CN116033917A - 与病毒感染相关的疾病或综合征的治疗和/或预防 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于治疗和/或预防与病毒感染相关的疾病或综合征的组合物和方法。本发明还涉及确定受试者对此类治疗的敏感性的方法，以及确定有效治疗所需的组合物的量的方法。

Description

与病毒感染相关的疾病或综合征的治疗和/或预防
技术领域
本发明提供了用于治疗和/或预防与病毒感染相关的疾病或综合征的组合物和方法。本发明还涉及用于确定受试者对此类治疗的易感性的方法，以及用于确定有效治疗所需的组合物的量的方法。
背景技术
病毒，例如冠状病毒，在世界范围内引起动物和人类的疾病。冠状病毒是RNA病毒。
已知人类冠状病毒(HCoV)主要导致上呼吸道和下呼吸道感染。人类冠状病毒的实例有：引起中东呼吸综合征的β冠状病毒(命名为MERS-CoV)、引起严重急性呼吸综合征的β冠状病毒(命名为SARS-CoV，或SARS-CoV-1)、引起冠状病毒疾病2019或COVID-19的新型冠状病毒(命名为SARS-CoV-2)、α冠状病毒299E、α冠状病毒NL63、β冠状病毒OC43和β冠状病毒HKU1。
由SARS-CoV-2感染引起的疾病或综合征也被称为COVID-19。SARS-CoV-2感染可以是无症状的，也可以导致与轻微或严重症状相关的疾病或综合征。与SARS-CoV-2(也被称为SARS-CoV-19)感染相关的疾病或综合征的最常见症状是发热和咳嗽、疲劳、呼吸困难、寒战、关节或肌肉疼痛、咳痰、产生痰、喘证(dyspnea)、肌痛(myalgia)、关节痛或咽喉痛、头痛、恶心、呕吐、腹泻、窦痛(sinus pain)、鼻塞、嗅觉或味觉的减弱或改变。其他症状包括食欲不振、体重减轻、胃痛、结膜炎、皮疹、淋巴瘤、情感淡漠和嗜睡。
症状严重的患者可发展成肺炎。相当多的肺炎患者需要被动氧疗。无创通气和经鼻高通量氧疗可应用于轻中度非高碳酸血症肺炎病例。对于严重急性呼吸综合征或急性呼吸窘迫综合征(SARS/ARDS)和机械通气患者，必须实施肺保护性通气策略。
虽然冠状病毒疾病2019(COVID-19)的主要并发症是呼吸衰竭，但据报道，相当多的患者具有影响周围神经系统和中枢神经系统的神经症状(Niazkar,Zibaee etal.2020Neurol Sci 41(7):1667-1671；Nordvig,Fong et al.2021,Neurol Clin Pract11(2):e135-e146)。造血途径、沿周围神经的逆向/顺向转运以及罕见的直接侵袭被认为是包括SARS-CoV-2在内的嗜神经病毒的可能的神经侵袭机制(Barrantes 2021Brain BehavImmun Health 14:100251；Tavcar,Potokar et al.2021,Front Cell Neurosci15:662578)。严重的SARS-CoV-2病例通常表现出不成比例和异常的炎症反应，包括细胞因子、趋化因子和促炎性信号的全身性上调(Najjar,Najjar et al.2020,J Neuroinflammation17(1):231)。这种全身性过度炎症可损害神经血管内皮功能、破坏血脑屏障、最终激活CNS免疫系统，并导致CNS并发症(Amruta,Chastain et al.,2021,Cytokine Growth FactorRev 58:1-15)。尽管最近COVID-19大流行引起了关注，但其他几种病毒与诸如阿尔茨海默病、帕金森病和多发性硬化症的主要脑部疾病有关。与病毒感染相关的疾病或综合征还包括例如炎性疾病的多种疾病或综合征，并且是社会的主要负担。因此，亟需改善与病毒相关的疾病或综合征的治疗和/或预防。
通过本文公开的方面以及权利要求中限定的方面来解决上述技术问题。
发明内容
本发明提供了一种用于在有需要的受试者中治疗和/或预防与病毒感染相关的疾病或综合征之用途的组合物，所述病毒感染优选为冠状病毒感染，更优选为SARS-CoV-2感染，所述组合物包含治疗有效量的α1-抗胰蛋白酶蛋白，其变体、同种型和/或片段。所述α1-抗胰蛋白酶(AAT)蛋白，其变体、同种型和/或片段可以是血浆提取的AAT，其变体、同种型和/或片段，特别是人血浆提取的AAT，其变体、同种型和/或片段；或重组α1-抗胰蛋白酶(rhAAT)蛋白，其变体、同种型和/或片段，优选地，所述α1-抗胰蛋白酶(AAT)蛋白，其变体、同种型和/或片段是重组α1-抗胰蛋白酶(rhAAT)蛋白，其变体、同种型和/或片段。所述病毒感染例如冠状病毒感染优选为SARS-CoV-2感染。与至少一个在病毒感染(优选为冠状病毒感染，更优选为SARS-CoV-2感染)期间的无症状或具有轻度症状的受试者相比，需要治疗和/或预防与病毒感染(优选为冠状病毒感染，更优选为SARS-CoV-2感染)相关的疾病或综合征的受试者可具有至少i)较低的内源性α-抗胰蛋白酶(AAT)水平，ii)较高的至少一种刺突蛋白启动蛋白酶(spike protein priming protease)水平，iii)较高的血管紧张素转换酶2(ACE2)受体水平，和/或iv)较高的干扰素-γ(IFN-γ)水平。
本发明还涉及一种用于确定目标受试者对与病毒感染相关的疾病或综合征的治疗和/或预防的敏感性的方法，所述治疗和/或预防使用本发明的用途的组合物，所述病毒感染优选为冠状病毒感染，更优选为SARS-CoV-2感染。
本发明还提供了一种用于确定有效治疗和/或预防与病毒感染相关的疾病或综合征的α1-抗胰蛋白酶(AAT)的治疗有效量的方法，所述治疗和/或预防使用用于本发明的用途的组合物，所述病毒感染优选为冠状病毒感染，更优选为SARS-CoV-2感染。
还提供了一种在有需要的受试者中治疗和/或预防与病毒感染相关的疾病或综合征的方法，所述病毒感染优选为冠状病毒感染，更优选为SARS-CoV-2感染，所述方法包括施用治疗有效量的α1-抗胰蛋白酶蛋白，其变体、同种型和/或片段。所述α1-抗胰蛋白酶(AAT)蛋白，其变体、同种型和/或片段可以是血浆提取的AAT，其变体、同种型和/或片段，特别是人血浆提取的AAT，其变体、同种型和/或片段；或重组α1-抗胰蛋白酶(rhAAT)蛋白，其变体、同种型和/或片段，优选地，所述α1-抗胰蛋白酶(AAT)蛋白，其变体、同种型和/或片段是重组α1-抗胰蛋白酶(rhAAT)蛋白，其变体、同种型和/或片段。
因此，本发明尤其涉及以下方面：
1.一种用于在有需要的受试者中治疗和/或预防与病毒感染相关的疾病或综合征之用途的组合物，所述组合物包含治疗有效量的α1-抗胰蛋白酶(AAT)蛋白，其变体、同种型和/或片段。
2.根据方面1所述之用途的组合物，其中所述有需要的受试者具有选自由以下组成的组的至少一种：
1.与至少一个在病毒感染期间的无症状或具有轻度症状的受试者相比，在病毒感染之前或在病毒感染期间较低的内源性α-抗胰蛋白酶(AAT)水平，
2.与至少一个在病毒感染期间的无症状或具有轻度症状的受试者相比，在病毒感染之前或在病毒感染期间较高的至少一种刺突蛋白启动蛋白酶水平，
3.与至少一个在病毒感染期间的无症状或具有轻度症状的受试者相比，在病毒感染之前或在病毒感染期间较高的受试者中的血管紧张素转换酶2(ACE2受体)水平，和
4.与至少一个在病毒感染期间的无症状或具有轻度症状的受试者相比，在病毒感染之前或在病毒感染期间较高的受试者中的干扰素-γ(IFN-γ)水平。
3.根据方面2所述之用途的组合物，其中所述在病毒感染之前或在病毒感染期间较低的内源性AAT水平是由AAT缺乏症引起的。
4.根据方面2或3所述之用途的组合物，其中所述刺突蛋白启动蛋白酶选自由以下组成的组的至少一种：跨膜蛋白酶丝氨酸亚型2(TMPRSS2)、跨膜蛋白酶亚型6(TMPRSS6)、组织蛋白酶L、组织蛋白酶B、前蛋白转化酶1(PC1)、胰蛋白酶、弹性蛋白酶、中性粒细胞弹性蛋白酶、蛋白裂解酶(matriptase)和弗林蛋白酶，所述刺突蛋白启动蛋白酶优选为组织蛋白酶L和弗林蛋白酶。
5.根据方面2至4中任一项所述之用途的组合物，其中所述较高的至少一种刺突蛋白启动蛋白酶水平是由年龄和/或遗传倾向引起的。
6.根据方面2至5中任一项所述之用途的组合物，其中所述较高的ACE2受体水平是由选自感染、炎症、年龄和/或遗传倾向的组中的至少一种引起的。
7.根据方面2至6中任一项所述之用途的组合物，其中所述较高的IFN-γ水平是由选自感染、炎症、年龄和遗传倾向的组中的至少一种引起的。
8.根据方面2至7中任一项所述之用途的组合物，其中所述有需要的受试者具有
i)较低的内源性AAT水平，和
ii)较高的至少一种刺突蛋白启动蛋白酶水平。
9.根据方面2至8中任一项所述之用途的组合物，其中所述有需要的受试者具有
i)较低的内源性AAT水平，和
iii)较高的ACE2受体水平。
10.根据方面2至9中任一项所述之用途的组合物，其中所述有需要的受试者具有
i)较低的内源性AAT水平，和
iv)较高的干扰素-γ水平。
11.根据方面10所述之用途的组合物，其中所述较高的IFN-γ水平是由选自由以下组成的组中的至少一种疾病或病症引起的：AAT缺乏症、肝病如非酒精性脂肪性肝病、糖尿病、肥胖症和/或心血管病症。
12.根据方面2至11中任一项所述之用途的组合物，其中所述有需要的受试者具有
i)较低的内源性AAT水平，
ii)较高的至少一种刺突蛋白启动蛋白酶水平，和
iii)较高的ACE2受体水平和/或iv)较高的IFN-γ水平。
13.根据前述方面中任一项所述之用途的组合物，其中所述α1-抗胰蛋白酶(AAT)蛋白、其变体、同种型和/或片段是从人血浆提取的。
14.根据方面1至12中任一项所述之用途的组合物，其中所述α1-抗胰蛋白酶(AAT)蛋白、其变体、同种型和/或片段是重组α1-抗胰蛋白酶(rhAAT)、其变体、同种型和/或片段。
15.根据方面14所述之用途的组合物，其中所述α1-抗胰蛋白酶蛋白如SEQ ID NO:1中所示。
16.根据方面14所述之用途的组合物，其中所述α1-抗胰蛋白酶片段是C末端序列片段，或其任意组合。
17.根据方面14所述之用途的组合物，其中所述α1-抗胰蛋白酶变体选自包括衍生自如SEQ ID NO:2所示的C末端序列的短环肽的组。
18.根据方面17所述之用途的组合物，其中衍生自α1-抗胰蛋白酶的C-末端序列的所述短环肽选自包括以下的组：环-(CPFVFLM)-SH、环-(CPFVFLE)-SH、环-(CPFVFLR)-SH和环-(CPEVFLM)-SH、或其任意组合。
19.根据前述方面中任一项所述之用途的组合物，其中所述组合物还包含药学上可接受的赋形剂或载剂。
20.根据前述方面中任一项所述之用途的组合物，其中所述组合物还包含核苷类似物、蛋白酶抑制剂、免疫抑制剂(例如，沙利鲁单抗(sarilumab)或托珠单抗)、抗生素、针对所述病毒结构成分的抗体或其片段(例如，被动免疫疗法)、干扰素β(例如，干扰素β-1a)和/或疫苗。
21.根据前述方面中任一项所述之用途的组合物，其中所述组合物通过静脉内注射、静脉内输注、剂量泵(dosator pump)输注、吸入性鼻喷雾剂、滴眼剂、皮肤贴剂、缓释制剂、活体外基因疗法或活体外细胞疗法施用，优选通过静脉内注射施用。
22.一种用于确定目标受试者对与病毒感染相关的疾病或综合征的治疗和/或预防的敏感性的方法，所述治疗和/或预防使用如方面1至21中任一项所限定的包含治疗有效量的α1-抗胰蛋白酶(AAT)蛋白，其变体、同种型和/或片段的组合物，所述方法包括以下步骤：
a)确定目标受试者在病毒感染之前或病毒感染期间的包括内源性α1-抗胰蛋白酶、至少一种刺突蛋白启动蛋白酶、ACE2受体和干扰素-γ的组中的至少一种的水平，
b)确定至少一个参考受试者在病毒感染期间的包括内源性α1-抗胰蛋白酶、至少一种刺突蛋白启动蛋白酶、ACE2受体和干扰素-γ的组中的至少一种的水平，其中所述参考受试者无症状或具有轻度症状，
c)将在步骤a)中确定的目标水平与在步骤b)中确定的参考水平进行比较，
其中如果所述目标受试者具有选自由以下组成的组中的至少一种，则所述目标受试者对与病毒感染相关的疾病或综合征的治疗和/或预防更敏感：
1.与所述内源性AAT的参考水平相比较低的内源性α-抗胰蛋白酶(AAT)的目标水平，
2.与所述至少一种刺突蛋白启动蛋白酶的参考水平相比较高的至少一种刺突蛋白启动蛋白酶的目标水平，
3.与所述血管紧张素转换酶2受体的参考水平相比较高的血管紧张素转换酶2(ACE2受体)的目标水平，以及
4.与所述干扰素-γ的参考水平相比较高的干扰素-γ(IFN-γ)的目标水平。
23.一种用于确定有效治疗和/或预防与病毒感染相关的疾病或综合征的α1-抗胰蛋白酶(AAT和/或rhAAT)的治疗有效量的方法，所述治疗和/或预防使用根据方面1至21中任一项所述的组合物，所述方法包括以下步骤：
a)确定目标受试者在病毒感染之前或病毒感染期间的内源性α1-抗胰蛋白酶的水平，
b)确定所述组合物中AAT的量，所述量是在所述受试者中达到至少10μM、优选至少20μM、更优选至少50μM、甚至更优选至少100μM、最优选至少200μM的AAT水平所需要的量。
24.根据方面1至21中任一项所述之用途的组合物，或根据方面22和23所述的方法，其中所述病毒是冠状病毒。
25.根据方面24所述之用途的组合物，或根据方面24所述的方法，其中所述病毒是SARS-CoV-2。
26.根据方面1至25中任一项所述之用途的组合物，或根据方面22至25所述的方法，其中所述疾病或综合征是呼吸综合征或严重急性呼吸综合征。
27.根据方面1至25中任一项所述之用途的组合物，或根据方面22至25所述的方法，其中所述疾病或综合征是神经系统炎性疾病或神经系统综合征。
28.根据方面1至27中任一项所述之用途的组合物，或根据方面27所述的方法，其中所述神经系统炎性疾病或神经系统综合征是选自以下的组的疾病或综合征：多发性硬化症、肌萎缩性侧索硬化症、阿尔茨海默病、帕金森病和亨廷顿病。
具体实施方式
尽管可以在本发明的实践或测试中使用与本文所述的方法和材料类似或等同的方法和材料，但在下文中将描述合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献的全部内容均通过引用纳入本文。提供本文讨论的出版物和申请仅因其公开先于本申请的提交日期。本文中的任何内容都不应被解释为承认本发明无权凭借在先发明而先于此类出版物。此外，材料、方法和实例仅是说明性的，而不是限制性的。
在矛盾的情况下，以本说明书(包括定义)为准。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语均与本文主题所属领域的技术人员通常理解的含义相同。如本文所用，提供以下定义以便于理解本发明。
术语“包含(comprise/comprising)”通常以包括(include/including)的含义使用，即允许存在一个或多个特征或组件。
如在说明书和权利要求中所使用的，单数形式的“一个”(a/an)和“所述”包括对复数个的引用，除非上下文另有明确规定。
如本文所用，“至少一个“表示“一个或多个”、“两个或多个”、“三个或多个”等。
如本文所用，术语“受试者”/“有需要的受试者”或“患者”/“有需要的患者”在本领域中是公认的，并且在本文中可互换使用以指代哺乳动物，包括狗、猫、大鼠、小鼠、猴、牛、马、山羊、绵羊、猪、骆驼，并且最优选是人。在一些情况下，所述受试者是需要治疗的受试者或患有疾病或障碍的受试者。然而，在其他方面，所述受试者可以是健康的受试者。该术语不表示特定的年龄或性别。因此，旨在涵盖成年受试者、儿童受试者和新生儿受试者，无论是男性还是女性。优选地，所述受试者是人。最优选地，所述受试者是患有与病毒感染相关的疾病或综合征的人，所述病毒感染优选为冠状病毒感染，更优选为SARS-CoV-2感染。
如本文所用，术语“肽”、“蛋白质”、“多肽”、“多肽的”和“肽的”可互换使用以表示通过相邻残基的α-氨基基团和羧基基团之间的肽键相互连接的一系列氨基酸残基。
术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用以指代任何种类的呈线性或环状构象的和呈单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸(例如DNA、cDNA……)聚合物或核糖核苷酸(例如RNA、mRNA……)聚合物或脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸(例如DNA/RNA)聚合物的组合。这些术语不应被解释为对聚合物长度的限制，并且可以包括已知的天然核苷酸类似物，以及在碱基、糖和/或磷酸部分(例如硫代磷酸酯主链)经修饰的核苷酸类似物。通常，特定核苷酸的类似物具有相同的碱基配对特异性；即A的类似物将与T碱基配对。
如本文所用，术语“载体(vector)”是指病毒载体或核酸(DNA或RNA)分子例如质粒或其他媒介物(vehicle)，其含有本发明的一种或多种异源核酸序列，并且优选被设计用于在不同宿主细胞之间进行转移。术语“表达载体”、“基因递送载体”和“基因治疗载体”是指在细胞中，优选在启动子的调控下，有效掺入并表达本发明的一种或多种核酸的任何载体。克隆或表达载体可以包含额外的元件，例如，除了启动子之外的调节元件和/或转录后调节元件。
术语“约”，特别是就给定量而言，意味着包括正负百分之十(10)的偏差，优选为百分之五，甚至更优选为百分之二，最优选为百分之一的偏差。
本发明涉及用于在有需要的受试者中治疗和/或预防与任何病毒感染相关的疾病或综合征之用途的组合物，所述组合物包含治疗有效量的α1-抗胰蛋白酶蛋白，其变体、同种型和/或片段。
所述α1-抗胰蛋白酶(AAT)蛋白，其变体、同种型和/或片段可以是血浆提取的AAT，其变体、同种型和/或片段，特别是人血浆提取的AAT，其变体、同种型和/或片段；或重组α1-抗胰蛋白酶(rhAAT)蛋白，其变体、同种型和/或片段，优选地，所述α1-抗胰蛋白酶(AAT)蛋白，其变体、同种型和/或片段是重组α1-抗胰蛋白酶(rhAAT)蛋白，其变体、同种型和/或片段。所述病毒感染可由无论有包膜还是无包膜的DNA病毒(双链或单链)、RNA病毒(单链或双链，阳性或阴性)、逆转录病毒或任何新兴病毒引起。
在本发明的一些方面，所述组合物用于在有需要的受试者中治疗和/或预防与呼吸道病毒感染相关的疾病或综合征。在一些方面，本文所述的呼吸道病毒是选自以下的组的病毒：鼻病毒、RSV、副流感病毒、偏肺病毒、冠状病毒、肠病毒、腺病毒、博卡病毒、多瘤病毒、单纯疱疹病毒和巨细胞病毒。
在本发明的一些方面，所述组合物用于在有需要的受试者中治疗和/或预防与DNA病毒感染相关的疾病或综合征。
在一些方面，本文所述的DNA病毒选自由以下组成的组：腺病毒、鼻病毒、RSV、流感病毒、副流感病毒、偏肺病毒、冠状病毒、肠病毒、腺病毒、博卡病毒、多瘤病毒、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、博卡病毒、多瘤病毒和巨细胞病毒。
在本发明的一些方面，所述组合物用于在有需要的受试者中治疗和/或预防与RNA病毒感染相关的疾病或综合征。所述RNA病毒可以是包膜RNA病毒或包被的RNA病毒，或者是无包膜RNA病毒或裸RNA病毒。所述RNA病毒可以是单链RNA(ssRNA)病毒或双链RNA(dsRNA)病毒。所述单链RNA病毒可以是正义ssRNA病毒或负义ssRNA病毒。
在一些方面，本文所述的RNA病毒选自由以下组成的组：鼻病毒、RSV、流感病毒、副流感病毒、偏肺病毒、冠状病毒、肠病毒、腺病毒、博卡病毒、多瘤病毒、单纯疱疹病毒和巨细胞病毒。在本发明的一些方面，所述组合物用于在有需要的受试者中治疗和/或预防与冠状病毒感染相关的疾病或综合征。在一些方面，本文所述的冠状病毒是选自以下的组的冠状病毒：α-CoV、β-CoV、γ-CoV或δ-CoV。在另一具体方面，本文所述的冠状病毒属于α-CoV或β-CoV属。在一些方面，本文所述的冠状病毒选自由以下组成的组：人类冠状病毒OC43(HCoV-OC43)、人类冠状病毒HKU1(HCoV-HKU1)、人类冠状病毒229E(HCoV-229E)、人类冠状病毒NL63(HCoV-NL63，New Haven冠状病毒)、中东呼吸综合征相关冠状病毒(MERS-CoV或“新型冠状病毒2012”)、严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV或“SARS-典型”)和严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2或“新型冠状病毒2019”)。优选地，所述病毒感染是RNA病毒感染，最优选冠状病毒感染是由选自包括MERS-CoV、SARS-CoV和SARS-CoV-2的非限制性组的冠状病毒引起的。最优选地，所述病毒感染是SARS-CoV-2感染。
应当理解，本发明包括所有与病毒感染相关的疾病或综合征，所述病毒感染优选为冠状病毒感染，更优选为SARS-CoV-2感染。所述与SARS-CoV-2感染相关的疾病或综合征也被称为COVID-19。在一个方面，与病毒感染相关的疾病或综合征是炎症例如全身血管的炎症(例如川崎病)、免疫疾病(例如格雷夫斯病)和/或呼吸综合征，特别是严重急性呼吸综合征。所述疾病或综合征可与病毒感染有关，因为病毒感染与所述疾病或综合征相关，先于所述疾病或综合征，促成所述疾病或综合征和/或导致所述疾病或综合征。例如，病毒感染可引发炎症，所述炎症直接或间接地引发所述疾病或综合征。与病毒感染相关的炎症可以是急性炎症或慢性炎症。与病毒感染相关的炎症随后可持续存在于全身和/或具体器官(例如脑)中和/或引起持续的损伤。在本发明的一些方面，所述组合物用于在有需要的受试者中治疗和/或预防与病毒感染相关的神经系统炎性疾病或神经系统综合征。
如本文所用，术语“神经系统炎性疾病或神经系统综合征”是指与健康参考受试者相比，以增加神经系统的炎症为特征的疾病、综合征和/或病症。本文所述的疾病或综合征包括与病毒有关的神经系统的疾病或综合征。炎症的特征在于血液和/或脑中的炎症标志物的失调和/或免疫细胞的浸润、活化、增殖和/或分化的增加。炎症标志物是在受试者中指示炎症的标志物。在某些方面，本文所述的炎症标志物是选自以下的组的标志物：CRP、红细胞沉降率(ESR)和降钙素原(PCT)、白介素(例如，IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-33、IL-32、IL-33、IL-35或IL-36)、肿瘤坏死因子(如TNFα、TNFβ)，干扰素(如干扰素γ)、MIP-I、MCP-I、RANTES、其他趋化因子和/或其他细胞因子。也可以间接检测炎症标志物，例如，通过检测炎症标志物的抑制因子(例如，结合因子和/或拮抗物)。在一些方面，在参与炎症的细胞、受参与炎症的细胞影响的细胞、脑脊液和/或血液中测量炎症标志物。在一些方面，炎症标标志物指示免疫细胞的浸润、活化、增殖和/或分化。炎症标志物的检测或两种或多种炎症标志物的比率被检测出超出了正常范围。炎症标志物的正常范围以及标志物(比率)是否必须低于或高于指示炎症的阈值是本领域技术人员已知的。在一些方面，检测至少一种炎症标志物的基因表达水平、RNA转录水平、蛋白质表达水平、蛋白质活性水平和/或酶活性水平。在一些方面，定量检测和/或定性检测至少一种炎症标志物，以确定需要治疗和/或预防的受试者的神经系统炎性疾病或神经系统综合征。
在一些方面，本文所述的神经系统炎性疾病或神经系统综合征以急性炎症为特征，即炎症症状的持续时间通常为约几分钟(例如，2、5、10、15、30、45分钟)至几天(例如，2、3、5、7、10或14天)。急性炎症通常作为刺激(如病毒感染)的直接结果发生。在一些方面，神经系统炎性疾病或神经系统综合征以慢性炎症为特征，即炎症症状的持续时间通常为至少约几天(例如，2、3、5、7、10或14天)，或者炎症症状复发至少一次(例如，一次或多次、两次或多次或三次或多次)。在一些方面，神经系统炎性疾病或神经系统综合征以慢性低度炎症为特征。慢性低度炎症可以在没有临床症状的情况下发生。
在某些方面，需要治疗和/或预防的受试者具有病毒感染史。因此，所述需要治疗和/或预防的受试者至少感染过一次病毒。在某些方面，所述需要治疗和/或预防的受试者至少感染过一次病毒。在某些方面，所述需要治疗和/或预防的受试者在儿童期至少感染过一次病毒。在某些方面，所述需要治疗和/或预防的受试者至少感染过一次病毒。在某些方面，所述需要治疗和/或预防的受试者在过去30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0.5年中至少感染过一次病毒。在某些方面，在诊断所述需要治疗和/或预防的受试者的神经系统炎性疾病或神经系统综合征的时间点，病毒感染是活跃的(例如可检测出的)。
用于检测病毒感染的方法是本领域技术人员已知的。在一些方面，本发明涉及用于检测病毒的方法，所述方法选自以下的组：病毒分离法、基于核酸的方法、基于显微镜的方法、宿主抗体检测、电子显微镜和宿主细胞表型。
在一些方面，在样本中检测本文所述的病毒感染，例如在选自以下的组的样本中：鼻咽拭子、血液、组织(例如皮肤)、痰、含漱液、支气管洗液、尿液、精液、粪便、脑脊液、干血斑、鼻粘液。
在一些方面，本文所述的病毒感染是作为从患者病史中检索的信息获得的。
检测(先前的)SARS-CoV-2感染的实例包括人IFN-γSARS-CoV-2ELISpotPLUS试剂盒(ALP)、试纸条(Mabtech，3420-4AST-P1-1)或T细胞反应的测定(Zuo,J.,Dowell,A.C.,Pearce,H.et al.,2021,Nat Immunol)。
在一些方面，本文所述的神经系统炎性疾病或神经系统综合征是交感神经系统炎性疾病或交感神经系统综合征。在一些方面，本文所述的神经系统炎性疾病或神经系统综合征是副交感神经系统炎性疾病或副交感神经系统综合征。在一些方面，本文所述的神经系统炎性疾病或神经系统综合征是中枢神经系统炎性疾病或中枢神经系统综合征。在一些方面，本文所述的神经系统炎性疾病或神经系统综合征是周围神经系统炎性疾病或周围神经系统综合征。
在某些方面，与病毒相关的神经系统炎性疾病或神经系统综合征选自以下的组：多发性硬化症、肌萎缩性侧索硬化症、阿尔茨海默病、帕金森病和亨廷顿病。
如本文所用，术语“多发性硬化症”是指以炎症、脱髓鞘、少突胶质细胞死亡、膜损伤和轴突死亡为特征的疾病或障碍。在一些方面，本文所述的多发性硬化症是指复发/缓解型多发性硬化症或进行性多发性硬化症。在一些方面，多发性硬化症是神经病学家的国际调查中定义的四种主要多发性硬化症类型中的至少一种(Lublin和Reingold，1996，Neurology 46(4)：907-11)，即复发/缓解型多发性硬化症、继发性进行性多发性硬化症、进行性/复发型多发性硬化症或原发性进行性多发性硬化症(PPMS)。
在一些方面，本文所述的多发性硬化症是指多发性硬化症的症状，包括视力问题、头晕(dizziness)、眩晕(vertigo)、感觉功能障碍、虚弱、协调性问题、平衡缺失、疲劳、疼痛、神经认知缺陷、心理健康缺陷、膀胱功能障碍、肠功能障碍、性功能障碍、热敏感性。
如本文所用，术语“亨廷顿病”是指由HTT基因中的三核苷酸重复扩增(例如CAG，其被翻译成多聚谷氨酰胺或PolyQ区)导致的致病突变亨廷顿蛋白(HTT或mHTT)的产生而引起的神经退行性疾病。在某些方面，突变亨廷顿蛋白加快了大脑某些区域的神经元细胞死亡的速度。在一些方面，本文所述的亨廷顿病是指亨廷顿病的症状，包括运动功能受损、认知障碍、抑郁、焦虑、运动障碍、舞蹈病、强直、肌肉挛缩(肌张力障碍)、眼球运动缓慢或眼球运动异常、步态受损、姿势改变、平衡性受损、意外的体重减轻、睡眠节律紊乱、昼夜节律紊乱和自主神经系统功能障碍。
如本文所用，术语“肌萎缩性侧索硬化症”是指影响上运动神经元(大脑中的运动神经元)和/或下运动神经元(脊髓中的运动神经元)并导致运动神经元死亡的进行性神经退行性疾病。在一些方面，肌萎缩性侧索硬化症包括本领域已知的肌萎缩性侧索硬化症的所有分类，包括但不限于典型肌萎缩性侧索硬化症(通常影响下运动神经元和上运动神经元)、原发性侧索硬化症(PLS，通常仅影响上运动神经元)、进行性延髓麻痹症(PBP或延髓发作，一种典型地以吞咽、咀嚼和说话困难开始的肌萎缩性侧索硬化症的形式)、进行性肌萎缩症(PMA，通常仅影响下运动神经元)和家族性肌萎缩性侧索硬化症(肌萎缩性侧索硬化症的遗传形式)。
在一些方面，术语“肌萎缩性侧索硬化症”是指肌萎缩性侧索硬化症的症状，包括但不限于进行性无力、萎缩、肌束震颤、反射亢进、构音障碍、吞咽困难和/或呼吸功能麻痹。
如本文所用，术语“阿尔茨海默病”(AD)是指与特定退行性脑疾病相关的精神退化，其特征为老年斑、神经纤维缠结(neuritic tangle)和进行性神经元损失，其临床表现为进行性记忆缺陷、意识模糊、行为问题、不能自理和/或身体逐渐退化。
在一些方面，使用NINCDS-ADRDA(国家神经和交流障碍研究所和阿尔茨海默病及相关疾病协会)标准来鉴定患有阿尔茨海默病的受试者：
1)临床痴呆等级(CDR)＝1；简易精神状态检查(MMSE)为16至24分，内侧颞叶萎缩(通过磁共振成像(MRI)确定)在Scheltens量表中>3分。在某些方面，术语“阿尔茨海默病”包括疾病的所有阶段，包括在1984年由NINCDS-ADRDA阿尔茨海默病诊断标准定义的以下阶段。
2)明确的阿尔茨海默病：患者符合可能患有阿尔茨海默病的标准，并且通过尸检或活组织检查具有AD的组织病理学证据。
可能患有或前驱性阿尔茨海默病：痴呆症已通过临床和神经心理学检查所证实。认知障碍也必须是进行性的，并且存在于两个或更多个认知领域。这些缺陷的发病年龄为40至90岁，以及最后，必须不存在能够产生痴呆综合征的其他疾病。
3)可能患有或非前驱性阿尔茨海默病：存在具有非典型的发作、表现的痴呆综合征；并且没有已知的病因；但是没有被认为是痴呆症的起源的能够产生痴呆症的共病的疾病。在某些方面，术语阿尔茨海默病是指阿尔茨海默病的一个阶段。在某些方面，术语阿尔茨海默病是指阿尔茨海默病的两个阶段。在一些方面，术语“阿尔茨海默病”是指阿尔茨海默病的症状，包括但不限于记忆力丧失、意识模糊、思维困难、语言改变、行为改变和/或性格改变。
如本文所用，术语“帕金森病”是指以多巴胺缺乏为特征的神经系统综合征，由黑质基底神经节的退行性变化、血管性变化或炎性变化引起。帕金森病的症状包括但不限于以下症状：静止性震颤、齿轮样强直、运动迟缓、姿势反射障碍、对1-多巴治疗的良好反应、没有明显的动眼神经麻痹、小脑或锥体体征、肌萎缩、运动障碍和/或言语障碍。在一个具体方面，本发明用于治疗多巴胺能功能障碍相关综合征。在一些方面，帕金森病包括帕金森病的任何阶段。在一些方面，术语帕金森病包括帕金森病的早期阶段，其广义上指帕金森病的第一阶段，其中患有该疾病的人表现出非致残性的轻度症状，例如单个肢体(例如手)的阵发性震颤，并且其仅影响身体的一侧。
在一些方面，术语帕金森病包括帕金森病的晚期阶段，其是指帕金森病的更严重的进展期阶段，其中患有该疾病的人表现出典型严重的并且可能导致一些残疾(例如，包括身体两侧的震颤、平衡性问题等)的症状。与晚期阶段的帕金森病相关的症状在个体中可能有显著差异，并且可能在疾病最初出现后数年才表现出来。
在一些方面，术语“帕金森病”是指帕金森病的症状，包括但不限于震颤(例如，休息时最明显的震颤)、颤抖(例如，手、臂、腿、颌和脸的颤抖)、肌肉僵硬、姿势反射缺乏、自主运动减慢、后倾、面具样面部表情、驼背姿势、平衡性差、协调性差、运动迟缓、姿势不稳定和/或步态异常。
神经系统炎性疾病或神经系统综合征与病毒感染之间的已确定的联系的实例：
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所述疾病或综合征优选与冠状病毒感染相关，更优选地，所述疾病或综合征与SARS-CoV-2感染相关。与SARS-CoV-2疾病或综合征相关的疾病或综合征优选选自由以下组成的组中的至少一种：发热、咳嗽、疲劳、呼吸困难、寒战、关节或肌肉疼痛、咳痰、产生痰、喘证、肌痛、关节痛或咽喉痛、头痛、恶心、呕吐、腹泻、窦痛、鼻塞、嗅觉或味觉的减弱或改变、食欲不振、体重减轻、胃痛、结膜炎、皮疹、淋巴瘤、情感淡漠和嗜睡，优选为发热、咳嗽、疲劳、呼吸困难、寒战、关节或肌肉疼痛、咳痰、产生痰、喘证、肌痛、关节痛或咽喉痛、头痛、恶心、呕吐、腹泻、窦痛、鼻塞、嗅觉或味觉的减弱或改变。
本发明涉及用于在有需要的受试者中治疗和/或预防与病毒感染的疾病或综合征的组合物，所述病毒感染优选为冠状病毒感染，所述组合物包含治疗有效量的α1-抗胰蛋白酶(AAT)蛋白，其变体、同种型和/或片段。所述冠状病毒优选为SARS-CoV-2。
发明人发现AAT和rhAAT抑制了若干种病毒的病毒进入(见图11、图21、图22)并减轻了炎症，特别是在神经系统的小胶质细胞中的炎症(图19、图20)。此外，神经元来源的SH-SY5Y细胞(经常用于研究包括帕金森病在内的神经退行性疾病(Xicoy,H.,Wieringa,B.&Martens,G.J.The SH-SY5Y cell line in Parkinson’s disease research:asystematic review.Mol Neurodegeneration 12,10,2017))显示了相对高拷贝数的刺突蛋白启动蛋白酶mRNA，即胰蛋白酶和组织蛋白酶B(图15e)。与SH-SY5Y中相对高的ACE2表达水平相结合(图3a)，这些神经组织(Bielarz V,Willemart K,Avalosse N,etal.Susceptibility of neuroblastoma and glioblastoma cell lines to SARS-CoV-2infection.Brain Res.2021May 1)和类似来源的细胞变得易受SARS-CoV-2病毒的感染。
可以使用各种策略，将用于本发明的用途的组合物递送至神经系统，包括脑并通过血脑屏障(Salameh,T.S.,&Banks,W.A.,2014,Advances in pharmacology,71,277-299；Tashima,T.,2020,Receptor-Mediated Transcytosis.Chemical and PharmaceuticalBulletin,68(4),316-32；Pardridge,W.M.,2020,Frontiers in aging neuroscience,11,373；Upadhyay,R.K.,2014,BioMed research international)。
在一些方面，将用于本发明的用途的组合物与血脑屏障增强蛋白融合。在一些方面，本文所述的血脑屏障增强蛋白是选自转铁蛋白、胰岛素、胰岛素样生长因子、低密度脂蛋白的组的至少一种全蛋白，所述蛋白质的变体、同种型和/或片段。
也可使用特洛伊木马策略(参见例如Pardridge，W.M.，2017，BioDrugs 31，503–519)。在一些方面，将用于本发明的用途的组合物与结合内源性BBB受体转运蛋白(如胰岛素受体或转铁蛋白受体)的抗体或其片段连接。
还可以改变用于本发明的用途的组合物以增加亲脂性并随后改善BBB穿过特性(参见例如Upadhyay,R.K.,2014,.BioMed research international,Article ID 869269,37pages)。在一些方面，用于本发明的组合物包含增加亲脂性的修饰。在一些方面，增加本文所述亲脂性的修饰包括添加至少一种亲水性肽、用至少一种亲水性肽替换序列部分、添加脂质部分、和/或用脂质部分替换非脂质部分。
因此，本发明至少部分基于AAT对与病毒感染相关的疾病或综合征的广泛作用。
用AAT和/或rhAAT蛋白进行治疗和/或预防可能特别适合特定的受试者。
因此，本发明还涉及一种用于在有需要的受试者中治疗和/或预防与病毒感染相关的疾病或综合征之用途的组合物，所述病毒感染优选为冠状病毒感染，更优选为SARS-CoV-2感染，所述组合物包含治疗有效量的α1-抗胰蛋白酶(AAT)蛋白，其变体、同种型和/或片段，其中所述有需要的受试者具有与至少一名参考受试者相比选自以下的至少一种改变的水平：i)内源性α-抗胰蛋白酶(AAT)、至少一种刺突蛋白启动蛋白酶、血管紧张素转换酶2(ACE2受体)和干扰素-γ(IFN-γ)。所述α1-抗胰蛋白酶(AAT)蛋白，其变体、同种型和/或片段可以是血浆提取的AAT，其变体、同种型和/或片段，特别是人血浆提取的AAT，其变体、同种型和/或片段；或重组α1-抗胰蛋白酶(rhAAT)蛋白，其变体、同种型和/或片段，优选地，所述α1-抗胰蛋白酶(AAT)蛋白，其变体、同种型和/或片段是重组α1-抗胰蛋白酶(rhAAT)蛋白，其变体、同种型和/或片段。
