WO2013157105A1 - ムチンサブタイプ5ac特異的ヒト化抗体およびその利用 - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to a mucin subtype 5AC-specific humanized antibody, an antigen-binding fragment thereof, and a pharmaceutical composition for treating a disease associated with abnormal expression of mucin subtype 5AC containing at least one of them.
- Mucin is a giant glycoprotein having a molecular weight of 1 to 10 million which is the main component of mucus secreted from epithelial cells.
- 21 types of mucin subtypes are known.
- mucin subtype 5AC is expressed as a secretory mucin in the stomach and trachea in normal tissues. It is known that this is frequently expressed as a membrane-bound mucin in cancer tissues, for example, cancer tissues of pancreatic cancer (Non-Patent Documents 1 and 2).
- Non-Patent Documents 1 and 2 cancer tissues of pancreatic cancer
- Non-Patent Documents 4 to 7 There have been several reports on murine antibodies and chimeric antibodies against mucin subtype 5AC (Non-Patent Documents 4 to 7), and several tens of mouse antibodies are commercially available.
- Non-Patent Document 8 when humanizing a monoclonal antibody derived from a mouse, it is a well-known matter that the antigen affinity is reduced with a few exceptions only by replacing only the complementarity determining region with a mouse sequence. Yes (see Non-Patent Document 8, for example). Therefore, in the framework region of a humanized antibody, some residues are substituted with mouse sequences (Non-Patent Documents 8 to 12). At this time, substitution of several residues in the framework region may change the affinity several tens of times, so that the sequence of the framework region that can produce a humanized antibody having sufficient affinity for the antigen is consistent. Just finding one requires a lot of trial and error.
- the present invention has been made in view of the above problems, and a main object thereof is to provide a humanized antibody having sufficient affinity for mucin subtype 5AC and use thereof.
- the mucin subtype 5AC-specific humanized antibody or antigen-binding fragment thereof comprises the heavy chain complementarity determining region 1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and the heavy chain complementarity determining region 2 Consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, the heavy chain complementarity determining region 3 consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, the light chain complementarity determining region 1 consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4,
- the light chain complementarity determining region 2 consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, the light chain complementarity determining region 3 consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, and (A) C of the heavy chain complementarity determining region 1
- the amino acid sequence of 5 residues adjacent to the terminal side is WVRQA (SEQ ID NO: 23); (B) The amino acid sequence of 3 residues adjacent to the N terminal side of heavy chain complementarity determining region 2 is WVS Is
- the pharmaceutical composition according to the present invention is a pharmaceutical composition for diagnosing or treating a disease associated with abnormal expression of mucin subtype 5AC, the mucin subtype 5AC specific humanized antibody according to the present invention, or an antigen thereof It is characterized by containing a binding fragment.
- the method for treating a disease associated with abnormal expression of mucin subtype 5AC comprises treating the mucin subtype 5AC specific humanized antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention with abnormal expression of mucin subtype 5AC. It includes the process of administering to the patient of the disease accompanying this.
- a method for diagnosing a disease associated with abnormal expression of mucin subtype 5AC according to the present invention is the mucin subtype 5AC described in the present invention.
- the method includes a step of detecting using a specific humanized antibody or an antigen-binding fragment thereof.
- a humanized antibody having sufficient affinity for mucin subtype 5AC, an antigen-binding fragment thereof, and treatment of a disease associated with abnormal expression of mucin subtype 5AC containing at least one of them Pharmaceutical compositions can be provided.
- the present invention provides mucin subtype 5AC-specific humanized antibodies, or antigen-binding fragments thereof.
- humanized antibody refers to an antibody that includes a non-human-derived complementarity-determining region and at least a part of a human-derived framework region.
- the more human-derived portion is, the more preferable it is, more preferably 50% or more, and 60%, 70%, 80%, 90%, 95% or 99% or more. More preferably, the framework region is particularly preferably 100% human.
- the complementarity determining regions are three regions which are also included in the variable regions of the heavy and light chains of the antibody and are also called hypervariable regions.
- Complementarity determining regions 1 CDR1
- Complementarity determining region 2 CDR2
- CDR3 complementarity determining region 3
- the framework region is a region adjacent to the complementarity determining region in the variable region. From the N-terminal side, the framework region 1 (FR1), the framework region 2 (FR2), the framework region 3 (FR3), This is called framework area 4 (FR4).
- the “antigen-binding fragment” refers to an antibody fragment that can bind to mucin subtype 5AC, and preferably includes an antibody variable region.
- an antigen-binding fragment may be obtained, for example, by digesting an antibody with a proteolytic enzyme such as pepsin or papain and purifying it, or may be prepared using genetic engineering.
- the heavy chain variable region consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7
- the light chain variable region consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14. It is obtained by humanizing mucin subtype 5AC specific mouse antibody.
- the heavy chain complementarity determining region 1 consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1
- the heavy chain complementarity determining region 2 is the amino acid shown in SEQ ID NO: 2.
- the heavy chain complementarity determining region 3 is composed of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3
- the light chain complementarity determining region 1 is composed of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4
- the light chain complementarity determining region 2 is It consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5
- the light chain complementarity determining region 3 consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6.
- each framework region of the mucin subtype 5AC-specific humanized antibody has (A) the amino acid sequence of 5 residues adjacent to the C-terminal side of the heavy chain complementarity determining region 1 as WVRQA ( (B) the amino acid sequence of 3 residues adjacent to the N-terminal side of heavy chain complementarity determining region 2 is WVS; (C) C in heavy chain complementarity determining region 2 Whether the amino acid sequence of the three residues adjacent to the terminal side is RFT or RVT; (D) the amino acid sequence of the three residues adjacent to the N terminal side of heavy chain complementarity determining region 3 is CAR; (E) whether the amino acid sequence of 3 residues adjacent to the N-terminal side of the light chain complementarity determining region 1 is ITC; (F) 3 residues adjacent to the N-terminal side of the light chain complementarity determining region 2 Is the amino acid sequence of LIY; (G) C in the light chain complementarity determining region 2 The amino acid sequence of 4 residues adjacent to the C-termin
- humanized antibodies By using framework regions having such specific sequence characteristics, humanized antibodies can be obtained that exhibit sufficient antigen affinity with little or no substitution of human-derived framework regions.
- framework regions having the sequence characteristics described above when used, several types of humanized antibodies having different human-derived framework regions and showing sufficient antigen affinity can be obtained.
- the mucin subtype 5AC-specific humanized antibody shares a specific amino acid sequence adjacent to the complement determining region with the mucin subtype 5AC-specific mouse antibody.
- the amino acid sequence of 4 residues adjacent to the C-terminal side of heavy chain complementarity determining region 1 is WVRQ (SEQ ID NO: 27), and (K) heavy chain complementarity determining region 2
- the amino acid sequence of one residue adjacent to the C-terminal side is R
- (L) the amino acid sequence of one residue adjacent to the N-terminal side of the light chain complementarity determining region 1 is C
- (M) The amino acid sequence of one residue adjacent to the C-terminal side of the light chain complementarity determining region 1 is W
- (N) the amino acid sequence of one residue adjacent to the N-terminal side of the light chain complementarity determining region 2 is Y
- (O) the amino acid sequence of one residue adjacent to the C-terminal side of the light chain complementarity determining region 2 is G,
- the amino acid sequence of the framework region of the heavy chain variable region is the amino acid sequence of the framework region of the heavy chain variable region of humanized antibodies 1 to 9 described in the Examples, that is, any one of SEQ ID NOs: 8 to 13. It is preferable to have 58% or more identity to the 1st to 30th, 36th to 49th, 67th to 98th and 111th to 121st amino acid sequences shown in FIG. More preferably, the framework region of the heavy chain variable region has an amino acid sequence from 1 to 30, 36 to 49, 67 to 98, and 111 of the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 8 to 13. It is preferable to have the identity of 70%, 80%, 90%, 95% or 99% or more with respect to the 121st, and it is particularly preferable to have the identity of 100%.
- the amino acid sequence of the framework region of the heavy chain variable region is preferably selected from human-derived amino acid sequences that have the amino acid residues adjacent to the complementarity-determining region satisfying the above-mentioned characteristics.
- the amino acid sequence may be appropriately substituted.
- the corresponding amino acid sequence of the humanized antibody may be substituted with the amino acid sequence of positions 42 to 45 of the heavy chain variable region of the mucin subtype 5AC-specific mouse antibody.
- amino acid sequence of the framework region of the light chain variable region is the amino acid sequence of the framework region of the light chain variable region of humanized antibodies 1 to 9 described in the Examples, that is, any one of SEQ ID NOs: 15 to 21. It is preferable that the amino acid sequence shown in FIG. 1 has 60% or more identity to the 1st to 23rd, 39th to 53rd, 61th to 92nd, and 102th to 111th positions.
- the amino acid sequence of the framework region of the light chain variable region is from the 1st to the 23rd, the 39th to the 53rd, the 61th to the 92nd and the 102th of the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOS: 15 to 21 It is preferable to have the identity of 70%, 80%, 90%, 95% or 99% or more with respect to the 111th, and it is particularly preferable to have the identity of 100%.
- amino acid sequence of the framework region of the light chain variable region is also preferably selected from human-derived amino acid sequences in which the amino acid residues adjacent to the complementarity-determining regions satisfy the above-mentioned characteristics. These amino acid sequences may be appropriately substituted.
- Humanized antibodies with such complementarity determining and framework regions have sufficient affinity for mucin subtype 5AC, as shown in the Examples.
- the affinity constant of the humanized antibody specific to mucin subtype 5AC according to this embodiment is not particularly limited, but preferably has an affinity constant in the range of 10 5 or more and 10 9 M ⁇ 1 or less. Can have an affinity constant of 10 6 or more.
- the affinity can be measured by, for example, the Scatchard assay of Munson et al., Anal. Biochem. 107: 220 (1980).
- the isotype of the antibody is not particularly limited, and may be any of IgG (IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4), IgM, IgA, IgD, and IgE. From the viewpoint of inducing ADCC (Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity), IgG (IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4) is preferable.
- the mucin subtype 5AC-specific humanized antibody according to this embodiment is obtained by incorporating a humanized antibody gene prepared based on the amino acid sequence designed as described above into an expression vector and introducing it into a host cell by a conventional method.
- the antibody can be obtained by expressing the antibody and recovering and purifying the protein.
- the host cell to be used is not particularly limited as long as it is a cell compatible with the expression of an antibody or a fusion protein containing the antibody.
- bacteria for example, E. coli
- actinomycetes for example, yeast, or insect cells (for example, SF9)
- mammalian cells for example, COS-1, CHO, or myeloma cells.
- Vectors can be introduced into host cells.
- epitope of the mucin subtype 5AC-specific humanized antibody according to this embodiment is present in the partial peptide of mucin subtype 5AC consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 22.
- the mucin subtype 5AC-specific humanized antibody according to this embodiment may have ADCC activity.
- the IgG isotype Fc region can damage the target cell or pathogen to which the variable region of the antibody is bound by binding to the Fc receptor of the effector cell and activating the effector cell.
- Effector cells can include T cells, NK cells, neutrophils, and macrophages, which can damage target cells or pathogens bound by antibodies, such as by releasing cytotoxic substances. To do.
- the mucin subtype 5AC specific to this embodiment is specific.
