ES2459290T3 - Anticuerpos monoclonales para la determinación inmunológica selectiva de formas de lamininas de alto peso molecular en líquidos corporales - Google Patents

Abstract

Procedimiento para la preparación de un anticuerpo monoclonal con especificidad por proteínas de la familia de las lamininas y el fragmento de laminina P1 el cual se puede preparar a partir de placenta humana por digestión con pepsina, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal se une al fragmento de laminina P1 y a laminina nativa, intacta, con aproximadamente la misma afinidad, estando excluido un anticuerpo que es producido por la línea celular de hibridoma DSM ACC2181, DSM ACC2180 o DSM ACC2182, caracterizado porque a) animales vertebrados, no humanos, se inmunizan con el fragmento de laminina P1, el cual se puede preparar a partir de placenta humana por digestión con pepsina, b) se obtienen linfocitos de los animales vertebrados inmunizados y se fusionan con células de mieloma, c) se seleccionan los híbridos en cuanto a la presencia del anticuerpo con las propiedades citadas y se clonan, y d) a partir de estos clones se obtiene el anticuerpo, en el que el anticuerpo une las estructuras plegadas nativas de los dominios de laminina P1 de la laminina y en el que el procedimiento se caracteriza porque el anticuerpo se forma por un hibridoma que resulta por fusión de células de una línea celular de mieloma y linfocitos de un animal vertebrado no humano inmunizado con fragmento de laminina P1 de placenta humana y a continuación se selecciona y porque el anticuerpo formado muestra una propiedad de unión a laminina humana purificada y a la forma de elevado peso molecular de la laminina obtenida a partir de suero humano.

