KR20230005965A - 바이러스 감염 관련 질환 또는 증후군의 치료 및/또는 예방 - Google Patents

바이러스 감염 관련 질환 또는 증후군의 치료 및/또는 예방 Download PDF

Info

Publication number
KR20230005965A
KR20230005965A KR1020227042186A KR20227042186A KR20230005965A KR 20230005965 A KR20230005965 A KR 20230005965A KR 1020227042186 A KR1020227042186 A KR 1020227042186A KR 20227042186 A KR20227042186 A KR 20227042186A KR 20230005965 A KR20230005965 A KR 20230005965A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
infection
aat
cov
sars
disease
Prior art date
Application number
KR1020227042186A
Other languages
English (en)
Inventor
니콜라이 주콥스키
Original Assignee
아틀라스 바이오테크놀로지 에스.에이.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 아틀라스 바이오테크놀로지 에스.에이. filed Critical 아틀라스 바이오테크놀로지 에스.에이.
Priority claimed from PCT/EP2021/061597 external-priority patent/WO2021219896A1/en
Publication of KR20230005965A publication Critical patent/KR20230005965A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/55—Protease inhibitors
    • A61K38/57—Protease inhibitors from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2121/00—Preparations for use in therapy

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 바이러스 감염 관련 질환 또는 증후군의 치료 및/또는 예방을 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명은 나아가 이러한 치료에 대한 개체의 민감성을 결정하는 방법 뿐만 아니라 효과적인 치료에 필요한 조성물의 양을 결정하는 방법에 관한 것이다.