- the humanized antibody contains an IgG1 or IgG3 constant region.
- the target cell of ADCC of the humanized antibody of the present invention is not particularly limited as long as it is a cell that abnormally expresses mucin subtype 5AC.
- a cancer cell such as bladder cancer, breast cancer, colon cancer.
- Mention may be made of leukemia and brain tumor cells.
- Specific examples include pancreatic cancer, lung cancer, breast cancer, gastric cancer, cervical cancer, and colon cancer cells.
- the pharmaceutical composition according to an embodiment of the present invention comprises a mucin subtype 5AC specific humanized antibody and / or an antigen-binding fragment thereof according to an embodiment of the present invention.
- the treatment method according to one embodiment of the present invention includes the step of administering to the patient the mucin subtype 5AC-specific humanized antibody and / or antigen-binding fragment thereof according to one embodiment of the present invention.
- the treatment method according to the present embodiment may include a step of administering the pharmaceutical composition according to the present embodiment to a patient.
- the pharmaceutical composition according to the present embodiment may contain a pharmaceutically acceptable normal carrier or diluent.
- the pharmaceutical composition according to this embodiment can be administered in an effective amount to a patient in need of treatment for a disease associated with abnormal expression of mucin subtype 5AC.
- a mucin subtype 5AC-specific humanized antibody and / or antigen-binding fragment thereof may be administered to a patient alone or in combination with a pharmaceutically acceptable carrier or diluent.
- Cancer particularly pancreatic cancer, can be treated by suppressing the growth of cells (eg, cancer cells) that abnormally express mucin subtype 5AC in vivo.
- symptoms can be improved by suppressing the expression of mucin subtype 5AC in cells and suppressing secretion of mucin subtype 5AC.
- the disease to be treated by the pharmaceutical composition and treatment method according to the present embodiment is a disease accompanied by abnormal expression of mucin subtype 5AC, and specifically includes cancer and asthma.
- the type of cancer is not particularly limited, for example, bladder cancer, breast cancer, colon cancer, kidney cancer, liver cancer, lung cancer, small cell lung cancer, esophageal cancer, gallbladder cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, stomach cancer, Mention may be made of cervical cancer, thyroid cancer, prostate cancer, squamous cell carcinoma, skin cancer, bone cancer, lymphoma, leukemia and brain tumor.
- the pharmaceutical composition of the present invention can efficiently treat pancreatic cancer, lung cancer, breast cancer, stomach cancer, cervical cancer, and colon cancer.
- the patient to whom the pharmaceutical composition according to the present embodiment is administered and the patient to which the treatment method is applied can be a human or a non-human.
- the pharmaceutical composition according to the present embodiment treats cancer by inducing ADCC.
- a pharmaceutical composition preferably contains a mucin subtype 5AC-specific humanized antibody having an Fc region of IgG isotype and / or an antigen-binding fragment thereof.
- the pharmaceutical composition according to this embodiment includes a mucin subtype 5AC-specific humanized antibody and / or an antigen-binding fragment thereof labeled with an isotope (eg, 90 Y, 111 In, etc.).
- an isotope eg, 90 Y, 111 In, etc.
- the humanized antibody contained in the pharmaceutical composition is advantageous from the viewpoint of human treatment compared to the original mouse monoclonal antibody or chimeric antibody.
- the half-life in the human body is considered to have a half-life close to that of normal human antibodies, and it is possible to reduce the dose compared to mouse monoclonal antibodies and chimeric antibodies.
- a pharmaceutical composition containing two or more mucin subtype 5AC-specific humanized antibodies or antigen-binding fragments thereof having different variable region amino acid sequences is used for each humanized antibody. Therefore, even if a humanized antibody that causes an immune response is included, the resulting immune response can be suppressed, which is preferable.
- the dosage form of the pharmaceutical composition according to this embodiment is not particularly limited, and for example, powders, fine granules, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, extracts, or Oral preparations such as pills, or parenteral preparations such as injections, solutions for external use, ointments, suppositories, topically applied creams, or eye drops.
- Examples of the oral preparation include gelatin, sodium alginate, starch, corn starch, sucrose, lactose, glucose, mannitol, carboxymethylcellulose, dextrin, polyvinylpyrrolidone, crystalline cellulose, soybean lecithin, sucrose, fatty acid ester, talc, magnesium stearate , Polyethylene glycol, magnesium silicate, anhydrous silicic acid, or synthetic aluminum silicate excipients, binders, disintegrants, surfactants, lubricants, fluidity promoters, diluents, preservatives, colorants , Fragrances, flavoring agents, stabilizers, humectants, preservatives, antioxidants and the like can be used according to conventional methods.
- parenteral administration methods include injection (subcutaneous, intravenous, etc.) or rectal administration. Of these, the injection is most preferably used.
- water-soluble solvents such as physiological saline or Ringer's solution
- water-insoluble solvents such as vegetable oil or fatty acid esters
- isotonic agents such as glucose or sodium chloride
- Solubilizers, stabilizers, preservatives, suspending agents, or emulsifiers can be optionally used.
- the pharmaceutical composition of the present invention may be administered using a sustained-release preparation technique using a sustained-release polymer or the like.
- the pharmaceutical composition of the present invention can be incorporated into a pellet of ethylene vinyl acetate polymer and the pellet can be surgically implanted into the tissue to be treated or prevented.
- the pharmaceutical composition according to the present embodiment is not limited thereto, but is a humanized antibody or antigen-binding fragment in an amount of 0.01 to 99% by weight, preferably 0.1 to 80% by weight. Can be contained.
- the dosage is, for example, the type of illness, the patient's age, sex, weight, degree of symptoms, or administration method, etc. It can be appropriately determined depending on the dose and can be administered orally or parenterally. It should be noted that the administration method, dose, administration period, administration interval, etc. of the pharmaceutical composition to humans are preferably determined by a controlled clinical trial.
- the pharmaceutical composition according to this embodiment can be used for diagnosis or examination of abnormal expression of mucin subtype 5AC prior to treatment or separately from treatment.
- a disease associated with abnormal expression of mucin subtype 5AC can be diagnosed (tested) by using the pharmaceutical composition according to the present embodiment for measuring the concentration of mucin subtype 5AC in the blood of a patient.
- the mucin subtype 5AC present in the sample collected from the subject or in the subject's body is used as the mucin subtype 5AC-specific humanized antibody according to the present embodiment or the antigen binding thereof.
- a step of detecting using a sex fragment is included, and based on the detection result, a disease associated with abnormal expression of mucin subtype 5AC can be diagnosed (tested). That is, the mucin subtype 5AC-specific humanized antibody or antigen-binding fragment thereof according to this embodiment can be used for diagnosis of a sample obtained by blood collection, biopsy, etc. from a subject, as well as radioactive substances, fluorescent substances, etc. It can be suitably used to perform localization, qualitative diagnosis (particularly, differentiation from benign diseases such as mass-forming pancreatitis) and the like by a method called so-called in-vivo diagnosis using an antibody labeled with.
- the mucin subtype 5AC-specific humanized antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention has the heavy chain complementarity determining region 1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and heavy chain complementarity.
- the determination region 2 consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2
- the heavy chain complementarity determination region 3 consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3
- the light chain complementarity determination region 1 shows the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4
- the light chain complementarity determining region 2 consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5
- the light chain complementarity determining region 3 consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6
- (A) the heavy chain complementarity determining region The amino acid sequence of 5 residues adjacent to the C-terminal side of 1 is WVRQA (SEQ ID NO: 23);
- the amino acid sequence of 3 residues adjacent to the N-terminal side of heavy chain complementarity determining region 2 is , WVS (C) whether the amino acid sequence of 3 residues adjacent to the C-terminal side of the heavy chain complementarity determining region 2 is RFT or RVT; (D) adjacent to the N-terminal side of the heavy chain complement
- the mucin subtype 5AC-specific humanized antibody or antigen-binding fragment thereof preferably corresponds to at least five of (A) to (I) above.
- the mucin subtype 5AC-specific humanized antibody, or antigen-binding fragment thereof has a 4-residue amino acid sequence adjacent to the C-terminal side of the heavy chain complementarity determining region 1, and is WVRQ (SEQ ID NO: 27).
- the amino acid sequence of one residue adjacent to the C-terminal side of the heavy chain complementarity determining region 2 is R, and the amino acid sequence of one residue adjacent to the N-terminal side of the light chain complementarity determining region 1 is C
- the amino acid sequence of one residue adjacent to the C-terminal side of the light chain complementarity determining region 1 is W
- the amino acid sequence of one residue adjacent to the N-terminal side of the light chain complementarity determining region 2 is
- the amino acid sequence of 1 residue adjacent to the C-terminal side of the light chain complementarity determining region 2 that is Y and G is 3 amino acid sequences adjacent to the N-terminal side of the light chain complementarity determining region 3 Is YYC
- one residue adjacent to the C-terminal side of the light chain complementarity determining region 3 is Amino acid sequence is preferably a FGQGTK (SEQ ID NO: 28).
- the amino acid sequence of the framework region of the heavy chain variable region is from 1 of the amino acid sequences shown in any one of SEQ ID NOs: 8 to 13.
- the amino acid sequence of the framework region of the light chain variable region has at least 58% identity to the 30th, 36th to 49th, 67th to 98th and 111th to 121st, Preferably, it has 60% or more identity to the 1st to 23rd, 39th to 53rd, 61th to 92nd and 102th to 111th of the amino acid sequence shown by any one of the heavy chain variable regions.
- the amino acid sequence of the framework region is 1 to 30th, 36 to 49th, 67 of the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 8 to 13, 67
- the amino acid sequence of the framework region of the light chain variable region is any one of SEQ ID NOs: 15 to 21 with 90% or more identity to the 98th and 111th to 121st It is more preferable to have 90% or more identity to the 1st to 23rd, 39th to 53rd, 61th to 92nd, and 102th to 111th.
- the pharmaceutical composition according to the present invention is a pharmaceutical composition for diagnosing or treating a disease associated with abnormal expression of mucin subtype 5AC, the mucin subtype 5AC specific humanized antibody according to the present invention, or an antigen thereof It is characterized by containing a binding fragment.
- the disease is preferably cancer or asthma, and the cancer is more preferably pancreatic cancer, lung cancer, breast cancer, stomach cancer, cervical cancer, or colon cancer.
- composition according to the present invention may contain two or more kinds of mucin subtype 5AC-specific humanized antibodies or antigen-binding fragments thereof according to the present invention, wherein the variable region amino acid sequences are different from each other. preferable.
- the method for treating a disease associated with abnormal expression of mucin subtype 5AC comprises treating the mucin subtype 5AC specific humanized antibody or antigen-binding fragment thereof according to the present invention with abnormal expression of mucin subtype 5AC. It includes the process of administering to the patient of the disease accompanying this.
- the disease is preferably cancer or asthma
- the cancer is more preferably pancreatic cancer, lung cancer, breast cancer, gastric cancer, cervical cancer, or colon cancer.
- two or more kinds of the above-mentioned mucin subtype 5AC-specific humanized antibodies or antigen-binding fragments thereof having different variable region amino acid sequences are administered to the patient. It is preferable.
- the method for diagnosing a disease associated with abnormal expression of mucin subtype 5AC according to the present invention is the mucin subtype 5AC described in the present invention.
