ES2776369T3 - Proteínas de fusión y vacunas de combinación - Google Patents

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Abstract

Una composición inmunogénica que comprende una proteína de fusión de fórmula I: (X)m-(R1)n-A-(Y)o-B-(Z)p (fórmula I) en la que X es un péptido señal o MHHHHHH (SEQ ID NO. 2); m es 0 o 1; R1 es un aminoácido; n es 0, 1, 2, 3, 4, 5 o 6; A es un fragmento inmunogénico de la Proteína E seleccionado de SEQ ID NO. 122, SEQ ID NO. 123, SEQ ID NO. 124, SEQ ID NO. 125, SEQ ID NO. 126, SEQ ID NO. 179 o SEQ ID NO. 180 o una secuencia que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con una cualquiera de SEQ ID NO. 122, SEQ ID NO. 123, SEQ ID NO. 124, SEQ ID NO. 125, SEQ ID NO. 126, SEQ ID NO. 179 o SEQ ID NO. 180; Y es GG; o es 1; B es un fragmento inmunogénico de PilA, al menos un 95 % idéntico a los aminoácidos 40-149 de cualquiera de SEQ ID NO. 58 a SEQ ID NO. 121; Z es GGHHHHHH (SEQ ID NO. 3); y p es 0 o 1. y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Description

DESCRIPCIÓN
Proteínas de fusión y vacunas de combinación
La presente solicitud reivindica prioridad a la solicitud de patente de Estados Unidos número 61/474779 enviada el 13 de abril de 2011 y la solicitud de patente de Estados Unidos número 61/534012 enviada el 13 de septiembre de 2011.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a composiciones que comprenden la Proteína E y Pilina A de Haemophilus influenzae (H. influenzae). Más particularmente, la presente solicitud se refiere a proteínas de fusión y composiciones inmunogénicas que comprenden la Proteína E y Pilina A, a vacunas que comprenden dichas composiciones inmunogénicas y a los usos terapéuticos de las mismas.
Antecedentes de la invención
La Proteína E (PE) es una lipoproteína de la membrana externa con propiedades adhesivas. Juega un papel en la adhesión/invasión de la Haemophilus influenzae no tipificable (NTHi) a las células epiteliales (J. Immunology 183: 2593-2601 (2009); The Journal of Infectious Diseases 199:522-531 (2009), Microbes and Infection 10:87-96 (2008)). Está altamente conservada tanto en Haemophilus influenzae encapsulada como en H. influenzae no tipificable y tiene un dominio de unión epitelial conservado (The Journal of Infectious Diseases 201:414-419 (2010)). Se han descrito trece mutaciones puntuales diferentes en especies diferentes de Haemophilus cuando se comparan con Haemophilus influenzae Rd como una cepa de referencia. Esta expresión se observa tanto en bacterias de crecimiento logarítmico como de fase estacionaria (documento WO2007/084053). Hotomi y col. 2005 (Vaccine 231(3)6-14) desvela que la proteína P4 recombinante de Haemophilus influenzae (Proteína E) induce respuestas inmunes específicas biológicamente activas contra la colonización nasofaríngea en ratones después de la inmunización intranasal.
La proteína E también está implicada en la resistencia al complemento humano a través de la unión a vitronectina (Immunology 183: 2593-2601 (2009)). La PE, por el dominio de unión PKRYARSVRQ YKILNCANYH LTQVR (SEQ ID NO 1, que corresponde a los aminoácidos 84-108 de SEQ ID NO 4), se une a la vitronectina que es un inhibidor importante de la ruta del complemento terminal (J. Immunology 183:2593-2601 (2009)). El documento US6420134B1 desvela que la Proteína E puede usarse en vacunas multivalentes diseñadas para H. influenzae y uno o más organismos infecciosos distintos.
La Pilina A (PilA) es probablemente la mayor subunidad de pilina del Pilus Tipo IV de H. influenzae implicados en la contracción de la motilidad (Infection and Immunity, 73: 1635-1643 (2005)). NTHi PilA es una adhesina conservada expresada in vivo. Ha demostrado estar implicada en la adherencia, la colonización y la formación de biopelículas de NTHi (Molecular Microbiology 65: 1288-1299 (2007)). Novotny y col. 2009 (Vaccine 28(1)279-289) desvela ensayos de los tres candidatos para vacunas derivadas de PilA en un modelo de chinchilla de otitis media (OM) inducida por Haemophilus influenzae no tipificable (NTHI) ascendente. La presentación de un epítopo de linfocito B derivado de la adhesina OMPP5 en el N-terminal de la proteína PilA soluble recombinante (en oposición al C-terminal) resultó en un inmunógeno quimérico protector que combinó los epítopos de dos adhesinas de NTHI distintas (pili tipo IV y OMP P5). El documento WO2007/008527A2 desvela proteínas quiméricas que comprenden la proteína mayor de la subunidad de pilus de contracción de NTHi (PiIA) que presentan una porción de la proteína NTHi OMP P5.
El documento WO2007/006665A1 describe un procedimiento de visualización de fagos filamentosos en el que los polipéptidos de interés visualizados en la partícula del fago se traslocan cotraduccionalmente a través de la membrana citoplásmica de bacterias Gram-negativas basándose en la ruta de la partícula de reconocimiento de señal. Alvandi y col. 2010 (Journal of Microbiology and Biotechnology 27(4)1573-0972 describe la expresión periplásmica y una purificación de una etapa de la subunidad B de ureasa de Helicobacterpylori.
Haemophilus influenzae no tipificable es un patógeno respiratorio importante y común que provoca otitis media en bebés y niños. NTHi es, después de Streptococcus pneumoniae, la causa más común de otitis media aguda en niños (J. Immunology 183: 2593-2601 (2009), Pediatrics 113:1451-1465 (2004)). Es una causa importante de sinusitis en niños y adultos (Current Infectious Disease Reports 11:177-182 (2009)). También se ha asociado a un riesgo aumentado de exacerbaciones en la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) en adultos (Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease 3:109-115 (2006)). Además, la H. influenzae no tipificable provoca neumonía adquirida en la comunidad en adultos y puede provocar neumonía en niños en países en desarrollo (Current Infectious Disease Reports 11:177-182 (2009)).
Existe una necesidad de vacunas para NTHi.
Breve sumario de la invención
Como un primer aspecto, la presente invención proporciona una composición inmunogénica que comprende una proteína de fusión de fórmula (I):
(X)m-(R1)n-A-(Y)o-B-(Z)p (fórmula I)
en la que
X es un péptido señal o MHHHHHH (SEQ ID NO. 2);
m es 0 o 1;
R1 es un aminoácido;
n es 0, 1,2, 3, 4, 5 o 6;
A es un fragmento inmunogénico de la Proteína E seleccionado de SEQ ID NO. 122, SEQ ID NO. 123, SEQ ID NO. 124, SEQ ID NO. 125, SEQ ID NO. 126, SEQ ID NO. 179 o SEQ ID NO. 180 o una secuencia que tiene al menos un 95 % de identidad con una cualquiera de SEQ ID NO. 122, SEQ ID NO. 123, SEQ ID NO. 124, SEQ ID NO. 125, SEQ ID NO. 126, SEQ ID NO. 179 o SEQ ID NO. 180;
Y es GG;
o es 1;
B es un fragmento inmunogénico de PilA, al menos un 95 % idéntico a los aminoácidos 40-149 de cualquiera de SEQ ID NO. 58 a SEQ ID NO. 121;
Z es GGHHHHHH (SEQ ID NO. 3);
y p es 0 o 1 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
Como un segundo aspecto, la presente invención proporciona composiciones inmunogénicas que comprenden las proteínas de fusión de fórmula (I) que comprende además un adyuvante farmacéuticamente aceptable.
En un tercer aspecto, la presente invención proporciona la composición inmunogénica para su uso en el tratamiento o la prevención de una afección o enfermedad provocada completamente o en parte por Haemophilus influenzae.
En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona la composición inmunogénica para su uso en el tratamiento o la prevención de otitis media.
En un quinto aspecto, la presente invención proporciona la composición inmunogénica para su uso en el tratamiento o la prevención de exacerbaciones en la enfermedad pulmonar obstructiva crónica.
En un sexto aspecto, la presente invención proporciona la composición inmunogénica para su uso en el tratamiento o la prevención de neumonía.
En un séptimo aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una proteína de fusión de fórmula (I) para su uso en el tratamiento o la prevención de una afección o enfermedad provocada completamente o en parte por Haemophilus influenzae. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender además un adyuvante farmacéuticamente aceptable.
Los aspectos adicionales de la presente invención se describen en la descripción detallada de realizaciones particulares, ejemplos y reivindicaciones que siguen.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1. SDS-PAGE de extractos bacterianos inducidos para las construcciones de proteínas de fusión LVL291, LVL268 y LVL269. La Fracción insoluble (I), la Fracción soluble (S) y la Fracción del medio de cultivo (M) se cargaron para LVL291, LVL268 y LVL269 antes y después de la inducción (ind).
Figura 2. SDS-PAGE y transferencia Western con referencia a los extractos de purificación inducidos para las construcciones de proteínas de fusión LVL291, LVL268 y LVL269. La Fracción de flujo a través (Ft), la Fracción de lavado (W) y la Fracción de elución (E) se cargaron para la purificación de LVL291, LVL268 y LVL269. Se usó la etiqueta anti-his para sondar los extractos.
Figura 3. SDS-PAGE de extractos bacterianos inducidos y de purificación para las construcciones de proteínas de fusión LVL291 y LVL315. La Fracción del medio de cultivo (M), la Fracción soluble (Sol), la Fracción insoluble (Ins), la Fracción de flujo a través (Ft), la Fracción de lavado n.° 1 (W1), la Fracción de lavado n.° 2 (W2) y la Fracción de elución (E) se cargaron para LVL291 y LVL315.
Figura 4. SDS-PAGE de extractos bacterianos inducidos y de purificación para la construcción de proteínas de fusión LVL312. La Fracción del medio de cultivo (M), la Fracción soluble (Sol), la Fracción insoluble (Ins), la Fracción de flujo a través (Ft), la Fracción de lavado n.° 1 (W1), la Fracción de lavado n.° 2 (W2) y la Fracción de elución (E) se cargaron para LVL312.
Figura 5. SDS-PAGE de extractos bacterianos inducidos (1 mM y 10 |jM IPTG) para la construcción de proteínas de fusión LVL317. Extractos de antes (NI) y después (In) de la inducción, Fracción soluble (S), Fracción insoluble (I).
Figura 6. SDS-PAGE de extractos bacterianos inducidos (1 mM y 10 j M IPTG) para la construcción de proteínas de fusión LVL318. Extractos de antes (NI) y después (In) de la inducción, Fracción del medio de cultivo (M), Fracción soluble (S), Fracción insoluble (I).
Figura 7. Espectros de CD de PE, PilA y proteínas de fusión PE-PilA.
Figura 8. Combinación del espectro de CD de PE y PilA.
Figura 9. Curva de desnaturalización térmica de PilA.
Figura 10. Curva de desnaturalización de PE.
Figura 11. Curva de desnaturalización térmica de la proteína de fusión PE-PilA.
Figura 12. Cromatograma típico SP Sepharose™ Fast Flow.
Figura 13. Cromatograma típico Q Sepharose™ Fast Flow.
Figura 14. SDS-PAGE de muestras en el procedimiento del procedimiento de purificación de la proteína de fusión PE-PilA.
Figura 15. Transferencia Western de muestras en el procedimiento del procedimiento de purificación de la proteína de fusión PE-PilA. La transferencia usa anti-PE policlonal de conejo.
Figura 16. Transferencia Western de muestras en el procedimiento del procedimiento de purificación de la proteína de fusión PE-PilA. La transferencia usa anti-E. coli (BLR) policlonal de conejo.
Figura 17. Transición térmica de la proteína de fusión PE-PilA y las proteínas PE y PilA. Curvas: PilA (1), Proteína E (Prot E, PE) (2), Volumen Purificado de PE-PilA no diluido, 737 pg/ml (3) y Volumen Purificado de PE-PilA diluido en una concentración de Recipiente Final 60 pg/ml (4).
Figura 18. Respuestas de anticuerpos contra la proteína de fusión PE-PilA LVL291 y contra PE y PilA monovalentes en el modelo de ratón Balb/c.
Figura 19. Efecto de la vacunación de la proteína de fusión PE-PilA en la eliminación de bacterias NTHi cepa 86-028NP en nasofaringe de ratón.
Figura 20. Efecto de la vacunación de la proteína de fusión PE-PilA en la eliminación de bacterias NTHi cepa 3224A en nasofaringe de ratón.
Figura 21. Efecto de la vacunación de PilA en la eliminación de bacterias en nasofaringe de ratón.
Figura 22. Efecto de la vacunación de PE en la eliminación de bacterias en nasofaringe de ratón.
Figura 23. (a) proteína de fusión PE-PilA LVL317 que se une a vitronectina y (b) proteínas de fusión PE-PilA LVL317 y LVL735 unidas a vitronectina.
Figura 24. Inhibición de la unión a vitronectina por anticuerpos policlonales contra la proteína de fusión PE-PilA. Figura 25. SDS-PAGE de fracciones solubles de extractos bacterianos inducidos para las construcciones de proteínas de fusión LVL291, LVL702, LVL736, LVL737, LVL738, LVL739, LVL740 y el vector pET26b (control negativo). (a) Experimento 1 (b) Experimento 2 (c) Experimento 3. Proteína de fusión PE-PilA indicada por una flecha.
Figura 26. El porcentaje de banda promedio de la proteína de fusión en la fracción soluble de los Experimentos 1, 2 y 3.
Figura 27. Respuesta de anticuerpos PE y PilA a LVL317 y LVL735.
Figura 28. Efecto de la vacunación de LVL317 y LVL735 en la eliminación de bacterias en un modelo de ratón de colonización nasofaríngea de Haemophilus influenzae no tipificable.
Descripción detallada de la invención
Salvo que se explique o defina de otra manera en el presente documento, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por un experto en la materia a la que la presente divulgación pertenece. Por ejemplo, las definiciones de términos comunes en biología molecular pueden encontrarse en Benjamin Lewin, Genes V, publicado por Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19­ 854287-9); Kendrew y col. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicada por Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); y Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).
Los términos singulares “un”, “una” y “el/la” incluyen referentes plurales salvo que el contexto indique claramente lo contrario. De forma similar, la palabra “o” se destina a incluir “y” salvo que el contexto indique claramente lo contrario. Ha de entenderse además que todos los tamaños de bases o los tamaños de aminoácidos y todos los valores de peso molecular o de masa molecular, dados para ácidos nucleicos o polipéptidos son aproximados y se proporcionan para descripción. Adicionalmente, las limitaciones numéricas dadas con respecto a las concentraciones o los niveles de una sustancia, tales como un antígeno pueden ser aproximadas. De esta manera, cuando se indica que una concentración es (por ejemplo) aproximadamente 200 pg, se entiende que la concentración incluye valores ligeramente más o ligeramente menos que (“aproximadamente” o “~”) 200 pg.
Aunque pueden usarse procedimientos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en el presente documento en la práctica o el ensayo de la presente divulgación, los procedimientos y materiales adecuados se describen a continuación.
El término “comprende” significa “incluye”. De esta manera, salvo que el contexto requiera claramente lo contrario, la palabra “comprende” y las variaciones tales como “comprender” y “que comprende” se entenderán que implican la inclusión de un compuesto o una composición citados (por ejemplo, ácido nucleico, polipéptido, antígeno) o etapa, o grupo de compuestos o etapas, pero no la exclusión de cualquier compuesto, composición, etapa o grupo de los mismos distintos. La abreviatura “e.g.” deriva del latín exempli gratia y se usa en el presente documento para indicar un ejemplo no limitante. De esta manera, la abreviatura “e.g.” es sinónimo de la expresión “por ejemplo”.
Para facilitar la revisión de las diversas realizaciones de la presente divulgación, se proporcionan las siguientes explicaciones de términos. Los términos y explicaciones adicionales se proporcionan en el contexto de la presente divulgación.
Un “sujeto” como se usa en el presente documento es un mamífero, incluyendo humanos, primates no humanos y mamíferos no primates tales como miembros del género de roedores (incluyendo pero no limitado a ratones y ratas) y miembros del orden Lagomorpha (incluyendo pero no limitado a conejos).
Como se usa en el presente documento "Proteína E", "proteína E", "Prot E" y "PE" significan Proteína E de H. influenzae. La Proteína E puede consistir en o comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 4 (MKKIILTLSL GLLTACSAQI QKAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK) así como todas las secuencias con al menos o exactamente el 75 %, 77 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 99 % o 100 % de identidad, sobre la longitud completa, a SEQ ID NO. 4. La comparación de 53 secuencias de la Proteína E de Haemophilus influenzae (Tabla 1, SEQ ID NO. 5 - SEQ ID NO. 57) demostró de aproximadamente el 77 % a aproximadamente el 100% de identidad a la Proteína E como se expone en la SEQ ID NO. 4. Por ejemplo, en la secuencia de aminoácidos de la Proteína E, el aminoácido n.° 20 puede ser isoleucina (I) o treonina (T); el aminoácido n.° 23 puede ser alanina (A) o valina (V); el aminoácido n.° 24 puede ser lisina (K) o ácido glutámico (E); el aminoácido n.° 31 puede ser alanina (A) o treonina (T); el aminoácido n.° 32 puede ser prolina (P) o alanina (A); el aminoácido n.° 34 puede ser treonina (T) o alanina (A); el aminoácido n.° 37 puede ser arginina (R) o glutamina (Q); el aminoácido n.° 47 puede ser valina (V) o alanina (A); el aminoácido n.° 57 puede ser triptófano (W) o puede estar ausente (-); el aminoácido n.° 70 puede ser alanina (A) o treonina (T); el aminoácido n.° 93 puede ser glutamina (Q) o ausente (-); el aminoácido n.° 109 puede ser treonina (T) o isoleucina (I); el aminoácido n.° 119 puede ser glicina (G) o serina (S); el aminoácido n.° 153 puede ser ácido glutámico (E) o lisina (K); el aminoácido n.° 156 puede ser serina (S) o leucina (L); el aminoácido n.° 160 puede ser lisina (K) o asparagina (N); el aminoácido n.° 161 puede ser lisina (K), isoleucina (I) o ausente (-); los aminoácidos n.° 162 - n.° 195 pueden estar ausentes o ser como se expone en SEQ ID NO. 15 (indicando (-) que el aminoácido n.° 166 está ausente) o como se expone en SEQ ID NO. 16; o cualquier combinación de los mismos.
La proteína E puede consistir en o comprender una secuencia de aminoácidos que difiere de SEQ ID NO. 4 en uno cualquiera o más aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en: el aminoácido n.° 20, el aminoácido n.° 23, el aminoácido n.° 24, el aminoácido n.° 31, el aminoácido n.° 32, el aminoácido n.° 34, el aminoácido n.° 37, el aminoácido n.° 47, el aminoácido n.° 57, el aminoácido n.° 70, el aminoácido n.° 93, el aminoácido n.° 109, el aminoácido n.° 119, el aminoácido n.° 153, el aminoácido n.° 156, el aminoácido n.° 160, el aminoácido n.° 161 y los aminoácidos n.° 162-n.° 195, en los que el aminoácido n.° 20 es treonina (T); el aminoácido n.° 23 es valina (V); el aminoácido n.° 24 es lisina (K); el aminoácido n.° 31 es treonina (T); el aminoácido n.° 32 es alanina (A); el aminoácido n.° 34 es alanina (A); el aminoácido n.° 37 es glutamina (Q); el aminoácido n.° 47 es alanina (A); el aminoácido n.° 57 está ausente (-); el aminoácido n.° 70 es treonina (T); el aminoácido n.° 93 está ausente (-); el aminoácido n.° 109 es isoleucina (I); el aminoácido n.° 119 es serina (S); el aminoácido n.° 153 es lisina (K); el aminoácido n.° 156 es leucina (L); el aminoácido n.° 160 es asparagina (N); el aminoácido n.° 161 es lisina (K) o isoleucina (I); o los aminoácidos n.° 162 - n.° 195 son como se expone en SEQ ID NO. 15 (indicando (-) que el aminoácido n.° 166 está ausente) o como se expone en SEQ ID NO. 16.
Tabla 1: Secuencias de aminoácidos de la Proteína E de 53 cepas de Haemophilus influenzae (SEQ ID NO. 5 - SEQ ID NO. 57. - indica ue el aminoácido está ausente.
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La proteína E puede ser la Proteína E de H. influenzae cepas 3224A, RdKW20, 86-028NP, R2846, R2866, 3655, PittAA, PittEE, PittHH, Pittll, R3021, 22.4-21, 3219C, 3185, 3241A, 038144S1, 810956, 821246, 840645, 902550Z19, A840177, A860514, A950014, 306543X4, A930105, 901905U, A920030, 3221B, 27W116791N, N218, N163, N162, N107, N91, D211PG, D211PD, D201PG, D201PD, D198PG, D198PD, D195PD, D189PG, D189PD, D129CG, D124PG, D124PD, D58PG, D330D, BS433, BS432, 1714, 1128 o BS430. La Proteína E puede ser la Proteína E como se expone en cualquiera de SEQ ID NO. 5 - SEQ ID NO. 57.
La proteína E puede ser una secuencia con al menos un 95 % de identidad, sobre la longitud completa, de cualquiera de SEQ ID NO. 4 - SEQ ID NO. 57. La proteína E puede ser una secuencia con al menos el 95 % de identidad, en toda la longitud, con cualquiera de las secuencias establecidas en la Tabla 1, SEQ ID NO: 5 - SEQ ID NO: 57.
Los fragmentos inmunogénicos de la Proteína E comprenden fragmentos inmunogénicos de al menos 7, 10, 15, 20, 25, 30 o 50 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO. 4. Los fragmentos inmunogénicos pueden activar anticuerpos que puedan unirse a SEQ ID NO. 4.
Los fragmentos inmunogénicos de la Proteína E pueden comprender fragmentos inmunogénicos de al menos 7, 10, 15, 20, 25, 30 o 50 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO. 4 - SEQ ID NO. 57. Los fragmentos inmunogénicos pueden activar anticuerpos que puedan unirse a la longitud completa de la que deriva el fragmento.
Los fragmentos inmunogénicos de la Proteína E comprenden fragmentos inmunogénicos de al menos 7, 10, 15, 20, 25, 30 o 50 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO. 5 - SEQ ID NO. 57. Los fragmentos inmunogénicos pueden activar anticuerpos que pueden unirse a la secuencia de longitud completa de la que deriva el fragmento.
Como se usa en el presente documento “PilA” significa Pilina A de H. influenzae. PilA puede consistir en o comprender la secuencia de proteína de SEQ ID NO. 58 MKLTTQQTLK KGFTLIELMI VIAIIAILAT IAIPSYQNYT KKAAVSELLQ ASAPYKADVE LCVYSTNETT NCTGGKNGIA ADITTAKGYV KSVTTSNGAI TVKGDGTLAN MEYILQATGN AATGVTWTTT CKGTDASLFP ANFCGSVTQ) así como las secuencias con un 80 % a un 100 % de identidad a SEQ ID NO. 58. Por ejemplo, PilA puede ser al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO.
