BR112013026175B1 - Proteína de fusão, composição imunogênica, vacina, e, processo para produzir expressão periplasmática de uma proteína de fusão - Google Patents

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Abstract

proteína de fusão, composição imunogênica, vacina, métodos para o tratamento ou prevenção de doença, tal como otite média, pneumonia, uma infecção ou doença associada a h. influenzae e exacerbações de doença pulmonar obstrutiva crônica aguda (aecopd), e, processos para produzir expressão preriplasmática de uma proteína de fusão e para preparar uma vacina a presente invenção diz respeito às composições que compreendem proteína e e pilina a de haemophilus influenzae. mais particularmente, o presente pedido diz respeito às proteínas de fusão e composições imunogênicas que compreendem proteína e e pila, vacinas que compreendem tais composições imunogênicas e usos terapêuticos das mesmas.

Description

PROTEÍNA DE FUSÃO, COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, VACINA, E, PROCESSO PARA PRODUZIR EXPRESSÃO PERIPLASMÁTICA DE UMA PROTEÍNA DE FUSÃO [001] Este pedido reivindica a prioridade do pedido de patente dos
Estados Unidos número 61/474779, depositado em 13 de abril de 2011, e do pedido de patente dos Estados Unidos número 61/534012, depositado em 13 de setembro de 2011.
CAMPO DA INVENÇÃO [002] A presente invenção diz respeito a composições que compreendem proteína E e pilina A DE Haemophilus influenzae (H. influenzae). Mais particularmente, o presente pedido diz respeito a proteínas de fusão e composições imunogênicas que compreendem proteína E e pilina A, vacinas que compreendem tais composições imunogênicas e usos terapêuticos das mesmas.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO [003] A proteína E (PE) é uma lipoproteína de membrana externa com propriedades adesivas. Desempenha um papel na adesão/invasão de Haemophilus influenzae não tipável (NTHi) em células epiteliais. (J. Immunology 183: 2593-2601 (2009); The Journal of Infectious Diseases 199:522-531 (2009), Microbes and Infection 10:87-96 (2008)). É muito conservada tanto em Haemophilus influenzae encapsulado e H. influenzae não tipável, e apresenta um domínio de ligação epitelial conservado. (The Journal of Infectious Diseases 201:414-419 (2010)). Treze mutações pontuais diferentes foram descritas em diferentes espécies de Haemophilus quando comparadas com Haemophilus influenzae Rd como uma cepa de referência. Sua expressão é observada tanto no crescimento logarítmico quanto na fase estacionária das bactérias. (WO2007/084053).
[004] A proteína E também está envolvida na resistência de complemento humano por meio da ligação à vitronectina. (Immunology 183:
Petição 870190129809, de 09/12/2019, pág. 11/336 / 112
2593-2601 (2009)). PE, pelo domínio de ligação PKRYARSVRQ YKILNCANYH LTQVR (SEQ ID NO. 1, que corresponde aos aminoácidos 84-108 de SEQ ID NO. 4), se liga à vitronectina que é um importante inibidor da via de complemento terminal (J. Immunology 183:2593-2601 (2009)).
[005] A pilina A (PilA) é provavelmente a principal subunidade de pilina do pili tipo IV de H. influenzae (Tfp), envolvido em motilidade por contração (Infection and Immunity, 73: 1635-1643 (2005)). NTHi PilA é uma adesina conservada e expressa in vivo. Mostrou estar envolvida na aderência de NTHi, colonização e formação de biofilme. (Molecular Microbiology 65: 1288-1299 (2007)).
[006] Haemophilus influenzae não tipável é um patógeno respiratório importante e comum que causa otite média em crianças e bebês. NTHi é, depois de Streptococcus pneumoniae, a causa mais comum de otite média aguda em crianças (J. Immunology 183: 2593-2601 (2009), Pediatrics 113:1451-1465 (2004)). É uma importante causa de sinusite em crianças e adultos. (Current Infectious Disease Reports 11:177-182 (2009)). Está associada ao risco aumentado de exacerbações na doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD) em adultos. (Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease 3:109-115 (2006)). Além disso, H. influenzae causa pneumonia adquirida na comunidade em adultos e pode causar pneumonia em crianças em países em desenvolvimento. (Current Infectious Disease Reports 11:177182 (2009)).
[007] Existe uma necessidade em relação às vacinas NTHi.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO [008] Como um primeiro aspecto, a presente invenção fornece proteínas de fusão da fórmula (I).
(X) m - (R1)n - A - (Y) o - B - (Z)p (fórmula I) em que:
X é um peptídeo sinal ou MHHHHHH (SEQ ID NO. 2);
Petição 870190129809, de 09/12/2019, pág. 12/336 / 112 m é 0 ou 1;
R1 é um aminoácido;
n é 0, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6;
A é proteína E de Haemophilus influenzae ou um fragmento imunogênico desta, ou PilA de Haemophilus influenzae ou um fragmento imunogênico desta;
Y é selecionado do grupo que consiste em GG, SG, SS, GGG e (G)h em que h é 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10;
o é 0 ou 1;
B é PilA de Haemophilus influenzae ou um fragmento imunogênico desta, ou proteína E de Haemophilus influenzae ou um fragmento imunogênico desta;
Z é GGHHHHHH (SEQ ID NO. 3); e p é 0 ou 1.
[009] Como um segundo aspecto, a presente invenção fornece composições imunogênicas que compreendem proteínas de fusão da fórmula (I). A composição pode compreender adicionalmente um adjuvante farmaceuticamente aceitável. A composição pode compreender um excipiente.
[0010] Em um terceiro aspecto, a presente invenção fornece um método para o tratamento ou prevenção de uma condição ou doença causada totalmente ou em parte por Haemophilus influenzae. O método compreende administrar a um sujeito que precisa desta uma quantidade terapeuticamente eficiente da proteína de fusão da fórmula (I).
[0011] Em um quarto aspecto, a presente invenção fornece um método para o tratamento ou prevenção de otite média. O método compreende administrar a um sujeito que precisa desta uma quantidade terapeuticamente eficiente da proteína de fusão da fórmula (I).
[0012] Em um quinto aspecto, a presente invenção fornece um
Petição 870190129809, de 09/12/2019, pág. 13/336 / 112 método para o tratamento ou prevenção de exacerbações em doença pulmonar obstrutiva crônica. O método compreende administrar a um sujeito que precisa desta uma quantidade terapeuticamente eficiente da proteína de fusão da fórmula (I).
[0013] Em um sexto aspecto, a presente invenção fornece um método para o tratamento ou prevenção de pneumonia. O método compreende administrar a um sujeito que precisa desta uma quantidade terapeuticamente eficiente da proteína de fusão da fórmula (I).
[0014] Em um sétimo aspecto, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende uma proteína de fusão da fórmula (I) para uso no tratamento ou prevenção de uma condição ou doença causada totalmente ou em parte por Haemophilus influenzae. As composições farmacêuticas podem compreender adicionalmente um adjuvante farmaceuticamente aceitável.
[0015] Em um oitavo aspecto, a presente invenção fornece ácidos nucleicos que codificam as proteínas da invenção.
[0016] Em um nono aspecto, a presente invenção fornece um processo de produzir ácidos nucléicos da invenção.
[0017] Os aspectos adicionais da presente invenção são descritos na descrição detalhada das modalidades, exemplos e reivindicações particulares a seguir.
DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOS [0018] A figura 1 mostra SDS-PAGE de extratos bacterianos induzidos para os construtos de proteína de fusão LVL291, LVL268 e LVL269. A fração insolúvel (I), fração solúvel (S) e fração de meio de cultura (M) foram carregadas para LVL291, LVL268 e LVL269 antes e após a indução (ind).
[0019] A figura 2 mostra SDS-PAGE e Western blot relacionados aos extratos de purificação para os construtos de proteína de fusão LVL291,
Petição 870190129809, de 09/12/2019, pág. 14/336 / 112
LVL268 e LVL269. Fração de fluxo (Ft), fração de lavagem (W) e fração de eluição (E) foram carregadas para purificação de LVL291, LVL268 e LVL269. Anti-his tag foi usado para sondar extratos.
[0020] A figura 3 mostra SDS-PAGE de extratos bacterianos induzidos e de purificação para os construtos de proteína de fusão LVL291 e LVL315. Fração de meio de cultura (M), fração solúvel (Sol), fração insolúvel (Ins), fração de fluxo (Ft), fração de lavagem #1 (W1), fração de lavagem #2 (W2) e fração de eluição (E) foram carregadas para LVL291 e LVL315.
[0021] A figura 4 mostra SDS-PAGE de extratos bacterianos induzidos e de purificação para o construto de proteína de fusão LVL312. Fração de meio de cultura (M), fração solúvel (Sol), fração insolúvel (Ins), fração de fluxo (Ft), fração de lavagem #1 (W1), fração de lavagem #2 (W2) e fração de eluição (E) foram carregadas para LVL312.
[0022] A figura 5 mostra SDS-PAGE de extratos bacterianos induzidos (IPTG 1mM e 10μΜ) para o construto de proteína de fusão LVL317. Extratos antes (NI) e após a indução (In), fração solúvel (S), fração insolúvel (I).
[0023] A figura 6 mostra SDS-PAGE de extratos bacterianos induzidos (IPTG 1mM e 10μΜ) para o construto de proteína de fusão LVL318. Extratos antes (NI) e após a indução (In), fração de meio de cultura (M), fração solúvel (S), fração insolúvel (I).
[0024] A figura 7 mostra os espectros CD das proteínas de fusão PE, PilA e PE-PilA.
[0025] A figura 8 mostra a combinação do espectro CD de PE e PilA.
[0026] A figura 9 mostra a curva de desnaturação térmica de PilA.
[0027] A figura 10 mostra a curva de desnaturação de PE.
[0028] A figura 11 mostra a curva de desnaturação térmica da proteína de fusão PE-PilA.
Petição 870190129809, de 09/12/2019, pág. 15/336 / 112 [0029] A figura 12 mostra o cromatograma de fluxo rápido típico SP Sepharose™.
[0030] A figura 13 mostra o cromatograma de fluxo rápido típico Q Sepharose™.
[0031] A figura 14 mostra SDS-PAGE de amostras em processo, a partir do processo de purificação da proteína de fusão PE-PilA.
[0032] A figura 15 mostra Western Blot de amostras em processo a partir do processo de purificação da proteína de fusão PE-PilA. Blot usando anti-PE policlonal de coelho.
[0033] A figura 16 mostra Western Blot de amostras em processo, a partir do processo de purificação da proteína de fusão PE-PilA. Blot usando anti-E.coli policlonal de coelho (BLR).
[0034] A figura 17 mostra a transição térmica da proteína de fusão PE-PilA e das proteínas PE e PilA. Curvas: PilA (1), proteína E (Prot E, PE) (2), volume de PE-PilA purificada não diluída, 737pg/mL (3), e volume de PE-PilA purificada diluída em concentração final do recipiente de 60pg/mL (4).
[0035] A figura 18 mostra as respostas do anticorpo contra proteína de fusão LVL291 PE-PilA e contra PE e PilA monovalente no modelo de camundongo Balb/c.
[0036] A figura 19 mostra o efeito da vacinação com proteína de fusão PE-PilA na evidência bacteriana de NTHi cepa 86-028NP na nasofaringe de camundongo.
[0037] A figura 20 mostra o efeito da vacinação com proteína de fusão PE-PilA na evidência bacteriana de NTHi cepa 3224A na nasofaringe de camundongo.
[0038] A figura 21 mostra o efeito da vacinação com PilA na evidência bacteriana na nasofaringe de camundongo.
[0039] A figura 22 mostra o efeito da vacinação com PE na evidência
Petição 870190129809, de 09/12/2019, pág. 16/336 / 112 bacteriana na nasofaringe de camundongo.
[0040] A figura 23 mostra (a) proteína de fusão LVL317 PE-PilA que se liga à vitronectina e (b) proteína de fusão LVL317 e LVL735 PE-PilA ligada à vitronectina.
[0041] A figura 24 mostra a inibição da ligação à vitronectina por anticorpos policlonais contra a proteína de fusão PE-PilA.
[0042] A figura 25 mostra SDS-PAGE das frações solúveis de extratos bacterianos induzidos para os construtos de proteína de fusão LVL291, LVL702, LVL736, LVL737, LVL738, LVL739, LVL740 e vetor pET26b (controle negativo). (a) Experimento 1 (b) Experimento 2 (c) Experimento 3. A proteína de fusão PE-PilA é indicada pela seta.
[0043] A figura 26 mostra o percentual médio da banda de proteína de fusão na fração solúvel dos experimentos 1, 2 e 3.
[0044] A figura 27 mostra a resposta ao anticorpo PE e PilA para LVL317 e LVL735.
[0045] A figura 28 mostra o efeito da vacinação com LVL735 e LVL317 na evidência bacteriana em um modelo de camundongo de colonização nasofaríngea com Haemophilus influenzae não tipável.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [0046] A menos que de outra forma aqui explicada ou definida, todos os termos técnicos e científicos aqui usados apresentam o mesmo significado, da maneira comumente entendida pelos versados na técnica, aos quais esta revelação pertence. Por exemplo, as definições de termos comuns na biologia molecular podem ser encontradas em Benjamin Lewin, Genes V, publicado por Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); e Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).
Petição 870190129809, de 09/12/2019, pág. 17/336 / 112 [0047] Os termos singulares “um”, “uma”, “o” e “a” incluem os referentes plurais, a menos que o contexto indique claramente de outra maneira. De maneira similar, a palavra “ou” é pretendida para incluir “e”, a menos que o contexto indique claramente de outra maneira. Entende-se adicionalmente que todos os tamanhos de base ou tamanhos de aminoácido, e todos os valores de peso molecular ou massa molecular fornecidos para ácidos nucléicos ou polipeptídeos são aproximados, e são fornecidos para descrição. Adicionalmente, as limitações numéricas fornecidas com relação às concentrações ou níveis de uma substância, tal como um antígeno, podem ser aproximadas. Assim, onde uma concentração é indicada para ser (por exemplo) aproximadamente 200 pg, pretende-se que a concentração inclua valores um pouco maiores ou um pouco menores que (“cerca de” ou “~”) 200 pg.
[0048] Embora os métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles aqui descritos possam ser usados na realização ou teste desta revelação, os métodos e materiais adequados são descritos a seguir.
[0049] O termo “compreende” significa “inclui”. Assim, a menos que o contexto possa exigir de outra forma, a palavra “compreende” e variações tais como “compreendem” e “compreendendo” serão entendidas para implicar a inclusão de um composto ou composição declarados (por exemplo, ácido nucleico, polipeptídeo, antígeno) ou etapa, ou grupo de compostos ou etapas, mas não a exclusão de qualquer de outros compostos, composição, etapas, ou grupos destes. A abreviação “e.g.” é derivada do Latim exempli gratia, e é aqui usada para indicar um exemplo não limitante. Assim, a abreviação “e.g.” é sinônimo do termo “por exemplo”.
[0050] A fim de facilitar a revisão das várias modalidades desta revelação, as explicações a seguir dos termos são fornecidas. Os termos e explicações adicionais são fornecidos no contexto desta revelação.
[0051] Um “sujeito”, da maneira aqui usada, é um mamífero,
Petição 870190129809, de 09/12/2019, pág. 18/336 / 112 incluindo humanos, primatas não humanos e mamíferos não primatas tais como os elementos do gênero de roedores (incluindo, mas sem limitação, camundongos e ratos), e elementos da ordem Lagomorpha (incluindo, mas sem limitação, coelhos).
[0052] Da maneira aqui usada, “Proteína E”, “proteína E”, “Prot E” e “PE” significam proteína E de H. influenzae. A proteína E pode consistir ou compreendem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO. 4 (MKKIILTLSL
GLLTACSAQI QKAEQNDVKL
APPTDVRSGY IRLVKNVNYY
IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV
YPEPKRYARS
VRQYKILNCA NYHLTQVRTD
FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH
TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK), bem como sequências com pelo menos ou exatamente 75 %, 77 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 99 % ou 100 % de identidade, em relação ao tamanho completo, com SEQ ID NO. 4. A comparação de 53 sequências de proteína E de Haemophilus influenzae (Tabela 1, SEQ ID NO. 5 - SEQ ID NO. 57) demonstrou aproximadamente 77 % a aproximadamente 100 % de identidade com a proteína E, da maneira apresentada em SEQ ID NO. 4. Por exemplo, na sequência de aminoácidos de proteína E, aminoácido #20 pode ser isoleucina (I) ou treonina (T); o aminoácido #23 pode ser alanina (A) ou valina (V); o aminoácido #24 pode ser lisina (K) ou ácido glutâmico (E); o aminoácido #31 pode ser alanina (A) ou treonina (T); o aminoácido #32 pode ser prolina (P) ou alanina (A); o aminoácido #34 pode ser treonina (T) ou alanina (A); o aminoácido #37 pode ser arginina (R) ou glutamina (Q); o aminoácido #47 pode ser valina (V) ou alanina (A); o aminoácido #57 pode ser triptofano (W) ou pode estar ausente (-); o aminoácido #70 pode ser alanina (A) ou treonina (T); o aminoácido #93 pode ser glutamina (Q) ou ausente (-); o aminoácido #109 pode ser treonina (T) ou isoleucina (I); o aminoácido #119 pode ser glicina (G) ou serina (S); o aminoácido #153 pode ser ácido glutâmico (E) ou lisina (K); o aminoácido #156 pode ser serina (S) ou leucina (L); o aminoácido #160 pode ser lisina
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10/ 112 (K) ou asparagina (N); o aminoácido #161 pode ser lisina (K), isoleucina (I) ou ausente (-); aminoácidos #162 - #195 podem estar ausentes, ou da maneira apresentada em SEQ ID NO. 15 (com (-) indicando que aminoácido #166 está ausente), ou da maneira apresentada em SEQ ID NO. 16; ou qualquer combinação destes.
[0053] A proteína E pode consistir ou compreender uma sequência de aminoácidos que difere de SEQ ID NO. 4 em qualquer um ou mais aminoácidos selecionados do grupo que consiste em: aminoácido #20, aminoácido #23, aminoácido #24, aminoácido #31, aminoácido #32, aminoácido #34, aminoácido #37, aminoácido #47, aminoácido #57, aminoácido #70, aminoácido #93, aminoácido #109, aminoácido #119, aminoácido #153, aminoácido #156, aminoácido #160, aminoácido #161 e aminoácidos #162-#195, em que aminoácido #20 é treonina (T); o aminoácido #23 é valina (V); o aminoácido #24 é lisina (K); o aminoácido #31 é treonina (T); o aminoácido #32 é alanina (A); o aminoácido #34 é alanina (A); o aminoácido #37 é glutamina (Q); o aminoácido #47 é alanina (A); o aminoácido #57 está ausente (-); o aminoácido #70 é treonina (T); o aminoácido #93 está ausente (-); o aminoácido #109 é isoleucina (I); o aminoácido #119 é serina (S); o aminoácido #153 é lisina (K); o aminoácido #156 é leucina (L); o aminoácido #160 é asparagina (N); o aminoácido #161 é lisina (K) ou isoleucina (I); ou aminoácidos #162 - #195 são da maneira apresentada em SEQ ID NO. 15 (com (-) indicando que o aminoácido #166 está ausente), ou da maneira apresentada em SEQ ID NO. 16.
Tabela 1: Sequências de aminoácido da proteína E a partir de 53 cepas de
Haemophilus influenzae (SEQ ID NO. 5 - SEQ ID NO. 57). - indica que o aminoácido está ausente.
Nome da cepa sequência de proteína E
3224a MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAKQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESI WVDNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRT DFYDEFWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGEAFSVDKK (SEQ ID NO.5)
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11/ 112
RdKW20 MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESI WVDNQEPQIVHFDAVVNLDRGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQIRT DFYDEFWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID NO.6)
86-028NP MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAKQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESI WVDNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRT DFYDEFWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGEAFSVDKK (SEQ ID NO.7)
R2846 MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESI WVDNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRT DFYDEFWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID NO.8)
R2866 MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESI WVDNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRT DFYDEFWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID NO.9)
3655 MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDMKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESI WVDNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRT DFYDEFWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID NO.10)
PittAA MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAKQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESI WVDNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRT DFYDEFWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGEAFSVDKK (SEQ ID NO.11)
PittEE MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDMKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESI VDNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTD FYDEFWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK(SEQ ID NO.12)
PittHH MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESI WVDNQEPQIVHFDTVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRT DFYDEFWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID NO.13)
PittlI MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESI WVDNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRT DFYDEFWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID NO.14)
R3021 MKKIILTLSLGLLTACSAQTQKAEQNDVKLTPPTDVQSGYVRLVKNVNYYIDSES IWVDNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRI DFYDEFWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKNKKI CT-LISLNFIQLLGCREYSIFLQLLLFYCWHF (SEQ ID NO.15)
22.4-21 MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESI WVDNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRT DFYDEFWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKKIKK ICTLISLNFIQLLGCREYSIFLQLLLFYCWHF (SEQ ID NO.16)
3219C MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDMKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESI WVDNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRT DFYDEFWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID NO.17)
3185 MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESI WVDNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRT DFYDEFWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID NO.18)
3241A MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAKQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESI WVDNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRT DFYDEFWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGEAFSVDKK (SEQ ID NO.19)
038144S1 MKKIILTLSLGLLTACSAQTQKVEQNDVKLTAPTDVRSGFVRLVKNVNYYIDSES IWVDNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVR TDFYDEFWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFLVDKK (SEQ ID NO.20)
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12/ 112
810956 MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAKQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESI WVDNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRT DFYDEFWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGEAFSVDKK (SEQ ID NO.21)
821246 MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESI WVDNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQIRT DFYDEFWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID NO.22)
840645 MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAKQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESI WVDNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRT DFYDEFWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGEAFSVDKK (SEQ ID NO.23)
902550Z19 MKKIILTLSLGLLTACSAQTQKVEQNDVKLTPPTDVRSGYVRLVKNVNYYIDSES IWVDNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVR TDFYDEFWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID NO.24)
A840177 MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAKQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESI WVDNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRT DFYDEFWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGEAFSVDKK (SEQ ID NO.25)
A860514 MKKIILTLSLGLLTACSAQTQKVEQNDVKLTAPTDVRSGYVRLVKNANYYIDSE SIWVDNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQV RTDFYDEFWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID NO.26)
A950014 MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESI WVDNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRI DFYDEFWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID NO.27)
306543X4 MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESI WVDNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRT DFYDEFWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK(SE Q ID NO.28)
A930105 MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESI WVDNQEPQIVHFDTVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRT DFYDEFWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK(SE Q ID NO.29)
901905U MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESI WVDNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRT DFYDEFWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID NO.30)
A920030 MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAKQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESI WVDNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRT DFYDEFWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGEAFSVDKK (SEQ ID NO.31)
3221B MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESI WVDNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRT DFYDEFWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID NO.32)
27W116791N MKKIILTLSLGLLTACSAQTQKVEQNDVKLTPPTDVRSGYVRLVKNVNYYIDSES IWVDNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVR TDFYDEFWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID NO.33)
N218 MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESI WVDNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRT DFYDEFWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID NO.34)
N163 MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAKQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESI WVDNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRT DFYDEFWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGEAFSVDKK (SEQ ID NO.35)
Petição 870190129809, de 09/12/2019, pág. 22/336 / 112
N162 MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAKQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESI WVDNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRT DFYDEFWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGEAFSVDKK (SEQ ID NO.36)
N107 MKKIILTLSLGLLTACSAQTQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESI WVDNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQIRT DFYDEFWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID NO.37)
N91 MKKIILTLSLGLLTACSAQTQKVEQNDVKLTAPADVRSGYVRLVKNVNYYIDSE SIWVDNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQV RTDFYDEFWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID NO.38)
D211PG MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAKQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESI WVDNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVR- YKILNCANYHLTQVRTDFYDEFWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQII CANYGEAFSVDKK (SEQ ID NO.39)
D211PD MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAKQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESI WVDNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVR- YKILNCANYHLTQVRTDFYDEFWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQII CANYGEAFSVDKK (SEQ ID NO.40)
D201PG MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESI WVDNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRT DFYDEFWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID NO.41)
D201PD MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESI WVDNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRT DFYDEFWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID NO.42)
D198PG MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESI WVDNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRT DFYDEFWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID NO.43)
D198PD MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESI WVDNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRT DFYDEFWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID NO.44)
D195PD MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESI WVDNQEPQIVHFDTVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRT DFYDEFWGQSLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID NO.45)
D189PG MKKIILTLSLGLLTACSAQTQKVEQNDVKLTPPTDVRSGYVRLVKNVNYYIDSES IWVDNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVR TDFYDEFWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTVYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID NO.46)
D189PD MKKIILTLSLGLLTACSAQTQKVEQNDVKLTPPTDVRSGYVRLVKNVNYYIDSES IWVDNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVR TDFYDEFWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTVYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID NO.47)
D129CG MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAKQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESI WVDNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRT DFYDEFWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGEAFSVDKK (SEQ ID NO.48)
D124PG MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESI WVDNQEPQIVHFDTVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRT DFYDEFWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID NO.49)
D124PD MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESI WVDNQEPQIVHFDTVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRT DFYDEFWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK(SE Q ID NO.50)
Petição 870190129809, de 09/12/2019, pág. 23/336 / 112
D58PG MKKIILTLSLGLLTACSAQTQKAEQNDVKLTPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESI WVDNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRT DFYDEFWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID NO.51)
D33OD MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAKQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESI WVDNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRT DFYDEFWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID NO.52)
BS433 MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESI WVDNQEPQIVHFDTVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRT DFYDEFWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID NO.53)
BS432 MKKIILTLSLGLLTACSAQTQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESI WVDNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQIRT DFYDEFWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK(SE Q ID NO.54)
1714 MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAKQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESI WVDNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRT DFYDEFWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGEAFSVDKK (SEQ ID NO.55)
1128 MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESI WVDNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRT DFYDEFWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID NO.56)
BS430 MKKIILTLSLGLLTACSAQIQKAEQNDMKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYIDSESI VDNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTD FYDEFWGQGLRAAPKKQKKHTLSLTPDTTLYNAAQIICANYGKAFSVDKK (SEQ ID NO.57)
[0054] A proteína E pode ser proteína E de H. influenzae cepa 3224A,
RdKW20, 86-028NP, R2846, R2866, 3655, PittAA, PittEE, PittHH, PittII,
R3021, 22.4-21, 3219C, 3185, 3241A, 038144S1, 810956, 821246, 840645, 902550Z19, A840177, A860514, A950014, 306543X4, A930105, 901905U, A920030, 3221B, 27W116791N, N218, N163, N162, N107, N91, D211PG, D211PD, D201PG, D201PD, D198PG, D198PD, D195PD, D189PG, D189PD, D129CG, D124PG, D124PD, D58PG, D33OD, BS433, BS432, 1714, 1128 ou BS430. A proteína E pode ser proteína E da maneira apresentada em qualquer de SEQ ID NO. 5 - SEQ ID NO. 57.
[0055] A proteína E pode ser uma sequência com pelo menos 95 % de identidade, em relação ao tamanho completo, com qualquer de SEQ ID NO. 4 - SEQ ID NO. 57. A proteína E pode ser uma sequência com pelo menos 95 % de identidade, em relação ao tamanho completo, com qualquer das sequências apresentadas na tabela 1, SEQ ID NO. 5 - SEQ ID NO. 57.
[0056] Os fragmentos imunogênicos de proteína E compreendem
Petição 870190129809, de 09/12/2019, pág. 24/336 / 112 fragmentos imunogênicos de pelo menos 7, 10, 15, 20, 25, 30 ou 50 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO. 4. Os fragmentos imunogênicos podem elicitar anticorpos que podem se ligar a SEQ ID NO. 4.
[0057] Fragmentos imunogênicos de proteína E podem compreender fragmentos imunogênicos de pelo menos 7, 10, 15, 20, 25, 30 ou 50 aminoácidos contíguos de qualquer de SEQ ID NO. 4 - SEQ ID NO. 57. Os fragmentos imunogênicos podem elicitar anticorpos que podem se ligar à sequência de tamanho completo, a partir da qual o fragmento é derivado.
[0058] Fragmentos imunogênicos de proteína E compreendem fragmentos imunogênicos de pelo menos 7, 10, 15, 20, 25, 30 ou 50 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO. 5 - SEQ ID NO. 57. Os fragmentos imunogênicos podem elicitar anticorpos que podem se ligar à sequência de tamanho completo, a partir da qual o fragmento é derivado.
