WO2013157102A1 - ムチンサブタイプ５ａｃ特異的ヒト化抗体およびその利用 - Google Patents

ムチンサブタイプ５ａｃ特異的ヒト化抗体およびその利用 Download PDF

Info

Publication number
WO2013157102A1
WO2013157102A1 PCT/JP2012/060503 JP2012060503W WO2013157102A1 WO 2013157102 A1 WO2013157102 A1 WO 2013157102A1 JP 2012060503 W JP2012060503 W JP 2012060503W WO 2013157102 A1 WO2013157102 A1 WO 2013157102A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
amino acid
acid sequence
seq
variable region
sequence shown
Prior art date
Application number
PCT/JP2012/060503
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
裕孝 星
真美 菊池
光 齋藤
梨江子 青木
素行 内田
鉄二 澤田
中西　猛
弘聖 平川
昌也 北村
Original Assignee
公立大学法人大阪市立大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 公立大学法人大阪市立大学 filed Critical 公立大学法人大阪市立大学
Priority to PCT/JP2012/060503 priority Critical patent/WO2013157102A1/ja
Publication of WO2013157102A1 publication Critical patent/WO2013157102A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3076—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties
    • C07K16/3092—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties against tumour-associated mucins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Definitions

  • the present invention relates to a mucin subtype 5AC-specific humanized antibody, an antigen-binding fragment thereof, and a pharmaceutical composition for treating a disease associated with abnormal expression of mucin subtype 5AC containing at least one of them.
  • Mucin is a giant glycoprotein having a molecular weight of 1 to 10 million which is the main component of mucus secreted from epithelial cells.
  • 21 types of mucin subtypes are known.
  • mucin subtype 5AC is expressed as a secretory mucin in the stomach and trachea in normal tissues. It is known that this is frequently expressed as a membrane-bound mucin in cancer tissues, for example, cancer tissues of pancreatic cancer (Non-Patent Documents 1 and 2).
  • Non-Patent Documents 1 and 2 cancer tissues of pancreatic cancer
  • Non-Patent Documents 4 to 7 There have been several reports on murine antibodies and chimeric antibodies against mucin subtype 5AC (Non-Patent Documents 4 to 7), and several tens of mouse antibodies are commercially available.
  • Non-Patent Document 8 when humanizing a monoclonal antibody derived from a mouse, it is a well-known matter that the antigen affinity is reduced with a few exceptions only by replacing only the complementarity determining region with a mouse sequence. Yes (see Non-Patent Document 8, for example). Therefore, in the framework region of a humanized antibody, some residues are substituted with mouse sequences (Non-Patent Documents 8 to 12). At this time, substitution of several residues in the framework region may change the affinity by several tens of times, and find the sequence of the framework region that can produce a humanized antibody having sufficient affinity for the antigen. Is generally difficult.
  • the present invention has been made in view of the above problems, and a main object thereof is to provide a humanized antibody having sufficient affinity for mucin subtype 5AC and use thereof.
  • the present inventors surprisingly produced a humanized antibody specific to mucin subtype 5AC using a complementarity determining region consisting of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 6 ( 1) exhibit sufficient antigen affinity without any substitution of human-derived framework regions; (2) on the contrary, even when several different types of human-derived framework regions are used, It was found that the antigen affinity was shown. That is, by using the complementarity determining region according to the present invention, it is possible to provide a mucin subtype 5AC specific humanized antibody exhibiting sufficient antigen affinity regardless of the sequence of the framework region.
  • the mucin subtype 5AC-specific humanized antibody or antigen-binding fragment thereof has the heavy chain complementarity determining region 1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and the heavy chain complementarity determining region 2 is a sequence. Consisting of the amino acid sequence shown in No. 2, the heavy chain complementarity determining region 3 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID No. 3, the light chain complementarity determining region 1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID No. 4, and the light chain The complementarity determining region 2 is composed of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, and the light chain complementarity determining region 3 is composed of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention is a pharmaceutical composition for diagnosing or treating a disease associated with abnormal expression of mucin subtype 5AC, the mucin subtype 5AC specific humanized antibody according to the present invention, or an antigen thereof It is characterized by containing a binding fragment.
  • the method for treating a disease associated with abnormal expression of mucin subtype 5AC comprises treating the mucin subtype 5AC specific humanized antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention with abnormal expression of mucin subtype 5AC. It includes the process of administering to the patient of the disease accompanying this.
  • the method for diagnosing a disease associated with abnormal expression of mucin subtype 5AC according to the present invention includes the mucin subtype 5AC specific to the mucin subtype 5AC according to the present invention. It includes a step of detecting using a humanized antibody or an antigen-binding fragment thereof.
  • a humanized antibody having sufficient affinity for mucin subtype 5AC, an antigen-binding fragment thereof, and treatment of a disease associated with abnormal expression of mucin subtype 5AC containing at least one of them Pharmaceutical compositions can be provided.
  • the present invention provides mucin subtype 5AC-specific humanized antibodies, or antigen-binding fragments thereof.
  • humanized antibody refers to an antibody that includes a non-human-derived complementarity-determining region and at least a part of a human-derived framework region.
  • the more human-derived portion is, the more preferable it is, more preferably 50% or more, and 60%, 70%, 80%, 90%, 95% or 99% or more. More preferably, the framework region is particularly preferably 100% human.
  • the complementarity determining regions are three regions which are also included in the variable regions of the heavy and light chains of the antibody and are also called hypervariable regions.
  • Complementarity determining regions 1 CDR1
  • Complementarity determining region 2 CDR2
  • CDR3 complementarity determining region 3
  • the framework region is a region adjacent to the complementarity determining region in the variable region. From the N-terminal side, the framework region 1 (FR1), the framework region 2 (FR2), the framework region 3 (FR3), This is called framework area 4 (FR4).
  • the “antigen-binding fragment” refers to an antibody fragment that can bind to mucin subtype 5AC, and preferably includes an antibody variable region.
  • an antigen-binding fragment may be obtained, for example, by digesting an antibody with a proteolytic enzyme such as pepsin or papain and purifying it, or may be prepared using genetic engineering.
  • the heavy chain variable region consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7
  • the light chain variable region consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14.
  • the mucin subtype 5AC-specific mouse antibody is obtained by humanization, and the heavy chain complementarity determining region 1 comprises the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and the heavy chain complementarity determining region 2 is shown in SEQ ID NO: 2.
  • the heavy chain complementarity determining region 3 is composed of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3
  • the light chain complementarity determining region 1 is composed of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4
  • the light chain complementarity determining region is 2 is a humanized antibody consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 and light chain complementarity determining region 3 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6.
  • a humanized antibody having such a complementarity determining region has sufficient affinity for mucin subtype 5AC even when the sequence of the framework region is changed, as shown in the Examples.
  • the affinity constant of the humanized antibody specific to mucin subtype 5AC according to this embodiment is not particularly limited, but preferably has an affinity constant in the range of 10 5 or more and 10 9 M ⁇ 1 or less. Can have an affinity constant of 10 6 or more.
  • the affinity can be measured by, for example, the Scatchard assay of Munson et al., Anal. Biochem. 107: 220 (1980).
  • the amino acid sequence of the framework region of the heavy chain variable region is the amino acid sequence of the framework region of the heavy chain variable region of humanized antibodies 1 to 9 described in the examples, that is, SEQ ID NO: It is preferable to have 58% or more identity to the 1st to 30th, 36th to 49th, 67th to 98th, and 111th to 121st amino acid sequences shown in any one of 8 to 13. More preferably, the framework region of the heavy chain variable region has an amino acid sequence from 1 to 30, 36 to 49, 67 to 98, and 111 of the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 8 to 13. It is preferable to have the identity of 70%, 80%, 90%, 95% or 99% or more with respect to the 121st, and it is particularly preferable to have the identity of 100%.
  • amino acid sequence of the framework region of the heavy chain variable region is preferably the same as the amino acid sequence derived from human, but may be appropriately substituted.
  • the corresponding amino acid sequence of the humanized antibody may be substituted with the amino acid sequence of positions 42 to 45 of the heavy chain variable region of the mucin subtype 5AC-specific mouse antibody.
  • the amino acid sequence of the framework region of the light chain variable region is the amino acid sequence of the framework region of the light chain variable region of humanized antibodies 1 to 9 described in Examples, ie, SEQ ID NOs: 15 to 21. It is preferable to have 60% or more identity to the 1st to 23rd, 39th to 53rd, 61th to 92nd, and 102th to 111st positions of any one of the amino acid sequences shown.
  • the amino acid sequence of the framework region of the light chain variable region is from the 1st to the 23rd, the 39th to the 53rd, the 61th to the 92nd and the 102th of the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOS: 15 to 21 It is preferable to have the identity of 70%, 80%, 90%, 95% or 99% or more with respect to the 111th, and it is particularly preferable to have the identity of 100%.
  • amino acid sequence of the framework region of the light chain variable region is preferably the same as the amino acid sequence derived from human, but may be appropriately substituted.
  • the isotype of the antibody is not particularly limited, and may be any of IgG (IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4), IgM, IgA, IgD, and IgE. From the viewpoint of inducing ADCC (Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity), IgG (IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4) is preferable.
  • the mucin subtype 5AC-specific humanized antibody according to this embodiment is obtained by incorporating a humanized antibody gene prepared based on the amino acid sequence designed as described above into an expression vector and introducing it into a host cell by a conventional method.
  • the antibody can be obtained by expressing the antibody and recovering and purifying the protein.
