EA031580B1 - Слитый белок, композиция и вакцина для индукции иммунного ответа против h. influenza и их терапевтическое применение - Google Patents

Слитый белок, композиция и вакцина для индукции иммунного ответа против h. influenza и их терапевтическое применение Download PDF

Info

Publication number
EA031580B1
EA031580B1 EA201391240A EA201391240A EA031580B1 EA 031580 B1 EA031580 B1 EA 031580B1 EA 201391240 A EA201391240 A EA 201391240A EA 201391240 A EA201391240 A EA 201391240A EA 031580 B1 EA031580 B1 EA 031580B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
seq
sequence
protein
pila
fusion protein
Prior art date
Application number
EA201391240A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201391240A1 (ru
Inventor
Норманд Блэйс
Стив Лабб
Ян Пулман
Original Assignee
Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=47008755&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA031580(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А. filed Critical Глаксосмитклайн Байолоджикалс С.А.
Publication of EA201391240A1 publication Critical patent/EA201391240A1/ru
Publication of EA031580B1 publication Critical patent/EA031580B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/285—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Pasteurellaceae (F), e.g. Haemophilus influenza
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/102—Pasteurellales, e.g. Actinobacillus, Pasteurella; Haemophilus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A61K2039/541—Mucosal route
    • A61K2039/543—Mucosal route intranasal
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55544—Bacterial toxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/575—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 humoral response
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Изобретение относится к слитым белкам, основанным на белке E и PilA H. influenza, к иммуногенным композициям, содержащим такие слитые белки, и к вакцинам, содержащим такие слитые белки или иммуногенные композиции. Изобретение также относится к терапевтическим применениям указанных слитых белков, композиций и вакцин. Кроме того, изобретение относится к способу получения указанных слитых белков.