Description

바이러스 감염 관련 질환 또는 증후군의 치료 및/또는 예방
본 발명은 바이러스 감염 관련 질환 또는 증후군의 치료 및/또는 예방을 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명은 나아가 이러한 치료에 대한 개체의 민감성을 결정하는 방법 뿐만 아니라 효과적인 치료에 필요한 조성물의 양을 결정하는 방법에 관한 것이다.
예를 들어 코로나바이러스와 같은 바이러스는 전 세계 동물과 인간에게 질병을 유발한다. 코로나바이러스는 RNA 바이러스이다.
인간 코로나바이러스(HCoV)는 주로 상기도 및 하기도 감염을 일으키는 것으로 알려져 있다. 인간 코로나바이러스의 예는 다음과 같다: 중동 호흡기 증후군을 유발하는 베타 코로나바이러스(MERS-CoV로 명명), 중증 급성 호흡기 증후군을 유발하는 베타 코로나바이러스(SARS-CoV, or SARS-CoV-1로 명명), 코로나바이러스 질환 2019 또는 COVID-19를 유발하는 신규한 코로나바이러스(SARS-CoV-2로 명명), 알파 코로나바이러스 299E, 알파 코로나바이러스 NL63, 베타 코로나바이러스 OC43 및 베타 코로나바이러스 HKU1.
SARS-CoV-2 감염에 의해 유발되는 질환 또는 증후군은 COVID-19라고도 불린다. SARS-CoV-2 감염은 무증상이거나, 경증 또는 중증 증상과 관련된 질환 또는 증후군으로 이어질 수 있다. SARS-CoV-2(SARS-CoV-19라고도 함) 감염과 관련된 질환 또는 증후군의 가장 흔한 증상은 발열 및 기침, 피로, 호흡 장애, 오한, 관절 또는 근육 통증, 객담, 가래 생성, 호흡 곤란, 근육통, 관절통 또는 인후염, 두통, 메스꺼움, 구토, 설사, 부비강 통증, 코막힘, 후각 또는 미각 감소 또는 변화이다. 추가 증상은 식욕 부진, 체중 감소, 복통, 결막염, 피부 발진, 림프종, 무감각 및 졸음을 포함한다.
증상이 심한 환자는 폐렴이 발생할 수 있다. 상당수의 폐렴 환자는 수동 산소 요법이 필요하다. 비-침습적 환기 및 고유량 비강 산소 요법이 경증 및 중등도 비-과탄산혈증 폐렴 사례에 적용될 수 있다. 폐-구조 환기 전략은 중증 급성 호흡기 증후군 또는 급성 호흡 곤란 증후군(SARS/ARDS) 및 기계 호흡 중인 환자에게 시행되어야 한다.
코로나바이러스 질환 2019(COVID-19)의 주요 합병증은 호흡 부전이지만, 상당수의 환자가 말초 및 중추 신경계에 영향을 미치는 신경 증상으로 보고된 바 있다(Niazkar, Zibaee et al. 2020 Neurol Sci 41(7): 1667-1671; Nordvig, Fong et al. 2021, Neurol Clin Pract 11(2): e135-e146). 조혈 경로, 말초 신경을 따른 후방/전방 수송 뿐만 아니라 희귀한 직접 침습은 SARS-CoV-2를 포함한 향신경성 바이러스의 잠재적인 신경침습 기전으로 간주된다(Barrantes 2021 Brain Behav Immun Health 14: 100251; Tavcar, Potokar et al. 2021, Front Cell Neurosci 15: 662578). SARS-CoV-2의 심각한 경우는 종종 사이토카인, 케모카인 및 전염증성 신호의 전신 상향조절을 포함하여, 불균형적이고 비정상적인 염증 반응을 나타낸다(Najjar, Najjar et al. 2020, J Neuroinflammation 17(1): 231). 이러한 전신 과염증은 신경혈관 내피 기능을 손상시키고, 혈액 뇌 장벽을 손상시켜, 궁극적으로 CNS 면역계를 활성화하고 CNS 합병증에 기여할 수 있다(Amruta, Chastain et al., 2021, Cytokine Growth Factor Rev 58: 1-15).
COVID-19 팬데믹이 최근 주목을 받았음에도 불구하고, 몇몇 다른 바이러스는 알츠하이머병, 파킨슨병 및 다발성 경화증과 같은 주요 뇌 장애와 관련이 있다. 바이러스 감염 관련 질환 또는 증후군은 나아가 염증성 질환과 같은 광범위한 질환 또는 증후군을 포함하며, 사회에 큰 부담이 된다. 그러므로, 바이러스 관련 질환 또는 증후군의 치료 및/또는 예방을 향상시킬 필요가 있다.
상기 기술적 문제는 본원에 기재되고 청구범위에 기재된 관점에 의해 해결된다.
본 발명은 이를 필요로 하는 개체에서, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 관련 질환 또는 증후군의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 조성물로서, 치료학적 유효량의 알파1-항트립신 단백질, 이의 변이체, 아이소폼(isoform) 및/또는 단편을 포함하는 조성물을 제공한다. 상기 알파1-항트립신(AAT) 단백질, 이의 변이체, 아이소폼 및/또는 단편은 혈장-추출 AAT, 이의 변이체, 아이소폼 및/또는 단편, 특히 인간 혈장-추출 AAT, AAT, 이의 변이체, 아이소폼 및/또는 단편; 또는 재조합 알파1-항트립신(rhAAT) 단백질, 이의 변이체, 아이소폼 및/또는 단편일 수 있고, 바람직하게는 상기 알파1-항트립신(AAT) 단백질, 이의 변이체, 아이소폼 및/또는 단편은 재조합 알파1-항트립신(rhAAT) 단백질, 이의 변이체, 아이소폼 및/또는 단편이다. 코로나바이러스 감염과 같은 바이러스 감염은 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염이다. 상기 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 관련 질환 또는 증후군의 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 개체는 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중 무증상이거나 경미한 증상을 가지는 적어도 하나의 개체와 비교하여, 적어도 i) 더 낮은 수준의 내인성 알파-항트립신(AAT), ii) 더 높은 수준의 적어도 하나의 스파이크 단백질 프라이밍 프로테아제, iii) 더 높은 수준의 안지오텐신 전환효소 2(ACE2) 수용체, 및/또는 iv) 더 높은 수준의 인테페론-감마(IFN-γ)를 가질 수 있다.
상기 발명은 또한 본 발명의 조성물을 이용하여 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 관련 질환 또는 증후군의 치료 및/또는 예방에 대한 관심 개체의 민감성을 결정하는 방법에 관한 것이다.
상기 발명은 나아가 본 발명의 조성물을 이용하여 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 관련 질환 또는 증후군의 효과적인 치료 및/또는 예방에 대한 알파1-항트립신(AAT)의 치료학적 유효량을 결정하는 방법을 제공한다.
이를 필요로 하는 개체에서 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 관련 질환 또는 증후군의 치료 및/또는 예방 방법이 또한 제공되는데, 상기 방법은 알파1-항트립신 단백질, 이의 변이체, 아이소폼 및/또는 단편의 치료학적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 상기 알파1-항트립신(AAT) 단백질, 이의 변이체, 아이소폼 및/또는 단편은 혈장-추출 AAT, 이의 변이체, 아이소폼 및/또는 단편, 특히 인간 혈장-추출 AAT, AAT, 이의 변이체, 아이소폼 및/또는 단편; 또는 재조합 알파1-항트립신(rhAAT) 단백질, 이의 변이체, 아이소폼 및/또는 단편일 수 있고, 바람직하게는 상기 알파1-항트립신(AAT) 단백질, 이의 변이체, 아이소폼 및/또는 단편은 재조합 알파1-항트립신(rhAAT) 단백질, 이의 변이체, 아이소폼 및/또는 단편이다.
따라서, 상기 발명은 그 중에서도, 다음 관점에 관한 것이다:
1. 치료학적 유효량의 알파1-항트립신(AAT) 단백질, 이의 변이체, 아이소폼 및/또는 단편을 포함하는, 바이러스 감염 관련 질환 또는 증후군의 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 개체에서 바이러스 감염 관련 질환 또는 증후군의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 조성물.
2. 관점 1에 있어서, 상기 이를 필요로 하는 개체는 하기로 구성된 군에서 선택된 적어도 하나 이상을 가지는 것인, 조성물:
1. 무증상이거나 경미한 증상을 가지는, 바이러스 감염 중인 적어도 하나의 개체와 비교하여, 바이러스 감염 전 또는 바이러스 감염 중 더 낮은 수준의 내인성 알파-항트립신(AAT),
2. 무증상이거나 경미한 증상을 가지는, 바이러스 감염 중인 적어도 하나의 개체와 비교하여, 바이러스 감염 전 또는 바이러스 감염 중 더 높은 수준의 적어도 하나의 스파이크 단백질 프라이밍 프로테아제,
3. 무증상이거나 경미한 증상을 가지는, 바이러스 감염 중인 적어도 하나의 개체와 비교하여, 바이러스 감염 전 또는 바이러스 감염 중 개체 내 더 높은 수준의 안지오텐신 전환 효소 2(ACE2 수용체), 및
4. 무증상이거나 경미한 증상을 가지는, 바이러스 감염 중인 적어도 하나의 개체와 비교하여, 바이러스 감염 전 또는 바이러스 감염 중 개체 내 더 높은 수준의 인터페론-감마(IFN-γ).
3. 관점 2에 있어서, 상기 바이러스 감염 전 또는 바이러스 감염 중 더 낮은 수준의 내인성 AAT는 AAT-결핍에 의해 야기되는 것인, 조성물.
4. 관점 2 또는 3에 있어서, 상기 스파이크 단백질 프라이밍 프로테아제는 막관통 프로테아제 세린 서브타입 2(TMPRSS2), 막관통 프로테아제 서브타입 6(TMPRSS6), 카텝신 L, 카텝신 B, 전구단백질 전환효소 1(PC1), 트립신, 엘라스타제, 호중구 엘라스타제, 마트립타제 및 푸린, 바람직하게는 카텝신 L 및 푸린으로 구성된 군에서 선택된 적어도 하나인 것인, 조성물.
5. 관점 2 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 상기 더 높은 수준의 적어도 하나의 스파이크 단백질 프라이밍 프로테아제는 연령 및/또는 유전적 소인에 의해 야기되는 것인, 조성물.
6. 관점 2 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 더 높은 수준의 ACE2 수용체는 감염, 염증, 연령 및 유전적 소인으로 구성된 군에서 선택된 적어도 하나에 의해 야기되는 것인, 조성물.
7. 관점 2 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 상기 더 높은 수준의 IFN-γ는 감염, 염증, 연령 및 유전적 소인으로 구성된 군에서 선택된 적어도 하나에 의해 야기되는 것인, 조성물.
8. 관점 2 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 상기 이를 필요로 하는 개체는
iii) 더 낮은 수준의 내인성 AAT, 및
iv) 더 높은 수준의 적어도 하나의 스파이크 단백질 프라이밍 프로테아제를 가지는 것인, 조성물.
9. 관점 2 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 상기 이를 필요로 하는 개체는
ii) 더 낮은 수준의 내인성 AAT 및
iii) 더 높은 수준의 ACE2 수용체를 가지는 것인, 조성물.
10. 관점 2 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 상기 이를 필요로 하는 개체는
ii) 더 낮은 수준의 내인성 AAT 및
iv) 더 높은 수준의 IFN-γ를 가지는 것인, 조성물.
11. 관점 10에 있어서, 상기 더 높은 수준의 IFN-γ는 AAT-결핍, 비-알코올성 지방간 질환과 같은 간질환, 당뇨병, 비만 및 심혈관 병태로 구성된 군에서 선택된 적어도 하나의 질병 또는 병태에 의해 야기되는 것인, 조성물.
12. 관점 2 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 상기 이를 필요로 하는 개체는
i) 더 낮은 수준의 내인성 AAT,
ii) 더 높은 수준의 적어도 하나의 스파이크 단백질 프라이밍 프로테아제, 및
iii) 더 높은 수준의 ACE2 수용체 및/또는 iv) 더 높은 수준의 IFN-γ을 가지는 것인, 조성물.
13. 선행하는 관점 중 어느 하나에 있어서, 상기 알파1-항트립신(AAT) 단백질, 이의 변이체, 아이소폼 및/또는 단편은 인간 혈장에서 추출되는 것인, 조성물.
14. 관점 1 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, 상기 알파1-항트립신(AAT) 단백질, 이의 변이체, 아이소폼 및/또는 단편은 재조합 알파1-항트립신(rhAAT), 이의 변이체, 아이소폼 및/또는 단편인 것인, 조성물.
15. 관점 14에 있어서, 상기 알파1-항트립신 단백질은 서열번호 1로 표시되는 것인, 조성물.
16. 관점 14에 있어서, 상기 알파1-항트립신 단편은 C-말단 서열 단편, 또는 이의 임의의 조합인 것인, 조성물.
17. 관점 14에 있어서, 상기 알파1-항트립신 변이체는 서열번호 2로 표시된 C-말단 서열로부터 유래된 짧은 고리형 펩티드를 포함하는 군에서 선택된 것인, 조성물.
18. 관점 17에 있어서, 상기 알파1-항트립신의 C-말단 서열로부터 유래된 짧은 고리형 펩티드는 Cyclo-(CPFVFLM)-SH, Cyclo-(CPFVFLE)-SH, Cyclo-(CPFVFLR)-SH, 및 Cyclo-(CPEVFLM)-SH, 또는 이의 임의의 조합을 포함하는 군에서 선택된 것인, 조성물.
19. 선행하는 관점 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물은 약학적으로 허용되는 부형제 또는 담체를 추가로 포함하는 것인, 조성물.
20. 선행하는 관점 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물은 뉴클레오시드 유사체, 프로테아제 억제제, 면역억제제(예: 사릴루맙(sarilumab) 또는 토실리주맙(tocilizumab)), 항생체, 바이러스의 구조적 성분에 대한 항체 또는 이의 단편(예: 수동 면역요법), 인터페론 베타(예: 인터페론 베타-1a), 및/또는 백신을 추가로 포함하는 것인, 조성물.
21. 선행하는 관점 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물은 정맥내 주사(injection), 정맥내 주입(infusion), 도세터(dosator) 펌프를 이용한 주입, 흡입 비강 분무, 점안액, 피부 패치, 서방성 제제, 생체외(ex vivo) 유전자치료 또는 생체외 세포요법, 바람직하게는 정맥내 주사에 의해 투여되는 것인, 조성물.
22. 다음 단계를 포함하는, 관점 1 내지 21 중 어느 하나에 정의된 치료학적 유효량의 알파1-항트립신(AAT) 단백질, 이의 변이체, 아이소폼 및/또는 단편을 포함하는 조성물을 이용하여, 바이러스 감염 관련 질환 또는 증후군의 치료 및/또는 예방에 대한 관심 개체의 민감성을 결정하는 방법:
a) 바이러스 감염 전 또는 바이러스 감염 중인 관심 개체에서 내인성 알파1-항트립신, 적어도 하나의 스파이크 단백질 프라이밍 프로테아제, ACE2 수용체 및 인터페론-감마를 포함하는 군 중 적어도 하나의 수준을 결정하는 단계,
b) 바이러스 감염 중인 적어도 하나의 참조 개체에서 내인성 알파1-항트립신, 적어도 하나의 스파이크 단백질 프라이밍 프로테아제, ACE2 수용체 및 인터페론-감마를 포함하는 군 중 적어도 하나의 수준을 결정하는 단계로서, 상기 참조 개체는 무증상이거나 경미한 증상을 가지는 것인 단계,
c) a) 단계에서 결정된 관심 수준을 b) 단계에서 결정된 참조 수준과 비교하는 단계로서, 상기 관심 개체가 하기로 구성된 군에서 선택된 적어도 하나를 가지는 경우, 상기 관심 개체가 바이러스 감염 관련 질환 또는 증후군의 치료 및/또는 예방에 더욱 민감한 것인 단계:
1. 내인성 AAT의 참조 수준과 비교하여, 더 낮은 수준의 관심 내인성 알파-항트립신(AAT),
2. 적어도 하나의 스파이크 단백질 프라이밍 프로테아제의 참조 수준과 비교하여, 더 높은 수준의 적어도 하나의 관심 스파이크 단백질 프라이밍 프로테아제,
3. ACE2 수용체의 참조 수준과 비교하여, 더 높은 수준의 관심 안지오텐신 전환효소 2(ACE 수용체), 및
4. IFN-γ의 참조 수준과 비교하여, 더 높은 수준의 관심 인터페론-감마(IFN-γ).
23. 다음 단계를 포함하는, 관점 1 내지 21 중 어느 하나에 따른 조성물을 이용하여 바이러스 감염 관련 질환 또는 증후군의 효과적인 치료 및/또는 예방을 위한 알파1-항트립신(AAT)의 치료학적 유효량을 결정하는 방법:
a) 바이러스 감염 전 또는 바이러스 감염 중인 관심 개체에서 내인성 알파1-항트립신의 수준을 결정하는 단계,
b) 적어도 10 μM, 바람직하게는 적어도 20 μM, 보다 바람직하게는 적어도50 μM, 보다 더 바람직하게는 적어도 100 μM, 및 가장 바람직하게는 적어도 200 μM의 개체 내 AAT의 수준을 달성하는데 필요한, 조성물 내 AAT의 양을 결정하는 단계.
24. 관점 1 내지 21 중 어느 하, 또는 관점 22 및 23에 있어서, 상기 바이러스는 코로나바이러스인, 조성물 또는 방법.
25. 관점 24에 따른 조성물 또는 관점 24에 따른 방법에 있어서, 상기 바이러스는 SARS-CoV-2인, 조성물 또는 방법.
26. 관점 1 내지 25 중 어느 하나, 또는 관점 22 내지 25에 있어서, 상기 질환 또는 증후군은 호흡기 증후군 또는 중증 급성 호흡기 증후군인, 조성물 또는 방법.
27. 관점 1 내지 25 중 어느 하나, 또는 관점 22 내지 25에 있어서, 상기 질환 또는 증후군은 신경계의 염증성 질환 또는 증후군인, 조성물 또는 방법.
28. 관점 1 내지 27 중 어느 하나에 따른 조성물, 또는 관점 27에 따른 방법에 있어서, 상기 신경계의 염증성 질환 또는 증후군은 다발성 경화증, 근위축성 측삭 경화증, 알츠하이머병, 파킨슨병 및 헌팅턴병의 군에서 선택된 질환 또는 증후군인, 조성물 또는 방법.
본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 재료는 하기에 기재한다. 여기에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참고문헌은 그 전체가 참고로서 포함된다. 여기에 논의된 간행물 및 적용은 본원의 출원일 이전의 개시내용에 대해서만 제공된다. 본원의 어떠한 내용도 본 발명이 선행 발명으로 인해 그러한 공개 보다 선행할 자격이 없음을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 또한, 재료, 방법 및 실시예는 예시일 뿐이며, 제한하려는 의도는 아니다.
충돌하는 경우, 정의를 포함한 본 명세서가 우선한다. 달리 정의되지 않는 한, 여기에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본원이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 사용된 것과 같이, 다음의 정의는 본 발명의 이해를 용이하게 하기 위해 제공된다.
"포함한다/포함하는"이라는 용어는 일반적으로 포함한다/포함하는 의미, 즉 하나 이상의 특징 또는 구성요소의 존재를 허용하는 의미로 사용된다.
명세서 및 청구범위에 사용된, 단수형 "하나의" 및 "상기"는 문맥이 명백히 달리 지시하지 않는 한 복수 대상을 포함한다.
본원에 있어서, "적어도 하나"는 "하나 이상", "둘 이상", "셋 이상" 등을 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "개체"/"이를 필요로 하는 개체" 또는 "환자"/"이를 필요로 하는 환자"는 당업계에 잘 알려져 있으며, 개, 고양이, 쥐, 생쥐, 원숭이, 소, 말, 염소, 양, 돼지, 낙타, 및 가장 바람직하게는, 인간을 포함하는 포유류를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 일부 경우에 있어서, 치료가 필요한 개체 또는 질병 또는 장애가 있는 개체이다. 그러나, 다른 관점에서, 상기 개체는 정상인 개체일 수 있다. 상기 용어는 특정 연령이나 성별을 나타내지 않는다. 따라서, 여성이든 남성이든, 성인, 아동 및 신생아 개체를 포함하는 것으로 의도된다. 바람직하게는, 상기 개체는 인간이다. 가장 바람직하게는, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 관련 질환 또는 증후군을 앓고 있는 인간이다.
본원에서 사용된 용어 "펩티드(peptide)", "단백질", "폴리펩티드(polypeptide)", "폴리펩티드의(polypeptidic)" 및 ""펩티드의(peptidic)"는 상호교환적으로 사용되어, 인접한 잔기의 알파-아미노기 및 카복시기 사이의 펩티드 결합에 의해 다른 것과 연결과 일련의 아미노산 잔기를 지명한다.
용어 "핵산", "폴리뉴클레오티드" 및 "올리고뉴클레오티드"는 상호교환적으로 사용되고, 선형 또는 원형 형태, 및 단일 또는 이중 가닥 형태의, 임의의 종류의 데옥시리보뉴클레오티드(예: DNA, cDNA, ...) 또는 리보뉴클레오티드(예: RNA, mRNA, ...) 중합체 또는 데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드(예: DNA/RNA) 중합체의 조합을 말한다. 이러한 용어는 중합체의 길이를 제한하는 것으로 해석되어서는 안되며, 천연 뉴클레오티드, 뿐만 아니라 염기, 당 및/또는 인산 모이어티(예: 포스포로티오에이트 골격)가 변형된 뉴클레오티드의 공지의 유사체를 포함할 수 있다. 일반적으로, 특정 뉴클레오티드의 유사체는 동일한 염기쌍 특이성을 가진다; 즉, A의 유사체는 T와 염기쌍을 이룰 것이다.
본원에서 사용된, 용어 "벡터"는 본 발명의 하나 이상의 이종 핵산 서열(들)을 함유하는, 바이러스 벡터 또는 플라스미드 또는 기타 비히클과 같은 핵산(DNA 또는 RNA) 분자이고, 특히, 상이한 숙주 세포 사이의 이동을 위해 설계된다. 용어 "발현 벡터", "유전자 전달 벡터" 및 "유전자 치료 벡터"는 세포 내, 특히 프로모터의 조절 하에서, 본 발명의 하나 이상의 핵산(들)을 편입 및 발현시키는데 효과적인 임의의 벡터를 말한다. 클로닝 또는 발현 벡터는 프로모터 외에 추가적인 요소, 예를 들어, 조절 및/또는 전사후 조절 요소를 포함할 수 있다.
용어 "약"은 특히 주어진 양과 관련하여, 10 퍼센트, 특히 5 퍼센트, 더욱 더 바람직하게는 2 퍼센트 및 가장 바람직하게는 1 퍼센트 전후의 편차를 포함하는 것을 의미한다.
본 발명은 이를 필요로 하는 개체에 임의의 바이러스 관련 질환 또는 증후군의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물은 치료학적 유효량의 알파1-항트립신 단백질, 이의 변이체, 아이소폼 및/또는 단편을 포함한다.
상기 알파1-항트립신 단백질, 이의 변이체, 아이소폼 및/또는 단편은 혈장-추출된 AAT, 이의 변이체, 아이소폼 및/또는 단편, 특히, 인간 혈장-추출된 AAT, 이의 변이체, 아이소폼 및/또는 단편; 또는 재조합 알파1-항트립신(rhAAT) 단백질, 이의 변이체, 아이소폼 및/또는 단편일 수 있고, 특히 상기 알파1-항트립신(AAT) 단백질, 이의 변이체, 아이소폼 및/또는 단편은 재조합 알파1-항트립신(rhAAT) 단백질, 이의 변이체, 아이소폼 및/또는 단편이다. 바이러스 감염은 DNA 바이러스(이중 또는 단일 가닥), RNA 바이러스(단일 또는 이중 가닥, 양성 또는 음성), 역전사 바이러스 또는 외피 또는 비외피 여부에 관계없이, 임의의 발생하는 바이러스로 인한 것일 수 있다.
본 발명의 일부 관점에서, 상기 조성물은 이를 필요로 하는 개체에서 호흡기 바이러스 감염 관련 질환 또는 증후군의 치료 및/또는 예방에 사용된다. 일부 관점에서, 본원에 기재된 호흡기 바이러스는 라이노바이러스, RSV, 파라인플루엔자, 메타뉴모바이러스, 코로나바이러스, 엔테로바이러스, 아데노바이러스, 보카바이러스, 폴리오마바이러스, 단순 헤르페스 바이러스 및 사이토메칼로바이러스의 군에서 선택된 바이러스이다.
본 발명의 일부 관점에서, 상기 조성물은 이를 필요로 하는 개체에서 DNA 바이러스 감염 관련 질환 또는 증후군의 치료 및/또는 예방에 사용된다.
일부 관점에서, 본원에 기재된 DNA 바이러스는 라이노바이러스, RSV, 파라인플루엔자, 메타뉴모바이러스, 코로나바이러스, 엔테로바이러스, 아데노바이러스, 보카바이러스, 폴리오마바이러스, 단순 헤르페스 바이러스 및 사이토메칼로바이러스로 구성된 군에서 선택된다.
본 발명의 일부 관점에서, 상기 조성물은 이를 필요로 하는 개체에서 RNA 바이러스 감염 관련 질환 또는 증후군의 치료 및/또는 예방에 사용된다. 상기 RNA 바이러스는 외피 또는 코팅된 바이러스 또는 비외피 또는 네이키드 RNA 바이러스일 수 있다. 상기 RNA 바이러스는 단일 가닥 RNA(ssRNA) 바이러스 또는 이중 가닥 RNA(dsRNA) 바이러스일 수 있다. 상기 단일 가닥 RNA 바이러스는 양성(positive) 센스 ssRNA 바이러스 또는 음성(negative) 센스 ssRNA 바이러스일 수 있다.
일부 관점에서, 본원에 기재된 상기 RNA 바이러스는 라이노바이러스, RSV, 파라인플루엔자, 메타뉴모바이러스, 코로나바이러스, 엔테로바이러스, 아데노바이러스, 보카바이러스, 폴리오마바이러스, 단순 헤르페스 바이러스 및 사이토메칼로바이러스로 구성된 군에서 선택된다.
본 발명의 일부 관점에서, 상기 조성물은 이를 필요로 하는 개체에서 코로나바이러스 감염 관련 질환 또는 증후군의 치료 및/또는 예방에 사용된다. 일부 관점에서, 본원에 기재된 상기 코로나바이러스는 α-CoV, β-CoV, γ-CoV 또는 δ-CoV의 군에서 선택된 속의 코로나바이러스이다. 또 다른 하나의 특정 관점에서, 본원에 기재된 상기 코로나바이러스는 α-CoV 또는 β-CoV 속이다. 일부 관점에서, 본원에 기재된 코로나바이러스는 인간 코로나바이러스 OC43(HCoV-OC43), 인간 코로나바이러스 HKU1(HCoV-HKU1), 인간 코로나바이러스 229E(HCoV-229E), 인간 코로나바이러스 NL63(HCoV-NL63, 뉴헤이븐(New Haven) 코로나바이러스), 중동 호흡기 증후군-관련 코로나바이러스(MERS-CoV 또는 "신규 코로나바이러스 2012"), 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스(SARS-CoV 또는 "SARS-클래식"), 및 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2 또는 "신규 코로나바이러스 2019")로 구성된 군에서 선택된다. 특히, 상기 바이러스 감염은 RNA 바이러스 감염, 가장 바람직하게는 MERS-CoV, SARS-CoV 및 SARS-CoV-2를 포함하는 비제한적인 군으로부터 선택된 코로나바이러스로 인한 코로나바이러스 감염이다. 가장 바람직하게는, 상기 바이러스 감염은 SARS-CoV-2 감염이다.
본 발명은 바이러스 감염, 특히 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 관련 모든 질환 또는 증후군을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 상기 SARS-CoV-2 감염 관련 질환 또는 증후군은 또한 COVID-19로도 불린다. 일 관점에서, 상기 바이러스 감염 관련 질환 또는 증후군은 예를 들어, 전신 혈관의, 염증(예: 가와사키병), 면역질환(예: 그레이브스병) 및/또는 호흡기 증후군, 특히 중증 급성 호흡기 증후군이다. 바이러스 감염이 질환 또는 증후군 이전에, 질환 또는 증후군과 연관되고, 상기 질환 또는 증후군에 기여하고/하거나 질환 또는 증후군을 유발한다는 점에서, 상기 질환 또는 증후군은 바이러스 감염과 관련될 수 있다. 예를 들어, 상기 바이러스 감염은 직접적으로 또는 간접적으로 질환 또는 증후군을 유도하는 염증을 유도할 수 있다. 바이러스 감염 관련 염증은 급성 또는 만성 염증일 수 있다. 상기 바이러스 감염 관련 염증은 추후 전신 및/또는 특정 기관, 예를 들어, 뇌에서 지속되고/되거나 지속적인 손상을 유발할 수 있다. 본 발명의 일부 관점에서, 상기 조성물은 이를 필요로 하는 개체에서 바이러스 감염 관련 신경계의 염증성 질환 또는 증후군의 치료 및/또는 예방에 사용된다.
본원에서 사용된, 용어 "신경계의 염증성 질환 또는 증후군"은 건강한 참조 개체와 비교하여 신경계 내 증가된 염증을 특징으로 하는 질환, 증후군 및/또는 병태를 말한다. 신경계의 질환 또는 증후군을 포함하는 본원에 기재된 질환 또는 증후군은 바이러스와 관련된다. 염증은 염증 마커의 조절장애 및/또는 혈액 및/또는 뇌에서 증가된 면역세포 침윤, 활성화, 증식 및/또는 분화를 특징으로 한다. 염증 마커는 개체 내의 염증을 나타내는 마커이다. 특정 관점에서, 본원에 기재된 염증 마커는 CRP, 적혈구 침강 속도(ESR) 및 프로칼시토닌(PCR), 인터루킨(예: IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-33, IL-32, IL-33, IL-35 또는 IL-36), 종양 괴사 인자(예: TNF 알파, TNF 베타), 인터페론(예: 인터페론 감마), MIP-I, MCP-I, RANTES, 기타 케모카인 및/또는 기타 사이토카인의 군에서 선택된다. 염증 마커는 또한 예를 들어, 염증 마커의 억제 인자(예: 결합 인자 및/또는 길항제)에 의해, 간접적으로 검출할 수 있다. 일부 관점에서, 상기 염증 마커는 염증에 관여하는 세포, 염증에 관여하는 세포에 의해 영향을 받는 세포, 뇌척수액 및/또는 혈액에서 측정된다. 일부 관점에서, 상기 염증 마커는 면역세포 침윤, 활성화, 증식 및/또는 분화를 나타낸다. 염증 마커의 검출 또는 둘 이상의 염증 마커의 비는 정상 범위를 벗어나 검출된다. 염증 마커의 정상 범위 및 마커(비)가 염증을 나타내는 역치 이하 또는 이상이어야 하는지 여부는 당업자에게 알려져 있다. 일부 관점에서, 적어도 하나의 염증 마커의 유전자 발현 수준, RNA 전사 수준, 단백질 발현 수준, 단백질 활성 수준 및/또는 효소 활성 수준이 검출된다. 일부 관점에서, 적어도 하나의 염증 마커는 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 개체에서 신경계의 염증성 질환 또는 증후군을 확인하기 위해 정량적으로 및/또는 정성적으로 검출된다.
일부 관점에서, 본원에 기재된 신경계의 염증성 질환 또는 증후군은 급성 염증을 특징으로 하며, 즉 염증의 지속 시간은 전형적으로 약 수분(예: 2, 5, 10, 15, 30, 45분)에서 수일(예: 2, 3, 5, 7, 10 또는 14일)이 걸린다. 급성 염증은 전형적으로 바이러스 감염과 같은 자극의 직접적인 결과로 발생한다. 일부 관점에서, 상기 신경계의 염증성 질환 또는 증후군은 만성 염증을 특징으로 하며, 즉 염증 증상의 지속 기간은 전형적으로 적어도 약 수일(예: 2, 3, 5, 7, 10 또는 14일)이 걸리고, 또는 염증의 증상이 적어도 한번(예: 한번 또는 이상, 두 번 또는 이상, 또는 세 번 또는 이상) 재발한다. 일부 관점에서, 상기 신경계의 염증성 질환 또는 증후군은 만성 저급 염증을 특징으로 한다. 만성 저급 염증은 임상 증상이 없을 때 발생할 수 있다.
특정 관점에서, 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 개체는 바이러스 감염의 이력이 있다. 그러므로, 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 개체는 적어도 한 번 바이러스에 감염되었다. 특정 관점에서, 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 개체는 적어도 한 번 바이러스에 감염되었다. 특정 관점에서, 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 개체는 어린 시절에 적어도 한 번 바이러스에 감염되었다. 특정 관점에서, 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 개체는 적어도 한 번 바이러스에 감염되었다. 특정 관점에서, 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 개체는 지난 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 또는 0.5 년 동안 적어도 한 번 바이러스에 감염되었다. 특정 관점에서, 바이러스 감염은 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 개체에서 신경계의 염증성 질환 또는 증후군의 진단 시점에 활성(예: 검출가능)이다.
바이러스 감염을 검출하는 방법은 당업자에게 알려져 있다. 일부 관점에서, 본 발명은 바이러스 분리, 핵산 기반 방법, 현미경 기반 방법, 숙주 항체 검출, 전자 현미경 및 숙주 세포 표현형의 군에서 선택된 바이러스 검출 방법에 관한 것이다.
일부 관점에서, 본원에 기재된 바이러스 감염은 비인두 면봉, 혈액, 조직(예: 피부), 가래, 가글액, 기관지 세척액, 소변, 정액, 대변, 뇌척수액, 건조 혈반 및 비강 점액의 군에서 선택된 샘플에서와 같은, 샘플에서 검출된다.
일부 관점에서, 본원에 기재된 바이러스 감염은 환자 이력으로부터 검색된 정보로부터 획득된다.
(이전) SARS-CoV-2 감염의 검출을 위한 예는 인간 IFN-γ SARS-CoV-2 ELISpotPLUS 키트(ALP), 스트립(Mabtech, 3420-4AST-P1-1) 또는 T-세포 반응의 확인이 포함된다(Zuo, J., Dowell, A.C., Pearce, H. et al., 2021, Nat Immunol).
일부 관점에서, 본원에 기재된 신경계의 염증성 질환 또는 증후군은 교감 신경계의 염증성 질환 또는 증후군이다. 일부 관점에서, 본원에 기재된 신경계의 염증성 질환 또는 증후군은 부교감 신경계의 염증성 질환 또는 증후군이다. 일부 관점에서, 본원에 기재된 신경계의 염증성 질환 또는 증후군은 중추 신경계의 염증성 질환 또는 증후군이다. 일부 관점에서, 본원에 기재된 신경계의 염증성 질환 또는 증후군은 말초 신경계의 염증성 질환 또는 증후군이다.
특정 관점에서, 바이러스 관련 신경계의 염증성 질환 또는 증후군은 다발성 경화증, 근위축성 측삭 경화증, 알츠하이머병, 파킨슨병 및 헌팅턴병의 군에서 선택된다.
본원에 사용된, 용어 "다발성 경화증"은 염증, 탈수초, 희소돌기아교세포 사멸, 막 손상 및 축색돌기 사멸을 특징으로 하는 질환 또는 장애를 말한다. 일부 관점에서, 본원에 기재된 다발성 경화증은 재발성/완화성 다발증 경화증 또는 진행성 다발성 경화증을 말한다. 일부 관점에서, 다발성 경화증은 신경과 전문의에 대한 국제 조사(Lublin and Reingold, 1996, Neurology 46(4):907-11)에 정의된 네 가지 주요 다발성 경화증 변종 중 적어도 하나이며, 이는 즉 재발성/완화성 다발성 경화증, 이차 진행성 다발증 경화증, 진행성/재발성 다발성 경화증, 또는 원발성 진행성 다발성 경화증(PPMS)이다.
일부 관점에서, 본원에 기재된 다발성 경화증은 시력 문제, 현기증, 어지러움, 감각 기능장애, 쇠약, 협응 문제, 균형 상실, 피로, 통증, 신경인지 결핍, 정신 건강 결핍, 방광 기능장애, 장 기능장애, 성 기능장애 및 열 감응성을 포함하는, 다발성 경화증의 증상을 말한다.
본원에 사용된, 용어 "헌팅턴병"은 병원성 돌연변이 헌팅턴 단백질(HTT 또는 mHTT)의 생성을 야기하는, HTT 유전자 내 트리-뉴클레오티드 반복 확장(예: vhffl-글루타민, 또는 PolyQ, 관으로 번역되는, CAG)에 의해 야기되는 신경퇴행성 질환을 말한다. 일부 관점에서, 돌연변이 헌팅턴 단백질은 뇌의 특정 영역에서 신경세포 사멸 속도를 가속화한다. 일부 관점에서, 본원에 기재된 헌팅턴병은 손상된 운동기능, 인지 장애, 우울증, 불안, 운동 장애, 무도병, 강직, 근육 수축(긴장이상), 느린 안구 운동 또는 비정상적인 안구 운동, 손상된 보행, 자세 변경, 손상된 균형, 의도하지 않은 체중 감소, 수면 리듬 장애, 일주기 리듬 장애 및 자율 신경계 기능장애를 포함하는 헌팅턴병의 증상을 말한다.
본원에 사용된, 용어 "근위축성 측삭 경화증"은 상부 운동 뉴런(뇌의 운동 뉴런) 및/또는 하부 운동 뉴런(척수의 운동 뉴런)에 영향을 미치고, 운동 뉴런 사멸을 초래하는, 진행성 신경퇴행성 질환을 말한다. 일부 관점에서, 근위축성 측삭 경화증은 고전적 근위축성 측삭 경화증(전형적으로 하부 및 상부 운동 뉴런 모두에 영향을 미침), 원발성 측삭 경화증(PLS, 전형적으로 상부 운동 뉴런에 영향을 미침), 진행성 숨뇌 마비(PBP 또는 연수 발생, 전형적으로 삼키기, 씹기 및 말하기의 어려움으로 시작되는 근위축성 측삭 경화증의 한 버전), 진행성 근육 위축(PMA, 전형적으로 하부 운동 뉴런에만 영향을 미침) 및 가족 근위축성 측삭 경화증(근위축성 측삭 경화증의 유전적 버전)을 포함하지만, 제한되는 것은 아닌, 당업계에 알려진 근위축성 측삭 경화증의 모든 분류를 포함한다.
일부 관점에서, 용어 "근위축성 측삭 경화증"은 진행성 쇠약, 위축, 섬유속연축, 과다반사, 구음장애, 연하곤란 및/또는 호흡기능 마비를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 근위축성 측삭 경화증의 증상을 말한다.
본원에서 사용된, 용어 "알츠하이머병"(AD)은 진행성 기억력 결핍, 혼란, 행동 문제, 스스로 돌봄 불가, 및/또는 점진적 신체 악화를 임상적으로 나타내는, 기억노인성 플라크, 신경염 엉킴 및 진행성 신경세포 소실을 특징으로 하는, 특정 퇴행성 뇌 질환과 연관된 정신 황폐화를 말한다.
일부 관점에서, 알츠하이머병을 앓고 있는 개체는 NINCDS-ADRDA(신경 및 의사소통 장애 국립 연구소 및 알츠하이머병 및 관련 장애 협회, National Institute of Neurological and Communicative Disorders and the Alzheimer’s Disease and Related Disorders Association) 기준을 사용하여 식별된다:
1) 임상 치매 등급(CDR) = 1; 셸텐스(Scheltens) 척도에서, 16 및 24 점 사이의 미니 정신 상태 검사(Mini Mental State Examination, MMSE) 및 > 3점의 중앙 측두엽 위축(Medial temporal atrophy; 자기 공명 영상, MRI로 확인). 일부 관점에서, 용어 알츠하이머병은 1984년 NINCDS-ADRDA 알츠하이머 진단 기준에 정의된 다음 단계를 포함하여, 질환의 모든 단계를 포함한다.
2) 확실한 알츠하이머병: 환자가 개연성이 있는 알츠하이머병의 기준을 충족하고, 부검 또는 생검을 통해 알츠하이머병의 조직병리학적 증거를 가진다.
개연성이 있는 또는 전구성 알츠하이머병: 치매는 임상 및 신경심리학적 검사에 의해 규명된다. 인자 장애는 또한 진행성이어야하고, 두 개 이상의 인지 영역에 존재해야 한다. 결핍의 시작은 40세에서 90세 사이였으며, 최종적으로 치매 증후군을 유발할 수 있는 다른 질환이 없어야만 한다.
3) 가능성 또는 비-전구성 알츠하이머병: 비정형 발병, 발현이 있고; 알려진 병인이 없는, 치매 증후군이지만; 치매를 유발할 수 있는 합병증은 이의 근원으로 여겨지지 않는다. 일부 관점에서, 용어 알츠하이머병은 알츠하이머병의 한 단계를 말한다. 일부 관점에서, 용어 알츠하이머병은 알츠하이머병의 두 단계를 말한다. 일부 관점에서, 용어 "알츠하이머병"은 기억 상실, 혼란, 사고 장애, 언어 변화, 행동 변화 및/또는 성격 변화를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 알츠하이머병의 증상을 말한다.
본원에 사용된, 용어 "파킨슨병"은 흑색질의 기저핵의 퇴행성, 혈관성 또는 염증성 변화로 인한, 도파민 결핍을 특징으로 하는 신경계 증후군을 말한다. 파킨슨병의 증상은 제한 없이 다음을 포함한다: 휴식 진전, 톱니바퀴 강직, 운동 완화증, 자세 반사 장애, 1-도파(1-dopa) 치료에 대한 양호한 반응, 현저한 안구운동 마비의 부재, 소뇌 또는 피라미드 징후, 근위축증, 운동장애 및/또는 실어증. 특정 관점에서, 본 발명은 도파민성 기능장애-관련 증후군의 치료에 사용된다. 일부 관점에서, 파킨슨병은 파킨슨병의 모든 단계를 포함한다. 일부 관점에서, 용어 파킨슨병은 상기 질환을 앓고 있는 사람은 단일 사지(예: 손)의 일시적 떨림과 같은, 장애를 입히지 않고, 신체의 한쪽에만 영향을 미치는, 가벼운 증상을 나타내는, 파킨슨병의 첫번째 단계를 광범위하게 나타내는, 파킨슨병의 초기 단계를 포함한다.
일부 관점에서, 용어 파킨슨병은 상기 질환을 앓고 있는 사람은 전형적으로 중증이고, 일부 장애(예: 신체 양쪽을 포함하는 떨림, 균형 문제, 등)를 일으킬 수 있는, 증상을 나타내는, 파킨슨병의 보다 진행성 단계를 말하는, 파킨슨병의 진전 단계를 포함한다. 진전 단계의 파킨슨병에 연관된 증상은 개인마다 크게 다를 수 있고, 질환의 초기 출현 후 나타나기까지 수년이 걸릴 수 있다.
일부 관점에서, 용어 "파킨슨병"은 떨림(예: 휴식 중에 가장 두드러지는 떨림), 흔들림(예: 손, 팔, 다리, 턱 및 얼굴의 떨림), 근육 강직, 자세 반사 부족, 수의 운동의 둔화, 역행, 가면같은 표정, 구부린 자세, 균형 불량, 협응 불량, 운동완만증, 자세 불안정 및/또는 보행 이상을 제한 없이 포함하는, 파킨슨병의 증상을 말한다.
신경계의 염증성 질환 또는 증후군 및 바이러스 감염의 규명된 관련성의 예:
뇌 장애 관여 바이러스 바이러스 족(family) 참고문헌
파킨슨병(PD) C형 간염 플라비바이러스과(Flaviviridae) Tsai, Liou et al. 2016 Neurology 86(9): 840-846
H5N1 오르토믹소바이러스과(Orthomyxoviridae) Jang, Boltz et al. 2012 J Neurosci 32(5): 1545-1559
SARS-CoV-2 코로나바이러스과(Coronaviridae) (Sulzer, Antonini et al. 2020 NPJ Parkinsons Dis 6: 18.)
HIV 레트로바이러스과(Retroviridae) Tse, Cersosimo et al. 2004 Parkinsonism Relat Disord 10(6): 323-334.
알츠하이머병(AD) 헤르페스 허피스바이러스과(Herpesviridae) Abbott 2020 Nature 587(7832): 22-25.
다발성 경화증(MS) 엡스타인-바 허피스바이러스과(Herpesviridae) Soldan and Lieberman, 2020, Drug Discov Today Dis Models 32(Pt A): 35-52
헤르페스 허피스바이러스과(Herpesviridae) Virtanen and Jacobson, 2012, CNS Neurol Disord Drug Targets 11(5): 528-544.
상기 질환 또는 증후군은 바람직하게는 코로나바이러스 감염에 관한 것이고, 더욱 바람직하게는 상기 질환 또는 증후군은 SARS-CoV-2 감염과 관련된다. SARS-CoV-2 질환 또는 증후군 관련 질환 또는 증후군은 바람직하게는 발열, 기침, 피로, 호흡 장애, 오한, 관절 또는 근육 통증, 객담, 가래 생성, 호흡 곤란, 근육통, 관절통 또는 인후염, 두통, 메스꺼움, 구토, 설사, 부비강 통증, 코막힘, 후각 또는 미각 감소 또는 변화, 식욕 부진, 체중 감소, 복통, 결막염, 피부 발진, 림프종, 무감각, 및 졸음, 바람직하게는, 발열, 기침, 피로, 호흡 장애, 오한, 관절 또는 근육 통증, 객담, 가래 생성, 호흡곤란, 근육통, 관절통 또는 인후염, 두통, 메스꺼움, 구토, 설사, 부비동 통증, 코막힘, 후각 또는 미각 감소로 구성된 군에서 선택된 적어도 하나이다.
본 발명은 이를 필요로 하는 개체에서 바이러스 감염, 바람직하게는, 코로나바이러스 감염 관련 질환 또는 증후군의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물은 치료학적 유효량의 알파1-항트립신(AAT) 단백질, 이의 변이체, 아이소폼 및/또는 단편을 포함한다. 상기 코로나바이러스는 바람직하게는 SARS-CoV-2이다.
본 발명자(들)는 AAT 및 rhAAT가 몇몇 바이러스의 바이러스 진입을 억제하고(도 11, 21, 22 참조) 특히 신경계의 미세아교세포에서 염증을 감소시킨다는(도 19, 20 참조) 것을 발견하였다. 게다가, 신경세포에서 유래하여 파킨슨병을 포함하는 신경퇴행성 질환의 연구에 종종 사용되는 SH-SY5Y 세포(Xicoy, H., Wieringa, B. & Martens, G.J. The SH-SY5Y cell line in Parkinson’s disease research: a systematic review. Mol Neurodegeneration 12, 10, 2017)는 스파이크 단백질 프라이밍 프로테아제 mRNA, 즉 트립신 및 카텝신 B(도 15e)의 상대적으로 높은 카피수를 나타낸다. SH-SY5Y에서 상대적으로 높은 수준의 ACE2 발현과 결합하여(도 3a), 이러한 신경 조직(Bielarz V, Willemart K, Avalosse N, et al. Susceptibility of neuroblastoma and glioblastoma cell lines to SARS-CoV-2 infection. Brain Res. 2021 May 1) 및 유사 기원 세포는 SARS-CoV-2 바이러스 감염에 취약해진다.
본 발명의 조성물을 뇌를 포함하는 신경계에 전달하고, 혈액 뇌 장벽을 통과하기 위해, 다양한 전략이 사용될 수 있다(Salameh, T. S., & Banks, W. A., 2014, Advances in pharmacology, 71, 277-299; Tashima, T., 2020, Receptor-Mediated Transcytosis. Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 68(4), 316-32; Pardridge, W. M., 2020, Frontiers in aging neuroscience, 11, 373; Upadhyay, R. K., 2014, BioMed research international).
일부 관점에서, 본 발명의 조성물은 혈액-뇌 장벽 강화 단백질에 융합된다. 일부 관점에서, 본원에 기재된 혈액-뇌 장벽 강화 단백질은 트랜스페린, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자, 저밀도 지질단백질의 군에서 선택된, 적어도 하나의 완전 단백질, 상기 단백질의 변이체, 아이소폼 및/또는 단편이다.
트로이 목마 전략이 또한 사용될 수 있다(예를 들어, Pardridge, W.M., 2017, BioDrugs 31, 503-519 참조). 일부 관점에서, 본 발명의 조성물은 인슐린 수용체 또는 트랜스페린 수용체와 같은, 내인성 BBB 수용체 수송체에 결합하는 항체 또는 이의 단편에 연결된다.
본 발명의 조성물은 또한 친유성을 증가시키고 이어서 BBB 교차 특성을 향상시키기 위해 변경될 수 있다(예: Upadhyay, R. K., 2014,. BioMed research international, Article ID 869269, 37 pages 참조). 일부 관점에서, 본 발명의 조성물은 친유성을 증가시키기 위한 변형을 포함한다. 일부 관점에서, 본원에 기재된 친유성을 증가시키기 위한 변형은 적어도 하나의 친수성 펩티드의 첨가, 서열 부분의 적어도 하나의 친수성 펩티드로의 치환, 지질 모이어티의 첨가, 및/또는 비-지질 모이어티의 지질 모이어티로의 교체를 포함한다.
따라서, 본 발명은 적어도 부분적으로 바이러스 감염 관련 질환 또는 증후군에 대한 AAT의 광범위한 효과에 기초한다.
특정 개체는 특히 AAT 및/또는 rhAAT 단백질의 치료 및/또는 예방에 적합할 수 있다.
그러므로, 본 발명은 또한 이를 필요로 하는 개체에서 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 관련 질환 또는 증후군의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물은 치료학적 유효량의 알파1-항트립신(AAT) 단백질, 이의 변이체, 아이소폼 및/또는 단편을 포함하며, 여기서 상기 이를 필요로 하는 개체는 적어도 하나의 참조 개체와 비교하여, i) 내인성 알파-항트립신(AAT), 적어도 하나의 스파이크 단백질 프라이밍 프로테아제, 안지오텐신 전환효소 2(ACE2 수용체) 및 인터페론-감마(IFN-γ)로부터 선택된 적어도 하나 이상의 변경된 수준을 가진다. 상기 알파1-항트립신(AAT) 단백질, 이의 변이체, 아이소폼 및/또는 단편은 혈장-추출 AAT, 이의 변이체, 아이소폼 및/또는 단편, 특히 인간 혈장-추출 AAT, 이의 변이체, 아이소폼 및/또는 단편; 또는 재조합 알파1-항트립신(rhAAT) 단백질, 이의 변이체, 아이소폼 및/또는 단편일 수 있고, 바람직하게는 상기 알파1-항트립신(AAT) 단백질, 이의 변이체, 아이소폼 및/또는 단편은 재조합 알파1-항트립신(rhAAT) 단백질, 이의 변이체, 아이소폼 및/또는 단편이다.
상기 "이를 필요로 하는 개체"는 관심 개체라고도 한다. 상기 이를 필요로 하는 개체는 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 관련 질환 또는 증후군을 가지는, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중 또는 감염이 있는 개체(즉, 감염된 개체)일 수 있다. 감염된 개체는 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 관련 질환 또는 증후군의 치료 및/또는 예방을 필요로 할 수 있다. AAT 및/또는 rhAAT에 의한 치료는 스파이크 단백질 프라이밍 프로테아제를 억제시켜 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염의 세포로의 진입을 억제하거나 감소시키고, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염의 체내 증식을 감소시키고/시키거나 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염에 대한 반응으로서 염증을 감소시킬 수 있다. 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 개체는 호흡기 증후군, 더욱 바람직하게는 급성 호흡기 증후군, 훨씬 더 바람직하게는 중증 급성 호흡기 증후군을 포함할 수 있다. 상기 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 개체는 발열, 기침, 피로, 호흡 장애, 오한, 관절 또는 근육 통증, 객담, 가래 생성, 호흡 곤란, 근육통, 관절통 또는 인후염, 두통, 메스꺼움, 구토, 설사, 부비강 통증, 코막힘, 후각 또는 미각 감소 또는 변화, 식욕 부진, 체중 감소, 복통, 결막염, 피부 발진, 림프종, 무감각, 및 졸음, 바람직하게는, 발열, 기침, 피로, 호흡 장애, 오한, 관절 또는 근육 통증, 객담, 가래 생성, 호흡곤란, 근육통, 관절통 또는 인후염, 두통, 메스꺼움, 구토, 설사, 부비동 통증, 코막힘, 후각 또는 미각 감소로 구성된 군에서 선택된 적어도 하나의 증상을 가질 수 있다. 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 개체는 집중 치료 및/또는 인공 환기가 필요할 수 있다. 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 개체는 상기 정의 중 하나 또는 이의 임의의 조합으로 정의될 수 있다.
이를 필요로 하는 개체는 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 이전의 개체일 수 있고, 이는 특히 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 후에 질환 또는 증후군의 발병에 취약하다. 이러한 개체는 감염 전의 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 관련 질환 또는 증후군의 예방을 필요로 할 수 있다.
상기 적어도 하나의 참조 개체는 참조 개체의 군일 수 있다. 바람직하게는, 참조(참조) 개체(들)는 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염이 있거나 중인 개체일 수 있는데, 이는 무증상이거나, 경미한 증상을 가질 수 있고, 더욱 바람직하게는 개체(들)는 무증상인, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염이 있거나 중인 개체이다.
본 발명에 따른 무증상은 상기 (참조) 개체가 증상이 없는 것, 바람직하게는 발열, 기침, 피로, 호흡 장애, 오한, 관절 또는 근육 통증, 객담, 가래 생성, 호흡 곤란, 근육통, 관절통 또는 인후염, 두통, 메스꺼움, 구토, 설사, 부비강 통증, 코막힘, 후각 또는 미각 감소 또는 변화, 식욕 부진, 체중 감소, 복통, 결막염, 피부 발진, 림프종, 무감각, 및 졸음, 더욱 바람직하게는, 발열, 기침, 피로, 호흡 장애, 오한, 관절 또는 근육 통증, 객담, 가래 생성, 호흡곤란, 근육통, 관절통 또는 인후염, 두통, 메스꺼움, 구토, 설사, 부비동 통증, 코막힘, 후각 또는 미각 감소로 구성된 군에서 선택된 증상이 없는 것을 의미한다. 무증상 (참조) 개체는 바람직하게는 호흡기 증후군, 보다 바람직하게는 급성 호흡기 증후군, 훨씬 더 바람직하게는 중증 급성 호흡기 증후군이 없다. 무증상 (참조) 개체는 집중 치료 및/또는 인공 환기를 필요로 하지 않는다. 무증상 (참조) 개체는 상기 정의 중 하나 또는 이의 임의의 조합으로 정의할 수 있다.
본 발명에 따른 경미한 증상을 가진 (참조) 개체는 바람직하게는 호흡기 증후군, 보다 바람직하게는 급성 호흡기 증후군, 훨씬 더 바람직하게는 중증 급성 호흡기 증후군이 없다. 경미한 증상을 가진 (참조) 개체는 집중 치료 및/또는 인공 환기를 필요로 하지 않는다. 경미한 증상을 가진 (참조) 개체는 발열, 기침, 피로, 호흡 장애, 오한, 관절 또는 근육 통증, 객담, 가래 생성, 호흡 곤란, 근육통, 관절통 또는 인후염, 두통, 메스꺼움, 구토, 설사, 부비강 통증, 코막힘, 후각 또는 미각 감소 또는 변화, 식욕 부진, 체중 감소, 복통, 결막염, 피부 발진, 림프종, 무감각, 및 졸음으로 구성된 군에서 선택된 적어도 하나의 증상을 가지고, 더욱 바람직하게는 발열, 기침, 피로, 호흡 장애, 오한, 관절 또는 근육 통증, 객담, 가래 생성, 호흡곤란, 근육통, 관절통 또는 인후염, 두통, 메스꺼움, 구토, 설사, 부비동 통증, 코막힘, 후각 또는 미각 감소를 가지지 않으며, 여기서 상기 경미한 증상을 가지는 (참조) 개체는 집중 치료 및/또는 인공 환기를 필요로 하지 않는다. 경미한 증상을 가지는 (참조) 개체는 상기 정의 중 하나 또는 이의 임의의 조합으로 정의될 수 있다.
참조 개체는 아동, 특히 10세 미만, 바람직하게는 5세 미만의 아동일 수 있다. 참조 개체는 1 내지 10세, 바람직하게는 2 내지 5세의 연령을 가질 수 있다.
바이러스 감염, 특히 코로나바이러스 감염, 더욱 특별히 SARS-CoV-2 감염 중인 또는 감염이 있는 (참조) 개체는 바람직하게는 바이러스, 특히 코로나바이러스, 더욱 특별히 SARS-CoV-2에 감염된 (참조) 개체인, 개체이다. 감염된 (참조) 개체는 상기 바이러스, 특히 코로나바이러스, 더욱 특별히 SARS-CoV-2 바이러스가 (참조) 개체의 신체의 세포에 들어간 것을 의미하며, 바람직하게는 (참조) 개체의 신체의 세포에서 증식하고 있다.
바이러스, 특히 코로나바이러스, 더욱 특별히 SARS-CoV-2 바이러스 감염 후, 감염된 개체 내 인터페론-감마 수준이 증가한다. 증가된 인터페론-감마 수준은 차례로 안지오텐신 전환 효소 2(ACE2 수용체)의 수준의 증가를 유발한다. 증가된 안지오텐신 전환 효소 2(ACE2 수용체)의 수준은 프로테아제에 의한 스파이크 단백질의 증가된 활성 및 프라이밍을 자극한다. 그 다음, ATT의 내인성 수준은 적어도 하나의 스파이크 단백질 프라이밍 프로테아제의 증가된 활성 수준에 반응하여 감소한다. 그 후, AAT의 내인성 수준은 나아가 AAT가 활성 스파이크 단백질 프라이밍 프로테아제에 결합(및 억제)함에 따라 대폭 감소시킨다. 적어도 하나의 참조 개체와 비교하여, i) 더 낮은 수준의 내인성 알파-항트립신(AAT), ii) 더 높은 수준의 적어도 하나의 스파이크 단백질 프라이밍 프로테아제, iii) 더 높은 수준의 안지오텐신 전환 효소 2(ACE2 수용체) 및/또는 iv) 더 높은 수준의 인터페론-감마(IFN-γ)의 군에서 선택된 적어도 하나를 가지는 개체는 특히 바이러스, 특히 코로나바이러스, 보다 특히 SARS-CoV-2 감염에 대한 반응으로 질병 또는 증후군의 발병에 민감하다. 따라서, 이러한 관심 개체는 치료학적 유효량의 알파1-항트립신(AAT) 단백질, 이의 변이체, 아이소폼 및/또는 단편을 포함하는 조성물을 이용한 치료 및/또는 예방을 받는데 관련되고 적합하다. 상기 알파1-항트립신(AAT) 단백질, 이의 변이체, 아이소폼 및/또는 단편은 혈장-추출 AAT, 이의 변이체, 아이소폼 및/또는 단편, 특히 인간 혈장-추출 AAT, 이의 변이체, 아이소폼 및/또는 단편; 또는 재조합 알파1-항트립신(rhAAT) 단백질, 이의 변이체, 아이소폼 및/또는 단편일 수 있고, 바람직하게는 알파1-항트립신(rhAAT) 단백질, 이의 변이체, 아이소폼 및/또는 단편은 재조합 알파1-항트립신(rhAAT) 단백질, 이의 변이체, 아이소폼 및/또는 단편이다. 가장 바람직하게는, 상기 AAT 단백질은 중국 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary (CHO)) 세포 및/또는 인간 배아 신장(Human Embryonic Kidney (HEK)) 세포에서 생산되는, 재조합 알파1-항트립신(rhAAT) 단백질이다.
본 발명은 또한 이를 필요로 하는 개체에서 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 보다 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 관련 질환 또는 증후군의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물은 치료학적 유효량의 알파1-항트립신(AAT) 단백질 및/또는 재조합 알파1-항트립신(rhAAT) 단백질, 이의 변이체, 아이소폼 및/또는 단편을 포함하는데, 여기서 상기 이를 필요로 하는 개체는 다음으로 구성된 군에서 선택된 적어도 하나를 가진다:
1. 무증상이거나 경미한 증상을 가지는, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중인 적어도 하나의 개체와 비교하여, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 전 또는 SARS-CoV-2 감염 중 더 낮은 수준의 내인성 알파-항트립신(AAT),
2. 무증상이거나 경미한 증상을 가지는, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중인 적어도 하나의 개체와 비교하여, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 전 또는 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중 더 높은 수준의 적어도 하나의 스파이크 단백질 프라이밍 프로테아제,
3. 무증상이거나 경미한 증상을 가지는, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중인 적어도 하나의 개체와 비교하여, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 전 또는 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중 개체 내 더 높은 수준의 안지오텐신 전환 효소 2(ACE2 수용체), 및
4. 무증상이거나 경미한 증상을 가지는, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중인 적어도 하나의 개체와 비교하여, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 전 또는 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중 개체 내 더 높은 수준의 인터페론-감마(IFN-γ).
상기 무증상이거나 경미한 증상을 가지는, 적어도 하나의 개체는 또한 적어도 하나의 참조 개체로도 불린다. 참조 개체는 본원에 기재된 바와 같이 정의된다.
상기 "이를 필요로 하는 개체"는 또한 관심 개체로도 불린다. 상기 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 관련 질환 또는 증후군의 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 것은 본원에 기재된 바와 같이 정의된다.
i) 내지 iv)에 정의된 수준은 단백질 수준 및/또는 mRNA 수준, 바람직하게는 단백질 또는 mRNA 수준일 수 있다. 단백질 수준(들)은 효소-결합 면역흡착 측정법(ELISA) 및/또는 광섬유 바이오센서(ForteBio Octet)에 기반한 생물층 간섭계(BLI)와 같은 항체-기반 분석을 사용하여 측정한다.
스파이크 단백질 프라이밍 프로테아제의 수준은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질로부터 유래된 형광 펩티드를 이용하여 스파이크 단백질 프로테아제의 활성을 측정하여 확인할 수 있다. 상기 방법은 제이미스(Jaimes) 등에 기재되어 있다(Javier A. Jaimes, Jean K. Millet, Gary R. Whittaker Proteolytic Cleavage of the SARS-CoV-2 Spike Protein and the Role of the Novel S1/S2 Site, CELL, iScience 23, 101212, June 26, 2020). 투명한 방법 펩티드: 바이오마틱(Biomatik, Wilmington, DE, USA)에 의해 HTVSLLRSTSQ(서열번호 11) and TNSPRRARSVA(서열번호 12) 서열로 각각 구성되고, (7-메톡시쿠마린-4-일)아세틸/2,4-디니트로페닐(MCA/DNP) FRET 쌍을 포함하는, SARS-CoV-2 스파이크 (S) S1/S2 부위로부터 유래된 형광 펩티드를 합성하였다. 재조합 푸린은 뉴잉글랜드 바이오랩(New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)에서 구입할 수 있다. 재조합 L-1-토실아미드-2-페닐에틸 클로로메틸 케톤(TPCK)-처리된 트립신은 시그마-알드리치(St Louis, MO, USA)에서 입수할 수 있다. 재조합 PC1, 마트립타제, 카텝신 B 및 카텝신 L은 R&D 시스템(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)으로부터 구입할 수 있다. 형광 펩티드 분석: 각각의 형광 펩티드에 대하여, 푸린에 대해 100 mM Hepes, 0.5% Triton X-100, 1 mM CaCl2 및 1 mM 2-메캅토에탄올 pH 7.5(10 U/mL로 희석); PCI에 대해 25 mM MES, 5 mM CaCl2, 1% (w/v) Brij-35, pH 6.0(2.2 ng/μL로 희석); 트립신에 대해 PBS(8 nM로 희석); 마트립타제에 대해 50 mM Tris, 50 mM NaCl, 0.01% (v/v) Tween® 20, pH 9.0(2.2 ng/μL로 희석); 카텝신 B에 대해 25 mM MES, pH 5.0(2.2 ng/μL로 희석); 카텝신 L에 대해 50 mM MES, 5 mM DTT, 1 mM EDTA, 0.005% (w/v) Brij-35, pH 6.0(2.2 ng/μL로 희석)으로 구성된 버퍼 및 50 μM로 희석된 펩티드를 사용하여 100 μL 부피로 반응을 수행한다. 반응은 30℃에서 3회 수행되며, 형광 방출은 λex 330 nm 및 λem 390 nm 파장 설정으로, SpectraMax 형광계(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 45분 동안 매분 측정하여, 시간에 따른 형광 강도의 추적 및 반응의 Vmax의 계산이 가능하다. 분석은 세 번의 독립적인 실험에서 Vmax의 평균을 나타내는 결과로 3번 수행하여야만 한다.
IFN-γ 단백질의 수준은 유세포 분석법, 입자-기반 면역분석법을 사용하여 측정할 수 있다. 이 방법은 후앙(Huang) 등(Huang KJ, Su IJ, Theron M, et al. An interferon-gamma-related cytokine storm in SARS patients. J Med Virol. 2005;75(2):185-194. doi:10.1002/jmv.20255) BD 인간 Th1/Th2 사이토카인 또는 케모카인 비드 어레이(CBA) 키트(BD Human Th1/Th2 Cytokine or Chemokine Bead Array (CBA) Kit)로부터 채택될 수 있다. 상기 BD 인간 Th1/Th2 사이토카인 CBA 키트(BD PharMingen, San Diego, CA)는 입자-기반 면역분석법에서 유세포 분석법에 의해 IFN-γ 수준을 측정한다. 이러한 키트는 50 ml의 환자 혈청 샘플에서 6개의 사이토카인의 동시 측정이 가능하다. 이러한 면역분석법의 검출 한계는 IFN-γ에 대해 7.1 pg/ml이다.
바람직하게는, 본원에 기재된 AAT의 내인성 수준은 단백질 수준이다. 본원에 기재된 적어도 하나의 스파이크 단백질 프로테아제의 수준은 바람직하게는 mRNA 수준이다. 본원에 기재된 ACE2 수용체의 수준은 바람직하게는 mRNA 수준이다. 본원에 기재된 IFN-γ의 수준은 바람직하게는 단백질 수준이다. 상기 단백질 및/또는 mRNA 수준은 혈액, 소변 또는 타액, 바람직하게는 혈액, 보다 바람직하게는 혈장, 가장 바람직하게는 인간 혈장에서 측정될 수 있다.
바이러스, 특히 코로나바이러스, 보다 특별히 SARS-CoV-2 바이러스의 세포로의 진입 및 세포 내 증식의 여러 요인은 이미 이해되고 있으나, 다른 것들은 여전히 조사 대상이다. SARS-CoV-2의 진입은 스파이크 단백질, 스파이크 단백질 프라이밍 프로테아제(들) 및 ACE2 수용체에 의해 매개된다. SARS-CoV-2 스파이크 단백질은 또한 스파이크 단백질 S로 불린다. 스파이크 단백질 프라이밍 프로테아제는 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질을 절단하여, 세포로의 진입을 위해 SARS-CoV-2를 프라이밍한다. SARS-CoV-2는 프라이밍된 스파이크 단백질의 ACE 수용체와의 상호작용에 의해 세포로 들어간다. 따라서, 적어도 하나 이상의 프라이밍 프로테아제(들)가 관심 개체 내에 존재한다면, SARS-CoV-2 바이러스의 세포 내의 진입이 더 쉽고 더 빠르다. 또한, 더 많은 ACE2 수용체(들)가 존재할수록, SARS-CoV-2의 세포로의 진입이 더 쉽고 더 빠르다. SARS-CoV-2의 감염은 염증을 유발하여 IFN-γ 발현을 증가시킨다. SARS-CoV-2 감염에 대한 반응으로 IFN-γ 발현은 차례로 ACE2 수용체 발현의 증가로 이어질 수 있다. SARS-CoV-2의 증식 동안, IFN-γ 수준은 더 증가하여, ACE2와 스파이크 단백질의 상호작용의 증가를 자극하고, 이어서 스파이크 단백질의 프라이밍, AAT 수준이 감소하고, 바이러스가 세포에 들어가면, 염증이 증가하여, 보다 더 높은 수준의 IFN-γ으로 이어진다. SARS-CoV-2의 감염 후, 우선, IFN-γ 수준이 증가하고, 두 번째로, AAT 수준이 감소하고 카텝신 L의 수준이 증가하고/하거나 다른 스파이크 단백질 프라이밍(S-프라이밍) 프로테아제가 증가한다. 도 1 참조.
따라서, 본 발명은 AAT 뿐만 아니라 rhAAT가 바이러스(예: 도 6, 7, 8, 11, 12, 21, 22 참조), 염증 관련 바이러스(예: 도 19, 20 참조), 특히 높은 IFN-γ 수준에 의한 염증 관여 바이러스의 진입을 동시에 줄인다는, 발견에 적어도 부분적으로 기초한다. 이러한 조합된 효과는 본원에 기재된 환자 집단에서 특히 유용하다.
특정 관점에서, 본 발명은 스파이크 단백질 프라이밍 프로테아제가 막관통 프로테아제 세린 서브타입 2(TMPRSS2), 막관통 프로테아제 서브타입 6(TMPRSS6), 카텝신 L, 카텝신 B, 전구단백질 전환효소 1(PC1), 트립신, 엘라스타제, 호중구 엘라스타제, 마트립타제 및 푸린으로 구성된 군에서 선택된 적어도 하나인, 본 발명에 따른 사용하기 위한 조성물에 관한 것이다.
특정 관점에서, 본 발명은 스파이크 단백질 프라이밍 프로테아제가 카텝신 L 및/또는 푸린인, 본 발명에 따른 조성물에 관한 것이다.
AAT는 인체 내에서 내인성으로 발현된다. AAT는 또한 알파-1 프로테아제 억제제로도 불린다. AAT는 프로테아제, 특히 막관통 프로테아제 세린 서브타입 2(TMPRSS2), 막관통 프로테아제 서브타입 6(TMPRSS6), 카텝신 L, 카텝신 B, 전구단백질 전환효소 1(PC1), 트립신, 엘라스타제, 호중구 엘라스타제, 마트립타제 및 푸린과 같은, 스파이크 단백질 프로테아제를 억제할 수 있다. 본 발명의 네 가지 플레이어(AAT, 스파이크 단백질 프라이밍 프로테아제(들), ACE2 수용체 및 IFN-γ)의 수준이 참조 개체와 비교하여 감염된 관심 개체에서 변경되면, 감염된 관심 개체는 특히 SARS-CoV-2 관련 질환 또는 증후군의 치료 및/또는 예방으로부터 이익을 얻을 수 있다. 낮은 내인성 AAT 수준은 SARS-CoV-2 관련 질환 또는 증후군 발병, 특히 COVID-19 발병에 대해 관심 개체의 더 높은 민감성으로 이어질 수 있다.
특정 관점에서, 본 발명은 바이러스 감염 전 또는 바이러스 감염 중 더 낮은 수준의 내인성 AAT가 AAT-결핍에 의해 유발되는, 본 발명에 따른 조성물에 관한 것이다.
알파1-항트립신(이하 "AAT")은 인체 내 자연적으로 발생하여 간, 바람직하게는 간세포에서 생성되는 단백질이다. 얀키아우스키엔(Janciauskiene) 등(Janciauskiene SM, Bals R, Koczulla R, Vogelmeier C, Kohnlein T, Welte T. The discovery of α1-antitrypsin and its role in health and disease. Respir Med. 2011;105(8):1129-1139. doi:10.1016/j.rmed.2011.02.002)에 따르면, AAT의 정상 혈장 농도는 0.9 내지 1.75 g/L의 범위이다. 52,000의 MW를 고려하면(Brantly M, Nukiwa T, Crystal RG. Molecular basis of alpha-1-antitrypsin deficiency. Am J Med. 1988;84(6A):13-31. doi:10.1016/0002-9343(88)90154-4), 이는 16 내지 32 μM의 정상 혈장 농도에 상응한다. 크리스탈 1990(Crystal RG. Alpha 1-antitrypsin deficiency, emphysema, and liver disease. Genetic basis and strategies for therapy. J Clin Invest. 1990 May;85(5):1343-52. doi: 10.1172/JCI114578. PMID: 2185272; PMCID: PMC296579)은 11 μM이 AAT-결핍의 임상 징후에 대한 역치 수준이라고 기재하고 있다. 대두분의 건강한 개인의 경우, 간에서 AAT의 2g의 일일 발현은 11 μM의 이러한 중요한 혈청 수준에 도달하기에 충분하며, 내인성 AAT 수준은 호중구 엘라스타제(NE)에 의한 파괴로부터 하기도를 보호하고 폐기종으로 끝나는 폐포의 진행성 파괴를 억제하기에 충분하다. 크리스탈 1990은 나아가 건강한 개인의 AAT의 정상적인 내인성 수준이 20-53 μM 사이로 다양하다는 것을 언급하고 있다. 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 전 건강한 인간 개체의 혈장 내 AAT 단백질의 내인성 수준은 5 및 60 μM 사이, 바람직하게는 10 및 40 μM 사이, 더욱 바람직하게는 25 내지 30 μM 사이, 훨씬 더 바람직하게는 16 및 32 μM 사이의 범위이다. 그렇지 않으면, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 전 건강한 인간 개체의 혈장 내 AAT 단백질의 내인성 수준은 바람직하게는 30 μM 보다 더 높고, 더욱 바람직하게는 40 μM 보다 더 높고, 가장 바람직하게는 50 μM 보다 더 높다. AAT 단백질은 혈장 AAT 단백질 또는 재조합 AAT(rhAAT) 단백질일 수 있다. 일부 관점에서, 혈장 AAT 단백질은 혈장으로부터 유래된다. 일부 관점에서, 재조합 AAT 단백질은 예를 들어, HEK 세포, CHO 세포 또는 E. coli 세포에서 재조합적으로 생성된다. 전 세계 제약회사는 유전 질환인, AAT-결핍의 치료를 위해 인간 혈장에서 AAT 단백질을 추출한다. 혈장 유래 AAT는 각각 식품의약국(FDA) 및 유럽 의약청(EMA)에 의해, 미국 및 유럽에서 승인을 받았다. 바람직하게는, 본 발명의 AAT 단백질은 가장 바람직하게는 서열번호 1에 기재된 바와 같은, 인간 아미노산 서열을 가진다(표 1 참조).
본 발명의 도 6a 및 6c에 나타낸 바와 같이, 10 μM의 AAT는 ACE2 수용체를 과발현하는, A549 세포에서 수도바이러스 진입을 20-30% 감소시킨다.
아주즈(Azouz) 등(Nurit P. Azouz, Andrea M. Klingler and Marc E. Rothenberg)에 따르면, 알파1-항트립신(AAT)은 SARS-CoV-2-프라이밍 프로테아제 TMPRSS2의 억제제이고(bioRxiv preprint online, https://doi.org/10.1101/2020.05.04.077826, posted on May 5, 2020), 1-100 μM AAT의 농도는 TMPRSS2 단백질분해 활성의 용량 의존적 억제를 달성한다.
본 발명의 도 7에 나타난 바와 같이, 100 μM의 AAT는 ACE2 수용체만을 과발현하는, A549 세포에서 수도바이러스 진입을 50-75% 감소시킨다.
본 발명의 도 8에 나타난 바와 같이, 100 μM의 AAT는 ACE2 수용체 및 스파이크 단백질 프라이밍 프로테아제 TMPRSS2 모두를 과발현하는 A549 세포에서만 수도바이러스 진입을 45%까지 감소시킨다.
바이러스 진입은 본 발명의 도 6 및 7 모두에서 TMPRSS2와 독립적으로 관찰된다는 점에 주목하는 것이 중요하다. 푸린 및/또는 카텝신 L과 같은 프라이밍 프로테아제가 아마도 다른 것들 중에서, TMPRSS2를 대체할 수 있음을 증명한다. 이와 관련하여, AAT 뿐만 아니라 rhAAT는 카텝신 B, 카텝신 L, 트립신, 푸린, PC1, 마트립타제, 엘라스타제 및 호중구 엘라스타제의 프로테아제의 활성을 감소시킨다(도 16).
그러므로, AAT 뿐만 아니라 rhAAT의 바이러스 진입에 대한 억제 효과는 다른 TMPRSS2 억제제의 효과를 넘어서 확장되는데(도 7, 8, 11, 12, 21, 22), 즉 AAT 뿐만 아니라 rhAAT은 몇몇 프라이밍 프로테아제(도 16) (예: TMPRSS2 기능을 교체할 수 있는 프로테아제) 및 이어진 ACE2-매개 바이러스 진입(도 7, 8, 11, 12, 21, 22)을 효과적으로 억제한다. 그러므로, AAT 뿐만 아니라 rhAAT는 프라이밍 프로테아제 활성을 감소시켜, 특히 프라이밍 프로테아제(들) 활성을 효율적으로 감소시켜 바이러스 진입을 감소시킨다.
따라서, 본 발명은 AAT 및/또는 rhAAT, 이의 변이체, 아이소폼 및/또는 단편을 포함하는 조성물이 특히 본원에 기재된 하나 이상의 전제조건을 가진 개체에서,바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 관련 질환 또는 증후군의 치료 및/또는 예방에 특히 효과적이라는 놀라운 발견에 적어도 부분적으로 기초한다.
본 발명에 있어서, i)에 따른 더 낮은 내인성 AAT 수준은 바람직하게는 인간 혈장 내 단백질 수준이다. i)에 따른 인간 혈장 내 더 낮은 내인성 AAT 수준은 바람직하게는 200μM 미만, 바람직하게는 150μM 미만, 100μM 미만, 90μM 미만, 80 μM 미만, 70μM 미만, 60μM 미만, 50μM 미만, 40μM 미만, 30μM 미만, 25μM 미만, 20μM 미만, 15μM 미만, 11μM 미만 또는 10μM 미만이다. 낮은 수준의 AAT는 스파이크 단백질 프라이밍 프로테아제(들)를 성공적으로 억제하기에 충분하지 않다. 낮은 수준의 내인성 AAT는 그러므로 바이러스 증식, 특히 코로나바이러스 증식, 더욱 특히 SARS-CoV-2 증식 및/또는 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 관련 질환 또는 증후군의 발병을 촉진시킬 수 있다. 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 전 또는 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중 더 낮은 수준의 내인성 AAT는 AAT 결핍에 의해 유발될 수 있고, 바람직하게는 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 전 더 낮은 수준의 내인성 AAT는 AAT 결핍에 의해 유발된다. AAT-결핍은 상염색체 공동우성 패턴으로 유전되는 상태이다. 공동우성은 유전자의 두 가지 다른 버전이 활성일(발현될) 수 있고, 두 버전 모두 유전적 특성에 기여한다는 것을 의미한다. M으로 불리는, SERPINA1 유전자의 가장 일반적인 버전(대립유전자)은 정상 수준의 알파-1 항트립신을 생성한다. 일반 인구의 대부분의 사람들은 각 세포에 M 대립유전자(MM)의 두 개의 카피를 가지고 있다. SERPINA1 유전자의 다른 버전은 알파-1 항트립신의 수준 감소를 야기한다. 예를 들어, S 대립유전자는 적당히 낮은 수준의 이러한 단백질을 생성하고, Z 대립유전자는 매우 적은 알파1-항트립신을 생성한다. 각 세포에 Z 대립유전자(ZZ)의 두 개의 카피가 있는 개인은 알파-1 항트립신 결핍이 있을 가능성이 있다. SZ 조합이 있는 개개인들은 특히 흡연하는 경우, 폐 질환(폐기종과 같은)의 발병 위험이 증가한다. 세계적으로, 1억6,100만명의 사람이 각 세포에 S 또는 Z 대립유전자의 하나의 카피 및 M 대립유전자의 하나의 카피(MS 또는 MZ)를 가진다고 추정된다. MS(또는 SS)를 가진 개인은 일반적으로 폐를 보호하기 위해 충분한 알파-1 항트립신을 생성한다. MZ 대립유전자를 가진 사람들은 폐 또는 간 기능 손상 위험이 약간 증가한다. 본 발명에 있어서 AAT 결핍이 있는 개체는 바람직하게는 SERPINA1 유전자의 ZZ 돌연변이, SZ 돌연변이, MS 돌연변이, MZ 돌연변이 또는 SS 돌연변이, 바람직하게는 ZZ 돌연변이를 가진다. SERPINA1 유전자의 ZZ 돌연변이에서 낮은 수준의 AAT 분비는 AAT의 미스폴딩 및 그 다음의 간세포의 소포체(ER) 내 축적에 기인함에 따라(Cystal 1990), 미스폴딩된 AAT의 축적이 그의 궁극적인 죽음을 초래하는 간세포의 건강에 부정적으로 영향을 미침에 따라 진행성 간 질환을 초래한다.
바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중 더 낮은 수준의 내인성 AAT는 또한 각각 바이러스 감염, 코로나바이러스 감염, 또는 SARS-CoV-2 감염에 의해 유발될 수 있다. 즉, 참조 개체 내 내인성 AAT의 수준은 건강한 간세포가 내인성 AAT 수준의 감소를 과잉 보상하려고 하기 때문에 바이러스 감염 중 일시적으로 증가할 수 있는 반면, 유전적 AAT-결핍이 있는 개체 내 내인성 AAT의 수준은 부재 또는 불완전한 바이러스 감염-유도 증가(건강한 간세포의 결핍)로 인해 더 낮다. 더 낮은 수준의 내인성 AAT는 또한 비-알코올성 지방간 질환, 1 또는 2형 당뇨병(바람직하게는 1형), 비만 및 심혈관 병태와 같은 간질환에 의해 유발될 수 있다. 간에 축적된 지방산 증착은 스트레스 증가(IFN-γ 증가), 조직 염증 및 이어진 더 낮은 수준의 AAT의 건강한 분비를 유발하는 간세포의 손상을 초래한다. 다른 유형의 간 질환과 마찬가지로, 간세포의 ER 내 미스폴딩된 AAT의 축적이 궁극적으로 간부전을 유발하므로, AAT-결핍은 시간에 따라 간질환을 초래한다는 점에 주목하는 것이 중요하다.
본 발명에 있어서, 스파이크 단백질 프라이밍 프로테아제는 바이러스, 바람직하게는 코로나바이러스, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질의 프라이밍을 가능하게 하는 임의의 프로테아제일 수 있다. 바람직하게는, 스파이크 단백질 프라이밍 프로테아제는 막관통 프로테아제 세린 서브타입 2(TMPRSS2), 막관통 프로테아제 서브타입 6(TMPRSS6), 카텝신 L, 카텝신 B, 전구단백질 전환효소 1(PC1), 트립신, 엘라스타제, 호중구 엘라스타제, 마트립타제 및 푸린, 더욱 바람직하게는 TMPRSS2, 카텝신 L 및 푸린, 훨씬 더 바람직하게는 카텝신 L 또는 푸린으로 구성된 군에서 선택된 적어도 하나이다. 스파이크 단백질 프라이밍 프로테아제는 또한 쌍을 이룬 염기성 아미노산 절단(PACE) 효소라고도 불린다.
본원에 기재된, 더 높은 수준의 적어도 하나의 스파이크 단백질 프라이밍 프로테아제, 바람직하게는 카텝신 L은 바람직하게는 인간 혈장 내 mRNA 수준 또는 인간 혈장 내 단백질 수준이다. 건강한 개체 내 카텝신 L의 혈장 농도는 0.2 내지 1 ng/mL(즉, 약 23-24 kDa의 분자량일 때 10 내지 50 pM; Kirschke 1977 https://febs.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1432-1033.1977.tb11393.x)이다. 게다가, 면역세포는 뇌를 포함하여, 염증에서 세포외 시스테인 카텝신의 주요 공급원인 것으로 알려져 있다(Hayashi et al., 2013, von Bernhardi et al., 2015, Wendt et al., 2008, Wendt et al., 2007). 본원에 기재된 적어도 하나의 스파이크 단백질 프라이밍 프로테아제의 수준은 인간 혈장에서 바람직하게는 0.2, 0.5 또는 1 ng/ml 보다 더 높다. 본원에 기재된 적어도 하나의 스파이크 단백질 프라이밍 단백질의 수준은 바람직하게는 10, 20, 30, 40, 50, 75 또는 100 pM 보다 더 높고, 바람직하게는 10 또는 50 pM 보다 더 높고, 훨씬 더 바람직하게는 50 pM 보다 더 높다. 이러한 관점에서, 상기 적어도 하나의 스파이크 단백질 프라이밍 프로테아제(들)는 바람직하게는 카텝신 L이다. 특정 관점에서, 본원에 기재된 적어도 하나의 스파이크 단백질 프라이밍 프로테아제(들)는 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9개의 스파이크 단백질 프라이밍 프로테아제이다. 특정 관점에서, 본원에 기재된 적어도 하나의 스파이크 단백질 프라이밍 프로테아제(들)는 TMPRSS2, 카텝신 B, 카텝신 L, 트립신, 푸린, PC1, 마트립타제, 엘라스타제 및 호중구 엘라스타제로 구성된 군에서 선택된 적어도 하나의 프로테아제이다. 특정 관점에서, 본원에 기재된 적어도 하나의 스파이크 단백질 프라이밍 프로테아제(들)는 TMPRSS2, 카텝신 B, 카텝신 L, 트립신, 푸린, PC1 및 마트립타제로 구성된 군에서 선택된 적어도 하나의 프로테아제이다.
특정 관점에서, 본 발명은 더 높은 수준의 적어도 하나의 스파이크 단백질 프라이밍 프로테아제는 연령 및/또는 유전적 소인에 의해 유발되는, 본 발명에 따른 조성물에 관한 것이다.
더 높은 수준의 적어도 하나의 스파이크 단백질 프라이밍 프로테아제는 연령 및/또는 유전적 소인에 의해 야기될 수 있다. 특히, 더 높은 수준의 카텝신 B 및 L, 바람직하게는 카텝신 B는 연령에 의해 야기될 수 있다. 더 높은 수준의 스파이크 프로테아제 단백질, 특히 카텝신 B 및 L, 더욱 바람직하게는 카텝신 B는 리소좀에 축적될 수 있다. 스파이크 단백질 프라이밍 프로테아제의 수준은 50세 이상, 바람직하게는 60세 이상, 더욱 바람직하게는 70세 이상, 훨씬 더 바람직하게는 80세 이상 및 가장 바람직하게는 90세 이상인, 관심 개체에서 더 높다. 아프리카계 미국인인 개체는 더 높은 수준의 스파이크 단백질 프라이밍 프로테아제, 특히 푸린에 대한 유전적 소인을 가질 수 있다. 도 2(a)에 나타난 바와 같이, HeLa 세포는 A549 세포와 비교할 때 푸린 및 카텝신 L의 상대적인 mRNA 비율이 다르다. HeLa 세포는 아프리카계 미국인 기원이다. A549 세포는 백인 기원의 기도 상피세포이다. 도 2(b)에 나타난 바와 같이, HeLa 세포는 A549 세포보다 SARS-CoV-2 진입에 더욱 민감하고(도 6), AAT 치료에 반응성이 더 적다. 유전적 소인은 개개의 관심 개체의 유전적 프로파일링에 의해 확인될 수 있다.
특정 관점에서, 본 발명은 더 높은 수준의 ACE2 수용체가 감염, 염증, 연령 및 유전적 소인의 군에서 선택된 적어도 하나에 의해 야기되는, 본 발명에 따른 조성물에 관한 것이다.
본원에 기재된 더 높은 수준의 ACE2 수용체는 바람직하게는 인간 혈장 내 mRNA 수준이다. 더 높은 수준의 ACE2 수용체는 감염, 염증(예: IFN-γ), 연령 및 유전적 소인의 군에서 선택된 적어도 하나에 의해 유발될 수 있다. 상기 감염은 바이러스 감염 및/또는 박테리아 감염, 바람직하게는 바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 훨씬 더 바람직하게는 SARS 또는 SARS-CoV-2 감염일 수 있다. 감염에 대한 추가적인 예는 레슈마니어증이다. 도 4 및 5에 나타난 바와 같이, ACE2 수용체 발현은 더 높은 수준의 IFN-γ에 반응하여 상향조절되는데, 이러한 수준은 염증에 대한 면역 반응으로 차례로 증가한다. 염증은 예를 들어, 박테리아 및/또는 바이러스 감염, 암, 지연형 과민증; 자가면역 질환(자가면역 뇌척수염, 류마티스성 관절염, 자가면역 인슐린염(1형 당뇨병으로도 알려짐)), 동종이식거부반응 및 이식편대 숙주반응, 비특이적 염증 및 사이토카인 분비에 의해 유발될 수 있다. 연령은 바람직하게는 50세 이상, 바람직하게는 60세 이상, 더욱 바람직하게는 70세 이상, 훨씬 더 바람직하게는 80세 이상, 및 가장 바람직하게는 90세 이상이다. 높은 수준의 IFN-γ에 대한 유전적 소인의 예는 가족성 지중해 발열이다. 유전적 소인은 개별 관심 개체의 유전적 프로파일링에 의해 확인될 수 있다. 본원에 기재된 더 높은 수준의 ACE2 수용체는 또한 qPCR에 의해 확인되고 본 발명의 도 3a에 나타난 바와 같이, 폐(Calu3), 결장(CaCo2), 간(HEPG2), 신장(HEK-293T), 및 뇌(SH-SY5Y)로 구성된 군에서 선택된 조직 내에 존재할 수 있다.
특정 관점에서, 본 발명은 더 높은 수준의 IFN-γ이 감염, 염증, 연령 및 유전적 소인의 군에서 선택된 적어도 하나에 의해 유발되는, 본 발명에 따른 조성물에 관한 것이다.
