JPS63159398A - アポリポタンパクａ―１に対して特異性を有するモノクローナル抗体又はそのパラトープ含有ポリペプチド部分並びにそれを使用する診断装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はアポリポタンパクＡ−１に関し、特に液体試料
中のアポリポタンパクＡ−１を分析するために有用なハ
イブリドーマ及びモノクローナルパラトピック（ｐａｒ
ａｔｏｐｉｃ）分子、及びかかる分析を行うための診断
法及び系′に関する。

発明の背景 Ａ、アテローム性動脈硬化症とりボタンバク類アテロー
ム性動脈硬化症は動脈壁に蓄積したコレステロール及び
他の脂質がかさばった斑を形成して血流を妨害し、ひい
ては凝血塊を形成し、動脈を遮断、心臓発作や心拍動の
ような閉塞性の血栓症や塞栓症を引き起こす病気である
。米国におけるすべての死の５０％まではアテローム性
動脈硬化症及びそれに派生する合併症による。

ヒトアテローム性動脈硬化症はコレステロールをはじめ
とする選ばれた脂質及び細胞の動脈壁への蓄積として定
義され、時の経過と共に閉塞性病巣を形成する。アテロ
ーム性動脈硬化症の病因は多くの因子によるが、多くの
臨床的、病原面的、遺伝的及び実験的証拠はりボタンバ
ク代謝の異常がアテローム性動脈硬化症の進展に寄与し
ていることを暗示している。これらの脂質はりボタンバ
ク類と称せられる脂質−タンパク質複合体として血流中
で運ばれる。

アテローム性動脈硬化症、特に冠状動脈症（ＣＡ　Ｄ）
として知られるその一態様は健康に関する主な問題であ
る。アテローム性動脈硬化症及びそれと関連した血管の
病気は１９８３年に９８３．０００の死ももたらした。

ＣＡＤ単独でもすべての形態の癌よりも多くの死を毎年
もたらしている。米国では毎年１００万以上の心ｌ蔵発
作が起こり、その結果５０万以上の人が死んでいる。

直接的な健康管理費用としてＣＡＤは米国に年に６００
億ドル以上の支出を要せしめている。この莫大な犠牲は
ＣＡＤを食事療法、行動修正（自動運動）、特別の療法
剤でコントロールできるようにするために、ＣＡＤに向
う危険のある母集団（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ）を固定
する方法に注意を向けさせた。

ＣＡＤにおけるコレステロールの大きな関わりあいゆえ
に、この分子及びそれと関連した車両タンパクが精力的
に研究された。コレステロール関連血脩リポタンパク粒
子の４つの主なりラスが明らかにされた。これらは腸又
は肝臓に源を発している。これらの粒子はコレステロー
ル及びトリグリセライドをはじめとする中性脂肪の輸送
に関与している。すべてのクラスの血禁リポタンパクは
その脂質−タンパク質複合体に関連したアポリポタンパ
クを有している。アポリポタンパク類はこれらのりボタ
ンバクの機能において必須の役割を果している。

最初のクラスはキロミクロン類である。これらはりボタ
ンバク中もっとも太き（、トリグリセライドに冨んでい
る。キロミクロン類の起源部位は腸である。

アポリポタンパク類はキロミクロン類の塊り中で量的に
は小さな比率しか有さないが、アポリポタンパクＡ−１
，Ａ−ｎ及び八−■は報告によるとキロミクロン類と密
接な関わりを有し、これらのＡアポリポタンパク類の腸
内合成が見い出された。キロミクロン類は又アポリポタ
ンパクＢ−４８を含有している。Ａアポリポタンパク類
のキロミクロン補体の多くは失われており、一方Ｃ及び
Ｅアポリポタンパク類はキロミクロン類をインビトロで
血饗や高密度リポタンパク（ＨＤＬ）にさらすときに得
られる。Ａアポリポタンパク類（アポＡ）の腸内生産は
脂肪吸収及びキロミクロン形成以外の因子によって制御
され得る。

リポタンパク類の次のクラスは超低密度リポタンパク類
、すなわちＶＬＤＬである。ＶＬＤＬ粒子はトリグリセ
ライド代謝及びこれらの脂質の肝臓からの輸送に関与す
る。アポリポタンパク類である、アポＢ−１００及びア
ポＥがＶＬＤＬ粒子の主な構成成分である。

第３のりボタンバクは低密度リポタンパク（ＬＤＬ）と
呼ばれ、ＶＬＤＬの異化代謝の特定産物である。

ＬＤＬ粒子中で優勢的なアポリポタンパクはアポリポタ
ンパクＢ−１００、すなわちアポＢ−１００である。

今では古典的なＦｒａｍｉｎｇｈａｍの研究（１９７１
）の結果はＣＡＤの危険性と血清コレステロールレベル
との間の相関関係を明らかにした。この研究は又低密度
リポタンパク（Ｌ　Ｄ　Ｌ）コレステロールの水準があ
がるとＣＡＤの危険性も増大することを示した。最近、
ｔｈｅ　Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃ１１ｎｉｃ
ｓＣｏｒｏｎａｒｙ　Ｐｒｉｍａｒｙ　Ｐｒｅｖｅｎｔ
ｉｏｎ　Ｔｒｉａｌ　　（脂質研究クリニック冠状初期
防止試験”）（１９８４）によって行われた研究は血漿
水準のコレステロールとＬＤＬコレステロールとを食事
療法と薬物との組合せ養生によって減することができ、
この血漿コレステロールの軽減により、ＣＡＤ死亡率が
減少することを明らかにした。

ＬＤＬは血漿中における主たるコレステロール運搬リポ
タンパクである。ＬＤＬはその油性の芯が約１５００分
子の、その各々がエステル結合によって長鎖脂肪酸に結
合しているコレステロールより構成された大きな球状粒
子である。このコレステロールエステルの芯はリン脂質
、非エステル化ニレステロール分子及び単分子アポリポ
タンパクＢ−１００よりなる層によって取りまかれてい
る。リン脂質は親水性の頭が外側になるように配列して
おり、それによってＬＤＬが血液又は細胞外流体中で水
和懸濁液として存在することを可能としている。

コレステロールは特別のＬＤＬ受容体を通してＬＤＬの
形で細胞に供給され、細胞のコレステロール代謝をコン
トロールできる場所である、リソソーム中でＬＤＬ粒子
からときはなだれる。細胞内コレステロールの蓄積は３
つのプロセスを調整する。

第１に、該蓄積はコレステロール生合成経路の１工程を
触媒する酵素であるＨ　Ｍ　Ｇ　　ＣＯＡリダクターゼ
の合成を止めることによって、細胞自身のコレステロー
ル製造能力を減少させる。酵素の抑制によって、細胞は
ＬＤＬの受容体経由取込みに由来する外部コレステロー
ルに依存するようになる。

第２にＬＤＬ由来コレステロールが入ってくるとリポタ
ンパクアセチルトランスフェラーゼとよばれる酵素が活
性化され細胞内のコレステロール貯蔵が促進される。こ
の酵素は過剰のコレステロール分子に脂肪酸をエステル
化させてコレステロールエステルを製造する。このエス
テルは貯蔵小滴中に置かれる。

第３にそしてもっとも重要なことであるが、細胞内への
コレステロールの蓄積は細胞が新しいしＤＬ受容体を合
成することをやめさせるフィードバック機構を働かせる
。細胞はそれによって、十分なコレステロールが細胞中
にもち込まれて細胞の種々の要求に適合するようにし、
他方受容体の過負荷にならないよう外部受容体の定員（
ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）を調整する。例えば活発に分裂
している礒維芽細胞は新しい膜物質を必要とするので、
ＬＤＬ受容体の最大定員である約４０．０００／　ｅ　
ｌ　１　を維持している。増殖していない細胞中では入
ってくるコレステロールは蓄積をはじめるので、フィー
ドバック機構が受容体製造を減じ、受容体の定員が１０
分の１ぐらいに減ぜられる。

一方、別の循環リポタンパクである高密度リポタンパク
（ＨＤＬ）粒子は低められたアテローム性動脈硬化症の
危険性しか有さない高められたコレステロールの状態に
関係している。アポリポタンパクΔ−■は構造タンパク
質でＨＤ　Ｌ粒子の配位子である。ＨＤ　ＬＯ量はアテ
ローム性動脈硬化症の予見された傾向と逆の相関関係を
与える。

高密度リポタンパク（ＨＤ　Ｌ）は２つの主なアポリポ
タンパクである、アポリポタンパクＡ−１（アポＡ−１
）及びアポリポタンパクＡ−■　（アポＡ−１）を含有
している。アポＡ−１はすべての霊長目動物のＨＤＬの
主たるタンパク成分である。すべてのＨＤ　Ｌ粒子はア
ポＡ−１を含有しており、ゆえにＨＤＬの免疫定量は通
常アポＡ−１の定量を含んでいた。ＨＤ　Ｌ粒子の約８
０％は又アポＡ−１１を含有しているが、アポＡ−ＩＩ
Ｌ、か有さないＨＤ　Ｌ粒子は未だ記述されていない。

アポＡ−１の１つの機能は血漿酵素であるレシチン−コ
レステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）の
賦活化である。この酵素はＨＤＬ上の遊離コレステロー
ルを、肝臓へ輸送するために、エステル化するのに必要
とされる。アポＡ−■不存在下では血中コレステロール
はエステル化されず、もってコレステロールは血中から
除去されない。ＨＤＬ代謝におけるアポＡ−１１の特定
の役割は未だ定義されていない。

多くの研究によって高められたＨＤＬ水準は減ぜられた
ＣＡＤの傾向と相関することが明らかとなった。ある著
書らはＨＤＬがコレステロールを動脈壁のような周辺部
位（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　５ｉｔｅｓ）からコレステ
ロールを除去するものと推定し、抗動脆硬化性をＨＤＬ
に帰結せしめている。ＨＤＬコレステロールのより高い
濃度は比較的正常の代謝、及び心臓血管病のより低い発
生率及び／又は減ぜられた激しさと関連している。他方
、ＬＤＬコレステロールの高められた水準は脂質の異常
代謝及びＣＡＤの増加した危険性と相関している。高脂
血症（血中に過剰の脂質）の患者やＣＡＤに対する特別
の危険性を有している患者の適切な管理のために、ＬＤ
Ｌ及びＨＤＬコレステロールの水準を頻繁に測定するこ
とが望ましい。今日までのＨＤＬコレステロールの分析
は、ＨＤＬの血中レベルを定量するのにやっかいかつ不
正確であった。

Ｂ、リポタンパクの構造及び機能 コレステロールが血漿中で遊離には存在せず、リポタン
パクによって身体の組織部位に輸送されることを理解す
ることは大切である。コレステロールは指示された細胞
合成や食事によって得られる。しかしながらコレステロ
ールは宿主からは肝臓によってしか除去されない。肝臓
ではコレステロールは胆汁酸にかえられ分泌される。

キロミクロンはコレステロール及びトリグリセライドを
引き続く処理のために肝臓に運ぶが、ＬＤＬはコレステ
ロールを冠状動脈をはじめとする肝臓外の組織に運搬す
る。よって、リポタンパクであるＬＤＬ／アポＢは周辺
組織への「悪玉」コレステロールの蓄積と関連している
。逆にいうと、リポタンパクＨＤＬ／アポＡは「善玉」
コレステロールを組織から除去して分泌のため肝臓に返
している。

歴史的にみるとりボタンバクを単離し性格づけるだめの
多くの系が開発されてきた。これらの技術は通常リポタ
ンパク粒子の物理化学的性質に基づ′、）でいる。２つ
のもっとよく用いられる技術は超遠心分離及び電気泳動
である。

分画密度勾配超遠心分離（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　
ｄｅｎｓｉｔｙｇｒａｄｉｅＭ　ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒ
ｉｆｕｇａｔｉｏｎ）　　はりボタンバク類が池の血漿
タンパク類より軽い又は密度が低いという事実を利用し
ており、キロミクロン（もっとも軽いりボタンバク）　
、ＶＬＤＬＳＬＤＬ及びＨＤＬを相互分離することは時
間がかかってやっかいではあるが比較的簡単である。電
気泳動技術は高脂血症患者の分類に有用であった。しか
しながら、これらの技術は通常の臨床試験所で容易に行
う訳にはいかない。

血中コレステロール又はトリグリセライドの単なる定量
は医師にどのリポタンパクがこれらの脂質を運んでいる
か及びそれらのりボタンバクの定量についての情報を与
えないことが分るであろう。

Ｃ０血漿リポタンパク類 血漿リポタンパク類の４つのメインのクラス、すなわち
キロミクロン、ＶＬＤＬＳＬＤＬ及びＨＤＬが定義され
たが、それらの中に明らかにサブクラスが存在する。す
べてのりボタンバクは腸又は肝臓又はその両方にその起
源を有しており、擬ミセル構造（ｐｓｅｕｄｏｍｉｃｅ
ｌｌａｒ　５ｉｒｕｃｔｕｒｅ）を有しているようであ
る。中性脂質、特にコレステロール及びトリグリセライ
ドは表面極性成分であるアポリポタンパク及びリン脂質
との相互反応を通して溶解した安定な形態でリポタンパ
クの窓中に維持される。

エステル化されないコレステロールも又これらの複合物
中に存在する。その極性は中性脂質類（コレステロール
エステル及びトリグリでライド）とより極性なアポリポ
タンパク類及びリン脂質類との中間に位置し、窓中にも
表面にも見い出される。

アポリポタンパク類、非エステル化コレステロール及び
リン脂質よりなる外側表面はコレステロールエステル及
びトリグリセライドよりなる水不溶性芯を取り囲み、こ
れらの非極性脂質を水性環境から保護している。この一
般的構造概念は低角度Ｘ線散乱研究（ｌｏｗ−ａｎｇｌ
ｅ　Ｘ−ｒａｙ　ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇｓｔｕｄｉｅｓ
　）及び種々の探針（ｐｒｏｂｅｓ）をリポタンパク類
の構造を調べるために用いた他の物理的方法によって支
持されている。血漿リポタンパク類の重要な機能は中性
血漿脂質の可溶化及び輸送である。

Ｄ、アポリポタンパク アポリポタンパクは血漿リポタンパクの脂質除去タンパ
クであって、単離した完全なりボタンバクを有機溶媒、
洗剤又はカオトロピック剤で処理することによって得ら
れる。リポタンパクとして捕らえられたタンパクのすべ
てが必ずしも脂質輸送についての役割をもっている訳で
はない。適切な例は、急性期反応物（ａｃｕｔｅ　ｐｈ
ａｓｅ　ｒｅａｃｔａｎｔｓ）である血清アミロイドＡ
タンパクがＨＤＬに結合して血漿中で輸送されるという
最近の認識である。

これらの低分子量タンパクは炎症状態でアポ−ＨＤ　Ｌ
の３０％まで含まれ得るが、それらが特定脂質の輸送を
受けもっているかどうか疑わしい。

ＨＤＬ粒子中に存在するアポリポタンパクＡ−■　（ア
ポＡ−Ｉ）は本発明で関心の的となるタンパク質である
。アポＡ−Ｉについて以下に議論する。

アポＡ−Ｉはすべての霊長目動物のＨＤＬの主たるタン
パク成分であり、すべてのＨＤＬ粒子中に存在し、ＨＤ
Ｌ粒子あたり多数、例えば約７〜８分子存在する。報告
によるとアポＡ−Ｉはキロミクロン、ＶＬＤＬ及びＬＤ
Ｌ中には比較的少量存在し、又ＨＤＬのタンパク質の約
６０〜８０％を構成する。

アポＡ−１は２４３〜２４５残基の１本鎖よりなり、シ
スチン、システィン、ロイシン又は炭水化物を含有せず
、いくつかの異性形態（ｉｓｏｆｏｒｍｓ）で存在する
。アポＡ−１は脂質のない状態で約５５％がα−ヘリッ
クス構造をとり、リン脂質を結合させるとα−ヘリック
ス構造は約７５％に増加する。このアポリポタンパクの
１１のへワックス残基よりなるくり返しサイクルが同定
された。

これらの単位は単一の先祖代々の鎖を表わすことが示唆
された。この鎖は遺伝子複製によって２２残基の繰返し
単位を与えた。これらの単位は密接な配列相同性を有し
ており、タンパクの脂質結合領域を表わすものと信じら
れている。

前述したごとく、アポＡ−１はＬＣＡＴ、すなわちコレ
ステロール及びホスファチジルコリンのそれぞれコレス
テロールエステル及びリゾホスファチジルコリンへの変
換を触媒する血漿酵素の有力な活性化物質である。アポ
Ａｉの特定の脂質結合領域がＬＣＡＴを活性化すること
が見い出された。この活性は脂質結合の性質と関連する
。前述したごとく、肝臓及び腸がアポＡ−１を合成する
が、血漿合計含量へのそれぞれの貢献及びアポＡ−１生
産を調節する因子ははっきりしていない。

典型的には、血漿アポＡ−Ｉの約９０％以上がＨＤＬと
関連し、約１％以下がＶＬＤＬ及びＬＤＬと関連し、約
１０％以下が血漿のりボタンバクのない分画と関連して
いる。各々の粒子タイプでのアポＡ−（の量はデータを
発表する人々によって異なっているが、これは粒子の分
離に用いた技術の差によるものであろう。

ＨＤＬの主たるタンパク構成成分であるアポＡ−■の測
定は臨床上重要である。多くの研究の結果ＣＡＤ被経者
ではアポＡ−１水準が減じていることが明らかとなった
。この観察はこの患者群における血清アポＡ−Ｉの保護
的役割を強調している。

いくつかの研究の結果はアポＡ−１水準を正確に測定す
ることによって異常脂質代謝、アテローム性動脈硬化症
及び特にＣＡＤに対する個々人の予後を予見することが
できることを示している。

しかしながら、その正確精密な測定の困難さのみゆえに
、アポＡ−１単独量は異常脂質代謝に対するマーカーと
して利用できなかった。比較的高いアポＡ−１水準が正
常脂質代謝と関連し、比較的低いアポＡ−１水準が異常
脂質代謝及びＣＡＤと関連するとはいっても、正常人と
ＣＡＤをもつ人との間のはっきりした境界線については
未だ報告されていない。

前記したごとく、アポＡ−Ｉを臨床上有用な免疫測定系
、例えば放射線免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素結合免疫測
定法（ＥＬＩＳＡ）、電気免疫測定法（ＥＩＡ）、放射
免疫拡散法（ＲＩ　Ｄ）又は免疫比濁法（ＴＮＡ）によ
って正確精密に定量することは極端に困難であることが
知られている。

例えばＳｔｅｉｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ、＋ｃＩｉｎ、
ｃｈｅｍ、　２９／３．４１５〜４２６　（１９８３）
の第１表によると種々の技術を用いて得られた値がばら
ついていることが分る。

分析の困難さについて述べられた理由の１つはアポリポ
タンパクＡｉ分子が大きな生化学的に異種な粒子の部分
として血漿及び血清中に存在し、分子抗原部位（エピト
ープ）のいくつかが隠され遮蔽されていることである。

従って、ある研究者らは通常隠されているエピトープが
遮蔽をとかれ免疫反応に参加できるようにするため、試
料に遮蔽解放処理を行った。

Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ、、Ｃ１１ｎ、Ｃｈｅ
＋＋＋、　　２９．４１５〜４２６　（１９８３）は血
漿や血清などの血液試料を尿素、テトラメチル尿素及び
グアニジンのような変性剤やドデシル硫酸す）　ＩＪウ
ム及びポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウ
レート（ツイーン２０〉のような界面活性剤で処理し、
５２℃で３時間及び３７℃で２時間加熱し、エタノール
とジエチルエーテノベメタノールとジエチルエーテル、
クロロホルムとメタノールのような混合有機溶媒で脱脂
質することによって遮蔽を解く方法を論じている。別の
特定の遮蔽解放処理はＭａｃｉｅｊｋｏ　ｅｔ　ａｌ、
、Ｃｌ１ｎ、Ｃｈｅｍ、　２８．１９９〜２０４（１９
８２）（界面活性剤）　、Ｋｏｒｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、
ＣＣ１１ｎＣｈｉ、　Ａｃｔａ、　　１４７．８５〜９
５　　（１９８５）（有機溶媒）、及びＢｕｒｙ　ｅｔ
　ａｌ、、Ｃｌ１ｎ、Ｃｈｅｍ、　３　ｌ、２４７〜２
５１　　（１９８５）（３７℃、２時間）によって報告
された研究に見い出される。

上記研究者の投入か及び他の研究者は血漿や血清中で存
在するときのアポＡ−１のみかけの異種性（ａｐｐａｒ
ｅｎｔ　ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）をさけるため
にポリクローナル抗体標品を用いた。すなわちＭａｃｉ
ｅｊｋｏ　ｅｔ　ａｌ、、Ｃ１１ｎ　Ｃｈｅｍ、２８．
１９９〜２０４（１９８２）　、Ｋｏｒｅｎ　ｅｔ　ａ
ｌ、、Ｃｌ１ｎ　Ｃｈｅｍ、Ａｃｔａ１４７．８５〜９
５　　（１９８５）　、Ｂｕｒｙ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｃ１１ｎ　Ｃｈｅｍ、　３１．２４７〜２５１　　（１
９８５）、及びＦｅ５ｍ１ｒｅ　ｅｔ　ａｌ、、Ｃ１１
ｎ　Ｃｈｅｍ、３０．７１２〜７１６　（１９８４）参
照。臨床的に有用な定量的免疫測定におけるポリクロー
ナル抗体の使用はもちろんいくつかの動物からの血清の
使用に伴う抗体活性の差及び異なるバッチの血清による
免疫特異性の差によるデメリットを伴う。

さらに、Ｋｏｔｔｋｅ　ｅｔ　ａｌ、、Ｍａｙｏ　Ｃ１
１ｎ、　Ｐｒｏｃ、　６１．３１３〜３２０　　（１９
８６）は色々な男性についてアポリポタンパク、Ａ−Ｉ
、Ａ−ｎ及びＢＳＨＤＬコレステロール、トリグリセラ
イド、及び年令を調査し、これら６つの指標のすべてが
ＣＡＤ患者を無症候コントロールから正確に識別するの
に必要であるとしている。これらの研究者は測定にあた
り放射線免疫測定法を用いた。

Ｋｏｔｔｋｅらの報文によると、ポリクローナル抗体、
抗体−試料維持時間１６時間、及び遮蔽解放界面活性剤
処理がアポＡ−ＩのＲＩＡ測定にあたって利用された。

報文によるとモノクローナル抗体がアポＢのＲＩＡ測定
にあたって用いろれた。ＫＯｔｔｋｅらは１標準偏差内
で重なりあわない、正常人及びＣＡＤ患者の平均アポＡ
−Ｉ値を報告した。

一方、ここで用いられたモノクローナルパラトピック分
子はさておき、他の研究者はＨＤＬ粒子及びアポＡ−Ｉ
と実質的に等しく免疫反応し、又試料中の実質上すべて
のアポＡ−Ｉと免疫反応するモノクローナル抗体につい
て何ら記載していない。Ｃｕｒｔｉｓｓ　ｅｊａｌ、、
Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２Ｑ　Ｑ、２９８２〜２９９
８　　（１９８５）はアポＡ−■及びＨＤＬとほぼ等し
く免疫反応するが、分析した試料中に存在することが知
られている放射能標識したアポＡ−Ｉ又はＨＤＬの約６
０％しか免疫化　　殿させることができないＡ−＞７と
称せられる１つのモノクローナル抗体を報告している。

ヒト血液試料におけるアポＡ−Ｉの存在を分析するため
の試薬としての、モノクローナル抗体又はそれらの抗体
の結合部位部分くすなわちバラトピック分子）の使用は
、一旦人手するとこれらの試薬は一定の品質で比較的大
量に生産でき、ポリクローナル抗体に付随するばらつき
の問題を回避できるので魅力的である。しかしながら、
かかる分析系の成分としての特定のモノクローナルパラ
トピック分子の使用に対し不利に作用する沢山の因子が
ある。

モノクローナルパラトピック分子の典型としてのモノク
ローナル抗体の使用について、モノクローナル抗体はタ
ーゲットとする抗原の抗原的異質性ゆえにあまりに免疫
特異的すぎて有用でないとされている、例えば、アポＡ
−１分析において有用であることが見い出された、通常
のポリクローナル抗体含有抗血清の特異性は大部分又は
すべての抗原性タンパク質の抗原決定基に結合する数百
数千の異なった抗体の合意によっている。その結果、抗
原の多形性、グリコジル化の異質性、わずかな変性又は
他の反応による抗原の構造の小さな変化は通常ポリクロ
ーナル結合に殆ど影響を与えない。同様にポリクローナ
ル抗血清からの抗体のより大きな又はより小さなサブセ
ットが修飾され又は変性された抗原に通常結合する。

他方、モノクローナル抗体は通常抗原分子の１つの抗原
決定基（エピトープ）に結合する。もし何らかの理由に
よってその決定基が変化すると、抗体は結合を続けるこ
とができたりできなくなったりする。このことが問題な
のか利点なのかは個々の場合による。本ケースにおいて
はもしモノクローナル抗体をアポリポタンパクの診断用
分析に用いるなら、アポリポタンパクの小さな抗原性変
化は大きな誤差を招来する。

第２に、その特定の特異性ゆえにモノクローナル抗体（
Ｍａｂ）の成功的使用はしばしば標的抗原へのその親和
性による０例えば液相中に存在するあるＭａｂが液相及
び固相抗原と結合するのに有用であるに十分な親和性を
有していても、その同じ抗体が固相−結合抗体として有
用でないことがある。

上記の問題点はモノクローナル抗体の使用′にあたって
一般的なことである。従って当業者はモノクローナル抗
体をテストし、使うべき分析系にそれを性格づけること
が必須だということを認識している。この点について（
Ｔｏｄｉｎｇ、Ｊａｍｅｓ　Ｗ、＋Ｍｏｎｏｃｌｏｎａ
ｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：　”　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅ
ｓ　ａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ　’　、＾ｃａｄｅｍｉｃ
　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８３）％ｐａ
ｇｅｓ　４０〜４６参照。

木宛里■短と微翌 本発明はハイブリドーマ、ハイブリドーマによって分泌
される、アポリポタンパクＡ−１と免疫的に反応するモ
ノクローナルパラトピック分子、液体試料中におけるア
ポリポタンパクＡ−１もしくはＨＤ　Ｌの存在を分析す
る方法、及び特に液体血液試料についてその方法を行う
のに有用な特にキット型式の診断用系に関する。

本発明の１つの面はＡＴＣＣ受入れ番号（ａｃｃｅｓｓ
ｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ）　ＨＢ　９２００　、　ＨＢ　
９２０１　。

）（Ｂ９２０２、ＨＢ９２０３及び１１　Ｂ　９２０４
を有するハイブリドーマ群から選ばれたハイブリドーマ
に関する。本発明はさらにこれらのハイブリドーマの各
々によって分泌され、アポリポタンパクＡ−１と反応す
るモノクローナルパラトピック分子に関する。これらの
モノクローナルパラトピック分子は好ましくはまるごと
のモノクローナル抗体である。

本発明の別の面は液体試料中のアポリポタンパクＡ−１
の存在を分析する方法である。この方法は分析すべき液
体試料を有効量の、前述の５つのモノクローナルパラト
ピック分子の１つと混合して混合物を形成させる工程を
含む。この混合物を生物学的分析条件下でパラトピック
分子が試料中に存在するアポリポタンパクＡ−１と免疫
反応するに十分な、予め決めた時間保持し、免疫反応物
を形成させる。ついで免疫反応物の存在を測定し、もっ
て原試料中のアポリポタンパクＡ−１の存在を測定する
。本発明の実施態様において、パラトピック分子は好ま
しくは表示手段（ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇｍｅａｎｓ　）
として作用できるように結合した（ｏｐｅｒａｔｉｖｅ
ｌｙ　１ｉｎｋｅｄ）放射性元素を含有する。

そして試料中のアポリポタンパクの存在は混合物の残余
から免疫反応物を分離し、発せられた放射線を分析する
ことによって測定することができる。

分析方法の別のＢ様によれば、第１のモノクローナルパ
ラトピック分子を混合物形成前に固体マトリックスに結
合して固体支持体を形成する。固体支持体の非特異性タ
ンパク結合部位をブロックする。液体試料の混合後に生
成する免疫反応物は固相−結合免疫反応物として固体支
持体に結合している。この態様においては固相−結合免
疫反応物の存在を第２のモノクローナルパラトピック分
子の使用によって測定することが好ましい。

すなわち、液相の第２のモノクローナルパラトピック分
子を上記第１の混合物と混合して第２の混合物を生成さ
せる。これら第２のパラトピック分子はアポリポタンパ
クＡ−１と免疫反応し、前述したモノクローナルパラト
ピック分子から選ばれるが、第１の混合物中で用いられ
ている分子でなく、文筆２のモノクローナルパラトピッ
ク分子の免疫反応は第１のパラトピック分子の免疫反応
によって実質上ブロックされず又阻害されない。

これら第２のパラトピック分子は好ましくは酵素である
表示手段に作用できるように結合される。

生成した第２の混合物を生物分析条件下で第２の表示手
段結合パラトピック分子が混合物中に存在するアポリポ
タンパクＡ−１と免疫反応するに十分な、予め設定した
時間保持する。両パラトピック分子の混合及び免疫反応
物の生成の後の固相及び液相を分離し、固相中の表示手
段−結合アポリボタンバクＡ−Ｉを測定し、もって試料
中のアポリポタンパクＡ−１の存在を測定する。

本発明のモノクローナルパラトピック分子は又液体試料
、特に血清もしくは血漿のような液体血液試料中のアポ
リポタンパクＡ−Ｉの量を定量的に分析するのに有用で
ある。定量分析を望む場合、上記に概要を示したと一般
的に同様な工程によって行われる。

すなわち、既知量の分析すべき液体試料を、アポリポタ
ンパクＡ−１と免疫反応し、ＡＴＣＣ受入れ番号ＨＢ９
２００もしくはＩＴ　Ｂ　９２０１を有するハイプリド
ーマの１つより分泌される第１のモノクローナルパラト
ピック分子を同相に結合させた固体マトリックスより本
質的になる固体支持体と混合して固液混合物を形成する
。固体支持体表面の非特異性タンパク結合部位をブロッ
クする。

固液相混合物を生物分析条件下に最初のパラトピック分
子が試料中に存在する実質上すべてのアポリポタンパク
Ａ−１と免疫反応するのに十分な、予め定められた時間
保持する。

上記液体試料のアポリポタンパクＡ−１をさらにアポリ
ポタンパクＡ−Ｉと免疫反応し、ＡＴＣＣ受入れ番号Ｈ
Ｂ９２００もしくはＨＢ９２０１を有するハイプリドー
マの１から分泌されるが最初の混合物中では使用されて
おらず、酵素表示手段と作用できるように結合した、液
相中の第２のモノクローナルパラトピック分子と混合し
て第２混合物を形成させる。この段階で用いられるパラ
トピック分子は最初の混合段階で述べた２つの残りの方
である。

第２の混合物を生物分析条件下に第２の表示手段結合パ
ラトピック分子がこの試料中の実質上すべてのアポリポ
タンパクＡ−１と免疫反応物を生成するに十分な、予め
設定した時間保持する。上記混合及び保持工程で生じた
固相と液相とを分離し、固相中の表示手段結合アポリポ
タンパクＡ−■含有免疫反応物の量ひいては試料中のア
ポリポタンパクＡ−１の量を測定する。

上記分析方法の２つの混合工程を実質上同時に行い、又
２つの保持工程を一緒に行うのが特に好ましい。これら
の工程を実質上同時でかつ一緒に行わない場合は、最初
の保持工程の終了時点の面相と液相とを第２の混合前に
分離するのが好ましい。この場合第２の混合で用いるア
ポリポタンパクＡ−１は最初の保持工程で生成した面相
結合免疫反応物中に存在するアポリポタンパクＡ−Ｉで
ある。

液体試料中のアポリポタンパクＡ−１の存在の測定に使
用するのに好適な代表的にはキット形態の診断用系は本
発明の別の面を構成する、１つの態様によれば、その系
は前述のノ＼イブリドーマの１つによって分泌され、少
なくとも１つの分析を行うに足る量のパラトピック分子
を含有するパフケージ（ａ　ｐａｃｋａｇｅ）よりなる
。さらに好ましくは診断用系はさろに上記パラトピック
分子に働けるように直接結合するか、上記パラトピック
分子とアポリポタンパクＡ−Ｉとの免疫反応を示すこと
ができる別の分子に結合した表示手段を含有することが
できる。

もっとも好ましくは、診断用系は液体血液試料中のアポ
リポタンパクＡ−Ｉの量を測定するのに用５１られる。

かかる診断用系は、アポリポタンパクＡ−１と免疫反応
し、ＡＴＣＣ受入れ番号ＨＢ９２００もしくはＨＢ９２
０１を有するハイブリドーマの１つによって分泌される
モノクローナルパラトピック分子をそれに結合させた固
体マトリックスより本質的になる固体支持体を含有する
第１のパッケージを含む。この固体支持体の非特異的タ
ンパク結合部位はブロックされている。この系はさらに
アポリポタンパクＡ−Ｉと免疫反応し、ＡＴＣＣ受入れ
番号ＨＢ９２００もしくはＨＢ９２０１を有するハイブ
リドーマの１つによって分泌されるが最初のパッケージ
のハイブリドーマによって分泌されず、酵素表示手段に
作用できるように結合したパラトピック分子を含有する
第２のパッケージを含む。

本発明はいくつかの利益及び利点を有する。

かかる利益及び利点の１つは本発明が血清、血漿のよう
な液体血液中に存在する実質上すべてのアポリポタンパ
クＡ−１もしくはＨＤ　Ｌ粒子と免疫反応することがで
きる試薬を提供することである。

本発明の別の利益及び利点はこれらのパラトピック分子
の使用によってアポリポタンパクＡ−１もしくはＨＤＬ
の定量分析ができることである。

本発明のさらに別の利益及び利点は本発明の２つのハイ
ブリドーマによって分泌される特に好ましいパラトピッ
ク分子の使用によって、血液試料中に存在するアポリポ
タンパクＡ−１の量を定量するための、高度に正確かつ
精密な分析を行うことができることである。

本発明のさらに別の利益及び利点は以下に述べる本発明
の詳細な記述から当業者が容易に見い出すことができる
であろう。

光皿ｐ詳細な開示 ■、議−諭 Ａ、定ｌ 「抗体」は抗原と特異的に結合することができる免疫グ
ロブリンとよばれるグリコジル化タンパク質の群の一員
である分子をいう。抗体は抗原の抗原決定基と抗体の抗
体結合部位との間の特異的、免疫学的相互結合作用によ
って抗原と結合する。

「抗体結合部位」とは抗原と特異的に結合する、１１鎖
及びＬ鎖の回部領域及び超可表領域よりなる、抗体分子
の構造部分をいう。Ｊｅｒｎｅ、　Ａｎｎ、　Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ。

（Ｉｎｓ　ｔ、　Ｐａｓ　ｔｅｕｒ）、１２５ｃ、３７
３〜３８９（１９７４）の命名に従って、抗体結合部位
を通常ここては「パラトープ」　（ρａｒａｔｏｐｅ）
と称する。

抗体の抗体結合部位含有（パラトープ含有）ポリペプチ
ド部分はパラトープを含有し抗原に結合する抗体分子の
部分をいい、例えば抗体のＦａｂ　％Ｆａｂ　’　、Ｆ
（ａｂ　’　）２及びＦ　（ｖ）部分を包含する。抗体
のＦａｂ及びＦ（ａｂ’）、部分は実質上完全な抗体を
よく知られた方法によってそれぞれパパイン及びペプシ
ンを用いてタンパク質加水分解することによって調製す
る。例えばＴｈｅｏｆｉｌｏｐｏｌｕｓ　ａｎｄ　Ｄｉ
ｘｏｎへの米国特許第４，３４２．５６６参照。抗体の
Ｆａｂ　’部分も又よく知られており、Ｆ（ａｂ’）ｚ
部分の２つのＨＳｉ部゛のジスルフィド結合をメルカプ
トエタノールで還元し、得られるタンパクメルカプタン
をヨードアセタミドのような試薬でアルキル化すること
によって生産される。完全な抗体が好ましく、本発明の
モノクローナル配位子分子の例示として用いる。

「抗原」は歴史的に抗体が結合する独立体（ｅｎｔｉｔ
ｙ）を表わすものとして、又抗体の生産を誘導する独立
体を表わすものとして用いられてきた。最近の用法によ
れば抗原は抗体が結合する独立体の意味に限定して用い
られ、他方「免疫原」が抗体生産を誘導する独立体の意
味に用いられる。

