WO2009154025A1 - 酸化LDL/β2GPI複合体に対する抗体及びその用途 - Google Patents
酸化LDL/β2GPI複合体に対する抗体及びその用途 Download PDFInfo
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Abstract
Description
「足関節上腕血圧比」:横になった状態で両腕、両足の血圧を測定すると、正常では足首の方がやや高い値になる。ところが血管につまりがある場合、そこから下流の血圧が低下し、足関節の血圧/上腕の血圧の比(ABI)が低くなる。ABIの低下は、下肢動脈だけでなく、全身に動脈硬化があることを推定する。
「脈波速度検査」:動脈の硬さを調べる方法で動脈硬化の進行を推定する方法。健康人は血管に弾力性があるため、振動が血管壁で吸収され、脈波の速度は遅い。動脈硬化が進むと、脈波は速くなるので、速度を指標として動脈硬化の進行を推定することができる。
「頸動脈超音波検査」:皮膚表面近くを走る頸動脈は内部の様子を超音波で観察しやすいので、この頸動脈を調べ、全身の動脈硬化の進行状況を推定する方法。
「MR血管造影(MRA)」:「CT血管造影(CTA)」血管疾患の画像診断法として従来血管造影が主流であったが、より侵襲が少なく血管造影にほぼ匹敵する画像情報が用いられるようになった。CTAの利点は、(1)空間分解能が高い、(2)検査が簡便、(3)石灰化病変の検出に優れる点が挙げられる。
上記「足関節上腕血圧比」、「脈波速度検査」では、粥状化位置特定と個別箇所ごとの進行状況の診断はできず、間接的に数値として評価せざるを得ない。
また、「頸動脈超音波検査」は、脈波速度検査などと違い、実際に血管の内部を画像として直接的に診ることができる点が優れている。しかし、超音波画像の濃淡や形から血管壁の状況を読みとる必要があるため、検査を行う医師や検査技師に技量が求められ、頸動脈以外の部位の、粥状化位置特定と個別箇所ごとの進行状況の診断はできない。
さらに、MRIや放射ラベルを用いたイメージングでも画像の濃淡や形から血管壁の状況を読みとる必要があるため、検査を行う医師や検査技師に技量が求められる(米国特許6716410号、米国特許6375925号)。
即ち本発明は、以下〔1〕~〔12〕を提供するものである。
〔1〕 酸化LDLとβ2-グリコプロテインIの複合体(酸化LDL/β2GPI複合体)に結合する、下記(a)~(e)のいずれかに記載の抗体;
(a)CDR1として配列番号:2に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:3に記載アミノ酸配列、及びCDR3として配列番号:4に記載のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗体、
(b)重鎖可変領域として配列番号:1に記載のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗体、
(c)CDR1として配列番号:7に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:8に記載アミノ酸配列、及びCDR3として配列番号:9に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体、
(d)軽鎖可変領域として配列番号:6に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体、
(e)上記(a)または(b)に記載の重鎖、および、上記(c)または(d)に記載の軽鎖の対を有する抗体。
〔2〕 〔1〕に記載の抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体。
〔3〕 ヒト化抗体またはキメラ抗体である、〔1〕または〔2〕に記載の抗体。
〔4〕 酸化LDLとβ2-グリコプロテインIの複合体(酸化LDL/β2GPI複合体)に結合する抗体を含む、動脈硬化の存在部位のイメージング剤。
〔5〕 〔1〕~〔3〕のいずれかに記載の抗体を含む、動脈硬化の存在部位のイメージング剤。
〔6〕 動脈硬化において、粥腫の位置及び/または大きさをイメージングする、〔4〕または〔5〕のイメージング剤。
〔7〕 酸化LDLとβ2-グリコプロテインIの複合体(酸化LDL/β2GPI複合体)に結合する抗体を含む、動脈硬化の存在部位のイメージング用キット。
〔8〕 〔1〕~〔3〕のいずれかに記載の抗体を含む、動脈硬化の存在部位のイメージング用キット。
〔9〕 以下に記載の工程を含む、動脈硬化治療剤の候補化合物のスクリーニング方法:
(a)〔1〕~〔3〕のいずれかに記載の抗体が投与された動脈硬化疾患モデル非ヒト動物に、候補化合物を投与する工程、
(b)該候補化合物を投与された動脈硬化疾患モデル非ヒト動物と、該候補化合物を投与されていない動脈硬化疾患モデル非ヒト動物において、動脈硬化巣をイメージングする工程、
(c)該候補化合物を投与された動脈硬化疾患モデル非ヒト動物と、該候補化合物を投与されていない動脈硬化疾患モデル非ヒト動物において、動脈硬化巣の大きさまたは存在部位を比較する工程、及び
(d)該候補化合物を投与された動脈硬化疾患モデル非ヒト動物において、該候補化合物を投与されていない動脈硬化疾患モデル非ヒト動物と比較して、動脈硬化巣が減少または消失する候補化合物を選択する工程。
〔10〕 〔1〕~〔3〕に記載の抗体を含む、動脈硬化の存在部位のイメージング方法。
〔11〕 動脈硬化の存在部位のイメージング剤の製造における、〔1〕~〔3〕に記載の抗体の使用。
〔12〕 動脈硬化の存在部位のイメージング方法に使用するための、〔1〕~〔3〕に記載の抗体。
本発明は、酸化変性LDL(酸化LDL)とβ2-グリコプロテインIの複合体(酸化LDL/β2GPI複合体)に結合する抗体を提供する。動脈硬化巣で酸化LDLと血漿糖タンパク質であるβ2GPIとの複合体が形成される。本願発明に包含される抗体は、この複合体に結合することを特徴とする。
(a)CDR1として配列番号:2に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:3に記載アミノ酸配列、及びCDR3として配列番号:4に記載のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗体、