Description

Изобретение относится к слитым белкам, основанным на белке Е и PilA Н. influenza, к иммуногенным композициям, содержащим такие слитые белки, и к вакцинам, содержащим такие слитые белки или иммуногенные композиции. Изобретение также относится к терапевтическим применениям указанных слитых белков, композиций и вакцин. Кроме того, изобретение относится к способу получения указанных слитых белков.
031580 В1
031580 Bl
Данная заявка испрашивает приоритет заявки на патент США номер 61/474779, поданной 13 апреля 2011 г., и заявки на патент США номер 61/534012, поданной 13 сентября 2011 г.
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим белок E и пилин A Haemophilus influenzae (H. influenzae). Более конкретно, настоящее изобретение относится к слитым белкам и иммуногенным композициям, содержащим белок E и пилин A, к вакцинам, содержащим такие иммуногенные композиции, и к их терапевтическим применениям.
Предшествующий уровень техники
Белок E (PE) представляет собой липопротеин наружной мембраны, обладающий адгезионными свойствами. Он играет роль при адгезии/инвазии нетипируемой Haemophilus influenzae (NTHi) в эпителиальные клетки. (J. Immunology 183: 2593-2601 (2009); The Journal of Infectious Diseases 199:522-531 (2009), Microbes and Infection 10:87-96 (2008)). Он является высоко консервативным как для инкапсулированной Haemophilus influenzae, так и для нетипируемой Н. Influenzae и имеет консервативный домен связывания с эпителием (The Journal of Infectious Diseases 201:414-419 (2010)). В различных видах Haemophilus описано тринадцать различных точечных мутаций по сравнению с Haemophilus influenzae Rd в качестве эталонного штамма. Экспрессию этого белка наблюдают как при логарифмическом росте, так и в стационарной фазе роста бактерий (WO2007/084053).
Белок E также вовлечен в устойчивость к комплементу человека посредством связывания витронектина (Immunology 183: 2593-2601 (2009)). Белок E посредством домена связывания PKRYARSVRQ YKILNCANYH LTQVR (SEQ ID NO: 1, соответствующая аминокислотам 84-108 SEQ ID NO: 4) связывает витронектин, являющийся важным ингибитором конечного биохимического пути комплемента (J. Immunology 183:2593-2601 (2009)).
Пилин A (PilA), вероятно, является основной субъединицей пилина пилуса типа IV (Tfp) H. influenzae, вовлеченного в сократительную способность (Infection and Immunity, 73: 1635-1643 (2005)). PilA NTHi представляет собой консервативный адгезин, экспрессирующийся in vivo. Показано, что он вовлечен в прикрепление, колонизацию и образование биопленки NTHi (Molecular Microbiology 65: 1288-1299 (2007)).
Нетипируемая Haemophilus influenzae является важным и распространенным патогеном дыхательных путей, вызывающим средний отит у новорожденных и детей. После Streptococcus pneumoniae NTHi является самым распространенным возбудителем острого среднего отита у детей (J. Immunology 183:2593-2601 (2009), Pediatrics 113:1451-1465 (2004)). Она является важным возбудителем синусита у детей и взрослых (Current Infectious Disease Reports 11:177-182 (2009)). Эта бактерия связана с повышенным риском обострений при хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) у взрослых (Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease 3:109-115 (2006)). Кроме того, нетипируемая Н. influenzae вызывает внебольничную пневмонию у взрослых и может вызывать пневмонию у детей в развивающихся странах (Current Infectious Disease Reports 11:177-182 (2009)).
Существует необходимость в вакцинах против NTHi.
Краткое изложение сущности изобретения
В настоящем изобретении предложен слитый белок для индукции иммунного ответа против Н. influenzae формулы I (X)m - (Ri)n - A - (Y)o - В - (Ζ)ρ (формула I), где X представляет собой сигнальный пептид, выбранный из группы, состоящей из Flgl (кольцевой флагеллярный пептидогликан), NadA (субъединица A хинолинатсинтазы) и pelB (пектатлиаза B), или последовательность MHHHHHH (SEQ ID NO: 2);
m равно 0 или 1;
R1 представляет собой аминокислоту, независимо выбранную из группы, состоящей из D, E, A, T, N, M и H;
n равно 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6;
A представляет собой белок E из Haemophilus influenzae или его иммуногенный фрагмент, состоящий по меньшей мере из 50 последовательных аминокислотных остатков последовательности SEQ ID NO: 4, либо PilA (пилин A) из Haemophilus influenzae или его иммуногенный фрагмент, состоящий по меньшей мере из 50 последовательных аминокислотных остатков последовательности SEQ ID NO: 58;
Y выбран из группы, состоящей из GG, SG, SS, GGG и (G)h, где h равно 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10;
o равно 0 или 1;
B представляет собой PilA из Haemophilus influenzae или его иммуногенный фрагмент, состоящий по меньшей мере из 50 последовательных аминокислотных остатков последовательности SEQ ID NO: 58, либо белок E из Haemophilus influenzae или его иммуногенный фрагмент, состоящий по меньшей мере из 50 последовательных аминокислотных остатков последовательности SEQ ID NO: 4;
Z представляет собой последовательность GGHHHHHH (SEQ ID NO: 3);
р равно 0 или 1, где белок E выбран из любой из последовательностей SEQ ID NO: 4-57 или полипептида с последо
- 1 031580 вательностью, идентичной по меньшей мере на 75, 77, 80, 85, 90, 95, 97, 99 или 100% последовательности SEQ ID NO: 4, и PilA выбран из любой из последовательностей SEQ ID NO: 58-121 или полипептида с последовательностью, идентичной по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 97 или 100% последовательности SEQ ID NO: 58.
В одном воплощении изобретения предложен указанный выше слитый белок, имеющий последовательность SEQ ID NO: 194.
В одном воплощении изобретения предложен указанный выше слитый белок, где A представляет собой иммуногенный фрагмент белка E, состоящий по меньшей мере из 50 последовательных аминокислотных остатков последовательности SEQ ID NO: 4. Предпочтительно A представляет собой иммуногенный фрагмент белка E из H. influenzae с последовательностью SEQ ID NO: 124. Также предпочтительно A представляет собой иммуногенный фрагмент белка E из Н. Influenzae с последовательностью SEQ ID NO: 125.
В еще одном воплощении изобретения предложен указанный выше слитый белок, где B представляет собой иммуногенный фрагмент PilA, состоящий по меньшей мере из 50 последовательных аминокислотных остатков последовательности SEQ ID NO: 58. Предпочтительно B представляет собой иммуногенный фрагмент PilA из Н. Influenzae с последовательностью SEQ ID NO: 127.
В еще одном воплощении предложен слитый белок, содержащий белок E и PilA из Haemophilus influenzae или их иммуногенные фрагменты, как определено выше, где слитый белок выбран из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 142,
SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 184,
SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 196,
SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 202 и SEQ ID NO: 204, лишенных сигнального пептида. В более конкретном воплощении слитый белок имеет последовательность SEQ ID NO: 194, лишенную сигнального пептида, представляющую собой SEQ ID NO: 219.
В другом аспекте настоящего изобретения предложена иммуногенная композиция для индукции иммунного ответа против H. influenzae, содержащая указанный выше слитый белок. В конкретном воплощении предложена иммуногенная композиция для индукции иммунного ответа против H. influenzae, содержащая слитый белок, имеющий последовательность SEQ ID NO: 148. В еще одном конкретном воплощении предложена иммуногенная композиция для индукции иммунного ответа против H. influenzae, содержащая слитый белок, имеющий последовательность SEQ ID NO: 194.
В одном воплощении иммуногенная композиция по изобретению дополнительно содержит белок D из H. influenzae. В одном воплощении иммуногенная композиция по изобретению дополнительно содержит адъювант. В одном воплощении изобретения адъювант представляет собой адъювант AS01E.
В одном воплощении предложена иммуногенная композиция, где A в составе слитого белка представляет собой белок E, имеющий последовательность SEQ ID NO: 4, или полипептид с последовательностью, идентичной по меньшей мере на 75, 77, 80, 85, 90, 95, 97, 99 или 100% последовательности SEQ ID NO: 4, или иммуногенный фрагмент белка E, состоящий по меньшей мере из 50 последовательных аминокислотных остатков последовательности SEQ ID NO: 4.
В конкретном воплощении предложена иммуногенная композиция, где белок E в составе слитого белка способен индуцировать иммунный ответ против H. influenzae, при котором распознается последовательность SEQ ID NO: 4.
В одном воплощении изобретения предложена иммуногенная композиция, где В в составе слитого белка представляет собой PilA, имеющий последовательность SEQ ID NO: 58, или полипептид с последовательностью, идентичной по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 97 или 100% последовательности SEQ ID NO: 58, или иммуногенный фрагмент PilA, состоящий по меньшей мере из 50 последовательных аминокислотных остатков последовательности SEQ ID NO: 58.
В одном воплощении изобретения предложена иммуногенная композиция, где PilA в составе слитого белка способен индуцировать иммунный ответ против H. influenzae, при котором распознается последовательность SEQ ID NO: 58.
В конкретном воплощении изобретения предложена иммуногенная композиция для индукции иммунного ответа против H. influenzae, содержащая слитый белок, имеющий последовательность SEQ ID NO: 177.
В еще одном конкретном воплощении изобретения предложена иммуногенная композиция для индукции иммунного ответа против H. influenzae, содержащая слитый белок, имеющий последовательность SEQ ID NO: 219.
В еще одном аспекте изобретения предложена вакцина для индукции иммунного ответа против H. influenzae, содержащая указанный выше слитый белок или указанные выше иммуногенные композиции.
В еще одном аспекте изобретения предложено применение указанного выше слитого белка в лечении или предупреждении среднего отита, острых приступов хронической обструктивной болезни легких (ОПХОБЛ), пневмонии или заболевания, вызванного H. influenzae.
В еще одном аспекте изобретения предложено применение указанной выше иммуногенной композиции в лечении или предупреждении среднего отита, острых приступов хронической обструктивной
- 2 031580 болезни легких (ОПХОБЛ), пневмонии или заболевания, вызванного H. influenzae.
В еще одном аспекте изобретения предложено применение вакцины по п.14 в лечении или предупреждении среднего отита, острых приступов хронической обструктивной болезни легких (ОПХОБЛ), пневмонии или заболевания, вызванного H. influenzae.
В еще одном аспекте изобретения предложен способ получения слитого белка по любому из пп.1-6, включающий траснформацию клетки E. coli рекомбинантным вектором, содержащим последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201 и 203; индукцию периплазматической экспрессии указанного белка, содержащего сигнальный пептид, выбранный из Flgl, NadA и pelB, путем добавления изопропилф^-1тиогалактопиранозида; и очистку полученного белка.
Дополнительные аспекты настоящего изобретения описаны в нижеследующем подробном описании конкретных воплощений, примеров и формулы изобретения.
Краткое описание графических материалов
Фиг. 1 - электрофорез в ДСН-ПААГ (в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия) индуцированных бактериальных экстрактов для конструкций слитых белков LVL291, LVL268 и LVL269. Для LVL291, LVL268 и LVL269 наносили нерастворимую фракцию (I), растворимую фракцию (S) и фракцию культуральной среды (M) до и после индукции (ind).
Фиг. 2 - электрофорез в ДСН-ПААГ и Вестерн-блоттинг, относящийся к очищенным экстрактам для конструкций слитых белков LVL291, LVL268 и LVL269. Для очистки LVL291, LVL268 и LVL269 наносили поток через фракцию (Ft), фракцию промывки (W) и фракцию элюирования (E) для очистки LVL291, LVL268 и LVL269. Метку анти-his использовали в качестве зонда для экстрактов.
Фиг. 3 - электрофорез в ДСН-ПААГ индуцированных бактериальных и очищенных экстрактов для конструкций слитых белков LVL291 и LVL315. Для LVL291 и LVL315 наносили нерастворимую фракцию (I), растворимую фракцию (S), фракцию культуральной среды (M), поток через фракцию (Ft), фракцию промывки #1 (W1), фракцию промывки #2 (W2) и фракцию элюирования (E).
Фиг. 4 - электрофорез в ДСН-ПААГ индуцированных бактериальных и очищенных экстрактов для конструкции слитого белка LVL312. Для LVL312 наносили нерастворимую фракцию (I), растворимую фракцию (S), фракцию культуральной среды (M), поток через фракцию (Ft), фракцию промывки #1 (W1), фракцию промывки #2 (W2) и фракцию элюирования (E).
Фиг. 5 - электрофорез в ДСН-ПААГ индуцированных (1 мМ и 10 мкМ ИПТГ (изопропилтиогалактозида)) бактериальных экстрактов для конструкции слитого белка LVL317. Наносили экстракты до индукции (NI) и после индукции (In), растворимую фракцию (S), нерастворимую фракцию (I).
Фиг. 6 - электрофорез в ДСН-ПААГ индуцированных (1 мМ и 10 мкМ ИПТГ) бактериальных экстрактов для конструкции слитого белка LVL318. Наносили экстракты до индукции (NI) и после индукции (In), растворимую фракцию (S), нерастворимую фракцию (I).
Фиг. 7 - спектры CD (кругового дихроизма) PE, PilA и слитых белков PE-PilA.
Фиг. 8 - объединение спектра CD PE и PilA CD.
Фиг. 9 - кривая термической денатурации PilA.
Фиг. 10 - кривая денатурации PE.
Фиг. 11 - кривая термической денатурации слитого белка PE-PilA.
Фиг. 12 - типичная хроматограмма SP Sepharose™ Fast Flow.
Фиг. 13 - типичная хроматограмма Q Sepharose™ Fast Flow.
Фиг. 14 - электрофорез в ДСН-ПААГ образцов междуоперационной проверки процесса очистки слитого белка PE-PilA.
Фиг. 15 - Вестерн-блоттинг образцов междуоперационной проверки процесса очистки слитого белка PE-PilA. При блоттинге использовали поликлональные антитела кролика против PE.
Фиг. 16 - Вестерн-блоттинг образцов междуоперационной проверки процесса очистки слитого белка PR-PilA. При блоттинге использовали поликлональные антитела кролика против E. coli (BLR).
Фиг. 17 - тепловой переход слитого белка PE-PilA и белков PE и PilA. Кривые: PilA (1), белок E (Prot E, PE) (2), партия очищенного неразведенного слитого белка PE-PilA, 737 мкг/мл (3) и партия очищенного слитого белка PE-PilA, находящегося в контейнере, при конечной концентрации 60 мкг/мл (4).
Фиг. 18 - ответы антител против слитого белка LVL291 PE-PilA и против моновалентных белков PE и PilA в модели мышей линии Balb/c.
Фиг. 19 - действие вакцинации слитым белком PE-PilA на клиренс бактерий NTHi штамма 86028NP в носоглотке мышей.
Фиг. 20 - действие вакцинации слитым белком PE-PilA на клиренс бактерий NTHi штамма 3224A в носоглотке мышей.
Фиг. 21 - действие вакцинации PilA на клиренс бактерий в носоглотке мышей.
Фиг. 22 - действие вакцинации PE на клиренс бактерий в носоглотке мышей.
Фиг. 23(a) - связывание слитого белка LVL317 PE-PilA с витронектином и (b) - связывание слитых белков LVL317 и LVL735 PE-PilA с витронектином.
- 3 031580
Фиг. 24 - ингибирование связывания витронектина поликлональными антителами против слитого белка PE-PilA.
Фиг. 25 - электрофорез в ДСН-ПААГ растворимых фракций индуцированных бактериальных экстрактов для конструкций слитых белков LVL291, LVL702, LVL736, LVL737, LVL738, LVL739, LVL740 и вектора pET26b (отрицательный контроль), (а) эксперимент 1, (b) эксперимент 2, (c) эксперимент 3. Слитый белок PE-PilA указан стрелкой.
Фиг. 26 - среднее процентное содержание полосы слитого белка в растворимой фракции из экспериментов 1, 2 и 3.
Фиг. 27 - ответ антител к PE и PilA на LVL317 и LVL735.
Фиг. 28 - действие вакцинации LVL735 и LVL317 на клиренс бактерий в мышиной модели колонизации носоглотки нетипируемой гемофильной палочкой Haemophilus influenzae.
Подробное описание изобретения
Если здесь не объяснено или не определено иное, все технические и научные термины, используемые в данной заявке, имеют такое же значение, как традиционно понимают обычные специалисты в области техники, к которой принадлежит данное изобретение. Например, определения традиционных терминов в молекулярной биологии можно найти в документах Benjamin Lewin, Genes V, published by Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9) и Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).
Термины в единственном числе включают ссылки на множественное число, если в контексте явным образом не указано иное. Подобным образом, слово или предназначено для включения и, если в контексте явным образом не указано иное. Кроме того, понятно, что все размеры оснований или размеры аминокислот, а также все значения молекулярной массы, приведенные для нуклеиновых кислот или полипептидов, являются приблизительными и приведены для описания. Кроме того, числовые пределы, приведенные в отношении концентраций или уровней вещества, такого как антиген, могут быть приблизительными. Таким образом, где указано, что концентрация составляет, например, приблизительно 200 пг, подразумевают, что эта концентрация включает значения, несколько большего или несколько меньшего, чем (примерно) 200 пг.
Хотя на практике можно использовать и тестировать методы или материалы, подобные или эквивалентные описанным в данной заявке, подходящие методы и материалы описаны ниже.
Термин содержит означает включает. Таким образом, если контекст не требует иного, слово содержит и его варианты, например содержать и содержащий, понимают как подразумевающий включение указанного соединения или композиции (например, нуклеиновой кислоты, полипептида, антигена) или стадии, либо группы соединений или стадий, но не исключение каких-либо других соединений, композиций, стадий или их групп.
Чтобы сделать более удобным обзор различных воплощений данного изобретения, приведены следующие объяснения терминов. Дополнительные термины и пояснения приведены в контексте данного описания.
Субъект, как используют в данной заявке, представляет собой млекопитающее, включая людей, приматов, кроме человека, и млекопитающих, кроме приматов, таких как представители рода грызунов (включающие, но не ограниченные ими, мышей и крыс) и представители порядка Lagomorpha (включающие, но не ограниченные ими, кроликов).
Как используют в данной заявке, Белок E, белок E, Prot E и PE означает белок E из H. influenzae. Белок E может состоять из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4 (MKKIILTLSL GLLTACSAQI QKAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY IDSESIWVDN QEPQIVHFDA WNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK), а также последовательностей, обладающих по меньшей мере или точно 75, 77, 80, 85, 90, 95, 97, 99 или 100% идентичностью по всей длине SEQ ID NO: 4, либо включать эти последовательности. Сравнение 53 последовательностей белка E из Haemophilus influenzae (табл. 1, SEQ ID NO: 5-57) продемонстрировало идентичность белку E, представленному в SEQ ID NO: 4, составляющую от приблизительно 77 до приблизительно 100%. Например, в аминокислотной последовательности белка E аминокислота № 20 может представлять собой изолейцин (I) или треонин (T); аминокислота № 23 может представлять собой аланин (A) или валин (V); аминокислота № 24 может представлять собой лизин (K) или глутаминовую кислоту (E); аминокислота № 31 может представлять собой аланин (A) или треонин (T); аминокислота № 32 может представлять собой пролин (P) или аланин (A); аминокислота № 34 может представлять собой треонин (T) или аланин (A); аминокислота № 37 может представлять собой аргинин (R) или глутамин (Q); аминокислота № 47 может представлять собой валин (V) или аланин (A); аминокислота № 57 может представлять собой триптофан (W) или может отсутствовать (-); аминокислота № 70 может представлять собой аланин (A) или треонин (T); аминокислота № 93 может представлять собой глутамин (Q) или отсутствовать (-); аминокислота № 109 может представлять собой треонин (T) или изолейцин (I); аминокислота № 119 может представлять собой глицин (G) или
- 4 031580 серин (S); аминокислота № 153 может представлять собой глутаминовую кислоту (E) или лизин (K); аминокислота № 156 может представлять собой серин (S) или лейцин (L); аминокислота № 160 может представлять собой лизин (K) или аспарагин (N); аминокислота № 161 может представлять собой лизин (K), изолейцин (I) или отсутствовать (-); аминокислоты №№ 162-195 могут отсутствовать или являются такими, как представлено в SEQ ID NO: 15, (где (-) указывает на отсутствие аминокислоты № 166) или как представлено в SEQ ID NO: 16; либо представляют собой любую их комбинацию.
Белок E может состоять из аминокислотной последовательности или включать аминокислотную последовательность, отличающуюся от SEQ ID NO: 4 любой одной или более чем одной аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из следующих аминокислот: аминокислоты № 20, аминокислоты № 23, аминокислоты № 24, аминокислоты № 31, аминокислоты № 32, аминокислоты № 34, аминокислоты № 37, аминокислоты № 47, аминокислоты № 57, аминокислоты № 70, аминокислоты № 93, аминокислоты № 109, аминокислоты № 119, аминокислоты № 153, аминокислоты № 156, аминокислоты № 160, аминокислоты № 161 и аминокислот № 162-№ 195, где аминокислота № 20 представляет собой треонин (T); аминокислота № 23 представляет собой валин (V); аминокислота № 24 представляет собой лизин (K); аминокислота № 31 представляет собой треонин (T); аминокислота № 32 представляет собой аланин (A); аминокислота № 34 представляет собой аланин (A); аминокислота № 37 представляет собой глутамин (Q); аминокислота № 47 представляет собой аланин (A); аминокислота № 57 отсутствует (-); аминокислота № 70 представляет собой треонин (T); аминокислота № 93 отсутствует (-); аминокислота № 109 представляет собой изолейцин (I); аминокислота № 119 представляет собой серин (S); аминокислота № 153 представляет собой лизин (K); аминокислота № 156 представляет собой лейцин (L); аминокислота № 160 представляет собой аспарагин (N); аминокислота № 161 представляет собой лизин (K) или изолейцин (I); или аминокислоты № 162 - № 195 являются такими, как представлено в SEQ ID NO: 15, (где (-) указывает на отсутствие аминокислоты № 166), или как представлено в SEQ ID NO: 16.
- 5 031580
Таблица 1
Аминокислотные последовательности белка E из 53 штаммов Haemophilus influenzae (SEQ ID NO: 5-57), указывает на отсутствие аминокислоты
Название штамма Последовательность белка Е
3224А MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAKQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWVDNQEPQ IVHFDAWNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDEFWGQGLRAAPKKQK KHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGEAFSVDKK (SEQ ID N0:5)
RdKW2 0 MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWVDNQEPQ IVHFDAWNLDRGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQIRTDFYDEFWGQGLRAAPKKQK KHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID N0:6)
86- 028NP MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAKQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWVDNQEPQ IVHFDAWNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDEFWGQGLRAAPKKQK KHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGEAFSVDKK (SEQ ID N0:7)
R2846 MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWVDNQEPQ IVHFDAWNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDEFWGQGLRAAPKKQK KHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID N0:8)
R2866 MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWVDNQEPQ IVHFDAWNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDEFWGQGLRAAPKKQK KHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID N0:9)
3655 MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDMKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWVDNQEPQ IVHFDAWNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDEFWGQGLRAAPKKQK KHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID N0:10)
PittAA MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAKQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWVDNQEPQ IVHFDAWNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDEFWGQGLRAAPKKQK KHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGEAFSVDKK (SEQ ID N0:11)
PittEE MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDMKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESI-VDNQEPQ IVHFDAWNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDEFWGQGLRAAPKKQK KHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK(SEQ ID N0:12)
PittHH MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWVDNQEPQ IVHFDTWNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDEFWGQGLRAAPKKQK KHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID N0:13)
Pittll MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWVDNQEPQ IVHFDAWNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDEFWGQGLRAAPKKQK KHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID N0:14)
- 6 031580
R3021 MKKIILTLSLGLLTACSAQTQKAEQNDVKLTPPTDVQSGYVRLVKNVNYYIDSESIWVDNQEPQ IVHFDAWNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRIDFYDEFWGQGLRAAPKKQK KHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKNKKICT-LISLNFIQLLGCREYSIFLQLLLFYC WHF (SEQ ID N0:15)
22.4- 21 MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWVDNQEPQ IVHFDAWNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDEFWGQGLRAAPKKQK KHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKKIKKICTLISLNFIQLLGCREYSIFLQLLLFYC WHF (SEQ ID N0:16)
3219C MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDMKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWVDNQEPQ IVHFDAWNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDEFWGQGLRAAPKKQK KHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID N0:17)
3185 MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWVDNQEPQ IVHFDAWNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDEFWGQGLRAAPKKQK KHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID N0:18)
3241A MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAKQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWVDNQEPQ IVHFDAWNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDEFWGQGLRAAPKKQK KHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGEAFSVDKK (SEQ ID N0:19)
038144 SI MKKIILTLSLGLLTACSAQTQKVEQNDVKLTAPTDVRSGFVRLVKNVNYYIDSESIWVDNQEPQ IVHFDAWNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDEFWGQGLRAAPKKQK KHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFLVDKK (SEQ ID N0:20)
810956 MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAKQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWVDNQEPQ IVHFDAWNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDEFWGQGLRAAPKKQK KHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGEAFSVDKK (SEQ ID N0:21)
821246 MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWVDNQEPQ IVHFDAWNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQIRTDFYDEFWGQGLRAAPKKQK KHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID N0:22)
840645 MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAKQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWVDNQEPQ IVHFDAWNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDEFWGQGLRAAPKKQK KHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGEAFSVDKK (SEQ ID N0:23)
902550 Z19 MKKIILTLSLGLLTACSAQTQKVEQNDVKLTPPTDVRSGYVRLVKNVNYYIDSESIWVDNQEPQ IVHFDAWNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDEFWGQGLRAAPKKQK
- 7 031580
KHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID N0:24)
А84017 7 MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAKQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWVDNQEPQ IVHFDAWNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDEFWGQGLRAAPKKQK KHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGEAFSVDKK (SEQ ID N0:25)
А86051 4 MKKIILTLSLGLLTACSAQTQKVEQNDVKLTAPTDVRSGYVRLVKNANYYIDSESIWVDNQEPQ IVHFDAWNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDEFWGQGLRAAPKKQK KHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID N0:26)
А95001 4 MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWVDNQEPQ IVHFDAWNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRIDFYDEFWGQGLRAAPKKQK KHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID N0:27)
306543 Х4 MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWVDNQEPQ IVHFDAWNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDEFWGQGLRAAPKKQK KHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK(SEQ ID N0:28)
А93010 5 MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWVDNQEPQ IVHFDTWNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDEFWGQGLRAAPKKQK KHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK(SEQ ID N0:29)
901905 и MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWVDNQEPQ IVHFDAWNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDEFWGQGLRAAPKKQK KHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID N0:30)
А92003 0 MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAKQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWVDNQEPQ IVHFDAWNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDEFWGQGLRAAPKKQK KHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGEAFSVDKK (SEQ ID N0:31)
3221В MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWVDNQEPQ IVHFDAWNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDEFWGQGLRAAPKKQK KHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID N0:32)
27W116 791N MKKIILTLSLGLLTACSAQTQKVEQNDVKLTPPTDVRSGYVRLVKNVNYYIDSESIWVDNQEPQ IVHFDAWNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDEFWGQGLRAAPKKQK KHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID N0:33)
N218 MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWVDNQEPQ IVHFDAWNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDEFWGQGLRAAPKKQK KHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID N0:34)
- 8 031580
N163 MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAKQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWVDNQEPQ IVHFDAWNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDEFWGQGLRAAPKKQK KHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGEAFSVDKK (SEQ ID N0:35)
N162 MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAKQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWVDNQEPQ IVHFDAWNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDEFWGQGLRAAPKKQK KHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGEAFSVDKK (SEQ ID N0:36)
N107 MKKIILTLSLGLLTACSAQTQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWVDNQEPQ IVHFDAWNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQIRTDFYDEFWGQGLRAAPKKQK KHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID N0:37)
N91 MKKIILTLSLGLLTACSAOTQKVEQNDVKLTAPADVRSGYVRLVKNVNYYIDSESIWVDNQEPO IVHFDAWNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDEFWGQGLRAAPKKQK KHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID N0:38)
D211PG MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAKQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWVDNQEPQ IVHFDAWNLDKGLYVYPEPKRYARSVR-YKILNCANYHLTQVRTDFYDEFWGQGLRAAPKKQK KHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGEAFSVDKK (SEQ ID N0:39)
D211PD MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAKQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWVDNQEPQ IVHFDAWNLDKGLYVYPEPKRYARSVR-YKILNCANYHLTQVRTDFYDEFWGQGLRAAPKKQK KHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGEAFSVDKK (SEQ ID N0:40)
D201PG MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWVDNQEPQ IVHFDAWNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDEFWGQGLRAAPKKQK KHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID N0:41)
D201PD MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWVDNQEPQ IVHFDAWNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDEFWGQGLRAAPKKQK KHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID N0:42)
D198PG MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWVDNQEPQ IVHFDAWNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDEFWGQGLRAAPKKQK KHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID N0:43)
D198PD MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWVDNQEPQ IVHFDAWNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDEFWGQGLRAAPKKQK KHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID N0:44)
- 9 031580
D195PD MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWVDNQEPQ IVHFDTWNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDEFWGQSLRAAPKKQK KHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID N0:45)
D189PG MKKIILTLSLGLLTACSAQTQKVEQNDVKLTPPTDVRSGYVRLVKNVNYYIDSESIWVDNQEPQ IVHFDAWNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDEFWGQGLRAAPKKQK KHTLSLTPDTTVYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID N0:46)
D189PD MKKIILTLSLGLLTACSAQTQKVEQNDVKLTPPTDVRSGYVRLVKNVNYYIDSESIWVDNQEPQ IVHFDAWNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDEFWGQGLRAAPKKQK KHTLSLTPDTTVYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID N0:47)
D129CG MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAKQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWVDNQEPQ IVHFDAWNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDEFWGQGLRAAPKKQK KHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGEAFSVDKK (SEQ ID N0:48)
D124PG MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWVDNQEPQ IVHFDTWNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDEFWGQGLRAAPKKQK KHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID N0:49)
D124PD MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWVDNQEPQ IVHFDTWNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDEFWGQGLRAAPKKQK KHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK(SEQ ID N0:50)
D58PG MKKIILTLSLGLLTACSAQTQKAEQNDVKLTPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWVDNQEPQ IVHFDAWNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDEFWGQGLRAAPKKQK KHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID N0:51)
D33OD MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAKQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWVDNQEPQ IVHFDAWNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDEFWGQGLRAAPKKQK KHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID N0:52)
BS433 MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWVDNQEPQ IVHFDTWNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDEFWGQGLRAAPKKQK KHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID N0:53)
BS432 MKKIILTLSLGLLTACSAQTQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWVDNQEPQ IVHFDAWNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQIRTDFYDEFWGQGLRAAPKKQK KHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK(SEQ ID N0:54)
1714 MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAKQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWVDNQEPQ IVHFDAWNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDEFWGQGLRAAPKKQK KHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGEAFSVDKK (SEQ ID N0:55)
1128 MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESIWVDNQEPQ IVHFDAWNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDEFWGQGLRAAPKKQK KHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID N0:56)
BS430 MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDMKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESI-VDNQEPQ IVHFDAWNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDEFWGQGLRAAPKKQK KHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID N0:57)
Белок E может представлять собой белок E из H. influenzae штамма 3224A, RdKW20, 86-028NP, R2846, R2866, 3655, PittAA, PittEE, PittHH, PittII, R3021, 22.4-21, 3219C, 3185, 3241A, 038144S1, 810956, 821246, 840645, 902550Z19, A840177, A860514, A950014, 306543X4, A930105, 901905U, A920030, 3221B, 27W116791N, N218, N163, N162, N107, N91, D211PG, D211PD, D201PG, D201PD, D198PG, D198PD, D195PD, D189PG, D189PD, D129CG, D124PG, D124PD, D58PG, D33OD, BS433, BS432, 1714, 1128 или BS430. Белок E может представлять собой белок E, представленный в любой из SEQ ID NO: 5-57.
Белок E может представлять собой последовательность, обладающую по меньшей мере 95% идентичностью по всей длине любой из SEQ ID NO: 4-57. Белок E может представлять собой последователь
- 10 031580 ность, обладающую по меньшей мере 95% идентичностью по всей длине любой из последовательностей, представленных в табл. 1, SEQ ID NO: 5-57.
Иммуногенные фрагменты белка E включают иммуногенные фрагменты, состоящие по меньшей мере из 7, 10, 15, 20, 25, 30 или 50 непрерывных аминокислот SEQ ID NO: 4. Эти иммуногенные фрагменты могут вызывать образование антител, которые могут связывать SEQ ID NO: 4.
Иммуногенные фрагменты белка E могут включать иммуногенные фрагменты, состоящие по меньшей мере из 7, 10, 15, 20, 25, 30 или 50 непрерывных аминокислот любой из SEQ ID NO: 4-57. Эти иммуногенные фрагменты могут вызывать образование антител, которые могут связывать полноразмерную последовательность, из которой получен данный фрагмент.
Иммуногенные фрагменты белка E включают иммуногенные фрагменты, состоящие по меньшей мере из 7, 10, 15, 20, 25, 30 или 50 непрерывных аминокислот SEQ ID NO: 5-57. Эти иммуногенные фрагменты могут вызывать образование антител, которые могут связывать полноразмерную последовательность, из которой получен данный фрагмент.
Как используют в данной заявке, PilA означает пилин A из H. influenzae. PilA может состоять из белковой последовательности SEQ ID NO: 58 (MKLTTQQTLK KGFTLIELMI VIAIIAILAT IAIPSYQNYT KKAAVSELLQ ASAPYKADVE LCVYSTNETT NCTGGKNGIA ADITTAKGYV KSVTTSNGAI TVKGDGTLAN MEYILQATGN AATGVTWTTT CKGTDASLFP ANFCGSVTQ), а также последовательностей, обладающих по меньшей мере 80-100% идентичностью SEQ ID NO: 58, либо включать эти последовательности. Например, PilA может обладать по меньшей мере 80, 85, 90, 95, 97 или 100% идентичностью SEQ ID NO: 58. Сравнение по всей длине 64 последовательностей PilA из Haemophilus influenzae (табл. 2, SEQ ID NO: 58-121) продемонстрировали идентичность PilA, представленному в SEQ ID NO: 58, составляющую приблизительно от 80% до 100%. Например, в аминокислотной последовательности PilA, аминокислота № 6 может представлять собой глутамин (Q) или лейцин (L); аминокислота № 7 может представлять собой глутамин (Q) или треонин (T); аминокислота № 37 может представлять собой глутамин (Q) или лизин (K); аминокислота № 44 может представлять собой аланин (A) или серин (S); аминокислота № 57 может представлять собой аланин (A) или серин (S); аминокислота № 67 может представлять собой аспарагин (N) или глицин (G); аминокислота № 68 может представлять собой глутаминовую кислоту (E) или лизин (K); аминокислота № 69 может представлять собой треонин (T) или пролин (P); аминокислота № 71 может представлять собой лизин (K), аспарагин (N), серин (S) или треонин (T); аминокислота № 73 может представлять собой треонин (T), серин (S) или метионин (M); аминокислота № 76 может представлять собой лизин (K), серин (S) или аспарагин (N); аминокислота № 84 может представлять собой треонин (T) или лизин (K); аминокислота № 86 может представлять собой аланин (A) или валин (V); аминокислота № 91 может представлять собой лизин (K) или аланин (A); аминокислота № 94 может представлять собой треонин (T), изолейцин (I) или лизин (K); аминокислота № 96 может представлять собой серин (S) или глутамин (Q); аминокислота № 97 может представлять собой аспарагин (N) или серин (S); аминокислота № 99 может представлять собой аланин (A) или глицин (G); аминокислота № 103 может представлять собой аланин (A) или лизин (K); аминокислота № 109 может представлять собой аспарагиновую кислоту (D), аланин (A) или треонин (T); аминокислота № 110 может представлять собой глицин (G), аспарагин (N) или аргинин (R); аминокислота № 112 может представлять собой серин (S) или глутаминовую кислоту (E); аминокислота № 114 может представлять собой треонин (T) или изолейцин (I); аминокислота № 116 может представлять собой треонин (T) или глутамин (Q); аминокислота № 118 может представлять собой глутаминовую кислоту (E), треонин (T), аланин (A), лизин (K) или серин (S); аминокислота № 121 может представлять собой серин (S) или аланин (A); аминокислота № 122 может представлять собой аланин (A) или треонин (T); аминокислота № 123 может представлять собой лизин (K), треонин (T) или аланин (A); аминокислота № 128 может представлять собой лизин (K) или треонин (T); аминокислота № 135 может представлять собой аспарагиновую кислоту (D) или глутаминовую кислоту (E); аминокислота № 136 может представлять собой аланин (A) или треонин (T); аминокислота № 145 может представлять собой глицин (G) или аргинин (R); аминокислота № 149 может представлять собой глутамин (Q) или лизин (K); либо любую их комбинацию.
PilA может состоять из аминокислотной последовательности или включать аминокислотную последовательность, отличающуюся от SEQ ID NO: 58 любой одной или более чем одной аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из следующих аминокислот: аминокислоты № 6, аминокислоты № 7, аминокислоты № 37, аминокислоты № 44, аминокислоты № 57, аминокислоты № 67, аминокислоты № 68, аминокислоты № 69, аминокислоты № 71, аминокислоты № 73, аминокислоты № 76, аминокислоты № 84, аминокислоты № 86, аминокислоты № 91, аминокислоты № 94, аминокислоты № 96, аминокислоты № 97, аминокислоты № 99, аминокислоты № 103, аминокислоты № 109, аминокислоты № 110, аминокислоты № 112, аминокислоты № 114, аминокислоты № 116, аминокислоты № 118 аминокислоты, № 121, аминокислоты № 122, аминокислоты № 123, аминокислоты № 128, аминокислоты № 135, аминокислоты № 136, аминокислоты № 145 и аминокислоты № 149, где аминокислота № 6 представляет собой лейцин (L); аминокислота № 7 представляет собой треонин (T); аминокислота № 37 представляет собой лизин (K); аминокислота № 44 представляет собой серин (S); аминокислота № 57 представляет собой серин (S); аминокислота № 67 представляет собой глицин (G); аминокислота № 68 представляет собой
- 11 031580 лизин (K); аминокислота № 69 представляет собой пролин (P); аминокислота № 71 представляет собой лизин (K), серин (S) или треонин (T); аминокислота № 73 представляет собой серин (S) или метионин (M); аминокислота № 76 представляет собой серин (S) или аспарагин (N); аминокислота № 84 представляет собой лизин (K); аминокислота № 86 представляет собой валин (V); аминокислота № 91 представляет собой аланин (A); аминокислота № 94 представляет собой изолейцин (I) или лизин (K); аминокислота № 96 представляет собой глутамин (Q); аминокислота № 97 представляет собой серин (S); аминокислота № 99 представляет собой глицин (G); аминокислота № 103 представляет собой аланин (A); аминокислота № 109 представляет собой аспарагиновую кислоту (D) или треонин (T); аминокислота № 110 представляет собой глицин (G) или аргинин (R); аминокислота № 112 представляет собой серин (S); аминокислота № 114 представляет собой треонин (T); аминокислота № 116 представляет собой треонин (T); аминокислота № 118 представляет собой глутаминовую кислоту (E), аланин (A), лизин (K) или серин (S); аминокислота № 121 представляет собой серин (S); аминокислота № 122 представляет собой треонин (T); аминокислота № 123 представляет собой лизин (K) или аланин (A); аминокислота № 128 представляет собой лизин (K); аминокислота № 135 представляет собой глутаминовую кислоту (E); аминокислота № 136 представляет собой треонин (T); аминокислота № 145 представляет собой аргинин (R); аминокислота № 149 представляет собой лизин (K).
- 12 031580
Таблица 2
Аминокислотные последовательности пилина A из 64 штаммов
Haemophilus influenzae (SEQ ID NO: 58-121)
Название штамма Последовательность PilA
86-028NP MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADVELCVY STNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANMEYILQATGNAATGVTWT TTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID N0:58)
NTH13219 С MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADVELCVY STNETTKCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVAGNGTLDGMSYTLTAEGDSAKGVTWK TTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID N0:59)
NTH13224 A MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADVELCVY STNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANMEYILQATGNAATGVTWT TTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID N0:60)
NTHil2 MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYKNYTKKAAVSELLQASAPYKADVELCVY STGKPSSCSGGSNGIAADITTAKGYVASVITQSGGITVKGDGTLANMEYILQAAGNAAAGVTWT TTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID N0:61)
NTHi44 MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADVELCVY STNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANMEYILQATGNAATGVTWT TTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID N0:62)
NTHi67 MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKSDVELCVY STGKPSTCSGGSNGIAADITTVKGYVKSVTTSNGAITVAGNGTLDGMSYTLTAEGDSAKGVTWT TTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID N0:63)
1054MEE MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADVELCVY STNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANMEYILQATGNAATGVTWT TTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID N0:64)
1729MEE MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADVELCVY STNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANMEYILQATGNAATGVTWT TTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID N0:65)
1728MEE MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADVELCVY STNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANMEYILQATGNAATGVTWT TTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID N0:66)
1885MEE MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYKNYTKKAAVSELLQASAPYKADVELCVY STNEITNCMGGKNGIAADITTAKGYVASVKTQSGGITVKGDGTLANMEYILQATGNAAAGVTWT TTCKGTDASLFPANFCGSITQ (SEQ ID N0:67)
- 13 031580
1060МЕЕ MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKASVSELLQASAPYKADVELCVY STNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVASVKTQSGGITVKGNGTLANMEYILQAKGNATAGVTWT TTCKGTDASLFPANFCRSVTK (SEQ ID N0:68)
RdKW2 0 MKLTTLQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADVELCVY STNETTSCTGGKNGIAADIKTAKGYVASVITQSGGITVKGNGTLANMEYILQAKGNAAAGVTWT TTCKGTDASLFPANFCGSVTK (SEQ ID N0:69)
214NP MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADVELCVY STGKPSSCSGGSNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANMEYILQASGNAATGVTWT TTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID N0:70)
1236MEE MKLTTLQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADVELCVY STNETTSCTGGKNGIAADIKTAKGYVASVITQSGGITVKGNGTLANMEYILQAKGNAAAGVTWT TTCKGTDASLFPANFCGSVTK (SEQ ID N0:71)
1714MEE MKLTTLQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADVELCVY STGKPSTCSGGSNGIAADITTAKGYVASVKTQSGGITVKGNGTLANMEYILQATGNAATGVTWT TTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID N0:72)
1128MEE MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKASVSELLQASAPYKSDVELCVY STGKPSTCSGGSNGIAADITTAKGYVASVKTQSGGITVKGNGTLANMEYILQAKGNATAGVTWT TTCKGTDASLFPANFCRSVTK (SEQ ID N0:73)
R2846 MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADVELCVY STNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANMEYILQATGNAATGVTWT TTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID N0:74)
R2866 MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADVELCVY STNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVASVKTQSGGITVKGDGTLANMEYILQATGNAATGVTWT TTCKGTEASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID N0:75)
3655 MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKASVSELLQASAPYKADVELCVY STNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVASVKTQSGGITVKGNGTLANMEYILQAKGNATAGVTWT TTCKGTDASLFPANFCRSVTK (SEQ ID N0:76)
PittAA MKLTTLQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADVELCVY STGKPSTCSGGSNGIAADITTAKGYVASVKTQSGGITVKGNGTLANMEYILQATGNAATGVTWT TTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID N0:77)
- 14 031580
PittGG MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADVELCVY STGKPSTCSGGSNGIAADITTAKGYVASVKTQSGGITVKGNGTLANMEYILQAKGNATAGVTWT TTCKGTDASLFPANFCRSVTK (SEQ ID N0:78)
Pittll MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADVELCVY STNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVASVKTQSGGITVKGDGTLANMEYILQATGNAATGVTWT TTCKGTEASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID N0:79)
R3021 MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADVELCVY STNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVASVKTQSGGITVKGDGTLANMEYILQATGNAATGVTWT TTCKGTEASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID N0:80)
22.4-21 MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKSDVELCVY STGKPSTCSGGSNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVAGNGTLDGMSYTLTAEGDSAKGVTWK TTCKGTDASLFPANFCGSVTK (SEQ ID N0:81)
3185A MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADVELCVY STNEATKCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANMEYILQASGNAATGVTWT TTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID N0:82)
3221B MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADVELCVY STNEATKCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANMEYILQASGNAATGVTWT TTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID N0:83)
3241A MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADVELCVY STNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANMEYILQATGNAATGVTWT TTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID N0:84)
038144S1 MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAISELLQASAPYKSDVELCVY STGKPSTCSGGSNGIAADITTAKGYVASVKTQSGGITVKGNGTLANMEYILQAKGNATAGVTWT TTCKGTDASLFPANFCRSVTK (SEQ ID N0:85)
821246 MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADVELCVY STNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVASVKTQSGGITVKGDGTLANMEYILQATGNAATGVTWT TTCKGTEASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID N0:86)
840645 MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADVELCVY STNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANMEYILQATGNAATGVTWT TTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID N0:87)
- 15 031580
902550Z1 9 MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKSDVELCVY STGKPSTCSGGSNGIAADITTVKGYVKSVTTSNGAITVAGNGTLDGMSYTLTAEGDSAKGVTWT TTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID N0:88)
А840177 MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADVELCVY STNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANMEYILQATGNAATGVTWT TTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID N0:89)
А920030 MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADVELCVY STNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVASVKTQSGGITVKGNGTLANMEYILQATGNAATGVTWT TTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID N0:90)
А950014 MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADVELCVY STGKPSTCSGGSNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVAGNGTLDRMSYTLTAEGDSAKGVTWT TTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID N0:91)
901905U MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADVELCVY STGKPSSCSGGSNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANMEYILQASGNAATGVTWT TTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID N0:92)
А920029 MKLTTQTTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKSDVELCVY STNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVASVITQSGGITVKGNGTLTNMEYILQATGNAATGVTWT TTCKGTDASLFPANFCGSITQ (SEQ ID N0:93)
А930105 MKLTTLQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADVELCVY STGKPSTCSGGNNGIAADIKTAKGYVASVKTQSGGITVKGDGTLANMEYILQATGNAATGVTWT TTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID N0:94)
306543X4 MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADVELCVY STGKPSSCSGGSNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANMEYILQASGNAATGVTWT TTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID N0:95)
N218 MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADVELCVY STNEATKCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANMEYILQASGNAATGVTWT TTCKGTDTSLFPANFCGSVTQ (SEQ ID N0:96)
N163 MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADVELCVY STNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANMEYILQATGNAATGVTWT TTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID N0:97)
- 16 031580
N162 MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADVELCVY STNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVASVKTQSGGITVKGNGTLANMEYILQATGNAATGVTWT TTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID N0:98)
N120 MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADVELCVY STGKPSTCSGGSNGIAADITTAKGYVASVKTQSGGITVKGNGTLANMEYILQAKGNATAGVTWT TTCKGTDASLFPANFCRSVTK (SEQ ID N0:99)
N107 MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADVELCVY STGKPSTCSGGSNGIAADITTAKGYVASVKTQSGGITVKGNGTLANMEYILQAKGNATAGVTWT TTCKGTDASLFPANFCRSVTK (SEQ ID N0:100)
N92 MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADVELCVY STNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANMEYILQATGNAATGVTWT TTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID N0:101)
N91 MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADVELCVY STGKPSTCSGGSNGIAADITTAKGYVASVKTQSGGITVKGNGTLANMEYILQAKGNATAGVTWT TTCKGTDASLFPANFCRSVTK (SEQ ID N0:102)
D219PG MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADVELCVY STNEATKCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANMEYILQASGNAATGVTWT TTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID N0:103)
D211PG MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADVELCVY STNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANMEYILQATGNAATGVTWT TTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID N0:104)
D211PD MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADVELCVY STNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANMEYILQATGNAATGVTWT TTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID N0:105)
D204CD MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADVELCVY STNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANMEYILXATGNAATGVTWT TTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID N0:106)
D198PG MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADVELCVY STNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANMEYILQATGNAATGVTWT TTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID N0:107)
- 17 031580
D198PD MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADVELCVY STNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANMEYILQATGNAATGVTWT TTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID N0:108)
D195PD MKLTTLQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADVELCVY STGKPSTCSGGNNGIAADIKTAKGYVASVKTQSGGITVKGDGTLANMEYILQATGNAATGVTWT TTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID N0:109)
D195CD MKLTTLQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADVELCVY STGKPSTCSGGNNGIAADIKTAKGYVASVKTQSGGITVKGDGTLANMEYILQATGNAATGVTWT TTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID N0:110)
D189PG MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADVELCVY STNETTSCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVAGNGTLDGMSYTLTAEGDSAKGVTWK TTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID N0:111)
D189PD MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADVELCVY STNETTSCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVAGNGTLDGMSYTLTAEGDSAKGVTWK TTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID N0:112)
D124PG MKLTTLQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADVELCVY STGKPSTCSGGNNGIAADIKTAKGYVASVKTQSGGITVKGDGTLANMEYILQATGNAATGVTWT TTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID N0:113)
D124PD MKLTTLQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADVELCVY STGKPSTCSGGNNGIAADIKTAKGYVASVKTQSGGITVKGDGTLANMEYILQATGNAATGVTWT TTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID N0:114)
D124CG MKLTTLQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADVELCVY STGKPSTCSGGNNGIAADIKTAKGYVASVKTQSGGITVKGDGTLANMEYILQATGNAATGVTWT TTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID N0:115)
D58PG MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADVELCVY STNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVASVKTQSGGITVKGDGTLANMEYILQATGNAATGVTWT TTCKGTEASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID N0:116)
BS433 MKLTTLQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADVELCVY STGKPSTCSGGNNGIAADIKTAKGYVASVKTQSGGITVKGDGTLANMEYILQATGNAATGVTWT TTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID N0:117)
BS432 MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADVELCVY STGKPSTCSGGSNGIAADITTAKGYVASVKTQSGGITVKGNGTLANMEYILQAKGNATAGVTWT TTCKGTDASLFPANFCRSVTK (SEQ ID N0:118)
BS430 MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADVELCVY STNEATKCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANMEYILQASGNAATGVTWT TTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID N0:119)
1714 MKLTTLQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADVELCVY STGKPSTCSGGSNGIAADITTAKGYVASVKTQSGGITVKGNGTLANMEYILQATGNAATGVTWT TTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID N0:120)
1128 MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKASVSELLQASAPYKSDVELCVY STGKPSTCSGGSNGIAADITTAKGYVASVKTQSGGITVKGNGTLANMEYILQAKGNATAGVTWT TTCKGTDASLFPANFCRSVTK (SEQ ID N0:121)
PilA может представлять собой PilA из H. influenzae штамма NTHi3219C, NTHi3224A, NTHi12, NTHi44, NTHi67, 1054MEE, 1729MEE, 1728MEE, 1885MEE, 1060MEE, RdKW20, 214NP, 1236MEE, 1714MEE, 1128MEE, 86-028NP, R2846, R2866, 3655, PittAA, PittGG, PittII, R3021, 22.4-21, 3185A, 3221B, 3241A, 038144S1, 821246, 840645, 902550Z19, A840177, A920030, A950014, 901905U, A920029, A930105, 306543X4, N218, N163, N162, N120, N107, N92, N91, D219PG, D211PG, D211PD, D204CD, D198PG,
- 18 031580
D198PD, D195PD, D195CD, D189PG, D189PD, D124PG, D124PD, D124CG, D58PG, BS433, BS432, BS430, 1714 или 1128. Аминокислотная последовательность PilA из H. influenzae штамма D204CD представлена в SEQ ID NO: 106, в которой X в положении № 116 представляет собой либо глутамин (Q), либо лейцин (L); неопределенность относительно аминокислоты в положении № 116 может быть прояснена путем технического разделения второго нуклеотида, кодирующего аминокислоту № 116, выяснения последовательности PilA для штамма D204CD. PilA может представлять собой PilA, представленный в любой из SEQ ID NO: 58-121.
PilA может представлять собой последовательность, обладающую по меньшей мере 95% идентичностью по всей длине любой из SEQ ID NO: 58-121 (как приведено в табл. 2).
Иммуногенные фрагменты PilA включают иммуногенные фрагменты, состоящие по меньшей мере из 7, 10, 15, 20, 25, 30 или 50 непрерывных аминокислот SEQ ID NO: 58-121. Эти иммуногенные фрагменты могут вызывать образование антител, которые могут связываться с полноразмерной последовательностью, из которой получен этот фрагмент.
Например, иммуногенные фрагменты PilA включают иммуногенные фрагменты, состоящие по меньшей мере из 7, 10, 15, 20, 25, 30 или 50 непрерывных аминокислот SEQ ID NO: 58. Эти иммуногенные фрагменты могут вызывать образование антител, которые могут связывать SEQ ID NO: 58.
Идентичность между полипептидами можно вычислить с помощью различных алгоритмов. Например, можно использовать программу Needle из пакета программ EMBOSS (свободно распространяемое программное обеспечение; EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite (2000). Trends in Genetics 16(6): 276-277) и программу Gap из пакета программ GCG® (Accelrys Inc.). Эта программа Gap представляет собой применение алгоритма Нидлмана-Вунша, описанного в статье Needleman, SB. and Wunsch, CD. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453. Использована оценочная матрица BLOSUM62, и штрафы на открытие и удлинение гэпа составляли соответственно 8 и 2.
При рассмотрении компьютерного выравнивания можно наблюдать идентичные остатки между двумя сравниваемыми последовательностями. Процент идентичности может быть вычислен путем (1) вычисления числа идентичностей, деленного на длину выравнивания, умноженного на 100 (например, для анализа с помощью программы Needle), (2) вычисления числа идентичностей, деленного на длину самой длинной последовательности, умноженного на 100, (3) вычисления числа идентичностей, деленного на длину самой короткой последовательности, умноженного на 100, или (4) вычисления числа идентичностей, деленного на число выровненных остатков, умноженного на 100 (остаток выровнен, если он находится напротив другого) (например, для анализа с помощью программы Gap).
Как используют в данной заявке, адъювант означает соединение или вещество, которое при введении субъекту в сочетании с вакциной, иммунотерапевтическим препаратом или другой композицией, содержащей антиген или иммуногенное вещество, повышает или усиливает иммунный ответ субъекта на введенный антиген или иммуногенное вещество (по сравнению с иммунным ответом, который был бы получен в отсутствие адъюванта). Его следует отличать от термина адъювантная терапия, определенного Национальным институтом рака Институтов здравоохранения США в контексте лечения рака как дополнительная терапия, вводимая после первичной терапии, чтобы снизить риск рецидива рака.
Консервативные замены хорошо известны и в целом представлены в виде оценочных матриц по умолчанию в компьютерных программах выравнивания последовательностей. Эти программы включают PAM250 (Dayhoft M.O. et al., (1978), A model of evolutionary changes in proteins, в Atlas of Protein sequence and structure 5(3) M.O. Dayhoft (ed.), 345-352), National Biomedical Research Foundation, Washington, и Blosum 62 (Steven Henikoft and Jorja G. Henikoft (1992), Amino acid substitution matrices from protein blocks), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (Biochemistry): 10915-10919. В изобретении, кроме того, предложены слитые белки формулы (I) содержащие консервативные аминокислотные замены. Например, слитые белки формулы (I) могут содержать консервативную замену любой аминокислоты из PE или PilA H. influenzae, как описано в любой из последовательностей, представленных в данной заявке (например, в любой последовательности PE, представленной в SEQ ID NO: 4-57, и/или в любой последовательности PilA, представленной в SEQ ID NO: 58-121).
Как используют в данной заявке, сигнальный пептид относится к короткому (менее 60 аминокислот, например от 3 до 60 аминокислот) полипептиду, присутствующему на белках-предшественниках (обычно на N конце), и который обычно отсутствует в зрелом белке. Сигнальный пептид (sp) обычно богат гидрофобными аминокислотами. Сигнальный пептид направляет транспорт и/или секрецию транслированного белка через мембрану. Сигнальные пептиды могут также называться направляющими сигналами, транзитными пептидами, сигналами локализации или сигнальными последовательностями. Например, сигнальная последовательность может представлять собой котрансляционный или посттрансляционный сигнальный пептид.
Гетерологичный сигнальный пептид может отщепляться от конструкций слитого белка пептидазами сигнального пептида во время или после транспортировки или секреции белка. Например, пептидаза сигнального пептида представляет собой пептидазу сигнального пептида I. Гетерологичный сигнальный пептид представляет собой пептид, который не связан с белком в том виде, в котором он существует в природе.
- 19 031580
Как используют в данной заявке, лечение означает предупреждение появления симптомов состояния или заболевания у субъекта, предупреждение рецидива симптомов состояния или заболевания у субъекта, задержку рецидива состояния или заболевания у субъекта, уменьшение тяжести или частоты симптомов состояния или заболевания у субъекта, замедление или устранение прогрессирования состояния и частичное или полное устранение симптомов заболевания или состояния у субъекта.
Как используют в данной заявке, возможно означает, что описанное впоследствии событие (события) может произойти или не произойти, и включает как событие (события), которое происходит, так и события, которые не происходят.
Патогенез заболевания, вызванного NTHi, начинается с колонизации носоглотки. Механизмы прикрепления и поддержания длительного пребывания в микросреде носоглотки рассматривают как детерминанты вирулентности для NTHi.
Значимость способности NTHi прикрепляться к поверхности эпителия слизистой оболочки человека-хозяина отражается во множественности адгезинов, экспрессируемых NTHi. Например, некоторые NTHi экспрессируют пили. Другие адгезивные структуры принадлежат к автотранспортному семейству белков; они включают Hap, HMW1/HMW2 и Hia/Hsf белки. Дополнительные белки внешней мембраны, такие как белок P2, белок P5 и OapA, были описаны как адгезивы к Haemophilus influenzae (Cellular Microbioilogy 4:191-200 (2002), Microbes and Infection 10:87-96 (2008), Vaccine 28:279-289 (2010)).
Средний отит является основной причиной заболеваемости у 80% всех детей в возрасте младше 3 лет (Expert Rev. Vaccines 5:517-534 (2006)). Более чем у 90% средний отит развивается до возраста 7 лет (Current Opinion in Investigational Drugs 4:953-958 (2003)). В 2000 г. в США насчитывалось более 16 млн посещений врачей частной практики по поводу среднего отита и было выписано приблизительно 13 млн рецептов на антибактериальные препараты (Pediatrics 113:1451-1465 (2004)). В европейских странах сообщаемая частота острого среднего отита находится в диапазоне от 0,125 до 1,24 на 1 год жизни ребенка (Expert Review of Vaccines 8:1479-1500 (2009)). Средний отит является инфекцией, требующей затрат, и наиболее распространенной причиной, по которой детям назначают антибиотики (Current Infectious Disease Reports 11:177-182 (2009)). Бактерии являются причиной приблизительно 70% случаев острого среднего отита, причем в качестве возбудителей преобладают следующие бактерии: Streptococcus pneumoniae, нетипируемая гемофильная палочка Haemophilus influenzae и Moraxella catarrhalis (Expert Review of Vaccines 5:517-534 (2006)). Часть детей страдает рецидивирующим и хроническим средним отитом, и у этих склонных к отиту детей происходит продолжительное накопление экссудата в барабанной полости, сопровождающееся утратой слуха и замедлениями в развитии языка и речи (Current Infectious Disease Reports 11:177-182 (2009)).
После введения семивалентной пневмококковой вакцины во многих странах, в некоторых исследованиях продемонстрировано значительное увеличение доли острого среднего отита, вызванного H. influenzae, причем H. influenzae становится преобладающим патогеном (Pediatric Infectious Disease Journal 23:824-828; Pediatric Infectious Disease Journal 23:829-833 (2004)).
Поскольку средний отит является многофакторным заболеванием, возможность предупреждения среднего отита путем применения вакцинации находится под вопросом (Current Infectious Disease Reports 11:177-182 (2009)). Тем не менее, результаты одного из исследований позволяют предположить, что существует возможность индукции антигеном, по меньшей мере частичной, защиты против нетипируемой H. influenzae (Lancet 367:740-748 (2006)). Один из подходов к разработке вакцинных антигенов состоит в применении антигенно консервативных участков генетически гетерогенных, но в большом количестве экспрессируемых поверхностных молекул. Другой подход состоит в идентификации поверхностных белков, проявляющих консервативность последовательности или функциональных эпитопов. Третья разработка вакцинного антигена может состоять в выборе антигена, экспрессируемого в процессе инфекции и колонизации у человека-хозяина. Автором Murphy (Curr. Infect. Disease Reports 11:177-182 (2009) установлено, что несмотря на существование нескольких потенциальных антигенов-кандидатов нетипируемой H. influenzae, невозможно с уверенностью предсказать, будет ли этот антиген-кандидат эффективным (Current Infectious Disease Reports 11:177-182 (2009)). Некоторые из белков, описанных в качестве потенциальных вакцинных антигенов, представляют собой следующие белки: белок адгезин Haemophilus (Hap), высокомолекулярные (HMW) белки 1 и 2, адгезин H. influenzae (Hia), белок D15, белок теплового шока HtrA, поверхностный белок P2, липопротеин D, пептиды P5, образованные из фимбрина, белок наружной мембраны P4, белок наружной мембраны (OMP) 26 (OMP26), белок P6, белок E, пилус типа IV, липополисахарид и фосфорилхолин (Current Infectious Disease Reports 11:177-182 (2009); Expert Review of Vaccines 5:517-534 (2006)).
Модель шиншиллы является надежной и одобренной моделью среднего отита и его предупреждения на животных (Expert Review of Vaccines 8:1063-1082 (2009)). Хотя модель шиншиллы может имитировать естественный ход инфекции у человека, другие предполагают, что результаты на модели шиншиллы могут варьировать от одной лаборатории к другой (Current Opinion in Investigational Drugs 4:953958 (2003)).
Для индукции среднего отита также использованы различные другие модели на грызуных, и эти результаты суммированы в статье Vaccine 26:1501-1524 (2008). При исследовании среднего отита часто
- 20 031580 используют животную модель мыши.
Присутствие бактерицидного антитела связано с защитой от среднего отита, вызванного нетипируемой H. influenzae. (Current Opinion in Infectious Disease 16:129-134 (2003)). Тем не менее, иммунный ответ необязательно должен быть бактерицидным, чтобы обладать эффективностью против NTHi. Антитела, которые взаимодействуют только с поверхностными адгезинами NTHi, могут снижать или устранять средний отит у шиншиллы. (Current Opinion in Investigational Drugs 4:953-958 (2003)).
Хроническая обструктивная болезнь легких представляет собой хроническое воспалительное заболевание легких и является одной из основных причин заболеваемости и смертности во всем мире. Причиной, лежащей в основе приблизительно одного из 20 смертельных случаев в 2005 г. в США, была ХОБЛ (Drugs and Aging 26:985-999 (2009)). По прогнозам, к 2020 г. ХОБЛ поднимется до пятого места в списке ведущих причин скорректированных по нетрудоспособности лет жизни и хронических заболеваний, приводящих к инвалидности, и до третьего места в списке важнейших причин смертности (Lancet 349:1498-1504 (1997)).
Течение ХОБЛ характеризуется прогрессирующим ухудшением ограничения воздушного потока и ухудшением функции легких. ХОБЛ может осложняться частыми и рецидивирующими острыми приступами (acute exacerbations, AE), связанными с колоссальными расходами на медицинскую помощь и с высокой смертностью (Proceedings of the American Thoracic Society 4:554-564 (2007)). Одно из исследований позволяет предположить, что приблизительно 50% острых приступов симптомов при ХОБЛ вызвано нетипируемой Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis, Streptococcus pneumoniae и Pseudomonas aeruginosa (Drugs and Aging 26:985-999 (2009)). H. influenzae обнаруживают при 20-30% обострений ХОБЛ; Streptococcus pneumoniae при 10-15% обострений ХОБЛ; a Moraxella catarrhalis при 10-15% обострений ХОБЛ. (New England Journal of Medicine 359:2355-2365 (2008)). Показано, что Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae и Moraxella catarrhalis являются первичными патогенами при обострениях бронхита в Гонконге, Южной Корее и на Филиппинах, тогда как Klebsiella spp., Pseudomonas aeruginosa и Acinetobacter spp. составляют большую долю патогенов в других азиатских странах/областях, включая Индонезию, Таиланд, Малайзию и Тайвань (Respirology, (2011) 16, 532-539; doi:10.1111/j.1440.1843.2011.01943.x). В Бангладеш у 20% пациентов, страдающих ХОБЛ, показан положительный посев мокроты на Pseudomonas, Klebsiella, Streptococcus pneumoniae и Haemophilus influenzae, тогда как у 65% пациентов при тяжелых обострениях ХОБЛ показаны положительные посевы на Pseudomonas, Klebsiella, Acinetobacter, Enterobacter, Moraxella catarrhalis и их комбинации (Mymensingh Medical Journal 19:576-585 (2010)). Тем не менее, выдвинуто предположение, что двумя важнейшими мерами предупреждения обострений ХОБЛ являются активные иммунизации и постоянная фармакотерапия (Proceedings of the American Thoracic Society 4:554-564 (2007)).
Существует необходимость в эффективных вакцинах против NTHi. Используя антигены, которые могут действовать на различных стадиях в патогенезе, можно улучшить эффективность вакцины. Авторы изобретения обнаружили, что PilA и PE могут благоприятным образом присутствовать в иммуногенных композициях по изобретению в виде слитых белков.
Настоящее изобретение относится к слитым белкам формулы (I) (X) m - (Ri )n - А - (Υ) о - В - (Ζ)ρ (формула I), где X представляет собой сигнальный пептид или MHHHHHH (SEQ ID NO: 2);
m равно 0 или 1;
R1 представляет собой аминокислоту;
n равно 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6;
A представляет собой белок E из Haemophilus influenzae или его иммуногенный фрагмент, либо PilA из Haemophilus influenzae или его иммуногенный фрагмент;
Y выбран из группы, состоящей из GG, SG, SS и (G)h, где h равно 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10;
o равно 0 или 1;
B представляет собой PilA из Haemophilus influenzae или его иммуногенный фрагмент, либо белок E из Haemophilus influenzae или его иммуногенный фрагмент;
Z представляет собой GGHHHHHH (SEQ ID NO: 3);
p равно 0 или 1.
В одном воплощении определены слитые белки формулы (I), где X выбран из группы, состоящей из сигнальной последовательности CcmH (мембранный белок H цитохрома c), DsbA (периплазматический белок дисульфидизомеразы I), DsbB (мембранный белок B с дисульфидными связями), Flgl (кольцевой флагеллярный пептидогликан), FocC (белок-шаперон F1c), MalE (субъединица E транспорта мальтозы), NadA (субъединица A хинолинатсинтазы), NikA (компонент A переносчика никеля ABC), NspA (поверхностный белок A Neisseria), Omp26 (наружный мембранный белок 26), OmpA (белок A наружной мембраны), OspA (белок A наружной поверхности), pelB (пектатлиаза B), PhoA (бактериальная щелочная фосфатаза), PhtD (пневмококковый белок гистидиновой триады D), PhtE (пневмококковый белок гистидиновой триады E), SfmC (периплазматический шаперон пилина), Sip1 (поверхностный иммуногенный белок), TolB (компонент B комплекса клеточной оболочки Tol-Pal), TorA (субъединица A системы три
- 21 031580 метиламин-Ы-оксидредуктазы), TorT (периплазматический белок T системы триметиламин-Nоксидредуктазы) и Yral (предполагаемый периплазматический шаперон пилина); либо любой их подгруппы. В одном воплощении X представляет собой котрансляционный сигнальный пептид или посттрансляционный сигнальный пептид. В одном воплощении X представляет собой сигнальную последовательность из Flgl (flgl sp). В другом конкретном воплощении X представляет собой сигнальную последовательность из pelB (pelB sp). В другом воплощении X представляет собой посттрансляционный сигнальный пептид. В другом воплощении X выбран из группы, состоящей из сигнальной последовательности из Flgl, NadA и pelB.
В одном воплощении определены слитые белки формулы (I), где m равно 1. В другом воплощении m равно 0.
В одном конкретном воплощении определены R1 и n, где (R1)n представляет собой от 1 до 6 аминокислот, обогащенных малыми, обычно гидрофильными аминокислотами. Гидрофильные аминокислоты включают глутаминовую кислоту (E), аспарагиновую кислоту (D) и аспарагин (N).
В одном воплощении определены слитые белки формулы (I), где n выбран из группы, состоящей из 0, 1, 2 и 6. В одном воплощении определены R1 и n, где (R1)n выбран из группы, состоящей из D, E, ATNDDD (SEQ ID NO: 178) и MD, либо любой их подгруппы.
В одном конкретном воплощении n выбран из группы, состоящей из 1, 2 и 6. В одном конкретном воплощении n равно 0.
В одном воплощении определены слитые белки формулы (I), где A представляет собой белок E из H. influenzae. В другом воплощении определены слитые белки формулы (I) в которых A представляет собой белок E, кодируемый аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43 SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56 и SEQ ID NO: 57; либо из любой подгруппы SEQ ID NO: 5-57. В другом воплощении определены слитые белки формулы (I), где A представляет собой белок E, который идентичен аминокислотной последовательности белка E, представленной в SEQ ID NO: 4, где идентичность составляет от 75 до 100%. В другом воплощении A представляет собой белок E, который идентичен аминокислотной последовательности белка E, представленной в SEQ ID NO: 4, где идентичность составляет от 90 до 100%. В другом воплощении A представляет собой белок E, который идентичен аминокислотной последовательности белка E, представленной в SEQ ID NO: 4, по меньшей мере на 95%. В другом воплощении A представляет собой белок E, который идентичен аминокислотной последовательности белка E, представленной в любой из SEQ ID NO: 4-57, по меньшей мере на 95%. В конкретном воплощении A представляет собой белок Е, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4.