  • the host cell to be used is not particularly limited as long as it is a cell compatible with the expression of an antibody or a fusion protein containing the antibody.
  • bacteria for example, E. coli
  • actinomycetes for example, yeast, or insect cells (for example, SF9)
  • mammalian cells for example, COS-1, CHO, or myeloma cells.
  • Vectors can be introduced into host cells.
  • epitope of the humanized antibody specific to mucin subtype 5AC is present in the partial peptide of mucin subtype 5AC consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 22.
  • the mucin subtype 5AC-specific humanized antibody according to this embodiment may have ADCC activity.
  • the IgG isotype Fc region can damage the target cell or pathogen to which the variable region of the antibody is bound by binding to the Fc receptor of the effector cell and activating the effector cell.
  • Effector cells can include T cells, NK cells, neutrophils, and macrophages, which can damage target cells or pathogens bound by antibodies, such as by releasing cytotoxic substances. To do.
  • the mucin subtype 5AC specific to this embodiment is specific.
  • the humanized antibody contains an IgG1 or IgG3 constant region.
  • the target cell of ADCC of the humanized antibody of the present invention is not particularly limited as long as it is a cell that abnormally expresses mucin subtype 5AC.
  • a cancer cell such as bladder cancer, breast cancer, colon cancer.
  • Mention may be made of leukemia and brain tumor cells.
  • Specific examples include pancreatic cancer, lung cancer, breast cancer, gastric cancer, cervical cancer, and colon cancer cells.
  • the pharmaceutical composition according to an embodiment of the present invention comprises a mucin subtype 5AC specific humanized antibody and / or an antigen-binding fragment thereof according to an embodiment of the present invention.
  • the treatment method according to one embodiment of the present invention includes the step of administering to the patient the mucin subtype 5AC-specific humanized antibody and / or antigen-binding fragment thereof according to one embodiment of the present invention.
  • the treatment method according to the present embodiment may include a step of administering the pharmaceutical composition according to the present embodiment to a patient.
  • the pharmaceutical composition according to the present embodiment may contain a pharmaceutically acceptable normal carrier or diluent.
  • the pharmaceutical composition according to this embodiment can be administered in an effective amount to a patient in need of treatment for a disease associated with abnormal expression of mucin subtype 5AC.
  • a mucin subtype 5AC-specific humanized antibody and / or antigen-binding fragment thereof may be administered to a patient alone or in combination with a pharmaceutically acceptable carrier or diluent.
  • Cancer particularly pancreatic cancer, can be treated by suppressing the growth of cells (eg, cancer cells) that abnormally express mucin subtype 5AC in vivo.
  • symptoms can be improved by suppressing the expression of mucin subtype 5AC in cells and suppressing secretion of mucin subtype 5AC.
  • the disease to be treated by the pharmaceutical composition and treatment method according to the present embodiment is a disease accompanied by abnormal expression of mucin subtype 5AC, and specifically includes cancer and asthma.
  • the type of cancer is not particularly limited, for example, bladder cancer, breast cancer, colon cancer, kidney cancer, liver cancer, lung cancer, small cell lung cancer, esophageal cancer, gallbladder cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, stomach cancer, Mention may be made of cervical cancer, thyroid cancer, prostate cancer, squamous cell carcinoma, skin cancer, bone cancer, lymphoma, leukemia and brain tumor.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can efficiently treat pancreatic cancer, lung cancer, breast cancer, stomach cancer, cervical cancer, and colon cancer.
  • the patient to whom the pharmaceutical composition according to the present embodiment is administered and the patient to which the treatment method is applied can be a human or a non-human.
  • the pharmaceutical composition according to the present embodiment treats cancer by inducing ADCC.
  • a pharmaceutical composition preferably contains a mucin subtype 5AC-specific humanized antibody having an Fc region of IgG isotype and / or an antigen-binding fragment thereof.
  • the pharmaceutical composition according to this embodiment includes a mucin subtype 5AC-specific humanized antibody and / or an antigen-binding fragment thereof labeled with an isotope (eg, 90 Y, 111 In, etc.).
  • an isotope eg, 90 Y, 111 In, etc.
  • the humanized antibody contained in the pharmaceutical composition is advantageous from the viewpoint of human treatment compared to the original mouse monoclonal antibody or chimeric antibody.
  • the half-life in the human body is considered to have a half-life close to that of normal human antibodies, and it is possible to reduce the dose compared to mouse monoclonal antibodies and chimeric antibodies.
  • a pharmaceutical composition containing two or more mucin subtype 5AC-specific humanized antibodies or antigen-binding fragments thereof having different variable region amino acid sequences is used for each humanized antibody. Therefore, even if a humanized antibody that causes an immune response is included, the resulting immune response can be suppressed, which is preferable.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition according to this embodiment is not particularly limited, and for example, powders, fine granules, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, extracts, or Oral preparations such as pills, or parenteral preparations such as injections, solutions for external use, ointments, suppositories, topically applied creams, or eye drops.
  • Examples of the oral preparation include gelatin, sodium alginate, starch, corn starch, sucrose, lactose, glucose, mannitol, carboxymethylcellulose, dextrin, polyvinylpyrrolidone, crystalline cellulose, soybean lecithin, sucrose, fatty acid ester, talc, magnesium stearate , Polyethylene glycol, magnesium silicate, anhydrous silicic acid, or synthetic aluminum silicate excipients, binders, disintegrants, surfactants, lubricants, fluidity promoters, diluents, preservatives, colorants , Fragrances, flavoring agents, stabilizers, humectants, preservatives, antioxidants and the like can be used according to conventional methods.
  • parenteral administration methods include injection (subcutaneous, intravenous, etc.) or rectal administration. Of these, the injection is most preferably used.
  • water-soluble solvents such as physiological saline or Ringer's solution
  • water-insoluble solvents such as vegetable oil or fatty acid esters
  • isotonic agents such as glucose or sodium chloride
  • Solubilizers, stabilizers, preservatives, suspending agents, or emulsifiers can be optionally used.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered using a sustained-release preparation technique using a sustained-release polymer or the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be incorporated into a pellet of ethylene vinyl acetate polymer and the pellet can be surgically implanted into the tissue to be treated or prevented.
  • the pharmaceutical composition according to the present embodiment is not limited thereto, but is a humanized antibody or antigen-binding fragment in an amount of 0.01 to 99% by weight, preferably 0.1 to 80% by weight. Can be contained.
  • the dosage is, for example, the type of illness, the patient's age, sex, weight, degree of symptoms, or administration method, etc. It can be appropriately determined depending on the dose and can be administered orally or parenterally. It should be noted that the administration method, dose, administration period, administration interval, etc. of the pharmaceutical composition to humans are preferably determined by a controlled clinical trial.
  • the pharmaceutical composition according to this embodiment can be used for diagnosis or examination of abnormal expression of mucin subtype 5AC prior to treatment or separately from treatment.
  • a disease associated with abnormal expression of mucin subtype 5AC can be diagnosed (tested) by using the pharmaceutical composition according to the present embodiment for measuring the concentration of mucin subtype 5AC in the blood of a patient.
  • the mucin subtype 5AC present in the sample collected from the subject or in the subject's body is used as the mucin subtype 5AC-specific humanized antibody according to the present embodiment or the antigen binding thereof.
  • a step of detecting using a sex fragment is included, and based on the detection result, a disease associated with abnormal expression of mucin subtype 5AC can be diagnosed (tested). That is, the mucin subtype 5AC-specific humanized antibody or antigen-binding fragment thereof according to this embodiment can be used for diagnosis of a sample obtained by blood collection, biopsy, etc. from a subject, as well as radioactive substances, fluorescent substances, etc. It can be suitably used to perform localization, qualitative diagnosis (particularly, differentiation from benign diseases such as mass-forming pancreatitis) and the like by a method called so-called in-vivo diagnosis using an antibody labeled with.
  • the mucin subtype 5AC-specific humanized antibody or antigen-binding fragment thereof has the heavy chain complementarity determining region 1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and heavy chain complementarity.
  • the determination region 2 consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2
  • the heavy chain complementarity determination region 3 consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3
  • the light chain complementarity determination region 1 shows the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4
  • the light chain complementarity determining region 2 is composed of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5
  • the light chain complementarity determining region 3 is composed of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6.
  • the amino acid sequence of the framework region of the heavy chain variable region is from 1 of the amino acid sequences shown in any one of SEQ ID NOs: 8 to 13.
  • the amino acid sequence of the framework region of the light chain variable region has at least 58% identity to the 30th, 36th to 49th, 67th to 98th and 111th to 121st, Preferably, it has 60% or more identity to the 1st to 23rd, 39th to 53rd, 61th to 92nd and 102th to 111th of the amino acid sequence shown by any one of the heavy chain variable regions.
  • the amino acid sequence of the framework region is 1 to 30th, 36 to 49th, 67 of the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 8 to 13, 67
  • the amino acid sequence of the framework region of the light chain variable region is any one of SEQ ID NOs: 15 to 21 with 90% or more identity to the 98th and 111th to 121st
  • the heavy chain variable region has any of SEQ ID NOs: 8 to 13 with respect to 1 to 23, 39 to 53, 61 to 92, and 102 to 111. More preferably, the light chain variable region is composed of the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 15 to 21, and the heavy chain variable region is represented by SEQ ID NO: 11.
  • the light chain variable region consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16; the heavy chain variable region consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11
  • the light chain variable region consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17; the heavy chain variable region consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11, and the light chain variable region consists of the amino acid shown in SEQ ID NO: 18.