所述“有需要的受试者”也被称为目标受试者。所述有需要的受试者可以是具有与病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)相关的疾病或综合征的处于病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间或患有病毒感染的受试者(即受感染的受试者)。受感染的受试者可能需要与病毒感染相关的疾病或综合征的治疗和/或预防，所述病毒感染优选为冠状病毒感染，更优选为SARS-CoV-2感染。使用AAT和/或rhAAT的治疗可通过抑制刺突蛋白启动蛋白酶来抑制或减少病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2病毒)进入细胞、减少病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2病毒)在体内的传播、和/或减少作为对病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)的应答的炎症。需要治疗和/或预防的受试者可患有呼吸综合征，更优选患有急性呼吸综合征，甚至更优选患有严重急性呼吸综合征。需要治疗和/或预防的受试者可具有选自由以下组成的组中的至少一种症状：发热、咳嗽、疲劳、呼吸困难、寒战、关节或肌肉疼痛、咳痰、产生痰、喘证、肌痛、关节痛或咽喉痛、头痛、恶心、呕吐、腹泻、窦痛、鼻塞、嗅觉或味觉的减弱或改变、食欲不振、体重减轻、胃痛、结膜炎、皮疹、淋巴瘤、情感淡漠和嗜睡，优选选自由以下组成的组：发热、咳嗽、疲劳、呼吸困难、寒战、关节或肌肉疼痛、咳痰、产生痰、喘证、肌痛、关节痛或咽喉痛、头痛、恶心、呕吐、腹泻、窦痛、鼻塞、嗅觉或味觉的减弱或改变。需要治疗和/或预防的受试者可能需要重症监护和/或人工通气。需要治疗和/或预防的受试者可以由上述定义之一或其任意组合来定义。
有需要的受试者也可以是在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)之前的受试者，其在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)之后特别容易发展出疾病或综合征。此类受试者可能需要在感染之前预防与病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)相关的疾病或综合征。
至少一个参考受试者可以是一组参考受试者。优选地，一个或多个参考(reference)受试者是无症状或具有轻度症状的患有病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)的或处于病毒感染期间的受试者(即受感染的受试者)，更优选地，受试者是无症状的患有病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)的或处于病毒感染期间的受试者。
根据本发明，无症状是指(参考)受试者没有症状，优选没有选自由以下组成的组的症状：没有发热、咳嗽、疲劳、呼吸困难、寒战、关节或肌肉疼痛、咳痰、产生痰、喘证、肌痛、关节痛或咽喉痛、头痛、恶心、呕吐、腹泻、窦痛、鼻塞、嗅觉或味觉的减弱或改变、食欲不振、体重减轻、胃痛、结膜炎、皮疹、淋巴瘤、情感淡漠和嗜睡，更优选地没有发热、咳嗽、疲劳、呼吸困难、寒战、关节或肌肉疼痛、咳痰、产生痰、喘证、肌痛、关节痛或咽喉痛、头痛、恶心、呕吐、腹泻、窦痛、鼻塞、嗅觉或味觉的减弱或改变。无症状(参考)受试者优选为未患呼吸综合征，更优选为未患急性呼吸综合征，甚至更优选为未患严重急性呼吸综合征。无症状(参考)受试者不需要重症监护和/或人工通气。无症状(参考)受试者可由上述定义之一或其任意组合来定义。
根据本发明，具有轻度症状的(参考)受试者优选为未患呼吸综合征，更优选为未患急性呼吸综合征，甚至更优选为未患严重急性呼吸综合征。优选地，具有轻度症状的(参考)受试者不需要重症监护和/或人工通气。具有轻度症状的(参考)受试者可具有选自由以下组成的组的至少一种症状：发热、咳嗽、疲劳、呼吸困难、寒战、关节或肌肉疼痛、咳痰、产生痰、喘证、肌痛、关节痛或咽喉痛、头痛、恶心、呕吐、腹泻、窦痛、鼻塞、嗅觉或味觉的减弱或改变、食欲不振、体重减轻、胃痛、结膜炎、皮疹、淋巴瘤、情感淡漠和嗜睡，更优选地没有发热、咳嗽、疲劳、呼吸困难、寒战、关节或肌肉疼痛、咳痰、产生痰、喘证、肌痛、关节痛或咽喉痛、头痛、恶心、呕吐、腹泻、窦痛、鼻塞、嗅觉或味觉的减弱或改变，其中具有轻度症状的(参考)受试者不需要重症监护和/或人工通气。具有轻度症状的(参考)受试者可由上述定义之一或其任意组合来定义。
参考受试者可以是儿童，特别是年龄小于10岁、优选小于5岁的儿童。参考受试者的年龄可以为1至10岁，优选为2至5岁。
处于病毒感染期间或患有病毒感染(特别是冠状病毒感染，更特别是SARS-CoV-2感染)的(参考)受试者是受试者，其优选是感染了病毒(特别是冠状病毒，更特别是SARS-CoV-2)的(参考)受试者。受感染的(参考)受试者是指病毒(特别是冠状病毒，更特别是SARS-CoV-2病毒)已经进入(参考)受试者身体的细胞，优选地，病毒已经在(参考)受试者身体的细胞中增殖。
在感染了病毒(特别是冠状病毒，更特别是SARS-CoV-2病毒)之后，受感染的受试者的干扰素-γ水平升高。干扰素-γ水平升高反过来导致血管紧张素转换酶2(ACE2受体)水平的升高。血管紧张素转换酶2(ACE2受体)水平升高会刺激蛋白酶对刺突蛋白活性的增加和启动。然后，AAT的内源性水平响应于至少一种刺突蛋白启动蛋白酶的活性水平的升高而降低。之后，随着AAT结合(并抑制)活性刺突蛋白启动蛋白酶，AAT的内源性水平进一步耗尽。与至少一个参考受试者相比，具有选自以下组中的至少一种的受试者特别容易发展出响应于病毒(特别是冠状病毒，更特别是SARS-CoV-2感染)的疾病或综合征：i)较低的内源性α-抗胰蛋白酶(AAT)水平、ii)较高的至少一种刺突蛋白启动蛋白酶水平、iii)较高的血管紧张素转换酶2(ACE2受体)水平和iv)较高的干扰素-γ(IFN-γ)水平。因此，这些目标受试者是特别相关的，并且适于接受使用包含治疗有效量的α1-抗胰蛋白酶(AAT)蛋白，其变体、同种型和/或片段的组合物的治疗和/或预防。所述α1-抗胰蛋白酶(AAT)蛋白，其变体、同种型和/或片段可以是血浆提取的AAT，其变体、同种型和/或片段，特别是人血浆提取的AAT，其变体、同种型和/或片段；或重组α1-抗胰蛋白酶(rhAAT)蛋白，其变体、同种型和/或片段，优选地，所述α1-抗胰蛋白酶(AAT)蛋白，其变体、同种型和/或片段是重组α1-抗胰蛋白酶(rhAAT)蛋白，其变体、同种型和/或片段。最优选地，所述AAT蛋白是在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和/或人胚胎肾(HEK)细胞中产生的重组α1-抗胰蛋白酶(rhAAT)蛋白。
本发明还涉及一种用于在有需要的受试者中治疗和/或预防与病毒感染相关的疾病或综合征的组合物，所述病毒感染优选为冠状病毒感染，更优选为SARS-CoV-2感染，所述组合物包含治疗有效量的α1-抗胰蛋白酶(AAT)蛋白和/或重组α1-抗胰蛋白酶(rhAAT)蛋白，其变体、同种型和/或片段，其中所述有需要的受试者具有选自由以下组成的组中的至少一种：
1.与至少一个在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间的无症状或具有轻度症状的受试者相比，在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)之前或在SARS-CoV-2感染期间较低的内源性α-抗胰蛋白酶(AAT)水平，
2.与至少一个在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间的无症状或具有轻度症状的受试者相比，在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)之前或在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间较高的至少一种刺突蛋白启动蛋白酶水平，
3.与至少一个在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间的无症状或具有轻度症状的受试者相比，在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)之前或在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间较高的受试者中的血管紧张素转换酶2(ACE2受体)水平，和
4.与至少一个在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间无症状或具有轻度症状的受试者相比，在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)之前或在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间较高的受试者中的干扰素-γ(IFN-γ)水平。
所述至少一个无症状或具有轻度症状的受试者也被称为至少一个参考受试者。参考受试者如本文所述来定义。
“有需要的受试者”也被称为目标受试者。需要治疗和/或预防与病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)相关的疾病综合征如本文所述来定义。
i)至iv)中所定义的水平可以是蛋白质水平和/或mRNA水平，优选为蛋白质或mRNA水平。使用基于抗体的测定法例如酶联免疫吸附测定法(ELISA)，和/或基于光纤生物传感器(ForteBio Octet)的生物层干涉测量法(BLI)来测量蛋白质水平。
可以通过使用衍生自SARS-CoV-2刺突蛋白的荧光肽测量刺突蛋白蛋白酶的活性来确定刺突蛋白启动蛋白酶的水平。Jaimes等人描述了该方法(Javier A.Jaimes,JeanK.Millet,Gary R.Whittaker Proteolytic Cleavage of the SARS-CoV-2Spike Proteinand the Role of the Novel S1/S2 Site,CELL,iScience 23,101212,June 26,2020)。公开的方法肽：衍生自分别由HTVSLLRSTSQ(SEQ ID NO:11)和TNSPRRARSVA(SEQ ID NO:12)序列组成的SARS-CoV-2刺突S1/S2位点并含有(7-甲氧基香豆素-4-基)乙酰基/2,4-二硝基苯基(MCA/DNP)FRET对的荧光肽，由Biomatik(Wilmington，DE，USA)合成。重组弗林蛋白酶可购自New England Biolabs(Ipswich,MA,USA)。重组L-1-甲苯磺酰氨基-2-苯乙基氯甲基酮(TPCK)处理的胰蛋白酶可以从Sigma-Aldrich(St Louis,MO,USA)获得。重组PC1、蛋白裂解酶、组织蛋白酶B和组织蛋白酶L可购自R&D Systems(Minneapolis,MN,USA)。荧光肽分析：对于每种荧光肽，使用以下缓冲液和稀释至50μM的肽在100μL体积中进行反应，用于弗林蛋白酶(稀释至10U/mL)的缓冲液包含100mM Hepes、0.5％ Triton X-100、1mM CaCl2和1mM2-巯基乙醇，pH 7.5；用于PC1(稀释至2.2ng/μL)的缓冲液包含25mM MES、5mM CaCl2、1％(w/v)Brij-35，pH 6.0；用于胰蛋白酶(稀释至8nM)的缓冲液为PBS；用于蛋白裂解酶(稀释至2.2ng/μL)的缓冲液包含50mM Tris、50mM NaCl、0.01％(v/v)
Figure BDA0004022404670000231
20，pH 9.0；用于组织蛋白酶B(稀释至2.2ng/μL)的缓冲液为25mM MES，pH 5.0；用于组织蛋白酶L(稀释至2.2ng/μL)的缓冲液包含50mM MES、5mM DTT、1mM EDTA、0.005％(w/v)Brij-35，pH 6.0。反应在30℃进行，一式三份，使用SpectraMax荧光计(Molecular Devices，Sunnyvale，CA，USA)，以λex 330nm和λem 390nm波长的设置，每分钟测量一次荧光发射，持续45分钟，跟踪随时间变化的荧光强度并计算反应的Vmax。分析应分为三份进行，结果代表三个独立实验的Vmax平均值。
可以使用流式细胞术、基于颗粒的免疫测定来测量IFN-γ蛋白的水平。该方法可借鉴Huang等人的方法(Huang KJ,Su IJ,Theron M,et al.An interferon-gamma-relatedcytokine storm in SARS patients.J Med Virol.2005；75(2):185-194.doi:10.1002/jmv.20255)。BD人Th1/Th2细胞因子或趋化因子珠阵列(CBA)试剂盒。BD人Th1/Th2细胞因子CBA试剂盒(BD PharMingen，San Diego，CA)在基于颗粒的免疫测定中通过流式细胞术测量IFN-γ水平。该试剂盒允许从50毫升患者血清样本中同时测量六种细胞因子。对于IFN-γ，这些免疫测定的检测极限为7.1pg/ml。
优选地，本文所述的AAT的内源水平是蛋白质水平。本文所述的至少一种刺突蛋白蛋白酶水平优选为mRNA水平。本文所述的ACE2受体水平优选为mRNA水平。本文所述的IFN-γ水平优选为蛋白质水平。蛋白质和/或mRNA水平可以在血液、尿液或唾液中进行测量，优选在血液中，更优选在血浆中，最优选在人血浆中进行测量。
已经了解了病毒(特别是冠状病毒，更特别是SARS-CoV-2病毒)进入细胞并在细胞中繁殖的几个因素，而其他因素仍是研究的主题。SARS-CoV-2病毒的进入是由刺突蛋白、刺突蛋白启动蛋白酶和ACE2受体介导的。SARS-CoV-2刺突蛋白也被称为刺突蛋白S。刺突蛋白启动蛋白酶切割SARS-CoV-2的刺突蛋白，从而启动SARS-CoV-2进入细胞。SARS-CoV-2通过启动的刺突蛋白与ACE受体的相互作用进入细胞。因此，如果在目标受试者中存在至少一种或多种启动蛋白酶，SARS-CoV-2病毒进入细胞就越容易且越快。此外，ACE2受体越多，SARS-CoV-2进入细胞就越容易且越快。SARS-CoV-2感染导致炎症，从而提高IFN-γ的表达。响应于SARS-CoV-2感染的IFN-γ表达可以反过来导致ACE2受体表达增加。在SARS-CoV-2增殖期间，IFN-γ水平进一步升高，刺激ACE2与刺突蛋白相互作用的增加和随后的刺突蛋白的启动，AAT水平降低，并且在病毒进入细胞时炎症增加，这导致甚至更高水平的IFN-γ。在感染SARS-CoV-2后，首先，IFN-γ水平升高，其次，AAT水平降低，并且组织蛋白酶L水平升高和/或其他刺突蛋白启动(S-启动)蛋白酶水平升高。参见图1。
因此，本发明至少部分基于以下发现：AAT和rhAAT同时减少了病毒的进入(参见例如图6、图7、图8、图11、图12、图21、图22)和病毒相关炎症(参见例如图19、图20)，特别是由于高IFN-γ水平引起的病毒相关炎症。这种组合效果在本文所述的患者群体中特别有用。
在某些方面，本发明涉及根据本发明的用途的组合物，其中所述刺突蛋白启动蛋白酶是选自由以下组成的组的至少一种：跨膜蛋白酶丝氨酸亚型2(TMPRSS2)、跨膜蛋白酶亚型6(TMPRSS6)、组织蛋白酶L、组织蛋白酶B、前蛋白转化酶1(PC1)、胰蛋白酶、弹性蛋白酶、中性粒细胞弹性蛋白酶、蛋白裂解酶和弗林蛋白酶。
在某些方面，本发明涉及根据本发明的用途的组合物，其中所述刺突蛋白启动蛋白酶是组织蛋白酶L和/或弗林蛋白酶。
AAT在人体中是内源性表达的。AAT也被称为α-1-蛋白酶抑制剂。AAT能够抑制蛋白酶，具体是刺突蛋白蛋白酶如跨膜蛋白酶丝氨酸亚型2(TMPRSS2)、跨膜蛋白酶亚型6(TMPRSS6/蛋白裂解酶-2)、组织蛋白酶L、组织蛋白酶B、前蛋白转化酶1(PC1)、胰蛋白酶、弹性蛋白酶、中性粒细胞弹性蛋白酶、蛋白裂解酶和弗林蛋白酶。如果与参考受试者相比，本发明的四种参与物(AAT、刺突蛋白启动蛋白酶、ACE2受体和IFN-γ)的水平在目标受试者中发生改变，则目标受试者可能特别受益于与SARS-CoV-2感染相关的疾病或综合征的治疗和/或预防。低内源性AAT水平可导致目标受试者更容易患上与SARS-CoV-2相关的疾病或综合征，特别是患上COVID-19。
在某些方面，本发明涉及根据本发明的用途的组合物，其中在病毒感染之前或病毒感染期间的较低的内源性AAT水平是由AAT缺乏症引起的。
α1-抗胰蛋白酶(下文称为“AAT”)是一种天然存在于人体中的蛋白质，其在肝脏中产生，优选在肝细胞中产生。根据Janciauskiene等人(Janciauskiene SM,Bals R,Koczulla R,Vogelmeier C,
Figure BDA0004022404670000251
T,Welte T.The discovery ofα1-antitrypsinand its role in health and disease.Respir Med.2011；105(8):1129-1139.doi:10.1016/j.rmed.2011.02.002)，AAT的正常血浆浓度为0.9g/L至1.75g/L。考虑到MW为52,000(Brantly M,Nukiwa T,Crystal RG.Molecular basis of alpha-1-antitrypsindeficiency.Am J Med.1988；84(6A):13-31.doi:10.1016/0002-9343(88)90154-4)，这对应于16μM至32μM的正常血浆浓度。Crystal 1990(Crystal RG.Alpha1-antitrypsindeficiency,emphysema,and liver disease.Genetic basis and strategies fortherapy.J Clin Invest.1990May；85(5):1343-52.doi:10.1172/JCI114578.PMID:2185272；PMCID:PMC296579)描述了11μM是AAT缺乏症的临床表现的阈值水平。对于大多数健康个体，肝脏中每日2g的AAT的表达足以达到11μM的临界血清水平，然后内源性AAT水平足以保护下呼吸道免受中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)的破坏，并抑制最终导致肺气肿的肺泡的进行性破坏。Crystal 1990进一步指出，健康个体中AAT的正常内源性水平在20μM至53μM变化。在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)之前，健康人类受试者血浆中AAT蛋白的内源性水平为5μM至60μM，优选为10μM至40μM，更优选为25μM至30μM，甚至更优选为16μM至32μM。或者，在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)之前，健康人类受试者血浆中的AAT蛋白的内源性水平优选高于30μM，更优选高于40μM，最优选高于50μM。AAT蛋白可以是血浆AAT蛋白或重组AAT(rhAAT)蛋白。在一些方面，血浆AAT蛋白来源于血液血浆。在一些方面，重组AAT蛋白是在例如HEK细胞、CHO细胞或大肠杆菌细胞中重组产生的。世界各地的制药公司从人血浆中提取AAT蛋白，用于治疗AAT缺乏症(一种遗传性障碍)。血浆来源的AAT在美国和欧盟分别获得了食品药品监督管理局(FDA)和欧洲药品管理局(EMA)的批准。优选地，本发明的AAT蛋白具有人氨基酸序列，最优选地，本发明的AAT蛋白如SEQ ID NO:1所示(见表1)。
如本发明的图6a和图6c所示，10μM的AAT减少了20％至30％的假病毒进入过表达ACE2受体的A549细胞。
根据Azouz等人(Nurit P.Azouz,Andrea M.Klingler and Marc E.Rothenberg,Alpha1-Antitrypsin(AAT)is an Inhibitor of the SARS-CoV-2–Priming ProteaseTMPRSS2,(bioRxiv preprint online,https://doi.org/10.1101/2020.05.04.077826,posted on May 5,2020)，浓度为1-100μM的AAT实现了对TMPRSS2蛋白水解活性的剂量依赖性抑制。
如本发明的图7所示，100μM的AAT减少了50％至75％的假病毒进入仅过表达ACE2受体的A549细胞。
如本发明的图8所示，100μM的AAT减少了多达至45％的假病毒进入仅过表达ACE2受体和刺突蛋白启动蛋白酶TMPRSS2的A549细胞。
值得注意的是，在本发明的图6和图7中观察到了病毒的进入独立于TMPRSS2。证明了启动蛋白酶如弗林蛋白酶和/或组织蛋白酶L(可能还有其他蛋白酶)能够替代TMPRSS2。在这方面，AAT和rhAAT降低了蛋白酶组织蛋白酶B、组织蛋白酶L、胰蛋白酶、弗林蛋白酶、PC1、蛋白裂解酶、弹性蛋白酶和中性粒细胞弹性蛋白酶的活性(图16)。
因此，AAT和rhAAT对病毒进入的抑制作用超出了其他TMPRSS2抑制剂的作用(图7、图8、图11、图12、图21、图22)，因为AAT和rhAAT有效地抑制了几种启动蛋白酶(图16)(例如，可以替代TMPRSS2功能的蛋白酶)和随后的ACE2介导的病毒进入(图7、图8、图11、图12、图21、图22)。
因此，AAT和rhAAT通过降低启动蛋白酶活性，特别是通过广泛地和有效地降低启动蛋白酶活性来减少病毒的进入。
因此，本发明至少部分基于以下令人惊讶的发现，即包含AAT和/或rhAAT，它们的变体、同种型和/或片段的组合物在与病毒感染(优选为冠状病毒感染，更优选为SARS-CoV-2感染)相关的疾病或综合征的治疗和/或预防中特别有效，特别是在具有一种或多种本文所述先决条件的受试者中。
在本发明中，根据i)的较低的内源性AAT的水平优选是人血浆中的蛋白质水平。根据i)的人血浆中的内源性AAT蛋白的水平优选小于200μM、优选小于150μM、100μM、小于90μM、小于80μM、小于70μM、小于60μM、小于50μM、小于40μM、小于30μM、小于25μM、小于20μM、小于15μM、小于11μM或小于10μM。更优选地，小于200μM、小于100μM、小于25μM、小于15μM或小于11μM。低水平的AAT不足以成功抑制刺突蛋白启动蛋白酶。因此，低水平的内源性AAT可促进病毒增殖(特别是冠状病毒增殖，更特别是SARS-CoV-2增殖)和/或与病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)相关的综合征疾病的发展。在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)之前或在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间，较低的内源性AAT水平可以是由AAT缺乏症引起的，优选地，在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)之前，较低的内源性AAT水平是由AAT缺乏症引起的。AAT缺乏症是一种常染色体共显性遗传的病症。共显性意味着基因的两个不同版本可能是活跃的(表达的)，并且两个版本都对遗传性状有贡献。SERPINA1基因的最常见版本(等位基因)名为M，产生正常水平的α-1抗胰蛋白酶。普通人群中的大多数人在每个细胞中都有两份M等位基因(MM)拷贝。SERPINA1基因的其他版本导致α-1抗胰蛋白酶水平的降低。例如，S等位基因产生适度低水平的这种蛋白质，而Z等位基因产生非常少的α-1抗胰蛋白酶。在每个细胞中有两份Z等位基因(ZZ)拷贝的个体可能患有α-1抗胰蛋白酶缺乏症。那些具有SZ组合的人患肺病(如肺气肿)的风险增加，特别是如果他们吸烟。据估计，全世界有1.61亿人在每个细胞中都有一份S或Z等位基因和一份M等位基因(MS或MZ)。具有MS(或SS)组合的个体通常产生足够的α-1抗胰蛋白酶来保护肺部。然而，具有MZ等位基因的人，肺或肝功能受损的风险略有增加。本发明中具有AAT缺乏症的受试者优选具有SERPINA1基因的ZZ突变、SZ突变、MS突变、MZ突变或SS突变，优选为ZZ突变。在SERPINA1基因的ZZ突变中，低水平的AAT分泌是由于AAT的错误折叠及其随后在肝细胞内质网(ER)中的积累(Crystal 1990)，从而导致进行性肝病，因为错误折叠的AAT的积累负面影响了肝细胞的健康，导致了它们最终的死亡。
在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间，较低的内源性AAT水平也可分别由病毒感染、冠状病毒感染或SARS-CoV-2感染引起。也就是说，在病毒感染期间，由于健康肝细胞试图过度补偿内源性AAT水平的下降，参考受试者的内源性AAT水平可能暂时升高，而具有遗传性AAT缺乏症的受试者的内源性AAT水平较低，由于不存在或不完全的病毒感染引起的升高(缺乏健康肝细胞)。
较低的内源性AAT水平也可由肝病引起，例如非酒精性脂肪性肝病、1型糖尿病或2型糖尿病(优选1型糖尿病)、肥胖症和心血管病症。脂肪酸在肝脏中的累积导致应激增加(IFN-γ增加)、组织炎症和随后对肝细胞的损伤，从而导致AAT的健康分泌水平降低。与其他类型的肝脏疾病一样，值得注意的是，AAT缺乏症随着时间的推移会导致肝脏疾病，因为错误折叠的AAT在肝细胞的ER中的积累最终会导致肝功能衰竭。
在本发明中，刺突蛋白启动蛋白酶可以是能够启动病毒(优选冠状病毒，更优选SARS-CoV-2)的刺突蛋白的任何蛋白酶。优选地，刺突蛋白启动蛋白酶是选自由以下组成的组中的至少一种：跨膜蛋白酶丝氨酸亚型2(TMPRSS2)、跨膜蛋白酶亚型6(TMPRSS6)、组织蛋白酶L、组织蛋白酶B、前蛋白转化酶1(PC1)、胰蛋白酶、弹性蛋白酶、中性粒细胞弹性蛋白酶、蛋白裂解酶和弗林蛋白酶，更优选为TMPRSS2、组织蛋白酶L和弗林蛋白酶，甚至更优选为组织蛋白酶L或弗林蛋白酶。刺突蛋白启动蛋白酶是弗林蛋白酶，也被称为配对碱性氨基酸切割(PACE)酶。
本文所述的较高的至少一种刺突蛋白启动蛋白酶(优选组织蛋白酶L)水平优选是人血浆中的mRNA水平，或人血浆中的蛋白质水平。健康受试者中组织蛋白酶L的血浆浓度为0.2ng/mL至1ng/mL(即分子量为约23kDa至24kDa时为10pM至50pM；(Kirschke1977https://febs.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1432-1033.1977.tb11393.x)。此外，已知免疫细胞是炎症中的细胞外半胱氨酸组织蛋白酶的主要来源，包括在脑中(Hayashi et al.,2013,von Bernhardi et al.,2015,Wendt et al.,2008,Wendt et al.,2007)。在人血浆中，本文所述的至少一种刺突蛋白启动蛋白酶蛋白水平优选高于0.2、0.5或1ng/ml。本文所述的至少一种刺突蛋白启动蛋白蛋白酶的水平优选高于10pM、20pM、30pM、40pM、50pM、75pM或100pM，优选高于10pM或50pM，甚至更优选高于50pM。在这方面，所述至少一种刺突蛋白启动蛋白酶优选是组织蛋白酶L。在某些方面，本文所述的至少一种刺突蛋白启动蛋白酶是至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种、至少九种刺突蛋白启动蛋白酶。在某些方面，本文所述的至少一种刺突蛋白启动蛋白酶是选自由以下组成的组的至少一种蛋白酶：TMPRSS2、组织蛋白酶B、组织蛋白酶L、胰蛋白酶、弗林蛋白酶、PC1、蛋白裂解酶、弹性蛋白酶和中性粒细胞弹性蛋白酶。在某些方面，本文所述的至少一种刺突蛋白启动蛋白酶是选自由以下组成的组的至少一种蛋白酶：TMPRSS2、组织蛋白酶B、组织蛋白酶L、胰蛋白酶、弗林蛋白酶、PC1和蛋白裂解酶。
在某些方面，本发明涉及根据本发明的用途的组合物，其中较高的至少一种刺突蛋白启动蛋白酶水平是由年龄和/或遗传倾向引起的。
较高的至少一种刺突蛋白启动蛋白酶水平可由年龄和/或遗传倾向引起。特别地，较高的组织蛋白酶B和组织蛋白酶L水平，优选组织蛋白酶B水平可由年龄引起。较高的刺突蛋白酶蛋白水平，特别是组织蛋白酶B和组织蛋白酶L水平，更优选组织蛋白酶B水平可在溶酶体中积累。在年龄超过50岁，优选超过60岁，更优选超过70岁，甚至更优选超过80岁，最优选超过90岁的目标受试者中，刺突蛋白启动蛋白酶的水平更高。非裔美国人的受试者可具有较高的刺突蛋白启动蛋白酶(尤其是弗林蛋白酶)水平的遗传倾向。如图2(a)所示，与A549细胞相比，HeLa细胞在弗林蛋白酶和组织蛋白酶L的相对mRNA率上有所不同。HeLa细胞来源于非裔美国人。A549细胞来源于高加索人的气道上皮细胞。如图2(b)所示，HeLa细胞相比于A549细胞(图6)更容易让SARS-CoV-2进入，并且对AAT治疗的反应较低。可以通过目标个体受试者的基因图谱来确定遗传倾向。
在某些方面，本发明涉及根据本发明的用途的组合物，其中较高的ACE2受体水平是由选自由感染、炎症、年龄和遗传倾向组成的组的至少一种引起的。
本文所述的较高的ACE2受体水平优选是人血浆中的mRNA水平。较高的ACE2受体水平可由选自感染、炎症(例如IFN-γ)、年龄和遗传倾向的组中的至少一种引起。感染可以是病毒感染和/或细菌感染，优选为病毒感染，更优选为冠状病毒感染，甚至更优选为SARS或SARS-CoV-2感染。感染的另一实例是利什曼病。如图4和图5所示，ACE2受体的表达响应于较高的IFN-γ水平而上调，而IFN-γ水平又随着对炎症的免疫反应而升高。炎症可以是由例如细菌和/或病毒感染、癌症、迟发型超敏反应；自身免疫性疾病(如自身免疫性脑脊髓炎、类风湿性关节炎、自身免疫性胰岛素炎(也被称为1型糖尿病)、同种异体移植排斥和移植物抗宿主反应、非特异性炎症和细胞因子释放引起的。年龄优选大于50岁，优选大于60岁，更优选大于70岁，甚至更优选大于80岁，最优选大于90岁。高IFN-γ水平的遗传倾向的一个实例是家族性地中海热。可以通过目标个体受试者的基因图谱来确定遗传倾向。本文所述的较高的ACE2受体水平也可存在于选自由以下组成的组的组织中：肺(Calu3)、结肠(CaCo2)、肝(HEPG2)、肾(HEK-293T)和脑(SH-SY5Y)，如qPCR所证实的和本发明的图3a所示。
在某些方面，本发明涉及根据本发明的用途的组合物，其中较高的IFN-γ水平是由选自感染、炎症、年龄和遗传倾向的组中的至少一种引起的。
根据iv)的较高的干扰素-γ(IFN-γ)水平优选是人血浆中的蛋白质或mRNA水平，更优选是人血浆中的蛋白质水平。在健康人体中，IFN-γ水平低于或接近分析的检测限，例如低于30pg/mL至50pg/mL)(Billau 1996；Kimura 2001)。IFN-γ几乎完全由自然杀伤(NK)细胞、CD4+淋巴细胞和一些CD8+淋巴细胞所产生。由NK细胞或T细胞产生IFN-γ需要辅助细胞的配合，所述辅助细胞主要是单核吞噬细胞，它们也需要处于某种活化状态(BilliauA.Interferon-gamma:biology and role in pathogenesis.Adv Immunol.1996；62:61-130.doi:10.1016/s0065-2776(08)60428-9)。因此，导致NK细胞活化和T细胞活化的炎症状况导致了IFN-γ水平升高。涉及循环NK细胞或T细胞的炎症状态(感染、癌症)预计会导致较高的血浆水平。
下表提供了几种病症下的IFN-γ的血浆水平值。
Figure BDA0004022404670000311
Figure BDA0004022404670000321
根据iv)的人血浆中的IFN-γ蛋白水平优选高于1pg/ml、5pg/ml、10pg/ml、15pg/ml、20pg/ml、25pg/ml、30pg/ml、40pg/ml、50pg/ml、75pg/ml、100pg/ml、125pg/ml、150pg/ml、200pg/ml、300pg/ml、400pg/ml或500pg/ml。较高的IFN-γ水平优选是由选自感染、炎症、年龄和遗传倾向的组中的至少一种引起的，更优选是由炎症引起的。感染可以是病毒感染和/或细菌感染，优选是病毒感染，更优选是冠状病毒感染，甚至更优选是SARS或SARS-CoV-2感染。感染的另一实例是利什曼病。炎症可以是由例如细菌和/或病毒感染、癌症、迟发型超敏反应；自身免疫性疾病(如自身免疫性脑脊髓炎、类风湿性关节炎、自身免疫性胰岛素炎(也被称为1型糖尿病)、同种异体移植排斥和移植物抗宿主反应、非特异性炎症和细胞因子释放引起的。年龄优选大于50岁，优选大于60岁，更优选大于70岁，甚至更优选大于80岁，最优选大于90岁。高IFN-γ水平的遗传倾向的一个实例是家族性地中海热。可以通过目标个体受试者的基因图谱来确定遗传倾向。
因此，本发明至少部分基于以下令人惊讶的发现：包含AAT和rhAAT，及它们的变体、同种型和/或片段的组合物减少了病毒增殖和炎症，特别是IFN-γ相关的炎症。
在一个方面，“有需要的受试者”，即目标受试者具有选自由以下组成的组的两种：
1.与至少一个在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间的无症状或具有轻度症状的受试者相比，在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)之前或在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间较低的内源性α-抗胰蛋白酶(AAT)水平，
2.与至少一个在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间的无症状或具有轻度症状的受试者相比，在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)之前或在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间较高的至少一种刺突蛋白启动蛋白酶水平，
3.与至少一个在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间的无症状或具有轻度症状的受试者相比，在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)之前或在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间较高的受试者中的血管紧张素转换酶2(ACE2受体)水平，和
4.与至少一个在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间的无症状或具有轻度症状的受试者相比，在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)之前或在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间较高的受试者中的干扰素-γ(IFN-γ)水平。
因此，所述“有需要的受试者”可具有
1.与至少一个在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间的无症状或具有轻度症状的受试者相比，在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)之前或在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间较低的内源性α-抗胰蛋白酶(AAT)水平，和
2.与至少一个在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间的无症状或具有轻度症状的受试者相比，在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)之前或在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间较高的至少一种刺突蛋白启动蛋白酶水平。
优选地，在这方面，本文所述的人血浆中的AAT蛋白水平低于52μM，人血浆中的组织蛋白酶L蛋白水平高于10pM。
另一方面，所述“有需要的受试者”可具有