В другом воплощении определены слитые белки формулы (I), где A представляет собой иммуногенный фрагмент белка E из H. influenzae. В другом воплощении A представляет собой иммуногенный фрагмент белка E, где белок E имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43 SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56 и SEQ ID NO: 57; или из любой подгруппы SEQ ID NO: 4-57. В другом воплощении A представляет собой иммуногенный фрагмент белка E, где белок E идентичен аминокислотной последовательности белка E, представленной в SEQ ID NO: 4, где идентичность составляет от 75% до 100%. В другом воплощении A представляет собой иммуногенный фрагмент белка E, где белок E идентичен аминокислотной последовательности белка E, представленной в SEQ ID NO: 4, где идентичность составляет от 90 до 100%. В другом воплощении A представляет собой иммуногенный фрагмент белка E, где белок E по меньшей мере на 95% идентичен любой из SEQ ID NO: 4-57. Более конкретно, в одном воплощении A представляет собой иммуногенный фрагмент белка E, где белок E идентичен аминокислотной последовательности белка E, представленной в SEQ ID NO: 124, где идентичность составляет от 93 до 100%. В конкретном воплощении A представляет собой иммуногенный фрагмент белка E, где белок E представляет собой SEQ ID NO: 4.
В другом воплощении A представляет собой иммуногенный фрагмент белка E из H. influenzae, вы
- 22 031580 бранный из группы, состоящей из аминокислот 17-160 SEQ ID NO: 4 (SEQ ID NO: 122), аминокислот 18160 SEQ ID NO: 4 (SEQ ID NO: 123), аминокислот 19-160 SEQ ID NO: 4 (SEQ ID NO: 124), аминокислот 20-160 SEQ ID NO: 4 (SEQ ID NO: 125) и аминокислот 22-160 SEQ ID NO: 4 (SEQ ID NO: 126). В другом воплощении A представляет собой иммуногенный фрагмент белка E из H. influenzae, выбранный из группы, состоящей из аминокислот 17-160 SEQ ID NO: 4 (SEQ ID NO: 122), аминокислот 18-160 SEQ ID NO: 4 (SEQ ID NO: 123), аминокислот 19-160 SEQ ID NO: 4 (SEQ ID NO: 124), аминокислот 20-160 SEQ ID NO: 4 (SEQ ID NO: 125), аминокислот 22-160 SEQ ID NO: 4 (SEQ ID NO: 126), аминокислот 23-160 SEQ ID NO: 4 (SEQ ID NO: 179) и аминокислот 24-160 SEQ ID NO: 4 (SEQ ID NO: 180). В следующем воплощении A представляет собой иммуногенный фрагмент белка E из H. influenzae, выбранный из группы, состоящей из аминокислот 17-160 SEQ ID NO: 4 (SEQ ID NO: 122), аминокислот 18-160 SEQ ID NO: 4 (SEQ ID NO: 123), аминокислот 20-160 SEQ ID NO: 4 (SEQ ID NO: 125), аминокислот 22-160 SEQ ID NO: 4 (SEQ ID NO: 126), аминокислот 23-160 SEQ ID NO: 4 (SEQ ID NO: 179) и аминокислот 24-160 SEQ ID NO: 4 (SEQ ID NO: 180). Более конкретно, в одном воплощении A представляет собой SEQ ID NO: 124, аминокислоты 19-160 SEQ ID NO: 4. В дополнительном воплощении A представляет собой SEQ ID NO: 125, аминокислоты 20-160 SEQ ID NO: 5. В другом воплощении A представляет собой иммуногенный фрагмент белка E из H. influenzae, выбранный из группы, состоящей из аминокислот 23-160 SEQ ID NO: 4 (SEQ ID NO: 179) и аминокислот 24-160 SEQ ID NO: 4 (SEQ ID NO: 180).
Белок E - SEQ ID NO: 4:
MKKIILTLSL GLLTACSAQI QKAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY
IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA
NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN
YGEAFSVDKK
Аминокислоты 17-160 белка E из SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 122:
SAQI QKAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY
IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA
NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN
YGEAFSVDKK
Аминокислоты 18-160 белка E из SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 123:
AQI QKAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY
IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA
NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN
YGEAFSVDKK
Аминокислоты 19-160 белка E из SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 124:
QI QKAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY
IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA
NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN
YGEAFSVDKK
Аминокислоты 20-160 белка E из SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 125:
I QKAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY
IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA
NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN
YGEAFSVDKK
Аминокислоты 22-160 белка E из SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 126:
- 23 031580
KAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY
IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA
NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK
Аминокислоты 23-160 белка E из SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 179:
AEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY
IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA
NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK
Аминокислоты 24-160 белка E из SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 180:
EQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY
IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA
NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK
В другом воплощении определены слитые белки формулы (I), где A представляет собой PilA из H. influenzae. В другом воплощении определены слитые белки формулы (I), где A представляет собой PilA из H. influenzae, имеющие аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120 и SEQ ID NO: 121; или из любой подгруппы SEQ ID NO: 58-121. В другом воплощении A представляет собой PilA, где PilA идентичен SEQ ID NO: 58 приблизительно на 80-100%. В другом воплощении А представляет собой PilA, где PilA по меньшей мере на 95% идентичен любой из последовательностей SEQ ID NO: 58-121. В конкретном воплощении А представляет собой PilA SEQ ID NO: 58.
В другом воплощении определены слитые белки формулы (I), где A представляет собой иммуногенный фрагмент PilA из H. influenzae. В другом воплощении A представляет собой иммуногенный фрагмент PilA, где PilA идентичен SEQ ID NO: 58 приблизительно на 80-100%. Например, A представляет собой иммуногенный фрагмент PilA, где PilA имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO:
101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO:
107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO:
113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO:
119, SEQ ID NO: 120 и SEQ ID NO: 121; или любой подгруппы SEQ ID NO: 58-121. В дополнительном воплощении A представляет собой иммуногенный фрагмент PilA, где PilA по меньшей мере на 95% идентичен любой из последовательностей SEQ ID NO: 58-121. В конкретном воплощении A представляет собой иммуногенный фрагмент PilA из H. influenzae штамма 86-028NP, где PilA представляет собой SEQ ID NO: 58.
PilA из Н. influenzae штамма 86-028NP - SEQ ID NO: 58:
MKLTTQQTLK KGFTLIELMI VIAIIAILAT IAIPSYQNYT KKAAVSELLQ ASAPYKADVE LCVYSTNETT NCTGGKNGIA ADITTAKGYV KSVTTSNGAI TVKGDGTLAN MEYILQATGN AATGVTWTTT CKGTDASLFP ANFCGSVTQ.
В другом воплощении A представляет собой иммуногенный фрагмент PilA, идентичный SEQ ID NO: 127 приблизительно на 75-100%. Более конкретно в одном воплощении A представляет собой SEQ ID NO: 127, фрагмент, состоящий из аминокислот 40-149 SEQ ID NO: 58.
- 24 031580
Аминокислоты 40-149 PilA из Н. influenzae штамма 86-028NP - SEQ ID NO:
127:
T KKAAVSELLQ
ASAPYKADVE LCVYSTNETT NCTGGKNGIA ADITTAKGYV KSVTTSNGAI
TVKGDGTLAN MEYILQATGN AATGVTWTTT CKGTDASLFP ANFCGSVTQ.
В другом воплощении A представляет собой иммуногенный фрагмент PilA, состоящий из аминокислот 40-149 из любой из последовательностей SEQ ID NO: 58-121. В дополнительном воплощении A представляет собой иммуногенный фрагмент, по меньшей мере на 95% идентичный аминокислотам 40149 из любой из последовательностей SEQ ID NO: 58-121.
В одном воплощении определены слитые белки формулы (I), где Y выбран из группы, состоящей из GG, SG и SS. В другом воплощении определены слитые белки формулы (I), где Y представляет собой GG или SG. В одном конкретном воплощении Y представляет собой GG
В одном воплощении определены слитые белки формулы (I), где o равно 1. В другом воплощении o равно 0.
В одном воплощении определены слитые белки формулы (I), где B представляет собой PilA из H. influenzae или иммуногенный фрагмент PilA из H. influenzae, когда A представляет собой белок E из H. influenzae или иммуногенный фрагмент белка E из H. influenzae. Например, B представляет собой PilA из H. influenzae штамма 86-028NP. В другом воплощении B представляет собой PilA из H. influenzae, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120 и SEQ ID NO: 121; или любой подгруппы SEQ ID NO: 58-121. В другом воплощении B представляет собой PilA, где PilA идентичен SEQ ID NO: 58 приблизительно на 80-100%. В другом воплощении B представляет собой PilA, где PilA по меньшей мере на 95% идентичен любой из SEQ ID NO: 58-121. В конкретном воплощении B представляет собой PilA SEQ ID NO: 58.
В другом воплощении B представляет собой PilA, где PilA по меньшей мере на 95% идентичен любой из SEQ ID NO: 58-121, a A представляет собой PE, где PE по меньшей мере на 95% идентичен любой из SEQ ID NO: 4-57.
В другом воплощении определены слитые белки формулы (I), где B представляет собой иммуногенный фрагмент PilA из H. influenzae, когда A представляет собой иммуногенный фрагмент белка E из H. influenzae. Например, B представляет собой иммуногенный фрагмент PilA из H. influenzae штамма 86028NP В другом воплощении B представляет собой иммуногенный фрагмент PilA, где PilA идентичен SEQ ID NO: 58 приблизительно на 80-100%. В другом воплощении В представляет собой иммуногенный фрагмент PilA, где PilA имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120 и SEQ ID NO: 121; или из любой подгруппы SEQ ID NO: 58-121. В другом воплощении В представляет собой иммуногенный фрагмент PilA, где PilA по меньшей мере на 95% идентичен любой из SEQ ID NO: 58-121. В конкретном воплощении В представляет собой иммуногенный фрагмент PilA из H. influenzae, где PilA имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 58. В другом воплощении В представляет собой иммуногенный фрагмент PilA, состоящий из аминокислот 40-149 из любой из SEQ ID NO: 58-121. Более конкретно, в одном воплощении В представляет собой фрагмент PilA, представленный в SEQ ID NO: 127. В дополнительном воплощении B представляет собой иммуногенный фрагмент, по меньшей мере на 95% идентичный аминокислотам 40-149 любой из последовательностей SEQ ID NO: 58-121.
- 25 031580
В одном конкретном воплощении B представляет собой фрагмент PilA, представленный в SEQ ID NO: 127, и A представляет собой иммуногенный фрагмент белка E, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125 и SEQ ID NO: 126. Более конкретно, B представляет собой фрагмент PilA, представленный в SEQ ID NO: 127, и A представляет собой фрагмент белка E, представленный в SEQ ID NO: 124, аминокислоты 19-160 белка E из SEQ ID NO: 4. В другом воплощении B представляет собой фрагмент PilA, представленный в SEQ ID NO: 127, и A представляет собой фрагмент белка E, представленный в SEQ ID NO: 125.
В другом воплощении B представляет собой иммуногенный фрагмент PilA, где PilA по меньшей мере на 95% идентичен любой из SEQ ID NO: 58-121 и A представляет собой иммуногенный фрагмент PE, где PE по меньшей мере на 95% идентичен любой из SEQ ID NO: 4-57.
В другом воплощении определены слитые белки формулы (I), где B представляет собой белок E из H. influenzae, когда A представляет собой PilA из H. influenzae. Например, B представляет собой белок E, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO:
11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO:
24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO:
37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43 SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO:
50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56 и SEQ ID NO: 57; или из любой подгруппы SEQ ID NO: 4-57. В другом воплощении определены слитые белки формулы (I), где B представляет собой белок E, где белок E идентичен аминокислотной последовательности белка E, представленной в SEQ ID NO: 4, приблизительно на 75-100%. В другом воплощении B представляет собой белок E, где белок E идентичен аминокислотной последовательности белка E, представленной в SEQ ID NO: 4, приблизительно на 90-100%. Например, B представляет собой белок E, где белок E по меньшей мере на 95% идентичен белку E, представленному в SEQ ID NO: 4. В другом воплощении B представляет собой белок E, где белок E по меньшей мере на 95% идентичен любой из SEQ ID NO: 4-57. В конкретном воплощении B представляет собой белок E, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4.
В другом воплощении определены слитые белки формулы (I), где B представляет собой иммуногенный фрагмент белка E из H. influenzae, когда A представляет собой иммуногенный фрагмент PilA из H. influenzae. Например, B представляет собой иммуногенный фрагмент белка E, где белок E имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO:
12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO:
25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO:
38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO:
51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56 и SEQ ID NO: 57; или из любой подгруппы SEQ ID NO: 4-57. В другом воплощении определены слитые белки формулы (I), где B представляет собой иммуногенный фрагмент белка E, где белок E идентичен белку E, имеющему аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4, приблизительно на 75-100%. В другом воплощении B представляет собой иммуногенный фрагмент белка E, где белок E идентичен белку E, имеющему аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4, приблизительно на 90-100%. В конкретном воплощении B представляет собой иммуногенный фрагмент белка E, имеющего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4. В дополнительном воплощении B представляет собой иммуногенный фрагмент белка E, где белок E по меньшей мере на 95% идентичен любой из SEQ ID NO: 4-SEQ ID NO: 57.
В другом воплощении B представляет собой фрагмент белка E из H. influenzae, выбранный из группы, состоящей из аминокислот 17-160 SEQ ID NO: 4 (SEQ ID NO: 122), аминокислот 18-160 SEQ ID NO: 4 (SEQ ID NO: 123), аминокислот 19-160 SEQ ID NO: 4 (SEQ ID NO: 124), аминокислот 20-160 SEQ ID NO: 4 (SEQ ID NO: 125) и аминокислот 22-160 SEQ ID NO: 4 (SEQ ID NO: 126). В другом воплощении B представляет собой иммуногенный фрагмент белка E из H.Influenzae, выбранный из группы, состоящей из аминокислот 17-160 SEQ ID NO: 4 (SEQ ID NO: 122), аминокислот 18-160 SEQ ID NO: 4 (SEQ ID NO: 123), аминокислот 19-160 SEQ ID NO: 4 (SEQ ID NO: 124), аминокислот 20-160 SEQ ID NO: 4 (SEQ ID NO: 125), аминокислот 22-160 SEQ ID NO: 4 (SEQ ID NO: 126), аминокислот 23-160 SEQ ID NO: 4 (SEQ ID NO: 179) и аминокислот 24-160 SEQ ID NO: 4 (SEQ ID NO: 180). Более конкретно, в одном воплощении В представляет собой фрагмент белка Е, представленный в SEQ ID NO: 123, аминокислоты 18-160 SEQ ID NO: 4.
- 26 031580
В одном конкретном воплощении B представляет собой иммуногенный фрагмент белка E, представленный в SEQ ID NO: 123, аминокислоты 18-160 SEQ ID NO: 4, когда A представляет собой иммуногенный фрагмент PilA, представленный в SEQ ID NO: 127.
В одном воплощении определены слитые белки формулы (I), где p равно 0. В другом воплощении определены слитые белки формулы (I), где p равно 1.
В одном воплощении слитый белок формулы (I) выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO:136,
SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO:148,
SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO:190,
SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 202 и
SEQ ID NO: 204; или из любой их подгруппы. В другом воплощении слитый белок формулы (I) приблизительно на 95% идентичен любой из SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 202 или SEQ ID NO: 204.
Слитые белки формулы (I) полезны в качестве иммуногенов у субъектов, таких как млекопитающие, особенно люди. В частности, слитые белки формулы (I) полезны при индукции иммунного ответа против H. influenzae у субъектов, особенно у людей. Более конкретно, слитые белки формулы (I) полезны при лечении или предупреждении среднего отита и/или тяжелых обострений ХОБЛ, и/или пневмонии.
Настоящее изобретение относится к иммуногенным композициям, содержащим белок E из H. influenzae (или его иммуногенный фрагмент) и PilA из H. influenzae (или его иммуногенный фрагмент), и к иммуногенным композициям, содержащим слитые белки, включающие белок E из H. influenzae (или его иммуногенный фрагмент) и PilA из H. influenzae (или его иммуногенный фрагмент). Настоящее изобретение также относится к вакцинам, включающим такие иммуногенные композиции, и к их терапевтическим применениям.
В одном воплощении иммуногенные композиции содержат белок E из H. influenzae (или его иммуногенный фрагмент) и PilA из H. influenzae (или его иммуногенный фрагмент). Белок E может иметь SEQ ID NO: 4 или последовательность белка E, по меньшей мере на 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичную SEQ ID NO: 4.
Иммуногенный фрагмент белка E может иметь последовательность SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125 или SEQ ID NO: 126, или последовательность, обладающую по меньшей мере 90, 95, 96, 97, 98, 99% идентичностью последовательности любой из SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125 или SEQ ID NO: 126. Иммуногенный фрагмент белка E может иметь последовательность SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 179 или SEQ ID NO: 180 или последовательность, обладающую по меньшей мере 90, 95, 96, 97, 98, 99% идентичностью последовательности любой из SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 179 или SEQ ID NO: 180. Аминокислотные отличия описаны в белке E из различных видов Haemophilus по сравнению с белком E из Haemophilus influenzae Rd в качестве эталонного штамма. В документе Microbes & Infection (Corrigendum to Identification of a novel Haemophilus influenzae protein important for adhesion to epithelia cells [Microbes Infect. 10 (2008) 87-97], доступно он-лайн July 6, 2010, Article in Press) представлена последовательность для белка E из H. influenzae штамма 772. В документе WO2002/28889 представлена последовательность для белка E из H. influenzae штамма 12085.
Белок E содержит участок связывания эпителиальных клеток (PKRYARSVRQ YKILNCANYH LTQVR, SEQ ID NO: 128), который описан как консервативный среди более чем 100 клинических изолятов NTHi, инкапсулированной H. influenzae и проанализированных штаммов из коллекций культур (Singh et al, J. Infect. Dis. 201(3):414-9 (2010)). Авторы Singh et al. сообщили, что белок E является высоко консервативным как в NTHi, так и в инкапсулированной H. influenzae (96,9-100% идентичности без сигнального пептида). В одном воплощении фрагмент белка E включает связывающий участок SEQ ID NO: 128 (PKRYARSVRQ YKILNCANYH LTQVR).
PilA представляет собой консервативный адгезин, экспрессирующийся in vivo. Сравнение 64 полноразмерных последовательностей PilA из Haemophilus influenzae показало приблизительно от 80 до 100% идентичности.
В другом воплощении иммуногенная композиция содержит слитый белок, определенный формулой (I).
В одном воплощении настоящие иммуногенные композиции можно вводить с другими антигенами из H. influenzae. Например, PE и PilA или слитый белок формулы (I) можно вводить с белком D из H. influenzae. Белок D может быть таким, как описано в документе WO91/18926. В другом воплощении иммуногенная композиция может содержать слитый белок формулы (I) и белок D из H. influenzae.
В другом воплощении иммуногенные композиции по изобретению можно вводить с дополнительными антигенами из других видов бактерий, также известных как возбудители среднего отита, острых приступов ХОБЛ или пневмонии.
Количество иммуногенной композиции, необходимое для достижения желаемого терапевтического
- 27 031580 или биологического эффекта, зависит от ряда факторов, таких как применение, для которого она предназначена, средства введения, реципиент, а также тип и тяжесть состояния, подлежащего лечению, и, в конечном счете, будет определено лечащим врачом или ветеринаром. Как правило, можно ожидать, что типичная доза для лечения состояния, полностью или частично вызванного H. influenzae у человека, находится, например, в диапазоне от приблизительно 0,003 до приблизительно 0,090 мг. Более конкретно, типичная доза для лечения состояния, полностью или частично вызванного H. influenzae у человека, может находиться в диапазоне от приблизительно 0,01 до приблизительно 0,03 мг слитого белка. Иммуногенная композиция может содержать дополнительные антигены; типичная доза для лечения состояния, полностью или частично вызванного H. influenzae у человека, может находиться в диапазоне от приблизительно 0,01 до приблизительно 0,03 мг для каждого дополнительного антигена. Данную дозу можно вводить в виде однократной стандартной дозы. Можно также вводить несколько отдельных стандартных доз. Например, отдельные стандартные дозы можно вводить в виде отдельных примирующих доз в течение первого года жизни или в виде отдельных бустерных доз, даваемых через регулярные интервалы (например, каждые 1, 5 или 10 лет).
Препараты, содержащие иммуногенные композиции по изобретению, могут быть приспособлены для введения посредством соответствующего пути, например посредством внутримышечного, подъязычного, чрескожного, внутрикожного или интраназального пути. Такие препараты могут быть получены любым способом, известным в данной области техники.
Иммуногенные композиции по настоящему изобретению могут дополнительно содержать адъювант. При использовании термина адъювант в данном описании он относится к веществу, которое вводят в сочетании с иммуногенной композицией для усиления иммунного ответа пациента на иммуногенный компонент композиции.
Подходящие адъюванты включают соль алюминия, такую как гель гидроксида алюминия, либо фосфат алюминия, либо квасцы, но могут также представлять собой соль кальция, магния, железа или цинка, либо могут представлять собой нерастворимую суспензию ацилированного тирозина или ацилированных сахаров, катионно- или анионно-дериватизированные сахариды или полифосфазены. В одном воплощении, слитый белок, PE или PilA может быть адсорбирован на фосфате алюминия. В другом воплощении, слитый белок, PE или PilA может быть адсорбирован на гидроксиде алюминия. В третьем воплощении, в качестве адъюванта можно использовать квасцы.
Подходящие адъювантные системы, которые стимулируют преимущественно Th1 ответ, включают нетоксичные производные липида A, монофосфориллипид A (MPL) или его производное, в частности 3де-O-ацилированный монофосфориллипид A (3D-MPL) (его получение см. в документе GB 2220211 A) и комбинацию монофосфориллипида A, предпочтительно 3-де-O-ацилированный монофосфориллипида A, вместе либо с солью алюминия (например, с фосфатом алюминия или гидроксидом алюминия), либо с эмульсией масло-в-воде. В таких комбинациях антиген и 3D-MPL содержатся в одних и тех же структурах в виде частиц, что дает возможность более эффективной доставки антигенных и иммуностимуляторных сигналов. Исследования показали, что 3D-MPL способен дополнительно усиливать иммуногенность антигена, адсорбированного на квасцах (Thoelen et al. Vaccine (1998) 16:708-14; EP 689454-B1).
Система AS01 представляет собой адъювантную систему, содержащую MPL (3Ю-дезацил-4'монофосфориллипид A), QS21 (Quillaja saponaria Molina, фракция 21) Antigenics, New York, NY, USA) и липосомы. Система AS01B представляет собой адъювантную систему, содержащую MPL, QS21 и липосомы (50 мкг MPL и 50 мкг QS21). AS01E представляет собой адъювантную систему, содержащую MPL, QS21 и липосомы (25 мкг MPL и 25 мкг QS21). В одном воплощении иммуногенная композиция или вакцина содержат AS01. В другом воплощении иммуногенная композиция или вакцина содержат AS01B или AS01Е. В конкретном воплощении иммуногенная композиция или вакцина содержат AS01E.
Система AS03 представляет собой адъювантную систему содержащую α-токоферол и сквален в эмульсии масло/вода (м/в). AS03A представляет собой адъювантную систему содержащую α-токоферол и сквален в эмульсии масло/вода (11,86 мг токоферола). AS03B представляет собой адъювантную систему, содержащую α-токоферол и сквален в эмульсии масло/вода (5,93 мг токоферола). AS03C представляет собой адъювантную систему, содержащую α-токоферол и сквален в эмульсии масло/вода (2,97 мг токоферола). В одном воплощении иммуногенная композиция или вакцина содержат систему AS03.
AS04 представляет собой адъювантную систему, содержащую MPL (50 мкг MPL), адсорбированный на соли алюминия (500 мкг Al3+). В одном воплощении иммуногенная композиция или вакцина содержат AS04.
Система, включающая применение QS21 и 3D-MPL, раскрыта в документе WO 94/00153. Композиция, в которой QS21 гасят холестерином, раскрыта в документе WO 96/33739. Дополнительный адъювантный препарат, включающий QS21, 3D-MPL и токоферол в эмульсии масло-в-воде, описан в документе WO 95/17210. В одном воплощении иммуногенная композиция дополнительно содержит сапонин, который может представлять собой QS21. Препарат может также содержать эмульсию масло-в-воде и токоферол (WO 95/17210). Неметилированные CpG-содержащие олигонуклеотиды (WO 96/02555) и другие иммуномодуляторные олигонуклеотиды (WO 0226757 и 03507822) также являются преимущественными индукторами TH1 ответа и подходят для применения в настоящем изобретении.
- 28 031580
Дополнительными адъювантами являются адъюванты, выбранные из группы, состоящей из солей металлов, эмульсий масло-в-воде, агонистов Toll-подобных рецепторов (в частности, агонист Tollподобного рецептора 2, агонист Toll-подобного рецептора 3, агонист Toll-подобного рецептора 4, агонист Toll-подобного рецептора 7, агонист Toll-подобного рецептора 8 и агонист Toll-подобного рецептора 9), сапонины или их комбинации.
В настоящем изобретении предложен способ получения иммуногенной композиции, включающий объединение слитого белка, имеющего формулу (I), с адъювантом.
Далее в настоящем изобретении предложена вакцина, содержащая иммуногенную композицию по изобретению и фармацевтически приемлемый эксципиент.
Возможные эксципиенты включают аргинин, плюрониловую кислоту (pluronic acid) и/или полисорбат. В предпочтительном воплощении применяют полисорбат 80 (например, TWEEN® 80). В дополнительном воплощении можно применять конечную концентрацию, составляющую от 0,03 до приблизительно 0,06%. В частности, можно применять конечную концентрацию полисорбата 80, составляющую приблизительно 0,03, 0,04, 0,05 или 0,06% (мас./об.).
В настоящем изобретении предложен способ получения иммуногенной композиции или вакцины, включающий объединение слитого белка формулы (I) с фармацевтически приемлемым эксципиентом.
В настоящем изобретении также предложены нуклеиновые кислоты, кодирующие белки по изобретению. Термин нуклеиновая кислота относится к полимерной форме нуклеотидов. Нуклеотиды могут представлять собой рибонуклеотиды, дезоксирибонуклеотиды или модифицированные формы либо рибонуклеотидов, либо дезоксирибонуклеотидов. Этот термин включает однонитевые и двунитевые формы ДНК. Нуклеиновые кислоты предпочтительно, по существу, не содержат других нуклеиновых кислот.
В настоящем изобретении предложен способ получения нуклеиновых кислот по изобретению. Нуклеиновые кислоты по изобретению могут быть получены способами, известными специалистам в данной области техники. Например, нуклеиновые кислоты по изобретению можно синтезировать частично или полностью. Нуклеиновые кислоты могут быть получены путем расщепления более длинных нуклеиновых кислот или соединения более коротких нуклеиновых кислот.
Приведенные ниже примеры предназначены только для иллюстрации и никоим образом не предназначены для ограничения объема изобретения.
В примерах приведенные ниже термины имеют обозначенное значение:
6xhis = шесть гистидинов;
xg = центробежная сила (гравитационное число);
АТФ = аденозинтрифосфат;
БЦК = бицинхониновая кислота;
БСА = бычий сывороточный альбумин;
°C = градусы Цельсия;
CaCl2 = хлорид кальция;
CV = объем колонки;
ДНК = дезоксирибонуклеиновая кислота;
ДСК = дифференциальная сканирующая калориметрия;
ДТТ = дитиотрейтол;
dNTP = дезоксинуклеозидтрифосфат;
ЭДТА = этилендиаминтетрауксусная кислота;
FT = проходящий поток;
HCl = хлорид водорода;
His = his = гистидин;
HEPES = 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота;
IMAC = аффинная хроматография на иммобилизованных ионах металла;
ИПТГ = изопропил-(3-O-1-тиогалактопиранозид);
KCl = хлорид калия;
K2HPO4 = двухосновный фосфат калия;
KH2PO4 = одноосновный фосфат калия;
ДСП = додецилсульфат лития;
л = литр;
MES = 2-(№морфолино)этансульфоновая кислота;
MgCl2 = хлорид магния;
мл = миллилитр;
об/мин = обороты в минуту;
мин = минута;
мМ = миллимоль;
мкл = микролитр;
NaCl = хлорид натрия;
Na2HPO4 = двухосновный фосфат натрия;
- 29 031580
NaH2PO4 = одноосновный фосфат натрия;
нг = нанограмм;
нм = нанометр;
O/N = в течение ночи;
ЗФР = забуференный фосфатом физиологический раствор;
ПЦР = полимеразная цепная реакция;
БО = буфер для образца;
сек = секунда;
мас./об. = масса/объем.
Примеры
Пример 1. Слитые белки.
Слитые белки были получены с различными сигнальными пептидами и аминокислотными линкерными последовательностями. Эти слитые белки давали возможность для секреции обоих белков, E и PilA (или их фрагментов) без ограничения одним бактериальным штаммом. Слитый белок высвобождается в периплазму после удаления гетерологичного сигнального пептида пептидазой сигнального пептида. Слитый белок, очищенный из бактерий, не содержит гетерологичный сигнальный пептид. Очищенные белки выделены из бактерий и не включают сигнальный пептид.
В приведенной ниже таблице описаны полученные слитые белки.
Таблица 3
Конструкции слитых белков, содержащих PilA и белок E
LVL312 flgl Е Фраг мент рна (А.А.: 40-149 SEQ Ш NO: 58, SEQ Ш NO: 127) G G Фраг мент ProtE (А.А.: 18-160 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 123) GGHHHHHH
А.А. 1 19 21 130 133 275 276 283
LVL291 pelB sp Фраг мент ProtE (A.A.: 19-160 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 124) G G Фраг мент рна (A.A.: 40-149 SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: GGHHHHHH
A.A. 1 22 23 164 167 276 277 284
LVL268 pelB sp D Фраг мент ProtE (A.A.: 20-160 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 125) G G Фраг мент риа (A.A.: 40-149 SEQ Ш NO: 58, SEQ Ш NO: 127) GGHHHHHH
A.A. 1 22 24 164 167 276 277 284
LVL269 AT ND DD Фраг мент ProtE (A.A.: 22-160 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 126) G G Фраг мент рна (A.A.: 40-149 SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 127) GGHHHHH H
A.A. 1 23 24-29 30 168 171 280 281 288
LVL270 MH HH HH Фраг мент ProtE (A.A.: 17-160 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 122) Фраг мент рна (A.A.: 40-149 SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 127)
A.A. 1 ' 1 8 151 154 263
LVL317 pelB sp Фраг мент ProtE (A.A.: 19-160 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 124) Фраг мент ρπα (A, A, :40-149 SEQ ID
A.A. 1 22 23 164 167 276
LVL318 pelB sp M D Фраг мент ProtE (A.A.: 22-160 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 126) G G Фраг мент ρπα(a.a.: 4o- 149 SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 127) I
A.A. 1 22 25 163 166 275
LVL702 pelB sp Фраг мент ProtE (A.A.: 2O-I6O SEQIDNO: 4, SEQ [DNO: 125) G G Фраг мент ρπα(a.a.: 4o- 149 SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 127) 1GHHHHHH
A.A. 1 22 23 163 166 275 283 |
LVL736 pelB sp Фраг мент ProtE (A.A.: 17-16О SEQIDNO: 4, SEQ [DNO: 122) G G Фраг мент ρπα (A.A.: 40-149 SEQIDNO: 58, SEQIDNO: 127) GG HH HH
A.A. 1 22 23 166 169 : 278 : 286 |
LVL737 pelB sp Фраг мент ProtE A.A.: 18-160 SEQIDNO: 4, SEQIDNOH23) G 3 Фраг мент ρπα (Α.Α.: 40-149 SEQIDNO: 58, SEQIDNO: 127) GGH НИН HH
A.A. 1 22 23 165 168 277 285
LVL738 pelB sp Фраг мент ProtE (A.A.: 22-160 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 126 G G Фраг мент ρπα (A.A.: 40-149 SEQ ID: 58, SEQ ID NO: 127 GGHHHHHH
- 30 031580
sp = Сигнальный пептид;
A.A. = аминокислоты
Последовательности ДНК и аминокислотные последовательности для каждого из сигнальных пептидов и плазмид, перечисленных в табл. 3, представлены ниже.
Сигнальные последовательности:
сигнальный пептид ре!В (ДНК) - SEQ ID NO: 129:
atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggcc сигнальный пептид pelB (Аминокислоты) - SEQ ID NO: 130:
MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MA сигнальный пептид FigI (ДНК) - SEQ ID NO: 131:
atgattaaatttctctctgcattaattcttctactggtcacgacggcggctcaggct сигнальный пептид FigI (Аминокислоты) - SEQ ID NO: 132:
MIKFLSALIL LLVTTAAQA сигнальный пептид Nad А (ДНК) - SEQ ID NO: 133:
atgaaacactttccatccaaagtactgaccacagccatccttgccactttctgtagcggcgcactggca сигнальный пептид Nad А (Аминокислоты) - SEQ ID NO: 134:
MKHFPSKVLT TAILATFCSG ALA
- 31 031580
Последовательности конструкций слитых белков.
Участок аминокислотной последовательности, подчеркнутый обычной линией, представляет собой последовательность PilA из Haemophilus influenzae штамма 86-028NP. Участок аминокислотной последовательности, подчеркнутый полужирной линией, был выделен из белка E из Haemophilus influenza штамма 772.
LVL312 (ДНК) - SEQ Ю NO: 135: atgattaaatttctctctgcattaattcttctactggtcacgacggcggctcaggctgagactaaaaaagcagcggtatct gaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgta cgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacg gtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgcaacag gtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttccagcaaatttttgcggaagtgtcacacaaggc ggcgcgcagattcagaaggctgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatac gtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttg atgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtataagatct tgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggggacagggtttgcgggcagcacc taaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtgcgaacta tggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggccaccaccaccaccaccactaa
LVL312 (белок): (flgl sp)(E)(PilA aa 40-149)(GG)(ProtE aa 18-160)(GGHHHHHH) - 32 031580
SEQ ID NO: 136
MIKFLSALIL LLVTTAAQAE TKKAAVSELL QASAPYKADV ELCVYSTNET
TNCTGGKNGI AADITTAKGY VKSVTTSNGA ITVKGDGTLA NMEYILQATG
NAATGVTWTT TCKGTDASLF PANFCGSVTQ GGAQIQKAEQ NDVKLAPPTD
VRSGYIRLVK NVNYYIDSES IWVDNQEPQI VHFDAWNLD KGLYVYPEPK
RYARSVRQYK ILNCANYHLT QVRTDFYDEF WGQGLRAAPK KQKKHTLSLT
PDTTLYNAAQ IICANYGEAF SVDKKGGHHH HHH
LVL291 (ДНК) - SEQ ID NO: 137: atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggcccagattcagaag gctgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaat tattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagat aagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatt taactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggggacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaac atacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttg ataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaa ttatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagc aaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatat ggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctct ttatttccagcaaatttttgcggaagtgtcacacaaggcggccaccaccaccaccaccactaa
LVL291 (белок)(ре\В sp)(ProtE aa 19-160)(GG)(PilA aa40-149)(GGHHHHHH) - SEQ ID NO: 138
MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MAQIQKAEQN DVKLAPPTDV RSGYIRLVKN
VNYYIDSESI WVDNQEPQIV HFDAWNLDK GLYVYPEPKR YARSVRQYKI
LNCANYHLTQ VRTDFYDEFW GQGLRAAPKK QKKHTLSLTP DTTLYNAAQI
ICANYGEAFS VDKKGGTKKA AVSELLQASA PYKADVELCV YSTNETTNCT
GGKNGIAADI TTAKGYVKSV TTSNGAITVK GDGTLANMEY ILQATGNAAT
GVTWTTTCKG TDASLFPANF CGSVTQGGHH HHHH
LVL268 (ДНК) - SEQ ID NO: 139: atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggccgatattcagaagg ctgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaatt
- 33 031580 attacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagata agggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcattt aactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggggacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaac atacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttg ataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaa ttatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagc aaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatat ggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctct ttatttccagcaaatttttgcggaagtgtcacacaaggcggccaccaccaccaccaccac
LVL268 (белок): (pelB sp)(D)(ProtE aa 20-160)(GG)(PilA aa40-149)(GGHHHHHH) SEQ ID NO: 140:
MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MADJQKAEQN DVKLAPPTDV RSGYIRLVKN VNYYIDSESI WVDNQEPQIV HFDAWNLDK GLYVYPEPKR YARSVRQYKI
LNCANYHLTQ VRTDFYDEFW GQGLRAAPKK QKKHTLSLTP DTTLYNAAQI
ICANYGEAFS VDKKGGTKKA AVSELLQASA PYKADVELCV YSTNETTNCT
GGKNGIAADI TTAKGYv'KSV TTSNGAITVK GDGTLANivlEY ILQATGNAAT
GVTWTTTCKG TDASLFPANF CGSVTQGGHH HHHH
LVL269 (ДНК) - SEQ ID NO: 141: atgaaacactttccatccaaagtactgaccacagccatccttgccactttctgtagcggcgcactggcagccacaaac gacgacgataaggctgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggt aaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcag tggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtataagatcttgaattg tgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggggacagggtttgcgggcagcacctaaaaa gcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtgcgaactatggtga agcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaattactgcaagcgtcagcgccttataa ggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcaga tataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcac attggcaaatatggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaagga acggatgcctctttatttccagcaaatttttgcggaagtgtcacacaaggcggccaccaccaccaccaccactaa
LVL269 (белок): (nadA sp)(ATNDDD)(ProtE aa 22-160)(GG)(PilA aa 40- 34 031580
149)(GGHHHHHH) - SEQ ID N0:142
LVKNVNYYID SESIWVDNQE PQIVHFDAW NLDKGLYVYP EPKRYARSVR
QYKILNCANY HLTQVRTDFY DEFWGQGLRA APKKQKKHTL SLTPDTTLYN
AAQIICANYG EAFSVDKKGG TKKAAVSELL QASAPYKADV ELCVYSTNET
TNCTGGKNGI AADITTAKGY VKSVTTSNGA ITVKGDGTLA NMEYILQATG
NAATGVTWTT TCKGTDASLF PANFCGSVTQ GGHHHHHH
LVL270 (ДНК) - SEQ ID NO: 143: atgcaccaccaccaccaccacagcgcgcagattcagaaggctgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgac tgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataacca agagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgca cgttctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggg gacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatg ctgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatct gaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgta cgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacg gtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgcaacag gtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttccagcaaatttttgcggaagtgtcacacaataa
LVL270 (белок): (MHHHHHH)(ProtE aa 17-160)(GG)(PilA aa40-149) - SEQ ID NO:
144:
Μ Η Η Η Η H HSAQ IQKAEQNDVK LAPPTDVRSG YIRLVKNVNY YIDSESIWVD NQEPQIVHFD AWNLDKGLY VYPEPKRYAR SVRQYKILNC ANYHLTQVRT
DFYDEFWGQG LRAAPKKQKK HTLSLTPDTT LYNAAQIICA NYGEAFSVDK
KGGTKKAAVS ELLQASAPYK ADVELCVYST NETTNCTGGK NGIAADITTA
KGYVKSVTTS NGAITVKGDG TLANMEYILQ ATGNAATGVT WTTTCKGTDA
SLFPANFCGS VTQ
LVL315 (ДНК) - SEQ ID NO: 145:
atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggccatggataaggctg aacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattatta catcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataagg
- 35 031580 gattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaact caagtacgaactgatttctatgatgaattttggggacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatac gttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataa aaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatg tgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaa ggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatggaat atattttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttc cagcaaatttttgcggaagtgtcacacaaggcggccaccaccaccaccaccactaa
LVL315 (белок): (pelB sp)(MD)(ProtE aa 22-160)(GG)(PilA aa40-149)(GGHHHHHH) - SEQ ID NO: 146:
MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MAMDKAEQND VKLAPPTDVR SGYIRLVKNV NYYIDSESIW VDNQEPQIVH FDAWNLDKG LYVYPEPKRY ARSVRQYKIL
NCANYHLTQV RTDFYDEFWG QGLRAAPKKQ KKHTLSLTPD TTLYNAAQII
CANYGEAFSV DKKGGTKKAA VSELLQASAP YKADVELCVY STNETTNCTG
GKNGIAADIT TAKGYVKSVT TSNGAITVKG DGTLANMEYI LQATGNAATG
VTWTTTCKGT DASLFPANFC GSVTQGGHHH HHH
LVL317 (ДНК) - SEQ ID NO: 147: atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggcccagattcagaag gctgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaat tattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagat aagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatt taactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggggacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaac atacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttg ataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaa ttatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagc aaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatat ggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctct ttatttccagcaaatttttgcggaagtgtcacacaataa
LVL317 (белок): (pelB sp)(ProtE aa 19-160)(GG)(PilAaa40-149) - SEQ ID NO: 148:
MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MAQIQKAEQN DVKLAPPTDV RSGYIRLVKN
- 36 031580
VNYYIDSESI WVDNQEPQIV HFDAWNLDK GLYVYPEPKR YARSVRQYKI
LNCANYHLTQ VRTDFYDEFW GQGLRAAPKK QKKHTLSLTP DTTLYNAAQI
ICANYGEAFS VDKKGGTKKA AVSELLQASA PYKADVELCV YSTNETTNCT
GGKNGIAADI TTAKGYVKSV TTSNGAITVK GDGTLANMEY ILQATGNAAT
GVTWTTTCKG TDASLFPANF CGSVTQ
LVL318 (ДНК) - SEQ ID NO: 149: atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggccatggataaggctg aacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattatta catcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataagg gattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaact caagtacgaactgatttctatgatgaattttggggacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatac gttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataa aaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatg tgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaa ggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatggaat atattttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttc cagcaaatttttgcggaagtgtcacacaataa
LVL318 (белок): (pelB sp)(MD)(ProtE aa 22-160)(GG)(PilA aa40-149) - SEQ ID NO: 150:
MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MAMDKAEQND VKLAPPTDVR SGYIRLVKNV NYYIDSESIW VDNQEPQIVH FDAWNLDKG LYVYPEPKRY ARSVRQYKIL
NCANYHLTQV RTDFYDEFWG QGLRAAPKKQ KKHTLSLTPD TTLYNAAQII
CANYGEAFSV DKKGGTKKAA VSELLQASAP YKADVELCVY STNETTNCTG
GKNGIAADIT TAKGYVKSVT TSNGAITVKG DGTLANMEYI LQATGNAATG
VTWTTTCKGT DASLFPANFC GSVTQ
LVL702 (ДНК) - SEQ ID NO: 181:
atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggccattcagaaggctg aacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattatta catcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataagg gattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaact
- 37 031580 caagtacgaactgatttctatgatgaattttggggacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatac gttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataa aaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatg tgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaa ggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatggaat atattttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttc cagcaaatttttgcggaagtgtcacacaaggcggccaccaccaccaccaccac
LVL702 (белок): (pelB sp)(ProtE aa 20-160)(GG)(PilA aa40-149)(GGHHHHHH) SEQ ID NO: 182:
MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MAIQKAEQND VKLAPPTDVR SGYIRLVKNV NYYIDSESIW VDNQEPQIVH FDAWNLDKG LYVYPEPKRY ARSVRQYKIL
NCANYHLTQV RTDFYDEFWG QGLRAAPKKQ KKHTLSLTPD TTLYNAAQII
CANYGEAFSV DKKGGTKKAA VSELLQASAP YKADVELCVY STNETTNCTG
GKNGIAADIT TAKGYVKSVT TSNGAITVKG DGTLANMEYI LQATGNAATG
VTWTTTCKGT DASLFPANFC GSVTQGGHHH HHH
LVL736 (ДНК) - SEQ ID NO: 183:
atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggccagcgcccagattc agaaggctgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaat gtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaat ttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaatt atcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggggacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaa gaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcatttt cagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgat gtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataacc acagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggc aaatatggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacgga tgcctctttatttccagcaaatttttgcggaagtgtcacacaaggcggccaccaccaccaccaccac
LVL736 (белок): (pelB sp)(ProtE aa 17-160)(GG)(PilA aa40-149)(GGHHHHHH) SEQ ID NO: 184:
MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MASAQIQKAE QNDVKLAPPT DVRSGYIRLV
- 38 031580
KNVNYYIDSE SIWVDNQEPQ IVHFDAWNL DKGLYVYPEP KRYARSVRQY
KILNCANYHL TQVRTDFYDE FWGQGLRAAP KKQKKHTLSL TPDTTLYNAA
QIICANYGEA FSVDKKGGTK KAAVSELLQA SAPYKADVEL CVYSTNETTN
CTGGKNGIAA DITTAKGYVK SVTTSNGAIT VKGDGTLANM EYILQATGNA
ATGVTWTTTC KGTDASLFPANFCGSVTQGG HHHHHH
LVL737 (ДНК) - SEQ ID NO: 185:
atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggccgcccagattcag aaggctgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgt gaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaattt agataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaatta tcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggggacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaag aaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttc agttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgt ggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataacca cagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggca aatatggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggat gcctctttatttccagcaaatttttgcggaagtgtcacacaaggcggccaccaccaccaccaccac
LVL737 (белок): (pelB sp)(ProtE aa 18-160)(GG)(PIIA aa40-149)(GGHHHHHH) SEQ ID NO: 186:
MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MAAQIQKAEQ NDVKLAPPTD VRSGYIRLVK NVNYYIDSES IWVDNQEPQI VHFDAWNLD KGLYVYPEPK RYARSVRQYK
ILNCANYHLT QVRTDFYDEF WGQGLRAAPK KQKKHTLSLT PDTTLYNAAQ
IICANYGEAF SVDKKGGTKK AAVSELLQAS APYKADVELC VYSTNETTNC
TGGKNGIAAD ITTAKGYVKS VTTSNGAITV KGDGTLANME YILQATGNAA
TGVTWTTTCK GTDASLFPAN FCGSVTQGGH HHHHH
LVL738 (ДНК) - SEQ ID NO: 187: atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggccaaggctgaacaa aatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcg atagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgt atgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagt
- 39 031580 acgaactgatttctatgatgaattttggggacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaag tttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaag gcggcactaaaaaagcagcggtatctgaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatat agcacaaatgaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctat gtaaaatcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatggaatatatttt gcaagctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttccagc aaatttttgcggaagtgtcacacaaggcggccaccaccaccaccaccac
LVL738 (белок): (pelB sp)(ProtE aa 22-160)(GG)(PIIA aa40-149)(GGHHHHHH) SEQ ID NO: 188:
MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MAKAEQNDVK LAPPTDVRSG YIRLVKNVNY YIDSESIWVD NQEPQIVHFD AWNLDKGLY VYPEPKRYAR SVRQYKILNC
ANYHLTQVRT DFYDEFWGQG LRAAPKKQKK HTLSLTPDTT LYNAAQIICA
NYGEAFSVDK KGGTKKAAVS ELLQASAPYK ADVELCVYST NETTNCTGGK
NGIAADITTA KGYVKSVTTS NGAITVKGDG TLANMEYILQ ATGNAATGVT
WTTTCKGTDASLFPANFCGS VTQGGHHHHH H
LVL739 (ДНК) - SEQ ID NO: 189:
atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggccgctgaa caaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattaca tcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataaggga ttgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactca agtacgaactgatttctatgatgaattttggggacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgtt aagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaa aaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgt atatagcacaaatgaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaagg ctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatggaatat attttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttcc agcaaatttttgcggaagtgtcacacaaggcggccaccaccaccaccaccac
LVL739 (белок): (pelB sp)(ProtE aa 23-160)(GG)(PIIA aa40-149)(GGHHHHHH) SEQ ID NO: 190:
MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MAAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY
- 40 031580
IDSESIWVDN QEPQIVHFDA WNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA
NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN
YGEAFSVDKK GGTKKAAVSE LLQASAPYKA DVELCVYSTN ETTNCTGGKN
GIAADITTAK GYVKSVTTSN GAITVKGDGT LANMEYILQA TGNAATGVTW
TTTCKGTDAS LFPANFCGSV TQG G Η Η Η Η Η H
LVL740 (ДНК) - SEQ ID NO: 191: atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggccgaacaaaatgat gtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtg aatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgttta tcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaa ctgatttctatgatgaattttggggacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaac acctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggc actaaaaaagcagcggtatctgaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcac aaatgaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaa atcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatggaatatattttgcaag ctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttccagcaaattttt gcggaagtgtcacacaaggcggccaccaccaccaccaccac
LVL740 (белок): (pelB sp)(ProtE aa 24-160)(GG)(PIIA aa40-149)(GGHHHHHH) SEQ ID NO: 192:
MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MAEQNDVKLA PPTDVRSGYI RLVKNVNYYI DSESIWVDNQ EPQIVHFDAV VNLDKGLYVY PEPKRYARSV RQYKILNCAN
YHLTQVRTDF YDEFWGQGLR AAPKKQKKHT LSLTPDTTLY NAAQIICANY
GEAFSVDKKG GTKKAAVSEL LQASAPYKAD VELCVYSTNE TTNCTGGKNG
IAADITTAKG YVKSVTTSNG AITVKGDGTL ANMEYILQAT GNAATGVTWT
TTCKGTDASL FPANFCGSVT QG G Η Η Η Η Η H
LVL735 (ДНК) - SEQ ID NO: 193: atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggccattcaga aggctgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtg aattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaattta gataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattat
- 41 031580 catttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggggacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaaga aacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttca gttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtg gaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccac agcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaa atatggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatg cctctttatttccagcaaatttttgcggaagtgtcacacaa
LVL735 (белок): (pelB sp)(ProtE aa 20-160)(GG)(PilA aa40-149) - SEQ ID NO: 194:
NYYIDSESIW VDNQEPQIVH FDAWNLDKG LYVYPEPKRY ARSVRQYKIL
NCANYHLTQV RTDFYDEFWG QGLRAAPKKQ KKHTLSLTPD TTLYNAAQII
CANYGEAFSV DKKGGTKKAA VSELLQASAP YKADVELCVY STNETTNCTG
GKNGIAADIT TAKGYVKSVT TSNGAITVKG DGTLANMEYI LQATGNAATG
VTWTTTCKGT DASLFPANFC GSVTQ
LVL778 (ДНК) - SEQ ID NO: 195:
atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggccagcgcccagattc agaaggctgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaat gtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaat ttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaatt atcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggggacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaa gaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcatttt cagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgat gtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataacc acagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggc aaatatggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacgga tgcctctttatttccagcaaatttttgcggaagtgtcacacaa
LVL778 (белок): (pelB sp)(ProtE aa 17-160)(GG)(PIIA aa40-149) - SEQ ID NO: 196:
MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MASAQIQKAE QNDVKLAPPT DVRSGYIRLV
KNVNYYIDSE SIWVDNQEPQ IVHFDAWNL DKGLYVYPEP KRYARSVRQY
KILNCANYHL TQVRTDFYDE FWGQGLRAAP KKQKKHTLSL TPDTTLYNAA
- 42 031580
QIICANYGEA FSVDKKGGTK KAAVSELLQA SAPYKADVEL CVYSTNETTN CTGGKNGIAA DITTAKGYVK SVTTSNGAIT VKGDGTLANM EYILQATGNA ATGVTWTTTC KGTDASLFPANFCGSVTQ
LVL779 (ДНК) - SEQ ID NO: 197: atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggccgcccagattcag aaggctgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgt gaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaattt agataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaatta tcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggggacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaag aaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttc agttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgt ggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataacca cagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggca aatatggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggat gcctctttatttccagcaaatttttgcggaagtgtcacacaa
LVL779 (белок): (pelB sp)(ProtE aa 18-160)(GG)(PilA aa40-149) - SEQ ID NO: 198: MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MAAQIQKAEQ NDVKLAPPTD VRSGYIRLVK
NVNYYIDSES IWVDNQEPQI VHFDAWNLD KGLYVYPEPK RYARSVRQYK
ILNCANYHLT QVRTDFYDEF WGQGLRAAPK KQKKHTLSLT PDTTLYNAAQ
IICANYGEAF SVDKKGGTKK AAVSELLQAS APYKADVELC VYSTNETTNC
TGGKNGIAAD ITTAKGYVKS VTTSNGAITV KGDGTLANME YILQATGNAA
TGVTWTTTCK GTDASLFPAN FCGSVTQ
LVL780 (ДНК) - SEQ ID NO: 199: atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggccaaggctgaacaa aatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcg atagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgt atgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagt acgaactgatttctatgatgaattttggggacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaag tttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaag gcggcactaaaaaagcagcggtatctgaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatat
- 43 031580 agcacaaatgaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctat gtaaaatcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatggaatatatttt gcaagctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttccagc aaatttttgcggaagtgtcacacaa
LVL78G (белок): (pelB sp)(ProtE aa 22-160)(GG)(PilA aa40-149) - SEQ ID NO: 200:
MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MAKAEQNDVK LAPPTDVRSG YIRLVKNVNY YIDSESIWVD NQEPQIVHFD AWNLDKGLY VYPEPKRYAR SVRQYKILNC
ANYHLTQVRT DFYDEFWGQG LRAAPKKQKK HTLSLTPDTT LYNAAQIICA
NYGEAFSVDK KGGTKKAAVS ELLQASAPYK ADVELCVYST NETTNCTGGK
NGIAADITTA KGYVKSVTTS NGAITVKGDG TLANMEYILQ ATGNAATGVT
WTTTCKGTDASLFPANFCGS VTQ
LVL781 (ДНК) - SEQ ID NO: 201:
Atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggccgctgaacaaaat gatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgata gtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatg tttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacg aactgatttctatgatgaattttggggacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagttta acacctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcg gcactaaaaaagcagcggtatctgaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagc acaaatgaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgta aaatcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatggaatatattttgca agctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttccagcaaat ttttgcggaagtgtcacacaa
LVL781 (белок): (pelB sp)(ProtE aa 23-160)(GG)(PilA aa40-149) - SEQ ID NO: 202:
MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MAAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY IDSESIWVDN QEPQIVHFDA WNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA
NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN
YGEAFSVDKK GGTKKAAVSE LLQASAPYKA DVELCVYSTN ETTNCTGGKN
GIAADITTAK GYVKSVTTSN GAITVKGDGT LANMEYILQA TGNAATGVTW
TTTCKGTDAS LFPANFCGSV TQ
- 44 031580
LVL782 (ДНК) - SEQ ID NO: 203:
atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggccgaacaaaatgat gtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtg aatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgttta tcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaa ctgatttctatgatgaattttggggacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaac acctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggc actaaaaaagcagcggtatctgaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcac aaatgaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaa atcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatggaatatattttgcaag ctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttccagcaaattttt gcggaagtgtcacacaa
LVL782 (белок): (pelB sp)(ProtE aa 24-160)(GG)(PilA aa40-149) - SEQ ID NO: 204:
MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MAEQNDVKLA PPTDVRSGYI RLVKNVNYYI
DSESIWVDNQ EPQIVHFDAV VNLDKGLYVY PEPKRYAR8V RQYKILNCAN
YHLTQVRTDF YDEFWGQGLR AAPKKQKKHT LSLTPDTTLY NAAQIICANY
GEAFSVDKKG GTKKAAVSEL LQASAPYKAD VELCVYSTNE TTNCTGGKNG
IAADITTAKG YVKSVTTSNG AITVKGDGTL ANMEYILQAT GNAATGVTWT
TTCKGTDASL FPANFCGSVT Q
Полноразмерная последовательность для PE и PilA, из которой были получены вышеописанные последовательности, представлена в SEQ ID NO: 4 (PE) и SEQ ID NO: 58 (PilA) соответственно.
Пример 2. Конструирование вектора и трансформация.
Праймеры для амплификации PE из H. influenzae штамма 772 были сконструированы на основе последовательности Н. influenzae штамма Hi Rd. Последовательность 5'-праймера содержит одно нуклеотидное отличие по сравнению с последовательностью NTHi 772, вносящее аминокислотное отличие в положении 24 по сравнению с описанной в настоящее время последовательностью генома NTHi 772. Аминокислота № 24 в конструкциях слитых белков представляет собой E (глутаминовую кислоту) вместо K (лизина), как обнаружено в NTHi 772.
Последовательность ДНК для PE из H. influenzae штамма Rd. - SEQ ID NO: 151 atgaaaaaaattattttaacattatcacttgggttacttaccgcttgttctgctcaaatccaaaaggctgaacaaaatgatgt gaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaa tcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgctgtggtgaatttagataggggattgtatgtttatcc tgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtataagattttgaattgtgcaaattatcatttaactcaaatacgaactga tttctatgatgaattttggggacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacct gatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtgcaaattatggtaaagcattttcagttgataaaaaataa
Последовательность белка для PE из H. influenzae штамма Rd. - SEQ ID NO: 152
MKKIILTLSL GLLTACSAQI QKAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY
IDSESIWVDN
QEPQIVHFDA WNLDRGLYV YPEPKRYARS
VRQYKILNCA
NYHLTQIRTD
FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN
YGKAFSVDKK
Последовательность ДНК для PE из H. influenzae штамма 772 (представленная в статье Microbes & Infection, Corrigendum to Identification of a novel Haemophilus influenza protein important for adhesion to epithelia cells [Microbes Infect. 10 (2008) 87-97], available online July 6, 2010, Article in Press)) - SEQ ID NO: 153 atgaaaaaaattattttaacattatcacttgggttacttactgcctgttctgctcaaatccaaaaggctaaacaaaatgatgt gaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaa tcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatc ctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaact gatttctatgatgaattttggggacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacac ctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaa
- 45 031580
Последовательность белка для PEE из H. influenzae штамма 772 (представленная в статье Microbes & Infection, Corrigendum to Identification of a novel Haemophilus influenzae protein important for adhesion to epithelia cells [Microbes Infect. 10 (2008) 87-97], available online July 6, 2010, Article in Press)) - SEQ ID NO: 154
MKKIILTLSL GLLTACSAQI QKAKQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY IDSESIWVDN QEPQIVHFDA WNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK
Конструирование векторов.
Для получения векторов LVL312, LVL291, LVL268, LVL269, LVL270, LVL702, LVL735, LVL778, LVL779, LVL780, LVL781 и LVL782 препарат для полимеразной цепной реакции (ПЦР) готовили из следующих компонентов (ниже приведены примеры конкретных компонентов): 36,6 мкл деионизованной воды, 5 мкл буфера № 1 10X, 5 мкл dNTP 2 мМ, 2 мкл MgCl2 25 мМ, 0,4 мкл праймера № 1 (50 мкМ), 0,4 мкл праймера № 2 (50 мкМ), 0,5 мкл матрицы (100 нг/мкл) и 0,4 мкл ДНК полимеразы KOD HiFi 2,5 ед./мкл (NOVAGEN®). Полимеразная цепная реакция включала 25 циклов: 15 с денатурация при 98°C, 2 с отжига при 55°C и 20 с элонгации праймеров при 72°C. Продукты ПЦР очищали, используя набор для очистки продуктов ПЦР QIAQUICK® PCR (QIAGEN®). Данный набор использовали в следующих условиях, рекомендованных поставщиком: добавление 5 об. буфера PB, предложенного в наборе для очистки продуктов ПЦР QIAQUICK® PCR, на 1 объем препарата ПЦР. Затем препарат ПЦР с буфером PB перемешивали на вортексе. Колонку QIAQUICK® помещали в пробирку для сбора объемом 2 мл. Для связывания ДНК в препарате ПЦР с колонкой смешанный образец наносили на колонку QIAQUICK® и центрифугировали в течение 30-60 с при 14000 об/мин. Проточную фракцию отбрасывали, и колонку QIAQUICK® помещали обратно в ту же пробирку. Для отмывки связанной ДНК в колонку QIAQUICK® добавляли 0,75 мл буфера PE, предложенного в наборе для очистки продуктов ПЦР QIAQUICK® PCR, и колонку центрифугировали в течение 30-60 с при 14000 об/мин. Проточную фракцию отбрасывали, и колонку QIAQUICK® помещали обратно в ту же пробирку. Колонку QIAQUICK® центрифугировали еще раз в пробирке для сбора объемом 2 мл в течение 1 мин для удаления остаточного отмывочного буфера. Каждую колонку QIAQUICK® помещали в чистую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Для элюирования ДНК добавляли 33 мкл воды на центр мембраны QIAQUICK®, и колонку центрифугировали в течение 1 мин при 14000 об/мин. Ферменты рестрикции и соответствующий буфер были получены от фирмы New England BioLabs. Например, смешивали приблизительно 5 мкл вектора pET26b (100 нг/мкл), 2 мкл буфера NEBuffer 2 (New England Biolabs, 1X NEBuffer 2: 50 мМ NaCl, 10 мМ ТрисHCl, 10 мМ MgCl2, 1 мМ дитиотрейтол, pH 7,9 при 25°C), 1 мкл NdeI (20000 ед./мл), 1 мкл HindIII(20000 ед./мл) и 11 мкл деионизованной воды смешивали и инкубировали в течение 2 ч при 37°C для расщепления ДНК. Затем проводили вторую стадию очистки, используя набор для очистки продуктов ПЦР QIAQUICK® PCR (QIAGEN®), методом, описанным выше.
Лигирование проводили, используя ДНК-лигазу Quick T4 и буфер для лигирования Quick Ligation Reaction Buffer от фирмы New England BioLabs. Например, около 10 нг вектора и 30 нг вставки в 10 мкл деионизованной воды смешивали с 10 мкл 2Х Quick Ligation Reaction Buffer (New England Biolabs, 132 мМ Трис-HCl, 20 мМ MgCl2, 2 мМ дитиотрейтола, 2 мМ АТФ, 15% полиэтиленгликоля, pH 7,6 при 25°C) и 1 мкл ДНК лигазы Quick T4 (New England Biolabs). Ферментативную реакцию инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре, после чего проводили трансформацию.
Для получения векторов LVL315, LVL317, LVL318, LVL736, LVL737, LVL738, LVL739 и LVL740 препарат ПЦР готовили из следующих компонентов: 40 мкл деионизованной воды, 5 мкл реакционного буфера 10X, 1 мкл смеси dNTP, 1 мкл праймера № 1 (10 мкМ), 1 мкл праймера № 2 (10 мкМ), 1 мкл матрицы (25 нг/мкл) и 1 мкл ДНК полимеразы PfuUltra высокой точности 2,5 ед./мкл (набор для сайтнаправленного мутагенеза QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit, Agilent Technologies, Stratagene Division). Полимеразная цепная реакция включала один цикл денатурации ДНК при 95°C в течение 30 с, 18 циклов: 30 с денатурации при 95°C, 1 мин для отжига при 55°C и 5 мин 30 с элонгации праймера при 68°C. Продукты ПЦР подвергали ферментативному гидролизу, используя 1 мкл фермента рестрикции DpnI при 37°C в течение 1 ч, после чего проводили трансформацию.
Подробный перечень последовательностей праймеров для ПЦР, используемых для амплификации, приведен в табл. 4.
Для получения вектора pRIT16711 фрагмент гена PE, кодирующий аминокислоты 22-160 SEQ ID NO: 4, за исключением последовательности, кодирующей соответствующий сигнал секреции, амплифицировали с помощью ПЦР с геномной ДНК NTHi штамма 772. Праймеры для амплификации были сконструированы на основе доступной последовательности штамма Hi Rd (в то время последовательность 772 была неизвестна). Последовательность 5'-праймера содержит одну мутацию по сравнению с последовательностью NTHi 772 (последовательностью, которая теперь доступна), вносящую одно аминокислотное отличие в кодирующую PE последовательность в положении 24, глутаминовую кислоту (E) вместо лизина (K). После амплификации с помощью ПЦР вставку клонировали в экспрессионном векторе
- 46 031580 pET-26(+) (NOVAGEN®), используя сайты рестрикции BamHI и XhoI.
Для получения вектора pRIT16671 фрагмент ДНК, кодирующий фрагмент гена PilA (аминокислоты 40-149 SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 127), за исключением его лидерного пептида, а также участка предсказанной гидрофобной альфа-спирали, амплифицировали с геномной ДНК NTHi штамма 86-028NP и клонировали в экспрессионном векторе pET15. Вектор pRIT16790 (содержащий аминокислоты 40-149 из NTHi штамма 86-028NP) использовали в качестве матрицы для получения вектора pRIT16671. Фрагмент гена PilA амплифицировали с помощью ПЦР, используя вектор pRIT16790 и праймеры MDES PILA-3 и MDES PILA-4. Фрагмент PilA клонировали в экспрессионном векторе pET-26, используя сайты рестрикции NdeI/XhoI. Последовательность ДНК, содержащую шесть аминокислот, представляющих собой гистидин (his), вставляли в 5'-праймер для присоединения шести гистидинов (6xhis) на N-конце последовательности PilA(MDES PILA-3).
Для получения вектора LVL312 (сигнальный пептид Flgl - E - фрагмент PilA - GG - фрагмент PE GGHHHHHH) проводили полимеразную цепную реакцию для амплификации гена PilA (аминокислоты 40-149/штамм 86-028NP), используя вектор pRIT16671 в качестве матрицы и белки CAN534 и CAN537. Последовательность ДНК, соответствующую сигнальному пептиду Flgl (sp), и аминокислоту, представляющую собой глутаминовую кислоту (E), встраивали в 5'-праймер (CAN534). Для сшивания последовательности PilA с последовательностью PE последовательность ДНК, соответствующую двум аминокислотам, представляющим собой глицин (GG), аминокислотный линкер и N-концевые аминокислоты PE встраивали в 3'-праймер (CAN537). Проводили другую полимеразную цепную реакцию для амплификации гена PE (аминокислоты 18-160), используя вектор pRIT16711 в качестве матрицы и праймеры CAN536 и CAN538. Последовательность ДНК, соответствующую C-концевым аминокислотам PilA и аминокислотам GG, встраивали в 5'-праймер для сшивания последовательности pilA с последовательностью PE (CAN536). Последовательность ДНК, соответствующую аминокислотному линкеру GG и аминокислотам 6xhis, встраивали в 3'-праймер (CAN538). Наконец, для получения LVL312 проводили третью полимеразную цепную реакцию для амплификации генов PilA и PE в слиянии с сигнальным пептидом Flgl на N-конце, аминокислотой, представляющей собой глутаминовую кислоту (E), между Flgl и pilA, линкером GG между последовательностями PilA и PE и линкером GG между PE и аминокислотами 6xhis на C-конце. Для достижения этой амплификации в качестве матрицы использовали продукты двух полимеразных цепных реакций, описанных выше, с праймерами CAN534 и CAN538. Последовательность ДНК, соответствующую сайту рестрикции NdeI, встраивали в 5'-праймер, а сайт рестрикции HindIII включали в 3'-праймер. Затем полученный продукт ПЦР встраивали в вектор клонирования pET-26b(+) (NOVAGEN®).
Для получения вектора LVL291 (сигнальный пептид pelB - фрагмент PE - GG - фрагмент PilA - GG 6xhis) проводили полимеразную цепную реакцию для амплификации гена PE (аминокислоты 19-160), используя вектор pRIT16711 в качестве матрицы и праймеры CAN544 и CAN546. Последовательность ДНК, соответствующую аминокислотной последовательности сигнального пептида pelB (sp), включали в 5'-праймер (CAN544). Для сшивания последовательности PilA с последовательностью PE, последовательность ДНК, соответствующую аминокислотному линкеру GG и N-концевым аминокислотам PilA, включали в 3'-праймер (CAN546). Другую полимеразную цепную реакцию проводили для амплификации гена PilA (аминокислоты 40-149 SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 127), используя вектор pRIT16671 в качестве матрицы, с праймерами CAN545 и CAN535. Последовательность ДНК, соответствующую C-концевым аминокислотам PE и аминокислотам GG, включали в 5'-праймер (CAN545) для сшивания последовательности PilA с последовательностью PE. Последовательность ДНК, соответствующую линкерным аминокислотам GG, и аминокислотам 6xhis, включали в 3'-праймер (CAN535). Наконец, для получения LVL291 проводили третью полимеразную цепную реакцию для амплификации генов PE и PilA в слиянии с сигнальным пептидом pelB на N-конце, линкером GG между последовательностями PE и PilA и линкером GG между PilA и аминокислотами 6xhis на C-конце. Для достижения этой амплификации продукты двух полимеразных цепных реакций, описанных выше, использовали в качестве матрицы с праймерами CAN544 и CAN535. Последовательность ДНК, соответствующую сайту рестрикции NdeI, включали в 5'праймер, а сайт рестрикции HindIII включали в 3'-праймер. Затем полученный продукт ПЦР встраивали в клонирующий вектор pET-26b(+)(NOVAGEN®).
Для получения вектора LVL268 (сигнальный пептид pelB - D - фрагмент РЕ - GG - фрагмент PilA GG - 6xhis) проводили полимеразную цепную реакцию для амплификации гена PE (аминокислоты 20160), используя вектор pRIT16711 в качестве матрицы с праймерами CAN547 и CAN546. Последовательность ДНК, соответствующую аминокислотной последовательности сигнального пептида pelB (sp) и аминокислоте, представляющей собой аспарагиновую кислоту (D), включали в 5'-праймер (CAN547). Для сшивания последовательности PilA с последовательностью PE, последовательность ДНК, соответствующую аминокислотному линкеру GG и N-концевым аминокислотам PilA, включали в 3'-праймер (CAN546). Другую полимеразную цепную реакцию проводили для амплификации гена PilA (аминокислоты 40-149/NTHi штамма 86-028NP), используя вектор pRIT16671 в качестве матрицы с CAN545 и CAN535. Последовательность ДНК, соответствующую C-концевым аминокислотам PE и аминокислотам GG, включали в 5'-праймер (CAN545) для сшивания последовательности PilA с последовательностью PE.
- 47 031580
Последовательность ДНК, соответствующую линкерным аминокислотам GG и аминокислотам 6xhis, включали в 3'-праймер (CAN535). Наконец, для получения вектора LVL268 проводили третью полимеразную цепную реакцию для амплификации генов PE и PilA в слиянии с сигнальным пептидом pelB на N-конце, аминокислотой D между сигнальным пептидом pelB и PE, линкером GG между последовательностями PE и pilA и линкером GG между PilA и аминокислотами 6xhis на C-конце. Для достижения этой амплификации продукты двух полимеразных цепных реакций, описанных выше, использовали в качестве матрицы с праймерами CAN547 и CAN535. Последовательность ДНК, соответствующую сайту рестрикции NdeI, включали в 5'-праймер, а сайт рестрикции HindIII включали в 3'-праймер. Затем полученный продукт ПЦР встраивали в клонирующий вектор pET-26b(+)(NOVAGEN®).
Для получения вектора LVL269 (сигнальный пептид NadA - ATNDDD - фрагмент PE - GG - фрагмент PilA - GG - 6xhis) проводили полимеразную цепную реакцию для амплификации гена PE (аминокислоты 22-160 SEQ ID NO: 4), используя вектор pRIT16711 в качестве матрицы с праймерами CAN548 и CAN546. Последовательность ДНК, соответствующую аминокислотной последовательности сигнального пептида pelB (sp) и аминокислотам ATNDDD, включали в 5'-праймер (CAN548). Для сшивания последовательности PilA с последовательностью PE последовательность ДНК, соответствующую аминокислотному линкеру GG и N-концевым аминокислотам PilA, включали в 3'-праймер (CAN546). Другую полимеразную цепную реакцию проводили для амплификации гена PilA (аминокислоты 40-149 SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 127), используя вектор pRIT16671 в качестве матрицы с праймерами CAN545 и CAN535. Последовательность ДНК, соответствующую C-концевым аминокислотам PE и аминокислотам GG, включали в 5'-праймер для сшивания последовательности PilA с последовательностью PE (CAN545). Последовательность ДНК, соответствующую линкерным аминокислотам GG и аминокислотам 6xhis, включали в 3'-праймер (CAN535). Наконец, для получения вектора LVL269 проводили третью полимеразную цепную реакцию для амплификации гена PE и PilA в слиянии с сигнальным пептидом NadA на N-конце, аминокислотами ATNDDD между сигнальным пептидом pelB и PE, линкером GG между последовательностями PE и pilA и линкером GG между PilA и аминокислотами 6xhis на C-конце. Для достижения этой амплификации продукты двух полимеразных цепных реакций, описанных выше, использовали в качестве матрицы с праймерами CAN548 и CAN535. Последовательность ДНК, соответствующую сайту рестрикции NdeI, включали в 5'-праймер, а сайт рестрикции HindIII включали в 3'-праймер. Затем полученный продукт ПЦР встраивали в клонирующий вектор pET-26b(+) (NOVAGEN®).
Для получения вектора LVL270 (M - 6xHis - фрагмент PE - GG - фрагмент PilA) проводили полимеразную цепную реакцию для амплификации гена PE (аминокислоты 17-160), используя вектор pRIT16711 в качестве матрицы с праймерами CAN540 и CAN542. Последовательность ДНК, соответствующую аминокислотам 6xhis, включали в 5'-праймер (CAN540). Для сшивания последовательности PilA с последовательностью PE последовательность ДНК, соответствующую аминокислотному линкеру GG и N-концевым аминокислотам PilA, включали в 3'-праймер (CAN542). Другую полимеразную цепную реакцию проводили для амплификации гена PilA (аминокислоты 40-149/NTHi штамма 86-028NP), используя вектор pRIT16671 в качестве матрицы, с праймерами CAN541 и CAN543. Последовательность ДНК, соответствующую C-концевым аминокислотам PE и аминокислотам GG, включали в 5'-праймер (CAN541) для сшивания последовательности PilA с последовательностью PE. Наконец, для получения LVL270 проводили третью полимеразную цепную реакцию для амплификации гена 6-his-PE-GG-PilA в слиянии. Для достижения этой амплификации продукты двух полимеразных цепных реакций, описанных выше, использовали в качестве матрицы с праймерами CAN540 и CAN543. Последовательность ДНК, соответствующую сайту рестрикции NdeI, включали в 5'-праймер, а сайт рестрикции HindIII включали в 3'-праймер. Затем полученный продукт ПЦР встраивали в клонирующий вектор pET-26b(+) (NOVAGEN®).
Для получения вектора LVL315 (сигнальный пептид pelB - MD - фрагмент РЕ - GG - фрагмент PilA - GG - 6xhis) проводили сайт-направленный мутагенез, чтобы изменить N-концевую аминокислотную последовательность PE QIQ на MD, используя LVL291 в качестве матрицы с праймерами CAN670 и CAN671 и набор для сайт-направленного мутагенеза QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent Technologies, Stratagene Division).
Для получения вектора LVL317 (сигнальный пептид pelB - фрагмент PE - GG - фрагмент pilA) проводили сайт-направленный мутагенез, чтобы включить стоп-кодон между геном PilA и последовательностью ДНК, соответствующей аминокислотным остаткам GGHHHHHH (SEQ ID NO: 3), используя LVL291 в качестве матрицы с праймерами CAN678 и CAN679 и набор для сайт-направленного мутагенеза QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent Technologies, Stratagene Division).
Для получения вектора LVL318 (сигнальный пептид pelB - MD - PE - GG - PilA) проводили сайтнаправленный мутагенез, чтобы включить стоп-кодон между геном PilA и последовательностью ДНК, соответствующей аминокислотным остаткам GGHHHHHH (SEQ ID NO: 3), используя LVL315 в качестве матрицы с праймерами CAN678 и CAN679 и набор для сайт-направленного мутагенеза QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent Technologies, Stratagene Division).
Для получения вектора LVL702 (LVL291 AQ) проводили полимеразную цепную реакцию, используя вектор LVL291 в качестве матрицы и праймеры CAN1517 и CAN1518. Делецию трех нуклеотидов,
- 48 031580 соответствующих аминокислоте Q в положении 23 последовательности LVL291, включали в 5'-праймер. Единственное различие между LVL702 и LVL291 составляет делеция аминокислоты Q в положении 23 последовательности LVL291. Сайты рестрикции NdeI и HindIII включали в 5'- и 3'-праймеры соответственно. Затем полученный продукт ПЦР встраивали в клонирующий вектор pET-26b(+) с (NOVAGEN®).