- the method includes a step of detecting using a specific humanized antibody or an antigen-binding fragment thereof.
- a mucin subtype 5AC-specific mouse antibody in which the heavy chain variable region consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 and the light chain variable region consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 is used as the amino acid sequence of the framework region derived from human. And humanized.
- This mucin subtype 5AC-specific mouse antibody is described in Non-Patent Document 4, and it is known that a chimeric antibody prepared from the mouse antibody has ADCC activity (Non-Patent Document 4). See).
- the amino acid sequence of the heavy chain complementarity determining region 1 shown in SEQ ID NO: 1 the amino acid sequence of the heavy chain complementarity determining region 2 shown in SEQ ID NO: 2
- Amino acid sequence of heavy chain complementarity determining region 3 shown in SEQ ID NO: 3 amino acid sequence of light chain complementarity determining region 1 shown in SEQ ID NO: 4
- amino acid sequence of light chain complementarity determining region 2 shown in SEQ ID NO: 5 was extracted.
- this example uses a human-derived framework region in which the specific amino acid sequence adjacent to the complementarity determining region is the same as that of the mucin subtype 5AC-specific mouse antibody. It was. Specifically, (J) the amino acid sequence of 4 residues adjacent to the C-terminal side of heavy chain complementarity determining region 1 is WVRQ (SEQ ID NO: 27), and (K) heavy chain complementarity determining region 2 The amino acid sequence of one residue adjacent to the C-terminal side is R, and (L) the amino acid sequence of one residue adjacent to the N-terminal side of the light chain complementarity determining region 1 is C, (M) The amino acid sequence of one residue adjacent to the C-terminal side of the light chain complementarity determining region 1 is W, and (N) the amino acid sequence of one residue adjacent to the N-terminal side of the light chain complementarity determining region 2 is Y, (O) the amino acid sequence of one residue adjacent to the C-terminal side of the light chain complementarity determining
- a humanized antibody was designed by combining the mouse complementarity-determining region described above and a human-derived framework region.
- the heavy chain variable region is VH-1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8
- the heavy chain variable region is VH-2 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9
- the heavy chain variable The region consists of VH-3 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10
- the heavy chain variable region consists of VH-4 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11
- the heavy chain variable region consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12.
- VH-5 and VH-6 whose heavy chain variable region consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13 were designed.
- FIG. 1 (a) shows the sequences of VH-1 to VH-6.
- the underlined portion indicates the complementarity determining region.
- the amino acid sequence from the 1st to the 30th of the heavy chain variable region is in the framework region 1
- the amino acid sequence from the 36th to the 49th is in the framework region 2.
- the amino acid sequence from the 67th to the 98th amino acid sequence corresponds to the framework region 3
- the amino acid sequence from the 111th to the 121st amino acid sequence corresponds to the framework region 4.
- VH-1 shows the sequence characteristics of (A), (C) and (D)
- VH-2 shows the sequence characteristics of (A) and (C)
- VH-3 has sequence characteristics of (C) and (D)
- VH-4 has sequence characteristics of (A) to (C)
- VH-5 has sequence characteristics of (A) to (D)
- VH-6 has the sequence characteristics (A) to (D), respectively.
- VH-1 to VH-6 all have (J) and (K) sequence characteristics.
- the 31st to 39th amino acid sequences in the heavy chain variable region are the mucin subtype 5AC-specific mouse antibody and VH-1 to VH-6.
- the amino acid sequence from the 50th to the 67th amino acid sequence is common to VH-1 to VH-6, and the amino acid sequence is represented by SEQ ID NO: 30.
- the 99th to 110th amino acid sequence consists of the amino chain sequence shown in SEQ ID NO: 31 in common with VH-1 to VH-6.
- the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 29 to 31 are also included in the heavy chain variable region of the mucin subtype 5AC-specific mouse antibody.
- the second amino acid residue in the heavy chain variable region is V
- the third amino acid residue is Q
- the fourth amino acid residue is The group is L
- the seventh amino acid residue is S
- the eighth amino acid residue is G
- the fourteenth amino acid residue is P
- the seventeenth amino acid residue is S
- the 18th amino acid residue is L
- the 22nd amino acid residue is C
- the 25th amino acid residue is S
- the 26th amino acid residue is G.
- the 29th amino acid residue is F, the 41st amino acid residue is P, the 43rd amino acid residue is K, the 45th amino acid residue is L;
- the 46th amino acid residue is E, the 47th amino acid residue is W;
- the 69th amino acid residue is T, the 73rd amino acid residue is D, the 77th amino acid residue is N, the 82nd amino acid residue is Q, and the 83rd amino acid residue is D.
- Amino acid residue is M, 85th amino acid residue is S, 90th amino acid residue is D, 91st amino acid residue is T, 94th amino acid residue
- the residue is Y, the 97th amino acid residue is C, the 98th amino acid residue is A, the 114th amino acid residue is G, and the 117th amino acid residue is Is V, the 118th amino acid residue is T, the 119th amino acid residue is V, the 120th amino acid residue is S, and the 121st amino acid residue is S. It is.
- the light chain variable region is VL-1 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15
- the light chain variable region is VL-2 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16
- the light chain variable The region consists of VL-3 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17
- the light chain variable region consists of VL-4 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 18, and the light chain variable region consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19.
- VL-5, VL-6 whose light chain variable region consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20, and VL-7 whose light chain variable region consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21 were designed.
- FIG. 1 (b) shows the sequences of VL-1 to VL-7.
- the underlined portion indicates the complementarity determining region.
- the amino acid sequence from the 1st to the 23rd of the light chain variable region is the framework region 1
- the amino acid sequence of the 39th to the 53rd is the framework region 2.
- the 61st to 92nd amino acid sequences correspond to the framework region 3
- the 102nd to 111th amino acid sequences correspond to the framework region 4, respectively.
- VL-1 shows the sequence characteristics of (F), (H) and (I)
- VL-2 shows the features of (E), (G) and (I).
- VL-3 shows the sequence characteristics of (E) to (G) and (I)
- VL-4 shows the sequence characteristics of (E) to (G) and (I)
- VL-5 Is the sequence characteristics of (F), (H) and (I)
- VL-6 is the sequence characteristics of (F), (H) and (I)
- VL-7 is (F), (H) And (I) have the sequence characteristics, respectively.
- VH-1 to VH-6 all have the sequence characteristics (J) to (Q).
- the 23rd to 39th amino acid sequences in the light chain variable region are shown in SEQ ID NO: 32 in common with VL-1 to VL-7. It consists of an amino chain sequence, the 53rd to 61st amino acid sequence is the amino chain sequence shown in SEQ ID NO: 33 in common with VL-1 to VL-7, and the 90th to 107th amino acid sequence is VL It consists of an amino chain sequence represented by SEQ ID NO: 34 in common with -1 to VL-7.
- the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 32-34 are also included in the light chain variable region of the mucin subtype 5AC-specific mouse antibody.
- the first amino acid residue in the light chain variable region is D
- the second amino acid residue is I
- the fifth amino acid residue is The group is T
- the 6th amino acid residue is Q
- the 8th amino acid residue is P
- the 16th amino acid residue is G
- the 42nd amino acid residue is Q
- the 44th amino acid residue is P
- the 45th amino acid residue is G
- the 48th amino acid residue is P
- the 50th amino acid residue is L.
- the 51st amino acid residue is L, the 63rd amino acid residue is P, the 65th amino acid residue is R, the 66th amino acid residue is F, The 68th amino acid residue is G; the 69th amino acid residue is S; The 70th amino acid residue is G, the 72nd amino acid residue is G, the 73rd amino acid residue is T, the 76th amino acid residue is T, and the 79th amino acid residue is G.
- the amino acid residue is I, the 80th amino acid residue is S, and the 86th amino acid residue is D.
- Table 1 summarizes the identities of each other in the VH-1 to VH-6 framework areas.
- Table 2 summarizes the identity of the VL-1 to VL-7 framework regions.
- the amino acid sequence identity of the framework regions from VH-1 to VH-6 ranges from 58% to 94%.
- the amino acid sequence identity of the framework region from VH-1 to VH-7 is in the range of 60% to 91%.
- humanized antibody 1 in which VH-1 and VL-1 are combined (the heavy chain variable region is composed of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, and the light chain variable region is shown in SEQ ID NO: 15).
- a humanized antibody 2 in which VH-4 and VL-5 are combined (the heavy chain variable region has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 and the light chain variable region has the SEQ ID NO: 19)
- a humanized antibody 3 in which VH-4 and VL-2 are combined (the heavy chain variable region is composed of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11, and the light chain variable region is represented by SEQ ID NO: 16)
- humanized antibody 4 in which VH-4 and VL-3 are combined (the heavy chain variable region has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11, and the light chain variable region has the sequence number 7), humanized antibody 5 in which VH-4 and VL-4 are combined (the heavy chain variable region consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11, and the light chain variable region has the sequence Human
- Humanized antibody 7 comprising a combination of VH-6 and VL-5 (the heavy chain variable region is composed of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13, and the light chain variable region is composed of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19).
- a humanized antibody 8 comprising a combination of VH-2 and VL-5 (the heavy chain variable region is composed of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9, and the light chain variable region is composed of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19).
- a humanized antibody 9 comprising a combination of VH-3 and VL-5 (the heavy chain variable region is composed of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10, and the light chain variable region is composed of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19).
- the framework regions of humanized antibodies 1 to 10 designed in this way all corresponded to the above-mentioned sequence characteristics (A) to (I) in the range of 5 to 7 inclusive.
- each designed gene was incorporated into an expression vector, and a humanized antibody was obtained by a transient expression system using HEK293 cells.
- Table 3 shows the yield of each humanized antibody. The yield was calculated from the concentration and volume after purification with a Protein A column or after concentration of the culture supernatant by ultrafiltration.
- the thin line filled with the lower side shows the result when non-specific human IgG (control) was added, and the thick line not filled with the lower side added the humanized antibody or the mouse antibody.
- (A) shows the results for the mouse antibody
- (b) shows the results for the humanized antibody 3
- (c) shows the results for the humanized antibody 4
- (d) Results for humanized antibody 5 are shown
- (e) shows another result for mouse antibody
- (f) shows results for humanized antibody 6, and
- H shows the results for humanized antibody 8
- (i) shows the results for humanized antibody 9
- (j) shows the results for humanized antibody 1
- (K) shows the results for humanized antibody 2
- (m) shows the results for humanized antibody 10.
- the result about the humanized antibody 8 measured similarly from BxPC3 cell in place of SW1990 is shown in FIG.
- ADCC activity was measured for humanized antibody 1 and humanized antibody 10.
- 10 mL of ascites collected by a conventional method was applied to a protein A column (1 mL), and then thoroughly washed with 10 volumes of PBS. After elution with 1 mL of citrate buffer (pH 3.0), the solution was neutralized with Tris buffer (pH 7.0). The obtained antibody solution was treated with a G25 column (5 mL) for desalting to recover 1 mL. Diluted to each concentration for evaluation of ADCC activity.
- ADCC activity was determined by culturing human pancreatic cancer cell line BxPC3 cells (103) and human PBMC (5x104) in RPMI medium for 12 hours, and then measuring the amount of LDH in the culture supernatant with LDH Cytotoxicity Detection Kit (Takara Bio). The cytotoxic rate (%) was calculated by the following formula.
