JP2735233B2 - 合成ペプチドおよびそれに対する抗体 - Google Patents
合成ペプチドおよびそれに対する抗体Info
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- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
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- C07K16/40—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
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- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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- G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は合成ペプチド、該ペプチドを用いる動物の免
疫化方法、該ペプチドに対する特異的な抗体およびその
精製方法に関する。
疫化方法、該ペプチドに対する特異的な抗体およびその
精製方法に関する。
ヒトの身体は血液の損失および血栓症から自身を防御
するために平衡状態にある２つのシステムすなわち凝固
系および繊維素溶解系を有する。この両者間の共同作用
により、はじめに止血のための不溶性フイブリン重合体
が形成され、これが創傷が治癒する間に繊維素溶解によ
る溶解過程により再び分解される。
するために平衡状態にある２つのシステムすなわち凝固
系および繊維素溶解系を有する。この両者間の共同作用
により、はじめに止血のための不溶性フイブリン重合体
が形成され、これが創傷が治癒する間に繊維素溶解によ
る溶解過程により再び分解される。
プラスミンおよびトロンビンはこの両システムにおけ
る中心的酵素である。生理学的条件下においては、凝固
系と繊維素溶解系との間の動的な平衡はプラスミンの血
栓溶解活性とトロンビンの血栓形成活性の制御の下にあ
る。
る中心的酵素である。生理学的条件下においては、凝固
系と繊維素溶解系との間の動的な平衡はプラスミンの血
栓溶解活性とトロンビンの血栓形成活性の制御の下にあ
る。
トロンビンは代表的なモリンプロテアーゼであり、不
活性な前駆物質であるプロトロンビンの形態で合成され
る。
活性な前駆物質であるプロトロンビンの形態で合成され
る。
プロトロンビンの活性化は、凝固カスケード内で中心
的位置を占める凝固第Xa因子によるタンパク分解に基づ
く。第Xa因子それ自体は外因性のみならず内因性凝固径
路によっても活性化されうるので、特別な機能を有す
る。活性化された第Ｘ因子（第Xa因子）がプロトロンビ
ン分子をテトラペプチドIle−Glu−Gly−Argに続くペプ
チド結合のところで特異的に開裂させることによりプロ
トロンビンを活性化させる。この分解により一方ではト
ロンビンが形成され、他方では等モル濃度でプロトロン
ビンフラグメントF1+2が形成される。分解された各プロ
トロンビン分子からトロンビン１分子とプロトロンビン
フラグメントF1+2１分子が形成されるので、血液または
血漿中におけるプロトロンビンフラグメントF1+2を測定
することにより、血液または血漿中に含有されるトロン
ビン濃度の凾数である凝固能力に関する直接的な帰納的
推論ができる。
的位置を占める凝固第Xa因子によるタンパク分解に基づ
く。第Xa因子それ自体は外因性のみならず内因性凝固径
路によっても活性化されうるので、特別な機能を有す
る。活性化された第Ｘ因子（第Xa因子）がプロトロンビ
ン分子をテトラペプチドIle−Glu−Gly−Argに続くペプ
チド結合のところで特異的に開裂させることによりプロ
トロンビンを活性化させる。この分解により一方ではト
ロンビンが形成され、他方では等モル濃度でプロトロン
ビンフラグメントF1+2が形成される。分解された各プロ
トロンビン分子からトロンビン１分子とプロトロンビン
フラグメントF1+2１分子が形成されるので、血液または
血漿中におけるプロトロンビンフラグメントF1+2を測定
することにより、血液または血漿中に含有されるトロン
ビン濃度の凾数である凝固能力に関する直接的な帰納的
推論ができる。
現在の技術においては、ラジオイムノアツセイの使用
によるトロンビンまたはプロトロンビンフラグメントF2
／F1+2の定量が知られている。この目的に必要な抗血清
は、精製されたプロトロンビン分子から得られたプロト
ロンビンフラグメントF2およびF1+2を動物の免疫化に使
用することにより生成される。かくして得られた粗製抗
血清から、固定されたプロトロンビンおよび相当するフ
ラグメントへの免疫吸着による精製により特異的な抗体
が濃縮される。これら抗体調製物はプロトロンビンフラ
グメントF2／F1+2の測定に適するが、しかし完全無欠の
分解されていないプロトロンビンと分解により遊離され
るプロトロンビンフラグメントF2／F1+2との間を完全に
区別することができない。その上この抗体調製物の特異
性が比較的低くて抗原の測定はラジオイムノアツセイ
（RIA）を使用してのみしか行うことができず、それに
このアツセイ法は実際上照射保護規定に設定された条件
が認められる場合にしか実施できないのでそれゆえ、比
較的大きな工業的骨折りおよび経済的出費を要する。終
りに、ラジオアイソトープで標識された抗体は常に新た
に調製されねばならない。何故ならタンパク質の放射性
標識化に通常使用されるアイソトープＩ−125は約２か
月しか半減期がないからである。
によるトロンビンまたはプロトロンビンフラグメントF2
／F1+2の定量が知られている。この目的に必要な抗血清
は、精製されたプロトロンビン分子から得られたプロト
ロンビンフラグメントF2およびF1+2を動物の免疫化に使
用することにより生成される。かくして得られた粗製抗
血清から、固定されたプロトロンビンおよび相当するフ
ラグメントへの免疫吸着による精製により特異的な抗体
が濃縮される。これら抗体調製物はプロトロンビンフラ
グメントF2／F1+2の測定に適するが、しかし完全無欠の
分解されていないプロトロンビンと分解により遊離され
るプロトロンビンフラグメントF2／F1+2との間を完全に
区別することができない。その上この抗体調製物の特異
性が比較的低くて抗原の測定はラジオイムノアツセイ