  • the heavy chain variable region consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12 and the light chain variable region consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19; Whether the light chain variable region consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19; the heavy chain variable region consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9, and the light chain variable region consists of SEQ ID NO: The heavy chain variable region consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10, and the light chain variable region consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19.
  • the heavy chain variable region consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 and the light chain variable region consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15; the heavy chain variable region is shown in SEQ ID NO: 11 Consisting of an amino acid sequence and the light chain variable region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19; or the heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 and the light chain variable region consisting of SEQ ID NO: 21 The amino acid sequence shown in FIG.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention is a pharmaceutical composition for diagnosing or treating a disease associated with abnormal expression of mucin subtype 5AC, the mucin subtype 5AC specific humanized antibody according to the present invention, or an antigen thereof It is characterized by containing a binding fragment.
  • the disease is preferably cancer or asthma, and the cancer is more preferably pancreatic cancer, lung cancer, breast cancer, stomach cancer, cervical cancer, or colon cancer.
  • composition according to the present invention may contain two or more kinds of mucin subtype 5AC-specific humanized antibodies or antigen-binding fragments thereof according to the present invention, wherein the variable region amino acid sequences are different from each other. preferable.
  • the method for treating a disease associated with abnormal expression of mucin subtype 5AC comprises treating the mucin subtype 5AC specific humanized antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention with abnormal expression of mucin subtype 5AC. It includes the process of administering to the patient of the disease accompanying this.
  • the disease is preferably cancer or asthma
  • the cancer is more preferably pancreatic cancer, lung cancer, breast cancer, gastric cancer, cervical cancer, or colon cancer.
  • two or more kinds of the above-mentioned mucin subtype 5AC-specific humanized antibodies or antigen-binding fragments thereof having different variable region amino acid sequences are administered to the patient. It is preferable.
  • the method for diagnosing a disease associated with abnormal expression of mucin subtype 5AC according to the present invention includes the mucin subtype 5AC specific to the mucin subtype 5AC according to the present invention. It includes a step of detecting using a humanized antibody or an antigen-binding fragment thereof.
  • a mucin subtype 5AC-specific mouse antibody in which the heavy chain variable region consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 and the light chain variable region consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 is used as the amino acid sequence of the framework region derived from human. And humanized.
  • This mucin subtype 5AC-specific mouse antibody is described in Non-Patent Document 4, and it is known that a chimeric antibody prepared from the mouse antibody has ADCC activity (Non-Patent Document 4). See).
  • the amino acid sequence of the heavy chain complementarity determining region 1 shown in SEQ ID NO: 1 the amino acid sequence of the heavy chain complementarity determining region 2 shown in SEQ ID NO: 2
  • Amino acid sequence of heavy chain complementarity determining region 3 shown in SEQ ID NO: 3 amino acid sequence of light chain complementarity determining region 1 shown in SEQ ID NO: 4
  • amino acid sequence of light chain complementarity determining region 2 shown in SEQ ID NO: 5 was extracted.
  • amino acid sequences of the framework region and the constant region were extracted from sequence information such as human antibodies, EU, KOL, NMEM, LAY, LEN, REI.
  • amino acid sequence of the framework region obtained from KOL the 42nd to 45th amino acid sequences were substituted with those derived from mouse antibodies.
  • the heavy chain variable region is VH-1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8
  • the heavy chain variable region is VH-2 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9
  • the heavy chain variable The region consists of VH-3 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10
  • the heavy chain variable region consists of VH-4 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11
  • the heavy chain variable region consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12.
  • VH-5 and VH-6 whose heavy chain variable region consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13 were designed.
  • FIG. 1 (a) shows the sequences of VH-1 to VH-6.
  • the underlined portion indicates the complementarity determining region.
  • the amino acid sequence from the 1st to the 30th of the heavy chain variable region is in the framework region 1
  • the amino acid sequence from the 36th to the 49th is in the framework region 2.
  • the amino acid sequence from the 67th to the 98th amino acid sequence corresponds to the framework region 3
  • the amino acid sequence from the 111th to the 121st amino acid sequence corresponds to the framework region 4.
  • Table 1 summarizes the identities of each other in the VH-1 to VH-6 framework areas. As shown in Table 1, the amino acid sequence identity of the framework regions from VH-1 to VH-6 ranges from 58% to 94%.
  • the light chain variable region is VL-1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15
  • the light chain variable region is VL-2 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16
  • the light chain variable The region consists of VL-3 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17
  • the light chain variable region consists of VL-4 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18, and the light chain variable region consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19.
  • VL-5, VL-6 whose light chain variable region consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20, and VL-7 whose light chain variable region consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21 were designed.
  • FIG. 1 (b) shows the sequences of VL-1 to VL-7.
  • the underlined portion indicates the complementarity determining region.
  • the amino acid sequence from the 1st to the 23rd of the light chain variable region is the framework region 1
  • the amino acid sequence of the 39th to the 53rd is the framework region 2.
  • the 61st to 92nd amino acid sequences correspond to the framework region 3
  • the 102nd to 111th amino acid sequences correspond to the framework region 4, respectively.
  • the identity of each other in the framework area from VL-1 to VL-7 is summarized in Table 2. As shown in Table 2, the amino acid sequence identity of the framework regions from VH-1 to VH-7 ranges from 60% to 91%.
  • humanized antibody 1 in which VH-1 and VL-1 are combined (the heavy chain variable region is composed of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, and the light chain variable region is shown in SEQ ID NO: 15).
  • a humanized antibody 2 in which VH-4 and VL-5 are combined (the heavy chain variable region has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 and the light chain variable region has the SEQ ID NO: 19)
  • a humanized antibody 3 in which VH-4 and VL-2 are combined (the heavy chain variable region is composed of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11, and the light chain variable region is represented by SEQ ID NO: 16)
  • humanized antibody 4 in which VH-4 and VL-3 are combined (the heavy chain variable region has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11, and the light chain variable region has the sequence number 7), humanized antibody 5 in which VH-4 and VL-4 are combined (the heavy chain variable region consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11, and the light chain variable region has the sequence Human
  • Humanized antibody 7 comprising a combination of VH-6 and VL-5 (the heavy chain variable region is composed of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13, and the light chain variable region is composed of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19).
  • a humanized antibody 8 comprising a combination of VH-2 and VL-5 (the heavy chain variable region is composed of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9, and the light chain variable region is composed of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19).
  • a humanized antibody 9 comprising a combination of VH-3 and VL-5 (the heavy chain variable region is composed of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10, and the light chain variable region is composed of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19).
  • the framework regions of humanized antibodies 1 to 10 designed in this way all corresponded to the above-mentioned sequence characteristics (A) to (I) in the range of 5 to 7 inclusive.
  • each designed gene was incorporated into an expression vector, and a humanized antibody was obtained by a transient expression system using HEK293 cells.
  • Table 3 shows the yield of each humanized antibody. The yield was calculated from the concentration and volume after purification with a Protein A column or after concentration of the culture supernatant by ultrafiltration.
  • the thin line filled with the lower side shows the result when non-specific human IgG (control) was added, and the thick line not filled with the lower side added the humanized antibody or the mouse antibody.
  • (A) shows the results for the mouse antibody
  • (b) shows the results for the humanized antibody 3
  • (c) shows the results for the humanized antibody 4
  • (d) Results for humanized antibody 5 are shown
  • (e) shows another result for mouse antibody
  • (f) shows results for humanized antibody 6, and
  • H shows the results for humanized antibody 8
  • (i) shows the results for humanized antibody 9
  • (j) shows the results for humanized antibody 1
  • (K) shows the results for humanized antibody 2
  • (m) shows the results for humanized antibody 10.
  • the result about the humanized antibody 8 measured similarly from BxPC3 cell in place of SW1990 is shown in FIG.
  • ADCC activity was measured for humanized antibody 1 and humanized antibody 10.
  • 10 mL of ascites collected by a conventional method was applied to a protein A column (1 mL), and then thoroughly washed with 10 volumes of PBS. After elution with 1 mL of citrate buffer (pH 3.0), the solution was neutralized with Tris buffer (pH 7.0). The obtained antibody solution was treated with a G25 column (5 mL) for desalting to recover 1 mL. Diluted to each concentration for evaluation of ADCC activity.
  • ADCC activity was determined by culturing human pancreatic cancer cell line BxPC3 cells (103) and human PBMC (5x104) in RPMI medium for 12 hours, and then measuring the amount of LDH in the culture supernatant with LDH Cytotoxicity Detection Kit (Takara Bio). The cytotoxic rate (%) was calculated by the following formula.
  • IgG1 of a healthy person was used as a control antibody, and the ADCC activity of the humanized antibody was evaluated by taking a difference from the result of the control antibody.
  • the present invention can be used in the field of antibody drug production and life science research.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