Description

Anticuerpos monoclonales para la determinacion inmunologica selectiva de formas de lamininas de alto peso molecular en liquidos corporales. La presente invencion se refiere a un procedimiento para la preparacion de lineas de celulas de hibridoma y a un procedimiento para la preparacion de anticuerpos monoclonales para la determinacion inmunologica selectiva de formas de lamininas de alto peso molecular en liquidos corporales, asi como a un procedimiento para la determinacion inmunologica de laminina. La laminina es una proteina de multiples dominios que se encuentra en todas las membranas basales y que forma complejos con otros componentes distintos, tipicos de la membrana basal tales como, por ejemplo, nidogeno, proteoglicano de heparan sulfato o colageno IV (Timpl, R. (1989) Eur. J. Biochem. 180; 487 a 502). Esta compuesta por tres polipeptidos distintos, unidos por puentes disulfuro. En este caso se forma la estructura de una cruz asimetrica (Figuras 1a y 1b). Recientemente se identificaron muchas variantes estructurales, las cuales se forman por el ensamblaje de 8 subunidades diferentes (conocidas hasta el momento). Para obtener una isoforma de laminina siempre se tienen que reunir polipeptidos de tres clases diferentes de moleculas: una cadena a (anteriormente cadena A), una cadena � (anteriormente cadena B1) y una cadena y (anteriormente cadena B2) (Burgeson, R.E.; et al. (1994) Matrix Biology, vol. 14, 209 a 211). A las lamininas se les atribuye un gran numero de funciones biologicas interesantes tales como, por ejemplo, la influencia sobre el crecimiento celular, la extension celular y el crecimiento de las neuritas, asi como la induccion de procesos de diferenciacion (Timpl, R. (1989) Eur. J. Biochem. 180; 487 a 502). Aun cuando las lamininas son componentes tipicos de todas las membranas basales, las distintas isoformas se caracterizan por una distribucion tisular muy especifica. La merosina, por ejemplo, (= laminina 2; a2,�1,y1) es parte componente de las membranas basales de las celulas de Schwann, de los musculos estriados y de los trofoblastos (Leivo, I.; Engvall, E. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85; 1544 a 1548). Otra variante, la laminina s (= laminina 3; a1,�2,y1) se encuentra en la membrana basal de las sinapsis en las placas terminales neuromusculares, en el endotelio de los vasos sanguineos y en los podocitos glomerulares (Hunter, D.D.; Shah, V.; Merlie, J.P.; Sanes, J.R. (1989) Nature 338; 229 a 234). Un tercer ejemplo, la laminina K (= laminina 6; a3,�1/�2,y1) es especifica de las membranas basales de la piel (Marinkovich, M.P.; Lunstrom, G.P.; Burgeson, R.E. (1992a) J. Biol. Chem. 267; 17900 a 17906). Alli, como componente de los "filamentos de anclaje", se encuentra tambien la kalinina/niceina (= laminina 5, a3,�3,y2) tipica de los tejidos epiteliales (Marinkovich, M.P.; Lunstrom, G.P.; Keene, D.R., Burgeson, R.E. (1992b) J. Cell. Biol. 119; 695 a 703). Para la deteccion de laminina en suero humano fueron desarrollados metodos de determinacion especificos para la diagnosis de diversas enfermedades. Como posibles indicaciones se citan fibrosis/cirrosis hepatica, fibrosis hepatica alcoholica, complicaciones diabeticas de la membrana basal (BM), enfermedades renales, arteriosclerosis inflamatoria cronica/poliartritis cronica y enfermedades tumorales (Kropf. J.; et al. (1991) Clin Chem. 37; 30; Niemela, O.; Risteli, L.; Sotaniemi, E.A.; Ristelli, J. (1985) Eur. J. Clin. Invest. 15; 132 a 137. Katayama, M.; Kamihagi, K.; Hirai, S.; Murakami, K.; Hino, F.; Kate, I. (1992) Br. J. Cancer 65; 509 a 514. Brocks, D.G.; Strecker, H.; Neubauer, H.P.; Timpl, R. (1986) Clin. Chem. 32; 787 a 791. Horikoshi, S.; Koide, H. (1991) Clin. Chim. Acta 196; 185 a 192). Actualmente se pueden adquirir comercialmente tres metodos para la determinacion de lamininas: Procedimiento 1: Un metodo de determinacion de laminina P1 sobre la base de un antisuero policlonal se comercializa por Behringwerke AG bajo la marca registrada "RIA-gnost®" (Brocks, D.G.; Strecker, H.; Neubauer, H.P.; Timpl, R. (1986) Clin. Chem. 32; 787 a 791). Procedimiento 2: Un inmunoensayo EIA para laminina sobre la base de dos anticuerpos monoclonales (TAKARA, Shuzo Co., LTD; Katayama et al., 1992; Katayama, M.; Kamihagi, K.; Hirai, S.; Murakami, K.; Hino, F.; Kate, I. (1992) Br. J. Cancer 65; 509 a 514). Procedimiento 3: Un inmunoensayo enzimatico de una etapa, tipo sandwich, basado en dos anticuerpos monoclonales (Fuji Chemical Ltd.; Iwata, K. (1990) Clin. Chim. Acta 191; 211 a 220). Mientras que en los procedimientos 1 y 3 se utilizan anticuerpos contra el fragmento "Lam P1" resistente a la pepsina, el procedimiento 2 se basa en anticuerpos contra una "laminina nativa", aislada segun el metodo de Wewer et al. (digestion cuidadosa con pepsina en ausencia de EDTA; Wewer, U.; Albrechtsen, R.; Manthorpe, M.; Varon, S.; Engvall, E.; Rouslahti, E. (1983) J. Biol. Chem. 258; 12654 a 12660). A partir del trabajo de Katayama (procedimiento 2) se desprende que el inmunoensayo de TAKARA correlaciona relativamente bien con el RIA-gnost® (Behringwerke) (r = 0,68) aunque en un suero tumoral (pulmonar) se presenta una distribucion de antigeno que se desvia del RIA-gnost®. A saber, segun una cromatografia de filtracion en gel de los anticuerpos dirigidos contra la "laminina nativa" en suero se detectan dos picos de antigeno en la zona de pesos moleculares de 330 a 150 kDa. En virtud de su tamafo, se debe tratar aqui de productos de degradacion de la "laminina serica". El RIA-gnost® (procedimiento 1) diagnostica por el contrario dos picos en el intervalo de 100 a 900 kDa, es decir evidentemente tanto estructuras nativas (intactas) como tambien estructuras degradadas. El reconocimiento comun de estructuras de laminina intactas y degradadas conduce, sin embargo, a inexactitudes en el dictamen diagnostico, puesto que por un lado se pueden solapar el colectivo normal y el colectivo de pacientes y, por otro lado, las fluctuaciones de concentracion en un pico se pueden equilibrar por desplazamientos cuantitativos de signo contrario en el otro pico. Para el inmunoensayo de Fuji (procedimiento 3) no existe cromatografia alguna de un suero. Pero a partir de una electroforesis en gel de SDS y de un borron de inmunotransferencia se observa que los anticuerpos utilizados reconocen en suero normal y en "suero de cirrosis hepatica" una banda de 200 kDa, es decir que evidentemente reaccionan de manera especifica con fragmentos degradados de la laminina.

Iwata, K. describe un inmunoensayo enzimatico de tipo sandwich de una sola etapa para laminina humana utilizando anticuerpos monoclonales (Iwata, K. Clinica Chimica Acta. 191 (1990), 211-220). Anticuerpos monoclonales contra la laminina se describen tambien por Abrahamson D.R. et al. (1989) (Abrahamson D.R. et al. J. Cell Biology (1989), 109, 3477-3491). Katayama et al. (1992) describen, ademas, fragmentos de laminina como marcadores tumorales (Katayama, M. et al. Br. J. Cancer (1992), 62, 509-514).

Frente a esto, es objeto de la presente invencion poner a disposicion un procedimiento para la preparacion de anticuerpos monoclonales que se unan al fragmento P1 de la laminina y a laminina nativa, intacta, con aproximadamente la misma afinidad.