（RIA）を使用してのみしか行うことができず、それに
このアツセイ法は実際上照射保護規定に設定された条件
が認められる場合にしか実施できないのでそれゆえ、比
較的大きな工業的骨折りおよび経済的出費を要する。終
りに、ラジオアイソトープで標識された抗体は常に新た
に調製されねばならない。何故ならタンパク質の放射性
標識化に通常使用されるアイソトープＩ−125は約２か
月しか半減期がないからである。
それゆえ本発明の目的は、プロトロンビンフラグメン
トF2／F1+2に対する特異的な抗体を生成させ従って生物
学的液体中におけるこれらフラグメントの含量の迅速か
つ正確な測定を可能にするような抗原を提供することで
あった。
トF2／F1+2に対する特異的な抗体を生成させ従って生物
学的液体中におけるこれらフラグメントの含量の迅速か
つ正確な測定を可能にするような抗原を提供することで
あった。
この目的は本発明に従い、部分的にプロトロンビンの
アミノ酸配列に相当しかつ抗原であるアミノ酸配列を有
する合成ペプチドにより達成された。
アミノ酸配列に相当しかつ抗原であるアミノ酸配列を有
する合成ペプチドにより達成された。
それゆえ本発明はプロトロンビンのFXa分解により形
成されるフラグメントF2／F1+2のカルボキシル末端に部
分的に相当し、かつアミノ酸配列H-Gly-Asp-Glu-Glu-Gl
y-Val-Trp-Cys-Tyr-Val-Ala-Gly-Lys-Pro-Gly-Asp-Phe-
Gly-Tyr-Cys-Asp-Leu-Asn-Tyr-Cys-Glu-Glu-Ala-Val-Gl
n-Glu-Glu-Thr-Gly-Asp-Gly-Leu-Asp-Glu-Asp-Ser-Asp-
Glu-Glu-Arg-Ala-Ile-Glu-Gly-Arg-OHを完全にあるいは
部分的にではあるがしかし少なくとも４個のカルボキシ
ル末端アミノ酸を含有するアミノ酸配列からなるペプチ
ドに関する（但し、アミノ酸配列H-Cys-Tyr-Val-Ala-Gl
y-Lys-Pro-Gly-Asp-Phe-Gly-Tyr-Cys-Asp-Leu-Asn-Tyr-
Cys-Glu-Glu-Ala-Val-Gln-Glu-Glu-Thr-Gly-Asp-Gly-Le
u-Asp-Glu-Asp-Ser-Asp-Glu-Glu-Arg-Ala-Ile-Glu-Gly-
Arg-OHまたはH-Ala-Ile-Glu-Gly-Arg-OHからなるペプチ
ドを除く。） 本発明によるペプチドの調製には慣用の方法例えばMe
rrifieldによる固相ペプチド合成（G.Barany及びR.B.Me
rrifield:“Solid-Phase Peptide Synthesis"in E.Gros
s und J.Meienhofer:The Peptides,Analysis,Synthesi
s,Biology,Academic Press,Inc.1980）ならびに可溶性
ペプチドセグメントの形のペプチド合成ができる慣用の
合成法が適当である。構造H-Cys（SH）‐Leu-Asp-Glu-A
sp-Ser-Asp-Glu-Glu-Arg-Ala-Ile-Glu-Gly-Argを有する
ペプチドが固相上で特に好都合に調製された。一時的な
保護基としてはFmoc（9-フルオレニルメチルオキシカル
ボニル）基が用いられ、AspおよびGluに対する恒久的な
保護基としてはO-t-Bu保護基、Serにはt-Bu、ArgにはMt
r（４−メトキシ−2,3,6−トリメチルフエニルスルホニ
ル）基、そしてCysには第三ブチルメルカプト基が用い
られた。Ｃ−末端アミノ酸の固定は１％架橋ポリスチレ
ンに結合したｐ−アルコキシベンジルエステル基により
行われた。ペプチドの合成は、一時的な保護基を除去し
そして後続の保護されたアミノ酸を縮合剤好ましくはカ
ルボジイミドを用いて縮合させることの反復により行わ
れた。樹脂からのペプチドの解裂は酸分解により行わ
れ、同時に側鎖官能基が脱保護される。脱保護すべき任
意のスルフヒドリル官能基は現在技術に従ってトリ−ｎ
−ブチルホスフインを用いて脱保護される。ペプチドの
精製はイオン交換クロマトグラフイー、RP−HPLCおよび
ゲル透過クロマトグラフイーにより行われた。ペプチド
の正確な組成はアミノ酸分析により確認された。
成されるフラグメントF2／F1+2のカルボキシル末端に部
分的に相当し、かつアミノ酸配列H-Gly-Asp-Glu-Glu-Gl
y-Val-Trp-Cys-Tyr-Val-Ala-Gly-Lys-Pro-Gly-Asp-Phe-
Gly-Tyr-Cys-Asp-Leu-Asn-Tyr-Cys-Glu-Glu-Ala-Val-Gl
n-Glu-Glu-Thr-Gly-Asp-Gly-Leu-Asp-Glu-Asp-Ser-Asp-
Glu-Glu-Arg-Ala-Ile-Glu-Gly-Arg-OHを完全にあるいは
部分的にではあるがしかし少なくとも４個のカルボキシ
ル末端アミノ酸を含有するアミノ酸配列からなるペプチ
ドに関する（但し、アミノ酸配列H-Cys-Tyr-Val-Ala-Gl
y-Lys-Pro-Gly-Asp-Phe-Gly-Tyr-Cys-Asp-Leu-Asn-Tyr-
Cys-Glu-Glu-Ala-Val-Gln-Glu-Glu-Thr-Gly-Asp-Gly-Le
u-Asp-Glu-Asp-Ser-Asp-Glu-Glu-Arg-Ala-Ile-Glu-Gly-
Arg-OHまたはH-Ala-Ile-Glu-Gly-Arg-OHからなるペプチ
ドを除く。） 本発明によるペプチドの調製には慣用の方法例えばMe
rrifieldによる固相ペプチド合成（G.Barany及びR.B.Me
rrifield:“Solid-Phase Peptide Synthesis"in E.Gros
s und J.Meienhofer:The Peptides,Analysis,Synthesi
s,Biology,Academic Press,Inc.1980）ならびに可溶性
ペプチドセグメントの形のペプチド合成ができる慣用の
合成法が適当である。構造H-Cys（SH）‐Leu-Asp-Glu-A
sp-Ser-Asp-Glu-Glu-Arg-Ala-Ile-Glu-Gly-Argを有する
ペプチドが固相上で特に好都合に調製された。一時的な
保護基としてはFmoc（9-フルオレニルメチルオキシカル
ボニル）基が用いられ、AspおよびGluに対する恒久的な
保護基としてはO-t-Bu保護基、Serにはt-Bu、ArgにはMt
