PT2048955E

PT2048955E - Administração de gene alvo para vacinação de células dendríticas

Info

Publication number: PT2048955E
Application number: PT77997658T
Authority: PT
Inventors: Pin Wang; Lili Yang; David Baltimore
Original assignee: California Inst Of Techn
Priority date: 2006-07-21
Filing date: 2007-07-23
Publication date: 2013-09-20
Also published as: ES2428067T3; US8906359B2; EP2526774A3; US9303072B2; BRPI0714495B8; SG173337A1; US9840721B2; CA2659529A1; AU2007275010A1; WO2008011636A2; EP2520168A1; EP2048955A4; US20180179555A1; KR101421312B1; US20190316153A1; KR20140035537A; BRPI0714495B1; BRPI0714495A2; EP2520168B1; EP2048955B1

Description

PE2048955 1

DESCRIÇÃO

"ADMINISTRAÇÃO DE GENE ALVO PARA VACINAÇÃO DE CÉLULAS DENDRÍTICAS"

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A invenção refere-se de um modo geral a administração direccionada para gene, e mais particularmente à utilização de um virus recombinante compreendendo uma molécula de direccionamento que tem como alvo e se liga células dendríticas e pode assim ser utilizado para vacinação de células dendríticas. A imunização é uma das ferramentas mais produtivas na prática médica moderna mas continua a ter limitações. Determinadas doenças infecciosas tais como HIV/SIDA, malária e tuberculose não são actualmente controladas de todo por imunização, enquanto que outras doenças infecciosas são controladas por regimes de imunização complexos. 0 cancro é um alvo promissor para tratamentos imunoterapêuticos, mas os resultados clinicos em ensaios experimentais têm sido decepcionantes (Rosenberg, S.A. et al. 2004. Nat. Med. 10:909-915). São necessários novos métodos de imunização, por exemplo, para induzir imunidade anti-tumoral de forma fiável. PE2048955

As células dendríticas (DCs) desempenham papéis críticos na imunidade inata e adaptativa. As DCs são células que apresentam antigénio especializadas com a capacidade única de capturarem e processarem antigénios, migrarem da periferia para um órgão linfóide, e apresentarem os antigénios para células T em repouso numa forma restrita de complexo de histocompatibilidade principal (MHC) (Banchereau, J. & Steinman, R.M. 1998. Nature 392:245-252; Steinman, R.M., et al. 2003. Ann Rev Immunol 21: 685-711). Estas células derivam da medula óssea (BM) e são caracterizadas por morfologia dendrítica e elevada mobilidade. As DCs imaturas são hábeis na ingestão de antigénio e são distribuídas como sentinelas em tecido periférico por todo o corpo. No entanto, a maturação de DCs é necessária de forma a construir uma resposta imunológica eficaz (Steinman, R.M., et al. 2003. supra). As DCs maduras expressam níveis elevados de complexo antigénio MHC e outras moléculas co-estimuladoras (tais como CD40, B7-1, B7-2 e CDla) (Steinman, R.M. 1991. Ann Rev. Immunol 9: 271-296, que está aqui incorporada por referência na sua totalidade; Banchereau, J. e R.M. Steinman 1998. supra). Estas moléculas desempenham papéis chave na estimulação de células T. A descoberta do papel das DCs como células que apresentam antigénio (APCs) especializadas alimentou tentativas de imunização/vacinação com base em DC que envolve a carga de DCs com antigénios específicos (Banchereau, J. & Palucka, A.K. 2005. Nat. Rev. Immunol. 3 ΡΕ2048955 5:296-306; Figdor, C.G. et al. 2004. Nat. Med. 10:475-480). No entanto, todas estas tentativas envolvem a carga ex vivo de DCs com antigénios específicos. As DCs geradas ex vivo são então administradas ao doente. A geração ex vivo de DCs para cada doente é um processo intensivo extremamente trabalhoso.

Pelo contrário, a presente invenção é dirigida inter alia ao direccionamento para, carga de antigénio e activação de DCs in vivo, o gue resulta em tratamento in vivo de doenças por geração de uma resposta imunitária benéfica no doente. A invenção preenche assim uma necessidade de longa data de regimes eficazes e eficientes para imunização/vacinação. O documento WO00/61772 refere-se a composições e métodos para gerar uma resposta imunitária utilizando sistemas de vector com base em alfavírus. O documento W02005/118802 refere-se a vectores retrovirais pseudotipa-dos de direccionamento.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A invenção proporciona um método in vitro de administração de um vector lentiviral que codifica um antigénio a uma célula dendrítica que expressa a DC-SIGN (ICAM-3 (Moléculas de Adesão Intercelular 3) Específica de Célula Dendrítica - Não Integrina), compreendendo o método: transdução da célula dendrítica com um vírus recombinante, ΡΕ2048955 em que o vírus recombinante compreende o referido vector lentiviral, em que o vírus recombinante compreende uma glicoproteína de alfavírus que s a referida célula que expressa a DC-SIGN, em que a referida glicoproteína é uma glicoproteína E2 de alfavírus com mutação num sítio de ligação de sulfato de heparano, para diminuir ou eliminar a sua ligação ao sulfato de heparano. A invenção proporciona ainda um vírus recombinante compreendendo um vector lentiviral que codifica um antigénio e uma glicoproteína de alfavírus que tem como alvo células que expressam a DC-SIGN em que a referida glicoproteína é uma glicoproteína E2 de alfavírus com mutação num sítio de ligação de sulfato de heparano, para diminuir ou eliminar a sua ligação ao sulfato de heparano, para utilização na estimulação de uma resposta imunitária ao referido antigénio num mamífero. A glicoproteína E2 de alfavírus com mutação num sítio de ligação de sulfato de heparano pode ser uma glicoproteína E2 de Sindbis com mutação num sítio de ligação de sulfato de heparano.

Na discussão de formas de realização da invenção a seguir, a referência a uma "molécula de direccionamento" ou a uma "molécula de direccionamento que se liga a DC-SIGN" deve ser entendida e interpretada como significando 5 PE2048955 uma glicoproteína E2 de alfavírus com mutação num sítio de ligação de sulfato de heparano para diminuir ou eliminar a sua ligação ao sulfato de heparano. A invenção é ainda definida nas reivindicações que a acompanham.

Em determinadas formas de realização, a molécula de direccionamento é SINmu também conhecida como SVGmu (SEQ ID N°: 11).

Nalgumas formas de realização, o antigénio pode ser um antigénio de tumor ou um antigénio do HIV. 0 vírus recombinante pode ser produzido por transfecção de uma linha celular de empacotamento com um vector virai compreendendo o polinucleótido a ser administrado e um vector compreendendo um gene que codifica a molécula de direccionamento; cultura da linha celular de empacotamento transfectada; e recuperação do vírus recombinante da cultura celular de empacotamento. Nalgumas formas de realização, a linha celular de empacotamento é uma linha celular 293.

Nalgumas formas de realização da invenção, o vector é administrado a uma célula dendrítica ín vitro, enquanto que em outras formas de realização o vector pode ser utilizado para administrar a uma célula dendrítica num sujeito in vivo. O sujeito é tipicamente um mamífero, tal como um ser humano, murganho ou porquinho da índia. PE2048955 A invenção pode ser utilizada para métodos de estimulação de uma resposta imunitária num mamifero. Um polinucleótido que codifica um antigénio para o qual é desejada uma resposta imunitária é administrado a células dendriticas que expressam DC-SIGN por contacto das células dendriticas com um vector lentiviral compreendendo o polinucleótido e uma molécula de direccionamento que liga DC-SIGN.

Adicionalmente, o vector pode codificar um ou mais genes de interesse, tal como um gene que codifica um antigénio e/ou um gene que codifica um factor de maturação de célula dendritica. A invenção pode ser utilizada para métodos de tratamento de um doente com uma doença. Um virus recom-binante é administrado ao doente, em que o virus recom-binante compreende um vector lentiviral que codifica um antigénio associado à doença e uma molécula de direccionamento que liga DC-SIGN. A molécula de direccionamento pode ser derivada de uma glicoproteína virai. Nalgumas formas de realização, a molécula de direccionamento é SVGmu (SEQ ID N°: 11). A doença a ser tratada é geralmente uma para a qual um antigénio é conhecido ou pode ser identificado. Nalgumas formas de realização da invenção, a doença a ser tratada é cancro. Noutras formas de realização, a doença é HIV/SIDA. 7 PE2048955

Também são proporcionadas células dendríticas transduzidas com um vírus recombinante, como aqui definido acima. Nalgumas formas de realização, a molécula de direccionamento é SVGmu (SEQ ID N°: 11). A invenção pode ser utilizada para imunizar um mamífero por administração de um polinucleótido que codifica um antigénio a células dendríticas que expressam DC-SIGN. Nalgumas formas de realização, faz-se contactar as células dendríticas com o vírus recombinante ex vivo. Noutras formas de realização, faz-se contactar as células dendríticas com o vírus recombinante in vivo.

Os métodos aqui descritos também podem ser utilizados para estimular uma resposta imunitária a um antigénio específico num mamífero por administração de um vector lentiviral que codifica o antigénio a células dendríticas utilizando um vírus recombinante compreendendo o polinucleótido e uma molécula de direccionamento que liga DC-SIGN. A resposta imunitária pode ser modulada proporcionando um outro polinucleótido cuja expressão na célula dendrítica module a resposta imunitária. Por exemplo, pode ser administrado um polinucleótido que codifique um factor de maturação dendrítica.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A figura 1 é uma representação esquemática de uma 8 ΡΕ2048955 estratégia geral de direccionamento de células dendríticas (DCs) para administração do antigénio. A glicoproteina do tipo selvagem do virus Sindbis sofre mutação no sitio de ligação do sulfato de heparano para suprimir a sua capacidade de ligação. A glicoproteina mutante resultante (SVGmu) liga DC-SIGN mas não liga o sulfato de heparina. DC-SIGN: ICAM-3 (Moléculas de Adesão Intercelular 3)

Especifica de Célula Dendritica - Não Integrina) A figura 2 ilustra imagens de microscopia confocal de laser de partículas de vírus colhidas a partir de células produtoras de vírus transfectadas de forma transiente com vector lentiviral, plasmídeos que codificam GFP-vpr e SVGmu, e outros constructos de empacotamento necessárias. As partículas de vírus são marcadas com GFP (verde). A incorporação de superfície de SVGmu foi detec-tada por imunocoloração com um anticorpo tag anti-HA (vermelho) para marcar SVGmu. Na lâmina "GFP", as partículas virais marcadas com GFP são verdes. Na lâmina "SVGmu", as partículas virais com incorporação de superfície SVGmu são coradas de vermelho. Na lâmina "Fundido", as partículas virais em que apenas GFP é expressa são verdes, as partículas virais em que apenas SVGmu é incorporado na superfície são vermelhas e as partículas virais que expressam ambos GFP e contendo SVGmu são amarelas. A sobreposição das cores verde e vermelha (amarela) indica as partículas virais contendo SVGmu, que representam a maior parte das partículas de vírus total. A barra de escala representa 2 μιη. 9 ΡΕ2048955 A figura 3A mostra a análise por citometria de fluxo de linhas celulares alvo construídas 293T.hDCSIGN que expressa a DC-SIGN humana, e 293T.mDCSIGN que expressa DC-SIGN murino. Linha sólida: expressão de DC-SIGN em linhas celulares alvo; área sombreada: coloração de fundo em células 293T. A figura 3B apresenta os resultados de citometria de fluxo para a detecção de GFP expressa em células 293T transduzidas com lentivector com envelope de glicoproteína de Sindbis do tipo selvagem (FUGW/SVG) ou glicoproteína de Sindbis mutante (FUGW/SVGmu). Um mililitro de sobrenadantes virais frescos de FUGW/SVG e FUGW/SVGmu foram utilizados para transduzir células 293T (2xl05) que expressam DC-SIGN de humano (293T.hDCSIGN) ou DC-SIGN de murino (293T.mDCSIGN). As células 293T parentais sem a expressão de DC-SIGN foram incluídas como controlos. Como ilustrado, o lentivector com envelope de glicoproteína do vírus de Sindbis mutante (SVGmu) é capaz de transduzir especifica-mente células 293T que expressam DC-SIGN de humano ou murganho. 0 título de transdução específica de FUGW/SVGmu foi estimado como sendo de aproximadamente lxlO6 TU/mL para 293T.hDC-SIGN e de aproximadamente Ο,δχΙΟ6 TU/mL para 293T.mDC-SIGN. A figura 4A apresenta os resultados de citometria de fluxo que ilustram a capacidade do lentivírus FUGW com envelope de glicoproteína do Sindbis mutante (FUGW/SVGmu) 10 PE2048955 em transduzir especificamente células dendríticas de murganho que expressam DC-SIGN numa cultura de medula óssea mista primária. As células de medula óssea inteiras isoladas a partir de murganhos B6 foram expostas ao sobrenadante virai fresco de FUGW/SVGmu. O lentivector FUGW pseudotipado com a glicoproteína ecotrópica (FUGW/Eco) foi incluído como um controlo não direccionado. Os antigénios de superfície das células positivas em GFP foram ensaiadas por coloração com anticorpos anti-CDllc e anti-DC-SIGN. A figura 4B apresenta resultados de citometria de fluxo indicando que o lentivírus de FUGW com envelope de glicoproteína de Sindbis mutante (FUGW/SVGmu) não transduz outros tipos de células, incluindo células T primárias (CD3+, painel superior) e células B (CD19+, painel inferior) . Células T com CD3+ e células B com CD19+ primárias foram isoladas do baço do murganho e transduzidas com o sobrenadante virai fresco do vector FUGW/SVGmu de direccionamento ou FUGW/Eco de não direccionamento. A expressão da GFP foi analisada por citometria de fluxo. Linha sólida: células expostas a vector lentiviral indicado; área sombreada: células sem transdução (como um controlo negativo). A figura 5 apresenta os resultados de citometria de fluxo que ilustram a capacidade do lentivírus FUGW com envelope de glicoproteína de Sindbis mutante (FUGW/SVGmu) em transduzir especificamente DCs derivadas de medula óssea (BMDCs). As BMDCs foram geradas por cultura de células de 11 ΡΕ2048955 medula óssea isoladas recentemente na presença de citocina GM-CSF durante 6 dias. As células foram então transduzidas com o sobrenadante virai fresco do vector de direccionamento FUGW/SVGmu ou vector não direccionamento FUGW/Eco. As expressões de GFP e CDllc foram determinadas por citometria de fluxo. A figura 6 apresenta a activação de BMDCs após a transdução alvo com FUGW/SVGmu. A activação de DC foi avaliada por análise da expressão de superfície de CD86 e I-Ab utilizando citometria de fluxo. A adição de LPS (1 pg/mL) durante a noite foi utilizada como um estimulador sinérgico para a activação de BMDCs transduzidas. Área sombreada: GFP negativo (não transdução); linha sólida: GFP positivo (transdução).

As figuras 7A, 7B e 7C ilustram o direccionamento para DCs in vivo utilizando lentivírus FUGW/SVGmu. Murganhos B6 foram injectados com 50xl06 TU de FUGW/SVGmu e analisados 3 dias depois. Murganhos não imunizados foram incluídos como um controlo. Na Figura 7A, as imagens mostram o tamanho de um gânglio linfóide inguinal representativo perto do local da injecção em comparação com a do gânglio linfóide equivalente distante do local da injecção. A figura 7B ilustra as contagens totais de células dos gânglios linfáticos indicados na figura 7A. A figura 7C ilustra a análise de fluxo de citometria representativa de células CDllc+ a partir dos dois gânglios linfáticos apresentados na Figura 7A. Os números indicam a fracção das populações de DC GFP+. 12 PE2048955 A figura 8 proporciona uma representação esquemática do lentivector que codifica o antigénio OVA (FOVA) (em cima) e o lentivector que codifica GFP (FUGW) como um controlo (fundo). A figura 9 ilustra a estimulação das células T 0T1 CD8+ in vitro por células dendriticas que foram transduzidas com o lentivector FOVA/SVGmu (DC/FOVA) ou FUGW/SVGmu (DC/FUGW), ou por BMDCs não transduzidas pulsadas com péptido OVAp (SIINFEKL) (DC/OVAp). Os padrões de marcadores de activação de superfície de células T OT1 co-cultivadas com BMDCs foram avaliados por coloração de anticorpos para CD25, CD69, CD62L e CD44. Área sombreada: células T 0T1 genuínas colhidas de animais transgénicos; linha sólida: células T OT1 co-cultivadas com as BMDCs indicadas. A figura 10A ilustra a medição de IFN-γ por ELISA em células T OT1 misturadas com várias diluições de BMDCs transduzidas com FOVA/SVGmu (), FUGW/SVGmu (·) ou pulsadas com péptido OVAp (A) e cultivadas durante 3 dias. A figura 10B ilustra as respostas proliferativas de células T 0T1 tratadas da Figura 10A, determinadas por um ensaio de incorporação de [3H] timidina durante 12 horas. A figura 11 ilustra a estimulação in vitro de 13 ΡΕ2048955 células T 0T2 CD4+ por células dendríticas que foram transduzidas com o lentivector FOVA/SVGmu (DC/FOVA) ou FUGW/SVGmu (DC/FUGW) ou por BMDCs não transduzidas pulsadas com péptido OVAp* (ISQAVHAAHAEINEAGR) (DC/OVAp*). Os padrões de marcadores de activação de superfície de células T, OT2 transgénicas, co-cultivadas com BMDCs foram avaliadas por coloração de anticorpos para CD25, CD69, CD62L e CD44. Área sombreada: células T 0T2 genuínas colhidas de animais transgénicos; linha sólida: células T 0T2 co-cultivadas com BMDCs. A figura 12 ilustra a medição de IFN-γ por ELISA em células T 0T2 misturadas com várias diluições de BMDCs transduzidas com FOVA/SVGmu (), FUGW/SVGmu (·) ou pulsadas com péptido OVAp* (▲) e cultivadas durante 3 dias. A figura 13A proporciona uma representação esquemática do vector retroviral MIG-0T1 utilizado para modificação genética de células estaminais hematopoiéticas (HSCs) de murino. A figura 13B ilustra a forma como células T 0T1 CD8+ derivadas das HSCs modificadas com MIG-OT1 em murganhos reconstituídos foram identificados pela co-expressão da GFP e TCR Voí2 ou νβ5. As HSCs de murganhos B6 foram infectadas com MIG-OT1 pseudotipo com Eco (MIG-OTl/Eco) e transferidas para murganhos receptores B6 irradiados. Oito semanas após a transferência, as células T OT1 CD8+ foram identificadas por citometria de fluxo. PE2048955 A figura 14A ilustra a avaliação de padrões de marcadores de activação de superfície em células T 0T1+ GFP+ isoladas dos baços de murganhos reconstituídos e imunizados. Os murganhos reconstituídos por HSCs modificadas por MIG-0T1 foram imunizados por injecção subcutânea directa de 10xl06 TU de FOVA/SVGmu ou FUGW/SVGmu (como um controlo) e analisados sete dias depois. Foi realizada a detecção de coloração de superfície para CD69, CD62L e CD44. Linha sólida: Células T OTl+ GFP+ de murganhos imunizados com FOVA/SVGmu; linha a tracejado: Células T 0T1+ GFP+ de controlo de murganhos imunizados com FUGW/SVGmu, área sombreada: Células T 0T1+ GFP+ de controlo de murganhos não imunizados. A figura 14B ilustra o número total de células 0T1 colhidas a partir de gânglios linfáticos (LN, □) ou baços (SP, ) de murganhos não imunizados (sem im.) ou murganhos imunizados com FUGW/SVGmu ou FOVA/SVGmu. A figura 15 ilustra a estimulação in vivo de células T específicas de antigénio e as respostas de anticorpo em murganhos de tipo selvagem após uma injecção subcutânea de lentivector FOVA/SVGmu com alvo em DC. Os murganhos B6 foram imunizados subcutaneamente com 50xl06 TU de FOVA/SVGmu ou FUGW/SVGmu (como um controlo). Murganhos sem imunização (sem im.) foram incluídos como um controlo negativo. Catorze dias após a imunização, as células de baço foram colhidas e analisadas relativamente à presença 15 PE2048955 de células T específicas de OVA determinadas por tetrâmero H-2Kb-SIINFEKL-PE e coloração de CD44. As percentagens indicadas são a percentagem de células T CD8+ totais.

As Figuras 16A e 16B ilustram as respostas in vivo de células T específicas de OVA observadas em murganhos que receberam diferentes doses subcutâneas de FOVA/SVGmu. As células T específicas de OVA foram identificadas por coloração com tetrâmero como na Figura 17. A figura 16A apresenta a percentagem medida de células T específicas de OVA após imunização com lOOxlO6 TU de FOVA/SVGmu. A figura 16B apresenta as respostas à dose de células T específicas de OVA após injecção das doses de FOVA/SVGmu indicadas. A figura 17A ilustra os padrões de marcadores de activação de superfície de células T CD8+ específicas de OVA (identificadas como células positivas em tetrâmero) isoladas de murganhos imunizados com FOVA/SVGmu, 2 semanas após a injecção. Os marcadores de activação de superfície foram avaliados por coloração de anticorpo para CD25, CD69, CD62L e CD44. Linha sólida: Células T CD8+ tetrâmero"1" de murganhos imunizados com FOVA/SVGmu; área sombreada: Células T CD8+ genuínas de murganhos não imunizados. A figura 17B ilustra o título de IgG de soro específico de OVA de murganhos B6 após imunização com 50xl06 TU de FOVA/SVGmu. Os soros foram colhidos no dia 7 e no dia 14 após a imunização e foram analisados relativa- 16 ΡΕ2048955 mente ao título de IgG específico de OVA utilizando ELISA em diluições de lOx em série, começando em 1:100. Os valores de titulação foram determinados pela diluição mais alta a qual a densidade óptica foi 2x as derivações padrão maior do que a do soro de linha de base na diluição equivalente. A figura 18 ilustra o tamanho do tumor em função do tempo num modelo de tumor E.G7 de murino. Os murganhos B6 foram imunizados com injecção subcutânea de 50xl06 TU de FOVA/SVGmu (A) ou vector simulado de FUW/SVGmu (·). Nenhuma imunização () foi incluída como um controlo. Foram incluídos quatro murganhos em cada grupo. No dia 14 após a imunização, os murganhos foram desafiados por via subcutânea com 5xl06 de células tumorais E.G7 (que expressam o antigénio OVA, painel esquerdo) ou com células tumorais EL4 parentais (sem o antigénio OVA, como um controlo, painel da direita). O crescimento tumoral foi determinado com um compasso de calibre fino e é apresentado como o produto dos dois diâmetros perpendiculares maiores (mm2) . A figura 19 ilustra o crescimento cinético in vivo de tumores num modelo de erradicação de tumor E.G7 de murino. Uma estirpe albina de murganhos B6 foram implantados com 5xl06 células tumorais E.G7 que expressam de forma estável um gene imagem de luciferase de pirilampo (E.G7.1uc). Um murganho (#1) sem implantação de tumor foi incluído como um controlo. Murganhos contendo tumores foram 17 ΡΕ2048955 tratados sem imunização (#2), ou com imunização pela injecção de 50xl06 TU de FOVA/SVGmu nos dias 3 e 10 (#3, #4) após o desafio de tumor. O crescimento cinético dos tumores foi monitorizado por imagiologia de animal vivo utilizando BLI. O p/s/cm2/sr representa fotões/seg/cm2/es-terradiano. A figura 20 apresenta a quantificação de sinais de luminescência gerada pelos tumores E.G7 na Figura 19. (□) para o murganho #2, (·) para o murganho #3; (▲) para o murganho #4. A figura 21 ilustra a percentagem de células T específicas de OVA presentes após imunização com lOOxlO6 TU de FOVA/SVGmu na estirpe albina de murganhos B6. Murganhos B6 albinos foram imunizados subcutaneamente com 50xl06 TU de FOVA/SVGmu. Murganhos sem imunização (sem im.) foram incluídos como um controlo negativo. Catorze dias após a imunização, as células de baço foram colhidas e analisadas relativamente à presença de células T específicas de OVA determinado por tetrâmero H-2Kb-SIINFEKL-PE e coloração de CD44. As percentagens indicadas são a percentagem de Células T CD8+ totais. A figura 22A proporciona uma representação esquemática de um lentivector com alvo em DC que codifica um gene imagem de luciferase de pirilampo (Luc), designado como Fluc/SVGmu. 18 PE2048955 A figura 22B ilustra a imagem de bioluminescência de murganhos injectados por via subcutânea com 50xl0s TU do lentivector Fluc/SVGmu com alvo em DC (apresentado na Figura 25A) ou um lentivector Fluc/VSVG não direccionado. A imagem representativa foi obtida no dia 30 após a injecção utilizando IVIS200® (Xenogen). A figura 23 ilustra que a administração de uma dose única de lentivector FOVA/SVGmu especifica de DC recombinante pode gerar células T IFN-y+CD8+ em murganhos B6. Murganhos B6 genuinos foram imunizados por injecção subcutânea de 50xl06 TU de lentivector FOVA/SVGmu, ou a mesma dose de FUGW/SVGmu como um controlo. Os murganhos B6 não imunizados (sem im.) foram incluídos como um controlo negativo. Duas semanas mais tarde, células do baço foram colhidas dos murganhos experimentais, e foram analisadas relativamente à produção de IFN-γ intracelular utilizando citometria de fluxo com ou sem re-estimulação de péptido OVAp. As percentagens indicadas são a percentagem de células T IFN-y+CD8+ das células T CD8+ totais. A figura 24 ilustra uma representação esquemática de constructos lentivirais para a preparação de vírus recombinantes com alvo em DC. A figura 25 apresenta uma representação esquemática de uma forma de realização de vacinação in situ contra o HIV/SIDA. PE2048955

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA FORMA DE REALIZAÇÃO

PREFERIDA

Tem sido demonstrado que a engenharia genética é um meio eficiente e potente para converter as células dendriticas (DCs) em células imunitárias especiais para induzir respostas imunitárias especificas de antigénio. Tem sido realizada uma vasta investigação envolvendo manipulação in vitro de DCs para vacinação/imunização contra o cancro, HIV e outras doenças. No entanto, até agora, não foi possivel administrar especificamente e eficientemente um gene de interesse, tal como um gene que codifica um antigénio, a células dendriticas in vitro e in vivo. Os inventores descobriram novos métodos e composições para o direccionamento eficiente e especifico para DCs in vitro e in vivo. Os métodos e composições podem ser utilizados para induzir respostas imunitárias especificas de antigénio, por exemplo para imunoterapia.

As formas de realização da invenção incluem métodos e composições de direccionamento para células dendriticas (DCs) por utilização de um virus recombinante para administrar um polinucleótido às DCs. Isto é conseguido através do direccionamento para a molécula de superfície especifica de DC, DC-SIGN (ICAM-3 (Moléculas de Adesão Intercelular 3) Especifica de Célula Dendritica -Não Integrina, também conhecida como CD209). A DC-SIGN é um receptor do tipo lectina do tipo C capaz de ligação rápida e endocitose de materiais (Geijtenbeek, T.B., et al. 2004. 20 ΡΕ2048955

Annu. Rev. Immunol. 22: 33-54). Os vírus recombinantes têm um envelope de molécula de direccionamento concebida que é específica no seu reconhecimento para DC-SIGN, tal como definido nas reivindicações. O polinucleótido codifica um antigénio. Nalgumas formas de realização, o vírus recombinante administra mais do que um gene para DCs. Por exemplo, podem ser administrados genes que codificam dois ou mais antigénios. A administração de mais do que um gene pode ser conseguida, por exemplo, por ligação dos genes a um locais de entrada interno no ribossoma (IRES) e/ou com sequências 2A, e condução da expressão utilizando um único promotor/estimulador.

Como discutido em mais pormenor a seguir, a invenção baseia-se na utilização de vírus recombinante, i.e. lentivírus, uma vez que estes vírus são capazes de incorporar nos seus envelopes um grande número de proteínas que são encontradas na superfície das células produtoras de vírus. Em geral, uma linha celular de empacotamento é transfectada com um vector virai que codifica um polinucleótido de interesse (tipicamente que codifica um antigénio) , pelo menos um plasmídeo que codifica componentes de empacotamento de vírus (tais como gag e pol) e uma molécula de direccionamento que é projectada para ligar células dendríticas. A molécula de direccionamento é geneticamente projectada para ligar-se especificamente ao marcador de superfície celular DC-SIGN de células dendríticas. Durante a gemulação do vírus, a molécula de direccionamento, que é expressa na membrana de células de empacotamento, é 21 ΡΕ2048955 incorporada no envelope virai. Como um resultado, as partículas retrovirais compreendem um núcleo incluindo o polinucleótido de interesse e um envelope compreendendo a molécula de direccionamento na sua superfície. A molécula de direccionamento é capaz de se ligar a DC-SIGN numa célula dendrítica, e o vírus é capaz de administrar o gene de interesse à célula dendrítica. Sem querer estar limitado pela teoria, acredita- se que a ligação induz endocitose, trazendo o vírus para um endossoma, despoletando a fusão de membrana, e permitindo que o núcleo do vírus entre no citosol. Após a transcrição reversa e migração do produto para o núcleo, o genoma do vírus integra-se no genoma da célula alvo, incorporando o polinucleótido de interesse no genoma da célula alvo. A DC expressa então o polinucleótido de interesse (que codifica um antigénio). 0 antigénio é então processado e apresentado a células T e B por DCs gerando uma resposta imunitária específica de antigénio. A via específica acima descrita não é necessária desde que a célula dendrítica seja capaz de estimular uma resposta imunitária específica de antigénio. A presente invenção é utilizada para proporcionar métodos e composições para o direccionamento directo de um gene de interesse para DCs in vitro e in vivo. Nalgumas formas de realização in vivo preferidas, o gene de interesse é administrado às DCs sem cultura in vitro de DCs. Por exemplo, o gene de interesse pode ser administrado PE2048955 a DCs por uma administração directa do virus de direccionamento num sujeito vivo. 0 gene de interesse codifica um antigénio contra o qual é desejada uma resposta imunitária. Exemplos de antigénios incluem: antigénios específicos do tumor, antigénios associados a tumores, antigénios específicos de tecido, antigénios bacterianos, antigénios virais, antigénios de levedura, antigénios de fungo, antigénios de protozoário, antigénios de parasita, agentes mitogénicos, e semelhantes. Outros antigénios serão evidentes para um perito na técnica e podem ser utilizados sem necessidade de experimentação indevida.