[0059] Da maneira aqui usada “PilA” significa pilina A de H. influenzae. PilA pode consistir ou compreender a sequência de proteína de SEQ ID NO. 58 (MKLTTQQTLK KGFTLIELMI VIAIIAILAT IAIPSYQNYT KKAAVSELLQ ASAPYKADVE LCVYSTNETT NCTGGKNGIA ADITTAKGYV KSVTTSNGAI TVKGDGTLAN MEYILQATGN AATGVTWTTT CKGTDASLFP ANFCGSVTQ), bem como sequências com 80 % a 100 % de identidade com SEQ ID NO. 58. Por exemplo, PilA pode ser pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % ou 100 % idêntica a SEQ ID NO. 58. A comparação de tamanho completo de 64 sequências de PilA de Haemophilus influenzae (Tabela 2, SEQ ID NO. 58 SEQ ID NO. 121) demonstrou aproximadamente 80 % a 100 % de identidade com PilA, da maneira apresentada em SEQ ID NO. 58. Por exemplo, na sequência de aminoácidos de PilA, o aminoácido #6 pode ser glutamina (Q) ou leucina (L); o aminoácido #7 pode ser glutamina (Q) ou treonina (T); o aminoácido #37 pode ser glutamina (Q) ou lisina (K); o aminoácido #44 pode ser alanina (A) ou serina (S); o aminoácido #57 pode ser alanina (A) ou serina
Petição 870190129809, de 09/12/2019, pág. 25/336 / 112 (S); o aminoácido #67 pode ser asparagina (N) ou glicina (G); o aminoácido #68 pode ser ácido glutâmico (E) ou lisina (K); o aminoácido #69 pode ser treonina (T) ou prolina (P); o aminoácido #71 pode ser lisina (K), asparagina (N), serina (S) ou treonina (T); o aminoácido #73 pode ser treonina (T), serina (S) ou metionina (M); o aminoácido #76 pode ser lisina (K), serina (S) ou asparagina (N); o aminoácido #84 pode ser treonina (T) ou lisina (K); o aminoácido #86 pode ser alanina (A) ou valina (V); o aminoácido #91 pode ser lisina (K) ou alanina (A); o aminoácido #94 pode ser treonina (T), isoleucina (I) ou lisina (K); o aminoácido #96 pode ser serina (S) ou glutamina (Q); o aminoácido #97 pode ser asparagina (N) ou serina (S); o aminoácido #99 pode ser alanina (A) ou glicina (G); o aminoácido #103 pode ser alanina (A) ou lisina (K); o aminoácido #109 pode ser ácido aspártico (D), alanina (A) ou treonina (T); o aminoácido #110 pode ser glicina (G), asparagina (N), ou arginina (R); o aminoácido #112 pode ser serina (S) ou ácido glutâmico (E); o aminoácido #114 pode ser treonina (T) ou isoleucina (I); o aminoácido #116 pode ser treonina (T) ou glutamina (Q); o aminoácido #118 pode ser ácido glutâmico (E), treonina (T), alanina (A), lisina (K) ou serina (S); o aminoácido #121 pode ser serina (S) ou alanina (A); o aminoácido #122 pode ser alanina (A) ou treonina (T); o aminoácido #123 pode ser lisina (K), treonina (T) ou alanina (A); o aminoácido #128 pode ser lisina (K) ou treonina (T); o aminoácido #135 pode ser ácido aspártico (D) ou ácido glutâmico (E); o aminoácido #136 pode ser alanina (A) ou treonina (T); o aminoácido #145 pode ser glicina (G) ou arginina (R); o aminoácido #149 pode ser glutamina (Q) ou lisina (K); ou qualquer combinação destes.
[0060] Pil A pode consistir ou compreender uma sequência de aminoácidos que difere de SEQ ID NO. 58 em qualquer um ou mais aminoácidos selecionados do grupo que consiste em aminoácido #6, aminoácido #7, aminoácido #37, aminoácido #44, aminoácido #57, aminoácido #67, aminoácido #68, aminoácido #69, aminoácido #71,
Petição 870190129809, de 09/12/2019, pág. 26/336 / 112 aminoácido #73, aminoácido #76, aminoácido #84, aminoácido#86, aminoácido #91, aminoácido #94, aminoácido #96, aminoácido#97, aminoácido #99, aminoácido #103, aminoácido #109, aminoácido #110, aminoácido #112, aminoácido #114, aminoácido #116, aminoácido#118 aminoácido, #121, aminoácido #122, aminoácido #123, aminoácido#128, aminoácido #135, aminoácido #136, aminoácido #145 e aminoácido #149, em que o aminoácido #6 é leucina (L); o aminoácido #7 é treonina (T); o aminoácido #37 é lisina (K); o aminoácido #44 é serina (S); o aminoácido #57 é serina (S); o aminoácido #67 é glicina (G); o aminoácido #68 é lisina (K); o aminoácido #69 é prolina (P); o aminoácido #71 é lisina (K), serina (S) ou treonina (T); o aminoácido #73 é serina (S) ou metionina (M); o aminoácido #76 é serina (S) ou asparagina (N); o aminoácido #84 é lisina (K); o aminoácido #86 é valina (V); o aminoácido #91 é alanina (A); o aminoácido #94 é isoleucina (I) ou lisina (K); o aminoácido #96 é glutamina (Q); o aminoácido #97 é serina (S); o aminoácido #99 é glicina (G); o aminoácido #103 é alanina (A); o aminoácido #109 é ácido aspártico (D) ou treonina (T); o aminoácido #110 é glicina (G) ou arginina (R); o aminoácido #112 é serina (S); o aminoácido #114 é treonina (T); o aminoácido #116 é treonina (T); o aminoácido #118 é ácido glutâmico (E), alanina (A), lisina (K) ou serina (S); o aminoácido #121 é serina (S); o aminoácido #122 é treonina (T); o aminoácido #123 é lisina (K) ou alanina (A); o aminoácido #128 é lisina (K); o aminoácido #135 é ácido glutâmico (E); o aminoácido #136 é treonina (T); o aminoácido #145 é arginina (R); o aminoácido #149 é lisina (K).
Tabela 2: Sequências de aminoácidos de pilina A de 64 cepas de Haemophilus influenzae (SEQ ID NO. 58 - SEQ ID NO. 121).
Nome da cepa Sequência de PilA
86-028NP MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKA DVELCVYSTNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANM EYILQATGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.58)
NTHi3219C MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKA DVELCVYSTNETTKCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVAGNGTLDGM SYTLTAEGDSAKGVTWKTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.59)
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NTHÍ3224A MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKA DVELCVYSTNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANM EYILQATGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.60)
NTHi12 MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYKNYTKKAAVSELLQASAPYKA DVELCVYSTGKPSSCSGGSNGIAADITTAKGYVASVITQSGGITVKGDGTLANME YILQAAGNAAAGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.61)
NTHi44 MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKA DVELCVYSTNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANM EYILQATGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.62)
NTHi67 MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKS DVELCVYSTGKPSTCSGGSNGIAADITTVKGYVKSVTTSNGAITVAGNGTLDGMS YTLTAEGDSAKGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.63)
1054MEE MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKA DVELCVYSTNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANM EYILQATGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.64)
1729MEE MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKA DVELCVYSTNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANM EYILQATGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.65)
1728MEE MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKA DVELCVYSTNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANM EYILQATGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.66)
1885MEE MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYKNYTKKAAVSELLQASAPYKA DVELCVYSTNEITNCMGGKNGIAADITTAKGYVASVKTQSGGITVKGDGTLANM EYILQATGNAAAGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSITQ (SEQ ID NO.67)
1060MEE MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKASVSELLQASAPYKA DVELCVYSTNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVASVKTQSGGITVKGNGTLANM EYILQAKGNATAGVTWTTTCKGTDASLFPANFCRSVTK (SEQ ID NO.68)
RdKW20 MKLTTLQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKA DVELCVYSTNETTSCTGGKNGIAADIKTAKGYVASVITQSGGITVKGNGTLANME YILQAKGNAAAGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTK (SEQ ID NO.69)
214NP MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKA DVELCVYSTGKPSSCSGGSNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANME YILQASGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.70)
1236MEE MKLTTLQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKA DVELCVYSTNETTSCTGGKNGIAADIKTAKGYVASVITQSGGITVKGNGTLANME YILQAKGNAAAGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTK (SEQ ID NO.71)
1714MEE MKLTTLQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKA DVELCVYSTGKPSTCSGGSNGIAADITTAKGYVASVKTQSGGITVKGNGTLANME YILQATGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.72)
1128MEE MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKASVSELLQASAPYKSD VELCVYSTGKPSTCSGGSNGIAADITTAKGYVASVKTQSGGITVKGNGTLANMEY ILQAKGNATAGVTWTTTCKGTDASLFPANFCRSVTK (SEQ ID NO.73)
R2846 MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKA DVELCVYSTNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANM EYILQATGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.74)
R2866 MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKA DVELCVYSTNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVASVKTQSGGITVKGDGTLANM EYILQATGNAATGVTWTTTCKGTEASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.75)
3655 MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKASVSELLQASAPYKA DVELCVYSTNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVASVKTQSGGITVKGNGTLANM EYILQAKGNATAGVTWTTTCKGTDASLFPANFCRSVTK (SEQ ID NO.76)
PittAA MKLTTLQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKA DVELCVYSTGKPSTCSGGSNGIAADITTAKGYVASVKTQSGGITVKGNGTLANME YILQATGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.77)
PittGG MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKA DVELCVYSTGKPSTCSGGSNGIAADITTAKGYVASVKTQSGGITVKGNGTLANME YILQAKGNATAGVTWTTTCKGTDASLFPANFCRSVTK (SEQ ID NO.78)
PittII MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKA DVELCVYSTNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVASVKTQSGGITVKGDGTLANM EYILQATGNAATGVTWTTTCKGTEASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.79)
Petição 870190129809, de 09/12/2019, pág. 28/336 / 112
R3021 MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKA DVELCVYSTNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVASVKTQSGGITVKGDGTLANM EYILQATGNAATGVTWTTTCKGTEASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.80)
22.4-21 MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKS DVELCVYSTGKPSTCSGGSNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVAGNGTLDGMS YTLTAEGDSAKGVTWKTTCKGTDASLFPANFCGSVTK (SEQ ID NO.81)
3185A MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKA DVELCVYSTNEATKCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANM EYILQASGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.82)
3221B MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKA DVELCVYSTNEATKCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANM EYILQASGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.83)
3241A MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKA DVELCVYSTNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANM EYILQATGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.84)
038144S1 MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAISELLQASAPYKSD VELCVYSTGKPSTCSGGSNGIAADITTAKGYVASVKTQSGGITVKGNGTLANMEY ILQAKGNATAGVTWTTTCKGTDASLFPANFCRSVTK (SEQ ID NO.85)
821246 MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKA DVELCVYSTNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVASVKTQSGGITVKGDGTLANM EYILQATGNAATGVTWTTTCKGTEASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.86)
840645 MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKA DVELCVYSTNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANM EYILQATGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.87)
902550Z19 MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKS DVELCVYSTGKPSTCSGGSNGIAADITTVKGYVKSVTTSNGAITVAGNGTLDGMS YTLTAEGDSAKGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.88)
A840177 MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKA DVELCVYSTNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANM EYILQATGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.89)
A920030 MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKA DVELCVYSTNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVASVKTQSGGITVKGNGTLANM EYILQATGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.90)
A950014 MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKA DVELCVYSTGKPSTCSGGSNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVAGNGTLDRMS YTLTAEGDSAKGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.91)
901905U MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKA DVELCVYSTGKPSSCSGGSNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANME YILQASGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.92)
A920029 MKLTTQTTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKSD VELCVYSTNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVASVITQSGGITVKGNGTLTNMEY ILQATGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSITQ (SEQ ID NO.93)
A930105 MKLTTLQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKA DVELCVYSTGKPSTCSGGNNGIAADIKTAKGYVASVKTQSGGITVKGDGTLANM EYILQATGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.94)
306543X4 MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKA DVELCVYSTGKPSSCSGGSNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANME YILQASGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.95)
N218 MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKA DVELCVYSTNEATKCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANM EYILQASGNAATGVTWTTTCKGTDTSLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.96)
N163 MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKA DVELCVYSTNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANM EYILQATGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.97)
N162 MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKA DVELCVYSTNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVASVKTQSGGITVKGNGTLANM EYILQATGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.98)
N120 MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKA DVELCVYSTGKPSTCSGGSNGIAADITTAKGYVASVKTQSGGITVKGNGTLANME YILQAKGNATAGVTWTTTCKGTDASLFPANFCRSVTK (SEQ ID NO.99)
Petição 870190129809, de 09/12/2019, pág. 29/336 / 112
N107 MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKA DVELCVYSTGKPSTCSGGSNGIAADITTAKGYVASVKTQSGGITVKGNGTLANME YILQAKGNATAGVTWTTTCKGTDASLFPANFCRSVTK (SEQ ID NO.100)
N92 MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKA DVELCVYSTNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANM EYILQATGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.101)
N91 MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKA DVELCVYSTGKPSTCSGGSNGIAADITTAKGYVASVKTQSGGITVKGNGTLANME YILQAKGNATAGVTWTTTCKGTDASLFPANFCRSVTK (SEQ ID NO.102)
D219PG MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKA DVELCVYSTNEATKCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANM EYILQASGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.103)
D211PG MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKA DVELCVYSTNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANM EYILQATGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.104)
D211PD MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKA DVELCVYSTNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANM EYILQATGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.105)
D204CD MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKA DVELCVYSTNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANM EYILXATGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.106)
D198PG MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKA DVELCVYSTNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANM EYILQATGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.107)
D198PD MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKA DVELCVYSTNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANM EYILQATGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.108)
D195PD MKLTTLQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKA DVELCVYSTGKPSTCSGGNNGIAADIKTAKGYVASVKTQSGGITVKGDGTLANM EYILQATGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.109)
D195CD MKLTTLQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKA DVELCVYSTGKPSTCSGGNNGIAADIKTAKGYVASVKTQSGGITVKGDGTLANM EYILQATGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.110)
D189PG MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKA DVELCVYSTNETTSCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVAGNGTLDGMS YTLTAEGDSAKGVTWKTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.111)
D189PD MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKA DVELCVYSTNETTSCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVAGNGTLDGMS YTLTAEGDSAKGVTWKTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.112)
D124PG MKLTTLQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKA DVELCVYSTGKPSTCSGGNNGIAADIKTAKGYVASVKTQSGGITVKGDGTLANM EYILQATGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.113)
D124PD MKLTTLQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKA DVELCVYSTGKPSTCSGGNNGIAADIKTAKGYVASVKTQSGGITVKGDGTLANM EYILQATGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.114)
D124CG MKLTTLQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKA DVELCVYSTGKPSTCSGGNNGIAADIKTAKGYVASVKTQSGGITVKGDGTLANM EYILQATGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.115)
D58PG MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKA DVELCVYSTNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVASVKTQSGGITVKGDGTLANM EYILQATGNAATGVTWTTTCKGTEASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.116)
BS433 MKLTTLQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKA DVELCVYSTGKPSTCSGGNNGIAADIKTAKGYVASVKTQSGGITVKGDGTLANM EYILQATGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.117)
BS432 MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKA DVELCVYSTGKPSTCSGGSNGIAADITTAKGYVASVKTQSGGITVKGNGTLANME YILQAKGNATAGVTWTTTCKGTDASLFPANFCRSVTK (SEQ ID NO.118)
BS430 MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKA DVELCVYSTNEATKCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANM EYILQASGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.119)
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1714 MKLTTLQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKA DVELCVYSTGKPSTCSGGSNGIAADITTAKGYVASVKTQSGGITVKGNGTLANME YILQATGNAATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ (SEQ ID NO.120)
1128 MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKASVSELLQASAPYKSD VELCVYSTGKPSTCSGGSNGIAADITTAKGYVASVKTQSGGITVKGNGTLANMEY ILQAKGNATAGVTWTTTCKGTDASLFPANFCRSVTK (SEQ ID NO.121)
[0061] PilA pode ser PilA de H. influenzae cepa NTHÍ3219C, NTHÍ3224A, NTHi12, NTHi44, NTHi67, 1054MEE, 1729MEE, 1728MEE, 1885MEE, 1060MEE, RdKW20, 214NP, 1236MEE, 1714MEE, 1128MEE, 86-028NP, R2846, R2866, 3655, PittAA, PittGG, PittII, R3021, 22.4-21, 3185A, 3221B, 3241A, 038144S1, 821246, 840645, 902550Z19, A840177, A920030, A950014, 901905U, A920029, A930105, 306543X4, N218, N163, N162, N120, N107, N92, N91, D219PG, D211PG, D211PD, D204CD, D198PG, D198PD, D195PD, D195CD, D189PG, D189PD, D124PG, D124PD, D124CG, D58PG, BS433, BS432, BS430, 1714 ou 1128. Uma sequência de aminoácidos para PilA de H. influenzae cepa D204CD é apresentada em SEQ ID NO. 106, em que X na posição #116 é tanto glutamina (Q) quanto leucina (L); de maneira ambígua como o aminoácido na posição #116 pode ser explicado por resolução técnica do segundo nucleotídeo que codifica o aminoácido #116, explicando a sequência de PilA para a cepa D204CD. PilA pode ser PilA da maneira apresentada em qualquer de SEQ ID NO. 58 - SEQ ID NO. 121.
[0062] PilA pode ser uma sequência com pelo menos 95 % de identidade, em relação ao tamanho completo, com qualquer de SEQ ID NO. 58 - SEQ ID NO. 121 (da maneira apresentada na tabela 2).
[0063] Fragmentos imunogênicos de PilA compreendem fragmentos imunogênicos de pelo menos 7, 10, 15, 20, 25, 30 ou 50 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO. 58 - SEQ ID NO. 121. Os fragmentos imunogênicos podem elicitar anticorpos que podem se ligar à sequência de tamanho completo, a partir da qual o fragmento é derivado.
[0064] Por exemplo, fragmentos imunogênicos de PilA compreendem fragmentos imunogênicos de pelo menos 7, 10, 15, 20, 25, 30 ou 50
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[0065] A identidade entre os polipeptídeos pode ser calculada por vários algoritmos. Por exemplo, o programa Needle, do pacote EMBOSS (software gratuito; EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite (2000). Trends in Genetics 16(6): 276—277) e o programa Gap do pacote GCG® (Accelrys Inc.) podem ser usados. Este programa Gap é uma implementação do algoritmo Needleman-Wunsch descrito em: Needleman, S. B. e Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453. A matriz de classificação BLOSUM62 foi usada, e as penalidades de abertura e extensão de intervalo foram respectivamente 8 e 2.
[0066] Observando o alinhamento obtido, os resíduos idênticos entre duas sequências comparadas podem ser observados. Um percentual de identidade pode ser computado (1) calculando o número de identidades dividido pelo tamanho do alinhamento, multiplicado por 100 (por exemplo, para a análise do programa Needle), (2) calculando o número de identidades dividido pelo tamanho da maior sequência, multiplicado por 100, (3) calculando o número de identidades dividido pelo tamanho da menor sequência, multiplicado por 100, ou (4) calculando o número de identidades dividido pelo número de resíduos alinhados, multiplicado por 100 (um resíduo é alinhado se estiver de frente um para o outro) (por exemplo, para a análise do programa Gap).
[0067] Da maneira aqui usada, “adjuvante” significa um composto ou substância que, quando administrado a um sujeito junto com uma vacina, imunoterapêutico, ou outra composição contendo antígeno ou imunógeno, aumenta ou melhora a resposta imune do sujeito ao antígeno ou imunógeno administrado (comparada à resposta imune que pode ser obtida na ausência de adjuvante). Isto é para ser distinguido a partir da “terapia com adjuvante”, definida pelo National Cancer Institute of the United States Institutes of
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Health, no contexto do tratamento de câncer como o tratamento adicional fornecido após o tratamento primário, para diminuir o risco do câncer ocorrer. [0068] As substituições conservativas são bem conhecidas e são em geral estabelecidas como as matrizes de classificação padrão nos programas de alinhamento de sequências. Estes programas incluem PAM250 (Dayhoft M.O. et al., (1978), “A model of evolutionary changes in proteins”, Em “Atlas of Protein sequence and structure” 5(3) M.O. Dayhoft (ed.), 345-352), National Biomedical Research Foundation, Washington, e Blosum 62 (Steven Henikoft e Jorja G. Henikoft (1992), “Amino acid substitution matrices from protein blocks”), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (Biochemistry): 1091510919. A invenção fornece adicionalmente proteínas de fusão da fórmula (I) contendo substituições conservativas de aminoácido. Por exemplo, as proteínas de fusão da fórmula (I) podem conter uma substituição conservativa de qualquer aminoácido de PE ou PilA de H. influenzae, da maneira descrita em qualquer das sequências aqui apresentadas (por exemplo, qualquer sequência de PE apresentada em SEQ ID NO. 4 - SEQ ID NO. 57 e/ou qualquer sequência de PilA apresentada em SEQ ID NO. 58 - SEQ ID NO. 121).
[0069] Da maneira aqui usada “peptídeo sinal” refere-se a um polipeptídeo pequeno (menos de 60 aminoácidos, por exemplo, 3 a 60 aminoácidos) presente nas proteínas precursoras (tipicamente na terminação N), e que é tipicamente ausente a partir da proteína madura. O peptídeo sinal (sp) é tipicamente rico em aminoácidos hidrofóbicos. O peptídeo sinal direciona o transporte e/ou secreção da proteína traduzida através da membrana. Os peptídeos sinais também podem ser denominados sinais de alvejamento, peptídeos trânsito, sinais de localização, ou sequências sinais. Por exemplo, a sequência sinal pode ser um peptídeo sinal cotranslacional ou pós-translacional.
[0070] Um peptídeo sinal heterólogo pode ser clivado a partir de um
Petição 870190129809, de 09/12/2019, pág. 33/336 / 112 construto de proteína de fusão por peptidases de peptídeo sinal, durante ou após o transporte ou secreção de proteína. Por exemplo, a peptidase de peptídeo sinal é peptidase de peptídeo sinal I. Um peptídeo sinal “heterólogo” é um que não está associado às proteína como elas existem na natureza.
[0071 ] Da maneira aqui usada, “tratamento” significa a prevenção de ocorrência de sintomas da condição ou doença em um sujeito, a prevenção de recorrência de sintomas da condição ou doença em um sujeito, o retardo de recorrência de sintomas da condição ou doença em um sujeito, a diminuição na gravidade ou frequência de sintomas da condição ou doença em um sujeito, retardando ou eliminando a progressão da condição e a eliminação parcial ou total de sintomas da doença ou condição em um sujeito.
[0072] Da maneira aqui usada, “opcionalmente” significa que o(s) evento(s) subsequentemente descrito(s) pode(m) ou não ocorrer, e inclui(m) tanto evento(s) que ocorre(m) quanto eventos que não ocorrem.
[0073] A patogênese da doença causada por NTHi começa com a colonização nasofaríngea. Os mecanismos para se aderir e permanecer por longo tempo no microambiente da nasofaringe são considerados ‘determinantes de virulência’ para NTHi.
[0074] A importância de NTHi que é capaz de se aderir às superfícies da mucosa epitelial de um hospedeiro humano é refletida na multiplicidade de adesinas expressas por NTHi(A otite média é uma das causas principais de morbidade em 80 % de todas as crianças menores de 3 anos de idade. (Expert Rev. Vaccines 5:517-534 (2006)). Mais de 90 % das crianças desenvolvem otite média antes dos 7 anos (Current Opinion in Investigational Drugs 4:953958 (2003)). Em 2000, ocorreram 16 milhões de visitas aos consultórios médicos em relação à otite média nos Estados Unidos, e aproximadamente 13 milhões de prescrições antibacterianas foram realizadas. (Pediatrics 113:14511465 (2004)). Nos países europeus, as taxas relatadas de otite média aguda variam entre 0,125 a 1,24 por criança ao ano. (Expert Review of Vaccines
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8:1479-1500 (2009)). A otite média é uma infecção cara e a razão mais comum das crianças receberem antibióticos. (Current Infectious Disease Reports 11:177-182 (2009)). As bactérias são responsáveis por aproximadamente 70 % dos casos de otite média aguda, com Streptococcus pneumoniae, não tipável Haemophilus influenzae, e Moraxella catarrhalis predominando como os agentes etiológicos (Expert Review of Vaccines 5:517-534 (2006)). Um subgrupo de crianças experimenta otite média recorrente e crônica, e estas crianças propensas à otite apresentam efusões do ouvido médio prolongadas que estão associadas com a perda de audição e retardo no desenvolvimento da fala e da linguagem. (Current Infectious Disease Reports 11:177-182 (2009)).
[0075] Após a introdução da vacina heptavalente pneumocócica em muitos países, alguns estudos demonstraram um aumento significativo na proporção de otite média aguda causada por H. influenzae, com H. influenzae se tornando o patógeno predominante. (Pediatric Infectious Disease Journal 23:824-828; Pediatric Infectious Disease Journal 23:829-833 (2004)).
[0076] Uma vez que a otite média é uma doença multifatorial, a possibilidade de prevenir a otite média usando uma estratégia de vacinação foi questionada. (Current Infectious Disease Reports 11:177-182 (2009)). Entretanto, os resultados de um estudo sugerem que é possível que um antígeno induza pelo menos proteção parcial contra H. influenzae não tipável. (Lancet 367:740-748 (2006)). Uma abordagem para desenvolver os antígenos de vacina é usar regiões antigenicamente conservadas de moléculas de superfície geneticamente heterogêneas, mas abundantemente expressas. Outra abordagem é identificar proteínas de superfície que demonstram conservação de sequência ou epítopo funcional. Uma terceira consideração para um antígeno de vacina pode ser selecionar um antígeno que é expresso durante a infecção e colonização em um hospedeiro humano. Murphy (Curr. Infect. Disease Reports 11:177-182 (2009) declara que, apesar da existência de
Petição 870190129809, de 09/12/2019, pág. 35/336 / 112 vários antígenos candidatos de H. influenzae não tipável potenciais, não se pode prever de maneira exata se o antígeno candidato será eficiente. (Current Infectious Disease Reports 11:177-182 (2009)). Algumas das proteínas descritas como antígenos potenciais de vacina são: proteína adesina de Haemophilus (Hap), proteínas de alto peso molecular (HMW) 1 e 2, adesina de H. influnzae (Hia), proteína D15, proteína do choque térmico HtrA, proteína de superfície P2, lipoproteína D, peptídeos derivados de fimbrina P5, proteína P4 da membrana externa, proteína (OMP) 26 da membrana externa (OMP26), proteína P6, proteína E, pili tipo IV, lipo-oligossacarídeo e fosforil colina. (Current Infectious Disease Reports 11:177-182 (2009); Expert Review of Vaccines 5:517-534 (2006)).
[0077] O modelo chinchila é um modelo de animal robusto e validado de otite média e sua prevenção (Expert Review of Vaccines 8:1063-1082 (2009)). Embora o modelo chinchila possa mimetizar o curso natural da infecção humana, outros sugerem que os resultados no modelo chinchila podem variar de um laboratório para outro. (Current Opinion in Investigational Drugs 4:953-958 (2003)).
[0078] Vários outros roedores também foram usados para a indução de otite média e são resumidos em Vaccine 26:1501-1524 (2008). O modelo de animal murino é frequentemente estudado na pesquisa de otite média.
[0079] A presença de anticorpo bactericida está associada com a proteção da otite média em virtude de H. influenzae não tipável. (Current Opinion in Infectious Disease 16:129-134 (2003)). Entretanto, uma resposta imune não precisa ser bactericida para ser eficiente contra NTHi. Os anticorpos que reagem apenas com as adesinas de superfície NTHi podem reduzir ou eliminar a otite média em chinchila. (Current Opinion in Investigational Drugs 4:953-958 (2003)).
[0080] A doença pulmonar obstrutiva crônica é uma doença inflamatória crônica dos pulmões e uma das principais causas de morbidade e
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[0081] O curso de COPD é caracterizado pela piora progressiva da limitação do fluxo de ar e um declínio na função pulmonar. COPD pode ser complicada por exacerbações (AE) frequentes e recorrentes, as quais estão associadas a grandes despesas com cuidado com a saúde e elevada morbididade. (Proceedings of the American Thoracic Society 4:554-564 (2007)). Um estudo sugere que aproximadamente 50 % das exacerbações agudas dos sintomas em COPD são causadas por Haemophilus influenzae não tipável, Moraxella catarrhalis, Streptococcus pneumoniae e Pseudomonas aeruginosa. (Drugs and Aging 26:985-999 (2009)). H. influenzae é encontrado em 20-30 % das exacerbações de COPD; Streptococcus pneumoniae em 10-15 % das exacerbações de COPD; e Moraxella catarrhalis em 10-15 % das exacerbações de COPD. (New England Journal of Medicine 359:2355-2365 (2008)). Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae e Moraxella catarrhalis mostraram ser os principais patógenos nas exacerbações agudas de bronquite em Hong Kong, Coréia do Sul e Filipinas, enquanto Klebsiella spp., Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter spp. constituem uma grande proporção de patógenos em outros países/regiões da Ásia, incluindo Indonésia, Tailândia, Malásia e Taiwan (Respirology, (2011) 16, 532-539; doi:10.1111/j.1440.1843.2011.01943.x). Em Bangladesh, 20 % dos pacientes com COPD exibiram cultura positiva de escarro para Pseudomonas, Klebsiella, Streptococcus pneumoniae e Haemophilus influenzae, enquanto 65 % dos pacientes com AECOPD exibiram culturas positivas para Pseudomonas, Klebsiella, Acinetobacter, Enterobacter,
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Moraxella catarrhalis e combinações destes. (Mymensingh Medical Journal 19:576-585 (2010)). Entretanto, sugere-se que as duas medições mais importantes para prevenir a exacerbação de COPD são as imunizações ativas e manutenção crônica da farmacoterapia. (Proceedings of the American Thoracic Society 4:554-564 (2007)).
[0082] Existe uma necessidade de vacinas eficientes contra NTHi. Usando antígenos que podem agir em diferentes etapas na patogênese, podese melhorar a eficiência de uma vacina. Os inventores observaram que PilA e PE podem estar presentes de maneira benéfica nas composições imunogênicas da invenção como proteínas de fusão.
[0083] A presente invenção diz respeito a proteínas de fusão da fórmula (I).
(X) m - (R1)n - A - (Y) o - B - (Z)p (fórmula I) em que:
X é um peptídeo sinal ou MHHHHHH (SEQ ID NO. 2);
m é 0 ou 1;
R1 é um aminoácido;
n é 0, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6;
A é proteína E de Haemophilus influenzae ou um fragmento imunogênico desta, ou PilA de Haemophilus influenzae ou um fragmento imunogênico desta;
Y é selecionado do grupo que consiste em GG, SG, SS e (G)h em que h é 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10;
o é 0 ou 1;
B é PilA de Haemophilus influenzae ou um fragmento imunogênico desta, ou proteína E de Haemophilus influenzae ou um fragmento imunogênico desta;
Z é GGHHHHHH (SEQ ID NO: 3); e p é 0 ou 1.