iv)에 따른 더 높은 수준의 인터페론-감마(IFN-γ)는 바람직하게는 인간 혈장 내 단백질 또는 mRNA 수준, 더욱 바람직하게는 인간 혈장 내 단백질 수준이다. 건강한 인간에 있어서, 상기 IFN-γ 수준은 예를 들어, 30 내지 50 pg/mL 미만의 분석의 검출 한계 이하 또는 쯤이다(Billau 1996; Kimura 2001). IFN-γ는 자연 살해(NK) 세포, CD4+ 및 일부 CD8+ 림프구에 의해 거의 독점적으로 생산된다. NK 또는 T 세포 중 하나에 의한 IFN-γ의 생산은 보조세포, 주로 단핵 식세포의 협력을 필요로 하며, 이들은 또한 일부 활성화 상태에 있어야 한다(Billiau A. Interferon-gamma: biology and role in pathogenesis. Adv Immunol. 1996;62:61-130. doi:10.1016/s0065-2776(08)60428-9). 따라서, NK 세포 활성화 및 T 세포 활성화로 이어지는 염증 상태는 IFN-γ 수준을 증가시킨다. 순환하는 NK 또는 T 세포(감염, 암)와 관련된 염증 상태는 더 높은 혈장 수준을 유발할 것으로 예상된다.
다음 표는 여러 조건의 IFN-γ의 혈장 수준에 대한 값을 제공한다.
조건 조건 유형 IFN-γ
(pg/mL)		 IFN-γ 대조군(pg/mL) 참고문헌
SARS 감염 456(급성기) 26.6pM 3.3(대조군) 0.19pM 후앙(Huang) 등
Huang, K.-J., Su, I.-J., Theron, M., Wu, Y.-C., Lai, S-K., Liu, C.-C. and Lei, H.-Y. (2005), An interferon-γ-related cytokine storm in SARS patients. J. Med. Virol., 75: 185-194. doi:10.1002/jmv.20255
레슈마니어증 감염 118(비처리) 6.9pM 31(처리) 1.8pM 하이루(Hailu) 등
Hailu A, van der Poll T, Berhe N, Kager PA. Elevated plasma levels of interferon (IFN)-gamma, IFN-γ inducing cytokines, and IFN-γ inducible CXC chemokines in visceral leishmaniasis.　Am J Trop Med Hyg. 2004;71(5):561-567.
가족성 지중해 발열 유전적 장애 19.4(급성 발병) 1.1pM 4.8(무발병) 0.28pM 코클루(Koklu) 등
Koklu S, Ozturk MA, Balci M, Yuksel O, Ertenli I, Kiraz S. Interferon-gamma levels in familial Mediterranean fever.　Joint Bone Spine. 2005;72(1):38-40. doi:10.1016/j.jbspin.2004.03.011
iv)에 따른 인간 혈장 내 IFN-γ 단백질의 수준은 바람직하게는 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100, 125, 150, 200, 300, 400 또는 500 pg/ml 보다 높다. 더 높은 수준의 IFN-γ는 바람직하게는 감염, 염증, 연령 및 유전적 소인의 군에서 선택된 적어도 하나, 더욱 바람직하게는 염증에 의해 유발된다. 감염은 바이러스 감염 및/또는 박테리아 감염, 바람직하게는 바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 훨씬 더 바람직하게는 SARS 또는 SARS-CoV-2 감염일 수 있다. 감염에 대한 추가적인 예는 레슈마니아증이다. 염증은 예를 들어, 박테리아 및/또는 바이러스 감염, 암, 지연형 과민증; 자가면역 질환(자가면역 뇌척수염, 류마티스성 관절염, 자가면역 인슐린염(1형 당뇨병으로도 알려짐)), 동종이식거부반응 및 이식편대 숙주반응, 비특이적 염증 및 사이토카인 분비에 의해 유발될 수 있다. 연령은 바람직하게는 50세 이상, 바람직하게는 60세 이상, 더욱 바람직하게는 70세 이상, 훨씬 더 바람직하게는 80세 이상, 및 가장 바람직하게는 90세 이상이다. 높은 수준의 IFN-γ에 대한 유전적 소인의 예는 가족성 지중해 발열이다. 유전적 소인은 개별 관심 개체의 유전적 프로파일링에 의해 확인될 수 있다.
따라서, 본 발명은 AAT 뿐만 아니라 rhAAT, 이의 변이체, 아이소폼 및/또는 단편을 포함하는 조성물은 바이러스 증식 및 염증, 특히 IFN-γ 관련 염증 모두를 감소시킨다는 놀라운 발견에 적어도 부분적으로 기초한다.
일 관점에서, "이를 필요로 하는 개체", 즉 관심 개체는 다음으로 구성된 군에서 선택된 두 가지를 가진다:
1. 무증상이거나 경미한 증상을 가지는, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중인 적어도 하나의 개체와 비교하여, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 전 또는 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중 더 낮은 수준의 내인성 알파-항트립신(AAT),
2. 무증상이거나 경미한 증상을 가지는, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중인 적어도 하나의 개체와 비교하여, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 전 또는 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중 더 높은 수준의 적어도 하나의 스파이크 단백질 프라이밍 프로테아제,
3. 무증상이거나 경미한 증상을 가지는, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중인 적어도 하나의 개체와 비교하여, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 전 또는 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중 개체 내 더 높은 수준의 안지오텐신 전환 효소 2(ACE2 수용체), 및
4. 무증상이거나 경미한 증상을 가지는, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중인 적어도 하나의 개체와 비교하여, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 전 또는 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중 개체 내 더 높은 수준의 인터페론-감마(IFN-γ).
따라서, "이를 필요로 하는 개체"는
1. 무증상이거나 경미한 증상을 가지는, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중인 적어도 하나의 개체와 비교하여, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 전 또는 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중 더 낮은 수준의 내인성 알파-항트립신(AAT), 및
2. 무증상이거나 경미한 증상을 가지는, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중인 적어도 하나의 개체와 비교하여, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 전 또는 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중 더 높은 수준의 적어도 하나의 스파이크 단백질 프라이밍 프로테아제를 가질 수 있다.
바람직하게는, 이러한 관점에서, 본원에 기재된 인간 혈장 내 AAT 단백질 수준은 52μM 보다 더 낮고, 인간 혈장 내 카텝신 L 단백질 수준은 10μM 보다 더 높다.
또 다른 한의 관점에서, "이를 필요로 하는 개체"는
1. 무증상이거나 경미한 증상을 가지는, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중인 적어도 하나의 개체와 비교하여, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 전 또는 SARS-CoV-2 감염 중 더 낮은 수준의 내인성 알파-항트립신(AAT), 및
2. 무증상이거나 경미한 증상을 가지는, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중인 적어도 하나의 개체와 비교하여, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 전 또는 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중 개체 내 더 높은 수준의 안지오텐신 전환 효소 2(ACE2 수용체)를 가질 수 있다.
아직 하나의 추가적인 관점에서, "이를 필요로 하는 개체"는
1. 무증상이거나 경미한 증상을 가지는, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중인 적어도 하나의 개체와 비교하여, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 전 또는 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중 더 낮은 수준의 내인성 알파-항트립신(AAT), 및
2. 무증상이거나 경미한 증상을 가지는, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중인 적어도 하나의 개체와 비교하여, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 전 또는 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중 개체 내 더 높은 수준의 인터페론-감마(IFN-γ)를 가질 수 있다.
이들 관점에서, 1. 및 4.는 AAT-결핍, 비알코올성 지방간 질환과 같은 간질환, 당뇨병, 비만 및 심혈관 병태로 구성된 군에서 선택된 적어도 하나의 질환 또는 증후군일 수 있다. 일부 관점에서, 본 발명은 더 높은 수준의 IFN-γ이 AAT-결핍, 비알코올성 지방간 질환과 같은 간질환, 당뇨병, 비만 및 심혈관 병태로 구성된 군에서 선택된 적어도 하나의 질환 또는 증후군에 의해 유발되는, 본 발명에 따른 조성물에 관한 것이다. 일부 관점에서, 본 발명은 더 낮은 수준의 AAT가 AAT-결핍, 비알코올성 지방간 질환과 같은 간질환, 당뇨병, 비만 및 심혈관 병태로 구성된 군에서 선택된 적어도 하나의 질환 또는 증후군에 의해 유발되는, 본 발명에 따른 조성물에 관한 것이다. 당뇨병은 1형 또는 2형 당뇨병일 수 있다. 간질환은 아세트아미노펜-유발 간 손상, 중증 만성 간염, 단순 지방증, 지방간염, 간섬유증 및 간경화를 포함하는 알코올성 간질환(ALD), 또는 심지어 HCC(간세포암종)일 수 있다. 심혈관 병태는 심장으로 가는 혈류의 갑작스러운 감소 또는 막힘, 심장경색, 급성 관상동맥 증후군(ACS), 또한 좌심실 박출률은 AAT와 반비례 관계가 있는, 급성 심근경색에서 발생하는 임의의 상태일 수 있는데, 이는 수축기 기능장애가 염증 반응과 관련이 있음을 시사한다.
바람직하게는, 이러한 과점에서, 본원에 기재된 인간 혈장 내 AAT 단백질은 52μM 보다 더 낮고, 본원에 기재된 인간 혈장 내 IFN-γ 단백질 수준은 0.19pM 보다 더 높다.
추가적인 관점에서, "이를 필요로 하는 개체", 즉 관심 개체는 다음으로 구성된 군에서 선택된 두 가지를 가진다:
1. 무증상이거나 경미한 증상을 가지는, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중인 적어도 하나의 개체와 비교하여, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 전 또는 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중 더 높은 수준의 적어도 하나의 스파이크 단백질 프라이밍 프로테아제,
2. 무증상이거나 경미한 증상을 가지는, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중인 적어도 하나의 개체와 비교하여, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 전 또는 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중 개체 내 더 높은 수준의 안지오텐신 전화 효소 2(ACE2 수용체), 및
3. 무증상이거나 경미한 증상을 가지는, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중인 적어도 하나의 개체와 비교하여, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 전 또는 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중 개체 내 더 높은 수준의 인터페론-감마(IFN-γ).
아직 하나의 추가적인 관점에서, "이를 필요로 하는 개체"는
1. 무증상이거나 경미한 증상을 가지는, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중인 적어도 하나의 개체와 비교하여, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 전 또는 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중 더 높은 수준의 적어도 하나의 스파이크 단백질 프라이밍 프로테아제, 및
2. 무증상이거나 경미한 증상을 가지는, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중인 적어도 하나의 개체와 비교하여, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 전 또는 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중 개체 내 더 높은 수준의 안지오텐신 전환 효소 2(ACE2 수용체)를 가질 수 있다.
아직 하나의 추가적인 관점에서, "이를 필요로 하는 개체"는
1. 무증상이거나 경미한 증상을 가지는, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중인 적어도 하나의 개체와 비교하여, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 전 또는 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중 더 높은 수준의 적어도 하나의 스파이크 단백질 프라이밍 프로테아제, 및
2. 무증상이거나 경미한 증상을 가지는, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중인 적어도 하나의 개체와 비교하여, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 전 또는 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중 개체 내 더 높은 수준의 인터페론-감마(IFN-γ)를 가질 수 있다.
아직 하나의 추가적인 관점에서, "이를 필요로 하는 개체"는
1. 무증상이거나 경미한 증상을 가지는, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중인 적어도 하나의 개체와 비교하여, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 전 또는 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중 개체 내 더 높은 수준의 안지오텐신 전환 효소 2(ACE2 수용체), 및
2. 무증상이거나 경미한 증상을 가지는, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중인 적어도 하나의 개체와 비교하여, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 전 또는 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중 개체 내 더 높은 수준의 인터페론-감마(IFN-γ)를 가질 수 있다.
추가적인 관점에서, "이를 필요로 하는 개체", 즉 관심 개체는 다음으로 구성된 군에서 선택된 세 가지를 가진다:
1. 무증상이거나 경미한 증상을 가지는, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중인 적어도 하나의 개체와 비교하여, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 전 또는 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중 더 낮은 수준의 내인성 알파-항트립신(AAT),
2. 무증상이거나 경미한 증상을 가지는, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중인 적어도 하나의 개체와 비교하여, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 전 또는 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중 더 높은 수준의 적어도 하나의 스파이크 단백질 프라이밍 프로테아제,
3. 무증상이거나 경미한 증상을 가지는, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중인 적어도 하나의 개체와 비교하여, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 전 또는 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중 개체 내 더 높은 수준의 안지오텐신 전환 효소 2(ACE2 수용체), 및
4. 무증상이거나 경미한 증상을 가지는, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중인 적어도 하나의 개체와 비교하여, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 전 또는 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중 개체 내 더 높은 수준의 인터페론-감마(IFN-γ).
따라서, "이를 필요로 하는 개체"는
1. 무증상이거나 경미한 증상을 가지는, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중인 적어도 하나의 개체와 비교하여, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 전 또는 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중 더 낮은 수준의 내인성 알파-항트립신(AAT),
2. 무증상이거나 경미한 증상을 가지는, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중인 적어도 하나의 개체와 비교하여, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 전 또는 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중 더 높은 수준의 적어도 하나의 스파이크 단백질 프라이밍 프로테아제, 및
3. 무증상이거나 경미한 증상을 가지는, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중인 적어도 하나의 개체와 비교하여, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 전 또는 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중 개체 내 더 높은 수준의 안지오텐신 전환 효소 2(ACE2 수용체)를 가질 수 있다.
추가적인 관점에서, "이를 필요로 하는 개체"는
1. 무증상이거나 경미한 증상을 가지는, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중인 적어도 하나의 개체와 비교하여, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 전 또는 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중 더 낮은 수준의 내인성 알파-항트립신(AAT),
2. 무증상이거나 경미한 증상을 가지는, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중인 적어도 하나의 개체와 비교하여, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 전 또는 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중 더 높은 수준의 적어도 하나의 스파이크 단백질 프라이밍 프로테아제, 및
3. 무증상이거나 경미한 증상을 가지는, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중인 적어도 하나의 개체와 비교하여, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 전 또는 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중 개체 내 더 높은 수준의 인터페론-감마(IFN-γ)를 가질 수 있다.
바람직하게는, 이러한 관점에서, 본원에 기재된 인간 혈장 내 AAT 단백질 수준은 36μM 보다 더 낮고, 본원에 기재된 인간 혈장 내 카텝신 L 단백질 수준은 10pM 보다 더 높으며, 본원에 기재된 인간 혈장 내 IFN-γ 단백질 수준은 0.19mM 보다 더 높다.
더욱 바람직하게는, 이러한 관점에서, 본원에 기재된 인간 혈장 내 AAT 단백질 수준은 52μM 보다 더 낮고, 본원에 기재된 인간 혈장 내 카텝신 L 단백질 수준은 10pM 보다 더 높으며, 본원에 기재된 인간 혈장 내 IFN-γ 단백질 수준은 0.19mM 보다 더 높다.
추가적인 관점에서, "이를 필요로 하는 개체"는
1. 무증상이거나 경미한 증상을 가지는, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중인 적어도 하나의 개체와 비교하여, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 전 또는 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중 더 높은 수준의 적어도 하나의 스파이크 단백질 프라이밍 프로테아제,
2. 무증상이거나 경미한 증상을 가지는, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중인 적어도 하나의 개체와 비교하여, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 전 또는 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중 개체 내 더 높은 수준의 안지오텐신 전환 효소 2(ACE2 수용체), 및
3. 무증상이거나 경미한 증상을 가지는, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중인 적어도 하나의 개체와 비교하여, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 전 또는 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중 개체 내 더 높은 수준의 인터페론-감마(IFN-γ)를 가질 수 있다.
추가적인 측면에서, "이를 필요로 하는 개체", 즉 관심 개체는
1. 무증상이거나 경미한 증상을 가지는, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중인 적어도 하나의 개체와 비교하여, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 전 또는 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중 더 낮은 수준의 내인성 알파-항트립신(AAT),
2. 무증상이거나 경미한 증상을 가지는, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중인 적어도 하나의 개체와 비교하여, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 전 또는 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중 더 높은 수준의 적어도 하나의 스파이크 단백질 프라이밍 프로테아제,
3. 무증상이거나 경미한 증상을 가지는, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중인 적어도 하나의 개체와 비교하여, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 전 또는 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중 개체 내 더 높은 수준의 안지오텐신 전환 효소 2(ACE2 수용체), 및
4. 무증상이거나 경미한 증상을 가지는, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중인 적어도 하나의 개체와 비교하여, 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 전 또는 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중 개체 내 더 높은 수준의 인터페론-감마(IFN-γ)를 가진다.
본 발명의 조성물 내 AAT 단백질은 혈장 AAT 단백질, 이의 변이체, 아이소폼 및/또는 단편; 또는 재조합 AAT 단백질, 이의 변이체, 아이소폼 및/또는 단편일 수 있다. 바람직하게는, 상기 AAT 단백질, 이의 변이체, 아이소폼 및/또는 단편은 재조합 AAT 단백질, 이의 변이체, 아이소폼 및/또는 단편이다. 혈장 AAT 단백질은 바람직하게는 혈장 AAT 단백질, 더욱 바람직하게는 인간 혈장(인간 혈장-추출 AAT로도 불림)에서 유래된다. 특정 관점에서, 본 발명은 알파1-항트립신(AAT) 단백질, 이의 변이체, 아이소폼 및/또는 단편은 재조합 알파1-항트립신(rhAAT로도 불림), 이의 변이체, 아이소폼 및/또는 단편인, 본 발명에 따른 조성물에 관한 것이다.
재조합 AAT 단백질은 예를 들어, CHO 세포, HEK 세포(HEK293 및/또는 HEK293T) 또는 E. coli 세포에서 재조합적으로 생산된다. 전 세계 제약회사는 유전 질환인 AAT-결핍 치료를 위해 인간 혈장에서 AAT 단백질을 추출한다. 혈장 유래 AAT는 FDA 및 EMA 승인을 받았다. 바람직하게는, 본 발명의 AAT 단백질은 가장 바람직하게는 서열번호 1에 기재된 바와 같은(표 1 참조), 인간 아미노산 서열을 가진다. 재조합 AAT 단백질, 이의 변이체, 아이소폼 및/또는 단편은 바람직하게는 Fc-도메인 및/또는 히스티딘-태그(His-tag)가 없다.
본 발명자(들)은 재조합 AAT(CHO 내 생산된 rhAAT)는 상이한 친화도로 AAT-항체에 결합하고(도 17), 혈장 유래 AAT 보다 더 현저한 생물학적 효과를 가진다는 것을 발견하였다. 특히, 재조합 AAT(rhAAT)는 혈장 유래 AAT 보다 더 효과적으로 ACE2/스파이크 단백질 매개 세포 융합을 억제하고(도 14), 상이한 효소 억제 프로파일을 가진다(도 16).
따라서, 본 발명은 CHO 세포에서 생산된 재조합 AAT(rhAAT)는 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 관련 질환 또는 증후군의 치료 및/또는 예방에 사용하기에 특히 효과적이라는 놀라운 발견에 적어도 부분적으로 기초한다.
특정 관점에서, 본 발명은 알파1-항트립신(AAT) 단백질, 이의 변이체, 아이소폼 및/또는 단편은 인간 세포(예: HEK293 또는 HEK293T 세포, 실시예 23 참조)에서 생산된 재조합 알파1-항트립신인, 본 발명에 따른 조성물에 관한 것이다.
본 발명자(들)는 인간 세포, 특히 HEK293(His-tag 없는 rhAAT)에서 생산된 재조합 AAT는 CHO 세포 뿐만 아니라 혈장-유래 AAT와 비교하여, 카텝신 L(도 16b), 트립신(도 16c), 푸린(도 16d) 및 호중구 엘라스타제(도 16i)의 효소 활성의 감소에 특히 효과적이다.
따라서, 본 발명은 인간 세포, 특히 HEK293에서 생산된 재조합 AAT는 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 관련 질환 또는 증후군의 치료 및/또는 예방에 사용하기에 특히 효과적이라는 놀라운 발견에 적어도 부분적으로 기초한다.
특정 관점에서, 본 발명은 알파1-항트립신(AAT) 단백질, 이의 변이체, 아이소폼 및/또는 단편이 더 많은 비-인간 글리칸 프로파일을 가지는 재조합 알파1-항트립신(CHO에서 생산된 rhAAT)인, 본 발명에 따른 조성물에 관한 것이다. 특정 관점에서, 본원에 기재된 비-인간 글리칸 프로파일은 포유류-세포-유래 글리칸 프로파일 및/또는 당조작된 글리칸 프로파일이다. 예를 들어, 당단백질의 푸코실화를 감소시키고/시키거나 시알릴화를 향상시키는데 사용되는, 당조작 전략은 당업자에게 알려져 있다. 특정 관점에서, 본원에 기재된 비-인간 글리칸 프로파일은 CHO-세포-유래 글리칸 프로파일이다. CHO 세포는 인간 세포와 다른 당화 기구를 발현시키는데, 이는 재조합 단백질 표면에서 글리칸의 상이한 구성을 야기한다(도 24) (Lalonde, M. E., & Durocher, Y., 2017, Journal of biotechnology, 251, 128-140).
특정 관점에서, 본 발명은 AAT 단백질, 이의 변이체, 아이소폼 및/또는 단편은 pXC-17.4(GS System, Lonza)에 의해 생산된 재조합 AAT, 이의 변이체, 아이소폼 및/또는 단편인, 본 발명에 따른 조성물에 관한 것이다.
본 발명자(들)는 CHO(재조합 AAT 1)에서 pXC-17.4(GS System, Lonza)에 의해 생산된 재조합 AAT가 혈장-유래 알파1-프로테이나제 억제제(혈장-유래 AAT) 및 CHO(재조합 AAT 2)에서 PL136/PL137(pCGS3, Merck)에 의해 생산된 재조합 AAT 보다 엘라스타제(도 16h) 및 호중구 엘라스타제(도 16i)의 활성에 대한 더욱 뚜렷한 효과를 유도함을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 재조합 AAT(rhAAT)의 특정 형태가 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 관련 질환 또는 증후군의 치료 및/또는 예방에 사용하기에 특히 효과적이라는 놀라운 발견에 적어도 부분적으로 기초한다.
본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 AAT 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드의 "단편"은 본 발명의 AAT 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드 보다 더 짧은 길이의 아미노산, 특히 서열번호 1에 기재된 AAT의 서열 보다 더 적은 아미노산을 함유하는 서열을 말한다. 상기 단편은 바람직하게는 기능성 단편, 예를 들어, 서열번호 1에 기재된 AAT 단백질과 동일한 생물학적 활성을 가지는 단편이다. 상기 기능성 단편은 바람직하게는 서열번호 1에 기재된 AAT 단백질로부터 유래된다. 어느 AAT 단편도 그것이 유래하는 고유의 AAT 서열과, 동일한 특성을 나타내는 한, 즉 생물학적으로 활성인 한, 사용될 수 있다.
바람직하게는, 상기 (기능성) 단편은 약 5개의 연속적인 아미노산, 약 7개의 연속적인 아미노산, 약 15개의 연속적인 아미노산, 약 20개의 연속적인 아미노산, 약 25개의 연속적인 아미노산, 약 20개의 연속적인 아미노산, 약 30개의 연속적인 아미노산, 약 35개의 연속적인 아미노산, 약 40개의 연속적인 아미노산, 약 45개의 연속적인 아미노산, 약 50개의 연속적인 아미노산, 약 55개의 연속적인 아미노산, 약 60개의 연속적인 아미노산, 약 100개의 연속적인 아미노산, 약 150개의 연속적인 아미노산, 약 200개의 연속적인 아미노산, 약 300개의 연속적인 아미노산, 등 또는 서열번호 1에 기재된 고유의 인간 AAT 아미노산 서열을 공유한다. 일부 관점에서, 본원에 기재된 상기 (기능성) 단편은 발현 최적화된 신호 단백질(예: 실시예 24)을 포함한다.
기능성 AAT 단편은 서열번호 2에 기재된 AAT의 C-말단 단편을 포함하거나 구성될 수 있다. 서열번호 2의 C-말단 단편은 서열번호 1의 374 내지 418 아미노산으로 구성된다.
더욱 바람직하게는, AAT 단편은 C-말단 AAT서열 374-418(서열번호 2) 보다 더 짧은 길이의 아미노산을 함유하는 단편이다. 그렇지 않으면, 상기 AAT 단편은 필수적으로 서열번호 2로 구성된다.
표 1
서열번호
MPSSVSWGILLLAGLCCLVPVSLAEDPQGDAAQKTDTSHHDQDHPTFNKITPNLAEFAFS
LYRQLAHQSNSTNIFFSPVSIATAFAMLSLGTKADTHDEILEGLNFNLTEIPEAQIHEGF
QELLRTLNQPDSQLQLTTGNGLFLSEGLKLVDKFLEDVKKLYHSEAFTVNFGDTEEAKKQ
INDYVEKGTQGKIVDLVKELDRDTVFALVNYIFFKGKWERPFEVKDTEEEDFHVDQVTTV
KVPMMKRLGMFNIQHCKKLSSWVLLMKYLGNATAIFFLPDEGKLQHLENELTHDIITKFL
ENEDRRSASLHLPKLSITGTYDLKSVLGQLGITKVFSNGADLSGVTEEAPLKLSKAVHKA
VLTIDEKGTEAAGAMFLEAIPMSIPPEVKFNKPFVFLMIEQNTKSPLFMGKVVNPTQK		 1
MFLEAIPMSIPPEVKFNKPFVFLMIEQNTKSPLFMGKVVNPTQK 2
Cyclo-(CPFVFLM)-SH 3
Cyclo-(CPFVFLE)-SH 4
Cyclo-(CPFVFLR)-SH 5
Cyclo-(CPEVFLM)-SH 6
용어 "변이체"는 AAT 고유 서열 펩티드와 어느 정도 상이한 아미노산 서열을 가지는 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드를 말하며, 이는 아미노산 치환에 의해 AAT 고유 서열에서 벗어난 아미노산 서열로서, 하나 이상의 아미노산이 동일한 특성 및 형태적 역할을 가진 또 다른 하나로 치환된다. 바람직하게는, 본 발명의 변이체는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90% 또는 85% 상동이다. 변이체는 또한 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90% 또는 85% 서열 상동성을 가질 수 있다. 아미노산 변이체는 고유 아미노산 서열의 아미노산 서열 내 특정 위치, 예를 들어, N- 또는 C-말단 서열에서 또는 아미노산 서열 내에 치환, 결실 및/또는 삽입을 가질 수 있다. 치환은 또한 보존적일 수 있고, 이러한 경우, 보존적 아미노산 치환은 다음의 5개 군 중 하나 내의 교환으로 본원에 정의된다:
Ⅰ. 작은 지방족, 비극성 또는 약한 극성 잔기: Ala, Ser, Thr, Pro, Gly
Ⅱ. 극성, 양전하 잔기: His, Arg, Lys
Ⅲ. 극성, 음전하 잔기: 및 그의 아미드: Asp, Asn, Glu, Gln
Ⅳ. 큰, 방향족 잔기: Phe, Tyr, Trp
Ⅴ. 큰, 지방족, 비극성 잔기: Met, Leu, Ile, Val, Cys.
"상동성(homology)"은 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 두 개의 폴리펩티드 모이어티 사이의 동일성 백분율을 의미한다. 두 개의 핵산 또는 두 개의 폴리펩티드 서열은 상기 서열이 정의된 길이의 분자에 걸쳐 적어도 약 50% 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 약 75% 서열 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 약 80% 또는 적어도 약 85% 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 90% 서열 동일성, 및 가장 바람직하게는 적어도 약 95%-98% 서열 동일성을 나타낼 때, 서로 "실질적으로 상동"이다. 본원에 사용된 바와 같이, 실질적으로 상동은 또한 특정 서열에 완전한 동일성을 나타내는 서열을 의미한다.
일반적으로, "동일성(identity)"은 각각 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 정확한 뉴클레오티드 대 뉴클레오티드 또는 아미노산 대 아미노산의 대응을 말한다. 백분율 동일성은 서열을 정리하고, 두 개의 정렬된 서열 사이의 정확한 일치(match) 수를 세고, 더 짧은 서열의 길이로 나누고, 그 결과에 100을 곱함으로써, 두 개의 분자 사이의 서열 정보의 직접적인 비교에 의해 결정될 수 있다.
대안적으로, 상동성은 쉽게 이용가능한 컴퓨터 프로그램에 의해 또는 상동성 영역 사이의 안정한 듀플렉스를 형성하는 조건 하에서 폴리뉴클레오티드의 혼성화, 뒤이은 단일 가닥 특이적 뉴클레아제(들)에 의한 소화 및 소화된 단편의 크기 결정에 의해 결정될 수 있다.
실질적으로 상동인 DNA 서열은 예를 들어, 특정 시스템에 대해 정의된 엄격한 조건 하에서 서던 혼성화 실험에서 확인될 수 있다. 적절한 혼성화 조건을 정의하는 것은 당업계의 기술 범위 내에 있다.
일부 관점에서, 본 발명은 알파1-항트립신 단편은 C-말단 서열 단편 또는 이의 임의의 조합인, 본 발명에 따른 조성물에 관한 것이다.
펩티드 변이체는 선형 펩티드 또는 고리형 펩티드일 수 있고, 서열번호 2에 기재된 C-말단 서열에서 유래된 짧은 고리형 펩티드를 포함하는 군에서 선택될 수 있다. 바람직하게는, 상기 알파1-항트립신의 C-말단 서열에서 유래된 짧은 고리형 펩티드는 Cyclo-(CPFVFLM)-SH, Cyclo-(CPFVFLE)-SH, Cyclo-(CPFVFLR)-SH, 및 Cyclo-(CPEVFLM)-SH, 또는 이의 임의의 조합을 포함하는 비제한적 군에서 선택될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 본 발명의 AAT 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드의 "아이소폼"은 AAT mRNA의 대안적 스플라이싱으로부터 생성되는 스플라이스 변이체를 말한다.
일부 관점에서, 본원에 기재된 바와 같은, AAT, 이의 변이체, 아이소폼 또는 단편의 아미노산 서열은 서열번호 1의 상응하는 아미노산 서열과 적어도 80% 동일하다. 일부 관점에서, AAT, 이의 변이체, 아이소폼 또는 단편의 아미노산 서열은 서열번호 1의 상응하는 아미노산 서열과 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하다.
본 발명의 펩티드, 이의 아이소폼, 단편 또는 변이체는 바람직하게는 표적 세포, 바람직하게는 기도의 세포에서 펩티드, 이의 아이소폼, 단편 또는 변이체의 축적을 증가시키는 제제에 접합될 수 있다. 이러한 제제는 예를 들어, 치료 약물(Qian Z. M. et al., “Targeted drug delivery via the transferrin receptor-mediated endocytosis pathway” Pharmacological Reviews, 54, 561, 2002) 또는 예를 들어, 이미 단백질 키나아제 C(Ioannides C.G. et al., “Inhibition of IL-2 receptor induction and IL-2 production in the human leukemic cell line Jurkat by a novel peptide inhibitor of protein kinase C” Cell Immunol., 131, 242, 1990) 및 단백질-티로신 포스파타제(Kole H.K. et al., “A peptide-based protein-tyrosine phosphatase inhibitor specifically enhances insulin receptor function in intact cells” J. Biol. Chem. 271, 14302, 1996)의 펩티드 억제제의 세포내 전달에 사용되고 있는, 데칸산, 미리스트산 및 스테아르산과 같은 지방산 군 중에서 또는 펩티드 중에서 선택될 수 있는 세포막 투과성 담체에 접합된 트랜스페린의 막 트랜스페린 수용체 매개 엔도사이토시스 와 같은 수용체 매개 엔토사이토시스를 유도하는 화합물일 수 있다. 바람직하게는, 세포막 투과성 담체가 사용된다. 더욱 바람직하게는, 세포막 투과성 담체 펩티드가 사용된다.
세포막 투과성 담체가 펩티드인 경우, 바람직하게는 양전하를 띤 아미노산이 풍부한 펩티드일 것이다.
바람직하게는, 이러한 양전하를 띤 아미노산 풍부한 펩티드는 아르기닌이 풍부한 펩티드이다. 그것은 푸타기(Futaki) 등(Futaki S. et al., “Arginine-rich peptides. An abundant source of membrane-permeable peptides having potential as carriers for intracellular protein delivery” J. Biol. Chem., 276, 5836, 2001)에 나와 있는데, 세포막 투과성 담체 펩티드 내 아르기닌 잔기의 수가 내재화 방법에 상당한 영향을 미치고, 내재화를 위한 최적의 아르기닌 잔기 수가 있는 것으로 보이며, 바람직하게는 6개 이상의 아르기닌을 포함하고, 더욱 바람직하게는 9개 이상의 아르기닌을 포함한다. 아르기닌 풍부 펩티드는 바람직하게는 적어도 6개의 아르기닌, 더욱 바람직하게는 적어도 9개의 아르기닌을 포함한다.
펩티드, 이의 아이소폼, 단편 또는 변이체는 스페이서(예: 2개의 글리신 잔기)에 의해 세포막 투과성 담체에 접합될 수 있다. 이러한 경우, 세포막 투과성 담체는 바람직하게는 펩티드이다.
일반적으로 아르기닌 풍부 펩티드는 HIV-TAT 48-57 펩티드(GRKKRRQRRR; 서열번호 7), FHV-coat 35-49 펩티드(RRRRNRTRRNRRRVR; 서열번호 8), HTLV-II Rex 4-16 펩티드(TRRQRTRRARRNR; 서열번호 9) 및 BMV gag 7-25 펩티드(서열번호 10)를 포함하는 비제한적인 군에서 선택된다.
당업자에 의해 결정된 임의의 세포막 투과성 담체가 사용될 수 있다.
고유 펩티드(L-형)의 내재하는 문제는 천연 프로테아제에 의한 분해이므로, 본 발명의 펩티드, 이의 아이소폼, 단편 또는 변이체 뿐만 아니라 세포막 투과성 펩티드는 펩티드의 D-형 및/또는 "레트로-인버소(retro-inverso) 이성질체"를 포함하도록 제조될 수 있다. 이러한 경우, 본 발명의, 펩티드의 단편 및 변이체의 레트로-인버소 이성질체, 뿐만 아니라 세포막 투과성 펩티드가 제조된다.
세포 내 펩티드의 축적을 증가시킬 수 있는 제제에 선택적으로 접합된, 본 발명의 펩티드, 이의 아이소폼, 단편 또는 변이체는 예를 들어, 마니아티스(Maniatis) 등, 1982, 분자 클로닝(Molecular Cloning), 실험실 매뉴얼(A laboratory Manual), 콜드 스프링 하버 실험실(Cold Spring Harbor Laboratory)와 같은 화학적 합성 또는 재조합 기술과 같은 당업계에 알려진 다양한 방법 및 기술에 의해 제조될 수 있다.
본원에 기재된 세포 내 펩티드의 축적을 증가시킬 수 있는 제제에 선택적으로 접합된, 본 발명의 펩티드, 이의 아이소폼, 단편 또는 변이체는 바람직하게는 세포 발현 시스템에서 재조합적으로 생산된다. 다양한 단세포 숙주 세포가 본 발명의 DNA 서열을 발현시키는데 유용하다. 이러한 숙주는 조직 배양에서 대장균, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 효모와 같은 균류의 균주, 및 CHO, YB/20, NSO, SP2/0, Rl. 1, B-W and L-M 세포, 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(예: COS 1, COS 7, BSCl, BSC40, 및 BMTlO), 곤충세포(예: Sf9) 및 인간세포와 같은, 동물세포 및 식물 세포와 같은, 잘 알려진 진핵 및 원핵 숙주를 포함할 수 있다.
본 발명의 알파1-항트립신 단백질, 이의 변이체, 아이소폼 및/또는 단편의 "치료학적 유효 용량 또는 양"은 투여 시 코로나바이러스 감염 관련 질환 또는 증후군에 대해 개체의 치료와 관련된 긍정적인 치료 또는 예방적 반응을 일으키는 양을 의미한다. 용어 "코로나바이러스 감염"은 MERS-CoV, SARS-CoV 및 SARS-CoV-2 뿐만 아니라 이의 변이체를 포함하는 군에서 선택된 코로나바이러스에 의해 유발된 감염을 말할 수 있다. 일부 관점에서, 본원에 기재된 SARS-CoV-2 변이체는 Lineage B.1.1.207, Lineage B.1.1.7, Cluster 5, 501.V2 변이체, Lineage P.1, Lineage B.1.429 / CAL.20C, Lineage B.1.427, Lineage B.1.526, Lineage B.1.525, Lineage B.1.1.317, Lineage B.1.1.318, Lineage B.1.351, Lineage B.1.617 및 Lineage P.3의 군에서 선택된 SARS-Co-2 변이체이다. 일부 관점에서, 본원에 기재된 SARS-CoV-2 변이체는 19A, 20A, 20C, 20G, 20H, 20B, 20D, 20F, 20I, 및 20E의 군에서 선택된 Nextstrain 클레이드에 의해 설명되는 SARS-CoV-2 변이체이다. 일부 관점에서, 본원에 기재된 SARS-CoV-2 바이러스는 D614G, E484K, N501Y, S477G/N, P681H, E484Q, L452R 및 P614R의 군에서 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 SARS-CoV-2 변이체이다. 일부 관점에서, 본원에 기재된 SARS-CoV-2 변이체는 본원에 기재된 변이체로부터 유래된 SARS-CoV-2 변이체이다. 일부 관점에서, 본원에 기재된 SARS-CoV-2 바이러스는 본원에 기재된 적어도 하나의 SARS-CoV-2 변이체의 바이러스 게놈 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9%의 서열 동일성을 가지는 SARS-CoV-2 변이체이다.
코로나바이러스 감염은 호흡기 증후군인 질환 또는 증후군을 일으키는 기도 감염을 유발할 수 있다. 호흡기 증후군은 중증 급성 호흡기 증후군(SARS)일 수 있다. 일부 관점에서, SARS-CoV-2 감염은 다음과 같이 구별될 수 있는 세 가지 감염의 임상 과정 중 적어도 하나이다: (1) 상기도 징후를 동반한 경미한 질병, (2) 생명을 위협하지 않는 폐렴, 및 (3) 폐렴, 급성 호흡 곤란 증후군(ARDS), 증증 전신 염증, 장기 부전, 심혈관 합병증을 동반한 중증 상태.
본 발명의 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용되는 희석제 또는 담체를 추가로 포함할 수 있다.
"약학적으로 허용되는 희석제 또는 담체"는 일반적으로 안전하고, 무독성이며 바람직한 약학적 조성물을 제조하는데 유용한 담체 또는 희석제를 의미하며, 인간의 약학적 사용에 허용되는 담체 또는 희석제를 포함한다.
이러한 약학적으로 허용되는 담체는 땅콩유, 대두유, 광물유, 참기름 등과 같은, 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 기원의 것을 포함하는, 물 및 오일과 같은, 멸균액일 수 있다. 물은 약학적 조성물이 정맥내 투여될 때 바람직한 담체이다. 식염수 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액은 특히 주사액을 위한, 액체 담체로 쓰일 수 있다.
약학적으로 허용되는 희석제 또는 담체는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 스테아르산나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다.
약학적 조성물은 예를 들어, 염산염, 브롬산염, 인산염, 황산염 등과 같은 무기산염; 및 아세트산, 프로피온산, 말론산, 벤조산 등과 같은 유기산의 염과 같은 하나 이상의 약학적으로 허용되는 염을 추가로 포함할 수 있다. 추가적으로, 습윤제 또는 유화제, pH 버퍼물질, 겔 또는 겔화 물질, 향료, 착색제, 마이크로스피어, 고분자, 현탁제 등과 같은, 보조 물질이 또한 여기에 존재할 수 있다. 또한, 보존제, 습윤제, 현탁제, 계면활성제, 항산화제, 고화방지제, 충전제, 착화제, 코팅제, 화학 안정제 등과 같은 하나 이상의 다른 통상의 약학적 성분이 또한 특히 투여형이 재구성가능한 형태인 경우, 존재할 수 있다. 적합한 예시적 성분은 거대결정질 셀룰로오스, 카복시메틸 셀룰로오스 나트륨, 폴리소르베이트80, 페닐에틸 알코올, 클로로부탄올, 소르브산 칼륨, 소르브산, 이산화황, 프로필 갈레이트, 파라벤류, 에틸 바닐린, 글리세린, 페놀, 파라클로로페놀, 젤라틴, 알부민 및 이의 조합을 포함한다. 약학적으로 허용되는 부형제의 완전한 논의는 본원에 참조로서 포함된 REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES(Mack Pub. Co., N.J. 1991)에서 이용가능하다.
대안적으로, 본 발명의 약학적 조성물은 하나 이상의 추가 치료제를 추가적으로 포함한다. 바람직하게는, 하나 이상의 치료제는 치료학적 유효량의 하나 이상의 뉴클레오시드 유사체, 프로테아제 억제제, 면역-억제제(예: 사릴루맙 또는 토실리주맙), 클로로퀸, 하이드록시클로로퀸 항생제, 바이러스의 구조적 성분에 대한 항체 또는 이의 단편(예: 수동 면역요법), 인터페론 베타(예: 인터페론 베타-1a) 및/또는 백신을 포함한다.
특정 다른 관점에서, 본 발명의 약학적 조성물 및 하나 이상의 추가적인 치료제는 실질적으로 동시에 또는 함께 투여될 수 있다. 예를 들어, 개체는 하나 이상의 추가 치료제를 이용한 치료 과정을 거치는 동안 본 발명의 사용하기 위한 약학적 조성물을 제공받을 수 있다. 또한, 개체는 다른 형태의 항바이러스 요법/들을 이미 가지거나 동시에 받을 수 있다고 생각된다.
일부 관점에서, 추가적인 치료제는 본 발명의, 항체, 이의 항원-결합 단편의 투여와 관련된 가능한 부작용(들)을 감소시키는데 유용할 수 있다.
일부 관점에서, 추가적인 치료제는 본 발명의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편의 투여와 관련된 효과를 지지하는데 유용할 수 있다.
일부 관점에서, 본 발명의, 추가적인 치료제 및 항체, 또는 이의 항원-결합 단편의 투여는 원하는 효과 및/또는 부작용에 관한 상승 효과를 초래한다.
일부 관점에서, 본원에 기재된 추가적인 치료제는 뉴클레오시드 유사체, 프로테아제 억제제 및 면역-억제제와 같은 면역 조절제의 군에서 선택된 적어도 하나의 제제이다.
일부 관점에서, 본원에 기재된 추가적인 치료제는 뉴클레오시드 유사체, 프로테아제 억제제, 면역-억제제(예: 사릴루맙 또는 토실리주맙), 클로로퀸, 하이드록시클로로퀸 항생제, 바이러스의 구조적 성분에 대한 항체 또는 이의 단편(예: 수동 면역요법), 인터페론 베타(예: 인터페론 베타-1a) 및/또는 백신의 군에서 선택된 적어도 하나의 제제이다.
뉴클레오시드 유사체의 비제한적인 예는 리바비린(Ribavirin), 렘데시비르(Remdesivir), β-d-N4-하이드록시시티딘(β-d-N4-hydroxycytidine), BCX4430, 젬시타빈 염산염(Gemcitabine hydrochloride), 6-아자우리딘(6-Azauridine), 미조리빈(Mizoribine), 아시클로비르 플렉시머(Acyclovir fleximer) 및 이의 하나 이상의 조합을 포함한다.
프로테아제 억제제의 비제한적인 예는 HIV 및/또는 HCV 프로테아제 억제제를 ㅍ h함한다.
일부 관점에서, 본원에 기재된 면역 조절제는 인터페론 베타이다. 일부 관점에서, 본원에 기재된 면역 조절제는 인터페론 베타-1a이다. 면역-억제제의 비제한적인 예는 예를 들어, IL-6(예: 사릴루맙 또는 토실리주맙), IL-1, IL-12, IL-18 및 TNF-알파 억제제와 같은, 인터루킨 억제제를 포함한다.
추가적인 치료제는 본원에 기재된 조성물 및 방법의 치료 효과를 향상시키거나 보완할 수 있다(예: 도 20, 11d 참조).
따라서, 본 발명은 특정 조합(AAT와 INF-베타-1와 같은)이 바이러스 진입 및 염증에 대한 AAT의 효과를 향상시킨다는 발견에 적어도 부분적으로 기초한다.
본 발명은 또한 유전자 전달 벡터 및 이를 포함하는 약학적 조성물을 고려한다. 바람직하게는 유전자 전달 벡터는 본 발명의 AAT 단백질, 이의 변이체, 아이소폼 및/또는 단편을 암호화하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 플라스미드 또는 벡터의 형태이다. 유전자 전달 벡터의 예는 바이러스 벡터, 비-바이러스 벡터, 미립자 담체 및 리포좀을 포함한다. 유전자 전달은 바람직하게는 시험관 내 또는 생체 외에서 수행된다.
따라서, 본 발명은 AAT 유전자 전달(유전자 요법)이 염증의 효과를 감소시킨다는 발견에 적어도 부분적으로 기초한다(도 19b 참조).
한 관점에서, 상기 바이러스 벡터는 생체 외 및 생체 내 유전자 전달, 바람직하게는 생체 외 유전자 전달에 적합한 벡터이다. 보다 바람직하게는, 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터 등과 같은 다른 바이러스 벡터를 제외하지 않는, 아데노 관련 바이러스(AAV) 및 렌티바이러스, 예를 들어, 1세대, 2세대 및 3세대 렌티바이러스를 포함하는 군에서 선택된다. 다른 전달 수단 또는 비히클이 알려져 있고(효소 시스템, 미세소포체, 유전자 총/금 나노입자에 벡터를 부착하는 수단) 제공되며, 일부 관점에서, 하나 이상의 바이러스 또는 플라스미드 벡터는 리포좀, 나노입자, 엑소좀, 미세소포체 또는 유전자 총을 통해 전달될 수 있다.
본 발명의 다른 관점에서, 본 발명의 약학적 조성물(들)은 서방성 제형 또는서방성 장치를 이용하여 투여하는 제형이다. 이러한 장치는 당업계에 잘 알려져 있고, 예를 들어, 비-서방성 약학적 조성물을 서방성 효과를 달성하기 위한 다양한 투여량으로 연속적이고, 정상 상태 방식으로, 시간 경과에 따른 약물 전달을 위해 제공할 수 있는, 경피 패치 및 소형 미식형 펌프를 포함한다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구, 비경구, 설하, 경피, 직장, 경점막, 국소, 흡입, 협측 투여, 흉막내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 피하, 근육내, 비강내, 척수강내 및 관절내 또는 이의 조합을 포함하는 상이한 경로에 의해 개체로 투여될 수 있다. 인간 사용을 위해, 조성물은 정상적인 인간 관행에 따라 적합하게 허용되는 제형으로 투여될 수 있다. 숙련된 기술자는 특정 환자에 가장 적합한 투여 요법 및 투여 경로를 쉽게 결정할 것이다. 본 발명의 조성물은 전통적인 주사기, 무바늘 주입 장치, "미세투사체 폭격 총" 또는 전기천공법("EP"), "유체역학적 방법" 또는 초음파와 같은 물리적 방법에 의해 투여될 수 있다. 조성물은 또한 정맥내 주사, 정맥내 주입, 도세터 펌프를 사용한 주입, 흡입 비강-분무, 피부 패치, 서방성 제제, 생체외 유전자치료 또는 생체외 세포요법, 바람직하게는 정맥내 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 또한 본원에 기재된 재조합 렌티바이러스, 재조합 아데노바이러스 및 재조합 아데노바이러스 벡터를 이용하거나 이용하지 않는, 본 발명의 AAT 단백질, 이의 변이체, 아이소폼 및/또는 단편을 암호화하는 핵산의 DNA 주입(DNA 접종이라고도 함)을 포함하는 여러 기술에 의해, 환자에게 전달될 수 있다.
조성물은 정맥내 주입되거나 폐 또는 기도에 국소 주사되거나 관심 조직에 전기천공될 수 있다.
본 발명은 나아가 이를 필요로 하는 개체에서 코로나바이러스 감염 관련 질환 또는 증후군의 치료 및/또는 예방 방법을 제공하는데, 상기 방법은 치료학적 유효량의 i) 본원에 기재된 알파1-항트립신 단백질, 이의 변이체, 아이소폼 및/또는 단편, 또는 ii) 본원에 기재된 본 발명의 사용하기 위한 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
추가로 제공되는 것은, 치료학적 유효량의 i) 본원에 기재된 알파1-항트립신 단백질, 이의 변이체, 아이소폼 및/또는 단편, 또는 ii) 본원에 기재된 본 발명의 사용하기 위한 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 코로나바이러스에 노출되었거나 노출된 것으로 의심되는 개체에 코로나바이러스 감염의 시작을 조절하는 방법이다.
본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는, 치료학적 유효량의 본원에 정의된 알파1-항트립신(AAT) 단백질, 이의 변이체, 아이소폼 및/또는 단편을 포함하는 조성물을 이용하여 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 관련 질환 또는 증후군의 치료 및/또는 예방을 위해 관심 개체의 민감성을 결정하기 위한 것에 관한 것이다:
a) 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 전 또는 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중 관심 개체에서 내인성 알파1-항트립신, 적어도 하나의 스파이크 단백질 프라이밍 프로테아제, ACE2 수용체 및 인터페론-감마로 구성된 군 중 적어도 하나의 수준을 결정하는 단계,
b) 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중 적어도 하나의 참조 개체에서 내인성 알파1-항트립신, 적어도 하나의 스파이크 단백질 프라이밍 프로테아제, ACE2 수용체 및 인터페론-감마로 구성된 군 중 적어도 하나의 수준을 결정하는 단계로서, 참조 개체는 무증상이거나 경미한 증상을 가지는 단계,
c) a) 단계에서 결정된 관심 수준을 b) 단계에서 결정된 참조 수준과 비교하는 단계로서, 관심 개체가 하기로 구성된 군에서 선택된 적어도 하나를 가지는 경우, 관심 개체가 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 관련 질환 또는 증후군의 치료 및/또는 예방에 더욱 민감한 것인 단계:
1. 내인성 AAT의 참조 수준과 비교하여, 내인성 알파-항트립신(AAT)의 더 낮은 관심 수준,
2. 적어도 하나의 스파이크 단백질 프라이밍 프로테아제의 참조 수준과 비교하여, 적어도 하나의 스파이크 단백질 프라이밍 프로테아제의 더 높은 관심 수준,
3. ACE2 수용체의 참조 수준과 비교하여, 안지오텐신 전환 효소 2(ACE2 수용체)의 더 높은 관심 수준, 및
4. IFN-γ의 참조 수준과 비교하여, 인터페론-감마(IFN-γ)의 더 높은 관심 수준.
본원에 제공된 모든 정의 및 조합은 적용가능한 경우 달리 표시되지 않는 한 이러한 관점에 적용된다.
본 발명은 나아가 하기 단계를 포함하는 본 발명의 조성물을 이용한 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 관련 질환 또는 증후군의 효과적인 치료 및/또는 예방을 위한 알파1-항트립신(AAT)의 치료학적 유효량을 결정하기 위한 방법에 관한 것이다:
a) 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 전 또는 바이러스 감염, 바람직하게는 코로나바이러스 감염, 더욱 바람직하게는 SARS-CoV-2 감염 중 관심 개체에서 내인성 알파1-항트립신의 수준을 결정하는 단계,
b) 적어도 10μM, 바람직하게는 적어도 20μM, 더욱 바람직하게는 50μM, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 100μM 및 가장 바람직하게는 적어도 200μM의 개체 내 AAT의 수준을 달성하기 위해 요구되는, 조성물 내 AAT의 양을 결정하는 단계.
본원에 제공된 모든 정의 및 조합은 적용가능한 경우 달리 표시되지 않는 한 이러한 관점에 적용된다.
일부 관점에서, 본 발명은 바이러스가 코로나바이러스인, 본 발명에 따른 방법에 관한 것이다. 일부 관점에서, 본 발명은 바이러스가 SARS-CoV-2인, 본 발명에 따른 방법에 관한 것이다. 일부 관점에서, 본 발명은 질환 또는 증후군이 호흡기 증후군 또는 중증 급성 호흡기 증후군인, 본 발명에 따른 방법에 관한 것이다. 일부 관점에서, 본 발명은 질환 또는 증후군이 신경계의 염증성 질환 또는 증후군인, 본 발명에 따른 방법에 관한 것이다. 일부 관점에서, 본 발명은 신경계의 염증성 질환 또는 증후군이 다발성 경화증, 근위축성 측삭 경화증, 알츠하이머병, 파킨슨병 및 헌팅턴병의 군에서 선택된 질환 또는 증후군인, 본 발명에 따른 방법에 관한 것이다.
본원에 제공된 모든 정의 및 조합은 적용가능한 경우 달리 표시되지 않는 한 이러한 관점에 적용된다.
당업자는 본원에 기재된 발명이 구체적으로 기재된 것 이외의 변형 및 변경이 가능하다는 것을 이해할 것이다. 본 발명은 이의 사상 또는 필수적인 특성을 벗어나지 않는 이러한 모든 변형 및 변경을 포함하는 것으로 이해되어야만 한다. 본 발명은 또한 본 명세서에 개별적으로 또는 집합적으로 언급되거나 표시된 모든 단계, 특성, 조성물 및 화합물, 및 상기 단계 또는 특성의 임의의 및 모든 조합 또는 임의의 두 개 이상을 포함한다. 본 발명의 내용은 그러므로 모든 관점에서 예시적이며 제한적이지 않은 것으로 간주되어야 하며, 첨부된 청구범위에 표시된 본 발명의 범위, 및 등가의 의미 및 범위 내에서 발생하는 모든 변경이 이에 포함되는 것으로 의도된다. 다양한 참고문헌이 본 명세서에 걸쳐 인용되며, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참조로서 포함된다. 전술한 설명은 하기 실시예를 참조하여 더욱 완전히 이해될 것이다.
도 1: SARS-CoV-2 감염 주기 및 숙주 세포 내 바이러스 진입을 차단하는 AAT의 역할의 개략도.
도 2(a): A549 및 HeLa 세포 내 카텝신 L, 푸린, ACE2 및 TMPRSS2의 내인성 mRNA 수준은 HeLa 세포와 A549 세포 모두 관련 양의 ACE2 mRNA 및 TMPRSS2를 발현하지 않음을 나타낸다. 두 세포주 모두 푸린 및 카텝신 L(SARS-CoV-1 및 SARS-CoV-2 유래 스파이크 단백질의 피라이밍 프로테아제)를 발현한다.
도 2(b): SARS-CoV-2 스파이크 D614G 수도바이러스 변이체는 증가된 감염성을 나타낸다. 루시퍼라제를 발현시키고 SARS-CoV-2 스파이크 야생형(D614) 또는 D614G로 위형화된 렌티바이러스를 ACE2 및/또는 TMPRSS2를 과발현시키거나 과발현시키지 않는 HeLa 세포를 형질도입하기 위해 사용하였다. 결과는 TMPRSS2를 과발현하는 HeLa 세포 내 SARS-CoV-2 수도바이러스 세포-진입에 대한 10 마이크로몰(10μM) 농도에서 및 ACE2만 발현하는 HeLa 세포에서 25%까지 혈장 유래 AAT에 의한 억제 효과를 나타내지 않는다.
도 3: a) 상이한 세포주 내 ACE2 유전자 발현. b) 상이한 세포주(조직) 내 TMPRSS2 유전자 발현.
도 4: IFN-γ 처리에 대한 A549 내 ACE2 발현.
도 5: IFN-γ 처리에 대한 HeLa 내 ACE2 발현.
도 6: SARS-CoV-2 수도바이러스 진입 분석. a) 내지 b) A549 세포 - WT 수도바이러스. a) WT D614 수도바이러스를 가진 A549-ACE2 세포. b) WT D614 수도바이러스를 가진 A549 - ACE2 - TMPRSS2. c 내지 d) A549 세포 - 스파이크 G416 돌연변이 수도바이러스. c) 돌연변이 G416 수도바이러스를 가진 A549 ACE2 세포. d) 돌연변이 G614 수도바이러스를 가진 A549 - ACE2 - TMPRSS2 세포.
레스피캄 = 글라시아(Glassia), FDA 승인 혈장 유래 AAT(임상 등급),
시그마 = 시그마에서 구입한 혈장 유래 AAT(비-GMP 등급).
도 7: SARS-CoV-2 수도바이러스 진입은 AAT의 100 및 200 마이크로몰 농도에서 모두 ACE2 강화 A549 세포에서 50-75% 차단된다. (PBS 5x 내 레스피캄 100uM, PBS 5x 내 시그마 100uM, PBS 2.5x 내 시그마 200uM, PBS 5x 내 포틀랜드 100uM, PBS 5x so 젠팍손, DMSO 0.2% 내 카모스타트 10uM 및 100uM, DMSO 0.2% 내 브롬헥신 10uM 및 100uM, DMSO 0.2% 내 벤젠설포닐 10uM 및 100uM).
도 8: SARS-CoV-2 수도바이러스 진입은 AAT의 100 및 200 마이크로몰 농도에서 모두 ACE2+TMPRSS2 강화 A549 세포에서 45%까지 차단된다. (PBS 5x 내 레스피캄 100uM, PBS 5x 내 시그마 100uM, PBS 2.5x 내 시그마 200uM, PBS 5x 내 포틀랜드 100uM, PBS 5x so 젠팍손, DMSO 0.2% 내 카모스타트 10uM 및 100uM, DMSO 0.2% 내 브롬헥신 10uM 및 100uM, DMSO 0.2% 내 벤젠설포닐 10uM 및 100uM).
도 9: ACE2는 코로나바이러스 질환 2019(COVID-19)의 원인이 되는 신종 코로나바이러스인, SARS-CoV-2에 의한 감염을 매개하는 숙주 세포 수용체이다. 약물 화합물(AAT) 처리는 바이러스와 수용체 사이의 상호작용을 방해한다. (https://www.rndsystems.com/resources/articles/ace-2-sars-receptor-identified로 조정).
도 10: SARS-CoV-2 수도바이러스 진입 분석 프로토콜.
도 11 a)b) ACE2 과발현 A549 인간 폐포 기저 상피세포 내 SARS-CoV-2 수도바이러스 진입에 대한 혈장 유래 및 재조합 AAT의 효과. 가장 뚜렷한 억제 효과(93.4%)는 벡터 pXC17.4(Lonza Biologics Plc)를 이용하여 CHO 세포 내 생산된 재조합 AAT1에 대해 200uM에서 관찰된다. c) ACE2 과발현 A549 인간 폐포 기저 상피세포 내 SARS-CoV-2 수도바이러스 진입에 대한 다른 세린 프로테아제 억제제의 효과. d) CHO 세포 내 생산된 25uM 혈장-유래 AAT 및 재조합 AAT(재조합 AAT 1, 재조합 AAT 2)와 조합된 10ng/mL의 IFN-베타-1a는 SARS-CoV-2 수도바이러스 진입 분석 내 추가적인 억제 효과를 나타낸다.
도 12 a)b) ACE2 과발현 HeLa 인간 자궁경부암 세포 내 SARS-CoV-2 수도바이러스 진입에 대한 혈장 유래 및 재조합 AAT의 효과. c) ACE2 과발현 HeLa 인간 자궁경부암 세포 내 SARS-CoV-2 수도바이러스 진입에 대한 다른 세린 프로테아제 억제제의 효과.
도 13 SARS-CoV-2 스파이크 융합 분석의 개략도.
도 14 ACE2 및 작은 비트 루시퍼라제 또는 SARS-CoV-2 스파이크 및 큰 비트루시퍼라제 중 하나를 과발현하는 HeLa 인간 자궁경부암 세포 내 SARS-CoV-2 스파이크 융합 분석. CHO 세포 내 생산된 재조합 AAT(rhAAT) (재조합 AAT 1 및 재조합 AAT 2)는 혈장 유래 AAT와 비교하여 SARS-CoV-2 스파이크 매개 세포 융합에 대한 더 좋은 억제 효과를 나타낸다.
도 15 a) 인간 폐 세포주 내 스파이크 단백질 프라이밍 프로테아제 유전자 발현의 qPCT 분석. b) 인간 폐 세포주 내 ACE2 유전자 발현의 qPCR 분석(Calu 3 및 A549)은 A549 세포주 내 ACE2의 내인성 발현을 나타내지 않는다. c) 인간 폐 세포주(A549) 대 결장 세포주(Caco2) 내 TMPRSS2 유전자 발현의 qPCR 분석은 A549 세포주 내 TMPRSS2의 내인성 발현을 나타내지 않는다. d)e) 다양한 인간 세포주(조직) 내 스파이크 단백질 프라이밍 프로테아제의 상대적 정량적 qPCR 분석. 분명히, 폐에서 유래한 세포는 각각, Calu3 및 A549 세포 내, 트립신 및 카텝신 B의 가장 높은 카피수를 나타낸다. 특히, 신경조직(SH-SY5Y) 유래 세포는 또한 트립신 및 카텝신 B 모두에 대해 상대적으로 높은 카피수를 나타낸다.
도 16 a) AAT 및 rhAAT 카텝신 B 프로테아제 활성을 억제한다. b) AAT 및 rhAAT는 벡터 pcDNA3.1(+)를 가진 HEK293 세포 내에서 생산된 재조합 AAT(재조합 AAT 4)에 대해 관찰된 가장 뚜렷한 억제 효과와 함께, 카텝신 L 프로테아제 활성을 억제한다. c) AAT 및 rhAAT는 벡터 pcDNA3.1(+)를 가진 HEK293 세포 내에서 생산된 재조합 AAT(재조합 AAT 4)에 대해 관찰된 가장 뚜렷한 억제 효과와 함께, 트립신 프로테아제 활성을 억제한다. d) AAT 및 rhAAT는 벡터 pcDNA3.1(+)를 가진 HEK293 세포 내에서 생산된 재조합 AAT(재조합 AAT 4)에 대해 관찰된 가장 뚜렷한 억제 효과와 함께, 푸린 프로테아제 활성을 억제한다. e) AAT 및 rhAAT는 PC1 프로테아제 활성을 억제한다. f) AAT 및 rhAAT는 TMPRSS2 프로테아제 활성을 억제한다. h) AAT 및 rhAAT는 벡터 pXC17.4를 가진 CHO 세포 내에서 생산된 재조합 AAT(재조합 AAT 1)에 대해 관찰된 가장 뚜렷한 억제 효과와 함께, 엘라스타제 프로테아제 활성을 억제한다. i) AAT 및 rhAAT는 벡터 pcDNA3.1(+)를 가진 HEK293 세포 내에서 생산된 재조합 AAT(재조합 AAT 4)에 대해 관찰된 가장 뚜렷한 억제 효과와 함께, 호중구 엘라스타제 활성을 억제한다.
도 17 Octet 방법을 이용하여 측정된 a) 혈장 유래 AAT 및 b) 재조합 AAT의 결합에 대한 표준 곡선. 상이한 결합 친화도가 벡터 PL136 및 137을 가진 CHO 세포에서 생산된 혈장 유래 AAT 및 재조합 AAT 사이에 관찰된다.
도 18 a) 실험 타임라인의 개략도 b) IFNγ-매개 미세아교세포 활성화(염증).
도 19 a) 실험 타임라인의 개략도 b) AAT는 IFNγ-매개 미세아교세포 활성화(염증)를 감소시킨다. 혈장 유래 AAT, 재조합 AAT(rhAAT) 및 AAT를 발현하는 유전자로 형질도입된 세포(유전자 요법)에 대해 효과가 관찰된다.
도 20 a) 실험 타임라인의 개략도 b) INFβ는 AAT로 얻은 항염증 효과를 향상시킨다.
도 21 a)b) Caco2 인간 결장 선암종 세포 내 MERS-CoV 수도바이러스 진입에 대한 혈장 유래 및 재조합 AAT의 효과 c) Caco2 인간 결장 선암종 세포 내 MERS-CoV 수도바이러스 진입에 대한 다른 세린 프로테아제 억제제의 효과.
도 22 a)b) ACE2 과발현 A549 인간 폐포 기저 상피세포 내 SARS-CoV-2 수도바이러스 진입에 대한 혈장 유래 및 재조합 AAT의 효과 c) ACE2 과발현 A549 인간 폐포 기저 상피세포 내 SARS-CoV-2 수도바이러스 진입에 대한 다른 프로테아제 억제제의 효과.
도 23 a) ADAM17 활성화 및 단백질 쉐딩에 대한 영향 b) 스파이크 단백질/IgG 면역 복합체에 의한 단핵구/대식세포의 활성화에 대한 영향.
도 24 상이한 공급원의 AAT 분자량 차이.
도 25 a) pXC-17.4(Lonza Biologics)의 벡터 지도 b) pJ201_AAT_native_SP(Merck)의 벡터 지도 c) pJ201_AAT_SP5(Merck)의 벡터 지도 d) PL136(Merck)의 벡터 지도 e) PL137(Merck)의 벡터 지도 f) 빈 pCGS3 벡터의 벡터 지도 g) pcDNA3.1(+)(GenScript)의 벡터 지도.
도 26 AAT 친화도의 검출을 위해 개발된 Octet 방법.
모든 도면: "레스피캄"은 혈장 유래 AAT(임상-등급)를 말한다; "시그마"는 혈장 유래 AAT를 말한다; "재조합 AAT 1"은 pXC-17.4(GS System, Lonza)에 의해 CHO 내 생산된 AAT를 말한다, "재조합 AAT 2"는 PL136/PL137(Merck)에 의해 CHO 내 생산된 AAT를 말한다, "재조합 AAT 3"는 HEK293T 내 생산된 AAT를 말한다; "재조합 AAT 4"는 pcDNA3.1(+)(GenScript)에 의해 HEK293 내 생산된 AAT를 말한다.
실시예
재료 및 방법
알파1-항트립신(AAT)에 의한 SARS-CoV-2 감염의 치료
SARS-CoV-2에 대한 AAT의 영향을 두 가지 수준으로 나타낸다:
1. 첫째, 세포 내 SARS-CoV-2의 프로테아제-의존적 진입
2. 둘째, 중증 SARS-CoV-2 질환 내 지나친 염증
중요하게도, 이는 COVID-19(즉, SARS-CoV-2에 의해 유발되는 질환)의 3 단계를 나타낸다:
1. 1단계 COVID-19(SARS-CoV-2에 의해 유발되는 질환, 독감-유사 증상, 보통 일주일 내 사라짐)는 치료를 필요로 하지 않는다.
2. 일반적으로 바이러스 폐렴을 특징으로 하는, 2단계 질환은 병원을 필요로 하고, 항바이러스 치료(즉, 세포 내 SARS-CoV-2 진입의 억제)는 추가 진행을 막기 위해 이 단계에서 주요한 관심사이다.
3. 3단계 COVID 질환은 급성 호흡 곤란 증후군(ARDS) 및 중증 전신 염증을 특징으로 한다; 이 단계는 항-염증성 및 항바이러스 치료를 필요로 한다.
분석에 따르면, AAT는 2단계 및 3단계 COVID-19의 치료에 유용한 반면, 1단계의 2 및 3단계로의 발전을 방지하기 위해 AAT의 예방적 투여가 고려된다.
실시예 1- 세포 내 SARS-CoV-2의 진입
SARS-CoV-2의 진입은 바이러스 스파이크 단백질의 숙주 세포 안지오텐신 전환 효소 2(ACE2) 수용체의 결합에 의해 매개된다. 체외 이러한 생물학적 사건을 재정리하기 위해, 수용체(GFP 또는 루시퍼라제)를 코딩하고 표면에 스파이크 단백질을 발현시키는 렌티벡터가 생성된다. 렌티벡터의 세포 진입은 SARS-CoV-2 메커니즘에 의해 매개되는데, 그 효율성은 표적 세포 내 수용체(GFP 또는 루시퍼라제)의 발현에 의해 측정된다 (Ou, X., Liu, Y., Lei, X. et al. Characterization of spike glycoprotein of SARS-CoV-2 on virus entry and its immune cross-reactivity with SARS-CoV. Nat Commun 11, 1620, 2020). AAT는 GFP 및/또는 루시퍼라제 신호를 판독하여 바이러스 진입에 대한 억제를 정량화하기 위해 추가된다.
막관통 세린 프로테아제 TMPRSS2는 SARS-CoV-2 감염(Toshio Hirano, Masaaki Murakami COVID-19: A New Virus, but a Familiar Receptor and Cytokine Release Syndrome Immunity, 22 April 2020) 및 C형 간염(Esumi M, Ishibashi M, Yamaguchi H, Nakajima S, Tai Y, Kikuta S, Sugitani M, Takayama T, Tahara M, Takeda M, WakitaT- Trans-membrane serine protease TMPRSS2 activates hepatitis C virus infection. Hepatology. 2015 Feb; 61(2):437-46)에 중대하다. C형 간염 감염은 AAT에 의해 차단될 수 있고(presumably through TMPRSS2 inhibition - Esumi et al., 2020), SARS-CoV-2(또한 일부 인플루엔자 바이러스의 고병원성 형태)는 프로테아제 푸린에 의한 절단을 가능하게 하는 서열을 가진다. 이러한 절단 부위는 SARS 및 MERS 코로나바이러스에 존재하지 않으며, 이는 SARS-CoV-2의 병원성에 중요함을 시사한다(B. Coutard, C. Valle, X. de Lamballerie, B. Canard, N.G. Seidah, E. Decroly, The spike glycoprotein of the new coronavirus 2019-nCoV contains a furin-like cleavage site absent in CoV of the same clade, Antiviral Research,Volume 176, 2020). 알파1-항트립신 포틀랜드는 푸린에 강력하고 선택적인 활성을 가진다(Jean F, Stella K, Thomas L, et al. alpha1-Antitrypsin Portland, a bioengineered serpin highly selective for furin: application as an antipathogenic agent. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998;95(13):7293-7298. doi:10.1073/pnas.95.13.7293). 그러므로, 야생형 AAT(혈장 유래) 뿐만 아니라 재조합(포유류 세포, 예를 들어, CHO 및/또는 HEK 세포 내 생산됨)은 푸린 활성을 나타낼 것으로 예상된다.
실험
1.1. 재조합 스파이크 단백질의 세포 절단에 대한 AAT의 영향
재조합 스파이크 단백질은 관련 세포 유형(당업계에 공지된 임의의 ACE2 발현 세포)에 첨가되고, 단백질 절단은 웨스턴 블롯팅으로 평가한다. 임의의 ACE2 발현 세포주가 사용될 수 있다. 다중 표적 세포주는 다양한 양의 ACE2 수용체를 발현시키며, 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다; Calu-3, SH-SY5Y, HEK, HT1080, A549, MRC 5, Huh7, Vero81, VeroE6, Hela, RS 및 LLCMK2.
1.2. 수도바이러스의 진입에 대한 AAT의 영향
SARS-CoV-2 스파이크 단백질을 바이러스 부착/융합 단백질로 사용하는 수도바이러스(즉, 수도형(pseudotyped) 바이러스 벡터)는 SARS-CoV-2의 세포로의 메커니즘을 정확하게 묘사한다. 이러한 진입은 프로테아제 억제제 AAT에 의해 억제되는 두 가지 단백질분해 단계에 의존적이다. 그러므로, 다양한 상이한 세포주, 바람직하게는 ACE2 발현 세포주에서 수도바이러스의 진입이 조사된다.
1.3. 활성 SARS-Co-2(생바이러스 시험)에 의한 세포 감염에 대한 AAT의 영향:
OFSP 권장사항에 따라 생물학적 보안 수준 3에서 조작된 살아있는 SARS-CoV-2 바이러스에 대하여 AAT를 시험하였다. 감소된 세포독성 및 바이러스 역가를 포함하는 효율을 평가하기 위해, 다중 매개변수가 측정됨에 따라, 바이러스는 AAT, 또는 이의 단편, 변이체 및 아이소폼 처리된 세포에 시험관 내에서 접종된다. 보다 구체적으로, SARS-CoV-2의 세포 감염은 바이러스 단백질을 사용한 면역형광법과 세포 사멸의 정량화로 평가된다. SARS-CoV-2가 신경 조직을 감염시키기 때문에(Helms J, Kremer S, Merdji H, et al. Neurologic Features in Severe SARS-CoV-2 Infection [published online ahead of print, 2020 Apr 15]. N Engl J Med. 2020; Pleasure SJ, Green AJ, Josephson SA. The Spectrum of Neurologic Disease in the Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 Pandemic Infection: Neurologists Move to the Frontlines. JAMA Neurol. Published online April 10, 2020), 신경조직(예: Minibrain™) 뿐만 아니라 신경아세포종 세포(SH-SY5Y)의 감염은 AAT와의 공동-처리로 수행되며, 바이러스 세포독성 또는 향성을 변형시킬 것으로 예상된다.
실시예 2 - "사이토카인 폭풍"으로도 알려진 중증 SARS-CoV-2 질환의 과도한 염증, Fu Y, Cheng Y, Wu Y. Understanding SARS-CoV-2-Mediated Inflammatory Responses: From Mechanisms to Potential Therapeutic Tools [published online ahead of print, 2020 Mar 3].　Virol Sin. 2020;1-6. doi:10.1007/s12250-020-00207-4):
SARS-CoV-2 유도 염증의 메커니즘 9 AAT의 활성
급속한 바이러스에 의한 염증
복제 및 세포 손상		 바이러스 진입의 억제
바이러스-유도 ACE2에 의해 유발된 염증
하향조절 및 쉐딩		 ADAM17의 억제
항-스파이크 IgG(항-S-IgG)에 의해 유도된 염증 반응 단백질분해는 항체-의존성 세포독성 및 TNF-cu 방출의 유도와 같은, 단핵구 FcyRJI-매개 기능도 향상시키는 것으로 나타남.
실험
2.1. ADAM17(TACE)의 SARS-CoV-2 활성화: SARS-CoV-2의 ADAM17 활성화 부분
병리학(예를 들어, Vanesa Palau, Marta Riera, Maria Jose Soler, ADAM17 inhibition may exert a protective effect on COVID-19, Nephrology Dialysis Transplantation, , gfaa093, https://doi.org/10.1093/ndt/gfaa093; https://clinicalaffairs.umn.edu/umn-research/regulation-sars-cov-2-receptor-ace2-adam17; Haga S, Yamamoto N, Nakai-Murakami C, et al. Modulation of TNF-alpha-converting enzyme by the spike protein of SARS-CoV and ACE2 induces TNF-alpha production and facilitates viral entry. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008;105(22):7809-7814. doi:10.1073/pnas.0711241105 참조). AAT는 ADAM17을 억제한다(예를 들어, Bergin DA, Reeves EP, Meleady P, et al. α-1 Antitrypsin regulates human neutrophil chemotaxis induced by soluble immune complexes and IL-8. J Clin Invest. 2010;120(12):4236?4250. doi:10.1172/JCI41196; Serban KA, Petrusca DN, Mikosz A, et al. Alpha-1 antitrypsin supplementation improves alveolar macrophages efferocytosis and phagocytosis following cigarette smoke exposure. PLoS One. 2017;12(4):e0176073. Published 2017 Apr 27. doi:10.1371/journal.pone.0176073 참조).
세포의 다음에의 노출 후 ADAM17 활성화 및 단백질 쉐딩(특히, ACE2)에 대한 AAT의 영향을 조사(도 21a):
i) 스파이크 단백질
ii) 수도바이러스
iii) SARS-CoV-2(생바이러스).
사용되는 가장 관련성이 높은 세포는 임의의 ACE2 발현 세포이다(상기 나열된 바와 같음).
2.2. SARS-CoV-2/IgG 면역 복합체에 의한 Fc 수용체의 활성화 (항체-의존성 향상, 예를 들어, F. Negro, Swiss Med Wkly. 2020;150:w20249 "Is antibody-dependent enhancement playing a role in COVID-19 pathogenesis?" 참조). 트립신-유사 프로테아제를 통한 단백질분해는 TNF 방출 유도와 같은, 단핵구 FcyRJI-매개 기능을 향상시킨다(J M　Debets,　J G　Van de Winkel,　J L　Ceuppens,　I E　Dieteren,　W A　Buurman in The Journal of Immunology　February 15, 1990,　144　(4)　1304-1310).
스파이크 단백질/IgG 면역 복합체에 의한 단핵구/대식세포의 활성화에 대한 AAT의 영향 조사(도 23b).
실시예 3 - 바이러스 증식을 감소시키는 AAT 효능을 뒷받침하는 추가 실험
3. 바이러스 폴리머라제 분석
SARAS-CoV-2 바이러스 폴리머라제는 바이러스 유전 물질 복제의 핵심 요소이다. 다중-서브유닛 바이러스 폴리머라제(적어도 3개의 코어 서브유닛 NSP7, NSP8 및 NSP12)를 발현하는 세포-주 세포주는 또한 바이러스 폴리머라제 활성에 의해서만 활성화될 수 있는 루시퍼라제 리포터를 과발현하도록 형질감염된다.
루시퍼라제 리포터 신호는 바이러스 폴리머라제 활성에 비례한다. AAT는 바이러스 폴리머라제 억제 활성을 평가하기 위해 시험된다.
숙주 세포에 진입하면, SARS-CoV-2는 숙주 세포 기계를 사용하여 자체 복제를 강화할 것이다. 이는 NSP1 바이러스 단백질에 의해 필수적으로 매개되는, 숙주 세포에 대한 독성 반응을 유도할 것이다.
이러한 생물학적 사건을 모방하기 위해, 테트라사이클린-유도성 프로모터에 의해 제어되는 바이러스 NSP1 단백질을 발현시키는 세포주가 생성된다. 테트라사이클린으로 세포를 처리한 후, 독성 NSP1 단백질이 발현될 것이다. AAT의 첨가는 바이러스 단백질에 의해 매개되는 이러한 독성 효과를 억제하는 것으로 추정된다.
실험 4
서론
최근 새롭게 등장한 SARS-CoV-2 코로나바이러스로 인한 팬데믹은 전 세계를 놀라게 하였다. SARS 및 MERS와 같은 이전의 코로나바이러스 발병과 달리, 새로운 바이러스는 특별히 높은 치명률이 아니라, 오히려 전례없는 약학적 성공을 특징으로 한다. 그리고 실제로, 이 바이러스는 전 세계 여러 국가에서 엄격한 조치를 취했음에도 불구하고 지금까지 모든 박별시도에 대체로 저항하였다.
SARS-CoV-2는 RNA 바이러스지만, 코로나바이러스는 여러 측면에서 다른 RNA 바이러스와는 다르다. 그들은 큰 게놈과 여전히 잘 이해되지 않는 정교한 수명 주기를 가지고 있다. 또한, 코로나바이러스는 다른 유형의 RNA 바이러스와 비교할 때 상대적으로 안정적인 게놈을 부여하는 교정 장치를 가지고 있다. 그리고 실제로, 팬데믹의 규모를 감안할 때, 지금까지 아미노산 변화로 이어지는 돌연변이는 상대적으로 거의 보고되지 않았다.
스파이크로도 알려진, 코로나바이러스 S 단백질은, 바이러스 외피의 지배적인 단백질이다. 이는 바이러스의 숙주 세포 표면 수용체에의 부착 및 뒤이은 바이러스 및 숙주 세포 막 사이의 융합을 매개하여, 숙주 세포 내 바이러스의 진입을 촉진한다. 이는 2개의 주요 서브유닛, 즉 S1 및 S2로 나누어지는 준안정성 예비-융합 형태로 존재하는 삼량체 클래스 I 융합 단백질이다. 숙주 세포 표면 수용체에 부착하기 위해, S1 도메인 내 함유된 수용체 결합 도메인(RBD)은 두 가지 상이한 상태를 정의하는, 힌지-유사 구조적 변화를 수행한다[1]. 이러한 구조적 변화는 단백질분해 처리 및/또는 S2 도메인과 숙주 세포막의 융합에 필요하다. 현재 PC 계열의 프로테아제, 트립신-유사 프로테아제 및 카텝신을 포함하는 다양한 프로테아제는 스파이크 단백질을 절단할 수 있다고 생각된다[2].
