JP2575296B2 - イムノアッセイ用合成スタンダード - Google Patents

イムノアッセイ用合成スタンダード

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、イムノアッセイで用い
ることができるペプチド性合成スタンダードに関する。
【０００２】
【従来の技術】免疫学において測定される分析物は、例
えば、クレアチンキナーゼ（例えば、ＣＫＭＢ）、ＨＣ
Ｇ、フィブリンモノマー、プロラクチン又はトロポニン
Ｔの如きヒトタンパク質であることが多い。天然供給源
から単離されるヒトタンパク質は、通常はかかる試験を
較正するために用いられる。この単離は難しく、費用が
かかりかつ感染性であり得る人体物質を扱うことを必要
とする。この方法では、較正に用いられるヒトタンパク
質が確実に感染性夾雑物を含有しないようにすることも
必要である。更に、ヒトタンパク質は全ての条件下で安
定である訳ではない。例えば、トロポニンＴは、液体ス
タンダードに要求されるような溶液中で適度な長期安定
性を有していない。更に、同じ緩衝条件下でかかるヒト
タンパク質の安定で共通のスタンダードを配合すること
は殆ど不可能である。というのは、これらタンパク質の
安定性最高域は、通常は相違しており、更には非常に狭
いｐＨ域であるからである。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、少な
くとも１の分析物特異性レセプターへの分析物の結合を
介してヒトタンパク質を検出するための免疫学的測定法
用のスタンダードであって、安定であり、製造が簡単か
つ廉価であり、そして上述の欠点を有しないスタンダー
ドを提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】この目的は、分析物を検
出するための試験で用いる液体安定キャリブレータであ
って、該試験において検出に用いられるレセプターの分
析物特異性結合領域に特異的に結合する少なくとも２の
結合部位をもつコンジュゲート(conjugate) を含み、該
結合部位が少なくとも１の可溶性キャリヤー物質により
連結されることで溶解後に長期安定性を有しており、そ
して該コンジュゲートが厳密に既知量で水溶液中に溶解
している合成物又は組換え産生物であるキャリブレータ
により達成される。本発明のキャリブレータは、イムノ
アッセイで検量線の作成に使用される標準物質を意味す
る。本発明は、更に、分析物を検出する試験において検
量線を作成するためにこの液体安定キャリブレータを使
用することに関する。本発明は、更に、分析物を少なく
とも１の分析物特異性レセプターに結合させ、生成した
コンプレックス(complex) をサンプル中の分析物の含有
量の指標として検出することにより、サンプル中の分析
物を検出する方法であって、 ａ）第１段階において、本発明による既知量のコンジュ
ゲートをサンプルの代わりに分析物特異性レセプターに
結合させ、 ｂ）コンジュゲートとレセプターとの間で生成したコン
プレックスを測定し、 ｃ）段階ｂ）からの測定結果を用いて検量線を作成し、 ｄ）サンプル中の分析物の試験を行い、そして測定した
シグナルをｃ）から得られた検量線と比較することによ
り分析物濃度を決定することを特徴とする方法に関す
る。
【０００５】検量線は、多数の測定値の分析物濃度に対
する関係と理解されるべきである。驚いたことに、その
ようなコンジュゲートは、イムノアッセイにおいて合成
スタンダードとして適するものであり、広いｐＨ域にお
いて溶液中で長期間安定であることが明らかになった。
試験において検出に用いられるレセプターの分析物特異
性領域に特異的に結合する結合部位を各々１個のみを含
むコンジュゲートは、かかる試験におけるスタンダード
として安定性に劣り、レセプターに対して低い親和性し
か有しない。レセプターとは、検出される分析物に結合
する当業者に既知の全ての普通の分子、例えば、抗体又
は結合タンパク質と理解される。少なくとも２の分析物
特異性結合領域を有するレセプター、例えば、抗体又は
それらの二価断片（Ｆ（ａｂ)2）が特に好ましく用いら
れる。レセプター中に２の分析物特異性結合領域が存在
すると、１のコンジュゲート当たりレセプターに対する
少なくとも２の結合部位が存在する本発明によるキャリ
ブレータに対して２本腕の結合が可能になり、このこと
により、１の結合部位しか有しないコンジュゲートと比
較して、コンジュゲートへのレセプターの親和力によっ
て、結合定数が１０００〜１0,０００倍に上昇するので
ある。
【０００６】本発明によるキャリブレータを用いると、
Ｆａｂ’断片の如きモノクローナルレセプターにも有益
である。これら多価化合物により、多数の標識レセプタ
ーの結合が可能になり、シグナルがかなり増加する。固
相結合一価レセプターは固相結合多価レセプターに匹敵
する特性を有するので、本発明によるペプチド誘導体
は、一価固相結合レセプターにも有益である。結合部位
とは、その配列がタンパク質抗原（分析物）のタンパク
質配列の一部であってしかもこのタンパク質に対するレ
セプターが特異的に結合するペプチドと理解される。こ
れらペプチドに加えて、結合部位とは、上述のペプチド
のレセプターと本質的に等価なレセプターへの結合の特
異性及び／又は親和性を有するアミノ酸配列を有するペ
プチドとも理解されるべきである。これらペプチドは、
好ましくは、上述のペプチドから、個々のアミノ酸残基
の置換、欠失又は挿入により誘導することができる。
【０００７】結合部位とは、１又は幾つかのアミノ酸が
化学反応により誘導された上述のペプチドのペプチド誘
導体とも理解されるべきである。本発明によるペプチド
誘導体の例は、特に、主鎖及び／又はフリーのアミノ
基、フリーのカルボキシル基及び／又はフリーの水酸基
の如き反応性アミノ酸側基が誘導された分子である。ア
ミノ基の誘導体の具体例は、スルホン酸アミド又はカル
ボン酸アミド、チオウレタン誘導体及びアンモニウム
塩、例えば、塩酸塩である。カルボキシル基誘導体の例
は、塩、エステル及びアミドである。水酸基誘導体の例
は、Ｏ−アシル又はＯ−アルキル誘導体である。ペプチ
ド誘導体という用語は、１又は幾つかのアミノ酸が、２
０の“標準”アミノ酸の天然に存在する又は天然に存在
しないアミノ酸同族体により置換されたペプチドも包含
する。かかる同族体の例は、４−ヒドロキシプロリン、
５−ヒドロキシリシン、３−メチルヒスチジン、ホモセ
リン、オルニチン、β−アラニン及び４−アミノ酪酸で
ある。このペプチド誘導体は、それらが由来するペプチ
ドのものと本質的に同等のレセプターへの結合の特異性
及び／又は親和性を有さなければならない。
【０００８】結合部位とは、上述のペプチド又はペプチ
ド誘導体と本質的に同等のレセプターへの結合の特異性
及び／又は親和性を有する、以下でペプチド擬似体と表
現するペプチド擬似物質とも理解されるべきである。ペ
プチド擬似体は、レセプターとのそれらの相互作用に関
してペプチドと置き換えることができ、しかも天然ペプ
チドに比較して、特にプロテイナーゼ又はペプチダーゼ
に対して向上した安定性を有することができる化合物で
ある。ペプチド擬似体の製造方法は、ジャイアニス(Gia
nnis) 及びコルター (Kolter), "Angew. Chem." 105 (1
993), 1303-1326 及びリー(Lee) ら, Bull. Chem. Soc.
