JP3370334B2 - 酸化リポタンパク質の測定法およびその用途 - Google Patents
酸化リポタンパク質の測定法およびその用途Info
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Description
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、酸化リポタンパク質とβ２−グリコプロテ
インＩ（β２−GPI）の特異的な結合反応を利用した酸
化リポタンパク質の免疫測定法及びその用途に関するも
のである。
インＩ（β２−GPI）の特異的な結合反応を利用した酸
化リポタンパク質の免疫測定法及びその用途に関するも
のである。
背景技術
脂質は、一般に難水溶性物質であるため、生体内にお
いてはリポタンパク質（非極性脂質である、トリグリセ
リドとコレステリルエステルの核をリン脂質とタンパク
質で被った複合体）の形で組織から組織へと運搬されて
いる。リポタンパク質は、その水和密度の違いにより、
カイロミクロン（0.950g/ml以下）、超低密度リポタン
パク質（VLDL,0.950g/ml〜1.006g/ml）、低密度リポタ
ンパク質（LDL,1.006g/ml〜1.063g/ml）、および高密度
リポタンパク質（HDL,1.063g/ml〜1.210g/ml）の４種類
に分類されている。なお、これらリポタンパク質を構成
するタンパク質は、“アポリポタンパク質”と称されて
いる。
いてはリポタンパク質（非極性脂質である、トリグリセ
リドとコレステリルエステルの核をリン脂質とタンパク
質で被った複合体）の形で組織から組織へと運搬されて
いる。リポタンパク質は、その水和密度の違いにより、
カイロミクロン（0.950g/ml以下）、超低密度リポタン
パク質（VLDL,0.950g/ml〜1.006g/ml）、低密度リポタ
ンパク質（LDL,1.006g/ml〜1.063g/ml）、および高密度
リポタンパク質（HDL,1.063g/ml〜1.210g/ml）の４種類
に分類されている。なお、これらリポタンパク質を構成
するタンパク質は、“アポリポタンパク質”と称されて
いる。
リポタンパク質は、生体内の脂質運搬のみならず、動
脈硬化の発症および進行に深く関与している。すなわ
ち、冠状動脈硬化症や脳動脈硬化症などの動脈硬化性疾
患の危険因子の一つは、血中リポタンパク質濃度（特
に、LDL濃度）が上昇する高コレステロール血症である
が、これらの疾患において、LDLは動脈硬化の促進作用
を、HDLはLDLとは逆の抑制作用をそれぞれ担っているも
のと考えられている。
脈硬化の発症および進行に深く関与している。すなわ
ち、冠状動脈硬化症や脳動脈硬化症などの動脈硬化性疾
患の危険因子の一つは、血中リポタンパク質濃度（特
に、LDL濃度）が上昇する高コレステロール血症である
が、これらの疾患において、LDLは動脈硬化の促進作用
を、HDLはLDLとは逆の抑制作用をそれぞれ担っているも
のと考えられている。
また、最近の研究から、リポタンパク質の酸化物が動
脈硬化の発症を促すことも示唆されている。すなわち、
動脈硬化発症の初期の段階において、血管内膜のマクロ
ファージは、コレステロールを多量に含有する酸化LDL
をレセプターを介して特異的に取り込み泡沫化すること
が解明されている（なお、酸化を受けていないLDLは、
マクロファージによっては取り込まれない）。このこと
は、酸化LDLに対する抗体を用いた免疫組織染色によ
り、動脈硬化病変部位に酸化LDLが広く分布しているこ
とからも裏付けられている。一方、HDLは、泡沫細胞か
らのコレステロールの流出を刺激する作用を有するが、
酸化HDLではこの作用が著しく低下することも解明され
ている。
脈硬化の発症を促すことも示唆されている。すなわち、
動脈硬化発症の初期の段階において、血管内膜のマクロ
ファージは、コレステロールを多量に含有する酸化LDL
をレセプターを介して特異的に取り込み泡沫化すること
が解明されている（なお、酸化を受けていないLDLは、
マクロファージによっては取り込まれない）。このこと
は、酸化LDLに対する抗体を用いた免疫組織染色によ
り、動脈硬化病変部位に酸化LDLが広く分布しているこ
とからも裏付けられている。一方、HDLは、泡沫細胞か
らのコレステロールの流出を刺激する作用を有するが、
酸化HDLではこの作用が著しく低下することも解明され
ている。
このように、動脈硬化性疾患と酸化リポタンパク質と
は密接に関係することが示唆され、酸化リポタンパクを
特異的に測定することは、動脈硬化の発症メカニズムの
解析や動脈硬化性疾患の診断の一助になり得る可能性を
有している。
は密接に関係することが示唆され、酸化リポタンパクを
特異的に測定することは、動脈硬化の発症メカニズムの
解析や動脈硬化性疾患の診断の一助になり得る可能性を
有している。
従来、酸化リポタンパク質の測定法としては、酸化リ
ポタンパク質を免疫して得られる抗体を用いたRIA法ま
たはEIA法が報告されている（たとえば、Biochimica et
Biophysica Acta,963,208−214（1988）、Proc.Natl.A
cad.Sci.USA,86,1372−1376（1989）、Clinica Chimica
Acta,218,97−103（1993）参照）。
ポタンパク質を免疫して得られる抗体を用いたRIA法ま
たはEIA法が報告されている（たとえば、Biochimica et
Biophysica Acta,963,208−214（1988）、Proc.Natl.A
cad.Sci.USA,86,1372−1376（1989）、Clinica Chimica
Acta,218,97−103（1993）参照）。
発明の開示
発明者らは、血中における酸化リポタンパク質の存在
形態を詳細に解析した結果、血中を循環しているβ２
−GPIは酸化を受けたリポタンパク質の酸化部位と結合
すること、抗リン脂質抗体症候群由来の抗カルジオリ
ピン抗体がβ２−GPIと酸化リポタンパク質の複合体に
反応することから、β２−GPIと酸化リポタンパク質の
複合体にはβ２−GPIとリン脂質の複合体のみに存在す
る抗原決定基と類似の構造の存在が示唆されること、な
どを見いだし、本発明を完成させた。
形態を詳細に解析した結果、血中を循環しているβ２
−GPIは酸化を受けたリポタンパク質の酸化部位と結合
すること、抗リン脂質抗体症候群由来の抗カルジオリ
ピン抗体がβ２−GPIと酸化リポタンパク質の複合体に
反応することから、β２−GPIと酸化リポタンパク質の
複合体にはβ２−GPIとリン脂質の複合体のみに存在す
る抗原決定基と類似の構造の存在が示唆されること、な
どを見いだし、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、下記のＡ群から選ばれた固相試
薬とＢ群から選ばれた抗体試薬の少なくとも二種類の試
薬を使用し、サンドイッチ法によりβ２−GPIと酸化リ
ポタンパク質の複合体（β２−GPI・酸化リポタンパク
質複合体）を測定する方法（本発明方法１）及びキット
（本発明キット１）に関するものである。
薬とＢ群から選ばれた抗体試薬の少なくとも二種類の試
薬を使用し、サンドイッチ法によりβ２−GPIと酸化リ
ポタンパク質の複合体（β２−GPI・酸化リポタンパク
質複合体）を測定する方法（本発明方法１）及びキット
（本発明キット１）に関するものである。
Ａ群；固相化抗カルジオリピン抗体
固相化抗リポタンパク質抗体（または固相化抗
アポリポタンパク質抗体） 固相化抗β２−GPI抗体 Ｂ群；抗カルジオリピン抗体 抗リポタンパク質抗体（または抗アポリポタン
パク質抗体） 抗β２−GPI抗体 また、本発明は、下記のＣ群から選ばれた固相試薬と
抗体試薬として抗カルジオリピン抗体を使用し、競合法
によりβ２−GPI・酸化リポタンパク質複合体を測定す
る方法（本発明方法２）及びキット（本発明キット２）
に関するものである。
アポリポタンパク質抗体） 固相化抗β２−GPI抗体 Ｂ群；抗カルジオリピン抗体 抗リポタンパク質抗体（または抗アポリポタン
パク質抗体） 抗β２−GPI抗体 また、本発明は、下記のＣ群から選ばれた固相試薬と
抗体試薬として抗カルジオリピン抗体を使用し、競合法
によりβ２−GPI・酸化リポタンパク質複合体を測定す
る方法（本発明方法２）及びキット（本発明キット２）
に関するものである。