(b)重鎖可変領域として配列番号:1に記載のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗体、
(c)CDR1として配列番号:7に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:8に記載アミノ酸配列、及びCDR3として配列番号:9に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体、
(d)軽鎖可変領域として配列番号:6に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体、
(e)上記(a)または(b)に記載の重鎖、および、上記(c)または(d)に記載の軽鎖の対を有する抗体。
この限りではないが、例えばある抗体が他の抗体と同じエピトープを認識するか否かは、両者のエピトープに対する競合によって確認することができる。抗体間の競合は、競合結合アッセイによって評価することができ、その手段としてELISA、蛍光エネルギー転移測定法(FRET)や蛍光微量測定技術(FMAT(登録商標))などが挙げられる。抗原に結合した該抗体の量は、同じエピトープへの結合に対して競合する候補競合抗体(被検抗体)の結合能に間接的に相関している。すなわち、同じエピトープに対する被検抗体の量や親和性が大きくなるほど、該抗体の抗原への結合量は低下し、抗原への被検抗体の結合量は増加する。具体的には、抗原に対し、適当な標識をした該抗体と評価すべき抗体を同時に添加し、標識を利用して結合している該抗体を検出する。抗原に結合した該抗体量は、該抗体を予め標識しておくことで、容易に測定できる。この標識は特には制限されないが、手法に応じた標識方法を選択する。標識方法は、具体的には蛍光標識、放射標識、酵素標識などが挙げられる。
Fabは、IgGをシステイン存在下パパイン消化することにより得られる、L鎖とH鎖可変領域、並びにCH1ドメイン及びヒンジ部の一部からなるH鎖フラグメントとから構成される分子量約5万の断片である。本発明では、上記抗体をパパイン消化することにより得ることができる。また、上記抗体のH鎖の一部及びL鎖をコードするDNAを適当なベクターに組み込み、当該ベクターを用いて形質転換した形質転換体よりFabを調製することもできる。
Fab'は、後述のF(ab')2のH鎖間のジスルフィド結合を切断することにより得られる分子量が約5万の断片である。本発明では、上記抗体をペプシン消化し、還元剤を用いてジスルフィド結合を切断することにより得られる。また、Fab同様に、Fab'をコードするDNAを用いて遺伝子工学的に調製することもできる。
F(ab')2は、IgGをペプシン消化することにより得られる、L鎖とH鎖可変領域、並びにCH1ドメイン及びヒンジ部の一部からなるH鎖フラグメントとから構成される断片(Fab')がジスルフィド結合で結合した分子量約10万の断片である。本発明では、上記抗体をペプシン消化することにより得られる。また、Fab同様に、F(ab')2をコードするDNAを用いて遺伝子工学的に調製することもできる。
Fvは、抗体を酵素、例えばパパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、または、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現できる(例えば、Co, M.S. et al., J. Immunol.(1994)152, 2968-2976、Better, M. & Horwitz, A. H. Methods in Enzymology(1989)178, 476-496、Plueckthun, A. ; Skerra, A. Methods in Enzymology(1989)178, 476-496、Lamoyi, E., Methods in Enzymology(1989)121, 652-663、Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology(1989)121, 663-669、Bird, R. E. et al., TIBTECH(1991)9, 132-137参照)。
scFvは、H鎖可変領域とL鎖可変領域とからなるFvを、片方の鎖のC末端と他方のN末端とを適当なペプチドリンカーで連結し一本鎖化した抗体断片である。ペプチドリンカーとしては例えば柔軟性の高い(GGGGS)3などを用いることができる。例えば、上記抗体のH鎖可変領域及びL鎖可変領域をコードするDNAとペプチドリンカーをコードするDNAを用いてscFv抗体をコードするDNAを構築し、これを適当なベクターに組み込み、当該ベクターを用いて形質転換した形質転換体よりscFvを調製することができる。
dsFvは、H鎖可変領域及びL鎖可変領域の適切な位置にCys残基を導入し、H鎖可変領域とL鎖可変領域とをジスルフィド結合により安定化させたFv断片である。各鎖におけるCys残基の導入位置は分子モデリングにより予測される立体構造に基づき決定することができる。本発明では例えば上記抗体のH鎖可変領域及びL鎖可変領域のアミノ酸配列から立体構造を予測し、かかる予測に基づき変異を導入したH鎖可変領域及びL鎖可変領域をそれぞれコードするDNAを構築し、これを適当なベクターに組み込み、そして当該ベクターを用いて形質転換した形質転換体よりdsFvを調製することができる。
尚、適当なリンカーを用いてscFv抗体、dsFv抗体などを連結させたり、ストレプトアビジンを融合させたりして抗体断片を多量体化することもできる。本発明の抗体(抗体断片を含む)に低分子化合物、タンパク質、標識物質などを融合又は結合させることにより、融合抗体又は標識化抗体を構成することができる。標識物質としては125I等の放射性物質、などを用いることができる。
sc(Fv)2は、2つのVH及び2つのVLをリンカー等で結合して一本鎖にした低分子化抗体である(Hudson et al、J Immunol. Methods 1999;231:177-189)。sc(Fv)2は、例えば、scFvをリンカーで結ぶことによって作製できる。