58. La comparación de longitud completa de 64 secuencias de PilA de Haemophilus influenzae (Tabla 2, SEQ ID NO.
58 - SEQ ID NO. 121) demostró aproximadamente un 80 % a un 100 % de identidad a PilA como se expone en SEQ ID NO. 58. Por ejemplo, en la secuencia de aminoácidos de PilA, el aminoácido n.° 6 puede ser glutamina (Q) o leucina (L); el aminoácido n.° 7 puede ser glutamina (Q) o treonina (T); el aminoácido n.° 37 puede ser glutamina (Q) o lisina (K); el aminoácido n.° 44 puede ser alanina (A) o serina (S); el aminoácido n.° 57 puede ser alanina (A) o serina (S); el aminoácido n.° 67 puede ser asparagina (N) o glicina (G); el aminoácido n.° 68 puede ser ácido glutámico (E) o lisina (K); el aminoácido n.° 69 puede ser treonina (T) o prolina (P); el aminoácido n.° 71 puede ser lisina (K), asparagina (N), serina (S) o treonina (T); el aminoácido n.° 73 puede ser treonina (T), serina (S) o metionina (M); el aminoácido n.° 76 puede ser lisina (K), serina (S) o asparagina (N); el aminoácido n.° 84 puede ser treonina (T) o lisina (K); el aminoácido n.° 86 puede ser alanina (A) o valina (V); el aminoácido n.° 91 puede ser lisina (K) o alanina (A); el aminoácido n.° 94 puede ser treonina (T), isoleucina (I) o lisina (K); el aminoácido n.° 96 puede ser serina (S) o glutamina (Q); el aminoácido n.° 97 puede ser asparagina (N) o serina (S); el aminoácido n.° 99 puede ser alanina (A) o glicina (G); el aminoácido n.° 103 puede ser alanina (A) o lisina (K); el aminoácido n.° 109 puede ser ácido aspártico (D), alanina (A) o treonina (T); el aminoácido n.° 110 puede ser glicina (G), asparagina (N), o arginina (R); el aminoácido n.° 112 puede ser serina (S) o ácido glutámico (E); el aminoácido n.° 114 puede ser treonina (T) o isoleucina (I); el aminoácido n.° 116 puede ser treonina (T) o glutamina (Q); el aminoácido n.° 118 puede ser ácido glutámico (E), treonina (T), alanina (A), lisina (K) o serina (S); el aminoácido n.° 121 puede ser serina (S) o alanina (A); el aminoácido n.° 122 puede ser alanina (A) o treonina (T); el aminoácido n.° 123 puede ser lisina (K), treonina (T) o alanina (A); el aminoácido n.° 128 puede ser lisina (K) o treonina (T); el aminoácido n.° 135 puede ser ácido aspártico (D) o ácido glutámico (E); el aminoácido n.° 136 puede ser alanina (A) o treonina (T); el aminoácido n.° 145 puede ser glicina (G) o arginina (R); el aminoácido n.° 149 puede ser glutamina (Q) o lisina (K); o cualquier combinación de los mismos..
Pil A puede consistir en o comprender una secuencia de aminoácidos que difiera de SEQ ID NO. 58 en uno o más aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en el aminoácido n.° 6, el aminoácido n.° 7, el aminoácido n.° 37, el aminoácido n.° 44, el aminoácido n.° 57, el aminoácido n.° 67, el aminoácido n.° 68, el aminoácido n.° 69, el aminoácido n.° 71, el aminoácido n.° 73, el aminoácido n.° 76, el aminoácido n.° 84, el aminoácido n.° 86, el aminoácido n.° 91, el aminoácido n.° 94, el aminoácido n.° 96, el aminoácido n.° 97, el aminoácido n.° 99, el aminoácido n.° 103, el aminoácido n.° 109, el aminoácido n.° 110, el aminoácido n.° 112, el aminoácido n.° 114, el aminoácido n.° 116, el aminoácido n.° 118, el aminoácido n.° 121, el aminoácido n.° 122, el aminoácido n.° 123, el aminoácido n.° 128, el aminoácido n.° 135, el aminoácido n.° 136, el aminoácido n.° 145 y el aminoácido n.° 149, en el que el aminoácido n.° 6 es leucina (L); el aminoácido n.° 7 es treonina (T); el aminoácido n.° 37 es lisina (K); el aminoácido n.° 44 es serina (S); el aminoácido n.° 57 es serina (S); el aminoácido n.° 67 es glicina (G); el aminoácido n.° 68 es lisina (K); el aminoácido n.° 69 es prolina (P); el aminoácido n.° 71 es lisina (K), serina (S) o treonina (T); el aminoácido n.° 73 es serina (S) o metionina (M); el aminoácido n.° 76 es serina (S) o asparagina (N); el aminoácido n.° 84 es lisina (K); el aminoácido n.° 86 es valina (V); el aminoácido n.° 91 es alanina (A); el aminoácido n.° 94 es isoleucina (I) o lisina (K); el aminoácido n.° 96 es glutamina (Q); el aminoácido n.° 97 es serina (S); el aminoácido n.° 99 es glicina (G); el aminoácido n.° 103 es alanina (A); el aminoácido n.° 109 es ácido aspártico (D) o treonina (T); el aminoácido n.° 110 es glicina (G) o arginina (R); el aminoácido n.° 112 es serina (S); el aminoácido n.° 114 es treonina (T); el aminoácido n.° 116 es treonina (T); el aminoácido n.° 118 es ácido glutámico (E), alanina (A), lisina (K) o serina (S); el aminoácido n.° 121 es serina (S); el aminoácido n.° 122 es treonina (T); el aminoácido n.° 123 es lisina (K) o alanina (A); el aminoácido n.° 128 es lisina (K); el aminoácido n.° 135 es ácido glutámico (E); el aminoácido n.° 136 es treonina (T); el aminoácido n.° 145 es arginina (R); el aminoácido n.° 149 es lisina (K).
Tabla 2: Secuencias de aminoácidos de la Proteína E de 53 cepas de Haemophilus influenzae (SEQ ID NO. 5 - SEQ ID NO. 57. - indica ue el aminoácido está ausente.
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PilA puede ser PilA de H. influenzae cepa NTHÍ3219C, NTHÍ3224A, NTHÍ12, NTHÍ44, NTHÍ67, 1054MEE, 1729MEE, 1728MEE, 1885MEE, 1060MEE, RdKW20, 214NP, 1236MEE, 1714MEE, 1128MEE, 86-028NP, R2846, R2866, 3655, PittAA, PittGG, Pittll, R3021, 22.4-21, 3185A, 3221B, 3241A, 038144S1, 821246, 840645, 902550Z19, A840177, A920030, A950014, 901905U, A920029, A930105, 306543X4, N218, N163, N162, N120, N107, N92, N91, D219PG, D211PG, D211PD, D204CD, D198PG, D198PD, D195PD, D195CD, D189PG, D189PD, D124PG, D124PD, D124CG, D58PG, BS433, BS432, BS430, 1714 o 1128. Una secuencia de aminoácidos para PilA de H. influenzae cepa D204CD se expone en SEQ ID NO. 106, en la que X en la posición n.° 116 es bien glutamina (Q) o leucina (L); la ambigüedad para el aminoácido en la posición n.° 116 podría esclarecerse por resolución técnica del segundo nucleótido que codifica el aminoácido n.° 116, clarificando la secuencia de PilA para la cepa D204CD. PilA puede ser PilA como se expone en cualquiera de SEQ ID NO. 58 - SEQ ID NO. 121.
PilA puede ser una secuencia con al menos un 95 % de identidad, sobre la longitud completa, a cualquiera de SEQ ID NO. 58 - SEQ ID NO. 121 (como se expone en la Tabla 2).
Los fragmentos inmunogénicos de PilA comprenden fragmentos inmunogénicos de al menos 7, 10, 15, 20, 25, 30 o 50 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO. 58 - SEQ ID NO. 121. Los fragmentos inmunogénicos pueden activar anticuerpos que pueden unirse a la secuencia de longitud completa de la que deriva el fragmento.
Por ejemplo, los fragmentos inmunogénicos de PilA comprenden fragmentos inmunogénicos de al menos 7, 10, 15, 20, 25, 30 o 50 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO. 58. Los fragmentos inmunogénicos pueden activar anticuerpos que pueden unirse a SEQ ID NO. 58.
La identidad entre polipéptidos puede calcularse por diversos algoritmos. Por ejemplo, puede usarse el programa Needle, del paquete EMBOSS (Software libre; EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite (2000). Trends in Genetics 16(6): 276-277) y el programa Gap del paquete GCG® (Accelrys Inc.). Este programa Gap es una implementación del algoritmo de Needleman-Wunsch descrito en: Needleman, S. B. y Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453. Se ha estado usando la matriz de puntuación BLOSUM62 y el hueco abierto y las sanciones de extensión fueron respectivamente 8 y 2.
Como se usa en el presente documento, “adyuvante” significa un compuesto o una sustancia que, cuando se administra a un sujeto junto con una vacuna, un producto inmunoterapéutico u otra composición que contiene antígeno o inmunógeno, aumenta o potencia la respuesta inmune del sujeto al antígeno o inmunógeno administrados (en comparación con la respuesta inmune que se obtendría en ausencia de adyuvante). Esto ha de distinguirse de “terapia adyuvante”, definida por el National Cancer Institute of the United States Institutes of Health en el contexto del tratamiento de cáncer como un tratamiento adicional dado después del tratamiento primario, para disminuir el riesgo de que el cáncer recurra.
Las sustituciones conservativas se conocen bien y se establecen generalmente como las matrices de puntuación por defecto en los programas de ordenador de alineamiento de secuencias. Estos programas incluyen PAM250 (Dayhoft M.O. y col., (1978), "A model of evolutionary changes in proteins", en "Atlas of Protein sequence and structure" 5(3) M.O. Dayhoft (ed.), 345-352), National Biomedical Research Foundation, Washington y Blosum 62 (Steven Henikoft y Jorja G. Henikoft (1992), "Amino acid substitution matrices from protein blocks"), Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89 (Biochemistry): 10915-10919. La invención proporciona además proteínas de fusión de fórmula (I) que contienen sustituciones de aminoácidos conservativas. Por ejemplo, las proteínas de fusión de fórmula (I) pueden contener una sustitución conservativa de cualquier aminoácido de PE o PilA de H. influenzae como se describen en cualquiera de las secuencias expuestas en el presente documento (por ejemplo, cualquier secuencia de PE expuesta en SEQ ID NO. 4 - SEQ ID NO. 57 y/o cualquier secuencia de PilA expuesta en SEQ ID NO. 58 - SEQ ID NO. 121).
Como se usa en el presente documento “péptido señal” se refiere a un polipéptido corto (menos de 60 aminoácidos, por ejemplo, 3 a 60 aminoácidos) presente en proteínas precursoras (típicamente en el N terminal) y que está típicamente ausente de la proteína madura. El péptido señal (ps) es típicamente rico en aminoácidos hidrófobos. El péptido señal dirige el transporte y/o la secreción de la proteína traducida a través de la membrana. Los péptidos señal también pueden denominarse señales de marcaje de diana, péptidos de tránsito, señales de localización o secuencias señal. Por ejemplo, la secuencia señal puede ser un péptido señal co-traduccional o post-traduccional.
Un péptido señal heterólogo puede escindirse de una construcción de proteína de fusión por peptidasas del péptido señal durante o después del transporte o la secreción de la proteína. Por ejemplo, la peptidasa del péptido señal es una peptidasa I del péptido señal. Un péptido señal “heterólogo” es uno que no está asociado a la proteína como existe en la naturaleza.
Como se usa en el presente documento “tratamiento” significa la prevención de la ocurrencia de síntomas de la afección o enfermedad en un sujeto, la prevención de la recurrencia de síntomas de la afección o enfermedad en un sujeto, el retraso de la recurrencia de los síntomas de la afección o enfermedad en un sujeto, la disminución en la gravedad o frecuencia de los síntomas de la afección o enfermedad en un sujeto, la ralentización o la eliminación del avance de la afección y la eliminación parcial o total de los síntomas de la enfermedad o afección en un sujeto.
Como se usa en el presente documento, “opcionalmente” significa que el evento o eventos posteriormente descritos pueden o pueden no ocurrir e incluye tanto evento o eventos que ocurren como eventos que no ocurren.
La patogénesis de la enfermedad provocada por NTHi comienza con la colonización nasofaríngea. Los mecanismos para adherirse y mantener la residencia a largo plazo dentro del microambiente nasofaríngeo se consideran “determinantes de la virulencia” para NTHi (Vaccine 28: 279-289 (2010)).
La importancia de que NTHi sea capaz de adherirse a las superficies epiteliales mucosas de un hospedador humano se refleja en la multiplicidad de adhesinas expresadas por NTHi. Por ejemplo, algún NTHi expresa pili. Otras estructuras adhesivas pertenecen a la familia autotransportadora de proteínas; estas incluyen proteínas Hap, HMW1/HMW2 e Hia/Hsf. Se han descrito además proteínas de membrana externa, tales como la proteína P2, la proteína P5 y OapA como adhesiones para Haemophilus influenzae (Cellular Microbiology 4:191-200 (2002), Microbes and Infection 10: 87-96 (2008), Vaccine 28: 279-289 (2010)).
La otitis media es una causa mayor de morbilidad en el 80 % de todos los niños menores de 3 años de edad (Expert Rev. Vaccines 5:517-534 (2006)). Más del 90 % de los niños desarrollan otitis media antes de la edad de 7 (Current Opinion in Investigational Drugs 4:953-958 (2003)). En 2000, hubo 16 millones de visitas realizadas a médicos en base a oficina para otitis media en los Estados Unidos y aproximadamente 13 millones de prescripciones antibacterianas dispensadas (Pediatrics 113:1451-1465 (2004)). En países europeos, las tasas de otitis media aguda informadas varían entre 0,125 y 1,24 por niño-año (Expert Review of Vaccines 8:1479-1500 (2009)). La otitis media es una infección costosa y la razón más común por la que los niños reciben antibióticos (Current Infectious Disease Reports 11:177-182 (2009)). Las bacterias son responsables de aproximadamente el 70 % de los casos de otitis media aguda, predominando como los agentes causantes Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae no tipificable y Moraxella (Expert Review of Vaccines 5:517-534 (2006)). Un subconjunto de niños experimentan otitis media recurrente y crónica y estos niños propensos a otitis tienen derrames prolongados en el oído medio que se asocian a la pérdida de audición y retrasos en el habla y el desarrollo del lenguaje (Current Infectious Disease Reports 11:177-182 (2009)).
Siguiendo la introducción de la vacuna neumocócica heptavalente en muchos países, algunos estudios han demostrado un aumento significativo en la proporción de otitis media aguda provocada por H. influenzae, volviéndose H. influenzae el patógeno predominante (Pediatric Infectious Disease Journal 23:824-828; Pediatric Infectious Disease Journal 23:829-833 (2004)).
Ya que la otitis media es una enfermedad multifactorial, se ha cuestionado la factibilidad de revenir la otitis media usando una estrategia de vacunación (Current Infectious Disease Reports 11:177-182 (2009)). Sin embargo, los resultados de un estudio sugieren que es posible que un antígeno induzca protección al menos parcial contra H. influenzae no tipificable (Lancet 367:740-748 (2006)). Un enfoque para desarrollar antígenos de vacuna es usar regiones antigénicamente conservadas de moléculas de superficie genéticamente heterogéneas pero abundantemente expresadas. Otro enfoque es identificar proteínas de superficie que demuestran la conservación de secuencias o de epítopos funcionales. Una tercera consideración para un antígeno de vacuna debería ser seleccionar un antígeno que se expresa durante la infección y la colonización en un hospedador humano. Murphy (Curr. Infect. Disease Reports 11:177-182 (2009) cita que, a pesar de la existencia de varios antígenos candidatos potenciales para H. influenzae no tipificable, uno no puede predecir con certeza si el antígeno candidato será eficaz (Current Infectious Disease Reports 11:177-182 (2009)). Algunas de las proteínas descritas como antígenos de vacuna potenciales son: proteína adhesina de Haemophilus (Hap), proteínas 1 y 2 de alto peso molecular (HMW), adhesina de H. influenzae (Hia), proteína D15, proteína de choque térmico HtrA, proteína de superficie P2, lipoproteína D, péptidos derivados de fimbrina P5, proteína de membrana externa P4, proteína de membrana externa (OMP) 26 (OMP26), proteína P6, Proteína E, pilus Tipo IV, lipooligosacárido y fosforil colina (Current Infectious Disease Reports 11:177-182 (2009); Expert Review of Vaccines 5:517-534 (2006)).
El modelo de chinchilla es un modelo animal robusto y validado de otitis media y su prevención (Expert Review of Vaccines 8:1063-1082 (2009)). Aunque el modelo de chinchilla puede imitar el transcurso natural de la infección humana, otros han sugerido que los resultados en el modelo de chinchilla pueden variar de un laboratorio a otro (Current Opinion in Investigational Drugs 4:953-958 (2003)).
También se han usado diversos roedores distintos para la inducción de otitis media y se resumen en Vaccine 26:1501-1524 (2008). El modelo animal murino normalmente se estudia en la investigación de otitis media.
La presencia de anticuerpos bactericidas se asocia a la protección de la otitis media debida a H. influenzae no tipificable (Current Opinion in Infectious Disease 16:129-134 (2003)). Sin embargo, una respuesta inmune no necesita ser bactericida para ser eficaz contra NTHi. Los anticuerpos que meramente reaccionan con las adhesinas de superficie de NTHi pueden reducir o eliminar la otitis media en la chinchilla (Current Opinion in Investigational Drugs 4:953-958 (2003)).
La enfermedad pulmonar obstructiva crónica es una enfermedad inflamatoria crónica de los pulmones y una causa principal de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. Aproximadamente una de 20 muertes en 2005 en los EE.UU. tuvo EPOC como causa subyacente (Drugs and Aging 26:985-999 (2009)). Se proyecta que en 2020 la EPOC se elevará a ser la quinta causa principal de años de vida ajustados por discapacidad, enfermedades invalidantes crónicas y a ser la tercera causa más importante de mortalidad (Lancet 349:1498-1504 (1997)).
El transcurso de la EPOC se caracteriza por el empeoramiento progresivo de la limitación de las vías aéreas y una disminución en la función pulmonar. La EPOC puede complicarse por exacerbaciones agudas (EA) frecuentes y recurrentes, que se asocia a enormes gastos de salud y alta morbilidad (Proceedings of the American Thoracic Society 4:554-564 (2007)). Un estudio sugiere que aproximadamente el 50 % de las exacerbaciones agudas de los síntomas de la EPOC están causados por Haemophilus influenzae no tipificable, Moraxella catarrhalis, Streptococcus pneumoniae y Pseudomonas aeruginosa (Drugs and Aging 26:985-999 (2009)). H. influenzae se encuentra en el 20­ 30 % de las exacerbaciones de EPOC; Streptococcus pneumoniae, en el 10-15 % de las exacerbaciones de EPOC; y Moraxella catarrhalis, en el 10-15 % de las exacerbaciones de EPOC (New England Journal of Medicine 359:2355-2365 (2008)). Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae y Moraxella catarrhalis han demostrado ser los patógenos primarios en las exacerbaciones agudas de bronquitis en Hong Kong, Corea del sur y las Filipinas, mientras que Klebsiella spp., Pseudomonas aeruginosa y Acinetobacter spp. constituyen una gran proporción de patógenos en otros países/regiones asiáticos incluyendo Indonesia, Tailandia, Malasia y Taiwán (Respirology, (2011) 16, 532-539; doi:10.1111/j.1440.1843.2011.01943.x). En Bangladesh, el 20 % de los pacientes con EPOC mostraron cultivos de esputo positivos para Pseudomonas, Klebsiella, Streptococcus pneumoniae y Haemophilus influenzae, mientras que el 65 % de los pacientes con EAEPOC mostraron cultivos positivos para Pseudomonas, Klebsiella, Acinetobacter, Enterobacter, Moraxella catarrhalis y combinaciones de los mismos (Mymensingh Medical Journal 19:576-585 (2010)). Sin embargo, se ha sugerido que las dos medidas más importantes para prevenir la exacerbación de EPOC son las inmunizaciones activas y el mantenimiento crónico de la farmacoterapia (Proceedings of the American Thoracic Society 4:554-564 (2007)).
Existe una necesidad de vacunas eficaces contra NTHi. Usar antígenos que pueden actuar en diferentes etapas en la patogénesis puede mejorar la efectividad de una vacuna. Los inventores han descubierto que PilA y PE pueden estar beneficiosamente presentes en las composiciones inmunogénicas de la invención como proteínas de fusión.
La presente invención se refiere a una composición inmunogénica que comprende una proteína de fusión de fórmula (I).
(X)m-(R1)n-A-(Y)o-B-(Z)p (fórmula I)
en la que
X es un péptido señal o MHHHHHH (SEQ ID NO. 2);
m es 0 o 1;
R1 es un aminoácido;
n es 0, 1, 2, 3, 4, 5 o 6;
A es un fragmento inmunogénico de la Proteína E seleccionado de SEQ ID NO. 122, SEQ ID NO. 123, SEQ ID NO. 124, SEQ ID NO. 125, SEQ ID NO. 126, SEQ ID NO. 179 o SEQ ID NO. 180 o una secuencia que tiene al menos un 95 % de identidad con una cualquiera de SEQ ID NO. 122, SEQ ID NO. 123, SEQ ID NO. 124, SEQ ID NO. 125, SEQ ID NO. 126, SEQ ID NO. 179 o SEQ ID NO. 180;
Y es GG; o es 1;
B es un fragmento inmunogénico de PilA, al menos un 95 % idéntico a los aminoácidos 40-149 de cualquiera de SEQ ID NO. 58 a SEQ ID NO. 121;
Z es GGHHHHHH (SEQ ID NO. 3); y p es 0 o 1 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
En una realización, las proteínas de fusión de fórmula (I) se definen en las que X se selecciona del grupo que consiste en la secuencia señal de CcmH (proteína H de membrana citocromo c), DsbA (proteína periplásmica disulfuro isomerasa I), DsbB (proteína B de membrana de enlace disulfuro), FlgI (proteína de anillo de peptidoglucano flagelar), FocC (proteína Chaperona F1c), MalE (subunidad E del transportador de maltosa), NadA (subunidad A de la quinolinato sintasa), NikA (componente A del transportador ABC de níquel), NspA (proteína A de superficie de Neisseria), Omp26 (proteína 26 de la membrana externa), OmpA (proteína A de la membrana externa), OspA (proteína A de superficie externa), pelB (pectato liasa B), PhoA (fosfatasa alcalina bacteriana), PhtD (proteína D de tríada de histidina neumocócica), PhtE (proteína E de la tríada de histidina neumocócica), SfmC (chaperona de pilina periplásmica), Sip1 (proteína inmunogénica de superficie), TolB (Componente B del Complejo de Envuelta Celular Tol-Pal), TorA (subunidad A del sistema N-óxido de trimetilamina reductasa), TorT (proteína T periplásmica del sistema N-óxido de trimetilamina reductasa) e Yral (chaperona de pilina periplásmica putativa); o cualquier subgrupo de las mismas. En una realización, X es un péptido señal co-traduccional o un péptido señal post-traduccional. En una realización X es la secuencia señal de FlgI (flgI sp). En otra realización particular, X es la secuencia señal de (pelB sp). En otra realización, X es un péptido señal post-traduccional. En otra realización, X se selecciona del grupo que consiste en la secuencia señal de FlgI, NadA y pelB.