Ｃ群；固相化カルジオリピン・β２−GPI複合体
特定の担体に固定化された固相化β２−GPI
さらに、本発明は、上記方法及びキットを動脈硬化性
疾患の診断に利用することに関するものである。
疾患の診断に利用することに関するものである。
図面の簡単な説明
第１図は、酸化LDLに対するβ２−GPIの結合性を示し
たものである。
たものである。
第２図は、β２−GPI・酸化LDL複合体に対する抗カル
ジオリピン（aCL）抗体の反応性を示したものである。
ジオリピン（aCL）抗体の反応性を示したものである。
第３図は、抗LDL抗体および抗アポＢタンパク質抗体
の反応性を示したものである。
の反応性を示したものである。
第４図は、aCL抗体を利用した競合的ELISA法による酸
化LDLの測定結果を示したものである。
化LDLの測定結果を示したものである。
第５図は、aCL抗体と抗LDL抗体を利用したサンドイッ
チELISA法による酸化LDLの測定結果を示したものであ
る。
チELISA法による酸化LDLの測定結果を示したものであ
る。
第６図は、抗アポＢタンパク質抗体と抗β２−GPI抗
体を利用したサンドイッチELISA法による酸化LDLの測定
結果を示したものである。
体を利用したサンドイッチELISA法による酸化LDLの測定
結果を示したものである。
第７図は、抗β２−GPI抗体と抗LDL抗体を利用したサ
ンドイッチELISA法による酸化LDLの測定結果を示したも
のである。
ンドイッチELISA法による酸化LDLの測定結果を示したも
のである。
第８図は、aCL抗体と抗アポＢタンパク質抗体を利用
したサンドイッチELISA法による酸化LDLの測定結果を示
したものである。
したサンドイッチELISA法による酸化LDLの測定結果を示
したものである。
第９図は、aCL抗体と抗HDL抗体を利用したサンドイッ
チELISA法による酸化HDLの測定結果を示したものであ
る。
チELISA法による酸化HDLの測定結果を示したものであ
る。
第10図は、健常人検体と急性心筋梗塞患者検体に含ま
れる酸化LDL量を測定した結果を示したものである。
れる酸化LDL量を測定した結果を示したものである。
発明を実施するための最良の形態
本明細書において使用される各用語は、以下の定義の
通りである。
通りである。
「β２−GPI」；
内因性凝固反応系に対する働きが注目されている公知
の血清タンパク質。本発明においては、哺乳類に属する
動物由来のものであればいずれのものでも使用でき、β
２−GPI中の糖鎖が一部もしくは全部欠如したものであ
ってもよい。
の血清タンパク質。本発明においては、哺乳類に属する
動物由来のものであればいずれのものでも使用でき、β
２−GPI中の糖鎖が一部もしくは全部欠如したものであ
ってもよい。
「抗β２−GPI抗体」；
β２−GPIに結合する抗体。特に、β２−GPI上の酸化
リポタンパク質との結合部位を認識しない抗体が好まし
い。
リポタンパク質との結合部位を認識しない抗体が好まし
い。
「抗カルジオリピン抗体」；
自己免疫疾患などの抗リン脂質抗体症候群の患者血清
中に見い出されるような、リン脂質とβ２−GPIの複合
体に反応する抗体。
中に見い出されるような、リン脂質とβ２−GPIの複合
体に反応する抗体。
「抗リポタンパク質抗体」；
リポタンパク質に結合する抗体。特に、酸化リポタン
パク質のβ２−GPI結合部位を認識しない抗体が好まし
い。
パク質のβ２−GPI結合部位を認識しない抗体が好まし
い。
「抗アポリポタンパク質抗体」；
リポタンパク質中のアポリポタンパク質部分に結合す
る抗体。特に、酸化リポタンパク質のβ２−GPI結合部
位を認識しない抗体が好ましい。
る抗体。特に、酸化リポタンパク質のβ２−GPI結合部
位を認識しない抗体が好ましい。
「特定の担体に固定化された固相化β２−GPI」；
合成樹脂の表面に物理的、化学的に水酸基、カルボニ
ル基、カルボキシル基などの極性基が導入された担体に
β２−GPIを固相化したものを指称する。
ル基、カルボキシル基などの極性基が導入された担体に
β２−GPIを固相化したものを指称する。
本発明でサンプルとして使用する生体試料は、酸化リ
ポタンパク質を含有するものであれば特に限定されず、
具体的には血液または血清、血漿などの血液分画物など
を使用することができる。また、サンプルの前処理とし
て、酸化リポタンパク質を含むサンプルにβ２−GPIを
添加反応させ、β２−GPI・酸化リポタンパク質複合体
を形成させておくことが肝要である。ただし、血清サン
プルのように、すでに十分量のβ２−GPIが存在し、サ
ンプル中の酸化リポタンパク質がβ２−GPI・酸化リポ
タンパク質複合体を形成している場合には、上記前処理
を省略することができる。なお、この前処理は、本発明
方法の反応時に同時に行ってもかまわない。
ポタンパク質を含有するものであれば特に限定されず、
具体的には血液または血清、血漿などの血液分画物など
を使用することができる。また、サンプルの前処理とし
て、酸化リポタンパク質を含むサンプルにβ２−GPIを
添加反応させ、β２−GPI・酸化リポタンパク質複合体
を形成させておくことが肝要である。ただし、血清サン
プルのように、すでに十分量のβ２−GPIが存在し、サ
ンプル中の酸化リポタンパク質がβ２−GPI・酸化リポ
タンパク質複合体を形成している場合には、上記前処理
を省略することができる。なお、この前処理は、本発明
方法の反応時に同時に行ってもかまわない。
（１） 本発明方法
本発明方法１は、上述したように、下記のＡ群から選
ばれた固相試薬とＢ群から選ばれた抗体試薬の少なくと
も二種類の試薬を使用し、サンドイッチ法によりβ２−
GPI・酸化リポタンパク質複合体を測定する方法に関す
るものである。
ばれた固相試薬とＢ群から選ばれた抗体試薬の少なくと
も二種類の試薬を使用し、サンドイッチ法によりβ２−
GPI・酸化リポタンパク質複合体を測定する方法に関す
るものである。
Ａ群；固相化抗カルジオリピン抗体
固相化抗リポタンパク質抗体（または固相化抗
アポリポタンパク質抗体） 固相化抗β２−GPI抗体 Ｂ群；抗カルジオリピン抗体 抗リポタンパク質抗体（または抗アポリポタン
パク質抗体） 抗β２−GPI抗体 上記Ａ群とＢ群の各試薬の組み合わせは、酸化リポタ
ンパク質を測定できる組み合わせであれば特に限定され
ない。たとえば、好適な試薬の組み合わせとしては下記
の組み合わせを例示することができる。
アポリポタンパク質抗体） 固相化抗β２−GPI抗体 Ｂ群；抗カルジオリピン抗体 抗リポタンパク質抗体（または抗アポリポタン
パク質抗体） 抗β２−GPI抗体 上記Ａ群とＢ群の各試薬の組み合わせは、酸化リポタ
ンパク質を測定できる組み合わせであれば特に限定され
ない。たとえば、好適な試薬の組み合わせとしては下記
の組み合わせを例示することができる。
（組み合わせ１）
Ａ群：固相化抗カルジオリピン抗体
Ｂ群：抗リポタンパク質抗体（または抗アポリポタン
パク質抗体）及び／または抗β２−GPI抗体 （組み合わせ２） Ａ群：固相化抗リポタンパク質抗体（または固相化抗
アポリポタンパク質抗体） Ｂ群：抗カルジオリピン抗体及び／または抗β２−GP
I抗体 （組み合わせ３） Ａ群：固相化抗β２−GPI抗体 Ｂ群：抗カルジオリピン抗体及び／または抗リポタン
パク質抗体（または抗アポリポタンパク質抗体） （組み合わせ４） Ａ群：固相化抗カルジオリピン抗体 Ｂ群：抗カルジオリピン抗体 さらに好適な試薬の組み合わせとしては下記の組み合
わせを例示することができる。
パク質抗体）及び／または抗β２−GPI抗体 （組み合わせ２） Ａ群：固相化抗リポタンパク質抗体（または固相化抗
アポリポタンパク質抗体） Ｂ群：抗カルジオリピン抗体及び／または抗β２−GP
I抗体 （組み合わせ３） Ａ群：固相化抗β２−GPI抗体 Ｂ群：抗カルジオリピン抗体及び／または抗リポタン
パク質抗体（または抗アポリポタンパク質抗体） （組み合わせ４） Ａ群：固相化抗カルジオリピン抗体 Ｂ群：抗カルジオリピン抗体 さらに好適な試薬の組み合わせとしては下記の組み合
わせを例示することができる。
（組み合わせ５）
Ａ群：固相化抗カルジオリピン抗体
Ｂ群：抗リポタンパク質抗体（または抗アポリポタン
パク質抗体） （組み合わせ６） Ａ群：固相化抗リポタンパク質抗体（または固相化抗
アポリポタンパク質抗体） Ｂ群：抗カルジオリピン抗体及び／または抗β２−GP