r（４−メトキシ−2,3,6−トリメチルフエニルスルホニ
ル）基、そしてCysには第三ブチルメルカプト基が用い
られた。Ｃ−末端アミノ酸の固定は１％架橋ポリスチレ
ンに結合したｐ−アルコキシベンジルエステル基により
行われた。ペプチドの合成は、一時的な保護基を除去し
そして後続の保護されたアミノ酸を縮合剤好ましくはカ
ルボジイミドを用いて縮合させることの反復により行わ
れた。樹脂からのペプチドの解裂は酸分解により行わ
れ、同時に側鎖官能基が脱保護される。脱保護すべき任
意のスルフヒドリル官能基は現在技術に従ってトリ−ｎ
−ブチルホスフインを用いて脱保護される。ペプチドの
精製はイオン交換クロマトグラフイー、RP−HPLCおよび
ゲル透過クロマトグラフイーにより行われた。ペプチド
の正確な組成はアミノ酸分析により確認された。
動物の免疫化における抗原として合成ペプチドを使用
するとこのペプチド中に露出されているハプテンに対す
る特異的な抗体が生成される。それゆえかくして生成さ
れた抗体はそのペプチド配列の起源である完全なタンパ
ク質の１個の抗体結合部位にそれぞれ特異的である。合
成ペプチドの使用は天然の精製プロトロンビンフラグメ
ントF2／F1+2の使用に比較してさらに２つの重大な利点
を有する。すなわち合成ペプチドは大規模かつ高純度に
調製されうるので、天然のプロトロンビンフラグメント
の骨の折れる単離および精製を行わなくてすむ。合成副
生物からの合成ペプチドの精製は良く確立されている
が、天然プロトロンビンフラグメントの工業的に骨の折
れる濃縮および精製法では、たとえ測定できないほど小
さくても抗原としての活性を依然として有する望ましか
らぬペプチドをなおある割合で含有する調製物を常に生
ずる。
するとこのペプチド中に露出されているハプテンに対す
る特異的な抗体が生成される。それゆえかくして生成さ
れた抗体はそのペプチド配列の起源である完全なタンパ
ク質の１個の抗体結合部位にそれぞれ特異的である。合
成ペプチドの使用は天然の精製プロトロンビンフラグメ
ントF2／F1+2の使用に比較してさらに２つの重大な利点
を有する。すなわち合成ペプチドは大規模かつ高純度に
調製されうるので、天然のプロトロンビンフラグメント
の骨の折れる単離および精製を行わなくてすむ。合成副
生物からの合成ペプチドの精製は良く確立されている
が、天然プロトロンビンフラグメントの工業的に骨の折
れる濃縮および精製法では、たとえ測定できないほど小
さくても抗原としての活性を依然として有する望ましか
らぬペプチドをなおある割合で含有する調製物を常に生
ずる。
本発明に従い、プロトロンビンのアミノ酸配列に完全
にまたは部分的に一致するアミノ酸配列を有するペプチ
ドが慣用のペプチド合成法の一つ、例えばメリフイール
ド合成により調製される。適当な配列を選択する場合、
タンパク質および／または露出されるエピトープの抗原
性が存在するゆえは高い抗原活性が予測されうるような
領域をできるだけ選択する。かくして合成ペプチドが抗
原としての活性を有し、従って免疫化により免疫応答が
惹起される。
にまたは部分的に一致するアミノ酸配列を有するペプチ
ドが慣用のペプチド合成法の一つ、例えばメリフイール
ド合成により調製される。適当な配列を選択する場合、
タンパク質および／または露出されるエピトープの抗原
性が存在するゆえは高い抗原活性が予測されうるような
領域をできるだけ選択する。かくして合成ペプチドが抗
原としての活性を有し、従って免疫化により免疫応答が
惹起される。
活性化された第Ｘ因子（Xa）はプロトロンビン分子を
認識配列Ile-Glu-Gly-Argで分解する。このテトラペプ
チドの存在はヒトおよびウシプロトロンビン中にしか検
出されていない。このテトラペプチドの稀少性ゆえにこ
のものはプロトロンビン分子の特異的な指標として使用
され易い傾向がある。
認識配列Ile-Glu-Gly-Argで分解する。このテトラペプ
チドの存在はヒトおよびウシプロトロンビン中にしか検
出されていない。このテトラペプチドの稀少性ゆえにこ
のものはプロトロンビン分子の特異的な指標として使用
され易い傾向がある。
活性化された第Ｘ因子によるプロトロンビンの分解は
配列Ile-Glu-Gly-ArgのArgの次で行われる。第Xa因子に
より、かくして新たなカルボキシ末端が生成され、この
ものは非常に高い抗原性を有する２種のアミノ酸Gluお
よびArgを末端領域で含有する。Ｃ−末端に第Xa因子分
解部位の認識配列を含有するペプチドまたはポリペプチ
ドが免疫化に特に良好に適する。
配列Ile-Glu-Gly-ArgのArgの次で行われる。第Xa因子に
より、かくして新たなカルボキシ末端が生成され、この
ものは非常に高い抗原性を有する２種のアミノ酸Gluお
よびArgを末端領域で含有する。Ｃ−末端に第Xa因子分
解部位の認識配列を含有するペプチドまたはポリペプチ
ドが免疫化に特に良好に適する。
予想外なことに、Ｃ−末端に第Xa因子プロテアーゼの
認識配列のテトラペプチドの配列を含有するペプチドま
たはポリペプチドに対する抗体が、分解されたプロトロ
ンビンフラグメントと専ら特異的に反応するが、しかし
ながら完全無欠なプロトロンビン分子とは反応しないこ
とが見出された。
認識配列のテトラペプチドの配列を含有するペプチドま
たはポリペプチドに対する抗体が、分解されたプロトロ
ンビンフラグメントと専ら特異的に反応するが、しかし
ながら完全無欠なプロトロンビン分子とは反応しないこ
とが見出された。
プロトロンビンに第Xa因子を作用させることにより生
成され、そのＣ−末端に第Xa因子認識配列を担持するフ
ラグメントは273個の鎖長さのアミノ酸を有する。免疫
化には全ポリペプチドもそのペプチドの部分配列も適す
るが、しかし後者はＣ−末端に第Xa因子認識配列をなお
有していなければならない。特に好ましい態様では例え
ば配列Leu-Asp-Glu-Asp-Ser-Asp-Glu-Glu-Arg-Ala-Ile-
Glu-Gly-Arg-OHを有するテトラデカペプチドの使用が提
供される。いずれの場合も、その分子のカルボキシル末
端配列が露出されそして免疫化を招来することのみが重
要なポイントである。
成され、そのＣ−末端に第Xa因子認識配列を担持するフ
ラグメントは273個の鎖長さのアミノ酸を有する。免疫
化には全ポリペプチドもそのペプチドの部分配列も適す
るが、しかし後者はＣ−末端に第Xa因子認識配列をなお
有していなければならない。特に好ましい態様では例え
ば配列Leu-Asp-Glu-Asp-Ser-Asp-Glu-Glu-Arg-Ala-Ile-