En una realización, se definen las proteínas de fusión de fórmula (I) en la que m es 1. En otra realización, m es 0.
En una realización particular, se definen R1 y n en las que (R-i)n es 1 a 6 aminoácidos enriquecidos en aminoácidos pequeños habitualmente hidrófilos. Los aminoácidos hidrófilos incluyen ácido glutámico (E), ácido aspártico (D) y asparagina (N).
En una realización, se definen las proteínas de fusión de fórmula (I) en las que n se selecciona del grupo que consiste en 0, 1, 2 y 6. En una realización particular, R1 y n se definen en las que (R-i)n se selecciona del grupo que consiste en D, E, a Tn DDD (SEQ ID NO. 178) y MD, o cualquier subconjunto de los mismos.
En una realización particular, n se selecciona del grupo que consiste en 1,2 y 6. En una realización particular, n es 0.
En una realización, se definen las proteínas de fusión de fórmula (I) en la que A es la Proteína E tal como se codifica por una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO.
13, SEQ ID NO. 14, SEQ ID NO.15, SEQ ID NO. 16, SEQ ID NO. 17, SEQ ID NO. 18, SEQ ID NO.19, SEQ ID NO.
20, SEQ ID NO. 21, SEQ ID NO.22, SEQ ID NO. 23, SEQ ID NO. 24, SEQ ID NO. 25, SEQ ID NO.26, SEQ ID NO.
27, SEQ ID NO. 28, SEQ ID NO.29, SEQ ID NO. 30, SEQ ID NO. 31, SEQ ID NO. 32, SEQ ID NO.33, SEQ ID NO.
34, SEQ ID NO. 35, SEQ ID NO. 36, SEQ ID NO. 37, SEQ ID NO. 38, SEQ ID NO.39, SEQ ID NO. 40, SEQ ID NO.
41, SEQ ID NO. 42, SEQ ID NO.43 SEQ ID NO. 44, SEQ ID NO. 45, SEQ ID NO. 46, SEQ ID NO.47, SEQ ID NO.
48, SEQ ID NO. 49, SEQ ID NO.50, SEQ ID NO. 51, SEQ ID NO. 52, SEQ ID NO. 53, SEQ ID NO.54, SEQ ID NO.
55, SEQ ID NO. 56 y SEQ ID NO. 57; o cualquier subconjunto de la SEQ ID NO: 5 a la SEQ ID NO:57. En otra realización, se definen las proteínas de fusión de fórmula (I) en las que A es la Proteína E, en la que la Proteína E es aproximadamente el 75 % al 100 % idéntica a la secuencia de aminiácidos de la Proteína E establecida en la SEQ ID NO: 4. En otra realización, A es la Proteína E, en la que la proteína E es aproximadamente el 90 % al 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la Proteína E establecida en la SEQ ID NO: 4. En otra realización, A es la Proteína E, en la que la proteína E es aproximadamente el 90 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la Proteína E establecida en la SEQ ID NO: 4. En otra realización, A es la Proteína E, en la que la proteína E es aproximadamente el 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la Proteína E establecida en cualquiera de la SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 57. En una realización particular, A es la Proteína E que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 4.
También se describen proteínas de fusión de fórmula (I) en la que A es un fragmento inmunogénico de la Proteína E, en las que la proteína E tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 13, SEQ ID NO. 14, SEQ ID NO. 15, SEQ ID NO. 16, SEQ ID NO. 17, SEQ ID NO. 18, SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 20, SEQ ID NO. 21, SEQ ID NO. 22, SEQ ID NO. 23, SEQ ID NO. 24, SEQ ID NO. 25, SEQ ID NO. 26, SEQ ID NO. 27, SEQ ID NO. 28, SEQ ID NO. 29, SEQ ID NO. 30, SEQ ID NO. 31, SEQ ID NO. 32, SEQ ID NO. 33, SEQ ID NO. 34, SEQ ID NO. 35, SEQ ID NO. 36, SEQ ID NO. 37, SEQ ID NO. 38, SEQ ID NO.39, SEQ ID NO. 40, SEQ ID NO. 41, SEQ ID NO. 42, SEQ ID NO. 43 SEQ ID NO. 44, SEQ ID NO. 45, SEQ ID NO. 46, SEQ ID NO. 47, SEQ ID NO. 48, SEQ ID NO. 49, SEQ ID NO. 50, SEQ ID NO. 51, SEQ ID NO. 52, SEQ ID NO. 53, SEQ ID NO. 54, SEQ ID NO. 55, SEQ ID NO. 56 y SEQ ID NO. 57; o cualquier subconjunto desde SEQ ID NO. 4 hasta SEQ ID NO. 57. También se describen proteínas de fusión de fórmula (I) en la que A es un fragmento inmunogénico de la Proteína E, en las que la proteína E es aproximadamente un 75 % a un 100 % idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 4. También se describen proteínas de fusión de fórmula (I) en la que A es un fragmento inmunogénico de la Proteína E, en las que la proteína E es aproximadamente un 90 % a aproximadamente un 100 % idéntica a SEQ ID NO. 4. También se describen proteínas de fusión de fórmula (I) en la que, A es un fragmento inmunogénico de la Proteína E, en las que la proteína E es al menos un 95 % idéntica a cualquiera de SEQ ID NO. 4 - SEQ ID NO. 57. También se describen proteínas de fusión de fórmula (I) en la que, A es un fragmento inmunogénico de la Proteína E, en las que la proteína E es un 93 % a un 100 % idéntica a SEQ ID NO. 124. En una realización particular, A es un fragmento inmunogénico de la Proteína E en la que la Proteína E es SEQ ID NO. 4.
En otra realización, A es un fragmento inmunogénico de la Proteína E de H. influenzae seleccionada del grupo que consiste en los aminoácidos 17-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 122), los aminoácidos 18-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 123), los aminoácidos 19-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 124), los aminoácidos 20-160 of SEQ ID NO. 4 (SEQ ID n O. 125) y los aminoácidos 22-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 126). En otra realización, A es un fragmento inmunogénico de la Proteína E de H. influenzae seleccionada del grupo que consiste en los aminoácidos 17-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 122), los aminoácidos 18-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 123), los aminoácidos 19-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 124), los aminoácidos 20-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO.
125), los aminoácidos 22-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 126), los aminoácidos 23-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID No . 179) y los aminoácidos 24-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ iD NO. 180). En una realización adicional, A es un fragmento inmunogénico de la Proteína E de H. influenzae seleccionada del grupo que consiste en los aminoácidos 17-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 122), los aminoácidos 18-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 123), los aminoácidos 20-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 125), los aminoácidos 22-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO.
126), los aminoácidos 23-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 179) y los aminoácidos 24-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 180). Más específicamente, en una realización, A es SEQ ID NO. 124, aminoácidos 19-160 de SEQ ID NO. 4. En una realización adicional, A es SEQ ID NO.125, aminoácidos 20-160 de SEQ ID NO. 5. En otra realización, A es un fragmento inmunogénico de la Proteína E de H. influenzae seleccionada del grupo que consiste en los aminoácidos 23-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 179) y los aminoácidos 24-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 180).
Proteína E - SEQ ID NO. 4
MKKIILTLSL GLLTACSAQI QKAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY
IDSESIWVDN QEPQIVHFDA WNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA
NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN
YGEAFSVDKK
Aminoácidos 17-160 de la Proteína E de SEQ ID NO. 4 - SEQ ID NO. 122
SAQI QKAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY
IDSESIWVDN QEPQIVHFDA WNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA
NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN
YGEAFSVDKK
Aminoácidos 18-160 de la Proteína E de SEQ ID NO. 4 - SEQ ID NO. 123
AQI QKAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY
IDSES IWVDN QEPQIVHFDA WNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA
NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN
YGEAFSVDKK
Aminoácidos 19-160 de la Proteína E de SEQ ID NO. 4 - SEQ ID NO. 124
QI QKAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY
IDSESIWVDN QEPQIVHFDA WNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA
NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN
YGEAFSVDKK
Aminoácidos 20-160 de la Proteína E de SEQ ID NO. 4 - SEQ ID NO. 125
I QKAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY
IDSESIWVDN QEPQIVHFDA WNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA
NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN
YGEAFSVDKK
Aminoácidos 22-160 de la Proteína E de SEQ ID NO. 4 - SEQ ID NO. 126
KAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY
IDSESIWVDN QEPQIVHFDA WNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA
NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN
YGEAFSVDKK
Aminoácidos 23-160 de la Proteína E de SEQ ID NO. 4 - SEQ ID NO. 179
AEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY
IDSESIWVDN QEPQIVHFDA WNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA
NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN
YGEAFSVDKK
Aminoácidos 24-160 de la Proteína E de SEQ ID NO. 4 - SEQ ID NO. 180
EQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY
IDSESIWVDN QEPQIVHFDA WNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA
NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN
YGEAFSVDKK
PilA de H. influenzae cepa 86-028NP - SEQ ID NO. 58
MKLTTQQTLK KGFTLIELMI VIAIIAILAT IAIPSYQNYT KKAAVSELLQ
ASAPYKADVE LCVYSTNETT NCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAI
TVKGDGTLAN MEYILQATGN AATGVTWTTTCKGTDASLFP ANFCGSVTQ
Aminoácidos 40-149 de PilA de H. influenzae cepa 86-028NP - SEQ ID NO. 127.
T KKAAVSELLQ
ASAPYKADVE LCVYSTNETT NCTGGKNGIAADITTAKGYV KSVTTSNGAI
TVKGDGTLAN MEYILQATGN AATGVTWTTTCKGTDASLFPANFCGSVTQ
En otra realización, se definen las proteínas de fusión de fórmula (I) en la que B es un fragmento inmunogénico de PilA de H. influenzae cuando A es un fragmento inmunogénico de la Proteína E de H. influenzae. Por ejemplo, B es un fragmento inmunogénico de PilA de H. influenzae cepa 86-028NP. En otra realización, B es un fragmento inmunogénico de PilA en el que PilA es aproximadamente un 80 % a un 100 % idéntica a SEQ ID NO: 58. En otra realización, B es un fragmento inmunogénico de PilA en el que PilA tiene un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO. 58, SEQ ID NO. 59, SEQ ID NO. 60, SEQ ID NO. 61, SEQ ID NO. 62, SEQ ID NO. 63, SEQ ID NO. 64, SEQ ID NO. 65, SEQ ID NO.66, SEQ ID NO. 67, SEQ ID NO. 68, SEQ ID NO. 69, SEQ ID NO. 70, SEQ ID NO. 71, SEQ ID NO.72, SEQ ID NO.73, SEQ ID NO. 74, SEQ ID NO. 75, SEQ ID NO. 76, SEQ ID NO. 77, SEQ ID NO. 78, SEQ ID NO. 79, SEQ ID NO.80, SEQ ID NO. 81, SEQ ID NO. 82, SEQ ID NO. 83, SEQ ID NO. 84, SEQ ID NO. 85, SEQ ID NO. 86, SEQ ID NO.87, SEQ ID NO. 88, SEQ ID NO. 89, SEQ ID NO. 90, SEQ ID NO. 91, SEQ ID NO. 92, SEQ ID NO. 93, SEQ ID NO.94, SEQ ID NO. 95, SEQ ID NO. 96, SEQ ID NO. 97, SEQ ID NO. 98, SEQ ID NO. 99, SEQ ID NO. 100, SEQ ID NO. 101, SEQ ID NO. 102, SEQ ID NO. 103, SEQ ID NO. 104, SEQ ID NO. 105, SEQ ID NO. 106, SEQ ID NO. 107, SEQ ID NO. 108, SEQ ID NO. 109, SEQ ID NO. 110, SEQ ID NO. 111, SEQ ID NO. 112, SEQ ID NO. 113, SEQ ID NO. 114, SEQ ID NO. 115, SEQ ID NO. 116, SEQ ID NO. 117, SEQ ID NO. 118, SEQ ID NO. 119, SEQ ID NO. 120 y SEQ ID NO. 121; o cualquier subconjunto desde SEQ ID NO. 58 hasta SEQ ID NO. 121. En otra realización, B es un fragmento inmunogénico de PilA en el que PilA es al menos un 95 % idéntica a cualquiera de SEQ ID NO. 58 - SEQ ID NO. 121. En una realización particular, B es un fragmento inmunogénico de PilA de H. influenzae en el que PilA tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO. 58. En otra realización, B es un fragmento inmunogénico de PilA que consiste en los aminoácidos 40-149 de cualquiera de SEQ ID NO. 58 -SEQ ID NO. 121. Más específicamente, en una realización B es el fragmento de PilA como se expone en SEQ ID NO.
127. En una realización adicional, B es un fragmento inmunogénico al menos un 95 % idéntico a los aminoácidos 40­ 149 de cualquiera de SEQ ID NO. 58 - SEQ ID NO. 121.
En una realización particular, B es un fragmento inmunogénico de PilA como se expone en SEQ ID NO. 127 y A es un fragmento inmunogénico de la Proteína E seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO. 122, SEQ ID NO. 124, SEQ ID NO. 125 y SEQ ID NO. 126. Más particularmente, B es el fragmento de PilA como se expone en SEQ ID NO.
127 y A es el fragmento de la Proteína E como se expone en SEQ ID NO. 124, aminoácidos 19-160 de la Proteína E de SEQ ID NO. 4. En otra realización, B es el fragmento de PilA como se expone en SEQ ID NO. 127 y A es el fragmento de la Proteína E como se expone en SEQ ID NO. 125.
En otra realización, B es el fragmento de PilA en el que PilA es al menos un 95 % idéntica a cualquiera de SEQ ID NO. 58 - SEQ ID NO. 121 y A es un fragmento inmunogénico de PE en el que PE es al menos un 95 % idéntica a cualquiera de SEQ ID NO. 4 - SEQ ID NO. 57.
En una realización, se definen las proteínas de fusión de fórmula (I) en la que p es 0. En otra realización, se definen las proteínas de fusión de fórmula (I) en la que p es 1.
En una realización, la proteína de fusión de fórmula (I) se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO. 138, SEQ ID NO. 140, SEQ ID NO. 142, SEQ ID NO. 144, SEQ ID NO. 146, SEQ ID NO. 148, SEQ ID NO. 150, SEQ ID NO.
182, SEQ ID NO. 184, SEQ ID NO. 186, SEQ ID NO. 188, SEQ ID NO. 190, SEQ ID NO. 192, SEQ ID NO. 194, SEQ ID NO. 196, SEQ ID NO. 198, SEQ ID NO. 200, SEQ ID NO. 202 y SEQ ID NO. 204; o cualquier subconjunto de las mismas. En otra realización, la proteína de fusión de fórmula (I) es aproximadamente un 95 % idéntica a cualquiera de SEQ ID NO. 138, SEQ ID NO. 140, SEQ ID NO. 142, SEQ ID NO. 144, SEQ ID NO. 146, SEQ ID NO. 148, SEQ ID NO. 150, SEQ ID NO. 182, SEQ ID NO. 184, SEQ ID NO. 186, SEQ ID NO. 188, SEQ ID NO. 190, SEQ ID NO.
192, SEQ ID NO. 194, SEQ ID NO. 196, SEQ ID NO. 198, SEQ ID NO. 200, SEQ ID NO. 202 o SEQ ID NO. 204.
Las proteínas de fusión de fórmula (I) son útiles como inmunógenos en sujetos tales como mamíferos, particularmente humanos. En particular, las proteínas de fusión de fórmula (I) son útiles induciendo una respuesta inmune contra H. influenzae en sujetos, particularmente humanos. Más específicamente, las proteínas de fusión de fórmula (I) son útiles en el tratamiento o la prevención de otitis media y/o EAEPOC y/o neumonía.
La presente invención también se refiere a vacunas que comprenden dichas composiciones inmunogénicas y a los usos terapéuticos de las mismas.
El fragmento inmunogénico de la Proteína E puede ser SEQ ID NO. 122, SEQ ID NO. 123, SEQ ID NO. 124, SEQ ID NO. 125 o SEQ ID NO. 126 o una secuencia que tiene al menos un 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia con una cualquiera de SEQ ID NO. 122, SEQ ID NO. 123, SEQ ID NO. 124, SEQ ID NO. 125 o SEQ ID NO. 126. El fragmento inmunogénico de la Proteína E puede ser SEQ ID NO. 122, SEQ ID NO. 123, SEQ ID NO. 124, SEQ ID NO. 125, SEQ ID NO. 126, SEQ ID NO. 179 o SEQ ID NO. 180 o una secuencia que tiene al menos un 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % de identidad de secuencia con una cualquiera de SEQ ID NO. 122, SEQ ID NO. 123, SEQ ID NO. 124, SEQ ID NO. 125, SEQ ID NO. 126, SEQ ID NO. 179 o SEQ ID NO. 180. Se han descrito diferencias de aminoácidos en la Proteína E de diversas especies de Haemophilus cuando se comparan con la Proteína E de Haemophilus influenzae Rd como una cepa de referencia. Microbes & Infection (Corrección a "Identification of a novel Haemophilus influenzae protein important for adhesion to epithelia cells" [Microbes Infect. 10 (2008) 87-97], disponible en línea 6 de julio, 2010, "Article in Press") proporciona una secuencia para la Proteína E de H. influenzae cepa 772. El documento WO2002/28889 proporciona una secuencia para la Proteína E de H. influenzae cepa 12085.
La Proteína E contiene una región de unión a células epiteliales (PKRYARSVRQ YKILNCANYH LTQVR, SEQ ID NO.
128) que se ha informado estar conservada entre más de 100 aislados clínicos de NTHi, H. influenzae encapsulada y cepas de colección de cultivos analizados (Singh y col, J. Infect. Dis. 201(3):414-9 (2010)). Singh y col. Informaron que la Proteína E estaba altamente conservada tanto en NTHi como H. influenzae encapsulada (96,9 % - 100 % de identidad sin el péptido señal). En una realización, el fragmento de la Proteína E comprende la región de unión de SEQ ID NO. 128 (PKRYARSVRQ YKILNCANYH LTQVR).
PilA es una adhesina conservada expresada in vivo. La comparación de longitud completa de 64 secuencias de PilA de Haemophilus influenzae demostró aproximadamente un 80 % a un 100 % de identidad.
En una realización, las presentes composiciones inmunogénicas pueden administrarse con otros antígenos de H. influenzae. Por ejemplo, la PE y PilA o la proteína de fusión de fórmula (I) pueden administrarse con la Proteína D de H. influenzae. La Proteína D puede ser como se describe en el documento WO91/18926. En otra realización, la composición inmunogénica puede incluir la proteína de fusión de fórmula (I) y la Proteína D de H. influenzae.
En otra realización, las composiciones inmunogénicas de la invención pueden administrarse con antígenos adicionales de otras especies bacterianas que también se sabe que provocan otitis media, EAEPOC o neumonía.
La cantidad de la composición inmunogénica que se requiere para lograr el efecto terapéutico o biológico deseado dependerá de un número de factores tales como el uso para el que se destina, el medio de administración, el receptor y el tipo y la gravedad de la afección a tratarse, y será en última instancia según la discreción del médico o veterinario que atiende. En general, una dosis típica para el tratamiento de una afección provocada completamente o en parte por H. influenzae en un humano, por ejemplo, puede esperarse que caiga en el intervalo de aproximadamente 0,003 mg a aproximadamente 0,090 mg. Más específicamente, una dosis típica para el tratamiento de una afección provocada completamente o en parte por H. influenzae en un humano puede caer en el intervalo de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 0,03 mg de la proteína de fusión. La composición inmunogénica puede contener antígenos adicionales; una dosis típica para el tratamiento de una afección provocada completamente o en parte por H. influenzae en un humano puede caer en el intervalo de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 0,03 mg para cada antígeno adicional. Esta dosis puede administrarse como una dosis unitaria única. También pueden administrarse varias dosis unitarias separadas. Por ejemplo, las dosis unitarias separadas pueden administrarse como dosis de cebado separadas dentro del primer año de vida o como dosis potenciadoras separadas dadas a intervalos regulares (por ejemplo, cada 1, 5 o 10 años).
Las formulaciones que comprenden las composiciones inmunogénicas de la invención pueden adaptarse para la administración por una vía apropiada, por ejemplo, por la vía intramuscular, sublingual, transcutánea, intradérmica o intranasal. Dichas formulaciones pueden prepararse por cualquier procedimiento conocido en la técnica.
Las composiciones inmunogénicas de la presente invención pueden comprender adicionalmente un adyuvante.
Cuando el término “adyuvante” se usa en la presente memoria descriptiva, se refiere a una sustancia que se administra junto con la composición inmunogénica para potenciar la respuesta inmune del paciente al componente inmunogénico de la composición.
Los adyuvantes adecuados incluyen una sal de aluminio tal como gel de hidróxido de aluminio o un fosfato de aluminio o alumbre, pero también puede ser una sal de calcio, magnesio, hierro o cinc, o puede ser una suspensión insoluble de tirosina acilada, o azúcares acilados, sacáridos catiónica o aniónicamente derivatizados o polifosfacenos. En una realización, la proteína de fusión, PE o PilA puede adsorberse sobre fosfato de aluminio. En otra realización, la proteína de fusión, PE o PilA puede adsorberse sobre hidróxido de aluminio. En una tercera realización, puede usarse alumbre como un adyuvante.
Los sistemas adyuvantes adecuados que promueven una respuesta predominantemente Th1 incluyen: derivados no tóxicos de lípido A, Monofosforil lípido A (MPL) o un derivado de los mismos, particularmente monofosforil lípido A 3-des-O-acetilado (3D-MPL) (para su preparación véase el documento GB 2220211 A); y una combinación de monofosforil lípido A, preferentemente monofosforil lípido A 3-des-O-acetilado, junto con bien una sal de aluminio (por ejemplo fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio) o bien una emulsión de aceite en agua. En dichas combinaciones, el antígeno y el 3D-MPL se contienen en las mismas estructuras particuladas, permitiendo la administración más eficiente de señales antigénicas e inmunoestimulantes. Los estudios han demostrado que el 3D-MPL es capaz de potenciar adicionalmente la inmunogenicidad de un antígeno adsorbido en alumbre (Thoelen et al. Vaccine (1998) 16:708-14; documento EP 689454-B1).