1.与至少一个在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间的无症状或具有轻度症状的受试者相比，在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)之前或在SARS-CoV-2感染期间较低的内源性α-抗胰蛋白酶(AAT)水平，和
2.与至少一个在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间的无症状或具有轻度症状的受试者相比，在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)之前或在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间较高的受试者中的血管紧张素转换酶2(ACE2受体)水平。
在又一方面，所述“有需要的受试者”可具有
1.与至少一个在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间的无症状或具有轻度症状的受试者相比，在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)之前或在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间较低的内源性α-抗胰蛋白酶(AAT)水平，和
2.与至少一个在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间的无症状或具有轻度症状的受试者相比，在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)之前或在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间较高的受试者中的干扰素-γ(IFN-γ)水平。
在这些方面，1.和4.可以是选自由以下组成的组中的至少一种疾病或病症：AAT缺乏症、肝病如非酒精性脂肪性肝病、糖尿病、肥胖症和心血管病症。在一些方面，本发明涉及根据本发明的用途的组合物，其中较高的IFN-γ水平是由选自由以下组成的组中的至少一种疾病或病症引起的：AAT缺乏症、肝病如非酒精性脂肪性肝病、糖尿病、肥胖症和心血管病症。在一些方面，本发明涉及根据本发明的用途的组合物，其中较低的AAT水平是由选自由以下组成的组中的至少一种疾病或病症引起的：AAT缺乏症、肝病如非酒精性脂肪性肝病、糖尿病、肥胖症和心血管病症。糖尿病可以是1型糖尿病或2型糖尿病。肝病可以是对乙酰氨基酚引起的肝损伤、重度慢性肝炎、酒精性肝病(ALD)，涵盖各种表型，包括单纯性脂肪变性、脂肪性肝炎、肝纤维化和肝硬化，甚至HCC(肝细胞癌)。心血管病症可以是由于流向心脏的血流突然减少或阻塞、心脏梗塞、急性冠状动脉综合征(ACS)引起的任何病症，也可以是在患有急性心肌梗塞的患者中的任何病症，其中左心室射血分数与血清中的AAT浓度呈负相关，表明收缩功能障碍与炎症反应有关。
优选地，在这方面，本文所述的人血浆中的AAT蛋白水平低于52μM，并且本文所述的人血浆中的IFN-γ蛋白水平高于0.19pM。
在另一方面，“有需要的受试者”，即目标受试者具有选自由以下组成的组的两种：
1.与至少一个在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间的无症状或具有轻度症状的受试者相比，在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)之前或在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间较高的至少一种刺突蛋白启动蛋白酶水平，
2.与至少一个在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间的无症状或具有轻度症状的受试者相比，在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)之前或在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间较高的受试者中血管紧张素转换酶2(ACE2受体)水平，和
3.与至少一个在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间的无症状或具有轻度症状的受试者相比，在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)之前或在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间较高的受试者中的干扰素-γ(IFN-γ)水平。
在又一方面，“有需要的受试者”可具有
1.与至少一个在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间的无症状或具有轻度症状的受试者相比，在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)之前或在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间较高的至少一种刺突蛋白启动蛋白酶水平，
2.与至少一个在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间的无症状或具有轻度症状的受试者相比，在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)之前或在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间较高的受试者中血管紧张素转换酶2(ACE2受体)水平。
在另一方面，所述“有需要的受试者”可具有
1.与至少一个在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间的无症状或具有轻度症状的受试者相比，在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)之前或在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间较高的至少一种刺突蛋白启动蛋白酶水平，和
2.与至少一个在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间的无症状或具有轻度症状的受试者相比，在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)之前或在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间较高的受试者中的干扰素-γ(IFN-γ)水平。
在另一方面，所述“有需要的受试者”可具有
1.与至少一个在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间的无症状或具有轻度症状的受试者相比，在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)之前或在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间较高的受试者中血管紧张素转换酶2(ACE2受体)水平，和
2.与至少一个在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间的无症状或具有轻度症状的受试者相比，在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)之前或在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间较高的受试者中的干扰素-γ(IFN-γ)水平。
在另一方面，所述“有需要的受试者”，即目标受试者具有选自由以下组成的组的三种：
1.与至少一个在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间的无症状或具有轻度症状的受试者相比，在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)之前或在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间较低的内源性α-抗胰蛋白酶(AAT)水平，
2.与至少一个在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间的无症状或具有轻度症状的至少一个受试者相比，在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)之前或在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间较高的至少一种刺突蛋白启动蛋白酶水平，
3.与至少一个在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间的无症状或具有轻度症状的受试者相比，在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)之前或在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间较高的受试者中血管紧张素转换酶2(ACE2受体)水平，和
4.与至少一个在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间的无症状或具有轻度症状的受试者相比，在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)之前或在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间较高的受试者中的干扰素-γ(IFN-γ)水平。
因此，所述“有需要的受试者”可具有
1.与至少一个在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间的无症状或具有轻度症状的受试者相比，在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)之前或在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间较低的内源性α-抗胰蛋白酶(AAT)水平，
2.与至少一个在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间的无症状或具有轻度症状的至少一个受试者相比，在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)之前或在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间较高的至少一种刺突蛋白启动蛋白酶水平，
3.与至少一个在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间的无症状或具有轻度症状的受试者相比，在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)之前或在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间较高的受试者中血管紧张素转换酶2(ACE2受体)水平。
在另一方面，所述“有需要的受试者”可具有
1.与至少一个在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间的无症状或具有轻度症状的受试者相比，在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)之前或在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间较低的内源性α-抗胰蛋白酶(AAT)水平，
2.与至少一个在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间的无症状或具有轻度症状的受试者相比，在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)之前或在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间较高的至少一种刺突蛋白启动蛋白酶水平，和
3.与至少一个在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间的无症状或具有轻度症状的受试者相比，在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)之前或在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间较高的受试者中的干扰素-γ(IFN-γ)水平。
优选地，在这方面，本文所述的人血浆中AAT蛋白水平低于36μM，本文所述的人血浆中组织蛋白酶L蛋白水平高于10pM，本文所述的人血浆中IFN-γ蛋白水平高于0.19mM。
更优选地，在这方面，本文所述的人血浆中的AAT蛋白水平低于52μM，本文所述的人血浆中的组织蛋白酶L蛋白水平高于10pM，本文所述的人血浆中的IFN-γ蛋白水平高于0.19mM。
在另一方面，所述“有需要的受试者”可具有
1.与至少一个在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间的无症状或具有轻度症状的受试者相比，在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)之前或在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间较高的至少一种刺突蛋白启动蛋白酶水平，
2.与至少一个在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间的无症状或具有轻度症状的受试者相比，在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)之前或在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间较高的受试者中血管紧张素转换酶2(ACE2受体)水平，和
3.与至少一个在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间的无症状或具有轻度症状的受试者相比，在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)之前或在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间较高的受试者中的干扰素-γ(IFN-γ)水平。
在另一方面，所述“有需要的受试者”，即目标受试者具有
1.与至少一个在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间的无症状或具有轻度症状的受试者相比，在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)之前或在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间较低的内源性α-抗胰蛋白酶(AAT)水平，
2.与至少一个在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间的无症状或具有轻度症状的受试者相比，在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)之前或在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间较高的至少一种刺突蛋白启动蛋白酶水平，
3.与至少一个在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间的无症状或具有轻度症状的受试者相比，在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)之前或在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间较高的受试者中血管紧张素转换酶2(ACE2受体)水平，和
4.与至少一个在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间的无症状或具有轻度症状的受试者相比，在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)之前或在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间较高的受试者中的干扰素-γ(IFN-γ)水平。
用于本发明的用途的组合物中的AAT蛋白可以是血浆AAT蛋白，其变体、同种型和/或片段；或重组AAT蛋白，其变体、同种型和/或片段。优选地，所述AAT蛋白，其变体、同种型和/或片段是重组AAT蛋白，其变体、同种型和/或片段。血浆AAT蛋白优选来源于血浆AAT蛋白，更优选来源于人血浆(也被称为人血浆提取的AAT)。在某些方面，本发明涉及根据本发明的用途的组合物，其中α1-抗胰蛋白酶(AAT)蛋白，其变体、同种型和/或片段是重组α1-抗胰蛋白酶(也被称为rhAAT)，其变体、同种型和/或片段。
重组AAT蛋白是在例如CHO细胞、HEK细胞(HEK293和/或HEK293T)或大肠杆菌细胞中重组产生的。世界各地的制药公司从人血浆中提取AAT蛋白，用于治疗AAT缺乏症(一种遗传障碍)。FDA和EMA批准了血浆来源的AAT。优选地，本发明的AAT蛋白具有人氨基酸序列，最优选地，本发明的AAT蛋白如SEQ ID NO:1所示(见表1)。重组AAT蛋白，其变体、同种型和/或片段优选不含Fc结构域和/或组氨酸标签(His标签)。
发明人发现，重组AAT(在CHO中产生的rhAAT)以不同的亲和力与AAT抗体结合(图17)，并且具有比血浆来源的AAT更显著的生物效应。特别地，重组AAT(rhAAT)比血浆来源的AAT更有效抑制ACE2/刺突蛋白介导的细胞融合(图14)，并具有不同的酶抑制特性(图16)。
因此，本发明至少部分基于以下令人惊讶的发现：在CHO细胞中产生的重组AAT(rhAAT)在用于与病毒感染相关的疾病或综合征的治疗和/或预防的用途中特别有效，所述病毒感染优选为冠状病毒感染，更优选为SARS-CoV-2感染。
在某些方面，本发明涉及根据本发明的用途的组合物，其中所述α1-抗胰蛋白酶(AAT)蛋白，其变体、同种型和/或片段是在人细胞(例如HEK293或HEK293T细胞，参见实施例23)中产生的重组α1-抗胰蛋白酶。
发明人发现，与在CHO细胞中产生的重组AAT(rhAAT)以及血浆来源的AAT相比，在人细胞特别是在HEK293中产生的重组AAT(没有His标签的rhAAT)在降低组织蛋白酶L(图16b)、胰蛋白酶(图16c)、弗林蛋白酶(图16d)和中性粒细胞弹性蛋白酶(图16i)的酶活性方面特别有效。
因此，本发明至少部分基于以下令人惊讶的发现：在人细胞特别是在HEK293中产生的重组AAT在用于与病毒感染相关的疾病或综合征的治疗和/或预防的用途中特别有效，所述病毒感染优选为冠状病毒感染，更优选为SARS-CoV-2感染。
在某些方面，本发明涉及根据本发明的用途的组合物，其中所述α1-抗胰蛋白酶(AAT)蛋白，其变体、同种型和/或片段是具有更多非人类聚糖谱的重组α1-抗胰蛋白酶(在CHO中产生的rhAAT)。在某些方面，本文所述的非人类聚糖谱是哺乳动物细胞来源的聚糖谱和/或糖工程化聚糖谱。糖工程化策略，例如用于降低糖蛋白的岩藻糖基化和/或增强糖蛋白的唾液酸化的糖工程化策略是本领域技术人员已知的。在某些方面，本文所述的非人类聚糖谱是CHO细胞来源的聚糖谱。CHO细胞表达的糖基化机制与人类细胞不同，这导致了重组蛋白表面聚糖的不同组成(图24)(Lalonde,M.E.,&Durocher,Y.,2017,Journal ofbiotechnology,251,128-140)。
在某些方面，本发明涉及根据本发明的用途的组合物，其中所述AAT蛋白，其变体、同种型和/或片段是由pXC-17.4(GS System，Lonza)产生的重组AAT，其变体、同种型和/或片段。
发明人发现，与血浆来源的α1-蛋白酶抑制剂(血浆来源的AAT)和在CHO中通过PL136/PL137(pCGS3，Merck)产生的重组AAT(重组AAT 2)相比，在CHO(重组AAT 1)中通过pXC-17.4(GS System，Lonza)产生的重组AAT诱导了对弹性蛋白酶(图16h)和中性粒细胞弹性蛋白酶(图16i)的活性更明显的抑制作用。
因此，本发明至少部分基于以下令人惊讶的发现：某些形式的重组AAT(rhAAT)在用于与病毒感染相关的疾病或综合征的治疗和/或预防的用途中特别有效，所述病毒感染优选为冠状病毒感染，更优选为SARS-CoV-2感染。
如本文所用，本发明的AAT蛋白、肽或多肽的“片段”是指在长度上含有比本发明的AAT蛋白、肽或多肽更少氨基酸的序列，特别是含有比SEQ ID NO:1中所示的AAT序列更少氨基酸的序列。所述片段优选是功能性片段，例如与SEQ ID NO:1中所示的AAT蛋白具有相同生物活性的片段。所述功能片段优选来源于SEQ ID NO:1中所示的AAT蛋白。可以使用任何AAT片段，只要它表现出与其来源的天然AAT序列相同的性质(即具有生物活性)。
优选地，所述(功能性)片段共享约5个连续氨基酸、至少约7个连续氨基酸、至少约15个连续氨基酸、至少约20个连续氨基酸、至少约25个连续氨基酸、至少约20个连续氨基酸、至少约30个连续氨基酸、至少约35个连续氨基酸、至少约40个连续氨基酸、至少约45个连续氨基酸、至少约50个连续氨基酸、至少约55个连续氨基酸、至少约60个连续氨基酸、至少约100个连续氨基酸、至少约150个连续氨基酸、至少约200个连续氨基酸、至少约300个连续氨基酸等……或更多个如SEQ ID NO:1中所示的天然人AAT氨基酸序列。在一些方面，本文所述的(功能性)片段包含表达优化的信号蛋白(例如实施例24)。
功能性AAT片段可包含如SEQ ID NO:2中所示的AAT的C-末端片段或由如SEQ IDNO:2中所示的AAT的C-末端片段组成。SEQ ID NO:2的C-末端片段由SEQ ID NO:1的氨基酸374至418组成。
更优选地，所述AAT片段是在长度上含有比C末端AAT序列374至418(SEQ ID NO:2)更少氨基酸的片段。或者，所述AAT片段基本上由SEQ ID NO:2组成。
Figure BDA0004022404670000431
术语“变体”是指具有在某种程度上与AAT天然序列肽不同的氨基酸序列的蛋白质、肽或多肽，即通过氨基酸替换而不同于AAT天然序列的氨基酸序列，其中一个或多个氨基酸被另一个具有相同特征和构象作用的氨基酸所替换。优选地，本发明的变体与SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸是至少99％、98％、97％、96％、95％、90％或85％同源的。变体还可以与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％或85％的序列一致性。氨基酸序列变体可在天然氨基酸序列的氨基酸序列内的某些位置(例如在N-或C-末端序列或在氨基酸序列内)具有替换、缺失和/或插入。替换也可以是保守的，在这种情况下，保守氨基酸替换在本文中被定义为以下五组之一内的交换：
I.小的脂肪族的非极性或弱极性残基：Ala、Ser、Thr、Pro、Gly
II.极性的带正电荷的残基：His、Arg、Lys
III.极性的带负电荷的残基：及它们的酰胺：Asp、Asn、Glu、Gln
IV.大的芳香族残基：Phe、Tyr、Trp
V.大的脂肪族的非极性残基：Met、Leu、Ile、Val、Cys。
“同源性”是指两个多核苷酸部分或两个多肽部分之间的一致性百分比。当两个核酸序列或两个多肽序列在限定的分子长度上表现出至少约50％的序列一致性，优选至少约75％的序列一致性，更优选至少约80％或至少约85％的序列一致性，更优选至少约90％的序列一致性，最优选至少约95％至98％的序列一致性时，这两个核酸序列或两个多肽序列是彼此“基本同源的”。如本文所用，基本同源的也指显示出与指定序列具有完全一致性的序列。
通常，“一致性”分别指两个多核苷酸序列或多肽序列的核苷酸对核苷酸或氨基酸对氨基酸的精确对应。一致性百分比可通过直接比较两个分子之间的序列信息来确定，通过序列比对，计算两个比对序列之间匹配的确切数目，除以较短序列的长度，并将结果乘以100。
或者，同源性可以通过容易获得的计算机程序或通过在同源区域之间形成稳定双链体的条件下的多核苷酸的杂交，然后用单链特异性核酸酶消化，并测定消化片段的大小来确定。基本同源的DNA序列可以在Southern杂交实验中，在例如针对该具体体系定义的严格条件下进行鉴定。确定合适的杂交条件是在本领域的技术范围内的。
在一些方面，本发明涉及根据本发明的用途的组合物，其中所述α1-抗胰蛋白酶片段是C-末端序列片段，或其任意组合。
肽变体可以是线性肽或环肽，并且可以选自包含衍生自如SEQ ID No.2所示的C-末端序列的短环肽的组。优选地，衍生自α1-抗胰蛋白酶C-末端序列的短环肽将选自包括环-(CPFVFLM)-SH、环-(CPFVFLE)-SH、环-(CPFVFLR)-SH和环-(CPEVFLM)-SH或其任意组合的非限制性组。
如本文所用，本发明的AAT蛋白、肽或多肽的“同种型”是指由AAT mRNA的选择性剪接产生的剪接变体。
在一些方面，本文所述的AAT、其变体、同种型或片段的氨基酸序列与SEQ ID NO:1中的相应氨基酸序列是至少80％一致的。在一些方面，AAT、其变体、同种型或片段的氨基酸序列与SEQ ID NO:1中的相应氨基酸序列是80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致的。
本发明的肽，其同种型、片段或变体可优选与增加所述肽，其同种型、片段或变体在靶细胞(优选呼吸道细胞)中的积累的剂缀合。此类剂可以是诱导受体介导的内吞作用的化合物，所述内吞作用是例如膜转铁蛋白受体介导的与治疗药物缀合的转铁蛋白的内吞作用(Qian Z.M.et al.,“Targeted drug delivery via the transferrin receptor-mediated endocytosis pathway”Pharmacological Reviews,54,561,2002)，或此类剂可以是细胞膜可渗透载剂(carrier)，所述载剂可以选自例如脂肪酸如癸酸、肉豆蔻酸和硬脂酸的组，其已被用于细胞内递送蛋白激酶C的肽抑制剂(Ioannides C.G.et al.,“Inhibition of IL-2receptor induction and IL-2production in the humanleukemic cell line Jurkat by a novel peptide inhibitor of protein kinase C”Cell Immunol.,131,242,1990))和蛋白酪氨酸磷酸酶(Kole H.K.et al.,“A peptide-based protein-tyrosine phosphatase inhibitor specifically enhances insulinreceptor function in intact cells”J.Biol.Chem.271,14302,1996)或所述载体可以选自肽。优选地，使用细胞膜可渗透载剂。更优选地，使用细胞膜可渗透载剂肽。
在细胞膜可渗透载剂是肽的情况下，它优选是富含带正电荷氨基酸的肽。
优选地，这种富含带正电荷氨基酸的肽是富含精氨酸的肽。Futaki等人(FutakiS.et al.,“Arginine-rich peptides.An abundant source of membrane-permeablepeptides having potential as carriers for intracellular protein delivery”J.Biol.Chem.,276,5836,2001)已经证明，细胞膜可渗透载剂肽中精氨酸残基的数量对内化方法有显著影响，并且似乎存在用于内化的最佳精氨酸残基数量，优选地，它们含有超过6个的精氨酸，更优选地，它们含有9个精氨酸。富含精氨酸的肽优选包含至少6个精氨酸，更优选至少9个精氨酸。
所述肽，其同种型、片段或变体可以通过间隔基(例如两个甘氨酸残基)与细胞膜可渗透载剂缀合。在这种情况下，细胞膜可渗透载剂优选为肽。
通常，富含精氨酸的肽选自包括以下的非限制性组：HIV-TAT48-57肽(GRKKRRQRRR；SEQ ID NO.7)、FHV外壳35-49肽(RRRRNRTRRNRRRVR；SEQ ID NO.8)、HTLV-IIRex 4-16肽(TRRQRTRRARRNR；SEQ ID NO.9)和BMV gag 7-25肽(SEQ ID NO.10)。
根据技术人员的决定可以使用任何细胞膜可渗透载剂。
由于天然肽(L-型)的固有问题是会被天然蛋白酶降解，本发明的肽，其同种型、片段或变体以及细胞膜可渗透肽可被制备成包括该肽的D-型和/或“反向-翻转异构体(retro-inverso isomer)”。在这种情况下，制备了本发明的肽的片段和变体以及细胞膜可渗透肽的反向-翻转异构体。
可以通过本领域已知的多种方法和技术例如化学合成或重组技术，如在Maniatiset al.1982,Molecular Cloning,A laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory中所述，来制备本发明的肽，其同种型、片段或变体，所述肽，其同种型、片段或变体任选地与增加所述肽在细胞中的积累的剂缀合。
优选在细胞表达系统中重组产生本发明的肽，其同种型、片段或变体，所述肽，其同种型、片段或变体任选地与增加所述肽在细胞中的积累的剂缀合。多种单细胞的宿主细胞可用于表达本发明的DNA序列。这些宿主可以包括众所周知的真核宿主和原核宿主，例如大肠杆菌(E.coli)、假单胞菌(Pseudomonas)、芽孢杆菌(Bacillus)、链霉菌(Streptomyces)、真菌如酵母的菌株，以及动物细胞如CHO、YB/20、NSO、SP2/0、Rl.1、B-W和L-M细胞、非洲绿猴肾细胞(例如COS 1、COS 7、BSCl、BSC40和BMTlO)、昆虫细胞(例如Sf9)以及组织培养中的人类细胞和植物细胞。
本发明的α1-抗胰蛋白酶蛋白，其变体、同种型和/或片段的“治疗有效剂量或治疗有效量”是指施用时对受试者的与冠状病毒感染相关疾病或综合征的治疗产生积极的治疗性或预防性反应的量。
术语“冠状病毒感染”可指由选自包含MERS-CoV、SARS-CoV和SARS-CoV-2及其任何变体的组的冠状病毒引起的感染。在一些方面，本文所述的SARS-CoV-2变体是选自以下的组的SARS-CoV-2变体：谱系B.1.1.207、谱系B.1.1.7、簇5、501.V2变体、谱系P.1、谱系B.1.429/CAL.20C、谱系B.1.427、谱系B.1.526、谱系B.1.525、谱系B.1.1.317、谱系B.1.1.318、谱系B.1.351、谱系B.1.617和谱系P.3。在一些方面，本文所述的SARS-CoV-2变体是选自以下的组的Nextstrain进化支所描述的SARS-CoV-2变体：19A、20A、20C、20G、20H、20B、20D、20F、20I和20E。在一些方面，本文所述的SARS-CoV-2病毒是包含选自以下的组的至少一个突变的SARS-CoV-2变体：D614G、E484K、N501Y、S477G/N、P681H、E484Q、L452R和P614R。在一些方面，本文所述的SARS-CoV-2变体是源自本文所述变体的SARS-CoV-2变体。在一些方面，本文所述的SARS-CoV-2病毒是与本文所述的至少一个SARS-CoV-2变体的病毒基因组序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％的序列一致性的SARS-CoV-2变体。
冠状病毒感染可引起呼吸道感染，从而导致作为呼吸综合征的疾病或综合征。所述呼吸综合征可以是严重急性呼吸综合征(SARS)。在某些方面，SARS-CoV-2感染是可区分的三种感染临床病程的至少一种：(1)具有上呼吸道表现的轻度疾病，(2)非危及生命的肺炎，和(3)具有肺炎、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、严重全身炎症、器官衰竭、心血管并发症的严重病症。
用于本发明的用途的组合物还可以包含一种或多种药学上可接受的稀释剂或载剂。
“药学上可接受的稀释剂或载剂”是指用于制备药物组合物的载剂或稀释剂，其通常是安全、无毒和理想的，并且包括人类药物用途可接受的载剂或稀释剂。
此类药学上可接受的载剂可以是无菌液体，如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉施用药物组合物时，水是优选的载剂。盐溶液以及葡萄糖水溶液和甘油溶液也可以用作液体载剂，特别是用于可注射溶液。
药学上可接受的稀释剂或载剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。
所述药物组合物还可以包含一种或多种药学上可接受的盐，例如无机酸盐如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；以及有机酸盐如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。此外，辅助物质如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质、凝胶或胶凝材料、调味剂、着色剂、微球、聚合物、悬浮剂等也可以存在于本文中。此外，还可以存在一种或多种其它常规药物成分如防腐剂、湿润剂、悬浮剂、表面活性剂、抗氧化剂、防结块剂、填充剂、螯合剂、包衣剂、化学稳定剂等，特别是如果剂型是可重构的形式。合适的示例性成分包括微晶纤维素、羧甲基纤维素钠、聚山梨醇酯80、苯乙醇、氯丁醇、山梨酸钾、山梨酸、二氧化硫、没食子酸丙酯、对羟基苯甲酸酯、乙基香兰素、甘油、苯酚、对氯苯酚、明胶、白蛋白及它们的组合。REMINGTON'SPHARMACEUTICAL SCIENCES(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中对药学上可接受的赋形剂进行了深入讨论，该文献通过引用并入本文。
或者，本发明的药物组合物还包含一种或多种另外的治疗剂。优选地，所述一种或多种治疗剂包含治疗有效量的一种或多种核苷类似物、蛋白酶抑制剂、免疫抑制剂(例如沙利鲁单抗或托珠单抗)、氯喹、羟氯喹抗生素、针对病毒结构成分的抗体或其片段(例如被动免疫疗法)、干扰素β(例如干扰素β-1a)和/或疫苗。
在某些其它方面，本发明的药物组合物和一种或多种额外的治疗剂是基本上同时或并发施用。例如，可以给予受试者用于本发明的用途的药物组合物，受试者同时接受用一种或多种额外的治疗剂的治疗。此外，预期所述受试者已经接受了其他形式的抗病毒治疗或可同时接受其他形式的抗病毒治疗。
在一些方面，所述额外的治疗剂可用于减少与本发明的抗体或其抗原结合片段的施用相关的可能的副作用。
在一些方面，所述额外的治疗剂可用于支持与本发明的抗体或其抗原结合片段的施用相关的作用。
在一些方面，额外的治疗剂和本发明的抗体或其抗原结合片段的施用会导致在所需效果和/或副作用方面的协同作用。
在一些方面，本文所述的额外的治疗剂是选自以下的组的至少一种剂：核苷类似物、蛋白酶抑制剂和免疫调节剂如免疫抑制剂。
在一些方面，本文所述的额外的治疗剂是选自以下的组的至少一种剂：核苷类似物、蛋白酶抑制剂、免疫抑制剂(例如沙利鲁单抗或托珠单抗)、氯喹、羟氯喹抗生素、针对病毒结构成分的抗体或其片段(例如被动免疫疗法)、干扰素β(例如干扰素β-1a)和/或疫苗。
核苷类似物的非限制性实例包括利巴韦林(Ribavirin)、瑞德西韦(Remdesivir)、β-d-N4-羟基胞苷、BCX4430、盐酸吉西他滨(Gemcitabine hydrochloride)、6-氮杂尿苷(6-Azauridine)、咪唑立宾(Mizoribine)、阿昔洛韦柔性体(Acyclovir fleximer)，及它们的一种或多种的组合。
