JP2530714B2 - フイブリンに対する抗体；抗体の製造に使用される免疫原、抗体及び抗体を基剤とした製薬学的製剤でフイブリンを測定する方法 - Google Patents
フイブリンに対する抗体；抗体の製造に使用される免疫原、抗体及び抗体を基剤とした製薬学的製剤でフイブリンを測定する方法Info
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- JP2530714B2 JP2530714B2 JP1114335A JP11433589A JP2530714B2 JP 2530714 B2 JP2530714 B2 JP 2530714B2 JP 1114335 A JP1114335 A JP 1114335A JP 11433589 A JP11433589 A JP 11433589A JP 2530714 B2 JP2530714 B2 JP 2530714B2
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明はフィブリンと特異的に反応す抗体に関する。
本発明を要約すれば、本発明によりフィブリノーゲン
のＡα−鎖の連鎖（または配列）111−207、特に148−1
61のアミノ酸配列に対応するアミノ酸連鎖を認識する抗
体が提供され、これらの新規抗体は特異的にフィブリ
ン、分子型Ｉ及び分子型IIの両者と反応し、フィブリノ
ーゲンとは反応せず、血液凝塊生成の検出、防止及び処
置に有効である抗体である。
のＡα−鎖の連鎖（または配列）111−207、特に148−1
61のアミノ酸配列に対応するアミノ酸連鎖を認識する抗
体が提供され、これらの新規抗体は特異的にフィブリ
ン、分子型Ｉ及び分子型IIの両者と反応し、フィブリノ
ーゲンとは反応せず、血液凝塊生成の検出、防止及び処
置に有効である抗体である。
Ａα鎖のフィブリノペプチドＡ及びＢβ鎖のフィブリ
ノペプチドＢは、通常血液中に存在しているトロンビン
により連続的に開裂されて、夫々単量体フィブリン分子
型Ｉ及び単量体フィブリン分子型IIを形成する。該単量
体フィブリンは或濃度まで溶液中に残留することができ
る。高濃度においては、単量体フィブリンは重合してフ
ィブリン凝塊を形成することが可能である。速やかにフ
ィブリン凝塊の差し迫った生成（トロンボシス［thromb
osis］）を同定し、血液容器中で凝血塊（トロンビ［th
rombi］）を防止することを可能とするためには、血液
中のフィブリンの早期検出は望ましいものであり、そし
て同時に検出手段はフィブリノーゲンとフィブリン自体
とを区別するものでなければならない。
ノペプチドＢは、通常血液中に存在しているトロンビン
により連続的に開裂されて、夫々単量体フィブリン分子
型Ｉ及び単量体フィブリン分子型IIを形成する。該単量
体フィブリンは或濃度まで溶液中に残留することができ
る。高濃度においては、単量体フィブリンは重合してフ
ィブリン凝塊を形成することが可能である。速やかにフ
ィブリン凝塊の差し迫った生成（トロンボシス［thromb
osis］）を同定し、血液容器中で凝血塊（トロンビ［th
rombi］）を防止することを可能とするためには、血液
中のフィブリンの早期検出は望ましいものであり、そし
て同時に検出手段はフィブリノーゲンとフィブリン自体
とを区別するものでなければならない。
この検出は原理的にはフィブリンに対する抗体を利用
して行われる。しかし研究されたフィブリンに対する大
部分の抗体は、フィブリノーゲンと反応するために使用
することができない。カドリク（Kudryk）等（（Macrom
olecular Immunology、21、89−94（1984））は抗原と
してのフィブリン断片により誘導され、フィブリンのβ
−鎖のアミノ末端に結合する単クローン性抗体を記載し
ている。ヒュイ（Hui）等（Hybridoma５、215−222（19
86））は又フィブリンのβ−鎖からペプチドで免疫する
ことにより得られる抗体を記載している。
して行われる。しかし研究されたフィブリンに対する大
部分の抗体は、フィブリノーゲンと反応するために使用
することができない。カドリク（Kudryk）等（（Macrom
olecular Immunology、21、89−94（1984））は抗原と
してのフィブリン断片により誘導され、フィブリンのβ
−鎖のアミノ末端に結合する単クローン性抗体を記載し
ている。ヒュイ（Hui）等（Hybridoma５、215−222（19
86））は又フィブリンのβ−鎖からペプチドで免疫する
ことにより得られる抗体を記載している。
しかし該抗体はフィブリノペプチドＢが開裂した後に
遊離するフィブリンのβ−鎖のアミノ末端のみを識別
し、従ってフィブリンＩの検出に使用できないという欠
点を有している。
遊離するフィブリンのβ−鎖のアミノ末端のみを識別
し、従ってフィブリンＩの検出に使用できないという欠
点を有している。
ヨーロッパ特許出願公開第152,612号明細書はフィブ
リノペプチドＡの開裂により生じる、α−鎖の新アミノ
末端からのペプチドを使用し動物を免疫することにより
誘導される抗体を用いて、フィブリンを測定する方法を
記載している。特にこの方法はフィブリンのα−鎖のア
ミノ末端を包含している。
リノペプチドＡの開裂により生じる、α−鎖の新アミノ
末端からのペプチドを使用し動物を免疫することにより
誘導される抗体を用いて、フィブリンを測定する方法を
記載している。特にこの方法はフィブリンのα−鎖のア
ミノ末端を包含している。
フィブリンに極めて特異的に作用し、そしてフィブリ
ノーゲンの免疫反応において活性ではないが、フィブリ
ン分子型Ｉ及びIIにおける免疫反応には活性である、フ
ィブリンのアミノ酸連鎖の切片から成る免疫原で動物を
免疫することにより得ることができる抗体が新規に見出
された。
ノーゲンの免疫反応において活性ではないが、フィブリ
ン分子型Ｉ及びIIにおける免疫反応には活性である、フ
ィブリンのアミノ酸連鎖の切片から成る免疫原で動物を
免疫することにより得ることができる抗体が新規に見出
された。
本発明による抗体は、３−97のアミノ酸残基の連鎖を
有し、少なくともその中の三個はフィブリノーゲンのＡ
α−鎖のアミノ酸連鎖111−207におけるアミノ酸残基と
相対的に同じ位置を占めているペプチドを認識する点に
特徴がある。
有し、少なくともその中の三個はフィブリノーゲンのＡ
α−鎖のアミノ酸連鎖111−207におけるアミノ酸残基と
相対的に同じ位置を占めているペプチドを認識する点に
特徴がある。
本発明による抗体はフィブリン分子型Ｉ及びフィブリ
ン分子型IIと反応しないだけではなく、又或種のフィブ
リン分解生産物とも反応しない。即ち、それらはフラグ
メントＤ−ダイマー、Ｄ−EGTAと、及びＡ−鎖と反応す
るが、それらはフラグメントＤ−ケート（cate）、Ｅ、
Ｘ、Ｙ及びＢ−鎖とは反応しない。国際公開第88/01514
号は抗原としてヒトのフィブリンを用いて発現（rais
e）され、そして本発明によるフィブリンの特定の連鎖
を持っていない、フィブリンに対する単クローン性抗体
を記載している。国際公開第88/01514号の抗体はフラグ
メントＤ−ダイマーとは最大限に、フラグメントＤ、
Ｘ、Ｙ及びＡ−鎖とは最小限に交差反応し、本発明の抗
体とは異なった免疫特性を呈している。
ン分子型IIと反応しないだけではなく、又或種のフィブ
リン分解生産物とも反応しない。即ち、それらはフラグ
メントＤ−ダイマー、Ｄ−EGTAと、及びＡ−鎖と反応す
るが、それらはフラグメントＤ−ケート（cate）、Ｅ、
Ｘ、Ｙ及びＢ−鎖とは反応しない。国際公開第88/01514
号は抗原としてヒトのフィブリンを用いて発現（rais
e）され、そして本発明によるフィブリンの特定の連鎖
を持っていない、フィブリンに対する単クローン性抗体
を記載している。国際公開第88/01514号の抗体はフラグ
メントＤ−ダイマーとは最大限に、フラグメントＤ、
Ｘ、Ｙ及びＡ−鎖とは最小限に交差反応し、本発明の抗
体とは異なった免疫特性を呈している。
好適にはペプチドの５個又はそれ以上のアミノ酸残基
は、フィブリノーゲンのＡα−鎖アミノ酸連鎖148−197
のアミノ酸と相対的に同一の位置を占めており、特にア
ミノ酸連鎖148−161のアミノ酸残基と同一である。本発
明による抗体を製造するためには、148−160の連鎖（Ly
s−Arg−Leu−Glu−Val−Asp−Ile−Asp−Ile−Lys−Il
e−Arg−Ser）、トリデカペプチドが極めて適当である
ことが見出されている。
は、フィブリノーゲンのＡα−鎖アミノ酸連鎖148−197
のアミノ酸と相対的に同一の位置を占めており、特にア
ミノ酸連鎖148−161のアミノ酸残基と同一である。本発
明による抗体を製造するためには、148−160の連鎖（Ly
s−Arg−Leu−Glu−Val−Asp−Ile−Asp−Ile−Lys−Il
e−Arg−Ser）、トリデカペプチドが極めて適当である
ことが見出されている。
免疫原性のアミノ酸連鎖は既知の方法、例えばJ.M.ス
テュワート（Stewart）及びJ.D.ヤング（Young）により
“固相ペプチド合成（Solid Phase Peptide Synthesi
s）”、ピアス・ケミカル（Pierce Chemical）社、第二
版、（1984）に記載されたような標準SPPS法により製造
することができる。この場合には、官能基を含み、カッ
プリング反応に関与しないアミノ酸の側鎖は逆に保護さ
れる。誘導体化されたアミノ酸の遊離のカルボキシル基
は活性化され、こうしてカップリングされるべき誘導体
化されたアミノ酸のアミノ基と反応を起こす。この活性
化はDDC（略語は後記に説明される）、DCC/HOBt又はDCC
/HONSuを用いて行うことができる。DCC/HOBtを用いる活
性化が好適である。
テュワート（Stewart）及びJ.D.ヤング（Young）により
“固相ペプチド合成（Solid Phase Peptide Synthesi
s）”、ピアス・ケミカル（Pierce Chemical）社、第二
版、（1984）に記載されたような標準SPPS法により製造
することができる。この場合には、官能基を含み、カッ
プリング反応に関与しないアミノ酸の側鎖は逆に保護さ
れる。誘導体化されたアミノ酸の遊離のカルボキシル基
は活性化され、こうしてカップリングされるべき誘導体
化されたアミノ酸のアミノ基と反応を起こす。この活性
化はDDC（略語は後記に説明される）、DCC/HOBt又はDCC
/HONSuを用いて行うことができる。DCC/HOBtを用いる活
性化が好適である。
Boc、Fmoc又はTrtはアミノ酸のα−アミノ官能基の保
護基として使用可能である。Fmocを用いる保護が好適で
ある。
護基として使用可能である。Fmocを用いる保護が好適で
ある。
カルボキシル、ヒドロキシル、グアニジノ及びアミノ
基のような側鎖官能基はそれらの反応性に従い、ペプチ
ド化学で普通である保護基で保護することができる。As
p及びGluにおけるカルボキシル基を保護するためには、
メタノール、tert−ブタノール又はベンジルアルコール
のようなアルコールから誘導された脂肪族又は芳香族残
基を使用することができる。これに関連してtert−ブタ
ノールが好適である。Serのヒドロキシル基はtert−ブ
タノールでエーテル化することにより保護することもで
きる。Argのグアニジノ官能基を保護するためには、ト
シル、ニトロ又はPms基を用い、及びプロトン化を利用
することができる。Pms基が好適である。Lysのε−アミ
ノ基はBoc又はMsc基により保護することができる。この
場合には、Boc基が好適である。α−アミノ官能基のた
めの保護基の塩基に関する安定性が小さいことを考慮す
ると、固体の樹脂への第一アミノ酸の結合は塩基に対し
安定でなければならない。所謂ｐ−アルコキシベンジル
アルコール樹脂への固定（anchoring）により、酸性媒
体中でエステル結合が不安定となるので、この場合この
固定法は好適である。随時“スペーサ（spacer）”、即
ち合成ペプチドの末端をキャリヤー（carrier）蛋白質
に結合させる切片は各種の構造を有していてもよい。こ
の目的に適当な化合物は、例えば２ないし８の炭素原子
を含むアルキル基の両端に二つの同一又は二つの異なっ
た基を含んでいる。この部類はなかんずく、グルタルア
ルデヒドのようなジアルデヒド、1,6−ヘキサメチレン
ジイソシアネートのようなジイソシアネート、1,6−ヘ
キサメチレンジアミンのようなジアミン、又はε−アミ
ノカプロン酸又はε−マレイミドカプロン酸のようなω
−アミノカルボン酸を含んでいる。これらの二官能性反
応剤を、必要に応じて活性化後、既知の方法により、一
方で合成ペプチド及び他方でキャリヤー蛋白質と結合さ
せる。ε−マレイミドカプロン酸は全体の“スペーサ”
部分として好適である。“スペーサ”の他の部分はアセ
チルチオ酢酸及び合成アミノ酸ノルロイシン（Nle）か
ら誘導されたメルカプトアセチル基から成っていてもよ
い。
基のような側鎖官能基はそれらの反応性に従い、ペプチ
ド化学で普通である保護基で保護することができる。As
p及びGluにおけるカルボキシル基を保護するためには、
メタノール、tert−ブタノール又はベンジルアルコール
のようなアルコールから誘導された脂肪族又は芳香族残
基を使用することができる。これに関連してtert−ブタ
ノールが好適である。Serのヒドロキシル基はtert−ブ
タノールでエーテル化することにより保護することもで
きる。Argのグアニジノ官能基を保護するためには、ト
シル、ニトロ又はPms基を用い、及びプロトン化を利用
することができる。Pms基が好適である。Lysのε−アミ
ノ基はBoc又はMsc基により保護することができる。この
場合には、Boc基が好適である。α−アミノ官能基のた
めの保護基の塩基に関する安定性が小さいことを考慮す
ると、固体の樹脂への第一アミノ酸の結合は塩基に対し
安定でなければならない。所謂ｐ−アルコキシベンジル
アルコール樹脂への固定（anchoring）により、酸性媒
体中でエステル結合が不安定となるので、この場合この
固定法は好適である。随時“スペーサ（spacer）”、即
ち合成ペプチドの末端をキャリヤー（carrier）蛋白質
に結合させる切片は各種の構造を有していてもよい。こ
の目的に適当な化合物は、例えば２ないし８の炭素原子
を含むアルキル基の両端に二つの同一又は二つの異なっ
た基を含んでいる。この部類はなかんずく、グルタルア
ルデヒドのようなジアルデヒド、1,6−ヘキサメチレン
ジイソシアネートのようなジイソシアネート、1,6−ヘ
キサメチレンジアミンのようなジアミン、又はε−アミ
ノカプロン酸又はε−マレイミドカプロン酸のようなω
−アミノカルボン酸を含んでいる。これらの二官能性反
応剤を、必要に応じて活性化後、既知の方法により、一
方で合成ペプチド及び他方でキャリヤー蛋白質と結合さ
せる。ε−マレイミドカプロン酸は全体の“スペーサ”
部分として好適である。“スペーサ”の他の部分はアセ
チルチオ酢酸及び合成アミノ酸ノルロイシン（Nle）か
ら誘導されたメルカプトアセチル基から成っていてもよ
い。
“スペーサ”を導入するためには、保護されたペプチ
ドがまだ樹脂に結合している時に、Nle及びアセチルチ
オ酢酸でアシル化される。
ドがまだ樹脂に結合している時に、Nle及びアセチルチ
オ酢酸でアシル化される。
ε−マレイミドカプロン酸はHONSu及びDCCによって活
性化され、マレイミドヘキサノイル−Ｎ−ヒドロキシス
クシンイミドを形成する。キャリヤー蛋白質を添加後、
キャリヤー蛋白質の遊離のアミノ基により活性エステル
分子のアミノリシスが起こる。
性化され、マレイミドヘキサノイル−Ｎ−ヒドロキシス
クシンイミドを形成する。キャリヤー蛋白質を添加後、
キャリヤー蛋白質の遊離のアミノ基により活性エステル
分子のアミノリシスが起こる。
“スペーサ”部分により延長されているペプチドを樹
脂から切り離し、及び保護基を外し、及び精製した後、
アミノ末端部分を例えばアセチル基を開裂する4N NaOH
/メタノール／ジオキサン（1/5/14）の混合物で処理す
ることにより、保護基を外す。マレイミド基を備えたキ
ャリヤー蛋白質とメルカプトアセチル基で延長された合
成ペプチドの間のカップリングは自然に進行する。
脂から切り離し、及び保護基を外し、及び精製した後、
アミノ末端部分を例えばアセチル基を開裂する4N NaOH
/メタノール／ジオキサン（1/5/14）の混合物で処理す
ることにより、保護基を外す。マレイミド基を備えたキ
ャリヤー蛋白質とメルカプトアセチル基で延長された合
成ペプチドの間のカップリングは自然に進行する。
原則的には任意の蛋白質、例えば牛血清アルブミン
（BSA）をキャリヤー蛋白質として使用することができ
る。
（BSA）をキャリヤー蛋白質として使用することができ
る。
こうして得られた免疫原はマウス、ラット、兎又は山
羊のような実験的動物を既知の方法で免疫するのに使用
することができる。このようにして、多クローン性抗体
を含む抗血清が得られる。
羊のような実験的動物を既知の方法で免疫するのに使用
することができる。このようにして、多クローン性抗体
を含む抗血清が得られる。
単クローン性抗体は、例えばG.コーラー（Kohler）及
びC.ミルシュタイン（Milstein）、Nature 256（197
5）、495−497に従って、それに相応する方式で誘導さ
れることが好ましい。既知のマウスの骨髄腫（myelom
a）細胞系がこの目的に使用できる。それ自体免疫グロ
ブリンを生成しない細胞系を使用することによって好都
合な結果が得られた。
びC.ミルシュタイン（Milstein）、Nature 256（197
5）、495−497に従って、それに相応する方式で誘導さ
れることが好ましい。既知のマウスの骨髄腫（myelom
a）細胞系がこの目的に使用できる。それ自体免疫グロ
ブリンを生成しない細胞系を使用することによって好都
合な結果が得られた。
免疫したBalb/cマウスの脾臓細胞を免疫グロブリンを
生成しない骨髄腫細胞系（好適には細胞系Sp2/0AG14又
はP3×63Ag8653）と融合（fuse）させる。融合しなかっ
た脾臓細胞と骨髄腫細胞が死滅し、骨髄腫細胞と融合し
た脾臓細胞（ハイブリドーマ［hybridoma］細胞）のみ
が生存する選択培地中で培養することにより、融合した
細胞を選択する。この選択段階の後、フィブリン−特異
性抗体を生産するハイブリドーマ細胞をELISA（enzyme
−linked immunosorbent assay）系中で選択する。フィ
ブリン−特異性抗体を生産するハイブリドーマ細胞をBa
lb/cマウスの腹腔中に導入すると、そこで成長し、液を
抜き取ることができ、そして必要な単クローン性抗体を
精製するための給源として使用される腹水液を生じる。
生成しない骨髄腫細胞系（好適には細胞系Sp2/0AG14又
はP3×63Ag8653）と融合（fuse）させる。融合しなかっ
た脾臓細胞と骨髄腫細胞が死滅し、骨髄腫細胞と融合し
た脾臓細胞（ハイブリドーマ［hybridoma］細胞）のみ
が生存する選択培地中で培養することにより、融合した
細胞を選択する。この選択段階の後、フィブリン−特異
性抗体を生産するハイブリドーマ細胞をELISA（enzyme
−linked immunosorbent assay）系中で選択する。フィ
ブリン−特異性抗体を生産するハイブリドーマ細胞をBa
lb/cマウスの腹腔中に導入すると、そこで成長し、液を
抜き取ることができ、そして必要な単クローン性抗体を
精製するための給源として使用される腹水液を生じる。
本発明は又上記のようにフィブリンに対する抗体を製
造するために使用できる免疫原に関する。
造するために使用できる免疫原に関する。
本発明による抗体はフィブリノーゲンと反応しない
が、フィブリン分子型Ｉ及び分子型IIと反応する。この
反応の感度は0.1μg/mlの次元のものであり、その感度
は20,000倍過剰に存在しているフィブリノーゲンによっ
て制限されない。
が、フィブリン分子型Ｉ及び分子型IIと反応する。この
反応の感度は0.1μg/mlの次元のものであり、その感度
は20,000倍過剰に存在しているフィブリノーゲンによっ
て制限されない。
フィブリン分子型Ｉを測定する利点は、凝塊における
正に最初の段階はフィブリンＩの形成であることであ
る。“可溶性フィブリン”の測定は極めて早期の凝塊を
正確に検出することを狙いとしているから、フィブリン
Ｉを認識する試験はフィブリンIIのみを認識する試験よ
りも高い診断的な価値を有する。フィブリンIIの生成は
フィブリンＩを経由して進行する。
正に最初の段階はフィブリンＩの形成であることであ
る。“可溶性フィブリン”の測定は極めて早期の凝塊を
正確に検出することを狙いとしているから、フィブリン
Ｉを認識する試験はフィブリンIIのみを認識する試験よ
りも高い診断的な価値を有する。フィブリンIIの生成は
フィブリンＩを経由して進行する。
本発明による抗体のもう一つの利点は、ｔ−PA（組織
プラスミノゲン活性化剤）によりプラスミノゲンの活性
化を促進する際に、即ち促進されたプラスミンの生成に
影響する、フィブリン中の部位を抗体が認識しているこ
とである。この部位と抗体との複合は促進を妨害し、そ
の測定中に血漿中に存在するフィブリンを手付かずにす
るのに役立っている。これは従来知られているフィブリ
ンに対する抗体については不可能なことであった。
プラスミノゲン活性化剤）によりプラスミノゲンの活性
化を促進する際に、即ち促進されたプラスミンの生成に
影響する、フィブリン中の部位を抗体が認識しているこ
とである。この部位と抗体との複合は促進を妨害し、そ
の測定中に血漿中に存在するフィブリンを手付かずにす
るのに役立っている。これは従来知られているフィブリ
ンに対する抗体については不可能なことであった。
従って本発明は又フィブリン、特に血液中のフィブリ
ンを、上記のような抗体を用いて、検出及び測定する方
法に関する。
ンを、上記のような抗体を用いて、検出及び測定する方
法に関する。
これは例えば所謂“サンドイッチ"ELISA又は“サンド
イッチ"EIAを用いて実行することができる。
イッチ"EIAを用いて実行することができる。
この方法においては、精製した単クローン性抗体を固
体キャリヤー中に固定（immobilize）し、その形態中
で、フィブリン含量の測定が要求されている液体（血液
／血漿）中で接触させる。次いでこうして単クローン性
抗体に結合したフィブリンの量が、放射性原子、蛍光性
基又は燐光性基、又は特に酵素（例えばセイヨウワサビ
［horseradish］ペルオキシダーゼ（HRP））のような検
出可能な標識で標識を付けた第二の抗体を添加すること
により測定される。結合した第二の抗体の量は標識の活
性、例えば酵素活性をを測定することにより定量でき
る。該活性は使用された血液又は血漿中のフィブリン含
量の尺度である。
体キャリヤー中に固定（immobilize）し、その形態中
で、フィブリン含量の測定が要求されている液体（血液
／血漿）中で接触させる。次いでこうして単クローン性
抗体に結合したフィブリンの量が、放射性原子、蛍光性
基又は燐光性基、又は特に酵素（例えばセイヨウワサビ
［horseradish］ペルオキシダーゼ（HRP））のような検
出可能な標識で標識を付けた第二の抗体を添加すること
により測定される。結合した第二の抗体の量は標識の活
性、例えば酵素活性をを測定することにより定量でき
る。該活性は使用された血液又は血漿中のフィブリン含
量の尺度である。
本方法の可能な具体化はフィブリン中の他のエピトー
プ（epitope）を同定する第二の標識された抗体を用い
ることにより検出することである。その場合には、本文
に記載された単クローン性抗体は固定形で使用され、第
二の抗体はHRP結合体として使用できる。本発明によれ
ば、第一の抗体は相当以上にフィブリンに特異的である
が、検出方法の特異性は、でき得れば、同様にフィブリ
ンを同定する第二の抗体を使用することによって更に一
層改善される。本発明は又上記のような例えば抗血清中
の抗体を含むフィブリンを測定するためのキットに関
し、及び又フィブリンを測定するために更に必要な構成
成分に関する。
プ（epitope）を同定する第二の標識された抗体を用い
ることにより検出することである。その場合には、本文
に記載された単クローン性抗体は固定形で使用され、第
二の抗体はHRP結合体として使用できる。本発明によれ
ば、第一の抗体は相当以上にフィブリンに特異的である
が、検出方法の特異性は、でき得れば、同様にフィブリ
ンを同定する第二の抗体を使用することによって更に一
層改善される。本発明は又上記のような例えば抗血清中
の抗体を含むフィブリンを測定するためのキットに関
し、及び又フィブリンを測定するために更に必要な構成
成分に関する。
本発明による抗体はフィブリン特異性であるから、そ
れらは生体内における（特に血液凝塊）フィブリンの検
出及び位置特定に使用することができる。この目的に
は、体外で検出できる物質で標識される。これは例えば
放射性であり、（γ）放射線を放射するため検出できる
Tc99mである。フェイツマ（Feitsma）によりNucl.Med.C
omm.8（1987）、771−777に記載された方法はこの目的
に特に適当している。フィブリンは活性物質、特に血液
凝塊を溶解するのに効果的な物質の凝塊の部位を、認識
するのに使用することができる。この結果活性物質によ
り高い効果がもたらされる。組織型−プラスミノーゲン
活性化因子又は他のプラスミノーゲン活性化因子、プラ
スミノーゲン、プラスミン又は他のプロテアーゼと抗フ
ィブリン抗体との組み合わせが考えられる。この原理の
実例はM.S.ラング（Runge）等により、Proc.Natl.Acad.
Sci.84（1987）、7695−7662及びC.ボード（Bode）等に
より、J.Biol.Chem.262、（1987）、10819−10823に記
載されている。本発明は又上記のような抗体と共役した
この種の活性物質を含む製薬学的製剤に関する。該活性
物質は好適にはフィブリン溶解剤である。フィブリン溶
解剤の例は組織−型プラスミノーゲン活性化因子（又は
組み替えDNA技術によって得られるその変種）及び又尿
−型プラスミノーゲン活性化因子（Ｕ−PA）、ストレプ
トキナーゼ、プラスミン、プラスミノーゲンである。
れらは生体内における（特に血液凝塊）フィブリンの検
出及び位置特定に使用することができる。この目的に
は、体外で検出できる物質で標識される。これは例えば
放射性であり、（γ）放射線を放射するため検出できる
Tc99mである。フェイツマ（Feitsma）によりNucl.Med.C
omm.8（1987）、771−777に記載された方法はこの目的
に特に適当している。フィブリンは活性物質、特に血液
凝塊を溶解するのに効果的な物質の凝塊の部位を、認識
するのに使用することができる。この結果活性物質によ
り高い効果がもたらされる。組織型−プラスミノーゲン
活性化因子又は他のプラスミノーゲン活性化因子、プラ
スミノーゲン、プラスミン又は他のプロテアーゼと抗フ
ィブリン抗体との組み合わせが考えられる。この原理の
実例はM.S.ラング（Runge）等により、Proc.Natl.Acad.
Sci.84（1987）、7695−7662及びC.ボード（Bode）等に
より、J.Biol.Chem.262、（1987）、10819−10823に記
載されている。本発明は又上記のような抗体と共役した
この種の活性物質を含む製薬学的製剤に関する。該活性
物質は好適にはフィブリン溶解剤である。フィブリン溶
解剤の例は組織−型プラスミノーゲン活性化因子（又は
組み替えDNA技術によって得られるその変種）及び又尿
−型プラスミノーゲン活性化因子（Ｕ−PA）、ストレプ
トキナーゼ、プラスミン、プラスミノーゲンである。
上記及び下記の実施例において使用される略語は次ぎ
の意味を有する： Ata−OH アセチルチオ酢酸 BSA 牛血清アルブミン Boc tert.−ブトキシカルボニル But tert.−ブチル CCD 向流分配 DCC ジシクロヘキシルカルボジイミド DMAP ４−ジメチルアミノピリジン DMF ジメチルホルムアミド Fmoc ９−フルオレニルメトキシカルボニル HOBt １−ヒドロキシ−1H−ベンゾトリアゾール HONSu Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド MHS ６−（マレイミド）ヘキサノイル−Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミド MSA メタンスルホン酸 Msc メチルスルホニルエトキシカルボニル Nle D,L−ノルロイシン （Ｐ） ｐ−アルコキシベンジルアルコール樹脂 PBS 燐酸塩緩衝食塩溶液（pH＝6.9、0.15N NaCl） Pms ペンタメチルフェニルスルホニル SPPS 固相ペプチド合成 Tha メルカプトアセチル TFA トリフルオロ酢酸 TLC 薄層クロマトグラフィー Trt トリチル 実施例 Ｉ フィブリノーゲンＡα−（148−160）−トリデカペプ
チド:H−Lys−Arg−Leu−Glu−Val−Asp−Ile−Asp−Il
e−Lys−Ile−Arg−Ser−OHを半自動ペプチド合成機
（ラボルテック［Labortec］SP−640、ブーベンドル
フ、スイス）を用いてｐ−アルコキシベンジルアルコー
ル樹脂（バケム［Bachem］、ブーベンドルフ、スイス）
上で製造した。アミノ酸をＣ−末端セリンから出発して
標準方法によりFmoc−アミノ酸として所与の順序でカッ
プリングさせた。この方法において、側鎖用として下記
の保護基を使用した:Lys:Boc;Arg:Pms;Glu、Asp及びSe
r:But。アミノ酸はDCC/HOBtによってカップリングさせ
た。最終的に保護基を外し、室温で２時間TFA/MSA/チオ
アニソール（10/1/1）で処理し、次いで濾過、エーテル
による沈澱及び水から凍結乾燥することによって遊離さ
せた。粗製のペプチドをラボルテック、ブーベンドル
フ、スイスから供給された10mlの下相（subphase）素子
を用いた装置中でCCDを使用して精製した。ブタノール
／酢酸／水系（5/1/4）が使用された。最大量画分から
得た試料を−80℃で真空に引いた密閉ガラスアンプル中
で、5.7N塩酸中において48時間105℃で加水分解した。
加水分解物を数回水で蒸発し、JEOL−JLC−6AM分析機中
でアミノ酸分析を行った。
の意味を有する： Ata−OH アセチルチオ酢酸 BSA 牛血清アルブミン Boc tert.−ブトキシカルボニル But tert.−ブチル CCD 向流分配 DCC ジシクロヘキシルカルボジイミド DMAP ４−ジメチルアミノピリジン DMF ジメチルホルムアミド Fmoc ９−フルオレニルメトキシカルボニル HOBt １−ヒドロキシ−1H−ベンゾトリアゾール HONSu Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド MHS ６−（マレイミド）ヘキサノイル−Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミド MSA メタンスルホン酸 Msc メチルスルホニルエトキシカルボニル Nle D,L−ノルロイシン （Ｐ） ｐ−アルコキシベンジルアルコール樹脂 PBS 燐酸塩緩衝食塩溶液（pH＝6.9、0.15N NaCl） Pms ペンタメチルフェニルスルホニル SPPS 固相ペプチド合成 Tha メルカプトアセチル TFA トリフルオロ酢酸 TLC 薄層クロマトグラフィー Trt トリチル 実施例 Ｉ フィブリノーゲンＡα−（148−160）−トリデカペプ
チド:H−Lys−Arg−Leu−Glu−Val−Asp−Ile−Asp−Il
e−Lys−Ile−Arg−Ser−OHを半自動ペプチド合成機
（ラボルテック［Labortec］SP−640、ブーベンドル
フ、スイス）を用いてｐ−アルコキシベンジルアルコー
ル樹脂（バケム［Bachem］、ブーベンドルフ、スイス）
上で製造した。アミノ酸をＣ−末端セリンから出発して
標準方法によりFmoc−アミノ酸として所与の順序でカッ
プリングさせた。この方法において、側鎖用として下記
の保護基を使用した:Lys:Boc;Arg:Pms;Glu、Asp及びSe
r:But。アミノ酸はDCC/HOBtによってカップリングさせ
た。最終的に保護基を外し、室温で２時間TFA/MSA/チオ
アニソール（10/1/1）で処理し、次いで濾過、エーテル
による沈澱及び水から凍結乾燥することによって遊離さ
せた。粗製のペプチドをラボルテック、ブーベンドル
フ、スイスから供給された10mlの下相（subphase）素子
を用いた装置中でCCDを使用して精製した。ブタノール
／酢酸／水系（5/1/4）が使用された。最大量画分から
得た試料を−80℃で真空に引いた密閉ガラスアンプル中
で、5.7N塩酸中において48時間105℃で加水分解した。
加水分解物を数回水で蒸発し、JEOL−JLC−6AM分析機中
でアミノ酸分析を行った。
実施例 II “スペーサ”の切片を備えたトリデカペプチド誘導
体、メルカプトアセチル−DL−ノルロイシルフィブリノ
ーゲン−Ａα（148−160）−トリデカペプチド（以後ト
リデカペプチドと称する）を、第１図に示すような合成
図表によって得た。
体、メルカプトアセチル−DL−ノルロイシルフィブリノ
ーゲン−Ａα（148−160）−トリデカペプチド（以後ト
リデカペプチドと称する）を、第１図に示すような合成
図表によって得た。
200工程後に、ネルンスト分布係数：（cpd.1）Ｋ＝0.
38（ｒ＝55）及び（cpd.2）Ｋ＝0.74（ｒ＝85）を有す
る二種の化合物がジオステレオマーの混合物から単離さ
れた。二種の化合物は等量に得られた。最大量画分から
得た試料を−80℃で真空に引いた密閉ガラスアンプル中
で、5.7N塩酸中において48時間105℃で加水分解した。
加水分解物を数回水で蒸発し、JEOL−JLC−6AM分析機中
でアミノ酸分析を行った。
38（ｒ＝55）及び（cpd.2）Ｋ＝0.74（ｒ＝85）を有す
る二種の化合物がジオステレオマーの混合物から単離さ
れた。二種の化合物は等量に得られた。最大量画分から
得た試料を−80℃で真空に引いた密閉ガラスアンプル中
で、5.7N塩酸中において48時間105℃で加水分解した。
加水分解物を数回水で蒸発し、JEOL−JLC−6AM分析機中
でアミノ酸分析を行った。
CCDにより精製した後、TLC及びアミノ酸分析によりペ
プチドの特性試験を行った；製造される共役物のアミノ
酸分析を行うことができるようにノルロイシンを入れ
た。化学的純度は数種の溶離系においてTLCによって測
定された。
プチドの特性試験を行った；製造される共役物のアミノ
酸分析を行うことができるようにノルロイシンを入れ
た。化学的純度は数種の溶離系においてTLCによって測
定された。
実施例 III 4.5mgのMHSを燐酸塩緩衝液（pH＝８）に溶かした非常
に純粋なBSA 50mgに添加した。５分間反応させた後、
燐酸塩緩衝液（pH＝６）を溶離液としてセファデックス
Ｇ−57を通すゲル濾過法により反応混合物を精製した。
に純粋なBSA 50mgに添加した。５分間反応させた後、
燐酸塩緩衝液（pH＝６）を溶離液としてセファデックス
Ｇ−57を通すゲル濾過法により反応混合物を精製した。
こうして得られたBSA−スペーサ溶液に、実施例IIか
らの37mgの活性ペプチドを添加した。室温で２時間反応
後、反応混合物をPBSに対して透析し、凍結乾燥した。
らの37mgの活性ペプチドを添加した。室温で２時間反応
後、反応混合物をPBSに対して透析し、凍結乾燥した。
実施例 IV 多クローン性抗体 単調にＮ−末端的にカップリングされたペプチド−キ
ャリヤー蛋白共役物を0.15MのNaClに溶解し、等容量の
フロインド完全アジュバント（Freund′s complete adj
uvant）と混合した。合計蛋白質が125μｇ（カップリン
グしたペプチド10μｇ）に相当する容積のこの混合物を
Balb/cマウスの腹腔中に注射する。これらの注射は４回
繰り返すが、今回はフロインド不完全アジュバントが使
用される。
ャリヤー蛋白共役物を0.15MのNaClに溶解し、等容量の
フロインド完全アジュバント（Freund′s complete adj
uvant）と混合した。合計蛋白質が125μｇ（カップリン
グしたペプチド10μｇ）に相当する容積のこの混合物を
Balb/cマウスの腹腔中に注射する。これらの注射は４回
繰り返すが、今回はフロインド不完全アジュバントが使
用される。
こうして免疫されたマウスの血液中の抗体の存在は、
この目的のために記載されたELISAにより検出される。
この目的のために記載されたELISAにより検出される。
実施例 Ｖ 単クローン性抗体 実施例IVに従って免疫されたBalb/cマウスに、その脾
臓の除去３日前に0.15N NaClに溶解した250gのBSA−ペ
プチド共役物を静脈内に注射する。ケーラー（Ｋle
r）及びミルシュタイン（Milstein）（Nature 256（19
75）495−497）により記載されたように、40％ポリエチ
レングリコールの存在においてマウスからの脾臓細胞を
骨髄腫細胞と混合する。融合後、細胞分散物を希釈し、
各容器が3.3×105個の脾臓細胞を含むように４個のマイ
クロタイター（microtiter）の容器上に分配する。脾臓
細胞及び骨髄腫細胞がケーラー及びミルシュタインによ
る選択培地中で死滅した後、ハイブリドーマの成長を示
す容器中の培養液が、フィブリン−特異性抗体の存在に
ついて10−14日後に試験された。
臓の除去３日前に0.15N NaClに溶解した250gのBSA−ペ
プチド共役物を静脈内に注射する。ケーラー（Ｋle
r）及びミルシュタイン（Milstein）（Nature 256（19
75）495−497）により記載されたように、40％ポリエチ
レングリコールの存在においてマウスからの脾臓細胞を
骨髄腫細胞と混合する。融合後、細胞分散物を希釈し、
各容器が3.3×105個の脾臓細胞を含むように４個のマイ
クロタイター（microtiter）の容器上に分配する。脾臓
細胞及び骨髄腫細胞がケーラー及びミルシュタインによ
る選択培地中で死滅した後、ハイブリドーマの成長を示
す容器中の培養液が、フィブリン−特異性抗体の存在に
ついて10−14日後に試験された。
この目的のためには、ポリスチレン製のマイクロタイ
ター板の容器をフィブリノーゲン又はフィブリン単量体
（ベリッツァー［Belitzer］等、Biochim.Biophys.Acta
154（1984）、367に従って製造された）で被覆する。
洗浄後、少量のハイブリドーマの培養液を被覆された容
器中に入れ、そこで37℃において１時間培養する。次い
で容器を再度洗浄する。マウスの免疫グロブリンを直接
指向し、セイヨウガラシ ペルオキシダーゼとカップキ
ングされた多クローン性抗体の溶液を次いで容器内に入
れ、そこで37℃で１時間培養する。洗浄後、培養液中に
存在する単クローン性抗体の量及び特異性の尺度とし
て、容器内のペルオキシダーゼの活性の存在を測定し且
つ定量する。
ター板の容器をフィブリノーゲン又はフィブリン単量体
（ベリッツァー［Belitzer］等、Biochim.Biophys.Acta
154（1984）、367に従って製造された）で被覆する。
洗浄後、少量のハイブリドーマの培養液を被覆された容
器中に入れ、そこで37℃において１時間培養する。次い
で容器を再度洗浄する。マウスの免疫グロブリンを直接
指向し、セイヨウガラシ ペルオキシダーゼとカップキ
ングされた多クローン性抗体の溶液を次いで容器内に入
れ、そこで37℃で１時間培養する。洗浄後、培養液中に
存在する単クローン性抗体の量及び特異性の尺度とし
て、容器内のペルオキシダーゼの活性の存在を測定し且
つ定量する。
フィブリン特異性抗体を生産する細胞系統をマッカー
ン（T.J.McKearn著、“Monoclonal Antibodies,Hybrido
mas;a new dimension in biological analysis"、Plenu
m、ニューヨーク、1980、374頁）により記載されたよう
に更に二回クローン化（clone）する。このようにして
見出された二種の細胞系統の実例は下記のようである： 実施例 VI 血液中のフィブリンの定量 健康な供与者からの新鮮な血漿を短時間少量のトロン
ビンで処理する。これにより該血漿に可溶な一定量のフ
ィブリンが生じる。本発明によって製造された（0.04M
トリス/HCl、pH7.5）単クローン性抗体の溶液（10μg
/ml）をポリスチレン製マイクロタイター板の容器中に
入れ、そこで４℃で16時間培養した。この培養の際、単
クローン性抗体は容器の壁に吸収される。洗浄後、トロ
ンビンで処理された血漿の一連の希釈物及びトロンビン
で処理しない同じ血漿を容器中にピペット注入する。好
適には４℃で１時間培養後、容器を洗浄し、他の単クロ
ーン性抗体（フィブリン特異性である必要はない）と共
役したセイヨウワサビ ペルオキシダーゼの溶液を容器
中に入れる。再度１時間培養（好適には４℃で）後、容
器を洗浄し、フィブリン−特異性抗体で被覆された容器
によって結合されているフィブリンの量の尺度としてペ
ルオキシダーゼを使用する。これはペルオキシダーゼの
基質としてテトラメチルベンジジンと過酸化水素の混合
物（E.S.ボス［Boss］等、J.Immunoassay ２（1981）1
87頁）を使用することにより為される。このようにして
ペルオキシダーゼの作用により青色生成物が得られ、37
℃で10分間培養後、1M H2SO4を添加して反応が終結す
る時に黄色に変化する。黄色の強度は405nmの波長で測
定され、ペルオキシダーゼ活性の尺度である。
ン（T.J.McKearn著、“Monoclonal Antibodies,Hybrido
mas;a new dimension in biological analysis"、Plenu
m、ニューヨーク、1980、374頁）により記載されたよう
に更に二回クローン化（clone）する。このようにして
見出された二種の細胞系統の実例は下記のようである： 実施例 VI 血液中のフィブリンの定量 健康な供与者からの新鮮な血漿を短時間少量のトロン
ビンで処理する。これにより該血漿に可溶な一定量のフ
ィブリンが生じる。本発明によって製造された（0.04M
トリス/HCl、pH7.5）単クローン性抗体の溶液（10μg
/ml）をポリスチレン製マイクロタイター板の容器中に
入れ、そこで４℃で16時間培養した。この培養の際、単
クローン性抗体は容器の壁に吸収される。洗浄後、トロ
ンビンで処理された血漿の一連の希釈物及びトロンビン
で処理しない同じ血漿を容器中にピペット注入する。好
適には４℃で１時間培養後、容器を洗浄し、他の単クロ
ーン性抗体（フィブリン特異性である必要はない）と共
役したセイヨウワサビ ペルオキシダーゼの溶液を容器
中に入れる。再度１時間培養（好適には４℃で）後、容
器を洗浄し、フィブリン−特異性抗体で被覆された容器
によって結合されているフィブリンの量の尺度としてペ
ルオキシダーゼを使用する。これはペルオキシダーゼの
基質としてテトラメチルベンジジンと過酸化水素の混合
物（E.S.ボス［Boss］等、J.Immunoassay ２（1981）1
87頁）を使用することにより為される。このようにして
ペルオキシダーゼの作用により青色生成物が得られ、37
℃で10分間培養後、1M H2SO4を添加して反応が終結す
る時に黄色に変化する。黄色の強度は405nmの波長で測
定され、ペルオキシダーゼ活性の尺度である。
下記に一例を挙げる： 本発明の主なる特徴及び態様は以下の通りである。
1.ペプチドのアミノ酸連鎖の少なくとも３個はフィブリ
ノーゲンのＡα−鎖のアミノ酸連鎖111−207におけるア
ミノ酸連鎖と同一の相対的位置を占めている、３−97個
のアミノ酸残基の連鎖を有するペプチドを直接に指向す
ることを特徴とする、フィブリンと特異的に反応する抗
体。
ノーゲンのＡα−鎖のアミノ酸連鎖111−207におけるア
ミノ酸連鎖と同一の相対的位置を占めている、３−97個
のアミノ酸残基の連鎖を有するペプチドを直接に指向す
ることを特徴とする、フィブリンと特異的に反応する抗
体。
2.少なくとも５個はＡαの148−197連鎖におけるアミノ
酸残基と同一の相対的位置を占めている、５−50個のア
ミノ酸残基の連鎖を有するペプチドを直接に指向する上
記１に記載の抗体。
酸残基と同一の相対的位置を占めている、５−50個のア
ミノ酸残基の連鎖を有するペプチドを直接に指向する上
記１に記載の抗体。
3.少なくとも５個はＡαの148−161連鎖におけるアミノ
酸残基と同一の相対的位置を占めている、５−14個のア
ミノ酸残基の連鎖を有するペプチドを直接に指向する上
記２に記載の抗体。
酸残基と同一の相対的位置を占めている、５−14個のア
ミノ酸残基の連鎖を有するペプチドを直接に指向する上
記２に記載の抗体。
4.Aαの148−160のアミノ酸連鎖を有するペプチドを直
接に指向する上記３に記載の抗体。
接に指向する上記３に記載の抗体。
5.随時“スペーサ”によって免疫原担体に結合している
アミノ酸連鎖で免疫することによって得られる上記１−
４の一つに記載の抗体。
アミノ酸連鎖で免疫することによって得られる上記１−
４の一つに記載の抗体。
6.それらが単クローン性である上記１−５の一つに記載
の抗体。
の抗体。
7.上記１−６の一つの記載に従って使用される免疫原。
8.上記１−６の一つに記載の抗体が使用されるフィブリ
ンの測定方法。
ンの測定方法。
9.抗体とフィブリンの反応を検出するために、フィブリ
ンの他のエピトープを同定する第二の標識された抗体が
使用される上記８に記載の方法。
ンの他のエピトープを同定する第二の標識された抗体が
使用される上記８に記載の方法。
10.上記１−６の一つに記載の抗体から成るフィブリン
測定用の診断キット。
測定用の診断キット。
11.上記１−６の一つに記載の抗体にカップリングした
活性物質を含む製薬学的製剤。
活性物質を含む製薬学的製剤。
12.活性物質がフィブリン溶解剤である上記11に記載の
製剤。
製剤。
第１図は本発明で使用されるメルカプトアセチル−DL−
ノルロイシルフィブリノーゲン−Ａα鎖（148−160）−
トリデカペプチドの固相合成の概要を示す図表である。
ノルロイシルフィブリノーゲン−Ａα鎖（148−160）−
トリデカペプチドの固相合成の概要を示す図表である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭60−158353（ＪＰ，Ａ) 特表 平２−502603（ＪＰ，Ａ) 国際公開87／6263（ＷＯ，Ａ) Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．20（５）, 521−528（1983)
Claims (4)
- 【請求項１】フイブリンと特異的に結合する抗体であっ
て、フイブリノーゲンのＡα−鎖のアミノ酸配列148−1
60（Lys−Arg−Leu−Glu−Val−Asp−Ile−Asp−Ile−L
ys−Ile−Arg−Ser）内の連続する少なくとも５個のア
ミノ酸残基に相当する配列を有するペプチドを認識する
ことを特徴とする抗体。 - 【請求項２】キヤリヤー蛋白質に結合した免疫源ペプチ
ドであって、フイブリノーゲンのＡα−鎖のアミノ酸配
列148−160（Lys−Arg−Leu−Glu−Val−Asp−Ile−Asp
−Ile−Lys−Ile−Arg−Ser）内の連続する少なくとも
５個のアミノ酸残基に相当する配列を有することを特徴
とするペプチド。 - 【請求項３】請求項１記載の抗体が使用されるフイブリ
ンの測定方法。 - 【請求項４】請求項１記載の抗体を含んで成るフイブリ
ン測定用の診断キツト。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NL8801227 | 1988-05-10 | ||
| NL8801227A NL8801227A (nl) | 1988-05-10 | 1988-05-10 | Antilichamen tegen fibrine; voor de bereiding van de antilichamen te gebruiken immunogeen, werkwijze voor het bepalen van fibrine met de antilichamen en farmaceutisch preparaat op basis van de antilichamen. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0228197A JPH0228197A (ja) | 1990-01-30 |
| JP2530714B2 true JP2530714B2 (ja) | 1996-09-04 |
Family
ID=19852288
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1114335A Expired - Fee Related JP2530714B2 (ja) | 1988-05-10 | 1989-05-09 | フイブリンに対する抗体；抗体の製造に使用される免疫原、抗体及び抗体を基剤とした製薬学的製剤でフイブリンを測定する方法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5099004A (ja) |
| EP (1) | EP0347959B1 (ja) |
| JP (1) | JP2530714B2 (ja) |
| AT (1) | ATE115188T1 (ja) |
| DE (1) | DE68919758T2 (ja) |
| DK (1) | DK213589A (ja) |
| NL (1) | NL8801227A (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE69302719T2 (de) * | 1992-02-17 | 1996-09-19 | Akzo Nv | Kalibrator und Verwendung davon in einer Immuntest |
| EP0678524B1 (en) * | 1993-11-02 | 2008-02-06 | Mitsubishi Kagaku Iatron, Inc. | Anti-human soluble fibrin antibodies, hybridoma producing them, and immunoassaying method |
| EP0738156A1 (en) * | 1993-12-27 | 1996-10-23 | Hamilton Civic Hospitals Research Development, Inc. | Methods and compositions for inhibiting thrombogenesis |
| US7829294B2 (en) * | 2004-12-28 | 2010-11-09 | Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. | Anti-human soluble fibrin monoclonal antibody and immunological assay method using the antibody |
| JP5709425B2 (ja) | 2010-07-27 | 2015-04-30 | シスメックス株式会社 | Ｄダイマー測定用試薬 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4722903A (en) * | 1983-11-14 | 1988-02-02 | New York Blood Center, Inc. | Monoclonal antibodies specific to in vivo fragments derived from human fibrinogen, human fiberin I or human fibrin II |
| US4851334A (en) * | 1984-01-03 | 1989-07-25 | The New York Blood Center, Inc. | Monoclonal antibodies specific to in vivo fragments derived from human fibrinogen, human fibrin I or human fibrin II |
| DE3400434A1 (de) * | 1984-01-09 | 1985-09-26 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Bestimmung von fibrin mit fibrin-spezifischen antikoerpern |
| US4927916A (en) * | 1984-04-23 | 1990-05-22 | The General Hospital Corporation | Method of producing fibrin-specific monoclonal antibodies lacking fibrinogen-cross-reactivity using fibrin-specific peptides |
| US4916070A (en) * | 1986-04-14 | 1990-04-10 | The General Hospital Corporation | Fibrin-specific antibodies and method of screening for the antibodies |
| WO1988001514A1 (en) * | 1986-08-25 | 1988-03-10 | American Biogenetic Sciences, Inc. | Monoclonal antibodies to fibrin |
-
1988
- 1988-05-10 NL NL8801227A patent/NL8801227A/nl not_active Application Discontinuation
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Non-Patent Citations (1)
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