Jpn. 66 (1993), 2006-2010 に記載されている。レセ
プター結合部位の長さは、通常は少なくとも４アミノ酸
である。この長さは、好ましくは４〜２０、４〜１５又
は特に好ましくは４〜１０アミノ酸である。ペプチド擬
似体の場合には、この分子に相当する長さ又は大きさが
必要である。
【０００９】次のペプチドは、例えば、トロポニンＴの
測定のための結合部位として適している。 配列番号：１ Leu Lys Asp Arg Ile Glu Lys Arg Arg Ala Glu 配列番号：２ Leu Ile Glu Ala His Phe Glu Asn 配列番号：３ Leu Gln Ala Leu Ile Glu Ala His Phe Glu Asn 配列番号：４ Leu Asn Glu Leu Gln Ala Leu Ile Glu Ala His Phe Glu Asn 配列番号：５ Pro Pro Lys Ile Pro Asp Gly Glu Arg 配列番号：６ Glu Gln Gln Arg Ile Arg Asn Glu Arg Glu Lys Glu 配列番号：７ Ala Leu Ser Asn Met Met His Phe 配列番号：８ Met Pro Asn Leu Val Pro Pro Lys Ile 配列番号：９ Leu Gln Glu Lys Phe Lys Gln Gln Lys Tyr 配列番号：10 Val Leu Arg Asn Arg Ile Asn Asp Asn Gln 配列番号：１、２、３、４及び／又は配列番号：６によ
るペプチドが特に適している。トロポニンＴの全ＤＮＡ
及びアミノ酸配列は、メスナルド (Mesnard, L) ら, FE
BS Letters 328, 1.2, (1993) 139-144 に記載されてい
る。
【００１０】次のペプチドは、例えば、フィブリンモノ
マーの測定のための結合部位として適している。 配列番号：11 Gly Pro Arg Val Val Glu Arg 本発明によるコンジュゲートは、免疫学的サンプル試験
におけるトロポニンＴ、ＨＣＧ及びＣＫＭＢ及びフィブ
リンモノマーの測定用スタンダードとして特に適してい
る。ＨＣＧ、ＣＫＭＢ及びフィブリンモノマーの免疫学
的サンドイッチ試験法は、例えば、次の文献に記載され
ている。
【００１１】 オコナー (J.F. O'Connor) Cancer Research 48, 1361-1366, (1988) グプタ (S.K. Gupta) Journal of immunological Methods 83 (1985) 159-168 ロンギ (B. Longhi) Journal of immunological Methods 92 (1986) 89-95 チャード (T. Chard) Human Reproduction Vol 7 No 5 pp 701-710 (1992) ウィザースプーン (L.R. Witherspoon) Clin. Chem. 38/6 887-897 (1992) Clin. Chem. 38/1, 144-147 (1992) ノーマン (R.J. Norman) Ann. Clin. Biochem. (1990) 27:183-194 クリステンセン (H. Christensen) Clin. Chem. 36/9, 1686-1688 (1990) フィガード (S.D. Figard) Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 28, 1991, 77-80 シーファーズ−ボーケル (U. Scheefers-Borchel) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 7091-7095 リル (H. Lill) Blood Coag. Fibrinol. 4 (1993) 97-102 デンフル (C.E. Dempfle) Blood Coag. Fibrinol. 4 (1993) 79-86 ザベル (Zabel, M.) Circulation (1993) 87 (5) p1542-50 バン・ブラーク (Van Blerk, M.) Clin. Chem. 38, 12 (1992) pp2380-6 バッテリー (Buttery, J.E.) Clin. Biochem. 25, 1 (1992) 11-13
【００１２】トロポニンＴの測定方法は、ＥＰ−Ａ−０
３９４ ８１９に記載されている。当業者によく知ら
れている方法に従って、あらゆる望まれるタンパク質分
析物のために結合部位を選択することが可能である。か
かる方法は、例えば、レゲンモルテル (V. Regenmorte
l), Synthetic Polypeptides as Antigens, Elsevier19
88, 1-16 に記載されている。イムノアッセイにおいて
合成スタンダードとして適するコンジュゲートは、それ
ぞれの場合に、試験において検出に用いられるレセプタ
ーの分析物特異性結合領域に特異的に結合する少なくと
も２の結合部位を含有する。唯一の分析物特異性レセプ
ターが必要である競合アッセイの場合には、このコンジ
ュゲートは、そのいずれもがこのレセプターに結合する
２の同一又は類似の結合部位を含有する。サンドイッチ
イムノアッセイの如き、その両方が分析物に同時に結合
することができる２の分析物特異性レセプターが必要で
あるアッセイの場合には、このコンジュゲートは、それ
ぞれの場合において、その２のレセプターに結合するこ
とができる２の同一又は類似の結合部位を含有する。通
常は、分析物の同じエピトープには競合しない２の相違
するレセプターが、これらアッセイに用いられる。従っ
て、この場合、コンジュゲートは、第１レセプターに対
する２の結合部位と第２レセプターに対する２の結合部
位を含有する。幾つかの場合には、例えば、分析物が反
復性エピトープを含有するか又は幾つかの同一のサブユ
ニットから構成されるなら、これらアッセイにおいて同
一のレセプターを用いることも可能である。この場合
は、このコンジュゲートは、レセプターに結合すること
ができる少なくとも４の同一又は類似の結合部位を含有
する。
【００１３】しかしながら、結合部位の数をより多くし
てもよい。コンジュゲートがキャリヤー物質として高分
子量の可溶性ポリマーを含有する場合は、それぞれのレ
セプター結合領域に対して５０までの結合部位が存在し
てもよい。コンジュゲート中の結合部位がこのキャリヤ
ー物質にカップリングしてアミノ酸とスペーサー分子の
直鎖状又は分枝状合成オリゴマーを形成する場合は、２
〜１６が結合部位の好ましい数である。直鎖状コンジュ
ゲートでは、キャリヤー物質は、好ましくは、結合部位
の間に配置された複数のペプチドオリゴマーから構成さ
れる。かかる場合には、キャリヤー物質は、好ましくは
スペーサーに該当する。分枝状コンジュゲートは、好ま
しくは三次様構造を有する（例えば、図１を参照のこ
と）。かかるコンジュゲート中の結合部位の数は、好ま
しくは２、４、８又は１６である。この場合、キャリヤ
ー物質の末端と結合部位の間にスペーサーが挿入される
のが好ましい。
【００１４】このコンジュゲートの好ましい態様におい
ては、その結合部位は、キャリヤー物質としての２、４
又は８アミノ基に分岐点を介して一緒に共有結合で連結
されている。そのような分岐点は２官能性又は多官能性
分子であり、その官能基で結合部位又は、必要に応じ
て、更なる分岐点が結合することができる。この結合
は、直接であってもスペーサーを介してもよい。好まし
い分岐点は、例えば、リシンの如きα−ビスアミノ酸又
はα−ビスアミンである。かかる分岐状ペプチドは、例
えば、タム (Tam, J.P.), Proc. Natl. Acad. Sci. USA
85 (1988) 5409-5431、ＷＯ９２／１８５２８及びマル
スデン(Marsden, H.S.) ら, J. Immunol. Meth. 147 (1
992) 65-72 に記載されている。分岐部位の官能基は、
結合部位内の（所望により活性化後の）化学基と結合で
きる化学基と理解される。この例は、１級又は２級アミ
ノ、カルボン酸、スルフヒドリル、アルコール、アルデ
ヒド及びスルホン酸官能基である。
【００１５】リシン及び好ましくは３〜７リシンを有す