스파이크 단백질 D614G 돌연변이는 잠재적으로 바이러스 부착, 융합원성 및/또는 면역원성을 변경할 수 있기 때문에 주목받았다. D614G 돌연변이는 감염성(ref), 전염성[3] 및/또는 치사율[4]을 증가시키는 것으로 시사되었다. 보다 최근의 연구는 G614 변이체가 실제로 세포로의 바이러스 진입을 향상시킨다는 것을 직접적으로 입증한다[5,6].
SARS-CoV-2는 다중-서브유닛 복제/전사 기계를 사용한다[7]. ORF1a 및 ORF1b 바이러스 폴리단백질의 절단 생성물로 생성된 일련의 비-구조적 단백질(nsp)은 바이러스 복제 및 전사를 촉진하기 위해 조립되어, 이러한 기계를 COVID-19 바이러스 감염에 대한 치료 개입의 잠재적 표적으로 만든다[8]. RNA-의존성 RNA 폴리머라제(RdRp, nsp12로도 알려짐)는 바이러스 RNA의 합성의 핵심 요소이다. 최근 해결된 그의 nsp7 및 nsp8 보조인자와 결합된 SARS-CoV-2 nsp12의 결정 구조는 COVID-19 바이러스의 복제 및 전사 주기에서 이러한 비-구조적 단백질이 가지는 중심 역할을 강조한다[8,9]. RdRp의 P314L 돌연변이는 주목을 덜 받았지만, 이러한 돌연변이가 바이러스 증거 판독을 변경하여 다운스트림 돌연변이 비율을 증가시킬 수 있다고 시사되었다[10].
본 연구에서, S 단백질과 RdR-폴리머라제에 수반되는 돌연변이가 있는 SARS-CoV-2 변이체의 출현을 조사한다. 두 돌연변이는 각각의 단백질의 전략적 관련 위치에 있으므로, 바이러스의 생물학을 변경하기 위한 후보이다. 개별 G624 또는 L323 변이체가 아닌, G624/323 변이체는 역학적으로 매우 성공적이며, 지난 몇달 동안 원래 D624/P323 변이체를 대체하였다.
방법:
세포주 및 배양
연구에 사용된 인간 세포주는 HEK 293T/17(인간 신장, ATC C#CRL-11268), A549, HeLa 및 HMC3-MHCIILuc 세포였다. 주요 조직적합성 복합체 II 프로모터(major histocompatibility complex II promoter, MHCII) 하에서 루시퍼라제 리포터를 코딩하는 HMC3-MHCIILuc 세포주는 인간 미세아교세포 활성화를 연구하는 유용한 도구로 기술되었으며, 제네바 대학의 칼-하인츠 크라우제(Karl-Heinz Krause) 교수로부터 입수하였다. HMC3-MHCIILuc 세포는 렌티바이러스 벡터로 형질도입되어, AAT-생산 HMC3-MHCIILuc;UbiAAT 세포주를 얻었다(렌티바이러스 생산 참조). 세포는 10%(ㅍ/v) 태아소혈청(FBS), 100 μg/ml 페니실린 및 스트렙토마이신, 2 mM l-글루타민, 1 mM 피루브산 나트륨 및 1% 비필수 아미노산이 보충된 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco modified Eagle medium, DMEM)에 유지하였다. HMC3 세포주는 비필수 아미노산을 첨가하지 않았다. 배양액은 5% CO2 대기 하에서 37℃로 유지되었다.
스파이크 융합 분석.
적합한 농도의 처리를 배양 배지에 미리 희석하였다. 이 혼합물의 상단에 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 및 큰 비트 분할-루시퍼라제(Largebit split-luciferase) 단편을 안정적으로 과발현하는 HeLa 세포주와 함께, 인간 ACE2 수용체와 작은 비트 분할-루시퍼라제(Smallbit split-luciferase) 단편을 안정적으로 과발현하는 HeLa 세포주를 첨가하고, 27℃에서 24시간 동안 배양하였다. ACE2 및 SARS-CoV-2 스파이크 사이의 상호작용은 두 세포주의 융합을 매개하고, 따라서 기능성 루시퍼라제로 이어지는 큰 비트 및 작은 비트 분할 루시퍼라제 단편 사이의 상호작용이다. 제조자의 지시에 따라 나노글로(Nanoglo) 키트(Promega)를 사용하여 발광을 측정하였다.
ACE2 및 TMPRSS2를 발현시키는 세포주의 생성.
Hela 및 A549 세포를 12 웰 플레이트에 웰 당 2E05 세포의 밀도로 플레이팅하였다. 그 다음날 세포를 ACE2/퓨로마이신 및/또는 TMPRSS2/블라스티시딘 렌티바이러스로 형질도입하였다. 형질도입 4일 후, 5 μg/ml의 블라스티시딘 및 퓨로마이신으로 세포를 선택하였따. 세포는 다클론 집단으로 유지되었다.
플라스미드
ACE2 및 TMPRSS2 cDNA ORF는 GenScript에서 구입하였고, 표준 클로닝 방법을 사용하여, 각각 pCDH-CMV-MCS-EF1α-Puro(서열번호 13) 및 pCDH-CMV-MCS-EF1α-Blast(서열번호 14)로 클로닝하였다. SARS-CoV-2-스파이크 단백질을 암호화하는 pCG1_SCoV2-S 플라스미드(서열번호 15)는 스테판 폴만 교수(University Gottingen, Gottingen, Germany)에게 제공받았다. G614 스파이크는 다음의 프라이머로 부위-지정 돌연변이유발을 이용하여 클로닝되었다: 5’-GCGTGAACTGTACCGAAGTG-3’(서열번호 16) 및 5’-CCTGGTACAGCACTGCC-3’(서열번호 17). SARS-CoV-2-스파이크의 C-말단 19개 아미노산 절단 버전은 프라이머 5’-AGCGAATTCGGATCCGCC-3’(서열번호 18) and 5’-ACAGTCGACTCTAGATTAGCAGCAGCTGCCACAG-3’(서열번호 19)를 이용한 PCR 증폭, 뒤이은 pCG1 플라스미드로의 클로닝에 의해 생성된다.
HEK293T 세포 내 생산된 AAT 정제
인간 AAT-His 태그를 과발현하는 HEK293T 세포의 상청액을 샘플링하고 Ni 세파로오스(Sepharose) 엑셀 히스티딘-태그 단백질 정제 수지(Cytiva)와 함께 진탕하면서 4℃에서 밤새 배양하였다. 상청액:수지의 부피비는 200:1이다. 그 다음 상청액을 버리고, 비드를 인산 완충 식염수(PBS)로 한 번 세척하였다. 10%(v/v) 용출 버퍼(500mM 이미다졸이 보충된 PBS, pH 7.5)로 한 번, 및 20% 용출 버퍼로 보충된 PBS로 한 번 세척하였다. 최종적으로, 정제된 AAT-His-태그는 100% 용출 버퍼로 용출되었다. 이미다졸을 투석으로 제거하여 PBS 버퍼 내 AAT-His를 얻었다.
렌티바이러스 생산
재조합-렌티바이러스 생산을 위해, 플라스미드를 인산칼슘 방법을 이용하여 HEK293T 세포에 형질감염시켰다. 간략히, 4.5x106 세포를 10-cm 디쉬에 플레이팅하고, 15 μg의 ACE2, TMPRSS2, AAT 또는 빈-발현 렌티바이러스 벡터, 10 μg의 패키징 플라스미드(psPAX2, 디디에 트로노(Didier Trono)의 선물[Addgene plasmid 12260]) 및 5 μg의 외피(pMD2G, 디디에 트로노의 선물[Addgene plasmid 12259]) 중 하나로 16시간 후에 형질감염시켰다. 형질감염 8시간 후 배지를 교체하였다. 48시간 후, 바이러스 상청액을 수집하고, 45 μm PVDF 필터를 사용하여 여과하고, -80℃에 보관하였다.
코로나바이러스 스파이크 수도형 렌티바이러스 생산
스파이크-수도형 렌티바이러스를 상기한 바와 같은 인산칼슘 방법을 이용하여, psPAX2, pCDH-CMV-Gluc-EF1α- GFP, 및 SARS-CoV-2 스파이크 D614 전장(FL)(서열번호 15), 스파이크 G614 전장(FL)(서열번호 20), 스파이크 D614 DeltaCter(서열번호 21), 스파이크 G614 DeltaCter(서열번호 22), SARS-CoV 스파이크(Sino Biological Europe GmbH, 카탈로그 번호: VG40150-G-N), MERS-CoV 스파이크(Sino Biological Europe GmbH, 카탈로그 번호: VG40069-G-N) 또는 빈 벡터(서열번호 23)로 293T 세포를 공동-형질감염시켜 생산하였다.
코로나바이러스 스파이크 수도형 렌티바이러스 감염성 분석
인간 ACE2 수용체를 안정적으로 과발현하는 HeLa, 인간 ACE2 수용체를 안정적으로 과발현하는 A549 세포 또는 Caco2 세포를 96-웰 플레이트에 시딩하였다. 플레이팅 3시간 후, 실험 설정에 따라, 화합물 처리를 수행하거나 생략하였다. 24시간 후, 세포를 코로나바이러스 수도바이러스로 6시간 동안 형질도입하였다. 그 다음, 배양 배지를 교체하고, 세포를 37℃에서 유지하였다. 3일 배양 후, 10uL 세포 상청액을 4 μM 코엘렌테라진이 보충된 50uL의 인산 완충 식염수[PBS]에 첨가하고, 즉시 광도계(Glomax; Promega)로 발광을 측정하여, 가우시아(Gaussia) 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 동시에, 세포를 트립신처리하고, 10% FBS가 보충된 PBS에 재현탁시키고, Attune NxT 유세포분석기(thermofisher Scientific)를 사용한 유세포분석에 의해 분석하였다. FlowJo 11(FlowJo, LLC, Ashland, OR)을 이용하여 데이터를 분석하였다.
무세포 분석(스파이크 단백질 프라이밍 프로테아제 억제)
트립신(Sigma-Aldrich)의 경우 100ul, 카텝신 B(R&D Systems)의 경우 75ul, 및 PC1(R&D Systems), 마트립타제(R&D Systems), 푸린(NEB), 카텝신 L(R&D Systems) 및 TMPRSS2(creative biomart)의 경우 50ul에서 반응을 수행하였다. 버퍼은 트립신의 경우 PBS pH 7.4(6.4nM로 희석) ; 카텝신 B의 경우 25 mM MES, pH 5 (1.76ng/ul로 희석); PC1의 경우 25 mM MES, 5 mM CaCl2, 1% Brij-35, pH(1.76ng/ul로 희석); 마트립타제의 경우 50 mM Tris, 50 mM NaCl, 0.01% Tween 20, pH 9(1.76 ng/ul로 희석); 푸린의 경우 100 mM HEPES, 1 mM CaCl2, 0.5% Triton X100, 1 mM 2-메르캅토에탄올, pH 7.5(10U/ml로 희석); 카텝신 L의 경우 0.005% Brij-35, 1 mM EDTA, 5 mM DTT, 50 mM MES, pH 6(1.76ng/ul로 희석); TMPRSS2의 경우 50 mM TrisHCl, 150 mM NaCl, 0.01% tween 20, pH 8(0.5uM로 희석)로 구성된다. 지정되지 않는 한, 모든 시약은 시그마 알드리치(Sigma Aldrich)에서 제공받았다. 트립신, 카텝신 B, PC1, 마트립타제, 푸린, 카텝신 L 분석을 위해, MCA/Lys (DNP) FRET 쌍(Biomatik)이 변형된 TNSPRRARSVA 서열로 구성된 SARS-CoV-2 펩티드를 사용하였다. TMPRSS2 분석을 위해, Boc-QAR-AMC(R&D Systems) 서열로 구성된 펩티드를 사용하였다. 돼지 췌장의 엘라스타제 ELA1의 경우, 분석 키트(E-12056)를 분자 프로브(Sigma-Aldrich)에서 구입하였고, 호중구 엘라스타제 ELA2의 경우, 분석 키트(BML-AK497)를 Enzo에서 구입하였으며, 제조자의 지시에 따라 시험을 수행하였다. 형광 또는 흡광도를 플레이트 판독기에서 45분 동안 매분 측정하였다. 분당 형광 단위로 각 조건에 대해 Vmax를 결정하였고, 효소 활성은 비처리 조건의 백분율로 표시된다.
유전자 발현 분석
제조사의 지시에 따라, RNeasy Micro Kit(Qiagen)를 이용하여 전체 RNA를 분리하였다. 각 샘플의 전체 RNA 500ng을 총 부피 10 μl로, 37℃에서 15분 동안, Takara의 Primescript 키트로 역전사시켰다. 상대적인 mRNA 수준을 2 델타 Ct 방법에 의해 SYBR Green PCR 키트(Applied Biosystems)를 이용한 정량적 RT-qPCR로 평가하였다. GAPDH를 내부 대조군으로 사용하였다.
유전자 카피수 추정
카피수에 대해, 제한 효소 소화를 이용하여 각각의 특정 플라스미드의 선형화를 수행하였다. 소화의 산물을 제조사의 지시에 따라 PCR 클린업 키트(GeneHET)를 사용하여 세척하였다. 그 다음, 광학 밀도를 측정하고 카피수를 확인하였다. 소화된 플라스미드로부터의 1/10의 연속 희석액을 qPCR에 사용하였다.
푸린, 카텝신 L, 마트립타제(stl4), 트립신(PRSS1), PC1(PCSK1)에 대한 플라스미드는 GenScript에서 제공받았고, 카텝신 B에 대한 플라스미드는 Sino Biological에서 제공받았다.
프라이머
유전자 올리고 서열(5'에서 3')
푸린 정방향 GGAACATGACAGCTGCAACT
(서열번호 32)
푸린 역방향 TCGTCACGATCTGCTTCTCA
(서열번호 33)
카텝신 L 정방향 TAGAGGCACAGTGGACCAAG
(서열번호 34)
카텝신 L 역방향 ATGGCCATTGTGAAGCTGTG
(서열번호 35)
카텝신 B 정방향 TCTCTGACCGGATCTGCATC
(서열번호 36)
카텝신 B 역방향 TCACAGGGAGGGATGGAGTA
(서열번호 37)
PC1 정방향 GCGTGCCTGAGAAGAAAGAG
(서열번호 38)
PC1 역방향 ATCCCGTTCTCTTTCAGCCA
(서열번호 39)
트립신 정방향 AAGTGTGAAGCCTCCTACCC
(서열번호 40)
트립신 역방향 GGTGTAGACTCCAGGCTTGT
(서열번호 41)
마트립타제 정방향 CCCAACAACCAGCATGTGAA
(서열번호 42)
마트립타제 역방향 ACTGGAGTCGTAGGAGAGGT
(서열번호 43)
마트립타제 정방향 AGAACGTCCTGCTCATCACA
(서열번호 44)
마트립타제 역방향 TGTGCAGTCAATGTTGGGTG
(서열번호 45)
결과: 수도형 렌티벡터를 이용한 세포 형질도입에 대한 S 단백질 D614G 돌연변이의 영향
바이러스 수용체 ACE2, 뿐만 아니라 스파이크 단백질을 절단할 수 있는 관련 프로테아제를 일관되게 발현하는 세포주를 확립하는 것을 목표로 하였다. 도 3A 및 B에서 볼 수 있듯이, Hela 세포도, A549 세포도 관련 양의 ACE2 mRNA를 발현하지 않았다. 마찬가지로, TMPRSS2의 mRNA 수준은 거의 검출할 수 없었다. 두 세포 유형 모두 푸린의 유전자 발현은 낮거나 중간이지만, 카텝신 L(SARS-CoV-1 및 SARS-CoV-2 모두에서 스파이크 단백질을 절단할 수 있는 프로테아제)의 유전자 발현은 상대적으로 높은 것으로 나타났다. 스파이크 단백질 수도형 렌티벡터에 허용되는 세포주를 확립하기 위해, 그러므로 Hela 세포 및 A549 세포를 개별적으로 또는 ACE2(서열번호 24) 및 TMPRSS2(서열번호 25)와 조합하여 형질도입하였다.
예상대로, 야생형(모의(mock)-형질도입된) Hela 세포 또는 A549 세포의 상술한 렌티벡터에의 노출은 GFP 또는 루시퍼라제 발현(도 3c-f)으로 이어지지 않았다. 마찬가지로, TMPRSS2 자체의 과발현은 유의한 형질도입률을 초래하지 않았다. D614 수도형 렌티벡터를 이용하여, ACE2 및 ACE2/TMPRSS2-발현 Hela 세포의 작지만 명확히 검출할 수 있는 형질도입이 있었지만, A549 세포의 형질도입은 매우 적었다. 이는 G614 수도형 벡터를 사용하였을 때 현저히 변경되었다. 두 ACE2-발현 주 모두에서 훨씬 더 강한 형질도입이 있었다. 그러나, ACE2-발현 HeLa 세포의 형질도입은 ACE2-발현 A549 세포 중 하나 보다 훨씬 더 강하다는 점에 유의해야 한다. 반대로, ACE2에 더하여 TMRPSS2의 과발현은 Hela 세포에 대한 경우가 아닌, 형질도입의 강력한 추가 향상으로 이어진다. 따라서, 대부분의 Hela 세포는 스파이크 절단 프로테아제를 이미 강력히 발현하고 있으며, 효율적인 형질도입을 위해 TMRPSS2의 과발현이 요구되지 않는다. 대조적으로, A549 세포에서, 단백질분해 절단은 속도-제한 단계인 것으로 보이며, 따라서 TMRPSS2의 과발현은 형질도입을 향상시킨다.
토론(바이러스 감염에 대한 HeLa 대 A549 세포주 민감성)
SARS-CoV-2 수도바이러스 감염에 대한 하나의 세포주(HeLa, 자궁경부, 여성, 아프리카계 미국인 기원)의 증가된 민감성은, 환자 모집단의 특성화가 COVID-19 진단을 받거나 예방 목적으로 환자에게 최대의 영향을 미치도록 맞춤화된 치료 전략을 결정하는데 핵심요소라는 개념의 기초가 되므로, 또 다른 세포주(A549, 폐, 남성, 백인 기원)에 비해 특히 흥미로운 관찰이다. 인종 자체가 고려해야 할 이차적인 역할을 할 수 있지만, 낮은 내인성 AAT 또는 더 높은 수준의 만성 염증(더 높은 IFN-γ 및/또는 카텝신 L)에 대한 유전적 소인은 예를 들어, 활성 치료 물질(AAT)의 더 높은 용량 및/또는 더 정기적인 투여를 필요로 한다.
실험 4
상이한 세포주에서 ACE2 및 TMPRSS2 유전자 발현의 내인성 수준을 검출하는 것을 목표로 하였다.
방법: RNeasy Micro Kit(Qiagen)를 이용하여 Calu3, CaCo2, VeroE6, HepG2, A549, SH-SY5Y, HEK293-117T, HeLa 세포주로부터 전체 RNA를 추출하였다. PrimeScript™ RT Reagent 키트(Takara)를 이용하여 전체 RNA로부터 상보적 DNA를 합성하였다. cDNA의 실시간 PCR 측정은 PowerUp SYBR™ Green Master Mix(Applied Biosystems)를 이용하여 수행하였고, 대조군 하우스키핑 유전자로서 GAPDH의 발현에 대해 정상화하였다. 프라이머는 하기에 열거한다:
ACE2 정방향: cattggagcaagtgttggatctt (서열번호 26)
ACE2 역방향: gagctaatgcatgccattctca (서열번호 27)
TMPRSS2 정방향: cacggactggatttatcgacaa (서열번호 28)
TMPRSS2 역방향: cgtcaaggacgaagaccatgt (서열번호 29)
GAPDH 정방향: gcacaagaggaagagagagacc (서열번호 30)
GAPDH 역방향: aggggagattcagtgtggtg (서열번호 31)
결과는 도3에 나타낸다.
실험 5
인터페론 감마 처리가 A549 세포주 내 ACE2 발현을 유도하는지 여부를 확인하는 것을 목표로 하였다.
프로토콜: A549 세포를 12 웰 플레이트에 시딩하고, 세포 분할 24시간 후에인터페론 감마의 첨가를 수행하였다. 처리는 48시간 동안 지속되었고, 전술된 바와 같이 RNA 추출, 역전사효소 반응 및 qPCR을 수행하였다(실험 4의 방법 부분 참조).
결과는 도 4에 나타낸다.
실험 6
인터페론 감마가 SARS-CoV-2 융합 단백질을 발현하는 HeLa 세포 내 ACE2 발현을 유도하는지 여부를 확인하는 것을 목표로 하였다.
프로토콜: HeLa 스파이크 세포를 12 웰 플레이트에 시딩하고, 세포 분할 24시간 후에인터페론 감마의 첨가를 수행하였다. 처리는 48시간 동안 지속되었고, 전술된 바와 같이 RNA 추출, 역전사효소 반응 및 qPCR을 수행하였다(실험 4의 방법 부분 참조).
결과는 도 5에 나타낸다.
실험 7: SARS-CoV-2 바이러스 진입 분석
결과는 도 7 및 8에 나타낸다. 루시퍼라제 리포터를 코딩하는 D614G 돌연변이가 있는 표면 단백질 SARS-CoV-2 스파이크를 발현하는 수도렌티벡터로 수행하였다(도 7 및 8).
수도렌티벡터는 ACE2 수용체(도 7) 또는 ACE2 및 TMPRRS2 모두(도 8)를 구성적으로 과발현하는 A549 세포에 첨가된다. 화합물 처리는 수도렌티벡터의 첨가 24시간(패널 A&B) 또는 1시간(패널 C&D) 전에 수행된다. 수도바이러스 분석 프로토콜에 대한 추가 도식 정보는 도 9 및 10에 제공된다.
실시예 4
ACE2(도 11 및 22) 또는 Caco2 인간 결장 선암종(도 21)을 과발현하는 A549 인간 폐포 기저 상피세포를 사용한 바이러스 진입 억제 시험을 다양한 공급원의 AAT(도 11a, 11b, 21a, 21b, 22a, 22b)로 또는 억제제 화합물(도 11c, 21c, 22c)로 24시간 동안 처리하였다. 그 다음, 루시퍼라제 리포터를 코딩하고 D614G 돌연변이가 있는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질(도 11), SARS-CoV 스파이크 단백질(도 22) 또는 MERS-CoV 스파이크 단백질(도 21)을 발현하는 렌티벡터를 6시간 동안 첨가하였다. 최종적으로, 배양 배지를 교체하고, 세포를 측정 전 추가로 3일 동안 배양하였다. 바이러스 진입을 렌티바이러스-매개 루시퍼라제 신호(도 11, 21, 22 진회색)로 측정하였고, 연회색으로 표시된 WST8-세포 생존능으로 정상화되었다. 모든 조건에 대해, DMSO/PBS의 농도를 정상화하였다(버퍼). 모든 조건은 3중으로 수행되었으며, 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 기술 정보는 재료 및 방법 부분을 참조한다.
실시예 5
ACE2를 과발현하는 HeLa 인간 자궁경부암 세포를 사용한 바이러스 진입 억제 시험을 다양한 공급원의 AAT(도 12a, 12b)로 또는 억제제 화합물(도 12c)로 24시간 동안 처리하였다. 그 다음, 루시퍼라제 리포터를 코딩하고 D614G 돌연변이가 있는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질을 발현하는 렌티벡터를 6시간 동안 첨가하였다. 최종적으로, 배양 배지를 교체하고, 세포를 측정 전 추가로 3일 동안 배양하였다. 바이러스 진입을 렌티바이러스-매개 루시퍼라제 신호(진회색)로 측정하였고, 연회색으로 표시된 WST8-세포 생존능으로 정상화되었다. 모든 조건에 대해, DMSO/PBS 의 농도를 정상화하였다(버퍼). 모든 조건은 3중으로 수행되었으며, 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 기술 정보는 재료 및 방법 부분을 참조한다.
실시예 6
SARS-CoV-2 스파이크 융합 분석. 시험의 원리는 도 13에 설명된다. ACE2 및 작은 비트 루시퍼라제 또는 SARS-CoV-2 스파이크 및 큰 비트 루시퍼라제를 과발현하는 HeLa 인간 자궁경부암 세포를 적절한 처리 농도로 동일한 수로 혼합하였다. 24시간 후, 루시퍼라제 리포터 신호의 양으로 세포 융합을 측정하였다. 루시퍼라제 신호는 버퍼 대조군의 기능에서 관찰된다. Sera를 1/16의 최종 농도로 희석되었다. 모든 조건에 대해, Sera/PBS의 농도는 정상화되었다(버퍼). 모든 조건은 3중으로 수행되었으며, 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다(도 14). 기술 정보는 재료 및 방법 부분을 참조한다.
실시예 7
A549 세포 내 프로테아제의 유전자 카피수를 확인하기 위하여, 정량적 PCR 분석을 수행하였다. 각각의 유전자에 대해 선형 플라스미드를 대조군으로서 사용하여 카피수를 계산하였다(도 15a). 기술 정보는 재료 및 방법 부분을 참조한다.
실시예 8
A549 세포 내 프로테아제 ACE2(도 15b) 및 TMPRSS2(도 15c)의 상대적인 유전자 발현을 확인하기 위하여, 정량적 PCR 분석을 수행하였다. Calu3 및 Caco2 세포주를 각각 ACE2 및 TMPRSS2 발현에 대한 기준으로 사용하였다. Gapdh 유전자를 정상화를 위해 사용하였다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 기술 정보는 재료 및 방법 부분을 참조한다.
실시예 9
SARS-CoV-2 펩티드 50uM, 카텝신 B 재조합 단백질 1.76ng/ul 및 1uM의 AAT를 45분 동안 함께 배양하였다. UV 분광광도계(330nm에서 여기 및 390nm에서 방출 감지)에서 매분 형광을 측정하였다(도 16a). Vmax 값은 추세선의 기울기로 결정되었다. 실험은 이중으로 수행되었다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 기술 정보는 재료 및 방법 부분을 참조한다.
실시예 10
SARS-CoV-2 펩티드 50uM, 카텝신 L 재조합 단백질 1.76ng/ul 및 10uM의 AAT를 45분 동안 함께 배양하였다. UV 분광광도계(330nm에서 여기 및 390nm에서 방출 감지)에서 매분 형광을 측정하였다(도 16b). Vmax 값은 추세선의 기울기로 결정되었다. 실험은 이중으로 수행되었다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 기술 정보는 재료 및 방법 부분을 참조한다.
실시예 11
SARS-CoV-2 펩티드 50uM, 트립신 재조합 단백질 6.4nM 및 두 가지 농도의 AAT(0.1 uM 및 1 uM)를 45분 동안 함께 배양하였다. UV 분광광도계(330nm에서 여기 및 390nm에서 방출 감지)에서 매분 형광을 측정하였다(도 16c). Vmax 값은 추세선의 기울기로 결정되었다. 실험은 이중으로 수행되었다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 기술 정보는 재료 및 방법 부분을 참조한다.
실시예 12
SARS-CoV-2 펩티드 50uM, 푸린 재조합 단백질 10U/ml 및 1uM의 AAT를 45분 동안 함께 배양하였다. UV 분광광도계(330nm에서 여기 및 390nm에서 방출 감지)에서 매분 형광을 측정하였다(도 16d). Vmax 값은 추세선의 기울기로 결정되었다. 실험은 이중으로 수행되었다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 기술 정보는 재료 및 방법 부분을 참조한다.
실시예 13
SARS-CoV-2 펩티드 50uM, PC1 재조합 단백질 1.76ng/ul 및 몇 가지 농도의 AAT(1uM, 10uM, 40uM 및 100uM)를 45분 동안 함께 배양하였다. UV 분광광도계(330nm에서 여기 및 390nm에서 방출 감지)에서 매분 형광을 측정하였다(도 16e). Vmax 값은 추세선의 기울기로 결정되었다. 실험은 이중으로 수행되었다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 기술 정보는 재료 및 방법 부분을 참조한다.
실시예 14
SARS-CoV-2 펩티드 50uM, 마트립타제 재조합 단백질 1.76ng/ul 및 몇 가지 농도의 AAT(1uM, 10uM, 40uM 및 100uM)를 45분 동안 함께 배양하였다. UV 분광광도계(330nm에서 여기 및 390nm에서 방출 감지)에서 매분 형광을 측정하였다(도 16f). Vmax 값은 추세선의 기울기로 결정되었다. 실험은 이중으로 수행되었다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 기술 정보는 재료 및 방법 부분을 참조한다.
실시예 15
AAT는 TMPRSS2 프로테아제 활성을 억제한다. Boc-QAR-AMC 펩티드 30 uM, TMPRSS2 재조합 단백질 0.5 uM 및 AAT 5 uM를 45분 동안 함께 배양하였다. UV 분광광도계(380nm에서 여기 및 460nm에서 방출 감지)에서 매분 형광을 측정하였다(도 16g). Vmax 값은 추세선의 기울기로 결정되었다. 실험은 이중으로 수행되었다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 기술 정보는 재료 및 방법 부분을 참조한다.
실시예 16
DQ™ 엘라스틴 기질 25ug/mL, 돼지 췌장 유래 엘라스타제(ELA1) 0.25U/mL 및 몇 가지 농도의 AAT(l0 nM, 50nM 및 l00 nM)를 45분 동안 함께 배양하였다. 형광 판독기(485nm에서 여기 및 530nm에서 방출 감지)에서 매분 형광을 측정하였다(도 16h). Vmax 값은 추세선의 기울기로 결정되었다. 실험은 이중으로 수행되었다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 기술 정보는 재료 및 방법 부분을 참조한다.
실시예 17
기질 MeOSuc-AAPV-pNA l00 uM, 정제된 인간 호중구 엘라스타제(ELA2) 2.2uU/ul 및 몇 가지 농도의 AAT(1 nM 및 l0 nM)를 45분 동안 함께 배양하였다. UV 분광광도계 판독기(A405nm)에서 매분 흡광도를 측정하였다(도 16i). Vmax 값은 20q분 동안의 추세선의 기울기로 결정되었다. 이는 이중으로 수행되었다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. 기술 정보는 재료 및 방법 부분을 참조한다.
실시예 18
역가 측정은 도 26에 설명된 바와 같은 Octet RED(Sartorius, Octet RED96) 방법, 단백질 A 바이오센서(Sartorius, Ref 18-5010; 18-5012), Mouse Mc anti hAAT IgG2A(abcam, ab116604), 정상화 버퍼(MBD; 0,02% Tween 20, 150mM, NaCl,1mg/mL BSA, PBS1X) 및 재생 버퍼(MBD; 10mM Glycine- HCL (pH2)) 결합을 이용하여 수행하였다. 혈장 유래 AAT(Sigma-Aldrich, SRP6312) 및 PL136/PL137 풀에 의해 CHO에서 생산된 재조합 AAT 사이의 비교(도 17).
Figure pct00001
실시예 19
인간 미세아교세포 HMC3-MHCIILuc 세포를 0일에 플레이팅하고, 1일에서 2일까지 IFNγ로 활성화하고, 루시퍼라제 활성 및 세포 생존능의 측정을 4일차에 수행하였다(도 18a). 활성화는 MHCII-구동(driven) 루시퍼라제의 활성에 의해 측정하고 세포 생존능에 대해 정상화되었다. 모든 조건에 대한 루시퍼라제 활성은 미처리 세포 대조군의 배수로 표시된다(도 18b). 모든 조건은 3중으로 수행하였고, 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
실시예 20
인간 미세아교세포 HMC3-MHCIILuc 및 HMC3-MHCIILuc;UbiAAT 세포를 0일에 플레이팅하고, 1일에서 2일까지 IFNγ로 활성화하고, 루시퍼라제 활성 및 세포 생존능의 측정을 4일차에 수행하였다. 혈장-유래 AAT를 HMC3-MHCIILuc 세포에 대해 0일에서 4일까지 적용하였다(도 19a). 활성화는 MHCII-구동(driven) 루시퍼라제의 활성에 의해 측정하고 세포 생존능에 대해 정상화되었다. 모든 조건에 대한 루시퍼라제 활성은 IFNγ-활성화 대조군의 백분율로 표시된다(도 19b). 모든 조건은 3중으로 수행하였고, 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
실시예 21
인간 미세아교세포 HMC3-MHCIILuc 세포를 0일에 플레이팅하고, 1일에서 2일까지 IFNγ 및/또는 IFNβ에 노출시키고, 루시퍼라제 활성 및 세포 생존능의 측정을 4일차에 수행하였다. 혈장-유래 AAT를 HMC3-MHCIILuc 세포에 대해 0일에서 4일까지 적용하였다(도 20a). 활성화는 MHCII-구동(driven) 루시퍼라제의 활성에 의해 측정하고 세포 생존능에 대해 정상화되었다. 모든 조건에 대한 루시퍼라제 활성은 IFNγ-활성화 대조군의 백분율로 표시된다(도 20b). 혈장-유래 AAT(1, 10, 25 μM) 막대는 비교 목적으로 실시예 2-을 반복한 것이다. 모든 조건은 3중으로 수행하였고, 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
실시예 22
쿠마시 도면 범례: 다중 공급원의 AAT를 이용한 쿠마시-염색된 SDS-PAGE. NuPage 4x LDS 샘플 버퍼(Life Technologies) 및 NuPage 10x 샘플 환원제(Life Technologies)와 혼합하여 환원된 샘플을 분석을 위해 제조하고, 70℃에서 10분 동안 배양하였다. 비-환원 샘플의 경우, 환원제 및 열 배양이 생략되었다. 레인 당 5ug의 단백질이 로딩되었다. 샘플을 TGS 버퍼와 함께 4-20% Mini- PROTEAN® Precast Gels(BioRad)에서 전기영동하였다. 그 다음, 젤을 고정 버퍼(50% 메탄올 + 10% 아세트산 + 40% H2O)에서 실온에서 30분 동안 고정시켰다. 쿠마시 블루(Sigma Aldrich)를 0.25%의 최종 농도로 첨가하고, 추가 15분 동안 배양하였다. 최종적으로, 고정 버퍼의 다중 세척에서 겔을 밤새 탈염색하고, G:Box 이미저(Syngene)에서 이미지화하였다(도 24).
실시예 23
HEK293 세포 내 재조합 인간 AAT의 발현. HEK293에 대해 서열번호 46 또는 HEK293T에 대해 서열번호 47에 기반함. HEK293에 대해, SERPINA1_OHu22141C_pcDNA3.1(+) 플라스미드를 함유하는 rhAAT 발현 클론을 도 25g의 벡터로부터 생성하였다. 플라스미드-함유 클론은 서열 검증되고, HEK293 세포(ATCC, Catalog# CRL-1573)의 형질감염을 위해 충분한 양의 플라스미드를 제조하였다. HEK293 세포를 플라스미드로 형질감염시키고, rhAAT 발현 및 3 세트의 6-웰 플레이트 내 배양액으로의 분비는 상업적으로 이용가능한 ELISA 키트(Thermo Fischer Scientific, Catalog# EH411RBX5)를 이용하여 확인하였다. pCMV-Td Tomato 및 EGFP 형광 마커로 형질감염된 세포 뿐만 아니라 모의 형질감염 세포를 대조군으로 사용하였다.
rhAAT HEK293 세포를 생성하기 위해 사용된 중요 재료 및 시약
Figure pct00002
Figure pct00003
절차
HEK293 세포 내 rhAAT의 생산은 두 단계로 실행되었다:
1. rhAAT 발현 세포의 준비
2. rhAAT의 생산
rhAAT 발현 세포의 준비
- 사전 발현(expression-ready) 플라스미드의 구축 및 검증
- 숙주 세포의 형질감염
- rhAAT-발현 (안정적) 풀의 생성
- 클론 선택
사전 발현 플라스미드의 구축 및 검증
서열번호 46에 나타낸 서열을 기반으로, SERPINA1_OHu22141C_pcDNA3.1(+) 플라스미드를 함유하는 rhAAT 발현 클론을 Genscript Biotech Corporation (Piscataway, NJ)에서 제조하였다.
플라스미드-함유 클론을 HEK293 세포의 형질감염을 위해 충분한 양의 플라스미드의 서열 검증 및 제조를 위해 RTI International(Research Triangle Park, NC)로 수송하였다.
숙주 세포의 일시적 형질감염
HEK293 세포를 SERPINA1_OHu22141C_pcDNA3.1(+) 플라스미드로 형질감염시키고, 3 세트의 6-웰 플레이트 내 배양액으로의 rhAAT 발현 및 분비를 상업적으로 이용가능한 ELISA 키트를 이용하여 확인하였다. pCMV-Td Tomato 및 EGFP 형광 마커로 형질감염된 세포 뿐만 아니라 모의 형질감염 세포를 대조군으로 사용하였다.
웰 당 실험 당 시약 및 플라스미드 DNA의 양
Figure pct00004
rhAAT-발현 (안정적) 풀의 생성
성공적인 일시적 형질감염이 확인되면, 항생제 선택에 의해 T-150에서 안정한 풀의 생성을 수행하였다. 플라스미드가 없는 세포를 제거하기 위하여 항생제 선택 하에 최대 2주 동안 세포를 유지시켰다. 그 후, 배양 상청액을 ELISA를 이용하여 단백질 발현에 대해 시험하였다.
추가 세포 확장 및 rhAAT 생산을 위해 진동 플라스크에 옮기기 전에, 풀링된 세포를 80℃에서 동결시켰다.
클론 선택
단일 클론을 분리하기 위해 세포를 수확하고 희석하고 10-cm2의 디쉬로 옮겼다. 트랜스진의 거동에 따라 50-96 콜로니로부터 3-6 클론을 ELISA에 의한 후속 확인 rhAAT 발현을 위해 확인하였다.
rhAAT의 생산
rhAAT의 생산은 세포 스택에서의 세포 확장 및 rhAAT 생산, 친화성 크로마토그래피에 의한 rhAAT의 정제, Amicon Ultra 15. 10kDa 튜브를 이용한 제품 농도 및 제형(버퍼 교환)을 포함한다.
세포 스택에서의 세포 확장 및 rhAAT 생산
재조합 앵커리지 의존성 HEK-293 세포를 10% 소태아혈청(FBS, Gibco), 페니실린-스트렙토마이신(Gibco) 및 Geneticin 선택적 항생제 G418 황산염(Gibco)가 보충된 둘베코 변형 이글 배지(DMEM, HyClone) 내 배양 처리된 T-플라스크 및 세포 스택(Cell Staks) 병에서 성장시켰다. 배양물을 37.0℃ 및 5% CO2에서 가습 인큐베이터에서 배양하였고, 롤러 병에서 성장할 때, 2.5 rpm으로 회전시키고, 이후 수확하였다.
친화성 크로마토그래피에 의한 rhAAT의 정제
정화된 배양 상청액을 pH 및 전도도에 대해 시험하였고, 필요에 따라, 각각 1M Tris, 1M NaCl을 포함하는 평형 버퍼의 pH 7.4 및 ±5 mS/cm를 이용하여 7.4 ± 0.1로 적정하였다. pH 및 전도도 조정에 이어서, 정화된 상청액을 정제 전에 0.2μm 필터를 통해 여과하였다.
친화성 크로마토그래피
rhAAT 선택 수지로 패킹된 친화성 크로마토그래피 컬럼을 3CV의 정제수로 헹구고 3CV 0.5M NaOH(2CV 후 30분 유지)로 소독한 후, 3CV의 정제수로 다시 헹구고, 10CV의 20nM Tris, 150nM NaCl pH 7.4 버퍼로 평형화하였다. rhAAT 선택 컬럼을 진동 플라스크 배양의 종료 시 rhAAT를 기준으로 계산된 정화된 상청액의 최대 부피, 정화된 상청액의 부피 및 10mg/mL 수지의 최대 컬럼 로딩 용량으로 로딩하였다. 필요한 경우, 수지의 과부하를 방지하기 위해, 정화된 상청액을 rhAAT 선택 컬럼을 통해 여러 사이클로 처리하였다. 로딩된 단백질을 4CV의 20mM Tris, 150mM NaCl pH 7.4 버퍼로 세척하고, rhAAT를 4CV의 20mM Tris, 2 M MgCl pH 7.4 버퍼로 PETG 수집 병으로 용출시켰다. 컬럼을 4CV의 PBS, pH 2.0 버퍼로 제거하고, 필요한 경우, 추가 사이클을 수행하기 전에 3CV의 20mM Tris, 150mM NaCl pH 7.4 버퍼로 평형화하였다.
실시예 24
벡터 PL136의 구축(pCGS3_AAT_native_SP; 도 25d) (HindIII/XhoI 제한 부위로의 원신호 펩티드(LC MCS)) 및 PL137 (pCGS3_AAT_SP5, 도 25e) (1-24 아미노산을 ATUMSM(Newark, California) 최적화된 신호 펩티드로 치환하여 서열번호 1의 신호 펩티드를 최적화함).
DNA2.0 독점(proprietary) 알고리즘(GeneGPS® Expression OptimizationTechnology, https://www.dna20.com/services/genegps)을 이용하여 중국 햄스터 난소 세포 내 발현을 위해 코딩 서열을 코돈 최적화하였다. 표준 코작 서열(GCCGCCACC)을 개시 코돈 앞에 추가하였다. HindIII 및 XhoI 제한 부위를 합성된 코딩 서열의 5' 및 3'에 추가하였다.
생성된 DNA 단편을 벡터 pJ201에 클로닝하였다. 클론 pJ201_AAT_native_SP (도 25b) 및 pJ201_AAT_SP5(도 25c)의 완전한 플라스미드 지도 및 서열을 제공한다.
pCGS3_AAT_native_SP 및 pCGS3_AAT_SP5는 다음의 클로닝 계획에 따라 얻었다(빈 pCGS3 벡터 도 25f):
Figure pct00005
단편 제조:
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
모든 소화는 37℃에서 2시간 동안 배양되었다. 관심 단편을 아가로스 겔 전기영동(1.2% 아가로스 겔)에 의해 분리하였다. 예상되는 크기의 단편을 절제하고, 겔 정제하여, 다음 라이게이션에 사용하였다:
Figure pct00009
라이게이션 혼합물(1 μl)을 Invitrogen의 E. coli Stabl2 세포로 형질전환하였다. 형질전환된 E. coli 세포를 50 mg/l 카르베니실린(Carbenicillin)을 함유한 무 동물(Animal Free), LB Agar Lennox에서 배양하였다. E. coli 콜로니를 50 mg/l 앰피실린을 함유하는 무 동물, 4ml LB Broth Lennox로 옮기고, 300 rpm의 진탕 배양기에서 33℃에서 밤새 배양하였다. Qiagen BioRobot 9600 및 Macherey-Nagel의 Nucleo Spin Robot-8 플라스미드 키트를 이용하여 E. coli 배양물로부터 플라스미드 DNA를 분리하였다. 그 다음, 클로닝 부위를 덮는 체인 특이적 시퀀싱 프라이머를 이용하여 DNA를 시퀀싱하였다. 다음 클론의 서열은 예상되는 것, PL136(pCGS3_AAT_native_SP; 도 25d) 및 PL137(pCGS3_AAT_SP5, 도 25e)과 동일한 것으로 확인되었다. CHO 내 PL136 및 CHO 내 PL137로부터 얻은 AAT를 풀링하였다.
실시예 25
유전자 합성 및 단일 유전자 구축
rhAAT 단일 유전자 벡터를 생산물 유전자의 벡터 pXC-17.4(Lonza)로의 서브-클로닝에 의해 구축하였다(도 25a).
DNA 증폭
1μL의 벡터 DNA를 사용하여 One Shot® Stbl3 Chemically Competent E. coli 세포(Life Technologies, C7373-03를 제조사의 지시에 따라 열충격 방법을 이용하여 형질전환하였다. 세포를 앰피실린-함유(50 μg/ml) LB 아가 플레이트(LB Broth Base, Select APS™ 및 Bacto-Agar, 모두 Becton Dickinson, 각각 292438 및 214010)에 펼치고, 박테리아 콜로니가 분명해질 때까지 37℃에서 밤새 배양하였다.
Giga 프렙의 경우, 단일 박테리아 배양을 사용하여, 이어서 50 μg 앰피실린을 함유하는 1.0 L Plasmid Plus Medium(Thomson, 446300)을 접종하는데 사용되는 스타터 배양물을 접종하고, 37℃에서 진탕하면서 밤새 배양하였다. 벡터 DNA는 QIAGEN Gigaprep 시스템(Qiagen, 12291)을 이용하여 분리하였다. 모든 경우에, DNA 농도는 Nanodrop 1000 분광광도계(Thermo-Scientific)를 이용하여 측정하고, 1mg/mL로 조정하였다. DNA 품질은 260 및 280 nm에서 흡광도 비율을 측정하여 평가하였다.
CHOK1SV GS-KO 세포의 일상적인 배양
CHOK1SV GS-KO 세포를 6mM L-글루타민(Life Technologies, 25030-123)이 보충된 CD-CHO 배지(Life Technologies, 10743-029)에서 배양하였다. 세포를 36.5℃, 5% CO2, 85% 습도, 140 rpm에서 진탕 배양기에서 배양하였다. 세포를 일상적으로 3-4일마다 계대배양하고, 0.2x106 세포/ml을 시딩하고, 형질감염에 이용가능한 충분한 세포를 가지도록 증식시켰다. 세포는 계대 20에 폐기되었다.
안정적인 재조합 CHOK1SV GS-KO 세포를 50 μM MSX(L-메티오닌 설폭시민, Sigma-Aldrich, M5379) 및 SP4가 보충된 CD-CHO 배지에서 배양하였다. 세포를 36.5℃, 5% CO2, 85% 습도, 140 rpm에서 진탕 배양기에서 배양하였다. 세포를 일상적으로 3-4일마다 계대배양하고, 0.2x106 세포/ml을 시딩하고, 대규모 유가 과증식에 이용가능한 충분한 세포를 가지도록 증식시켰다.
CHOK1SV GS-KO 세포의 안정적인 풀링된 형질감염
단일 유전자 벡터 DNA 플라스미드를 Pvul로 선형화, 뒤이은 에탄올 침전 및 최종 농도 400 μg/ml로 EB 버퍼에 재현탁에 의해 형질감염을 위해 제조하였다. 형질감염은 Gene Pulse XCell을 이용한 전기천공법을 통해 수행하였다. 각각의 형질감염을 위해, 생존 세포를 예열된 CD-CHO 배지에서 1.43x 107 세포/ml까지 재현탁시켰다. 400 μg/ml의 농도에서 100 μl의 선형화된 DNA를 0.4cm 갭 전기천공 큐벳에 분주하고, 700 μl 세포 현탁액을 첨가하였다. 세 개의 세포 및 DNA 큐벳을 300 V, 900 μF에서 전기천공하고, 10 ml/L SP4(Lonza, BESP1076E)이 보충된 30 ml의 예열된 CD-CHO로 즉시 회수하여 안정한 풀을 생성하였다. 형질감염체를 36.5℃, 5% CO2, 85% 습도, 140 rpm에서 진탕 배양기에서 배양하였다.
총 3개의 안정적인 풀 형질감염체가 확립되었다. 형질감염 24시간 후 배양물을 원심분리하고 50 μM MSX 및 10 ml/L SP4가 보충된 예열된 CD-CHO로 재현탁시켰다. 세포 성장 및 생존능을 형질감염 후 주기적으로 확인하였다.
생존 세포 밀도가 >0.6x 106 세포/ml일 때, 형질감염체 배양물이 진행하기에 적합하였다. 500 ml 통기 에를렌마이어 플라스크(Fisher Scientific (Corning), 10352742)에, 50 μM MSX/ 10 ml/L SP4가 보충된 CD-CHO 배지에서 최종 부피 100ml로 0.2x 106 세포/ml에서 세포를 시딩하고, 36.5℃, 5% CO2, 85% 습도, 140 rpm에서 진탕 배양기에서 배양하였다. 배양물이 기하급수적 성장에 적응되면, 세포 배양물을 모니터링하고 확장시켰다. 50 μM MSX/10 ml/L SP4가 보충된 CD-CHO에서 0.2x 106 세포/ml 농도로 500 ml 통기 에를렌마이어 플라스크에서 200ml 배양 부피로 배양물을 확장하였고, 상술된 조건 하에서 배양하였다(부분 0 참조). 그 다음 배양물을 적절한 생산 부피로 확장하였다.
축약된 유가 배양 과성장
확립된 안정적인 풀에서 4 mL/L SPE가 보충된 Lonza의 CM42 기본 배지에서 0.2x 106 세포/mL에서 적절한 배양 부피를 시딩하여 제품 당 2L의 생산 부피로 증식시켰다. 생산 부피를 5 L (Generon, 931116) 진탕 플라스크에서 확립하였고, 36.5℃, 5% CO2, 85% 습도, 140 rpm에서 진탕 배양기에서 배양하였다. 급식을 시작하기 전, 4일차 및 배양물을 11일차에 수확하기 전까지 주기적으로, 세포 수와 생존능을 모니터링하였다. Lonza의 독점 사료의 혼합물로 구성된, 한 회분(bolus) 사료를 4 및 8일차에 투여하였다.
생산 배양물의 수확 및 농축
배양물을 3000rpm에서 10분 동안 원심분리하여 수확하고, 0.22 μm PES 막을 사용하여 여과하여, 정화된 상청액을 얻었다.
알파-1 항트립신 친화성 크로마토그래피
정화된 세포 상청액을 자체(in-house) 포장된 50 ml 알파-1 항-트립신 선택 컬럼(GE Healthcare)을 이용하여 정제하였다. 20mM Tris, 150mM NaCl, pH 7.4로 생산물 적용 전 및 후 컬럼을 평형화하였고, 20mM Tris, 2 M MgCl2, pH 7.4로 용출을 수행하였다. AKTA Purifier에서 10 ml/분으로 상기 절차를 수행하였다. 친화성 크로마토그래피 용출액의 생산물-함유 분획을 풀링하고, 10 kDa MWCO(D02-E010-05-N)가 포함된 Spectrum’s KrosFlo TFF 시스템을 사용하여 Tangential Flow Filtration(TFF)에 의해 버퍼를 50mM Tris, 75mM NaCl, pH 8.0으로 교환하였다.
음이온 교환 크로마토그래피
풀링되고 버퍼가 교환된 분획을 AKTA Purifier에서 10 ml/분으로 25 ml CaptoQ 컬럼(직렬로 연결된 5x 5ml 컬럼)(GE Healthcare)을 이용하여 추가 정제하였다. 50mM Tris, 75mM NaCl, pH 8.0로 생산물 적용 전 및 후에 컬럼을 평형화하였다. 생산물을 50mM Tris, 1 M NaCl, pH 8.0으로 10 CV 선형 구배에 걸쳐 용출시켰다. 음이온 교환 크로마토그래피 용출액에서 생산물-함유 분획을 풀링하고, 1 mg/ml로 희석하고, 품질을 분석하였다.
SE-HPLC
복제 샘플을 Zorbax GF-250 9.4mM ID x 25 cm 컬럼(Agilent)을 이용한, Agilent 1200 시리즈 HPLC 시스템에서 SE-HPLC에 의해 분석하였다. 1 mg/mL 샘플의 80 μL 분주량(또는 샘플이 < 1 mg/mL인 경우 스톡 농도)를 주입하고, 50mM 인산나트륨, 150mM 염화나트륨, 500mM 아르기닌, pH 6.0에서 1 mL/분으로 15분 동안 실행하였다. 가용성 응집물 수준은 Empower 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 버퍼 성분에서 발생하는 신호는 빈(blank) 버퍼 주입에 의해 분석하였고, 달리 명시되지 않는 한, 데이터 분석에서 생략하였다.
생산물 농도
Vivaspin Turbo-15 Centrifugal Filter Units 30KDa Molecular Weight Cut-Off(Sartorius, VS15T02)를 이용하여 정제된 생산물을 25mg/mL의 표적까지 농축하였다.
[참고문헌]
1. Wrapp, D., et al., Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation. Science, 2020. 367(6483): p. 1260-1263.
2. Jaimes, J.A., J.K. Millet, and G.R. Whittaker, Proteolytic Cleavage of the SARS-CoV-2 Spike Protein and the Role of the Novel S1/S2 Site. iScience, 2020. 23(6): p. 101212.
3. Korber, B., et al., Spike mutation pipeline reveals the emergence of a more transmissible form of SARS-CoV-2. bioRxiv, 2020: p. 2020.04.29.069054.
4. Becerra-Flores, M. and T. Cardozo, SARS-CoV-2 viral spike G614 mutation exhibits higher case fatality rate. Int J Clin Pract, 2020.
5. Li, Q., et al., The Impact of Mutations in SARS-CoV-2 Spike on Viral Infectivity and Antigenicity. Cell, 2020.
6. Ogawa, J., et al., The D614G mutation in the SARS-CoV-2 Spike protein increases infectivity in an ACE2 receptor dependent manner. bioRxiv, 2020.
7. Goodfellow, I. Goodfellow, and S.I. Taube, Calicivirus Replication and　Reverse Genetics
Viral Gastroenteritis : Molecular Epidemiology and Pathogenesis. 2016: p. 355-378.
8. Yin, W., et al., Structural basis for inhibition of the RNA-dependent RNA polymerase from SARS-CoV-2 by remdesivir. Science, 2020.
9. Gao, Y., et al., Structure of the RNA-dependent RNA polymerase from COVID-19 virus. Science, 2020. 368(6492): p. 779-782.
10. Pachetti, M., et al., Emerging SARS-CoV-2 mutation hot spots include a novel RNA-dependent-RNA polymerase variant. J Transl Med, 2020. 18(1): p. 179.
SEQUENCE LISTING <110> Atlas Biotechnology S.A. <120> Treatment and/or prevention of a disease or a syndrome related to a virus infection <130> AD2955 PCT BS <160> 47 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 418 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alpha1-Antitrypsin (AAT) <400> 1 Met Pro Ser Ser Val Ser Trp Gly Ile Leu Leu Leu Ala Gly Leu Cys 1 5 10 15 Cys Leu Val Pro Val Ser Leu Ala Glu Asp Pro Gln Gly Asp Ala Ala 20 25 30 Gln Lys Thr Asp Thr Ser His His Asp Gln Asp His Pro Thr Phe Asn 35 40 45 Lys Ile Thr Pro Asn Leu Ala Glu Phe Ala Phe Ser Leu Tyr Arg Gln 50 55 60 Leu Ala His Gln Ser Asn Ser Thr Asn Ile Phe Phe Ser Pro Val Ser 65 70 75 80 Ile Ala Thr Ala Phe Ala Met Leu Ser Leu Gly Thr Lys Ala Asp Thr 85 90 95 His Asp Glu Ile Leu Glu Gly Leu Asn Phe Asn Leu Thr Glu Ile Pro 100 105 110 Glu Ala Gln Ile His Glu Gly Phe Gln Glu Leu Leu Arg Thr Leu Asn 115 120 125 Gln Pro Asp Ser Gln Leu Gln Leu Thr Thr Gly Asn Gly Leu Phe Leu 130 135 140 Ser Glu Gly Leu Lys Leu Val Asp Lys Phe Leu Glu Asp Val Lys Lys 145 150 155 160 Leu Tyr His Ser Glu Ala Phe Thr Val Asn Phe Gly Asp Thr Glu Glu 165 170 175 Ala Lys Lys Gln Ile Asn Asp Tyr Val Glu Lys Gly Thr Gln Gly Lys 180 185 190 Ile Val Asp Leu Val Lys Glu Leu Asp Arg Asp Thr Val Phe Ala Leu 195 200 205 Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Gly Lys Trp Glu Arg Pro Phe Glu Val 210 215 220 Lys Asp Thr Glu Glu Glu Asp Phe His Val Asp Gln Val Thr Thr Val 225 230 235 240 Lys Val Pro Met Met Lys Arg Leu Gly Met Phe Asn Ile Gln His Cys 245 250 255 Lys Lys Leu Ser Ser Trp Val Leu Leu Met Lys Tyr Leu Gly Asn Ala 260 265 270 Thr Ala Ile Phe Phe Leu Pro Asp Glu Gly Lys Leu Gln His Leu Glu 275 280 285 Asn Glu Leu Thr His Asp Ile Ile Thr Lys Phe Leu Glu Asn Glu Asp 290 295 300 Arg Arg Ser Ala Ser Leu His Leu Pro Lys Leu Ser Ile Thr Gly Thr 305 310 315 320 Tyr Asp Leu Lys Ser Val Leu Gly Gln Leu Gly Ile Thr Lys Val Phe 325 330 335 Ser Asn Gly Ala Asp Leu Ser Gly Val Thr Glu Glu Ala Pro Leu Lys 340 345 350 Leu Ser Lys Ala Val His Lys Ala Val Leu Thr Ile Asp Glu Lys Gly 355 360 365 Thr Glu Ala Ala Gly Ala Met Phe Leu Glu Ala Ile Pro Met Ser Ile 370 375 380 Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys Pro Phe Val Phe Leu Met Ile Glu 385 390 395 400 Gln Asn Thr Lys Ser Pro Leu Phe Met Gly Lys Val Val Asn Pro Thr 405 410 415 Gln Lys <210> 2 <211> 44 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminal AAT sequence 374-418 <400> 2 Met Phe Leu Glu Ala Ile Pro Met Ser Ile Pro Pro Glu Val Lys Phe 1 5 10 15 Asn Lys Pro Phe Val Phe Leu Met Ile Glu Gln Asn Thr Lys Ser Pro 20 25 30 Leu Phe Met Gly Lys Val Val Asn Pro Thr Gln Lys 35 40 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> short cyclic peptide derived from the C-terminal sequence of Alpha1-Antitrypsin <400> 3 Cys Pro Phe Val Phe Leu Met 1 5 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> short cyclic peptide derived from the C-terminal sequence of Alpha1-Antitrypsin <400> 4 Cys Pro Phe Val Phe Leu Glu 1 5 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> short cyclic peptide derived from the C-terminal sequence of Alpha1-Antitrypsin <400> 5 Cys Pro Phe Val Phe Leu Arg 1 5 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> short cyclic peptide derived from the C-terminal sequence of Alpha1-Antitrypsin <400> 6 Cys Pro Glu Val Phe Leu Met 1 5 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HIV-TAT 48-57 peptide <400> 7 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 8 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FHV-coat 35-49 peptide <400> 8 Arg Arg Arg Arg Asn Arg Thr Arg Arg Asn Arg Arg Arg Val Arg 1 5 10 15 <210> 9 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HTLV-II Rex 4-16 peptide <400> 9 Thr Arg Arg Gln Arg Thr Arg Arg Ala Arg Arg Asn Arg 1 5 10 <210> 10 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BMV gag 7-25 peptide <400> 10 Lys Met Thr Arg Ala Gln Arg Arg Ala Ala Ala Arg Arg Asn Arg Trp 1 5 10 15 Thr Ala Arg <210> 11 <211> 11 <212> PRT <213> Viruses <220> <223> Fluorogenic peptides derived from SARS-CoV spike <400> 11 His Thr Val Ser Leu Leu Arg Ser Thr Ser Gln 1 5 10 <210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> Viruses <220> <223> Fluorogenic peptides derived from SARS-CoV-2 spike <400> 12 Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala 1 5 10 <210> 13 <211> 7394 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pCDH-CMV-MCS-EF1慣-Puro lentivector <400> 13 acgcgtgtag tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atggtaacga tgagttagca 60 acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta 120 cgatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac gggtctgaca tggattggac gaaccactga 180 attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacaata aacgggtctc 240 tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 300 agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 360 ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg 420 cccgaacagg gacctgaaag cgaaagggaa accagagctc tctcgacgca ggactcggct 480 tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg gcggcgactg gtgagtacgc caaaaatttt 540 gactagcgga ggctagaagg agagagatgg gtgcgagagc gtcagtatta agcgggggag 600 aattagatcg cgatgggaaa aaattcggtt aaggccaggg ggaaagaaaa aatataaatt 660 aaaacatata gtatgggcaa gcagggagct agaacgattc gcagttaatc ctggcctgtt 720 agaaacatca gaaggctgta gacaaatact gggacagcta caaccatccc ttcagacagg 780 atcagaagaa cttagatcat tatataatac agtagcaacc ctctattgtg tgcatcaaag 840 gatagagata aaagacacca aggaagcttt agacaagata gaggaagagc aaaacaaaag 900 taagaccacc gcacagcaag cggccactga tcttcagacc tggaggagga gatatgaggg 960 acaattggag aagtgaatta tataaatata aagtagtaaa aattgaacca ttaggagtag 1020 cacccaccaa ggcaaagaga agagtggtgc agagagaaaa aagagcagtg ggaataggag 1080 ctttgttcct tgggttcttg ggagcagcag gaagcactat gggcgcagcg tcaatgacgc 1140 tgacggtaca ggccagacaa ttattgtctg gtatagtgca gcagcagaac aatttgctga 1200 gggctattga ggcgcaacag catctgttgc aactcacagt ctggggcatc aagcagctcc 1260 aggcaagaat cctggctgtg gaaagatacc taaaggatca acagctcctg gggatttggg 1320 gttgctctgg aaaactcatt tgcaccactg ctgtgccttg gaatgctagt tggagtaata 1380 aatctctgga acagatttgg aatcacacga cctggatgga gtgggacaga gaaattaaca 1440 attacacaag cttaatacac tccttaattg aagaatcgca aaaccagcaa gaaaagaatg 1500 aacaagaatt attggaatta gataaatggg caagtttgtg gaattggttt aacataacaa 1560 attggctgtg gtatataaaa ttattcataa tgatagtagg aggcttggta ggtttaagaa 1620 tagtttttgc tgtactttct atagtgaata gagttaggca gggatattca ccattatcgt 1680 ttcagaccca cctcccaacc ccgaggggac ccgacaggcc cgaaggaata gaagaagaag 1740 gtggagagag agacagagac agatccattc gattagtgaa cggatctcga cggtatcggt 1800 taacttttaa aagaaaaggg gggattgggg ggtacagtgc aggggaaaga atagtagaca 1860 taatagcaac agacatacaa actaaagaat tacaaaaaca aattacaaaa ttcaaaattt 1920 tatcgattac tagtattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta 1980 catctacgta ttagtcatcg ctattaccat ggtgatgcgg ttttggcagt acatcaatgg 2040 gcgtggatag cggtttgact cacggggatt tccaagtctc caccccattg acgtcaatgg 2100 gagtttgttt tggcaccaaa atcaacggga ctttccaaaa tgtcgtaaca actccgcccc 2160 attgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg gtgggaggtt tatataagca gagctcgttt 2220 agtgaaccgt cagatcgcct ggagacgcca tccacgctgt tttgacctcc atagaagatt 2280 ctagagctag cgaattcgaa tttaaatcgg atccgcggcc gcaaggatct gcgatcgctc 2340 cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc gcccacagtc cccgagaagt tggggggagg 2400 ggtcggcaat tgaacgggtg cctagagaag gtggcgcggg gtaaactggg aaagtgatgt 2460 cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg tgggggagaa ccgtatataa gtgcagtagt 2520 cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt tgccgccaga acacagctga agcttcgagg 2580 ggctcgcatc tctccttcac gcgcccgccg ccctacctga ggccgccatc cacgccggtt 2640 gagtcgcgtt ctgccgcctc ccgcctgtgg tgcctcctga actgcgtccg ccgtctaggt 2700 aagtttaaag ctcaggtcga gaccgggcct ttgtccggcg ctcccttgga gcctacctag 2760 actcagccgg ctctccacgc tttgcctgac cctgcttgct caactctacg tctttgtttc 2820 gttttctgtt ctgcgccgtt acagatccaa gctgtgaccg gcgcctacga tatgaccgag 2880 tacaagccca cggtgcgcct cgccacccgc gacgacgtcc ccagggccgt acgcaccctc 2940 gccgccgcgt tcgccgacta ccccgccacg cgccacaccg tcgatccgga ccgccacatc 3000 gagcgggtca ccgagctgca agaactcttc ctcacgcgcg tcgggctcga catcggcaag 3060 gtgtgggtcg cggacgacgg cgccgcggtg gcggtctgga ccacgccgga gagcgtcgaa 3120 gcgggggcgg tgttcgccga gatcggcccg cgcatggccg agttgagcgg ttcccggctg 3180 gccgcgcagc aacagatgga aggcctcctg gcgccgcacc ggcccaagga gcccgcgtgg 3240 ttcctggcca ccgtcggcgt ctcgcccgac caccagggca agggtctggg cagcgccgtc 3300 gtgctccccg gagtggaggc ggccgagcgc gccggggtgc ccgccttcct ggagacctcc 3360 gcgccccgca acctcccctt ctacgagcgg ctcggcttca ccgtcaccgc cgacgtcgag 3420 gtgcccgaag gaccgcgcac ctggtgcatg acccgcaagc ccggtgcctg acaatcaacc 3480 tctggattac aaaatttgtg aaagattgac tggtattctt aactatgttg ctccttttac 3540 gctatgtgga tacgctgctt taatgccttt gtatcatgct attgcttccc gtatggcttt 3600 cattttctcc tccttgtata aatcctggtt gctgtctctt tatgaggagt tgtggcccgt 3660 tgtcaggcaa cgtggcgtgg tgtgcactgt gtttgctgac gcaaccccca ctggttgggg 3720 cattgccacc acctgtcagc tcctttccgg gactttcgct ttccccctcc ctattgccac 3780 ggcggaactc atcgccgcct gccttgcccg ctgctggaca ggggctcggc tgttgggcac 3840 tgacaattcc gtggtgttgt cggggaaatc atcgtccttt ccttggctgc tcgcctgtgt 3900 tgccacctgg attctgcgcg ggacgtcctt ctgctacgtc ccttcggccc tcaatccagc 3960 ggaccttcct tcccgcggcc tgctgccggc tctgcggcct cttccgcgtc ttcgccttcg 4020 ccctcagacg agtcggatct ccctttgggc cgcctccccg cctggtacct ttaagaccaa 4080 tgacttacaa ggcagctgta gatcttagcc actttttaaa agaaaagggg ggactggaag 4140 ggctaattca ctcccaacga agataagatc tgctttttgc ttgtactggg tctctctggt 4200 tagaccagat ctgagcctgg gagctctctg gctaactagg gaacccactg cttaagcctc 4260 aataaagctt gccttgagtg cttcaagtag tgtgtgcccg tctgttgtgt gactctggta 4320 actagagatc cctcagaccc ttttagtcag tgtggaaaat ctctagcagt agtagttcat 4380 gtcatcttat tattcagtat ttataacttg caaagaaatg aatatcagag agtgagagga 4440 acttgtttat tgcagcttat aatggttaca aataaagcaa tagcatcaca aatttcacaa 4500 ataaagcatt tttttcactg cattctagtt gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt 4560 atcatgtctg gctctagcta tcccgcccct aactccgccc atcccgcccc taactccgcc 4620 cagttccgcc cattctccgc cccatggctg actaattttt tttatttatg cagaggccga 4680 ggccgcctcg gcctctgagc tattccagaa gtagtgagga ggcttttttg gaggcctaga 4740 cttttgcaga gaccaaattc gtaatcatgt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc 4800 cgctcacaat tccacacaac atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct 4860 aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa 4920 acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta 4980 ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc 5040 gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg 5100 caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt 5160 tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa 5220 gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct 5280 ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc 5340 cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg 5400 tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct 5460 tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag 5520 cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga 5580 agtggtggcc taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga 5640 agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg 5700 gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag 5760 aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag 5820 ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat 5880 gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct 5940 taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac 6000 tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa 6060 tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg 6120 gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt 6180 gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca 6240 ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt 6300 cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct 6360 tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg 6420 cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg 6480 agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg 6540 cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa 6600 aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt 6660 aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt 6720 gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt 6780 gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca 6840 tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat 6900 ttccccgaaa agtgccacct gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca ttaacctata 6960 aaaataggcg tatcacgagg ccctttcgtc tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc 7020 tctgacacat gcagctcccg gagacggtca cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca 7080 gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg 7140 cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat 7200 gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc attcgccatt caggctgcgc aactgttggg 7260 aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg 7320 caaggcgatt aagttgggta acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg 7380 ccagtgccaa gctg 7394 <210> 14 <211> 7193 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pCDH-CMV-MCS-EF1慣-Blast lentivector <400> 14 acgcgtgtag tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atggtaacga tgagttagca 60 acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta 120 cgatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac gggtctgaca tggattggac gaaccactga 180 attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacaata aacgggtctc 240 tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 300 agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 360 ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg 420 cccgaacagg gacctgaaag cgaaagggaa accagagctc tctcgacgca ggactcggct 480 tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg gcggcgactg gtgagtacgc caaaaatttt 540 gactagcgga ggctagaagg agagagatgg gtgcgagagc gtcagtatta agcgggggag 600 aattagatcg cgatgggaaa aaattcggtt aaggccaggg ggaaagaaaa aatataaatt 660 aaaacatata gtatgggcaa gcagggagct agaacgattc gcagttaatc ctggcctgtt 720 agaaacatca gaaggctgta gacaaatact gggacagcta caaccatccc ttcagacagg 780 atcagaagaa cttagatcat tatataatac agtagcaacc ctctattgtg tgcatcaaag 840 gatagagata aaagacacca aggaagcttt agacaagata gaggaagagc aaaacaaaag 900 taagaccacc gcacagcaag cggccactga tcttcagacc tggaggagga gatatgaggg 960 acaattggag aagtgaatta tataaatata aagtagtaaa aattgaacca ttaggagtag 1020 cacccaccaa ggcaaagaga agagtggtgc agagagaaaa aagagcagtg ggaataggag 1080 ctttgttcct tgggttcttg ggagcagcag gaagcactat gggcgcagcg tcaatgacgc 1140 tgacggtaca ggccagacaa ttattgtctg gtatagtgca gcagcagaac aatttgctga 1200 gggctattga ggcgcaacag catctgttgc aactcacagt ctggggcatc aagcagctcc 1260 aggcaagaat cctggctgtg gaaagatacc taaaggatca acagctcctg gggatttggg 1320 gttgctctgg aaaactcatt tgcaccactg ctgtgccttg gaatgctagt tggagtaata 1380 aatctctgga acagatttgg aatcacacga cctggatgga gtgggacaga gaaattaaca 1440 attacacaag cttaatacac tccttaattg aagaatcgca aaaccagcaa gaaaagaatg 1500 aacaagaatt attggaatta gataaatggg caagtttgtg gaattggttt aacataacaa 1560 attggctgtg gtatataaaa ttattcataa tgatagtagg aggcttggta ggtttaagaa 1620 tagtttttgc tgtactttct atagtgaata gagttaggca gggatattca ccattatcgt 1680 ttcagaccca cctcccaacc ccgaggggac ccgacaggcc cgaaggaata gaagaagaag 1740 gtggagagag agacagagac agatccattc gattagtgaa cggatctcga cggtatcggt 1800 taacttttaa aagaaaaggg gggattgggg ggtacagtgc aggggaaaga atagtagaca 1860 taatagcaac agacatacaa actaaagaat tacaaaaaca aattacaaaa ttcaaaattt 1920 tatcgattac tagtattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta 1980 catctacgta ttagtcatcg ctattaccat ggtgatgcgg ttttggcagt acatcaatgg 2040 gcgtggatag cggtttgact cacggggatt tccaagtctc caccccattg acgtcaatgg 2100 gagtttgttt tggcaccaaa atcaacggga ctttccaaaa tgtcgtaaca actccgcccc 2160 attgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg gtgggaggtt tatataagca gagctcgttt 2220 agtgaaccgt cagatcgcct ggagacgcca tccacgctgt tttgacctcc atagaagatt 2280 ctagagctag cgaattcgaa tttaaatcgg atccgcggcc gcaaggatct gcgatcgctc 2340 cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc gcccacagtc cccgagaagt tggggggagg 2400 ggtcggcaat tgaacgggtg cctagagaag gtggcgcggg gtaaactggg aaagtgatgt 2460 cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg tgggggagaa ccgtatataa gtgcagtagt 2520 cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt tgccgccaga acacagctga agcttcgagg 2580 ggctcgcatc tctccttcac gcgcccgccg ccctacctga ggccgccatc cacgccggtt 2640 gagtcgcgtt ctgccgcctc ccgcctgtgg tgcctcctga actgcgtccg ccgtctaggt 2700 aagtttaaag ctcaggtcga gaccgggcct ttgtccggcg ctcccttgga gcctacctag 2760 actcagccgg ctctccacgc tttgcctgac cctgcttgct caactctacg tctttgtttc 2820 gttttctgtt ctgcgccgtt acagatccaa gctgtgaccg gcgcctacga tatggccaag 2880 cctttgtctc aagaagaatc caccctcatt gaaagagcaa cggctacaat caacagcatc 2940 cccatctctg aagactacag cgtcgccagc gcagctctct ctagcgacgg ccgcatcttc 3000 actggtgtca atgtatatca ttttactggg ggaccttgtg cagaactcgt ggtgctgggc 3060 actgctgctg ctgcggcagc tggcaacctg acttgtatcg tcgcgatcgg aaatgagaac 3120 aggggcatct tgagcccctg cggacggtgc cgacaggtgc ttctcgatct gcatcctggg 3180 atcaaagcca tagtgaagga cagtgatgga cagccgacgg cagttgggat tcgtgaattg 3240 ctgccctctg gttatgtgtg ggagggctaa caatcaacct ctggattaca aaatttgtga 3300 aagattgact ggtattctta actatgttgc tccttttacg ctatgtggat acgctgcttt 3360 aatgcctttg tatcatgcta ttgcttcccg tatggctttc attttctcct ccttgtataa 3420 atcctggttg ctgtctcttt atgaggagtt gtggcccgtt gtcaggcaac gtggcgtggt 3480 gtgcactgtg tttgctgacg caacccccac tggttggggc attgccacca cctgtcagct 3540 cctttccggg actttcgctt tccccctccc tattgccacg gcggaactca tcgccgcctg 3600 ccttgcccgc tgctggacag gggctcggct gttgggcact gacaattccg tggtgttgtc 3660 ggggaaatca tcgtcctttc cttggctgct cgcctgtgtt gccacctgga ttctgcgcgg 3720 gacgtccttc tgctacgtcc cttcggccct caatccagcg gaccttcctt cccgcggcct 3780 gctgccggct ctgcggcctc ttccgcgtct tcgccttcgc cctcagacga gtcggatctc 3840 cctttgggcc gcctccccgc ctggtacctt taagaccaat gacttacaag gcagctgtag 3900 atcttagcca ctttttaaaa gaaaaggggg gactggaagg gctaattcac tcccaacgaa 3960 gataagatct gctttttgct tgtactgggt ctctctggtt agaccagatc tgagcctggg 4020 agctctctgg ctaactaggg aacccactgc ttaagcctca ataaagcttg ccttgagtgc 4080 ttcaagtagt gtgtgcccgt ctgttgtgtg actctggtaa ctagagatcc ctcagaccct 4140 tttagtcagt gtggaaaatc tctagcagta gtagttcatg