ES2328306T3 - Anticuerpo monospecifico reactivo con friginogeno y fibrinopeptido b. - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo monoespecífico que se une específicamente con un epítopo definido por la secuencia de aminoácidos SEC ID NO 1 y que se une específicamente con fibrinopéptido B y des-Arg fibrinopéptido B.

Description

Anticuerpo monoespecífico reactivo con fibrinógeno y fibrinopéptido B.

Antecedentes de la invención

La invención se refiere a ensayos y procedimientos para detectar y medir la digestión de fibrinógeno mediada por enzimas. Más es particular, la invención se refiere a un anticuerpo específicamente reactivo con un dominio de fibrinógeno y con un producto metabólico de la degradación de fibrinógeno, y a un procedimiento de uso del anticuerpo.

La coagulación de la sangre es parte de la respuesta natural del cuerpo a una lesión o trauma y es crucial para parar la pérdida de sangre en tales situaciones. La formación del coágulo de sangre deriva de una serie de acontecimientos denominada cascada de la coagulación, cuyas primeras etapas implican la formación de la trombina de enzima. La trombina convierte el fibrinógeno circulante en fibrina, una estructura similar a una malla que forma el armazón insoluble del coágulo de sangre. La hemostasis permitida por le formación del coágulo es frecuentemente un proceso que ahorra vidas en respuesta a un trauma, que actúa para detener la salida de sangre de una vasculatura dañada.

El proceso que ahorra vidas de la formación de coágulos en respuesta a una lesión, sin embargo, es una amenaza mortal cuando se produce en sitios inapropiados del cuerpo o en momentos inoportunos. Por ejemplo, un coágulo puede obstruir un vaso sanguíneo y por ello reducir o parar el suministro de sangre a un órgano u otra parte del cuerpo. Además, el depósito de fibrina contribuye a una estenosis parcial o completa de los vasos sanguíneos, dando por resultado la disminución crónica del flujo sanguíneo. Son igualmente amenazantes los coágulos que se desprenden de sus sitios originales y fluyen a través del sistema circulatorio causando bloqueos en sitios remotos. Tales coágulos son conocidos como émbolos. De hecho, las patologías de la coagulación de la sangre, tales como ataques de corazón, ictus y similares se ha estimado que son origen de aproximadamente 50% de todas las muertes hospitalarias.

El fibrinógeno es una de las proteínas más abundantes y mejor estudiadas del sistema circulatorio humano. Al final de la década de los 60 se estableció firmemente la estructura general de la subunidad de fibrinógeno (Blomback, 1968) y una década después se dio a conocer la secuencia completa de aminoácidos (Lottspeich y otros, 1977; Henschen y otros, 1977; Henschen y otros, 1979; Doolittle y otros, 1979). A lo largo de los diez años siguientes se identificó la agrupación de tres genes separados que codifican las unidades \alpha (alfa), \beta (beta) y \gamma (gamma) en el cromosoma 4q23-q32 (Kant y otros, 1985) y se publicaron las secuencias genéticas aparentemente completas de las tres subunidades de fibrinógeno (Chung y otros, 1991).

El fibrinógeno (también denominado abreviadamente en esta memoria "Fg") es una proteína homodímera fuertemente unida con disulfuro, compuesta por dosunidades simétricas (monómeros) de los que cada una incluye copias individuales o tres cadenas polipeptídicas: las cadenas A\alpha (alfa), B\beta (beta) y \gamma (gamma). Así, el fibrinógeno tiene la estructura genérica (A\alphaB\beta\gamma)_{2}. Para una revisión véase Doolittle (1987). Las tres unidades de fibrinógeno tienen dominios enrollados que permiten que las unidades se acoplen entre sí para formar una región "de rollo enrollado" en el monómero de fibrinógeno. Además, cada una de las cadenas B\beta y \gamma tiene un dominio globular, mientras que la cadena A\alpha está presente en dos formas, una forma predominante que no tiene un dominio globular correspondiente (A\alpha) y una forma menos prevalente en la que está presente un dominio globular (A\alpha_{E}) (Fu y otros, 1992, 1994). Consecuentemente, a causa de que el fibrinógeno es homodímero y porque se han identificado dos formas de la subunidad A\alpha, se reconocen dos formas principales de fibrinógeno (A\alphaB\beta\gamma)_{2} y (A\alpha_{E}B\beta\gamma)_{2}.

La compleja estructura del fibrinógeno y su papel central en la formación de coágulos de sangre y la curación de heridas son la causa del importante papel que ha tenido en la investigación bioquímica y médica. Recientemente se ha prestado una atención nueva a las relaciones de estructura/función en la molécula de fibrinógeno. Esta nuevo interés ha sido propiciado en parte por la mayor comprensión de este ámbito de actividad de la proteína en los estados normal y de enfermedad (Blomback 1991; Bini y otros, 1992; Dvorak 1992). Además, se han desarrollado anticuerpos que son específicamente reactivos con los fragmentos o que se unen específicamente sólo a algunos de ellos, lo que permite la identificación molecular de ciertos fragmentos con gran exactitud y precisión (Kudryk y otros 1989a). Si bien se ha identificado un anticuerpo monoclonal con especifidad para el fibrinopétido humano A (Kudryk y otros, 198b; véase también memoria de patente europea EP 0 345 811 B1), hasta el momento no se ha dado cuenta de una sonda específica comparable para el fibrinopéptido B. Sin embargo, a pesar de estos avances, la complejidad del fibrinógeno y su sistema metabólico no se han elucidado completamente hasta el momento.

El hígado sintetiza el fibrinógeno y lo secreta en la circulación. El fibrinógeno circulante es polimerizado por ataque de la trombina para formar fibrina, que es el componente principal de los coágulos de sangre o trombos. Posteriormente, la fibrina se despolimeriza por ataque de la plasmina y se restablece la fluidez del plasma. Muchas de estas etapas de los procesos de polimerización y despolimerización han sido bien establecidos (Doolittle 1984). Se sabe ahora que los elevados niveles de fibrinógeno que son parte de la respuesta en fase aguda que ocurre en la estela de infecciones y traumas proceden de la producción hepática incrementada, principalmente en respuesta a interleucina 6 (IL-6) (Sehgal y otros, 1989).

La degradación del fibrinógeno por escisión hidrolítica por la trombina da dos formas de fibrina. La primera forma, "fibrina I", es definida por escisión mediada por trombina de la cadena \alpha (o la cadena "A\alpha") en A\alpha 16-17. La escisión libera dos péptidos cortos N-terminales designados "fibrinopéptido A" o "FPA" (A\alpha1-16). Seguidamente, la trombina escinde la cadena \beta (o la cadena "B\beta") en B\beta14-15 para crear "fibrina II". La escisión de la cadena B\beta en B\beta14-15 libera un péptido conocido como "fibrinopéptido B" o "FPB", constituido por los 14 primeros restos de la cadena B\beta (B\beta1-4). Véase Blomback (1991). Es sólo después de que la trombina escinde el fibrinógeno cuando se produce la polimerización de la fibrina. El fibrinopéptido B, especialmente, está íntimamente relacionado con el comienzo de la polimerización de fibrina.

En la curación de heridas, el fibrinógeno actúa como una proteína clave consiguiendo una rápida detención de la hemorragia que sigue a la lesión del vaso. Promueve tanto la agregación de las plaquetas activadas entre sí para formar un tapón hemostático como la unión endotelial de células en el sitio de la lesión para cerrar los márgenes de la herida. Como la proteína adherente más abundante de la sangre, el fibrinógeno se une específicamente a plaquetas, células endoteliales y neutrófilos mediante diferentes integrinas (Hynes 1992). En análisis in vitro y en vivo se han identificado cinco dominios putativos de reconocimiento en fibrinógeno humano distribuidos en sus tres subunidades (Klockzewick
y otros 1984; Cheresh y otros, 1989; Loike y otros 1991; Farell y otros 1992; Gonda y otros 1982; Ribes y otros 1989).

Se han encontrado niveles elevados de fibrinógeno en pacientes que sufren enfermedad coronaria cardíaca clínicamente sintomática, ictus y enfermedad vascular periférica. Aunque los mecanismos subyacentes permanecen especulativos, recientes estudios epidemiológicos dejan poca duda de que los niveles de fibrinógeno en plasma son un factor de riesgo cardiovascular independiente que posee una fuerza de predicción que es como mínimo tan alta como la de otros factores de riesgo aceptados tales como fumar, hipertensión, hiperlipoptroteinemia o diabetes (Ernst 1990; Ernst y iotros 1993). La estructura de la fibrina ha sido extensamente analizada in vitro (Doolittle 1984). Sólo recientemente, sin embargo, se ha prestado atención a la estructura molecular de los trombos humanos y las placas ateroescleróticas con respecto al fibrinógeno y los productos de fibrina (Bini y otros 1987). Mientras que los trombos formados in vivo están constituidos principalmente por fibrina II reticulada por el factor XIIIa, el fibrinógeno en sí es un componente principal de lesiones ateroescleróticas no complicadas, en particular placas fibrosas y grasas. Análisis inmunohistoquímicos así como inmunoelectroforéticos indican que el fibrinógeno de la intima aórtica está bien protegido comparativamente de la trombina y plasmina y que gran parte de él está depositado mediante reticulación directa por la transglutaminasa del tejido sin convertirse en fibrina (Valenzuela y otros 1992). El mayor conocimiento de estas cuestiones está a la espera del desarrollo de procedimientos para la determinación diferencial de subtipos de fibrinógeno en muestras médicas.

La proteína derivada de fibrinógeno es también un componente principal de los estromas en los que células tumorales están embebidas, pero se conoce poco su estructura molecular. Las células tumorales promueven la secreción de potentes factores de permeabiidad que causan el escape de fibrinógeno de los vasos sanguíneos (Dvorak y otros 1992). Se produce una coagulación extravascular debida a procoagulantes asociados con células tumorales. La matriz de fibrinógeno/fibrina resultante se remodela constantemente durante el crecimiento del tumor como consecuencia de fibrinolisis inducida por activantes de plasminógeno derivado de células tumorales. Se supone que los productos de degradación de fibrina/fibrinógeno juegan un papel durante el escape de células tumorales matastásicas del tumor primario. Hay indicaciones de que la integrina \alpha_{v}\beta_{3}, que se sabe que interacciona con el sitio RGDS en la región C-terminal de la cadena \alpha, puede ser un receptor de superficie importante de células tumorales puesto que preferentemente se expresa en melanomas invasivos (Felding-Habermann y otros 1992).

Procyk y otros, Blood (1991), vol. 77, nº. 7, págs. 1469-1475, comparan la unión de varios anticuerpos monoclonales a fibrinógeno, entre ellas la unión de T2G1 a B\beta 15-21 y la unión de 1-BC6 a B\beta1-21.

Wilner y otros, Biochemistry (1979), vol. 18, nº. 23, págs. 5078-5082, describen la preparación de suero policlonal de conejo a fibrinopéptido B para identificar epítopos.

De la discusión anterior se deduce con claridad que existen brechas significativas en la comprensión del proceso trombótico. El tratamiento inteligente de pacientes depende de que se conozcan de forma exacta y precisa sus estados trombóticos. El estado presente de la técnica carece de ensayos y procedimientos necesarios para poder hacer tales determinaciones.

Como resultado de ello, existe necesidad de ensayos muy específicos, sensibles y reproductibles para Intensificar la comprensión de la estructura y función del fibrinógeno, en especial en cuanto a la generación y función de los fibrinopéptidos A y B por escisión con trombina. Consecuentemente, hay necesidad de sondas adecuadas para la detección específica y la purificación de fibrinopéptido B y fibrinógeno que incorpora el péptido. Además, se necesitan medios para el ensayo diagnóstico de cuestiones en cuanto a la cantidad de distribución de fibrinógeno en el cuerpo así como para controlar la generación de fibrinopéptido B como índice de la actividad de trombina in vivo (esto es, estado trombolítico). La presente invención se dirige eficazmente a estas y otras necesidades por primera vez.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona, entre otras cosas, un anticuerpo monoespecífico que se une específicamente a un epítopo definido por una secuencia de aminoácidos SEC ID NO 1 y que se une específicamente con el fibrinopéptido B o des-Arg fibrinopéptido B. El anticuerpo monoespecífico puede unirse específicamente a fibrinógeno y sus fragmentos que comprenden la secuencia de aminoácidos definida por SEC ID NO 1. También, el anticuerpo puede unirse al "nudo disulfuro" N-terminal o NH-terminal de fibrinógeno escindido por bromuro de cianógeno (CNBr) (abreviadamente "N-DSK" (A\alpha1-51, B\beta1-118, \gamma1-78)_{2}, M_{f} = 58.000).

Preferiblemente, el anticuerpo monoespecífico está marcado detectablemente por conjugación a un resto detectable. El resto detectable se puede seleccionar entre el grupo constituido por radionúclidos, enzimas, componentes específicos de unión de pares, sustancias colorantes coloidales, fluorocromos, sustancias reductoras, látex, digoxigenina, metales, partículas, dansil lisina, anticuerpos, proteína A, proteína G, materiales densos en electrones y cromóforos.