重鎖相補性決定領域１が配列番号１に示されるアミノ酸配列からなり、重鎖相補性決定領域２が配列番号２に示されるアミノ酸配列からなり、重鎖相補性決定領域３が配列番号３に示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖相補性決定領域１が配列番号４に示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖相補性決定領域２が配列番号５に示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖相補性決定領域３が配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるムチンサブタイプ５ＡＣ特異的ヒト化抗体、その抗原結合性断片、およびそれらの少なくとも何れかを含有するムチンサブタイプ５ＡＣの異常発現を伴う疾患の治療用医薬組成物。

Description

ムチンサブタイプ５ＡＣ特異的ヒト化抗体およびその利用
　本発明は、ムチンサブタイプ５ＡＣ特異的ヒト化抗体、その抗原結合性断片、およびそれらの少なくとも何れかを含有するムチンサブタイプ５ＡＣの異常発現を伴う疾患の治療用医薬組成物に関するものである。
　ムチンは、上皮細胞等から分泌される粘液の主成分である分子量が１００万から１０００万の巨大糖タンパク質である。現在、ムチンのサブタイプは２１種類が知られている。このうちムチンサブタイプ５ＡＣは、正常組織では胃および気管において分泌型ムチンとして発現している。これが、癌組織、例えば、膵臓癌の癌組織では、高頻度で、膜結合型ムチンとして発現していることが知られている（非特許文献１、２）。また、喘息の患者において、気道におけるムチンサプタイプ５ＡＣの過剰分泌が、喘息の悪化につながることが知られている（非特許文献３）。
　ムチンサブタイプ５ＡＣに対するマウス抗体およびキメラ抗体については幾つかの報告があり（非特許文献４～７）、数十種類のマウス抗体が市販されている。
International Journal of Gastrointestinal Cancer, 2003, 34, pp9-18 International Journal of Oncology, 2004, 24, pp107-113 日本小児アレルギー学会誌, 2007, 21, pp180-186 International Journal of Oncolgy, 2002, 21, pp649-654 Hybrid Hybridomics, 2004, 23(2), pp93-99 International Journal of Cancer, 2002, 99(3), pp336-343 FEBS Journal, 2008, 275(3), pp481-489 Nature, 1988, 332, pp323-327 Journal of Immunology, 1995, 155(2), pp925-937 Journal of Molecular Biology, 1992, 224, pp487-499 Journal of Immunological Methods, 2003, 275, pp31-40 Protein Science, 2008, 17, pp261-270
　臨床応用を考慮すれば、ムチンサブタイプ５ＡＣ特異的抗体をヒト化することは、非常に有益である。
　ここで、マウス由来のモノクローナル抗体をヒト化する場合、相補性決定領域のみをマウス配列に置換するだけでは、一部の例外を除いてその抗原親和性が低下してしまうことは周知の事柄である（例えば、非特許文献８を参照）。そのため、ヒト化抗体のフレームワーク領域についても、一部の残基をマウス配列に置換することが行われる（非特許文献８～１２）。このとき、フレームワーク領域における数残基の置換が親和性を数十倍変化させることがあり、抗原に対して十分な親和性を有するヒト化抗体を作製し得るフレームワーク領域の配列を見出すことは一般に困難である。
　本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、ムチンサブタイプ５ＡＣに対して十分な親和性を有するヒト化抗体およびその利用を提供することを主たる目的とする。
　本発明者らは、鋭意検討の結果、驚くべきことに、配列番号１～６に示されるアミノ酸配列からなる相補性決定領域を用いてムチンサブタイプ５ＡＣ特異的ヒト化抗体を作製した場合、（１）ヒト由来のフレームワーク領域を何ら置換せずとも十分な抗原親和性を示すこと、（２）それどころか、互いに異なる何種類ものヒト由来のフレームワーク領域を用いた場合にも、同様に、十分な抗原親和性を示すことを見出した。すなわち、本発明に係る相補性決定領域を用いれば、フレームワーク領域の配列によらずに十分な抗原親和性を示すムチンサブタイプ５ＡＣ特異的ヒト化抗体を提供することができる。
　本発明に係るムチンサブタイプ５ＡＣ特異的ヒト化抗体、またはその抗原結合性断片は、重鎖相補性決定領域１が配列番号１に示されるアミノ酸配列からなり、重鎖相補性決定領域２が配列番号２に示されるアミノ酸配列からなり、重鎖相補性決定領域３が配列番号３に示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖相補性決定領域１が配列番号４に示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖相補性決定領域２が配列番号５に示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖相補性決定領域３が配列番号６に示されるアミノ酸配列からなることを特徴としている。
　本発明に係る医薬組成物は、ムチンサブタイプ５ＡＣの異常発現を伴う疾患の診断用または治療用の医薬組成物であって、本発明に係るムチンサブタイプ５ＡＣ特異的ヒト化抗体、またはその抗原結合性断片を含有することを特徴としている。
　また、本発明に係るムチンサブタイプ５ＡＣの異常発現を伴う疾患の治療方法は、本発明に係るムチンサブタイプ５ＡＣ特異的ヒト化抗体、またはその抗原結合性断片を、ムチンサブタイプ５ＡＣの異常発現を伴う疾患の患者に投与する工程を包含することを特徴としている。
　また、本発明に係るムチンサブタイプ５ＡＣの異常発現を伴う疾患の診断方法は、被験者からの採取物中または被験者の体内に存在するムチンサブタイプ５ＡＣを、本発明に係るムチンサブタイプ５ＡＣ特異的ヒト化抗体、またはその抗原結合性断片を用いて検出する工程を包含することを特徴としている。
　本発明によれば、ムチンサブタイプ５ＡＣに対して十分な親和性を有するヒト化抗体、その抗原結合性断片、およびそれらの少なくとも何れかを含有するムチンサブタイプ５ＡＣの異常発現を伴う疾患の治療用医薬組成物を提供することができる。
本発明の一実施形態に係るヒト化抗体の可変領域のアミノ酸配列を示す図である。 本発明の実施形態に係るヒト化抗体の抗原親和性を示す、フローサイトメトリーの結果を示すグラフである。
　（ヒト化抗体）
　本発明は、ムチンサブタイプ５ＡＣ特異的ヒト化抗体、またはその抗原結合性断片を提供する。
　本明細書において、「ヒト化抗体」とは、非ヒト由来の相補性決定領域を含み、ヒト由来のフレームワーク領域を少なくとも一部含む抗体を指す。ヒト化抗体のフレームワーク領域では、ヒト由来の部分が多いほど好ましく、５０％以上であることがより好ましく、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％以上であることがさらに好ましく、フレームワーク領域が１００％ヒト由来であることが特に好ましい。
　なお、相補性決定領域は、抗体の重鎖および軽鎖のそれぞれの可変領域に含まれ、超可変領域とも称される３つの領域であって、Ｎ末端側から、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、相補性決定領域３（ＣＤＲ３）と称される。
　また、フレームワーク領域は、可変領域において相補性決定領域に隣接する領域であり、Ｎ末端側から、フレームワーク領域１（ＦＲ１）、フレームワーク領域２（ＦＲ２）、フレームワーク領域３（ＦＲ３）、フレームワーク領域４（ＦＲ４）と称される。
　また、本明細書において、「抗原結合性断片」とは、ムチンサブタイプ５ＡＣに結合することができる抗体断片を指し、好ましくは、抗体の可変領域を含むものであり、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ディアボディー、単一鎖抗体分子等が挙げられる。このような抗原結合性断片は、例えば、抗体をペプシン又はパパイン等のタンパク質分解酵素によって消化し、精製することにより得てもよいし、遺伝子工学を用いて調製してもよい。
　本発明の一実施形態に係るムチンサブタイプ５ＡＣ特異的ヒト化抗体は、重鎖可変領域が配列番号７に示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域が配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなるムチンサブタイプ５ＡＣ特異的マウス抗体をヒト化して得られるものであり、重鎖相補性決定領域１が配列番号１に示されるアミノ酸配列からなり、重鎖相補性決定領域２が配列番号２に示されるアミノ酸配列からなり、重鎖相補性決定領域３が配列番号３に示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖相補性決定領域１が配列番号４に示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖相補性決定領域２が配列番号５に示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖相補性決定領域３が配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるヒト化抗体である。
　このような相補性決定領域を備えたヒト化抗体は、実施例に示すように、フレームワーク領域の配列が変化しても、ムチンサブタイプ５ＡＣに対する十分な親和性を有する。本実施形態に係るムチンサブタイプ５ＡＣ特異的ヒト化抗体の親和定数は、特に限定されるものではないが、１０５以上１０９Ｍ－１以下の範囲の親和定数を有するものが好ましく、より好ましくは１０６以上の親和定数を有するものであり得る。なお、親和性は、例えば、Munson et al., Anal. Biochem. 107:220 (1980)のスキャッチャード（Scatchard）アッセイにより測定することができる。
　なお、実施例に示すように、重鎖可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸配列は、実施例に記載のヒト化抗体１～９の重鎖可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸配列、すなわち、配列番号８から１３の何れか一つに示されるアミノ酸配列の１から３０番目、３６から４９番目、６７から９８番目および１１１から１２１番目に対して、５８％以上の同一性を有することが好ましい。より好ましくは、重鎖可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸配列は、配列番号８から１３の何れか一つに示されるアミノ酸配列の１から３０番目、３６から４９番目、６７から９８番目および１１１から１２１番目に対して、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％以上の同一性を有することが好ましく、１００％の同一性を有していることが特に好ましい。
　なお、重鎖可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸配列は、ヒト由来のアミノ酸配列と同一のものが好ましいが、適宜置換されていてもよい。例えば、上記ムチンサブタイプ５ＡＣ特異的マウス抗体の重鎖可変領域の４２から４５番目のアミノ酸配列によって、ヒト化抗体の対応するアミノ酸配列を置換するものであってもよい。
　また、同様に、軽鎖可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸配列は、実施例に記載のヒト化抗体１～９の軽鎖可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸配列、すなわち、配列番号１５から２１の何れか一つに示されるアミノ酸配列の１から２３番目、３９から５３番目、６１から９２番目および１０２から１１１番目に対して、６０％以上の同一性を有することが好ましい。より好ましくは、軽鎖可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸配列は、配列番号１５から２１の何れか一つに示されるアミノ酸配列の１から２３番目、３９から５３番目、６１から９２番目および１０２から１１１番目に対して、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％以上の同一性を有することが好ましく、１００％の同一性を有していることが特に好ましい。
　軽鎖可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸配列も、同様に、ヒト由来のアミノ酸配列と同一のものが好ましいが、適宜置換されていてもよい。
　抗体のアイソタイプは、特に限定されず、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥの何れであってもよい。ＡＤＣＣ（Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity）を誘導する観点からは、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４）が好ましい。
　本実施形態に係るムチンサブタイプ５ＡＣ特異的ヒト化抗体は、上述したように設計したアミノ酸配列に基づいて作製したヒト化抗体遺伝子を、定法によって、発現ベクターに組み込み、宿主細胞へ導入し、ヒト化抗体を発現させ、タンパク質を回収し、精製することによって得ることができる。用いる宿主細胞としては、抗体または抗体を含有する融合蛋白質等の発現に適合する細胞であれば、特に限定されないが、例えば、細菌（例えば、大腸菌）、放線菌、酵母、又は昆虫細胞（例えば、ＳＦ９）、好ましくは、哺乳類細胞（例えば、ＣＯＳ-１、ＣＨＯ、又はミエローマ細胞）を挙げることができる。具体的には、マウスミエローマ細胞Ｓｐ２-Ｏ-ａｇ１４（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８１）又はハムスター卵巣細胞ＣＨＯを用い、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、カチオニックリボソームを用いた方法、エレクトロポレーション法、又はリポフェクション法で、ベクターを宿主細胞に導入することができる。