ここで論議される独立体が免疫原的及び、抗原的の両方
を意味する場合、−１１ｕに抗原と称することにする。

「抗原決定基」は抗体結合部位が免疫学的に結合する抗
原の実際の構造部分をいう。Ｊｅｒｎｅの命名では抗原
決定基を「エピトープ」と再定義している。

「生物的に活性な」は他の一般的もしくは有効な能力が
その分子にあるかもしれないが、少なくとも抗原もしく
は特異性抗体結合部位に特異的に結合する、タンパク質
性分子の能力をいう。抗体結合部位を含有するパラトピ
ック分子の生物的活性は水性媒体中中なくとも生理的な
ｐＨ及びイオン強度でパラトープ（抗体結合部位）とそ
のエピトープ（抗原決定基）とを混合したとき両者の免
疫反応によって免疫反応物が生成することによって実証
される。好ましくは生物活性は生物分析条件下、すなわ
ち本発明で有用なモノクローナルパラトピック分子がエ
ピトープ（抗原決定基）に結合する、約５〜約９までの
ｐＨＮ留水のそれから約１Ｍの塩化ナトリウムのそれま
でのイオン強度及び約４〜約４５℃までの温度の条件下
で生ずる。本発明で有用なモノクローナルパラトピック
分子はすべて生物的に活性である。

「エライッ」は試料中の抗原もしくは抗体を検出し又は
その量を定量するのに、固相に結合した抗原もしくは抗
体、及び酵素−抗体複合体もしくは酵素−抗原複合体を
用いる、酵素結合抗体免疫吸着アッセイを意味する。エ
ライサ技術についての記述はり、Ｐ、５ｉｔｅら、”　
Ｂａ５ｉｃ　ａｎｄ　Ｃ１ｉｎｉｃａｌＩＣ１１ｎｉｃ
ａｌＩ　”　４版、２２章（１９８２）　、Ｌａｎｇｅ
Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ　　（ロスア
ルトス、ＣＡ）発行；及び米国特許第３，６５４，０９
０．３，８５０，７５２及び４．０１６．０４３にみら
れる。これらの記述を参考にここに加入する。

「酵素」はそれに対ししばしば特異的である基質に触媒
作用によっである変化を促進し又は生ずることができる
タンパク質を意味する。

ここで用いられる「免疫反応物」は免疫反応の生産物、
すなわち抗体もしくはパラトープを含有する分子が抗原
に免疫的に結合するときに生成する実体（ｅｎｔｉｔｙ
）を意味する。従って免疫反応物は分子間に形成される
特異的複合物である。

「表示手段」、「酵素表示手段」又は「標識」はここで
は種々の文法形式において相互変換的に用いられ、免疫
反応物の存在を表示する検出可能な信号の生成に直接又
は間接に関与する単′一原子、分子及び酵素を包含する
。抗体に結合し、又は抗体に入れることができる、実質
上いかなる表示手段も本発明では有用であり、かかる表
示手段は単独でもしくは別の試薬との組合せで用いるこ
とができる。かかる表示群又は標識はそれ自身免疫化学
でよく知られており、新規なパラトピック分子、方法及
び／又は系と共に用いられる限りに本発明の一部を構成
する。酵素表示手段と結合したパラトピック分子は本発
明では酵素結合パラトピック分子と称する場合がある。

本発明におけるこ丸ごとの抗体」（ｗｈｏｌｅａｎｔｉ
ｂｏｄｙ）　　と細胞によって分泌される完全な、そっ
くりそのままの分子をエピトープとの免疫反応という生
物活性に必要なパラトープを含有する他の、より小さな
分子から区別するために用いる。

本発明のパラトープ分子とはモノクローナルパラトピッ
ク分子である。「モノクローナル抗体」（Ｍａｂ）はた
だ１種の抗体分子を分泌するハイブリドーマのクローン
によって生産される抗体であり、モノクローナルパラト
ピック分子とは下記に議論するが、モノクローナル抗体
又はそのパラトープ含有ポリペプチド部分である。ハイ
ブリドーマ細胞は抗体産生細胞とミエローマもしくは他
の自己永続性細胞系とを融合したものである。かかる抗
体ははじめＫｏｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、
Ｎａｔｕｒｅ、　２５６．４９５〜４９７　（１９７５
）によって記述された。

この記述を参考として本発明に加入する。

「モノクローナルパラトピック分子」及び「パラトピッ
ク分子」は本発明においては相互変換的に集合的に用い
られ、モノクローナル抗体の結合部位を含有する１群の
分子を表わし、丸ごとのモノクローナル抗体、実質上丸
ごとのモノクローナル抗体及びモノクローナル抗体の抗
体結合部位含有部分を包含する。Ａｌ−１０，ＡＩ−Ｌ
　Ｌ、Ａｌ−１２、Ａｌ−１３及びＡｌ−１４と名づけ
られた丸ごとのモノクローナル抗体は本発明のパラトピ
ック分子であり、パラトープを含有する丸ごとの抗体で
ある。「モノクローナルパラトピック分子」や「パラト
ピック分子」は上記モノクローナル抗体の抗体結合部位
を含有する包括的生物活性分子を意図するときに用いら
れ、「パラトピック分子」の語を伴うか伴わないＡｌ−
１０、Ａｌ−１１、Ａｌ−１２、Ａｌ−１３及びＡｌ−
１４はハイブリドーマＨＢ　９２００、ＨＢ９２０１゜
ＨＢ９２０２、ＨＢ９２０３又はＨＢ９２０４によって
生産される特定の丸ごとの抗体が意図されるときに用い
られる。

「分泌する」及び「産生ずる」は当分野ではしばしば相
互変換的に用いられ、それから抗体分子が得られる細胞
に関して用いられる。しかしながら抗体産生細胞はそれ
らをとりまく環境中へ抗体分子を分泌しないかもしれな
い。本発明であげたハイブリドーマ細胞は抗体を環境中
へ分泌する。

それでも当分野で用いられる用語に従って本発明では、
かかる細胞も「抗体産生」細胞と称する場合があり、又
その抗体を「産生された」と称する場合がある。本発明
においては上記抗体のバラトープ含有ポリペプチド部分
についても同様に「産生された」又は「分泌された」と
いうが、かかる分子はそれ自身「産生され」又は「分泌
された」抗体から調製されることを理解すべきである。

［上清液Ｊ　（”　５ｕｐｅｒｎａｔｅ　”　ａｎｄ　
”　５ｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）は本発明では相互変換的
に用いられ、細胞が培養されるインビトロの液体培地に
関する。本発明で関心のあるハイブリドーマの培養によ
って産生されたモノクローナル抗体は培養培地環境に分
泌される。従ってこれらの細胞についての培養培地上清
液はモノクローナルパラトピック分子の１つの好ましい
取得源であり、よく知られた技術によりハイブリドーマ
細胞から容易に分離して得ることができる。かかる技術
の例は低速遠心分離であり、これによって液体培地から
細胞を沈殿させる。モノクローナルパラトピック分子は
又ハイブリドーマ組織を導入した実験動物の腹水腫瘍流
体（腹水流体）から得ることもできる。両方法について
は後述する。本発明で３種以上の抗原及びパラトピック
分子成分を混合して免疫反応混合物を生成させる場合に
用いる「実質上同時に」はそれらの成分のいずれか２つ
の混合後約１５分以内好ましくは約５分以内にすべての
成分を存在させ１つの混合物へ混合することを意味する
。

パラトピック分子とその抗原であるアポリポタンパクＡ
−１とを免疫反応させて免疫反応物を生成させることに
関して本発明で用いる「実質上すべて」はパラトピック
分子が過剰に存在する場合にパラトピック分子が溶液中
に存在する抗原の約９０％と免疫反応することを意味す
る。

本発明は５つのハイブリドーマによって分泌されるパラ
トピック分子に関する。これらのパラトピック分子はア
ポリポタンパクＡ−１と免疫反応する。アポリポタンパ
クＡ−１分子は本発明ではしばしばアポＡ−Ｉと称せら
れる。

５つのハイプリドーマ中実験室番号１１９１１１４．２
１１８及びＨ１０３Ｄ　８．１　Ｄ　１１のハイブリド
ーマ、及びＡｔ−１０及びＡｔ−１１とそれぞれ命名し
た　′分泌パラトピック分子が特に好適である。パラト
ピック分子Ａｌ−１０及びＡｌ−１１の各々はアポリポ
タンパクＡ−１上の大事に取り扱われた抗原決定基と免
疫反応し、又流体相ＲＩＡの１２Ｊ−ＨＤ　Ｌ粒子の少
なくとも約９０％と免疫反応する。第１図及び２図から
分るごとく、パラトピック分子Ａｌ−１０及びＡｌ−１
１は共にアポＡ−１と結合するが、実質上お互いの結合
を妨害しない。

５つのハイブリドーマの各々は特許手続上の微生物の寄
託の国際的承認に関するブダペスト条約に従ってアメリ
カンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）　、ロ
ソクウ゛イレ、ＭＤに１９８６年９月１６日に寄託され
た。実験室命名、パラトピック分子の命名及びそれらの
クラス、及びＡＴＣＣ受入れ番号を以下に示す。

１１９１Ｈ４，２ｔ１８　　　　　　Ａｌ−１０２ａ　
　　、　ＨＢ　９２００Ｈ１０３Ｄ８．１０１１　　　
　　　八ｌ−１１１１１Ｂ　　９２０１Ｈ１０５Ｃ７，
ＩＣｌ０　　　　ＡＩ　−１２１Ｈａ　９２０２Ｈ１０
５Ｆ４．１Ｂ４　　　　Ａｌ−１３１，１１Ｂ９２０３
１１１１４０１２．２０８　　　　　　八ｌ−１４２ａ
　　　　ｆｌＢ　　９２０４上記寄託はブダペスト条約
の要求にそって行われた。すなわち寄託期間は寄託の日
から３０年、寄託機関での寄託についての最後の要求か
ら５年、又はこの出願からの特許の有効期間のうちもっ
とも長い期間である。ハイブリドーマは寄託機関で非生
存状態になったら補充しなければならず、又この出願か
らの特許の発行以後はＡＴＣＣから公衆に入手可能な状
態にされる。

Ｃｕｒｔｉｓｓ及びＥｄｇｉｎｇｔｏｎ、Ｊ、Ｂｉｏｌ
、Ｃｈｅｍ、、　　２６０．２９８２〜２９９３　　（
１９８５）はヒトＨＤ　Ｌの免疫化学的異質性、及びそ
のモノクローナルパラトピック分子がアポＡ−Ｉと免疫
反応する３つのハイブリドーマの調製について報告して
いる。

Ａｌ−４、Ａｌ−７及びＡｌ−９と名づけられたこれら
のモノクローナルパラトピック分子は各々、液体相ＲＩ
Ａ中でヒトアポＡ−１及びヒトＨＤ　Ｌ粒子と免疫反応
したが、異なる免疫反応性を示した。

この報文で報告された研究によると抗体過剰下での”’
　Ｉ　−ＨＤ　Ｌを用いた、液体相、ＲＩＡ間接免疫沈
殿免疫活性は、合計トリクロロ酢酸沈殿放射能標識％と
してＡｌ−４約４４％、Ａｌ−７約６１％及びＡｌ−９
約３２％であった。流体相ＲＩＡ中における単離された
１２５■−アポＡ−１に対するＡｌ−４、Ａｌ−７及び
Ａｌ−９の最大免疫反応は報文によるとＡｌ−４及びＡ
ｌ−７について約６０％、及びＡｌ−９について約３０
％であった。

これらのモノクローナルパラトピック分子の２又は３種
の組合せによっても標識ＨＤＬを１００％免疫沈殿させ
ることはできなかった。しかしながら、これらのモノク
ローナルパラ）・ピンク分子のいずれか２つとアポリポ
タンパクＡ−１１に対するモノクローナルパラトピック
分子との組合セは沈殿性”’Ｉ−ＨＤＬの１００％と免
疫反応することができた。

後に結果の部で議論するごとく、ここに開示するハイブ
リドーマのヒトＨＤ　Ｌ及びヒトアポＡ−１との免疫活
性はＣｕｒｔｉｓｓ　ａｎｄ　Ｅｄｇｉｎｇｔｏｎ、Ｊ
、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、、　２６０．２９８２〜２９９３　　（１９
８５）で報告された免疫活性よりかなり向上している。

液体相ＲＩＡ中のＨＤＬに対するこれらの最大免疫活性
は１２’Ｉ−ＨＤＬの約６０％と免疫反応すると報告さ
れたＡｌ−７の最大免疫活性よりも約３０％以上大きい
。

本発明のハイブリドーマはマウス牌細胞と非分泌性マウ
スミエローマ系Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞との３つ
の別個の融合によって調製された。

新鮮なそのままのヒトＨＤＬ又は新鮮なグルグルアルデ
ヒド−架橋ヒｌ−ＨＤ　Ｌを免疫源として用いた。

Ｃ１方広 本発明の方法によって、液体試験中のアポリポタンパク
Ａ−１の存在、及び望まれる場合は量が測定される。液
体試料は水性のものであり、水単独、塩組成物、又は緩
衝液又は血液試料等の体流体を包含する。

アポＡ−Ｉ又はＨＤ　Ｌの定量分析が望まれる液体血液
試料がしばしば本発明の方法の対象となる。

試料は血清でも血漿でもよく、これらを用いて得られる
結果には統計上差異がない。実際問題として、後にこの
方法を用いて得られた結果では血清及び血漿の分析から
得られた平均値を用いている。

血清又は血漿のいずれを用いたかに拘らず、液体血液試
料は、好ましくは、この分野で知られているように少な
くとも約１２時間絶食した人から得られている。かかる
血液試料を「絶食」試料と称する。血清又は血漿を定量
分析の液体試料として使う場合、かかる試料のアポＡ−
１を測定する場合に通常行われる、遮蔽をとく処理（ａ
ｎ　ｕｎｍａｓｋｉｎｇｔｒｅａｔｍｅｎｔ　）を試料
に施す必要はないことをここに注記する。

血漿や血清のような液体血液試料を用いて、特に好適な
エライサ法によって正確かつ精密な結果が得られること
は驚くべきことである。というのはこれらの試料物質は
分析を妨害すると予想されるタンパク質、脂質及び他の
化合物を含有しているからである。例えばＭａｇｇｉｏ
、　Ｅｎｚｙｍｅ−１ｍｎｕｎｏａｓｓａｙ＋ＣＲＣＰ
ｒｅｓｓ、Ｉｎｃ、Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ＋ＰＬ＋　１
９８０、ｐａｇｅ６５参照。

定量的測定に関しては、アポリポタンパクＡ−■の量を
予め設定した量の液体試料を用いて測定する。液体試料
が血漿や血清のような液体血液試料のときアポＡ−１の
測定に際し通常用いられる、遮蔽解放処理は必要ない。

すなわち試料をかかる遮蔽解放処理を行わずに用いるこ
とができる。

定量分析を望む場合、分析者が用いる液体試料の容量を
知ることは重要でない。しかしながらもちろん、用いる
試料容積及びアポＡ−１ｔｍ度は用いた試薬を圧倒する
ほど高くてはいけないし、実際的でないほど少量のアポ
Ａ−１の存在を求めるほど小さいものであってもならな
い。例えば正確かつ精密な定量測定は約１０〜約２００
ｎｇのアポＡ−１を含有する試料を用いてエライサ法に
よりルーチンに行うことができる。かくのごとく定量測
定はごく少量のアポＡ−１で行うことができる。

一般的には本方法は分析しようとする液体試料と有効量
の前述の５つのモノクローナルパラトピック分子よりな
る群から選ばれるパラトピック分子とを混合して混合物
を生成させる工程を包含する。混合物を生物分析条件下
にパラトピック分子が試料中に存在するアポリポタンパ
クＡ−１と免疫反応して免疫反応物を生成するのに十分
な、予め設定された時間保持する。ついで免疫反応物の
存在を測定し、それによってもとの試料中のアポリポタ
ンパクＡ−１の存在を測定する。

上記分析はよく知られた、固体用分析でも液体相分析で
も他の免疫分析でもよいことを理解すべきである。典型
的な液相及び固相分析を例示的に以下に説明する。さら
に固相分析では競合する、アポＡ−１（ＨＤＬ）又はパ
ラトピック分子を固体相に結合することができる。

免疫反応物の存在は多くの方法によって測定でき、それ
らの各々は代表的にはここに記述するような表示手段を
用いる。

本発明においては、パラトピック分子は好ましくは表示
手段として働けるように結合した放射性元素を含有し、
もとの試料中のアポリポタンパクＡ−１の存在は免疫反
応物を混合物の残余から分離し、それから発せられる放
射能を分析することによって測定される。

分析方法の別の態様において、混合前に第１のモノクロ
ーナルパラトピック分子を固体マトリックスに結合させ
て固体支持体を形成させる。固体支持体の非特異性タン
パク結合部位をブロックする。混合後に生ずる免疫反応
物を固相結合免疫反応物として固体支持体に結合させる
。本態様においては後で議論するごとく、固相結合免疫
反応物の存在を第２モノクローナルパラトピック分子で
ある表示手段含有分子の使用によって測定するのが好ま
しい。この場合、液相の表示手段含有分子を上記第１混
合物と混合して第２混合物を生成させる。

これらの表示手段含有分子は第１のモノクローナルパラ
トピック分子の免疫反応によって実質上ブロックされな
い、アポリポタンパクＡ−１の第２のエピトープを免疫
反応しない。かかる表示手段含有分子は前述のモノクロ
ーナルパラトピック分子から選ばれるが、第１の混合物
で用いた分子とは異なる分子である。モノクローナルパ
ラトピック分子の特に有用な一対はＡＴＣＣ受入れ番号
　　。

）ＩＢ９２００及び夏（Ｂ９２０２を有するハイブリド
ーマによって分泌されるものである。これら第２のパラ
トピック分子は好ましくは酵素である表示手段に作用で
きるように結合する。結合する表示手段はここに述べる
ごとくいかなる表示手段であってもよい。

生成した第２の混合物を生物分析条件下に第２の表示手
段結合パラトピック分子が混合物中のアポリポタンパク
Ａ−Ｉと免疫反応するに十分な、予め設定した時間保持
する。両パラトピック分子の混合とそれらの免疫反応物
の生成後、固体相と液体相とを分離する。ついで固相中
の表示手段結合アポリポタンパクＡ−Ｉの存在を測定し
、もって試料中のアポリポタンパクＡ−Ｉの存在を測定
する。固を目結合パラトピック分子、アポＡ−Ｉ抗原及
び標識結合第２パラトピック分子の間で生成した免疫反
応物を本発明ではサンドイッチ免疫反応物という場合が
ある。