El anticuerpo monoespecífico se puede unir a un sustrato. Los sustratos adecuados pueden incluir un componente seleccionado entre el grupo constituido por geles, hidrogeles, resinas, perlas, nitrocelulosa, filtros de nailon, placas de microtitulación, matraces de cultivo y materiales polímeros.

El anticuerpo monoespecífico de la invención puede comprender una región de unión a antígeno que se puede seleccionar entre el grupo constituido por Fab, F(ab')_{2} y fragmentos de Fv.

El anticuerpo monoespecífico puede ser un anticuerpo modificado, sintético, recombinante o quimérico. Preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. Más preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal producido por la línea de hibridomas identificada como P10.

La invención proporciona también una composición de unión a fibrinógeno o un fibrinopéptido B, que comprende un anticuerpo monoespecífico que se une específicamente a un epítopo definido por una secuencia de aminoácidos SEC ID NO 1. El anticuerpo monoespecífico puede unirse también específicamente con fibrina(fibrinógeno) o sus fragmentos que comprenden la secuencia de aminoácidos definida por SEC ID NO 1. Por ejemplo, el anticuerpo monoespecífico de la composición se une específicamente a fibrinopétido B y des-Arg fibrinopépido B. También, el anticuerpo de la composición se une específicamente al fragmento N-DSK de fibrinógeno escindido por bromuro de cianógeno.

Preferiblemente, la composición incluye un anticuerpo monoespecífico que está marcado detectablemente por conjugación a un resto detectable. También en este caso, el resto detectable para marcar el anticuerpo se puede seleccionar entre el grupo constituido por radionúclidos, enzimas, componentes para unir pares específicos, sustancias colorantes coloidales, fluorocromos, sustancias reductoras, látex, digoxigenina, metales, partículas, dansil lisina, anticuerpos, proteína A, proteína G, materiales densos en electrones y cromóferos.

Alternativamente, la composición puede incluir un anticuerpo monoespecífico unido a un sustrato. El sustrato adecuado puede incluir un componente seleccionado entre el grupo constituido por geles, hidrogeles, resinas, perlas, nitrocelulosa, filtros de nailon, placas de microtitulación, matraces de cultivo y materiales polímeros.

El anticuerpo monoespecífico de la composición puede comprender una región de unión de antígeno y la región de unión de antígeno puede seleccionarse entre el grupo constituido por fragmentos Fab, F(ab')_{2} y Fv. El anticuerpo monoespecífico puede ser un anticuerpo modificado, sintético, recombinante o quimérico. Preferiblemente, el anticuerpo monoespecífico de la composición es u anticuerpo monoclonal. Más preferiblemente, el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoclonal producido por la línea de células de hibridoma identificada como P10.

La composición puede comprender además un componente diferenciador que se une a fibrinógeno o una subunidad de fibrinógeno. Por ejemplo, la composición puede incluir un anticuerpo diferenciador (un segundo anticuerpo) que tiene especifidad para otro dominio de fibrinógeno.

La invención proporciona además un procedimiento para detectar in vitro fibrinógeno o un fragmento suyo que comprende una secuencia de aminoácidos definida por SEC ID NO 1, procedimiento que comprende:

poner en contacto un sistema evaluable con una composición que comprende un anticuerpo monoespecífico que se une específicamente a un epítopo definido por una secuencia de aminoácidos SEC ID NO 1, y

medir la unión específica del anticuerpo en el sistema evaluable,

en el que la unión específica del anticuerpo en el sistema evaluable está asociada con la presencia de fibrinógeno en la muestra.

Consecuentemente, el procedimiento se puede seleccionar entre el grupo constituido por procedimientos de ensayo inmunoabsorbente ligado a una enzima, procedimientos inmunonefelométricos, procedimientos de aglutinación, procedimientos de precipitación, procedimientos de inmunodifusión, procedimientos inmunoelectroforéticos, procedimientos inmunofluorescentes, procedimientos inmunorradiológicos y procedimientos inmunohistoquímicos.

En el procedimiento, el anticuerpo monoespecífico puede estar marcado detectablemente por conjugación a un resto detectable como se ha descrito antes. Alternativamente, el anticuerpo monoespecífico puede unirse a un sustrato como se ha descrito antes.

El anticuerpo monoespecífico útil de acuerdo con el procedimiento puede comprender una región de unión a antígeno, tal como una región de unión a antígeno seleccionada entre el grupo constituido por fragmentos de Fab,
F(ab')_{2} y Fv. El anticuerpo monoespecífico puede ser un anticuerpo modificado, sintético, recombinante o quimérico. Preferiblemente, el anticuerpo monoespecífico de la composición es un anticuerpo monoclonal; más preferiblemente, el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoclonal producido por la línea de células de hibridoma identificada como P10.

La invención proporciona además un kit para la detección de fibrinógeno o un fragmento del mismo, que comprende:

(a)

una composición que comprende un anticuerpo monoespecífico que se une específicamente a un epítopo definido por una secuencia de aminoácidos SEC ID NO 1, y

(b)

un recipiente que contiene la composición.

El kit puede incluir un anticuerpo monoespecífico que está marcado detectablemente por conjugación a un resto detectable, según se ha descrito. El kit puede incluir un anticuerpo monoespecífico que está unido a un sustrato.

Preferiblemente, el anticuerpo monoespecífico del kit es un anticuerpo monoclonal, más preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal producido por la línea de células de hibrodoma identificada como P10.

Además, la invención proporciona un procedimiento para diagnosticar la presencia o probabilidad de trombogénesis o aterogénesis en un sujeto, que comprende:

(a)

medir una cantidad de proteína que comprende una secuencia de aminoácidos definida por la SEC ID NO 1 en un sujeto mediante una composición que comprende un anticuerpo monoespecífico que se une específicamente a un epítopo definido por una secuencia de aminoácidos SEC ID NO 1,

(b)

comparar la cantidad medida de la proteína del sujeto con una cantidad de proteína que se sabe que tiene asociación con trombogénesis o aterogénesis, y

(c)

determinar por la comparación la presencia o probabilidad de trombogénesis o aterogénesis en el sujeto.

Además, la invención proporciona una línea continua de células que produce un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a un epítopo definido por una secuencia de aminoácidos SEC ID NO 1. Una línea continua de células de hibridoma muy preferida está identificada como P10.

Como resultado de la invención, el experimentador está habilitado ahora para detectar específicamente un importante producto de escisión enzimática de fibrina(fibrinógeno) que permite la determinación precisa y exacta del estado trombótico en individuos. Se proporcionan procedimientos para detectar el producto peptídico mediante un anticuerpo monoespecífico, y una variedad de aplicaciones inmunológicas afines permiten la determinación de la presencia del producto peptídico en muestras biológicas de muchos tipos. Así, se incrementa la capacidad del técnico para diagnosticar y tratar trastornos trombolíticos

En la descripción detallada y los ejemplos que se presentan seguidamente se apreciarán estas y otras ventajas de la invención. La descripción detallada y los ejemplos intensifican la comprensión de la invención.

Breve descripción de los dibujos

En los dibujos que se acompañan se muestran realizaciones preferentes de ciertos aspectos de la invención; de ellos:

La Figura 1A es una separación electroforética de muestras de proteína, teñidas para la proteína.

La Figura 1B es una transferencia de Western usando una sonda basada en anticuerpo T54-2.

La Figura 1C es una transferencia de Western usando una sonda basada en P10.

La Figura 2A es una separación electroforética de muestras de proteína, teñidas para la proteína.

La Figura 2B es una transferencia de Western usando una sonda basada en anticuerpo P5/3.

La Figura 2C es una transferencia de Western usando una sonda basada en P10.

La Figura 3A es una transferencia de mancha Western indirecta de una separación de proteína usando anticuerpo P10 como sonda, con sustrato de 4-cloro-1-naftol y ligado por HRPO a un anticuerpo secundario. La Figura 3B es una transferencia de Western indirecta de una separación de proteína usando anticuerpo P10 como sonda, con un sustrato quimioluminiscente y ligado por HRPO a un anticuerpo secundario.

La Figura 4 es una representación gráfica de una separación cromatográfica de una muestra de proteína de fusión MBP-FPB escindida por enzima, que muestra la reactividad de fracciones con anticuerpo de P10 y el anticuerpo
B/4-6.

La Figura 5 es una tabla que muestra la secuencia de aminoácidos de una porción de la proteína de fusión MBP-FPB, dándose en la parte inferior datos de secuenciación para dos péptidos obtenidos mediante escisión selectiva de la proteína de fusión.

La Figura 6A es un cromatograma de HPLC que muestra una separación de una mezcla de fibrinógeno-péptidos relacionados antes de la separación por inmunoafinidad usando el anticuerpo de P10: La Figura 6B es un cromatograma de HPLC que muestra una separación de la fracción no adsorbida de P10 recogida de una separación en columna de inmunoafinidad de P10 de péptidos relacionados con fibrinógeno mezclados. La Figura 6C es un cromatograma de HPLC que muestra una separación de la fracción adsorbida de P10 recogida de una separación en columna de inmunoafinidad de P10 de péptidos relacionados con fibrinógeno mezclados.

La Figura 7 es un gráfico que ilustra un ELISA competitivo usando el anticuerpo P10.

La Figura 8 es un gráfico que ilustra un ELISA competitivo usando el anticuerpo P10.

La Figura 9 es un gráfico que ilustra un ELISA competitivo usando el anticuerpo P10.

Descripción detallada de la invención

Se sabe que, debido a la fluidez y complejidad de la fisiología de la formación y degradación de la fibrina, en la sangre en circulación y en lesiones trombóticas y ateroescleróticas están presentes muchas formas de fibrina y fibrinógeno. Las múltiples formas de estas moléculas son resultado de la continua agresión por enzimas proteolíticas que escinden de varias formas las moléculas.

La invención proporciona al especialista experimentado una herramienta especialmente útil para estimar el estado trombótico de pacientes en un centro clínico. El anticuerpo de la invención es exquisitamente sensible al fibrinopéptido B y el des-Arg FBP, que son ambos metabolitos significativos del fibrinógeno, una proteína conocida para caracterizar el estado trombótico. Como resultado de ello, el anticuerpo de la invención permite la detección precisa y exacta de fbibrinopéptido B y des-Asrg FPB, dando por resultado una medida objetiva del estado trombótico del paciente.

El fibrinopéptido B humano (hFPB), B\beta 1014) se define por la secuencia de aminoácidos QGVNDNEEGFFSAR (SEC ID NO 4), pero típicamente se observa como ZGVNDNEEGFFSAR (SEC ID NO 5) con su ácido piroglutámico N-terminal ciclado (abreviadamente, "Z"). Sin embargo, se sabe por experimentación que cuando se añade hFBP a la sangre, la mayor parte del péptido se convierte en muy poco tiempo en un metabolito des-Arg/hFPB, por eliminación de la arginina C-terminal. El des-Arg fibrinopéptido B humano (des-Arg hFPB, B\beta1-13) se define por la secuencia de aminoácidos QGVNDNEEGFFSA (SEC ID NO 2) o, más típicamente, ZGVNDNEEGFFSA (SEC ID NO 3). La conversión de hFPB en des-Arg hFPB está mediada por una carboxipeptidasa. in vitro, este proceso de conversión puede inhibirse usando o-fenantrolina durante la recogida de sangre. Desafortunadamente, ha sido imposible controlar este proceso in vivo. Sin conocer la cuantía en que se ha metabolizado FPB de esta manera, no es posible determinar la cuantía de FPB que circula en la sangre.

Este problema se ha eludido ahora generando un anticuerpo que reacciona específicamente con, o se une específicamente a, un epítopo del fibrinopéptido B, sin tener en cuenta si se ha eliminado la arginina C-terminal (y sin tener en cuenta si el resto N-terminal es glutamina o ácido piroglutámico). Así, el anticuerpo permite por vez primera la detección simultánea de ambos péptidos, B\beta1-13 y B\beta1-14. En la medida en que ambas formas de FPB son ahora detectables en un ensayo, es determinable la cantidad total de FPB y se posibilita la estimación precisa del estado trombótico de un paciente una vez que se ha eliminado el fibrinógeno de una muestra clínica por ultrafiltración, precipitación con etanol o por otros procedimientos conocidos en la técnica.

La presente invención proporciona anticuerpos monoespecíficos que son reactivos con o se unen a, un epítopo de fibrinopéptido B, fibrinógeno o fragmentos de él que contienen el epítopo definidor. En particular, la invención proporciona anticuerpos monoespecíficos, tales como anticuerpos monoclonales, que son específicamente reactivos con fibrinopéptido B, des-Arg fibrinopéptido B y fibrinógeno. La invención proporciona también composiciones que contienen tales anticuerpos monoespecíficos así como sondas detectables para la detección, localización y purificación de fibrinógeno y específicamente su fibrinopéptido B. También se proporcionan procedimientos para la preparación de anticuerpos monoclonales anti-FPB detectables, procedimientos para uso de tales anticuerpos para la detección, localización y purificación de fibrinopéptido B y compuestos relacionados, y procedimientos para la diagnosis de trastornos afines.