Os métodos aqui descritos podem ser facilmente adoptados para utilizar moléculas de direccionamento que são especificas para DCs ou que podem ser manipuladas para proporcionar a especificidade desejada. A molécula de direccionamento é uma glicoproteína E2 de alfavirus com mutação num sitio de ligação de sulfato de heparano, que se liga a DC-SIGN em células dendriticas e que facilita a administração do gene de interesse nas células dendriticas. Exemplos de moléculas de direccionamento incluem, mas não estão limitadas a, glicoproteinas derivadas de virus Sindbis.

Qualquer método conhecido na técnica pode ser utilizado para projectar a molécula de direccionamento para proporcionar a especificidade desejada. Exemplos de métodos incluem, mas não estão limitados a, engenharia de proteínas racional e "shuffling" de DNA. Geralmente, para projectar 23 PE2048955 uma molécula de direccionamento específica para DCs, é proporcionada uma glicoproteína virai que interage com um marcador de superfície específico de células dendríticas. A glicoproteína E2 de alfavírus interage com DC-SIGN. A glicoproteína virai também pode interagir com pelo menos um segundo marcador de superfície celular tal como, por exemplo, sulfato de heparano (HS) , que é expresso em outros tipos de células sem ser DCs. A glicoproteína virai é modificada de tal modo que a sua capacidade em interagir com o marcador de superfície específico de DC é mantida enquanto que a sua capacidade em interagir com sulfato de heparano é diminuída ou eliminada. A modificação pode ser uma mutação em pelo menos um resíduo da sequência de aminoácidos da glicoproteína virai. A mutação pode ser uma eliminação, adição ou substituição do resíduo, e pode ser realizada por métodos padrão conhecidos na técnica. A especificidade desejada pode ser prontamente confirmada. Por exemplo, uma vez a glicoproteína virai modificada, pode ser utilizada para preparar um vírus recombinante por co-transfecção com um vector virai contendo um gene repórter e pelo menos um plasmídeo que codifica componentes de empacotamento de vírus numa linha celular de empacotamento. A glicoproteína é incorporada no envelope virai durante a gemulação do vírus. 0 vírus pode ser utilizado para transfectar tanto uma população pura de DCs bem como uma população mista de células contendo DCs, e a especificidade da transdução virai de DCs pode ser confirmada por análise das células quanto à expressão do gene repórter em DCs e não numa extensão significativa em outros tipos de células. 24 ΡΕ2048955

Se a especificidade não é suficientemente rigorosa (por exemplo, se é observado níveis de infecção indesejáveis de outros tipos de células), a glicoproteína virai pode ser ainda modificada e ensaiada tal como descrito até a especificidade desejada ser atingida.

As formas de realização da presente invenção incluem a administração a DCs de activadores de DC e/ou de factores de maturação em conjunto com antigénios. Exemplos de activadores de DC e de factores de maturação incluem, mas não estão limitados a, moléculas de estimulação, citocinas, quimiocinas, anticorpos e outros agentes, tais como ligandos Flt-3. Por exemplo, os factores de maturação de DC pode incluir, pelo menos, um dos seguintes: GM-CSF, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15, IL-21, IL-23, TNFoí, B7.1, B7.2, 4-1BB, ligando CD40 (CD40L) e CD40 induzido por fármaco (ÍCD40) (Hanks, B.A., et al. 2005. Nat Med 11:130-137) .

As formas de realização da presente invenção também incluem métodos e composições relacionados com a administração de vírus recombinante como descrito acima, ou DCs infectadas com vírus recombinante, em doentes para estimular respostas imunitárias específicas de antigénio, tal como, por exemplo, respostas de células T (respostas inmunitárias celulares) e respostas de células B (respostas inmunitárias humorais). Por exemplo, as células T CD4 activadas podem coordenar e orquestrar as células T CD8+ citotóxicas e as células B numa resposta específica de 25 PE2048955 antigénio. Em formas de realização preferidas, o virus recombinante e/ou DCs infectadas com virus recombinante são utilizados para estimular respostas imunitárias para a prevenção e tratamento de doenças tais como, mas não limitadas a, cancro e SIDA/HIV. Qualquer doença pode ser tratada para a qual seja benéfica uma resposta imunitária a um antigénio em particular, incluindo, mas sem estar limitado a, doença neoplásica, doença infecciosa, e doenças relacionadas com imunidade.

Tal como aqui descrito, foram realizados estudos que resultaram na descoberta de métodos e composições que podem ser utilizados para direccionar os virus recombinantes de forma a administrar genes que codificam antigénios específicos a DCs. A modificação genética de DCs de modo a induzir respostas imunitárias produtivas pode ser utilizada na prevenção e tratamento de doenças e proporciona um método eficaz de induzir imunidade de células T eficaz, bem como uma forte produção de anticorpos. Os métodos e composições aqui descritos podem proporcionar meios poderosos de imunização com antigénios desejados. A referida imunização pode prevenir e tratar doenças tais como, por exemplo, o cancro e SIDA/HIV.

Definições A não ser que de outro modo definido, os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado como normalmente entendido por um perito na 26 ΡΕ2048955 técnica à qual pertence esta invenção. Ver, e.g., Singleton et ai., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 1994); Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, NY 1989) . Quaisquer métodos, dispositivos e materiais semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos podem ser utilizados na realização desta invenção.

Tal como aqui utilizado, os termos ácido nucleico, polinucleótido e nucleótidos são intermutáveis e referem-se a qualquer ácido nucleico, composto de ligações fosfodiéster ou ligações modificadas tais como fosfotriés-ter, fosforamidato, siloxano, carbonato, carboximetiléster, acetamidato, carbamato, tioéter, fosforamidato em ponte, fosfonato de metileno em ponte, fosforamidato em ponte, fosforamidato em ponte, fosfonato de metileno em ponte, fosforotioato, metilfosfonato, fosforoditioato, fosforo-tioato em ponte ou ligações de sultona, e combinações de tais ligações.

Os termos ácido nucleico, polinucleótido e nu-cleótido também incluem especificamente ácidos nucleicos compostos de outras bases sem ser as cinco bases que ocorrem biologicamente (adenina, guanina, timina, citosina e uracilo) .

Como aqui utilizado, uma molécula de ácido nucleico é referida como "isolada" quando a molécula de 27 ΡΕ2048955 ácido nucleico está substancialmente separada das moléculas de ácido nucleico contaminantes que codificam outros polipéptidos. "Imunização" refere-se à administração de antigénio a um hospedeiro. Nalgumas formas de realização, o antigénio é administrado a células que apresentam antigénios, tais como células dendriticas. Como descrito a seguir, virus recombinante compreendendo um gene que codifica um antigénio pode ser direccionado para células dendriticas com uma molécula de afinidade especifica para DC-SIGN em células dendriticas. Assim, pode ser administrado o antigénio para o qual uma resposta imunitária é desejada às células dendriticas. Outros métodos para imunização são bem conhecidos na técnica.

0 termo resposta "imunológica" ou "imunitária" é o desenvolvimento de uma resposta humoral (mediada por anticorpos) e/ou celular (mediada pelas células T especificas de antigénios ou os seus produtos de secreção) benéfica dirigida contra um péptido amilóide num doente receptor. Tal resposta pode ser uma resposta activa induzida por administração de imunogénio ou uma resposta passiva induzida por administração de anticorpo ou células T que foram motivo de "priming". Uma resposta imunitária celular é provocada pela apresentação de epitopos polipeptidicos em associação com moléculas MHC de Classe I ou Classe II para activar células T auxiliadoras CD4+ especificas de antigénio e/ou células T citotóxicas CD8+. A 28 ΡΕ2048955 resposta pode também envolver a activação de monócitos, macrófagos, células NK, basófilos, células dendriticas, astrócitos, células da microglia, eosinófilos ou outros componentes da imunidade inata. A presença de uma resposta imunológica mediada por células pode ser determinada por ensaios de proliferação (células T CD4 + ) , ou ensaios de CTL (linfócito T citotóxico) (Burke et ai., J. Inf. Dis. 170, 1110-1119 (1994)), por apoptose dependente de antigénio (ensaio linfócito T citotóxico, Tigges et al. J. Immunol. 156, 3901-3910) ou por secreção de citocinas. As contribuições relativas de respostas humoral e celular para o efeito protector ou terapêutico de um imunogénio podem ser distinguidas por isolamento separado de IgG e células T de um animal singénico imunizado e determinação do efeito protector ou terapêutico num segundo sujeito.

Um "agente imunogénico" ou "imunogénio" é capaz de induzir uma resposta imunológica contra si mesmo após administração a um doente, opcionalmente em conjunto com um adjuvante. O termo "adjuvante" refere-se a um composto que quando administrado em conjunto com um antigénio aumenta, melhora, e/ou impulsiona a resposta imunitária ao antigénio, mas quando administrado sozinho não gera uma resposta imunitária contra o antigénio. Um adjuvante pode ser administrado com o virus recombinante da invenção como uma composição única, ou pode ser administrado antes, em simultâneo ou após a administração do virus recombinante da 29 ΡΕ2048955 invenção. Os adjuvantes podem melhorar uma resposta imunitária através de vários mecanismos incluindo recrutamento de linfócitos, estimulação de células B e/ou T, e estimulação de macrófagos. "Anticorpos" (Abs) e "imunoglobulinas" (Igs) são glicoproteinas tendo as mesmas caracteristicas estruturais. Enquanto que os anticorpos exibem especificidade de ligação a um antigénio específico, as imunoglobulinas incluem os anticorpos e outras moléculas do tipo anticorpo que não têm especificidade de antigénio. Os polipéptidos deste último tipo são, por exemplo, produzidos em niveis baixos pelo sistema linfático e em niveis aumentados por mielomas. 0 termo "anticorpo" é utilizado no sentido mais lato e inclui especificamente anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos monoclonais de comprimento completo) humanos, não humanos (e.g. murino), quiméricos, e humanizados, anticorpos policlonais, anticorpos multi-especificos (e.g., anticorpos biespecíficos), anticorpos de cadeia simples, e fragmentos de anticorpos desde que exibam a actividade biológica desejada. Tipicamente, os fragmentos competem com o anticorpo intacto do qual foram derivados para ligação especifica a um antigénio. 0 termo "epitopo" ou "determinante antigénico" refere-se a um sitio num antigénio ao qual células B e/ou T respondem. Os epítopos de células B podem ser formados a partir de aminoácidos contíguos ou aminoácidos não conti- 30 ΡΕ2048955 guos justapostos por dobramento terciário de uma proteína. Os epítopos formados a partir de aminoácidos contíguos são tipicamente retidos após exposição a solventes desnatu-rantes enquanto que os epítopos formados por dobramentos terciários são tipicamente perdidos após tratamento com solventes desnaturantes. Um epítopo inclui tipicamente pelo menos 3, e mais frequentemente, pelo menos 5 ou 8-10 aminoácidos numa conformação espacial única. Os métodos para determinar a conformação espacial de epítopos inclui, por exemplo, cristalografia de raios-x e ressonância magnética nuclear bidimensional. Ver, e.g., Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed. (1996). Os anticorpos que reconhecem o mesmo epítopo podem ser identificados num imunoensaio simples mostrando a capacidade de um anticorpo em bloquear a ligação de outro anticorpo a um antigénio alvo. As células T reconhecem epítopos contínuos com cerca de nove aminoácidos para células CD8 ou cerca de 13-15 aminoácidos para células CD4. As células T que reconhecem o epítopo podem ser identificadas por ensaios in vitro que medem a proliferação dependente de antigénio, como determinado por incorporação de 3H-timidina por células T motivos de "priming" em resposta a um epítopo (ver Burke, supra; Tigges, supra) . "Células alvo" são todas as células em que é desej ada a administração de um polinucleótido ou a expressão de um gene de interesse. Preferencialmente, as células alvo são células dendríticas, particularmente células dendríticas que expressam DC-SIGN. 31 ΡΕ2048955 0 termo "mamífero" é definido como um indivíduo que pertence à classe Mammalia, e inclui, sem limitação, humanos, animais domésticos e de quinta, e animais de zoológico, desporto e de estimação, tais como ovelhas, cães, cavalos, gatos e vacas. 0 termo "sujeito" ou "doente" inclui sujeitos humanos e outros mamíferos que recebem tratamento profiláctico ou terapêutico.

Tal como aqui utilizado, "tratamento" é uma intervenção clínica que pode ser terapêutica ou profiláctica. Em aplicações terapêuticas, as composições farmacêuticas ou medicamentos são administrados a um doente suspeito de, ou que já sofre de uma tal doença numa quantidade suficiente para curar, ou pelo menos parar parcialmente, os sintomas da doença e suas complicações. Em aplicações profiláticas, as composições farmacêuticas ou medicamentos são administrados a um doente susceptível a, ou de outro modo em risco de, uma determinada doença numa quantidade suficiente para eliminar ou reduzir o risco ou retardar o início da doença. Uma quantidade adequada para conseguir isto é definida como uma dose terapeuticamente ou farmaceuticamente eficaz. Tal quantidade pode ser administrada como uma dose única ou pode ser administrada de acordo com um regime segundo o qual é eficaz. A quantidade pode curar a doença mas, tipicamente, é administrada de modo a aliviar os sintomas de uma doença, 32 PE2048955 ou para a profilaxia de uma doença ou distúrbio de se desenvolver. Em ambos os regimes terapêuticos e profilácticos, os agentes são normalmente administrados em várias dosagens até que uma resposta imunitária suficiente tenha sido alcançada. Tipicamente, a resposta imunitária é monitorizada e são administradas dosagens repetidas se a resposta imunitária começar a desvanecer. O "tratamento" não necessita de eliminar completamente uma doença, nem necessita de impedir completamente um sujeito de adoecer com a doença ou distúrbio. "Tumor", como aqui utilizado, refere-se ao crescimento e proliferação de todas as células neoplásicas, quer sejam malignas ou benignas, e todas as células e tecidos pré-cancerigenos e cancerígenos. 0 termo "cancro" refere-se a uma doença ou distúrbio que é caracterizado por crescimento celular desregulado. Exemplos de cancro incluem, mas não estão limitados a, carcinoma, linfoma, blastoma e sarcoma. Exemplos de cancros específicos incluem, mas não estão limitados a, cancro de pulmão, cancro do cólon, cancro da mama, cancro do testículo, cancro do estômago, cancro pancreático, cancro do ovário, cancro do figado, cancro da bexiga, cancro colorretal e cancro da próstata. Cancros adicionais são bem conhecidos dos peritos na técnica e incluem, mas não estão limitados a: leucemia, linfoma, cancro do colo do útero, tumores de glioma, adenocarcinomas e cancro da pele. Exemplos de cancros incluem, mas não PE2048955 estão limitados a, tumor da bexiga, tumor da mama, tumor da próstata, carcinoma de células basais, cancro do tracto biliar, cancro da bexiga, cancro ósseo, cancro cérebro e CNS (e.g., tumor de glioma), cancro cervical, coriocarci-noma, cancro de cólon e recto, cancro do tecido conjuntivo, cancro do sistema digestivo; cancro do endométrio, cancro de esófago; cancro ocular; cancro da cabeça e pescoço; cancro gástrico; neoplasma intra-epitelial; cancro renal; cancro da laringe; leucemia; cancro do fígado; cancro do pulmão (e.g. células pequenas e células não pequenas); linfoma incluindo linfoma de Hodgkin e não Hodgkin; melanoma; mieloma, neuroblastoma, cancro de cavidade oral (e.g., lábio, língua, boca e faringe); cancro do ovário; cancro pancreático, retinoblastoma; rabdomiossarcoma; cancro rectal, cancro renal, cancro do sistema respiratório; sarcoma, cancro de pele; cancro do estômago, cancro do testículo, cancro da tiróide; cancro uterino, cancro do sistema urinário, bem como outros carcinomas e sarcomas. O cancro também inclui as neoplasias e distúrbios malignos em mamíferos, que são bem conhecidos na técnica.

Um "vector" é um ácido nucleico que é capaz de transportar outro ácido nucleico. Os vectores podem ser, por exemplo, plasmídeos, cosmídeos ou fago. Um "vector de expressão" é um vector que é capaz de dirigir a expressão de uma proteína ou proteínas codificadas por um ou mais genes transportados pelo vector quando está presente no meio adequado. 34 ΡΕ2048955 0 termo "elemento regulador" e "elemento de controlo de expressão" são utilizados intermutavelmente e referem-se a moléculas de ácido nucleico que podem influenciar a transcrição e/ou tradução de uma sequência de codificação ligada operativamente num ambiente em particular. Estes termos são utilizados de forma ampla e abrangem todos os elementos que promovem ou regulam a transcrição, incluindo promotores, elementos nucleares necessários para a interacção básica de polimerase de RNA e factores de transcrição, elementos a montante, poten-ciadores e elementos de resposta (ver, e.g., Lewin, "Genes V" (Oxford University Press, Oxford), páginas 847-873). Exemplos de elementos reguladores em procariotas incluem promotores, sequências de operador e locais de ligação no ribossoma. Elementos reguladores que são utilizados em células eucarióticas podem incluir, sem limitação, promotores, estimuladores, sinais de "splicing" e sinais de poliadenilação. 0 termo "transfecção" refere-se à introdução de um ácido nucleico numa célula hospedeira. "Retrovirus" são virus possuindo um genoma de RNA. "Lentivírus" refere-se a um género de retrovirus que são capazes de infectar células que se dividem e que não se dividem. Vários exemplos de lentivirus incluem HIV (virus de imunodeficiência humana: incluindo HIV do tipo 1, 35 PE2048955 e HIV do tipo 2), o agente etiológico da síndrome da imunodeficiência adquirida humana (SIDA); Maedi-Visna, que provoca encefalite (visna) ou pneumonia (maedi) em ovelhas, o virus da artrite-encefalite caprina, o que provoca imunodeficiência, artrite, e encefalopatia em caprinos; o virus da anemia infecciosa equina, o que provoca anemia hemolitica auto-imune e encefalopatia em cavalos; virus da imunodeficiência felina (FIV), o que provoca a imuno-deficiência em gatos; virus de imunodeficiência bovina (BIV), o que provoca a linfadenopatia, linfocitose, e possivelmente infecção do sistema nervoso central em gado; e virus da imunodeficiência simia (SIV), o que provoca a deficiência imunitária e encefalopatia em primatas sub-humanos.

Um genoma lentiviral é geralmente organizado numa repetição terminal longa (LTR) na extremidade 5', o gene gag, o gene pol, o gene env, os genes acessórios (nef, vif, vpr, vpu) e uma LTR 3'. A LTR virai está dividida em três regiões intituladas U3, R e U5. A região U3 contém o potenciador e elementos promotores. A região U5 contém os sinais de poliadenilação. A região R (repetição) separa as regiões U3 e U5 e sequências transcritas da região R surgem em ambas as extremidades 5' e 3' do RNA virai. Ver, por exemplo, "RNA Viruses: A Practical Approach" (Alan J. Cann, Ed., Oxford University Press, (2000)), O Narayan e Clements J. Gen. Virology 70:1617-1639 (1989), Fields et al. Fundamental Virology Raven Press. (1990), Miyoshi H, Blomer 36 ΡΕ2048955 U, Takahashi M, Gage FH, Verma IM. J Virol. 72(10):8150-7 (1998) e Patente US N° 6013516. "Gamaretrovírus" refere-se a um género da família retroviridae. Exemplos de gamaretrovírus incluem, mas não estão limitados a, vírus de células estaminais de murganho, vírus de leucemia murina, vírus de leucemia felina, vírus de sarcoma felino e vírus da reticuloendoteliose aviária.

Um "vírus híbrido" como aqui utilizado refere-se a um vírus contendo componentes de um ou mais de outros vectores virais, incluindo o elemento de vectores não retrovirais, por exemplo, híbridos adenovirais-retrovirais. Tal como aqui utilizado, vectores híbridos contendo um componente retroviral são considerados como estando dentro do âmbito dos retrovírus. "Virião", "partícula virai" e "partícula retroviral" são aqui utilizados para se referir a um único vírus compreendendo um genoma de RNA, proteínas derivadas de gene pol, proteínas derivadas de gene gag e uma bicamada lipídica exibindo uma (glico)proteína em envelope. O genoma de RNA é geralmente um genoma de RNA recombinante e pode assim conter uma sequência de RNA que é exógena ao genoma virai nativo. 0 genoma de RNA pode ainda compreender uma sequência virai endógena defeituosa.

Um retrovírus "pseudotipado" é uma partícula retroviral contendo uma proteína de envelope que é de um 37 ΡΕ2048955 virus diferente do vírus do qual o genoma de RNA é derivado. A proteína de envelope pode ser, por exemplo e sem limitação, de um retrovírus diferente ou de uma origem não retroviral. A proteína de envelope pode ser uma proteína de envelope nativa ou uma proteína de envelope que sofre modificação, mutação ou engenharia como aqui descrito. Nalgumas formas de realização, uma proteína de envelope é uma glicoproteína virai específica de DC-SIGN que é derivada de uma glicoproteína de um dos seguintes: vírus Sindbis, vírus influenza, vírus da febre de Lassa, vírus da encefalite transmitida por carraças, vírus Dengue, vírus da hepatite B, vírus da raiva, vírus da floresta de Semliki, vírus Ross River, vírus Aura, vírus da doença de Borna, vírus Hantaan e vírus SARS-CoV. "Transformação", como aqui definido, descreve um processo pelo qual o DNA exógeno entra numa célula alvo. A transformação pode basear-se em qualquer método conhecido para a inserção de sequências de ácidos nucleicos estranhas numa célula hospedeira procariótica ou eucariótica e pode incluir, mas sem estar limitado a, infecção virai, electroporação, choque térmico, lipofecção e bombardeamento de partículas. Células "transformadas" incluem células transformadas de forma estável nas quais o ácido nucleico introduzido é capaz de replicação quer como um plasmídeo de replicação autónoma ou como parte do cromossoma hospedeiro. Também estão incluídas as células que expressam transitoriamente um gene de interesse. 38 ΡΕ2048955

Uma "molécula fusogénica", tal como aqui descrita, é qualquer molécula que pode despoletar a fusão da membrana quando presente na superfície de um vírus e permite que um núcleo de vírus passe através da membrana e, tipicamente, entre no citosol de uma célula alvo. As moléculas fusogénicas podem ser, por exemplo, glicopro-teínas virais. Exemplos de glicoproteínas virais contempladas como moléculas fusogénicas incluem, mas não estão limitadas a, hemaglutinina, hemaglutinina mutante, SIN e glicoproteínas virais dos seguintes vírus: vírus Sindbis, vírus influenza, vírus da febre de Lassa, Vírus da encefalite transmitida por carraça, vírus Dengue, vírus da hepatite B, vírus da raiva, vírus da Floresta Semliki, vírus Ross River, vírus Aura, vírus da doença de Borna, vírus Hantaan e vírus SARS-CoV. As glicoproteínas podem ser nativas ou modificadas para ter a actividade desejada.

Por "transgene" entende-se qualquer sequência de nucleótidos, particularmente uma sequência de DNA, que é integrada em um ou mais cromossomas de uma célula hospedeira por intervenção humana, tal como pelos métodos da presente invenção. 0 transgene compreende preferencialmente um "gene de interesse".

Um "gene de interesse" não está limitado de qualquer forma e pode ser qualquer ácido nucleico, sem limitação, que se deseja que seja administrado, integrado, transcrito, traduzido e/ou expresso numa célula alvo. 0 gene de interesse pode codificar um produto funcional, tal 39 ΡΕ2048955 como uma proteína ou uma molécula de RNA. De preferência, o gene de interesse codifica uma proteína ou outra molécula, cuja expressão seja desejada na célula alvo. 0 gene de interesse está geralmente ligado operacionalmente a outras sequências que são úteis para obter a expressão desejada do gene de interesse, tal como sequências reguladoras da transcrição. Nalgumas formas de realização, um gene de interesse é preferencialmente um que codifica um antigénio para o qual é desejada uma resposta imunitária. Outros genes de interesse que podem ser utilizados nalgumas formas de realização são os genes que codificam activadores de células dendriticas e/ou factores de maturação.

Uma "relação funcional" e "ligado operativamente" significa, no que diz respeito ao gene de interesse, que o gene está na localização e orientação correctas em relação ao promotor e/ou potenciador cuja expressão do gene será afectada quando o promotor e/ou potenciador entrar em contacto com as moléculas adequadas. "Sequências 2A" ou elementos são pequenos péptidos introduzidos como um ligante entre duas proteínas, permitindo auto-processamento de poliproteínas intra-ribos-somal autónomo (de Felipe. Genetic Vaccines and Ther. 2:13 (2004); deFelipe et al. Traffic 5:616-626 (2004)). Os péptidos curtos permitem a co-expressão de várias proteínas a partir de um único vector, tal como a co-expressão de uma molécula fusogénica e molécula de afinidade a partir do mesmo vector. Assim, nalgumas formas de realização os PE2048955 polinucleótidos que codificam os elementos 2A são incorporados num vector entre polinucleótidos que codificam proteinas a serem expressas. "Factores de maturação de DC" (também conhecidos como "activadores de DC") são compostos que podem induzir a activação ou estimulação de DCs de modo a que as DCs facilitem o surgimento de respostas inmunitárias celulares e humorais. Os factores de maturação de DC tipicos são conhecidos na técnica e incluem, mas não estão limitados a, moléculas de estimulação, citocinas, quimiocinas, anticorpos e outros agentes, tais como ligandos Flt-3 (Figdor, C.G., et al. 2004. Nat Med 10:475-480; Pulendran, B., et al. 2000. J Immunol 165: 566-572; Maraskovsky, E., et al. 2000. Blood 96:878-884). Exemplos de factores de maturação de DC podem incluir, mas não estão limitados a, GM-CSF, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15, IL-21, IL-23, TNFoí, B7.1 , B7.2, 4-1BB, ligando de CD40 (CD40L) e CD40 induzido por fármaco (ÍCD40).

Moléculas de Direccionamento

Como discutido acima, uma molécula de direccionamento é uma glicoproteina E2 de alfavirus com mutação num sitio de ligação de sulfato de heparano que está incorporado num virus recombinante para direccionar o virus para as células dendriticas que expressam DC-SIGN.

Nalgumas formas de realização uma sequência tag é 41 PE2048955 incorporada numa molécula de direccionamento para permitir a detecção da expressão da molécula de direccionamento e a presença da molécula de direccionamento em partículas virais.

Os alfavírus, tais como o vírus da floresta de Semliki (SFV), vírus Ross River (RRV) e vírus Aura (AV) , compreendem as glicoproteínas de superfície, tais como El, E2 e E3. 0 derivado da glicoproteína E2 do vírus de Sindbis (SIN) é uma glicoproteína não retroviral que se liga especificamente a uma molécula em particular nas superfícies celulares (glicosaminoglicano sulfato de heparina para E2, ácido siálico para AH) e pode ser utilizada para criar moléculas de direccionamento nalgumas formas de realização. A sua fusão é relativamente independente da ligação a moléculas de receptor, e a activação de fusão é conseguida por acidificação no endossoma (Skehel e Wiley, Annu. Rev. Biochem. 69, 531-569 (2000); Smit, J. et al. J. Virol. 73, 8476-8484 (1999)). Além disso, pode tolerar determinadas modificações genéticas e permanecer eficientemente instalada na superfície retroviral (Morizono et al. J. Virol. 75, 8016-8020) . O gene que codifica a molécula de direccionamento é preferencialmente clonado num vector de expressão, tal como pcDNA3 (Invitrogen). As células de empacotamento, tais como as células 293T são então co-transfectadas com o vector virai que codifica um gene de interesse (tipicamente PE2048955 que codifica um antigénio), pelo menos um virus que codifica plasmideo com componentes de empacotamento, e um vector para expressão da molécula de direccionamento. Se a função de direccionamento está separada da função fusogénica, também é proporcionado um ou mais vectores que codificam uma molécula de afinidade e quaisquer componentes associados. A molécula de direccionamento é expressa na membrana da célula de empacotamento e incorporada no virus recombinante. A expressão de moléculas de direccionamento na superfície da célula de empacotamento pode ser analisada, por exemplo, por FACS.

