JPH06279494A

JPH06279494A - リポタンパク質（ａ）ペプチドおよびその使用

Info

Publication number: JPH06279494A
Application number: JP1530994A
Authority: JP
Inventors: Geoffrey Dr Burns; バーンスゲオフレイ; Wolf-Dieter Engel; エンゲルヴォルフ−ディーター; Christoph Seidel; サイデルクリストフ
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1993-02-09
Filing date: 1994-02-09
Publication date: 1994-10-04

Abstract

(57)【要約】（修正有）【目的】リポタンパク質Ｌｐ（ａ）に対する抗体の簡単
な精製法、及びＬｐ（ａ）の特異的測定のための信頼で
きる検出方法を提供する。【構成】配列番号１〜８の配列の１つを含み，ＣＤスペ
クトルにおいて１９０と２００ｍｍの間にネガティブバ
ンドを有するリポタンパク質（ａ）ペプチド、及びアフ
ィニティークロマトグラフィーによる抗体の精製のため
のこれらの使用、そして抗体の製造のための免疫原とし
てのおよび免疫学的試験における標準物質または凝集試
験における競合ハプテンとしてのこれらの使用。配列番号：

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、リポタンパク質（ａ）
の配列の一部分を有するペプチド、アフィニティークロ
マトグラフィー手法による抗体の精製のためのこれらの
使用、そして抗体の製造のための免疫原としての、およ
び免疫学的試験における標準物質としてのまたは凝集試
験における競合ハプテンとしてのこれらの使用に関する
ものである。

【０００２】

【従来の技術】リポタンパク質（ａ）（Ｌｐ(ａ)）が高
濃度であることは、ＬＤＬ濃度とは無関係に心筋梗塞ま
たは卒中の危険因子を意味している（H.-C.Guoら，Jour
nal ofLipid Research 30 (1989), 23-37）。診断にお
けるこの危険因子の意義は、特に、このＬｐ（ａ）濃度
が食習慣またはヒドロキシ−メチルグルタリル−ＣｏＡ
リダクターゼ阻害剤を使用した治療によって影響を受け
ないことから、このＬｐ（ａ）濃度を測定することによ
り心筋梗塞または卒中の遺伝的素因の重要な指標が得ら
れる点である（C.Labeurら，Clinical Chemistry 35(19
89),1380-1384）。

【０００３】しかし、Ｌｐ（ａ）は一方でコレステロー
ルエステル高含有の点およびアポタンパク質Ｂ１００が
成分である点においてＬＤＬにきわめて類似しているこ
と、そして他方、ＬＤＬからＬｐ（ａ）を区別するもの
であるアポタンパク質（ａ）がプラスミノーゲンへの非
常に高い相同性を示すという事実によって、Ｌｐ（ａ）
の診断上の特異的検出が困難となっている（H.-C.Guo
ら，Journal of Lipid Research 30(1989),23-37）。し
たがって、Ｌｐ（ａ）の免疫感作によって得られた抗血
清はＬｐ（ａ）のみでなく、ＬＤＬおよび／またはプラ
スミノーゲンとも相当程度反応する。

【０００４】それでもなお、Ｌｐ（ａ）を可能なかぎり
特異的に検出するため、Ｌｐ（ａ）に対する抗血清が、
ＬＤＬ、Ｌｐ（ａ）またはアポリポタンパク質（ａ）上
の時間のかかる免疫吸着精製によって精製された（Kraf
t ら、Arteriosclerosis 8(1988),212-216）。さらに、
特別のＥＬＩＳＡ試験操作手段によって、特異的Ｌｐ
（ａ）試験を成功させる試みが行なわれた（Fless ら、
Journal of Lipid Research 30 (1989),651-662）。こ
の方法においては、例えば、試料から検出すべきＬｐ
（ａ）を固定化するのにアポリポタンパク質（ａ）に対
する抗体を使用し、そして固定化したＬｐ（ａ）を検出
するのにアポリポタンパク質Ｂ１００に対する抗体を使
用する。しかし、これらの方法はきわめて時間がかか
る。その上、Ｌｐ（ａ）の生理的濃度（１mg/ml 以上に
至るまで）においては、きわめて干渉を受けやすいＥＬ
ＩＳＡ原理による測定のために、試料の高倍率（100 か
ら1000倍）の希釈が必要である。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、した
がって、Ｌｐ（ａ）に対する抗体の簡単な精製法、そし
てＬｐ（ａ）の特異的測定のための、信頼できる検出方
法を提供することであった。