I抗体 （組み合わせ７） Ａ群：固相化抗β２−GPI抗体 Ｂ群：抗リポタンパク質抗体（または抗アポリポタン
パク質抗体） Ａ及びＢ群の試薬を調製する際に使用する抗体として
は、それ自体公知の方法を適宜応用して調製したものを
使用することができる。
パク質抗体） （組み合わせ６） Ａ群：固相化抗リポタンパク質抗体（または固相化抗
アポリポタンパク質抗体） Ｂ群：抗カルジオリピン抗体及び／または抗β２−GP
I抗体 （組み合わせ７） Ａ群：固相化抗β２−GPI抗体 Ｂ群：抗リポタンパク質抗体（または抗アポリポタン
パク質抗体） Ａ及びＢ群の試薬を調製する際に使用する抗体として
は、それ自体公知の方法を適宜応用して調製したものを
使用することができる。
たとえば、抗カルジオリピン抗体としては、抗リン脂
質抗体症候群の患者血清、またはこの血清から単離精製
された抗体画分であってもよく、またNZWマウスとBXSB
マウスからのF1マウスの脾臓細胞とミエローマ細胞との
細胞融合により得られるモノクローナル抗体であっても
よい。
質抗体症候群の患者血清、またはこの血清から単離精製
された抗体画分であってもよく、またNZWマウスとBXSB
マウスからのF1マウスの脾臓細胞とミエローマ細胞との
細胞融合により得られるモノクローナル抗体であっても
よい。
また、抗リポタンパク質抗体、抗アポリポタンパク質
抗体または抗β２−GPI抗体は、既に市販されているも
のもあり、その場合にはそれを使用することができる。
また、公知の各血清タンパク質を抗原として使用し、常
法により調製されたものを使用することもできる。使用
する上記各抗体の種類は、ポリクローナル抗体、モノク
ローナル抗体、それらの活性フラグメント〔Ｆ（ab'）
２、Fab'など〕など特に制限されない。なお、上記各抗
体を調製する際に抗原として使用する各血清タンパク質
は哺乳動物由来のものが好ましく、血清中から単離精製
されたもの、組換えDNA手法により調製されたもののい
ずれであってもかまわない。
抗体または抗β２−GPI抗体は、既に市販されているも
のもあり、その場合にはそれを使用することができる。
また、公知の各血清タンパク質を抗原として使用し、常
法により調製されたものを使用することもできる。使用
する上記各抗体の種類は、ポリクローナル抗体、モノク
ローナル抗体、それらの活性フラグメント〔Ｆ（ab'）
２、Fab'など〕など特に制限されない。なお、上記各抗
体を調製する際に抗原として使用する各血清タンパク質
は哺乳動物由来のものが好ましく、血清中から単離精製
されたもの、組換えDNA手法により調製されたもののい
ずれであってもかまわない。
上記Ａ群に属する固相試薬を調製する際に使用する担
体としては、通常使用されているもの、たとえば、ポリ
塩化ビニル、ポリスチレン、スチレン−ジビニルベンゼ
ン共重合体、スチレン−無水マレイン酸共重合体、ナイ
ロン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポ
リアクリロニトリル、ポリプロピレン、ポリメチレンメ
タクリレートなどの合成有機高分子化合物、デキストラ
ン誘導体（セファデックスなど）、アガロースゲル（セ
ファロース、バイオゲルなど）、セルロース（ペーパー
ディスク、濾紙など）などの多糖類、ガラス、シリカゲ
ル、シリコーンなどの無機高分子化合物を例示すること
ができ、これらはアミノ基、カルボキシル基、カルボニ
ル基、水酸基、スルヒドリル基などの官能基が導入され
たものであってもよい。特に、ポリスチレンまたはポリ
塩化ビニルを好適な例として挙げることができる。
体としては、通常使用されているもの、たとえば、ポリ
塩化ビニル、ポリスチレン、スチレン−ジビニルベンゼ
ン共重合体、スチレン−無水マレイン酸共重合体、ナイ
ロン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポ
リアクリロニトリル、ポリプロピレン、ポリメチレンメ
タクリレートなどの合成有機高分子化合物、デキストラ
ン誘導体（セファデックスなど）、アガロースゲル（セ
ファロース、バイオゲルなど）、セルロース（ペーパー
ディスク、濾紙など）などの多糖類、ガラス、シリカゲ
ル、シリコーンなどの無機高分子化合物を例示すること
ができ、これらはアミノ基、カルボキシル基、カルボニ
ル基、水酸基、スルヒドリル基などの官能基が導入され
たものであってもよい。特に、ポリスチレンまたはポリ
塩化ビニルを好適な例として挙げることができる。
担体の形状は、平板状（マイクロタイタープレート、
ディスクなど）、粒子状（ビーズなど）、管状（試験管
など）、繊維状、膜状、微粒子状（ラテックス粒子な
ど）、カプセル状、小胞体状などいずれの形状であって
もよく、測定法に応じて好適な形状の担体を適宜選択す
ればよい。
ディスクなど）、粒子状（ビーズなど）、管状（試験管
など）、繊維状、膜状、微粒子状（ラテックス粒子な
ど）、カプセル状、小胞体状などいずれの形状であって
もよく、測定法に応じて好適な形状の担体を適宜選択す
ればよい。
上記Ａ群に属する固相試薬は、上記担体上に目的の抗
体を結合させることにより調製することができる。担体
と抗体の結合は、物理的吸着法、イオン結合法、共有結
合法、包括法など公知の方法〔たとえば、「固定化酵
素」（千畑一郎編、昭和50年３月20日、（株）講談社発
行）参照〕を採用することができ、とりわけ、物理的吸
着法は簡便である点で好ましい。また、上記結合は直接
行ってもよく、両物質の間に他の物質（スペーサーな
ど）を介して行ってもよい。
体を結合させることにより調製することができる。担体
と抗体の結合は、物理的吸着法、イオン結合法、共有結
合法、包括法など公知の方法〔たとえば、「固定化酵
素」（千畑一郎編、昭和50年３月20日、（株）講談社発
行）参照〕を採用することができ、とりわけ、物理的吸
着法は簡便である点で好ましい。また、上記結合は直接
行ってもよく、両物質の間に他の物質（スペーサーな
ど）を介して行ってもよい。
このようにして得られた固相試薬は、非特異的結合を
抑制するため、ゼラチン、BSAなどの通常のブロッキン
グ剤を用いてブロッキング処理を施してもよい。
抑制するため、ゼラチン、BSAなどの通常のブロッキン
グ剤を用いてブロッキング処理を施してもよい。
上記Ｂ群に属する抗体試薬は、免疫測定法で常用され
ている標識剤で標識されていてもよく、そのような標識
剤としては、放射性同位体（たとえば32P、3H、14C、
125Iなど）、酵素（たとえばβ−ガラクトシダーゼ、ペ
ルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコース
−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、カタラーゼ、グルコー
スオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、アルコールオキシ
ダーゼ、モノアミンオキシダーゼなど）、補酵素・補欠
分子族（たとえば、FAD、FMN、ATP、ビオチン、ヘムな
ど）、フルオレセイン誘導体（たとえば、フルオレセイ
ンイソチオシアネート、フルオレセインチオフルバミル
など）、ローダミン誘導体（たとえば、テトラメチルロ
ーダミンＢイソチオシアネートなど）、ウムベリフェロ
ンおよび１−アニリノ−８−ナフタレンスルホン酸など
の蛍光色素、ルミノール誘導体〔たとえば、ルミノー
ル、イソルミノール、Ｎ−（６−アミノヘキシル）−Ｎ
−エチルイソルミノールなど〕などを例示することがで
きる。
ている標識剤で標識されていてもよく、そのような標識
剤としては、放射性同位体（たとえば32P、3H、14C、
125Iなど）、酵素（たとえばβ−ガラクトシダーゼ、ペ
ルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコース
−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、カタラーゼ、グルコー
スオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、アルコールオキシ
ダーゼ、モノアミンオキシダーゼなど）、補酵素・補欠
分子族（たとえば、FAD、FMN、ATP、ビオチン、ヘムな
ど）、フルオレセイン誘導体（たとえば、フルオレセイ
ンイソチオシアネート、フルオレセインチオフルバミル
など）、ローダミン誘導体（たとえば、テトラメチルロ