- IgG1 of a healthy person was used as a control antibody, and the ADCC activity of the humanized antibody was evaluated by taking a difference from the result of the control antibody.
- the present invention can be used in the field of antibody drug production and life science research.
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Abstract
フレームワーク領域が特定の配列的特徴を有するムチンサブタイプ5AC特異的ヒト化抗体、その抗原結合性断片、およびそれらの少なくとも何れかを含有するムチンサブタイプ5ACの異常発現を伴う疾患の治療用医薬組成物。
Description
本発明は、ムチンサブタイプ5AC特異的ヒト化抗体、その抗原結合性断片、およびそれらの少なくとも何れかを含有するムチンサブタイプ5ACの異常発現を伴う疾患の治療用医薬組成物に関するものである。
ムチンは、上皮細胞等から分泌される粘液の主成分である分子量が100万から1000万の巨大糖タンパク質である。現在、ムチンのサブタイプは21種類が知られている。このうちムチンサブタイプ5ACは、正常組織では胃および気管において分泌型ムチンとして発現している。これが、癌組織、例えば、膵臓癌の癌組織では、高頻度で、膜結合型ムチンとして発現していることが知られている(非特許文献1、2)。また、喘息の患者において、気道におけるムチンサプタイプ5ACの過剰分泌が、喘息の悪化につながることが知られている(非特許文献3)。
ムチンサブタイプ5ACに対するマウス抗体およびキメラ抗体については幾つかの報告があり(非特許文献4~7)、数十種類のマウス抗体が市販されている。
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臨床応用を考慮すれば、ムチンサブタイプ5AC特異的抗体をヒト化することは、非常に有益である。
ここで、マウス由来のモノクローナル抗体をヒト化する場合、相補性決定領域のみをマウス配列に置換するだけでは、一部の例外を除いてその抗原親和性が低下してしまうことは周知の事柄である(例えば、非特許文献8を参照)。そのため、ヒト化抗体のフレームワーク領域についても、一部の残基をマウス配列に置換することが行われる(非特許文献8~12)。このとき、フレームワーク領域における数残基の置換が親和性を数十倍変化させることがあるため、抗原に対して十分な親和性を有するヒト化抗体を作製し得るフレームワーク領域の配列を一つ見出すだけでも、非常に多数の試行錯誤が必要となる。
本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、ムチンサブタイプ5ACに対して十分な親和性を有するヒト化抗体およびその利用を提供することを主たる目的とする。
本発明者らは、鋭意検討の結果、独自の知見に基づき、特定の配列的特徴を有するフレームワーク領域を用いることによって、ヒト由来のフレームワーク領域を置換せずとも十分な抗原親和性を示すヒト化抗体が得られること、(2)それどころか、上記特定の配列的特徴を有するフレームワーク領域を用いれば、互いに異なるヒト由来のフレームワーク領域を有し、何れも十分な抗原親和性を示す何種類ものヒト化抗体が得られることを見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明に係るムチンサブタイプ5AC特異的ヒト化抗体、またはその抗原結合性断片は、重鎖相補性決定領域1が配列番号1に示されるアミノ酸配列からなり、重鎖相補性決定領域2が配列番号2に示されるアミノ酸配列からなり、重鎖相補性決定領域3が配列番号3に示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖相補性決定領域1が配列番号4に示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖相補性決定領域2が配列番号5に示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖相補性決定領域3が配列番号6に示されるアミノ酸配列からなり、(A)重鎖相補性決定領域1のC末端側に隣接する5残基のアミノ酸配列が、WVRQA(配列番号23)であるか;(B)重鎖相補性決定領域2のN末端側に隣接する3残基のアミノ酸配列が、WVSであるか;(C)重鎖相補性決定領域2のC末端側に隣接する3残基のアミノ酸配列が、RFTまたはRVTであるか;(D)重鎖相補性決定領域3のN末端側に隣接する3残基のアミノ酸配列が、CARであるか;(E)軽鎖相補性決定領域1のN末端側に隣接する3残基のアミノ酸配列が、ITCであるか;(F)軽鎖相補性決定領域2のN末端側に隣接する3残基のアミノ酸配列が、LIYであるか;(G)軽鎖相補性決定領域2のC末端側に隣接する4残基のアミノ酸配列が、GVPS(配列番号24)であるか;(H)軽鎖相補性決定領域3のN末端側に隣接する5残基のアミノ酸配列が、AVYYC(配列番号25)またはGVYYC(配列番号26)であるか;または(I)軽鎖相補性決定領域3のC末端側に隣接する3残基のアミノ酸配列が、FGQであることを特徴としている。
本発明に係る医薬組成物は、ムチンサブタイプ5ACの異常発現を伴う疾患の診断用または治療用の医薬組成物であって、本発明に係るムチンサブタイプ5AC特異的ヒト化抗体、またはその抗原結合性断片を含有することを特徴としている。
また、本発明に係るムチンサブタイプ5ACの異常発現を伴う疾患の治療方法は、本発明に係るムチンサブタイプ5AC特異的ヒト化抗体、またはその抗原結合性断片を、ムチンサブタイプ5ACの異常発現を伴う疾患の患者に投与する工程を包含することを特徴としている。
また、本発明に係るムチンサブタイプ5ACの異常発現を伴う疾患の診断方法は、被験者からの採取物中または被験者の体内に存在するムチンサブタイプ5ACを、本発明に係る記載のムチンサブタイプ5AC特異的ヒト化抗体、またはその抗原結合性断片を用いて検出する工程を包含することを特徴としている。
本発明によれば、ムチンサブタイプ5ACに対して十分な親和性を有するヒト化抗体、その抗原結合性断片、およびそれらの少なくとも何れかを含有するムチンサブタイプ5ACの異常発現を伴う疾患の治療用医薬組成物を提供することができる。
(ヒト化抗体)
本発明は、ムチンサブタイプ5AC特異的ヒト化抗体、またはその抗原結合性断片を提供する。
本発明は、ムチンサブタイプ5AC特異的ヒト化抗体、またはその抗原結合性断片を提供する。
本明細書において、「ヒト化抗体」とは、非ヒト由来の相補性決定領域を含み、ヒト由来のフレームワーク領域を少なくとも一部含む抗体を指す。ヒト化抗体のフレームワーク領域では、ヒト由来の部分が多いほど好ましく、50%以上であることがより好ましく、60%、70%、80%、90%、95%または99%以上であることがさらに好ましく、フレームワーク領域が100%ヒト由来であることが特に好ましい。
なお、相補性決定領域は、抗体の重鎖および軽鎖のそれぞれの可変領域に含まれ、超可変領域とも称される3つの領域であって、N末端側から、相補性決定領域1(CDR1)、相補性決定領域2(CDR2)、相補性決定領域3(CDR3)と称される。
また、フレームワーク領域は、可変領域において相補性決定領域に隣接する領域であり、N末端側から、フレームワーク領域1(FR1)、フレームワーク領域2(FR2)、フレームワーク領域3(FR3)、フレームワーク領域4(FR4)と称される。
また、本明細書において、「抗原結合性断片」とは、ムチンサブタイプ5ACに結合することができる抗体断片を指し、好ましくは、抗体の可変領域を含むものであり、例えば、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv断片、ディアボディー、単一鎖抗体分子等が挙げられる。このような抗原結合性断片は、例えば、抗体をペプシン又はパパイン等のタンパク質分解酵素によって消化し、精製することにより得てもよいし、遺伝子工学を用いて調製してもよい。
本発明の一実施形態に係るムチンサブタイプ5AC特異的ヒト化抗体は、重鎖可変領域が配列番号7に示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域が配列番号14に示されるアミノ酸配列からなるムチンサブタイプ5AC特異的マウス抗体をヒト化して得られるものである。
本実施形態に係るムチンサブタイプ5AC特異的ヒト化抗体において、重鎖相補性決定領域1は配列番号1に示されるアミノ酸配列からなり、重鎖相補性決定領域2は配列番号2に示されるアミノ酸配列からなり、重鎖相補性決定領域3は配列番号3に示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖相補性決定領域1は配列番号4に示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖相補性決定領域2は配列番号5に示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖相補性決定領域3は配列番号6に示されるアミノ酸配列からなる。
また、本実施形態に係るムチンサブタイプ5AC特異的ヒト化抗体の各フレームワーク領域は、(A)重鎖相補性決定領域1のC末端側に隣接する5残基のアミノ酸配列が、WVRQA(配列番号23)であるか;(B)重鎖相補性決定領域2のN末端側に隣接する3残基のアミノ酸配列が、WVSであるか;(C)重鎖相補性決定領域2のC末端側に隣接する3残基のアミノ酸配列が、RFTまたはRVTであるか;(D)重鎖相補性決定領域3のN末端側に隣接する3残基のアミノ酸配列が、CARであるか;(E)軽鎖相補性決定領域1のN末端側に隣接する3残基のアミノ酸配列が、ITCであるか;(F)軽鎖相補性決定領域2のN末端側に隣接する3残基のアミノ酸配列が、LIYであるか;(G)軽鎖相補性決定領域2のC末端側に隣接する4残基のアミノ酸配列が、GVPS(配列番号24)であるか;(H)軽鎖相補性決定領域3のN末端側に隣接する5残基のアミノ酸配列が、AVYYC(配列番号25)またはGVYYC(配列番号26)であるか;または(I)軽鎖相補性決定領域3のC末端側に隣接する3残基のアミノ酸配列が、FGQであるものであり、より好ましくは(A)~(I)の五つ以上に該当しているものであり得、特に好ましくは、五つ以上七つ以下に該当しているものであり得る。このような特定の配列的特徴を有するフレームワーク領域を用いることによって、ヒト由来のフレームワーク領域を殆どまたは全く置換せずとも十分な抗原親和性を示すヒト化抗体が得られる。また、上述した配列的特徴を有するフレームワーク領域を用いれば、互いに異なるヒト由来のフレームワーク領域を有し、何れも十分な抗原親和性を示す何種類ものヒト化抗体が得られる。
また、より好ましくは、本実施形態に係るムチンサブタイプ5AC特異的ヒト化抗体は、上記ムチンサブタイプ5AC特異的マウス抗体と、相補性決定領域に隣接する特定のアミノ酸配列が共通している。具体的には、(J)重鎖相補性決定領域1のC末端側に隣接する4残基のアミノ酸配列が、WVRQ(配列番号27)であり、(K)重鎖相補性決定領域2のC末端側に隣接する1残基のアミノ酸配列が、Rであり、(L)軽鎖相補性決定領域1のN末端側に隣接する1残基のアミノ酸配列が、Cであり、(M)軽鎖相補性決定領域1のC末端側に隣接する1残基のアミノ酸配列が、Wであり、(N)軽鎖相補性決定領域2のN末端側に隣接する1残基のアミノ酸配列が、Yであり、(O)軽鎖相補性決定領域2のC末端側に隣接する1残基のアミノ酸配列が、Gであり、(P)軽鎖相補性決定領域3のN末端側に隣接する3残基のアミノ酸配列が、YYCであり、(Q)軽鎖相補性決定領域3のC末端側に隣接する1残基のアミノ酸配列が、FGQGTK(配列番号28)であり得る。このような配列的特徴を有するヒト化抗体を作製することにより、ムチンサブタイプ5ACに対する十分な親和性を有するヒト化抗体をより効率よく得ることができる。
なお、重鎖可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸配列は、実施例に記載のヒト化抗体1~9の重鎖可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸配列、すなわち、配列番号8から13の何れか一つに示されるアミノ酸配列の1から30番目、36から49番目、67から98番目および111から121番目に対して、58%以上の同一性を有することが好ましい。より好ましくは、重鎖可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸配列は、配列番号8から13の何れか一つに示されるアミノ酸配列の1から30番目、36から49番目、67から98番目および111から121番目に対して、70%、80%、90%、95%または99%以上の同一性を有することが好ましく、100%の同一性を有していることが特に好ましい。
なお、重鎖可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸配列は、ヒト由来のアミノ酸配列から、相補性決定領域に隣接するアミノ酸残基が上述した特徴を満たすものを選択することが好ましいが、ヒト由来のアミノ酸配列を適宜置換したものであってもよい。例えば、上記ムチンサブタイプ5AC特異的マウス抗体の重鎖可変領域の42から45番目のアミノ酸配列によって、ヒト化抗体の対応するアミノ酸配列を置換するものであってもよい。
また、軽鎖可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸配列は、実施例に記載のヒト化抗体1~9の軽鎖可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸配列、すなわち、配列番号15から21の何れか一つに示されるアミノ酸配列の1から23番目、39から53番目、61から92番目および102から111番目に対して、60%以上の同一性を有することが好ましい。より好ましくは、軽鎖可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸配列は、配列番号15から21の何れか一つに示されるアミノ酸配列の1から23番目、39から53番目、61から92番目および102から111番目に対して、70%、80%、90%、95%または99%以上の同一性を有することが好ましく、100%の同一性を有していることが特に好ましい。
軽鎖可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸配列も、同様に、ヒト由来のアミノ酸配列から、相補性決定領域に隣接するアミノ酸残基が上述した特徴を満たすものを選択することが好ましいが、ヒト由来のアミノ酸配列を適宜置換したものであってもよい。
このような相補性決定領域およびフレームワーク領域を備えたヒト化抗体は、実施例に示すように、ムチンサブタイプ5ACに対する十分な親和性を有する。本実施形態に係るムチンサブタイプ5AC特異的ヒト化抗体の親和定数は、特に限定されるものではないが、105以上109M-1以下の範囲の親和定数を有するものが好ましく、より好ましくは106以上の親和定数を有するものであり得る。なお、親和性は、例えば、Munson et al., Anal. Biochem. 107:220 (1980)のスキャッチャード(Scatchard)アッセイにより測定することができる。
抗体のアイソタイプは、特に限定されず、IgG(IgG1、IgG2、IgG3、及びIgG4)、IgM、IgA、IgD及びIgEの何れであってもよい。ADCC(Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity)を誘導する観点からは、IgG(IgG1、IgG2、IgG3、及びIgG4)が好ましい。
本実施形態に係るムチンサブタイプ5AC特異的ヒト化抗体は、上述したように設計したアミノ酸配列に基づいて作製したヒト化抗体遺伝子を、定法によって、発現ベクターに組み込み、宿主細胞へ導入し、ヒト化抗体を発現させ、タンパク質を回収し、精製することによって得ることができる。用いる宿主細胞としては、抗体または抗体を含有する融合蛋白質等の発現に適合する細胞であれば、特に限定されないが、例えば、細菌(例えば、大腸菌)、放線菌、酵母、又は昆虫細胞(例えば、SF9)、好ましくは、哺乳類細胞(例えば、COS-1、CHO、又はミエローマ細胞)を挙げることができる。具体的には、マウスミエローマ細胞Sp2-O-ag14(ATCC CRL1581)又はハムスター卵巣細胞CHOを用い、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、カチオニックリボソームを用いた方法、エレクトロポレーション法、又はリポフェクション法で、ベクターを宿主細胞に導入することができる。
(エピトープ)
なお、本実施形態に係るムチンサブタイプ5AC特異的ヒト化抗体のエピトープは、配列番号22に示されるアミノ酸配列からなる、ムチンサブタイプ5ACの部分ペプチドに存在する。
なお、本実施形態に係るムチンサブタイプ5AC特異的ヒト化抗体のエピトープは、配列番号22に示されるアミノ酸配列からなる、ムチンサブタイプ5ACの部分ペプチドに存在する。
(ADCC活性)
本実施形態に係るムチンサブタイプ5AC特異的ヒト化抗体は、ADCC活性を有し得る。IgGアイソタイプのFc領域は、エフェクター細胞のFc受容体に結合し、エフェクター細胞を活性化することによって、抗体の可変領域が結合した標的細胞または病原体を障害することができる。エフェクター細胞としては、T細胞、NK細胞、好中球、およびマクロファージを挙げることができ、これらのエフェクター細胞は、細胞障害性の物質を放出することなどにより抗体の結合した標的細胞または病原体を障害する。IgGのIgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4の4つのサブクラスのうち、IgG1およびIgG3が強いADCC活性を示すことがわかっており、ADCC活性を示すためには、本実施形態に係るムチンサブタイプ5AC特異的ヒト化抗体は、IgG1またはIgG3の定常領域を含んでいることが好ましい。
本実施形態に係るムチンサブタイプ5AC特異的ヒト化抗体は、ADCC活性を有し得る。IgGアイソタイプのFc領域は、エフェクター細胞のFc受容体に結合し、エフェクター細胞を活性化することによって、抗体の可変領域が結合した標的細胞または病原体を障害することができる。エフェクター細胞としては、T細胞、NK細胞、好中球、およびマクロファージを挙げることができ、これらのエフェクター細胞は、細胞障害性の物質を放出することなどにより抗体の結合した標的細胞または病原体を障害する。IgGのIgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4の4つのサブクラスのうち、IgG1およびIgG3が強いADCC活性を示すことがわかっており、ADCC活性を示すためには、本実施形態に係るムチンサブタイプ5AC特異的ヒト化抗体は、IgG1またはIgG3の定常領域を含んでいることが好ましい。
本発明のヒト化抗体のADCCの標的細胞は、ムチンサブタイプ5ACを異常発現している細胞であれば、特に限定されるものではないが、例えば癌細胞であり、膀胱癌、乳癌、結腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、小細胞肺癌、食道癌、胆嚢癌、卵巣癌、膵臓癌、胃癌、子宮頸部癌、甲状腺癌、前立腺癌、扁平上皮癌、皮膚癌、骨癌、リンパ腫、白血病及び脳腫瘍の細胞を挙げることができる。特には膵臓癌、肺癌、乳癌、胃癌、子宮頸癌、および大腸癌の細胞を挙げることができる。
(医薬組成物および治療方法)
本発明の一実施形態に係る医薬組成物は、本発明の一実施形態に係るムチンサブタイプ5AC特異的ヒト化抗体および/またはその抗原結合性断片を含む。また、本発明の一実施形態に係る治療方法は、本発明の一実施形態に係るムチンサブタイプ5AC特異的ヒト化抗体および/またはその抗原結合性断片を患者に投与する工程を含む。本実施形態に係る治療方法は、本実施形態に係る医薬組成物を患者に投与する工程を含んでもよい。
本発明の一実施形態に係る医薬組成物は、本発明の一実施形態に係るムチンサブタイプ5AC特異的ヒト化抗体および/またはその抗原結合性断片を含む。また、本発明の一実施形態に係る治療方法は、本発明の一実施形態に係るムチンサブタイプ5AC特異的ヒト化抗体および/またはその抗原結合性断片を患者に投与する工程を含む。本実施形態に係る治療方法は、本実施形態に係る医薬組成物を患者に投与する工程を含んでもよい。
本実施形態に係る医薬組成物は、薬剤学的に許容することのできる通常の担体または希釈剤等を含んでいてもよい。
本実施形態に係る医薬組成物は、ムチンサブタイプ5ACの異常発現を伴う疾患の治療が必要な患者に、有効量で投与することができる。例えば、本発明の一実施形態に係るムチンサブタイプ5AC特異的ヒト化抗体および/またはその抗原結合性断片単独で、または、薬剤学的に許容することのできる担体もしくは希釈剤と共に患者に投与され、ムチンサブタイプ5ACを異常発現する細胞(例えば、癌細胞)の生体内での増殖を抑制することにより、癌、特には、膵臓癌を治療することができる。また、喘息においては、細胞内でのムチンサブタイプ5ACの発現を抑制し、ムチンサブタイプ5ACの分泌を抑制することにより、症状を改善することができる。
本実施形態に係る医薬組成物および治療方法の治療対象となる疾患は、ムチンサブタイプ5ACの異常発現を伴う疾患であり、具体的には癌および喘息を挙げることができる。癌の種類は、特に限定されることはないが、例えば、膀胱癌、乳癌、結腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、小細胞肺癌、食道癌、胆嚢癌、卵巣癌、膵臓癌、胃癌、子宮頸部癌、甲状腺癌、前立腺癌、扁平上皮癌、皮膚癌、骨癌、リンパ腫、白血病および脳腫瘍を挙げることができる。本発明の医薬組成物は、特には膵臓癌、肺癌、乳癌、胃癌、子宮頸癌、および大腸癌を効率よく治療することができる。
なお、本実施形態に係る医薬組成物を投与する患者および治療方法を適用する患者は、ヒトまたは非ヒトであり得る。
一つの局面において、本実施形態に係る医薬組成物は、ADCCを誘導することによって癌の治療を行うものである。このような医薬組成物は、IgGアイソタイプのFc領域を有するムチンサブタイプ5AC特異的ヒト化抗体および/またはその抗原結合性断片を含有していることが好ましい。
他の局面において、本実施形態に係る医薬組成物は、ムチンサブタイプ5AC特異的ヒト化抗体および/またはその抗原結合性断片にアイソトープ(例えば、90Y、111In等)を標識したものを含むこともできる。アイソトープで標識されたヒト化抗体等は、ムチンサブタイプ5ACの異常発現した標的細胞に結合し、アイソトープからの放射線によって、標的細胞を障害する。
医薬組成物に含まれるヒト化抗体は、もとのマウスモノクローナル抗体、またはキメラ抗体と比較して、ヒトの治療の観点から有利である。第一に、ADCCまたは補体依存性細胞障害(CDC)活性を有する場合は、抗体のエフェクターとして働く領域がヒト抗体であるため、効率的である。第二に、ヒト化抗体のフレームワーク領域、および定常領域がヒトの免疫系から異物として認識されないため、マウスモノクローナル抗体およびキメラ抗体と比較して、投与されたヒト抗体に対する免疫応答が少ない。第三に、ヒト体内での半減期が、通常のヒト抗体に近い半減期を有すると考えられ、マウスモノクローナル抗体およびキメラ抗体と比較して、投与量を減少させることが可能である。