　（エピトープ）
　本実施形態に係るムチンサブタイプ５ＡＣ特異的ヒト化抗体のエピトープは、配列番号２２に示されるアミノ酸配列からなる、ムチンサブタイプ５ＡＣの部分ペプチドに存在する。
　（ＡＤＣＣ活性）
　本実施形態に係るムチンサブタイプ５ＡＣ特異的ヒト化抗体は、ＡＤＣＣ活性を有し得る。ＩｇＧアイソタイプのＦｃ領域は、エフェクター細胞のＦｃ受容体に結合し、エフェクター細胞を活性化することによって、抗体の可変領域が結合した標的細胞または病原体を障害することができる。エフェクター細胞としては、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、好中球、およびマクロファージを挙げることができ、これらのエフェクター細胞は、細胞障害性の物質を放出することなどにより抗体の結合した標的細胞または病原体を障害する。ＩｇＧのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４の４つのサブクラスのうち、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３が強いＡＤＣＣ活性を示すことがわかっており、ＡＤＣＣ活性を示すためには、本実施形態に係るムチンサブタイプ５ＡＣ特異的ヒト化抗体は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ３の定常領域を含んでいることが好ましい。
　本発明のヒト化抗体のＡＤＣＣの標的細胞は、ムチンサブタイプ５ＡＣを異常発現している細胞であれば、特に限定されるものではないが、例えば癌細胞であり、膀胱癌、乳癌、結腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、小細胞肺癌、食道癌、胆嚢癌、卵巣癌、膵臓癌、胃癌、子宮頸部癌、甲状腺癌、前立腺癌、扁平上皮癌、皮膚癌、骨癌、リンパ腫、白血病及び脳腫瘍の細胞を挙げることができる。特には膵臓癌、肺癌、乳癌、胃癌、子宮頸癌、および大腸癌の細胞を挙げることができる。
　（医薬組成物および治療方法）
　本発明の一実施形態に係る医薬組成物は、本発明の一実施形態に係るムチンサブタイプ５ＡＣ特異的ヒト化抗体および／またはその抗原結合性断片を含む。また、本発明の一実施形態に係る治療方法は、本発明の一実施形態に係るムチンサブタイプ５ＡＣ特異的ヒト化抗体および／またはその抗原結合性断片を患者に投与する工程を含む。本実施形態に係る治療方法は、本実施形態に係る医薬組成物を患者に投与する工程を含んでもよい。
　本実施形態に係る医薬組成物は、薬剤学的に許容することのできる通常の担体または希釈剤等を含んでいてもよい。
　本実施形態に係る医薬組成物は、ムチンサブタイプ５ＡＣの異常発現を伴う疾患の治療が必要な患者に、有効量で投与することができる。例えば、本発明の一実施形態に係るムチンサブタイプ５ＡＣ特異的ヒト化抗体および／またはその抗原結合性断片単独で、または、薬剤学的に許容することのできる担体もしくは希釈剤と共に患者に投与され、ムチンサブタイプ５ＡＣを異常発現する細胞（例えば、癌細胞）の生体内での増殖を抑制することにより、癌、特には、膵臓癌を治療することができる。また、喘息においては、細胞内でのムチンサブタイプ５ＡＣの発現を抑制し、ムチンサブタイプ５ＡＣの分泌を抑制することにより、症状を改善することができる。
　本実施形態に係る医薬組成物および治療方法の治療対象となる疾患は、ムチンサブタイプ５ＡＣの異常発現を伴う疾患であり、具体的には癌および喘息を挙げることができる。癌の種類は、特に限定されることはないが、例えば、膀胱癌、乳癌、結腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、小細胞肺癌、食道癌、胆嚢癌、卵巣癌、膵臓癌、胃癌、子宮頸部癌、甲状腺癌、前立腺癌、扁平上皮癌、皮膚癌、骨癌、リンパ腫、白血病および脳腫瘍を挙げることができる。本発明の医薬組成物は、特には膵臓癌、肺癌、乳癌、胃癌、子宮頸癌、および大腸癌を効率よく治療することができる。
　なお、本実施形態に係る医薬組成物を投与する患者および治療方法を適用する患者は、ヒトまたは非ヒトであり得る。
　一つの局面において、本実施形態に係る医薬組成物は、ＡＤＣＣを誘導することによって癌の治療を行うものである。このような医薬組成物は、ＩｇＧアイソタイプのＦｃ領域を有するムチンサブタイプ５ＡＣ特異的ヒト化抗体および／またはその抗原結合性断片を含有していることが好ましい。
　他の局面において、本実施形態に係る医薬組成物は、ムチンサブタイプ５ＡＣ特異的ヒト化抗体および／またはその抗原結合性断片にアイソトープ（例えば、９０Ｙ、１１１Ｉｎ等）を標識したものを含むこともできる。アイソトープで標識されたヒト化抗体等は、ムチンサブタイプ５ＡＣの異常発現した標的細胞に結合し、アイソトープからの放射線によって、標的細胞を障害する。
　医薬組成物に含まれるヒト化抗体は、もとのマウスモノクローナル抗体、またはキメラ抗体と比較して、ヒトの治療の観点から有利である。第一に、ＡＤＣＣまたは補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）活性を有する場合は、抗体のエフェクターとして働く領域がヒト抗体であるため、効率的である。第二に、ヒト化抗体のフレームワーク領域、および定常領域がヒトの免疫系から異物として認識されないため、マウスモノクローナル抗体およびキメラ抗体と比較して、投与されたヒト抗体に対する免疫応答が少ない。第三に、ヒト体内での半減期が、通常のヒト抗体に近い半減期を有すると考えられ、マウスモノクローナル抗体およびキメラ抗体と比較して、投与量を減少させることが可能である。
　特に、可変領域のアミノ酸配列が互いに異なるムチンサブタイプ５ＡＣ特異的ヒト化抗体、またはその抗原結合性断片を二種類以上含有している医薬組成物は、個々のヒト化抗体等の投与量をそれぞれ低減することができるため、例え、免疫応答を引き起こすヒト化抗体等を含んでいたとしても、生じる免疫応答を抑制することができるため好ましい。
　本実施形態に係る医薬組成物の投与剤型としては、特に限定がなく、例えば、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン剤、シロップ剤、エキス剤、若しくは丸剤等の経口剤、または注射剤、外用液剤、軟膏剤、坐剤、局所投与のクリーム、若しくは点眼薬などの非経口剤を挙げることができる。
　前記経口剤は、例えば、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、澱粉、コーンスターチ、白糖、乳糖、ぶどう糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、デキストリン、ポリビニルピロリドン、結晶セルロース、大豆レシチン、ショ糖、脂肪酸エステル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、ケイ酸マグネシウム、無水ケイ酸、または合成ケイ酸アルミニウムなどの賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、希釈剤、保存剤、着色剤、香料、矯味剤、安定化剤、保湿剤、防腐剤、または酸化防止剤等を用いて、常法に従って製造することができる。
　非経口投与方法としては、注射（皮下、静脈内等）、または直腸投与等が例示される。これらのなかで、注射剤が最も好適に用いられる。例えば、注射剤の調製においては、ヒト化抗体の他に、例えば、生理食塩水若しくはリンゲル液等の水溶性溶剤、植物油若しくは脂肪酸エステル等の非水溶性溶剤、ブドウ糖若しくは塩化ナトリウム等の等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、懸濁化剤、または乳化剤などを任意に用いることができる。また、本発明の医薬組成物は、徐放性ポリマーなどを用いた徐放性製剤の手法を用いて投与してもよい。例えば、本発明の医薬組成物をエチレンビニル酢酸ポリマーのペレットに取り込ませて、このペレットを治療または予防すべき組織中に外科的に移植することができる。
　本実施形態に係る医薬組成物は、これに限定されるものではないが、０．０１～９９重量％、好ましくは０．１～８０重量％の量で、ヒト化抗体、または抗原結合性断片を含有することができる。本実施形態に係る医薬組成物を用いる場合、および本実施形態に係る治療方法を行う場合の投与量は、例えば、病気の種類、患者の年齢、性別、体重、症状の程度、または投与方法などに応じて適宜決定することができ、経口的にまたは非経口的に投与することが可能である。なお、ヒトへの医薬組成物の投与方法、投与量、投与期間、および投与間隔等は、管理された臨床治験によって決定されることが望ましい。
　また、本実施形態に係る医薬組成物は、治療に先立ってあるいは治療とは別に、ムチンサブタイプ５ＡＣの異常発現の診断もしくは検査にも用いることができる。例えば、患者の血液中におけるムチンサブタイプ５ＡＣの濃度等の測定に本実施形態に係る医薬組成物を用いることで、ムチンサブタイプ５ＡＣの異常発現を伴う疾患を診断（検査）することができる。言い換えれば、本実施形態に係る診断方法は、被験者からの採取物中または被験者の体内に存在するムチンサブタイプ５ＡＣを、本実施形態に係るムチンサブタイプ５ＡＣ特異的ヒト化抗体、またはその抗原結合性断片を用いて検出する工程を包含し、その検出結果に基づいて、ムチンサブタイプ５ＡＣの異常発現を伴う疾患を診断（検査）することができる。すなわち、本実施形態に係るムチンサブタイプ５ＡＣ特異的ヒト化抗体、またはその抗原結合性断片は、被験者から採血、バイオプシー等により得られた採取物の診断に用い得る他、放射性物質や蛍光物質等により標識した抗体を用いた、いわゆる体内診断と称される方法により、膵癌の局在、質的診断（特に腫瘤形成性膵炎等の良性疾患との鑑別）等を行うために好適に用い得る。
　（まとめ）
　以上のように、本発明に係るムチンサブタイプ５ＡＣ特異的ヒト化抗体、またはその抗原結合性断片は、重鎖相補性決定領域１が配列番号１に示されるアミノ酸配列からなり、重鎖相補性決定領域２が配列番号２に示されるアミノ酸配列からなり、重鎖相補性決定領域３が配列番号３に示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖相補性決定領域１が配列番号４に示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖相補性決定領域２が配列番号５に示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖相補性決定領域３が配列番号６に示されるアミノ酸配列からなることを特徴としている。
　上記ムチンサブタイプ５ＡＣ特異的ヒト化抗体、またはその抗原結合性断片は、重鎖可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸配列が、配列番号８から１３の何れか一つに示されるアミノ酸配列の１から３０番目、３６から４９番目、６７から９８番目および１１１から１２１番目に対して、５８％以上の同一性を有し、軽鎖可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸配列が、配列番号１５から２１の何れか一つに示されるアミノ酸配列の１から２３番目、３９から５３番目、６１から９２番目および１０２から１１１番目に対して、６０％以上の同一性を有することが好ましく、重鎖可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸配列が、配列番号８から１３の何れか一つに示されるアミノ酸配列の１から３０番目、３６から４９番目、６７から９８番目および１１１から１２１番目に対して、９０％以上の同一性を有し、軽鎖可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸配列が、配列番号１５から２１の何れか一つに示されるアミノ酸配列の１から２３番目、３９から５３番目、６１から９２番目および１０２から１１１番目に対して、９０％以上の同一性を有することがより好ましく、重鎖可変領域が、配列番号８から１３の何れか一つに示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域が、配列番号１５から２１の何れか一つに示されるアミノ酸配列からなることがさらに好ましく、重鎖可変領域が、配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域が、配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなるか；重鎖可変領域が、配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域が、配列番号１７に示されるアミノ酸配列からなるか；重鎖可変領域が、配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域が、配列番号１８に示されるアミノ酸配列からなるか；重鎖可変領域が、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域が、配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなるか；重鎖可変領域が、配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域が、配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなるか；重鎖可変領域が、配列番号９に示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域が、配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなるか；重鎖可変領域が、配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域が、配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなるか；重鎖可変領域が、配列番号８に示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域が、配列番号１５に示されるアミノ酸配列からなるか；重鎖可変領域が、配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域が、配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなるか；または重鎖可変領域が、配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域が、配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなることが特に好ましい。