Glu-Gly-Arg-OHを有するテトラデカペプチドの使用が提
供される。いずれの場合も、その分子のカルボキシル末
端配列が露出されそして免疫化を招来することのみが重
要なポイントである。
ペプチドが免疫応答を惹起することは意図されない
が、しかしペプチドの唯一の機能がすでに存在する抗体
により認識されるべきである場合は、より短いペプチド
で充分である。その場合好都合な態様は配列Glu-Glu-Ar
g-Ala-Ile-Glu-Gly-Arg-OHを有するオクタペプチドに基
づく。
が、しかしペプチドの唯一の機能がすでに存在する抗体
により認識されるべきである場合は、より短いペプチド
で充分である。その場合好都合な態様は配列Glu-Glu-Ar
g-Ala-Ile-Glu-Gly-Arg-OHを有するオクタペプチドに基
づく。
これらペプチドに意図される使用を顧慮すると、反応
性側鎖基を有するアミノ酸をそれがハプテンの構造に影
響しないようにペプチド中に導入することが適切であ
る。この理由で、その遊離のSH基がチオエーテルを介し
た多くの担体への結合に適するもう一つのアミノ酸とし
てＮ−末端にシステインを付加することが好都合であ
る。例えば前記ペプチドにより表わされる抗原をペンタ
デカペプチドCys（SH）‐Leu-Asp-Glu-Asp-Ser-Asp-Glu
-Glu-Arg-Ala-Ile-Glu-Gly-Argの形で提供するのが好ま
しい。
性側鎖基を有するアミノ酸をそれがハプテンの構造に影
響しないようにペプチド中に導入することが適切であ
る。この理由で、その遊離のSH基がチオエーテルを介し
た多くの担体への結合に適するもう一つのアミノ酸とし
てＮ−末端にシステインを付加することが好都合であ
る。例えば前記ペプチドにより表わされる抗原をペンタ
デカペプチドCys（SH）‐Leu-Asp-Glu-Asp-Ser-Asp-Glu
-Glu-Arg-Ala-Ile-Glu-Gly-Argの形で提供するのが好ま
しい。
免疫化に用いられるペプチドは慣用法で化学的合成に
より製造できるし、あるいは遺伝子操作により得られう
るポリペプチドの精製によっても製造されうる。考えら
れうる例は、大腸菌中でプロトロンビンフラグメントF2
またはF1+2を強力なプロモーターの制御の下に遺伝子工
学的に合成するか、あるいは第Xa分解部位を越えて伸び
るペプチド、または同様に遺伝子工学的に得られた第Xa
因子によりインビトロで分解されて所望の抗原性カルボ
キシル末端を生ずるペプチドを遺伝子操作により合成す
ることである。
より製造できるし、あるいは遺伝子操作により得られう
るポリペプチドの精製によっても製造されうる。考えら
れうる例は、大腸菌中でプロトロンビンフラグメントF2
またはF1+2を強力なプロモーターの制御の下に遺伝子工
学的に合成するか、あるいは第Xa分解部位を越えて伸び
るペプチド、または同様に遺伝子工学的に得られた第Xa
因子によりインビトロで分解されて所望の抗原性カルボ
キシル末端を生ずるペプチドを遺伝子操作により合成す
ることである。
免疫化に用いられるかまたは免疫吸着剤として使用さ
れることが意図されるペプチドは担体分子に結合される
ことが大切である。慣用の、広く用いられる担体分子の
例をあげれば、ウシ血清アルブミン、卵アルブミンおよ
び多糖類である。好ましい態様においては、ペプチドま
たはポリペプチドをキーホールリンペツト（Keyhole ly
mpet）ヘモシアニンに結合させる。
れることが意図されるペプチドは担体分子に結合される
ことが大切である。慣用の、広く用いられる担体分子の
例をあげれば、ウシ血清アルブミン、卵アルブミンおよ
び多糖類である。好ましい態様においては、ペプチドま
たはポリペプチドをキーホールリンペツト（Keyhole ly
mpet）ヘモシアニンに結合させる。
本発明による合成ペプチドを免疫吸着剤として使用す
る場合は、固形マトリツクスの調製に適する物質に結合
させるのが好ましい。好ましい態様は短いペプチド、例
えば、前記したオクタペプチドを臭化シアンで活性化さ
れたセフアロースに結合させることである。
る場合は、固形マトリツクスの調製に適する物質に結合
させるのが好ましい。好ましい態様は短いペプチド、例
えば、前記したオクタペプチドを臭化シアンで活性化さ
れたセフアロースに結合させることである。
適当な動物を、担体に結合されたペプチドを用いて免
疫すると抗体が再現可能に形成される。免疫化および抗
体取得にとって好ましい動物種はウサギである。何故な
らその場合得られうる血液量と飼育および世話にかかる
費用との関連が好ましいからである。
疫すると抗体が再現可能に形成される。免疫化および抗
体取得にとって好ましい動物種はウサギである。何故な
らその場合得られうる血液量と飼育および世話にかかる
費用との関連が好ましいからである。
本発明により合成ペプチドを用い動物に生成されたか
かる抗血清から、特異的なアツセイに関連するイムノグ
ロブリンフラクシヨンが慣用の免疫吸着法により富化さ
れうる。しかしながら、この場合かかる免疫吸着に用い
られるマトリツクスのための材料としては、抗体に結合
されており、かつ免疫化に用いられたペプチドと同じ抗
原決定基を有するペプチドを用いることも好ましい。そ
の場合免疫吸着による精製に使用されるペプチドはかな
り短かくて済む。所望の抗体の免疫吸着による精製に使
用するための唯一の前提条件はただ、この比較的短いポ
リペプチドにより形成される抗原決定基が所望の抗体に
より認識されかつ効果的に結合されるということであ
る。
かる抗血清から、特異的なアツセイに関連するイムノグ
ロブリンフラクシヨンが慣用の免疫吸着法により富化さ
れうる。しかしながら、この場合かかる免疫吸着に用い
られるマトリツクスのための材料としては、抗体に結合
されており、かつ免疫化に用いられたペプチドと同じ抗
原決定基を有するペプチドを用いることも好ましい。そ
の場合免疫吸着による精製に使用されるペプチドはかな
り短かくて済む。所望の抗体の免疫吸着による精製に使
用するための唯一の前提条件はただ、この比較的短いポ
リペプチドにより形成される抗原決定基が所望の抗体に
より認識されかつ効果的に結合されるということであ
る。
抗体の免疫吸着により精製に使用されるペプチドは例
えばオクタペプチド、好ましくはペプチドH-Glu-Glu-Ar
g-Ala-Ile-Glu-Gly-Argであることができる。
えばオクタペプチド、好ましくはペプチドH-Glu-Glu-Ar
g-Ala-Ile-Glu-Gly-Argであることができる。