蛋白酶抑制剂的非限制性实例包括HIV蛋白酶抑制剂和/或HCV蛋白酶抑制剂。
在一些方面，本文所述的免疫调节剂是干扰素β。在一些方面，本文所述的免疫调节剂是干扰素β-1a。免疫抑制剂的非限制性实例包括白细胞介素抑制剂，例如IL-6(例如沙利鲁单抗或托珠单抗)、IL-1、IL-12、IL-18和TNF-α的抑制剂。
所述额外的治疗剂可以改善或补充本文所述的组合物和方法的治疗效果(参见例如图20、图11d)。
因此，本发明至少部分基于以下发现：某些组合(如IFN-β-1a和AAT)改善了AAT对病毒的进入和炎症的作用。
本发明还考虑了基因递送载体和含有该载体的药物组合物。优选地，所述基因递送载体是包含一个或多个编码本发明的AAT蛋白，其变体、同种型和/或片段的核酸的质粒或载体的形式。所述基因递送载体的实例包括例如病毒载体、非病毒载体、颗粒载剂和脂质体。所述基因递送优选在体外(in vitro)或活体外(ex vivo)进行。
因此，本发明至少部分基于以下发现：AAT基因递送(基因疗法)降低了炎症效应(参见例如图19b)。
在一个方面，所述病毒载体是适用于活体外和体内基因递送的载体，优选适用于活体外基因递送的载体。更优选地，所述病毒载体选自包括以下的组：腺相关病毒(AAV)和慢病毒如第一代、第二代和第三代慢病毒，不排除其他病毒载体例如腺病毒载体、疱疹病毒载体等。其他递送方式或媒介物是已知的(例如酵母系统、微泡、基因枪/将载体附着到金纳米颗粒上的方式)并且已提供，在一些方面，可以通过脂质体、纳米颗粒、外泌体、微泡或基因枪递送一种或多种病毒载体或质粒载体。
在本发明的其他方面，本发明的药物组合物是持续释放制剂，或者是使用持续释放装置施用的制剂。此类装置在本领域中是众所周知的，包括例如透皮贴剂和微型可植入泵，它们可以随时间通过连续、稳态的方式以多种剂量提供药物递送，以实现非持续释放药物组合物的持续释放效果。
本发明的药物组合物可以通过不同的途径施用于受试者，包括口服、胃肠外、舌下、经皮、经直肠、经粘膜、局部、经吸入、经颊施用、胸膜内、静脉内、动脉内、腹膜内、皮下、肌内、鼻内、鞘内和关节内或其组合。对于人类使用，可以根据正常的人类实践将所述组合物作为合适的可接受制剂施用。熟练的技术人员将很容易确定最适合具体患者的给药方案和施用途径。本发明的组合物的施用可以通过传统的注射器、无针注射装置、“微粒轰击枪”或其他物理方法如电穿孔(“EP”)、“流体动力学方法”或超声波。所述组合物还可以通过静脉内注射、静脉内输注、剂量泵输注、吸入性鼻喷雾剂、滴眼剂、皮肤贴剂、缓释制剂、活体外基因疗法或活体外细胞疗法施用，优选通过静脉内注射施用。
本发明的药物组合物也可以通过多种技术递送给患者，包括使用体内电穿孔和不使用体内电穿孔的编码本发明的AAT蛋白，其变体、同种型和/或片段的核酸的DNA注射(也被称为DNA疫苗接种)；脂质体介导、纳米颗粒促进的重组载体，如本文所述的重组慢病毒、。
所述组合物可以经静脉内注射或者局部注射到肺或呼吸道中、或者经电穿孔到目标组织中。
本发明还提供了在有需要的受试者中治疗和/或预防与冠状病毒感染相关的疾病或综合征的方法，所述方法包括施用治疗有效量的i)本文所述的α1-抗胰蛋白酶蛋白，其变体、同种型和/或片段，或ii)本文所述的用于本发明的用途的药物组合物。
还提供了在暴露于冠状病毒的受试者或疑似暴露于冠状病毒的受试者中调节冠状病毒感染发作的方法，所述方法包括向需要这种治疗的受试者施用治疗有效量的i)如本文所述的α1-抗胰蛋白酶蛋白，其变体、同种型和/或片段，或ii)如本文所述用于本发明的用途的药物组合物。
本发明还涉及用于确定目标受试者对与病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)相关的疾病或综合征的治疗和/或预防的敏感性，所述治疗和/或预防使用如本文所定义的包含治疗有效量的α1-抗胰蛋白酶(AAT)蛋白，其变体、同种型和/或片段的组合物，包括以下步骤：
a)确定目标受试者在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)之前或病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间的由内源性α1-抗胰蛋白酶、至少一种刺突蛋白启动蛋白酶、ACE2受体和干扰素-γ组成的组中的至少一种的水平，
b)确定至少一个参考受试者在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间的由内源性α1-抗胰蛋白酶、至少一种刺突蛋白启动蛋白酶、ACE2受体和干扰素-γ组成的组中的至少一种的水平，其中所述参考受试者无症状或具有轻度症状，
c)将在步骤a)中确定的目标水平与在步骤b)中确定的参考水平进行比较，
其中如果所述目标受试者具有选自由以下组成的组中的至少一种，则所述目标受试者对与病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)相关的疾病或综合征的治疗和/或预防更敏感：
1.与所述内源性AAT的参考水平相比较低的内源性α-抗胰蛋白酶(AAT)的目标水平，
2.与所述至少一种刺突蛋白启动蛋白酶的参考水平相比较高的至少一种刺突蛋白启动蛋白酶的目标水平，
3.与所述血管紧张素转换酶2受体的参考水平相比较高的血管紧张素转换酶2(ACE2受体)的目标水平，以及
4.与所述干扰素-γ的参考水平相比较高的干扰素-γ(IFN-γ)的目标水平。
如果适用且除非另有说明，本文提供的所有定义和组合均适用于该方面。
本发明还涉及一种方法，用于确定有效治疗和/或预防与病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)相关的疾病或综合征的α1-抗胰蛋白酶(AAT)的治疗有效量，所述治疗和/或预防使用用于本发明的用途的组合物，所述方法包括以下步骤：
a)确定目标受试者在病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)之前或病毒感染(优选冠状病毒感染，更优选SARS-CoV-2感染)期间的内源性α1-抗胰蛋白酶的水平，
b)确定所述组合物中AAT的量，所述量是在所述受试者中达到至少10μM、优选至少20μM、更优选至少50μM、甚至更优选至少100μM、最优选至少200μM的AAT水平所需要的。
如果适用且除非另有说明，本文提供的所有定义和组合均适用于该方面。
在一些方面，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述病毒是冠状病毒。在一些方面，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述病毒是SARS-CoV-2。在一些方面，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述疾病或综合征是呼吸综合征或严重急性呼吸综合征。在一些方面，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述疾病或综合征是神经系统炎性疾病或神经系统综合征。在一些方面，本发明涉及根据本发明的方法，其中所述神经系统炎性疾病或神经系统综合征是选自以下的组的疾病或综合征：多发性硬化症、肌萎缩性侧索硬化症、阿尔茨海默病、帕金森病和亨廷顿病。
如果适用且除非另有说明，本文提供的所有定义和组合均适用于这些方面。
本领域的技术人员将会理解，除了那些具体描述的之外，本文所述的本发明易于进行变化和修改。应当理解，本发明在不背离其精神或基本特征的前提下包括所有这些变化和修改。本发明还包括本说明书中单独或共同提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及所述步骤或特征的任何组合和所有组合或任何两个或更多个。因此，认为本公开在所有方面都是说明性的，而不是限制性的，所附权利要求指示了本发明的范围，并且在等同物的含义和范围内的所有变化都旨在包含在本发明的范围中。在本说明书中引用了多个参考文献，每个文献均通过引用整体并入本文。参考下面的实施例，将更全面地理解前面的描述。
序列表
<110> 阿特拉斯生物技术股份有限公司
<120> 与病毒感染相关的疾病或综合征的治疗和/或预防
<130> AD2955 PCT BS
<160> 47
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 418
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> α1-抗胰蛋白酶（AAT）（Alpha1-Antitrypsin (AAT)）
<400> 1
Met Pro Ser Ser Val Ser Trp Gly Ile Leu Leu Leu Ala Gly Leu Cys
1               5                   10                  15
Cys Leu Val Pro Val Ser Leu Ala Glu Asp Pro Gln Gly Asp Ala Ala
            20                  25                  30
Gln Lys Thr Asp Thr Ser His His Asp Gln Asp His Pro Thr Phe Asn
        35                  40                  45
Lys Ile Thr Pro Asn Leu Ala Glu Phe Ala Phe Ser Leu Tyr Arg Gln
    50                  55                  60
Leu Ala His Gln Ser Asn Ser Thr Asn Ile Phe Phe Ser Pro Val Ser
65                  70                  75                  80
Ile Ala Thr Ala Phe Ala Met Leu Ser Leu Gly Thr Lys Ala Asp Thr
                85                  90                  95
His Asp Glu Ile Leu Glu Gly Leu Asn Phe Asn Leu Thr Glu Ile Pro
            100                 105                 110
Glu Ala Gln Ile His Glu Gly Phe Gln Glu Leu Leu Arg Thr Leu Asn
        115                 120                 125
Gln Pro Asp Ser Gln Leu Gln Leu Thr Thr Gly Asn Gly Leu Phe Leu
    130                 135                 140
Ser Glu Gly Leu Lys Leu Val Asp Lys Phe Leu Glu Asp Val Lys Lys
145                 150                 155                 160
Leu Tyr His Ser Glu Ala Phe Thr Val Asn Phe Gly Asp Thr Glu Glu
                165                 170                 175
Ala Lys Lys Gln Ile Asn Asp Tyr Val Glu Lys Gly Thr Gln Gly Lys
            180                 185                 190
Ile Val Asp Leu Val Lys Glu Leu Asp Arg Asp Thr Val Phe Ala Leu
        195                 200                 205
Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Gly Lys Trp Glu Arg Pro Phe Glu Val
    210                 215                 220
Lys Asp Thr Glu Glu Glu Asp Phe His Val Asp Gln Val Thr Thr Val
225                 230                 235                 240
Lys Val Pro Met Met Lys Arg Leu Gly Met Phe Asn Ile Gln His Cys
                245                 250                 255
Lys Lys Leu Ser Ser Trp Val Leu Leu Met Lys Tyr Leu Gly Asn Ala
            260                 265                 270
Thr Ala Ile Phe Phe Leu Pro Asp Glu Gly Lys Leu Gln His Leu Glu
        275                 280                 285
Asn Glu Leu Thr His Asp Ile Ile Thr Lys Phe Leu Glu Asn Glu Asp
    290                 295                 300
Arg Arg Ser Ala Ser Leu His Leu Pro Lys Leu Ser Ile Thr Gly Thr
305                 310                 315                 320
Tyr Asp Leu Lys Ser Val Leu Gly Gln Leu Gly Ile Thr Lys Val Phe
                325                 330                 335
Ser Asn Gly Ala Asp Leu Ser Gly Val Thr Glu Glu Ala Pro Leu Lys
            340                 345                 350
Leu Ser Lys Ala Val His Lys Ala Val Leu Thr Ile Asp Glu Lys Gly
        355                 360                 365
Thr Glu Ala Ala Gly Ala Met Phe Leu Glu Ala Ile Pro Met Ser Ile
    370                 375                 380
Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys Pro Phe Val Phe Leu Met Ile Glu
385                 390                 395                 400
Gln Asn Thr Lys Ser Pro Leu Phe Met Gly Lys Val Val Asn Pro Thr
                405                 410                 415
Gln Lys
<210> 2
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> C端AAT序列374-418（C-terminal AAT sequence 374-418）
<400> 2
Met Phe Leu Glu Ala Ile Pro Met Ser Ile Pro Pro Glu Val Lys Phe
1               5                   10                  15
Asn Lys Pro Phe Val Phe Leu Met Ile Glu Gln Asn Thr Lys Ser Pro
            20                  25                  30
Leu Phe Met Gly Lys Val Val Asn Pro Thr Gln Lys
        35                  40
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 衍生自α1-抗胰蛋白酶的C端序列的短环肽（short cyclic peptide derivedfrom the C-terminal sequence of
Alpha1-Antitrypsin）
<400> 3
Cys Pro Phe Val Phe Leu Met
1               5
<210> 4
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 衍生自α1-抗胰蛋白酶的C端序列的短环肽（short cyclic peptide derivedfrom the C-terminal sequence of
Alpha1-Antitrypsin）
<400> 4
Cys Pro Phe Val Phe Leu Glu
1               5
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 衍生自α1-抗胰蛋白酶的C端序列的短环肽（short cyclic peptide derivedfrom the C-terminal sequence of
Alpha1-Antitrypsin）
<400> 5
Cys Pro Phe Val Phe Leu Arg
1               5
<210> 6
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 衍生自α1-抗胰蛋白酶的C端序列的短环肽（short cyclic peptide derivedfrom the C-terminal sequence of
Alpha1-Antitrypsin）
<400> 6
Cys Pro Glu Val Phe Leu Met
1               5
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HIV-TAT 48-57 peptide
<400> 7
Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1               5                   10
<210> 8
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> FHV外壳35-49肽（FHV-coat 35-49 peptide）
<400> 8
Arg Arg Arg Arg Asn Arg Thr Arg Arg Asn Arg Arg Arg Val Arg
1               5                   10                  15
<210> 9
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HTLV-II Rex 4-16肽（HTLV-II Rex 4-16 peptide）
<400> 9
Thr Arg Arg Gln Arg Thr Arg Arg Ala Arg Arg Asn Arg
1               5                   10
<210> 10
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> BMV gag 7-25肽（BMV gag 7-25 peptide）
<400> 10
Lys Met Thr Arg Ala Gln Arg Arg Ala Ala Ala Arg Arg Asn Arg Trp
1               5                   10                  15
Thr Ala Arg
<210> 11
<211> 11
<212> PRT
<213> 病毒（Viruses）
<220>
<223> Fluorogenic peptides derived from SARS-CoV spike
<400> 11
His Thr Val Ser Leu Leu Arg Ser Thr Ser Gln
1               5                   10
<210> 12
<211> 11
<212> PRT
<213> 病毒（Viruses）
<220>
<223> 衍生自SARS-CoV-2刺突蛋白的荧光肽（Fluorogenic peptides derived fromSARS-CoV-2 spike）
<400> 12
Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala
1               5                   10
<210> 13
<211> 7394
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> pCDH-CMV-MCS-EF1α-Puro慢病毒载体（pCDH-CMV-MCS-EF1α-Purolentivector）
<400> 13
acgcgtgtag tcttatgcaa tactcttgta gtcttgcaac atggtaacga tgagttagca 60
acatgcctta caaggagaga aaaagcaccg tgcatgccga ttggtggaag taaggtggta 120
cgatcgtgcc ttattaggaa ggcaacagac gggtctgaca tggattggac gaaccactga 180
attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacaata aacgggtctc 240
tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 300
agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 360
ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg 420
cccgaacagg gacctgaaag cgaaagggaa accagagctc tctcgacgca ggactcggct 480
tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg gcggcgactg gtgagtacgc caaaaatttt 540
gactagcgga ggctagaagg agagagatgg gtgcgagagc gtcagtatta agcgggggag 600
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
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cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat 5640
caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa 5700
gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct 5760
cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta 5820
cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct 5880
caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg 5940
gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa 6000
gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt 6060
cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta 6120
catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca 6180
gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta 6240
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gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg 6360
cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac 6420
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ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat 6660
gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg 6720
acgtctaaga aaccattatt atcatgacat taacctataa aaataggcgt atcacgaggc 6780
cctttcgtct cgcgcgtttc ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg 6840
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tcaggcgcca ttcgccattc aggctgcgca actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct 7080
cttcgctatt acgccagctg gcgaaagggg gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa 7140
cgccagggtt ttcccagtca cgacgttgta aaacgacggc cagtgccaag ctg 7193
<210> 15
<211> 8159
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> pCG1_SCoV2-S质粒（pCG1_SCoV2-S plasmid）
<400> 15
gaattcgagc tcgccccgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 60
acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 120
ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 180
aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 240
ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 300
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ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt 420
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tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctcgttta gtgaaccgtc 540
agatcgcctg gagacgccat ccacgctgtt ttgacctcca tagaagacac cgggaccgat 600
ccagcctccg ggggatcgat cccccgatcc tgagaacttc agggtgagtt tggggaccct 660
tgattgttct ttctttttcg ctattgtaaa attcatgtta tatggagggg gcaaagtttt 720
cagggtgttg tttagaatgg gaagatgtcc cttgtatcac catggaccct catgataatt 780
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tgtttatttg tcagattgta agtactttct ctaatcactt ttttttcaag gcaatcaggg 960
tatattatat tgtacttcag cacagtttta gagaacaatt gttataatta aatgataagg 1020
tagaatattt ctgcatataa attctggctg gcgtggaaat attcttattg gtagaaacaa 1080
ctacatcctg gtcatcatcc tgcctttctc tttatggtta caatgatata cactgtttga 1140
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caactgcacc ttcgagtacg tgtcccagcc tttcctgatg gacctggaag gcaagcaggg 1860
caacttcaag aacctgcgcg agttcgtgtt caagaacatc gacggctact tcaagatcta 1920
cagcaagcac acccctatca acctcgtgcg ggatctgcct cagggcttct ctgctctgga 1980
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catcaccgac gccgtggatt gtgcccttga tcctctgagc gagacaaagt gcaccctgaa 2220
gtccttcacc gtggaaaagg gcatctacca gaccagcaac ttccgggtgc agcccaccga 2280
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cgagcgggac atctccaccg agatctatca ggccggcagc accccttgta acggcgtgga 2760
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tcacgccgat cagctgacac ctacatggcg ggtgtactcc accggcagca atgtgtttca 3240
gaccagagcc ggctgtctga tcggagccga gcacgtgaac aatagctacg agtgcgacat 3300
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cgattccacc gagtgctcca acctgctgct gcagtacggc agcttctgca cccagctgaa 3600
tagagccctg acagggatcg ccgtggaaca ggacaagaac acccaagagg tgttcgccca 3660
agtgaagcag atctacaaga cccctcctat caaggacttc ggcggcttca atttcagcca 3720
gattctgccc gatcctagca agcccagcaa gcggagcttc atcgaggacc tgctgttcaa 3780
caaagtgaca ctggccgacg ccggcttcat caagcagtat ggcgattgtc tgggcgacat 3840
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gctgaccgat gagatgatcg cccagtacac atctgccctg ctggccggca caatcacaag 3960
cggctggaca tttggagctg gcgccgctct gcagatcccc tttgctatgc agatggccta 4020
ccggttcaac ggcatcggag tgacccagaa tgtgctgtac gagaaccaga agctgatcgc 4080
caaccagttc aacagcgcca tcggcaagat ccaggacagc ctgagcagca cagcaagcgc 4140
cctgggaaag ctgcaggacg tggtcaacca gaatgcccag gcactgaaca ccctggtcaa 4200
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ggacaaggtg gaagccgagg tgcagatcga cagactgatc accggaaggc tgcagtccct 4320
gcagacctac gttacccagc agctgatcag agccgccgag attagagcct ctgccaatct 4380
ggccgccacc aagatgtctg agtgtgtgct gggccagagc aagagagtgg acttttgcgg 4440
caagggctac cacctgatga gcttccctca gtctgcccct cacggcgtgg tgtttctgca 4500
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gacccagcgg aacttctacg agccccagat catcaccacc gacaacacct tcgtgtctgg 4680
caactgcgac gtcgtgatcg gcattgtgaa caataccgtg tacgaccctc tgcagcccga 4740
gctggacagc ttcaaagagg aactggataa gtactttaag aaccacacaa gccccgacgt 4800
ggacctgggc gatatcagcg gaatcaatgc cagcgtcgtg aacatccaga aagagatcga 4860
ccggctgaac gaggtggcca agaatctgaa cgagagcctg atcgacctgc aagaactggg 4920
gaagtacgag cagtacatca agtggccctg gtacatctgg ctgggcttta tcgccggact 4980
gattgccatc gtgatggtca caatcatgct gtgttgcatg accagctgct gtagctgcct 5040
gaagggctgt tgtagctgtg gcagctgctg caagttcgac gaggacgatt ctgagcccgt 5100