前にも述べたごとく、本発明のモノクローナルパラトピ
ック分子は又液体試料、特に血清もしくは血漿のような
液体血液試料中のアポリポタンパクＡ−Ｉの量を定量的
に分析するのに有用である。

定量結果を望む場合、上記面相分析について概観したと
同様の一般的手法が用いられる。

すなわち、アポリポタンパクＡ−Ｉの定量分析において
、予め設定した既知量の、脱遮蔽処理をしていない血漿
もしくは血清のような血液試料とアポＡ−１と免疫反応
する、本質的に固相結合第１モノクローナルパラトピッ
ク分子を有する固体マトリックスよりなる固体支持体と
を混合して第１の固相液相混合物を形成させる。これら
の固相結合第１モノクローナルパラｉ・ピック分子は試
料中に予想されるアポＡ−１の量より過剰に存在し、Ａ
ＴＣＣ受入れ番号ＨＢ９２００又はＨＢ９２０１を有す
るハイブリドーマの１つによって分泌される。

固体支持体表面の非特異性タンパク結合部位は混合に先
立ってブロックする。

第１の固液用混合物を生物分析条件下に第１パラトピッ
ク分子が既知の少量の試料中のアポリポタンパクＡ、−
１と免疫反応して、試料中に存在する事実上すべてのア
ポリポタンパクＡ−１を含有する同和結合免疫反応物を
生成するに十分な、予め設定した時間保持する。

試料のアポＡ−１をアポＡ−１と免疫反応して第２の混
合物を与える液相第２モノクローナルパラトピック分子
と混合する。これら第２のモノクローナルパラトピック
分子はＡＴＣＣ受入れ番号ＨＢ９２００又はＨＢ９２０
１を有するハイブリドーマの１つによって分泌されるが
、第１の混合物中で用いたものではない。これら第２の
パラトピック分子は酵素表示手段に働けるよう（ｏｐｅ
ｒａｔｉｖｅｌｙ）に結合している。すなわち、この工
程で用いるパラトピック分子は第１の混合工程であげた
２つのパラトピック分子の残りである。

第２の混合物を生物分析条件下に第２の酵素結合パラト
ピック分子が既知の少量の試料中の実質上すべてのアポ
リポタンパクＡ−１を含有するサンドイッチ免疫反応物
を生成するのに十分な、予め設定した時間保持する。両
パラトピック分子の混合、及び両パラトピック分子とア
ポＡ−１との免疫反応物の生成の後の固相と液相とをす
すぎによって分離し、固相中の表示手段結合アポリポタ
ンパクＡ−Ｉ含有サンドイッチ免疫反応物の量を測定す
る。２つのモノクローナルパラトピック分子の各々が既
知少量の試料中の実質上すべてのアポＡ−１と免疫反応
し、又パラトピック分子の少なくとも１つがアポＡ−１
上の非交差反応性で大事に取扱われた（ｃｏｎｓｅｒｖ
ｅｄ　）エピトープと免疫反応するので、免疫反応物中
の酵素結合アポＡ−１の定量が既知少量の試料中のアポ
リポタンパクＡ−［の定量を与えることになる。試料中
のアポリポタンパクＡ−Ｉの量は既知少量の液体試料の
最初に用いた予め設定された量をもとに容易に計算する
ことができる。

上に論じたアポリポタンパクＡ−１の固相分析は、すで
に述べたごとく混合及び保持工程の各々を引き続いて行
うこともできるし、２つのＹ昆合工程を実質上同時に、
かつ２つの保持工程を一緒にして行うこともできる。

工程を順次行う場合には、固相結合モノクローナルパラ
トピック分子を混合し、混合物を、酵素表示手段結合パ
ラトピック分子及び得られる混合物の保持に先立って保
持するのが好ましい。好ましい、順次工程に従う場合に
は、液体酵素表示手段結合パラトピック分子を混合し、
混合物を保持するに先立って、同相と液相を分離し、分
離の確実にするため固相をすすぎ洗いするのが好ましい
。

適当な試料と酵素表示手段結合パラ１−ピック分子とを
最初に混合することもできる。この方法による場合には
固相結合モノクローナルバラトビッり分子の混合に先立
って相の分離はしなくてよい。

もっとも好ましくは、固相結合モノクローナルパラトピ
ック分子、液体試料及び酵素表示手段結合パラトピック
分子を別々に実質上同時に混合し、得られる固液相混合
物を保持する。すなわち、混合物を同和結合モノクロー
ナルパラトピック分子が実質上すべてのアポＡ−１と固
相結合免疫反応物を形成し、液相酵素表示手段結合パラ
トピック分子も試料中の実質上すべてのアポＡ−Ｉと免
疫反応するのに十分な時間保持する。生成する免疫反応
物を固相結合サンドイッチ免疫反応物という。

液相も又存在する。

上述してきたそれぞれの分析において、２つのモノクロ
ーナルパラトピック分子のいずれを固相結合パラトピッ
ク分子として用いても同様な結果が得られる。しかしな
がら、本発明で論する、アポリポタンパクＡ−１につい
ての大部分の研究は固相マトリックスに結合させた、Ａ
ＴＣＣ受入れ番号ＨＢ９２００　（ＡＩ−１０）を有す
るハイブリドーマによって分泌される分子を用いて行っ
た。

上記各方法で有用な典型的固体マトリックスは当該分野
でよく知られており、例えばＦａｌｃｏｎＭｉｃｒｏｔ
ｅｓｔ　ｍ　Ｆｌｅｘｉｂｌｅ　Ａｓ５ａｙ　Ｐｌａｔ
ｅｓ　（ＦａｌｃｏｎＰｌａｓｔｉｃｓ、０ｘｎａｒｄ
、ＣＡ）の名のちとに販売されている９６穴微量力価プ
レート（ａ　９６−ｗｅｌｌ　ｍ１ｃｒｏｔｔｔｅｒｐ
ｌａｔｅ　）　、又はＩｍｍｕｌｏｎ　　［及び１１　
（Ｄｙｎａｔｅｃｈ。

Ａｌｅｘａｎｄｒｉａ、ＶＡ　）の名のもとに販売され
ている微量力価条片（ａ　ｍ１ｃｒｏｔｉｔｅｒ　５ｔ
ｒｉｐ）のような−一列に１２穴を有する微量力価条片
などの固体マトリックスを包含する。微量力価条片やプ
レートは透明のプラスチック材料、好ましくはポリ塩化
ビニルやポリスチレンでつくられる。本発明の上述の方
法で使用し得る別の固体マトリックスはＡｂｂｏｔｔ　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｎｏｒｔｈ　Ｃｈｉｃａｇ
ｏ、ＩＬから販売されている直径約１μｍ〜約５１−の
ポリスチレンビーズ；いかなる手頃な大きさでのポリス
チレン製の管、棒状物又はパドル状物；及びポリスチレ
ンラテックスであって、ポリスチレン粒子が約１μｍの
大きさを有し、ラテックスの残りの部分より遠心分離に
よって分離され得るポリスチレンラテックスを包含する
。

固体マトリックスは又Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　
Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ＋Ｐｉｓｃａｔａｉ＋ａｙ、　ＮＪ
で製造されているセファデックスＧ−２５，５０，１０
０，２００等の架橋デキス１ヘラン：　Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓで製造されている
セファロース６Ｂ、Ｃｈ６Ｂ、４Ｂ、Ｃｈ４６等のアガ
ロース及び架橋アガロースなどの種々の物質でつくるこ
とができる。

表示手段は本発明のパラトピック分子又は有用な抗原に
直接結合させることができ、又別れた分子よりなること
もできる。１表示手段はヤギもくしはウサギ抗マウス抗
体のような、本発明のパラトピック分子に結合する抗体
などの別れた分子であってもよい。本発明でタンパクＡ
と呼ばれることもあるスタフィロコッカス・アウレウス
タンパクΔも又非結合分子表示体もしくは標識手段とし
て用いることができる。この表示体もしくは標識手段に
対して、本発明の丸ごとのもしくは実質上丸ごとのパラ
トピック分子、すなわちタンパクＡが結合する、パラト
ピック分子のＦｃ？ｆＪＩ域部を有する分子が用いられ
る。かかる使用においてはタンパク八自身が放射性元素
やフルオロクロム（ｆ　ｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅ）色素
のような標識を有している。

放射性元素は特に有用な標識である。本発明で用いるこ
とができる典型的な放射能標識剤はＴ線を発する放射性
元素である。Ｔ線を発する１２４１．１２５１．１２８
　Ｉ、１３１■、１３２（及び５ＩＣｒのような元素が
Ｔ線放出放射性元素表示群を形成する。

他の有用な表示群は陽電子を発する１ＩＣ１ｌ［ｌＦ、
ＩＳＯ及び”Ｎのような元素である。発せられた陽電子
は混合物中の電子と出会うとＴ線を生ずる。

放射性モノクローナルパラトピック分子は代表的には、
米国特許第４，３８１，２９２に記述されているように
して、モノクローナルパラトピック分子を単離し、これ
に上記のもしくは別の適当な放射性元素の１つを標識す
ることによってつくることができる。典型的表示標識手
段は螢光性標識剤であり、このものは抗体もしくは抗原
にそれらを変性させることなく化学的に結合して、有用
な免疫螢光性トレーサーであるフルオロクロム（色素）
を形成する。適当な螢光性標識剤はフルオレセインイソ
シアネート　（ＦＩＣ）、フルオレセインイソチオシア
ネート　（ＦＩＴＣ）、ジメチルアミノ−ナフタレン−
８−スルオニルクロリド（口ＡＮＳＣ）、テトラメチル
ローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）　、リサ
ミン（ｌｉｓｓａｍｉｎｅ）ローダミン８２００スルホ
ニルクロリド（ＲＢ２００ＳＣ）等のフルオロクロムで
ある。免疫螢光分析技術についてはＤｅＬｕｌａ、１ｍ
ｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ
　”Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ａｓ　Ａ　Ｔｏｏｌ、Ｍａｒｃ
ｈａｌｏｎｉｓ　ｅｔ　ａｌ、＋ｅｄｓ。

Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　　＆　５ｏｎｓ、Ｉ、ｔｄ、、
　ｐｐ、　　ｌ　８９−２３１（１９８２）に記載され
ており、これを参考に本発明中に加入する。

酵素は特に好適な表示手段である。酵素を用いる場合、
好ましくは本発明のパラトピック分子に直接結合させて
複合体を形成させる。パラトピック分子に結合させる有
用な酵素分子又は他の表示手段は作用できるように（ｏ
ｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ）結合すべきである。すなわち酵
素や他の標識の機能は結合やパラトピック分子によって
実質上積われてはならないし、又酵素や他の標識が結合
するモノクローナルパラトピック分子の機能もその結合
や酵素もしくは他の標識の存在によって実質上積われて
はならない。

酵素表示手段は西洋わさびパーオキシダーゼ（ＨＲＰＯ
）、グルコースオキシダーゼ等の生物活性酵素である。

よく知られているごとく、表示手段がＨＲＰ　Ｏやグル
コースオキシダーゼのような酵素である場合には抗体−
抗原複合物が生成したことを顕在化するために別の試薬
を要する。

ＨＲＰＯのための別の試薬は過酸化水素及びジアミノベ
ンジジンのような酸化色素プレカーサーである。グルコ
ースオキシダーゼに関して有用な別の試薬はグルコース
及び２．２′−アジノージ−（３−エチルベンズチアゾ
リン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）である。

酵素をパラトピック分子に働けるように結合して複合体
を生成させる技術は当分野でよく知られている。典型的
技術はＭａｇｇｉｏ、　Ｅｎｚｙｍｅ−１ｍｍｕｎｏａ
ｓｓａｙ。

Ｃｈａｐｔｅｒ　４　ｂｙ　Ｋａｂａｋｏｆｆ、ＣＲＣ
Ｐｒｅｓｓ＋Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ。

ＰＬ、ｐａｇｅｓ７１〜ｌ　Ｏ４（１９８０）で論ぜら
れている。

ハイブリドーマ上清液や腹水から得られたものとしての
モノクローナルパラトピック分子をそのまま用いること
もできるが、精製したパラトピック分子を利用すること
が好ましい。

パラトピック分子の精製についてはいくつかの手段が当
分野でよく知られているが、代表的にはクロマトグラフ
ィーを利用する。本発明についてより抜きの精製技術は
ファーストプロティン液体クロマトグラフ４−　（Ｆａ
ｓｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏ
ｇｒａｐｈｙ）　　（Ｆ　Ｐ　Ｌ　Ｃ）である。

酵素結合パラトピック分子複合物を流体相中で混合物に
供給する。これらの分子は代表的には水性組成物中に溶
解する。代表的な組成物は、零発　明で用いる典型的な
精製モノクローナル抗体含有組成物の場合と同様、希釈
剤としてリン酸緩衝食塩水（Ｐ　Ｂ　Ｓ）を包含する緩
衝塩を含有する。希釈した腹水流体も又有用である。

前に述べたごと（、固相支持体表面の非特異性タンパク
結合部位はブロックする。固相結合パラトピック分子は
、吸着又は他のよく知られた付着手段によって固体マト
リックスに結合している。

ウシ、ウマ又は他の血清アルブミンのような、分析を妨
害せず、またヒトアポＡ−１で汚染されていないタンパ
ク質の水溶液を固体相と混合して、パラトピック分子含
有固体支持体表面の、モノクローナルパラトピック分子
によって占拠されていないタンパク質結合部位に、混合
したタンパク質を吸着させる。

代表的なタンパク質水溶液はｐＨ７、１−７，５のＰＢ
Ｓ中の約３〜約ｌｏ重量％のウシ血清アルブミンを包含
する。タンパク質水溶液−固体支持体混合物は代表的に
は３７℃で少なくとも１時間保持し、ついで固相をすす
いで非結合タンパク質を除去する。

すべに述べたごとく、液体血液試料は血漿又は血清であ
る。後で個々的に記述する、分析における直線関係を得
るために、試料は使用前に約１＝２、５００から約１：
２０，０００、さらに好ましくは約１：５０００に希釈
するのが好ましい。より小さい希釈度を用いると混合物
にあまりに多くのアポリポタンパク抗原を与え、分析結
果の直線性を損うのみならず、抗原に対する固相結合パ
ラトピック分子の過剰性を低め又はなくすことになる。

約１：２０，０００より大きい使用は精密性を減する傾
向がある。

保持時間は、周囲室温（約２０〜２５℃）で最低約３０
分を用いる限り、結果において殆ど変化なく広範囲に変
化させることができる。最低３０分の保持時間を用いる
場合、保持混合物はその間攪拌して、アポリポタンパク
Ａ−１抗原とモノクローナルパラトピック分子との間の
実質上完全な免疫反応を確保するのが好ましい。室温で
１時間以上というようなより長い保持時間を用いる場合
は攪拌を要しない。攪拌は約１１００ｒｐで回転するジ
ャイロシェーカー（ｇｙｒｏ−ｓｈａｋｅｒ）によって
供給される。定量法で用いられる各分析は室温で約３０
〜約６０分のパラトピック分子−試料混合物保持時間を
用いて行うことができる。

免疫反応物中のアポリポタンパクＡ−１抗原の量は分離
した酵素結合アポリポタンパク含有固相と予め設定した
量の視覚化剤もしくは試薬の混合によって測定される。

酵素表示手段としてＨＲＰＯを用いる場合、水性媒体中
の過酸化水素と酸化色素プレカーサー〔例えばＯ−フェ
ニレンジアミン（ＯＰＤ））のような視覚化剤を分離し
た固相結合免疫反応物と混合する。混合物を生物分析条
件下に周囲温度で少なくとも約３０分のような予め設定
された時間保持して発色を進行させる。ついで発色の進
行を４Ｎ硫酸のような停止試薬を添加して停止させる。

よく知られているごとく、組成物の光学密度を読み、標
準曲線値と比較してアポリポタンパクの量を決定する。

従って、一旦固体支持体及び液体試料を調製すると、定
量分析を室温で約１時間で行うことができる。すなわち
パラトピック分子及び試料から生じた混合物の攪拌を伴
う３０分の保持時間及び発色進行のためのさらに３０分
の保持時間である。

実際問題として、各使用の直前に固体支持体を調製する
必要はなく、ここに述べるごとくかかる支持体は使用前
に調製し、少なくとも１力月間は湿らせてカバーして通
常の冷蔵条件下に保存することができる。

アポＡ−１定量分析ではエライザで得られた光学密度値
をそれに対して比較してアポリポタンパクの濃度を計算
する標準（ｓｔａｎｄａｒｄ＞を用いる。

この分析では第２の標準を用いる。すなわち、標準とし
て特定のＨＤＬ又はアポＡ−Ｉを用いるより、プールさ
れたヒ１−ＨＤＬを標準として用いる。

第２の標準を用いるのは貯蔵された第１のアポリポタン
パクやＨＤＬが比較的不安定なためである。

Ｋｏｔｔｋｅ及び共同研究者も第１標準として使用した
精製アポＡ−１の劣化を見い出し、アポＡ−１に対する
ポリクローナル血清を用いてそれらのＲＩＡ中の第２標
準を用いた。Ａｕ　ｅｔ　ａｌ、＋ｃ１ｉｎ、ｃｈｅｍ
。

３２．１３９４〜１３９７　（１９８６）。

第２標準はＨＤＬ、（アポＡ−１）を含有する凍結乾燥
した、プールしたヒト絶食血漿として供給され、使用前
に再構成される。各標準はそれ自体筒１のＨＤ　Ｌもし
くはアポＡ−１標阜に対して標準化される。典型的手順
は物質及び方法の部（ｔｈｅＭａｔｅｒｉａｌｓ　ａｎ
ｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　５ｅｃｔｉｏｎ　）にアポリポタ
ンパクＡ−１について説明する。

Ｄ９診断システム 本発明は、前述の方法を実践するのに用いることができ
る、典型的にはキットの形をした、診断システムも考慮
している。そのシステムは、前述のアポＡｉと免疫反応
を起こすモノクローナル・パラトピック（ｐａｒａｔｏ
ｐｉｃ）分子の１つを含むパッケージを有している。そ
のパッケージはアポＡ−■の検定を少なくとも１回行う
に十分な量の、それらパラトピック分子を含んでいる。

さらに好ましくは、その検定システムは、上記パラトピ
ック分子と実効的に直接結びついている、もしくは、ア
ポＡ−１と上記パラトピック分子との免疫反応を知らせ
ることができるその他の分子と結びついている指示手段
を含む。