tcatcttatt attcagtatt 4200 tataacttgc aaagaaatga atatcagaga gtgagaggaa cttgtttatt gcagcttata 4260 atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc 4320 attctagttg tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta tcatgtctgg ctctagctat 4380 cccgccccta actccgccca tcccgcccct aactccgccc agttccgccc attctccgcc 4440 ccatggctga ctaatttttt ttatttatgc agaggccgag gccgcctcgg cctctgagct 4500 attccagaag tagtgaggag gcttttttgg aggcctagac ttttgcagag accaaattcg 4560 taatcatgtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca 4620 tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat 4680 taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt 4740 aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct 4800 cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa 4860 aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa 4920 aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc 4980 tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga 5040 caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc 5100 cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt 5160 ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct 5220 gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg 5280 agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta 5340 gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct 5400 acactagaag gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa 5460 gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt 5520 gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta 5580 cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat 5640 caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa 5700 gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct 5760 cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta 5820 cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct 5880 caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg 5940 gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa 6000 gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt 6060 cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta 6120 catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca 6180 gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta 6240 ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct 6300 gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg 6360 cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac 6420 tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact 6480 gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa 6540 atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt 6600 ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat 6660 gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg 6720 acgtctaaga aaccattatt atcatgacat taacctataa aaataggcgt atcacgaggc 6780 cctttcgtct cgcgcgtttc ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg 6840 agacggtcac agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt 6900 cagcgggtgt tggcgggtgt cggggctggc ttaactatgc ggcatcagag cagattgtac 6960 tgagagtgca ccatatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca 7020 tcaggcgcca ttcgccattc aggctgcgca actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct 7080 cttcgctatt acgccagctg gcgaaagggg gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa 7140 cgccagggtt ttcccagtca cgacgttgta aaacgacggc cagtgccaag ctg 7193 <210> 15 <211> 8159 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pCG1_SCoV2-S plasmid <400> 15 gaattcgagc tcgccccgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 60 acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 120 ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 180 aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 240 ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 300 tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc 360 ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt 420 ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa 480 tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctcgttta gtgaaccgtc 540 agatcgcctg gagacgccat ccacgctgtt ttgacctcca tagaagacac cgggaccgat 600 ccagcctccg ggggatcgat cccccgatcc tgagaacttc agggtgagtt tggggaccct 660 tgattgttct ttctttttcg ctattgtaaa attcatgtta tatggagggg gcaaagtttt 720 cagggtgttg tttagaatgg gaagatgtcc cttgtatcac catggaccct catgataatt 780 ttgtttcttt cactttctac tctgttgaca accattgtct cctcttattt tcttttcatt 840 ttctgtaact ttttcgttaa actttagctt gcatttgtaa cgaattttta aattcacttt 900 tgtttatttg tcagattgta agtactttct ctaatcactt ttttttcaag gcaatcaggg 960 tatattatat tgtacttcag cacagtttta gagaacaatt gttataatta aatgataagg 1020 tagaatattt ctgcatataa attctggctg gcgtggaaat attcttattg gtagaaacaa 1080 ctacatcctg gtcatcatcc tgcctttctc tttatggtta caatgatata cactgtttga 1140 gatgaggata aaatactctg agtccaaacc gggcccctct gctaaccatg ttcatgcctt 1200 cttctttttc ctacagctcc tgggcaacgt gctggttatt gtgctgtctc atcattttgg 1260 caaagaattg taatacgact cactataggg cgaattcgga tccgccacca tgttcgtgtt 1320 tctggtgctg ctgcctctgg tgtccagcca gtgtgtgaac ctgaccacaa gaacccagct 1380 gcctccagcc tacaccaaca gctttaccag aggcgtgtac taccccgaca aggtgttcag 1440 atccagcgtg ctgcactcta cccaggacct gttcctgcct ttcttcagca acgtgacctg 1500 gttccacgcc atccacgtgt ccggcaccaa tggcaccaag agattcgaca accccgtgct 1560 gcccttcaac gacggggtgt actttgccag caccgagaag tccaacatca tcagaggctg 1620 gatcttcggc accacactgg acagcaagac ccagagcctg ctgatcgtga acaacgccac 1680 caacgtggtc atcaaagtgt gcgagttcca gttctgcaac gaccccttcc tgggcgtcta 1740 ctatcacaag aacaacaaga gctggatgga aagcgagttc cgggtgtaca gcagcgccaa 1800 caactgcacc ttcgagtacg tgtcccagcc tttcctgatg gacctggaag gcaagcaggg 1860 caacttcaag aacctgcgcg agttcgtgtt caagaacatc gacggctact tcaagatcta 1920 cagcaagcac acccctatca acctcgtgcg ggatctgcct cagggcttct ctgctctgga 1980 acccctggtg gatctgccca tcggcatcaa catcacccgg tttcagacac tgctggccct 2040 gcacagaagc tacctgacac ctggcgatag cagcagcgga tggacagctg gtgccgccgc 2100 ttactatgtg ggctacctgc agcctagaac cttcctgctg aagtacaacg agaacggcac 2160 catcaccgac gccgtggatt gtgcccttga tcctctgagc gagacaaagt gcaccctgaa 2220 gtccttcacc gtggaaaagg gcatctacca gaccagcaac ttccgggtgc agcccaccga 2280 atccatcgtg cggttcccca atatcaccaa tctgtgcccc ttcggcgagg tgttcaatgc 2340 caccagattc gcctctgtgt acgcctggaa ccggaagcgg atcagcaatt gcgtggccga 2400 ctactccgtg ctgtacaact ccgccagctt cagcaccttc aagtgctacg gcgtgtcccc 2460 taccaagctg aacgacctgt gcttcacaaa cgtgtacgcc gacagcttcg tgatccgggg 2520 agatgaagtg cggcagattg cccctggaca gacaggcaag atcgccgact acaactacaa 2580 gctgcccgac gacttcaccg gctgtgtgat tgcctggaac agcaacaacc tggactccaa 2640 agtcggcggc aactacaatt acctgtaccg gctgttccgg aagtccaatc tgaagccctt 2700 cgagcgggac atctccaccg agatctatca ggccggcagc accccttgta acggcgtgga 2760 aggcttcaac tgctacttcc cactgcagtc ctacggcttt cagcccacaa atggcgtggg 2820 ctatcagccc tacagagtgg tggtgctgag cttcgaactg ctgcatgccc ctgccacagt 2880 gtgcggccct aagaaaagca ccaatctcgt gaagaacaaa tgcgtgaact tcaacttcaa 2940 cggcctgacc ggcaccggcg tgctgacaga gagcaacaag aagttcctgc cattccagca 3000 gtttggccgg gatatcgccg ataccacaga cgccgttaga gatccccaga cactggaaat 3060 cctggacatc accccttgca gcttcggcgg agtgtctgtg atcacccctg gcaccaacac 3120 cagcaatcag gtggcagtgc tgtaccagga cgtgaactgt accgaagtgc ccgtggccat 3180 tcacgccgat cagctgacac ctacatggcg ggtgtactcc accggcagca atgtgtttca 3240 gaccagagcc ggctgtctga tcggagccga gcacgtgaac aatagctacg agtgcgacat 3300 ccccatcggc gctggcatct gtgccagcta ccagacacag acaaacagcc ccagacgggc 3360 cagatctgtg gccagccaga gcatcattgc ctacacaatg tctctgggcg ccgagaacag 3420 cgtggcctac tccaacaact ctatcgctat ccccaccaac ttcaccatca gcgtgaccac 3480 agagatcctg cctgtgtcca tgaccaagac cagcgtggac tgcaccatgt acatctgcgg 3540 cgattccacc gagtgctcca acctgctgct gcagtacggc agcttctgca cccagctgaa 3600 tagagccctg acagggatcg ccgtggaaca ggacaagaac acccaagagg tgttcgccca 3660 agtgaagcag atctacaaga cccctcctat caaggacttc ggcggcttca atttcagcca 3720 gattctgccc gatcctagca agcccagcaa gcggagcttc atcgaggacc tgctgttcaa 3780 caaagtgaca ctggccgacg ccggcttcat caagcagtat ggcgattgtc tgggcgacat 3840 tgccgccagg gatctgattt gcgcccagaa gtttaacgga ctgacagtgc tgccaccact 3900 gctgaccgat gagatgatcg cccagtacac atctgccctg ctggccggca caatcacaag 3960 cggctggaca tttggagctg gcgccgctct gcagatcccc tttgctatgc agatggccta 4020 ccggttcaac ggcatcggag tgacccagaa tgtgctgtac gagaaccaga agctgatcgc 4080 caaccagttc aacagcgcca tcggcaagat ccaggacagc ctgagcagca cagcaagcgc 4140 cctgggaaag ctgcaggacg tggtcaacca gaatgcccag gcactgaaca ccctggtcaa 4200 gcagctgtcc tccaacttcg gcgccatcag ctctgtgctg aacgatatcc tgagcagact 4260 ggacaaggtg gaagccgagg tgcagatcga cagactgatc accggaaggc tgcagtccct 4320 gcagacctac gttacccagc agctgatcag agccgccgag attagagcct ctgccaatct 4380 ggccgccacc aagatgtctg agtgtgtgct gggccagagc aagagagtgg acttttgcgg 4440 caagggctac cacctgatga gcttccctca gtctgcccct cacggcgtgg tgtttctgca 4500 cgtgacatac gtgcccgctc aagagaagaa tttcaccacc gctccagcca tctgccacga 4560 cggcaaagcc cactttccta gagaaggcgt gttcgtgtcc aacggcaccc attggttcgt 4620 gacccagcgg aacttctacg agccccagat catcaccacc gacaacacct tcgtgtctgg 4680 caactgcgac gtcgtgatcg gcattgtgaa caataccgtg tacgaccctc tgcagcccga 4740 gctggacagc ttcaaagagg aactggataa gtactttaag aaccacacaa gccccgacgt 4800 ggacctgggc gatatcagcg gaatcaatgc cagcgtcgtg aacatccaga aagagatcga 4860 ccggctgaac gaggtggcca agaatctgaa cgagagcctg atcgacctgc aagaactggg 4920 gaagtacgag cagtacatca agtggccctg gtacatctgg ctgggcttta tcgccggact 4980 gattgccatc gtgatggtca caatcatgct gtgttgcatg accagctgct gtagctgcct 5040 gaagggctgt tgtagctgtg gcagctgctg caagttcgac gaggacgatt ctgagcccgt 5100 gctgaagggc gtgaaactgc actacaccta atctagagtc gactgtttaa acctgcaggc 5160 atgcaagctg atctttttcc ctctgccaaa aattatgggg acatcatgaa gccccttgag 5220 catctgactt ctggctaata aaggaaattt attttcattg caatagtgtg ttggaatttt 5280 ttgtgtctct cactcggaag gacatatggg agggcaaatc atttaaaaca tcagaatgag 5340 tatttggttt agagtttggc aacatatgcc atatgctggc tgccatgaac aaaggtggct 5400 ataaagaggt catcagtata tgaaacagcc ccctgctgtc cattccttat tccatagaaa 5460 agccttgact tgaggttaga ttttttttat attttgtttt gtgttatttt tttctttaac 5520 atccctaaaa ttttccttac atgttttact agccagattt ttcctcctct cctgactact 5580 cccagtcata gctgtccctc ttctcttatg aactcgagga gctttttgca aaagcctagg 5640 cctccaaaaa agcctcctca ctacttctgg aatagctcag aggccgaggc ggcctcggcc 5700 tctgcataaa taaaaaaaat tagtcagcca tggggcggag aatgggcgga actgggcgga 5760 gttaggggcg ggatgggcgg agttaggggc gggactatgg ttgctgacta attgagactg 5820 cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct 5880 tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac 5940 tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga 6000 gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat 6060 aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac 6120 ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct 6180 gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg 6240 ctttctcaat gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg 6300 ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt 6360 cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg 6420 attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac 6480 ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga 6540 aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt 6600 gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt 6660 tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga 6720 ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc 6780 taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct 6840 atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt cgtgtagata 6900 actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca 6960 cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga 7020 agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg ggaagctaga 7080 gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg 7140 gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga 7200 gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt 7260 gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact gcataattct 7320 cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca 7380 ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat 7440 accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga 7500 aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc 7560 aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg 7620 caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc 7680 ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt 7740 gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaacgtctt 7800 caagctgcct cgcgcgtttc ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg 7860 agacggtcac agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt 7920 cagcgggtgt tggcgggtgt cggggcgcag ccatgaccca gtcacgtagc gatagcggag 7980 ttggcttaac tatgcggcat cagagcagat tgtactgaga gtgcaccata tcgacgctct 8040 cccttatgcg actcctgcat taggaagcag cccagtagta ggttgaggcc gttgagcacc 8100 gccgccgcaa ggaatggtgc tggcttatcg aaattaatcg actcactata gggagaccc 8159 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G614 Spike primer 1 <400> 16 gcgtgaactg taccgaagtg 20 <210> 17 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G614 Spike primer 2 <400> 17 cctggtacag cactgcc 17 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> truncated SARS-CoV2-Spike primer 1 <400> 18 agcgaattcg gatccgcc 18 <210> 19 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> truncated SARS-CoV2-Spike primer 2 <400> 19 acagtcgact ctagattagc agcagctgcc acag 34 <210> 20 <211> 8159 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> plasmids encoding Spike G614 Full length (FL) <400> 20 gaattcgagc tcgccccgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 60 acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 120 ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 180 aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 240 ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 300 tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc 360 ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt 420 ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa 480 tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctcgttta gtgaaccgtc 540 agatcgcctg gagacgccat ccacgctgtt ttgacctcca tagaagacac cgggaccgat 600 ccagcctccg ggggatcgat cccccgatcc tgagaacttc agggtgagtt tggggaccct 660 tgattgttct ttctttttcg ctattgtaaa attcatgtta tatggagggg gcaaagtttt 720 cagggtgttg tttagaatgg gaagatgtcc cttgtatcac catggaccct catgataatt 780 ttgtttcttt cactttctac tctgttgaca accattgtct cctcttattt tcttttcatt 840 ttctgtaact ttttcgttaa actttagctt gcatttgtaa cgaattttta aattcacttt 900 tgtttatttg tcagattgta agtactttct ctaatcactt ttttttcaag gcaatcaggg 960 tatattatat tgtacttcag cacagtttta gagaacaatt gttataatta aatgataagg 1020 tagaatattt ctgcatataa attctggctg gcgtggaaat attcttattg gtagaaacaa 1080 ctacatcctg gtcatcatcc tgcctttctc tttatggtta caatgatata cactgtttga 1140 gatgaggata aaatactctg agtccaaacc gggcccctct gctaaccatg ttcatgcctt 1200 cttctttttc ctacagctcc tgggcaacgt gctggttatt gtgctgtctc atcattttgg 1260 caaagaattg taatacgact cactataggg cgaattcgga tccgccacca tgttcgtgtt 1320 tctggtgctg ctgcctctgg tgtccagcca gtgtgtgaac ctgaccacaa gaacccagct 1380 gcctccagcc tacaccaaca gctttaccag aggcgtgtac taccccgaca aggtgttcag 1440 atccagcgtg ctgcactcta cccaggacct gttcctgcct ttcttcagca acgtgacctg 1500 gttccacgcc atccacgtgt ccggcaccaa tggcaccaag agattcgaca accccgtgct 1560 gcccttcaac gacggggtgt actttgccag caccgagaag tccaacatca tcagaggctg 1620 gatcttcggc accacactgg acagcaagac ccagagcctg ctgatcgtga acaacgccac 1680 caacgtggtc atcaaagtgt gcgagttcca gttctgcaac gaccccttcc tgggcgtcta 1740 ctatcacaag aacaacaaga gctggatgga aagcgagttc cgggtgtaca gcagcgccaa 1800 caactgcacc ttcgagtacg tgtcccagcc tttcctgatg gacctggaag gcaagcaggg 1860 caacttcaag aacctgcgcg agttcgtgtt caagaacatc gacggctact tcaagatcta 1920 cagcaagcac acccctatca acctcgtgcg ggatctgcct cagggcttct ctgctctgga 1980 acccctggtg gatctgccca tcggcatcaa catcacccgg tttcagacac tgctggccct 2040 gcacagaagc tacctgacac ctggcgatag cagcagcgga tggacagctg gtgccgccgc 2100 ttactatgtg ggctacctgc agcctagaac cttcctgctg aagtacaacg agaacggcac 2160 catcaccgac gccgtggatt gtgcccttga tcctctgagc gagacaaagt gcaccctgaa 2220 gtccttcacc gtggaaaagg gcatctacca gaccagcaac ttccgggtgc agcccaccga 2280 atccatcgtg cggttcccca atatcaccaa tctgtgcccc ttcggcgagg tgttcaatgc 2340 caccagattc gcctctgtgt acgcctggaa ccggaagcgg atcagcaatt gcgtggccga 2400 ctactccgtg ctgtacaact ccgccagctt cagcaccttc aagtgctacg gcgtgtcccc 2460 taccaagctg aacgacctgt gcttcacaaa cgtgtacgcc gacagcttcg tgatccgggg 2520 agatgaagtg cggcagattg cccctggaca gacaggcaag atcgccgact acaactacaa 2580 gctgcccgac gacttcaccg gctgtgtgat tgcctggaac agcaacaacc tggactccaa 2640 agtcggcggc aactacaatt acctgtaccg gctgttccgg aagtccaatc tgaagccctt 2700 cgagcgggac atctccaccg agatctatca ggccggcagc accccttgta acggcgtgga 2760 aggcttcaac tgctacttcc cactgcagtc ctacggcttt cagcccacaa atggcgtggg 2820 ctatcagccc tacagagtgg tggtgctgag cttcgaactg ctgcatgccc ctgccacagt 2880 gtgcggccct aagaaaagca ccaatctcgt gaagaacaaa tgcgtgaact tcaacttcaa 2940 cggcctgacc ggcaccggcg tgctgacaga gagcaacaag aagttcctgc cattccagca 3000 gtttggccgg gatatcgccg ataccacaga cgccgttaga gatccccaga cactggaaat 3060 cctggacatc accccttgca gcttcggcgg agtgtctgtg atcacccctg gcaccaacac 3120 cagcaatcag gtggcagtgc tgtaccaggg cgtgaactgt accgaagtgc ccgtggccat 3180 tcacgccgat cagctgacac ctacatggcg ggtgtactcc accggcagca atgtgtttca 3240 gaccagagcc ggctgtctga tcggagccga gcacgtgaac aatagctacg agtgcgacat 3300 ccccatcggc gctggcatct gtgccagcta ccagacacag acaaacagcc ccagacgggc 3360 cagatctgtg gccagccaga gcatcattgc ctacacaatg tctctgggcg ccgagaacag 3420 cgtggcctac tccaacaact ctatcgctat ccccaccaac ttcaccatca gcgtgaccac 3480 agagatcctg cctgtgtcca tgaccaagac cagcgtggac tgcaccatgt acatctgcgg 3540 cgattccacc gagtgctcca acctgctgct gcagtacggc agcttctgca cccagctgaa 3600 tagagccctg acagggatcg ccgtggaaca ggacaagaac acccaagagg tgttcgccca 3660 agtgaagcag atctacaaga cccctcctat caaggacttc ggcggcttca atttcagcca 3720 gattctgccc gatcctagca agcccagcaa gcggagcttc atcgaggacc tgctgttcaa 3780 caaagtgaca ctggccgacg ccggcttcat caagcagtat ggcgattgtc tgggcgacat 3840 tgccgccagg gatctgattt gcgcccagaa gtttaacgga ctgacagtgc tgccaccact 3900 gctgaccgat gagatgatcg cccagtacac atctgccctg ctggccggca caatcacaag 3960 cggctggaca tttggagctg gcgccgctct gcagatcccc tttgctatgc agatggccta 4020 ccggttcaac ggcatcggag tgacccagaa tgtgctgtac gagaaccaga agctgatcgc 4080 caaccagttc aacagcgcca tcggcaagat ccaggacagc ctgagcagca cagcaagcgc 4140 cctgggaaag ctgcaggacg tggtcaacca gaatgcccag gcactgaaca ccctggtcaa 4200 gcagctgtcc tccaacttcg gcgccatcag ctctgtgctg aacgatatcc tgagcagact 4260 ggacaaggtg gaagccgagg tgcagatcga cagactgatc accggaaggc tgcagtccct 4320 gcagacctac gttacccagc agctgatcag agccgccgag attagagcct ctgccaatct 4380 ggccgccacc aagatgtctg agtgtgtgct gggccagagc aagagagtgg acttttgcgg 4440 caagggctac cacctgatga gcttccctca gtctgcccct cacggcgtgg tgtttctgca 4500 cgtgacatac gtgcccgctc aagagaagaa tttcaccacc gctccagcca tctgccacga 4560 cggcaaagcc cactttccta gagaaggcgt gttcgtgtcc aacggcaccc attggttcgt 4620 gacccagcgg aacttctacg agccccagat catcaccacc gacaacacct tcgtgtctgg 4680 caactgcgac gtcgtgatcg gcattgtgaa caataccgtg tacgaccctc tgcagcccga 4740 gctggacagc ttcaaagagg aactggataa gtactttaag aaccacacaa gccccgacgt 4800 ggacctgggc gatatcagcg gaatcaatgc cagcgtcgtg aacatccaga aagagatcga 4860 ccggctgaac gaggtggcca agaatctgaa cgagagcctg atcgacctgc aagaactggg 4920 gaagtacgag cagtacatca agtggccctg gtacatctgg ctgggcttta tcgccggact 4980 gattgccatc gtgatggtca caatcatgct gtgttgcatg accagctgct gtagctgcct 5040 gaagggctgt tgtagctgtg gcagctgctg caagttcgac gaggacgatt ctgagcccgt 5100 gctgaagggc gtgaaactgc actacaccta atctagagtc gactgtttaa acctgcaggc 5160 atgcaagctg atctttttcc ctctgccaaa aattatgggg acatcatgaa gccccttgag 5220 catctgactt ctggctaata aaggaaattt attttcattg caatagtgtg ttggaatttt 5280 ttgtgtctct cactcggaag gacatatggg agggcaaatc atttaaaaca tcagaatgag 5340 tatttggttt agagtttggc aacatatgcc atatgctggc tgccatgaac aaaggtggct 5400 ataaagaggt catcagtata tgaaacagcc ccctgctgtc cattccttat tccatagaaa 5460 agccttgact tgaggttaga ttttttttat attttgtttt gtgttatttt tttctttaac 5520 atccctaaaa ttttccttac atgttttact agccagattt ttcctcctct cctgactact 5580 cccagtcata gctgtccctc ttctcttatg aactcgagga gctttttgca aaagcctagg 5640 cctccaaaaa agcctcctca ctacttctgg aatagctcag aggccgaggc ggcctcggcc 5700 tctgcataaa taaaaaaaat tagtcagcca tggggcggag aatgggcgga actgggcgga 5760 gttaggggcg ggatgggcgg agttaggggc gggactatgg ttgctgacta attgagactg 5820 cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct 5880 tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac 5940 tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga 6000 gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat 6060 aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac 6120 ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct 6180 gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg 6240 ctttctcaat gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg 6300 ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt 6360 cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg 6420 attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac 6480 ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga 6540 aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt 6600 gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt 6660 tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga 6720 ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc 6780 taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct 6840 atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt cgtgtagata 6900 actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca 6960 cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga 7020 agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg ggaagctaga 7080 gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg 7140 gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga 7200 gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt 7260 gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact gcataattct 7320 cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca 7380 ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat 7440 accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga 7500 aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc 7560 aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg 7620 caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc 7680 ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt 7740 gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaacgtctt 7800 caagctgcct cgcgcgtttc ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg 7860 agacggtcac agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt 7920 cagcgggtgt tggcgggtgt cggggcgcag ccatgaccca gtcacgtagc gatagcggag 7980 ttggcttaac tatgcggcat cagagcagat tgtactgaga gtgcaccata tcgacgctct 8040 cccttatgcg actcctgcat taggaagcag cccagtagta ggttgaggcc gttgagcacc 8100 gccgccgcaa ggaatggtgc tggcttatcg aaattaatcg actcactata gggagaccc 8159 <210> 21 <211> 8102 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> plasmids encoding Spike D614 DeltaCter <400> 21 gaattcgagc tcgccccgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 60 acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 120 ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 180 aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 240 ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 300 tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc 360 ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt 420 ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa 480 tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctcgttta gtgaaccgtc 540 agatcgcctg gagacgccat ccacgctgtt ttgacctcca tagaagacac cgggaccgat 600 ccagcctccg ggggatcgat cccccgatcc tgagaacttc agggtgagtt tggggaccct 660 tgattgttct ttctttttcg ctattgtaaa attcatgtta tatggagggg gcaaagtttt 720 cagggtgttg tttagaatgg gaagatgtcc cttgtatcac catggaccct catgataatt 780 ttgtttcttt cactttctac tctgttgaca accattgtct cctcttattt tcttttcatt 840 ttctgtaact ttttcgttaa actttagctt gcatttgtaa cgaattttta aattcacttt 900 tgtttatttg tcagattgta agtactttct ctaatcactt ttttttcaag gcaatcaggg 960 tatattatat tgtacttcag cacagtttta gagaacaatt gttataatta aatgataagg 1020 tagaatattt ctgcatataa attctggctg gcgtggaaat attcttattg gtagaaacaa 1080 ctacatcctg gtcatcatcc tgcctttctc tttatggtta caatgatata cactgtttga 1140 gatgaggata aaatactctg agtccaaacc gggcccctct gctaaccatg ttcatgcctt 1200 cttctttttc ctacagctcc tgggcaacgt gctggttatt gtgctgtctc atcattttgg 1260 caaagaattg taatacgact cactataggg cgaattcgga tccgccacca tgttcgtgtt 1320 tctggtgctg ctgcctctgg tgtccagcca gtgtgtgaac ctgaccacaa gaacccagct 1380 gcctccagcc tacaccaaca gctttaccag aggcgtgtac taccccgaca aggtgttcag 1440 atccagcgtg ctgcactcta cccaggacct gttcctgcct ttcttcagca acgtgacctg 1500 gttccacgcc atccacgtgt ccggcaccaa tggcaccaag agattcgaca accccgtgct 1560 gcccttcaac gacggggtgt actttgccag caccgagaag tccaacatca tcagaggctg 1620 gatcttcggc accacactgg acagcaagac ccagagcctg ctgatcgtga acaacgccac 1680 caacgtggtc atcaaagtgt gcgagttcca gttctgcaac gaccccttcc tgggcgtcta 1740 ctatcacaag aacaacaaga gctggatgga aagcgagttc cgggtgtaca gcagcgccaa 1800 caactgcacc ttcgagtacg tgtcccagcc tttcctgatg gacctggaag gcaagcaggg 1860 caacttcaag aacctgcgcg agttcgtgtt caagaacatc gacggctact tcaagatcta 1920 cagcaagcac acccctatca acctcgtgcg ggatctgcct cagggcttct ctgctctgga 1980 acccctggtg gatctgccca tcggcatcaa catcacccgg tttcagacac tgctggccct 2040 gcacagaagc tacctgacac ctggcgatag cagcagcgga tggacagctg gtgccgccgc 2100 ttactatgtg ggctacctgc agcctagaac cttcctgctg aagtacaacg agaacggcac 2160 catcaccgac gccgtggatt gtgcccttga tcctctgagc gagacaaagt gcaccctgaa 2220 gtccttcacc gtggaaaagg gcatctacca gaccagcaac ttccgggtgc agcccaccga 2280 atccatcgtg cggttcccca atatcaccaa tctgtgcccc ttcggcgagg tgttcaatgc 2340 caccagattc gcctctgtgt acgcctggaa ccggaagcgg atcagcaatt gcgtggccga 2400 ctactccgtg ctgtacaact ccgccagctt cagcaccttc aagtgctacg gcgtgtcccc 2460 taccaagctg aacgacctgt gcttcacaaa cgtgtacgcc gacagcttcg tgatccgggg 2520 agatgaagtg cggcagattg cccctggaca gacaggcaag atcgccgact acaactacaa 2580 gctgcccgac gacttcaccg gctgtgtgat tgcctggaac agcaacaacc tggactccaa 2640 agtcggcggc aactacaatt acctgtaccg gctgttccgg aagtccaatc tgaagccctt 2700 cgagcgggac atctccaccg agatctatca ggccggcagc accccttgta acggcgtgga 2760 aggcttcaac tgctacttcc cactgcagtc ctacggcttt cagcccacaa atggcgtggg 2820 ctatcagccc tacagagtgg tggtgctgag cttcgaactg ctgcatgccc ctgccacagt 2880 gtgcggccct aagaaaagca ccaatctcgt gaagaacaaa tgcgtgaact tcaacttcaa 2940 cggcctgacc ggcaccggcg tgctgacaga gagcaacaag aagttcctgc cattccagca 3000 gtttggccgg gatatcgccg ataccacaga cgccgttaga gatccccaga cactggaaat 3060 cctggacatc accccttgca gcttcggcgg agtgtctgtg atcacccctg gcaccaacac 3120 cagcaatcag gtggcagtgc tgtaccagga cgtgaactgt accgaagtgc ccgtggccat 3180 tcacgccgat cagctgacac ctacatggcg ggtgtactcc accggcagca atgtgtttca 3240 gaccagagcc ggctgtctga tcggagccga gcacgtgaac aatagctacg agtgcgacat 3300 ccccatcggc gctggcatct gtgccagcta ccagacacag acaaacagcc ccagacgggc 3360 cagatctgtg gccagccaga gcatcattgc ctacacaatg tctctgggcg ccgagaacag 3420 cgtggcctac tccaacaact ctatcgctat ccccaccaac ttcaccatca gcgtgaccac 3480 agagatcctg cctgtgtcca tgaccaagac cagcgtggac tgcaccatgt acatctgcgg 3540 cgattccacc gagtgctcca acctgctgct gcagtacggc agcttctgca cccagctgaa 3600 tagagccctg acagggatcg ccgtggaaca ggacaagaac acccaagagg tgttcgccca 3660 agtgaagcag atctacaaga cccctcctat caaggacttc ggcggcttca atttcagcca 3720 gattctgccc gatcctagca agcccagcaa gcggagcttc atcgaggacc tgctgttcaa 3780 caaagtgaca ctggccgacg ccggcttcat caagcagtat ggcgattgtc tgggcgacat 3840 tgccgccagg gatctgattt gcgcccagaa gtttaacgga ctgacagtgc tgccaccact 3900 gctgaccgat gagatgatcg cccagtacac atctgccctg ctggccggca caatcacaag 3960 cggctggaca tttggagctg gcgccgctct gcagatcccc tttgctatgc agatggccta 4020 ccggttcaac ggcatcggag tgacccagaa tgtgctgtac gagaaccaga agctgatcgc 4080 caaccagttc aacagcgcca tcggcaagat ccaggacagc ctgagcagca cagcaagcgc 4140 cctgggaaag ctgcaggacg tggtcaacca gaatgcccag gcactgaaca ccctggtcaa 4200 gcagctgtcc tccaacttcg gcgccatcag ctctgtgctg aacgatatcc tgagcagact 4260 ggacaaggtg gaagccgagg tgcagatcga cagactgatc accggaaggc tgcagtccct 4320 gcagacctac gttacccagc agctgatcag agccgccgag attagagcct ctgccaatct 4380 ggccgccacc aagatgtctg agtgtgtgct gggccagagc aagagagtgg acttttgcgg 4440 caagggctac cacctgatga gcttccctca gtctgcccct cacggcgtgg tgtttctgca 4500 cgtgacatac gtgcccgctc aagagaagaa tttcaccacc gctccagcca tctgccacga 4560 cggcaaagcc cactttccta gagaaggcgt gttcgtgtcc aacggcaccc attggttcgt 4620 gacccagcgg aacttctacg agccccagat catcaccacc gacaacacct tcgtgtctgg 4680 caactgcgac gtcgtgatcg gcattgtgaa caataccgtg tacgaccctc tgcagcccga 4740 gctggacagc ttcaaagagg aactggataa gtactttaag aaccacacaa gccccgacgt 4800 ggacctgggc gatatcagcg gaatcaatgc cagcgtcgtg aacatccaga aagagatcga 4860 ccggctgaac gaggtggcca agaatctgaa cgagagcctg atcgacctgc aagaactggg 4920 gaagtacgag cagtacatca agtggccctg gtacatctgg ctgggcttta tcgccggact 4980 gattgccatc gtgatggtca caatcatgct gtgttgcatg accagctgct gtagctgcct 5040 gaagggctgt tgtagctgtg gcagctgctg ctaatctaga gtcgactgtt taaacctgca 5100 ggcatgcaag ctgatctttt tccctctgcc aaaaattatg gggacatcat gaagcccctt 5160 gagcatctga cttctggcta ataaaggaaa tttattttca ttgcaatagt gtgttggaat 5220 tttttgtgtc tctcactcgg aaggacatat gggagggcaa atcatttaaa acatcagaat 5280 gagtatttgg tttagagttt ggcaacatat gccatatgct ggctgccatg aacaaaggtg 5340 gctataaaga ggtcatcagt atatgaaaca gccccctgct gtccattcct tattccatag 5400 aaaagccttg acttgaggtt agattttttt tatattttgt tttgtgttat ttttttcttt 5460 aacatcccta aaattttcct tacatgtttt actagccaga tttttcctcc tctcctgact 5520 actcccagtc atagctgtcc ctcttctctt atgaactcga ggagcttttt gcaaaagcct 5580 aggcctccaa aaaagcctcc tcactacttc tggaatagct cagaggccga ggcggcctcg 5640 gcctctgcat aaataaaaaa aattagtcag ccatggggcg gagaatgggc ggaactgggc 5700 ggagttaggg gcgggatggg cggagttagg ggcgggacta tggttgctga ctaattgaga 5760 ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc 5820 gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct 5880 cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg 5940 tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc 6000 cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga 6060 aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct 6120 cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg 6180 gcgctttctc aatgctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag 6240 ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat 6300 cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac 6360 aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac 6420 tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc 6480 ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt 6540 tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc 6600 ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg 6660 agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca 6720 atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca 6780 cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag 6840 ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac 6900 ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc 6960 agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct 7020 agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc 7080 gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg 7140 cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc 7200 gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat 7260 tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag 7320 tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat 7380 aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg 7440 cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca 7500 cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga 7560 aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc 7620 ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata 7680 tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaacgt 7740 cttcaagctg cctcgcgcgt ttcggtgatg acggtgaaaa cctctgacac atgcagctcc 7800 cggagacggt cacagcttgt ctgtaagcgg atgccgggag cagacaagcc cgtcagggcg 7860 cgtcagcggg tgttggcggg tgtcggggcg cagccatgac ccagtcacgt agcgatagcg 7920 gagttggctt aactatgcgg catcagagca gattgtactg agagtgcacc atatcgacgc 7980 tctcccttat gcgactcctg cattaggaag cagcccagta gtaggttgag gccgttgagc 8040 accgccgccg caaggaatgg tgctggctta tcgaaattaa tcgactcact atagggagac 8100 cc 8102 <210> 22 <211> 8102 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> plasmids Spike G614 DeltaCter <400> 22 gaattcgagc tcgccccgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 60 acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 120 ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 180 aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 240 ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 300 tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc 360 ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt 420 ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa 480 tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctcgttta gtgaaccgtc 540 agatcgcctg gagacgccat ccacgctgtt ttgacctcca tagaagacac cgggaccgat 600 ccagcctccg ggggatcgat cccccgatcc tgagaacttc agggtgagtt tggggaccct 660 tgattgttct ttctttttcg ctattgtaaa attcatgtta tatggagggg gcaaagtttt 720 cagggtgttg tttagaatgg gaagatgtcc cttgtatcac catggaccct catgataatt 780 ttgtttcttt cactttctac tctgttgaca accattgtct cctcttattt tcttttcatt 840 ttctgtaact ttttcgttaa actttagctt gcatttgtaa cgaattttta aattcacttt 900 tgtttatttg tcagattgta agtactttct ctaatcactt ttttttcaag gcaatcaggg 960 tatattatat tgtacttcag cacagtttta gagaacaatt gttataatta aatgataagg 1020 tagaatattt ctgcatataa attctggctg gcgtggaaat attcttattg gtagaaacaa 1080 ctacatcctg gtcatcatcc tgcctttctc tttatggtta caatgatata cactgtttga 1140 gatgaggata aaatactctg agtccaaacc gggcccctct gctaaccatg ttcatgcctt 1200 cttctttttc ctacagctcc tgggcaacgt gctggttatt gtgctgtctc atcattttgg 1260 caaagaattg taatacgact cactataggg cgaattcgga tccgccacca tgttcgtgtt 1320 tctggtgctg ctgcctctgg tgtccagcca gtgtgtgaac ctgaccacaa gaacccagct 1380 gcctccagcc tacaccaaca gctttaccag aggcgtgtac taccccgaca aggtgttcag 1440 atccagcgtg ctgcactcta cccaggacct gttcctgcct ttcttcagca acgtgacctg 1500 gttccacgcc atccacgtgt ccggcaccaa tggcaccaag agattcgaca accccgtgct 1560 gcccttcaac gacggggtgt actttgccag caccgagaag tccaacatca tcagaggctg 1620 gatcttcggc accacactgg acagcaagac ccagagcctg ctgatcgtga acaacgccac 1680 caacgtggtc atcaaagtgt gcgagttcca gttctgcaac gaccccttcc tgggcgtcta 1740 ctatcacaag aacaacaaga gctggatgga aagcgagttc cgggtgtaca gcagcgccaa 1800 caactgcacc ttcgagtacg tgtcccagcc tttcctgatg gacctggaag gcaagcaggg 1860 caacttcaag aacctgcgcg agttcgtgtt caagaacatc gacggctact tcaagatcta 1920 cagcaagcac acccctatca acctcgtgcg ggatctgcct cagggcttct ctgctctgga 1980 acccctggtg gatctgccca tcggcatcaa catcacccgg tttcagacac tgctggccct 2040 gcacagaagc tacctgacac ctggcgatag cagcagcgga tggacagctg gtgccgccgc 2100 ttactatgtg ggctacctgc agcctagaac cttcctgctg aagtacaacg agaacggcac 2160 catcaccgac gccgtggatt gtgcccttga tcctctgagc gagacaaagt gcaccctgaa 2220 gtccttcacc gtggaaaagg gcatctacca gaccagcaac ttccgggtgc agcccaccga 2280 atccatcgtg cggttcccca atatcaccaa tctgtgcccc ttcggcgagg tgttcaatgc 2340 caccagattc gcctctgtgt acgcctggaa ccggaagcgg atcagcaatt gcgtggccga 2400 ctactccgtg ctgtacaact ccgccagctt cagcaccttc aagtgctacg gcgtgtcccc 2460 taccaagctg aacgacctgt gcttcacaaa cgtgtacgcc gacagcttcg tgatccgggg 2520 agatgaagtg cggcagattg cccctggaca gacaggcaag atcgccgact acaactacaa 2580 gctgcccgac gacttcaccg gctgtgtgat tgcctggaac agcaacaacc tggactccaa 2640 agtcggcggc aactacaatt acctgtaccg gctgttccgg aagtccaatc tgaagccctt 2700 cgagcgggac atctccaccg agatctatca ggccggcagc accccttgta acggcgtgga 2760 aggcttcaac tgctacttcc cactgcagtc ctacggcttt cagcccacaa atggcgtggg 2820 ctatcagccc tacagagtgg tggtgctgag cttcgaactg ctgcatgccc ctgccacagt 2880 gtgcggccct aagaaaagca ccaatctcgt gaagaacaaa tgcgtgaact tcaacttcaa 2940 cggcctgacc ggcaccggcg tgctgacaga gagcaacaag aagttcctgc cattccagca 3000 gtttggccgg gatatcgccg ataccacaga cgccgttaga gatccccaga cactggaaat 3060 cctggacatc accccttgca gcttcggcgg agtgtctgtg atcacccctg gcaccaacac 3120 cagcaatcag gtggcagtgc tgtaccaggg cgtgaactgt accgaagtgc ccgtggccat 3180 tcacgccgat cagctgacac ctacatggcg ggtgtactcc accggcagca atgtgtttca 3240 gaccagagcc ggctgtctga tcggagccga gcacgtgaac aatagctacg agtgcgacat 3300 ccccatcggc gctggcatct gtgccagcta ccagacacag acaaacagcc ccagacgggc 3360 cagatctgtg gccagccaga gcatcattgc ctacacaatg tctctgggcg ccgagaacag 3420 cgtggcctac tccaacaact ctatcgctat ccccaccaac ttcaccatca gcgtgaccac 3480 agagatcctg cctgtgtcca tgaccaagac cagcgtggac tgcaccatgt acatctgcgg 3540 cgattccacc gagtgctcca acctgctgct gcagtacggc agcttctgca cccagctgaa 3600 tagagccctg acagggatcg ccgtggaaca ggacaagaac acccaagagg tgttcgccca 3660 agtgaagcag atctacaaga cccctcctat caaggacttc ggcggcttca atttcagcca 3720 gattctgccc gatcctagca agcccagcaa gcggagcttc atcgaggacc tgctgttcaa 3780 caaagtgaca ctggccgacg ccggcttcat caagcagtat ggcgattgtc tgggcgacat 3840 tgccgccagg gatctgattt gcgcccagaa gtttaacgga ctgacagtgc tgccaccact 3900 gctgaccgat gagatgatcg cccagtacac atctgccctg ctggccggca caatcacaag 3960 cggctggaca tttggagctg gcgccgctct gcagatcccc tttgctatgc agatggccta 4020 ccggttcaac ggcatcggag tgacccagaa tgtgctgtac gagaaccaga agctgatcgc 4080 caaccagttc aacagcgcca tcggcaagat ccaggacagc ctgagcagca cagcaagcgc 4140 cctgggaaag ctgcaggacg tggtcaacca gaatgcccag gcactgaaca ccctggtcaa 4200 gcagctgtcc tccaacttcg gcgccatcag ctctgtgctg aacgatatcc tgagcagact 4260 ggacaaggtg gaagccgagg tgcagatcga cagactgatc accggaaggc tgcagtccct 4320 gcagacctac gttacccagc agctgatcag agccgccgag attagagcct ctgccaatct 4380 ggccgccacc aagatgtctg agtgtgtgct gggccagagc aagagagtgg acttttgcgg 4440 caagggctac cacctgatga gcttccctca gtctgcccct cacggcgtgg tgtttctgca 4500 cgtgacatac gtgcccgctc aagagaagaa tttcaccacc gctccagcca tctgccacga 4560 cggcaaagcc cactttccta gagaaggcgt gttcgtgtcc aacggcaccc attggttcgt 4620 gacccagcgg aacttctacg agccccagat catcaccacc gacaacacct tcgtgtctgg 4680 caactgcgac gtcgtgatcg gcattgtgaa caataccgtg tacgaccctc tgcagcccga 4740 gctggacagc ttcaaagagg aactggataa gtactttaag aaccacacaa gccccgacgt 4800 ggacctgggc gatatcagcg gaatcaatgc cagcgtcgtg aacatccaga aagagatcga 4860 ccggctgaac gaggtggcca agaatctgaa cgagagcctg atcgacctgc aagaactggg 4920 gaagtacgag cagtacatca agtggccctg gtacatctgg ctgggcttta tcgccggact 4980 gattgccatc gtgatggtca caatcatgct gtgttgcatg accagctgct gtagctgcct 5040 gaagggctgt tgtagctgtg gcagctgctg ctaatctaga gtcgactgtt taaacctgca 5100 ggcatgcaag ctgatctttt tccctctgcc aaaaattatg gggacatcat gaagcccctt 5160 gagcatctga cttctggcta ataaaggaaa tttattttca ttgcaatagt gtgttggaat 5220 tttttgtgtc tctcactcgg aaggacatat gggagggcaa atcatttaaa acatcagaat 5280 gagtatttgg tttagagttt ggcaacatat gccatatgct ggctgccatg aacaaaggtg 5340 gctataaaga ggtcatcagt atatgaaaca gccccctgct gtccattcct tattccatag 5400 aaaagccttg acttgaggtt agattttttt tatattttgt tttgtgttat ttttttcttt 5460 aacatcccta aaattttcct tacatgtttt actagccaga tttttcctcc tctcctgact 5520 actcccagtc atagctgtcc ctcttctctt atgaactcga ggagcttttt gcaaaagcct 5580 aggcctccaa aaaagcctcc tcactacttc tggaatagct cagaggccga ggcggcctcg 5640 gcctctgcat aaataaaaaa aattagtcag ccatggggcg gagaatgggc ggaactgggc 5700 ggagttaggg gcgggatggg cggagttagg ggcgggacta tggttgctga ctaattgaga 5760 ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc 5820 gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct 5880 cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg 5940 tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc 6000 cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga 6060 aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct 6120 cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg 6180 gcgctttctc aatgctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag 6240 ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat 6300 cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac 6360 aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac 6420 tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc 6480 ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt 6540 tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc 6600 ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg 6660 agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca 6720 atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca 6780 cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag 6840 ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac 6900 ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc 6960 agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct 7020 agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc 7080 gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg 7140 cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc 7200 gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat 7260 tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag 7320 tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat 7380 aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg 7440 cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca 7500 cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga 7560 aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc 7620 ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata 7680 tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaacgt 7740 cttcaagctg cctcgcgcgt ttcggtgatg acggtgaaaa cctctgacac atgcagctcc 7800 cggagacggt cacagcttgt ctgtaagcgg atgccgggag cagacaagcc cgtcagggcg 7860 cgtcagcggg tgttggcggg tgtcggggcg cagccatgac ccagtcacgt agcgatagcg 7920 gagttggctt aactatgcgg catcagagca gattgtactg agagtgcacc atatcgacgc 7980 tctcccttat gcgactcctg cattaggaag cagcccagta gtaggttgag gccgttgagc 8040 accgccgccg caaggaatgg tgctggctta tcgaaattaa tcgactcact atagggagac 8100 cc 8102 <210> 23 <211> 4337 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> plasmids encoding empty vector <400> 23 gaattcgagc tcgccccgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 60 acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 120 ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 180 aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 240 ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 300 tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc 360 ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt 420 ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa 480 tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctcgttta gtgaaccgtc 540 agatcgcctg gagacgccat ccacgctgtt ttgacctcca tagaagacac cgggaccgat 600 ccagcctccg ggggatcgat cccccgatcc tgagaacttc agggtgagtt tggggaccct 660 tgattgttct ttctttttcg ctattgtaaa attcatgtta tatggagggg gcaaagtttt 720 cagggtgttg tttagaatgg gaagatgtcc cttgtatcac catggaccct catgataatt 780 ttgtttcttt cactttctac tctgttgaca accattgtct cctcttattt tcttttcatt 840 ttctgtaact ttttcgttaa actttagctt gcatttgtaa cgaattttta aattcacttt 900 tgtttatttg tcagattgta agtactttct ctaatcactt ttttttcaag gcaatcaggg 960 tatattatat tgtacttcag cacagtttta gagaacaatt gttataatta aatgataagg 1020 tagaatattt ctgcatataa attctggctg gcgtggaaat attcttattg gtagaaacaa 1080 ctacatcctg gtcatcatcc tgcctttctc tttatggtta caatgatata cactgtttga 1140 gatgaggata aaatactctg agtccaaacc gggcccctct gctaaccatg ttcatgcctt 1200 cttctttttc ctacagctcc tgggcaacgt gctggttatt gtgctgtctc atcattttgg 1260 caaagaattg taatacgact cactataggg cgaattcgga tccgccacct ctagagtcga 1320 ctgtttaaac ctgcaggcat gcaagctgat ctttttccct ctgccaaaaa ttatggggac 1380 atcatgaagc cccttgagca tctgacttct ggctaataaa ggaaatttat tttcattgca 1440 atagtgtgtt ggaatttttt gtgtctctca ctcggaagga catatgggag ggcaaatcat 1500 ttaaaacatc agaatgagta tttggtttag agtttggcaa catatgccat atgctggctg 1560 ccatgaacaa aggtggctat aaagaggtca tcagtatatg aaacagcccc ctgctgtcca 1620 ttccttattc catagaaaag ccttgacttg aggttagatt ttttttatat tttgttttgt 1680 gttatttttt tctttaacat ccctaaaatt ttccttacat gttttactag ccagattttt 1740 cctcctctcc tgactactcc cagtcatagc tgtccctctt ctcttatgaa ctcgaggagc 1800 tttttgcaaa agcctaggcc tccaaaaaag cctcctcact acttctggaa tagctcagag 1860 gccgaggcgg cctcggcctc tgcataaata aaaaaaatta gtcagccatg gggcggagaa 1920 tgggcggaac tgggcggagt taggggcggg atgggcggag ttaggggcgg gactatggtt 1980 gctgactaat tgagactgca ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt 2040 attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg 2100 cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac 2160 gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg 2220 ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca 2280 agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc 2340 tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc 2400 ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcaatgc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag 2460 gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc 2520 ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca 2580 gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg 2640 aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga aggacagtat ttggtatctg cgctctgctg 2700 aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct 2760 ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa 2820 gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa 2880 gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa 2940 tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc 3000 ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat agttgcctga 3060 ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg gagggcttac catctggccc cagtgctgca 3120 atgataccgc gagacccacg ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc 3180 ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca actttatccg cctccatcca gtctattaat 3240 tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc 3300 attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt 3360 tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc 3420 ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact catggttatg 3480 gcagcactgc ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt 3540 gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg 3600 gcgtcaatac gggataatac cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct catcattgga 3660 aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg 3720 taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg 3780 tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt 3840 tgaatactca tactcttcct ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc 3900 atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca 3960 tttccccgaa aacgtcttca agctgcctcg cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct 4020 gacacatgca gctcccggag acggtcacag cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac 4080 aagcccgtca gggcgcgtca gcgggtgttg gcgggtgtcg gggcgcagcc atgacccagt 4140 cacgtagcga tagcggagtt ggcttaacta tgcggcatca gagcagattg tactgagagt 4200 gcaccatatc gacgctctcc cttatgcgac tcctgcatta ggaagcagcc cagtagtagg 4260 ttgaggccgt tgagcaccgc cgccgcaagg aatggtgctg gcttatcgaa attaatcgac 4320 tcactatagg gagaccc 4337 <210> 24 <211> 9893 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Vector for ACE2 transduction <400> 24 acgcgtgtag tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atggtaacga tgagttagca 60 acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta 120 cgatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac gggtctgaca tggattggac gaaccactga 180 attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacaata aacgggtctc 240 tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 300 agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 360 ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg 420 cccgaacagg gacctgaaag cgaaagggaa accagagctc tctcgacgca ggactcggct 480 tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg gcggcgactg gtgagtacgc caaaaatttt 540 gactagcgga ggctagaagg agagagatgg gtgcgagagc gtcagtatta agcgggggag 600 aattagatcg cgatgggaaa aaattcggtt aaggccaggg ggaaagaaaa aatataaatt 660 aaaacatata gtatgggcaa gcagggagct agaacgattc gcagttaatc ctggcctgtt 720 agaaacatca gaaggctgta gacaaatact gggacagcta caaccatccc ttcagacagg 780 atcagaagaa cttagatcat tatataatac agtagcaacc ctctattgtg tgcatcaaag 840 gatagagata aaagacacca aggaagcttt agacaagata gaggaagagc aaaacaaaag 900 taagaccacc gcacagcaag cggccactga tcttcagacc tggaggagga gatatgaggg 960 acaattggag aagtgaatta tataaatata aagtagtaaa aattgaacca ttaggagtag 1020 cacccaccaa ggcaaagaga agagtggtgc agagagaaaa aagagcagtg ggaataggag 1080 ctttgttcct tgggttcttg ggagcagcag gaagcactat gggcgcagcg tcaatgacgc 1140 tgacggtaca ggccagacaa ttattgtctg gtatagtgca gcagcagaac aatttgctga 1200 gggctattga ggcgcaacag catctgttgc aactcacagt ctggggcatc aagcagctcc 1260 aggcaagaat cctggctgtg gaaagatacc taaaggatca acagctcctg gggatttggg 1320 gttgctctgg aaaactcatt tgcaccactg ctgtgccttg gaatgctagt tggagtaata 1380 aatctctgga acagatttgg aatcacacga cctggatgga gtgggacaga gaaattaaca 1440 attacacaag cttaatacac tccttaattg aagaatcgca aaaccagcaa gaaaagaatg 1500 aacaagaatt attggaatta gataaatggg caagtttgtg gaattggttt aacataacaa 1560 attggctgtg gtatataaaa ttattcataa tgatagtagg aggcttggta ggtttaagaa 1620 tagtttttgc tgtactttct atagtgaata gagttaggca gggatattca ccattatcgt 1680 ttcagaccca cctcccaacc ccgaggggac ccgacaggcc cgaaggaata gaagaagaag 1740 gtggagagag agacagagac agatccattc gattagtgaa cggatctcga cggtatcggt 1800 taacttttaa aagaaaaggg gggattgggg ggtacagtgc aggggaaaga atagtagaca 1860 taatagcaac agacatacaa actaaagaat tacaaaaaca aattacaaaa ttcaaaattt 1920 tatcgattac tagtattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta 1980 catctacgta ttagtcatcg ctattaccat ggtgatgcgg ttttggcagt acatcaatgg 2040 gcgtggatag cggtttgact cacggggatt tccaagtctc caccccattg acgtcaatgg 2100 gagtttgttt tggcaccaaa atcaacggga ctttccaaaa tgtcgtaaca actccgcccc 2160 attgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg gtgggaggtt tatataagca gagctcgttt 2220 agtgaaccgt cagatcgcct ggagacgcca tccacgctgt tttgacctcc atagaagatt 2280 ctagagctag cgtttaaact taagcttggt accgagctcg gatccactag tccagtgtgg 2340 tggaattctg cagatatcca gcacagtggc ggccgctcga gatgtcaagc tcttcctggc 2400 tccttctcag ccttgttgct gtaactgctg ctcagtccac cattgaggaa caggccaaga 2460 catttttgga caagtttaac cacgaagccg aagacctgtt ctatcaaagt tcacttgctt 2520 cttggaatta taacaccaat attactgaag agaatgtcca aaacatgaat aatgctgggg 2580 acaaatggtc tgccttttta aaggaacagt ccacacttgc ccaaatgtat ccactacaag 2640 aaattcagaa tctcacagtc aagcttcagc tgcaggctct tcagcaaaat gggtcttcag 2700 tgctctcaga agacaagagc aaacggttga acacaattct aaatacaatg agcaccatct 2760 acagtactgg aaaagtttgt aacccagata atccacaaga atgcttatta cttgaaccag 2820 gtttgaatga aataatggca aacagtttag actacaatga gaggctctgg gcttgggaaa 2880 gctggagatc tgaggtcggc aagcagctga ggccattata tgaagagtat gtggtcttga 2940 aaaatgagat ggcaagagca aatcattatg aggactatgg ggattattgg agaggagact 3000 atgaagtaaa tggggtagat ggctatgact acagccgcgg ccagttgatt gaagatgtgg 3060 aacatacctt tgaagagatt aaaccattat atgaacatct tcatgcctat gtgagggcaa 3120 agttgatgaa tgcctatcct tcctatatca gtccaattgg atgcctccct gctcatttgc 3180 ttggtgatat gtggggtaga ttttggacaa atctgtactc tttgacagtt ccctttggac 3240 agaaaccaaa catagatgtt actgatgcaa tggtggacca ggcctgggat gcacagagaa 3300 tattcaagga ggccgagaag ttctttgtat ctgttggtct tcctaatatg actcaaggat 3360 tctgggaaaa ttccatgcta acggacccag gaaatgttca gaaagcagtc tgccatccca 3420 cagcttggga cctggggaag ggcgacttca ggatccttat gtgcacaaag gtgacaatgg 3480 acgacttcct gacagctcat catgagatgg ggcatatcca gtatgatatg gcatatgctg 3540 cacaaccttt tctgctaaga aatggagcta atgaaggatt ccatgaagct gttggggaaa 3600 tcatgtcact ttctgcagcc acacctaagc atttaaaatc cattggtctt ctgtcacccg 3660 attttcaaga agacaatgaa acagaaataa acttcctgct caaacaagca ctcacgattg 3720 ttgggactct gccatttact tacatgttag agaagtggag gtggatggtc tttaaagggg 3780 aaattcccaa agaccagtgg atgaaaaagt ggtgggagat gaagcgagag atagttgggg 3840 tggtggaacc tgtgccccat gatgaaacat actgtgaccc cgcatctctg ttccatgttt 3900 ctaatgatta ctcattcatt cgatattaca caaggaccct ttaccaattc cagtttcaag 3960 aagcactttg tcaagcagct aaacatgaag gccctctgca caaatgtgac atctcaaact 4020 ctacagaagc tggacagaaa ctgttcaata tgctgaggct tggaaaatca gaaccctgga 4080 ccctagcatt ggaaaatgtt gtaggagcaa agaacatgaa tgtaaggcca ctgctcaact 4140 actttgagcc cttatttacc tggctgaaag accagaacaa gaattctttt gtgggatgga 4200 gtaccgactg gagtccatat gcagaccaaa gcatcaaagt gaggataagc ctaaaatcag 4260 ctcttggaga taaagcatat gaatggaacg acaatgaaat gtacctgttc cgatcatctg 4320 ttgcatatgc tatgaggcag tactttttaa aagtaaaaaa tcagatgatt ctttttgggg 4380 aggaggatgt gcgagtggct aatttgaaac caagaatctc ctttaatttc tttgtcactg 4440 cacctaaaaa tgtgtctgat atcattccta gaactgaagt tgaaaaggcc atcaggatgt 4500 cccggagccg tatcaatgat gctttccgtc tgaatgacaa cagcctagag tttctgggga 4560 tacagccaac acttggacct cctaaccagc cccctgtttc catatggctg attgtttttg 4620 gagttgtgat gggagtgata gtggttggca ttgtcatcct gatcttcact gggatcagag 4680 atcggaagaa gaaaaataaa gcaagaagtg gagaaaatcc ttatgcctcc atcgatatta 4740 gcaaaggaga aaataatcca ggattccaaa acactgatga tgttcagacc tccttttagc 4800 ccaaatcgga tccgcggccg caaggatctg cgatcgctcc ggtgcccgtc agtgggcaga 4860 gcgcacatcg cccacagtcc ccgagaagtt ggggggaggg gtcggcaatt gaacgggtgc 4920 ctagagaagg tggcgcgggg taaactggga aagtgatgtc gtgtactggc tccgcctttt 4980 tcccgagggt gggggagaac cgtatataag tgcagtagtc gccgtgaacg ttctttttcg 5040 caacgggttt gccgccagaa cacagctgaa gcttcgaggg gctcgcatct ctccttcacg 5100 cgcccgccgc cctacctgag gccgccatcc acgccggttg agtcgcgttc tgccgcctcc 5160 cgcctgtggt gcctcctgaa ctgcgtccgc cgtctaggta agtttaaagc tcaggtcgag 5220 accgggcctt tgtccggcgc tcccttggag cctacctaga ctcagccggc tctccacgct 5280 ttgcctgacc ctgcttgctc aactctacgt ctttgtttcg ttttctgttc tgcgccgtta 5340 cagatccaag ctgtgaccgg cgcctacgat atgaccgagt acaagcccac ggtgcgcctc 5400 gccacccgcg acgacgtccc cagggccgta cgcaccctcg ccgccgcgtt cgccgactac 5460 cccgccacgc gccacaccgt cgatccggac cgccacatcg agcgggtcac cgagctgcaa 5520 gaactcttcc tcacgcgcgt cgggctcgac atcggcaagg tgtgggtcgc ggacgacggc 5580 gccgcggtgg cggtctggac cacgccggag agcgtcgaag cgggggcggt gttcgccgag 5640 atcggcccgc gcatggccga gttgagcggt tcccggctgg ccgcgcagca acagatggaa 5700 ggcctcctgg cgccgcaccg gcccaaggag cccgcgtggt tcctggccac cgtcggcgtc 5760 tcgcccgacc accagggcaa gggtctgggc agcgccgtcg tgctccccgg agtggaggcg 5820 gccgagcgcg ccggggtgcc cgccttcctg gagacctccg cgccccgcaa cctccccttc 5880 tacgagcggc tcggcttcac cgtcaccgcc gacgtcgagg tgcccgaagg accgcgcacc 5940 tggtgcatga cccgcaagcc cggtgcctga caatcaacct ctggattaca aaatttgtga 6000 aagattgact ggtattctta actatgttgc tccttttacg ctatgtggat acgctgcttt 6060 aatgcctttg tatcatgcta ttgcttcccg tatggctttc attttctcct ccttgtataa 6120 atcctggttg ctgtctcttt atgaggagtt gtggcccgtt gtcaggcaac gtggcgtggt 6180 gtgcactgtg tttgctgacg caacccccac tggttggggc attgccacca cctgtcagct 6240 cctttccggg actttcgctt tccccctccc tattgccacg gcggaactca tcgccgcctg 6300 ccttgcccgc tgctggacag gggctcggct gttgggcact gacaattccg tggtgttgtc 6360 ggggaaatca tcgtcctttc cttggctgct cgcctgtgtt gccacctgga ttctgcgcgg 6420 gacgtccttc tgctacgtcc cttcggccct caatccagcg gaccttcctt cccgcggcct 6480 gctgccggct ctgcggcctc ttccgcgtct tcgccttcgc cctcagacga gtcggatctc 6540 cctttgggcc gcctccccgc ctggtacctt taagaccaat gacttacaag gcagctgtag 6600 atcttagcca ctttttaaaa gaaaaggggg gactggaagg gctaattcac tcccaacgaa 6660 gataagatct gctttttgct tgtactgggt ctctctggtt agaccagatc tgagcctggg 6720 agctctctgg ctaactaggg aacccactgc ttaagcctca ataaagcttg ccttgagtgc 6780 ttcaagtagt gtgtgcccgt ctgttgtgtg actctggtaa ctagagatcc ctcagaccct 6840 tttagtcagt gtggaaaatc tctagcagta gtagttcatg tcatcttatt attcagtatt 6900 tataacttgc aaagaaatga atatcagaga gtgagaggaa cttgtttatt gcagcttata 6960 atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc 7020 attctagttg tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta tcatgtctgg ctctagctat 7080 cccgccccta actccgccca tcccgcccct aactccgccc agttccgccc attctccgcc 7140 ccatggctga ctaatttttt ttatttatgc agaggccgag gccgcctcgg cctctgagct 7200 attccagaag tagtgaggag gcttttttgg aggcctagac ttttgcagag accaaattcg 7260 taatcatgtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca 7320 tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat 7380 taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt 7440 aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct 7500 cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa 7560 aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa 7620 aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc 7680 tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga 7740 caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc 7800 cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt 7860 ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct 7920 gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg 7980 agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta 8040 gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct 8100 acactagaag gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa 8160 gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt 8220 gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta 8280 cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat 8340 caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa 8400 gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct 8460 cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta 8520 cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct 8580 caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg 8640 gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa 8700 gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt 8760 cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta 8820 catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca 8880 gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta 8940 ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct 9000 gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg 9060 cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac 9120 tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact 9180 gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa 9240 atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt 9300 ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat 9360 gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg 9420 acgtctaaga aaccattatt atcatgacat taacctataa aaataggcgt atcacgaggc 9480 cctttcgtct cgcgcgtttc ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg 9540 agacggtcac agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt 9600 cagcgggtgt tggcgggtgt cggggctggc ttaactatgc ggcatcagag cagattgtac 9660 tgagagtgca ccatatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca 9720 tcaggcgcca ttcgccattc aggctgcgca actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct 9780 cttcgctatt acgccagctg gcgaaagggg gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa 9840 cgccagggtt ttcccagtca cgacgttgta aaacgacggc cagtgccaag ctg 9893 <210> 25 <211> 8668 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Vector for TMPRSS2 transduction <400> 25 acgcgtgtag tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atggtaacga tgagttagca 60 acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta 120 cgatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac gggtctgaca tggattggac gaaccactga 180 attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacaata aacgggtctc 240 tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 300 agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 360 ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg 420 cccgaacagg gacctgaaag cgaaagggaa accagagctc tctcgacgca ggactcggct 480 tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg gcggcgactg gtgagtacgc caaaaatttt 540 gactagcgga ggctagaagg agagagatgg gtgcgagagc gtcagtatta agcgggggag 600 aattagatcg cgatgggaaa aaattcggtt aaggccaggg ggaaagaaaa aatataaatt 660 aaaacatata gtatgggcaa gcagggagct agaacgattc gcagttaatc ctggcctgtt 720 agaaacatca gaaggctgta gacaaatact gggacagcta caaccatccc ttcagacagg 780 atcagaagaa cttagatcat tatataatac agtagcaacc ctctattgtg tgcatcaaag 840 gatagagata aaagacacca aggaagcttt agacaagata gaggaagagc aaaacaaaag 900 taagaccacc gcacagcaag cggccactga tcttcagacc tggaggagga gatatgaggg 960 acaattggag aagtgaatta tataaatata aagtagtaaa aattgaacca ttaggagtag 1020 cacccaccaa ggcaaagaga agagtggtgc agagagaaaa aagagcagtg ggaataggag 1080 ctttgttcct tgggttcttg ggagcagcag gaagcactat gggcgcagcg tcaatgacgc 1140 tgacggtaca ggccagacaa ttattgtctg gtatagtgca gcagcagaac aatttgctga 1200 gggctattga ggcgcaacag catctgttgc aactcacagt ctggggcatc aagcagctcc 1260 aggcaagaat cctggctgtg gaaagatacc taaaggatca acagctcctg gggatttggg 1320 gttgctctgg aaaactcatt tgcaccactg ctgtgccttg gaatgctagt tggagtaata 1380 aatctctgga acagatttgg aatcacacga cctggatgga gtgggacaga gaaattaaca 1440 attacacaag cttaatacac tccttaattg aagaatcgca aaaccagcaa gaaaagaatg 1500 aacaagaatt attggaatta gataaatggg caagtttgtg gaattggttt aacataacaa 1560 attggctgtg gtatataaaa ttattcataa tgatagtagg aggcttggta ggtttaagaa 1620 tagtttttgc tgtactttct atagtgaata gagttaggca gggatattca ccattatcgt 1680 ttcagaccca cctcccaacc ccgaggggac ccgacaggcc cgaaggaata gaagaagaag 1740 gtggagagag agacagagac agatccattc gattagtgaa cggatctcga cggtatcggt 1800 taacttttaa aagaaaaggg gggattgggg ggtacagtgc aggggaaaga atagtagaca 1860 taatagcaac agacatacaa actaaagaat tacaaaaaca aattacaaaa ttcaaaattt 1920 tatcgattac tagtattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta 1980 catctacgta ttagtcatcg ctattaccat ggtgatgcgg ttttggcagt acatcaatgg 2040 gcgtggatag cggtttgact cacggggatt tccaagtctc caccccattg acgtcaatgg 2100 gagtttgttt tggcaccaaa atcaacggga ctttccaaaa tgtcgtaaca actccgcccc 2160 attgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg gtgggaggtt tatataagca gagctcgttt 2220 agtgaaccgt cagatcgcct ggagacgcca tccacgctgt tttgacctcc atagaagatt 2280 ctagagctag cgtttaaact taaggccacc atggctttga actcagggtc accaccagct 2340 attggacctt actatgaaaa ccatggatac caaccggaaa acccctatcc cgcacagccc 2400 actgtggtcc ccactgtcta cgaggtgcat ccggctcagt actacccgtc ccccgtgccc 2460 cagtacgccc cgagggtcct gacgcaggct tccaaccccg tcgtctgcac gcagcccaaa 2520 tccccatccg ggacagtgtg cacctcaaag actaagaaag cactgtgcat caccttgacc 2580 ctggggacct tcctcgtggg agctgcgctg gccgctggcc tactctggaa gttcatgggc 2640 agcaagtgct ccaactctgg gatagagtgc gactcctcag gtacctgcat caacccctct 2700 aactggtgtg atggcgtgtc acactgcccc ggcggggagg acgagaatcg gtgtgttcgc 2760 ctctacggac caaacttcat ccttcaggtg tactcatctc agaggaagtc ctggcaccct 2820 gtgtgccaag acgactggaa cgagaactac gggcgggcgg cctgcaggga catgggctat 2880 aagaataatt tttactctag ccaaggaata gtggatgaca gcggatccac cagctttatg 2940 aaactgaaca caagtgccgg caatgtcgat atctataaaa aactgtacca cagtgatgcc 3000 tgttcttcaa aagcagtggt ttctttacgc tgtatagcct gcggggtcaa cttgaactca 3060 agccgccaga gcaggattgt gggcggcgag agcgcgctcc cgggggcctg gccctggcag 3120 gtcagcctgc acgtccagaa cgtccacgtg tgcggaggct ccatcatcac ccccgagtgg 3180 atcgtgacag ccgcccactg cgtggaaaaa cctcttaaca atccatggca ttggacggca 3240 tttgcgggga ttttgagaca atctttcatg ttctatggag ccggatacca agtagaaaaa 3300 gtgatttctc atccaaatta tgactccaag accaagaaca atgacattgc gctgatgaag 3360 ctgcagaagc ctctgacttt caacgaccta gtgaaaccag tgtgtctgcc caacccaggc 3420 atgatgctgc agccagaaca gctctgctgg atttccgggt ggggggccac cgaggagaaa 3480 gggaagacct cagaagtgct gaacgctgcc aaggtgcttc tcattgagac acagagatgc 3540 aacagcagat atgtctatga caacctgatc acaccagcca tgatctgtgc cggcttcctg 3600 caggggaacg tcgattcttg ccagggtgac agtggagggc ctctggtcac ttcgaagaac 3660 aatatctggt ggctgatagg ggatacaagc tggggttctg gctgtgccaa agcttacaga 3720 ccaggagtgt acgggaatgt gatggtattc acggactgga tttatcgaca aatgagggca 3780 gacggctaag cggccgcaag gatctgcgat cgctccggtg cccgtcagtg ggcagagcgc 3840 acatcgccca cagtccccga gaagttgggg ggaggggtcg gcaattgaac gggtgcctag 3900 agaaggtggc gcggggtaaa ctgggaaagt gatgtcgtgt actggctccg cctttttccc 3960 gagggtgggg gagaaccgta tataagtgca gtagtcgccg tgaacgttct ttttcgcaac 4020 gggtttgccg ccagaacaca gctgaagctt cgaggggctc gcatctctcc ttcacgcgcc 4080 cgccgcccta cctgaggccg ccatccacgc cggttgagtc gcgttctgcc gcctcccgcc 4140 tgtggtgcct cctgaactgc gtccgccgtc taggtaagtt taaagctcag gtcgagaccg 4200 ggcctttgtc cggcgctccc ttggagccta cctagactca gccggctctc cacgctttgc 4260 ctgaccctgc ttgctcaact ctacgtcttt gtttcgtttt ctgttctgcg ccgttacaga 4320 tccaagctgt gaccggcgcc tacgatatgg ccaagccttt gtctcaagaa gaatccaccc 4380 tcattgaaag agcaacggct acaatcaaca gcatccccat ctctgaagac tacagcgtcg 4440 ccagcgcagc tctctctagc gacggccgca tcttcactgg tgtcaatgta tatcatttta 4500 ctgggggacc ttgtgcagaa ctcgtggtgc tgggcactgc tgctgctgcg gcagctggca 4560 acctgacttg tatcgtcgcg atcggaaatg agaacagggg catcttgagc ccctgcggac 4620 ggtgccgaca ggtgcttctc gatctgcatc ctgggatcaa agccatagtg aaggacagtg 4680 atggacagcc gacggcagtt gggattcgtg aattgctgcc ctctggttat gtgtgggagg 4740 gctaacaatc aacctctgga ttacaaaatt tgtgaaagat tgactggtat tcttaactat 4800 gttgctcctt ttacgctatg tggatacgct gctttaatgc ctttgtatca tgctattgct 4860 tcccgtatgg ctttcatttt ctcctccttg tataaatcct ggttgctgtc tctttatgag 4920 gagttgtggc ccgttgtcag gcaacgtggc gtggtgtgca ctgtgtttgc tgacgcaacc 4980 cccactggtt ggggcattgc caccacctgt cagctccttt ccgggacttt cgctttcccc 5040 ctccctattg ccacggcgga actcatcgcc gcctgccttg cccgctgctg gacaggggct 5100 cggctgttgg gcactgacaa ttccgtggtg ttgtcgggga aatcatcgtc ctttccttgg 5160 ctgctcgcct gtgttgccac ctggattctg cgcgggacgt ccttctgcta cgtcccttcg 5220 gccctcaatc cagcggacct tccttcccgc ggcctgctgc cggctctgcg gcctcttccg 5280 cgtcttcgcc ttcgccctca gacgagtcgg atctcccttt gggccgcctc cccgcctggt 5340 acctttaaga ccaatgactt acaaggcagc tgtagatctt agccactttt taaaagaaaa 5400 ggggggactg gaagggctaa ttcactccca acgaagataa gatctgcttt ttgcttgtac 5460 tgggtctctc tggttagacc agatctgagc ctgggagctc tctggctaac tagggaaccc 5520 actgcttaag cctcaataaa gcttgccttg agtgcttcaa gtagtgtgtg cccgtctgtt 5580 gtgtgactct ggtaactaga gatccctcag acccttttag tcagtgtgga aaatctctag 5640 cagtagtagt tcatgtcatc ttattattca gtatttataa cttgcaaaga aatgaatatc 5700 agagagtgag aggaacttgt ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat 5760 cacaaatttc acaaataaag catttttttc actgcattct agttgtggtt tgtccaaact 5820 catcaatgta tcttatcatg tctggctcta gctatcccgc ccctaactcc gcccatcccg 5880 cccctaactc cgcccagttc cgcccattct ccgccccatg gctgactaat tttttttatt 5940 tatgcagagg ccgaggccgc ctcggcctct gagctattcc agaagtagtg aggaggcttt 6000 tttggaggcc tagacttttg cagagaccaa attcgtaatc atgtcatagc tgtttcctgt 6060 gtgaaattgt tatccgctca caattccaca caacatacga gccggaagca taaagtgtaa 6120 agcctggggt gcctaatgag tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc 6180 tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag 6240 aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt 6300 cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga 6360 atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg 6420 taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa 6480 aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt 6540 tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct 6600 gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct 6660 cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc 6720 cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt 6780 atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc 6840 tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaaggacag tatttggtat 6900 ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa 6960 acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa 7020 aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga 7080 aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct 7140 tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga 7200 cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc 7260 catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg 7320 ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat 7380 aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat 7440 ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg 7500 caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc 7560 attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa 7620 agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc 7680 actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt 7740 ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag 7800 ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt 7860 gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag 7920 atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac 7980 cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc 8040 gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca 8100 gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg 8160 ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc taagaaacca ttattatcat 8220 gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac gaggcccttt cgtctcgcgc gtttcggtga 8280 tgacggtgaa aacctctgac acatgcagct cccggagacg gtcacagctt gtctgtaagc 8340 ggatgccggg agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg ggtgttggcg ggtgtcgggg 8400 ctggcttaac tatgcggcat cagagcagat tgtactgaga gtgcaccata tgcggtgtga 8460 aataccgcac agatgcgtaa ggagaaaata ccgcatcagg cgccattcgc cattcaggct 8520 gcgcaactgt tgggaagggc gatcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa 8580 agggggatgt gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg 8640 ttgtaaaacg acggccagtg ccaagctg 8668 <210> 26 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACE2 forward primer <400> 26 cattggagca agtgttggat ctt 23 <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACE2 reverse primer <400> 27 gagctaatgc atgccattct ca 22 <210> 28 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TMPRSS2 forward primer <400> 28 cacggactgg atttatcgac aa 22 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TMPRSS2 reverse primer <400> 29 cgtcaaggac gaagaccatg t 21 <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH forward primer <400> 30 gcacaagagg aagagagaga cc 22 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH reverse primer <400> 31 aggggagatt cagtgtggtg 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Furin Forward <400> 32 ggaacatgac agctgcaact 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Furin Reverse <400> 33 tcgtcacgat ctgcttctca 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cathepsin L Forward <400> 34 tagaggcaca gtggaccaag 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cathepsin L Reverse <400> 35 atggccattg tgaagctgtg 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cathepsin B Forward <400> 36 tctctgaccg gatctgcatc 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cathepsin B Reverse <400> 37 tcacagggag ggatggagta 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PC1 Forward <400> 38 gcgtgcctga gaagaaagag 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PC1 Reverse <400> 39 atcccgttct ctttcagcca 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Trypsin Forward <400> 40 aagtgtgaag cctcctaccc 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Trypsin Reverse <400> 41 ggtgtagact ccaggcttgt 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Matriptase Forward <400> 42 cccaacaacc agcatgtgaa 20 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Matriptase Reverse <400> 43 actggagtcg taggagaggt 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Matriptase Forward <400> 44 agaacgtcct gctcatcaca 20 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Matriptase Reverse <400> 45 tgtgcagtca atgttgggtg 20 <210> 46 <211> 6623 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HEK293 AAT Vector <400> 46 gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60 ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120 cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180 ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240 gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300 tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360 cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420 attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480 atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540 atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600 tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660 actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720 aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780 gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840 ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggctagc 900 gtttaaactt aagcttgcca ccatgccgtc ttctgtctcg tggggcatcc tcctgctggc 960 aggcctgtgc tgcctggtcc ctgtctccct ggctgaggat ccccagggag atgctgccca 1020 gaagacagat acatcccacc atgatcagga tcacccaacc ttcaacaaga tcacccccaa 1080 cctggctgag ttcgccttca gcctataccg ccagctggca caccagtcca acagcaccaa 1140 tatcttcttc tccccagtga gcatcgctac agcctttgca atgctctccc tggggaccaa 1200 ggctgacact cacgatgaaa tcctggaggg cctgaatttc aacctcacgg agattccgga 1260 ggctcagatc catgaaggct tccaggaact cctccgtacc ctcaaccagc cagacagcca 1320 gctccagctg accaccggca atggcctgtt cctcagcgag ggcctgaagc tagtggataa 1380 gtttttggag gatgttaaaa agttgtacca ctcagaagcc ttcactgtca acttcgggga 1440 caccgaagag gccaagaaac agatcaacga ttacgtggag aagggtactc aagggaaaat 1500 tgtggatttg gtcaaggagc ttgacagaga cacagttttt gctctggtga attacatctt 1560 ctttaaaggc aaatgggaga gaccctttga agtcaaggac accgaggaag aggacttcca 1620 cgtggaccag gtgaccaccg tgaaggtgcc tatgatgaag cgtttaggca tgtttaacat 1680 ccagcactgt aagaagctgt ccagctgggt gctgctgatg aaatacctgg gcaatgccac 1740 cgccatcttc ttcctgcctg atgaggggaa actacagcac ctggaaaatg aactcaccca 1800 cgatatcatc accaagttcc tggaaaatga agacagaagg tctgccagct tacatttacc 1860 caaactgtcc attactggaa cctatgatct gaagagcgtc ctgggtcaac tgggcatcac 1920 taaggtcttc agcaatgggg ctgacctctc cggggtcaca gaggaggcac ccctgaagct 1980 ctccaaggcc gtgcataagg ctgtgctgac catcgacgag aaagggactg aagctgctgg 2040 ggccatgttt ttagaggcca tacccatgtc tatccccccc gaggtcaagt tcaacaaacc 2100 ctttgtcttc ttaatgattg aacaaaatac caagtctccc ctcttcatgg gaaaagtggt 2160 gaatcccacc caaaaataac tcgagtctag agggcccgtt taaacccgct gatcagcctc 2220 gactgtgcct tctagttgcc agccatctgt tgtttgcccc tcccccgtgc cttccttgac 2280 cctggaaggt gccactccca ctgtcctttc ctaataaaat gaggaaattg catcgcattg 2340 tctgagtagg tgtcattcta ttctgggggg tggggtgggg caggacagca agggggagga 2400 ttgggaagac aatagcaggc atgctgggga tgcggtgggc tctatggctt ctgaggcgga 2460 aagaaccagc tggggctcta gggggtatcc ccacgcgccc tgtagcggcg cattaagcgc 2520 ggcgggtgtg gtggttacgc gcagcgtgac cgctacactt gccagcgccc tagcgcccgc 2580 tcctttcgct ttcttccctt cctttctcgc cacgttcgcc ggctttcccc gtcaagctct 2640 aaatcggggg ctccctttag ggttccgatt tagtgcttta cggcacctcg accccaaaaa 2700 acttgattag ggtgatggtt cacgtagtgg gccatcgccc tgatagacgg tttttcgccc 2760 tttgacgttg gagtccacgt tctttaatag tggactcttg ttccaaactg gaacaacact 2820 caaccctatc tcggtctatt cttttgattt ataagggatt ttgccgattt cggcctattg 2880 gttaaaaaat gagctgattt aacaaaaatt taacgcgaat taattctgtg gaatgtgtgt 2940 cagttagggt gtggaaagtc cccaggctcc ccagcaggca gaagtatgca aagcatgcat 3000 ctcaattagt cagcaaccag gtgtggaaag tccccaggct ccccagcagg cagaagtatg 3060 caaagcatgc atctcaatta gtcagcaacc atagtcccgc ccctaactcc gcccatcccg 3120 cccctaactc cgcccagttc cgcccattct ccgccccatg gctgactaat tttttttatt 3180 tatgcagagg ccgaggccgc ctctgcctct gagctattcc agaagtagtg aggaggcttt 3240 tttggaggcc taggcttttg caaaaagctc ccgggagctt gtatatccat tttcggatct 3300 gatcaagaga caggatgagg atcgtttcgc atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt 3360 tctccggccg cttgggtgga gaggctattc ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc 3420 tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag 3480 accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg caggacgagg cagcgcggct atcgtggctg 3540 gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac 3600 tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc 3660 gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg cggcggctgc atacgcttga tccggctacc 3720 tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc 3780 ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg 3840 ttcgccaggc tcaaggcgcg catgcccgac ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat 3900 gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc 3960 cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa 4020 gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat 4080 tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt gacgagttct tctgagcggg actctggggt 4140 tcgaaatgac cgaccaagcg acgcccaacc tgccatcacg agatttcgat tccaccgccg 4200 ccttctatga aaggttgggc ttcggaatcg ttttccggga cgccggctgg atgatcctcc 4260 agcgcgggga tctcatgctg gagttcttcg cccaccccaa cttgtttatt gcagcttata 4320 atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc 4380 attctagttg tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta tcatgtctgt ataccgtcga 4440 cctctagcta gagcttggcg taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc 4500 cgctcacaat tccacacaac atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct 4560 aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa 4620 acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta 4680 ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc 4740 gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg 4800 caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt 4860 tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa 4920 gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct 4980 ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc 5040 cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg 5100 tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct 5160 tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag 5220 cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga 5280 agtggtggcc taactacggc tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga 5340 agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg 5400 gtagcggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag 5460 atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga 5520 ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa 5580 gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa 5640 tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc 5700 ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga 5760 taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa 5820 gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt 5880 gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg 5940 ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc 6000 aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg 6060 gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag 6120 cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt 6180 actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt 6240 caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac 6300 gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac 6360 ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag 6420 caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa 6480 tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga 6540 gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc 6600 cccgaaaagt gccacctgac gtc 6623 <210> 47 <211> 8143 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HEK293T AAT Vector <400> 47 aaaggcggcc gccaccatgg ggaccctcag cgctccgcct tgtacccaga ggattaagtg 60 gaaagggctg ctgctgacag ccagcctgtt aaacttctgg aacttgccca ccaccgctga 120 ggacccacaa ggcgacgcgg cccagaagac cgatacaagc caccacgacc aagatcatcc 180 taccttcaac aagatcactc ccaacctcgc tgagtttgcc ttctccttgt atcgccagct 240 tgcgcaccaa tccaattcaa ccaatatatt cttcagccca gtaagtatcg ctactgcgtt 300 tgcaatgctt agtttgggaa caaaagcgga cactcacgac gaaatccttg agggcttgaa 360 tttcaacttg accgaaattc cggaggccca gattcacgaa gggttccagg agcttttgag 420 gacactgaac cagccagact cacaattgca acttacaacc ggcaacggac tgtttctttc 480 cgagggcctt aaacttgttg ataaatttct tgaagacgtc aagaagctgt accactcaga 540 agcatttaca gtcaacttcg gcgataccga agaggcaaag aagcaaatca acgactatgt 600 ggagaaggga actcagggga aaatagtaga cctggtaaag gaattggacc gcgacacggt 660 attcgcgttg gttaattaca tctttttcaa gggtaagtgg gaacggccat ttgaagtgaa 720 ggacaccgaa gaagaagact tccacgtaga ccaggtaact actgttaaag tcccaatgat 780 gaaacgattg ggtatgttta acattcagca ttgtaagaag ctctcatcct gggttctttt 840 gatgaaatac ttggggaatg caacggccat attctttctt ccggatgagg gaaagttgca 900 acacctggaa aatgaactca cacacgacat cattacgaaa ttcttggaaa atgaagaccg 960 gaggtccgct tctttgcacc tgccaaaact cagtataacg ggtacatatg acctcaagtc 1020 cgtcctcggt caactgggaa taactaaggt cttttctaac ggagcagatt tgagcggcgt 1080 cacagaagaa gcacctttga aacttagtaa ggctgtccat aaagcggtac tcacaattga 1140 cgagaaaggg accgaagctg cgggggctat gtttctggag gcaatcccaa tgagcatacc 1200 accagaagtt aaatttaaca aacctttcgt tttcctcatg atagagcaaa acacaaaaag 1260 tccgctgttt atgggaaagg tagtgaatcc tacccagaaa gggagcgcta gcgaaaacct 1320 gtacttccaa ggcacttccg cttggtccca tcctcagttt gagaaaggcg gaggtagtgg 1380 cggaggatcc ggtggatctg cttggagcca tccacagttc gaaaagggat cccaccatca 1440 tcaccatcac caccaccatc attaatgact gagtagtcta gaagttgtct cctcctgcac 1500 tgactgactg atacaatcga tttctggatc cgcaggccta atcaacctct ggattacaaa 1560 atttgtgaaa gattgactgg tattcttaac tatgttgctc cttttacgct atgtggatac 1620 gctgctttaa tgcctttgta tcatgctatt gcttcccgta tggctttcat tttctcctcc 1680 ttgtataaat cctggttgct gtctctttat gaggagttgt ggcccgttgt caggcaacgt 1740 ggcgtggtgt gcactgtgtt tgctgacgca acccccactg gttggggcat tgccaccacc 1800 tgtcagctcc tttccgggac tttcgctttc cccctcccta ttgccacggc ggaactcatc 1860 gccgcctgcc ttgcccgctg ctggacaggg gctcggctgt tgggcactga caattccgtg 1920 gtgttgtcgg ggaagctgac gtcctttcca tggctgctcg cctgtgttgc cacctggatt 1980 ctgcgcggga cgtccttctg ctacgtccct tcggccctca atccagcgga ccttccttcc 2040 cgcggcctgc tgccggctct gcggcctctt ccgcgtcttc gccttcgccc tcagacgagt 2100 cggatctccc tttgggccgc ctccccgcct gtctagcttg actgactgag atacagcgta 2160 ccttcagctc acagacatga taagatacat tgatgagttt ggacaaacca caactagaat 2220 gcagtgaaaa aaatgcttta tttgtgaaat ttgtgatgct attgctttat ttgtaaccat 2280 tataagctgc aataaacaag ttaacaacaa caattgcatt cattttatgt ttcaggttca 2340 gggggaggtg tgggaggttt tttaaagcaa gtaaaacctc tacaaatgtg gtattggccc 2400 atctctatcg gtatcgtagc ataacccctt ggggcctcta aacgggtctt gaggggtttt 2460 ttgtgcccct cgggccggat tgctatctac cggcattggc gcagaaaaaa atgcctgatg 2520 cgacgctgcg cgtcttatac tcccacatat gccagattca gcaacggata cggcttcccc 2580 aacttgccca cttccatacg tgtcctcctt accagaaatt tatccttaag gtcgtcagct 2640 atcctgcagg cgatctctcg atttcgatca agacattcct ttaatggtct tttctggaca 2700 ccactagggg tcagaagtag ttcatcaaac tttcttccct ccctaatctc attggttacc 2760 ttgggctatc gaaacttaat taagcgatct gcatctcaat tagtcagcaa ccatagtccc 2820 gcccctaact ccgcccatcc cgcccctaac tccgcccagt tccgcccatt ctccgcccca 2880 tcgctgacta atttttttta tttatgcaga ggccgaggcc gcctcggcct ctgagctatt 2940 ccagaagtag tgaggaggct tttttggagg cctaggcttt tgcaaaggag gtagccaaca 3000 tgattgaaca agatggattg cacgcaggtt ctcccgccgc ttgggtggag aggctattcg 3060 gctatgactg ggcacaacag acaatcggct gctctgatgc cgccgtgttc cggctgtcag 3120 cgcaggggcg cccggttctt tttgtcaaga ccgacctgtc cggtgccctg aatgaactcc 3180 aggacgaggc agcgcggcta tcgtggctgg ccacgacggg cgttccttgc gcagctgtgc 3240 tcgacgttgt cactgaagcg ggaagggact ggctgctatt gggcgaagtg ccggggcagg 3300 atctcctgtc atctcacctt gctcctgccg agaaagtatc catcatggct gatgcaatgc 3360 ggcggctgca tacgcttgat ccggctacct gcccattcga ccaccaagcg aaacatcgca 3420 tcgagcgagc acgtactcgg atggaagccg gtcttgtcga tcaggatgat ctggacgaag 3480 agcatcaggg gctcgcgcca gccgaactgt tcgccaggct caaggcgcgg atgcccgacg 3540 gcgaggatct cgtcgtgacc cacggcgatg cctgcttgcc gaatatcatg gtggaaaatg 3600 gccgcttttc tggattcatc gactgtggcc ggctgggtgt ggcggaccgc tatcaggaca 3660 tagcgttggc tacccgtgat attgctgaag agcttggcgg cgaatgggct gaccgcttcc 3720 tcgtgcttta cggtatcgcc gctcccgatt cgcagcgcat cgccttctat cgccttcttg 3780 acgagttctt ctagtatgta agccctgtgc cttctagttg ccagccatct gttgtttgcc 3840 cctcccccgt gccttccttg accctggaag gtgccactcc cactgtcctt tcctaataaa 3900 atgaggaaat tgcatcgcat tgtctgagta ggtgtcattc tattctgggg ggtggggtgg 3960 ggcaggacag caagggggag gattgggaag acaatagcag gcatgctggg gatgcggtgg 4020 gctctatggt taattaacca gtcaagtcag ctacttggcg agatcgactt gtctgggttt 4080 cgactacgct cagaattgcg tcagtcaagt tcgatctggt ccttgctatt gcacccgttc 4140 tccgattacg agtttcattt aaatcatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg 4200 taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa 4260 aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt 4320 tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct 4380 gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct 4440 cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc 4500 cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt 4560 atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc 4620 tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat 4680 ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa 4740 acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa 4800 aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga 4860 aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct 4920 tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga 4980 cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc 5040 catagttgca tttaaatttc cgaactctcc aaggccctcg tcggaaaatc ttcaaacctt 5100 tcgtccgatc catcttgcag gctacctctc gaacgaacta tcgcaagtct cttggccggc 5160 cttgcgcctt ggctattgct tggcagcgcc tatcgccagg tattactcca atcccgaata 5220 tccgagatcg ggatcacccg agagaagttc aacctacatc ctcaatcccg atctatccga 5280 gatccgagga atatcgaaat cggggcgcgc ctggtgtacc gagaacgatc ctctcagtgc 5340 gagtctcgac gatccatatc gttgcttggc agtcagccag tcggaatcca gcttgggacc 5400 caggaagtcc aatcgtcaga tattgtactc aagcctggtc acggcagcgt accgatctgt 5460 ttaaacctag atattgatag tctgatcggt caacgtataa tcgagtccta gcttttgcaa 5520 acatctatca agagacagga tcagcaggag gctttcgcat gagtattcaa catttccgtg 5580 tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc 5640 tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcgcg agtgggttac atcgaactgg 5700 atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgcttt ccaatgatga 5760 gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc 5820 aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtattca ccagtcacag 5880 aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga 5940 gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgattgg aggaccgaag gagctaaccg 6000 cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga 6060 atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacct 6120 tgcgtaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacag ttgatagact 6180 ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt 6240 ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg 6300 ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt caggcaacta 6360 tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac 6420 cgattctagg tgcattggcg cagaaaaaaa tgcctgatgc gacgctgcgc gtcttatact 6480 cccacatatg ccagattcag caacggatac ggcttcccca acttgcccac ttccatacgt 6540 gtcctcctta ccagaaattt atccttaaga tcgtttaaac tcgactctgg ctctatcgaa 6600 tctccgtcgt ttcgagctta cgcgaacagc cgtggcgctc atttgctcgt cgggcatcga 6660 atctcgtcag ctatcgtcag cttacctttt tggcagcgat cgcggctccc gacatcttgg 6720 accattagct ccacaggtat cttcttccct ctagtggtca taacagcagc ttcagctacc 6780 tctcaattca aaaaacccct caagacccgt ttagaggccc caaggggtta tgctatcaat 6840 cgttgcgtta cacacacaaa aaaccaacac acatccatct tcgatggata gcgattttat 6900 tatctaactg ctgatcgagt gtagccagat ctagtaatca attacggggt cattagttca 6960 tagcccatat atggagttcc gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc 7020 gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat 7080 agggactttc cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt 7140 acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc 7200 cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta 7260 cgtattagtc atcgctatta ccatgctgat gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg 7320 atagcggttt gactcacggg gatttccaag tctccacccc attgacgtca atgggagttt 7380 gttttggcac caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac 7440 gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata agcagagctg gtttagtgaa 7500 ccgtcagatc gcctggagac gccatccacg ctgttttgac ctccatagaa gacaccggga 7560 ccgatccagc ctcccctcga agcttacatg tggtaccgag ctcggatcct gagaacttca 7620 gggtgagtct atgggaccct tgatgttttc tttccccttc ttttctatgg ttaagttcat 7680 gtcataggaa ggggagaagt aacagggtac acatattgac caaatcaggg taattttgca 7740 tttgtaattt taaaaaatgc tttcttcttt taatatactt ttttgtttat cttatttcta 7800 atactttccc taatctcttt ctttcagggc aataatgata caatgtatca tgcctctttg 7860 caccattcta aagaataaca gtgataattt ctgggttaag gcaatagcaa tatttctgca 7920 tataaatatt tctgcatata aattgtaact gatgtaagag gtttcatatt gctaatagca 7980 gctacaatcc agctaccatt ctgcttttat tttatggttg ggataaggct ggattattct 8040 gagtccaagc taggcccttt tgctaatcat gttcatacct cttatcttcc tcccacagct 8100 cctgggcaac gtgctggtct gtgtgctggc ccatcacttt ggc 8143