Для получения вектора LVL735 (LVL317 AQ) проводили полимеразную цепную реакцию, используя вектор LVL317 в качестве матрицы и праймеры CAN1517 и CAN1519. Делецию трех нуклеотидов, соответствующих аминокислоте Q в положении 23 последовательности LVL317, включали в 5'-праймер. Единственное различие между LVL735 и LVL317 составляет делеция аминокислоты Q в положении 23 последовательности LVL317. Сайты рестрикции NdeI и HindIII включали в 5'- и 3'-праймеры соответственно. Затем полученный продукт ПЦР встраивали в клонирующий вектор pET-26b(+) (NOVAGEN®).
Для получения вектора LVL736 (LVL291+SA) проводили сайт-направленный мутагенез, чтобы добавить аминокислоты S и A между аминокислотами 22 и 23 последовательности LVL291. Использовали LVL291 в качестве матрицы с праймерами CAN1531 и CAN1532 и набор для сайт-направленного мутагенеза QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent Technologies, Stratagene Division).
Для получения вектора LVL737 (LVL291 + A) проводили сайт-направленный мутагенез, чтобы добавить аминокислоту A между аминокислотами 22 и 23 последовательности LVL291. Использовали LVL291 в качестве матрицы с праймерами CAN1529 и CAN1530 и набор для сайт-направленного мутагенеза QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent Technologies, Stratagene Division).
Для получения вектора LVL738 (LVL291 AQIQ) проводили сайт-направленный мутагенез, чтобы удалить аминокислоты Q, I и Q в положениях 23-25 на последовательности LVL291. Использовали LVL291 в качестве матрицы с праймерами CAN1523 и CAN1524 и набор для сайт-направленного мутагенеза QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent Technologies, Stratagene Division).
Для получения вектора LVL739 (LVL291 AQQIQK) проводили сайт-направленный мутагенез, чтобы удалить аминокислоты Q, I, Q и K в положениях 23-26 последовательности LVL291. Использовали LVL291 в качестве матрицы с праймерами CAN1525 и CAN1526 и набор для сайт-направленного мутагенеза QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent Technologies, Stratagene Division).
Для получения вектора LVL740 (LVL291 AQQIQKA) проводили сайт-направленный мутагенез, чтобы удалить аминокислоты Q, I, Q, K и A в положениях 23-27 последовательности LVL291. Использовали LVL291 в качестве матрицы с праймерами CAN1527 и CAN1528 и набор для сайт-направленного мутагенеза QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent Technologies, Stratagene Division).
Для получения векторов LVL778 (LVL736 A6xHis tag), LVL779 (LVL737 A6xHis tag), LVL780 (LVL738 A6xHis tag), LVL781 (LVL739 A6xHis tag) и LVL782 (LVL740 A6xHis tag) проводили полимеразную цепную реакцию, используя векторы LVL736, LVL737, LVL738, LVL739 и LVL740 в качестве матрицы, соответственно с праймерами CAN1669 и CAN543. Делеция метки 6xHis tag соответствует аминокислотной последовательности GGHHHHHH (SEQ ID NO: 3) в C-концевых последовательностях. Данная делеция была включена в 3'-праймер. Сайты рестрикции NdeI и HindIII включали в 5'- и 3'праймеры соответственно. Затем полученный продукт ПЦР встраивали в клонирующий вектор pET26b(+)(NOVAGEN®).
- 49 031580
Таблица 4
Последовательности праймеров, используемых для амплификации PE, PilA и PE-PilA
Праймер ID Последовательность ДНК 5’- 3’
CAN534 CACACACATATGATTAAATTTCTCTCTGCATTAATTCTTCTACTGGTCACGACGGCGGC TCAGGCTGAGACTAAAAAAGCAGCGGTATCTG (SEQ ID NO: 155)
CAN535 TGTGTGAAGCTTTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGCCGCCTTGTGTGACACTTCCGCAAA AATTTGC (SEQ ID NO: 156)
CAN536 TTTGCGGAAGTGTCACACAAGGCGGCGCGCAGATTCAGAAGGCTGAACAAAATGATGT (SEQ ID NO: 157)
CAN537 ACATCATTTTGTTCAGCCTTCTGAATCTGCGCGCCGCCTTGTGTGACACTTCCGCAAA (SEQ ID NO: 158)
CAN538 TGTGTGAAGCTTTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGCCGCCTTTTTTATCAACTGAAAATG (SEQ ID NO: 159)
CAN540 CACACACATATGCACCACCACCACCACCACAGCGCGCAGATTCAGAAGGCTGAACAAAA TGATGT (SEQ ID NO: 160)
CAN541 CATTTTCAGTTGATAAAAAAGGCGGCACTAAAAAAGCAGCGGTATC (SEQ ID NO: 161)
CAN542 GATACCGCTGCTTTTTTAGTGCCGCCTTTTTTATCAACTGAAAATG (SEQ ID NO: 162)
CAN543 TGTGTGAAGCTTTTATTGTGTGACACTTCCGCAAA (SEQ ID NO: 163)
CAN544 CACACACATATGAAATACCTGCTGCCGACCGCTGCTGCTGGTCTGCTGCTCCTCGCTGC CCAGCCGGCGATGGCCCAGATTCAGAAGGCTGAACAAAATGATGT (SEQ ID NO: 164)
CAN545 GCATTTTCAGTTGATAAAAAAGGCGGCACTAAAAAAGCAGCGGTATCTG (SEQ ID NO: 165)
CAN546 CAGATACCGCTGCTTTTTTAGTGCCGCCTTTTTTATCAACTGAAAATGC (SEQ ID NO: 166)
CAN547 CACACACATATGAAATACCTGCTGCCGACCGCTGCTGCTGGTCTGCTGCTCCTCGCTGC CCAGCCGGCGATGGCCGATATTCAGAAGGCTGAACAAAATGATGT(SEQ ID NO: 167)
CAN548 CACACACATATGAAACACTTTCCATCCAAAGTACTGACCACAGCCATCCTTGCCACTTT CTGTAGCGGCGCACTGGCAGCCACAAACGACGACGATAAGGCTGAACAAAATGATG (SEQ ID NO: 168)
CAN670 GCCGGCGATGGCCATGGATAAGGCTGAACAAAATG (SEQ ID NO: 169)
CAN671 CATTTTGTTCAGCCTTATCCATGGCCATCGCCGGC (SEQ ID NO: 170)
CAN678 GGAAGTGTCACACAATAAGGCGGCCACCACCACC (SEQ ID NO: 171)
CAN679 GGTGGTGGTGGCCGCCTTATTGTGTGACACTTCC (SEQ ID NO: 172)
CAN 1517 GATATACATATGAAATACCTGCTGCCGACCGCTGCTGCTGGTCTGCTGCTCCTCGCTGC CCAGCCGGCGATGGCCATTCAGAAGGCTGAACAAAA(SEQ ID NO: 205)
CAN 1518 GGCCGCAAGCTTTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGCCGCC(SEQ ID NO: 206)
CAN 1519 GGCCGCAAGCTTTTATTGTGTGACACTTCC(SEQ ID NO: 207)
CAN 1523 GCTGCCCAGCCGGCGATGGCCAAGGCTGAACAAAATGATGTG (SEQ ID NO: 208)
CAN 1524 CACATCATTTTGTTCAGCCTTGGCCATCGCCGGCTGGGCAGC (SEQ ID NO: 209)
CAN 1525 GCTGCCCAGCCGGCGATGGCCGCTGAACAAAATGATGTGAAGC (SEQ ID NO: 210)
CAN 1526 GCTTCACATCATTTTGTTCAGCGGCCATCGCCGGCTGGGCAGC (SEQ ID NO: 211)
CAN 1527 GCTGCCCAGCCGGCGATGGCCGAACAAAATGATGTGAAGCTGG (SEQ ID NO: 212)
CAN 1528 CCAGCTTCACATCATTTTGTTCGGCCATCGCCGGCTGGGCAGC (SEQ ID NO: 213)
CAN 1529 GCTGCCCAGCCGGCGATGGCCGCCCAGATTCAGAAGGCTGAAC (SEQ ID NO: 214)
CAN 1530 GTTCAGCCTTCTGAATCTGGGCGGCCATCGCCGGCTGGGCAGC (SEQ ID NO: 215)
CAN 1531 GCTGCCCAGCCGGCGATGGCCAGCGCCCAGATTCAGAAGGCTGAAC (SEQ ID NO: 216)
CAN 1532 GTTCAGCCTTCTGAATCTGGGCGCTGGCCATCGCCGGCTGGGCAGC (SEQ ID NO: 217)
CAN 1669 CACACACATATGAAATACCTGCTGCCGACC (SEQ ID NO: 218)
MDesPILA -3 GAATTCCATATGCACCATCACCATCACCATACTAAAAAAGCAGCGGTATCTGAA (SEQ ID NO: 173)
MDesPILA -4 GCGCCGCTCGAGTCATTGTGTGACACTTCCGC (SEQ ID NO: 174)
MnoNTHi- 44 GCCCAGCCGGCGATGGCCCAGATCCAGAAGGCTGAACAAAATG (SEQ ID NO: 175)
MnoNTHi- 45 CATTTTGTTCAGCCTTCTGGATCTGGGCCATCGCCGGCTGGGC (SEQ ID NO: 176)
Трансформация.
Клетки Escherichia coli BLR (DE3) или E. coli HMS (DE3) трансформировали плазмидной ДНК в соответствии со стандартными методами с клетками, обработанными CaCl2. (Hanahan D. Plasmid transformation by Simanis In Glover, D.M. (Ed), DNA cloning. IRL Press London (1985): p. 109-135). Кратко, компетентные клетки BLR (DE3) или HMS174(DE3) подвергали мягкому оттаиванию на льду. С компетентными клетками смешивали приблизительно 4 мкл плазмиды (10-100 нг), используя 50-100 мкл компетентных клеток. Затем этот препарат инкубировали на льду в течение 30 мин. Для проведения реакции трансформации препарат подвергали тепловому импульсу при 42°C в течение 45 с, затем инкубировали на льду в течение 2 мин. К трансформированным клеткам добавляли приблизительно 0,5 мл среды SOC (сверхоптимальная среда с катаболитной репрессией, Super Optimal broth with Catabolite repression), и клеточную культуру инкубировали при 37°C в течение 1 ч, после чего высевали на агар Лурия-Бертани (LB), содержащий 50 мкг/мл канамицина. Высевали около 100 мкл трансформированной клеточной культуры и инкубировали в течение ночи при 37°C.
- 50 031580
Штамм BLR (DE3): BLR представляет собой recA- производное штамма BL21 (F- ompT hsdSB(rBmB-) gal dcm (DE3). Данный штамм E. coli, используемый для экспрессии рекомбинантных белков, улучшает выход мономеров плазмиды и может помочь стабилизировать плазмиды-мишени, содержащие повторяющиеся последовательности, или плазмиды, продукты которых могут вызвать потерю профага DE3. (Studier, F.W. (1991) J. Mol. Biol. 219: 37-44). Подробный генотип E. coli BLR (DE3) опубликован NOVAGEN®. (F-ompT hsdSB (rB- mB-) gal dcm A(srl-recA)306::Tn10 (TetR) (DE3).
Штамм HMS174 (DE3): штаммы HMS174 несут мутацию recA на генетическом фоне K-12. Как и BLR, эти штаммы могут стабилизировать некоторые гены-мишени, продукты которых могут вызвать потерю профага DE3. Подробный генотип E. coli HMS174 (DE3) опубликован NOVAGEN® (F- recA1 hsdR(rK12- mK12+) (DE3) (Rif R).
Продуцирование с использованием BLR (DE3) и характеризация конструкций, включающих His метку, описаны в примерах 3-6.
Пример 3. Экспрессия белка с использованием качалочной колбы.
Как правило, одну чашку конфлюэнтного агара, инокулированного Escherichia coli BLR (DE3), трансформированного рекомбинантной плазмидой, снимали, ресуспендировали в культуральной среде и использовали для инокуляции 800 мл среды LB (Becton, Dickinson and Company) с добавлением или без добавления 1% (мас./об., мас./об.) глюкозы (Laboratoire MAT, номер по каталогу: GR-0101) и 50 мкг/мл канамицина (Sigma) до получения OD60o нм (оптической плотности), составляющей от 0,1 до 0,2. Культуры инкубировали при 37°C при качании со скоростью 250 об/мин до достижения OD600 нм, приблизительно равной 0,8.
Затем 1 мл каждой культуры собирали, центрифугировали при 14000 об/мин в течение 5 мин и супернатанты и осадки по отдельности замораживали при -20°C.
При OD600 нм, приблизительно равной 0,8, культуры BLR (DE3) охлаждали (-20°C, 20 мин или 4°C, 1 ч, предпочтительно при 4°C в течение 1 ч), после чего индуцировали экспрессию рекомбинантного белка путем добавления 1 мМ изопропил-в-Э-1-тиогалактопиранозида (ИПТГ; EMD Chemicals Inc., номер по каталогу: 5815) и инкубации в течение ночи при 16, 22 и 30°C, или 3 ч при 37°C при встряхивании со скоростью 250 об/мин, предпочтительно в течение ночи при 22°C. После периода инкубации культуры центрифугировали при 14000 RPM в течение 5 мин или при 6000 об/мин в течение 15 мин и супернатант (образец фракции среды) и осадки (содержащие растворимую и нерастворимую фракции) замораживали при -20°C отдельно.
Эти условия используют для периплазматической экспрессии белка.
Пример 4. Очистка белка с использованием качалочной колбы, клеточных суспензий, конструкций, включающих His метку.
Каждый бактериальный осадок, полученный после индукции, ресуспендировали в буфере, представляющем собой 20 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновую кислоту (HEPES) (pH 8.0), содержащем 500 мМ NaCl, 10 мМ имидазол и смесь ингибиторов протеаз Roche COMPLETE® (1 таблетка/50 мл буфера HEPES, содержащего 500 мМ NaCl, таблетки Roche COMPLETE® ULTRA, Roche Diagnostics Corporation).
Альтернативно, вместо буфера HEPES, содержащего NaCl, можно использовать буфер, представляющий собой от 20 до 50 мМ бицин. Например, можно использовать буфер, представляющий собой 20 мМ бицин. Бактерии подвергали лизису, используя устройство фирмы Constant Systems 1,1 кВ 2X 30000 PSI (фунт/кв.дюйм; 206,8*103 кПА). Растворимый (супернатант) и нерастворимый (осадок) компоненты разделяли с помощью центрифугирования при 20000 g в течение 20 мин при 4°C.
Белки, включающие 6-His метку, очищали в нативных условиях аффинной хроматографией на иммобилизованных ионах металла (IMAC), используя протокол очистки белка PROFINIA™ (Bio-Rad Laboratories, Inc.). Растворимые компоненты наносили на колонку His Trap объемом 5 мл (Bio-Rad Laboratories, Inc.), предварительно уравновешенную тем же буфером, который используют для бактериальной суспензии; растворимые компоненты добавляли со скоростью вплоть до 5 мл/мин (с получением проточной фракции). После нанесения на колонку ее промывали 10 объемами колонки того же буфера со скоростью, составляющей 10 мл/мин (с получением промывочной фракции № 1). Вторую промывку проводили с использованием 20 мМ бицинового буфера или 20 мМ буфера HEPES (pH 8,0), содержащего 500 мМ NaCl и 20 мМ имидазол, с получением промывочной фракции № 2). Элюирование проводили, используя 2 объема колонки 20 мМ буфера HEPES или 50 мМ бицинового буфера (pH 8,0), содержащего 500 мМ NaCl и 250 мМ имидазол, со скоростью, составляющей 10 мл/мин, с получением фракции элюирования.
Для повышения чистоты белка, положительные фракции элюирования с IMAC объединяли и наносили на колонку для эксклюзионной хроматографии (SEC) (HILOAD™ SUPERDEX™ 200 26/60 от фирмы GE Healthcare), предварительно уравновешенную в фосфатно-солевом буферном растворе без кальция или магния (NaCl 137 мМ, KCl 2,7 мМ, Na2HPO4 8,1 мМ, KH2PO4 1,47 мМ, pH 7,4). Образцы из фракций элюирования анализировали электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ДСН-ПААГ). Образцы концентрировали, используя мембрану Centricon 10000 MW (Millipore).
Концентрацию белка определяли, используя спектрофотометр.
- 51 031580
Пример 5. Электрофорез в ДСН-ПААГ и Вестерн-блот-анализ конструкций, включающих His метку.
Анализ конструкций LVL317 и LVL318, не включающих His метку, в ДСН-ПААГ
Получение растворимой и нерастворимой фракции
Например, 1 мл культуры после индукции (см., например, пример 3 выше) центрифугировали при 14000 об/мин в течение 2 мин. Осадок повторно растворяли, используя 40 мкл реагента для экстракции белка BUGBUSTER® (NOVAGEN®, EMD4 Biosciences, Merck), с получением клеточной суспензии. Клеточную суспензию инкубировали на вращающейся платформе в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем клеточную суспензию центрифугировали при 14000 об/мин в течение 2 мин, чтобы отделить растворимую фракцию. Полученный в результате осадок (нерастворимую фракцию) повторно растворяли, используя 70 мкл деионизованной воды, 5 мкл дитиотрейтола (ДТТ) 1 М и 25 мкл 4X буфера для образца NUPAGE® LDS (додецилсульфат лития) (INVITROGEN™). Растворимую фракцию (супернатант клеточной суспензии повторно солюбилизированного осадка) добавляли к 30 мкл деионизованной воды, 5 мкл ДТТ 1 М и 25 мкл 4Х буфера для образца LDS.
Получение фракции среды.
Например, чтобы получить фракцию среды, 100 мкл супернатанта из индуцированной культуры цельных клеток после центрифугирования (см., например, пример 3 выше) концентрировали путем добавления 500 мкл реагента RC I (Bio-Rad Laboratories, Inc.); образец перемешивали и инкубировали в течение 1 мин при комнатной температуре. Затем к образцу добавляли 500 мкл реагента II (Bio-Rad Laboratories, Inc.) и перемешивали. Этот препарат центрифугировали при 14000 об/мин в течение 10 мин. Осадок повторно растворяли, используя 28 мкл деионизованной воды, 2 мкл ДТТ 1 М и 10 мкл LDS SB 4X.
Получение очищенной фракции.
Например, очищенные белки (например, полученные, как описано в примере 4) готовили для анализа в ДСН-ПААГ путем добавления 70 мкл образца, 5 мкл ДТТ 1 М и 25 мкл 4Х буфера для образца LDS.
Анализ в ДСН-ПААГ и перенос на нитроцеллюлозную мембрану.
Анализ в ДСН-ПААГ и перенос на нитроцеллюлозную мембрану проводили в соответствии с рекомендациями изготовителя (Invitrogen), используя гели NUPAGE® бис-трис 4-12%. Препараты образцов, буферы и условия миграции соответствовали условиям, рекомендованным поставщиками.
В одном примере на гель наносили 20 мкл образца из мастер-микса, содержащего 70 мкл фракции очищенного белка, 5 мкл ДТТ 1 М и 25 мкл LDS SB 4X.
После анализа образцов на гелях NUPAGE® бис-трис 4-12% белки переносили на нитроцеллюлозные мембраны.
Нитроцеллюлозные мембраны блокировали в течение 30 мин при 37°C, 60 об/мин, используя свежий раствор 3% молоко/ЗФР 1X. После блокирующей инкубации добавляли первичные антитела (антитело к 6X His Tag®, Abcam PLC, номер по каталогу: ab9108) при разведении 1:1000 в свежем растворе 3% молоко/ЗФР 1X и инкубировали в течение 1 ч при 37°C, 60 об/мин. Затем мембраны отмывали три раза, в течение 5 мин каждый раз, при комнатной температуре, используя 0,02% полисорбат 20 (например, TWEEN™ 20)/ЗФР 1X. Добавляли вторичные антитела (против IgG (H+L) кролика, меченые щелочной фосфатазой (AP), Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) при разведении 1:14000, используя свежий раствор 3% молоко/ЗФР 1X. Мембраны инкубировали в течение 1 ч при 37°C, 60 об/мин. Затем мембраны отмывали три раза, в течение 5 мин каждый раз, при комнатной температуре, используя 0,02% полисорбат 20 (например, TWEEN™ 20)/ЗФР 1X, после чего мембраны проявляли раствором, состоящим из 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфата/нитросинего тетразолия (например, BCIP®/NBT от Sigma-Aldrich®, 1 таблетка/10 мл воды).
Электрофорез в ДСН-ПААГ индуцированных бактериальных экстрактов для конструкций слитых белков LVL291, LVL268 и LVL269 см. на фиг. 1. Нерастворимую фракцию (I), растворимую фракцию (S) и фракцию культуральной среды (M) наносили для LVL291, LVL268 и LVL269 до и после индукции (ind).
Электрофорез в ДСН-ПААГ и Вестерн-блот-анализ, относящийся к экстрактам, для конструкций слитых белков LVL291, LVL268 и LVL269 см. на фиг. 2. Для очистки LVL291, LVL268 и LVL269 наносили проточную фракцию (Ft), промывочную фракцию (W) и фракцию элюирования (E). В качестве зонда для экстрактов использовали антитела против his метки.
Электрофорез в ДСН-ПААГ индуцированных бактериальных и очищенных экстрактов для конструкций слитых белков LVL291 и LVL315 см. на фиг. 3. Для LVL291 и LVL315 наносили фракцию культуральной среды (M), растворимую фракцию (Sol), нерастворимую фракцию (Ins), проточную фракцию (Ft), промывочную фракцию № 1 (W1), промывочную фракцию № 2 (W2) и фракцию элюирования (E).
Электрофорез в ДСН-ПААГ индуцированных бактериальных и очищенных экстрактов для конструкции слитого белка LVL312 см. на фиг. 4. Для LVL312 наносили фракцию культуральной среды (M), растворимую фракцию (Sol), нерастворимую фракцию (Ins), проточную фракцию (Ft), промывочную фракцию № 1 (W1), промывочную фракцию № 2 (W2) и фракцию элюирования (E).
- 52 031580
Электрофорез в ДСН-ПААГ растворимых фракций из индуцированных бактериальных экстрактов для конструкций слитых белков LVL291, LVL702, LVL736, LVL737, LVL738, LVL739, LVL740 и вектора pET26b (отрицательный контроль) см. на фиг. 25. (a) Эксперимент 1, (b) Эксперимент 2, (c) Эксперимент 3. Слитый белок PE-PilA указан стрелкой.
Среднее процентное содержание слитого белка в полосе в растворимой фракции из экспериментов 1, 2 и 3 см. на фиг. 26.
Бактериальные экстракты LVL317 и LVL318, используемые в анализе ДСН-ПААГ на фиг. 5 и фиг. 6 соответственно, в целом были получены, как описано выше.
Фиг. 5. Электрофорез в ДСН-ПААГ индуцированных (1 мМ и 10 мкМ ИПТГ) бактериальных экстрактов для конструкции слитого белка LVL317. Экстракты до (NI) и после индукции (In), растворимой фракции (S), нерастворимой фракции (I).
Фиг. 6. Электрофорез в ДСН-ПААГ индуцированных (1 мМ и 10 мкМ ИПТГ) бактериальных экстрактов для конструкции слитого белка LVL318. Экстракты до (NI) и после индукции (In), фракции культуральной среды (M), растворимой фракции (S), нерастворимой фракции (I).
Белки, разделенные электрофорезом в ДСН-ПААГ, переносили на мембрану Immobilon-P. Полосы белка, окрашенные Кумасси синим, вырезали и помещали в реактор для секвенирования. Секвенирование проводили в соответствии с протоколом изготовителя, используя секвенатор Applied Biosystems PROCISE® Protein Sequencer, модель 494-cLC.
Таблица 5
Профили экспрессии белка в качалочной колбе и отщепление сигнального пептида для конструкций слитого белка
ID конструкции слитого белка Описание N-конец —> С-конец Профиль экспрессии белка Отщепление сигнального пептида
LVL312 Flgl sp - Е - фрагмент PilA - GG фрагмент РЕ -GGHHHHHH In: +++ So: + Se: + Подтверждено
LVL291 PelB sp - Фрагмент РЕ - GG - Фрагмент PilA- GGHHHHHH In : +++ So : ++ Se: + Подтверждено
LVL268 PelB sp - D - Фрагмент PE - GG Фрагмент PilA- GGHHHHHH In : +++ So : ++ Se: + Подтверждено
LVL269 NadA sp - ATNDDD - Фрагмент PE - GG - Фрагмент PilA GGHHHHHH In : +++ So : ++ Se: + Подтверждено
LVL270 MHHHHHH - Фрагмент PE - GG - Фрагмент PilA In : + So: - Se: - Не тестировали
LVL315 PelB sp - MD - Фрагмент PE - GG - Фрагмент PilA- GGHHHHHH In : +++ So : ++ Se: + Подтверждено
LVL317 PelB - Фрагмент PE - GG - Фрагмент PilA In : +++ So : + Se: Nt Подтверждено
LVL318 PelB sp - MD - Фрагмент PE - GG - Фрагмент PilA In : +++ So: + Se: -
LVL702 PelB sp - Фрагмент PE - GG - Фрагмент PilA- GGHHHHHH In : +++ So : ++ Se: Nt Подтверждено
LVL736 PelB sp - Фрагмент PE - GG - Фрагмент PilA- GGHHHHHH In : +++ So : ++ Se: Nt Подтверждено
LVL737 PelB sp - Фрагмент РЕ - GG - Фрагмент PilA- GGHHHHHH In : +++ So : ++ Se: Nt Подтверждено
LVL738 PelB sp - Фрагмент PE - GG - Фрагмент PilA- GGHHHHHH In : +++ So : ++ Se: Nt Подтверждено
LVL739 PelB sp - Фрагмент PE - GG - Фрагмент PilA- GGHHHHHH In : +++ So : ++ Se: Nt Подтверждено
LVL740 PelB sp - Фрагмент PE - GG - Фрагмент PilA- GGHHHHHH In : +++ So : ++ Se: Nt Подтверждено
- 53 031580
So = Растворимая фракция. In = Нерастворимая фракция. Se = Белок, секретируемый во фракцию среды. Nt = не тестировали.
Приведенная ниже оценка основана на визуальном осмотре (Кумасси) - +: низкая экспрессия; ++: средняя экспрессия; +++: высокая экспрессия; -: отсутствие экспрессии
Пример 6. Характеризация слитого белка LVL291.
Физические свойства LVL291: укладка PE и PilA в LVL291 и температура плавления.
Круговой дихроизм.
Анализ вторичной структуры.
Круговой дихроизм (CD) используют для определения вторичной структуры композиции белка путем измерения различия в поглощении света с левой круговой поляризацией по сравнению со светом с правой круговой поляризацией за счет структурной асимметрии. Форма и величина спектров CD в области далекого УФ-излучения (190-250 нм) различаются в зависимости от того, проявляет ли белок структуру бета-слоя, альфа-спирали или статистической спирали. Относительное содержание каждого типа вторичной структуры в данном образце белка можно вычислить путем сравнения с эталонными спектрами.
Спектры далекого УФ-излучения измеряют на спектрополяриметре Jasco J-720, используя оптический путь, составляющий 0,01 см от 178 до 250 нм, причем, разрешение и ширина полосы составляют 1 нм. Температуру кюветы поддерживают при 23°C с помощью термостатированного блока кюветы Peltier RTE-111. Во время измерения поддерживают скорость потока азота, составляющую 10 л/мин.
Результаты.
Спектры CD далекого УФ-излучения, полученные для белков PE (из конструкции pRIT16762), PilA (из конструкции pRIT 16790) и PE-PilA, являются характеристическими для уложенных белков, содержащих смесь альфа- и бета-структур, но PE значительно богаче альфа-спиралями, чем PilA и PE-PilA (фиг. 7, спектры CD РЕ, PilA и слитых белков PE-PilA).
С целью оценки целостности укладки индивидуальных белков PE и PilA, когда они связаны вместе в виде химерного белка, а затем проверки возможного взаимодействия между ними, вычисляли разностные спектры.
Когда спектры далекого УФ-излучения PE и PilA объединяют, полученный в результате спектр накладывается на спектр химерного белка PE-PilA (фиг. 8, объединение спектра CD PE и PilA). Этот результат позволяет предположить, что химерный белок PE-PilA содержит все вторичные структуры, обнаруживаемые в индивидуальных компонентах. Он также позволяет предположить, что слияние белков не оказывает значительного воздействия на вторичные структуры индивидуальных компонентов, и, следовательно, что укладка PE и PilA по отдельности и в виде слитого белка значительно не отличается.
Оценка температуры плавления.
Чтобы оценить, влияет ли экспрессия в виде слитого белка на термодинамические свойства индивидуальных белков, температуры плавления PEE, PilA и PE-PilA определили путем мониторинга развертывания альфа-спирали под действием температуры с помощью кругового дихроизма.
Присутствие альфа-спирали характеризуется минимумом сигнала кругового дихроизма при 222 нм, поэтому значительное возрастание сигнала CD при 222 нм во время повышения температуры является показателем денатурации белка. Определение температуры, при которой происходит утрата вторичной структуры белка, позволяет определить его температуру плавления (Tm), соответствующую температуре, при которой половина белков утратила свою структуру.
Температуру плавления можно определить путем идентификации точки максимальной кривизны на кривой термической денатурации, полученной на основании диаграммы температуры против CD при 222 нм.
Температура плавления PilA и PE, определенная посредством CD далекого УФ-излучения, составляет соответственно 52 и 68°C (фиг. 9, кривая термической денатурации PilA; фиг. 10, кривая термической денатурации PE).
Слитый белок PE-PilA проявляет два отдельных значения Tm при 48 и 71°C (фиг. 11, кривая термической денатурации слитого белка PE-PilA). Эти значения указывают на то, что белки PE и PilA при связывании в виде химерного белка все же уложены независимо, и что они развертываются при подобной температуре, находясь отдельно или в слиянии. Результаты наблюдений, что развертывание участка PilA при 48°C не вызывает осаждения или воздействия на Tm участка PE при 71°C, являются явным признаком того, что взаимодействие между PE и PilA внутри слитого белка является минимальным, и что они не обладают значительным наблюдаемым воздействием друг на друга. Температуры плавления этих белков чувствительны к различным внешним условиям, включая состав буфера или присутствие взаимодействующих молекул; то, что значительных изменений при слиянии PE и PilA не наблюдают, является явным признаком сохранения большей части структуры и свойств как PE, так и PilA при их связывании вместе.
Пример 7. Процесс ферментации.
- 54 031580
Слитые белки по изобретению могут быть получены способами, известными специалистам в данной области техники.
Пример 8. Очистка белка PE, PilA и LVL317.
Очистка белка PE из DRIT16762.
Для получения экспрессионного вектора pRIT16762 вектор pRIT16711 расщепляли, используя ферменты рестрикции BamHI и NcoI, чтобы делетировать 6 аминокислотных остатков между сигнальной последовательностью (pelB) и PE. Полученный вектор был назван pRIT16712. В этом векторе между сигнальной последовательностью pelB и PE находится 3 аминокислоты: MDP. На второй стадии проводили сайт-направленный мутагенез, чтобы изменить аминокислотную последовательность с MDP на QIQ, используя pRIT16712 в качестве матрицы, с праймерами MnoNTHi-44 и MnoNTHi-45 (описаны в табл. 4) и набор для сайт-направленного мутагенеза QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent Technologies, Stratagene Division).
Рабочий посевной материал E. coli BLR(DE3), содержащий PE QIQ (из конструкции pRIT16762), оттаивали с -80°C и использовали для приготовления 100 мл предварительной культуры в среде LB путем инкубации в течение ночи при 37°C при качании при 215 об/мин. После ночной инкубации восемь колб, содержащих 800 мл среды LB APS, инокулировали 12,5 мл предварительной культуры, и измеренное значение OD600 составляло около 0,06. Культуры инкубировали в течение 3 ч при 37°C при встряхивании. При значении OD600 около 0,9 добавляли 1 мМ ИПТГ, чтобы начать индукцию. Во время индукции культуры инкубировали в течение 19 ч при 22°C при встряхивании. После индукции значение OD600 составляло около 2,2. Клеточные культуры переносили в центрифужные пакеты объемом 1 л, помещенные внутри флаконов объемом 1 л, центрифугировали при 4°C в течение 30 мин при 6000*g и супернатант отбрасывали. Аликвоты культуры объемом 1 мл до и после индукции и супернатант хранили для дальнейшего анализа.
Лизис индуцированного штамма BLR(DE3), содержащего PE QIQ.
Центрифужные пакеты извлекали из центрифужных флаконов, открывали и осадок выталкивали из пакета в химический стакан. Восемь осадков объединяли вместе и ресуспендировали в 100 мл связывающего буфера (20 мМ HEPES, 10 мМ имидазол, 500 мМ NaCl, pH 8,01). Штамм E. coli BLR (DE3), содержащий конструкцию PE QIQ, разрушали с помощью клеточного дезинтегратора TS Series Bench Top от фирмы Constant Systems Ltd. (1*30 kPsi (1*206,8*103 кПА); 1*15 kPsi (1*103,4*103 кПА)). Лизат центрифугировали в течение 30 мин, 6000 об/мин, 4°C. Супернатант сохраняли и наносили на колонку IMAC.
Очистка PE QIQ с помощью IMAC.
Колонку IMAC (BioRad, Bio-Scale Mini Profinity IMAC картридж 5 мл) уравновешивали 5CV связывающего буфера (20 мМ HEPES, 10 мМ имидазол, 500 мМ NaCl, pH 8,01) при 5 мл/мин. На колонку IMAC наносили 100 мл супернатанта лизата при 2,5 мл/мин. Проточную фракцию собирали фракциями по 50 мл для дальнейшего анализа. Колонку промывали 3CV связывающего буфера, чтобы удалить несвязавшийся белок. Образцы, содержащие несвязавшиеся белки, собирали в одну аликвоту объемом 15 мл в пробирку на 50 мл. Колонку промывали 2CV буфера промывки (20 мМ HEPES, 20 мМ имидазол, 500 мМ NaCl, pH 8,01), собирали во фракциях по 2 мл в 96-луночный планшет. Затем связанный белок элюировали 6CV 100% буфера элюирования (20 мМ HEPES, 250 мМ имидазол, 500 мМ NaCl, pH 8,01). Элюированный белок собирали фракциями по 2 мл в 96-луночные планшеты. Промывку и элюирование проводили при 5 мл/мин.
Эксклюзионная хроматография (SEC) на пуле IMAC РЕ QIQ.
Колонку SEC (GE Healthcare, HILOAD™ 26/60 SUPERDEX™ 75 марки для препаративных целей, высота 60 см, объем приблизительно 319 мл) уравновешивали 3CV буфера SEC (20 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, pH 8,49). На колонку наносили 11 мл элюата IMAC при скорости тока 2,5 мл/мин. Фракции по 2 мл собирали от 0,3 CV до 0,9 CV. Проводили два анализа, а затем фракции анализировали с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ. Фракции от двух анализов, содержащие белок Prot E, объединяли вместе (пул SEC, суммарный объем приблизительно 48 мл). К пулу SEC добавляли 500 мМ аргинина.
Дозирование объединенных образцов PE QIQ, полученных в описанном выше протоколе SEC.
Пул SEC дозировали способом RCDC (совместимым с восстанавливающим агентом и детергентом) из набора Bio-Rad RC DC™, следуя протоколу изготовителя.
Для каждого тестируемого образца и стандарта 25 мкл распределяют в микроцентрифужные пробирки в двух повторах. В каждую пробирку добавляют 125 мкл реагента I Bio-Rad RC; каждую пробирку перемешивают на вортексе и инкубируют в течение 1 мин при комнатной температуре. В каждую пробирку добавляют 125 мкл реагента II Bio-Rad RC; каждую пробирку перемешивают на вортексе, а затем центрифугируют при 14000*g в течение 5 мин. Супернатанты отбрасывают путем переворачивания пробирок на чистую поглощающую тонкую бумагу, позволяя жидкости полностью вытечь из пробирок. В каждую пробирку добавляют 25,4 мкл реагента A (заранее приготовленного путем смешивания 20 мкл реагента S на 1 мл реагента A); каждую пробирку перемешивают на вортексе и инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин или до полного растворения осадка. Перед переходом к следующей стадии перемешивают на вортексе. В каждую пробирку добавляют 200 мкл реагента B RC и сразу пере
- 55 031580 мешивают на вортексе. Инкубируют при комнатной температуре в течение 15 мин. Все образцы переносят в 96-луночный планшет и считывают поглощение при 750 нм, чтобы определить концентрацию белка для каждого неизвестного образца белка.
Концентрация ProtE составляла 1,069 мг/мл.
Очистка белка PilA, включающего His метку.
PilA очищали, следуя общему методу, описанному ниже.
Клетки E. coli, содержащие конструкцию, кодирующую PilA или его фрагмент, суспендируют в смеси BUGBUSTER® и нуклеазы BENZONASE® (NOVAGEN®), например 10 мл BUGBUSTER® и 10 мкл нуклеазы BENZONASE®. Клеточный лизат перемешивают при комнатной температуре на вращающейся платформе, например, в течение 15 мин. Клеточный лизат центрифугируют при 4°C, например, при 16000 g в течение 20 мин. Супернатант, содержащий белок, наносят на колонку Ni NTA, содержащую смолу Ni NTA HIS/BIND®, и перемешивают при 4°C, например, в течение 1 ч. Колонка может состоять из 2 мл смолы Ni NTA HIS BIND® (NOVAGEN®) и 10 мл 1X связывающего буфера (из набора Ni NTA фирмы NOVAGEN®). Затем собирают проточную фракцию колонки. Смолу промывают два раза 1X буфером промывки, например, содержащим 300 мМ NaCl, 50 мМ NaH2PO4, 25 мМ имидазол, pH 8,0. Промывку собирают самотеком. Белок элюируют из колонки 1X буфером элюирования, например 300 мМ NaCl, 50 мМ NaH2PO4, 250 мМ имидазол, pH 8,0. Белок можно дополнительно очистить с помощью диализа связывающим буфером и повторно пропустить через колонку Ni NTA, как описано выше.
Расщепление PilA тромбином.
Затем PilA инкубируют с тромбином (разведенным 1/50) при комнатной температуре в течение 16 ч, чтобы удалить гистидиновую метку.
Эксклюзионная хроматография (SEC) на PilA, расщепленном тромбином.
Колонку SEC (GE Healthcare, HILOAD™ 26/60 SUPERDEX™ 75 марки для препаративных целей, высота 60 см, объем приблизительно 319 мл) уравновешивали 5CV буфера SEC (20 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, pH 8,52). На колонку наносили приблизительно 10 мл расщепленного PilA при скорости тока 2,5 мл/мин. Фракции по 2 мл собирали от 0,3 CV до 0,9 CV. Проводили два анализа, а затем фракции анализировали с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ. Фракции от двух анализов, содержащие расщепленный белок PilA, объединяли вместе (пул SEC, суммарный объем приблизительно 52 мл).
Дозирование PilA, пул SEC.
Пул SEC дозировали способом RCDC, как описано выше. Концентрация расщепленного PilA составляла 5,37 мг/мл.
Диализ пула SEC PilA ЗФР 1х pH 7,4 (коэффициент диализа = 1600) и дозирование с помощью RCDC.
Концентрация после диализа, определенная с помощью RCDC, составляла 3,0 мг/мл.
Очистка LVL317.
Осмотический шок.
Поскольку экспрессия и процессинг слитого белка LVL317 происходит в периплазме бактерий, белок экстрагировали с помощью осмотического шока.
Замороженную (-20°C) собранную клеточную суспензию E. coli B2448, содержащую LVL317, из культуры в ферментере объемом 4 л объединяли и ресуспендировали в гипертоническом буфере, состоящем из 24 мМ Трис-HCl 16% (мас./об.) сахарозы, 9,9% (мас./об.) глюкозы, 10 мМ ЭДТА, pH 8,0, вплоть до конечного объема, составляющего 4 л. Суспензию мягко перемешивали в течение 30 мин при комнатной температуре, используя трехлопастную мешалку, установленную на базовом смесителе RW 16, при средней скорости. Суспензию центрифугировали при 15900xg в течение 30 мин при комнатной температуре. Супернатант (SN1) хранили для анализа в геле.
Полученный в результате осадок ресуспендировали в гипотоническом растворе, представляющем собой 38 мМ MgCl2, и перемешивали в течение 30 мин при комнатной температуре. Смесь центрифугировали при 15900 xg в течение 30 мин при комнатной температуре, и антиген выделили в супернатанте (SN2).
Осветление SN2 проводили путем фильтрования через полиэфирсульфоновый фильтр 0,45/0,2 мкм Sartorius Sartopore 2 MidiCap при скорости тока, составляющей 600 мл/мин.
Супернатант SN2 разводили 1:3 20 мМ NaH2PO4-Na2HPO4, pH 7,0, при необходимости доводили pH до 7,0 и проводили еще одно осветление путем фильтрования через полиэфирсульфоновый фильтр 0,45/0,2 мкм Sartorius Sartopore 2 MidiCap при скорости тока, составляющей 600 мл/мин.
Хроматография на SP-сефарозе™ Fast Flow (SP FF).
Разведенный/отфильтрованный супернатант SN2 наносили и иммобилизовали на сильной катионообменной смоле (SP-сефароза™ FF фирмы GE Healthcare) на колонке, имеющей ID (внутренний диаметр) 14 см и длину 20 см (объем колонки 3100 мл), уравновешенной 2CV буфера, представляющего собой 20 мМ NaH2PO4/Na2HPO4, pH 7,0. После промывания колонки 5CV буфера 20 мМ NaH2PO4/Na2HPO4 pH 7,0 антиген (содержащийся в LVL317) элюировали путем повышения концентрации NaCl вплоть до 100 мМ в таком же буфере промывки.
- 56 031580
Характерную хроматограмму на SP-сефарозе™ Fast Flow см. на фиг. 12.
Хроматография на Q-сефарозе™ Fast Flow (Q FF).
Антиген, присутствующий в элюате SP FF, разводили 1:4 20 мМ Трис pH 8,5, при необходимости доводили pH до 8,5 и пропускали через сильную анионообменную смолу (Q-сефароза™ FF фирмы GE Healthcare) на колонке, имеющей ID (внутренний диаметр) 14 см и длину 11,8 см (объем колонки 1800 мл), уравновешенной 2CV 20 мМ Трис-буфером pH 8,5. Антиген был выделен в проточной фракции.
Характерную хроматограмму на Q-сефарозе™ Fast Flow см. на фиг. 13.
Концентрирование, диафильтрация, добавление полисорбата 80 и стерильное фильтрование.
Проточную фракцию Q FF, содержащую антиген, концентрировали до 0,7-0,8 мг/мл на основании хроматограммы УФ и подвергали диафильтрации 5DV буфера, представляющего собой 10 мМ KH2PO4/K2HPO4 pH 6,5, используя мембрану Pellicon-2™ с порогом отсечения молекулярной массы 10 кДа (Millipore).
Используя 5% исходный раствор, полисорбат 80 (например, TWEEN™ 80) добавляли к ретентату ультрафильтрации и перемешивали в течение 30 мин магнитной мешалкой при 130 об/мин при 4°C. Конечная концентрация полисорбата 80 составляла 0,04%. Ретентат ультрафильтрации стерилизовали фильтрованием через целлюлозоацетатную мембрану 0,45/0,2 мкм (Sartobran 300, Sartorius). Очищенную партию хранили при -20 или -80°C. Абсолютная концентрация белка, измеренная с помощью AAA (аминокислотного анализа), составляла 0,737 мг/мл.
Пример 9. Использование полисорбата 80.
Эксперимент по титрованию показал, что добавление полисорбата 80, в частности TWEEN™ 80, до конечной концентрации, составляющей 0,04% (мас./об.) от очищенной партии, перед стерилизационным фильтрованием уменьшает образование нитевидных частиц и агломерацию.
Согласно анализу ДСК, TWEEN™ 80 снижал степень структурного изменения (30-45°C), наблюдаемого после циклов замораживания/оттаивания после хранения при -20°C и после хранения в течение 4 суток при 4, -20, -80 и 37°C.
Пример 10. Электрофорез в ДСН-ПААГ и Вестерн-блот-анализ LVL317.
Электрофорез в ДСН-ПААГ и Вестерн-блот-анализ.
На гель NUPAGE®, бис-трис 4-12%, наносили, как описано ниже, 10 мкг образца в буфере для образца NUPAGE® LDS, содержащем 50 мМ ДТТ, нагретого в течение 5 мин при 95°C (для образцов, имеющих низкую концентрацию, наносили 20 мкл образца). Продвижение: 35 мин при 200 В при комнатной температуре (КТ) в подвижном буфере NUPAGE® MES. Гель окрашивали в течение 2 ч в Instant blue (Novexin № по каталогу: ISB01L) и удаляли окрашивание в течение ночи в воде.
Содержание дорожек:
1: стандарт MW (молекулярной массы) (10 мкл),
2: начало (суммарная фракция) (10 мкг),
3: SN1 нефильтрованная (10 мкг),
4: SN2 нефильтрованная (10 мкг),
5: не экстрагированная (10 мкг),
6: нанесение на SP FF (10 мкг),
7: проточная фракция SP FF (6,9 мкг),
8: промывка SP FF (20 мкл),
9: элюирование SP FF (10 мкг),
10: смыв с колонки SP FF (10 мкг),
11: нанесение Q FF (8,9 мкг),
12: элюирование Q FF (9,8 мкг),
13: смыв с колонки Q FF (4,8 мкг),
14: ретентат TFFb перед добавлением 0,04% TWEEN™ 80 (10 мкг),
15: очищенная нефильтрованная партия, добавлен 0,04% TWEEN™ 80 (10 мкг),
16: очищенная стерильно фильтрованная партия; добавлен 0,04% TWEEN™ 80 (10 мкг),
17: очищенная стерильно фильтрованная партия; добавлен 0,04% TWEEN™ 80 (20 мкг + добавленный клеточный лизат E. coli Rix (1 мкг)),
18: клеточный лизат E. coli Rix (2 мкг),
19: клеточный лизат E. coli Rix (1 мкг),
20: клеточный лизат E. coli Rix (0,5 мкг).
Электрофорез образцов, отбираемых в ходе процесса, в ДСН-ПААГ из процесса очистки слитого белка PE-PilA см. на фиг. 14.
Для Вестерн-блоттинга белки переносили при 4°C в течение ночи при 30 В в буфере для блоттинга NUPAGE® + 20% метанол, 0,1% ДСН на нитроцеллюлозной мембране. Мембраны блокировали в течение 1 ч 50 мМ Трис, 150 мМ NaCl pH 7,4 + 5% обезжиренное сухое молоко, инкубировали в течение 2 ч в первичном поликлональном антителе кролика, разведенном в блокирующем буфере (anti-Prot-E 1/50000 и anti-E. coli (BLR) 1/1000), промывали 3*5 мин в 50 мМ Трис pH 7,4 + 0,05% Tween 20, инкубировали в течение 1 ч во вторичном антителе (антителе коза против кролика, конъюгированном со щелочной фос
- 57 031580 фатазой, разведенном 1/5000 в блокирующем буфере), промывали 3*5 мин в буфере для промывки и проявляли субстратом BCIP/NBT (1 таблетка на 10 мл). Все инкубации проводили в 25 мл на мембрану.
Вестерн-блоттинг образцов, отбираемых в ходе процесса, из процесса очистки слитого белка PEPilA см. на фиг. 15. При блоттинге использовали поликлональное антитело кролика anti-PE.
Содержание дорожек:
1: стандарт MW (10 мкл),
2: начало (суммарная фракция) (10 мкг),
3: SN1 нефильтрованная (10 мкг),
4: SN2 нефильтрованная (10 мкг),
5: не экстрагированная (10 мкг),
6: нанесение на SP FF (10 мкг),
7: проточная фракция SP FF (6,9 мкг),
8: промывка SP FF (20 мкл),
9: элюирование SP FF (10 мкг),
10: смыв с колонки SP FF (10 мкг),
11: нанесение Q FF (8,9 мкг),
12: элюирование Q FF (9,8 мкг),
13: смыв с колонки Q FF (4,8 мкг),
14: ретентат TFFb перед добавлением 0,04% TWEEN™ 80 (10 мкг),
15: очищенная нефильтрованная партия, добавлен 0,04% TWEEN™ 80 (10 мкг),
16: очищенная стерильно фильтрованная партия; добавлен 0,04% TWEEN™ 80 (10 мкг),
17: очищенная стерильно фильтрованная партия; добавлен 0,04% TWEEN™ 80 (20 мкг + добавленный клеточный лизат E. coli Rix (1 мкг)),
18: клеточный лизат E. coli Rix (2 мкг),
19: клеточный лизат E. coli Rix (1 мкг),
20: клеточный лизат E. coli Rix (0,5 мкг).
Вестерн-блоттинг образцов, отбираемых в ходе процесса, из процесса очистки слитого белка PEPilA см. на фиг. 16. При блоттинге использовали поликлональное антитело кролика anti-E. coli (BLR).
Содержание дорожек:
1: стандарт MW (10 мкл),
2: начало (суммарная фракция) (10 мкг),
3: SN1 нефильтрованная (10 мкг),
4: SN2 нефильтрованная (10 мкг),
5: не экстрагированная (10 мкг),
6: нанесение на SP FF (10 мкг),
7: проточная фракция SP FF (6,9 мкг),
8: промывка SP FF (20 мкл),
9: элюирование SP FF (10 мкг),
10: смыв с колонки SP FF (10 мкг),
11: нанесение Q FF (8,9 мкг),
12: элюирование Q FF (9,8 мкг),
13: смыв с колонки Q FF (4,8 мкг),
14: ретентат TFFb перед добавлением 0,04% TWEEN™ 80 (10 мкг),
15: очищенная нефильтрованная партия, добавлен 0,04% TWEEN™ 80 (10 мкг),
16: очищенная стерильно фильтрованная партия; добавлен 0,04% TWEEN™ 80 (10 мкг),
17: очищенная стерильно фильтрованная партия; добавлен 0,04% TWEEN™ 80 (20 мкг + добавленный клеточный лизат E. coli Rix (1 мкг)),
18: клеточный лизат E. coli Rix (2 мкг),
19: клеточный лизат E. coli Rix (1 мкг),
20: клеточный лизат E. coli Rix (0,5 мкг).
Примечания к фигурам электрофореза в ДСН-ПААГ и Вестерн-блот-анализа: слитый белок PE-PilA мигрирует при 30 кДа. Экстракция путем осмотического шока позволяет экстрагировать слитый белок, экспрессия и процессинг которого происходит в периплазме бактерий, имеющий уменьшенную бактериальную контаминацию. Происходят небольшие потери слитого белка в процессе гипертонической обработки (дорожка 3). Небольшая часть не экстрагируется гипотонической обработкой и остается связанной с клетками (дорожка 5). Небольшая потеря происходит в проточной фракции SP FF (дорожка 7) и в фракции смыва с колонки является обеих колонок (дорожки 10 и 13). Поскольку общий объем фракции смыва с колонки является низким, потеря слитого белка незначительна. Деградированные полосы видны в смыве с колонки, но не видны в конечном продукте. В очищенной партии отсутствует значительное загрязнение белками клетки-хозяина из E. coli (дорожка 16).
В результате анализа LVL735 и LVL778 получили профили, подобные профилям LVL317.
Пример 11. Данные температуры плавления для PE, PilA и LVL317.
- 58 031580
Температурный переход слитого белка PE-PilA, не включающего His-метку (LVL317), сравнивали с температурным переходом обоих his-меченых белков PE (как описано в примере 8) и расщепленных белков PilA (как описано в примере 8), очищенных, как описано выше.
Перед ДСК белки PE и PilA подвергали диализу в течение ночи в 10 мМ K2HPO4/KH2PO4 pH 6,5 + 0,04% Tween 80 (отношение образец: объем буфера составляет 1:250), чтобы они находились в том же буфере, что и слитый белок. После диализа концентрацию белка измеряли BCA и доводили до 300 мкг/мл (PE) и 500 мкг/мл (PilA).
Анализ проводили на приборе VIл™-ДСК от фирмы MicroCal, LLC (отделение GE Healthcare). Конечный буфер для диализа использовали в качестве стандарта и вычитали из сканирований. Скорость сканирования ДСК составляла 90°CM. В целях оценки способности к измерению температурного перехода в конечном контейнере (FC; Final Container) после приготовления препарата, слитый белок разводили до концентрации FC (60 мкг/мл). Данные конечного контейнера не представлены.
Результаты.
Температурный переход для слитого белка PE-PilA и белков PE и PilA см. на фиг. 17. Кривые: PilA (1), белок У (Prot E, ЗУ) (2), PE-PilA PB неразведенный 737 мкг/мл (3) и PE-PilA PB, разведенный при концентрации FC, составляющей 60 мкг/мл (4).
PilA Tm: 53°С
Белок Е Tm: 63
PE-PilA РВ (очищенная партия) неразведенный Тт< 53,7°С иТт2: 66,1 °C
737 мкг/мл
PE-PilA РВ, разведенный в концентрации FC 60 Тт1: 53,2°С и Тт2: 67,6°С мкг/мл
В очищенном слитом белке (LVL317) было обнаружено два перехода (кривые 3 и 4).
Значение Tm1 (53,7°C) слитого белка PE-PilA является близким значению перехода PilA (53°C).
Значительный сдвиг наблюдают в Tm2 в PE-PilA (66,1°C) по сравнению с переходом PE (63°C). Слияние обоих доменов, по-видимому, стабилизирует фрагмент PE.
Сдвиг значения Tm2 в разведенном слитом белке по сравнению с неразведенным является артефактом концентрации, возникающим в результате круто снижающегося наклона, типичного для агрегации, которая зависит от концентрации.
Анализ укладки антигена LVL735 и LVL778 выявил сходство с LVL317.
Пример 12. Иммунный ответ против PilA на конструкцию слитого белка PE-PilA LVL291 у мышей Balb/c.
Иммунный ответ, направленный против очищенного слитого белка PE-PilA LVL291 (слитого белка LVL291 без гетерологичного сигнального пептида), включенного в композицию AS03A, оценивали у мышей Balb/c. Животных (20 мышей/группа) иммунизировали внутримышечным путем на сутки 0, 14 и 28 10 мкг PE (с вектора pRIT16762), PilA (с вектора pRIT16790) или PE-PilA, где каждый был включен в препарат AS03a. Контрольную группу вакцинировали только одним AS03a. Ответ антител, направленных против каждого антигена, определяли в индивидуальных сыворотках, собранных на сутки 42. При отрицательном контроле ответ антител не был получен. Как показано на фиг. 18, ответ антител, направленных против PilA, был выше у мышей, иммунизированных слитым белком PE-PilA, по сравнению с ответом антител у мышей, иммунизированных моновалентным PilA. Ответы антител, направленных против PE, были сходными у мышей, иммунизированных слитым белком, и мышей, иммунизированных моновалентным PE. GMT = средний геометрический титр. Данные снимали и анализировали с помощью программного обеспечения SOFTMAX® Pro Software (Molecular Devices) для WINDOWS® (Microsoft); для вычисления стандартной кривой использовали четырехпараметрическую логистическую логарифмическую функцию. Четырехпараметрическая логистическая логарифмическая функция с высокой степенью точности описывает кривую сравнительного сывороточного дисплея выраженной сигмовидной формы при нанесении на график оптической плотности против концентрации (логарифмический масштаб). Концентрации антител вычисляли при каждом разведении образцов сыворотки мышей путем интерполяции стандартной кривой. Антитело в сыворотках контроля качества и в неизвестных образцах сыворотки получают путем усреднения значений всех разведений, которые попадают в пределы рабочего диапазона (10-80%) кривой разведения стандарта.
Результаты представлены на фиг. 18, где графически представлены ответы антител против слитого белка PE-PilA LVL291 и против моновалентных PE и PilA в модели мыши Balb/c.
Пример 13. Модель колонизации носоглотки мыши. Иммунизация PE-PilA. Провокация штаммом NTHi 86-028NP и штаммом NTHi 3224A.
Самок мышей Balb/c (20/группа) иммунизировали интраназально 6 мкг очищенного слитого белка PE-PilA (LVL291 для провокации 86-028NP; LVL317 для провокации штаммом 3224A), включенного в композицию с LT (термолабильный токсин Escheria coli) на сутки 0 и 14 и 6 мкг очищенного слитого белка PE-PilA в забуференном фосфатом физиологическом растворе (ЗФР) на сутки 28. Контрольных
- 59 031580 мышей (20/группа) вакцинировали только одним LT. Затем мышам проводили интраназальную провокацию 5*106 KOE (колониеобразующих единиц) гомологичного штамма NTHi 86-028NP и гетерологичного штамма NTHi 3224A. Гомологию и гетерологию определяют по отношению к штамму NTHi, которым были иммунизированы мыши. Бактериальные колонии считали в полостях носа, извлеченных на 1 и 2 сутки после провокации. D1 = сутки 1. D2 = сутки 2.
Вакцинация PE-PilA повышала клиренс штамма NTHi 86-028NP и штамма 3224A в носоглотке на сутки 1 и сутки 2 после провокации.
Для эксперимента, проведенного со штаммом NTHi 86-028NP: двумерную фиксированную таблицу ANOVA строили, используя значения log10 подсчетов в качестве ответа, где фиксированные факторы представляли собой группу (4 уровня) и сутки (2 уровня). Допущение неоднородности дисперсии отвергали, и модель с неоднородными дисперсиями приводили в соответствие с данными. Между двумя факторами не было обнаружено значимого взаимодействия. Группа слитого белка PE-PilA (6 мкг на мышь) имела значимо сниженное число KOE по сравнению с контрольной группой (LT); отношение геометрического среднего было равно 0,06 при 95% доверительном интервале, равном 0,01, 0,25.
Для эксперимента, проведенного со штаммом NTHi 3224A: трехмерную фиксированную таблицу ANOVA строили, используя значения log10 в качестве ответа, где фиксированные факторы представляли собой группу, сутки и эксперимент. Критерий Шапиро-Уилка и Левена не отвергал допущения нормальности и неоднородности дисперсий. Между двумя факторами и между тремя факторами не было обнаружено значимого взаимодействия, и в анализе учитывали только основные факторы. PE-PilA/LT значимо снижал число KOE по сравнению с контрольной группой; отношение геометрического среднего было равно 0,11 при 95% доверительном интервале, равном 0,02, 0,61.
Действие вакцинации слитым белком PE-PilA на бактериальный клиренс штамма NTHi 86-028NP в носоглотке мыши см. на фиг. 19.
Действие вакцинации слитым белком PE-PilA на бактериальный клиренс штамма NTHi 3224A в носоглотке мыши см. на фиг. 20.
Пример 14. Модель колонизации носоглотки мыши. Иммунизация PilA. Провокация штаммом NTHi 3219C.
Самок мышей OF1 (20 мышей/группа) иммунизировали интраназально 3 мкг PilA (с вектора 16790), включенного в композицию с LT, на сутки 0 и 14, и 3 мкг PilA в ЗФР на сутки 28. Контрольных мышей (20/группа) вакцинировали только одним LT. Затем мышам проводили интраназальную провокацию 5*106 KOE штамма NTHi 3219C. Бактериальные колонии считали в полостях носа, извлеченных на 3 и 4 сутки после провокации. D3 = сутки 3, D4 = сутки 4.
Действие вакцинации PilA на бактериальный клиренс в носоглотке мыши см. на фиг. 21.
Пример 15. Модель колонизации носоглотки мыши. Иммунизация PE. Провокация штаммом NTHi 3224A.
Самок мышей Balb/c (20/группа) иммунизировали интраназально 3 мкг PE (с вектора pRIT16762), включенного в композицию с LT, на сутки 0 и 14 и 3 мкг PE в ЗФР на сутки 28. Контрольных мышей вакцинировали только одним LT. Затем мышам проводили интраназальную провокацию 5*106 KOE штамма NTHi 3224A. Бактериальные колонии считали в полостях носа, извлеченных на 3 и 4 сутки после провокации. 10 мышей исследовали на сутки 3 (D3). 10 мышей исследовали на сутки 4 (D4). Вакцинация PE значимо повышала клиренс NTHi в носоглотке на сутки 4 после провокации (фиг. 22), как определено с использованием критерия Данна для статистического анализа.
Действие вакцинации PE на бактериальный клиренс в носоглотке мыши см. на фиг. 22.
Пример 16. Связывание витронектина. Ингибирование связывания витронектина слитым белком PE-PilA LVL317 и LVL735.
Оценивали способность PE в очищенной конструкции слитого белка PE-PilA LVL317 к связыванию с витронектином. Микротитрационные планшеты (POLYSORP™, Nunc, Thermo Fisher Scientific) покрывали PE (с вектора pRIT16762) или очищенным слитым белком PE-PilA LVL317 (10 мкг/мл). Планшеты промывали четыре раза NaCl 150 мМ - полисорбат 20, 0,05% (например, TWEEN™ 20) и блокировали в течение от одного до 2 ч ЗФР-БСА 1%. После четырех промывок добавляли витронектин (витронектин из плазмы человека, SIGMA-ALDRICH®) (10 мкг/мл), разведенный в два раза (12 разведений), и планшеты инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем планшеты промывали 4 раза NaCl 150 мМ - полисорбат 20, 0,05% (например, TWEEN™ 20). После промывок связанный витронектин определяли, используя меченое пероксидазой антитело овцы против витронектина человека (US Biological) с последующим добавлением субстрата орто-фенилендиамин/H^^ Проявленное окрашивание прямо пропорционально количеству антитела, иммобилизованного на витронектине.
См. на фиг. 23: (a) слитый белок PE-PilA LVL317, связанный с витронектином. PilA = PilA из штамма NTHi 86-028NP (как описано для pRIT16790); PE = белок E (как описано для pRIT16762) и (b) слитый белок PE-PilA LVL317 и LVL735, связанный с витронектином.
Пример 17. Связывание витронектина. Ингибирование связывания витронектина антителами против слитого белка PE-PilA LVL291.
Микротитрационные планшеты (POLYSORP™, Nunc, Thermo Fisher Scientific) покрывали PE (с
- 60 031580 вектора pRIT16762) или очищенным слитым белком PE-PilA (10 мкг/мл). Планшеты промывали четыре раза NaCl 150 мМ - полисорбат 20, 0,05% (например, TWEEN™ 20) и блокировали в течение 2 ч ЗФРБСА 1%. После промывок добавляли витронектин (витронектин из плазмы человека, SIGMAALDRICH®) при концентрации 50 мкг/мл, и очищенные антитела против PE-PilA (полученные и очищенные в лаборатории) серийно разводили в два раза и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем планшеты промывали 4 раза NaCl 150 мМ - полисорбат 20, 0,05% (например, TWEEN™ 20). После промывок связанный витронектин определяли, используя меченое пероксидазой антитело овцы против витронектина человека (US Biological) с последующим добавлением субстрата ортофенилендиамин··! 12O2. Проявленное окрашивание прямо пропорционально количеству антитела, иммобилизованного на витронектине.
Наблюдали ингибирование связывания витронектина с PE поликлональными антителами против слитого белка PE-PilA.
Ингибирование связывания витронектина с PE поликлональными антителами, направленными против слитого белка PE-PilA, см. на фиг. 24.
Пример 18. Антигенность слитого белка LVL291 PE-PilA. ELISA.
Очищенный слитый белок PE-PilA LVL291 оценивали в тесте на антигенность с моновалентными белками в качестве контроля. Слитый белок тестировали в сэндвич-анализе ELISA, проявляемом поликлональными антителами (кролика и морской свинки), полученными против фрагмента гена PE, кодирующего аминокислоты 22-160 SEQ ID NO: 4 (как описано для PRIT16711), или против PilA из штамма NTHi 86-028NP (с вектора pRIT16790).
PilA или PE добавляли в концентрации 100 нг/мл и серийно разводили в два раза. После 30 мин инкубации и после промывки связанный антиген определяли с помощью поликлональной сыворотки кролика, полученной после иммунизации PE или PilA. Связанные антитела определяли, используя меченный пероксидазой Ig против кролика (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.), с последующим добавлением субстрата орто-фениден-диамин··! 12O2. Проявленное окрашивание прямо пропорционально количеству присутствующего антигена. Считывания поглощения измеряли, используя спектрофотометр для микротитрационных планшетов. Антигенность образцов определяли путем сравнения с кривой сравнительного антигена, представляющего собой полноразмерный PE или полноразмерный PilA, и выражали в мкг/мл. Сравнительный антиген представлял 100% антигенности.
Как видно в табл. 6, антигенность наблюдали для очищенного слитого белка PE-PilA LVL291 по сравнению с моновалентными антигенами PE и PilA.
Таблица 6
Относительная антигенность, полученная для очищенного слитого белка PE-PilA LVL291 в тесте на антигенность
Относительная антигенность РЕ (%)
Белок Е в качестве стандарта 100
PE-PilA 130-148
Относительная антигенность РЕ (%)
PilA в качестве стандарта 100
PE-PilA 120-152
Пример 19. Иммуногенность слитого белка PE-PilA LVL735.
Самок мышей Balb/c (n=34) иммунизировали внутримышечным путем 50 мкл вакцинной композиции, содержащей 1, 0,2 или 0,04 мкг слитого белка PE-PilA LVL317 или LVL735, включенного в композицию с AS01E или AlPO4 (фосфатом алюминия), на сутки 0, 14 и 28. Ответы антител на PE и PilA определяли в индивидуальных сыворотках, собранных на сутки 42, и измеряли уровень IgG против PE и PilA и выражали его в мкг/мл.
Ответ антител PE и PilA на LVL317 и LVL735 см. на фиг. 27. GMC = геометрическая средняя концентрация. GMT = геометрический средний титр. IC = доверительные интервалы.
- 61 031580
Пример 20. Защитная эффективность слитых белков LVL735 и LVL317 в модели колонизации носоглотки мыши нетипируемой гемофильной палочкой Haemophilus influenzae.
Самок мышей Balb/c иммунизировали интраназально 10 мкл вакцинной композиции, содержащей 5,8 мкг LVL735 или LVL317 в смеси с 0,5 мкг лабильного токсина E. coli (LT), на сутки 0 и 14. На сутки 28 вводили бустерную дозу, составляющую 5,8 мкг LVL735 или LVL317 без адъюванта. Контрольных мышей вакцинировали только одним LT на сутки 0 и 14 и ЗФР на сутки 28. Животным проводили интраназальную провокацию 5*106 KOE штамма NTHi 3224A на сутки 42. Бактериальные колонии считали в полостях носа, извлеченных на 1 и 2 сутки после провокации (n = 10/момент времени).
Полости носа гомогенизируют в среде и проводят подсчет бактерий. Результаты выражены в KOE/мл.
Действие вакцинации LVL735 и LVL317 на бактериальный клиренс в модели колонизации носоглотки мыши нетипируемой Haemophilus influenzae см. на фиг. 28.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> Пулман, Ян
Блэйс, Норманд
Лабб, Стив вакцина для индукции иммунного терапевтическое применение <120> Слитый белок, композиция и ответа против H. influenza и их
<130> VR64575WO
<150> 61/474779
<151> 2011-04-13
<150> 61/534012
<151> 2011-09-13
<160> 219
<170> FastSEQ for Windows версия 4.0
<210> 1
<211> 25
<212> БЕЛОК
<213> Haemophilus influenzae
<400> 1
Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile Leu Asn Cys 1 5 1015
Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val Arg
2025
<210> <211> <212> <213> 2 7 БЕЛОК Искусственная последовательность
<220> <223> синтетическая конструкция
<400> 2
Met His His His His His His
- 62 031580 <210> 3 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> синтетическая конструкция <400> 3
Gly Gly His His His His His His
5 <210> 4 <211> 160 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 4
Met Lys Lys Ile Ile Leu Thr Leu Ser Leu Gly Leu Leu Thr Ala Cys
1 5 10 15
Ser Ala Gln Ile Gln Lys Ala Glu Gln Asn Asp Val Lys Leu Ala Pro
20 25 30
Pro Thr Asp Val Arg Ser Gly Tyr Ile Arg Leu Val Lys Asn Val Asn
35 40 45
Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln
50 55 60
Ile Val His Phe Asp Ala Val Val Asn Leu Asp Lys Gly Leu Tyr Val
65 70 75 80
Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile
85 90 95
Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val Arg Thr Asp Phe Tyr
100 105 110
Asp Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys
115 120 125
Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Ala
130 135 140
Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Glu Ala Phe Ser Val Asp Lys Lys
145 150 155 160
<210> 5 <211> 160 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 5
Met Lys Lys Ile Ile Leu Thr Leu Ser Leu Gly Leu Leu Thr Ala Cys
1 5 10 15
Ser Ala Gln Ile Gln Lys Ala Lys Gln Asn Asp Val Lys Leu Ala Pro
20 25 30
Pro Thr Asp Val Arg Ser Gly Tyr Ile Arg Leu Val Lys Asn Val Asn
35 40 45
Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln
50 55 60
Ile Val His Phe Asp Ala Val Val Asn Leu Asp Lys Gly Leu Tyr Val
65 70 75 80
Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile
85 90 95
Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val Arg Thr Asp Phe Tyr
100 105 110
Asp Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys
115 120 125
- 63 031580
Lys His 130 Thr Leu Ser Leu Thr 135 Pro Asp Thr Thr Leu 140 Tyr Asn Ala Ala
Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Glu Ala Phe Ser Val Asp Lys Lys
145 150 155 160
<210> 6 <211> 160 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 6
Met Lys Lys Ile Ile Leu Thr Leu Ser Leu Gly Leu Leu Thr Ala Cys
1 5 10 15
Ser Ala Gln Ile Gln Lys Ala Glu Gln Asn Asp Val Lys Leu Ala Pro
20 25 30
Pro Thr Asp Val Arg Ser Gly Tyr Ile Arg Leu Val Lys Asn Val Asn
35 40 45
Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln
50 55 60
Ile Val His Phe Asp Ala Val Val Asn Leu Asp Arg Gly Leu Tyr Val
65 70 75 80
Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile
85 90 95
Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Ile Arg Thr Asp Phe Tyr
100 105 110
Asp Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys
115 120 125
Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Ala
130 135 140
Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Lys Ala Phe Ser Val Asp Lys Lys
145 150 155 160
<210> 7 <211> 160 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 7
Met Lys Lys Ile Ile Leu Thr Leu Ser Leu Gly Leu Leu Thr Ala Cys
1 5 10 15
Ser Ala Gln Ile Gln Lys Ala Lys Gln Asn Asp Val Lys Leu Ala Pro
20 25 30
Pro Thr Asp Val Arg Ser Gly Tyr Ile Arg Leu Val Lys Asn Val Asn
35 40 45
Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln
50 55 60
Ile Val His Phe Asp Ala Val Val Asn Leu Asp Lys Gly Leu Tyr Val
65 70 75 80
Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile
85 90 95
Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val Arg Thr Asp Phe Tyr
100 105 110
Asp Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys
115 120 125
Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Ala
130 135 140
Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Glu Ala Phe Ser Val Asp Lys Lys
145 150 155 160
<210> 8
- 64 031580 <211> 160 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 8
Met Lys Lys Ile Ile Leu Thr Leu Ser Leu Gly Leu Leu Thr Ala Cys
1 5 10 15
Ser Ala Gln Ile Gln Lys Ala Glu Gln Asn Asp Val Lys Leu Ala Pro
20 25 30
Pro Thr Asp Val Arg Ser Gly Tyr Ile Arg Leu Val Lys Asn Val Asn
35 40 45
Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln
50 55 60
Ile Val His Phe Asp Ala Val Val Asn Leu Asp Lys Gly Leu Tyr Val
65 70 75 80
Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile
85 90 95
Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val Arg Thr Asp Phe Tyr
100 105 110
Asp Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys
115 120 125
Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Ala
130 135 140
Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Lys Ala Phe Ser Val Asp Lys Lys
145 150 155 160
<210> 9 <211> 160 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 9
Met Lys Lys Ile Ile Leu Thr Leu Ser Leu Gly Leu Leu Thr Ala Cys
1 5 10 15
Ser Ala Gln Ile Gln Lys Ala Glu Gln Asn Asp Val Lys Leu Ala Pro
20 25 30
Pro Thr Asp Val Arg Ser Gly Tyr Ile Arg Leu Val Lys Asn Val Asn
35 40 45
Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln
50 55 60
Ile Val His Phe Asp Ala Val Val Asn Leu Asp Lys Gly Leu Tyr Val
65 70 75 80
Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile
85 90 95
Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val Arg Thr Asp Phe Tyr
100 105 110
Asp Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys
115 120 125
Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Ala
130 135 140
Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Lys Ala Phe Ser Val Asp Lys Lys
145 150 155 160
<210> 10 <211> 160 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae
<400> 10
Met Lys Lys Ile Ile Leu Thr Leu Ser Leu Gly Leu Leu Thr Ala Cys
1 5 10 15
- 65 031580
Ser Ala Gln Ile Gln 20 Lys Ala Glu Gln Asn 25 Asp Met Lys Leu 30 Ala Pro
Pro Thr Asp Val Arg Ser Gly Tyr Ile Arg Leu Val Lys Asn Val Asn
35 40 45
Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln
50 55 60
Ile Val His Phe Asp Ala Val Val Asn Leu Asp Lys Gly Leu Tyr Val
65 70 75 80
Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile
85 90 95
Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val Arg Thr Asp Phe Tyr
100 105 110
Asp Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys
115 120 125
Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Ala
130 135 140
Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Lys Ala Phe Ser Val Asp Lys Lys
145 150 155 160
<210> 11 <211> 160 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 11
Met Lys Lys Ile Ile Leu Thr Leu Ser Leu Gly Leu Leu Thr Ala Cys
1 5 10 15
Ser Ala Gln Ile Gln Lys Ala Lys Gln Asn Asp Val Lys Leu Ala Pro
20 25 30
Pro Thr Asp Val Arg Ser Gly Tyr Ile Arg Leu Val Lys Asn Val Asn
35 40 45
Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln
50 55 60
Ile Val His Phe Asp Ala Val Val Asn Leu Asp Lys Gly Leu Tyr Val
65 70 75 80
Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile
85 90 95
Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val Arg Thr Asp Phe Tyr
100 105 110
Asp Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys
115 120 125
Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Ala
130 135 140
Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Glu Ala Phe Ser Val Asp Lys Lys
145 150 155 160
<210> 12 <211> 159 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 12
Met Lys Lys Ile Ile Leu Thr Leu Ser Leu Gly Leu Leu Thr Ala Cys
1 5 10 15
Ser Ala Gln Ile Gln Lys Ala Glu Gln Asn Asp Met Lys Leu Ala Pro
20 25 30
Pro Thr Asp Val Arg Ser Gly Tyr Ile Arg Leu Val Lys Asn Val Asn
35 40 45
Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln Ile
50 55 60
Val His Phe Asp Ala Val Val Asn Leu Asp Lys Gly Leu Tyr Val Tyr
- 66 031580
65 70 75 80
Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile Leu
85 90 95
Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val Arg Thr Asp Phe Tyr Asp
100 105 110
Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys Lys
115 120 125
His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Ala Gln
130 135 140
Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Lys Ala Phe Ser Val Asp Lys Lys
145 150 155
<210> 13 <211> 160 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 13
Met Lys Lys Ile Ile Leu Thr Leu Ser Leu Gly Leu Leu Thr Ala Cys
1 5 10 15
Ser Ala Gln Ile Gln Lys Ala Glu Gln Asn Asp Val Lys Leu Ala Pro
20 25 30
Pro Thr Asp Val Arg Ser Gly Tyr Ile Arg Leu Val Lys Asn Val Asn
35 40 45
Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln
50 55 60
Ile Val His Phe Asp Thr Val Val Asn Leu Asp Lys Gly Leu Tyr Val
65 70 75 80
Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile
85 90 95
Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val Arg Thr Asp Phe Tyr
100 105 110
Asp Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys
115 120 125
Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Ala
130 135 140
Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Lys Ala Phe Ser Val Asp Lys Lys
145 150 155 160
<210> 14 <211> 160 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 14
Met Lys Lys Ile Ile Leu Thr Leu Ser Leu Gly Leu Leu Thr Ala Cys
1 5 10 15
Ser Ala Gln Ile Gln Lys Ala Glu Gln Asn Asp Val Lys Leu Ala Pro
20 25 30
Pro Thr Asp Val Arg Ser Gly Tyr Ile Arg Leu Val Lys Asn Val Asn
35 40 45
Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln
50 55 60
Ile Val His Phe Asp Ala Val Val Asn Leu Asp Lys Gly Leu Tyr Val
65 70 75 80
Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile
85 90 95
Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val Arg Thr Asp Phe Tyr
100 105 110
Asp Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys
115 120 125
- 67 031580
Lys His 130 Thr Leu Ser Leu Thr 135 Pro Asp Thr Thr Leu 140 Tyr Asn Ala Ala
Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Lys Ala Phe Ser Val Asp Lys Lys
145 150 155 160
<210> 15 <211> 194 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 15
Met Lys Lys Ile Ile Leu Thr Leu Ser Leu Gly Leu Leu Thr Ala Cys
1 5 10 15
Ser Ala Gln Thr Gln Lys Ala Glu Gln Asn Asp Val Lys Leu Thr Pro
20 25 30
Pro Thr Asp Val Gln Ser Gly Tyr Val Arg Leu Val Lys Asn Val Asn
35 40 45
Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln
50 55 60
Ile Val His Phe Asp Ala Val Val Asn Leu Asp Lys Gly Leu Tyr Val
65 70 75 80
Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile
85 90 95
Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val Arg Ile Asp Phe Tyr
100 105 110
Asp Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys
115 120 125
Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Ala
130 135 140
Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Lys Ala Phe Ser Val Asp Lys Asn
145 150 155 160
Lys Lys Ile Cys Thr Leu Ile Ser Leu Asn Phe Ile Gln Leu Leu Gly
165 170 175
Cys Arg Glu Tyr Ser Ile Phe Leu Gln Leu Leu Leu Phe Tyr Cys Trp
180 185 190
His Phe
<210> 16 <211> 195 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 16
Met Lys Lys Ile Ile Leu Thr Leu Ser Leu Gly Leu Leu Thr Ala Cys
1 5 10 15
Ser Ala Gln Ile Gln Lys Ala Glu Gln Asn Asp Val Lys Leu Ala Pro
20 25 30
Pro Thr Asp Val Arg Ser Gly Tyr Ile Arg Leu Val Lys Asn Val Asn
35 40 45
Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln
50 55 60
Ile Val His Phe Asp Ala Val Val Asn Leu Asp Lys Gly Leu Tyr Val
65 70 75 80
Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile
85 90 95
Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val Arg Thr Asp Phe Tyr
100 105 110
Asp Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys
115 120 125
Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Ala
- 68 031580
130 135 140
Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Lys Ala Phe Ser Val Asp Lys Lys
145 150 155 160
Ile Lys Lys Ile Cys Thr Leu Ile Ser Leu Asn Phe Ile Gln Leu Leu
165 170 175
Gly Cys Arg Glu Tyr Ser Ile Phe Leu Gln Leu Leu Leu Phe Tyr Cys
180 185 190
Trp His Phe
195 <210> 17 <211> 160 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 17
Met Lys Lys Ile Ile Leu Thr Leu Ser Leu Gly Leu Leu Thr Ala Cys
1 5 10 15
Ser Ala Gln Ile Gln Lys Ala Glu Gln Asn Asp Met Lys Leu Ala Pro
20 25 30
Pro Thr Asp Val Arg Ser Gly Tyr Ile Arg Leu Val Lys Asn Val Asn
35 40 45
Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln
50 55 60
Ile Val His Phe Asp Ala Val Val Asn Leu Asp Lys Gly Leu Tyr Val
65 70 75 80
Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile
85 90 95
Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val Arg Thr Asp Phe Tyr
100 105 110
Asp Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys
115 120 125
Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Ala
130 135 140
Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Lys Ala Phe Ser Val Asp Lys Lys
145 150 155 160
<210> 18 <211> 160 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 18
Met Lys Lys Ile Ile Leu Thr Leu Ser Leu Gly Leu Leu Thr Ala Cys
1 5 10 15
Ser Ala Gln Ile Gln Lys Ala Glu Gln Asn Asp Val Lys Leu Ala Pro
20 25 30
Pro Thr Asp Val Arg Ser Gly Tyr Ile Arg Leu Val Lys Asn Val Asn
35 40 45
Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln
50 55 60
Ile Val His Phe Asp Ala Val Val Asn Leu Asp Lys Gly Leu Tyr Val
65 70 75 80
Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile
85 90 95
Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val Arg Thr Asp Phe Tyr
100 105 110
Asp Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys
115 120 125
Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Ala
130 135 140
- 69 031580
Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Lys Ala Phe
145 150 155
Ser Val Asp Lys Lys
160 <210> 19 <211> 160 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 19
Met Lys Lys Ile Ile Leu Thr Leu Ser Leu Gly Leu Leu Thr Ala Cys
1 5 10 15
Ser Ala Gln Ile Gln Lys Ala Lys Gln Asn Asp Val Lys Leu Ala Pro
20 25 30
Pro Thr Asp Val Arg Ser Gly Tyr Ile Arg Leu Val Lys Asn Val Asn
35 40 45
Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln
50 55 60
Ile Val His Phe Asp Ala Val Val Asn Leu Asp Lys Gly Leu Tyr Val
65 70 75 80
Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile
85 90 95
Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val Arg Thr Asp Phe Tyr
100 105 110
Asp Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys
115 120 125
Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Ala
130 135 140
Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Glu Ala Phe Ser Val Asp Lys Lys
145 150 155 160
<210> 20 <211> 160 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 20
Met Lys Lys Ile Ile Leu Thr Leu Ser Leu Gly Leu Leu Thr Ala Cys
1 5 10 15
Ser Ala Gln Thr Gln Lys Val Glu Gln Asn Asp Val Lys Leu Thr Ala
20 25 30
Pro Thr Asp Val Arg Ser Gly Phe Val Arg Leu Val Lys Asn Val Asn
35 40 45
Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln
50 55 60
Ile Val His Phe Asp Ala Val Val Asn Leu Asp Lys Gly Leu Tyr Val
65 70 75 80
Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile
85 90 95
Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val Arg Thr Asp Phe Tyr
100 105 110
Asp Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys
115 120 125
Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Ala
130 135 140
Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Lys Ala Phe Leu Val Asp Lys Lys
145 150 155 160
<210> 21 <211> 160 <212> БЕЛОК
- 70 031580 <213> Haemophilus influenzae <400> 21
Met Lys Lys Ile Ile Leu Thr Leu Ser Leu Gly Leu Leu Thr Ala Cys
1 5 10 15
Ser Ala Gln Ile Gln Lys Ala Lys Gln Asn Asp Val Lys Leu Ala Pro
20 25 30
Pro Thr Asp Val Arg Ser Gly Tyr Ile Arg Leu Val Lys Asn Val Asn
35 40 45
Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln
50 55 60
Ile Val His Phe Asp Ala Val Val Asn Leu Asp Lys Gly Leu Tyr Val
65 70 75 80
Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile
85 90 95
Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val Arg Thr Asp Phe Tyr
100 105 110
Asp Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys
115 120 125
Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Ala
130 135 140
Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Glu Ala Phe Ser Val Asp Lys Lys
145 150 155 160
<210> 22 <211> 160 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 22
Met Lys Lys Ile Ile Leu Thr Leu Ser Leu Gly Leu Leu Thr Ala Cys
1 5 10 15
Ser Ala Gln Ile Gln Lys Ala Glu Gln Asn Asp Val Lys Leu Ala Pro
20 25 30
Pro Thr Asp Val Arg Ser Gly Tyr Ile Arg Leu Val Lys Asn Val Asn
35 40 45
Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln
50 55 60
Ile Val His Phe Asp Ala Val Val Asn Leu Asp Lys Gly Leu Tyr Val
65 70 75 80
Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile
85 90 95
Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Ile Arg Thr Asp Phe Tyr
100 105 110
Asp Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys
115 120 125
Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Ala
130 135 140
Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Lys Ala Phe Ser Val Asp Lys Lys
145 150 155 160
<210> 23 <211> 160 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 23
Met Lys Lys Ile Ile Leu Thr Leu Ser Leu Gly Leu Leu Thr Ala Cys
1 5 10 15
Ser Ala Gln Ile Gln Lys Ala Lys Gln Asn Asp Val Lys Leu Ala Pro
20 25 30
- 71 031580
Pro Thr Asp 35 Val Arg Ser Gly Tyr 40 Ile Arg Leu Val Lys 45 Asn Val Asn
Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln
50 55 60
Ile Val His Phe Asp Ala Val Val Asn Leu Asp Lys Gly Leu Tyr Val
65 70 75 80
Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile
85 90 95
Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val Arg Thr Asp Phe Tyr
100 105 110
Asp Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys
115 120 125
Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Ala
130 135 140
Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Glu Ala Phe Ser Val Asp Lys Lys
145 150 155 160
<210> 24 <211> 160 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 24
Met Lys Lys Ile Ile Leu Thr Leu Ser Leu Gly Leu Leu Thr Ala Cys
1 5 10 15
Ser Ala Gln Thr Gln Lys Val Glu Gln Asn Asp Val Lys Leu Thr Pro
20 25 30
Pro Thr Asp Val Arg Ser Gly Tyr Val Arg Leu Val Lys Asn Val Asn
35 40 45
Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln
50 55 60
Ile Val His Phe Asp Ala Val Val Asn Leu Asp Lys Gly Leu Tyr Val
65 70 75 80
Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile
85 90 95
Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val Arg Thr Asp Phe Tyr
100 105 110
Asp Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys
115 120 125
Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Ala
130 135 140
Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Lys Ala Phe Ser Val Asp Lys Lys
145 150 155 160
<210> 25 <211> 160 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 25
Met Lys Lys Ile Ile Leu Thr Leu Ser Leu Gly Leu Leu Thr Ala Cys
1 5 10 15
Ser Ala Gln Ile Gln Lys Ala Lys Gln Asn Asp Val Lys Leu Ala Pro
20 25 30
Pro Thr Asp Val Arg Ser Gly Tyr Ile Arg Leu Val Lys Asn Val Asn
35 40 45
Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln
50 55 60
Ile Val His Phe Asp Ala Val Val Asn Leu Asp Lys Gly Leu Tyr Val
65 70 75 80
Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile
- 72 031580
85 90 95
Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val Arg Thr Asp Phe Tyr
100 105 110
Asp Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys
115 120 125
Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Ala
130 135 140
Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Glu Ala Phe Ser Val Asp Lys Lys
145 150 155 160
<210> 26 <211> 160 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 26
Met Lys Lys Ile Ile Leu Thr Leu Ser Leu Gly Leu Leu Thr Ala Cys
1 5 10 15
Ser Ala Gln Thr Gln Lys Val Glu Gln Asn Asp Val Lys Leu Thr Ala
20 25 30
Pro Thr Asp Val Arg Ser Gly Tyr Val Arg Leu Val Lys Asn Ala Asn
35 40 45
Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln
50 55 60
Ile Val His Phe Asp Ala Val Val Asn Leu Asp Lys Gly Leu Tyr Val
65 70 75 80
Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile
85 90 95
Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val Arg Thr Asp Phe Tyr
100 105 110
Asp Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys
115 120 125
Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Ala
130 135 140
Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Lys Ala Phe Ser Val Asp Lys Lys
145 150 155 160
<210> 27 <211> 160 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 27
Met Lys Lys Ile Ile Leu Thr Leu Ser Leu Gly Leu Leu Thr Ala Cys
1 5 10 15
Ser Ala Gln Ile Gln Lys Ala Glu Gln Asn Asp Val Lys Leu Ala Pro
20 25 30
Pro Thr Asp Val Arg Ser Gly Tyr Ile Arg Leu Val Lys Asn Val Asn
35 40 45
Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln
50 55 60
Ile Val His Phe Asp Ala Val Val Asn Leu Asp Lys Gly Leu Tyr Val
65 70 75 80
Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile
85 90 95
Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val Arg Ile Asp Phe Tyr
100 105 110
Asp Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys
115 120 125
Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Ala
130 135 140
- 73 031580
Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Lys Ala Phe
145 150 155
Ser Val Asp Lys Lys
160 <210> 28 <211> 160 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 28
Met Lys Lys Ile Ile Leu Thr Leu Ser Leu Gly Leu Leu Thr Ala Cys
1 5 10 15
Ser Ala Gln Ile Gln Lys Ala Glu Gln Asn Asp Val Lys Leu Ala Pro
20 25 30
Pro Thr Asp Val Arg Ser Gly Tyr Ile Arg Leu Val Lys Asn Val Asn
35 40 45
Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln
50 55 60
Ile Val His Phe Asp Ala Val Val Asn Leu Asp Lys Gly Leu Tyr Val
65 70 75 80
Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile
85 90 95
Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val Arg Thr Asp Phe Tyr
100 105 110
Asp Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys
115 120 125
Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Ala
130 135 140
Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Lys Ala Phe Ser Val Asp Lys Lys
145 150 155 160
<210> 29 <211> 160 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 29
Met Lys Lys Ile Ile Leu Thr Leu Ser Leu Gly Leu Leu Thr Ala Cys
1 5 10 15
Ser Ala Gln Ile Gln Lys Ala Glu Gln Asn Asp Val Lys Leu Ala Pro
20 25 30
Pro Thr Asp Val Arg Ser Gly Tyr Ile Arg Leu Val Lys Asn Val Asn
35 40 45
Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln
50 55 60
Ile Val His Phe Asp Thr Val Val Asn Leu Asp Lys Gly Leu Tyr Val
65 70 75 80
Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile
85 90 95
Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val Arg Thr Asp Phe Tyr
100 105 110
Asp Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys
115 120 125
Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Ala
130 135 140
Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Lys Ala Phe Ser Val Asp Lys Lys
145 150 155 160
<210> 30 <211> 160 <212> БЕЛОК
- 74 031580 <213> Haemophilus influenzae <400> 30
Met Lys Lys Ile Ile Leu Thr Leu Ser Leu Gly Leu Leu Thr Ala Cys
1 5 10 15
Ser Ala Gln Ile Gln Lys Ala Glu Gln Asn Asp Val Lys Leu Ala Pro
20 25 30
Pro Thr Asp Val Arg Ser Gly Tyr Ile Arg Leu Val Lys Asn Val Asn
35 40 45
Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln
50 55 60
Ile Val His Phe Asp Ala Val Val Asn Leu Asp Lys Gly Leu Tyr Val
65 70 75 80
Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile
85 90 95
Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val Arg Thr Asp Phe Tyr
100 105 110
Asp Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys
115 120 125
Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Ala
130 135 140
Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Lys Ala Phe Ser Val Asp Lys Lys
145 150 155 160
<210> 31 <211> 160 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 31
Met Lys Lys Ile Ile Leu Thr Leu Ser Leu Gly Leu Leu Thr Ala Cys
1 5 10 15
Ser Ala Gln Ile Gln Lys Ala Lys Gln Asn Asp Val Lys Leu Ala Pro
20 25 30
Pro Thr Asp Val Arg Ser Gly Tyr Ile Arg Leu Val Lys Asn Val Asn
35 40 45
Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln
50 55 60
Ile Val His Phe Asp Ala Val Val Asn Leu Asp Lys Gly Leu Tyr Val
65 70 75 80
Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile
85 90 95
Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val Arg Thr Asp Phe Tyr
100 105 110
Asp Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys
115 120 125
Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Ala
130 135 140
Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Glu Ala Phe Ser Val Asp Lys Lys
145 150 155 160
<210> 32 <211> 160 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 32
Met Lys Lys Ile Ile Leu Thr Leu Ser Leu Gly Leu Leu Thr Ala Cys
1 5 10 15
Ser Ala Gln Ile Gln Lys Ala Glu Gln Asn Asp Val Lys Leu Ala Pro
20 25 30
- 75 031580
Pro Thr Asp 35 Val Arg Ser Gly Tyr 40 Ile Arg Leu Val Lys 45 Asn Val Asn
Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln
50 55 60
Ile Val His Phe Asp Ala Val Val Asn Leu Asp Lys Gly Leu Tyr Val
65 70 75 80
Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile
85 90 95
Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val Arg Thr Asp Phe Tyr
100 105 110
Asp Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys
115 120 125
Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Ala
130 135 140
Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Lys Ala Phe Ser Val Asp Lys Lys
145 150 155 160
<210> 33 <211> 160 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 33
Met Lys Lys Ile Ile Leu Thr Leu Ser Leu Gly Leu Leu Thr Ala Cys
1 5 10 15
Ser Ala Gln Thr Gln Lys Val Glu Gln Asn Asp Val Lys Leu Thr Pro
20 25 30
Pro Thr Asp Val Arg Ser Gly Tyr Val Arg Leu Val Lys Asn Val Asn
35 40 45
Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln
50 55 60
Ile Val His Phe Asp Ala Val Val Asn Leu Asp Lys Gly Leu Tyr Val
65 70 75 80
Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile
85 90 95
Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val Arg Thr Asp Phe Tyr
100 105 110
Asp Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys
115 120 125
Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Ala
130 135 140
Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Lys Ala Phe Ser Val Asp Lys Lys
145 150 155 160
<210> 34 <211> 160 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 34
Met Lys Lys Ile Ile Leu Thr Leu Ser Leu Gly Leu Leu Thr Ala Cys
1 5 10 15
Ser Ala Gln Ile Gln Lys Ala Glu Gln Asn Asp Val Lys Leu Ala Pro
20 25 30
Pro Thr Asp Val Arg Ser Gly Tyr Ile Arg Leu Val Lys Asn Val Asn
35 40 45
Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln
50 55 60
Ile Val His Phe Asp Ala Val Val Asn Leu Asp Lys Gly Leu Tyr Val
65 70 75 80
Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile
- 76 031580
85 90 95
Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val Arg Thr Asp Phe Tyr
100 105 110
Asp Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys
115 120 125
Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Ala
130 135 140
Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Lys Ala Phe Ser Val Asp Lys Lys
145 150 155 160
<210> 35 <211> 160 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 35
Met Lys Lys Ile Ile Leu Thr Leu Ser Leu Gly Leu Leu Thr Ala Cys
1 5 10 15
Ser Ala Gln Ile Gln Lys Ala Lys Gln Asn Asp Val Lys Leu Ala Pro
20 25 30
Pro Thr Asp Val Arg Ser Gly Tyr Ile Arg Leu Val Lys Asn Val Asn
35 40 45
Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln
50 55 60
Ile Val His Phe Asp Ala Val Val Asn Leu Asp Lys Gly Leu Tyr Val
65 70 75 80
Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile
85 90 95
Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val Arg Thr Asp Phe Tyr
100 105 110
Asp Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys
115 120 125
Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Ala
130 135 140
Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Glu Ala Phe Ser Val Asp Lys Lys
145 150 155 160
<210> 36 <211> 160 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 36
Met Lys Lys Ile Ile Leu Thr Leu Ser Leu Gly Leu Leu Thr Ala Cys
1 5 10 15
Ser Ala Gln Ile Gln Lys Ala Lys Gln Asn Asp Val Lys Leu Ala Pro
20 25 30
Pro Thr Asp Val Arg Ser Gly Tyr Ile Arg Leu Val Lys Asn Val Asn
35 40 45
Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln
50 55 60
Ile Val His Phe Asp Ala Val Val Asn Leu Asp Lys Gly Leu Tyr Val
65 70 75 80
Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile
85 90 95
Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val Arg Thr Asp Phe Tyr
100 105 110
Asp Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys
115 120 125
Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Ala
130 135 140
- 77 031580
Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Glu Ala Phe Ser Val Asp Lys Lys
145 150 155 160 <210> 37 <211> 160 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 37
Met Lys Lys Ile Ile Leu Thr Leu Ser Leu Gly Leu Leu Thr Ala Cys
1 5 10 15
Ser Ala Gln Thr Gln Lys Ala Glu Gln Asn Asp Val Lys Leu Ala Pro
20 25 30
Pro Thr Asp Val Arg Ser Gly Tyr Ile Arg Leu Val Lys Asn Val Asn
35 40 45
Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln
50 55 60
Ile Val His Phe Asp Ala Val Val Asn Leu Asp Lys Gly Leu Tyr Val
65 70 75 80
Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile
85 90 95
Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Ile Arg Thr Asp Phe Tyr
100 105 110
Asp Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys
115 120 125
Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Ala
130 135 140
Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Lys Ala Phe Ser Val Asp Lys Lys
145 150 155 160
<210> 38 <211> 160 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 38
Met Lys Lys Ile Ile Leu Thr Leu Ser Leu Gly Leu Leu Thr Ala Cys
1 5 10 15
Ser Ala Gln Thr Gln Lys Val Glu Gln Asn Asp Val Lys Leu Thr Ala
20 25 30
Pro Ala Asp Val Arg Ser Gly Tyr Val Arg Leu Val Lys Asn Val Asn
35 40 45
Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln
50 55 60
Ile Val His Phe Asp Ala Val Val Asn Leu Asp Lys Gly Leu Tyr Val
65 70 75 80
Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile
85 90 95
Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val Arg Thr Asp Phe Tyr
100 105 110
Asp Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys
115 120 125
Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Ala
130 135 140
Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Lys Ala Phe Ser Val Asp Lys Lys
145 150 155 160
<210> 39 <211> 159 <212> БЕЛОК
- 78 031580 <213> Haemophilus influenzae <400> 39
Met Lys Lys Ile Ile Leu Thr Leu Ser Leu Gly Leu Leu Thr Ala Cys
1 5 10 15
Ser Ala Gln Ile Gln Lys Ala Lys Gln Asn Asp Val Lys Leu Ala Pro
20 25 30
Pro Thr Asp Val Arg Ser Gly Tyr Ile Arg Leu Val Lys Asn Val Asn
35 40 45
Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln
50 55 60
Ile Val His Phe Asp Ala Val Val Asn Leu Asp Lys Gly Leu Tyr Val
65 70 75 80
Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Tyr Lys Ile Leu
85 90 95
Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val Arg Thr Asp Phe Tyr Asp
100 105 110
Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys Lys
115 120 125
His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Ala Gln
130 135 140
Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Glu Ala Phe Ser Val Asp Lys Lys
145 150 155
<210> 40 <211> 159 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 40
Met Lys Lys Ile Ile Leu Thr Leu Ser Leu Gly Leu Leu Thr Ala Cys
1 5 10 15
Ser Ala Gln Ile Gln Lys Ala Lys Gln Asn Asp Val Lys Leu Ala Pro
20 25 30
Pro Thr Asp Val Arg Ser Gly Tyr Ile Arg Leu Val Lys Asn Val Asn
35 40 45
Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln
50 55 60
Ile Val His Phe Asp Ala Val Val Asn Leu Asp Lys Gly Leu Tyr Val
65 70 75 80
Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Tyr Lys Ile Leu
85 90 95
Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val Arg Thr Asp Phe Tyr Asp
100 105 110
Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys Lys
115 120 125
His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Ala Gln
130 135 140
Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Glu Ala Phe Ser Val Asp Lys Lys
145 150 155
<210> 41 <211> 160 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 41
Met Lys Lys Ile Ile Leu Thr Leu Ser Leu Gly Leu Leu Thr Ala Cys
1 5 10 15
Ser Ala Gln Ile Gln Lys Ala Glu Gln Asn Asp Val Lys Leu Ala Pro
20 25 30
- 79 031580
Pro Thr Asp 35 Val Arg Ser Gly Tyr 40 Ile Arg Leu Val Lys 45 Asn Val Asn
Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln
50 55 60
Ile Val His Phe Asp Ala Val Val Asn Leu Asp Lys Gly Leu Tyr Val
65 70 75 80
Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile
85 90 95
Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val Arg Thr Asp Phe Tyr
100 105 110
Asp Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys
115 120 125
Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Ala
130 135 140
Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Lys Ala Phe Ser Val Asp Lys Lys
145 150 155 160
<210> 42 <211> 160 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 42
Met Lys Lys Ile Ile Leu Thr Leu Ser Leu Gly Leu Leu Thr Ala Cys
1 5 10 15
Ser Ala Gln Ile Gln Lys Ala Glu Gln Asn Asp Val Lys Leu Ala Pro
20 25 30
Pro Thr Asp Val Arg Ser Gly Tyr Ile Arg Leu Val Lys Asn Val Asn
35 40 45
Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln
50 55 60
Ile Val His Phe Asp Ala Val Val Asn Leu Asp Lys Gly Leu Tyr Val
65 70 75 80
Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile
85 90 95
Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val Arg Thr Asp Phe Tyr
100 105 110
Asp Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys
115 120 125
Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Ala
130 135 140
Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Lys Ala Phe Ser Val Asp Lys Lys
145 150 155 160
<210> 43 <211> 160 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 43
Met Lys Lys Ile Ile Leu Thr Leu Ser Leu Gly Leu Leu Thr Ala Cys
1 5 10 15
Ser Ala Gln Ile Gln Lys Ala Glu Gln Asn Asp Val Lys Leu Ala Pro
20 25 30
Pro Thr Asp Val Arg Ser Gly Tyr Ile Arg Leu Val Lys Asn Val Asn
35 40 45
Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln
50 55 60
Ile Val His Phe Asp Ala Val Val Asn Leu Asp Lys Gly Leu Tyr Val
65 70 75 80
Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile
- 80 031580
85 90 95
Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val Arg Thr Asp Phe Tyr
100 105 110
Asp Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys
115 120 125
Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Ala
130 135 140
Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Lys Ala Phe Ser Val Asp Lys Lys
145 150 155 160
<210> 44 <211> 160 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 44
Met Lys Lys Ile Ile Leu Thr Leu Ser Leu Gly Leu Leu Thr Ala Cys
1 5 10 15
Ser Ala Gln Ile Gln Lys Ala Glu Gln Asn Asp Val Lys Leu Ala Pro
20 25 30
Pro Thr Asp Val Arg Ser Gly Tyr Ile Arg Leu Val Lys Asn Val Asn
35 40 45
Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln
50 55 60
Ile Val His Phe Asp Ala Val Val Asn Leu Asp Lys Gly Leu Tyr Val
65 70 75 80
Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile
85 90 95
Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val Arg Thr Asp Phe Tyr
100 105 110
Asp Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys
115 120 125
Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Ala
130 135 140
Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Lys Ala Phe Ser Val Asp Lys Lys
145 150 155 160
<210> 45 <211> 160 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 45
Met Lys Lys Ile Ile Leu Thr Leu Ser Leu Gly Leu Leu Thr Ala Cys
1 5 10 15
Ser Ala Gln Ile Gln Lys Ala Glu Gln Asn Asp Val Lys Leu Ala Pro
20 25 30
Pro Thr Asp Val Arg Ser Gly Tyr Ile Arg Leu Val Lys Asn Val Asn
35 40 45
Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln
50 55 60
Ile Val His Phe Asp Thr Val Val Asn Leu Asp Lys Gly Leu Tyr Val
65 70 75 80
Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile
85 90 95
Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val Arg Thr Asp Phe Tyr
100 105 110
Asp Glu Phe Trp Gly Gln Ser Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys
115 120 125
Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Ala
130 135 140
- 81 031580
Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Lys Ala Phe
145 150 155
Ser Val Asp Lys Lys
160 <210> 46 <211> 160 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 46
Met Lys Lys Ile Ile Leu Thr Leu Ser Leu Gly Leu Leu Thr Ala Cys
1 5 10 15
Ser Ala Gln Thr Gln Lys Val Glu Gln Asn Asp Val Lys Leu Thr Pro
20 25 30
Pro Thr Asp Val Arg Ser Gly Tyr Val Arg Leu Val Lys Asn Val Asn
35 40 45
Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln
50 55 60
Ile Val His Phe Asp Ala Val Val Asn Leu Asp Lys Gly Leu Tyr Val
65 70 75 80
Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile
85 90 95
Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val Arg Thr Asp Phe Tyr
100 105 110
Asp Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys
115 120 125
Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Val Tyr Asn Ala Ala
130 135 140
Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Lys Ala Phe Ser Val Asp Lys Lys
145 150 155 160
<210> 47 <211> 160 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 47
Met Lys Lys Ile Ile Leu Thr Leu Ser Leu Gly Leu Leu Thr Ala Cys
1 5 10 15
Ser Ala Gln Thr Gln Lys Val Glu Gln Asn Asp Val Lys Leu Thr Pro
20 25 30
Pro Thr Asp Val Arg Ser Gly Tyr Val Arg Leu Val Lys Asn Val Asn
35 40 45
Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln
50 55 60
Ile Val His Phe Asp Ala Val Val Asn Leu Asp Lys Gly Leu Tyr Val
65 70 75 80
Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile
85 90 95
Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val Arg Thr Asp Phe Tyr
100 105 110
Asp Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys
115 120 125
Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Val Tyr Asn Ala Ala
130 135 140
Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Lys Ala Phe Ser Val Asp Lys Lys
145 150 155 160
<210> 48 <211> 160 <212> БЕЛОК
- 82 031580 <213> Haemophilus influenzae <400> 48
Met Lys Lys Ile Ile Leu Thr Leu Ser Leu Gly Leu Leu Thr Ala Cys
1 5 10 15
Ser Ala Gln Ile Gln Lys Ala Lys Gln Asn Asp Val Lys Leu Ala Pro
20 25 30
Pro Thr Asp Val Arg Ser Gly Tyr Ile Arg Leu Val Lys Asn Val Asn
35 40 45
Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln
50 55 60
Ile Val His Phe Asp Ala Val Val Asn Leu Asp Lys Gly Leu Tyr Val
65 70 75 80
Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile
85 90 95
Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val Arg Thr Asp Phe Tyr
100 105 110
Asp Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys
115 120 125
Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Ala
130 135 140
Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Glu Ala Phe Ser Val Asp Lys Lys
145 150 155 160
<210> 49 <211> 160 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 49
Met Lys Lys Ile Ile Leu Thr Leu Ser Leu Gly Leu Leu Thr Ala Cys
1 5 10 15
Ser Ala Gln Ile Gln Lys Ala Glu Gln Asn Asp Val Lys Leu Ala Pro
20 25 30
Pro Thr Asp Val Arg Ser Gly Tyr Ile Arg Leu Val Lys Asn Val Asn
35 40 45
Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln
50 55 60
Ile Val His Phe Asp Thr Val Val Asn Leu Asp Lys Gly Leu Tyr Val
65 70 75 80
Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile
85 90 95
Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val Arg Thr Asp Phe Tyr
100 105 110
Asp Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys
115 120 125
Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Ala
130 135 140
Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Lys Ala Phe Ser Val Asp Lys Lys
145 150 155 160
<210> 50 <211> 160 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 50
Met Lys Lys Ile Ile Leu Thr Leu Ser Leu Gly Leu Leu Thr Ala Cys
1 5 10 15
Ser Ala Gln Ile Gln Lys Ala Glu Gln Asn Asp Val Lys Leu Ala Pro
20 25 30
- 83 031580
Pro Thr Asp 35 Val Arg Ser Gly Tyr 40 Ile Arg Leu Val Lys 45 Asn Val Asn
Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln
50 55 60
Ile Val His Phe Asp Thr Val Val Asn Leu Asp Lys Gly Leu Tyr Val
65 70 75 80
Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile
85 90 95
Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val Arg Thr Asp Phe Tyr
100 105 110
Asp Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys
115 120 125
Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Ala
130 135 140
Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Lys Ala Phe Ser Val Asp Lys Lys
145 150 155 160
<210> 51 <211> 160 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 51
Met Lys Lys Ile Ile Leu Thr Leu Ser Leu Gly Leu Leu Thr Ala Cys
1 5 10 15
Ser Ala Gln Thr Gln Lys Ala Glu Gln Asn Asp Val Lys Leu Thr Pro
20 25 30
Pro Thr Asp Val Arg Ser Gly Tyr Ile Arg Leu Val Lys Asn Val Asn
35 40 45
Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln
50 55 60
Ile Val His Phe Asp Ala Val Val Asn Leu Asp Lys Gly Leu Tyr Val
65 70 75 80
Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile
85 90 95
Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val Arg Thr Asp Phe Tyr
100 105 110
Asp Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys
115 120 125
Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Ala
130 135 140
Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Lys Ala Phe Ser Val Asp Lys Lys
145 150 155 160
<210> 52 <211> 160 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 52
Met Lys Lys Ile Ile Leu Thr Leu Ser Leu Gly Leu Leu Thr Ala Cys
1 5 10 15
Ser Ala Gln Ile Gln Lys Ala Lys Gln Asn Asp Val Lys Leu Ala Pro
20 25 30
Pro Thr Asp Val Arg Ser Gly Tyr Ile Arg Leu Val Lys Asn Val Asn
35 40 45
Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln
50 55 60
Ile Val His Phe Asp Ala Val Val Asn Leu Asp Lys Gly Leu Tyr Val
65 70 75 80
Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile
- 84 031580
85 90 95
Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val Arg Thr Asp Phe Tyr
100 105 110
Asp Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys
115 120 125
Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Ala
130 135 140
Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Lys Ala Phe Ser Val Asp Lys Lys
145 150 155 160
<210> 53 <211> 160 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 53
Met Lys Lys Ile Ile Leu Thr Leu Ser Leu Gly Leu Leu Thr Ala Cys
1 5 10 15
Ser Ala Gln Ile Gln Lys Ala Glu Gln Asn Asp Val Lys Leu Ala Pro
20 25 30
Pro Thr Asp Val Arg Ser Gly Tyr Ile Arg Leu Val Lys Asn Val Asn
35 40 45
Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln
50 55 60
Ile Val His Phe Asp Thr Val Val Asn Leu Asp Lys Gly Leu Tyr Val
65 70 75 80
Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile
85 90 95
Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val Arg Thr Asp Phe Tyr
100 105 110
Asp Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys
115 120 125
Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Ala
130 135 140
Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Lys Ala Phe Ser Val Asp Lys Lys
145 150 155 160
<210> 54 <211> 160 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 54
Met Lys Lys Ile Ile Leu Thr Leu Ser Leu Gly Leu Leu Thr Ala Cys
1 5 10 15
Ser Ala Gln Thr Gln Lys Ala Glu Gln Asn Asp Val Lys Leu Ala Pro
20 25 30
Pro Thr Asp Val Arg Ser Gly Tyr Ile Arg Leu Val Lys Asn Val Asn
35 40 45
Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln
50 55 60
Ile Val His Phe Asp Ala Val Val Asn Leu Asp Lys Gly Leu Tyr Val
65 70 75 80
Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile
85 90 95
Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Ile Arg Thr Asp Phe Tyr
100 105 110
Asp Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys
115 120 125
Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Ala
130 135 140
- 85 031580
Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Lys Ala Phe
145 150 155
Ser Val Asp Lys Lys
160 <210> 55 <211> 160 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 55
Met Lys Lys Ile Ile Leu Thr Leu Ser Leu Gly Leu Leu Thr Ala Cys
1 5 10 15
Ser Ala Gln Ile Gln Lys Ala Lys Gln Asn Asp Val Lys Leu Ala Pro
20 25 30
Pro Thr Asp Val Arg Ser Gly Tyr Ile Arg Leu Val Lys Asn Val Asn
35 40 45
Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln
50 55 60
Ile Val His Phe Asp Ala Val Val Asn Leu Asp Lys Gly Leu Tyr Val
65 70 75 80
Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile
85 90 95
Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val Arg Thr Asp Phe Tyr
100 105 110
Asp Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys
115 120 125
Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Ala
130 135 140
Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Glu Ala Phe Ser Val Asp Lys Lys
145 150 155 160
<210> 56 <211> 160 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 56
Met Lys Lys Ile Ile Leu Thr Leu Ser Leu Gly Leu Leu Thr Ala Cys
1 5 10 15
Ser Ala Gln Ile Gln Lys Ala Glu Gln Asn Asp Val Lys Leu Ala Pro
20 25 30
Pro Thr Asp Val Arg Ser Gly Tyr Ile Arg Leu Val Lys Asn Val Asn
35 40 45
Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln
50 55 60
Ile Val His Phe Asp Ala Val Val Asn Leu Asp Lys Gly Leu Tyr Val
65 70 75 80
Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile
85 90 95
Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val Arg Thr Asp Phe Tyr
100 105 110
Asp Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys
115 120 125
Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Ala
130 135 140
Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Lys Ala Phe Ser Val Asp Lys Lys
145 150 155 160
<210> 57 <211> 159 <212> БЕЛОК
- 86 031580 <213> Haemophilus influenzae <400> 57
Met Lys Lys Ile Ile Leu Thr Leu Ser Leu Gly Leu Leu Thr Ala Cys
1 5 10 15
Ser Ala Gln Ile Gln Lys Ala Glu Gln Asn Asp Met Lys Leu Ala Pro
20 25 30
Pro Thr Asp Val Arg Ser Gly Tyr Ile Arg Leu Val Lys Asn Val Asn
35 40 45
Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln Ile
50 55 60
Val His Phe Asp Ala Val Val Asn Leu Asp Lys Gly Leu Tyr Val Tyr
65 70 75 80
Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile Leu
85 90 95
Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val Arg Thr Asp Phe Tyr Asp
100 105 110
Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys Lys
115 120 125
His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Ala Gln
130 135 140
Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Lys Ala Phe Ser Val Asp Lys Lys
145 150 155
<210> 58 <211> 149 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 58
Met 1 Lys Leu Thr Thr 5 Gln Gln Thr Leu Lys 10 Lys Gly Phe Thr Leu 15 Ile
Glu Leu Met Ile Val Ile Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala Thr Ile Ala
20 25 30
Ile Pro Ser Tyr Gln Asn Tyr Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu
35 40 45
Leu Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr
50 55 60
Ser Thr Asn Glu Thr Thr Asn Cys Thr Gly Gly Lys Asn Gly Ile Ala
65 70 75 80
Ala Asp Ile Thr Thr Ala Lys Gly Tyr Val Lys Ser Val Thr Thr Ser
85 90 95
Asn Gly Ala Ile Thr Val Lys Gly Asp Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu
100 105 110
Tyr Ile Leu Gln Ala Thr Gly Asn Ala Ala Thr Gly Val Thr Trp Thr
115 120 125
Thr Thr Cys Lys Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys
130 135 140
Gly Ser Val Thr Gln
145
<210> 59 <211> 149 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 59
Met 1 Lys Leu Thr Thr 5 Gln Gln Thr Leu Lys 10 Lys Gly Phe Thr Leu 15 Ile
Glu Leu Met Ile Val Ile Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala Thr Ile Ala
20 25 30
- 87 031580
Ile Pro Ser Tyr Gln Asn 35 Tyr Thr Lys 40 Lys Ala Ala Val 45 Ser Glu Leu
Leu Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr
50 55 60
Ser Thr Asn Glu Thr Thr Lys Cys Thr Gly Gly Lys Asn Gly Ile Ala
65 70 75 80
Ala Asp Ile Thr Thr Ala Lys Gly Tyr Val Lys Ser Val Thr Thr Ser
85 90 95
Asn Gly Ala Ile Thr Val Ala Gly Asn Gly Thr Leu Asp Gly Met Ser
100 105 110
Tyr Thr Leu Thr Ala Glu Gly Asp Ser Ala Lys Gly Val Thr Trp Lys
115 120 125
Thr Thr Cys Lys Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys
130 135 140
Gly Ser Val Thr Gln
145 <210> 60 <211> 149 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 60
Met 1 Lys Leu Thr Thr 5 Gln Gln Thr Leu Lys 10 Lys Gly Phe Thr Leu 15 Ile
Glu Leu Met Ile Val Ile Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala Thr Ile Ala
20 25 30
Ile Pro Ser Tyr Gln Asn Tyr Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu
35 40 45
Leu Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr
50 55 60
Ser Thr Asn Glu Thr Thr Asn Cys Thr Gly Gly Lys Asn Gly Ile Ala
65 70 75 80
Ala Asp Ile Thr Thr Ala Lys Gly Tyr Val Lys Ser Val Thr Thr Ser
85 90 95
Asn Gly Ala Ile Thr Val Lys Gly Asp Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu
100 105 110
Tyr Ile Leu Gln Ala Thr Gly Asn Ala Ala Thr Gly Val Thr Trp Thr
115 120 125
Thr Thr Cys Lys Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys
130 135 140
Gly Ser Val Thr Gln
145 <210> 61 <211> 149 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 61
Met 1 Lys Leu Thr Thr 5 Gln Gln Thr Leu Lys 10 Lys Gly Phe Thr Leu 15 Ile
Glu Leu Met Ile Val Ile Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala Thr Ile Ala
20 25 30
Ile Pro Ser Tyr Lys Asn Tyr Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu
35 40 45
Leu Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr
50 55 60
Ser Thr Gly Lys Pro Ser Ser Cys Ser Gly Gly Ser Asn Gly Ile Ala
65 70 75 80
Ala Asp Ile Thr Thr Ala Lys Gly Tyr Val Ala Ser Val Ile Thr Gln
- 88 031580
85 90 95
Ser Gly Gly Ile Thr Val Lys Gly Asp Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu
100 105 110
Tyr Ile Leu Gln Ala Ala Gly Asn Ala Ala Ala Gly Val Thr Trp Thr
115 120 125
Thr Thr Cys Lys Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys
130 135 140
Gly Ser Val Thr Gln
145
<210> 62 <211> 149 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 62
Met 1 Lys Leu Thr Thr 5 Gln Gln Thr Leu Lys 10 Lys Gly Phe Thr Leu 15 Ile
Glu Leu Met Ile Val Ile Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala Thr Ile Ala
20 25 30
Ile Pro Ser Tyr Gln Asn Tyr Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu
35 40 45
Leu Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr
50 55 60
Ser Thr Asn Glu Thr Thr Asn Cys Thr Gly Gly Lys Asn Gly Ile Ala
65 70 75 80
Ala Asp Ile Thr Thr Ala Lys Gly Tyr Val Lys Ser Val Thr Thr Ser
85 90 95
Asn Gly Ala Ile Thr Val Lys Gly Asp Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu
100 105 110
Tyr Ile Leu Gln Ala Thr Gly Asn Ala Ala Thr Gly Val Thr Trp Thr
115 120 125
Thr Thr Cys Lys Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys
130 135 140
Gly Ser Val Thr Gln
145
<210> 63 <211> 149 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 63
Met 1 Lys Leu Thr Thr 5 Gln Gln Thr Leu Lys 10 Lys Gly Phe Thr Leu 15 Ile
Glu Leu Met Ile Val Ile Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala Thr Ile Ala
20 25 30
Ile Pro Ser Tyr Gln Asn Tyr Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu
35 40 45
Leu Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ser Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr
50 55 60
Ser Thr Gly Lys Pro Ser Thr Cys Ser Gly Gly Ser Asn Gly Ile Ala
65 70 75 80
Ala Asp Ile Thr Thr Val Lys Gly Tyr Val Lys Ser Val Thr Thr Ser
85 90 95
Asn Gly Ala Ile Thr Val Ala Gly Asn Gly Thr Leu Asp Gly Met Ser
100 105 110
Tyr Thr Leu Thr Ala Glu Gly Asp Ser Ala Lys Gly Val Thr Trp Thr
115 120 125
Thr Thr Cys Lys Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys
130 135 140
- 89 031580
Gly Ser Val Thr Gln
145 <210> 64 <211> 149 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae
<400> 64
Met Lys Leu Thr Thr Gln Gln Thr Leu Lys Lys Gly Phe Thr Leu Ile
1 5 10 15
Glu Leu Met Ile Val Ile Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala Thr Ile Ala
20 25 30
Ile Pro Ser Tyr Gln Asn Tyr Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu
35 40 45
Leu Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr
50 55 60
Ser Thr Asn Glu Thr Thr Asn Cys Thr Gly Gly Lys Asn Gly Ile Ala
65 70 75 80
Ala Asp Ile Thr Thr Ala Lys Gly Tyr Val Lys Ser Val Thr Thr Ser
85 90 95
Asn Gly Ala Ile Thr Val Lys Gly Asp Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu
100 105 110
Tyr Ile Leu Gln Ala Thr Gly Asn Ala Ala Thr Gly Val Thr Trp Thr
115 120 125
Thr Thr Cys Lys Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys
130 135 140
Gly Ser Val Thr Gln
145
<210> 65 <211> 149 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae
<400> 65
Met Lys Leu Thr Thr Gln Gln Thr Leu Lys Lys Gly Phe Thr Leu Ile
1 5 10 15
Glu Leu Met Ile Val Ile Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala Thr Ile Ala
20 25 30
Ile Pro Ser Tyr Gln Asn Tyr Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu
35 40 45
Leu Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr
50 55 60
Ser Thr Asn Glu Thr Thr Asn Cys Thr Gly Gly Lys Asn Gly Ile Ala
65 70 75 80
Ala Asp Ile Thr Thr Ala Lys Gly Tyr Val Lys Ser Val Thr Thr Ser
85 90 95
Asn Gly Ala Ile Thr Val Lys Gly Asp Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu
100 105 110
Tyr Ile Leu Gln Ala Thr Gly Asn Ala Ala Thr Gly Val Thr Trp Thr
115 120 125
Thr Thr Cys Lys Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys
130 135 140
Gly Ser Val Thr Gln
145 <210> 66 <211> 149 <212> БЕЛОК
- 90 031580 <213> Haemophilus influenzae <400> 66
Met 1 Lys Leu Thr Thr 5 Gln Gln Thr Leu Lys 10 Lys Gly Phe Thr Leu 15 Ile
Glu Leu Met Ile Val Ile Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala Thr Ile Ala
20 25 30
Ile Pro Ser Tyr Gln Asn Tyr Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu
35 40 45
Leu Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr
50 55 60
Ser Thr Asn Glu Thr Thr Asn Cys Thr Gly Gly Lys Asn Gly Ile Ala
65 70 75 80
Ala Asp Ile Thr Thr Ala Lys Gly Tyr Val Lys Ser Val Thr Thr Ser
85 90 95
Asn Gly Ala Ile Thr Val Lys Gly Asp Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu
100 105 110
Tyr Ile Leu Gln Ala Thr Gly Asn Ala Ala Thr Gly Val Thr Trp Thr
115 120 125
Thr Thr Cys Lys Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys
130 135 140
Gly Ser Val Thr Gln
145 <210> 67 <211> 149 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 67
Met 1 Lys Leu Thr Thr 5 Gln Gln Thr Leu Lys 10 Lys Gly Phe Thr Leu 15 Ile
Glu Leu Met Ile Val Ile Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala Thr Ile Ala
20 25 30
Ile Pro Ser Tyr Lys Asn Tyr Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu
35 40 45
Leu Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr
50 55 60
Ser Thr Asn Glu Ile Thr Asn Cys Met Gly Gly Lys Asn Gly Ile Ala
65 70 75 80
Ala Asp Ile Thr Thr Ala Lys Gly Tyr Val Ala Ser Val Lys Thr Gln
85 90 95
Ser Gly Gly Ile Thr Val Lys Gly Asp Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu
100 105 110
Tyr Ile Leu Gln Ala Thr Gly Asn Ala Ala Ala Gly Val Thr Trp Thr
115 120 125
Thr Thr Cys Lys Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys
130 135 140
Gly Ser Ile Thr Gln
145 <210> 68 <211> 149 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 68
Met 1 Lys Leu Thr Thr 5 Gln Gln Thr Leu Lys 10 Lys Gly Phe Thr Leu 15 Ile
Glu Leu Met Ile Val Ile Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala Thr Ile Ala
20 25 30
- 91 031580
Ile Pro Ser Tyr Gln Asn 35 Tyr Thr 40 Lys Lys Ala Ser Val 45 Ser Glu Leu
Leu Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr
50 55 60
Ser Thr Asn Glu Thr Thr Asn Cys Thr Gly Gly Lys Asn Gly Ile Ala
65 70 75 80
Ala Asp Ile Thr Thr Ala Lys Gly Tyr Val Ala Ser Val Lys Thr Gln
85 90 95
Ser Gly Gly Ile Thr Val Lys Gly Asn Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu
100 105 110
Tyr Ile Leu Gln Ala Lys Gly Asn Ala Thr Ala Gly Val Thr Trp Thr
115 120 125
Thr Thr Cys Lys Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys
130 135 140
Arg Ser Val Thr Lys
145 <210> 69 <211> 149 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 69
Met 1 Lys Leu Thr Thr 5 Leu Gln Thr Leu Lys 10 Lys Gly Phe Thr Leu 15 Ile
Glu Leu Met Ile Val Ile Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala Thr Ile Ala
20 25 30
Ile Pro Ser Tyr Gln Asn Tyr Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu
35 40 45
Leu Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr
50 55 60
Ser Thr Asn Glu Thr Thr Ser Cys Thr Gly Gly Lys Asn Gly Ile Ala
65 70 75 80
Ala Asp Ile Lys Thr Ala Lys Gly Tyr Val Ala Ser Val Ile Thr Gln
85 90 95
Ser Gly Gly Ile Thr Val Lys Gly Asn Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu
100 105 110
Tyr Ile Leu Gln Ala Lys Gly Asn Ala Ala Ala Gly Val Thr Trp Thr
115 120 125
Thr Thr Cys Lys Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys
130 135 140
Gly Ser Val Thr Lys
145 <210> 70 <211> 149 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 70
Met 1 Lys Leu Thr Thr 5 Gln Gln Thr Leu Lys 10 Lys Gly Phe Thr Leu 15 Ile
Glu Leu Met Ile Val Ile Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala Thr Ile Ala
20 25 30
Ile Pro Ser Tyr Gln Asn Tyr Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu
35 40 45
Leu Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr
50 55 60
Ser Thr Gly Lys Pro Ser Ser Cys Ser Gly Gly Ser Asn Gly Ile Ala
65 70 75 80
Ala Asp Ile Thr Thr Ala Lys Gly Tyr Val Lys Ser Val Thr Thr Ser
- 92 031580
85 90 95
Asn Gly Ala Ile Thr Val Lys Gly Asp Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu
100 105 110
Tyr Ile Leu Gln Ala Ser Gly Asn Ala Ala Thr Gly Val Thr Trp Thr
115 120 125
Thr Thr Cys Lys Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys
130 135 140
Gly Ser Val Thr Gln
145
<210> 71 <211> 149 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 71
Met 1 Lys Leu Thr Thr 5 Leu Gln Thr Leu Lys 10 Lys Gly Phe Thr Leu 15 Ile
Glu Leu Met Ile Val Ile Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala Thr Ile Ala
20 25 30
Ile Pro Ser Tyr Gln Asn Tyr Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu
35 40 45
Leu Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr
50 55 60
Ser Thr Asn Glu Thr Thr Ser Cys Thr Gly Gly Lys Asn Gly Ile Ala
65 70 75 80
Ala Asp Ile Lys Thr Ala Lys Gly Tyr Val Ala Ser Val Ile Thr Gln
85 90 95
Ser Gly Gly Ile Thr Val Lys Gly Asn Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu
100 105 110
Tyr Ile Leu Gln Ala Lys Gly Asn Ala Ala Ala Gly Val Thr Trp Thr
115 120 125
Thr Thr Cys Lys Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys
130 135 140
Gly Ser Val Thr Lys
145
<210> 72 <211> 149 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 72
Met 1 Lys Leu Thr Thr 5 Leu Gln Thr Leu Lys 10 Lys Gly Phe Thr Leu 15 Ile
Glu Leu Met Ile Val Ile Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala Thr Ile Ala
20 25 30
Ile Pro Ser Tyr Gln Asn Tyr Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu
35 40 45
Leu Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr
50 55 60
Ser Thr Gly Lys Pro Ser Thr Cys Ser Gly Gly Ser Asn Gly Ile Ala
65 70 75 80
Ala Asp Ile Thr Thr Ala Lys Gly Tyr Val Ala Ser Val Lys Thr Gln
85 90 95
Ser Gly Gly Ile Thr Val Lys Gly Asn Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu
100 105 110
Tyr Ile Leu Gln Ala Thr Gly Asn Ala Ala Thr Gly Val Thr Trp Thr
115 120 125
Thr Thr Cys Lys Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys
130 135 140
- 93 031580
Gly Ser Val Thr Gln
145 <210> 73 <211> 149 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae
<400> 73
Met Lys Leu Thr Thr Gln Gln Thr Leu Lys Lys Gly Phe Thr Leu Ile
1 5 10 15
Glu Leu Met Ile Val Ile Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala Thr Ile Ala
20 25 30
Ile Pro Ser Tyr Gln Asn Tyr Thr Lys Lys Ala Ser Val Ser Glu Leu
35 40 45
Leu Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ser Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr
50 55 60
Ser Thr Gly Lys Pro Ser Thr Cys Ser Gly Gly Ser Asn Gly Ile Ala
65 70 75 80
Ala Asp Ile Thr Thr Ala Lys Gly Tyr Val Ala Ser Val Lys Thr Gln
85 90 95
Ser Gly Gly Ile Thr Val Lys Gly Asn Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu
100 105 110
Tyr Ile Leu Gln Ala Lys Gly Asn Ala Thr Ala Gly Val Thr Trp Thr
115 120 125
Thr Thr Cys Lys Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys
130 135 140
Arg Ser Val Thr Lys
145
<210> 74 <211> 149 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae
<400> 74
Met Lys Leu Thr Thr Gln Gln Thr Leu Lys Lys Gly Phe Thr Leu Ile
1 5 10 15
Glu Leu Met Ile Val Ile Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala Thr Ile Ala
20 25 30
Ile Pro Ser Tyr Gln Asn Tyr Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu
35 40 45
Leu Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr
50 55 60
Ser Thr Asn Glu Thr Thr Asn Cys Thr Gly Gly Lys Asn Gly Ile Ala
65 70 75 80
Ala Asp Ile Thr Thr Ala Lys Gly Tyr Val Lys Ser Val Thr Thr Ser
85 90 95
Asn Gly Ala Ile Thr Val Lys Gly Asp Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu
100 105 110
Tyr Ile Leu Gln Ala Thr Gly Asn Ala Ala Thr Gly Val Thr Trp Thr
115 120 125
Thr Thr Cys Lys Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys
130 135 140
Gly Ser Val Thr Gln
145 <210> 75 <211> 149 <212> БЕЛОК
- 94 031580 <213> Haemophilus influenzae <400> 75
Met 1 Lys Leu Thr Thr 5 Gln Gln Thr Leu Lys 10 Lys Gly Phe Thr Leu 15 Ile
Glu Leu Met Ile Val Ile Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala Thr Ile Ala
20 25 30
Ile Pro Ser Tyr Gln Asn Tyr Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu
35 40 45
Leu Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr
50 55 60
Ser Thr Asn Glu Thr Thr Asn Cys Thr Gly Gly Lys Asn Gly Ile Ala
65 70 75 80
Ala Asp Ile Thr Thr Ala Lys Gly Tyr Val Ala Ser Val Lys Thr Gln
85 90 95
Ser Gly Gly Ile Thr Val Lys Gly Asp Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu
100 105 110
Tyr Ile Leu Gln Ala Thr Gly Asn Ala Ala Thr Gly Val Thr Trp Thr
115 120 125
Thr Thr Cys Lys Gly Thr Glu Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys
130 135 140
Gly Ser Val Thr Gln
145 <210> 76 <211> 149 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 76
Met 1 Lys Leu Thr Thr 5 Gln Gln Thr Leu Lys 10 Lys Gly Phe Thr Leu 15 Ile
Glu Leu Met Ile Val Ile Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala Thr Ile Ala
20 25 30
Ile Pro Ser Tyr Gln Asn Tyr Thr Lys Lys Ala Ser Val Ser Glu Leu
35 40 45
Leu Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr
50 55 60
Ser Thr Asn Glu Thr Thr Asn Cys Thr Gly Gly Lys Asn Gly Ile Ala
65 70 75 80
Ala Asp Ile Thr Thr Ala Lys Gly Tyr Val Ala Ser Val Lys Thr Gln
85 90 95
Ser Gly Gly Ile Thr Val Lys Gly Asn Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu
100 105 110
Tyr Ile Leu Gln Ala Lys Gly Asn Ala Thr Ala Gly Val Thr Trp Thr
115 120 125
Thr Thr Cys Lys Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys
130 135 140
Arg Ser Val Thr Lys
145 <210> 77 <211> 149 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 77
Met 1 Lys Leu Thr Thr 5 Leu Gln Thr Leu Lys 10 Lys Gly Phe Thr Leu 15 Ile
Glu Leu Met Ile Val Ile Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala Thr Ile Ala
20 25 30
- 95 031580
Ile Pro Ser Tyr Gln Asn 35 Tyr Thr Lys 40 Lys Ala Ala Val 45 Ser Glu Leu
Leu Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr
50 55 60
Ser Thr Gly Lys Pro Ser Thr Cys Ser Gly Gly Ser Asn Gly Ile Ala
65 70 75 80
Ala Asp Ile Thr Thr Ala Lys Gly Tyr Val Ala Ser Val Lys Thr Gln
85 90 95
Ser Gly Gly Ile Thr Val Lys Gly Asn Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu
100 105 110
Tyr Ile Leu Gln Ala Thr Gly Asn Ala Ala Thr Gly Val Thr Trp Thr
115 120 125
Thr Thr Cys Lys Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys
130 135 140
Gly Ser Val Thr Gln
145 <210> 78 <211> 149 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 78
Met 1 Lys Leu Thr Thr 5 Gln Gln Thr Leu Lys 10 Lys Gly Phe Thr Leu 15 Ile
Glu Leu Met Ile Val Ile Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala Thr Ile Ala
20 25 30
Ile Pro Ser Tyr Gln Asn Tyr Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu
35 40 45
Leu Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr
50 55 60
Ser Thr Gly Lys Pro Ser Thr Cys Ser Gly Gly Ser Asn Gly Ile Ala
65 70 75 80
Ala Asp Ile Thr Thr Ala Lys Gly Tyr Val Ala Ser Val Lys Thr Gln
85 90 95
Ser Gly Gly Ile Thr Val Lys Gly Asn Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu
100 105 110
Tyr Ile Leu Gln Ala Lys Gly Asn Ala Thr Ala Gly Val Thr Trp Thr
115 120 125
Thr Thr Cys Lys Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys
130 135 140
Arg Ser Val Thr Lys
145 <210> 79 <211> 149 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 79
Met 1 Lys Leu Thr Thr 5 Gln Gln Thr Leu Lys 10 Lys Gly Phe Thr Leu 15 Ile
Glu Leu Met Ile Val Ile Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala Thr Ile Ala
20 25 30
Ile Pro Ser Tyr Gln Asn Tyr Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu
35 40 45
Leu Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr
50 55 60
Ser Thr Asn Glu Thr Thr Asn Cys Thr Gly Gly Lys Asn Gly Ile Ala
65 70 75 80
Ala Asp Ile Thr Thr Ala Lys Gly Tyr Val Ala Ser Val Lys Thr Gln
- 96 031580
85 90 95
Ser Gly Gly Ile Thr Val Lys Gly Asp Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu
100 105 110
Tyr Ile Leu Gln Ala Thr Gly Asn Ala Ala Thr Gly Val Thr Trp Thr
115 120 125
Thr Thr Cys Lys Gly Thr Glu Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys
130 135 140
Gly Ser Val Thr Gln
145
<210> 80 <211> 149 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 80
Met 1 Lys Leu Thr Thr 5 Gln Gln Thr Leu Lys 10 Lys Gly Phe Thr Leu 15 Ile
Glu Leu Met Ile Val Ile Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala Thr Ile Ala
20 25 30
Ile Pro Ser Tyr Gln Asn Tyr Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu
35 40 45
Leu Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr
50 55 60
Ser Thr Asn Glu Thr Thr Asn Cys Thr Gly Gly Lys Asn Gly Ile Ala
65 70 75 80
Ala Asp Ile Thr Thr Ala Lys Gly Tyr Val Ala Ser Val Lys Thr Gln
85 90 95
Ser Gly Gly Ile Thr Val Lys Gly Asp Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu
100 105 110
Tyr Ile Leu Gln Ala Thr Gly Asn Ala Ala Thr Gly Val Thr Trp Thr
115 120 125
Thr Thr Cys Lys Gly Thr Glu Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys
130 135 140
Gly Ser Val Thr Gln
145
<210> 81 <211> 149 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 81
Met 1 Lys Leu Thr Thr 5 Gln Gln Thr Leu Lys 10 Lys Gly Phe Thr Leu 15 Ile
Glu Leu Met Ile Val Ile Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala Thr Ile Ala
20 25 30
Ile Pro Ser Tyr Gln Asn Tyr Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu
35 40 45
Leu Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ser Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr
50 55 60
Ser Thr Gly Lys Pro Ser Thr Cys Ser Gly Gly Ser Asn Gly Ile Ala
65 70 75 80
Ala Asp Ile Thr Thr Ala Lys Gly Tyr Val Lys Ser Val Thr Thr Ser
85 90 95
Asn Gly Ala Ile Thr Val Ala Gly Asn Gly Thr Leu Asp Gly Met Ser
100 105 110
Tyr Thr Leu Thr Ala Glu Gly Asp Ser Ala Lys Gly Val Thr Trp Lys
115 120 125
Thr Thr Cys Lys Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys
130 135 140
- 97 031580
Gly Ser Val Thr Lys
145 <210> 82 <211> 149 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae
<400> 82
Met Lys Leu Thr Thr Gln Gln Thr Leu Lys Lys Gly Phe Thr Leu Ile
1 5 10 15
Glu Leu Met Ile Val Ile Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala Thr Ile Ala
20 25 30
Ile Pro Ser Tyr Gln Asn Tyr Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu
35 40 45
Leu Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr
50 55 60
Ser Thr Asn Glu Ala Thr Lys Cys Thr Gly Gly Lys Asn Gly Ile Ala
65 70 75 80
Ala Asp Ile Thr Thr Ala Lys Gly Tyr Val Lys Ser Val Thr Thr Ser
85 90 95
Asn Gly Ala Ile Thr Val Lys Gly Asp Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu
100 105 110
Tyr Ile Leu Gln Ala Ser Gly Asn Ala Ala Thr Gly Val Thr Trp Thr
115 120 125
Thr Thr Cys Lys Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys
130 135 140
Gly Ser Val Thr Gln
145
<210> 83 <211> 149 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae
<400> 83
Met Lys Leu Thr Thr Gln Gln Thr Leu Lys Lys Gly Phe Thr Leu Ile
1 5 10 15
Glu Leu Met Ile Val Ile Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala Thr Ile Ala
20 25 30
Ile Pro Ser Tyr Gln Asn Tyr Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu
35 40 45
Leu Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr
50 55 60
Ser Thr Asn Glu Ala Thr Lys Cys Thr Gly Gly Lys Asn Gly Ile Ala
65 70 75 80
Ala Asp Ile Thr Thr Ala Lys Gly Tyr Val Lys Ser Val Thr Thr Ser
85 90 95
Asn Gly Ala Ile Thr Val Lys Gly Asp Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu
100 105 110
Tyr Ile Leu Gln Ala Ser Gly Asn Ala Ala Thr Gly Val Thr Trp Thr
115 120 125
Thr Thr Cys Lys Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys
130 135 140
Gly Ser Val Thr Gln
145 <210> 84 <211> 149 <212> БЕЛОК
- 98 031580 <213> Haemophilus influenzae <400> 84
Met 1 Lys Leu Thr Thr 5 Gln Gln Thr Leu Lys 10 Lys Gly Phe Thr Leu 15 Ile
Glu Leu Met Ile Val Ile Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala Thr Ile Ala
20 25 30
Ile Pro Ser Tyr Gln Asn Tyr Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu
35 40 45
Leu Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr
50 55 60
Ser Thr Asn Glu Thr Thr Asn Cys Thr Gly Gly Lys Asn Gly Ile Ala
65 70 75 80
Ala Asp Ile Thr Thr Ala Lys Gly Tyr Val Lys Ser Val Thr Thr Ser
85 90 95
Asn Gly Ala Ile Thr Val Lys Gly Asp Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu
100 105 110
Tyr Ile Leu Gln Ala Thr Gly Asn Ala Ala Thr Gly Val Thr Trp Thr
115 120 125
Thr Thr Cys Lys Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys
130 135 140
Gly Ser Val Thr Gln
145 <210> 85 <211> 149 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 85
Met 1 Lys Leu Thr Thr 5 Gln Gln Thr Leu Lys 10 Lys Gly Phe Thr Leu 15 Ile
Glu Leu Met Ile Val Ile Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala Thr Ile Ala
20 25 30
Ile Pro Ser Tyr Gln Asn Tyr Thr Lys Lys Ala Ala Ile Ser Glu Leu
35 40 45
Leu Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ser Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr
50 55 60
Ser Thr Gly Lys Pro Ser Thr Cys Ser Gly Gly Ser Asn Gly Ile Ala
65 70 75 80
Ala Asp Ile Thr Thr Ala Lys Gly Tyr Val Ala Ser Val Lys Thr Gln
85 90 95
Ser Gly Gly Ile Thr Val Lys Gly Asn Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu
100 105 110
Tyr Ile Leu Gln Ala Lys Gly Asn Ala Thr Ala Gly Val Thr Trp Thr
115 120 125
Thr Thr Cys Lys Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys
130 135 140
Arg Ser Val Thr Lys
145 <210> 86 <211> 149 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 86
Met 1 Lys Leu Thr Thr 5 Gln Gln Thr Leu Lys 10 Lys Gly Phe Thr Leu 15 Ile
Glu Leu Met Ile Val Ile Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala Thr Ile Ala
20 25 30
- 99 031580
Ile Pro Ser Tyr Gln Asn 35 Tyr Thr Lys 40 Lys Ala Ala Val 45 Ser Glu Leu
Leu Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr
50 55 60
Ser Thr Asn Glu Thr Thr Asn Cys Thr Gly Gly Lys Asn Gly Ile Ala
65 70 75 80
Ala Asp Ile Thr Thr Ala Lys Gly Tyr Val Ala Ser Val Lys Thr Gln
85 90 95
Ser Gly Gly Ile Thr Val Lys Gly Asp Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu
100 105 110
Tyr Ile Leu Gln Ala Thr Gly Asn Ala Ala Thr Gly Val Thr Trp Thr
115 120 125
Thr Thr Cys Lys Gly Thr Glu Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys
130 135 140
Gly Ser Val Thr Gln
145 <210> 87 <211> 149 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 87
Met 1 Lys Leu Thr Thr 5 Gln Gln Thr Leu Lys 10 Lys Gly Phe Thr Leu 15 Ile
Glu Leu Met Ile Val Ile Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala Thr Ile Ala
20 25 30
Ile Pro Ser Tyr Gln Asn Tyr Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu
35 40 45
Leu Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr
50 55 60
Ser Thr Asn Glu Thr Thr Asn Cys Thr Gly Gly Lys Asn Gly Ile Ala
65 70 75 80
Ala Asp Ile Thr Thr Ala Lys Gly Tyr Val Lys Ser Val Thr Thr Ser
85 90 95
Asn Gly Ala Ile Thr Val Lys Gly Asp Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu
100 105 110
Tyr Ile Leu Gln Ala Thr Gly Asn Ala Ala Thr Gly Val Thr Trp Thr
115 120 125
Thr Thr Cys Lys Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys
130 135 140
Gly Ser Val Thr Gln
145 <210> 88 <211> 149 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 88
Met 1 Lys Leu Thr Thr 5 Gln Gln Thr Leu Lys 10 Lys Gly Phe Thr Leu 15 Ile
Glu Leu Met Ile Val Ile Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala Thr Ile Ala
20 25 30
Ile Pro Ser Tyr Gln Asn Tyr Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu
35 40 45
Leu Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ser Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr
50 55 60
Ser Thr Gly Lys Pro Ser Thr Cys Ser Gly Gly Ser Asn Gly Ile Ala
65 70 75 80
Ala Asp Ile Thr Thr Val Lys Gly Tyr Val Lys Ser Val Thr Thr Ser
- 100 031580
85 90 95
Asn Gly Ala Ile Thr Val Ala Gly Asn Gly Thr Leu Asp Gly Met Ser
100 105 110
Tyr Thr Leu Thr Ala Glu Gly Asp Ser Ala Lys Gly Val Thr Trp Thr
115 120 125
Thr Thr Cys Lys Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys
130 135 140
Gly Ser Val Thr Gln
145 <210> 89 <211> 149 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 89
Met 1 Lys Leu Thr Thr 5 Gln Gln Thr Leu Lys 10 Lys Gly Phe Thr Leu 15 Ile
Glu Leu Met Ile Val Ile Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala Thr Ile Ala
20 25 30
Ile Pro Ser Tyr Gln Asn Tyr Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu
35 40 45
Leu Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr
50 55 60
Ser Thr Asn Glu Thr Thr Asn Cys Thr Gly Gly Lys Asn Gly Ile Ala
65 70 75 80
Ala Asp Ile Thr Thr Ala Lys Gly Tyr Val Lys Ser Val Thr Thr Ser
85 90 95
Asn Gly Ala Ile Thr Val Lys Gly Asp Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu
100 105 110
Tyr Ile Leu Gln Ala Thr Gly Asn Ala Ala Thr Gly Val Thr Trp Thr
115 120 125
Thr Thr Cys Lys Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys
130 135 140
Gly Ser Val Thr Gln
145 <210> 90 <211> 149 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 90
Met 1 Lys Leu Thr Thr 5 Gln Gln Thr Leu Lys 10 Lys Gly Phe Thr Leu 15 Ile
Glu Leu Met Ile Val Ile Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala Thr Ile Ala
20 25 30
Ile Pro Ser Tyr Gln Asn Tyr Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu
35 40 45
Leu Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr
50 55 60
Ser Thr Asn Glu Thr Thr Asn Cys Thr Gly Gly Lys Asn Gly Ile Ala
65 70 75 80
Ala Asp Ile Thr Thr Ala Lys Gly Tyr Val Ala Ser Val Lys Thr Gln
85 90 95
Ser Gly Gly Ile Thr Val Lys Gly Asn Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu
100 105 110
Tyr Ile Leu Gln Ala Thr Gly Asn Ala Ala Thr Gly Val Thr Trp Thr
115 120 125
Thr Thr Cys Lys Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys
130 135 140
- 101 031580
Gly Ser Val Thr Gln
145 <210> 91 <211> 149 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae
<400> 91
Met Lys Leu Thr Thr Gln Gln Thr Leu Lys Lys Gly Phe Thr Leu Ile
1 5 10 15
Glu Leu Met Ile Val Ile Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala Thr Ile Ala
20 25 30
Ile Pro Ser Tyr Gln Asn Tyr Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu
35 40 45
Leu Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr
50 55 60
Ser Thr Gly Lys Pro Ser Thr Cys Ser Gly Gly Ser Asn Gly Ile Ala
65 70 75 80
Ala Asp Ile Thr Thr Ala Lys Gly Tyr Val Lys Ser Val Thr Thr Ser
85 90 95
Asn Gly Ala Ile Thr Val Ala Gly Asn Gly Thr Leu Asp Arg Met Ser
100 105 110
Tyr Thr Leu Thr Ala Glu Gly Asp Ser Ala Lys Gly Val Thr Trp Thr
115 120 125
Thr Thr Cys Lys Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys
130 135 140
Gly Ser Val Thr Gln
145
<210> 92 <211> 149 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae
<400> 92
Met Lys Leu Thr Thr Gln Gln Thr Leu Lys Lys Gly Phe Thr Leu Ile
1 5 10 15
Glu Leu Met Ile Val Ile Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala Thr Ile Ala
20 25 30
Ile Pro Ser Tyr Gln Asn Tyr Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu
35 40 45
Leu Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr
50 55 60
Ser Thr Gly Lys Pro Ser Ser Cys Ser Gly Gly Ser Asn Gly Ile Ala
65 70 75 80
Ala Asp Ile Thr Thr Ala Lys Gly Tyr Val Lys Ser Val Thr Thr Ser
85 90 95
Asn Gly Ala Ile Thr Val Lys Gly Asp Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu
100 105 110
Tyr Ile Leu Gln Ala Ser Gly Asn Ala Ala Thr Gly Val Thr Trp Thr
115 120 125
Thr Thr Cys Lys Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys
130 135 140
Gly Ser Val Thr Gln
145 <210> 93 <211> 149 <212> БЕЛОК
- 102 031580 <213> Haemophilus influenzae <400> 93
Met 1 Lys Leu Thr Thr 5 Gln Thr Thr Leu Lys 10 Lys Gly Phe Thr Leu 15 Ile
Glu Leu Met Ile Val Ile Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala Thr Ile Ala
20 25 30
Ile Pro Ser Tyr Gln Asn Tyr Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu
35 40 45
Leu Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ser Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr
50 55 60
Ser Thr Asn Glu Thr Thr Asn Cys Thr Gly Gly Lys Asn Gly Ile Ala
65 70 75 80
Ala Asp Ile Thr Thr Ala Lys Gly Tyr Val Ala Ser Val Ile Thr Gln
85 90 95
Ser Gly Gly Ile Thr Val Lys Gly Asn Gly Thr Leu Thr Asn Met Glu
100 105 110
Tyr Ile Leu Gln Ala Thr Gly Asn Ala Ala Thr Gly Val Thr Trp Thr
115 120 125
Thr Thr Cys Lys Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys
130 135 140
Gly Ser Ile Thr Gln
145 <210> 94 <211> 149 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 94
Met 1 Lys Leu Thr Thr 5 Leu Gln Thr Leu Lys 10 Lys Gly Phe Thr Leu 15 Ile
Glu Leu Met Ile Val Ile Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala Thr Ile Ala
20 25 30
Ile Pro Ser Tyr Gln Asn Tyr Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu
35 40 45
Leu Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr
50 55 60
Ser Thr Gly Lys Pro Ser Thr Cys Ser Gly Gly Asn Asn Gly Ile Ala
65 70 75 80
Ala Asp Ile Lys Thr Ala Lys Gly Tyr Val Ala Ser Val Lys Thr Gln
85 90 95
Ser Gly Gly Ile Thr Val Lys Gly Asp Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu
100 105 110
Tyr Ile Leu Gln Ala Thr Gly Asn Ala Ala Thr Gly Val Thr Trp Thr
115 120 125
Thr Thr Cys Lys Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys
130 135 140
Gly Ser Val Thr Gln
145 <210> 95 <211> 149 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 95
Met 1 Lys Leu Thr Thr 5 Gln Gln Thr Leu Lys 10 Lys Gly Phe Thr Leu 15 Ile
Glu Leu Met Ile Val Ile Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala Thr Ile Ala
20 25 30
- 103 031580
Ile Pro Ser Tyr Gln Asn 35 Tyr Thr Lys 40 Lys Ala Ala Val 45 Ser Glu Leu
Leu Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr
50 55 60
Ser Thr Gly Lys Pro Ser Ser Cys Ser Gly Gly Ser Asn Gly Ile Ala
65 70 75 80
Ala Asp Ile Thr Thr Ala Lys Gly Tyr Val Lys Ser Val Thr Thr Ser
85 90 95
Asn Gly Ala Ile Thr Val Lys Gly Asp Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu
100 105 110
Tyr Ile Leu Gln Ala Ser Gly Asn Ala Ala Thr Gly Val Thr Trp Thr
115 120 125
Thr Thr Cys Lys Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys
130 135 140
Gly Ser Val Thr Gln
145 <210> 96 <211> 149 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 96
Met 1 Lys Leu Thr Thr 5 Gln Gln Thr Leu Lys 10 Lys Gly Phe Thr Leu 15 Ile
Glu Leu Met Ile Val Ile Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala Thr Ile Ala
20 25 30
Ile Pro Ser Tyr Gln Asn Tyr Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu
35 40 45
Leu Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr
50 55 60
Ser Thr Asn Glu Ala Thr Lys Cys Thr Gly Gly Lys Asn Gly Ile Ala
65 70 75 80
Ala Asp Ile Thr Thr Ala Lys Gly Tyr Val Lys Ser Val Thr Thr Ser
85 90 95
Asn Gly Ala Ile Thr Val Lys Gly Asp Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu
100 105 110
Tyr Ile Leu Gln Ala Ser Gly Asn Ala Ala Thr Gly Val Thr Trp Thr
115 120 125
Thr Thr Cys Lys Gly Thr Asp Thr Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys
130 135 140
Gly Ser Val Thr Gln
145 <210> 97 <211> 149 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 97
Met 1 Lys Leu Thr Thr 5 Gln Gln Thr Leu Lys 10 Lys Gly Phe Thr Leu 15 Ile
Glu Leu Met Ile Val Ile Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala Thr Ile Ala
20 25 30
Ile Pro Ser Tyr Gln Asn Tyr Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu
35 40 45
Leu Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr
50 55 60
Ser Thr Asn Glu Thr Thr Asn Cys Thr Gly Gly Lys Asn Gly Ile Ala
65 70 75 80
Ala Asp Ile Thr Thr Ala Lys Gly Tyr Val Lys Ser Val Thr Thr Ser
- 104 031580
85 90 95
Asn Gly Ala Ile Thr Val Lys Gly Asp Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu
100 105 110
Tyr Ile Leu Gln Ala Thr Gly Asn Ala Ala Thr Gly Val Thr Trp Thr
115 120 125
Thr Thr Cys Lys Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys
130 135 140
Gly Ser Val Thr Gln
145 <210> 98 <211> 149 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 98
Met 1 Lys Leu Thr Thr 5 Gln Gln Thr Leu Lys 10 Lys Gly Phe Thr Leu 15 Ile
Glu Leu Met Ile Val Ile Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala Thr Ile Ala
20 25 30
Ile Pro Ser Tyr Gln Asn Tyr Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu
35 40 45
Leu Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr
50 55 60
Ser Thr Asn Glu Thr Thr Asn Cys Thr Gly Gly Lys Asn Gly Ile Ala
65 70 75 80
Ala Asp Ile Thr Thr Ala Lys Gly Tyr Val Ala Ser Val Lys Thr Gln
85 90 95
Ser Gly Gly Ile Thr Val Lys Gly Asn Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu
100 105 110
Tyr Ile Leu Gln Ala Thr Gly Asn Ala Ala Thr Gly Val Thr Trp Thr
115 120 125
Thr Thr Cys Lys Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys
130 135 140
Gly Ser Val Thr Gln
145 <210> 99 <211> 149 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 99
Met 1 Lys Leu Thr Thr 5 Gln Gln Thr Leu Lys 10 Lys Gly Phe Thr Leu 15 Ile
Glu Leu Met Ile Val Ile Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala Thr Ile Ala
20 25 30
Ile Pro Ser Tyr Gln Asn Tyr Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu
35 40 45
Leu Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr
50 55 60
Ser Thr Gly Lys Pro Ser Thr Cys Ser Gly Gly Ser Asn Gly Ile Ala
65 70 75 80
Ala Asp Ile Thr Thr Ala Lys Gly Tyr Val Ala Ser Val Lys Thr Gln
85 90 95
Ser Gly Gly Ile Thr Val Lys Gly Asn Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu
100 105 110
Tyr Ile Leu Gln Ala Lys Gly Asn Ala Thr Ala Gly Val Thr Trp Thr
115 120 125
Thr Thr Cys Lys Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys
130 135 140
- 105 031580
Arg Ser Val Thr Lys
145 <210> 100 <211> 149 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae
<400> 100
Met Lys Leu Thr Thr Gln Gln Thr Leu Lys Lys Gly Phe Thr Leu Ile
1 5 10 15
Glu Leu Met Ile Val Ile Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala Thr Ile Ala
20 25 30
Ile Pro Ser Tyr Gln Asn Tyr Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu
35 40 45
Leu Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr
50 55 60
Ser Thr Gly Lys Pro Ser Thr Cys Ser Gly Gly Ser Asn Gly Ile Ala
65 70 75 80
Ala Asp Ile Thr Thr Ala Lys Gly Tyr Val Ala Ser Val Lys Thr Gln
85 90 95
Ser Gly Gly Ile Thr Val Lys Gly Asn Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu
100 105 110
Tyr Ile Leu Gln Ala Lys Gly Asn Ala Thr Ala Gly Val Thr Trp Thr
115 120 125
Thr Thr Cys Lys Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys
130 135 140
Arg Ser Val Thr Lys
145
<210> 101 <211> 149 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae
<400> 101
Met Lys Leu Thr Thr Gln Gln Thr Leu Lys Lys Gly Phe Thr Leu Ile
1 5 10 15
Glu Leu Met Ile Val Ile Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala Thr Ile Ala
20 25 30
Ile Pro Ser Tyr Gln Asn Tyr Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu
35 40 45
Leu Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr
50 55 60
Ser Thr Asn Glu Thr Thr Asn Cys Thr Gly Gly Lys Asn Gly Ile Ala
65 70 75 80
Ala Asp Ile Thr Thr Ala Lys Gly Tyr Val Lys Ser Val Thr Thr Ser
85 90 95
Asn Gly Ala Ile Thr Val Lys Gly Asp Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu
100 105 110
Tyr Ile Leu Gln Ala Thr Gly Asn Ala Ala Thr Gly Val Thr Trp Thr
115 120 125
Thr Thr Cys Lys Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys
130 135 140
Gly Ser Val Thr Gln
145 <210> 102 <211> 149 <212> БЕЛОК
- 106 031580 <213> Haemophilus influenzae <400> 102
Met 1 Lys Leu Thr Thr 5 Gln Gln Thr Leu Lys 10 Lys Gly Phe Thr Leu 15 Ile
Glu Leu Met Ile Val Ile Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala Thr Ile Ala
20 25 30
Ile Pro Ser Tyr Gln Asn Tyr Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu
35 40 45
Leu Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr
50 55 60
Ser Thr Gly Lys Pro Ser Thr Cys Ser Gly Gly Ser Asn Gly Ile Ala
65 70 75 80
Ala Asp Ile Thr Thr Ala Lys Gly Tyr Val Ala Ser Val Lys Thr Gln
85 90 95
Ser Gly Gly Ile Thr Val Lys Gly Asn Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu
100 105 110
Tyr Ile Leu Gln Ala Lys Gly Asn Ala Thr Ala Gly Val Thr Trp Thr
115 120 125
Thr Thr Cys Lys Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys
130 135 140
Arg Ser Val Thr Lys
145 <210> 103 <211> 149 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 103
Met 1 Lys Leu Thr Thr 5 Gln Gln Thr Leu Lys 10 Lys Gly Phe Thr Leu 15 Ile
Glu Leu Met Ile Val Ile Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala Thr Ile Ala
20 25 30
Ile Pro Ser Tyr Gln Asn Tyr Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu
35 40 45
Leu Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr
50 55 60
Ser Thr Asn Glu Ala Thr Lys Cys Thr Gly Gly Lys Asn Gly Ile Ala
65 70 75 80
Ala Asp Ile Thr Thr Ala Lys Gly Tyr Val Lys Ser Val Thr Thr Ser
85 90 95
Asn Gly Ala Ile Thr Val Lys Gly Asp Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu
100 105 110
Tyr Ile Leu Gln Ala Ser Gly Asn Ala Ala Thr Gly Val Thr Trp Thr
115 120 125
Thr Thr Cys Lys Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys
130 135 140
Gly Ser Val Thr Gln
145 <210> 104 <211> 149 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 104
Met 1 Lys Leu Thr Thr 5 Gln Gln Thr Leu Lys 10 Lys Gly Phe Thr Leu 15 Ile
Glu Leu Met Ile Val Ile Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala Thr Ile Ala
20 25 30
- 107 031580
Ile Pro Ser Tyr Gln Asn Tyr 35 Thr 40 Lys Lys Ala Ala Val 45 Ser Glu Leu
Leu Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr
50 55 60
Ser Thr Asn Glu Thr Thr Asn Cys Thr Gly Gly Lys Asn Gly Ile Ala
65 70 75 80
Ala Asp Ile Thr Thr Ala Lys Gly Tyr Val Lys Ser Val Thr Thr Ser
85 90 95
Asn Gly Ala Ile Thr Val Lys Gly Asp Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu
100 105 110
Tyr Ile Leu Gln Ala Thr Gly Asn Ala Ala Thr Gly Val Thr Trp Thr
115 120 125
Thr Thr Cys Lys Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys
130 135 140
Gly Ser Val Thr Gln
145
<210> 105 <211> 149 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 105
Met 1 Lys Leu Thr Thr 5 Gln Gln Thr Leu Lys 10 Lys Gly Phe Thr Leu 15 Ile
Glu Leu Met Ile Val Ile Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala Thr Ile Ala
20 25 30
Ile Pro Ser Tyr Gln Asn Tyr Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu
35 40 45
Leu Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr
50 55 60
Ser Thr Asn Glu Thr Thr Asn Cys Thr Gly Gly Lys Asn Gly Ile Ala
65 70 75 80
Ala Asp Ile Thr Thr Ala Lys Gly Tyr Val Lys Ser Val Thr Thr Ser
85 90 95
Asn Gly Ala Ile Thr Val Lys Gly Asp Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu
100 105 110
Tyr Ile Leu Gln Ala Thr Gly Asn Ala Ala Thr Gly Val Thr Trp Thr
115 120 125
Thr Thr Cys Lys Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys
130 135 140
Gly Ser Val Thr Gln
145
<210> 106 <211> 149 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <220>
<221> VARIANT <222> (1)...(149) <223> Xaa = glutamine or leucine <400> 106
Met 1 Lys Leu Thr Thr 5 Gln Gln Thr Leu Lys 10 Lys Gly Phe Thr Leu 15 Ile
Glu Leu Met Ile Val Ile Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala Thr Ile Ala
20 25 30
Ile Pro Ser Tyr Gln Asn Tyr Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu
35 40 45
- 108 031580
Leu Gln 50 Ala Ser Ala Pro Tyr Lys 55 Ala Asp Val Glu 60 Leu Cys Val Tyr
Ser Thr Asn Glu Thr Thr Asn Cys Thr Gly Gly Lys Asn Gly Ile Ala
65 70 75 80
Ala Asp Ile Thr Thr Ala Lys Gly Tyr Val Lys Ser Val Thr Thr Ser
85 90 95
Asn Gly Ala Ile Thr Val Lys Gly Asp Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu
100 105 110
Tyr Ile Leu Xaa Ala Thr Gly Asn Ala Ala Thr Gly Val Thr Trp Thr
115 120 125
Thr Thr Cys Lys Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys
130 135 140
Gly Ser Val Thr Gln
145 <210> 107 <211> 149 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 107
Met 1 Lys Leu Thr Thr 5 Gln Gln Thr Leu Lys 10 Lys Gly Phe Thr Leu 15 Ile
Glu Leu Met Ile Val Ile Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala Thr Ile Ala
20 25 30
Ile Pro Ser Tyr Gln Asn Tyr Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu
35 40 45
Leu Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr
50 55 60
Ser Thr Asn Glu Thr Thr Asn Cys Thr Gly Gly Lys Asn Gly Ile Ala
65 70 75 80
Ala Asp Ile Thr Thr Ala Lys Gly Tyr Val Lys Ser Val Thr Thr Ser
85 90 95
Asn Gly Ala Ile Thr Val Lys Gly Asp Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu
100 105 110
Tyr Ile Leu Gln Ala Thr Gly Asn Ala Ala Thr Gly Val Thr Trp Thr
115 120 125
Thr Thr Cys Lys Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys
130 135 140
Gly Ser Val Thr Gln
145 <210> 108 <211> 149 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 108
Met 1 Lys Leu Thr Thr 5 Gln Gln Thr Leu Lys 10 Lys Gly Phe Thr Leu 15 Ile
Glu Leu Met Ile Val Ile Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala Thr Ile Ala
20 25 30
Ile Pro Ser Tyr Gln Asn Tyr Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu
35 40 45
Leu Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr
50 55 60
Ser Thr Asn Glu Thr Thr Asn Cys Thr Gly Gly Lys Asn Gly Ile Ala
65 70 75 80
Ala Asp Ile Thr Thr Ala Lys Gly Tyr Val Lys Ser Val Thr Thr Ser
85 90 95
Asn Gly Ala Ile Thr Val Lys Gly Asp Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu
- 109 031580
100 105 110
Tyr Ile Leu Gln Ala Thr Gly Asn Ala Ala Thr Gly Val Thr Trp Thr
115 120 125
Thr Thr Cys Lys Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys
130 135 140
Gly Ser Val Thr Gln
145
<210> 109 <211> 149 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 109
Met 1 Lys Leu Thr Thr 5 Leu Gln Thr Leu Lys 10 Lys Gly Phe Thr Leu 15 Ile
Glu Leu Met Ile Val Ile Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala Thr Ile Ala
20 25 30
Ile Pro Ser Tyr Gln Asn Tyr Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu
35 40 45
Leu Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr
50 55 60
Ser Thr Gly Lys Pro Ser Thr Cys Ser Gly Gly Asn Asn Gly Ile Ala
65 70 75 80
Ala Asp Ile Lys Thr Ala Lys Gly Tyr Val Ala Ser Val Lys Thr Gln
85 90 95
Ser Gly Gly Ile Thr Val Lys Gly Asp Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu
100 105 110
Tyr Ile Leu Gln Ala Thr Gly Asn Ala Ala Thr Gly Val Thr Trp Thr
115 120 125
Thr Thr Cys Lys Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys
130 135 140
Gly Ser Val Thr Gln
145
<210> 110 <211> 149 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 110
Met 1 Lys Leu Thr Thr 5 Leu Gln Thr Leu Lys 10 Lys Gly Phe Thr Leu 15 Ile
Glu Leu Met Ile Val Ile Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala Thr Ile Ala
20 25 30
Ile Pro Ser Tyr Gln Asn Tyr Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu
35 40 45
Leu Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr
50 55 60
Ser Thr Gly Lys Pro Ser Thr Cys Ser Gly Gly Asn Asn Gly Ile Ala
65 70 75 80
Ala Asp Ile Lys Thr Ala Lys Gly Tyr Val Ala Ser Val Lys Thr Gln
85 90 95
Ser Gly Gly Ile Thr Val Lys Gly Asp Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu
100 105 110
Tyr Ile Leu Gln Ala Thr Gly Asn Ala Ala Thr Gly Val Thr Trp Thr
115 120 125
Thr Thr Cys Lys Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys
130 135 140
Gly Ser Val Thr Gln
145
- 110 031580 <210> 111 <211> 149 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 111
Met 1 Lys Leu Thr Thr 5 Gln Gln Thr Leu Lys 10 Lys Gly Phe Thr Leu 15 Ile
Glu Leu Met Ile Val Ile Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala Thr Ile Ala
20 25 30
Ile Pro Ser Tyr Gln Asn Tyr Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu
35 40 45
Leu Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr
50 55 60
Ser Thr Asn Glu Thr Thr Ser Cys Thr Gly Gly Lys Asn Gly Ile Ala
65 70 75 80
Ala Asp Ile Thr Thr Ala Lys Gly Tyr Val Lys Ser Val Thr Thr Ser
85 90 95
Asn Gly Ala Ile Thr Val Ala Gly Asn Gly Thr Leu Asp Gly Met Ser
100 105 110
Tyr Thr Leu Thr Ala Glu Gly Asp Ser Ala Lys Gly Val Thr Trp Lys
115 120 125
Thr Thr Cys Lys Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys
130 135 140
Gly Ser Val Thr Gln
145
<210> 112 <211> 149 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 112
Met 1 Lys Leu Thr Thr 5 Gln Gln Thr Leu Lys 10 Lys Gly Phe Thr Leu 15 Ile
Glu Leu Met Ile Val Ile Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala Thr Ile Ala
20 25 30
Ile Pro Ser Tyr Gln Asn Tyr Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu
35 40 45
Leu Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr
50 55 60
Ser Thr Asn Glu Thr Thr Ser Cys Thr Gly Gly Lys Asn Gly Ile Ala
65 70 75 80
Ala Asp Ile Thr Thr Ala Lys Gly Tyr Val Lys Ser Val Thr Thr Ser
85 90 95
Asn Gly Ala Ile Thr Val Ala Gly Asn Gly Thr Leu Asp Gly Met Ser
100 105 110
Tyr Thr Leu Thr Ala Glu Gly Asp Ser Ala Lys Gly Val Thr Trp Lys
115 120 125
Thr Thr Cys Lys Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys
130 135 140
Gly Ser Val Thr Gln
145
<210> 113 <211> 149 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae
- 111 031580 <400> 113
Met 1 Lys Leu Thr Thr 5 Leu Gln Thr Leu Lys 10 Lys Gly Phe Thr Leu 15 Ile
Glu Leu Met Ile Val Ile Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala Thr Ile Ala
20 25 30
Ile Pro Ser Tyr Gln Asn Tyr Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu
35 40 45
Leu Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr
50 55 60
Ser Thr Gly Lys Pro Ser Thr Cys Ser Gly Gly Asn Asn Gly Ile Ala
65 70 75 80
Ala Asp Ile Lys Thr Ala Lys Gly Tyr Val Ala Ser Val Lys Thr Gln
85 90 95
Ser Gly Gly Ile Thr Val Lys Gly Asp Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu
100 105 110
Tyr Ile Leu Gln Ala Thr Gly Asn Ala Ala Thr Gly Val Thr Trp Thr
115 120 125
Thr Thr Cys Lys Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys
130 135 140
Gly Ser Val Thr Gln
145
<210> 114 <211> 149 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 114
Met 1 Lys Leu Thr Thr 5 Leu Gln Thr Leu Lys 10 Lys Gly Phe Thr Leu 15 Ile
Glu Leu Met Ile Val Ile Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala Thr Ile Ala
20 25 30
Ile Pro Ser Tyr Gln Asn Tyr Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu
35 40 45
Leu Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr
50 55 60
Ser Thr Gly Lys Pro Ser Thr Cys Ser Gly Gly Asn Asn Gly Ile Ala
65 70 75 80
Ala Asp Ile Lys Thr Ala Lys Gly Tyr Val Ala Ser Val Lys Thr Gln
85 90 95
Ser Gly Gly Ile Thr Val Lys Gly Asp Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu
100 105 110
Tyr Ile Leu Gln Ala Thr Gly Asn Ala Ala Thr Gly Val Thr Trp Thr
115 120 125
Thr Thr Cys Lys Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys
130 135 140
Gly Ser Val Thr Gln
145
<210> 115 <211> 149 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 115
Met 1 Lys Leu Thr Thr 5 Leu Gln Thr Leu Lys 10 Lys Gly Phe Thr Leu 15 Ile
Glu Leu Met Ile Val Ile Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala Thr Ile Ala
20 25 30
Ile Pro Ser Tyr Gln Asn Tyr Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu
35 40 45
- 112 031580
Leu Gln 50 Ala Ser Ala Pro Tyr Lys 55 Ala Asp Val Glu 60 Leu Cys Val Tyr
Ser Thr Gly Lys Pro Ser Thr Cys Ser Gly Gly Asn Asn Gly Ile Ala
65 70 75 80