Los anticuerpos monoespecíficos de la invención pueden presentar reactividad anti FPB que es independiente del contexto molecular o celular en el que se presenta el fibrinógeno B. Por tanto, la invención incluye anticuerpos monoespecíficos que identifican epítopos de fibrinopéptido B, sea como moléculas independientes o incorporadas a una molécula de fibrinógeno, intracelular o extracelular, sea natural (nativo), modificado o sintético (por ejemplo, recombinante). Los anticuerpos monoespecíficos de la invención pueden ser específicamente reactivos con una forma particular de fibrinógeno B, o pueden ser reactivos con un fragmento nativo o sintético de él.

A los fines de una descripción más clara y precisa de la invención, en la discusión siguiente se han adoptado ciertas convenciones terminológicas. Se piensa que estas convenciones proporcionen un medio práctico para una descripción intensificada de la invención, y no son limitativas; el especialista experto apreciará que se pueden tener otras interpretaciones adicionales aunque no inconsistentes.

Un "anticuerpo" de acuerdo con la presente memoria se define en sentido amplio como una proteína que se une específicamente a un epítopo. Los anticuerpos son monoespecíficos, preferiblemente monoclonales. Los anticuerpos monoclonales se pueden producir por procedimientos conocidos en la técnica. Entre estos procedimientos está incluido el procedimiento inmunológico descrito por Köhler y Milstein (1975) y por Campbell (1985), así como el procedimiento de ADN recombinante descrito por Huse y otros (1989).

Tal como se usa en esta memoria, el término "anticuerpo monoespecífico" se refiere a cualquier anticuerpo homogéneo o región de unión de antígeno que es reactivo, o preferiblemente, específicamente reactivo, a un epítopo individual o determinante antigénico. El término "anticuerpo monoespecífico" se refiere más comúnmente a un anticuerpo monoclonal, abreviadamente "MoAb", como convencionalmente se entiende ese término. El término "anticuerpo monoespecífico", sin embargo, tal como se usa en esta memoria, se refiere a anticuerpos homogéneos que son nativos, modificados o sintéticos, y puede incluir anticuerpos híbridos o quiméricos. El término no incluye "anticuerpos policlonales" como ese término se entiende comúnmente.

El término "región de unión de antígeno" se refiere a un fragmento natural, modificado o sintético de un anticuerpo monoespecífico de la invención que es reactivo con un epítopo o fibrinopéptido B o fibrinógeno. Tales regiones de unión de antígeno incluyen, no exclusivamente, fragmentos Fab, F(ab')_{2} y Fv.

Los equivalentes funcionales del anticuerpo de la invención incluyen además fragmentos de anticuerpos que tienen las mismas características de unión que las del anticuerpo entero o características comparables. Tales fragmentos pueden contener uno de los fragmentos Fab, o ambos, o el fragmento F(ab')_{2}. Preferiblemente, los fragmentos de anticuerpo contienen la totalidad de las estas regiones determinantes ("CDR") del anticuerpo entero, aunque también pueden ser funcionales fragmentos que contienen menos de la totalidad de tales regiones, como tres, cuatro o cinco CDR. Los fragmentos se pueden preparar por procedimientos descritos por Lamoyi y otros (1983) y por Parham (1983).

El uso del término "monoespecífico" en el contexto de la presente invención no debe interpretarse que limita el anticuerpo en cuanto a la reactividad con sólo un resto químico individual. Se ha encontrado que el anticuerpo es específicamente reactivo con un epítopo definido por una secuencia de aminoácidos SEC ID NO 1, que se ha encontrado en una pluralidad de restos proteínicos relacionados, incluido fibrinógeno activo así como fragmentos del mismo, incluso fibrinoéptido B, des-Arg fibrinopéptido B y el fragmento N-DSK de fibrinógeno resultante de la escisión con bromuro de cianógeno. El término "anti FPB" se refiere a la capacidad del anticuerpo monespecífico de la invención para reaccionar específicamente con un epítopo definido por la SEC ID NO 1, que es característica de fibrinógeno, fibrinopéptido B, des-Arg fibrinopéptido B, N-DSK y péptidos relacionados.

Consecuentemente, el anticuerpo de la invención es monoespecíficamente reactivo con el epítopo definido por una secuencia de aminoácidos característica de la SEC ID NO 1 y otras secuencias funcionalmente equivalentes, esto es, las secuencias de aminoácidos que presentan similares características de unión. Este anticuerpo no es significativamente reactivo por cruce con restos que carecen del epítopo definidor.

Entre otras propiedades del anticuerpo de la invención, se demuestra en esta memoria que el anticuerpo es reactivo con péptidos que contienen la SEC ID NO. 2 o la SEC ID NO 3, que difieren en su término N. Este rasgo implica que el epítopo definido no está limitado por el carácter del resto n-terminal. Consecuentemente, se entiende que el anticuerpo de la invención reacciona específicamente con un epítopo definido por la secuencia de aminoácidos GVNDNEEGFF
SA (SEC ID NO 1). Las proteínas que contienen esta secuencia dentro de sus estructuras primarias y que carecen de una interferencia estérica significativa de otras estructuras de orden superior, se unirán, por tanto, con el anticuerpo de la invención. Tales proteínas pueden ser naturales, tales como fibrina I, o sintéticas, por ejemplo, producidas por procedimientos sintéticos o recombinantes tales los conocidos en la técnica. Se espera que los homólogos de la secuencia de aminoácidos caracterizada por la SEC ID NO 1 y las proteínas que contienen la secuencia que define el epítopo sean también reactivos con el anticuerpo de la invención. Sin embargo, el anticuerpo no presenta reactividad por cruce sustancial con restos que carecen de este epítopo.

El término "fibrinógeno" sin más incluye cualquier tipo de fibrinógeno. Fibrinógeno, por tanto, se refiere a moléculas de fibrinógeno monómeras o dímeras que tienen la estructura de monómero (A\alphaB\beta\gamma), así como moléculas que tienen la estructura de monómero (A\alpha_{2}B\beta\gamma) y otras moléculas híbridas, sean naturales, modificadas o sintéticas. El término "fibrinógeno" se refiere en general a fibrinógeno de seres humanos, pero puede incluir fibrinógeno de cualquier especie, especialmente mamífera. Además, el término puede estar específicamente limitado a una especie particular en contextos particulares, tales como "fibrinógeno humano".

Es sabido en la técnica que, en general, los anticuerpos monoclonales son difíciles de producir. Por ejemplo, se ha estimado que es necesario explorar más de 1.000 clones para encontrar un anticuerpo o dos que sean suficientemente específicos y que tengan una afinidad suficiente con el antígeno como para poder usarlos. Estas dificultades derivan de problemas tales como la irreproductibilidad de un tamizado inicial positivo o de un fallo en la obtención de subclones en la primera clonación. Tales problemas se relacionan comúnmente con la muerte de células, la inestabilidad de las líneas de células, un rendimiento bajo del anticuerpo en ascitis, inestabilidad del anticuerpo, etc.

Generalmente, para ser útil como inmunógeno, un fragmento de péptido debe contener suficientes restos de aminoácido para definir un epítopo de la molécula que se detecta. Si el fragmento es demasiado corto para ser inmunógeno, puede conjugarse a una molécula soporte. Entre algunas moléculas soporte adecuadas están incluidas hemocianina de lapa californiana y albúmina de suero bovino. La conjugación se puede hacer por procedimientos conocidos en la técnica. Uno de tales procedimientos es combinar un resto de cisteína del fragmento con un resto de cisteína de la molécula soporte.

Sin embargo, a pesar de estas dificultades, la presente invención proporciona líneas de células de hibridoma que producen anticuerpos monoclonales reactivos con un epítopo de fibrinopéptido B y fibrinógeno y fragmentos del mismo que contienen el epítopo. Los anticuerpos producidos por estos hibridomas son también aspectos importantes de la invención.

Se puede usar la tecnología de hibridomas descrita originalmente por Köhler y Milstein (1975) para preparar líneas de células de hibridoma cuyo producto secretor, anticuerpos monoclonales, es reactivo con un epítopo o determinante antigénico de fibrinopéptido B. Seguidamente se describe un procedimiento general de preparación de estas líneas de células de hibridoma. En los Ejemplos se dan más detalles concernientes a la construcción de una línea específica de células de hibridoma. Los expertos en la técnica reconocerán que la presente invención, incluidos los anticuerpos monoclonales y las líneas de células de hibridoma descritas aquí detalladamente, proporcionan una variedad de maneras para hacer los hibridomas y por ello los anticuerpos de la invención. Las líneas de células de hibridoma de la invención se pueden preparar usando fibrinopéptido B o un fragmento inmunogénico N-terminal correspondiente de fibrinógeno como material inmunogénico para activación de células de bazo inmunológicammente relevantes. Generalmente, se inocula un mamífero hospedador con un péptido o fragmento de péptido según se ha descrito antes y luego se hace una inmunización de recuerdo. Los bazos se escogen de los mamíferos inoculados unos pocos días después de la inmunización de recuerdo final. Se recogen luego las células de bazo que producen anticuerpo y se inmortalizan por fusión con células de mieloma de ratón. Las células híbridas, denominadas hibridomas, son líneas de células continuas resultantes de la fusión, que luego se seleccionan y exploran en cuanto a la reactividad con el péptido. Se remite al experimentador a Köhler y Milstein (1975), Kennett y otros (1980) y Goding (1986) para más detalles sobre tecnología de hibridomas: Véase también Campbell (1985).

Los anticuerpos monoespecíficos anti FPB descritos aquí son meramente ilustrativos de la invención y todos los anticuerpos que son específicamente reactivos con fibrinopéptido B o un fragmento de él, independientemente de la especie de origen o o la designación de clase o subclase de imunoglobulina, incluidas IgG, IgA, IgM, IgE e IgD, están incluidos en el ámbito de esta invención. La presente invención proporciona también fragmentos que se unen al antígeno de los anticuerpos anti FPB. La capacidad de unirse a fibrinopéptido B en oposición a sustancias que no contienen FPB es una característica general de los anticuerpos monoespecíficos de acuerdo con la invención.

Como se ha discutido antes, los anticuerpos monoespecíficos de la invención se pueden construir y aislar por inmunización de animales, preparación de hibridomas e identificación de anticuerpos con una reactividad con fibrinopéptido B y fibrinógeno similar a la de los anticuerpos anti FPB descritos. Sin embargo, la presente invención proporciona también un medio para identificar anticuerpos monoespecíficos de la invención que no requiere la determinación de la reactividad del anticuerpo con una gran número de fragmentos relacionados con B\beta. Los anticuerpos de la invención se pueden identificar también por inmunoprecipitación y estudios de unión competitiva usando el anticuerpo producido por las líneas de células descritas aquí.

Las inmunoprecipitaciones usando el anticuerpo monoespecífico anti FPB se pueden usar para determinar la identidad del antígeno. La confirmación de la identidad se puede obtener empobreciendo en antígeno las muestras detectables tales como muestras de plasma, usando cantidades en exceso de anticuerpo anti FPB y observando la incapacidad de otro anticuerpo de inmunoprecipitar un fragmento de cadena B\beta de la muestra tratada. También, en casos en los que los anticuerpos se unen al mismo epítopo o epítopos íntimamente asociados, cada anticuerpo competirá con el(los) otro(s) para unirse al fibrinopéptido B. Los ensayos de unión competitiva son generalmente conocidos en la técnica y en los ejemplos siguientes se presenta un tipo convencional.

El tratamiento de preparaciones de anticuerpo con enzimas proteolíticas tales como papaína y pepsina genera fragmentos de anticuerpo, incluidas las especies Fab y F(ab')_{2}, que retienen actividad antiantígeno El tratamiento de los anticuerpos de la invención con tales enzimas se puede usar por tanto para generar fragmentos que se unen a antígeno de fibrinopéptido B de la invención. La preparación de fragmentos que se unen a antigeno de los anticuerpos de la invención y su utilidad diagnóstica y terapéutica, así como otras aplicaciones, serán sugeridas de por sí al especialista experimentado, Los fragmentos que se unen a antígeno del anticuerpo anti FPB son especialmente útiles en realizaciones específicas de la presente invención.

Los expertos en la técnica comprenderán que la región que se une al antígeno de los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo de la invención es un rasgo clave de la presente invención. Las células de hibridoma anti FPB de la invención actúan como una fuente preferida de ADN que codifica tales regiones de unión de antígeno de la invención. Este ADN se puede unir, mediante tecnología de ADN recombinante, a ADN que codifica cualquier secuencia deseada de restos de aminoácidos dando una nueva secuencia de ADN "condensada" o "quimérica" que codifica una proteína condensada o quimérica. De esta maneras se pueden obtener anticuerpos de la invención en los que una porción del anticuerpo deriva finalmente de una especie y otra porción del anticuerpo deriva de otra especie. Sin embargo, la presente
invención comprende también cualquier molécula quimérica que contiene una región que se une a antígeno anti FPB.

Los anticuerpos de la presente invención también se pueden marcar por conjugación a cualquier grupo detectable, tal como marcadores fluorescentes, marcadores de enzimas y radionúclidos para identificar la expresión de fibrinógeno o productos de escisión, incluido fibrinopéptido B o partes del mismo. Se pueden seleccionar marcadores detectables adecuados entre los conocidos en la técnica, incluidos, no limitativamente, radionúclidos, enzimas, componentes de unión de pares específicos, sustancias colorantes coloidales, fluorocromos, sustancias reductoras, látex, digoxigenina, metales, partículas, dansil lisina, anticuerpos, proteína A, proteína G, materiales de alta densidad de electrones, cromóforos y similares. Se puede emplear eficazmente cualquier marcador adecuado, directa o indirectamente detectable. Un experto en la técnica sabrá claramente que los marcadores mencionados antes son meramente ilustrativos de los diferentes marcadores que se podrían utilizar en esta invención.

Hunter y otros (1962) y David y otros (1974), por ejemplo, han descrito procedimientos para marcar anticuerpos. En las patentes U.S. n^{os}. 3.940.475 y 3.645.090 se han descrito procedimientos adicionales para marcar anticuerpos.

El marcador puede ser radiactivo, esto es, contener un radionúclido. Algunos ejemplos de radionúclidos útiles son ^{32}P, ^{125}I ^{131}I, ^{111}In yH. El uso de radionúclidos ha sido descrito en el documento de patente U.K. nº. 2.034.323, y en las patentes U.S. n^{os}. 4.358.535 y 4.302.204.

Entre algunos ejemplos de marcadores no radiactivos están incluidas enzimas, cromóforos, átomos y moléculas detectables por microscopía electrónica, y iones metálicos detectables por sus propiedades magnéticas.

Entre algunos marcadores enzimáticos útiles están incluidas enzimas que causan un cambio detectable en un sustrato. Entre las enzimas y sus sustratos útiles están incluidos, por ejemplo, peroxidasa de rábano picante (piroqalol o o-fenilendiamina), beta-galactosidasa (fluoresceína beta-D-galactopiranósido) y fosfatasa alcalina (fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo/nitrotetrazolio azul). El uso de marcadores enzimáticos se describe en los documentos U.K. 2.019.404 y EP 63.879 y también lo describe Rotman (1961).

Entre los cromóforos útiles están incluidos, por ejemplo, moléculas fluorescentes, quimioluminiscentes y bioluminiscentes, así como colorantes. Entre los cromóforos específicos útiles en la presente invención están, por ejemplo, fluoresceína, rodamina, rojo de Texas, ficoeritrina, umbeliferona, luminol.

Los marcadores se pueden conjugar a una sonda de anticuerpo por procedimientos que son bien conocidos en la técnica. Los marcadores se pueden unir directamente a la sonda mediante un grupo funcional. La sonda contiene, o se puede hacer que contenga, tal grupo funcional. Entre los ejemplos de grupos funcionales adecuados están incluidos, amino, carboxilo, sulfhidrilo, maleiimida, isocianato, isotiocianato. Alternativamente, marcadores tales como enzimas y moléculas cromóferas se pueden conjugar a anticuerpos por medio de agentes de acoplamiento tales como dialdehídos, carbodiimidas, dimaleimidas y similares.

El marcador también se puede conjugar a la sonda de anticuerpo por medio de un ligando unido a la sonda por un procedimiento descrito antes y un receptor del ligando unido al marcador. Cualquiera de las combinaciones conocidas de ligando-receptor es adecuada. Entre los pares adecuados de ligando-receptor están incluidos, por ejemplo, biotina-avidina o -estreptavidina, y anticuerpo antígeno. Se prefiere la combinación biotina-avidina. Así, los anticuerpos anti FPB de la invención se pueden derivatizar por conjugación con marcadores fluorescentes, marcadores de enzima, radionúclidos, marcadores densos en electrones, sustratos, etc. en una multiplicidad de aplicaciones inmunoquímicas e inmunohistológicas.

Los anticuerpos monoespecíficos de la invención se pueden unir o anexionar a materiales sustrato de acuerdo con procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. Generalmente, tales materiales son sustancialmente sólidos y relativamente insolubles, imparten estabilidad frente al desmoronamiento químico de los anticuerpos y permite que los anticuerpos se ordenen en distribuciones espaciales específicas. Entre los materiales sustrato, los materiales se pueden seleccionar de acuerdo con los deseos del experimentador y son ejemplos de ellos materiales tales como geles, hidrogeles, resinas, perlas, nitrocelulosa, filtros de nailon, placas de microtitulación, matraces de cultivo, materiales polímeros y otros similares, sin limitación.

Los anticuerpos monoespecíficos de la presente invención, estén o no marcados, se pueden usar en ensayos inmunológicos para determinar la presencia de fibrinógeno o péptidos asociados a FPB en muestras de tejido de sujetos humanos o animales. Muestras de biopsia o necropsia de los sujetos, así como muestras de colecciones de tejido o bancos de sangre se pueden evaluar en cuanto a la presencia de fibrinógeno y FPB usando un anticuerpo anti FPB de esta invención. Además, se pueden emplear preparaciones farmacéuticas adecuadas de acuerdo con la invención para uso in vivo, como puede ser para la visualización de fibrinógeno o sustancias que contienen FPB y estructuras en un sujeto vivo.

Así, la invención proporciona un procedimiento para unir fibrinopéptido B, fibrinógeno o un fragmento del mismo que comprende la secuencia de aminoácidos definida por SEC ID NO 1 por medio del anticuerpo monoespecífico anti FPB. Consecuentemente, se pueden detectar y medir por medio de anticuerpos monoespecíficos de la invención fibrinógeno y fibrinopéptido B, sus variantes modificadas o sintéticas asi como sus fragmentos.

En el procedimiento de unión de fibrinógeno de la invención, el procedimiento incluye poner en contacto el sistema evaluable en el que se determina la presencia o ausencia de fibrinógeno, con una composición que comprende un anticuerpo monoespecífico anti FPB o una región del mismo que se une a antígeno. El procedimiento implica luego medir una cuantía de asociación o unión específica entre un analito del sistema evaluable y el anticuerpo monoespecífico. En este procedimiento, la unión específica del anticuerpo en el sistema indica la presencia del analito, esto es fibrinógeno o fragmentos del mismo que contienen FPB, y el procedimiento de la invención puede realizarse in vivo, in vitro o como una combinación de los mismos.

La presente invención proporciona además un procedimiento para detectar la presencia de fibrinógeno B en una muestra. El procedimiento implica el uso de una sonda marcada que reconoce proteína/péptido presentes en una muestra biológica tal como una muestra de sangre. La sonda puede ser un anticuerpo de acuerdo con la invención que reconoce analitos que contienen FPB presentes en la muestra.

La invención proporciona también un procedimiento diagnóstico para la caracterización de fibrinógeno. En este procedimiento, una muestra biológica tal como un fluido corporal se pone en contacto con un anticuerpo de acuerdo con la invención para poder detectar fibrinógeno o sus productos de degradación. Por ejemplo, se pueden ensayar muestras de plasma usando el anticuerpo, antes o después de ultrafiltración, para poder medir las concentraciones de péptido. Tal ensayo se puede usar como índice de la actividad de trombina in vivo. Véase, por ejemplo, Kudryk y otros (1989b). Se pueden adaptar otros procedimientos de ensayo conocidos en la técnica para usar el anticuerpo de la invención.

Un procedimiento típico implica la separación diferencial de productos de degradación, como puede ser la separación de productos por electroforesis en gel. Los productos se miden luego poniendo en contacto los productos con anticuerpos que son específicamente reactivos o están específicamente asociados con uno o varios dominios de fibrinógeno. Kudryk (1989a) y otros describen varios anticuerpos de este tipo. Preferiblemente, tales anticuerpos son específicamente reactivos con un producto de degradación individual, lo que permite la caracterización del producto respecto a otros productos.

En una realización preferente, el procedimiento de detección emplea un anticuerpo monoespecífico que se ha marcado detectablemente con un resto de marcador. En otras realizaciones, el procedimiento puede emplear un anticuerpo monoespecífico que se ha unido a un material sustrato En el procedimiento, la composición puede incluir también otros reactivos tales como otros anticuerpos que detectan diferencialmente otras subunidades o subtipos de fibrinógeno. Este procedimiento puede adaptarse además para uso con al menos un anticuerpo que tiene especifidad para fragmentos alternativos, permitiendo el análisis diferencial o caracterización de FPB libre o de fragmentos que contienen FPB y otros fragmentos de la misma muestra. Por ejemplo, se pueden emplear dos o más anticuerpos conjugados a distintos marcadores fluorescentes como sondas en separaciones de proteínas u otras técnicas inmunométricas.

El procedimiento de unión de fibrinógeno de la invención incluye procedimientos conocidos en la técnica que emplean anticuerpos para unir específicamente sustancias diana. Entre los procedimientos preferidos están incluidos procedimientos inmunoquímicos tales como los procedimientos de ensayo inmunoabsorbente ligado a una enzima (ELISA), procedimientos inmunonefelométricos, procedimientos de aglutinación, procedimientos de precipitación, procedimientos de inmunodifusión, procedimientos inmunoelectroforéticos, procedimientos inmunofluorescentes y procedimientos de radioinmunensayo.

Los ensayos para detectar la presencia de proteínas con anticuerpos han sido descritos previamente y siguen formatos conocidos, tales como los formatos de transferencia estándar y ELISA. Estos formatos normalmente están basados en incubar un anticuerpo con una muestra sospechosa de contener la proteína y detectar la presencia de un complejo entre el anticuerpo y la proteína. El anticuerpo se marca antes, durante o después de la etapa de incubación. Preferiblemente la proteína se inmoviliza antes de ja detección. La inmovilización se puede realizar uniendo directamente la proteína a una superficie sólida o uniendo la proteína a anticuerpos inmovilizados.

El protocolo estándar de ELISA es ejemplar y lo describen, por ejemplo, Kennett y otros (1980). En resumen, se revisten placas con proteína antigénica a una concentración suficiente para unir cantidades detectables del anticuerpo. Después de incubar las placas con la proteína, las placas se bloquean con un agente de bloqueo adecuado tal como, por ejemplo, suero normal de cabra al 10%. Se añade la muestra, tal como suero de un paciente, y se titula para determinar el punto final. Se añaden simultáneamente controles positivos y negativos para cuantificar la cantidad de anticuerpo presente en las muestras desconocidas. Después de la incubación, se ensayan las muestras con Ig de cabra antihumano conjugada a un marcador adecuado, tal como una enzima. La presencia del marcador indica la presencia de anticuerpos antiproteína en la muestra.

En una realización preferente, se inmoviliza una proteína sobre un soporte sólido mediante un primer anticuerpo inmovilizado específico para la proteína. El primer anticuerpo inmovilizado se incuba con una muestra sospechosa de contener la proteína. Si está presente, la proteína se une al primer anticuerpo.

A la proteína inmovilizada se une un segundo anticuerpo, también específico para la proteína. El segundo anticuerpo se puede marcar por procedimientos conocidos en la técnica. Se eliminan por lavado los materiales no inmovilizados y la presencia de marcador inmovilizado indica la presencia de la proteína. Este y otros inmunoensayos se describen en la patente U.S. nº. 4.376.110.

\newpage

Los inmunoensayos pueden implicar una etapa o dos etapas. En un ensayo de una etapa, la molécula diana, si está presente, se inmoviliza y se incuba con un anticuerpo marcado. El anticuerpo marcado se une a la molécula diana inmovilizada. Después de lavar para eliminar moléculas no unidas, se ensaya la muestra en cuanto a la presencia del marcador.

En el ensayo en dos etapas, la molécula diana inmovilizada se incuba con un primer anticuerpo no marcado. El complejo molécula diana-anticuerpo, si está presente, se une luego a un segundo anticuerpo marcado que es específico para el anticuerpo no marcado. Se lava la muestra y se ensaya en cuanto a la presencia del marcador, como se ha descrito antes.

Los ensayos inmunométricos descritos antes incluyen inmunoensayos sandwich simultáneo, sandwich directo y sandwich inverso. Estos términos son bien conocidos por los expertos en la técnica.

En un inmunoensayo sandwich directo, primeramente se incuba una muestra con un anticuerpo contra la proteína que contiene inmunoabsorbente de fase sólida. La incubación se continúa durante un tiempo suficiente para que la proteína de la muestra se una al anticuerpo inmovilizado en la fase sólida. Después de la primera incubación, se separa de la mezcla de incubación el inmunoabente de fase sólida y se lava para eliminar la proteína en exceso y otras sustancias que interfieren que también pueden estar presentes en la muestra. La proteína que contiene inmunoabsorbente de fase sólida, unida a los anticuerpos inmovilizados, se incuba una segunda vez con anticuerpo marcado soluble reactivo por cruce con un dominio diferente en la proteína. Después de la segunda incubación, se realiza otro lavado para eliminar el anticuerpo marcado no unido del inmunoabsorbente sólido y eliminar anticuerpo marcado no unido específicamente. Luego se detecta el anticuerpo marcado unido al inmunoabsorbente de fase sólida y la cantidad detectada de anticuerpo marcado sirve como medida directa de la cantidad de antígeno presente en la muestra original. Alternativamente, también se puede detectar el anticuerpo marcado que no está asociado con el complejo inmunoabsorbente, en cuyo caso la medida está en proporción inversa a la cantidad de antígeno presente en la muestra. Se describen ensayos sándwich directo en, por ejemplo, las patentes U.S. n^{os}. 3.867.517, 4.012.294 y 4.376.110.

En un ensayo sandwich inverso, la muestra que contiene el antígeno se incuba inicialmente con anticuerpo marcado. A la mezcla anticuerpo marcado/muestra se añade un inmunoabsorbente de fase sólida que contiene un anticuerpo que es reactivo por cruce con un dominio diferente del antígeno y se realiza una segunda incubación. No se requiere la etapa de lavado inicial requerida en un ensayo sandwich directo, aunque después de la incubación se realiza un lavado. Se han descrito ensayos sandwich inversos en, por ejemplo, las patentes U.S. n^{os}. 4.098.876 y 4.376.110.

En un ensayo sandwich simultáneo, se incuban simultáneamente en una etapa de incubación la muestra, el inmunoabsorbente con anticuerpo inmovilizado y anticuerpo marcado soluble específico para un dominio diferente del antígeno. El ensayo simultáneo requiere sólo una incubación individual y no requiere etapas de lavado. El uso de un ensayo simultáneo es una técnica muy útil que proporciona facilidad de manipulación, homogeneidad, reproductibilidad, linealidad de los ensayos y alta precisión. Véase, por ejemplo, patente U.S. nº. 4.376.110.

En cada uno de los ensayos anteriores, la muestra que contiene antígeno, el inmunoabsorbente de fase sólida con anticuerpo inmovilizado y el anticuerpo marcado soluble se incuban en condiciones y durante un tiempo suficientes para que el antígeno se una a los anticuerpos inmovilizados y a los anticuerpos solubles. En general, es deseable tener condiciones de incubación suficientes para unir tanto antígeno como sea posible, puesto que esto maximiza la unión de anticuerpo marcado a la fase sólida, aumentando así la señal. Las concentraciones específicas de los anticuerpos marcados y no marcados, la temperatura y el tiempo de incubación así como otras condiciones del ensayo pueden variar dependiendo de varios factores, incluida la concentración de antígeno en la muestra, la naturaleza de la muestra y similares. Los expertos en la técnica serán capaces de determinar las condiciones operativas y óptimas de ensayo para cada determinación empleando experimentación de rutina.

Son conocidos muchos inmunoabsorbentes de fase sólida y se pueden usar en la presente invención. Entre los inmunoabsorbentes bien conocidos están incluidos perlas hechas de vidrio, poliestireno, polipropileno, dextrano, nailon y otros materiales, y tubos hechos de tales materiales o revestidos con los mismos, y similares. Los anticuerpos inmovilizados pueden unirse covalentemente o físicamente al inmunoabsorbente de fase sólida por técnicas tales como unión por covalencia mediante un enlace de amida o éster, o por absorción.

La invención incluye además un procedimiento para determinar o diagnosticar la existencia o probabilidad de trombogénesis o aterogénesis en un sujeto. Alternativamente, el procedimiento incluye la detección y localización de placas y/o lesiones fibróticas o ateroescleróticas. En este procedimiento, se mide una cantidad de un analito (por ejemplo, fibrinógeno o un fragmento de él que comprende la SEC ID NO 1) por medio de una composición que incluye un anticuerpo monoespecífico anti FPB de la invención. La cantidad medida de analito de fibrinógeno se compara con una cantidad del analito que se reconoce o se sabe que está asociada con trombogénesis o aterogénesis. El procedimiento implica luego la determinación, a partir del(los) valor(es) medido(s) y estándar, de la presencia o probabilidad de trombogénesis o aterogénesis en el sujeto. El procedimiento puede incluir medir o detectar fibrinógeno y fragmentos B\beta 1-13 de él in vivo, como puede ser por obtención de imagen o visualización de la localización y/o distribución de fibrinógeno y especialmente fibrinopéptido B en el cuerpo. Alternativamente, el procedimiento incluye obtener una muestra médica del sujeto y medir el fibrinógeno ex vivo o in vitro. Este procedimiento preferiblemente implica la medición diferencial de como mínimo dos epítopos de fibrinógeno, incluido el epítopo de fibrinopéptido B.

La invención incluye también un procedimiento para fraccionar fibrinógeno o fragmentos del mismo que comprenden la SEC ID NO 1. Tal procedimiento incluye poner en contacto una muestra médica que contiene fibrinógeno o fragmentos del mismo con una composición de la invención que incluye un anticuerpo monoespecífico anti FPB. Preferiblemente, el procedimiento se realiza usando condiciones que conducen a la unión de fibrinógeno o fragmentos del mismo con el anticuerpo monoespecífico. Luego se elimina de la muestra el fibrinógeno unido o sus fragmentos. Este procedimiento está representado por procedimientos del tipo de cromatografía, tanto preparativa como analítica. En la técnica son conocidos numerosos procedimientos de este tipo y el experto los puede seleccionar. En este procedimiento, el anticuerpo monoespecífico puede ser soluble, estar en suspensión en fase líquida o unido a una fase sustancialmente sólida, como se desee.

La invención incluye además un procedimiento para purificar fibrinógeno o un fragmento de fibrinógeno que comprende la secuencia de aminoácidos definida por la SEC ID NO 1. Para purificar o separar tales proteínas de otros componentes de muestras biológicas, el procedimiento puede comprender poner en contacto una muestra que contiene fibrinógeno o un fragmento B\beta1-13 del mismo con una composición que comprende un anticuerpo monoespecífico que se une específicamente con el fibrinógeno o el fragmento, en condiciones que conducen a la unión del anticuerpo con el fibrinógeno o el fragmento. Luego se elimina selectivamente del anticuerpo el fibrinógeno o los fragmentos.

En el procedimiento el anticuerpo monoespecífico puede ser soluble, por ejemplo, en suspensión en una fase líquida o puede estar agregado a una fase o sustrato sólido.

La invención proporciona además kits diagnósticos y experimentales que incluyen anticuerpo monoespecífico anti FPB y que permiten la detección, purificación y/o separación de fibrinógeno y los diversos fragmentos del mismo de manera específica y reproductible. En estos kits, los anticuerpos pueden proporcionarse con medios para unirlos a restos de marcadores detectables o superficies de sustratos. Alternativamente, los kits pueden incluir reactivos de control positivo y/o negativo así como otros reactivos para adaptar el uso de los anticuerpos de la invención a técnicas particulares experimentales o diagnósticas según se desee. Los kits pueden prepararse para uso in vivo o in vitro y pueden adaptarse en particular para realizar cualquiera de los procedimientos de la invención, tales como ELISA. Por ejemplo, se pueden hacer kits que contienen anticuerpo unido a placas de microtitulación de múltiples pocillos.

Ejemplos

En los ejemplos siguientes se usaron técnicas convencionales, incluida la construcción y uso de vectores y proteínas de fusión resultantes. Tales procedimientos son bien conocidos por los expertos de la técnica de cualificación normal y se describen en numerosas publicaciones, incluida la de Sambrook y otros (1989). También se emplearon procedimientos convencionales para la preparación y aislamiento de los hibridomas y su producto anticuerpo. Véase, por ejemplo, Kennett y otros (1980) y Goding (1986).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 1 Preparación de proteína de fusión como inmunógeno para la preparación de anticuerpo monoclonal

Se preparó una proteína de fusión como inmunógeno para preparar un anticuerpo monoclonal. Se sintetizaron (Chung y otros 1981) los oligonucleótidos de sentido y antisentido que codifican los 13 primeros aminoácidos OGVN
DNEEGFFSA (SEC ID NO 2) de la cadena B\beta de fibrinógeno. Después de hibridar, formaron un oligonucleótido de doble cadena que luego se ligó para formar un polímero que comprendía 9 repeticiones de B\beta1-13.

Un vector ((pMAL-c2) de proteína de unión a maltosa (MBP), disponible comercialmente, permite la expresión y purificación de proteínas de fusión producidas a a partir de un gen clonado o marco de lectura abierta. El vector pMAL-c2 (6646 pares de base) tiene una supresión exacta del gen malE de E. coli que codifica la proteína de unión a maltosa (la secuencia señal). El procedimiento usa el promotor "tac" fuerte y las señales de iniciación de la translación de malE dando una expresión citoplasmática de alto nivel del gen clonado.

La secuencia con 9 repeticiones se insertó en el vector pMAL-c2 cadena abajo del gen MalE dando por resultado la expresión de una proteína que se une a maltosa fusionada con el polímero peptídico. La proteína de fusión de MBP (designada "MBP/B\beta1-13(9X)") se expresó en E. coli.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 2 Generación y exploración de anticuerpos monoclonales que secretan hibridomas Inmunización y producción de hibridomas

Se realizó la inmunización con la proteína de fusión MBP/B\beta1-13(9X) en general de acuerdo con el protocolo usado al preparar el anticuerpo específico para fibrinopéptido A designado MoAb/MC8C2-5 por Kudryk y otros (1989b). Se inmunizaron ratones BALB/c (Jackson Lab., Bar Harbor, ME) intraperitonealmente (i.p.) con la proteína de fusión (aprox. 0,1 mg/animal) mezclada con coadyuvante completo de Freund. Se administraron seis inyecciones (i.p.) a intervalos de dos semanas de inmunización de recuerdo empleando la proteína de fusión mezclada con coaduyuvante de Freund incompleto. Después de un período de reposo de cuatro semanas, los animales recibieron nuevamente inmunización de recuerdo (i.-p.) y tres días después de esta inmunización final, se usó para fusión el bazo del animal que presentaba el título más alto. Antes de sacrificarlo, se recogió suero de este animal. Las células del bazo se fusionaron con células de mieloma (P3X63Ag8.653) a razón de aproximadamente 4:1 en 1 ml. de polietilenglicol al 50% (peso molecular de aprox. 4000, VWR Scientific, New York, NY) en mmedio RPMI 1640 (Sigma, St. Louis, MO). El resto del procedimiento de fusión ("fusión por agitación") fue idéntico al ya descrito (Harlow y otros, 1988).

\vskip1.000000\baselineskip

Ensayo de antisueros de prefusión/fusión y medios de cultivo de hibridomas

Se usaron anticuerpos para estimar el título por el ensayo inmunoabsorbente ligado a una enzima (ELISA). En el procedimiento ELISA, se revistieron placas de microtitulación con lo siguiente: proteína de fusión MBP/B\beta1-13(9X), proteína de unión de maltosa purificada (MBP), fibrinógeno humano intacto, fibrina II humana intacta, N-DSK antes y después de digestión con trombina, así como conjugados de suero bovino (BSA) preparados con B\beta1-13 o B\beta1-14. También se usaron placas similares en medios de cultivo de hibridoma. El revestimiento de las placas de microtitulación de polivinilo (Costar, Cambridge, MA), el lavado, el bloqueo y la detección de anticuerpo fueron similares a las descritas previamente (Kudryk y otros, 1983). Los anticuerpos policlonales de animales inmunizados con la proteína de fusión se unieron a todas salvo fibrina II y N-DSK digerida con trombina ("(T)-DSK"), esto es, (A\alpha17-51, B\beta15-118, \gamma1-78)_{2}, -52 kDa, una especie no coagulable que carece de FPA y FPB. A diferencia, el anticuerpo presente en medio de cultivo de clones P10 (CCT) reaccionó sólo con las estructuras que contenían la SEC ID NO 1 (esto es, proteína de fusión, fibrinógeno intacto y N-DSK, y conjugados de BSA de B\beta1-13 o B\beta1-14.

\vskip1.000000\baselineskip

Producción de ascitis, purificación e isotipificación de anticuerpo

Puesto que se conoce que los niveles de anticuerpo están en el intervalo de 3-15 mg/ml, se hizo crecer la línea de células de hibridoma P10 (véase más adelante) en la cavidad peritoneal de ratones BALB usando el protocolo siguiente. Se inyectaron (i.p.) 0,5 ml de coadyuvante incompleto de Freund en los ratones. Al siguiente día de esta estimulación, se inyectaron (i.p.) aproximadamente 10^{7} células híbridas en los animales. Se recogieron ascitis 8-12 días después en una unidad de filtración Millex-PF de 0,8 \mum (Millipore Corp., Bedford, MA), se ajustó para un contenido de 0,1% de NaN_{3} y se almacenaron congelados (-70ºC) hasta que era necesario. Usualmente, el título de los anticuerpos se estimó por cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) usando columnas DEAE o BIO-GEL® HPHT. El anticuerpo de ascitis se purificó por cromatografía sobre BAKERBOND® Abx (J.T. Baker Chemical Co., Phillipsburg, NJ) como se describe para ascites preparados por la línea de células de hibridoma 8C2-5 (véase Kudryk y otros 1989b y patente europea nº. 0 345 811 B1). El isotipo del anticuerpo purificado se determinó por procedimientos ELISA convencionales. Se recubrieron placas de microtitulación de polivinilo con anticuerpo a una concentración de aproximadamente 0,5 \mug/ml en Na_{2}CO_{3}/NaHCO_{3}, pH 9,6, y la exploración se realizó usando el kit Screen Type^{MC} y el procedimiento obtenido de Boehringer Mannheim (Indianopolis, IN).

Como se esperaba, la amplia mayoría de los clones aislados produjo anticuerpos que eran específicos para el MBP soporte. Sin embargo, se aisló un anticuerpo que reaccionaba no sólo con la proteína de fusión sino también con fibrinógeno.

Como se detalla en los siguientes Ejemplos 3 y 4, después de escisión en el sitio de fusión de la proteína recombinante por el factor Xa de coagulación de plasma bovino, se demostró que el anticuerpo no era reactivo con el soporte de MBP. Así, se demostró que este anticuerpo es específicamente reactivo con el resto de FPB, no sólo en la forma polímera sintética, sino también integrado en fibrinógeno. Al anticuerpo monoespecífico y su línea de células de hibridoma se dio la designación "P10". Este cuerpo se caracterizó como perteneciente a la clase IgG1, isotipo \kappa.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 3A Análisis de inmunotransferencia usando P10/HRPO

El anticuerpo P10 se marcó para ser detectable agregando peroxidasa de rábano amargo (URPO) al anticuerpo por medios convencionales (Kudryk y otros, 1989b). Se preparó una inmunotransferencia usando el anticuerpo P10 marcado detectablemente para determinar otros aspectos de esta unión a péptidos relacionados con fibrinógeno. Para demostrar la especifidad, se contrastó la reactividad del anticuerpo P10 de un conjunto de muestras con la de la obtenida con anticuerpo T54-2 (IgG1, isotipo \kappa). Este último anticuerpo es específico para un epítopo (B\beta123-127) encontrado en la cadena de fibrinógeno B\beta (carril 2) y la cadena de fibrina \beta (carril 3). El anticuerpo T54-2 también reacciona con un segmento N-terminal de la cadena B\beta de fibrinógeno (B\beta1-190) presente en una subpoblación de fragmentos de N-DSK debido a escisión incompleta por CNBr en la unión de B\beta Met118-Tyr119. El anticuerpo T54-2 se describe en detalle en ka solicitud de patente U.S. nº. serial..........presentada ......titulada "Anticuerpo Monoespecífico Reactivo con Productos de Fusión de Metaloproteinasa de Matriz de Fibrina(fibrinógeno)" (archivo del abogado 454-16) cuya entera descripción se incorpora aquí por referencia.

\newpage

Las Figuras 1A-1C muestran separaciones electreoforéticas (SDS-PAGE, 7% de geles) de muestras de fibrina(fibrinógeno) después de reducción exhaustiva con ditiotreitol (DTT) (McDonagh y otros 1972):

Carril 1:

marcadores de proteína con los pesos moleculares indicados (kDA)

Carril 2:

fibrinógeno

Carril 3:

fibrina reticulada XIIIa

Carril 4:

N-DSK.

La Figura 1 es gel teñido de proteína. Se detectaron bandas reactivas con el anticuerpo (Figs 1B y 1C) usando el sustrato quimioluminiscente (LUMINOL®) de acuerdo con las especificaciones del fabricante (sistema de detección por transferencia ECL Western, Amersham, Arlington Heights, IL).

Como se muestra en la Fig 1C, el anticuerpo P10 no se une a la cadena \beta de fibrina (carril 3). A diferencia, la Fig. 1B muestra que el anticuerpo T54 reacciona sólo con la cadena B\beta de N-DSK de mayor tamaño (B\beta1-190). La Fig. 1C también muestra claramente que el anticuerpo P10 marcado se une a la cadena B\beta de fibrinógeno, pero no reacciona con la cadena libre de hFPB de la fibrina reticulada del factor XIIIa. El anticuerpo también se une a dos bandas de la proteína de N-DSK reducida. La banda que se mueve más rápidamente es B\beta1-118 y la más lenta es B\beta1-190, estando presente la última en una pequeña población de fragmentos de N-DSK debido a una escisión incompleta por CNBr en la unión de B\beta Met118-Tyr119. Estos resultados son consistentes con unión monoespecífica del anticuerpo P10 con el dominio de FPB. Además, la unión se ve en varios contextos, que incluyen FPB libre, fibrinógeno intacto y digestiones con CNBr de fibrinógeno, mientras que no hay unión con fibrina que carece del resto de FPB.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 3B Análisis de inmunotransferencia usando líquido de cultivo del clon de P10 (CCF)

Para más ilustración de la especifidad inesperada del anticuerpo P10 a diferencia de otros anticuerpos aislados usando el procedimiento del Ejemplo 2, se sometieron a electroforesis las muestras siguientes (SDS-PAGE, geles de gradiente 5-15%).

Carril 1:

marcadores de proteína con pesos moleculares indicados (kDA) (carril 1)

Carril 2:

fibrinógeno reducido

Carril 3:

proteína de fusión reducida (inmunógena) antes de escisión con el factor Xa (carril 3).

En la Fig. 2 se presentan los resultados de inmunotransferencia usando el P10 y otro anticuerpo. La membrana teñida con proteína se muestra en la Fig. 2A. Las bandas de proteína unida a anticuerpo (Figs. 2B y 2C) se detectaron usando inmunoglobulina de conejo antirratón conjugada a peroxidasa de rábano amargo (RAM-HRPO), H_{2}O_{2} y 4-cloro-1-naftol. Para comparación, el anticuerpo P5/3 (isotipo desconocido) en P5/3 CCF reacciona con el inmunógeno intacto y la proteína de maltosa "libre" (MBP) pero fracasa totalmente en la reacción con fibrinógeno (Fig. 2B). El anticuerpo P5/3 tampoco reacciona con la cadena B\beta de fibrinógeno, N-DSK o péptidos B\beta1-13 y B\beta1-14 (datos no presentados). Claramente, el anticuerpo P5/3 esta dirigido a un epítopo localizado en MBP. A diferencia, el anticuerpo P10 es claramente reactivo con fibrinógeno (Fig. 2C).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 3C Inmunotransferencia de productos de escisión con factor Xa de proteína de fusión

Para demostrar que el anticuerpo P10 es específico para péptidos que contienen B\beta1-13 en oposición al vehículo MBP, se sometieron a electroforesis las siguientes muestras (SDS-PAGE, geles de gradiente 5-15%).

Carril 1:

proteína de fusión reducida (inmunógeno) antes de escisión con el factor Xa

Carril 2:

proteína de fusión reducida (inmunógeno) después de (5 horas) escisión con el factor Xa.

Las bandas de proteína unida a anticuerpo de la Figura 3A se detectaron usando RAM-HRPO, H_{2}O_{2} y 4-cloro-1-naftol. Las membranas representadas en la Figura 3B se trataron con el sustrato quimioluminiscente como en la Figura 1. Tras escisión con el factor Xa de coagulación de plasma bovino (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA) como se detalla en las instrucciones del fabricante, el MBP "libre" (aprox. 44 kDa) ya no se une al anticuerpo P10 mientras que el mismo anticuerpo reacciona con el péptido liberado (carril 2, polímero de B\beta1-13, aprox. 18 kDa).

Ejemplo 4 Aislamiento del péptido liberado del factor Xa (B\beta1-13 polímero) por cromatografía de afinidad

El digerido de factor Xa (preparado como se ha descrito en el Ejemplo 3C) se hizo pasar por una pequeña columna (aprox. 3 ml) de amilosa equilibrada con Tris-HCl 20 mM, pH 7,4, que contenía NaCl 200 mM, EDTA 1 mM y NaN_{3} 1 mM. La Figura 4 es un gráfico que ilustra la separación cromatográfica de dos picos significativos. El primer pico (pico I) contenía proteína reactiva con el anticuerpo P10. Se combinaron como se indica las fracciones del pico I, se desalaron y se sometieron a análisis de secuencias (véase más adelante). El segundo pico, (pico II), que contenía en su mayor parte MBP no reactivo del anticuerpo P10, se eluyó con el tampón de equilibrado que adicionalmente contenía maltosa 10 mM. El anticuerpo B/4-6 (isotipo desconocido) es similar a P5/3 (véase Figura 2) en cuanto a que reacciona con el inmunógeno intacto y MBP "libre" (esto es, el pico II), pero fracasa totalmente en la reacción con fibrinógeno, su cadena B\beta, N-DSK o los péptidos B\beta1-13 y B\beta1-14. Claramente, el anticuerpo B/4-6 está también dirigido a un epítopo localizado sobre MBP.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 5 Estructura del péptido liberado por el factor Xa (B\beta1-13 polímero)

La proteína purificada del pico I (descrita en el Ejemplo 4) se sometió a análisis de secuencia de aminoácidos usando un secuenciador en fase líquida pulsado (modelo 477A, Applied Biosystems, Inc.) con un analizador en línea de feniltiohindantoin (PHT) aminoácido (modelo 120A, Applied Biosystems, Inc.). En la Fig. 5 se da la secuencia de los 15 ciclos iniciales, indicándose el rendimiento en pmol debajo de cada resto. La secuencia más importante se inicia con B\beta Gly2. Esta observación se puede explicar suponiendo la presencia de alguna enzima contaminante en el lote del factor Xa usado para liberar el péptido relacionado con fibrinógeno de la proteína de fusión. La estructura teórica del péptido escindido por Xa, no adsorbida en resina de amilosa, se da en la parte de arriba de la Fig. 5. La estructura de este péptido debe iniciarse con los cuatro primeros restos derivados de vector (ISEF). Como se muestra en la Fig. 5, se identificó un péptido con esta secuencia, pero no era el péptido más importante.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 6 Cromatografía de inmunoafinidad usando anticuerpo P10

Las metaloproteinasas de matriz (MMP) tienen la capacidad de degradar varias proteínas y protoglicanos que constituyen membranas de base y la matriz extracelular de tejido conectivo. Dos estudios recientes han revelado la presencia de MMP en placas ateroescleróticas. Los solicitantes y otros han demostrado previamente que tales placas contienen también grandes cantidades de antígeno relacionado con fibrinógeno. La hipótesis actual de los inventores es que las MMP pueden jugar un papel en la degradación de fibrina (fibrinógeno) en los ateromas. Como se ha descrito ya en un reciente estudio de los inventores (Bini y otros 1996), la digestión de fibrinógeno (Fg) o fibrina reticulada XIIIa (XL-Fb) por la metaloproteinasa 3 de matriz (estromelisina 1, MMP-3) da por resultado pérdida de reactividad con MoAb/4A5 (anti-\gamma397-411). Esto contrasta con lo que acaece con plasmina, con la que la pérdida de epítopo de cualquier sustrato sólo se produce si las digestiones con plasmina se realizan en un medio exento de Ca^{2+}. En estudios más recientes no publicados todavía, los inventores han dado cuenta de otras diferencias inmunoquímicas importantes en digestiones por varias MMP en comparación con las generadas por plasmina. En la actualidad los inventores no conocen la suerte del segmento B\beta1-13/B\beta1-14 del fibrinógeno durante su escisión con MMP-1 o cualquier otra enzima de esta familia.

Una aplicación del anticuerpo P10 es como matriz de inmunoafinidad para aislar y posteriormente caracterizar la naturaleza molecular de los productos de degradación generados por MMP. Es posible que péptidos de diferente tamaño que contienen el segmento B\beta1-13/B\beta1-14 de fibrinógeno sean liberados por diferentes MMP y que la identificación de tales péptidos en muestras clínicas pudiera proporcionar información sobre la naturaleza y la extensión de la actividad de MMP in vivo. Se ha conocido que B\beta1-42 es la especie principal liberada del fibrinógeno o la fibrina I por la acción del plasma (Hurlet-Jensen y otros 1983). El péptido B\beta1-42 reacciona completamente con el anticuerpo P10 y, por tanto, se uniría a columnas de afinidad preparadas con este anticuerpo.

Consecuentemente, se realizó la siguiente demostración de este principio. El anticuerpo se purificó del líquido ascítico por procedimientos descritos previamente (vease Kudryk y otros, 1989b y patente europea nº. 0.345.811 B1) y luego se acopló covalentemente a una columna AminoLink^{MC} (2 ml) de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante (Pierce, Rockford, IL). Se aplicó una mezcla de péptidos encontrada en el material sobrenadante de un coágulo de fibrina a la columna de anticuerpo P10 que se había equilibrado previamente con tampón A-3 (Tris40 mM-HCl, pH 7,5, NaCl 110 mM, 0,1% de NaN_{3}).

Las fracciones recogidas de la columna de P10 se dividieron en una fracción de P10 no adsorbida y una fracción de P10 adsorbida, cada una de las cuales se analizó por cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) en una columna de fase inversa Vydac 214TP butyl C_{4} (10 x 250 mm) para determinar el contenido.

Como control, se analizó también por HPLC la mezcla de péptidos aplicada a la columna de P10. Se identificaron tres picos principales (Fig 6A) que se designaron en el orden de elución, picos I, II y III.

La Fig. 6B es un cromatograma de HPLC de la fracción de P10 no adsorbida que contiene un pico, esto es, el pico grande del lado derecho del cromatograma, que corresponde al péptido 1 de la mezcla de material. El péptido se identificó por análisis de secuencia como fibrinopéptido A humano (no representados los datos). Los otros picos mayores de la Fig. 6A son sales no peptídicas del tampón.

La Fig. 6C es un cromatograma que muestra la separación por HPLC de los péptidos adsorbidos de P10, eluidos de la columna de anticuerpo con tampón de equilibrado que contenía NaSCN 3 M. Los dos picos a la derecha del gráfico corresponden a los picos I y II de la separación de péptidos mezclados. El análisis de los aminoácidos confirmó que el péptido II (R_{f} aprox. 51,7 min) corresponde a FPB y que el péptido III (R_{f} aprox. 55,6 min) es la especie des-Arg (datos no representados).

Estos datos demuestran con claridad que los péptidos que contienen FPB pueden ser purificados eficazmente a partir de una mezcla de péptidos derivada de fibrinógeno por cromatografía de inmunoafinidad usando el anticuerpo monoespecífico de la invención.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 7A Curvas estándar determinadas por ELISA de dosis-respuesta de la reactividad de P10/HRPO

Se realizó un ELISA de competición de acuerdo con procedimientos convencionales (véase, por ejemplo, Kudryk y otros 1989b) para determinar la afinidad comparativa del anticuerpo P10 para el fibrinógeno. B\beta1-13 (des-Arg hFPB) y B\beta1-14 (hFPB). Específicamente, se revistieron placas con fibrinógeno intacto. La inhibición se determinó usando la ecuación I = (A/A_{0}) x 100, en la que A es la absorbancia en presencia de un competidor y A_{0} es la absorbancia en pocillos de control (tampón sin competidor). Los datos dereactividad dosis-respuesta se linealizaron por medio de transformadas logit (Rodbard y otros, 1969). Puesto que el fibrinógeno contiene 2 mol de FPB/mol, se calculó que la concentración de inhibidor era de 170 kDa.

Los resultados de este ensayo se presentan gráficamente en la Fig. 7. La Fig. 7 revela que el anticuerpo P10 es sustancialmente más reactivo con fibrinógeno intacto que con cualquiera de los péptidos B\beta. Sin embargo, la Fig.7 también revela que el anticuerpo P10 no discrimina entre las dos formas de hFPB. Por tanto, el anticuerpo P10 es adecuado para uso en inmunoensayos para detectar el contenido total de péptido hFPB en una muestra biológica.

Ha de entenderse que este ensayo no reflejará una imagen real del contenido de FPB cuando se realiza directamente con muestras de plasma de pacientes, debido a la fuerte reactividad del anticuerpo con fibrinógeno. Esta fuerte reactividad con fibrinógeno impediría la estimación directa del contenido real de péptidos FPB. También, se genera a velocidad variable en plasma in vitro un péptido que contiene hFPB, B\beta1-42. Además, ni la adición de los inhibidores más comunes (por ejemplo, TRASYLOL® (aprotinina), heparina, EDTA, ácido \varepsilon-aminocaproico (EACA), inhibidor de tripsina de soja, p-aminobenzamidina o una combinación de heparina, TRASYLOR®, EACA y benzamidina), ni el almacenamiento del plasma por debajo de -70ºC, impide la generación del péptido B\beta1-42 (Nossel y otros, 1979). Por tanto, es aconsejable tratar el plasma de pacientes para eliminar el fibrinógeno antes de hacer el ensayo de péptidos derivados de fibrinógeno.

Por ejemplo, el fibrinógeno se puede eliminar del plasma por precipitación con etanol (Kudryk y otros 1982). Este procedimiento no garantiza una eliminación total, pero péptidos tales como B\beta1-13 o FPB se retienen casi cuantitativamente en el etanol sobrenadante. Generalmente, el etanol sobrenadante se procesa seguidamente por ultrafiltración (por ejemplo, usando una celda con un corte a 10 kDa). De esta manera se eliminan pequeñas cantidades de fibrinógeno no precipitado por etanol y se recuperan en el utrafiltrado péptidos de bajo peso molecular tales como B\beta1-13 o FPB. Alternativamente, se pueden ultrafiltrar directamente muestras de plasma, pero la filtración es lenta y hay siempre la posibilidad de que péptidos tales como B\beta1-13 o FPB puedan escindirse durante este proceso.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 7B Curvas estándar determinadas por ELISA de dosis-respuesta de la reactividad de P10

Se realizó un ELISA de competición de acuerdo en general con lo descrito en el Ejemplo 7A para determinar la reactividad de otro grupo de inhibidores y el anticuerpo P10. Los resultados se ilustran en la Fig.8. El péptido B\beta1-14(n) mostrado en la Fig. 8 corresponde al fragmento identificado como péptido II en el Ejemplo 6 (véanse las Figs. 6A-6C). El péptido B\beta1-21 se preparó en un sintetizador de péptidos Biosearch modelo 9600. El péptido B\beta1-41 se aisló de una digestión con el factor Xa de la proteína de fusión MBP/B\beta1-41. Esta última se hizo usando un vector y un protocolo similares a los descritos antes para la preparación del inmunógeno del anticuerpo P10 (Ejemplo 1).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 7C Curvas estándar determinadas por ELISA de dosis-respuesta de la reactividad de P10

Se realizó otro ELISA de competición de acuerdo en general con lo descrito en el Ejemplo 7A para determinar la reactividad de otro grupo de inhibidores y el anticuerpo P10. Los resultados se ilustran en la Fig.9. El N-DSK usado en este experimento se aisló de una fracción de HPLC de fibrinógeno escindido con CNBr por cromatografía de afinidad de P10. Se generó (T)N-DSK a partir de N-DSK por digestión con trombina. Este fragmento digerido con trombina se diferencia de N-DSK en que se han escindido ambos fibrinopéptidos A y B. A diferencia de la fibrina, (T)N-DSK es un fragmento completamente no coagulable que también se puede obtener directamente de fibrina por escisión con CNBr. (La unión menor observada de (T)N-DSK es insustancial, especialmente cuando se contrasta frente a los otros sustratos, y puede ser debida a digestión incompleta).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 8 Aplicación inmunohistoquímica de un anticuerpo anti FPB

Se marca el anticuerpo P10 con un marcador químico fluorescente, isotiocianato de fluoresceína. Se recoge una muestra de tejido, se monta para análisis microscópico y se tiñe usando el anticuerpo P10 marcado. Bajo observación al microscopio, usando una fuente luminosa apropiada, se ve que el anticuerpo marcado se une específicamente con las estructuras o regiones del tejido que contienen fibrinógeno o B\beta1-13, lo que permite la rápida diferenciación de esas regiones o estructuras de otras regiones o estructuras, incluidas las teñidas con otros colorantes. En particular, el anticuerpo marcado como fluorescente permite la detección inmunohistoquímica de antígenos relacionados con fibrinógeno en espacios vasculares y extravasculares.

\vskip1.000000\baselineskip

Depósito biológico

La invención según se reivindica es considerada de acuerdo con la memoria descriptiva y las referencias y los materiales de partida fácilmente asequibles. Sin embargo, los solicitantes deben depositar en la American Type Culture Collection, Rockville, Md., USA (ATCC) la línea de células de hibridoma descrita en esta memoria antes.

Este depósito se debe hacer bajo las disposiciones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los Fines del Procedimiento de Patentes y las regulaciones al respecto (Tratado de Budapest). Esto asegura el mantenimiento de un cultivo viable durante 30 años a partir de la fecha de depósito. ATCC hará asequibles los organismos en los términos del Tratado de Budapest y con sometimiento a un acuerdo entre los solicitantes y ATCC que asegura una asequibilidad no restringida después de la expedición de la patente U.S. pertinente. La asequibilidad de las cepas depositadas no ha de interpretarse como una licencia para practicar la invención contraviniendo los derechos concedidos bajo la autoridad de cualquier gobierno de acuerdo con sus leyes sobre patentes.

\vskip1.000000\baselineskip

Bibliografía

En la memoria anterior se han mencionado las publicaciones siguientes:

Bini A, Fenoglio JJ, J Sobel, Owen J, Fejgl M, y Kaplan KL, "Immunochemical characterization of fibrinogen, fibrin I, and fibrin II in human thrombi and atherosclerotic lesions", Blood 69:1038-1045 (1987).

Bini A y Kudryk BJ, "Fibrin and its derivatives in the normal and diseased vessel wall", Ann NY Acad Sci 667:112-126 (1992).

Bini A, Itoh Y, Kudryk BJ, y Nagase H, "Degradation of cross-linked fibrin by matrix metalloproteinase 3 (stromelysin 1): Hydrolysis of \gammaGly404-Ala405 peptide bond", Biochemistry 35(40):13056-13063 (1996).

Blombäck B, Blombäck M, Henschen A, Hessel B, Iwanaga S. y Woods KR, "N-terminal disulphide knot of human fibrinogen", Nature 218:130-134 (1968).

Blombäck B, "Fibrinogen and fibrin formation and its role in fibrinolysis", pp. 225-279, in Biotechnology of Blood, Goldstein J, ed., Butterworth-Heinemann, Boston (1991).

Campbell, "Monoclonal antibody technology, the production and characterization of rodent and human hybridomas"en Burdon y otros, eds, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Volum. 13, Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1985).

Cheresh DA, Berliner SA, Vicente V, y Ruggeri ZM, "Recognition of distinct adhesive sites on fibrinogen by related integrins on platelets and endothelial cells", Cell 58:945-953 (1989).

Chung DW, Que BG, Rixon MW, Mace M Jr, Davie EW, "Characterization of complementary deoxyribonucleic acid and genomic deoxyribonucleiv acid for the \beta chain of human fibrinogen", Biochemistry 22(13):3244-3250 (1983).

Chung DW, Harris JE, y Davie EW, "Nucleotide sequences of the three genes coding for human fibrinogen", Adv Exp Med Biol 281:39-48 (1991).

David GS y Reisfeld RA, "Protein iodination with solid state lactoperoxidase", Biochemistry 13(5):1014-1021 (1974).

Doolittle RF, Watt KWK, Cottrell BA, Strong DD, y Riley M, "The amino acid sequence of the alpha-chain of human fibrinogen", Nature 280:464-468 (1979).

Doolittle RF, "Fibrinogen and fibrin", Annu Rev Biochem 53:195-229 (1984).

Doolittle RF, "Fibrinogen and fibrin", en Bloom AL, y DP Thomas, eds., Hemostasis and Thrombosis, Churchill Livingston, Edinburgh, New York (1987).

Dvorak HF, Nagy JA, Berse B, Brown LP, Yeo K-T, Yeo T-K, Dvorak AM, Van de Water L, Sioussat TM, y Senger DR, "Vascular permeability factor, fibrin, and the pathogenesis of tumor stroma formation", Ann NY Acad Sci 667:101-111 (1992).

Ernst E, "Plasma fibrinogen - An independent cardiovascular risk factor", J Internal Med 227:365-372 (1990).

Ernst E y Resch KL, "Fibrinogen as a cardiovascular risk factor: A meta-analysis and review of the literature", Ann Intern Med 118:956-963 (1993).

Farrell DH, Thiagarajan P, Chung DW, y Davie EW, "Role of fibrinogen alpha and gamma chain sites in platelet aggregation", Proc Natl Acad Sci USA 89:10729-10732 (1992).

Felding-Habermann B, Ruggeri ZM, y Cheresh DA, "Distinct biological consequences of integrin alpha v beta 3-mediated melanoma cell adhesion to fibrinogen and its plasmic fragments", J Biol Chem 267:5070-5077 (1992).

Fu Y, Weissbach L, Plant PW, Oddoux C, Cao Y, Liang TJ, Roy SN, Redman CM, y Grieninger G, "Carboxy-terminal-extended variant of the human fibrinogen \alpha subunit: a novel exon conferring marked homology to \beta and \gamma subunits", Biochemistry 31:11968-11972 (1992).

Fu Y, y Grieninger G, "Fib_{420}: A normal human variant of fibrinogen with two extended \alpha chains", Proc Nail Acad Sci USA 91:2625-28 (1994).

Goding JW, en Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, New York, NY (1986).

Gonda SR y Shainoff JR, "Adsorptive endocytosis of fibrin monomer by macrophages: Evidence of a receptor for the amino terminus of the fibrin alpha chain", Proc Natl Acad Sci USA 79:4565-4569 (1982).

Harlow E y Lane D, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988).

Henschen A y Lottspeich F, "Amino Acid sequence of human fibrin, preliminary note on the completion of the beta-chain sequence", Hoppe-Seyler's Z Physiol Chem 358:1643-1646 (1977).

Henschen A, Lottspeich F, y Hessel B, "Amino acid sequence of human fibrin, preliminary note on the completion of the intermediate part of the alpha-chain sequence", Hoppe-Seyler's Z Physiol Chem 360:1951-1956 (1979).

Hunter WM y Greenwood FC, "Preparation of Iodine-131 labelled human growth hormone of high specific activity", Nature 144:495-496 (1962).

Hurlet-Jensen A, Koehn JA, y Nossel HL, "The release of B\beta1-42 from fibrinogen and fibrin by plasmin", Thromb Res 29:609-617 (1983).

Huse WD, Sastry L, Iverson, SA, Kang AS, Alting-Mees M, Burton DR, Benkovic SJ, y Lerner RA, "Generation of a large combinatorial library of the irnmunoglobulin repertoire in phage lambda", Science 246:1275-1281 (1989).

Hynes RO, "Integrins: Versatility, modulation, and signaling in cell adhesion", Cell 69:11-25 (1992).

Kant JA, Fornace AJ Jr, Saxe D, Simon MI, McBride OW, y Crabtree GR, "Evolution and organization of the fibrinogen locus on chromosome 4: Gene duplication accompanied by transposition and inversion", Proc Natl Acad Sci USA 82:2344-2348 (1985).

Kennett RH, McKearn TJ, y Bechtol KB, eds., Monoclonal Antibodies. Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, New York (1980).

Kloczewiak M, Timmons S, Lukas TJ, y Hawiger J, "Platelet receptor recognition site on human fibrinogen. Synthesis and structure-function relationship of peptides corresponding to the carboxy-terminal segment of the gamma chain", Biochemistry 23:1767-1774 (1984).

Köhler G, y Milstein C, "Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity", Nature 256:495-497 (1975).

Kudryk B, Robinson D, Netre C, Hessel B, Blombäck M, y Blombäck B, "Measurement in human blood of fibrinogen/fibrin fragments containing the B\beta15-42 sequence", Thromb Res 25:277-291 (1982).

Kudryk B, Rohoza A. Ahadi M, Chin J, y Wiebe ME, "A monoclonal antibody with ability to distinguish between NH_{2}-terminal fragments derived from fibrinogen and fibrin", Mol Immunol 20-1191-1200 (1983).

Kudryk BJ, Grossman ZD, McAfee JG, y Rosebrough SF, "Monoclonal antibodies as probes for fibrin(ogen) proteolysis", capítulo 19 de Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy, Chatal J-F, ed., CRC Press, Boca Raton (1989a).

Kudryk B, Cidlund M, Rohoza A, Ahadi M, Coiffe D, y Weitz JI, "Use of a synthetic homologue of human fibrinopeptide A for production of a monoclonal antibody specific for the free peptide", Blood 74(3):1036-1044 (1989b).

Lamoyi E y Nisonoff A, "Preparation of F(ab')_{2} fragments from mouse IgG of various subclasses", Immunol Meth 56:235-243 (1983).

Loike JD, Sodeik B, Cao Y, Leucona S, Weitz JI, Detmers PA, Wright SD, y Silverstein SC, "CD11c/CD18 on neutrophils recognizes a domain at the N terminus of the A-alpha chain of fibrinogen", Proc Natl Acad Sci USA 88:1044-1048 (1991).

Lottspeich F, y Henschen A, "Amino acid sequence of human fibrin. Preliminary note on the completion of the gamma-chain sequence", Hoppe-Seyler's Z Physiol Chem 358:935-938 (1977).

McDonagh J, Messel H, McDonagh RP Jr, Murano G, y Blombäck B, "Molecular weight analysis of fibrinogen and fibrin chains by an improved sodium dodecyl sulfate gel electrophoresis method", Biochim Biophys Acta 257:135-42 (1972).

Nossel HL, y Kaplan KL, "Simultaneous measurement of thrombin and plasmin proteolysis of fibrinogen and of platelet release", pp. 97-110 in The Chemistry and Physiology of the Human Plasma Proteins, Bing D, ed., Pergamon Press, New York (1979).

Parham P, "On the fragmentation of monoclonal IgG1, IgG2a, IgG2b from BALB/c mice", J Immunol 131(6):2895-2902 (1983).

Ribes JA, Ni F, Wagner DD, y Francis CW, "Mediation of fibrin-induced release of von Willebrand factor from cultured endothelial cells by the fibrin beta chain", J Clin Invest 84:435-442 (1989).

Rodbard D, Bridson W, y Rayford PL, "Rapid calculation of radioimmunoassay results", J Lab & Clin Med 74(5):770-781 (1969).

Rotman, Proc Natl Acad Sci USA 47:1981-1991 (1961).

Sambrook J, Fritsch EF, y Maniatis T, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989).

Sehgal PB, Grieninger G, y Tosato G, eds., "Regulation of the acute phase and immune responses: Interleukin-6", Ann NY Acad Sci 557:1-583 (1989).

Valenzuela R, Shainoff JR, DiBelio PM, Urbanic DA, Anderson JM, Matsueda GR, y Kudryk BJ, "Immunoelectrophoretic and immunohistochemical characterizations of fibrinogen derivatives in atherosclerotic aortic intimas and vascular prosthesis pseudo-intimas", Amer J Pathol 141:861-880 (1992).

(1) INFORMACIÓN GENERAL

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE: The New York Blood Center, Inc.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

INVENTORES: Kudryk, Bohdan J

\hskip3,9cm Bini, Alexandra

\hskip3,9cm Zhang, Jian-Zhomg

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: ANTICUERPO MONOESPECÍFICO REACTIVO CON FIBRINÓGENO Y FIBRINOPÉPTIDO B

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 6

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

DIRECCIÓN DE LA CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESTINATARIO; Hoffmann & Baron, LLP

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 350 Jericho Turnpike

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Jericó

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: NEW YORK

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: USA

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO ZIP: 11753

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DEL MEDIO: Disquete, 8,90 cm, alm. 1,44 Mb

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: WordPerfect

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL: Presentada la solicitud de PCT

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR.

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: 08/900.660

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE LA PRESENTACIÓN: 25 de julio de 1997

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN DE ABOGADO/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Baron, Ronald J

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO. 29281

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE: 454-15PCT

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: 516 822 3550

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFAX: 516 822 3582

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO 1

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 12 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO 1

1

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO 2

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO 2

\vskip1.000000\baselineskip

2

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO 3

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = "ácido piroglutámico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO 3

\vskip1.000000\baselineskip

3

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO 4

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 14 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO 4

\vskip1.000000\baselineskip

4

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO 5

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 14 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

RASGO

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE:CLAVE: sitio modificado

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

SITUACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: nota/ = "ácido piroglutámico"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO 5

\vskip1.000000\baselineskip

5

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO 6

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TOPOLGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO 6

\vskip1.000000\baselineskip

6

Claims (34)

1. Un anticuerpo monoespecífico que se une específicamente con un epítopo definido por la secuencia de aminoácidos SEC ID NO 1 y que se une específicamente con fibrinopéptido B y des-Arg fibrinopéptido B.

2. Un anticuerpo monoespecífico de acuerdo con la reivindicación 1, anticuerpo que está detectablemente marcado por conjugación a un resto detectable.

3. Un anticuerpo monoespecífico de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el resto detectable se selecciona entre el grupo constituido por radionúclidos, enzimas, componentes de pares de unión específicos, sustancias colorantes coloidales, fluorocromos, sustancias reductoras, látex, digoxigenina, metales, partículas, dansil lisina, anticuerpos, proteína A, proteína G, materiales densos en electrones y cromóforos.

4. Un anticuerpo monoespecífico de acuerdo con la reivindicación 1, anticuerpo que está unido a un sustrato.

5. Un anticuerpo monoespecífico de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el sustrato incluye un componente seleccionado entre el grupo constituido por geles, hidrogeles, resinas, perlas, nitrocelulosa, filtros de nailon, placas de microtitulación, matraces de cultivo y materiales polímeros.

6. Un anticuerpo monoespecífico de acuerdo con la reivindicación 1, anticuerpo que comprende una región que se une a antígeno.

7. Un anticuerpo monoespecífico de acuerdo con la reivindicación 6, en el que la región que se une a antígeno se selecciona entre el grupo constituido por fragmentos Fab, F(Ab')_{2} y Fv.

8 Un anticuerpo monoespecífico de acuerdo con la reivindicación 1, anticuerpo que es un anticuerpo modificado, sintético, recombinante o quimérico.

9. Un anticuerpo monoespecífico de acuerdo con la reivindicación 1, anticuerpo que es un anticuerpo monoclonal.

10. Una composición de unión a fibrinógeno o fibrinopéptido B, que comprende un anticuerpo monoespecífico de acuerdo con la reivindicación 1.

11. Una composición de acuerdo con la reivindicación 10, en la que el anticuerpo está detectablemente marcado por conjugación con un resto detectable.

12. Una composición de acuerdo con la reivindicación 11, en la que el resto detectable se selecciona entre el grupo constituido por radionúclidos, enzimas, componentes específicos de unión de pares, sustancias colorantes coloidales, fluorocromos, sustancias reductoras, látex, digoxigenina, metales, partículas, dansil lisina, anticuerpos, proteína A, proteína G, materiales densos en electrones y cromóforos.

13. Una composición de acuerdo con la reivindicación 10, en la que el anticuerpo está unido a un sustrato.

14. Una composición de acuerdo con la reivindicación 13, en la que el sustrato incluye un componente seleccionado entre el grupo de geles, hidrogeles, resinas, perlas, nitrocelulosa, filtros de nailon, placas de microtitulación, matraces de cultivo y materiales polímeros.

15. Una composición de acuerdo con la reivindicación 10, en la que el anticuerpo comprende una región de unión a antígeno.

16. Una composición de acuerdo con la reivindicación 15, en la que la región de unión a antígeno se selecciona entre el grupo constituido por fragmentos Fab, F(ab')_{2} y Fv.

17. Una composición de acuerdo con la reivindicación 10, en la que el anticuerpo es un anticuerpo modificado, sintético, recombinante o quimérico.

18. Una composición de acuerdo con la reivindicación 10, en la que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

19. Una composición de acuerdo con la reivindicación 10, composición que comprende además un componente diferenciador que se une específicamente a fibrinógeno o una subunidad o fragmento del mismo.

20. Una composición de acuerdo con la reivindicación 19, en la que el componente diferenciador es un segundo anticuerpo que se une a otro dominio de fibrinógeno.

\newpage

21. Un procedimiento para detectar fibrinógeno o un fragmento del mismo, que comprende una secuencia de aminoácidos definida por la SEC ID NO 1 in vitro, procedimiento que comprende:

poner en contacto un sistema evaluable con una composición de acuerdo con la reivindicación 10,

medir la unión específica del anticuerpo en el sistema evaluable,

en el que la unión específica del anticuerpo en el sistema evaluable está asociada con la presencia de fibrinógeno en la muestra.

22. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 21, procedimiento que se selecciona entre el grupo constituido por procedimientos de ensayo inmunoabsorbente ligado a una enzima, procedimientos inmunonefelométricos, procedimientos de aglutinación, procedimientos de precipitación, procedimientos de inmunodifusión, procedimientos inmunoelectroforéticos, procedimientos inmunofluorescentes, procedimientos de ensayo inmunorradiológicos y procedimientos inmunohistoquímicos.

23. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 21, en el que el anticuerpo está detectablemente marcado por conjugación a un resto detectable.

24. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 23, en el que el resto detectable se selecciona entre el grupo constituido por radionúclidos, enzimas, componentes específicos de unión de pares, sustancias colorantes coloidales, fluorocromos, sustancias reductoras, látex, digoxigenina, metales, partículas, dansil lisina, anticuerpos, proteína A, proteína G, materiales densos en electrones y cromóforos.

25. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 21, en el que el anticuerpo está unido a un sustrato.

26. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 25, en el que el sustrato se selecciona entre el grupo constituido por geles, hidrogeles, resinas, perlas, nitrocelulosa, filtros de nailon, placas de microtitulación, matraces de cultivo y materiales polímeros.

27. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 21, en el que el anticuerpo comprende una región de unión a antígeno.

28. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 27, en el que la región de unión que se une con antígeno se selecciona entre el grupo constituido por fragmentos Fab, F(Ab')_{2} y Fv.

29. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 21, en el que el anticuerpo es un anticuerpo modificado, sintético, recombinante o quimérico.

30. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 21, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

31. Un kit para la detección de fibrinógeno o un fragmento del mismo, que comprende:

(a)

una composición de acuerdo con la reivindicación 10,

(b)

un recipiente que aloja la composición.

32. Un kit de acuerdo con la reivindicación 31, en el que el anticuerpo está detectablemente marcado por conjugación a un resto detectable.

33. Un kit de acuerdo con la reivindicación 31, en el que el anticuerpo está unido a un sustrato.

34. Un procedimiento in vitro para diagnosticar la presencia o probabilidad de trombogénesis o aterogénesis en un sujeto, que comprende:

(a)

medir una cantidad de proteína que comprende una secuencia de aminoácidos definida por la SEC ID NO 1 en un sujeto mediante una composición de acuerdo con la reivindicación 10,

(b)

comparar la cantidad medida de la proteína del sujeto con una cantidad de proteína que se sabe que tiene una asociación con trombogénesis o aterogénesis, y

(c)

determinar por la comparación la presencia o probabilidad de trombogénesis o aterogénesis en el sujeto.

35. Una línea continua de células que produce un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicación 1.