るリシンのホモオリゴマーも、三次様構造を有するコン
ジュゲートのキャリヤー物質として好ましい。それぞれ
の場合において同じレセプターに向けられた結合部位
は、同一のアミノ酸配列を有しても相違するアミノ酸配
列を有してもよい。しかしながら、その結合部位はその
レセプターの同じ結合領域を特異的に認識することが確
保されなければならない。結合部位を一緒に及び／又は
共有結合でキャリヤー物質と３〜４０原子長のスペーサ
ーを介して連結し、コンジュゲートを形成することが有
利である。スペーサーは、２の結合部位の末端に又は１
の結合部位と可溶性キャリヤーに結合でき、その結果、
これら結合部位の間に空間距離を設ける２官能性分子と
理解される。
【００１６】スペーサーは、水溶性のための適度な極性
を有する線状分子であるのが好ましい。また、スペーサ
ーは、アミノ酸残基から構成されるのが特に好ましい。
これらアミノ酸は、天然分析物の結合部位の天然の中間
配列に一致するものであっても天然配列とは異なるもの
であってもよい。この場合、例えば、アラニン、グリシ
ン、システイン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン
酸、セリン、ロイシンの如き天然アミノ酸又は、例え
ば、β−アラニン、γ−アミノ酪酸又はω−アミノカプ
ロン酸の如き非天然直鎖状ω−アミノ酸が、やはり好ま
しい。それらは、共有結合（例えば、−ＣＯ−ＮＨ−、
−ＮＨＣＯ−、−Ｓ−Ｓ−、−ＣＯ−Ｏ−、−Ｏ−ＣＯ
−）を介して又は二価のスペーサーを介してカップリン
グする。スペーサーの長さは、レセプターが実質的に邪
魔されないで結合部位に結合できるように選ばなければ
ならない。４０原子を越えるスペーサー長は、何ら更な
る特別な利益を有しない。更に、かかる分子は合成によ
り多くの時間を浪費する。
【００１７】それぞれの場合において、スペーサーは、
好ましくは１〜１０アミノ酸から構成される。好ましい
スペーサーは、オリゴグリシン、オリゴ−β−アラニ
ン、オリゴ−ω−アミノカプロン酸、又はβ−アラニン
とω−アミノカプロン酸からできたオリゴペプチドであ
る。このコンジュゲートのＮ末端はフリーであっても、
例えば、アセチル、tert−ブチルオキシカルボキシル、
ペプチジル、アリール又はアルキル残基の如き結合した
有機残基を含有していてもよい。そのＣ末端もカルボキ
シレートとしてフリー型で存在しても、有機残基で誘導
されて、例えば、アルキルエステル又はアリールエステ
ルであってもよい。好ましい態様においては、これらＣ
末端とＮ末端は、その分子が環状構造を有するように二
価のスペーサー又はペプチド配列により連結される。
【００１８】更なる態様においては、キャリヤー物質
は、スペーサーと分岐点との組み合わせ体であって、結
合部位のための複数の官能性結合基を有するポリマーに
相当してもよい。かかるポリマーは、例えば、１０００
〜５百万ダルトン、好ましくは１0,０００〜百万ダルト
ンの分子量を有する可溶性のポリアミン、デキストラ
ン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリペプ
チド、タンパク質又は核酸であってもよい。アルブミ
ン、イムノグロブリン又はβ−ガラクトシダーゼの如き
可溶性タンパク質が、ポリマーとして特に適している。
このポリマーは、カップリングできる２〜５００の基を
保有する。結合部位とこのポリマーの間に結合を形成す
るための多くの適当な方法が当業者に知られている。こ
のポリマーに結合部位を結合させるには、ポリマーを活
性化するのが有利である。この結合は、例えば、ホモ２
官能性リンカーのヘテロを介して又はアミド結合の直接
形成を介して行うことができる。アミノ基を保有するポ
リマーを結合部位のＮ−ヒドロキシコハク酸イミドエス
テル誘導体と反応させるのが特に有利である。ＳＨ基を
保有するポリマーと結合部位のマレインイミド誘導体と
の直接反応又はマレインイミド誘導キャリヤーポリマー
とＳＨ基を保有する結合部位の使用が特に適している。
【００１９】本発明により用いられるコンジュゲート
は、例えば、タム(J.P. Tam), Proc.Natl. Acad. Sci.
USA, 58 (1988), 5409-5413；プレスメット (D.N. Pres
smett) ら, J. Biol. Chem. 263 (1988), 1719-1725；
ランキネン (H. Lankinen), J.Gen. Virol. 70 (1989),
3159-3169 ；ＷＯ９２／１８５２８又はマルスデン(H.
S. Marsden)ら, J. Immunol. Methods. 147 (1992), 65
-72 に記載されたものの如き既知の方法に従って調製
することができる。少なくとも２の結合部位及び少なく
とも１の可溶性キャリヤー物質を含む本発明によるコン
ジュゲートが、分析物の検出のための試験における検量
線を作成するために液体キャリブレータとして用いられ
る。本発明による液体キャリブレータを調製するとき
は、コンジュゲートが液体キャリブレータ中に厳密に決
められかつ既知の量で存在するよう注意しなければなら
ない。使用前に更なる希釈段階を必要としないで検量線
を作成できるように、種々の濃度の液体キャリブレータ
を提供するのが有利である。この液体キャリブレータ中
でのコンジュゲートの濃度は、検出されるべき分析物に
依存し、通常は生理学的に存在し得る分析物濃度をカバ
ーする。0.１〜１０００ｎｇ／ｍｌの典型的濃度でキャ
リブレータのシリーズが提供される。トロポニンＴ試験
のための液体キャリブレータシリーズは、例えば、０、
0.１、0.５、１、５、１０、５０、１００及び５００ｎ
ｇ／ｍｌのコンジュゲート濃度をカバーする。フィブリ
ンモノマー試験の場合には、このキャリブレータシリー
ズ中のコンジュゲート濃度は、例えば、１０、５０、１
００、２５０及び５００ｎｇ／ｍｌである。
【００２０】液体安定キャリブレータという用語は、通
常は緩衝液である特定量の溶媒中に厳密に決められた量
のコンジュゲートを溶解させた後に、それによって生成
した液体キャリブレータが長期安定性を有することを意
味する。溶媒中へのコンジュゲートの溶解は、メーカー
により既に行われていてもよい。これは、末端ユーザー
が如何なる追加の作業工程も行わなくてもよいという利
益をもたらす。一方、ユーザーがこのコンジュゲートを
溶解してもよい。このコンジュゲートは、乾燥物質、例
えば、凍結乾燥品としてメーカーにより供給される。こ
れは、使用前、即ち、溶解前に不適当に輸送又は不適当
に貯蔵しても損傷が少ないという利益をもたらす。この
液体キャリブレータは、このコンジュゲートに加えて、
例えば、緩衝剤、安定剤又は保存剤の如き更なる補助物
質を厳密に決められかつ既知の量で含有する。リン酸ナ
トリウム、ＭＥＳ又はＰＩＰＥＳは、緩衝剤として特に
適していることが証明されている。ｐＨ値は、好ましく
は5.０〜6.０である。例えば、ウシ血清アルブミンを安
定剤として用いてもよい。本発明による安定剤は、貯蔵
に際して、天然に存在する分析物から作られてきた安定
剤よりも高い安定性を有している。この効果は、分析物
がトロポニンＴの如き不安定なタンパク質である場合
に、特に著しい。これは、例えば、タンパク質分解性攻
撃、表面への非特異的結合又は凝集し易さがその理由で
あり得る。
【００２１】更に、本発明は、少なくとも２の相違する
分析物の検出のための幾つかの試験に用いるための液体
安定普遍キャリブレータに関する。この普遍キャリブレ
ータは、少なくとも２の相違する前述のキャリブレータ
の混合物から構成される。これら合成キャリブレータ
は、厳密に決められた物質であるので、混合物中におけ
るそれら相互の影響は、有機供給源からの物質との影響
よりも極めて小さい。少なくとも１の分析物特異性レセ
プターへの分析物の結合によるサンプル中の分析物の検
出方法は当業者によく知られており、例えば、チャン
(D.W. Chang)、パールシュタイン (M.T. Perlstein), I
mmunoassay-a practical guide, Academic Press, Inc.
(1987), ウィスダム (Wisdom), Clin. Chem. 22/8 (1
976),1243-1255, オレリッチ (Oellerich), J. Clin.