本発明に従い、合成ペプチドを用いて免疫付与するこ
とにより動物系に抗体が誘発されそして免疫吸着により
精製される。これら抗体は免疫化およひ精製に用いられ
たペプチドと特異的に反応する。用いられたペプチドの
配列の如何により、これら抗体はフラグメントF2および
F1+2にのみ結合するか、あるいは天然のプロトロンビン
分子中に露出されているペプチド配列が選択される場合
は完全無欠なプロトロンビン分子にも結合する。
とにより動物系に抗体が誘発されそして免疫吸着により
精製される。これら抗体は免疫化およひ精製に用いられ
たペプチドと特異的に反応する。用いられたペプチドの
配列の如何により、これら抗体はフラグメントF2および
F1+2にのみ結合するか、あるいは天然のプロトロンビン
分子中に露出されているペプチド配列が選択される場合
は完全無欠なプロトロンビン分子にも結合する。
適当なペプチドを免疫吸着剤として選択することによ
り、プロトロンビン分子の第Xa因子分解部位の配列に相
当するこの分子の抗原決定基と特異的に反応する抗体が
選択されうる。Ｃ−末端に第Xa因子認識配列を有するペ
プチドが免疫化にのみならず免疫吸着による精製に使用
される好ましい場合は、この配列に対する抗体ではある
がしかし完全無欠な天然のプロトロンビンとは反応しな
い抗体が富化される。何故なら天然のプロトロンビン分
子中においては第Xa因子分解部位は充分に露出されてい
ないかまたは抗原としての認識に必要なより高次の構造
を有しないからである。
り、プロトロンビン分子の第Xa因子分解部位の配列に相
当するこの分子の抗原決定基と特異的に反応する抗体が
選択されうる。Ｃ−末端に第Xa因子認識配列を有するペ
プチドが免疫化にのみならず免疫吸着による精製に使用
される好ましい場合は、この配列に対する抗体ではある
がしかし完全無欠な天然のプロトロンビンとは反応しな
い抗体が富化される。何故なら天然のプロトロンビン分
子中においては第Xa因子分解部位は充分に露出されてい
ないかまたは抗原としての認識に必要なより高次の構造
を有しないからである。
本発明により得られた抗体は種々の特徴を有する多数
のイムノアツセイに用いられうる。この目的には好都合
にはそれらを固形担体に結合させるが、好ましくはポリ
スチレン管に吸着させることにより固定させる。以下の
イムノアツセイ用に調製された管は気密に密封して４℃
で貯蔵されうる。
のイムノアツセイに用いられうる。この目的には好都合
にはそれらを固形担体に結合させるが、好ましくはポリ
スチレン管に吸着させることにより固定させる。以下の
イムノアツセイ用に調製された管は気密に密封して４℃
で貯蔵されうる。
プロトロンビンフラグメントF2／F1+2の含量は本発明
に従い、検体をかかる方法で固定された抗体とプレイン
キユベーシヨンすることにより測定され、固定された抗
体により結合されたフラグメントF2／F1+2の濃度は次に
第２の抗体とインキユベーシヨンすることにより検出さ
れる。この第２の抗体は測定可能な性質、例えば色原体
基質と反応または結合する能力を有する必要がある。
に従い、検体をかかる方法で固定された抗体とプレイン
キユベーシヨンすることにより測定され、固定された抗
体により結合されたフラグメントF2／F1+2の濃度は次に
第２の抗体とインキユベーシヨンすることにより検出さ
れる。この第２の抗体は測定可能な性質、例えば色原体
基質と反応または結合する能力を有する必要がある。
この第２の抗体はマーカー酵素好ましくはペルオキシ
ダーゼに結合しているのが好都合である。しかしながら
この第２の抗体に蛍光性分子例えばフルオレセインイソ
チオシアネートあるいは放射性標識を具備させることを
選択することもできる。
ダーゼに結合しているのが好都合である。しかしながら
この第２の抗体に蛍光性分子例えばフルオレセインイソ
チオシアネートあるいは放射性標識を具備させることを
選択することもできる。
プロトロンビンフラグメントF2／F1+2の測定は検体好
ましくは血漿、および標識された抗体を固定された抗体
と同時にインキユベーシヨンすることにより行うことも
できる。その他競合的測定法も可能で、その場合標識お
よび未標識プロトロンビンフラグメントF2／F1+2が固定
された抗体上の結合部位について競争する。
ましくは血漿、および標識された抗体を固定された抗体
と同時にインキユベーシヨンすることにより行うことも
できる。その他競合的測定法も可能で、その場合標識お
よび未標識プロトロンビンフラグメントF2／F1+2が固定
された抗体上の結合部位について競争する。
この方法で測定されたプロトロンビンフラグメントF2
／F1+2の濃度によりプロトロンビンの活性化度に関する
情報が提供される。
／F1+2の濃度によりプロトロンビンの活性化度に関する
情報が提供される。
以下の実施例により本発明を説明する。実施例中にて
用いられる略語を説明すれば次のとおりである。
用いられる略語を説明すれば次のとおりである。
FPA フイブリノペプチドＡ ELISA エンザイムイムノアツセイ（エンザイム−
リンクトイムノソルベントアツセイ） RIA ラジオイムノアツセイ KLH キーホールリンペツトヘモシアニン PBS 燐酸塩緩衝食塩水 トリス トリス（ヒドロキシメチル）アミノメ
タン EDTA エチレンジアミン四酢酸 OD 吸光率（光学濃度） Asp L-アルパラギン酸 Ala L-アラニン Arg L-アルギニン Gly グリシン Glu L-グルタミン酸 Ilu L-イソロイシン Ser L-セリン Cys（SH） L-システイン Fmos 9-フルオレニルメチルオキシカルボニル O-t-Bu 第三ブチルエステル t-Bu 第三ブチルエーテル Mtr 4-メトキシ‐2,3,6-トリメチルフエニル
スルホニル DMF ジメチルホルムアミド RP-HPLC 逆相高性能液体クロマトグラフイー GMBS ガンママレイミド酪酸ヒドロキシスクシン
イミドエステル 実施例 １ 免疫化用抗原の調製 ａ）ペンタデカペプチド H-Cys（SH）‐Leu-Asp-Glu-A
sp-Ser-Asp-Glu-Glu-Arg-Ala-Ile-Glu-Gly-Argに関する
ペプチド合成 このペプチドの合成は半自動式ペプチドシンセサイザ
ーを用いて行われた。Fmos-Arg（Mtr）‐p-アルコキシ
ベンジルエステル樹脂1gを20％ピペリジン/DMF（v/v）1
5mlを用いて脱保護し次にDMFおよびイソプロパノールを
用いて数回洗った。Fmos-Gly 1ミリモル（３倍過剰）お
よびHOBt 203mgをDMF 15ml中に溶解したものを加えた。