ーダミンＢイソチオシアネートなど）、ウムベリフェロ
ンおよび１−アニリノ−８−ナフタレンスルホン酸など
の蛍光色素、ルミノール誘導体〔たとえば、ルミノー
ル、イソルミノール、Ｎ−（６−アミノヘキシル）−Ｎ
−エチルイソルミノールなど〕などを例示することがで
きる。
抗体と標識剤との結合は、成書〔たとえば、「続生化
学実験講座５免疫生化学研究法」（株）東京化学同人、
（1986年発行）第102〜112頁〕に記載されているような
公知の方法から適宜選択して実施すればよい。
学実験講座５免疫生化学研究法」（株）東京化学同人、
（1986年発行）第102〜112頁〕に記載されているような
公知の方法から適宜選択して実施すればよい。
このような固相試薬と抗体試薬を用いての測定手順
は、通常のサンドイッチ法の手順をそのまま採用すれば
よい。すなわち、固相試薬と被検サンプルを反応させ、
必要によりBF分離後、さらに抗体試薬を反応させる（ツ
ーステップ法）か、固相試薬、被検サンプル及び抗体試
薬を同時に反応させ（ワンステップ法）、反応後いずれ
の場合でもそれ自体公知の方法によりサンプル中の酸化
リポタンパク質を検出または定量することができる。
は、通常のサンドイッチ法の手順をそのまま採用すれば
よい。すなわち、固相試薬と被検サンプルを反応させ、
必要によりBF分離後、さらに抗体試薬を反応させる（ツ
ーステップ法）か、固相試薬、被検サンプル及び抗体試
薬を同時に反応させ（ワンステップ法）、反応後いずれ
の場合でもそれ自体公知の方法によりサンプル中の酸化
リポタンパク質を検出または定量することができる。
また、本発明方法２は、下記のＣ群から選ばれた固相
試薬と抗体試薬として抗カルジオリピン抗体を使用し、
競合法によりβ２−GPIと酸化リポタンパク質の複合体
を測定する方法に関するものである。
試薬と抗体試薬として抗カルジオリピン抗体を使用し、
競合法によりβ２−GPIと酸化リポタンパク質の複合体
を測定する方法に関するものである。
Ｃ群；固相化カルジオリピン・β２−GPI複合体
特定の担体に固定化された固相化β２−GPI抗
体試薬として使用する抗カルジオリピン抗体は、上述の
ものと同じものを例示することができる。
体試薬として使用する抗カルジオリピン抗体は、上述の
ものと同じものを例示することができる。
上記Ｃ群の固相試薬の中、固相化カルジオリピン−β
２−GPI複合体は、担体（前記の抗体の結合に用いたも
のと同じもの）上にカルジオリピンを常法により結合さ
せ、これをさらにβ２−GPIと反応させて得られたもの
である。
２−GPI複合体は、担体（前記の抗体の結合に用いたも
のと同じもの）上にカルジオリピンを常法により結合さ
せ、これをさらにβ２−GPIと反応させて得られたもの
である。
特定の担体に固定化された固相化β２−GPIは、特定
の担体にβ２−GPIを固定化する点を除けば、固相化抗
体試薬と同様にして得られたものである。なお、特定の
担体とは、前記の定義のように、物理化学的処理（例え
ば、放射線照射、オゾン処理など）により、合成樹脂の
表面に水酸基、カルボニル基、カルボキシル基などの極
性基が導入された担体であり、具体的には、EBプレート
（ラボシステムズ社製）、Ｈタイププレート、Ｃタイプ
プレート（住友ベークライト社製）、マキシソーププレ
ート（ヌンク社製）などを例示することができる。
の担体にβ２−GPIを固定化する点を除けば、固相化抗
体試薬と同様にして得られたものである。なお、特定の
担体とは、前記の定義のように、物理化学的処理（例え
ば、放射線照射、オゾン処理など）により、合成樹脂の
表面に水酸基、カルボニル基、カルボキシル基などの極
性基が導入された担体であり、具体的には、EBプレート
（ラボシステムズ社製）、Ｈタイププレート、Ｃタイプ
プレート（住友ベークライト社製）、マキシソーププレ
ート（ヌンク社製）などを例示することができる。
このような固相試薬と抗体試薬を用いての測定手順
は、通常の競合法の手順をそのまま採用すればよい。す
なわち、抗体試薬に対し、固相試薬と被検サンプル中の
β２−GPI・酸化リポタンパク質複合体を競合反応さ
せ、反応後それ自体公知の方法によりサンプル中の酸化
リポタンパク質を検出または定量することができる。
は、通常の競合法の手順をそのまま採用すればよい。す
なわち、抗体試薬に対し、固相試薬と被検サンプル中の
β２−GPI・酸化リポタンパク質複合体を競合反応さ
せ、反応後それ自体公知の方法によりサンプル中の酸化
リポタンパク質を検出または定量することができる。
なお、サンドイッチ法、競合法などの免疫測定法の詳
細に付いては、たとえば以下の文献を参照すればよい。
細に付いては、たとえば以下の文献を参照すればよい。
入江 寛編「続ラジオイムノアッセイ」（（株）講談
社、昭和54年５月１日発行） 石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（（株）
医学書院、1982年12月15日発行） 臨床病理 臨時増刊 特集第53号「臨床検査のための
イムノアッセイ−技術と応用−」（臨床病理刊行会、19
83年発行） 「バイオテクノロジー事典」（（株）シーエムシー、
1986年10月９日発行） 「Methods in ENZYMOLOGY Vol.70」（Immunochemical
techniques（Part A）） 「Methods in ENZYMOLOGY Vol.73」（Immunochemical
techniques（Part B）） 「Methods in ENZYMOLOGY Vol.74」（Immunochemical
techniques（Part C）） 「Methods in ENZYMOLOGY Vol.84」（Immunochemical
techniques（Part D:Selected Immunoassay）） 「Methods in ENZYMOLOGY Vol.92」（Immunochemical
techniques（Part E:Monoclonal Antibodies and Gene
ral Immunoassay Methods）） ［〜はアカデミックプレス社発行］ （２） 本発明のキット 本発明の測定キットの中、キット１は本発明方法１
を、キット２は本発明方法２をそれぞれ実施するための
ものである。
社、昭和54年５月１日発行） 石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（（株）
医学書院、1982年12月15日発行） 臨床病理 臨時増刊 特集第53号「臨床検査のための
イムノアッセイ−技術と応用−」（臨床病理刊行会、19
83年発行） 「バイオテクノロジー事典」（（株）シーエムシー、
1986年10月９日発行） 「Methods in ENZYMOLOGY Vol.70」（Immunochemical
techniques（Part A）） 「Methods in ENZYMOLOGY Vol.73」（Immunochemical
techniques（Part B）） 「Methods in ENZYMOLOGY Vol.74」（Immunochemical
techniques（Part C）） 「Methods in ENZYMOLOGY Vol.84」（Immunochemical
techniques（Part D:Selected Immunoassay）） 「Methods in ENZYMOLOGY Vol.92」（Immunochemical
techniques（Part E:Monoclonal Antibodies and Gene
ral Immunoassay Methods）） ［〜はアカデミックプレス社発行］ （２） 本発明のキット 本発明の測定キットの中、キット１は本発明方法１
を、キット２は本発明方法２をそれぞれ実施するための
ものである。
すなわち、キット１は、下記のＡ群から選ばれた固相
試薬とＢ群から選ばれた抗体試薬の少なくとも二種類の
試薬を構成試薬として含有することを特徴としている。
試薬とＢ群から選ばれた抗体試薬の少なくとも二種類の
試薬を構成試薬として含有することを特徴としている。
Ａ群；固相化抗カルジオリピン抗体
固相化抗リポタンパク質抗体（または固相化抗
アポリポタンパク質抗体） 固相化抗β２−GPI抗体 Ｂ群；抗カルジオリピン抗体 抗リポタンパク質抗体（または抗アポリポタン