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atgcaagctg atctttttcc ctctgccaaa aattatgggg acatcatgaa gccccttgag 5220
catctgactt ctggctaata aaggaaattt attttcattg caatagtgtg ttggaatttt 5280
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agccttgact tgaggttaga ttttttttat attttgtttt gtgttatttt tttctttaac 5520
atccctaaaa ttttccttac atgttttact agccagattt ttcctcctct cctgactact 5580
cccagtcata gctgtccctc ttctcttatg aactcgagga gctttttgca aaagcctagg 5640
cctccaaaaa agcctcctca ctacttctgg aatagctcag aggccgaggc ggcctcggcc 5700
tctgcataaa taaaaaaaat tagtcagcca tggggcggag aatgggcgga actgggcgga 5760
gttaggggcg ggatgggcgg agttaggggc gggactatgg ttgctgacta attgagactg 5820
cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct 5880
tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac 5940
tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga 6000
gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat 6060
aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac 6120
ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct 6180
gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg 6240
ctttctcaat gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg 6300
ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt 6360
cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg 6420
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gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt 6660
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ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc 6780
taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct 6840
atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt cgtgtagata 6900
actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca 6960
cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga 7020
agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg ggaagctaga 7080
gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg 7140
gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga 7200
gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt 7260
gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact gcataattct 7320
cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca 7380
ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat 7440
accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga 7500
aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc 7560
aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg 7620
caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc 7680
ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt 7740
gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaacgtctt 7800
caagctgcct cgcgcgtttc ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg 7860
agacggtcac agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt 7920
cagcgggtgt tggcgggtgt cggggcgcag ccatgaccca gtcacgtagc gatagcggag 7980
ttggcttaac tatgcggcat cagagcagat tgtactgaga gtgcaccata tcgacgctct 8040
cccttatgcg actcctgcat taggaagcag cccagtagta ggttgaggcc gttgagcacc 8100
gccgccgcaa ggaatggtgc tggcttatcg aaattaatcg actcactata gggagaccc 8159
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> G614刺突引物1（G614 Spike primer 1）
<400> 16
gcgtgaactg taccgaagtg 20
<210> 17
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> G614刺突引物2（G614 Spike primer 2）
<400> 17
cctggtacag cactgcc 17
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 截短的SARS-CoV2-刺突引物1（truncated SARS-CoV2-Spike primer 1）
<400> 18
agcgaattcg gatccgcc 18
<210> 19
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 截短的SARS-CoV2-刺突引物2（truncated SARS-CoV2-Spike primer 2）
<400> 19
acagtcgact ctagattagc agcagctgcc acag 34
<210> 20
<211> 8159
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 编码刺突G614全长(FL)的质粒（plasmids encoding Spike G614 Full length(FL)）
<400> 20
gaattcgagc tcgccccgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 60
acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 120
ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 180
aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 240
ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 300
tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc 360
ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt 420
ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa 480
tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctcgttta gtgaaccgtc 540
agatcgcctg gagacgccat ccacgctgtt ttgacctcca tagaagacac cgggaccgat 600
ccagcctccg ggggatcgat cccccgatcc tgagaacttc agggtgagtt tggggaccct 660
tgattgttct ttctttttcg ctattgtaaa attcatgtta tatggagggg gcaaagtttt 720
cagggtgttg tttagaatgg gaagatgtcc cttgtatcac catggaccct catgataatt 780
ttgtttcttt cactttctac tctgttgaca accattgtct cctcttattt tcttttcatt 840
ttctgtaact ttttcgttaa actttagctt gcatttgtaa cgaattttta aattcacttt 900
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tagaatattt ctgcatataa attctggctg gcgtggaaat attcttattg gtagaaacaa 1080
ctacatcctg gtcatcatcc tgcctttctc tttatggtta caatgatata cactgtttga 1140
gatgaggata aaatactctg agtccaaacc gggcccctct gctaaccatg ttcatgcctt 1200
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gcctccagcc tacaccaaca gctttaccag aggcgtgtac taccccgaca aggtgttcag 1440
atccagcgtg ctgcactcta cccaggacct gttcctgcct ttcttcagca acgtgacctg 1500
gttccacgcc atccacgtgt ccggcaccaa tggcaccaag agattcgaca accccgtgct 1560
gcccttcaac gacggggtgt actttgccag caccgagaag tccaacatca tcagaggctg 1620
gatcttcggc accacactgg acagcaagac ccagagcctg ctgatcgtga acaacgccac 1680
caacgtggtc atcaaagtgt gcgagttcca gttctgcaac gaccccttcc tgggcgtcta 1740
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caactgcacc ttcgagtacg tgtcccagcc tttcctgatg gacctggaag gcaagcaggg 1860
caacttcaag aacctgcgcg agttcgtgtt caagaacatc gacggctact tcaagatcta 1920
cagcaagcac acccctatca acctcgtgcg ggatctgcct cagggcttct ctgctctgga 1980
acccctggtg gatctgccca tcggcatcaa catcacccgg tttcagacac tgctggccct 2040
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ttactatgtg ggctacctgc agcctagaac cttcctgctg aagtacaacg agaacggcac 2160
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caaagtgaca ctggccgacg ccggcttcat caagcagtat ggcgattgtc tgggcgacat 3840
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gctgaccgat gagatgatcg cccagtacac atctgccctg ctggccggca caatcacaag 3960
cggctggaca tttggagctg gcgccgctct gcagatcccc tttgctatgc agatggccta 4020
ccggttcaac ggcatcggag tgacccagaa tgtgctgtac gagaaccaga agctgatcgc 4080
caaccagttc aacagcgcca tcggcaagat ccaggacagc ctgagcagca cagcaagcgc 4140
cctgggaaag ctgcaggacg tggtcaacca gaatgcccag gcactgaaca ccctggtcaa 4200
gcagctgtcc tccaacttcg gcgccatcag ctctgtgctg aacgatatcc tgagcagact 4260
ggacaaggtg gaagccgagg tgcagatcga cagactgatc accggaaggc tgcagtccct 4320
gcagacctac gttacccagc agctgatcag agccgccgag attagagcct ctgccaatct 4380
ggccgccacc aagatgtctg agtgtgtgct gggccagagc aagagagtgg acttttgcgg 4440
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cggcaaagcc cactttccta gagaaggcgt gttcgtgtcc aacggcaccc attggttcgt 4620
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caactgcgac gtcgtgatcg gcattgtgaa caataccgtg tacgaccctc tgcagcccga 4740
gctggacagc ttcaaagagg aactggataa gtactttaag aaccacacaa gccccgacgt 4800
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ttgtgtctct cactcggaag gacatatggg agggcaaatc atttaaaaca tcagaatgag 5340
tatttggttt agagtttggc aacatatgcc atatgctggc tgccatgaac aaaggtggct 5400
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atccctaaaa ttttccttac atgttttact agccagattt ttcctcctct cctgactact 5580
cccagtcata gctgtccctc ttctcttatg aactcgagga gctttttgca aaagcctagg 5640
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tctgcataaa taaaaaaaat tagtcagcca tggggcggag aatgggcgga actgggcgga 5760
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gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat 6060
aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac 6120
ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct 6180
gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg 6240
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cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg 6420
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ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga 6540
aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt 6600
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gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt 7260
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cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca 7380
ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat 7440
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aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc 7560
aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg 7620
caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc 7680
ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt 7740
gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaacgtctt 7800
caagctgcct cgcgcgtttc ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg 7860
agacggtcac agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt 7920
cagcgggtgt tggcgggtgt cggggcgcag ccatgaccca gtcacgtagc gatagcggag 7980
ttggcttaac tatgcggcat cagagcagat tgtactgaga gtgcaccata tcgacgctct 8040
cccttatgcg actcctgcat taggaagcag cccagtagta ggttgaggcc gttgagcacc 8100
gccgccgcaa ggaatggtgc tggcttatcg aaattaatcg actcactata gggagaccc 8159
<210> 21
<211> 8102
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> p编码刺突D614 DeltaCter的质粒（plasmids encoding Spike D614DeltaCter）
<400> 21
gaattcgagc tcgccccgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 60
acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 120
ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 180
aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 240
ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 300
tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc 360
ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt 420
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tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctcgttta gtgaaccgtc 540
agatcgcctg gagacgccat ccacgctgtt ttgacctcca tagaagacac cgggaccgat 600
ccagcctccg ggggatcgat cccccgatcc tgagaacttc agggtgagtt tggggaccct 660
tgattgttct ttctttttcg ctattgtaaa attcatgtta tatggagggg gcaaagtttt 720
cagggtgttg tttagaatgg gaagatgtcc cttgtatcac catggaccct catgataatt 780
ttgtttcttt cactttctac tctgttgaca accattgtct cctcttattt tcttttcatt 840
ttctgtaact ttttcgttaa actttagctt gcatttgtaa cgaattttta aattcacttt 900
tgtttatttg tcagattgta agtactttct ctaatcactt ttttttcaag gcaatcaggg 960
tatattatat tgtacttcag cacagtttta gagaacaatt gttataatta aatgataagg 1020
tagaatattt ctgcatataa attctggctg gcgtggaaat attcttattg gtagaaacaa 1080
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tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc 6000
cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga 6060
aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct 6120
cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg 6180
gcgctttctc aatgctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag 6240
ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat 6300
cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac 6360
aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac 6420
tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc 6480
ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt 6540
tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc 6600
ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg 6660
agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca 6720
atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca 6780
cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag 6840
ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac 6900
ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc 6960
agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct 7020
agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc 7080
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gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat 7260
tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag 7320
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cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga 7560
aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc 7620
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tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaacgt 7740
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cgtcagcggg tgttggcggg tgtcggggcg cagccatgac ccagtcacgt agcgatagcg 7920
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tctcccttat gcgactcctg cattaggaag cagcccagta gtaggttgag gccgttgagc 8040
accgccgccg caaggaatgg tgctggctta tcgaaattaa tcgactcact atagggagac 8100
cc 8102
<210> 22
<211> 8102
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 刺突G614 DeltaCter质粒（plasmids Spike G614 DeltaCter）
<400> 22
gaattcgagc tcgccccgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 60
acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 120
ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 180
aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 240
ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 300
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ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt 420
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tgattgttct ttctttttcg ctattgtaaa attcatgtta tatggagggg gcaaagtttt 720
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tgtttatttg tcagattgta agtactttct ctaatcactt ttttttcaag gcaatcaggg 960
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tagaatattt ctgcatataa attctggctg gcgtggaaat attcttattg gtagaaacaa 1080
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ctatcacaag aacaacaaga gctggatgga aagcgagttc cgggtgtaca gcagcgccaa 1800
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taccaagctg aacgacctgt gcttcacaaa cgtgtacgcc gacagcttcg tgatccgggg 2520
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cgagcgggac atctccaccg agatctatca ggccggcagc accccttgta acggcgtgga 2760
aggcttcaac tgctacttcc cactgcagtc ctacggcttt cagcccacaa atggcgtggg 2820
ctatcagccc tacagagtgg tggtgctgag cttcgaactg ctgcatgccc ctgccacagt 2880
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ccccatcggc gctggcatct gtgccagcta ccagacacag acaaacagcc ccagacgggc 3360
cagatctgtg gccagccaga gcatcattgc ctacacaatg tctctgggcg ccgagaacag 3420
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cgattccacc gagtgctcca acctgctgct gcagtacggc agcttctgca cccagctgaa 3600
tagagccctg acagggatcg ccgtggaaca ggacaagaac acccaagagg tgttcgccca 3660
agtgaagcag atctacaaga cccctcctat caaggacttc ggcggcttca atttcagcca 3720
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gctgaccgat gagatgatcg cccagtacac atctgccctg ctggccggca caatcacaag 3960
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gaagtacgag cagtacatca agtggccctg gtacatctgg ctgggcttta tcgccggact 4980
gattgccatc gtgatggtca caatcatgct gtgttgcatg accagctgct gtagctgcct 5040
gaagggctgt tgtagctgtg gcagctgctg ctaatctaga gtcgactgtt taaacctgca 5100
ggcatgcaag ctgatctttt tccctctgcc aaaaattatg gggacatcat gaagcccctt 5160
gagcatctga cttctggcta ataaaggaaa tttattttca ttgcaatagt gtgttggaat 5220
tttttgtgtc tctcactcgg aaggacatat gggagggcaa atcatttaaa acatcagaat 5280
gagtatttgg tttagagttt ggcaacatat gccatatgct ggctgccatg aacaaaggtg 5340
gctataaaga ggtcatcagt atatgaaaca gccccctgct gtccattcct tattccatag 5400
aaaagccttg acttgaggtt agattttttt tatattttgt tttgtgttat ttttttcttt 5460
aacatcccta aaattttcct tacatgtttt actagccaga tttttcctcc tctcctgact 5520
actcccagtc atagctgtcc ctcttctctt atgaactcga ggagcttttt gcaaaagcct 5580
aggcctccaa aaaagcctcc tcactacttc tggaatagct cagaggccga ggcggcctcg 5640
gcctctgcat aaataaaaaa aattagtcag ccatggggcg gagaatgggc ggaactgggc 5700
ggagttaggg gcgggatggg cggagttagg ggcgggacta tggttgctga ctaattgaga 5760
ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc 5820