Petição 870190129809, de 09/12/2019, pág. 38/336 / 112 [0084] Em uma modalidade, as proteínas de fusão da fórmula (I) são definidas, em que X é selecionado do grupo que consiste na sequência sinal de CcmH (citocromo c proteína de membrana H), DsbA (isomerase dissulfeto I de proteína periplasmática), DsbB (dissulfeto ligado à proteína de membrana B), FlgI (proteína do anel de peptideoglicano flagelar), FocC (proteína chaperona F1c), MalE (subunidade E transportadora da maltose), NadA (subunidade A de quinolinato sintase), NikA (componente A transportador de níquel ABC), NspA (proteína A da superfície de Neisseria), Omp26 (proteína de membrana externa 26), OmpA (proteína de membrana externa A), OspA (proteína A da superfície externa), pelB (pectato liase B), PhoA (fosfatase alcalina bacteriana), PhtD (proteína D da tríade de histidina pneumocócica), PhtE (proteína E da tríade de histidina pneumocócica), SfmC (chaperona pilina periplasmática), Sip1 (proteína imunogênica de superfície), TolB (componente B do complexo do envelope celular Tol-Pal), TorA (subunidade A do sistema trimetilamina N-óxido redutase), TorT (proteína T periplasmática do sistema trimetilamina N-óxido redutase) e Yral (pilina chaperona periplasmática provável); ou qualquer subgrupo deste. Em uma modalidade, X é um peptídeo sinal cotranslacional ou um peptídeo sinal póstranslacional. Em uma modalidade, X é a sequência sinal de FlgI (flgl sp). Em outra modalidade particular, X é a sequência sinal de pelB (pelB sp). Em outra modalidade, X é um peptídeo sinal pós-translacional. Em outra modalidade, X é selecionado do grupo que consiste na sequência sinal de FlgI, NadA e pelB.
[0085] Em uma modalidade, as proteínas de fusão da fórmula (I) são definidas, em que m é 1. Em outra modalidade, m é 0.
[0086] Em uma modalidade particular, R1 e n são definidos em que (R1)n é 1 a 6 aminoácidos enriquecidos em aminoácidos pequenos, em geral hidrofílicos. Os aminoácidos hidrofílicos incluem ácido glutâmico (E), ácido aspártico (D) e asparagina (N).
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30/ 112 [0087] Em uma modalidade, as proteínas de fusão da fórmula (I) são definidas, em que n é selecionado do grupo que consiste em 0, 1, 2 e 6. Em uma modalidade particular, R1 e n são definidos, em que (R1)n é selecionado do grupo que consiste em D, E, ATNDDD (SEQ ID NO. 178) e MD, ou qualquer subgrupo destes.
[0088] Em uma modalidade particular, n é selecionado do grupo que consiste em 1, 2 e 6. Em uma modalidade particular, n é 0.
[0089] Em uma modalidade, as proteínas de fusão da fórmula (I) são definidas, em que A é proteína E de H. influenzae. Em outra modalidade, as proteínas de fusão da fórmula (I) são definidas, em que A é proteína E codificada por uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 13, SEQ ID NO. 14, SEQ ID NO. 15, SEQ ID NO. 16, SEQ ID NO. 17, SEQ ID NO. 18, SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 20, SEQ ID NO. 21, SEQ ID NO. 22, SEQ ID NO. 23, SEQ ID NO. 24, SEQ ID NO. 25, SEQ ID NO. 26, SEQ ID NO. 27, SEQ ID NO. 28, SEQ ID NO. 29, SEQ ID NO. 30, SEQ ID NO. 31, SEQ ID NO. 32, SEQ ID NO. 33, SEQ ID NO. 34, SEQ ID NO. 35, SEQ ID NO. 36, SEQ ID NO. 37, SEQ ID NO. 38, SEQ ID NO.39, SEQ ID NO. 40, SEQ ID NO. 41, SEQ ID NO. 42, SEQ ID NO. 43 SEQ ID NO. 44, SEQ ID NO. 45, SEQ ID NO. 46, SEQ ID NO. 47, SEQ ID NO. 48, SEQ ID NO. 49, SEQ ID NO. 50, SEQ ID NO. 51, SEQ ID NO. 52, SEQ ID NO. 53, SEQ ID NO. 54, SEQ ID NO. 55, SEQ ID NO. 56 e SEQ ID NO. 57; ou qualquer subgrupo de SEQ ID NO. 5 à SEQ ID NO. 57. Em outra modalidade, as proteínas de fusão da fórmula (I) são definidas, em que A é proteína E, em que proteína E é aproximadamente 75 % a 100 % idêntica à sequência de proteína E de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 4. Em outra modalidade, A é proteína E, em que proteína E é aproximadamente 90 % a 100 % idêntica à sequência de proteína E de aminoácidos apresentada em
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SEQ ID NO: 4. Em outra modalidade, A é proteína E, em que proteína E é pelo menos 95 % idêntica à sequência de proteína E de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 4. Em modalidade adicional, A é proteína E, em que proteína E é pelo menos 95 % idêntica a proteína E apresentada em qualquer de SEQ ID NO. 4 - SEQ ID NO. 57. Em uma modalidade particular, A é proteína E com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO. 4.
[0090] Em outra modalidade, as proteínas de fusão da fórmula (I) são definidas, em que A é um fragmento imunogênico de proteína E de H. influenzae. Em outra modalidade, A é um fragmento imunogênico de proteína E, em que proteína E apresenta uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 13, SEQ ID NO. 14, SEQ ID NO. 15, SEQ ID NO. 16, SEQ ID NO. 17, SEQ ID NO. 18, SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 20, SEQ ID NO. 21, SEQ ID NO. 22, SEQ ID NO. 23, SEQ ID NO. 24, SEQ ID NO. 25, SEQ ID NO. 26, SEQ ID NO. 27, SEQ ID NO. 28, SEQ ID NO. 29, SEQ ID NO. 30, SEQ ID NO. 31, SEQ ID NO. 32, SEQ ID NO. 33, SEQ ID NO. 34, SEQ ID NO. 35, SEQ ID NO. 36, SEQ ID NO. 37, SEQ ID NO. 38, SEQ ID NO.39, SEQ ID NO. 40, SEQ ID NO. 41, SEQ ID NO. 42, SEQ ID NO. 43 SEQ ID NO. 44, SEQ ID NO. 45, SEQ ID NO. 46, SEQ ID NO. 47, SEQ ID NO. 48, SEQ ID NO. 49, SEQ ID NO. 50, SEQ ID NO. 51, SEQ ID NO. 52, SEQ ID NO. 53, SEQ ID NO. 54, SEQ ID NO. 55, SEQ ID NO. 56 e SEQ ID NO. 57; ou qualquer subgrupo de SEQ ID NO. 4 à SEQ ID NO. 57. Em outra modalidade, A é um fragmento imunogênico de proteína E, em que proteína E é aproximadamente 75 % a 100 % idêntica à sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 4. Em outra modalidade, A é um fragmento imunogênico de proteína E, em que proteína E é aproximadamente 90 % a 100 % idêntica a SEQ ID NO. 4. Em uma modalidade adicional, A é
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32/ 112 um fragmento imunogênico de proteína E, em que proteína E é pelo menos 95 % idêntica a any de SEQ ID NO. 4 - SEQ ID NO. 57. Mais especificamente, em uma modalidade, A é um fragmento imunogênico de proteína E, em que proteína E é 93 % a 100 % idêntica a SEQ ID NO. 124. Em uma modalidade particular, A é um fragmento imunogênico de proteína E em que proteína E é SEQ ID NO. 4.
[0091] Em outra modalidade, A é um fragmento imunogênico de proteína E de H. influenzae selecionada do grupo que consiste em aminoácidos 17-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 122), aminoácidos 18160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 123), aminoácidos 19-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 124), aminoácidos 20-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 125) e aminoácidos 22-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 126). Em outra modalidade, A é um fragmento imunogênico de proteína E de H. influenzae selecionado do grupo que consiste em aminoácidos 17-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 122), aminoácidos 18-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 123), aminoácidos 19-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 124), aminoácidos 20-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 125), aminoácidos 22160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 126), aminoácidos 23-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 179) e aminoácidos 24-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 180). Em uma modalidade adicional, A é um fragmento imunogênico de proteína E de H. influenzae selecionado do grupo que consiste em aminoácidos 17-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 122), aminoácidos 18160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 123), aminoácidos 20-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 125), aminoácidos 22-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 126), aminoácidos 23-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 179) e aminoácidos 24-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 180). Mais especificamente, em uma modalidade, A é SEQ ID NO. 124, aminoácidos 19160 de SEQ ID NO. 4. Em uma modalidade adicional, A é SEQ ID NO.125, aminoácidos 20-160 de SEQ ID NO. 5. Em outra modalidade, A é fragmento
Petição 870190129809, de 09/12/2019, pág. 42/336 / 112 imunogênico de proteína E de H. influenzae selecionado do grupo que consiste em aminoácidos 23-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 179) e aminoácidos 24-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 180).
Proteína E - SEQ ID NO. 4
MKKIILTLSL GLLTACSAQI QKAEQNDVKL
APPTDVRSGY
VVNLDKGLYV
FYDEFWGQGL
IRLVKNVNYY
YPEPKRYARS
RAAPKKQKKH
IDSESIWVDN
VRQYKILNCA
TLSLTPDTTL
QEPQIVHFDA
NYHLTQVRTD
YNAAQIICAN
YGEAFSVDKK
Aminoácidos 17-160 de proteína E de SEQ ID NO. 4 - SEQ ID NO. 122
SAQI QKAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK
Aminoácidos 18-160 de proteína E de SEQ ID NO. 4 - SEQ ID NO. 123
AQI QKAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK
Aminoácidos 19-160 de proteína E de SEQ ID NO. 4 - SEQ ID NO. 124
QI QKAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH
TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK
Aminoácidos 20-160 de proteína E de SEQ ID NO. 4 - SEQ ID NO. 125
I QKAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY
IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK
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Aminoácidos 22-160 de proteína E de SEQ ID NO. 4 - SEQ ID NO. 126
KAEQNDVKL APPTDVRSGY
IRLVKNVNYYIDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK Aminoácidos 23-160 de proteína E de SEQ ID NO. 4 - SEQ ID NO. 179
AEQNDVKL APPTDVRSGY
IRLVKNVNYYIDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK Aminoácidos 24-160 proteína E de SEQ ID NO. 4 - SEQ ID NO. 180
EQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYYIDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK [0092] Em outra modalidade, as proteínas de fusão da fórmula (I) são definidas, em que A é PilA de H. influenzae. Em outra modalidade, as proteínas de fusão da fórmula (I) são definidas, em que A é PilA de H. influenzae com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO. 58, SEQ ID NO. 59, SEQ ID NO. 60, SEQ ID NO. 61, SEQ ID NO. 62, SEQ ID NO. 63, SEQ ID NO. 64, SEQ ID NO. 65, SEQ ID NO. 66, SEQ ID NO. 67, SEQ ID NO. 68, SEQ ID NO. 69, SEQ ID NO. 70, SEQ ID NO. 71, SEQ ID NO.72, SEQ ID NO. 73, SEQ ID NO. 74, SEQ ID NO. 75, SEQ ID NO. 76, SEQ ID NO. 77, SEQ ID NO. 78, SEQ ID NO. 79, SEQ ID NO. 80, SEQ ID NO. 81, SEQ ID NO. 82, SEQ ID NO. 83, SEQ ID NO. 84, SEQ ID NO. 85, SEQ ID NO. 86, SEQ ID NO. 87, SEQ ID NO. 88, SEQ ID NO. 89, SEQ ID NO. 90, SEQ ID NO. 91, SEQ ID NO. 92, SEQ ID NO. 93, SEQ ID NO. 94, SEQ ID NO. 95, SEQ ID NO. 96, SEQ ID NO. 97, SEQ ID NO. 98, SEQ ID NO. 99, SEQ ID NO. 100, SEQ ID NO. 101,
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SEQ ID NO. 102, SEQ ID NO. 103, SEQ ID NO. 104, SEQ ID NO.105,
SEQ ID NO. 106, SEQ ID NO. 107, SEQ ID NO. 108, SEQ ID NO.109,
SEQ ID NO. 110, SEQ ID NO. 111, SEQ ID NO. 112, SEQ ID NO.113,
SEQ ID NO. 114, SEQ ID NO. 115, SEQ ID NO. 116, SEQ ID NO.117,
SEQ ID NO. 118, SEQ ID NO. 119, SEQ ID NO. 120 e SEQ ID NO. 121; ou qualquer subgrupo de SEQ ID NO. 58 à SEQ ID NO. 121. Em outra modalidade, A é PilA em que PilA é aproximadamente 80 % a 100 % idêntica a SEQ ID NO. 58. Em outra modalidade, A é PilA em que PilA é pelo menos 95 % idêntica a qualquer de SEQ ID NO. 58 - SEQ ID NO. 121. Em uma modalidade particular, A é PilA de SEQ ID NO. 58.
[0093] Em outra modalidade, as proteínas de fusão da fórmula (I) são definidas, em que A um fragmento imunogênico de PilA de H. influenzae. Em outra modalidade, A é um fragmento imunogênico de PilA em que PilA é aproximadamente 80 % a 100 % idêntica a SEQ ID NO. 58. Por exemplo, A é um fragmento imunogênico de PilA em que PilA apresenta uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO. 58, SEQ ID NO. 59, SEQ ID NO. 60, SEQ ID NO. 61, SEQ ID NO. 62, SEQ ID NO. 63, SEQ ID NO. 64, SEQ ID NO. 65, SEQ ID NO. 66, SEQ ID NO. 67, SEQ ID NO. 68, SEQ ID NO. 69, SEQ ID NO. 70, SEQ ID NO. 71, SEQ ID NO.72, SEQ ID NO. 73, SEQ ID NO. 74, SEQ ID NO. 75, SEQ ID NO. 76, SEQ ID NO. 77, SEQ ID NO. 78, SEQ ID NO. 79, SEQ ID NO. 80, SEQ ID NO. 81, SEQ ID NO. 82, SEQ ID NO. 83, SEQ ID NO. 84, SEQ ID NO. 85, SEQ ID NO. 86, SEQ ID NO. 87, SEQ ID NO. 88, SEQ ID NO. 89, SEQ ID NO. 90, SEQ ID NO. 91, SEQ ID NO. 92, SEQ ID NO. 93, SEQ ID NO. 94, SEQ ID NO. 95, SEQ ID NO. 96, SEQ ID NO. 97, SEQ ID NO. 98, SEQ ID NO. 99, SEQ ID NO. 100, SEQ ID NO. 101, SEQ ID NO. 102, SEQ ID NO. 103,
SEQ ID NO. 104, SEQ ID NO. 105, SEQ ID NO. 106, SEQ ID NO.107,
SEQ ID NO. 108, SEQ ID NO. 109, SEQ ID NO. 110, SEQ ID NO.111,
SEQ ID NO. 112, SEQ ID NO. 113, SEQ ID NO. 114, SEQ ID NO.115,
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SEQ ID NO. 116, SEQ ID NO. 117, SEQ ID NO. 118, SEQ ID NO. 119, SEQ ID NO. 120 e SEQ ID NO. 121; ou qualquer subgrupo SEQ ID NO. 58 à SEQ ID NO. 121. Em uma modalidade adicional, A é um fragmento imunogênico de PilA em que PilA é pelo menos 95 % idêntica a qualquer de SEQ ID NO. 58 - SEQ ID NO. 121. Em uma modalidade particular, A é um fragmento imunogênico de PilA de H. influenzae cepa 86-028NP em que PilA é SEQ ID NO. 58.
PilA de H. influenzae cepa 86-028NP - SEQ ID NO. 58
MKLTTQQTLK KGFTLIELMI VIAIIAILAT IAIPSYQNYT KKAAVSELLQ ASAPYKADVE LCVYSTNETT NCTGGKNGIA ADITTAKGYV KSVTTSNGAI TVKGDGTLAN MEYILQATGN AATGVTWTTT CKGTDASLFP ANFCGSVTQ [0094] Em outra modalidade, A é um fragmento imunogênico de PilA aproximadamente 75 % a 100 % idêntica a SEQ ID NO. 127. Mais especificamente, em uma modalidade, A é SEQ ID NO. 127, um fragmento que consiste em aminoácidos 40-149 de SEQ ID NO. 58.
Aminoácidos 40-149 de PilA de H. influenzae cepa 86-028NP - SEQ ID NO. 127.
T KKAAVSELLQ ASAPYKADVE LCVYSTNETT NCTGGKNGIA ADITTAKGYV KSVTTSNGAI TVKGDGTLAN MEYILQATGN AATGVTWTTT CKGTDASLFP ANFCGSVTQ [0095] Em outra modalidade, A é um fragmento imunogênico de PilA que consiste em aminoácidos 40-149 de qualquer de SEQ ID NO. 58 - SEQ ID NO. 121. Em uma modalidade adicional, A é um fragmento imunogênico pelo menos 95 % idêntico aos aminoácidos 40-149 de qualquer de SEQ ID NO. 58 - SEQ ID NO. 121.
[0096] Em uma modalidade, as proteínas de fusão da fórmula (I) são definidas, em que Y é selecionado do grupo que consiste em GG, SG e SS. Em outra modalidade, as proteínas de fusão da fórmula (I) são definidas, em
Petição 870190129809, de 09/12/2019, pág. 46/336 / 112 que Y é GG ou SG. Em uma modalidade particular, Y é GG.
[0097] Em uma modalidade, as proteínas de fusão da fórmula (I) são definidas, em que o é 1. Em outra modalidade, o é 0.
[0098] Em uma modalidade, as proteínas de fusão da fórmula (I) são definidas, em que B é PilA de H. influenzae ou um fragmento imunogênico de PilA de H. influenzae, quando A é proteína E de H. influenzae ou um fragmento imunogênico de proteína E de H. influenzae. Por exemplo, B é PilA de H. influenzae cepa 86-028NP. Em outra modalidade, B é PilA de H. influenzae com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO. 58, SEQ ID NO. 59, SEQ ID NO. 60, SEQ ID NO. 61, SEQ ID NO. 62, SEQ ID NO. 63, SEQ ID NO. 64, SEQ ID NO. 65, SEQ ID NO. 66, SEQ ID NO. 67, SEQ ID NO. 68, SEQ ID NO. 69, SEQ ID NO. 70, SEQ ID NO. 71, SEQ ID NO.72, SEQ ID NO. 73, SEQ ID NO. 74, SEQ ID NO. 75, SEQ ID NO. 76, SEQ ID NO. 77, SEQ ID NO. 78, SEQ ID NO. 79, SEQ ID NO. 80, SEQ ID NO. 81, SEQ ID NO. 82, SEQ ID NO. 83, SEQ ID NO. 84, SEQ ID NO. 85, SEQ ID NO. 86, SEQ ID NO. 87, SEQ ID NO. 88, SEQ ID NO. 89, SEQ ID NO. 90, SEQ ID NO. 91, SEQ ID NO. 92, SEQ ID NO. 93, SEQ ID NO. 94, SEQ ID NO. 95, SEQ ID NO. 96, SEQ ID NO. 97, SEQ ID NO. 98, SEQ ID NO. 99, SEQ ID NO. 100, SEQ ID NO. 101, SEQ ID NO. 102, SEQ ID NO. 103, SEQ ID NO. 104, SEQ ID NO. 105,
SEQ ID NO. 106, SEQ ID NO. 107, SEQ ID NO. 108, SEQ ID NO.109,
SEQ ID NO. 110, SEQ ID NO. 111, SEQ ID NO. 112, SEQ ID NO.113,
SEQ ID NO. 114, SEQ ID NO. 115, SEQ ID NO. 116, SEQ ID NO.117,
SEQ ID NO. 118, SEQ ID NO. 119, SEQ ID NO. 120 e SEQ ID NO. 121; ou qualquer subgrupo de SEQ ID NO. 58 à SEQ ID NO. 121. Em outra modalidade, B é PilA em que PilA é aproximadamente 80 % a 100 % idêntica a SEQ ID NO. 58. Em outra modalidade, B é PilA em que PilA é pelo menos 95 % idêntica a qualquer de SEQ ID NO. 58 - SEQ ID NO. 121. Em uma modalidade particular, B é PilA de SEQ ID NO. 58.
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38/ 112 [0099] Em outra modalidade, B é PilA em que PilA é pelo menos 95 % idêntica a qualquer de SEQ ID NO. 58 - SEQ ID NO. 121 e A é PE em que PE é pelo menos 95 % idêntica a qualquer de SEQ ID NO. 4 - SEQ ID NO.
57.
[00100] Em outra modalidade, as proteínas de fusão da fórmula (I) são definidas, em que B é um fragmento imunogênico de PilA de H. influenzae quando A é um fragmento imunogênico de proteína E de H. influenzae. Por exemplo, B é um fragmento imunogênico do PilA de H. influenzae cepa 86028NP. Em outra modalidade, B é um fragmento imunogênico de PilA em que PilA é aproximadamente 80 % a 100 % idêntica a SEQ ID NO: 58. Em outra modalidade, B é um fragmento imunogênico de PilA em que PilA apresenta um aminoácido selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO.
58, SEQ ID NO. 59, SEQ ID NO. 60, SEQ ID NO. 61, SEQ ID NO. 62, SEQ ID NO. 63, SEQ ID NO. 64, SEQ ID NO. 65, SEQ ID NO. 66, SEQ ID NO. 67, SEQ ID NO. 68, SEQ ID NO. 69, SEQ ID NO. 70, SEQ ID NO. 71, SEQ ID NO.72, SEQ ID NO. 73, SEQ ID NO. 74, SEQ ID NO. 75, SEQ ID NO. 76, SEQ ID NO. 77, SEQ ID NO. 78, SEQ ID NO. 79, SEQ ID NO. 80, SEQ ID NO. 81, SEQ ID NO. 82, SEQ ID NO. 83, SEQ ID NO. 84, SEQ ID NO. 85, SEQ ID NO. 86, SEQ ID NO. 87, SEQ ID NO. 88, SEQ ID NO. 89, SEQ ID NO. 90, SEQ ID NO. 91, SEQ ID NO. 92, SEQ ID NO. 93, SEQ ID NO. 94, SEQ ID NO. 95, SEQ ID NO. 96, SEQ ID NO. 97, SEQ ID NO. 98, SEQ ID NO. 99, SEQ ID NO. 100, SEQ ID NO. 101, SEQ ID NO. 102, SEQ ID NO. 103, SEQ ID NO. 104, SEQ ID NO. 105, SEQ ID NO. 106, SEQ ID NO. 107, SEQ ID NO. 108, SEQ ID NO. 109, SEQ ID NO. 110, SEQ ID NO. 111, SEQ ID NO. 112, SEQ ID NO. 113, SEQ ID NO. 114, SEQ ID NO. 115, SEQ ID NO. 116, SEQ ID NO. 117, SEQ ID NO. 118, SEQ ID NO. 119, SEQ ID NO. 120 e SEQ ID NO. 121; ou qualquer subgrupo de SEQ ID NO. 58 à SEQ ID NO. 121. Em outra modalidade, B é um fragmento imunogênico de PilA em que PilA é pelo menos 95 % idêntica a qualquer de SEQ ID NO.
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- SEQ ID NO. 121. Em uma modalidade particular, B é um fragmento imunogênico de PilA de H. influenzae em que PilA apresenta a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO. 58. Em outra modalidade, B é um fragmento imunogênico de PilA que consiste em aminoácidos 40-149 de qualquer de SEQ ID NO. 58 - SEQ ID NO. 121. Mais especificamente, em uma modalidade, B é o fragmento de PilA da maneira apresentada em SEQ ID NO. 127. Em uma modalidade adicional, B é um fragmento imunogênico pelo menos 95 % idêntico aos aminoácidos 40-149 de qualquer de SEQ ID NO. 58 - SEQ ID NO. 121.
[00101] Em uma modalidade particular, B é o fragmento de PilA da maneira apresentada em SEQ ID NO. 127 e A é um fragmento imunogênico de proteína E selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO. 122, SEQ ID NO. 124, SEQ ID NO. 125 e SEQ ID NO. 126. Mais particularmente, B é o fragmento de PilA da maneira apresentada em SEQ ID NO. 127 e A é o fragmento de proteína E da maneira apresentada em SEQ ID NO. 124, aminoácidos 19-160 de proteína E de SEQ ID NO. 4. Em outra modalidade, B é o fragmento de PilA da maneira apresentada em SEQ ID NO. 127 e A é o fragmento de proteína E da maneira apresentada em SEQ ID NO. 125.
[00102] Em outra modalidade, B é um fragmento imunogênico de PilA em que PilA é pelo menos 95 % idêntica a qualquer de SEQ ID NO. 58 SEQ ID NO. 121 e A é um fragmento imunogênico de PE em que PE é pelo menos 95 % idêntica a qualquer de SEQ ID NO. 4 - SEQ ID NO. 57.
[00103] Em outra modalidade, as proteínas de fusão da fórmula (I) são definidas, em que B é proteína E de H. influenzae quando A é PilA de H. influenzae. Por exemplo, B é proteína E com uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 13, SEQ ID NO. 14, SEQ ID NO. 15, SEQ ID NO. 16, SEQ ID NO. 17, SEQ ID NO. 18, SEQ ID NO. 19, SEQ
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ID NO. 20, SEQ ID NO. 21, SEQ ID NO. 22, SEQ ID NO. 23, SEQ ID NO. 24, SEQ ID NO. 25, SEQ ID NO. 26, SEQ ID NO. 27, SEQ ID NO. 28, SEQ ID NO. 29, SEQ ID NO. 30, SEQ ID NO. 31, SEQ ID NO. 32, SEQ ID NO. 33, SEQ ID NO. 34, SEQ ID NO. 35, SEQ ID NO. 36, SEQ ID NO. 37, SEQ ID NO. 38, SEQ ID NO.39, SEQ ID NO. 40, SEQ ID NO. 41, SEQ ID NO. 42, SEQ ID NO. 43 SEQ ID NO. 44, SEQ ID NO. 45, SEQ ID NO. 46, SEQ ID NO. 47, SEQ ID NO. 48, SEQ ID NO. 49, SEQ ID NO. 50, SEQ ID NO. 51, SEQ ID NO. 52, SEQ ID NO. 53, SEQ ID NO. 54, SEQ ID NO. 55, SEQ ID NO. 56 e SEQ ID NO. 57; ou qualquer subgrupo de SEQ ID NO. 4 à SEQ ID NO. 57. Em outra modalidade, as proteínas de fusão da fórmula (I) são definidas, em que B é proteína E, em que proteína E é aproximadamente 75 % a 100 % idêntica à sequência de proteína E de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 4. Em outra modalidade, B é proteína E, em que proteína E é aproximadamente 90 % a 100 % idêntica à sequência de proteína E de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 4. Por exemplo, B é proteína E, em que proteína E é pelo menos 95 % idêntica a proteína E da maneira apresentada em SEQ ID NO. 4. Em outra modalidade, B é proteína E em que proteína E é pelo menos 95 % idêntica a qualquer de SEQ ID NO. 4 - SEQ ID NO. 57. Em uma modalidade particular, B é proteína E com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO. 4.
[00104] Em outra modalidade, as proteínas de fusão da fórmula (I) são definidas, em que B é um fragmento imunogênico de proteína E de H. influenzae quando A é um fragmento imunogênico de PilA de H. influenzae. Por exemplo, B é um fragmento imunogênico de proteína E, em que proteína E apresenta uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 13, SEQ ID NO. 14, SEQ ID NO. 15, SEQ ID NO. 16, SEQ ID NO. 17, SEQ ID NO. 18, SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 20, SEQ ID NO. 21,
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SEQ ID NO. 22, SEQ ID NO. 23, SEQ ID NO. 24, SEQ ID NO. 25, SEQ ID NO. 26, SEQ ID NO. 27, SEQ ID NO. 28, SEQ ID NO. 29, SEQ ID NO. 30, SEQ ID NO. 31, SEQ ID NO. 32, SEQ ID NO. 33, SEQ ID NO. 34, SEQ ID NO. 35, SEQ ID NO. 36, SEQ ID NO. 37, SEQ ID NO. 38, SEQ ID NO.39, SEQ ID NO. 40, SEQ ID NO. 41, SEQ ID NO. 42, SEQ ID NO. 43, SEQ ID NO. 44, SEQ ID NO. 45, SEQ ID NO. 46, SEQ ID NO. 47, SEQ ID NO. 48, SEQ ID NO. 49, SEQ ID NO. 50, SEQ ID NO. 51, SEQ ID NO. 52, SEQ ID NO. 53, SEQ ID NO. 54, SEQ ID NO. 55, SEQ ID NO. 56 e SEQ ID NO. 57; ou qualquer subgrupo de SEQ ID NO. 4 à SEQ ID NO. 57. Em outra modalidade, as proteínas de fusão da fórmula (I) são definidas, em que B é um fragmento imunogênico de proteína E, em que proteína E é aproximadamente 75 % a 100 % idêntica à sequência de proteína E de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO. 4. Em outra modalidade, B é um fragmento imunogênico de proteína E em que proteína E é aproximadamente 90 % a 100 % idêntica à sequência de proteína E de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 4. Em uma modalidade particular, B é um fragmento imunogênico de proteína E com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO. 4. Em uma modalidade adicional, B é um fragmento imunogênico de proteína E, em que proteína E é pelo menos 95 % idêntica a qualquer de SEQ ID NO. 4 - SEQ ID NO. 57.
