptídeos Neospora, polipeptídeos Nosema, polipeptí- deos Pentatricomonas, polipeptídeos Plasmodium, por exemplo, P. falciparum circunsporozoite (PfCSP), proteína de superfície sporozoite 2 (PfSSP2), antígeno 1 do estado do fígado de término carboxil (PfLSAl c- term) e proteína exportada 1 (PfExp-I), polipeptídeos Pneumocistis, polipeptídeos Toxoplasma e polipeptídeos Tripanosoma.
Os exemplos de antígenos de parasitas de helmintos inclu- em, mas, sem limitação, polipeptídeos de Acantoqueilonema, polipeptí- deos de Aelurostrongilus, polipeptídeos de Ancilostoma, carpolipeptí- deos de Angiostrongilus, polipeptídeos de Ascaris, polipeptídeos de Brugia, polipeptídeos de Bunostomum, polipeptídeos de Capilaria, polipeptídeos de Chabertia, polipeptídeos de Cooperia, polipeptídeos de Crenosoma, polipeptídeos de Dictiocaulus, polipeptídeos de Dioctofime, polipeptídeos de Dipetalonema, polipeptídeos de Difilobotrium, polipep- tídeos de Diplidium, polipeptídeos de Dirofílaria, polipeptídeos de Dracunculus, polipeptídeos de Enterobius, polipeptídeos Filaroides, polipeptídeos de Hemonchus, polipeptídeos de Lagoquilascaris, polipep- tídeos de Loa, polipeptídeos de Mansonela, polipeptídeos de Muelerius, polipeptídeos de Nanoíietus, polipeptídeos de Necator, polipeptídeos de Nematodirus, polipeptídeos de Oesofagostomum, polipeptídeos de Onchocerca, polipeptídeos de Opistorchis, polipeptídeos de Ostertagia, polipeptídeos de Paraülaria, polipeptídeos de Paragonimus, polipeptí- deos de Parascaris, polipeptídeos de Fisaloptera, polipeptídeos de Protostrongilus, polipeptídeos de Setaria, polipeptídeos de Spirocerca, polipeptídeos de Spirometra, polipeptídeos de Stefanofllaria, polipeptí- deos de Strongiloides, polipeptídeos de Strongilus, polipeptídeos de Telazia, polipeptídeos de Toxascaris, polipeptídeos de Toxocara, polipep- tídeos de Trichinela, polipeptídeos de Tricostrongilus, polipeptídeos deTrichuris, polipeptídeos de Uncinaria e polipeptídeos de Wuchereria.
Os exemplos de antígenos de ectoparasitas incluem, mas,
sem limitação, polipeptídeos (incluindo antígenos protetores bem como alergênicos) de pulgas; carrapatos, incluindo carrapatos duros e carra- patos macios; moscas, tais como mosquito-pólvora, mosquitos, moscas de areia, moscas negras, moscas de cavalo, moscas do chifre, moscas de veados, moscas tsé-tsé, moscas de estábulos, moscas causadoras de miases e mosquito picadores; formigas; aranhas; piolhos; mitas e besouros verdadeiros, tais como besouros de cama e besouros de conenose.
Uma vez que o antígeno tenha sido identificado e/ou sele- cionado, um polinucleotídeo que codifica o antígeno desejado é identifi- cado. Preferivelmente, o polinucleotídeo compreende um cDNA. Os polinucleotídeos codificando o antígeno são preferivelmente introduzi- dos nas células dendríticas alvo usando um virus recombinante, mais preferivelmente um lentivirus ou gamaretrovirus recombinante, incluin- do uma molécula direcionadora que se liga à DC-SIGN como descrito acima. O virus recombinante primeiro se liga à membrana da célula dendrítica por meio da molécula direcionadora DC-SIGN, e o núcleo viral contendo um polinucleotídeo codificando o antígeno subseqüente- mente entra no citosol. O polinucleotídeo (por exemplo, um codificando o antígeno) é então preferivelmente integrado no genoma da célula e expresso. Se contatado ex vivo, as células dendríticas alvo são então transferidas de volta para o paciente, por exemplo, por injeção, onde elas interagem com células imunos que são capazes de gerar uma resposta imuno contra o antígeno desejado. Em modalidades preferidas, o virus recombinante é injetado no paciente onde ele transduz as células dendríticas direcionadas in situ. As células dendríticas então expressam o antígeno particular associado com a doença ou desordem a ser tratada e o paciente está capaz de montar uma resposta imuno efetiva contra a doença ou desordem.
Em algumas modalidades, o vírus recombinante contém uma seqüência de polinucleotídeo codificando mais do que um antíge- no, e sob a transdução de uma célula dendrítica direcionada, gera respostas imunos para a multitude de antígenos liberados à célula. Em algumas modalidades, os antígenos são relacionados a uma doença ou desordem única. Em outras modalidades, os antígenos são relacionados a múltiplas doenças ou desordens.
Em modalidades da invenção, fatores de maturação de DC que ativam e/ou estimulam a maturação de DCs são liberados em conjunto com o vírus recombinante carregando o polinucleotídeo ou gene de interesse. Em algumas modalidades, as DCs são ativadas pela liberação de fatores de maturação de DC antes da liberação do vírus. Em algumas modalidades, as DCs são ativadas pela liberação de fatores de maturação de DC após a liberação do vírus. Em algumas modalida- des, as DCs são ativadas pela liberação dos fatores de maturação de DC simultaneamente com a liberação do vírus. Em algumas modalidades, os fatores de maturação de DC são providos junto com a administração do vírus. Em outras modalidades, os fatores de maturação de DC são proporcionados separadamente da administração do vírus.
Em certas modalidades, um ou mais fatores de maturação de DC podem ser codificados por um ou mais genes que estão contidos no vírus e expressos após o vírus transduzir a célula dendrítica. Em algumas modalidades, o um ou mais genes codificando os fatores de maturação de DC podem ser incluídos no vetor viral codificando um antígeno. Em modalidades adicionais, o um ou mais genes codificando os fatores de maturação de DC podem ser incluídos em um vetor viral que codifica mais do que um antígeno. Em algumas modalidades, podem ser proporcionados um ou mais genes que codificam os fatores de maturação de DC providos num vetor separado que é co-transfectado com o vetor viral codificando um ou mais antígenos em uma linhagem de células de empacotamento.
Em algumas modalidades, os métodos da presente invenção podem ser usados para imunoterapia adotiva em um paciente. Como descrito acima, um antígeno contra o qual uma resposta imuno é desejada é identificado. Um polinucleotídeo codificando o antígeno desejado é obtido e empacotado em um virus recombinante. Células dendríticas alvo são obtidas do paciente e transduzidas com u virus recombinante contendo um polinucleotídeo que codifica o antígeno desejado. As células dendríticas são então transferidas de volta para o paciente.
Vacinação
Como discutido acima, várias moléculas direcionadoras projetadas que se ligam ao marcador da célula dendrítica de superfície DC-SIGN são contemplados para uso na produção de vírus recombinan- te que liberação um gene codificando um antígeno às DCs. O vírus pode ser usado para transduzir DCs in vitro ou in vivo para prevenção de uma doença ou desordem. Por exemplo, a glicoproteína do envelope do vírus Sindbis pode ser projetada para se ligar preferencialmente à DC-SIGN e usada para pseudotipar um vírus recombinante. Um gene codificando um antígeno contra o qual uma resposta imuno é desejada, tal como para câncer (por exemplo, Mart-1) ou outra doença/desordem (tal como uma infecção viral) pode ser liberado às DCs usando métodos descritos aqui neste documento. Em algumas modalidades, múltiplos genes codificando múltiplos antígenos podem ser liberados às DCs usando métodos descritos aqui neste documento, através do uso de múltiplos vetores virais, ou, preferencialmente, um sistema de vetor multicistrônico. O um ou mais genes para o um ou mais antígenos podem ser acompanhados por genes codificando moléculas estimulató- rias (tal como GM-CSF, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15, IL-21, IL-23, TNF-a, B7.1, B7.2, 4-1BB, ligante CD40 (CD40L) e CD40 droga indutor (ÍCD40) (Hanks, e colaboradores, 2005, Nat Med.. 11:130-137, o qual é aqui incorporado neste documento por referência em sua totalidade) e/ou uma molécula relatora (tal como GFP, luciferase e semelhantes) usando múltiplos vetores ou, preferivelmente, um sistema de vetor multicistrô- nico.
Em algumas modalidades da invenção, DCs humanas são geradas pela obtenção de progenitores hematopoiéticos humanos CD34a+ e usando um método de cultura in vitro como descrito em qualquer lugar (por exemplo, Banchereau e colaboradores, Cell, 106, 271-274 (2001)). Os vírus tendo uma molécula direcionadora que se liga à DC-SIGN são gerados compreendendo um gene codificando um antígeno contra o qual uma resposta imuno é desejada e são usados para transduzir DCs de humanos. A especificidade e eficiência da transdução podem ser quantificadas pela FACS. A maturação das DCs pode ser caracterizada pela análise FACS de regulação para cima do marcador de superfície tal como o MHC II.
Em outras modalidades, o vírus pode ser injetado in vivo,
onde ele contata DCs naturais e liberação um polinucleotídeo de inte- resse, tipicamente um gene codificando um antígeno. A quantidade de partículas virais é pelo menos 50 χ IO6 TU, e pode ser pelo menos 1 χ IO7 TU, pelo menos 2 χ IO7 TU, pelo menos 3 χ IO7 TU, pelo menos 4 χ IO7 TU ou pelo menos 5 χ IO7 TU. Em intervalos selecionados, as DCs de órgãos linfóide de recipiente podem ser usadas para medir a expres- são, por exemplo, pela observação da expressão do marcador, tal como um GFP ou luciferase. As células T dos nódulos linfáticos e baço dos recipientes tratados com virus podem ser medidas pela magnitude e durabilidade da resposta ao estímulo do antígeno. Células do tecido outras que as DCs, tais como as células epiteliais e células linfóides, podem ser analisadas quanto à especificidade da liberação de gene in vivo.
É amplamente aceito que o método potencial mais efetivo para terminar a epidemia da AIDS (e outras doenças virais) é uma vacina. Até hoje, nenhum método de vacinação contra o HIV passou com sucesso de um teste na fase III. Assim, existe uma urgente neces- sidade para novas e efetivas estratégias de vacinação. Em algumas modalidades da invenção, a vacinação DC é usada. Um gene é clonado codificando uma proteína viral, tais como aquelas descritas acima, em um vetor viral. Pacientes infectados com os vírus compreendendo uma molécula direcionadora que se liga à DC-SIGN nas DCs, preferivelmente com uma especificidade tal que efeitos colaterais indesejáveis são evitados. A molécula direcionadora pode ser, por exemplo, uma glico- proteína de envelope de vírus de Sindbis projetada e a administração do vírus pode ser efetuada, por exemplo, por injeção. Em um modelo animal, vírus relatores HIV clonados molecularmente (NFNSZ-r-HSAS, NL-r-HSAS) e isolados clínicos podem ser usados para testar os animais por injeção por veia final. A evidência da infecção pode ser monitorada durante o tempo em esplenócitos, nódulos linfáticos e sangue periférico. O PCR para a proteína HlV-gag e FCAS para a HAS nos vírus relatores podem ser usados para testar a integração e replicação viral. A vacina- ção de DC in situ produtiva pode aumentar a resistência a um teste de HIV. Veja Exemplos 17-20.
Em algumas modalidades, são proporcionadas as células dendríticas transduzidas com um virus recombinante como descrito aqui neste documento para a prevenção ou tratamento de uma doença ou desordem. Em modalidades preferidas, as células dendríticas expressam um antígeno contra o qual uma resposta imuno é desejada. O antígeno é tipicamente um que não é normalmente expresso em uma célula dendrítica, mas é expresso após a célula alvo ser transduzida com o vírus recombinante contendo um polinucleotídeo codificando um antígeno. Em algumas modalidades, as células dendríticas ainda ex- pressam um fator de maturação de DC que é fornecido para a célula dendrítica por um vírus recombinante como descrito aqui neste docu- mento.
Em alguns aspectos da invenção, um adjuvante é adminis-
trado em conjunto com um vírus recombinante da invenção. O adjuvan- te pode ser administrado com o vírus recombinante, antes do vírus recombinante ou após o vírus recombinante.
Uma variedade de adjuvantes pode ser usada em combina- ção com o vírus recombinante da invenção para induzir uma resposta imuno ao antígeno codificado para o virus recombinante. Adjuvantes preferidos aumentam a resposta intrínseca para um antígeno sem causar mudanças conformacionais no antígeno que afetem a forma qualitativa da resposta. Adjuvantes preferidos incluem alume, 3 De-O- acilado monofosforil lipídeo A (MPL) (ver GB 2.220.211). A QS21 é um triterpeno glicosídeo ou saponina isolada da casca da árvore Quillaja Saponaria Molina encontrada na América do Sul (ver, Kensil e colabo- radores, in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approaeh (eds. Powell 86 Newman, Plenum Press, NY, 1995); Patente US 5.057.540). Outros adjuvantes são emulsões óleo em água (tal como esqualeno ou óleo de amendoim), opcionalmente em combinação com estimulantes imunos, tais como um lipídeo monofosforil A (ver Stoute e colaborado- res, N. Engl J. Med., 336, 86-91(1997)). Outro adjuvante é o CpG (Bioworld Today, nov. 15, 1998). Alternativamente, Αβ pode ser acopla- do a um adjuvante. Por exemplo, uma versão lipopeptídeo de Αβ pode ser preparado pelo acoplamento de ácido palmítico ou outros lipídeos diretamente ao terminal-N de Αβ como descrito para a vacinação com antígeno da hepatite B (Livingston, J. Immunol., 159, 1383-1392 (1997)). Todavia, tal acoplamento não mudaria substancialmente a conformação de Αβ de forma a afetar a natureza da resposta imuno ao mesmo. Adjuvantes podem ser administrados como um componente de uma composição terapêutica com um agente ativo ou pode ser adminis- trado separadamente, antes, concorrentemente com ou após a adminis- tração do agente terapêutico.
Uma classe preferida de adjuvantes são os sais de alumínio
(alume), tais como hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, sulfato de alumínio. Tais adjuvantes podem ser usados com ou sem outros agen- tes imunoestimulantes tais como MPL ou 3-DMP, QS21, aminoácidos poliméricos e monoméricos tais como ácido poliglutâmico ou polilisina. Outra classe de adjuvantes são formulações de emulsão óleo em água. Tais adjuvantes podem ser usados com ou sem outros agentes imuno- estimulanmtes específicos tais como peptídeos de muramil (por exem- plo, N-acetilmuramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil- normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), N-acetilmuramil-L- alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-( r-2'dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxi- fosforiloxi)-etilamina (MTP-PE), N-acetilglucsaminil-N-acetilmuramil-L- A1 -D-isoglu-L-Ala-dipalmitoxi propilamida (DTP-DPP) teramida®, ou outros componentes da parede celular bacteriana. Emulsões óleo em água incluem (a) MF59 (W090/14837), contendo 5% de Esqualeno, 0,5% de Tween 80 e 0,5% de Span 85 (opcionalmente contendo vária quantidades de MTP-PE) formulada em partículas submicrônicas usando um microfluidizador tal como o microfluidizador Model IlOY (Microfluidics, NewtonMA), (b) SAF, contendo 10% de Esqualeno, 0,4% de Tween 80, 5% de polímero pluronic bloqueado Ll21 e thr-MDP, seja microfluidizado em emulsão submicron ou posto em vortex para gerar uma emulsão com tamanho de partícula maior, e (c) sistema adjuvante Ribi® (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, MT) contendo 2% de esqua- leno, 0,2% de Tween 80 e um ou mais componentes da parede celular bacteriana do grupo consistindo de monofosforilipideo A (MPL), trealose dimicolato (TDM) e esqueleto da parede celular (CWS), preferivelmente MPL + CWS (Detox®). Outra classe de adjuvantes preferidos são adju- vantes de saponina, tais como Stimulon® (QS21, Aquila, Worcester, MA) ou partículas geradas dos mesmos tais como ISCOMs (complexos imunoestimulantes) e ISCOMATRIX. Outros adjuvantes incluem Adju- vante de Freund Completo (CFA) e Adjuvante de Freund Incompleto (IFA). Outros adjuvantes incluem citocinas, tais como as interleucinas (IL-1, IL-2 e IL-12), fator de estímulo de colônia de macrófago (M-CSF), fator de necrose de tumor (TNF).
Um adjuvante pode ser administrado com o vírus recombi- nante da invenção como uma composição única ou pode ser adminis- trado antes, concorrentemente ou após a administração do vírus re- combinante da invenção. Imunogênio e adjuvante podem ser empacota- dos e supridos no mesmo frasco ou podem ser empacotados em frascos separados e misturados antes do uso. O imunogênio e adjuvante são tipicamente empacotados com um rótulo indicando a aplicação terapêu- tica pretendida. Se o imunogênio e adjuvante são empacotados separa- damente, o pacote tipicamente inclui instruções para mistura antes do uso. A escolha de um adjuvante e/ou veículo depende da estabilidade da vacina contendo o adjuvante, a rota de administração, o programa de dosagem, a eficácia do adjuvante para as espécies sendo vacinadas e, em humanos, um adjuvante aceitável farmaceuticamente é um que tenha sido aprovado ou está aprovável para administração humana pelos corpos regulatórios pertinentes. Por exemplo, o adjuvante de Freund Completo não é apropriado para administração humana. Alu- me, MPL e QS21 são preferidos. Opcionalmente, dois ou mais adjuvan- tes diferentes podem ser usados simultaneamente. Combinações prefe- ridas incluem alume com MPL, alume com QS21, MPL com QS21 e alume, QS21 e MPL juntos. Também, adjuvante de Freund Incompleto pode ser usado (Chang e colaboradores, Advanced Drug Delivery Revi- ews, 32, 173-186 (1998)), opcionalmente em combinação com qualquer de alume, QS21 e MPL e todas as combinações dos mesmos.
Composições Farmacêuticas e Kits
Também contemplado aqui neste documento estão compo- sições farmacêuticas e kits contendo um vírus recombinante fornecido aqui neste documento e um ou mais componentes. As composições farmacêuticas podem incluir um vírus recombinante provido aqui neste documento e um veículo farmacêutico. Os kits podem incluir as com- posições farmacêuticas e/ou combinações fornecidas aqui neste docu- mento e um ou mais componentes, tais como instruções para uso e um dispositivo para administrar um composto a um sujeito.
São proporcionadas aqui neste documento composições farmacêuticas contendo um vírus fornecido aqui neste documento e um veículo farmacêutico apropriado. As composições farmacêuticas provi- das aqui neste documento podem ser de várias formas, por exemplo, na forma sólida, líquida, em pó, aquosa ou liofilizada. Exemplos de veículos farmacêuticos apropriados são conhecidos na técnica. Tais veículos e/ou aditivos podem ser formulados por métodos convencionais e podem ser administrados ao sujeito em uma dose apropriada. Agentes de estabilização tais como lipídeos, inibidores de nuclease, polímeros e agentes quelantes podem preservar as composições da degradação dentro do corpo. O vírus recombinante provido aqui neste documento pode ser empacotado como kits. Kits podem opcionalmente incluir um ou mais componentes tais como instruções para uso, dispositivos e reagen- tes adicionais e componentes, tais como tubos, containeres e seringas para a prática do método. Kits exemplares podem incluir os vírus proporcionados aqui neste documento e podem opcionalmente fornecer instruções para uso, um dispositivo para detecção de um vírus em um sujeito, um dispositivo para administração do vírus a um sujeito e um dispositivo para administração de um composto a um sujeito.
Os kits compreendendo polinucleotídeos que codificam um
gene de interesse (tipicamente um antígeno) são também contemplados aqui neste documento. Em algumas modalidades, o kit inclui pelo menos um plasmídeo codificando componentes de empacotamento de vírus e vetor codificando uma molécula direcionadora que é projetada para se ligar às células dendríticas, preferivelmente com especificidade. Em algumas modalidades, o kit inclui pelo menos um plasmídeo codifi- cando componentes de empacotamento de vírus, um vetor codificando uma molécula direcionadora que é projetada para se ligar a células dendríticas e um vetor codificando pelo menos um fator de maturação de DC.
Os kits compreendendo um vetor viral que codifica um gene de interesse (tipicamente um antígeno) e opcionalmente, uma seqüência de polinucleotídeo codificando um fator de maturação de DC são tam- bém contemplados aqui neste documento. Em algumas modalidades, o kit inclui pelo menos um plasmídeo codificando componentes de empa- cotamento de vírus e vetor codificando uma molécula direcionadora que é projetada para se ligar às células dendríticas.
Num exemplo, um kit pode conter instruções. As instru- ções tipicamente incluem uma expressão tangível descrevendo o vírus e, opcionalmente, outros componentes incluídos no kit e métodos para a administração, incluindo métodos para determinar o estado apropriado do sujeito, a quantidade de dosagem apropriada e o método de adminis- tração apropriado, para a administração do vírus. As instruções podem também incluir um guia para monitoramento do sujeito durante a duração do tempo de tratamento.
Os kits fornecidos aqui neste documento podem incluir um dispositivo para administração do vírus a um sujeito. Qualquer uma de uma variedade de dispositivos conhecidos na técnica para a adminis- tração de medicamentos ou vacinas pode ser incluída nos kits forneci- dos aqui neste documento. Dispositivos exemplares incluem, mas, sem limitação, uma agulha hipodérmica, uma agulha intravenosa, um cateter, um dispositivo de injeção sem agulha, um inalador, um dispen- sador de líquido, tal como um colírio. Tipicamente, o dispositivo para a administração do vírus do kit será compatível com o vírus do kit; por exemplo, um dispositivo de injeção sem agulha tal como um dispositivo de injeção a alta pressão pode ser incluído nos kits com os vírus não danificados pela injeção a alta pressão, mas é tipicamente não incluído em kits com vírus danificados por injeção a alta pressão.
Os kits providos aqui neste documento também podem in- cluir um dispositivo para administração de um composto, tal como um ativador ou estimulador de DC, a um sujeito. Qualquer uma de uma variedade de dispositivos conhecidos na técnica para a administração de medicamentos a um sujeito pode ser incluída nos kits fornecidos aqui neste documento. Dispositivos exemplares incluem uma agulha hipodérmica, uma agulha intravenosa, um cateter, uma injeção sem agulha, mas, sem limitação, uma agulha hipodérmica, uma agulha intravenosa, um cateter, um dispositivo de injeção sem agulha, um inalador, um dispensador de líquido, tal como um colírio. Tipicamente, o dispositivo para a administração do composto do kit será compatível com o método desejável de administração do composto. Os seguintes exemplos são oferecidos com propósitos ilus- trativos apenas e não se pretende que limitem o escopo da presente invenção de qualquer modo. Na verdade, várias modificações da inven- ção em adição àquelas mostradas e descritas aqui neste documento se tornarão aparentes àqueles versados na técnica a partir da descrição precedente caem dentro do escopo das reivindicações anexadas.
Todas as patentes e literaturas de referências citadas na presente especificação são aqui incorporadas por referência em suas totalidades.
Exemplo 1
Projetando uma Molécula Direcionadora DC Específica
Os vetores lentivirais podem ser racionalmente projetados para fazê-los capazes de transduzir DCs de um modo célula específica. Certos sob-conjuntos de DCs possuem em suas superfícies a proteína DC-SIGN (Geijtenbeek, T.B. e colaboradores, 2000; Geijtenbeek, T.B. e colaboradores, 2000, supra), um receptor semelhante à lectina tipo C capaz de rápida ligação e endocitose de materiais (Geijtenbeek, T.B. e colaboradores, 2004, supra), o qual pode ser usada como um receptor direcionador em DCs. O vírus Sindbis (SV) - um membro do gênero Alfavírus e da família Togaviridae - é capaz de infectar DCs através da DC-SIGN (Klimstra, W.B. e colaboradores, 2003, J. Virol., 77: 12022- 12032, o qual é aqui incorporado neste documento por referência em sua totalidade). Todavia, o receptor viral canônico para a cepa de labo- ratório do SV é o sulfato de heparana de superfície de célula (HS), o qual é expresso por muitos tipos de células (Strauss, J.H. e colaborado- res, 1994, Arch. Virol., 9: 473-484; Byrnes, A.P. e D.E. Griffin, 1998, J. Virol., 72: 7349-7356, cada um dos quais é aqui incorporado neste documento por referência em sua totalidade). Levando vantagem da separação física dos dois sítios de ligação-receptor na glicoproteína de envelope SV (daqui em diante designada como SVG), o receptor foi projetado para se cego ao seu alvo de ligação canônico HS e para deixar intacta sua habilidade de interagir com a DC-SIGN (Figura 1). Uma vez que ela é incorporada na superfície viral, esta glicoproteína mutante é capaz de mediar a infecção de DCs, mas não as outras células.
O cDNA para o tipo original SVG foi obtido do laboratório do Dr. J.H. Strauss, laboratório no Califórnia Institute of Technology e clonado no vetor pcDNA3 (Invitrogen) pelo PCR para gerar o plasmídeo pSVG. Uma seqüência identificadora de dez resíduos (MYPYDVPDYA) foi inserida na proteína E2 entre os aminoácidos 71 e 74 pela mutagê- nese do PCR para quebrar o sítio de ligação da HS (Karavans, G. e colaboradores, 1998, Crit. Rev. Oncol. Hemat., 28: 7-30; Lavillete, D. e colaboradores, 2001, Curr. Opin. Biotech., 12: 461-466; Russel, S.J. e F.L. Cosset, 1999, J. Gene. Med., 1: 300,311; Sandrin, V. e colaborado- res, 2003, Curr. Top Microbiol., 281: 137-178; Verhoeyen, E. e F.L. Cosset, 2004, J. Gene Med., 6: S83-S94, cada um dos quais é aqui incorporado neste documento por referência em sua totalidade). Um anticorpo disponível contra a seqüência identificadora inserida fornecia a habilidade para monitorar a expressão do SVG modificado. De forma a diminuir adicionalmente a infecção HS específica, diversos resíduos críticos foram identificados como sendo envolvidos na ligação a molécu- las HS (Coffin, J.M. e colaboradores, 1997, Retrovírus, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press; Battini, J.L. e colaboradores, 1998, J. Virol., 72: 428-435; Valsesiawittmann, S. e colaboradores, 1994, J. Virol., 68: 4609-4619; Wu, B.W. e colaboradores, 2000, Virology, 269: 7-17; Cosset, F.L. e colaboradores, 1995, J. Virol. 69: 6314-6322; Kayman, S.C. e colaboradores, 1999, J. Virol., 73: 1802-1808; Lorimar, I.A.J. e S.J. Lavictoire, 2000, J. Immunol Methods, 237: 147-157; Barnett, A.L. e colaboradores, 2001, Proc Nat Acad Sci USA, 98: 4113- 4118; Benedict, C. A. e colaboradores, 2002, Hum. Gene Ther., 10: 545-557; Gollan, T.J. e M.R. Green, 2002, J. Virol., 76:3558-3563, cada um dos quais é aqui incorporado neste documento em sua totalidade. Dois de tais resíduos foram mudados para alaninas (157KE158 a 157AA158).
Uma deleção adicional foi introduzida para a glicoproteína E3 do SVG para remover aminoácidos 61-64. Este SVG modificado foi designado como SVGmu (SEQ ID NO: 11). O cDNA para o SVGmu foi clonado a jusante do promotor CMV no vetor pcDNA3 (designado como pSVGmu, SEQ ID NO: 3).
Exemplo 2
Preparação de Vírus Recombinante
Contendo uma Molécula Direcionadora DC Específica
A preparação do lentivírus pseudotipado SVGmu recombi- nante foi conduzida pela transfecção transiente mediado por fosfato de cálcio padrão de células 293T com o vetor lentiviral FUGW (SEQ ID NO: 1) ou seus derivados, os construtos de empacotamento codificando genes gag, pol e rev e pSVGmu (Exemplo 1). O FUGW é um vetor lentivi- ral auto-inativante carregando o promotor ubiquitina-C humano para direcionar a expressão de um gene relator GFP (Lois, C. e colaborado- res, 2002, Science, 295: 868-872, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade). Os vetores de transferência lentivirais (FUGW e seus derivados) usados nestes estudos são vetores lentivirais baseados no HIV de terceira geração, nos quais a maior parte da região U3 do LTR 3* é deletado, resultante em um LTR- 3' auto - inativante (SIN).
Para a transfecção transiente das células 293T, as células 293T foram postas em cultura em pratos de cultura de tecido de 6 cm (Corning ou BD Biosciences) foram transfectadas com o plasmídeo de vetor de transferência lentiviral apropriado (5 μg), junto com 2,5 μg cada do plasmídeo de envelope (SVG, SVGmu, Eco ou VSVG) e os plasmídeos de empacotamento (pMDLg/pRRE e pRSV-Rev). Os sobrenadantes virais foram coletados 48 e 72 horas pós-transfecção e filtrados através de um filtro de 0,45 μιη (Corning). Para preparar vetores virais concen- trados para estudo in vivo, os sobrenadantes virais foram ultra centri- fugados (Optima L-80 K ultra centrífuga preparativa, Beckman Coulter) a 50.000 χ g por 90 min. As pelotas foram então re-suspensas e um volume apropriado de PBS frio.
Os vírus pseudotipados resultantes com SVGmu são daqui em diante referidos como FUGW/SVGmu. Os vírus de controle envelo- pados com a glicoproteína SVG do tipo original são daqui em diante referidos como FUGW/SVG.
Exemplo 3
Imagem Confocal
do Vírus Recombinante Bmpacotado
Lentivetores rotulados vpr-GFP foram produzidos como des-
crito no Exemplo 2, exceto com o uso do lentivetor FUW (o qual não contém o gene relator GFP) e com um plasmídeo separado codificando vpr-GFP (2,5 μg). Sobrenadante viral fresco foi repousado em coberturas revestidas com polilisina em um prato de cultura de 6 poços e centrifu- gado a 3.700 χ g a 4°C por 2 horas usando uma centrífuga Sorvall Legend RT. As coberturas foram rinsadas com PBS frio duas vezes e imuno tingidas com anticorpo anti-HA-biotina (Miltenyi Bioetc) e Cy5- streptavidina (Invitrogen). Imagens fluorescentes foram tomadas com um microscópio confocal de varredura a laser Zeiss LSM 510 equipado com conjuntos de filtros para fluoresceína e Cy5. Uma objetiva de imersão em óleo plano-apocromático (63x/1.4) foi usado para imagem.
A Figura 2 mostra os resultados da imagem confocal do ví- rus recombinante produzido pelo protocolo. (A barra de escala represen- ta 2 μπι). Partículas no slide "GFP" foram tingidas de verde, partículas no slide "SVGmu" são tingidas de vermelho e partículas no slide "Mistu- rado" foram tingidas de verde onde apenas GFP é expresso, vermelho onde apenas SVGmu é expresso onde e amarelo/amarelo-laranja onde GFP e SVGmu são ambos expressados. Mais do que 90% das partículas rotuladas de GFP continham SVGmu. Assim, a produção de partículas lentivirais mostrando SVGmu foi confirmada através da imagem confo- cal.
Exemplo 4
Preparação de Linhagens de Células DC-Sign
Para facilitar o estudo da transdução direcionada, linhagens de células DC-SIGN expressando DC-SIGN humano (daqui para a frente referido como 293T.hDCSIGN) e DC-SIGN murino (daqui em diante referido como 293T.mDCSIGN) foram elaboradas. As linhagens de células 293T.hDCSIGN e 293T.mDCSIGN foram geradas pela transdu- ção estável de células 293T originais com um lentivetor VSVG pseudoti- pado. Os cDNAs para DC-SIGN humano e DC-SIGN murino foram amplificados dos plasmídeos pUNO-hDCSIGNNlAa e pUNO-mDCSIGN (InvivoGene) e clonados a jusante do promotor ubiquitina-C humano no plasmídeo lentiviral FUW para gerar FUW-hDCSIGN (SEQ ID NO: 5) e FUW-mDCSIGN (SEQ ID NO: 6), respectivamente. Os lentivetores foram então submetidos a tingimento de anticorpo (anticorpo DC-SIGN anti- humano da BD Biosciences e DC-SIGN anti-murino da eBioscience) e classificação de células para produzir uma população uniforme de linhagens de células DC-SIGN+ 293T.hDCSIGN e mDC-SIGN+ 293T.mDCSIGN.
A citometria de fluxo mostrou que a DC-SIGN foi expressa em virtualmente todas as células 293T.hDCSIGN e 293T.mDCSIGN da linhagem de células (Figura 3A). Em cada diagrama, as linhas sólidas (área não preenchida) representa a expressão da DC-SIGN nas linha- gens de células 293T DC-SIGN e a área sombreada representa o tingi- mento de fundo das células 293T não transduzidas.
Exemplo 5
Avaliação do Vírus Recombinante DC-Sign Específico
por Transdução de Linhagens de Células DC-Sign
Para acessar a eficiência e especificidade de transdução da FUGW/SVG ou FUGW/SVGmu (Exemplo 2), os vírus foram usados para transduzir as linhagens de células 293T.hDCSIGN e 293T.mDC- SIGN (Exemplo 4). A eficiência de transdução foi medida pela expressão da GFP dentro das linhagens de células.
As células alvo (células 293T.hDCSIGN, 293T.mDCSIGN ou 293T; 0,2 χ IO6 por poço) foram postas em um prato de cultura de 24 poços (Corning ou BD Biosciences) e infectadas por rotação com os sobrenadantes virais (1 ml por poço) a 2.500 rpm e 30°C por 90 min usando uma centrífuga Sorvall Legend. Subseqüentemente, os sobrena- dantes foram substituídos com meio de cultura fresco e incubados por 3 dias a 37°C com 5% de CO2. A percentagem de células GFP+ foi medida por citometria de fluxo. O título da transdução foi determinado pelas faixas de diluições que exibiram uma resposta linear.
A citometria de fluxo mostrou que a FUGW/SVG (contendo a glicoproteína de envelope SVG do tipo original) tinha uma eficiência de transdução (11-16% transdução) em direção das três linhagens de células alvo (293T, 293T.hDCSIGN e 293T.mDCSIGN) (Figura3B). Isto indica que a SVG tem ampla especificidade e a presença da DC-SIGN na superfície da célula não altera marcadamente a habilidade de transdu- ção de um vetor lentiviral SVG pseudotipado. Pelo contrário, o vetor FUGW/SVGmu (contendo a glicoproteína de envelope SVG mutante) poderia especificamente transduzir as células 293T.hDCSIGN e 293T.mDCSIGN com uma eficiência de transdução de 42% e 34%, respectivamente mas não as células 293T (Figura 3B). Estes resultados demonstram que um vetor lentiviral pseudotipado mostrando SVGmu pode especificamente transduzir células expressando seja DC-SIGN humano ou murino. Além disso, o SVG mutante deu transdução mais eficiente das células expressando DC-SIGN do que a SVG do tipo origi- nal.
A integração estável do vetor lentiviral FUGW nas células transduzidas foi confirmada por análise de PCR da integração genômica do gene relator GFP. Para demonstrar que a transdução específica foi mediada pela DC-SIGN, a adição de anticorpo DC-SIGN anti-humano solúvel para o sobrenadante viral FUGW/SVGmu antes de sua exposi- ção às células 293T.hDCSIGN reduziu a eficiência de transdução (dados não mostrados). O título específico do FUGW/SVGmu para a 293T.mDCSIGN foi estimado ser 1 χ IO6 TU (Unidades de Transdu- ção)/ml. O título da FUGW/SVGmu para a 293T.mDCSIGN foi estimado ser 1-2 χ 10* TU/ml.
Exemplo 6
Avaliação do Vírus Recombinante in Vitro
Para investigar a especificidade do lentivetor projetado para a transdução de células dendríticas (DCs) expressando a DC-SIGN, células da medula óssea total (BM) foram isoladas de camundongos e transduzidas diretamente com o vetor viral FUGW/SVGmu (Exemplo 2). Um protocolo para gerar DCs de camundongos de progenitores cresci- dos em culturas BM foi adaptado para uso no experimento (Buchholz, C.J. e colaboradores, 1998, Nat. Biotech., 16: 951-954, o qual é aqui incorporado neste documento por referência em sua totalidade).
As células de medula óssea total foram coletadas de ca- mundongos fêmeas B6 (Charles River Breeding Laboratories), e BMDCs foram geradas como descrito em qualquer lugar (Yang, L. e D. Baltimo- re, 2005, Proc. Natl Acad. Sei. USA, 102:4518-4523, o qual é aqui incorporado neste documento por referência em sua totalidade). Ou as células BM totais ou BMDCs foram postas em um prato de cultura de 24 poços (2 χ IO6 células por poço) e infectadas por rotação com o sobrenadante viral (1 ml por poço) a 2.500 rpm e 30°C por 90 min usando uma centrífuga Sorvall RT7. Após a rotação, o sobrenadante foi removido e substituído com meio RPMI fresco contendo 10% de FBS e GM-CSF (1:20 J558L meio condicionado). As células foram postas em cultura por 3 dias e foram analisadas quanto a expressão de GFP usando citometria de fluxo.
As células BM isoladas de camundongos foram transduzi- das diretamente seja com o vetor viral FUGW/SVGmu ou com um vetor de controle. Para o controle, um lentivetor (FUGW/EcO) (Eco) envelopa- do de glicoproteína do vírus de leucemia murina ecotrópica foi usado; o vetor envelopado com Eco pode infectar células de roedores com uma ampla especificidade. Três dias pós-infecção, a eficiência de transdução foi analisada por citometria de fluxo (Figura 4A). Aproximadamente 9% das células nas culturas BM misturadas foram DCs (como indicado pela expressão da CDl lc), das quais a maioria (aproximadamente 80%) eram DC-SIGN altas (dados não mostrados). Foi observado que 12% das células BM totais foram GFP positivas (GFP+) na transdução FUGW/SVGmu (Figura 4A). Quando limitados a células GFP+, foi observado que até 95% das células transduzidas foram duplo-positivo para DC-SIGN e CDllc (DC-SIGN+CD1 Ic+), indicando que a FUGW/SVGmu especificamente transduz DCs expressando a DC-SIGN e não outros tipos de células na medula óssea. Pelo contrário, embora 68% da células da BM totais fossem GFP positivas após exposição à FUGW/Eco, apenas 9% das células transduzidas foram DCs, dentro das quais 6,5% foram DC-SIGN+. A transdução estável da FUGW/SVGmu foi verificada por análise Alu PCR (Butler, S.L. e colaboradores, 2001, Nat. Med., 7: 631- 634, o qual é aqui incorporado neste documento por referência em sua totalidade) da integração genômica do LTR do suporte principal lentive- tor. Além disso, nós usamos a FUGW/SVGmu para transduzir células T e B coletadas do baço de camundongo e virtualmente nenhuma trans- dução foi observada (Figura 4B), indicando notável especificidade de transdução.
A eficiência do lentivetor contendo SVGmu para transduzir DCs derivadas da medula óssea (BM), postas em cultura in vitro (BMDCs) foi também testada. As DCs derivadas da medula óssea (BM) (BMDCs) foram geradas como descrito acima postas em cultura na presença do fator de estimulação de colônia macrófago-granulócito (GM- CSF) por 6 dias. As células foram então expostas ou ao lentivetor FUGW/SVGmu ou FUGW/Eco. A citometria de fluxo das BMDCs no dia 3 pós-transdução mostrou que a FUGW/Eco transduziu ambas as células DCs CDllc+ (33%) e CDl Ic- (7,6%) (Figura 5), o que é consis- tente com o tropismo amplo da Eco. Ao contrário, a FUGW/SVGmu apenas transduziu células DCs CDllc+ (32,7%) e nenhuma das células GFP+ foram detectadas entre as células CDllc- (Figura 5), indicando que a FUGW/SVGmu pode especificamente modificar as BMDCs.
Estes resultados assim coletivamente demonstram que Ien- tivetores recombinantes projetados contendo SVGmu especificamente transduzem DCs in vitro e que a transdução direcionada é correlaciona- da com a expressão da DC-SIGN na superfície das DCs.
Exemplo 7 Efeito do Vírus Recombinante na Ativação de Células Dendríticas in Vitro O lentivírus recombinante foi adicionalmente examinado para determinar se ele poderia especificamente direcionar, transduzir e ativar as DCs em DCs maduras. A sobrerregulação da superfície da molécula co-estimulatória B7.2 (CD86) e a molécula I-Ab MHC classe II, as quais são consideradas ser as assinaturas da ativação da DC (Ste- inman, R.M. e colaboradores, 2003, Annu. Rev. Immunol., 21: 685-711, o qual é aqui incorporado neste documento por referência em sua totalidade), foi medida em DCs expostas ao vírus recombinante. As BMDCs foram geradas e infectadas com FUGW/SVGmu como descrito no Exemplo 6. LPS em uma concentração de 1 μg/ml foi também adicionado durante a noite para ativação adicional das BMDCs trans- duzidas.
A citometria de fluxo das BMDCs 3 dias após a trans- dução mostrou que o tratamento com FUGW/SVGmu elevou a expres- são dos marcadores de ativação da DC, CD86 e I-Ab, nas DCs GFP positivas, quando comparado com as DCs GFP negativas (Figura 6, painel de topo). A área sombreada indica células GFP negativas (não transduzidas) e a linha sólida (área não preenchida) indica células GFP positivas (transduzidas). Foi observado que a transdução direcionada das BMDCs apresentou sinergia com o tratamento com lipopolissacarí- deo (LPS) para adicionalmente amadurecer as DCs (Figura 6, painel de baixo). Isto indica que a transdução direcionada pode tanto trabalhar sozinha como em combinação com outros fatores de maturação de DC para induzir a ativação de DC.
Exemplo 8
Direcionamento de Células Dendríticas in Vivo
Pelo Vírus Recombinante
A prova de que se esta metodologia pode ser usada para va- cinação pode ser examinada por experimentação in vivo. Para testar se os lentivetores projetados contendo SVGmu poderiam direcionar DCs in vivo, o lentivetor recombinante e concentrado FUGW/SVGmu (50 χ IO6 TU re-suspenso em 200 μΐ de PBS) foi injetado de modo sub-cutâneo no flanco esquerdo de camundongos fêmeas C57BL/6 (B6, Charles River Breeding Laboratories) próximo do nódulo linfático inguinal (dentro da faixa de 1 cm). O nódulo linfático inguinal esquerdo e o nódulo linfático equivalente no lado oposto foram isolados para exame do tamanho no dia 3 pós-injeção. As células foram coletadas destes nódulos e o seus números totais foram contados. A percentagem de DCs GFP+ foi anali- sada por citometria de fluxo em células tingidas anticorpo anti-CDllc (BD Biosciences).
No dia 3, um significante aumento do nódulo linfático in- guinal esquerdo próximo ao local da injeção foi observado (Figura 7a, imagem da esquerda) e o número de células neste nódulo linfático aumentou mais do que 10 vezes, comparado com o nódulo linfático equivalente no lado oposto ou nódulos linfáticos de um camundongo não experimentado (Figura 7B). Isto indica que a administração do vetor pode aumentar o trânsito e proliferação de linfócitos em um nódulo linfático próximo.
A citometria de fluxo indicou que aproximadamente 3,8%
das células CDllc+ totais no nódulo linfático inguinal esquerdo foram DCs GFP+ (Figura 7C), que parecem ter migrado do local de injeção. Isto é considerado um efeito maior notável de uma injeção sub-cutânea do vetor e demonstra que o vírus recombinante está efetivamente infectando DCs in vivo.
Exemplo 9
Avaliação da Especificidade do Vírus Recombinante
por Transdução in Vivo Para examinar a especificidade in vivo do lentivetor DC di- recionado, um vetor lentiviral codificando uma luciferase de vaga-lume foi construído. O cDNA da luciferase do vaga-lume foi amplificado da pGL4.2LucP (Promega) e clonado na FUGW (Lois, C. e colaboradores, 2002, supra) para substituir a GFP, produzindo o construto Fluc (SEQ ID NO: 4) (Figura 22A). O gene relator da luciferase foi então utilizado para visualizar a transdução in vivo das células do tecido usando protocolos padrões de imagem de bioluminescência (BLI).
O lentivetor recombinante (daqui em diante referido como Fluc/SVGmu) foi injetado de forma sub-cutânea no flanco esquerdo do camundongo. Em outro camundongo, o lentivetor pseudotipado com glicoproteína viral de estomatite vesicular (daqui em diante referida como Fluc/VSVG) foi injetado com um vetor de controle não específico. Os camundongos tratados com o vetor foram então visto na imagem não invasiva usando BLI. Os camundongos tratados com Fluc/VSVG ti- nham um sinal forte e permanente no local de injeção, indicando que tecidos não específicos foram transduzidos para expressar a luciferase (Figura 22B). Isto é consistente com o fato de que o vírus VSVG envelo- pado tem ampla especificidade. Pelo contrário, nenhum sinal significan- te foi detectado no local de injeção dos camundongos tratados com Fluc/SVGmu (Figura 22B), indicando que o lentivetor contendo SVGmu tinha uma especificidade de alvo relativamente precisa. Em nenhum momento o sinal de luminescência foi capaz de ser detectado nos camundongos direcionados, provavelmente devido à distribuição rara e esparsa das DCs, que está além da sensibilidade do método BLI atual.
Após um mês, os camundongos injetados com Fluc/SVGmu foram submetidos à análise de biodistribuição por RT- PCR quantitativa e nenhuma cópia detectável do lentivetor foi observa- da em todos os órgãos isolados (coração, fígado, baço, rim, gônada, pulmão, pele, nódulo linfático), verificando a falta de infecção não específica nos animais e assim a especificidade do vetor direcionado
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25 para as DCs.
Exemplo IO Liberação de Antígeno in Vitro Pelo Vírus Recombinante
Para determinar se a transdução direcionada das DCs por
um lentivetor recombinante poderia ser usada para efetivamente libera- çãor genes de antígenos para as DCs por estimulação de respostas de células T antígeno específicas CD8+ e CD4+, um lentivetor expressando o antígeno modelo, ovalbumina de frango (OVA), foi construído. Em camundongos C57BL/6J (B6), a OVA é um antígeno alvo bem caracteri- zado para o receptor OTl de célula T CD8+, o qual especificamente se liga à OVA257-269 (designada como OVAp), e o receptor OT2 da célula T CD4+, que especificamente se liga à OVA323-339 (designada como OVAp*) (Yang, L. e D. Baltimore, 2005, Proc. Natl Acad. Sci., USA, 102:4518- 4523, o qual é aqui incorporado neste documento por referência em sua totalidade). O lentivetor expressando a OVA (FOVA (SEQ ID NO: 2), Figura 8, topo) foi construído da FUGW (Figura 8, fundo) pela substitui- ção da GFP com o cDNA da ovalbumina de frango.
As BMDCs (Exemplo 6) foram transduzidas no dia 6 da cul- tura ou com o lentivírus recombinante FOVA/SVGmu ou lentivírus recombinante de controle FUGW/SVGmu (codificando um gene relator não relevante GFP). No dia 6 as BMDCs foram infectadas por rotação com o sobrenadante viral e postas em cultura por 3 dias adicionais. No dia 9, as células não aderentes foram coletadas e postas em cultura novamente em meio RPMI contendo 10% de FBS, GM-CSF (meio condi- cionante 1:20 J558L), e 1 μg/ml de LPS (Sigma). No dia 10, as células foram coletadas e usadas para a estimulação das células T. As BMDCs modificadas foram designadas como DC/FOVA e DC/FUGW, depen- dendo do lentivetor usado para a transdução. Em paralelo, células não aderentes foram coletadas da cultura de BMDC do dia 9 não transduzi- das e foram postas em cultura novamente no mesmo meio (RPMI con- tendo 10% de PBS, GM-CSF e LPS). No dia 10, as células foram coleta- das e carregadas ou com OVAp (OVA257-269, especificamente ligadas pelos receptores da célula T OT1, daqui em diante referidas como DC/OVAp) ou OVAp* (OVA323-339, especificamente ligada pelos recepto- res de célula T OT2, daqui em diante referidas como DC/OVAp*) e usadas como controles positivos para a estimulação da célula T. Para examinar a habilidade das BMDCs transduzidas pelo vetor para proces- sar e apresentar o antígeno OVA transgênico, células do baço foram coletadas de camundongos transgênicos OTl e OT2 e postas em cultura com as BMDCs transduzidas pelo lentivetor ou BMDCs carregadas ou com OVAp ou OVAp*, na razão indicada. Três dias depois, o sobrena- dante foi analisado quanto aos marcadores de ativação de superfície usando citometria de fluxo. A proliferação de célula T foi testada usando a incorporação de [3H] timidina.
Após uma co-cultura de três dias com várias razões de DC/FOVA para células T transgênicas, as células T OTl responderam vigorosamente como medido pela liberação daIFN-γ (Figura 10A) e a proliferação de células T (Figura 10B). Como esperado, nenhuma res- posta OVA óbvia foi detectada usando a DC/FUGW (Figuras IOA e 10B). Foi também observado que a expressão transgênica da OVA foi ainda mais eficiente do que a carga de peptídeo para estimulação de uma resposta da célula T OT1, o que é consistente com a noção de que a MHC classe I favorece a apresentação dos peptídeos produzidos endo- genamente. A citometria de fluxo mostrou que as células T OTl ativa- das exibiram o fenótipo de célula T citotóxico executor típico (CD25+CD69+CD62LbaixoCD44alto) após estimulação ou por DC/FOVA ou DC/OVAp (Figura 9).
Quando as DCs foram postas em co-cultura com células T
CD4+ OT2, a ativação de células T foi observada, como indicado pelas mudanças nos marcadores de superfície (Figura 11) e a produção de IFN-γ (Figura 12). Todavia, a estimulação de células CD4+ não foi tão pronunciada quanto as das células CD8+, presumivelmente devido à apresentação menos eficiente de peptídeos antígenos endógenos para as moléculas MHC classe II. Pela modificação da localização celular do antígeno OVA para direcioná-lo para o caminho da apresentação da MHC classe II, um aumento da estimulação da CD4 foi alcançada que foi ainda melhor do que aquela das DCs pulsadas com peptídeo (dados não mostrados).
Estes resultados mostram que o método do direcionamento
da DC através da infecção por lentivetor pode efetivamente liberação antígenos às DCs e estimular ambas as respostas da célula T CD8+ e CD4+.
Exemplo 11
Liberação de Antígeno in Vivo
Pelo Viras Recombinante
Para determinar se as DCs direcionadas com lentivetores poderiam ativar células T antígeno específicas in vivo, um método de transferência de gene receptor de célula T (TCR) em células troncos
hematopoiéticas de murino (HSCs) foi usado para gerar células T antí- geno específicas e TCR projetadas em camundongos, como descrito em qualquer lugar (Yang, L. e D. Baltimore, 2005, supra). Um vetor retro viral tricistrônico MIG-OTl co-expressando OTl TCRa e TCRp, junto com o marcador GFP (Figura 13A) foi construído.
Brevemente, camundongos fêmeas B6 (Charles River Bree-
ding Laboratories) foram tratados com 250 μg de 5-fluoracila (Sigma). Cinco dias depois, células da medula óssea (BM) enriquecidas com HSCs foram coletadas da tíbia e fêmur e postas em cultura em uma placa de cultura de 24 poços (2 χ IO6 células por poço) em meio de cultura de BM (RPMI contendo 10% de FBS, 20 ng/ml de rmIL-3, 50 ng/ml de rmIL-6 e 50 ng/ml de rmSCF (PeproTech)). Nos dias 1 e 2 da cultura, as células foram infectadas por rotação com o vetor retro viral MIG-OTl pseudotipado com Eco (2 ml de sobrenadante viral por poço) a 2.500 rpm e 30°C por 90 min. Após cada rotação, o sobrenadante foi removido e substituído com meio de cultura de BM fresco. No dia 3, as células BM transduzidas foram coletadas e transferidas para camun- dongos recipientes B6 recebendo 1200 rads de irradiação corporal total. Oito semanas pós-transferência, os camundongos foram usados para o estudo de imunização in vivo. Cada camundongo recebeu uma dose de injeção sub-cutânea de IOx IO6 TU do lentivetor direcionador. Sete dias após, células do baço e nódulo linfático foram coletadas e analisadas quanto à presença de células T OTl e seus marcadores de ativação de superfície usando citometria de fluxo.
Oito semanas pós-transferência, a análise das células T periféricas dos camundongos reconstituídos mostrou que aproxima- damente 5% das células T CD8+ foram GFP+OTl+ (Figura 13B). Alguns dos camundongos reconstituídos foram imunizados via injeção sub- cutânea da mesma dose (10 χ IO6 TU) ou de FOVA/SVGmu (Exemplo 10) ou FUGW/SVGmu (Exemplo 2). A análise das células GFP+OTl+ coletadas dos órgãos linfóides periféricos 7 dias após mostrou que a imunização da DC direcionada pela FOVA/SVGmu dobrou o número de células T OTl quando comparado com os camundongos de controles, o quais ou não imunizados ou imunizados com FUGW/SVGmu (Figura 14B). As células T GFP+OTl+ derivadas de camundongos FOVA/SVGmu imunizados exibiram um fenótipo de memória executor (CD69baixoCD62altoCD44alto), indicando que estas células passaram por uma resposta imuno produtiva (Figura 14A).
Estes resultados demonstram que um lentivetor recombi-
nante contendo SVGmu de superfície pode direcionar DCs in vivo para eficientemente estimular células T antígeno específicas e induzir uma resposta imuno forte.