最も好ましくは、そのシステムは、液体血液試料中に存
在するアポＡ−１を定量するのに適している。そのよう
なシステムは、基本的に、アポＡ−■と免疫反応を起こ
すモノクローナルパラトピック分子を結合し、そしてそ
の表面の非特異的タンパク質結合部位がブロックされて
いる固体マトリックスからなる固体サポートを含む第１
のパッケージを含んでいる。

さらに、このシステムは、アポＡ−■と免疫反応を起こ
す酵素結合モノクローナルパラトピック分子結合物を含
む第２のパッケージを含有している。定量的なアポＡ−
１の測定に関してこれまでに議論してきたように、同じ
２つのパラトピック分子か本システムで使用される。

上述の診断システムの固相マトリクスは、これまでに議
論してきた、との固相マトリクスも使用することができ
る。前述の１２穴ストリツプや９６六マイクロプレート
のようなマイクロタイターウェルは特に好ましい。固体
サポート上の非特異的結合部位は、以前に議論した方法
でブロックした。

固体マトリックスは、本態様の固相結合モノクローナル
パラトピック分子のためのコンテナを構成することがで
きる。酵素結合モノクローナルパラトピック分子のため
の典型的コンテナは、ガラスもしくは、ポリエチレン又
はポリプロピレンでできたバイアル又は瓶である。典型
的固体マトリクスとしてマイクロプレート、固相結合モ
ノクローナルパラトピック分子として全モノクローナル
抗体Ａｌ−１０、液体血液試料として血清、そして、Ｈ
ＲＰＯに結合した全モノクローナル抗体Ａｌ−１１を用
いた、より好ましい典型的なキット型の診断システムは
、次に示すものを含んでいる；ａ）非特異的タンパク質
結合部位をブロックし、そして、血清試料中のアポリポ
タンパク質Ａ−１を検定するのに十分な量のモノクロー
ナル抗体Ａｌ−１０を結合したマイクロプレートからな
る固体サポート。

ｂ）血清試料中に存在するアポＡ−１の量を検定するの
に十分な量存在するＨＲＰＯに実効的に結合しているモ
ノクローナル抗体Ａｌ−１１を含む水溶液を含む、単独
パッケージ。

最も好ましくは、診断システムは上記成分及び以下に示
すものを１つ以上含む；　（ｉ）既知濃度の過酸化水素
、（ｉｉ）ＯＰＤのような観察可能な酸化的色素前駆体
、（ｉｉｉ　）発色反応を抑える、４Ｎ硫酸のような停
止剤溶液、（ｉｖ）４０定に使用する乾燥型又は液体型
の１つ以とのバッファ、（ｖ）標準参照曲線を作成する
ための物質、及び（ｖｌ）本検定を行うための説明書。

上に列挙した各成分は少なくとも１回の検定をするのに
十分な量、その診断システム中に存在し、そして、これ
らの成分は適当に別々にパッケージされている。

■、結果 以前に示したように、登録された各ハイプリドーマによ
って分泌されるパラトピック分子は、ＩＩ　Ｄ　Ｌ及び
アポＡ−１の両方と免疫反応を起こす。

ＨＤＬ及びアポＡ−１と、それらのモノクローナルパラ
トピック分子との免疫反応に対し、液相中で得られた結
果は、全トリクロロ酢酸沈澱化”５ｌ−ＨＤＬに対する
パーセンテージとして、以下の表ＬＡ及びＩＢに示した
。

表ＩＡ 液相ＲＩＡ中での”５Ｉ−ＨＤＬとの免疫沈殿化最高値
（％） モノクローナル　　　　　　　ＦＰＬＣ−パラトピック
分子’　　Ｄ！水２　腹水２・３上清４八ｌ−１０９２
，６８５，９２７，０ ＡＩ−１１１００，０９３，０Ｂ５．０ＡＩ−１２８９
，７９４，０８７，０ ＡＩ−１３９３，１９３，１８１，０ ＡＩ−１４９１，４９１，４３４，Ｏ ｌ、液相パラトピック分子を液相”’Ｉ−ＨＤＬ又はＩ
ＺＪ−アポＡｉと混合した。

２、　マウス腹水液を、列挙したパラトピック分子源と
して用いた。

３、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（Ｆ　Ｐ　
Ｌ　Ｃ）により精製したマウス腹水液を、列挙したパラ
トピック分子源として用いた。

４、ハイブリドーマ細胞培養液の上清を、列挙したパラ
トピック分子源として用いた。

表ＩＢ 液＋目ＲＩＡ中の１．２ｓＩ−アポ−Ｉとの免疫沈殿化
最高＠（％） Ａｌ　−１０６４，７７０，２８８，０ＡＩ−１１４８
，８６０，４４１，０ ＡＩ　−１２４３，８４６，１４４，０ＡＩ−１３５３
，０４８，１３５，０ ＡＩ−１４２２，０３４，９３０，０ １、２，３，４表ＩＡ脚注参照 上記表ＩＡ中のデータから読み取ることができるように
、本発明のパラトピック分子１マ、カーナス（Ｃａｒｔ
ｉｓｓ）及びニシントン（Ｅｄｇｉｎｇｔｏｎ）により
、１９８５年、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケ
ミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）　　、２６０
巻、２９８２〜２９９３頁に報告された抗体よりもはる
かに１２ＳＩ　　ＨＤＬ、との免疫反応を起こす。また
、上記データは、カーナス（Ｃｕｒｔｉｓｓ）及びニシ
ントン（Ｅｄｇｉｎｇｔｏｎ）により報告された同じ抗
原に対する免疫反応性と比較して、１２５Ｉ−アポＡ−
■と一般的に高い免疫反応性を示した。さらに、研究に
より、標準物質の年令が、得られる結果に大きな効果を
もちうろことが示された。

また、血液試料中のアポＡ−１のイライザ測定において
、本発明のＡｌ−１０及びＡｌ−１１と比較して、カー
ナス（Ｃｕｒｔｉｓｓ）及びニシントン（Ｅｄｇｉｎｇ
ｔｏｎ）の三種の抗−アポＡ−１及び抗−アポＡ−ｎモ
ノクローナルのいくつか組合せを用いた研究を行った。

全んどのこれらの比較は、同等の結果を与えた。

しかし、いくつかの試料、特にＣＡ　Ｄ　患者由来の血
液試料は、ここに述べられている検定及び他の方法によ
り行なわれた検定と比較して、異常な結果を与えた。カ
ーナス（Ｃｕｒｔｉｓｓ）及びニシントン（Ｅｄｇｉｎ
ｇｔｏｎ）のモノクローナルの２つの組合せに対し、こ
れらの同等の、及び異常な結果のいくつかを表２に示し
た。

表２ イライザ法により測定したアポＡ−１１］の比較１１（
１０５）　　　４６．０　　　　４９．０　　　　　Ｂ
４．３２（１２０）　　　８０．０　　　　７７．０　
　　１３１３　　　　　７１．６　　　　　Ｎ、Ｄ、ｈ
１５８４　　　　　７３．８　　　　　Ｎ、Ｄ、’　　
　　１５１５　　　　１１０　　　　　８９．０　　　
１６０６　　　　　６０．０　　　１２’２　　　　　
８６．２７　　　　　２９．０　　　　４９．０　　　
１３０８　　　　　２９．０　　　　５０．０　　　１
３８９（１５９）　　　１５１　　　　　−’　　　　
１５８１、　ここで議論されている一般的なサンドイッ
チ・イライザ技術を用いたイライザ法により測定される
、デシリットル当りのアポＡ−１のミリグラム量。

２、市販（＃ｌカルバイオケムーベーリング（Ｃｏｌｂ
ｉｏｃｈｅｍ−Ｂｅｈｒｉｎｇ）　、＃　２インターナ
シヨナル・ユニオン・オブ・イム／ロジカル・スタンダ
ード（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｕｎｉｏｎ　ｏｆ
　ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＳｔａｎｄａｒｄｓ）　
　（Ｉ　Ｕ　Ｉ　Ｓ）　、＃　６アイソラプ（Ｉｓｏｌ
ａｂ）電気泳動試料、及び＃９オメガ（Ｏｍｅｇａ）の
もの、正常なアシンブトマチックなヒｌ−（＃３゜４及
び５）又はＣＡＤ患者（＃７及び８）由来のアポＡ−１
含有試料。カッコ内の数字は、提供者により、存在して
いると言われているアポＡ−１量を示している。

３、固体７トリソクスに結合は、カーナス（Ｃｕｒｔｉ
ｓｓ）及びニシントン（Ｅａｇｉｎｇｔｏｎ）のモノク
ローナル（Ｃ＆Ｅ　　Ｍａｂ）Ａ　Ｉ　−４、Ａｌ−７
及びＡｌ１−１及び指示手段含有第二モノクローナルと
してＨＲＰ　Ｏに結合したモノクローナルＡｌ−４を用
いて行なわれたイライザ法。

４、　固体マトリックスに結合したモノクローナルＡｌ
−７、Ａｌ−９及びＡ■−１及び第二モノクローナルと
して１（ＲＰ　Ｏ結合Ａｌ−４を用いた脚注３と同様の
イライザ法。

５、本発明のモノクローナル・パラトピック分子を用い
た、脚注３と同様のイライザ法。Ａｌ−１０は固体マト
リックスに結合しており、一方、第２のモノクローナル
・パラトピック分子として、ＨＲＰ　０−結合Ａｌ−１
１を用いた・６、Ｎ、Ｄ、＝試験せず。

７、得られた値が、検定範囲を越えている。

上記データは、本発明のパラトピック分子の使用が、異
常試料中のカーチス（Ｃｕｒｔｉｓｓ）及びニシントン
（Ｅｄｇ　ｉｎｇ　ｔｏｎ）の抗体を用いて得られた結
果と異なる結果を与えることを示している一方、これら
のデータは、その結果が正しいことを示してはいない。

下記の表３にまとめられたデータは、本発明のパラトピ
ック分子を用いて得られたデータが、カーチス（Ｃｕｒ
ｔｉｓｓ）及びニシントン（Ｅｄｇｉｎｇｔｏｎ）抗体
を用いて得られたデータと比較して、これら異常試料に
対し、正しいことを説明している。

表３にまとめたデータは、３０人の正常でアシンブトマ
チックなヒト（１５名の男性及び１５名の女性）に由来
する血清及び、または血漿及びここで述べられている定
性的サンドイッチ検定法を用いて得られた。また、その
検定は、２つの市販のＲＩＡ（ＲＩＡ−１及びＲＩＡ−
１１）及び２つの市販のＲ［Ｄ（ＲＩＤ−１及びＲＩＤ
−■）を用いて行った。各供与者由来の試料は各検定法
で測定した。

表３ 異なる方法を用いて得られたアポＡ−１値の比較表１ ＥＬＩＳ八”　　　ＲＩＡ−１’　　　ＲＩＡ−１１’
　　ＲＩＤ−１’　　ＲＩＤ−Ｉ！’平均′？１５５　
　１１４　　１３９　　１７５　　１８６Ｓ、Ｄ、”　
３９．４　　２８，７　　３２．６　　４０．６　１７
．６１、　デシリットル当りのアポＡ−１ｉｔ（ミリグ
ラム） ２、血清及び血漿を用いた、表２の脚注５で述べられた
のと同様に行なわれたイライザ法。

３、ＲＩＡ−１は血漿を使用し、ＴＸフレンズウッド（
Ｆｒｔｅｎｄｓｗｏｏｄ）のアイソテックス・ダイアグ
ノチクス（Ｉｓｏｔｅｘ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）か
ら購入した物質を、提供者の説明書に従って用いて行っ
た。

４、ＲＩＡ−１１は血清を使用し、ＭＥ、ボートランド
（Ｐｏｒｔｌａｎｄ）のベントレックス・ラボラトリ−
・インク（Ｖｅｎｔｒｅｘ　ＬａｂｏｒａＬｏｒｉｅｓ
　Ｉｎｃ、）から購入した物質を提供者の説明書に従が
って用いて行った。

５、ＲＩＤ−ｆは、血漿を使用し、ＣＡ、バーリンゲー
ム（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ）のタボ・インク（Ｔａｇ。

Ｉｎｃ、）から購入した物質を、提供者の説明書に従っ
て用いて行った。

６、ＲＩＡｉは血清を使用し、ＣＡ、う・ジョー７　（
Ｊｏｌｌａ）のカルバイオケムーベーリング（Ｃａｌｂ
ｉｏｃｈｅｍ−Ｂｅｈｒｉｎｇ）から購入した物質を、
提供者の説明書に従って用いて行った。

７、３０全ての検定試料のアポＡ−１平均値８、Ｓ、Ｄ
、＝平均値の標準偏差 上記まとめから読みとれるように、本発明のイライザ法
を用いて得られた平均値は、２つのＲＩＡ（低値側）及
び２つのＲＩＤ（高値側）の中間の値である。このよう
に、本発明のイライザ法を用いて得られた結果の一般的
な正当性から、Ａｌ−１０及びＡｌ−１１を用いて得ら
れた表２中のデータは本当に正しいように思える。

他のいかなる検定法と同様に、本発明の検定法は、標準
試料を使用する。イライザ検定法では、１次のアポＡ−
１又はＨＤＬ標準物質を使用することができるが、簡単
さと、正確さのため、好ましい態様では２次のＨＤ　Ｌ
標準物質が使用された。

用いられた第２の標準物質は、何人かの提供者からプー
ルした空腹時の血漿から得た。ここで、典型的には２０
人の提供者からの血漿プールを用いた。２次の標準物質
は、それ自身、１次の標準物質に対し、標準化した。通
常、保存するには不安定であるということで、１次のア
ポＡ−１標準物質は使用されない。精製タンパク質又は
、そのタンパク質のグルタミン又はアスパラギン残基は
脱アミノ化することができると考えられるでいる。

１次標準物質として使用された時、同様のことが精製し
たＨＤＬについても起こることが考えられている。

本発明の定量的イライザ法において、２次標準物質を用
いて得られたデータの正当性にさらに確認するために、
固相結合Ａｌ−１０及びＨＲＰ　０結合Ａｌ−１１を、
種々の市販のアポＡ−１標準物質とともに用いて、一連
のイライザ法を行った。

これらの結果を以下の表４に示した。

表４ 種々のアポＡ−１標準物質を用いた定量的イライザ法１ １、　デシリットル当りのアポＡ−１９（ミリグラム） ２、入手した実験室調製物由来の、又は市販の（＃１−
１１）又は正常の、アシンブトマチックな提供者（＃１
２−１７）由来の試料。試料１２は、表２の試料３と同
じヒト由来のものであり、試料１５は表２の試料５と同
じヒト由来のものであることを注意しておく。

３、　ここで述べられているように２次のＩ（Ｄ　Ｌ標
準物質。

４、−次の標準物質■は、ＶＡ、スプリングフィールド
（Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ）のメロイ・ラボラトリ−（
Ｍｅｌｏｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から入手した
。

５、−次の標準物質■は、ＣＡ、う・ジヨウ（Ｌａ　Ｊ
ｏｌｌａ）のスクリップス・ラボラトリ−（Ｓｃｒｉｐ
ｐｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から入手した。

６、−次の標準物質■は、ＣＡ、エル・セグンド（ＥＩ
　Ｓｅｇｕｎｄｏ）のケミコン・インターナショナル・
インク（Ｃｈｅｓｉｃｏｎ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ
ｌ、　Ｉｎｃ、）から入手した。

表４のデータを横に比較してみると分るように、全ての
標準物質について得られた結果は同じであった。また、
メロイ（Ｍｅｌｏｙ）標準物質を用いて得られた値は、
一般的に言って、他の標準物質を用いて得られた値より
、いくぶんか近いことを見てとれる。さらに、メロイ（
Ｍｅｌｏｙ）標準物質の提供者により示された値は、独
立した分析により見い出された値の約半分であったこと
を注意しておく。

一連の測定は、本発明の定量検定の再現性（変動係数）
を確かめるため、上記市販標準物質を用い、約３ケ月の
期間に渡って行った。変動係数は約１１〜１３パーセン
トであることが分った。

本発明の検定を行うに当り、アポＡ−１と、他のモノク
ローナルパラトピック分子との免疫反応を知らせる、指
示手段結合パラトピック分子が使用された。ＨＤ　Ｌ粒
子当り、１個以上のアポＡ−■分子が存在するので、正
確で精密な定量検定結果を得るため、固相結合パラトピ
ック分子及び指示手段結合パラトピック分子が、アポＡ
−Ｉ上の異なるエピトープと必ず免疫反応するのかどう
かは明確ではない。しかし、両パラトピック分子が全て
の試料のアポＡ−１又はＨＤ　Ｌと実質的に免疫反応す
ることができる限り、その２つのタイプのモノクローナ
ルパラトピック分子の各々が別のモノクローナルパラト
ピック分子の免疫反応を阻害することがないことが望し
い。

図１及び２の競合免疫酵素測定法から見てとれるように
、ＩＩ　ＲＰ　Ｏ標識Ａｌ−１０は、アポＡ−■及びＨ
ＤＬと免疫反応する。図１のデータは、標識したＡｌ−
１０とアポＡ−１との免疫反応が未標識のＡｌ−１０の
存在により阻害されるが、未標識のＡｌ−１１の存在に
よっては阻害されないことを示している。図２は、固相
抗原としてＨＤＬを用いたのと同様の結果を示している
。また、ＨＲＰＯ標識Ａｌ−１１を未標識のＡｌ−１゜
と、及びＡｌ−１１を抗原としてアポＡ−１及びＨＤＬ
と用いることにより、同等の結果が得られた。

”’Ｉ−ＨＤＬ及び”’Ｉ　−７ポＡ−１を用いた付加
的液相結合研究がトサオ（Ｔｓａｏ）等により、（１９
８２年）ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、ＣＩ＋ｅｍ、）　　２５７巻、１
５２２２〜１５２２８真に一般的に述べられているＲＩ
Ａ技術を用いて行なわれた。これらの研究の結果は、ト
リクロロ酢酸（ＴＣＡ）により沈殿可能な全放射活性の
パーセンテージとして以下の表５に示した。

表５ ＡＩ−１０及びＡｌ−１１の液相免疫反応性抗原の結合
最高値（％） パラトピック分子１　　１２Ｊ−ｕＤＬ”　　＋　２５
１−アポＡ−１”Ａｌ−１０ 上清　２９．２　　　９０．３ 腹水　９２．６　　　　− ｐｐＬｃｔｌｉ水８６．０　　　７０．２ｌ−１１ 上清　・８Ｂ、６　　　４２．０ 腹水　１００．０　　　４９．０ ＦＰＬＣ腹水９３．Ｑ　　　　６０．４１、　液相パラ
トピック分子として、ハイブリドーマ細胞培養上清（上
清）、マウス腹水液（腹水）、及び高速タンパク質液体
クロマトグラフィーにより精製した腹水（ＦＰＬＣ腹水
）が用いられた。