パク質抗体） 抗β２−GPI抗体 また、キット２は、下記のＣ群から選ばれた固相試薬
と抗体試薬として抗カルジオリピン抗体を構成試薬とし
て含有することを特徴とするものである。
アポリポタンパク質抗体） 固相化抗β２−GPI抗体 Ｂ群；抗カルジオリピン抗体 抗リポタンパク質抗体（または抗アポリポタン
パク質抗体） 抗β２−GPI抗体 また、キット２は、下記のＣ群から選ばれた固相試薬
と抗体試薬として抗カルジオリピン抗体を構成試薬とし
て含有することを特徴とするものである。
Ｃ群；固相化カルジオリピン・β２−GPI複合体
特定の担体に固定化された固相化β２−GPI
上記Ａ〜Ｃ群に属する各試薬は、上述した方法により
調製することができる。また、上記Ａ〜Ｃ群に属する各
試薬のほかに、必要により、発色試薬、反応停止用試
薬、標準抗原試薬、サンプル前処理用試薬などの各試薬
から測定法に応じた適当な試薬を適宜選択し、本発明の
キットに添付することができる。
調製することができる。また、上記Ａ〜Ｃ群に属する各
試薬のほかに、必要により、発色試薬、反応停止用試
薬、標準抗原試薬、サンプル前処理用試薬などの各試薬
から測定法に応じた適当な試薬を適宜選択し、本発明の
キットに添付することができる。
以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明する。
（１） 実施例で使用する抗体の説明；
SLE−１
抗リン脂質抗体症候群患者由来の抗カルジオリピン
（aCL）抗体陽性血清で、カルジオリピンとβ２−GPIの
複合体に結合性を有する。
（aCL）抗体陽性血清で、カルジオリピンとβ２−GPIの
複合体に結合性を有する。
WB−CAL−１及びWB−CAL−３
NZW ｘ BXSB F1（W/B F1）マウス由来のaCL抗体
産生細胞とミエローマ細胞を細胞融合して得たハイブリ
ドーマから得られるモノクローナルaCL抗体〔The Journ
al of Immunology,149,1063−1068（1992）〕で、カル
ジオリピンとβ２−GPIの複合体に結合性を有する。
産生細胞とミエローマ細胞を細胞融合して得たハイブリ
ドーマから得られるモノクローナルaCL抗体〔The Journ
al of Immunology,149,1063−1068（1992）〕で、カル
ジオリピンとβ２−GPIの複合体に結合性を有する。
Cof−22
ヒトβ２−GPIを免疫したBALB/cマウスの脾細胞とミ
エローマ細胞を細胞融合して得たハイブリドーマから得
られるモノクローナル抗β２−GPI抗体で、β２−GPIに
結合性を有する（WO92/19755）。ただし、β２−GPI上
の酸化リポタンパク質との結合部位は認識しない。
エローマ細胞を細胞融合して得たハイブリドーマから得
られるモノクローナル抗β２−GPI抗体で、β２−GPIに
結合性を有する（WO92/19755）。ただし、β２−GPI上
の酸化リポタンパク質との結合部位は認識しない。
9F5−３及び10E3−３
酸化LDLを免疫したBALB/cマウスの脾細胞とミエロー
マ細胞を細胞融合して得たハイブリドーマから得られる
モノクローナル抗LDL抗体で、酸化LDL及び非酸化LDLに
結合性を有する。ただし、酸化LDLのβ２−GPI結合部位
を認識しない（第３図参照）。
マ細胞を細胞融合して得たハイブリドーマから得られる
モノクローナル抗LDL抗体で、酸化LDL及び非酸化LDLに
結合性を有する。ただし、酸化LDLのβ２−GPI結合部位
を認識しない（第３図参照）。
なお、このような抗体は公知の方法により容易に取得
可能である（J.Bio.Chem.,269,15274−15279（1994）,S
cience 241,215−218（1988）,Am.J.Pathol.,135,815−
825（1989）.Biochim,Biophys.Acta.963,208−214（198
8）など参照） 1D2及び5G6 ヒト精製アポＢタンパク質（Medix Biotech Inc.Fost
er,CA）を免疫したBALB/cマウスの脾細胞とミエローマ
細胞を細胞融合して得たハイブリドーマから得られるモ
ノクローナル抗アポＢタンパク質抗体で、アポＢタンパ
ク質に結合性を有する。ただし、酸化LDLのβ２−GPI結
合部位を認識しない（第３図参照）。
可能である（J.Bio.Chem.,269,15274−15279（1994）,S
cience 241,215−218（1988）,Am.J.Pathol.,135,815−
825（1989）.Biochim,Biophys.Acta.963,208−214（198
8）など参照） 1D2及び5G6 ヒト精製アポＢタンパク質（Medix Biotech Inc.Fost
er,CA）を免疫したBALB/cマウスの脾細胞とミエローマ
細胞を細胞融合して得たハイブリドーマから得られるモ
ノクローナル抗アポＢタンパク質抗体で、アポＢタンパ
ク質に結合性を有する。ただし、酸化LDLのβ２−GPI結
合部位を認識しない（第３図参照）。
なお、このような抗体はケミコン社などから市販され
ているので、それを使用してもかまわない。
ているので、それを使用してもかまわない。
H1
モノクローナル抗HDL抗体で、酸化HDL及び非酸化HDL
に結合性を有する。ただし、酸化HDLのβ２−GPI結合部
位を認識しない。
に結合性を有する。ただし、酸化HDLのβ２−GPI結合部
位を認識しない。
なお、このような抗体は抗LDL抗体の場合と同様に公
知の方法により容易に取得可能である。
知の方法により容易に取得可能である。
（２） 酸化LDLの調製
600μｇのヒトLDL（Organon Teknika Corp,Durham,N
C）を、５μMCuSO4を含むPBS（2ml）中で37℃、24時間
処理した。
C）を、５μMCuSO4を含むPBS（2ml）中で37℃、24時間
処理した。
（３） LDL中の過酸化脂質の定量
非酸化LDLあるいは酸化LDLの各サンプル（0.4ml）に
対し、8.1％SDS（0.1ml）、20％酢酸（pH3.5、0.75ml）
および0.8％チオバルビツール酸（0.75ml）を加え、95
℃で１時間反応させた。冷却後、蒸留水（0.5ml）、ｎ
−ブタノールとピリジンの混合溶媒（15:1、2.5ml）を
添加撹拌した。3000rpm、20分間の遠心後、有機層を採
取し、532nmの吸光度を測定した。なお、標準品として
テトラメトキシプロパンを用いた。過酸化脂質量をマロ
ンジアルデヒド当量で表わすと、非酸化LDLでは8.8nmol
/mgであるのに対し、酸化LDLでは50.8nmol/mgであっ
た。
対し、8.1％SDS（0.1ml）、20％酢酸（pH3.5、0.75ml）
および0.8％チオバルビツール酸（0.75ml）を加え、95
℃で１時間反応させた。冷却後、蒸留水（0.5ml）、ｎ
−ブタノールとピリジンの混合溶媒（15:1、2.5ml）を
添加撹拌した。3000rpm、20分間の遠心後、有機層を採
取し、532nmの吸光度を測定した。なお、標準品として
テトラメトキシプロパンを用いた。過酸化脂質量をマロ
ンジアルデヒド当量で表わすと、非酸化LDLでは8.8nmol
/mgであるのに対し、酸化LDLでは50.8nmol/mgであっ
た。
実施例1:酸化LDLに対するβ２−GPIの結合性（第１図）
ポリスチレンプレートの各ウエルに２μg/mlの酸化LD
L（OxLDL）または非酸化LDL（native LDL）を50μｌず
つ添加し、４℃で16−24時間静置した。0.05％Tween20
含有PBS（PBS−Tween）で洗浄後、適宜希釈したβ２−G
PIを100μｌ入れ、室温で１時間反応させた。洗浄後、
ペルオキシダーゼ標識抗β２−GPI抗体（Cof−22）を10
0μｌずつ入れ、さらに室温で１時間反応させた。洗浄
後、0.005％過酸化水素含有0.3mMテトラメチルベンジジ
ン（TMBZ）溶液を100μｌずつ添加し、室温で10分間反
応後、2N硫酸を100μｌずつ添加して反応を停止し、450
nmの吸光度を測定した。
L（OxLDL）または非酸化LDL（native LDL）を50μｌず
つ添加し、４℃で16−24時間静置した。0.05％Tween20
含有PBS（PBS−Tween）で洗浄後、適宜希釈したβ２−G
PIを100μｌ入れ、室温で１時間反応させた。洗浄後、
ペルオキシダーゼ標識抗β２−GPI抗体（Cof−22）を10