Ala Asp Ile Lys Thr Ala Lys Gly Tyr Val Ala Ser Val Lys Thr Gln
85 90 95
Ser Gly Gly Ile Thr Val Lys Gly Asp Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu
100 105 110
Tyr Ile Leu Gln Ala Thr Gly Asn Ala Ala Thr Gly Val Thr Trp Thr
115 120 125
Thr Thr Cys Lys Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys
130 135 140
Gly Ser Val Thr Gln
145 <210> 116 <211> 149 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 116
Met 1 Lys Leu Thr Thr 5 Gln Gln Thr Leu Lys 10 Lys Gly Phe Thr Leu 15 Ile
Glu Leu Met Ile Val Ile Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala Thr Ile Ala
20 25 30
Ile Pro Ser Tyr Gln Asn Tyr Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu
35 40 45
Leu Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr
50 55 60
Ser Thr Asn Glu Thr Thr Asn Cys Thr Gly Gly Lys Asn Gly Ile Ala
65 70 75 80
Ala Asp Ile Thr Thr Ala Lys Gly Tyr Val Ala Ser Val Lys Thr Gln
85 90 95
Ser Gly Gly Ile Thr Val Lys Gly Asp Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu
100 105 110
Tyr Ile Leu Gln Ala Thr Gly Asn Ala Ala Thr Gly Val Thr Trp Thr
115 120 125
Thr Thr Cys Lys Gly Thr Glu Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys
130 135 140
Gly Ser Val Thr Gln
145 <210> 117 <211> 149 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 117
Met 1 Lys Leu Thr Thr 5 Leu Gln Thr Leu Lys 10 Lys Gly Phe Thr Leu 15 Ile
Glu Leu Met Ile Val Ile Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala Thr Ile Ala
20 25 30
Ile Pro Ser Tyr Gln Asn Tyr Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu
35 40 45
Leu Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr
50 55 60
Ser Thr Gly Lys Pro Ser Thr Cys Ser Gly Gly Asn Asn Gly Ile Ala
65 70 75 80
Ala Asp Ile Lys Thr Ala Lys Gly Tyr Val Ala Ser Val Lys Thr Gln
85 90 95
Ser Gly Gly Ile Thr Val Lys Gly Asp Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu
- 113 031580
100 105 110
Tyr Ile Leu Gln Ala Thr Gly Asn Ala Ala Thr Gly Val Thr Trp Thr
115 120 125
Thr Thr Cys Lys Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys
130 135 140
Gly Ser Val Thr Gln
145
<210> 118 <211> 149 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 118
Met 1 Lys Leu Thr Thr 5 Gln Gln Thr Leu Lys 10 Lys Gly Phe Thr Leu 15 Ile
Glu Leu Met Ile Val Ile Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala Thr Ile Ala
20 25 30
Ile Pro Ser Tyr Gln Asn Tyr Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu
35 40 45
Leu Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr
50 55 60
Ser Thr Gly Lys Pro Ser Thr Cys Ser Gly Gly Ser Asn Gly Ile Ala
65 70 75 80
Ala Asp Ile Thr Thr Ala Lys Gly Tyr Val Ala Ser Val Lys Thr Gln
85 90 95
Ser Gly Gly Ile Thr Val Lys Gly Asn Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu
100 105 110
Tyr Ile Leu Gln Ala Lys Gly Asn Ala Thr Ala Gly Val Thr Trp Thr
115 120 125
Thr Thr Cys Lys Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys
130 135 140
Arg Ser Val Thr Lys
145
<210> 119 <211> 149 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 119
Met 1 Lys Leu Thr Thr 5 Gln Gln Thr Leu Lys 10 Lys Gly Phe Thr Leu 15 Ile
Glu Leu Met Ile Val Ile Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala Thr Ile Ala
20 25 30
Ile Pro Ser Tyr Gln Asn Tyr Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu
35 40 45
Leu Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr
50 55 60
Ser Thr Asn Glu Ala Thr Lys Cys Thr Gly Gly Lys Asn Gly Ile Ala
65 70 75 80
Ala Asp Ile Thr Thr Ala Lys Gly Tyr Val Lys Ser Val Thr Thr Ser
85 90 95
Asn Gly Ala Ile Thr Val Lys Gly Asp Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu
100 105 110
Tyr Ile Leu Gln Ala Ser Gly Asn Ala Ala Thr Gly Val Thr Trp Thr
115 120 125
Thr Thr Cys Lys Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys
130 135 140
Gly Ser Val Thr Gln
145
- 114 031580 <210> 120 <211> 149 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 120
Met 1 Lys Leu Thr Thr 5 Leu Gln Thr Leu Lys 10 Lys Gly Phe Thr Leu 15 Ile
Glu Leu Met Ile Val Ile Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala Thr Ile Ala
20 25 30
Ile Pro Ser Tyr Gln Asn Tyr Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu
35 40 45
Leu Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr
50 55 60
Ser Thr Gly Lys Pro Ser Thr Cys Ser Gly Gly Ser Asn Gly Ile Ala
65 70 75 80
Ala Asp Ile Thr Thr Ala Lys Gly Tyr Val Ala Ser Val Lys Thr Gln
85 90 95
Ser Gly Gly Ile Thr Val Lys Gly Asn Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu
100 105 110
Tyr Ile Leu Gln Ala Thr Gly Asn Ala Ala Thr Gly Val Thr Trp Thr
115 120 125
Thr Thr Cys Lys Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys
130 135 140
Gly Ser Val Thr Gln
145
<210> 121 <211> 149 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 121
Met 1 Lys Leu Thr Thr 5 Gln Gln Thr Leu Lys 10 Lys Gly Phe Thr Leu 15 Ile
Glu Leu Met Ile Val Ile Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala Thr Ile Ala
20 25 30
Ile Pro Ser Tyr Gln Asn Tyr Thr Lys Lys Ala Ser Val Ser Glu Leu
35 40 45
Leu Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ser Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr
50 55 60
Ser Thr Gly Lys Pro Ser Thr Cys Ser Gly Gly Ser Asn Gly Ile Ala
65 70 75 80
Ala Asp Ile Thr Thr Ala Lys Gly Tyr Val Ala Ser Val Lys Thr Gln
85 90 95
Ser Gly Gly Ile Thr Val Lys Gly Asn Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu
100 105 110
Tyr Ile Leu Gln Ala Lys Gly Asn Ala Thr Ala Gly Val Thr Trp Thr
115 120 125
Thr Thr Cys Lys Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys
130 135 140
Arg Ser Val Thr Lys
145
<210> 122 <211> 144 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae
- 115 031580
<400> 122
Ser Ala Gln Ile Gln Lys Ala Glu Gln Asn Asp Val Lys Leu Ala Pro
1 5 10 15
Pro Thr Asp Val Arg Ser Gly Tyr Ile Arg Leu Val Lys Asn Val Asn
20 25 30
Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln
35 40 45
Ile Val His Phe Asp Ala Val Val Asn Leu Asp Lys Gly Leu Tyr Val
50 55 60
Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile
65 70 75 80
Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val Arg Thr Asp Phe Tyr
85 90 95
Asp Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys
100 105 110
Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Ala
115 120 125
Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Glu Ala Phe Ser Val Asp Lys Lys
130 135 140
<210> 123 <211> 143 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 123
Ala Gln Ile Gln Lys Ala Glu Gln Asn Asp Val Lys Leu Ala Pro Pro
1 5 10 15
Thr Asp Val Arg Ser Gly Tyr Ile Arg Leu Val Lys Asn Val Asn Tyr
20 25 30
Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln Ile
35 40 45
Val His Phe Asp Ala Val Val Asn Leu Asp Lys Gly Leu Tyr Val Tyr
50 55 60
Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile Leu
65 70 75 80
Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val Arg Thr Asp Phe Tyr Asp
85 90 95
Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys Lys
100 105 110
His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Ala Gln
115 120 125
Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Glu Ala Phe Ser Val Asp Lys Lys
130 135 140
<210> 124 <211> 142 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 124
Gln Ile Gln Lys Ala Glu Gln Asn Asp Val Lys Leu Ala Pro Pro Thr
1 5 10 15
Asp Val Arg Ser Gly Tyr Ile Arg Leu Val Lys Asn Val Asn Tyr Tyr
20 25 30
Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln Ile Val
35 40 45
His Phe Asp Ala Val Val Asn Leu Asp Lys Gly Leu Tyr Val Tyr Pro
50 55 60
Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile Leu Asn
65 70 75 80
- 116 031580
Cys Ala Asn Tyr His 85 Leu Thr Gln Val Arg 90 Thr Asp Phe Tyr Asp 95 Glu
Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys Lys His
100 105 110
Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Ala Gln Ile
115 120 125
Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Glu Ala Phe Ser Val Asp Lys Lys
130 135 140
<210> 125 <211> 141 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 125
Ile Gln Lys Ala Glu Gln Asn Asp Val Lys Leu Ala Pro Pro Thr Asp
1 5 10 15
Val Arg Ser Gly Tyr Ile Arg Leu Val Lys Asn Val Asn Tyr Tyr Ile
20 25 30
Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln Ile Val His
35 40 45
Phe Asp Ala Val Val Asn Leu Asp Lys Gly Leu Tyr Val Tyr Pro Glu
50 55 60
Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile Leu Asn Cys
65 70 75 80
Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val Arg Thr Asp Phe Tyr Asp Glu Phe
85 90 95
Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys Lys His Thr
100 105 110
Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Ala Gln Ile Ile
115 120 125
Cys Ala Asn Tyr Gly Glu Ala Phe Ser Val Asp Lys Lys
130 135 140
<210> 126 <211> 139 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 126
Lys Ala Glu Gln Asn Asp Val Lys Leu Ala Pro Pro Thr Asp Val Arg
1 5 10 15
Ser Gly Tyr Ile Arg Leu Val Lys Asn Val Asn Tyr Tyr Ile Asp Ser
20 25 30
Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln Ile Val His Phe Asp
35 40 45
Ala Val Val Asn Leu Asp Lys Gly Leu Tyr Val Tyr Pro Glu Pro Lys
50 55 60
Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile Leu Asn Cys Ala Asn
65 70 75 80
Tyr His Leu Thr Gln Val Arg Thr Asp Phe Tyr Asp Glu Phe Trp Gly
85 90 95
Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys Lys His Thr Leu Ser
100 105 110
Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Ala Gln Ile Ile Cys Ala
115 120 125
Asn Tyr Gly Glu Ala Phe Ser Val Asp Lys Lys
130 135
<210> 127
- 117 031580 <211> 110 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 127
Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu Leu Gln Ala Ser Ala Pro Tyr
1 5 10 15
Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr Ser Thr Asn Glu Thr Thr Asn
20 25 30
Cys Thr Gly Gly Lys Asn Gly Ile Ala Ala Asp Ile Thr Thr Ala Lys
35 40 45
Gly Tyr Val Lys Ser Val Thr Thr Ser Asn Gly Ala Ile Thr Val Lys
50 55 60
Gly Asp Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu Tyr Ile Leu Gln Ala Thr Gly
65 70 75 80
Asn Ala Ala Thr Gly Val Thr Trp Thr Thr Thr Cys Lys Gly Thr Asp
85 90 95
Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys Gly Ser Val Thr Gln
100 105 110
<210> 128 <211> 25 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 128
Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile Leu Asn Cys
1 5 10 15
Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val Arg
20 25
<210> 129 <211> 66 <212> DNA <213> Искусственная последовательность <220>
<223> pelB signal peptide <400> 129 atgaaatacc tgctgccgac cgctgctgct ggtctgctgc tcctcgctgc ccagccggcg 60 atggcc 66 <210> 130 <211> 22 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> pelB сигнальный пептид <400> 130
Met 1 Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 15
5 10
Ala Gln Pro Ala Met Ala
20
<210> 131 <211> 57 <212> ДНК
- 118 031580 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> FlgI сигнальный пептид <400> 131 atgattaaat ttctctctgc attaattctt ctactggtca cgacggcggc tcaggct 57 <210> 132 <211> 19 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> FlgI сигнальный пептид <400> 132
Met Ile Lys Phe Leu Ser Ala Leu Ile Leu Leu Leu Val Thr Thr Ala
5 10 15
Ala Gln Ala <210> 133 <211> 69 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> NadA сигнальный пептид <400> 133 atgaaacact ttccatccaa agtactgacc acagccatcc ttgccacttt ctgtagcggc gcactggca <210> 134 <211> 23 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> NadA сигнальный пептид <400> 134
Met Lys His Phe Pro Ser Lys Val Leu Thr Thr Ala Ile Leu Ala Thr
1 5 10 15
Phe Cys Ser Gly Ala Leu Ala
20
<210> 135 <211> 852 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> LVL312 <400> 135 atgattaaat ttctctctgc attaattctt ctactggtca cgacggcggc tcaggctgag60 actaaaaaag cagcggtatc tgaattactg caagcgtcag cgccttataa ggctgatgtg120 gaattatgtg tatatagcac aaatgaaaca acaaactgta cgggtggaaa aaatggtatt180 gcagcagata taaccacagc aaaaggctat gtaaaatcag tgacaacaag caacggtgca240
- 119 031580 ataacagtaa aatgctgcaa ccagcaaatt aatgatgtga aatgtgaatt gtacattttg cgttatgcac caagtacgaa aagcaaaaga attatttgtg caccaccact aaggggatgg caggtgtaac tttgcggaag agctggcacc attacatcga atgcagtggt gttctgttcg ctgatttcta aacatacgtt cgaactatgg aa cacattggca ttggacaaca tgtcacacaa gccgactgat tagtgaatcg gaatttagat tcagtataag tgatgaattt aagtttaaca tgaagcattt aatatggaat acttgcaaag ggcggcgcgc gtacgaagcg atctgggtgg aagggattgt atcttgaatt tggggacagg cctgatacaa tcagttgata atattttgca gaacggatgc agattcagaa gatatatacg ataaccaaga atgtttatcc gtgcaaatta gtttgcgggc cgctttataa aaaaaggcgg agctacaggt ctctttattt ggctgaacaa tttggtaaag gccacaaatt tgagcctaaa tcatttaact agcacctaaa tgctgctcag ccaccaccac
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
852 <210> 136 <211> 283 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> LVL312 <400> 136
Met Ile Lys Phe Leu Ser Ala Leu Ile Leu Leu Leu Val Thr Thr Ala
1 5 10 15
Ala Gln Ala Glu Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu Leu Gln Ala
20 25 30
Ser Ala Pro Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr Ser Thr Asn
35 40 45
Glu Thr Thr Asn Cys Thr Gly Gly Lys Asn Gly Ile Ala Ala Asp Ile
50 55 60
Thr Thr Ala Lys Gly Tyr Val Lys Ser Val Thr Thr Ser Asn Gly Ala
65 70 75 80
Ile Thr Val Lys Gly Asp Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu Tyr Ile Leu
85 90 95
Gln Ala Thr Gly Asn Ala Ala Thr Gly Val Thr Trp Thr Thr Thr Cys
100 105 110
Lys Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys Gly Ser Val
115 120 125
Thr Gln Gly Gly Ala Gln Ile Gln Lys Ala Glu Gln Asn Asp Val Lys
130 135 140
Leu Ala Pro Pro Thr Asp Val Arg Ser Gly Tyr Ile Arg Leu Val Lys
145 150 155 160
Asn Val Asn Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln
165 170 175
Glu Pro Gln Ile Val His Phe Asp Ala Val Val Asn Leu Asp Lys Gly
180 185 190
Leu Tyr Val Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln
195 200 205
Tyr Lys Ile Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val Arg Thr
210 215 220
Asp Phe Tyr Asp Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys
225 230 235 240
Lys Gln Lys Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr
245 250 255
Asn Ala Ala Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Glu Ala Phe Ser Val
260 265 270
Asp Lys Lys Gly Gly His His His His His His
275 280
<210> 137 <211> 855 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
- 120 031580 <220>
<223> LVL291 <400> 137 atgaaatacc atggcccaga cgaagcggat tgggtggata ggattgtatg ttgaattgtg ggacagggtt gatacaacgc gttgataaaa ccttataagg ggtggaaaaa acaacaagca attttgcaag acggatgcct caccaccacc tgctgccgac ttcagaaggc atatacgttt accaagagcc tttatcctga caaattatca tgcgggcagc tttataatgc aaggcggcac ctgatgtgga atggtattgc acggtgcaat ctacaggtaa ctttatttcc actaa cgctgctgct tgaacaaaat ggtaaagaat acaaattgta gcctaaacgt tttaactcaa acctaaaaag tgctcagatt taaaaaagca attatgtgta agcagatata aacagtaaaa tgctgcaaca agcaaatttt ggtctgctgc gatgtgaagc gtgaattatt cattttgatg tatgcacgtt gtacgaactg caaaagaaac atttgtgcga gcggtatctg tatagcacaa accacagcaa ggggatggca ggtgtaactt tgcggaagtg tcctcgctgc tggcaccgcc acatcgatag cagtggtgaa ctgttcgtca atttctatga atacgttaag actatggtga aattactgca atgaaacaac aaggctatgt cattggcaaa ggacaacaac tcacacaagg ccagccggcg gactgatgta tgaatcgatc tttagataag gtataagatc tgaattttgg tttaacacct agcattttca agcgtcagcg aaactgtacg aaaatcagtg tatggaatat ttgcaaagga cggccaccac
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
855 <210> 138 <211> 284 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> LVL291 <400> 138
Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala
1 5 10 15
Ala Gln Pro Ala Met Ala Gln Ile Gln Lys Ala Glu Gln Asn Asp Val
20 25 30
Lys Leu Ala Pro Pro Thr Asp Val Arg Ser Gly Tyr Ile Arg Leu Val
35 40 45
Lys Asn Val Asn Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn
50 55 60
Gln Glu Pro Gln Ile Val His Phe Asp Ala Val Val Asn Leu Asp Lys
65 70 75 80
Gly Leu Tyr Val Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg
85 90 95
Gln Tyr Lys Ile Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val Arg
100 105 110
Thr Asp Phe Tyr Asp Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro
115 120 125
Lys Lys Gln Lys Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu
130 135 140
Tyr Asn Ala Ala Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Glu Ala Phe Ser
145 150 155 160
Val Asp Lys Lys Gly Gly Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu Leu
165 170 175
Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr Ser
180 185 190
Thr Asn Glu Thr Thr Asn Cys Thr Gly Gly Lys Asn Gly Ile Ala Ala
195 200 205
Asp Ile Thr Thr Ala Lys Gly Tyr Val Lys Ser Val Thr Thr Ser Asn
210 215 220
Gly Ala Ile Thr Val Lys Gly Asp Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu Tyr
225 230 235 240
Ile Leu Gln Ala Thr Gly Asn Ala Ala Thr Gly Val Thr Trp Thr Thr
245 250 255
Thr Cys Lys Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys Gly
- 121 031580
260 265
Ser Val Thr Gln Gly Gly His His His His His His
275 280
270 <210> 139 <211> 852 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> LVL268 <400> 139 atgaaatacc tgctgccgac cgctgctgct ggtctgctgc tcctcgctgc ccagccggcg60 atggccgata ttcagaaggc tgaacaaaat gatgtgaagc tggcaccgcc gactgatgta120 cgaagcggat atatacgttt ggtaaagaat gtgaattatt acatcgatag tgaatcgatc180 tgggtggata accaagagcc acaaattgta cattttgatg cagtggtgaa tttagataag240 ggattgtatg tttatcctga gcctaaacgt tatgcacgtt ctgttcgtca gtataagatc300 ttgaattgtg caaattatca tttaactcaa gtacgaactg atttctatga tgaattttgg360 ggacagggtt tgcgggcagc acctaaaaag caaaagaaac atacgttaag tttaacacct420 gatacaacgc tttataatgc tgctcagatt atttgtgcga actatggtga agcattttca480 gttgataaaa aaggcggcac taaaaaagca gcggtatctg aattactgca agcgtcagcg540 ccttataagg ctgatgtgga attatgtgta tatagcacaa atgaaacaac aaactgtacg600 ggtggaaaaa atggtattgc agcagatata accacagcaa aaggctatgt aaaatcagtg660 acaacaagca acggtgcaat aacagtaaaa ggggatggca cattggcaaa tatggaatat720 attttgcaag ctacaggtaa tgctgcaaca ggtgtaactt ggacaacaac ttgcaaagga780 acggatgcct ctttatttcc agcaaatttt tgcggaagtg tcacacaagg cggccaccac840 caccaccacc ac852 <210> 140 <211> 284 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> LVL268 <400> 140
Met 1 Lys Tyr Leu Leu 5 Pro Thr Ala Ala Ala 10 Gly Leu Leu Leu Leu 15 Ala
Ala Gln Pro Ala Met Ala Asp Ile Gln Lys Ala Glu Gln Asn Asp Val
20 25 30
Lys Leu Ala Pro Pro Thr Asp Val Arg Ser Gly Tyr Ile Arg Leu Val
35 40 45
Lys Asn Val Asn Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn
50 55 60
Gln Glu Pro Gln Ile Val His Phe Asp Ala Val Val Asn Leu Asp Lys
65 70 75 80
Gly Leu Tyr Val Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg
85 90 95
Gln Tyr Lys Ile Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val Arg
100 105 110
Thr Asp Phe Tyr Asp Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro
115 120 125
Lys Lys Gln Lys Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu
130 135 140
Tyr Asn Ala Ala Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Glu Ala Phe Ser
145 150 155 160
Val Asp Lys Lys Gly Gly Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu Leu
165 170 175
Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr Ser
180 185 190
- 122 031580
Thr Asn Glu Thr Thr Asn Cys 195 Thr Gly 200 Gly Lys Asn Gly 205 Ile Ala Ala
Asp Ile Thr Thr Ala Lys Gly Tyr Val Lys Ser Val Thr Thr Ser Asn
210 215 220
Gly Ala Ile Thr Val Lys Gly Asp Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu Tyr
225 230 235 240
Ile Leu Gln Ala Thr Gly Asn Ala Ala Thr Gly Val Thr Trp Thr Thr
245 250 255
Thr Cys Lys Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys Gly
260 265 270
Ser Val Thr Gln Gly Gly His His His His His His
275 280
<210> 141 <211> 867 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> LVL269 <400> 141 atgaaacact gcactggcag ccgactgatg agtgaatcga aatttagata cagtataaga gatgaatttt agtttaacac gaagcatttt caagcgtcag acaaactgta gtaaaatcag aatatggaat acttgcaaag ggcggccacc ttccatccaa ccacaaacga tacgaagcgg tctgggtgga agggattgta tcttgaattg ggggacaggg ctgatacaac cagttgataa cgccttataa cgggtggaaa tgacaacaag atattttgca gaacggatgc accaccacca agtactgacc cgacgataag atatatacgt taaccaagag tgtttatcct tgcaaattat tttgcgggca gctttataat aaaaggcggc ggctgatgtg aaatggtatt caacggtgca agctacaggt ctctttattt ccactaa acagccatcc gctgaacaaa ttggtaaaga ccacaaattg gagcctaaac catttaactc gcacctaaaa gctgctcaga actaaaaaag gaattatgtg gcagcagata ataacagtaa aatgctgcaa ccagcaaatt ttgccacttt atgatgtgaa atgtgaatta tacattttga gttatgcacg aagtacgaac agcaaaagaa ttatttgtgc cagcggtatc tatatagcac taaccacagc aaggggatgg caggtgtaac tttgcggaag ctgtagcggc gctggcaccg ttacatcgat tgcagtggtg ttctgttcgt tgatttctat acatacgtta gaactatggt tgaattactg aaatgaaaca aaaaggctat cacattggca ttggacaaca tgtcacacaa
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
867 <210> 142 <211> 288 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> LVL269 <400> 142
Met Lys His Phe Pro Ser Lys Val Leu Thr Thr Ala Ile Leu Ala Thr
1 5 10 15
Phe Cys Ser Gly Ala Leu Ala Ala Thr Asn Asp Asp Asp Lys Ala Glu
20 25 30
Gln Asn Asp Val Lys Leu Ala Pro Pro Thr Asp Val Arg Ser Gly Tyr
35 40 45
Ile Arg Leu Val Lys Asn Val Asn Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile
50 55 60
Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln Ile Val His Phe Asp Ala Val Val
65 70 75 80
Asn Leu Asp Lys Gly Leu Tyr Val Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala
85 90 95
Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu
100 105 110
Thr Gln Val Arg Thr Asp Phe Tyr Asp Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu
- 123 031580
115 120 125
Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Pro
130 135 140
Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Ala Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly
145 150 155 160
Glu Ala Phe Ser Val Asp Lys Lys Gly Gly Thr Lys Lys Ala Ala Val
165 170 175
Ser Glu Leu Leu Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu
180 185 190
Cys Val Tyr Ser Thr Asn Glu Thr Thr Asn Cys Thr Gly Gly Lys Asn
195 200 205
Gly Ile Ala Ala Asp Ile Thr Thr Ala Lys Gly Tyr Val Lys Ser Val
210 215 220
Thr Thr Ser Asn Gly Ala Ile Thr Val Lys Gly Asp Gly Thr Leu Ala
225 230 235 240
Asn Met Glu Tyr Ile Leu Gln Ala Thr Gly Asn Ala Ala Thr Gly Val
245 250 255
Thr Trp Thr Thr Thr Cys Lys Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala
260 265 270
Asn Phe Cys Gly Ser Val Thr Gln Gly Gly His His His His His His
275 280 285
<210> 143 <211> 792 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> LVL270 <400> 143 atgcaccacc ctggcaccgc tacatcgata gcagtggtga tctgttcgtc gatttctatg catacgttaa aactatggtg gaattactgc aatgaaacaa aaaggctatg acattggcaa tggacaacaa gtcacacaat accaccacca cgactgatgt gtgaatcgat atttagataa agtataagat atgaattttg gtttaacacc aagcattttc aagcgtcagc caaactgtac taaaatcagt atatggaata cttgcaaagg aa cagcgcgcag acgaagcgga ctgggtggat gggattgtat cttgaattgt gggacagggt tgatacaacg agttgataaa gccttataag gggtggaaaa gacaacaagc tattttgcaa aacggatgcc attcagaagg tatatacgtt aaccaagagc gtttatcctg gcaaattatc ttgcgggcag ctttataatg aaaggcggca gctgatgtgg aatggtattg aacggtgcaa gctacaggta tctttatttc ctgaacaaaa tggtaaagaa cacaaattgt agcctaaacg atttaactca cacctaaaaa ctgctcagat ctaaaaaagc aattatgtgt cagcagatat taacagtaaa atgctgcaac cagcaaattt tgatgtgaag tgtgaattat acattttgat ttatgcacgt agtacgaact gcaaaagaaa tatttgtgcg agcggtatct atatagcaca aaccacagca aggggatggc aggtgtaact ttgcggaagt
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
792 <210> 144 <211> 263 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> LVL270 <400> 144
Met 1 His His His His 5 His His Ser Ala Gln 10 Ile Gln Lys Ala Glu Gln 15
Asn Asp Val Lys Leu Ala Pro Pro Thr Asp Val Arg Ser Gly Tyr Ile
20 25 30
Arg Leu Val Lys Asn Val Asn Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp
35 40 45
Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln Ile Val His Phe Asp Ala Val Val Asn
- 124 031580
50 55 60
Leu Asp Lys Gly Leu Tyr Val Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg
65 70 75 80
Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr
85 90 95
Gln Val Arg Thr Asp Phe Tyr Asp Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg
100 105 110
Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp
115 120 125
Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Ala Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Glu
130 135 140
Ala Phe Ser Val Asp Lys Lys Gly Gly Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser
145 150 155 160
Glu Leu Leu Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys
165 170 175
Val Tyr Ser Thr Asn Glu Thr Thr Asn Cys Thr Gly Gly Lys Asn Gly
180 185 190
Ile Ala Ala Asp Ile Thr Thr Ala Lys Gly Tyr Val Lys Ser Val Thr
195 200 205
Thr Ser Asn Gly Ala Ile Thr Val Lys Gly Asp Gly Thr Leu Ala Asn
210 215 220
Met Glu Tyr Ile Leu Gln Ala Thr Gly Asn Ala Ala Thr Gly Val Thr
225 230 235 240
Trp Thr Thr Thr Cys Lys Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn
245 250 255
Phe Cys Gly Ser Val Thr Gln
260
<210> 145 <211> 852 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> LVL315 <400> 145 atgaaatacc atggccatgg agcggatata gtggataacc ttgtatgttt aattgtgcaa cagggtttgc acaacgcttt gataaaaaag tataaggctg ggaaaaaatg acaagcaacg ttgcaagcta gatgcctctt caccaccact tgctgccgac ataaggctga tacgtttggt aagagccaca atcctgagcc attatcattt gggcagcacc ataatgctgc gcggcactaa atgtggaatt gtattgcagc gtgcaataac caggtaatgc tatttccagc aa cgctgctgct acaaaatgat aaagaatgtg aattgtacat taaacgttat aactcaagta taaaaagcaa tcagattatt aaaagcagcg atgtgtatat agatataacc agtaaaaggg tgcaacaggt aaatttttgc ggtctgctgc gtgaagctgg aattattaca tttgatgcag gcacgttctg cgaactgatt aagaaacata tgtgcgaact gtatctgaat agcacaaatg acagcaaaag gatggcacat gtaacttgga ggaagtgtca tcctcgctgc caccgccgac tcgatagtga tggtgaattt ttcgtcagta tctatgatga cgttaagttt atggtgaagc tactgcaagc aaacaacaaa gctatgtaaa tggcaaatat caacaacttg cacaaggcgg ccagccggcg tgatgtacga atcgatctgg agataaggga taagatcttg attttgggga aacacctgat attttcagtt gtcagcgcct ctgtacgggt atcagtgaca ggaatatatt caaaggaacg ccaccaccac
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
852 <210> 146 <211> 283 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> LVL315 <400> 146
- 125 031580
Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala
1 5 10 15
Ala Gln Pro Ala Met Ala Met Asp Lys Ala Glu Gln Asn Asp Val Lys
20 25 30
Leu Ala Pro Pro Thr Asp Val Arg Ser Gly Tyr Ile Arg Leu Val Lys
35 40 45
Asn Val Asn Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln
50 55 60
Glu Pro Gln Ile Val His Phe Asp Ala Val Val Asn Leu Asp Lys Gly
65 70 75 80
Leu Tyr Val Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln
85 90 95
Tyr Lys Ile Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val Arg Thr
100 105 110
Asp Phe Tyr Asp Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys
115 120 125
Lys Gln Lys Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr
130 135 140
Asn Ala Ala Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Glu Ala Phe Ser Val
145 150 155 160
Asp Lys Lys Gly Gly Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu Leu Gln
165 170 175
Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr Ser Thr
180 185 190
Asn Glu Thr Thr Asn Cys Thr Gly Gly Lys Asn Gly Ile Ala Ala Asp
195 200 205
Ile Thr Thr Ala Lys Gly Tyr Val Lys Ser Val Thr Thr Ser Asn Gly
210 215 220
Ala Ile Thr Val Lys Gly Asp Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu Tyr Ile
225 230 235 240
Leu Gln Ala Thr Gly Asn Ala Ala Thr Gly Val Thr Trp Thr Thr Thr
245 250 255
Cys Lys Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys Gly Ser
260 265 270
Val Thr Gln Gly Gly His His His His His His
275 280
<210> 147 <211> 831 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> LVL317 <400> 147 atgaaatacc tgctgccgac cgctgctgct ggtctgctgc tcctcgctgc ccagccggcg60 atggcccaga ttcagaaggc tgaacaaaat gatgtgaagc tggcaccgcc gactgatgta120 cgaagcggat atatacgttt ggtaaagaat gtgaattatt acatcgatag tgaatcgatc180 tgggtggata accaagagcc acaaattgta cattttgatg cagtggtgaa tttagataag240 ggattgtatg tttatcctga gcctaaacgt tatgcacgtt ctgttcgtca gtataagatc300 ttgaattgtg caaattatca tttaactcaa gtacgaactg atttctatga tgaattttgg360 ggacagggtt tgcgggcagc acctaaaaag caaaagaaac atacgttaag tttaacacct420 gatacaacgc tttataatgc tgctcagatt atttgtgcga actatggtga agcattttca480 gttgataaaa aaggcggcac taaaaaagca gcggtatctg aattactgca agcgtcagcg540 ccttataagg ctgatgtgga attatgtgta tatagcacaa atgaaacaac aaactgtacg600 ggtggaaaaa atggtattgc agcagatata accacagcaa aaggctatgt aaaatcagtg660 acaacaagca acggtgcaat aacagtaaaa ggggatggca cattggcaaa tatggaatat720 attttgcaag ctacaggtaa tgctgcaaca ggtgtaactt ggacaacaac ttgcaaagga780 acggatgcct ctttatttcc agcaaatttt tgcggaagtg tcacacaata a831 <210> 148
- 126 031580 <211> 276 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> LVL317 <400> 148
Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala
1 5 10 15
Ala Gln Pro Ala Met Ala Gln Ile Gln Lys Ala Glu Gln Asn Asp Val
20 25 30
Lys Leu Ala Pro Pro Thr Asp Val Arg Ser Gly Tyr Ile Arg Leu Val
35 40 45
Lys Asn Val Asn Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn
50 55 60
Gln Glu Pro Gln Ile Val His Phe Asp Ala Val Val Asn Leu Asp Lys
65 70 75 80
Gly Leu Tyr Val Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg
85 90 95
Gln Tyr Lys Ile Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val Arg
100 105 110
Thr Asp Phe Tyr Asp Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro
115 120 125
Lys Lys Gln Lys Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu
130 135 140
Tyr Asn Ala Ala Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Glu Ala Phe Ser
145 150 155 160
Val Asp Lys Lys Gly Gly Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu Leu
165 170 175
Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr Ser
180 185 190
Thr Asn Glu Thr Thr Asn Cys Thr Gly Gly Lys Asn Gly Ile Ala Ala
195 200 205
Asp Ile Thr Thr Ala Lys Gly Tyr Val Lys Ser Val Thr Thr Ser Asn
210 215 220
Gly Ala Ile Thr Val Lys Gly Asp Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu Tyr
225 230 235 240
Ile Leu Gln Ala Thr Gly Asn Ala Ala Thr Gly Val Thr Trp Thr Thr
245 250 255
Thr Cys Lys Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys Gly
260 265 270
Ser Val Thr Gln
275
<210> 149 <211> 828 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> LVL318 <400> 149 atgaaatacc tgctgccgac cgctgctgct ggtctgctgc tcctcgctgc ccagccggcg60 atggccatgg ataaggctga acaaaatgat gtgaagctgg caccgccgac tgatgtacga120 agcggatata tacgtttggt aaagaatgtg aattattaca tcgatagtga atcgatctgg180 gtggataacc aagagccaca aattgtacat tttgatgcag tggtgaattt agataaggga240 ttgtatgttt atcctgagcc taaacgttat gcacgttctg ttcgtcagta taagatcttg300 aattgtgcaa attatcattt aactcaagta cgaactgatt tctatgatga attttgggga360 cagggtttgc gggcagcacc taaaaagcaa aagaaacata cgttaagttt aacacctgat420 acaacgcttt ataatgctgc tcagattatt tgtgcgaact atggtgaagc attttcagtt480
- 127 031580 gataaaaaag gcggcactaa aaaagcagcg gtatctgaat tactgcaagc gtcagcgcct 540 tataaggctg atgtggaatt atgtgtatat agcacaaatg aaacaacaaa ctgtacgggt 600 ggaaaaaatg gtattgcagc agatataacc acagcaaaag gctatgtaaa atcagtgaca 660 acaagcaacg gtgcaataac agtaaaaggg gatggcacat tggcaaatat ggaatatatt 720 ttgcaagcta caggtaatgc tgcaacaggt gtaacttgga caacaacttg caaaggaacg 780 gatgcctctt tatttccagc aaatttttgc ggaagtgtca cacaataa 828 <210> 150 <211> 275 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> LVL318 <400> 150
Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala
1 5 10 15
Ala Gln Pro Ala Met Ala Met Asp Lys Ala Glu Gln Asn Asp Val Lys
20 25 30
Leu Ala Pro Pro Thr Asp Val Arg Ser Gly Tyr Ile Arg Leu Val Lys
35 40 45
Asn Val Asn Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln
50 55 60
Glu Pro Gln Ile Val His Phe Asp Ala Val Val Asn Leu Asp Lys Gly
65 70 75 80
Leu Tyr Val Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln
85 90 95
Tyr Lys Ile Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val Arg Thr
100 105 110
Asp Phe Tyr Asp Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys
115 120 125
Lys Gln Lys Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr
130 135 140
Asn Ala Ala Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Glu Ala Phe Ser Val
145 150 155 160
Asp Lys Lys Gly Gly Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu Leu Gln
165 170 175
Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr Ser Thr
180 185 190
Asn Glu Thr Thr Asn Cys Thr Gly Gly Lys Asn Gly Ile Ala Ala Asp
195 200 205
Ile Thr Thr Ala Lys Gly Tyr Val Lys Ser Val Thr Thr Ser Asn Gly
210 215 220
Ala Ile Thr Val Lys Gly Asp Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu Tyr Ile
225 230 235 240
Leu Gln Ala Thr Gly Asn Ala Ala Thr Gly Val Thr Trp Thr Thr Thr
245 250 255
Cys Lys Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys Gly Ser
260 265 270
Val Thr Gln
275
<210> 151 <211> 483 <212> ДНК <213> Haemophilus influenzae <400> 151 atgaaaaaaa ttattttaac attatcactt gggttactta ccgcttgttc tgctcaaatc 60 caaaaggctg aacaaaatga tgtgaagctg gcaccgccga ctgatgtacg aagcggatat 120 atacgtttgg taaagaatgt gaattattac atcgatagtg aatcgatctg ggtggataac 180
- 128 031580 caagagccac tatcctgagc aattatcatt cgggcagcac tataatgctg taa aaattgtaca ctaaacgtta taactcaaat ctaaaaagca ctcagattat ttttgatgct tgcacgttct acgaactgat aaagaaacat ttgtgcaaat gtggtgaatt tagatagggg attgtatgtt 240 gttcgtcagt ataagatttt gaattgtgca 300 ttctatgatg aattttgggg acagggtttg 360 acgttaagtt taacacctga tacaacgctt 420 tatggtaaag cattttcagt tgataaaaaa 480
483 <210> 152 <211> 160 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 152
Met Lys Lys Ile Ile Leu Thr Leu Ser Leu Gly Leu Leu Thr Ala Cys
1 5 10 15
Ser Ala Gln Ile Gln Lys Ala Glu Gln Asn Asp Val Lys Leu Ala Pro
20 25 30
Pro Thr Asp Val Arg Ser Gly Tyr Ile Arg Leu Val Lys Asn Val Asn
35 40 45
Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln
50 55 60
Ile Val His Phe Asp Ala Val Val Asn Leu Asp Arg Gly Leu Tyr Val
65 70 75 80
Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile
85 90 95
Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Ile Arg Thr Asp Phe Tyr
100 105 110
Asp Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys
115 120 125
Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Ala
130 135 140
Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Lys Ala Phe Ser Val Asp Lys Lys
145 150 155 160
<210> 153 <211> 480 <212> ДНК <213> Haemophilus influenzae <400> 153 atgaaaaaaa ttattttaac attatcactt gggttactta ctgcctgttc tgctcaaatc60 caaaaggcta aacaaaatga tgtgaagctg gcaccgccga ctgatgtacg aagcggatat120 atacgtttgg taaagaatgt gaattattac atcgatagtg aatcgatctg ggtggataac180 caagagccac aaattgtaca ttttgatgca gtggtgaatt tagataaggg attgtatgtt240 tatcctgagc ctaaacgtta tgcacgttct gttcgtcagt ataagatctt gaattgtgca300 aattatcatt taactcaagt acgaactgat ttctatgatg aattttgggg acagggtttg360 cgggcagcac ctaaaaagca aaagaaacat acgttaagtt taacacctga tacaacgctt420 tataatgctg ctcagattat ttgtgcgaac tatggtgaag cattttcagt tgataaaaaa480 <210> 154 <211> 160 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 154
Met Lys Lys Ile Ile Leu Thr Leu Ser Leu Gly Leu Leu Thr Ala Cys
1 5 10 15
Ser Ala Gln Ile Gln Lys Ala Lys Gln Asn Asp Val Lys Leu Ala Pro
20 25 30
Pro Thr Asp Val Arg Ser Gly Tyr Ile Arg Leu Val Lys Asn Val Asn
35 40 45
- 129 031580
Tyr Tyr 50 Ile Asp Ser Glu Ser 55 Ile Trp Val Asp Asn Gln 60 Glu Pro Gln
Ile Val His Phe Asp Ala Val Val Asn Leu Asp Lys Gly Leu Tyr Val
65 70 75 80
Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile
85 90 95
Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val Arg Thr Asp Phe Tyr
100 105 110
Asp Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys
115 120 125
Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Ala
130 135 140
Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Glu Ala Phe Ser Val Asp Lys Lys
145 150 155 160
<210> 155 <211> 91 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 155 cacacacata tgattaaatt tctctctgca ttaattcttc tactggtcac gacggcggct 60 caggctgaga ctaaaaaagc agcggtatct g 91 <210> 156 <211> 66 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 156 tgtgtgaagc ttttagtggt ggtggtggtg gtggccgcct tgtgtgacac ttccgcaaaa 60 atttgc 66 <210> 157 <211> 58 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 157
tttgcggaag tgtcacacaa ggcggcgcgc agattcagaa ggctgaacaa aatgatgt 58
<210> 158
<211> 58
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<400> 158
acatcatttt gttcagcctt ctgaatctgc gcgccgcctt gtgtgacact tccgcaaa 58
<210> 159
- 130 031580 <211> 59 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 159 tgtgtgaagc ttttagtggt ggtggtggtg gtggccgcct tttttatcaa ctgaaaatg 59 <210> 160 <211> 65 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 160 cacacacata tgcaccacca ccaccaccac agcgcgcaga ttcagaaggc tgaacaaaat 60 gatgt 65 <210> 161 <211> 46 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 161 cattttcagt tgataaaaaa ggcggcacta aaaaagcagc ggtatc 46 <210> 162 <211> 46 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 162 gataccgctg cttttttagt gccgcctttt ttatcaactg aaaatg 46 <210> 163 <211> 35 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 163 tgtgtgaagc ttttattgtg tgacacttcc gcaaa 35 <210> 164 <211> 104 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер
- 131 031580 <400> 164 cacacacata tgaaatacct gctgccgacc gctgctgctg gtctgctgct cctcgctgcc 60 cagccggcga tggcccagat tcagaaggct gaacaaaatg atgt 104 <210> 165 <211> 49 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 165 gcattttcag ttgataaaaa aggcggcact aaaaaagcag cggtatctg 49 <210> 166 <211> 49 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 166 cagataccgc tgctttttta gtgccgcctt ttttatcaac tgaaaatgc 49 <210> 167 <211> 104 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 167 cacacacata tgaaatacct gctgccgacc gctgctgctg gtctgctgct cctcgctgcc 60 cagccggcga tggccgatat tcagaaggct gaacaaaatg atgt 104 <210> 168 <211> 115 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 168 cacacacata tgaaacactt tccatccaaa gtactgacca cagccatcct tgccactttc 60 tgtagcggcg cactggcagc cacaaacgac gacgataagg ctgaacaaaa tgatg 115 <210> 169 <211> 35 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 169 gccggcgatg gccatggata aggctgaaca aaatg 35 <210> 170 <211> 35
- 132 031580 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 170 cattttgttc agccttatcc atggccatcg ccggc 35 <210> 171 <211> 34 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 171 ggaagtgtca cacaataagg cggccaccac cacc 34 <210> 172 <211> 34 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 172 ggtggtggtg gccgccttat tgtgtgacac ttcc 34 <210> 173 <211> 54 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 173 gaattccata tgcaccatca ccatcaccat actaaaaaag cagcggtatc tgaa 54 <210> 174 <211> 32 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 174 gcgccgctcg agtcattgtg tgacacttcc gc 32 <210> 175 <211> 43 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 175 gcccagccgg cgatggccca gatccagaag gctgaacaaa atg 43
- 133 031580 <210> 176 <211> 43 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 176 cattttgttc agccttctgg atctgggcca tcgccggctg ggc <210> 177 <211> 254 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Слитый белок <400> 177
Gln Ile Gln Lys Ala Glu Gln Asn Asp Val Lys Leu Ala Pro Pro Thr
1 5 10 15
Asp Val Arg Ser Gly Tyr Ile Arg Leu Val Lys Asn Val Asn Tyr Tyr
20 25 30
Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln Ile Val
35 40 45
His Phe Asp Ala Val Val Asn Leu Asp Lys Gly Leu Tyr Val Tyr Pro
50 55 60
Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile Leu Asn
65 70 75 80
Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val Arg Thr Asp Phe Tyr Asp Glu
85 90 95
Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys Lys His
100 105 110
Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Ala Gln Ile
115 120 125
Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Glu Ala Phe Ser Val Asp Lys Lys Gly Gly
130 135 140
Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu Leu Gln Ala Ser Ala Pro Tyr
145 150 155 160
Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr Ser Thr Asn Glu Thr Thr Asn
165 170 175
Cys Thr Gly Gly Lys Asn Gly Ile Ala Ala Asp Ile Thr Thr Ala Lys
180 185 190
Gly Tyr Val Lys Ser Val Thr Thr Ser Asn Gly Ala Ile Thr Val Lys
195 200 205
Gly Asp Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu Tyr Ile Leu Gln Ala Thr Gly
210 215 220
Asn Ala Ala Thr Gly Val Thr Trp Thr Thr Thr Cys Lys Gly Thr Asp
225 230 235 240
Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys Gly Ser Val Thr Gln
245 250
<210> <211> <212> <213> 178 6 БЕЛОК Искусственная последовательность
<220> <223> Синтетическая конструкция
- 134 031580 <400> 178
Ala Thr Asn Asp Asp Asp
5 <210> 179 <211> 138 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 179
Ala Glu Gln Asn Asp Val Lys Leu Ala Pro Pro Thr Asp Val Arg Ser
1 5 10 15
Gly Tyr Ile Arg Leu Val Lys Asn Val Asn Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu
20 25 30
Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln Ile Val His Phe Asp Ala
35 40 45
Val Val Asn Leu Asp Lys Gly Leu Tyr Val Tyr Pro Glu Pro Lys Arg
50 55 60
Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile Leu Asn Cys Ala Asn Tyr
65 70 75 80
His Leu Thr Gln Val Arg Thr Asp Phe Tyr Asp Glu Phe Trp Gly Gln
85 90 95
Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys Lys His Thr Leu Ser Leu
100 105 110
Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Ala Gln Ile Ile Cys Ala Asn
115 120 125
Tyr Gly Glu Ala Phe Ser Val Asp Lys Lys
130 135
<210> 180 <211> 137 <212> БЕЛОК <213> Haemophilus influenzae <400> 180
Glu Gln Asn Asp Val Lys Leu Ala Pro Pro Thr Asp Val Arg Ser Gly
1 5 10 15
Tyr Ile Arg Leu Val Lys Asn Val Asn Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser
20 25 30
Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln Ile Val His Phe Asp Ala Val
35 40 45
Val Asn Leu Asp Lys Gly Leu Tyr Val Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr
50 55 60
Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His
65 70 75 80
Leu Thr Gln Val Arg Thr Asp Phe Tyr Asp Glu Phe Trp Gly Gln Gly
85 90 95
Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys Lys His Thr Leu Ser Leu Thr
100 105 110
Pro Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Ala Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr
115 120 125
Gly Glu Ala Phe Ser Val Asp Lys Lys
130 135
<210> 181 <211> 849 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
- 135 031580 <223> LVL702 <400> 181 atgaaatacc atggccattc agcggatata gtggataacc ttgtatgttt aattgtgcaa cagggtttgc acaacgcttt gataaaaaag tataaggctg ggaaaaaatg acaagcaacg ttgcaagcta gatgcctctt caccaccac tgctgccgac agaaggctga tacgtttggt aagagccaca atcctgagcc attatcattt gggcagcacc ataatgctgc gcggcactaa atgtggaatt gtattgcagc gtgcaataac caggtaatgc tatttccagc cgctgctgct acaaaatgat aaagaatgtg aattgtacat taaacgttat aactcaagta taaaaagcaa tcagattatt aaaagcagcg atgtgtatat agatataacc agtaaaaggg tgcaacaggt aaatttttgc ggtctgctgc gtgaagctgg aattattaca tttgatgcag gcacgttctg cgaactgatt aagaaacata tgtgcgaact gtatctgaat agcacaaatg acagcaaaag gatggcacat gtaacttgga ggaagtgtca tcctcgctgc caccgccgac tcgatagtga tggtgaattt ttcgtcagta tctatgatga cgttaagttt atggtgaagc tactgcaagc aaacaacaaa gctatgtaaa tggcaaatat caacaacttg cacaaggcgg ccagccggcg tgatgtacga atcgatctgg agataaggga taagatcttg attttgggga aacacctgat attttcagtt gtcagcgcct ctgtacgggt atcagtgaca ggaatatatt caaaggaacg ccaccaccac
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
849 <210> 182 <211> 283 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> LVL702 <400> 182
Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala
1 5 10 15
Ala Gln Pro Ala Met Ala Ile Gln Lys Ala Glu Gln Asn Asp Val Lys
20 25 30
Leu Ala Pro Pro Thr Asp Val Arg Ser Gly Tyr Ile Arg Leu Val Lys
35 40 45
Asn Val Asn Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln
50 55 60
Glu Pro Gln Ile Val His Phe Asp Ala Val Val Asn Leu Asp Lys Gly
65 70 75 80
Leu Tyr Val Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln
85 90 95
Tyr Lys Ile Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val Arg Thr
100 105 110
Asp Phe Tyr Asp Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys
115 120 125
Lys Gln Lys Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr
130 135 140
Asn Ala Ala Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Glu Ala Phe Ser Val
145 150 155 160
Asp Lys Lys Gly Gly Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu Leu Gln
165 170 175
Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr Ser Thr
180 185 190
Asn Glu Thr Thr Asn Cys Thr Gly Gly Lys Asn Gly Ile Ala Ala Asp
195 200 205
Ile Thr Thr Ala Lys Gly Tyr Val Lys Ser Val Thr Thr Ser Asn Gly
210 215 220
Ala Ile Thr Val Lys Gly Asp Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu Tyr Ile
225 230 235 240
Leu Gln Ala Thr Gly Asn Ala Ala Thr Gly Val Thr Trp Thr Thr Thr
245 250 255
Cys Lys Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys Gly Ser
260 265 270
Val Thr Gln Gly Gly His His His His His His
- 136 031580
275
280 <210> 183 <211> 858 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> LVL736 <400> 183 atgaaatacc atggccagcg gatgtacgaa tcgatctggg gataagggat aagatcttga ttttggggac acacctgata ttttcagttg tcagcgcctt tgtacgggtg tcagtgacaa gaatatattt aaaggaacgg caccaccacc tgctgccgac cccagattca gcggatatat tggataacca tgtatgttta attgtgcaaa agggtttgcg caacgcttta ataaaaaagg ataaggctga gaaaaaatgg caagcaacgg tgcaagctac atgcctcttt accaccac cgctgctgct gaaggctgaa acgtttggta agagccacaa tcctgagcct ttatcattta ggcagcacct taatgctgct cggcactaaa tgtggaatta tattgcagca tgcaataaca aggtaatgct atttccagca ggtctgctgc caaaatgatg aagaatgtga attgtacatt aaacgttatg actcaagtac aaaaagcaaa cagattattt aaagcagcgg tgtgtatata gatataacca gtaaaagggg gcaacaggtg aatttttgcg tcctcgctgc tgaagctggc attattacat ttgatgcagt cacgttctgt gaactgattt agaaacatac gtgcgaacta tatctgaatt gcacaaatga cagcaaaagg atggcacatt taacttggac gaagtgtcac ccagccggcg accgccgact cgatagtgaa ggtgaattta tcgtcagtat ctatgatgaa gttaagttta tggtgaagca actgcaagcg aacaacaaac ctatgtaaaa ggcaaatatg aacaacttgc acaaggcggc
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
858 <210> 184 <211> 286 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> LVL736 <400> 184
Met 1 Lys Tyr Leu Leu 5 Pro Thr Ala Ala Ala 10 Gly Leu Leu Leu Leu 15 Ala
Ala Gln Pro Ala Met Ala Ser Ala Gln Ile Gln Lys Ala Glu Gln Asn
20 25 30
Asp Val Lys Leu Ala Pro Pro Thr Asp Val Arg Ser Gly Tyr Ile Arg
35 40 45
Leu Val Lys Asn Val Asn Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val
50 55 60
Asp Asn Gln Glu Pro Gln Ile Val His Phe Asp Ala Val Val Asn Leu
65 70 75 80
Asp Lys Gly Leu Tyr Val Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser
85 90 95
Val Arg Gln Tyr Lys Ile Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln
100 105 110
Val Arg Thr Asp Phe Tyr Asp Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala
115 120 125
Ala Pro Lys Lys Gln Lys Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr
130 135 140
Thr Leu Tyr Asn Ala Ala Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Glu Ala
145 150 155 160
Phe Ser Val Asp Lys Lys Gly Gly Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu
165 170 175
Leu Leu Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val
180 185 190
Tyr Ser Thr Asn Glu Thr Thr Asn Cys Thr Gly Gly Lys Asn Gly Ile
195 200 205
- 137 031580
Ala Ala Asp Ile Thr Thr Ala Lys 215 Gly Tyr Val Lys 220 Ser Val Thr Thr
210
Ser Asn Gly Ala Ile Thr Val Lys Gly Asp Gly Thr Leu Ala Asn Met
225 230 235 240
Glu Tyr Ile Leu Gln Ala Thr Gly Asn Ala Ala Thr Gly Val Thr Trp
245 250 255
Thr Thr Thr Cys Lys Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe
260 265 270
Cys Gly Ser Val Thr Gln Gly Gly His His His His His His
275 280 285
<210> 185 <211> 855 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> LVL737 <400> 185 atgaaatacc atggccgccc gtacgaagcg atctgggtgg aagggattgt atcttgaatt tggggacagg cctgatacaa tcagttgata gcgccttata acgggtggaa gtgacaacaa tatattttgc ggaacggatg caccaccacc tgctgccgac agattcagaa gatatatacg ataaccaaga atgtttatcc gtgcaaatta gtttgcgggc cgctttataa aaaaaggcgg aggctgatgt aaaatggtat gcaacggtgc aagctacagg cctctttatt accac cgctgctgct ggctgaacaa tttggtaaag gccacaaatt tgagcctaaa tcatttaact agcacctaaa tgctgctcag cactaaaaaa ggaattatgt tgcagcagat aataacagta taatgctgca tccagcaaat ggtctgctgc aatgatgtga aatgtgaatt gtacattttg cgttatgcac caagtacgaa aagcaaaaga attatttgtg gcagcggtat gtatatagca ataaccacag aaaggggatg acaggtgtaa ttttgcggaa tcctcgctgc agctggcacc attacatcga atgcagtggt gttctgttcg ctgatttcta aacatacgtt cgaactatgg ctgaattact caaatgaaac caaaaggcta gcacattggc cttggacaac gtgtcacaca ccagccggcg gccgactgat tagtgaatcg gaatttagat tcagtataag tgatgaattt aagtttaaca tgaagcattt gcaagcgtca aacaaactgt tgtaaaatca aaatatggaa aacttgcaaa aggcggccac
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
855 <210> 186 <211> 285 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> LVL737 <400> 186
Met 1 Lys Tyr Leu Leu 5 Pro Thr Ala Ala Ala Gly 10 Leu Leu Leu Leu 15 Ala
Ala Gln Pro Ala Met Ala Ala Gln Ile Gln Lys Ala Glu Gln Asn Asp
20 25 30
Val Lys Leu Ala Pro Pro Thr Asp Val Arg Ser Gly Tyr Ile Arg Leu
35 40 45
Val Lys Asn Val Asn Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp
50 55 60
Asn Gln Glu Pro Gln Ile Val His Phe Asp Ala Val Val Asn Leu Asp
65 70 75 80
Lys Gly Leu Tyr Val Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val
85 90 95
Arg Gln Tyr Lys Ile Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val
100 105 110
Arg Thr Asp Phe Tyr Asp Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala
115 120 125
Pro Lys Lys Gln Lys Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr
- 138 031580
130 135 140
Leu Tyr Asn Ala Ala Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Glu Ala Phe
145 150 155 160
Ser Val Asp Lys Lys Gly Gly Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu
165 170 175
Leu Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr
180 185 190
Ser Thr Asn Glu Thr Thr Asn Cys Thr Gly Gly Lys Asn Gly Ile Ala
195 200 205
Ala Asp Ile Thr Thr Ala Lys Gly Tyr Val Lys Ser Val Thr Thr Ser
210 215 220
Asn Gly Ala Ile Thr Val Lys Gly Asp Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu
225 230 235 240
Tyr Ile Leu Gln Ala Thr Gly Asn Ala Ala Thr Gly Val Thr Trp Thr
245 250 255
Thr Thr Cys Lys Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys
260 265 270
Gly Ser Val Thr Gln Gly Gly His His His His His His
275 280 285
<210> 187 <211> 843 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> LVL738 <400> 187 atgaaatacc atggccaagg tatatacgtt aaccaagagc gtttatcctg gcaaattatc ttgcgggcag ctttataatg aaaggcggca gctgatgtgg aatggtattg aacggtgcaa gctacaggta tctttatttc cac tgctgccgac ctgaacaaaa tggtaaagaa cacaaattgt agcctaaacg atttaactca cacctaaaaa ctgctcagat ctaaaaaagc aattatgtgt cagcagatat taacagtaaa atgctgcaac cagcaaattt cgctgctgct tgatgtgaag tgtgaattat acattttgat ttatgcacgt agtacgaact gcaaaagaaa tatttgtgcg agcggtatct atatagcaca aaccacagca aggggatggc aggtgtaact ttgcggaagt ggtctgctgc ctggcaccgc tacatcgata gcagtggtga tctgttcgtc gatttctatg catacgttaa aactatggtg gaattactgc aatgaaacaa aaaggctatg acattggcaa tggacaacaa gtcacacaag tcctcgctgc cgactgatgt gtgaatcgat atttagataa agtataagat atgaattttg gtttaacacc aagcattttc aagcgtcagc caaactgtac taaaatcagt atatggaata cttgcaaagg gcggccacca ccagccggcg acgaagcgga ctgggtggat gggattgtat cttgaattgt gggacagggt tgatacaacg agttgataaa gccttataag gggtggaaaa gacaacaagc tattttgcaa aacggatgcc ccaccaccac
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
843 <210> 188 <211> 281 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> LVL738 <400> 188
Met 1 Lys Tyr Leu Leu 5 Pro Thr Ala Ala Ala Gly 10 Leu Leu Leu Leu 15 Ala
Ala Gln Pro Ala Met Ala Lys Ala Glu Gln Asn Asp Val Lys Leu Ala
20 25 30
Pro Pro Thr Asp Val Arg Ser Gly Tyr Ile Arg Leu Val Lys Asn Val
35 40 45
Asn Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro
50 55 60
- 139 031580
Gln Ile Val His Phe Asp Ala Val Val Asn Leu Asp Lys Gly Leu Tyr
65 70 75 80
Val Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys
85 90 95
Ile Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val Arg Thr Asp Phe
100 105 110
Tyr Asp Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln
115 120 125
Lys Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala
130 135 140
Ala Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Glu Ala Phe Ser Val Asp Lys
145 150 155 160
Lys Gly Gly Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu Leu Gln Ala Ser
165 170 175
Ala Pro Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr Ser Thr Asn Glu
180 185 190
Thr Thr Asn Cys Thr Gly Gly Lys Asn Gly Ile Ala Ala Asp Ile Thr
195 200 205
Thr Ala Lys Gly Tyr Val Lys Ser Val Thr Thr Ser Asn Gly Ala Ile
210 215 220
Thr Val Lys Gly Asp Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu Tyr Ile Leu Gln
225 230 235 240
Ala Thr Gly Asn Ala Ala Thr Gly Val Thr Trp Thr Thr Thr Cys Lys
245 250 255
Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys Gly Ser Val Thr
260 265 270
Gln Gly Gly His His His His His His
275 280
<210> 189 <211> 840 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> LVL739 <400> 189 atgaaatacc tgctgccgac cgctgctgct ggtctgctgc tcctcgctgc ccagccggcg60 atggccgctg aacaaaatga tgtgaagctg gcaccgccga ctgatgtacg aagcggatat120 atacgtttgg taaagaatgt gaattattac atcgatagtg aatcgatctg ggtggataac180 caagagccac aaattgtaca ttttgatgca gtggtgaatt tagataaggg attgtatgtt240 tatcctgagc ctaaacgtta tgcacgttct gttcgtcagt ataagatctt gaattgtgca300 aattatcatt taactcaagt acgaactgat ttctatgatg aattttgggg acagggtttg360 cgggcagcac ctaaaaagca aaagaaacat acgttaagtt taacacctga tacaacgctt420 tataatgctg ctcagattat ttgtgcgaac tatggtgaag cattttcagt tgataaaaaa480 ggcggcacta aaaaagcagc ggtatctgaa ttactgcaag cgtcagcgcc ttataaggct540 gatgtggaat tatgtgtata tagcacaaat gaaacaacaa actgtacggg tggaaaaaat600 ggtattgcag cagatataac cacagcaaaa ggctatgtaa aatcagtgac aacaagcaac660 ggtgcaataa cagtaaaagg ggatggcaca ttggcaaata tggaatatat tttgcaagct720 acaggtaatg ctgcaacagg tgtaacttgg acaacaactt gcaaaggaac ggatgcctct780 ttatttccag caaatttttg cggaagtgtc acacaaggcg gccaccacca ccaccaccac840 <210> 190 <211> 280 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> LVL739
- 140 031580
<400> 190
Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala
1 5 10 15
Ala Gln Pro Ala Met Ala Ala Glu Gln Asn Asp Val Lys Leu Ala Pro
20 25 30
Pro Thr Asp Val Arg Ser Gly Tyr Ile Arg Leu Val Lys Asn Val Asn
35 40 45
Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln
50 55 60
Ile Val His Phe Asp Ala Val Val Asn Leu Asp Lys Gly Leu Tyr Val
65 70 75 80
Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile
85 90 95
Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val Arg Thr Asp Phe Tyr
100 105 110
Asp Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys
115 120 125
Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Ala
130 135 140
Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Glu Ala Phe Ser Val Asp Lys Lys
145 150 155 160
Gly Gly Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu Leu Gln Ala Ser Ala
165 170 175
Pro Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr Ser Thr Asn Glu Thr
180 185 190
Thr Asn Cys Thr Gly Gly Lys Asn Gly Ile Ala Ala Asp Ile Thr Thr
195 200 205
Ala Lys Gly Tyr Val Lys Ser Val Thr Thr Ser Asn Gly Ala Ile Thr
210 215 220
Val Lys Gly Asp Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu Tyr Ile Leu Gln Ala
225 230 235 240
Thr Gly Asn Ala Ala Thr Gly Val Thr Trp Thr Thr Thr Cys Lys Gly
245 250 255
Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys Gly Ser Val Thr Gln
260 265 270
Gly Gly His His His His His His
275 280
<210> 191 <211> 837 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> LVL740 <400> 191 atgaaatacc tgctgccgac cgctgctgct ggtctgctgc tcctcgctgc ccagccggcg60 atggccgaac aaaatgatgt gaagctggca ccgccgactg atgtacgaag cggatatata120 cgtttggtaa agaatgtgaa ttattacatc gatagtgaat cgatctgggt ggataaccaa180 gagccacaaa ttgtacattt tgatgcagtg gtgaatttag ataagggatt gtatgtttat240 cctgagccta aacgttatgc acgttctgtt cgtcagtata agatcttgaa ttgtgcaaat300 tatcatttaa ctcaagtacg aactgatttc tatgatgaat tttggggaca gggtttgcgg360 gcagcaccta aaaagcaaaa gaaacatacg ttaagtttaa cacctgatac aacgctttat420 aatgctgctc agattatttg tgcgaactat ggtgaagcat tttcagttga taaaaaaggc480 ggcactaaaa aagcagcggt atctgaatta ctgcaagcgt cagcgcctta taaggctgat540 gtggaattat gtgtatatag cacaaatgaa acaacaaact gtacgggtgg aaaaaatggt600 attgcagcag atataaccac agcaaaaggc tatgtaaaat cagtgacaac aagcaacggt660 gcaataacag taaaagggga tggcacattg gcaaatatgg aatatatttt gcaagctaca720 ggtaatgctg caacaggtgt aacttggaca acaacttgca aaggaacgga tgcctcttta780 tttccagcaa atttttgcgg aagtgtcaca caaggcggcc accaccacca ccaccac837
- 141 031580 <210> 192 <211> 279 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> LVL740 <400> 192
Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala
1 5 10 15
Ala Gln Pro Ala Met Ala Glu Gln Asn Asp Val Lys Leu Ala Pro Pro
20 25 30
Thr Asp Val Arg Ser Gly Tyr Ile Arg Leu Val Lys Asn Val Asn Tyr
35 40 45
Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln Ile
50 55 60
Val His Phe Asp Ala Val Val Asn Leu Asp Lys Gly Leu Tyr Val Tyr
65 70 75 80
Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile Leu
85 90 95
Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val Arg Thr Asp Phe Tyr Asp
100 105 110
Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys Lys
115 120 125
His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Ala Gln
130 135 140
Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Glu Ala Phe Ser Val Asp Lys Lys Gly
145 150 155 160
Gly Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu Leu Gln Ala Ser Ala Pro
165 170 175
Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr Ser Thr Asn Glu Thr Thr
180 185 190
Asn Cys Thr Gly Gly Lys Asn Gly Ile Ala Ala Asp Ile Thr Thr Ala
195 200 205
Lys Gly Tyr Val Lys Ser Val Thr Thr Ser Asn Gly Ala Ile Thr Val
210 215 220
Lys Gly Asp Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu Tyr Ile Leu Gln Ala Thr
225 230 235 240
Gly Asn Ala Ala Thr Gly Val Thr Trp Thr Thr Thr Cys Lys Gly Thr
245 250 255
Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys Gly Ser Val Thr Gln Gly
260 265 270
Gly His His His His His His
275
<210> 193 <211> 825 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> LVL735 <400> 193 atgaaatacc tgctgccgac cgctgctgct ggtctgctgc tcctcgctgc ccagccggcg60 atggccattc agaaggctga acaaaatgat gtgaagctgg caccgccgac tgatgtacga120 agcggatata tacgtttggt aaagaatgtg aattattaca tcgatagtga atcgatctgg180 gtggataacc aagagccaca aattgtacat tttgatgcag tggtgaattt agataaggga240 ttgtatgttt atcctgagcc taaacgttat gcacgttctg ttcgtcagta taagatcttg300 aattgtgcaa attatcattt aactcaagta cgaactgatt tctatgatga attttgggga360 cagggtttgc gggcagcacc taaaaagcaa aagaaacata cgttaagttt aacacctgat420
- 142 031580 acaacgcttt gataaaaaag tataaggctg ggaaaaaatg acaagcaacg ttgcaagcta gatgcctctt ataatgctgc gcggcactaa atgtggaatt gtattgcagc gtgcaataac caggtaatgc tatttccagc tcagattatt aaaagcagcg atgtgtatat agatataacc agtaaaaggg tgcaacaggt aaatttttgc tgtgcgaact gtatctgaat agcacaaatg acagcaaaag gatggcacat gtaacttgga ggaagtgtca atggtgaagc tactgcaagc aaacaacaaa gctatgtaaa tggcaaatat caacaacttg cacaa attttcagtt gtcagcgcct ctgtacgggt atcagtgaca ggaatatatt caaaggaacg
480
540
600
660
720
780
825 <210> 194 <211> 275 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> LVL735 <400> 194
Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala
1 5 10 15
Ala Gln Pro Ala Met Ala Ile Gln Lys Ala Glu Gln Asn Asp Val Lys
20 25 30
Leu Ala Pro Pro Thr Asp Val Arg Ser Gly Tyr Ile Arg Leu Val Lys
35 40 45
Asn Val Asn Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln
50 55 60
Glu Pro Gln Ile Val His Phe Asp Ala Val Val Asn Leu Asp Lys Gly
65 70 75 80
Leu Tyr Val Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln
85 90 95
Tyr Lys Ile Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val Arg Thr
100 105 110
Asp Phe Tyr Asp Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys
115 120 125
Lys Gln Lys Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr
130 135 140
Asn Ala Ala Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Glu Ala Phe Ser Val
145 150 155 160
Asp Lys Lys Gly Gly Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu Leu Gln
165 170 175
Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr Ser Thr
180 185 190
Asn Glu Thr Thr Asn Cys Thr Gly Gly Lys Asn Gly Ile Ala Ala Asp
195 200 205
Ile Thr Thr Ala Lys Gly Tyr Val Lys Ser Val Thr Thr Ser Asn Gly
210 215 220
Ala Ile Thr Val Lys Gly Asp Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu Tyr Ile
225 230 235 240
Leu Gln Ala Thr Gly Asn Ala Ala Thr Gly Val Thr Trp Thr Thr Thr
245 250 255
Cys Lys Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys Gly Ser
260 265 270
Val Thr Gln
275
<210> 195 <211> 834 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> LVL778
- 143 031580 <400> 195 atgaaatacc tgctgccgac cgctgctgct ggtctgctgc tcctcgctgc ccagccggcg60 atggccagcg cccagattca gaaggctgaa caaaatgatg tgaagctggc accgccgact120 gatgtacgaa gcggatatat acgtttggta aagaatgtga attattacat cgatagtgaa180 tcgatctggg tggataacca agagccacaa attgtacatt ttgatgcagt ggtgaattta240 gataagggat tgtatgttta tcctgagcct aaacgttatg cacgttctgt tcgtcagtat300 aagatcttga attgtgcaaa ttatcattta actcaagtac gaactgattt ctatgatgaa360 ttttggggac agggtttgcg ggcagcacct aaaaagcaaa agaaacatac gttaagttta420 acacctgata caacgcttta taatgctgct cagattattt gtgcgaacta tggtgaagca480 ttttcagttg ataaaaaagg cggcactaaa aaagcagcgg tatctgaatt actgcaagcg540 tcagcgcctt ataaggctga tgtggaatta tgtgtatata gcacaaatga aacaacaaac600 tgtacgggtg gaaaaaatgg tattgcagca gatataacca cagcaaaagg ctatgtaaaa660 tcagtgacaa caagcaacgg tgcaataaca gtaaaagggg atggcacatt ggcaaatatg720 gaatatattt tgcaagctac aggtaatgct gcaacaggtg taacttggac aacaacttgc780 aaaggaacgg atgcctcttt atttccagca aatttttgcg gaagtgtcac acaa834 <210> 196 <211> 278 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> LVL778 <400> 196
Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala
1 5 10 15
Ala Gln Pro Ala Met Ala Ser Ala Gln Ile Gln Lys Ala Glu Gln Asn
20 25 30
Asp Val Lys Leu Ala Pro Pro Thr Asp Val Arg Ser Gly Tyr Ile Arg
35 40 45
Leu Val Lys Asn Val Asn Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val
50 55 60
Asp Asn Gln Glu Pro Gln Ile Val His Phe Asp Ala Val Val Asn Leu
65 70 75 80
Asp Lys Gly Leu Tyr Val Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser
85 90 95
Val Arg Gln Tyr Lys Ile Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln
100 105 110
Val Arg Thr Asp Phe Tyr Asp Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala
115 120 125
Ala Pro Lys Lys Gln Lys Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr
130 135 140
Thr Leu Tyr Asn Ala Ala Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Glu Ala
145 150 155 160
Phe Ser Val Asp Lys Lys Gly Gly Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu
165 170 175
Leu Leu Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val
180 185 190
Tyr Ser Thr Asn Glu Thr Thr Asn Cys Thr Gly Gly Lys Asn Gly Ile
195 200 205
Ala Ala Asp Ile Thr Thr Ala Lys Gly Tyr Val Lys Ser Val Thr Thr
210 215 220
Ser Asn Gly Ala Ile Thr Val Lys Gly Asp Gly Thr Leu Ala Asn Met
225 230 235 240
Glu Tyr Ile Leu Gln Ala Thr Gly Asn Ala Ala Thr Gly Val Thr Trp
245 250 255
Thr Thr Thr Cys Lys Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe
260 265 270
Cys Gly Ser Val Thr Gln
275
- 144 031580 <210> 197 <211> 831 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> LVL779 <400> 197 atgaaatacc tgctgccgac cgctgctgct ggtctgctgc tcctcgctgc ccagccggcg60 atggccgccc agattcagaa ggctgaacaa aatgatgtga agctggcacc gccgactgat120 gtacgaagcg gatatatacg tttggtaaag aatgtgaatt attacatcga tagtgaatcg180 atctgggtgg ataaccaaga gccacaaatt gtacattttg atgcagtggt gaatttagat240 aagggattgt atgtttatcc tgagcctaaa cgttatgcac gttctgttcg tcagtataag300 atcttgaatt gtgcaaatta tcatttaact caagtacgaa ctgatttcta tgatgaattt360 tggggacagg gtttgcgggc agcacctaaa aagcaaaaga aacatacgtt aagtttaaca420 cctgatacaa cgctttataa tgctgctcag attatttgtg cgaactatgg tgaagcattt480 tcagttgata aaaaaggcgg cactaaaaaa gcagcggtat ctgaattact gcaagcgtca540 gcgccttata aggctgatgt ggaattatgt gtatatagca caaatgaaac aacaaactgt600 acgggtggaa aaaatggtat tgcagcagat ataaccacag caaaaggcta tgtaaaatca660 gtgacaacaa gcaacggtgc aataacagta aaaggggatg gcacattggc aaatatggaa720 tatattttgc aagctacagg taatgctgca acaggtgtaa cttggacaac aacttgcaaa780 ggaacggatg cctctttatt tccagcaaat ttttgcggaa gtgtcacaca a831 <210> 198 <211> 277 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> LVL779 <400> 198
Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala
1 5 10 15
Ala Gln Pro Ala Met Ala Ala Gln Ile Gln Lys Ala Glu Gln Asn Asp
20 25 30
Val Lys Leu Ala Pro Pro Thr Asp Val Arg Ser Gly Tyr Ile Arg Leu
35 40 45
Val Lys Asn Val Asn Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp
50 55 60
Asn Gln Glu Pro Gln Ile Val His Phe Asp Ala Val Val Asn Leu Asp
65 70 75 80
Lys Gly Leu Tyr Val Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val
85 90 95
Arg Gln Tyr Lys Ile Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val
100 105 110
Arg Thr Asp Phe Tyr Asp Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala
115 120 125
Pro Lys Lys Gln Lys Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr
130 135 140
Leu Tyr Asn Ala Ala Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Glu Ala Phe
145 150 155 160
Ser Val Asp Lys Lys Gly Gly Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu
165 170 175
Leu Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr
180 185 190
Ser Thr Asn Glu Thr Thr Asn Cys Thr Gly Gly Lys Asn Gly Ile Ala
195 200 205
Ala Asp Ile Thr Thr Ala Lys Gly Tyr Val Lys Ser Val Thr Thr Ser
210 215 220
Asn Gly Ala Ile Thr Val Lys Gly Asp Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu
225 230 235 240
- 145 031580
Tyr Ile Leu Gln Ala 245 Thr Gly Asn Ala Ala Thr Gly Val 250 Thr Trp 255 Thr
Thr Thr Cys Lys Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys
260 265 270
Gly Ser Val Thr Gln
275
<210>
<211>
<212>
<213>
199
819
ДНК
Искусственная последовательность <220>
<223>
LVL780
199 <400> atgaaatacc atggccaagg tatatacgtt aaccaagagc gtttatcctg gcaaattatc ttgcgggcag ctttataatg aaaggcggca gctgatgtgg aatggtattg aacggtgcaa gctacaggta tctttatttc tgctgccgac ctgaacaaaa tggtaaagaa cacaaattgt agcctaaacg atttaactca cacctaaaaa ctgctcagat ctaaaaaagc aattatgtgt cagcagatat taacagtaaa atgctgcaac cagcaaattt cgctgctgct tgatgtgaag tgtgaattat acattttgat ttatgcacgt agtacgaact gcaaaagaaa tatttgtgcg agcggtatct atatagcaca aaccacagca aggggatggc aggtgtaact ttgcggaagt ggtctgctgc ctggcaccgc tacatcgata gcagtggtga tctgttcgtc gatttctatg catacgttaa aactatggtg gaattactgc aatgaaacaa aaaggctatg acattggcaa tggacaacaa gtcacacaa tcctcgctgc cgactgatgt gtgaatcgat atttagataa agtataagat atgaattttg gtttaacacc aagcattttc aagcgtcagc caaactgtac taaaatcagt atatggaata cttgcaaagg ccagccggcg acgaagcgga ctgggtggat gggattgtat cttgaattgt gggacagggt tgatacaacg agttgataaa gccttataag gggtggaaaa gacaacaagc tattttgcaa aacggatgcc
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
819 <210>
<211>
<212>
<213>
200
273
БЕЛОК
Искусственная последовательность <220>
<223>
LVL780 <400>
200
Met 1 Lys Tyr Leu Leu 5 Pro Thr Ala Ala Ala 10 Gly Leu Leu Leu Leu 15 Ala
Ala Gln Pro Ala Met Ala Lys Ala Glu Gln Asn Asp Val Lys Leu Ala
20 25 30
Pro Pro Thr Asp Val Arg Ser Gly Tyr Ile Arg Leu Val Lys Asn Val
35 40 45
Asn Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro
50 55 60
Gln Ile Val His Phe Asp Ala Val Val Asn Leu Asp Lys Gly Leu Tyr
65 70 75 80
Val Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys
85 90 95
Ile Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val Arg Thr Asp Phe
100 105 110
Tyr Asp Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln
115 120 125
Lys Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala
130 135 140
Ala Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Glu Ala Phe Ser Val Asp Lys
145 150 155 160
Lys Gly Gly Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu Leu Gln Ala Ser
165 170 175
- 146 031580
Ala Pro Tyr Lys 180 Ala Asp Val Glu Leu 185 Cys Val Tyr Ser Thr Asn 190 Glu
Thr Thr Asn Cys Thr Gly Gly Lys Asn Gly Ile Ala Ala Asp Ile Thr
195 200 205
Thr Ala Lys Gly Tyr Val Lys Ser Val Thr Thr Ser Asn Gly Ala Ile
210 215 220
Thr Val Lys Gly Asp Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu Tyr Ile Leu Gln
225 230 235 240
Ala Thr Gly Asn Ala Ala Thr Gly Val Thr Trp Thr Thr Thr Cys Lys
245 250 255
Gly Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys Gly Ser Val Thr
260 265 270
Gln
<210>
<211>
<212>
<213>
201
816
ДНК
Искусственная последовательность <220>
<223>
LVL781
201 <400> atgaaatacc atggccgctg atacgtttgg caagagccac tatcctgagc aattatcatt cgggcagcac tataatgctg ggcggcacta gatgtggaat ggtattgcag ggtgcaataa acaggtaatg ttatttccag tgctgccgac aacaaaatga taaagaatgt aaattgtaca ctaaacgtta taactcaagt ctaaaaagca ctcagattat aaaaagcagc tatgtgtata cagatataac cagtaaaagg ctgcaacagg caaatttttg cgctgctgct tgtgaagctg gaattattac ttttgatgca tgcacgttct acgaactgat aaagaaacat ttgtgcgaac ggtatctgaa tagcacaaat cacagcaaaa ggatggcaca tgtaacttgg cggaagtgtc ggtctgctgc gcaccgccga atcgatagtg gtggtgaatt gttcgtcagt ttctatgatg acgttaagtt tatggtgaag ttactgcaag gaaacaacaa ggctatgtaa ttggcaaata acaacaactt acacaa tcctcgctgc ctgatgtacg aatcgatctg tagataaggg ataagatctt aattttgggg taacacctga cattttcagt cgtcagcgcc actgtacggg aatcagtgac tggaatatat gcaaaggaac ccagccggcg aagcggatat ggtggataac attgtatgtt gaattgtgca acagggtttg tacaacgctt tgataaaaaa ttataaggct tggaaaaaat aacaagcaac tttgcaagct ggatgcctct
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
816 <210>
<211>
<212>
<213>
202
272
БЕЛОК
Искусственная последовательность <220>
<223>
LVL781 <400>
202
Met 1 Lys Tyr Leu Leu 5 Pro Thr Ala Ala Ala 10 Gly Leu Leu Leu Leu 15 Ala
Ala Gln Pro Ala Met Ala Ala Glu Gln Asn Asp Val Lys Leu Ala Pro
20 25 30
Pro Thr Asp Val Arg Ser Gly Tyr Ile Arg Leu Val Lys Asn Val Asn
35 40 45
Tyr Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln
50 55 60
Ile Val His Phe Asp Ala Val Val Asn Leu Asp Lys Gly Leu Tyr Val
65 70 75 80
Tyr Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile
85 90 95
Leu Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val Arg Thr Asp Phe Tyr
100 105 110
- 147 031580
Asp Glu Phe 115 Trp Gly Gln Gly Leu 120 Arg Ala Ala Pro Lys 125 Lys Gln Lys
Lys His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Ala
130 135 140
Gln Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Glu Ala Phe Ser Val Asp Lys Lys
145 150 155 160
Gly Gly Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu Leu Gln Ala Ser Ala
165 170 175
Pro Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr Ser Thr Asn Glu Thr
180 185 190
Thr Asn Cys Thr Gly Gly Lys Asn Gly Ile Ala Ala Asp Ile Thr Thr
195 200 205
Ala Lys Gly Tyr Val Lys Ser Val Thr Thr Ser Asn Gly Ala Ile Thr
210 215 220
Val Lys Gly Asp Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu Tyr Ile Leu Gln Ala
225 230 235 240
Thr Gly Asn Ala Ala Thr Gly Val Thr Trp Thr Thr Thr Cys Lys Gly
245 250 255
Thr Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys Gly Ser Val Thr Gln
260 265 270
<210>
<211>
<212>
<213>
203
813
ДНК
Искусственная последовательность <220>
<223>
LVL782
203 <400> atgaaatacc atggccgaac cgtttggtaa gagccacaaa cctgagccta tatcatttaa gcagcaccta aatgctgctc ggcactaaaa gtggaattat attgcagcag gcaataacag ggtaatgctg tttccagcaa tgctgccgac aaaatgatgt agaatgtgaa ttgtacattt aacgttatgc ctcaagtacg aaaagcaaaa agattatttg aagcagcggt gtgtatatag atataaccac taaaagggga caacaggtgt atttttgcgg cgctgctgct gaagctggca ttattacatc tgatgcagtg acgttctgtt aactgatttc gaaacatacg tgcgaactat atctgaatta cacaaatgaa agcaaaaggc tggcacattg aacttggaca aagtgtcaca ggtctgctgc ccgccgactg gatagtgaat gtgaatttag cgtcagtata tatgatgaat ttaagtttaa ggtgaagcat ctgcaagcgt acaacaaact tatgtaaaat gcaaatatgg acaacttgca caa tcctcgctgc atgtacgaag cgatctgggt ataagggatt agatcttgaa tttggggaca cacctgatac tttcagttga cagcgcctta gtacgggtgg cagtgacaac aatatatttt aaggaacgga ccagccggcg cggatatata ggataaccaa gtatgtttat ttgtgcaaat gggtttgcgg aacgctttat taaaaaaggc taaggctgat aaaaaatggt aagcaacggt gcaagctaca tgcctcttta
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
813 <210>
<211>
<212>
<213>
204
271
БЕЛОК
Искусственная последовательность <220>
<223>
LVL782 <400>
204
Met 1 Lys Tyr Leu Leu 5 Pro Thr Ala Ala Ala Gly 10 Leu Leu Leu Leu 15 Ala
Ala Gln Pro Ala Met Ala Glu Gln Asn Asp Val Lys Leu Ala Pro Pro
20 25 30
Thr Asp Val Arg Ser Gly Tyr Ile Arg Leu Val Lys Asn Val Asn Tyr
35 40 45
Tyr Ile Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln Ile
50 55 60
- 148 031580
Val His Phe Asp Ala Val Val Asn Leu Asp Lys Gly Leu Tyr Val Tyr
65 70 75 80
Pro Glu Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile Leu
85 90 95
Asn Cys Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val Arg Thr Asp Phe Tyr Asp
100 105 110
Glu Phe Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys Lys
115 120 125
His Thr Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Ala Gln
130 135 140
Ile Ile Cys Ala Asn Tyr Gly Glu Ala Phe Ser Val Asp Lys Lys Gly
145 150 155 160
Gly Thr Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu Leu Gln Ala Ser Ala Pro
165 170 175
Tyr Lys Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr Ser Thr Asn Glu Thr Thr
180 185 190
Asn Cys Thr Gly Gly Lys Asn Gly Ile Ala Ala Asp Ile Thr Thr Ala
195 200 205
Lys Gly Tyr Val Lys Ser Val Thr Thr Ser Asn Gly Ala Ile Thr Val
210 215 220
Lys Gly Asp Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu Tyr Ile Leu Gln Ala Thr
225 230 235 240
Gly Asn Ala Ala Thr Gly Val Thr Trp Thr Thr Thr Cys Lys Gly Thr
245 250 255
Asp Ala Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys Gly Ser Val Thr Gln
260 265 270
<210> 205 <211> 95 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 205 gatatacata tgaaatacct gctgccgacc gctgctgctg gtctgctgct cctcgctgcc cagccggcga tggccattca gaaggctgaa caaaa <210> 206 <211> 39 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 206 ggccgcaagc ttttagtggt ggtggtggtg gtggccgcc <210> 207 <211> 30 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 207 ggccgcaagc ttttattgtg tgacacttcc <210> 208
- 149 031580 <211> 42 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 208 gctgcccagc cggcgatggc caaggctgaa caaaatgatg tg <210> 209 <211> 42 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 209 cacatcattt tgttcagcct tggccatcgc cggctgggca gc <210> 210 <211> 43 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 210 gctgcccagc cggcgatggc cgctgaacaa aatgatgtga agc <210> 211 <211> 43 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 211 gcttcacatc attttgttca gcggccatcg ccggctgggc agc <210> 212 <211> 43 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 212 gctgcccagc cggcgatggc cgaacaaaat gatgtgaagc tgg <210> 213 <211> 43 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 213
- 150 031580
ccagcttcac atcattttgt tcggccatcg ccggctgggc agc 43
<210> 214
<211> 43
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> праймер
<400> 214
gctgcccagc cggcgatggc cgcccagatt cagaaggctg aac 43
<210> 215 <211> 43 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 215 gttcagcctt ctgaatctgg gcggccatcg ccggctgggc agc <210> 216 <211> 46 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 216 gctgcccagc cggcgatggc cagcgcccag attcagaagg ctgaac <210> 217 <211> 46 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 217 gttcagcctt ctgaatctgg gcgctggcca tcgccggctg ggcagc <210> 218 <211> 30 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> праймер <400> 218 cacacacata tgaaatacct gctgccgacc <210> 219 <211> 253 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
- 151 031580 <223> СЛИТЫЙ БЕЛОК <400> 219
Ile Gln Lys Ala Glu Gln Asn Asp Val Lys Leu Ala Pro Pro Thr Asp
1 5 10 15
Val Arg Ser Gly Tyr Ile Arg Leu Val Lys Asn Val Asn Tyr Tyr Ile
20 25 30
Asp Ser Glu Ser Ile Trp Val Asp Asn Gln Glu Pro Gln Ile Val His
35 40 45
Phe Asp Ala Val Val Asn Leu Asp Lys Gly Leu Tyr Val Tyr Pro Glu
50 55 60
Pro Lys Arg Tyr Ala Arg Ser Val Arg Gln Tyr Lys Ile Leu Asn Cys
65 70 75 80
Ala Asn Tyr His Leu Thr Gln Val Arg Thr Asp Phe Tyr Asp Glu Phe
85 90 95
Trp Gly Gln Gly Leu Arg Ala Ala Pro Lys Lys Gln Lys Lys His Thr
100 105 110
Leu Ser Leu Thr Pro Asp Thr Thr Leu Tyr Asn Ala Ala Gln Ile Ile
115 120 125
Cys Ala Asn Tyr Gly Glu Ala Phe Ser Val Asp Lys Lys Gly Gly Thr
130 135 140
Lys Lys Ala Ala Val Ser Glu Leu Leu Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Lys
145 150 155 160
Ala Asp Val Glu Leu Cys Val Tyr Ser Thr Asn Glu Thr Thr Asn Cys
165 170 175
Thr Gly Gly Lys Asn Gly Ile Ala Ala Asp Ile Thr Thr Ala Lys Gly
180 185 190
Tyr Val Lys Ser Val Thr Thr Ser Asn Gly Ala Ile Thr Val Lys Gly
195 200 205
Asp Gly Thr Leu Ala Asn Met Glu Tyr Ile Leu Gln Ala Thr Gly Asn
210 215 220
Ala Ala Thr Gly Val Thr Trp Thr Thr Thr Cys Lys Gly Thr Asp Ala
225 230 235 240
Ser Leu Phe Pro Ala Asn Phe Cys Gly Ser Val Thr Gln
245 250