AS01 es un Sistema Adyuvante que contiene MPL (3-0-desacil-4'-monofosforil lípido A), QS21 ((Quillaja saponaria Molina, fracción 21) Antigenics, Nueva York, NY, EE.UU.) y liposomas. AS01B es un Sistema Adyuvante que contiene MPL, QS21 y liposomas (50 |jg MPL y 50 |jg QS21). AS01E es un Sistema Adyuvante que contiene MPL, QS21 y liposomas (25 jg MPL y 25 jg QS21). En una realización, la composición inmunogénica o vacuna comprende AS01. En otra realización, la composición inmunogénica o vacuna comprende AS01B o AS01E. En una realización particular, la composición inmunogénica o vacuna comprende AS01E.
AS03 es un Sistema Adyuvante que contiene a-Tocoferol y escualeno en una emulsión aceite/agua (o/w, por el inglés). AS03a es un Sistema Adyuvante que contiene a-Tocoferol y escualeno en una emulsión o/w (11,86 mg de tocoferol). AS03b es un Sistema Adyuvante que contiene a-Tocoferol y escualeno en una emulsión o/w (5,93 mg de tocoferol). AS03c es un Sistema Adyuvante que contiene a-Tocoferol y escualeno en una emulsión o/w (2,97 mg de tocoferol). En una realización, la composición inmunogénica o vacuna comprende AS03.
AS04 es un Sistema Adyuvante que contiene MPL (50 jg MPL) adsorbido en una sal de aluminio (500 jg AL3+). En una realización, la composición inmunogénica o vacuna comprende AS04.
Un sistema que implica el uso de QS21 y 3D-MPL se desvela en el documento WO 94/00153. Una composición en la que QS21 se inactiva con colesterol se desvela en el documento WO 96/33739. Una formulación adyuvante adicional que implica QS21, 3D-MPL y tocoferol en una emulsión de aceite en agua se describe en el documento WO 95/17210. En una realización la composición inmunogénica comprende adicionalmente una saponina, que puede ser QS21. La formulación puede comprender además una emulsión de aceite en agua y tocoferol (documento WO 95/17210). CpG sin metilar que contiene oligonucleótidos (documento WO 96/02555) y otros oligonucleótidos inmunomoduladores (documento WO 0226757 y documento WO 03507822) son también inductores preferenciales de una respuesta TH1 y también son adecuados para su uso en la presente invención.
Los adyuvantes adicionales son aquellos seleccionados del grupo de sales metálicas, emulsiones de aceite en agua, agonistas del receptor tipo Toll (en particular, agonista del receptor 2 tipo Toll, agonista del receptor 3 tipo Toll, agonista del receptor 4 tipo Toll, agonista del receptor 7 tipo Toll, agonista del receptor 8 tipo Tol y agonista del receptor 9 tipo Toll), saponinas o combinaciones de los mismos.
La presente invención proporciona un procedimiento para preparar una composición inmunogénica que comprende combinar una proteína de fusión de fórmula (I) con un adyuvante.
La presente invención proporciona además una vacuna que contiene una composición inmunogénica de la invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
Los posibles excipientes incluyen arginina, ácido plurónico y/o polisorbato. En una realización preferida, se usa polisorbato 80 (por ejemplo, TWEEN® 20). En una realización adicional, se usa una concentración final de aproximadamente el 0,03 % a aproximadamente el 0,06 %. Específicamente, puede usarse una concentración final de aproximadamente el 0,03 %, 0,04 %, 0,05 % o 0,06 % de polisorbato 80 (p/v).
La presente invención proporciona un procedimiento para preparar una composición inmunogénica o vacuna que comprende combinar una proteína de fusión de fórmula (I) con un excipiente farmacéuticamente aceptable.
La presente invención también proporciona ácidos nucleicos que codifican las proteínas de la invención. La expresión “ácido nucleico” se refiere a una forma polimérica de nucleótidos. Los nucleótidos pueden ser ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos o formas modificadas de ribonucleótidos o bien desoxirribonucleótidos. La expresión incluye formas sencillas y dobles de ADN. Preferentemente los ácidos nucleicos están sustancialmente libres de otros ácidos nucleicos.
La presente invención proporciona un procedimiento para producir ácidos nucleicos de la invención. Los ácidos nucleicos de la invención pueden prepararse por procedimientos conocidos por aquellos expertos en la materia. Por ejemplo, los ácidos nucleicos de la invención pueden prepararse digiriendo aminoácidos más largos o uniendo aminoácidos más cortos.
Los siguientes ejemplos se destinan a la ilustración solamente y no se destinan a limitar el ámbito de la invención de ninguna manera.
En los ejemplos, los siguientes términos tienen el significado designado:
6xhis = seis histidinas;
xg = fuerza centrífuga (número de gravedades)
ATP = adenosín trifosfato;
BCA = ácido bicinconínico;
BSA = albúmina de suero bovino;
°C = grados Celsius;
CaCl2= cloruro cálcico;
CV = volumen de la columna;
ADN = ácido desoxirribonucleico;
DSC = calorimetría diferencial de barrido;
DTT = ditiotreitol;
dNTP = desoxinucleósido trifosfato;
EDTA = ácido etilendiaminotetraacético;
FT = flujo a través;
HCl = cloruro de hidrógeno;
His = his = histidina;
HEPES = ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetansulfónico;
IMAC = cromatografía de afinidad de metal inmovilizado;
IPTG = isopropil p-D-1-tiogalactopiranósido;
KCI = cloruro potásico;
K2HPO4 = fosfato potásico dibásico;
KH2PO4 = fosfato potásico monobásico;
LDS = dodecil sulfato de litio;
l = litro;
MES = ácido 2-(A/-morfolino)etansulfón¡co;
MgCl2 = cloruro magnésico;
ml = mililitro;
RPM = revoluciones por minuto;
min = minuto;
mM = millimolar;
|jl = microlitro;
NaCl = cloruro sódico;
Na2HPO4 = fosfato sódico dibásico;
NaH2PO4 = fosfato sódico monobásico;
ng = nanogramo;
nm = nanómetro;
O/N = durante toda la noche;
PBS = tampón fosfato salino;
PCR = reacción en cadena de la polimerasa;
SB = tampón de muestra;
s = segundo;
p/v = peso/volumen.
Ejemplos
Ejemplo 1: Proteínas de fusión
Las proteínas de fusión se produjeron con diferentes péptidos señal y secuencias conectoras de aminoácidos. Estas proteínas de fusión permitieron la secreción tanto de Proteína E como de PilA (o fragmentos de las mismas) sin restringirse a una única cepa bacteriana. La proteína de fusión se libera en el periplasma después de la retirada del péptido señal heterólogo por una peptidasa de péptido señal. La proteína de fusión purificada de las bacterias no contiene el péptido señal heterólogo. Las proteínas “purificadas” se retiran de las bacterias y carecen del péptido señal.
La siguiente tabla describe las construcciones de proteínas de fusión fabricadas.
Tabla 3: Construcciones de Proteínas de Fusión que contienen PilA y Proteina E.
8
Figure imgf000024_0001
(continuación)
Figure imgf000025_0001
sp = péptido se ñ a l; A.A. = aminoácido
El ADN y las secuencias de aminoácidos para cada uno de los péptidos señal y los plásmidos listados en la Tabla 3 se exponen a continuación.
SECUENCIAS SEÑAL:
Péptido señal pelB (ADN) - SEQ ID NO. 129: atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggcc
Péptido señal pelB (Aminoácido) - SEQ ID NO. 130:
MKYLLPTAAA GLLLLAAQPA MA
Péptido señal Flgl (ADN) - SEQ ID NO. 131:
atgattaaatttctctctgcattaattcttctactggtcacgacggcggctcaggct
Péptido señal FlghI (Aminoácido) - SEQ ID NO. 132:
MIKFLSALIL LLVTTAAQA
Péptido señal NadA (ADN) - SEQ ID NO. 133: atgaaacactttccatccaaagtactgaccacagccatccttgccactttctgtagcggcgcactggca
Péptido señal NadA (Aminoácido) - SEQ ID NO. 134:
MKHFPSKVLT TAILATFCSG ALA SECUENCIAS DE CONSTRUCCIÓN DE PROTEÍNAS DE FUSIÓN:
La porción subrayada única de las secuencias de aminoácidos es de PilA de Haemophilus influenzae cepa 86-028NP. La porción subrayada en negrita de las secuencias de aminoácido derivó de la Proteína E de Haemophilus influenzae cepa 772.
L VL312 (ADN) - SEQ ID NO. 135: atgattaaatttctctctgcattaattcttctactggtcacgacggcggctcaggctgagactaaaaaagcagcggtatctgaattactg caagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaatg gtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggat ggcacattggcaaatatggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaac ggatgcctctttatttccagcaaatttttgcggaagtgtcacacaaggcggcgcgcagattcagaaggctgaacaaaatgatgtgaa gctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtg gataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgca cgttctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggggacagggt ttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtg cgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggccaccaccaccaccaccactaa
LVL312 (proteína): (flgI sp)(E)(PiIA aa 40-149)(GG)(ProtE aa 18-160)(GGHHHHHH) - SEQ ID NO. 136 (Ejemplo comparativo)
MIKFLSALIL LLVTTAAQAE TKKAAVSELL QASAPYKADV ELCVYSTNET
TNCTGGKNGI AADITTAKGY VKSVTTSNGA ITVKGDGTLA NMEYILQATG
NAATGVTWTT TCKGTDASLF PANFCGSVTQ GGAOIOKAEO NDVKLAPPTD
VRSGYIRLVK NVNYYIDSES IWVDNOEPOI VHFDAWNLD KGLYVYPEPK
RYARSVROYK ILNCANYHLT OVRTDFYDEF WGOGLRAAPK KOKKHTLSLT
PDTTLYNAAQ IICANYGEAF SVDKKGGHHH HHH
LVL291 (ADN) - SEQ ID NO. 137: atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggcccagattcagaaggctgaaca aaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtga atcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcc taaacgttatgcacgttctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattt tggggacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgc tcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaattactgcaa gcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaatggtatt gcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggc acattggcaaatatggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacgga tgcctctttatttccagcaaatttttgcggaagtgtcacacaaggcggccaccaccaccaccaccactaa
LVL291 (Proteína)(pe\B sp)(ProtE aa 19-160)(GG)(PiIA aa40-149)(GGHHHHHH) - SEQ ID NO. 138
MKYLLPTAAA GLLLLAAOPAMAOIOKAEON DVKLAPPTDV RSGYIRLVKN
VNYYIDSESI WVDNOEPOIV HFDAWNLDK GLYVYPEPKR YARSVROYKI
LNCANYHLTO VRTDFYDEFW GOGLRAAPKK OKKHTLSLTP DTTLYNAAOI
ICANYGEAFS VDKKGGTKKA AVSELLQASA PYKADVELCV YSTNETTNCT
GGKNGIAADI TTAKGYVKSV TTSNGAITVK GDGTLANMEY ILQATGNAAT
GVTWTTTCKG TDASLFPANF CGSVTQGGHH HHHH
LVL268 (ADN) - SEQ ID NO. 139: atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggccgatattcagaaggctgaaca aaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtga atcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcc taaacgttatgcacgttctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattt tggggacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgc tcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaattactgcaa gcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaatggtatt gcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggc acattggcaaatatggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacgga tgcctctttatttccagcaaatttttgcggaagtgtcacacaaggcggccaccaccaccaccaccac
LVL268 (proteína): (pelB sp)(D)(ProtE aa 20-160)(GG)(PiIA aa40-149)(GGHHHHHH) - SEQ ID NO. 140:
MKYLLPTAAA GLLLLAAOPAMADIOKAEON DVKLAPPTDV RSGYIRLVKN
VNYYIDSESI WVDNOEPOIV HFDAWNLDK GLYVYPEPKR YARSVROYKI
LNCANYHLTO VRTDFYDEFW GOGLRAAPKK OKKHTLSLTP DTTLYNAAOI
ICANYGEAFS VDKKGGTKKA AVSELLQASA PYKADVELCV YSTNETTNCT
GGKNGIAADI TTAKGYVKSV TTSNGAITVK GDGTLANMEY ILQATGNAAT
GVTWTTTCKG TDASLFPANF CGSVTQGGHH HHHH
LVL269 (ADN) - SEQ ID NO. 141: atgaaacactttccatccaaagtactgaccacagccatccttgccactttctgtagcggcgcactggcagccacaaacgacgacg ataaggctgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattatt acatcgatagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtat gtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgat ttctatgatgaattttggggacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaac gctttataatgctgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtat ctgaattactgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtacgggtg gaaaaaatggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagta aaaggggatggcacattggcaaatatggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttg caaaggaacggatgcctctttatttccagcaaatttttgcggaagtgtcacacaaggcggccaccaccaccaccaccactaa
LVL269 (proteína): (nadA sp)(ATNDDD)(ProtE aa 22-160)(GG)(PiIA aa 40-149)(GGHHHHHH) - SEQ ID NO.142
MHHHHHHSAg IQKAEQNDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNY YIDSESIWVD
NOEPOIVHFDAWNLDKGLY VYPEPKRYARSVROYKILNCANYHLTOVRT
DFYDEFWGOG LRAAPKKOKKHTLSLTPDTT LYNAAOIICANYGEAFSVDK
KGGTKKAAVS ELLQASAPYKADVELCVYSTNETTNCTGGKNGIAADITTA
KGYVKSVTTSNGAITVKGDG TLANMEYILQATGNAATGVTWTTTCKGTDA
SLFPANFCGSVTQ
LVL270 (ADN) - SEQ ID NO. 143: atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggccatggataaggctgaacaaaa tgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcg atctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaa cgttatgcacgttctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggg gacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcag attatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaattactgcaagcgt cagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgca gcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacat tggcaaatatggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcc tctttatttccagcaaatttttgcggaagtgtcacacaaggcggccaccaccaccaccaccactaa
LVL270 (proteína): (MHHHHHH)(ProtE aa 17-160)(GG)(PiIA aa40-149) - SEQ ID NO. 144:
MHHHHHHSAQ IOKAEONDVK LAPPTDVRSG YIRLVKNVNY YIDSESIWVD
NOEPOIVHFD AWNLDKGLY VYPEPKRYAR SVROYKILNC ANYHLTOVRT
DFYDEFWGOG LRAAPKKOKK HTLSLTPDTT LYNAAOIICA NYGEAFSVDK
KGGTKKAAVS ELLQASAPYK ADVELCVYST NETTNCTGGK NGIAADITTA
KGYVKSVTTS NGAITVKGDG TLANMEYILQ ATGNAATGVT WTTTCKGTDA
SLFPANFCGS VTQ
L VL315 (ADN) - SEQ ID NO. 145: atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggccatggataaggctgaacaaaa tgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcg atctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaa cgttatgcacgttctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggg gacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcag attatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaattactgcaagcgt cagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgca gcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacat tggcaaatatggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcc tctttatttccagcaaatttttgcggaagtgtcacacaaggcggccaccaccaccaccaccactaa
LVL315 (proteína): (pelB sp)(MD)(ProtE aa 22-160)(GG)(PiIA aa40-149)(GGHHHHHH) - SEQ ID NO. 146:
MKYLLPTAAAGLLLLAAOPAMAMDKAEOND VKLAPPTDVR SGYIRLVKNV
NYYIDSESIWVDNOEPOIVH FDAWNLDKG LYVYPEPKRY ARSVROYKIL
NCANYHLTOVRTDFYDEFWG OGLRAAPKKO KKHTLSLTPD TTLYNAAOII
CANYGEAFSV DKKGGTKKAAVSELLQASAP YKADVELCVY STNETTNCTG
GKNGIAADIT TAKGYVKSVT TSNGAITVKG DGTLANMEYI LQATGNAATG
VTWTTTCKGT DASLFPANFC GSVTQGGHHH HHH LVL317 (ADN) - SEQ ID NO. 147: atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggcccagattcagaaggctgaaca aaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtga atcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcc taaacgttatgcacgttctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattt tggggacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgc tcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaattactgcaa gcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaatggtatt gcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggc acattggcaaatatggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacgga tgcctctttatttccagcaaatttttgcggaagtgtcacacaataa
LVL317 (proteína): (pelB sp)(ProtE aa 19-160)(GG)(PilA aa40-149) - SEQ ID NO. 148:
MKYLLPTAAA GLLLLAAOPAMAOIOKAEON DVKLAPPTDV RSGYIRLVKN
VNYYIDSESI WVDNOEPOIV HFDAWNLDK GLYVYPEPKR YARSVROYKI
LNCANYHLTOVRTDFYDEFW GOGLRAAPKK OKKHTLSLTP DTTLYNAAOI
ICANYGEAFS VDKKGGTKKAAVSELLQASA PYKADVELCV YSTNETTNCT
GGKNGIAADI TTAKGYVKSV TTSNGAITVK GDGTLANMEY ILQATGNAAT
GVTWTTTCKG TDASLFPANF CGSVTQ
LVL318 (ADN) - SEQ ID NO. 149: atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggccatggataaggctgaacaaaa tgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcg atctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaa cgttatgcacgttctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggg gacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcag attatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaattactgcaagcgt cagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgca gcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacat tggcaaatatggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcc tctttatttccagcaaatttttgcggaagtgtcacacaataa
LVL318 (proteína): (pelB sp)(MD)(ProtE aa 22-160)(GG)(PiIA aa40-149) - SEQ ID NO. 150:
MKYLLPTAAA GLLLLAAOPA MAMDKAEOND VKLAPPTDVR SGYIRLVKNV
NYYIDSESIW VDNOEPOIVH FDAWNLDKG LYVYPEPKRY ARSVROYKIL
NCANYHLTOV RTDFYDEFWG OGLRAAPKKO KKHTLSLTPD TTLYNAAOII
CANYGEAFSV DKKGGTKKAA VSELLQASAP YKADVELCVY STNETTNCTG
GKNGIAADIT TAKGYVKSVT TSNGAITVKG DGTLANMEYI LQATGNAATG
VTWTTTCKGT DASLFPANFC GSVTQ LVL702 (ADN) - SEQ ID NO. 181: atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggccattcagaaggctgaacaaaa tgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcg atctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaa cgttatgcacgttctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggg gacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcag attatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaattactgcaagcgt cagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgca gcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacat tggcaaatatggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcc tctttatttccagcaaatttttgcggaagtgtcacacaaggcggccaccaccaccaccaccac
LVL702 (proteína): (pelB sp)(ProtE aa 20-160)(GG)(PilA aa40-149)(GGHHHHHH) - SEQ ID NO. 182:
MKYLLPTAAA GLLLLAAOPA MAIOKAEOND VKLAPPTDVR SGYIRLVKNV
NYYIDSESIW VDNOEPOIVH FDAWNLDKG LYVYPEPKRY ARSVROYKIL
NCANYHLTOV RTDFYDEFWG OGLRAAPKKO KKHTLSLTPD TTLYNAAOII
CANYGEAFSV DKKGGTKKAA VSELLQASAP YKADVELCVY STNETTNCTG
GKNGIAADIT TAKGYVKSVT TSNGAITVKG DGTLANMEYI LQATGNAATG
VTWTTTCKGT DASLFPANFC GSVTQGGHHH HHH
LVL736 (ADN) - SEQ ID NO. 183:
atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggccagcgcccagattcagaaggc tgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcga tagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcct gagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgat gaattttggggacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataa tgctgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaatta ctgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtacgggtggaaaaa atggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggg gatggcacattggcaaatatggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaagg aacggatgcctctttatttccagcaaatttttgcggaagtgtcacacaaggcggccaccaccaccaccaccac
LVL736 (proteína): (pelB sp)(ProtE aa 17-160)(GG)(PilA aa40-149)(GGHHHHHH) - SEQ ID NO. 184:
MKYLLPTAAA GLLLLAAOPA MASAOIOKAE ONDVKLAPPT DVRSGYIRLV
KNVNYYIDSE SIWVDNOEPO IVHFDAVVNL DKGLYVYPEP KRYARSVROY
KILNCANYHL TOVRTDFYDE FWGOGLRAAP KKOKKHTLSL TPDTTLYNAA
OIICANYGEA FSVDKKGGTK KAAVSELLQA SAPYKADVEL CVYSTNETTN
CTGGKNGIAA DITTAKGYVK SVTTSNGAIT VKGDGTLANM EYILQATGNA
ATGVTWTTTC KGTDASLFPA NFCGSVTQGG HHHHHH
LVL737 (ADN) - SEQ ID NO. 185:
atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggccgcccagattcagaaggctga acaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatag tgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctga gcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatga attttggggacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgc tgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaattactg caagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaatg gtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggat ggcacattggcaaatatggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaac ggatgcctctttatttccagcaaatttttgcggaagtgtcacacaaggcggccaccaccaccaccaccac
LVL737 (proteína): (pelB sp)(ProtE aa 18-160)(GG)(PilA aa40-149)(GGHHHHHH) - SEQ ID NO. 186:
MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAAOIOKAEO NDVKLAPPTDVRSGYIRLVK
NVNYYIDSES IWVDNOEPOI VHFDAWNLD KGLYVYPEPK RYARSVROYK
ILNCANYHLT OVRTDFYDEF WGOGLRAAPKKOKKHTLSLT PDTTLYNAAO
IICANYGEAF SVDKKGGTKK AAVSELLQAS APYKADVELC VYSTNETTNC
TGGKNGIAAD ITTAKGYVKS VTTSNGAITV KGDGTLANME YILQATGNAA
TGVTWTTTCKGTDASLFPAN FCGSVTQGGH HHHHH
LVL738 (ADN) - SEQ ID NO. 187: atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggccaaggctgaacaaaatgatgt gaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctg ggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgtta tgcacgttctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggggaca gggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattatt tgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaattactgcaagcgtcagc gccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcag atataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggca aatatggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatt tccagcaaatttttgcggaagtgtcacacaaggcggccaccaccaccaccaccac
LVL738 (proteína): (pelB sp)(ProtE aa 22-160)(GG)(PilA aa40-149)(GGHHHHHH) - SEQ ID NO. 188:
MKYLLPTAAAGLLLLAAOPAMAKAEONDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNY
YIDSESIWVDNOEPOIVHFDAWNLDKGLY VYPEPKRYARSVROYKILNC
ANYHLTOVRT DFYDEFWGOG LRAAPKKOKK HTLSLTPDTT LYNAAOIICA
NYGEAFSVDKKGGTKKAAVS ELLQASAPYKADVELCVYSTNETTNCTGGK
NGIAADITTAKGYVKSVTTS NGAITVKGDG TLANMEYILQATGNAATGVT
WTTTCKGTDASLFPANFCGS VTQGGHHHHH H