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cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga 6060
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tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc 6480
ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt 6540
tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc 6600
ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg 6660
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atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca 6780
cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag 6840
ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac 6900
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agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct 7020
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gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg 7140
cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc 7200
gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat 7260
tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag 7320
tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat 7380
aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg 7440
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cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga 7560
aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc 7620
ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata 7680
tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaacgt 7740
cttcaagctg cctcgcgcgt ttcggtgatg acggtgaaaa cctctgacac atgcagctcc 7800
cggagacggt cacagcttgt ctgtaagcgg atgccgggag cagacaagcc cgtcagggcg 7860
cgtcagcggg tgttggcggg tgtcggggcg cagccatgac ccagtcacgt agcgatagcg 7920
gagttggctt aactatgcgg catcagagca gattgtactg agagtgcacc atatcgacgc 7980
tctcccttat gcgactcctg cattaggaag cagcccagta gtaggttgag gccgttgagc 8040
accgccgccg caaggaatgg tgctggctta tcgaaattaa tcgactcact atagggagac 8100
cc 8102
<210> 23
<211> 4337
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 编码空载体的质粒（plasmids encoding empty vector）
<400> 23
gaattcgagc tcgccccgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 60
acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 120
ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 180
aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 240
ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 300
tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc 360
ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt 420
ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa 480
tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctcgttta gtgaaccgtc 540
agatcgcctg gagacgccat ccacgctgtt ttgacctcca tagaagacac cgggaccgat 600
ccagcctccg ggggatcgat cccccgatcc tgagaacttc agggtgagtt tggggaccct 660
tgattgttct ttctttttcg ctattgtaaa attcatgtta tatggagggg gcaaagtttt 720
cagggtgttg tttagaatgg gaagatgtcc cttgtatcac catggaccct catgataatt 780
ttgtttcttt cactttctac tctgttgaca accattgtct cctcttattt tcttttcatt 840
ttctgtaact ttttcgttaa actttagctt gcatttgtaa cgaattttta aattcacttt 900
tgtttatttg tcagattgta agtactttct ctaatcactt ttttttcaag gcaatcaggg 960
tatattatat tgtacttcag cacagtttta gagaacaatt gttataatta aatgataagg 1020
tagaatattt ctgcatataa attctggctg gcgtggaaat attcttattg gtagaaacaa 1080
ctacatcctg gtcatcatcc tgcctttctc tttatggtta caatgatata cactgtttga 1140
gatgaggata aaatactctg agtccaaacc gggcccctct gctaaccatg ttcatgcctt 1200
cttctttttc ctacagctcc tgggcaacgt gctggttatt gtgctgtctc atcattttgg 1260
caaagaattg taatacgact cactataggg cgaattcgga tccgccacct ctagagtcga 1320
ctgtttaaac ctgcaggcat gcaagctgat ctttttccct ctgccaaaaa ttatggggac 1380
atcatgaagc cccttgagca tctgacttct ggctaataaa ggaaatttat tttcattgca 1440
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attgccgcat tgcagagata ttgtatttaa gtgcctagct cgatacaata aacgggtctc 240
tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 300
agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 360
ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg 420
cccgaacagg gacctgaaag cgaaagggaa accagagctc tctcgacgca ggactcggct 480
tgctgaagcg cgcacggcaa gaggcgaggg gcggcgactg gtgagtacgc caaaaatttt 540
gactagcgga ggctagaagg agagagatgg gtgcgagagc gtcagtatta agcgggggag 600
aattagatcg cgatgggaaa aaattcggtt aaggccaggg ggaaagaaaa aatataaatt 660
aaaacatata gtatgggcaa gcagggagct agaacgattc gcagttaatc ctggcctgtt 720
agaaacatca gaaggctgta gacaaatact gggacagcta caaccatccc ttcagacagg 780
atcagaagaa cttagatcat tatataatac agtagcaacc ctctattgtg tgcatcaaag 840
gatagagata aaagacacca aggaagcttt agacaagata gaggaagagc aaaacaaaag 900
taagaccacc gcacagcaag cggccactga tcttcagacc tggaggagga gatatgaggg 960
acaattggag aagtgaatta tataaatata aagtagtaaa aattgaacca ttaggagtag 1020
cacccaccaa ggcaaagaga agagtggtgc agagagaaaa aagagcagtg ggaataggag 1080
ctttgttcct tgggttcttg ggagcagcag gaagcactat gggcgcagcg tcaatgacgc 1140
tgacggtaca ggccagacaa ttattgtctg gtatagtgca gcagcagaac aatttgctga 1200
gggctattga ggcgcaacag catctgttgc aactcacagt ctggggcatc aagcagctcc 1260
aggcaagaat cctggctgtg gaaagatacc taaaggatca acagctcctg gggatttggg 1320
gttgctctgg aaaactcatt tgcaccactg ctgtgccttg gaatgctagt tggagtaata 1380
aatctctgga acagatttgg aatcacacga cctggatgga gtgggacaga gaaattaaca 1440
attacacaag cttaatacac tccttaattg aagaatcgca aaaccagcaa gaaaagaatg 1500
aacaagaatt attggaatta gataaatggg caagtttgtg gaattggttt aacataacaa 1560
attggctgtg gtatataaaa ttattcataa tgatagtagg aggcttggta ggtttaagaa 1620
tagtttttgc tgtactttct atagtgaata gagttaggca gggatattca ccattatcgt 1680
ttcagaccca cctcccaacc ccgaggggac ccgacaggcc cgaaggaata gaagaagaag 1740
gtggagagag agacagagac agatccattc gattagtgaa cggatctcga cggtatcggt 1800
taacttttaa aagaaaaggg gggattgggg ggtacagtgc aggggaaaga atagtagaca 1860
taatagcaac agacatacaa actaaagaat tacaaaaaca aattacaaaa ttcaaaattt 1920
tatcgattac tagtattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta 1980
catctacgta ttagtcatcg ctattaccat ggtgatgcgg ttttggcagt acatcaatgg 2040
gcgtggatag cggtttgact cacggggatt tccaagtctc caccccattg acgtcaatgg 2100
gagtttgttt tggcaccaaa atcaacggga ctttccaaaa tgtcgtaaca actccgcccc 2160
attgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg gtgggaggtt tatataagca gagctcgttt 2220
agtgaaccgt cagatcgcct ggagacgcca tccacgctgt tttgacctcc atagaagatt 2280
ctagagctag cgtttaaact taaggccacc atggctttga actcagggtc accaccagct 2340
attggacctt actatgaaaa ccatggatac caaccggaaa acccctatcc cgcacagccc 2400
actgtggtcc ccactgtcta cgaggtgcat ccggctcagt actacccgtc ccccgtgccc 2460
cagtacgccc cgagggtcct gacgcaggct tccaaccccg tcgtctgcac gcagcccaaa 2520
tccccatccg ggacagtgtg cacctcaaag actaagaaag cactgtgcat caccttgacc 2580
ctggggacct tcctcgtggg agctgcgctg gccgctggcc tactctggaa gttcatgggc 2640
agcaagtgct ccaactctgg gatagagtgc gactcctcag gtacctgcat caacccctct 2700
aactggtgtg atggcgtgtc acactgcccc ggcggggagg acgagaatcg gtgtgttcgc 2760
ctctacggac caaacttcat ccttcaggtg tactcatctc agaggaagtc ctggcaccct 2820
gtgtgccaag acgactggaa cgagaactac gggcgggcgg cctgcaggga catgggctat 2880
aagaataatt tttactctag ccaaggaata gtggatgaca gcggatccac cagctttatg 2940
aaactgaaca caagtgccgg caatgtcgat atctataaaa aactgtacca cagtgatgcc 3000
tgttcttcaa aagcagtggt ttctttacgc tgtatagcct gcggggtcaa cttgaactca 3060
agccgccaga gcaggattgt gggcggcgag agcgcgctcc cgggggcctg gccctggcag 3120
gtcagcctgc acgtccagaa cgtccacgtg tgcggaggct ccatcatcac ccccgagtgg 3180
atcgtgacag ccgcccactg cgtggaaaaa cctcttaaca atccatggca ttggacggca 3240
tttgcgggga ttttgagaca atctttcatg ttctatggag ccggatacca agtagaaaaa 3300
gtgatttctc atccaaatta tgactccaag accaagaaca atgacattgc gctgatgaag 3360
ctgcagaagc ctctgacttt caacgaccta gtgaaaccag tgtgtctgcc caacccaggc 3420
atgatgctgc agccagaaca gctctgctgg atttccgggt ggggggccac cgaggagaaa 3480
gggaagacct cagaagtgct gaacgctgcc aaggtgcttc tcattgagac acagagatgc 3540
aacagcagat atgtctatga caacctgatc acaccagcca tgatctgtgc cggcttcctg 3600
caggggaacg tcgattcttg ccagggtgac agtggagggc ctctggtcac ttcgaagaac 3660
aatatctggt ggctgatagg ggatacaagc tggggttctg gctgtgccaa agcttacaga 3720
ccaggagtgt acgggaatgt gatggtattc acggactgga tttatcgaca aatgagggca 3780
gacggctaag cggccgcaag gatctgcgat cgctccggtg cccgtcagtg ggcagagcgc 3840
acatcgccca cagtccccga gaagttgggg ggaggggtcg gcaattgaac gggtgcctag 3900
agaaggtggc gcggggtaaa ctgggaaagt gatgtcgtgt actggctccg cctttttccc 3960
gagggtgggg gagaaccgta tataagtgca gtagtcgccg tgaacgttct ttttcgcaac 4020
gggtttgccg ccagaacaca gctgaagctt cgaggggctc gcatctctcc ttcacgcgcc 4080
cgccgcccta cctgaggccg ccatccacgc cggttgagtc gcgttctgcc gcctcccgcc 4140
tgtggtgcct cctgaactgc gtccgccgtc taggtaagtt taaagctcag gtcgagaccg 4200
ggcctttgtc cggcgctccc ttggagccta cctagactca gccggctctc cacgctttgc 4260
ctgaccctgc ttgctcaact ctacgtcttt gtttcgtttt ctgttctgcg ccgttacaga 4320
tccaagctgt gaccggcgcc tacgatatgg ccaagccttt gtctcaagaa gaatccaccc 4380
tcattgaaag agcaacggct acaatcaaca gcatccccat ctctgaagac tacagcgtcg 4440
ccagcgcagc tctctctagc gacggccgca tcttcactgg tgtcaatgta tatcatttta 4500
ctgggggacc ttgtgcagaa ctcgtggtgc tgggcactgc tgctgctgcg gcagctggca 4560
acctgacttg tatcgtcgcg atcggaaatg agaacagggg catcttgagc ccctgcggac 4620
ggtgccgaca ggtgcttctc gatctgcatc ctgggatcaa agccatagtg aaggacagtg 4680
atggacagcc gacggcagtt gggattcgtg aattgctgcc ctctggttat gtgtgggagg 4740
gctaacaatc aacctctgga ttacaaaatt tgtgaaagat tgactggtat tcttaactat 4800
gttgctcctt ttacgctatg tggatacgct gctttaatgc ctttgtatca tgctattgct 4860
tcccgtatgg ctttcatttt ctcctccttg tataaatcct ggttgctgtc tctttatgag 4920
gagttgtggc ccgttgtcag gcaacgtggc gtggtgtgca ctgtgtttgc tgacgcaacc 4980
cccactggtt ggggcattgc caccacctgt cagctccttt ccgggacttt cgctttcccc 5040
ctccctattg ccacggcgga actcatcgcc gcctgccttg cccgctgctg gacaggggct 5100
cggctgttgg gcactgacaa ttccgtggtg ttgtcgggga aatcatcgtc ctttccttgg 5160
ctgctcgcct gtgttgccac ctggattctg cgcgggacgt ccttctgcta cgtcccttcg 5220
gccctcaatc cagcggacct tccttcccgc ggcctgctgc cggctctgcg gcctcttccg 5280
cgtcttcgcc ttcgccctca gacgagtcgg atctcccttt gggccgcctc cccgcctggt 5340
acctttaaga ccaatgactt acaaggcagc tgtagatctt agccactttt taaaagaaaa 5400
ggggggactg gaagggctaa ttcactccca acgaagataa gatctgcttt ttgcttgtac 5460
tgggtctctc tggttagacc agatctgagc ctgggagctc tctggctaac tagggaaccc 5520
actgcttaag cctcaataaa gcttgccttg agtgcttcaa gtagtgtgtg cccgtctgtt 5580
gtgtgactct ggtaactaga gatccctcag acccttttag tcagtgtgga aaatctctag 5640
cagtagtagt tcatgtcatc ttattattca gtatttataa cttgcaaaga aatgaatatc 5700
agagagtgag aggaacttgt ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat 5760
cacaaatttc acaaataaag catttttttc actgcattct agttgtggtt tgtccaaact 5820
catcaatgta tcttatcatg tctggctcta gctatcccgc ccctaactcc gcccatcccg 5880
cccctaactc cgcccagttc cgcccattct ccgccccatg gctgactaat tttttttatt 5940
tatgcagagg ccgaggccgc ctcggcctct gagctattcc agaagtagtg aggaggcttt 6000
tttggaggcc tagacttttg cagagaccaa attcgtaatc atgtcatagc tgtttcctgt 6060
gtgaaattgt tatccgctca caattccaca caacatacga gccggaagca taaagtgtaa 6120
agcctggggt gcctaatgag tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc 6180
tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag 6240
aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt 6300
cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga 6360
atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg 6420
taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa 6480
aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt 6540
tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct 6600
gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct 6660
cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc 6720
cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt 6780
atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc 6840
tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaaggacag tatttggtat 6900
ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa 6960
acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa 7020
aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga 7080
aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct 7140
tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga 7200
cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc 7260
catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg 7320
ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat 7380
aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat 7440
ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg 7500
caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc 7560
attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa 7620
agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc 7680
actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt 7740
ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag 7800
ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt 7860
gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag 7920
atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac 7980
cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc 8040
gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca 8100
gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg 8160
ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc taagaaacca ttattatcat 8220
gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac gaggcccttt cgtctcgcgc gtttcggtga 8280
tgacggtgaa aacctctgac acatgcagct cccggagacg gtcacagctt gtctgtaagc 8340
ggatgccggg agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg ggtgttggcg ggtgtcgggg 8400
ctggcttaac tatgcggcat cagagcagat tgtactgaga gtgcaccata tgcggtgtga 8460
aataccgcac agatgcgtaa ggagaaaata ccgcatcagg cgccattcgc cattcaggct 8520
gcgcaactgt tgggaagggc gatcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa 8580
agggggatgt gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg 8640
ttgtaaaacg acggccagtg ccaagctg 8668
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> ACE2正向引物（ACE2 forward primer）
<400> 26
cattggagca agtgttggat ctt 23
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<<213> ACE2反向引物（ACE2 reverse primer）
<400> 27
gagctaatgc atgccattct ca 22
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> TMPRSS2正向引物（TMPRSS2 forward primer）
<400> 28
cacggactgg atttatcgac aa 22
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<<213> TMPRSS2反向引物（TMPRSS2 reverse primer）
<400> 29
cgtcaaggac gaagaccatg t 21
<210> 30
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> GAPDH反向引物（GAPDH reverse primer）
<400> 30
gcacaagagg aagagagaga cc 22
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<<213> GAPDH反向引物（GAPDH reverse primer）
<400> 31
aggggagatt cagtgtggtg 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 弗林蛋白酶正向（Furin Forward）
<400> 32
ggaacatgac agctgcaact 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 弗林蛋白酶反向（Furin Reverse）
<400> 33
tcgtcacgat ctgcttctca 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 组织蛋白酶L正向（Cathepsin L Forward）
<400> 34
tagaggcaca gtggaccaag 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 组织蛋白酶L反向（Cathepsin L Reverse）
<400> 35
atggccattg tgaagctgtg 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 组织蛋白酶B正向（Cathepsin B Forward）
<400> 36
tctctgaccg gatctgcatc 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 组织蛋白酶B反向（Cathepsin B Reverse）
<400> 37
tcacagggag ggatggagta 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PC1正向（PC1 Forward）
<400> 38
gcgtgcctga gaagaaagag 20
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PC1反向（PC1 Reverse）
<400> 39
atcccgttct ctttcagcca 20
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 胰蛋白酶正向（Trypsin Forward）
<400> 40
aagtgtgaag cctcctaccc 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 胰蛋白酶反向（Trypsin Reverse）
<400> 41
ggtgtagact ccaggcttgt 20
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 基质蛋白酶正向（Matriptase Forward）
<400> 42
cccaacaacc agcatgtgaa 20
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 基质蛋白酶反向（Matriptase Reverse）
<400> 43
actggagtcg taggagaggt 20
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 基质蛋白酶正向（Matriptase Forward）
<400> 44
agaacgtcct gctcatcaca 20
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 基质蛋白酶反向（Matriptase Reverse）
<400> 45