1Mジイソプロピルカルボジイミド溶液（ジクロロメタン
中）1.1mlを添加したのち1.5時間結合させた。DMFおよ
びイソプロパノールで洗浄することにより過剰の試薬を
除去した。この結合スキームをN-末端アミノ酸まで保持
した。後者アミノ酸としてBocは保護されたアミノ酸が
用いられた。
リンクトイムノソルベントアツセイ） RIA ラジオイムノアツセイ KLH キーホールリンペツトヘモシアニン PBS 燐酸塩緩衝食塩水 トリス トリス（ヒドロキシメチル）アミノメ
タン EDTA エチレンジアミン四酢酸 OD 吸光率（光学濃度） Asp L-アルパラギン酸 Ala L-アラニン Arg L-アルギニン Gly グリシン Glu L-グルタミン酸 Ilu L-イソロイシン Ser L-セリン Cys（SH） L-システイン Fmos 9-フルオレニルメチルオキシカルボニル O-t-Bu 第三ブチルエステル t-Bu 第三ブチルエーテル Mtr 4-メトキシ‐2,3,6-トリメチルフエニル
スルホニル DMF ジメチルホルムアミド RP-HPLC 逆相高性能液体クロマトグラフイー GMBS ガンママレイミド酪酸ヒドロキシスクシン
イミドエステル 実施例 １ 免疫化用抗原の調製 ａ）ペンタデカペプチド H-Cys（SH）‐Leu-Asp-Glu-A
sp-Ser-Asp-Glu-Glu-Arg-Ala-Ile-Glu-Gly-Argに関する
ペプチド合成 このペプチドの合成は半自動式ペプチドシンセサイザ
ーを用いて行われた。Fmos-Arg（Mtr）‐p-アルコキシ
ベンジルエステル樹脂1gを20％ピペリジン/DMF（v/v）1
5mlを用いて脱保護し次にDMFおよびイソプロパノールを
用いて数回洗った。Fmos-Gly 1ミリモル（３倍過剰）お
よびHOBt 203mgをDMF 15ml中に溶解したものを加えた。
1Mジイソプロピルカルボジイミド溶液（ジクロロメタン
中）1.1mlを添加したのち1.5時間結合させた。DMFおよ
びイソプロパノールで洗浄することにより過剰の試薬を
除去した。この結合スキームをN-末端アミノ酸まで保持
した。後者アミノ酸としてBocは保護されたアミノ酸が
用いられた。
各結合段階ではニンヒドリン試験により完結したか否
か検査した。樹脂1.06gをチオアニソール2.5ml、エタン
ジチオール2.5mlおよびトリフルオロ酢酸15mlと35℃で
４時間撹拌しそして過した。酸性溶液をエーテル中に
注ぎ、沈澱したペプチドを過しそしてセフアデツクス
（Sephadex ）G-25カラム（３×100cm、0.5％酢酸）で
クロマトグラフイーした。ペプチドプールを凍結乾燥し
た。収量：ペプチド230mg。
か検査した。樹脂1.06gをチオアニソール2.5ml、エタン
ジチオール2.5mlおよびトリフルオロ酢酸15mlと35℃で
４時間撹拌しそして過した。酸性溶液をエーテル中に
注ぎ、沈澱したペプチドを過しそしてセフアデツクス
（Sephadex ）G-25カラム（３×100cm、0.5％酢酸）で
クロマトグラフイーした。ペプチドプールを凍結乾燥し
た。収量：ペプチド230mg。
ｂ）スルフヒドリル基の脱保護 ペプチド70mgをトリフルオロエタノール7mlおよび水3
50μｌ中に溶解させ、Ｎ−メチルモルホリンを用いてpH
7.3に調整した。反応容器を窒素でパージし、ｎ−トリ
ブチルホスフイン40μｌを加えた。この混合物を室温で
１時間撹拌し、水50mlを用いて希釈しそしてpH4.0に調
整した。水相をジエチルエーテル10mlを用いて３回抽出
し、10mlとなるまで濃縮しそしてセフアデツクスG25
（３×100cm、0.5％酢酸）で精製した。収量：ペプチド
55mg。
50μｌ中に溶解させ、Ｎ−メチルモルホリンを用いてpH
7.3に調整した。反応容器を窒素でパージし、ｎ−トリ
ブチルホスフイン40μｌを加えた。この混合物を室温で
１時間撹拌し、水50mlを用いて希釈しそしてpH4.0に調
整した。水相をジエチルエーテル10mlを用いて３回抽出
し、10mlとなるまで濃縮しそしてセフアデツクスG25
（３×100cm、0.5％酢酸）で精製した。収量：ペプチド
55mg。
ｃ）接合体の調製 キーホールリンペツトヘモシアニン30mgをpH8.0の0.0
5ミリモル燐酸ナトリウム緩衝液中に溶解させそして3mg
のGMBSを用いて１時間活性化した。このタンパク質をセ
フアデツクスG50のカラム（２×30cm）でクロマトグラ
フイーした（0.1モル燐酸ナトリウム、0.5ミリモルEDT
A、pH6.0）。タンパク質プールを6mlとなるまで濃縮し
そしてスルフヒドリル基を含有するペプチド30mgと１時
間インキユベーシヨンした。透析および凍結乾燥後の収
量：ペプチド接合体38mg。
5ミリモル燐酸ナトリウム緩衝液中に溶解させそして3mg
のGMBSを用いて１時間活性化した。このタンパク質をセ
フアデツクスG50のカラム（２×30cm）でクロマトグラ
フイーした（0.1モル燐酸ナトリウム、0.5ミリモルEDT
A、pH6.0）。タンパク質プールを6mlとなるまで濃縮し
そしてスルフヒドリル基を含有するペプチド30mgと１時
間インキユベーシヨンした。透析および凍結乾燥後の収
量：ペプチド接合体38mg。
実施例 ２ ウサギの免疫化 ウサギ５匹を動物１匹当り毎回2mgの抗原を用いて８
週間免疫した。ペプチド−KLH−接合体の投与は皮下お
よび静脈から行われた。次に動物から放血させ、得られ
た粗製抗血清をプールしそして防腐剤を用いて安定化さ
せた。収量：抗血清850ml。
週間免疫した。ペプチド−KLH−接合体の投与は皮下お
よび静脈から行われた。次に動物から放血させ、得られ
た粗製抗血清をプールしそして防腐剤を用いて安定化さ
せた。収量：抗血清850ml。
実施例 ３ 免疫吸着剤の調製 粗製抗血清をアフイニテイクロマトグラフイー精製す
るには配列H-Glu-Glu-Arg-Ala-Ile-Glu-Gly-Arg-OHを有
するオクタペプチド（実施例1aにおけるようにして調
製）約20mgを固相に共有により固定させた。この結合反
応は記載された方法（Axen,R.氏他、Nature、214、130
2、1967）に従い臭化シアンで活性化されたセフアロー
スを用いて行われた。次に免疫吸着剤を燐酸塩緩衝食塩
水（PBS、0.15モル/l、pH7.2）および酢酸（0.5モル/
l、pH2.5）を用いてそれぞれ洗った。使用前に吸着剤を
ゲルの３倍量のPBSを用いて平衡となした。収量：ペプ
チド−セフアロース約20ml。