Claims (26)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Слитый белок для индукции иммунного ответа против H. influenzae формулы I (X)m - (Ri)n - A - (Y)o - В - (Ζ)ρ (формула I), где X представляет собой последовательность MHHHHHH (SEQ ID NO: 2) или сигнальный пептид, выбранный из Flgl (кольцевой флагеллярный пептидогликан), NadA (субъединица A хинолинатсинтазы) и pelB (пектатлиаза B);
    m равно 0 или 1;
    Ri представляет собой аминокислоту, независимо выбранную из D, Е, A, Т, N, М и H;
    n равно 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6;
    A представляет собой белок E из Haemophilus influenzae или его иммуногенный фрагмент, состоящий по меньшей мере из 50 последовательных аминокислотных остатков последовательности SEQ ID NO: 4, либо PilA (пилин A) из Haemophilus influenzae или его иммуногенный фрагмент, состоящий по меньшей мере из 50 последовательных аминокислотных остатков последовательности SEQ ID NO: 58;
    Y выбран из SG, SS и (G)h, где h равно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10;
    o равно 0 или 1;
    B представляет собой PilA из Haemophilus influenzae или его иммуногенный фрагмент, состоящий по меньшей мере из 50 последовательных аминокислотных остатков последовательности SEQ ID NO: 58, либо белок E из Haemophilus influenzae или его иммуногенный фрагмент, состоящий по меньшей мере из 50 последовательных аминокислотных остатков последовательности SEQ ID NO: 4;
    Z представляет собой последовательность GGHHHHHH (SEQ ID NO: 3);
    p равно 0 или 1, где белок E выбран из полипептида с любой из последовательностей SEQ ID NO: 4-57 или полипептида с последовательностью, идентичной по меньшей мере на 75, 77, 80, 85, 90, 95, 97 или 99% последовательности SEQ ID NO: 4, и PilA выбран из полипептида с любой из последовательностей SEQ ID NO:
    - 152 031580
    58-121 или полипептида с последовательностью, идентичной по меньшей мере на 80, 85, 90, 95 или 97% последовательности SEQ ID NO: 58.
  2. 2. Слитый белок по п.1, имеющий последовательность SEQ ID NO: 194.
  3. 3. Слитый белок по п.1, где A представляет собой иммуногенный фрагмент белка E, состоящий по меньшей мере из 50 последовательных аминокислотных остатков последовательности SEQ ID NO: 4.
  4. 4. Слитый белок по п.3, где A представляет собой иммуногенный фрагмент белка E, имеющего последовательность SEQ ID NO: 124.
  5. 5. Слитый белок по п.3, где A представляет собой иммуногенный фрагмент белка E, имеющего последовательность SEQ ID NO: 125.
  6. 6. Слитый белок по п.1, где B представляет собой иммуногенный фрагмент PilA, состоящий по меньшей мере из 50 последовательных аминокислотных остатков последовательности SEQ ID NO: 58.
  7. 7. Слитый белок по п.6, где B представляет собой иммуногенный фрагмент PilA, имеющего последовательность SEQ ID NO: 127.
  8. 8. Слитый белок, содержащий белок E и PilA или их иммуногенные фрагменты, как определено в
    п.1, где слитый белок имеет последовательность, выбранную из последовательностей SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 148,
    SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 190,
    SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 202 и SEQ ID NO: 204, лишенных сигнального пептида.
  9. 9. Слитый белок по п.8, имеющий последовательность SEQ ID NO: 219.
  10. 10. Иммуногенная композиция для индукции иммунного ответа против H. influenzae, содержащая слитый белок по любому из пп.1-9.
  11. 11. Иммуногенная композиция для индукции иммунного ответа против Н. influenzae по п.10, содержащая слитый белок, имеющий последовательность SEQ ID NO: 148.
  12. 12. Иммуногенная композиция для индукции иммунного ответа против H. influenzae по п.10, содержащая слитый белок, имеющий последовательность SEQ ID NO: 194.
  13. 13. Иммуногенная композиция по п.10, дополнительно содержащая белок D из H. influenzae.
  14. 14. Иммуногенная композиция по п.10, дополнительно содержащая адъювант.
  15. 15. Иммуногенная композиция по п.14, где адъювант представляет собой адъювант AS01E.
  16. 16. Иммуногенная композиция по п.10, где A в составе слитого белка представляет собой белок E, имеющий последовательность, идентичную по меньшей мере на 75, 77, 80, 85, 90, 95, 97, 99 или 100% последовательности SEQ ID NO: 4, или иммуногенный фрагмент белка E, состоящий по меньшей мере из 50 последовательных аминокислотных остатков последовательности SEQ ID NO: 4.
  17. 17. Иммуногенная композиция по любому из пп.10-16, где белок E в составе слитого белка способен индуцировать иммунный ответ против H. influenzae, при котором распознается последовательность SEQ ID NO: 4.
  18. 18. Иммуногенная композиция по п.10, где B в составе слитого белка представляет собой PilA, имеющий последовательность, идентичную по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 97 или 100% последовательности SEQ ID NO: 58, или иммуногенный фрагмент PilA, состоящий по меньшей мере из 50 последовательных аминокислотных остатков последовательности SEQ ID NO: 58.
  19. 19. Иммуногенная композиция по любому из пп.10-18, где PilA в составе слитого белка способен индуцировать иммунный ответ против H. influenzae, при котором распознается последовательность SEQ ID NO: 58.
  20. 20. Иммуногенная композиция для индукции иммунного ответа против H. influenzae, содержащая слитый белок по п.1, имеющий последовательность SEQ ID NO: 177.
  21. 21. Иммуногенная композиция для индукции иммунного ответа против H. influenzae, содержащая слитый белок по п.1, имеющий последовательность SEQ ID NO: 219.
  22. 22. Вакцина для индукции иммунного ответа против H. influenzae, содержащая слитый белок по любому из пп.1-9 или иммуногенные композиции по любому из пп.10-21.
  23. 23. Применение слитого белка по любому из пп.1-9 в лечении или предупреждении среднего отита, острых приступов хронической обструктивной болезни легких (ОПХОБЛ), пневмонии или заболевания, вызванного H. influenzae.
  24. 24. Применение иммуногенной композиции по любому из пп.10-21 в лечении или предупреждении среднего отита, острых приступов хронической обструктивной болезни легких (ОПХОБЛ), пневмонии или заболевания, вызванного H. influenzae.
  25. 25. Применение вакцины по п.22 в лечении или предупреждении среднего отита, острых приступов хронической обструктивной болезни легких (ОПХОБЛ), пневмонии или заболевания, вызванного H. influenzae.
  26. 26. Способ получения слитого белка по п.1, включающий траснформацию клетки E. coli рекомбинантным вектором, содержащим последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201 и 203; индукцию путем добавления изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида экспрессии указанной последовательности, приводящей к пери
    - 153 031580 плазматическому синтезу указанного белка, содержащего сигнальный пептид, выбранный из Flgl, NadA и pelB; выделение и очистку синтезированного белка.
    LVL291 L.VL268 LVL269
    Условные обозначения:
    S = растворимая фракция
    Ind. = индукция
EA201391240A 2011-04-13 2012-04-12 Слитый белок, композиция и вакцина для индукции иммунного ответа против h. influenza и их терапевтическое применение EA031580B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161474779P 2011-04-13 2011-04-13
US201161534012P 2011-09-13 2011-09-13
PCT/CA2012/050236 WO2012139225A1 (en) 2011-04-13 2012-04-12 Fusion proteins and combination vaccines comprising haemophilus influenzae protein e and pilin a