【０００６】

【課題を解決するための手段】この目的は、配列番号：
１−８に示される配列の１つを含み、ＣＤスペクトルに
おいて190 と200 nmの間にネガティブバンドを示すペプ
チドによって達成される。配列番号：１−８に示される
配列の一部分のみを含んでおり、類似の機序で結合する
ペプチドもまた、本発明に好適である。しかし、そうし
たペプチドの最小の長さは４アミノ酸である。

【０００７】これらのペプチドの総長は、それらがラン
ダムコイル構造をとっている限り、制限はない。しか
し、50アミノ酸より長いペプチドの使用は、合成のため
により多くの時間を要し、不均質で未決定の種々の長さ
のペプチドの混合物が形成されるため、通常有利ではな
い。長さ４から20アミノ酸を有するペプチドが好ましく
使用される。

【０００８】本発明によるペプチド抗原の適合性に関し
て、これらが一定の折畳み構造ではなく線状型で存在す
ることが必要である。この線状構造はランダムコイル構
造をも意味する。あるオリゴペプチドがこうした構造を
有しているかどうかを調べるのにＣＤ分光法を使用して
もよい。ランダムコイル構造を有するペプチドはＣＤス
ペクトルにおいて190 と200nm の間にネガテイブバンド
を有する（Ann.Rev.Biophys.Chem.17 (1988),145-166参
照）。

【０００９】本発明のペプチドは既知の方法、好ましく
はフルオレニル−オキシカルボニル固相合成法によっ
て、製造される。驚くべきことに、これらのペプチドの
使用により、ＬＤＬおよび／またはプラスミノーゲンに
は低反応性しか有していない、Ｌｐ（ａ）に対する抗体
を、アフィニティークロマトグラフィー法によって１ス
テップで得ることが可能であることがわかった。ここに
おいて、低反応性という用語はＬＤＬおよび／またはプ
ラスミノーゲンとの交差反応性がＬｐ（ａ）との反応性
に比較して多くとも1.0 ％であることを意味するものと
理解される。

【００１０】したがって、本発明はさらに、（ａ）ペプ
チドが担体物質に結合され、この上で抗体がアフィニテ
ィークロマトグラフィーにより既知の操作によって精製
できるアフィニティークロマトグラフィーによるＬｐ
（ａ）に対する抗体の精製のための、本発明のペプチド
の使用、また別に（ｂ）ペプチドが担体物質に結合さ
れ、この上で抗体がアフィニティークロマトグラフィー
により既知の操作によって精製できるアフィニティーク
ロマトグラフィーによるＬｐ（ａ）に対する抗体の精製
の方法に関する。

【００１１】アフィニティークロマトグラフィーにおい
て通常使用されるすべての担体物質が担体物質として使
用され得るが、Sepharose-AH（Pharmacia LKB)または A
ffi-Gel 10 （BioRad）が好ましく使用される。この過
程においてペプチドのSepharose-AHへの結合はマレイミ
ドベンゾイル-Ｎ-ヒドロキシ−サクシンイミドエステル
（ＭＢＳ）またはグルタルアルデヒドによるペプチドの
活性化を行なうことにより、既知の方法で実施される。
Affi-Gel 10 への結合にはペプチドの活性化を必要とせ
ず、製造業者の指示に従って実施される。この方法で得
られたアフィニティークロマトグラフィーマトリックス
を使用する抗血清の精製は、抗血清を加え、高イオン強
度の緩衝液で洗浄し、続いて低イオン強度で５以下のｐ
Ｈ値の緩衝液で溶出することより、既知の方法で実施さ
れる。好ましくは0.5mol/l塩化ナトリウム中のＰＢＳ
（Dulbecco and Vogt, J.Exp.Med.99 (1954),167-182に
よる）で洗浄し、0.2mol/lグリシン塩酸ｐＨ2.6 で溶出
される。この方法で得られる抗体は、ＬＤＬおよびプラ
スミノーゲンとは低い反応性しか示さない。