特に、可変領域のアミノ酸配列が互いに異なるムチンサブタイプ5AC特異的ヒト化抗体、またはその抗原結合性断片を二種類以上含有している医薬組成物は、個々のヒト化抗体等の投与量をそれぞれ低減することができるため、例え、免疫応答を引き起こすヒト化抗体等を含んでいたとしても、生じる免疫応答を抑制することができるため好ましい。
本実施形態に係る医薬組成物の投与剤型としては、特に限定がなく、例えば、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン剤、シロップ剤、エキス剤、若しくは丸剤等の経口剤、または注射剤、外用液剤、軟膏剤、坐剤、局所投与のクリーム、若しくは点眼薬などの非経口剤を挙げることができる。
前記経口剤は、例えば、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、澱粉、コーンスターチ、白糖、乳糖、ぶどう糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、デキストリン、ポリビニルピロリドン、結晶セルロース、大豆レシチン、ショ糖、脂肪酸エステル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、ケイ酸マグネシウム、無水ケイ酸、または合成ケイ酸アルミニウムなどの賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、希釈剤、保存剤、着色剤、香料、矯味剤、安定化剤、保湿剤、防腐剤、または酸化防止剤等を用いて、常法に従って製造することができる。
非経口投与方法としては、注射(皮下、静脈内等)、または直腸投与等が例示される。これらのなかで、注射剤が最も好適に用いられる。例えば、注射剤の調製においては、ヒト化抗体の他に、例えば、生理食塩水若しくはリンゲル液等の水溶性溶剤、植物油若しくは脂肪酸エステル等の非水溶性溶剤、ブドウ糖若しくは塩化ナトリウム等の等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、懸濁化剤、または乳化剤などを任意に用いることができる。また、本発明の医薬組成物は、徐放性ポリマーなどを用いた徐放性製剤の手法を用いて投与してもよい。例えば、本発明の医薬組成物をエチレンビニル酢酸ポリマーのペレットに取り込ませて、このペレットを治療または予防すべき組織中に外科的に移植することができる。
本実施形態に係る医薬組成物は、これに限定されるものではないが、0.01~99重量%、好ましくは0.1~80重量%の量で、ヒト化抗体、または抗原結合性断片を含有することができる。本実施形態に係る医薬組成物を用いる場合、および本実施形態に係る治療方法を行う場合の投与量は、例えば、病気の種類、患者の年齢、性別、体重、症状の程度、または投与方法などに応じて適宜決定することができ、経口的にまたは非経口的に投与することが可能である。なお、ヒトへの医薬組成物の投与方法、投与量、投与期間、および投与間隔等は、管理された臨床治験によって決定されることが望ましい。
また、本実施形態に係る医薬組成物は、治療に先立ってあるいは治療とは別に、ムチンサブタイプ5ACの異常発現の診断もしくは検査にも用いることができる。例えば、患者の血液中におけるムチンサブタイプ5ACの濃度等の測定に本実施形態に係る医薬組成物を用いることで、ムチンサブタイプ5ACの異常発現を伴う疾患を診断(検査)することができる。言い換えれば、本実施形態に係る診断方法は、被験者からの採取物中または被験者の体内に存在するムチンサブタイプ5ACを、本実施形態に係るムチンサブタイプ5AC特異的ヒト化抗体、またはその抗原結合性断片を用いて検出する工程を包含し、その検出結果に基づいて、ムチンサブタイプ5ACの異常発現を伴う疾患を診断(検査)することができる。すなわち、本実施形態に係るムチンサブタイプ5AC特異的ヒト化抗体、またはその抗原結合性断片は、被験者から採血、バイオプシー等により得られた採取物の診断に用い得る他、放射性物質や蛍光物質等により標識した抗体を用いた、いわゆる体内診断と称される方法により、膵癌の局在、質的診断(特に腫瘤形成性膵炎等の良性疾患との鑑別)等を行うために好適に用い得る。
(まとめ)
以上のように、本発明に係るムチンサブタイプ5AC特異的ヒト化抗体、またはその抗原結合性断片は、重鎖相補性決定領域1が配列番号1に示されるアミノ酸配列からなり、重鎖相補性決定領域2が配列番号2に示されるアミノ酸配列からなり、重鎖相補性決定領域3が配列番号3に示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖相補性決定領域1が配列番号4に示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖相補性決定領域2が配列番号5に示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖相補性決定領域3が配列番号6に示されるアミノ酸配列からなり、(A)重鎖相補性決定領域1のC末端側に隣接する5残基のアミノ酸配列が、WVRQA(配列番号23)であるか;(B)重鎖相補性決定領域2のN末端側に隣接する3残基のアミノ酸配列が、WVSであるか;(C)重鎖相補性決定領域2のC末端側に隣接する3残基のアミノ酸配列が、RFTまたはRVTであるか;(D)重鎖相補性決定領域3のN末端側に隣接する3残基のアミノ酸配列が、CARであるか;(E)軽鎖相補性決定領域1のN末端側に隣接する3残基のアミノ酸配列が、ITCであるか;(F)軽鎖相補性決定領域2のN末端側に隣接する3残基のアミノ酸配列が、LIYであるか;(G)軽鎖相補性決定領域2のC末端側に隣接する4残基のアミノ酸配列が、GVPS(配列番号24)であるか;(H)軽鎖相補性決定領域3のN末端側に隣接する5残基のアミノ酸配列が、AVYYC(配列番号25)またはGVYYC(配列番号26)であるか;または(I)軽鎖相補性決定領域3のC末端側に隣接する3残基のアミノ酸配列が、FGQであることを特徴としている。
以上のように、本発明に係るムチンサブタイプ5AC特異的ヒト化抗体、またはその抗原結合性断片は、重鎖相補性決定領域1が配列番号1に示されるアミノ酸配列からなり、重鎖相補性決定領域2が配列番号2に示されるアミノ酸配列からなり、重鎖相補性決定領域3が配列番号3に示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖相補性決定領域1が配列番号4に示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖相補性決定領域2が配列番号5に示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖相補性決定領域3が配列番号6に示されるアミノ酸配列からなり、(A)重鎖相補性決定領域1のC末端側に隣接する5残基のアミノ酸配列が、WVRQA(配列番号23)であるか;(B)重鎖相補性決定領域2のN末端側に隣接する3残基のアミノ酸配列が、WVSであるか;(C)重鎖相補性決定領域2のC末端側に隣接する3残基のアミノ酸配列が、RFTまたはRVTであるか;(D)重鎖相補性決定領域3のN末端側に隣接する3残基のアミノ酸配列が、CARであるか;(E)軽鎖相補性決定領域1のN末端側に隣接する3残基のアミノ酸配列が、ITCであるか;(F)軽鎖相補性決定領域2のN末端側に隣接する3残基のアミノ酸配列が、LIYであるか;(G)軽鎖相補性決定領域2のC末端側に隣接する4残基のアミノ酸配列が、GVPS(配列番号24)であるか;(H)軽鎖相補性決定領域3のN末端側に隣接する5残基のアミノ酸配列が、AVYYC(配列番号25)またはGVYYC(配列番号26)であるか;または(I)軽鎖相補性決定領域3のC末端側に隣接する3残基のアミノ酸配列が、FGQであることを特徴としている。
上記ムチンサブタイプ5AC特異的ヒト化抗体、またはその抗原結合性断片は、上記(A)から(I)の少なくとも五つに該当していることが好ましい。
上記ムチンサブタイプ5AC特異的ヒト化抗体、またはその抗原結合性断片は、重鎖相補性決定領域1のC末端側に隣接する4残基のアミノ酸配列が、WVRQ(配列番号27)であり、重鎖相補性決定領域2のC末端側に隣接する1残基のアミノ酸配列が、Rであり、軽鎖相補性決定領域1のN末端側に隣接する1残基のアミノ酸配列が、Cであり、軽鎖相補性決定領域1のC末端側に隣接する1残基のアミノ酸配列が、Wであり、軽鎖相補性決定領域2のN末端側に隣接する1残基のアミノ酸配列が、Yであり、軽鎖相補性決定領域2のC末端側に隣接する1残基のアミノ酸配列が、Gであり、軽鎖相補性決定領域3のN末端側に隣接する3残基のアミノ酸配列が、YYCであり、軽鎖相補性決定領域3のC末端側に隣接する1残基のアミノ酸配列が、FGQGTK(配列番号28)であることが好ましい。
上記ムチンサブタイプ5AC特異的ヒト化抗体、またはその抗原結合性断片は、重鎖可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸配列が、配列番号8から13の何れか一つに示されるアミノ酸配列の1から30番目、36から49番目、67から98番目および111から121番目に対して、58%以上の同一性を有し、軽鎖可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸配列が、配列番号15から21の何れか一つに示されるアミノ酸配列の1から23番目、39から53番目、61から92番目および102から111番目に対して、60%以上の同一性を有することが好ましく、重鎖可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸配列が、配列番号8から13の何れか一つに示されるアミノ酸配列の1から30番目、36から49番目、67から98番目および111から121番目に対して、90%以上の同一性を有し、軽鎖可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸配列が、配列番号15から21の何れか一つに示されるアミノ酸配列の1から23番目、39から53番目、61から92番目および102から111番目に対して、90%以上の同一性を有することがより好ましい。
本発明に係る医薬組成物は、ムチンサブタイプ5ACの異常発現を伴う疾患の診断用または治療用の医薬組成物であって、本発明に係るムチンサブタイプ5AC特異的ヒト化抗体、またはその抗原結合性断片を含有することを特徴としている。
上記医薬組成物では、上記疾患が、癌または喘息であることが好ましく、上記癌が、膵臓癌、肺癌、乳癌、胃癌、子宮頸癌、または大腸癌であることがより好ましい。
また、本発明に係る医薬組成物は、可変領域のアミノ酸配列が互いに異なる、本発明に係るムチンサブタイプ5AC特異的ヒト化抗体、またはその抗原結合性断片を二種類以上含有していることが好ましい。
また、本発明に係るムチンサブタイプ5ACの異常発現を伴う疾患の治療方法は、本発明に係るムチンサブタイプ5AC特異的ヒト化抗体、またはその抗原結合性断片を、ムチンサブタイプ5ACの異常発現を伴う疾患の患者に投与する工程を包含することを特徴としている。
上記治療方法では、上記疾患が、癌または喘息であることが好ましく、上記癌が、膵臓癌、肺癌、乳癌、胃癌、子宮頸癌、または大腸癌であることがより好ましい。
また、本発明に係る治療方法では、上記工程において、可変領域のアミノ酸配列が互いに異なる、上記ムチンサブタイプ5AC特異的ヒト化抗体、またはその抗原結合性断片を二種類以上、上記患者に投与することが好ましい。
また、本発明に係るムチンサブタイプ5ACの異常発現を伴う疾患の診断方法は、被験者からの採取物中または被験者の体内に存在するムチンサブタイプ5ACを、本発明に係る記載のムチンサブタイプ5AC特異的ヒト化抗体、またはその抗原結合性断片を用いて検出する工程を包含することを特徴としている。