　本発明に係る医薬組成物は、ムチンサブタイプ５ＡＣの異常発現を伴う疾患の診断用または治療用の医薬組成物であって、本発明に係るムチンサブタイプ５ＡＣ特異的ヒト化抗体、またはその抗原結合性断片を含有することを特徴としている。
　上記医薬組成物では、上記疾患が、癌または喘息であることが好ましく、上記癌が、膵臓癌、肺癌、乳癌、胃癌、子宮頸癌、または大腸癌であることがより好ましい。
　また、本発明に係る医薬組成物は、可変領域のアミノ酸配列が互いに異なる、本発明に係るムチンサブタイプ５ＡＣ特異的ヒト化抗体、またはその抗原結合性断片を二種類以上含有していることが好ましい。
　また、本発明に係るムチンサブタイプ５ＡＣの異常発現を伴う疾患の治療方法は、本発明に係るムチンサブタイプ５ＡＣ特異的ヒト化抗体、またはその抗原結合性断片を、ムチンサブタイプ５ＡＣの異常発現を伴う疾患の患者に投与する工程を包含することを特徴としている。
　上記治療方法では、上記疾患が、癌または喘息であることが好ましく、上記癌が、膵臓癌、肺癌、乳癌、胃癌、子宮頸癌、または大腸癌であることがより好ましい。
　また、本発明に係る治療方法では、上記工程において、可変領域のアミノ酸配列が互いに異なる、上記ムチンサブタイプ５ＡＣ特異的ヒト化抗体、またはその抗原結合性断片を二種類以上、上記患者に投与することが好ましい。
　また、本発明に係るムチンサブタイプ５ＡＣの異常発現を伴う疾患の診断方法は、被験者からの採取物中または被験者の体内に存在するムチンサブタイプ５ＡＣを、本発明に係るムチンサブタイプ５ＡＣ特異的ヒト化抗体、またはその抗原結合性断片を用いて検出する工程を包含することを特徴としている。
　以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが参考として援用される。
　（ヒト化抗体の作製）
　重鎖可変領域が配列番号７に示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域が配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなるムチンサブタイプ５ＡＣ特異的マウス抗体をヒト由来のフレームワーク領域のアミノ酸配列を用いてヒト化した。なお、このムチンサブタイプ５ＡＣ特異的マウス抗体は、非特許文献４に記載されているものであり、当該マウス抗体から作製したキメラ抗体がＡＤＣＣ活性を有することが知られている（非特許文献４を参照）。
　まず、上記ムチンサブタイプ５ＡＣ特異的マウス抗体の配列情報から、配列番号１に示される重鎖相補性決定領域１のアミノ酸配列、配列番号２に示される重鎖相補性決定領域２のアミノ酸配列、配列番号３に示される重鎖相補性決定領域３のアミノ酸配列、配列番号４に示される軽鎖相補性決定領域１のアミノ酸配列、配列番号５に示される軽鎖相補性決定領域２のアミノ酸配列、および配列番号６に示される軽鎖相補性決定領域３のアミノ酸配列をそれぞれ抽出した。
　また、ヒト抗体、ＥＵ、ＫＯＬ、ＮＭＥＭ、ＬＡＹ、ＬＥＮ、ＲＥＩ等の配列情報から、フレームワーク領域および定常領域のアミノ酸配列を抽出した。なお、ＫＯＬから取得したフレームワーク領域のアミノ酸配列については、４２から４５番目のアミノ酸配列をマウス抗体由来のものに置換した。
　そして、ヒト化抗体重鎖として、重鎖可変領域が配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるＶＨ－１、重鎖可変領域が配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるＶＨ－２、重鎖可変領域が配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなるＶＨ－３、重鎖可変領域が配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるＶＨ－４、重鎖可変領域が配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるＶＨ－５、重鎖可変領域が配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなるＶＨ－６をそれぞれ設計した。
　図１（ａ）に、ＶＨ－１～ＶＨ－６のそれぞれの配列を示す。図１（ａ）において、下線部は相補性決定領域を示しており、重鎖可変領域の１から３０番目のアミノ酸配列がフレームワーク領域１に、３６から４９番目のアミノ酸配列がフレームワーク領域２に、６７から９８番目のアミノ酸配列がフレームワーク領域３に、１１１から１２１番目のアミノ酸配列がフレームワーク領域４にそれぞれ対応する。
　また、ＶＨ－１からＶＨ－６のフレームワーク領域における互いの同一性を表１にまとめる。表１に示すように、ＶＨ－１からＶＨ－６のフレームワーク領域のアミノ酸配列の同一性は、５８％から９４％の範囲にある。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　また、ヒト化抗体軽鎖として、軽鎖可変領域が配列番号１５に示されるアミノ酸配列からなるＶＬ－１、軽鎖可変領域が配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなるＶＬ－２、軽鎖可変領域が配列番号１７に示されるアミノ酸配列からなるＶＬ－３、軽鎖可変領域が配列番号１８に示されるアミノ酸配列からなるＶＬ－４、軽鎖可変領域が配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなるＶＬ－５、軽鎖可変領域が配列番号２０に示されるアミノ酸配列からなるＶＬ－６、軽鎖可変領域が配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなるＶＬ－７をそれぞれ設計した。
　図１（ｂ）に、ＶＬ－１～ＶＬ－７のそれぞれの配列を示す。図１（ｂ）において、下線部は相補性決定領域を示しており、軽鎖可変領域の１から２３番目のアミノ酸配列がフレームワーク領域１に、３９から５３番目のアミノ酸配列がフレームワーク領域２に、６１から９２番目のアミノ酸配列がフレームワーク領域３に、１０２から１１１番目のアミノ酸配列がフレームワーク領域４にそれぞれ対応する。
　また、ＶＬ－１からＶＬ－７のフレームワーク領域における互いの同一性を表２にまとめる。表２に示すように、ＶＨ－１からＶＨ－７のフレームワーク領域のアミノ酸配列の同一性は、６０％から９１％の範囲にある。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　そして、最終的に、ＶＨ－１とＶＬ－１とを組み合わせたヒト化抗体１（重鎖可変領域が、配列番号８に示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域が、配列番号１５に示されるアミノ酸配列からなる）、およびＶＨ－４とＶＬ－５とを組み合わせたヒト化抗体２（重鎖可変領域が、配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域が、配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなる）、ＶＨ－４とＶＬ－２とを組み合わせたヒト化抗体３（重鎖可変領域が、配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域が、配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなる）、ＶＨ－４とＶＬ－３とを組み合わせたヒト化抗体４（重鎖可変領域が、配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域が、配列番号１７に示されるアミノ酸配列からなる）、ＶＨ－４とＶＬ－４とを組み合わせたヒト化抗体５（重鎖可変領域が、配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域が、配列番号１８に示されるアミノ酸配列からなる）、ＶＨ－５とＶＬ－５とを組み合わせたヒト化抗体６（重鎖可変領域が、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域が、配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなる）、ＶＨ－６とＶＬ－５とを組み合わせたヒト化抗体７（重鎖可変領域が、配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域が、配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなる）、ＶＨ－２とＶＬ－５とを組み合わせたヒト化抗体８（重鎖可変領域が、配列番号９に示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域が、配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなる）、ＶＨ－３とＶＬ－５とを組み合わせたヒト化抗体９（重鎖可変領域が、配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域が、配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなる）、およびＶＨ－４とＶＬ－７とを組み合わせたヒト化抗体１０（重鎖可変領域が、配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域が、配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなる）の遺伝子をそれぞれ設計した。
　このように設計したヒト化抗体１～１０のフレームワーク領域は、何れも上述した（Ａ）～（Ｉ）の配列的特徴について五つ以上七つ以下の範囲で該当していた。
　そして、設計した各遺伝子を発現ベクターに組み込み、ＨＥＫ２９３細胞を用いた一過性発現系により、ヒト化抗体を取得した。表３に各ヒト化抗体の収量を示す。なお、収量は、ＰｒｏｔｅｉｎＡカラムで精製した後、または、培養上清を限外濾過で濃縮した後の濃度および容積から算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　次に、ヒト化抗体１～１０のムチンサブタイプ５ＡＣへの結合を、フローサイトメトリーによって検討した。ムチンサブタイプ５ＡＣを発現しているＢｘＰＣ３細胞（約２ｘ１０５個／５０μＬ）に対し、２０μｇ／ｍＬ相当量の非特異的なヒト化抗体（コントロール）またはムチンサブタイプ５ＡＣ特異的マウス抗体を加え、氷温にて、約１時間反応させた。そして、二次抗体として、Ａｘｅｌａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８　Ａｎｔｉ　ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ（２０μｇ／ｍＬ）、またはＡｘｅｌａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８　Ａｎｔｉ　ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ（２０μｇ／ｍＬ）を加え、０．５時間反応させた。その後、フローサイトメトリー（ＦａｃｓＣａｌｉｂｕｒ：ＢＥＣＯＮ　ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ社製）を用いて、ヒト化抗体の抗原親和性を分析した。結果を図２に示す。
　図２では、下側が塗りつぶされた細い線が、非特異的なヒトＩｇＧ（コントロール）を加えたときの結果を示し、下側が塗りつぶされていない太い線が、ヒト化抗体またはマウス抗体を加えたときの結果を示す。また、（ａ）は、マウス抗体についての結果を示し、（ｂ）は、ヒト化抗体３についての結果を示し、（ｃ）は、ヒト化抗体４についての結果を示し、（ｄ）は、ヒト化抗体５についての結果を示し、（ｅ）は、マウス抗体についての別の結果を示し、（ｆ）は、ヒト化抗体６についての結果を示し、（ｇ）は、ヒト化抗体７についての結果を示し、（ｈ）は、ヒト化抗体８についての結果を示し、（ｉ）は、ヒト化抗体９についての結果を示し、（ｊ）は、ヒト化抗体１についての結果を示し、（ｋ）は、ヒト化抗体２についての結果を示し、（ｍ）は、ヒト化抗体１０についての結果を示す。また、ＢｘＰＣ３細胞からＳＷ１９９０に替えて同様に測定したヒト化抗体８についての結果を、図２（ｌ）に示す。
　図２に示すように、ヒト化抗体１～１０は、何れも、マウス抗体と比べても十分な抗原親和性を示した。なお、ヒト化抗体１について、ＥＬＩＳＡ法を行った結果、同様に、ムチンサブタイプ５ＡＣとの結合が示された。
　続いて、ヒト化抗体１およびヒト化抗体１０について、ＡＤＣＣ活性を測定した。定法により回収した腹水１０ｍＬをプロテインＡカラム（１ｍＬ）にアプライ後、１０倍容量のＰＢＳで十分洗浄した。１ｍＬのクエン酸バッファー（ｐＨ３．０）で溶出後、トリスバッファー（ｐＨ７．０）で中和した。得られた抗体溶液は脱塩のためにＧ２５カラム（５ｍＬ）で処理して１ｍＬを回収した。ＡＤＣＣ活性の評価のために各濃度に希釈して用いた。ＡＤＣＣ活性は、ヒト膵臓癌細胞株ＢｘＰＣ３細胞（１０３）とヒトＰＢＭＣ（５ｘ１０４）をＲＰＭＩ培地で１２時間培養後、培養上清中のＬＤＨ量をＬＤＨ　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（タカラバイオ）で測定した。細胞障害率（％）は以下の式で算出した。また、コントロール抗体として、健常人のＩｇＧ１を用い、コントロール抗体の結果との差分を取ることにより、ヒト化抗体のＡＤＣＣ活性を評価した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000004
　結果、表４に示すように何れのヒト化抗体においてもＡＤＣＣ活性が見られた。なお、表４では、ヒト化抗体の細胞傷害率からコントロール抗体の細胞傷害率を減算したものが、５ポイント未満である場合には「×」と、５ポイント以上４０ポイント未満である場合には「○」と、４０ポイント以上である場合には「◎」とそれぞれ示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　本発明は、抗体医薬の製造分野および生命科学の研究分野において利用可能である。