Exemplo 12
Indução das Respostas do CTL e Anticorpo in Viw Pela Administração Direta do Vírus Recombinante
Os estudos foram conduzidos quanto a eficácia do direcio- namento DC in vivo para induzir uma resposta do linfócito T citotóxico CD8+ antígeno específico (CTL) e resposta do anticorpo através da administração do lentivetor direcionador a camundongos do tipo origi- nal não testados.
Camundongos B6 do tipo original (Charles River Breeding Laboratories) receberam uma injeção única do lentivetor direcionador (50 χ IO6 de FUGW/SVG ou FOVA/SVGmu) de forma sub-cutânea no flanco direito na dose indicada. No dia 7 e dia 14 pós-imunização, o sangue foi coletado dos camundongos imunizados através de sangra- mento do rabo e o soro IgG anti-OVA foi medido usando ELISA. No dia 14, células do baço e nódulo linfático foram coletadas e analisadas quanto a presença de células T OVA específicas e seus marcadores de ativação de superfície usando citometria de fluxo.
A presença de células T OVA específicas foi medida ao se
medir a secreção de citocina e tingimento do tetrâmero. No dia 14 pós- injeção, as células T coletadas dos órgãos linfóides periféricos foram analisadas. O lentivetor direcionando para DCs nativas foi capaz de extrair células T CD8+ respondendo a OVA em ambos os nódulos linfáti- cos (dados não mostrados) e baço (Figura 23). A administração de uma dose única de FOVA/SVGmu recombinante foi suficiente para gerar células T CD8+, que poderiam ser iniciada a secretar IFN-γ sob re- estimulação da OVAp (Figura 23). A administração do vetor de controle FUGW/SVGmu falhou em gerar quaisquer respostas OVAp específicas (Figura 23). Para adicionalmente avaliar a magnitude das respostas, as células T CD8+ OVAp específicas foram medidas por tingimento de tetrâmero MHC classe I. Uma freqüência elevada de células T OVAp específicas (>6%) foi obtida após a injeção em dose única (Figura 15); nenhuma célula tetrâmero positiva foi detectada nos camundongos tratados com FUGW/SVGmu (Figura 15). Os dados gerados pela quan- tificação do tetrâmero correlacionaram bem com a análise de células executoras CD8+ testadas por tingimento IFN-γ intracelular (Figura 23). A análise de fenótipo destas células T OVAp positivas mostrou que estas células mostraram as características de superfície de células T de memória executora (CD24baix°CD69baix°CD62Lalt°CD44alt°) (Figura 17A).
Para investigar a resposta da dose da administração do Ien- tivetor, doses de FOVA/SVGmu variando de 100 χ IO6 TU a 3 χ IO6 TU foram injetadas de forma sub-cutânea e células T OVAp específicas no baço foram medidas no dia 14 pós-injeção. Uma alta freqüência excep- cional (12%) de células T CD8+ OVAp específicas foram detectadas na dose de 100 χ IO6 TU (Figura 16A). A porcentagem de células OVAp específicas correlacionaram proporcionalmente com a quantidade de vetor recombinante administrado (Figura 16B). Um platô na resposta da dose não foi alcançado ao aumentar a quantidade de vetor injetado e/ou a freqüência de injeção.
Além disso, os níveis de IgG no soro específicos para a OVA em camundongos foram examinados no 7° e 14° dias após imunização com FOVA/SVGmu (50 χ IO6 TU). O título do IgG no soro foi 1:10.000 no dia 7 e 1:30.000 no dia 14 (Figura 17B). Esta é uma resposta de anticorpo bastante impressionante para uma injeção em dose única sem adjuvante adicional ou outros estímulos, indicando que a imuniza- ção com lentivetor direcionado pode também extrair significante secre- ção de célula B de anticorpos antígeno específicos. Estes resultados mostram que a administração in vivo de um lentivetor direcionador a DC pode induzir ambas as respostas imunos celular e humoral contra o antígeno liberado.
Exemplo 13
Geração de Imunidade Antitumor: Proteção Preventiva
A imunidade antitumor gerada após a administração in vivo do lentivetor DC direcionado foi avaliada. Um modelo de tumor E.G7 (Wang, L. e D. Baltimore, 2005, supra) foi usado no qual a OVA serve como o antígeno do tumor.
As linhagens de células de tumor EL4 (C57BL/6J, H-2b,
timoma) e E.G7 (células EL4 estavelmente expressando uma cópia do cDNA da OVA de frango) foram usadas para o teste do tumor de ca- mundongos. Para o experimento de proteção do tumor, camundongos B6 (Charles River Breeding Laboratories) receberam uma injeção única de 50 χ IO6 TU do lentivetor direcionador (FOVA/SVGmu ou FUGW/SVGmu) no flanco direito. Duas semanas após, 5 χ IO6 células EL4 ou E.G7 foram injetadas de forma sub-cutânea no flanco esquerdo dos camundongos. O tamanho do tumor foi medido a cada outro dia usando compassos de calibre finos e foi mostrado como o produto dos dois diâmetros perpendiculares maiores a χ b (mm2). Os camundongos foram mortos quando os tumores alcançaram 400 mm2.
A vacinação com 50 χ IO6 TU de FOVA/SVGmu protegeu completamente os camundongos do teste do tumor E.G7 (Figura 18, esquerda), enquanto os tumores cresceram rapidamente nos camun- dongos recebendo uma vacinação de imitação com o lentivetor sem o transgene OVA (Figura 18, esquerda). Esta proteção era OVA específica porque nos camundongos vacinados cresceram tumores EL4 de contro- le que não expressavam a OVA (Figura 18, direita), independente do lentivetor usado para a imunização. Exemplo 14 Geração de Imunidade Antitumor: Tratamento de Tumor
A imunidade antitumor gerada após uma administração ín vivo do lentivetor DC direcionado foi avaliada onde as células do tumor foram introduzidas antes da administração do lentivetor. As etapas da injeção do tumor e administração do lentivetor foram reversas em relação àquelas do Exemplo 3 para testar se um tumor estabelecido poderia ser eliminado, em um teste de "vacinação terapêutica". Para este fim, células de tumor E.G7 expressando o gene luciferase do vaga- Iume (E.G7.1uc) foram usadas para testar os camundongos, permitindo monitoramento constante da cinética de crescimento do tumor em animais vivos usando BLI. Para facilitar a imagem, uma cepa albina de camundongos B6 (The Jackson Laboratory) foi usada. Estes camundon- gos não possuem pigmentação e desta forma tem baixa absorção de fundo do sinal de luminescência. A injeção destes camundongos com 100 χ IO6 TU de FOVA/SVGmu (Exemplo 10) mostrou uma resposta similar àquela observada em camundongos B6 canônicos (Figura 21). Células de tumor E.G7.1uc (5 χ IO6) foram implementadas de forma sub-cutânea nos camundongos B6 albinos. Os camundongos foram imunizados com FOVA/SVGmu (50 χ IO6 TU por camundongos por tempo) duas vezes nos dias 3 e 10 pós-teste do tumor via injeção sub- cutânea. O experimento foi repetido três vezes com um experimento representativo mostrado nas Figuras 19 e 20.
Os camundongos que receberam a imunização do lentivetor
DC direcionador mostraram um declínio do crescimento do tumor começando no dia 9, seguido pela regressão do tumor e uma redução de luminescência abaixo do nível de detecção no dia 11 (Figuras 19 e 20). Embora uma recorrência mínima do tumor tenha sido observada do dia 12 ao dia 16, os camundongos tratados com FOVA/SVGmu estiveram livres da doença ao final do dia 18 e depois disso; nenhuma reincidên- cia do tumor foi observada enquanto durou o experimento (> 60 dias). Pelo contrário, os tumores cresceram progressivamente nos camundon- gos não recebendo tratamento e os camundongos tiveram que ser removidos do experimento após o dia 16 devido ao tamanho grande dos tumores. Foi interessante notar que a regressão do tumor foi observada começando 7 dias após a imunização com o lentivetor. O tempo de regressão do tumor se correlaciona com a cinética da resposta imuno antígeno específica induzida pela vacinação.
Exemplo 15
Liberação in Vitro de Antígeno e Fatores de Maturação Por Vírus Recombinante
O sucesso da vacinação DC pode depender do estado de maturação das DCs (Banchereau, J. & Palucka, A.K., 2005, Nat Rev. Immunol., 5:296-306; Schuler, G. e colaboradores, 2003, Curr. Opin. Immunol., 15:138-147; Figdor, C.G. e colaboradores, 2004, Nat. Med., 10:475-480, cada um dos quais é aqui incorporado neste documento por referência em suas totalidades). Desta forma, os genes podem ser incluídos nos vetores lentivirais que codificam as moléculas estimulató- rias a disparar a maturação desejada da DC. As citocinas que podem ser usadas incluem, mas, sem limitação, GM-CSF, IL-4, TNF-α, IL-6 e semelhantes. Em algumas modalidades, o agente de maturação que é usado é o ligante CD40 (CD40L), o qual é tipicamente expresso em células T CD4 e serve como um ligante para o receptor CD40 nas DCs (Matano, T. e colaboradores, 1995, J. Gen. Virol, 76: 3165-3169; Ngu- yen, T.H., e colaboradores, 1998, Hum. Gene Tker., 9: 2469-2479, cada um dos quais é aqui incorporado neste documento por referência em suas totalidades). Para manipular adicionalmente as DCs de forma a serem uma vacina potente para terapia, um receptor CD40 droga induzível (ÍCD40) é adaptado no sistema de liberação do gene em algu- mas modalidades. Como descrito em qualquer lugar, o ÍCD40 foi proje- tado e consiste de um domínio citoplasmático do CD40 fundido a domínios ligação de ligante e uma seqüência direcionadora de membra- na (Hanks, B.A., e colaboradores, 2005, Nat. Med., 11:130-137, o qual é aqui incorporado neste documento por referência em sua totalidade). Quando o ÍCD40 é expresso, a maturação e ativação das DCs é regulada com uma droga permeável ao lipídeo, dimerizante.
Para examinar o efeito da inclusão de fatores de maturação
de DC, o cDNA para ovalbumina (OVA, como descrito no Exemplo 10), GM-CSF, IL-4, TNFa, IL-6 e CD40L são obtidos. O ÍCD40 é construído como descrito em qualquer lugar (Hanks, B.A., e colaboradores, 2005, supra). Usando seqüência IRES e semelhantes a 2A, vetores lentivirais multicistrônicos capazes de eficientemente transladar até quatro proteí- nas são construídos. Este sistema é adaptado para construir vetores lentivirais co-expressando os seguintes genes: OVA e uma molécula de fator de maturação (GM-CSF, IL-4, TNFa, IL-6, CD40L ou ÍCD40) (Figura 24A, rotulada como "FUOIM"). Uma seqüência de vetor exem- plar é proporcionada pela SEQ ID NO: 7. Lentivírus de SVGmu envelo- pados são preparados (como descrito no Exemplo 2) e os lentivírus são transduzidos in vitro em BMDCs de camundongos colocadas em cultura (gerado como descrito no Exemplo 6) para especificamente liberaçãor estes genes nas células. A maturação das BMDCs é medida pela análise FACS para sobrerregulação de diversas moléculas chaves que tem papéis essenciais no processo de estimulação da célula T. Marcadores representativos típicos são ICAM-I (CD54), B7.1 (CD80), MHC classe I, MHC classe II e CD40 endógeno. As BMDCs transduzidas com lentiví- rus codificando apenas os genes OVA e GFP servem como controles para o experimento. É observado que a sobrerregulação dos marcado- res de maturação é alcançada quando DCs ÍCD40 modificadas são expostas a uma quantidade efetiva da droga dimérica AP20187.
Além disso, dois aspectos característicos de DCs maduras são a redução da capacidade para a endocitose e o potencial melhorado para a ativação da célula Τ. A ingestão de dextrana FITC rotulada é usado para quantificar a endocitose de DCs transduzidas. As DCs maduras são também usadas para estimular as células T a expressar os receptores de célula T OTl (TCRs) (como descrito no Exemplo 10), de forma a avaliar suas capacidades de montar uma resposta imuno. É observado que quando as DCs ÍCD40 modificadas são expostas a uma quantidade efetiva da droga dimérica AP20187, a ingestão de dextrana FITC rotulada é reduzida em relação àquela de DCs não ÍCD40 modifi- cadas. Além disso, é observado que após a co-cultura com várias razões de DCs ÍCD40 modificadas (tratadas com a droga dimérica) para as células T transgênicas, as células T OTl respondem mais vigorosamente como medido pela liberação de IFN-γ e a proliferação da célula do que aquelas em co-cultura com DCs não ÍCD40 modificadas.
A longevidade de DCs é outro parâmetro que determina a imunidade dependente da célula T. Os efeitos de moléculas estimulado- ras na sobrevivência da DC usando um teste de carência de soro in vitro serão comparados usando o método como descrito em Hanks e colabo- radores, ((Hanks, B.A., e colaboradores, 2005, supra).
Se necessário, duas molécula de fator de maturação podem ser liberados pelo vetor lentiviral para DCs direcionadas, uma vez que a configuração do vetor tem a capacidade de expressar quatro proteínas.
Exemplo 16
Liberação in Vivo de Antígeno e Fatores de Maturação
Por Vírus Recombinante Vírus recombinantes empacotados com o vetor lentiviral FUOIM (SEQ ID NO: 7) são preparados como descrito no Exemplo 15. Os vírus são administrados a camundongos B6 não testados para liberação do antígeno OVA e moléculas do fator de maturação a DCs e indução da imunidade a doses graduadas de vírus é avaliada como descrito no Exemplo 11.
É observado que a imunização da DC direcionada por lenti- vírus contendo ÍCD40 aumenta o número de células T que respondem à OVA quando comparado aos camundongos de controle, os quais são ou não imunizados, imunizados com um lentivírus contendo não OVA (por exemplo, FUGW/SVGmu) ou imunizados com lentivírus contendo não ÍDC40 (por exemplo, FOVA/SVGmu).
Além disso, a resistência dos animais ao teste do tumor é acessada com os lentivetores contendo ÍCD40, como descrito no Exem- pio 13. Os camundongos são injetados com os seguintes lentivetores no experimento do teste do tumor: FUOIM/SVGmu, FOVA/SVGmu ou FUGW/SVGmu. As seguintes linhagens de células são usadas para o teste do tumor: EL4 (C57BL/6J, H-2b, timoma) e E.G7 (células EL4 estáveis expressando uma cópia do cDNA de OVA de frango). É obser- vado que os camundongos recebendo imunização pelos lentivetores DC direcionadores FUOIM/SVGmu e FOVA/SVGmu são protegidas do teste do tumor. Pelo contrário, é observado que os tumores crescem rapida- mente em camundongos recebendo uma vacinação de imitação com um lentivetor sem o transgene OVA (FUGW/SVGmu). Esta proteção é OVA específica porque os camundongos vacinados crescem tumores EL4 de controle que não expressam a OVA, independente do lentivetor usado para imunização.
Finalmente, o potencial deste método para erradicar um tumor estabelecido é acessado com os lentivetores contendo ÍCD40, como descrito no Exemplo 14. Os seguintes lentivetores são usados para a imunização no experimento: FUOIM/SVGmu e FOVA/SVGmu. As seguintes linhagens de células são usadas para o tratamento do tumor: EL4 e E.G7. É observado que os camundongos injetados com célula do tumor receberam imunização pelos lentivetores DC direciona- dores (FUOIM/SVGmu e FOVA/SVGmu) mostram um declínio do crescimento Pelo contrário do tumor, seguido pela regressão do tumor e uma redução da luminescência abaixo do nível de detecção. Ainda, nenhuma reincidência do tumor é observada durante o tempo do experimento (> 60 dias). , os tumores crescem progressivamente em camundongos não recebendo tratamento.
Exemplo 17 Apresentação de Antígeno HIV/AIDS Pelo Vírus Recombinante in Vitro
Para tratar HIV/AIDS, DCs de "funcionalidade dupla" são geradas baseadas na estratégia da liberação do gene descrita. As DCs de "funcionalidade dupla" são eficazes em ambas extração de anticorpos neutralizantes (Nabs) e indução de imunidade de célula T (Figura 25). Para eficientemente extrair Nabs, um gene codificando uma ligação de membrana quimérica gpl20 (gpl20m) é liberado às DCs. A gpl20 é uma glicoproteína de envelope para HIV e é considerada ser o imunóge- no mais potente (Klimstra, W.B. e colaboradores, 2003, J. Virol., 77: 12022-12032; Bernard, K.A. e colaboradores, 2000, Virology, 276: 93- 103; Byrnes, A.P., e colaboradores, 1998, J. Virol., 72: 7349-7356, cada um dos quais é aqui incorporado neste documento por referência em suas totalidades). Como descrito em qualquer lugar, a gpl20 fundida com o domínio de trans-membrana da glicoproteína de vírus da estoma- tite vesicular pode ser expressa na superfície da célula em uma forma trimérica, mimetizando o trímero maduro na superfície do virion HIV (Klimstra, W.B. e colaboradores, 1998, J. Virol, 72: 7357-7366, que é aqui incorporado neste documento por referência em sua totalidade). Esta forma de imunógeno será mostrada na superfície da DC. Em adição à expressão da superfície, as DCs podem também apresentar peptídeos epítopes derivados da gpl20 em modo restrito em MHC para células T.
Visto que a infecção de HIV pode signifícantemente impedir a função da DC através da depleção das células T CD4, é desejável projetar DCs que funcionem independentemente das células Τ. A expressão do CD40L ou ÍCD40 pode resultar na maturação e ativação das DCs na ausência de células T CD4. Assim, CD40L ou ÍCD40 projetadas, como descrito no Exemplo 16, que funciona como uma molécula de maturação e estimulatória, são incorporadas no vírus DC direcionador.
O construto lentiviral para geneticamente modificar as DCs é ilustrado na Figura 24b e é rotulado como FUGmID (SEQ ID NO: 8). São obtidos cDNAs códon otimizados para gpl20 da NIH AIDS Research & Reference Reagent Program. A seqüência códon otimizada pode alcançar excepcionalmente altos níveis de expressão de gene fora do contexto do genoma HIV-1. O construto é preparado por fusão da gpl20 com o domínio da trans-membrana da glicoprotreína do vírus da estomatite vesicular.
São conduzidos testes in vitro para acessar a eficácia das DCs gene modificadas para extrair Nabs. As células B CD19+ são isola- das de baços de camundongos B6 não testados usando microcontas anti-CD19 (MiHenyi Biotech, Auburn, CA) e postas em co-cultura com DCs modificadas na presença de IL-4 e IL-6. O vetor lentiviral FUmGID é co-transfectado com SVGmu nas linhagens de células para preparar o vírus FUmGID/SVGmu, como descrito no Exemplo 2. Os vírus resul- tantes são transduzidos em DCs derivadas de medula óssea (BMDCs). As DCs transduzidas são irradiadas (3.000) rad e usadas como células apresentando antígeno (APCs) na co-cultura com células Β. A duração do tempo da proliferação das células B em resposta a BMDCs transdu- zidas é medido. É observado que as células B proliferam em uma maior extensão em co-cultura com BMDCs transduzidas do que aquelas que são postas em co-cultura com BMDCs transduzidas por imitação.
Para investigar o efeito de geneticamente modificar DCs na diferenciação de células B em células secretando imunoglobulinas específicas, o método de co-cultura como previamente descrito é empre- gado com a exceção de que as DCs não são irradiadas. Após 14 dias, o título de vários isotipos de anticorpo HIV específico em sobrenadantes em cultura é determinado por ELISA usando gll20 recombinante (disponível da NIB: AIDS Research & Reference Reagent Program) como o antígeno. As expressões dos vários isotipos de anticorpos HIV específi- cos são maiores em células B em co-cultura com BMDCs transduzidas do que aquelas em co-cultura com BMDCs transduzidas em imitação.
Para acessar a eficácia das DCs modificadas geneticamente para ativar as células T in vitro, células T CD3+ foram isoladas de camundongos B6 não testados e postas em co-cultura com DCs infec- tadas com lentivírus e irradiadas. A duração do tempo da proliferação da célula T foi medida. A proliferação da célula T é encontrada ser maior em culturas de célula T em co-cultura com DCs transduzidas e irradiadas do que aquelas em co-cultura com DCs transduzidas em imitação.
Os resultados são esperados coletivamente demonstrar que a BMDCs transduzidas com o lentivetor FUmGID/SVGmu é efetivo em ambas a estimulação de células B para produzir anticorpos de neutrali- zação (Nabs) e na indução da imunidade da célula T contra HIV/AIDS.
Exemplo 18 Apresentação de Antígeno HIV/AIDS Pelo Viras Recombinante in Vivo
Para avaliar a ativação de células B in vivo, camundongos B6 são imunizados por injeção sub-cutânea com o lentivírus recombi- nante preparado como descrito no Exemplo 17. Os controles incluem camundongos injetados com lentivírus codificando antígenos apenas, lentivírus codificando moléculas de maturação apenas e camundongos não testados sem qualquer tratamento. Duas semanas após a injeção do vírus, anticorpos do soro contra HIV são medidos por ELISA. O título do anticorpo é encontrado ser maior naqueles camundongos injetados com o vírus FUmGID/SVGmu bem como naqueles injetados com lenti- vírus codificando antígenos apenas. Pelo contrário, o título do anticorpo é relativamente baixo naqueles camundongos imunizados com o lentiví- rus codificando moléculas de maturação apenas e em camundongos não testados.
Para a ativação in vivo de células T, os vírus recombinantes
descritos são injetados em camundongos B6. Sete dias depois, as células T são isoladas e suas proliferações e secreção de citocinas, após re-estimulação in vitro com DCs geneticamente modificadas, é medida como descrito no Exemplo 12. A durabilidade das respostas da célula T executoras é também monitorada. O lentivetor direcionado para DCs nativas é capaz de extrair células T que respondem ao HIV em ambos o nódulo linfático e o baço. A administração de FUmGID/SVGmu recom- binante é suficiente para gerar células T que secretam IFN-γ. Pelo contrário, a administração de um vetor de controle de imitação (por exemplo, FUGW/SVGmu) falha em extrair uma resposta HIV específica.
Exemplo 19 Vacinação Contra HIV/ AIDS in Situ
Pelo Vírus Recombinante: Proteção Contra o Teste de HIV De forma a testar in situ a abordagem da vacinação DC para tratar com o HIV, um novo modelo de camundongo de patogênese HIV envolvendo quimeras humano/camundongo é desenvolvido. Como descrito em qualquer lugar, o camundongo RAG2-/-yc-/- pode ser recons- tituído com um sistema imuno adaptado ao humano (Strauss, J.H. e colaboradores, 1994, Archives ofVirology, 9: 473-484, que é aqui incor- porado neste documento por referência em sua totalidade). O camun- dongo RAG2-/-yc-/- não tem células Β, T e NK (Morizono, K. e colaborado- res, 2001, J. Virol., 75: 8016-8020, o qual é aqui incorporado neste documento por referência em sua totalidade). A injeção de sangue do cordão humano CD34+ no fígado de camundongos de um dia de idade parcialmente irradiados leva a geração e maturação de DCs, células B e células T humanas com funcionalidade diversa com restrição MHC humana. Além disso, este modelo direciona o desenvolvimento de órgãos linfóides primários e secundários e a produção de uma resposta imuno de célula T CD8+ funcional contra um teste viral. Além disso, a observação do isotipo Ig mudando de IgM para IgG indica a existência de imunidade de célula T CD4+ funcional.
Para determinar a efetividade da proteção preventiva contra o HIV por imunização DC direcionada, as quimeras huma- no/camundongo são administradas vírus recombinantes envelopados com SVGmu por injeção. Os vírus recombinantes codificam o antígeno gpl20m (exemplo 17) em conjunto com um estimulador de maturação (por exemplo, CD40L ou ÍCD40 como no Exemplo 15), e eles são prepa- rados e concentrados como descrito no Exemplo 2. Os camundongos imunizados são então inoculados com HIV de acordo com os métodos bem conhecidos na técnica, tal como, por exemplo, via rota intraperito- neal ou intravenosa. Desde que os camundongos reconstituídos man- têm células T CD4 humanas, os animais são testados com vírus relato- res HIV clonados molecularmente, NFNSX-r-HSAS (CCR5-trópico), NL-r- HSAS (CXCR4-trópico) e isolados clínicos (Baenzinger e colaboradores,
20
25
30 2006, ProcNatl Acad. Sei. USA, 103:15951-15956, o qual é aqui incor- porado neste documento por referência em sua totalidade). O vírus relator competente para replicação também contém o antígeno estável ao calor (HSA) na região vpr. Ainda, para estabelecer um infecção produtiva antes da inoculação, células mononucleares do sangue periférico singênico infectadas (PBMCs) são injetadas no espaço perito- neal da quimera humano/camundongo reconstituída.
A evidência da infecção de HIV é monitorada durante o tempo nos baços, nódulos linfáticos, PBMCs e sangue periférico. A FACS para HSA nos vírus relatores HIV é usada para testar quanto a integração e replicação viral HIV. A carga viral HIV é também medida do plasma usando RT-PCR. Através da avaliação do infecção de HIV por estes métodos, é observado que a vacinação DC in situ produtiva torna os camundongos imunizados mais resistentes ao teste do HIV do que aqueles que não foram imunizados.
Exemplo 20 Vacinação Contra HIV/ AIDS in Situ Pelo Vírus Recombinante: Remoção da Infecção de HIV
Para testar a habilidade da abordagem da vacinação in situ de remover uma infecção de HIV, quimeras humano/camundongo são primeiro testadas com vírus relator HIV clonado molecularmente, NFNSX-r-HSAS (CCR5-trópico), como descrito no Exemplo 19. A infec- ção de HIV ativa é monitorada pela análise FACS da expressão HSA em células T CD4 humanas. Uma vez que a infecção de HIV é confirmada com sucesso, os vírus recombinantes projetados (Exemplo 19) são injetados em animais via injeção sub-cutânea ou por qualquer rota ótima determinada por uma pessoa versada na técnica (por exemplo, s.c., i.d., i.v. ou i.p.). A carga viral de HIV é então monitorada por RT- PCR e as contagens de CD4 periféricas são feitas. É observado que a vacinação é capaz de baixar a carga viral de HIV e remover uma infec- ção de HIV estabelecida em camundongos imunizados comparado com controles não vacinados.
A terapia anti-retro viral altamente ativa (HAART), utilizan- do uma estratégia de três drogas, tem aumentado significantemente a morbidade e mortalidade devido à AIDS. A estratégia esboçada acima pode ser adaptada para este paradigma pela transdução simultanea- mente de células DC in vivo com vírus recombinantes projetados. Em conjunto com a HAART, os estudos acima são repetidos para avaliar a habilidade de prevenir ou reduzir a infecção após o teste de HIV (Exem- plo 19) e para remover uma infecção de HIV ativa.
Exemplo 21
Tratamento de Tumor Maligno em Pessoa Humana
Usando Vírus Recombinante
Um paciente humano é diagnosticado com um tumor ma-
ligno. Ao paciente é administrada uma quantidade apropriada de vírus recombinante contendo um gene que codifica um antígeno específico para o tumor e envelopado com uma molécula direcionadora DC-SIGN, tal como, por exemplo, SVGmu. O vírus opcionalmente contém um gene codificando um fator de maturação de DC, como descrito no Exemplo 15. O vírus é administrado por injeção intravenosa semanal- mente pela duração do tratamento. Em tempos periódicos durante e após o regime de tratamento, a carga de tumor é acessada por imagem de ressonância magnética (MRI). Reduções significantes no tamanho do tumor são achadas enquanto o tratamento progride.
Exemplo 22
Prevenção da Formação do Tumor em Pessoa Humana Usando Vírus Recombinante
Um grupo de pacientes humanos é administrado com uma quantidade apropriada de vírus recombinante contendo pelo menos um gene codificando um antígeno que é comumente e especificamente associado com as células do tumor e opcionalmente contendo um gene codificando um fator de maturação de DC, como descrito no Exemplo 15. O vírus é envelopado com uma molécula direcionadora DC-SIGN específica, tal como, por exemplo, SVGmu (Exemplo 2). Os pacientes no grupo experimental e no grupo de controle são monitorados periodica- mente quanto ao crescimento do tumor. É observado que a incidência da formação do tumor maligno é diminuída em relação ao grupo de controle para pacientes a quem o vírus é administrado.
Exemplo 23
Tratamento de HIV/AIDS em Pessoa Humana Usando Vírus Recombinante
Um paciente humano é diagnosticado com HIV/AIDS. O pa- ciente é administrado com uma quantidade apropriada de vírus recom- binante contendo um gene que codifica Gp 120 (Exemplo 17) e envelo- pado com uma molécula direcionadora específica para DC-SIGN, tal como, por exemplo, SVGmu (Exemplo 2). O vírus opcionalmente contém um gene codificando um fator de maturação de DC, como descrito no Exemplo 15. O vírus é administrado por injeção intravenosa semanal- mente pela duração do tratamento. Em tempos periódicos durante e após o regime de tratamento, a carga viral de HIV é acessada pela medida dos anticorpos no sangue do paciente contra HIV usando ELISA. A contagem das células T do paciente é também avaliada. É observado que uma redução significante na carga viral de HIV é alcan- çada enquanto o tratamento progride. Além disso, é observado que a contagem das células T do paciente pára de diminuir, enquanto o tratamento progride.
Exemplo 24 Prevenção de HIV/AIDS em Pessoa Humana Usando um Vírus Recombinante
Um grupo de pacientes humanos considerados em risco pa-
ra a infecção de HIV é administrado uma quantidade apropriada de vírus recombinante contendo um gene codificando GP120 (Exemplo 17) e opcionalmente contendo um gene codificando um fator de maturação de DC, como descrito no Exemplo 15. O vírus é envelopado com uma molécula direcionadora específica para DC-SIGN, tal como, por exem- plo, SVGmu (Exemplo 2). Os pacientes no grupo experimental e no grupo de controle são testados a cada 6 meses para a infecção de HIV e se positivos, monitorados quanto a carga viral de HIV e contagem de células T. Se positivamente infectados pacientes dentro do grupo vaci- nado, é observado que a carga viral de HIV permanece baixa e a conta- gem de células T permanece relativamente alta para os pacientes positi- vamente infectados no grupo de controle.
Embora a invenção precedente tenha sido descrita em deta- lhes para propósitos de clareza de compreensão, será óbvio que certas modificações podem ser praticadas dentro do escopo das reivindicações anexadas. Todas as publicações e documentos de patentes citados aqui neste documento são aqui incorporados por referência em suas totali- dades para todos os propósitos na mesma extensão como se cada um fosse individualmente denotado.
25 Listagem de seqüências
<110> Wang1 Pin Yang, Lili Bal ti more, David
<120> Liberaçao de Gene de Alvo Para vacinação de células Dendriticas <130> CALTE.0B5A
<150> U.S. 60/832,497 <151> 2006-07-21
<150> U.S. 60/920,260 <151> 2007-03-27
<160> 11
<170> FastSEQ para a versão 4.0 do Windows
<210> 1 <211> 9941 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> vetor de Plasmidio Construído
gtcgacggat cgggagatct cccgatcccc tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg 60 atgccgcata gttaagccag tatctgctcc ctgcttgtgt gttggaggtc Qctgagtagt 120 gcgcgagcaa iatttaagct acaacaaggc aaggcttgac cgacaattgc atgaagaatc 180 tgcttagggt taggcgtttt gcgctgcttc gcgatgtacg ggccagatat acgcgttgac 240 attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg gtcattagtt catagcccat 300 atatggagtt Ecgcgttaca taacttacgg taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg 360 acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt 420 tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag 480 tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc 540 attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag 600 tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacat caatgggcgt ggatagcggt 660 ttqactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt caatgggagt ttgttttggc 720 accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactc cgccccattg acgcaaatgg 780 gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagcgc gttttgcctg tactgggtct 840 ctctggttag accagãtctg igcctgggag ctctctggct aactagggaa cccactgctt 900 aagcctcaat aaagcttgcc ttgagtgctt caagtagtgt gtgcccgtct Qttgtgtgac 960 tctggtaact agagatccct cagacccttt tagtcagtgt ggaaaatctc tagcagtggc 1020 gcccgaacag ggacttgaaa gcgaaaggga aaccagagga gctctctcga cgcaggactc 1080 ggcttgctga igcgcgcacg gcaagaggcg aggggcggcg actggtgagt acgccaaaaa 1140 ttttgactag cggaggctag aaggagagag atgggtgcga gagcgtcagt attaagcggg 1200 ggagaattag atcgcgatgg gaaaaaattc ggttaaggcc agggggaaag aaaaaatata 1260 aattaaaaca tatagtatgg gcaagcaggg agctagaacg attcgcagtt aatcctggcc 1320 tqttagaaac atcagaaggc tgtagacaaa tactgggaca gctacaacca tcccttcaga ii«u caggatcaga agaacttãga tcattatata atacagtagc aaccctctat tgtgtgcatc 1440 aaaqgataga gataaaagac accaaggaag ctttagacaa gatagaggaa gagcaaaaca 1500 ISSStaagac ?accgca?ag caagcggccg ctgatcttca gaçctggagg aggagatatg 1560 agggacaatt ggagaagtga attatataaa tataaagtag taaaaattga accattagga 1620 gtagcaccca ccaaggcaaa gagaagagtg gtgcagagag aaaaaagagc agtgggaata 1680 ggagctttgt tccttgggtt cttgggagca gcaggaagca ctatgggcgc agcgtcaatg 1740 acgctgacgg tacaggcèag acaattattg tctggtatag tgcagcagca gaacaatttg 1800 ctgagggcti ttgaggcgca acagcatctg ttgcaactca cagtctgggg catcaagcag 1860 ctccaggcaa gaatcctggc tgtggaaaga tacctaaagg atcaacagct cctggggatt 1920 tggggttgct ctggaaaact catttgcacc actgctgtgc cttggaatgc tagttggagt 1980 aataaatctc tggãacagat ttggaatcac acgacctgga tggagtggga cagagaaatt 2040 aacaattaca caagcttaat acactcctta attgaagaat cgcaaaacca gcaagaaaag 2100 aatgaacaag aattattgga attagataaa tgggcaagtt tgtggaattg gtttaacata 2160 acaaattggc tgtggtatat aaaattattc ataatgatag taggaggctt ggtaggttta 2220 agaatagttt ttgctgtact ttctatagtg aatagagtta ggcagggata ttcaccatta 2280 tcgtttcaga cccacctccc aaccccgagg ggacccgaca ggcccgaagg aatagaagaa 2340 gaaggtggag gcgccaattc
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<210> 2 <211> 9206 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> vetor de Plasmidio construído <400> 2 gtcgacggat
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4/29
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cctcccgagg
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<210> 5 <211> 10401 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Vetor de Plastmdio Construído
<400> 5
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agaatagttt
tcgtttcaga
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13/29 taagcctcaa ctctggtaac ccgtttaaac gcccctcccc aaaatgagga tggggcagga tgggctctat cgccctgtag cacttgccag tcgccggctt ctttacggca cgccctgata tcttgttcca ggattttgcc cgaattaatt aggcagaagt aggctcccca cccgccccta ccatggctga attccagaag agcttgtata tatatcggca gccgttccgg ctcgggttct accctgttca tgggtgcgcg cgggacgcct gccctgcgcg gtgctacgag ttccgggacg caccccaact ttcacaaata gtatcttatc tagctgtttc agcataaagt cgctcactgc caacgcgcgg tcgctgcgct cggttatcca aaggccagga gacgagcatc agataccagg cttaccggat cgctgtaggt ccccccgttc gtaagacacg tatgtaggcg acagtatttg tcttgatccg attacgcgca gctcagtgga ttcacctaga taaacttggt ctatttcgtt ggcttaccat gatttatcag ttatccgcct gttaatagtt tttggtatgg atgttgtgca gccgcagtgt tccgtaagat atgcggcgac agaactttaa ttaccgctgt tcttttactt aagggaataa tgaagcattt aataaacaaa
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10401
<210> 6 <211> 990Β <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> vetor de Plasmidio construído
<400> 6
gtcgacggat
atgccgcata
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tgcttagggt
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acccccgccc
tccattgacg
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ggagaattag
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gtagcaccca
ggagctttgt
acgctgacgg
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aacaattaca
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gtcacttggt
cggtgggacg
gttgccctga
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gcggcaagaa
gatgggctgg
cgggagatct
gttaagccag
aatttaagct
taggcgtttt
gactagttat
ccgcgttaca
attgacgtca
tcaatgggtg
gccaagtacg
gtacatgacc
taccatggtg
gggatttcca
acgggacttt
tgtacggtgg
accagatctg
aaagcttgcc
agagatccct
ggacttgaaa
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cggaggctag
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tatagtatgg
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agaacttaga
gataaaagac
caccgcacag
ggagaagtga
ccaaggcaaa
tccttgggtt
tacaggccag
ttgaggcgca
gaatcctggc
ctggaaaact
tggaacagat
caagcttaat
aattattgga
tgtggtatat
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cccacctccc
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aaacaaatta
tggttaatta
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catttgcacc
ttggaatcac
acactcctta
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ttctatagtg
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aaagaatagt
caaaaattca
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gcgagcgctg
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gacattttag
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ggatttgggt
ctgctgggct
gagagaccgc
ggggggagcg
gggctgtgag
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tatggtgcac
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gcgatgtacg
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ggtaaactgc
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ttcctacttg
ggcagtacat
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gtaacaactc
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caagtagtgt
tagtcagtgt
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catccacaat
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tgggggcggg
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<210> 8 <211> 11893 <212> DNA
<213> seqüência Artificial <220>
<223> vetor de Plastrndio construído
<400> 8
gtcgacggat
atgccgcata
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cccgatcccc tatctgctcc acaacaaggc gcgctgcttc taatagtaat taacttacgg ataatgacgt gagtatttac ccccctattg ttatgggact atgcggtttt agtctccacc
tatggtgcac ctgcttgtgt aaggcttgac gcgatgtacg caattacggg taaatggccc atgttcccat ggtaaactgc acgtcaatga ttcctacttg ggcagtacat ccattgacgt
tctcagtaca gttggaggtc cgacaattgc ggccagatat gtcattagtt gcctggctga agtaacgcca ccacttggca cggtaaatgg gcagtacatc caatgggcgt caatgggagt
atctgctctg 60 gctgagtagt 120 atgaagaatc 180 acgcgttgac 240 catagcccat 300 ccgcccaacg 360 atagggactt 420 gtacatcaag 480 cccgcctggc 540 tacgtattag 600 ggatagcggt 660 ttgttttggc 720 accaaaatca gcggtaggcg
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ccaaaatgtc gaggtctata agcctgggag ttgagtgctt cagacccttt gcgaaaggga gcaagaggcg aaggagagag gaaaaaattc gcaagcaggg tgtagacaaa tcattatata accaaggaag caagcggccg attatataaa gagaagagtg cttgggagca acaattattg acagcatctg tgtggaaaga catttgcacc ttggaatcac acactcctta attagataaa aaaattattc ttctatagtg aaccccgagg agacagatcc tggcagtatt aaagaatagt caaaaattca agggtgcagc gcgagcgctg ctcaggacag gacattttag acaggcgagg gaacgccgat ggatttgggt ctgctgggct gagagaccgc ggggggagcg gggctgtgag tgaggccttc ggggaccctg ggggcggcag cgtcgtgtcg gtaggtgtgc ctcctgaatc ctttggtcgg cgctcggggt tttgggtcaa aaaattgtcc ttaacgaatt tgctggtcgc ccgtgtggaa aggaggtgca agatcgtgct agatgcacga cccccctgtg gcgtggtgaa gcttcaacat agctggacat actaccgcct tcgaccccat acaagacctt gcatcaagcc tcatcatccg gcagcatcga gccccggcca
20/29 gtaacaactc taagcagcgc ctctctggct caagtagtgt tagtcagtgt aaccagagga aggggcggcg atgggtgcga ggttaaggcc agctagaacg tactgggaca atacagtagc ctttagacaa ctgatcttca tataaagtag gtgcagagag gcaggaagca tctggtatag ttgcaactca tacctaaagg actgctgtgc acgacctgga attgaagaat tgggcaagtt ataatgatag aatagagtta ggacccgaca attcgattag catccacaat agacataata aaattttcgg ggcctccgcg ccacgtcaga cggcccgctg gacgggactt aaaagtagtc gattatataa cgcggttctt ggccggggct caagggctgt cacaaaatgg gtcgttgaaa gctaatgcgg acgtgaagtt ttatgcggtg tgacgtcacc ggtaggcttt gacaggcgcc ttttatgtac tggcgagtgt tatgtaattt gctaaattct catgcccatg ttccgtgcta ggaggccaag caacgtgtgg gggcaacgtg ggacatcatc cgtgaccctg caacaccacc caccaccgag cgtgagcctg gatcaactgc ccccatccac caacggcacc cgtggtgagc cagcgagaac gatcgtgtgc gaccttctac
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<213> seqüência Artificial <220>
<223> vetor de Plasnndio Construído <220>
<221> misc_feature <222> 4189
<223> n=a, t, c or g
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4Β80 4440 4500 4560 4620 4680 4740 4800 4860 4920 4980 5040 5100 5160 5220 5280 5340 5400 5460 5520 5580 5640 5700 5760 5820 5880 5940 6000 6060 6120 6180 6240 6300 6360 6420 6480 6540 6600 6660 6720 6780 6840 6900 6960 7020 7080 7140 7200 7260 7320 7380 7440 7500 7560 7620 7680 7740 7800 7860 7920 7980 8040 8100 8160 8220 8280 8340 8400 8460 gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa ttatggcagc actgcataat tctcttactg ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg aatgttgaat actcatactc ttcctttttc gtctcatgag cggatacata tttgaatgta gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgac
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<210> 10 <211> 9394 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> vetor de Plasirndio Construído
<220>
<221> misc_feature <222> 7971
<223> n=a ,t, c or g
<400> 10
ttgtacaaag
tagcatacat
gatatcaagc
attcttaact
catgctattg
tctctttatg
gctgacgcaa
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ggatggatga
taacttcgta 60 ggtacaattc 120 attgactggt 180 gcctttgtat 240 ctggttgctg 300 cactgtgttt 360 ttccgggact 420 tgcccgctgc 480 gaaatcatcg 540 gtccttctgc 600 gccggctctg 660 ttgggccgcc 720 caatcacaag 780 aggaggagga 840 ttctcatcac 900 ttttaatatt 960 gtttctcatg 1020 ttttattttt 1080 actggggtgt 1140 aattttaaaa 1200 aggactttga 1260 ttattttcta 1320 ttttttgtgt 1380 tccctgtttt 1440 tttcataggt 1500 gcctcactgt 1560 cattctttcc 1620 acattttaga 1680 gggactggaa 1740 ccacacacaa 1800 tccactgacc 1860 agccaatgaa 1920 cccggagaga 1980 aaaatattaq agtggaggtt tgacagccgc ctagcatttc atcacatggc cegagagctg 2040 catccggact g?a??gggtc tStctSgtla gaccagatct Qagcctggga gctctctggc 2100 taactaggga acccactgct taagcctcaa taaagcttgc ettgagtgct tcaagtagtg ^xou tgtgcccgtc tgttgtgtga ctctggtaac tagagatccc tcagaccctt ttagtcagtg ^zu tggaaaatct ctagcagcat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag ^ou qccgegttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg aegagcatca ^aaaaatcga 234ü cactcaaqtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct to aaaaactccc tEqtgcgctc tcctgttccg iccctgccgc ttaccggata cctgtccgcc 2460 tttrtccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg 2520 gtgtaggtcg «?gct?cla gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc 2580 tacaccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ^u ctggcagcag ccl?tggtaa caggattlgc agagcgaggt atgtaggcgg Jgctacagag 2700 oataacctaa ctacqgetac aetagaagaa eagtatttgg tatctgeget í/ou ctactaaaqe SttaccS cggaiiaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc 2820 aeeqctggta Sggtggttt ttttgtttgc Lgcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga 2880 tcteaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca 2940 eattaaqaqa ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacetagat ccttttaaat áuuu
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SSÍSESÍ sssss SSSSS2 h ? MS
SSSSS SSSSiSeC 38» bsèíí us
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d338S» SSSSS SSSSSi ξ ?c C 36βο
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ggtaaactgc ccacttggea gtaeateaag tgtatcatat gecaagtacg ccccc^ y
ISSSS geagtaeate § fgfJ - JfJg
ggcagtacat caatgggcgt ggatagcggt "Qactcacg gggattxcca ^t 4800
Sfacfacfc 3SSKS ngssas S™ i5!8
S3SSS IatCSlSSS SSSfS Itsi SS
Isisl iill Illillllli Iii liiililiil Il
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ISSgSS ÍSSSSSI Si séss 55Γο
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IIiiI IIiI ilil IisI lécfel ssss ss tccttaattg aagaatcgca aaaccagcaa gataaatggg caagtttgtg gaattggttt ttattcataa tgatagtagg aggcttggta atagtgaata gagttaggca gggatattca ccgaggggac ccgacaggcc cgaaggaata agatccattc gattagtgaa cggatcggca agtattcatc cacaatttta aaagaaaagg aatagtagac ataatagcaa cagacataca aattcaaaat tttcgggttt attacaggga cccggtgctt tgctctgagc cagcccacca ttttcaagta taaagtctag tgctaaattt tgggggaagg aaaaaaaatg gtggcagtgt tgttgtgtgt gaggatttct aatgacatgt cattctgcca tgtcaccccc tcgtgctcag aagattgata taaaccatgc ttcttgtgta cagcctgcat ttctgccagg gcccgctcta tcacgagatt ccagcaggtc gagggaccta ttatattaag ggttccaagc ttaagcggcc agttattaat agtaatcaat tacggggtca gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta tgggtggagt atttacggta aactgcccac agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt atgaccttat gggactttcc tacttggcag atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc cggtgggagg tctatataag cagagctggt cggctagaaa attgtccgct aaattctggc gttatcacaa gtttgtacaa aaaagcaggc tccggtaccg aattcaaaga caactcagag atggaatttt gttttgatgt attcaaggag ttctactgcc ccattgccat catgtcagct agcaccagga cacaaataaa taaggttgtt agtattgaag ctcagtgtgg cacatctgta aaccaaatca ccaaaccaaa tgatgtttat gaagagagat acccaatcct gccagaatac ggcttggaac ctatcaactt tcaaacagct tgggtagaaa gtcagacaaa tggaattatc tctcaaactg caatggttct ggttaatgcc tttaaggatg aagacacaca agcaatgcct gtgcagatga tgtaccagat tggtttattt aagatcctgg agcttccatt tgccagtggg gaagtctcag gccttgagca gcttgagagt accagttcta atgttatgga agagaggaag gaggaaaaat acaacctcac atctgtctta tcttcagcca atctgtctgg catctcctca catgcagcac atgcagaaat caatgaagca ggagtggatg ctgcaagcgt ctctgaagaa atcaagcaca tcgcaaccaa cgccgttctc gaagaaagct gaaaaactct gtcccttcca taaaatgaaa agtatgttct ctgctgcatc gactggaggc ttgctgaagg ctgtatgctg cactgactga caacccatga ttcagttctc catggaacaa atggcccatc tagacccagc
27/29
gaaaagaatg aacaagaatt attggaatta 6180 aacataacaa attggctgtg gtatataaaa 6240 ggtttaagaa tagtttttgc tgtactttct 6Β00 ccattatcgt ttcagaccca cctcccaacc 6360 gaagaagaag gtggagagag agacagagac 6420 ctgcgtgcgc caattctgca gacaaatggc 6480 ggggattggg gggtacagtg caggggaaag 6540 aactaaagaa ttacaaaaac aaattacaaa 6600 cagcagagat ccagtttggt tagtaccggg 6660 gtttggaatg actccttttt atgacttgaa 6720 aatttgaaca actgtatagt ttttgctggt 6780 ttttttcaga attagaagtg aaatgaaaat 6840 ggtggttgca tactgagtga agccggtgag 6900 taatgtactt tacagaaatc ctaaactcaa 6960 tatccggtct cttctctggg tagtctcact 7020 gtcgaggtcg acggtatcga taagctcgct 7080 ataacttcgt atagcataca ttatacgaag 7140 gcgtggataa ccgtattacc gccatgcatt 7200 ttagttcata gcccatatat ggagttccgc 7260 ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg 7320 acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa 7380 ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca 7440 aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac 7500 tacatctacg tattagtcat cgctattacc 7560 gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga 7620 gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg 7680 ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta 7740 ttagtgaacc gtcagatccg ctagcgctac 7800 cgtttttggc ttttttgtta gacaggatcc 7860 tctttaaagg aaccaattca gtcgactgga 7920 ttcaccatgg gctccatcgg ngcagcaagc 7980 ctcaaagtcc accatgccaa tgagaacatc 8040 ctagccatgg tatacctggg tgcaaaagac 8100 cgctttgata aacttccagg attcggagac 8160 aacgttcact cttcacttag agacatcctc 8220 tcgttcagcc ttgccagtag actttatgct 8280 ttgcagtgtg tgaaggaact gtatagagga 8340 gcagatcaag ccagagagct catcaattcc 8400 agaaatgtcc ttcagccaag ctccgtggat 8460 attgtcttca aaggactgtg ggagaaaaca 8520 ttcagagtga ctgagcaaga aagcaaacct 8580 agagtggcat caatggcttc tgagaaaatg 8640 acaatgagca tgttggtgct gttgcctgat 8700 ataatcaact ttgaaaaact gactgaatgg 8760 atcaaagtgt acttacctcg catgaagatg 8820 atggctatgg gcattactga cgtgtttagc 8880 gcagagagcc tgaagatatc tcaagctgtc 8940 ggcagagagg tggtagggtc agcagaggct 9000 tttagggctg accatccatt cctcttctgt 9060 ttctttggca gatgtgtttc cccttaaaaa 9120 acaagaccca gagcactgta gtatcagggg 9180 cagacttcat aaaagctgga gcttaatcta 9240 tgagaactga attccatggg ttgttttggc 9300 acaggacaca aggcctgtta ctagcactca 9360 tttc 9394
<210> 11 <211> 986 <212> PRT
<213> seqüência Artificial <220>
<223> Mutated Sindbis virus glycoprotein <400> 11
Met Ser Ala Ala Pro Leu Val Thr Ala Met Cys Leu Leu Gly Asn Val 10 15 Ser Phe Pro Cys Asp Arg Pro Pro Thr Cys Tyr Thr Arg Glu Pro ser
25 30
Arq Ala Leu Asp Ile Leu Glu Glu Asn Val Asn His Glu Ala Tyr Asp
40 45
Thr Leu Leu Asn Ala Ile Leu Arg Cys Gly Ser Ser Gly ser vai lie
50 55 60
Asp Asp Phe Thr Leu Thr Ser Pro Tyr Leu Gly Thr Cys ser Tyr Cys
65 70 75 . -, π 80
His His Thr vai Pro Cys Phe Ser Pro vai Lys Ile Glu Gln vai Trp
85 90 n 95
ASD Glu Ala Asp Asp Asn Thr lie Arg Ile Gln Thr Ser Ala Gln Phe
100 105 HO
Gly Tyr Asp Gln Ser Gly Ala Ala Ser Ala Asn Lys Tyr Arg Tyr Met
115 120 125
Ser Leu Lys Gln Met Tyr Pro Tyr Asp vai Pro Asp Tyr Ala Thr vai
130 135 140
Lys Glu Gly Thr Met Asp Asp Ile Lys Ile Ser Thr Ser Gly Pro Cys 145 150 155 160
Arg Arg Leu Ser Tyr Lys Gly Tyr Phe Leu Leu Ala Lys Cys Pro Pro
Gly Asp Ser Val Thr Val Ser Ile vai Ser Ser Asn ser Ala Thr ser
180 185 190
Cys Thr Leu Ala Arg Lys Ile Lys Pro Lys Phe vai Gly Arg Glu Lys
195 200 205
Tvr asp Leu Pro Pro vai His Gly Lys Lys lie Pro Cys Thr Val Tyr
210 215 220
Asp Arg Leu Ala Ala Thr Thr Ala Gly Tyr Ile Thr Met His Arg Pro 225 230 235 240
Ara Pro His Ala Tyr Thr Ser Tyr Leu Glu Glu ser Ser Gly Lys Val
a 245 250 255
Tyr Ala Lys Pro Pro Ser Gly Lys Asn Ile Thr Tyr Glu Cys Lys Cys
260 265 270
Glv Asp Tyr Lys Thr Gly Thr Val ser Thr Arg Thr Glu Ile Thr Gly
275 280 285
Cvs Thr Ala Ile Lys Gln Cys Val Ala Tyr Lys Ser Asp Gln Thr Lys
290 295 300
Trp vai Phe Asn ser Pro Asp Leu Ile Arg His Asp Asp His Thr Ala 305 310 315 320
Gln Gly Lys Leu His Leu Pro Phe Lys Leu Ile Pro ser Thr Cys Met
325 330 335
vai Pro vai Ala His Ala Pro Asn vai Ile His Gly Phe Lys His Ile
340 345 350
ser Leu Gln Leu Asp Thr Asp His Leu Thr Leu Leu Thr Thr Arg Arg
355 360 365
Leu Gly Ala Asn Pro Glu Pro Thr Thr Glu Trp Ile vai Gly Lys Thr
370 375 380
vai Arg Asn Phe Thr vai Asp Arg Asp Gly Leu Glu Tyr lie Trp Gly 385 390 395 400
Asn His Glu Pro vai Arg vai Tyr Ala Gln Glu ser Ala Pro Gly Asp
405 410 415
pro His Gly Trp Pro His Glu Ile vai Gln His Tyr Tyr His Arg His
420 425 430
pro vai Tyr Thr lie Leu Ala Val Ala ser Ala Thr Val Ala Met Met
435 440 445
Ile Gly vai Thr Val Ala vai Leu Cys Ala Cys Lys Ala Arg Arg Glu
450 455 460
Cvs Leu Thr Pro Tyr Ala Leu Ala Pro Asn Ala Val Ile Pro Thr ser ,ir 470 475 4oU
Leu Ala Leu Leu Cys Cys vai Arg ser Ala Asn Ala Glu Thr Phe Thr
485 490 495
Glu Thr Met Ser Tyr Leu Trp ser Asn ser Gln Pro Phe Phe Trp vai
500 505 510
Gln Leu Cys Ile Pro Leu Ala Ala Phe Ile vai Leu Met Arg Cys Cys
515 520 „ 525
Ser cvs Cys Leu Pro Phe Leu vai vai Ala Gly Ala Tyr Leu Ala Lys
530 535 540
vai Asp Ala Tyr Glu His Ala Thr Thr vai Pro Asn Val Pro Gln Ile 545 550 555 560
pro Tyr Lys Ala Leu vai Glu Arg Ala Gly Tyr Ala Pro Leu Asn Leu 565 570 575
Glu Ile Thr vai Met Ser ser Glu vai Leu Pro ser Thr Asn Gln Glu
580 585 590
Tyr Ile Thr Cys Lys Phe Thr Thr vai Val Pro Ser Pro Lys Ile Lys
595 600 605
Cys Cys Gly Ser Leu Glu Cys Gln Pro Ala Ala His Ala Gly Tyr Thr
610 615 620
Cys Lys vai Phe Gly Gly Val Tyr Pro Phe Met Trp Gly Gly Ala Gln 625 630 635 640
Cvs Phe Cys Asp Ser Glu Asn Ser Gln Met Ser Glu Ala Tyr Val Glu
645 650 655 .