以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが参考として援用される。
(ヒト化抗体の作製)
重鎖可変領域が配列番号7に示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域が配列番号14に示されるアミノ酸配列からなるムチンサブタイプ5AC特異的マウス抗体をヒト由来のフレームワーク領域のアミノ酸配列を用いてヒト化した。なお、このムチンサブタイプ5AC特異的マウス抗体は、非特許文献4に記載されているものであり、当該マウス抗体から作製したキメラ抗体がADCC活性を有することが知られている(非特許文献4を参照)。
重鎖可変領域が配列番号7に示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域が配列番号14に示されるアミノ酸配列からなるムチンサブタイプ5AC特異的マウス抗体をヒト由来のフレームワーク領域のアミノ酸配列を用いてヒト化した。なお、このムチンサブタイプ5AC特異的マウス抗体は、非特許文献4に記載されているものであり、当該マウス抗体から作製したキメラ抗体がADCC活性を有することが知られている(非特許文献4を参照)。
まず、上記ムチンサブタイプ5AC特異的マウス抗体の配列情報から、配列番号1に示される重鎖相補性決定領域1のアミノ酸配列、配列番号2に示される重鎖相補性決定領域2のアミノ酸配列、配列番号3に示される重鎖相補性決定領域3のアミノ酸配列、配列番号4に示される軽鎖相補性決定領域1のアミノ酸配列、配列番号5に示される軽鎖相補性決定領域2のアミノ酸配列、および配列番号6に示される軽鎖相補性決定領域3のアミノ酸配列をそれぞれ抽出した。
また、(A)重鎖相補性決定領域1のC末端側に隣接する5残基のアミノ酸配列が、WVRQA(配列番号23)であるか;(B)重鎖相補性決定領域2のN末端側に隣接する3残基のアミノ酸配列が、WVSであるか;(C)重鎖相補性決定領域2のC末端側に隣接する3残基のアミノ酸配列が、RFTまたはRVTであるか;(D)重鎖相補性決定領域3のN末端側に隣接する3残基のアミノ酸配列が、CARであるか;(E)軽鎖相補性決定領域1のN末端側に隣接する3残基のアミノ酸配列が、ITCであるか;(F)軽鎖相補性決定領域2のN末端側に隣接する3残基のアミノ酸配列が、LIYであるか;(G)軽鎖相補性決定領域2のC末端側に隣接する4残基のアミノ酸配列が、GVPS(配列番号24)であるか;(H)軽鎖相補性決定領域3のN末端側に隣接する5残基のアミノ酸配列が、AVYYC(配列番号25)またはGVYYC(配列番号26)であるか;または(I)軽鎖相補性決定領域3のC末端側に隣接する3残基のアミノ酸配列が、FGQであるという配列的特徴を有するヒト抗体、EU、KOL、NMEM、LAY、LEN、REI等の配列情報から、フレームワーク領域および定常領域のアミノ酸配列を抽出した。なお、KOLから取得したフレームワーク領域のアミノ酸配列については、42から45番目のアミノ酸配列をマウス抗体由来のものに置換した。
また、別の観点から述べれば、本実施例では、相補性決定領域に隣接する特定のアミノ酸配列が、上記ムチンサブタイプ5AC特異的マウス抗体と同一であるようなヒト由来のフレームワーク領域を用いた。具体的には、(J)重鎖相補性決定領域1のC末端側に隣接する4残基のアミノ酸配列が、WVRQ(配列番号27)であり、(K)重鎖相補性決定領域2のC末端側に隣接する1残基のアミノ酸配列が、Rであり、(L)軽鎖相補性決定領域1のN末端側に隣接する1残基のアミノ酸配列が、Cであり、(M)軽鎖相補性決定領域1のC末端側に隣接する1残基のアミノ酸配列が、Wであり、(N)軽鎖相補性決定領域2のN末端側に隣接する1残基のアミノ酸配列が、Yであり、(O)軽鎖相補性決定領域2のC末端側に隣接する1残基のアミノ酸配列が、Gであり、(P)軽鎖相補性決定領域3のN末端側に隣接する3残基のアミノ酸配列が、YYCであり、(Q)軽鎖相補性決定領域3のC末端側に隣接する1残基のアミノ酸配列が、FGQGTK(配列番号28)であるという配列的特徴を有するヒト由来のフレームワーク領域を用いた。
そして、上述したマウス由来の相補性決定領域とヒト由来のフレームワーク領域とを組み合わせることにより、ヒト化抗体を設計した。
まず、ヒト化抗体重鎖として、重鎖可変領域が配列番号8に示されるアミノ酸配列からなるVH-1、重鎖可変領域が配列番号9に示されるアミノ酸配列からなるVH-2、重鎖可変領域が配列番号10に示されるアミノ酸配列からなるVH-3、重鎖可変領域が配列番号11に示されるアミノ酸配列からなるVH-4、重鎖可変領域が配列番号12に示されるアミノ酸配列からなるVH-5、重鎖可変領域が配列番号13に示されるアミノ酸配列からなるVH-6をそれぞれ設計した。
図1(a)に、VH-1~VH-6のそれぞれの配列を示す。図1(a)において、下線部は相補性決定領域を示しており、重鎖可変領域の1から30番目のアミノ酸配列がフレームワーク領域1に、36から49番目のアミノ酸配列がフレームワーク領域2に、67から98番目のアミノ酸配列がフレームワーク領域3に、111から121番目のアミノ酸配列がフレームワーク領域4にそれぞれ対応する。
図1(a)における点線部が示すように、VH-1は(A)、(C)および(D)の配列的特徴を、VH-2は(A)および(C)の配列的特徴を、VH-3は(C)および(D)の配列的特徴を、VH-4は(A)~(C)の配列的特徴を、VH-5は(A)~(D)の配列的特徴を、VH-6は(A)~(D)の配列的特徴をそれぞれを有している。
また、VH-1~VH-6は何れも(J)および(K)の配列的特徴を有している。言い換えれば、図1(a)における下向きの角括弧が示すように、重鎖可変領域における第31~39番目のアミノ酸配列は、上記ムチンサブタイプ5AC特異的マウス抗体およびVH-1~VH-6に共通して配列番号29に示されるアミノ鎖配列からなり、第50~67番目のアミノ酸配列は、VH-1~VH-6に共通して配列番号30に示されるアミノ鎖配列からなり、第99~110番目のアミノ酸配列は、VH-1~VH-6に共通して配列番号31に示されるアミノ鎖配列からなる。これら配列番号29~31に示されるアミノ酸配列は、上記ムチンサブタイプ5AC特異的マウス抗体の重鎖可変領域にも同様に含まれている。
さらに、VH-1~VH-6では、共通して、重鎖可変領域における第2番目のアミノ酸残基がVであり、第3番目のアミノ酸残基がQであり、第4番目のアミノ酸残基がLであり、第7番目のアミノ酸残基がSであり、第8番目のアミノ酸残基がGであり、第14番目のアミノ酸残基がPであり、第17番目のアミノ酸残基がSであり、第18番目のアミノ酸残基がLであり、第22番目のアミノ酸残基がCであり、第25番目のアミノ酸残基がSであり、第26番目のアミノ酸残基がGであり、第29番目のアミノ酸残基がFであり、第41番目のアミノ酸残基がPであり、第43番目のアミノ酸残基がKであり、第45番目のアミノ酸残基がLであり、第46番目のアミノ酸残基がEであり、第47番目のアミノ酸残基がWであり、第69番目のアミノ酸残基がTであり、第73番目のアミノ酸残基がDであり、第77番目のアミノ酸残基がNであり、第82番目のアミノ酸残基がQであり、第83番目のアミノ酸残基がMであり、第85番目のアミノ酸残基がSであり、第90番目のアミノ酸残基がDであり、第91番目のアミノ酸残基がTであり、第94番目のアミノ酸残基がYであり、第97番目のアミノ酸残基がCであり、第98番目のアミノ酸残基がAであり、第114番目のアミノ酸残基がGであり、第117番目のアミノ酸残基がVであり、第118番目のアミノ酸残基がTであり、第119番目のアミノ酸残基がVであり、第120番目のアミノ酸残基がSであり、第121番目のアミノ酸残基がSである。
また、ヒト化抗体軽鎖として、軽鎖可変領域が配列番号15に示されるアミノ酸配列からなるVL-1、軽鎖可変領域が配列番号16に示されるアミノ酸配列からなるVL-2、軽鎖可変領域が配列番号17に示されるアミノ酸配列からなるVL-3、軽鎖可変領域が配列番号18に示されるアミノ酸配列からなるVL-4、軽鎖可変領域が配列番号19に示されるアミノ酸配列からなるVL-5、軽鎖可変領域が配列番号20に示されるアミノ酸配列からなるVL-6、軽鎖可変領域が配列番号21に示されるアミノ酸配列からなるVL-7をそれぞれ設計した。
図1(b)に、VL-1~VL-7のそれぞれの配列を示す。図1(b)において、下線部は相補性決定領域を示しており、軽鎖可変領域の1から23番目のアミノ酸配列がフレームワーク領域1に、39から53番目のアミノ酸配列がフレームワーク領域2に、61から92番目のアミノ酸配列がフレームワーク領域3に、102から111番目のアミノ酸配列がフレームワーク領域4にそれぞれ対応する。
図1(b)における点線部が示すように、VL-1は(F)、(H)および(I)の配列的特徴を、VL-2は(E)、(G)および(I)の配列的特徴を、VL-3は(E)~(G)および(I)の配列的特徴を、VL-4は(E)~(G)および(I)の配列的特徴を、VL-5は(F)、(H)および(I)の配列的特徴を、VL-6は(F)、(H)および(I)の配列的特徴を、VL-7は(F)、(H)および(I)の配列的特徴をそれぞれを有している。
また、VH-1~VH-6は何れも(J)~(Q)の配列的特徴を有している。言い換えれば、図1(b)における下向きの角括弧が示すように、軽鎖可変領域における第23~39番目のアミノ酸配列は、VL-1~VL-7に共通して配列番号32に示されるアミノ鎖配列からなり、第53~61番目のアミノ酸配列は、VL-1~VL-7に共通して配列番号33に示されるアミノ鎖配列からなり、第90~107番目のアミノ酸配列は、VL-1~VL-7に共通して配列番号34に示されるアミノ鎖配列からなる。これら配列番号32~34に示されるアミノ酸配列は、上記ムチンサブタイプ5AC特異的マウス抗体の軽鎖可変領域にも同様に含まれている。
さらに、VL-1~VL-7では、共通して、軽鎖可変領域における第1番目のアミノ酸残基がDであり、第2番目のアミノ酸残基がIであり、第5番目のアミノ酸残基がTであり、第6番目のアミノ酸残基がQであり、第8番目のアミノ酸残基がPであり、第16番目のアミノ酸残基がGであり、第42番目のアミノ酸残基がQであり、第44番目のアミノ酸残基がPであり、第45番目のアミノ酸残基がGであり、第48番目のアミノ酸残基がPであり、第50番目のアミノ酸残基がLであり、第51番目のアミノ酸残基がLであり、第63番目のアミノ酸残基がPであり、第65番目のアミノ酸残基がRであり、第66番目のアミノ酸残基がFであり、第68番目のアミノ酸残基がGであり、第69番目のアミノ酸残基がSであり、第70番目のアミノ酸残基がGであり、第72番目のアミノ酸残基がGであり、第73番目のアミノ酸残基がTであり、第76番目のアミノ酸残基がTであり、第79番目のアミノ酸残基がIであり、第80番目のアミノ酸残基がSであり、第86番目のアミノ酸残基がDである。
また、VH-1からVH-6のフレームワーク領域における互いの同一性を表1にまとめる。また、VL-1からVL-7のフレームワーク領域における互いの同一性を表2にまとめる。表1に示すように、VH-1からVH-6のフレームワーク領域のアミノ酸配列の同一性は、58%から94%の範囲にある。また、表2に示すように、VH-1からVH-7のフレームワーク領域のアミノ酸配列の同一性は、60%から91%の範囲にある。