0μｌずつ入れ、さらに室温で１時間反応させた。洗浄
後、0.005％過酸化水素含有0.3mMテトラメチルベンジジ
ン（TMBZ）溶液を100μｌずつ添加し、室温で10分間反
応後、2N硫酸を100μｌずつ添加して反応を停止し、450
nmの吸光度を測定した。
その結果、第１図に示すように、酸化LDLのみにβ２
−GPIが結合することが明らかとなった。
−GPIが結合することが明らかとなった。
実施例2:β２−GPI・酸化LDL複合体に対するaCL抗体の
反応性（第２図） ポリスチレンプレートの各ウエルに２μg/mlの酸化LD
Lもしくは非酸化LDLを50μｌずつ添加し、４℃で16−24
時間静置した。PBS−Tweenで洗浄後、β２−GPI（100μ
g/ml）存在下もしくは非存在下で、適宜希釈したWB−CA
L−１を室温で１時間反応させた。洗浄後、ペルオキシ
ダーゼ標識抗マウスIgG抗体を100μｌずつ添加し、さら
に室温で１時間反応させた。洗浄後、0.005％過酸化水
素含有0.3mM TMBZ溶液を100μｌずつ添加して室温で10
分間反応後、2N硫酸を100μｌずつ添加して反応を停止
し、450nmの吸光度を測定した。
反応性（第２図） ポリスチレンプレートの各ウエルに２μg/mlの酸化LD
Lもしくは非酸化LDLを50μｌずつ添加し、４℃で16−24
時間静置した。PBS−Tweenで洗浄後、β２−GPI（100μ
g/ml）存在下もしくは非存在下で、適宜希釈したWB−CA
L−１を室温で１時間反応させた。洗浄後、ペルオキシ
ダーゼ標識抗マウスIgG抗体を100μｌずつ添加し、さら
に室温で１時間反応させた。洗浄後、0.005％過酸化水
素含有0.3mM TMBZ溶液を100μｌずつ添加して室温で10
分間反応後、2N硫酸を100μｌずつ添加して反応を停止
し、450nmの吸光度を測定した。
その結果、第２図に示すように、β２−GPI・酸化LDL
複合体のみにaCL抗体が結合することが明らかとなっ
た。
複合体のみにaCL抗体が結合することが明らかとなっ
た。
実施例3:抗LDL抗体および抗アポＢタンパク質抗体の反
応性（第３図） ポリ塩化ビニルプレートの各ウェルに２μg/mlの酸化
LDLもしくは非酸化LDLを50μｌずつ添加し、４℃で16−
24時間静置した。PBSで洗浄後、３％ゼラチン溶液を200
μｌずつ入れ、室温で１時間静置した。ゼラチン溶液を
除去後、適宜希釈したβ２−GPIおよび一定量のペルオ
キシダーゼ標識抗LDL抗体（9F5−３、10E−３）もしく
はペルオキシダーゼ標識抗アポＢタンパク質抗体（1D
2、5G6）を室温で１時間反応させた（全量50μｌ）。洗
浄後、0.005％過酸化水素含有0.3mM TMBZ溶液を100μ
ｌずつ添加して室温で10分間反応後、2N硫酸を50μｌず
つ添加して反応を停止し、450nmの吸光度を測定した。
応性（第３図） ポリ塩化ビニルプレートの各ウェルに２μg/mlの酸化
LDLもしくは非酸化LDLを50μｌずつ添加し、４℃で16−
24時間静置した。PBSで洗浄後、３％ゼラチン溶液を200
μｌずつ入れ、室温で１時間静置した。ゼラチン溶液を
除去後、適宜希釈したβ２−GPIおよび一定量のペルオ
キシダーゼ標識抗LDL抗体（9F5−３、10E−３）もしく
はペルオキシダーゼ標識抗アポＢタンパク質抗体（1D
2、5G6）を室温で１時間反応させた（全量50μｌ）。洗
浄後、0.005％過酸化水素含有0.3mM TMBZ溶液を100μ
ｌずつ添加して室温で10分間反応後、2N硫酸を50μｌず
つ添加して反応を停止し、450nmの吸光度を測定した。
その結果、第３図に示すように、抗LDL抗体および抗
アポＢタンパク質抗体の両抗体とも酸化LDLのβ２−GPI
結合部位を認識しないことが明らかとなった。
アポＢタンパク質抗体の両抗体とも酸化LDLのβ２−GPI
結合部位を認識しないことが明らかとなった。
実施例4:競合的ELISA法による酸化LDLの測定（第４図）
酸素原子を含有する酸性基が導入されたポリスチレン
プレート〔Ｃタイププレート（住友ベークライト社
製）〕の各ウエルに10μg/mlのβ２−GPIを50μｌずつ
添加し、４℃で16−24時間静置した。PBS−Tweenで洗浄
後、β２−GPI（100μg/ml）存在下もしくは非存在下
で、aCL抗体、すなわち100倍希釈したSLE−１血清もし
くは0.5μg/mlのWB−CAL−１を、適宜希釈した酸化LDL
もしくは非酸化LDLと室温で１時間反応させた。洗浄
後、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトもしくはマウスIgG抗
体を100μｌずつ添加し、さらに室温で１時間反応させ
た。洗浄後、0.005％過酸化水素含有0.3mM TMBZ溶液を
100μｌずつ添加して室温で10分間反応後、2N硫酸を100
μｌずつを添加して反応を停止し、450nmの吸光度を測
定した。
プレート〔Ｃタイププレート（住友ベークライト社
製）〕の各ウエルに10μg/mlのβ２−GPIを50μｌずつ
添加し、４℃で16−24時間静置した。PBS−Tweenで洗浄
後、β２−GPI（100μg/ml）存在下もしくは非存在下
で、aCL抗体、すなわち100倍希釈したSLE−１血清もし
くは0.5μg/mlのWB−CAL−１を、適宜希釈した酸化LDL
もしくは非酸化LDLと室温で１時間反応させた。洗浄
後、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトもしくはマウスIgG抗
体を100μｌずつ添加し、さらに室温で１時間反応させ
た。洗浄後、0.005％過酸化水素含有0.3mM TMBZ溶液を
100μｌずつ添加して室温で10分間反応後、2N硫酸を100
μｌずつを添加して反応を停止し、450nmの吸光度を測
定した。
その結果、第４図に示すように、aCL抗体に対して固
相化β２−GPIとβ２−GPI・酸化LDL複合体が競合的に
反応し、この原理を利用して酸化LDLを測定できること
が明らかとなった。
相化β２−GPIとβ２−GPI・酸化LDL複合体が競合的に
反応し、この原理を利用して酸化LDLを測定できること
が明らかとなった。
実施例5:サンドイッチELISA法による酸化LDLの測定
（１）（第５図） ポリスチレンプレートの各ウェルに５μg/mlのaCL抗
体（WB−CAL−１もしくはWB−CAL−３）を50μｌずつ添
加し、４℃で16−24時間静置した。PBS−Tweenで洗浄
後、適宜希釈した酸化LDLあるいは非酸化LDLのサンプル
を50μｌ添加し、更に、200μg/mlのβ２−GPIを50μｌ
ずつ添加して、室温にて１時間反応させた。洗浄後、ペ
ルオキシダーゼ標識抗LDL抗体（9F5−３）を100μｌず
つ添加し、室温で１分間反応させた。洗浄後、0.005％
過酸化水素含有0.3mM TMBZ溶液を100μｌずつ添加して
室温で10分間反応後、2N硫酸を100μｌずつを添加して
反応を停止し、450nmの吸光度を測定した。
（１）（第５図） ポリスチレンプレートの各ウェルに５μg/mlのaCL抗
体（WB−CAL−１もしくはWB−CAL−３）を50μｌずつ添
加し、４℃で16−24時間静置した。PBS−Tweenで洗浄
後、適宜希釈した酸化LDLあるいは非酸化LDLのサンプル
を50μｌ添加し、更に、200μg/mlのβ２−GPIを50μｌ
ずつ添加して、室温にて１時間反応させた。洗浄後、ペ
ルオキシダーゼ標識抗LDL抗体（9F5−３）を100μｌず
つ添加し、室温で１分間反応させた。洗浄後、0.005％
過酸化水素含有0.3mM TMBZ溶液を100μｌずつ添加して
室温で10分間反応後、2N硫酸を100μｌずつを添加して
反応を停止し、450nmの吸光度を測定した。
その結果、第５図に示すように、aCL抗体と抗LDL抗体
を利用したサンドイッチ法によりβ２−GPI・酸化LDL複
合体を特異的に測定でき、酸化LDLの測定に利用できる
ことが明らかとなった。
を利用したサンドイッチ法によりβ２−GPI・酸化LDL複
合体を特異的に測定でき、酸化LDLの測定に利用できる
ことが明らかとなった。
実施例6:サンドイッチELISA法による酸化LDLの測定
（２）（第６図） ポリスチレンプレートの各ウェルに５μg/mlの抗アポ
Ｂタンパク質抗体（1D2もしくは5G6）を50μｌずつ添加
し、４℃で16−24時間静置した。PBSで３回洗浄後、適
宜希釈した酸化LDLあるいは非酸化LDLのサンプルを50μ
ｌ添加し、更に、200μg/mlのβ２−GPIを50μｌずつ添
加して、室温にて１時間反応させた。洗浄後、ペルオキ
シダーゼ標識抗β２−GPI抗体（Cof−22）を100μｌず
つ添加し、室温で１時間反応させた。洗浄後、0.005％
過酸化水素含有0.3mM TMBZ溶液を100μｌずつ添加して
室温で10分間反応後、2N硫酸を100μｌずつ添加して反
応を停止し、450nmの吸光度を測定した。
（２）（第６図） ポリスチレンプレートの各ウェルに５μg/mlの抗アポ
Ｂタンパク質抗体（1D2もしくは5G6）を50μｌずつ添加
し、４℃で16−24時間静置した。PBSで３回洗浄後、適
宜希釈した酸化LDLあるいは非酸化LDLのサンプルを50μ
ｌ添加し、更に、200μg/mlのβ２−GPIを50μｌずつ添
加して、室温にて１時間反応させた。洗浄後、ペルオキ
シダーゼ標識抗β２−GPI抗体（Cof−22）を100μｌず
つ添加し、室温で１時間反応させた。洗浄後、0.005％
過酸化水素含有0.3mM TMBZ溶液を100μｌずつ添加して
室温で10分間反応後、2N硫酸を100μｌずつ添加して反
応を停止し、450nmの吸光度を測定した。
その結果、第６図に示すように、抗アポＢタンパク質
抗体と抗β２−GPI抗体を利用したサンドイッチ法によ
りβ２−GPI・酸化LDL複合体を特異的に測定でき、酸化
LDLの測定に利用できることが明らかとなった。
抗体と抗β２−GPI抗体を利用したサンドイッチ法によ
りβ２−GPI・酸化LDL複合体を特異的に測定でき、酸化
LDLの測定に利用できることが明らかとなった。
実施例7:サンドイッチELISA法による酸化LDLの測定
（３）（第７図） ポリ塩化ビニルプレートの各ウェルに10μg/mlの抗β
２−GPI抗体（Cof−22）を50μｌずつ添加し、４℃で16
−24時間静置した。PBSで洗浄後、３％ゼラチン溶液を2
00μｌずつ添加し、室温で１時間静置した。ゼラチン溶
液を除去した後、100μg/mlのβ２−GPIを50μｌずつ添
加し、室温で１時間反応させた。洗浄後、酸化LDLある
いは非酸化LDLのサンプルを50μｌ添加し、室温で１時
間反応させた。洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗LDL抗
体（10E3−３）を50μｌずつ添加し、室温にて１時間反
応させた。洗浄後、0.005％過酸化水素含有0.3mM TMBZ
溶液を100μｌずつ添加して室温で10分間反応後、2N硫
酸を50μｌずつ添加して反応を停止し、450nmの吸光度
を測定した。
（３）（第７図） ポリ塩化ビニルプレートの各ウェルに10μg/mlの抗β
２−GPI抗体（Cof−22）を50μｌずつ添加し、４℃で16
−24時間静置した。PBSで洗浄後、３％ゼラチン溶液を2
00μｌずつ添加し、室温で１時間静置した。ゼラチン溶
液を除去した後、100μg/mlのβ２−GPIを50μｌずつ添
加し、室温で１時間反応させた。洗浄後、酸化LDLある
いは非酸化LDLのサンプルを50μｌ添加し、室温で１時
間反応させた。洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗LDL抗
体（10E3−３）を50μｌずつ添加し、室温にて１時間反
応させた。洗浄後、0.005％過酸化水素含有0.3mM TMBZ
溶液を100μｌずつ添加して室温で10分間反応後、2N硫
酸を50μｌずつ添加して反応を停止し、450nmの吸光度
を測定した。
その結果、第７図に示すように、抗β２−GPI抗体と
抗LDL抗体を利用したサンドイッチ法によりβ２−GPI・
酸化LDL複合体を特異的に測定でき、酸化LDLの測定に利
用できることが明らかとなった。
抗LDL抗体を利用したサンドイッチ法によりβ２−GPI・
酸化LDL複合体を特異的に測定でき、酸化LDLの測定に利
用できることが明らかとなった。
実施例8:サンドイッチELISA法による酸化LDLの測定
（４）（第８図） ポリスチレンプレートの各ウェルに５μg/mlのaCL抗
体（WB−CAL−１）を50μｌずつ添加し、４℃で16−24
時間静置した。PBSで洗浄後、３％ゼラチン溶液を300μ
ｌずつ添加し、室温で１時間静置した。ゼラチン溶液を
除去した後、200μg/mlのβ２−GPIを50μｌずつ添加
し、さらに適宜希釈したリポタンパク質を50μｌずつ添
加し、室温で２時間反応させた。PBSで洗浄後、ペルオ
キシダーゼ標識抗アポＢタンパク質抗体（1D2）を50μ
ｌずつ添加し、室温にて１時間反応させた。PBSで洗浄
後、0.005％過酸化水素含有0.3mM TMBZ溶液を100μｌ
ずつ添加して室温で20分間反応後、2N硫酸を50μｌずつ
添加して反応を停止し、450nmの吸光度を測定した。
（４）（第８図） ポリスチレンプレートの各ウェルに５μg/mlのaCL抗
体（WB−CAL−１）を50μｌずつ添加し、４℃で16−24
時間静置した。PBSで洗浄後、３％ゼラチン溶液を300μ
ｌずつ添加し、室温で１時間静置した。ゼラチン溶液を
除去した後、200μg/mlのβ２−GPIを50μｌずつ添加
し、さらに適宜希釈したリポタンパク質を50μｌずつ添
加し、室温で２時間反応させた。PBSで洗浄後、ペルオ
キシダーゼ標識抗アポＢタンパク質抗体（1D2）を50μ
ｌずつ添加し、室温にて１時間反応させた。PBSで洗浄
後、0.005％過酸化水素含有0.3mM TMBZ溶液を100μｌ
ずつ添加して室温で20分間反応後、2N硫酸を50μｌずつ
添加して反応を停止し、450nmの吸光度を測定した。
その結果、第８図に示すように、aCL抗体と抗アポＢ
タンパク質抗体を利用したサンドイッチ法によりβ２−
GPI・酸化LDL複合体を測定でき、酸化LDLの測定に利用
できることが明らかとなった。
タンパク質抗体を利用したサンドイッチ法によりβ２−
GPI・酸化LDL複合体を測定でき、酸化LDLの測定に利用
できることが明らかとなった。
実施例9:サンドイッチELISA法による酸化HDLの測定（第
９図） ポリスチレンプレートの各ウェルに５μg/mlのaCL抗
体（WB−CAL−１）を50μｌずつ添加し、４℃で16−24
時間静置した。PBSで洗浄後、３％ゼラチン溶液を300μ
ｌずつ添加し、室温で１時間静置した。ゼラチン溶液を
除去した後、200μg/mlのβ２−GPIを50μｌずつ添加
し、さらに適宜希釈したリポタンパク質を50μｌずつ添
加し、室温で２時間反応させた。PBSで洗浄後、ペルオ
キシダーゼ標識抗HDL抗体（H1）を50μｌずつ添加し、
室温にて１時間反応させた。PBSで洗浄後、0.005％過酸
化水素含有0.3mM TMBZ溶液を100μｌずつ添加して室温
で20分間反応後、2N硫酸を50μｌずつ添加して反応を停
止し、450nmの吸光度を測定した。
９図） ポリスチレンプレートの各ウェルに５μg/mlのaCL抗
体（WB−CAL−１）を50μｌずつ添加し、４℃で16−24
時間静置した。PBSで洗浄後、３％ゼラチン溶液を300μ
ｌずつ添加し、室温で１時間静置した。ゼラチン溶液を
除去した後、200μg/mlのβ２−GPIを50μｌずつ添加
し、さらに適宜希釈したリポタンパク質を50μｌずつ添
加し、室温で２時間反応させた。PBSで洗浄後、ペルオ
キシダーゼ標識抗HDL抗体（H1）を50μｌずつ添加し、
室温にて１時間反応させた。PBSで洗浄後、0.005％過酸
化水素含有0.3mM TMBZ溶液を100μｌずつ添加して室温
で20分間反応後、2N硫酸を50μｌずつ添加して反応を停
止し、450nmの吸光度を測定した。
その結果、第９図に示すように、aCL抗体と抗HDL抗体
を利用したサンドイッチ法によりβ２−GPI・酸化HDL複
合体を測定でき、酸化HDLの測定に利用できることが明
らかとなった。
を利用したサンドイッチ法によりβ２−GPI・酸化HDL複
合体を測定でき、酸化HDLの測定に利用できることが明
らかとなった。
実施例10:血清中の酸化LDLの測定（第10図）
ポリスチレンプレートの各ウェルに５μg/mlのaCL抗
体（WB−CAL−１）を50μｌずつ添加し、４℃で16−24
時間静置した。PBSで洗浄後、ゼラチン溶液を300μｌず
つ添加し、室温で１時間静置してブロックした。ゼラチ
ン溶液を除去した後、200μg/mlのβ２−GPIを50μｌず