Com base na informação obtida, por exemplo a partir de estudos estruturais e de modelação molecular, a mutagénese pode ser utilizada para gerar as formas mutantes de glicoproteinas que mantêm a sua capacidade fusogénica mas têm a especificidade de ligação desejada e/ou do nivel de ligação. Podem ser criados vários mutantes para cada glicoproteina e ensaiados utilizando os métodos descritos a seguir, ou outros métodos conhecidos na técnica, para identificar FMs com as caracteristicas mais desejadas. Por exemplo, pode ser testada a capacidade das moléculas de direccionamento em administrar antigénios especificamente a células dendriticas por determinação da sua capacidade para estimular uma resposta imunitária sem provocar efeitos secundários indesejados num mamífero. A capacidade de visar especificamente células dendriticas também pode ser directamente testada, por exemplo, em cultura de células, tal como descrito a seguir. 43 PE2048955

Para seleccionar moléculas de direccionamento adequadas (quer de tipo selvagem ou mutante), vírus que contêm a molécula de direccionamento (e uma molécula de afinidade quando adequado) são preparados e testados quanto à sua selectividade e/ou a sua capacidade em facilitar a penetração da membrana da célula alvo. Os vírus que exibem uma glicoproteína de tipo selvagem podem ser utilizados como controlos para examinar os efeitos de titulação em mutantes. As células que expressam o parceiro de ligação da molécula de direccionamento (ou molécula de afinidade quando adequado) são transduzidas pelo vírus utilizando um ensaio de infecção padrão. Após um tempo especificado, por exemplo 48 horas após a transdução, as células podem ser recolhidas e pode ser determinada a percentagem de células infectadas pelo vírus compreendendo a molécula de direccionamento (ou molécula de afinidade e molécula fusogénica) por, por exemplo, FACS. A selectividade pode ser avaliada por cálculo da percentagem de células infectadas por vírus. Da mesma forma, o efeito de mutações em título virai pode ser quantificado por divisão da percentagem de células infectadas por vírus compreendendo uma molécula de direccionamento mutante pela percentagem de células infectadas pelo vírus compreendendo a correspondente molécula de direccionamento de tipo selvagem. Um mutante preferido proporcionará a melhor combinação de selectividade e título infeccioso. Uma vez a molécula de direccionamento seleccionada, podem ser realizados os ensaios de concentração virais para confirmar que os vírus 44 ΡΕ2048955 com envelope pela FM possam ser concentrados. Os sobre-nadantes virais são recolhidos e concentrados por ultracen-trifugação. Os títulos dos vírus podem ser determinados por diluição limitada de solução de armazenamento virai e transdução de células que expressam o parceiro de ligação da molécula de afinidade.

Nalgumas formas de realização, a proteína de fusão BlaM-Vpr pode ser utilizada para avaliar a penetração virai e, assim, a eficácia de uma molécula de fusão (de tipo selvagem ou mutante). 0 vírus pode ser preparado, por exemplo, por transfecção transiente de células de empacotamento com um ou mais vectores compreendendo os elementos virais, BlaM-Vpr, e a FM de interesse (e uma molécula de afinidade se adequado). Os vírus resultantes podem ser utilizados para infectar células que expressam uma molécula a molécula de direccionamento (ou molécula de afinidade) que se liga especificamente na ausência ou na presença do inibidor livre de ligação (tal como um anticorpo). As células podem então ser lavadas com meio independente de C02 e carregadas com corante CCF2 (Aurora Bioscience). Após incubação à temperatura ambiente para permitir a conclusão da reacção de clivagem, as células podem ser fixadas com paraformaldeído e analisadas por FACS e microscopia. A presença de células azuis indica a penetração dos vírus no citoplasma; seria de esperar menos células azuis quando é adicionado anticorpo de bloqueio.

Para investigar se a penetração é dependente de 45 ΡΕ2048955 um valor de pH baixo, e seleccionar moléculas de direccionamento (ou moléculas fusogénicas) com a dependência de pH desejado, pode ser adicionado NH4C1 ou outro composto que altera o pH no passo de infecção (o NH4CI irá neutralizar os compartimentos ácidos de endossomas). No caso do NH4C1, o desaparecimento de células azuis irá indicar que a penetração de virus é dependente de pH baixo.

Além disso, para confirmar que a actividade é dependente de pH, podem ser adicionados ao tampão de incubação agentes lisossomotrópicos, tais como cloreto de amónio, cloroquina, concanamicina, bafilomicina Al, monensina, nigericina, etc. Estes agentes podem elevar o pH dentro dos compartimentos endossomais (e.g., Drose e Altendorf, J. Exp. Biol. 200, 1-8, 1997). O efeito inibidor destes agentes irá revelar o papel do pH para a fusão e penetração virai. As diferentes cinéticas de penetração entre os virus exibindo diferentes moléculas fusogénicas podem ser comparadas e a mais adequada seleccionada para uma aplicação em particular.

Os ensaios de entrada de PCR podem ser utilizados para monitorizar a transcrição reversa e assim determinar a cinética de síntese de DNA virai, como uma indicação da cinética de penetração virai. Por exemplo, as partículas virais compreendendo uma determinada molécula de direccionamento pode ser incubada com células de empacotamento, tais como células 293T que expressam o cognato adequado PE2048955 para a molécula de direccionamento (ou nalgumas formas de realização, uma molécula de afinidade separada). Imediatamente, ou após a incubação (para permitir que a infecção ocorra) , os vírus não ligados são removidos e são analisadas as alíquotas das células. O DNA pode então ser extraído destas alíquotas e realizadas semi-quantitativas utilizando primários específicos de LTR. A aparência dos produtos de DNA específicos de LTR irá indicar o sucesso da penetração virai e desencapsulamento.

Vectores

Numa forma de realização preferida, são utilizados um ou mais vectores para introduzir sequências de polinucleótidos numa linha celular de empacotamento para a preparação de um vírus recombinante tal como aqui descrito. Os vectores podem conter sequências de polinucleótidos que codificam os vários componentes do vírus recombinante, incluindo a molécula de direccionamento específica para DC, um(uns) gene(s) de interesse (que tipicamente codificam um antigénio) , e quaisquer componentes necessários para a produção do vírus que não são administrados pela célula de empacotamento. Nalgumas formas de realização, os vectores contendo sequências de polinucleótidos que codificam uma molécula de afinidade específica para DC e uma molécula fusogénica separada são substituídos por um vector que codifica uma molécula de direccionamento específica para DC na preparação do vírus. Os vectores de expressão de células eucarióticas são bem 47 ΡΕ2048955 conhecidos na técnica e estão disponíveis a partir de várias fontes comerciais.

Num aspecto da invenção, os vectores contendo sequências de polinucleótidos que codificam factores de maturação de DC também são utilizados para a preparação do vírus. Estes polinucleótidos estão tipicamente sob o controlo de um ou mais elementos reguladores que direccionam a expressão das sequências de codificação na célula de empacotamento e célula alvo, como adequado. Várias linhas de evidência demonstraram que o êxito da vacinação com DC é dependente do estado de maturação das DCs (Banchereau, J e Palucka, A.K. Nat. Rev. Immunol. 5:296-306 (2005); Schuler, G. et al. Curr. Opin. Immunol. 15:138-147 (2003); Figdor, C.G. et al. Nat. Med. 10:475-480 (2004)). A maturação pode transformar DCs a partir de células activamente envolvidas na captura de antigénio em células especializadas para o "priming" de células T. Num aspecto da invenção, o vector inclui genes que codificam as moléculas estimuladoras para desencadear a maturação de DC desejada. Tais moléculas estimuladoras também são referidas como factores de maturação ou de factores estimuladores de maturação.

Nalgumas formas de realização, as células de empacotamento são co-transfectadas com um vector virai que codifica um antigénio e um ou mais de vectores adicionais. Por exemplo, para além do vector virai que codifica um antigénio, de preferência um segundo vector transporta um 48 PE2048955 gene que codifica uma molécula de direccionamento que liga células dendriticas, tal como SVGmu, como descrito noutro local da aplicação. A molécula de direccionamento codifica uma glicoproteina E2 virai modificada que é especifica para DC-SIGN. A glicoproteina virai modificada é preferencialmente derivada do vírus de Sindbis. Nalgumas formas de realização, o vector virai que codifica um antigénio também inclui uma sequência de polinucleótido que codifica um factor de maturação de DC. Nalgumas formas de realização, a sequência de polinucleótido que codifica um factor de maturação de DC está contida num terceiro vector que é co-transfectado com o vector virai que codifica um antigénio e o um ou mais vectores adicionais nas células de empacotamento .

Noutras formas de realização, são utilizados um ou mais vectores de expressão multicistrónica que incluem dois ou mais dos elementos (e.g., os genes virais, gene(s) de interesse, a molécula de direccionamento, factores de maturação de DC) necessários para a produção do virus recombinante desejado em células de empacotamento. A utilização de vectores multicistrónicos reduz o número total de vectores necessários e assim evita as possíveis dificuldades associadas com a expressão de coordenação de vários vectores. Num vector multicistrónico os vários elementos a serem expressos estão operativamente ligados a um ou mais promotores (e outros elementos de controlo de expressão, se necessário). Em outras formas de realização é utilizado um vector multicistrónico compreendendo um gene 49 ΡΕ2048955 de interesse, um gene repórter e elementos virais. 0 gene de interesse codifica um antigénio e, opcionalmente, um factor de maturação de DC. Um tal vector pode ser co-transfectado, por exemplo, juntamente com um vector que codifica uma molécula de direccionamento, ou, nalgumas formas de realização, um vector multicistrónico que codifica uma FM e uma molécula de afinidade. Nalgumas formas de realização o vector multicistrónico compreende um gene que codifica um antigénio, um gene que codifica um factor de maturação de DC e elementos virais.

Cada componente a ser expresso num vector de expressão multicistrónica pode ser separado, por exemplo, por um elemento IRES ou um elemento 2A virai, para permitir a expressão separada de várias proteínas a partir do mesmo promotor. São conhecidos na técnica elementos IRES e elementos 2A (Patente US N° 4937190; de Felipe et al. 2004. Traffic 5: 616-626). Numa forma de realização, os oligonucleótidos que codificam sequências de sitios de clivagem de furina (RAKR) (Fang et al. 2005. Nat. Biotech 23: 584-590), ligados com sequências do tipo 2A de virus das doenças pé e boca (FMDV), virus da rinite equina A (ERAV), e virus asigna thosea (TAV) (Szymczak et ai. 2004. Nat. Biotechnol. 22: 589-594) são utilizados para separar elementos genéticos num vector multicistrónico. A eficácia de um vector multicistrónico em particular para utilização na sintese do virus recombinante desejado pode ser facilmente testado por detecção da expressão de cada um dos genes utilizando protocolos padrão. 50 ΡΕ2048955 A geração do(s) vector(es) pode ser realizada utilizando quaisquer técnicas de engenharia genética adequadas conhecidas na técnica, incluindo, sem limitação, as técnicas convencionais de digestão com endonucleases de restrição, ligação, transformação, a purificação do plasmideo, e sequenciação de DNA, como descrito por exemplo em Sambrook et al. (1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y.), Coffin et al. (Retroviruses. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. (1997)) e "RNA Viruses: A Practical Approach" (Alan J. Cann, Ed., Oxford University Press, (2000). 0(s) vector(es) pode(m) incorporar sequências do genoma de qualquer organismo conhecido. As sequências podem ser incorporadas na sua forma nativa ou podem ser modificadas de qualquer forma. Por exemplo, as sequências podem compreender inserções, eliminações ou substituições.

Os elementos de controlo de expressão que podem ser utilizados para regular a expressão dos componentes são conhecidos na técnica e incluem, mas não estão limitados a, promotores indutiveis, promotores constitutivos, sinais de secreção, potenciadores e outros elementos reguladores.

Numa forma de realização, um vector pode incluir um replicão procariótico, i.e., uma sequência de DNA tendo a capacidade de dirigir a replicação autónoma e manutenção da molécula de DNA recombinante extra-cromossomicamente ΡΕ2048955 numa célula hospedeira procariótica, tal como uma célula hospedeira bacteriana, transformada com o mesmo. Tais replicões são bem conhecidas na técnica. Além disso, os vectores que incluem um replicão procariótico também podem incluir um gene cuja expressão confere um marcador detectável, tal como uma resistência a fármacos. Os genes bacterianos tipicos de resistência a fármacos são os que conferem resistência a ampicilina ou tetraciclina. 0(s) vector(es) pode(m) incluir um ou mais genes de marcadores seleccionáveis que são eficazes numa célula eucariótica, tal como um gene para um marcador de selecção de resistência a fármacos. Este gene codifica um factor necessário para a sobrevivência ou crescimento de células hospedeiras transformadas cultivadas num meio de cultura selectivo. As células hospedeiras não transformadas com o vector contendo o gene de selecção não sobreviverão no meio de cultura. Os genes de selecção tipicos codificam proteínas que conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, e.g., ampicilina, neomicina, metotrexato ou tetraciclina, deficiências auxotróficas complementares, ou fornecem nutrientes críticos retidos nos meios. 0 marcador seleccionável pode opcionalmente estar presente num plasmídeo separado e introduzido por co-transfecção.

Os vectores irão normalmente conter um promotor que é reconhecido pela célula de empacotamento e que está operativamente ligado ao(s) polinucleótido(s) que codifica(m) a molécula de direccionamento, componentes PE2048955 virais, e semelhantes. Um promotor é um elemento de controlo de expressão formado por uma sequência de ácido nucleico que permite a ocorrência de ligação de RNA polimerase e a transcrição. Os promotores são sequências não traduzidas, que estão localizadas a montante (5') relativamente ao codão de iniciação de um gene estrutural (geralmente na gama de 100 a 1000 pb) , e controlam a transcrição e tradução da sequência de polinucleótido especifica de antigénio à qual estão operativamente ligados. Os promotores podem ser indutiveis ou constitutivos. A actividade dos promotores indutiveis é induzida pela presença ou ausência de factores bióticos ou abióticos. Os promotores indutiveis podem ser uma ferramenta útil em engenharia genética, porque a expressão de genes aos quais estão operacionalmente ligados pode ser ligada ou desligada em determinados estágios de desenvolvimento de um organismo ou num tecido em particular. Os promotores indutiveis podem ser agrupados como promotores regulados quimicamente e promotores regulados fisicamente. Os promotores regulados quimicamente típicos incluem, mas não estão limitados a, promotores regulados por álcool (e.g., promotor do gene do álcool desidrogenase I (alcA)) , promotores regulados por tetraciclina (e.g., promotor reactivo a tetraciclina) , promotor regulado por esteróide (e.g., promotor com base em receptor de glucocorticóide (GR) de murganho, promotor com base em receptor de estrogénio (ER) humano, promotor com base em receptor de ecdisona de traça, e os promotores baseados na superfamília de receptores de esteróide/re-tinóide/tiróide), promotores regulados por metal (e.g., 53 ΡΕ2048955 promotores com base em receptor de gene metalotioneína) e promotores relacionados com patogénese (e.g. promotores com base em proteína relacionada com patogénio de Arabidopsis e milho). Os promotores regulados fisicamente típicos incluem, mas não estão limitados a, promotores regulados por temperatura (e.g., promotores de choque térmico), e promotores regulados por luz (e.g. promotor SSU de soja). Outros exemplos de promotores estão descritos noutro local, por exemplo, no protocolo de transferência de hiper texto: //www.patentlens.net/daisy/promoters/768/271.html.

Um perito na técnica será capaz de seleccionar um promotor adequado com base nas circunstâncias específicas. Vários promotores diferentes são bem conhecidos na técnica, tal como os métodos para ligar operacionalmente o promotor ao gene a ser expresso. Podem ser utilizadas as sequências de promotor nativas e vários promotores heterólogos para direccionar a expressão na célula de empacotamento e célula alvo. No entanto, são preferidos os promotores heterólogos, uma vez que qeralmente permitem uma maior transcrição e rendimentos mais elevados da proteína desejada quando comparado com o promotor nativo. 0 promotor pode ser obtido, por exemplo, a partir dos genomas de vírus tais como vírus polioma, vírus da varíola aviária, adenovírus, vírus do papiloma bovino, vírus de sarcoma aviário, citomegalovírus, um retrovírus, vírus da hepatite B e Vírus Símio 40 (SV40) . O promotor pode também ser, por exemplo, um promotor mamífero 54 PE2048955 heterólogo, e.g., o promotor de actina ou um promotor de imunoglobulina, um promotor de choque térmico, ou o promotor normalmente associado à sequência nativa, desde que tais promotores sejam compatíveis com a célula alvo. Numa forma de realização, o promotor é o promotor virai que ocorre naturalmente num sistema de expressão virai. Nalgumas formas de realização, o promotor é um promotor especifico de célula dendrítica. 0 promotor especifico de célula dendritica pode ser, por exemplo, promotor de CDllc. A transcrição pode ser aumentada por inserção de uma sequência potenciadora no(s) vector(es). Os potenciadores são tipicamente elementos de DNA de actuação cis, com normalmente cerca de 10 a 300 pb de comprimento, que actuam num promotor para aumentar a sua transcrição. São agora conhecidas várias sequências potenciadoras de genes de mamífero (globina, elastase, albumina, a-fetoproteína e insulina). De preferência, será utilizado um potenciador de um vírus de células eucarióticas. Exemplos incluem o potenciador de SV40 no lado mais distante da origem de replicação (bp 100-270), o potenciador de promotor precoce de citomegalovírus, o potenciador de polioma no lado mais distante da origem de replicação, e potenciadores de adenovírus. 0 potenciador pode sofrer "splicing" no vector numa posição 5' ou 3' relativamente à sequência de polinucleótido específica de antigénio, mas está preferencialmente localizado num sítio 5' relativamente ao promotor. 55 PE2048955

Os vectores de expressão também irão conter sequências necessárias para a finalização da transcrição e para estabilizar o mARN. Estas sequências são frequentemente encontradas nas regiões não traduzidas de 5' e, ocasionalmente 3', de DNAs ou cDNAs eucarióticos ou virais e são bem conhecidas na técnica.

Os vectores plasmídeos contendo um ou mais dos componentes descritos acima são facilmente construídos utilizando técnicas padrão bem conhecidas na técnica.

Para a análise para confirmar as sequências correctas nos plasmídeos construídos, o plasmídeo pode ser replicado em E. coli, purificado e analisado por digestão com endonucleases de restrição e/ou sequenciado por métodos convencionais.

Também podem ser utilizados vectores que proporcionam a expressão transitória em células de mamiferos. A expressão transiente envolve a utilização de um vector de expressão que é capaz de se replicar eficazmente numa célula hospedeira, de tal forma que a célula hospedeira acumula várias cópias do vector de expressão e, por sua vez, sintetiza niveis elevados de um polipéptido codificado pelo polinucleótido específico de antigénio no vector de expressão. Ver Sambrook et al., supra, pp. 16.17-16.22.

Outros vectores e métodos adequados para adaptação à expressão dos polipéptidos virais são bem conhecidos 56 ΡΕ2048955 na técnica e são facilmente adaptados às circunstâncias especificas.

Utilizando os ensinamentos aqui proporcionados, um perito na técnica irá reconhecer que a eficácia de um sistema de expressão em particular pode ser testado por transformação de células de empacotamento com um vector compreendendo um gene que codifica uma proteína repórter e determinação da expressão utilizando uma técnica adequada, por exemplo, determinando a fluorescência de um conjugado de proteína fluorescente verde. Os genes repórter adequados são bem conhecidos na técnica. A transformação de células de empacotamento com os vectores da presente invenção é realizada por métodos bem conhecidos, e o método a ser utilizado não está limitado de qualquer forma. São conhecidos na técnica vários sistemas de administração não virais, incluindo por exemplo, electroporação, sistemas de administração com base em lípidos incluindo lipossomas, administração de DNA "nu", e administração utilizando compostos de policiclodextrina, tais como os descritos em Schatzlein AG. (2001. Non-Viral Vectors in Câncer Gene Therapy: Principies and Progresses. Anticancer Drugs) . São normalmente utilizados métodos de tratamento de sal ou lípido catiónicos, ver, por exemplo, Graham et al. (1973. Virol. 52:456; Wigler et al. (1979. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76:1373-76). O método de precipitação com fosfato de cálcio é preferido. No entanto, também podem ser utilizados outros métodos para a 57 PE2048955 introdução do vector em células, incluindo micro-injecção nuclear e fusão de protoplastos bacterianos.

Vector Virai e Células de Empacotamento

Um dos vectores codifica o virus nuclear (o "vector virai"). Há um grande número de vectores virais disponíveis que são adequados para utilização com a invenção, incluindo os identificados para as aplicações de terapia genética humana, tais como os descritos por Pfeifer e Verma (Pfeifer, A. e I.M. Verma. 2001. Annu. Rev. Genomics. Hum. Genet. 2:177-211). Os vectores virais adequados incluem vectores baseados em vírus de RNA, tais como vectores derivados de retrovírus, e.g., vectores derivados do vírus de Moloney da leucemia murina (MLV), e incluem vectores derivados de retrovírus mais complexos, e.g., vectores derivados de lentivírus. Vectores derivados de vírus da imunodeficiência humana (HIV-1) pertencem a esta categoria. Outros exemplos incluem vectores lentivirais derivados de HIV-2, vírus da imunodeficiência felina (FIV), vírus da anemia infecciosa equina, vírus da imunodeficiência símia (SIV) e vírus maedi/visna. O vector virai compreende preferencialmente um ou mais genes que codificam componentes do vírus recombinante, bem como um ou mais genes de interesse, tais como, por exemplo, um antigénio e/ou um factor de maturação de DC. O vector virai pode também compreender elementos genéticos que facilitam a expressão do gene de interesse numa célula 58 ΡΕ2048955 alvo, tais como sequências de promotor e potenciador. De forma a impedir a replicação na célula alvo, os genes virais endógenos necessários para a replicação podem ser removidos e administrados separadamente na linha celular de empacotamento.

Numa forma de realização preferida, o vector virai compreende uma LTR 5' retroviral intacta e uma LTR 3' de auto-inactivação.

Qualquer método conhecido na técnica pode ser utilizado para produzir partículas retrovirais infecciosas cujo genoma compreende uma cópia de RNA do vector virai. Para este propósito, o vector virai (juntamente com outros vectores que codificam o gene de interesse, a molécula de direccionamento especifica para DC, etc.) é introduzido de preferência numa linha celular com empacotamento de RNA genómico virai com base no vector virai em partículas virais. A linha celular de empacotamento proporciona as proteínas virais que são necessárias em trans para o empacotamento do RNA genómico virai em partículas virais. A linha celular de empacotamento pode ser qualquer linha celular que seja capaz de expressar proteínas retrovirais. As linhas celulares de empacotamento preferidas incluem 293 (ATCC CCL X), HeLa (ATCC CCL 2), D17 (ATCC CCL 183), MDCK (ATCC CCL 34), BHK (ATCC CCL-10) e Cf2Th (ATCC CRL 1430). A linha celular de empacotamento pode expressar estavelmente 59 ΡΕ2048955 as proteínas virais necessárias. Uma tal linha celular de empacotamento está descrita, por exemplo, na Patente US N° 6218181. Em alternativa, uma linha celular de empacotamento pode ser transfectada de forma transiente com plasmídeos compreendendo ácido nucleico que codifica uma ou mais proteínas virais necessárias, incluindo a molécula de direccionamento específica para DC (ou, em alternativa, uma molécula de afinidade específica para DC e molécula fusogénica), juntamente com os vectores virais que codificam o gene de interesse, que codifica tipicamente um antigénio e pode adicionalmente codificar um factor de maturação de DC.

As partículas virais compreendendo um polinucleótido com o gene de interesse e uma molécula de direccionamento que é específica para células dendríticas são recolhidas e deixadas a infectar a célula alvo. Nalgumas formas de realização preferidas, o vírus é pseudotipado para alcançar a especificidade da célula alvo. Os métodos para a pseudotipagem são bem conhecidos na técnica e também aqui descritos.

Numa forma de realização, o vírus recombinante utilizado para administrar o gene de interesse é um len-tivírus modificado e o vector virai baseia-se num lenti-vírus. Como os lentivírus são capazes de infectar células que se dividem e que não se dividem, nesta forma de realização não é necessário para as células alvo de se dividirem (ou para estimular as células alvo a dividirem-se). 60 ΡΕ2048955 O constructo virai compreende sequências de um genoma de lentivirus, tais como o genoma de HIV ou o genoma de SIV. O constructo virai compreende preferencialmente sequências das LTR 5' e 3' de um lentivirus. Mais preferencialmente, o constructo virai compreende as sequências R e U5 da LTR 5' de um lentivirus e LTR 3' inactivada ou auto-inactivada de um lentivirus. As sequências LTR podem ser sequências LTR de lentivirus de qualquer espécie. Por exemplo, elas podem ser sequências LTR de HIV, SIV, FIV ou BIV. De preferência, as sequências LTR são sequências LTR de HIV. O constructo virai compreende preferencialmente uma LTR 3' inactivada ou auto-inactivada. A LTR 3' pode ser tornada auto-inactivada por qualquer método conhecido na técnica. Na forma de realização preferida, o elemento U3 da LTR 3' contém uma eliminação da sua sequência potenciadora, de preferência a caixa TATA, sítios Spl e NF-kappa B. Como resultado da auto-inactivação de LTR 3', o pró-virus que é integrado no genoma da célula hospedeira irá compreender um LTR 5' inactivado.

Opcionalmente, a sequência U3 da LTR 5' lentiviral pode ser substituída por uma sequência de promotor no constructo virai. Isto pode aumentar o título de vírus recuperado da linha celular de empacotamento. Uma sequência potenciadora pode também ser incluída. Pode ser utilizada qualquer combinação de potenciador/promotor que 61 PE2048955 aumenta a expressão do genoma de RNA virai na linha celular de empacotamento. Numa forma de realização preferida é utilizada a sequência intensificador/promotor de CMV.

Nalgumas formas de realização preferidas, o cons-tructo compreende sequências de um genoma gamaretrovirus, tais como o genoma do virus de células estaminais de murganho (MSCV) ou o genoma do virus da leucemia murina (MLV). 0 constructo virai compreende preferencialmente sequências de LTR 5' e 3' de um gamaretrovirus. As sequências LTR podem ser sequências LTR de qualquer gamaretrovirus de quaisquer espécies. Por exemplo, podem ser sequências LTR do virus de células estaminais de murganho (MSCV), virus da leucemia murina (MLV), virus da leucemia felina (FLV), virus do sarcoma felino (FAV), virus da reticuloendoteliose aviária (ARV). De preferência, as sequências LTR são sequências LTR de MLV e MSCV.

Nalgumas formas de realização, o constructo virai compreende preferencialmente uma LTR 3' inactivada ou auto-inactivada. A LTR 3' pode ser tornada auto-inactivada por qualquer método conhecido na técnica. Na forma de realização preferida, o elemento U3 da LTR 3' contém uma eliminação da sua sequência potenciadora, de preferência a caixa TATA, sitios Spl e NF-kappa B. Como resultado da auto-inactivação de LTR 3', o pró-virus que é integrado no genoma da célula hospedeira irá compreender uma LTR 5' inactivada. 62 ΡΕ2048955

Opcionalmente, a sequência U3 da LTR 5' gama-retroviral pode ser substituída com uma sequência promotora no constructo virai. Isto pode aumentar o titulo de virus recuperado da linha celular de empacotamento. Uma sequência potenciadora também pode ser incluida. Pode ser utilizada qualquer combinação de potenciador/promotor que aumenta a expressão do genoma de RNA virai na linha celular de empacotamento. Numa forma de realização preferida é utilizada a sequência intensificador/promotor CMV. 0 constructo virai compreende um gene que codifica um antigénio que é desejavelmente expresso em uma ou mais células alvo. De preferência, o gene de interesse está localizado entre as sequências LTR 5' e 3'. Além disso, o gene de interesse está de preferência numa relação funcional com outros elementos genéticos, por exemplo, sequências reguladoras da transcrição, tais como promotores e/ou potenciadores, para regular a expressão do gene de interesse de um modo particular uma vez o gene incorporado na célula alvo. Em determinadas formas de realização, as sequências reguladoras da transcrição úteis são as que são altamente reguladas em relação à actividade, tanto temporalmente como espacialmente.

Nalgumas formas de realização, o gene de interesse está numa relação funcional com sequências reguladoras de promotor/potenciador internas. Um promotor/po-tenciador "interno" é um que está localizado entre as sequências LTR 5' e LTR 3' no constructo virai e está 63 PE2048955 operacionalmente ligado ao gene que é desejavelmente expresso. 0 promotor/estimulador interno pode ser qualquer promotor, potenciador ou combinação promotor/potenciador conhecido para aumentar a expressão de um gene com o qual ele está numa relação funcional. Uma "relação funcional" e "ligado operativamente" significa, sem limitação, que o gene que está na localização e orientação correctas em relação ao promotor e/ou potenciador, cuja expressão do gene será afectada quando o promotor e/ou potenciador está em contacto com as moléculas adequadas. 0 promotor/potenciador interno é preferencialmente seleccionado com base no padrão de expressão desejado do gene de interesse e as propriedades especificas dos promotores/intensificadores conhecidos. Assim, o promotor interno pode ser um promotor constitutivo. Exemplos não limitativos de promotores constitutivos que podem ser utilizados incluem o promotor de ubiquitina, CMV (Karasuyama et al. 1989. J. Exp. Med. 169:13), beta-actina (Gunning et al. 1989. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:4831-4835) e pgk (ver, por exemplo, Adra et al. 1987 . Gene 60:65-74; Singer-Sam et al. 1984. Gene 32:409-417; e Dobson et al. 1982. Nucleic Acids Res. 10:2635-2637).