[00105] Em outra modalidade, B é um fragmento de proteína E de H. influenzae selecionada do grupo que consiste em aminoácidos 17-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 122), aminoácidos 18-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 123), aminoácidos 19-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 124), aminoácidos 20-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 125) e aminoácidos 22160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 126). Em outra modalidade, B é um fragmento imunogênico de proteína E de H. influenzae selecionado do grupo que consiste em aminoácidos 17-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 122), aminoácidos 18-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 123), aminoácidos 19
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160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 124), aminoácidos 20-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 125), aminoácidos 22-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 126), aminoácidos 23-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 179) e aminoácidos 24-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 180). Mais especificamente, em uma modalidade, B é o fragmento de proteína E da maneira apresentada em SEQ ID NO. 123, aminoácidos 18-160 de SEQ ID NO. 4.
[00106] Em uma modalidade particular B é um fragmento imunogênico de proteína E da maneira apresentada em SEQ ID NO. 123, aminoácidos 18-160 de SEQ ID NO. 4 quando A é um fragmento imunogênico de PilA da maneira apresentada em SEQ ID NO. 127.
[00107] Em uma modalidade, as proteínas de fusão da fórmula (I) são definidas, em que p é 0. Em outra modalidade, as proteínas de fusão da fórmula (I) são definidas, em que p é 1.
[00108] Em uma modalidade, a proteína de fusão da fórmula (I) é selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO. 136, SEQ ID NO. 138, SEQ ID NO. 140, SEQ ID NO. 142, SEQ ID NO. 144, SEQ ID NO.146,
SEQ ID NO. 148, SEQ ID NO. 150, SEQ ID NO. 182, SEQ ID NO.184,
SEQ ID NO. 186, SEQ ID NO. 188, SEQ ID NO. 190, SEQ ID NO.192,
SEQ ID NO. 194, SEQ ID NO. 196, SEQ ID NO. 198, SEQ ID NO.200,
SEQ ID NO. 202 e SEQ ID NO. 204; ou qualquer subgrupo destes. Em outra modalidade, o proteína de fusão da fórmula (I) é aproximadamente 95 % idêntica a qualquer de SEQ ID NO. 136, SEQ ID NO. 138, SEQ ID NO.140,
SEQ ID NO. 142, SEQ ID NO. 144, SEQ ID NO. 146, SEQ ID NO.148,
SEQ ID NO. 150, SEQ ID NO. 182, SEQ ID NO. 184, SEQ ID NO.186,
SEQ ID NO. 188, SEQ ID NO. 190, SEQ ID NO. 192, SEQ ID NO.194,
SEQ ID NO. 196, SEQ ID NO. 198, SEQ ID NO. 200, SEQ ID NO. 202 ou SEQ ID NO. 204.
[00109] As proteínas de fusão da fórmula (I) são usadas como
Petição 870190129809, de 09/12/2019, pág. 52/336 / 112 imunógenos em sujeitos tais como mamíferos, particularmente humanos. Em particular, as proteínas de fusão da fórmula (I) são usadas na indução de uma resposta imune contra H. influenzae em sujeitos, particularmente humanos. Mais especificamente, as proteínas de fusão da fórmula (I) são usadas no tratamento ou prevenção de otite média, e/ou AECOPD, e/ou pneumonia. [00110] A presente invenção diz respeito a composições imunogênicas que compreendem proteína E de H. influenzae (ou um fragmento imunogênico desta) e PilA de H. influenzae (ou um fragmento imunogênico desta), e composições imunogênicas que compreendem proteínas de fusão de proteína E de H. influenzae (ou um fragmento imunogênico desta) e PilA de H. influenzae (ou um fragmento imunogênico desta). A presente invenção also diz respeito a vacinas que compreendem tais composições imunogênicas e usos terapêuticos das mesmas.
[00111] Em uma modalidade, as composições imunogênicas compreendem proteína E de H. influenzae (ou um fragmento imunogênico desta) e PilA de H. influenzae (ou um fragmento imunogênico desta). A proteína E pode ser SEQ ID NO. 4 ou uma sequência de proteína E pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idêntica a SEQ ID NO. 4.
[00112] O fragmento imunogênico de proteína E pode ser SEQ ID NO. 122, SEQ ID NO. 123, SEQ ID NO. 124, SEQ ID NO. 125 ou SEQ ID NO. 126, ou uma sequência com pelo menos 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidade de sequência com qualquer uma de SEQ ID NO. 122, SEQ ID NO. 123, SEQ ID NO. 124, SEQ ID NO. 125 ou SEQ ID NO. 126. O fragmento imunogênico de proteína E pode ser SEQ ID NO. 122, SEQ ID NO. 123, SEQ ID NO. 124, SEQ ID NO. 125, SEQ ID NO. 126, SEQ ID NO. 179 ou SEQ ID NO. 180 ou uma sequência com pelo menos 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidade de sequência com qualquer uma de SEQ ID NO. 122, SEQ ID NO. 123, SEQ ID NO. 124, SEQ ID NO. 125, SEQ ID
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NO. 126, SEQ ID NO. 179 ou SEQ ID NO. 180. As diferenças do aminoácido foram descritas na proteína E de várias espécies de Haemophilus quando comparado à proteína E de Haemophilus influenzae Rd como uma cepa de referência. Microbes & Infection (Corrigido para “Identification of a novel Haemophilus influenzae protein important for adhesion to epithelia cells” [Microbes Infect. 10 (2008) 87-97], disponível na internet em 6 de julho de 2010, “Artigo em impressão”), fornece uma sequência para proteína E de H. influenzae cepa 772. WO2002/28889 fornece uma sequência para proteína E de H. influenzae cepa 12085.
[00113] A proteína E contém uma região de ligação de célula epitelial (PKRYARSVRQ YKILNCANYH LTQVR, SEQ ID NO. 128) que foi relatada como conservada entre mais de 100 isolados clínicos de H. influenzae NTHi encapsulado, e cepas de coleção de cultura analisados (Singh et al, J. Infect. Dis. 201(3):414-9 (2010)). Singh et al. relataram que a proteína E era muito conservada tanto em H. influenzae NTHi quanto encapsulado (96.9 % 100 % de identidade sem o peptídeo sinal). Em uma modalidade, o fragmento de proteína E compreende a região de ligação de SEQ ID NO. 128 (PKRYARSVRQ YKILNCANYH LTQVR).
[00114] PilA é uma adesina conservada expressa in vivo. A comparação de tamanho completo de 64 sequências de PilA de Haemophilus influenzae demonstrou aproximadamente 80 % a 100 % de identidade.
[00115] Em outra modalidade, a composição imunogênica compreende uma proteína de fusão da maneira definida pela fórmula (I).
[00116] Em uma modalidade, as presentes composições imunogênicas podem ser administradas com outros antígenos de H. influenzae. Por exemplo, a PE e PilA, ou a proteína de fusão da fórmula (I) podem ser administradas com proteína D de H. influenzae. A proteína D pode ser da maneira descrita em WO91/18926. Em outra modalidade, a composição imunogênica pode incluir a proteína de fusão da fórmula (I) e proteína D de H. influenzae.
Petição 870190129809, de 09/12/2019, pág. 54/336 / 112 [00117] Em outra modalidade, as composições imunogênicas da invenção podem ser administradas com antígenos adicionais de outras espécies bacterianas também conhecidas por causar otite média, AECOPD ou pneumonia.
[00118] A quantidade da composição imunogênica que é exigida para atingir o efeito terapêutico ou biológico desejado dependerá de inúmeros fatores tal como o uso para o qual é pretendido, o meio de administração, o receptor e o tipo e gravidade da condição que está sendo tratada, e estará por fim na descrição do médico ou veterinário atendente. Em geral, uma dose típica para o tratamento de uma condição causada completamente ou em parte por H. influenzae em um humano, por exemplo, pode ser esperada para estar na faixa de cerca de 0,003 mg a cerca de 0,090 mg. Mais especificamente, uma dose típica para o tratamento de uma condição causada totalmente ou parcialmente por H. influenzae em um humano pode estar na faixa de cerca de 0,01 mg a cerca de 0,03 mg de proteína de fusão. A composição imunogênica pode conter antígenos adicionais; uma dose típica para o tratamento de uma condição causada totalmente ou parcialmente por H. influenzae em um humano pode estar na faixa de cerca de 0,01 mg a cerca de 0,03 mg para cada antígeno adicional. Esta dose pode ser administrada como uma dose única. Várias doses únicas também podem ser administradas. Por exemplo, as doses únicas separadas podem ser administradas como doses iniciais separadas no primeiro ano de vida, ou como doses de reforço separadas fornecidas em intervalos regulares (por exemplo, a cada 1, 5 ou 10 anos).
[00119] As formulações compreendendo as composições imunogênicas da invenção podem ser adaptadas para a administração por uma via apropriada, por exemplo, pela via intramuscular, sublingual, transcutânea, intradérmica ou intranasal. Tais formulações podem ser preparadas por qualquer método conhecido na técnica.
[00120] As composições imunogênicas da presente invenção podem
Petição 870190129809, de 09/12/2019, pág. 55/336 / 112 compreender adicionalmente um adjuvante. Quando o termo “adjuvante” é usado nesta especificação, refere-se a uma substância que é administrada junto com a composição imunogênica para reforçar a resposta imune do paciente em relação ao componente imunogênico da composição.
[00121] Os adjuvantes adequados incluem um sal de alumínio tal como gel de hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio ou alúmen, mas também podem ser um sal de cálcio, magnésio, ferro ou zinco, ou podem ser uma suspensão insolúvel de tirosina acilada ou açúcares acilados, sacarídeos cationicamente ou anionicamente derivados, ou polifosfazenos. Em uma modalidade, a proteína de fusão, PE ou PilA pode ser adsorvida em fosfato de alumínio. Em outra modalidade, a proteína de fusão, PE ou PilA pode ser adsorvida em hidróxido de alumínio. Em uma terceira modalidade, alúmen pode ser usado como um adjuvante.
[00122] Os sistemas adequados de adjuvante que promovem uma resposta predominantemente Th1 incluem: derivados não tóxicos de lipídeo A, monofosforil lipídeo A (MPL) ou um derivado deste, particularmente monofosforil lipídeo A 3-de-O-acilado (3D-MPL) (para sua preparação, ver GB 2220211 A); e uma combinação de monofosforil lipídeo A, preferivelmente monofosforil lipídeo A 3-de-O-acilado, tanto junto com um sal de alumínio (por exemplo, fosfato de alumínio ou hidróxido de alumínio) quanto uma emulsão óleo-em-água. Em tais combinações, o antígeno e 3DMPL estão contidos nas mesmas estruturas particuladas, permitindo uma distribuição mais eficiente de sinais antigênicos e imunoestimulatórios. Estudos mostraram que 3D-MPL é capaz de melhorar adicionalmente a imunogenicidade de um antígeno adsorvido em alúmen (Thoelen et al. Vaccine (1998) 16:708-14; EP 689454-B1).
[00123] AS01 é um sistema de adjuvante que contém MPL (3-0desacil-4'- monofosforil lipídeo A), QS21 (Quillaja saponaria Molina, fração 21) Antigenics, Nova Iorque, NY, USA) e lipossomos. AS01B é um sistema
Petição 870190129809, de 09/12/2019, pág. 56/336 / 112 adjuvante que contém MPL, QS21 e lipossomos (50 qg de MPL e 50 qg de QS21). AS01E é um sistema de adjuvante que contém MPL, QS21 e lipossomos (25 qg de MPL e 25 qg de QS21). Em uma modalidade, a composição imunogênica ou vacina compreende AS01. Em outra modalidade, a composição imunogênica ou vacina compreende AS01B ou AS01E. Em uma modalidade particular, a composição imunogênica ou vacina compreende AS01E.
[00124] AS03 é um sistema de adjuvante que contém α-Tocoferol e esqualeno em uma emulsão óleo/água (o/a). AS03A é um sistema de adjuvante que contém α-Tocoferol e esqualeno em uma emulsão o/a (11,86 mg de tocopherol). AS03B é um sistema de adjuvante que contém α-Tocoferol e esqualeno em uma emulsão o/a (5,93 mg de tocoferol). AS03C é um sistema de adjuvante que contém α-Tocoferol e esqualeno em uma emulsão o/a (2,97 mg de tocoferol). Em uma modalidade, a composição imunogênica ou vacina compreende AS03.
[00125] AS04 é um sistema de adjuvante que contém MPL (50 qg MPL) adsorvido em um sal de alumínio (500 qg de Al3+ ). Em uma modalidade, a composição imunogênica ou vacina compreende AS04.
[00126] Um sistema que envolve o uso de QS21 e 3D-MPL é revelado em WO 94/00153. Uma composição em que o QS21 é finalizado com colesterol é revelado em WO 96/33739. Uma formulação de adjuvante adicional que envolve QS21, 3D-MPL e tocoferol em uma emulsão óleo em água é descrita em WO 95/17210. Em uma modalidade, a composição imunogênica compreende adicionalmente uma saponina, que pode ser QS21. A formulação também pode compreender uma emulsão óleo em água e tocoferol (WO 95/17210). CpG não metilado que contém oligonucleotídeos (WO 96/02555) e outros oligonucleotídeos imunomodulatórios (WO 0226757 e WO 03507822) também são indutores preferenciais de uma resposta TH1, e são adequados para uso na presente invenção.
Petição 870190129809, de 09/12/2019, pág. 57/336 / 112 [00127] Os adjuvantes adicionais são aqueles selecionados do grupo de sais metálicos, emulsões óleo em água, agonistas do receptor do tipo Toll, (em particular agonista do receptor tipo Toll 2, agonista do receptor tipo Toll 3, agonista do receptor tipo Toll 4, agonista do receptor tipo Toll 7, agonista do receptor tipo Toll 8 e agonista do receptor tipo Toll 9), saponinas ou combinações destes.
[00128] A presente invenção fornece um processo para preparar uma composição imunogênica compreendendo combinar uma proteína de fusão da fórmula (I) com um adjuvante.
[00129] A presente invenção fornece adicionalmente uma vacina contendo uma composição imunogênica da invenção e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
[00130] Os excipientes possíveis incluem arginina, ácido plurônico e/ou polissorbato. Em uma modalidade preferida, o polissorbato 80 (por exemplo, TWEEN® 80) é usado. Em uma modalidade adicional, uma concentração final de cerca de 0,03 % a cerca de 0,06 % é usada. Especificamente, uma concentração final de cerca de 0,03 %, 0,04 %, 0,05 % ou 0,06 % de polissorbato 80 (p/v) pode ser usada.
[00131] A presente invenção fornece um processo para preparar uma composição imunogênica ou vacina compreendendo combinar uma proteína de fusão da fórmula (I) com um excipiente farmaceuticamente aceitável.
[00132] A presente invenção também fornece ácidos nucléicos que codificam as proteínas da invenção. O termo “ácido nucléico” refere-se a uma forma polimérica de nucleotídeos. Os nucleotídeos podem ser ribonucleotídeos, deoxrribonucleotídeos, ou formar modificadas tanto de ribonucleotídeos quanto de desoxirribonucleotídeos. O termo inclui as formas simples e duplas de DNA. Os ácidos nucléicos são de maneira preferível substancialmente livres de outros ácidos nucléicos.
[00133] A presente invenção fornece um processo de produzir ácidos
Petição 870190129809, de 09/12/2019, pág. 58/336 / 112 nucléicos da invenção. Os ácidos nucléicos da invenção podem ser preparados por métodos conhecidos pelos versados na técnica. Por exemplo, os ácidos nucléicos da invenção podem ser sintetizados em parte ou por completo. Os ácidos nucléicos podem ser preparados digerindo aminoácidos mais longos ou unindo aminoácidos mais curtos.
[00134] Os exemplos a seguir são pretendidos apenas para ilustração e não são pretendidos como limitantes do escopo da invenção de maneira alguma.
[00135] Nos exemplos, os termos a seguir apresentam o significado determinado:
6xhis = seis histidinas;
xg = força centrífuga (número em gravidades)
ATP = adenosina trifosfato;
BCA = ácido bicinconínico;
BSA = albumina sérica bovina;
°C = graus Celsius;
CaCl2 = cloreto de cálcio;
CV = volume da coluna;
DNA = ácido desoxirribonucléico;
DSC = varredura por calorimetria diferencial;
DTT = ditiotreitol;
dNTP = trifosfato de desoxinucleosídeo;
EDTA = ácido etilenodiaminatetracético;
FT = fluxo completo;
HCl = cloreto de hidrogênio;
His = his = histidina;
HEPES = ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanossulfônico; IMAC = cromoatografia por afinidade com metal imobilizado; IPTG = isopropil P-D-1-tiogalactopiranosídeo;
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KCl = cloreto de potássio;
K2HPO4 = fosfato de potássio dibásico;
KH2PO4 = fosfato de potássio monobásico;
LDS = sulfato de dodecil e lítio;
L = litro;
MES = ácido 2-(A-morfolino)etanossulfônico;
MgCl2 = cloreto de magnésio;
ml = mililitro;
RPM = revoluções por minuto;
min = minuto;
mM = milimolar;
pL = microlitro;
NaCl = cloreto de sódio;
Na2HPO4 = fosfato de sódio dibásico;
NaH2PO4 = fosfato de sódio monobásico;
ng = nanograma;
nm = nanômetro;
O/N = por toda a noite;
PBS = salina tamponada com fosfato;
PCR = reação em cadeia da polimerase;
SB = tampão da amostra;
sec = segundo; w/v = peso/volume.
EXEMPLOS
Exemplo 1: Proteínas de fusão [00136] As proteínas de fusão foram produzidas com diferentes peptídeos sinais e sequências ligadoras de aminoácido. Estas proteínas de fusão permitiram a secreção tanto de proteína E quanto de PilA (ou fragmentos destas) sem ficar restrito a uma única cepa bacteriana. A proteína
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51/112 de fusão é liberada no periplasma após a remoção do peptídeo sinal heterólogo por uma peptidase de peptídeo sinal. A proteína de fusão purificada a partir de bactérias não contém o peptídeo sinal heterólogo. As proteínas “purificadas” são removidas das bactérias e estão ausentes no peptídeo sinal.
[00137] A tabela a seguir descreve construtos de proteína de fusão preparados.
Tabela 3: Construtos de proteína de fusão contendo PilA e proteína E.
ConstrutoID S-ter mina I.............................................
......C-Terminal
LVL312 Ogl sp E Fragmento PilA (A.A.: 40-149 de SEQ ID NO. 58, SEQ ID NO. 127) GG Fragmento ProtE (A.A.: 18 a 160 de SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO.123) GGHH HHHH
A.A. 1 19 21 130 133 275 276 283
LVL291 pelB sp Fragmento ProtE (A.A.: 19 a 160 de SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 124) GG Fragmento PilA (A.A.: 40-149 de SEQ ID NO. 58, SEQ ID NO. 127) GGHHH HHH
A.A. 1 22 23 164 167 276 277 284
LVL268 pelB sp D Fragmento ProtE (A.A.: 20 a 160 de SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 125) GG Fragmento PilA (A.A.: 40-149 de SEQ ID NO. 58, SEQ ID NO. 127) GGHH HHHH
A.A. 1 22 24 164 167 276 277 284
LVL269 nadA sp ATNDDD Fragmento ProtE (A.A.: 22 a 160 de SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 126) GG Fragmento PilA (A.A.: 40-149 de SEQ ID NO. 58, SEQ ID NO. 127) GGHH HHHH
A. A. 1 23 24-29 30 168 171 280 281 288
LVL270 MHHHHHH Fragmento ProtE (A.A.: 17 a 160 de SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 122) GG Fragmento PilA (A.A.: 40-149 de SEQ ID NO. 58, SEQ ID NO. 127)
A.A. 17 8 151 154 263
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LVL315 pelB IV sp ID Fragmento ProtE (A.A.: 22 a 160 de SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 126) GG F P ( d Γ* I ragmento •ilA A.A.: 40-149 e SEQ ID JO. 58, SEQ D NO. 127) GGHH HHHH
122 25 163166 275 276 283
LVL317 pelB sp Fragmento ProtE (A.A.: 19 a 160 de SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 124) GG Fragmento PilA (A.A.: 40-149 de SEQ ID NO. 58, SEQ ID NO. 127)
A. A. 1 22 23 164 167 276
LVL318 pelB sp MD Fragmento ProtE (A.A.: 22 a 160 de SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 126) GG Fragmento PilA (A.A.: 40-149 de SEQ ID NO. 58, SEQ ID NO. 127)
A. A. 1 22 25 163 166 275
LVL702 pelB sp Fragmento ProtE (A.A.: 20 a 160 de SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 125) GG Fragmento PilA (A.A.: 40-149 de SEQ ID NO. 58, SEQ ID NO. 127) GGHHHH HH
A. A. 1 22 23 163 166 275 283
LVL736 pelB sp Fragmento ProtE (A.A.: 17 a 160 de SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 122) GG Fragmento PilA (A.A.: 40-149 de SEQ ID NO. 58, SEQ ID NO. 127) GGHHHH HH
A.A. 1 22 23 166 169 278 286
LVL737 pelB sp Fragmento ProtE (A.A.: 18 a 160 de SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO.123) GG Fragmento PilA (A.A.: 40-149 de SEQ ID NO. 58, SEQ ID NO. 127) GGH HHH HH
A.A. 1 22 23 165 168 277 285
LVL738 pelB sp Fragmento ProtE (A.A.: 22 a 160 de SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 126) GG Fragmento PilA (A.A.: 40-149 de SEQ ID NO. 58, SEQ ID NO. 127) GGHHHH HH
A. A. 1 22 23 161 164 273 281
LVL739 pelB sp ragmen to ’rotE A.A.: 23 a 160 le SEQ ID SO. 4, SEQ ID SO. 179) GG F P G d S I ragmento ilA V.A.: 40-14 e SEQ II [Q. 58, SE( D NO. 127) GGHHHHHH )
A.A. 1 22 23 160 163 272 280
LVL740 pelB sp ragmen to ’rotE A.A.: 24 a 160 le SEQ ID SO. 4, SEQ ID SO. 180) GG F P G d S I ragmento ilA V.A.: 40-14 e SEQ II [Q. 58, SEt. D NO. 127) GGHHHHHH )
A. A. 1 22 23 159 162 271 279
LVL735 pelB sp Fragmento ProtE (A.A.: 20 a 160 de SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 125) GG Fragmento PilA (A.A.: 40-149 de SEQ ID NO. 58, SEQ ID NO. 127)
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A. A. 1 22 23 163 166 275
LVL778 pelB sp Fragmento ProtE (A.A.: 17 a 160 de SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 122) GG Fragmento PilA (A.A.: 40-149 de SEQ ID NO. 58, SEQ ID NO. 127)
A. A. 1 22 23 166 169 278
LVL779 pelB sp Fragmento ProtE (A.A.: 18 a 160 de SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO.123) GG Fragmento PilA (A.A.: 40-149 de SEQ ID NO. 58, SEQ ID NO. 127)
A. A. 1 22 23 165 168 277
LVL780 pelB sp Fragmento ProtE (A.A.: 22 a 160 de SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 126) GG Fragmento PilA (A.A.: 40-149 de SEQ ID NO. 58, SEQ ID NO. 127)
A. A. 1 22 23 161 164 273
LVL781 pelB sp Fragmento ProtE (A.A.: 23 a 160 de SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 179) GG Fragmento PilA (A.A.: 40-149 de SEQ ID NO. 58, SEQ ID NO. 127)
A. A. 1 22 23 160 163 272
LVL782 pelB sp Fragmento ProtE (A.A.: 24 a 160 de SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 180) GG Fragmento PilA (A.A.: 40-149 de SEQ ID NO. 58, SEQ ID NO. 127)
A. A. 1 22 23 159 162 271
sp = peptídeo sinal; A.A. = aminoácido
As sequências de DNA e aminoácidos para cada um dos peptídeos sinais e plasmideos listados na tabela 3 são apresentados a seguir.
SEQUÊNCIAS SINAIS:
peptídeo sinal pelB (DNA) - SEQ ID NO. 129: atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggc gatggcc peptídeo sinal pelB (Aminoácido) - SEQ ID NO. 130: MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MA peptídeo sinal Figi (DNA) - SEQ ID NO. 131: atgattaaatttctctctgcattaattcttctactggtcacgacggcggctcaggct peptídeo sinal Flgl (Aminoácido) - SEQ ID NO. 132: MIKFLSALIL LLVTTAAQA peptídeo sinal NadA (DNA) - SEQ ID NO. 133: atgaaacactttccatccaaagtactgaccacagccatccttgccactttctgtagcggcg cactggca
Petição 870190129809, de 09/12/2019, pág. 63/336 / 112 peptídeo sinal NadA (Aminoácido) - SEQ ID NO. 134:
MKHFPSKVLT TAILATFCSG ALA
SEQUÊNCIAS DO CONSTRUTO DE PROTEÍNA DE FUSÃO:
[00138] A porção sublinhada simples das sequências de aminoácidos é de PilA de Haemophilus influenzae cepa 86-028NP. A posão sublinhada em negrito das sequências de aminoácidos foi derivada de proteína E de Haemophilus influenza cepa 772.
LVL312 (DNA) - SEQ ID NO. 135:
atgattaaatttctctctgcattaattcttctactggtcacgacggcggctcaggctgagact aaaaaagcagcggtatctgaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagc acaaatgaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatg taaaatcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatggaatatatt ttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttc cagcaaatttttgcggaagtgtcacacaaggcggcgcgcagattcagaaggctgaacaaaatgatgtgaagct ggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatc gatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgttt atcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagt acgaactgatttctatgatgaattttggggacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgtt aagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgat aaaaaaggcggccaccaccaccaccaccactaa
LVL312 (proteína): (flgI sp)(E)(PilA aa 40-149)(GG)(ProtE aa 18160)(GGHHHHHH) - SEQ ID NO. 136
MIKFLSALIL LLVTTAAQAE TKKAAVSELL
QASAPYKADV ELCVYSTNET TNCTGGKNGI AADITTAKGY
VKSVTTSNGA ITVKGDGTLA NMEYILQATG NAATGVTWTT
TCKGTDASLF PANFCGSVTQ GGAQIQKAEQ NDVKLAPPTD
VRSGYIRLVK NVNYYIDSES IWVDNQEPQI VHFDAVVNLD
KGLYVYPEPK RYARSVRQYK ILNCANYHLT QVRTDFYDEF
WGQGLRAAPK KQKKHTLSLT PDTTLYNAAQ IICANYGEAF
Petição 870190129809, de 09/12/2019, pág. 64/336 / 112
SVDKKGGHHH HHH
LVL291 (DNA) - SEQ ID NO. 137:
atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggc gatggcccagattcagaaggctgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggata tatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaatt gtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttc gtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggggaca gggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgc tgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggt atctgaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaaca aactgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaa caagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatggaatatattttgcaagctacaggt aatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttccagcaaatttttgcg gaagtgtcacacaaggcggccaccaccaccaccaccactaa
LVL291 (Proteína)(pelB sp)(ProtE aa 19-160)(GG)(PilA aa40149)(GGHHHHHH) - SEQ ID NO. 138
MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MAQIQKAEQN
DVKLAPPTDV RSGYIRLVKN VNYYIDSESI WVDNQEPQIV
HFDAVVNLDK GLYVYPEPKR YARSVRQYKI LNCANYHLTQ
VRTDFYDEFW GQGLRAAPKK QKKHTLSLTP DTTLYNAAQI
ICANYGEAFS VDKKGGTKKA AVSELLQASA PYKADVELCV
YSTNETTNCT GGKNGIAADI TTAKGYVKSV TTSNGAITVK
GDGTLANMEY ILQATGNAAT GVTWTTTCKG TDASLFPANF
CGSVTQGGHH HHHH
LVL268 (DNA) - SEQ ID NO. 139:
atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggc gatggccgatattcagaaggctgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatat atacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattg tacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcg
Petição 870190129809, de 09/12/2019, pág. 65/336 / 112 tcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggggacag ggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgct gctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggta tctgaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaa actgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaac aagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatggaatatattttgcaagctacaggta atgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttccagcaaatttttgcgg aagtgtcacacaaggcggccaccaccaccaccaccac
LVL268 (proteína): (pelB sp)(D)(ProtE aa 20-160)(GG)(PilA aa40149)(GGHHHHHH) - SEQ ID NO. 140:
MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MADIQKAEQN
DVKLAPPTDV RSGYIRLVKN VNYYIDSESI WVDNQEPQIV
HFDAVVNLDK GLYVYPEPKR YARSVRQYKI LNCANYHLTQ
VRTDFYDEFW GQGLRAAPKK QKKHTLSLTP DTTLYNAAQI
ICANYGEAFS VDKKGGTKKA AVSELLQASA PYKADVELCV
YSTNETTNCT GGKNGIAADI TTAKGYVKSV TTSNGAITVK
GDGTLANMEY ILQATGNAAT GVTWTTTCKG TDASLFPANF
CGSVTQGGHH HHHH
LVL269 (DNA) - SEQ ID NO. 141:
atgaaacactttccatccaaagtactgaccacagccatccttgccactttctgtagcggcg cactggcagccacaaacgacgacgataaggctgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtac gaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaaga gccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgc acgttctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaat tttggggacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacg ctttataatgctgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaa agcagcggtatctgaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaat gaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaat cagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatggaatatattttgcaa
Petição 870190129809, de 09/12/2019, pág. 66/336 / 112 gctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttccagca aatttttgcggaagtgtcacacaaggcggccaccaccaccaccaccactaa
LVL269 (proteína): (nadA sp)(ATNDDD)(ProtE aa 22-160)(GG)(PilA aa 40149)(GGHHHHHH) - SEQ ID NO.142
MKHFPSKVLT TAILATFCSG ALAATNDDDK
AEQNDVKLAP PTDVRSGYIR LVKNVNYYID SESIWVDNQE
PQIVHFDAVV NLDKGLYVYP EPKRYARSVR QYKILNCANY
HLTQVRTDFY DEFWGQGLRA APKKQKKHTL SLTPDTTLYN
AAQIICANYG EAFSVDKKGG TKKAAVSELL QASAPYKADV
ELCVYSTNET TNCTGGKNGI AADITTAKGY VKSVTTSNGA
ITVKGDGTLA NMEYILQATG NAATGVTWTT TCKGTDASLF
PANFCGSVTQ GGHHHHHH
LVL270 (DNA) - SEQ ID NO. 143:
atgcaccaccaccaccaccacagcgcgcagattcagaaggctgaacaaaatgatgtga agctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtg aatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgta tgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactc aagtacgaactgatttctatgatgaattttggggacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacat acgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttca gttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctg atgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagata taaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggca cattggcaaatatggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaa aggaacggatgcctctttatttccagcaaatttttgcggaagtgtcacacaataa
LVL270 (proteína): (MHHHHHH)(ProtE aa 17-160)(GG)(PilA aa40-149) SEQ ID NO. 144:
MHHHHHHSAQ IQKAEQNDVK LAPPTDVRSG
YIRLVKNVNY YIDSESIWVD NQEPQIVHFD AVVNLDKGLY VYPEPKRYAR SVRQYKILNC ANYHLTQVRT DFYDEFWGQG
Petição 870190129809, de 09/12/2019, pág. 67/336 / 112
LRAAPKKQKK HTLSLTPDTT LYNAAQIICA NYGEAFSVDK
KGGTKKAAVS ELLQASAPYK ADVELCVYST NETTNCTGGK
NGIAADITTA KGYVKSVTTS NGAITVKGDG TLANMEYILQ
ATGNAATGVT WTTTCKGTDA SLFPANFCGS VTQ
LVL315 (DNA) - SEQ ID NO. 145:
atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggc gatggccatggataaggctgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatata cgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtac attttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtca gtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggggacagggt ttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgct cagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatct gaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaac tgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaa gcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatggaatatattttgcaagctacaggtaat gctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttccagcaaatttttgcggaa gtgtcacacaaggcggccaccaccaccaccaccactaa
LVL315 (proteína): (pelB sp)(MD)(ProtE aa 22-160)(GG)(PilA aa40149)(GGHHHHHH) - SEQ ID NO. 146:
MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MAMDKAEQND
VKLAPPTDVR SGYIRLVKNV NYYIDSESIW VDNQEPQIVH
FDAVVNLDKG LYVYPEPKRY ARSVRQYKIL NCANYHLTQV
RTDFYDEFWG QGLRAAPKKQ KKHTLSLTPD TTLYNAAQII
CANYGEAFSV DKKGGTKKAA VSELLQASAP YKADVELCVY
STNETTNCTG GKNGIAADIT TAKGYVKSVT TSNGAITVKG
DGTLANMEYI LQATGNAATG VTWTTTCKGT DASLFPANFC
GSVTQGGHHH HHH
LVL317 (DNA) - SEQ ID NO. 147:
atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggc
Petição 870190129809, de 09/12/2019, pág. 68/336 / 112 gatggcccagattcagaaggctgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggata tatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaatt gtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttc gtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggggaca gggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgc tgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggt atctgaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaaca aactgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaa caagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatggaatatattttgcaagctacaggt aatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttccagcaaatttttgcg gaagtgtcacacaataa
LVL317 (proteína): (pelB sp)(ProtE aa 19-160)(GG)(PilA aa40-149) - SEQ ID NO. 148:
MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MAQIQKAEQN
DVKLAPPTDV RSGYIRLVKN VNYYIDSESI WVDNQEPQIV
HFDAVVNLDK GLYVYPEPKR YARSVRQYKI LNCANYHLTQ
VRTDFYDEFW GQGLRAAPKK QKKHTLSLTP DTTLYNAAQI
ICANYGEAFS VDKKGGTKKA AVSELLQASA PYKADVELCV
YSTNETTNCT GGKNGIAADI TTAKGYVKSV TTSNGAITVK
GDGTLANMEY ILQATGNAAT GVTWTTTCKG TDASLFPANF
CGSVTQ
LVL318 (DNA) - SEQ ID NO. 149:
atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggc gatggccatggataaggctgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatata cgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtac attttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtca gtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggggacagggt ttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgct cagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatct
Petição 870190129809, de 09/12/2019, pág. 69/336 / 112 gaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaac tgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaa gcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatggaatatattttgcaagctacaggtaat gctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttccagcaaatttttgcggaa gtgtcacacaataa
LVL318 (proteína): (pelB sp)(MD)(ProtE aa 22-160)(GG)(PilA aa40-149) SEQ ID NO. 150:
MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MAMDKAEQND
VKLAPPTDVR SGYIRLVKNV NYYIDSESIW VDNQEPQIVH
FDAVVNLDKG LYVYPEPKRY ARSVRQYKIL NCANYHLTQV
RTDFYDEFWG QGLRAAPKKQ KKHTLSLTPD TTLYNAAQII
CANYGEAFSV DKKGGTKKAA VSELLQASAP YKADVELCVY
STNETTNCTG GKNGIAADIT TAKGYVKSVT TSNGAITVKG
DGTLANMEYI LQATGNAATG VTWTTTCKGT DASLFPANFC GSVTQ
LVL702 (DNA) - SEQ ID NO. 181: atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggc gatggccattcagaaggctgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatata cgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtac attttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtca gtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggggacagggt ttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgct cagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatct gaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaac tgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaa gcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatggaatatattttgcaagctacaggtaat gctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttccagcaaatttttgcggaa gtgtcacacaaggcggccaccaccaccaccaccac
LVL702 (proteína): (pelB sp)(ProtE aa 20-160)(GG)(PilA aa40149)(GGHHHHHH) - SEQ ID NO. 182:
Petição 870190129809, de 09/12/2019, pág. 70/336 /112
MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MAIQKAEQND
VKLAPPTDVR SGYIRLVKNV NYYIDSESIW VDNQEPQIVH
FDAVVNLDKG LYVYPEPKRY ARSVRQYKIL NCANYHLTQV
RTDFYDEFWG QGLRAAPKKQ KKHTLSLTPD TTLYNAAQII
CANYGEAFSV DKKGGTKKAA VSELLQASAP YKADVELCVY
STNETTNCTG GKNGIAADIT TAKGYVKSVT TSNGAITVKG
DGTLANMEYI LQATGNAATG VTWTTTCKGT DASLFPANFC
GSVTQGGHHH HHH
LVL736 (DNA) - SEQ ID NO. 183:
atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggc gatggccagcgcccagattcagaaggctgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaag cggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagcca caaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgtt ctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttgg ggacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgcttta taatgctgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagca gcggtatctgaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaa caacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagt gacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatggaatatattttgcaagcta caggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttccagcaaattt ttgcggaagtgtcacacaaggcggccaccaccaccaccaccac
LVL736 (proteína): (pelB sp)(ProtE aa 17-160)(GG)(PilA aa40149)(GGHHHHHH) - SEQ ID NO. 184:
MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MASAQIQKAE
QNDVKLAPPT DVRSGYIRLV KNVNYYIDSE SIWVDNQEPQ
IVHFDAVVNL DKGLYVYPEP KRYARSVRQY KILNCANYHL
TQVRTDFYDE FWGQGLRAAP KKQKKHTLSL TPDTTLYNAA
QIICANYGEA FSVDKKGGTK KAAVSELLQA SAPYKADVEL
CVYSTNETTN CTGGKNGIAA DITTAKGYVK SVTTSNGAIT
Petição 870190129809, de 09/12/2019, pág. 71/336 / 112
VKGDGTLANM EYILQATGNA ATGVTWTTTC KGTDASLFPA NFCGSVTQGG HHHHHH
LVL737 (DNA) - SEQ ID NO. 185:
atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggc gatggccgcccagattcagaaggctgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcg gatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccaca aattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttct gttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggg gacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttat aatgctgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagca gcggtatctgaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaa caacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagt gacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatggaatatattttgcaagcta caggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttccagcaaattt ttgcggaagtgtcacacaaggcggccaccaccaccaccaccac
LVL737 (proteína): (pelB sp)(ProtE aa 18-160)(GG)(PilA aa40149)(GGHHHHHH) - SEQ ID NO. 186:
MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MAAQIQKAEQ
NDVKLAPPTD VRSGYIRLVK NVNYYIDSES IWVDNQEPQI
VHFDAVVNLD KGLYVYPEPK RYARSVRQYK ILNCANYHLT
QVRTDFYDEF WGQGLRAAPK KQKKHTLSLT PDTTLYNAAQ
IICANYGEAF SVDKKGGTKK AAVSELLQAS APYKADVELC
VYSTNETTNC TGGKNGIAAD ITTAKGYVKS VTTSNGAITV
KGDGTLANME YILQATGNAA TGVTWTTTCK GTDASLFPAN
FCGSVTQGGH HHHHH
LVL738 (DNA) - SEQ ID NO. 187:
atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggc gatggccaaggctgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttg gtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttg
Petição 870190129809, de 09/12/2019, pág. 72/336 / 112 atgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtata agatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggggacagggtttgc gggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcaga ttatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaatt actgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtac gggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaac ggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgc aacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttccagcaaatttttgcggaagtgtc acacaaggcggccaccaccaccaccaccac
LVL738 (proteína): (pelB sp)(ProtE aa 22-160)(GG)(PilA aa40149)(GGHHHHHH) - SEQ ID NO. 188:
MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MAKAEQNDVK
LAPPTDVRSG YIRLVKNVNY YIDSESIWVD NQEPQIVHFD
AVVNLDKGLY VYPEPKRYAR SVRQYKILNC ANYHLTQVRT
DFYDEFWGQG LRAAPKKQKK HTLSLTPDTT LYNAAQIICA
NYGEAFSVDK KGGTKKAAVS ELLQASAPYK ADVELCVYST
NETTNCTGGK NGIAADITTA KGYVKSVTTS NGAITVKGDG
TLANMEYILQ ATGNAATGVT WTTTCKGTDA SLFPANFCGS
VTQGGHHHHHH
LVL739 (DNA) - SEQ ID NO. 189:
atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggc gatggccgctgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggta aagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatg cagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtataaga tcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggggacagggtttgcggg cagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattat ttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaattact gcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtacgg gtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacgg
Petição 870190129809, de 09/12/2019, pág. 73/336 / 112 tgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgcaac aggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttccagcaaatttttgcggaagtgtcaca caaggcggccaccaccaccaccaccac
LVL739 (proteína): (pelB sp)(ProtE aa 23-160)(GG)(PilA aa40149)(GGHHHHHH) - SEQ ID NO. 190:
MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MAAEQNDVKL
APPTDVRSGY IRLVKNVNYY IDSESIWVDN QEPQIVHFDA
VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD
FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN
YGEAFSVDKK GGTKKAAVSE LLQASAPYKA DVELCVYSTN
ETTNCTGGKN GIAADITTAK GYVKSVTTSN GAITVKGDGT
LANMEYILQA TGNAATGVTW TTTCKGTDAS LFPANFCGSV
TQGGHHHHHH
LVL740 (DNA) - SEQ ID NO. 191:
atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggc gatggccgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaag aatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagt ggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtataagatcttg aattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggggacagggtttgcgggcagc acctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtg cgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaattactgcaa gcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtacgggtgg aaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacggtgca ataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggt gtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttccagcaaatttttgcggaagtgtcacacaag gcggccaccaccaccaccaccac
LVL740 (proteína): (pelB sp)(ProtE aa 24-160)(GG)(PilA aa40149)(GGHHHHHH) - SEQ ID NO. 192:
MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MAEQNDVKLA
Petição 870190129809, de 09/12/2019, pág. 74/336 / 112
PPTDVRSGYI RLVKNVNYYI DSESIWVDNQ EPQIVHFDAV
VNLDKGLYVY PEPKRYARSV RQYKILNCAN YHLTQVRTDF
YDEFWGQGLR AAPKKQKKHT LSLTPDTTLY NAAQIICANY
GEAFSVDKKG GTKKAAVSEL LQASAPYKAD VELCVYSTNE
TTNCTGGKNG IAADITTAKG YVKSVTTSNG AITVKGDGTL
ANMEYILQAT GNAATGVTWT TTCKGTDASL FPANFCGSVT
QGGHHHHHH
LVL735 (DNA) - SEQ ID NO. 193:
atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggc gatggccattcagaaggctgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatata cgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtac attttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtca gtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggggacagggt ttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgct cagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatct gaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaac tgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaa gcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatggaatatattttgcaagctacaggtaat gctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttccagcaaatttttgcggaa gtgtcacacaa
LVL735 (proteína): (pelB sp)(ProtE aa 20-160)(GG)(PilA aa40-149) - SEQ
ID NO. 194:
MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MAIQKAEQND
VKLAPPTDVR SGYIRLVKNV NYYIDSESIW VDNQEPQIVH
FDAVVNLDKG LYVYPEPKRY ARSVRQYKIL NCANYHLTQV
RTDFYDEFWG QGLRAAPKKQ KKHTLSLTPD TTLYNAAQII
CANYGEAFSV DKKGGTKKAA VSELLQASAP YKADVELCVY
STNETTNCTG GKNGIAADIT TAKGYVKSVT TSNGAITVKG
DGTLANMEYI LQATGNAATG VTWTTTCKGT DASLFPANFC GSVTQ
Petição 870190129809, de 09/12/2019, pág. 75/336 / 112
LVL778 (DNA) - SEQ ID NO. 195: atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggc gatggccagcgcccagattcagaaggctgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaag cggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagcca caaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgtt ctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttgg ggacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgcttta taatgctgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagca gcggtatctgaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaa caacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagt gacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatggaatatattttgcaagcta caggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttccagcaaattt ttgcggaagtgtcacacaa
LVL778 (proteína): (pelB sp)(ProtE aa 17-160)(GG)(PilA aa40-149) - SEQ ID NO. 196:
MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MASAQIQKAE QNDVKLAPPT DVRSGYIRLV KNVNYYIDSE SIWVDNQEPQ
IVHFDAVVNL DKGLYVYPEP KRYARSVRQY KILNCANYHL
TQVRTDFYDE FWGQGLRAAP KKQKKHTLSL TPDTTLYNAA
QIICANYGEA FSVDKKGGTK KAAVSELLQA SAPYKADVEL
CVYSTNETTN CTGGKNGIAA DITTAKGYVK SVTTSNGAIT
VKGDGTLANM EYILQATGNA ATGVTWTTTC KGTDASLFPA
NFCGSVTQ
LVL779 (DNA) - SEQ ID NO. 197:
atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggc gatggccgcccagattcagaaggctgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcg gatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccaca aattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttct gttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggg
Petição 870190129809, de 09/12/2019, pág. 76/336 / 112 gacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttat aatgctgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagca gcggtatctgaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaa caacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagt gacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatggaatatattttgcaagcta caggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttccagcaaattt ttgcggaagtgtcacacaa
LVL779 (proteína): (pelB sp)(ProtE aa 18-160)(GG)(PilA aa40-149) - SEQ
ID NO. 198:
MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MAAQIQKAEQ
NDVKLAPPTD VRSGYIRLVK NVNYYIDSES IWVDNQEPQI
VHFDAVVNLD KGLYVYPEPK RYARSVRQYK ILNCANYHLT
QVRTDFYDEF WGQGLRAAPK KQKKHTLSLT PDTTLYNAAQ
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VYSTNETTNC TGGKNGIAAD ITTAKGYVKS VTTSNGAITV
KGDGTLANME YILQATGNAA TGVTWTTTCK GTDASLFPAN
FCGSVTQ
LVL780 (DNA) - SEQ ID NO. 199:
atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggc gatggccaaggctgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttg gtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttg atgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtata agatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggggacagggtttgc gggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcaga ttatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaatt actgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtac gggtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaac ggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgc aacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttccagcaaatttttgcggaagtgtc
Petição 870190129809, de 09/12/2019, pág. 77/336 / 112 acacaa
LVL780 (proteína): (pelB sp)(ProtE aa 22-160)(GG)(PilA aa40-149) - SEQ
ID NO. 200:
MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MAKAEQNDVK
LAPPTDVRSG YIRLVKNVNY YIDSESIWVD NQEPQIVHFD
AVVNLDKGLY VYPEPKRYAR SVRQYKILNC ANYHLTQVRT
DFYDEFWGQG LRAAPKKQKK HTLSLTPDTT LYNAAQIICA
NYGEAFSVDK KGGTKKAAVS ELLQASAPYK ADVELCVYST
NETTNCTGGK NGIAADITTA KGYVKSVTTS NGAITVKGDG
TLANMEYILQ ATGNAATGVT WTTTCKGTDA SLFPANFCGS VTQ
LVL781 (DNA) - SEQ ID NO. 201:
atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggc gatggccgctgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggta aagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatg cagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtataaga tcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggggacagggtttgcggg cagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattat ttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaattact gcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtacgg gtggaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacgg tgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgcaac aggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttccagcaaatttttgcggaagtgtcaca caa
LVL781 (proteína): (pelB sp)(ProtE aa 23-160)(GG)(PilA aa40-149) - SEQ
ID NO. 202:
MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MAAEQNDVKL
APPTDVRSGY IRLVKNVNYY IDSESIWVDN QEPQIVHFDA
VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD
FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN
Petição 870190129809, de 09/12/2019, pág. 78/336 / 112
YGEAFSVDKK GGTKKAAVSE LLQASAPYKA DVELCVYSTN
ETTNCTGGKN GIAADITTAK GYVKSVTTSN GAITVKGDGT
LANMEYILQA TGNAATGVTW TTTCKGTDAS LFPANFCGSV TQ LVL782 (DNA) - SEQ ID NO. 203:
atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggc gatggccgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaag aatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagt ggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtataagatcttg aattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggggacagggtttgcgggcagc acctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtg cgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaattactgcaa gcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtacgggtgg aaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacggtgca ataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggt gtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttccagcaaatttttgcggaagtgtcacacaa LVL782 (proteína): (pelB sp)(ProtE aa 24-160)(GG)(PilA aa40-149) - SEQ ID NO. 204:
MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MAEQNDVKLA PPTDVRSGYI RLVKNVNYYI DSESIWVDNQ EPQIVHFDAV
VNLDKGLYVY PEPKRYARSV RQYKILNCAN YHLTQVRTDF
YDEFWGQGLR AAPKKQKKHT LSLTPDTTLY NAAQIICANY
GEAFSVDKKG GTKKAAVSEL LQASAPYKAD VELCVYSTNE
TTNCTGGKNG IAADITTAKG YVKSVTTSNG AITVKGDGTL
ANMEYILQAT GNAATGVTWT TTCKGTDASL FPANFCGSVT Q [00139] A sequência de tamanho completo para PE e PilA, a partir da qual as sequências anteriores foram obtidas, são apresentadas em SEQ ID NO. 4 (PE) e SEQ ID NO. 58 (PilA), respectivamente.
Exemplo 2: Construção e transformação de vetor [00140] Os oligonucleotídeos iniciadores para amplificar PE a partir de
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H. influenzae cepa 772 foram desenhados com base na sequência de H. influenzae cepa Hi Rd. A sequência de oligonucleotídeo iniciador 5' contém uma diferença de nucleotídeo comparada à sequência de NTHi 772, introduzindo um aminoácido diferente na posição 24 quando comparada com a sequência de genoma de NTHi 772 atualmente relatada. O aminoácido #24 nos construtos de proteína de fusão é E (ácido glutâmico) em vez de K (lisina), da maneira observada em NTHi 772.
Sequência de DNA para PE de H. influenzae cepa Rd. - SEQ ID NO. 151 atgaaaaaaattattttaacattatcacttgggttacttaccgcttgttctgctcaaatccaaa aggctgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaat gtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgctgtggt gaatttagataggggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtataagattttgaatt gtgcaaattatcatttaactcaaatacgaactgatttctatgatgaattttggggacagggtttgcgggcagcacct aaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtgcaaa ttatggtaaagcattttcagttgataaaaaataa
Sequência de proteína para PE de H. influenzae cepa Rd. - SEQ ID NO. 152
GLLTACSAQI QKAEQNDVKL
IDSESIWVDN QEPQIVHFDA
VRQYKILNCA NYHLTQIRTD
TLSLTPDTTL YNAAQIICAN
MKKIILTLSL
APPTDVRSGY IRLVKNVNYY VVNLDRGLYV YPEPKRYARS FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH YGKAFSVDKK
Sequência de DNA para PE de H. influenzae cepa 772 (da maneira apresentada em: Microbes & Infection, retificada para “Identification of a novel Haemophilus influenzae protein important for adhesion to epithelium cells” [Microbes Infect. 10 (2008) 87-97], disponível em 6 de julho de 2010, “Artigo para impressão”)) - SEQ ID NO. 153 atgaaaaaaattattttaacattatcacttgggttacttactgcctgttctgctcaaatccaaa aggctaaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaat gtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtgg
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71/ 112 tgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtataagatcttgaa ttgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggggacagggtttgcgggcagcac ctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtgcg aactatggtgaagcattttcagttgataaaaaa
Sequência de proteína para PE de H. influenzae cepa 772 (da maneira apresentada em: Microbes & Infecção, retificada para “Identification of a novel Haemophilus influenzae protein important for adhesion to epithelium cells” [Microbes Infect. 10 (2008) 87-97], disponível em 6 de julho de 2010, “Artigo em impressão”)) - SEQ ID NO. 154
MKKIILTLSL GLLTACSAQI QKAKQNDVKL
APPTDVRSGY IRLVKNVNYY IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN
YGEAFSVDKK
Construção de vetor:
[00141] Para gerar LVL312, LVL291, LVL268, LVL269, LVL270, LVL702, LVL735, LVL778, LVL779, LVL780, LVL781 e LVL782, uma preparação da reação em cadeia da polimerase (PCR) dos componentes a seguir foi realizada (componentes específicos são subsequentemente exemplificados): 36,6 pL de água deionizada, 5 pL de tampão #1 10X, 5 pL de dNTPs 2mM, 2 pL MgCl2 25 mM, 0,4 pL de oligonucleotídeo iniciador #1 (50 pM), 0,4 pL de oligonucleotídeo iniciador #2 (50 pM), 0.5 pL de molde (100 ng/pL) e 0,4 pL de DNA polimerase KOD HiFi 2,5 unidades/pL (NOVAGEN®) foi formulada. A reação em cadeia da polimerase envolveu 25 ciclos de 15 segundos de desnaturação a 98 °C, 2 segundos para anelar a 55 °C e 20 segundos de extensão de oligonucleotídeo iniciador a 72 °C. Os produtos de PCR foram purificados usando estojo de purificação de PCR QIAQUICK® (QIAGEN®). Este produto foi usado em condições recomendadas pelo fornecedor que foram: a adição de tampão PB 5 volumes,
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72/ 112 fornecido no estojo de purificação de PCR QIAQUICK®, em 1 volume da preparação de PCR. A preparação de PCR com tampão PB foi subsequentemente misturada por vortex. Uma coluna QIAQUICK® foi colocada em um tubo de coleta de 2 mL. Para ligar o DNA da preparação de PCR na coluna, a amostra mista foi aplicada na coluna QIAQUICK ® e centrifugada por 30-60 segundos a 14.000 RPM. O fluxo foi descartado e a coluna QIAQUICK ® foi colocada novamente no mesmo tubo. Para lavar o DNA ligado, 0,75 mL de tampão PE, fornecido no estojo de purificação de PCR QIAQUICK ® PCR, foi adicionado à coluna QIAQUICK ®, e a coluna foi centrifugada por 30-60 segundos em 14.000 RPM. O fluxo foi descartado e a coluna QIAQUICK ® foi coletada novamente no mesmo tubo. A coluna QIAQUICK ® foi centrifugada mais uma vez no tubo de 2 mL por 1 minuto para remover o tampão de lavagem residual. Cada coluna QIAQUICK ® foi colocada em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL limpo. Para eluir o DNA, 33 pL de água foram adicionados no centro da membrana QIAQUICK ® e a coluna foi centrifugada por 1 minuto a 14.000 RPM. As enzimas de restrição e o tampão relacionado foram obtidos a partir de New England BioLabs. Por exemplo, aproximadamente 5 pL de vetor pET26b (100 ng/pL), 2 pL de tampão NE 2 (New England Biolabs, 1X NEBuffer 2: NaCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM, MgCl2 10 mM, ditiotreitol 1 mM, pH 7,9 a 25 °C), 1 pL de Ndel (20.000 unidades/mL), 1 pL de Hindlll (20.000 unidades/mL) e 11 pL de água deionizada foram misturados e incubados por duas horas a 37 °C para digestão de DNA. A partir deste ponto, uma segunda etapa de purificação foi realizada usando o estojo de purificação de PCR QIAQUICK ® (QIAGEN®), com o procedimento descrito anteriormente.
[00142] A ligação foi realizada usando DNA ligase Quick T4 e tampão de reação de ligação Quick da New England BioLabs. Por exemplo, em torno de 10 ng de vetor e 30 ng de inserto em 10 pL de água deionizada foram misturados com 10 pL de tampão de reação de ligação Quick 2X (New
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England Biolabs, 132 mM Tris-HCl, MgCl2 20 mM, ditiotreitol 2mM, ATP 2 mM, 15 % de polietileno glicol, pH 7,6 a 25 °C) e 1 gL de DNA ligase Quick T4 (New England Biolabs). A reação enzimática foi incubada por 5 minutos em temperatura ambiente antes da transformação.
[00143] Para gerar LVL315, LVL317, LVL318, LVL736, LVL737, LVL738, LVL739 e LVL740, uma preparação de PCR dos componentes a seguir foi realizada: 40 gL de água deionizada, 5 gL de reação tampão 10X, 1 gL de mistura de dNTPs, 1 gL de oligonucleotídeo iniciador #1 (10 gM), 1 gL de oligonucleotídeo iniciador #2 (10 gM), 1 gL de molde (25 ng/gL) e 1 gL de DNA polimerase PfuUltra High-Fidelity 2,5 unidades/gL (QuikChange II Estojo de mutagênese sítio direcionada, Agilent Technologies, Stratagene Division) foi formulada. Reação em cadeia da polimerase envolveu um ciclo de desnaturação a 95 °C por 30 segundos, 18 ciclos de 30 segundos de desnaturação a 95 °C, 1 minuto para anelar a 55 °C, e 5 minutos e 30 segundos de extensão de oligonucleotídeo iniciador a 68 °C. Os produtos de PCR foram digeridos usando 1 gL de enzima de restrição Dpnl a 37 °C por uma hora antes da transformação.
[00144] Uma lista detalhada de sequências de oligonucleotídeo iniciador para PCR usada para amplificações é ilustrada na tabela 4.
[00145] Para gerar pRIT16711, o fragmento de gene de PE que codifica os aminoácidos 22 a 160 de SEQ ID NO. 4, que exclui a sequência que codifica seu sinal de secreção correspondente, foi amplificado por PCR a partir do DNA genômico da cepa NTHi 772. Os oligonucleotídeos iniciadores para a amplificação foram desenhados com base na sequência disponível da cepa Hi Rd (neste momento, a sequência 772 não era conhecida). A sequência de oligonucleotídeo iniciador 5' contém uma mutação comparada à sequência de NTHi 772 (sequência da maneira atualmente disponível), que introduz um aminoácido diferente na sequência codificante de PE na posição 24, ácido glutâmico (E) em vez de lisina (K). Após a amplificação por PCR, o inserto
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74/ 112 foi clonado no vetor de expressão pET-26(+) (NOVAGEN®) usando os sítios de restrição BamHI e XhoI.
[00146] Para gerar pRIT16671, um fragmento de DNA que codifica um fragmento de gene de PilA (aminoácidos 40 a 149 de SEQ ID NO. 58, SEQ ID NO. 127), que exclui seu peptídeo principal bem como uma porção da alfa hélice hidrofóbica prevista, foi amplificado a partir do DNA genômico de NTHi cepa 86-028NP e clonado no vetor de expressão pET15. O vetor pRIT16790 (que contém os aminoácidos 40 a 149 de NTHi cepa 86-028NP) foi usado como um molde para gerar o vetor pRIT16671. O fragmento de gene de PilA foi amplificado por PCR usando o vetor pRIT16790 e oligonucleotídeos iniciadores MDES PILA-3 e MDES PILA-4. O fragmento de PilA foi clonado no expressão vetor pET-26 usando os sítios de restrição NdeI/XhoI. A sequência de DNA que codifica seis aminoácidos histidina (his) foi incorporada no oligonucleotídeo iniciador 5' para adicionar seis histidinas (6xhis) na extremidade N-terminal da sequência PilA (MDES PILA-3).
