CN102702356B - 鼠源dcf1特异性多克隆抗体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种鼠源DCF1特异性多克隆抗体及其制备方法。该特异性多克隆抗体是将SEQIDNO:2的第44位到76位氨基酸残基组成的多肽特异性结合。用该抗体能检测到小鼠乳腺癌细胞4T1与正常的小鼠乳腺组织中DCF1的表达差异，将4T1的癌细胞状态通过JNKinhibitorII抑制后，通过制备的多克隆抗体也检测到了DCF1的蛋白表达减少，说明制备的多克隆抗体可以用来检测小鼠乳腺癌不同状态下DCF1的表达水平。

Description

鼠源DCF1特异性多克隆抗体及其制备方法

技术领域

    本发明涉及了一种新的鼠源DCF1特异性多克隆抗体及其制备方法。

技术背景

树突状细胞因子（dendritic cell factor 1，DCF1）又名跨膜蛋白59（transmembrane protein 59，TMEM59），首先发现于免疫系统的树突细胞中，是一个表达范围比较普遍的单次跨膜蛋白。根据UniProt对其的注释信息，DCF1主要定位在高尔基体上。目前对于该蛋白的功能研究报道还比较少，其功能可能与物质的运输相关，已有报道和文章表明DCF1与其同源蛋白TMEM59-like能够抑制淀粉样前体蛋白APP向细胞膜的转运以及进一步的剪切，而APP与阿尔兹海默症（Alzheimer's disease，AD）的形成相关，说明DCF1与神经退行性疾病存在某种联系。

根据目前已有的信息， DCF1商品化的相关抗体只有抗人的多克隆抗体，虽然其说明上指出也能抗鼠源的DCF1，但是在实际应用中发现这种识别效果非常不好；而抗鼠源DCF1商品化的抗体还没有。随着DCF1研究的深入，相关功能的报道肯定会越来越多，而且为了深入研究，必然会借助一些模式动物如小鼠、果蝇等。所以，制备一种新的抗鼠源DCF1的特异性抗体进行后续研究具有迫切性。

发明内容

本发明目的之一在于提供一种鼠源DCF1特异性多克隆抗体。

本发明的目的之二在于提供该克隆抗体的制备方法。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种鼠源DCF1特异性多克隆抗体，其特征在于所述的特异性多克隆抗体是将SEQ ID NO:2的第44位到76位氨基酸残基组成的多肽特异性结合。

上述的特异性多克隆抗体是将SEQ ID NO:2的第44位到76位氨基酸残基对应的cDNA序列构建到原核表达质粒pGEX-4T-1中，得到重组质粒pGEX-4T1-59a，再将该重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，得到可溶表达带有鼠源DCF1第44位到76位氨基酸残基的多肽融和蛋白。