La presente invencion se fundamenta, ademas, en la mision de poner a disposicion un procedimiento para la determinacion inmunologica de laminina nativa en base a los anticuerpos que se han de desarrollar. De este modo, en una determinacion correspondiente, se eliminan las inexactitudes en el dictamen diagnostico, como las que se tuvieron que soportar con los metodos de determinacion conocidos hasta el momento.

El problema se soluciona conforme a la invencion mediante los procedimientos definidos en las reivindicaciones.

Una linea celular de hibridoma de acuerdo con las reivindicaciones se caracteriza preferentemente porque los linfocitos fueron extraidos de ratones de la cepa Balb/c inmunizados con laminina P1, y porque la linea celular de mieloma es la linea celular P3X63AG8.653 del mieloma de raton.

Tres lineas celulares de hibridoma, las cuales presentan las propiedades anteriormente indicadas, fueron depositadas en la Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM) (Coleccion alemana de microorganismos y cultivos celulares), Marscheroder Weg 1b, D-38124-Braunschweig, conforme a las prescripciones del Tratado de Budapest el 12 de julio 1994 con los numeros de deposito DSM ACC2181, DSM ACC2180 y DSM ACC2182.

Estas lineas celulares de hibridoma producen anticuerpo monoclonales que presentan las propiedades de acuerdo con las reivindicaciones en los procedimientos reivindicados, pero no encuentran uso alguno.

Las lineas celulares DSM ACC2181 y DSM ACC2180 de hibridoma producen respectivamente un anticuerpo de la subclase IgG2a, y la linea celular DSM ACC2182 de hibridoma, un anticuerpo de la subclase IG 1. Para la solucion del problema planteado al principio se pone a disposicion un procedimiento para la preparacion de un anticuerpo monoclonal con especificidad por proteinas de la familia de las lamininas y el fragmento de laminina P1 el cual se puede preparar a partir de placenta humana por digestion con pepsina. El procedimiento se caracteriza porque el anticuerpo monoclonal se une al fragmento de laminina P1 y a laminina nativa, intacta, con aproximadamente la misma afinidad, estando excluido un anticuerpo que es producido por la linea celular de hibridoma DSM ACC2181, DSM ACC2180 o DSM ACC2182, caracterizado porque a) animales vertebrados, no humanos, se inmunizan con el fragmento de laminina P1, el cual se puede

preparar a partir de placenta humana por digestion con pepsina, b) se obtienen linfocitos de los animales vertebrados inmunizados y se fusionan con celulas de mieloma, c) se seleccionan los hibridos en cuanto a la presencia del anticuerpo con las propiedades citadas y se clonan,

y d) a partir de estos clones se obtiene el anticuerpo, en el que el anticuerpo une las estructuras plegadas nativas de los dominios de laminina P1 de laminina y en el que el procedimiento se caracteriza porque el anticuerpo se forma por un hibridoma que resulta por fusion de celulas de una linea celular de mieloma y linfocitos de un animal vertebrado no humano inmunizado con fragmento de laminina P1 de placenta humana y a continuacion se selecciona y porque el anticuerpo formado muestra una propiedad de union a laminina humana purificada y a la forma de elevado peso molecular de la laminina obtenida a partir de suero humano.

Ademas de esto, la mision establecida se resuelve por un procedimiento para la determinacion inmunologica de laminina nativa utilizando un anticuerpo estratificado, fijado adhesiva o covalentemente a un material de soporte, y un segundo anticuerpo marcado, el cual reconoce el antigeno unido al anticuerpo estratificado, caracterizado porque el anticuerpo estratificado es un anticuerpo monoclonal conforme a la definicion en una de las reivindicaciones 1 a 4.

Pero, preferentemente, la mision establecida se resuelve por un procedimiento para la determinacion inmunologica de laminina nativa utilizando un anticuerpo estratificado, fijado adhesiva o covalentemente a un material de soporte, y un segundo anticuerpo marcado, el cual reconoce el antigeno unido al anticuerpo estratificado, caracterizado porque el segundo anticuerpo marcado es un anticuerpo monoclonal conforme a la definicion en una de las reivindicaciones 1 a 4.

Los procedimientos para la determinacion inmunologica conformes a la invencion se pueden utilizar especialmente en procedimientos para la diagnosis de enfermedades que van acompafadas de una modificacion del contenido de laminina en los liquidos corporales, para lo cual los liquidos corporales se extraen del cuerpo vivo, pero no se aportan de nuevo a este.

A continuacion se explica la invencion con mas detalle, especialmente las formas de ejecucion preferidas. La invencion se define por medio de las reivindicaciones.

Para la preparacion de los anticuerpos monoclonales se pueden inmunizar animales, especialmente roedores tales como, por ejemplo, ratones, ratas, conejos, cobayas, con laminina P1, que fue aislada segun el metodo descrito en el Ejemplo 1, en presencia de coadyuvantes.

De modo particularmente preferido se emplean ratones, especialmente los de la cepa Balb/c. Con repetidas inyecciones secundarias, por ejemplo en intervalos de 4 a 8 semanas, se refuerza la respuesta inmune. El exito de la inmunizacion se controla por determinacion de la concentracion de anticuerpos especificos con un ELISA, en si conocido por el experto en la materia. Algunos dias antes de la fusion de los linfocitos con una linea celular de mieloma se tratan los animales con laminina P1 sin coadyuvante. Se obtienen linfocitos de los animales y se fusionan con una linea celular de mieloma, la cual puede proceder igualmente de una de las especies animales anteriormente citadas, preferentemente sin embargo de raton, especialmente con la linea celular P3X63AG8.653. Ventajosamente, se fusionan linfocitos con lineas celulares de mieloma de la misma especie. La fusion y el ulterior cultivo de los clones celulares se llevan a cabo de un modo conocido por el experto en la materia, determinandose en el liquido sobrenadante del cultivo celular la concentracion de los anticuerpos especificos mediante ensayos de union inmunologicos. A partir de los clones celulares que se originan en la fusion se seleccionan los clones adecuados para la utilizacion en procedimientos inmunologicos con ayuda de una serie de rastreos expuesta en las Tablas 4 y 5. Se puede trabajar con lineas celulares que se preparan por fusion de linfocitos de ratones de la cepa Balb/c contra laminina P1 la linea celular de mieloma P3X63AG8.653 del raton Los anticuerpos monoclonales de los procedimientos conformes a la invencion pertenecen al grupo de las inmunoglobulinas, preferentemente a la clase de las proteinas IgG, IgA e IgM. Los anticuerpos de la subclase IgG2a e IgG1 se pueden emplear de manera especialmente ventajosa. Los anticuerpos se caracterizan especialmente porque su afinidad para la laminina intacta es aproximadamente igual a su afinidad para el antigeno de inmunizacion fragmento de laminina P1, creado por digestion con pepsina (Tablas 2 y 3). La estrategia de rastreo representada en las Tablas 4 y 5 pone en claro que efectivamente la predominante mayoria de los clones obtenidos por la fusion produce anticuerpos monoclonales, los cuales unicamente reconocen el fragmento artificial de la laminina P1 creado por el tratamiento con pepsina. Con gran probabilidad, estos anticuerpos reaccionan con estructuras inmunogenicas que fueron creadas artificialmente como consecuencia de la escision proteolitica de las cadenas, pero que no se presentan en la estructura nativa de la proteina. Tan solo unos pocos de los anticuerpos monoclonales obtenidos, pero especialmente los anticuerpos descritos a modo de ejemplo, reaccionan con las estructuras nativas, no generadas por digestion con pepsina en los dominios centrales de la laminina.

Para la preparacion y caracterizacion de los anticuerpos conformes a las reivindicaciones es importante que se disponga de una fuente adecuada para la obtencion del antigeno de inmunizacion y de las diferentes variantes estructurales decisivas para el rastreo. La laminina P1 humana asi como diferentes preparados de laminina se purifican a partir de placenta humana, segun los metodos descritos en los ejemplos. A partir de este organo se pueden obtener al menos dos isoformas de laminina diferentes (Brown, C.J.; Wiedemann, H.; Timpl, R. (1994) J. Cell Sci. 107; 329 a 338).

Los anticuerpos se pueden utilizar en diferentes procedimientos inmunologicos tales como, por ejemplo, en los ensayos inmunorradiometricos despues de marcar el anticuerpo de marcado con cloramina T o reactivo de Bolton-Hunter, asi como en otros ensayos de union competitivos y no competitivos tales como los inmunoensayos fluorescentes, enzimaticos, quimioluminiscentes u otros inmunoensayos, incluidas todas las formas de los radioinmunoensayos (Harlow, E.; Lane, D. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH; 2a Ed.; Nueva York; 319 a

359; 553 a 612). En este caso es intrascendente que el anticuerpo estratificado este unido de forma covalente o no covalente a tubitos de poliestireno, esferitas de poliestireno, particulas paramagneticas o materiales activados para columnas de cualquier tipo. Por lo tanto, los anticuerpos monoclonales se pueden emplear en procedimientos inmunologicos para el aislamiento y la caracterizacion, asi como para la determinacion cuantitativa de laminina en tejidos y liquidos corporales. Se procede segun metodos conocidos por el experto en la materia haciendo que una muestra liquida, que contiene laminina, reaccione con uno de los anticuerpos monoclonales conformes a la invencion, ya sea en solucion o preferentemente sobre un soporte solido, y determinando la cantidad de laminina a traves del complejo antigeno-anticuerpo formado. Los productos de degradacion de la laminina en los liquidos corporales, captados hasta el momento conjuntamente o reconocidos exclusivamente en la determinacion inmunologica, no son reconocidos en este inmunoensayo, sino que exclusivamente las estructuras de laminina intactas.

La invencion se explica mas ampliamente en los ejemplos siguientes.

Ejemplo 1 Preparacion de laminina P1 humana (antigeno de inmunizacion)

El antigeno de inmunizacion laminina P1 es un fragmento de la laminina de un tamafo de 200 a 250 kDa, el cual se puede extraer y aislar del tejido placentario despues de una digestion intensiva con pepsina. Este fragmento contiene los dominios internos en forma de bastoncitos (dominios III) de los brazos cortos de las cadenas de laminina a, y y (Risteli, L; Timpl, R. (1981) Biochem. J. 193, 749 a 755). Las tres cadenas de polipeptidos (de las cuales existen varias isoformas) estan unidas entre si por puentes disulfuro y se caracterizan por una estructura identica tridimensional. Tal como se representa en la Figura 1b, en cada uno de los tramos de las cadenas de las subunidades de la laminina se encuentran enfilados linealmente, unos junto a otros, siete a catorce motivos estructurales, los denominados "EGF-like repeats" (repeticiones iguales al factor de crecimiento epitelial), los cuales se caracterizan todos por el mismo motivo de plegamiento. Cada uno de los 50 a 60 aminoacidos de un "EGF-like repeat", debido a una secuencia tipica, fija, de uniones disulfuro, adoptan una estructura en forma de hoja de trebol. A nivel de secuencia, entre los "EGF-like repeats" de las cadenas cortas de laminina existe una identidad > 30 % (Engel, J. (1989) FEBS Lett. 251, N° 1,2; 1 a 7).

El antigeno de inmunizacion de la laminina P1 se preparo tal como se explica a continuacion:

1.

Descongelacion 1,2 kg de placenta humana se descongelaron en 500 ml de agua + IP, a 4°C durante 16 a 20 horas. (IP = inhibidores de proteasas = NEM 1 mM, PMSF 1 mM, PCMB 0,28 mM)

2.

Homogeneizacion Despues de la descongelacion se ajusto el volumen de la tanda a 2,5 l y se homogeneizo con el Ultraturrax durante 3 a 5 minutos. Finalmente, se centrifugo a 6500 x g durante 10 minutos a 4°C .

3.

Lavado El precipitado obtenido se agito 8 veces con respectivamente 1,8 l de NaCl 3 M, Triton X-100 al 0,1%, Tris/HCl 0,02 M, pH 7,4 + IP y, a continuacion, se centrifugo a 6500 x g, 10 minutos, 4°C. Finalmente, el precipitado se agito en agua y se centrifugo de nuevo. El precipitado se extrajo a 4°C durante 64 horas con 3 L de tampon (NaCl 1 M, EDTA 10 mM, Triton X-100 al 1 %, Tris/HCl 0,02 M, pH 8,6 + IP). El material no soluble se separo por centrifugacion a 26000 x g (30 minutos) y se siguio elaborando.

4.

Digestion con pepsina El ultimo precipitado se agito en 3,0 l de acido acetico 0,5 M, EDTA 10 mM, se homogeneizo con el Ultraturrax durante 3 minutos y se siguio agitando durante 2 horas mas. El valor del pH de la tanda se ajusto despues a 2,5 con acido formico. La digestion proteolitica tuvo lugar despues de la adicion de 100 mg de pepsina a 4°C y duro 40 h. Despues de la digestion con pepsina se separaron las turbideces presentes por 30 minutos de centrifugacion a 26000 x g (4°C).

5.

Precipitacion acida con NaCl En el sobrenadante de la centrifugacion (3,16 l) se introdujeron bajo agitacion 366,1 g de NaCl (= 1,9 M) y se siguio agitando durante 2 horas mas. El precipitado formado se separo por centrifugacion del tampon acido a 6500 x g (4°C, 10 min), se disolvio en 1,8 L de NaCl 0,02 M, urea 2 M, Tris/HCl 0,05 M, pH 8,6 y se dializo 7 veces frente a 8 L del mismo tampon. Las turbideces en la solucion se pudieron separar por centrifugacion (30 minuntos, 26000 x g, 4°C).

6.

Cromatografia en Q-sefarosa FF (5x15 cm) Se efectuaron en cada caso 5 separaciones y se aplicaron sobre la columna respectivamente 350 ml de muestra. Condiciones de elucion: Tampon A; NaCl 0,02 M, Tris/HCl 0,05 M, EDTA 1 mM pH 7,4

Tampon B; NaCl 1 M, Tris/HCl 0,05 M, EDTA 1 mM pH 7,4

Caudal: 3 ml/min

Gradiente lineal (90 ml) de NaCl 0,02 a 0,1 M

Gradiente escalonado; 300 ml de tampon con NaCl 0,1 M

450 ml de tampon con NaCl 0,25 M

300 ml de tampon con NaCl 0,5 M

Cada una de las fracciones de la cromatografia se analizaron con ayuda de laminina P1 RIA-gnost® y las fracciones de laminina P1 obtenidas (elucion con NaCl 0,25 M) se agruparon.

7.

Precipitacion con sulfato de amonio El grupo que contiene laminina P1 se diluyo 3:1 con (NH4)2SO4 3 M y se incubo durante 2 horas a 4°C. El precipitado se obtuvo por 30 minutos de centrifugacion a 26000 x g (4°C).

8.

Cromatografia en superosa 6 prep grade 16/50 La proteina precipitada se disolvio en un volumen adecuado de fosfato-Na 50 mM, NaCl 0,15 M, azida de Na al 0,02 % pH 2,0 y se separo en porciones de 2 ml por medio de la cromatografia de filtracion en gel.

Condiciones de elucion: Tampon; fosfato de Na 50 mM, NaCl 0,15 M, azida de Na al 0,02 % pH 2,0 caudal; 1,0 ml/min

Cada una de las fracciones de la cromatografia se analizaron otra vez con ayuda de la laminina P1 RIA-gnost®. Se reunieron las fracciones que contienen laminina de las 25 cromatografias separadas y se les afadio NaOH 2M, de manera que se ajustaba un valor de pH de 8,0. La solucion se mezclo despues 3:1 con una solucion 3 M de (NH4)2SO4 y se incubo durante una noche. El precipitado formado se separo por centrifugacion a 26000 x g (30 minutos, 4°C) y se disolvio en 20 mL de NH4HCO3 0,2 M.

9.

Digestion con colagenasa A la solucion se afadieron aproximadamente 1 mg de colagenasa, asi como una punta de espatula de MgCl2 y CaCl2 y se incubo durante 4 horas a 37°C. La digestion proteolitica se detuvo por adicion de 3 ml de acido formico.

10.

Cromatografia en superosa 6 prep grade 16/50 Despues de la digestion se cromatografio de nuevo tal como se ha descrito anteriormente. Las fracciones positivas en el RIA se diluyeron 3:1 (despues de haber sido ajustadas con NaOH 2 M a un valor de 8,0)con(NH4)2SO4 y en esta forma se conservaron a 4°C.

El precipitado formado se suspendio en (NH4)2SO4 3 M, se distribuyo en 22 porciones de 0,5 mL y se centrifugo en la centrifuga de Eppendorf durante 4 minutos. A partir del sobrenadante de las partes alicuotas se tomaron en cada caso 0,48 mL. La laminina P1 aislada se puede conservar como precipitado de sulfato de amonio a 4°C al menos durante 4 meses sin perdida de contenido.

11.

Rendimiento/calidad Determinacion de la concentracion con laminina P1 RIA-gnost® :

108 600 E (23,9 mg) Caracteristica en el RIA: Curva de inhibicion lineal Enlace-So = 66,9 % 50% interceptado = 1,302 U/ml Suero normal = 1,72 U/ml

Ejemplo 2 Preparacion de la carga I de laminina

Las etapas de lavado y la extraccion tienen lugar tal como se describe en el Ejemplo 1.

En una Ultrasette (300 kDa) la proteina extraida se transvasa a un tampon de urea 2 M, Tris/HCl 0,05 M, NaCl 0,02 M, EDTA 2 mM, pH 7,4 y se aplica sobre una Q-sefarosa FF 60/14. La proteina ligada se puede eluir en NaCl 0,15 M, disuelto en el tampon de aplicacion. El material eluido se concentra nuevamente con la Ultrasette (300kDa) y se cromatografia a traves de una superosa 6 prep. grade 16/50 con un caudal de 1 ml/min en PBS, EDTA 2 mM. Las fracciones que contienen laminina (determinadas con laminina P1 RIA-gnost®) se reunen, se concentran con la Ultrasette y se incuban a la TA con 5000 unidades de benzonasa (pureza II) durante >2h. A continuacion se aplica la muestra sobre una ConA-sefarosa 4B (2,6 x 10 cm) equilibrada con NaCl 0,15 M, Tris/HCl 0,05 M, pH 7,4. Con un caudal de 1 ml/min se puede eluir de nuevo la laminina con metil a-D-manopiranosida 0,4 M en el tampon de equilibrio. Para una purificacion ulterior y con la finalidad de un transvase a un tampon PBS + EDTA 2 mM, el material eluido se cromatografia con una Sephacril S500 Superfine (2,6 x 140 cm, 1 ml/min).

Ejemplo 3 Preparacion de la carga II de laminina

Las etapas de lavado y la extraccion tienen lugar como se describe en el Ejemplo 1.

El extracto de EDTA que contiene laminina se concentra con ayuda de una Ultrasette (300 kDa) hasta 25 ml y al mismo tiempo se traspasa a tampon Tris/HCl 50 mM, MgCl2 1 mM, pH 8,0. A continuacion se incuba a la temperatura ambiente con 5000 unidades de benzonasa durante 2 horas. La solucion asi tratada se conduce despues por una columna de afinidad anti MAK P1, a la cual se habian acoplado covalentemente (segun datos del fabricante) 4 anticuerpos monoclonales diferentes con propiedades de union, tanto a la laminina P1 como tambien a la laminina intacta. Los anticuerpos monoclonales siguientes, caracterizados asi por los autores de la invencion para su diferenciacion, se inmovilizaron en una CNBr-Sepharose 4B (6 ml) activada: A24/2/2 (2,7 mg), A 27/2/1 (1,5 mg), A9/2/1 (0,6 mg) y A 28/1/1 (5,2 mg).

A la columna de afinidad (equilibrada en NaCl 0,1 M, Tris/HCl 0,05 M, EDTA 10 mM, Pefabloc 0,1 M, pH 7,4) se aplican 25 ml de extracto de EDTA con un caudal de 1 ml/min, y despues se eluye con glicina/HCl 0,1 M, pH 2,7. El valor del pH del material eluido se debe neutralizar inmediatamente con ayuda de una solucion Tris 0,8 M, y finalmente se trasvasa a un tampon NH4HCO3 0,1 M + EDTA 2 mM con ayuda de un Macrosep 100 kDa.

Ejemplo 4 Produccion de hibridoma

Ratones de la cepa Balb/c se inmunizan subcutaneamente con 20 Ig de laminina P1 obtenida segun el Ejemplo 1, en presencia de coadyuvante de Freund completo. Al cabo de 4 semanas y al cabo de tres meses se refuerza la reaccion inmune por otra inyeccion subcutanea de 20 Ig de laminina P1 en presencia de coadyuvante de Freund incompleto. Tres dias antes de la fusion se refuerza la respuesta inmune por inyeccion intraperitoneal de otros 100 Ig de laminina P1.

Para la fusion se sacrifican los animales y se aislan las celulas del bazo. En presencia de polietilenglicol se fusionan las celulas del bazo con la linea celular P3X63AG8.653 de mieloma. Por cultivo de la mezcla de fusion en el medio de hipoxantina-aminopterina-timidina durante un espacio de tiempo de dos semanas se seleccionan las celulas hibridas de bazo x P3X63AG8.653. Los clones celulares obtenidos se sublonan multiples veces para conseguir una linea celular estable. Las colonias celulares que se originan se ensayan en diferentes ensayos de union inmunologicos en cuanto a la produccion de anticuerpos. Las lineas celulares originadas a partir de las cuales se obtienen los anticuerpos A27/2/1, A9/2/1 y A33/2/20, nominados asi por los autores de la invencion para su diferenciacion, se han depositado en la Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Merscheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, conforme a las prescripciones del Tratado de Budapest el 12 de julio de 1994 con los numeros de deposito DSM ACC2181, DSM ACC2180 y DSM ACC2182.

Ejemplo 5 Ensayos para la caracterizacion e identificacion de anticuerpos monoclonales especificos

En las Tablas 4 y 5 se representa una secuencia cronologica del rastreo.

La inmunizacion de ratones con laminina P1 conduce a un extraordinario numero de clones de hibridomas productores de anticuerpos. Para encontrar ahora los clones que producen anticuerpos monoclonales contra motivos estructurales que se presentan en los correspondientes dominios de la molecula nativa de laminina, se tuvo que llevar a cabo un rastreo diferencial, en el cual con los metodos mas variados de analisis inmunologicos se puede detectar la union de los anticuerpos monoclonales a estructuras nativas o, respectivamente, naturales. Los anticuerpos que tan solo reaccionaban con la laminina P1 purificada fueron separados inmediatamente. Para llevar a cabo los experimentos se tiene que obtener laminina nativa por extraccion de placenta humana (veanse los Ejemplos 2 y 3). Pero en este caso hay que tener cuidado de que por una purificacion demasiado exhaustiva de una forma de laminina dominante, no se limite demasiado el espectro de las formas de laminina posiblemente presentes. A partir de un trabajo de Brown et al. (Brown, C.J.; Wiedemann, H.; Timpl, R. (1994) J. Cell Sci. 107; 329 a 338) se desprende que a partir de la placenta se pueden obtener al menos dos variantes de laminina diferentes (laminina 2 y laminina 4). Como extremadamente importante parecia ya en las fases tempranas del proceso del rastreo ensayar la reaccion de los anticuerpos monoclonales con las estructuras de laminina presentes en el suero. Para estos examenes se tiene que aislar la laminina serica con ayuda de una columna Sephadex S-400 (1,0 x 30 cm) a partir de aproximadamente 20 ml de suero de personas de ensayo sanas. Los antigenos del suero eluyen de la columna en dos anchos picos, conteniendo el pico 1 estructuras antigenas con pesos moleculares > 600 kDa. El pico 2 contiene productos de degradacion de la laminina serica con pesos moleculares en el orden de magnitud del antigeno de inmunizacion (aprox. 200 kDa) y, respectivamente, fragmentos menores. En el transcurso del rastreo se seleccionan tan solo los anticuerpos (clones) que, junto a su propiedad de unirse a la laminina humana purificada procedente de la placenta, manifiestan tambien una buena reaccion con la "laminina serica", preferentemente con la forma de alto peso molecular. Otro criterio de seleccion es la capacidad de unirse al antigeno a la par con un segundo anticuerpo monoclonal. En la Tabla 6 se demuestra, con ayuda del ejemplo de algunos anticuerpos monoclonales de la misma inmunizacion, como los elementos individuales del rastreo (veanse las Tablas 4 y 5) en su aspecto conjunto hacen posible una caracterizacion y seleccion de los anticuerpos monoclonales conformes a la invencion. La Tabla 7 recopila los ensayos, que apuntaban a analizar las propiedades de union a la laminina serica en comparacion con los estandares reconocidos.