つ添加し、さらに適宜希釈した血清検体を50μｌずつ添
加し、室温にて２時間反応させた。PBSで洗浄後、ペル
オキシダーゼ標識抗アポＢ抗体（1D2）を100μｌずつ添
加し、室温で１時間反応させた。PBSで洗浄後、0.005％
過酸化水素含有0.3mM TMBZ溶液を100μｌずつ添加して
室温で20分間反応後、1N硫酸を100μｌずつ添加して反
応を停止し、450nmの吸光度を測定した。
体（WB−CAL−１）を50μｌずつ添加し、４℃で16−24
時間静置した。PBSで洗浄後、ゼラチン溶液を300μｌず
つ添加し、室温で１時間静置してブロックした。ゼラチ
ン溶液を除去した後、200μg/mlのβ２−GPIを50μｌず
つ添加し、さらに適宜希釈した血清検体を50μｌずつ添
加し、室温にて２時間反応させた。PBSで洗浄後、ペル
オキシダーゼ標識抗アポＢ抗体（1D2）を100μｌずつ添
加し、室温で１時間反応させた。PBSで洗浄後、0.005％
過酸化水素含有0.3mM TMBZ溶液を100μｌずつ添加して
室温で20分間反応後、1N硫酸を100μｌずつ添加して反
応を停止し、450nmの吸光度を測定した。
その結果、第10図に示すように、健常人（normal）検
体に比べ、急性心筋梗塞患者（AMI）検体に含まれる酸
化LDLの存在量は有意に高値を示した。
体に比べ、急性心筋梗塞患者（AMI）検体に含まれる酸
化LDLの存在量は有意に高値を示した。
産業上の利用可能性
本発明の測定法及びキットは、酸化リポタンパク質と
β２−GPIとの特異的な結合を利用したものであって、
この特異的な結合反応を利用することにより、リポタン
パク質の実用的な測定法の提供を初めて可能としたので
ある。
β２−GPIとの特異的な結合を利用したものであって、
この特異的な結合反応を利用することにより、リポタン
パク質の実用的な測定法の提供を初めて可能としたので
ある。
また、本発明では、サンプル中の酸化リポタンパク質
を、血中の存在状態であるβ２−GPI・酸化リポタンパ
ク質複合体として測定するため、動脈硬化疾患症（たと
えば、糖尿病性動脈硬化、心筋梗塞、脳梗塞など）の臨
床症状が強く反映された測定値を得ることができ、これ
ら疾患の診断に有用である。
を、血中の存在状態であるβ２−GPI・酸化リポタンパ
ク質複合体として測定するため、動脈硬化疾患症（たと
えば、糖尿病性動脈硬化、心筋梗塞、脳梗塞など）の臨
床症状が強く反映された測定値を得ることができ、これ
ら疾患の診断に有用である。
フロントページの続き
(56)参考文献 国際公開91／15772（ＷＯ，Ａ１)
国際公開92／9893（ＷＯ，Ａ１)
欧州特許出願公開407035（ＥＰ，Ａ
１)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
G01N 33/50 - 33/98
Claims (10)
- 【請求項１】試料中の酸化リポタンパク質の存在もしく
は非存在を検出するための方法であって、 β２−グリコプロテインＩ（β２−GPI）を含む試料で
あって酸化リポタンパク質を含む場合にはβ２−GPIと
酸化リポタンパク質との複合体を形成している試料を用
意し； 該試料と、下記のＡ群から選ばれる少なくとも一種の固
相化抗体試薬およびＢ群から選ばれる少なくとも一種の
標識化抗体試薬からなる少なくとも二種の抗体試薬とを
反応させて、該試料中のβ２−GPIと酸化リポタンパク
質との複合体をサンドイッチ法によりアッセイして； 次いで、酸化リポタンパク質の存在もしくは非存在の指
標である該標識化抗体試薬に結合した該複合体を検出し
て、該試料中における酸化リポタンパク質の存在もしく
は非存在を検出する、上記方法。 Ａ群：固相化抗カルジオリピン抗体 固相化抗リポタンパク質抗体 固相化アポリポタンパク質抗体 固相化抗β２−GPI抗体 Ｂ群：抗カルジオリピン抗体 抗リポタンパク質抗体 抗アポリポタンパク質抗体 抗β２−GPI抗体 - 【請求項２】固相化抗体試薬が固相化抗カルジオリピン
抗体であり、標識化抗体試薬が抗リポタンパク質抗体、
抗アポリポタンパク質抗体または抗β２−GPI抗体であ
る請求項１の方法。 - 【請求項３】固相化抗体試薬が固相化抗カルジオリピン
抗体であり、標識化抗体試薬が抗リポタンパク質抗体ま
たは抗アポリポタンパク質抗体と抗β２−GPI抗体であ
る請求項１の方法。 - 【請求項４】固相化抗体試薬が固相化抗リポタンパク質
または固相化抗アポリポタンパク質抗体であり、標識化
抗体試薬が抗カルジオリピン抗体または抗β２−GPI抗
体である請求項１の方法。 - 【請求項５】固相化抗体試薬が固相化抗リポタンパク質
抗体または固相化抗アポリポタンパク質抗体であり、標
識化抗体試薬が抗カルジオリピン抗体と抗β２−GPI抗
体である請求項１の方法。 - 【請求項６】固相化抗体試薬が固相化抗β２−GPI抗体
であり、標識化抗体試薬が抗カルジオリピン抗体、抗リ
ポタンパク質抗体または抗アポリポタンパク質抗体であ
る請求項１の方法。 - 【請求項７】固相化抗体試薬が固相化抗β２−GPI抗体
であり、標識化抗体試薬が抗リポタンパク質抗体または
抗アポリポタンパク質抗体と抗β２−GPI抗体である請
求項１の方法。 - 【請求項８】固相化抗体試薬が固相化抗カルジオリピン
抗体であり、標識化抗体試薬が抗カルジオリピン抗体で
ある請求項１の方法。 - 【請求項９】試料中の酸化リポタンパク質の存在もしく
は非存在を定量的に評価するための方法であって、 β２−グリコプロテインＩ（β２−GPT）を含む試料で
あって酸化リポタンパク質を含む場合にはβ２−GPTと
酸化リポタンパク質との複合体を形成している試料を用
意し； 該試料と、下記のＡ群から選ばれる少なくとも一種の固
相化抗体試薬およびＢ群から選ばれる少なくとも一種の
標識化抗体試薬からなる少なくとも二種の抗体試薬とを
反応させて、該試料中のβ２−GPIと酸化リポタンパク
質との複合体をサンドイッチ法によりアッセイして； 次いで、酸化リポタンパク質の存在もしくは非存在の指
標である該標識化抗体試薬に結合した該複合体を定量的
に評価して、該試料中における酸化リポタンパク質の存
在もしくは非存在を定量的に評価する、上記方法。 Ａ群：固相化抗カルジオリピン抗体 固相多化抗リポタンパク質抗体 固相化アポリポタンパク質抗体 固相化抗β２−GPI抗体 Ｂ群：抗カルジオリピン抗体 抗リポタンパク質抗体 抗アポリポタンパク質抗体 抗β２−GPI抗体 - 【請求項１０】動脈硬化性疾患の危険性を評価する請求
項９の方法。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5-265606 | 1993-09-29 | ||
| JP26560693 | 1993-09-29 | ||
| JP5-347404 | 1993-12-24 | ||
| JP34740493 | 1993-12-24 | ||
| PCT/JP1994/001594 WO1995009363A1 (fr) | 1993-09-29 | 1994-09-28 | Procede de titrage de lipoproteine oxydee et applications de ce procede |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP3370334B2 true JP3370334B2 (ja) | 2003-01-27 |
Family
ID=26547065
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP51021395A Expired - Lifetime JP3370334B2 (ja) | 1993-09-29 | 1994-09-28 | 酸化リポタンパク質の測定法およびその用途 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5900359A (ja) |
| EP (1) | EP0722086A4 (ja) |
| JP (1) | JP3370334B2 (ja) |
| AU (1) | AU7707294A (ja) |
| CA (1) | CA2172247A1 (ja) |
| WO (1) | WO1995009363A1 (ja) |
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