Chem. Clin. Biochem. 18 (1980), 197-208 及びカジ
ェ (Kage) とコッテン (Kottgen), mta 3 (1988), 10,7
97-804 に記載されている。
【００２２】本発明によるコンジュゲートは、均一イム
ノアッセイ並びに不均一イムノアッセイに用いることが
できる。均一イムノアッセイは、例えば、ＴＩＮＩＡ、
凝集法、ＦＰＩＡ（蛍光偏光イムノアッセイ）又はＣＥ
ＤＩＡの如き沈殿法、即ち、フリーのフラクションと結
合したフラクションとを分離することなくレセプター−
分析物反応の程度を定量する方法として理解される。不
均一イムノアッセイは、例えば、放射性イムノアッセイ
又はサンドイッチアッセイ、即ち、結合したフラクショ
ンからフリーのフラクションを分離した後にレセプター
−分析物反応の程度を定量する方法として理解される。
例えば、酵素標識又は蛍光標識がサンドイッチイムノア
ッセイにおける標識として用いられる。かかる標識は、
当業者に知られており、例えば、次の文献に記載されて
いる。
【００２３】 ベイテス (D.L. Bates) Trends in Biotechnology 5 (7) (1987) pp204-209 アトー (M.A. Ator) JBC 262, 31, 14954-14960 (1987) ベイザビ (K. Beyzavi) Ann. Clin. Biochem. 24, 145-152 (1987) エネン (J. Ennen) mta 4 (1989) 3, p.199-203 エネン mta 4 (1989) 5, p.414-416 エキンス (Ekins, R.) J. Biolumin. Chemilumin., July 1989, 4 (1), p59-78 ヘルガート (Helgert K.) Pharmazie Nov. 1989, 44 (11) p745-52 イシカワ (Ishikawa, E.) J. Clin. Lab. Anal. 1989, 3 (4) p252-65 ポルストマン (Porstmann) J. Immunol. Methods, June 24, 1992, 150 (1-2) p5-21 イシカワ Mol. Cell Probes, April 1991, 5 (2) p81-95 ウェバー (Weber, T.H.) Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl., 1990, 201, p77-82 ウォーカー (Walker, M.R.) Methods Biochem. Anal. 1992, 36, p179-208 キング (King, W.J.) Immunol. Ser. 1990, 53, p83-93 イシカワ Clin. Chim. Acta, Dec. 17, 1990 194 (1), p51-72
【００２４】本発明によるコンジュゲートは、サンドイ
ッチアッセイの使用に特に適していることが証明されて
いる。この場合、サンプルを少なくとも２の分析物特異
性レセプターとインキュベートすることにより測定を行
う。この際、これらレセプターのうちの１は分析物との
反応の前か後に固相に固定化されており、その２番目の
レセプターは標識を持っている。免疫反応完了後に液相
と固相とを分離し、分析物の量の指標として、これら２
相のうちの１における標識を測定する。少なくとも１の
分析物特異性レセプターに分析物を結合させ、生成した
コンプレックスをそのサンプル中の分析物の含有量の指
標として検出することによりサンプル中の分析物を検出
する方法では、第１段階において、既知量の本発明によ
るコンジュゲートをサンプルの代わりに分析物特異性レ
セプターに結合させる。コンジュゲートとレセプターの
間に形成されるコンプレックスを測定した後、これら結
果から検量線を作成する。その後、分析物試験を行っ
て、測定したシグナルをこの検量線と比較することによ
って分析物濃度を決定する。
【００２５】本発明によるコンジュゲートは、方法に依
存して特定の組成を有さなければならない。唯１つの分
析物特異性レセプターしか必要でない検出方法、例え
ば、競合的方法を用いる場合は、少なくとも１の可溶性
キャリヤー物質により連結された少なくとも２の結合部
位のコンジュゲートを用いる。サンドイッチイムノアッ
セイの如き少なくとも２の分析物特異性レセプターが必
要な検出方法を用いる場合は、少なくとも１の可溶性キ
ャリヤー物質により連結されたこれら２のレセプターそ
れぞれに対する少なくとも２の結合部位のコンジュゲー
トを用いる。これら２のレセプターは、同一であって
も、即ち、その抗原の同一のエピトープを認識するもの
であっても、相違していても、即ち、その抗原の相違す
るエピトープを認識するものであってもよい。前者の場
合には、抗原は幾つかの同一のエピトープを有さなけれ
ばならず、これは、例えば、反復性エピトープ又は同一
のサブユニットを有する抗原の場合である。これの例
は、フィブリンモノマーである。従って、この場合、コ
ンジュゲートは、少なくとも４の同一結合部位を有さな
ければならない。後者の場合には、コンジュゲートは、
第１レセプターに対する少なくとも２の結合部位と第２
の相違するレセプターに対する少なくとも２の結合部位
を含有する。トロポニンＴは、例えば、このやり方で検
出できる。
【００２６】以下の実施例、図面及び配列表により本発
明を更に説明する。図１は、本発明による好適なコンジ
ュゲートの好ましい三次様構造を示す。この場合、II及
びIII も好適な下部構造である。Ｔ：スペーサー，挿入
は任意である；Ｑ：抗体結合部位。図２及び３は、実施
例３で用いたペプチドＡ（図２）及びペプチドＢ（図
３）を示す。図４及び５は、実施例８で合成したコンジ
ュゲート（図４）及び実施例９で合成したコンジュゲー
ト（図５）を示す。図６は、合成ＦＭコンジュゲートII
及びIII 及び先行技術のフィブリンスタンダードを用い
て実施例１０により得られた標準曲線を示す。
【００２７】
【実施例】実施例１ 合成トロポニンＴコンジュゲート Ｎα，Ｎε−ビス−
（ロイシル−リシル−アスパルチル−アルギニル−イソ
ロイシル−グルタミル−リシル−アルギニル−アルギニ
ル−アラニル−グルタミル−アルギニル−アラニル−グ
ルタミル−グルタミニル−グルタミニル−アルギニル−
イソロイシル−アルギニル−アスパラギル−グルタミル
−アルギニル−グルタミル−リシル−グルタミル−アル
ギニル−グルタミニル−β−アラニル−β−アラニル）
−リシンアミド（Ｉ）の製造 このコンジュゲート（Ｉ）を、ジンザー・アナリチック
・カンパニー (ZINSSER Analytic Campany) からのＳＭ
ＰＳ３５０ペプチド合成装置を用いるＦｍｏｃ−（フル
オレニルメトキシ−カルボニル−）−固相ペプチド合成
法により、アドバンスド・ケムテック・カンパニー(ADV
ANCED CHEMTECH Campany) からの１５ｍｇの４−（2'，
4'−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）−
フェノキシ樹脂ＳＡ５０３０上で、0.２２mmol／ｇの負
荷で作った。各９０μmol の次のＮ−Ｆｍｏｃアミノ酸
誘導体を、２７０μｌジメチルホルムアミド中の９０μ
mol １−ヒドロキシベンゾトリアゾール及び９０μmol
N,Ｎ−ジイソプロピルカルボジイミドのジメチルホルム
アミド溶液１０５μｌと一緒に、震盪しながら、合成さ
れる固相結合ペプチドに２度カップリングさせた：Ｎε
−Ｆｍｏｃ−リシン、β−アラニン、β−アラニン、グ
ルタミン（−トリチル）、アルギニン（−ペンタメチル
クロマン）、グルタミン酸（−tert−ブチルエステ
ル）、Ｎε−tert−ブチルオキシカルボニル−リシン、
グルタミン酸（−tert−ブチルエステル）、アルギニン
（−ペンタメチルクロマン）、グルタミン酸（−tert−
ブチルエステル）、アスパラギン（−トリチル）、アル
ギニン（−ペンタメチルクロマン）、イソロイシン、ア
ルギニン（−ペンタメチルクロマン）、グルタミン（−
トリチル）、グルタミン（−トリチル）、グルタミン酸
（tert−ブチルエステル）、アラニン、アルギニン（−
ペンタメチルクロマン）、グルタミン酸（−tert−ブチ
ルエステル）、アラニン、アルギニン（−ペンタメチル
クロマン）、アルギニン（−ペンタメチルクロマン）、
Ｎε−tert−ブチルオキシカルボニル−リシン、グルタ
ミン酸（−tert−ブチルエステル）、イソロイシン、ア
ルギニン（−ペンタメチルクロマン）、アスパラギン酸
（−tert−ブチルエステル）、Ｎε−tert−ブチルオキ
シカルボニル−リシン、ロイシン。カップリング時間は
４０及び３０分であった。Ｆｍｏｃ保護基の開裂は、ジ
メチルホルムアミド中の５０％ピペリジン溶液６００μ
ｌを用いて、各二重カップリング後に行った。開裂時間
は２０分であった。洗浄工程は、各反応工程後に１回に
付き７００μｌのジメチルホルムアミドで８回行った。
濾過して溶媒を除いた樹脂を、それぞれの場合において