上述的特异性多克隆抗体是将多肽融和蛋白作为抗原免疫动物而获得。

一种制备上述的鼠源DCF1特异性多克隆抗体的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：

a.对DCF1氨基酸序列进行了蛋白跨膜结构预测，其中第1到239位氨基酸为胞外段结构；

b.用PCR处于胞外段第44到76位氨基酸残基对应的cDNA，重组入pGEX-4T-1中，构建成pGEX-4T1-59a载体；

c.将载体转化到BL21(DE3)中，原核可溶表达表达得到包含目的DCF1多肽的可溶性融合蛋白；

d.将融合蛋白为抗原免疫动物燥，得到以上述制备的蛋白，按照多抗免疫方案进行动物免疫，得到特异性多克隆抗体。

利用Western Blot和Immunohistochemical技术对制备得到的多克隆抗体进行特异性评测。同时利用制备的上述多克隆抗体检测小鼠乳腺癌细胞4T1及正常小鼠乳腺组织DCF1的蛋白表达情况，发现4T1中DCF1的表达高于正常组织。为了更加确认这种结果，通过在4T1细胞的培养基中JNK inhibitor II，而JNK信号通路已被证实与多种疾病相关，因此，JNK被认为是可以调节疾病状态细胞恢复到正常状态的一个潜在靶点。当4T1细胞受到JNK inhibitor II的抑制后，出现增殖速度变慢这种癌细胞状态发生改变的现象，再通过上述制备的多克隆抗体检测DCF1的表达变化后发现，DCF1在4T1中的表达量随着其癌细胞状态受抑制程度的加深而降低。用该抗体能检测到小鼠乳腺癌细胞4T1与正常的小鼠乳腺组织中DCF1的表达差异，将4T1的癌细胞状态通过JNK inhibitor II抑制后，通过制备的多克隆抗体也检测到了DCF1的蛋白表达减少，说明制备的多克隆抗体可以用来检测小鼠乳腺癌不同状态下DCF1的表达水平。

附图说明

图1为TMHMM Server v.2.0预测的DCF1跨膜结构

图2为扩增的抗原序列cDNA片段及重组质粒pGEX-4T1-59a经BamHI和 SalI双酶切的电泳图（A-扩增到的抗原序列cDNA片段；B-重组质粒pGEX-4T1-59a酶切产物），说明目的片段已经插入到pGEX-4T-1载体中。

图3为扩增的Elisa底物筛选序列cDNA片段及重组质粒pET-30a-59c经BamHI和 SalI双酶切的电泳图（A-Elisa底物筛选序列cDNA片段；B-重组质粒pET-30a-59c酶切产物），说明目的片段已经插入到pET-30a载体中。

图4 A为pGEX-4T1-59a转化到BL21(DE3)中，经IPTG诱导表达，超声破碎后的表达产物SDS-PAGE分析（1-Marker；2-菌体超声破碎后的上清液；3-菌体超声破碎后的沉淀），说明目的蛋白主要分布在可溶相；B为A中得到的上清液经Glutathione Resin纯化后的SDS-PAGE分析（1-PBS稀释的菌体破碎上清，即样品；2-样品经Glutathione Resin后的流出液；3-PBS洗涤流出液；4-洗脱流出液；5-Marker），说明目的蛋白主要在洗脱液中，可以用作抗原。

图5 A为pET-30a-59c转化到BL21(DE3)中，经IPTG诱导表达，超声破碎后的表达产物SDS-PAGE分析（1-菌体超声破碎后的上清液；2-菌体超声破碎后的沉淀；3-Marker），说明目的蛋白主要分布在可溶相；B为A中得到的上清液经Ni柱纯化后的SDS-PAGE分析（1上样样品；2-样品经Ni柱后的流出液；3-PBS洗涤流出液；4、5-洗脱流出液；6-Marker），说明目的蛋白主要在洗脱液中，可以用作Elisa筛选用底物。

图6为在哺乳动物细胞HEK293T过表达鼠的DCF1，对制备的多克隆抗体进行Western Bolt分析（A-HEK293T白光照片；B-对HEK293T转染pEGFP-N2质粒后的荧光照片；C对-HEK293T转染pEGFP-N2-DCF1质粒后的荧光照片；D-抽提A,B,C蛋白进行的Western Bolt），说明制备的多克隆抗体对内源DCF1的特异性结合能力。

图7为在哺乳动物细胞U251转染pEGFP-N2-DCF1质粒后，对制备的多克隆抗体进行荧光共定位分析。（A, E）EGFP，绿色；（B, F）本发明制备的抗DCF1多克隆抗体，红色；（C, G）DAPI，蓝色；（D, H）Merge。说明制备的多克隆抗体能与细胞内的DCF1共定位，具有特异性结合能力。

图8为使用制备的多克隆抗体对小鼠乳腺癌细胞4T1与正常小鼠乳腺组织进行的DCF1表达水平分析，Western Bolt结果显示在4T1中DCF1表达水平要高于正常组织。