tgtgcagtca atgttgggtg 20
<210> 46
<211> 6623
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> HEK293 AAT载体（HEK293 AAT Vector）
<400> 46
gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60
ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120
cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180
ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240
gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300
tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360
cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420
attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480
atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540
atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600
tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660
actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720
aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780
gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840
ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggctagc 900
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tctccgtcgt ttcgagctta cgcgaacagc cgtggcgctc atttgctcgt cgggcatcga 6660
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accattagct ccacaggtat cttcttccct ctagtggtca taacagcagc ttcagctacc 6780
tctcaattca aaaaacccct caagacccgt ttagaggccc caaggggtta tgctatcaat 6840
cgttgcgtta cacacacaaa aaaccaacac acatccatct tcgatggata gcgattttat 6900
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tataaatatt tctgcatata aattgtaact gatgtaagag gtttcatatt gctaatagca 7980
gctacaatcc agctaccatt ctgcttttat tttatggttg ggataaggct ggattattct 8040
gagtccaagc taggcccttt tgctaatcat gttcatacct cttatcttcc tcccacagct 8100
cctgggcaac gtgctggtct gtgtgctggc ccatcacttt ggc 8143
附图说明
图1：SARS-CoV-2感染周期和AAT在阻止病毒进入宿主细胞中的作用的示意图。
图2(a)：A549和HeLa细胞中的组织蛋白酶L、弗林蛋白酶、ACE2和TMPRSS2的内源性mRNA水平显示，HeLa细胞和A549细胞均不表达相应量的ACE2 mRNA和TMPRSS2。两种细胞系均表达弗林蛋白酶和组织蛋白酶L(来自SARS-CoV-1和SARS-CoV-2的刺突蛋白的启动蛋白酶)。
图2(b)：SARS-CoV-2刺突D614G假病毒变体显示出增加的传染性。用表达荧光素酶并用SARS-CoV-2-刺突野生型(D614)或D614G突变体(G614)假型化的慢病毒转导过表达ACE2和/或TMPRSS2或不过表达ACE2和/或TMPRSS2的HeLa细胞。结果显示，10微摩尔(10μM)浓度的血浆来源的AAT对过表达TMPRSS2的HeLa细胞中SARS-CoV-2假病毒细胞进入没有抑制作用，而在仅表达ACE2的HeLa细胞中显示出高达25％的抑制作用。
图3：a)不同细胞系中ACE2基因的表达。b)不同细胞系(组织)中TMPRSS2基因的表达。
图4：响应于IFN-γ处理的A549中的ACE2的表达。
图5：响应于IFN-γ处理的HeLa中的ACE2的表达。
图6：SARS-CoV-2假病毒进入试验。a)至b)A549细胞-WT假病毒。a)带有WT D614假病毒的A549-ACE2细胞。b)带有WT D614假病毒的A549-ACE2-TMPRSS2细胞。c至d)A549细胞-刺突G416突变假病毒。c)带有突变体G416假病毒的A549 ACE2细胞。d)带有突变体G614假病毒的A549-ACE2-TMPRSS2细胞。
Respikam＝Glassia，FDA批准的血浆来源的AAT(临床级)，Sigma＝购自Sigma的血浆来源的AAT(非GMP级)。
图7：在100微摩尔和200微摩尔的浓度的AAT下，ACE2增强的A549细胞中的50％至75％的SARS-CoV-2假病毒进入被阻断。(Respikam 100uM在PBS 5x中；Sigma 100uM在PBS5x中；Sigma200uM在PBS 2.5x中；Portland 100uM在PBS 5x中；Genfaxon在PBS5x中；10uM和100uM的卡莫司他在0.2％ DMSO中；10uM和100uM的溴己新在0.2％ DMSO中；10uM和100uM的苯磺酰基在0.2％ DMSO中)。
图8：在100微摩尔和200微摩尔的浓度的AAT下，ACE2+TMPRSS2增强的A549细胞中多达45％的SARS-CoV-2假病毒进入被阻断。(Respikam 100uM在PBS 5x中；Sigma 100uM在PBS 5x中；Sigma 200uM在PBS 2.5x中；Portland 100uM在PBS 5x中；Genfaxon在PBS 5x中；10uM和100uM的卡莫司他在0.2％ DMSO中；10uM和100uM的溴己新在0.2％ DMSO中；10uM和100uM的苯磺酰基在0.2％DMSO中)。
图9ACE-2是负责介导SARS-CoV-2感染的宿主细胞受体，该新型冠状病毒导致冠状病毒疾病2019(COVID-19)。用药物化合物(AAT)的处理破坏了病毒和受体之间的相互作用。(改编自https://www.rndsystems.com/resources/articles/ace-2-sars-receptor-identified)。
图10：SARS-CoV-2假病毒进入试验方案。
图11a)b)血浆来源的AAT和重组AAT对SARS-CoV-2假病毒进入过表达ACE2的A549人肺泡基底上皮细胞的影响。在200uM重组AAT 1时观察到最显著的抑制作用(93.4％)，所述重组AAT 1是使用载体pXC17.4(Lonza Biologics Plc)在CHO细胞中产生的。c)其它丝氨酸蛋白酶抑制剂对SARS-CoV-2假病毒进入过表达ACE2的A549人肺泡基底上皮细胞的影响。d)10ng/mL的IFN-β-1a与25uM的血浆来源的AAT和在CHO细胞中产生的重组AAT(重组AAT 1、重组AAT 2)的组合在SARS-CoV-2假病毒进入试验中显示出相加的抑制作用。
图12a)b)血浆来源的AAT和重组AAT对SARS-CoV-2假病毒进入过表达ACE2的HeLa人宫颈癌细胞的影响。c)其它丝氨酸蛋白酶抑制剂对SARS-CoV-2假病毒进入过表达ACE2的HeLa人宫颈癌细胞的影响。
图13 SARS-CoV-2刺突融合试验的示意图。
图14在过表达ACE2和小片段荧光素酶或SARS-CoV-2刺突和大片段荧光素酶的HeLa人宫颈癌细胞中的SARS-CoV-2刺突融合试验。在CHO细胞中产生的重组AAT(rhAAT)(重组AAT 1和重组AAT2)显示出比血浆来源的AAT更好的对SARS-CoV-2刺突介导的细胞融合的抑制作用。
图15a)人肺细胞系中刺突蛋白启动蛋白酶基因表达的qPCR分析b)人肺细胞系(Calu 3和A549)中ACE2基因表达的qPCR分析显示在A549细胞系中没有ACE2的内源性表达c)人肺细胞系(A549)与结肠细胞系(Caco2)中的TMPRSS2基因表达的qPCR分析显示在A549细胞系中没有TMPRSS2的内源性表达d)e)多种人细胞系(组织)中的刺突蛋白启动蛋白酶基因表达的相对定量qPCR分析。显然，来源于肺的细胞显示出最高的胰蛋白酶和组织蛋白酶B的拷贝数(分别在Calu3细胞和A549细胞中)。值得注意的是，来源于神经组织的细胞(SH-SY5Y)也表现出相对高的胰蛋白酶和组织蛋白酶B的拷贝数。
图16a)AAT和rhAAT抑制组织蛋白酶B蛋白酶活性b)AAT和rhAAT抑制组织蛋白酶L蛋白酶活性，其中最显著的抑制作用是在用载体pcDNA3.1(+)在HEK293细胞中产生的重组AAT(重组AAT 4)中观察到的c)AAT和rhAAT抑制胰蛋白酶蛋白酶活性，其中最显著的抑制作用是在用载体pcDNA3.1(+)在HEK293细胞中产生的重组AAT(重组AAT 4)中观察到的d)AAT和rhAAT抑制弗林蛋白酶蛋白酶活性，其中最显著的抑制作用是在用载体pcDNA3.1(+)在HEK293细胞中产生的重组AAT(重组AAT 4)中观察到的e)AAT和rhAAT抑制PC1蛋白酶活性f)AAT和rhAAT抑制蛋白裂解酶蛋白酶活性g)AAT和rhAAT抑制TMPRSS2蛋白酶活性h)AAT和rhAAT抑制弹性蛋白酶蛋白酶活性，其中最显著的抑制作用是在用载体pXC17.4在CHO细胞中产生的重组AAT(重组AAT 1)中观察到的i)AAT和rhAAT抑制中性粒细胞弹性蛋白酶蛋白酶活性，其中最显著的抑制作用是在用载体pcDNA3.1(+)在HEK293细胞中产生的重组AAT(重组AAT 4)中观察到的。
图17使用Octet方法测量的a)血浆来源的AAT和b)重组AAT的结合的标准曲线。在血浆来源的AAT和用载体PL136和137在CHO细胞中产生的重组AAT之间观察到不同的结合亲和力。
图18a)实验时间线示意图b)IFNγ介导的小胶质细胞活化(炎症)。
图19a)实验时间线示意图b)AAT降低了IFNγ介导的小胶质细胞活化(炎症)。观察到了血浆来源的AAT、重组AAT(rhAA)和用表达AAT的基因转导的细胞(基因疗法)的作用。
图20a)实验时间线示意图b)IFNβ提高了AAT的抗炎作用。
图21a)b)血浆来源的AAT和重组AAT对MERS-CoV假病毒进入Caco2人结肠直肠腺癌细胞的影响c)其它丝氨酸蛋白酶抑制剂对MERS-CoV假病毒进入Caco3人结肠直肠腺癌细胞的影响。
图22a)b)血浆来源的AAT和重组AAT对SARS-CoV假病毒进入过表达ACE2的A549人肺泡基底上皮细胞的影响c)其它蛋白酶抑制剂对SARS-CoV假病毒进入过表达ACE2的A549人肺泡基底上皮细胞的影响。
图23a)AAT对ADAM17活化和蛋白质脱落的影响b)AAT对通过刺突蛋白/IgG免疫复合物激活单核细胞/巨噬细胞的影响。
图24不同来源AAT的分子量差异。
图25a)pXC-17.4(Lonza Biologics)的载体图谱b)pJ201_AAT_native_SP(Merck)的载体图谱c)pJ201_AAT_SP5(Merck)的载体图谱d)PL136(Merck)的载体图谱e)PL137(Merck)的载体图谱f)空pCGS3的载体图谱g)pcDNA3.1(+)(GenScript)的载体图谱。
图26为检测AAT亲和力开发的Octet方法。
所有附图：“Respikam”是指血浆来源的AAT(临床级)；“Sigma”是指血浆来源的AAT；“重组AAT 1”是指通过pXC-17.4(GS System，Lonza)在CHO中产生的AAT，“重组AAT 2”是指通过PL136/PL137(Merck)在CHO中产生的AAT，“重组AAT 3”是指在HEK293T中产生的AAT；“重组AAT 4”是指通过pcDNA3.1(+)(GenScript)在HEK293中产生的AAT。
实施例
材料和方法
通过α1-抗胰蛋白酶(AAT)对SARS-CoV-2感染进行治疗
AAT对SARS-CoV-2感染的影响表现在两个层面上：
1.第一，SARS-CoV-2依赖蛋白酶进入细胞
2.第二，严重SARS-CoV-2疾病中的过度炎症
重要的是，这代表了COVID-19(即由SARS-CoV-2引起的疾病)的三个阶段：
1.第一阶段COVID-19(由SARS-CoV-2引起的疾病，类似流行感冒的症状，通常在一周内消失)不需要治疗。
2.第二阶段疾病，以病毒性肺炎为典型特征，需要住院且抗病毒治疗(即抑制SARS-CoV-2进入细胞)是该阶段的主要目的，以防止进一步发展。
3.第三阶段COVID疾病的特征在于急性呼吸窘迫综合征(ARDS)和严重全身炎症；这个阶段需要抗炎和抗病毒治疗。
根据我们的分析，AAT可用于治疗II期和III期COVID-19，而AAT的预防性施用是为了防止I期发展为II期和III期。
实施例1 -SARS-CoV-2进入细胞
SARS-CoV-2的进入是由病毒刺突蛋白与宿主细胞血管紧张素转换酶2(ACE2)受体的结合来介导的。为了在体外重现这一生物事件，生成了编码报告基因(GFP或荧光素酶)并在其表面表达刺突蛋白的慢病毒载体。慢病毒载体进入细胞是由SARS-CoV-2机制介导的，其效率通过报告基因(GFP或荧光素酶)在靶细胞中的表达来测定(Ou,X.,Liu,Y.,Lei,X.etal.Characterization of spike glycoprotein of SARS-CoV-2on virus entry and itsimmune cross-reactivity with SARS-CoV.Nat Commun 11,1620,2020)。加入AAT，并通过读取GFP和/或荧光素酶信号来量化对病毒进入的抑制。
跨膜丝氨酸蛋白酶TMPRSS2对SARS-CoV-2感染(Toshio Hirano,MasaakiMurakami COVID-19:A New Virus,but a Familiar Receptor and Cytokine ReleaseSyndrome Immunity,22April 2020)和丙型肝炎感染(Esumi M,Ishibashi M,YamaguchiH,Nakajima S,Tai Y,Kikuta S,Sugitani M,Takayama T,Tahara M,Takeda M,WakitaT-Trans-membrane serine protease TMPRSS2 activates hepatitis C virus infection.Hepatology.2015Feb；61(2):437-46)至关重要。丙型肝炎感染可以被AAT阻断(可能是通过TMPRSS2抑制——Esumi et al.,2020)，SARS-CoV-2(以及一些高致病性形式的流感病毒)具有允许被蛋白酶弗林蛋白酶切割的序列。这种切割位点在SARS和MERS冠状病毒中不存在，表明它对SARS-CoV-2的致病性十分重要(B.Coutard,C.Valle,X.de Lamballerie,B.Canard,N.G.Seidah,E.Decroly,The spike glycoprotein of the new coronavirus2019-nCoV contains a furin-like cleavage site absent in CoV of the sameclade,Antiviral Research,Volume176,2020)。α1-抗胰蛋白酶Portland对弗林蛋白酶具有很强的和选择性的活性(Jean F,Stella K,Thomas L,et al.alpha1-AntitrypsinPortland,a bioengineered serpin highly selective for furin:application as anantipathogenic agent.Proc Natl Acad Sci U S A.1998；95(13):7293–7298.doi:10.1073/pnas.95.13.7293)。因此，设想野生型AAT(血浆来源的)以及重组体(在哺乳动物细胞，例如CHO和/或HEK细胞中产生的)将显示弗林蛋白酶活性。
实验
1.1.AAT对细胞的重组刺突蛋白切割的影响
将重组刺突蛋白加入相关细胞类型(任何表达ACE2的细胞和本领域已知的细胞)中，通过蛋白质印迹评估蛋白水解切割。可以使用任何表达ACE2的细胞系。多种靶细胞系表达不同量的ACE2受体，包括但不限于：Calu-3、SH-SY5Y、HEK、HT1080、A549、MRC5、Huh7、Vero81、VeroE6、Hela、RS和LLCMK2。
1.2.AAT对假病毒进入的影响
使用SARS-CoV-2刺突蛋白作为病毒附着/融合蛋白的假病毒(即假型病毒载体)正确地描述了SARS-CoV-2进入细胞的机制。这种进入依赖于被蛋白酶抑制剂AAT抑制的两个蛋白水解步骤。因此，对假病毒进入多种不同的细胞系(优选为表达ACE2的细胞系)进行了研究。
1.3.AAT对活性SARS-CoV-2细胞感染的影响(活病毒试验)：
根据OFSP的建议，在生物安全级别3下，对活SARS-CoV-2病毒进行了AAT的测试。将病毒体外接种到经AAT或其任何片段、变体和同种型处理的细胞上，测量多个参数(包括降低的细胞毒性和病毒滴度)以评估效率。更具体地，通过病毒蛋白的免疫荧光以及细胞死亡的量化来评估SARS-CoV-2的细胞感染。因为SARS-CoV-2感染了神经组织(Helms J,KremerS,Merdji H,et al.Neurologic Features in Severe SARS-CoV-2Infection[在线发表后出版,2020Apr 15].N Engl J Med.2020；Pleasure SJ,Green AJ,Josephson SA.TheSpectrum of Neurologic Disease in the Severe Acute Respiratory SyndromeCoronavirus 2Pandemic Infection:Neurologists Move to the Frontlines.JAMANeurol.Published online April 10,2020)，神经组织(如MinibrainTM)和神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)的感染将与AAT进行联合处理，并有望改变病毒的细胞毒性或病毒嗜性。
实施例2-严重SARS-CoV-2疾病中的过度炎症，也被称为“细胞因子风暴”，Fu Y,Cheng Y,Wu Y.Understanding SARS-CoV-2-Mediated Inflammatory Responses:FromMechanisms to Potential Therapeutic Tools[在线发表后出版,2020Mar 3].VirolSin.2020；1–6.doi:10.1007/s12250-020-00207-4)：
Figure BDA0004022404670000601
实验
2.1.ADAM17(TACE)的SARS-CoV-2活化：SARS-CoV-2病理学的ADAM17活化部分(参见，例如，Vanesa Palau,Marta Riera,María JoséSoler,ADAM17 inhibition may exerta protective effect on COVID-19,Nephrology Dialysis Transplantation,gfaa093,https://doi.org/10.1093/ndt/gfaa093；
https://clinicalaffairs.umn.edu/umn-research/regulation-sars-cov-2-receptor-ace2-adam17；Haga S,Yamamoto N,Nakai-Murakami C,et al.Modulation ofTNF-alpha-converting enzyme by the spike protein of SARS-CoV and ACE2 inducesTNF-alpha production and facilitates viral entry.Proc Natl Acad Sci U SA.2008；105(22):7809–7814.doi:10.1073/pnas.0711241105)。AAT抑制ADAM17(参见，例如Bergin DA,Reeves EP,Meleady P,et al.α-1Antitrypsin regulates human neutrophilchemotaxis induced by soluble immune complexes and IL-8.J Clin Invest.2010；120(12):4236–4250.doi:10.1172/JCI41196；Serban KA,Petrusca DN,Mikosz A,etal.Alpha-1antitrypsin supplementation improves alveolar macrophagesefferocytosis and phagocytosis following cigarette smoke exposure.PLoSOne.2017；12(4):e0176073.Published 2017Apr 27.doi:10.1371/journal.pone.0176073)。
在细胞暴露于以下物质后，研究AAT对ADAM17活化和蛋白质脱落(特别是ACE2)的影响(图23a)：
i)刺突蛋白
ii)假病毒
iii)SARS-CoV-2(活病毒)。
要使用的最相关的细胞是任何表达ACE2的细胞(如上所列)。
2.2.通过SARS-CoV-2/IgG免疫复合物激活Fc受体(抗体依赖性增强，参见例如F.Negro,Swiss Med Wkly.2020；150:w20249“Is antibody-dependent enhancementplaying a role in COVID-19pathogenesis？”)。通过胰蛋白酶样蛋白酶的蛋白水解增强了单核细胞FcyRJI介导的功能，例如诱导TNF释放(J M Debets,J G Van de Winkel,J LCeuppens,I E Dieteren,W A Buurman in The Journal of Immunology February 15,1990,144(4)1304-1310)。
研究了AAT对通过刺突蛋白/IgG免疫复合物激活单核细胞/巨噬细胞的影响(图23b)。
实施例3-支持AAT降低病毒增殖的功效的附加实验
3.病毒聚合酶试验
SARS-CoV-2病毒聚合酶是病毒遗传物质复制的关键要素。转染表达多亚基病毒聚合酶(包含至少3个核心亚基NSP7、NSP8和NSP12)的细胞系，使其也过表达只能被病毒聚合酶活性激活的荧光素酶报告基因。
荧光素酶报告信号与病毒聚合酶活性成正比。测试AAT以评估病毒聚合酶抑制活性。
一旦进入宿主细胞，SARS-CoV-2将利用宿主细胞机制来增强自身的复制。这将在宿主细胞中引起毒性反应，这主要是由NSP1病毒蛋白介导的。
为了模拟这一生物学事件，生成了表达由四环素诱导型启动子控制的病毒NSP1蛋白的细胞系。在用四环素处理细胞后，有毒的NSP1蛋白将被表达。据推测，加入AAT可抑制这种由病毒蛋白介导的毒性作用。
实验4
概述
最近由新出现的SARS-CoV-2冠状病毒引起的大流行震惊了世界。与以前的冠状病毒爆发(如SARS和MERS)不同，这种新病毒的特点不是特别高的病死率，而是前所未有的流行病学成功。事实上，尽管全球许多国家采取了严格的措施，但到目前为止，该病毒在很大程度上抵抗住了所有的根除尝试。
SARS-CoV-2是一种RNA病毒，但冠状病毒在几个方面不同于其他RNA病毒。它们有庞大的基因组和复杂的生命周期，但人们对此仍知之甚少。此外，与其他类型的RNA病毒相比，冠状病毒具有校对机制，这提供了相对稳定的基因组。事实上，考虑到大流行的规模，迄今为止报道的导致氨基酸变化的突变相对较少。
冠状病毒S蛋白，也被称为刺突蛋白，是病毒包膜的主要蛋白。它介导病毒与宿主细胞表面受体的附着以及随后病毒和宿主细胞膜之间的融合，以促进病毒进入宿主细胞。它是一种三聚体I类融合蛋白，以亚稳态融合前构象存在，所述亚稳态融合前构象分为两个主要亚基，即S1和S2。为了附着到宿主细胞表面受体上，S1结构域中包含的受体结合结构域(RBD)发生铰链样构象变化，定义了两种不同的状态[1]。这种构象变化是蛋白水解加工和/或S2结构域与宿主细胞膜融合所必需的。现在认为包括蛋白酶的PC家族、胰蛋白酶样蛋白酶和组织蛋白酶的多种蛋白酶都能够切割刺突蛋白[2]。
刺突蛋白D614G突变已经受到关注，因为它可能改变病毒的附着、融合性和/或免疫原性。D614G突变被认为增加了传染性(ref)、传播性[3]和/或病死率[4]。最近的研究直接证明G614变体确实增强了病毒进入细胞[5，6]。
SARS-CoV-2采用多亚基复制/转录机制[7]。作为ORF1a和ORF1b病毒多蛋白的切割产物产生的一组非结构蛋白(nsp)组装以促进病毒复制和转录，使这种机制成为针对COVID-19病毒感染的治疗干预的潜在靶标[8]。RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp，也被称为nsp12)是病毒RNA合成的关键参与者。最近解析的SARS-CoV-2nsp12及其nsp7和nsp8辅因子复合物的晶体结构强调了这些非结构蛋白在COVID-19病毒复制和转录周期中的核心作用[8，9]。RdRp的P314L突变受到的关注较少，但是有人认为这种突变可能会改变病毒的校对，从而导致下游突变率增加[10]。
在这项研究中，我们研究了伴随有S蛋白和RdR-聚合酶的突变的SARS-CoV-2变体的出现。这两种突变都位于各自蛋白质的战略相关位点，因此是改变病毒生物学的候选位点。G624/L323变体，而不是单独的G624突变体或L323突变体，在流行病学上非常成功，并且在最近几个月已经上取代了原先的D624/P323变体。
方法：
细胞系和培养
本研究中使用的人细胞系是HEK 293T/17(人肾，ATC C#CRL-11268)、A549、HeLa和HMC3-MHCIILuc细胞。在主要组织相容性复合物II启动子(MHCII)下编码荧光素酶报告基因的HMC3-MHCIILuc细胞系已被描述为研究人小胶质细胞活化的有价值的工具，该细胞系获自日内瓦大学的Karl-Heinz Krause教授。用慢病毒载体转导HMC3-MHCIILuc细胞以获得产生AAT的HMC3-MHCIILuc；UbiAAT细胞系(参见慢病毒的产生)。将细胞维持在补充有10％(v/v)胎牛血清(FBS)、100μg/ml的青霉素和链霉素、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和1％非必需氨基酸的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中。HMC3细胞系中未添加非必需氨基酸。将培养物保持在37℃，5％ CO2的环境中。
刺突融合试验。
在培养基中进行合适的处理浓度的预稀释。在该混合物的顶部加入稳定过表达人ACE2受体和小片段的分裂荧光素酶(split-luciferase)片段的HeLa细胞系，以及稳定过表达SARS-CoV-2刺突蛋白和大片段的分裂荧光素酶片段的HeLa细胞系，并在27℃孵育24小时。ACE2和SARS-CoV-2刺突之间的相互作用介导了两种细胞系的融合，因此大片段的和小片段的分裂荧光素酶片段之间的相互作用产生功能性荧光素酶。根据制造商说明，用Nanoglo试剂盒(Promega)测量光发射。
表达ACE2和TMPRSS2的细胞系的生成。
将Hela细胞和A549细胞以每孔2E05个细胞的密度平铺接种在12孔板中。第二天，用ACE2/嘌呤霉素慢病毒和/或TMPRSS2/杀稻瘟菌素慢病毒共转导细胞。转导后4天，用5μg/ml的杀稻瘟菌素和嘌呤霉素选择细胞。将细胞保持为多克隆群体。
质粒
ACE2和TMPRSS2的cDNA ORF购自GenSript，并使用标准克隆方法分别克隆到pCDH-CMV-MCS-EF1α-Puro(SEQ ID NO:13)慢病毒载体和pCDH-CMV-MCS-EF1α-Blast(SEQ ID NO:14)慢病毒载体中。编码SARS-CoV-2-刺突蛋白的pCG1_SCoV2-S质粒(SEQ ID NO:15)由Stefan
Figure BDA0004022404670000641
教授(哥廷根大学，哥廷根，德国)提供。，使用以下引物，用定点诱变克隆G614刺突：5’-GCGTGAACTGTACCGAAGTG-3’(SEQ ID NO:16)和5’-CCTGGTACAGCACTGCC-3’(SEQ ID NO:17)。使用引物5’-AGCGAATTCGGATCCGCC-3’(SEQ ID NO:18)和5’-ACAGTCGACTCTAGATTAGCAGCAGCTGCCACAG-3’(SEQ ID NO:19)通过PCR扩增产生C-末端19个氨基酸截短形式的SARS-CoV-2-刺突，然后克隆到pCG1质粒中。
HEK293T细胞中产生的AAT纯化
对来自过表达人AAT-His标签的HEK293T细胞的上清液进行取样，并与NiSepharose excel组氨酸标签的蛋白纯化树脂(Cytiva)一起在4℃振荡孵育过夜。上清液与树脂的体积比为200:1。然后弃去上清液，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤珠子一次。用补充有10％(v/v)洗脱缓冲液的PBS(补充有500mM咪唑的PBS，pH 7.5)洗涤珠子一次，并用补充有20％洗脱缓冲液的PBS洗涤一次。最终纯化的AAT-His标签是在100％洗脱缓冲液中洗脱的。通过透析去除咪唑，以得到在PBS缓冲液中的AAT-His。
慢病毒的产生
对于重组慢病毒的产生，使用磷酸钙法将质粒转染入HEK293T细胞。简而言之，将4.5×106个细胞平铺接种在10厘米的培养皿中，并在16小时后用15μg的ACE2、TMPRSS2、AAT或空表达的慢病毒载体的任一种，10μg的包装质粒(psPAX2，来自Didier Trono的赠予[Addgene质粒12260])和5μg的包膜(pMD2G，来自Didier Trono的赠予[Addgene质粒12259])进行转染。转染8小时后更换培养基。48小时后，收集病毒上清液，使用45μm PVDF过滤器过滤，并储存在-80℃。
冠状病毒刺突假型慢病毒的产生
使用如上所述的磷酸钙方法，通过用psPAX2、pCDH-CMV-Gluc-EF1α-GFP以及编码以下任一个的质粒共转染293T细胞来产生刺突假型慢病毒：SARS-CoV-2刺突D614全长(FL)(SEQ ID NO:15)、刺突G614全长(FL)(SEQ ID NO:20)、刺突D614 DeltaCter(SEQ ID NO:21)、刺突G614 DeltaCter(SEQ ID NO:22)、SARS-CoV刺突(Sino Biological EuropeGmbH，目录号:VG40150-G-N)、MERS-CoV刺突(Sino Biological Europe GmbH，目录号:VG40069-G-N)或空载体(SEQ ID NO:23)。
冠状病毒刺突假型慢病毒传染性试验
将稳定过表达人ACE2受体的HeLa、稳定过表达人ACE2受体的A549细胞或Caco2细胞接种到96孔板中。铺板3小时后，根据实验设置，进行化合物处理或不进行处理。24小时后，用冠状病毒假病毒转导细胞6小时。然后更换培养基并将细胞保持在37℃。孵育三天后，通过将10uL细胞上清液加入到补充有4μM腔肠素的50uL的磷酸盐缓冲盐水[PBS]中并立即在光度计(Glomax，Promega)中测量发光。同时，将细胞用胰蛋白酶消化并重悬于补充有10％ FBS的PBS中，并使用Attune NxT流式细胞仪(thermofisher Scientific)通过流式细胞术进行分析。使用FlowJo 11(FlowJo,LLC,Ashland,OR)对数据进行分析。
无细胞试验(刺突蛋白启动蛋白酶抑制)
在100ul的胰蛋白酶(Sigma-Aldrich)，75ul的组织蛋白酶B(R&D Systems)和50ul的PC1(R&D Systems)、蛋白裂解酶(R&D Systems)、弗林蛋白酶(NEB)、组织蛋白酶L(R&DSystems)和TMPRSS2(creative biomart)中进行反应。缓冲液包括以下：PBS，pH7.4，用于胰蛋白酶(稀释至6.4nM)；25mM MES，pH 5，用于组织蛋白酶B(稀释至1.76ng/ul)；25mM MES，5mM CaCl2，1％ Brij-35，pH 6，用于PC1(稀释至1.76ng/ul)；50mM Tris，50mM NaCl，0.01％吐温20，pH 9，用于蛋白裂解酶(稀释至1.76ng/ul)；的100mM HEPES，1mM CaCl2，0.5％ Triton X100，1mM 2-巯基乙醇，pH 7.5，用于弗林蛋白酶(稀释至10U/ml)；0.005％Brij-35，1mM EDTA，5mM DTT，50mM MES，pH 6，用于组织蛋白酶L(稀释至1.76ng/ul)；50mMTrisHCl，150mM NaCl，0.01％吐温20，pH 8，用于TMPRSS2(稀释至0.5uM)。除非特别说明，所有试剂均由Sigma Aldrich提供。对于胰蛋白酶、组织蛋白酶B、PC1、蛋白裂解酶、弗林蛋白酶、组织蛋白酶L试验，使用包含具有修饰MCA/Lys(DNP)FRET对(Biomatik)的序列TNSPRRARSVA的SARS-CoV-2肽。对于TMPRSS2试验，使用包含序列Boc-QAR-AMC(R&DSystems)的肽。对于来自猪胰腺的弹性蛋白酶ELA1，检测试剂盒(E-12056)购自molecularprobes(Sigma-Aldrich)，并且对于中性粒细胞弹性蛋白酶ELA2，检测试剂盒(BML-AK497)购自Enzo，根据制造商说明书进行测试。在酶标仪中每分钟测量一次荧光或吸光度，持续45分钟。对于每种条件，以每分钟荧光单位来确定Vmax，以未处理条件的百分比来表示酶活性。
基因表达分析
根据制造商的说明，使用RNeasy Micro试剂盒(Qiagen)分离总RNA。使用来自Takara的Primescript试剂盒，以10μl的总体积，对来自每个样本的500ng的总RNA在37℃反转录15分钟。通过2δCt方法，使用SYBR Green PCR试剂盒(Applied Biosystems)通过定量RT-qPCR评估相对mRNA水平。GAPDH用作内部对照。
基因拷贝数估计
对于拷贝数，使用限制性酶消化对每个具体质粒进行线性化。根据制造商说明，使用PCR clean up试剂盒(GeneJET)清洗消化产物。然后测量光密度并确定拷贝数。将来自消化质粒的1/10连续稀释液用于qPCR。
用于弗林蛋白酶、组织蛋白酶L、蛋白裂解酶(stl4)、胰蛋白酶(PRSS1)、PC1(PCSK1)的质粒由GenScript提供，并且用于组织蛋白酶B的质粒由Sino Biological提供。
引物
Figure BDA0004022404670000671
结果：S蛋白D614G突变对用假型慢病毒载体的细胞转导的影响