Claims (28)

  1. 치료학적 유효량의 알파1-항트립신(AAT) 단백질, 이의 변이체, 아이소폼 및/또는 단편을 포함하는, 바이러스 감염 관련 질환 또는 증후군의 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 개체에서 바이러스 감염 관련 질환 또는 증후군의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 이를 필요로 하는 개체는 하기로 구성된 군에서 선택된 적어도 하나를 가지는 것인, 조성물:
    1. 무증상이거나 경미한 증상을 가지는, 바이러스 감염 중인 적어도 하나의 개체와 비교하여, 바이러스 감염 전 또는 바이러스 감염 중 더 낮은 수준의 내인성 알파-항트립신(AAT),
    2. 무증상이거나 경미한 증상을 가지는, 바이러스 감염 중인 적어도 하나의 개체와 비교하여, 바이러스 감염 전 또는 바이러스 감염 중 더 높은 수준의 적어도 하나의 스파이크 단백질 프라이밍 프로테아제,
    3. 무증상이거나 경미한 증상을 가지는, 바이러스 감염 중인 적어도 하나의 개체와 비교하여, 바이러스 감염 전 또는 바이러스 감염 중 개체 내 더 높은 수준의 안지오텐신 전환 효소 2(ACE2 수용체), 및
    4. 무증상이거나 경미한 증상을 가지는, 바이러스 감염 중인 적어도 하나의 개체와 비교하여, 바이러스 감염 전 또는 바이러스 감염 중 개체 내 더 높은 수준의 인터페론-감마(IFN-γ).
  3. 제2항에 있어서, 바이러스 감염 전 또는 바이러스 감염 중 더 낮은 수준의 내인성 AAT는 AAT-결핍에 의해 야기되는 것인, 조성물.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 스파이크 단백질 프라이밍 프로테아제는 막관통 프로테아제 세린 서브타입 2(TMPRSS2), 막관통 프로테아제 서브타입 6(TMPRSS6), 카텝신 L, 카텝신 B, 전구단백질 전환효소 1(PC1), 트립신, 엘라스타제, 호중구 엘라스타제, 마트립타제 및 푸린, 바람직하게는 카텝신 L 및 푸린으로 구성된 군에서 선택된 적어도 하나인 것인, 조성물.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 더 높은 수준의 적어도 하나의 스파이크 단백질 프라이밍 프로테아제는 연령 및/또는 유전적 소인에 의해 야기되는 것인, 조성물.
  6. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 더 높은 수준의 ACE2 수용체는 감염, 염증, 연령 및 유전적 소인으로 구성된 군에서 선택된 적어도 하나에 의해 야기되는 것인, 조성물.
  7. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 더 높은 수준의 IFN-γ는 감염, 염증, 연령 및 유전적 소인으로 구성된 군에서 선택된 적어도 하나에 의해 야기되는 것인, 조성물.
  8. 제2항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이를 필요로 하는 개체는
    iii) 더 낮은 수준의 내인성 AAT, 및
    iv) 더 높은 수준의 적어도 하나의 스파이크 단백질 프라이밍 프로테아제를 가지는 것인, 조성물.
  9. 제2항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이를 필요로 하는 개체는
    ii) 더 낮은 수준의 내인성 AAT 및
    iii) 더 높은 수준의 ACE2 수용체를 가지는 것인, 조성물.
  10. 제2항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이를 필요로 하는 개체는
    ii) 더 낮은 수준의 내인성 AAT 및
    iv) 더 높은 수준의 IFN-γ를 가지는 것인, 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 더 높은 수준의 IFN-γ는 AAT-결핍, 비-알코올성 지방간 질환과 같은 간질환, 당뇨병, 비만 및 심혈관 병태로 구성된 군에서 선택된 적어도 하나의 질병 또는 병태에 의해 야기되는 것인, 조성물.
  12. 제2항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이를 필요로 하는 개체는
    i) 더 낮은 수준의 내인성 AAT,
    ii) 더 높은 수준의 적어도 하나의 스파이크 단백질 프라이밍 프로테아제, 및
    iii) 더 높은 수준의 ACE2 수용체 및/또는 iv) 더 높은 수준의 IFN-γ을 가지는 것인, 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 알파1-항트립신(AAT) 단백질, 이의 변이체, 아이소폼 및/또는 단편은 인간 혈장에서 추출되는 것인, 조성물.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 알파1-항트립신(AAT) 단백질, 이의 변이체, 아이소폼 및/또는 단편은 재조합 알파1-항트립신(rhAAT), 이의 변이체, 아이소폼 및/또는 단편인 것인, 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 알파1-항트립신 단백질은 서열번호 1로 표시되는 것인, 조성물.
  16. 제14항에 있어서, 알파1-항트립신 단편은 C-말단 서열 단편, 또는 이의 임의의 조합인 것인, 조성물.
  17. 제14항에 있어서, 알파1-항트립신 변이체는 서열번호 2로 표시된 C-말단 서열로부터 유래된 짧은 고리형 펩티드를 포함하는 군에서 선택된 것인, 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 알파1-항트립신의 C-말단 서열로부터 유래된 짧은 고리형 펩티드는 Cyclo-(CPFVFLM)-SH, Cyclo-(CPFVFLE)-SH, Cyclo-(CPFVFLR)-SH, 및 Cyclo-(CPEVFLM)-SH, 또는 이의 임의의 조합을 포함하는 군에서 선택된 것인, 조성물.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 약학적으로 허용되는 부형제 또는 담체를 추가로 포함하는 것인, 조성물.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 뉴클레오시드 유사체, 프로테아제 억제제, 면역억제제(예: 사릴루맙 또는 토실리주맙), 항생체, 바이러스의 구조적 성분에 대한 항체 또는 이의 단편(예: 수동 면역요법), 인터페론 베타(예: 인터페론 베타-1a), 및/또는 백신을 추가로 포함하는 것인, 조성물.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 정맥내 주사, 정맥내 주입, 도세터 펌프를 이용한 주입, 흡입 비강 분무, 점안액, 피부 패치, 서방성 제제, 생체외 유전자치료 또는 생체외 세포요법, 바람직하게는 정맥내 주사에 의해 투여되는 것인, 조성물.
  22. 다음 단계를 포함하는, 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 정의된 치료학적 유효량의 알파1-항트립신(AAT) 단백질, 이의 변이체, 아이소폼 및/또는 단편을 포함하는 조성물을 이용하여, 바이러스 감염 관련 질환 또는 증후군의 치료 및/또는 예방에 대한 관심 개체의 민감성을 결정하는 방법:
    a) 바이러스 감염 전 또는 바이러스 감염 중인 관심 개체에서 내인성 알파1-항트립신, 적어도 하나의 스파이크 단백질 프라이밍 프로테아제, ACE2 수용체 및 인터페론-감마를 포함하는 군 중 적어도 하나의 수준을 결정하는 단계,
    b) 바이러스 감염 중인 적어도 하나의 참조 개체에서 내인성 알파1-항트립신, 적어도 하나의 스파이크 단백질 프라이밍 프로테아제, ACE2 수용체 및 인터페론-감마를 포함하는 군 중 적어도 하나의 수준을 결정하는 단계로서, 상기 참조 개체는 무증상이거나 경미한 증상을 가지는 것인 단계,
    c) a) 단계에서 결정된 관심 수준을 b) 단계에서 결정된 참조 수준과 비교하는 단계로서, 상기 관심 개체가 하기로 구성된 군에서 선택된 적어도 하나를 가지는 경우, 상기 관심 개체가 바이러스 감염 관련 질환 또는 증후군의 치료 및/또는 예방에 더욱 민감한 것인 단계:
    1. 내인성 AAT의 참조 수준과 비교하여, 더 낮은 수준의 관심 내인성 알파-항트립신(AAT),
    2. 적어도 하나의 스파이크 단백질 프라이밍 프로테아제의 참조 수준과 비교하여, 더 높은 수준의 적어도 하나의 관심 스파이크 단백질 프라이밍 프로테아제,
    3. ACE2 수용체의 참조 수준과 비교하여, 더 높은 수준의 관심 안지오텐신 전환효소 2(ACE 수용체), 및
    4. IFN-γ의 참조 수준과 비교하여, 더 높은 수준의 관심 인터페론-감마(IFN-γ).
  23. 다음 단계를 포함하는, 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 이용하여 바이러스 감염 관련 질환 또는 증후군의 효과적인 치료 및/또는 예방을 위한 알파1-항트립신(AAT)의 치료학적 유효량을 결정하는 방법:
    a) 바이러스 감염 전 또는 바이러스 감염 중인 관심 개체에서 내인성 알파1-항트립신의 수준을 결정하는 단계,
    b) 적어도 10 μM, 바람직하게는 적어도 20 μM, 보다 바람직하게는 적어도50 μM, 보다 더 바람직하게는 적어도 100 μM, 및 가장 바람직하게는 적어도 200 μM의 개체 내 AAT의 수준을 달성하는데 필요한, 조성물 내 AAT의 양을 결정하는 단계.
  24. 제1항 내지 제21항 중 어느 한항에 따른 조성물, 또는 제22항 또는 제23항에 따른 방법에 있어서, 상기 바이러스는 코로나바이러스인, 조성물 또는 방법.
  25. 제24항에 따른 조성물 또는 제24항에 따른 방법에 있어서, 상기 바이러스는 SARS-CoV-2인, 조성물 또는 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 조성물, 또는 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 방법에 있어서, 상기 질환 또는 증후군은 호흡기 증후군 또는 중증 급성 호흡기 증후군인, 조성물 또는 방법.
  27. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 조성물, 또는 제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 방법에 있어서, 상기 질환 또는 증후군은 신경계의 염증성 질환 또는 증후군인, 조성물 또는 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 조성물, 또는 제27항에 따른 방법에 있어서, 신경계의 염증성 질환 또는 증후군은 다발성 경화증, 근위축성 측삭 경화증, 알츠하이머병, 파킨슨병 및 헌팅턴병의 군에서 선택된 질환 또는 증후군인, 조성물 또는 방법.
KR1020227042186A 2020-05-01 2021-05-03 바이러스 감염 관련 질환 또는 증후군의 치료 및/또는 예방 KR20230005965A (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP20172564.5 2020-05-01
EP20172564 2020-05-01
EP20192016.2 2020-08-20
EP20192016 2020-08-20
PCT/EP2021/061597 WO2021219896A1 (en) 2020-05-01 2021-05-03 Treatment and/or prevention of a disease or a syndrome related to a virus infection

