NO174004B

NO174004B - Hybridomer og monoklonale, paratropiske molekyler overforapolipoprotein a-1 for anvendelse in vitro

Info

Publication number: NO174004B
Application number: NO87874055A
Authority: NO
Inventors: Linda K Curtiss
Original assignee: Scripps Clinic Res
Priority date: 1986-09-29
Filing date: 1987-09-28
Publication date: 1993-11-22
Also published as: NZ221938A; PT85826B; EP0266880A3; IL83937A0; IL83937A; GR3006843T3; ATE83267T1; DK490387D0; FI92715C; DK490387A; JP2505218B2; EP0266880B1; ES2051744T3; NO874055L; EP0266880A2; IE872502L; US5126240A; PT85826A; FI92715B; DE3783015D1

Description

Teknisk område

Foreliggende oppfinnelse angår hybridomer og monoklonale, paratopiske molekyler som er anvendbare for å bestemme apolipoprotein A-I in vitro i en væskeprøve, såvel som en diagnostisk metode og et system for utførelse av en slik bestemmelse.

Bakgrunn for oppfinnelsen

A. Atherosclerosis og lipoproteiner

Atherosclerosis er en sykdom hvori cholesterol og

andre lipider som akkumuleres på arterieveggene, danner voluminøse plakker som inhiberer strømningen av blod og som kan føre til dannelse av en klump som kan stoppe til arterien og forårsake okklusiv trombotisk eller embolisk sykdom slik som hjerteinfarkt eller slag. Opptil 50% av alle dødsfall i USA er forårsaket av atherosclerosis og dens sekundære komplikasjoner.

Human atherosclerosis er definert som akkumulering

av utvalgte lipider, innbefattende cholesterol, og celler i arterieveggene og som med tiden fremkaller okklusive lesjoner. Selv om etiologien av atherosclerosis skyldes mange faktorer, antyder en stor mengde av kliniske, patolog-iske, genetiske og eksperimentelle bevis at abnormaliteter i lipoproteinmetabolismen kan bidra til utvikling av atherosclerosis. Disse lipider bæres i blodstrømmen som lipid-proteinkomplekser som kalles lipoproteiner.

Atherosclerosis, og i særdeleshet den form som er kjent som' koronar arteriesykdom (CAD), er et alvorlig helseproblem. Atherosclerosis og dens beslektede vaskulære sykdommer sto for 983.000 dødsfall i 1983, og CAD alene sto for flere dødsfall årlig enn alle samlede former for cancer. I USA oppstår mer enn 1 million hjerteinfarkt hvert år, og mer enn 500.000 mennesker dør som et resultat av denne sykdom. I direkte helsekostnader koster CAD

USA mere enn 60 milliarder dollar pr. år. Dette enorme

beløp har rettet oppmerksomheten mot måter til å identi-

fisere bestemte populasjoner på med risiko for CAD slik at

sykdommen kan reguleres med diett, adferdsendring (mosjon) og spesifikke, terapeutiske midler.

Fordi cholesterol spiller en hovedrolle i CAD, er dette molekyl og dets assosierte plasmaproteiner grundig blitt studert. Fire hovedklasser av cholesterol-assosierte plasma-lipoproteinpartikler er blitt definert og har sin opprinnelse i tarm eller lever. Disse partikler er involvert i transporten av nøytrale lipider innbefattende cholesterol og triglycerider. Alle klasser av plasma-lipoproteiner har apolipoproteiner assosiert med lipid-proteinkomplekset, og apolipoproteinene spiller en nødvendig rolle ved funksjonen av disse lipoproteiner.

Den første klasse er chylomikronene. Disse er de største av lipoproteinene og er rike på triglycerider. Oppfinnelsessetet for chylomikronene er tarmen.

Mens apolipoproteiner er en kvantitativt mindre del av massen av chylomikroner, er apolipoprotein A-I, A-II og A-IV rapportert signifikant å være assosiert med chylomikroner, og tarmsyntese av disse A apolipoproteiner er blitt funnet. Chylomikroner inneholder også apolipoprotein B-48. Mye av chylomikronkomplementet av A apolipoproteiner tapes, og C og E apolipoproteiner oppnås når chylomikroner eksponeres for plasma eller lipoprotein med høy densitet (HDL) in vitro. Tarmproduksjon av A apolipoproteinene (apo A) kan reguleres med andre faktorer enn fettabsorpsjon og chylomikrondannelse.

Den neste klasse av lipoproteiner er lipoproteiner med meget lav densitet, VLDL. VLDL-partikkelen er involvert i triglyceridmetabolisme og transport av disse lipider fra leveren. Apolipoprotein apo B-100 og apo E er hovedbestanddelene av VLDL-partikkelen.

Det tredje lipoprotein kalles lipoprotein med lav densitet (LDL) og er et spesifikt produkt av katabolismen av VLDL. Det dominerende apolipoprotein i LDL-partikkelen er apolipoprotein B-100 eller apo B-100.

Resultatene av den nå klassiske Framingham-studie

(1971) viste en klar korrelasjon mellom risikoen for CAD og serumcholesterolnivåer. Denne studie viste også at forhøyede nivåer av lavdensitets-lipoprotein-(LDL) cholesterol er assosiert med forøket risiko for CAD. Nylig har en studie utført av Lipid Research Clinics Coronary Primary Prevention Trial (1984) vist at plasmanivåer av cholesterol og LDL-cholesterol kan reduseres ved en kombinert kur av diett og legemidler, og at denne reduksjon av plasmacholesterol resulterer i reduksjon av forekomsten av CAD-dødelighet.

LDL er det hoved cholesterol-bærende lipoprotein

i plasma. LDL er en stor tubeformet partikkel hvis olje-aktige kjerne er sammensatt av ca. 1500 molekyler cholesterol, hver bundet med en esterbinding til en lang-kjedet fettsyre. Denne kjerne av cholesterylestere er om-sluttet av et lag av fosfolipid, uforestrede cholesterolmolekyler og ett enkelt molekyl av apolipoprotein B-100. Fosfolipidene er anordnet slik at de hydrofile hoder er

på utsiden, som muliggjør at LDL kan være i hydratisert suspensjon i blodet eller ekstracellulære væsker.

Cholesterolet avgis til cellene på LDL via en spesifikk LDL-reseptor og frigis fra LDL-partikkelen i lysosomer hvor den kan regulere cellens cholesterol-metabolisme. En akkumulering av intracellulært cholesterol modulerer tre prosesser.

For det første reduserer den cellens evne til å fremstille sitt eget cholesterol ved å bryte av syntesen av et enzym, HMG CoA reduktase, som katalyserer et trinn i cholesterolets biosyntetiske rute. Undertrykkelse av enzymet gjør cellen avhengig av fremmed cholesterol avledet fra reseptor-formidlet opptak av LDL.

For det andre aktiverer innkommende LDL-avledet cholesterol lagring av cholesterol i cellen ved aktivering av et enzym som angis som lipoprotein-acyltransferase. Dette enzym forestrer fettsyrer til overskytende cholesterolmolekyler og danner cholesterylestere som avsettes i lagringsdroplets.

For det tredje og mest signifikant, vil en akkumulering av cholesterol innen cellene drive en feedback-mekanisme som bevirker at cellen stopper å syntetisere nye LDL-reseptorer. Celler justerer derved sitt komplement

av ytre reseptorer slik at tilstrekkelig cholesterol bringes inn i cellene for å oppfylle cellens varierende behov, men ikke tilstrekkelig til å overbelaste disse. Fibroblastceller som aktivt deler seg slik at nytt membran-materiale behøves, opprettholder eksempelvis et maksimalt komplement av LDL-reseptorer på ca. 40.000 pr. celle. I celler som ikke vokser, begynner det innkommende cholesterol å akkumuleres, feedback-systemet reduserer reseptorfrem-stilling og komplementet av reseptorer reduseres så mye som til en tiendedel.

På den annen side er det blitt vist at et annet sirkulerende lipoprotein, lipoprotein-høydensitets- (HDL) partikkelen, er implisert i en tilstand med forhøyet cholesterol assosiert med en nedsatt risiko for atherosclerosis. Apolipoprotein A-I er et strukturelt protein og ligand av HDL-partikkelen. Mengden av HDL til-veiebringer en invers korrelasjon med den forutsagte forekomst av atherosclerosis.

Høydensitets-cholesterol (HDL) inneholder to hoved apolipoproteiner, apolipoprotein A-I (apo A-I) og apolipoprotein A-II (apo A-II). Apo A-I er hovedproteinkomponenten av all primat HDL. Alle HDL-partikler inneholder apo A-I, og immunokvantifisering av HDL har derfor vanligvis innbefattet kvantifisering av apo A-I. Ca. 80% av HDL-partiklene inneholder også apo A-II, men HDL-partikler som bare inneholder apo A-II, er ikke blitt beskrevet.

En funksjon av apo A-I er aktivering av plasma-enzymet, lecithin-cholesterol-acyltransferase (LCAT).

Dette enzym er nødvendig for forestring av fritt cholesterol på HDL for transport til leveren. I fravær av apo A-I forestres ikke cholesterol, og cholesterol renses således ikke fra blodet. Den spesifikke rolle i HDL-metabolismen som spilles av apo A-II, er ikke blitt definert.

Mange studier har vist at forhøyede HDL-nivåer korrelerer med en redusert hyppighet av CAD. Enkelte for-fattere har postulert at HDL fjerner cholesterol fra peri-fere steder slik som arterieveggen, og bidrar derfor til de anti-atherogene egenskaper av HDL. Høyere konsentrasjoner av HDL-cholesterol er korrelert med relativt normal lipidmetabolisme og en lavere forekomst av og/eller en nedsatt strenghet av kardiovaskulær sykdom, mens forhøyede nivåer av LDL-cholesterol er assosiert med unormal lipidmetabolisme og en forøket risiko for CAD. For riktig behandling av pasienter med hyperlipidemia (overskudd av lipider i blodet) og pasienter med særlig risiko for CAD, er det ønskelig å hyppig bestemme nivåer av LDL- og HDL-cholesterol. Hittil har bestemmelser av HDL-cholesterol vært besværlige og unøyaktige ved bestemmelse av blod-nivåer av HDL.

B. Lipoproteinstruktur og funksjon

Det er viktig å forstå at cholesterol ikke eksisterer fritt i plasma, men transporteres til vevsteder i kroppen av lipoproteiner. Cholesterol kan erholdes ut fra direkte cellulær syntese eller ved diett. Imidlertid kan cholesterol fjernes fra verten bare av leveren hvor det omdannes til gallesyrer og utskilles.

Chylomikroner bærer cholesterol og triglycerider

til leveren for etterfølgende bearbeidelse, mens LDL avgir cholesterol til ekstrahepatisk vev, innbefattende koronar-arteriene. Lipoproteinet, LDL/apo B, er således involvert i avsetningen av "dårlig" cholesterol i perifert vev. Derimot fjerner lipoproteinet HDL/apo A, "godt" cholesterol fra vevet og fører cholesterol tilbake til leveren for utskillelse.

Historisk sett er mange systemer blitt utviklet for å isolere og karakterisere lipoproteiner. Disse teknikker er vanligvis basert på de fysiokjemikalske egenskaper av lipoproteinpartiklene. De to mest hyppig anvendte teknikker er ultrasentrifugering og elektroforese.

Differensiell densitetsgradient-ultrasentrifugering drar fordel av det faktum at lipoproteinene er lettere eller mindre tette enn andre plasmaproteiner, og det er relativt enkelt, ennskjønt tidkrevende og besværlig, å separere chylomikronene (de letteste lipoproteiner), VLDL, LDL og HDL fra hverandre. Elektroforetiske teknikker har vært anvendbare for klassifisering av pasienter med hyperlipidemia. Disse teknikker er imidlertid ikke lett å utføre i et vanlig klinisk laboratorium.

Det kan også sees at en enkel kvantifisering av blodcholesterol eller triglycerider ikke gir legen informa-sjon om hvilke lipoproteiner som bærer disse lipider og deres mengde.

C. Plasma- lipoproteiner

Fire hovedklasser av plasma-lipoproteiner, dvs. chylomikroner, VLDL, LDL og HDL, er blitt definert, og underklasser innen disse eksisterer uten tvil. Alle lipoproteiner har sin opprinnelse i tarm eller lever, eller begge deler, og synes å ha en pseudomicellær struktur. Nøytrale lipider, og i særdeleshet cholesterolestere og triglycerider, opprettholdes i kjernen av lipoproteinene i en løselig og stabil form gjennom interaksjoner med de polare overflatebestanddeler, apolipoproteiner og fosfolipider.

Uforestret cholesterol er også til stede i disse komplekser. Dets polaritet ligger mellom den av de nøy-trale lipider (cholesterolestere og triglycerider) og den av de mer polare apolipoproteiner og fosfolipider, og finnes både i kjernen og på overflaten.

En ytre overflate bestående av apolipoprotein, uforestret cholesterol og fosfolipider, omgir en vann-løselig kjerne av cholesterylestere og triglycerider som beskytter de apolare lipider mot det vandige miljø. Den generelle, strukturelle oppfatning er blitt understøttet av lav-vinklede røntgenspredningsstudier og ved andre fysikalske metoder hvori et utall prøver er blitt anvendt for å utlede strukturen av lipoproteinene. En viktig funksjon av plasma-lipoproteinene er således oppløselig-gjørelse og transport av nøytrale plasmalipider.

D. Apolipoproteiner

Apolipoproteiner er lipidfrie proteinkomponenter av plasma-lipoproteinene erholdt ved behandling av isolerte, intakte lipoproteiner med organiske løsningsmidler, deter-genter eller chaotrope midler. Ikke alle proteiner opp-bragt med lipoproteiner spiller nødvendigvis en rolle i lipidtransport. Et betydningsfullt eksempel er den nylige oppdagelse at serum amyloid A proteiner, akutt fase-reak-tanter, transporteres i plasma bundet til HDL. Disse lav-molekylære proteiner omfatter opptil 30% av apo-HDL i inflammatoriske tilstander, men det er tvilsomt om de har en spesifikk lipidtransportrolle.

Apolipoprotein A-I (apo A-I) tilstedeværende i HDL-partikler, er det protein som har interesse ved foreliggende oppfinnelse. Apo A-I er diskutert i det etterfølgende.

Apo A-I er hovedproteinkomponenten av all primat

HDL og er til stede i alle HDL-partikler, og det er mange, eksempelvis 7-8, apo A-I-molekyler pr. HDL-partikkel.

Det er blitt rapportert å være til stede i relativt mindre mengder i chylomikroner, VLDL og LDL, såvel som å utgjøre 60-80% av proteinet av HDL.

Apo A-I består av en enkel kjede av 243 til

245 rester, det inneholder ikke cystin, leucin eller carbo-hydrat, og eksisterer i flere isoformer.

Apo A-I har et alfa spiralinnhold på ca. 55% i lipidfri tilstand som øker opptil 75% etter binding av fosfolipid. Repeterende sykluser på 11 spiralrester er blitt identifisert i dette apolipoprotein. Det er blitt foreslått at disse enheter representerer en enkel familiekjede som ved genduplikasjon har utviklet en 22-rest repeterende enhet. Disse enheter har enhver sekvenshomologi og er antatt å representere de lipid-bindende regioner av proteinet.

Som tidligere angitt, er apo A-I en kraftig aktivator av LCAT, et plasmaenzym som katalyserer omdann-elsen av cholesterol og fosfatidylcholin til cholesteryl-ester og lysofosfatidylcholin. Spesifikke lipid-bindende regioner av apo A-I er blitt funnet å aktivere LCAT, og denne aktivitet er blitt assosiert med lipidbindings-egenskapen. Som allerede angitt, syntetiserer lever og tarm apo A-I, men deres relative bidrag til det totale plasmainnhold og faktorene som modulerer apo A-I-produk-sjon, er ikke vel definert.

Typisk er mer enn 90% av plasma apo A-I assosiert med HDL, mindre enn 1% med VLDL og LDL, og ca. 10% eller mindre er assosiert med den lipoproteinfrie fraksjon av plasma. Mengdene av apo A-I i hver partikkeltype avviker med de som har rapportert dataene, og synes å være en funksjon av den anvendte teknikk ved separering av partiklene.

Måling av hovedproteinbestanddelen av HDL, apo A-I, er klinisk viktig. Resultatene av et utall studier har vist at apo A-I-nivåer er reduserte i pasienter med CAD. Denne observasjon understreker den beskyttende rolle av plasma apo A-I i denne pasientgruppe.

Resultatene av flere studier antyder at ved måling av apo A-I-nivået nøyaktig, kan det være mulig å forutsi et individs prognose for unormal lipidmetabolisme, atherosclerosis og spesielt CAD. Imidlertid har mengden av apo A-I alene ikke vært mulig for utnyttelse som en markør for unormal lipidmetabolisme alene, på grunn av vanskelig-heten med nøyaktig og presis måling av dette. Mens således relativt høye apo A-I-nivåer er tilbøyelige til å korrelere med normal lipidmetabolisme og relativt lave nivåer med unormal lipidmetabolisme og CAD, er en klar skillelinje mellom normale personer og de med kjent CAD ikke blitt rapportert.

Som tidligere angitt, er apo A-I blitt funnet å være uhyre vanskelig å nøyaktig og sikkert kvantifisere i et klinisk anvendbart immunobestemmelsessystem slik som en radioimmunobestemmelse (RIA), en enzymkjedet immuno-

bestemmelse (ELISA), en eléktroimmunobestemmelse (EIA),

en radialimmunodiffusjon (RID) eller ved immunonefeloraetri (INA). Se f.eks. tabell 1 i Steinberg et al. (1983), Clin. Chem. 29/ 3:415-426, for variasjon i verdier rapportert under anvendelse av forskjellige teknikker.

En av de hevdede årsaker for disse analytiske vanskeligheter er at apolipoprotein A-I-molekylet er til stede i plasma og serum som en del av en stor, biokjemisk heterogen partikkel, innen hvilken noen av molekylenes antigeniske steder (epitoper) er skjult og maskert. Følge-lig har flere forskere utnyttet avmaskeringsbehandlinger for sine prøver slik at de normalt skjulte epitoper er umaskerte og tilgjengelige for immunoreaksjon.

Steinberg et al. (1983), Clin. Chem. 29:415-426, diskuterer også avmaskering ved behandling av en blodprøve slik som plasma eller serum med denaturerende midler slik som urea, tetramethylurea og guanidin, overflateaktive midler slik som natriumdodecylsulfat og polyoxyethylen- (20) sorbitan-monolaurat (Tween<®> 20), oppvarming til 52°C i 3 timer og til 37°C i 2 timer, og avlipidiserende, organiske løsningsmidler slik som blandinger av ethanol og diethylether, methanol og diethylether, kloroform og methanol, og lignende. Ytterligere spesifikke avmaskeringsbehandlinger kan finnes i arbeidet rapportert av Maciejko et al. (1982), Clin. Chem. 28:199-204 (overflate-aktivt middel); Koren et al. (1985), Clin. Chim. Acta 147:85-95 (organisk løsningsmiddel); og Bury et al. (1985), Clin. Chem. 31:247-251 (37°C, 2 timer).

Enkelte av de ovenfor angitte forskere og andre har også anvendt polyklonale antistoffpreparater for å hjelpe til å unngå den tilsynelatende heterogenisitet av apo A-I slik det eksisterer i plasma og serum. Maciejko et al. (1982), Clin. Chem. 28.=199-204' Koren et al. (1985), Clin. Chim. Acta 147:85-95; Bury et al. (1985), Clin. Chem. 21:247-251 og Fesmire et al. (1984), Clin. Chem. 30:712-716. Selvsagt medfører bruk av polyklonale antistoffer i klinisk anvendbare, kvantitative immunobestemmelser, det uheldige trekk med forskjeller i antistoffaktivitet som medfølger anvendelse av sera fra flere dyr, og også forskjeller i immunospesifisitet fra forskjellige satser av serum.

Videre har Kottke et al. (1986), Mayo Clin. Proe. ^1:313-320, målt nivåer av apolipoprotein A-I, A-II og B, HDL-cholesterol, triglycerider og alder som variabler i menn, og funnet at anvendelse av alle seks av disse variabler var nødvendige for nøyaktig å skille CAD-pasienter fra asymptomatiske kontroller. Disse forskere anvendte radioimmunobestemmelser for sine bestemmelser.

Polyklonale antistoffer, en antistoff-prøve-oppholdelsestid på 16 timer, og en avmaskerende, detergent-behandling, er blitt rapportert anvendt for RIA-måling av apo A-I-verdier av Kottke et al. Et monoklonalt antistoff er blitt rapportert anvendt for RIA-måling av apo B. Kottke et al. rapporterte midlere apo A-I-verdier for normale og CAD-pasienter som ikke overlappet innen et standardavvik.

Bortsett fra de monoklonale, paratopiske molekyler anvendt her, har på den annen side ingen andre forskere beskrevet monoklonale antistoffer som immunoreagerer hovedsakelig likt med HDL-partikler og apo A-I, og som såvel også immunoreagerer med hovedsakelig alt av apo A-I tilstedeværende i en prøve. Således har Curtiss et al.

(1985), J. Biol. Chem. 200:2982-2998, rapportert ett monoklonalt antistoff betegnet med A-I-7, som immunoreagerte ca. likt med apo A-I og HDL, men som var i stand til immunoutfelling av bare ca. 60% av radiomerket apo A-I eller HDL kjent for å være til stede i de undersøkte prøver.

3. Monoklonale, paratopiske molekyler som reagenser for apo A- I

Anvendelse av monoklonale antistoffer eller deres antistoffbindende steddeler, dvs. (paratopiske molekyler) som reagenser for bestemmelse av nærvær av apo A-I i humane blodprøver, er attraktivt fordi slike reagenser så snart disse er oppnådd, kan produseres i relativt store mengder med ensartet kvalitet, og det er således mulig å unngå uensartethetsproblemet forbundet med polyklonale antistoffer. Imidlertid er det et utall faktorer som mot-virker bruk av et bestemt monoklonalt, paratopisk molekyl som en komponent i slike bestemmelsessystemer.

Under anvendelse av et monoklonalt antistoff som eksempel på et monoklonalt, paratopisk molekyl, er det ifølge teknikkens stand hevdet at et monoklonalt antistoff kan være for immunospesifikt til å kunne være anvendbart på grunn av den antigeniske heterogenitet av dets målanti-gen. Eksempelvis avhenger spesifisiteten av konvensjonelle polyklonalt antistoff-holdige antisera av en samstemmighet av hundre tusener av forskjellige antistoffer som bindes til antigeniske determinanter som dekker mesteparten eller alt av et antigenisk protein, som er blitt funnet å være anvendbart i apo A-I-bestemmeIser. Som et resultat av dette vil små forandringer i strukturen av antigenet på grunn av genetisk polymorfisme, heterogenitet av glycosyl-ering eller ubetydelig denaturering eller annen reaksjon vanligvis ha liten effekt på polyklonal antistoffbinding. På lignende måte vil en større eller mindre delmengde av antistoffer fra polyklonalt antisera vanligvis binde antigener som er blitt modifisert eller denaturert.

Monoklonale antistoffer bindes vanligvis derimot til en antigenisk determinant (epitope) på antigenmolekylet. Hvis av en aller annen grunn, denne determinant forandres, kan antistoffet, eller kan ikke antistoffet fortsette å bindes. Hvorvidt dette er et problem eller en fordel avhenger av de individuelle omstendigheter. Hvis som i foreliggende tilfelle, det monoklonale antistoff skal anvendes i en diagnostisk bestemmelse med hensyn til et apolipoprotein, kan en mindre antigenisk variasjon i dette protein forårsake store feil.

På grunn av deres unike spesifisitet er for det andre en vellykket bruk av et monoklonalt antistoff (Mab) ofte avhengig av dets affinitet overfor målantigenet. Mens f.eks. en Mab kan ha tilstrekkelig affinitet til å være anvendbart ved binding av antigen i væskefase og fast fase mens Mab i seg selv foreligger i væskefase, kan det samme antistoff ikke være anvendbart som et fast fase-bundet antistoff som er anvendbart ved binding til og bibeholdelse av antigenet fra oppløsning.

De ovenfor angitte problemer er generiske for anvendelse av monoklonale antistoffer. Fagmannen vil derfor ha erkjent at det er vesentlig å teste og karakterisere monoklonale antistoffer i ethvert bestemmeIsessystem hvori disse skal anvendes. Se Goding, James W., Monoclonal Antibodies: "Principles and Practice", Academic Press,

New York (1983), side 40-46.

Kort sammendrag av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse angår hybridomer og de monoklonale, paratopiske molekyler utskilt av disse hybridomer som immunologisk reagerer med apolipoprotein A-I, for anvendelse in vitro, såvel som metoder for bestemmelse av nærvær av apolipoprotein A-I eller HDL i en væskeprøve, og et diagnostisk system, typisk i settform, som er anvendbart ved utførelse av bestemmelsesmetodene, i særdeleshet på væskeformige blodprøver.

En side ved oppfinnelsen angår således et hybridom som er valgt fra gruppen av hybridomer med ATCC deponer-ingsnummere HB 9200, HB 9201, HB 9202, HB 9203 og HB 9204. Oppfinnelsen angår enn videre de monoklonale, paratopiske molekyler som utskilles av hvert av disse hybridomer og reagerer med apolipoprotein A-I, og immuno-utfeller minst 90 % <125>I HDL i en flytende fase. Disse monoklonale, paratopiske molekyler er fortrinnsvis hele monoklonale antistoffer.

En ytterligere side ved oppfinnelsen angår en

metode for bestemmelse av nærvær av apolipoprotein A-I i en væskeprøve. Denne metode omfatter trinn for blanding av en væskeprøve som skal bestemmes, med en effektiv mengde av et av de ovenfor angitte fem monoklonale, paratopiske molekyler, under dannelse av en blanding. Denne blanding

opprettholdes under biologiske bestemmelsesbetingelser i et på forhånd bestemt tidsrom tilstrekkelig for at de paratopiske molekyler får immunoreagere med apolipoprotein A-I tilstedeværende i prøven, og danne en immunoreaktant. Nærvær av immunoreaktanten bestemmes deretter slik at det derved bestemmes nærvær av apolipoprotein A-I i den opprinnelige prøve. I denne utførelsesform av oppfinnelsen inneholder de paratopiske molekyler fortrinnsvis et operativt-kjedet, radioaktivt element som et indikerende middel, og nærvær av apolipoprotein A-I i den opprinnelige prøve bestemmes ved separering av immunoreaktanten fra resten av blandingen og bestemmelse av den utskilte be-stråling av den fraskilte immunoreaktant.

I en annen utførelsesform av bestemmelsesmetoden er de førstnevnte monoklonale, paratopiske molekyler bundet til en fast rnatriks under dannelse av en fast bærer, før dannelse av blandingen. De ikke-spesifikke proteinbindingssteder av denne faste bærer blokkeres. Immunoreaktanten som dannes etter blanding av væskeprøven, bindes til den faste bærer som en fast fase-bundet immunoreaktant. I denne utførelsesform foretrekkes det at nærvær av en fast fase-bundet immunoreaktant bestemmes under anvendelse av andre monoklonale, paratopiske molekyler.

Her blandes andre monoklonale, paratopiske molekyler i væskefase med den ovenfor angitte blanding, under dannelse av en andre blanding. Disse andre paratopiske molekyler immunoreagerer med apolipoprotein A-I og er valgt fra de ovenfor angitte monoklonale, paratopiske molekyler, men er ikke de molekyler som ble anvendt i den førstnevnte blanding, heller ikke er immunoreaksjonen av disse andre monoklonale, paratopiske molekyler vesentlig blokkert eller inhibert av immunoreaksjonen av de førstnevnte paratopiske molekyler. Disse andre paratopiske molekyler er operativt kjedet til et indikerende middel som fortrinnsvis er et enzym.

Den således dannede andre blanding opprettholdes under biologiske bestemmelsesbetingelser i et på forhånd bestemt tidsrom tilstrekkelig til at de andre indikeringsmiddel-kjedede, paratopiske molekyler får immunoreagere med apolipoprotein A-I tilstedeværende i blandingen. Den faste og væskeformige fase dannet etter blanding av begge paratopiske molekyler, og dannelsen av immunoreaktantene, separeres, og nærvær av indikeringsmiddel-kjedet apolipoprotein A-I i den fraskilte, faste fase bestemmes, hvorved nærvær av apolipoprotein A-I i prøven derved bestemmes.

De monoklonale, paratopiske molekyler ifølge oppfinnelsen er også anvendbare ved kvantitative bestemmelser med hensyn til mengde av apolipoprotein A-I i en væskeprøve, i særdeleshet i en væskeformig blodprøve slik som serum eller plasma. Hvor kvantitative resultater ønskes,

følges generelt trinn lik de som er angitt ovenfor.

Således blandes en kjent mengde av en væskeprøve som skal bestemmes med en fast bærer som hovedsakelig består av en fast matriks som har fast fase-bundne, første monoklonale, paratopiske molekyler som immunoreagerer med apolipoprotein A-I og er utskilt av et av hybridomene med ATCC deponeringsnummer HB 9200 eller HB 9201, under dannelse av en fast-væskefaseblanding. De ikke-spesifikke proteinbindingssteder på overflaten av den faste bærer blokkeres. Den fast-væskefaseblanding opprettholdes under biologiske bestemmelsesbetingelser i et på forhånd bestemt tidsrom tilstrekkelig til at de første paratopiske molekyler får immunoreagere med hovedsakelig alt av apolipoprotein A-I tilstedeværende i prøven.

Apolipoprotein A-I i den ovenfor angitte væskeprøve blandes enn videre med andre monoklonale, paratopiske molekyler i væskefase som immunoreagerer med apolipoprotein A-I, og som er utskilt av et av hybridomene med ATCC deponeringsnummer HB 9200 eller 9201, men som ikke er anvendt i den førstnevnte blanding, og er operativt kjedet til et enzymindikerende middel under dannelse av en andre blanding. Således er de paratopiske molekyler anvendt i dette trinn, forskjellig fra de to angitte i det første blandingstrinn.

Den således dannede, andre blanding opprettholdes under biologiske bestemmelsesbetingelser i et på forhånd bestemt tidsrom tilstrekkelig til at de andre indikeringsmiddel-kjedede, paratopiske molekyler får danne en immunoreaktant med hovedsakelig alt apolipoprotein A-I tilstedeværende i denne prøve. Den faste og væskeformige prøve som resulterer fra de ovenfor angitte blandings- og opprettholdelsestrinn, separeres, og mengden av indikeringsmiddel-kjedet apolipoprotein A-I-holdig immunoreaktant tilstedeværende i den fraskilte, faste fase bestemmes, og mengden av apolipoprotein A-I i prøven bestemmes derved.

Det er særlig foretrukket at de to blandetrinn i den ovenfor angitte bestemmeIsesmetode utføres hovedsakelig samtidig, og at de to opprettholdelsestrinn utføres sammen. Hvor disse trinn ikke utføres hovedsakelig samtidig og sammen, foretrekkes det at den faste og væskeformige fase tilstedeværende etter endt første opprettholdelsestrinn, separeres før den andre blanding, i hvilket tilfelle apolipoprotein A-I anvendt i den andre blanding, er det som er til stede i den fast fase-bundne immunoreaktant dannet i dette første opprettholdelsestrinn.

Et diagnostisk system, typisk i settform, som er egnet for anvendelse ved bestemmelse av nærvær av apolipoprotein A-I i en væskeprøve, utgjør et annet trekk ved oppfinnelsen. I en utførelsesform omfatter systemet en pakke som inneholder paratopiske molekyler utskilt av et av de tidligere diskuterte hybridomer, tilstedeværende i en mengde tilstrekkelig til å utføre minst én bestemmelse. Fortrinnsvis innbefatter det diagnostiske system enn videre et indikeringsmiddel som er operativt kjedet direkte til det ovenfor angitte, paratopiske molekyl, eller kjedet til et annet molekyl som er i stand til å signalisere immunoreaksjonen mellom de ovenfor angitte paratopiske molekyler og apolipoprotein A-I.

Fortrinnsvis er det diagnostiske system egnet for anvendelse ved bestemmelse av mengden av apolipoprotein A-I tilstedeværende i en væskeformet blodprøve. Dette diagnostiske system omfatter en første pakke inneholdende en fast bærer som består hovedsakelig av en fast matriks som har monoklonale, paratopiske molekyler som immunoreagerer med apolipoprotein A-I og som utskilles av et av hybri-

domene med ATCC deponeringsnummer HB 9200 eller HB 9201,

I

bundet til den faste matriks. De ikke-spesifikke proteinbindingssteder av denne faste bærer er blokkert. Dette system innbefatter enn videre en andre pakke som inneholder paratopiske molekyler som immunoreagerer med apolipoprotein A-I, som er utskilt av et.av hybridomene med ATCC deponeringsnummer HB 9200 eller HB 9201, men som ikke utskilles av hybridomet av den første pakke, og som er operativt kjedet til et enzymindikerende middel.

Foreliggende oppfinnelse medfører flere fordeler.

En av disse fordeler er at oppfinnelsen tilveie-bringer reagenser som er i stand til å immunoreagere med hovedsakelig alt av apolipoprotein A-I eller HDL-partikler i en væskeformig blodprøve slik som serum eller plasma.

En annen fordel med foreliggende oppfinnelse er at anvendelse av disse paratopiske molekyler kan tilveiebringe en kvalitativ bestemmelse med hensyn til nærvær av apolipoprotein A-I eller HDL.

En ytterligere fordel med foreliggende oppfinnelse

er at det gjennom bruk av bestemte, foretrukne, paratopiske molekyler utskilt av to av hybridomene ifølge oppfinnelsen,

kan utføres en meget nøyaktig og presis bestemmelse for å kvantifisere mengden av apolipoprotein A-I tilstedeværende i en blodprøve.

Ytterligere fordeler ved oppfinnelsen vil fremgå

for fagmannen fra den detaljerte beskrivelse av oppfinn-

elsen som følger.

Kort beskrivelse av tegningene

I figurene som utgjør en del av beskrivelsen:

inneholder figur 1 en kurve som illustrerer evnen

til en kjent, konstant mengde (0,375 ug/ml) av pepperrotperoxydase (HRPO)-merket AI-10-molekyler til å immuno-

reagere med fast fase-festet apolipoprotein A-I-reagens i nærvær av økende mengder av umerket AI-10 ( ▲ ) og AI-11 ( ) molekyler. Ordinaten er i optiske densitets-enheter, mens abscissen er i enheter på mikrogram (ug) av tilsatte/ umerkede, konkurrerende, monoklonale antistoffer. Detaljer ved denne studie er angitt i avsnittet Materialer og metoder.

Kurven illustrerer at økende mengder av umerkede AI-10-molekyler i immunoreaksjonsblandingen på tilsvarende måte nedsetter mengden av merket AI-10 bundet som fast fase-immunoreaktant. Umerket AI-10 konkurrerer således med merket AI-10 med hensyn til apo A-I.

Kurven illustrerer også at økende mengder av umerkede AI-11-molekyler ikke signifikant reduserer mengden av merkede AI-10-molekyler bundet som fast fase-immunoreaktant. Således konkurrerer ikke umerkede AI-11-molekyler med merkede AI-10-molekyler med hensyn til binding til apolipoprotein A-I.

Figur 2 inneholder en kurve som illustrerer at lignende resultater erholdes med de angitt i figur 1,

under anvendelse av HDL som et fast fase-bundet antigen med en konstant mengde (0,375 ug/ml) HRPO-merket AI-10-molekyler og umerkede AI-11-molekyler ( ) og AI-10-molekyler AI-10- og AI-11-molekyler bindes derfor til forskjellige epitoper som er tilstrekkelig adskilt på overflaten av apolipoprotein A-I eller HDL og således muliggjør en binding av begge monoklonale antistoffmolekyler til et enkelt apo A-I-molekyl uten sterisk å konkurrere med og inhibere den andres binding.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

I. Diskusjon

A. Definisjoner

Uttrykket "antistoff" angir et molekyl som er et medlem av en familie av glycosylerte proteiner som kalles immunoglobuliner som kan spesifikt bindes med et antigen. Et slikt antistoff bindes med sitt antigen ved en spesifikk immunologisk bindingsinteraksjon mellom den antigeniske determinant av antigenet og antistoffets antistoffbindingssete.

Et "antistoffbindingssete" er den strukturelle del av et antistoffmolekyl omfattet av tungt- og lett-

kjedede variable og hypervariable regioner som spesifikt binder antigen. Under anvendelse av nomenklaturen ifølge Jerne, (1974), Ann. Immunol. (Inst. Pasteur), 125C:373-389. er et antistoffbindingssete vanligvis her angitt som en "paratope".

Antistoffbindingssete-holdige (paratope-holdige) polypeptiddeler av antistoffer er de deler av antistoffmolekyler som inneholder paratopen og bindes til et antigen, og innbefatter f.eks. Fab-, Fab'-, F(ab')2~og F(v)-delene av antistoffene. Fab- og F(ab')2-delene av antistoffer dannes ved den proteolyttiske reaksjon av papain og pepsin på hovedsakelig intakte antistoffer ved velkjente metoder. Se f.eks. US patentskrift 4.342.566. Fab<1->antistoffdeler er også velkjente og produseres fra Ffab<1>^-deler etterfulgt av reduksjon av disulfidbindingene som kjeder de to tungkjededeler, slik som med mercaptoethanol, og etterfulgt av alkylering av det resulterende protein-mercaptan med et reagens slik som jodacetamid. Intakte antistoffer foretrekkes og anvendes som eksempler på de monoklonale ligandmolekyler ifølge oppfinnelsen.

Ordet "antigen" har vært anvendt historisk for å betegne en enhet som bindes av et antistoff, og også for å betegne den enhet som fremkaller produksjonen av antistoff. Nyere bruk begrenser betydningen av antigen til den enhet som bindes av et antistoff, mens "immunogen" anvendes for den enhet som fremkaller antistoffproduksjon. Hvor en enhet diskutert her både er immunogenisk og antigenisk, vil den generelt bli angitt som et antigen.

Uttrykket "antigenisk determinant" angir den aktuelle, strukturelle del av antigenet som immunologisk bindes av et antistoffbindingssted. Jerne-nomenklaturen definerer en antigenisk determinant som en "epitope". Uttrykket "biologisk aktiv" henviser i det minste til et proteinaktig molekyls evne til spesifikt å binde antigen eller spesifikt antistoffbindingssete, selv om annen generell eller effektorevne også kan være til stede i dette molekyl. Biologisk aktivitet av et paratopisk molekyl inneholdende et antistoffbindingssete, bevises ved den immunologiske reaksjon av paratopen (antistoffbindingssete) med dens epitope (antigenisk determinant) etter blanding av disse i et vandig medium under dannelse av en immunoreaktant, i det minste ved fysiologiske pH-verdier og ionestyrker. Fortrinnsvis oppstår biologisk aktivitet under biologiske bestemmelsesbetingelser, dvs. de betingelser hvori et monoklonalt, paratopisk molekyl som er anvendbart ifølge foreliggende oppfinnelse, bindes til epi-topen (antigenisk determinant) innen et pH-område på fra 5 til 9, ved ionestyrker slik som de av destillert vann til den av ca. 1 molar natriumklorid, og ved temperaturer på fra 4°C til 45°C. De monoklonale, paratopiske molekyler som her er anvendbare, er alle biologisk aktive.

"ELISA" angir en enzymkjedet immunosorbentbestemm-else som anvender et antigen eller antistoff bundet til en fast fase og et enzym-antistoff eller enzym-antigenkon-jugat for å påvise og kvantifisere mengden av antigen eller antistoff tilstedeværende i en prøve. En beskrivelse av ELISA-teknikken finnes i kapittel 22 i den 4. utgave av Basic and Clinical Immunology av D.P. Sites et al., publisert av Lange Medical Publications, Los Altos, CA, i 1982 og i U.S. patenter nr. 3 654 090, 3 850 752 og 4 016 043.

"Enzym" angir et protein som er i stand til å akselerere eller bevirke ved katalytisk virkning en viss forandring i et substrat for hvilket det ofte er spesifikt.

"Immunoreaktant" som anvendt her, angir produktet av en immunologisk reaksjon, dvs. den enhet som dannes når et antigen immunologisk bindes av et antistoff eller et molekyl inneholdende en paratope. En immunoreaktant er derfor en spesifikk type av kompleks dannet mellom molekyler.

Uttrykkene "indikerende midler", "enzym-indikerende midler" eller "merke" (eller markør) anvendes om hverandre her i forskjellige grammatikalske former for å innbefatte enkle atomer, molekyler og enzymer som enten er direkte eller indirekte involvert i produksjonen av et påvisbart signal for å indikere deres nærvær. Hovedsakelig ethvert indikerende middel som kan kjedes til eller inkorporeres i et antistoff, er her anvendbart, og disse indikerende midler kan anvendes alene eller i forbindelse med ytterligere reagenser. Slike indikerende grupper eller merker er i seg selv velkjente innen immunkjemien og utgjør en del av foreliggende oppfinnelse bare såfremt de anvendes med ellers nye paratopiske molekyler, metoder og/eller systemer. Paratopiske molekyler kjedet til et enzym-indikerende middel, angis enkelte ganger her som enzym-kjedede, paratopiske molekyler.

Uttrykket "helt antistoff" anvendes her for å skille mellom et komplett, intakt molekyl utskilt av en celle, og andre, mindre molekyler som også inneholder den nødvendige paratope for biologisk aktivitet i en immun-reaksjon med en epitope.

De paratopiske molekyler ifølge oppfinnelsen er monoklonale, paratopiske molekyler. Et "monoklonalt antistoff" (Mab) er et antistoff produsert av kloner av et hybridom som utskiller bare en type av antistoffmolekyl,

og et monoklonalt, paratopisk molekyl er et monoklonalt antistoff eller en paratope-holdig polypeptiddel derav, som diskutert i det etterfølgende. Hybridomcellen fusjoneres fra en antistoff-produserende celle og en myeloma eller annen selv-evigvarende cellelinje. Slike antistoffer ble først beskrevet av Kohler og Milstein, Nature, 256, 495-497 (1975).

Utrykkene "monoklonalt, paratopisk molekyl" og "paratopisk molekyl" alene anvendes om hverandre og samlet her for å angi den slekt av molekyler som inneholder et bindingssete av et monoklonalt antistoff, og innbefatter et helt, monoklonalt antistoff, et hovedsakelig helt, monoklonalt antistoff og en antistoffbindingssete-holdig del av et monoklonalt antistoff. De hele, monoklonale antistoffer betegnet som AI-10 og AI-11, AI-12, AI-13 og AI-14, er paratopiske molekyler ifølge oppfinnelsen slik som deler av disse hele antistoffer som innbefatter paratopen. Uttrykkene "monoklonalt, paratopisk molekyl" eller "paratopisk molekyl" anvendes her alene når et generisk biologisk aktivt molekyl inneholdende antistoffbindings-setet av de ovenfor angitte monoklonale antistoffer, tas i betraktning, mens uttrykkene AI-10, AI-11, AI-12, AI-13 og AI-14 med eller uten ordene "paratopisk molekyl" anvendes hvor de spesifikke hele antistoffer produsert av hybridomene HB 9200, HB 9201, HB 9202, HB 9203 eller HB 9204, tas i betraktning.

Ordene "utskille" og "produsere" anvendes ofte om hverandre innen faget for å angi celler fra hvilke antistoffmolekyler erholdes. Celler som produserer antistoffer, kan imidlertid ikke utskille disse molekyler i sitt eget miljø. De hybridomceller som her er av interesse, utskiller monoklonale antistoffer i sitt miljø. Ikke desto mindre er slike celler enkelte ganger angitt her som "antistoff-produserende" celler, og deres antistoffer er enkelte ganger angitt som å være "produsert" i overensstemmelse med den angivelse som anvendes innen faget. Paratope-holdige polypeptiddeler av de ovenfor angitte antistoffer angis på lignende måte her som å være "produsert" eller "utskilt", selv om det skal forstås at slike molekyler fremstilles fra antistoffer som i seg selv er "produsert" eller "utskilt".

Uttrykket "supernatant" angir det in vitro væske-medium hvori cellene dyrkes. Monoklonale antistoffer produsert av de hybridomkulturer som her er av interesse, utskilles i deres dyrkningsmediummiljø. Dyrkningsmedium-supernatanten for disse celler er derfor en foretrukket kilde for de monoklonale, paratopiske molekyler og kan lett erholdes fri for hybridomceller ved velkjente teknikker. Eksempler på slike teknikker er sentrifugering ved lav hastighet for å sedimentere celler ut av væskemediet. Monoklonale, paratopiske molekyler kan alternativt erholdes fra ascites tumorvæske (ascitesvæske) av laboratoriedyr i hvilken hybridomvevet var innført. Begge metoder beskrives i det etterfølgende.

Uttrykket "hovedsakelig samtidig" som anvendt her

i relasjon til blanding av tre eller flere antigen- og paratopiske molekylkomponenter under dannelse av en immuno-reaks jonsblanding, betyr at alle komponentene er til stede og blandes i en enkelt blanding innen 15 minutter etter hverandre, og fortrinnsvis innen 5 minutter fra blanding av to av komponentene.

Uttrykket "hovedsakelig alt" som anvendt her i relasjon til immunoreaksjonen av et paratopisk molekyl og dets antigen apolipoprotein A-I under dannelse av en immunoreaktant betyr at det paratopiske molekyl immunoreagerer med ca. 90% av antigenet tilstedeværende i løs-ning, under dannelse av immunoreaktanten når det paratopiske molekyl er til stede i overskudd.

B. Hybridomer og monoklonale, paratopiske molekyler

Foreliggende oppfinnelse angår paratopiske molekyler som utskilles av fem hybridomer. Disse paratopiske molekyler immunoreagerer med apolipoprotein A-I. Apolipoprotein A-I-molekylet angis også hyppig her som apo A-I.

Av de fem hybridomer er de som bærer laboratorie-betegnelsene H91H4.2H8 og H103D8.1D11, og som utskiller paratopiske molekyler betegnet som AI-10 og AI-11, særlig foretrukne. Hvert av de paratopiske molekyler AI-10 og AI-11 immunoreagerer med en bevart antigenisk determinant på apolipoprotein A-I og immunoreagerer med minst 90% av 125 I-HDL-partikler i en væskefase-RIA. Som det kan sees ved undersøkelse av figur 1 og 2, bindes begge paratopiske molekyler AI-10 og AI-11 til apo A-I, men interfererer ikke i vesentlig grad med hverandres binding.

Hvert av de fem hybridomer ble deponert ved American

Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, 16. sep-tember 1986, i overensstemmelse med Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure. Laboratoriebetegn-elser, paratopiske molekylbetegnelser og deres klasser, såvel som ATCC deponeringsnumre er som følger.

De ovenfor angitte deponeringer ble foretatt i overensstemmelse med Budapest-traktatkravene at varigheten av deponeringen skal være 30 år fra deponeringsdagen eller i 5 år etter den siste anmodning om deponering fra depon-eringsmyndighetene i levetiden til et patent som bevilges fra foreliggende søknad. Hybridomene vil bli erstattet hvis disse blir ikke levedyktige ved deponeringsstedet og vil bli gjort tilgjengelig for almenheten av ATCC etter bevilgning av et patent på basis av denne søknad.

Curtiss og Edgington (1985), J. Biol. Chem., 260;2982-2993, har rapportert om den immunokjemiske heterogenitet av humant HDL, og også rapportert fremstillingen av tre hybridomer hvis monoklonale, paratopiske molekyler immunoreagerte med apo A-I. Disse monoklonale, paratopiske molekyler betegnet AI-4, AI-7 og AI-9, immunoreagerte hver med humant apo A-I og humane HDL-partikler i væskefase-RIA, men utviste forskjellige nivåer av immunoreaktivitet. Studiene rapportert i denne publikasjon, indikerte væskefase, RIA indirekte immunoutfellings-immunoreaktivi-125

teter med I-HDL i antistoffoverskudd som prosenter av total trikloreddiksyre-utfellbar radiomarkør av: AI-4 på

ca. 44%; AI-7 ca. 61% og AI-9 ca. 32%. Maksimal immuno-125

reaksjon av AI-4, AI-7 og AI-9 til isolert I-apo A-I i væskefase-RIA ble rapportert å være 60% for AI-4 og AI-7,

og ca. 30% for AI-9.

Kombinasjoner av to eller tre av disse monoklonale, paratopiske molekyler mislyktes i å immunoutfelle 100%

av merket HDL. Kombinasjoner av to vilkårlige av disse monoklonale, paratopiske molekyler med monoklonale, paratopiske molekyler til apolipoprotein A-II var vellykket når det gjelder immunoreagering med 100% av det utfellbare <125>I-HDL.

Som diskutert i avsnittet Resultater, er immunoreaktivitetene av foreliggende, beskrevne hybridomer med både humant HDL og humant apo A-I, betydelig forbedret i forhold til de som er rapportert i Curtiss og Edgington

(1985), J. Biol. Chem., 260:2982-2993. Disse maksimale immunoreaktiviteter overfor HDL i en væskefase-RIA er ca. 30% eller større enn de som er rapportert for AI-7 som

125

immunoreagerte med ca. 60% av I-HDL.

Hybridomene ifølge oppfinnelsen ble fremstilt fra tre separate fusjoner av musesplenocytter med celler av den ikke-utskillende musemyelomalinje P3x63Ag8.653.

Friskt, naturlig eller friskt, glutaraldehyd-tverrbundet, humant HDL ble anvendt som immunogener.

C. Metoder

Ifølge metodeutførelsesformen av oppfinnelsen bestemmes nærvær og, om ønsket, mengden av apolipoprotein A-I i en væskeprøve. Væskeprøven er vandig og kan være vann alene, en sammensetning av salter, en bufferløsning eller en kroppsvæske slik som en blodprøve.

En væskeblodprøve anvendes ofte ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen hvori en kvantitativ bestemmelse av apo A-I eller HDL ønskes. Prøven kan enten være serum eller plasma, idet resultater erholdt under anvendelse av begge, er blitt funnet å være statisk ikke skillbare. Enkelte resultater angitt i det etterfølgende under anvendelse av metoden, ble erholdt under anvendelse av midlere verdier erholdt fra bestemmelser av både serum og plasma. Uten hensyn til hvorvidt serum eller plasma anvendes, erholdes fortrinnsvis væskeblodprøven fra personer som har fastet i minst 12 timer, hvilket er kjent innen faget.

En slik blodprøve er angitt som en "fastende" prøve. Det skal også bemerkes at hvor serum eller plasma anvendes som væskeprøven i en kvantitativ bestemmelse, behøver ikke denne prøve underkastes en avmaskeringsbehandling slik som vanligvis utføres ved bestemmelse av apo A-I fra slike prøver.

Det var overraskende at nøyaktige og korrekte resultater kunne erholdes under anvendelse av de særlig foretrukne ELISA-metoder beskrevet her, under anvendelse av en væskeblodprøve slik som plasma eller serum, fordi disse prøvematerialer inneholder proteiner, lipider og andre forbindelser som ville kunne forventes å interferere med bestemmelsen. Se f.eks. Maggio, Enzyme-Immunoassay, CRC Press, Inc., Boda Raton, FL, 1980, side 65.

For kvantitative målinger bestemmes mengden av apolipoprotein A-I under anvendelse av en på forhånd bestemt mengde av væskeprøve. Hvor væskeprøven er en væskeformig blodprøve slik som plasma eller serum, er en avmaskeringsbehandling slik som er vanlig for måling av apo A-I, ikke nødvendig, og denne prøve kan anvendes fri for slike avmaskeringsbehandlinger.

Hvor en kvalitativ bestemmelse ønskes, er det ikke kritisk at brukeren kjenner volumet av den anvendte væske-prøve. Selvsagt må imidlertid ikke det anvendte prøve-volum og apo A-I-konsentrasjon være så store at de over-velder de anvendte reagenser, og heller ikke skal de være så små at nærvær av en urealistisk liten mengde av apo A-I etterstrebes. Eksempelvis utføres nøyaktige og sikre kvantitative bestemmelser rutinemessig ved en ELISA-metode under anvendelse av prøver som inneholder 10 til 200 nanogram apo A-I. Således kan kvalitative bestemmelser utføres ved ytterligere mindre mengder av apo A-I.

Generelt omfatter metoden trinn for blanding av en væskeprøve som skal bestemmes med en effektiv mengde av paratopiske molekyler valgt fra gruppen bestående av de ovenfor angitte fem monoklonale, paratopiske molekyler, under dannelse av en blanding. Denne blanding opprettholdes under biologiske bestemmelsesbetingelser i et på forhånd bestemt tidsrom tilstrekkelig til at de paratopiske molekyler får immunoreagere med apolipoprotein A-I tilstedeværende i prøven og under dannelse av en immunoreaktant. Nærvær av immunoreaktanten bestemmes deretter, hvorved nærvær av apolipoprotein A-I i den opprinnelige prøve derved bestemmes.

Det skal forstås at den ovenfor angitte bestemmelse kan være en fast eller væskefasebestemmelse, eller en hvilken som helst annen immunobestemme1se, hvilket er velkjent. Eksempler på væske og fast fase-bestemmelser er illustrert i det etterfølgende. For fast fase-bestemmelser kan i tillegg enten konkurrerende apo A-I (HDL) eller de paratopiske molekyler bindes til den faste fase.

Nærvær av immunoreaktanten kan bestemmes på et utall måter hvor hver typisk anvender et indikerende middel som her beskrevet.

Ved denne side av oppfinnelsen inneholder de paratopiske molekyler imidlertid fortrinnsvis et operativt-kjedet, radioaktivt element som et indikerende middel, og nærvær av apolipoprotein A-I i den opprinnelige prøve bestemmes ved separering av immunoreaktanten fra resten av blandingen og bestemmelse av den utsendte stråling av den separerte immunoreaktant.

I en annen utførelsesform av bestemmelsesmetoden bindes de førstnevnte monoklonale, paratopiske molekyler til en fast matriks under dannelse av en fast bærer før blandingen. De ikke-spesifikke proteinbindingssteder av denne faste bærer blokkeres. Den således dannede immunoreaktant etter blandingen bindes til den faste bærer som en fast fase-bundet immunoreaktant. I denne utførelsesform foretrekkes det at nærvær av fast fase-bundet immunoreaktant bestemmes under anvendelse av indikerende middel-holdige

molekyler som er andre monoklonale, paratopiske molekyler, som diskutert i det etterfølgende. Her blandes indikerende middel-holdige molekyler i væskefase med den ovenfor angitte, førstnevnte blanding under dannelse av en andre blanding.

Disse indikerende middel-holdige molekyler immunoreagerer med en andre epitope av apolipoprotein A-I som ikke er hovedsakelig blokkert ved immunoreaksjonen av de førstnevnte monoklonale, paratopiske molekyler, og er valgt fra de ovenfor angitte monoklonale, paratopiske molekyler, men er ikke de molekyler som ble anvendt i den førstnevnte blanding. Et særlig anvendbart par av monoklonale, paratopiske molekyler er de som utskilles av hybridomene med ATCC deponeringsnummer HB 9200 og HB 9201. Disse andre paratopiske molekyler er operativt kjedet til et indikerende middel som fortrinnsvis er et enzym. De kjedede, indikerende midler kan være et hvilket som helst indikerende middel som her diskutert.

Den således dannede, andre blanding opprettholdes under biologiske bestemmelsesbetingelser i et på forhånd bestemt tidsrom tilstrekkelig til at de andre indikerende middel-kjedede, paratopiske molekyler får immunoreagere med apolipoprotein A-I tilstedeværende i blandingen. De faste og væskeformige faser som dannes etter blanding av begge paratopiske molekyler, og dannelsen av deres immunoreaktanter, separeres. Nærvær av indikerende middel-kjedet apolipoprotein A-I i den separerte, faste fase bestemmes, hvorved nærvær av apolipoprotein A-I i prøven derved bestemmes. Immunoreaktanten dannet mellom et fast fase-bundet, paratopisk molekyl, apo A-I antigen og markør-kjedet, andre paratopiske molekyl, angis enkelte ganger her som en sammensatt immunoreaktant.

De monoklonale, paratopiske molekyler ifølge oppfinnelsen er også anvendbare ved kvantitative bestemmelser med hensyn til mengden av apolipoprotein A-I i en væskeprøve, i særdeleshet i en væskeformig blodprøve slik som serum eller plasma, som tidligere angitt. Hvor kvantitative resultater ønskes, følges trinn generelt lik de som er beskrevet ovenfor, med hensyn til fast fase-bestemmelsen.

Ved kvantitativ analyse med hensyn til mengden av apolipoprotein A-I dannes først en fast-væskefaseblanding ved blanding av en på forhånd bestemt, kjent mengde av en væskeprøve slik som plasma eller serum, som er fri for avmaskeringsbehandling, med en fast bærer som består hovedsakelig av en fast matriks som er fast fase-bundne, første monoklonale, paratopiske molekyler som immunoreagerer med apo A-I. Disse fast fase-bundne, første monoklonale, paratopiske molekyler er til stede i overskudd i forhold til mengden av apo A-I som forventes i prøven, og er utskilt av et av hybridomene med ATCC deponeringsnummer HB 9200 eller HB 9201. Ikke-spesifikke proteinbindingssteder på overflaten av denne faste bærer er blokkert før denne blanding.

Denne førstnevnte fast-væskefaseblanding opprettholdes under biologiske bestemmelsesbetingelser i et på forhånd bestemt tidsrom som er tilstrekkelig til at de første paratopiske molekyler får immunoreagere med apolipoprotein A-I tilstedeværende i en prøvealiquot, og danne en fast fase-bundet immunoreaktant som inneholder hovedsakelig alt apolipoprotein A-I tilstedeværende i prøven.

Apo A-I i prøven blandes også med væskefase — andre monoklonale, paratopiske molekyler som immunoreagerer med apolipoprotein A-I under dannelse av en andre blanding. Disse andre monoklonale, paratopiske molekyler er utskilt av ett av hybridomene med ATCC deponeringsnummer HB 9 200

eller HB 9201, men anvendes ikke i den førstnevnte blanding. Disse andre paratopiske molekyler er også operativt kjedet til et enzym-indikerende middel. Således er de paratopiske molekyler anvendt i dette trinn, de andre av de to paratopiske molekyler angitt i det ovenfor, første, blandetrinn.

Den således dannede andre blanding opprettholdes under biologiske bestemmelsesbetingelser i et på forhånd bestemt tidsrom tilstrekkelig til at de andre, enzymkjedede, paratopiske molekyler får danne en sammensatt immunoreaktant som inneholder hovedsakelig alt apolipoprotein A-I i prøve-aliquoten.

Den faste og væskeformige fase som resulterer fra blanding av begge de paratopiske molekyler, og dannelsen av immunoreaktanter mellom begge de paratopiske molekyler og apo A-I, separeres ved skylling, og mengden av indikerende middel-kjedet apolipoprotein A-I-holdig, sammensatt immunoreaktant tilstedeværende i den separerte, faste fase, bestemmes. Fordi hvert av de to monoklonale, paratopiske molekyler immunoreagerer med hovedsakelig alt av apo A-I tilstedeværende i prøvealiquoten, og fordi minst ett av de paratopiske molekyler immunoreagerer med en ikke-kryss-reaktiv, bibeholdt epitope på apo A-I, gir bestemmelsen av mengden av enzym-kjedet apo A-I i immunoreaktant en bestemmelse av mengden av apolipoprotein A-I tilstedeværende i en prøvealiquot. Mengden av apolipoprotein A-I i prøven kan lett beregnes ut fra kjennskap til volumet av den opprinne-lig anvendte, på forhånd bestemte mengde av væskeprøve-aliquot.

De fast fase-bestemmelser med hensyn til apolipoprotein A-I diskutert i det foregående, kan hver utføres i hvert av blande- og opprettholdelsestrinnene i hver bestemmelse utført i rekkefølge, eller de to blandetrinn kan utføres hovedsakelig samtidig med de to opprettholdelsestrinn i hver bestemmelse utført sammen, som allerede angitt.

Når trinnene utføres i rekkefølge, foretrekkes det at de fast fase-bundne, monoklonale, paratopiske molekyler blandes og at den dannede blanding opprettholdes før blanding med de enzym-indikeringsmiddel-kjedede, paratopiske molekyler og opprettholdelse av den resulterende blanding. Når de foretrukne, sekvensvise trinn følges, foretrekkes det enn videre at de faste og væskeformige faser som dannes, separeres, og at den faste fase skylles for å sikre separering før blanding av de væskeformige enzym-indikeringsmiddel-kjedede, paratopiske molekyler til den separerte, faste

fase, og opprettholdelse av denne blanding.

Det skal også bemerkes at de enzym-indikeringsmiddel-kjedede, paratopiske molekyler kan først blandes med den egnede prøve. Når denne utførelsesform av metoden anvendes, skjer det ingen separering av fasene før blanding av de fast fase-bundne, monoklonale, paratopiske molekyler.

Fortrinnsvis blandes separat- de fast fase-bundne, monoklonale, paratopiske molekyler, væskeprøven og de enzym-indikeringsmiddel-kjedede/ paratopiske molekyler hovedsakelig samtidig, og de resulterende fase-væskefasebland-inger opprettholdes sammen. Således opprettholdes blandingen i et tidsrom tilstrekkelig til at de fast fase-bundne, monoklonale, paratopiske molekyler får danne fast fase-bundne immunoreaktanter med hovedsakelig alt av apo A-I, og for at de enzym-indikeringsmiddel-kjedede, paratopiske molekyler i væskefase også får immunoreagere med hovedsakelig alt av apo A-I i prøven. Den således dannede immunoreaktant angis som en fast fase-bundet, sammensatt immunoreaktant. En væskefase er også til stede.

Lignende resultater erholdes under anvendelse av det ene eller andre av de to monoklonale, paratopiske molekyler som de fast fase-bundne, paratopiske molekyler i de respektive bestemmelser. Mesteparten av det her diskuterte arbeide, ble imidlertid utført under anvendelse av mole-kylene utskilt av hybridomet med ATCC deponeringsnummer HB 9200 (AI-10) bundet til fast fase-matriks for bestemmelse av apolipoprotein A-I.

Eksempler på faste matriser som er anvendbare i

de ovenfor angitte metoder, er velkjente innen faget og innbefatter en fast matriks slik som en 96-brønns mikrotiterplate solgt under betegnelsen Falcon Microtest III Flexible Assay Plates, eller en mikrotiterremse inneholdende

12 brønner i en rekke, slik som de remser som selges under betegnelsen "Immulon" I og II. Mikrotiterremsen eller platen fremstilles av et klart plastmateriale, fortrinnsvis polyvinylklorid eller polystyren. Alternativt kan faste matriser for anvendelse i den ovenfor beskrevne metode

ifølge oppfinnelsen innbefatte polystyrenperler med diameter på 1 mikrometer til 5 millimeter; polystyrenrør eller -pinner av en hvilken som helst egnet størrelse, og poly-styrenlatex hvis polystyrenpartikler er en størrelse på ca. 1 mikrometer og som kan sentrifugalsepareres fra resten av latexen. Den faste matriks kan også være dannet av et utall materialer slik som tverrbundet dextran, f.eks. Sephadex<® >G-25, -50, -100, -200 og lignende, agarose og tverrbundet agarose, f.eks. Sepharose<®> 6B, CL6B, 4B, CL46 og lignende.

De indikerende midler kan være kjedet direkte til et paratopisk molekyl ifølge oppfinnelsen, til et anvendbart antigen, eller kan omfatte et separat molekyl. De indikerende midler kan være et separat molekyl slik som antistoffer som bindes til paratopiske molekyler ifølge oppfinnelsen, slik som geite- eller kanin anti-muse-antistoff. Staphylococcus aureus protein A, enkelte ganger her angitt som protein A, kan også anvendes som en separat molekyl-indikator eller markerende mdidel hvori hele eller hovedsakelig hele, paratopiske molekyler ifølge oppfinnelsen anvendes, dvs. hvor molekyler inneholdende delen av Fc-regionene av paratopiske molekyler som er bundet av protein A, anvendes. Ved slike anvendelser inneholder protein A i seg selv en markør slik som et radioaktivt element eller et fluorokromt fargestoff.

Radioaktive elementer utgjør en klasse av markører som er særlig anvendbare. Eksempler på radiomerkende midler som kan anvendes ifølge oppfinnelsen, er et radioaktivt element som produserer gammastråler. Elementer som i seg selv utsender gammastråler slik som I, I, I, 131 I, 132 I og <51>Cr, representerer en klasse av gammastråle-emisjonsproduserende, radioaktivt element-indikerende grupper. En annen klasse av anvendbare, indikerende grupper

11 18 15 13

er slike elementer som C, F, 0 og N som i seg selv utsender positroner. De således utsendte positroner produserer gammastråler når de støter an mot elektroner tilstedeværende i blandingen.

Et radioaktivt, monoklonalt, paratopisk molekyl kan typisk fremstilles ved isolering av det monoklonale, paratopiske molekyl og deretter merking av det paratopiske molekyl med et av de ovenfor angitte eller annet egnet radioaktivt element slik som beskrevet i US patentskrift 4.381.292. Eksempler på indikatormerkende midler er et fluorescent-merkende middel som kan kjemisk kjedes til antistoffer eller antigener uten å denaturere disse, under dannelse av et fluorokrom . (fargestoff) som er et anvendbart immunofluorescent sporstoff. Egnede fluorescent-merkende midler er fluorokromer slik som fluorescein-isocyanat (FIC), fluorescein-isothiocyanat (FITC), dimethylamino-nafthalen-S-sulfonylklorid (DANSC), tetramethylrhodamin-isothiocyanat (TRITC), lissamin-rhodamin B200-sulfonylklorid (RB 200 SC) og lignende. En beskrivelse av immunofluorescens-analyse-teknikker finnes i DeLula, "Immunofluorescence Analysis",

i Antibody As A Tool, Marchalonis et al., red.,

John Wiley & Sons, Ltd. s. 189-231 (1982).

Et enzym er et særlig foretrukket, indikerende middel. Når dette anvendes, kjedes enzymet fortrinnsvis direkte til et paratopisk molekyl ifølge oppfinnelsen under dannelse av et konjugat.

Det skal forstås at anvendbare enzymmolekyler eller andre indikerende midler kjedet til et paratopisk molekyl, er operativt kjedet. Funksjonen av enzymet eller markøren svekkes således ikke vesentlig av bindingen eller av det paratopiske molekyl, og funksjonen av det monoklonale, paratopiske molekyl til hvilket enzymet eller annen markør er kjedet, svekkes hovedsakelig ikke av denne binding eller nærvær av enzymet eller annen markør.

De enzym-indikerende midler er et biologisk aktivt enzym slik som pepperrotperoxydase (HRPO) eller glucoseoxydase eller lignende. Hvor det indikerende middel er et enzym slik som HRPO eller glucoseoxydase, er som kjent ytterligere reagenser nødvendig for å visualisere det faktum at et antistoff-antigenkompleks er blitt dannet. Slike ytterligere reagenser for HRPO innbefatter hydrogenperoxyd og en oxydasjonsfargestoff-forløper slik som diaminobenzidin. Ytterligere reagenser som er anvendbare med glucoseoxydase, innbefatter glucose og 2,2<1->azino-di-(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsyre) (ABTS).

Teknikker for operativ kjeding- av et enzym til et paratopisk molekyl under dannelse av et konjugat er velkjent innen faget. Eksempler på teknikker er diskutert i Maggio, Enzyme-Immunoassay, kapittel 4, av Kabakoff, CRC Press,

Boca Raton, FL (1980), s. 71-104.

De monoklonale, paratopiske molekyler kan anvendes som de erholdt fra hybridomsupernatanter eller ascites. Imidlertid foretrekkes det at rensede, paratopiske molekyler anvendes.

Flere måter for rensing av paratopiske molekyler er velkjent innen faget og anvender typisk kromatografiske teknikker. Hurtig protein-væskekromatografi (FPLC) er den her valgte renseteknikk.

De enzym-kjedede, paratopiske molekyIkonjugater tilveiebringes til blandingen i væskefase. Disse molekyler oppløses typisk i en vandig sammensetning. Typiske sammensetninger inneholder buffersalter, hvilket er tilfelle med de rensede monoklonalt antistoff-holdige sammensetninger anvendt her, som innbefatter fosfatbufret saltvann (PBS) som et fortynningsmiddel. Fortynnet ascitesvæske er også anvendbar.

Som ovenfor angitt, er ikke-spesifikke proteinbindingssteder på overflaten av fast fase-bæreren. blokkert. Således bindes de fast fase-bundne, paratopiske molekyler ved adsorpsjon eller andre velkjente festemetoder til den faste matriks. Deretter tilblandes en vandig løsning av et protein som er fritt for innvirkning på bestemmelsen, slik som kveg, hest eller annet serumalbumin som også er fritt for forurensning med humant apo A-I, med den faste fase for å adsorbere det tilblandede protein på overflaten av den paratopiske molekyl-holdige, faste bærer ved proteinbindingssteder på overflaten som ikke er okkupert av det monoklonale, paratopiske molekyl.

En typisk vandig proteinløsning inneholder 3 til

10 vekt% kvegserumalbumin i PBS ved en pH-verdi på

7,1-7,5. Den vandige proteinløsning-faste bærerblanding opprettholdes typisk i et tidsrom på minst 1 time ved 37°C, og den resulterende, faste fase skylles deretter fri for ubundet protein.

Den væskeformige blodprøve kan være plasma eller serum som allerede angitt. Denne prøve fortynnes fortrinnsvis i en grad på 1:2500 til 1:20.000, og fortrinnsvis til 1:5000 før bruk, for å oppnå lineære resultater i de etter-følgende spesifikt beskrevne bestemmelser.

Anvendelse av en mindre fortynning kan tilveiebringe for mye apolipoprotein-antigen til blandingen og svekke lineariteten av bestemmelsesresultatene, såvel som å redusere eller oppheve det fast fase-bundne, paratopiske molekyloverskudd i fcorhold til blandet antigen. Anvendelse av fortynninger større enn 1:20.000 er tilbøyelig til å redusere nøyaktigheten.

De anvendte opprettholdelsestider kan variere

vidt med liten variasjon i resultater så lenge en minimums-tid på ca. 30 minutter ved omgivende romtemperatur (20-25 °C) anvendes. Hvor det er ønskelig å anvende minst 30-minutters opprettholdelsestid, foretrekkes det at den opprettholdte blanding omrøres i løpet av dette tidsrom for å sikre hovedsakelig fullstendig immunoreaksjon mellom apolipoprotein A-I-antigenet og monoklonale, paratopiske molekyler. Hvor lengre opprettholdelsestider, slik som 1 time eller mer ved romtemperatur, anvendes, er omrøring ikke nødvendig. Den ønskede omrøring kan lett bevirkes ved hjelp av en gyro-rister drevet ved ca. 100 opm. Hver av bestemmelsene anvendt i den kvantitative metode, er i stand til å utføres under anvendelse av opprettholdelsestider for paratopisk molekyl-prøveblandinger på 30 minutter til 60 minutter ved omgivende romtemperatur.

Mengden av det tilstedeværende apolipoprotein A-I-antigen i den undersøkte immunoreaktant bestemmes ved blanding av den separerte enzym-kjedede apolipoprotein-holdige faste fase med en på forhånd bestemt mengde av visualiserende reagens eller reagenser. Hvor HRPO anvendes som enzym-indikerende middel, blandes visualiserende reagenser slik som hydrogenperoxyd og en oxydativ fargestoff-forløper slik som o-fenylendiamin (OPD) tilstedeværende i et vandig medium, med den separerte fast fase-bundne immunoreaktant. Den således dannede blanding opprettholdes under biologiske bestemmelsesbetingelser i et på forhånd bestemt tidsrom slik som minst 30 minutter ved omgivende temperatur for utvikling av farge. Fargeutviklingen stoppes deretter ved blanding av et stoppreagens slik som 4N svovelsyre. Den optiske densitet av sammensetningen avleses deretter, sammenlignes med en standardkurveverdi, og mengden av apolipoprotein bestemmes, hvilket er velkjent innen faget.

Så snart den faste bærer og den væskeformige blod-prøve er blitt fremstilt, kan en kvantitativ bestemmelse utføres ved omgivende romtemperatur i løpet av et tidsrom på ca. 1 time, dvs. en 30-minutters opprettholdelsestid med omrøring for blandingen dannet fra paratopiske molekyler og prøven, og en ytterligere 30-minutters opprettholdelsestid for fargeutvikling. Man behøver således ikke fremstille den faste bærer like før bruk, idet slike bærere som her er beskrevet, snarere kan fremstilles og lagres fuktig og dekket under vanlige avkjølingsbetingelser i et tidsrom på minst 1 måned før bruk.

De apo A-I kvantitative bestemmelser gjør bruk av en standard mot hvilken de optiske densitetsverdier erholdt ved ELISA, sammenlignes, for å beregne konsentrasjonen av apolipoprotein. Bestemmelsen gjør bruk av en sekundær standard. Snarere enn anvendelse av en spesifikk HDL eller apo A-I som standard, anvendes det ved bestemmelsen oppsamlet, humant HDL som standard. De sekundære standarder anvendes på grunn av den relative ustabilitet av primært apolipoprotein A-I eller HDL ved lagring. Kottke og med-arbeidere observerte også nedbrytning av renset apo A-I anvendt som primær standard, og anvendte en sekundær standard i sine RIA-bestemmelser med polyklonalt serum for apo A-I. Au et al. (1986), Clin. Chem. 32:1394-1397.

De sekundære standarder tilveiebringes som lyofilisert, oppsamlet, human, "fastende" plasma inneholdende HDL (apo A-I) og rekonstitueres før bruk. Hver av standardene standardiseres i seg selv mot primære HDL- eller apo A-I-standarder. En eksempelvis prosedyre er illustrert for apolipoprotein A-I i avsnittet Materialer og metoder.

D. Diagnostiske systemer

Foreliggende oppfinnelse tar også i betraktning et diagnostisk system, typisk i settform, som kan anvendes for utførelse av de ovenfor beskrevne metoder. Systemet innbefatter en pakke som inneholder et av de ovenfor beskrevne monoklonale, paratopiske molekyler og som immunoreagerer med apo A-I. Pakken inneholder en mengde av disse paratopiske molekyler tilstrekkelig til å utføre minst én bestemmelse med hensyn til apo A-I.

Bestemmelsessystemet inneholder fortrinnsvis enn videre et indikerende middel som er operativt kjedet direkte til de ovenfor angitte paratopiske molekyler eller er kjedet til et annet molekyl som er i stand til å signalisere immunoreaksjon mellom de ovenfor angitte paratopiske molekyler og apo A-I.

Fortrinnsvis er systemet egnet for anvendelse ved kvantitativ bestemmelse av mengden av apo A-I tilstedeværende i en væskeformig blodprøve. Et slikt system omfatter en første pakke inneholdende en fast bærer som består hovedsakelig av en fast matriks som har bundet monoklonale, paratopiske molekyler som immunoreagerer med apo A-I og hvis ikke-spesifikke proteinbindingssteder på overflaten er blokkert. Systemet innbefatter enn videre en andre pakke som inneholder et enzym-kjedet, monoklonalt, paratopisk molekylkonjugat som immunoreagerer med apo A-I. De samme to paratopiske molekyler som anvendes i dette system, er som tidligere beskrevet i forbindelse med kvantitativ apo A-I-bestemmelse.

Fast fase-matriksen av det ovenfor angitte diagnostiske system kan være hvilke som helst av de ovenfor diskuterte fast fase-matrikser. Mikrotiterbrønner slik som de i de tidligere beskrevne 12-brønns remser og 96-brønns plater, er særlig foretrukne. Ikke-spesifikke bindingsseter på de faste bærere blokkeres som tidligere diskutert.

Den faste matriks kan utgjøre en beholder for de fast fase-bundne, monoklonale, paratopiske molekyler ifølge denne utførelsesform. Typiske beholdere for de enzym-kjedede, monoklonale, paratopiske molekyler er ampuller eller flasker fremstilt av glass eller plast slik som polyethylen eller polypropylen.

Under anvendelse av en mikrotiterplate som et eksempel på en fast matriks, og hele, monoklonale antistoffer AI-10 som de fast fase-bundne, monoklonale, paratopiske molekyler, serum som den væskeformige blodprøve, og hele, monoklonale antistoffer AI-11 kjedet til HRPO, vil et mer foretrukket diagnostisk system i settform innbefatte følgende: a) en fast bærer som består hovedsakelig av en mikrotiterplate som har monoklonalt antistoff AI-10 bundet dertil i en mengde tilstrekkelig til å utføre en bestemmelse av en serumprøve med hensyn til mengde av apolipoprotein A-I tilstedeværende deri, og hvis ikke-spesifikke proteinbindingssteder på overflaten er blokkert; og

b) en separat pakke som inneholder en vandig løs-ning inneholdende monoklonalt antistoff AI-11 operativt

kjedet til HRPO som er til stede i en mengde tilstrekkelig til å utføre en bestemmelse av en serumprøve med hensyn til mengden av tilstedeværende apo A-I.

Fortrinnsvis innbefatter et diagnostisk system de ovenfor angitte komponenter og én eller flere av følgende: (i) en tilførsel av hydrogenperoxyd med kjent konsentrasjon; (ii) en visualiserende, oxydativ fargestoff-

forløper slik som OPD; (iii) en løsning av et stoppmiddel slik som 4N svovelsyre for å stanse den farge-dannende reaksjon; (iv) én eller flere buffere i tørr form eller væskeform for anvendelse i bestemmelsen; (v) materialer for fremstilling av standard referansekurver og (vi) instruk-

sjoner for utførelse av bestemmelsen.

Hver av de umiddelbart ovenfor angitte komponenter er til stede i det diagnostiske system i en mengde tilstrekkelig til å utføre minst én bestemmelse, og disse komponenter er separat forpakket etter behov.

II. Resultater

Som tidligere angitt, immunoreagerer de paratopiske molekyler utskilt av hvert av de deponerte hybridomer, med både HDL og apo A-I. Typiske resultater erholdt i en væskefase-RIA for immunoreaksjon av hvert av disse monoklonale, paratopiske molekyler med HDL og apo A-I, er illustrert i tabell IA og IB i det etterfølgende, som prosenter av totalt trikloreddiksyre-utfellbart <125>I-HD<L.>

<3>Muse-ascitesvæske renset ved hurtig protein-væskekromatografi (FPLC), ble anvendt som kilden for de angitte, paratopiske molekyler. <4>Supernatant fra hybridomcellekultur ble anvendt som kilden for de angitte, paratopiske molekyler.

Som det fremgår fra dataene i tabell IA, immunoreagerer de paratopiske molekyler ifølge oppfinnelsen i

125

meget større grad med I-HDL enn antistoffene tidligere beskrevet i Curtiss og Edgington (1985), J. Biol. Chem. 260;2982-2993. De ovenfor angitte data illustrerer også en

125

generelt forøket lmmunoreaktivitet med I-apo A-I sammenlignet med immunoreaktivitetene overfor det samme antigen rapportert av Curtiss og Edgington. I tillegg har ytterligere forskningsarbeide indikert at alderen av standarden har en meget stor effekt på de erholdte resultater.

En studie ble også foretatt under anvendelse av forskjellige kombinasjoner av de tre anti-apo A-I og anti-apo A-II monoklonale forbindelser ifølge Curtiss og Edgington sammenlignet med AI-10 og AI-11 ifølge oppfinnelsen i ELISA-måling av apo A-I i blodprøver. Mesteparten av disse sammenligninger viste sammenlignbare resultater.

Flere prøver, og i særdeleshet blodprøver fra CAD-pasienter, ga imidlertid avvikende resultater sammenlignet med den her beskrevne bestemmelse og bestemmelser utført med andre teknikker. Enkelte av disse sammenlignbare og avvikende resultater er vist i tabell 2, for to kombinasjoner av de monoklonale forbindelser ifølge Curtiss og Edgington.

# 9 (Omega)]; fra normale, asymptomatiske personer ( # 3, 4 og 5) ; eller CAD-pasienter ( # 7 og 8) . Tall i parentes er mengden av apo A-I påstått å være til stede av fabrikanten.

<3>ELISA utført under anvendelse av en blanding av monoklonale forbindelser ifølge Curtiss og Edgington (C&E Mab) AI-4, AI-7 og AII-1 bundet til den faste matriks, og monoklonalt AI-4 kjedet til HRPO som det indikeringsmiddel-holdige, andre, monoklonale molekyl.

4

ELISA som i fotnote 3 under anvendelse av monoklonale forbindelser AI-7, AI-9 og AII-1 bundet til den faste matriks og HRPO-kjedet AI-4 som det andre, monoklonale molekyl.

<5>ELISA som i fotnote 3 under anvendelse av monoklonale, paratopiske molekyler ifølge oppfinnelsen. AI-10 var bundet til den faste matriks, mens HRPO-kjedet AI-11 ble anvendt som det andre, monoklonale, paratopiske molekyl.

^N.D. = ikke foretatt.

<7>Den erholdte verdi var over bestemmelsesområdet.

Mens. de ovenfor angitte data indikerer at anvendelse av foreliggende paratopiske molekyler gir forskjellige resultater fra de som erholdes under anvendelse av antistoffene ifølge Curtiss og Edgington i de avvikende prøver, indikerer disse data ikke hvilke av resultatene som er korrekte. Dataene oppført i etterfølgende tabell 3, illustrerer at dataene erholdt under anvendelse av de paratopiske molekyler ifølge oppfinnelsen, er korrekte for disse avvikende prøver sammenlignet med de erholdt under anvendelse av antistoffene ifølge Curtiss og Edgington.

Dataene oppført i tabell 3, ble erholdt under anvendelse av serum og/eller plasma fra 30 normale, asymptomatiske personer (15 menn og 15 kvinner) og den her beskrevne kvantitative, "sammensatte" bestemmelse. Bestemmelser ble også utført under anvendelse av to kommersielt tilgjengelige RIA (RIA-I og RIA-II) og to kommersielt tilgjengelige RID (RID-I og RID-II). En prøve fra hver donor ble målt i hver bestemmelse.

Som det fremgår fra det ovenfor angitte sammendrag, var middelverdien erholdt under anvendelse av foreliggende ELISA, ca. midtveis mellom middelverdiene erholdt med de

to RIA-bestemmelser (på den lave side) og de to RID-bestemmelser (på den høye side). Således fremgår det fra den generelle gyldighet av resultatet erholdt under anvendelse av foreliggende ELISA, at dataene i tabell 2 erholdt under anvendelse av AI-10 og AI-11, virkelig var korrekte.

Bestemmelsene ifølge oppfinnelsen anvender som mange andre bestemmelser, en standard. ELISA-bestemmelsene kan anvende en primær apo A-I eller HDL-standard, men på grunn av hensiktsmessighet og nøyaktighet anvendes fortrinnsvis en sekundær HDL-standard.

Den anvendte sekundære standard erholdes fra oppsamlet fastende plasma fra flere donorer. Her anvendes typisk en ansamling av plasma fra 20 donorer. Den sekundære standard standardiseres i seg selv mot en primær standard.

En primær apo A-I-standard anvendes vanligvis ikke fordi slike standarder ikke har vært stabile ved lagring. Det er antatt at det rensede protein eller glutamin eller asparaginrester av proteinet kan deamineres. Det samme antas å finne sted med renset HDL når det anvendes som en primær standard.

For ytterligere å bekrefte dataene erholdt under anvendelse av den sekundære standard i kvantitative ELISA-bestemmelser ifølge oppfinnelsen, ble en serie av ELISA-bestemmelser utført under anvendelse av fast fase-bundet AI-10 og HRPO-kjedet AI-11 med forskjellige kommersielt tilgjengelige apo A-I-standarder. Disse resultater er vist i etterfølgende tabell 4.

Som det fremgår fra en horisontal sammenligning av dataene i tabell 4, var resultatene erholdt med alle standardene, like. Verdiene erholdt under anvendelse av Meloy-standarden, kan også sees å være generelt noe lavere enn verdiene erholdt under anvendelse av de andre standarder. Det skal ytterligere bemerkes at verdien oppnådd med Meloy-standarden, var ca. halvparten av den som ble funnet ved en uavhengig analyse.

En serie av bestemmelser ble utført over et tidsrom på ca. 3 måneder under anvendelse av de ovenfor angitte, kommersielle standarder for å fastslå reproduserbarheten (variasjonskoeffisienten) av den kvantitative bestemmelse ifølge oppfinnelsen. Variasjonskoeffisienten ble funnet å være 11-13%.

Ved utførelse av bestemmelsene ifølge oppfinnelsen anvendes indikeringsmiddel-kjedede, paratopiske molekyler som immunoreagerer med apo A-I for å signalisere immuno-reaks jonen mellom apo A-I og andre monoklonale, paratopiske molekyler. Da mer enn ett apo A-I-molekyl er til stede pr. HDL-partikkel, er det uklart hvorvidt det er nødvendig at

de fast fase-bundne, paratopiske molekyler og de indikeringsmiddel-kjedede, paratopiske molekyler immunoreagerer med forskjellige epitoper på apo A-I for å oppnå et nøyaktig og sikkert kvantitativt bestemmelsesresultat. Så lenge begge paratopiske molekyler imidlertid er i stand til å immunoreagere med hovedsakelig alt av apo A-I eller HDL av

en prøve, foretrekkes det at hver av de to typer av monoklonale, paratopiske molekyler ikke inhiberer immunoreaksjonen av de andre monoklonale, paratopiske molekyler.

Som det kan sees fra de konkurrerende immunoenzymo-metriske data i figur 1 og 2, immunoreagerer HRPO-merket AI-10 med apo A-I og HDL. Dataene i figur 1 illustrerer at immunoreaksjonen av merket AI-10 med apo A-I inhiberes av nærvær av umerket AI-10, men ikke av nærvær av umerket AI-11. Figur 2 illustrerer et lignende resultat under anvendelse av HDL som fast fase-antigen. Sammenlignbare resultater ble også erholdt under anvendelse av HRPO-merket AI-11 med umerket AI-10 og AI-11 med apo A-I og HDL som antigen.

Ytterligere væskefase-bindingsstudier under anvend-125 125

else av I-HDL og I-apo A-I ble utført under anvendelse av RIA-teknikker som generelt beskrevet i Tsao et al. (1982), J. Biol. Chem. 257;15222-15228. Resultatene av disse studier er vist i tabell 5 som prosenter av total trikloreddiksyre (TCA)-utfellbar radioaktivitet.

Dataene i tabell 5 illustrerer den relativt høye binding av hele AI-10 og AI-11 til radiomerket HDL i den anvendte væskefasebestemmelse. Disse data gjenspeiler også den relative ustabilitet og den resulterende lave binding til apo A-I i seg selv. Den relative ustabilitetet av apolipoprotein A-I har nødvendiggjort bruk av en lyofilisert plasmaansamling som den sekundære standard i apo A-I-bestemmelsen som tidligere diskutert. De ovenfor angitte data illustrerer også en relativt lavere binding av AI-11 til apo A-I enn til HDL-partikler. Ikke desto mindre indikerer en sammenligning av data erholdt under anvendelse av ELISA-metoden for apo A-I med data erholdt fra de mer møysommelige teknikker som angitt i tabell 4, at ELISA-metoden kvantitativt påviser hovedsakelig alt av apo A-I (HDL) tilstedeværende i de bestemte prøver.

Ytterligere resultater erholdt under anvendelse av den tidligere beskrevne bestemme1sesmetode og nærmere beskrevet i detalj i avsnittet Materialer og metoder, er diskutert i det etterfølgende. Brønner av 96-brønns polystyren-mikrotiterplater ble anvendt som faste matriser. Hele, monoklonale antistoffer AI-10 ble anvendt som de fast fase-bundne, første, monoklonale, paratopiske molekyler. Ikke-spesifikke proteinbindingssteder på de faste bærer-overflater ble blokkert med BSA. HRPO-kjedede, hele, monoklonale antistoffer AI-11 ble anvendt som de andre og fjerde monoklonale, paratopiske molekyler, med OPD som den visualiserende, oxydative fargestoff-forløper.

Bestemmelser med hensyn til apo A-I ble utført

for 37 asymptomatiske personer uten noe kjent CAD. Disse personer er angitt som "normale".

Apo A-I-verdier ble erholdt under anvendelse av fortynnet plasma og serum som de væskeformige blodprøver. Disse verdier ble funnet ikke å utvise noen statistisk signi-fikante forskjeller mellom de to prøvekilder og ble slått sammen.

Et sammendrag av resultatene for de "normale" er vist i tabell 6, for 23 menn og 14 kvinner separat, og som "kombinerte" verdier. Et lignende sammendrag av apo A-I-verdier erholdt fra plasma og serum fra 4 2 menn som klinisk var identifisert til å ha CAD, er også vist i tabell 6.

Betrakter man de ovenfor angitte data og sammen-ligner disse data med dataene angitt i Kottke et al. (1986), Mayo Clin. Proe, 6j.:313-320, fremgår det at de midlere verdier for normale og CAD-pasienter med hensyn til apo A-I

i den ovenfor angitte bestemmelse, er lik de som er rapportert av Kottke et al. Lignende standardavvik ble erholdt for begge bestemmelsestyper.

Denne likhet med hensyn til resultat var overraskende av flere grunner. For det første anvendte Kottke et al. en detergent (Tween<®> 20) avmaskeringsbehandling ved deres bestemmelser, mens foreliggende væskeformige blodprøver var frie for slike behandlinger. For det andre anvendte Kottke et al. en radioimmunobestemmelse som generelt betraktes å være mer nøyaktig og riktig enn en ELISA som anvendt her. Voller et al. (1976), Bull. World Health Organ., 23:55-65. For det tredje ble polyklonale antistoffer som normalt betraktes å være i stand til forbedret immuno-reaks jon med det relativt heterogene apo A-I, anvendt av Kottke et al., mens monoklonale antistoffer ble anvendt her. For det fjerde anvendte Kottke et'al. en opprettholdelsestid på 16 timer ved romtemperatur for immunoreaksjonen av deres polyklonale antistoffer med apo A-I, mens et tidsrom på

30 minutter ved romtemperatur ble anvendt her.

III. Materialer og metoder

A. Lipoproteiner

I disse studier ble lipoproteiner isolert fra

plasma erholdt ved plasmaforese av normalt fastende-donor-blod ved den lokale blodbank. For dette formål ble det således erholdte plasma justert til å inneholde en sluttkonsentrasjon på 5 millimolar (mM) benzamidim, 1 mM diiso-propylfluorfosfat, 10 mM ethylendiamintetraeddiksyre

(EDTA), 10 milligram pr. milliliter (mg/ml) soyabønne-trypsininhibitor og 10.000 enheter pr. ml aprotinin. Lipoproteinene ble deretter isolert fra dette justerte plasma ved sekvens-ultrasentrifugering under anvendelse av fast kaliumbromid (KBr) for densitetsjustering.

Først ble det justerte plasma sentrifugert ved ca. 200.000xg i 18 til 24 timer. Fast KBr ble tilsatt til bunnlaget inntil densiteten var større enn 1,063 gram pr. milliliter (g/ml). Den resulterende sammensetning ble deretter lagt under en 0,1% EDTA-løsning inneholdende KBr til en densitet på 1,063 g/ml og ble ytterligere sentrifugert ved 200.000xg i ytterligere 4 8 timer.

Bunnlaget ble igjen gjenvunnet, og til dette ble det tilsatt fast KBr inntil densiteten var større enn 1,21 g/ml. Dette justerte lag ble lagt under en 0,1% EDTA-løsning inneholdende KBr til en densitet på 1,21 g/ml, og ble ytterligere sentrifugert ved 200.000xg i ytterligere 48 timer.

Topplaget ble deretter gjenvunnet, og fast KBr ble tilsatt inntil densiteten var større enn 1,063 g/ml. Dette justerte topplag ble lagt under en 0,1% EDTA-løsning inneholdende KBr til en densitet på 1,063 g/ml og ble ytterligere sentrifugert ved 200.000xg i mer enn 48 timer.

Midtlaget ble gjenvunnet, og fast KBr ble tilsatt til dette inntil densiteten var større enn 1,21 g/ml.

Dette justerte midtlag ble lagt under en 0,1% EDTA-løsning inneholdende KBr til en densitet på 1,21 g/ml og ble sentrifugert ved 300.000xg i mer enn 48 timer.

Topplaget ble gjenvunnet og betegnet som lipoproteiner med høy densitet (HDL) ved en densitet lik 1,063 til 1,21 g/ml. Det gjenvundne HDL ble dialysert mot lipoproteinbuffer (LLB) inneholdende 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,005% alfa-tocoferol og 5 mM benzamidin, og ble lagret under sterile betingelser i ikke mer enn 21 dager.

B. Isolering av apoprotein A- I

Apoprotein A-I (apo A-I) ble renset fra delipidert HDL (diskutert i det etterfølgende) ved størrelsesfraksjon-ering under anvendelse av høytrykksvæskekromatografi (HPLC) etter prosedyrene ifølge Kinoshita et al. (1983), J. Bio-chem. _9_i: 615-617. Ca. 300 mg ether:ethanol-delipidert HDL ble oppløst i 200 mikroliter (ul) 0,1% natriumdodecylsulfat

(SDS), 0,1 M natriumfosfat (pH 7,0) og ble størrelsesfrak-sjonert på "Spherogel" - TSK 3000 SW HPLC-kolonner, og fraksjoner inneholdende det rensede apo A-I ble lagret ved -20°C.

C. Utvikling av monoklonale, paratopiske molekyler

De fem monoklonale, paratopiske molekyler ble erholdt fra tre separate fusjoner av splenocytter fra immuniserte Balb/c ByJ mus under anvendelse av standard fusjoneringsprotokoller som diskutert i det etterfølgende. Kultursupernatanter ble oppsamlet og ble undersøkt først ved fast fase, og hvis de var positive, ble de undersøkt på nytt ved væskefase-radioimmunobestemmelse som beskrevet i det etterfølgende. Alle hybridomer ble klonet minst to ganger ved begrensende fortynning og ble lagret fryst i flytende nitrogen.

Kort angitt, ble Balb/c ByJ mus immunisert intraperitonealt (i.p.) med humant HDL som immunogen i Freunds komplette adjuvans (CFA) etterfulgt av en andre og tredje immunisering, hver med et mellomrom på ca. 3 uker, i Freunds ufullstendige adjuvans (IFA). For hybridomet

AI-10 (ATCC HB 9200) alene ble HDL først kryssbundet med glutaraldehyd og ble deretter injisert først med 500 enheter interferon-gamma (IFN-y) i CFA, og uten IFN-7 i etterfølg-ende IFA-immunisering. Det glutaraldehyd-tverrbundne HDL ble fremstilt ved omsetning av friskt HDL i fosfatbufret saltvann med glutaraldehyd til en sluttkonsentrasjon på .0,04% ved 20°C i et tidsrom på 18 timer. For hybridom AI-11, AI-12, AI-13 og AI-14 (ATCC HB 9201, HB 9202,

HB 9203 og HB 9204) ble immuniseringene foretatt med naturlig HDL. I alle tilfeller mottok musene ca. 3 måneder etter

den siste adjuvans-holdige immunisering, en perfusjons-boosterbehandling med naturlig HDL intravenøst (i.v.) i normalt saltvann og en andre lignende perfusjons-boosterbehandling en dag senere.

De således behandlede dyr ble avlivet tre dager etter siste boosterbehandling, og milten av hver mus ble høstet. En miltcellesuspensjon ble deretter fremstilt. Miltceller ble deretter ekstrahert fra miltcellesuspensjonen ved sentrifugering i ca. 10 minutter ved 1000 opm ved 23°C. Etter fjerning av supernatanten ble cellepelleten resuspendert i 5 ml kald NH4Cl-lyserende buffer og ble inkubert i ca. 10 minutter.

Til den lyserte cellesuspensjon ble det tilsatt

10 ml Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) og HEPES [4-(2-hydroxyethyl)-1-piperidin-ethansulfonsyre]-buffer,

og denne blanding ble sentrifugert i ca. 10 minutter ved 1000 opm ved 2 3°C.

Supernatanten ble dekantert, pelleten ble resuspendert i 15 ml DMEM og HEPES og ble sentrifugert i ca. 10 minutter ved 1000 opm ved 23°C. Den ovenfor angitte prosedyre ble gjentatt.

Pelleten ble deretter resuspendert i 5 ml DMEM og HEPES. En aliquot av miltcellesuspensjonen ble deretter fjernet for telling.

Fusjoner ble utført på følgende måte under anvendelse av den ikke-utskillende muse-myelomacellelinje P3x63Ag8.653.1, en subklon av linje P3x63Ag8.653 (ATCC 1580). Under anvendelse av et myeloma/miltcelleforhold på 1

til 10 eller 1 til 5, ble en tilstrekkelig mengde myelomaceller sentrifugert til en pellet, ble vasket to ganger i 15 ml DMEM og HEPES og ble sentrifugert i 10 minutter ved 1000 opm ved 2 3°C.

Miltceller og myelomaceller ble kombinert i rund-bunnede 15 ml rør. Celleblandingen ble sentrifugert i 10 minutter ved 1000 opm ved 23°C, og supernatanten ble fjernet ved aspirasjon. Deretter ble 200 ul 30% (vekt pr. volum) vandig polyethylenglycol med molekylvekt 4000 (PEG) tilsatt ved ca. 37°C under anvendelse av en 1 ml pipette og under kraftig omrøring for å bryte opp pelleten, og cellene ble forsiktig blandet i fra 15 til 30 sekunder. Celleblandingen ble sentrifugert 4 minutter ved 700 opm.

8 minutter fra tidspunktet for tilsetning av PEG ble 5 ml DMEM pluss HEPES-buffer tilsatt langsomt til pelleten uten å forstyrre cellene. Etter 1 minutt ble den resulterende blanding brutt opp med en 1 ml pipette og ble inkubert i ytterligere 4 minutter. Denne blanding ble sentrifugert i 7 minutter ved 1000 opm. Supernatanten ble dekantert, 5 ml HT-(hypoxanthin/thymidin) medium ble langsomt tilsatt til pelleten, og blandingen ble opprettholdt ufor-styrret i 5 minutter. Pelleten ble deretter brutt opp i store stykker, og den sluttelige cellesuspensjon ble anbragt i T7 5 kolber (2,5 ml pr. kolbe) i hvilket 7,5 ml HT-medium på forhånd var blitt anbragt. Den resulterende cellesuspensjon ble inkubert ved 37°C for å dyrke de fusjonerte celler. Etter 2 4 timer ble 10 ml HT-medium tilsatt til kolbene, etterfulgt 6 timer senere ved tilblanding av 0,3 ml av 0,04 mM aminopterin. 48 timer etter fusjon ble 10 ml HAT-(hypoxanthin/aminopterin/thymidin) medium tilsatt til kolbene. 3 dager etter fusjon ble levedyktige celler anbragt i 96-brønns vevkulturplater med ca. 2x10 4 levedyktige celler pr. brønn (768 totale brønner) i HAT-buffermedium som beskrevet i Kennett et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 8<_>1:77 (1978). Cellene ble f6ret 7 dager etter fusjon med HAT-medium og ved 4-5 dagers intervaller deretter etter behov med HT-medium. Veksten ble fulgt mikroskopisk, og kultursupernatanter som inneholdt antistoffer, ble oppsamlet på dag 14 for bestemmelse av HDL-spesifikk antistoffproduksjon ved fast fase-radioimmunobestemmelse (RIA) som beskrevet i Curtiss og Edgington (1982), J. Biol. Chem. 257:15213-15221.

De således fremstilte hybridomer som produserer anti-HDL-antistoffer, ble undersøkt, bestemt, og deres leve-dyktighet ble bestemt. Foreliggende hybridomer ble utvalgt fra ca. 30 hybridomkulturer som utskilte anti-HDL-antistoffer i deres kulturmedia.

D. Paratopisk molekylfremstilling og rensing

Ascitesvæske ble erholdt fra 10 uker gamle

Balb/c mus som var blitt behandlet med 0,3 ml mineralolje og injisert intraperitonealt med 3-50xl0<5> hybridomceller. Den gjennomsnittlige tid for utvikling av ascites, var 9 dager. Etter klaring ved sentrifugering ved 15.000xg i 15 minutter ved 23°C ble ascitesvæsker produsert av hvert hybridom, oppsamlet og lagret fryst ved -20°C.

Rensede, monoklonale, paratopiske molekyler fra hvert av de fem hybridomer ble fremstilt ved hurtig protein-væskekromatografi (FPLC) under anvendelse av en "Pharmacia" Mono Q HR5/5 anionbytterkolonne under anvendelse av en

0-0,5 molar (M) NaCl-gradient i 10 mM Tris, pH 8,0, idet fabrikantens veiledninger ble brukt. Rensede Mab ble kon-sentrert under anvendelse av en "Amicon" omrørt ultrafiltrer-ingscelle til en konsentrasjon på 1 mg/ml, ble dialysert i PBS (fosfatbufret saltvann, pH 7,2) og ble lagret ved -70°C.

Monoklonale antistoffer AI-4, AI-7, AI-9 og AII-1 ble fremstilt som diskutert i Curtiss og Edgington (1985),

J. Biol. Chem. 260;2982-2993.

E. Radiojodering

Radiojodering av HDL, apo A-I og immmunokjemisk renset geite anti-muse lg ble utført enzymatisk under anvendelse av "Enzymobead"-joderingsprosedyren og "Enzymobead" erholdt fra Biorad. "Enzymobead"-joderingen ble anvendt for å karakterisere antigenene og antistoffene for fast fase-radioimmunobestemmelsen som diskutert i det etterfølgende.

G. Løsningsmiddel- delipidering av lipoproteiner

Om nødvendig, ble lipoproteiner delipidert ved organisk ekstraksjon og ble betegnet som delipiderte lipoproteiner. For dette formål ble det lipoprotein som skulle analyseres, dialysert mot 0,01% EDTA med en pH-verdi på 7,5 over natten (ca. 18 timer).

Den resulterende prøve ble dialysert mot 0,003% EDTA i ca. 12 timer, og ble deretter lyofilisert til 10 til 20 milligram protein pr. rør. Til hvert rør ble det tilsatt 35 ml absolutt ethanol:vannfri ether (1:1) ved 4°C, og den resulterende løsning ble blandet.

Etter blanding ble løsningen inkubert i 20 minutter ved -20°C. Løsningene ble deretter sentrifugert i 30 minutter ved lOOOxg ved 0°C, og supernatanten ble helt av.

Den ovenfor beskrevne ethanoletherekstraksjon ble utført ytterligere to ganger idet totalt tre ekstraksjoner ble utført. 500 ml vannfri ether ved 4°C ble deretter tilsatt til prøven som ble opprettholdt i 30 minutter ved -20°C. Den kalde prøve ble sentrifugert ved lOOOxg i 30 minutter ved -20°C, og supernatanten ble helt av og kastet.

Pelleten ble tørket under anvendelse av nitrogengass.

H. Kvantitativ apo A- I ( HDL)- sammensatt ( sandwich)

ELISA

1. Apo A-I primære standarder:

Kvantifisering av HDL og isolert apolipoprotein A- I

HDL-fraksjonen (1,063-1,21 g/ml) ble erholdt fra oppsamlet humanplasma ved standard ultrasentrifugerings-teknikker og ble dialysert i PBS. Den ble deretter steril-filtrert gjennom en 0,45 mikrometers filterenhet og lagret ved 4°C. Proteininnholdet av HDL-fraksjonen ble bestemt ved en modifisert Lowry proteinbestemmelse med BSA som standard. Tre fortynninger av HDL-fraksjonen ble utført in duplo for å sikre avlesninger innen en lineær del av standardkurven. Eksempelvis ble HDL-fraksjonen kjørt ved fortynninger på 1:5, 1:10 og 1:20. Proteinkonsentrasjonen var vanligvis mellom 5 og 10 mg/ml. For utstrakt lagring ble HDL-fraksjonen fortynnet med PBS til en proteinkonsen-tras jon på 1-2 mg/ml. Etter fortynning ble proteinkonsentrasjonen igjen bekreftet ved Lowry-bestemmelse ved fortynninger på 1:2, 1:5 og 1:10. Den fortynnede HDL-fraksjon ble deretter oppdelt i aliquoter og lagret ved 4°C.

Isolert apolipoprotein A-I kan erholdes fra et utall kommersielle kilder. Selv om fabrikanten typisk innbefatter en angivelse av proteininnhold og renhet, ble proteinkonsentrasjonen alltid bekreftet ved en Lowry-bestemmelse og justert hvis dette var nødvendig, basert på disse resultater. Fortynninger av apo A-I-preparatet ble foretatt som beskrevet i foregående avsnitt. Preparatet ble oppdelt i aliquoter og lagret som foreslått av fabrikanten.

HDL- og/eller apo A-I-preparatene ble deretter bestemt som ukjente prøver (fortynnet 1:5000) i apo A-I ELISA (beskrevet i det etterfølgende). Minimum to forsøks-plater pr. dag, inneholdende et komplett sett av standarder, kvalitetskontroller og fortynninger av HDL og/eller apo A-I-preparatene, ble utført over en fem-dagers periode. ELISA-verdiene erholdt for HDL og/eller apo A-I, stemte overens innen 20% av Lowry proteinbestemmelsesverdien. Hvis verdiene ikke var i overensstemmelse med de fastslåtte grenser, ble Lowry-bestemmeIsen gjentatt for å bekrefte den anviste proteinkonsentrasjon. Hvis verdiene fremdeles var uover-ensstemmende, var aldring eller forurensning av preparatet vanligvis en indikasjon, og det ble ikke betraktet som egnet for anvendelse som en primærstandard.

Renheten av primærstandarden ble også bestemt ved analytisk natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese;

SDS-PAGE.

2. Apo A-I ELISA-sekundærstandardfremstilling og ver di ti Idel ing,

a. Fremstilling av lyofilisert standard oppsamlet plasma

Friskt plasma eller serum ble oppsamlet fra minst 10 normolipidemiske personer som hadde fastet over natten. Phlebotomi ble utført under anvendelse av sterile rør inneholdende dinatrium-EDTA ved ikke-traumatisk venipunktur. Prøvene ble sentrifugert ved 1500xg i 30 minutter ved 4°C, og plasmaet ble overført til rene, tett lukkede rør og ble lagret i ikke mer enn 24 timer ved 4°C. Like mengder av prøvene ble kombinert, og 0,5 ml mengder ble oppdelt i aliquoter i syre-rensede Wheaton 5 ml serumampuller og ble lyofilisert over natten (16-18 timer). Ampullene ble forseglet og lagret ved 4°C.

b. Rekonstituering av lyofilisert, oppsamlet plasmastandard

Ampullene fikk anta romtemperatur før rekonstituering. Aluminiumringen og korken ble fjernet idet vakuumet i ampullen langsomt ble opphevet. Under anvendelse av en presisjonspipette ble de tørkede, oppsamlede standarder rekonstituert med 0,5 ml dobbeltdestillert vann ved langsom avgivelse av vannet til sidene av ampullene. Korkene ble anbragt på nytt, og ampullene ble hurtig hvirvlet 3-4 ganger og opprettholdt ved romtemperatur i minst 30 minutter. Standarden ble ikke omrørt kraftig, men hvirvlet forsiktig for å sikre fullstendig oppløsning. c. Verditildeling av apo A- I- sekundærstandard Apo A-I-verdien av den lyofiliserte sekundærstandard ble bestemt i apo A-I ELISA under anvendelse av primærstandarden (enten HDL eller apo A-I) som kalibrator. ELISA-prosedyren beskrives i det etterfølgende.

Den lyofiliserte sekundærstandard ble bestemt som en ukjent prøve in triplo på minimum to bestemmelsesplater pr. dag i minst 10 dager som ga minimum 20 verdier (gjennomsnitt av tre forsøk). Alle verdier erholdt for den sekundære standard, ble det beregnet gjennomsnitt av, og apo A-I-verdien i milligram pr. desiliter (mg/dl) ble til-delt.

Så snart tildelingen var blitt foretatt, ble den sekundære standard anvendt til å konstruere en standardkurve som ble bestemt på den samme ELISA-plate med en primær standardkurve, med et komplett sett av kontroller. Primære og sekundære standardkurver ble undersøkt i minimum to bestemmelser på 96-brønns plater pr. dag i løpet av en periode på 5 dager.

Så snart verditildelingen av den sekundære standard var akseptert, ble standardkuver konstruert og bestemt på samme ELISA-plate med den aksepterte mengde av lyofilisert standard over en periode på fem dager (2 forsøksplater pr. dag) .

3. Bestemmelsen, generelt

Isolerte AI-10-molekyler ble festet til veggene av polystyren-mikrotiterplatebrønner ved tilblanding av 0,15 ml av en pH 9,0 natriumbicarbonatbuffer inneholdende 5 mikrogram pr. milliliter (ug/ml) AI-10 i hver brønn. Platene ble opprettholdt i 18 timer ved 4°C og ble deretter vasket 3 ganger med PBS inneholdende 0,1% BSA og 0,05% polyoxyethylen (20) sorbitan-monolaurat (Tween<®> 20). Gjenværende, ikke-spesifikke bindingssteder ble deretter blokkert ved tilblanding av 0,2 ml PBS inneholdende 10% BSA i hver brønn,idet blandingen ble opprettholdt i 1 time ved 37°C, etterfulgt av skylling. De således fremstilte brønner kan anvendes i opptil en måned etter fremstilling når de lagres i et fuktig kammer.

Humant HDL ble fortynnet i PBS til konsentrasjoner varierende fra 1,0 til 0,031 ug/ml for anvendelse som standard kontrolløsninger. Som ovenfor angitt, anvendes humant HDL snarere enn humant apo A-I som standard i disse forsøk fordi apo A-I er blitt funnet å være relativt ustabilt ved lagring, mens HDL synes å være relativt mer lagringsstabilt. Plasma- (eller serum) prøver ble fortynnet 1:5000 i PBS. 40 mikroliter (ul) av standard eller prøve ble blandet i brønnene in triplo. Innen 5 minutter deretter ble 50 ul PBS inneholdende HRPO-merket AI-11 paratopiske molekyler, tilblandet i hver brønn. Immunoreaksjonsbland-ingene ble opprettholdt i et tidsrom på 30 minutter ved 25°C. Ikke-bundet materiale ble deretter separert fra brønnene ved vasking som ovenfor beskrevet.

Mengden av fast fase-festet, sammensatt immunoreaktant inneholdende HRPO-markør, ble deretter bestemt ved tilblanding av 0,1 ml friskt fremstilt substratløsning (destillert vann inneholdende 3% H202 og 0,67 mg/ml o-fenylendiamin). 4. Trinnvis apo A- I HDL- sammensatt ELISA Følgende trinn ble utført ved utførelse av apolipoprotein A-I-sammensatt ELISA. Kommersielle kontroller ble rekonstituert i henhold til forpakningsbilagene med avionisert vann. Kontrollene ble hvirvlet forsiktig og opprettholdt i 20-30 minutter ved romtemperatur for å sikre fullstendig oppløsning.

a. Prøver og kontroller

Prøver og kontroller ble fortynnet 1:5000 i PBS. En seriefortynning kan fremstilles som følger: 20 jai prøve + 1,98 ml PBS (1:100); 40 ul av den ovenfor angitte fortynning + 1,96 ml PBS (1:5000).

b. Standardfortynning

Isolert apo A-I- (HDL) standard ble fortynnet til 4 ug/ml i PBS. Deretter ble det foretatt doble seriefor-tynninger til 0,031 ug/ml. Under anvendelse av et HDL-preparat angitt som 860527 som inneholdt 868 ug/ml, er 4 ug/ml = 46 ul + 9,954 ml PBS (1:217); 2 ug/ml = 1 ml av den ovenfor angitte fortynning

+ 1 ml PBS; og doble fortynninger fortsettes til 0,031 ug/ml.

c. HRPO- merket AI- 11- fortynning

En 1:5000 fortynning av AI-11 HRPO-konjugat-antistoff i PBS ble anvendt. Følgende fortynninger kan fremstilles:

20 ul + 1,98 ml PBS (1:100); og

240 ul av den ovenfor angitte fortynning + 11,76 ml PBS (1:5000).

Fortynningene ble dekket med folie for å beskytte mot lys. Denne mengde er tilstrekkelig til 2 plater.

d. 3% hydrogenperoxyd

Fortynn 30% hydrogenperoxyd (H202) 1:10 i destillert vann.

e. o- fenylendiaminsubstrat

Oppløs 1 o-fenylendiamin- (OPD) tablett i 15 ml destillert vann. Tilsett 62,5 ul 3% H2°2' Dekk med folie for å beskytte mot lys. Fremstill substrat friskt hver gang like før bruk.

5. Bestemmelsesprosedyre

a. Ekvilibrer antistoff-bundet ELISA-plate

ved omgivende temperatur (20-22°C) i minst 20 minutter. Fjern platen fra posen og snu platen for å fjerne restbuffer i brønnene. Fyll brønnene med 300 ul skyllebuffer (PBS inneholdende 0,1% BSA og 0,05% Tween<®> 20, pH 7,2) og opprett-hold i et tidsrom på 10 minutter. Snu platen for å fjerne buffer og tørk platen på papirhåndkle. La ikke brønnene være tomme lenger enn 10 minutter under bestemmelsen.

b. Tilsett 50 ul standard eller prøve til brønnene in triplo.

0 ug/ml-standarden er 50 ul PBS.

Tilsett 50 ul fortynnede HDL-standarder til standard-brønnene (0,031, 0,062, 0,125, 0,25, 0,50, 1,0 ug/ml).

Tilsett 50 ul av fortynnede kontroller og pasient-prøver til de respektive brønner. c. Tilsett 50 ul/brønn av HRPO-kjedet antistoff til alle brønner. d. Vikle platen inn i aluminiumsfolie og an-bring på en gyro-rister (ca. 100 opm) i 30 minutter ved romtemperatur (20-25°C).

e. Vask platen ved fylling av brønnene med

300 ul/brønn av skyllebuffer og snu platen for å fjerne bufferen. Gjenta dette ytterligere to ganger til totalt tre vaskinger. Tørk platen på papirhåndkle etter tredje vask. La ikke platen tørke ut.

f. Tilsett 100 ul/brønn av friskt fremstilt OPD-substrat. Tillat fargen å utvikles ved romtemperatur i 30 minutter.

g. Stopp reaksjonen med 50 ul 4N svovelsyre i alle brønner. Avles O.D. ved 492 nm.

I. Plasmaprøver og lipoproteinkvantifisering

Plasmaprøver ble erholdt fra 20 pasienter med koronar arteriesykdom fra hjertekateteriseringslaboratoriet ved San Diego VA-Hospitalet. I tillegg ble plasma erholdt fra 37 normale personer.

Blod ble oppsamlet i rør inneholdende 1,5 mg/ml ethylendiamintetraacetat (EDTA), og plasmaet ble separert umiddelbart ved sentrifugering ved 4°C.

Totalt plasmacholesterol og triglycerider ble målt på friske plasmaprøver i et standardisert, klinisk laboratorium under anvendelse av en Abbott ABA-200 bikromatisk analyseringsanordning og Boehringer-Mannheims cholesterol-reagens 236691 med høy ytelse og Abbott Laboratories triglycerid A-gent. LDL- og HDL-cholesterol ble målt under anvendelse av teknikkene beskrevet i Lipid Research Clinic Procedures, HEW publ. nr. 75-628 (NIH), 2 utg., Washington, D.C., Gov. Print. Off., (1974).

Kvantitative apolipoprotein A-I-bestemmelser ble også utført under anvendelse av kommersielt tilgjengelige bestemmelsessett. Instruksjoner vedlagt hvert sett, ble fulgt ved utførelse av bestemmelsene.

Kvantitative ELISA-studier med hensyn til apo A-I ble utført som her beskrevet på serum eller plasmaprøver erholdt fra givere som allerede beskrevet, eller på prøver erholdt fra laboratoriepreparater, som gaver fra kommersielle fabrikanter.

125

J. Væskefase I- merket antigen RIA

For å bestemme fraksjonen av <125>I-HDL-partikler og apo A-I bundet av AI-10, AI-11, AI-12, AI-13 og AI-14, ble

en væskefase-RIA anvendt [Curtiss og Edgington (1985) ,

J. Biol. Chem. 260:2982-2993]. Til 0,1 ml radiojodert antigen (HDL eller apolipoprotein A-I) ble det tilsatt 0,1 ml fosfatbufret saltvann, pH 7,2, og 0,1 ml varierende fortynninger av musehybridomkulturvæske eller ascitesvæske fortynnet i 1:50 normalt museserum. Alle buffere inneholdt også 5% dextran (molvekt 40.000). Etter 18 timer ved 4°C ble 0,1 ml av utfellende, andre antistoff (geite anti-muse IgG-serum) tilsatt. Etter en 4-timers inkubering ved 4°C ble 2 ml kald PBS tilsatt, og rørene ble sentrifugert ved 2000xg i 30 minutter ved 4°C. Supernatantene ble dekantert,

125

og I-aktiviteten av pelletene ble bestemt i en gamma-teller.

Maksimal utfellbar radioaktivitet ble bestemt ved

å erstatte det andre antistoff med 100% TCA. Den minimale, utfellbare radioaktivitet eller ikke-spesifikke binding (NSB) ble bestemt ved å erstatte de spesifikke hybridom-antistoffer med et irrelevant hybridom-antistoff av samme tungkj edeklasse.

Dataene ble beregnet som:

hvori "midlere" er den midlere radioaktivitet utfelt i nærvær av en gitt mengde av spesifikt antistoff, "NSB" er mengden av ikke-spesifikt bundet radioaktivitet utfelt som ble bestemt ved å erstatte de spesifikke, paratopiske molekyler ifølge oppfinnelsen med et irrelevant hybridom-antistoff av samme tungkjedeklasse, og "TCA" er den maksimalt TCA-utfellbare radioaktivitet.

K. Konkurrerende immunoenzymometrisk bestemmelse

med hensyn til AI- 10 og AI- 11

Fleksible polyvinylklorid-mikrotiterplater ble belagt i løpet av et tidsrom på 18 timer (over natten) ved 4°C med 0,2 ml fosfatbufret saltvann (PBS) inneholdende 5 ug/ml av enten HDL eller renset apo A-I. Brønnene ble vasket med 0,3 ml PBS inneholdende 1,0 g BSA og 0,5 ml Tween<®> 20 pr. liter. Gjenværende bindingssteder på brønnene ble blokkert ved inkubering av 0,2 ml PBS inneholdende 30 BSA pr. liter i brønnene i 1 time ved omgivende temperatur (20-25°C). Brønnene ble deretter vasket tre ganger med skyllebuffer. Platene ble anvendt umiddelbart.

0,05 ml PBS inneholdende 0,375 ug/ml AI-10 konju-gert med pepperrotperoxydase, ble inkubert i de prebelagte brønner med 0,05 ml PBS inneholdende fra 0 til 8,0 ug/ml ukonjugert AI-10 eller ukonjugert AI-11 monoklonalt antistoff. Inkuberingstiden var 3 timer ved omgivende temperatur. Brønnene ble deretter vasket tre ganger med skyllebuffer, og 0,1 ml PBS inneholdende o-fenylendiaminsubstrat, ble tilsatt til alle brønnene og ble inkubert i 30 minutter ved omgivende temperatur (20-25°C). Fargereaksjonen ble stoppet ved tilsetning av 0,05 ml 4N H2S04 til alle brønner, og den optiske densitet (O.D.) av hver brønn ble bestemt ved 490 nanometer (nm) under anvendelse av en "Dynatech" 96-brønns plateavleser.

Resultater av den apo A-I-belagte plate er vist i figur 1, og resultater av den HDL-belagte plate er vist i figur 2. En 21-gangers økning av umerkede AI-11-molekyler konkurrerte ikke signifikant med peroxydase-merkede AI-10-molekyler med hensyn til binding til HDL eller apo A-I. Undersøkelsen er blitt gjentatt under anvendelse av peroxydase-merket AI-11 med umerket AI-10 og AI-11 til de samme konsentrasjoner med hovedsakelig samme resultater.

Claims

1. Monoklonalt, paratopisk molekyl for anvendelse in vitro, karakterisert ved at det immunologisk reagerer med apolipoprotein A-I og utskilles av et hybridom valgt fra hybridomer med ATCC deponeringsnummer HB 9200, HB 9201, HB 9202, HB 9203 og HB 9204; og at det immunoutf eller minst 90%12<5>I-HDL i en flytende fase.

2. Monoklonalt, paratopisk molekyl ifølge krav 1, karakterisert ved at det er et helt antistoff.

3. Fremgangsmåte for bestemmelse av tilstedeværelse og mengde av apolipoprotein A-I i en væske- eller blodprøve, karakterisert ved anvendelse av de monoklonale paratopiske molekyler ifølge krav 1.

4. Diagnostisk system for anvendelse in vitro ved bestemmelse av nærvær av apolipoprotein A-I i en væskeprøve, karakterisert ved at det omfatter: a) en pakke med paratopiske molekyler som immunreagerer med apolipoprotein A-I og er utskilt av et av hybridomene valgt fra gruppen bestående av hybridomer med ATCC deponeringsnummer HB 9200, HB 9201, HB 9202, HB 9203 og HB 9203 og HB 9204, og eventuelt et indikeringsmiddel; idet angitte, paratopiske molekyler er til stede i en mengde tilstrekkelig til å utføre en bestemmelse av nærværet av apolipoprotein A-I.

5. Diagnostisk system egnet for anvendelse in vitro ved bestemmelse av mengden av apolipoprotein A-I tilstedeværende i en væskeformig blodprøve, karakterisert ved at det omfatter: (a) en første pakke inneholdende en fast bærer bestående hovedsakelig av en fast matriks som har monoklonale, paratopiske molekyler som immunreagerer med apolipoprotein A-I og er utskilt av et av hybridomene med ATCC deponeringsnummer HB 9200 eller HB 9201 bundet til angitte matriks, de ikke-spesifikke proteinbindingssteder på angitte bærer er blokkert; og (b) en andre pakke inneholdende paratopiske molekyler som immunreagerer med apolipoprotein A-I, som er utskilt av et av hybridomene med ATCC deponeringsnummer HB 9200 eller HB 9201, men er ikke de paratopiske molekyler i angitte, første pakke, og som er operativt kjedet til et indikeringsmiddel; hvilke paratopiske molekyler er til stede i en mengde tilstrekkelig til å utføre en bestemmelse av nærvær av apolipoprotein A-I.

6. Diagnostisk system ifølge krav 5, karakterisert ved at de monoklonale, paratopiske molekyler utskilt av hybridomet med ATCC deponeringsnummer HB 9200, er bundet til angitte, faste matriks i angitte, første pakke.

7. Hybridom, som produserer de monoklonale, paratopiske molekyler ifølge krav 1, karakterisert ved at det har ATCC deponeringsnummer valgt fra HB 9200, HB 9201, HB 9202, HB 9203 og HB 9204.