我们的目的是建立持续表达病毒受体ACE2的细胞系，以及能切割刺突蛋白的相关蛋白酶。如图3A和图3B所示，Hela细胞和A549细胞均不表达相应量的ACE2 mRNA。类似地，TMPRSS2的mRNA水平几乎检测不到。两种细胞类型都显示出低到中等的弗林蛋白酶基因表达，但是相对高的组织蛋白酶L(一种能够切割来自SARS-CoV-1和SARS-CoV-2的刺突蛋白的蛋白酶)基因表达水平。为了建立允许刺突蛋白假型慢病毒载体的细胞系，我们因此分别用ACE2(SEQ ID NO:24)和TMPRSS2(SEQ ID NO:25)转导了Hela细胞和A549细胞或者用ACE2(SEQ ID NO:24)和TMPRSS2(SEQ ID NO:25)联合转导了Hela细胞和A549细胞。
正如所预期的，将野生型(模拟转导的)Hela细胞或A549细胞暴露于上述慢病毒载体并不会导致GFP或荧光素酶表达(图3c-f)。类似地，TMPRSS2的过度表达本身并没有导致显著的转导率。使用D614假型慢病毒载体，表达ACE2和ACE2/TMPRSS2的Hela细胞有少量但清晰可检测的转导，但A549细胞只有非常少量的转导。当使用G614假型载体时，这种情况明显改变。两种表达ACE2的细胞系都有更强的转导。然而，应当注意，表达ACE2的HeLa细胞的转导比表达ACE2的A549细胞的转导要强得多。相反，除ACE2以外TMRPSS2的过表达导致了转导的强烈的另外增强，而Hela细胞则不是这种情况。因此，最有可能的是Hela细胞已经强烈表达一种刺突切割蛋白酶，而TMRPSS2的过表达并不是有效转导所必需的。相反，在A549细胞中，蛋白水解切割似乎是一个限速步骤，因此过表达TMRPSS2增强了转导。讨论(HeLa细胞系与A549细胞系对病毒感染的易感性)
与另一种细胞系(A549，肺，男性，高加索来源)相比，一种细胞系(HeLa，宫颈，女性，非裔美国人来源)对SARS-CoV-2假病毒感染的易感性增加是一个特别有趣的观察结果，因为它强调了这样一个概念，即患者群体的特征是确定治疗策略的关键，所述治疗策略旨在对经诊断患有COVID-19的患者或出于预防的目的实现最大影响。尽管种族本身可能是考虑的次要因素，但例如低内源性AAT或较高水平的慢性炎症(较高的IFN-γ和/或组织蛋白酶L)的遗传倾向需要更高剂量和/或更规律的活性治疗物质(AAT)的施用。
实验4
目的是检测不同细胞系中ACE2和TMPRSS2基因表达的内源性水平。
方法：使用RNeasy Micro试剂盒(Qiagen)从Calu3、CaCo2、VeroE6、HepG2、A549、SH-SY5Y、HEK293-117T、HeLa细胞系中提取总RNA。使用PrimeScriptTMRT试剂试剂盒(Takara)从总RNA合成互补DNA。使用PowerUp SYBRTMGreen Master Mix(AppliedBiosystems)进行cDNA的实时PCR测量，并相对于GAPDH的表达(作为对照管家基因)归一化。引物如下所列：
ACE2正向:cattggagcaagtgttggatctt(SEQ ID NO:26)
ACE2反向:gagctaatgcatgccattctca(SEQ ID NO:27)
TMPRSS2正向:cacggactggatttatcgacaa(SEQ ID NO:28)
TMPRSS2反向:cgtcaaggacgaagaccatgt(SEQ ID NO:29)
GAPDH正向:gcacaagaggaagagagagacc(SEQ ID NO:30)
GAPDH反向:aggggagattcagtgtggtg(SEQ ID NO:31)
结果如图3所示。
实验5
目的是确定干扰素γ处理是否诱导了A549细胞系中的ACE2的表达。
方案：将A549细胞接种在12孔板中，并在细胞分裂后24小时加入干扰素γ。处理持续48小时，我们如前所述进行RNA提取、逆转录酶反应和qPCR(参见实验4的方法部分)。
结果如图4所示。
实验6
目的是确定干扰素γ处理是否诱导了表达SARS-CoV-2融合蛋白的HeLa细胞中的ACE2的表达。
方案：将HeLa刺突细胞接种在12孔板中，并在细胞分裂后24小时加入干扰素γ。处理持续48小时，我们如前所述进行RNA提取、逆转录酶反应和qPCR(参见实验4的方法部分)。
结果如图5所示。
实验7：SARS-CoV-2病毒进入试验
结果如图7和图8所示。用表达带有D614G突变的表面蛋白SARS-CoV-2刺突和编码荧光素酶报告基因的假慢病毒载体完成(图7和图8)。
将假慢病毒载体添加到组成性过表达ACE2受体(图7)或ACE2和TMPRSS2两者(图8)的A549细胞上。在添加假慢病毒载体前24小时(子图A&B)或1小时(子图C&D)进行化合物处理。图9和10提供了关于假病毒检测方案的其他示意性信息。
实施例4
用多种来源的AAT(图11a、图11b、图21a、图21b、图22a、图22b)或抑制剂化合物(图11c、图21c、图22c)处理过表达ACE2的A549人肺泡基底上皮细胞(图11和图22)或Caco2人结直肠腺癌(图21)24小时以进行病毒进入抑制测试。然后加入编码荧光素酶报告基因并表达带有D614G突变的SARS-CoV-2刺突蛋白(图11)、SARS-CoV刺突蛋白(图22)或MERS-CoV刺突蛋白(图21)的慢病毒载体6小时。最后，更换培养基，并在测量前将细胞再培养3天。通过慢病毒介导的荧光素酶信号(图11、图21、图22深灰色)测量病毒的进入，并用显示为浅灰色的WST8-细胞活力进行归一化。对于所有条件，DMSO/PBS的浓度均已被归一化(缓冲液)。所有条件重复三次，误差线代表标准偏差。技术信息请参考材料和方法部分。
实施例5
用多种来源的AAT(图12a、图12b)或抑制剂化合物(图12c)处理过表达ACE2的HeLa人宫颈癌细胞24小时以进行病毒进入抑制试验。然后加入编码荧光素酶报告基因并表达带有D614G突变的SARS-CoV-2刺突蛋白的慢病毒载体6小时。最后，更换培养基，并在测量前将细胞再培养3天。通过慢病毒介导的荧光素酶信号(深灰色)测量病毒的进入，并用显示为浅灰色的WST8-细胞活力进行归一化。对于所有条件，DMSO/PBS的浓度均已被归一化(缓冲液)。所有条件重复三次，误差线代表标准偏差。技术信息请参考材料和方法部分。
实施例6
SARS-CoV-2刺突融合试验。测试原理如图13所示。将过表达ACE2和小片段荧光素酶的HeLa人宫颈癌细胞或过表达SARS-CoV-2刺突和大片段荧光素酶的HeLa人宫颈癌细胞以相等的量并以合适的处理浓度混合。24小时后，通过荧光素酶报告信号的量来测量细胞融合。根据缓冲液对照观察荧光素酶信号。血清以1/16的终浓度进行稀释。对于所有条件，血清/PBS的浓度均已被归一化(缓冲液)。所有条件重复三次，误差线代表标准偏差(图14)。技术信息请参考材料和方法部分。
实施例7
进行定量PCR分析以确定A549细胞中蛋白酶的基因拷贝数。使用每个基因的线性质粒作为对照来计算拷贝数(图15a)。技术信息请参考材料和方法部分。
实施例8
进行定量PCR分析以确定A549细胞中蛋白酶ACE2(图15b)和TMPRSS2(图15c)的相对基因表达。Calu3细胞系和Caco2细胞系分别用作ACE2和TMPRSS2表达的参照。Gapdh基因用于归一化。误差线表示标准偏差。技术信息请参考材料和方法部分。
实施例9
将50uM的SARS-CoV-2肽、1.76ng/ul的组织蛋白酶B重组蛋白和1uM的AAT一起孵育45分钟。在紫外分光光度计中每分钟测量一次荧光(在330nm激发，在390nm发射检测)(图16a)。Vmax值由趋势线的斜率决定。实验重复两次。误差线表示标准偏差。技术信息请参考材料和方法部分。
实施例10
将50μM的SARS-CoV-2肽、1.76ng/ul的组织蛋白酶L重组蛋白和l0 uM的AAT一起孵育45分钟。在紫外分光光度计中每分钟测量一次荧光(在330nm激发，在390nm发射检测)(图16b)。Vmax值由趋势线的斜率决定。实验重复两次。误差线表示标准偏差。技术信息请参考材料和方法部分。
实施例11
将50uM的SARS-CoV-2肽、6.4nM胰蛋白酶重组蛋白和两种浓度的AAT(0.1uM和1uM)一起孵育45分钟。在紫外分光光度计中每分钟测量一次荧光(在330nm激发，在390nm发射检测)(图16c)。Vmax值由趋势线的斜率决定。实验重复两次。误差线表示标准偏差。技术信息请参考材料和方法部分。
实施例12
将50uM的SARS-CoV-2肽、10U/ml的弗林蛋白酶重组蛋白和1uM的AAT一起孵育45分钟。在紫外分光光度计中每分钟测量一次荧光(在330nm激发，在390nm发射检测)(图16d)。Vmax值由趋势线的斜率决定。实验重复两次。误差线表示标准偏差。技术信息请参考材料和方法部分。
实施例13
将50uM的SARS-CoV-2肽、1.76ng/ul的PCI重组蛋白和几种浓度的AAT(1uM、10uM、40uM和l00 uM)一起孵育45分钟。在紫外分光光度计中每分钟测量一次荧光(在330nm激发，在390nm发射检测)(图16e)。Vmax值由趋势线的斜率决定。实验重复两次。误差线表示标准偏差。技术信息请参考材料和方法部分。
实施例14
将50uM的SARS-CoV-2肽、1.76ng/ul的蛋白裂解酶重组蛋白和几种浓度的AAT(1uM、10uM、40uM和l00 uM)一起孵育45分钟。在紫外分光光度计中每分钟测量一次荧光(在330nm激发，在390nm发射检测)(图16f)。Vmax值由趋势线的斜率决定。实验重复两次。误差线表示标准偏差。技术信息请参考材料和方法部分。
实施例15
AAT抑制TMPRSS2蛋白酶活性。将30uM的Boc-QAR-AMC肽、0.5uM的TMPRSS2重组蛋白和5uM的AAT一起孵育45分钟。在紫外分光光度计中每分钟测量一次荧光(在380nm激发，在460nm发射检测)(图16g)。Vmax值由趋势线的斜率决定。实验重复两次。误差线表示标准偏差。技术信息请参考材料和方法部分。
实施例16
将25ug/mL的DQTM弹性蛋白底物、0.25U/mL的来自猪胰腺的弹性蛋白酶(ELA1)和几种浓度的AAT(10nM、50nM和100nM)一起孵育45分钟。在荧光读取器中每分钟测量一次荧光(在485nm激发，在530nm发射检测)(图16h)。Vmax值由趋势线的斜率决定。重复两次。误差线表示标准偏差。技术信息请参考材料和方法部分。
实施例17
将100uM的底物MeOSuc-AAPV-pNA、2.2uU/ul的纯化的人中性粒细胞弹性蛋白酶(ELA2)和几种浓度的AAT(1nM和10nM)一起孵育45分钟。在分光光度计读数器(A405 nm)中每分钟测量一次吸光度(图16i)。Vmax值由20分钟内趋势线的斜率确定。重复两次。误差线表示标准偏差。技术信息请参考材料和方法部分。
实施例18
滴度测量使用Octet RED(Sartorius，Octet RED96)方法，蛋白A生物传感器(Sartorius，Ref 18-5010；18-5012)，小鼠Mc抗hAAT IgG2A(abcam，ab116604)、中和缓冲液(MBD；150mM 0.02％吐温20、1mg/mL NaCl、BSA、PBS1X)和再生缓冲液(MBD；10mM甘氨酸-HCL(pH2))结合如图26所示。比较血浆来源的AAT(Sigma-Aldrich，SRP6312)和通过PL136/PL137库在CHO中产生的重组AAT(图17)。
Figure BDA0004022404670000731
Figure BDA0004022404670000741
实施例19
在第0天将人小胶质细胞HMC3-MHCIILuc细胞铺板，在第1天用IFNγ活化直至第2天，在第4天测量荧光素酶活性和细胞活力(图18a)。通过MHCII驱动的荧光素酶的活性来测量活化，并相对于细胞活力归一化。所有条件下的荧光素酶活性均表示为未处理细胞对照的倍数(图18b)。所有条件重复三次，误差线代表标准偏差。
实施例20
在第0天将人小胶质HMC3-MHCIILuc和HMC3-MHCIILuc细胞；UbiAAT细胞铺板，在第1天用IFNγ活化直至第2天，并在第4天测量荧光素酶活性和细胞活力。从第0天到第4天，将血浆来源的AAT施加于HMC3-MHCIILuc细胞(图19a)。通过MHCII驱动的荧光素酶的活性来测量活化，并相对于细胞活力归一化。所有条件下的荧光素酶活性均表示为IFNγ活化对照的百分比(图19b)。所有条件重复三次，误差线代表标准偏差。
实施例21
在第0天将人小胶质HMC3-MHCIILuc细胞铺板，在第1天暴露于IFNγ和/或IFNβ直到第2天，在第4天测量荧光素酶活性和细胞活力。从第0天到第4天，施加血浆来源的AAT(图20a)。通过MHCII驱动的荧光素酶的活性来测量活化，并相对于细胞活力归一化。所有条件下的荧光素酶活性均表示为IFNγ活化对照的百分比(图20b)。血浆来源的AAT(1μM、10μM、25μM)的柱是实施例20的重复，用于比较目的。所有条件重复三次，误差线代表标准偏差。
实施例22
考马斯图片说明：考马斯染色的来自多个来源AAT的SDS-PAGE。通过与NuPage 4xLDS样本缓冲液(Life Technologies)和NuPage 10x样本还原剂(Life Technologies)混合，并在70℃孵育10分钟，制备用于分析的还原样本。对于非还原样本，省略还原剂和热孵育。每个泳道加载5ug蛋白质。样本在含TGS缓冲液的4-20％ Mini-
Figure BDA0004022404670000752
预制胶(BioRad)上进行电泳。然后将凝胶在固定缓冲液(50％甲醇+10％乙酸+40％ H2O)中于室温固定30分钟。加入最终浓度为0.25％的考马斯蓝(Sigma Aldrich)，再孵育15分钟。最后，将凝胶在固定缓冲液的多次洗涤中过夜脱色，并在G:Box成像仪(Syngene)上成像(图24)。
实施例23
重组人AAT在HEK 293细胞中的表达。基于SEQ ID NO:46用于HEK293的或基于SEQID NO:47用于HEK293T。对于HEK293，从图25g中的载体产生包含SERPINA1_OHu22141C_pcDNA3.1(+)质粒的rhAAT表达克隆。对含质粒的克隆进行序列验证，并制备足够量的质粒用于转染HEK 293细胞(ATCC，Catalog#CRL-1573)。用质粒转染HEK293细胞，并在3组6孔板中使用市售ELISA试剂盒(Thermo Fischer Scientific，Catalog#EH411RBX5)证实rhAAT表达并分泌到培养液中。将模拟转染的细胞以及用pCMV-Td Tomato和EGFP荧光标记转染的细胞用作对照。
用于生成rhAAT HEK 293细胞的关键材料和试剂
Figure BDA0004022404670000751
Figure BDA0004022404670000761
步骤
HEK 293细胞中rhAAT的产生分两个阶段进行：
1.rhAAT表达细胞的制备。
2.rhAAT的产生。
rhAAT表达细胞的制备
rhAAT表达细胞的制备包括以下活动：
-准备好表达的质粒(expression-ready plasmid)的构建和验证
-宿主细胞的转染
-表达rhAAT的(稳定的)库的生成
-克隆选择
准备好表达的质粒的构建和验证
基于SEQ ID NO:46所示的序列，由Genscript Biotech公司(Piscataway，NJ)制备含有SERPINA1_OHu22141C_pcDNA3.1(+)质粒的rhAAT表达克隆。
将含质粒的克隆运送到RTI International(Research Triangle Park，NC)进行序列验证，并制备足够量的质粒用于转染HEK 293细胞。
宿主细胞的瞬时转染
用SERPINA1_OHu22141C_pcDNA3.1(+)质粒转染HEK293细胞，使用市售ELISA试剂盒证实3组6孔板中rhAAT表达并分泌到培养液中。将模拟转染的细胞以及用pCMV-TdTomato和EGFP荧光标记转染的细胞用作对照。
每个实验每孔的试剂和质粒DNA的量
Figure BDA0004022404670000771
Figure BDA0004022404670000781
表达rhAAT的(稳定的)库的生成
在确认瞬时转染成功后，在T-150中通过抗生素选择生成稳定的库。在抗生素选择下将细胞维持长达2周，以消除没有质粒的细胞。随后，使用ELISA测试培养物上清液的蛋白质表达。
在转移之前，将合并的细胞于80℃冷冻，以用于在摇瓶中进一步的细胞扩增和rhAAT产生。
克隆选择
收集稀释的细胞并转移到10-cm2的培养皿中用于分离单个克隆。根据转基因的行为，从50至96个克隆中鉴定出3至6个克隆，用于随后通过ELISA来确认rhAAT的表达。
rhAAT的产生
rhAAT的产生包括细胞扩增和在cell stack中产生rhAAT，通过亲和层析纯化rhAAT，利用Amicon Ultra 15，10kDa管进行产物浓缩和配制(缓冲液交换)。
细胞扩增和Cell Stack中的rhAAT的产生
重组贴壁依赖型HEK-293细胞在经培养处理的T形瓶和Cell Stack瓶中在补充有10％胎牛血清(FBS，Gibco)、青霉素-链霉素(Gibco)和遗传霉素选择性抗生素G418硫酸盐(Gibco)的Dulbecco改良Eagles培养基(DMEM，HyClone)中生长。培养物在37.0℃和5％ CO2的湿润培养箱中培养，并且当在滚瓶中生长时以2.5rpm旋转，随后收获。通过亲和层析的rhAAT的纯化
测试澄清的培养物上清液的pH和电导率，并根据需要分别使用1M Tris(pH 7.4)和±5mS/cm的含有1M NaCl的平衡缓冲液滴定至7.4±0.1。调节pH和电导率后，在纯化前通过0.2μm过滤器对澄清的上清液进行过滤。
亲和层析
用3CV的纯化水冲洗装有rhAAT选择树脂的亲和层析柱，并用3CV的0.5M NaOH进行消毒(在2CV后保持30分钟)，然后用3CV的纯化水再次冲洗并用10CV的20mM Tris、150mMNaCl的缓冲液(pH7.4)进行平衡。rhAAT选择柱加载最大体积的澄清上清液，所述最大体积根据摇瓶培养结束时的rhAAT滴度、澄清上清液的体积和10mg/mL树脂的最大柱载容量进行计算。如果需要，为了避免树脂过载，将澄清的上清液通过rhAAT选择柱进行多次循环处理。用4CV的20mM Tris、150mM NaCl的缓冲液(pH 7.4)洗涤负载的蛋白质，并用4CV的20mMTris、2M MgCl的缓冲液(pH 7.4)将rhAAT洗脱到PETG收集瓶中。用4CV的PBS，pH 2.0缓冲液对柱进行剥离，并且如果需要，在进行另外的循环之前，用3CV的20mM Tris、150mM NaCl的缓冲液(pH 7.4)进行平衡。
实施例24
载体PL136(pCGS3_AAT_native_SP；图25d)(原始信号肽进入HindIII/XhoI限制性位点(LC MCS))和PL137(pCGS3_AAT_SP5，图25e)(SEQ ID NO:1的信号肽通过用ATUMSM(Newark，California)优化的信号肽替换氨基酸1-24进行了优化)。
使用DNA2.0专有算法(
Figure BDA0004022404670000791
Expression OptimizationTechnology,https://www.dna20.com/services/genegps)，对编码序列进行密码子优化并在中国仓鼠卵巢细胞中进行表达。在起始密码子之前添加了规范的kozak序列(GCCGCCACC)。在合成的编码序列的5’和3’处添加了HindIII和XhoI限制性位点。
将得到的DNA片段克隆到载体pJ201中。提供了克隆pJ201_AAT_native_SP(图25b)和pJ201_AAT_SP5(图25c)的完整质粒图谱和序列。
根据以下克隆方案获得pCGS3_AAT_native_SP和pCGS3_AAT_SP5(空pCGS3载体，图25f)：
Figure BDA0004022404670000801
片段制备：
pCGS3/HindIII-Xhol
MQ-H20 33μl
pCGS3(1μg/μl) 1μl
10x CutSmart缓冲液 4μl
HindllI-HF 1μl
Xhol 1μl
总计 40μl
pJ201_AAT-native_SP/HindIII-Xhol
MQ-H20 9μl
pJ201_AAT_native_SP(50ng/μl) 25μl
10X CutSmart缓冲液 4μl
HindIII-HF 1μl
Xhol 1μl
总计 40μl
pJ201_AAT-SP5/HindIII-Xhol
MQ-H20 9μl
pJ201_AAT-SP5(50ng/μl) 25μl
10×CutSmar缓冲液 4μl
HindIII-HF 1μl
Xhol 1μl
总计 40μl
所有消化物在37℃孵育2小时。通过琼脂糖凝胶电泳(1.2％琼脂糖凝胶)分离目标片段。切下预期大小的片段，通过凝胶纯化并用于以下连接：
连接
pCGS3_AAT_native_SP_A
MQ-H20 4ul
pCGS3/HindIII-Xhol(10ng/μl) 2μl
pJ201_AAT_native_SP/HindIII-Xhol(10ng/μl> 2μl
10×连接酶缓冲液 1μl
T4 DNA连接酶 1μl
总计 10μl
pCGS3_AAT_SP5_A
MQ-H20 4μl
pCGS3/HindIII-Xhol(10ng/μl) 2μl
pJ201_AAT_SP5/HindllI-Xhol (10ng/μl) 2μl
10X连接酶缓冲液 1μl
T4 DNA连接酶 1μl
总计 10μl
将连接混合物(1μl)转化到来自Invitrogen的大肠杆菌Stabl2细胞中。将转化的大肠杆菌细胞培养在含有50mg/l羧苄青霉素且无动物成分的LB琼脂Lennox上。将大肠杆菌菌落转移到4ml的含50mg/l氨苄青霉素且无动物成分的LB肉汤Lennox中，并在摇床培养箱中以300rpm于33℃孵育过夜。使用QiagenBioRobot 9600和来自Macherey-Nagel的NucleoSpinRobot-8质粒试剂盒从大肠杆菌培养物中分离质粒DNA。然后使用覆盖克隆位点的链特异性测序引物对DNA进行测序。
以下克隆的序列被证实与预期的PL136(pCGS3_AAT_native_SP；图25d)和PL137(pCGS3_AAT_SP5，图25e)的序列是一致的。合并从CHO中的PL1 36和CHO中的PL1 37获得的AAT。
实施例25
基因合成和单基因构建体
通过将产物基因亚克隆到载体pXC-17.4(Lonza)中构建rhAAT单基因载体(图25a)。
DNA扩增
根据制造商的说明，使用热休克法，用1μL载体DNA转化One
Figure BDA0004022404670000821
Stbl3化学感受态大肠杆菌细胞(Life Technologies，C7373-03)。将细胞涂布在含氨苄青霉素(50g/ml)的LB琼脂平板上(LB Broth Base，Select APSTM和Bacto-Agar，均来自Becton Dickinson，分别是292438和214010)，并在37℃孵育过夜，直到细菌菌落明显。
对于Giga准备，使用单一细菌培养物接种起子培养物，该起子培养物随后用于接种到含有50μg氨苄青霉素的1.0L Plasmid Plus培养基(Thomson，446300)中，并在37℃振荡孵育过夜。使用QIAGEN Gigaprep系统(QIAGEN，12291)分离载体DNA。在所有情况下，使用Nanodrop 1000分光光度计(Thermo-Scientific)测量DNA浓度，并调节至1mg/mL。通过测量260nm和280nm处的吸光度比来评估DNA质量。
CHOK1SV GS-KO细胞的常规培养
将CHOK1SV GS-KO细胞在补充有6mM L-谷氨酰胺(Life Technologies，25030-123)的CD-CHO培养基(Life Technologies，10743-029)中进行培养。将细胞在36.5℃、5％CO2、85％湿度、140rpm的振荡培养箱中进行培养。每3至4天对细胞进行常规传代培养，以0.2×106个细胞/ml接种，并进行增殖，以便有足够的细胞可用于转染。细胞在传至第20代时被丢弃。
将稳定的重组CHOK1SV GS-KO细胞在补充有50μM MSX(L-蛋氨酸亚砜亚胺，Sigma-Aldrich，M5379)和SP4的CD-CHO培养基中进行培养。将细胞在36.5℃、5％ CO2、85％湿度、140rpm的振荡培养箱中进行培养。每3至4天对细胞进行常规传代培养，以0.2×106个细胞/ml接种，并进行繁殖，以便有足够的细胞可用于大规模补料分批过度生长。
CHOK1SV GS-KO细胞的稳定混合转染
用于转染的单基因载体DNA质粒的制备是通过用PvuI线性化，随后乙醇沉淀并在EB缓冲液中重悬至400μg/ml的最终浓度。使用Gene Pulse XCell通过电穿孔进行转染。对于每次转染，将活细胞重悬于预热的CD-CHO培养基中至1.43×107个细胞/ml。将100μl浓度为400μg/ml的线性化DNA等分到0.4cm间隙的电穿孔比色皿中，并加入700μl细胞悬浮液。三个比色皿的细胞和DNA在300V、900μF下进行电穿孔，并立即回收到补充有10ml/L SP4(Lonza，BESP1076E)的30ml的预热CD-CHO中，以产生稳定的库。转染物在36.5℃、5％ CO2、85％湿度、140rpm的振荡培养箱中进行培养。
总共建立了3个稳定的库转染物。转染后24小时，将培养物离心并重悬于补充有50μM MSX和10ml/L SP4的预热CD-CHO中。转染后定期检查细胞生长和活力。
当活细胞密度>0.6×106个细胞/ml时，适合进行转染物培养。将细胞以0.2×106个细胞/ml，按100ml的终体积接种于500ml通气锥形瓶(Fisher Scientific(Corning)，10352742)中的补充有50μM MSX/10ml/L SP4的CD-CHO培养基中，并在36.5℃、5％ CO2、85％湿度、140rpm的振荡培养箱中孵育。监测细胞培养物，一旦培养物适应指数生长，就扩增细胞培养物。将培养物在500ml通气锥形瓶中以0.2×106细胞/ml的浓度在补充有50μMMSX/10ml/L SP4的CD-CHO中扩增至200ml培养体积，并在上述条件下孵育(参见第0节)。然后将培养物扩大到适当的生产量。
简略的补料分批过度生长
通过从所建立的稳定的库将合适的培养体积以0.2×106个细胞/mL接种于补充有4mL/L SPE的Lonza的CM42基础培养基中，将细胞增殖至每种产物2L的生产量。在5L(Generon，931116)摇瓶中建立生产量，并在36.5℃、5％ CO2、85％湿度和140rpm的振荡培养箱中进行培养。在第4天开始给饲料前监测细胞计数和活力，并定期监测，直到在第11天收获培养物。在第4天和第8天施用由Lonza专有饲料的混合物组成的大剂量饲料。
生产培养物的收获和浓缩
通过在3000rpm离心10分钟收获培养物，并使用0.22μm PES膜过滤以获得澄清的上清液。
α-1抗胰蛋白酶亲和层析
使用内部填充有50ml的α-1抗胰蛋白酶选择柱(GE Healthcare)来纯化澄清的细胞上清液。在施加产物之前和之后，用20mM Tris、150mM NaCl(pH 7.4)平衡柱，并用20mMTris、2M MgCl2(pH 7.4)进行洗脱。该过程在AKTA净化器上以10ml/min的速度进行。将来自亲和层析洗脱液的含有产物的级分合并使用带有10kDa MWCO(D02-E010-05-N)的Spectrum’s KrosFlo TFF系统通过切向流过滤(TFF)将缓冲液交换为50mM Tris、75mMNaCl(pH 8.0)。
阴离子交换层析
使用25ml CaptoQ柱(串联连接的5ⅹ5ml柱)(GE Healthcare)在AKTA纯化器上以10ml/min进一步纯化合并的并经缓冲液交换的级分。在施加产物之前和之后，用50mMTris，75mM NaCl(pH 8.0)平衡柱。通过10CV线性梯度将产物洗脱至50mM Tris、1M NaCl(pH8.0)中。合并来自阴离子交换层析洗脱液的含产物的级分，稀释至1mg/ml并进行质量分析。
SE-HPLC
在Agilent 1200系列HPLC系统上，使用Zorbax GF-250 9.4mM IDⅹ25cm柱(Agilent)，通过SE-HPLC分析重复样品。注射1mg/mL的样品(或原液浓度，如果样品浓度<1mg/mL)的80μL等分试样，并在50mM磷酸钠、150mM氯化钠、500mM精氨酸(pH 6.0)中以1mL/min运行15分钟。使用Empower软件分析可溶性聚集体水平。缓冲液成分产生的信号通过空白缓冲液注射进行分析，并在数据分析中省略，除非另有说明。
产物浓度
使用Vivaspin Turbo-15离心过滤单元30KDa分子量截留(Sartorius，VS15T02)将纯化的产物浓缩至25mg/mL的目标浓度。
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Claims (28)

1.一种用于在有需要的受试者中治疗和/或预防与病毒感染相关的疾病或综合征之用途的组合物，所述组合物包含治疗有效量的α1-抗胰蛋白酶(AAT)蛋白、其变体、同种型和/或片段。
2.根据权利要求1所述之用途的组合物，其中所述有需要的受试者具有选自由以下组成的组的至少一种：
1.与至少一个在病毒感染期间的无症状或具有轻度症状的受试者相比，在病毒感染之前或在病毒感染期间较低的内源性α-抗胰蛋白酶(AAT)水平，
2.与至少一个在病毒感染期间的无症状或具有轻度症状的受试者相比，在病毒感染之前或在病毒感染期间较高的至少一种刺突蛋白启动蛋白酶水平，
3.与至少一个在病毒感染期间的无症状或具有轻度症状的受试者相比，在病毒感染之前或在病毒感染期间较高的受试者中的血管紧张素转换酶2(ACE2受体)水平，和
4.与至少一个在病毒感染期间的无症状或具有轻度症状的受试者相比，在病毒感染之前或在病毒感染期间较高的受试者中的干扰素-γ(IFN-γ)水平。
3.根据权利要求2所述之用途的组合物，其中所述在病毒感染之前或在病毒感染期间较低的内源性AAT水平是由AAT缺乏症引起的。
4.根据权利要求2或3所述之用途的组合物，其中所述刺突蛋白启动蛋白酶选自由以下组成的组的至少一种：跨膜蛋白酶丝氨酸亚型2(TMPRSS2)、跨膜蛋白酶亚型6(TMPRSS6)、组织蛋白酶L、组织蛋白酶B、前蛋白转化酶1(PC1)、胰蛋白酶、弹性蛋白酶、中性粒细胞弹性蛋白酶、蛋白裂解酶和弗林蛋白酶，所述刺突蛋白启动蛋白酶优选为组织蛋白酶L和弗林蛋白酶。
5.根据权利要求2至4中任一项所述之用途的组合物，其中所述较高的至少一种刺突蛋白启动蛋白酶水平是由年龄和/或遗传倾向引起的。
6.根据权利要求2至5中任一项所述之用途的组合物，其中所述较高的ACE2受体水平是由选自感染、炎症、年龄和/或遗传倾向的组中的至少一种引起的。
7.根据权利要求2至6中任一项所述之用途的组合物，其中所述较高的IFN-γ水平是由选自感染、炎症、年龄和遗传倾向的组中的至少一种引起的。
8.根据权利要求2至7中任一项所述之用途的组合物，其中所述有需要的受试者具有
iii)较低的内源性AAT水平，和
iv)较高的至少一种刺突蛋白启动蛋白酶水平。
9.根据权利要求2至8中任一项所述之用途的组合物，其中所述有需要的受试者具有
ii)较低的内源性AAT水平，和
iii)较高的ACE2受体水平。
10.根据权利要求2至9中任一项所述之用途的组合物，其中所述有需要的受试者具有
ii)较低的内源性AAT水平，和
iv)较高的干扰素-γ水平。
11.根据权利要求10所述之用途的组合物，其中所述较高的IFN-γ水平是由选自由以下组成的组中的至少一种疾病或病症引起的：AAT缺乏症、肝病如非酒精性脂肪性肝病、糖尿病、肥胖症和/或心血管病症。
12.根据权利要求2至11中任一项所述之用途的组合物，其中所述有需要的受试者具有
i)较低的内源性AAT水平，
ii)较高的至少一种刺突蛋白启动蛋白酶水平，和
iii)较高的ACE2受体水平和/或iv)较高的IFN-γ水平。
13.根据前述权利要求中任一项所述之用途的组合物，其中所述α1-抗胰蛋白酶(AAT)蛋白、其变体、同种型和/或片段是从人血浆提取的。
14.根据权利要求1至12中任一项所述之用途的组合物，其中所述α1-抗胰蛋白酶(AAT)蛋白、其变体、同种型和/或片段是重组α1-抗胰蛋白酶(rhAAT)、其变体、同种型和/或片段。
15.根据权利要求14所述之用途的组合物，其中所述α1-抗胰蛋白酶蛋白如SEQ ID NO:1中所示。
16.根据权利要求14所述之用途的组合物，其中所述α1-抗胰蛋白酶片段是C末端序列片段、或其任意组合。
17.根据权利要求14所述之用途的组合物，其中所述α1-抗胰蛋白酶变体选自包括衍生自如SEQ ID NO:2所示的C末端序列的短环肽的组。
18.根据权利要求17所述之用途的组合物，其中衍生自α1-抗胰蛋白酶的C-末端序列的所述短环肽选自包括以下的组：环-(CPFVFLM)-SH、环-(CPFVFLE)-SH、环-(CPFVFLR)-SH和环-(CPEVFLM)-SH、或其任意组合。
19.根据前述权利要求中任一项所述之用途的组合物，其中所述组合物还包含药学上可接受的赋形剂或载剂。
20.根据前述权利要求中任一项所述之用途的组合物，其中所述组合物还包含核苷类似物、蛋白酶抑制剂、免疫抑制剂(例如，沙利鲁单抗或托珠单抗)、抗生素、针对所述病毒结构成分的抗体或其片段(例如，被动免疫疗法)、干扰素β(例如，干扰素β-1a)和/或疫苗。
21.根据前述权利要求中任一项所述之用途的组合物，其中所述组合物通过静脉内注射、静脉内输注、剂量泵输注、吸入性鼻喷雾剂、滴眼剂、皮肤贴剂、缓释制剂、活体外基因疗法或活体外细胞疗法施用，优选通过静脉内注射施用。
22.一种用于确定目标受试者对与病毒感染相关的疾病或综合征的治疗和/或预防的敏感性的方法，所述治疗和/或预防使用如权利要求1至21中任一项所限定的包含治疗有效量的α1-抗胰蛋白酶(AAT)蛋白、其变体、同种型和/或片段的组合物，所述方法包括以下步骤：
a)确定目标受试者在病毒感染之前或病毒感染期间的包括内源性α1-抗胰蛋白酶、至少一种刺突蛋白启动蛋白酶、ACE2受体和干扰素-γ的组中的至少一种的水平，
b)确定至少一个参考受试者在病毒感染期间的包括内源性α1-抗胰蛋白酶、至少一种刺突蛋白启动蛋白酶、ACE2受体和干扰素-γ的组中的至少一种的水平，其中所述参考受试者无症状或具有轻度症状，
c)将在步骤a)中确定的目标水平与在步骤b)中确定的参考水平进行比较，
其中如果所述目标受试者具有选自由以下组成的组中的至少一种，则所述目标受试者对与病毒感染相关的疾病或综合征的治疗和/或预防更敏感：
1.与所述内源性AAT的参考水平相比较低的内源性α-抗胰蛋白酶(AAT)的目标水平，
2.与所述至少一种刺突蛋白启动蛋白酶的参考水平相比较高的至少一种刺突蛋白启动蛋白酶的目标水平，
3.与所述血管紧张素转换酶2受体的参考水平相比较高的血管紧张素转换酶2(ACE2受体)的目标水平，以及
4.与所述干扰素-γ的参考水平相比较高的干扰素-γ(IFN-γ)的目标水平。
23.一种用于确定有效治疗和/或预防与病毒感染相关的疾病或综合征的α1-抗胰蛋白酶(AAT)的治疗有效量的方法，所述治疗和/或预防使用根据权利要求1至21中任一项所述的组合物，所述方法包括以下步骤：
a)确定目标受试者在病毒感染之前或病毒感染期间的内源性α1-抗胰蛋白酶的水平，
b)确定所述组合物中AAT的量，所述量是在所述受试者中达到至少10μM、优选至少20μM、更优选至少50μM、甚至更优选至少100μM、最优选至少200μM的AAT水平所需要的量。
24.根据权利要求1至21中任一项所述之用途的组合物，或根据权利要求22和23所述的方法，其中所述病毒是冠状病毒。
25.根据权利要求24所述之用途的组合物，或根据权利要求24所述的方法，其中所述病毒是SARS-CoV-2。
26.根据权利要求1至25中任一项所述之用途的组合物，或根据权利要求22至25所述的方法，其中所述疾病或综合征是呼吸综合征或严重急性呼吸综合征。
27.根据权利要求1至25中任一项所述之用途的组合物，或根据权利要求22至25所述的方法，其中所述疾病或综合征是神经系统炎性疾病或神经系统综合征。
28.根据权利要求1至27中任一项所述之用途的组合物，或根据权利要求27所述的方法，其中所述神经系统炎性疾病或神经系统综合征是选自以下的组的疾病或综合征：多发性硬化症、肌萎缩性侧索硬化症、阿尔茨海默病、帕金森病和亨廷顿病。
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