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20230005965A true KR20230005965A (ko) 2023-01-10

Family

ID=83807521

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020227042186A KR20230005965A (ko) 2020-05-01 2021-05-03 바이러스 감염 관련 질환 또는 증후군의 치료 및/또는 예방

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20230302104A1 (ko)
EP (1) EP4142775A1 (ko)
JP (1) JP2023523652A (ko)
KR (1) KR20230005965A (ko)
CN (1) CN116033917A (ko)
AU (1) AU2021263106A1 (ko)
CA (1) CA3174939A1 (ko)
IL (1) IL297741A (ko)
MX (1) MX2022013309A (ko)

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1314447C (zh) * 2004-04-12 2007-05-09 爱华生物科技(香港)有限公司 一种具有抑制蛋白酶作用的药物的制备方法
US9421248B2 (en) * 2011-12-30 2016-08-23 Grifols, S.A. Alpha 1-proteinase inhibitor for delaying the onset or progression of pulmonary exacerbations
JP2018509164A (ja) * 2015-03-10 2018-04-05 ザ・トラスティーズ・オブ・コロンビア・ユニバーシティ・イン・ザ・シティ・オブ・ニューヨーク 組換えＧｌｕｔ１アデノ随伴ウイルスベクターコンストラクトおよびＧｌｕｔ１発現を回復させる方法

Also Published As

Publication number Publication date
IL297741A (en) 2022-12-01
AU2021263106A1 (en) 2022-11-03
CA3174939A1 (en) 2021-11-04
JP2023523652A (ja) 2023-06-06
MX2022013309A (es) 2022-11-14
EP4142775A1 (en) 2023-03-08
CN116033917A (zh) 2023-04-28
US20230302104A1 (en) 2023-09-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11028142B2 (en) Compositions and methods for TCR reprogramming using fusion proteins
CN111295449B (zh) 腺病毒载体及其用途
KR101666228B1 (ko) 생물치료학적 분자를 발현시키기 위한 치료학적 유전자-스위치 작제물 및 생물반응기, 및 이의 용도
US20030119104A1 (en) Chromosome-based platforms
KR102494564B1 (ko) 말라리아 백신
KR20210108423A (ko) 아데노 관련 바이러스 (aav) 생산자 세포주 및 관련 방법
KR20210105382A (ko) 단백질을 코딩하는 rna
KR20220121844A (ko) 유전자의 발현을 동시에 조절하기 위한 조성물 및 방법
JP2024037917A (ja) 組換えｔ細胞受容体遺伝子を用いて細胞ベースの治療薬を製造するための技法
CN111094569A (zh) 光控性病毒蛋白质、其基因及包含该基因的病毒载体
NZ237147A (en) Carrier bound recombinant proteins; production and vaccines
US11814412B2 (en) Artificial proteins and compositions and methods thereof
KR20230117327A (ko) 가용성 알칼리성 포스파타제 작제물 및 가용성 알칼리성 포스파타제 작제물을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터
TW202308669A (zh) 嵌合共刺激性受體、趨化激素受體及彼等於細胞免疫治療之用途
KR20240021906A (ko) 발현 벡터, 박테리아 서열-무함유 벡터, 및 이를 제조하고 사용하는 방법
CN101516199A (zh) 用于树突状细胞免疫的靶向基因输送
KR20230005965A (ko) 바이러스 감염 관련 질환 또는 증후군의 치료 및/또는 예방
KR20240022571A (ko) Rna-가이드된 이펙터 동원을 위한 시스템, 방법 및 성분
CA2522166C (en) Lambda integrase mutein for use in recombination
KR20240023100A (ko) 유전자 발현을 조절하기 위한 조성물 및 방법

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination