ES2304782T3 - Anticuerpos monoclonales para determinacion inmunologica selectiva de formas de lamininas de alto peso molecular, intactas en fluidos corporales. - Google Patents
Anticuerpos monoclonales para determinacion inmunologica selectiva de formas de lamininas de alto peso molecular, intactas en fluidos corporales. Download PDFInfo
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Abstract
Anticuerpo monoclonal con especificidad para proteínas de la familia de las lamininas y para el fragmento de la laminina P1 que se puede preparar a partir de placenta humana por digestión con pepsina, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal se une preferentemente a las estructuras plegadas de forma nativa de los dominios de la laminin P1 de la laminina, la afinidad del anticuerpo a la laminina nativa, intacta, es aproximadamente igual a la afinidad del anticuerpo al fragmento de la laminina P1, y el anticuerpo presenta las propiedades de un anticuerpo monoclonal que es producido por la línea celular DSM ACC2181, DSM ACC2180 o DSM ACC2182 del hibridoma.
Description
Anticuerpos monoclonales para la determinación
inmunológica selectiva de formas de lamininas de alto peso
molecular, intactas en fluidos corporales.
La presente invención se refiere a anticuerpos
monoclonales para la determinación inmunológica selectiva de formas
de lamininas de alto peso molecular en líquidos corporales, así como
a un procedimiento para la preparación de estos anticuerpos.
La laminina es una proteína de múltiples
dominios que se encuentra en todas las membranas basales y que forma
complejos con otros componentes distintos, típicos de la membrana
basal tales como, por ejemplo, nidógeno, heparanosulfato de
proteoglicano o colágeno IV (Timpl, R. (1989) Eur. J. Biochem. 180;
487 a 502). Está compuesta por tres polipéptidos distintos, unidos
por puentes disulfuro. En este caso se forma la estructura de una
cruz asimétrica (Figuras 1a y 1b). Recientemente se identificaron
muchas variantes estructurales, las cuales se forman por el
ensamblaje de 8 subunidades diferentes (conocidas hasta el momento).
Para obtener una forma de laminina siempre se tienen que reunir
polipéptidos de tres clases diferentes de moléculas: una cadena
\alpha (anteriormente cadena A), una cadena \beta
(anteriormente cadena B1) y una cadena \gamma (anteriormente
cadena B2) (Burgeson, R.E.; et al. (1994) Matrix Biology,
vol. 14, 209 a 211).
A las lamininas se les atribuye un gran número
de funciones biológicas interesantes tales como, por ejemplo, la
influencia sobre el crecimiento celular, la extensión (spreading)
celular y el crecimiento de las neuritas, así como la inducción de
procesos de diferenciación (Timpl, R. (1989) Eur. J. Biochem. 180;
487 a 502).
Aun cuando las lamininas son componentes típicos
de todas las membranas basales, las distintas isoformas se
caracterizan por una distribución tisular muy específica. La
merosina, por ejemplo, (= laminina 2; \alpha2,\beta1,\gamma1)
es parte componente de las membranas basales de las células de
Schwann, de los músculos estriados y de los trofoblastos (Leivo,
I.; Engvall, E. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85; 1544 a 1548).
Otra variante, la laminina-s (= laminina 3;
\alpha1,\beta2,\gamma1) se encuentra en la membrana basal de
las sinapsis en las placas terminales neuromusculares, en el
endotelio de los vasos sanguíneos y en los podocitos glomerulares
(Hunter, D.D.; Shah, V.; Merlie, J.P.; Sanes, J.R. (1989) Nature
338; 229 a 234).
Un tercer ejemplo, la laminina-k
(= laminina 6; \alpha3,\beta1/\beta2,\gamma1) es específica
de la membrana basal de la piel (Marinkovich, M.P.; Lunstrom, G.P.;
Burgeson, R.E. (1992a) J. Biol. Chem. 267; 17900 a 17906). Allí,
como componente de "los filamentos de anclaje", se encuentra
también la kalinina/niceina (= laminina 5,
\alpha3,\beta3,\gamma2) típica de los tejidos epiteliales
(Marinkovich, M.P.; Lunstrom, G.P.; Keene, D.R., Burgeson, R.E.
(1992b) J. Cell. Biol. 119; 695 a 703).
Para la detección de laminina en suero humano
fueron desarrollados métodos de determinación específicos para la
diagnosis de diversas enfermedades. Como posibles indicaciones se
citan fibrosis/cirrosis hepática, fibrosis hepática alcohólica,
complicaciones diabéticas de la membrana basal (BM), enfermedades
renales, arteriosclerosis inflamatoria crónica/poliartritis crónica
y enfermedades tumorales (Kropf. J.; et al. (1991) Clin Chem.
37; 30; Niemelä, O.; Risteli, L.; Sotaniemi, E.A.; Ristelli, J.
(1985) Eur. J. Clin. Invest. 15; 132 a 137. Katayama, M.; Kamihagi,
K.; Hirai, S.; Murakami, K.; Hino, F.; Kate, I. (1992) Br. J. Cancer
65; 509 a 514. Brocks, D.G.; Strecker, H.; Neubauer, H.P.; Timpl,
R. (1986) Clin. Chem. 32; 787 a 791. Horikoshi, S.; Koide, H. (1991)
Clin. Chim. Acta 196; 185 a 192).
Actualmente se pueden adquirir comercialmente
tres métodos para la determinación de lamininas:
- \quad
- Un método de determinación de laminina P1 sobre la base de un antisuero policlonal se comercializa por Behringwerke AG bajo la marca registrada "RIA-gnost®" (Brocks, D.G.; Strecker, H.; Neubauer, H.P.; Timpl, R. (1986) Clin. Chem. 32; 787 a 791).
- \quad
- Un inmunoensayo EIA para laminina sobre la base de dos anticuerpos monoclonales (TAKARA, Shuzo Co., LTD; Katayama et al., 1992; Katayama, M.; Kamihagi, K.; Hirai, S.; Murakami, K.; Hino, F.; Kate, I. (1992) Br. J. Cancer 65; 509 a 514).
- \quad
- Un inmunoensayo enzimático de una etapa, tipo sandwich, basado en dos anticuerpos monoclonales (Fuji Chemical Ltd.; Iwata, K. (1990) Clin. Chim. Acta 191; 211 a 220).
Mientras que en el procedimiento 1 y 3 se
utilizan anticuerpos contra el fragmento "Lam P1" resistente a
la pepsina, el procedimiento 2 se basa en anticuerpos contra una
"laminina nativa", aislada según el método de Wewer et
al. (digestión cuidadosa con pepsina en ausencia de EDTA; Wewer,
U.; Albrechtsen, R.; Manthorpe, M.; Varon, S.; Engvall, E.;
Burgeson, R.E. (1983a) J. Biol. Chem. 258; 12654 a 12660).
A partir del trabajo de Katayama (procedimiento
2) se desprende que el inmunoensayo de TAKARA correlaciona
relativamente bien con el RIA-gnost® (Behringwerke)
(r = 0,68) aunque en un suero tumoral (pulmonar) se presenta una
distribución de antígeno que se desvía del
RIA-gnost®. A saber, según una cromatografía de
filtración en gel de los anticuerpos dirigidos contra la
"laminina nativa" en suero se detectan dos picos de antígeno
en la zona de pesos moleculares de 330 a 150 kDa. En virtud de su
tamaño, se debe tratar aquí de productos de degradación de la
"laminina sérica".