LVL739 (ADN) - SEQ ID NO. 189: atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggccgctgaacaaaatgatgtgaa gctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtg gataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgca cgttctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggggacagggt ttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtg cgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaattactgcaagcgtcagcgcct tataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatat aaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaat atggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttcc agcaaatttttgcggaagtgtcacacaaggcggccaccaccaccaccaccac
LVL739 (proteína): (pelB sp)(ProtE aa 23-160)(GG)(PilA aa40-149)(GGHHHHHH) - SEQ ID NO. 190:
MKYLLPTAAA GLLLLAAOPAMAAEONDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY
IDSESIWVDN OEPOIVHFDA WNLDKGLYV YPEPKRYARS VROYKILNCA
NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN
YGEAFSVDKK GGTKKAAVSE LLQASAPYKA DVELCVYSTN ETTNCTGGKN
GIAADITTAK GYVKSVTTSN GAITVKGDGT LANMEYILQA TGNAATGVTW
TTTCKGTDAS LFPANFCGSV TQGGHHHHHH
LVL740 (ADN) - SEQ ID NO. 191: atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggccgaacaaaatgatgtgaagct ggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggat aaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgt tctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggggacagggtttg cgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtgcg aactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaattactgcaagcgtcagcgccttat aaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataac cacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatg gaatatattttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttccag caaatttttgcggaagtgtcacacaaggcggccaccaccaccaccaccac
LVL740 (proteína): (pelB sp)(ProtE aa 24-160)(GG)(PilA aa40-149)(GGHHHHHH) - SEQ ID NO. 192:
MKYLLPTAAA GLLLLAAOPA MAEONDVKLA PPTDVRSGYI RLVKNVNYYI
DSESIWVDNO EPOIVHFDAV VNLDKGLYVY PEPKRYARSV ROYKILNCAN
YHLTOVRTDF YDEFWGOGLRAAPKKOKKHT LSLTPDTTLY NAAOIICANY
GEAFSVDKKG GTKKAAVSEL LQASAPYKAD VELCVYSTNE TTNCTGGKNG
IAADITTAKG YVKSVTTSNG AITVKGDGTL ANMEYILQAT GNAATGVTWT
TTCKGTDASL FPANFCGSVT QGGHHHHHH LVL735 (ADN) - SEQ ID NO. 193: atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggccattcagaaggctgaacaaaa tgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcg atctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaa cgttatgcacgttctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggg gacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcag attatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaattactgcaagcgt cagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgca gcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacatt ggcaaatatggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcct ctttatttccagcaaatttttgcggaagtgtcacacaa
LVL735 (proteína): (pelB sp)(ProtE aa 20-160)(GG)(PilA aa40-149) - SEQ ID NO. 194:
MKYLLPTAAA GLLLLAAOPAMAIOKAEOND VKLAPPTDVR SGYIRLVKNV
NYYIDSESIW VDNOEPOIVH FDAWNLDKG LYVYPEPKRY ARSVROYKIL
NCANYHLTOV RTDFYDEFWG OGLRAAPKKO KKHTLSLTPD TTLYNAAOII
CANYGEAFSV DKKGGTKKAA VSELLQASAP YKADVELCVY STNETTNCTG
GKNGIAADIT TAKGYVKSVT TSNGAITVKG DGTLANMEYI LQATGNAATG
VTWTTTCKGT DASLFPANFC GSVTQ
LVL778 (ADN) - SEQ ID NO. 195: atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggccagcgcccagattcagaaggc tgaacaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcga tagtgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcct gagcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgat gaattttggggacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataat gctgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaattac tgcaagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaat ggtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaagggg atggcacattggcaaatatggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaagga acggatgcctctttatttccagcaaatttttgcggaagtgtcacacaa
LVL778 (proteína): (pelB sp)(ProtE aa 17-160)(GG)(PilA aa40-149) - SEQ ID NO. 196:
MKYLLPTAAA GLLLLAAOPA MASAOIOKAE ONDVKLAPPT DVRSGYIRLV
KNVNYYIDSE SIWVDNOEPO IVHFDAWNL DKGLYVYPEP KRYARSVROY
KILNCANYHL TOVRTDFYDE FWGOGLRAAP KKOKKHTLSL TPDTTLYNAA
OIICANYGEA FSVDKKGGTK KAAVSELLQA SAPYKADVEL CVYSTNETTN
CTGGKNGIAA DITTAKGYVK SVTTSNGAIT VKGDGTLANM EYILQATGNA
ATGVTWTTTC KGTDASLFPA NFCGSVTQ
LVL779 (ADN) - SEQ ID NO. 197: atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggccgcccagattcagaaggctga acaaaatgatgtgaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatag tgaatcgatctgggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctga gcctaaacgttatgcacgttctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatga attttggggacagggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgc tgctcagattatttgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaattactg caagcgtcagcgccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaatg gtattgcagcagatataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggat ggcacattggcaaatatggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaac ggatgcctctttatttccagcaaatttttgcggaagtgtcacacaa
LVL779 (proteína): (pelB sp)(ProtE aa 18-160)(GG)(PilA aa40-149) - SEQ ID NO. 198:
MKYLLPTAAAGLLLLAAOPAMAAOIOKAEO NDVKLAPPTDVRSGYIRLVK
NVNYYIDSES IWVDNOEPOI VHFDAWNLD KGLYVYPEPK RYARSVROYK
ILNCANYHLTOVRTDFYDEFWGOGLRAAPK KOKKHTLSLT PDTTLYNAAO
IICANYGEAF SVDKKGGTKKAAVSELLQAS APYKADVELC VYSTNETTNC
TGGKNGIAAD ITTAKGYVKS VTTSNGAITVKGDGTLANME YILQATGNAA
TGVTWTTTCKGTDASLFPAN FCGSVTQ
LVL780 (ADN) - SEQ ID NO. 199: atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggccaaggctgaacaaaatgatgt gaagctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctg ggtggataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgtta tgcacgttctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggggaca gggtttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattatt tgtgcgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaattactgcaagcgtcagc gccttataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcag atataaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggca aatatggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatt tccagcaaatttttgcggaagtgtcacacaa
LVL780 (proteína): (pelB sp)(ProtE aa 22-160)(GG)(PilA aa40-149) - SEQ ID NO. 200:
MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAKAEONDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNY
YIDSESIWVDNOEPOIVHFDAWNLDKGLY VYPEPKRYARSVRQYKILNC
ANYHLTOVRT DFYDEFWGOG LRAAPKKOKKHTLSLTPDTT LYNAAOIICA
NYGEAFSVDKKGGTKKAAVS ELLQASAPYKADVELCVYSTNETTNCTGGK
NGIAADITTAKGYVKSVTTS NGAITVKGDGTLANMEYILQATGNAATGVT
WTTTCKGTDASLFPANFCGS VTQ LVL781 (ADN) - SEQ ID NO. 201: atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggccgctgaacaaaatgatgtgaa gctggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtg gataaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgca cgttctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggggacagggt ttgcgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtg cgaactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaattactgcaagcgtcagcgcct tataaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatat aaccacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaat atggaatatattttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttcc agcaaatttttgcggaagtgtcacacaa
LVL781 (proteína): (pelB sp)(ProtE aa 23-160)(GG)(PilA aa40-149) - SEQ ID NO. 202:
MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAAEONDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY
IDSESIWVDNOEPOIVHFDAWNLDKGLYV YPEPKRYARS VROYKILNCA
NYHLTOVRTD FYDEFWGOGL RAAPKKOKKH TLSLTPDTTL YNAAOIICAN
YGEAFSVDKK GGTKKAAVSE LLQASAPYKA DVELCVYSTN ETTNCTGGKN
GIAADITTAK GYVKSVTTSN GAITVKGDGT LANMEYILQATGNAATGVTW
TTTCKGTDAS LFPANFCGSVTQ
LVL782 (ADN) - SEQ ID NO. 203: atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggccgaacaaaatgatgtgaagct ggcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggat aaccaagagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgt tctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggggacagggtttg cgggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtgcg aactatggtgaagcattttcagttgataaaaaaggcggcactaaaaaagcagcggtatctgaattactgcaagcgtcagcgccttat aaggctgatgtggaattatgtgtatatagcacaaatgaaacaacaaactgtacgggtggaaaaaatggtattgcagcagatataac cacagcaaaaggctatgtaaaatcagtgacaacaagcaacggtgcaataacagtaaaaggggatggcacattggcaaatatg gaatatattttgcaagctacaggtaatgctgcaacaggtgtaacttggacaacaacttgcaaaggaacggatgcctctttatttccag caaatttttgcggaagtgtcacacaa
LVL782 (proteína): (pelB sp)(ProtE aa 24-160)(GG)(PilA aa40-149) - SEQ ID NO. 204:
MKYLLPTAAAGLLLLAAOPAMAEONDVKLAPPTDVRSGYIRLVKNVNYYI
DSESIWVDNOEPOIVHFDAVVNLDKGLYVY PEPKRYARSVROYKILNCAN
YHLTOVRTDFYDEFWGOGLRAAPKKOKKHTLSLTPDTTLYNAAOIICANY
GEAFSVDKKGGTKKAAVSELLQASAPYKADVELCVYSTNETTNCTGGKNG
IAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANMEYILQATGNAATGVTWT
TTCKGTDASLFPANFCGSVTQ
La secuencia de longitud completa para PE y PilA de la que se obtuvieron las secuencias anteriores se exponen en SEQ ID NO. 4 (PE) y SEQ ID NO. 58 (PilA), respectivamente.
Ejemplo 2: Construcción del vector y Transformación
Los cebadores para amplificar PE de H. influenzae cepa 772 se diseñaron en base a la secuencia de H. influenzae cepa Hi Rd. La secuencia cebadora 5' contiene una diferencia de nucleótidos en comparación con la secuencia NTHi 772, introduciendo una diferencia de aminoácidos en la posición 24 cuando se compara con la secuencia del genoma NTHi 772 actualmente informada. El aminoácido n.° 24 en las construcciones de la proteína de fusión es E (ácido glutámico) en lugar de K (lisina) como se encuentra en NTHi 772.
Secuencia de ADN para PE de H. influenzae cepa Rd. - SEQ ID NO. 151 atgaaaaaaattattttaacattatcacttgggttacttaccgcttgttctgctcaaatccaaaaggctgaacaaaatgatgtgaagctg gcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggata accaagagccacaaattgtacattttgatgctgtggtgaatttagataggggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgttc tgttcgtcagtataagattttgaattgtgcaaattatcatttaactcaaatacgaactgatttctatgatgaattttggggacagggtttgcg ggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtgcaaat tatggtaaagcattttcagttgataaaaaataa
Secuencia de Proteína para PE de H. influenzae cepa Rd. - SEQ ID NO. 152
MKKIILTLSL GLLTACSAQI QKAEQNDVKLAPPTDVRSGY IRLVKNVNYY
IDSESIWVDN QEPQIVHFDAWNLDRGLYVYPEPKRYARS VRQYKILNCA
NYHLTQIRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKHTLSLTPDTTL YNAAQIICAN
YGKAFSVDKK
Secuencia de ADN para PE de H. influenzae cepa 772 (como se expone en: Microbes & Infection, Corrección de "Identification of a novel Haemophilus influenzae protein important for adhesion to epithelia cells" [Microbes Infect. 10 (2008) 87-97], disponible en línea 6 de julio, 2010, "Article in Press")) - SEQ ID NO. 153
atgaaaaaaattattttaacattatcacttgggttacttactgcctgttctgctcaaatccaaaaggctaaacaaaatgatgtgaagctg
gcaccgccgactgatgtacgaagcggatatatacgtttggtaaagaatgtgaattattacatcgatagtgaatcgatctgggtggata
accaagagccacaaattgtacattttgatgcagtggtgaatttagataagggattgtatgtttatcctgagcctaaacgttatgcacgtt
ctgttcgtcagtataagatcttgaattgtgcaaattatcatttaactcaagtacgaactgatttctatgatgaattttggggacagggtttgc
gggcagcacctaaaaagcaaaagaaacatacgttaagtttaacacctgatacaacgctttataatgctgctcagattatttgtgcga
actatggtgaagcattttcagttgataaaaaa
Secuencia de Proteína para PE de H. influenzae cepa 772 (como se expone en: Microbes & Infection, Corrección de "Identification of a novel Haemophilus influenzae protein important for adhesión to epithelia cells" [Microbes Infect. 10 (2008) 87-97], disponible en línea 6 de julio, 2010, "Article in Press")) - SEQ ID NO.154
MKKIILTLSL GLLTACSAQI QKAKQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY
IDSESIWVDN QEPQIVHFDAWNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA
NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN
YGEAFSVDKK
Construcción del vector
Para generar LVL312, LVL291, LVL268, LVL269, LVL270, LVL702, LVL735, LVL778, LVL779, LVL780, LVL781 y LVL782, se preparó una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de los siguientes componentes (los componentes específicos se ejemplifican posteriormente): se formularon 36,6 |jl de agua desionizada, 5 |jl de tampón n.° 110X, 5 |jl de dNTP 2 mM, 2 j l de MgCh 25 mM, 0,4 j l de cebador n.° 1 (50 jM ), 0,4 j l de cebador n.° 2 (50 jM ), 0,5 j l de molde (100 ng/jl) y 0,4 j l de ADN polimerasa KOD HiFi 2,5 unidades/jl (NOv Ag EN®). La reacción en cadena de la polimerasa implicó 25 ciclos de 15 segundos de desnaturalización a 98 °C, 2 segundos para hibridar a 55 °C y 20 segundos de extensión de cebadores a 72 °C. Los productos de PCR se purificaron usando el kit de purificación QIAQUICK® PCR (QIAGEN®). Este producto se usó en condiciones recomendadas por el proveedor que fueron: la adición de 5 volúmenes de Tampón PB, proporcionado en el kit de purificación QIAQUICK® PCR, a 1 volumen de la preparación de PCR. La preparación de PCR con Tampón PB se mezcló posteriormente con un vórtex. Se colocó una columna QIAQUICK® en un tubo de recogida de 2 ml. Para unir el ADN en la preparación de PCR a la columna, la muestra mixta se aplicó a la columna QIAQUICK® y se centrifugó durante 30-60 segundos a 14000 RPM. El flujo a través se descartó y la columna QIAQUICK® se colocó de nuevo en el mismo tubo. Para lavar el ADN unido se añadieron 0,75 ml de Tampón PE, proporcionado en el kit de purificación QIAQUICK® PCR, a la columna QIAQUICK® y la columna se centrifugó durante 30-60 segundos a 14 000 RPM. El flujo a través se descartó y la columna QIAQUICK® se colocó de nuevo en el mismo tubo. La columna QIAQUICK® se centrifugó una vez más en el tubo de recolección de 2 ml durante 1 minuto para retirar el tampón de lavado residual. Cada columna QIAQUICK® se colocó en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml limpio. Para eluir el ADN, se añadieron 33 j l de agua al centro de la membrana QIAQUICK® y la columna se centrifugó durante 1 minuto a 14 000 RPM. Las enzimas de restricción y el tampón relacionado se obtuvieron de New England BioLabs. Por ejemplo, aproximadamente 5 j l de vector pET26b (100 ng/jl), 2 j l de NETampón2 (New England Biolabs, 1X NETampón2: 50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCh, 1 mM ditiotreitol, pH 7,9 a 25 °C), 1 j l de NdeI (20 000 unidades/ml), 1 j l of HindIII (20 000 unidades/ml) y 11 j l de agua desionizada se mezclaron e incubaron durante dos horas a 37 °C para la digestión de ADN. En lo sucesivo, se realizó una segunda etapa de purificación usando el kit de purificación QIAQUICK® PCR (QIAGEN®) con el procedimiento descrito anteriormente.
La ligación se realizó usando ADN ligasa T4 Quick y Tampón de Reacción de Ligación Quick de New England BioLabs. Por ejemplo, alrededor de 10 ng de vector y 30 ng de inserto en 10 j l de agua desionizada se mezclaron con 10 j l de Tampón de Reacción de Ligación Quick 2X (New England BioLabs, 132 mM Tris-HCl, 20 mM MgCh, 2 mM ditiotreitol, 2 mM ATP, 15 % polietilenglicol, pH 7,6 a 25 1C) y 1 j l de ADN ligasa T4 Quick (New England BioLabs). La reacción enzimática se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente antes de la transformación.
Para generar LVL315, LVL317, LVL318, LVL736, LVL737, LVL738, LVL739 y LVL740, se preparó una preparación de PCR de los siguientes componentes: se formularon 40 j l de agua desionizada, 5 j l de tampón de reacción 10X, 1 j l de mezcla de dNTP, 1 j l de cebador n.° 1 (10 jM ), 1 j l de cebador n.° 2 (10 jM ), 1 j l de molde (25 ng/jl) y 1 j l de ADN polimerasa PfuUltra Alta Fidelidad 2,5 unidades/jl (Kit de Mutagénesis Dirigida al Sitio QuikChange II, Agilent Technologies, Stratagene Division). La reacción en cadena de la polimerasa implicó un ciclo de desnaturalización a 95 °C durante 30 s, 18 ciclos de 30 s de desnaturalización a 95 °C, 1 min para la hibridación a 55 °C y 5 min 30 s de extensión de cebadores a 68 °C. Los productos de PCR se digirieron usando 1 j l de enzima de restricción DpnI a 37 °C durante una hora antes de la transformación.
En la Tabla 4 se ilustra una lista detallada de secuencias de cebadores de PCR usadas para las amplificaciones.
Para generar pRIT16711, el fragmento génico PE que codifica para los aminoácidos 22 a 160 de SEQ ID NO. 4, que excluye la secuencia que codifica para su señal de secreción correspondiente, se amplificó por PCR a partir del ADN genómico de NTHi cepa 772. Los cebadores de amplificación se diseñaron a base de la secuencia disponible de la cepa Hi Rd (en ese momento, la secuencia 772 no se conocía). La secuencia del cebador 5' contiene una mutación en comparación con la secuencia NTHi 772 (la secuencia ya disponible), introduciendo una diferencia de aminoácidos en la secuencia codificante de PE en la posición 24, ácido glutámico (E) en lugar de lisina (K). Después de la amplificación por PCR, el inserto se clonó en el vector de expresión pET-26(+) (NOVAGEN®) usando los sitios de restricción BamHI y XhoI.
Para generar pRIT16671, un fragmento de ADN que codifica para un fragmento génico de PilA (aminoácidos 40 a 149 de SEQ ID NO. 58, SEQ ID NO. 127), que excluye su péptido líder así como una porción de la hélice alfa hidrófoba predicha, se amplificó a partir de ADN genómico de NTHi cepa 86-028NP y se clonó en el vector de expresión pET15. El vector pRIT1670 (que contiene los aminoácidos 40 a 149 de NTHi cepa 86-028NP) se usó como un molde para generar el vector pRIT16671. El fragmento génico de PilA se amplificó por PCR usando el vector pRIT1670 y los cebadores MDES PILA-3 y MDES PILA-4. El fragmento de PilA se clonó en el vector de expresión pET-26 usando los sitios de restricción Ndel / XhoI La secuencia de ADN que codifica seis aminoácidos histidina (his) se incorporó en el cebador 5' para añadir seis histidinas (6xhis) en el extremo N-terminal de la secuencia PilA (MDES PILA-3).
Para generar LVL312 (péptido señal FlgI-E-fragmento PilA-GG-fragmento PE-GGHHHHHH), se realizó una reacción en cadena de la polimerasa para amplificar el gen PilA (aminoácidos 40-149 / cepa 86-028NP) usando el vector pRIT16671 como un molde y los cebadores CAN534 y CAN537. La secuencia de ADN que corresponde al péptido señal (sp) FlgI y el aminoácido ácido glutámico (E) se incorporaron en el cebador 5' (CAN534). Para conectar la secuencia PilA con la secuencia PE, la secuencia de ADN que corresponde al conector de dos aminoácidos glicina (GG) y los aminoácidos PE N-terminales se incorporaron en el cebador 3' (CAN537). Se realizó otra reacción en cadena de la polimerasa para amplificar el gen PE (aminoácidos 18-160) usando el vector pRIT16711 como un molde y los cebadores CAN536 y CAN538. La secuencia de ADN que corresponde a los aminoácidos de PilA C-terminales y los aminoácidos GG se incorporaron en el cebador 5' para conectar PilA con la secuencia de PE (CAN536). La secuencia de ADN que corresponde al conector de aminoácidos GG y los aminoácidos 6xhis se incorporaron en el cebador 3' (CAN538). Finalmente, para generar LVL312, se realizó una tercera reacción en cadena de la polimerasa para amplificar los genes PilA y PE en fusión al péptido señal FlgI en el N-terminal, un aminoácido ácido glutámico (E) entre FlgI y PilA, un conector Gg entre las secuencias PilA y PE y un conector GG entre PE y los aminoácidos 6xhis en el C-terminal. Para lograr esta amplificación, los productos de las dos reacciones en cadena de la polimerasa descritos anteriormente se usaron como molde con los cebadores CAN534 y CAN538. La secuencia de ADN que corresponde al sitio de restricción Ndel se incorporó en el cebador 5' y el sitio de restricción HindIII se incorporó en el cebador 3'. El producto de PCR generado se insertó después en el vector de clonación pET-26b(+) (NOVAGEN®).
Para generar LVL291 (péptido señal pelB-fragmento PE-GG-fragmento PilA-GG-6xhis), se realizó una reacción en cadena de la polimerasa para amplificar el gen PE (aminoácidos 19-160) usando el vector pRIT16711 como un molde y los cebadores CAN547 y CAN546. La secuencia de ADN que corresponde a los aminoácidos del péptido señal (sp) se incorporó en el cebador 5' (CAN544). Para conectar la secuencia PilA con la secuencia PE, la secuencia de ADN que corresponde al conector de aminoácidos GG y los aminoácidos PilA N-terminales se incorporaron en el cebador 3' (CAN546). Se realizó otra reacción en cadena de la polimerasa para amplificar el gen PilA (aminoácidos 40-149 de SEQ ID NO. 58, SEQ ID NO. 127) usando el vector pRIT16671 como un molde y los cebadores CAN545 y CAN535. La secuencia de ADN que corresponde a los aminoácidos de PE C-terminales y los aminoácidos GG se incorporaron en el cebador 5' (CAN545) para conectar la secuencia de PilA con la secuencia de PE. La secuencia de ADN que corresponde al conector de aminoácidos GG y los aminoácidos 6xhis se incorporaron en el cebador 3' (CAN535). Finalmente, para generar LVL291, se realizó una tercera reacción en cadena de la polimerasa para amplificar los genes PE y PilA en fusión al péptido señal pelB en el N-terminal, un conector GG entre las secuencias PE y PilA y un conector GG entre PilA y los aminoácidos 6xhis en el C-terminal. Para lograr esta amplificación, los productos de las dos reacciones en cadena de la polimerasa descritos anteriormente se usaron como molde con los cebadores CAN544 y CAN535. La secuencia de ADN que corresponde al sitio de restricción Ndel se incorporó en el cebador 5' y el sitio de restricción HindIII se incorporó en el cebador 3'. El producto de PCR generado se insertó después en el vector de clonación pET-26b(+) (NOVAGEN®).
Para generar LVL268 (péptido señal pelB-D-fragmento PE-GG-fragmento PilA-GG-6xhis), se realizó una reacción en cadena de la polimerasa para amplificar el gen PE (aminoácidos 20-160) usando el vector pRIT16711 como un molde y los cebadores CAN547 y CAN546. La secuencia de ADN que corresponde a los aminoácidos del péptido señal (sp) pelB y el aminoácido ácido aspártico (D) se incorporaron en el cebador 5' (CAN547). Para conectar la secuencia PilA con la secuencia PE, la secuencia de ADN que corresponde al conector de aminoácidos GG y los aminoácidos PilA N-terminales se incorporaron en el cebador 3' (CAN546). Se realizó otra reacción en cadena de la polimerasa para amplificar el gen PilA (aminoácidos 40-149 / cepa 86-028NP) usando el vector pRIT16671 como un molde y los cebadores CAN545 y CAN535. La secuencia de ADN que corresponde a los aminoácidos de PE C-terminales y los aminoácidos GG se incorporaron en el cebador 5' (CAN545) para conectar la secuencia de PilA con la secuencia de PE. La secuencia de ADN que corresponde al conector de aminoácidos GG y los aminoácidos 6xhis se incorporaron en el cebador 3' (CAN535). Finalmente, para generar LVL268, se realizó una tercera reacción en cadena de la polimerasa para amplificar los genes PE y PilA en fusión al péptido señal pelB en el N-terminal, un aminoácido ácido aspártico (D) entre el péptido señal pelB y PE, un conector GG entre las secuencias PE y PilA y un conector GG entre PilA y los aminoácidos 6xhis en el C-terminal. Para lograr esta amplificación, los productos de las dos reacciones en cadena de la polimerasa descritos anteriormente se usaron como molde con los cebadores CAN547 y CAN535. La secuencia de ADN que corresponde al sitio de restricción Ndel se incorporó en el cebador 5' y el sitio de restricción HindlII se incorporó en el cebador 3'. El producto de PCR generado se insertó después en el vector de clonación pET-26b(+) (NOVAGEN®).
Para generar LVL269 (péptido señal NadA-ATNDDD-fragmento PE-GG-fragmento PilA-GG-6xhis), se realizó una reacción en cadena de la polimerasa para amplificar el gen PE (aminoácidos 22-160 de SEQ ID NO. 4) usando el vector pRIT16711 como un molde y los cebadores CAN548 y CAN546. La secuencia de ADN que corresponde a los aminoácidos del péptido señal (sp) pelB y los aminoácidos a Tn DDD se incorporaron en el cebador 5' (CAN548). Para conectar la secuencia PilA con la secuencia PE, la secuencia de ADN que corresponde al conector de aminoácidos GG y los aminoácidos PilA N-terminales se incorporaron en el cebador 3' (CAN546). Se realizó otra reacción en cadena de la polimerasa para amplificar el gen PilA (aminoácidos 40-149 de SEQ ID NO. 58, SEQ ID NO. 127) usando el vector pRIT16671 como un molde y los cebadores CAN545 y CAN535. La secuencia de ADN que corresponde a los aminoácidos de PE C-terminales y los aminoácidos GG se incorporaron en el cebador 5' para conectar la secuencia de PilA con la secuencia de PE (CAN545). La secuencia de ADN que corresponde al conector de aminoácidos GG y los aminoácidos 6xhis se incorporaron en el cebador 3' (CAN535). Finalmente, para generar LVL269, se realizó una tercera reacción en cadena de la polimerasa para amplificar los genes PE y PilA en fusión al péptido señal NadA en el N-terminal, los aminoácidos ATNDDD entre el péptido señal NadA y PE, un conector GG entre las secuencias PE y PilA y un conector GG entre PilA y los aminoácidos 6xhis en el C-terminal. Para lograr esta amplificación, los productos de las dos reacciones en cadena de la polimerasa descritos anteriormente se usaron como molde con los cebadores CAN547 y CAN535. La secuencia de ADN que corresponde al sitio de restricción Ndel se incorporó en el cebador 5' y el sitio de restricción HindlII se incorporó en el cebador 3'. El producto de PCR generado se insertó después en el vector de clonación pET-26b(+) (No Va GEN®).
Para generar LVL270 (M-6xHis-fragmento PE-GG-fragmento PilA), se realizó una reacción en cadena de la polimerasa para amplificar el gen PE (aminoácidos 17-160) usando el vector pRIT16711 como un molde con los cebadores CAN540 y CAN542. La secuencia de ADN que corresponde a los aminoácidos 6xhis se incorporaron en el cebador 5' (CAN540). Para conectar la secuencia PilA con la secuencia PE, la secuencia de ADN que corresponde al conector de aminoácidos GG y los aminoácidos PilA N-terminales se incorporaron en el cebador 3' (CAN542). Se realizó otra reacción en cadena de la polimerasa para amplificar el gen PilA (aminoácidos 40-149 / NTHi cepa 86-028NP) usando el vector pRIT16671 como un molde con los cebadores CAN541 y CAN543. La secuencia de ADN que corresponde a los aminoácidos de PE C-terminales y los aminoácidos GG se incorporaron en el cebador 5' (CAN541) para conectar la secuencia de PilA con la secuencia de PE. Finalmente, para generar LVL270, se realizó una tercera reacción en cadena de la polimerasa para amplificar el gen 6-his-PE-GG-PilA en fusión. Para lograr esta amplificación, los productos de las dos reacciones en cadena de la polimerasa descritos anteriormente se usaron como molde con los cebadores CAN540 y CAN543. La secuencia de ADN que corresponde al sitio de restricción Ndel se incorporó en el cebador 5' y el sitio de restricción HindlII se incorporó en el cebador 3'. El producto de PCR generado se insertó después en el vector de clonación pET-26b(+) (No Va GEN®).
Para generar LVL315 (péptido señal pelB-MD-fragmento PE-GG-fragmento PilA-GG-6xhis), se realizó una mutagénesis dirigida al sitio para cambiar la secuencia de aminoácidos de PE N-terminales de QIQ a MD usando LVL291 como un molde con los cebadores CAN670 y CAN671 y el Kit de Mutagénesis Dirigida al Sitio QuikChange II (Agilent Technologies, Stratagene Division).
Para generar LVL317 (péptido señal pelB-fragmento PE-GG-fragmento PilA), se realizó una mutagénesis dirigida al sitio para incorporar un codón de parada entre el gen PilA y la secuencia de ADN que corresponde a los restos de aminoácidos GGHHHHHH (SEQ ID NO: 3) usando LVL291 como un molde con los cebadores CAN678 y CAN679 y el Kit de Mutagénesis Dirigida al Sitio QuikChange II (Agilent Technologies, Stratagene Division).
Para generar LVL318 (péptido señal pelB-MD-PE-GG-PilA), se realizó una mutagénesis dirigida al sitio para incorporar un codón de parada entre el gen PilA y la secuencia de ADN que corresponde a los restos de aminoácidos GGHHHHHH (SEQ ID NO: 3) usando LVL315 como un molde con los cebadores CAN678 y CAN679 y el Kit de Mutagénesis Dirigida al Sitio QuikChange II (Agilent Technologies, Stratagene Division).
Para generar LVL702 (LVL291 AQ), se realizó una reacción en cadena de la polimerasa usando el vector LVL291 como molde y los cebadores CAN1517 y CAN1518. La deleción de tres nucleótidos que corresponden al aminoácido Q en la posición 23 en la secuencia LVL291 se incorporó al cebador 5'. La única diferencia entre LVL702 y LVL291 es la deleción del aminoácido Q en la posición 23 en la secuencia LVL291. Los sitios de restricción NdeI y HindIII se incorporaron en los cebadores 5' y 3' respectivamente. El producto de PCR generado se insertó después en el vector de clonación pET-26b(+) (NOVAGEN®).
Para generar LVL735 (LVL317 AQ), se realizó una reacción en cadena de la polimerasa usando el vector LVL317 como molde y los cebadores CAN1517 y CAN1519. La deleción de tres nucleótidos que corresponden al aminoácido Q en la posición 23 en la secuencia LVL317 se incorporó al cebador 5'. La única diferencia entre LVL735 y LVL317 es la deleción del aminoácido Q en la posición 23 en la secuencia LVL317. Los sitios de restricción NdeI y HindIII se incorporaron en los cebadores 5' y 3' respectivamente. El producto de PCR generado se insertó después en el vector de clonación pET-26b(+) (NOVAGEN®).
Para generar LVL736 (LVL291 SA), se realizó una mutagénesis dirigida al sitio para añadir los aminoácidos S y A entre el aminoácido 22 y 23 en la secuencia LVL291. Se usó LVL291 como un molde con los cebadores CAN1531 y CAN1532 y el Kit de Mutagénesis Dirigida al Sitio QuikChange II (Agilent Technologies, Stratagene Division).
Para generar LVL737 (LVL291 A), se realizó una mutagénesis dirigida al sitio para añadir el aminoácido A entre el aminoácido 22 y 23 en la secuencia LVL291. Se usó LVL291 como un molde con los cebadores CAN1529 y CAN1530 y el Kit de Mutagénesis Dirigida al Sitio QuikChange II (Agilent Technologies, Stratagene Division).
Para generar LVL738 (LVL291 AQIQ), se realizó una mutagénesis dirigida al sitio para eliminar los aminoácidos Q, I y Q en las posiciones 23 a 25 en la secuencia LVL291. Se usó LVL291 como un molde con los cebadores CAN1523 y CAN1524 y el Kit de Mutagénesis Dirigida al Sitio QuikChange II (Agilent Technologies, Stratagene Division).
Para generar LVL739 (LVL291 AQIQK), se realizó una mutagénesis dirigida al sitio para eliminar los aminoácidos Q, I, Q y K en las posiciones 23 a 26 en la secuencia LVL291. Se usó LVL291 como un molde con los cebadores CAN1525 y CAN1526 y el Kit de Mutagénesis Dirigida al Sitio QuikChange II (Agilent Technologies, Stratagene Division).
Para generar LVL740 (LVL291 AQIQKA), se realizó una mutagénesis dirigida al sitio para eliminar los aminoácidos Q, I, Q, K y A en las posiciones 23 a 27 en la secuencia LVL291. Se usó LVL291 como un molde con los cebadores CAN1527 y CAN1528 y el Kit de Mutagénesis Dirigida al Sitio QuikChange II (Agilent Technologies, Stratagene Division).
Para generar LVL778 (LVL736 Aetiqueta 6xHis), LVL779 (LVL737 Aetiqueta 6xHis), LVL780 (LVL738 Aetiqueta 6xHis), LVL781 (LVL739 Aetiqueta 6xHis) y LVL782 (LVL740 Aetiqueta 6xHis) se realizó una mutagénesis dirigida al sitio usando los vectores LVL736, LVL737, LVL738, LVL739 y LVL740 como moldes, respectivamente, con los cebadores CAN1669 y CAN543. La deleción de la etiqueta 6xHis corresponde a la secuencia de aminoácidos GGHHHHHH (SEQ ID NO. 3) en las secuencias C-terminales. Esta deleción se incorporó en el cebador 3'. Los sitios de restricción Ndel y HindIII se incorporaron en los cebadores 5' y 3' respectivamente. El producto de PCR generado se insertó después en el vector de clonación pET-26b(+) (NOVAGEN®).
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Transformación
Las células de Escherichia coli BLR (DE3) o E. coli HMS (DE3) se transformaron con ADN plasmídico de acuerdo con procedimientos convencionales con células tratadas con CaCh (Hanahan D. « Plasmid transformaron by Simanis. » In Glover, D. M. (Ed), DNA cloning. IRL Press London. (1985): p. 109-135.). Brevemente, las células BLR (DE3) o HMS174(DE3) competentes se descongelaron suavemente en hielo. Se mezclaron aproximadamente 4 |jl de plásmido (10-100 ng) usando 50-100 j l de células competentes. En lo sucesivo, esta formulación se incubó en hielo durante 30 min. Para realizar la reacción de trasformación, a la formulación se dieron pulsos de calor a 42 °C durante 45 segundos y después se incubaron en hielo durante 2 minutos. Se añadieron aproximadamente 0,5 ml de medio SOC (caldo Súper Óptimo con represión de catabolitos) a las células transformadas y el cultivo celular se incubó a 37 °C durante una hora antes de colocar en placa en agar Luria-Bertani (LB) con 50 ug/ml de kanamicina. Se colocaron en placa alrededor de 100 j l de cultivo celular transformado y se incubó durante toda la noche a 37°C.
BLR (DE3): BLR es un derivado recA de BL21 (F- ompThsdSB(rB- mB-) gal dcm (DE3). Esta cepa de E. coli usada para la expresión de proteínas recombinantes mejora los rendimientos de monómeros de plásmido y puede ayudar a estabilizar los plásmidos diana que contienen secuencias repetitivas o cuyos productos pueden causar la pérdida del profago DE3 (Studier, F.W. (1991) J. Mol. Biol. 219: 37-44). El genotipo detallado de E.coli BLR (DE3) se ha publicado por NOVAGEN®. (F- ompT hsdSB (rBmB-) gal dcm A(srl-recA)306::Tn10 (TetR) (DE3).
HMS174 (DE3): Las cepas HMS174 proporcionan la mutación recA en un fondo K-12. Como BLR, estas cepas pueden estabilizar ciertos genes diana cuyos productos pueden provocar la pérdida del profago DE3. El genotipo detallado de E.coli HMS174 (DE3) se ha publicado por NOVAGEN®. (F- recAI hsdR(rK12- mK12+) (DE3) (Rif R).
La producción usando BLR (DE3) y la caracterización de construcciones etiquetadas con His se describen del Ejemplo 3 al Ejemplo 6
Ejemplo 3: Expresión de proteínas usando un matraz de agitación
Generalmente, se despojó una placa de agar confluente inoculada con Escherichia coli BLR (DE3) transformada con plásmido recombinante, se resuspendió en medio de cultivo y se usó para inocular 800 ml de caldo LB (Becton, Dickinson and Company) ± 1 % (peso/volumen, p/v), glucosa (Laboratoire MAT, número de catálogo: GR-0101) y 50 jg/m l de kanamicina (Sigma) para obtener una D.O.600 nm entre 0,1 y 0,2. Los cultivos se incubaron a 37 °C con agitación de 250 RPM para alcanzar una D.O.600 nm de -0,8.
Después se recogió un ml de cada cultivo, se centrifugó a 14000 RPM durante 5 minutos y los sobrenadantes y los sedimentos se congelaron a -20 °C separadamente.
A una D.O.600 nm de ~0,8, los cultivos de BLR (DE3) se enfriaron (-20 °C, 20 minutos o 4 °C, ° hora, preferentemente a 4 °C durante 1 hora) antes de inducir la expresión de la proteína recombinante por la adición de isopropil p-D-1-tiogalactopiranósido 1 mM (IPTG; EMD Chemicals Inc., número de catálogo: 5815) y se realizó la incubación durante toda la noche a 16, 22 y 30 °C o 3 horas a 37 °C con agitación de 250 RPM, preferentemente durante toda la noche a 22 °C. Después del periodo de inducción los cultivos se centrifugaron a 14000 RPM durante 5 minutos o 6000 RPM durante 15 minutos y los sobrenadantes (muestra de la fracción de medio) y los sedimentos (que contienen fracciones soluble e insoluble) se congelaron a -20 °C separadamente.
Estas condiciones se usan para la expresión de proteínas periplásmicas.
Ejemplo 4: Purificación de proteínas usando un matraz de agitación, pastas de células, construcciones etiquetadas con His
Cada sedimento bacteriano obtenido después de la inducción se resuspendió en 20 mM de tampón ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetansulfónico (HEPES) (pH 8,0) que contiene 500 mM NaCl, 10 mM imidazol y Cóctel Inhibidor de Proteasa Roche COMPLETE® (1 comprimido/50 ml de tampón HEPES que contiene 500 mM NaCl, comprimidos Roche COMPLETE® ULTRA, Roche Diagnostics Corporation). Alternativamente, puede usarse tampón bicina 20 a 50 mM en lugar de tampón HEPES que contiene NaCl. Por ejemplo, puede usarse tampón bicina 20 mM. Las bacterias se lisaron usando un Sistema Constante 1,1 kW 2 X 206842,72 kPa (kilopascales) (30 000 PSI (libras por pulgada cuadrada)). Los componentes solubles (sobrenadante) e insolubles (sedimentos) se separaron por centrifugación a 20 000 g durante 20 min a 4 °C.
Las proteínas etiquetadas con 6-His se purificaron en condiciones nativas en cromatografía de afinidad de metal inmovilizado (IMAC) usando el protocolo de purificación de proteínas PROFINIA™ (Bio-Rad Laboratories, Inc.). Los componentes solubles se cargaron en una columna Trap 5 ml His (Bio-Rad Laboratories, Inc.) pre-equilibrada con el mismo tampón usado para la resuspensión de bacterias; los componentes solubles se añadieron hasta 5 ml/min (produciendo una “fracción de flujo a través”). Después de cargar en la columna, la columna se lavó con 10 volúmenes de columna del mismo tampón a una velocidad de 10 ml/min (produciendo una “fracción de lavado n.° 1”). Se realizó un segundo lavado usando 20 mM de tampón bicina o 20 mM de tampón HEPES (pH 8,0) que contiene 500 mM de NaCl y 20 mM de imidazol, produciendo una “fracción de lavado n.° 2”. La elución se realizó usando 2 volúmenes de columna de 20 mM de tampón HEPES o 50 mM de tampón bicina (pH 8,0) que contiene 500 mM de NaCl y 250 mM de imidazol a una velocidad de 10 ml/min, produciendo una “fracción de elución”.
Para mejorar la pureza de la proteína, las fracciones de elución positivas de IMAC se pusieron en conjunto y se cargaron en una columna de cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) (HILOADTM s Up ERDEX™ 200 06/60 de GE Healthcare) pre-equilibrada en tampón fosfato salino sin calcio o magnesio (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 8,1 mM, KH2PO41,47 mM, pH 7,4). Las muestras de las fracciones de elución se analizaron por electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato sódico (SDS-PAGE). Las muestras se concentraron usando Centricon 10 000 MW (Millipore).
La concentración de proteína se determinó usando un espectrómetro.
Ejem plo 5: A nális is de S D S -P A G E y transferencia W estern de construcciones etiquetadas con H is y A nális is de S D S -P A G E de construcciones LV L317 y LVL318 no etiquetadas con His
Preparación de la fracción soluble e insoluble
Por ejemplo, 1 ml de cultivo después de la inducción, véase, por ejemplo, el Ejemplo 3 anterior) se centrifugó a 14000 RPM durante 2 min. El sedimento se resolubilizó usando 40 |jl de Reactivo de Extracción de Proteínas BUGBUSTER® (NOVAGEN®, EMD4 Biosciences, Merck), creando una suspensión celular. La suspensión celular se incubó en una plataforma rotatoria durante 10 min a temperatura ambiente. La suspensión celular se centrifugó después a 14 000 RPM durante 2 min para separar la fracción soluble. El sedimento resultante (fracción insoluble) se resolubilizó usando 70 j l de agua desionizada, 5 j l de ditiotreitol (DTT) 1 M y 25 j l de Tampón de Muestra NUPAg E® LDS (dodecil sulfato de litio) 4X (INVITROGEN™). La fracción soluble (sobrenadante de la suspensión celular del sedimento resolubilizado) se añadió a 30 j l de agua desionizada, 5 j l de DTT 1 M y 25 j l de Tampón de Muestra LDS 4X.
Preparación de la fracción de medios
Por ejemplo, para preparar la fracción de medios, se concentraron 100 j l del sobrenadante del cultivo celular entero inducido después de la centrifugación (véase, por ejemplo, el Ejemplo 3 anterior) añadiendo 500 j l de reactivo RC I (Bio-Rad Laboratories, Inc.); la muestra se mezcló y se incubó durante 1 min a temperatura ambiente. Después, se añadieron 500 j l de Reactivo II (Bio-Rad Laboratories, Inc.) a la muestra y se mezcló. Esta formulación se centrifugó a 14000 RPM durante 10 min. El sedimento se resolubilizó usando 28 j l de agua desionizada, 2 j l de DTT 1 M y 10 j l de Tampón de Muestra LDS 4X.
Preparación de la fracción de purificación
Por ejemplo, las proteínas purificadas (por ejemplo, obtenidas como se describe en el Ejemplo 4) se prepararon para el análisis por s Ds -PAGE añadiendo 70 j l de muestra, 5 j l de DTT 1 M y 25 j l de Tampón de Muestra LDS 4X.
Análisis de SDS-PAGE y transferencia a una membrana de nitrocelulosa
El análisis de SDS-PAGE y transferencia a una membrana de nitrocelulosa se realizaron de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Invitrogen) usando geles NUPAGE® Bis-Tris 4-12 %. Las preparaciones de las muestras, los tampones y las condiciones de migración se realizaron en condiciones recomendadas por los proveedores.
En un ejemplo, el gel se cargó con una muestra de 20 ul de una mezcla maestra que comprendía 70 j l de una fracción de proteína purificada, 5 j l de DTT 1 M y 25 j l de Tampón de Muestra LDS 4X.
Después de que las muestras se corrieran en geles NUPAGE® Bis-Tris 4-12 %, las proteínas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa.
Las membranas de nitrocelulosa se bloquearon durante 30 minutos a 37 °C, 60 RPM usando leche al 3 % / solución fresca de PBS 1X. Después de bloquear la incubación, se añadieron Anticuerpos Primarios (Anticuerpo 6X His Tag®, Abcam PLC, número de catálogo: ab9108) a una dilución de: 1:1000 en leche al 3 % / solución fresca de PBS 1X durante 1 hora a 37 °C, 60 RPM. Después de esto, las membranas se lavaron tres veces, durante 5 minutos cada una, a temperatura ambiente usando polisorbato 20 al 0,02 % (por ejemplo, TWEEN™ 20) / PBS 1X. Se añadieron Anticuerpos Secundarios (fosfatasa alcalina (AP) de conejo anti-IgG (H+L) de conejo, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) a una dilución 1:14 000 usando leche al 3 % / solución fresca de PBS 1X. Las membranas se incubaron durante 1 hora a 37 °C, 60 RPM. Después de esto, las membranas se lavaron tres veces durante 5 minutos a temperatura ambiente usando polisorbato 20 al 0,02 % (por ejemplo, TWEEN™ 20) / PBS 1X antes de las exposiciones de membrana a 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato/nitro azul de tetrazolio (por ejemplo, BCIP®/NBT de Sigma-Aldrich®, 1 comprimido / 10 ml de agua).
Véase la Figura 1 para SDS-PAGE de los extractos bacterianos inducidos para las construcciones de proteínas de fusión LVL291, LVL268 y LVL269. La Fracción Insoluble (I), Fracción Soluble (S) y Fracción medio de cultivo (M) se cargaron para LVL291, LVL268 y LVL269 antes y después de la inducción (ind).
Véase la Figura2 para SDS-PAGE y transferencia Western con respecto a los extractos de purificación para las construcciones de proteínas de fusión LVL291, LVL268 y LVL269. La Fracción de flujo a través (Ft), fracción de lavado (W) y Fracción de elución (E) se cargaron para la purificación de LVL291, LVL268 y LVL269. Se usó Anti­ etiqueta his para sondar los extractos.