【００１２】さらに本発明のペプチドは、ＬＤＬおよび
／またはプラスミノーゲンには低い反応性しか有しな
い、Ｌｐ（ａ）に対する抗体の製造のための免疫原また
はハプテンとして好適である。したがって、本発明は、
（ａ）ＬＤＬおよび／またはプラスミノーゲンには低い
反応性しか有しない、Ｌｐ（ａ）に対する抗体の製造の
ための免疫原としての本発明のペプチドの使用、また別
に（ｂ）免疫原として本発明のペプチドを使用する、Ｌ
ＤＬおよび／またはプラスミノーゲンには低い反応性し
か有しない、Ｌｐ（ａ）に対する抗体の製造方法にも関
している。この過程においては、ペプチドは免疫感作の
ためのペプチドとして使用するか、または担体分子に結
合される。免疫感作はこのために通常使用される動物に
おける既知の方法で実施される。ウサギ、ヤギ、ラッ
ト、ヒツジ、またはモノクロナール抗体の製造のために
は、マウスが好ましく使用される。得られた抗血清は、
好ましくは、アフィニティークロマトグラフィーによ
り、上に記載したように精製することができる。モノク
ロナール抗体の製造のためには、免疫感作した動物の脾
臓細胞を既知の方法によって不死化し、培養上澄液がＬ
ｐ（ａ）に対する抗体を含んでいるそれらの不死化した
細胞をクローン化する。培養上澄液がＬｐ（ａ）に対す
る抗体を有しているかどうかは、ＥＬＩＳＡ試験の方法
による通常の手法で決定される。

【００１３】本発明のペプチドのさらに有利な点は、こ
れらが均一な組成で大量に得られることである。そのた
めこれらは、天然の素材から分離したきわめて不均一な
物質よりも、Ｌｐ（ａ）の定量測定の標準物質としてよ
り好適である。したがって、本発明のさらに別の目的
は、Ｌｐ（ａ）定量測定のための免疫試験における標準
物質としての本発明のペプチドの使用である。この場
合、Ｌｐ（ａ）の免疫測定は、すべての既知の方法によ
って実施することができる。例えば非競合試験システム
のようなある種の場合においては、等しいかまたは異な
る配列を有するいくつかの本発明のペプチドを担体分子
に結合させる必要がある。

【００１４】さらにこの発明は、競合免疫試験における
ハプテンとしての本発明のペプチドの使用にも関してい
る。このためには、本発明のペプチドは好ましくはビオ
チニル化され、ストレプタビジン（streptavidin）で被
覆した固相に結合され、ＥＬＩＳＡ原理に基づく通常の
方法で、競合試験が実施される。しかし、ＥＬＩＳＡ原
理に基づく競合試験においては、本発明のペプチドは標
識（酵素、蛍光標識）に結合することもできる。

【００１５】しかし、ＥＬＩＳＡに基づく免疫検定にお
いては、Ｌｐ（ａ）が生理的濃度である場合、試料の高
度の、したがって時間がかかり、ミスを起こしやすい前
希釈を行なう必要がある。この場合、濃度範囲の点にお
いてより好適な比濁分析測定法（ＴＩＮＩＡ＝比濁阻害
免疫検定(turbidimetric inhibition immunoassay)）
は、これまでのところ、Ｌｐ（ａ）がある特定の条件下
でないと、ポリクロナールについて、モノクロナール抗
体と同様に、適切な濁度シグナルを示さないという事実
において障害があった。しかし、本発明のペプチドの１
つまたはいくつかをある担体に結合させ、得られた複合
体を凝集試験のハプテンとして使用する場合には、そう
した適切な濁度を得ることができる。そしてこの濁度
は、測定すべき被検体によって、被検体の量に比例した
量だけ、減少する。１担体分子あたりペプチド30から40
分子を結合させるのが望ましい。担体への本発明のペプ
チドの結合は、この場合、直接共有結合によっても、ま
たは例えばペプチドをビオチニル化し、担体物質をスト
レプタビジンで被覆することにより、間接的に行なうこ
ともできる。免疫グロブリン、アルブミン、β−ガラク
トシダーゼなどのタンパク質、アミノデキストランまた
はポリリシンなどの高分子、あるいはラテックスまたは
金などの粒子が単独であるいは互いに組み合わせて、担
体分子として好適に使用される。担体分子への結合は、
たとえばグルタルアルデヒド、エチルジメチルアミノプ
ロピルカルボジイミド、マレイミドヘキサン酸−Ｎ−ヒ
ドロキシサクシンイミドエステルのような試薬、または
他の既知のホモまたはヘテロ２官能連結剤を使用して、
既知の方法で行なうことができる。

【００１６】したがって本発明は、Ｌｐ（ａ）の測定の
ための凝集試験における、本発明のペプチドのＬｐ
（ａ）ハプテンとしての使用にも関するものである。こ
こで、本発明の少なくとも１つのペプチドをある担体に
結合させ、この方法で形成された複合体を、この各々の
Ｌｐ（ａ）ハプテンを認識する抗体とインキュベートし
て凝集を生じさせるが、試料からの遊離のＬｐ（ａ）が
存在すると、この凝集の生成が減少する。

【００１７】最後に本発明は、担体に結合したＬｐ
（ａ）ハプテンをこのハプテンに対する抗体と分析すべ
き試料とともにインキュベートし、この分析すべき試料
の存在下または不存在下でこの過程において生じる測定
シグナルを測定する競合凝集試験によるＬｐ（ａ）の免
疫測定方法であって、この担体結合Ｌｐ（ａ）ハプテン
が本発明のペプチドの少なくとも１つを含んでいる前記
の方法に関するものである。

【００１８】この過程における凝集試験は周知の方法で
実施される。このためには、例えばまず、担体に結合し
たＬｐ（ａ）ハプテンを、このハプテンを認識し、それ
故担体結合Ｌｐ（ａ）ハプテンとの複合体を形成する抗
体とともにインキュベートすると、ある測定シグナルが
得られる。このシグナルは通常この試薬溶液の一定の濁
度である。分析すべき試料の添加後、試料からの遊離の
Ｌｐ（ａ）が抗体との結合に関して担体結合Ｌｐ（ａ）
ハプテンと競合し、そのため抗体による担体結合Ｌｐ
（ａ）ハプテンの凝集すなわち濁度が減少する。測定し
た濁度の減少を、既知の量のＬｐ（ａ）標準物質を添加
したときに得られる濁度の減少と比較し、この比較によ
って分析すべき試料中のＬｐ（ａ）量が決定される。本
発明のペプチドがこの標準物質として好ましく使用され
る。これとは別に、当業者に慣用の競合試験操作に関す
る他の方法によって、凝集試験を実施することも可能で
ある。たとえば、担体結合Ｌｐ（ａ）ハプテンを試料と
抗体とともに同時にインキュベートして、その間試料か
らの遊離のＬｐ（ａ）が抗体との結合に関して担体結合
ハプテンと競合する結果、観測される凝集が試料中の遊
離のＬｐ（ａ）の量に反比例するようにしてもよい。さ
らに、まず抗体を試料とともにインキュベートすること
によって、試料中の遊離のＬｐ（ａ）の量に相当する量
の抗体を結合させることも可能である。担体結合Ｌｐ
（ａ）ハプテンとともにインキュベートした後、試料中
の遊離のＬｐ（ａ）量に正比例する凝集が生じる。

【００１９】この過程において、Ｌｐ（ａ）濃度は、モ
ルベースで（例えば配列配列番号：８に示されるペプ
チドなどの、Ｌｐ（ａ）中に１箇所のみに存在するペプ
チドを使用する場合）、または質量ベースで（例えば配
列番号：１−７に示される配列を有するペプチドなど
の、Ｌｐ（ａ）分子あたり数箇所に存在するペプチドを
使用する場合）、測定される。

【００２０】さらに、本発明は、ある標識に結合したＬ
ｐ（ａ）ハプテンをこのハプテンに対する抗体と分析す
べき試料とともにインキュベートし、この分析すべき試
料の存在下および不存在下においてこのようにして生じ
る測定シグナルを測定するＬｐ（ａ）の免疫測定方法で
あって、この標識に結合したＬｐ（ａ）ハプテンが本発
明のペプチドの少なくとも１つを含んでいることを特徴
とする前記の方法に関するものである。この過程におい
て、標識として、酵素、酵素フラグメント、化学発光ま
たは蛍光染料、および放射性同位体などの、通常使用さ
れるすべての標識が使用できる。測定は好ましくはＦＰ
ＩＡ、ＥＭＩＴまたはＣＥＤＩＡ原理によって実施され
る。

【００２１】蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）にお
いては、ハプテンは蛍光物質で標識される。これらの分
子は光エネルギーを吸収し、約10^-8秒後、より長い波長
の光として再び放出する。その発蛍光団が偏光によって
励起されると、放出光の偏光度はトレーサー（被検体−
発蛍光団複合体）の回転スピードに依存する。トレーサ
ーの抗体との結合が発蛍光団の回転を妨害する。遊離の
トレーサーは、大きくてより不活性の抗体−トレーサー
複合体よりも速く回転し、励起光をより多く偏光解消す
る。試料中に存在する被検体が多いほど、抗体−トレー
サー複合体の形成はより少なく、そしてより小さい蛍光
偏光が測定されることになる（W.Dandliker ら、Journa
l of Exp.Med.122(1965),1029 ）。

【００２２】酵素増幅免疫検定法（enzyme multiplied
immunoassay technique ）（ＥＭＩＴ）においては、検
出すべきハプテンをマーカー酵素と、その酵素活性が保
持されるような方法で、共有結合させる。しかし、抗体
がハプテンの部分に結合した後は、酵素への基質の結合
が立体的に妨害されるので、基質の酵素による変換を生
じさせることができない。ＣＥＤＩＡ原理におけると同
様にこの場合も、測定すべき試料溶液からの抗原が、酵
素結合ハプテンから抗体を追い出し(displace)、かくし
て試料溶液中の分析すべき抗原の濃度に比例した酵素作
用を可能にする（ Gunzer ら、"Kontakte III",1980,3-
11および K.Rubenstein, Biochemical and Biophysical
Research Communications 47(1972),846-851 ）。

【００２３】ＣＥＤＩＡ原理においては、分析すべき試
料からの抗原のみが、不活性酵素受容体と不活性酵素供
与体との会合に影響を与えて、活性な酵素を生成させ
る。そしてこの活性が分析すべき試料中の抗原の量に比
例する(Henderson et al., Clinical Chemistry 32 (19
86), 1637-1641) 。この場合、検出のためには、それぞ
れ２つの酵素的に不活性な成分、すなわち大きなポリペ
プチド（酵素受容体）と小さなポリペプチド（酵素供与
体）として存在し、これらの成分が自然に会合して酵素
的に活性なタンパク質を形成する、例えばβ−ガラクト
シダーゼのような特定の酵素が使用される。被検体とし
て検出すべきハプテンは、その結合によって、活性な酵
素を形成するための酵素供与体の酵素受容体への会合が
妨げられないような方法で、酵素供与体に結合される。
しかし、抗原に対する抗体が抗原−酵素供与体複合体に
結合したときには、この会合は妨げられる。したがっ
て、酵素受容体、抗原−酵素供与体複合体およびこれに
相当する抗体が存在する試薬溶液中では、活性な酵素は
形成されず、酵素活性は測定されない。試料溶液添加後
は、この試料溶液からの抗原が抗体を抗原−酵素供与体
複合体との結合から追い出し、そして活性な酵素の形成
を可能にする。

【００２４】ペプチドをある担体物質に結合させ、そし
てこの上で抗体をアフィニティークロマトグラフィーに
より既知の方法で精製するアフィニティークロマトグラ
フィーによる、Ｌｐ（ａ）に対する抗体の精製方法、ま
たは本発明のペプチドを免疫原として使用する、ＬＤＬ
および／またはプラスミノーゲンに低反応性である、Ｌ
ｐ（ａ）に対する抗体の製造方法によって製造された抗
体は、Ｌｐ（ａ）の検出のための免疫学的方法に、特に
好適である。したがって、本発明は、Ｌｐ（ａ）の検出
のための免疫学的方法における、本発明の抗体の使用に
も関するものである。

【００２５】本発明のペプチドの配列を示す、配列表１
−８とともに、以下の実施例によって、本発明をさらに
明らかにする。

【００２６】

【実施例】

実施例１ペプチドの合成Ｃ末端のＣｙｓによって延長される、配列番号: １を有
するペプチドは、フルオレニルオキシカルボニル（Ｆｍ
ｏｃ）固相合成法によって製造された。その反応はラボ
ルテック(Labortec)SP 640ペプチド合成装置（Laborte
c, スイス）で実施された。この場合、合成は、５ｇの
ウォング(Wang)樹脂 (ポリスチレン/1％ジビニルベンゼ
ン) 上で0.5mmol/g のペプチド添加量で実施された（JA
CS 95 (1973),1328 と類似）。カップリングは、反応媒
体としてのジメチルホルムアミド中で、樹脂を、相当す
るＦｍｏｃアミノ酸誘導体（１当量）とジシクロヘキシ
ルカルボジイミド 1.2当量、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリ
アゾール 1.1当量とともに室温で90分間、インキュベー
トすることによって実施された。アンカー基１mol に対
してそれぞれのＦｍｏｃアミノ酸誘導体４当量を、次の
順序で使用した：グルタミン（トリチル保護基を有す
る）、アラニン、プロリン、トレオニン（３級ブチル保
護基を有する）、グルタミン酸（３級ブチルエステル保
護基を有する）、グルタミン（トリチル保護基を有す
る）、アルギニン（ペンタメチルクロミウム保護基を有
する）、プロリン、グリシン、バリン、グルタミン（ト
リチル保護基を有する）、グルタミン酸（３級ブチルエ
ステル保護基を有する）およびシステイン（トリチル保
護基を有する）。カップリング収率はカイザー(Kaiser)
試験によって検査された（ Anal.Biochem.34 (1970),59
5 ）。カップリング後、ジメチルホルムアミド中、20％
ピペリジンとともに室温で10−20分インキュベートする
ことによって、Ｆｍｏｃ基が切断された。樹脂の配合量
(loading) は各ピペリジン開裂後、放出されたフルベン
基のＵＶ吸収の方法によって測定された。ペプチドの完
全合成後でも、配合量は0.43mmol/gであった。

【００２７】ペプチドは、トリフルオロ酢酸 200ml、エ
タンジチオール20ml、ｍ−クレゾール20mlおよび水10ml
とともに室温で30分間インキュベートすることによっ
て、樹脂から切り離された。続いて反応溶液を、空気を
排除しながら、トルエンとともに数回蒸発させ、そして
過酸化物を含まないジエチルエーテルによってペプチド
を沈澱させた。

【００２８】精製のため、得られた粗生成物を窒素雰囲
気下セファデックス−Ｇ10カラムを通すことによって精
製した。凍結乾燥後、ＲＰ−ＨＰＬＣによって純度54％
の物質 2.4ｇが得られた。さらに精製するため、このペ
プチド 400mgを、分取ＲＰ−ＨＰＬＣカラム（40mmｘ25
0mm Ｃ18物質、５μm、300Å）によって、水／トリフル
オロ酢酸からアセトニトリル／トリフルオロ酢酸勾配
（緩衝液Ａ：水中 0.1％トリフルオロ酢酸、緩衝液Ｂ：
水／アセトニトリル 60:40中 0.1％トリフルオロ酢酸、
60分間でＢ０％からＢ 100％まで）で精製した。凍結乾
燥後、ＨＰＬＣによって純度97.2％の白色物質97mgが得
られた。ＦＡＢ−ＭＳ法によって、得られたペプチドの
同一性を調べた。

【００２９】実施例２ペプチドのビオチニル化実施例１によって得られたペプチド抗原１モル当量のビ
オチニル化のため、このペプチドをアルゴン飽和リン酸
カリウム緩衝液（0.1mol/l pH8.0）に濃度５ mg/mlで溶
解し、Ｄ−ビオチニル-ε-アミノカプロン酸−Ｎ−ヒド
ロキシサクシンイミドエステル３当量（１μmolをアル
ゴン飽和ジメチルホルムアミド５μlに溶解）を添加
し、アルゴン雰囲気中、撹拌しながら、室温で２時間イ
ンキュベートした。分析用ＲＰ−ＨＰＬＣによってモニ
ターし、初期生成物が５％より少なくなった時、反応混
合物を直接分取ＲＰ−ＨＰＬＣカラムに通し、生成物を
0.1％トリフルオロ酢酸／水から 0.1％トリフルオロ酢
酸／アセトニトリル勾配法（90分間に０％から100 ％ア
セトニトリルまで）によって精製した。生成物を濃縮お
よび凍結乾燥したところ、収率は40から90％であった。
得られた物質の純度をＨＰＬＣ、毛管電気泳動およびＴ
ＬＣ法によって測定し、その同一性をＦＡＢ−ＭＳおよ
び特異的染色試薬（ビオチン含有のためのｐ−ジメチル
アミノシンナムアルデヒド）を使用したＴＬＣによって
測定し、そして微量分析法によってアッセイを行なっ
た。

【００３０】実施例３Ｌｐ（ａ）に対する抗血清のアフィニティークロマトグ
ラフィーによる精製チェルシ（Chersi）らによって述べられているようにし
て（J.Immunol.Meth.122 (1989),285-289）、免疫吸着
剤を製造した。このために、セファロース−ＡＨ（ＰＢ
Ｓ６ml中に充填したゲル３ml）を室温で２時間、注意
深く混合しながら、マレイミドベンゾイル-Ｎ-ヒドロキ
シサクシンイミドエステル（ＭＢＳ、ジメチルホルムア
ミド中５mg/ml ）で処理した。続いて、過剰のＭＢＳを
４℃、15分間2000ｇで遠心分離して除去した。ゲル物質
を洗浄するため、これをＰＢＳ中に再懸濁し、再び遠心
分離した。これらの洗浄サイクルを数回繰り返した。最
後の遠心工程後、ＰＢＳ４ml中の配列番号：１−８に
示される配列を有するペプチドの当モル混合物２mgをゲ
ルに加え、注意深く混合し、室温で60分間インキュベー
トした。次に、懸濁液にメルカプトエタノールを最終濃
度10mmol/lとなるように添加し、再び30分間インキュベ
ートし、小さなカラムに分配し、ＰＢＳ／10mmol/lメル
カプトエタノールで洗浄した。抗体を精製する前に、こ
のゲル物質に以下のような洗浄サイクルを行なった。少
なくとも３カラム容積のＰＢＳ、 0.5mmol/lＮａＣｌ／
0.05％Tween20 、30mmol/lＮａＣｌ、0.2mol/lグリシン
ｐＨ2.6 、そして30mmol/lＮａＣｌで洗浄した。次に
ゲル物質をＰＢＳ、ｐＨ7.0で平衡化し、抗体を含んで
いる精製すべき血清をカラムに通した。ＰＢＳ、0.5mol
/lＮａＣｌ／0.05％Tween20および30mmol/lＮａＣｌに
よる洗浄工程後、結合した抗体を0.2mol/lグリシン、ｐ
Ｈ2.6 により溶出し、その後４℃において直接ＰＢＳに
対して透析した。

【００３１】実施例４免疫吸着により精製した抗体の特異性の測定実施例３によって得られた抗体の特異性をサンドイッチ
検定の方法によって測定した。このために以下の試薬を
使用した：試薬１：実施例１に従って調製したビオチニル化ペプチ
ド（0.2μg/ml） 40mmol/lリン酸緩衝液ｐＨ7.0、0.9 ％塩化ナトリウ
ム 10％ＢＳＡ試薬２：20mU/ml ペルオキシダーゼ標識したヒツジ免疫
グロブリンＧに対するＦａｂフラグメント（Boehringer
Mannheim GmbH,Cat.No.1301 977） 40mmol/lリン酸緩衝液ｐＨ7.0 0.5 ％Ｔｗｅｅｎ20 0.2 ％ＢＳＡ 0.2 ％ウシ免疫グロブリン（Sigma,Cat.No.Ｉ5506）この実験操作のため、試薬１１mlと１：100 に希釈し
た試験すべき抗体溶液10μlとをストレプタビジンで被
覆したポリスチレン管（ＥＰ−Ａ 344 578の実施例１に
したがって製造）にピペットで入れて、室温で１時間イ
ンキュベートした。つぎにこの管を正常の水道水で３回
洗浄し、続いて試薬２１mlと室温で１時間インキュベ
ートし、そして再び水道水で３回洗浄した。3.2mmol/l
過ホウ素酸ナトリウム含有100mmol/l リン酸−クエン酸
緩衝液ｐＨ4.4 中ＡＢＴＳ^R（ Boehringer Mannheim Gm
bH,Cat.No.746407 ）を添加し、室温で60分インキュベ
ートした後、標識Ｆａｂフラグメントの結合を420nm に
おける吸光度を測定することにより決定した。次表は８
つの試験抗血清と配列番号：１−８に示された配列のペ
プチドとの反応性を示す。この場合、10のネガティブコ
ントロール血清の平均値よりも３標準偏差高い値を示す
シグナルを陽性としている。

【００３２】

【表１】

【００３３】実施例５免疫吸着によって精製した抗体の交差反応性抗血清ａ（実施例４、表１参照）の交差反応性を測定す
るために、異なる濃度（濃度は表２参照）のＬｐ
（ａ）、ＬＤＬおよびプラスミノーゲンの存在下で、実
施例４に記載したサンドイッチ免疫検定を実施した。こ
の過程において、添加した遊離の抗原は、固定されたビ
オチニル化ペプチドと、抗血清との結合に関して競合
し、その結果、抗血清の固相への結合が、かくしてシグ
ナル強度が、添加した遊離の抗原の抗血清との反応性に
相当する大きさまで増加する。従って、得られるシグナ
ルを減少させるのに必要な遊離の抗原量が多いほど、そ
の抗血清のこの抗原との反応性が低いことになる。抗血
清ａを、実施例３によるアフィニティークロマトグラフ
ィーによる精製の前および後に、この方法で試験した。
表２に示されるように、抗血清ａのＬＤＬおよびプラス
ミノーゲンに対する交差反応性は、アフィニティークロ
マトグラフィーによる精製によって著しく減少させるこ
とができる。

【００３４】

【表２】

【００３５】実施例６Ｌｐ（ａ）の免疫測定のための凝集試験Ｌｐ（ａ）を均一系免疫検定において測定した。この試
験のために、以下の組成の試薬を使用した：試薬１：ペプチド１に対するモノクロナール抗体（75μg/ml、Bo
ehringer Mannheim GmbH,Cat.No.1411012 ）ポリストレプタビジン（20μg/ml） 20mmol/lＭＥＳ、ｐＨ6.0 225mmol/l ＮａＣｌ 4.5 ％ＰＥＧ6000 0.75％Brij35 0.1 ％ＮａＮ₃ 試薬２： 20mmol/lＭＥＳ，ｐＨ6.0 150mmol/l ＮａＣｌ 6.0 ％ＰＥＧ6000 0.5 ％Brij35 0.1 ％ＮａＮ₃ ビオチニル化ペプチド（２μg/ml、実施例２参照）測定はHitachi704で37℃において実施した。試薬１ 350
μlおよび試料10μlをキュベット中で５分間インキュベ
ートした。続いて、試薬２ 70μl をピペットで加え、
５分間インキュベートし、340nm における吸光度の変化
を測定した。測定された濁度を、既知の量のＬｐ（ａ）
標準物質のを添加したときに得られる濁度と比較し、こ
の比較から分析すべき試料中のＬｐ（ａ）量を決定し
た。

【００３６】

【配列表】

（１）一般情報： (iii) 配列の数：８（２）配列番号：１の情報： (i) 配列の特徴： (A) 配列の長さ：１２アミノ酸 (B) 配列の型：アミノ酸 (C) 鎖の数：１本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：ペプチド (xi) 配列の記載：配列番号：１：

【００３７】

【化１】

【００３８】（２）配列番号：２の情報： (i) 配列の特徴： (A) 配列の長さ：１３アミノ酸 (B) 配列の型：アミノ酸 (C) 鎖の数：１本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：ペプチド (xi) 配列の記載：配列番号：２：

【００３９】

【化２】

【００４０】（２）配列番号：３の情報： (i) 配列の特徴： (A) 配列の長さ：１２アミノ酸 (B) 配列の型：アミノ酸 (C) 鎖の数：１本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：ペプチド (xi) 配列の記載：配列番号：３：

【００４１】

【化３】

【００４２】（２）配列番号：４の情報： (i) 配列の特徴： (A) 配列の長さ：８アミノ酸 (B) 配列の型：アミノ酸 (C) 鎖の数：１本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：ペプチド (xi) 配列の記載：配列番号：４：

【００４３】

【化４】

【００４４】（２）配列番号：５の情報： (i) 配列の特徴： (A) 配列の長さ：１０アミノ酸 (B) 配列の型：アミノ酸 (C) 鎖の数：１本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：ペプチド (xi) 配列の記載：配列番号：５：

【００４５】

【化５】

【００４６】（２）配列番号：６の情報： (i) 配列の特徴： (A) 配列の長さ：７アミノ酸 (B) 配列の型：アミノ酸 (C) 鎖の数：１本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：ペプチド (xi) 配列の記載：配列番号：６：

【００４７】

【化６】

【００４８】（２）配列番号：７の情報： (i) 配列の特徴： (A) 配列の長さ：１１アミノ酸 (B) 配列の型：アミノ酸 (C) 鎖の数：１本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：ペプチド (xi) 配列の記載：配列番号：７：

【００４９】

【化７】

【００５０】（２）配列番号：８の情報： (i) 配列の特徴： (A) 配列の長さ：８アミノ酸 (B) 配列の型：アミノ酸 (C) 鎖の数：１本鎖 (D) トポロジー：直鎖状 (ii) 配列の種類：ペプチド (xi) 配列の記載：配列番号：８：

【００５１】

【化８】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者クリストフサイデルドイツ連邦共和国 82362 ヴァイルハイムアメールシュトラーセ 39

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号：１−８に示される配列の１つ
を含み、ＣＤスペクトルにおいて190 と200 nmの間にネ
ガティブバンドを有するリポタンパク質（ａ）ペプチ
ド。
【請求項２】担体に結合したＬｐ（ａ）ハプテンをこ
のハプテンに対する抗体と分析すべき試料とともにイン
キュベートし、その分析すべき試料の存在下および不存
在下でこの過程において生ずる測定シグナルを測定する
競合凝集試験によるＬｐ（ａ）の免疫測定方法であっ
て、この担体に結合したＬｐ（ａ）ハプテンが請求項１
記載のペプチドの少なくとも１つを含むものである前記
の方法。
【請求項３】標識に結合したＬｐ（ａ）ハプテンをこ
のハプテンに対する抗体と分析すべき試料とともにイン
キュベートし、その分析すべき試料の存在下および不存
在下でこの過程において生ずる測定シグナルを測定する
Ｌｐ（ａ）の免疫測定方法であって、この標識に結合し
たＬｐ（ａ）ハプテンが請求項１記載のペプチドの少な
くとも１つを含むものである前記の方法。
【請求項４】免疫原として本発明のペプチドを使用す
る、ＬＤＬおよび／またはプラスミノーゲンには低反応
性である、Ｌｐ（ａ）に対する抗体の製造方法。
【請求項５】Ｌｐ（ａ）の検出のための免疫学的方法
における、請求項４記載の方法によって得られる抗体の
使用。