El RIA-gnost® (procedimiento 1)
diagnostica por el contrario dos picos en el intervalo de 100 a 900
kDa, es decir evidentemente tanto estructuras nativas (intactas)
como también estructuras degradadas. El reconocimiento común de
estructuras de laminina intactas y degradadas conduce, sin embargo,
a inexactitudes en el dictamen diagnóstico, puesto que por un lado
se pueden solapar el colectivo normal y el colectivo de pacientes y,
por otro lado, las fluctuaciones de concentración en un pico se
pueden equilibrar por desplazamientos cuantitativos de signo
contrario en el otro pico.
Para el inmunoensayo de Fuji (procedimiento 3)
no existe cromatografía alguna de un suero. Pero a partir de una
electroforesis en gel de SDS y de un inmunoblot se observa, que
los anticuerpos utilizados reconocen en suero normal y en "suero
de cirrosis hepática" una banda de 200 kDa, es decir que
evidentemente reaccionan de manera específica con fragmentos
degradados de la laminina.
Iwata, K. describe un inmunoensayo enzimático de
tipo sandwich de una sola etapa para laminina humana utilizando
anticuerpos monoclonales (Iwata, K. Clinica Chimica Acta. 191
(1990), 211-220). Anticuerpos monoclonales contra
la laminina se describen también por Abrahamson D. R. et al.
(1989) (Abrahamson D. R. et al. J. Cell Biology (1989), 109,
3477-3491). Katayama et al. (1992) describen,
además, fragmentos de laminina como marcadores tumorales (Katayama,
M. et al. Br. J. Cancer (1992), 62,
509-514).
Frente a esto, es objeto de la presente
invención poner a disposición anticuerpos monoclonales y un
procedimiento para su preparación, los cuales se unan
preferentemente a laminina nativa, intacta, especialmente a las
estructuras plegadas de forma nativa de los dominios de la laminina
P1 de la laminina.
La presente invención se fundamenta, además, en
la misión de poner a punto un procedimiento para la determinación
inmunológica de laminina en base a los anticuerpos que se han de
desarrollar, en el cual se detecte exclusivamente la colonia de
laminina de alto peso molecular, por lo que, evitando la detección
conjunta de productos de degradación de la laminina, sea posible
una determinación más exacta del contenido de laminina intacta o,
respectivamente, de dos subcolonias de laminina en líquidos
corporales. De este modo, en un procedimiento diagnóstico que se
basa en un método de determinación de laminina de este tipo, se
eliminan las inexactitudes en el dictamen diagnóstico, como las que
se tuvieron que soportar con los métodos de determinación conocidos
hasta el momento.
El problema se soluciona conforme a la invención
por un anticuerpo monoclonal
- 1.
- con especificidad para las proteínas de la familia de las lamininas y para el fragmento de laminina P1 que se puede preparar a partir de placenta humana por digestión con pepsina, el cual se caracteriza porque el anticuerpo monoclonal se une preferentemente a las estructuras plegadas de forma nativa de los dominios de la laminin P1 de la laminina, la afinidad del anticuerpo para la laminina nativa, intacta, es aproximadamente igual a la afinidad del anticuerpo para el fragmento de la laminina P1, y el anticuerpo presenta las propiedades de un anticuerpo monoclonal que es producido por la línea celular DSM ACC2181, DSM ACC2180 o DSM ACC2182 del hibridoma,
- 2.
- el cual (anticuerpo), se caracteriza además preferentemente porque se forma a partir de un hibridoma que se origina por la fusión de células de una línea celular de mieloma y linfocitos de un animal vertebrado, no humano, inmunizado previamente con laminina P1 y que, a continuación de esto, fue seleccionado, porque el anticuerpo formado, junto a una buena capacidad de unión a la laminina de placenta humana purificada, presenta también una buena reacción con la forma de elevado peso molecular de la laminina obtenida a partir de suero humano.
- 3.
- Además, el anticuerpo monoclonal conforme a la presente invención tiene preferentemente la facultad de unirse al antígeno, por pares con otro anticuerpo conforme a la invención.
El problema planteado se soluciona, además, por
una línea celular de hibridoma, la cual produce un anticuerpo con
las propiedades expuestas bajo los n^{os} 1 a 3, obtenible por
fusión de células de una línea celular de mieloma y linfocitos de
un animal vertebrado, no humano, inmunizado previamente con laminina
P1 y subsiguiente selección de los híbridos en cuanto a que el
anticuerpo producido por el híbrido presente también, junto a una
buena propiedad de unión a la laminina humana de placenta,
purificada, una buena reacción con la forma de elevado peso
molecular de la laminina obtenida a partir de suero humano.
Una línea celular de hibridoma de este tipo se
caracteriza preferentemente porque los linfocitos fueron extraídos
de ratones de la cepa balb/c inmunizados con laminina P1, y porque
la línea celular de mieloma es la línea celular P3X63AG8.653 del
mieloma de ratón.
\newpage
Tres líneas celulares de hibridoma, las cuales
presentan las propiedades anteriormente indicadas, fueron
depositadas en la Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen GmbH (DSM) (Colección alemana de microorganismos y
cultivos celulares), Marscheroder Weg 1b,
D-38124-Braunschweig, conforme a las
prescripciones del Budapester Vertrages (Acuerdo de Budapest) el
12. de julio 1994 con los números de depósito, DSM ACC2181, DSM
ACC2180 y DSM ACC2182.
Estas líneas celulares de hibridoma producen
anticuerpo monoclonales que presentan las ventajosas propiedades
reseñadas bajo los n^{os} 1 a 3.
Las líneas celulares DSM ACC2181 y DSM ACC2180
de hibridoma producen respectivamente un anticuerpo de la subclase
IgG2a, y la línea celular DSM ACC2182 de hibridoma, un anticuerpo de
la subclase IG 1.
Para la solución del problema planteado al
principio también se pone a disposición un procedimiento para la
preparación de un anticuerpo monoclonal conforme a la invención, el
cual se caracteriza porque
- a)
- animales vertebrados, no humanos, se inmunizan con el fragmento de laminina P1, el cual se puede preparar a partir de placenta humana por digestión con pepsina,
- b)
- se obtienen linfocitos de los animales vertebrados inmunizados y se fusionan con células de mieloma,
- c)
- se seleccionan los híbridos en cuanto a la presencia de un anticuerpo con las propiedades citadas bajo los n^{os} 1 a 4 y se clonan, y
- d)
- a partir de estos clones se obtiene el anticuerpo.
Este procedimiento se caracteriza
preferentemente porque para la ejecución de la etapa d) del
procedimiento se emplean las líneas celulares DSM ACC2181, DSM
ACC2180 o DSM ACC2182 de hibridoma.
Además de esto, el problema propuesto se
resuelve por un procedimiento para la determinación inmunológica de
laminina nativa utilizando un anticuerpo estratificado, fijado
adhesiva o covalentemente a un material de soporte, y un segundo
anticuerpo marcado, el cual reconoce el antígeno unido al anticuerpo
estratificado, caracterizado porque el anticuerpo estratificado es
un anticuerpo monoclonal conforme a la presente invención.
Pero, preferentemente, el problema propuesto se
resuelve por un procedimiento para la determinación inmunológica de
laminina nativa utilizando un anticuerpo estratificado, fijado
adhesiva o covalentemente a un material de soporte, y un segundo
anticuerpo marcado, el cual reconoce el antígeno unido al anticuerpo
estratificado, caracterizado porque el segundo anticuerpo marcado
es un anticuerpo monoclonal conforme a la presente invención.
En este caso, el anticuerpo estratificado puede
ser igualmente un anticuerpo monoclonal conforme a la presente
invención, preferentemente es el que se produce a partir de la línea
celular DSM ACC2181 de hibridoma y que presenta las constantes de
unión representadas en la Tabla 3.
Los anticuerpos monoclonales conformes a la
invención se pueden utilizar especialmente en procedimientos para
la diagnosis de enfermedades que transcurren con una modificación
del contenido de laminina en los líquidos corporales, para lo cual
los líquidos corporales se extraen del cuerpo vivo, pero que no se
aportan de nuevo a éste.
A continuación, la invención se explica con más
detalle, especialmente las formas de ejecución preferidas. Más
adelante, la invención se definirá por medio de las
reivindicaciones.
Para la preparación de los anticuerpos
monoclonales se pueden inmunizar animales, especialmente roedores
tales como, por ejemplo, ratones, ratas, conejos, cobayas, con
laminina P1, que fue aislada según el método descrito en el Ejemplo
1, en presencia de coadyuvantes.
De modo particularmente preferido se emplean
ratones, especialmente los de la cepa Balb/c. Con repetidas
inyecciones secundarias, por ejemplo en intervalos de 4 a 8 semanas,
se refuerza la respuesta inmune. El éxito de la inmunización se
controla por determinación de la concentración de los anticuerpos
específicos con un ELISA, en sí conocido por el experto en la
materia. Algunos días antes de la fusión de los linfocitos con una
línea celular de mieloma se tratan los animales con laminina P1 sin
coadyuvante. Se obtienen linfocitos de los animales y se fusionan
con una línea celular de mieloma, la cual puede proceder igualmente
de una de las especies animales anteriormente citadas,
preferentemente sin embargo de ratón, especialmente con la línea
celular P3X63AG8.653. Ventajosamente, se fusionan linfocitos con
líneas celulares de mieloma de la misma especie. La fusión y el
ulterior cultivo de los clones celulares se llevan a cabo de un modo
conocido por el experto en la materia, determinándose en el líquido
sobrenadante del cultivo celular la concentración de los anticuerpos
específicos mediante ensayos de unión inmunológicos. A partir de
los clones celulares que se originan en la fusión se seleccionan
los clones adecuados para la utilización en procedimientos
inmunológicos con ayuda de una serie de pruebas (screening)
expuesta en las Tablas 4 y 5. De modo particularmente preferido, se
trabaja con líneas celulares que se preparan por fusión de
linfocitos de ratones de la cepa Balb/c contra laminina P1 la línea
celular de mieloma P3X63AG8.653. del ratón.
Los anticuerpos monoclonales conformes a la
invención pertenecen al grupo de las inmunoglobulinas,
preferentemente a la clase de las proteínas IgG, IgA e IgM. Los
anticuerpos de la subclase IgG2a e IgG1 se pueden emplear de manera
especialmente ventajosa. El anticuerpo conforme a la invención se
caracteriza especialmente porque su afinidad para la laminina
intacta es aproximadamente igual a su afinidad para el antígeno de
inmunización laminina P1, creado por digestión con pepsina (Tablas
2 y 3). La estrategia de "screening" representada en las
Tablas 4 y 5 pone en claro que efectivamente la predominante mayoría
de los clones obtenidos por la fusión produce anticuerpos
monoclonales, los cuales únicamente reconocen el fragmento
artificial de la laminina P1 creado por el tratamiento con pepsina.
Con gran probabilidad, estos anticuerpos reaccionan con estructuras
inmunogénicas que fueron creadas artificialmente como consecuencia
de la escisión proteolítica de las cadenas, pero que no se
presentan en la estructura nativa de la proteína. Tan sólo unos
pocos de los anticuerpos monoclonales obtenidos, pero especialmente
los anticuerpos conformes a la presente invención, reaccionan con
las estructuras nativas, no generadas por digestión con pepsina en
los dominios centrales de la laminina.
Para la preparación y caracterización de los
anticuerpos conformes a la invención es importante que se disponga
de una fuente adecuada para la obtención del antígeno de
inmunización y de las diferentes variantes estructurales decisivas
para el "screening". La laminina humana P1 así como diferentes
preparados de laminina se purifican a partir de placenta humana,
según los métodos descritos en los ejemplos. A partir de este órgano
se pueden obtener al menos dos isoformas de laminina diferentes
(Brown, C.J.; Wiedemann, H.; Timpl, R. (1994) J. Cell Sci. 107; 329
a 338).
\global\parskip0.900000\baselineskip
Los anticuerpos conformes a la invención se
pueden utilizar en diferentes procedimientos inmunológicos tales
como, por ejemplo, en los ensayos inmunoradiométricos después de
marcar el anticuerpo de marcado con cloramina T o reactivo de
Bolton-Hunter, así como en otros ensayos de unión
competitivos y no competitivos tales como los inmunoensayos
fluorescentes, enzimáticos, quimioluminiscentes u otros
inmunoensayos, incluidas todas las formas de los radioinmunoensayos
(Harlow, E.; Lane, d. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH;
2nd Edn.; Nueva York; 319 a 359. 553 a 612). En este caso es
intrascendente que el anticuerpo estratificado esté unido covalente
o no covalentemente a tibitos de poliestireno, esferitas de
poliestireno, partículas paramagnéticas o materiales activados para
columnas de cualquier tipo. Por lo tanto, los anticuerpos
monoclonales se pueden emplear en procedimientos inmunológicos para
el aislamiento y la caracterización, así como la determinación
cuantitativa de laminina en tejidos y líquidos corporales. Se
procede según métodos conocidos por el experto en la materia
haciendo que una muestra líquida, que contiene laminina, reaccione
con uno de los anticuerpos monoclonales conformes a la invención,
ya sea en solución o preferentemente sobre un soporte sólido, y
determinando la cantidad de laminina a través del complejo
antígeno-anticuerpo formado. Los productos de
degradación de la laminina en los líquidos corporales, captados
hasta el momento conjuntamente o reconocidos exclusivamente en la
determinación inmunológica no son reconocidos en este inmunoensayo,
sino que exclusivamente las estructuras de laminina intactas.
La invención se explica más ampliamente en los
ejemplos siguientes.
El antígeno de inmunización laminina P1 es un
fragmento de la laminina del tamaño de 200 a 250 kDa, el cual se
puede extraer y aislar después de una digestión intensiva con
pepsina del tejido placentario. Este fragmento contiene los
dominios internos en forma de bastocitos (dominios III) de los
brazos cortos de las cadenas de laminina \alpha, \beta y
\gamma (Risteli, L; Timpl, R. (1981) Biochem. J. 193, 749 a 755).
Las tres cadenas de polipéptidos (de las cuales existen varias
isoformas) están unidas entre sí por puentes disulfuro y se
caracterizan por una estructura idéntica tridimensional. Tal como se
representa en la Figura 1b, en cada uno de los sectores de las
cadenas de las subunidades de la laminina se encuentran enfilados
linealmente, unos junto a otros, siete a catorce motivos
estructurales, los denominados "EGF-like
repeats" (repeticiones iguales al factor de crecimiento
epitelial), los cuales se caracterizan todos por el mismo motivo de
plegamiento. Cada uno de los 50 a 60 aminoácidos de un
"EGF-like repeats", debido a una secuencia
típica, fija, de uniones disulfuro, adoptan una estructura en forma
de hoja de trébol. A nivel de secuencia, entre los
"EGF-like repeats" de las cadenas cortas de
laminina existe una identidad > 30% (Engel, J. (1989) FEBS Lett.
251, No. 1,2; 1 a 7).
El antígeno de inmunización de la laminina P1 se
preparó tal como se explica a continuación:
1,2 kg de placenta humana se descongelaron en
500 ml de agua + IP, a 4ºC durante 16 a 20 horas.
(IP = inhibidores de proteasas = NEM 1 mM, PMSF
1 mM, PCMB 0,28 mM)
\vskip1.000000\baselineskip
Después de la descongelación se ajustó el
volumen de la tanda de partida a 2,5 l y se homogeneizó con el
Ultraturrax durante 3 a 5 minutos.
Finalmente, se centrifugó a 6500 x g durante 10
minutos a 4ºC .
\global\parskip1.000000\baselineskip
El precipitado obtenido se agitó 8 veces con
respectivamente 1,8 l de NaCl 3M, Triton X-100 al
0,1%, Tris/HCl 0,02M, pH 7,4 + IP y, a continuación, se centrifugó
a 6500 x g, 10 minutos, 4ºC. Finalmente, el precipitado se agitó en
agua y se centrifugó de nuevo. El precipitado se extrajo a 4ºC
durante 64 horas con 3L de tampón (NaCl 1M, EDTA 10 mM, Triton
X-100 al 1%, Tris/HCl 0,02 M, pH 8,6 + IP). El
material no soluble se separó por centrifugación a 26000 x g (30
minutos) y se siguió elaborando.
\vskip1.000000\baselineskip
El último precipitado se agitó en 3,0 l de ácido
acético 0,5M, EDTA 10 mM, se homogeneizó con el Ultraturrax durante
3 minutos y se siguió agitando durante 2 horas más. El valor del pH
de la tanda de partida se ajustó después a 2,5 con ácido fórmico.
La digestión proteolítica tuvo lugar después de la adición de 100 mg
de pepsina a 4ºC y duró 40 h. Después de la digestión con pepsina
se separaron las turbideces presentes por 30 minutos de
centrifugación a 26000 x g (4ºC).
\vskip1.000000\baselineskip
En el líquido sobrenadante de la centrifugación
(3,16 l) se introdujeron bajo agitación 366,1 g de NaCl (= 1,9M) y
se siguió agitando durante 2 horas más.
El precipitado formado se separó por
centrifugación del tampón ácido a 6500 x g (4ºC, 10 min), se
disolvió en 1,8 L de NaCl 0,02M, urea 2M, Tris/HCl 0,05M, pH 8,6 y
se dializó 7 veces frente a 8 L del mismo tampón. Las turbideces en
la solución se pudieron separar por centrifugación (30 minuntos,
26000 x g, 4ºC).
\vskip1.000000\baselineskip
Se efectuaron en cada caso 5 separaciones y se
aplicaron sobre la columna respectivamente 350 ml de muestra.
- Condiciones de elución:
- Tampón A; NaCl 0,02M, Tris/HCl 0,05M, EDTA 1 mM pH 7,4
- \quad
- Tampón B; NaCl 1M, Tris/HCl 0,05M, EDTA 1 mM pH 7,4
- \quad
- Caudal: 3 ml/min
- \quad
- Gradiente lineal (90 ml) de NaCl 0,02M a 0,1 M
- Gradiente escalonado;
- 300 ml de tampón con NaCl 0,1 Ml
- \quad
- 450 ml de tampón con NaCl 0,25 M
- \quad
- 300 ml de tampón con NaCl 0,5 M
Cada una de las fracciones de la cromatografía
se analizaron con ayuda de laminina P1 RIA-gnost® y
las fracciones de laminina P1 obtenidas (elución con NaCl 0,25M) se
agruparon.
\vskip1.000000\baselineskip
El grupo que contiene laminina P1 se diluyó 3:1
con (NH_{4})_{2}SO_{4} 3M y se incubó durante 2 horas
a 4ºC. El precipitado se obtuvo por 30 minutos de centrifugación a
26000 x g (4ºC).
\vskip1.000000\baselineskip
La proteína precipitada se disolvió en un
volumen adecuado de fosfato-Na 50 mM, NaCl 0,15M,
azida-Na al 0,02% pH 2,0 y se separó en porciones de
2 ml por medio de la cromatografía de filtración en gel.
- Condiciones de elución:
- Tampón; fosfato-Na 50 mM, NaCl 0,15M, azida-Na al 0,02%
- \quad
- pH 2,0
- \quad
- caudal; 1,0 ml/min
Cada una de las fracciones de la cromatografía
se analizaron otra vez con ayuda de la laminina P1
RIA-gnost®. Se reunieron las fracciones que
contienen laminina de las 25 cromatografías separadas y se les
añadió NaOH 2M, de manera que se ajustaba un valor de pH de 8,0. A
la solución se mezcló después 3:1 con una solución 3M de
(NH_{4})_{2}S0_{4} y se incubó durante una noche. El
precipitado formado se separó por centrifugación a 26000 x g (30
minutos, 4ºC) y se disolvió en 20 mL de NH_{4}HCO_{3} 0,2M.
\vskip1.000000\baselineskip
A la solución se añadió aproximadamente 1 mg de
colagenasa, así como una punta de espátula de MgCl_{2} y
CaCl_{2} y se incubó durante 4 horas a 37ºC. La digestión
proteolítica se detuvo por adición de 3 ml de ácido fórmico.
\vskip1.000000\baselineskip
Después de la digestión se cromatografió de
nuevo tal como se ha descrito anteriormente.
Las fracciones positivas en el RIA se diluyeron
3:1 (después de haber sido ajustadas con NaOH 2M a un valor de 8,0)
con (NH_{4})_{2}SO_{4} y en esta forma se conservaron a
4ºC.
El precipitado formado se suspendió en
(NH_{4})_{2}SO_{4} 3M, se distribuyó en 22 porciones de
0,5 mL y se centrifugaron en la centrífuga de Eppendorf durante 4
minutos. A partir del sobrenadante de cada parte alícuota se
tomaron en cada caso 0,48 mL.
La laminina P1 aislada se puede conservar como
precipitado de sulfato de amonio a 4ºC al menos durante 4 meses sin
pérdida de contenido.
\vskip1.000000\baselineskip
Determinación de la concentración con laminina
P1 RIA-gnost® :
- \quad
- 108 600 E (23,9 mg)
Característica en el RIA:
Curva de inhibición lineal
Enlace-So = 66,9%
50% interceptado = 1,302 E/ml
Suero normal = 1,72 E/ml
Las etapas de lavado y la extracción tienen
lugar tal como se describe en el Ejemplo 1.
En una Ultrasette (300 kDa), la proteína
extraída se transvasa a un tampón de urea 2 M, Tris/HCl 0,05 M, NaCl
0,02 M, EDTA 2 mM, pH 7,4 y se aplica sobre una
Q-sefarosa FF 60/14. La proteína ligada se puede
eluir en NaCl 0,15 M, disuelto en el tampón de aplicación. El
eluido se concentra nuevamente con la Ultrasette (300 kDa) y se
cromatografía a través de una superosa 6 prep. grade 16/50 con un
caudal de 1 ml/min en PBS, EDTA 2 mM. Las fracciones que contienen
laminina (determinadas con laminina P1 RIA-gnost®)
se reúnen, se concentran con la Ultrasette y se incuban a la TA con
5000 unidades de benzonasa (pureza II) durante >2 h. A
continuación se aplica la muestra sobre una
ConA-sefarosa 4B (2,6 x 10 cm) equilibrada con NaCl
0,15 M, Tris/HCl 0,05 M, pH 7,4. Con un caudal de 1 ml/min se puede
eluir de nuevo la laminina con metil
\alpha-D-manopiranosida 0,4 M en
el tampón de equilibrio. Para una purificación ulterior y con la
finalidad de un transvase a un tampón PBS + EDTA 2 mM, el eluido se
cromatografía con una Sephacril S500 superfina (2,6 x 140 cm, 1
ml/min).
Las etapas de lavado y la extracción tienen
lugar como se describe en el Ejemplo 1.
El extracto de EDTA que contiene laminina se
concentra con ayuda de una Ultrasette (300 kDa) hasta 25 ml y al
mismo tiempo se traspasa a tampón Tris/HCl 50 mM, MgCl_{2} 1 mM,
pH 8,0. A continuación se incuba a la temperatura ambiente con 5000
unidades de benzonasa durante 2 horas. La solución así tratada se
conduce después por una columna de afinidad anti MAK P1, a la cual
se habían acoplado covalentemente (según datos del fabricante) 4
anticuerpos monoclonales diferentes con propiedades de unión, tanto
a la laminina P1 como también a la laminina intacta. Los
anticuerpos monoclonales siguientes, caracterizados así por nosotros
para su diferenciación, se inmovilizaron en una
CNBr-Sepharosa 4B (6 ml) activada:
A24/2/2 (2,7 mg), A 27/2/1 (1,5 mg), A9/2/1 (0,6
mg) y A 28/1/1 (5,2 mg).
A la columna de afinidad (equilibrada en NaCl
0,1 M, Tris/HCl 0,05 M, EDTA 10 mM, Pefabloc 0,1 M, pH 7,4) se
aplican 25 ml de extracto de EDTA con un caudal de 1 ml/min y,
después, se eluye con glicina/HCl 0,1 M, pH 2,7. El valor del pH
del eluido se debe neutralizar inmediatamente con ayuda de una
solución Tris 0,8 M, y finalmente se trasvasa a un tampón
NH_{4}HCO_{3} 0,1 M + EDTA 2 mM con ayuda de un Macrosep 100
kDa.
Ratones de la cepa Balb/c se inmunizan
subcutáneamente con 20 \mug de laminina P1 obtenida según el
Ejemplo 1, en presencia de coadyuvante Freund completo. Al cabo de
4 semanas y al cabo de tres meses se refuerza la reacción inmune
por otra inyección subcutánea de 20 \mug de laminina P1 en
presencia de coadyuvante Freund incompleto. Tres días antes de la
fusión se refuerza la respuesta inmune por inyección intraperitoneal
de otros 100 \mug de laminina P1.
Para la fusión se sacrifican los animales y se
aíslan las células del bazo. En presencia de polietilenglicol se
fusionan las células del bazo con la línea celular P3X63AG8.653. de
mieloma. Por cultivo de la mezcla de fusión en el medio
hipoxantina-aminopterina-timidina
durante un espacio de tiempo de dos semanas se seleccionan las
células híbridas de bazo x P3X63AG8.653. Los clones celulares
obtenidos se sublonan múltiples veces para conseguir una línea
celular estable. Las colonias celulares que se originan se ensayan
en diferentes ensayos de unión inmunológicos en cuanto a la
producción de anticuerpos. Las líneas celulares originadas a partir
de las cuales se obtienen los anticuerpos A27/2/1, A9/2/1 y
A33/2/20, nominados así por los autores para su diferenciación, se
han depositado en la Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen GmbH (DSM), Merscheroder Weg 1b,
D-38124 Braunschweig, conforme a las prescripciones
del Tratado de Budapest el 12. de julio 1994 con los números de
depósito DSM ACC2181, DSM ACC2180 y DSM ACC2182.
En las Tablas 4 y 5 se representa una secuencia
cronológica del "screening".
La inmunización de ratones con laminina P1
conduce a un gran número de clones de hibridomas productores de
anticuerpos. Para encontrar ahora los clones que producen
anticuerpos monoclonales contra motivos estructurales que se
presentan en los correspondientes dominios de la molécula nativa de
laminina, se tuvo que llevar a cabo un "screening"
diferencial, en el cual con los métodos más variados de análisis
inmunológicos se puede detectar la unión de los anticuerpos
monoclonales a estructuras nativas o, respectivamente, naturales.
Los anticuerpos que tan sólo reaccionaban con la laminina P1
purificada fueron separados inmediatamente.
Para llevar a cabo los experimentos se tiene que
obtener laminina nativa por extracción de placenta humana (véanse
Ejemplos 2 y 3). Pero en este caso hay que tener cuidado de que por
una purificación demasiado exhaustiva de una forma de laminina
dominante, no se limite demasiado el espectro de las formas de
laminina posiblemente presentes. A partir de un trabajo de Brown
et al. (Brown, C.J.; Wiedemann, H.; Timpl, R. (1994) J. Cell
Sci. 107; 329 a 338) se desprende que a partir de la placenta se
pueden obtener al menos dos variantes de laminina diferentes
(laminina 2 y laminina 4).
Como extremadamente importante parecía ya en las
fases tempranas del proceso del "screening" ensayar la reacción
de los anticuerpos monoclonales con las estructuras de laminina
presentes en el suero. Para estos exámenes se tiene que aislar la
laminina sérica con ayuda de una columna Sephadex
S-400 (1,0 x 30 cm) a partir de aproximadamente 20
ml de suero de personas de ensayo sanas. Los antígenos del suero
eluyen de la columna en dos anchos picos, conteniendo el pico 1
estructuras antígenas con pesos moleculares > 600 kDa. El pico 2
contiene productos de degradación de la laminina sérica con pesos
moleculares en orden de magnitud del antígeno de inmunización
(aprox. 200 kDa) y, respectivamente, fragmentos menores. En el
transcurso del "screening" se seleccionan tan solo los
anticuerpos (clones), que junto a su propiedad de unirse a la
laminina humana purificada procedente de la placenta, manifiestan
también una buena reacción con la "laminina sérica",
preferentemente con la forma de alto peso molecular. Otro criterio
de selección es la capacidad se unirse al antígeno a la par con un
segundo anticuerpo monoclonal. En la Tabla 6 se demuestra, con
ayuda del ejemplo de algunos anticuerpos monoclonales de la misma
inmunización, cómo los elementos individuales del "screening"
(véanse Tablas 4 y 5) en su aspecto conjunto hacen posible una
caracterización y selección de los anticuerpos monoclonales
conformes a la invención. La Tabla 7 recopila los ensayos, que
apuntaban a analizar las propiedades de unión a la laminina sérica
en comparación con los estándares reconocidos.
0,2 ml de una solución con 40 \mug de los
anticuerpos monoclonales en tampón fosfato 0,05 M, pH 7,4, se
disponen previamente en un tubito para ensayo de poliestireno (12 x
55 mm) y se mezclan con solución de Na^{125}J de 100 MBq,
tamponada con tampón fosfato 0,5 M, pH 7,4. Después de la adición de
50 \mul de una solución acuosa de 20 \mug de cloramina T se
mezcla durante 1 minuto. A continuación, se finaliza la reacción de
yodación por adición de 50 \mul de una solución acuosa de 20
\mug de disulfito de sodio.
El Na^{125}J sin reaccionar se separa a
continuación de los anticuerpos monoclonales marcados con ^{125}J
por cromatografía en un intercambiador de aniones o en una
cromatografía de filtración en gel PD-10. Los
anticuerpos purificados, marcados con ^{125}J, tienen una
actividad específica de 5 a 12 mCi/mg (180 a 450 MBq/mg).
Para la fijación del anticuerpo monoclonal
A27/2/1 a los tubitos de pioliestireno (12 x 75 mm) se incuban en
cada tubito 0,5 ml del anticuerpo monoclonal A27/2/1 en una
concentración de 20 \mug/ml en PBS durante 20 horas a la TA.
Después de filtrar con succión la solución de anticuerpos se bloquea
con 1 ml de PBS/1% BSA durante 1 hora a la TA. Después de filtrar
son succión la solución, los tubitos se pueden guardar en la
nevera.
En los tubitos recubiertos se pipetean
respectivamente, a 17 hasta 25ºC, 50 \mul de muestra o 100 \mul
del estándar y se completan con 150 \mul de PBS/Tween. Después de
2 horas de incubación se filtran con succión y se lavan 2 veces. A
continuación se añaden 200 \mul de ^{125}J A9/2/1 y se incuba de
nuevo durante 2 horas a la TA. Después de filtrar con succión y
después de dos etapas de lavado se puede determinar en el
contador-\gamma la actividad ligada.
En los tubitos recubiertos se pipetean
respectivamente, a 17 hasta 25ºC, 200 \mul de muestra o de
estándar. A continuación se añaden 200 \mul de marcador y
se incuba durante 4 horas a la TA. Después de filtrar con succión y
de dos etapas de lavado se puede determinar en el
contador-\gamma la actividad ligada.
Como estándar se emplea laminina P1 del kit de
RIA-gnost® Lam-P1 (Behringwerke AG,
Marburg). Con ello, los dos ensayos tienen una magnitud de
referencia común y se pueden comparar bien entre sí y con la Lamp P1
RIA-gnost®.
La laminina P1, la laminina humana (carga II),
así como diferentes sueros se fraccionan según el peso molecular
con ayuda de una columna de Sefarosa S-400. Después
se examina la distribución de las magnitudes de antigeneidad de la
laminina con ayuda de los procedimientos de ensayo
inmunoradiométricos. En el caso de un grupo de suero normal los
resultados se comparan con la Lam P1 RIA-gnost®. En
las Figuras 2 a 4 se muestran los cromatogramas de los estándares y
de un grupo de suero normal.
- Dimensión de la columna:
- 1,0 x 30 cm
- Tampón de elución:
- PBS + Tween-20 al 0,04% + azid-Na al 0,02%
- Caudal:
- 0,2 ml/min
La calibración de la columna se efectuó con los
marcadores de pesos moleculares tiroglobulina (670 kDa),
inmunoglobulina (156 kDa), ovalbúmina (44 kDa) y mioglobina (17
kDa).
En las Figuras 5 a 7 se representan sueros
individuales de pacientes con patología hepática alcohólica, PBC
(cirrosis biliar primaria) y CAH (hepatitis crónica activa).
La Figura 8 muestra un Semidry Blot (semiseco)
según la prescripción estándar con un sistema tampón discontinuo
después de la separación de aproximadamente 1 \mug de laminina
carga II (Ejemplo 3) por electroforesis en gel SDS (gel acabado
Novex 4 a 12% de poliacrilamida) bajo condiciones reductoras (+ SH)
y, respectivamente, no reductoras (-SH). La membrana de
nitrocelulosa se cortó en forma de tiras y las tiras individuales se
incubaron con los anticuerpos monoclonales A9/2/1, A27/2/1 y
A33/2/20. Como segundo anticuerpo se utilizó fosfatasa alcalina
anti-ratón (Sigma A 5153).
Es evidente que con los ensayos conformes a la
invención se obtienen motivos de distribución de antígeno típicos y
en cada caso característicos. Esto es un claro indicio que los dos
procedimientos de determinación inmunológicos reconocen
específicamente diferentes formas de laminina.
Además de esto, se puede ver que los anticuerpos
monoclonales no presentan reacción alguna con las estructuras
desnaturalizadas formadas por reducción. Por consiguiente, los
anticuerpos monoclonales conformes a la presente invención
reconocen específicamente los motivos estructurales plegados de
forma nativa de los dominios de la laminina-P1.
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Para poder estimar someramente qué estructuras
de laminina son reconocidas por los dos ensayos, de examinaron
diferentes preparaciones de laminina. La siguiente tabla no permite
ciertamente clasificaciones unívocas, pero indica claramente que
los dos ensayos enlazan determinadas variantes con prioridades
diferentes (afinidades).
La pregunta de cual de las isoformas de la
laminina puede ser reconocida por los métodos de ensayo descritos
no se puede aclarar mediante los datos mostrados. Una solución de
este problema sólo sería posible si varias isoformas (en su forma
nativa) estuvieran presentes de manera purificada.
\vskip1.000000\baselineskip
La Tabla 8 muestra que en los dos nuevos ensayos
de laminina no son detectables reacciones cruzadas dignas de
mención en relación con proteínas séricas y proteínas del tejido
conjuntivo humano, seleccionadas. Igualmente, tampoco se pudo
detectar ninguna reacción cruzada en relación con laminina/nidógeno
y laminina P1 del tumor EHS del ratón.
Se analizaron diferentes colectivos séricos
conforme a las prescripciones del Ejemplo 8, con ayuda de los
ensayos inmunoradiométricos conformes a la invención. Los resultados
de las determinaciones cuantitativas se recopilan en las Tablas 9 a
17. Las dos variantes de análisis diagnostican en las indicaciones
de enfermedades hepáticas alcohólicas, PBC (cirrosis biliar
primaria), CAH (hepatitis crónica activa), cirrosis hepática
descompensada, cirrosis de orígen desconocido, así como en sueros
tumorales niveles incrementados de laminina, y en la indicación de
diabetes se encuentran contenidos de laminina claramente
disminuidos. Con ayuda de las correlaciones de los ensayos
conformes a la invención con respecto a la Laminina P1
RIA-gnost®, indicadas en las Tablas, se ve
claramente que los dos procedimientos inmunológicos se diferencian
entre sí y que los dos ensayos discrepan del
RIA-gnost® en cuanto a su dictamen diagnóstico. Con
ello se confirma el efecto descrito en el Ejemplo 9 - una
diferencia en el motivo de distribución del antígeno.