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201391240A1 EA201391240A1 (ru) 2014-04-30
EA031580B1 true EA031580B1 (ru) 2019-01-31

Family

ID=47008755

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201391240A EA031580B1 (ru) 2011-04-13 2012-04-12 Слитый белок, композиция и вакцина для индукции иммунного ответа против h. influenza и их терапевтическое применение

Country Status (34)

Country Link
US (7) US8945577B2 (ru)
EP (2) EP2707393B1 (ru)
JP (1) JP6196963B2 (ru)
KR (1) KR101999673B1 (ru)
CN (3) CN103476799A (ru)
AR (1) AR086078A1 (ru)
AU (1) AU2012243412C1 (ru)
BR (1) BR112013026175B1 (ru)
CA (1) CA2830786C (ru)
CL (1) CL2013002937A1 (ru)
CO (1) CO6781540A2 (ru)
CR (1) CR20130529A (ru)
CY (2) CY1120319T1 (ru)
DK (2) DK3321287T3 (ru)
DO (1) DOP2013000235A (ru)
EA (1) EA031580B1 (ru)
ES (2) ES2776369T3 (ru)
HR (2) HRP20180216T1 (ru)
HU (2) HUE048848T2 (ru)
IL (2) IL271862B (ru)
LT (2) LT3321287T (ru)
MA (1) MA35110B1 (ru)
ME (1) ME02995B (ru)
MX (1) MX350013B (ru)
PE (1) PE20140986A1 (ru)
PL (2) PL2707393T3 (ru)
PT (2) PT3321287T (ru)
RS (1) RS56903B1 (ru)
SG (2) SG10201602549WA (ru)
SI (2) SI2707393T1 (ru)
TW (1) TW201302779A (ru)
UY (1) UY34017A (ru)
WO (1) WO2012139225A1 (ru)
ZA (1) ZA201307118B (ru)

Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW201302779A (zh) 2011-04-13 2013-01-16 Glaxosmithkline Biolog Sa 融合蛋白質及組合疫苗
GB201218660D0 (en) 2012-10-17 2012-11-28 Glaxosmithkline Biolog Sa Immunogenic composition
CN104853768B (zh) * 2012-10-17 2019-04-19 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 免疫原性组合物
DK3051957T3 (da) 2013-09-30 2019-09-16 Iaf Science Holdings Ltd Tyggeprodukt og fremgangsmåde til fremstilling deraf
TW201620927A (zh) 2014-02-24 2016-06-16 葛蘭素史密斯克藍生物品公司 Ｕｓｐａ２蛋白質構築體及其用途
US10648966B2 (en) * 2015-01-16 2020-05-12 University Of Kentucky Research Foundation Lipid bilayer-integrated SPP1 connector protein nanopore and SPP1 connector protein variants for use as lipid bilayer-integrated nanopore
CN105175549B (zh) * 2015-09-30 2019-08-16 康希诺生物股份公司 一种流感嗜血杆菌融合蛋白及其构建方法与应用
GB201621686D0 (en) 2016-12-20 2017-02-01 Glaxosmithkline Biologicals Sa Novel methods for inducing an immune response
WO2018178265A1 (en) 2017-03-31 2018-10-04 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Immunogenic composition, use and method of treatment
US11167022B2 (en) * 2017-03-31 2021-11-09 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Immunogenic composition, use and method of treatment
IE87414B1 (en) 2017-05-30 2023-07-19 Glaxosmithkline Biologicals Sa Novel methods for manufacturing an adjuvant
US11723966B2 (en) 2017-08-14 2023-08-15 Glaxosmithkline Biologicals Sa Methods of boosting immune responses
CN107602697B (zh) * 2017-08-29 2020-05-05 杭州医学院 一种治疗流感嗜血杆菌引起鼻窦炎的血清及该血清的应用
BR112020010790A2 (pt) 2017-12-01 2020-11-10 Glaxosmithkline Biologicals S.A. purificação da saponina
EP3810163A1 (en) * 2018-06-19 2021-04-28 GlaxoSmithKline Biologicals SA Immunogenic composition
MX2021001479A (es) 2018-08-07 2021-04-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa Novedosos procesos y vacunas.
US20220339282A1 (en) 2018-11-29 2022-10-27 Glaxosmithkline Biologicals Sa Methods for manufacturing an adjuvant
CN110540597B (zh) * 2018-12-20 2021-04-30 湖北工业大学 基于流感嗜血杆菌表面蛋白的乳胶微球免疫层析试纸的制备方法
CN110540598B (zh) * 2018-12-20 2021-04-30 湖北工业大学 基于流感嗜血杆菌表面蛋白抗体的流感嗜血杆菌Elisa检测试剂盒及制备方法
EP3931206A1 (en) 2019-02-27 2022-01-05 Evaxion Biotech ApS Vaccines targeting h. influenzae
US20220221455A1 (en) 2019-04-18 2022-07-14 Glaxosmithkline Biologicals Sa Antigen binding proteins and assays
JP2022535091A (ja) 2019-06-05 2022-08-04 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム サポニン精製
BR112021026775A2 (pt) 2019-08-05 2022-05-10 Glaxosmithkline Biologicals Sa Processo para preparar uma composição que compreende um polipeptídeo de proteína d
BR112021026565A2 (pt) * 2019-08-05 2022-05-03 Glaxosmithkline Biologicals Sa Composição imunogênica
JP2024510717A (ja) 2021-02-22 2024-03-11 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム 免疫原性組成物、使用及び方法
KR20220142219A (ko) * 2021-04-14 2022-10-21 한국생명공학연구원 장내 미생물에서 단백질 분비를 유도하는 신호서열
WO2024017827A1 (en) 2022-07-19 2024-01-25 Glaxosmithkline Biologicals Sa Continuous process for vaccine production

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007008527A2 (en) * 2005-07-08 2007-01-18 Children's Hospital Inc. Chimeric vaccine for haemophilus influenzae-induced disease
WO2007006665A1 (en) * 2005-07-08 2007-01-18 University Of Zürich Phage display using cotranslational translocation of fusion polypeptides
WO2007084053A1 (en) * 2006-01-17 2007-07-26 Arne Forsgren A NOVEL SURFACE EXPOSED HAEMOPHILUS INFLUENZAE PROTEIN (PROTEIN E; pE)

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE454403B (sv) 1984-05-30 1988-05-02 Alfa Laval Agri Int Anvendning av ett cellyteprotein med fibronektin-, fibrinogen-, kollagen-, och/eller lamininbindande egenskaper vid framstellning av sarbehandlingsmedel
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
AU648251B2 (en) * 1989-03-09 1994-04-21 Wyeth Holdings Corporation Vaccines for nontypable haemophilus influenzae
SE466259B (sv) 1990-05-31 1992-01-20 Arne Forsgren Protein d - ett igd-bindande protein fraan haemophilus influenzae, samt anvaendning av detta foer analys, vacciner och uppreningsaendamaal
ES2108278T3 (es) 1992-06-25 1997-12-16 Smithkline Beecham Biolog Composicion de vacuna con coadyuvantes.
WO1994021292A1 (en) 1993-03-23 1994-09-29 Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) Vaccine compositions containing 3-o deacylated monophosphoryl lipid a
GB9326253D0 (en) 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
ATE328890T1 (de) 1994-07-15 2006-06-15 Univ Iowa Res Found Immunomodulatorische oligonukleotide
UA56132C2 (ru) 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиция вакцины (варианты), способ стабилизации qs21 по отношению к гидролизу (варианты), способ приготовления вакцины
US6440425B1 (en) 1995-05-01 2002-08-27 Aventis Pasteur Limited High molecular weight major outer membrane protein of moraxella
KR100425929B1 (ko) 1995-06-23 2004-05-31 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 알루미늄포스페이트상에흡착된다당류컨쥬게이트항원을포함하는백신조성물
BR9714160A (pt) 1996-12-20 2000-05-02 Univ Texas Antìgenos uspa1 e uspa2 de moraxella catarrhalis
ATE384072T1 (de) 2000-09-26 2008-02-15 Idera Pharmaceuticals Inc Modulation der immunostimulatorischen aktivität von immunostimulierenden oligonukleotidanaloga durch positionelle chemische veränderungen
PT2088197T (pt) 2000-10-02 2016-08-01 Id Biomedical Corp Quebec Antigénios de haemophilus influenzae e fragmentos de adn correspondentes
US6942802B2 (en) 2001-04-13 2005-09-13 Wyeth Holdings Corporation Removal of bacterial endotoxin in a protein solution by immobilized metal affinity chromatography
WO2003035836A2 (en) 2001-10-24 2003-05-01 Hybridon Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5' ends
GB0222764D0 (en) 2002-10-02 2002-11-06 Univ Bristol Therapeutic peptide
US7049076B2 (en) 2003-07-09 2006-05-23 Sentigen Biosciences, Inc. Method for assaying protein—protein interaction
GB0410866D0 (en) 2004-05-14 2004-06-16 Chiron Srl Haemophilius influenzae
AR053385A1 (es) * 2005-05-12 2007-05-02 Novartis Ag Genes y proteinas novedosos de brachyspira hyodysenteriae y uso de los mismos para diagnostico y terapia
US8092811B2 (en) 2005-08-10 2012-01-10 Arne Forsgren Ab Interaction of Moraxella catarrhalis with epithelial cells, extracellular matrix proteins and the complement system
GB2444903A (en) * 2006-12-21 2008-06-25 Secr Defence Live Francisella vaccine, inactivated at gene FTT1564
CN102124030B (zh) * 2008-06-20 2015-06-17 国立大学法人冈山大学 抗氧化LDL/β2GPI复合物的抗体及其用途
TW201302779A (zh) 2011-04-13 2013-01-16 Glaxosmithkline Biolog Sa 融合蛋白質及組合疫苗

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007008527A2 (en) * 2005-07-08 2007-01-18 Children's Hospital Inc. Chimeric vaccine for haemophilus influenzae-induced disease
WO2007006665A1 (en) * 2005-07-08 2007-01-18 University Of Zürich Phage display using cotranslational translocation of fusion polypeptides
WO2007084053A1 (en) * 2006-01-17 2007-07-26 Arne Forsgren A NOVEL SURFACE EXPOSED HAEMOPHILUS INFLUENZAE PROTEIN (PROTEIN E; pE)

Also Published As

Publication number Publication date
BR112013026175B1 (pt) 2020-05-12
HUE036983T2 (hu) 2018-08-28
US20200331972A1 (en) 2020-10-22
EP3321287B1 (en) 2020-02-26
JP6196963B2 (ja) 2017-09-13
US20180222946A1 (en) 2018-08-09
US20160250313A1 (en) 2016-09-01
DK3321287T3 (da) 2020-05-04
KR20140026483A (ko) 2014-03-05
ME02995B (me) 2018-10-20
SG10201602549WA (en) 2016-05-30
ES2658512T3 (es) 2018-03-12
AU2012243412C1 (en) 2015-12-10
HRP20180216T1 (hr) 2018-03-09
RS56903B1 (sr) 2018-05-31
US9296794B2 (en) 2016-03-29
CA2830786C (en) 2021-10-26
AU2012243412A1 (en) 2013-04-18
CY1122824T1 (el) 2021-05-05
PL2707393T3 (pl) 2018-05-30
US20150175670A1 (en) 2015-06-25
PT3321287T (pt) 2020-05-22
DOP2013000235A (es) 2014-03-16
UY34017A (es) 2012-11-30
US11198707B2 (en) 2021-12-14
CL2013002937A1 (es) 2014-07-25
KR101999673B1 (ko) 2019-07-12
AU2012243412B2 (en) 2015-05-14
US20150166613A1 (en) 2015-06-18
AR086078A1 (es) 2013-11-20
MA35110B1 (fr) 2014-05-02
CN107522788A (zh) 2017-12-29
IL228344A0 (en) 2013-12-31
US8945577B2 (en) 2015-02-03
US20170029472A1 (en) 2017-02-02
EP3321287A1 (en) 2018-05-16
HUE048848T2 (hu) 2020-08-28
US10730917B2 (en) 2020-08-04
WO2012139225A1 (en) 2012-10-18
DK2707393T3 (da) 2018-01-29
PE20140986A1 (es) 2014-08-20
SG193906A1 (en) 2013-11-29
BR112013026175A2 (pt) 2016-11-29
IL271862A (en) 2020-02-27
NZ615328A (en) 2015-10-30
MX350013B (es) 2017-08-23
US10023616B2 (en) 2018-07-17
EA201391240A1 (ru) 2014-04-30
ZA201307118B (en) 2022-03-30
TW201302779A (zh) 2013-01-16
CO6781540A2 (es) 2013-10-31
EP2707393B1 (en) 2017-12-20
LT3321287T (lt) 2020-06-10
LT2707393T (lt) 2018-03-12
CY1120319T1 (el) 2019-07-10
ES2776369T3 (es) 2020-07-30
PL3321287T3 (pl) 2020-07-27
IL271862B (en) 2022-07-01
PT2707393T (pt) 2018-02-09
CR20130529A (es) 2014-03-05
JP2014512365A (ja) 2014-05-22
CN107383201A (zh) 2017-11-24
EP2707393A4 (en) 2014-11-05
SI2707393T1 (en) 2018-03-30
EP2707393A1 (en) 2014-03-19
CN103476799A (zh) 2013-12-25
HRP20200466T1 (hr) 2020-06-26
MX2013011939A (es) 2014-03-27
US20140056934A1 (en) 2014-02-27
CA2830786A1 (en) 2012-10-18
US9409957B2 (en) 2016-08-09
SI3321287T1 (sl) 2020-07-31
US10214569B2 (en) 2019-02-26
IL228344B (en) 2020-01-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11198707B2 (en) Fusion proteins and combination vaccines comprising Haemophilus influenzae Protein E and Pilin A
JP6236086B2 (ja) １種以上の肺炎球菌莢膜糖類コンジュゲートとインフルエンザ菌由来のタンパク質Ｅおよび／またはＰｉｌＡを含むタンパク質成分とを含む免疫原性組成物
JP6515036B2 (ja) Ｃ．ディフィシルＣＤＴｂ及び／又はＣＤＴａタンパク質のエレメントを含む免疫原性組成物
TW201620927A (zh) Ｕｓｐａ２蛋白質構築體及其用途
JP2010172332A (ja) Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ誘発性疾患のためのキメラワクチン
JP2020100625A (ja) クロストリジウム・ディフィシル免疫原性組成物
US20230414738A1 (en) Haemophilus influenzae vaccine and methods of use
NZ615328B2 (en) Fusion proteins and combination vaccines comprising haemophilus influenzae protein e and pilin a

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ KG MD TJ TM