そして、最終的に、VH-1とVL-1とを組み合わせたヒト化抗体1(重鎖可変領域が、配列番号8に示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域が、配列番号15に示されるアミノ酸配列からなる)、およびVH-4とVL-5とを組み合わせたヒト化抗体2(重鎖可変領域が、配列番号11に示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域が、配列番号19に示されるアミノ酸配列からなる)、VH-4とVL-2とを組み合わせたヒト化抗体3(重鎖可変領域が、配列番号11に示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域が、配列番号16に示されるアミノ酸配列からなる)、VH-4とVL-3とを組み合わせたヒト化抗体4(重鎖可変領域が、配列番号11に示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域が、配列番号17に示されるアミノ酸配列からなる)、VH-4とVL-4とを組み合わせたヒト化抗体5(重鎖可変領域が、配列番号11に示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域が、配列番号18に示されるアミノ酸配列からなる)、VH-5とVL-5とを組み合わせたヒト化抗体6(重鎖可変領域が、配列番号12に示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域が、配列番号19に示されるアミノ酸配列からなる)、VH-6とVL-5とを組み合わせたヒト化抗体7(重鎖可変領域が、配列番号13に示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域が、配列番号19に示されるアミノ酸配列からなる)、VH-2とVL-5とを組み合わせたヒト化抗体8(重鎖可変領域が、配列番号9に示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域が、配列番号19に示されるアミノ酸配列からなる)、VH-3とVL-5とを組み合わせたヒト化抗体9(重鎖可変領域が、配列番号10に示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域が、配列番号19に示されるアミノ酸配列からなる)、およびVH-4とVL-7とを組み合わせたヒト化抗体10(重鎖可変領域が、配列番号11に示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域が、配列番号21に示されるアミノ酸配列からなる)の遺伝子をそれぞれ設計した。
このように設計したヒト化抗体1~10のフレームワーク領域は、何れも上述した(A)~(I)の配列的特徴について五つ以上七つ以下の範囲で該当していた。
そして、設計した各遺伝子を発現ベクターに組み込み、HEK293細胞を用いた一過性発現系により、ヒト化抗体を取得した。表3に各ヒト化抗体の収量を示す。なお、収量は、ProteinAカラムで精製した後、または、培養上清を限外濾過で濃縮した後の濃度および容積から算出した。
次に、ヒト化抗体1~10のムチンサブタイプ5ACへの結合を、フローサイトメトリーによって検討した。ムチンサブタイプ5ACを発現しているBxPC3細胞(約2x105個/50μL)に対し、20μg/mL相当量の非特異的なヒト化抗体(コントロール)またはムチンサブタイプ5AC特異的マウス抗体を加え、氷温にて、約1時間反応させた。そして、二次抗体として、Axela Fluor 488 Anti mouse IgG(20μg/mL)、またはAxela Fluor 488 Anti human IgG(20μg/mL)を加え、0.5時間反応させた。その後、フローサイトメトリー(FacsCalibur:BECON DICKINSON社製)を用いて、ヒト化抗体の抗原親和性を分析した。結果を図2に示す。
図2では、下側が塗りつぶされた細い線が、非特異的なヒトIgG(コントロール)を加えたときの結果を示し、下側が塗りつぶされていない太い線が、ヒト化抗体またはマウス抗体を加えたときの結果を示す。また、(a)は、マウス抗体についての結果を示し、(b)は、ヒト化抗体3についての結果を示し、(c)は、ヒト化抗体4についての結果を示し、(d)は、ヒト化抗体5についての結果を示し、(e)は、マウス抗体についての別の結果を示し、(f)は、ヒト化抗体6についての結果を示し、(g)は、ヒト化抗体7についての結果を示し、(h)は、ヒト化抗体8についての結果を示し、(i)は、ヒト化抗体9についての結果を示し、(j)は、ヒト化抗体1についての結果を示し、(k)は、ヒト化抗体2についての結果を示し、(m)は、ヒト化抗体10についての結果を示す。また、BxPC3細胞からSW1990に替えて同様に測定したヒト化抗体8についての結果を、図2(l)に示す。
図2に示すように、ヒト化抗体1~10は、何れも、マウス抗体と比べても十分な抗原親和性を示した。なお、ヒト化抗体1について、ELISA法を行った結果、同様に、ムチンサブタイプ5ACとの結合が示された。
続いて、ヒト化抗体1およびヒト化抗体10について、ADCC活性を測定した。定法により回収した腹水10mLをプロテインAカラム(1mL)にアプライ後、10倍容量のPBSで十分洗浄した。1mLのクエン酸バッファー(pH3.0)で溶出後、トリスバッファー(pH7.0)で中和した。得られた抗体溶液は脱塩のためにG25カラム(5mL)で処理して1mLを回収した。ADCC活性の評価のために各濃度に希釈して用いた。ADCC活性は、ヒト膵臓癌細胞株BxPC3細胞(103)とヒトPBMC(5x104)をRPMI培地で12時間培養後、培養上清中のLDH量をLDH Cytotoxicity Detection Kit(タカラバイオ)で測定した。細胞障害率(%)は以下の式で算出した。また、コントロール抗体として、健常人のIgG1を用い、コントロール抗体の結果との差分を取ることにより、ヒト化抗体のADCC活性を評価した。
結果、表4に示すように何れのヒト化抗体においてもADCC活性が見られた。なお、表4では、ヒト化抗体の細胞傷害率からコントロール抗体の細胞傷害率を減算したものが、5ポイント未満である場合には「×」と、5ポイント以上40ポイント未満である場合には「○」と、40ポイント以上である場合には「◎」とそれぞれ示す。
本発明は、抗体医薬の製造分野および生命科学の研究分野において利用可能である。
Claims (14)
- 重鎖相補性決定領域1が配列番号1に示されるアミノ酸配列からなり、
重鎖相補性決定領域2が配列番号2に示されるアミノ酸配列からなり、
重鎖相補性決定領域3が配列番号3に示されるアミノ酸配列からなり、
軽鎖相補性決定領域1が配列番号4に示されるアミノ酸配列からなり、
軽鎖相補性決定領域2が配列番号5に示されるアミノ酸配列からなり、
軽鎖相補性決定領域3が配列番号6に示されるアミノ酸配列からなり、
以下の(A)から(I)の少なくとも一つに該当することを特徴とするムチンサブタイプ5AC特異的ヒト化抗体、またはその抗原結合性断片:
(A)重鎖相補性決定領域1のC末端側に隣接する5残基のアミノ酸配列が、WVRQAであるか;
(B)重鎖相補性決定領域2のN末端側に隣接する3残基のアミノ酸配列が、WVSであるか;
(C)重鎖相補性決定領域2のC末端側に隣接する3残基のアミノ酸配列が、RFTまたはRVTであるか;
(D)重鎖相補性決定領域3のN末端側に隣接する3残基のアミノ酸配列が、CARであるか;
(E)軽鎖相補性決定領域1のN末端側に隣接する3残基のアミノ酸配列が、ITCであるか;
(F)軽鎖相補性決定領域2のN末端側に隣接する3残基のアミノ酸配列が、LIYであるか;
(G)軽鎖相補性決定領域2のC末端側に隣接する4残基のアミノ酸配列が、GVPSであるか;
(H)軽鎖相補性決定領域3のN末端側に隣接する5残基のアミノ酸配列が、AVYYCまたはGVYYCであるか;または
(I)軽鎖相補性決定領域3のC末端側に隣接する3残基のアミノ酸配列が、FGQである。 - 上記(A)から(I)の少なくとも五つに該当することを特徴とする請求項1に記載のムチンサブタイプ5AC特異的ヒト化抗体、またはその抗原結合性断片。
- 重鎖相補性決定領域1のC末端側に隣接する4残基のアミノ酸配列が、WVRQであり、
重鎖相補性決定領域2のC末端側に隣接する1残基のアミノ酸配列が、Rであり、
軽鎖相補性決定領域1のN末端側に隣接する1残基のアミノ酸配列が、Cであり、
軽鎖相補性決定領域1のC末端側に隣接する1残基のアミノ酸配列が、Wであり、
軽鎖相補性決定領域2のN末端側に隣接する1残基のアミノ酸配列が、Yであり、
軽鎖相補性決定領域2のC末端側に隣接する1残基のアミノ酸配列が、Gであり、
軽鎖相補性決定領域3のN末端側に隣接する3残基のアミノ酸配列が、YYCであり、
軽鎖相補性決定領域3のC末端側に隣接する1残基のアミノ酸配列が、FGQGTKであることを特徴とする請求項1または2に記載のムチンサブタイプ5AC特異的ヒト化抗体、またはその抗原結合性断片。 - 重鎖可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸配列が、配列番号8から13の何れか一つに示されるアミノ酸配列の1から30番目、36から49番目、67から98番目および111から121番目に対して、58%以上の同一性を有し、
軽鎖可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸配列が、配列番号15から21の何れか一つに示されるアミノ酸配列の1から23番目、39から53番目、61から92番目および102から111番目に対して、60%以上の同一性を有することを特徴とする請求項1に記載のムチンサブタイプ5AC特異的ヒト化抗体、またはその抗原結合性断片。 - 重鎖可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸配列が、配列番号8から13の何れか一つに示されるアミノ酸配列の1から30番目、36から49番目、67から98番目および111から121番目に対して、90%以上の同一性を有し、
軽鎖可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸配列が、配列番号15から21の何れか一つに示されるアミノ酸配列の1から23番目、39から53番目、61から92番目および102から111番目に対して、90%以上の同一性を有することを特徴とする請求項1または2に記載のムチンサブタイプ5AC特異的ヒト化抗体、またはその抗原結合性断片。 - 請求項1~5のいずれか一項に記載のムチンサブタイプ5AC特異的ヒト化抗体、またはその抗原結合性断片を含有することを特徴とするムチンサブタイプ5ACの異常発現を伴う疾患の治療用または診断用の医薬組成物。
- 上記疾患が、癌または喘息であることを特徴とする請求項6に記載の医薬組成物。
- 上記癌が、膵臓癌、肺癌、乳癌、胃癌、子宮頸癌、または大腸癌である請求項7に記載の医薬組成物。
- 可変領域のアミノ酸配列が互いに異なる、上記ムチンサブタイプ5AC特異的ヒト化抗体、またはその抗原結合性断片を二種類以上含有していることを特徴とする請求項6から8の何れか一項に記載の医薬組成物。
- 請求項1~5のいずれか一項に記載のムチンサブタイプ5AC特異的ヒト化抗体、またはその抗原結合性断片をムチンサブタイプ5ACの異常発現を伴う疾患の患者に投与する工程を包含することを特徴とするムチンサブタイプ5ACの異常発現を伴う疾患の治療方法。
- 上記疾患が、癌または喘息であることを特徴とする請求項10に記載の治療方法。
- 上記癌が、膵臓癌、肺癌、乳癌、胃癌、子宮頸癌、または大腸癌である請求項11に記載の治療方法。
- 上記工程では、可変領域のアミノ酸配列が互いに異なる、上記ムチンサブタイプ5AC特異的ヒト化抗体、またはその抗原結合性断片を二種類以上、上記患者に投与することを特徴とする請求項10から12の何れか一項に記載の治療方法。
- 被験者からの採取物中または被験者の体内に存在するムチンサブタイプ5ACを、請求項1~5のいずれか一項に記載のムチンサブタイプ5AC特異的ヒト化抗体、またはその抗原結合性断片を用いて検出する工程を包含することを特徴とするムチンサブタイプ5ACの異常発現を伴う疾患の診断方法。
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