Véase la Figura 3 para SDS-PAGE de los extractos bacterianos inducidos y de purificación para las construcciones de proteínas de fusión LVL291 y LVL315. La Fracción del medio de cultivo (M), la Fracción soluble (Sol), la Fracción insoluble (Ins), la Fracción de flujo a través (Ft), la Fracción de lavado n.° 1 (W1), la Fracción de lavado n.° 2 (W2) y la Fracción de elución (E) se cargaron para LVL291 y LVL315.
Véase la Figura 4 para SDS-PAGE de los extractos bacterianos inducidos y de purificación para la construcción de proteínas de fusión LVL312. La Fracción del medio de cultivo (M), la Fracción soluble (Sol), la Fracción insoluble (Ins), la Fracción de flujo a través (Ft), la Fracción de lavado n.° 1 (W1), la Fracción de lavado n.° 2 (W2) y la Fracción de elución (E) se cargaron para LVL312.
Véase la Figura 25 para SDS-PAGE de las fracciones solubles de extractos bacterianos inducidos para las construcciones de proteínas de fusión LVL291, LVL702, LVL736, LVL737, LVL738, LVL739, LVL740 y el vector pET26b (control negativo). (a) Experimento 1 (b) Experimento 2 (c) Experimento 3. Proteína de fusión PE-PilA indicada por una flecha.
Véase la Figura 26 para el porcentaje de banda promedio de la proteína de fusión en la fracción soluble de los Experimentos 1, 2 y 3.
Los extractos bacterianos LVL317 y LVL318 usados en el análisis SDS-PAGE en la Figura 5 y la Figura 6, respectivamente, se prepararon generalmente como se describe anteriormente.
Figura 5. SDS-PAGE de extractos bacterianos inducidos (1 mM y 10 |jM IPTG) para la construcción de proteínas de fusión LVL317. Extractos de antes (NI) y después (In) de la inducción, Fracción soluble (S), Fracción insoluble (I).
Figura 6. SDS-PAGE de extractos bacterianos inducidos (1 mM y 10 j M IPTG) para la construcción de proteínas de fusión LVL318. Extractos de antes (NI) y después (In) de la inducción, Fracción del medio de cultivo (M), Fracción soluble (S), Fracción insoluble (I).
Las proteínas separadas por SDS-PAGE se transfirieron a una membrana Immobilon-P. Las bandas de proteínas teñidas con Azul Coomassie se cortaron y se colocaron en un reactor secuenciador. La secuenciación se llevó a cabo de acuerdo con el protocolo del fabricante usando un Secuenciador de Proteínas PROCISE® de Applied Biosystems, modelo 494-cLC.
Tabla 5: Perfiles de expresión de proteínas de matraz de agitación y escisión del péptido señal para las construcciones de proteínas de fusión.
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(continuación)
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E jem plo 6: C aracterización de la p ro te ína de fusión LVL291
PROPIEDADES FÍSICAS DE LVLS291: Plegamiento de PE y PilA en LVL291 y Punto de fusión
Dicroísmo circular:
Análisis de la estructura secundaria
El dicroísmo circular (DC) se usa para determinar la composición de la estructura secundaria de una proteína midiendo la diferencia en la absorción de la luz polarizada a mano izquierda frente a la luz polarizada a mano derecha que se debe a la asimetría circular. La forma y la magnitud de los espectros de DC en la región UV lejana (190-250 nm) son diferentes si una proteína exhibe una estructura de lámina beta, de hélice alfa o de enrollamiento aleatorio. La abundancia relativa de cada tipo de estructura secundaria en una muestra de proteína dada puede calcularse por comparación con los espectros de referencia.
Los espectros de UV lejanos se miden usando un camino óptico de 0,01 cm de 178 a 250 nm, con una resolución de 1 nm y anchura de banda en un espectropolarímetro Jasco J-720. La temperatura de la célula se mantiene a 23 °C por un bloqueante de células RTE-111 con termostato Peltier. Se mantiene un flujo de nitrógeno de 10 l/min durante las mediciones.
Resultados:
Los espectros de DC de UV lejano obtenidos para las proteínas PE (a partir de la construcción pRIT16762), PilA (a partir de la construcción pRIT 16790) y PEPilA son característicos de proteínas plegadas que contienen una mezcla de estructuras alfa y beta, pero PE es significativamente más rica en hélices alfa que PilA y PE-PilA (Figura 7, espectros DC de las proteínas de fusión PE, PilA y PE-PilA).
Para evaluar la integridad del plegamiento de las proteínas PE y PilA individuales una vez unidas juntas en una proteína quimérica y después verificar una posible interacción entre ambas, se calcularon los espectros de diferencia.
• Cuando se combinan los espectros UV lejanos de PE y PilA, el espectro resultante se superpone al espectro de la quimera PE-PilA (Figura 8, combinación del espectro de DC de PE y PilA). Este resultado sugiere que la quimera PE-PilA contiene todas las estructuras secundarias que se detectan en los componentes individuales. También sugiere que la fusión de las proteínas no tiene mayor impacto en las estructuras secundarias de los componentes individuales y en consecuencia que el plegamiento de PE y PilA no es significativamente diferente si las proteínas están separadas o en fusión.
Evaluación del punto de fusión:
Para evaluar si la expresión en la fusión tiene un impacto en las propiedades termodinámicas de las proteínas individuales, se han evaluado los puntos de fusión de PE, PilA y PE-PilA monitorizando el desplegamiento de la hélice alfa con la temperatura por dicroísmo circular.
La presencia de la hélice alfa se caracteriza por un mínimo en la señal de dicroísmo circular en 222 nm, por lo que un aumento significativo en la señal de DC en 222 nm durante el aumento de temperatura es una indicación de la desnaturalización proteica. La determinación de la temperatura a la que la proteína se somete a la pérdida de estructura secundaria permite la determinación del punto de fusión (Tm), que corresponde a la temperatura a la que la mitad de las proteínas han perdido su estructura.
El punto de fusión puede determinarse por la identificación del punto de inflexión en la curva de desnaturalización térmica obtenida a partir de un gráfico de temperatura frente a DC 222 nm.
• Los puntos de fusión de PilA y PE como se determina por DC de UV lejano son respectivamente 52 °C y 68 °C (Figura 9, curva de desnaturalización térmica de PilA; Figura 10, curva de desnaturalización térmica de PE). • La proteína de fusión PE-PilA exhibe dos Tm distintas a 48 °C y 71 °C (Figura 11, curva de desnaturalización térmica de PE-PilA). Estos valores indican que las proteínas PE y PilA todavía se pliegan independientemente cuando se unen a una quimera y que se despliegan a una temperatura similar aunque estén separadas o en fusión. La observación de que el desplegamiento de la porción PilA a 48 °C no provoca la precipitación o impacta en la Tm de la porción PE a 71 °C es una indicación fuerte de que la interacción entre PE y PilA dentro de la fusión es mínima y que no tienen un impacto mayor observable entre sí. Los puntos de fusión de las proteínas son sensibles a diversas condiciones externas, incluyendo la composición del tampón o la presencia de moléculas que interactúen; que no se observe mayor variación tras la fusión de PE y PilA es una indicación fuerte de la conservación de la mayoría de la estructura y de las propiedades tanto de PE como de PilA cuando se unen juntas.
E jem plo 7: Procedim iento de ferm entación
Las proteínas de fusión de la invención pueden prepararse por procedimientos conocidos por aquellos expertos en la materia.
Ejem plo 8: Purificación de prote ínas de PE, PilA y LVL317
Purificación de la proteína PE a partir de pRIT16762:
Para generar el vector de expresión pRIT16762, el vector pRIT16711 se digirió usando las enzimas de restricción BamHI y Ncol para eliminar 6 restos de aminoácidos entre la secuencia señal (pelB) y PE. El vector obtenido se llamó pRIT16762. En este vector, hay 3 aminoácidos entre la secuencia señal pelB y PE: MDP. En una segunda etapa, se realizó una mutagénesis dirigida al sitio para cambiar la secuencia de aminoácidos de MDP a QIQ usando pRIT16762 como molde con los cebadores MnoNTHi-44 y MnoNTHi-45 (descritos en la Tabla 4) y el kit de Mutagénesis dirigida al sitio QuikChange II (Agilent Technologies, Stratagene Division).
La semilla funcional de E. coli BLR (DE3) que contenía PE QIQ (de la construcción pRIT16762) se descongeló de -80 °C y se usó para preparar 100 ml de pre-cultivo en caldo LB en una incubación durante toda la noche a 37 °C en agitación a 215 RPM. Después de la incubación durante toda la noche, ocho matraces que contenían 800 ml de LB APS se inocularon con 12,5 ml de pre-cultivo y se midió la DO600 a alrededor de 0,06. Los cultivos se incubaron 3 h a 37 °C con agitación. A una DO600 a alrededor de 0,9, se añadió 1 mM IPTG para iniciar la inducción. Durante la inducción, los cultivos se incubaron 19 h a 22 °C con agitación. Después de la inducción, la DO600 fue alrededor de 2,2. Los cultivos celulares se transfirieron a bolsas de centrífuga de 1 l colocadas dentro de botellas de 1 l y se centrifugaron a 4 °C durante 30 minutos a 6.000 xg y el sobrenadante se descartó. Se guardaron alícuotas de 1 ml de cultivo pre- y post-inducción y sobrenadante para análisis futuros.
Lisis de las BLR (DE3) inducidas con PE QIQ
Las bolsas de centrífuga se retiraron de las botellas de centrifugación, se abrieron y el sedimento se expulsó de la bolsa a un vaso de precipitados. Los ocho sedimentos se pusieron juntos y se resuspendieron en 100 ml de tampón de unión (20 mM Hepes, 10mM imidazol, 500 mM NaCl, pH 8,01). Las E.coli BLR (De 3) que contenían la construcción PE QIQ se rompieron con el disruptor celular Bench Top Serie TS de Constant Systems Ltd. (1x 206,85 MPa; 1x103,43 MPa (1x30 kPsi; 1x15kPsi)). El lisado se centrifugó 30 minutos, 6000 RPM, 4 °C. El sobrenadante se guardó y se cargó en una columna IMAC.
Purificación IMAC de PE QIQ
La columna IMAC (BioRad, Bio-Scale Mini Profinity IMAC cartucho de 5 ml) se equilibró con 5 CV de tampón de unión (20 mM HEPES, 10 mM imidazol, 500 mM NaCl, pH 8,01) a 5 ml/min. Se cargaron 100 ml de sobrenadante lisado en la IMAC a 2,5ml/min. El flujo a través se recogió en fracciones de 50 ml para análisis futuros. La columna se lavó con 3 CV de tampón de unión para retirar la proteína sin unir. La muestra que contenía proteínas sin unir se recogió en una alícuota de 15 ml en un tubo de 50 ml. La columna se lavó con 2 CV de tampón de lavado (20 mM HEPES, 20 mM imidazol, 500 mM NaCl, pH 8,01) recogido en fracciones de 2 ml en una placa de 96 pocillos. La proteína unida se eluyó después con 6 CV de tampón de elución al 100 % (20 mM HEPES, 250 mM imidazol, 500 mM NaCl, pH 8,01). La proteína eluida se recogió en fracciones de 2 ml en placas de 96 pocillos. El lavado y la elución se realizaron a 5 ml/min.
Cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) del conjunto IMAC de PE QIQ
La columna SEC (GE healthcare, HILOAD™ 26/60 SUPERDEX™ 75 clasificación prep, 60 cm de altura aprox. 319 ml de volumen) se equilibró con 3 CV de tampón SEC (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 8,49). Se cargaron 11 ml de eluido IMAC en la columna a un caudal de 2,5 ml/min. Se recogieron fracciones de 2 ml de 0,3 CV a 0,9 CV. Se realizaron dos ejecuciones después las fracciones se analizaron por SDS-PAGE. Las fracciones de las dos ejecuciones que contienen la proteína Prot E se pusieron juntos ("conjunto SEC ", 48 ml de volumen total aprox.). Se añadieron 500 mM de Arginina al conjunto SEC.
Dosificación de las muestras puestas en conjunto PE QIQ generadas en el protocolo SEC anterior
El conjunto SEC se dosificó con el procedimiento RCDC (Agente reductor y detergente compatible, por sus siglas en inglés) del kit Bio-Rad RC DC™ siguiendo el protocolo del fabricante:
Para cada muestra ensayada y patrón, se distribuyeron 25 |jl en tubos de microfuga por duplicado. Se añadieron 125 |jl de Reactivo I Bio-Rad RC en cada tubo; cada tubo se sometió a vórtex y se incubó durante 1 minuto a temperatura ambiente. Se añadieron 125 j l de Reactivo II Bio-Rad RC en cada tubo; cada tubo se sometió a vórtex y se centrifugó después a 14.000 xg durante 5 minutos. Los sobrenadantes se descartan invirtiendo los tubos en papel de tejido absorbente permitiendo que el líquido se drene completamente de los tubos. Se añaden 25,4 j l de Reactivo A (ya preparado mezclando 20 j l de Reactivo S por 1 ml de Reactivo A) a cada tubo; cada tubo se sometió a vórtex y se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente o hasta que el precipitado se disuelva completamente. Se somete a vórtex antes de avanzar a la siguiente etapa. Añadir 200 j l de reactivo B de CD a cada tubo y someter a vórtex inmediatamente. Incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos. Transferir todas las muestras a una placa de 96 pocillos y leer la absorbancia a 750 nm para determinar la concentración de proteína para cada muestra de proteína desconocida.
La concentración de ProtE fue 1,069 mg/ml.
Purificación de proteína PilA etiquetada conHis
PilA se purificó siguiendo el procedimiento general a continuación:
Las células de E. coli que contienen una construcción que codifica PilA o un fragmento de la misma se suspenden en BUGBUSTER® y nucleasa BENZONASE® (NOVAGEN®), por ejemplo 10 ml de BUGBUSTER® y 10 ul de nucleasa BENZONASE®. El lisado celular se mezcla a temperatura ambiente en una plataforma rotatoria, por ejemplo, durante 15 minutos. El lisado celular se centrifuga a 4 °C, por ejemplo a 16.000 g durante 20 minutos. El sobrenadante que contiene la proteína se añade a una columna Ni NTA que contiene una resina Ni NTA HISBIND® y se mezcla a 4 °C, por ejemplo durante 1 hora. La columna puede consistir en 2 ml de resina Ni NTA HISBIND® (NOVAGEN®) y 10 ml de tampón de unión 1X (del kit de NOVAGEN® de tampón Ni-NTA). Después se recoge el flujo a través de la columna. La resina se lava dos veces con tampón de lavado 1X, por ejemplo, que contiene 300 mM NaCl, 50 mM NaH2PO4, 25 mM imidazona, pH 8,0). El lavado se recoge por flujo de gravedad. La proteína se elyue de la columna con tampón de elución 1X, por ejemplo, 300 mM NaCl, 50 mM NaH2PO4, 250 mM imidazona, pH 8,0. La proteína puede purificarse adicionalmente por diálisis con el tampón de unión y reejecutarse sobre una columna Ni NTA como se ha descrito anteriormente.
Escisión de trombina de PilA
PilA se incuba después con trombina (diluida 1/50) a temperatura ambiente durante 16 h, para retirar la etiqueta de histidina.
Cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) en PilA escindida con trombina.
La columna SEC (GE healthcare, HILOAD™ 26/60 SUPERDEX™ 75 clasificación prep., 60 cm de altura aprox. 319 ml de volumen) se equilibró con 5 CV de tampón SEC (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 8,52). Se cargaron aproximadamente 10 ml de PilA escindida en la columna a un caudal de 2,5 ml/min. Se recogieron fracciones de 2 ml de 0,3 CV a 0,9 CV. Se realizaron dos ejecuciones después las fracciones se analizaron por SDS-PAGE. Las fracciones de las dos ejecuciones que contenían la proteína PilA escindida se pusieron juntas (“conjunto SEC”, 52 ml de volumen aprox. total).
Dosificación de PilA, conjunto SEC.
El conjunto SEC se dosificó con el procedimiento RCDC como se describe anteriormente. La concentración de PilA escindida estuvo en 5,37 mg/ml.
Diálisis del conjunto SEC PilA con PBS 1x pH 7,4 (factor de diálisis = 1600) y dosificación por RCDC La concentración post-diálisis determinada por RCDC estuvo en 3,0 mg/ml.
Purificación de LVL317
Choque osmótico
Ya que la proteína de fusión LVL317 se expresa y procesa en el periplasma bacteriano, la proteína se extrajo por choque osmótico.
Una pasta celular de E. coli B2448 recolectada congelada (-20 °C) que contenía LVL317 de 4 l de cultivo fermentador se puso en conjunto y se resuspendió en un tampón hipertónico que consiste en 24 mM Tris-HCl, 16 % (p/v) sacarosa, 9,9 % (p/v) glucosa, 10 mM EDTA, pH 8,0 hasta un volumen final de 4 l. La suspensión se mezcló cuidadosamente durante 30 min a temperatura ambiente usando un propulsor de 3 hojas instalado en un agitador básico RW 16, a velocidad media. La suspensión se centrifugó a 15.900 x g durante 30 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante (SN1) se guardó para el análisis en gel.
El sedimento resultante se resuspendió en una solución hipotónica; 38 mM MgCh, y se mezcló durante 30 min a temperatura ambiente. LA mezcla se centrifugó a 15.900 x g durante 30 minutos a temperatura ambiente y el antígeno se recuperó en el sobrenadante (SN2).
Se realizó una clarificación del SN2 por filtración a través de un filtro Sartorius Sartopore 2 MidiCap de polietersulfona 0,45/0,2 |jm, a 600 ml/min de caudal.
El SN2 se diluyó 1:3 con 20 mM NaH2PO4-Na2HPO4, pH 7,0, el pH se ajustó a 7,0 si fuera necesario y se realizó otra clarificación por filtración a través de un filtro Sartorius Sartopore 2 MidiCap de polietersulfona 0,45/0,2 jm , a 600 ml/min de caudal.
Cromatografía SP SEPHAROSE™ de flujo rápido (SP FF)
El SN2 diluido/filtrado se cargó y se capturó en una resina intercambiadora catiónica fuerte (SP SEPHAROSE™ FF -GE Healthcare) en una columna de 14 cm DI (diámetro interno) x 20 cm (volumen de la columna 3100 ml) equilibrada con 2 CV de tampón 20 mM NaH2PO4 / Na2HPO4 pH 7,0. Después de lavar la columna con 5 CV de tampón 20 mM NaH2PO4 / Na2HPO4 pH 7,0, el antígeno (contenido dentro de LVL317) se eluyó aumentando la concentración de NaCl hasta 100 mM en el mismo tampón de lavado.
Véase la Figura 12 para un cromatograma típico de SP SEPHAROSE™ de Flujo Rápido.
Cromatografía Q SEPHAROSE™ de flujo rápido (Q FF)
El antígeno presente en el Eluido de SP FF se diluyó 1:4 con un 20 mM Tris pH 8,5, el pH se ajustó a 8,5 si fuera necesario y se pasó a través de una resina intercambiadora catiónica fuerte (Q SEPHAROSE™ FF - GE Healthcare) en una columna de 14 cm DI x 11,8 cm (volumen de la columna 1800 ml) equilibrada con 2 CV de tampón 20 mM Tris pH 8,5. El antígeno se recuperó en la fracción de flujo a través.
Véase la Figura 13 para un cromatograma típico de Q SEPHAROSE™ de Flujo Rápido.
Concentración, diafiltración, adición de polisorbato 80 y filtración estéril
El flujo a través Q FF que contenía el antígeno se concentró hasta 0,7-0,8 mg/ml a base del cromatograma UV y se diafiltró con 5 DV de tampón 10 mM KH2PO4 / K2HPO4 pH 6,5 usando una membrana Pellicon-2™ de 10 kDa de corte (Millipore).
Usando una solución madre al 5 %, se añadió polisorbato 80 (por ejemplo, TWEEN™ 80) al retenido de ultrafiltración y se agitó durante 30 minutos con un agitador magnético a 130 rpm a 4 °C. La concentración final del polisorbato 80 fue el 0,04 %. El retenido de ultrafiltración se esterilizó por filtración a través de una membrana de Acetato de Celulosa 0,45/0,2 jm (Sartobran 300, Sartorius). El volumen purificado se almacenó a -20 °C o -80 °C. La concentración absoluta de proteína se midió por AAA (Análisis de aminoácidos) a 0,737 mg/ml.
E jem plo 9: Uso de Polisorbato 80
Un experimento de titulación indicó que la adición de polisorbato 80, específicamente, TWEEN™ 80 a una concentración final del 0,04 % (p/v) al volumen purificado antes de la filtración estéril redujo la formación de partículas filamentosas y la agregación.
De acuerdo con el análisis de DSC, el TWEEN™ 80 redujo el grado de cambio estructural (30-45 °C) visto después de ciclos de congelación/descongelación después del almacenamiento a -20 °C y después de 4 días de almacenamiento a 4 °C, -20 °C y 37 °C.
E jem plo 10: A nális is S D S -P A G E y transferencia W estern de LVL317
Análisis SDS-PAGE y transferencia Western
Se cargó un gel NUPAGE®, Bis-Tris al 4-12 % como se describe a continuación con 10 |jg de muestra en tampón de muestra NUPAGE® LDS que contiene 50 mM DTT calentado 5 min a 95 °C (se cargaron 20 j l de muestra para muestras que tienen concentración baja). Migración: 35 minutos a 200 Voltios a temperatura ambiente (TA) en Tampón de ejecución NUPAGE® MES. El gel se tiñó 2 horas con azul Instant (Novexin cat.: ISB01L) y se destiñó durante toda la noche en agua.
Contenidos de carril:
1: Patrón MW (10 j l) 2: Inicio (fracción total) (10 jg ) 3: SN1 sin filtrar (10 jg )
4: SN2 sin filtrar (10 jg ) 5: Sin extraer (10 jg ) 6: Carga SP FF (10 jg )
7: Flujo a través SP FF (6,9 jg ) 8: Lavado SP FF (20 j l) 9: Elución SP FF (10 jg )
10: Tira SP FF (10 jg ) 11: Carga Q FF (8,9 jg ) 12: Elución Q FF (9,8 jg )
13: Tira Q FF (4,8 jg ) 14: TFF retenido antes del pico 0,04 % TWEEN™ 80 (10 jg )
15: Volumen purificado Sin filtrar pico de 0,04 % TWEEN™ 80 (10 jg)
16: Volumen purificado Filtrado estéril pico de 0,04 % TWEEN™ 80 (10 jg)
17: Volumen purificado Filtrado estéril pico 0,04 % TWEEN™ 80 (20 jg pico de lisado celular E. Coli Rix (1 jg ))
18: lisado celular E. Coli Rix (2 jg )
19: lisado celular E. Coli Rix (1 jg)
20: lisado celular E. Coli Rix (0,5 jg)
Véase la Figura 14 para un SDS-PAGE de las muestras en el procedimiento a partir del procedimiento de purificación de la proteína de fusión Pe-PilA.
