ES2216518T3 - Anticuerpo monocional y ensayo para detectar el propeptido n-terminal del procolageno iii (piiinp). - Google Patents
Anticuerpo monocional y ensayo para detectar el propeptido n-terminal del procolageno iii (piiinp).Info
- Publication number
- ES2216518T3 ES2216518T3 ES99926319T ES99926319T ES2216518T3 ES 2216518 T3 ES2216518 T3 ES 2216518T3 ES 99926319 T ES99926319 T ES 99926319T ES 99926319 T ES99926319 T ES 99926319T ES 2216518 T3 ES2216518 T3 ES 2216518T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- piiinp
- baselineskip
- antibody
- iii
- antibodies
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 108010034596 procollagen Type III-N-terminal peptide Proteins 0.000 title claims abstract description 179
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title description 21
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 17
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims description 13
- 101100328886 Caenorhabditis elegans col-2 gene Proteins 0.000 claims description 11
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 claims description 7
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 claims description 7
- KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-proline Natural products NCC(=O)N1CCCC1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 108010060199 cysteinylproline Proteins 0.000 claims description 2
- 108010029020 prolylglycine Proteins 0.000 claims description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 abstract description 17
- 108010050808 Procollagen Proteins 0.000 abstract description 14
- 239000012634 fragment Substances 0.000 abstract description 12
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 abstract description 9
- 230000007017 scission Effects 0.000 abstract description 9
- 230000028023 exocytosis Effects 0.000 abstract description 3
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 40
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 37
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 37
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 37
- 238000000034 method Methods 0.000 description 32
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 28
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 24
- 101100328884 Caenorhabditis elegans sqt-3 gene Proteins 0.000 description 20
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 19
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 17
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 16
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 15
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 15
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 13
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 12
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 12
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 12
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 12
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 12
- 241000894007 species Species 0.000 description 12
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 11
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 11
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 10
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 10
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 9
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 9
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 8
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 8
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 7
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 7
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 7
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 6
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 6
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 6
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 5
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 5
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 5
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 5
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 230000003176 fibrotic effect Effects 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 4
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 4
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 4
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 4
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 230000003393 splenic effect Effects 0.000 description 4
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 4
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 3
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- DSWOTZCVCBEPOU-IUCAKERBSA-N Met-Arg-Gly Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CCCNC(N)=N DSWOTZCVCBEPOU-IUCAKERBSA-N 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 3
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 3
- IOVBCLGAJJXOHK-SRVKXCTJSA-N Ser-His-His Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CO)N)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(O)=O)C1=CN=CN1 IOVBCLGAJJXOHK-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 3
- 108010069926 arginyl-glycyl-serine Proteins 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 208000036449 fibrotic liver disease Diseases 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 3
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 3
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 3
- 230000037390 scarring Effects 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 3
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 3
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-M 4-nitrophenolate Chemical compound [O-]C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- WCBVQNZTOKJWJS-ACZMJKKPSA-N Ala-Cys-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O WCBVQNZTOKJWJS-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 2
- 208000008439 Biliary Liver Cirrhosis Diseases 0.000 description 2
- 208000032544 Cicatrix Diseases 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 2
- NCWOMXABNYEPLY-NRPADANISA-N Glu-Ala-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O NCWOMXABNYEPLY-NRPADANISA-N 0.000 description 2
- CQMFNTVQVLQRLT-JHEQGTHGSA-N Gly-Thr-Gln Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O CQMFNTVQVLQRLT-JHEQGTHGSA-N 0.000 description 2
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 2
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 2
- 206010058031 Joint adhesion Diseases 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 210000000709 aorta Anatomy 0.000 description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 2
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 2
- 239000013628 high molecular weight specie Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 2
- 208000005069 pulmonary fibrosis Diseases 0.000 description 2
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000037387 scars Effects 0.000 description 2
- 108010026333 seryl-proline Proteins 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000022309 Alcoholic Liver disease Diseases 0.000 description 1
- 206010002329 Aneurysm Diseases 0.000 description 1
- 108090000672 Annexin A5 Proteins 0.000 description 1
- QTAIIXQCOPUNBQ-QXEWZRGKSA-N Arg-Val-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O QTAIIXQCOPUNBQ-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 1
- DPWDPEVGACCWTC-SRVKXCTJSA-N Asn-Tyr-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DPWDPEVGACCWTC-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- QTIZKMMLNUMHHU-DCAQKATOSA-N Asp-Pro-His Chemical compound C1C[C@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)O)N)C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O QTIZKMMLNUMHHU-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010004659 Biliary cirrhosis Diseases 0.000 description 1
- 208000033222 Biliary cirrhosis primary Diseases 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 101100275473 Caenorhabditis elegans ctc-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000002177 Cataract Diseases 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 206010008909 Chronic Hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 208000000419 Chronic Hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 208000006154 Chronic hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- 206010009208 Cirrhosis alcoholic Diseases 0.000 description 1
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 1
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 description 1
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 1
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 1
- 102000001187 Collagen Type III Human genes 0.000 description 1
- 108010069502 Collagen Type III Proteins 0.000 description 1
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 1
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 208000032131 Diabetic Neuropathies Diseases 0.000 description 1
- 206010013801 Duchenne Muscular Dystrophy Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241001596967 Escherichia coli M15 Species 0.000 description 1
- 206010053717 Fibrous histiocytoma Diseases 0.000 description 1
- 208000010412 Glaucoma Diseases 0.000 description 1
- MGJMFSBEMSNYJL-AVGNSLFASA-N Gln-Asn-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O MGJMFSBEMSNYJL-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- 206010018364 Glomerulonephritis Diseases 0.000 description 1
- GTFYQOVVVJASOA-ACZMJKKPSA-N Glu-Ser-Cys Chemical compound C(CC(=O)O)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N GTFYQOVVVJASOA-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LUJVWKKYHSLULQ-ZKWXMUAHSA-N Gly-Ile-Cys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)CN LUJVWKKYHSLULQ-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- OOCFXNOVSLSHAB-IUCAKERBSA-N Gly-Pro-Pro Chemical compound NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(O)=O)CCC1 OOCFXNOVSLSHAB-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- ABPRMMYHROQBLY-NKWVEPMBSA-N Gly-Ser-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CO)NC(=O)CN)C(=O)O ABPRMMYHROQBLY-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 1
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- 206010019728 Hepatitis alcoholic Diseases 0.000 description 1
- 206010019755 Hepatitis chronic active Diseases 0.000 description 1
- LYCVKHSJGDMDLM-LURJTMIESA-N His-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 LYCVKHSJGDMDLM-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- JIUYRPFQJJRSJB-QWRGUYRKSA-N His-His-Gly Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)NCC(O)=O)C1=CN=CN1 JIUYRPFQJJRSJB-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- CNHSMSFYVARZLI-YJRXYDGGSA-N His-His-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O CNHSMSFYVARZLI-YJRXYDGGSA-N 0.000 description 1
- 102000018251 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 208000018121 Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase deficiency Diseases 0.000 description 1
- LDRALPZEVHVXEK-KBIXCLLPSA-N Ile-Cys-Glu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N LDRALPZEVHVXEK-KBIXCLLPSA-N 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 208000002260 Keloid Diseases 0.000 description 1
- 208000009625 Lesch-Nyhan syndrome Diseases 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 208000000185 Localized scleroderma Diseases 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 208000037848 Metastatic bone disease Diseases 0.000 description 1
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 description 1
- 206010062575 Muscle contracture Diseases 0.000 description 1
- 206010048654 Muscle fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 206010034238 Pelvic adhesions Diseases 0.000 description 1
- 101710172876 Peroxidase B Proteins 0.000 description 1
- 241000243820 Polychaeta Species 0.000 description 1
- 208000012654 Primary biliary cholangitis Diseases 0.000 description 1
- DCHQYSOGURGJST-FJXKBIBVSA-N Pro-Thr-Gly Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O DCHQYSOGURGJST-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 101710118538 Protease Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- RFBKULCUBJAQFT-BIIVOSGPSA-N Ser-Cys-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CO)N)C(=O)O RFBKULCUBJAQFT-BIIVOSGPSA-N 0.000 description 1
- ANOQEBQWIAYIMV-AEJSXWLSSA-N Ser-Val-Pro Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N ANOQEBQWIAYIMV-AEJSXWLSSA-N 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000009594 Systemic Scleroderma Diseases 0.000 description 1
- 206010042953 Systemic sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- XPNSAQMEAVSQRD-FBCQKBJTSA-N Thr-Gly-Gly Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O XPNSAQMEAVSQRD-FBCQKBJTSA-N 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 description 1
- 230000009102 absorption Effects 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 206010001053 acute respiratory failure Diseases 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 208000002353 alcoholic hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 208000010002 alcoholic liver cirrhosis Diseases 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 208000001119 benign fibrous histiocytoma Diseases 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 230000004097 bone metabolism Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 230000009787 cardiac fibrosis Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000036569 collagen breakdown Effects 0.000 description 1
- 230000011382 collagen catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 208000006111 contracture Diseases 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 201000010305 cutaneous fibrous histiocytoma Diseases 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003748 differential diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 150000002019 disulfides Chemical class 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009144 enzymatic modification Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 230000009795 fibrotic process Effects 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- -1 for example Substances 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 108010010147 glycylglutamine Proteins 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000002650 habitual effect Effects 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 208000010710 hepatitis C virus infection Diseases 0.000 description 1
- 108010040030 histidinoalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010036413 histidylglycine Proteins 0.000 description 1
- 108010028295 histidylhistidine Proteins 0.000 description 1
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001969 hypertrophic effect Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 210000001117 keloid Anatomy 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 208000018191 liver inflammation Diseases 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000003228 microsomal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- 206010028537 myelofibrosis Diseases 0.000 description 1
- 210000004898 n-terminal fragment Anatomy 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 210000002990 parathyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000004738 parenchymal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 235000020030 perry Nutrition 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 108010029843 preprocollagen Proteins 0.000 description 1
- 108010004914 prolylarginine Proteins 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 239000012474 protein marker Substances 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 1
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 201000002793 renal fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 201000004193 respiratory failure Diseases 0.000 description 1
- 208000037803 restenosis Diseases 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 201000004409 schistosomiasis Diseases 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000012536 storage buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Anticuerpo monoclonal dirigido contra un epítopo dentro de la mayor parte de los 30 aminoácidos N-terminales del PIIINP humano.
Description
Anticuerpo monocional y ensayo para detectar el
propéptido N-terminal del procolágeno III
(PIIINP).
La molécula de propéptido
N-terminal del procolágeno (III) (PIIINP) es un
fragmento proteolítico que emana de la escisión específica del
procolágeno (III) mediante la N-proteinasa después
de exocitosis. La presente invención se refiere a los anticuerpos
que se unen a este extremo N-terminal y a un ensayo
que usa estos anticuerpos.
Los colágenos I y III se sintetizan en forma de
prepropéptidos y se modifican ampliamente
post-traduccionalmente. Entre las modificaciones
intracelulares específicas están las glicosilaciones, las
reacciones de hidroxilación enzimática que implican lisina y
prolina en sus posiciones 3- y 4-, y la eliminación proteolítica
específica del péptido guía. Los propéptidos modificados
espontáneamente se ensamblan en homotrímeros
[\alpha_{1}(III)]_{3} en el caso del colágeno (III), y
la mayoría de las veces heterotrímeros
[\alpha_{1}(I)]_{2}\alpha_{2} (I) así como - en un
menor grado - homodímeros [\alpha_{1}(I)]_{3} en el
caso del colágeno (I) en los compartimentos microsomales. Después
de la exocitosis, el propéptido se escinde primero en el extremo C
del colágeno naciente y después en el extremo N mediante un
conjunto de endoproteasas específicas. De manera notable, los
procolágenos I y II se escinden mediante una actividad proteinasa
distinta de la actividad N-proteinasa específica
para el procolágeno (III) (Peltonen y col., 1985). Recientemente se
ha sugerido un gen candidato para una N-proteinasa
específica del colágeno (III) (Scout y col., 1996). Está disponible
una secuencia supuesta de cDNA para la N-proteinasa
del procolágeno (I) bovino (Colige y col., 1996).
El PIIINP se presenta en forma de un trímero
constituido por tres subunidades monoméricas del PIIINP idénticas
que se unen mediante puentes intermoleculares disulfuro. El PIIINP a
su vez se divide estructuralmente en tres dominios. La mayor parte
del dominio localizado N-terminalmente (Col1) consta
de una estructura globular unida mediante varios puentes de cistina
intramoleculares. El Col3 es el dominio intermedio y posee una
estructura de tipo colágeno caracterizada por residuos Gly y Pro
periódicos. Este dominio se acopla en una estructura de tipo
colágeno de triple hélice característica que caracteriza el dominio
Col3. El dominio Col2 comprende las partes de la región
telopeptiídica del procolágeno proximal al sitio de escisión por
N-proteinasa. Las tres subunidades del PIIINP
monoméricas se acoplan en forma de hebras de péptidos paralelas en
este dominio. Característicamente, el dominio Col2 contiene dos
residuos cisteína que están ambos implicados en la formación del
puente disulfuro intermolecular y que son los únicos responsables
de la estructura trimérica del PIIINP (Kühn y col., 1982).
La secuencia de cDNA entera que codifica el
PIIINP se clonó mediante PCR a partir de una genoteca de cDNA de
aorta humana (cDNA de clon rápido, Clontech, Estados Unidos),
verificada la secuencia y subclonada en el vector "fagomido"
(un fago cuyo genoma contiene un plásmido que se puede escindir
mediante coinfección del hospedador con un fago auxiliar)
bacteriano pBluescript SK- (Stratagene, Estados Unidos). La
información de la secuencia se ha obtenido a partir del programa
DNASTAR (acceso nº X14420 del banco de genes; Ala - Kokko y col.,
1989, figura 1).
El colágeno (III) es el colágeno característico
de los órganos parenquimales y es el segundo más frecuente en los
tejido fibróticos. Aunque el colágeno (I) es el colágeno más
frecuente formador de cicatrices y aunque el colágeno (I) se regula
hacia arriba incluso más drásticamente en la fibrosis hepática que
el colágeno (III) se produce en grandes cantidades en el hueso
(Uitto y col., 1986) y por lo tanto es de valor limitado en la
diagnosis diferencial de los procesos fibróticos en los órganos
parenquimales. Las determinaciones en suero del propéptido
C-terminal del procolágeno (I) se han usado por lo
tanto principalmente para el control de los trastornos del
metabolismo óseo (Eriksen y col., 1993).
Los niveles en suero del propéptido
N-terminal del procolágeno (III) (PIIINP) se
establecen ya como un parámetro en suero en los pacientes con
fibrosis hepática para estimar la cantidad de deposición de
colágeno en este órgano (por ejemplo, Plebani y Burlina, 1991).
Sin embargo, los niveles elevados del PIIINP
circulante se pueden también originar de la escisión del colágeno
(III) depositado y por lo tanto refleja fibrolisis en lugar de
fibrogénesis (Schuppan, 1991). Esto se debe al hecho que el PIIINP
está presente sobre la superficie del colágeno (III) después de su
deposición en la matriz extracelular (Fleischmajer y col., 1986).
Las masas moleculares de las especies del PIIINP que emanan de la
fibrolisis se observa que es distinta de las especies generadas en
la fibrogénesis e incluyen las especies de masas moleculares más
altas así como más bajas que circulan en el plasma (Niemalä y col.,
1982). Aunque las determinaciones en suero del PIIINP se establecen
bastante bien para el control de la fibrosis hepática en diversas
enfermedades subyacentes tales como cirrosis biliar primaria (por
ejemplo, Davis y Madri, 1987), hepatitis crónica B y C (Murawaki y
col., 1995, Jeffers y col., 1996), y enfermedad alcohólica hepática
(Savolainen y col, 1984), son de poca ayuda en el establecimiento
de diagnosis. Esto es debido a dos características diferentes de las
determinaciones en suero del PIIINP: 1. los niveles del PIIINP
circulante parecen correlacionarse con la fase aguda de la
inflamación hepática cuando la deposición excesiva de colágeno no es
todavía visible histológicamente y de hecho puede que nunca se
llegue a manifestar (Savolainen y col., 1984, Hansen y col., 1995)
2. el aumento de los niveles del PIIINP circulante en los
escenarios clínicos pueden indicar fibroliis en vez de fibrogénesis
debido a que el PIIINP no escindido está presente sobre la
superficie de las fibras de colágeno (III) y se libera en el
proceso de la degradación del colágeno (Davis y Madri, 1987).
El valor diagnóstico de las determinaciones del
PIIINP se ha debatido ampliamente. A partir de los experimentos de
tamices moleculares con los sueros de pacientes se ha mostrado que
los ensayos de sueros que reconocen el PIIINP detectan tres formas
diferentes de pesos moleculares. La fracción que contiene especies
de pesos moleculares inferiores consta de dominios monoméricos del
Col1. La cantidad absoluta de este dominio circulante del Col1 es
relativamente constante en voluntarios sanos así como en pacientes
con hepatitis activa crónica y hepatitis alcohólica aguda. Además
del fragmento del dominio Col1 circulante, los anticuerpos también
reconocen especies del PIIINP mayores que las triméricas en los
sueros. No se conoce la naturaleza molecular exacta de estas
especies de alto peso molecular. La proporción relativa de las
especies de alto peso molecular parece variar dependiendo del tipo
de enfermedad hepática. El PIIINP trimérico que emana de la
síntesis del colágeno y se escinde mediante la
N-proteasa es habitualmente la especie más
abundante del PIIINP pero su proporción relativa no es constante
(Niemelä y col., 1982).
Un problema adicional con los niveles en suero
del PIIINP no diferenciados es la cuestión no resuelta de si el
PIIINP se correlaciona con la neosíntesis del colágeno (III) en
curso o si se correlaciona mejor con la deposición de colágeno
aparente en el hígado. Aunque algunos investigadores han publicado
que los niveles del PIIINP se correlacionan mejor con el mRNA del
colágeno (III) (Hayasaka y col., 1991) otros estudios no dan
soporte a estas observaciones.
Un número de patentes han tratado el problema de
las determinaciones del PIIINP a partir de los sueros de los
pacientes y con los procedimientos para mejorar la validez del
diagnóstico de estas determinaciones. Para las mediciones del PIIINP
en sueros de pacientes con enfermedades hepáticas se han descrito
varios radioinmunoensayos diferentes del PIIINP. El documento EP
004940A1 de Timpl y col., 1979, describe un radioinmunoensayo de
inhibición de no equilibrio basándose en un sistema antígeno -
anticuerpo de bovino que muestra reactividad cruzada con el PIIINP
humano. El procedimiento descrito en esta patente lo publicó
posteriormente Rohde y col, 1979, y se usó para desarrollar el
ensayo del PIIINP RIAgnost de Behring AG, Marburg, Alemania. Sin
embargo, el procedimiento no permite una determinación precisa del
PIIINP trimérico en sueros de pacientes ya que los anticuerpos
policlonales usados en el ensayo reconocen tanto el PIIINP como los
productos de degradación del PIIINP, en particular el dominio
monomérico del Col1. Además, la avidez del antisuero para el
producto de degradación monomérico es menor que para el PIIINP
intacto. Así que, las muestras de suero muestran una curva de
inhibición menos pronunciada cuando se compara con el patrón del
PIIINP y la concentración del PIIINP tiene que estimarse mediante el
procedimiento de interceptación del 50% que requiere tres diluciones
de sueros.
Con el fin de superar el problema con la curva de
inhibición plana de las muestras de sueros se ha desarrollado una
variante de ensayo que usa fragmentos Fab de anticuerpos. El
procedimiento descrito en el documento EP 0089008A2 de Timpl y col,
1983, y posteriormente publicado por Rohde y col., 1983, se
aprovecha de un antisuero que se ha desarrollado generado mediante
la inmunización de ratones con el Col1. El antisuero se usa para
generar fragmentos Fab de anticuerpo que tienen una avidez casi
igual para el Col1 y para el PIIINP intacto. Por lo tanto, las
curvas de inhibición paralelas se obtienen a partir de muestras de
sueros y patrones y solamente se requiere una sola dilución. Sin
embargo, el valor de diagnóstico de este ensayo es inferior al
ensayo del PIIINP RIAgnost debido a que el ensayo Fab no diferencia
eficazmente entre enfermedades hepáticas activas e inactivas.
El bajo valor de diagnóstico del ensayo Fab ha
conducido a la suposición de que en lugar de usar un antisuero con
igual afinidad al PIIINP y al Col1, podría ser mejor usar
anticuerpo que no reconozca el Col1 en absoluto. La solicitud de
patente europea EP 0298210A2 de Brocks y Timpl, 1988, describe un
procedimiento de cómo inducir un antisuero que reconozca el PIIINP
intacto y alguna especie del precolágeno de tipo III no definido
con un peso molecular mayor que el PIIINP, pero no el Col1. El
antisuero se obtiene después de la inmunización de ratones con un
péptido de secuencia definida. Sin embargo el péptido reivindicado
es de origen de ratas o bovino y el antisuero obtenido después de
la inmunización no muestra suficiente reactividad cruzada con el
PIIINP humano. Por lo tanto, el ensayo no es aplicable a las
muestras humanas (Brocks y col., 1993).
De manera similar, en la solicitud de la patente
europea 0304292A2 de Risteli y Risteli, 1988, se reivindica un
procedimiento que permite la generación de anticuerpos policlonales
que casi no tienen afinidad para el producto de degradación del
PIIINP el Col1. En particular se reivindica que los anticuerpos
deseados se obtienen después de la inmunización de ratones con un
propéptido aminoterminal trimérico exento de enzimas proteolíticas.
Además, el documento EP 0304292A2 describe un RIA de equilibrio que
es más fácil realizar que los RIA de no equilibrio mencionados en
las solicitudes de las patentes anteriores. Una descripción
detallada del ensayo, que está comercialmente disponible de Orion
Diagnostica, Espoo, Finlandia, lo publicaron Risteli y col.,
1988.
La producción de dos anticuerpos monoclonales
como describen en el documento EP 0289930A2 Brocks y col., 1988, y
el documento EP 0339443A2 Brockks y col., 1989, ha permitido el
desarrollo de un inmunoensayo radiométrico. El patrón de reacción
de ambos anticuerpos contra el PIIINP separado mediante
cromatografía en gel es muy similar y se caracteriza por la
ausencia de reactividad contra el Col1. El ensayo está
comercialmente disponible en forma ensayo del PIIINP RIAgnost de
tubo recubierto de Behring Diagnostica, Marburg, Alemania. Los
autores también reivindican la combinación de estos dos anticuerpos
y otros anticuerpos no especificados contra el PIIINP en
inmunoensayos sándwich.
Todos los anticuerpos descritos en la
bibliografía y en las diversas patentes se han inducido contra el
PIIINP purificado de fuentes humanas o bovinas. Por lo tanto, el
epítopo de unión de los anticuerpos no está bien caracterizado.
Numerosas publicaciones han descrito la
producción de los recombinantes de procolágenos. Una publicación
(Lee y col., 1990) reivindica la producción de un mutante del
colágeno \alpha_{2}(I) en el sitio de escisión por la
C-proteinasa en las células A2 derivadas de la
estirpe de células epiteliales de hígado de rata W8 que es
deficiente para el colágeno \alpha_{2}(I). Dos
publicaciones recientes describen la expresión recombinante de
minigenes del colágeno \alpha_{1}(III) (Lee y Bulleid,
1994; Bulleid y col., 1996). La única expresión recombinante del
propéptido N-terminal del procolágeno
\alpha_{1}(III), por ejemplo, para los propósitos de las
inmunizaciones selectivas, o la expresión del PIIINP truncado, por
ejemplo, no se ha descrito para los propósitos de mapeo de epítopos.
Las inmunizaciones solamente se han llevado a cabo con los péptidos
sintéticos elegidos arbitrariamente de estructura secundaria no
investigada.
Aunque las inmunizaciones se realizaron en
nuestro caso con un oligopéptido que presumiblemente se producía en
forma de una molécula monomérica, los anticuerpos resultante de
manera preferente pueden todavía reconocer el PIIINP trimérico.
Esto se puede deber al hecho de que un anticuerpo se puede
simultáneamente unir a dos epítopos idénticos sobre cadenas
adyacentes (Rohde y col., 1983).
Un péptido sintético de la región Col1
(N-ICESCPTGGQNYSP-C) se ha usado
para inducir anticuerpos que se reivindican para dirigirse contra el
PIINP intacto y que parece que no tiene reactividad cruzada con las
formas monoméricas del PIIINP (documento EP 0298210A2 de Brocks y
Timpl, 1988). Más tarde, los mismos autores han publicado que los
anticuerpos dirigidos contra este péptido no reconocen el PIIINP
humano (Brocks y col., 1993).
De la bibliografía citada anteriormente resulta
evidente que los planteamientos de mapeo de epítopos sistemáticos
que utiliza la tecnología de DNA recombinante no se han descrito
antes para el PIIINP.
Existe un considerable interés en los anticuerpos
generados contra el PIIINP. Una fuente (Rohde y col., 1979)
describe la generación de los anticuerpos policlonales reactivos
contra el PIIINP y reivindica su uso como herramienta de diagnóstico
para las determinaciones del PIIINP en muestras de sueros humanos.
Para las inmunizaciones, se utilizó el dominio purificado del Col1
del procolágeno de tipo III bovino. Los resultados de esta
investigación eran también el sujeto del documento EP 000490A1 de
Timpl, 1979.
La generación de anticuerpos contra el fragmento
del oligopéptido sintético
(N-ICESCPTGGQNYSP-C) ha sido el
sujeto del documento EP 0298210B2 de Brocks y Timpl, 1988. Los
anticuerpos que reconocen este antígeno se reivindicaron para
reconocer el PIIINP intacto en sueros de roedores también. Sin
embargo, los anticuerpos no eran de reactividad cruzada con el
PIIINP humano (Brocks y col., 1993).
Los documentos EP 0289930 de Brocks y col., 1988,
y EP 0339443 de Brocks y col, 1989, reivindica la generación de dos
anticuerpos monoclonales que son selectivos para el reconocimiento
del PIIINP humano intacto en diversos fluidos corporales. En
particular, reivindican la generación de los anticuerpos
monoclonales que se dirigen contra un epítopo que no se localiza
sobre Col1 en el documento EP 0289930 y en el documento EP 0339443.
Aunque el anticuerpo reivindicado en el documento EP 0289930
reconoce exclusivamente la especie de mayor peso molecular y el
PIIINP intacto aunque no reacciona con los productos de degradación
del Col1, el anticuerpo reivindicado en el documento EP 0339443
reconoce una especie adicional del PIIINP que es mayor en peso
molecular que el Col1 pero más pequeño que el PIIINP intacto. La
naturaleza exacta del antígeno y la base de esta interacción no se
explica adicionalmente. El reconocimiento de una especie del PIIINP
intermedia discreta adicionalmente es el fundamento de la
heterogeneidad de los antígenos del PIIINP circulante y enfatiza la
necesidad de identificar claramente la naturaleza del epítopo que
se reconoce en cada caso.
De la bibliografía citada anteriormente resulta
evidente que no se han descrito hasta ahora los anticuerpos
monoclonales con los epítopos de unión bien definidos que reconocen
el PIIINP.
La falta de la unión detallada arroja dudas en el
valor de diagnóstico de las determinaciones del PIIINP que usa
estos anticuerpos.
Una serie diversa de enfermedades se asocia con
la producción inapropiada o no regulada del colágeno. Las
mediciones del PIIINP se pueden realizar a partir de sueros de
pacientes o de otros fluidos corporales de pacientes con estas
enfermedades. Entre estas están la fibrosis hepática de diversas
etiologías, cirrosis alcohólica, cirrosis biliar, hepatitis,
esquistosomiasis, fibrosis cardiaca de diversas etiologías, fibrosis
intersticial idiopática, fibrosis pulmonar idiomática, fibrosis
pulmonar intersticial, fibrosis pulmonar aguda, síndrome de
insuficiencia respiratoria aguda, fibrosis perimuscular, fibrosis
pericentral, dermatofibroma, fibrosis renal, neuropatía diabética,
glomerulonefritis, escleroderma sistémico y localizado, queloides,
cicatrices hipertróficas, adherencias de articulaciones graves,
artrosis, mielofibrosis, cicatrización corneal, fibrosis cística,
fibrosis muscular, distrofia muscular de Duchenne, constricción
esofágica, cicatrización retroabdominal, enfermedad de Crohn,
colitis ulcerosa, aneurisma de grandes vasos.
Además los trastornos fibróticos se pueden
inducir o iniciar mediante revisiones de cicatrices, cirugías
plásticas, glaucoma, fibrosis de cataratas, cicatrización corneal,
adherencias de articulaciones, enfermedad de transplante frente al
hospedador, cirugía de tendón, constricción nerviosa, contractura
de Dupuytren, adherencias de OB/GYN, adherencias pélvicas, fibrosis
peridural, enfermedades de la glándula tiroides o paratiroides,
enfermedad ósea metastásica, mieloma múltiple y reestenosis.
La diagnosis precoz es esencial para un potencial
tratamiento de estas enfermedades. Hasta ahora, los ensayos de
suero para enfermedades fibróticas no están bien establecidos y la
diagnosis final debe basarse completamente sobre biopsias
invasivas.
Las mediciones del PIIINP también se pueden
realizar para medir la relación de síntesis de colágeno en
pacientes que se someten a terapia con glucocorticosteroides.
Además, los anticuerpos dirigidos contra el
PIIINP se pueden usar para evaluar la síntesis de colágeno en
muestras de tejidos de pacientes con enfermedad fibrótica mediante
la tinción inmunohistoquímica de secciones en criostato y
parafina.
El inmunoensayo de la invención comprende la
reacción de dos anticuerpos con una muestra de fluido humano, en la
que el anticuerpo de captura se une específicamente a la mayor
parte de los 30 aminoácidos N-terminales de la
molécula del PIIINP. Este anticuerpo de captura se une
preferentemente a este PIIINP trimérico. Un segundo anticuerpo de
especificidad de epítopo diferente se usa para detectar este
complejo. Preferiblemente los anticuerpos son monoclonales y dichos
ambos anticuerpos del ensayo se unen específicamente a la
proteína.
El anticuerpo o anticuerpos del ensayo que se une
específicamente al PIIINP muestra preferiblemente menos de
aproximadamente 3% de reactividad cruzada, en un ensayo tal como se
describe en el ejemplo 6 más adelante en este documento o un ensayo
similar con una muestra de plasma humano, con PIIICP, PICP, colágeno
(III), colágeno (I) y colágeno (VI).
"Anticuerpo", "anticuerpo de la
invención" u otro término similar como se usa en esta memoria
descriptiva incluye una inmunoglobulina entera así como los
fragmentos de unión antigénicos o los fragmentos inmunorreactivos
que se unen específicamente al PIIINP, incluyendo Fab, Fab',
F(ab')_{2} y F(v).
La muestra de fluido humano usada en el ensayo de
la invención puede ser cualquier muestra que contiene el PIIINP,
por ejemplo, sangre u orina. Típicamente se emplea una muestra de
suero o plasma.
Los anticuerpos de la invención se pueden
preparar mediante las técnicas generalmente conocidas en la técnica,
y habitualmente se generan para una muestra del PIIINP. Los
anticuerpos también se pueden generar a partir de un péptido
inmunogénico que comprende uno o más epítopos del PIIINP que
muestran por el PIIINP nativo.
Más particularmente, los anticuerpos se pueden
preparar inmunizando un mamífero con una muestra purificada del
PIIINP, o un péptido inmunogénico como se ha descrito
anteriormente, solo o acomplejado con una captura. Los mamíferos
adecuados incluyen los animales de laboratorio habituales tales
como ovejas, cabras, conejos, cobayas, ratas y ratones. Las ratas y
ratones, especialmente los ratones, se prefieren para obtener los
anticuerpos monoclonales. El antígeno se puede administrar al
mamífero mediante cualquiera de las numerosas vías adecuadas tales
como inyección subcutánea, intraperitoneal, intravenosa,
intramuscular o intracutánea.
Preferiblemente la inmunización se hace mediante
inyección subcutánea, intraperitoneal o intravenosa. El intervalo de
inmunización óptimo, dosis de inmunización, etc., puede variar
dentro de intervalos relativamente amplios y se pueden determinar
empíricamente basándose en esta descripción. Los procedimientos
típicos incluyen la inyección del antígeno varias veces durante un
número de semanas. Los anticuerpos se recogen del suero del animal
inmunizado mediante las técnicas habituales y se analizan para
encontrar los anticuerpos específicos para el PIIINP. Los
anticuerpos monoclonales se pueden producir en las células que
producen los anticuerpos y las células utilizadas para generar los
anticuerpos monoclonales usando las técnicas de fusión habituales
para formar las células de hibridoma. Habitualmente esto implica
fusionar la célula productora de anticuerpos con una estirpe
celular inmortal, tal como una célula de mieloma, para producir la
célula híbrida. Como alternativa, los anticuerpos monoclonales se
pueden producir a partir de células mediante el procedimiento de
Huse y col., (1989).