- EDTA:
- Ácido etilendiamino-tetraacético
- NEM:
- N-etilmaleinimida
- PBS:
- Solución salina tamponada con fosfato (solución tampón PM 16, Serva)
- PCMB:
- Sal sódica del ácido 4-hidroximercurio-benzoico
- PMSF:
- Fluoruro de fenilmetilsulfonilo
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Productos químicos, enzimas
Colagenasa, Worthington (CLSPA)
Pepsina, Boehringer Mannheim (Nr. 108057)
Benzonasa, Merck Darmstadt (Nr. 1654)
Todos los productos químicos utilizados se
especificaban con "p.A." (para análisis); se adquirieron de las
razones sociales Riedel d.H., y Merck.
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Medios de separación
Q-sefarose® FF, Pharmacia
Superose® 6 (16/50), Pharmacia
Ultrasette® (300 kDa), Filtron
Sefarose® activada con BrCN, Pharmacia
ConA-Sepharose® 4B,
Pharmacia
Sephadex® S-400, Pharmacia
\vskip1.000000\baselineskip
Aclaraciones en cuanto a las Tablas 1 a 3:
Con el sistema BIAcore® de la razón social
Pharmacia Biosensor se pueden seguir on-line las
interacciones bioespecíficas. El principio de la medición se basa
en un fenómeno óptico (surface plasmon resonance), el cual sufre la
influencia de la masa unida a una película de oro. Expresado de
manera simplificada, en el caso de este sistema se trata de una
cromatografía de afinidad miniaturizada sobre la superficie de un
sensor de oro. La cantidad de un ligando específico unido se puede
representar fotográficamente en forma de una señal de resonancia
(Chaiken, I.; Rose, S.; Karlsson, R. (1992) Anal. Biochem. 201; 197
a 201. Karlsson, R. Altschuh, D.; van Regenmortel, M.H.V. (1992)
Measurement of antibody affinity, en: Structure of Antigens; CRC
Press (van Regenmortel, ed); Boca Raton, Fl.; 127 a 148).
La laminina P1 se inmovilizó sobre un chip
sensor conforme a las instrucciones del manual del usuario con una
concentración de 200 \mug/ml en acetato-Na 10 mM,
pH = 4,0. Para la regeneración de la matriz de afinidad de la
Lam-P1 se puede llevar a cabo un impulso doble con 4
\mul de HCl 100 mM. La capa de laminina P1 es extremadamente
estable y se puede utilizar durante 2 meses (> 300 análisis
individuales) sin pérdida de calidad.
Para el "screening" en busca de potentes
anticuerpos se condujeron directamente 4 a 25 \mul del líquido
sobrenadante del cultivo de las respectivas colonias celulares sobre
la matriz de afinidad, al cabo de 1 a 5 minutos se puede reconocer
la unión (fuerza relativa) en el RU y en la constancia de la señal.
Esto permite una selección rápida y al mismo tiempo de fuerte
expresión de los clones interesantes. Inyecciones sucesivas con
diferentes líquidos sobrenadantes de cultivos sin regeneración
intermedia hacen posible el "screening" de los anticuerpos que
se pueden unir al mismo tiempo a diferentes epítopos del
antígeno.
Los líquidos sobrenadantes de hibridomas se
condujeron sobre la capa de laminina P1 del "chip" de BIAcore®
tal como se ha descrito anteriormente. Tras la unión del anticuerpo
(caudal de la muestra) se inyectaron después secuencialmente en
cada caso 4 \mul de anticuerpos de las subclases específicas anti
ratón. Un incremento de la señal es nuevamente la expresión de una
unión recíproca. Con ello, en el espacio de 5 minutos es posible
una clasificación unívoca de la subclase.
Para una unión selectiva y reversible de
anticuerpos de ratón se puede inmovilizar sobre el chip sensor del
BIAcore® un anticuerpo especial (Fc-específico Rabbit
anti mouse (conejo antiratón); RAM-Fc)
con ayuda de un método estándar. Puesto que la señal del sistema de
medida depende directamente de la masa del ligando unido, es
posible llevar a cabo determinaciones de concentración, sobre todo
cuando el material estándar y la muestra que se ha de analizar
tienen pesos moleculares iguales. La determinación de la
concentración de una proteína específica es incluso posible en
mezclas complejas, puesto que como en el ejemplo anterior por la
especificidad de la unión sólo se capta en el chip sensor la masa
del ligando deseado.
Con ayuda de un anticuerpo monoclonal bien
caracterizado (MAK 238), existente en el laboratorio se creó una
curva estándar para la determinación de la cantidad de anticuerpos
presente en los líquidos sobrenadantes del cultivo (= rendimiento
de la síntesis del clon). A través de la curva estándar las señales
promediadas a partir de determinaciones dobles de muestras
desconocidas (sobrenadantes de cultivos) se pueden convertir por
cálculo en concentraciones (\mug/ml de anticuerpos monoclonales).
Para la elaboración de esta serie de mediciones tan complejas y
largas, el sistema BIAcore, se sirve de un programa de randomización
de manera que se niegan las fuentes de fallos que se podrían
producir por la solicitación de la matriz de afinidad o por los
diferentes tiempos de permanencia.
En virtud del tan solo escaso enriquecimiento de
la laminina humana en la preparación (laminin carga I) no se pudo
llevar a cabo ninguna inmovilización directa (como, por ejemplo, en
el caso de Lam-P1). Por lo tanto, se tuvo que
construir una matriz de afinidad que estuviera en condiciones de
pescar la laminina a partir de la solución heterogénea.
Sobre la inmovilizada RAM-Fc
(véase más arriba) se ligaron anticuerpos específicos de los
sobrenadantes de los cultivos y, con ello, se crearon matrices de
afinidad (no covalentes) para la laminina humana. Sobre estas capas
específicas se pudo conducir la muestra de laminina. En el caso de
un reconocimiento, se podía observar un nuevo incremento de la
señal.
Con el sistema BIAcore® es posible determinar
cuantitativamente la unión de ligandos (Chaiken, I.; Rosé, S.;
Karlsson, R. (1992) Anal. Biochem. 201; 197 a 201. Karlsson, R.
Altschuh, D.; van Regenmortel, M.H.V. (1992) Measurement of
antibody affinity, en: Structure of Antigens; CRC Press (van
Regenmortel, ed); Boca Raton, Fl.; 127 a 148), puesto que la fase
de asociación, el ajuste del equilibrio de unión y la fase de
disociación se pueden representar como procesos separados en el
tiempo. El "Software" del instrumento hace posible una
conversión relativamente sencilla de los datos de la medición en los
correspondientes cálculos de tablas.
Para la determinación de las constantes de unión
se tiene que conducir (por ejemplo) un anticuerpo específico (una
purificación previa no es absolutamente necesaria) en varias
diluciones sobre la matriz de afinidad. Durante la fase de
asociación el programa proporciona en intervalos definidos por el
usuario los valores de RU y la pendiente actual de la curva, de
manera que es posible un trazado del slope/R. La constante de
asociación k_{as} se puede determinar si la pendiente de esta
función para todas las concentraciones analizadas se relaciona con
las actuales concentraciones presentes (en nM). En el experimento,
la fase de disociación se prolonga extremadamente en el caso de la
concentración máxima de anticuerpos. A partir del dato InR1/Rn
frente al tiempo se puede obtener la constante de disociación
k_{dis}. La constante de equilibrio KD se obtiene a partir de la
fórmula k_{as}/k_{dis}.
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\vskip1.000000\baselineskip
A partir de las tres tablas se deduce, que los
tres anticuerpos monoclonales posee unas propiedades de unión muy
buenas, sobre todo que los anticuerpos se caracterizan por una unión
muy fuerte al antígeno inmovilizado. En el caso de la capa de
laminina, por ejemplo, no se puede detectar una disociación en
ninguno de los anticuerpos durante el espacio de tiempo del
análisis (30 min). No obstante, si se conduce antígeno disuelto, por
ejemplo sobre una capa de A27/2/1, entonces la asociación tiene
lugar con una cinética rápida invariable (kas1,2x10^{5}/Ms). Pero
entonces se anexiona una clara fase de disociación, de manera que se
puede determinar una constante de equilibrio de aproximadamente
1x10^{9} para la unión de la laminina. De manera interesante, las
constantes de unión a la Lam P1 se diferencian en el factor 1000 en
función de que la LamP1 se presente inmovilizada (localmente en
alta concentración) o que tenga que ser ligada a partir de la
solución. Este efecto podría ser la base para el reconocimiento
exclusivo del pico de alto peso molecular (laminina sérica intacta)
en el suero humano (véase más abajo).
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- Anticuerpos estratificados
- = A27/2/1
- Segundo anticuerpo
- = A9/2/1 B2
- \quad
- = A33/2/20
- \quad
- = IgG policlonal anti LamP1
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Determinación de la distribución del antígeno en
sueros normales
Determinación de los contenidos normales
Ensayos en cuanto a reactividades cruzadas
Aplicación en distintas indicaciones
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Se examinaron los sueros de 80 diabéticos
asignados de forma estacionaria (32% tipo l, 68% tipo II) con una
duración de la diabetes de 11-14 años (Stracke, H.;
Wiek, K.; Günzler, V.; Federlin, K. (1993) Die Medizinische Welt
44; 383 a 385), en los cuales se diagnosticó quiropatía (36%),
retinopatía (48%), neuropatía (66%) y nefropatía (39%).
Claims (15)
1. Anticuerpo monoclonal con especificidad para
proteínas de la familia de las lamininas y para el fragmento de la
laminina P1 que se puede preparar a partir de placenta humana por
digestión con pepsina, caracterizado porque el anticuerpo
monoclonal se une preferentemente a las estructuras plegadas de
forma nativa de los dominios de la laminin P1 de la laminina, la
afinidad del anticuerpo a la laminina nativa, intacta, es
aproximadamente igual a la afinidad del anticuerpo al fragmento de
la laminina P1, y el anticuerpo presenta las propiedades de un
anticuerpo monoclonal que es producido por la línea celular DSM
ACC2181, DSM ACC2180 o DSM ACC2182 del hibridoma.
2. Anticuerpo monoclonal según la reivindicación
1, caracterizado porque el anticuerpo se forma por un
hibridoma que se origina por la fusión de células de una línea
celular de mieloma y linfocitos de un animal vertebrado, no humano,
inmunizado previamente con laminina P1, y que a continuación de esto
fue seleccionado, porque el anticuerpo formado, junto a una buena
capacidad de unión a la laminina de placenta humana purificada,
presenta también una buena reacción con la forma de elevado peso
molecular de la laminina obtenida a partir de suero humano.
3. Anticuerpo monoclonal según la reivindicación
1 o 2, caracterizado por la capacidad de unirse, a pares,
con otro anticuerpo conforme a la reivindicación 1 o 2 al
antígeno.
4. Anticuerpo monoclonal según una de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque se le clasifica
en la subclase lgG 2a.
5. Anticuerpo monoclonal según una de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque se le clasifica
en la subclase lgG 1.
6. Línea celular de hibridoma, la cual produce
un anticuerpo conforme a una de las reivindicaciones 1 a 3, que se
puede obtener por la fusión de células de una línea celular de
mieloma y linfocitos de un animal vertebrado, no humano, inmunizado
previamente con laminina P1 y subsiguiente selección de los híbridos
después de que el anticuerpo producido por el híbrido presente
también junto a una buena propiedad de unión a la laminina de
placenta humana purificada, una buena reacción con la forma de
elevado peso molecular de la laminina obtenida a partir de suero
humano.
7. Línea celular de hibridoma según la
reivindicación 6, caracterizada porque los linfocitos fueron
extraídos de ratones de la cepa balb/c inmunizados con laminina P1,
y la línea celular de mieloma es la línea celular P3X63AG8.653 del
mieloma de ratón.
8. La línea celular DSM ACC2181 del
hibridoma.
9. La línea celular DSM ACC2180 del
hibridoma.
10. La línea celular DSM ACC2182 del
hibridoma.
11 Procedimiento para la preparación de un
anticuerpo monoclonal conforme a una de las reivindicaciones 1 a 5,
caracterizado porque
- a)
- animales vertebrados, no humanos, se inmunizan con el fragmento de laminina P1, el cual se puede preparar a partir de placenta humana por digestión con pepsina,
- b)
- se obtienen linfocitos de los animales vertebrados inmunizados y se fusionan con células de mieloma,
- c)
- se seleccionan los híbridos en cuanto a la presencia de un anticuerpo con las propiedades citadas en las reivindicaciones 1 a 3 y se clonan, y
- d)
- a partir de estos clones se obtiene el anticuerpo.
12. Procedimiento según la reivindicación 11,
caracterizado porque para la ejecución de la etapa d) del
procedimiento en la reivindicación 11 se emplean las líneas
celulares DSM ACC2181, DSM ACC2180 o DSM ACC2182 de hibridoma.
13. Procedimiento para la determinación
inmunológica de laminina nativa utilizando un anticuerpo
estratificado fijado adhesiva o covalentemente a un material de
soporte y un segundo anticuerpo marcado, el cual reconoce el
antígeno unido al anticuerpo estratificado, caracterizado
porque el anticuerpo estratificado es una anticuerpo monoclonal
conforme a una de las reivindicaciones 1 a 5.
14. Procedimiento para la determinación
inmunológica de laminina nativa utilizando un anticuerpo
estratificado fijado adhesiva o covalentemente a un material de
soporte y un segundo anticuerpo marcado, el cual reconoce el
antígeno unido al anticuerpo estratificado, caracterizado
porque el segundo anticuerpo es una anticuerpo monoclonal conforme
a una de las reivindicaciones 1 a 5.
15. Procedimiento según la reivindicación 14,
caracterizado porque el anticuerpo estratificado es un
anticuerpo monoclonal conforme a una de las reivindicaciones 1 a
5.
16. Procedimiento según la reivindicación 14 o
15, caracterizado porque el anticuerpo estratificado es un
anticuerpo monoclonal producido por la línea celular DSM ACC2181 del
hibridoma.
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