標識物質としては、酵素発光(ルシフェラーゼ)による発光、発光低分子を利用するものと、蛍光タンパクや蛍光低分子)を用いるもの、放射性核種等が挙げられるがこれらには限定されない。放射性核種としては51Cr、59Fe、57Co、67Ga、75Se、81mKr、99mTc、111In、125I、131I、133Xe、201Tlなどのγ線放出核種や、11C、13N、15O、18F、35mCl、76Br、 45Ti、48V、60Cu、61Cu、62Cu、66Ga、89Zr、94mTc、124Iなどの陽電子放出核種などが挙げられるがこれらには限定されない。なお当業者には自明であるが"m"とは核異性体を示す。
蛍光標識や発光標識としては酵素発光(ルシフェラーゼ)による発光を利用するものと、蛍光(GFP、DsRed、クサビラオレンジ等の蛍光タンパク質やFITCやCy5.5、Alexa Fluor 750などの蛍光性低分子)を用いるものとのが使用できる。
酵素発光(ルシフェラーゼ)による発光の場合は基質投与が別途必要である。
特に、動物本来の自家蛍光による影響を軽減したものが好ましく、さらには皮膚透過性の高いシグナルを発する標識が好ましい。
(a)配列番号:5に記載の塩基配列を有する、重鎖をコードするDNA
(b)配列番号:10に記載の塩基配列を有する、軽鎖をコードするDNA
(c)CDR1として配列番号:2に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:3に記載アミノ酸配列、及びCDR3として配列番号:4に記載のアミノ酸配列を有する重鎖をコードするDNA
(d)CDR1として配列番号:7に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:8に記載アミノ酸配列、及びCDR3として配列番号:9に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖をコードするDNA
動脈硬化には大きく分け、粥腫と石灰化病変の症状が存在するが、本発明のイメージング剤によって、特に、動脈硬化粥腫部位が染色される。
粥腫は、マクロファージが、コレステロールを多量に含有する酸化LDLをレセプターを介して特異的に取り込み、泡沫化することが知られており、それが血管内膜に蓄積、プラーク(粥腫)を形成する、動脈硬化の一病態である。
前記プローブを生体に生体内投与(例えば静脈内投与)した後、PETやSPECT、CCDカメラなどの画像計測装置を用いて蓄積量や分布を測定することができる。
そのようなCT技術は、ポジトロン断層法 (PET)や単一光子放射断層撮影 (SPECT)、や核磁気共鳴画像法 (MRI) などの、断面像を得て、物体の(輪切りなどの)2次元断面画像を得る技術であるが、これらの検査技術は単に断面画像として用いられるだけでなく、コンピュータ画像処理技術向上によってその2次元画像を統合し3次元グラフィックスとして表示されることも多く、3次元的な病変の位置の特定、診断、手術方針決定等に有力な技術となっている。
例えば、単純CTは、造影剤を使用せずにX線照射等の撮影を行うものであり、組織の浮腫、骨の形態異常、形態など造影剤を用いなくても充分に観察でき、一方、造影CTとは、X線吸収率の高い造影剤等を血管内に注射してから撮影を行うものをいい、血管や血流が豊富な組織の形状を観察することができる。さらに、いわゆる次世代CT、例えば、線源がらせん状に動くヘリカルCT、検出器自体を対軸方向に、分割した、多列検出器CT (MDCT)(マルチスライスCT(MSCT)とも呼ぶ)なども、開発され、それらはいずれも特に制限なく、単独又は併用で発明のイメージング剤の検出に適用可能である。
イメージング用標識プローブ(本発明のイメージング剤)がX線吸収率の高い放射線核種である場合は、検出器としてのCTの単独使用も可能である。
酵素発光(ルシフェラーゼ)による発光の場合は基質投与が別途必要である。
特に、動物本来の自家蛍光による影響を軽減したものが好ましく、さらには皮膚透過性の高いシグナルを発する標識が好ましい。
それゆえ、CCDカメラで補足可能な波長、例えばおよそ350~900 nmの光を、発する標識が好ましい。さらにCCDカメラによる測定動物の体表面における測定値から生体内の光源の強さを測定できる機械が好ましい。蛍光標識の場合、反射蛍光画像、透過蛍光画像のいずれでも良いが、両方の画像を捉えることが好ましい。また、蛍光画像の多方面(反射、透過を問わず)重ね合わせ、それに線源情報を統合して処理し、立体画像(3次元)として捉えることが、3次元的な位置、分布を正確に構成でき、好ましい。こうして得た3次元画像は、さらにCT画像とさらに統合することもできる。
注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばD-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート80(TM)、HCO-50と併用してもよい。
投与量、投与方法は、対象の体重や年齢、症状、mg抗体あたりの蛍光標識の強度・検出機械の検出感度などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
また、上記キットには、イメージングに用いるための指示書、適当な容器、コントロール試薬等、通常のキットに含まれるものを含んでいてもよい。
(a)本発明の酸化LDL/β2GPI複合体に結合する抗体、及び、候補化合物を動脈硬化疾患モデル非ヒト動物に投与する工程、例えば、本発明の酸化LDL/β2GPI複合体に結合する抗体が投与された動脈硬化疾患モデル非ヒト動物に候補化合物を投与する工程、
(b)該抗体、及び、該候補化合物を投与された動脈硬化疾患モデル非ヒト動物と、該抗体を投与されているが該候補化合物は投与されていない動脈硬化疾患モデル非ヒト動物において、動脈硬化巣をイメージングする工程、
(c)該抗体、及び、該候補化合物を投与された動脈硬化疾患モデル非ヒト動物と、該抗体を投与されているが該候補化合物は投与されていない動脈硬化疾患モデル非ヒト動物において、動脈硬化巣(例えば、動脈硬化巣の大きさまたは存在部位)を比較する工程、及び
(d)該抗体、及び、該候補化合物を投与された動脈硬化疾患モデル非ヒト動物において、該抗体を投与されているが該候補化合物は投与されていない動脈硬化疾患モデル非ヒト動物と比較して、動脈硬化巣が減少または消失する候補化合物を選択する工程。
各工程は、上述した技術または公知の技術を用いて実施される。