Claims (14)

  1. 　重鎖相補性決定領域１が配列番号１に示されるアミノ酸配列からなり、
    　重鎖相補性決定領域２が配列番号２に示されるアミノ酸配列からなり、
    　重鎖相補性決定領域３が配列番号３に示されるアミノ酸配列からなり、
    　軽鎖相補性決定領域１が配列番号４に示されるアミノ酸配列からなり、
    　軽鎖相補性決定領域２が配列番号５に示されるアミノ酸配列からなり、
    　軽鎖相補性決定領域３が配列番号６に示されるアミノ酸配列からなることを特徴とするムチンサブタイプ５ＡＣ特異的ヒト化抗体、またはその抗原結合性断片。
  2. 　重鎖可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸配列が、配列番号８から１３の何れか一つに示されるアミノ酸配列の１から３０番目、３６から４９番目、６７から９８番目および１１１から１２１番目に対して、５８％以上の同一性を有し、
    　軽鎖可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸配列が、配列番号１５から２１の何れか一つに示されるアミノ酸配列の１から２３番目、３９から５３番目、６１から９２番目および１０２から１１１番目に対して、６０％以上の同一性を有することを特徴とする請求項１に記載のムチンサブタイプ５ＡＣ特異的ヒト化抗体、またはその抗原結合性断片。
  3. 　重鎖可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸配列が、配列番号８から１３の何れか一つに示されるアミノ酸配列の１から３０番目、３６から４９番目、６７から９８番目および１１１から１２１番目に対して、９０％以上の同一性を有し、
    　軽鎖可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸配列が、配列番号１５から２１の何れか一つに示されるアミノ酸配列の１から２３番目、３９から５３番目、６１から９２番目および１０２から１１１番目に対して、９０％以上の同一性を有することを特徴とする請求項１または２に記載のムチンサブタイプ５ＡＣ特異的ヒト化抗体、またはその抗原結合性断片。
  4. 　重鎖可変領域が、配列番号８から１３の何れか一つに示されるアミノ酸配列からなり、
    　軽鎖可変領域が、配列番号１５から２１の何れか一つに示されるアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項１から３の何れか一項に記載のムチンサブタイプ５ＡＣ特異的ヒト化抗体、またはその抗原結合性断片。
  5. 　重鎖可変領域が、配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域が、配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなるか；
    　重鎖可変領域が、配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域が、配列番号１７に示されるアミノ酸配列からなるか；
    　重鎖可変領域が、配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域が、配列番号１８に示されるアミノ酸配列からなるか；
    　重鎖可変領域が、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域が、配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなるか；
    　重鎖可変領域が、配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域が、配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなるか；
    　重鎖可変領域が、配列番号９に示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域が、配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなるか；
    　重鎖可変領域が、配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域が、配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなるか；
    　重鎖可変領域が、配列番号８に示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域が、配列番号１５に示されるアミノ酸配列からなるか；
    　重鎖可変領域が、配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域が、配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなるか；または
    　重鎖可変領域が、配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域が、配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項１から４の何れか一項に記載のムチンサブタイプ５ＡＣ特異的ヒト化抗体、またはその抗原結合性断片。
  6. 　請求項１～５のいずれか一項に記載のムチンサブタイプ５ＡＣ特異的ヒト化抗体、またはその抗原結合性断片を含有することを特徴とするムチンサブタイプ５ＡＣの異常発現を伴う疾患の治療用または診断用の医薬組成物。
  7. 　上記疾患が、癌または喘息であることを特徴とする請求項６に記載の医薬組成物。
  8. 　上記癌が、膵臓癌、肺癌、乳癌、胃癌、子宮頸癌、または大腸癌である請求項７に記載の医薬組成物。
  9. 　可変領域のアミノ酸配列が互いに異なる、上記ムチンサブタイプ５ＡＣ特異的ヒト化抗体、またはその抗原結合性断片を二種類以上含有していることを特徴とする請求項６から８の何れか一項に記載の医薬組成物。
  10. 　請求項１～５のいずれか一項に記載のムチンサブタイプ５ＡＣ特異的ヒト化抗体、またはその抗原結合性断片をムチンサブタイプ５ＡＣの異常発現を伴う疾患の患者に投与する工程を包含することを特徴とするムチンサブタイプ５ＡＣの異常発現を伴う疾患の治療方法。
  11. 　上記疾患が、癌または喘息であることを特徴とする請求項１０に記載の治療方法。
  12. 　上記癌が、膵臓癌、肺癌、乳癌、胃癌、子宮頸癌、または大腸癌である請求項１１に記載の治療方法。
  13. 　上記工程では、可変領域のアミノ酸配列が互いに異なる、上記ムチンサブタイプ５ＡＣ特異的ヒト化抗体、またはその抗原結合性断片を二種類以上、上記患者に投与することを特徴とする請求項１０から１２の何れか一項に記載の治療方法。
  14. 　被験者からの採取物中または被験者の体内に存在するムチンサブタイプ５ＡＣを、請求項１～５のいずれか一項に記載のムチンサブタイプ５ＡＣ特異的ヒト化抗体、またはその抗原結合性断片を用いて検出する工程を包含することを特徴とするムチンサブタイプ５ＡＣの異常発現を伴う疾患の診断方法。
PCT/JP2012/060503 2012-04-18 2012-04-18 ムチンサブタイプ５ａｃ特異的ヒト化抗体およびその利用 WO2013157102A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/JP2012/060503 WO2013157102A1 (ja) 2012-04-18 2012-04-18 ムチンサブタイプ５ａｃ特異的ヒト化抗体およびその利用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/JP2012/060503 WO2013157102A1 (ja) 2012-04-18 2012-04-18 ムチンサブタイプ５ａｃ特異的ヒト化抗体およびその利用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2013157102A1 true WO2013157102A1 (ja) 2013-10-24