９０％トリフルオロ酢酸、３％チオアニソール、３％エ
タンジチオール及び３％チオクレゾールの混合物７５０
μｌで２０分以内に処理しそして続けて１４０分間処理
することによってペプチドを切り離した。プールした濾
液に１５ｍｌの冷ジイソプロピルエーテルを添加するこ
とによって生成物を沈殿させ、濾過により単離した。残
渣を３ｍｌの５０％酢酸中に溶解して凍結乾燥した。こ
の凍結乾燥操作を２度繰り返した。逆相ＨＰＬＣで４８
％の純度である１０ｍｇの粗製物質が得られ、その５ｍ
ｇを分取逆相ＨＰＬＣにより精製した。収量：１ｍｇ
（ＬＳＩＭＳ：Ｍ−Ｈ+ ：７４３8.４；マトリックス；
ｍＮＢＡ，加速器電圧：６ｋＶ）。
【００２８】実施例２ 合成トロポニンＴコンジュゲート ロイシル−リシル−
アスパルチル−アルギニル−イソロイシル−グルタミル
−リシル−アルギニル−アルギニル−アラニル−グルタ
ミル−アルギニル−アラニル−グルタミル−グルタミニ
ル−グルタミニル−アルギニル−イソロイシル−アルギ
ニル−アスパラギル−グルタミル−アルギニル−グルタ
ミル−リシル−グルタミル−アルギニル−グルタミニル
−ロイシル−リシル−アスパルチル−アルギニル−イソ
ロイシル−グルタミル−リシル−アルギニル−アルギニ
ル−アラニル−グルタミル−アルギニル−アラニル−グ
ルタミル−グルタミニル−グルタミニル−アルギニル−
イソロイシル−アルギニル−アスパラギル−グルタミル
−アルギニル−グルタミル−リシル−グルタミル−アル
ギニル−グルタミン（II）の製造 このコンジュゲート（II）を、ジンザー・アナリチック
・カンパニーからのＳＭＰＳ３５０ペプチド合成装置を
用いるＦｍｏｃ−（フルオレニルメトキシ−カルボニル
−）−固相ペプチド合成法により、アドバンスド・ケム
テック・カンパニーからの１５ｍｇの４−（2'，4'−ジ
メトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）−フェノ
キシ樹脂ＳＡ５０３０上で、0.２２mmol／ｇの負荷で作
った。各９０μmol の次のＮ−Ｆｍｏｃアミノ酸誘導体
を、２７０μｌＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）中の９
０μmol １−ヒドロキシベンゾトリアゾール及び９０μ
mol N,Ｎ−ジイソプロピルカルボジイミドのＤＭＦ溶液
１０５μｌと一緒に、震盪しながら、合成される固相結
合ペプチドに２度カップリングさせた：グルタミン（−
トリチル）、アルギニン（ペンタメチルクロマン）、グ
ルタミン酸（tert−ブチルエステル）、リシン（tert−
ブトキシカルボニル）、グルタミン酸（tert−ブチルエ
ステル）、アルギニン（ペンタメチルクロマン）、グル
タミン酸（tert−ブチルエステル）、アスパラギン（ト
リチル）、アルギニン（ペンタメチルクロマン）、イソ
ロイシン、アルギニン（ペンタメチルクロマン）、グル
タミン（トリチル）、グルタミン（トリチル）、グルタ
ミン酸（tert−ブチルエステル）、アラニン、アルギニ
ン（ペンタメチルクロマン）、グルタミン酸（tert−ブ
チルエステル）、アラニン、アルギニン（ペンタメチル
クロマン）、アルギニン（ペンタメチルクロマン）、リ
シン（tert−ブトキシカルボニル）、グルタミン酸（te
rt−ブチルエステル）、イソロイシン、アルギニン（ペ
ンタメチルクロマン）、アスパラギン酸（tert−ブチル
エステル）、リシン（tert−ブトキシカルボニル）、ロ
イシン。ロイシンをカップリングした後、同じアミノ酸
配列を再度続けてこの上に合成した。カップリング時間
は４０及び３０分であった。Ｆｍｏｃ保護基の開裂は、
ＤＭＦ中の５０％ピペリジン溶液６００μｌを用いて、
各二重カップリング後に行った。開裂時間は２０分であ
り、もう１度繰り返した。洗浄工程は、各反応工程後に
１回に付き７００μｌのＤＭＦで８回行った。濾過して
溶媒を除いた樹脂を、それぞれの場合において９０％ト
リフルオロ酢酸、３％チオアニソール、３％エタンジチ
オール及び３％チオクレゾールの混合物７５０μｌで２
０分以内に処理し、そして続けて１４０分間処理するこ
とによってペプチドを切り離した。プールした濾液に１
５ｍｌの冷ジイソプロピルエーテルを添加することによ
って生成物を沈殿させ、濾過により単離した。残渣を３
ｍｌの５０％酢酸中に溶解して凍結乾燥した。この凍結
乾燥操作を２度繰り返した。逆相ＨＰＬＣで５２％の純
度である１７ｍｇの粗製物質が得られ、その５ｍｇを分
取逆相ＨＰＬＣにより精製した。１ｍｇの純粋な物質
（ＨＰＬＣによれば＞９９％）が得られた。
【００２９】実施例３ 電気化学発光イムノアッセイでのトロポニンＴの測定 トロポニンＴに対するビオチン標識モノクローナル抗体
（ＭＡＢ）及びルテニウム−トリス（ビスピリジル）標
識抗体をトロポニンＴ被覆及びストレプトアビジン被覆
磁性ポリマー粒子（ビーズ）と共に１０分間インキュベ
ートした。インキュベーションの間、免疫コンプレック
ス並びに磁性粒子へのビオチニル化ＭＡＢの結合が形成
された。反応セル中の反応混合液を吸引により取り出す
ことによって反応を停止させた。磁性ポリマー粒子を磁
石によって測定室内の電極上に固定した。残りの反応混
合液を吸引により除去して、磁性粒子をアッセイ用緩衝
液で洗浄した。続いて、電圧をかけることにより発光が
励起された。
【００３０】試薬： 溶液１： インキュベーション緩衝液 １００ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ7.０ 0.１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン） 0.１％メチルイソチアゾロン 0.１％安息香酸ナトリウム 溶液２： トロポニンＴに対するビオチニル化ＭＡＢ，インキュベ
ーション緩衝液中２μｇ／ｍｌ 溶液３： トロポニンＴに対するルテニウム−トリス（ビスピリジ
ル）標識ＭＡＢ，インキュベーション緩衝液中２μｇ／
ｍｌ 溶液４： ６００μｇ／ｍｌ磁性ビーズ、次の溶液中におけるスト
レプトアビジン被覆体：５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝液、
0.１％ＢＳＡ、0.１％Ｔｈｅｓｉｔ、0.１％クロロアセ
トアミド、0.０１％メチルイソチアゾロン，ｐＨ7.４ 溶液５： アッセイ用緩衝液：ｐＨ6.８ 0.１６Ｍトリス−プロピルアミン、0.２Ｍリン酸水素二
カリウム、0.１％ポリドカノール（Thesit）、0.１％オ
キサバン (Oxaban) Ａ
【００３１】試験するコンジュゲートをヒト血清又はイ
ンキュベーション緩衝液中で計量した。上記の方法でこ
れらサンプルを測定することによって得られるシグナル
をその校正溶液で得られるシグナルと比較した。回収量
／計量値の指数をこれから計算した。溶液１〜４の各６
０μｌを６０μｌのサンプルと室温で１０分間インキュ
ベートした。その後、測定室内のこの反応混合液を吸引
により取り除いて、磁性粒子を分離した。測定室をアッ
セイ用緩衝液で満たして測定シグナルを記録した。その
シグナルを校正溶液のシグナルと比較することによって
サンプルの濃度を決定した。測定は、アイゲン (Igen)
・カンパニーＵＳＡからのオリゲン (Origen) 1.０装置
で行った。結果を表１に示した。
【００３２】
【表１】表１ ａ）コンジュゲートＩ 回収率 2) 最初の計量値 ３週間後 −20℃ ３週間後 ４℃ Ｓｔｄ ａ ２１８１４４1) ９５％ ９３％ Ｓｔｄ ｂ ３２０９９８ ８８％ １０２％ Ｓｔｄ ｃ ６２０４８９ ９４％ ９５％ Ｓｔｄ ｄ ２４１６９２３ ９２％ ９０％ Ｓｔｄ ｅ ４２７５５８６ ９０％ ８８％
【００３３】
【表２】表２ ｂ）コンジュゲートII 回収率 2) 最初の計量値 ３週間後 −20℃ ３週間後 ４℃ Ｓｔｄ ａ ３１８１４３1) ９０％ ９０％ Ｓｔｄ ｂ ４４２０７９８ ８８％ １００％ Ｓｔｄ ｃ ７２０７８９ ９０％ ９２％ Ｓｔｄ ｄ ２６１６５２２ ９３％ ８５％ Ｓｔｄ ｅ ４５７６７８９ ８８％ ８３％
【００３４】
【表３】表３ ｃ）ヒト心臓トロポニンＴ 回収率 2) 最初の計量値 ３週間後 −20℃ ３週間後 ４℃ Ｓｔｄ ａ ２４１２３３1) ９５％ ６０％ Ｓｔｄ ｂ ４６７３４５ ９８％ ５８％ Ｓｔｄ ｃ ８１４３２５ ９３％ ５５％ Ｓｔｄ ｄ ２４５６３４２ ８８％ ６３％ Ｓｔｄ ｅ ４６７５４３２ ８９％ ５９％ 1) 発光単位2) 溶液の調製直後に得られた測定結果に対する回収率
（％）。３５℃で貯蔵。3) Ｓｔｄ：トロポニンスタンダード（エンザイムン (E
nzymun)・テストＴｎＴ，ベーリンガー・マンハイムＧ
ｍｂＨからの従来型スタンダード）
【００３５】実施例４ トロポニンＴコンジュゲート(III) の製造 ２００ｍｇのウシ血清アルブミン（2.９μｍｏｌ）を６
ｍｌの0.１Ｍリン酸カリウム緩衝液ｐＨ8.０に溶解し
た。４4.６ｍｇのマレインイミドヘキサン酸−Ｎ−ヒド
ロキシコハク酸イミドエステル（１４５μｍｏｌ）を0.