图9 为通过CCK-8检测在4T1细胞的培养基中加入JNK inhibitor II后细胞的增殖情况，结果显示加入抑制剂4T1的增殖受到明显抑制，说明4T1细胞在JNK受到抑制后的癌症状态发生改变，增殖能力显著减弱。

图10为不同抑制剂浓度及作用时间下4T1细胞的生长状态照片以及对应条件下4T1细胞内DCF1的表达情况，结果表明制备的多克隆抗体能够检测到4T1在癌症状态发生改变后引起细胞内DCF1表达的变化。

具体实施方式

实施例一：pGEX-4T1-59a与pET-30a-59c原核表达载体的构建与鉴定

用TMHMM Server v.2.0对DCF1氨基酸序列进行的蛋白跨膜结构预测，利用Premier 5.0软件以及表达的融合蛋白不发生移码突变的原理设计DCF1膜外段抗原序列及Elisa底物用蛋白序列的上游和下游引物，在其上游和下游引物中分别引入BamHI和 SalI的酶切位点及相应的保护碱基，并且在上下游引物中分别加入起始密码和终止密码，引物由上海英潍捷基公司合成。其中抗原序列的上游引物为：5’-CGCGGATCCatgGACACAGCGTCCTGTCAC-3’，下游引物为：5’-CAAGACGTCGACctaCAGCCTGCAGCCTCTCTGG-3’； Elisa底物用蛋白序列的上游引物为：5’-CGCGGATCCatgGACACAGCGTCCTGTCAC-3’； 下游引物为：5’- CAAGACGTCGACctaTCCAGAGTTAAGAGATAG -3’。以小鼠脑cDNA为模板，用上下游引物扩增抗原序列和Elisa底物用蛋白序列，将抗原序列插入到pGEX-4T-1载体中，将Elisa底物用蛋白序列插入到pET-30a载体中。酶切，PCR鉴定，测序正确，见图2、图3。载体构建完成后可以用于后续实验。

实施例二：抗原多肽融合蛋白的可溶性表达及纯化

将pGEX-4T1-59a载体热激转化到BL21(DE3)感受态中，待平板上长出菌落后，用灭菌牙签挑单菌落至装有5mL LB培养基的试管中，37℃、220rpm振荡培养过夜，按1%的接种量即2mL菌液加至装有200mL LB培养基的三角瓶中，37℃振荡培养之OD₆₀₀为0.8时，加入IPTG至终浓度为0.5mM进行诱导培养，37℃继续振荡培养4h后，6000rpm离心5min将菌体收集到50 mL离心管中。将收集有菌体的50 mL离心管置于冰上，加入预冷的菌体超声破碎缓冲液10mL，300W，30s超声，15s暂停，持续30min。破碎完全后，将离心管放到离心机当中，4℃、11000rpm离心15min，收集上清，纯化前上清保存于－80℃冰箱中。分别取少量上清与沉淀作为样本，进行SDS-PAGE融合蛋白可溶性表达分析，见图4-A。结果显示目的蛋白主要存在于上清相中，达到了可溶性表达抗原多肽融合蛋白的目的。

利用GST标签对上清中的目的蛋白进行纯化，具体流程参照GenScipt的 Glutathione Resin产品说明书，并取纯化过程中各组分进行SDS-PAGE分析，见图4-B。结果表明目的蛋白主要存在于洗脱液当中，纯化成功，可以用作后续免疫的抗原。

实施例三：Elisa底物用蛋白的表达及纯化

将pET-30a-59c载体热激转化到BL21(DE3)感受态中，后续扩大培养、诱导发酵和超声破碎同实施例二中的方法。分别取少量上清与沉淀作为样本，进行SDS-PAGE融合蛋白可溶性表达分析，见图5-A。结果显示目的蛋白存在于上清相中。

利用His标签对上清中的目的蛋白进行纯化，具体流程参照Amersham Biosciences的 Ni Sepharose 6 Fast Flow产品说明书，并取纯化过程中各组分进行SDS-PAGE分析，见图5-B。结果表明目的蛋白主要存在于洗脱液当中，纯化成功，可以用作后续Elisa检测用底物包被蛋白。