Un protocolo adecuado prevé la inmunización
intraperitoneal de un ratón con una composición que comprende el
PIIINP purificado llevado a cabo durante un período de
aproximadamente dos a siete meses. Las células esplénicas se pueden
eliminar del ratón inmunizado. Los sueros del ratón inmunizado se
ensayan para los títulos de los anticuerpos específicos para el
PIIINP antes de la escisión de las células esplénicas. Las células
esplénicas de los ratones escindidas se condensan después a una
estirpe celular linfoide homogénea o heterogénea adecuada
(preferiblemente homogénea) que tiene un marcador tal como la
deficiencia de la hipoxantina guanina fosforribosiltransferasa
(abreviadamente en inglés HGPRT) o deficiencia de la timidinaquinasa
(TK). Preferiblemente una célula de mieloma se emplea como la
estirpe celular linfoide. Las células de mieloma y las células
esplénicas se mezclan juntas, por ejemplo, en una relación de
células de mieloma a células esplénicas de aproximadamente 1 a 4.
Las células se pueden fusionar mediante el procedimiento de
polietilenglicol (PEG). El hibridoma así clonado se desarrolla en
un medio de cultivo, por ejemplo, RPMI-1640 (Moore y
col., 1967).
Los hibridomas, desarrollados después del
procedimiento de fusión, se analizan, por ejemplo, mediante
radioinmunoensayo o inmunoensayo enzimático, para secreción de
anticuerpos que se unen específicamente al PIIINP, por ejemplo, se
seleccionan los anticuerpos que se unen al PIIINP completo, a la
región I de la subsecuencia pero no a la región II. Preferiblemente
se emplea un ELISA para el análisis. Los hibridomas que muestran
resultados positivos tras dicho análisis se pueden expandir y clonar
limitando el procedimiento de dilución. Además, los análisis se
realizan preferiblemente para seleccionar los anticuerpos que se
pueden unir al PIIINP en disolución así como en las muestras de
fluidos humanos.
El ensayo de la invención se ilustra mediante el
siguiente protocolo usando la fosfatasa alcalina como marcador del
anticuerpo conjugado. Una muestra de ensayo, por ejemplo, una
muestra de suero humano, se añade a un anticuerpo del PIIINP (es
decir, un anticuerpo que se une al PIIINP) unido sobre una captura
tal como una placa de microtítulo y la reacción anticuerpo -
antígeno se lleva a cabo, seguido de la adición del anticuerpo de
PIIINP conjugado marcado con fosfatasa alcalina obtenido como se ha
indicado anteriormente, y después se realiza una reacción anticuerpo
- antígeno. Los anticuerpos habitualmente se disuelven en
disolución antes de poner en contacto con la muestra de ensayo. Los
diluyentes adecuados incluyen los conocidos en la técnica para uso
en inmunoensayos. Una disolución específicamente preferida para
disolver los anticuerpos para poner en contacto con una muestra de
ensayo contiene Tris 20 mM, cloruro sódico 500 mM, IgG de ratón
0,05 mg/ml y BSA al 5% (p/v).
Preferiblemente, tanto los anticuerpos de captura
como los conjugados del ensayo de la invención se unen
específicamente al PIIINP, y el anticuerpo unido al soporte, la
muestra de fluido humano y el anticuerpo marcado se incuban juntos,
seguido de las etapas de lavado para retirar cualquier anticuerpo
marcado no unido y la muestra de plasma humano distinta del PIIINP
que ha reaccionado. Los agentes de lavado adecuados incluyen los
conocidos en la técnica para uso en los inmunoensayos. Una
disolución de tampón específicamente preferida contiene 27,2 g/l de
imidazol, 17,5 g/l de cloruro sódico y 4 ml/l de Tween® 20. Si es
necesario, se añade al ensayo un sustrato para la fosfatasa
alcalina y los productos de reacción se ensayan para la actividad
enzimática midiendo la absorbancia o fluorescencia del producto
resultante. La cantidad detectada de anticuerpo marcado unido es
directamente proporcional a la concentración del PIIINP en la
muestra de suero humano ensayado. Así que una determinación
cuantitativa de la concentración del PIIINP en la muestra de ensayo
de plasma se puede determinar mediante la comparación de la
absorbancia o fluorescencia de la muestra de ensayo con los valores
de absorbancia obtenidos a partir de soluciones patrones que
contienen cantidades conocidas del PIIINP. Puede ser deseable
preparar las curvas de calibración a partir de los valores de
absorbancia obtenidos de numerosas soluciones patrones para
facilitar la interpretación de los valores obtenidos de una muestra
de ensayo.
Un inmunoensayo específicamente preferido de la
invención se llevó a cabo como sigue. El anticuerpo monoclonal de
captura y el anticuerpo monoclonal conjugado marcado con fosfatasa
alcalina (AP) se incubó junto con una muestra de plasma humano a
37ºC durante 30 minutos. Después la placa se lavó y se incubó
durante 15 minutos a temperatura ambiente con sustrato de AP y se
cuantificó el conjugado unido.
El PIIINP se puede purificar a partir de una
muestra de suero humano mediante el uso de los complejos de captura
acoplados con uno o más anticuerpos de la invención en cantidades
suficientes para la inmunización. Se purificaron cantidades
suficientes y por lo tanto la invención incluye los procedimientos
para obtener el PIIINP purificado usando los anticuerpos de la
invención y los aparatos relacionados. Un procedimiento de
purificación proporciona el acoplamiento de un anticuerpo de la
invención sobre una captura apropiada como se conoce en la técnica,
tal como un gel o resina, después se envasa la captura en una
columna, y después se eluye una disolución de muestra que contiene
el PIIINP a través de la columna para absorber selectivamente el
PIIINP. El anticuerpo se puede acoplar adecuadamente sobre la
captura mediante procedimientos conocidos, por ejemplo, el
procedimiento del bromuro de cianógeno, el procedimiento del
glutaraldehído, el procedimiento de la carbodiimida acuosa, el
procedimiento del éster activo, y similares. El anticuerpo también
se puede absorber físicamente sobre la superficie de la
captura.
Se llevó a cabo PCR siguiendo las recomendaciones
de los fabricantes para condiciones tampón con 2,5 unidades de
polimerasa Taq (Boehringer Mannheim, Alemania). Se añadieron
dos cebadores específicos con sitios de restricción KpnI y
HindIII integrados en sus respectivos extremos 5' (P1 y P5,
tabla 1) a una concentración final de 500 fM cada una. Se utilizó 1
\mul de cDNA de clon - Rápido de aorta humana como molde en una
reacción de 100 \mul de PCR. La PCR se llevó a cabo con un
termociclador UNO de alto rendimiento fabricado por Biometra,
Alemania. Se utilizó el siguiente programa: etapa inicial de
desnaturalización del molde: 5 minutos a 94ºC. Las condiciones
habituales de ciclo fueron: 45 segundos a 94ºC, 60 segundos a 55ºC,
60 segundos a 72ºC. Se llevaron a cabo 30 ciclos. Una etapa de
ampliación de 420 segundos completó el programa. El fragmento de PCR
resultante se purificó a partir de un gel de agarosa al 2% con un
estuche de extracción de gel QIAEX II (Qiagen, Alemania) y
fosforilado mediante tratamiento con polinucleotidoquinasa de T4
(Boehringer Mannheim, Alemania). El vector de fagomido bacteriano
pBluescript SK^{-} se digirió con la enzima de restricción
SmaI (Boehringer Mannheim, Alemania) y el plásmido
linealizado se desfosforiló con fosfatasa de intestino de ternera
de Boehringer Mannheim, Alemania. El fragmento de PCR modificado
enzimáticamente y el vector se ligaron con ligasa de T4 (Boehringer
Mannheim, Alemania) durante 12 horas a 16ºC. Todas las etapas de
modificación enzimática se llevaron a cabo según las recomendaciones
de los fabricantes. El plásmido ligado se transformó en la estirpe
de E. coli sure II (Stratagene, Estados Unidos) según el
procedimiento descrito en Sambrook y col, 1988. Las colonias
resultantes se expandieron en medio LB con 100 \mug/ml de
ampicilina y el DNA de plásmido se aisló según el protocolo de
Quiagen Mini Kit (Qiagen Alemania). El plásmido se ensayó para la
integración de la inserción mediante digestión con KpnI y
HindIII (Boehringer Mannheim, Alemania) según las
recomendaciones de los fabricantes. Se identificó un clon positivo
(hP5). El clon se expandió, se verificó la secuencia mediante
la secuenciación del nucleótido de doble direccionalidad en un
secuenciador de Applied Biosystems (Estados Unidos), y se aislaron
cantidades mayores del plásmido hP5. Éste servía como molde
para todas las construcciones de expresión descritas más adelante en
este documento.
Posteriormente, el plásmido hP5 servía
como molde para la generación de una construcción de la expresión
diana His N-terminal comprendiendo la región de
propéptidos entera pero careciendo de la presecuencia localizada
N-terminalmente y la región de telopéptidos distal
al sitio de escisión por la N-proteinasa. Para este
fin, se usó 1 \mug de plásmido hP5 como molde y la
amplificación se llevó a cabo con los cebadores P3 y P14 (véase la
tabla 1 para la información de secuencias). P3 y P14 contenían los
sitios de restricción KpnI y HindIII y sus extremos,
respectivamente. Se llevaron a cabo 12 ciclos de PCR en las mismas
condiciones de ciclo como se ha descrito anteriormente. Este
producto de PCR se subclonó de manera extremo romo en el vector de
fagomido bacteriano pBluescript SK^{-}. Se obtuvo un plásmido que
contenía el cDNA del PIIINP maduro y se designó 4.5. Este plásmido
se digirió con KpnI y HindIII (Boehringer Mannenheim,
Alemania) y el cDNA del PIIINP se purificó a partir de un gel de
agarosa al 2%. Posteriormente se fosforiló la inserción. Se ligó con
el plásmido de expresión diana de His PQE30 (Qiagen, Alemania) que
se había digerido previamente con el mismo conjunto de enzimas de
restricción que la inserción, y se desfosforiló. Se transformaron
las E. coli sure II competentes con el plásmido. Se
identificó y se expandió una colonia que llevaba el derivado de
pQE30 con la secuencia de PIIINP. Todas las etapas de modificación
se llevaron cabo de manera análoga al procedimiento indicado para la
generación de hP5. El clon se designó 4.5.2.
En resumen, después de usa segunda
transformación, la proteína de fusión diana
N-terminal His se expresó en la cepa de E.
coli M15 que llevaba el plásmido pREP4 (según el manual de
QIAexpresionist, p. 35, Qiagen, Alemania, temperatura de incubación
37ºC). La proteína de fusión recombinante se purificó sobre una
columna de Superflow Ni-NTA (Qiagen,Alemania) según
el protocolo de purificación del fabricante (Protocolo 7, manual
QIAexpresionist, pp. 45 - 46 Qiagen, Alemania).
Para la generación de una proteína truncada
N-terminalmente, se utilizó un cebador que
reconocía una secuencia cadena debajo de la secuencia que codifica
los 30 primeros aminoácidos N-terminales del PIIINP
(P11-2, tabla 1) en combinación con un cebador
específico para la secuencia que comprendía el sitio de escisión por
la N-proteinasa localizado en el terminal C (P14,
tabla 1). Los procedimientos experimentales eran completamente
análogos a los descritos para la construcción del plásmido
4.5.2. excepto que la inserción se subclonó en el vector de
expresión de pQE31 (Qiagen, Alemania) y que el cebador cadena
arriba (P11-2) contenía un sitio de restricción
PstI en su extremo 5'. Por lo tanto, la inserción y el
vector se digirieron con PstI (Boehringer Mannheim,
Alemania) en lugar de KpnI. Esta construcción se designó
clon6. Después de la inducción con IPTG una proteína de
fusión N-terminal que carecía de los primero 30
aminoácidos del dominio Col1 del PIIINP y que diferían del péptido
derivado de 4.5.2 en la secuencia de aminoácidos adyacente a
la secuencia de aminoácidos N-terminal diana His se
purificó sobre una columna Ni-NTA.
Se generó otra secuencia de cDNA del PIIINP
truncada mediante PCR usando un par de cebadores que reconocía la
secuencia que codifica el extremo N-terminal de la
molécula (P3, tabla 1) y la secuencia justo cadena arriba de la
secuencia que codifica el dominio Col2 entero (P12, tabla1).
Después de la subclonación de este fragmento en el vector de
expresión de pQE30, transformación, expresión de la proteína
recombinante y su purificación, se obtuvo un PIIINP carente de
21aminoácidos en su extremo C cuando se compara con la molécula no
truncada. La construcción se designó 2.8.6. De nuevo, todos
los procedimientos experimentales se llevaron a cabo de manera
análoga a los descritos para la preparación del plásmido
4.5.2.
Las proteínas purificadas se separaron mediante
electroforesis sobre un gel SDS al 12,5% (Sambrook y col, 1989).
Para determinar qué especies de PIIINP unidas por disulfuros de peso
molecular y mutantes truncados se expresaban de manera recombinante
en la cepa M15 con el plásmido pREP4, se omitió el mercaptoetanol
[5% (v/v)] como agente reductor de los tampones de muestra y las
bandas resultantes se compararon con un patrón de tamaño molecular
y con sus homólogos reducidos con mercaptoetanol.
Comparando la especie de PIIINP no reducida con
la proteína reducida, que aparecía como una banda sobre un gel de
SDS, resulta evidente que el PIIINP recombinante se sintetizaba
ampliamente en forma de una proteína monomérica. Solamente las
especies con movilidades electroforéticas correspondientes a los
monómeros eran discernibles en cada caso (figura 3).
La preparación de la muestra de PIIINP para
eliminar el tampón y otros recombinantes se realizó usando el
cartucho de preparación de muestras ProSpin de Appied Biosystem
(Estados Unidos) y concentradores Centricon (Amicon, Estados
Unidos), mediante transferencia en sobre membrana de PVDF después de
electroforesis sobre gel SDS o mediante la filtración por gel en
ácido fórmico sobre una columna de gel de sílice. Se utilizaron una
unidad de electroforesis vertical (LKB/Pharmacia, Alemania), una
célula de transferencia trans y un suministro eléctrico para el
modelo de transferencia 250/2,5 (BioRad, Alemania). Los reactivos
para la electroforesis y la membrana de PVDF eran de BioRad. Todos
los compuestos químicos usados eran de pureza proanálisis o
bioquímica (Merck, Alemania). El marcador de la proteína preteñida
era de BioRad (Alemania).
El análisis de la secuencia
N-terminal de los fragmentos del PIIINP se
realizaron usando el secuenciador de fase gas - líquido - sólido
473A de Appied Biosystems. Se usó el programa de secuenciador
habitual. El secuenciador, los diferentes programas de ejecución,
los ciclos, así como el sistema de separación de PHT, se describen
en detalle en el manual respectivo (sistema de secuenciación de
proteínas del manual de usuario modelo 473A (1989), Applied
Biosystems , Estados Unidos). La detección de los aminoácidos de
PHT se realizó en línea usando una columna RP-18
(220 mm \times 2 mm, material de 5 \mu) columna de PTH de
Applied Biosystems. Los aminoácidos de PTH se identificaron y se
cuantificaron mediante un patrón de 50 pM de todos los aminoácidos
de PHT. Los datos se recogieron y se integraron usando el sistema
de datos del secuenciador 610A de Applied Biosystems. Se utilizaron
para la secuenciación aproximadamente 20 ng de los fragmentos del
PIIINP respectivos.
Las proteínas 4.5.2, y 2.8.6 y
clon6 se secuenciaron N-terminalmente como
se ha descrito anteriormente. El número de ciclos era suficiente en
cada caso para alcanzar la secuencia de colágeno de la proteína de
fusión. La tabla 2 resume los resultados de la secuenciación de los
aminoácidos de tres proteínas de PIIINP representativos. Era
idéntica a la secuencia publicada en cada caso.
Hembras de ratones BALB/c se inmunizaron con
PIIINP para proporcionar los dadores de bazo para la fusión de PEG,
descrita más adelante en este documento, que generaba los
anticuerpos monoclonales que se unían específicamente al
PIIINP.
Hembras de ratones BALB/c se sensibilizaron con
10 \mug cada una de PIIINP purificado en una emulsión inmunógena
preparada como sigue:
0,125 ml del
propéptido-N-terminal-procolágeno-III
(325 \mug/ml en Tris 50 mM/NaCl 50 mM/EDTA 0,1 mM pH 7,4).
1,500 ml de adyuvante de Freund completo
1,375 ml de disolución salina tamponada con
fosfatos de Dulbecco
Cada ratón se inyectó con 0,5 ml de esta emulsión
inmunógena i. p. Los ratones se reinmunizaron con dosis de hasta 50
\mug de PIIINP purificado i. p. en un protocolo de inmunización
que se llevó a cabo durante aproximadamente seis meses.
El PIIINP se diluyó con un tampón de
recubrimiento (tampón carbonato, pH 9) a una concentración de 1
\mug/ml. 100 \mul de cada disolución (10 ng de PIIINP) se
colocaron en cada pocillo de las placas de microtitulación, que se
cerraron herméticamente y se incubaron durante una noche a 2 - 8ºC.
Después los contenidos de los pocillos se aspiraron y las placas
se lavaron una vez con tampón de lavado/almacenamiento, se aspiró
el lavado, y las placas se volvieron a cerrar herméticamente otra
vez. Las placas se almacenaron a 2 - 8ºC hasta uso.
Los hibridomas que secretan anticuerpos
monoclonales para
propéptido-N-terminal-procolágeno-III
se generaron mediante la fusión de dos células. Se empleó la
técnica de fusión de PEG. Las células de mieloma usadas eran HRPT
menos P3 - X63-Ag8.653 (P3X) (ATCC CRL1580). La
selección para los híbridos se efectuó usando medios HAT
(hipoxantina, aminopterina y timidina). Las células de mieloma P3X
no sobrevivieron en este medio ya que carecen del aparato para usar
hipoxantina para producir purinas. La aminopterina presente en el
medio bloquea la síntesis endógena de purinas y pirimidinas.
Las células de bazo se obtuvieron de un ratón
inmunizado con
propéptido-N-terminal
procolágeno-III como se ha descrito en el ejemplo 1.
Las células se liberaron del bazo usando un fórceps y una aguja,
después se suspendieron en 12 ml de medio completo frío al 20% sin
suero (base de RPMI 1640, Gibco). Después las células se
centrifugaron a 200 g durante 10 minutos después de lo cual el
sobrenadante se retiró mediante aspiración, y las células se
resuspendieron otra vez en medio frío. Este procedimiento de lavado
se repitió dos veces, y las células se resuspendieron en un volumen
final de 10 ml. El recuento de células viables de los esplenocitos
era 1,7 \times 10^{8} con una viabilidad de 98% mediante la
técnica de exclusión de azul tripano.
Las células de mieloma se recogieron
mecánicamente, se reunieron y se centrifugaron a 200 g durante 10
minutos después de o cual se retiró el sobrenadante por aspiración,
y las células se resuspendieron en 50 ml de medio completo al 20%.
El recuento de células viables de las células de mieloma era 2,9 x
10^{6} células viables por ml con una viabilidad de 76%.
Los esplenocitos y 15 ml de la suspensión de la
células de mieloma se combinaron en una relación de células de bazo
a células de mieloma de aproximadamente 4:1 con un recuento de
células viables total de 2,13 \times 10^{8}. El volumen se llevó
hasta 50 ml con medio completo frío al 20% sin suero y después las
células se centrifugaron a 200 g durante 10 minutos. Después el
sedimento de células se lavó dos veces con este medio a un volumen
de 50 ml. Después del lavado final, el sobrenadante se retiró
mediante aspiración y el sedimento se centrifugó a 200 g durante 3
minutos y el sobrenadante restante se aspiró. Después las células
se fusionaron con PEF al 40% (peso molecular 7.000 a 9.000)
tamponado en RMPI 1640; la fusión se realizó en un tubo mantenido en
un baño de agua caliente (37ºC). 1 ml de disolución de PEG
calentada hasta 37ºC se añadió al sedimento y se incubó durante 1
minuto. Después la disolución de PEG diluyó mediante la adición de
20 ml de medio completo al 20% caliente sin suero. Las células
fusionadas se incubaron a 37ºC durante 10 minutos y después de
centrifugó a 200 g durante 10 minutos.
Después el sedimento de células fusionadas se
resuspendió en 50 ml de medio completo al 20% y se sembró a
densidades de células de 1,09 \times 10^{5} a 4,26 \times
10^{5} por pocillo. Las células se sembraron en un volumen final
de 200 \mul por pocillo de medio completo al 20% con 250
unidades/ml de IL-6. Después de incubación durante
una noche a 37ºC y CO_{2} al 10%, la mitad del medio en cada
pocillo se aspiró y las células se alimentaron con HAT al 20%, HAT
al 20% con 5 \mug/ml de STM o HAT al 20% con 500 unidades/ml de
IL-6. Las células se exploraron visualmente y se
alimentaron periódicamente con estos medios durante varias semanas,
mientras el crecimiento de los hibridomas se controló y los
pocillos en crecimiento se analizaron para la presencia de
anticuerpos anti-PIIINP comenzando el día 12 hasta
el14 después de la fusión usando las placas de microtitulación
recubiertas con PIIINP descritas anteriormente y los procedimientos
habituales bien conocidos por los expertos bioquímicos.
Para analizar los anticuerpos monoclonales
específicos de epítopos, se usaron los tres péptidos
recombinantes. Los anticuerpos monoclonales que reconocen los tres
péptidos no usaron ninguno adicional debido a que estos anticuerpos
se dirigían bien contra la diana His N-terminal o
contra la región entre los epítopos muy N-terminales
del Col1 y el comienzo del Col2. Los anticuerpos que reconocen
solamente el péptido completo (4.5.2) y el péptido de
deleción C-terminal (2.8.6) carente de la
mayor parte de los 21 aminoácidos C-terminales
correspondiente a una deleción del dominio Col2 entero y que no
reacciona con el péptido de deleción N-terminal
(clon 6) carente de la mayor parte de los 30 aminoácidos
localizados C-terminalmente se clasificaron como
específicos de los epítopos para la región Col1
N-terminal. La figura 2 muestra los epítopos
presentes sobre todas las construcciones del PIIINP y la tabla 4
resume los resultados de ELISA y ensayos de transferencia de
Western obtenidos con los diferentes anticuerpos y antígenos.
Mediante el mismo indicio, los anticuerpos que
reconocen solamente el péptido completo (4.5.2) y el péptido
de deleción N-terminal (clon 6) se
identificaron como específico de los epítopos para el dominio Col2
localizado N-terminalmente.
Para caracterizar las características de unión de
los anticuerpos monoclonales generados recientemente, se aplicaron
las técnicas tanto ELISA como de transferencia de Western. Se
seleccionaron dos anticuerpos monoclonales adecuados (mAb 35J22 y
mAb 35J23) que reconocían exclusivamente la mayor parte de los 30
aminoácidos N-terminales del PIIINP y sus epítopos
de unión y que permitían la detección sensible de PIIINP nativa de
muestras de pacientes.
Después de la identificación del título óptimo
que usa el PIIINP recombinante completo en un ensayo ELISA donde el
PIIINP recombinante se recubrió a una concentración de masa fija,
los péptidos de deleción se recubrieron a la misma concentración, y
la intensidad de la señal se determinó de una manera análoga exacta
al PIIINP completo. La tabla 4 resume los resultados de este ensayo
ELISA para el anticuerpo monoclonal 35J23 y reconocimiento de los
diferentes antígenos.
Después de la determinación de los títulos
óptimos de los diferentes anticuerpos las tres variantes del PIIINP
se sometieron a electroforesis a concentraciones molares iguales y
se realizaron las transferencias de Western. Las diferencias en el
reconocimiento de antígenos se podrían así correlacionar con la
especificidad de los epítopos.
Con el fin de inducir los anticuerpos selectivos
para el dominio Col2 se eligió una secuencia de oligopéptidos
correspondiente a los 21 aminoácidos localizados inmediatamente
N-terminal al sitio de escisión por la
N-proteinasa. La secuencia exacta el péptido se
proporciona en la tabla 3. Los 14 últimos aminoácidos de la
secuencia de oligopéptidos son idénticos a la secuencia del dominio
Col2 del PIIINP. Ya que el epítopo de unión de un anticuerpo
monoclonal típico es de al menos 6 aminoácidos, los anticuerpos
inducidos contra este oligopéptido reconocen típicamente una
subsecuencia de la región Col2.
Se indujo un anticuerpo monoclonal, mAB 35JC2 y
se caracterizó adicionalmente.
Las mediciones de las concentraciones de
propéptido N-terminal del procolágeno (III)
(abreviadamente en inglés PIIINP) en los sueros de los pacientes se
llevaron a cabo empleando la tecnología sándwich. Un anticuerpo
monoclonal específico de un epítopo que reconoce un epítopo
N-terminal de la molécula del PIIINP (mAb 35J23) se
unía específicamente e inmunizaba el PIIINP del suero circulante. Se
usó un segundo anticuerpo monoclonal (mAb JC2) para detectar este
complejo.
La combinación de los anticuerpos monoclonales
específicos del sitio como se han descrito anteriormente reconocía
exclusivamente especies de peso molecular más alto del PIIINP que
se refieren a la deposición de novo del procolágeno (III) en
la matriz extracelular en los sueros de todos los pacientes y
controles. Esta especificidad para el PIIINP intacto distingue
además el nuevo ensayo de los ensayos que reconocen adicionalmente
las especies de peso molecular más bajo. Los fragmentos del PIIINP
más cortos probablemente representan los productos de degradación
que emanan del PIIINP y pueden no reflejar necesariamente la
síntesis del colágeno reciente. Por lo tanto, el nuevo ensayo
descrito anteriormente es muy específico para el propósito de
controlar la síntesis de colágeno frente a la descomposición del
colágeno.
Una placa de microtitulación (Nunc Maxisorb,
Alemania) se recubrió con mAb 35J23 o mAb 35J22 (2 \mug/ml, 100
\mul de volumen total por pocillo) durante una noche a 4ºC. El
siguiente día se eliminó el sobrenadante y los pocillos se
bloquearon con BSA al 3% (p/v) en PBS (200 \mul de volumen total
por pocillo) durante 2 horas. Se lavaron los pocillos 3 veces con
tampón de lavado (Twen 20 al 0,05%, BioRad, Alemania).
Posteriormente, se aplicaron 50 \mul de suero de pacientes a cada
pocillo durante 1 hora. El suero se retiró de los pocillos y las
placas se lavaron 3 veces con tampón de lavado como se ha descrito
anteriormente. El antisuero anti-PIIINP policlonal
de Biodesign (Reino Unido, lote nº 40331R) se utilizó para detectar
este complejo (dilución 1:500 (v/v, 100 \mul de volumen total por
pocillo). Después de lavar tres veces, se aplicó el anticuerpo
anti-conejo A 0545 marcado con peroxidasa de Sigma
(Alemania) (dilución 1:20000 (v/v), 100 \mul de volumen total por
pocillo). Después de lavar 5 veces se desarrolló un ensayo ELISA
con 100 \mul de sustrato de peroxidasa de TMB + disolución de
peroxidasa B (1:1 (v/v), ambas de Laboratorios Kirkegaard y Perry ,
Estados Unidos) durante 30 minutos. Se detuvo la reacción mediante
la adición de 100 \mul de H_{2}SO_{4} 1 N y se determinó la
D. O. a 450 nm.
Más sorprendentemente, ambos anticuerpos
monoclonales, mAb 35J22 y mAb 35J23, preferentemente se unían al
PIIINP trimérico frente a la proteína recombinante monomérica
4.5.2.
La figura 3 y la tabla 4 muestran la correlación
de la D. O. obtenida con este ensayo con las concentraciones del
PIIINP determinadas con Orion RIA cuando las muestras de los mismos
pacientes seleccionados se medían con ambos procedimientos.
La curva de calibración mostrada en la figura 4
se obtuvo con el PIIINP recombinante cuando se ensayaba con el
ensayo ELISA descrito en el ejemplo 8. El ensayo se realizó como se
ha descrito anteriormente para los sueros de los pacientes, excepto
que se recubrían diluciones sucesivas del PIIINP recombinante (100
\mul de volumen total). El título del antisuero policlonal
anti-PIIINP se varió en este experimento. Los
mejores resultados se obtuvieron con diluciones 1:500 de antisuero
anti-PIIINP. Cuando se comparan los resultados con
las mediciones de los sueros de los pacientes con concentraciones
conocidas del PIIINP resulta evidente que este tipo de ensayo
preferiblemente reconoce el PIIINP intacto mientras no reconoce
ávidamente el material recombinante monomérico. Con el antígeno
recombinante el umbral de detección era aproximadamente 100 ng/ml y
el intervalo dinámico del ensayo se desplazó a las concentraciones
del PIIINP 20 - 100 veces más altas que con el material trimérico
en los sueros de los pacientes. Notablemente, el reconocimiento
preferencial del material trimérico no se debe al antisuero
policlonal que no distingue entre material monomérico y trimérico y
se ha mostrado en los ensayos individuales ELISA realizados con el
antisuero policlonal solamente (datos no mostrados).
La tabla 5 muestra las concentraciones del PIIINP
en los sueros de pacientes con enfermedad hepática fibrótica
tipificada en niños. Los datos implican una correlación entre los
niveles del PIIINP circulante según se determina con el inmunoensayo
de sándwich descrito anteriormente y la gravedad clínica de la
enfermedad hepática fibrótica.
El ensayo del PIIINP se estableció como un
inmunopensayo de sándwich con adición simultánea de tanto los
reactivos como de la muestra, y la adición posterior de partículas
magnéticas.
- -
- 10 \mul de muestra de suero y 10 \mul de tampón de partículas magnéticas se pipetearon en la cubeta de reacción.
- -
- 30 segundos más tarde 65 \mul de reactivo R1 y 65 \mul de reactivo R2 se dispensaron en la cubeta. El reactivo R1 contiene un anticuerpo monoclonal anti-PIIINP con fluoresceína en usa disolución tamponada. El reactivo R2 contiene un anticuerpo anti-PIIINP de especificidad de epítopos diferente conjugado a la fosfatasa alcalina en una disolución tamponada.
- -
- La mezcla de reacción se incubó durante 21 minutos a 37ºC para formar el complejo inmune de sándwich.
- -
- Se añadieron 10 \mul de partículas magnéticas recubiertas con un anticuerpo anti-fluoresceína, y la mezcla se incubó a 37ºC durante 8 minutos adicionales.
- -
- El complejo unido a las partículas se separó de la mezcla de reacción aplicando un campo magnético externo. Se lavaron las partículas para retirar el exceso de muestra y reactivo.
- -
- Se añadieron 300 \mul de p-nitrofenolato a la mezcla de reacción. Se formó el anión de p-nitrofenolato coloreado, y la relación de formación era directamente proporcional a la concentración del PIIINP presente en la muestra. A bajas concentraciones la relación del incremento de absorbancia se controló a 405 nm, a una relación alta de formación de color la longitud de onda del filtro se cambió a 450 nm.
Brocks D,
Günzier-Pukall V, Hachmann H,
Pünter J, y Timpl R (1989) Monoklonaler
Antikörper zur selektiven imnunologischen Bestimmung von intaktem
Prokollagen Peptid (Typ III) und Prokollagen (Typ III) en
örperflüssigkeiten. Solicitud de patente europea n°
0339443A2
Brocks D y Timpl R (1988)
Verfahren zur selektiven immunologischen Bestimmung von intaktem
Prokollagen Peptid (Typ III) und Prokollagen (Typ III) in
Körperflüssigkeiten und Mitte zu dessen Durchführung. Socitud
de patente europea n° 0298210A2
Brocks D, Pünter J, Strecker
H, y Tímpl R (1988) Monoklonaler Antikörper zur
selektiven immunologischen Bestimmung von intaktem Prokollagen
Peptid (Typ III) und Prokollagen (Typ III) in
Körperfüssigkeiten.Socitud de patente europea n°
0289930A2
Brocks DG, Steinert C, Gerl
M, Knolle J, Neubauer HP, y Günzler V
(1993) A radioimmunoassay for the N-terminal
propeptide of rat procollagen type (III). Matrix 13:
381-387
Bulleid NJ, Wilson R, y Lees
JF (1996) Type-III procollagen assembly in
semi-intact cells: chain association, nucleation and
triple-helix folding do not require formation of
inter-chain disulfide bonds but
triple-helix nucleation does require hydroxylation.
Biochem. J. 317: 195-202
Colige A, Nusgens BV, y
Lapiere CM (1996) Cloning of the cDNA of the bovine
procollagen I N-proteinase. N° de acceso del banco
de genes X96389
Davis BH y Madri JA (1987)
An immunohistochemical and serum ELISA study of type I and III
procollagen aminopeptides in prirnary biliary cirrhosis. Am. J.
Path. 128: 265-275
Eriksen EF, Charles P,
Melsen F, Moselcilde L, Risteli L, y
Risteli J (1993) Serurn markers of type I collagen
formation and degradation in metaboiic borre disease: Correlations
to borre histomorphometry. J. Bone Miner. Res. 8:
127-132
Fieischmajer R, Timpl R,
Tudermann L, Raisher L, Wiestner M,
Perlish JS, y Graves PN (1981) Ultrastructural
identification of extension aminopropeptides of type I and III
collagens in human skin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:
7360-7364
Hansen M, Stoltenberg M,
Host NB, Boesby S, Lorenzen I, y
Bentsen KD (1995) Glucocorticoids inhibit the
synthesis rate of type Hl collagen, but do not affect the hepatic
clearance of íts aminoterminal propetide (PIIINP). Scand. J.
Lab. Invest. 55: 543-548
Hayasaka A, Koch J, Schuppan
D, Maddrey WC, y Hahn EG (1991) The serum
concentrations of .the aminoterminal propeptide of procollagen type
III and the hepatic content of mRNA for the al chain of procollagen
type III in carbon tetrachloride-induced rat liver
fibrogenesis. J. Hepatology 13: 328-338
Huse WD, Sastry L, Iverson
SA, Kang AS, Alting-Mees M,
Burton DR, Benkovic SJ, y Lerner RA
(1989) Generation of a large combinatorial library of the
inununo-globulin repertoire in phage lambda.
Science 246: 1275-1281
Jeffers U,
Coelho-Littte ME, Cheinquer H,
Vargas C, Civantos F, Alvarez L, Reddy
R, Parker T, de Medina M, Li X, Hill M,
LaRue S, y Schiff ER (1996)
Procotlagen-III-peptide and chronic
vira' C hepatitis. Am. J. Gastroent. 90:
1437-1440
Kühn K, Wiestner M, Krieg T,
y Müller PK (1982) Structure and function of the
animo terminal propeptide of type I and III collagen. Conn.
Tissue Res. 10: 43-50
Lee ST, Kessler E, y
Greenspan DS (1990) Analysis of
site-directed mutations in human
pro-\alpha2(1) collagen which block
cleavage by the C-proteinase. J. Bid. Chem.
265: 21992-21996
Lees JF y Bulleid NJ (1994)
The role of cysteine residues in the folding and association of
the COOH-terminal propeptide of types I and III
procollagen. J. Biol. Chem. 269:
24354-24360
Moore GE, Gema. RE, y
Franklin HA (1967) Culture of normal human
leukocytes. JAMA 199: 87-92
Murawaki Y, Ikuta Y,
Nishimura Y, Koda M, y Kawasaki H
(1995) Serum markers for connective tissue turnover in
patients with chronic hepatitis B and chronic hepatitis C: A
comparative analysis. J. Hepatol. 23:
145-152
Niemelä O, Risteli L,
Sotaniemi EA, y Risteli J (1982) Heterogeneity
of the antigens related to the aminoterminal propeptide of type III
procollagen in human serum. Clínica Chimica Acta 124:
39-44
Peltonen L, Halila R, y
Ryhänen L (1985) Enzymes converting procollagens to
collagens. J. Cell. Biochem. 28: 15-21
Plebani M y Burlina A (1991)
Biochemical markers of hepatic fibrosis. Clin. Biochem. 24:
219-239
Risteli J y Risteli L (1988)
Antibody to propeptide of procollagen type III, and assay method
using it. European Patent Appl. 0304292A2
Rohde H, Bruckner P, y Timpl
R (1983) Immunochemical properties of the aminopropeptide of
procollagen type III. Eur. J. Biochem 135:
197-202
Rohde FI, Vargas L, Hahn E,
Kalbfieisch H, Bruguera M, y Timpl R.
(1979) Radioimmunoassay for type III procollagen peptide and
its application to human liver disease. Eur. J. Clin. Invest.
9: 451-459
Savolainen ER, Goldberg B,
Leo MA, Velez M, y Líeber CS (1984)
Diagnostic value of serum procollagen peptide measurements in
alcoholic liver disease. Alcohol. Clin. Exp. Res. 8:
384-389
Schuppan D (1991) Connective tissue
polypeptides in serum as parameters to monitor antifibrotic
treatment in hepatic fibrogenesis. J. Hepatology 13 (Suppl.
3): S17-S25
Scott 1C, Halita R, Jenkins
JM, Mehan S, Apostolu S, Winqvist R,
Callen DF, Prockop DJ, Peltonen L, y
Kadler KE (1996) Molecular cloning, expression and
chromosomal localization of a human gene encoding a 33 kDa putative
metallopeptidase (PRSMI). Gene 174:
135-143
Timpl R (1979) Verfahren zur
radioimmunologischen Bestimmung von Prokollagen (Typ III) und
Prokollagen-Peptid (Typ III), zur Herstellung von
fiir das Verfahren geeignetem Prokollagen-Peptid
(Typ III) und zur Herstellung von
Anti-Prokollagen-Peptid (Typ
III)-Serum. European Patent AppL 000490A1
Timpl R, Brocks D, Neubauer
H, y Strecker H (1983) Verfahren zur getneinsamen
irnmunologischen Bestimrnung von Prokollagen-Peptid
(Typ III) und Prokollagen-Peptid Coll (Typ III) und
Verfahren zur Herstellung von
Anti-Prokollagen-Peptid Coll (Typ
III)-Serum. European Patent Appl. 0089008A2
Uitto J, Murray LW, Blumberg
B, y Shamban A (1986) Biocheinistry of collagen in
diseases. Ann. Int. Med. 105: 740-756
Tabla
1
hP5 (molde que se extiende desde la
secuencia de secreción a la región del telopéptido)
P1 y P5
| \hskip0,3cm P1: | 5'-CGCG GGT ACC AAG GGG AGC TGG CTA CTT CTC–3' |
| \hskip0,3cm P5: | 5'-CGCG AAG CTT AGG ATA GCC TGC GAG TCC TCC–3' |
4.5.2 (secuencia de cDNA entera)
P3 y P14
| \hskip0,3cm P3: | 5'-CGCG GGT ACC CAG GAA GCT GTT GAA GGA GGA–3' |
| \hskip0,3cm P14: | 5'-CGCG AAG CTT GGG AGA ATA GTT CTG AGG AC–3' |
Clon6 (deleción N-terminal
de 30 aminoácidos adyacentes C-terminalmente a la
secuencia guía de secreción)
PP11 - 2 y P14
| \hskip0,3cm P11-2: | 5'-CGCG CTG CAG TGT GAC TCA GGA TCC GTT CT–3' |
| \hskip0,3cm P14: | 5'-CGCG AAG CTT GGG AGA ATA GTT CTG AGG AC-3' |
2.8.6 (deleción C-terminal
de 21 aminoácidos adyacentes N-terminalmente al
sitio de escisión con N-proteinasa)
P3 - 2 y P12
| \hskip0,3cm P3: | 5'-CGCG GGT ACC CAG GAA GCT GTT GAA GGA GGA-3' |
| \hskip0,3cm P12: | 5'-CGCG AAG CTT AGG GGA CCC TGG TTG TCC T-3' |
Tabla
2
- PIIINP 4.5.2
- Met-Arg-Gly-Ser-His-His-His-His-His-His-Gly-Ser-Ala-Cys-Glu-Leu-Gly-Thr-Gln-Glu-Ala-Val- Glu-Gly-Gly-...
- PIIINP 2.8.6
- Met-Arg-Gly-Ser-His-His-His-His-His-His-Gly-Ser-(Ala)-(Cys)-Glu-Leu-Gly-Thr-Gln-Glu-Ala-(Val)-Glu-Gly-Gly-...
- PIIINP clon6
- Met-Arg-Gly-Ser-His-His-His-His-His-His-Thr-Asp-Pro-His-Ala-Ser-Ser-Val-Pro-Arg-Val-Asp- Leu-Gln-...
La tabla 2 muestra los resultados de la
secuenciación N-terminal de las proteínas de fusión
diana His del PIIINP. Los aminoácidos de la secuencia del colágeno
se imprimen en letras negritas.
Los aminoácidos que no eran directamente
discernibles en el procedimiento pero cuya presencia se puede
inferir de los resultados de los ciclos de secuenciación
posteriores se imprimen entre paréntesis.
La tabla 3 resume los resultados de los ensayos
de ELISA que mide la reactividad de los dos anticuerpos monoclonales
contra 4.5.2 recombinante y contra las proteínas de deleción.
Las secuencias de aminoácidos N-terminales eran
idénticas en todos los casos hasta el comienzo de la secuencia del
colágeno. La proteína de control, la PIIICP4.1, era una proteína de
fusión diana 6xHis idéntica a las proteínas del PIIINP en su
secuencia de no colágeno N-terminal y se usó para
determinar que los anticuerpos no se dirigían contra la secuencia
diana His.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
La tabla 4 muestra los resultados de las
mediciones de las concentraciones de sueros del PIIINP realizados
con el ensayo Orion comercialmente disponible y con el ELISA
sándwich usando el anticuerpo monoclonal mAb 35J23 y el suero
anti-PIIINP policlonal. Los ensayos están en
excelente acuerdo (r = 0,94). La tercera columna describe las
concentraciones del PIIINP calculadas según se estimó con el ensayo
ELISA sándwich.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
La tabla 5 muestra los resultados las mediciones
de las concentraciones de sueros del PIIINP en sueros de pacientes
con enfermedades hepáticas fibróticas. Los pacientes se clasificaron
según la clasificación clínica de niños. Las mediciones se
realizaron con ELISA sándwich con el anticuerpo monoclonal mAb
35J23 y el suero anti-PIIINP policlonal (Biodesign,
Reino Unido). Los ensayos se calibraron con sueros donde la
concentración del PIIINP se determinó con el estuche Orion RIA y
ELISA Sándwich usando el mAb 35J23 y el antisuero
anti-PIIINP policlonal. La correlación entre la D.
O. en el ensayo ELISA y los valores de estuche Orion era excelente
(r = 0,76, datos no mostrados aquí.).
La figura 1 muestra la secuencia de cDNA
N-terminal de preprocolágeno (III) que se extiende
más allá de la región telomérica. Las diferentes localizaciones de
los cebadores descritas anteriormente se indican mediante flechas
que apuntan en la dirección de la extensión de las cadenas de
polinucleótidos.
La figura 2 muestra esquemáticamente las regiones
de cDNA codificadas por cada una de las construcciones hP5,
4.5.2, 2,8.6 y clon6.
La figura 3 muestra los resultados de las
mediciones de las concentraciones en suero del PIIINP realizadas con
el ensayo de Orion comercialmente disponible y su correlación con
los resultados del ELISA sándwich con el anticuerpo monoclonal mAb
35J23 y el antisuero policlonal anti-PIIINP. Los
ensayos estaban en excelente acuerdo (r = 0,94).
La figura 4 muestra la relación entre las
absorciones medidas con el ensayo ELISA sándwich con el anticuerpo
monoclonal mAb 35J23 en combinación con el suero policlonal
anti-PIIINP y las concentraciones de recubrimiento
del PIIINP monomérico recombinante (4.5.2).
\vskip0.333000\baselineskip
<110> Bayer AG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<120> Anticuerpo monoclonal y ensayo para
detectar PIIINP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<130> MoAb y ensayo para detectar
PIIINP
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<140> 98109688.6
\vskip0.333000\baselineskip
<141>
1998-05-28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<160> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 519
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 173
\vskip0.333000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Primer
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Descripción del organismo
desconocido: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcgggtacc aaggggagct ggctacttct c
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Descripción del organismo
desconocido: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcgctgcag tgtgactcag gatccgttct
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Descripción del organismo
desconocido: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 5
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcgaagctt aggggaccct ggttgtcct
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Descripción del organismo
desconocido: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 6
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcgggtacc caggaagctg ttgaaggagg a
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<220>
\vskip0.333000\baselineskip
<223> Descripción del organismo
desconocido: artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcgaagctt aggatagcct gcgagtcctc c
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.333000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 8
\sa{Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly
Ser Ala Cys Glu Leu}
\sac{Gly Thr Gln Glu Ala Val Glu Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.333000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 9
\sa{Met Arg Gly Ser His His His His is His Gly
Ser Ala Cys Glu Leu}
\sac{Gly Thr Gln Glu Ala Val Glu Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.333000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 10
\sa{Met Arg Gly Ser His His His His His His Thr
Asp Pro His Ala Ser}
\sac{Ser Val Pro Arg Val Asp Leu Gln}
\newpage
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.333000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 11
\sa{Gly Ser Pro Gly Pro Pro Gly Ile Cys Glu Ser
Cys Pro Thr Gly Pro}
\sac{G1n Asn Tyr Ser Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.333000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 12
\sa{Ile Cys Glu Ser Cys Pro Thr Gly Gly Gln Asn
Tyr Ser Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.333000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.333000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.333000\baselineskip
<213> Poliqueto polinoide "Axial
Seamount"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
<400> 13
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcgaagcct gggagaatag ttctgaggac
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (5)
1. Anticuerpo monoclonal dirigido contra un
epítopo dentro de la mayor parte de los 30 aminoácidos
N-terminales del PIIINP humano.
2. Anticuerpo monoclonal como se ha descrito en
1. caracterizado por la unión preferencial al PIIINP
trimérico.
3. Anticuerpo monoclonal inducido contra un
oligopéptido con la secuencia N - Gly - Ser - Pro - Gly - Pro - Pro
- Gly - Ile - Cys - Glu - Ser - Cys - Pro - Thr - Gly - Pro - Gln -
Asn - Tyr - Ser - Pro - C o una subsecuencia del dominio Col2 del
PIIINP.
4. Uso de un anticuerpo como se ha descrito en 1.
y 2. como un anticuerpo de captura y un anticuerpo como se ha
descrito en 3. como un anticuerpo detector en un inmunoensayo
sándwich que detecta el PIIINP intacto.
5. Inmunoensayo con un anticuerpo descrito en 1.
y 2. solo o en combinación con otros anticuerpos dirigidos contra
el PIIINP que detecta específicamente el PIIINP trimérico.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP98109688 | 1998-05-28 | ||
| EP98109688 | 1998-05-28 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2216518T3 true ES2216518T3 (es) | 2004-10-16 |
Family
ID=8232014
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES99926319T Expired - Lifetime ES2216518T3 (es) | 1998-05-28 | 1999-05-17 | Anticuerpo monocional y ensayo para detectar el propeptido n-terminal del procolageno iii (piiinp). |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7541149B1 (es) |
| EP (1) | EP1086135B1 (es) |
| AT (1) | ATE260298T1 (es) |
| AU (1) | AU4362399A (es) |
| DE (1) | DE69915059T2 (es) |
| DK (1) | DK1086135T3 (es) |
| ES (1) | ES2216518T3 (es) |
| PT (1) | PT1086135E (es) |
| WO (1) | WO1999061477A2 (es) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10053870A1 (de) * | 2000-10-31 | 2002-05-08 | Burchardt Elmar Reinhold | Procollagen (III)-Propeptide und verwandte Substanzen zur Behandlung von fibrotischen Erkrankungen |
| US9404932B2 (en) | 2007-11-05 | 2016-08-02 | Nordic Bioscience A/S | Pathology biomarker assay |
| EP2538218A3 (en) * | 2007-11-05 | 2013-04-24 | Nordic Bioscience A/S | Biochemical markers for CVD risk assessment |
| DK2770327T3 (en) | 2009-03-30 | 2017-08-28 | Nordic Bioscience As | BIOMARKERING ASSAY FOR FIBROSE |
| CN102020715B (zh) * | 2010-10-22 | 2012-09-05 | 上海贝西生物科技有限公司 | 一种抗ⅲ型前胶原氨基末端肽单克隆抗体及其用途 |
| GB201306792D0 (en) * | 2013-04-15 | 2013-05-29 | Nordic Bioscience As | PIIINP Neo-epitope assay |
| EP3411716A1 (en) | 2016-02-03 | 2018-12-12 | Nordic Bioscience A/S | Combined biomarker measurement of fibrosis |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE1163385B (de) * | 1966-11-22 | 1964-02-20 | Olympia Werke Ag | Magnetkopfanordnung |
| DE2816841A1 (de) * | 1978-04-18 | 1979-10-31 | Max Planck Gesellschaft | Radioimmunologische bestimmung von prokollagen (typ iii) und prokollagen- peptid (typ iii) |
| DE3209149A1 (de) | 1982-03-13 | 1983-10-06 | Hoechst Ag | Verfahren zur gemeinsamen immunologischen bestimmung von prokollagen-peptid (typ iii) und prokollagen-peptid col 1 (typ iii) und verfahren zur herstellung von anti-prokollagen-peptid col 1 (typ iii)-serum |
| US5679583A (en) | 1987-05-02 | 1997-10-21 | Hoechst Aktiengesellschaft | Monoclonal antibodies for the selective immunological determination of intact procollagen peptide (type III) and procollagen (type III) in body fluids |
| ATE89862T1 (de) * | 1987-05-02 | 1993-06-15 | Hoechst Ag | Monoklonaler antikoerper zur selektiven immunologischen bestimmung von intaktem prokollagen peptid (typ iii) und prokollagen (typ iii) in koerperfluessigkeiten. |
| DE3714634A1 (de) * | 1987-05-02 | 1988-11-17 | Hoechst Ag | Verfahren zur selektiven immunologischen bestimmung von intaktem prokollagen peptid (typ iii) und prokollagen (typ iii) in koerperfluessigkeiten und mittel zu dessen durchfuehrung |
| GB2208865B (en) | 1987-08-19 | 1991-12-11 | Farmos Group Ltd | Purified propeptide of procollagen type iii, antibody to the propeptide and assay method using the antibody. |
| ES2065350T3 (es) * | 1988-04-27 | 1995-02-16 | Hoechst Ag | Anticuerpo monoclonal para la determinacion immunologica selectiva de peptido (tipo iii) intacto y procolageno (tipo iii) en liquidos corporales. |
| US5512283A (en) * | 1990-07-06 | 1996-04-30 | Allergene, Inc. | Methods for the selective suppression of an immune response to dust mite der Pi |
| DE69125992T2 (de) * | 1990-09-14 | 1997-08-21 | Tosoh Corp | Verfahren und Kit für Immunoassay |
-
1999
- 1999-05-17 DK DK99926319T patent/DK1086135T3/da active
- 1999-05-17 ES ES99926319T patent/ES2216518T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-05-17 WO PCT/EP1999/003392 patent/WO1999061477A2/en active IP Right Grant
- 1999-05-17 PT PT99926319T patent/PT1086135E/pt unknown
- 1999-05-17 US US09/701,313 patent/US7541149B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-05-17 DE DE69915059T patent/DE69915059T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-05-17 EP EP99926319A patent/EP1086135B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-05-17 AT AT99926319T patent/ATE260298T1/de not_active IP Right Cessation
- 1999-05-17 AU AU43623/99A patent/AU4362399A/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1999061477A2 (en) | 1999-12-02 |
| US7541149B1 (en) | 2009-06-02 |
| ATE260298T1 (de) | 2004-03-15 |
| DK1086135T3 (da) | 2004-06-21 |
| EP1086135A2 (en) | 2001-03-28 |
| DE69915059T2 (de) | 2004-08-26 |
| DE69915059D1 (de) | 2004-04-01 |
| WO1999061477A3 (en) | 2000-03-09 |
| PT1086135E (pt) | 2004-07-30 |
| EP1086135B1 (en) | 2004-02-25 |
| AU4362399A (en) | 1999-12-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2647427B2 (ja) | 被検者の病態の判定のための検出方法、モノクロ−ナル抗体および検出キット | |
| ES2369008T3 (es) | Método para detectar probnp con un anticuerpo monoclonal que fija los aminoácidos 42-46. | |
| ES2292426T3 (es) | Metodo para detectar probnp n-terminal. | |
| US5217896A (en) | Monoclonal antibodies recognizing parathyroid hormone-like protein | |
| US5387504A (en) | Monospecific antibodies and assay system for detecting stromelysin cleavage products | |
| KR20120064072A (ko) | 콜라겐 네오에피토프 항체 | |
| ES2216518T3 (es) | Anticuerpo monocional y ensayo para detectar el propeptido n-terminal del procolageno iii (piiinp). | |
| Seetharamaiah et al. | Generation and characterization of monoclonal antibodies to the human thyrotropin (TSH) receptor: antibodies can bind to discrete conformational or linear epitopes and block TSH binding | |
| Lazarova et al. | IgG autoantibodies in patients with anti-epiligrin cicatricial pemphigoid recognize the G domain of the laminin 5 α-subunit | |
| US6025148A (en) | Monospecific antibodies against a subunit of fibrinogen | |
| US6124107A (en) | Assay for marker of human polymorphonuclear leukocyte elastase activity | |
| ES2459290T3 (es) | Anticuerpos monoclonales para la determinación inmunológica selectiva de formas de lamininas de alto peso molecular en líquidos corporales | |
| ES2296634T3 (es) | Ensayo de diagnostico para proteina gla de matriz humana y su utilizacion como biomarcador. | |
| AU2006213411B2 (en) | Antibody for assay of ADAMTS13 activity and method of activity assay | |
| ES2207665T3 (es) | Propeptido aminoterminal de procolageno de tipo 1, su anticuerpo y metodo de analisis utilizando el mismo. | |
| WO2008059616A1 (fr) | Anticorps reconnaissant le domaine c de la midkine | |
| EP0913692A1 (en) | An immunoassay for procollagen-III-C-terminal propeptide | |
| KR20000070256A (ko) | 라미닌의 니도겐-결합 도메인에 결합하는 항체, 이의 제조방법및 용도 | |
| JPH02238894A (ja) | エンドセリンに対する抗体およびその用途 | |
| US7629131B2 (en) | Rabbit monoclonal antibodies against mouse/human Id3 proteins | |
| CN101018810A (zh) | 抗滑膜素抗体 | |
| Kudryk et al. | Use of a synthetic homologue of human fibrinopeptide A for production of a monoclonal antibody specific for the free peptide | |
| US20060286609A1 (en) | Rabbit monoclonal antibody against Id1 protein | |
| JP4393210B2 (ja) | 抗体およびその用途 | |
| Schipper et al. | Preparation and characterization of monoclonal antibodies against ornithine decarboxylase |