例えば、動脈硬化疾患モデルマウスとしては遺伝子を過剰発現させるトランスジェニックマウスと、ある遺伝子を欠損させるジーンターゲッティングによるノックアウトマウス、例えば、動脈硬化モデルとしては悪玉コレステロールとして知られているLDLを形作っているタンパク質(アポリポタンパク質E)のアポE欠失(apoE-/-)、LDL受容体欠失(LDLR-/-)、ヒト型アポB導入、ドミナント変異アポE導入モデルがある。さらには、2型糖尿病モデルマウス(KKAy)、あるいは、マウスのなかでもっとも動脈硬化になりやすいC57BL6系統で、この系統では高コレステロール食のみで動脈硬化巣がみられる場合もあり、高コレステロール食等、その餌により作製された、動脈硬化モデルマウスも用いることができる。
ウサギは高コレステロール食により約2ヶ月半で動脈硬化巣がみられる場合もあり、さらにLDL受容体欠損の動脈硬化疾患モデルウサギとしては、WHHLウサギなどが知られている。
ブタでもアポBのLDL受容体結合部分のアミノ酸配列異常により、動脈硬化をおこしやすいモデルがしられており、当業者であれば、血栓症・動脈硬化モデル動物作製法 編著 鈴木 宏治(株式会社 金芳堂)など参照して、動脈硬化モデル動物を作製、本発明に利用できる。
<3H3抗体>
配列番号1:重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号2:重鎖CDR1のアミノ酸配列
配列番号3:重鎖CDR2のアミノ酸配列
配列番号4:重鎖CDR3のアミノ酸配列
配列番号5:重鎖可変領域の塩基配列
配列番号6:軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号7:軽鎖CDR1のアミノ酸配列
配列番号8:軽鎖CDR2のアミノ酸配列
配列番号9:軽鎖CDR3のアミノ酸配列
配列番号10:軽鎖可変領域の塩基配列
なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
[実施例1]
酸化LDL/β 2 GPI複合体の調製
600μgのヒトLDL(Organon Teknika Corp,Durham,NC)を、5μM CuSO4 を含むPBS(2mL)中で37℃、12時間酸化処理した。1 mMのEDTAを添加することによって酸化を停止させた。
上記、酸化LDL 0.2 mg/mLをヒトβ2GPI(Affinity Biologicalsより購入)とともに終濃度 0.2mg/mL、37℃条件下で、16時間インキュベートし、酸化LDL/β2GPI複合体を得た。
抗原免疫
ヒト酸化LDL/β2GPI複合体精製タンパク質を同量のコンプリートアジュバント(SIGMA;F5881)と混合してエマルジョンにし、BALB/cマウス(メス)のfoot-padに5~50μg/headで3から7日おきに数回免疫した。最終免疫の3~5日後にマウスから鼠径リンパ節を摘出し、マウス骨髄腫細胞P3U1(P3-X63Ag8U1)との細胞融合を行った。
細胞融合、及びモノクローナル抗体産生細胞の選択と取得
細胞融合は次に示す一般的な方法を基本として行った。全ての培地中のFetal Bovine Serum(FBS)は、56℃で30min保温する処理により、非働化したものを使用した。P3U1は、RPMI1640-10%FBS(Penicillin, Streptomycin 含)で培養して準備した。
摘出したマウスの鼠径リンパ節細胞とP3U1を10:1~2:1の割合で混合し、遠心した。沈殿した細胞に50%ポリエチレングリコール4000(Merck社、ガスクロマトグラフィー用 PEG4000、カタログNo. 9727)を融合促進剤として徐々に加えながら穏やかに混合し、細胞融合を行った。さらにRPMI1640を徐々に加えながら穏やかに混合後、遠心した。沈殿した融合細胞を、15% FCSを含むHAT培地(RPMI1640, HAT-supplement(Invitrogen;11067-030), Penicillin, Streptomycin)で適宜希釈し、200 μL/wellで96穴のマイクロプレートに播種した。
融合細胞をCO2インキュベータ(5% CO2、37 ℃)中で培養し、コロニーが十分に形成されたところで、培養上清をサンプリングしてスクリーニングを行った。
スクリーニングは、免疫に使用したヒト酸化LDL/β2GPI複合体抗原を感作した96穴プレートに対するELISA(実施例4に記載)で陽性となったものを選別した。15% FCSを含むHT培地(RPMI1640, HT-supplement(Invitrogen;21060-017), Penicillin, Streptomycin)でこれらを拡大培養後、限界希釈(limiting dilution)法により単クローン化した。このようにして、抗ヒト酸化LDL/β2GPI複合体抗体を免疫原としてクローン3H3を含むハイブリドーマクローン他、7種類を得た。
ヒト酸化LDL/β 2 GPI複合体及びβ 2 GPIに対する反応性(ELISA)
抗ヒト酸化LDL/β2GPI複合体抗体を検出するためのELISAは、以下の方法によって行った。すなわち、酸化LDL/β2GPIをマイクロプレート(Nunc社 Maxisorp)に1 μg/mL (50 μL/ウエル)入れて、4℃で一晩インキュベートすることによって吸着させ、このプレートを1% BSAを用いてブロッキングした。Assay buffer(1% BSA, 0.15 M NaCl/20mM HEPES (pH 7.4))を用いて、各横軸に記載の抗体濃度に希釈したサンプル50μLを入れて、ウエル中で30分間インキュベートした。液を捨て、0.1% Tween20/PBSで洗浄した後、次いでHRP標識した抗マウスIgG (MBL code 330) 2000倍希釈 50 μLをプレートに添加しウエル中で30分間インキュベートした。液を捨て、0.1% Tween20/ PBS で洗浄した後、基質TMB (MOSS社;TMBZ) を50 μL添加し、室温にて 3分間インキュベートし、0.18 M 硫酸 50 μL を添加して反応停止後、吸光度 450 nmで検出した(図1A)。