实施例四：多克隆抗体制备

实施例二制备得到的融合蛋白可以作为抗原用于动物免疫，本发明主要以新西兰大白兔（购于复旦大学实验动物中心）为免疫对象进行抗体制备，免疫过程如下：取2kg重的新西兰大白兔，免疫前耳静脉取血作为对照。首次免疫抗原量为400μg蛋白，注射体积为500μL，佐剂为弗式完全佐剂，乳化完全后兔背部4点注射。15天后进行第二次免疫，抗原量为400μg蛋白，注射体积为500μL，佐剂为弗式不完全佐剂，乳化完全后兔背部4点注射。此后第10和20天分别进行第三和四次免疫，免疫操作与第二次相同。第四次免疫一周后用Elisa法检测抗血清效价，当效价未达到10⁶时，继续进行免疫，当效价达到10⁶后，不再进行免疫，2周后可以进行取血和抗血清的收集。抗血清的收集：将收集的血置于37℃半小时，4℃，11000rpm离心15min，收集上清分装保存于－80℃。

实施例五：间接Elisa法检测抗血清效价

1.将实施例二制得的pET-30a-59c表达的蛋白用包被缓冲液稀释成10μg/mL，吸取包被抗原到Elisa板中，100μL/孔， 4℃过夜。

说明：此处以pET-30a-59c表达蛋白作为底物的目的是排除GST标签引起的免疫反应（即假阳性），因为pET-30a带的标签是His标签，而插入的片段包括了用作抗原GST标签蛋白的全部序列。

2.倒掉Elisa板中的液体，PBST洗板3次，200μL/孔，拍干。

3.用封闭液进行封闭，300μL/孔，37℃、2h，封闭完后倒掉封闭液，PBST洗板3次，200μL/孔，拍干。

4.抗血清用PBST稀释成浓度梯度分别为1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000、1:12800、1:256000、1:512000、1:1024000，每孔加入不同浓度一抗100μL。对照为免疫前小鼠血清，稀释梯度如上，37℃孵育2h。

5.倒掉一抗，PBST洗板3次，200μL/孔，拍干。

6.羊抗兔IgG-HRP用PBST稀释成1:10000，每孔加样100μL，37℃孵育1h。

7.倒掉二抗，PBST洗板3次，200μL/孔，拍干。

8.底物OPD用底物稀释液稀释成50μg/mL，每孔加样100μL，37℃孵育30min。

9.每孔加50μL终止液终止反应。

10.在自动酶联检测仪上选择490nm测OD，进行分析，结果见表1。结果显示兔血清效价足够强，可以用于后续检测。

表1 间接Elisa法检测兔多抗血清效价

OD	1000×	2000×	4000×	8000×	16000×	32000×	64000×	128000×	256000×	512000×	1024000×
												CON	0.085	0.160	0.078	0.080	0.079	0.083	0.124	0.107	0.131	0.103	0.128
兔血清	1.328	1.320	1.297	1.261	1.239	1.121	1.061	0.880	0.630	0.405	0.302

注：OD＞0.2即为阳性

实施例六：Western Blot检测多克隆抗体的特异性

在HEK293T细胞中转染pEGFP-N2-DCF1质粒，以转染pEGFP-N2空载体及不转质粒的细胞为对照，质粒在细胞中的发光情况见图6-A,B,C。通过发光情况可以说明细胞中已经表达了内源的DCF1，此时对细胞的总蛋白进行抽提。将制备的蛋白进行SDS-PAGE电泳，电泳结束进行转膜，转膜在Bio-Rad半干转印槽中进行，首先根据胶的大小剪滤纸和NC膜，剪好后在转膜液中平衡10min。然后准备好半干转印槽，按滤纸、NC膜、胶、滤纸的顺序放好，为避免气泡产生，用拿玻璃棒碾几下。之后开始转膜，恒压25V，时间1h。转完膜后取出膜用PBS洗一下，然后将NC膜置于封闭液中（含1% BSA的PBS）封闭过夜。用封闭液将本发明制备的多抗血清按一定比例稀释，室温摇2h，吸出一抗，PBS洗3次，每次5min。用PBS稀释红外染料标记的Odyssey二抗，稀释比例为 1:10000，室温摇1h，吸出二抗，PBS洗3次，每次5min。将膜晾干后，在Odyssey双色红外荧光扫描系统扫描成像，结果见6-D。Western Blot结果说明本发明制备的多克隆抗体与在哺乳动物细胞内表达的蛋白进行特异性结合，且效果明显。