Para la transferencia Western, las proteínas se transfirieron a 4 °C durante toda la noche a 30 Voltios en tampón de transferencia NUPAGE® 20 % metanol, 0,1 % SDS en una membrana de nitrocelulosa. Las membranas se bloquearon 1 hora con 50 mM Tris, 150 mM NaCl pH 7,4 5 % de leche seca no grasa, se incubó 2 horas en anticuerpo primario policlonal de conejo diluido en tampón de bloqueo (anti-Prot-E 1/50000 y anti-Ecoli (BLR) 1/1 000), se lavó 3x5 minutos en 50 mM Tris pH 7,4 0,05 % Tween 20, se incubó durante 1 hora en anticuerpo secundario (cabra anti­ conejo conjugado a fosfatasa alcalina diluida 1/5000 en tampón de bloqueo), se lavó 3x5 minutos en tampón de lavado y se desarrolló en sustrato BCIP/NBT (1 comprimido por 10 ml). Todas las incubaciones se realizaron en 25 ml por membrana.
Véase la Figura 15 para una transferencia Western de las muestras en el procedimiento a partir del procedimiento de purificación de la proteína de fusión Pe-PilA. La transferencia usa anti-PE policlonal de conejo.
Contenidos de carril:
1: Patrón MW (10 j l) 2: Inicio (fracción total) (10 jg ) 3: SN1 sin filtrar (10 jg )
4: SN2 sin filtrar (10 jg ) 5: Sin extraer (10 jg ) 6: Carga SP FF (10 jg )
7: Flujo a través SP FF (6,9 jg ) 8: Lavado SP FF (20 j l) 9: Elución SP FF (10 jg )
10: Tira SP FF (10 jg ) 11: Carga Q FF (8,9 jg ) 12: Elución Q FF (9,8 jg )
13: Tira Q FF (4,8 jg ) 14: TFF retenido antes del pico 0,04 % TWEEN™ 80 (10 jg )
15: Volumen purificado Sin filtrar pico de 0,04 % TWEEN™ 80 (10 jg)
16: Volumen purificado Filtrado estéril pico de 0,04 % TWEEN™ 80 (10 jg)
17: Volumen purificado Filtrado estéril pico 0,04 % TWEEN™ 80 (20 jg pico de lisado celular E. Coli Rix (1 jg ))
18: lisado celular E. Coli Rix (2 jg )
19: lisado celular E. Coli Rix (1 jg)
20: lisado celular E. Coli Rix (0,5 jg)
Véase la Figura 16 para una transferencia Western de las muestras en el procedimiento a partir del procedimiento de purificación de la proteína de fusión Pe-PilA. La transferencia usa anti-E. coli (BLR) policlonal de conejo.
Contenidos de carril:
1: Patrón MW (10 j l ) 2: Inicio (fracción total) (10 jg ) 3: SN1 sin filtrar (10 jg )
4: SN2 sin filtrar (10 pg) 5: Sin extraer (10 pg) 6: Carga SP FF (10 pg)
7: Flujo a través SP FF (6,9 pg) 8: Lavado SP FF (20 pl) 9: Elución SP FF (10 pg)
10: Tira SP FF (10 pg) 11 : Carga Q FF (8,9 pg) 12: Elución Q FF (9,8 pg)
13: Tira Q FF (4,8 pg) 14: TFF retenido antes del pico 0,04 % TWEEN™ 80 (10 pg)
15: Volumen purificado Sin filtrar pico de 0,04 % TWEEN™ 80 (10 pg)
16: Volumen purificado Filtrado estéril pico de 0,04 % TWEEN™ 80 (10 pg)
17: Volumen purificado Filtrado estéril pico 0,04 % TWEEN™ 80 (20 pg pico de lisado celular E. Coli Rix (1 pg)) 18: lisado celular E. Coli Rix (2 pg)
19: lisado celular E. Coli Rix (1 pg)
20: lisado celular E. Coli Rix (0,5 pg)
Comentarios de las figuras de SDS-PAGE y Transferencia Western: La proteína de fusión PE-PilA migra a 30 kDa. La extracción por choque osmótico extrae la proteína de fusión expresada y procesada en el periplasma bacteriano y reduce la contaminación de la bacteria. Pequeña pérdida de la proteína de fusión durante el tratamiento hipertónico (carril 3). Una pequeña proporción no se extrae por tratamiento hipotónico y se mantiene asociada a las células (carril 5). Pequeña pérdida en el flujo a través de SP FF (carril 7) y en la fracción de tira de ambas columnas (carriles 10 y 13). Ya que el volumen total de la fracción de tira es bajo la pérdida de proteína no es significativa. Las bandas degradadas son visibles en las fracciones de tira pero no en el producto final. No hay contaminación significativa de proteínas de la célula hospedadora E. coli en el volumen purificado (carril 16).
El análisis de LVL735 y LVL778 produjo perfiles similares a LVL31.
E jem plo 11: Datos de puntos de fusión p ara PE, PilA y LVL317
La transición térmica de la proteína de fusión PE-PilA sin etiqueta His (LVL317) se comparó con la transición térmica tanto de las proteínas PE etiquetada con his (como se describe en el Ejemplo 8) como PilA escindida (como se describe en el Ejemplo 8), purificadas como se describe anteriormente.
Antes de la DSC, PE y PilA se dializaron durante toda la noche en 10 mM K2HPO4/KH2PO4 pH 6,5 0,04 % Tween 80 (relación 1:250 volumen de la muestra:del tampón) para tenerlas en el mismo tampón como la proteína de fusión. Después de la diálisis, la concentración de las proteínas se midió por BCA y se ajustó a 300 pg/ml (PE) y 500 pg/ml (PilA).
El análisis se realizó en VP™-DSC de MicroCal, LLC (parte de GE Healthcare). El tampón de diálisis final se usó como referencia y se sustrajo de los barridos. Velocidad de barrido de DSC 90 °C/h. Para evaluar la capacidad de medir la transición térmica en el Recipiente Final (RF) después de la formulación, la proteína de fusión se diluyó a la concentración RF (60 pg/ml). Datos de recipiente final no mostrados.
Resultados:
Véase la Figura 17 para la transición térmica de la proteína de fusión Pe-PilA y las proteínas PE y PilA. Curvas: PilA (1), Proteína E (Prot E, PE) (2), PE-PilA PB sin diluir 737mg/ml (3) y PE-PilA PB diluida a la concentración RF 60 pg/ml (4).
1 - PilA Tm: 53 °C
2 - Proteína E Tm: 63
3 - PE-PilA PB (Volumen Purificado) sin diluir 737 pg/ml Tm-i: 53,7 °C y Tm2 : 66,1 °C 4 - PE-PilA PB diluida a la concentración RF 60 pg/ml Tm1: 53,2 °C y Tm2: 67,6 °C
Se detectaron dos transiciones en la proteína de fusión purificada (LVL317) (curvas 3 y 4).
La Tm1 (53,7 °C) de la proteína de fusión PE-PilA es similar a la transición de PilA (53 °C).
Desplazamiento significativo de Tm2 en PE-PilA (66,1 °C) en comparación con la transición de PE (63 °C). La fusión de ambos dominios parece estabilizar el fragmento PE.
El desplazamiento de Tm2 en la proteína de fusión diluida en comparación con la no diluida es un artefacto de concentración que surge de la fuerte pendiente decreciente típica de la agregación que es dependiente de la concentración.
El análisis del plegamiento de antígenos de LVL735 y LVL778 fueron similares a aquel de LVL317.
Ejem plo 12: Respuesta de inm unogenic idad de la construcción LVL291 de p rote ína de fusión PE-PilA en ratones Balb /c
La respuesta inmune dirigida contra la proteína de fusión PE-PilA LVL291 (la proteína de fusión LVL291 sin el péptido señal heterólogo) formulada en AS03a se evaluó en ratones Balb/c. Los animales (20 ratones/grupo) se inmunizaron por la vía intramuscular los días 0, 14 y 28 con 10 |jg de PE (del vector pRIT16762), PilA (del vector pRIT16790) o PE-PilA, cada uno formulado en AS03a. El grupo control se vacunó solamente con AS03a . La respuesta de anticuerpos dirigida contra cada antígeno se determinó en sueros individuales recogidos el día 42. No se obtuvo respuesta de anticuerpos con el control negativo. Como se muestra en la Figura 18, la respuesta de anticuerpos dirigidos contra PilA fue mayor en ratones inmunizados con la fusión PE-PilA en comparación con la respuesta de anticuerpos en ratones inmunizados con PilA monovalente. Las respuestas de anticuerpos dirigidas contra PE fueron similares en ratones inmunizados con la proteína de fusión y ratones inmunizados con PE monovalente. GMT = título de media geométrica. Los datos se capturaron y analizaron con el Software SOFTMAX® Pro (Molecular Devices) en WINDOWS® (Microsoft); la función log logística de cuatro parámetros se usó para calcular la curva patrón. La función log logística de cuatro parámetros describe, con un alto grado de precisión, la curva del suero de referencia que muestra una forma sigmoidea pronunciada cuando se representa en una escala densidad óptica frente a concentración (log). Las concentraciones de anticuerpos se calcularon en cada dilución de muestras de suero de ratón por interpolación de la curva patrón. El anticuerpo en los sueros de control de calidad y en las muestras de suero desconocidas se obtiene promediando los valores de todas las diluciones que caen dentro del intervalo de trabajo (10­ 80 %) de la curva de dilución de la referencia.
Los resultados se muestran en la Figura 18, que grafica las respuestas de anticuerpos frente a la proteína de fusión PE-PilA LVL291 y contra PE y PilA monovalentes en el modelo de ratón Balb/c.
Ejem plo 13: M odelo de colonización nasofaríngeo m urino. Inm unización con PE-PilA . D esafío con N TH i cepa 86-028N P y N TH i cepa 3224A.
Ratones hembra balb/c (20/grupo) se inmunizaron intranasalmente los días 0 y 14 con 6 jg de una proteína de fusión PE-PilA purificada (LVL291 para el desafío con 86-028NP; LVL317 para el desafío con la cepa 322a ) formulada con LT (toxina lábil al calor de Escherichia coli) y el día 28 con 6 jg de una proteína de fusión PE-PilA purificada en tampón fosfato salino (PBS). Los ratones control (20/grupo) se vacunaron con LT sola. Los ratones se desafiaron intranasalmente de forma posterior con 5 x 106 UFC (unidades formadoras de colonias) de NTHi homóloga cepa 86-028NP y NTHi heteróloga cepa 322A. La homología y la heterología se determinan por referencia a la cepa NTHi con la que los ratones se inmunizaron. Se contaron las colonias bacterianas en las cavidades nasales y se retiraron los días 1 y 2 después del desafío. D1 = día 1. D2 = día 2.
La vacunación PE-PilA aumentó la desaparición de NTHi cepa 86-028NP y NTHi cepa 322A en la nasofaringe el día 1 y el día 2 después del desafío.
Para el experimento realizado con NTHi cepa 86-028NP: Se realizó un ANOVA fijo de 2 vías usando los valores log10 de los recuentos como respuesta, siendo los factores fijos el grupo (4 niveles) y el día (2 niveles). Se rechazó asumir la heterogeneidad de la varianza y se ajustó a los datos un modelo con varianzas heterogéneas. No se detectó interacción significativa entre los 2 factores. El grupo fusión PE-PilA (6 jg por ratón) redujo significativamente las UFC en comparación con el grupo control (LT); siendo la relación de la media geométrica igual a 0,06 con un intervalo de confianza del 95 % de 0,01, 0,25.
Para el experimento realizado con NTHi cepa 322A: Se realizó un ANOVA fijo de 3 vías usando los valores log10 como respuesta, siendo los factores fijos el grupo, el día y el experimento. El ensayo de Shapiro-Wilk y Levene no rechazó las presunciones de normalidad y homogeneidad de las varianzas. No se detectó interacción significativa entre ninguno de los 2 factores o entre los 3 factores y solamente se mantuvieron los factores principales en el análisis. PE-PilA / LT redujeron significativamente las UFC en comparación con el grupo control; siendo la relación de la media geométrica igual a 0,11 con un intervalo de confianza del 95 % de 0,02, 0,61.
Véase la Figura 19 para el efecto de la vacunación de la proteína de fusión Pe-PilA en la desaparición bacteriana de NTHi cepa 86-028NP en la nasofaringe de ratón.
Véase la Figura 20 para el efecto de la vacunación de la proteína de fusión Pe-PilA en la desaparición bacteriana de NTHi cepa 322A en la nasofaringe de ratón.
E jem plo 14: M odelo de colonización nasofaríngeo m urino. Inm unización con PilA. Desafío con N TH i cepa 3219C.
Ratones hembra OF1 (20 ratones/grupo) se inmunizaron intranasalmente los días 0 y 14 con 3 jg de PilA (del vector 16790) formulada con LT y el día 28 con 3 jg de PilA en PBS. Los ratones control se vacunaron con LT sola. Los ratones se desafiaron intranasalmente de forma posterior con 5 x 106 UFC de NTHi cepa 3219C. Se contaron las colonias bacterianas en las cavidades nasales y se retiraron los días 3 y 4 después del desafío. D3 = día 3. D4 = día 4.
Véase la Figura 21 para el efecto de la vacunación de PilA en la desaparición bacteriana en la nasofaringe de ratón.
Ejem plo 15: M odelo de colonización nasofaríngeo m urino. Inm unización con PE. Desafío con N TH i cepa 3224A.
Ratones hembra Balb/c (20 ratones/grupo) se inmunizaron intranasalmente los días 0 y 14 con 3 |jg de PE (del vector pRIT16762) formulada con LT y el día 28 con 3 jg de PilA en PBS. Los ratones control se vacunaron con LT sola. Los ratones se desafiaron intranasalmente de forma posterior con 5 x 106 UFC de NTHi cepa 3224A. Se contaron las colonias bacterianas en las cavidades nasales y se retiraron los días 3 y 4 después del desafío. Se examinaron 10 ratones el día 3 (D3). Se examinaron 10 ratones el día 4 (D4). La vacunación de PE aumentó significativamente la desaparición de NTHi en la nasofaringe el día 4 después del desafío (Figura 22), usando el ensayo de Dunn para el análisis estadístico.
Véase la Figura 22 para el efecto de la vacunación de PE en la desaparición bacteriana en la nasofaringe de ratón.
E jem plo 16: Unión a Vibronectina. Inhibición de la unión a vibronectina p o r la proteína de fusión PE-PilA LV L317 y LVL735.
Se evaluó la capacidad de PE en la construcción de proteína de fusión PE-PilA LVL317 para unirse a vitronectina. Unas placas de microtitulación (POLYSORP™, Nunc, Thermo Fisher Scientific) se recubrieron con PE (del vector pRIT16762) o con proteína de fusión PE-PilA LVL317 purificada (10 jg/ml). Las placas se lavaron cuatro veces con NaCl 150 mM-polisorbato 20, 0,05 % (por ejemplo, Tw Ee N™ 20) y se bloquearon durante una o dos horas con PBS-BSA al 1 %. Después de cuatro lavados, se añadió vitronectina (Vitronectina de plasma humano, SIGMA-ALDRICH®) (10 jg/ml), se diluyó dos veces (12 diluciones) y las placas se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente. Las placas se lavaron después 4veces con NaCl 150 mM-polisorbato 20, 0,05 % (por ejemplo, TWEEN™ 20). Después de los lavados, la vitronectina unida se detectó usando peroxidasa de oveja anti-vitronectina humana (US Biological) seguido de la adición de orto-fenilen diamina/sustrato H2O2. El color desarrollado es directamente proporcional a la cantidad de anticuerpo fijado a la vitronectina.
Véase la Figura 23 para (a) proteína de fusión PE-PilA LVL317 unida a vitronectina. PilA = PilA de NTHi cepa 86-028NP (como se describe para pRIT16790); PE = Proteína E (como se describe para pRIT16762) y (b) proteína de fusión PE-PilA LVL317 y lVl735 unidas a vitronectina.
E jem plo 17: Unión a Vibronectina. Inhibición de la unión a vibronectina p o r anticuerpos dirig idos contra la prote ína de fusión PE-PilA LVL291.
Unas placas de microtitulación (POLYSORP™, Nunc, Thermo Fisher Scientific) se recubrieron con PE (del vector pRIT16762) o con proteína de fusión PE-PilA purificada (10 jg/ml). Las placas se lavaron cuatro veces con NaCl 150 mM-polisorbato 20, 0,05 % (por ejemplo, Tw Ee N™ 20) y se bloquearon durante una o dos horas con PBS-BSA al 1 %. Después de los lavados, se añadió vitronectina (Vitronectina de plasma humano, SIGMA-ALDRICH®) a 40 jg/m l y los anticuerpos anti-PE-PilA purificados (producidos y purificados en el laboratorio) se diluyeron en serie dos veces y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente. Las placas se lavaron después 4 veces con NaCl 150 mM-polisorbato 20, 0,05 % (por ejemplo, TWEEN™ 20). Después de cuatro lavados, la vitronectina unida se detectó usando peroxidasa de oveja anti-vitronectina humana (US Biological) seguido de la adición de orto-fenilen diamina/sustrato H2O2. El color desarrollado es directamente proporcional a la cantidad de anticuerpo fijado a la vitronectina. Se observó la inhibición de la unión de vitronectina a PE por los anticuerpos policlonales dirigidos contra PE-PilA.
Véase la Figura 34 para la inhibición de la unión de vitronectina por los anticuerpos policlonales contra la proteína de fusión PE-PilA.
E jem plo 18: A ntigenic idad de la pro te ína de fusión PE-PilA LVL291. ELISA.
La proteína de fusión PE-PilA LVL291 purificada se validó en un ensayo de antigenicidad con proteínas monovalentes como control. La proteína de fusión se ensayó en un ELISA de sándwich desarrollado con anticuerpos policlonales (de conejo y de cobaya) generados contra el fragmento génico PE que codifica para los aminoácidos 22 a 160 de SEQ ID NO: 4 (como se describe para pRIT16711) o contra PilA de NTHi cepa 86-028NP (del vector pRIT16790).
PilA o PE se añadió a 100 ng/ml y se diluyó en serie dos veces. Después de 30 minutos de incubación y después de lavar, el antígeno unido se detectó por un suero policlonal de conejo obtenido después de la inmunización con PE o PilA. Los anticuerpos unidos se detectaron usando una peroxidasa anti-Ig de conejo (Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc.) seguido de la adición de orto-fenilen diamina/sustrato H2O2. El color desarrollado es directamente proporcional a la cantidad de antígeno presente. Las lecturas de absorbancia se midieron usando un espectrofotómetro para placas de microtitulación. La antigenicidad de las muestras se determinó por comparación con la curva del antígeno de referencia PE de longitud completa o de PilA de longitud completa y se expresa en ug/ml. La referencia representó el 100 % de antigenicidad.
Como se observa en la tabla 6: La antigenicidad se observó con la proteína de fusión PE-PilA LVL291 purificada en comparación con los antígenos PE y PilA monovalentes.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Una composición inmunogénica que comprende una proteína de fusión de fórmula I:
    (X)m-(Ri)n-A-(Y)o-B-(Z)p (fórmula I)
    en la que
    X es un péptido señal o MHHHHHH (SEQ ID NO. 2);
    m es 0 o 1;
    R1 es un aminoácido;
    n es 0, 1, 2, 3, 4, 5 o 6;
    A es un fragmento inmunogénico de la Proteína E seleccionado de SEQ ID NO. 122, SEQ ID NO. 123, SEQ ID NO. 124, SEQ ID NO. 125, SEQ ID NO. 126, SEQ ID NO. 179 o SEQ ID NO. 180 o una secuencia que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con una cualquiera de SEQ ID NO. 122, SEQ ID NO. 123, SEQ ID NO.
    124, SEQ ID NO. 125, SEQ ID NO. 126, SEQ ID NO. 179 o SEQ ID NO. 180;
    Y es GG; o es 1;
    B es un fragmento inmunogénico de PilA, al menos un 95 % idéntico a los aminoácidos 40-149 de cualquiera de SEQ ID NO. 58 a SEQ ID NO. 121;
    Z es GGHHHHHH (SEQ ID NO. 3); y
    p es 0 o 1.
    y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
    2. La composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 1, en la que X es el péptido señal de una proteína seleccionada del grupo que consiste en FlgI, NadA y pelB.
    3. La composición inmunogénica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en la que m es 0.
    4. La composición inmunogénica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que n es 0.
    5. La composición inmunogénica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que A es un fragmento inmunogénico de la Proteína E de H. influenzae seleccionado del grupo que consiste en los aminoácidos 17-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 122), los aminoácidos 18-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 123), los aminoácidos 19-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 124), los aminoácidos 20-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO.
    125), los aminoácidos 22-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 126), los aminoácidos 23-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 179) y los aminoácidos 24-160 de SEQ ID NO. 4 (SEQ ID NO. 180).
    6. La composición inmunogénica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que B es un fragmento inmunogénico de PilA que consiste en los aminoácidos 40-149 de cualquiera de SEQ ID NO. 58 - SEQ ID NO. 121.
    7. La composición inmunogénica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que B es el fragmento inmunogénico de PilA de H. influenzae como se expone en SEQ ID NO. 127 (T KKAAVSELLQ ASAPYKADVE LCVYSTNETT NCTGGKNGIA ADITTAKGYV KSVTTSNGAI TVKGDGTLAN MEYILQATGN AATGVTWTTT CKGTDASLFP ANFCGSVTQ).
    8. La composición inmunogénica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que A es SEQ ID NO. 125 (I QKAEQNDVKL APPTDVRSGY IRLVKNVNYY IDSESIWVDN QEPQIVHFDA VVNLDKGLYV YPEPKRYARS VRQYKILNCA NYHLTQVRTD FYDEFWGQGL RAAPKKQKKH TLSLTPDTTL YNAAQIICAN YGEAFSVDKK).
    9. La composición inmunogénica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que B es el fragmento de PilA como se expone en SEQ ID NO. 127 y A es un fragmento inmunogénico de la Proteína E seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO. 122, SEQ ID NO. 124, SEQ ID NO. 125 y SEQ ID NO. 126.
    10. La composición inmunogénica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 que además comprende la Proteína D de H. influenzae.
    11. La composición inmunogénica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que además comprende un adyuvante en la que opcionalmente el adyuvante es AS01 (por ejemplo, AS01B o AS01E).
    12. La composición inmunogénica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende además arginina, ácido plurónico y/o polisorbato.
    13. La composición inmunogénica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en la que la composición inmunogénica está adaptada para la administración intramuscular.
    14. La composición inmunogénica de las reivindicaciones 1-13,
    - para su uso en el tratamiento o la prevención de exacerbaciones agudas de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EA-EPOC); yo
    - para su uso en el tratamiento o la prevención de neumonía; y/o
    - para su uso en el tratamiento o la prevención de una infección o enfermedad por H. influenzae.
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