Family

ID=49383087

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2012/060503 WO2013157102A1 (ja) 2012-04-18 2012-04-18 ムチンサブタイプ５ａｃ特異的ヒト化抗体およびその利用

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2013157102A1 (ja)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107660213A (zh) * 2015-02-10 2018-02-02 米纳瓦生物技术公司 人源化抗muc1*抗体
JPWO2021075545A1 (ja) * 2019-10-18 2021-04-22
WO2021075544A1 (ja) 2019-10-18 2021-04-22 日本メジフィジックス株式会社 Ｒｉ標識されたヒト化抗体
WO2022149578A1 (ja) 2021-01-08 2022-07-14 日本メジフィジックス株式会社 Ａｃ－２２５溶液の製造方法およびＡｃ－２２５溶液を用いた医薬の製造方法
WO2022225006A1 (ja) 2021-04-21 2022-10-27 日本メジフィジックス株式会社 β線を放出する核種で標識されたヒト化抗体
WO2022225007A1 (ja) 2021-04-21 2022-10-27 日本メジフィジックス株式会社 放射性抗腫瘍剤
US12006371B2 (en) 2022-08-04 2024-06-11 Minerva Biotechnologies Corporation Humanized anti-MUC1* antibodies

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH07203974A (ja) * 1994-01-13 1995-08-08 Tosoh Corp 癌特異的ムチンを認識する抗体の遺伝子断片等
JP2007515925A (ja) * 2003-02-13 2007-06-21 セルテック アール アンド ディ リミテッド ヒトＩＬ−１βに対する特異性を有する抗体分子
JP2010077133A (ja) * 1994-12-23 2010-04-08 Glaxosmithkline Llc Ｉｌ−５により媒介される疾病の治療に有用な組み換えｉｌ−５アンタゴニスト
JP2011042581A (ja) * 2008-06-20 2011-03-03 Okayama Univ 酸化ＬＤＬ／β２ＧＰＩ複合体に対する抗体及びその用途

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH07203974A (ja) * 1994-01-13 1995-08-08 Tosoh Corp 癌特異的ムチンを認識する抗体の遺伝子断片等
JP2010077133A (ja) * 1994-12-23 2010-04-08 Glaxosmithkline Llc Ｉｌ−５により媒介される疾病の治療に有用な組み換えｉｌ−５アンタゴニスト
JP2007515925A (ja) * 2003-02-13 2007-06-21 セルテック アール アンド ディ リミテッド ヒトＩＬ−１βに対する特異性を有する抗体分子
JP2011042581A (ja) * 2008-06-20 2011-03-03 Okayama Univ 酸化ＬＤＬ／β２ＧＰＩ複合体に対する抗体及びその用途

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
TAMAMORI Y. ET AL.: "Granulocyte-colony stimulating factor enhances chimeric antibody Nd2 dependent cytotoxicity against pancreatic cancer mediated by polymorphonuclear neutrophils", INTERNATIONAL JOURNAL OF ONCOLOGY, vol. 21, 2002, pages 649 - 654 *
TETSUJI SAWADA ET AL.: "Mucin Hyoteki to shita Suigan no Kotai Ryoho", JAPANESE JOURNAL OF CLINICAL MEDICINE, vol. 64, no. 1, pages 274 - 278 *

Cited By (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107660213B (zh) * 2015-02-10 2023-01-13 米纳瓦生物技术公司 人源化抗MUCl＊抗体
JP2018512379A (ja) * 2015-02-10 2018-05-17 ミネルバ バイオテクノロジーズ コーポレーション ヒト化抗ｍｕｃ１＊ 抗体
US11897967B2 (en) 2015-02-10 2024-02-13 Minerva Biotechnologies Corporation Humanized anti-MUC1* antibodies
US11746159B2 (en) 2015-02-10 2023-09-05 Minerva Biotechnologies Corporation Humanized anti-MUC1* antibodies
JP7324789B2 (ja) 2015-02-10 2023-08-10 ミネルバ バイオテクノロジーズ コーポレーション ヒト化抗ｍｕｃ１＊ 抗体
JP2021075569A (ja) * 2015-02-10 2021-05-20 ミネルバ バイオテクノロジーズ コーポレーション ヒト化抗ｍｕｃ１＊ 抗体
CN107660213A (zh) * 2015-02-10 2018-02-02 米纳瓦生物技术公司 人源化抗muc1*抗体
JPWO2021075544A1 (ja) * 2019-10-18 2021-11-04 日本メジフィジックス株式会社 Ｒｉ標識されたヒト化抗体
EP4046654A4 (en) * 2019-10-18 2023-11-08 Sumitomo Pharma Co., Ltd. HUMANIZED ANTIBODY AND METHOD OF USE THEREOF
KR20220083785A (ko) 2019-10-18 2022-06-20 스미토모 파마 가부시키가이샤 인간화 항체 및 그 사용 방법
KR20220084135A (ko) 2019-10-18 2022-06-21 니혼 메디피직스 가부시키가이샤 Ri 표지된 인간화 항체
US11369701B2 (en) 2019-10-18 2022-06-28 Nihon Medi-Physics Co., Ltd. Ri-labeled humanized antibody
JPWO2021075545A1 (ja) * 2019-10-18 2021-04-22
CN114585393A (zh) * 2019-10-18 2022-06-03 日本医事物理股份有限公司 Ri-标记的人源化抗体
WO2021075545A1 (ja) 2019-10-18 2021-04-22 大日本住友製薬株式会社 ヒト化抗体およびその使用方法
JP7036996B2 (ja) 2019-10-18 2022-03-15 日本メジフィジックス株式会社 Ｒｉ標識されたヒト化抗体
JP7291797B2 (ja) 2019-10-18 2023-06-15 住友ファーマ株式会社 ヒト化抗体およびその使用方法
WO2021075544A1 (ja) 2019-10-18 2021-04-22 日本メジフィジックス株式会社 Ｒｉ標識されたヒト化抗体
US11752223B2 (en) 2021-01-08 2023-09-12 Nihon Medi-Physics Co., Ltd. Method for producing Ac-225 solution and method for producing medicine using Ac-225 solution
WO2022149578A1 (ja) 2021-01-08 2022-07-14 日本メジフィジックス株式会社 Ａｃ－２２５溶液の製造方法およびＡｃ－２２５溶液を用いた医薬の製造方法
WO2022225007A1 (ja) 2021-04-21 2022-10-27 日本メジフィジックス株式会社 放射性抗腫瘍剤
WO2022225006A1 (ja) 2021-04-21 2022-10-27 日本メジフィジックス株式会社 β線を放出する核種で標識されたヒト化抗体
KR20230174243A (ko) 2021-04-21 2023-12-27 니혼 메디피직스 가부시키가이샤 β선을 방출하는 핵종으로 표지된 인간화 항체
US12006371B2 (en) 2022-08-04 2024-06-11 Minerva Biotechnologies Corporation Humanized anti-MUC1* antibodies

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2019218516B2 (en) Antibodies to T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains (TIGIT) and uses thereof
WO2013157105A1 (ja) ムチンサブタイプ５ａｃ特異的ヒト化抗体およびその利用
CN108503708B (zh) 抗人cd47抗体及其用途
KR102536145B1 (ko) 항-pd-1 항체 및 이의 용도
US20190309069A1 (en) Pd-1 antibody, antigen-binding fragment thereof, and medical application thereof
CN104271602B (zh) 双特异性抗体
JP2020504171A (ja) 抗ＰＤ−１抗体との組み合わせのための抗Ｔｉｍ−３抗体
CN107530421A (zh) 抗cd47抗体及其用途
CA3034849A1 (en) Anti-pd1 monoclonal antibody, pharmaceutical composition thereof and use thereof
EP3712170A1 (en) Cd96 antibody, antigen-binding fragment and pharmaceutical use thereof
US20130071385A1 (en) Monoclonal antibodies
JP2018531219A6 (ja) Ｐｄ−ｌ１抗体
JP2020504095A (ja) 抗ＰＤ−Ｌ１抗体との組み合わせのための抗Ｔｉｍ−３抗体
JP2018531219A (ja) Ｐｄ−ｌ１抗体
CN109843927A (zh) 抗b7-h3抗体、其抗原结合片段及其医药用途
WO2019024911A1 (zh) B7h3抗体-药物偶联物及其医药用途
MX2010011955A (es) Inmunoglobulinas de dominio variable doble y usos de las mismas.
WO2013157102A1 (ja) ムチンサブタイプ５ａｃ特異的ヒト化抗体およびその利用
US11427632B2 (en) Antibodies with low immunogenicity and uses thereof
US9725519B2 (en) Antibody against transporter and use thereof
CN112969714A (zh) 抗cd40抗体、其抗原结合片段及其医药用途
CN114591434B (zh) 抗Siglec15抗体及其制备方法和用途
EP4165082A1 (en) Antibodies binding tnfr2 and uses thereof
CN115947855B (zh) 抗cd24抗体的制备及其用途
US20220185911A1 (en) Therapeutic antibodies for treating lung cancer

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 12874563

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 12874563

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP