JPS62501770A

JPS62501770A - ヒトアポリポタンパク質のペプチドフラグメント、種特異性抗体及び使用方法

Info

Publication number: JPS62501770A
Application number: JP86500543A
Authority: JP
Inventors: フエアード，ジヨージ; セン，アラプ
Original assignee: ゾマ、コーポレーション
Priority date: 1984-12-31
Filing date: 1985-12-26
Publication date: 1987-07-16
Also published as: EP0209543A1; WO1986004144A1; EP0209543A4

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ヒトアポリポタンパク質のペプチドフラグメント、種特異性抗体及び使用方法関連出願とのクロスレファレンス下記出願は、１９８４年１２月３１日に出願された米国特許出願用６８８．０４０号明細書の一部継続出願で本発明は、一定のアポリポタンパク質（ＡＬＰ）ペプチドフラグメント（即ち、ドメイン又は部分）が免疫学的に活性であって、ＡＬＰを認識する種特異性（ｔｙｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体を産生ずるために使用することができる、という発見に関する。得られるフラグメント及びＡＬＰ種特異性抗体は、本発明のもう１つの面、叩らＡＬＰ定ｍ分析系において使用される。

１旦且韮リポタンパク質は血中でｆＩ環する脂質及びタンパク質の凝集体であって、脂質を体内輸送させるための手段である。これらの凝集体の脂質部分は実質的にコレステロール及びトリグリセリドからなる。血清リポタンパク質はそれらの密度によって分類される。これらの分類としては、プレーβ−リポタンパク質としても知られる超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）；β−リポタンパク質としても知られる低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）：及び、α−リポタンパク質としても知られる高密度リポタンパク１ｆｆ（ＨＤＬ）が挙げられる。リポタンパク質の第四の分類はキロミクロン（Ｃ）（ＹＬＯ）であり、トリグリセリド脂肪８６％、コレステロール３％、リン脂質９％及びタンパク質２％からなる安定な小滴である。キロミクロンは腸リンパ管及び食中食後の血中に見出され、吸収された長鎖脂肪及びコレステロールが腸から輸送された際の形で存在している。

リポタンパク質の１つの機能は、最終的な細胞内利用のために、コレステロール及びコレステロールのエステル類のような水不溶性物質を輸送することである。

すべての細胞は成長のためにコレステロールを必要とするが、細胞によるコレステロールの過剰蓄積はアテローム性動脈硬化症を特徴とする特定の疾患に至ることが知られている。総面清コレステロール吊はアテローム性動脈硬化症の発生と相関々係があることが現在では知られている。しかしながら、すべてのりボタンバク質種が異なった量のコレステロールを含有しているため、総血清コレステロール測定値は、各リポタンパク質種が血清中の総すポタンパク質ｍ中に占める聞の複合的な平均値である。

最近の研究では、コレステロールの細胞内蓄積をになうリポタンパク質の種類としてＬＤＬを対象としていたが、一方、ＨＤＬは細胞からの過剰コレステロールの除去に際し重要であることが既に判明している。更に、アテローム性動脈硬化症とＬＤＬコレステロールｍとの関係は、アテローム性動脈硬化症と総血清コレステロール旦との同様の関係よりも著しく強い。逆に、アテローム性動脈硬化症とＨＤＬコレステロール量との間には負の関係が存在するようである。ボッマン・ジエイ・ダブルら、サーキュレーション、第２巻、第１６１−１７８頁。

１９５０年（ＧｏＨｍａｎｎ、　Ｊ、　Ｈ，ｅｔ　ａｌ、、　Ｃ１ｒｃｕｌａｔｉｏｎ、　２：１６１−１７８　（１９５０）　）　：バール・デー・ビーら、アメリカン・ジャーナル・オブ・メデイシン、第１１巻、第４８０−４９３頁、１９５１年（８ａｒｒ、　Ｄ、　Ｐ、　ａｔ　ａｔ、。

＾ｍｅｒｉｃａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、　１１：４８０ −４９３　（１９５１）　）；ニラカラ・イー、スカンジナビアン・ジャーナル・オブ・クリニカル・ラボラトリ−・インベステイゲーション、増補版、第５巻、第１−ｉｏｉ頁、１９５２年（Ｎｉｋｋａｌａ、　Ｅ、、　５ｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｌ１ｎｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、　５：１−１０１　（１９５２））　；ジエンクス・ダブル・ビーら、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベステイゲーション、第３５巻、第９８０−９９０頁、１９５６年（Ｊｅｎｃｋｓ、　Ｗ、Ｐ、　ｅｔ　ａ！、、　Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　ＩｎｖｅｓｔｉｇａＮｏｎ、　３５：９８０−９９０　（１９５６））’　；及び、ミラー・ジー・ジエイら、ランセット、第１巻。

７８９７、第１６−１９頁、１９７５年（ｔｌｉｌｌｅｒ、　Ｇ。

Ｊ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｌａｎｃｅｔ、　Ｈ７８９７）：　１６−１９　（１９７５））参照。

このように、多種類のりボタンバク質は異なった比率でコレステロール及びトリグリセリドを含有しているため、総コレステロール及び総トリグリセリドの測定だけでは異常なりボタンバク質パターンを識別する上で不十分である。かかる事実の認識は、研究者を、脂質よりむしろ特異的リポタンパク質の濃度を測定するための様々な方法に目を向けさせた。シアーズ（Ｓｅａｒｓ　＞の米国特許第４．１２６．４１６号明細書は、血漿中のＬＤＬコレステロール聞の測定方法について記載しており、該方法では、ＬＤＬコレステロールはＬＤＬを植物性レクチンと選択的に凝集させることにより他の可溶性コレステロール両分から分離され、しかる後凝集しＤＬと会合したコレステロールの量が検出される。

ゴリ７ス（Ｇｏｌｉａｓ）の米国特許第４．１６７．４６７号明細書は、体液中のｌ−Ｉ　Ｄ　Ｌ　Ｍ離コレステロール濃度を測定し、かつ同時に体液試料中のＶＬＤＬ及びＬＤＬ遊離コレステロール濃度を測定するための電気泳動法について記載する。この方法は、液体媒体間で直接的流通を図り、電気泳動に付されたりボタンバク質に対する発現基質を使用し、更に各リポタンパク質ＭＩｌａコレステロールのｒｌｉ度を定量することからなる。ゴリアスの方法は、各リポタンパク質遊離コレステロール画分の直接的かつ同時的測定が各両分を沈降させることなく達成される、という従来技術の改善を意図している。

とューク１ｅｕｃｋ　）の米国特許第４，１８５．９６３号明ｍ　！！　Ｌｔ、ＶＬＤＬ、ＣＨＹＬＯ及びＨＤＬを多１ｉ１［ｉ［イオンと一緒に血清から抽出して血清中の脂質を測定し、次いで血清中のＬＤＬ脂質含徂を測定するための方法について記載する。

ザンダース（Ｓａｎｄｅｒｓ　）の米国特許第４．２１５．９９３号明細書は、ヒト血清中のＬ　Ｄ　Ｌ　ｈｔらＨＤ　Ｌを分離し、次いでＨＤＬコレステロールを定量するための方法について記載する。ＬＤＬは、金属イオン類を試料に添加せずども血清から沈降してくる。沈降試薬は、有機！１箔液の使用により、ヒト血清のｐ　ＨをＬＤＬのほぼ等電点にまで低下させる。

ベンツエン（Ｂｅｎｔｚｅｎ　）の米国特許第４．３０９．１８８号明ｍ書は、硫酸処理多糖類が共有結合した支持体を含有する小カラムにりよりＬＯＬ及びＨＤＬが分離される分離方法について記載する。第一のｐＨ緩衝液で溶出させることによりＬＤＬを集め：第二のｐＨｌ１ｉｆｉ液で溶出させることによりＨＤＬを集める。

しかる後、ＬＤＬ／ＨＤＬ比が決定可能となる。

ティベル（Ｔｅｉｐｅｌ）の米国特許第４．０３９．２８５号明細書は、比濁分析により各リポタンパク質の種類及び脂質の濃度を測定するための単−試料法について開示する。混合物のイオン強度は、最大密度リポタンパク質から最小密度リポタンパク質までの各種類の複合体を漸時溶解せしめる段階で高められる。各段階の不溶性複合体に関する濁度を測定すると、血液試料中の各リポタンパク質の種類及び脂質の濃度が計算できるようになる。

心血管障害に関する最近の疫学的研究から、血清リポタンパク質の総量及びこれらのりボタンバク質が属する群毎の差異を調べるのみならず、更に、これらの群の中で、存在するアポリポタンパク質（ＡＬＰ）秒毎の差異及び特に各ＡＬＰの存在量を調べることが有利であることが判明した。アポリポタンパク質は、脂質部分と結合してホモタンパク質を形成するようなタンパク質部分である。現在、いくつかのＡＬＰのタイプ及びサブタイプがＦＭ認されている。

アポリポタンパク質Ａ（アポ−Ａ）には、サブタイプＡ１及びＡ２がある。アポ −Ａ１はＨＤＬの主要なアポリポタンパク質であって、ＨＤＬ粒子の表面部分を占め、中性脂質核を覆っていると考えられる。アポ−Ａ１は成熟循環ＨＤＬの産生に必要な血漿中のレシチン：コレステロール・アシルトランスフェラーゼ、即ちコレステロールエステル化酵素を活性化させることも知られている。

上述のように、血漿ＨＤＬｆｆｉと冠状動脈疾患の進行との間には逆関数的関係がある。更に、ヘイズら、サーキュレーション、第６２巻、増補版第４号、第１１６頁。

１９８０年（Ｈｅｉｓｓ、　Ｇ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃ１ｒｃｕｌａｔｉｏｎ、　ｆ３２：５ｕｐｐｌｅｌＩｌｅｎｔ　ＴＶ、　１１６　（１９８０））参照。

ＨＤＬにおいて第二に量的に多いアポリポタンパク質はアポ−Ａ２である。アポ −Ａ１はアポ−Ａ２の場合よりも全体的に少ないＨＤＬ脂質と結合しているが；しかしながら、これらのアポリポタンパク質問の相互作用によりアポ−Ａ　はアポ−Ａ１の結合能を高めることが報告された。モリセットら、′リポタンパク質：構造及び機能”、アニュアル・レビュー・オブ・バイオケミストリー、第４４巻、第１８３号、第１９６−１９８頁。

１９７５年（Ｈｏｒｒｉｓｅｔｔ　ｅｔ　ａｌ、、　”Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ：５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ−Ａｎｎｕａｌ　Ｒｅｖｉｅｗ　ｏｒ　Ｂｉｏ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　４４：　１８３．１９６−１９８（１９７５）　）。

再度に精製されたＬＤＬは、分子量が２５０，０００〜５００，０００ドルトンの非常に大きなタンパク質、即ちアポリポタンパク質８（アポ−Ｂ）の単一分子を含有プることが判明した。スミスら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第２４７巻、第３３７６頁、１９８４年（Ｓｍｉｔｈ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＢｉｏｌｏａｉｃａｌ　ｃｈｅ＋ｎ１ｓｔｒｙ、　２４７：　３３７６　（１９８４））並びにミルン・アール・ダブル及びマーセル・アイ・エル、フエーデレーション・オブ・ヨーロピアン・バイオケミカル・ソサエティーズ・レターズ、第１４６巻、第９７頁。

１９８２年（Ｈｉｌｎｅ、　Ｒ，Ｈ，ａｎｄ　Ｈａｒｃｅｌ、　１．　Ｌ　、、　Ｆｅｄｅ−ｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｂｉｏｃｈｅｌｃａｌ　５ｏｃｉｅｔｉｅｓ　Ｌｅｔｔｅｒｓ。

１４６：９７（１９８２））参照。ＬＤＬは、コレステロールが細胞レセプターに結合し、エンドサイト−シスプロセスによって取込まれる末梢組織にコレステロールを輸送するキー的役割を果たす。ＬＤＬは゛コレステロールの病的取込みおよ沈着において重要な役割を果たすことも知られており、非常に高′ｆ：ｉ度のＬＤしはいくつかの類型のヒトアテローム性動脈硬化症におりる原因物質として関与することも知られている。更に、長期間にわたるＬＤＬｉ１１度の緩徐な上昇は、大半のヒトアテローム性動脈硬化症の進行に際しての重要なファクターであるかもしれない。

ボッマンら、サイエンス、第１１１巻、第１６６頁。

１９５１年（Ｇｏｆｆｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、　１１１：１６６（１９５１））；ゴールドシュタインら、メタボリズム、第２６巻、第１２５７頁、１９７７年（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｈｅｔａ−ｂｏｌｉｓＩＩｌ、　２６：１２５７（１９７７）　）参照。アポ−８は、トリグリセリド及びコレステロールの輸送においていくつかの重要な役割を果たし、しかもヒト肝臓における高トリグリセリドリポタンパク質の形成及び分泌のために必要であることが知られている。それは、常にＬＤＬに見出される唯一のタンパク質であって、ＬＤＬレセプターに対する相補的な部位を有し、かつ該レセプターにより認識される。ブタアポ−８の一定の対立遺伝子の存在はブタ動脈における脂質の沈着及びプラーク形成と強固な相間々係があることを照明した事実もある。

ラバクツら、イクスビアリメンタル・モレキュラー・パソロジー、第２７巻、第４２９頁、１９７７年（Ｒａｐａｃｚ　ａｔ　ａｔ、、　Ｅｘｐｅｒｉ−ＩＩｌｅｎｔａｌ　Ｈｏ１ｅｃｕ！ａｒ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、　２７：４２９（１９７７））参照。

アポリポタンパクＩＣ（アポ−Ｃ）には、サブタイプのアポ−Ｃ、アポ−Ｃ２及びアポ−Ｃ３がある。アポ−Ｃは血漿リポタンパク質膜のタンパク質部分の一部であるとが明らかにされた〔アイゼンベルブ・ニスら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第２５４巻、第１２６０３頁、１９７９年（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ。

Ｓ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｒ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　２５４：１２６０３　（１９７９））参照。ＣＨＹＬＯ及びＶＬＤＬにおいて総タンパク質の４０〜８０％を占めるアポ−Ｃは血漿ＨＤＬ中に存在し、リポタンパク質リパーゼ酵素系活性の′、Ｊ１節に関し重要な役割を果たす。最近、ＶＬＤＬトリグリヒリドの加水分解の程度とりボタンバク質膜のアポ−Ｃの含量との関係が明らかにされたが、アポ−Ｃ分子は急速なトリグリセリド加水分解後にＶＬＤＬからＨＤＬに転移され、新たに分泌された粒子が循環中に入ると再度ＶＬＤＬに戻るのである。同様の観察結果は食事性キロミクロン血症の治）ヨ段階と発生段階とにおいても報告された。

循環するコレステロール担持リポタンパク質の排出又は取込みプロセスにおいて特に中心をなす１つのアポリポタンパク質はアポリポタンパク質Ｅ（アポ−Ｅ）である。マーラー・アール・ダブル、メディカル・クリニック・オブ・ナーザン・アメリカ、第６６巻、第３７５頁。

１９８２年（Ｈａｈｌｅｙ、　Ｒ，Ｗ、、　Ｈｅｄ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｎｏｒｔｈ、＾ｍｅｒ、　。

６６：３７５（１９８２）　）参照。アポ−Ｅの重要な機能は、特異的表面レセプターを介するリポタンパク質の細胞内取込みに際して媒介することである。マーレー・アール・ダブル、クリニツシエ・ウォッヒエンシュリフト、第６１巻。

第２２５頁、１９８３年（Ｈａｈｌｃｙ、　Ｒ，Ｗ、、　Ｋ１１ｎｉｓｃｈｅＷｏｃｈｃｎｓｃｈｒｉｆｔ、　６１：２２５（１９ｇ３）　）参照。アポ−Ｅは、繊維芽細胞及び各種末梢細胞の低密度リポタンパク質レセプターと結合し、その結果ｍｒｒａ内コレステロール代謝に影響を及ぼすことが知られている。それは更に肝臓原形質膜レセプター、即ちアポーＥレセプターと特異的に結合し、しかもキロミクロン残留クリアランスの主要な決定物質として機能する。

アポリポタンパク質Ｅ（アポ−Ｅ）には、３種の主な同様の形態、即ちアポ−Ｅ２、アポ−Ｅ３及びアポ−Ｅ４がある。アミノ酸配列分析により、３種の異種形態にはそれらの一次構造に差異があることが明らかにされた。様々な形態のアポ −Ｅ２についてこれまで述べられてきたおり、すべての形態のアポ−Ｅ２がＬＤＬレセプター結合活性を減少させかつアポーＥレセプター結合活性を減少させていることが照明された。更に、これらの異常な型のアポ−Ｅ２は遺伝子異常高リボブＯティン血症■型と関係しており、これは高コレステロール残留リポタンパク質の不完全クリアランスにも一部起因しているようである〔ワイスグレーバー・エッチ・ケイら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第２５８巻、第１２３１１頁、１９８３年（Ｗｅｉｓｇｒａｂｃｒ、　Ｈ。

に、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　２５８：１２３４１（１９８３）　）。この事実は、アポ−Ｅがコレステロール及び脂質の代謝において決定的役割を果たすことを示唆している。

循環中からのコレステロール含有リポタンパク質の除去を媒介する各８ｉ細胞レセプターとＡＬＰとの相互作用に関連して、最近認識された事実に基づき、ＡＬＰの特異的試験法を開発する努力が続けられてきた。ホームクイスト（１ｌｏｌｉｑｕｉｓｔ　）らの米国特許第４．３９９．２１７号明細書は、免疫酵素法による血清リポタンパク質試Ｍ法について記載する。アポリポタンパク質抗体は支持体上に固定されている。血清試料は酵素標識特異的アポリポタンパク質と一緒に加えられる。

支持体に固定されていないすべての試薬を除去し、しかる後支持体に結合した酵素活性を測定することにより、競合試験において被検試料中に存在する特異的アポリポタンパク質の邑を間接的に測定することができる。このように、試験においては、１種特異性”抗体、特異的標識抗原（アポリポタンパク質）及び競合試験系を必要とする。９種特異性”抗体は、密度勾配超速心力分離により分離された血清リポタンパク質画分から得られる精製アポリポタンパク質でウサギを免疫することによって産生される。しかしながら、超速心力分離は、高純度アポリポタンパク質画分を得るためにはやや不十分である。

したがって、ウサギの免疫によって産生きれる抗体の“硬性妥性パと同様に不十分である。このように、アポリポタンパク質及びそれに対する高度に特異的な抗体に関し、極めて正確な真の硬性異的試験法に対する必要性が存在し続けていた。

発明の開示各種ＡＬＰがコレステロール代謝に関与する役割と、高度のＡＬＰ特異性の正確有効かつ安価な試験法に対する必要性とに鑑み、発明者らは、ポリペプチド中において免疫原性及び免疫特異性の双方の存在領域を確認する努力をすべく、各種ＡＬＰの既知アミノ酸配列について評価した。これらの努力により、各々のアポ −Ａ１、アポ−Ａ２、アポ−Ｂ１アポ−Ｃ３及びアポ−Ｅ２のアミノ酸配列中において免疫原性及び免疫特異性が併存する特異的ポリペプチド部分（フラグメント）を確認するに至った。

発明者らは次いで、ポリペプチドフラグメントを合成し、フラグメントをキャリアタンパク質と結合させ、真に硬性異的で非交差反応性の抗体を免疫処理により産生さることに成功した。

検出可能な標識抗体、基体−固体化抗体及び本発明の検出可能な標識免疫特異性ペプチドもしくは精製ＡＬＰを必要とする競合型及びサンドインチ型の試験法も同様に開発された。

図面の簡単な説明図１は、アポ−Ａ１に対してそれぞれ特異的な３種のペプチド配列（Ａ、Ｂ及びＣ）、並びにアポ−Ａ１特異性抗体を産生ずるために使用される３種の合成ペプチド（Ａ′、Ｂ′及びＣ′）について示す。

図２は、アポ−Ｅ２に対して特異的なペプチド配列、並びにアポ−Ａ１特異性抗体を産生ずるために使用される合成ペプチド（Ａ′）について示す。

図３は、アポ−Ｃ３に対して特異的な３種のペプチド配列（Ａ、Ｂ及びＣ）、並びにアポ−０３特異性抗体を産生ずるために使用される３種の合成ペプチド（Ａ ’、Ｂ′及びＣ’　）について示す。

図４は、アポ−８に対してそれぞれ特異的な２種のペプチド配列（Ａ及びＢ）、並びにアポーＢ特異性抗体を産生ずるために使用される２種の合成ペプチド（Ａ ′及びＢ’　）について示す。

図５は、アポ−Ａ２に対して特異的な２種のペプチド配列（Ａ及びＢ）、並びにアポ−Ａ２特異性抗体を産生ずるために使用される２種の合成ペプチド（Ａ’及びＢ’　）について示ず。

図６（Ａ及びＢ）は、以下の具体的プロトコール■を用いて５Ｏ８−ＰＡＧＥゲルから得られたウェスターン免疫プロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｔａｕｎｕｎｏｂｌｏｔ）の図である。

図７は、二１−ロセルロースフィルター上にスポットされた様々な聞の各種アポリポタンパク質がら得られる代表的免疫ドツトプロット（ｉｍ＋ｎｕｎｏｄｏｔ　ｂｌｏｔ）の図である。

各種アポリポタンパク質について決定されたアミノ酸配列から選択されるペプチド部分（フラグメント）は、本発明の開発において出発点を形成する。アポリポタンパク質Ａ１のアミノ酸配列は、ブリュワー・エッチ・ビー・ジュニアら、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ、第８０巻。

第６２３−６３０頁、１９７８年（Ｂｒｅｗｅｒ、　Ｈ，Ｂ、、　Ｊｒ。

ｅｔ　ａｔ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　ＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、　８０：６２３−６３０（１９７８））の文献で報告さている。ヒトアポ−Ａ２のアミノ酸配列は、モリセットら。

゛リポタンパク質：構造及び機能″、アニュアル・レビュー・バイオケミストリー、第４４巻、第１８３−２０７頁、１９７５年（Ｈｏｒｒｉｓｅｔｔ　ｅｔ　ａｔ、。

”Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ：　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ”、　ＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｃｎ　Ｂｉｏｃｈｃａ＋１ｓｔｒｙ、　４４：１８３−２０７（１９７５）　）において公表されている。同様に、アポリポタンパクＴＩＥ２の完全なアミノ酸配列は、ロール・ニス・シー・ジュニアら。

ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第２５７巻、第４１７１− ４１７８頁、１９８２年（Ｒａｌｌ、　Ｓ、　Ｃ，Ｊｒ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈ（！ｌｌ１ｉＳｔｒｌ／、　２５７：４１７１−４１７８（１９８２））で報告されティる。

アポリポタンパク質Ｃ３の完全なアミノ酸配列も、ブリコワーら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第２４９巻、第４９７５−４９８４頁。

１９７４年（ＢｒＣｖｅｒ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｊｏｕｎａｌ　ｏｆ　ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ、　２４９：４９７５−４９８４（１９７４））で公知になっている。

アポリポタンパク質Ｂから得られる一定のタンパク質分解フラグメントのアミノ末端配列も同様に公知であり、ルベーフ・アール・シーら、フエデレーション・オブ・ユーロビアン・バイオケミカル・ソサエティーズ・レターズ、第１７０巻、第１０５−１０８頁、１９８４年（ＬｅＢｏｅｕｒ、　Ｒ，Ｃ，ｅｔ　ａｌ、、　Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＥｕｒｏｐｅａｎＢｉｏｃｈｃｍｉｃａｌ　５ｏｃｉｅｔｉｅｓ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、　１７０：１０５−１０８（１９Ｂ４　）　）で報告されている。

天然アミノ酸配列に屈する各種セグメントに対応したペプチドドメインが得られる。１つの態様では、ペプチドフラグメントは、参考のために本明細書に包含されるメリフィールド、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエテー、第８５巻、第２１４９頁、１９６２年（Ｈｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａ１１ｅｒｉｃａｎ　ＣｈｅｍｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｙ、　８５：２１４９（１９６２））並びにスチュワード及びヤング、基礎的固相ペプチド合成（フリーマン、サンフランジ２１．１９６９年）　（Ｓｔｅｗａｒｔ　ａｎｄ　Ｙｏｕｎｇ、　ｉｎＵｎｄｅｒｌｙｉｎｇ　５ｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　（ＦｒｅｅＩＩｌａｎ。

Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、　１９６９））に記載された周知の固相ペプチド合成法により合成される。しかしながら、例えば、タンパク質分解酵素又は化学試薬を用いて天然アミノ酸配列を切断することによりフラグメントを得ることも可能である。

以上のように、“ペプチドフラグメント”、゛′ペプチドドメイン”及び゛″ペプチド部分′°という語は、配列中に典型的には８〜２０個のアミノ酸、更に好ましくは１０〜１６個のアミノ酸を有した天然タンパク質の一部をなす合成及び天然のアミノ酸配列双方を含む意であり、１２〜１５個のアミノ酸からなるオリゴペプチドが好ましい鎖長である。゛天然アミノ酸配列から１りることか可能な ”という語は、合成配列、及び天然配列中に存在しない分離された配列を得るために天然配列を切断することによって得られる配列を双方含む息である。更に、選択された配列の他に、天然配列中に存在しない１以上のアミノ酸を含有するオリゴペプチドも含まれる。本発明は、更に、天然ＡＬＰタンパク質に存在しない２Ｊ：Ｊ、上のドメインからなる免疫特異性ペプチドとなるように２以上の異なるペプチド部分（フラグメント）を共有結合させることにより得られる新規なポリペプチドにも関する。

各種のペプチドフラグメントは、免疫原性（体液性免疫応答性誘発能を物質に賦与せしめる性質及び物質がこの性質を有する程度）及び免疫特異性（免疫応答により誘発されて抗体が特定のりボタンバク質又はアポリポタンパク質と結合する能力）を調べるために評価された。

“アポリポタンパク質種特異性”という語は、特定のＡＬＰに限定された高度の特異的免疫反応性を含む意である。

図１においてＡ、Ｂ及びＣはアポ−Ａ１において見出される３１１の天然アミノ酸配列を表わす、Ａ′、Ｂ′及びＣ′は、合成されかつ抗体産生能について評価された３秤のペプチドを表わし、しかも抗原物質として使用された実際の合成ペプチドを表わしている。各々の合成配列は、キャリアタンパク質と結合し得るように、カルボキシ末端に更にシスティン残基を有していることに注意ずべきである。

次いで図２において、Ａは、アポ−Ｅ２の免疫原性及び免疫特異性について評価されたアポ−Ｅ２におけるアミノ酸配列を表わす。また、合成ペプチドフラグメントＡ′は、キャリアタンパク質と結合し得るように、カルボキシ末端にシスティン残基を有する。

図３において、Ａ、Ｂ及びＣに相当するペプチド配列は、免疫原性及びアポリポタンパク￥ＩＣ３に対する免疫特異性について評価された。各々の合成ペプチドは、キャリアタンパク質と結合し得るように、カルボキシ末端にシスティン残基を有する（Ａ’　、Ｂ’及びＣ′）。

図４において、そこに示された２秤の配列Ａ及びＢは、免疫原性及びアポリポタンパク￥１Ｂに対する免疫特異性について評価された。更にそれに対応した合成ペプチドＡ′及びＢ′は、キャリアタンパク質と結合し得るように、各々カルボキシ末端に加えられたシスティンを有する。

図５において、Ａ及びＢはアポ−Ａ２に関し見出された２種の天然アミノ酸配列を表わしており、アポ−Ａ２における免疫原性及び免疫特異性について評価された。

合成ペプチドフラグメントＡ′及びＢ′は、キャリアタンパク質と結合し得るように、カルボキシ末端にシスティン残基を有する。

本発明の範囲内には、上記フラグメント中において、免疫原性及び免疫特異性双方を有するアミノ酸配列が含まれる。したがって、ペプチドフラグメントは、所望のＡＬＰ種特異性抗体を産生ずることが可能な１以上のエピトープ、即ち免疫原性ドメイン（抗原決定基）を有しており、天然配列に正確に対応したペプチドフラグメントであっても、又は本発明での使用に際し免疫原性及び免疫特異性に影響を与えない程度に変更されたペプチドフラグメントであってもよい。同様に、キャリアタンパク質との結合性を高めるために加えられる他のアミノ酸残基、あるいは標識性を高めるために又は動物の免疫系（免疫応答能）の活性化が可能なアミノ酸配列によりペプチドフラグメントの免疫原性を高めるために加えられるアミノ酸残基を使用したものも含まれる。“標識可能残基″という語は、所望の配列中に現存するか、又は検の放射性同位体の結合を可能ならしめるために所望の配列中に尋人されたチロシンのような残塁を含む意である。

特に重要なものは下記式のペプチドである：又は−ＮＲ３Ｒ４であり：Ｍは薬学上許容される陽イオン、又は低級（０１〜Ｃ６）分岐状もしくは直鎖状アルキル基であり、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は同一でも異なっていてもよく、水素及び低ｔｘｔ　＜ｃ　−Ｃ６＞分岐状もしくは直鎖状アルキル基からなる群より選択され；Ｘは上記アミノ酸配列又はペプチドフラグメントある〕；２）　その酸付加塩：３）　その保護又は一部保護誘導体。

技術的に公知の如く、アミノ酸残基は、適切なアミノもしくはカルボキシ保護基を用いたそれらの保護型でも又は未保護型であってもよい。

使用される陽イオンＭは、アルカリもしくはアルカリ土類金属陽イオン（即ち、Ｎａ、に１Ｌ　ｉ　、１／２　Ｃａ。

１／２３ａ等）又はアミン陽イオン（即ち、テトラアルキルアンモニウム、トリアルキルアンモニウムであり、ここでアルキルはＣ１〜Ｃ１２であってもよい）である。

様々な長さをもつペプチドは遊離アミン（Ｎ末端）の型でもその酸付加塩の型であってもよい。通常の酸付加塩は、ハロゲン化水素酸塩、即ち、ＨＢｒ、Ｈｌ、更に好ましくは）」Ｃ１である。

本発明により（ウェル当りペプチド５ｎｏを用いて）調製されたすべての合成ペプチド抗血清についてのＥＬＩＳＡ力価は、１：１６００以上、通常１：１２０００以上である。ウェル当たり天然アポ−Ａ１１００ｒｌを用いたアポーΔ１抗血清のＥＬＩＳＡ力価は１：１２０００以上であった。

抗体産生を促進するために、抗原性物質（ペプチドフラグメント）は、当該技術分野において周知でかつ汎用される技術により、アルブミン又は鎧型カサガイヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ　Ｉｉｍｏｅｔ　ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ、にＬ）Ｉ　）のようなキャリアタンパク質と結合せしめられていてもよい。好ましくは、キャリアタンパク質はＫＬＩ（であって、システィン残基により抗原性物質と結合している。

更に、抗原性物質は免疫学的に不活性又は活性な担体と混合することができる。

免疫応答を促進又はｙｋ導するフロイント完全アジュバントのような担体が使用されてもよい。

動物抗血清の調製法は周知技術である〔例えば、チャード、生化学及び分子生物学における実験室的技術。

“放射免疫試験及び関連技術の概説”、第３８５−３９６頁、ノース・ホランド・パブリッシング・カンパニー、１９７８年（Ｃｈａｒｄ、　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　Ｉｎ八へｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、”Ａｎ　Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｒａｄｉｏ−ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　ａｎｄ　Ｒｅ１ａｔｅｄ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ″、　ｐａａｅｓ　３８５− ３９６゜Ｎｏｒｔｈ　Ｈｏ１ｌａｎｄ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ　（１９７８）　参照）。動物の選択は、利用上の便宜及び得られる抗血清の容１の面でのおおよその必要ａの間のバランスにより通常決定される。ヤギ、ロバ及びウマのような大型種が、太りの血清が容易に得られることから好ましい。しかしながら通常高力価血清を与えるウサギ又はモルモットのような小型種を用いることも可能である。通常、抗原性物質（ペプチドフラグメントハブテン−キャリアタンパク質複合体）の皮下注射が、抗体が産生されるべき動物の免疫系に対し行なわれる。適切な抗体の検出は、血清を適切な標識トレーサー含有分子で試験することにより行なわれてもよい。トレーサー含有分子と結びついた両分が次いで単離され、必要であれば更に精製される。これらの抗体はしかる後、特定のＡＬＰを定性定日するための各種免疫試験において利用することができる。本発明の範囲に属する免疫試験としては、競合試験及び免疫測定試験の双方が含まれる。

ホルモン、タンパク質、抗体その他のような有機分子の微旦分析に利用される一般的競合結合試験法は当該技術分野において周知である。チャード、同上参照。

これらのいずれの競合結合試験法も本発明の目的、即ち特異的ＡＬＰの定石のために利用することができる。競合結合試験、典型的には放射免疫試験（ＲＩＡ）を実施するためには、標識含有分子及びＡＬＰに対し親和性をもつ結合性分子を調製することが必要である。未知かのＡＬＰを含有した少倒の液体又は組織試料は、抗体更には既知量の抗原特異性標識抗体の存在下でインキュベートされる。

抗体は、必ずしも本発明の抗原性ペプチドフラグメントから産生せしめられることは（好ましいけれども）必要ではない。典型的には、しかしながら、抗体を産生ずるために使用されかつ更にチロシン残基を含有する同一の合成ペプチドはチロシン残基を介して放射性ヨウ素で標識され、トレーサー含有分子を有する。試験試料と抗体及びトレーサー含有分子とのインキュベートが終了した後、遊離型及び結合（免疫複合体）型間でのトレーサー含有分子の分布率を調べることが必要であるゎ通常、しかし常にではないが、そのためには、結合画分が遊離画分から物理的に分離されることを必要とする。

例えば、特定のＡＬＰに対する抗体はプレートに結合することができる。遊離型と結合型とのトレーサー含有分子間の物理化学的差異を利用する様々な他の技術がその目的のために利用されてもよい。一般的に利用可能な方法は、ヤロー、フ７−マコロジカル・レビュー、第２８巻、第１６１頁、１９７３年（Ｙａｌｏｗ、　ＰｈａｒＩｌｌａｃｏｌ、Ｒｅｖ、。

２８：１６１　（１９７３）　）に記載されている。これらの技術としては、吸着、沈降、塩析法、有様溶媒、電気泳動分離その他がある。チャード、同上、第４０５−４２２頁参照。

特に有用な放射性同位体は、　ト１、１１　Ｔ、３２Ｐ、３５ｓ、１４ｃ、５１ｃ　ｒ、ｃ　＋、　ｃｏ、５８ｃ０．Ｆｅ、　Ｓｅ及び１５２ＥＵである。

ｔＪ！１．用性標識は１例であって、代わりに、ペプチド配列は、蛍光標識、酵素標識、ラジカル標識、アビジン−ビオチン標識又はバクテリオファージ標識を用い、当業者に公知の技術（チャード、同上）によって標識されてもよい。

代表的蛍光標識としては、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、０−フタルアルデヒド及びフルオレサミンがある。

代表的化学ルミネセンス化合物としては、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル類、イミダゾール類、アクリジニウム塩類及びシュウ酸エステル類がある。代表的生物ルミネセンス化合物としては、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及びエキオリンがある。

代表的酵素としては、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、マレイン酸デヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼ及びペルオキシダーゼがある。

２秤の代表的酵素試験法は、酵素結合免疫ソルベント試験（ＥＬＩＳＡ）、及び酵素複合化免疫試験（ｅｎｚｙｍｅＣｏｒｐ、）　）としても知られる均一酵素免疫試験である。

古典的ＥＬＩＳＡ系では、分離は、抗体が固相に結合することを利用して行なわれる。ＥＭＩＴ系においては、トレーサー−抗体複合体の酵素が不活性化されることを利用しており；活性はしたがって分離工程を経ザして測定することができる。

本発明のＡＬＰ種特異性抗体は、サンドインチ免疫試験法としても知られる免疫測定試験において使用するためにも利用される。これらの免疫測定試験には、同時的サンドインチ、フォワード（ｆｏｒｗａｒｄ　）サンドインチ、リバース（ｒｅｖｅｒｓｅ　）サンドインチ免疫試験がある。これらの各用語は当業者に十分理解されている。

フォワードサンドインチ免疫試験において、試料はまずＡＬＰに対する抗体を含有した固相免疫吸着剤と一緒にインキュベートされる。インキュベートは、試料中のＡＬＰが固相中の固定化抗体と結合するために十分な時間にわたり継続される。最初のインキュベート後、固相免疫吸着剤はインキュベート混合物から分げ１され、試料中に存在しているであろう過剰のＡＬＰ及び他の干渉物質を除去するために洗浄される。固定化抗体と結合したＡＬＰを含有する固相吸着剤は、次いで、ＡＬＰ上の別のドメインと交差反応する可溶性標識抗体と一緒に再度インキュベートされる。２回目のインキュベート後、固相免疫吸着剤から未結合、標識抗体を除去し、かつ非特異的結合標識抗体を除去するために、再度洗浄が行なわれる。固相免疫吸着剤に結合した標識抗体はしかる後検出され、検出された標識抗体伍は原試料中に存在する抗原Ｆの直接測定値として扱われる。一方、免疫吸着剤複合体と結合しない標識抗体が検出されてもよく、この場合にあっては、測定値は試料中の抗原伍と逆比例する。フォワードサンドインチ試験は、例えば米国特許第３．８６７．５１７号；第４．０１２，２９４号；及び第４，３７６．１１０号明細書に記載されている。

リバースサンドインチ試験においては、試ｆ’ｌはまず標識抗体と一緒にインキュベートされ、しがる後ＡＬＰ上の別のドメインと交差反応する固定化抗体を含有した固相免疫吸着剤がそこに加えられ、再度インキュベートが行なわれる。フォワードサンドインチ試験で必要とされた最初の洗浄工程は不要であるが、２回目のインキュベート後に洗浄が行なわれる。リバースサンドインチ試験は、例えば米国特許第４，０９８，８７６号及び第４．３７６．１１０号明号明１＠に記載されている。

同時的サンドインチ試験においては、試料、固定化抗体を担持した免疫吸着剤及び別のドメインに対し特異的な可溶性標識抗体は、１回のインキュベート工程において同時的にインキュベートされる。同時的試験では１回のインキュベートのみが必要で、洗浄工程を要しない。

同時的試験の利用は、非常に有用な方法であって、操作容易性、均一性、再現性、試験の直線性（ｌ　１ｎｅａｒｉｔｙ　）及び高精度をもたらす。参考のために本明細書に包含されるデビット（ＤａＶｉｄ）らの米国特許第４．３７６．１１０号明ｌ１書参照。

上記各々の試験において、抗原含有試料、固定化抗体担持固相免疫吸着剤及び可溶性標識抗体は、抗原を固定化抗体及び可溶性抗体に結合せしめ得るような条件下でかつそのために十分な時間にわたりインキュベートされる。一般に、できる限り多くの抗原を結合せしめるために要されるインキュベート条件を与えることが望ましいが、その理由は、これによって最大限まで標識抗体を固相に結合させ、シグナルを増大させるためである。勿論、標識されかつ固定された抗体の具体的濃度、インキュベートの温度及び時間、その他のこのような試験条件は、試料中の抗原の濃度及び試料の性質その他をはじめとする様々なファクターに基づき変更することができる。当業者は、日常的実験法により個々に測定するために、効果的かつＲ適の試験条件を選択することができる。

従来使用されており、しかも本発明で使用することができる固相免疫吸着剤には多数のものがある。周知の免疫吸着剤としては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、デキストラン、ナイロン及び他の物質から形成されるビーズ類；このような物質から形成され又はそれで被覆された管等がある。固定抗体は、アミドもしくはエステル結合を介する共有結合のような方法又は吸着法によって、固相免疫吸着剤に共有結合せしめられるか又は物理的に結合せしめられてもよい。

上記競合試験と同様に、可溶性抗体は、放射性同位元素標識、蛍光標識、酵素標識、ラジカルｅｉ識又はバクテリオファージ標識のようないずれかの検出可能な標識で標識されてもよい。最も一般的には、標識は放射性同位元素標識又は酵素標識である。

上記のように、免疫測定試験では、アポリポタンパク質に対し種特異性がある２種の別個独立の抗体を必要とする。これら抗体のうち１ｇ！は固相支持体に結合しているが、他は検出可能なように１１Ａ識されている。本質的に２種の別個の抗体はＡＬＰ種特異性であるが、抗原性タンパク質中の異なるドメインと交差反応する。１つの態様において、２種の異なる抗体は、ＡＬＰアミノ酸配列配列中なる免疫原性及び免疫特異性セグメントに相当する２種の異なる合成配列を用いることにより産生されてもよい。例えば、図１において、合成ペプチドＡ′及び合成ペプチドＢ′はアポ−Ａ１における免疫原性及び免疫特異性の双方を有することが見出されたニ一方が基質に結合し、他方が検出可能に標識された、各々の合成配列に対する抗体を用いることは、各種のサンドインチ試験において有用である。

一方、例えばウサギ及びマウスにおいて同一の合成ペプチド配列を用いて異なる２種の抗血清を産生ずることにより、同一のアポリポタンパク質に対しては種特異性であるものの異なるドメインと交差反応する抗体を産生せしめることも可能である。

所謂ｄ延型免疫測定試験は、例えば、チュー（Ｃｈｕ）の米国特許第４，２８９，７４７号明細書及びウォルターズ（Ｗｏｌｔｃｒｓ　）の米国特許第４，３４３．８９６号明ａａに記載されているようにして利用することもできる。

更に、本発明の試験に使用される物質は理論的にキットのＢｌ　３Ｂにも適している。そのようなキットは、バイアル、試験管等のような１以上の容器手段を密閉収納するために仕切られた運搬手段からなっていてもよい。各々の上記容器手段は本発明方法において使用される個別的要素の１つを収容する。

例えば、上記容器手段の１つは免疫吸着剤結合抗体を収容していてもよい。これらの抗体は、異なる固相免疫吸着剤と結合していてもよく、又は容器の内壁に直接結合していてもよい。第二の容器は、凍結乾燥品又は溶液として検出可能に標識されたペプチドフラグメントを収容していてもよい。

運搬手段は、様々な既知間の抗原又はペプチドフラグメントを各々収容した多数の容器を有していてもよい。

これら後者の容器は標準曲線を作成するために使用することができ、未知母の抗原含有試料から得られる結果をこの標準曲線にあてはめることができる。

一般的プロトコール１、Ｌ反亙ＩＫ　Ｌ　＋−１と結合したペプチドは、各々のアポリポタンパク質と結合可能な単一特異性抗体を産生ずるために、ウサギのような実験動物の免疫に使用された。典型的実験では、抗体が産生されるべき特定のタンパク質的１００μ９をフロイント完全アジュバントと混合し、ウサギの支脚皿に皮下部位から免疫接種し、１０〜１４日後不完全フロインドアジュバントと混合された゛等ｍのタンパク質を皮下的に免疫接種し二更に１０〜１４日後、１０％水酸化アルミニウム溶液と混合された更に５０〜１００μりのタンパク質で動物を免疫する。動物はその後４週毎に５０〜１００μｓのタンパク質で免疫される。

■、試験各々のタンパク質に対し産生された特異的抗体の力価は、（ａ）酵素結合免疫ソルベント試験（ＥＬＩＳＡ）、及び（ｂ）放射性同位元素標識タンパク質分子を免疫沈降せしめる抗体の効力から測定された。典型的ＥＬＩＳＡ試験はでは、１０〜１００ｎｏの試験抗原（即ち特定の被検タンパク質）が小型滴定器（コアルコンブロダクッ（Ｆａｌｃｏｎ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　）又はベルコプロダクッ（Ｂｅｌ　Ｉｃ。

Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）　）のウェル底のタンパク質溶液を風乾することにより、プラスチック表面に結合せしめられる。一連の試験抗血清希釈液をウェル内でインキュベートし、未結合抗体を洗浄除去し、結合抗体を次いで試験抗血清が産生された免疫グロブリン種に対する酵素結合第二抗体調製液と一緒にインキュベートする。各つＩル中で結合した酵素えはしかる後適切な発色試験によって定番される。このような試験において、試験抗原に対する高力価抗体含有血清は数千倍に希釈することができ、それでもなお顕茗な発色を示す。被検血清試料の貯′ｉａ温度（室温、４℃、−２０℃及び−８０℃）いかんにかかわらず同レベルの７ポリボタンパク質を検出できることが判明した。

他の試験、即ち放射免疫沈降試験（ＲＩＰ）においては、試験抗原は　Ｉのような放射性同位体で標識される。一定足の放射性同位元素標識抗原は次いで一連の試験抗血清希釈液と一緒にインキュベートされる。免疫複白化抗体は、試験血清が産生された免疫グロブリン種に対する第二抗体を用い、又は固定スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　）細菌ＱＪｉ３液を用い、又はビーズ上に固定されたスタフィロコッカス・アウレウスタンパク質Ａを用いて沈降せしめられる。前記ＥＬＩＳＡ法と同様に、高力価特異的抗体含有血清は数千倍に希釈されてもなＪ５、多品の放ＤＩ性同位元素標識抗原を沈降させることができる。

いずれの試験においても、試験血精試料中の具体的抗体価は、非免疫処理動物由来血清又は試験タンパク質とは無関係のタンパク質で免疫処理された動物由来血清から得られる値（色又は沈降した放射能）を差引くことにより決定される。抗血清の持具性及び異なるタンパク質の免疫学的関連性は、いずれかの試験において、抗原結合性の範囲に関する血清希釈液の相対的効力を試験することによって評価することができる。

■、免疫ブＯット法典型的免疫プロット法において、タンパク質はまず変性還元剤の存在下でポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）に付される。タンパク質を次いで、トリス−ｌ−Ｉ　ＣＩ　、グリシン及びメタノール（又はイソプロパツール）含有伝導溶液中で電気泳動的にニトロセルロース股上に移動させる。ニトロセルロース股上の非特異的結合部位をウシ血消アルブミン含有トリスーＮａＣＩＩｉ衝液（３〜５％ｗｔ／ｖｏｌ　）によりブロックする。上記緩衝液中の特異的抗血清の適切な希釈液を次いで、特定のタンパク質に抗体分子を結合させるために、ニトロセルロース膜と接触させる。未結合抗体をツイーン（Ｔｗｃｅｎ　）２０のような非イオン系界面活性剤添加トリス緩衝液で洗浄づる。結合抗体含有タンパク質バンドは、次いで、（１）特異的抗体が産生された免疫グロブリン種に対する酵素結合第二抗体を用いる比色法、又は（２）二Ｉ〜ロセルロース股上の特定抗原と結合した免疫グロブリン分子に結合するためにスタフィロコッカス・アウレウス由来放射性同位元素標識タンパク質Ａを用いるオートラジオグラフィー法によって視覚化することができる。この免疫プロット法により、特異的抗体でＨｙｌされる分子種を同定することができる。したがって、この方法は、試験試料のようなく例えば、血漿又は血清中の〉アポリポタンパク質氾合物を用いることにより、抗ペプチド抗体血演の種特異性を評価するために利用することができる。

抗体調製物の種特異性が解明されると、更に簡易なアプローチ法が特定タンパク質の定量のために利用し得る。

本明細書において゛′免疫ドツトプロット″として述べられているこの方法では、ニトロセルロースフィルター上に生母の水溶液をスボッ１−シ、酢酸：イソブロバノール：水（１０：　２０　：　７０ｖ／ｖ　）のような酸アルコール混合物を用いてニトロセルロース上にタンパク質を固定し、しかる後上記抗体結合技術を実施することを要する。

免疫ドラ１−プロット法における低バツクグランド反応性を確保するために番よ、被検血清試料はまず、沸騰し、かつ１０ｍＭジチオスレイトールＳ有０．１％５ＤＳｆｆｉ液を血清中に加えて還元することにより処理される。この溶液は次いで沸騰水中に１０分間浸漬される。室温で冷却後、試料は等間の市販のパンゾルビンで処理される。

試料はしかる後ＡＰＬについて分析することができる。

体内プロトコール本発明の実施用のプロトコール：ＫＬＨ＋ＭＢＳ”　ＭＢ　−ＫＬＨＭＳ−ＫＬＩ−１＋ペプチド−３Ｈペプチド−Ｋ　Ｌ　ｌ−１＊　ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル１且１、ＫＬＩ］：ｐＨ７，２の１０ｍＭリン酸ｇ衝液（ＰＢ）に対し透析される。

使用前約２０ｗ＋ｙ／−に調整される。

２、　ペプチド：約５Ｑ／ｄ。カップリング前に新たに秤伍される。

３、ＭＢＳ４、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）５、ＰＢＳ（リン酸緩′ｆ１液）衆且１、　ガラス又は他の非プラスチック製の管を用いる。

２　、Ｋ　Ｌ　Ｈ２００μρにＰＢ５５μｍを加え、次いで徐々にＭ　Ｂ　Ｓ　８５Ｈｇ　（３り／ＭＢＳ１５００μｐＤＭＦ）を加える。

３、　室温で３０分間撹拌する。

４、　ｐＨ６，０の５０ｍＭリン酸ナトリウム［液で予備洗浄されたセファデックスＧ−２５カラム（層容邑約１５ｍＱ）に通す。

５、　約１ｄの両分を集める。

６゜　２８０ｎｍの吸光度を読取る。

７、ＭＢ−ＫＬＨ含有含有ピー金管−ルする。

８、ＭＢ−ＫＬＨ４１ＱにＰＢ１ｄ中のペプチド５ｍｇ（入手可能であれば：　Ｉ−ペプチドｉｏｏ、ｏｏ。

ｃｐｍを追加する）を加える。

９、ｐＨを７〜７．５に＜Ｎａ０ｔ−（又はｌ−（ＣＩで）調整する。

１０、室温で２〜４時間撹拌する。

１１、ＰＢＳで総量１０Ｉ＋！ｉ！に希釈する。

１２、　０．５．ｄずつ凍結する。

Ｉｌ、２−エヱ叉旦刃１ −次注射一第１日目− 最終容ｆｆ１１．！ＭとなるようにＰＢＳを用いてペプチド−ＫＬＨ複合体く２００μｇ／ウサギ）を不完全フロインドアジュバント１．５−及びミコバクテリウム３ηと混合し：乳化させる。支脚皿及び背中に沿った数か所に皮下的に１．！Ｍ／ウサギを注射する。

二次注射−第１４日目− 一次免疫と同様であるが、ミコバクテリウムを省略する。

三次注射−第２１日目− 最終容ｆｆ１１．２ｄとなるようにＡＩ　（ＯＨ）３１０ＩＩｒｇ／ＩＲ１含有ＰＢＳ中にペプチド−ＫＬＨ複合体（２００μｇ／ウサギ）を混合する。十分に振盪し、１１ｄ／ウサギを（腹腔又は皮下的に）注射する。

通常、三次注射後７８目及び１４日目（即ち、開始後２８日目及び３５日目）にウサギから採血する。

追加免疫はＡｌ（ＯＨ）３の点で三次免疫と同様であり、７日及び１４日後にウサギから採血する。

追加免疫において良好な応答をＸ導するペプチド聞／ウサギは（ペプチドに結合した）５０μｇＫＬＨ／ウサギまで減少させることができる。

Ｉ［１，ＥＬＩＳＡ操作１、　ウェル数９６の皿にウェル当りｐＨ７，４のＰＢＳ５０．ｌ中のタンパク質１０〜１１００ｎを加える。

２、　ウェルを乾燥させるために蓋のない３７℃のインキュベーター中で一夜インキユベートする。

３、　タンパク質を皿に固定するため、ウェルを無水メタノールで満たり。

４、　蒸留水で２回洗浄する。

５、　ウェルの非特異的結合部位をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）中の３％Ｂ５Ａ１０．０５％ツイーン２０１００μｍでブロックする。給湯室中３７℃で２〜４時間インキュベートする。

６、　０．０５％ツイーン２０含有ＰＢＳ溶液で２回ウェルを洗浄し、続いて蒸留水で２回洗浄する。

７、　皿の連続的ウェル中に所望回の試験抗体連続希釈液（１％ＢＳＡ及び０．０５％ツイーン２０含有ＰＢＳで調製された希釈液）を加える。

８、　給湯室中３７℃で２時間皿をインキュベートする。

９、　工程６を繰返す。

１０、　ヤギ族（適切な種類の）ペルオキシダーゼ複合体の望ましい希釈液５０ μｍを各ウェルに加え、３７℃で１時間インキュベートする。

１１、　工程６を繰返ず。

１２、　０．０１％Ｈ２Ｏ２含有リン酸−クエン酸緩衝液で調製したばかりの０ −フェニレンジアミンニ塩酸塩（ＯＰＤ）５０μρを各ウェルに加える。

１３、　所望の色が足りるままで反応を続ける。

１４、　所望の時間経過後、４Ｎ　Ｈ２ＳＯ４５０μｍで各ウェルの反応を停止させる。

１５、　ウェル中の発色を４９０ｎｍで読取る。

■、ｆニスターンプロット操１６　トリス−ＨＣｌ　（２０ｍＭ＞、グリシン（１５０ｍＭ）　、メタノール（２０％Ｖ／Ｖ　）を含有したｐＨ８，３の緩衝液でポリアクリルアミドゲルを２回（各々１０分間）洗浄する。

２、　上記緩衝液中にゲル大のニトロセルロース紙を浸漬する。

３、　標準プロット装置（即ち、バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）　、リッチモンド、カリフォルニア州）を用いる従来技術により、上記緩衝液中で移動させる。

４、　ブロック緩衝液、即ち３％８ＳＡ及び０．１％ＮＰ４０含有Ｍ笥液Ｂに浸漬することにより、非特異的結合部位をブロックする。

緩衝液Ｂは１０ｍＭｔ−リス塩基、１５０ｍＭＮａＣＩからなり、Ｉ）８７．４Ｆある。

５、　フィルターを蒸留水で洗浄する。

６、　所望の希釈倍率となるように適宜徂の抗体をブロック緩衝液に加える。ニトロセルロースフィルターをこの希釈抗体溶液と一緒に２０〜２５℃で２〜４時間又は−夜振盪する。。

７６　緩衝液Ｂ及び０．１％ＮＰ４０含有緩衝液Ｂで人聞に洗浄する。

ｓ、　１２５１標識ＳＰＡ含有ブロツク緩衝液（約５×１０５Ｃｐｆｆｌ／Ｉｄ）を加える。４５分間振盪する。

９、　緩衝液Ｂで１回（１０分間）、０．１％ＮＰ４０含有緩衝液Ｂで４回（各洗浄につき１０分間）、緩衝液Ｂで２回（各洗浄につき１０分間）洗浄する。

１０、フィルターを乾燥する。

１１、　−８０℃で一夜又は必要な時間Ｘ線フィルム（コダックＸ線ＸＡＲ−５）に暴露する。

以上のように本発明を概括的に説明したが、本発明は具体例によって更に詳細に説明され、一方かかる具体例は他に記載のない限り本発明の説明のためにのみ掲げられているのであって、本発明を限定するためのものでは変性アポリポタンパク質のウェスターン免疫プロット■ 電気泳動精製ヒトアポリポタンパク質△−１、Ｂ及びＣ−ｌ１１（Ｃ３）をカルビオケムベーリング社（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｅｈｒｉｎａ　Ｉｎｃ、　）　（ラジョラ、カルフォルニア州）から組入した。これらのタンパク質１００μ び／ｄ含有溶液及び（アポリポタンパク質Ｅの供給源としての）精製ヒト血清Ｖ　Ｌ　Ｄ　Ｌ　１００μ／〆含有溶液を１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＢＳ）中１００℃で１０分間インキュベートした。アポリポタンパク質１μ３含有試料を５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に塗布し、レームリ（Ｌａｍｍｌｉ）　ノ方法〔ネーチャー、第２２７巻、第６８０頁、１９７０年（Ｎａｔｕｒｅ。

２２７：６８０．１９７０））に従い電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に付した。

結果は図６に図示されている。パネル（Ａ＞の第１列及び第２列において、アポ −Ａ１及びアポ−Ｃ３の混合物を１３％５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分別した。

１１％ＳＤＳ　−ＰＡＧＥを用いて、第３列に塗布されたＶＬＤＬＩμ９からアポ−Ｅを分別した。５％ＳＤＳ　−ＰＡＧＥを用い、第４列に塗布されたアポ− Ｂを分別した。これらゲル系において各列に含まれる分子量標準の位置は、第１列と第２列の聞及び第３列と第４列の間に示されており；示された値はキロドルトンである。電気泳動終了後、“具体的プロトコール■”で記載されたウェスターン法により、１：１０００に希釈された特異的ペプチド抗血清で免疫プロットした。図１に示されたアポ−Ａ１ペプチド由来ペプチドＡ′及びＢ′から誘導される合成ペプチド抗血清は、第１列に示された結果を与えた。図２に示されたアポーＥペプチドＡ′配列から誘導される合成ペプチド抗血清は、第３列に示された結果を与えた。図３に示されたアポ−０３配列由来ペプチドＡ′から誘導される合成ペプチド抗血清は、第２列に示された結果を与え、同様の結果は図３に示されたペプチドＢ′山来抗血清についても得られた。図４に示されたアポーＢペプチドＡ′から誘導される合成ペプチド抗血清は、第４列に示された結果を与えた。各列で確認されたバンドの位置は、アポ−Ａ１　（２４，０００）、アポ− Ｂ　（２００，０００〜５００．０００）、アポ−Ｅ（３３，０００＞及びアポ −Ｃ３（１２，０００）についての既知分子量と一致する。

アポ−Ｂに対する我々の抗ペプチド血清は、ルボーフ（ＬｅＢｏｅｕｆ　）ら〔フエデレーション・オブ・ヨーロピアン・バイオケミカル・ソサエティーズ・レターズ、第１７０巻、第１０５頁、１９８４年（Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆＥｕｒｏｐｅａｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｏｃｉｅｔｉｅｓ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、　１７０：１０５゜１９８４）　）で公表された配列から誘導されたが、これらの研究者はヒトアポ−Ｂの単離されたＭＷ２４，０００及びＭＷ２２．０００のスタフィロコッカス・アウレウスプロテアーゼ切断フラグメントの部分的Ｎ末端配列決定を実施した。パネル（Ｂ）において、アポ−８約５μグをスタフィロコッカス・アウレウスプロテアーゼで切断し、次いで３〜２７％勾配５ＤＳ− ＰＡＧＥによるゲル電気泳動に付した。アポーＢベブヂドＡ’　（図４）抗血清を用いたウェスターンプロット法から、合成ペプチドがこのアポ−８プロテアーゼフラグメントに由来していることから予想されるようなＭＷ２４．０００の抗体を結合せしめる主バンドを検出する。

匠ユ天然アポリポタンパク質の免疫ドツトプロット、用免疫ドツトプロット分析は、合成ペプチド抗血清の特異性を確認するために、精製アポ−Ａ１、アポ−８及びアポ−Ｃｍ（Ｃ３）を用いて行われた。この操作は゛一般的ブロトコール■”で記載されたとおりに行なわれ、オー１〜ラジオグラフイー結果は図７に示されている。ニトロセルロースフィルター紙ストリップに、μｇ値で示された様々な吊のアポ−Ｂ１アポ−Ａ１又はアポ−Ｃ３を各スポットと隣接するようにスボツ１〜した。無関係のタンパク質混合ｖｌＪ（１μグ／スポツト）を各フィルターストリップ上にスポットし、更に各ストリップの下端に標ｔ￥（１μ９）及び指示されたμヒ聞のアポ−Ｂ１アポ−Ａ　及びアポ−０３の混合物をスポットした。

フィルターストリップを次いで合成ペプチド抗血清（１：１０００−８釈液）と −緒にインキュベートし、゛′プロ１へコール■”で記載されたように処理した。ストリップには、左から右にかけて、アポ−８（アポーＢスポット用にラベルされ、図４のペプチドＡ′からｍ　Ｑされる抗血清で試験される；同様の結果は、ここには示されていないが、図４のペプチドＢ′から誘導される抗血清を用いた場合にも得られた）、アポ−Ａ　（アポ−Ａ１スポラト用にラベルされ、図１のペプチドＡ′から誘導される抗血清で試験される：同様の結果は、ここには示されていないが、図１のペプチドＢ′から誘導される抗血清を用いた場合にも（９られた）、アポ−Ｃ（アポ−Ｃ３スポット用にラベルされ、図３のペプチドＡ ′からＨ４される抗血清で試験される；同様の結果は、ここには示されていないが、図３のペプチドＢ′から誘ηされる抗血清を用いた場合にも得られた）及びコントロール（アポ−Ｃ３スポツト用にラベルされ、図１のペプチドＡ′から誘導される抗血清で試験されるニアポーＡ１又はアポ−８及びフィルター上にスポットされたものとは異なるアポリポタンパク質から誘導されるペプチド抗血清を用いた別のコントロールでも、同様の結果、即ち抗体及び１２５１−１ａ　準タンパクｉＡの未結合を示した）とラベルされている。ＶＬＤＬとラベルされたストリップを、約２．１及び０．５μびの精製ヒトＶＬＤＬ並びに無関係タンパク質混合物及び該混合物に加えられたＶＬＤＬでスポットした。図２のペプチドＡ ′からＦｌｌｒ　Ｗ’４されるペプチド抗血清（１：１０００希釈液）と−緒にインキュベートすると、このストリップで示されるように、ＶＬＤＬのアポ−Ｅを特異的に検出することができた。

図７で示されるように合成ペプチド抗血清の特異性を確認し得る同様の結果は、ここには示されていないが、図１のペプチドＣ′　（アポ−Ａ）からｇ　ｌされる抗血清、図３のペプチドＣ’　（アポ−０３）からＭ　’１１される抗血清、並びに図５のペプチドＡ′及びＢ’　（アポ−Ａ２）から誘導される抗血清を用いた場合にも得られた。

しアポリポタンパク−のＥＬＩＳＡｆｆヒトアポ−Ａ２に対する合成ペプチド抗血清の特異性を確認するため、′具体的プロトコール■”に記載されたようなＥＬＩＳＡ法を利用して分析を実施した。

アポ−Ａ２５０ｎｏ／ウニ／Ｌ／を用い、次の抗体；即ち、（１）５０％硫酸アンモニウム沈降再懸濁抗体、及び（２）図５のアポ−Ａ２ペプチドＡ′及びＢ′ で“具体的プロトコール■”に従い免疫されたウサギ由来の一部精製免疫グロブリンについて１：１６００及び１：８０１釈液の力価を調べた。他の合成ペプチドで免疫されたウサギ由来血清の前免疫画分及び相当する両分は、同様のアポ− Ａ２抗原ウェルでごくわずかな力価しか示さなかった。

肚Ａアポリポタンパク質のサンドイッチＥＬＩＳＡ　Ｕ競”旦よ」」シ（権北一定の合成アポリポタンパク質ペプチドフラグメントに対して産生された抗体を用い、サンドインチＥＬＩＳＡ及び競合ＥＬＩＳＡの方法を実施した。

（ａ）　サンドイッチＥＬＩＳＡにおいては、合成ペプチドに対して産生されたアポ−Ａ１に対し特異的な抗体を、リン酸緩衝液中で一夜ＥＬＩＳＡウェルと結合させた。ウェルを洗浄して未結合抗体を除去し、次いで、脱脂質され〔チャン・ビー・イー及びノールズ・ビー・アール、ジャーナル・オブ・リビッド・リサーチ、第１７巻、第１７６−１８１頁、１９７６年（Ｃｈａｎ、　Ｂ、　Ｅ　ａｎｄにｎｏｗｌｅｓ、　Ｂ、　Ｒ，、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　１７：１７６−１８１　、（１９７６））　、４　Ｍグアニジン塩酸塩で処理され、又は１％トリトンｘｉｏｏで処理されたヒト血清の一連の希釈液と一緒にインキュベートした。室温又は３７℃で１〜２時間インキュベート後、ウェルを天吊に洗浄し、次いで１：５００に希釈された市販アポ−Ａ１モノクローナル抗体を加えた。１〜２時間のインキュベート後、ウェルを再度洗浄し、ネズミモノクローナル抗体の特異的結合性を、ウサギ抗マウス■ｇＧに結合した西洋ワサビペルオキシダーゼを用いて調べた。

（ｂ）　競合ＥＩＩＳＡにおいては、合成ペプチドに対して産生されたアポ−Ａ１に対して特異的な抗体でウェルを被覆した。血清を上記工程（ａ）と同様に希釈した。

血清の一連の面釈液をウェル中ピオチン化アポーＡ１タンパク質（トレーサー）５〜１５ｎＱと一緒にインキュベートし、固定化抗体に対する結合競合性の程度を、ウェルの洗浄後、結合ずべきストレプトアビジン−西洋ワサとペルオキシダーゼ複合体、続いて呈色を利用してモニターした。

既知濃度のアポ−Ａ１と一緒に血清を用い、試験血清試料中のアポ−Ａ１を足回するために、試験（ａ）及び（ｂ）の双方における標準曲線を作成した。

成上合成ペプチドに対して産生されたアポリポタンパク質Ａ、に対し特異的な抗体をアフィニティーＲＩＪし、被検試料に関する（ビオチン化された）単一抗体ＥＬＩＳＡを実施するために使用した。

図１で示されるように、アポ−Ａ　のＮＨ２末端近くに位置する配列のアポ−Ａ１の合成ペプチドＡ′に対して産生された抗体を含有する抗血清を、アフィニティークロマドグラフイーにより処理した。アフィニティーカラムを合成ペプチド及びセフイロースで調製した。特異的抗体をｐＨ２，５で５０ｍＭグリシンから溶出させた。

溶出抗体のピーク画分は、５ＤＳ−ＰＡＧＥにより、ることが示された。

以上のように本発明の詳細な説明したきたが、当業者が本発明の内容及び精神に影響を及ぼさない限り若干の修正をなし得ることは当業者にとって明らかであろう。

浄書（内容に変更なし）手続乎甫正書（方式）昭和６２年５月ｔ’ｌ−日

Claims

【特許請求の範囲】

１．アポリボタンパク質種特異性の、天然アミノ酸配列から誘導可能な免疫原性ペプチドフラグメント。
２．　アポリボタンパク質種特異性であってかつキャリアタンパク質と結合する、天然アミノ酸配列から誘導可能な免疫原性ペプチドフラグメント。
３．　標識可能な残基を有する、請求の範囲第１項又は第２項記載のペプチドフラグメント。
４．　キャリアタンパク質と結合可能な残基を更に有する、請求の範囲第１項又は第２項記載のペプチドフラグメント。
５．　配列中に１２〜１５個のアミノ酸を有する、請求の範囲第１項又は第２項記載のペプチドフラグメント。
６．　残基がシステインである、請求の範囲第４項記載のペプチドフラグメント。
７．下記配列：【配列があります】からなる、請求の範囲第１項又は第２項記載のペプチドフラグメント。
８．下記配列：【配列があります】からなる、請求の範囲第１項又は第２項記載のペプチドフラグメント。
９．下記配列：【配列があります】からなる、請求の範囲第１項又は第２項記載のペプチドフラグメント。
１０．下記配列：【配列があります】からなる、請求の範囲第１項又は第２項記載のペプチドフラグメント。
１１．下記配列：【配列があります】からなる、請求の範囲第１項又は第２項記載のペプチドフラグメント。
１２．下記配列：【配列があります】からなる、請求の範囲第１項又は第２項記載のペプチドフラグメント。
１３．下記配列：【配列があります】からなる、請求の範囲第１項第２項記載のペプチドフラグメント。
１４．下記配列：【配列があります】からなる、請求の範囲第１項又は第２項記載のペプチドフラグメント。
１５．下記配列：【配列があります】からなる、請求の範囲第１項又は第２項記載のペプチドフラグメント。
１６．下記配列：【配列があります】からなる、請求の範囲第１項又は第２項記載のペプチドフラグメント。
１７．下記配列：【配列があります】からなる、請求の範囲第１項又は第２項記載のペプチドフラグメント。
１８．カルボキシ末端にシステイン残基を更に有する、請求の範囲第７項記載のペプチドフラグメント。
１９．カルボキシ末端にシステイン残基を更に有する、請求の範囲第８項記載のペプチドフラグメント。
２０．カルボキシ末端にシステイン残基を更に有する、請求の範囲第９項記載のペプチドフラグメント。
２１．カルボキシ末端にシステイン残基を更に有する、請求の範囲第１０項記載のペプチドフラグメント。
２２．カルボキシ末端にシステイン残基を更に有する、請求の範囲第１１項記載のペプチドフラグメント。
２３．カルボキシ末端にシステイン残基を更に有する、請求の範囲第１２項記載のペプチドフラグメント。
２４．カルボキシ末端にシステイン残基を更に有する、請求の範囲第１３項記載のペプチドフラグメント。
２５．　カルボキシ末端にシステイン残基を更に有する、請求の範囲第１４項記載のペプチドフラグメント。
２６．カルボキシ末端にシステイン残基を更に有する、請求の範囲第１５項記載のペプチドフラグメント。
２７．カルボキシ末端にシステイン残基を更に有する、請求の範囲第１６項記載のペプチドフラグメント。
２８．カルボキシ末端にシステイン残基を更に有する、請求の範囲第１７項記載のペプチドフラグメント。
２９．次式：１）Ｈ２Ｎ−Ｘ−ＣＯ−Ｒ１〔上記式中、Ｒ１はＣｙｓ−ＣＯ−Ｒ２、ＯＨ、ＯＭ又は−ＮＲ３Ｒ４であり：Ｍは薬学上許容される陽イオン又は低級分岐状もしくは直鎖状アルキル基であり：Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は同一でも異なってもよく、水素及び低級分岐状もしくは直鎖状アルキル基からなる群より選択され；Ｘは請求の範囲第１項又は第２項のペプチドフラグメントである〕：２）その酸付加塩；並びに３）その保護又は一部保護誘導体；のペプチド。
３０．ペプチドフラグメントが、（ａ）【配列があります】（ｂ）【配列があります】（ｃ）【配列があります】（ｄ）【配列があります】（ｅ）【配列があります】（ｆ）【配列があります】（ｇ）【配列があります】からなる群より選択される、請求の範囲第２９項記載のペプチド。
３１．アポリボタンパク質種特異性抗体と交差反応する、天然アミノ酸配列から誘導可能な、検出可能に標識されたペプチドフラグメント。
３２．検出可能な標識が、放射性同位元素標識、酵素標識、蛍光標識、化学ルミネセンス標識及びバクテリオファージ標識からなる群より選択される、請求の範囲第３１項記載の検出可能に標識されたペプチドフラグメント。
３３．検出可能な標識が放射性同位元素標識である、請求の範囲第３２項記載の検出可能に標識されたペプチドフラグメント。
３４．放射性同位元素標識が１２５Ｉである、請求の範囲第３３項記載の検出可能に標識されたペプチドフラグメント。
３５．免疫原として請求の範囲第１項又は第２項記載のペプチドフラグメントを用いることにより誘導可能な、アポリボタンパク質種特異性抗血清。
３６．請求の範囲第１項又は第２項記載のペプチドフラグメントからなる免疫原を用いることにより誘導される、アポリボタンパク質種特異性の検出可能に標識された抗体。
３７．　試料中のＡＬＰを定性及び／又は定量するための方法であって、予測されるＡＬＰを含有した上記試料を、請求の範囲第３１項の標識ペプチドフラグメント及び上記ＡＬＰに対する抗体と接触させ、しかる後、上記抗体及び上記標識ペプチドフラグメント間の結合の程度を測定する、ことからなる方法。
３８．試料中のＡＬＰを定性及び／又は定量するための方法であって、ＡＬＰ含有が予測される上記試料を、請求の範囲第３６項の標識抗体及び該標識抗体と交差反応するドメイン以外の上記ＡＬＰ上のドメインと交差反応する第二固定化抗体と接触させ、しかる後、標識抗体量を測定する、ことからなる方法。
３９．１以上の容器手段を収納するために仕切られた運搬手段、及び請求の範囲第３１項の標識ペプチドフラグメントを含有した上記１以上の容器手段のうち少なくとも１つからなる、ＡＬＰ検出用キット。
４０．１以上の容器手段を収納するために仕切られた運搬手段、請求の範囲第３６項の標識抗体を含有した上記１以上の容器手段のうち少なくとも１つ、未標識抗体（該未標識抗体は、上記ＡＬＰに対し特異的であるが、上記ＡＬＰ上の別のドメインと交差反応する）を含有した上記１以上の容器手段のうちの残余からなる、ＡＬＰ検出用キット。