るには配列H-Glu-Glu-Arg-Ala-Ile-Glu-Gly-Arg-OHを有
するオクタペプチド（実施例1aにおけるようにして調
製）約20mgを固相に共有により固定させた。この結合反
応は記載された方法（Axen,R.氏他、Nature、214、130
2、1967）に従い臭化シアンで活性化されたセフアロー
スを用いて行われた。次に免疫吸着剤を燐酸塩緩衝食塩
水（PBS、0.15モル/l、pH7.2）および酢酸（0.5モル/
l、pH2.5）を用いてそれぞれ洗った。使用前に吸着剤を
ゲルの３倍量のPBSを用いて平衡となした。収量：ペプ
チド−セフアロース約20ml。
同様な方法で、実施例１におけると同様にして調製さ
れたテトラデカペプチドを免疫吸着剤の製造に用いた。
れたテトラデカペプチドを免疫吸着剤の製造に用いた。
実施例 ４ 特異的な抗体の単離 粗製抗血清100mlをPBSで平衡となしたオクタペプチド
−セフアロース（1.5×15cm）に加えそして次に280nmで
の吸光が0.01になるまでPBSで洗った。次に食塩水（１
モル/l、pH7.0）および水（pH7.0）を用いて洗浄する
が、その際ゲルの３倍量をそれぞれ用いた。免疫吸着剤
から0.1モル/l酢酸（pH2.5）を用いて抗体を溶離し、抗
体溶液を固形燐酸ナトリウム（0.01モル/l）を用いてpH
7.0に調整し、濃縮し（Amicon膜）そして−70℃で貯蔵
した。収量：抗体35〜40mg。
−セフアロース（1.5×15cm）に加えそして次に280nmで
の吸光が0.01になるまでPBSで洗った。次に食塩水（１
モル/l、pH7.0）および水（pH7.0）を用いて洗浄する
が、その際ゲルの３倍量をそれぞれ用いた。免疫吸着剤
から0.1モル/l酢酸（pH2.5）を用いて抗体を溶離し、抗
体溶液を固形燐酸ナトリウム（0.01モル/l）を用いてpH
7.0に調整し、濃縮し（Amicon膜）そして−70℃で貯蔵
した。収量：抗体35〜40mg。
実施例 ５ 免疫吸着により得られた抗体のアツセイ ａ）抗体により被覆された管の調製 実施例４で得られた抗体をトリス緩衝溶液（0.025モ
ル/l、pH7.6）を用いて濃度５μg/mlまで希釈しそして
ポリスチレン管に吸着させることにより固定した。管１
つにつき抗体溶液250μｌを20℃で20時間インキユベー
シヨンし、次に液体を吸引して除き、そして管を気密状
に密封して４℃で貯蔵した。
ル/l、pH7.6）を用いて濃度５μg/mlまで希釈しそして
ポリスチレン管に吸着させることにより固定した。管１
つにつき抗体溶液250μｌを20℃で20時間インキユベー
シヨンし、次に液体を吸引して除き、そして管を気密状
に密封して４℃で貯蔵した。
ｂ）エンザイムイムノアツセイ（ELISA）操作 アツセイすべき検体（血漿、血清）をインキユベーシ
ヨン緩衝液（0.01モル/lのトリス、0.01モル/lのEDTA、
ヘパリン（2U/ml）、0.05％のツイーン、pH7.6）を用い
て1:1に希釈しそして管（実施例5a参照）１本当り検体2
00μｌと37℃で30分間インキユベーシヨンした。次にイ
ンキユベーシヨン溶液を除去しそして管をそれぞれ500
μｌずつの洗浄溶液（0.02モル/lの燐酸ナトリウム、0.
05％ツイーン、pH7.6）で２回洗った。次にペルオキシ
ダーゼと接合された抗−プロトロンビン抗体200μｌを
加え管を37℃で30分間インキユベーシヨンした。接合体
溶液を除去し２回洗浄したのち、基質−色原体溶液（過
酸化水素;o−フエニレンジアミン）200μｌを加えそし
てこの管を室温でインキユベーシヨンした。1/2時間イ
ンキユベーシヨンしたのちペルオキシダーゼを硫酸で不
活化しそして反応溶液の吸光度を492nmで測定した。
ヨン緩衝液（0.01モル/lのトリス、0.01モル/lのEDTA、
ヘパリン（2U/ml）、0.05％のツイーン、pH7.6）を用い
て1:1に希釈しそして管（実施例5a参照）１本当り検体2
00μｌと37℃で30分間インキユベーシヨンした。次にイ
ンキユベーシヨン溶液を除去しそして管をそれぞれ500
μｌずつの洗浄溶液（0.02モル/lの燐酸ナトリウム、0.
05％ツイーン、pH7.6）で２回洗った。次にペルオキシ
ダーゼと接合された抗−プロトロンビン抗体200μｌを
加え管を37℃で30分間インキユベーシヨンした。接合体
溶液を除去し２回洗浄したのち、基質−色原体溶液（過
酸化水素;o−フエニレンジアミン）200μｌを加えそし
てこの管を室温でインキユベーシヨンした。1/2時間イ
ンキユベーシヨンしたのちペルオキシダーゼを硫酸で不
活化しそして反応溶液の吸光度を492nmで測定した。
以下の表には、血漿または血清の希釈度の凾数として
の492nmでの吸光度を血漿または血清を含有しない管の
吸光度と比較して示す。
の492nmでの吸光度を血漿または血清を含有しない管の
吸光度と比較して示す。
第 １ 表 希 釈 度 OD492/30分 血漿 1:10 0.13 1:100 0.12 1:1000 0.11 1:10000 0.11 血清 1:10 3.72 1:100 3.71 1:1000 2.81 1:10000 0.97 ブランク緩衝液 0.045 ｃ）インビトロで形成されたフラグメントF2／F1+2を測
定するためのエンザイムイムノアツセイ（ELISA）操作 もう一つの実験でフラグメントF2／F1+2に対する抗体
の特異性について検査した。クエン酸塩溶液を凝固阻止
した血漿に塩化カルシウム溶液を用いて再びカルシウム
添加した（塩化カルシウムの最終濃度0.025モル/l）。
種々の時点で一部分を採取しそしてEDTA（0.1モル/
l）、アンチトロンビンIII（3IU/ml）およびヘパリン
（5IU/ml）の添加により反応を停止させた。検体をイン
キユベーシヨン緩衝液で1:1に希釈しそしてELISAでアツ
セイした。
定するためのエンザイムイムノアツセイ（ELISA）操作 もう一つの実験でフラグメントF2／F1+2に対する抗体
の特異性について検査した。クエン酸塩溶液を凝固阻止
した血漿に塩化カルシウム溶液を用いて再びカルシウム
添加した（塩化カルシウムの最終濃度0.025モル/l）。
種々の時点で一部分を採取しそしてEDTA（0.1モル/
l）、アンチトロンビンIII（3IU/ml）およびヘパリン
（5IU/ml）の添加により反応を停止させた。検体をイン
キユベーシヨン緩衝液で1:1に希釈しそしてELISAでアツ
セイした。
その結果を第２表に示す。