[00147] Para gerar LVL312 (peptídeo sinal FlgI-E-Fragmento PilAGG-PE fragmento-GGHHHHHH), uma reação em cadeia da polimerase foi realizada para amplificar o gene PilA (aminoácidos 40-149/cepa 86-028NP) usando o vetor pRIT16671 como um molde e oligonucleotídeos iniciadores CAN534 e CAN537. A sequência de DNA que corresponde ao peptídeo sinal Flgl (sp) e aminoácido ácido glutâmico (E) foi incorporada no oligonucleotídeo iniciador 5' (CAN534). Para ligar a sequência PilA na sequência PE, a sequência de DNA que corresponde aos dois ligadores de aminoácido glicina (GG) e aos aminoácidos N-terminais de PE foi incorporada no oligonucleotídeo iniciador 3' (CAN537). Outra reação em cadeia da polimerase foi realizada para amplificar o gene PE (aminoácidos 18-160) usando o vetor pRIT16711 como um molde e oligonucleotídeos iniciadores CAN536 e CAN538. A sequência de DNA que corresponde aos aminoácidos C-terminais PilA e aminoácidos GG foi incorporada no
Petição 870190129809, de 09/12/2019, pág. 84/336 / 112 oligonucleotídeo iniciador 5' para ligar a sequência pilA à PE (CAN536). A sequência de DNA que corresponde aos ligadores de aminoácidos GG e aminoácidos 6xhis foi incorporada no oligonucleotídeo iniciador 3' (CAN538). Finalmente, para gerar LVL312, uma terceira reação em cadeia da polimerase foi realizada para amplificar os genes em fusão PilA e PE com o peptídeo sinal Flgl na terminação N, um aminoácido ácido glutâmico (E) entre Flgl e pilA, um ligador de GG entre as sequências PilA e PE e um ligador GG entre PE e os aminoácidos 6xhis na C-terminus. Para atingir esta amplificação, os produtos das duas reações em cadeia da polimerase descritos anteriormente foram usados como um molde com os oligonucleotídeos iniciadores CAN534 e CAN538. A sequência de DNA que corresponde ao sítio de restrição Ndel foi incorporada no oligonucleotídeo iniciador 5' e o sítio de restrição Hindlll foi incorporado no oligonucleotídeo iniciador 3'. O produto de PCR gerado foi então inserido no vetor de clonagem pET-26b(+) (NOVAGEN®).
[00148] Para gerar LVL291 (peptídeo sinal pelB-PE fragmento-GGfragmento PilA-GG-6xhis), uma reação em cadeia da polimerase foi realizada para amplificar o gene PE (aminoácidos 19-160) usando o vetor pRIT16711 como um molde e oligonucleotídeos iniciadores CAN544 e CAN546. A sequência de DNA que corresponde aos aminoácidos do peptídeo sinal pelB (sp) foi incorporada no oligonucleotídeo iniciador 5' (CAN544). Para ligar a sequência PilA na sequência PE, a sequência de DNA que corresponde ao ligador de aminoácidos GG e aos aminoácidos N-terminais PilA foi incorporada no oligonucleotídeo iniciador 3' (CAN546). Outra reação em cadeia da polimerase foi realizada para amplificar o gene PilA (aminoácidos 40-149 de SEQ ID NO. 58, SEQ ID NO. 127) usando o vetor pRIT16671 como um molde, com os oligonucleotídeos iniciadores CAN545 e CAN535. A sequência de DNA que corresponde aos aminoácidos C-terminais PE e aminoácidos GG foi incorporada no oligonucleotídeo iniciador 5' (CAN545)
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76/ 112 para ligar a sequência PilA na sequência PE. A sequência de DNA que corresponde ao ligador de aminoácidos GG e aminoácidos 6xhis foi incorporada no oligonucleotídeo iniciador 3' (CAN535). Finalmente, para gerar LVL291, uma terceira reação em cadeia da polimerase foi realizada para amplificar os genes PE e PilA em fusão com o peptídeo sinal pelB na terminação N, um ligador de GG entre as sequências PE e PilA e um ligador de GG entre PilA e aminoácidos 6xhis na terminação C. Para atingir esta amplificação, os produtos de duas reações em cadeia da polimerase descritos anteriormente foram usados como um molde com os oligonucleotídeos iniciadores CAN544 e CAN535. A sequência de DNA que corresponde ao sítio de restrição Ndel foi incorporada no oligonucleotídeo iniciador 5' e sítio de restrição Hindlll foi incorporado no oligonucleotídeo iniciador 3'. O produto de PCR gerado foi então inserido no vetor de clonagem pET-26b(+) (NOVAGEN®).
[00149] Para gerar LVL268 (peptídeo sinal pelB-D-PE fragmento-GGfragmento PilA-GG-6xhis), uma reação em cadeia da polimerase foi realizada para amplificar o gene PE (aminoácidos 20-160) usando o vetor pRIT16711 como um molde com os oligonucleotídeos iniciadores CAN547 e CAN546. A sequência de DNA que corresponde aos aminoácidos do peptídeo sinal pelB (sp) e ao aminoácido ácido aspártico (D) foi incorporada no oligonucleotídeo iniciador 5' (CAN547). Para ligar a sequência PilA na sequência PE, a sequência de DNA que corresponde ao ligador dos aminoácidos GG e aos aminoácidos N-terminais PilA foi incorporada no oligonucleotídeo iniciador 3' (CAN546). Outra reação em cadeia da polimerase foi realizada para amplificar o gene PilA (aminoácidos 40-149/NTHi cepa 86-028NP) usando o vetor pRIT16671 como um molde com CAN545 e CAN535. A sequência de DNA que corresponde aos aminoácidos C-terminal PE e aminoácidos GG foi incorporada no oligonucleotídeo iniciador 5' (CAN545) para ligar a sequência PilA na sequência PE. A sequência de DNA que corresponde ao ligador de
Petição 870190129809, de 09/12/2019, pág. 86/336 / 112 aminoácidos GG e aminoácidos 6xhis foi incorporada no oligonucleotídeo iniciador 3' (CAN535). Finalmente, para gerar LVL268, uma terceira reação em cadeia da polimerase foi realizada para amplificar os genes de PE e PilA em fusão com o peptídeo sinal pelB na terminação N, um D aminoácido entre peptídeo sinal pelB e PE, um ligador de GG entre as sequências PE e pilA e um ligador de GG entre PilA e aminoácidos 6xhis em C-termo. Para atingir esta amplificação, os produtos das duas reações em cadeia da polimerase descritos anteriormente foram usados como um molde com os oligonucleotídeos iniciadores CAN547 e CAN535. A sequência de DNA que corresponde ao sítio de restrição Ndel foi incorporada no oligonucleotídeo iniciador 5' e o sítio de restrição Hindlll foi incorporado no oligonucleotídeo iniciador 3'. O produto de PCR gerado foi então inserido no vetor de clonagem pET-26b(+) (NOVAGEN®).
[00150] Para gerar LVL269 (peptídeo sinal NadA-ATNDDD-PE fragmento-GG-fragmento PilA-GG-6xhis), uma reação em cadeia da polimerase foi realizada para amplificar o gene PE (aminoácidos 22-160 de SEQ ID NO. 4) usando o vetor pRIT16711 como um molde com os oligonucleotídeos iniciadores CAN548 e CAN546. A sequência de DNA que corresponde aos aminoácidos do peptídeo sinal pelB (sp) e aminoácidos ATNDDD foi incorporada no oligonucleotídeo iniciador 5' (CAN548). Para ligar a sequência PilA na sequência PE, a sequência de DNA que corresponde ao ligador de aminoácido GG e aos aminoácidos N-terminais PilA foi incorporada no oligonucleotídeo iniciador 3' (CAN546). Outra reação em cadeia da polimerase foi realizada para amplificar o gene PilA (aminoácidos 40-149 de SEQ ID NO. 58, SEQ ID NO. 127) usando o vetor pRIT16671 como um molde com os oligonucleotídeos iniciadores CAN545 e CAN535. A sequência de DNA que corresponde aos aminoácidos C-terminais PE e aminoácidos GG foi incorporada no oligonucleotídeo iniciador 5' para ligar a sequência PilA na sequência PE (CAN545). A sequência de DNA que
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78/ 112 corresponde ao ligador de aminoácidos GG e aminoácidos 6xhis foi incorporada no oligonucleotídeo iniciador 3' (CAN535). Finalmente, para gerar LVL269, uma terceira reação em cadeia da polimerase foi realizada para amplificar o gene PE e PilA em fusão com o peptídeo sinal NadA na terminação N, aminoácidos ATNDDD entre o peptídeo sinal pelB e PE, um ligador de GG entre as sequências PE e PilA e um ligador de GG entre PilA e aminoácidos 6xhis na terminação C. Para atingir esta amplificação, os produtos das duas reações em cadeia da polimerase descritos anteriormente foram usados como um molde com os oligonucleotídeos iniciadores CAN548 e CAN535. A sequência de DNA que corresponde ao sítio de restrição Ndel foi incorporada no oligonucleotídeo iniciador 5' e sítio de restrição Hindlll foi incorporado no oligonucleotídeo iniciador 3'. O produto de PCR gerado foi então inserido no vetor de clonagem pET-26b(+) (NOVAGEN®).
[00151] Para gerar LVL270 (M-6xHis-PE fragmento-GG-Fragmento PilA), uma reação em cadeia da polimerase foi realizada para amplificar o gene PE (aminoácidos 17-160) usando o vetor pRIT16711 como um molde com os oligonucleotídeos iniciadores CAN540 e CAN542. A sequência de DNA que corresponde a aminoácidos 6xhis foi incorporada no oligonucleotídeo iniciador 5' (CAN540). Para ligar a sequência PilA na sequência PE, a sequência de DNA que corresponde ao ligador de aminoácido GG e aos aminoácidos N-terminais PilA foi incorporada no oligonucleotídeo iniciador 3' (CAN542). Outra reação em cadeia da polimerase foi realizada para amplificar o gene PilA (aminoácidos 40-149/NTHi cepa 86-028NP) usando vetor pRIT16671 como um molde com os oligonucleotídeos iniciadores CAN541 e CAN543. A sequência de DNA que corresponde aos aminoácidos C-terminais de PE e aminoácidos GG foi incorporada no oligonucleotídeo iniciador 5' (CAN541) para ligar a sequência PilA em PE. Finalmente, para gerar LVL270, uma terceira reação em cadeia da polimerase foi realizada para amplificar o gene 6-his-PE-GG-PilA em fusão. Para atingir
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79/ 112 esta amplificação, os produtos das duas reações em cadeia da polimerase descritos anteriormente foram usados como um molde com os oligonucleotídeos iniciadores CAN540 e CAN543. A sequência de DNA que corresponde ao sítio de restrição Ndel foi incorporada no oligonucleotídeo iniciador 5' e sítio de restrição Hindlll foi incorporado no oligonucleotídeo iniciador 3'. O produto de PCR gerado foi então inserido no vetor de clonagem pET-26b(+) (NOVAGEN®).
[00152] Para gerar LVL315 (peptídeo sinal pelB-MD-PE fragmentoGG-Fragmento PilA-GG-6xhis), uma mutagênese sítio direcionada foi realizada para mudar a sequência N-terminal PE de aminoácidos de QIQ a MD usando LVL291 como um molde, com os oligonucleotídeos iniciadores CAN670 e CAN671 e o estojo de mutagênese sítio direcionada QuikChange II (Agilent Technologies, Stratagene Division).
[00153] Para gerar LVL317 (peptídeo sinal pelB-PE fragmento-GGfragmento PilA), uma mutagênese sítio direcionada foi realizada para incorporar um códon de parada entre o gene PilA e a sequência de DNA que corresponde aos resíduos de aminoácido GGHHHHHH (SEQ ID NO: 3) usando LVL291 como um molde, com os oligonucleotídeos iniciadores CAN678 e CAN679 e o estojo de mutagênese sítio direcionada QuikChange II (Agilent Technologies, Stratagene Division).
[00154] Para gerar LVL318 (peptídeo sinal pelB-MD-PE-GG-PilA), uma mutagênese sítio direcionada foi realizada para incorporar um códon de parada entre o gene PilA e a sequência de DNA que corresponde aos resíduos de aminoácido GGHHHHHH (SEQ ID NO: 3) usando LVL315 como um molde, com os oligonucleotídeos iniciadores CAN678 e CAN679 e o estojo de mutagênese sítio direcionada QuikChange II (Agilent Technologies, Stratagene Division).
[00155] Para gerar LVL702 (LVL291 AQ), uma reação em cadeia da polimerase foi realizada usando o vetor LVL291 como molde e os
Petição 870190129809, de 09/12/2019, pág. 89/336 / 112 oligonucleotídeos iniciadores CAN1517 e CAN1518. A eliminação de três nucleotídeos que corresponde ao aminoácido Q na posição 23 na sequência LVL291 foi incorporada no oligonucleotídeo iniciador 5'. A única diferença entre LVL702 e LVL291 é a eliminação de aminoácido Q na posição 23 na sequência LVL291. Os sítios de restrição Ndel e Hindlll foram incorporados nos oligonucleotídeos iniciadores 5' e 3', respectivamente. O produto de PCR gerado foi então inserido no vetor de clonagem pET-26b(+) (NOVAGEN®). [00156] Para gerar LVL735 (LVL317 AQ), uma reação em cadeia da polimerase foi realizada usando o vetor LVL317 como molde e os oligonucleotídeos iniciadores CAN1517 e CAN1519. A eliminação de três nucleotídeos que correspondem ao aminoácido Q na posição 23 na sequência LVL317 foi incorporada no oligonucleotídeo iniciador 5'. A única diferença entre LVL735 e LVL317 é a eliminação do aminoácido Q na posição 23 na sequência LVL317. Os sítios de restrição Ndel e Hindlll foram incorporados nos oligonucleotídeos iniciadores 5' e 3' respectivamente. O produto de PCR gerado foi então inserido no vetor de clonagem pET-26b(+) (NOVAGEN®). [00157] Para gerar LVL736 (LVL291 + SA), uma mutagênese sítio direcionada foi realizada para adicionar aminoácidos S e A entre os aminoácido 22 e 23 na sequência LVL291. LVL291 foi usado como molde com os oligonucleotídeos iniciadores CAN1531 e CAN1532 e o estojo de mutagênese sítio direcionada QuikChange II (Agilent Technologies, Stratagene Division).
[00158] Para gerar LVL737 (LVL291 + A), uma mutagênese sítio direcionada foi realizada para adicionar o aminoácido A entre o aminoácido 22 e 23 na sequência LVL291. LVL291 foi usado as molde com os oligonucleotídeos iniciadores CAN1529 e CAN1530 e o estojo de mutagênese sítio direcionada QuikChange II (Agilent Technologies, Stratagene Division).
[00159] Para gerar LVL738 (LVL291 AQIQ), uma mutagênese sítio
Petição 870190129809, de 09/12/2019, pág. 90/336 /112 direcionada foi realizada para eliminar os aminoácidos Q, I e Q nas posições 23 a 25 na sequência LVL291. LVL291 foi usado as molde com os oligonucleotídeos iniciadores CAN1523 e CAN1524 e o estojo de mutagênese sítio direcionada QuikChange II (Agilent Technologies, Stratagene Division).
[00160] Para gerar LVL739 (LVL291 AQIQK), uma mutagênese sítio direcionada foi realizada para eliminar aminoácidos Q, I, Q e K nas posições 23 a 26 na sequência LVL291. LVL291 foi usado as molde com os oligonucleotídeos iniciadores CAN1525 e CAN1526 e o estojo de mutagênese sítio direcionada QuikChange II (Agilent Technologies, Stratagene Division).
[00161] Para gerar LVL740 (LVL291 AQIQKA), uma mutagênese sítio direcionada foi realizada para eliminar aminoácidos Q, I, Q, K e A nas posições 23 a 27 na sequência LVL291. LVL291 foi usado as molde com os oligonucleotídeos iniciadores CAN1527 e CAN1528 e o estojo de mutagênese sítio direcionada QuikChange II (Agilent Technologies, Stratagene Division).
[00162] Para gerar LVL778 (LVL736 A6xHis tag), LVL779 (LVL737 A6xHis tag), LVL780 (LVL738 A6xHis tag), LVL781 (LVL739 A6xHis tag) e LVL782 (LVL740 A6xHis tag), uma reação em cadeia da polimerase foi realizada usando os vetores LVL736, LVL737, LVL738, LVL739 e LVL740 como molde, respectivamente, com os oligonucleotídeos iniciadores CAN1669 e CAN543. A eliminação de 6xHis tag corresponde à sequência de aminoácidos GGHHHHHH (SEQ ID NO. 3) nas sequências C-terminais. Esta eliminação foi incorporada no oligonucleotídeo iniciador 3'. Os sítios de restrição Ndel e Hindlll foram incorporados nos oligonucleotídeos iniciadores 5' e 3' respectivamente. O produto de PCR gerado foi então inserido no vetor de clonagem pET-26b(+) (NOVAGEN®).
Tabela 4: Sequências de oligonucleotídeo iniciador para PCR usadas para as
Petição 870190129809, de 09/12/2019, pág. 91/336 / 112 amplificações de PE, PilA e PE-PilA.
Oligonucleotídeo iniciador ID Sequência de DNA 5’ - 3’
CAN534 CACACACATATGATTAAATTTCTCTCTGCATTAATTCTTCTACTG GTCACGACGGCGGCTCAGGCTGAGACTAAAAAAGCAGCGGTAT CTG (SEQ ID NO. 155)
CAN535 TGTGTGAAGCTTTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGCCGCCTTGTG TGACACTTCCGCAAAAATTTGC (SEQ ID NO. 156)
CAN536 TTTGCGGAAGTGTCACACAAGGCGGCGCGCAGATTCAGAAGGC TGAACAAAATGATGT (SEQ ID NO. 157)
CAN537 ACATCATTTTGTTCAGCCTTCTGAATCTGCGCGCCGCCTTGTGTG ACACTTCCGCAAA (SEQ ID NO. 158)
CAN538 TGTGTGAAGCTTTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGCCGCCTTTTTT ATCAACTGAAAATG (SEQ ID NO. 159)
CAN540 CACACACATATGCACCACCACCACCACCACAGCGCGCAGATTC AGAAGGCTGAACAAAATGATGT (SEQ ID NO. 160)
CAN541 CATTTTCAGTTGATAAAAAAGGCGGCACTAAAAAAGCAGCGGT ATC (SEQ ID NO. 161)
CAN542 GATACCGCTGCTTTTTTAGTGCCGCCTTTTTTATCAACTGAAAAT G (SEQ ID NO. 162)
CAN543 TGTGTGAAGCTTTTATTGTGTGACACTTCCGCAAA (SEQ ID NO. 163)
CAN544 CACACACATATGAAATACCTGCTGCCGACCGCTGCTGCTGGTCT GCTGCTCCTCGCTGCCCAGCCGGCGATGGCCCAGATTCAGAAGG CTGAACAAAATGATGT (SEQ ID NO. 164)
CAN545 GCATTTTCAGTTGATAAAAAAGGCGGCACTAAAAAAGCAGCGG TATCTG (SEQ ID NO. 165)
CAN546 CAGATACCGCTGCTTTTTTAGTGCCGCCTTTTTTATCAACTGAAA ATGC (SEQ ID NO. 166)
CAN547 CACACACATATGAAATACCTGCTGCCGACCGCTGCTGCTGGTCT GCTGCTCCTCGCTGCCCAGCCGGCGATGGCCGATATTCAGAAGG CTGAACAAAATGATGT(SEQ ID NO. 167)
CAN548 CACACACATATGAAACACTTTCCATCCAAAGTACTGACCACAGC CATCCTTGCCACTTTCTGTAGCGGCGCACTGGCAGCCACAAACG ACGACGATAAGGCTGAACAAAATGATG (SEQ ID NO. 168)
CAN670 GCCGGCGATGGCCATGGATAAGGCTGAACAAAATG (SEQ ID NO. 169)
CAN671 CATTTTGTTCAGCCTTATCCATGGCCATCGCCGGC (SEQ ID NO. 170)
CAN678 GGAAGTGTCACACAATAAGGCGGCCACCACCACC (SEQ ID NO. 171)
CAN679 GGTGGTGGTGGCCGCCTTATTGTGTGACACTTCC (SEQ ID NO. 172)
CAN1517 GATATACATATGAAATACCTGCTGCCGACCGCTGCTGCTGGTCT GCTGCTCCTCGCTGCCCAGCCGGCGATGGCCATTCAGAAGGCTG AACAAAA(SEQ ID NO. 205)
CAN1518 GGCCGCAAGCTTTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGCCGCC(SEQ ID NO. 206)
CAN1519 GGCCGCAAGCTTTTATTGTGTGACACTTCC(SEQ ID NO. 207)
CAN1523 GCTGCCCAGCCGGCGATGGCCAAGGCTGAACAAAATGATGTG (SEQ ID NO. 208)
CAN1524 CACATCATTTTGTTCAGCCTTGGCCATCGCCGGCTGGGCAGC (SEQ ID NO. 209)
CAN1525 GCTGCCCAGCCGGCGATGGCCGCTGAACAAAATGATGTGAAGC (SEQ ID NO. 210)
CAN1526 GCTTCACATCATTTTGTTCAGCGGCCATCGCCGGCTGGGCAGC (SEQ ID NO. 211)
CAN1527 GCTGCCCAGCCGGCGATGGCCGAACAAAATGATGTGAAGCTGG (SEQ ID NO. 212)
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CAN1528 CCAGCTTCACATCATTTTGTTCGGCCATCGCCGGCTGGGCAGC (SEQ ID NO. 213)
CAN1529 GCTGCCCAGCCGGCGATGGCCGCCCAGATTCAGAAGGCTGAAC (SEQ ID NO. 214)
CAN1530 GTTCAGCCTTCTGAATCTGGGCGGCCATCGCCGGCTGGGCAGC (SEQ ID NO. 215)
CAN1531 GCTGCCCAGCCGGCGATGGCCAGCGCCCAGATTCAGAAGGCTG AAC (SEQ ID NO. 216)
CAN1532 GTTCAGCCTTCTGAATCTGGGCGCTGGCCATCGCCGGCTGGGCA GC (SEQ ID NO. 217)
CAN1669 CACACACATATGAAATACCTGCTGCCGACC (SEQ ID NO. 218)
MDesPILA-3 GAATTCCATATGCACCATCACCATCACCATACTAAAAAAGCAGC GGTATCTGAA (SEQ ID NO. 173)
MDesPILA-4 GCGCCGCTCGAGTCATTGTGTGACACTTCCGC (SEQ ID NO. 174)
MnoNTHi-44 GCCCAGCCGGCGATGGCCCAGATCCAGAAGGCTGAACAAAATG (SEQ ID NO. 175)
MnoNTHi-45 CATTTTGTTCAGCCTTCTGGATCTGGGCCATCGCCGGCTGGGC (SEQ ID NO. 176)
Transformação [00163] As células de Escherichia coli BLR (DE3) ou E. coli HMS (DE3) foram transformadas com DNA plasmidial de acordo com métodos padrões com células tratadas com CaCl2. (Hanahan D. « Plasmid transformation by Simanis. » em Glover, D. M. (Ed), DNA cloning. IRL Press London. (1985): p. 109-135.). Resumidamente, as células competentes BLR (DE3) ou HMS174(DE3) foram descongeladas ao poucos no gelo. Aproximadamente 4 pL de plasmídeo (10-100 ng) foram misturados usando 50-100 pL de células competentes. A partir deste ponto, esta formulação foi incubada no gelo por 30 minutos. Para realizar a reação de transformação, a formulação foi pulsada termicamente a 420C por 45 segundos, e a seguir foi incubada no gelo por 2 minutos. Aproximadamente 0,5 mL de meio SOC (caldo Super Optimal com repressão de catabólito) foram adicionados às células transformadas e a cultura de células foi incubada a 37 °C por uma hora antes de ser plaqueada em ágar Luria-Bertani (LB) com 50 ug/mL de canamicina. Em torno de 100 pL de cultura de célula transformada foram plaqueados e incubados por toda a noite a 37 °C.
[00164] BLR (DE3): BLR é um derivado recA~de BL21 (F- ompT hsdSB(rB- mB-) gal dcm (DE3). Esta cepa de E. coli usada para a expressão de proteínas recombinantes melhora os rendimentos do monômero de
Petição 870190129809, de 09/12/2019, pág. 93/336 / 112 plasmídeo e pode auxiliar na estabilização dos plasmídeos alvo que contêm sequências repetidas, ou cujos produtos podem causar a perda do pró-fago DE3. (Studier, F.W. (1991) J. Mol. Biol. 219: 37-44). O genótipo detalhado de E.coli BLR (DE3) foi publicado por NOVAGEN®. (F- ompT hsdSB (rBmB-) gal dcm A(srl-recA)306::Tn10 (TetR) (DE3).
[00165] HMS174 (DE3): as cepas HMS174 fornecem a mutação recA em um fundo K-12. Assim como BLR, estas cepas podem estabilizar certos genes alvo cujos produtos podem causar a perda do pró-fago DE3. O genótipo detalhado de E.coli HMS174 (DE3) foi publicado por NOVAGEN®. (FrecAl hsdR(rK12- mK12+) (DE3) (Rif R ).
Produção usando BLR (DE3) e caracterização de construtos marcados com His são descritas no exemplo 3 até o exemplo 6
Exemplo 3: Expressão de proteína usando frasco de agitação [00166] Em geral, uma placa de ágar confluente inoculada com Escherichia coli BLR (DE3) transformada com plasmídeo recombinante foi raspada, ressuspensa em meio de cultura e usada para inocular 800 mL de caldo LB (Becton, Dickinson and Company) ±1 % (peso/volume, p/v) glicose (Laboratoire MAT, número de catálogo: GR-0101) e 50 pg/mL de canamicina (Sigma) para obter O.D.600nm entre 0,1 e 0,2. As culturas foram incubadas a 37 °C com agitação de 250 RPM para atingir uma O.D.600nm de ~0,8.
[00167] Um mL de cada cultura foi então coletado, centrifugado a 14.000 RPM por 5 minutos e os sobrenadantes e precipitados foram congelados a -20 °C, separadamente.
[00168] Em uma O.D.600nm ~0.8, as culturas de BLR (DE3) foram resfriadas (-20 °C, 20 minutos ou 4 °C, 1 hora, preferivelmente a 4 °C por 1 hora) antes de induzir a expressão da proteína recombinante pela adição de isopropil P-D-1-tiogalactopiranosídeo 1 mM (IPTG; EMD Chemicals Inc., número de catálogo: 5815) e incubação por toda a noite a 16, 22 e 30 °C, ou 3
Petição 870190129809, de 09/12/2019, pág. 94/336 / 112 horas a 37 °C com agitação de 250 RPM, preferivelmente por toda a noite a 22 °C. Após o período de indução, as culturas foram centrifugadas em 14.000 RPM por 5 minutos ou 6.000 RPM por 15 minutos, e o sobrenadante (amostra da fração do meio) e os precipitados (contendo a fração solúvel e insolúvel) foram congelados a -20 °C separadamente.
[00169] Estas condições são usadas para a expressão de proteína periplasmática.
Exemplo 4: Purificação de proteína usando frasco de agitação, pastas de célula, construtos marcados com His tag [00170] Cada precipitado bacteriano obtido após a indução foi ressuspenso em tampão de ácido 4-(2-hidroxietil)-1piperazinaetanossulfônico 20 mM (HEPES) (pH 8,0) contendo NaCl 500 mM, imidazol 10 mM e coquetel inibidor de protease Roche COMPLETE® (1 comprimido/50 mL de tampão HEPES contendo NaCl 500 mM, comprimidos Roche COMPLETE® ULTRA, Roche Diagnostics Corporation).
[00171] Alternativamente, o tampão bicina 20 a 50 mM pode ser usado em vez de tampão HEPES contendo NaCl. Por exemplo, o tampão bicina 20 mM pode ser usado. As bactérias foram lisadas usando um sistema constante 1.1 KW 2 X 30.000 PSI (libras por polegada quadrada). Os componentes solúveis (sobrenadante) e insolúveis (precipitados) foram separados por centrifugação a 20.000g por 20 minutos a 4 °C.
[00172] As proteínas marcadas com 6-His foram purificadas em condições naturais na cromatografia por afinidade de metal imobilizado (IMAC), usando o protocolo de purificação de proteína PROFINIA™ (BioRad Laboratories, Inc.). Os componentes solúveis foram preenchidos em uma coluna de 5 mL His Trap (Bio-Rad Laboratories, Inc.) pré-equilibrada com o mesmo tampão usado para ressuspensão bacteriana; os componentes solúveis foram adicionados em até 5 mL/min (produzindo uma “fração de fluxo”) Após o preenchimento na coluna, a coluna foi lavada com 10 volumes de
Petição 870190129809, de 09/12/2019, pág. 95/336 / 112 coluna do mesmo tampão, em uma taxa de 10 mL/min (produzindo uma “fração de lavagem #1). Uma segunda lavagem usando tampão bicina 20 mM ou tampão HEPES 20 mM (pH 8,0) contendo NaCl 500 mM e imidazol 20 mM foi realizada, produzindo uma “fração de lavagem #2). A eluição foi realizada usando 2 volumes de coluna de tampão HEPES 20mM ou tampão bicina 50mM (pH 8,0), contendo NaCl 500 mM e imidazol 250 mM em uma taxa de 10 mL/min, produzindo um “fração de eluição”.
[00173] Para melhorar a pureza da proteína, as frações de eluição positivas de IMAC foram agrupadas e preenchidas em uma coluna de cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) (HILOADTM SUPERDEXTM 200 26/60 da GE Healthcare) pré-equilibrada em salina tamponada com fosfato sem cálcio ou magnésio (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 8,1 mM, KH2PO4 1,47 mM, pH 7,4). As amostras das frações de eluição foram analisadas por eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio e poliacrilamida (SDS-PAGE). As amostras foram concentradas usando Centricon 10 000 MW (Millipore).
[00174] A concentração de proteína foi determinada usando espectrômetro.
Exemplo 5: Análise de SDS-PAGE e Western Blot dos construtos marcados com His & análise SDS-PAGE dos construtos LVL317 & LVL318 construtos não marcados com His
Preparação da _fração solúvel e insolúvel [00175] Por exemplo, 1 mL de cultura após indução (ver, por exemplo, Exemplo 3 anterior) foi centrifugado em 14.000 RPM por 2 minutos. O precipitado foi ressolubilizado usando 40 gL de reagente de extração de proteína BUGBUSTER®(NOVAGEN®, EMD4 Biosciences, Merck), criando uma suspensão celular. A suspensão celular foi incubada em uma plataforma de rotação por 10 minutos em temperatura ambiente. A suspensão celular foi então centrifugada a 14.000 RPM por 2 minutos para separar a fração solúvel.
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O precipitado resultante (a fração insolúvel) foi ressolubilizada usando 70 pL de água deionizada, 5 pL de ditiotreitol (DTT) 1M e 25 pL de NUPAGE® LDS (Dodecil sulfato de lítio)e tampão da amostra 4X (INVITROGEN™). A fração solúvel (sobrenadante da suspensão celular do precipitado ressolubilizado) foi adicionada em 30 pL de água deionizada, 5 pL de DTT 1M e 25 pL de tampão da amostra LDS 4X.
Preparação da _ fração dos meios [00176] Por exemplo, para preparar a fração dos meios, 100 pL do sobrenadante a partir da cultura de células completamente induzidas após a centrifugação (ver, por exemplo, exemplo 3 anterior) foram concentrados adicionando 500 pL do reagente RC I (Bio-Rad Laboratories, Inc.); a amostra foi misturada e incubada por 1 minuto em temperatura ambiente. A seguir, 500 pL de Reagent II (Bio-Rad Laboratories, Inc.) foram adicionados à amostra e misturados. Esta formulação foi centrifugada em 14.000 RPM por 10 minutos. O precipitado foi ressolubilizado usando 28 pL de água deionizada, 2 pL de DTT 1M e 10 pL de LDS SB 4X.
Preparação da _fração de purificação [00177] Por exemplo, as proteínas purificadas (por exemplo, obtidas da maneira descrita no exemplo 4) foram preparadas por análise de SDS-PAGE adicionando 70 pL de amostra, 5 pL de DTT 1M e 25 pL de tampão de amostra LDS 4X.
Análise SDS-PAGE e transferência para membrana de nitrocelulose [00178] A análise SDS-PAGE e a transferência para a membrana de nitrocelulose foram realizadas de acordo com as recomendações do fabricante (Invitrogen) usando géis NUPAGE® Bis-Tris 4-12 %. As preparações das amostras, tampões e condições de migração foram realizadas em condições recomendadas pelos fornecedores.
[00179] Em um exemplo, o gel foi preenchido com uma amostra de 20 uL de uma mistura principal compreendendo 70 pL de uma fração de proteína
Petição 870190129809, de 09/12/2019, pág. 97/336 / 112 purificada, 5 pL de DTT 1M e 25 pL de LDS SB 4X.
[00180] Após as amostras serem corridas em géis NUPAGE® Bis-Tris
4-12 %, as proteínas foram transferidas para as membranas de nitrocelulose.
[00181] As membranas de nitrocelulose foram bloqueadas por 30 minutos a 37 oC, 60 RPM, usando solução nova de 3 % leite/PBS 1X. Após a incubação com bloqueio, os anticorpos primários foram adicionados (anticorpo 6X His Tag®, Abcam PLC, número de catálogo: ab9108) em uma diluição de: 1:1.000 em solução nova de 3 % leite/PBS 1X por 1 hora a 37 oC, 60 RPM. Após isto, as membranas foram lavadas três vezes, por 5 minutos cada, em temperatura ambiente usando 0,02 % de polissorbato 20 (por exemplo, TWEENTM 20)/PBS 1X. Os anticorpos secundários (fosfatase alcalina (AP) anti-IgG (H+L) de coelho, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) foram adicionados em diluição 1:14.000 usando solução nova de 3 % leite/PBS 1X. As membranas foram incubadas por 1 hora a 37 oC, 60 RPM. Após isto, as membranas foram lavadas três vezes por 5 minutos em temperatura ambiente usando 0,02 % de polissorbato 20 (por exemplo, TWEENTM 20)/PBS 1X antes das exposições da membrana em 5-bromo-4cloro-3-indolil fosfato/nitro azul tetrazólio (por exemplo, BCIP®/NBT da Sigma-Aldrich®, 1 comprimido/10 mL água).
[00182] Ver a figura 1 para SDS-PAGE de extratos bacterianos induzidos para os construtos de proteína de fusão LVL291, LVL268 e LVL269. A fração insolúvel (I), fração solúvel (S) e fração de meio de cultura (M) foram carregadas para LVL291, LVL268 e LVL269 antes e após indução (ind).
[00183] Ver a figura 2 para SDS-PAGE e Western blot relacionado aos extratos de purificação para os construtos de proteína de fusão LVL291, LVL268 e LVL269. Fração de fluxo (Ft), fração de lavagem (W) e fração de eluição (E) foram carregadas para purificação de LVL291, LVL268 e LVL269. Anti-his tag foi usado para sondar extratos.
Petição 870190129809, de 09/12/2019, pág. 98/336 / 112 [00184] Ver a figura 3 para SDS-PAGE de extratos bacterianos induzidos e de purificação para os construtos de proteína de fusão LVL291 e LVL315. Fração de meio de cultura (M), fração solúvel (Sol), fração insolúvel (Ins), fração de fluxo (Ft), fração de lavagem #1 (W1), fração de lavagem #2 (W2) e fração de eluição (E) foram carregadas para LVL291 e LVL315.
[00185] Ver a figura 4 para SDS-PAGE de extratos bacterianos induzidos e de purificação para construto de proteína de fusão LVL312. fração de meio de cultura (M), fração solúvel (Sol), fração insolúvel (Ins), fração de fluxo (Ft), fração de lavagem #1 (W1), fração de lavagem #2 (W2) e fração de eluição (E) foram carregadas para LVL312.
[00186] Ver a figura 25 para SDS-PAGE das frações solúveis dos extratos bacterianos induzidos para os construtos de vetor de proteína de fusão LVL291, LVL702, LVL736, LVL737, LVL738, LVL739, LVL740 e pET26b (controle negativo). (A) Experimento 1 (b) Experimento 2 (c) Experimento 3. A proteína de fusão PE-PilA indicada pela seta.
[00187] Ver a figura 26 para o percentual médio de banda de proteína de fusão na fração solúvel dos experimentos 1, 2 e 3.
[00188] Os extratos bacterianos LVL317 e LVL318 usados na análise SDS-PAGE na figura 5 e figura 6, respectivamente, foram preparados em geral da maneira descrita anteriormente.
[00189] A figura 5 descreve SDS-PAGE de extratos bacterianos induzidos (IPTG 1mM e 10μΜ) para o construto de proteína de fusão LVL317. Os extratos de antes (NI) e após a indução (In), fração solúvel (S), fração insolúvel (I).
[00190] A figura 6mostra SDS-PAGE de extratos bacterianos induzidos (IPTG 1mM e 10μΜ) para o construto de proteína de fusão LVL318. Os extratos de antes (NI) e após a indução (In), fração de meio de cultura (M), fração solúvel (S), fração insolúvel (I).
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90/112 [00191] As proteínas separadas por SDS-PAGE foram transferidas para uma membrana Immobilon-P. As bandas de proteína coradas com azul de Coomassie foram cortadas e colocadas em um reator sequenciador. O sequenciamento foi realizado de acordo com o protocolo do fabricante, usando um sequenciador de proteínas Applied Biosystems PROCISE®, modelo 494-cLC.
Tabela 5: Perfis da expressão de proteína no frasco de agitação e clivagem do peptídeo sinal para os construtos de proteína de fusão.
ID do construto de proteína de fusão Descrição terminação N ~^> terminação C Perfis de expressão de proteína Clivagem de peptídeo sinal
LVL312 Figi sp - E - Fragmento PilA - GG - PE fragmento -GGHHHHHH In: +++ So: + Se: + Confirmado
FVE291 PelB sp - PE fragmento - GG - Fragmento PilA GGHHHHHH In: +++ So: ++ Se: + Confirmado
FVE268 PelB sp - D - PE fragmento - GG - Fragmento PilA -GGHHHHHH In: +++ So: ++ Se: + Confirmado
FVE269 NadA sp - ATNDDD - PE fragmento - GG Fragmento PilA - GGHHHHHH In: +++ So: ++ Se: + Confirmado
FVE270 MHHHHHH - PE fragmento - GG - Fragmento PilA In: + So: Se: - Não testado
LVL315 PelB sp - MD - PE fragmento - GG - Fragmento PilA - GGHHHHHH In: +++ So: ++ Se: + Confirmado
LVL317 PelB - PE fragmento - GG - Fragmento PilA In: +++ So: + Se: Nt Confirmado
LVL318 PelB sp - MD - PE fragmento - GG - Fragmento PilA In: +++ So: + Se: -
LVL702 PelB sp - PE fragmento - GG - Fragmento PilA GGHHHHHH In: +++ So: ++ Se: Nt Confirmado
FVE736 PelB sp - PE fragmento - GG - Fragmento PilA GGHHHHHH In: +++ So: ++ Se: Nt Confirmado
FVE737 PelB sp - PE fragmento - GG - Fragmento PilA GGHHHHHH In: +++ So: ++ Se: Nt Confirmado
FVE738 PelB sp - PE fragmento - GG - Fragmento PilA GGHHHHHH In: +++ So: ++ Se: Nt Confirmado
FVE739 PelB sp - PE fragmento - GG - Fragmento PilA GGHHHHHH In: +++ So: ++ Se: Nt Confirmado
FVE740 PelB sp - PE fragmento - GG - Fragmento PilA GGHHHHHH In: +++ So: ++ Se: Nt Confirmado
So = Fração solúvel. In = Fração insolúvel. Se = Proteína secretada na fração dos meios. Nt = Não testado. A classificação a seguir foi baseada na inspeção visual (coomassie) +: pouca expressão; ++: média expressão; +++: muita expressão; nenhuma expressão
Exemplo 6: Caracterização de proteína de fusão LVL291
PROPRIEDADES FÍSICAS DE LVL291: Dobramento de PE e PilA em
EVL291 & ponto de fusão
Dicroísmo circular:
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Análise de Estrutura secundária [00192] O dicroísmo circular (CD) é usado para determinar a composição de estrutura secundária de uma proteína medindo a diferença na absorção de luz polarizada à esquerda versus luz polarizada à direita, que é em virtude da assimetria estrutural. A forma e a magnitude do espectro CD na região far-UV (190-250nm) são diferentes se uma proteína exibe uma estrutura em folha, alfa-hélice ou bobina aleatória. A abundância relativa de cada tipo de estrutura secundária em uma dada amostra de proteína pode ser calculada por comparação com os espectros de referência.
[00193] Os espectros de far-UV são medidos usando uma via ótica de 0,01cm de 178 a 250nm, com uma resolução de 1nm e largura de banda em um espectropolarímetro Jasco J-720. A temperatura da célula é mantida a 23 °C por um bloco de células Peltier thermostated RTE-111. Um fluxo de nitrogênio de 10 L/min é mantido durante as medições.
Resultados:
[00194] Os espectros de far-UV CD obtidos para PE (a partir do construto pRIT16762), PilA (a partir do construto pRIT 16790) e as proteínas PE-PilA são característicos de proteínas dobradas contendo uma mistura de estruturas alfa e beta, mas PE é significativamente mais enriquecido em alfa hélice do que PilA e PE-PilA (Figura 7, espectros CD de proteínas de fusão PE, PilA e PE-PilA).
[00195] A fim de avaliar a integridade do dobramento das proteínas individuais PE e PilA, uma vez ligadas juntas em uma proteína quimérica, e a seguir verificar uma possível interação entre ambas, os espectros de diferença foram calculados.
[00196] Quando os espectros PE e PilA far-UV são combinados, o espectro resultante se sobrepõe ao espectro de quimera PE-PilA (Figura 8, Combinação de espectro de PE e PilA CD). Este resultado sugere que a quimera PE-PilA contém todas as estruturas secundárias que são detectadas
Petição 870190129809, de 09/12/2019, pág. 101/336 / 112 nos componentes individuais. Sugere-se também que a fusão das proteínas não apresenta nenhum impacto principal nas estruturas secundárias dos componentes individuais, e consequentemente que o dobramento de PE e PilA não é significativamente diferente se as proteínas forem separadas ou em fusão.
Avaliação do ponto de _fusão:
[00197] A fim de avaliar se a expressão em fusão apresenta um impacto nas propriedades termodinâmicas das proteínas individuais, os pontos de fusão de PE, PilA e PE-PilA foram avaliados monitorando o desdobramento da alfa hélice com temperatura por dicroísmo circular.
[00198] A presença de alfa hélice é caracterizada por um mínimo no sinal de dicroísmo circular qm 222nm, assim, um aumento significativo no sinal de CD em 222nm durante o aumento da temperatura é uma indicação de desnaturação de proteína. A determinação da temperatura na qual a proteína se submete à perda da estrutura secundária permite a determinação do ponto de fusão (Tm), o que corresponde à temperatura na qual metade das proteínas apresenta perda de sua estrutura.
[00199] O ponto de fusão pode ser determinado por identificação do ponto de inflexão na curva de desnaturação térmica, a partir de um gráfico da temperatura versus CD 222nm.
[00200] O ponto de fusão de PilA e PE, da maneira determinada por far-UV CD, são respectivamente de 52 °C e 68 °C (Figura 9, curva de desnaturação térmica de PilA; Figura 10, curva de desnaturação térmica de PE).
[00201] A proteína de fusão PE-PilA exibe duas Tm's distintas a 48 °C e 71 °C (Figura 11, curva de desnaturação térmica de proteína de fusão PEPilA). Estes valores indicam que as proteínas PE e PilA ainda são independentemente dobradas quando ligadas em uma quimera, e que são desdobradas em uma temperatura similar se forem separadas ou em fusão. A
Petição 870190129809, de 09/12/2019, pág. 102/336 / 112 observação que o desdobramento da porção PilA a 48 °C não causa precipitação ou impacto na Tm da porção PE a 71 °C é uma forte indicação de que a interação entre PE e PilA na fusão é mínima, e que não apresenta um impacto principal observável uma na outra. Os pontos de fusão de proteínas são sensíveis em várias condições externas, incluindo composição tampão ou presença de moléculas de interação; em que nenhuma variação principal é observada mediante a fusão de PE e PilA, que é um forte indicativo da conservação de muitas estruturas e das propriedades tanto de PE quanto de PilA quando são ligadas juntas.
Exemplo 7: Processo de fermentação [00202] As proteínas de fusão da invenção podem ser preparadas por métodos conhecidos pelos versados na técnica.
Exemplo 8: Purificação de proteína de PE, PilA, e LVL317
Purificação de proteína PE a partir de pR!T16762:
[00203] Para gerar o vetor de expressão pRIT16762, o vetor pRIT16711 foi digerido usando as enzimas de restrição BamHI e NcoI a fim de eliminar os resíduos do aminoácido 6 entre a sequência sinal (pelB) e PE. O vetor obtido foi denominado pRIT16712. Neste vetor, existem 3 aminoácidos entre a sequência sinal pelB e PE: MDP. Em uma segunda etapa, uma mutagênese sítio direcionada foi realizada para alterar a sequência de aminoácidos de MDP a QIQ usando pRIT16712 como molde, com os oligonucleotídeos iniciadores MnoNTHi-44 e MnoNTHi-45 (descritos na tabela 4) e o estojo de mutagênese sítio direcionada QuikChange II (Agilent Technologies, Stratagene Division).
[00204] A amostra de referência de E. coli BLR(DE3) contendo PE QIQ (do construto pRIT16762) foi descongelada a partir de -80 °C e foi usada para preparar 100 mL de pré-cultura em caldo LB, com incubação por toda a noite a 37 °C em agitação a 215 RPM. Após incubação por toda a noite, oito frascos contendo 800 mL de LB APS foram inoculados com 12,5 mL de pré
Petição 870190129809, de 09/12/2019, pág. 103/336 / 112 cultura e OD600 medida em torno de 0,06. As culturas foram incubadas por 3 horas a 37 °C com agitação. Em uma OD600 em torno de 0,9, IPTG 1mM foi adicionado para iniciar a indução. Durante a indução, as culturas foram incubadas 19 horas a 22 °C com agitação. Após indução, OD600 estava em torno de 2,2. As culturas de células foram transferidas para tubos de centrífugas de 1L colocadas dentro de garrafas de 1L, e centrifugadas a 4 °C por 30 minutos a 6.000 x g e o sobrenadante foi descartado. As alíquotas de 1mL de cultura pré e pós-indução e o sobrenadante foram mantidos para análise futura.
Lise de BLR(DE3) induzida com PE QIQ [00205] As bolsas de centrífuga foram removidas a partir das garrafas de centrifugação, abertas e o precipitado foi retirado da bolsa para um béquer. Os oito precipitados foram agrupados e ressuspensos em 100 mL de tampão de ligação (Hepes 20mM, imidazol 10mM, NaCl 500mM, pH 8,01). A E.coli BLR (DE3) contendo o construto PE QIQ foi rompida com o TS Series Bench Top cell disrupter da Constant Systems Ltd. (1 x 30 kPsi; 1 x 15 kPsi). O lisado foi centrifugado 30 minutos, 6.000 RPM, 4 °C. O sobrenadante foi mantido e colocado em uma coluna IMAC.
Purificação IMAC de PE QIQ [00206] A coluna IMAC (BioRad, Bio-Scale Mini Profinity IMAC cartucho de 5 mL) foi equilibrada com 5CV de tampão de ligação (HEPES 20mM, imidazol 10mM, NaCl 500mM, pH 8,01) em 5 mL/minutos. 100 mL do sobrenadante lisado foram colocados na IMAC em 2,5 mL/minuto. O fluxo foi coletado em frações de 50 mL para análise futura. A coluna foi lavada com 3CV de tampão de ligação para remover a proteína ligada. A amostra contendo proteínas não ligadas foi coletada em uma alíquota de 15 mL em um tubo de 50 mL. A coluna foi lavada com 2CV de tampão de lavagem (HEPES 20mM, imidazol de 20mM, NaCl 500mM, pH 8,01) coletado em frações de 2 mL em uma placa de 96 poços. A proteína ligada foi
Petição 870190129809, de 09/12/2019, pág. 104/336 / 112 eluída com 6CV de tampão de eluição 100 % (HEPES 20mM, imidazol 250mM, NaCl 500mM, pH 8,01). A proteína eluída foi coletada em frações de 2 mL em placas de 96 poços. A lavagem e eluição foram realizadas em 5 mL/minuto.
Cromatografia por exclusão de tamanho (SEGUNDOS) no agrupamento IMAC de PE QIQ [00207] A coluna SEC (GE healthcare, HILOAD™ 26/60 SUPERDEXTM 75 grau prep, altura de 60 cm, aproximadamente volume de 319 mL) foi equilibrada com 3CV de tampão SEC (HEPES 20mM, NaCl 150mM, pH 8,49). 11 mL de eluição IMAC foram colocados na coluna em uma vazão de 2,5 mL/minutos. As frações de 2 mL foram coletadas de 0,3 CV a 0,9 CV. Duas corridas foram realizadas e a seguir as frações foram analisadas por SDS-PAGE. As frações a partir das duas corridas contendo proteína Prot E foram agrupadas (“agrupamento SEC”, volume total de aproximadamente 48 mL). Arginina 500mM foi adicionada no agrupamento SEC.
Dosagem das amostras PE QIQ agrupadas gerada no protocolo SEC anterior [00208] O agrupamento SEC foi dosado com o método RCDC (agente redutor e detergente compatível) a partir do estojo Bio-Rad RC DCTM, seguindo o protocolo do fabricante:
[00209] Para cada amostra testada e padrão, 25 pL foram distribuídos em tubos de microcentrífuga, em duplicata. 125 pL de reagente I RC Bio-Rad foram adicionados em cada tubo; cada tubo foi colocado em vortex e incubado por 1 minuto em temperatura ambiente. 125 pL de Reagent II RC Bio-Rad são adicionados em cada tubo; cada tubo é colocado em vortex e então centrifugado a 14.000 x g por 5 minutos. Os sobrenadantes são descartados invertendo os tubos em papel limpo e absorvente, permitindo que o líquido seja completamente drenado dos tubos. 25,4 pL de reagente A (já
Petição 870190129809, de 09/12/2019, pág. 105/336 / 112 preparado misturando 20gL de reagente S por 1 mL de reagente A) são adicionados em cada tubo; cada tubo é colocado em vortex e incubado em temperatura ambiente por 5 minutos, ou até que o precipitado seja completamente dissolvido. Colocar em vortex antes de continuar a próxima etapa. Adicionar 200 gL de reagente B DC para cada tubo e colocar em vortex imediatamente. Incubar em temperatura ambiente por 15 minutos. Transferir todas as amostras para uma placa de 96 poços e ler a absorbância a 750 nm para determinar a concentração de proteína para cada amostra de proteína desconhecida.
[00210] A concentração de ProtE foi 1,069 mg/mL
Purificação de proteína PilA marcada com His:
[00211] PilA foi purificada após o procedimento geral a seguir:
[00212] As células de E. coli contendo um construto que codifica PilA ou um fragmento deste são suspensas em nuclease BUGBUSTER® e BENZONASE® (NOVAGEN®), por exemplo, 10 mL de nuclease BUGBUSTER® e 10 ul de BENZONASE®. O lisado celular é misturado em temperatura ambiente em uma plataforma de rotação, por exemplo, por 15 minutos. O lisado celular é centrifugado a 4 °C, por exemplo, a 16.000 g por 20 minutos. O sobrenadante contendo a proteína é adicionado em uma coluna Ni NTA contendo a resina Ni NTA HIS · BIND® e misturado a 4 °C, por exemplo, por 1 hora. A coluna pode consistir em 2 mL de resina Ni NTA HIS BIND® (NOVAGEN®) e 10 mL de tampão de ligação 1X (do estojo com tampão Ni-NTA NOVAGEN®). O fluxo da coluna é então coletado. A resina é lavada duas vezes com tampão de lavagem 1X, por exemplo, contendo NaCl 300 mM, NaH2PO4 50mM, imidazol 25 mM, pH 8,0). A lavagem é coletada por fluxo de gravidade. A proteína é eluída a partir da coluna com tampão de eluição 1X, por exemplo, NaCl 300 mM, NaH2PO4 50mM, imidazol 250 mM, pH 8,0. A proteína pode ser purificada adicionalmente por diálise com o tampão de eluição e corrida novamente em uma coluna Ni NTA, da maneira
Petição 870190129809, de 09/12/2019, pág. 106/336 / 112 descrita anteriormente.
Clivagem de PilA com trombina.
[00213] PilA é a seguir incubada com trombina (diluída 1/50) em temperatura ambiente por 16 horas para remover a marca de histidina.
Cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) em PilA clivada com trombina.
[00214] A coluna SEC (GE healthcare, HILOAD™ 26/60 SUPERDEXTM 75 grau prep, altura de 60 cm, volume aproximado de 319 mL) foi equilibrada com 5CV de tampão SEC (HEPES 20mM, NaCl 150mM, pH 8,52). Aproximadamente 10 mL de PilA clivada foram colocados na coluna em uma vazão de 2,5 mL/minutos. As frações de 2 mL foram coletadas de 0,3 CV a 0,9 CV. Duas corridas foram realizadas e a seguir as frações foram analisadas por SDS-PAGE. As frações de duas corridas contendo proteína PilA clivada foram agrupadas juntas (“agrupamento SEC”, volume total aproximado de 52 mL).
Dosagem de PilA, agrupamento SEC.
[00215] O agrupamento SEC foi dosado com o método RCDC da maneira descrita anteriormente. A concentração de PilA clivada foi de 5,37 mg/mL.
Diálise de agrupamento SEC de PilA com PBS 1x pH 7,4 (fator de diálise = 1.600) e dosagem por RCDC [00216] A concentração pós-diálise determinada por RCDC foi em 3,0 mg/mL.
Purificação de LVL317
Choque osmótico [00217] Uma vez que a proteína de fusão LVL317 é expressa e processada no periplasma bacteriano, a proteína foi extraída por choque osmótico.
[00218] A pasta celular de E. coli B2448 coletada e congelada (-20 °C)
Petição 870190129809, de 09/12/2019, pág. 107/336 / 112 contendo LVL317, a partir de 4 L de cultura de fermentação, foi agrupada e ressuspensa em um tampão hipertônico que consiste em Tris-HCl 24 mM, 16 % (p/v) de sacarose, 9,9 % (p/v) de glicose, EDTA 10 mM, pH 8,0, até um volume final de 4L. A suspensão foi misturada suavemente por 30 minutos em temperatura ambiente usando um propulsor de 3 lâminas instalado em um agitador RW 16 básico, em velocidade média. A suspensão foi centrifugada em 15.900 x g por 30 minutos em temperatura ambiente. O sobrenadante (SN1) foi mantido para análise em gel.
[00219] O precipitado resultante foi ressuspenso em uma solução hipotônica; MgCl2 38 mM e misturado por 30 minutos em temperatura ambiente. A mistura foi centrifugada em 15.900 x g por 30 minutos em temperatura ambiente, e o antígeno foi recuperado no sobrenadante (SN2).
[00220] Uma clarificação do SN2 foi realizada por filtração por meio de um filtro de polietersulfona de 0,45/0,2 pm Sartorius Sartopore 2 MidiCap, em 600 mL/min de vazão.
[00221] O SN2 foi diluído 1:3 com NaH2PO4-Na2HPO4 20 mM, pH 7,0. O pH foi ajustado para 7.0 se necessário e outra clarificação com filtração por meio de um filtro de polietersulfona de 0,45/0,2 pm Sartorius Sartopore 2 MidiCap, em 600 mL/min, foi realizada.
Cromatografia de fluxo rápido SP SEPHAROSE™ (SP FF) [00222] O SN2 diluído/filtrado foi carregado e capturado em uma resina de troca catiônica forte (SP SEPHAROSE™ FF - GE Healthcare), em uma coluna de 14 cm ID (diâmetro interno) x 20 cm de comprimento (volume da coluna de 3.100 mlL) equilibrada com 2CV de tampão NaH2PO4/Na2HPO4 20 mM pH 7,0. Após lavar a coluna com 5CV de tampão NaH2PO4/Na2HPO4 20 mM pH 7,0, o antígeno (contido em LVL317) foi eluído aumentando a concentração de NaCl em até 100 mM no mesmo tampão de lavagem.
[00223] Ver a figura 12 para um cromatograma de fluxo rápido SP SEPHAROSE™ típico.
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Cromatografia de fluxo rápido Q SEPHAROSE™ (Q FF) [00224] O antígeno presente no eluído SP FF foi diluído 1:4 com um Tris 20 mM pH 8,5, pH ajustado para 8,5 se necessário, e passado por uma resina de troca aniônica forte (Q SEPHAROSE™ FF - GE Healthcare) em uma coluna de 14 cm ID x 11,8 cm em tamanho (volume da coluna 1.800 mL) equilibrada com 2CV de tampão Tris 20 mM pH 8,5. O antígeno foi recuperado na fração de fluxo.
[00225] Ver a figura 13 para um cromatograma de fluxo rápido Q SEPHAROSE™ típico.
Concentração, diafiltração, adição de polissorbato 80 e esterilização por filtração [00226] O fluxo Q FF contendo o antígeno foi concentrado em até 0,70,8mg/mL com base no cromatograma de UV, e diafiltrado com 5DV de tampão KH2PO4/K2HPO4 10 mM pH 6,5 usando uma membrana Pellicon-2™ de corte 10 kDa (Millipore).
[00227] Usando uma solução estoque de 5 %, o polissorbato 80 (por exemplo, TWEENTM 80) foi adicionado na ultrafiltração do retentado e agitado por 30 minutos com agitador magnético em 130 rpm a 4 °C. A concentração final de polissorbato 80 foi 0,04 %. O retentado da ultrafiltração foi esterilizado por filtração com uma membrana de acetato de celulose de 0,45/0,2 pm (Sartobran 300, Sartorius). O volume purificado foi armazenado a -20 °C ou -80 °C. A concentração absoluta de proteína foi medida por AAA (análise de aminoácido) a 0,737mg/mL.
Exemplo 9: Uso de polissorbato 80 [00228] Um experimento de titulação indicou que a adição de polissorbato 80, especificamente TWEENTM 80, em uma concentração final de 0,04 % (p/v) do volume purificado antes da esterilização por filtração reduziu a formação e agregação de partícula filamentosa.
[00229] De acordo com a análise DSC, TWEEN™ 80 reduziu o grau
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100/ 112 de mudança estrutural (30-45 °C) observado após ciclos de congelamento/descongelamento, após armazenamento a -20 °C e após armazenamento por 4 dias a 4 °C, -20 °C, -80 °C e 37 °C.
Exemplo 10: Análise SDS-PAGE e Western Blot de LVL317
Análise SDS-PAGE e Western:
[00230] Gel Bis-Tris 4-12 % NUPAGE® foi carregado, da maneira descrita a seguir, com 10 pg de amostra em tampão de amostra de LDS NUPAGE® contendo DTT 50 mM aquecido por 5 minutos a 95 °C (20 pL de amostra foram preenchidos nas amostras com concentração baixa). Migração: 35 minutos a 200 Volts em temperatura ambiente (RT) em tampão de corrida NUPAGE® MES. O gel foi corado 2 horas em azul Instant (Novexin cat.: ISB01L) e descorado por toda a noite em água.
[00231 ] Conteúdos da canaleta:
1: Padrão MW (10pL) 2: Início (fração total) (10pg) 3: SN1 sem filtração (10pg)
4: SN2 sem filtração (10pg) 5: Não extraído (10pg) 6:
Carga SP FF (10pg)
7: Fluxo SP FF (6.9pg) 8: Lavagem SPFF (20pL)
9:Eluição SP FF (10pg)
10: Fita SP FF (10pg) 11: Carga Q FF (8.9pg)
12:Eluição Q FF (9.8pg)
13: Fita Q FF (4.8pg) 14: Retentado TFF antes de TWEENtm 80 0,04 % reforçado (10pg)
15: Volume purificado sem filtração de TWEEN™ 80 a 0,04 % reforçado (10pg)
16: Volume purificado e esterilizado por filtração de
TWEEN™ 80 a 0,04 % reforçado (10pg)
17: Volume purificado e esterilizado por filtração de
TWEEN™ 80 a 0,04 % reforçado (20 pg + lisado celular de E. Coli Rix
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101/ 112 reforçado (1pg))
18: Lisado celular de E. Coli Rix (2pg) 19: Lisado celular de E. Coli Rix (1pg) 20: Lisado celular de E. Coli Rix (0.5pg) [00232] Ver a figura 14 para um SDS-PAGE das amostras em processo, a partir do processo de purificação de proteína de fusão PE-PilA.
[00233] Em relação a Western Blot, as proteínas foram transferidas para 4 °C por toda a noite a 30 Volts em tampão de transferência NUPAGE® + 20 % de metanol, 0,1 % de SDS em membrana de nitrocelulose. As membranas foram bloqueadas 1 hora com Tris 50mM, NaCl 150mM pH 7,4 + 5 % de leite em pó desnatado, incubadas 2 horas em anticorpo primário de coelho diluído em tampão de bloqueio (anti-Prot-E 1/50 000 e anti-E. coli (BLR) 1/1.000), lavadas 3 x 5 minutos em Tris 50mM pH 7,4 + Tween 20 a 0,05 %, incubadas 1 hora em anticorpo secundário (cabra anticoelho conjugado com fosfatase alcalina diluída 1/5.000 em tampão de bloqueio), lavadas 3 x 5minutos em tampão de lavagem e desenvolvidas em substrato BCIP/NBT (1 comprimido por 10 mL). Todas as incubações foram realizadas em 25 mL por membrana.
[00234] Ver a figura 15 para um Western Blot das amostras em processo, a partir do processo de purificação da proteína de fusão PE-PilA. Blot foi realizado usando anti-PE de coelho policlonal.
[00235] Conteúdos da canaleta:
1: Padrão MW (10pL) 2: Início (fração total) (10pg) 3: SN1 sem filtração (10pg)
4: SN2 sem filtração (10pg) 5: Não extraído (10pg) 6:
Carga SP FF (10pg)
7: Fluxo SP FF (6.9pg) 8: Lavagem SPFF (20pL) 9:
Eluição SP FF (10pg)
10: Fita SP FF (10pg) 11: Carga Q FF (8.9pg) 12: Eluição Q
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FF (9.8qg)
13: Fita Q FF (4.8qg) 14: Retentado TFF antes de TWEENtm a 0,04 % reforçado (10qg)
15: Volume purificado sem filtração de TWEENtm 80 a 0,04 % reforçado (10qg)
16: Volume purificado com esterilização por filtração de TWEENtm 80 a 0,04 % reforçado (10qg)
17: Volume purificado com esterilização por filtração de TWEENtm 80 a 0,04 % reforçado (20qg + Lisado celular de E. Coli Rix reforçado (1qg))
18: Lisado celular de E. Coli Rix (2qg)
19: Lisado celular de E. Coli Rix (1qg)
20: Lisado celular de E. Coli Rix (0.5qg) [00236] Ver a figura 16 para um Western Blot de amostras em processo, a partir do processo de purificação de proteína de fusão PE-PilA. Blot foi realizado usando anti-E.coli de coelho policlonal (BLR).
[00237] Conteúdos da canaleta:
1: Padrão MW (10qL) 2: Início (fração total) (10qg) 3: SN1 sem filtração (10qg)
4: SN2 sem filtração (10qg) 5: Não extraído (10qg) 6: Carga SP FF (10qg)
7: Fluxo SP FF (6.9qg) 8: Lavagem SPFF (20qL) 9:
Eluição SP FF (10qg)
10: Fita SP FF (10qg) 11: Carga Q FF (8,9qg) 12: Eluição Q FF (9,8qg)
13: Fita Q FF (4.8qg) 14: Retentado TFF antes de TWEENtm 80 a 0,04 % reforçado (10qg)
15: Volume purificado sem filtração de TWEENtm 80 a 0,04 % reforçado (10qg)
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16: Volume purificado com esterilização por filtração de TWEENtm 80 a 0,04 % reforçado (10gg)
17: Volume purificado com esterilização por filtração de TWEENTm 80 a 0,04 % reforçado (20pg + Lisado celular de E. Coli Rix reforçado (1μg))
18: Lisado celular de E. Coli Rix (2pg) 19: Lisado celular de E. Coli Rix (^g) 20: Lisado celular de E. Coli Rix (0,5pg) [00238] Comentários das figuras de SDS-PAGE e Western Blot: A proteína de fusão PE-PilA migra a 30kDa. A extração por choque osmótico extraiu a proteína de fusão expressa e processada no periplasma bactérias e reduziu a contaminação das bactérias. Ocorreu uma pequena perda de proteína de fusão durante o tratamento hipertônico (canaleta 3). Uma pequena proporção não foi extraída por tratamento hipertônico e permaneceu associada às células (canaleta 5). Ocorreu uma pequena perda no fluxo de SP FF (canaleta 7) e na fração de fita de ambas as colunas (canaletas 10 e 13). Uma vez que o volume total da fração de fita é menor, a perda de proteína de fusão não é significativa. As bandas degradadas são visíveis nas frações de fita, mas não no produto final. Não houve nenhuma contaminação significativa de proteínas celulares do hospedeiro E. coli no volume purificado (canaleta 16).
[00239] A análise de LVL735 e LVL778 rendeu perfis similares à LVL317.
Exemplo 11: Dados do ponto de fusão para PE, PilA e LVL317 [00240] A transição térmica da proteína de fusão PE-PilA não marcada com His (LVL317) foi comparada com a transição térmica tanto de proteínas PE marcadas com his (da maneira descrita no exemplo 8) quanto PilA clivadas (da maneira descrita no exemplo 8), purificadas da maneira descrita anteriormente.
[00241] Anteriormente, DSC, PE e PilA foram dialisadas por toda a
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104 / 112 noite em K2HPO4/KH2PO4 10mM pH 6,5 + Tween 80 a 0,04 % (razão de volume de 1:250 amostra:tampão) para que estivessem no mesmo tampão da proteína de fusão. Após diálise, a concentração de proteínas foi medida por BCA e ajustada para 300 pg/mL (PE) e 500 pg/mL (PilA).
[00242] A análise foi realizada em VPTM-DSC a partir de MicroCal, LLC (parte de GE Healthcare). O tampão de diálise final foi usado como referência e subtraído dos das varreduras. A taxa de varredura DSC foi 90 °C/hr. A fim de avaliar a capacidade de medir a transição térmica no recipiente final (FC) após a formulação, a proteína de fusão foi diluída na concentração de FC (60 pg/mL). Os dados do recipiente final não são mostrados.
Resultados:
[00243] Ver a figura 17 para a transição térmica de proteína de fusão PE-PilA e proteínas PE e PilA. Curvas: PilA (1), proteína E (Prot E, PE) (2), PE-PilA PB não diluída 737pg/mL (3), e PE-PilA PB diluída em concentração de FC de 60 pg/mL (4).
[00244] 1 - PilA Tm: 53 °C [00245] 2 - proteína E Tm: 63 [00246] 3 - PE-PilA PB (Volume purificado) não diluída 737 pg/mL
Tm1: 53,7 °C e Tm2: 66,1 °C [00247] 4 - PE-PilA PB diluída em concentração de FC de 60 pg/mL
Tm1: 53,2 °C e Tm2: 67,6 °C [00248] Duas transições foram detectadas na proteína de fusão purificada (LVL317) (curvas 3 e 4).
[00249] A Tm1 (53,7 °C) da proteína de fusão PE-PilA é similar à transição de PilA (53 °C).
[00250] O deslocamento significativo de Tm2 em PE-PilA (66,1 °C) foi comparado à transição de PE (63 °C). A fusão de ambos os domínios parece estabilizar o fragmento PE.
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105/ 112 [00251] O deslocamento de Tm2 na proteína de fusão diluída comparado à não diluída é um artefato de concentração que aumenta a partir da diminuição da inclinação típica acentuada de agregação que dependente da concentração.
[00252] A análise do dobramento do antígeno de LVL735 e LVL778 foi similar àquele de LVL317.
Exemplo 12: Resposta à imunogenicidade anti-PilA em construto de proteína de fusão PE-PilA de LVL291 em camundongos Balb/c.
[00253] A resposta imune direcionada contra a proteína de fusão PEPilA de LVL291 purificada (a proteína de fusão LVL291 sem o peptídeo sinal heterólogo), formulada em AS03A, foi avaliada em camundongos Balb/c. Os animais (20 camundongos/grupo) foram imunizados pela via intramuscular nos dias 0, 14 e 28 com 10 pg de PE (a partir do vetor pRIT16762), PilA (a partir do vetor pRIT16790) ou PE-PilA, cada qual formulado em AS03A. O grupo controle foi vacinado apenas com AS03A. A resposta ao anticorpo direcionada contra cada antígeno foi determinada nos soros individuais coletados no dia 42. Nenhuma resposta ao anticorpo foi obtida com o controle negativo. Da maneira mostrada na figura 18, a resposta ao anticorpo direcionada contra PilA foi maior em camundongos imunizados com a fusão PE-PilA, comparado à resposta ao anticorpo em camundongos imunizados com PilA monovalente. As respostas ao anticorpo direcionadas contra PE foram similares em camundongos imunizados com a proteína de fusão e em camundongos imunizados com PE monovalente. GMT = média geométrica da titulação. Os dados foram capturados e analisados com o software SOFTMAX® Pro (Molecular Devices) utilizado em WINDOWS® (Microsoft); a função log-logística de quatro parâmetros foi usada para calcular a curva padrão. A função log-logística de quatro parâmetros descreve, com um grau elevado de exatidão, a curva do soro de referência que exibe uma forma sigmoidal acentuada quando representada graficamente em
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106/ 112 uma escala de densidade ótica-versus-concentração (log). As concentrações de anticorpo foram calculadas em cada diluição das amostras séricas de camundongos por interpolação da curva padrão. O anticorpo nos soros de controle de qualidade e nas amostras de soro desconhecidas é obtido calculando a média dos valores de todas as diluições que estão na faixa funcional (10-80 %) da curva de diluição da referência.
[00254] Os resultados são mostrados na figura 18, que representa graficamente as resposta ao anticorpo contra a proteína de fusão PE-PilA LVL291, e contra PE e PilA monovalente no modelo de camundongo Balb/c.
Exemplo 13: Modelo de colonização nasofaringeana em murino. Imunização com PE-PilA. Desafio com NTHi cepa 86-028NP e NTHi cepa 3224A.
[00255] Os camundongos Balb/c fêmeas (20/grupo) foram imunizados intranasalmente nos dias 0 e 14 com 6 pg de uma proteína de fusão PE-PilA purificada (LVL291 para desafio com 86-028NP; LVL317 para desafio com a cepa 3224A) formulada com LT (toxina termolábil de Escherichia coli), e no dia 28 com 6 pg de uma proteína de fusão PE-PilA purificada em salina tamponada com fosfato (PBS). Os camundongos controle (20/grupo) foram vacinados apenas com LT. Os camundongos foram desafiados subsequentemente por via intranasal com 5 x 106 CFU (unidades formadoras de colônia) de NTHi cepa 86-028NP homóloga e NTHi cepa 3224a heteróloga. A homologia e heterologia são determinadas por referência com a cepa de NTHi, com a qual os camundongos foram imunizados. As colônias de bactérias foram contadas nas cavidades nasais removidas nos dias 1 e 2 após o desafio. D1 = dia 1. D2 = dia 2.
[00256] A vacinação com PE-PilA aumentou a separação de NTHi cepa 86-028NP e cepa 3224A na nasofaringe no dia 1 e dia 2 após o desafio.
[00257] Em relação ao experimento realizado com NTHi cepa 86028NP: Uma ANOVA fixa de 2 variâncias foi realizada usando os valores de
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107/ 112 log10 das contagens como resposta, os fatores fixos sendo o grupo (4 níveis) e o dia (2 níveis). A suposição de heterogeneidade de variância foi rejeitada e um modelo com variâncias heterogêneas foi ajustado com os dados. Nenhuma interação significativa foi detectada entre os 2 fatores. O grupo de fusão PEPilA (6 pg por camundongo) reduziu significativamente a CFU comparado ao grupo controle (LT); a razão de média geométrica foi igual a 0,06, com um intervalo de confiança de 95 % de 0,01, 0,25.
[00258] Em relação ao experimento conduzido com NTHi cepa 3224A: Uma ANOVA fixa de 3 variâncias foi realizada usando os valores de log10 como resposta, os fatores fixos sendo o grupo, o dia e o experimento. Os testes de Shapiro-Wilk e Levene não rejeitaram as suposições de normalidade e de homogeneidade das variâncias. Nenhuma interação significativa entre qualquer dos 2 fatores ou entre os 3 fatores foi detectada, e apenas os fatores principais foram mantidos na análise. PE-PilA/LT reduziu significativamente CFU comparada com o grupo controle; a razão de média geométrica sendo igual a 0,11 com um intervalo de confiança de 95 % de 0,02, 0,61.
[00259] Ver a figura 19 para efeito da vacinação com proteína de fusão PE-PilA na evidência da bactéria NTHi cepa 86-028NP na nasofaringe de camundongo.
[00260] Ver a figura 20 para efeito da vacinação com proteína de fusão PE-PilA na evidência da bactéria NTHi cepa 3224A na nasofaringe de camundongo.
Exemplo 14: Modelo de colonização nasofaringea de murino. Imunização com PilA. Desafio com NTHi cepa 3219C.
[00261] Os camundongos OF1 fêmeas (20 camundongos/grupo) foram imunizados intranasalmente nos dias 0 e 14 com 3 pg de PilA (a partir do vetor 16790) formulada com LT, e no dia 28 com 3 pg de PilA em PBS. Os camundongos controle foram vacinados apenas com LT. Os camundongos foram desafiados subsequentemente por via intranasal com 5 x 106 CFU de
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NTHi cepa 3219C. As colônias bacterianas foram contadas nas cavidades nasais removidas 3 e 4 dias após o desafio. D3 = dia 3. D4 = dia 4.
[00262] Ver a figura 21 para efeito da vacinação de PilA na evidência bacteriana na nasofaringe do camundongo.
Exemplo 15: Modelo de colonização nasofaringea de murino. Imunização com PE. Desafio com NTHi cepa 3224A.
[00263] Os camundongos Balb/c fêmeas (20 camundongos/grupo) foram imunizados intranasalmente nos dias 0 e 14 com 3pg de PE (a partir do vetor pRIT16762) formulada com LT e no dia 28 com 3 pg de PE em PBS. Os camundongos controle foram vacinados apenas com LT. Os camundongos foram desafiados subsequentemente por via intranasal com 5 x 106 CFU de NTHi cepa 3224A. As colônias bacterianas foram contadas nas cavidades nasais removidas 3 e 4 dias após o desafio. 10 camundongos foram examinados no dia 3 (D3). 10 camundongos foram examinados no dia 4 (D4). A vacinação com PE aumentou significativamente a evidência de NTHi na nasofaringe no dia 4 após o desafio (Figura 22), usando o teste Dunn para análise estatística.
[00264] Ver a figura 22 para efeito da vacinação com PE na evidência bacteriana na nasofaringe de camundongos.
Exemplo 16: Ligação com vitronectina. Inibição de ligação com vitronectina por proteína de fusão PE-PilA de LVL317 & LVL735.
[00265] A capacidade de PE no construto de proteína de fusão de LVL317 PE-PilA purificada de se ligar à vitronectina foi avaliada. As placas de microtitulação (POLYSORPTM, Nunc, Thermo Fisher Scientific) foram revestidas com PE (a partir do vetor pRIT16762) ou com proteína de fusão PE-PilA de LVL317 purificada (10 pg/mL). As placas foram lavadas quatro vezes com NaCl 150mM-polissorbato 20, 0,05 % (por exemplo, TWEENtm 20) e bloqueadas por uma a duas horas com PBS-BSA 1 %. Após quatro lavagens, a vitronectina (Vitronectina a partir do plasma humano, SIGMA
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ALDRICH®) foi adicionada (10 gg/mL), diluída duas vezes (12 diluições), e as placas foram incubadas por 1 hora em temperatura ambiente. As placas foram então lavadas 4 vezes com NaCl 150mM-polissorbato 20, 0,05 % (por exemplo TWEENTM 20). Após as lavagens, a vitronectina ligada foi detectada usando vitronectina anti-humana em folha de peroxidase (US Biological), seguido pela adição do substrato orto-fenileno diamina/H2O2. A cor desenvolvida é diretamente proporcional à quantidade de anticorpo fixo na vitronectina.
[00266] Ver a figura 23 para (A) proteína de fusão PE-PilA de LVL317 ligada à vitronectina. PilA = PilA de NTHi cepa 86-028NP (descrita para pRIT16790); PE = proteína E (descrita para pRIT16762) e (b) proteína de fusão PE-PilA de LVL317 e LVL735 ligada à vitronectina.
Exemplo 17: Ligação com vitronectina. Inibição de ligação com vitronectina por anticorpos direcionados contra a proteína de fusão PEPilA de LVL291.
[00267] As placas de microtitulação (POLYSORPTM, Nunc, Thermo Fisher Scientific) foram revestidas com PE (a partir do vetor pRIT16762), ou com proteína de fusão PE-PilA purificada (10 gg/mL). As placas foram lavadas quatro vezes com NaCl 150mM-polissorbato 20, 0,05 % (por exemplo, TWEENTM 20) e bloqueadas por duas horas com PBS-BSA 1 %. Após as lavagens, a vitronectina (Vitronectina do plasma humano, SIGMAALDRICH®) foi adicionada em 50gg/mL e os anticorpos anti-PE-PilA purificados (produzidos e purificados internamente) foram diluídos duas vezes em série e incubados por 1 hora em temperatura ambiente. As placas foram então lavadas 4 vezes com NaCl 150mM-polissorbato 20, 0,05 % (por exemplo, TWEENTM 20). Após quatro lavagens, a vitronectina ligada foi detectada usando folha de peroxidase antivitronectina (US Biological), seguido pela adição do substrato orto-fenileno diamina/H2O2. A cor desenvolvida é diretamente proporcional à quantidade de anticorpo fixo na
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110/ 112 vitronectina.
[00268] A inibição de vitronectina que se liga a PE por anticorpos policlonais direcionados contra PE-PilA foi observada.
[00269] Ver a figura 24 para inibição de vitronectina que se liga aos anticorpos policlonais contra proteína de fusão PE-PilA.
Exemplo 18: Antigenicidade da proteína de fusão PE-PilA de LVL291. ELISA.
[00270] A proteína de fusão PE-PilA de LVL291 purificada foi validada em um teste de antigenicidade com proteínas monovalentes como controle. A proteína de fusão foi testada em um ELISA sanduíche desenvolvido com anticorpos policlonais (coelho e porquinho da Índia) gerados contra o fragmento de gene de PE que codifica os aminoácidos 22 a 160 de SEQ ID NO: 4 (descrito para pRIT16711), ou contra PilA de NTHi cepa 86-028NP (a partir do vetor pRIT16790).
[00271] PilA ou PE foi adicionada em 100 ng/mL e diluída duas vezes em série. Após 30 minutos de incubação e após lavagem, o antígeno ligado foi detectado por um soro policlonal de coelho obtido após imunização com PE ou PilA. Os anticorpos ligados foram detectados usando uma peroxidase de Ig anticoelho (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) seguido pela adição do substrato orto-fenileno-diamina/H2O2. A cor desenvolvida é diretamente proporcional à quantidade de antígeno presente. As leituras de absorbância foram medidas usando um espectrofotômetro para as placas de microtitulação. A antigenicidade das amostras foi determinada por comparação com a curva do antígeno de referência de PE de tamanho total ou PilA de tamanho total, e é expressa em ug/mL. A referência representou 100 % de antigenicidade.
[00272] Da maneira observada na tabela 6, a antigenicidade foi observada com a proteína de fusão PE-PilA de LVL291 purificada, comparada com os antígenos monovalentes de PE e PilA.
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111/ 112
Tabela 6: Antigenicidade relativa obtida com a proteína de fusão PE-PilA de
LVL291 no teste de
Antigenicidade relativa de PE (%)
proteína E como referência 100
PE-PilA 130-148
Antigenicidade relativa de PE ( %)
PilA como referência 100
PE-PilA 120-152
Exemplo 19: Imunogenicidade de proteína de fusão PE-PilAde LVL735.
[00273] Os camundongos Balb/c fêmeas (n = 34) foram imunizados pela via intramuscular nos dias 0, 14 e 28 com 50 pL de formulação de vacina contendo 1, 0,2 ou 0,04 pg de proteína de fusão PE-PilA LVL317 ou LVL735 formulada com AS01e ou AlPO4 (fosfato de alumínio). As respostas do anticorpo à PE e PilA foram determinadas em soros individuais coletados no dia 42 e o nível de IgG contra PE e PilA foi medido e expresso em pg /mL.
[00274] Ver a figura 27 para a resposta de anticorpo PE e PilA à LVL317 e LVL735. GMC= média geométrica da concentração. GMT = média geométrica da titulação. IC = intervalos de confiança.
Exemplo 20: Eficácia protetora das proteínas de fusão LVL735 e LVL317 em um modelo de camundongo da colonização nasofaríngea de Haemophilus influenzae não tipável.
[00275] Os camundongos Balb/c fêmeas foram imunizados intranasalmente nos dias 0 e 14 com 10 pL de formulação de vacina contendo 5,8 pg de LVL735 ou LVL317 misturado com 0,5 pg de toxina lábil de E. coli (LT). Uma dose de reforço de 5,8 pg de LVL735 ou LVL317 sem adjuvante foi administrada no dia 28. Os camundongos controle foram vacinados apenas com LT nos dias 0 e 14, e PBS no dia 28. Os animais foram desafiados intranasalmente com 5 x 106 cfu de NTHi 3224A cepa no dia 42. As colônias bacterianas foram contadas nas cavidades nasais removidas 1 e 2 dias após o desafio (n = 10/ponto de tempo).
[00276] As cavidades nasais são homogeneizadas em meio e uma
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112/ 112 quantificação bacteriana é realizada. Os resultados são expressos em CFU/mL.
[00277] Ver a figura 28 para o efeito da vacinação com LVL735 e LVL317 na evidência bacteriana em um modelo camundongo de colonização nasofaríngea com Haemophilus influenzae não tipável.

Claims (24)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Proteína de fusão da fórmula I:
    (X) m - (R1)n - A - (Y) o - B - (Z)p (fórmula I) caracterizada pelo fato de que:
    X é um peptídeo sinal ou MHHHHHH (SEQ ID NO. 2);
    m é 0 ou 1;
    R1 é um aminoácido;
    n é 0, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6;
    A é um fragmento imunogênico da proteína E selecionado dentre SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 179 ou SEQ ID NO: 180 ou uma sequência tendo pelo menos 95% de identidade de sequência a quaisquer um dentre SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 179 ou SEQ ID NO: 180;
    Y é selecionado do grupo que consiste em GG, SG, SS, GGG e (G)h em que h é 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10;
    o é 0 ou 1;
    B é um fragmento imunogênico de PilA pelo menos 95% idêntico aos aminoácidos 40-149 de quaisquer um dentre SEQ ID NO: 58 à SEQ ID NO: 121;
    Z é GGHHHHHH (SEQ ID NO. 3); e p é 0 ou 1.
  2. 2. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que X é o peptídeo sinal de uma proteína selecionada do grupo que consiste em FlgI, NadA e pelB.
  3. 3. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que m é 0.
  4. 4. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que A é um fragmento
    Petição 870190129809, de 09/12/2019, pág. 123/336
    2 / 5 imunogênico de proteína E de H. influenzae selecionado do grupo que consiste dos aminoácidos17-160 da SEQ ID NO: 4 (SEQ ID NO: 122), aminoácidos 18-160 da SEQ ID NO: 4 (SEQ ID NO: 123), aminoácidos 19160 da SEQ ID NO: 4 (SEQ ID NO: 124), aminoácidos 20-160 da SEQ ID NO: 4 (SEQ ID NO: 125), aminoácidos 22-160 da SEQ ID NO: 4 (SEQ ID NO: 126), aminoácidos 23-160 da SEQ ID NO: 4 (SEQ ID NO: 179) e aminoácidos 24-160 da SEQ ID NO: 4 (SEQ ID NO: 180).
  5. 5. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, caracterizada pelo fato de que B é um fragmento imunogênico de PilA consistindo dos aminoácidos 40-149 de quaisquer uma das SEQ ID NO: 58 a SEQ ID NO: 121.
  6. 6. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5, caracterizada pelo fato de que B é um fragmento imunogênico de PilA de H. influenzae como estabelecido na SEQ ID NO: 127.
  7. 7. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6, caracterizada pelo fato de que A é SEQ ID NO: 125.
  8. 8. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6, caracterizada pelo fato de que A é SEQ ID NO: 124.
  9. 9. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, caracterizada pelo fato de que B é um fragmento de PilA como estabelecido na SEQ ID NO: 127 e A é um fragmento imunogênico de Proteína E selecionado do grupo que consiste da SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125 e SEQ ID NO: 126.
  10. 10. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de ser selecionado do grupo que consiste de SEQ ID NO. 138, SEQ ID NO. 140, SEQ ID NO. 142, SEQ ID NO. 144, SEQ ID NO. 146, SEQ ID NO. 148, SEQ ID NO. 150, SEQ ID NO. 182, SEQ ID NO. 184, SEQ ID NO. 186, SEQ ID NO. 188, SEQ ID NO. 190, SEQ ID NO. 192,
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    3 / 5
    SEQ ID NO. 194, SEQ ID NO. 196, SEQ ID NO. 198, SEQ ID NO. 200, SEQ ID NO. 202 ou SEQ ID NO. 204.
  11. 11. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de ser selecionado do grupo que consiste de SEQ ID NO. 138, SEQ ID NO. 140, SEQ ID NO. 142, SEQ ID NO. 144, SEQ ID NO. 146, SEQ ID NO. 148, SEQ ID NO. 150, SEQ ID NO. 182, SEQ ID NO. 184, SEQ ID NO. 186, SEQ ID NO. 188, SEQ ID NO. 190, SEQ ID NO. 192, SEQ ID NO. 194, SEQ ID NO. 196, SEQ ID NO. 198, SEQ ID NO. 200,
    SEQ ID NO. 202 ou SEQ ID NO. 204, em que o peptídeo sinal foi removido.
  12. 12. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de ser como na SEQ ID NO: 148.
  13. 13. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de ser como na SEQ ID NO. 177 (QIQKAEQN
    DVKLAPPTDV HFDAVVNLDK VRTDFYDEFW ICANYGEAFS YSTNETTNCT GDGTLANMEY CGSVTQ).
  14. 14.
    RSGYIRLVKN
    GLYVYPEPKR
    GQGLRAAPKK VDKKGGTKKA
    GGKNGIAADI
    ILQATGNAAT
    VNYYIDSESI
    YARSVRQYKI
    QKKHTLSLTP
    AVSELLQASA
    TTAKGYVKSV
    GVTWTTTCKG
    WVDNQEPQIV
    LNCANYHLTQ
    DTTLYNAAQI
    PYKADVELCV
    TTSNGAITVK
    TDASLFPANF
    Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de ser como na SEQ ID NO: 194.
  15. 15. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de ser como na SEQ ID NO. 219 (IQKAEQND
    VKLAPPTDVR
    FDAVVNLDKG RTDFYDEFWG CANYGEAFSV STNETTNCTG
    SGYIRLVKNV
    LYVYPEPKRY
    QGLRAAPKKQ
    DKKGGTKKAA
    GKNGIAADIT
    NYYIDSESIW
    ARSVRQYKIL
    KKHTLSLTPD
    VSELLQASAP
    TAKGYVKSVT
    VDNQEPQ IVH
    NCANYHLTQV
    TTLYNAAQII
    YKADVELCVY
    TSNGAITVKG
    Petição 870190129809, de 09/12/2019, pág. 125/336
    4 / 5
    DGTLANMEYI LQATGNAATG VTWTTTCKGT DASLFPANFC GSVTQ).
  16. 16. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de que compreende proteínas de fusão como definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 15.
  17. 17. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que compreende ainda a proteína D de H. influenzae.
  18. 18. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 16 ou reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um adjuvante, opcionalmente em que o adjuvante é AS01, por exemplo, AS01B ou AS01E.
  19. 19. Vacina, caracterizada pelo fato de que compreende a proteína de fusão como definida em qualquer uma das reivindicações 1-15, ou composições imunogênicas como definidas em qualquer uma das reivindicações 16-18.
  20. 20. Proteína de fusão, de acordo com as reivindicações 1-15, ou composição imunogênica de acordo com as reivindicações 16-18, ou vacina de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que é para uso no tratamento ou prevenção de otite média.
  21. 21. Proteína de fusão, composição imunogênica, ou vacina de acordo com as reivindicações 1-19, caracterizada pelo fato de que é para uso no tratamento ou prevenção de exacerbações de doença pulmonar obstrutiva crônica aguda (AECOPD); e/ou para uso no tratamento ou prevenção de pneumonia; e/ou para uso no tratamento ou prevenção de infecção ou doença associada a H. influenzae.
  22. 22. Proteína de fusão, composição imunogênica, ou vacina de acordo com as reivindicações 1-19, caracterizada pelo fato de que é para uso no tratamento ou prevenção de exacerbações de doença pulmonar obstrutiva
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    5 / 5 crônica aguda (AECOPD).
  23. 23. Proteína de fusão de acordo com as reivindicações 1-15, caracterizada pelo fato de que é para uso na indução de resposta imune contra H. influenzae em humanos.
  24. 24. Processo para produzir expressão periplasmática de uma proteína de fusão como definida em qualquer uma das reivindicações 1-15, caracterizado pelo fato de que o processo compreende induzir a expressão de proteínas contendo um peptídeo sinal, em que o peptídeo sinal é de FlgI ou pelB.
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