５ｍｌジオキサンに溶解して上記溶液に滴下した。それ
を室温（ＲＴ）で１７時間攪拌した。上記溶液を、0.１
Ｍリン酸カリウム緩衝液ｐＨ6.０で平衡にしたＡｃａ２
０２（ファルマシア）を満たしたカラム（３ｃｍ×４０
ｃｍ）で濾過した（検出λ＝２２６ｎｍ）。最初のピー
クの画分を集め、ピアス (Pierce) の方法（ＢＣＡ法）
に従ってそのタンパク質含有量を測定した。エルマン
(Ellman) の方法に従って、得られたマレインイミドヘ
キサノイル基の付加量を測定した。ウシ血清アルブミン
分子当たり１7.５マレインイミドヘキサノイル基であっ
た。
【００３６】１０ｍｇのシステイニル−β−アラニル−
β−アラニル−アラニル−グルタミル−グルタミニル−
グルタミニル−アルギニル−イソロイシル−アルギニル
−アスパラギニル−グルタミル−アルギニル−グルタミ
ル−リシル−グルタミル−アルギニル−アミド（4.７９
μｍｏｌ）と8.２ｍｇのシステイニル−γ−アミノカプ
ロイル−セリル−ロイシル−リシル−アスパルチル−ア
ルギニル−イソロイシル−グルタミル−リシル−アルギ
ニル−アルギニル−アラニル−グルタミル−アミド（4.
７９μｍｏｌ）を１ｍｌの0.１Ｍリン酸カリウム緩衝液
ｐＨ6.０中に溶解した。この溶液をアルゴンで飽和し
た。0.１Ｍリン酸カリウム緩衝液ｐＨ6.０中9.４６ｍｇ
／ｍｌの濃度のマレインイミドヘキサノイル活性化ウシ
血清アルブミン（付加量１7.５：１）の溶液2.１３ｍｌ
を上記溶液に添加した。それを再度アルゴンで飽和し、
酸素を排除しながら室温で１７時間攪拌した。４ｍｌの
0.０５Ｍコハク酸緩衝液ｐＨ4.０を添加して１リッター
の１％酢酸に対して４回透析した。不溶性沈殿物を遠心
分離した。上記溶液を、0.０５Ｍコハク酸緩衝液ｐＨ4.
０で平衡にしたＡｃａ２０２（ファルマシア）を満たし
たカラム（３ｃｍ×２８ｃｍ）で濾過した（検出λ＝２
２６ｎｍ）。最初のピークの画分を集め、ピアスの方法
（ＢＣＡ法）に従ってそのタンパク質含有量を測定し
た。３５ｍｌの溶液中に１9.８ｍｇのタンパク質コンジ
ュゲートが見出された。エルマンの方法によっては更な
るマレインイミド活性は検出されなかった。
【００３７】実施例５ トロポニンＴコンジュゲート（IV）の製造 ２００ｍｇのウシ血清アルブミン（2.９μｍｏｌ）を６
ｍｌの0.１Ｍリン酸カリウム緩衝液ｐＨ8.０に溶解し
た。４4.６ｍｇのマレインイミドヘキサン酸−Ｎ−ヒド
ロキシコハク酸イミドエステル（１４５μｍｏｌ）を0.
５ｍｌジオキサンに溶解して上記溶液に添加した。それ
を室温で１７時間攪拌した。上記溶液を、0.１Ｍリン酸
カリウム緩衝液ｐＨ6.０で平衡にしたＡｃａ２０２（フ
ァルマシア）を満たしたカラム（３ｃｍ×４０ｃｍ）で
濾過した（検出λ＝２２６ｎｍ）。最初のピークの画分
を集め、ピアスの方法（ＢＣＡ法）に従ってそのタンパ
ク質含有量を測定した。エルマンの方法に従って、得ら
れたマレインイミドヘキサノイル基の負荷量をウシ血清
アルブミン分子当たり１8.０と測定した。
【００３８】３５ｍｇのシステイニル−γ−アミノカプ
ロイル−ロイシル−リシル−アスパルチル−アルギニル
−イソロイシル−グルタミル−リシル−アルギニル−ア
ルギニル−アラニル−グルタミル−アルギニル−アラニ
ル−グルタミル−グルタミニル−グルタミニル−アルギ
ニル−イソロイシル−アルギニル−アスパルギル−グル
タミル−アルギニル−グルタミル−リシル−グルタミル
−アルギニル−グルタミル−アミド（9.６μｍｏｌ）を
３ｍｌの0.１Ｍリン酸カリウム緩衝液ｐＨ6.０中に溶解
し、この溶液をアルゴンで飽和した。2.３５ｍｌのマレ
インイミドヘキサノイル活性化ウシ血清アルブミン溶液
（ｃ＝9.２ｍｇ／ｍｌ）をこのペプチド溶液に添加し、
この全溶液を再度アルゴンで飽和した。この溶液を室温
で１７時間攪拌した。0.５ｍｌの５０％酢酸を添加した
後、Ｇ４グラスフィルターフリットで濾過した。この溶
出液を、0.１Ｍリン酸カリウム緩衝液ｐＨ6.０で平衡に
したＡｃａ２０２（ファルマシア）で満たしたカラム
（３ｃｍ×４０ｃｍ）で濾過した（検出λ＝２２６ｎ
ｍ）。最初のピークの画分を集め、ピアスの方法（ＢＣ
Ａ法）に従ってそのタンパク質含有量を測定した。２5.
５ｍｌの溶出液中に２５ｍｇのタンパク質コンジュゲー
トが見出された。エルマンの方法によっては更なるマレ
インイミド活性は検出されなかった。
【００３９】実施例６ 合成トロポニンＴキャリブレータ（Ｉ）の安定性 実施例１のトロポニンＴコンジュゲート（Ｉ）の安定性
を、天然抗原から作ったキャリブレータの安定性と比較
した。ウシ心臓（ｂｃＴｎＴ）及びヒト心臓（ｈｃＴｎ
Ｔ）からのトロポニンＴを天然抗原として用いた。この
キャリブレータを−８０℃、４℃及び２５℃の温度で３
週間まで貯蔵した。このキャリブレータで得られた測定
シグナルを１週間間隔で測定し、開始シグナルと比較し
た。試験操作は実施例３と一致する。−８０℃で貯蔵し
た場合は如何なる相違もなかった。全てのキャリブレー
タは、３週間後も依然として１００％安定性を示した。
４℃での貯蔵も有意な相違を示さなかった。ｂｃＴｎＴ
の場合だけ、測定シグナルが３週間後に開始シグナルの
９２％に落ちた。本発明によるキャリブレータの優れた
安定性は、２５℃で貯蔵した場合に明白である。ｈｃＴ
ｎＴ及びｂｃＴｎＴの場合には、測定シグナルは２５℃
で３週間後にそれぞれ開始シグナルの２４％と５％に低
下したのに反して、合成キャリブレータのシグナルは依
然として開始値の５０％であった。
【００４０】実施例７ 可溶性フィブリンの試験のための合成ＦＭコンジュゲー
ト（Ｉ）の製造 可溶性フィブリンの試験のためのＦＭコンジュゲート
（Ｉ）を、ジンザー・アナリチック・カンパニーからの
ＳＭＰＳ３５０ペプチド合成装置を用いるＦｍｏｃ−
（フルオレニルメトキシ−カルボニル−）固相ペプチド
合成法により、アドバンスド・ケムテック・カンパニー
からの0.２２mmol／ｇの負荷を有する１５ｍｇの４−
（2'，4'−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチ
ル）−フェノキシ樹脂ＳＡ５０３０上で合成した。各９
０μmol の次のＮ−Ｆｍｏｃアミノ酸誘導体を、２７０
μｌジメチルホルムアミド中の９０μmol １−ヒドロキ
シベンゾトリアゾール及び９０μmol N,Ｎ−ジイソプロ
ピルカルボジイミドのジメチルホルムアミド溶液１０５
μｌと一緒に、合成される固相結合ペプチドに順次２度
カップリングさせた：Ｎε−Ｆｍｏｃ−リシン、β−ア
ラニン、β−アラニン、アルギニン（−ペンタメチルク
ロマン）、グルタミン酸（−tert−ブチルエステル）、
バリン、バリン、アルギニン（−ペンタメチルクロマ
ン）、プロリン及びグリシン。カップリング時間は４０
及び３０分であった。Ｆｍｏｃ保護基の開裂は、ジメチ
ルホルムアミド中の５０％ピペリジン溶液６００μｌを
用いて、各二重カップリング後に行った。洗浄工程は、
各反応工程後に１回に付き７００μｌのジメチルホルム
アミドで８回行った。濾過して溶媒を除いた樹脂を、そ
れぞれの場合において９０％トリフルオロ酢酸、３％チ
オアニソール、３％エタンジチオール及び３％チオクレ
ゾールの混合物７５０μｌで２０分以内に処理しそして
続けて１４０分間処理することによってペプチドを切り
離した。プールした濾液に１５ｍｌの冷ジイソプロピル
エーテルを添加することによって生成物を沈殿させ、濾
過により単離した。残渣を３ｍｌの５０％酢酸中に溶解
して凍結乾燥した。この凍結乾燥操作を２度繰り返し
た。逆相ＨＰＬＣで５３％の純度である７ｍｇの粗製物
質が得られ、その５ｍｇを分取逆相ＨＰＬＣにより精製
した。収量：1.２５ｍｇ（ＬＳＩＭＳ：Ｍ−Ｈ+ ：２３
０0.５；マトリックス；ｍＮＢＡ，加速器電圧：６ｋ
Ｖ）。このようにして、配列番号：１１に示した配列に
対応し、それぞれの場合において２分子のβ−アラニン
から構成されるスペーサーを介してリシンにそれぞれ連
結している２つのペプチドからコンジュゲートが形成さ
れた。
【００４１】実施例８ 可溶性フィブリンの試験のための合成ＦＭコンジュゲー
ト（II）の製造 可溶性フィブリンの試験のためのＦＭコンジュゲート
（II）を、ジンザー・アナリチック・カンパニーからの
ＳＭＰＳ３５０ペプチド合成装置を用いるＦｍｏｃ−
（フルオレニルメトキシ−カルボニル−）固相ペプチド
合成法により、アドバンスド・ケムテック・カンパニー
からの0.２２mmol／ｇの負荷を有する１５ｍｇの４−
（2'，4'−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチ
ル）−フェノキシ樹脂ＳＡ５０３０上で合成した。各９
０μmol の次のＮ−Ｆｍｏｃアミノ酸誘導体を、２７０
μｌジメチルホルムアミド中の９０μmol １−ヒドロキ
シベンゾトリアゾール及び９０μmol N,Ｎ−ジイソプロ
ピルカルボジイミドのジメチルホルムアミド溶液１０５
μｌと一緒に、合成される固相結合ペプチドに順次２度
カップリングさせた：Ｎε−Ｆｍｏｃ−リシン、Ｎε−
Ｆｍｏｃ−リシン、β−アラニン、β−アラニン、アル
ギニン（−ペンタメチルクロマン）、グルタミン酸（−
tert−ブチルエステル）、バリン、バリン、アルギニン
（−ペンタメチルクロマン）、プロリン及びグリシン。
カップリング時間は４０及び３０分であった。Ｆｍｏｃ
保護基の開裂は、ジメチルホルムアミド中の５０％ピペ
リジン溶液６００μｌを用いて、各二重カップリング後
に行った。洗浄工程は、各反応工程後に１回に付き７０
０μｌのジメチルホルムアミドで８回行った。濾過して
溶媒を除いた樹脂を、それぞれの場合において９０％ト
リフルオロ酢酸、３％チオアニソール、３％エタンジチ
オール及び３％チオクレゾールの混合物７５０μｌで２
０分以内に処理しそして続けて１４０分間処理すること
によってペプチドを切り離した。プールした濾液に１５
ｍｌの冷ジイソプロピルエーテルを添加することによっ
て生成物を沈殿させ、濾過により単離した。残渣を３ｍ
ｌの５０％酢酸中に溶解して凍結乾燥した。この凍結乾
燥操作を２度繰り返した。逆相ＨＰＬＣで４８％の純度
である１５ｍｇの粗製物質が得られ、その５ｍｇを分取
逆相ＨＰＬＣにより精製した。収量：1.０２ｍｇ（ＬＳ
ＩＭＳ：Ｍ−Ｈ+ ：４８５4.３；マトリックス；ｍＮＢ
Ａ，加速器電圧：６ｋＶ）。このようにして、配列番
号：１１に示した配列に対応し、２分子のスペーサーを
介して３リシン残基から構成されるキャリヤーにそれぞ
れ連結している４つのペプチドからコンジュゲートが形
成された（図４）。
【００４２】実施例９ 可溶性フィブリンの試験のための合成ＦＭコンジュゲー
ト(III) の製造 可溶性フィブリンの試験のためのＦＭコンジュゲート(I
II) を、ジンザー・アナリチック・カンパニーからのＳ
ＭＰＳ３５０ペプチド合成装置を用いるＦｍｏｃ−（フ
ルオレニルメトキシ−カルボニル−）固相ペプチド合成
法により、アドバンスド・ケムテック・カンパニーから
の0.２２mmol／ｇの負荷を有する１５ｍｇの４−（2'，
4'−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）−
フェノキシ樹脂ＳＡ５０３０上で合成した。各９０μmo
l の次のＮ−Ｆｍｏｃアミノ酸誘導体を、２７０μｌジ
メチルホルムアミド中の９０μmol １−ヒドロキシベン
ゾトリアゾール及び９０μmol N,Ｎ−ジイソプロピルカ
ルボジイミドのジメチルホルムアミド溶液１０５μｌと
一緒に、合成される固相結合ペプチドに順次２度カップ
リングさせた：Ｎε−Ｆｍｏｃ−リシン、Ｎε−Ｆｍｏ
ｃ−リシン、Ｎε−Ｆｍｏｃ−リシン、β−アラニン、
β−アラニン、アルギニン（−ペンタメチルクロマ
ン）、グルタミン酸（−tert−ブチルエステル）、バリ
ン、バリン、アルギニン（−ペンタメチルクロマン）、
プロリン及びグリシン。カップリング時間は４０及び３
０分であった。Ｆｍｏｃ保護基の開裂は、ジメチルホル
ムアミド中の５０％ピペリジン溶液６００μｌを用い
て、各二重カップリング後に行った。洗浄工程は、各反
応工程後に１回に付き７００μｌのジメチルホルムアミ
ドで８回行った。濾過して溶媒を除いた樹脂を、それぞ
れの場合において９０％トリフルオロ酢酸、３％チオア
ニソール、３％エタンジチオール及び３％チオクレゾー
ルの混合物７５０μｌで２０分以内に処理しそして続け
て１４０分間処理することによってペプチドを切り離し
た。プールした濾液に１５ｍｌの冷ジイソプロピルエー
テルを添加することによって生成物を沈殿させ、濾過に
より単離した。残渣を３ｍｌの５０％酢酸中に溶解して
凍結乾燥した。この凍結乾燥操作を２度繰り返した。逆
相ＨＰＬＣで４２％の純度である２３ｍｇの粗製物質が
得られ、その５ｍｇを分取逆相ＨＰＬＣにより精製し
た。収量：0.９５ｍｇ。このようにして、配列番号：１
１に示した配列に対応し、２つのβ−アラニン分子のス
ペーサーを介して７リシン残基から構成されるキャリヤ
ーにそれぞれ連結している８つのペプチドからコンジュ
ゲートが形成された（図５）。
【００４３】実施例１０ 可溶性フィブリンの試験におけるフィブリンスタンダー
ドと合成ＦＭコンジュゲートＩ、II及びIII との比較 フィブリン、フィブリンスタンダード及びフィブリン分
解生成物の製造並びにサンプルの処理は、リル (Lill)
ら, Blood Coagulation and Fibrinolysis 4 (1993) 97
-102 に従って行った。
【００４４】試験原理 固相としてストレプトアビジン被覆試験管を用いて２段
階サンドイッチアッセイを行った。同じフィブリン特異
性モノクローナル抗体をビオチニル化捕捉ＭＡＢとして
及びパーオキシダーゼ標識ＭＡＢとして用いた。この試
験は、ＥＳ３３測定器で室温で行った。２０μｌの血漿
を６０μｌインキュベーション緩衝液（5.３３Ｍ ＫＳ
ＣＮ、0.０２５Ｍリン酸ナトリウム，ｐＨ7.３）と共に
３０分間、ストレプトアビジン被覆ポリスチレン製試験
管（ベーリンガー・マンハイムＧｍｂＨ）内でインキュ
ベートした。１０００μｌのビオチニル化抗体（1.３μ
ｇ／ｍｌビオチニル化抗体、0.１Ｍリン酸カリウム、5.
９ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、0.５ｍｇ／ｍｌツィ
ーン２０（登録商標），ｐＨ7.０）を添加して、３０分
間インキュベートした。この抗体は、Ｂａｌｂ／ｃマウ
スをフィブリンのα−基からの合成Ｎ−末端ヘプタペプ
チドＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ
−Ａｒｇで免疫感作することによって得たものであっ
た。このペプチドは、マレインイミドベンゾイル−Ｎ−
ヒドロキシコハク酸エステルにより、キーホールリンペ
ットヘモシアニンにカップリングさせたものであった。
モノクローナル抗体は、コーラー (Kohler) 及びミルス
タイン (Milstein), Nature 256 (1975), 495-497 に従
って得た。続いて、この試験管を4.３ｍＭ ＮａＣｌ溶
液で洗浄した。その後、１０００μｌのパーオキシダー
ゼ標識抗体溶液（0.１４Ｕ／ｍｌパーオキシダーゼコン
ジュゲート、0.０３５Ｍリン酸カリウム、0.１５４Ｍ
ＮａＣｌ、１０ｍｇ／ｍｌポリエチレングリコール４０
０００、２ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、0.５ｍｇ／
ｍｌツィーン２０（登録商標），ｐＨ7.４）を添加して
３０分間インキュベートした。その後、この溶液を試験
管から除去し、これを4.３ｍＭ ＮａＣｌ溶液で洗浄し
た。１０００μｌのＡＢＴＳ（登録商標）溶液（ベーリ
ンガー・マンハイムＧｍｂＨ）を添加して３０分間イン
キュベートした。続いて、４２２ｎｍの波長で吸光度を
測定し、標準曲線と比較することによってフィブリン濃
度を決定した。
【００４５】標準曲線 図６は標準曲線を示す。これらは、０〜５０μｇ／ｍｌ
フィブリンの範囲で測定したものである。エンザイムン
・テストＦＭ（ベーリンガー・マンハイムＧｍｂＨ）の
フィブリンスタンダード及び合成ＦＭコンジュゲートII
及びIII をスタンダードとして用いた。ＦＭコンジュゲ
ートを補充した凍結乾燥血漿サンプルをスタンダードと
して役立てた。その結果を図６に示した。それは、本発
明によるコンジュゲートと先行技術のスタンダードとの
間の非常に高い相関を示している。
【配列表】
【００４６】 配列番号：１ 配列の長さ：１１ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００４７】 配列番号：２ 配列の長さ：８ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００４８】 配列番号：３ 配列の長さ：１１ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００４９】 配列番号：４ 配列の長さ：１４ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００５０】 配列番号：５ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００５１】 配列番号：６ 配列の長さ：１２ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００５２】 配列番号：７ 配列の長さ：８ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００５３】 配列番号：８ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００５４】 配列番号：９ 配列の長さ：１０ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００５５】 配列番号：１０ 配列の長さ：１０ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【００５６】 配列番号：１１ 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に照らして好適なコンジュゲートの好ま
しい三次様構造を示す。この場合、II及びIII も好適な
下部構造である。Ｔ：スペーサー，挿入は任意である；
Ｑ：抗体結合部位。
【図２】実施例３で用いたペプチドＡを示す。
【図３】実施例３で用いたペプチドＢを示す。
【図４】実施例８で合成したコンジュゲートを示す。
【図５】実施例９で合成したコンジュゲートを示す。
【図６】合成ＦＭコンジュゲートII及びIII 及び先行技
術のフィブリンスタンダードを用いて実施例１０により
得られた標準曲線を示す。

Claims (3)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 分析物を検出するための試験で用いる液
    体安定キャリブレータであって、該試験において検出に
    用いられるレセプターの分析物特異性結合領域に特異的
    に結合する少なくとも２の結合部位をもつコンジュゲー
    トを含み、該結合部位が少なくとも１の可溶性キャリヤ
    ー物質により連結されることで溶解後に長期安定性を有
    しており、そして該コンジュゲートが厳密に既知量で水
    溶液中に溶解している合成物又は組換え産生物であるキ
    ャリブレータ。
  2. 【請求項２】 分析物を少なくとも１の分析物特異性レ
    セプターに結合させ、生成したコンプレックスをサンプ
    ル中の分析物の含有量の指標として検出ことにより、サ
    ンプル中の分析物を検出する方法であって、 ａ）第１段階において、試験において検出に用いられる
    レセプターの分析物特異性結合領域に特異的に結合する
    少なくとも２の結合部位をもつ既知量のコンジュゲート
    であって、該結合部位が少なくとも１の可溶性キャリヤ
    ー物質により連結されることで溶解後に長期安定性を有
    しておりそして該コンジュゲートが合成物又は組換え産
    生物であるそのコンジュゲートを、サンプルの代わりに
    分析物特異性レセプターに結合させ、 ｂ）コンジュゲートとレセプターとの間で生成したコン
    プレックスを測定し、 ｃ）段階ｂ）からの測定結果を用いて検量線を作成し、 ｄ）サンプル中の分析物の検出を行い、そして測定した
    シグナルをｃ）から得られた検量線と比較することによ
    り分析物濃度を決定する方法。
  3. 【請求項３】 少なくとも２の相違する分析物を検出す
    るための試験で用いる液体安定万能キャリブレータであ
    って、請求項１に記載の少なくとも２の相違するキャリ
    ブレータの混合物を含む普遍キャリブレータ。
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