实施例七：细胞免疫组化对多克隆抗体进行共定位分析

在24孔板上种植的U251细胞中转染pEGFP-N2-DCF1质粒，以转染pEGFP-N2空载的细胞作为对照。待荧光显微镜下观察发光后，进行细胞免疫组化实验，操作如下：将种植到24孔板上U251细胞用PBS漂洗三次，用4%多聚甲醛固定15min，2次，吸除固定液，PBS漂洗三次，边洗边轻轻振荡，用5%正常山羊血清37℃封闭2h，PBS漂洗三次，再加入一抗（本发明制备的多克隆抗体），4℃下孵育过夜，次日PBS漂洗三次，每次10min。然后加入二抗（TRITC-conjugated goat anti-rabbit antibodies），室温孵育1h，弃二抗，PBS漂洗三次，加入DAPI显色5min，弃掉DAPI，加入200μLPBS后，荧光显微镜下观察，结果如图7。免疫组化结果显示本发明制备的多克隆抗体可以有效地和细胞内表达的DCF1进行特异性结合，达到共定位的目的。

实施例八：用本抗体检测小鼠乳腺癌细胞中DCF1的表达情况

抽提小鼠乳腺癌细胞4T1与正常小鼠乳腺组织的总蛋白，按照实施例六的操作进行Western Blot检测，一抗为本发明制备的多克隆抗体，结果见图8。说明本发明制备的抗体不仅可以特异性结合外源质粒转染到哺乳动物细胞中过表达得到的DCF1，而且可以特异性结合哺乳动物本身表达的DCF1，同时更为重要的是发现了DCF1在小鼠乳腺癌细胞和正常小鼠乳腺组织的蛋白表达差异，这为建立DCF1与癌症的联系打下了基础。

实施例九：用JNK inhibitor II改变4T1的癌症状态

在4T1细胞的培养基加入不同量的JNK inhibitor II，使其终浓度分别为0μM、22.5μM、45μM、67.5μM，通过CCK-8检测细胞的增殖情况，结果如图9所示，在22.5μM、45μM、67.5μM的抑制剂浓度下，抑制剂加入24h后4T1的增殖受到显著抑制，说明JNK受到抑制后能够改变4T1的癌细胞状态，可以进行后续研究。同时看到45μM、67.5μM条件下增殖抑制情况差别不大，因此选择以0μM、22.5μM、45μM的抑制剂浓度为最终工作浓度。

实施例十：使用本抗体检测在4T1不同状态下细胞内DCF1的表达情况

根据实施例九中能改变4T1癌症状态的条件设置，在4T1细胞的培养基加入相应浓度的抑制剂，分别以0h、12h、24h和36h为时间节点提取细胞的总蛋白，进行Western Blot检测，一抗为本发明制备的多克隆抗体。结果如图10所示，当抑制剂的终浓度为45μM，加入24h后，4T1中表达DCF1的水平发生变化。当抑制剂的终浓度为22.5μM时，加入36h后，4T1中DCF1的表达水平发生变化。结果不仅说明本发明制备的抗体可以检测到4T1内DCF1的表达随着4T1癌细胞状态的改变而发生变化，说明了DCF1可以用来作为诊断乳腺癌的一个新标准。

序列表

<110>  上海大学

<120>  鼠源DCF1特异性多克隆抗体及其制备方法

<160>  2

 

<210>  1

<211>  715

<212>  DNA

<213>  鼠

<400>  1

ATGGC GGCGC CAAAG GGGAA GCTTT GGGTC CAGGC CCAAC TGGGG CTCCC GCCGC TGCTG      60

CTGTT GACTA TGGCG CTGGC CGGAG GCTCG GGGAC TGCAG CGGCC GAAGC CTTTG ACTCG      120

GTCCT GGGAG ACACA GCGTC CTGTC ACCGG GCCTG TCAGC TGACC TACCC CTTGC ACACC      180

TACCC GAAGG AAGAG GAGTT ATACG CATGC CAGAG AGGCT GCAGG CTGTT TTCAA TTTGC      240

CAGTT TGTGG ATGAT GGGCT TGATT TAAAT CGGAC CAAGC TGGAA TGTGA ATCTG CGTGC      300

ACAGA AGCAT ATTCC CAACC TGATG AGCAG TATGC TTGTC ATCTT GGCTG CCAGG ATCAG      360

TTGCC ATTTG CTGAA CTGAG ACAAG AACAA CTCAT GTCCC TGATG CCAAG AATGC ATCTC      420

CTCTT CCCTC TGACT CTGGT GAGGT CGTTC TGGAG TGACA TGATG GACTC TGCAC AGAGC      480

TTCAT AACCT CTTCA TGGAC TTTTT ATCTT CAAGC CGATG ACGGA AAAAT AGTTA TATTC      540

CAGTC TAAGC CAGAA ATTCA GTATG CACCG CAGTT GGAGC AGGAG CCTAC AAACT TGAGA      600

GAATC ATCTT TAAGC AAAAT GTCCT ATCTG CAGAT GAGAA ACTCA CAAGC ACACA GGAAC      660

TACCT TGAAG AGGAA GAAAG CGATG GCTTT TTAAG ATGTC TATCT CTTAA CTCTG GA         715

 

 210>  2

<211>  239

<212>  PRT

<213>  鼠

<400>  1 

MAAPK GKLWV QAQLG LPPLL LLTMA LAGGS GTAAA EAFDS VLGDT ASCHR ACQLT YPLHT      60

YPKEE ELYAC QRGCR LFSIC QFVDD GLDLN RTKLE CESAC TEAYS QPDEQ YACHL GCQDQ     120

LPFAE LRQEQ LMSLM PRMHL LFPLT LVRSF WSDMM DSAQS FITSS WTFYL QADDG KIVIF     180

QSKPE IQYAP QLEQE PTNLR ESSLS KMSYL QMRNS QAHRN YLEEE ESDGF LRCLS LNSG      239

 

Claims (2)

1.一种鼠源树突状细胞因子DCF1特异性多克隆抗体，其特征在于所述的特异性多克隆抗体是将SEQ ID NO:2的第44位到76位氨基酸残基对应的cDNA序列构建到原核表达质粒pGEX-4T-1中，得到重组质粒pGEX-4T1-59a，再将该重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，得到可溶表达带有鼠源DCF1第44位到76位氨基酸残基的多肽融和蛋白，再将该多肽融和蛋白作为抗原免疫动物而获得。

2.一种制备根据权利要求1所述的鼠源树突状细胞因子DCF1特异性多克隆抗体的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：

a.对树突状细胞因子DCF1氨基酸序列进行了蛋白跨膜结构预测，其中第1到239位氨基酸为胞外段结构；

b.用PCR处于胞外段第44到76位氨基酸残基对应的cDNA，重组入pGEX-4T-1中，构建成pGEX-4T1-59a载体；

c.将载体转化到BL21(DE3)中，原核可溶表达得到包含目的树突状细胞因子DCF1多肽的可溶性融合蛋白；

d.纯化步骤c所得的融合蛋白，以纯化后的融合蛋白为抗原，按照多抗免疫方案进行动物免疫，得到特异性多克隆抗体。 

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