Leu Ser Ala Asp Cys Ala Ser Asp His Ala Gln Ala Ile Lys Val His
660 665 670
Thr Ala Ala Met Lys vai Gly Leu Arg Ile vai Tyr Gly Asn Thr Thr
675 680 685
ser Phe Leu Asp vai Tyr vai Asn Gly vai Thr Pro Gly Thr Ser Lys
690 695 700
Asp Leu Lys vai lie Ala Gly Pro lie Ser Ala Ser Phe Thr Pro Phe 705 710 715 720
Asp His Lys vai Val Ile His Arg Gly Leu vai Tyr Asn Tyr Asp Phe
725 730 735
Pro Glu Tyr Gly Ala Met Lys Pro Gly Ala Phe Gly Asp Ile Gln Ala
740 745 750
Thr Ser Leu Thr Ser Lys Asp Leu lie Ala Ser Thr Asp Ile Arg Leu
755 760 765
Leu Lys Pro Ser Ala Lys Asn Val His vai Pro Tyr Thr Gln Ala ser
770 775 780
ser Gly Phe Glu Met Trp Lys Asn Asn Ser Gly Arg Pro Leu Gln Glu 785 790 795 800
Thr Ala Pro Phe Gly Cys Lys Ile Ala vai Asn Pro Leu Arg Ala vai
805 810 815
Asp Cys Ser Tyr Gly Asn lie Pro Ile Ser Ile Asp Ile Pro Asn Ala
820 825 830
Ala Phe Ile Arg Thr Ser Asp Ala Pro Leu Val ser Thr vai Lys Cys
835 840 845
Glu Val Ser Glu Cys Thr Tyr ser Ala Asp Phe Gly Gly Met Ala Thr
850 855 860
Leu Gln Tyr vai Ser Asp Arg Glu Gly Gln Cys Pro vai His Ser His 865 870 875 880
Ser Ser Thr Ala Thr Leu Gln Glu Ser Thr Val His Val Leu Glu Lys
885 890 895
Gly Ala vai Thr Val His Phe Ser Thr Ala Ser Pro Gln Ala Asn Phe
y 900 905 n 910
Ile vai Ser Leu Cys Gly Lys Lys Thr Thr Cys Asn Ala Glu Cys Lys
915 920 925
Pro Pro Ala Asp His Ile vai ser Thr Pro His Lys Asn Asp Gln Glu
930 935 940 ,
Phe Gln Ala Ala Ile Ser Lys Thr Ser Trp ser Trp Leu Phe Ala Leu 945 950 955 960
Phe Gly Gly Ala Ser Ser Leu Leu lie Ile Gly Leu Met lie Phe Ala
965 970 975
Cvs Ser Met Met Leu Thr Ser Thr Arg Arg 980 985

Claims (53)

"Método de Liberação de Polinucleotídio para Célula Dendrítica que Expressa DC-SIGN, Vetor, Vírus Recombinantes e Célula Dendrítica Transduzida com os Mesmos e Seus Usos" Reivindicações
1. - Método de Liberação de Polinucleotídio para Célula Dendrítica que Expressa DC-SIGN, caracterizado por que compreende: transduzir a célula dendrítica com um vírus recombinan- te, em que o vírus recombinante compreende o polinucleotí- dio a ser liberado e uma molécula alvo que se liga a DC-SIGN.
2. - Método de Liberação de Polinucleotídio para Célula Dendrítica que Expressa DC-SIGN, de acordo com a Reivindicação 1, caracteriza- do por que o vírus recombinante compreende seqüências do genoma de um lentivírus.
3. - Método de Liberação de Polinucleotídio para Célula Dendrítica que Expressa DC-SIGN, de acordo com a Reivindicação 2, caracteriza- do por que o vírus recombinante compreende seqüências de um geno- ma de HIV.
4. - Método de Liberação de Polinucleotídio para Célula Dendrítica que Expressa DC-SIGN, de acordo com a Reivindicação 1, caracteriza- do por que o vírus recombinante compreende seqüências do genoma de um gamaretrovírus.
5. - Método de Liberação de Polinucleotídio para Célula Dendrítica que Expressa DC-SIGN, de acordo com a Reivindicação 4, caracteriza- do por que o vírus recombinante compreende seqüências do genoma de um Vírus de Célula Tronco de Camundongo (MSCV) ou do genoma de um Vírus de Leucemia Murina (MLV).
6. - Método de Liberação de Polinucleotídio para Célula Dendrítica que Expressa DC-SIGN, de acordo com a Reivindicação 1, caracteriza- do por que a molécula alvo compreende uma glicoproteína viral deriva- da a partir de um vírus de uma família de vírus selecionada do grupo de: Togaviridae, Flaviviridae, Coronaviridae, Filoviridae e Herpesviridae.
7. - Método de Liberação de Polinucleotídio para Célula Dendrítica que Expressa DC-SIGN, de acordo com a Reivindicação 1, caracteriza- do por que a molécula alvo compreende uma glicoproteína viral deriva- da a partir de pelo menos um vírus selecionado do grupo de: Vírus de Sindbis, vírus da gripe, Vírus da febre de Lassa, vírus da encefalite transmitida pelo carrapato, Vírus da dengue, vírus da Hepatite B, Vírus da hidrofobia, Vírus da Floresta de Semliki, Vírus do Rio Ross, Vírus Aura, Vírus da doença de Borna, Vírus de Hantaan e vírus de SARS- CoV.
8. - Método de Liberação de Polinucleotídio para Célula Dendrítica que Expressa DC-SIGN, de acordo com a Reivindicação 7, caracteriza- do por que a molécula alvo compreende uma glicoproteína viral modifi- cada derivada do vírus de Sindbis.
9. - Método de Liberação de Polinucleotídio para Célula Dendrítica que Expressa DC-SIGN, de acordo com a Reivindicação 8, caracteriza- do por que a molécula alvo é SVGmu (SEQ ID NO: 11).
10. - Método de Liberação de Polinucleotídio para Célula Dendrítica que Expressa DC-SIGN, de acordo com a Reivindicação 1, caracteriza- do por que o vírus recombinante é pseudotipado.
11. - Método de Liberação de Polinucleotídio para Célula Dendrítica que Expressa DC-SIGN, de acordo com a Reivindicação 1, caracteriza- do por que o polinucleotídio compreende pelo menos um dos seguintes: um gene que codifica uma proteína de interesse, um gene que codifica um siRNA e um gene que codifica um microRNA de interesse.
12. - Método de Liberação de Polinucleotídio para Célula Dendrítica que Expressa DC-SIGN, de acordo com a Reivindicação 11, caracteri- zado por que o gene que codifica uma proteína de interesse codifica um antígeno.
13. - Método de Liberação de Polinucleotídio para Célula Dendrítica que Expressa DC-SIGN, de acordo com a Reivindicação 12, caracteri- zado por que o antígeno é um antígeno de tumor.
14. - Método de Liberação de Polinucleotídio para Célula Dendrítica que Expressa DC-SIGN, de acordo com a Reivindicação 12, caracteri- zado por que o antígeno é um antígeno de HIV.
15. - Método de Liberação de Polinucleotídio para Célula Dendrítica que Expressa DC-SIGN, de acordo com a Reivindicação 1, caracteriza- do por que compreende ainda os passos de: transfectar uma linha de célulass de embalagem com um vetor viral que compreende o polinucleotídio a ser liberado e um vetor que compreende um gene que codifica a molécula alvo; cultivar a linha de células de embalagem transfectada; e recuperar o vírus recombinante a partir da cultura de cé- lulas de embalagem.
16. - Método de Liberação de Polinucleotídio para Célula Dendrítica que Expressa DC-SIGN, de acordo com a Reivindicação 15, caracteri- zado por que a referida linha de células de embalagem é uma linha de células 293.
17. - Método de Liberação de Polinucleotídio para Célula Dendrítica que Expressa DC-SIGN, de acordo com a Reivindicação 15, caracteri- zado por que o polinucleotídio é liberado para uma célula dendrítica in vitro.
18. - Método de Liberação de Polinucleotídio para Célula Dendrítica que Expressa DC-SIGN, de acordo com a Reivindicação 15, caracteri- zado por que o polinucleotídio é liberado para uma célula dendrítica num sujeito in vivo.
19. - Método de Liberação de Polinucleotídio para Célula Dendrítica que Expressa DC-SIGN, de acordo com a Reivindicação 18, caracteri- zado por que o sujeito é um mamífero.
20. - Método de Liberação de Polinucleotídio para Célula Dendrítica que Expressa DC-SIGN, de acordo com a Reivindicação 19, caracteri- zado por que o sujeito é uma pessoa humana.
21. - Método de Liberação de Polinucleotídio para Célula Dendrítica que Expressa DC-SIGN, de acordo com a Reivindicação 19, caracteri- zado por que o sujeito é um rato.
22. - Vírus Recombinante, caracterizado por que compreende: um polinucleotídio de interesse; e uma molécula alvo que se liga de preferência a DC-SIGN.
23. - Vírus Recombinante, de acordo com a Reivindicação 22, caracte- rizado por que o vírus recombinante compreende seqüências do geno- ma de um lentivírus.
24. - Vírus Recombinante, de acordo com a Reivindicação 23, caracte- rizado por que o recombinante compreende seqüências a partir de um genoma de HIV.
25. - Vírus Recombinante, de acordo com a Reivindicação 22, caracte- rizado por que o vírus recombinante compreende seqüências a partir de do genoma de um gamaretrovírus.
26. - Vírus Recombinante, de acordo com a Reivindicação 25, caracte- rizado por que o vírus recombinante compreende seqüências a partir do genoma de um Vírus de Célula Tronco de Camundongo (MSCV) ou do genoma de um Vírus de Leucemia Murina (MLV).
27. - Vírus Recombinante, de acordo com a Reivindicação 22, caracte- rizado por que a molécula alvo compreende uma glicoproteína viral derivada a partir de um vírus de uma família de vírus selecionada do grupo de: Togaviridae, Flaviviridae, Coronaviridae, Filoviridae e Herpes- viridae.
28. - Vírus Recombinante, de acordo com a Reivindicação 22, caracte- rizado por que a molécula alvo compreende uma glicoproteína viral derivada a partir de pelo menos um vírus selecionado do grupo de: Vírus de Sindbis, vírus da gripe, Vírus da febre de Lassa, vírus da encefalite transmitida pelo carrapato, Vírus da dengue, Vírus da Hepati- te B, Vírus da hidrofobia, Vírus da Floresta de Semliki, Vírus do Rio Ross, Vírus Aura, Vírus da doença de Borna, Vírus de Hantaan e vírus de SARS-CoV.
29. - Vírus Recombinante, de acordo com a Reivindicação 28, caracte- rizado por que a molécula alvo compreende uma glicoproteína viral derivada a partir do vírus de Sindbis.
30. - Vírus Recombinante, de acordo com a Reivindicação 29, caracte- rizado por que a molécula alvo é SVGmu (SEQ ID NO: 11).
31. - Vírus Recombinante, de acordo com a Reivindicação 22, caracte- rizado por que o vírus recombinante é pseudotipado.
32. - Vírus Recombinante, de acordo com a Reivindicação 22, caracte- rizado por que o polinucleotídio compreende pelo menos um dos seguintes: um gene que codifica uma proteína de interesse, um gene que codifica um siRNA e um gene que codifica um microRNA de interes- se.
33. - Vírus Recombinante, de acordo com a Reivindicação 30, caracte- rizado por que a proteína de interesse é um antígeno.
34. - Vírus Recombinante, de acordo com a Reivindicação 33, caracte- rizado por que o antígeno é um antígeno de tumor.
35. - Vírus Recombinante, de acordo com a Reivindicação 33, caracte- rizado por que antígeno é um antígeno de HIV.
36. - Vírus Recombinante, de acordo com a Reivindicação 21, caracte- rizado por que polinucleotídio de interesse codifica um gene repórter.
37. - Uso de Vírus Recombinante, na preparação de medicamento para estimular uma resposta imuno num mamífero por liberação de um polinucleotídio que codifica um antígeno para células dendríticas expressando DC-SIGN, caracterizado por que o vírus recombinante compreende o polinucleotídio e uma molécula alvo que se liga especifi- camente a DC-SIGN.
38. - Vetor, caracterizado por que codifica uma molécula alvo que se liga especificamente a DC-SIGN.
39. - Vetor, de acordo com a Reivindicação 38, caracterizado por que a molécula alvo é derivada a partir de uma glicoproteína viral.
40.- Vetor, de acordo com a Reivindicação 39, caracterizado por que a molécula alvo é SVGmu (SEQ ID NO: 11).
41. - Uso de Vírus Recombinante, na preparação de medicamento para tratar paciente com uma doença por administração do vírus recombi- nante ao paciente, caracterizado por que o vírus recombinante com- preende pelo menos um gene de interesse que codifica um antígeno associado à doença e uma molécula alvo que se liga a DC-SIGN.
42. - Uso de Vírus Recombinante, de acordo com a Reivindicação 41, caracterizado por que o vírus recombinante codifica um segundo gene de interesse.
43. - Uso de Vírus Recombinante, de acordo com a Reivindicação 42, caracterizado por que o segundo gene de interesse codifica um fator de maturação.
44. - Uso de Vírus Recombinante, de acordo com a Reivindicação 43, caracterizado por que o fator de maturação é selecionado a partir do grupo que consiste em GM-CSF, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15, IL-21, IL- 23, TNFa, B7.1, B7.2, 4-1BB, ligante de CD40 (CD40L) e CD40 (ÍCD40) induzível por droga.
45. - Uso de Vírus Recombinante, de acordo com a Reivindicação 41, caracterizado por que a molécula alvo é derivada a partir de uma glicoproteína viral.
46. - Uso de Vírus Recombinante, de acordo com a Reivindicação 45, caracterizado por que a molécula alvo é SVGmu (SEQ ID NO: 11).
47. - Uso de Vírus Recombinante, de acordo com a Reivindicação 41, caracterizado por que a doença é câncer.
48. - Uso de Vírus Recombinante, de acordo com a Reivindicação 41, caracterizado por que a doença é HIV/AIDS.
49. - Célula Dendrítica Transduzida com Vírus Recombinante, caracterizada por que o vírus recombinante compreende um polinucle- otídio de interesse e uma molécula alvo que se liga a DC-SIGN.
50. - Célula Dendrítica Transduzida com Vírus Recombinante de acordo com a Reivindicação 49, caracterizada por que a molécula alvo compreende uma glicoproteína viral derivada a partir de um vírus de uma família de vírus selecionada do grupo de: Togaviridae, Flaviviridae, Coronaviridae, Filoviridae e Herpesviridae.
51. - Célula Dendrítica Transduzida com Vírus Recombinante, de acordo com a Reivindicação 49, caracterizada por que a molécula alvo compreende uma glicoproteína viral derivada a partir de pelo menos um vírus selecionado do grupo de: Vírus de Sindbis, vírus da gripe, Vírus da febre de Lassa, vírus da encefalite transmitida pelo carrapato, Vírus da dengue, Vírus da Hepatite B, Vírus da hidrofobia, Vírus da Floresta de Semliki, Vírus do Rio Ross, Vírus Aura, Vírus da doença de Borna, Vírus de Hantaan e vírus de SARS-CoV.
52. - Célula Dendrítica Transduzida com Vírus Recombinante de reivindicação 49, caracterizada por que a molécula alvo é SVGmu (SEQ ID NO: 11).
53. - Uso de Vírus Recombinante, na preparação de medicamento para imunizar um mamífero por liberação de polinucleotídio que codifica um antígeno para células dendríticas que expressam DC-SIGN, caracteri- zado por que o vírus recombinante compreende um polinucleotídio que codifica um antígeno e uma molécula alvo que se liga a DC-SIGN.
