NO302032B1 - Antistoffer mot fibrin, immunogent peptid som binder til antistoffene, anvendelse av et slikt antistoff, samt diagnosesett for bestemmelse av fibrin - Google Patents

Description

Oppfinnelsen vedrører antistoffer som reagerer spesifikt med fibrin, immunogent peptid som binder til antistoffene, anvendelse av et slikt antistoff, samt diagnosesett for bestemmelse av fibrin.

Trombin løsner enzymatisk i rekkefølge fibrinopeptidene A i Aa-kjedene og fibrinopeptidene B i Bp-kjedene fra fibrinogenet som normalt er til stede i blod, slik at det dannes hhv. monomer fibrin type I og monomer fibrin type II. Opp til en viss konsentrasjon er disse monomere fibrinene i stand til å forbli i oppløsning. Ved høyere konsentrasjon kan monomer fibrin polymerisere til en fibrinklump. For å påvise en forestående dannelse av en fibrinklump (trombose) tidlig og for å være i stand til å forhindre blodklumper (tromber) i blodårene, er det ønskelig med en tidlig påvisning av fibrin i blodet, idet det er nødvendig for midlene for påvisning å skjelne mellom fibrinogenet og selve fibrinet.

Påvisningen kan i prinsippet utføres ved hjelp av antistoffer mot fibrin. De fleste undersøkte antistoffer mot fibrin er imidlertid ikke brukbare ettersom de reagerer med fibrinogen. Det er også blitt beskrevet antistoffer som faktisk skjelner mellom fibrin og fibrinogen. Således har Kudryk et al. (Molecular Immunology, 21, s. 89-94 (1984), EP-A 151.239) beskrevet et monoklonalt antistoff som induseres ved hjelp av fibrinfragmenter som antigener og binder seg til aminoenden av p-kjeden i fibrin. Hui et al. (Hybridoma, 5,

s. 215-222 (1986)) har også beskrevet et antistoff som fås ved å immunisere med et peptid fra p-kjedeenden av fibrin.

Disse antistoffene har imidlertid den ulempe at de gjenkjenner bare aminoenden av p-kjeden i fibrin som frigjøres etter at fibrinopeptid B er løsnet, og de er derfor ikke anvendbare for påvisning av fibrin I.

Europeisk patentsøknad nr. 152.612 beskriver en frem-gangsmåte for å bestemme fibrin ved hjelp av et antistoff som induseres ved å immunisere et dyr med et peptid fra den nye aminoenden i a-kjeden som fremstilles ved å løsne fibrinopeptid A. I dette tilfelle er særlig aminoenden av a-kjeden i fibrin involvert.

I internasjonal patentsøknad WO 88.01514 beskrives et antistoff mot fibrin som induseres ved å anvende humanfibrin som antigen. Antistoffet er særlig rettet mot et avsnitt av a-kjeden i fibrin.

Det er nå blitt funnet antistoffer som reagerer spesifikt med fibrin, men ikke med fibrinogen, for anvendelse in vitro, og som kan fås ved å immunisere et dyr med et immunogen som inneholder et avsnitt om aminosyresekvensen til fibrin som ikke er aktiv i fibrinogen, men som er aktiv i fibrinene av type I og type II i immunreaksjoner.

Antistoffene ifølge oppfinnelsen er kjennetegnet ved at de er rettet mot et peptid med 5-69 aminosyrerester, hvorav en sekvens på minst 5 aminosyrerester er identisk med en sekvens som finnes i aminosyresekvensen 311-379 i y^jeden til fibrinogen.

Fortrinnsvis befinner 5 eller flere aminosyrerester i peptidet seg i den samme relative stilling som de samme aminosyrerestene i aminosyresekvensen 311-369 i Y-kj©den i fibrin. Helst befinner 5 eller flere aminosyrerester seg i den samme relative stilling som de samme aminosyrerestene i sekvensen y-311-336, og særlig som de samme aminosyrerestene i en mindre del av denne sekvensen som 315-322.

Aminosyresekvensen y-311-379 i fibrin er kjent og er:

(311)QFSTWDNDNDKFEGNCAEQDGSGWWM(336)NKCHAGHLNGVYYQGGTYSKASTPN-GYDNGIIWATWKTRWYSM(379). Denne aminosyresekvensen med en av-kobling mellom M(336) og N(337), men med en disulfidbro mellom C(326) og C(339), oppstår også som fragment FCB-5 ved dekompo-neringen av fibrin med cyanbromid (se A. Henschen, Haemo-staseologie, I (1981), s. 49-61). Det nevnte FCB-5 kan også anvendes til å fremstille antistoffer ifølge oppfinnelsen.

Den immunogene aminosyresekvens kan fremstilles på kjent måte, f.eks. ved hjelp av en standard SPPS-metode, slik som beskrevet av Stewart, J.M., Young, J.D. i "Solid Phase Peptide Synthesis", Pierce Chemical Company, 2. opplag, 1984. Under disse omstendigheter beskyttes sidekjedene i aminosyrene som inneholder en funksjonell gruppe, og som ikke bør delta i koblingsreaksjonen, reversibelt. Den frie karboksylgruppe i en derivatisert aminosyre aktiveres og bringes derfor til å reagere med aminogruppen i den derivatiserte aminosyre som skal tilkobles. Denne aktiveringen kan gjøres med DCC (forkortelsene er forklart nedenunder), DCC/HOBt eller DCC/HONSu. Preferansen er for aktivering med DCC/HOBt.

Boe, Fmoc eller Trt kan anvendes som beskyttelses-gruppe for a-aminogruppen i aminosyrer.

Sidekjedegruppene, slik som karboksyl-, hydroksyl-, guanidino- og aminogruppene, kan beskyttes i overensstemmelse med deres reaktivitet med beskyttelsesgruppene, noe som er standard innen peptidkjemi. Alifatiske eller aromatiske rester som skriver seg fra alkoholer, slik som metanol, tert.-butanol eller benzylalkohol, kan anvendes som beskyttelse for karbok-sylgruppene i Asp og Glu. I denne sammenheng er tert.-butanol foretrukket. Hydroksylgruppene i Ser og Thr kan også beskyttes ved hjelp av foretring med tert.-butanol. Merkaptogruppen i cystein kan beskyttes med tritylgruppen. Tosyl-, nitro- eller Pms-gruppen eller protonisering kan anvendes for å beskytte guanidinogruppen i Arg. £-aminogruppen i Lys kan beskyttes ved hjelp av Boe- eller Msc-gruppen. I dette tilfelle er Boc-gruppen foretrukket. I betraktning av beskyttelsesgruppens lave stabilitet overfor baser for a-aminogruppen (Fmoc) må bindingen av den første aminosyre til den faste harpiks være stabil overfor en base. Forankringen til den såkalte p-alk-oksybenzylalkoholharpiksen gir en labil esterbinding i syre-mediet, og denne forankringen er foretrukket i denne sammenheng.

Det eventuelle "avstandsstykke", avsnittet som for-binder enden av et syntetisk peptid til et bærerprotein, kan være sammensatt på forskjellige måter. Forbindelsene egnet for dette formål har f.eks. to identiske eller to forskjellige reaktive grupper i endene til en alkylgruppe som inneholder f.eks. 2-8 karbonatomer. Disse gruppene omfatter bl.a. slike dialdehyder som glutaraldehyd, slike diisocyanater som 1,6-heksametylendiisocyanat, slike diaminer som 1,6-heksametylen-diamin, eller slike o-aminokarboksylsyrer som 6-aminokapron-syre, 6-maleimidkapronsyre. Disse bifunksjonelle reagenser bindes, eventuelt etter aktivering, på kjent måte til på den ene side det syntetiske peptid og på den annen side til bærerproteinet. E-maleimidkapronsyre er foretrukket som et avsnitt i det totale "avstandsstykke". Det andre avsnittet i "avstandsstykket" kan bestå av en merkaptoacetylgruppe som skriver seg fra acetyltioeddiksyre og aminosyrenorleucinet (Nie), som ikke opptrer i naturen.

For å innføre "avstandsstykket", acyleres det beskyt-tede peptid med Nie og acetyltioeddiksyre mens det fortsatt er bundet til harpiksen. e-maleimidkapronsyren aktiveres ved hjelp av HONSu og DCC, hvorved man får maleimidoheksanoyl-N-hydroksysuccinimid. Etter at et bærerprotein er blitt tilføyd, aminolyseres de aktive estermolekylene ved hjelp av de frie aminogruppene i bærerproteinet.

Etter løsning fra harpiksen, avbeskyttelse og rensing av peptidet som er forlenget med et avsnitt av "avstandsstykket", avbeskyttes aminoendedelen, f.eks. ved behandling med en blanding av 4 N NaOH/metanol/dioksan (1/5/14), og som et resultat av dette løsnes acetylgruppen. Koblingen mellom bærerproteinet tilveiebrakt med en maleimidogruppe og det syntetiserte peptid forlenget med en merkaptoacetylgruppe for-løper spontant.

Prinsipielt kan hvilket som helst protein, f.eks. bovint serumalbumin (BSA), men også andre egnede organiske eller uorganiske materialer, anvendes som bærer.

Med immunogenet erholdt på denne måte er det mulig å immunisere forsøksdyr, slik som mus, rotter, kaniner eller geiter, på kjent måte. På en annen måte fås antisera inne-holdende polyklonale antistoffer.

Monoklonale antistoffer induseres fortrinnsvis på en tilsvarende måte, slik som ifølge Kohler, G., Milstein, C,. Nature, 256 (1975), s. 495-497. For dette formål kan de kjente musmyelomcellelinjene anvendes. Gunstige resultater oppnås ved å anvende en cellelinje som ikke i seg selv produserer noe immunglobulin.

Miltceller fra immuniserte Balb/c-mus fusjoneres med en myelomcellelinje (fortrinnsvis cellelinjen Sp 2/0 AG14 eller P3 x 63 Ag 8653), som ikke produserer noe immunglobulin. De fusjonerte cellene velges ut ved dyrking i et seleksjons-medium hvor ufusjonerte miltceller og myelomceller dør, og hvor bare miltceller som er fusjonert med myelomcellene (hybridomceller) overlever. Etter dette seleksjonstrinnet velges de hybridomcellene som produserer de fibrinspesifikke antistoffene ut i et ELISA-system. Hybridomcellene som produserer fibrinspesifikke antistoffer, innføres i bukhulen til Balb/c-mus hvor de dyrkes og produserer ascitesvæske som kan tappes ut, og som tjener som en kilde for rensing av de på-krevde monoklonale antistoffer.

Oppfinnelsen vedrører også et immunogent peptid som er kjennetegnet ved at det har 5-69 aminosyrerester, hvorav en sekvens på minst 5 aminosyrerester er identisk med en sekvens som finnes i aminosyresekvensen 311-379 i y_kjeden "til fibrinogen, og binder til antistoffet ifølge krav 1.

Antistoffene ifølge oppfinnelsen reagerer ikke med fibrinogen, men reagerer med fibrin type I og type II. Denne reaksjonens følsomhet er i størrelsesorden 0,1 pl/ml, og føl-somheten begrenses ikke av fibrinogen som er til stede i et 20.000 gangers overskudd.

Fordelen ved å bestemme fibrin type I er at det første trinnet av alle i sammenklumpingen er dannelsen av fibrin I. På grunn av at bestemmelsen av "oppløselig fibrin" er rettet nøyaktig mot å påvise den aller tidligste sammen-klumping, har en test rettet mot fibrin I en bedre diagnostisk verdi enn en som er rettet bare mot fibrin II. Dannelsen av fibrin II forløper via fibrin I.

En ytterligere fordel ved antistoffene ifølge oppfinnelsen er at de er rettet mot et sted i fibrinet som er involvert i fremskyndelsen av aktiveringen av plasminogen med t-PA (vevplasminogenaktivator); dvs. i fremskyndet plasmindannelse. Kompleksdannelse av dette stedet med antistoffet vil motvirke denne fremskyndelsen og således hjelpe til å holde det fibrin som er til stede i plasma intakt under bestemmelsen av det. Dette er umulig med antistoffene mot fibrin som hittil har vært kjent.

Oppfinnelsen vedrører derfor en anvendelse av et antistoff ifølge krav 1 for bestemmelse av fibrin, særlig i blod. Dette kan finne sted f.eks. med en såkalt "sandwich"-ELISA eller "sandwich"-EIA.

Det rensede monoklonale antistoff immobiliseres under disse betingelsene på en fast bærer og bringes i kontakt i den tilstand med væsken (blod/plasma) som det er ønsket å bestemme fibrininnholdet i. Så bestemmes mengden av fibrin bundet på denne måte ved hjelp av de monoklonale antistoffene ved å tilsette et andre antistoff som er merket med en påvisbar markør, slik som et radioaktivt atom, en fluorescerende eller lumi-nescerende gruppe, eller særlig et enzym (f.eks. pepperrotperoksidase (HRP)). Mengden av det bundne, andre antistoff bestemmes så ved å måle aktiviteten, f.eks. enzymaktiviteten, til markøren. Denne aktiviteten er et mål for fibrinkonsentra-sjonen i blodet eller plasmaet som anvendes.

Oppfinnelsen vedrører videre et diagnosesett for bestemmelse av fibrin som er kjennetegnet ved at det omfatter et antistoff ifølge krav 1. Antistoffet kan foreligge f.eks. i et antiserum, og settet kan også inneholde ytterligere be-standdeler som trengs for å bestemme fibrin.

Ovenfor og i eksemplene nedenunder har forkortelsene de følgende betydninger:

Ata-OH acetyltioeddiksyre

BSA bovint serumalbumin

Boe tert.-butoksykarbonyl

Bufc tert.-butyl

CCD motstrøms fordeling

DCC dicykloheksylkarbodiimid

DMAP 4-dimetylaminopyridin

DMF dimetylformamid

Fmoc 9-fluorenylmetyloksykarbony1

HOBt 1-hydroksy-lH-benzotriazol

HONSu 1-hydroksysuccinimid

MHS 6 - (maleimido )heksanoyl-N-hydi:oksy-succinimid

MSA metansulfonsyre

Msc metylsulfonyletyloksykarbonyl

Nie D,L-norleucin

(P) p-alkoksybenzylalkoholharpiks PBS fosfatbufret saltoppløsning (pH = 6,9,

0,15 M NaCl)

Pms pentametylfenylsulfonyl

SPPS fastfase-peptidsyntese

Tha merkaptoacetyl

TFA trifluoreddiksyre

TLC tynnsjiktskromatografi

Trt trityl.

Eksempel I

Peptidet y-311-336 (QFSTWDNDNDKFEGNCAEQDGSGWWM) ble fremstilt på en p-alkoksybenzylalkoholharpiks ved hjelp av et halvautomatisk peptidfremstillingsapparat ("Labortec SP-640"). Aminosyrene ble koblet i rekkefølgen angitt som Fmoc-aminosyrer iht. en standardmetode ved å starte med C-endemetio-ninet. Ved denne fremgangsmåten ble de følgende beskyttelses-grupper brukt for sidekjedene: [Lys(K): Boe; Cys(C): Trt; Glu(E), Asp(D), Thr(T) og Ser(S): Bu<*>]. Aminosyrene ble koblet ved hjelp av DCC/HOBt. Harpiksen ble til sist avblokkert og frigjort ved behandling med TFA/MSA/tioanisol (10/1/1) i 2 timer ved værelsestemperatur, etterfulgt av filtrering, utfelling med eter og lyofilisering fra vann. Det urene peptid ble renset ved hjelp av CCD i et apparat med elementer på 10 ml av nedre fase. Det ble gjort bruk av et system av buta-nol, eddiksyre og vann i forholdet 5:1:4. Prøver fra toppene ble hydrolysert i 5,7 N saltsyre ved 105°C i 48 timer i for-seglede glassampuller evakuert ved -80°C. Hydrolysatet ble inndampet flere ganger med vann og underkastet aminosyreanalyse i et "JE0L-JLC-6AM"-analyseapparat.

Eksempel II

Peptidet merkaptoacetyl-D,L-norleucylfibrinogen-y (311-336), utstyrt med et avsnitt av "avstandsstykket" (ifølge eksempel I), ble erholdt ifølge synteseskjemaet gjengitt i europeisk patentsøknad nr. 347.959.

Etter rensing ved hjelp av CCD ble peptidetkarakterisert vedhjelp av TLC og aminosyreanalyse. Norleucinet ble tatt med for å være i stand til å bestemme antallet peptider pr. bærermolekyl. Den kjemiske renhet ble bestemt ved hjelp av TLC i forskjellige oppløsningssystemer.

Eksempel III

4,5 mg MHS ble tilsatt 50 mg svært rent BSA oppløst i 1 ml fosfatbuffer (pH = 8). Etter omsetning i 5 min blei reaksjonsblandingen renset ved hjelp av gelfiltrering under anvendelse av "Sephadex G-25" med fosfatbuffer (pH = 6) som elueringsmiddel. 37 mg av det aktiverte peptid fra eksempel II ble tilsatt BSA-avstandsstykkeoppløsningen som derved ble erholdt. Etter omsetning i 2 timer ved værelsestemperatur ble reaksjonsblandingen dialysert mot PBS og lyofilisert.

Eksempel IV

Pol<y>klonale antistoffer

Et ensformig, N-ende-koblet peptidbærerprotein-konjugat ble oppløst i 0,15 M NaCl og blandet med et like stort volum av Freunds komplette adjuvans. Et volum av denne blandingen som svarer til 125 ug totalt protein (10 ug koblet peptid), ble injisert i bukhulen til Balb/c-mus. Disse injek-sjonene ble gjentatt fire ganger, men Freunds ukomplette adjuvans ble nå brukt.

Tilstedeværelsen av antistoffer i blodet til musene immunisert på denne måte, ble bestemt ved hjelp av den ovenfor beskrevne ELISA.

Eksempel V

Monoklonale antistoffer ,

Balb/c-musene immunisert ifølge eksempel IV ble injisert intravenøst med 250 pg BSA-peptidkonjugat oppløst i 0,15 M NaCl 3 dager før fjerningen av milten. Miltceller fra musene ble blandet med myelomceller i et forhold på 4:1 i nær-vær av 40 % polyetylenglykol (molekylvekt 4000), som beskrevet av Kohler og Milstein (Nature, 256 (1975), s. 495-497. Etter fusjon ble cellesuspensjonen fortynnet og fordelt over veggene i fire mikrotiterplater slik at hver brønn inneholdt 3,3 x10<5>miltceller.

Etter at miltcellene og myelomcellene hadde dødd i seleksjonsmediet til K6hler og Milstein, ble dyrkningsvæsker fra brønnene som utviste hybridomvekst testet etter 10- 14 dager med hensyn på tilstedeværelsen av fibrinspesifikke antistoffer.

For dette formål ble brønnene i polystyrenmikrotiter-plater belagt med fibrinogen eller fibrinmonomerer (fremstilt ifølge Belitzer et al., Biochim. Biophys. Acta, 154 (1968),

s. 367). Etter vasking ble små volumer av dyrkningsvæsken av hybridomene innført i de belagte brønnene og inkubert der i 1 time ved 37°C. Så ble brønnene på nytt vasket. En oppløsning av polyklonale antistoffer rettet mot musimmunglobuliner og koblet med pepperrotperoksidase ble så innført i brønnene og inkubert der i 1 time ved 37°C. Etter vasking ble tilstedeværelsen av peroksidaseaktivitet i brønnene bestemt og kvanti-fisert som et mål for mengden av og spesifisiteten til de monoklonale antistoffene som er til stede i dyrkningsvæskene.

Cellelinjene som produserer et fibrinspesifikt antistoff ble så klonet to ytterligere ganger, som beskrevet av McKearn (T.J. McKearn i "Monoclonal Antibodies, Hybridomas: a new dimension in biological analysis. Plenum, New York, 1980, s. 374.

Eksempler på to cellelinjer funnet på denne måte:

Eksempel VI

Bestemmelse av fibrin i blod

Nytappet blod fra friske givere ble behandlet et kort tidsrom med en liten mengde trombin. Ved denne fremgangsmåten ble en mengde oppløselig fibrin fremstilt i plasmaet. En opp-løsning (10 ug/ml) av et monoklonalt antistoff (i 0,04 M tris/Hel, pH 7,5) fremstilt ifølge oppfinnelsen, ble innført i brønnene i en polystyrenmikrotiterplate og inkubert der i 16 timer ved 4°C. Ved denne inkubasjonen ble de monoklonale antistoffene adsorbert på veggen i brønnene. Etter vasking ble fortynningsserier av plasmaet behandlet med trombin og av det samme plasma uten trombinbehandling pipettert over i brønnene. Etter inkubering i 1 time, fortrinnsvis ved 4°C, ble brønnene vasket og en oppløsning av et pepperrotperoksidasekonjugat med et annet monoklonalt antistoff (som ikke behøver å være fibrinspesifikt) innført i brønnene. Etter å ha inkubert på

nytt i 1 time (fortrinnsvis ved 4°C) ble brønnene vasket og peroksidaseaktiviteten anvendt som et mål for mengden av fibrin som er blitt bundet til brønnene belagt med det fibrinspesifikke antistoff. Dette gjøres ved å anvende en blanding av tetrametylbenzidin og hydrogenperoksid som substrat for peroksidase (E.S. Bos et al., J. Immunoassay, 2 (1981),

s. 187). Som et resultat av virkningen av peroksidase ble det på denne måte fremstilt et blått produkt som forandres til gult når reaksjonen stanses ved å tilsette 1 M H2S04€»tter inkubasjon i 10 min ved 37°C. Styrken på den gule fargen ble målt ved en bølgelengde på 405 m/u og er et mål for peroksi-daseaktivi teten .

Et eksempel:

Claims (9)

1. Antistoffer som reagerer spesifikt med fibrin, men ikke med fibrinogen, for anvendelse in vitro,karakterisert vedat antistoffene er rettet mot et peptid med 5-69 aminosyrerester, hvorav en sekvens på minst 5 aminosyrerester er identisk med en sekvens som finnes i aminosyresekvensen 311-379 i y-kjeden til fibrinogen.

2. Antistoffer ifølge krav 1,karakterisert vedat de er rettet mot et peptid hvor minst fem aminosyrerester er identisk med en sekvens som finnes i aminosyreresekvensen y-311-336.

3. Antistoffer ifølge krav 1,karakterisert vedat de er rettet mot et peptid som inneholder aminosyresekvensen y-315-322.

4. Antistoffer ifølge krav 3,karakterisert vedat de er rettet mot et peptid som inneholder aminosyresekvensen y-311-336.

5. Antistoffer ifølge krav 1,karakterisert vedat de er erholdt ved å immunisere med en aminosyresekvens som er bundet til en immunogen bærer, eventuelt via et "avstandsstykke".

6. Antistoffer ifølge krav 1,karakterisert vedat antistoffene er monoklonale .

7. Immunogent peptid, karakterisert vedat det har 5-69 aminosyrerester, hvorav en sekvens på minst 5 aminosyrerester er identisk med en sekvens som finnes i aminosyresekvensen 311-379 i y-kjeden til fibrinogen, og binder til antistoffet ifølge krav 1.

8. Anvendelse av et antistoff ifølge krav 1 for bestemmelse av fibrin.

9. Diagnosesett for bestemmelse av fibrin,karakterisert vedat det omfatter et antistoff ifølge krav 1.