第 ２ 表 時間（分） OD492/39分 ０ 0.18 ３ 0.30 ６ 0.32 12 0.58 15 1.20 18 1.69 21 1.88 25 1.96 ブランク緩衝液 0.045 フラグメントF2／F1+2がこの方法で定量的に測定され
うることをこの結果は示している。一方再カルシウム添
加反応中、フラグメントF2／F1+2の濃度は時間が増すと
共に高まった。
うることをこの結果は示している。一方再カルシウム添
加反応中、フラグメントF2／F1+2の濃度は時間が増すと
共に高まった。
プロトロンビンのアミノ酸配列の全部または一部に相
当しかつ抗原性であるアミノ酸配列を有する本発明によ
るペプチドは、従ってペプチド中に存在するそれぞれの
抗原決定基に対し特異的に結合する抗体を誘発させる。
これら特異的な抗体は次に同じ抗原決定基を有するペプ
チドに免疫吸着させることにより精製されうる。合成ペ
プチドの使用には、絶対的に純粋な抗原が免疫化に使用
され従って、生成する免疫血清が他のタンパク質または
プロトロンビン分子の他の部分と何ら交差反応しないと
いうかなりの長所を有する。第Xa因子分解部位を含有す
るペプチドが本発明により用いられるのが好ましい。こ
のペプチドに対する抗体を用いると、分解されたプロト
ロンビン分子のみが検出されうる。何故なら完全無欠の
天然のプロトロンビン中ではこの配列は抗体認識されな
いからである。結合された抗体の量を測定することによ
り遊離されたプロトロンビンフラグメントF2／F1+2の濃
度に関する直接の情報を得ることができ、従ってプロト
ロンビンの活性化度に関する情報が提供されうる。
当しかつ抗原性であるアミノ酸配列を有する本発明によ
るペプチドは、従ってペプチド中に存在するそれぞれの
抗原決定基に対し特異的に結合する抗体を誘発させる。
これら特異的な抗体は次に同じ抗原決定基を有するペプ
チドに免疫吸着させることにより精製されうる。合成ペ
プチドの使用には、絶対的に純粋な抗原が免疫化に使用
され従って、生成する免疫血清が他のタンパク質または
プロトロンビン分子の他の部分と何ら交差反応しないと
いうかなりの長所を有する。第Xa因子分解部位を含有す
るペプチドが本発明により用いられるのが好ましい。こ
のペプチドに対する抗体を用いると、分解されたプロト
ロンビン分子のみが検出されうる。何故なら完全無欠の
天然のプロトロンビン中ではこの配列は抗体認識されな
いからである。結合された抗体の量を測定することによ
り遊離されたプロトロンビンフラグメントF2／F1+2の濃
度に関する直接の情報を得ることができ、従ってプロト
ロンビンの活性化度に関する情報が提供されうる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，74（５），1969− 72，1977
Claims (13)
- 【請求項１】プロトロンビンのFXa分解により形成され
るフラグメントF2／F1+2のカルボキシル末端に部分的に
相当し、かつアミノ酸配列H-Gly-Asp-Glu-Glu-Gly-Val-
Trp-Cys-Tyr-Val-Ala-Gly-Lys-Pro-Gly-Asp-Phe-Gly-Ty
r-Cys-Asp-Leu-Asn-Tyr-Cys-Glu-Glu-Ala-Val-Gln-Glu-
Glu-Thr-Gly-Asp-Gly-Leu-Asp-Glu-Asp-Ser-Asp-Glu-Gl
u-Arg-Ala-Ile-Glu-Gly-Arg-OHを完全にあるいは部分的
にではあるがしかし少くとも４個のカルボキシル末端ア
ミノ酸を含有するアミノ酸配列からなるペプチド（但
し、アミノ酸配列H-Cys-Tyr-Val-Ala-Gly-Lys-Pro-Gly-
Asp-Phe-Gly-Tyr-Cys-Asp-Leu-Asn-Tyr-Cys-Glu-Glu-Al
a-Val-Gln-Glu-Glu-Thr-Gly-Asp-Gly-Leu-Asp-Glu-Asp-
Ser-Asp-Glu-Glu-Arg-Ala-Ile-Glu-Gly-Arg-OHまたはH-
Ala-Ile-Glu-Gly-Arg-OHからなるペプチドを除く）。 - 【請求項２】アミノ酸配列H-Leu-Asp-Glu-Asp-Ser-Asp-
Glu-Glu-Arg-Ala-Ile-Glu-Gly-Arg-OH、H-Glu-Glu-Arg-
Ala-Ile-Glu-Gly-Arg-OHまたはH-Cys（SH）‐Leu-Asp-G
lu-Asp-Ser-Asp-Glu-Glu-Arg-Ala-Ile-Glu-Gly-Arg-OH
からなるペプチド。 - 【請求項３】遺伝子操作によるかあるいは化学合成によ
り製造された請求項１記載のペプチド。 - 【請求項４】請求項１記載のペプチドに不溶性のポリマ
ー担体あるいはキーホールリンペット（keyhole limpe
t）ヘモシアニン、アルブミンまたは卵アルブミンが結
合したペプチド。 - 【請求項５】請求項１記載のペプチドを動物（但しヒト
を除く）に注射して該動物を免疫化する方法。 - 【請求項６】前記ペプチドがアミノ酸配列H-Glu-Glu-Ar
g-Ala-Ile-Glu-Gly-Arg-OHからなる請求項５記載の方
法。 - 【請求項７】請求項１に記載のペプチドを使用して免疫
吸着により該ペプチドに対する特異的な抗体を精製する
方法。 - 【請求項８】前記ペプチドがアミノ酸配列H-Glu-Glu-Ar
g-Ala-Ile-Glu-Gly-Arg-OHからなる請求項７記載の方
法。 - 【請求項９】請求項１〜４のいずれかに記載のペプチド
を用いて動物（但しヒトを除く）を免疫しそして次に請
求項７または８のいずれかに記載の免疫吸着により精製
することにより得られた、請求項１記載のペプチドに対
する抗体。 - 【請求項１０】請求項１記載のペプチドおよび／または
天然のプロトロンビンまたはその一部分と特異的に反応
することからなる請求項９記載の抗体。 - 【請求項１１】プロトロンビンフラグメントF2／F1+2に
特異的に結合しかつ担体に結合されていることからなる
請求項10記載の抗体。 - 【請求項１２】プロトロンビンフラグメントF2／F1+2を
請求項９〜11のいずれかに記載の抗体に結合させ、得ら
れた結合体をその量が測定可能である第２の抗体と結合
させ、次いで第２の抗体を検出することからなるプロト
ロンビンフラグメントF1+2／F2を測定する方法。 - 【請求項１３】第２の抗体にマーカー酵素が結合されて
いることからなる請求項12記載の測定方法。
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