２、ＴＣ八へ殿化放射活性のパーセンテージ。

表５のデータは、使用した液相検定法において、放射能
標識したＨ　Ｄ　Ｌに対する、全Ａｌ−１０及びＡｌ−
１１の比較的高い結合能を示している。

また、それらのデータは、アポＡ−１の相対的不安定性
及び低い結合性も反映している。アポリポプロティンＡ
−１の相対的不安定性が、先に議論したように、アポＡ
ｉ検定における第二の標準物質として、凍結乾燥した血
漿プールの使用を必要とさせている。また上記データは
Ａｌ−１１がＨＤＬ粒子に対するよりもアポＡ−１に対
して、より低い結合性を示している。にもかかわらず、
表４におけるのと同様に、より複雑な技術により得られ
たデータを、アポＡ−１に対しイライザ法を用いて得ら
れたデータと比較すると、イライザ法が検定した試料中
に存在する実質的に全ての７ポＡ−１（ＨＤＬ）を定量
的に検出することが示される。

さらに、これまでに述べてきた、そして、これから材料
と方法のセクションでより詳しく述べられるように、こ
の検定法を用いて得られた結果は、以下に議論されてい
る。９６穴のマイクロプレートのウェルを固体マトリク
スとして用いた。モノクローナル抗体全体は、固相結合
第一モノクローナルパラトピック分子として用いた。固
体サポート表面上の非特異的タンパク質結合部位は、Ｂ
ＳＡでプロ・ツクした。ＨＲＰＯ−結合モノクローナル
抗体全体は、第二及び第四のモノクローナルパラトピッ
ク分子として、観察可能な酸化的色素前駆体としてのＯ
ＰＤと共に用いた。

アポＡ−１の検定は、ＣＡＤの経験のない３７名のアシ
ンブトマチックなヒトに対して行った。

これらの人は“正常人”と呼ぶことにする。

アポＡ−１値は、液体血液試料として、希釈した血漿及
び血清を用いて得た。これらの値は、２つの試料源の間
で統計的に有意な差は示されず、使用に当って平均化し
たつ “正常人”の結果を２３名の男性及び１４名の女性を別
けた値、及び合せた値として、以下の表６に示した。診
療的にＣＡＤを保有していると診断された４２名の男性
の血清及び血漿から得られたアポＡ−１の同様のまとめ
も、表６に示した。

表６ 正常なアポリポプロティンＡ−ルベル 正常人 男性”　　　　　女株゛　　　　　丘肚″ｎ＝２３　　
　　　　ｎ＝１４　　　　　　ｎ＝３７平均−１４３平
均＝１５２　　　　平均＝１４７標準偏差　　　　標準
偏差　　　　標準偏差＝２６．５　　　　　　＝　１０
．７　　　　　　＝２２．０標準偏差範囲　　標準偏差
範囲　　標準偏差範囲＝ｌ１６〜１７０　　　＝１４１
−１６３　　　＝１２５〜１６９旦人旦諏煮 ｎ＝４２ 平均−１１０ 標準偏差 ＝２８．８ 標準偏差範囲 一８１．２〜１３９ １、　“ｎ”は各検査におけるヒトの数。“平均”はデ
シリットル当りのミリグラム量で表わした平均のアポＡ
−１値。“標″準偏差”は平均からの標準偏差の値。“
標準偏差範囲“とは、平均の両側の標準偏差の巾。検定
法は、“材料と方法”のセクションで述べるように行っ
た。

上記のデータを見直し、そして、コトク（Ｋｏ　Ｌ　ｔ
ｋｅ）等が、マヨ　クリニカル　プロシージャ（Ｍａｙ
。

Ｃ１１ｎ、　Ｐｒｏｃ、）　、６１巻、３１３〜３２ｏ
頁に報告したデータと、これらのデータを比較してみる
と、上記検定におけるアポＡ−１に対する正常人とＣＡ
Ｄ患者の平均値は、コトク（Ｋｏｔｔｋｅ）等により報
告されたものと同じである。両タイプの検定法で同じ標
準偏差が得られた。

この結果の同一性はいくつかの理由で驚くべきことであ
る。第１に、コトヶ（Ｋｏｔｔｋｅ）等の研究者は、彼
等の検定に対し、界面活性剤（トウィーン２０）による
アンマスキング処理を用いているのに対し、本液体血液
試料では、そのような処理は行なわなかった。第２に、
コトク（Ｋｏｔｔｋｅ）等のグループは、ここで用いた
イライザ法より、より正確であると一般的に考えられて
いる放射性免疫検定法を用いている。ボラ−（Ｖｏｌｌ
ｅｒ）等、１９７６年７’レチン・イン・ワールド・ヘ
ルス・オーガニゼー’、ｙ　Ｂ　ン（Ｂｕｌｌ、　Ｗｏ
ｒｌｄ　）ｌｅａｌｔｈ　Ｏｒｇａｎ、）５３巻、５５
〜６５頁）。

第３に、相対的に異種のアポ、Ａ−１と、うまく免疫反
応を起こすことのできると通常考えられているポリクロ
ーナル抗体をコトク（Ｋｏｔｔｋｅ）等は用いているの
に対し、ここでは、モノクローナル抗体を用いている。

第４に、コトク（ｋｏｔｔｋｅ）等のグループは、彼等
のポリクローナル抗体と、アポＡ−１との免疫反応のた
めに、１６時間、室温に維持しているが、ここでは、室
温で３０分間という条件を採用している。

■、材料と方法 Ａ、リポプロティン 本研究では、地方血液銀行（ＣＡ、サン・ディエゴ・サ
ン・ディエゴ血漿センター）における正常な絶食提供者
の血液のプラズマオレシスにより得られた血漿から、リ
ポプロティンを単離した。

その目的のために、そのようにして得られた血漿を最終
濃度が、５ミリモラー（ｍＭ）ベンズアミジン、１ｍＭ
ジイソプロピルフルオロホスフェート、１０ｍＭエチレ
ンジアミンテトラアセチック・アシッド（ＥＤＴＡ）　
、ミリリットル当り１０ミリグラム（１０■／ｖａｌ）
の大豆トリプシン・インヒビター及びミリリットル当り
１０．０００ユニツトのアプロチニンとなるよう調整し
た。それから、密度調整として固体のシュウ化カリウム
（にＢｒ）を用いた連続超遠心により、この調整した血
漿からリポプロティンを単離した。

第１に、その調整血漿を、約２００．０００ｘｇで１８
から２４時間遠心した。団体ＫＢｒを、密度がミリリッ
トル当り１．０６３グラム以上になるまで下層に加えた
。その混合物を１．０６３　ｇ／　ｍｌの密度のＫＢｒ
を含む０．１％Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　＞、＝液の下に重層し
、２００．０００ｘ　ｇで４８時間以上遠心した。

再び下層を回収し、密度が１．２１ｇ／ｎｕ以上になる
まで団体ＫＢｒを加えた。その調整層を、密度１．２１
ｇ／ｍｇのＫＢｒを含む０．１％ＥＤＴＡ溶液の下に重
層し、さらに２００，０００　ｘｇで４８時間以上遠心
した。

その後、最上層を回収し、その密度が１．０’６３ｇ／
ｍ１１以上になるまで団体のＫＢｒを加えた。その調整
最上層を、密度１．０６３ｇ／ｍβのＫＢｒを含む０．
１％ＥＤＴＡ溶液の下に重層し、さらに、２００、００
０ｘｇで４８時間以上遠心した。

中間層を回収し、そして、その密度が１．２１　ｇ／ｍ
β以上となるまで固体ＫＢｒを加えた。この調整中間層
を密度１．２１ｇ／ｍβのＫＢｒを含む０．１％ＥＤＴ
Ａ溶液の下に重層し、そして、３００．０００ｘｇで４
８時間以上遠心した。

最上層を回収し、１．０６３から１．２１ｇ／＋ｎｊ！
の密度に相当する物質を高密度リポプロティン（ＨＤＬ
）と命名した。その回収したＨＤＬを１５０ｍＭ　　Ｎ
ａＣ／！、１ｍ　　ＥＤＴＡ、０．００５％アルファー
トコフェロール、及び５ｍＭベンズアミジンを含むリポ
プロティンバッファ（ＬＬＢ）に対し透析し、そして、
その保存は、無菌条件下でわずか２１日間とした。

Ｂ、アポプロティンＡ−１の単離 アポプロティンＡ−１（アポＡ−１）は、高速液体クロ
マトグラフィーを用いたサイズ分画と、それに続く、キ
ノシタ（Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ）等（１９８３年、ジャー
ナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、）　　９４巻、６１５〜６１７頁）の
操作により、脱脂したＩＩＤＬ（以下に議論する）から
精製した。約３０■のエーテル：エタノール脱脂ＨＤＬ
を、２００マイクロリツトルの０．１％ラウリル硫酸ナ
トリウム（ＳＤＳ）　、０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐ
Ｈ７，０）に溶解し、そして、スフエロゲルーＴＳＫ３
０００ＳＷＨＰＬＣカラム（ＣＡ。

フラートン（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ）　、ベックマン・イ
ンスツルメント・インク（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｉｎｓｔｒ
ｕｍｅｎｔｓ　Ｉｎｃ、）　）によりサイズ分画し、そ
してマイナス２０℃で精製したアポＡ−Ｉを含む両分を
保存した。

Ｃ，モノクローナルパラトピック分子の生成５種のモノ
クローナル・パラトピック分子は、ここで議論されてい
る標準融合プロトコールを用いて、免疫化Ｂａｔ　ｂ／
ｃ　ＢｙＪマウス（ＣＡ、う・ジョラ（Ｌａ　Ｊｏｌｌ
ａ）　、スクリップス・クリニック・アンド・リサーチ
・ファンデーション・ビバリウム（Ｓｃｒｉｐｐｓ　Ｃ
１１ｎｉｃ　ａｎｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄａ
ｔｉｏｎＶｉｖａｒｉｕｍ）　）由来のスプレノサイト
の３度の別々の融合から得られた。培養液の上清を収穫
し、そして以下に述べるように、まず固相によりスクリ
ーニングし、さらに陽性ならば、液相放射性免疫検定に
より再スクリーニングした。全てのハイブリドーマを、
限定希釈により、少なくとも２度クローン化し、そして
、液体窒素中で凍結保存した。

簡便に、Ｂａｔ　ｂ／ｃ　ＢｙＪマウスを完全フロイン
ドアジュバント（ＣＦ　Ａ）中の免疫原としてのヒトの
ＨＤＬで腹膜注射（ｉ、ｐ、）により免疫化し、つづい
て不完全フロインドアジュバント（ＩＦＡ）を用いて、
各約三週間をおいて、第二及び第三の免疫化を行った。

ハイブリドーマＡｌ−１０（ＡＴＣＣＨＢ　　９２００
）だけに対しては、そのＨＤＬをまずグルタルアルデヒ
ドで交叉結合し、そしてその後、最初にＣＦＡ中のイン
ターフェロン−ガンマ（Ｉ　ＦＮ−γ）５００ユニット
ト共に注射して、そして、引き続＜ＩＦＡ免疫化におい
ては、ＩＦＮ−ｒなしで注射した。グルタルアルデヒド
で交叉結合させたＨＤＬをリン酸緩衝食塩水中、最終濃
度０．０４パーセントのグルタルアルデヒドと新鮮なＨ
ＤＬを、２０℃で１８時間反応させることにより調製し
た。ハイブリドーマＡｌ−１１、Ａｌ−１２、Ａｌ−１
３及びＡｌ−１４（ＡＴＣＣＨＢ９２０１、ＨＢ９２０
２、ＨＢ９２０３及びＨＢ９２０４）に対する免疫には
、本来のＨＤＬを用いた。全ての場合、最後のアジュバ
ント含有免疫化後の約３ケ月、そのマウスは、正規の生
理食塩水中の本来のＨＤＬの追加免疫静脈注射を受け、
そして、１日後、第二の同様の追加免疫注射を受けた。

そのように処理した動物を最後の追加免疫の約３日後、
犠牲とし、そして、各々のマウスの肺臓を収穫した。そ
して、膵臓細胞懸濁液を調製した。

それから、膵臓細胞を、２３℃、１１０００ｒｐ、１０
分間の遠心により、膵臓細胞懸濁液から抽出した。上清
の除去後、その細胞のペレットを５ｍｌの冷ＮＨ，ＣＩ
溶解バッファ中に再懸濁し、そして約１０分間インキュ
ベートした。

その溶解懸濁液に、ｌＯｍβのダルベコ（Ｄｕｌｂｅｃ
ｃｏ）　（ｔ７正イーグル・メディアム（ＤＭＥＭ）（
ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）　）及びＨＥＰＥＳ　（４−（２
−ヒドロキシエチル）−１−ピペリジン−エタンスルホ
ン酸）ハンファを加え、そして、その混合物を２３℃、
１１０００ｒｐ、約１０分間遠心した。

その上清をデカンテーションし、そのペレットを、１５
ｍｊ７のＤ　Ｍ　Ｅ　Ｍ及びＨＥＰＥＳに再懸濁し、そ
して２３℃、１０００ｒｌ）ＩＴＩ、約１０分間遠心し
た。上記の操作をくり返した。

それから、ペレットを５ｍｌのＤ　Ｍ　Ｅ　Ｍ及びＨＥ
ＰＥＳに再懸濁した。その膵臓細胞懸濁液の部分標本を
計数のために取り除いた。

融合は、非分泌マウスミエローマ細胞系列Ｐ３Ｘ６３Ａ
ｇ８，６５３．１　、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８，６５３系列の
サブクローン（ＡＴＣＣ）を用いて、次に示す方法で行
った。約１対１０又は、約１対５の、膵臓細胞に対する
ミエローマの比を用いて、十分な量のミエローマ細胞を
ペレットへと遠心し、１５ｍｆのＤ　Ｍ　Ｅ　Ｍ及びＨ
ＥＰＥＳで２度洗浄し、そして２３℃、ｌｏｏｏｒｐｍ
、１０分間の遠心を行った。

肺臓細ｑ包及びミエローマ細胞を、１５＋＋＋ｊ！の丸
底管内で合わせた（ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）　）。

その細胞混合物を、２３℃で、１１０００ｒｌ）、１０
分間遠心した。そして、その上清を吸引により取除いた
。その後、約３７℃で、２００μβ０３０パーセント（
重量／体積）のポリエチレングリコール（分子量４００
０）水溶液（ＰＥＧ、ＭＤ。

バルチ％７　（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）ＡＴＣＣ）を、激
しく撹拌しながらｌ　ｍｌピペットで加え、そのペレッ
トを破壊した。そして、細胞を１５から３０秒秒間中か
に混合した。その細胞混合物を７０Ｏｒｐｍで４分間遠
心した。

ＰＥＧを加えた時から約８分後、細胞をみださないよう
に、そのペレットに５ｍｌのＤＭＭプラスＨＥＰＥＳバ
ッファをゆっくりと加えた。１分後、生成した混合物を
ｌ　ｍｌピペットを使って分散し、さらに４分間インキ
ュベートした。この混合物を１１００Ｏｒｐで、７分間
遠心した。そして上清をデカンテーションし、５　ｍｌ
のＨＴ（ヒポキサンチン／チミジン）培地をゆっくりと
そのペレットに注ぎ、そして、その混合物を、乱すこと
なく５分間維持した。それからそのペレットを、大きな
塊りに壊し、さらにその最終的な細胞懸濁液を、１．５
ｔａｌのＨＴ培地を予め入れておいたＴ７５フラスコ（
フラスコ当り２．５ｍ１）に移した。

生成した細胞懸濁液を３７℃でインキュベートし、その
融合細胞を生育させた。２４時間後、そのフラスコに１
０ｓ＋ｌのＨＴ培地を加え、６時間後、０．３ｍｌの０
．０４ｍＭアミノプテリンを加えた。

融合後４８時間後に、そのフラスコに１０＋＋／ｌのＨ
ＡＴ　（ヒボキサンチン／アミノプテリン／チミジン）
培地を加えた。

融合後３日後、生育可能細胞を、ケネット（Ｋｅｎｎｅ
ｔｔ）等がカレント・トップ・マイクロビオル・イムツ
ル（Ｃｕｒｒ、Ｔｏｐ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ、）８１巻、７７頁（１９７８）に報告したよ
うに、ＨＡＴバッファー中、ウェル当り、約２ＸｌＯ’
個の生育可能細胞（計７６８ウェル）となるように、９
６大の組織培養プレートに捲いた。その細胞を、融合後
７日後、ＨＡＴ培地で生育させ、そして、その後は、必
要に応じて、４〜５日間隔でＨＴ培地で生育させた。生
育を顕微鏡で追跡し、そして、抗体を含む培養上清を１
４日後に、力−チス（Ｃｕｒｔｉｓｓ）及びニシントン
（Ｅｄｇｉｎｇｔｏｎ）が１９８２年、ジャーナル・オ
ブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃ
ｈｅｎ＋、）　　２５７巻、１５２１３〜１５２２１頁
に述べているように、固相放射性免疫検定法（ＲＩＡ）
によって、Ｈ［ｌＬ特異的抗体産生を検定するために収
集した。

そのように調製した抗−ＨＤＬ抗体を産生ずるハイブリ
ドーマをスクリーニングし、検定し、そして、それらの
生育能力を測定した。本発明のハイブリドーマを、その
培養培地中への抗−ＨＤＬ抗体を分泌する約３０のハイ
ブリドーマ培養物からスクリーニングした。

Ｄ、パラトピック分子の調製と精製 ０．３ｍｌのミネラルオイルで感作され、そして、３〜
５０Ｘ１０’ハイブリドーマ細胞をイントラペリントニ
アリーに注射した、年令ｌＯ週間のＢａ１ｂ／ｃマウス
から、腹水液を得た。腹水の発生のための平均時間は９
日間であった。２３℃、１５、ＯＯＯｘｇ、　１５分間
の遠心による透明化につづいて、各ハイブリドーマから
作られた腹水液をプールし、−２０℃で保存した。

５個の各ハイブリドーマからの精製したモノクローナル
パラトピック分子を、カラムの説明書に従って、１０ｍ
Ｍ）リス（ｐＨ８，０）中で０−０．５モラー（Ｍ）の
ＮａＣｌ勾配を用いた、ファルマシア・モノ・Ｑ　　Ｈ
Ｒ５１５アニオン交換カラム（ファルマシア・ファイン
・ケミカルス、ＮＪ。

ビスカタウェイ　（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）　）を使用
して、高速タンパク質液体クロマトグラフィーにより調
製した。ネｎ製したマブス（Ｍａｂｓ）をアミコン（八
ｍ１ｃｏｎ）の攪拌限外゛濾過セルを用いて１■／Ｉ１
１の濃度まで濃縮し、ＰＢＳ（ＩＪン酸緩衝生理食塩水
、ｐＨ７，２）に対し透析し、−７０℃に保存した。

カーチス（Ｃｕｒｔｉｓｓ）及びニシントン（Ｅｄｇｉ
ｎｇｔｏｎ）により（１９８５年）ジャーナル・オプ・
バイナロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ
ｍ、）　　２６０巻、２９８２〜２９９３頁に報告され
たように、モノクローナル抗体Ａｌ−４、Ａｌ−７、Ａ
ｌ−９及びＡｎ−１を調製した。

Ｅ、放射性ヨウ素化 ＨＤＬ、アポ−Ａ−１及び免疫化学的に精製したヤギの
抗−マウスＩｇの放射性ヨろ素化は、エンザイモビート
、ヨ゛つ素化操作法及びバイオラド（ＣＡ、バーリンガ
ム（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ）　）から入手したエンザイ
モビードを用いて、酵素的に行った。

そのエンザイモビードヨウ素化は、以下に述べる固相放
射性免疫検定法に対し、抗原及び抗体を特徴づけるのに
利用した。

Ｆ、リポプロティンの溶剤による脱脂 必要に応じ、リポプロティンを、有機的抽出により脱脂
し、脱脂リポプロティンと呼んだ。この目的のため、分
析すべきリポプロティンをｐＨ７，５の０．０１パーセ
ントＥＤＴＡ溶液に対し、−晩透析した（約１８時間）
。

生成した試料を０．００３パーセントＥＤＴＡに対し、
約１２時間透析し、そしてチューブ当り、１０〜２０ミ
リグラムのタンパク質を凍結乾燥した。各チューブに対
し、４℃で、無水アルコール：無水エーテル（１：　１
）　３５　ｍｌ！を加え、できた混合物を攪拌した。

混合後、その溶液を一２０℃で２０分間、インキュベー
トした。さらにその溶液を０℃で１００゜ｒｐｍ＋　３
０分間の遠心を行い、その上清をデカンテーションした
。

上述のエタノール・エーテル抽出をあと２回、計３回行
った。さらに、４℃において、３５Ｉ１１の無水エーテ
ルをその試料に加え、そして、−２０℃に３０分間保持
した。その試料を、−２０℃で１１００Ｏｘ、３０分間
の遠心を行い、その上清をデカンテーションにより廃棄
した。そのベレットを窒素ガスを用いて乾燥した。

Ｇ、定量的アポＡ−１（ＨＤＬ）サンドイツチイライザ
法 １、　アポＡ−Ｉの一次標準物質：　ＨＤＬ及び単離し
たアポリポプロティンＡ−１の定量ＨＤＬ画分（１，０
６３〜１．２１　ｇ／　ｍｌ）を、標準的超遠心技術に
より、プールしたヒトの血漿から得、ＰＢＳに対し透析
した。さらに０．４５ミクロン・アクロディスク・フィ
ルター・ユニットで濾過することにより除菌し、そして
、４℃で保存した。そのＨＤＬ画分のタンパク質含量を
Ｏ５＾を標準物質とした。修正ローリ−（Ｌｏｓｖｒｙ
）タンパク質検定法により測定した。そのＨＤＬ画分の
三種の希釈物について２度づつ分析を行い、標準曲線の
線形部分範囲内での測定値を確保した。例えばＨＤＬ画
分の１：５．１：１０及びｌ：２０希釈物で行ない、通
常のタンパク質濃度は、５〜１０１１ｆ／１ａｉｌの範
囲にあった。さらに長期保存するために、そのＨＤＬ画
分を１〜２ｍｇ／１１１１のタンパク質濃度となるよう
に、ＰＢＳで希釈した。希釈後、再び、そのタンパク質
濃度を１：２．１：５及び１：１０希釈についてローリ
−検定法で確かめた。それから希釈したＨＤＬ画分を小
分けし、４℃に保存した。

いくつかの市販光から、単離したアポリポプロティンＡ
−Ｉを人手することができる。製造業者は、通常、タン
パク質含量や純度を提供しているが、タンパク質濃度は
、常にローリ−法で確かめ、必要なら、これらの結果に
基づいて調整した。アポＡ−ＩＩ製の希釈は、以前のセ
クションで述べたように行った。その調製物を小分けし
、そして、製造業者により示された方法に従がい保存し
た。

さらに、そのＨＤＬそして、またはアポ・Ａ−Ｉ調製物
をアポＡ−Ｉイライヂ法（以後述べられる）において、
未知試料（１：５０００希釈）として検定した。完全な
標準物質セット、定性コントロール及びＨＤＬそして、
またはアポＡ−Ｉ調製物の希釈物を含む、１日当り、最
低２枚の検定プレートを５日間に渡って検定した。ＨＤ
Ｌそして、またはアポＡ−１に対して得られた、イライ
ザ法による測定値は、ローリ−タンパク貿検定法による
値と２０％の誤差範囲で一致していた。もし、この値が
設定限界を越えていたなら、ローリ−検定法をくり返し
、その定められたタンパク質濃度を確認した。その値が
それでも異なる場合は、その調製物の老朽化又は汚染が
通常指示され、−次標準物質として使用するのにふされ
しいとは思えなかった。

また、−次漂準物質の純度は、分析用のラウリル硫酸ナ
トリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法：　５Ｄ
Ｓ−ＰＡＧＥにより測定した。

２、アポＡ−１イライザ法二次標準物質の調製及び値の
割振り ａ、凍結乾燥した血漿標準物質の調製、新鮮な血漿又は
血清を、−晩絶食した少なくとも１０名のノルモリビデ
ミック　（ｍｏｒｍｏｌｉｐｉｄｅｍｉｃ）なヒトから
採取した。

フェルホトミーは、非外傷性静脈穿刺により、ＥＤＴＡ
、２ナトリウムを含む滅菌チューブを用いて行った。そ
の試料を４℃で、１５００ｘｇ、　３０分間遠心した。

そして、その血漿を、清潔でしっかりとキャップした試
験管に移し、そして、４℃にわずか２４時間保存した。

等量の試料と合わせ、０．５ｍｎの部分標本を酸洗浄し
たライ−トン（Ｗｈｅａｔｏｎ）の５ｍｌ血清バイアル
に移し、そして−晩（約１６〜１８時間）凍結乾燥した
。そのバイアルをシールし、４℃で保存した。

ｂ、凍結乾燥した血漿標準物質の再構成バイアルを再構
成前に室温に戻した。アルミニウム・リングとストッパ
ーを除き、バイアル中の真空を開放した。精密なピペッ
トを用いて、乾燥、プールした標準物質を、２回の０，
５ｍｊ：蒸留水をバイアルの壁にゆっくり分配すること
により再構成した。再びストッパーをして、そのバイア
ルをすばやく３〜４回振り混ぜ、少なくとも３０分間室
温に放置した。その標準物質を、完全に溶解するのに、
激しく撹拌せず、おだやかに振り混ぜた。

Ｃ，アポＡ−に二次標準物質の値の割り振り凍結乾燥し
た二次標準物質のアポＡ−Ｉ値をキャリブレータ−とし
て−次標準物質（ＨＤＬ又はアポＡ−１）を用いたアポ
Ａ−Ｉイライザ法で測定した。このイライザ検定操作を
ここで述べる。

凍結乾燥した二次標準物質を、少なくとも１０日間、１
日当り、最少２個の検定プレートについて、３度未知試
料として検定を行い。最小２０個の値（三度の平均）を
得た。二次標準物質について得られた全ての１直を平均
し、そしてそのアポＡ−Ｉ値をデシリットル当りのミリ
グラム数（＋ｎｇ／ｄβ）で示した。

一度、その箸の割振りをしてしまうと、その二次標準物
質を、−次標準物質曲線を使って、同様のイライザ法で
検定した標準曲線を、完全なコントロールのセットを用
いて作ることに使うことができる。−次及び二次の標準
曲線の検定は、５日間にわたって、１日当り最小限２個
の検定９６穴プレートについて行った。一度、その値の
割振りが受け入れられれば、標準曲線が作られ、５日間
にわたって、現在受け入れられているロフトの凍結乾燥
した標準物質をつかって、同じイムノプレートについて
検定される。

３、一般的検定法 単離したＡｌ−１０分子を、各ウェル当り、ミリリット
ル当り５マイクログラムの濃度でＡｌ−１０を含む、ｐ
Ｈ９，０の重炭酸バッファ、０．１５ｍ１を加えること
によって、ポリスチレンマイクロプレート　（ＣＡ、サ
ンタ・アナ（Ｓａｒ＋ｔａ　Ａｎａ）　　、アービンΦ
サイエンティフィック　（ＩｒｖｉｎＳｃｉｅｎｔｉｆ
ｉｃ）　、ナンク・イムノプレート１（Ｎｕｎｃ−１ｍ
ｍｕｎｏ　Ｐｌａｔｅ　ｌ）のつ、ルの壁に固定した。

そのプレートを４℃に１８時間維持し、そして、０．１
％のＢＳＡ及び０．０５％ポリエチレン（２０）ソルビ
タン・モノラウレート　（トウィーン（Ｔｗｅｅｎ）２
０）を含むＰＢＳで３度洗浄した。それから、残留する
非特異的結合部位を各ウェル中に１０％ＢＳＡを含む０
．２ｍｊ７０ＰＢＳを加え、３７℃で１時間その混合物
を維持し、ついで洗浄することにより、ブロックした。

そのように調製したウェルを加湿室に保存した場合、調
製後約１ケ月まで使用することができた。

標準コントロール溶液として使用するために、１、０〜
０．０３１μｇ／ｒａｌの濃度範囲となるよう、ヒトの
ＨＤＬをＰＢＳで希釈した。以前に記したように、アポ
Ａｉは保存に関し、比較的不安定であることが分ったが
一方、ＨＤＬは比較的保存に関し安定であるために、い
くつかの検定において、ヒトのアポＡ−１よりもむしろ
ヒトのＨＤＬを標準物質として用いた。血漿（又は血清
）試料をＰＢＳで１　：　５０００に希釈した。

標準試料もしくは試料５０μｌを各々三個ウェル中で混
合した。その後約５分以内に、ＨＲＰＯ標識化したＡｌ
−１１パラトピック分子を含む５０μｌのＰＢＳを各ウ
ェル中に加え混合した。免疫反応混合物を２５℃に３０
分間維持した。未結合の物質を上述した方法に従い洗浄
することによりウェルから分離した。ＨＲＰＯ標識を含
む固相固定したサンドイッチ免疫反応物を、新しく調製
した基質溶液（３％の１１□０！及び０．６７　ｔｒｗ
；ｒ／　ｃａｌのＯ−フェニレンジアミンを含む蒸留水
）０．１＋ａｆｆｉを加えることにより検定した。

４、段階的アポＡ−Ｉ　　ＨＤＬサンドイッチイライザ
法 次のステップは、アポリポプロティンＡ−１サンドイツ
チイライザ法を行うことである。市販のコントロールを
添付説明書に従かい脱イオン水で再、構成した。

そのコントロールをおだやかに振り混ぜ、そして２０〜
３０分間室温に維持し、完全に溶解した。

ａ、試料及びコントロール 試料及びコントロールをＰＢＳで１　：　５０００に希
釈した。一連の希釈は、次のように行った。

２０μ！試料＋１．９８　ｎ１ｆｆｉＰＢｓ　（１：１
００）：４０μｌの上記希釈液＋１．９６　ｍ１ＰＢｓ
（１：ｂ、標準物質の希釈 単離したアポＡ−１（ＨＤＬ）標準物質を４μｇ／ｌｅ
ｌとなるようＰＢＳで希釈した。それから、０．０３１
μｇ７ｍｌまでの２倍の連続希釈を行った０例えば、８
６８μｇ／１Ｉ１１！含有の８６０５２７と命名したＨ
ＤＬ調製物を用いて次のように。

４μｇ／ｍｅ　＝４６ｐ　ｌ　＋９．９５４　ｍｌｌ　
　ＰＢＳ（１：　２１７）　：２１Ｊｇ７ｍｌ＝ｌ　ｍ
ｌ上記溶液＋１ｍｊ！ＰＢＳ；そして、０．０３１μｇ
７ｍｌまで２倍希釈を続ける。

ｃ、ＨＲＰＯ標識Ａｌ−１１の希釈 ＰＢＳ中の１　：　５０００希釈したＡｌ−１１ＨＲＰ
Ｏ結合物抗体を用いた。その希釈は次のように行った。

２０μＮ＋１．９８ｍρＰＢＳ　（１：１００）ｉそし
て、 ２４０μｌの上記溶液＋１１．７６ｍ　ｌ　ＰＢＳ（１
：　５０００）光を遮断するためにフォイルでカバーせ
よ。この量は、２つのプレートに対し十分なものである
。

ｄ、３パーセント過酸化水素 ３０パーセントの過酸化水素（）ｌｚｏｚ）を蒸留水で
１＝ｌＯに希釈した。

ｅ、Ｏ−フェニレンジアミン基質 １５ｍｊ！の蒸留水に１個のＯ−フェニレンジアミン（
ＯＰ　Ｄ）錠剤（シグマ、ケミカル、（ＳｉｇｍａＣｈ
ｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）セントルイス（Ｓｔ、Ｌｏｕｉ
ｓ）　、Ｍ　Ｏ）　−を溶かし、６２．５μｌの３パー
セント１１□Ｏｔを加えた。光から保護するためフォイ
ルでカバーをする。

基質は使用前その都度新しく調製した。

５、検定手順 ａ、室温付近く２０〜２２℃）で少なくとも２０分間抗
体結合イライザプレートを平衡化した。バッグからプレ
ートを取り出し、逆さにすることで、ウェル中に残存す
るバッファを除いた。ウェル中を３００μｌの洗浄バッ
ファ（０，１％ＢＳＡ及び０．０５％トウィーン２０を
含むＰＢＳ　（ｐＨ７，２）で満たし、そして、１０分
間維持した。プレートを逆さにしてバッファを除き、そ
して、ペーパータオルによって、プレートを乾燥させた
。検定の間、１０分以上、ウェルを空のままにしてはな
らない。

ｂ、各３個、５０μｌの標準物質又は試料をウェルに加
える。

０、ｃｒｇ／ｍｊ＋の標準物質は５０μｌのＰＢＳを用
いた。５０μｌ希釈ＨＤＬ標準物質を標準つ工、ルに加
えた（０．０３１．０．０６２、Ｏ，ｌ　２５、０．２
５．０．５０．１．０μｇ／ｍＪ）。

５０μｌの希釈コントロール及び患者からの試料を各々
のウェルに加える。

Ｃ１全てのウェルに、ウェル当り５０μβのＨＲＰＯ結
合抗体を加える。

ｄ、プレートをアルミニウムホイルで包み、そして、室
温付近（約２０〜２５℃）で３０分間、ジャイローシエ
イカー（約１１００ＲＰ＞の上に置いた。

ｅ、ウェルを、ウェル当り３００μｌの洗浄バッファで
満たし、それからプレートを逆さにしてバッファを除く
。もう２回、計３回洗浄をくり返した。三回の洗浄のあ
とペーパータオルでプレートを乾燥させた。プレートを
乾燥したままにしてはならない。

ｆ、ウェル当り１００μｌの新しく調製したＯＰＤ基質
を加え、室温で３０分間発色させた。

ｇ、全てのウェルに４Ｎの硫酸５０μｌを加えて反応を
停止した。４９２ｎｍの０．０．値を測定した。

ｈ、血漿試料及びリポプロティンの定量血漿試料は、サ
ンディエゴＶＡ病院の、心臓カテライゼーション研究室
からの、冠状動脈病の２０名の患者から入手した。加え
て、血漿を、３７名の正常人から入手した。

血液を、１．５■／ｍｌのエチレンジアミンテトラ酢酸
塩（ＥＤＴＡ）を含むチューブに採取し、そして４℃で
遠心した。

全血漿コレステロール及びトリクリセライトを、アボッ
トＡＢＡ−２００バイクロミツク・アナライザー、及び
バーリンガー・マンハイムのハイ・パーフォーマンス・
コレステロール・リーテント２３６６９１及びアボット
・ラボラトリーズ・トリグリセライドＡ−ジェント（Ａ
−ｇｅｎｔ）を用い、標準診療室で、新鮮な血漿試料に
ついて測定した。

ＬＤＬ−及びＨＤＬ−コレステロールを、（１９７４年
）、ガバーメント・プリント・オフ（Ｇｏｖ、Ｐｒ１ｎ
ｔ。

Ｏｆｆ、）　、ワシントンＤ、Ｃ，第２版、ＨＥＷ発刊
番号７５−６２８　（ＮＩＩ−１）　、脂ｌ硯叉蕎遼王
嵐（Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃ１１ｎｉｃ　Ｐ
ｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）に述べられている技術を用いて測
定した。

定量的アポリポプロティンＡ−１検定法は、ＴＸ。

フレンズウソド（Ｆｒｉｅｎｄｓ　ｗｏｏｄ）　、アイ
ソテックス・ダイアグノスティクス・インク（Ｉｓｏｔ
ｅｘ口ｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　＋　Ｉｎｃ、）ＭＥ、ボ
ートランド（Ｐｏｒｔｌａｎｄ）　、ベントレックス、
ラボラトリーズ・インク（Ｖｅｎｔｒｅｘ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ　、　Ｉｎｃ、）　　ＣＡ。

バーリンガム（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ）、タボ・インク
（Ｔａｇ。

Ｉｎｃ、）及びＣＡ、う・ジヨウ（Ｌａ　Ｊｏｌｌａ）
　、カルバイオケムーベーリング（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅ
ｍ　−Ｂｅｈｒｉｎｇ）から提供される市販の検定キッ
トを用いても行った。各キットに付いている説明書に従
って検定を行った。

アポＡ−１に対する定量的イライザ研究は、すでに述べ
てきたように、提供者から入手した血清又は血漿試料に
ついて、もしくは、研究調製物を譲ってもらったり、又
は、市販業者から入手した試料について、ここで述べら
れている方法に従って行った。これらの市販試料は、Ｖ
Ａ、スプリングフィールド（Ｓｐｒｉｎｇｆ　１ｅｌｄ
）のメロイ・ラボラドリース（Ｍｅｌｏｙ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ）　；　ＣＡ　、う・ジヨウ（Ｌａ　Ｊ
ｏｌｌａ）のスクリップス・ラボラドリース（Ｓｃｒｉ
ｐｐｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）　　：　Ｐ　Ａ％
フマルーン（Ｍａｌｖｅｒｎ）オメガ／クーパー・バイ
オメディカル・インク　（Ｏｍｅｇａ／Ｃｏｏｐｅｒ　
Ｂｉｏｅ＋ｅｄｉｃａｌ　Ｉｎｃ、）　　；ＯＨ、アク
ロン（Ａｋｒｏｎ）のアイソラブ・ラブ（Ｉｓｏｌａｂ
Ｌａｂ）　　：ＣＡ％う・ジヨウ（Ｌａ　Ｊｏｌｌａ）
のカルバイオケムーベーリング（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ
−Ｂｅｈｒｉｎｇ）　　；ＧＡ、アトランタ（Ａｔｌａ
ｎｔａ）、疾病コントロールセンター（ｔｈｅ　Ｃｅｎ
ｔｅｒｓ　ｆｏｒ　Ｄｉｓｅａｓ　Ｃｏｎｔｒｏｌ）を
通して得られるインターナショナル・ユニオン・オプ・
イムノロジカル・スタンダーズ （Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｕｎｉｏｎ　ｏｆ　Ｉ
ｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＳｔａｎｄａｒｄｓ）　（Ｉ
ＵＩＳ）　　：及びＣＡ、エル・セグンド（ＥＩ　Ｓｅ
ｇｕｎｄｏ）のケミコン・インターナショナル・インク
（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　５
Ｉｎｃ、）から入手した。ギフト試料は、ＮＪ、ラリタ
ン（Ｒａｒｉｔａｎ）のオルト・ダイアグノスティック
・システムズ・インク（Ｏｒｔｈｏ　Ｄｉａｇｎｏｓｔ
ｉｃｓ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　。

Ｉｎｃ、）の好意によった。アポＡ−１標準物質は、メ
ロイ・ラボラトリーズ（Ｍｅｌｏｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ）、スクリップス・ラボラトリーズ（Ｓｃｒ　
ｉ　ｐｐＳＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）及びケミコン・
インターナショナル（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ　Ｉｎｔｅｒｎ
ａｔｉｏｎａｌ）から入手した。

■、液相＋ｔＳ（標識抗原ＲＩＡ ＡＩ−１０，Ａｌ−１１、Ａｌ−１２、Ａｌ−１３及び
Ａｌ−１４により結合されたＩｔ！１ｌ−ＨＤＬ粒子及
びアポＡ−１の割合を測定するために、液相ＲＩＡを用
いた（カーチス（Ｃｕｒｔｉｓｓ）とニシントン（Ｅｄ
ｇｉｎｇｔｏｎ）　（１９８５年）ジャーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ。

Ｂｉｏｃｈｅｎ＋、Ｃｈｅｍ、）　２６０巻、２９８２
−２９９３頁）。

０、ｌｎｌの放射性ヨウ素化した抗原（ＨＤＬ又はアポ
リボプロティンＡ−１＞に、０．１ｎｊ！のリン酸緩衝
食塩水（ｐＨ７，２）及びマウス・ハイプリドーマ培養
液又は腹水液を１１５０正常マウス血清でいろいろに希
釈したもの０．１ｎｊ！を加えた。また全てのバッファ
も５％デキストラン（分子量４０．０００）を含む。４
℃、１８時間後、沈殿化のための第２抗体０．１ｍｆｆ
１を加えた。４℃、４時間のインキュベーション後、２
ｔａｌｌの冷ＰＢＳを加え、そしてそのチューブを４℃
で２０００ｘｇ、３０分の遠心をした。その上清をデカ
ンテーションし、そして、そのペレットのＩｔＳ夏活性
をガンマ線計数器で測定した。最高の沈殿化放射性活性
を第二抗体を１００％ＴＣＡと置き換えることにより測
定した。非特異的結合の沈殿化放射性活性最小値は、そ
の特異的ハイブリドーマ抗体を、同じヘビーチェイン類
の無関係なハイプリドーマ抗体と置き換えることにより
測定した。

データは次のように計算した。

平均−ＮＳＢ　ＸＩＱＯ 結合１２５■−抗原パーセント＝□ ＴＣＡ−ＮＳＢ ここで“平均”とは、与えられた特異的抗体量の存在下
において沈殿する平均放射性活性、“ＮＳＢ”とは本発
明の特異的パラトピック分子を、同じヘビーチェイン類
の、無関係なハイブリドーマ抗体と置き換えることによ
り測定した、非特異的に結合した沈殿化放射性活性量、
及び“ＴＣＡ”はＴＣＡ沈殿化の放射性活性最高値を示
している。

Ｊ、Ａｌ−１０及びＡｌ−１１に対する競合免疫酵素測
定検定法。

フレキシブルなポリビニルクロライド製のマイクロプレ
ートを５μｇ／＋＋Ｊ！のＨＤＬ又は精製アポＡ−１を
含む、０．２ｎｊ！のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を用
い、４℃、１８時間（−晩）でコーティングした。その
ウェルを、リットル当り１．０ｇのＢＳＡ及び０．５＋
ｊ！のトウィーン２０を含む、０．３ｎｊ！のＰＢＳで
３回洗浄した。ウェルの残存する結合部位をり７）ル当
り３０　　ＢＳＡを含む０．２ｎｊ！のＰＢＳをウェル
に入れ、室温（２０〜２５℃）で約１時間インキュベー
トすることによりブロックした。それからそのウェルを
洗浄バッファで３度洗浄した。そしてそのプレートは直
ちに使用した。

ホースラディツシュ・パーオキシダーゼと結合した０、
　３７５μｇ／ｍｌｌのＡｌ−１０を含むＰＢＳ（０，
０５ｍ１）を、θ〜８．０μｇ／ｍｌの未結合Ａｌ−１
０又は未結合のＡｌ−１１モノクロ一ナル抗体を含む０
．０５ｍ１のＰＢＳで予めコーティングしたウェル中で
インキュベートした。インキュベーション時間は、室温
で３時間である。それからウェルを洗浄バッファで３度
洗浄し、そして、０−フ二二レンジアミン基質を含む０
１ｌＩ１１１ｉ！のＰＢＳを全てのウェルに加え、室温
（２０〜２５℃）で３０分間インキュベートした。その
発色反応を全てのウェルに４Ｎ硫酸０．０５＋ｎ１加え
ることにより停止し、そして、各ウェルの光学密度（０
９口、）をダイナチク（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）　　９６−
穴プレート読み取り器を用い、４９０ナノメーターで測
定した。

アポＡ−１でコーティングしたプレートの結果を図１に
示し、そして、ＨＤＬでコーティングしたプレートの結
果を図２に示した。未標識Ａｌ−１１分子の２１倍の増
加はＨＤＬ又はアポＡ−Ｉへの結合に対し、有意に競合
することはなかった。

この研究を、同濃度の未標識Ａｌ−１０及びＡｌ−１１
とともにパーオキシダーゼで標識したＡｌ−１１を用い
て繰り返し、同様の結果を与えている。

本発明は、好ましい態様に関して述べられている。そし
て、当業者にとっては、公開されている事柄の修正そし
て、または変化は、ここで述べられている発明の範囲を
逸脱することなしに行なうことができることは明白であ
ろう。

【図面の簡単な説明】

第１図は既知の一定量（０，３７５μｇ／　ｍｊ２）の
西洋わさびパーオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）標識Ａｌ−１
０分子の増加量の非標識化Ａｌ−１゜（ム）及びＡｌ　
　ｌｉ（■）分子の存在下での、固相−結合試薬アポリ
ボタンバクＡ−Ｉと免疫反応する能力を示す図面である
。縦軸は光学密度を表わし、横軸は加えた非標識化競合
モノクローナル抗体のμｇである。 この図面は免疫反応混合物中の非標識化Ａｌ−１０分子
の量を増していくと、固相免疫反応物として結合した標
識Ａ　Ｉ　−１０の量が減することを示している。すな
わちアポＡ−Ｉに対し、非標識Ａｌ−１０は標識Ａｌ−
１０と競合する。 この図面は又非標１ＡＩ−１１分子の量を増しても固相
免疫反応物として結合した標識Ａｌ−１０分子の量は意
味のある程度には減じないことを示している。すなわち
、非標識Ａｌ−１１分子はアポリポタンパクＡ−１への
結合に際し標識Ａｌ−１０分子と競合しない。 第２図は固相結合抗原としてＨＤ　Ｌを用い、又一定量
（０，３７５μｇ／ｌ１１）ＨＲＰＯ標識Ａｌ−１０分
子、及び非標識Ａｌ−１１分子（■）及びＡｌ−１０分
子（＾）を用いて得られた第１図と同様な結果を示す。 従ってＡｌ−１０及びＡｌ−１１モノクロ一ナル抗体分
子は、単一のアポＡ−Ｉ分子に立体的に他方の結合と競
合せず、又他方の結合を阻害せずに結合することができ
るほど十分に、アポリポタンパクＡ−１もしくはＨＤＬ
の表面で隔てられた異なるエピトープに結合する。 （’Ｏ’Ｏ） （０”０）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）アポリポタンパクＡ− I と免疫反応し、ＡＴＣ
   Ｃ受入れ番号ＨＢ９２００、ＨＢ９２０１、ＨＢ９２０
   ２、ＨＢ９２０３及びＨＢ９２０４を有するハイブリド
   ーマよりなる群から選ばれたハイブリドーマによって分
   泌されるモノクローナルパラトピック分子。 （２）丸ごとの抗体である特許請求の範囲第１項記載の
   モノクローナルパラトピック分子。 （３）液体試料中のアポリポタンパクＡ− I の存在を
   分析する方法において、 （ａ）分析すべき液体試料と有効量の、アポリポタンパ
   クＡ− I と免疫反応し、ＡＴＣＣ受け入れ番号ＨＢ９
   ２００、ＨＢ９２０１、ＨＢ９２０２、ＨＢ９２０３及
   びＨＢ９２０４を有するハイブリドーマよりなる群から
   選ばれたハイブリドーマによって分泌されるモノクロー
   ナルパラトピック分子とを混合して混合物を生成させ、 （ｂ）混合物を生物分析条件下に該パラトピック分子が
   該試料中のアポリポタンパクＡ− I と免疫反応して免
   疫反応物を生成するに十分な、予め設定された時間保持
   し、ついで （ｃ）免疫反応物の存在を測定する ことを特徴とする方法。 （４）該パラトピック分子が、作用できるように結合し
   た放射性元素を含有し、アポリポタンパクＡ− I の存
   在を、免疫反応物を混合物の残余から分離し、それが発
   する放射線を分析することによって測定する特許請求の
   範囲第３項記載の方法。 （５）該最初に言及したモノクローナルパラトピック分
   子を該混合物形成に先立って固体マトリックスに結合し
   て固体支持体を形成させ、固体支持体の非特異的タンパ
   ク結合部位をブロックし、さらに生成した該混合物を固
   相結合免疫反応物として固体支持体に結合させる特許請
   求の範囲第３項記載の方法。 （６）固相結合免疫反応物中のアポリポタンパクＡ−
   I の存在を （ｉ）液相第２モノクローナルパラトピック分子であっ
   て、ＡＴＣＣ受入れ番号ＨＢ９２００、ＨＢ９２０１、
   ＨＢ９２０２、ＨＢ９２０３及びＨＢ９２０４を有する
   ハイブリドーマよ りなる群から選ばれたハイブリドーマによ って分泌されるが、該最初に言及した混合 物においては利用されておらず、酵素表示 手段に作用できるように結合した第２モノ クローナルパラトピック分子と該最初に言 及した混合物とを混合して該第２パラトピ ック分子とアポリポタンパクＡ− I とを免 疫反応させて第２の混合物を形成させ、 （ｉｉ）第２の混合物を生物分析条件下に該第２の表示
   手段結合パラトピック分子が該混合 物中のアポリポタンパクＡ− I と免疫反応 してサンドイッチ免疫反応物及び液相を生 成するのに十分な、予め設定した時間保持 し、 （ｉｉｉ）固相と液相とを分離し、ついで （ｉｖ）固相サンドイッチ免疫反応物中の表示手段結合
   アポリポタンパクＡ− I の存在、ひ いては該試料中のアポリポタンパクＡ− I の存在を測定する ことによって測定する特許請求の範囲第５項記載の方法
   。 （７）液体試料中のアポリポタンパクＡ− I の量を測
   定する方法において、 （ａ）予め設定した量の液体試料と、アポリポタンパク
   Ａ− I と免疫反応し、ＡＴＣＣ受入れ番号ＨＢ９２０
   ０又はＨＢ９２０１を有するハイブリドーマの１つによ
   って分泌される第１のモノクローナルパラトピック分子
   を固相結合させた固体マトリックスより本質的になる固
   体支持体とを混合して固液相混合物を形成させ（該支持
   体表面の非特異性タンパク質結合部位はブロックする）
   、 （ｂ）固液相混合物を生物分析条件下に第１パラトピッ
   ク分子が試料中のアポリポタンパクＡ− I と免疫反応
   して、試料中の実質上すべてのアポリポタンパクＡ−
   I を含有する固相結合免疫反応物を生成させるに十分な
   、予め設定された時間保持し、 （Ｃ）該液体試料中のアポリポタンパクＡ− I と、液
   相第２モノクローナルパラトピック分子であって、アポ
   リポタンパクＡ− I と免疫反応し、ＡＴＣＣ受入れ番
   号ＨＢ９２００又は ＨＢ９２０１を有するハイブリドーマの１つによって分
   泌されるが最初に言及した混合物においては利用されて
   おらず、かつ酵素表示手段に作用できるように結合した
   第２モノクローナルパラトピック分子とを混合して第２
   混合物を形成させ、 （ｄ）第２混合物を生物分析条件下に該第２の表示手段
   結合パラトピック分子が試料中の実質上すべてのアポリ
   ポタンパクＡ− I を含有する免疫反応物を生成させる
   のに十分な、予め設定された時間保持し、 （ｅ）上記（ａ）〜（ｄ）の工程の結果生じタ固相及び
   液相を分離し、 （ｆ）固相中の表示手段結合アポリポタンパクＡ− I
   含有免疫反応物の量、ひいては試料中のアポリポタンパ
   クＡ− I の量を測定する 工程よりなることを特徴とする方法。 （８）混合工程（ａ）及び（ｃ）を実質上同時に行い、
   保持工程（ｂ）及び（ｄ）を一緒にして行う特許請求の
   範囲第７項記載の方法。 （９）液体血液試料中のアポリポタンパクＡ− I の量
   を測定する方法において、 （ａ）液体血液試料；アポリポタンパクＡ− I と免疫
   反応し、ＡＴＣＣ受入れ番号ＨＢ９２００又はＨＢ９２
   ０１を有するハイブリドーマの１つによって分泌される
   第１のモノクローナルパラトピック分子を固相結合させ
   た固体マトリックスより本質的になる固体支持体；及び
   酵素表示手段に作用できるように結合した、ＡＴＣＣ受
   入れ番号ＨＢ９２００又はＨＢ ９２０１を有するハイブリドーマのいずれかによって分
   泌されるが固体マトリックスに結合した第１パラトピッ
   ク分子ではない第２の液相モノクローナルパラトピック
   分子を実質上同時に混合することによって固液相混合物
   を形成させ（該支持体表面の非特異的タンパク結合部位
   はブロックする）、 （ｂ）固液相混合物を生物分析条件下に第１パラトピッ
   ク分子及び表示手段結合第２パラトピック分子が試料中
   の実質上すべてのアポリポタンパクＡ− I と免疫反応
   して固相結合サンドイッチ免疫反応物及び液相を形成す
   るのに十分な、予め設定した時間保持し、 （ｃ）固相と液相とを分離し、ついで （ｄ）固相中の表示手段結合アポリポタンパクＡ− I
   含有サンドイッチ免疫反応物の量、ひいては試料中のア
   ポリポタンパクＡ− I の量を測定する 工程よりなることを特徴とする方法。 （１０）第１パラトピック分子がＡＴＣＣ受入れ番号Ｈ
   Ｂ９２００を有するハイブリドーマによって分泌される
   特許請求の範囲第９項記載の方法。 （１１）液体試料中のアポリポタンパクＡ− I の存在
   の測定に用いるのに適当な診断系であって、アポリポタ
   ンパクＡ− I と免疫反応し、ＡＴＣＣ受入れ番号ＨＢ
   ９２００、ＨＢ９２０１、ＨＢ９２０２、ＨＢ９２０３
   及びＨＢ９２０４を有するハイブリドーマよりなる群か
   ら選ばれたハイブリドーマの１つによって分泌されるパ
   ラトピック分子であって、アポリポタンパクＡ− I の
   存在の１回の測定するのに十分な量のパラトピック分子
   を有するパッケージよりなることを特徴とする診断系。 （１２）さらに表示手段を包含する特許請求の範囲第１
   １項記載の診断系。 （１３）液体血液試料中のアポリポタンパクＡ− I の
   量の測定に使用するのに適当な診断系であって、（ａ）
   アポリポタンパクＡ− I と免疫反応し、ＡＴＣＣ受入
   れ番号ＨＢ９２００又はＨＢ ９２０１を有するハイブリドーマの１つによって分泌さ
   れるモノクローナルパラトピック分子と結合させた固体
   マトリックスより本質的になり、その非特異的タンパク
   質結合部位をブロックした固体支持体を含有する第１の
   パッケージ、及び （ｂ）アポリポタンパクＡ− I と免疫反応し、ＡＴＣ
   Ｃ受入れ番号ＨＢ９２００又はＨＢ ９２０１を有するハイブリドーマの１つによって分泌さ
   れるが第１のパッケージのパラトピック分子ではなく、
   かつ表示手段に作用できるように結合したパラトピック
   分子であって、アポリポタンパクＡ− I の存在の１測
   定を行うのに十分な量のパラトピック分子を含有する第
   ２のパッケージ よりなることを特徴とする診断系。 （１４）ＡＴＣＣ受入れ番号ＨＢ９２００を有するハイ
   ブリドーマによって分泌されるモノクローナルパラトピ
   ック分子が第１のパッケージの固体マトリックスに結合
   している特許請求の範囲第１３項記載の診断系。 （２）ＨＢ９２００、ＨＢ９２０１、ＨＢ９２０２、Ｈ
   Ｂ９２０３及びＨＢ９２０４よりなる群から選ばれたＡ
   ＴＣＣ受入れ番号を有するハイブリドーマ。