Em alternativa, o promotor pode ser um promotor especifico de tecido. Nalgumas formas de realização preferidas, o promotor é um promotor especifico da célula 64 ΡΕ2048955 alvo. Por exemplo, o promotor pode ser o promotor específico de célula dendrítica CDllc (Masood, R. et al. 2001. Int J Mol Med 8:335-343; Somia, N.V., et al. 1995. Proc Acad Sei USA 92:7570-7574.) Além disso, os promotores podem ser seleccionados para permitir a expressão indutível do gene. São conhecidos na técnica vários sistemas para expressão indutível, incluindo o sistema reactivo a tetraciclina e o sistema operador-repressor lac. Também está contemplado que pode ser utilizada uma combinação de promotores para obter a expressão desejada do gene de interesse. O perito na técnica será capaz de seleccionar um promotor com base no padrão de expressão desejada do gene no organismo e/ou na célula alvo de interesse.

Nalgumas formas de realização, o constructo virai compreende preferencialmente pelo menos um promotor de Polimerase II ou III de RNA. O promotor de Polimerase II ou III de RNA está operativamente ligado ao gene de interesse e pode também estar ligado a uma sequência de terminação. Além disso, pode ser incorporado mais do que um promotor de Polimerase II ou III de RNA.

Os promotores de polimerase II e III de RNA são bem conhecidos pelo perito na técnica. Pode ser encontrada uma gama adequada de promotores de polimerase III de RNA em, por exemplo, Paule e White. Nucleic Acids Research., Vol 28, pp 1283-1298 (2000) . A definição de promotores de polimerase II ou III de RNA, respectivamente, também inclui qualquer fragmento de DNA sintético ou de engenharia que 65 PE2048955 pode dirigir a polimerase II ou III de RNA, respectivamente, para transcrever as suas sequências de codificação de RNA a jusante. Além disso, o promotor ou promotores de polimerase II ou III (Pol II ou III) de RNA utilizado(s) pode(m) ser indutivel(eis) como parte do vector virai. Pode ser utilizado qualquer promotor de Pol II ou III indutivel adequado com os métodos da invenção. Os promotores de Pol II ou III particularmente adequados incluem os promotores que respondem a tetraciclina proporcionados em Ohkawa e Taira Human Gene Therapy, Vol. 11, pp 577-585 (2000) e em Meissner et al. Nucleic Acids Research, Vol. 29, pp 1672-1682 (2001).

Um potenciador interno também pode estar presente no constructo virai para aumentar a expressão do gene de interesse. Por exemplo, pode ser utilizado o potenciador de CMV (Karasuyama et al. 1989. J. Exp. Med. Chem. 169:13). Nalgumas formas de realização, o potenciador de CMV pode ser utilizado em combinação com o promotor de β-actina de galinha. Um perito na técnica será capaz de seleccionar o potenciador adequado com base no padrão de expressão desej ada. 0 polinucleótido que codifica um antigénio contra o qual uma resposta imunitária é desejada não está limitado de qualquer forma e inclui qualquer ácido nucleico que o perito na técnica deseje ter integrado, transcrito, traduzido e/ou expresso na célula alvo. 66 ΡΕ2048955

Além disso, nalgumas formas de realização polinucleótido pode conter mais do que um gene interesse, que pode ser colocado numa relação funcional com o promotor virai. 0 gene de interesse pode codificar uma proteina, um siRNA ou um microRNA. Nalgumas formas de realização, o polinucleótido a ser administrado pode compreender genes múltiplos que codificam pelo menos uma proteina, pelo menos um siRNA, pelo menos um microRNA ou quaisquer combinações dos mesmos. Por exemplo, o polinucleótido a ser administrado pode incluir um ou mais genes que codificam um ou mais antigénios contra os quais é desejada uma resposta imunitária. Os um ou mais antigénios podem estar associados a uma doença ou distúrbio único, ou podem estar associados a várias doenças e/ou distúrbios. Nalgumas formas de realização, um gene que codifica uma proteina de regulação imunitária pode ser construído com um gene primário que codifica um antigénio para o qual é desejada uma resposta imunitária, e a combinação pode provocar e regular a resposta imunitária para a direcção e magnitude desejadas. Nalgumas formas de realização, um gene que codifica um siRNA ou microRNA pode ser construído com um gene primário que codifica um antigénio contra o qual é desejada uma resposta imunitária, e a combinação pode regular a extensão da resposta imunitária. (Ver, por exemplo, formas de realização de polinucleótidos na Figura 24c e Figura 24d, com as sequências que acompanham em SEQ ID N°: 9 e SEQ ID N°: 10, respectivamente.) Nalgumas formas de realização, um gene que codifica uma proteína marcadora pode ser colocado após um gene primário de interesse para 67 ΡΕ2048955 permitir a identificação de células que estão a expressar a proteina desejada. Numa forma de realização, uma proteina marcadora fluorescente, de preferência a proteina verde fluorescente (GFP), é incorporada no constructo juntamente com o gene de interesse (que normalmente codifica um antigénio) . Se está incluido mais do que um gene, são também preferencialmente incluídas sequências de locais de entrada internos no ribossoma (IRES), ou elementos 2A, separando o gene primário de interesse de um gene repórter e/ou de qualquer outro gene de interesse. As sequências IRES ou 2A podem facilitar a expressão do gene repórter, ou de outros genes. 0 constructo virai também pode conter elementos genéticos adicionais. Os tipos de elementos que podem ser incluídos no constructo não estão limitados de qualquer forma e serão escolhidos pelo perito na técnica para conseguir um resultado em particular. Por exemplo, pode ser incluido um sinal que facilita a entrada nuclear do genoma virai na célula alvo. Um exemplo de tal sinal é o sinal flap do HIV-1.

Além disso, podem ser incluídos elementos que facilitam a caracterização do sitio de integração do provirus na célula alvo. Por exemplo, uma sequência supressora âmbar de tRNA pode ser incluida no constructo.

Além disso, o constructo pode conter um ou mais elementos genéticos destinados a aumentar a expressão do 68 ΡΕ2048955 gene de interesse. Por exemplo, um elemento de resposta a virus da hepatite das marmotas (WRE) pode ser colocado no constructo (Zufferey et al. 1999. J. Virol. 74:3668-3681;

Deglon et al. 2000. Hum. Gene Ther. 11:179-190).

Um isolador β-globina de galinha também pode ser incluido no constructo virai. Foi demostrando que este elemento reduz a possibilidade de silenciar o provirus integrado na célula alvo devido aos efeitos de metilação e heterocromatinizaçao. Além disso, o isolador pode proteger o gene interno potenciador, promotor e exógeno dos efeitos de posição positivos ou negativos do DNA circundante no local de integração no cromossoma.

Quaisquer elementos genéticos adicionais são preferencialmente inseridos em 3' do gene de interesse.

Numa forma de realização especifica, o vector virai compreende: uma sequência potenciadora/promotora de citomegalovirus (CMV) ; as sequências R e U5 da LTR 5' de HIV; o sinal flap de HIV-1; um potenciador interno; um promotor interno; um gene de interesse; o elemento de resposta do virus da hepatite das marmotas; uma sequência supressora âmbar de tRNA; um elemento U3 com uma eliminação da sua sequência potenciadora; o isolador β-globina de galinha; e as sequências R e U5 da LTR 3' do HIV. O constructo virai é de preferência clonado num plasmideo que pode ser transfectado numa linha celular de 69 ΡΕ2048955 empacotamento. 0 plasmídeo preferido compreende preferencialmente sequências úteis para a replicação do plasmídeo em bactérias.

Administração do Vírus 0 vírus pode ser administrado a uma célula alvo de qualquer forma que permita o contacto do vírus com as células dendríticas alvo (DCs) nas quais seja desejada a administração de um polinucleótido de interesse. Em formas de realização preferidas, uma quantidade adequada de vírus é directamente introduzida num animal (in vivo), por exemplo, por injecção no corpo. Nalgumas formas de realização preferidas, as partículas virais são injectadas numa corrente sanguínea periférica de mamífero. Noutras formas de realização preferidas, as partículas virais são injectadas num mamífero por injecção intradérmica, injecção subcutânea, injecção na cavidade intra-peritoneal ou injecção intra-venal. 0 vírus pode ser administrado utilizando um dispositivo de injecção subdérmica tais como os dispositivos descritos nas patentes US N° 7241275, 7115108, 7108679, 7083599, 7083592, 7047070, 6971999, 6808506, 6780171, 6776776, 6689118, 6670349, 6569143, 6494865, 5997501, 5848991, 5328483, 5279552, 4886499. São também adequados outros locais de injecção, tal como directamente nos órgãos compreendendo as células alvo. Por exemplo, pode ser utilizada injecção intra-gânglio linfático, injecção intra-baço ou injecção intra-medula óssea para administrar o vírus ao gânglio linfático, baço e 70 PE2048955 medula óssea, respectivamente. Dependendo das circunstâncias em particular e natureza das células alvo específicas, a introdução pode ser realizada por outros meios incluindo por exemplo, inalação ou contacto directo com tecidos epiteliais, por exemplo os no olho, boca ou pele.

Noutras formas de realização, as células alvo são administradas e feitas contactar com o vírus in vitro, tal como em placas de cultura. As células alvo são tipicamente células dendríticas obtidas de um sujeito saudável ou um sujeito necessitado de tratamento. De preferência, as células alvo são obtidas a partir de células dendríticas de um sujeito no qual é desejável estimular uma resposta imunitária para um antigénio. Os métodos para obter células de um sujeito são bem conhecidos na técnica. O vírus pode ser suspenso em meios e adicionado aos poços de uma placa de cultura, tubo ou outro recipiente. Os meios contendo o vírus podem ser adicionados antes da colocação das células em placas ou após a colocação das células em placas. De preferência, as células são incubadas numa quantidade adequada de meios para proporcionar a viabilidade e permitir as concentrações adequadas de vírus nos meios de tal forma que ocorra a infecção da célula hospedeira.

As células são preferencialmente incubadas com o vírus durante um período de tempo suficiente para permitir que o vírus infecte as células. De preferência, as células são incubadas com o vírus durante pelo menos 1 hora, mais 71 PE2048955 preferencialmente pelo menos 5 horas, e ainda mais preferencialmente pelo menos 10 horas.

Em ambas as formas de realização de administração in vivo e in vitro, pode ser utilizada qualquer concentração de virus que seja suficiente para infectar as células alvo desejadas, como pode ser facilmente determinado pelo perito na técnica. Quando a célula alvo é para ser cultivada, a concentração das partículas virais é de pelo menos 1 PFU/pL, mais preferencialmente de pelo menos 10 PFU/pL, ainda mais preferencialmente de pelo menos 400 PFU/pL e ainda mais preferencialmente de pelo menos 1 x 104 PFU/pL.

Nalgumas formas de realização, após a infecção com o vírus in vitro, as células alvo podem ser introduzidas (ou reintroduzidas) num animal. Nalgumas formas de realização, as células podem ser introduzidas na derme, sob a derme, ou na corrente sanguínea periférica. As células introduzidas num animal são preferencialmente células derivadas do referido animal, para evitar uma resposta imunitária adversa. Também podem ser utilizadas células derivadas de um animal doador tendo uma base imunitária semelhante. Também podem ser utilizadas outras células, incluindo as concebidas para evitar uma resposta imunogénica adversa.

As células alvo podem ser analisadas, por exemplo, para a integração, transcrição e/ou expressão do 72 ΡΕ2048955 polinucleótido ou gene(s) de interesse, o número de cópias do gene integrado e a localização da integração. Tal análise pode ser realizada em qualquer momento e pode ser realizada por quaisquer métodos conhecidos na técnica.

Os sujeitos em que um virus recombinante ou DCs infectadas com virus são administrados podem ser analisados relativamente à localização de células infectadas, expressão do polinucleótido administrado com o virus ou gene de interesse, estimulação de uma resposta imunitária, e monitorizados relativamente a sintomas associados a uma doença ou distúrbio por quaisquer métodos conhecidos na técnica.

Os métodos de infecção de células descritos acima não dependem de caracteristicas especificas individuais das células. Como um resultado, são prontamente estendidos a todos os mamíferos. Nalgumas formas de realização, o vírus recombinante é administrado a um humano ou a células dendríticas humanas. Noutras formas de realização, o vírus recombinante é administrado a um murganho ou a células dendríticas de murganho. Ainda noutras formas de realização, o vírus recombinante é administrado a um animal que não seja um humano ou um murganho, ou a células dendríticas de um animal que não um humano ou um murganho.

Como discutido acima, o vírus recombinante pode ser pseudotipado para lhe conferir uma vasta gama de hospedeiros bem como especificidade de célula alvo. Um 73 ΡΕ2048955 perito na técnica também estaria ciente de promotores internos adequados para conseguir a expressão desejada de um polinucleótido ou gene de interesse numa espécie animal em particular. Assim, um perito na técnica será capaz de modificar o método de infectar células dendriticas derivadas de qualquer espécie. 0 virus recombinante pode ser avaliado para determinar a especificidade da molécula alvo incorporada no virus que tem como alvo as células dendriticas. Por exemplo, pode ser obtida uma população mista de células da medula óssea de um sujeito e cultivadas in vitro. 0 virus recombinante pode ser administrado à população mista de células de medula óssea e pode ser avaliada a expressão de um gene repórter incorporado no virus nas células em cultura. Nalgumas formas de realização, pelo menos cerca de 50%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 60%, 70%, 80% ou 90%, ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 95% das células transduzidas na população de células mistas são células dendriticas que expressam DC-SIGN.

Terapêutica

Os métodos da presente invenção podem ser utilizados para prevenir ou tratar uma grande variedade de doenças ou distúrbios, particularmente aqueles para os quais seria benéfica a activação de uma resposta imunitária num doente. Muitas dessas doenças são bem conhecidas na técnica. Por exemplo, as doenças ou distúrbios que são - 74 - ΡΕ2048955 susceptíveis de tratamento ou prevenção pelos métodos da presente invenção incluem, sem limitação, cancros, doenças auto-imunitárias e infecções, incluindo infecções virais, bacterianas, fúngicas e parasitárias. Em formas de realização da invenção, uma doença é tratada por utilização de virus recombinantes para administrar um gene de interesse às células dendriticas, em que a expressão do gene produz um antigénio especifico da doença e conduz à estimulação de respostas imunitárias celulares específicas de antigénio e de respostas imunitárias humorais.

Em formas de realização da invenção, é utilizado um vírus recombinante para administrar polinucleótidos que codificam um antigénio contra o qual é desejada uma resposta imunitária para as células dendriticas. Nalgumas formas de realização, a administração pode ser conseguida por contacto das células dendriticas com o vírus recombinante in vitro, após o que as células dendriticas transduzidas são administradas a um doente. Nalgumas formas de realização, a administração pode ser conseguida, por administração do vírus a um sujeito para o contacto in vivo com células dendriticas. As células dendriticas estimulam então as células T ou B específicas de antigénio num doente para induzir respostas imunitárias celulares e humorais para o antigénio expresso. Em tais formas de realização, um doente que sofre de uma doença ou distúrbio é tratado por geração de células imunitárias com uma especificidade desej ada. 75 ΡΕ2048955

Qualquer antigénio que está associado a uma doença ou distúrbio pode ser administrado a células dendríticas utilizando os virus recombinantes, como aqui descrito. Um antigénio que está associado com a doença ou distúrbio é identificado para a preparação de um virus recombinante que tem como alvo células dendriticas. São bem conhecidos na técnica antigénios associados a várias doenças e distúrbios. Um antigénio pode ser previamente conhecido como estando associado à doença ou distúrbio, ou pode ser identificado por qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, um antigénio para um tipo de cancro do qual um doente sofre pode ser conhecido como um antigénio associado a tumor. Num aspecto, a invenção proporciona um método para administrar genes que codificam antigénios tumorais e outras proteinas necessárias para DCs in vivo utilizando lentivirus recombinante de engenharia. Noutras formas de realização, um antigénio relacionado com a doença ou distúrbio é identificado a partir do doente a ser tratado. Por exemplo, pode ser identificado um antigénio associado a um tumor a partir do próprio tumor por qualquer método conhecido na técnica. Os antigénios associados a tumores não estão limitados de qualquer forma, e incluem, por exemplo, antigénios identificados nas células cancerígenas do doente a ser tratado. São conhecidos antigénios associados a tumores para uma variedade de cancros, incluindo, por exemplo, cancro da próstata e cancro da mama. Nalguns cancros da mama, por exemplo, o receptor Her-2 é sobre-expresso na 76 ΡΕ2048955 superfície de células cancerígenas. Exemplos de antigénios tumorais incluem, mas não estão limitados a: MAGE, BAGE, RAGE, e NY-ESO, que são antigénios sem mutação expressos nas áreas imuno-privilegiadas dos testes e numa variedade de células tumorais; antigénios de tumor específicos de linhagem, tais como os antigénios de linhagem melanócito-melanoma MART-1/Melan-A, gplOO, gp75, mda-7, proteína tirosinase e relacionada com tirosinase, ou o antigénio de membrana específico da próstata (PSMA) e antigénio específico da próstata (PSA), que são antigénios expressos em células normais e neoplásicas derivadas do mesmo tecido; proteínas/péptidos de epítopo derivados de genes mutantes em células de tumor ou genes transcritos em diferentes níveis em tumor quando comparado com células normais, tais como ras mutante, rearranjo bcr/abl, Her2/neu, p53 mutante ou do tipo selvagem, 1B1 do citocromo P450, e sequências de intrões expressas de forma anormal tal como N-acetilglucosaminiltransferase-V; rearranjos clonais de genes de imunoglobulina que geram idiótipos únicos em mieloma e linfomas de células B; proteínas/péptidos de epítopo derivados de processos oncovirais, tais como as proteínas E6 e E7 do vírus do papiloma humano; proteínas oncofetais sem mutação com uma expressão selectiva de tumor, tais como antigénio carcinoembrionário e alfa-fetoproteína. Foram revistos vários antigénios associados a tumor (ver, por exemplo, "Tumor-Antigens Recognized By T-Lymphocytes", Boon T, Cerottini J C, Vandeneynde B, Vanderbruggen P, Vanpel A, Annual Review of Immunology 12: 337-365, 1994; "A listing of human tumor antigens 77 ΡΕ2048955 recognized by T cells", Renkvist N, Castelli C, Robbins P F, Parmiani G. Câncer Iinmunology Immunotherapy 50: (1) 3-15 MAR 2001). O antigénio também pode ser de um antigénio associado a uma doença infecciosa, tal como, por exemplo, HIV/SIDA. O antigénio pode ser, por exemplo, gpl20 (Klimstra, W.B., et ai. 2003. J Virol 11:12022-12032; Bernard, K.A., et ai. 2000. Virology 276:93-103; Byrnes, A.P., et ai. 1998. J Virol 72: 7349-7356). Outros exemplos de antigénios incluem, mas não estão limitados a: gag, pol, env, tat, nef e rev (Lieberman, J. et ai. 1997. AIDS Res Hum Retroviruses 13(5): 383-392; Menendez-Arias, L. et ai. 1998. Virai Immunol 11(4): 167-181).

Exemplos de antigénios virais incluem, mas não estão limitados a, polipéptidos de adenovirus, polipéptidos de alfavirus, polipéptidos de calicivirus, e.g., um antigénio de capsideo de calicivirus, polipéptidos de coronavirus, polipéptidos do virus da cinomose, polipéptidos do virus Ebola, polipéptidos de enterovirus, polipéptidos de flavivirus, polipéptidos do virus da hepatite (AE), e.g., um núcleo ou antigénio de superfície da hepatite B, polipéptidos de herpesvirus, e.g., glicoproteina do vírus herpes simplex ou do virus varicela zoster, polipéptidos do virus da imunodeficiência, e.g., o envelope ou protease do virus da imunodeficiência humana, polipéptidos do virus da peritonite infecciosa, polipéptidos do virus influenza, e.g., uma hemaglutinina A, 78 PE2048955 neuraminidase ou nucleoproteína do vírus influenza, poli-péptidos do vírus da leucemia, polipéptidos do vírus Marburg, polipéptidos do ortomixovírus, polipéptidos do vírus de papiloma, polipéptidos do vírus parainfluenza, e.g., a hemaglutinina/neuraminidase, polipéptidos do para-mixovírus, polipéptidos do parvovírus, polipéptidos do pestivírus, polipéptidos do picornavírus, e.g., um polipéptido de capsídeo de poliovirus, polipéptidos do vírus da varíola, e.g., um polipéptido do vírus vaccinia, polipéptidos do vírus da raiva, e.g., uma glicoproteína G do vírus da raiva, polipéptidos de reovírus, polipéptidos de retrovírus e polipéptidos de rotavírus.

Exemplos de antigénios bacterianos incluem, mas não estão limitados a, polipéptidos de Actinomyces, polipéptidos de Bacillus, polipéptidos de Bacteroides, polipéptidos de Bordetella, polipéptidos de Bartonella, polipéptidos de Borrelia, e.g., OspA de B. burgdorferi, polipéptidos de Brucella, polipéptidos de Campylobacter, polipéptidos de Capnocytophaga, polipéptidos de Chlamydia, polipéptidos de Clostridium, polipéptidos de Coryne— bacterium, polipéptidos de Coxiella, polipéptidos de Derma-tophilus, polipéptidos de Enterococcus, polipéptidos de Ehrlichia, polipéptidos de Escherichia, polipéptidos de Francisella, polipéptidos de Fusobacterium, polipéptidos de Haemobartonella, e.g., Haemophilus, proteína da membrana externa do tipo b de H. influenzae, polipéptidos de Helicobacter, polipéptidos de Klebsiella, polipéptidos de bactérias com forma L, polipéptidos de Leptospira, 79 ΡΕ2048955 polipéptidos de Listeria, polipéptidos de Mycobacteria, polipéptidos de Mycoplasma, polipéptidos de Neisseria, polipéptidos de Neorickettsia, polipéptidos de Nocardia, polipéptidos de Pasteurella, polipéptidos de Peptococcus, polipéptidos de Peptostreptococcus, polipéptidos de Pneumo-coccus, polipéptidos de Proteus, polipéptidos de Pseudo-monas, polipéptidos de Rickettsia, polipéptidos de Rocha-limaea, polipéptidos de Salmonella, polipéptidos de Shi-gella, polipéptidos de Staphylococcus, polipéptidos de Streptococcus, e.g., proteínas M de S. pyogenes, polipéptidos de Treponema, e polipéptidos de Yersinia, e.g., antigénios F1 e V de Y. pestis.

Exemplos de antigénios de fungos incluem, mas não estão limitados a, polipéptidos de Absidia, polipéptidos de Acremonium, polipéptidos de Alternaria, polipéptidos de Aspergillus, polipéptidos de Basidiobolus, polipéptidos de Bipolaris, polipéptidos de Blastomyces, polipéptidos de Candida, polipéptidos de Coccidioides, polipéptidos de Conidiobolus, polipéptidos de Cryptococcus, polipéptidos de Curvalaria, polipéptidos de Epidermophyton, polipéptidos de Exophiala, polipéptidos de Geotrichum, polipéptidos de Histoplasma, polipéptidos de Madurella, polipéptidos de Malassezia, polipéptidos de Microsporum, polipéptidos de Moniliella, polipéptidos de Mortierella, polipéptidos de Mucor, polipéptidos de Paecilomyces, polipéptidos de Penicillium, polipéptidos de Phialemonium, polipéptidos de Phialophora, polipéptidos de Prototheca, polipéptidos de Pseudallescheria, polipéptidos de Pseudomicrodochium, 80 PE2048955 polipéptidos de Pythium, polipéptidos de Rhinosporidium, polipéptidos de Rhizopus, polipéptidos de Scolecobasidium, polipéptidos de Sporothrix, polipéptidos de Stemphylium, polipéptidos de Trichophyton, polipéptidos de Trichosporon e polipéptidos de Xylohypha.

Exemplos de antigénios de parasitas protozoários incluem, mas não estão limitados a, polipéptidos de Babesia, polipéptidos de Balantidium, polipéptidos de Besnoitia, polipéptidos de Cryptosporidium, polipéptidos de

Eimeria, polipéptidos de Encephalitozoon, polipéptidos de Entamoeba, polipéptidos de Giardia, polipéptidos de Hammondia, polipéptidos de Hepatozoon, polipéptidos de Isospora, polipéptidos de Leishmania, polipéptidos de Microsporidia, polipéptidos de Neospora, polipéptidos de Nosema, polipéptidos de Pentatrichomonas, polipéptidos de

Plasmodium, e.g., circunsporozoito de P. falciparum (PfCSP), proteína 2 de superfície do esporozoíto (PfSSP2), extremidade carboxilo do antigénio 1 de estágio de fígado (PfLSAl c-term), e proteína 1 exportada (PfExp-1), polipéptidos de Pneumocystis, polipéptidos de Sarcocystis, polipéptidos de Schistosoma, polipéptidos de Theileria, polipéptidos de Toxoplasma e polipéptidos de Trypanosoma.

Exemplos de antigénios de parasitas helmintos incluem, mas não estão limitados a, polipéptidos de Acanthocheilonema, polipéptidos de Aelurostrongylus, polipéptidos de Ancylostoma, polipéptidos de Angiostrongylus, polipéptidos de Ascaris, polipéptidos de 81 ΡΕ2048955

Brugia, polipéptidos de Bunostomum, polipéptidos de Capillaria, polipéptidos de Chabertia, polipéptidos de Cooperia, polipéptidos de Crenosoma, polipéptidos de Dictyocaulus, polipéptidos de Dioctophyme, polipéptidos de Dipetalonema, polipéptidos de Diphyllobothrium, polipéptidos de Diplydium, polipéptidos de Dirofliaria, polipéptidos de Dracunculus, polipéptidos de Enterobius, polipéptidos de Filaroides, polipéptidos de Haemonchus, polipéptidos de Lagochilascaris, polipéptidos de Loa, polipéptidos de Mansonella, polipéptidos de Muellerius, polipéptidos de Nanophyetus, polipéptidos de Necator, polipéptidos de Nematodirus, polipéptidos de Oesophagostomum, polipéptidos de Onchocerca, polipéptidos de Opisthorchis, polipéptidos de Ostertagia, polipéptidos de Para filaria, polipéptidos de Paragonimus, polipéptidos de Parascaris, polipéptidos de Physaloptera, polipéptidos de Protos-trongylus, polipéptidos de Setaria, polipéptidos de Spiro-cerca, polipéptidos de Spirometra, polipéptidos de Stepha-nofilaria, polipéptidos de Strongyloides, polipéptidos de Strongylus, polipéptidos de Thelazia, polipéptidos de Toxascaris, polipéptidos de Toxocara, polipéptidos de Trichinella, polipéptidos de Trichostrongylus, polipéptidos de Trichuris, polipéptidos de Uncinaria e polipéptidos de Wuchereria.

Exemplos de antigénios de ectoparasitas incluem, mas não estão limitados a, polipéptidos (incluindo antigénios protectores bem como alergénios) de pulgas; carraças, incluindo carraças duras e carraças moles; moscas, 82 ΡΕ2048955 tais como melgas, mosquitos, moscas da areia, moscas negras, moscas do cavalo, mosca dos chifres, moscardos, moscas tsé-tsé, moscas estáveis, moscas causadoras de miíase e mosquitos picadores; formigas; aranhas; piolhos; ácaros; e percevejos verdadeiros, tais como percevejos da cama e barbeiros.

Uma vez o antigénio identificado e/ou selec-cionado, é identificado um polinucleótido que codifica o antigénio desejado. De preferência, o polinucleótido compreende um cDNA. Os polinucleótidos que codificam o antigénio são de preferência introduzidos em células dendriticas alvo, utilizando um vírus recombinante, mais preferencialmente um lentivírus ou gamaretrovírus recombinante, incluindo uma molécula de direccionamento que liga DC-SIGN, como descrito acima. 0 vírus recombinante primeiro liga-se à membrana da célula dendrítica pela molécula de direccionamento a DC-SIGN, e o núcleo virai contendo um polinucleótido que codifica o antigénio subsequentemente entra no citosol. 0 polinucleótido (e.g., um que codifica o antigénio) é, então integrado de preferência no genoma da célula e expresso. Se houver contacto ex vivo, as células dendriticas alvo são então transferidas de volta ao doente, por exemplo por injecção, onde interagem com células imunitárias que são capazes de gerar uma resposta imunitária contra o antigénio desejado. Em formas de realização preferidas, o vírus recombinante é injectado no doente, onde transduz as células dendriticas segmentadas alvo in situ. As células dendriticas expressam então o antigénio em 83 ΡΕ2048955 particular associado à doença ou distúrbio a ser tratado, e o doente é capaz de construir uma resposta imunitária eficaz contra a doença ou distúrbio.

Nalgumas formas de realização, o virus recombi-nante contém uma sequência de polinucleótido que codifica mais do que um antigénio, e após a transdução de uma célula dendritica alvo, gera respostas imunitárias para a multiplicidade de antigénios administrados à célula. Nalgumas formas de realização, os antigénios estão relacionados com uma única doença ou distúrbio. Em outras formas de realização, os antigénios estão relacionados com várias doenças ou distúrbios.

Em formas de realização da invenção, os factores de maturação de DC que activam e/ou estimulam a maturação das DC's são administrados em conjunto com o virus recombinante transportando o polinucleótido ou gene de interesse. Nalgumas formas de realização, as DCs são activadas por administração de factores de maturação de DC, antes da administração do virus. Nalgumas formas de realização, as DCs são activadas por administração de factores de maturação de DC após a administração do virus. Nalgumas formas de realização, as DCs são activadas por administração de factores de maturação de DC simultaneamente com a administração do virus. Nalgumas formas de realização, os factores de maturação de DC são proporcionados em conjunto com a administração do virus. Noutras 84 ΡΕ2048955 formas de realização, os factores de maturação de DC são proporcionados separadamente da administração do virus.

Em determinadas formas de realização, um ou mais factores de maturação de DC podem ser codificados por um ou mais genes que estão contidos no vírus e expressos após o vírus transduzir uma célula dendrítica. Nalgumas formas de realização, os um ou mais genes que codificam os factores de maturação de DC podem ser incluídos num vector virai que codifica um antigénio. Noutras formas de realização, os um ou mais genes que codificam os factores de maturação de DC podem ser incluídos num vector virai que codifica mais do que um antigénio. Nalgumas formas de realização, os um ou mais genes que codificam os factores de maturação de DC podem ser proporcionados num vector separado, que é co-transfectado com o vector virai que codifica um ou mais antigénios em uma linha celular de empacotamento.

Nalgumas formas de realização, os métodos da presente invenção podem ser utilizados para imunoterapia adoptiva num doente. Como descrito acima, é identificado um antigénio contra o qual é desejada uma resposta imunitária. Um polinucleótido que codifica o antigénio desejado é obtido e encapsulado num vírus recombinante. As células dendríticas alvo são obtidas do doente e transduzidas com um vírus recombinante contendo um polinucleótido que codifica o antigénio desejado. As células dendríticas são então transferidas de volta para o doente. ΡΕ2048955 85

Vacinação

Como discutido acima, estão contempladas várias moléculas de direccionamento desenvolvidas por engenharia que ligam o marcador de célula dendritica de superfície DC-SIGN para utilização na produção de vírus recombinante que administra um gene que codifica um antigénio a DCs. 0 vírus pode ser utilizado para transdução de DCs in vitro ou in vivo para a prevenção de uma doença ou distúrbio. Por exemplo, a glicoproteína do envelope do vírus de Sindbis pode ser desenvolvida por engenharia para se ligar preferencialmente a DC-SIGN e utilizada para pseudotipar um vírus recombinante. Um gene que codifica um antigénio contra o qual é desejada uma resposta imunitária, tal como para o cancro (por exemplo, Mart-1), ou para outra doença/distúrbio (tal como infecção virai) pode ser administrado a DCs utilizando os métodos aqui descritos. Nalgumas formas de realização, podem ser administrados vários genes que codificam vários antigénios a DCs utilizando os métodos aqui descritos, por utilização de vários vectores virais, ou, de preferência, um sistema de vector multicistrónico. Os um ou mais genes para um ou mais antigénios podem ser acompanhados de genes que codificam moléculas estimuladoras (tais como GM-CSF, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15, IL-21, IL-23, TNFoí, B7.1, B7.2, 4-1BB, ligando CD40 (CD40L), CD40 induzido por fármaco (ÍCD40), e semelhantes) e/ou uma molécula repórter (tal como GFP, luciferase e semelhantes) utilizando vários vectores ou, de preferência, um sistema de vector multicistrónico. 86 ΡΕ2048955

Nalgumas formas de realização da invenção, as DCs humanas são geradas por obtenção de progenitoras hemato-poiéticas CD34a+ humanas e utilizando um método de cultura in vitro, tal como descrito noutro local (e.g., Banchereau et al. Cell 106, 271-274 (2001)). Os virus portadores de uma molécula de direccionamento que liga DC-SIGN são gerados compreendendo um gene que codifica um antigénio contra o qual uma resposta imunitária é desejada e são utilizados para transduzir DCs humanas. A especificidade e eficiência de transdução podem ser quantificadas por FACS. A maturação de DCs pode ser caracterizada por análise FACS de sobre-regulação de marcador de superfície, tal como MHC II .

Noutras formas de realização, o vírus pode ser injectado in vivo, onde contacta DCs naturais e administra um polinucleótido de interesse, tipicamente um gene que codifica um antigénio. A quantidade de partículas virais é de pelo menos 50 x 106 TU, e pode ser pelo menos 1 x 107 TU, pelo menos 2 x 107 TU, pelo menos 3 x 107 ou pelo menos 4 x 107 TU, ou pelo menos 5 x 107 TU. Em intervalos seleccionados, as DCs dos órgãos linfóides do receptor podem ser utilizadas para medir a expressão, por exemplo, por observação da expressão do marcador, tal como GFP ou luciferase. As células T dos gânglios linfáticos e baços de receptores tratados com vírus podem ser medidas a partir da magnitude e duração da resposta ao estímulo antigénio. As células teciduais sem serem DCs, tais como células 87 ΡΕ2048955 epiteliais e células linfóides, podem ser analisadas quanto a especificidade de administração de genes in vivo. É amplamente aceite que o método potencial mais eficaz para acabar com a epidemia da SIDA (e outras doenças virais) é uma vacina. Até agora, nenhum método de vacinação contra o HIV passou com sucesso a fase III de ensaio. Assim, existe uma necessidade urgente de estratégias de vacinação novas e eficazes. Nalgumas formas de realização da invenção, é utilizada a vacinação com DC. Um gene é clonado que codifica uma proteina virai, tais como as descritas acima, num vector virai. Os doentes são infectados com virus compreendendo uma molécula de direccionamento que liga DC-SIGN em DCs, de preferência com especificidade de tal modo que são evitados os efeitos secundários indesejáveis. A molécula de direccionamento pode ser, por exemplo, uma glicoproteina do envelope do virus de Sindbis desenvolvida por engenharia, e a administração do virus pode ser realizada, por exemplo, por

injecção. Num modelo animal, os virus repórter de HIV molecularmente clonados (NFNSZ-r-HSAS, NL-r-HSAS) e isolados clinicos podem ser utilizados para desafiar os animais por injecção na veia da cauda. A evidência de infecção pode ser monitorizada ao longo do tempo em esplenócitos, gânglios linfáticos e no sangue periférico. Pode ser utilizada PCR para a proteina de HlV-gag e FACS para HAS nos virus repórter para testar relativamente à integração e replicação virai. A vacinação com DC in situ PE2048955 produtiva pode aumentar a resistência a um desafio de HIV. Ver exemplos 17-20.

Nalgumas formas de realização, as células dendriticas transduzidas com um virus recombinante tal como aqui descrito são administradas para a prevenção ou tratamento de uma doença ou distúrbio. Em formas de realização preferidas, as células dendriticas expressam um antigénio contra o qual é deseja uma resposta imunitária. 0 antigénio é tipicamente um que não é normalmente expresso numa célula dendritica, mas é expresso após a célula alvo ser transduzida com o virus recombinante contendo um polinucleótido que codifica o antigénio. Nalgumas formas de realização, as células dendriticas expressam ainda um factor de maturação de DC, que é administrado à célula dendritica por um virus recombinante tal como aqui descrito.

Nalguns aspectos da invenção, um adjuvante é administrado em conjunto com um virus recombinante da invenção. 0 adjuvante pode ser administrado com o virus recombinante, antes do virus recombinante, ou depois do virus recombinante.

Pode ser utilizada uma variedade de adjuvantes em combinação com o virus recombinante da invenção para induzir uma resposta imunitária ao antigénio codificado no virus recombinante. Os adjuvantes preferidos aumentam a resposta intrínseca a um antigénio sem provocar alterações 89 ΡΕ2048955 conformacionais no antigénio que afectem a forma qualitativa da resposta. Os adjuvantes preferidos incluem alum, monofosforil lipídio A (MPL) 3-De-O-acilado (ver GB 2220211). QS21 é um glicosídeo triterpénico ou saponina isolada da casca da árvore Quillaja Saponaria Molina encontrada na América do Sul (ver Kensil et al., em Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman, Plenum Press, NY, 1995); Patente US N° 5057540) . Outros adjuvantes são emulsões de óleo em água (tais como esqualeno ou óleo de amendoim), opcionalmente em combinação com estimulantes inmunitários, tais como monofosforil lipídio A (ver Stoute et al., N. Engl. J. Med. 336, 86-91 (1997)). Outro adjuvante é CpG (Bioworld Today, Nov. 15, 1998). Em alternativa, Αβ pode ser acoplado a um adjuvante. Por exemplo, uma versão lipopéptido de Αβ pode ser preparada por acoplamento de ácido palmítico ou outros lípidos directamente para o terminal N de Αβ, tal como descrito para vacinação com antigénio para hepatite B (Livingston, J. Immunol. 159, 1383-1392 (1997)). No entanto, o referido acoplamento não deve alterar substancialmente a conformação de Αβ de forma a afectar a natureza da sua resposta imunitária. Os adjuvantes podem ser administrados como um componente de uma composição terapêutica com um agente activo ou podem ser administrados separadamente, antes, simultaneamente com, ou após a administração do agente terapêutico.

Uma classe preferida de adjuvantes são os sais de alumínio (alum), tais como hidróxido de alumínio, fosfato 90 ΡΕ2048955 de alumínio, sulfato de alumínio. Tais adjuvantes podem ser utilizados com ou sem outros agentes imunoestimulantes específicos tais como MPL ou 3-DMP, QS21, aminoácidos poliméricos ou monoméricos tais como ácido poliglutâmico ou polilisina. Outra classe de adjuvantes são formulações de emulsões de água em óleo. Tais adjuvantes podem ser utilizados com ou sem outros agentes imunoestimulantes específicos tais como péptidos de muramilo (e.g., N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-nor-muramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'— 2'dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE), N-ace- tilglucsaminil-N-acetilmuramil-L-Al-D-isoglu-L-Ala-dipalmi-toxi-propilamida (DTP-DPP) theramide™) , ou outros componentes da parede celular bacteriana. As emulsões óleo em água incluem (a) MF59 (WO 90/14837), contendo 5% de Esqua-leno, 0,5% de Tween 80, e 0,5% de Span 85 (opcionalmente contendo diversas quantidades de MTP-PE), formuladas em partículas submicrónicas utilizando um microfluidificador tal como o microfluidificador Model 110Y (Microfluidics, Newton MA), (b) SAF, contendo 10% de Esqualeno, 0,4% de Tween 80, 5% de polímero bloqueado plurónico L121, e thr- MDP, microfluidizado numa emulsão submicrónica ou agitada em vortex para gerar uma emulsão com partícula de tamanho maior, e (c) sistema de adjuvante Ribi™ (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, MT) contendo 2% de esqualeno, 0,2% de Tween 80, e um ou mais componentes da parede celular bacteriana a partir do grupo que consiste em monofosforilipídio A (MPL), dimicolato de trealose (TDM) e esqueleto da parede 91 ΡΕ2048955 celular (CWS) , de preferência MPL + CWS (Detox™) . Outra classe de adjuvantes preferida é adjuvantes de saponina, tal como Stimulon™ (QS21, Aquila, Worcester, MA) ou partículas geradas do mesmo tais como ISCOMs (complexos imunoestimulantes) e ISCOMATRIX. Outros adjuvantes incluem o Adjuvante de Freund Completo (CFA) e Adjuvante de Freund Incompleto (IFA). Outros adjuvantes incluem citocinas, tais como interleucinas (IL-1, IL-2 e IL-12), factor estimulante de colónias de macrófagos (M-CSF), factor de necrose tu-moral (TNF).

Um adjuvante pode ser administrado com o virus recombinante da invenção como uma composição única, ou pode ser administrado antes, em simultâneo ou após a administração do vírus recombinante da invenção. O imunogénio e o adjuvante podem ser embalados e fornecidos no mesmo frasco ou podem ser embalados em frascos separados e misturados antes da utilização. 0 imunogénio e o adjuvante são tipicamente embalados com uma etiqueta que indica a aplicação terapêutica a que se destina. Se o imunogénio e o adjuvante forem embalados separadamente, a embalagem inclui tipicamente instruções para a mistura antes da utilização. A escolha de um adjuvante e/ou veículo depende da estabilidade da vacina contendo o adjuvante, da via de administração, do esquema de administração, da eficácia do adjuvante para a espécie a ser vacinada, e, em seres humanos, um adjuvante farmaceuticamente aceitável é um que tenha sido aprovado ou pode vir a ser aprovado para administração a seres humanos pelos órgãos reguladores 92 ΡΕ2048955 pertinentes. Por exemplo, o adjuvante de Freund Completo não é adequado para administração a seres humanos. Os preferidos são o Alum, MPL e QS21. Opcionalmente, podem ser utilizados simultaneamente dois ou mais adjuvantes diferentes. As combinações preferidas incluem alum com MPL, alum com QS21, MPL com QS21 e alum, QS21 e MPL em conjunto. Além disso, o adjuvante de Freund Incompleto pode ser opcionalmente utilizado (Chang et al., A Advanced Drug Delivery Comments 32, 173-186 (1998)), em combinação com qualquer um dos alum, QS21 e MPL e todas as suas combinações.

Composições farmacêuticas e kits

Também estão aqui contempladas composições farmacêuticas e kits contendo um virus recombinante aqui proporcionado e um ou mais componentes. As composições farmacêuticas podem incluir um virus recombinante aqui proporcionado e um veiculo farmacêutico. Os kits podem incluir as composições farmacêuticas e/ou combinações aqui proporcionadas, e um ou mais componentes, tais como instruções de utilização, um dispositivo para administração de um composto a um sujeito, e um dispositivo para a administração de um composto a um sujeito. São aqui proporcionadas composições farmacêuticas contendo um virus aqui proporcionado e um veiculo farmacêutico adequado. As composições farmacêuticas aqui proporcionadas podem estar em várias formas, e.g., na forma PE2048955 sólida, líquida, pó, aquosa ou liofilizada. Exemplos de veículos farmacêuticos adequados são conhecidos na técnica. Tais veículos e/ou aditivos podem ser formulados por métodos convencionais e podem ser administrados ao sujeito numa dose adequada. Os agentes estabilizantes, tais como lípidos, inibidores de nuclease, polímeros e agentes quelantes podem preservar as composições de se degradarem no corpo.

Os vírus recombinantes aqui proporcionados podem ser embalados como kits. Os kits podem incluir opcionalmente um ou mais componentes, tais como instruções de utilização, dispositivos e reagentes adicionais, e componentes, tais como tubos, recipientes e seringas para a prática dos métodos. Exemplos de kits podem incluir os vírus aqui proporcionados, e podem incluir opcionalmente instruções de utilização, um dispositivo para detectar um vírus num sujeito, um dispositivo para a administração do vírus a um sujeito e um dispositivo para a administração de um composto a um sujeito.

Kits compreendendo polinucleótidos que codificam um gene de interesse (normalmente um antigénio) também são aqui contemplados. Nalgumas formas de realização, o kit inclui pelo menos um plasmídeo que codifica componentes de empacotamento do vírus e vector que codifica uma molécula de direccionamento que é concebida para ligar células dendríticas, preferencialmente com especificidade. Nalgumas formas de realização, o kit inclui pelo menos um plasmídeo 94 ΡΕ2048955 que codifica componentes de empacotamento do virus, um vector que codifica uma molécula de direccionamento que é concebida para ligar células dendriticas e um vector que codifica pelo menos um factor de maturação de DC.

Kits compreendendo um vector virai que codifica um gene de interesse (normalmente um antigénio) e opcionalmente uma sequência de polinucleótido que codifica um factor de maturação de DC também são aqui contemplados. Nalgumas formas de realização, o kit inclui pelo menos um plasmideo que codifica componentes de empacotamento do virus e vector que codifica uma molécula de direccionamento que é concebida para ligar células dendriticas.

Num exemplo, um kit pode conter instruções. As instruções incluem tipicamente uma expressão tangível que descreve o vírus e, opcionalmente, outros componentes incluídos no kit, e métodos para a administração, incluindo métodos para determinar o estado adequado do sujeito, a quantidade de dosagem adequada, e o método de administração adequado, para a administração do vírus. As instruções também podem incluir orientação para monitorizar o sujeito durante a duração do tempo de tratamento.

Os kits aqui proporcionados também podem incluir um dispositivo para a administração de um vírus a um sujeito. Qualquer um de uma variedade de dispositivos conhecidos na técnica para a administração de medicamentos ou vacinas pode ser incluído nos kits aqui proporcionados. 95 PE2048955

Exemplos de dispositivos incluem, mas não estão limitados a, uma agulha hipodérmica, uma agulha intravenosa, um cateter, um dispositivo de injecção sem agulha, um inalador, e um distribuidor de liquido, tal como um conta-gotas. Tipicamente, o dispositivo para a administração de um vírus do kit será compatível com o vírus do kit; por exemplo, um dispositivo de injecção sem agulha tal como um dispositivo de injecção de alta pressão pode ser incluído nos kits com vírus não danificados por injecção de alta pressão, mas não é tipicamente incluído nos kits com vírus danificados por injecção de alta pressão.

Os kits aqui proporcionados também podem incluir um dispositivo para a administração de um composto, tal como um activador ou estimulador de DC, a um sujeito. Qualquer um de uma variedade de dispositivos conhecidos na técnica para a administração de medicamentos a um sujeito pode ser incluído nos kits aqui proporcionados. Exemplos de dispositivos incluem uma agulha hipodérmica, uma agulha intravenosa, um cateter, uma injecção sem agulha, mas não estão limitados a, uma agulha hipodérmica, uma agulha intravenosa, um cateter, um dispositivo de injecção sem agulha, um inalador, e um distribuidor de líquido, tal como um conta-gotas. Tipicamente, o dispositivo para a administração do composto do kit será compatível com o método desejado de administração do composto.

Os seguintes exemplos são proporcionados apenas com propósitos ilustrativos, e não pretendem limitar de 96 ΡΕ2048955 qualquer modo o âmbito da presente invenção. De facto, várias modificações da invenção além das aqui apresentadas e descritas serão evidentes para os peritos na técnica a partir da descrição anterior e caem no âmbito das reivindicações em anexo. EXEMPLO 1

CONCEPÇÃO DE UMA MOLÉCULA DIRECCIONADA ESPECI-FICAMENTE PARA DC

Vectores lentivirais podem ser racionalmente desenvolvidos para torná-los capazes de transduzir de um modo especifico DCs numa célula. Alquns subconjuntos de DCs têm na sua superfície a proteina DC-SIGN (Geijtenbeek, T.B., et al. 2000; Geijtenbeek, T.B., et ai. 2000, supra), um receptor do tipo lectina do tipo C capaz de ligação rápida e endocitose de materiais (Geijtenbeek, T.B., et al. 2004, supra.), que pode ser utilizado como um receptor direccionado para DCs. O vírus Sindbis (SV) - um membro do género Alphavirus e da família Togaviridae - é capaz de infectar DCs através de DC-SIGN (Klimstra, W.B., et al. 2003. J. Virol. 77: 12022-12032). No entanto, o receptor virai canónico para a estirpe laboratorial de SV é sulfato de heparano na superfície celular (HS), que é expresso por vários tipos de células (Strauss, J.H., et al. 1994. Arch. Virol. 9: 473-484; Byrnes, A.P., e D.E. Griffin. 1998. J.

Virol. 12: 7349-7356). Tirando vantagem da separação física dos dois locais de ligação ao receptor na glicoproteína de 97 ΡΕ2048955 envelope de SV (aqui a seguir designada como SVG), o receptor foi desenvolvido para ser cego para o seu HS alvo de ligação canónico e para deixar intacta a sua capacidade para interagir com DC-SIGN (Figura 1). Uma vez incorporada numa superficie virai, esta glicoproteina mutante é capaz de mediar a infecção de DCs mas não a de outras células. 0 cDNA para SVG do tipo selvagem foi obtido do laboratório do Dr. J.H. Strauss no Califórnia Institute of Technology e clonado no vector pcDNA3 (Invitrogen) por PCR para gerar o plasmideo pSVG. Uma sequência tag de dez residuos (MYPYDVPDYA) foi inserida na proteina E2 entre os aminoácidos 71 e 74 por mutagénese por PCR para interromper o sitio de ligação de HS (Karavans, G., et al. 1998. Crit Rev Oncol Hemat 28: 7-30; Lavillete, D., et al. 2001. Curr Opin Biotech 12: 461-466; Russell, S.J. e F.L. Cosset. 1999. J Gene Med 1: 300-311; Sandrin, V., et al. 2003. Curr Top Microbiol 281: 137-178; Verhoeyen, E. e F.L. Cosset. 2004. J Gene Med 6: S83-S94) . Um anticorpo disponivel contra a sequência tag inserida proporcionou a capacidade para monitorizar a expressão da SVG modificada. De modo a diminuir ainda mais a infecção especifica de HS, vários residuos criticos foram identificados como estando envolvidos na ligação a moléculas de HS (Coffin, J.M., et al. 1997. Retroviruses. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press; Battini, J. L., et al. 1998. J Virol 72:428-435; Valsesiawittmann, s., et al. 1994. j Virol 68:4609-4619; Wu, B.W., et al. 2000. Virology 269: 7-17;

Cosset, F.L., et al. 1995. J Virol 69:6314-6322; Kayman, PE2048955 S.C., et al. 1999. J. Virol 73: 1802-1808; Lorimar, I.A.J. e S.J. Lavictoire. 2000. J Immunol Methods 237:147-157; Barnett, A.L., et al. 2001. Proc Nat Acad Sei USA 98: 4113-4118; Benedict, C.A., et al. 2002. Hum Gene Ther 10:545-557; Gollan, T.J. e M.R. Green. 2002. J Virol 76:3558-3563). Dois desses resíduos sofreram mutação para dar alaninas (157KE158 a 157AA158).

Uma eliminação adicional foi introduzida na glicoproteína E3 de SVG para remover os aminoácidos 61-64. Esta SVG modificada foi designada como SVGmu (SEQ ID N°: 11) . O cDNA para SVGmu foi clonado a jusante do promotor CMV no vector pcDNA3 (designado como pSVGmu, SEQ ID N°: 3). EXEMPLO 2

PREPARAÇÃO DE VÍRUS RECOMBINANTE CONTENDO A MOLÉCULA DIRECCIONADA ESPECIFICAMENTE PARA DC A preparação do lentivirus pseudotipado com SVGmu recombinante foi realizada por transfecção transiente mediada por fosfato de cálcio de células 293T com o vector lentiviral FUGW (SEQ ID N°: 1) ou seus derivados, os constructos de empacotamento que codificam os genes gag, pol e rev, e pSVGmu (Exemplo 1). FUGW é um vector lentiviral que se auto-inactiva carregando o promotor de ubiquitina-C humana para conduzir a expressão de um gene repórter GFP (Lois, C., et al. 2002. Science 295: 868-872). Os vectores de transferência lentivirais (FUGW e seus 99 ΡΕ2048955 derivados) utilizados nestes estudos são vectores lentivirais com base em HIV de terceira geração, nos quais a maioria da região U3 da LTR 3' FOI eliminada, resultando numa LTR 3' auto-inactivada (SIN).

Para a transfecção transiente de células 293T, células 293T cultivadas em placas de cultura teciduais de 6 cm (Corning ou BD Biosciences) foram transfectadas com o plasmideo vector de transferência lentiviral adequado (5 μρ) , em conjunto com 2,5 μρ de cada plasmideo de envelope (SVG, SVGmu, Eco ou VSVG) e os plasmideos de empacotamento (pMDLg/pRRE e pRSV-Rev). Os sobrenadantes virais foram colhidos 48 e 72 horas após a transfecção e filtrados através de um filtro de 0,45 μιη (Corning). Para preparar vectores virais concentrados para estudo in vivo, os sobrenadantes virais foram ultracentrifugados (ultracentrifugador preparativo Óptima L-80 K, Beckman Coulter) a 50000 x g durante 90 min. Os sedimentos foram então novamente suspensos num volume adequado de PBS frio.

Os virus resultantes pseudotipados com SVGmu são aqui a seguir referidos como FUGW/SVGmu. Os virus de controlo em envelope com a glicoproteina SVG do tipo selvagem são aqui a seguir referidos como FUGW/SVG. EXEMPLO 3

IMAGEM CONFOCAL DE VÍRUS RECOMBINANTE EMPACOTADO

Os lentivectores marcados com GFP-vpr foram 100 PE2048955 produzidos como descrito no Exemplo 2, excepto com a utilização de lentivector FUW (que não contém o gene repórter GFP) e com um plasmídeo em separado que codifica GFP-vpr (2,5 μg). O sobrenadante virai fresco foi revestido sobre lamelas revestidas com polilisina numa placa de cultura de 6 poços e centrifugado a 3700 x g a 4 °C durante 2 horas utilizando um centrifugador Sorvall Legend RT. As lamelas foram enxaguadas duas vezes com PBS frio e imunocoradas com anticorpo anti-HA-biotina (Miltenyi Biotec) e Cy5-estreptavidina (Invitrogen). Foram registadas imagens fluorescentes com um microscópio confocal de varrimento a laser Zeiss LSM 510 equipado com conjuntos de filtros para fluoresceina e Cy5. Foi utilizada uma objectiva de imersão em óleo plan-apochromat (63x/l,4) para a geração de imagens. A Figura 2 apresenta os resultados da imagem confocal do virus recombinante produzido pelo protocolo. (A barra de escala representa 2 μιη.) As partículas nas lâminas "GFP" estão coradas de verde, as partículas nas lâminas "SVGmu" estão coradas de vermelho e as partículas nas lâminas "Fundido" estão coradas de verde apenas onde GFP é expresso, de vermelho apenas onde SVGmu é expresso e de amarelo/amarelo-laranja onde ambos GFP e SVGmu são expressos. Mais de 90% das partículas marcadas com GFP continham SVGmu. Assim, a produção de partículas lentivirais que exibem SVGmu foi confirmada através de imagem confocal. 101 ΡΕ2048955 EXEMPLO 4

PREPARAÇÃO DE LINHAS CELULARES DC-SIGN

Para facilitar o estudo de transdução alvo, foram construídas linhas celulares DC-SIGN que expressam DC-SIGN humana (aqui a seguir referido como 293T.hDCSIGN) e DC-SIGN de murino (aqui a seguir referido como 293T.mDCSIGN). As linhas celulares 293T.hDCSIGN e 293T.mDCSIGN foram geradas por transdução estável de células 293T parentais com um lentivector pseudotipado de VSVG. Os cDNAs de DC-SIGN humana e DC-SIGN de murino foram amplificados de plasmídeos pUNO-hDCSIGNIAa e pUNO-mDCSIGN (InvivoGene) e clonados a jusante do promotor de ubiquitina-C humana no plasmídeo lentiviral FUW para gerar FUW-hDCSIGN (SEQ ID N°: 5) e FUW-mDCSIGN (SEQ ID N°: 6), respectivamente. Os lentivectores foram então pseudotipados com VSVG e utilizados para transduzir células 293T. As células resultantes foram submetidas a coloração com anticorpo (anticorpo DC-SIGN anti-humana da BD Biosciences e DC-SIGN de anti-murino da eBioscience) e separação de células para se obter uma população uniforme de linhas celulares DC-SIGN+ 293T.hDCSIGN e MDC-SIGN+ 293T.mDCSIGN.

A citometria de fluxo mostrou que DC-SIGN foi virtualmente expressa em todas as células 293T.hDCSIGN e 293T.mDCSIGN das linhas celulares (Figura 3A) . Em cada diagrama, as linhas sólidas (área não preenchida) representa a expressão de DC-SIGN nas linhas celulares 293T 102 ΡΕ2048955 DC-SIGN, e a área sombreada representa a coloração de fundo de células 293T não transduzidas. EXEMPLO 5

AVALIAÇÃO DO VÍRUS RECOMBINANTE ESPECÍFICO PARA DC-SIGN POR TRANSDUÇÃO DE LINHAS CELULARES DC-SIGN

Para avaliar a eficácia e especificidade de transdução de FUGW/SVG ou FUGW/SVGmu (Exemplo 2), os virus foram utilizados para transduzir as linhas celulares 293T.hDCSIGN e 293T.mDCSIGN (Exemplo 4) . A eficácia de transdução foi medida por expressão de GFP nas linhas celulares.

As células alvo (células 293T.hDCSIGN, 293T.mDCSIGN ou 293T; 0,2xl06 por poço) foram semeadas numa placa de cultura de 24 poços (Corning ou BD Biosciences) e infectadas por agitação com sobrenadantes virais (1 mL por poço) a 2500 rpm e 30 °C durante 90 min utilizando um centrifugador Sorvall Legend. Subsequentemente, os sobrenadantes foram substituídos com meio de cultura fresco e incubados durante 3 dias a 37 °C com 5% de CO2. A percentagem de células GFP+ foi medida por citometria de fluxo. O titulo de transdução foi determinado pelas gamas de diluição que exibiram uma resposta linear.

A citometria de fluxo mostrou que FUGW/SVG (contendo a glicoproteína de envelope de SVG do tipo sei- PE2048955 vagem) tinha uma eficácia de transdução semelhante (11~16% de transdução) para as três linhas celulares alvo (293T, 293T.hDCSIGN e 293T.mDCSIGN) (Figura 3B) . Isto indica que SVG tem uma vasta especificidade e a presença de DC-SIGN na superfície da célula não altera significativamente a capacidade de transdução de um vector lentiviral pseudotipado com SVG. Pelo contrário, o vector FUGW/SVGmu (contendo a glicoproteina de envelope de SVG mutante) pode transduzir especificamente células 293T.hDCSIGN e 293T.mDCSIGN com uma eficácia de transdução de 42% e 34%, respectivamente, mas não as células 293T (Figura 3B) . Estes resultados demonstram que um vector lentiviral pseudotipado exibindo SVGmu pode transduzir especificamente células tanto em DC-SIGN humana como de murino. Além disso, a SVG mutante deu transdução mais eficaz de células que expressam DC-SIGN do que SVG do tipo selvagem. A integração estável do vector lentiviral FUGW nas células transduzidas foi confirmada por análise de PCR da integração genómica do gene repórter GFP. Para demonstrar que a transdução especifica foi mediada por DC-SIGN, a adição de anticorpo DC-SIGN anti-humana solúvel ao sobrenadante virai FUGW/SVGmu antes da sua exposição às células 293T.hDCSIGN reduziu a eficácia de transdução (dados não apresentados). 0 titulo especifico de FUGW/SVGmu para 293T.mDCSIGN foi estimado em lxlO6 TU (Unidades de Transdução)/mL. 0 titulo de FUGW/SVGmu para 293T.hDCSIGN foi estimado em l-2xl06 TU/mL. PE2048955 104 EXEMPLO 6 AVALIAÇÃO DO VÍRUS RECOMBINANTE in vitro

Para investigar a especificidade do lentivector desenvolvido para a transdução de células dendriticas (DCs) que expressam DC-SIGN, foram isoladas células de medula óssea completas (BM) de murganhos e directamente transdu-zidas com o vector virai FUGW/SVGmu (Exemplo 2) . Foi adaptado um protocolo para gerar DCs de murganho a partir de progenitores cultivados em culturas de BM para utilização na experiência (Buchholz, C.J., et al. 1998. Nat Biotech 16:951-954). As células de medula óssea completas foram colhidas de murganho fêmea B6 (Charles River Breeding Laboratories) e foram geradas BMDCs como descrito noutro sitio (Yang, L. e D. Baltimore. 2005. Proc. Natl. Acad.

Sei. USA 102: 4518-4523). Tanto as células BM como BMDCs foram colocadas em placa numa placa de cultura de 24 poços (2xl06 células por poço) e infectadas por agitação com sobrenadante virai (1 mL por poço) a 2500 rpm e 30 °C durante 90 min utilizando um centrifugador Sorvall RT7. Após a centrifugação, o sobrenadante foi removido e substituído com meio RPMI fresco contendo 10% de FBS e GM-CSF (1:20 de meio condicionado com J558L). As células foram cultivadas durante 3 dias e foram analisadas para a expressão de GFP utilizando citometria de fluxo. 105 ΡΕ2048955

As células de BM isoladas de murganhos foram directamente transduzidas com vector virai FUGW/SVGmu ou com um vector de controlo. Para o controlo, foi utilizado um lentivector em envelope (Eco) com glicoproteína de vírus da leucemia murina ecotrópica (FUGW/Eco); o vector com envelope de Eco pode infectar células de roedores com uma ampla especificidade. Três dias após a infecção, a eficácia de transdução foi analisada por citometria de fluxo (Figura 4A) . Cerca de 9% das células nas culturas de BM mistas foram DCs (como indicado pela expressão de CDllc) , das quais a maioria (cerca de 80%) foram DC-SIGN elevada (dados não apresentados) . Observou-se que 12% do total de células de BM eram GFP positivas (GFP+) após transdução de FUGW/SVGmu (Figura 4A) . Quando fechado em células GFP+, observou-se que até 95% das células transduzidas eram DC-SIGN e CDllc duplamente positivas (DC-SIGN+CDllc+) , indicando que FUGW/SVGmu transduz especificamente DCs que expressam DC-SIGN e não outros tipos de células na medula óssea. Pelo contrário, apesar de 68% do total de células de BM serem GFP-positivas após exposição a FUGW/Eco, apenas 9% das células transduzidas eram DCs, de entre as quais 6,5% eram DC-SIGN+. A transdução estável de FUGW/SVGmu foi verificada por análise de PCR Alu (Butler, S.L., et al. 2001. Nat. Med. 7: 631-634) da integração genómica da LTR da estrutura de lentivector. Além disso, utilizou-se FUGW/SVGmu para 106 PE2048955 transduzir células T e B primárias colhidas do baço de murganho e não foi virtualmente detectada transdução (Figura 4B) , indicando especificidade de transdução notável.

Também foi testada a eficácia do lentivector que contém SVGmu para transduzir DCs derivadas de medula óssea (BM) , (BMDCs), cultivadas in vitro. Foram geradas DCs que derivam de medula óssea (BM) (BMDCs) como descrito acima por cultura, na presença de factor estimulante de colónias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF) durante 6 dias. As células foram então expostas a FUGW/SVGmu ou lentivector FUGW/Eco. A citometria de fluxo das BMDCs no dia 3 após a transdução mostrou que FUGW/Eco transduziram células DCs CDllc+ (33%) e CDllc” (7,6%) (Figura 5) , o que é consistente com o vasto tropismo de Eco. Pelo contrário, FUGW/SGVmu apenas transduziu DCs CDllc+ (32,7%), e nenhumas células GFP+ foram detectadas entre as células CDllc” (Figura 5) , indicando que FUGW/SVGmu pode modificar especificamente BMDCs.

Assim, estes resultados demonstram colectivamente que os lentivectores recombinantes desenvolvidos contendo SVGmu podem transduzir especificamente DCs in vitro e que a transdução alvo está correlacionada com a expressão de DC-SIGN na superfície de DCs. 107 ΡΕ2048955 EXEMPLO 7 EFEITO DE VÍRUS RECOMBINANTE NA ACTIVAÇÃO DE CÉLULAS DENDRÍTICAS in vitro O lentivírus recombinante foi ainda examinado para determinar se poderia ser direccionado, transduzir e activar especificamente DCs em DCs maduras. A superficie de sobre-regulação da molécula co-estimuladora B7.2 (CD86) e a molécula MHC de classe II I-Ab, que são consideradas como sendo as assinaturas de activação de DC (Steinman, R.M., et al. 2003. Annu. Rev. Immunol. 21: 685-711), foi medida em DCs expostas ao virus recombinante. As BMDCs foram geradas e infectadas com FUGW/SVGmu como descrito no Exemplo 6. Também foi adicionado durante a noite LPS a uma concentração de 1 μρ/ιτΛ para a activação adicional de BMDCs transduzidas. A citometria de fluxo de BMDCs três dias após a transdução mostrou que o tratamento com FUGW/SVGmu elevou a expressão de marcadores de activação de DC, CD86 e I-Ab, em DCs GFP positivas, quando comparado com DCs GFP negativas (Figura 6, painel superior). A área sombreada indica células GFP negativas (não transduzidas), e a linha sólida (área não preenchida) indica células GFP positivas (transduzidas) . Observou-se que a transdução alvo de BMDCs estava em sinergia com tratamento de lipopolissacárido (LPS) para uma maturação adicional de DCs (Figura 6, painel inferior). Isto indica que a transdução alvo pode funcionar 108 ΡΕ2048955 sozinha ou em combinação com outros factores de maturação de DC para induzir activação de DC. EXEMPLO 8

DIRECCIONAMENTO DE CÉLULAS DENDRÍTICAS in vivo POR VÍRUS RECOMBINANTE A prova de se esta metodologia pode ser utilizada para vacinação pode ser examinada por experimentação in vivo. Para testar se os lentivectores desenvolvidos tendo SVGmu poderiam alvejar DCs in vivo, o lentivector recombinante e concentrado FUGW/SVGmu (50xl06 TU novamente suspensos em 200 μύ de PBS) foi subcutaneamente injectado no flanco esquerdo dos murganhos fêmea C57BL/6 (B6, Charles River Breeding Laboratories) perto de um gânglio linfático inguinal (numa gama de 1 cm). O gânglio linfático inguinal esquerdo e o gânglio linfático equivalente no lado oposto foram isolados para inspecção do tamanho no dia 3 após a injecção. As células foram colhidas destes gânglios e os seus números totais foram contados. A percentagem de DCs GFP+ foi analisada por citometria de fluxo em células coradas com anticorpo anti-CDllc (BD Biosciences).

No dia 3, foi observado um aumento significativo do gânglio linfático inguinal esquerdo perto do local da injecção (Figura 7A, imagem da esquerda), e o número de células neste gânglio linfático aumentou mais de 10 vezes, quando comparado com o gânglio linfático equivalente no 109 ΡΕ2048955 lado oposto ou gânglios linfáticos de um murganho genuíno (Figura 7B) . Isso indica que a administração de vector pode aumentar o tráfico e a proliferação de linfócitos num gânglio linfático próximo. A citometria de fluxo indicou que aproximadamente 3,8% do total de células CDllc+ nas células de gânglios linfáticos inguinais esquerdos eram DCs GFP+ (Figura 7C) , que parecem ter migrado do local da injecção. Isto é considerado um efeito notavelmente grande de uma injecção subcutânea de vector e demonstra que o vírus recombinante é eficaz na infecção de DCs in vivo. EXEMPLO 9 AVALIAÇÃO DA ESPECIFICIDADE DE VÍRUS RECOMBINANTE POR TRANSDUÇÃO in vivo

Para examinar a especif icidade in vivo do lentivector direccionado para DC, foi construído um vector lentiviral que codifica uma luciferase de pirilampo. O cDNA da luciferase de pirilampo foi amplificado de pGL4.2LucP (Promega) e clonado em FUGW (Lois, C. et al. 2002. supra.) para substituir GFP, para proporcionar o constructo Fluc (SEQ ID N°: 4) (Figura 22A) . O gene repórter de luciferase foi então utilizado para visualizar a transdução in vivo das células teciduais utilizando protocolos padrão de imagem de bioluminescência (BLI). 110 PE2048955 O lentivector recombinante (aqui a seguir referido como Fluc/SVGmu) foi injectado subcutaneamente no flanco esquerdo do murganho. Num outro murganho, foi injectado um lentivector pseudotipado com glicoproteina virai de estomatite vesicular (aqui a seguir referido como Fluc/VSVG) como um controlo de vector não especifico. Os murganhos tratados com vector foram então fotografados de modo não invasivo utilizando BLI. Os murganhos tratados com Fluc/VSVG tinham um sinal forte e permanente no local da injecção, o que indica que os tecidos não especificos foram transduzidos para expressar luciferase (Figura 22B). Isto é consistente com o facto de que o virus em envelope de VSVG tem vasta especificidade. Pelo contrário, não foi detectado nenhum sinal significativo no local de injecção de murganhos tratados com Fluc/SVGmu (Figura 22B), o que indica que o lentivector contendo SVGmu tinha uma especificidade alvo relativamente restritiva. Em nenhum momento o sinal de luminescência foi capaz de ser detectado nos murganhos alvo, provavelmente devido à distribuição rara e esparsa das DCs, que está para além da sensibilidade do método de BLI actual.

Após um mês, os murganhos injectados com Fluc/SVGmu foram submetidos a análise de biodistribuição por RT-PCR quantitativa e não foi observada nenhuma cópia detectável do lentivector em todos os órgãos isolados (coração, figado, baço, rim, gônadas, pulmão, pele, gânglio linfático), verificando a falta de infecção não especifica nos animais e, assim, a especificidade do vector alvo de DCs. 111 PE2048955 EXEMPLO 10

ADMINISTRAÇÃO DE ANTIGÉNIO in vitro POR VÍRUS RECOMBINANTE

Para determinar se a transdução direccionada de DCs por um lentivector recombinante poderia ser utilizada para administrar eficazmente os genes de antigénio a DCs para a estimulação de respostas de células T CD8+ e CD4 + especificas para antigénio, foi construído um lentivector que expressa o antigénio modelo, ovalbumina de galinha (OVA). Em murganhos C57BL/6J (B6), OVA é um antigénio alvo bem caracterizado para o receptor OT1 de células T CD8+, que se liga especif icamente a OVA257-269 (designado como OVAp), e para o receptor OT2 de células T CD4+, que se liga especif icamente a OVA323-339 (designado como OVAp*) (Yang, L. e D. Baltimore. 2005. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 102: 4518-4523). O lentivector que expressa OVA (FOVA (SEQ ID N°: 2), figura 8, em cima) foi construído a partir de FUGW (Figura 8, parte inferior) por substituição de GFP com o cDNA de ovalbumina de galinha.

As BMDCs (Exemplo 6) foram transduzidas no dia 6 de cultura com lentivírus recombinante FOVA/SVGmu ou lentivírus recombinante controlo FUGW/SVGmu (que codifica um gene repórter não relevante de GFP). No dia 6, as BMDCs foram infectadas por agitação com sobrenadante virai e cultivadas durante um período adicional de 3 dias. No dia 112 PE2048955 9, as células não aderentes foram colhidas e novamente cultivadas em meio RPMI contendo 10% de FBS, GM-CSF (1:20 de meio condicional J558L) e 1 μg/mL de LPS (Sigma). No dia 10, as células foram colhidas e utilizadas para estimulação de células T. As BMDCs modificadas foram designadas como DC/FOVA e DC/FUGW, dependendo do lentivector utilizado para a transdução. Em paralelo, células não aderentes foram colhidas da cultura de BMDC não transduzida do dia 9, e foram novamente cultivadas no mesmo meio (RPMI contendo 10% de FBS, GM-CSF e LPS). No dia 10, as células foram colhidas e carregadas com OVAp (OVA257-269, especificamente ligada por receptores OT1 de células T, aqui a seguir designado DC/OVAp) ou OVAp* (OVA323-339, especif icamente ligada por receptores OT2 de células T, aqui a seguir referido como DC/OVAp*), e utilizadas como controlos positivos para a estimulação das células T. Para examinar a capacidade de BMDCs transduzidas com vector para processar e apresentar o antigénio OVA transgénico, foram colhidas células do baço de murganhos transgénicos 0T1 e OT2 e cultivadas com as BMDCs transduzidas com lentivector, ou BMDCs carregadas com OVAp ou OVAp*, na razão indicada. Após três dias, o sobrenadante foi colhido e ensaiado para a produção de IFN-γ utilizando ELISA e as células foram colhidas e analisadas relativamente aos seus marcadores de activação de superfície utilizando citometria de fluxo. A proliferação de células T foi ensaiada utilizando a incorporação de [3H] timidina.

Após uma co-cultura de três dias com diferentes 113 ΡΕ2048955 razões de DC/FOVA para células T transgénicas, os OT1 de células T responderam vigorosamente como medido pela libertação de IFN-γ (Figura 10A) e a proliferação de células T (Figura 10B). Tal como esperado, nenhuma resposta óbvia de OVA foi detectada utilizando DC/FUGW (Figuras 10A e 10B) . Observou-se também que a expressão transgénica de OVA foi ainda mais eficaz do que a carga com péptido para a estimulação de uma resposta de 0T1 de células T, o que é consistente com a noção de que MHC de classe I favorece a apresentação de peptideos produzidos por via endógena. A citometria de fluxo mostrou que os 0T1 de células T activados exibiram o fenótipo de células T citotóxicas efectoras tipico (CD25+CD69+CD62LbaixoCD44a:Lto) após estimulação por DC/FOVA ou DC/OVAp (Figura 9).

Quando as DCs foram co-cultivadas com OT2 de células T CD4 + , também foi observada a activação de células T, tal como indicado pelas alterações nos marcadores de superfície (Figura 11) e na produção de IFN-γ (Figura 12) . No entanto, a estimulação de células CD4+ não foi tão pronunciada como a das células CD8+, provavelmente devido à apresentação menos eficaz dos péptidos de antigénios endógenos às moléculas de MHC de classe II. Ao modificar a localização celular do antigénio OVA para o dirigir para a via de apresentação de MHC de classe II, foi conseguido um aumento da estimulação de CD4 que foi ainda melhor do que a de DCs pulsadas com péptido (dados não apresentados).

Estes resultados mostram que o método de direc- 114 ΡΕ2048955 cionamento para DC através de infecção de lentivector pode administrar eficazmente antigénios a DCs e estimular respostas de células T CD8+ e CD4+. EXEMPLO 11

ADMINISTRAÇÃO DE ANTIGÉNIO in vivo POR VÍRUS RECOMBINANTE

Para determinar se as DCs alvo de lentivectores poderiam activar células T especificas para antigénio in vivo, foi utilizado um método de transferência de genes de receptores de células T (TCR) em células estaminais hematopoiéticas de murino (HSCs) para gerar células T especificas para antigénio e desenvolvidas para TCR em murganhos, tal como descrito noutro local (Yang, L. e D. Baltimore, D. 2005. supra.). Foi construído um vector retroviral tricistrónico MIG-OT1 que co-expressa TCRa e TCRP OT1, em conjunto com o marcador de GFP (Figura 13A).

Resumidamente, murganhos fêmea B6 (Charles River Breedling Laboratories) foram tratados com 250 μg de 5-fluorouracilo (Sigma). Após cinco dias, células de medula óssea (BM) enriquecidas com HSCs foram colhidas da tíbia e do fémur e cultivadas numa placa de cultura de 24 poços (2xl06 células por poço) em meio de cultura BM (RPMI contendo 10% de FBS, 20 ng/mL de rmIL-3, 50 ng/mL de rmIL-6 e 50 ng/mL de rmSCF (PeproTech) ) . No dia 1 e no dia 2 da cultura, as células foram infectadas por agitação com o 115 PE2048955 vector retroviral MIG-OT1 pseudotipado com Eco (2 mL de sobrenadante virai por poço) a 2500 rpm e 30 °C durante 90 min. Após cada centrifugação, o sobrenadante foi removido e substituído com meio de cultura BM fresco. No dia 3, as células BM transduzidas foram colhidas e transferidas para murganhos receptores B6 que receberam 1200 rads de irradiação corporal total. Após oito semanas da transferência, os murganhos foram utilizados para estudos de imunização in vivo. Cada murganho recebeu uma dose de injecção subcutânea de 10xl06 TU de lentivector direccionado. Após sete dias, células do baço e dos gânglios linfáticos foram colhidas e analisadas relativamente à presença de OT1 de células T e seus marcadores de activação de superfície utilizando citometria de fluxo.

Após oito semanas da transferência, a análise das células T periféricas dos murganhos reconstituídos mostrou que cerca de 5% das células T CD8+ eram GFP+0T1+ (Figura 13B). Alguns dos murganhos reconstituídos foram imunizados via injecção subcutânea da mesma dose (10xl06 TU) de FOVA/SVGmu (Exemplo 10) ou de FUGW/SVGmu (Exemplo 2) . A análise das células T GFP+0T1+ colhidas dos órgãos linfóides periféricos após 7 dias mostrou que a imunização de DC alvo por FOVA/SVGmu duplicou o número de OT1 de células T, quando comparado com os murganhos de controlo, que não estavam imunizados ou imunizados com FUGW/SVGmu (Figura 14B) . As células T GFP+0T1+ derivadas de murganhos imunizados com FOVA/SVGmu exibiram um fenótipo de memória efectora (CD69baix0CD62alt0CD44alt0) , indicando que estas 116 ΡΕ2048955 células passaram por uma resposta imune produtiva (Figura 14A) .

Estes resultados demonstram que um lentivector recombinante contendo SVGmu na superfície pode direccionar DCs in vivo para estimular eficazmente células T específicas para antigénio e induzir uma forte resposta imunitária. EXEMPLO 12

INDUÇÃO DE CTL in vivo E RESPOSTAS DE ANTICORPOS POR ADMINISTRAÇÃO DIRECTA DE VÍRUS RECOMBINANTE

Foram realizados estudos na eficácia do direccionamento para DC in vivo para induzir uma resposta de linfócitos T citotóxicos (CTL) CD8+ específicos para antigénio e resposta de anticorpos através da administração do lentivector direccionado a murganhos do tipo selvagem genuínos.

Foi dada a murganhos B6 do tipo selvagem (Charles River Breeding Laboratories) uma única injecção de lentivector direccionado (50xl06 TU de FUGW/SVG ou FOVA/SVGmu) por via subcutânea no flanco direito na dose indicada. No dia 7 e no dia 14 após a imunização, o sangue foi colhido dos murganhos imunizados através de sangramento da cauda e o soro de IgG anti-OVA foi medido utilizando ELISA. No dia 14, as células do baço e dos gânglios 117 PE2048955 linfáticos foram colhidas e analisadas relativamente à presença de células T especificas de OVA e seus marcadores de activação de superficie utilizando citometria de fluxo. A presença de células T especificas de OVA foi determinada por medição de secreção de citocinas e coloração com tetrâmero. No dia 14 após a injecção, as células T colhidas de órgãos linfóides periféricos foram analisadas. 0 lentivector direccionado para DCs nativas foi capaz de provocar células T CD8+ que respondem a OVA no gânglio linfático (dados não apresentados) e no baço (Figura 23) . A administração de uma dose única de FOVA/SVGmu recombinante foi suficiente para gerar células T CD8+, que podem ser motivo de "priming" para segregar IFN-γ após re-estimulação de OVAp (Figura 23). A administração do vector de controlo FUGW/SVGmu falhou em gerar quaisquer respostas especificas de OVAp (Figura 23) . Para melhor avaliar a amplitude das respostas, as células T CD8+ especificas de OVAp foram medidas por coloração com tetrâmero de MHC de classe I. Foi obtida uma elevada frequência de células T especificas de OVAp (> 6%) após uma injecção de dose única (Figura 15); não foram detectadas células positivas de tetrâmero nos murganhos tratados com FUGW/SVGmu (Figura 15). Os dados gerados por quantificação de tetrâmero correlacionaram-se bem com a análise de células efectoras CD8+ ensaiada por coloração de IFN-γ intracelular (Figura 23) . A análise de fenótipo destas células T positivas para OVAp mostrou que estas células exibiram as caracteristicas de superficie de células T de 118 PE2048955 memória efectoras (CD25baix0CD69baix0CD62Lalt0CD44alt0) (Figura 17A) .

Para investigar a resposta à dose da administração de lentivector, foram injectadas subcutaneamente doses de FOVA/SVGmu variando de lOOxlO6 TU a 3xl06 TU e foram medidas as células T especificas de OVAp no baço no dia 14 após a injecção. Foi detectada uma frequência excepcionalmente elevada (12%) de células T CD8+ especificas de OVAp na dose de lOOxlO6 TU (Figura 16A) . A percentagem de células especificas de OVAp correlacionou-se proporcionalmente com a quantidade de vector recombinante administrada (Figura 16B). Não foi alcançado um patamar na resposta à dose com as doses que foram testadas, indicando que aumentos adicionais podem ser alcançados por aumento da quantidade de vector injectado e/ou da frequência de injecção.

Além disso, os niveis de soro de IgG específicos para OVA em murganhos foram examinados nos 7o e 14° dias após a imunização com FOVA/SVGmu (50xl06 TU) . O título de soro de IgG foi de 1:10000 no dia 7 e de 1:30000 no dia 14 (Figura 17B) . Isto é uma resposta de anticorpos muito impressionante para uma injecção de dose única sem adjuvante adicional ou outros estímulos, indicando que a imunização de lentivector direccionado também pode induzir secreção significativa de células B de anticorpos específicos de antigénio. PE2048955

Estes resultados mostram que a administração in vivo de um lentivector direccionado para DC pode induzir respostas imunológicas celular e humoral contra o antigénio administrado. EXEMPLO 13

GERAÇÃO DE IMUNIDADE ANTI-TUMORAL: PROTECÇÃO

PREVENTIVA

Foi avaliada a imunidade anti-tumoral gerada após uma administração in vivo de lentivector direccionado para DC. Foi utilizado um modelo tumoral E.G7 (Wang, L. e D. Baltimore. 2005. supra.) no qual OVA serve como o antigénio tumoral.

Foram utilizadas linhas celulares tumorais EL4 (C57BL/6J, H-2b, timoma) e E.G7 (células EL4 que expressam de um modo estável uma cópia de cDNA de OVA de galinha) para o desafio do tumor de murganhos. Para a experiência de protecção do tumor, murganhos B6 (Charles River Breeding Laboratories) receberam uma injecção única de 50xl06 TU do lentivector direccionado (FOVA/SVGmu ou FUGW/SVGmu) no flanco direito. Após duas semanas, 5xl06 células EL4 ou E.G7 foram subcutaneamente injectadas no flanco esquerdo dos murganhos. O tamanho do tumor foi medido todos os dias utilizando compassos finos e foi apresentado como o produto dos dois maiores diâmetros perpendiculares a x b (mm2) . Os murganhos foram sacrificados quando os tumores atingiram 4 0 0 mm2. 120 ΡΕ2048955 A vacinação com 50xl06 TU de FOVA/SVGmu protegeu completamente os murganhos do desafio de tumor E.G7 (Figura 18, à esquerda), enquanto os tumores cresceram rapidamente em murganhos que receberam uma vacina simulada com um lentivector sem o transgénio OVA (Figura 18, à esquerda). Esta protecção foi especifica de OVA porque nos murganhos vacinados cresceram tumores EL4 de controlo que não possuem a expressão de OVA (Figura 18, direita), sem prestar atenção ao lentivector utilizado para a imunização. EXEMPLO 14

GERAÇÃO DE IMUNIDADE ANTI-TUMORAL: TRATAMENTO DO

TUMOR A imunidade anti-tumoral gerada após uma administração in vivo de lentivector direccionado para DC foi avaliada em que as células tumorais foram introduzidas antes da administração do lentivector. Os passos de injecção do tumor e administração de lentivector foram invertidos relativamente ao Exemplo 13 para testar se um tumor estabelecido poderia ser eliminado, num ensaio de "vacinação terapêutica". Para este fim, foram utilizadas células tumorais E.G7 que expressam o gene de luciferase de pirilampo (E.G7.1uc) para desafiar os murganhos, permitindo uma monitorização estreita das cinéticas de crescimento dos tumores em animais vivos utilizando BLI. Para facilitar a imagem, foi utilizada uma estirpe de albino de murganhos B6 121 PE2048955 (The Jackson Laboratory) . Estes murganhos não têm pigmentação e, assim, têm baixa absorção de fundo do sinal de luminescência. A injecção destes murganhos com lOOxlO6 TU de FOVA/SVGmu (Exemplo 10) mostrou uma resposta similar à observada em murganhos canónicos B6 (Figura 21) . As células tumorais E.G7.1uc (5xl06) foram subcutaneamente implantadas nos murganhos albinos B6. Os murganhos foram imunizados por FOVA/SVGmu (50xl06 TU por murganho por tempo) duas vezes, nos dias 3 e 10 após o desafio com tumor por meio de injecção subcutânea. A experiência foi repetida três vezes com uma experiência representativa apresentada nas Figuras 19 e 20.

Os murganhos que receberam a imunização de lentivector direccionado para DC mostraram um declínio de crescimento tumoral a partir do dia 9, seguido de regressão tumoral e uma redução de luminescência abaixo do nivel de detecção no dia 11 (Figuras 19 e 20) . Apesar de se ter observado recorrência tumoral mínima do dia 12 até ao dia 16, os murganhos tratados com FOVA/SVGmu estavam livres de doença no final do dia 18 e a seguir; não foi observada reincidência do tumor durante o tempo em que a experiência decorreu (> 60 dias). Pelo contrário, os tumores cresceram progressivamente nos murganhos que não receberam tratamento e os murganhos tiveram de ser removidos da experiência após o dia 16 devido ao tamanho grande dos tumores. Foi interessante notar que a regressão tumoral foi observada a partir do dia 7 após a imunização com lentivector. O tempo de regressão tumoral correlaciona-se bem com as cinéticas 122 ΡΕ2048955 de uma resposta imunitária especifica para o antigénio induzida por vacinação. EXEMPLO 15

ADMINISTRAÇÃO DE ANTIGÉNIO in vitro E FACTORES DE MATURAÇÃO POR UM VÍRUS RECOMBINANTE 0 sucesso da vacinação com DC pode depender do estado de maturação de DCs (Banchereau, J. e A.K. . Palucka 2005. Nat Rev Immunol 5:296-306; Schuler, G., et al. 2003 Curr Opin Immunol 15: 138-147; Figdor, C.G., et al. 2004

Nat Med 10: 475-480). Assim, podem ser incluídos genes nos vectores lentivirais que codificam as moléculas estimuladoras para desencadear a maturação desejada de DC. As citocinas que podem ser utilizadas incluem, mas não estão limitadas a, GM-CSF, IL-4, TNFa, IL-6, e semelhantes. Nalgumas formas de realização, o agente de maturação que é utilizado é o ligando CD40 (CD40L), que é normalmente expresso em células T CD4 e serve como um ligando para o receptor CD40 em DCs (Matano, T., et al. 1995. J Gen Virol 76: 3165-3169; Nguyen, T.H., et al. 1998. Hum Gene Ther 9: 2469-2479). Para manipular ainda mais DCs para serem uma vacina potente para terapia, um receptor CD40 induzido por fármaco (ÍCD40) é adaptado no sistema de administração de genes nalgumas formas de realização. Como descrito noutro local, o ÍCD40 foi concebido e consiste de um domínio citoplasmático de CD40 fundido a domínios de ligação ao ligando e a uma sequência direccionada para membrana 123 ΡΕ2048955 (Hanks, B.A., et al. 2005. Nat Med 11: 130-137). Quando ÍCD40 é expresso, a maturação e activação de DCs é regulada com um fármaco de dimerização permeável a lípidos.

Para examinar o efeito de inclusão de factores de maturação de DC, são obtidos os cDNAs de ovalbumina (OVA, tal como descrito no Exemplo 10), GM-CSF, IL-4, TNFa, IL-6 e CD40L. O ÍCD40 é construído como descrito noutro local (Hanks, B.A., et al. 2005. supra). Utilizando IRES e sequências do tipo 2A, são construídos vectores lentivirais multicistrónicos capazes de traduzir eficientemente até quatro proteínas. Este sistema está adaptado para construir vectores lentivirais que co-expressam os seguintes genes: OVA e uma molécula de factor de maturação (GM-CSF, IL-4, TNFa, IL-6, CD40L ou ÍCD40) (Figura 24a, rotulada como "FUOIM"). Uma sequência de vector exemplar é proporcionada por SEQ ID N°: 7. Os lentivírus em envelope com SVGmu são preparados (como descrito no Exemplo 2), e os lentivírus são transduzidos in vitro em BMDCs de murganhos cultivadas (geradas como descrito no Exemplo 6) para administrar especificamente estes genes nas células. A maturação de BMDCs é medida por análise FACS para a sobre-regulação de várias moléculas chave que têm papéis essenciais no processo de estimulação das células T. Marcadores representativos típicos são ICAM-1 (CD54), B7.1 (CD80), MHC de classe I, MHC de classe II e CD40 endógeno. As BMDCs transduzidas com lentivírus que codificam apenas OVA e genes GFP servem como controlos para a experiência. Observa-se que a sobre-regulação de marcadores de maturação 124 PE2048955 é alcançada quando DCs modificadas com ÍCD40 são expostas a uma quantidade eficaz de fármaco dimérico AP20187.

Além disso, duas propriedades características de DCs maduras são a capacidade reduzida para a endocitose e o potencial melhorado para activação de células T. A captação de dextrano marcado com FITC é utilizada para quantificar a endocitose de DCs transduzidas. As DCs maduras também são utilizadas para estimular células T que expressam recep-tores 0T1 de células T (TCRs) (como descrito no Exemplo 10), de modo a avaliar a sua capacidade para construir uma resposta imunológica. Observa-se que quando DCs modificadas com ÍCD40 são expostas a uma quantidade eficaz de fármaco dimérico AP20187, a captação de dextrano marcado com FITC é reduzida relativamente às DCs não modificadas com ÍCD40. Além disso, observa-se que após co-cultura com diferentes razões de DCs modificadas com ÍCD40 (tratadas com o fármaco dimérico) para células T transgénicas, os OT1 de células T respondem mais vigorosamente como medido pela libertação de proliferação de IFN-γ e células T do que as co-cultivadas com DCs não modificadas com ÍCD40. A longevidade de DCs é outro parâmetro que determina a imunidade dependente de células T. Os efeitos das moléculas estimuladoras na sobrevivência de DC utilizando um ensaio de diminuição de soro in vitro serão comparados utilizando o método tal como descrito em Hanks et al. (Hanks, B.A., et al. 2005. supra). 125 PE2048955

Se necessário, duas moléculas de factores de maturação podem ser administrados por vector lentiviral às DCs alvo, uma vez que a configuração do vector tem a capacidade de expressar quatro proteínas. EXEMPLO 16

ADMINISTRAÇÃO DE ANTIGÉNIO in vivo E FACTORES DE MATURAÇÃO POR UM VÍRUS RECOMBINANTE

Os vírus recombinantes empacotados com vector lentiviral FUOIM (SEQ ID N°: 7) são preparados como descrito no Exemplo 15. Os vírus são administrados aos murganhos genuínos B6 para administrar o antigénio OVA e moléculas de factores de maturação a DCs, e é avaliada a indução de imunidade a doses graduais de vírus como descrito no Exemplo 11.

Observa-se que a imunização de DC alvo por len-tivírus contendo ÍCD40 aumenta o número de células T que respondem a OVA, em comparação com os murganhos de controlo, que não são imunizados, imunizados com um len-tivírus que não contém OVA (e.g. FUGW/SVGmu) ou imunizados com lentivírus que não contém ÍCD40 (e.g. FOVA/SVGmu).

Além disso, a resistência dos animais a um desafio de tumor é avaliada com os lentivectores contendo ÍCD40, como descrito no Exemplo 13. Os murganhos são injectados com os seguintes lentivectores na experiência de 126 PE2048955 desafio de tumor: FUOIM/SVGmu, FOVA/SVGmu ou FUGW/SVGmu. As seguintes linhas celulares são utilizadas para o desafio de tumor: EL4 (C57BL/6J, H-2b, timoma) e E.G7 ((células EL4 que expressam de modo estável uma cópia de cDNA de OVA de galinha). Observa-se que os murganhos que receberam imunização pelos lentivectores direccionados para DC FUOIM/SVGmu e FOVA/SVGmu são protegidos do desafio de tumor. Pelo contrário, observa-se que os tumores crescem rapidamente em murganhos que receberam uma vacinação simulada com um lentivector que não tem transgénio OVA (FUGW/SVGmu). Esta protecção é especifica para OVA porque nos murganhos vacinados, crescem tumores EL4 de controlo que não possuem a expressão de OVA, sem atenção ao lentivector utilizado para a imunização.

Finalmente, o potencial deste método para erradicar um tumor estabelecido é avaliado com os lentivectores contendo ÍCD40, como descrito no Exemplo 14. Os seguintes lentivectores são utilizados para imunização na experiência: FUOIM/SVGmu e FOVA/SVGmu. As seguintes linhas celulares são utilizadas para o tratamento de tumor: EL4 e E.G7. Observa-se que os murganhos injectados com células tumorais que recebem imunização pelos lentivectores direccionados para DC (FUOIM/SVGmu e FOVA/SVGmu) mostram uma diminuição de crescimento tumoral, seguido de regressão tumoral e uma redução de luminescência abaixo do nivel de detecção. Além disso, nenhuma reincidência do tumor é observada durante o tempo em que a experiência decorre (> 60 dias). Pelo contrário, os tumores crescem progressivamente em murganhos que não receberam tratamento. 127 PE2048955 EXEMPLO 17 APRESENTAÇÃO DE ANTIGÉNIO DE HIV/SIDA POR VÍRUS RECOMBINANTE in vitro

Para tratar HIV/SIDA, são geradas DCs "de função dupla" com base na estratégia de administração de gene descrita. As DCs "de função dupla" são eficazes tanto na indução de anticorpos neutralizantes (Nabs) como na indução de imunidade de células T (Figura 25). Para induzir eficientemente NAbs, um gene que codifica gpl20 ligado à membrana quimérica (gpl20m) é entregue a DCs. A Gpl20 é uma glicoproteina em envelope para HIV e é considerada o imunogénio mais potente (Klimstra, W.B., et al. 2003. J Virol 77:12022-12032; Bernard, K.A., et al. 2000. Virology 276:93-103; Byrnes, A.P., et al. 1998. J Virol 72: 7349- 7356) . Conforme descrito noutro local, a gpl20 fundida com o dominio transmembranar da glicoproteina do virus de estomatite vesicular pode ser expressa na superfície celular numa forma trimérica, imitando o trimero maduro na superfície do virião de HIV (Klimstra, W.B., et al. 1998. J Virol 12: 7357-7366). Esta forma de imunogénio será exibida na superfície de DC. Além da expressão de superfície, as DCs também podem apresentar péptidos de epitopo que derivam de gpl20 de forma restrita de MHC para células T.

Uma vez que a infecção de HIV pode prejudicar significativamente a função de DC através da eliminação de 128 ΡΕ2048955 células T CD4, é desejável desenvolver DCs que funcionem de forma independente das células T. A expressão de CD40L ou ÍCD40 pode resultar na maturação e activação de DCs na ausência de células T CD4. Assim, o CD40L ou ÍCD40 desenvolvido, como descrito no Exemplo 16, o qual funciona como uma molécula estimuladora e de maturação, é incorporado no virus direccionado para DC. 0 constructo lentiviral para modificar geneticamente DCs é ilustrado na Figura 24b e é rotulado como FUGmID (SEQ ID N°: 8). São obtidos cDNAs optimizados por codão para gpl20 de NIH AIDS Research & Reference Reagent Program. A sequência optimizada por codão pode atingir niveis excepcionalmente elevados de expressão de gene fora do contexto do genoma de HIV-1. 0 constructo é preparado por fusão de gpl20 com o dominio transmembranar da glicoproteina do virus de estomatite vesicular.

Os ensaios in vitro são conduzidos para avaliar a eficácia de DCs modificadas por gene para induzir NAbs. As células B CD19+ são isoladas de baços de murganhos B6 genuínos utilizando micro-esferas anti-CD19 (MiHenyi Biotech, Auburn, CA) e co-cultivadas com DCs modificadas na presença de IL-4 e IL-6. 0 vector lentiviral FUmGID é co-transfectado com SVGmu em linhas celulares para preparar o vírus FUmGID/SVGmu, como descrito no Exemplo 2. Os vírus resultantes são transduzidos em DCs que derivam de medula óssea (BMDCs). As DCs transduzidas devem ser irradiadas (3000 rad) e utilizadas como células que apresentam 129 ΡΕ2048955 antigénios (APCs), em co-cultura com células B. 0 período em que decorre a proliferação de células B em resposta às BMDCs transduzidas é medido. Observa-se que as células B proliferam numa extensão maior em co-cultura com BMDCs transduzidas do que as que são co-cultivadas com BMDCs transduzidas simuladas.

Para investigar o efeito de DCs geneticamente modificadas na diferenciação de células B em células específicas que segregam imunoglobulina, o método de co-cultura como anteriormente descrito é utilizado com a excepção de que as DCs não são irradiadas. Após 14 dias, o título de vários isotipos de anticorpo específico de HIV em sobrenadantes da cultura é determinado por ELISA utilizando gpl20 recombinante (disponível de NIB: AIDS Research & Reference Reagent Program) como o antigénio. A expressão dos vários isotipos de anticorpo específico de HIV são maiores em células B co-cultivadas com BMDCs transduzidas do que nas co-cultivadas com BMDCs transduzidas simuladas.

Para avaliar a eficácia das DCs geneticamente modificadas para activar células T in vitro, as células T CD3+ são isoladas a partir de murganhos B6 genuínos e co-cultivadas com DCs irradiadas e infectadas com lentivírus. 0 período em que decorre a proliferação das células T é medido. Constata-se que a proliferação de células T como sendo maior em culturas de células T co-cultivadas com DCs irradiadas e transduzidas do que as co-cultivadas com DCs transduzidas simuladas. 130 ΡΕ2048955

Os resultados são esperados para demonstrar colectivamente que as BMDCs transduzidas com o lentivector FUmGID/SVGmu é eficaz tanto na estimulação de células B para produzir anticorpos neutralizantes (Nabs) como na indução de imunidade de células T contra HIV/SIDA. EXEMPLO 18 APRESENTAÇÃO DE ANTIGÉNIO DE HIV/SIDA POR VÍRUS RECOMBINANTE in vivo

Para avaliar a activação de células B in vivo, murganhos B6 são imunizados por injecção subcutânea com os lentivirus recombinantes preparados como descrito no Exemplo 17. Os controlos incluem murganhos injectados com lentivirus que codificam antigénios sozinhos, lentivirus que codificam moléculas de maturação sozinhas, e murganhos genuínos sem qualquer tratamento. Duas semanas após a injecção de vírus, os anticorpos de soro contra HIV são medidos por ELISA. Constatou-se que o título de anticorpo é maior do que o dos murganhos injectados com o vírus FUmGID/SVGmu bem como os injectados com lentivirus que codificam antigénios sozinhos. Pelo contrário, o título de anticorpos é relativamente baixo nos murganhos imunizados com lentivirus que codifica moléculas de maturação sozinhas e em murganhos genuínos.

Para a activação das células T in vivo, os vírus 131 PE2048955 recombinantes descritos são injectados em murganhos B6. Após sete dias, as células T são isoladas, e a sua proliferação e secreção de citocinas, após re-estimulação in vitro com DCs geneticamente modificadas, é medida como descrito no Exemplo 12. A duração das respostas de células T efectoras também é monitorizada. O lentivector direccionado para DCs nativas é capaz de induzir células T gue respondem a HIV tanto em gânglio linfático como em baço. A administração de FUmGID/SVGmu recombinante é suficiente para gerar células T que segregam IFN-γ. Pelo contrário, a administração de um vector de controlo simulado (e.g. FUGW/SVGmu) falha na indução de uma resposta especifica para HIV. EXEMPLO 19

VACINAÇÃO DE HIV/SIDA in situ POR VÍRUS RECOMBINANTE: PROTECÇÃO CONTRA DESAFIO DE HIV

De modo a testar a abordagem de vacinação de DC in situ para lidar com HIV, é desenvolvido um novo modelo de murganho de patogénese de HIV envolvendo quimeras humano/murganho. Como descrito noutro lugar, o murganho RAG2‘/‘yc“/‘ pode ser reconstituído com um sistema imunitário adaptativo de humano (Strauss, J.H., et al. 1994. Archives of Virology 9:473-484). Os murganhos RAG2_/"yc"/_ não têm células B, T e NK (Morizono, K., et al. 2001. J Virol 75: 8016-8020). A injecção de sangue do cordão umbilical humano CD34+ no fígado de murganhos de um dia de idade 132 ΡΕ2048955 parcialmente irradiados leva à produção e maturação de DCs, células B e células T humanas funcionalmente diversas, com a restrição de MHC humana. Além disso, este modelo orienta o desenvolvimento de órgãos linfóides primários e secundários, e a produção de uma resposta imunitária de células T CD8+ funcionais contra um desafio virai. Além disso, a observação do isotipo Ig que varia de IgM para IgG indica a existência de imunidade de células T CD4+ funcionais.

Para determinar a eficácia da protecção preventiva contra HIV por imunização direccionada a DC, às quimeras de humano/murganho são administrados virus recombinantes em envelope com SVGmu por injecção. Os virus recombinantes codificam o antigénio gpl20m (Exemplo 17) em conjunto com um estimulador de maturação (por exemplo, CD40L ou ÍCD40 como no Exemplo 15) , e são preparados e concentrados como descrito no Exemplo 2. Os murganhos imunizados foram então inoculados com HIV de acordo com métodos bem conhecidos na técnica, tal como, por exemplo, via intraperitoneal ou por vias intravenosas. Uma vez que os murganhos reconstituidos mantêm as células T CD4 humanas, os animais são desafiados com virus repórteres com HIV molecularmente clonados, NFNSX-r-HSAS (CCR5-trópico), NL-r-HSAS (CXCR4-trópico) e isolados clinicos (Baenziger, et al. 2006. Proc Natl Acad Sei USA 103:15951-15956). Os virus repórteres capazes de replicação também contêm o antigénio estável ao calor (HSA) na região vpr. Além disso, para estabelecer uma infecção produtiva antes da 133 ΡΕ2048955 inoculação, as células mononucleares de sangue periférico singenéico infectadas (PBMCs) são injectadas no espaço peritoneal da quimera humano/murganho reconstituida. A evidência de infecção por HIV é monitorizada no tempo nos baços, gânglios linfáticos, PBMCs e sangue periférico. É utilizado FACS para HSA nos virus repórteres de HIV para testar a integração e replicação virai de HIV. A carga virai de HIV também é medida a partir de plasma utilizando RT-PCR. Através da avaliação de infecção por HIV por estes métodos, observa-se que a vacinação de DC in situ produtiva torna os murganhos imunizados mais resistentes ao desafio de HIV do que os que não foram imunizados. EXEMPLO 20

VACINAÇÃO DE HIV/SIDA in situ POR VÍRUS RECOM-BINANTE: ELIMINAÇÃO DE INFECÇÃO POR HIV

Para testar a capacidade da abordagem de vacinação de DC in situ para eliminar uma infecção de HIV activa, as quimeras de humano/murganho são primeiro desafiadas com virus repórter de HIV molecularmente clonado, NFNSX-r-HSAS (CCR5-trópico), como descrito no Exemplo 19. A infecção de HIV activa é monitorizada por análise de FACS de expressão de HSA em células T CD4 humanas. Uma vez que a infecção de HIV bem sucedida é confirmada, os virus recombinantes desenvolvidos (Exemplo 19) são injectados nos animais por injecção subcutânea ou 134 ΡΕ2048955 por uma via óptima determinada por um perito na técnica (por exemplo, s.c., i.d., i.v. ou i.p.). A carga virai de HIV é então monitorizada por RT-PCR, e as contagens de CD4 periféricas são seguidas. Observa-se que a vacinação de DC é capaz de baixar a carga virai de HIV e de eliminar uma infecção de HIV estabelecida em murganhos imunizados quando comparado com controlos não vacinados. A terapia antiretroviral altamente activa (HAART), utilizando uma estratégia de três fármacos, tem melhorado significativamente a morbidade e mortalidade por SIDA. A estratégia acima descrita pode ser adaptada a este paradigma por células de DC que transduzem simultaneamente in vivo com virus recombinantes desenvolvidos. Em conjunto com HAART, os estudos acima são repetidos para avaliar a capacidade de prevenir ou reduzir a infecção após desafio de HIV (Exemplo 19) e de eliminar uma infecção de HIV activa. EXEMPLO 21

TRATAMENTO DE UM TUMOR MALIGNO NUM HUMANO UTILIZANDO UM VÍRUS RECOMBINANTE

Um doente humano é diagnosticado com um tumor maligno. 0 doente é administrado com uma quantidade adequada de virus recombinante contendo um gene que codifica um antigénio especifico para o tumor e envolvido com uma molécula que direcciona especificamente para DC- PE2048955 SIGN, tal como, por exemplo, SVGmu. O virus contém opcionalmente um gene que codifica um factor de maturação de DC, como descrito no Exemplo 15. O virus é administrado semanalmente por injecção intravenosa durante a duração do tratamento. Em tempos periódicos durante e após o regime de tratamento, a carga tumoral é avaliada por imagiologia de ressonância magnética (MRI). Reduções significativas no tamanho do tumor são constatadas como progressos de tratamento. EXEMPLO 22

PREVENÇÃO DE FORMAÇÃO DE TUMOR NUM HUMANO UTILIZANDO UM VÍRUS RECOMBINANTE

Um grupo de doentes humanos é administrado com uma quantidade adequada de virus recombinante contendo pelo menos um gene que codifica um antigénio que é geralmente e especificamente associado com células tumorais e que contém opcionalmente um gene que codifica um factor de maturação de DC, como descrito no Exemplo 15. O virus é envolvido com uma molécula direccionada especificamente para DC-SIGN, tal como, por exemplo, SVGmu (Exemplo 2) . Os doentes no grupo experimental e num grupo de controlo são monitorizados periodicamente relativamente ao crescimento tumoral. Observa-se que a incidência de formação de tumor maligno é menor nos doentes aos quais o virus é administrado do que no grupo de controlo. 136 ΡΕ2048955 EXEMPLO 23

TRATAMENTO DE SIDA/HIV NUM HUMANO UTILIZANDO UM VÍRUS RECOMBINANTE

Um doente humano é diagnosticado com HIV/SIDA. O doente é administrado com uma quantidade adequada de vírus recombinante contendo um gene que codifica para Gpl20 (Exemplo 17) e envolvido com uma molécula direccionada especificamente para DC-SIGN, tal como, por exemplo, SVGmu (Exemplo 2) . 0 vírus contém opcionalmente um gene que codifica um factor de maturação de DC, como descrito no

Exemplo 15. 0 vírus é administrado semanalmente por injecção intravenosa durante a duração do tratamento. Em tempos periódicos durante e após o regime de tratamento, a carga virai de HIV é avaliada medindo os anticorpos no sangue do doente contra HIV por ELISA. A contagem de células T do doente também é avaliada. Observa-se que uma redução significativa da carga virai de HIV é conseguida à medida que o tratamento progride. Além disso, observa-se que a contagem de células T do doente deixa de diminuir à medida que o tratamento progride. EXEMPLO 24

PREVENÇÃO DE HIV/SIDA NUM HUMANO UTILIZANDO UM VÍRUS RECOMBINANTE

Um grupo de doentes humanos, considerado em risco de infecção por HIV, é administrado com uma quantidade 137 ΡΕ2048955 adequada de virus recombinante contendo um gene de codifica GP120 (Exemplo 17) e contém opcionalmente um gene que codifica um factor de maturação de DC, como descrito no Exemplo 15. 0 virus é envolvido com uma molécula direccionada especificamente para DC-SIGN, tal como, por exemplo, SVGmu (Exemplo 2) . Os doentes no grupo experimental e num grupo de controlo são testados a cada 6 meses para relativamente a infecção por HIV e se positivo, monitorizados para a carga virai de HIV e contagem de células T. Em doentes infectados positivamente no grupo vacinado, observa-se que a carga virai de HIV permanece baixa e a contagem de células T permanece elevada relativamente aos doentes infectados positivamente do grupo de controlo.

Apesar da presente invenção ter sido descrita em pormenor para propósitos de elucidação de compreensão, será evidente que podem ser praticadas determinadas modificações dentro do âmbito das reivindicações em anexo.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Wang, Pin Yang, Lili Baltimore, David

<120> ADMINISTRAÇÃO DE GENE ALVO PARA VACINAÇÃO DE CÉLULAS DENDRÍTICAS

<130> CALTE.035A <150> U.S. 60/832,497 <151> 2006-07-21 <150> U.S. 60/920,260 <151> 2007-03-27 138 PE2048955 <160> 11 <170> FastSEQ para Windows versão 4.0

<210> 1 <211> 9941 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Vector de plamídeo construído <400> 1 gtcgacggat cgggagatct atgccgcata gttaagccag gcgcgagcaa aatttaagct tgcttagggt taggcgtttt attgattatt gactagttat atatggagtt ccgcgttaca acccccgccc attgacgtca tccattgacg tcaatgggtg tgl-atcal-at· grraagtarg attatgccca gtacatgacc tcatcgctat taccatggtg ttgactcacg gggatttcca accaaaatca acgggacttt gcggtaggcg tgtacggtgg ctctggttag accagatctg aagcctcaat aaagcttgcc tctggtaact agagatccct gcccgaacag ggacttgaaa ggcttgctga agcgcgcacg ttttgactag cggaggctag ggagaattag atcgcgatgg aattaaaaca tatagtatgg tgttagaaac atcagaaggc caggatcaga agaacttaga aaaggataga gataaaagac aaagtaagac caccgcacag agggacaatt ggagaagtga gtagcaccca ccaaggcaaa ggagctttgt tccttgggtt acgctgacgg tacaggccag ctgagggcta ttgaggcgca ctccaggcaa gaatcctggc tggggttgct ctggaaaact aataaatctc tggaacagat aacaattaca caagcttaat aatgaacaag aattattgga cccgatcccc tatggtgcac tatctgctcc ctgcttgtgt acaacaaggc aaggcttgac gcgctgcttc gcgatgtacg taatagtaat 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720 cgccccattg acgcaaatgg 780 gttttgcctg tactgggtct 840 aactagggaa cccactgctt 900 gtgcccgtct gttgtgtgac 960 ggaaaatctc tagcagtggc 1020 gctctctcga cgcaggactc 1080 actggtgagt acgccaaaaa 1140 gagcgtcagt attaagcggg 1200 agggggaaag aaaaaatata 1260 attcgcagtt aatcctggcc 1320 gctacaacca tcccttcaga 1380 aaccctctat tgtgtgcatc 1440 gatagaggaa gagcaaaaca 1500 gacctggagg aggagatatg 1560 taaaaattga accattagga 1620 aaaaaagagc agtgggaata 1680 ctatgggcgc agcgtcaatg 1740 tgcagcagca gaacaatttg 1800 cagtctgggg catcaagcag 1860 atcaacagct cctggggatt 1920 cttggaatgc tagttggagt 1980 tggagtggga cagagaaatt 2040 cgcaaaacca gcaagaaaag 2100 tgtggaattg gtttaacata 2160 139 PE2048955 acaaattggc tgtggtatat aaaattattc ataatgatag taggaggctt ggtaggttta 2220 agaatagttt ttgctgtact ttctatagtg aatagagtta ggcagggata ttcaccatta 2280 tcgtttcaga cccacctccc aaccccgagg ggacccgaca ggcccgaagg aatagaagaa 2340 gaaggtggag agagagacag agacagatcc attcgattag tgaacggatc ggcactgcgt 2400 gcgccaattc tgcagacaaa tggcagtatt catccacaat tttaaaagaa 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<210> 2 <211> 9206 <212> DNA <213> Sequência artificial <22 0> PE2048955 <223> Vector de plamideo construído <400> 2 gtcgacggat cgggagatct cccgatcccc tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg 60 atgccgcata gttaagccag tatctgctcc ctgcttgtgt gttggaggtc gctgagtagt 120 gcgcgagcaa aatttaagct acaacaaggc aaggcttgac cgacaattgc atgaagaatc 180 tgcttagggt taggcgtttt gcgctgcttc gcgatgtacg ggccagatat acgcgttgac 240 attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg gtcattagtt catagcccat 300 atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg 360 acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt 420 tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag 480 tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc 540 attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag 600 tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacat caatgggcgt ggatagcggt 660 ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt caatgggagt ttgttttggc 720 accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactc 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<210> 7 <211> 11586 <212> DNA <213> Sequência artificial <22 0> <223> Vector de plamideo construído <22 0> <221> misc_feature <222> 3907 <223> n=a, t, c ou g <400> 7 gtcgacggat cgggagatct cccgatcccc tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg 60 atgccgcata gttaagccag tatctgctcc ctgcttgtgt gttggaggtc gctgagtagt 120 gcgcgagcaa aatttaagct acaacaaggc aaggcttgac cgacaattgc atgaagaatc 180 tgcttagggt taggcgtttt gcgctgcttc gcgatgtacg ggccagatat acgcgttgac 240 attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg gtcattagtt catagcccat 300 atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg 360 acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt 420 tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag 480 tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc 540 attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag 600 tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacat caatgggcgt ggatagcggt 660 ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt caatgggagt ttgttttggc 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ttttgttatt gtcttttggg cttctatata cattttagaa 7200 tgaggttggc aagttctgta gatcttagcc actttttaaa agaaaagggg ggactggaag 7260 ggctaattca ctcccaacga agacaagata tccttgatct gtggatctac cacacacaag 7320 gctacttccc tgattggcag aactacacac cagggccagg gatcagatat ccactgacct 7380 ttggatggtg ctacaagcta gtaccagttg agcaagagaa ggtagaagaa gccaatgaag 7440 gagagaacac ccgcttgtta caccctgtga gcctgcatgg gatggatgac ccggagagag 7500 aagtattaga gtggaggttt gacagccgcc tagcatttca tcacatggcc cgagagctgc 7560 atccggactg tactgggtct ctctggttag accagatctg agcctgggag ctctctggct 7620 aactagggaa cccactgctt aagcctcaat aaagcttgcc ttgagtgctt caagtagtgt 7680 gtgcccgtct gttgtgtgac tctggtaact agagatccct cagacccttt tagtcagtgt 7740 ggaaaatctc tagcagcatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg 7800 ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac 7860 gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg 7920 gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct 7980 ttctcccttc gggaagcgtg 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agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg 8880 ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct 8940 ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta 9000 gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg 9060 ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga 9120 ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt 9180 gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca 9240 ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt 9300 cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt 9360 ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga 9420 aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt 9480 gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc 9540 gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgac 9569 163 ΡΕ2048955

<210> 10 <211> 9394 <212> DNA <213> Sequência artificial <22 0> <223> Vector de plamídeo construído <22 0> <221> misc_feature <222> 7971 <223> n=a ,t, c or g <400> 10 ttgtacaaag tagcatacat gatatcaagc attcttaact catgctattg tctctttatg gctgacgcaa ttcgctttcc tggacagggg tcctttcctt tacgtccctt cggcctcttc tccccgcatc tagcaataca ggtgggtttt atcatatcaa tctctaattt tgtaatgatt tactgatttg tgcaaatatt ataagtctta gtcataagaa aaagatttaa gtatggtatg tctaaaaaag cacttacata ctatccccac cattttgttc atgaggttgg gggctaattc ggctacttcc tttggatggt ggagagaaca gaagtattag catccggact taactaggga tgtgcccgtc tggaaaatct gccgcgttgc cgctcaagtc ggaagctccc tttctccctt gtgtaggtcg tgcgccttat ctggcagcag ttcttgaagt ctgctgaagc accgctggta tctcaagaag tggtgataac ctcgagggcg caattcgtcg agggacctaa taacttcgta 60 tatacgaagt tatacatgtt taagggttcc ggttccacta ggtacaattc 120 ttatcgataa tcaacctctg gattacaaaa tttgtgaaag attgactggt 180 atgttgctcc ttttacgcta tgtggatacg ctgctttaat gcctttgtat 240 cttcccgtat ggctttcatt ttctcctcct tgtataaatc ctggttgctg 300 aggagttgtg gcccgttgtc aggcaacgtg gcgtggtgtg cactgtgttt 360 cccccactgg ttggggcatt gccaccacct gtcagctcct ttccgggact 420 ccctccctat tgccacggcg gaactcatcg ccgcctgcct tgcccgctgc 480 ctcggctgtt gggcactgac aattccgtgg tgttgtcggg gaaatcatcg 540 ggctgctcgc ctgtgttgcc acctggattc tgcgcgggac gtccttctgc 600 cggccctcaa tccagcggac cttccttccc gcggcctgct gccggctctg 660 cgcgtcttcg ccttcgccct cagacgagtc ggatctccct ttgggccgcc 720 gataccgtcg acctcgatcg agacctagaa aaacatggag caatcacaag 780 gcagctacca atgctgattg tgcctggcta gaagcacaag aggaggagga 840 ccagtcacac ctcaggtacc aagcatgggg taaagtactg ttctcatcac 900 ggttatatac catcaatatt gccacagatg ttacttagcc ttttaatatt 960 agtgtatatg caatgatagt tctctgattt ctgagattga gtttctcatg 1020 atttagagtt tctctttcat ctgttcaaat ttttgtctag ttttattttt 1080 taagacttct ttttataatc tgcatattac aattctcttt actggggtgt 1140 ttctgtcatt ctatggcctg acttttctta atggtttttt aattttaaaa 1200 atattcatgc aatctaatta acaatctttt ctttgtggtt aggactttga 1260 atttttctct acactgaagt catgatggca tgcttctata ttattttcta 1320 agttttgcct tctccattta gacttataat tcactggaat ttttttgtgt 1380 acatatgggt tcccttttat tttttacata taaatatatt tccctgtttt 1440 aaaaagatca tcattttccc attgtaaaat gccatatttt tttcataggt 1500 tatcaatggg tctgtttctg agctctactc tattttatca gcctcactgt 1560 acatctcatg ctttgctcta aatcttgata tttagtggaa cattctttcc 1620 tacaagaata tttttgttat tgtcttttgg gcttctatat acattttaga 1680 caagttctgt agatcttagc cactttttaa aagaaaaggg gggactggaa 1740 actcccaacg aagacaagat atccttgatc tgtggatcta ccacacacaa 1800 ctgattggca gaactacaca ccagggccag ggatcagata tccactgacc 1860 gctacaagct agtaccagtt gagcaagaga aggtagaaga agccaatgaa 1920 cccgcttgtt acaccctgtg agcctgcatg ggatggatga cccggagaga 1980 agtggaggtt tgacagccgc ctagcatttc atcacatggc ccgagagctg 2040 gtactgggtc tctctggtta gaccagatct gagcctggga gctctctggc 2100 acccactgct taagcctcaa taaagcttgc cttgagtgct tcaagtagtg 2160 tgttgtgtga ctctggtaac tagagatccc tcagaccctt ttagtcagtg 2220 ctagcagcat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag 2280 tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga 2340 agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct 2400 tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc 2460 cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg 2520 ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc 2580 ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca 2640 ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag 2700 ggtggcctaa ctacggctac actagaagaa cagtatttgg tatctgcgct 2760 cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc 2820 gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga 2880 atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca 2940 164 PE2048955 cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat 3000 taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac 3060 caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt 3120 gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt 3180 gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag 3240 ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct 3300 attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt 3360 gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc 3420 tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt 3480 agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg 3540 gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg 3600 actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct 3660 tgcccggcgt caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc 3720 attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt 3780 tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt 3840 tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg 3900 aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat 3960 tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg 4020 cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgac gtcgacggat cgggagatct cccgatcccc 4080 tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg atgccgcata gttaagccag tatctgctcc 4140 ctgcttgtgt gttggaggtc gctgagtagt gcgcgagcaa aatttaagct acaacaaggc 4200 aaggcttgac cgacaattgc atgaagaatc tgcttagggt taggcgtttt gcgctgcttc 4260 gcgatgtacg ggccagatat acgcgttgac attgattatt gactagttat taatagtaat 4320 caattacggg gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg 4380 taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt 4440 atgttcccat agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac 4500 ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg 4560 acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttatgggact 4620 ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt 4680 ggcagtacat caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc 4740 ccattgacgt caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc 4800 gtaacaactc cgccccattg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata 4860 taagcagcgc gttttgcctg tactgggtct ctctggttag accagatctg agcctgggag 4920 ctctctggct aactagggaa cccactgctt aagcctcaat aaagcttgcc ttgagtgctt 4980 caagtagtgt gtgcccgtct gttgtgtgac tctggtaact agagatccct cagacccttt 5040 tagtcagtgt ggaaaatctc tagcagtggc gcccgaacag ggacttgaaa gcgaaaggga 5100 aaccagagga gctctctcga cgcaggactc ggcttgctga agcgcgcacg gcaagaggcg 5160 aggggcggcg actggtgagt acgccaaaaa ttttgactag cggaggctag aaggagagag 5220 atgggtgcga gagcgtcagt attaagcggg ggagaattag atcgcgatgg gaaaaaattc 5280 ggttaaggcc agggggaaag aaaaaatata aattaaaaca tatagtatgg gcaagcaggg 5340 agctagaacg attcgcagtt aatcctggcc tgttagaaac atcagaaggc tgtagacaaa 5400 tactgggaca gctacaacca tcccttcaga caggatcaga agaacttaga tcattatata 5460 atacagtagc aaccctctat tgtgtgcatc aaaggataga gataaaagac accaaggaag 5520 ctttagacaa gatagaggaa gagcaaaaca aaagtaagac caccgcacag caagcggccg 5580 gccgcgctga tcttcagacc tggaggagga gatatgaggg acaattggag aagtgaatta 5640 tataaatata aagtagtaaa aattgaacca ttaggagtag cacccaccaa ggcaaagaga 5700 agagtggtgc agagagaaaa aagagcagtg ggaataggag ctttgttcct tgggttcttg 5760 ggagcagcag gaagcactat gggcgcagcg tcaatgacgc tgacggtaca ggccagacaa 5820 ttattgtctg gtatagtgca gcagcagaac aatttgctga gggctattga ggcgcaacag 5880 catctgttgc aactcacagt ctggggcatc aagcagctcc aggcaagaat cctggctgtg 5940 gaaagatacc taaaggatca acagctcctg gggatttggg gttgctctgg aaaactcatt 6000 tgcaccactg ctgtgccttg gaatgctagt tggagtaata aatctctgga acagatttgg 6060 aatcacacga cctggatgga gtgggacaga gaaattaaca attacacaag cttaatacac 6120 tccttaattg aagaatcgca aaaccagcaa gaaaagaatg aacaagaatt attggaatta 6180 gataaatggg caagtttgtg gaattggttt aacataacaa attggctgtg gtatataaaa 6240 ttattcataa tgatagtagg aggcttggta ggtttaagaa tagtttttgc tgtactttct 6300 atagtgaata gagttaggca gggatattca ccattatcgt ttcagaccca cctcccaacc 6360 ccgaggggac ccgacaggcc cgaaggaata gaagaagaag gtggagagag agacagagac 6420 agatccattc gattagtgaa cggatcggca ctgcgtgcgc caattctgca gacaaatggc 6480 agtattcatc cacaatttta aaagaaaagg ggggattggg gggtacagtg caggggaaag 6540 aatagtagac ataatagcaa cagacataca aactaaagaa ttacaaaaac aaattacaaa 6600 aattcaaaat tttcgggttt attacaggga cagcagagat ccagtttggt tagtaccggg 6660 cccggtgctt tgctctgagc cagcccacca gtttggaatg actccttttt atgacttgaa 6720 ttttcaagta taaagtctag tgctaaattt aatttgaaca actgtatagt ttttgctggt 6780 tgggggaagg aaaaaaaatg gtggcagtgt ttttttcaga attagaagtg aaatgaaaat 6840 tgttgtgtgt gaggatttct aatgacatgt ggtggttgca tactgagtga agccggtgag 6900 cattctgcca tgtcaccccc tcgtgctcag taatgtactt tacagaaatc ctaaactcaa 6960 ΡΕ2048955 aagattgata taaaccatgc ttcttgtgta tatccggtct cttctctggg tagtctcact 7020 cagcctgcat ttctgccagg gcccgctcta gtcgaggtcg acggtatcga taagctcgct 7080 tcacgagatt ccagcaggtc gagggaccta ataacttcgt atagcataca ttatacgaag 7140 ttatattaag ggttccaagc ttaagcggcc gcgtggataa ccgtattacc gccatgcatt 7200 agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc 7260 gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg 7320 acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa 7380 tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 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ttgccagtag actttatgct 8280 gaagagagat acccaatcct gccagaatac ttgcagtgtg tgaaggaact gtatagagga 8340 ggcttggaac ctatcaactt tcaaacagct gcagatcaag ccagagagct catcaattcc 8400 tgggtagaaa gtcagacaaa tggaattatc agaaatgtcc ttcagccaag ctccgtggat 8460 tctcaaactg caatggttct ggttaatgcc attgtcttca aaggactgtg ggagaaaaca 8520 tttaaggatg aagacacaca agcaatgcct ttcagagtga ctgagcaaga aagcaaacct 8580 gtgcagatga tgtaccagat tggtttattt agagtggcat caatggcttc tgagaaaatg 8640 aagatcctgg agcttccatt tgccagtggg acaatgagca tgttggtgct gttgcctgat 8700 gaagtctcag gccttgagca gcttgagagt ataatcaact ttgaaaaact gactgaatgg 8760 accagttcta atgttatgga agagaggaag atcaaagtgt acttacctcg catgaagatg 8820 gaggaaaaat acaacctcac atctgtctta atggctatgg gcattactga cgtgtttagc 8880 tcttcagcca atctgtctgg catctcctca gcagagagcc tgaagatatc tcaagctgtc 8940 catgcagcac atgcagaaat caatgaagca ggcagagagg tggtagggtc agcagaggct 9000 ggagtggatg ctgcaagcgt ctctgaagaa tttagggctg accatccatt cctcttctgt 9060 atcaagcaca tcgcaaccaa cgccgttctc ttctttggca gatgtgtttc cccttaaaaa 9120 gaagaaagct gaaaaactct gtcccttcca acaagaccca gagcactgta gtatcagggg 9180 taaaatgaaa agtatgttct ctgctgcatc cagacttcat aaaagctgga gcttaatcta 9240 gactggaggc ttgctgaagg ctgtatgctg tgagaactga attccatggg ttgttttggc 9300 cactgactga caacccatga ttcagttctc acaggacaca aggcctgtta ctagcactca 9360 catggaacaa atggcccatc tagacccagc tttc 9394

<210> 11 <211> 986 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Glicoproteina de vírus Sindbis com mutação <400> 11

Met Ser Ala Ala Pro Leu Vai Thr Ala Met Cys Leu Leu Gly Asn Val 1 5 10 15 Ser Phe Pro cys Asp Arg Pro Pro Thr Cys Tyr Thr Arg Glu Pro Ser 20 25 30 Arg Ala Leu Asp lie Leu Glu Glu Asn Vai Asn His Glu Ala Tyr Asp 35 40 45 val Ile Thr Leu Leu Asn Ala Ile Leu Arg cys Gly Ser Ser Gly ser 50 55 60 Asp Asp Phe Thr Leu Thr Ser Pro Tyr Leu Gly Thr Cys Ser Tyr Cys 65 70 75 val 80 His HÍS Thr vai Pro Cys Phe Ser Pro Vai Lys Ile Glu Gin Trp 85 90 95 Asp Glu Ala Asp ASp Asn Thr ile Arg ile Gin Thr Ser Ala Gin Phe 100 105 110 ΡΕ2048955 - 166 -

Gly Tyr Asp Gin Ser Gly Ala Ala Ser Ala Asn Lys Tyr Arg Tyr Met 115 120 125 Ser Leu Lys Gin Met Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Thr Val 130 135 140 Lys Glu Gly Thr Met Asp ASp Ile Lys ile Ser Thr Ser Gly Pro Cys 145 150 155 160 Arg Arg Leu Ser Tyr Lys Gly Tyr Phe Leu Leu Ala Lys cys Pro Pro 165 170 175 Gly Asp Ser val Thr val Ser Ile Val Ser Ser Asn Ser Ala Thr ser 180 185 190 cys Thr Leu Ala Arg Lys ile Lys Pro Lys Phe val Gly Arg Glu Lys 195 200 205 Tyr Asp Leu Pro Pro Val His Gly Lys Lys Ile Pro Cys Thr Val Tyr 210 215 220 Asp Arg Leu Ala Ala Thr Thr Ala Gly Tyr Ile Thr Met His Arg pro 225 230 235 240 Arg Pro U-í c 1 1 1 Ala Tyr Thr Cor Tyr Leu Gl u Glu Ser ser Gly Lys val 245 250 255 Tyr Ala Lys Pro Pro Ser Gly Lys Asn Ile Thr Tyr Glu Cys Lys Cys 260 265 270 Gly Asp Tyr Lys Thr Gly Thr Val Ser Thr Arg Thr Glu Ile Thr Gly 275 280 285 cys Thr Ala Ile Lys Gin cys Val Ala Tyr Lys Ser Asp Gin Thr Lys 290 295 300 Trp val Phe Asn Ser Pro Asp Leu ile Arg His Asp Asp His Thr Ala 505 310 315 320 Gin Gly Lys Leu His Leu pro Phe Lys Leu Ile pro Ser Thr Cys Met 325 330 335 Vai Pro val Ala His Ala Pro Asn val Ile His Gly Phe Lys HÍS ile 340 345 350 Ser Leu Gin Leu ASP Thr Asp His Leu Thr Leu Leu Thr Thr Arg Arg 355 360 365 Leu Gly Ala Asn Pro Glu Pro Thr Thr Glu Trp Ile Val Gly Lys Thr 370 375 380 Vai Arg Asn Phe Thr Val Asp Arg Asp Gly Leu Glu Tyr Ile Trp Gly 385 390 395 400 Asn His Glu Pro val Arg Val Tyr Ala Gin Glu Ser Ala Pro Gly Asp 405 410 415 Pro His Gly Trp Pro His Glu Ile val Gin His Tyr Tyr His Arg His 420 425 430 pro Val Tyr Thr ile Leu Ala val Ala Ser Ala Thr val Ala Met Met 435 440 445 lie Gly Val Thr Val Ala Val Leu Cys Ala Cys Lys Ala Arg Arg Glu 450 455 460 Cys Leu Thr Pro Tyr Ala Leu Ala pro Asn Ala val Ile Pro Thr Ser 465 470 475 480 Leu Ala Leu Leu Cys Cys val Arg Ser Ala Asn Ala Glu Thr Phe Thr 485 490 495 Glu Thr Met Ser Tyr Leu Trp Ser Asn Ser Gin Pro Phe Phe Trp Val 500 505 510 Gin Leu cys Ile Pro Leu Ala Ala Phe Ile val Leu Met Arg Cys Cys 515 520 525 Ser Cys Cys Leu Pro Phe Leu val val Ala Gly Ala Tyr Leu Ala Lys 530 535 540 Val ASP Ala Tyr Glu His Ala Thr Thr Val Pro Asn val Pro Gin Ile 545 550 555 560 Pro Tyr Lys Ala Leu val Glu Arg Ala Gly Tyr Ala Pro Leu Asn Leu 565 570 575 Glu Ile Thr Val Met Ser Ser Glu val Leu Pro Ser Thr Asn Gin Glu 580 585 590 Tyr Ile Thr Cys Lys Phe Thr Thr Val Val Pro Ser Pro Lys Ile Lys 595 600 605 Cys Cys Gly Ser Leu Glu Cys Gin Pro Ala Ala His Ala Gly Tyr Thr 610 615 620 Cys Lys val Phe Gly Gly val Tyr Pro Phe Met Trp Gly Gly Ala Gin 625 630 635 640 Cys Phe cys Asp ser Glu Asn Ser Gin Met Ser Glu Ala Tyr Val Glu 167 ΡΕ2048955

Leu Ser Thr Ala Ala Ala 675 Asp 660 Met 645 Cys Lys Ala Val ser Gly Asp Leu 680 His 665 Arg 650 Ala Ile Gin Val Ala Tyr Ile Gly 685 Lys 670 Asn 655 val Thr HÍS Thr Ser Phe Leu Asp val Tyr val Asn Gly val Thr pro Gly Thr Ser Lys 690 695 700 Phe Thr Phe Asp Leu Lys val Ile Ala Gly Pro ile Ser Ala Ser Pro 705 710 715 720 Asp His Lys Vai val 725 lie His Arg Gly Leu 730 Val Tyr Asn Tyr Asp 735 Phe Pro Glu Tyr Gly 740 Ala Met Lys Pro Gly 745 Ala Phe Gly ASp Ile 750 Gin Ala Thr Ser Leu Thr ser Lys Asp Leu Ile Ala Ser Thr Asp Ile Arg Leu 755 760 765 Gin Ala Leu Lys pro Ser Ala Lys Asn val His val Pro Tyr Thr Ser 770 775 780 Gin Glu Ser Glv Phe Glu Met Trp Lys Asn Asn Ser Gly Arg Pro Leu 785 790 795 800 Thr Ala Pro Phe Gly Cys Lys Ile Ala Val Asn pro Leu Arg Ala Val 805 810 Ile 815 Asp Cys Ser Tyr Gly Asn Ile Pro ile Ser ile Asp Pro Asn Ala 820 825 Thr 830 Ala Phe ile Arg Thr Ser Asp Ala Pro Leu val Ser Val Lys cys 835 840 845 Glu vai ser Glu Cys Thr Tyr Ser Ala Asp Phe Gly Gly Met Ala Thr 850 855 860 Leu Gin Tyr val Ser Asp Arg Glu Gly Gin Cys Pro val His Ser His RCC uu J o yr\ KJ i KJ Q7C Uí J 880 Ser Ser Thr Ala Thr Leu Gin Glu Ser Thr val His val Leu Glu Lys 885 890 895 Gly Ala vai Thr val His Phe Ser Thr Ala Ser Pro Gin Ala Asn Phe 900 905 910 Ile Vai Ser Leu Cys Gly Lys Lys Thr Thr Cys Asn Ala Glu cys Lys 915 920 925 Pro Pro Ala Asp His Ile Val Ser Thr Pro His Lys Asn ASP Gin Glu 930 935 940 Phe Gin Ala Ala Ile Ser Lys Thr Ser Trp Ser T rp Leu Phe Ala Leu 945 950 955 960 Phe Gly Gly Ala Ser Ser Leu Leu Ile Ile Gly Leu Met ile Phe Ala 965 Thr 970 975 Cys Ser Met Met Leu Ser Thr Arg Arg 980 985

Lisboa, 16 de setembro de 2013

Claims

ΡΕ2048955 1 REIVINDICAÇÕES 1. Método de administração in vitro de um vector lentiviral que codifica um antigénio a uma célula dendritica que expressa DC-SIGN (ICAM-3 (Moléculas de Adesão Intracelular 3) Especifica de Célula Denditrica -Não Integrina), o método compreendendo: transdução da célula dendritica com um virus recombinante, em que o virus recombinante compreende o referido vector lentiviral, em que o virus recombinante compreende uma glicoproteina de alfavirus que é direccionada para a referida célula que expressa DC-SIGN, em que a referida glicoproteina é uma glicoproteina E2 de alfavirus com mutação num sitio de ligação de sulfato de heparano para diminuir ou eliminar a sua ligação a sulfato de heparano.
2. Método da reivindicação 1, em que a referida glicoproteina é uma glicoproteina E2 de Sindbis com mutação num sitio de ligação de sulfato de heparano.
3. Método da reivindicação 2, em que o virus compreende uma proteina EI de Sindbis e a referida proteina E2 de Sindbis e opcionalmente (a) compreende sequências de um genoma de virus de leucemia murina (MLV) ou de um genoma de virus de imunodeficiência humana (HIV), e/ou (b) que codifica um antigénio de tumor ou um antigénio de HIV. 2 ΡΕ2048955
4. Vírus recombinante como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou uma composição farmacêutica compreendendo o referido vírus recombinante.
5. Vírus recombinante compreendendo um vector lentiviral que codifica um antigénio e uma glicoproteína de alfavírus que é direccionada para células que expressam DC-SIGN em que a referida glicoproteína é uma glicoproteína E2 de alfavírus com mutação num sítio de ligação de sulfato de heparano para diminuir ou eliminar a sua ligação a sulfato de heparano, para utilizar na estimulação de uma resposta imunitária no referido antigénio num mamífero.
6. Vírus recombinante para utilizar de acordo com a reivindicação 5 em que a referida glicoproteína é uma glicoproteína E2 de Sindbis com mutação num sítio de ligação de sulfato de heparano.
7. Vírus recombinante para utilizar de acordo com a reivindicação 5 ou 6, em que o mamífero é um ser humano.
8. Vírus recombinante para utilizar de acordo com a reivindicação 5, 6 ou 7, em que o vírus compreende uma proteína El de Sindbis e a referida proteína E2 de Sindbis.
9. Vírus recombinante para utilizar de acordo PE2048955 com qualquer uma das reivindicações 5 a 8, em que o vector lentiviral compreende sequências de um genoma de Virus de Leucemia Murina (MLV) ou de um genoma de HIV.
10. Virus recombinante para utilizar de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 9, em que o antigénio é um antigénio de tumor ou um antigénio de HIV.
11. Virus recombinante para utilizar de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 10, em que o virus recombinante codifica um segundo gene de interesse, tal como um factor de maturação seleccionado do grupo que consiste em GM-CSF, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15, IL-21, IL-23, TNFoí, B7.1, B7.2, 4-1BB, ligando CD40 (CD40L) e CD40 induzido por fármaco (ÍCD40).
12. Célula dendritica transduzida com um virus recombinante, em que o virus recombinante é como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.
13. Virus recombinante para utilizar de acordo com a reivindicação 5 em que o antigénio é um antigénio associado a tumor, antigénio virai, antigénio bacteriano, antigénio fúngico, antigénio de parasita protozoário, antigénio de parasita helminto, ou antigénio de ectoparasita.
14. Virus recombinante para utilizar de acordo com a reivindicação 13, PE2048955 em que o referido antigénio associado a tumor é seleccionado do grupo que consiste em receptor Her-2, MAGE, BAGE, RAGE e NY-ESO, MART-1/Melan-A, gplOO, gp75, mda-7, tirosinase e proteína relacionada com tirosinase, antigénio de membrana específico da próstata (PSMA), antigénio específico da próstata (PSA), ras com mutação, rearranjo de bcr/abl, Her2/neu, p53 com mutação ou do tipo selvagem, citocromo P450 1B1, N-acetilglucosaminiltransferase-V; proteínas E6 e E7 de vírus do papiloma humano; antigénio carcinoembriónico e alfa-fetoproteína; em que o referido antigénio virai é seleccionado do grupo que consiste em polipéptidos de adenovírus, polipéptidos de alfavírus, polipéptidos de calicivírus, polipéptidos de coronavírus, polipéptidos do vírus da cinomose, polipéptidos do vírus Ebola, polipéptidos de enterovírus, polipéptidos de flavivírus, polipéptidos do vírus da hepatite (AE) , um núcleo ou antigénio de superfície da hepatite B, polipéptidos de herpesvírus, glicoproteína do vírus herpes simplex, glicoproteína do vírus varicela zoster, polipéptidos do vírus da imuno-deficiência, envelope ou protease do vírus da imunodefi-ciência humana, polipéptidos do vírus da peritonite infecciosa, polipéptidos do vírus influenza, hemaglutinina <ãe influenza A, neuraminidase de influenza A, núcleo-proteína de influenza A, polipéptidos do vírus da leucemia, polipéptidos do vírus Marburg, polipéptidos do ortomixovírus, polipéptidos do vírus de papiloma, poli- PE2048955 péptidos do vírus parainfluenza, hemaglutinina/neura minidase do vírus parainfluenza, polipéptidos do parami-xovírus, polipéptidos do parvovírus, polipéptidos do pestivírus, polipéptidos do picornavírus, polipéptido de capsídeo de poliovírus, polipéptidos do vírus da varíola, polipéptido do vírus vaccinia, polipéptidos do vírus da raiva, glicoproteína G do vírus da raiva, polipéptidos de reovírus, polipéptidos de retrovírus e polipéptidos de rotavírus; em que o referido antigénio i bacteriano é seleccionado do grupo que consiste em: polipéptidos de Actinomyces, polipéptidos de Bacillus, polipéptidos de Bacteroides, polipéptidos de Bordetella, polipéptidos de Bartonella, polipéptidos de Borrelia, OspA de B. burgdorferi, polipéptidos de Brucella, polipéptidos de Campylobacter, polipéptidos de Capnocytophaga, polipéptidos de Chlamydia, polipéptidos de Clostridium, polipéptidos de Corynebacterium, polipéptidos de Coxiella, polipéptidos de Dermatophilus, polipéptidos de Enterococcus, polipéptidos de Ehrlichia, polipéptidos de Escherichia, polipéptidos de Francisella, polipéptidos de Fusobacterium, polipéptidos de Haemobartonella, polipéptidos de Haemophilus, proteína da membrana externa do tipo b de H. influenzae, polipéptidos de Helicobacter, polipéptidos de Klebsiella, polipéptidos de bactérias com forma L, polipéptidos de Leptospira, polipéptidos de Listeria, polipéptidos de Mycobacteria, polipéptidos de Mycoplasma, polipéptidos de Neisseria, polipéptidos de Neorickettsia, polipéptidos de Nocardia, 6 ΡΕ2048955 polipéptidos de Pasteurella, polipéptidos de Peptococcus, polipéptidos de Peptostreptococcus, polipéptidos de Pneumococcus, polipéptidos de Proteus, polipéptidos de Pseudomonas, polipéptidos de Rickettsia, polipéptidos de Rochalimaea, polipéptidos de Salmonella, polipéptidos de Shigella, polipéptidos de Staphylococcus, polipéptidos de Streptococcus, proteínas M de S. pyogenes, polipéptidos de Treponema, e polipéptidos de Yersinia, antigénio Fl de Y. pestis e antigénio V de Y. pestis; em que o referido antigénio de fungo é selec-cionado do grupo que consiste em: polipéptidos de Absidia, polipéptidos de Acremonium, polipéptidos de Alternaria, polipéptidos de Aspergillus, polipéptidos de Basidiobolus, polipéptidos de Bipolaris, polipéptidos de Blastomyces, polipéptidos de Candida, polipéptidos de Coccidioides, polipéptidos de Conidiobolus, polipéptidos de Cryptococcus, polipéptidos de Curvalaria, polipéptidos de Epidermophyton, polipéptidos de Exophiala, polipéptidos de Geotrichum, polipéptidos de Histoplasma, polipéptidos de Madurella, polipéptidos de Malassezia, polipéptidos de Microsporum, polipéptidos de Moniliella, polipéptidos de Mortierella, polipéptidos de Mucor, polipéptidos de Paecilomyces, polipéptidos de Penicillium, polipéptidos de Phialemonium, polipéptidos de Phialophora, polipéptidos de Prototheca, polipéptidos de Pseudallescheria, polipéptidos de Pseudo-microdochium, polipéptidos de Pythium, polipéptidos de Rhinosporidium, polipéptidos de Rhizopus, polipéptidos de Scolecobasidium, polipéptidos de Sporothrix, polipéptidos 7 PE2048955 de Stemphylium, polipéptidos de Trichophyton, polipéptidos de Trichosporon e polipéptidos de Xylohypha. em que o referido antigénio de parasita protozoário é seleccionado do grupo que consiste em: polipéptidos de Babesia, polipéptidos de Balantidium, polipéptidos de Besnoitia, polipéptidos de Cryptosporidium, polipéptidos de Eimeria, polipéptidos de Encephalitozoon, polipéptidos de Entamoeba, polipéptidos de Giardia, polipéptidos de Hammondia, polipéptidos de Hepatozoon, polipéptidos de Isospora, polipéptidos de Leishmania, polipéptidos de Microsporidia, polipéptidos de Neospora, polipéptidos de Nosema, polipéptidos de Pentatrichomonas, polipéptidos de Plasmodium, circunsporozoíto de P. falciparum (PfCSP), proteina 2 de superfície do esporozoito (PfSSP2), extremidade carboxilo do antigénio 1 de estágio de figado (PfLSAl c-term), proteina 1 exportada (PfExp-1),, polipéptidos de Pneumocystis, polipéptidos de Sarcocystis, polipéptidos de Schistosoma, polipéptidos de Theileria, polipéptidos de Toxoplasma e polipéptidos de Trypanosoma; em que o referido antigénio de helminto é seleccionado do grupo que consiste em: polipéptidos de Acanthocheilonema, polipéptidos de Aelurostrongylus, polipéptidos de Ancylostoma, polipéptidos de Angiostrongylus, polipéptidos de Ascaris, polipéptidos de Brugia, polipéptidos de Bunostomum, polipéptidos de Capillaria, polipéptidos de Chabertia, polipéptidos de Cooperia, polipéptidos de Crenosoma, polipéptidos de Dictyocaulus, poli- ΡΕ2048955 péptidos de Dioctophyme, polipéptidos de Dipetalonema, polipéptidos de Diphyllobothrium, polipéptidos de Diply-dium, polipéptidos de Dirofilaria, polipéptidos de Dracun-culus, polipéptidos de Enterobius, polipéptidos de Fila-roides, polipéptidos de Haemonchus, polipéptidos de Lago-chilascaris, polipéptidos de Loa, polipéptidos de Manso-nella, polipéptidos de Muellerius, polipéptidos de Nano-phyetus, polipéptidos de Necator, polipéptidos de Nema-todirus, polipéptidos de Oesophagostomum, polipéptidos de Onchocerca, polipéptidos de Opisthorchis, polipéptidos de Ostertagia, polipéptidos de Parafilaria, polipéptidos de Paragonimus, polipéptidos de Parascaris, polipéptidos de Physaloptera, polipéptidos de Protostrongylus, polipéptidos de Setaria, polipéptidos de Spirocerca, polipéptidos de Spirometra, polipéptidos de Stephanofilaria, polipéptidos de Strongyloides, polipéptidos de Strongylus, polipéptidos de Thelazia, polipéptidos de Toxascaris, polipéptidos de Toxocara, polipéptidos de Trichinella, polipéptidos de Trichostrongylus, polipéptidos de Trichuris, polipéptidos de Uncinaria e polipéptidos de Wuchereria; e em que o referido antigénio de ectoparasita é seleccionado do grupo que consiste em: polipéptidos de pulga; polipéptidos de carraça, polipéptidos de carraça dura, polipéptidos de carraça mole; polipéptidos de mosca, polipéptidos de melga, polipéptidos de mosquito, polipéptidos de mosca da areia, polipéptidos de mosca negra, polipéptidos de mosca do cavalo, polipéptidos de mosca dos chifres, polipéptidos de moscardo, polipéptidos de mosca 9 ΡΕ2048955 tsé-tsé, polipéptidos de mosca estável, polipéptidos de mosca causadora de miíase e polipéptidos de mosquito picador; e polipéptidos de formiga; polipéptidos de aranha, polipéptidos de piolho; polipéptidos de ácaro; polipéptidos de percevejo da cama e polipéptidos de percevejo barbeiro.
15. Vírus recombinante para utilizar de acordo com a reivindicação 5 em que o virus recombinante é administrado por via subcutânea ou intradérmica. Lisboa, 16 de setembro de 2013