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Families Citing this family (65)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070065906A1 (en) * 2003-03-05 2007-03-22 Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute Process for producing heterologous protein in e. coli
WO2006130855A2 (en) 2005-06-01 2006-12-07 California Institute Of Technology Method of targeted gene delivery using viral vectors
CA2659529C (en) 2006-07-21 2016-11-01 California Institute Of Technology Targeted gene delivery for dendritic cell vaccination
US8119772B2 (en) * 2006-09-29 2012-02-21 California Institute Of Technology MART-1 T cell receptors
US20090257982A1 (en) * 2008-04-11 2009-10-15 Scheiber Lane Bernard medical device for treating diabetes mellitus, obesity, chronic fatigue, aging, and other medical conditions by utilizing modified virus virions to insert messenger ribonucleic acid molecules into cells
US20090257983A1 (en) * 2008-04-11 2009-10-15 Scheiber Lane Bernard Medical treatment device for treating aids by utilizing modified human immunodeficiency virus virions to insert anti-viral medications into t-helper cells
US20090258879A1 (en) * 2008-04-12 2009-10-15 Scheiber Lane Bernard Method for treating cancer, rheumatoid arthritis and other medical diseases by utilizing modified virus virions to insert medications into targeted cells
EA027693B1 (ru) * 2008-09-26 2017-08-31 Токаджен Инк. Рекомбинантный репликационно-компетентный ретровирус с цитозиндезаминазной активностью для генной терапии нарушений клеточной пролиферации
US9051359B2 (en) 2009-03-30 2015-06-09 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Influenza virus vaccines and uses thereof
JP5941841B2 (ja) 2009-05-26 2016-06-29 アイカーン スクール オブ メディシン アット マウント サイナイ 周期的投与によって作製されたインフルエンザウイルスに対するモノクローナル抗体及びその使用
DK2456786T4 (en) 2009-07-24 2017-08-07 Immune Design Corp LENTIVIRUS VECTORS DETERMINED PSEUDOTYPE WITH A COAT PEGYCLOPROTEIN FROM SINDBIS VIRUS
EP2536425B1 (en) 2010-02-18 2019-06-19 Icahn School of Medicine at Mount Sinai Vaccines for use in the prophylaxis and treatment of influenza virus disease
WO2011119628A2 (en) 2010-03-23 2011-09-29 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for self-adjuvanting vaccines against microbes and tumors
AU2011235220B2 (en) 2010-03-30 2016-03-10 Mount Sinai School Of Medicine Influenza virus vaccines and uses thereof
MX350795B (es) 2011-04-08 2017-09-19 Inmune Design Corp Composiciones inmunogenicas y metodos para utilizar las composiciones para inducir respuestas inmunes humorales y celulares.
IN2014CN02114A (pt) 2011-09-20 2015-05-29 Sinai School Medicine
US9713635B2 (en) 2012-03-30 2017-07-25 Immune Design Corp. Materials and methods for producing improved lentiviral vector particles
WO2013149167A1 (en) 2012-03-30 2013-10-03 Immune Design Corp. Lentiviral vector particles having improved transduction efficiency for cells expressing dc- sign
US8323662B1 (en) 2012-03-30 2012-12-04 Immune Design Corp. Methods useful for generating highly mannosylated pseudotyped lentiviral vector particles comprising a Vpx protein
CN102702356B (zh) * 2012-07-18 2013-12-25 上海大学 鼠源dcf1特异性多克隆抗体及其制备方法
ES2786051T3 (es) 2012-10-25 2020-10-08 Tocagen Inc Vector retroviral con casete de mini-promotor
ES2929942T3 (es) 2012-12-18 2022-12-05 Icahn School Med Mount Sinai Vacunas contra el virus de la gripe y sus usos
US10000546B2 (en) * 2013-03-13 2018-06-19 Health Research, Inc. Compositions and method for use of recombinant T cell receptors for direct recognition of tumor antigen
WO2014159960A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Antibodies against influenza virus hemagglutinin and uses thereof
WO2014163213A1 (en) * 2013-04-05 2014-10-09 Kyushu University, National University Corporation Anti-tumor dna vaccine
EA035259B1 (ru) * 2014-02-14 2020-05-21 Иммьюн Дизайн Корп. Иммунотерапия рака с применением комбинации местной и системной иммунной стимуляции
CN103933558B (zh) * 2014-05-13 2015-11-18 无锡伊琳生物技术有限公司 一种新型、广谱的治疗性肿瘤疫苗的制备和使用方法
WO2015191508A1 (en) 2014-06-09 2015-12-17 Voyager Therapeutics, Inc. Chimeric capsids
SG11201703148TA (en) 2014-11-05 2017-05-30 Voyager Therapeutics Inc Aadc polynucleotides for the treatment of parkinson's disease
CN114717264A (zh) 2014-11-14 2022-07-08 沃雅戈治疗公司 治疗肌萎缩性侧索硬化(als)的组合物和方法
KR102584655B1 (ko) 2014-11-14 2023-10-06 보이저 테라퓨틱스, 인크. 조절성 폴리뉴클레오티드
EP3230441A4 (en) 2014-12-12 2018-10-03 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the production of scaav
AU2016209032A1 (en) 2015-01-23 2017-08-10 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Influenza virus vaccination regimens
CN104830786A (zh) * 2015-05-05 2015-08-12 杨光华 基于her-2/neu抗原的dc细胞、靶向性免疫细胞群及其制备方法和用途
EP3297680A2 (en) 2015-05-20 2018-03-28 Yeda Research and Development Co. Ltd Method of targeting senescent cells
AU2016321256A1 (en) 2015-09-09 2018-03-29 Immune Design Corp. NY-ESO-1 specific TCRs and methods of use thereof
CN106916791B (zh) * 2015-12-25 2021-05-04 中国医学科学院医学生物学研究所 人轮状病毒毒种ztr-18毒株及其分离，培养及鉴定
EA201891717A1 (ru) 2016-02-23 2019-02-28 Иммьюн Дизайн Корп. Препараты мультигеномных ретровирусных векторов и способы и системы для их получения и применения
MX2018012472A (es) 2016-04-15 2019-08-12 Alpine Immune Sciences Inc Proteinas inmunomoduladoras variantes de ligando icos y sus usos.
MA43552A (fr) 2016-04-15 2018-11-07 Alpine Immune Sciences Inc Protéines immunomodulatrices à variants de cd80 et leurs utilisations
WO2017189959A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease
WO2017189964A2 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions for the treatment of disease
US11951121B2 (en) 2016-05-18 2024-04-09 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treating Huntington's disease
BR112018073384A2 (pt) 2016-05-18 2019-03-06 Voyager Therapeutics, Inc. polinucleotídeos moduladores
BR112018075032A2 (pt) 2016-06-15 2019-03-26 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai proteínas de hemaglutinina do vírus influenza e seus uso
US11471488B2 (en) 2016-07-28 2022-10-18 Alpine Immune Sciences, Inc. CD155 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
CN110088127A (zh) 2016-07-28 2019-08-02 高山免疫科学股份有限公司 Cd155变体免疫调节蛋白及其用途
WO2018022945A1 (en) 2016-07-28 2018-02-01 Alpine Immune Sciences, Inc. Cd112 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
WO2018044933A1 (en) 2016-08-30 2018-03-08 The Regents Of The University Of California Methods for biomedical targeting and delivery and devices and systems for practicing the same
EP3872180A1 (en) 2016-10-20 2021-09-01 Alpine Immune Sciences, Inc. Secretable variant immunomodulatory proteins and engineered cell therapy
WO2018148180A2 (en) 2017-02-07 2018-08-16 Immune Design Corp. Materials and methods for identifying and treating cancer patients
HUE064136T2 (hu) 2017-03-16 2024-02-28 Alpine Immune Sciences Inc PD-L1 variáns immunmódosító fehérjék és alkalmazásuk
EP3596115A1 (en) 2017-03-16 2020-01-22 Alpine Immune Sciences, Inc. Pd-l2 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
MX2019010887A (es) 2017-03-16 2019-10-15 Alpine Immune Sciences Inc Proteinas inmunomoduladoras de cb80 variante y usos de estas.
US11254733B2 (en) 2017-04-07 2022-02-22 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Anti-influenza B virus neuraminidase antibodies and uses thereof
CN110913866A (zh) 2017-05-05 2020-03-24 沃雅戈治疗公司 治疗肌萎缩性侧索硬化(als)的组合物和方法
MX2019013172A (es) 2017-05-05 2020-09-07 Voyager Therapeutics Inc Composiciones y metodos para tratar la enfermedad de huntington.
JOP20190269A1 (ar) 2017-06-15 2019-11-20 Voyager Therapeutics Inc بولي نوكليوتيدات aadc لعلاج مرض باركنسون
US20210139889A1 (en) * 2017-06-19 2021-05-13 Yale University Compositions and Methods for Multiplexed Genome Editing and Screening
CA3070087A1 (en) 2017-07-17 2019-01-24 Voyager Therapeutics, Inc. Trajectory array guide system
CN111479924B (zh) 2017-10-16 2024-06-14 沃雅戈治疗公司 肌萎缩性侧索硬化症(als)的治疗
EP3697908A1 (en) 2017-10-16 2020-08-26 Voyager Therapeutics, Inc. Treatment of amyotrophic lateral sclerosis (als)
EA202090974A1 (ru) 2017-10-18 2020-08-05 Элпайн Иммьюн Сайенсиз, Инк. Вариантные иммуномодулирующие белки лиганда icos и сопутствующие композиции и способы
WO2019241758A1 (en) 2018-06-15 2019-12-19 Alpine Immune Sciences, Inc. Pd-1 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
CA3120868A1 (en) 2018-11-30 2020-06-04 Alpine Immune Sciences, Inc. Cd86 variant immunomodulatory proteins and uses thereof

Family Cites Families (70)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5168062A (en) * 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
US4886499A (en) 1986-12-18 1989-12-12 Hoffmann-La Roche Inc. Portable injection appliance
US5057540A (en) 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
US4937190A (en) 1987-10-15 1990-06-26 Wisconsin Alumni Research Foundation Translation enhancer
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
CA2017507C (en) 1989-05-25 1996-11-12 Gary Van Nest Adjuvant formulation comprising a submicron oil droplet emulsion
US5298420A (en) * 1990-08-03 1994-03-29 Tanox Biosystems, Inc. Antibodies specific for isotype specific domains of human IgM and human IgG expressed or the B cell surface
TW279133B (pt) 1990-12-13 1996-06-21 Elan Med Tech
US5328483A (en) 1992-02-27 1994-07-12 Jacoby Richard M Intradermal injection device with medication and needle guard
CA2145063A1 (en) * 1992-09-22 1994-03-31 Cambridge Genetics Limited Recombinant viruses displaying a nonviral polypeptide on their external surface
US6534051B1 (en) 1992-11-20 2003-03-18 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Cell type specific gene transfer using retroviral vectors containing antibody-envelope fusion proteins and wild-type envelope fusion proteins
US5279552A (en) 1993-01-11 1994-01-18 Anton Magnet Intradermal injection device
US5997501A (en) 1993-11-18 1999-12-07 Elan Corporation, Plc Intradermal drug delivery device
AU4594996A (en) 1994-11-30 1996-06-19 Chiron Viagene, Inc. Recombinant alphavirus vectors
US5660835A (en) 1995-02-24 1997-08-26 East Carolina University Method of treating adenosine depletion
US6261554B1 (en) * 1995-07-25 2001-07-17 Introgene B.V. Compositions for targeted gene delivery
US6013516A (en) 1995-10-06 2000-01-11 The Salk Institute For Biological Studies Vector and method of use for nucleic acid delivery to non-dividing cells
US5910434A (en) * 1995-12-15 1999-06-08 Systemix, Inc. Method for obtaining retroviral packaging cell lines producing high transducing efficiency retroviral supernatant
US6734014B1 (en) * 1996-02-08 2004-05-11 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Methods and compositions for transforming dendritic cells and activating T cells
FR2747046B1 (fr) * 1996-04-05 1998-06-19 Univ Paris Curie Nouveaux vaccins issus de plasmovirus
US6432699B1 (en) * 1997-03-28 2002-08-13 New York University Viral vectors having chimeric envelope proteins containing the IgG-binding domain of protein A
US20010007659A1 (en) * 1997-04-17 2001-07-12 The University Of California Use of lentiviral vectors for antigen presentation in dendritic cells
US6531123B1 (en) * 1997-05-01 2003-03-11 Lung-Ji Chang Lentiviral vectors
US6099847A (en) * 1997-05-15 2000-08-08 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Chimeric Gag pseudovirions
WO1999013905A1 (en) * 1997-09-18 1999-03-25 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Receptor-binding pocket mutants of influenza a virus hemagglutinin for use in targeted gene delivery
ZA988446B (en) 1997-09-18 2000-03-22 Res Dev Foundation Production of vaccines using arthropod vectored viruses.
US6218181B1 (en) 1998-03-18 2001-04-17 The Salk Institute For Biological Studies Retroviral packaging cell line
US7078483B2 (en) * 1998-04-29 2006-07-18 University Of Southern California Retroviral vectors including modified envelope escort proteins
AU4012100A (en) * 1999-03-16 2000-10-04 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Pseudotyped lentiviral vectors and uses thereof
WO2000061772A2 (en) * 1999-04-14 2000-10-19 Chiron Corporation Compositions and methods for generating an immune response utilizing alphavirus-based vector systems
EP1046651A1 (en) * 1999-04-19 2000-10-25 Koninklijke Universiteit Nijmegen Composition and method for modulating dendritic cell-T interaction
AU6930200A (en) 1999-08-27 2001-03-26 Regents Of The University Of California, The Use of lentiviral vectors for antigen presentation in dendritic cells
EP1210433A2 (en) 1999-08-31 2002-06-05 The Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions of a novel serine protease inhibitor
WO2001026681A2 (en) * 1999-10-13 2001-04-19 Chiron Corporation Method of obtaining cellular immune responses from proteins
US7241275B2 (en) 1999-10-14 2007-07-10 Becton, Dickinson And Company Intradermal needle
US20020193740A1 (en) 1999-10-14 2002-12-19 Alchas Paul G. Method of intradermally injecting substances
US6776776B2 (en) 1999-10-14 2004-08-17 Becton, Dickinson And Company Prefillable intradermal delivery device
US6569143B2 (en) 1999-10-14 2003-05-27 Becton, Dickinson And Company Method of intradermally injecting substances
US6494865B1 (en) 1999-10-14 2002-12-17 Becton Dickinson And Company Intradermal delivery device including a needle assembly
US6627442B1 (en) * 2000-08-31 2003-09-30 Virxsys Corporation Methods for stable transduction of cells with hiv-derived viral vectors
EP1201750A1 (en) * 2000-10-26 2002-05-02 Genopoietic Synthetic viruses and uses thereof
JP2004532012A (ja) * 2001-03-02 2004-10-21 メルク　エンド　カムパニー　インコーポレーテッド ウイルスリポーター粒子
US7732193B2 (en) * 2001-09-13 2010-06-08 California Institute Of Technology Method for expression of small RNA molecules within a cell
US7737124B2 (en) * 2001-09-13 2010-06-15 California Institute Of Technology Method for expression of small antiviral RNA molecules with reduced cytotoxicity within a cell
AU2002336517B2 (en) * 2001-09-13 2008-09-11 California Institute Of Technology Method for producing transgenic animals
US7195916B2 (en) * 2001-09-13 2007-03-27 California Institute Of Technology Method for expression of small antiviral RNA molecules within a cell
US6971999B2 (en) 2001-11-14 2005-12-06 Medical Instill Technologies, Inc. Intradermal delivery device and method
ES2374042T3 (es) 2002-02-04 2012-02-13 Becton, Dickinson And Company Dispositivo y método para suministrar o extraer una sustancia a través de la piel.
US7047070B2 (en) 2002-04-02 2006-05-16 Becton, Dickinson And Company Valved intradermal delivery device and method of intradermally delivering a substance to a patient
US7115108B2 (en) 2002-04-02 2006-10-03 Becton, Dickinson And Company Method and device for intradermally delivering a substance
US6780171B2 (en) 2002-04-02 2004-08-24 Becton, Dickinson And Company Intradermal delivery device
US6863884B2 (en) * 2002-05-01 2005-03-08 Cell Genesys, Inc. Pseudotyped retroviral vectors
US7455833B2 (en) * 2002-07-15 2008-11-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for treating viral infections using antibodies and immunoconjugates to aminophospholipids
DE60322070D1 (de) * 2002-08-16 2008-08-21 Dept Of Medical Sciences Minis Rekombinante bcg-vakzine
US7250251B2 (en) * 2002-09-09 2007-07-31 The J. David Gladstone Institutes Virion-based fusion assay
WO2004056966A2 (en) 2002-12-18 2004-07-08 Salk Institute For Biological Studies Methods of inhibiting gene expression by rna interference
US7090837B2 (en) * 2003-01-21 2006-08-15 The Salk Institute For Biological Studies Compositions and methods for tissue specific targeting of lentivirus vectors
US20050214318A1 (en) * 2003-10-23 2005-09-29 Nmk Research, Llc Immunogenic composition and method of developing a vaccine based on fusion protein
US7108679B2 (en) 2004-03-11 2006-09-19 Becton, Dickinson And Company Intradermal syringe and needle assembly
JP2005291001A (ja) 2004-03-31 2005-10-20 Isuzu Motors Ltd ディーゼルエンジン
US20050238626A1 (en) 2004-04-01 2005-10-27 Lili Yang Antigen specific T cell therapy
WO2005113584A1 (en) * 2004-04-29 2005-12-01 Board Of Regents, University Of Texas System Methods and compositions comprising protein l immunoglobulin binding domains for cell-specific targeting
WO2005118802A2 (en) * 2004-06-03 2005-12-15 The Regents Of The University Of California Targeting pseudotyped retroviral vectors
GB0417494D0 (en) * 2004-08-05 2004-09-08 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
WO2006031996A2 (en) * 2004-09-14 2006-03-23 University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education Targeting viruses using a modified sindbis glycoprotein
WO2006130855A2 (en) 2005-06-01 2006-12-07 California Institute Of Technology Method of targeted gene delivery using viral vectors
US9631217B2 (en) * 2006-06-29 2017-04-25 Deep Science, Llc Systems for arbitrary peptide synthesis
CA2659529C (en) * 2006-07-21 2016-11-01 California Institute Of Technology Targeted gene delivery for dendritic cell vaccination
FR2917303B1 (fr) * 2007-06-12 2015-04-03 Imv Technologies Element filtrant et paillette munie d'un bouchon comportant un tel element filtrant
EP3342872A1 (en) 2007-12-11 2018-07-04 The University of North Carolina at Chapel Hill Polypurine tract modified retroviral vectors

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