β2GPIとの反応性を検出するためのELISAは、以下の方法によって行った。すなわち、β2GPIをマイクロプレート(Nunc社Maxisorp)に1 μg/mL (50 μL/ウエル)入れて、4 ℃で一晩インキュベートすることによって吸着させ、このプレートを1% BSAを用いてブロッキングした。Assay buffer(1% BSA, 0.15 M NaCl/20 mM HEPES (pH 7.4))を用いて、各横軸に記載の抗体濃度に希釈したサンプル50 μLを入れて、ウエル中で30分間インキュベートした。液を捨て、0.1% Tween20/PBSで洗浄した後、次いでHRP標識した抗マウスIgG (MBL code 330) 2000倍希釈 50 μLをプレートに添加しウエル中で30分間インキュベートした。液を捨て、0.1% Tween20/PBS で洗浄した後、基質TMB (MOSS社; TMBZ) を50 μL添加し、室温にて3分間インキュベートし、0.18 M 硫酸 50 μL を添加して反応停止後、吸光度 450 nmで検出した(図1B)。
さらに、β2GPIをマイクロプレート(nunc社 Maxisorp)に~50 μg/mLまで濃度を変え (50 μL/ウエル)入れて、4℃で一晩インキュベートすることによって吸着させ、同様に抗体反応性を試験した(図示さず)。
その結果、固相化酸化LDL/β2GPI複合体に対しては、2H6 > 3H3, 2A12, 3D4 > 4C12, 1H4の反応性を示した。また、固相化β2GPIに対しては、2H6, 3D4 > 2A12, 4F10を示し、3H3, 4C12については反応性を示さなかった(図1A,B)。
しかし、マイクロタイタープレートへの感作濃度をあげると3H3なども反応性を示した(図示さず)。
抗体の反応性を確認する方法として次に、遊離の抗原で阻害をかける試験を行い、さらに、各抗体の特異性を見た。
溶液中の遊離のβ 2 GPI、酸化LDL/β 2 GPI複合体に対する競合反応性(ELISA)
固相化ヒト酸化LDL/β2GPI複合体及びβ2GPIに対する反応性(ELISA)試験において、各抗体と反応させる際に、酸化LDL/β2GPI複合体またはβ2GPIを共存させて反応することにより、固相抗原に対する阻害反応を行った(図2に測定系模式図を示す)。
すなわち、β2GPIをマイクロプレート(Nunc社; Maxisorp)に1 μg/mL (50 μL/ウエル)入れて、4 ℃で一晩インキュベートすることによって吸着させ、このプレートを1% BSAを用いてブロッキングした。Assay buffer(1% BSA, 0.15 M NaCl/20 mM HEPES (pH 7.4))を用いて、適当な濃度に希釈した抗体サンプル25 μL及び、競合させる抗原である酸化LDL/β2GPI複合体またはβ2GPIを各横軸に記載の抗原濃度にAssay bufferを用いて希釈したサンプル25 μLを入れて、ウエル中で30分間インキュベートした。液を捨て、0.1% Tween20/PBSで洗浄した後、次いでHRP標識した抗マウスIgG (MBL; Code 330) 2000倍希釈 50 μLをプレートに添加しウエル中で30分間インキュベートした。液を捨て、0.1% Tween20/PBS で洗浄した後、基質TMB (MOSS社; TMBZ) を50 μL添加し、室温にて 3分間インキュベートし、0.18 M 硫酸 50 μL を添加して反応停止後、吸光度 450 nmで検出した。
その結果、3H3, 4C12, 2A12ではELISA中に混在させた遊離の抗原が酸化LDL/β2GPI複合体の場合、固相の酸化LDL/β2GPIへの結合阻害が顕著であり、β2GPIでは阻害がかからなかった。2H6では、フリーの抗原が酸化LDL/β2GPI複合体でも阻害が起こる一方でβ2GPIの混在でも若干阻害が見られた。3D4では、遊離の抗原が酸化LDL/β2GPI複合体よりも、β2GPIによる阻害の方が高い阻害が見られた(図3)。
これらの結果より、各抗体の反応性は表1にまとめられる(実施例7に示す)。3H3は4C12と近い反応性を示すが同一の反応性ではなく、異なる特異性を有していた。
抗体の動脈硬化巣免疫組織染色
apoE-/-マウスおよび LDLR-/-マウス(Jackson Labより入手し、岡山大学内動物実験施設にて系統維持)を8週齢までは、普通飼料で飼育し(オリエンタル酵母NMF)、それ以降に高脂肪食(コレステロール1%、コール酸1%、無塩バター15%を普通飼料に配合)を4-6ヶ月負荷すると、胸部あるいは腹部大動脈に動脈硬化巣(プラーク)が現れ、肥厚、粥腫が出現する。そこで、8ヶ月齢のこれらマウスを屠殺し、特に今回は、胸部大動脈、大動脈の起始部、および大動脈弁の凍結切片を作製し、標本とし観察した。
蛍光免疫染色抗体法のためには、凍結切片を調製後、パラホルムアルデヒド固定し実験に供した。
モノクローナル抗体のCy5.5標識
0.1 M炭酸緩衝液(pH9.3)に対し、4 ℃で一晩透析した各種モノクローナル抗体(1mg/ml)をFluorolink Cy5.5 monofunctional dye (1 tube)に入れ、室温で30分間反応させ標識した。反応後、Sephadex G-25カラムにてCy5.5標識抗体を得た。
凍結切片を用いた免疫蛍光染色
1%パラホルムアルデヒドで5分間固定した切片に各種モノクローナル抗体を4℃で一晩反応させた。洗浄後、FITC標識抗マウスIgGあるいはIgM抗体(2次抗体)を室温で1時間反応させた。DAPlおよびRhodamine Phalloidin染色は、この2次抗体の反応時に添加した。その後、蛍光顕微鏡にて観察、撮影した。
免疫組織染色
結果、C57BL6系統のマウスを普通飼料で飼育したものに対し、3H3抗体、Mac3を用いる免疫蛍光染色では、泡沫化マクロファージが集族してできた粥腫が染まった。3H3によっても同様な部位が染まっている(図4)。
動脈硬化好発モデルマウス(高脂肪食を負荷したapoE-/-)の大動脈弁の免疫蛍光染色を酸化LDL/β2GPI複合体を認識する他の抗体で行ったものと比較した。粥腫の染色陽性例は、粥腫の染色陽性例は、3H3および抗体Aのみである(図5)。
Cy5.5、Alexaなどを標識した粥腫に特異的な種々のモノクローナル抗体で動脈硬化巣の特異的な免疫染色が可能となった。
[実施例7]
イメージング
in vivoイメージング:
Xenogen社のIVIS(登録商標) Imaging System、IVIS200により、イメージングを行った(Excitation:640 nm, Emission: 720 nm.)。
実験1:実施例6と同様に作製した高脂肪食負荷apoE-/-マウスに尾静脈より、Cy5.5標識モノクローナル抗体(0.25 mg/ml)を0.15 ml/head投与した。生理食塩水(PBS、対照)、Cy5.5標識抗体A、Cy5.5標識3H3抗体の3種類を投与した。投与して24時間後に胸部皮膚を剥がし、生きた状態で全身を撮影した(図7)。
実験2:更に胸部大動脈が繋がった状態で心臓を摘出して撮影した(図7)。3H3投与で大動脈起始部が強く染まる。抗体Aでも幾分染まるが3H3の場合ほど蛍光強度は強くない。2A12では全く染まらない。
大動脈起始部の一定面積あたりの蛍光強度を測定した。PBSを投与した対照マウスの蛍光を1.0とした。3H3投与で、対照の3倍程度の蛍光が確認された。その他の抗体投与では蛍光強度に大きな変化は見られなかった(図10)。
以上、今回の抗体群の特異性試験を表1にまとめた。
酸化LDL/β 2 GPI複合体を認識するマウスモノクローナル抗体の可変領域遺伝子の解析
解析したモノクローナル抗体は、4種類のClone (3H3, 4C12, 2H6, 3D4)である。
これら4種類のCloneの抗体サブグラスは、3H3と4C12がIgG2b、2H6と3D4はIgG1である。
(L鎖可変領域遺伝子の解析)
4種(3H3, 4C12, 2H6, 3D4)のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞をRPMI1640+10%FCS培地でそれぞれ培養した。そのハイブリドーマ細胞からQuickPrep micro mRNA purification kit (Amersham Biosciences, code 27-9255-01)を用いてmRNAを得た。そのmRNAをFirst-Strand cDNA Synthesis kit (Amersham Biosciences, code 27-9261-01)を用いてcDNAとした。このcDNAを鋳型としてPCR法で遺伝子を増幅させるのであるが、以下に示す11パターンのPrimerの組み合わせによりPCR反応を行った。ここで、MKV1~MKV11のPrimer配列は、多くのモノクローナル抗体のシグナル配列を解析することで、ほぼ全てのモノクローナル抗体のL鎖シグナルは配列をこの11種類のPrimer配列で網羅するように設定されている。この11種類のMKV primerとマウスL鎖定常領域配列に相当するMKC primer間における11パターンのPCR反応から少なくとも1種類のPCR反応で目的のL鎖可変領域が増幅されてくる。
マウスハイブリドーマからのcDNA 4 μL
2.5 mM dNTPs 4 μL
MKV1~MKV11 primer(20μM)の11種類中の1つ 2.5 μL
MKC primer(20μM) 2.5 μL
DMSO 2.5 μL
×10 pfu polymerase Buffer 5 μL
pfu polymerase 1 μL
滅菌水 28.5 μL
Total 50 μL
94℃ 2 min
94℃ 1 min 55℃ 2min 72℃ 2min (30サイクル)
72℃ 4min
4℃ 無制限時間
MKV1 primer:ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTG(配列番号:11)
MKV2 primer:ATGGAGWCAGACACACTCCTGYTATGGGTG(配列番号:12)
MKV3 primer:ATGAGTGTGCTCACTCAGGTCCTGGSGTTG(配列番号:13)
MKV4 primer:ATGAGGRCCCCTGCTCAGWTTYTTGGMWTCTTG(配列番号:14)
MKV5 primer:ATGGATTTWCAGGTGCAGATTWTCAGCTTC(配列番号:15)
MKV6 primer:ATGAGGTKCYYTGYTSAGYTYCTGRGG(配列番号:16)
MKV7 primer:ATGGGCWTCAAGATGGAGTCACAKWYYCWGG(配列番号:17)
MKV8 primer:ATGTGGGGAYCTKTTTYCMMTTTTTCAATTG(配列番号:18)
MKV9 primer:ATGGTRTCCWCASCTCAGTTCCTTG(配列番号:19)
MKV10 primer:ATGTATATATGTTTGTTGTCTATTTCT(配列番号:20)
MKV11 primer:ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCC(配列番号:21)
MKC primer:ACTGGATGGTGGGAAGATGG(配列番号:22)
(M=A or C, R=A orG, W=A orT, S=C or G, Y=C or T, K=G orT)
3H3:MKV7 - MKC
4C12:MKV7 - MKC
2H6:MKV5 - MKC
3D4:MKV4 - MKC
PCR増幅したL鎖可変領域遺伝子はpCR2.1ベクター(Invitogen)に挿入された。
L鎖可変領域遺伝子が挿入されたPCR2.1ベクターは、DNAシークエンサー(Applied Biosystems製:3130 Genatic Analyzer)によりDNA塩基配列が解読された。
4種(3H3, 4C12, 2H6, 3D4)のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞をRPMI1640+10%FCS培地でそれぞれ培養した。そのハイブリドーマ細胞からQuickPrep micro mRNA purification kit (Amersham Biosciences, code 27-9255-01)を用いてmRNAを得た。そのmRNAをFirst-Strand cDNA Synthesis kit (Amersham Biosciences, code 27-9261-01)を用いてcDNAとした。このcDNAを鋳型としてPCR法でH鎖可変領域遺伝子を増幅させるのであるが、以下に示す12パターンのPrimerの組み合わせによりPCR反応を行った。ここで、MHV1~MHV12のPrimer配列は、多くのモノクローナル抗体のシグナル配列を解析することで、ほぼ全てのモノクローナル抗体のH鎖シグナルは配列をこの12種類のPrimer配列で網羅するように設定されている。この12種類のMHV primerとマウスH鎖定常領域配列に相当するMHCG2bあるいはMHCG1 primer間における12パターンのPCR反応から少なくとも1種類のPCR反応で目的のH鎖可変領域が増幅されてくる。ここで、MHCG2b Primerは、マウスIgG2bのH鎖定常領域に相当する配列を持ち、MHCG1 Primerは、マウスIgG1のH鎖定常領域に相当する配列である。それゆえ、IgG2b サブクラスである3H3 cloneと4C12 cloneのPCR増幅には、MHCG2b Primerが用いられ、IgG1サブクラスである2H6 cloneと3D4 cloneのPCR増幅には、MHCG1 Primerが用いられた。
マウスハイブリドーマからのcDNA 4 μL
2.5 mM dNTPs 4 μL
MHV1~MHV12 primer(20μM)の12種類中の1つ 2.5 μL
MHCG2b あるいはMHCG1 primer(20μM) 2.5 μL
DMSO 2.5 μL
×10 pfu polymerase Buffer 5 μL
pfu polymerase 1 μL
滅菌水 28.5 μL
Total 50 μL
94℃ 2 min
94℃ 1 min 55℃ 2min 72℃ 2min (30サイクル)
72℃ 4min
4℃ 無制限時間
MHV1 primer:ATGAAATGCAGCTGGGGCATSTTCTTC(配列番号:23)
MHV2 primer:ATGGGATGGAGCTRTATCATSYTCTT(配列番号:24)
MHV3 primer:ATGAAGWTGTGGTTAAACTGGGTTTTT(配列番号:25)
MHV4 primer:ATGRACTTTGGGYTCAGCTTGRTTT(配列番号:26)
MHV5 primer:ATGGACTCCAGGCTCAATTTAGTTTTCCTT(配列番号:27)
MHV6 primer:ATGGCTGTCYTRGSGCTRCTCTTCTGC(配列番号:28)
MHV7 primer:ATGGRATGGAGCKGGRTCTTTMTCTT(配列番号:29)
MHV8 primer:ATGAGAGTGCTGATTCTTTTGTG(配列番号:30)
MHV9 primer:ATGGMTTGGGTGTGGAMCTTGCTATTCCTG(配列番号:31)
MHV10 primer:ATGGGCAGACTTACATTCTCATTCCTG(配列番号:32)
MHV11 primer:ATGGATTTTGGGCTGATTTTTTTTATTG(配列番号:33)
MHV12 primer:ATGATGGTGTTAAGTCTTCTGTACCTG(配列番号:34)
MHCG2b primer:CAGTGGATAGACTGATGGGGG(配列番号:35)
MHCG1 primer:CAGTGGATAGACAGATGGGGG(配列番号:36)
(M=A or C, R=A orG, W=A orT, S=C or G, Y=C or T, K=G orT)
3H3:MHV4 - MHCG2b
4C12:MKV4 - MHCG2b
2H6:MHV4 - MHCG1
3D4:MHV1 - MHCG1
H鎖可変領域遺伝子が挿入されたPCR2.1ベクターは、DNAシークエンサー(Applied Biosystems製:3130 Genatic Analyzer)によりDNA塩基配列が解読された。
その結果、本発明に用いることのできる3H3のアミノ酸配列、CDRが明らかになった(図11)。
本明細書で開示した抗体の塩基配列およびアミノ酸配列は、以下の配列番号に従って配列表に記載されている。
<3H3抗体>
配列番号1:重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号2:重鎖CDR1のアミノ酸配列
配列番号3:重鎖CDR2のアミノ酸配列
配列番号4:重鎖CDR3のアミノ酸配列
配列番号5:重鎖可変領域の塩基配列
配列番号6:軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号7:軽鎖CDR1のアミノ酸配列
配列番号8:軽鎖CDR2のアミノ酸配列
配列番号9:軽鎖CDR3のアミノ酸配列
配列番号10:軽鎖可変領域の塩基配列
IVIS 200および3次元CTを用いた画像解析に関する検討
Computed Tomography(CT)画像を統合することによる、動脈硬化病巣の3次元(局在)イメージ得るための実験を実施した。
In vivo蛍光イメージング:
IVIS 200 Imaging System(Xenogen社)を用いて、蛍光イメージングを行った(Cy5.5の場合Excitation:640 nm、Emission: 720 nm、Alexa Fluor 750の場合Excitation:745 nm、Emission: 800 nm)。Cy5.5標識3H3抗体(IgG)0.25 mg/ml、0.15 ml/1匹、またはAlexa Fluor750標識3H3抗体1.0~1.5 mg/ml、0.15 ml/1匹を高脂肪食負荷ApoE-/-マウスの尾静脈より投与し、2~24時間後に、IVIS 200にて麻酔吸入下でin vivo蛍光を観察・撮影した。ApoE-/-マウスでは黒い体毛が蛍光を吸収するため体毛を剃って観察した。はじめに反射光による蛍光観察を行い、その後、透過光による蛍光観察を行って、マウスの3次元(3D)画像を作成し、光源情報と融合させた(図9 A :統合前のIVISによる3次元画像)。 図の赤い点の部分が3H3に標識した蛍光シグナルであり、濃度が濃いほど、蛍光強度が強い、即ち、イメージング剤が局在化していることを示す。
Ex vivoイメージング:
3D-CT解析の終了後マウスを安楽死させ、PBS 10 mlで心灌流し、心臓および大動脈を摘出し、IVIS 200により反射蛍光画像を得た。
CT イメージング:
eXplore Locus CT System (GE Healthcare)によりCTイメージングを行った。IVIS 200によりイメージングを行ったのと同じマウス個体を用い、麻酔吸入下にX線照射を行い、CT画像を得た。
蛍光とCTの画像統合:
IVIS 200により検出した蛍光イメージング画像と、CTを用いて撮影した画像を、汎用3D 可視化ソフト(Amira、Mercury Computer Systems)を用いて統合させた(図9B:統合後の3次元CT画像)。
なお、一連の手順を模式的に示した(図8)。
(A) IVIS 200による特異抗体を用いた蛍光イメージング(反射)。
(B)統合前のIVIS 200による特異抗体を用いた蛍光イメージング(透過光;左)と CT像(中) 統合図(右):蛍光イメージング(透過光;左)中の赤い点の部分について濃度が濃いほど、蛍光強度が強い、即ち、イメージング剤が局在化集中した部分(3H3結合 反応性が高い部位)であることを示す。
(C) IVISによる蛍光シグナルと3次元CTの統合画像:コンピューターの仮想空間上に3次元像を動画として構成(3次元グラフィックスのアニメーション)として、多方面からその標識された位置を確認した写真である。
可視光は生体内で吸収されてしまうためin vivo イメージングを行うには、生体に吸収されにくい波長である近赤外の蛍光標識が適している。今回は、Cy5.5またはAlexa Fluor 750により標識した抗体をマウスの尾静脈より投与して、IVIS200により蛍光を測定し、反射および透過による蛍光測定条件の検討を行った。Cy5.5標識抗体によるin vivoイメージングの反射蛍光画像では動脈硬化発症ApoE-/-マウスの大動脈弁および胸部大動脈の強いシグナルが観察された。さらに、ex vivoイメージングおよびex vivo蛍光顕微鏡観察により、静脈投与した蛍光標識抗体の動脈硬化巣への局在が確認できた。しかしながら、Cy5.5標識抗体を用いる場合、透過蛍光のシグナルが弱く、立体画像(3次元)での蛍光位置特定が容易ではなかった。一方、Alexa Fluor 750標識抗体では、静脈内投与後2時間後で強い特異的なシグナルが反射蛍光画像、透過蛍光画像の両方で得られ、立体画像を構築してみると胸の内部に強い蛍光シグナルが認められた(図8A、B中の左図)。続いて同じマウスについてCT撮影を行い、CT画像より骨と肺の臓器抽出を行って得られた画像(図8B中と、IVIS200により構築した蛍光イメージング画像をAmiraにより統合させた、統合3D画像(図8B右)を得たところ、心臓とその近傍の位置に蛍光シグナルが観察された。図の赤い点の部分について濃度が濃いほど、蛍光強度が強い、即ち、イメージング剤が局在化していることを示す。CT(中央)と3D-CT統合の画像を示した(図8B右)。コンピューターの仮想空間上に3次元像を動画として構成(3次元グラフィックスのアニメーション)として、多方面からその標識された位置を確認した(図8C)。
動脈硬化好発モデルマウス(例えば、アポE欠失(ApoE-/-)マウス:高い血漿コレステロール濃度を維持し、自然発生アテローム性動脈硬化様病変を発症する)と、当該イメージング用の抗体を用いることで、粥状動脈硬化の治療薬のスクリーニング系が構築できる。
さらには、当該抗体をヒト化抗体に変換して、臨床診断用イメージングシステムを構築することが可能である。従って、動脈粥腫からのプラーク遊離などが動脈塞栓を起因とした脳塞栓症、心筋梗塞の原因となることが知られており、慢性的かつ無症候性に潜行進展するヒトの粥状動脈硬化のモニタリング法は、生活習慣病の予防、治療方針の一助になるといえる。
Claims (9)
- 酸化LDLとβ2-グリコプロテインIの複合体(酸化LDL/β2GPI複合体)に結合する、下記(a)~(e)のいずれかに記載の抗体;
(a)CDR1として配列番号:2に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:3に記載アミノ酸配列、及びCDR3として配列番号:4に記載のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗体、
(b)重鎖可変領域として配列番号:1に記載のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗体、
(c)CDR1として配列番号:7に記載のアミノ酸配列、CDR2として配列番号:8に記載アミノ酸配列、及びCDR3として配列番号:9に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体、
(d)軽鎖可変領域として配列番号:6に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体、
(e)上記(a)または(b)に記載の重鎖、および、上記(c)または(d)に記載の軽鎖の対を有する抗体。 - 請求項1に記載の抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体。
- ヒト化抗体またはキメラ抗体である、請求項1又は2に記載の抗体。
- 酸化LDLとβ2-グリコプロテインIの複合体(酸化LDL/β2GPI複合体)に結合する抗体を含む、動脈硬化の存在部位のイメージング剤。
- 請求項1~3のいずれかに記載の抗体を含む、動脈硬化の存在部位のイメージング剤。
- 動脈硬化において、粥腫の位置及び/または大きさをイメージングする、請求項4または5のイメージング剤。
- 酸化LDLとβ2-グリコプロテインIの複合体(酸化LDL/β2GPI複合体)に結合する抗体を含む、動脈硬化の存在部位のイメージング用キット。
- 請求項1~3のいずれかに記載の抗体を含む、動脈硬化の存在部位のイメージング用キット。
- 以下に記載の工程を含む、動脈硬化治療剤の候補化合物のスクリーニング方法:
(a)請求項1~3のいずれかに記載の抗体が投与された動脈硬化疾患モデル非ヒト動物に、候補化合物を投与する工程、
(b)該候補化合物を投与された動脈硬化疾患モデル非ヒト動物と、該候補化合物を投与されていない動脈硬化疾患モデル非ヒト動物において、動脈硬化巣をイメージングする工程、
(c)該候補化合物を投与された動脈硬化疾患モデル非ヒト動物と、該候補化合物を投与されていない動脈硬化疾患モデル非ヒト動物において、動脈硬化巣の大きさまたは存在部位を比較する工程、及び
(d)該候補化合物を投与された動脈硬化疾患モデル非ヒト動物において、該候補化合物を投与されていない動脈硬化疾患モデル非ヒト動物と比較して、動脈硬化巣が減少または消失する候補化合物を選択する工程。
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