Ejemplo 6 Marcacion radiactiva de los anticuerpos monoclonales A 27/2/1 y A 9/2/1

0,2 ml de una solucion con 40 Ig de los anticuerpos monoclonales en tampon fosfato 0,05 M, pH 7,4, se disponen previamente en un tubito para ensayo de poliestireno (12 x 55 mm) y se mezclan con solucion de Na 125I de 100 MBq, tamponada con tampon fosfato 0,5 M, pH 7,4. Despues de la adicion de 50 Il de una solucion acuosa de 20 Ig de cloramina T se mezcla durante 1 minuto. A continuacion, se finaliza la reaccion de yodacion por adicion de 50 µl de una solucion acuosa de 20 µg de disulfito de sodio.

El Na 125I sin reaccionar se separa a continuacion de los anticuerpos monoclonales marcados con 125I por cromatografia en un intercambiador de aniones o en una cromatografia de filtracion en gel PD-10. Los anticuerpos purificados, marcados con 125I, tienen una actividad especifica de 5 a 12 mCi/mg (180 a 450 MBq/mg).

Ejemplo 7 Recubrimiento de los tubitos para ensayo con anticuerpos

Para la fijacion del anticuerpo monoclonal A27/2/1 a los tubitos de pioliestireno (12 x 75 mm) se incuban en cada tubito 0,5 ml del anticuerpo monoclonal A27/2/1 en una concentracion de 20 Ig/ml en PBS durante 20 horas a la TA. Despues de filtrar con succion la solucion de anticuerpos se bloquea con 1 ml de PBS/1 % BSA durante 1 hora a la TA. Despues de filtrar son succion la solucion, los tubitos se pueden guardar en la nevera.

Ejemplo 8 Ensayos inmunorradiometricos

Variante de ensayo 1: A27/2/1 -125I A9/2/1

En los tubitos recubiertos se pipetean respectivamente, a 17 hasta 25°C, 50 Il de muestra o 100 Il del estandar y se completan con 150 Il de PBS/Tween. Despues de 2 horas de incubacion se filtran con succion y se lavan 2 veces. A continuacion se afaden 200 Il de 125I A9/2/1 y se incuba de nuevo durante 2 horas a la TA. Despues de filtrar con succion y despues de dos etapas de lavado se puede determinar en el contador-y la actividad ligada.

Variante de ensayo 2: A27/2/1 -125I A33/2/20

En los tubitos recubiertos se pipetean respectivamente, a 17 hasta 25°C, 200 Il de muestra o de estandar. A continuacion se afaden 200 Il de marcador y se incuba durante 4 horas a la TA. Despues de filtrar con succion y de dos etapas de lavado se puede determinar en el contador-y la actividad ligada.

Antigeno estandar

Como estandar se emplea laminina P1 del kit de RIA-gnost® Lam-P1 (Behringwerke AG, Marburg). Con ello, los dos ensayos tienen una magnitud de referencia comun y se pueden comparar bien entre si y con la Lamp P1 RIA-gnost®.

Ejemplo 9 Determinacion de la distribucion de pesos moleculares de las muestras estandar y los antigenos que reaccionan con los procedimientos de ensayo descritos, en sueros normales asi como en sueros patologicos

Laminina P1, laminina humana (carga II), asi como diferentes sueros se fraccionan segun el peso molecular con ayuda de una columna de Sepharose S-400. Despues se examina la distribucion de las magnitudes de antigeneidad de la laminina con ayuda de los procedimientos de ensayo inmunorradiometricos. En el caso de un grupo de suero normal los resultados se comparan con la Lam P1 RIA-gnost®. En las Figuras 2 a 4 se muestran los cromatogramas de los estandares y de un grupo de suero normal.

Dimension de la columna : 1,0 x 30 cm Tampon de elusion: PBS + Tween-20 al 0,04% + azida de Na al 0,02% Caudal: 0,2 ml/min

La calibracion de la columna se efectuo con los marcadores de pesos moleculares tiroglobulina (670 kDa), inmunoglobulina (156 kDa), ovalbumina (44 kDa) y mioglobina (17 kDa).

En las Figuras 5 a 7 se representan sueros individuales de pacientes con patologia hepatica alcoholica, PBC (cirrosis biliar primaria) y CAH (hepatitis cronica activa).

La Figura 8 muestra un Semidry Blot (semiseco) segun la prescripcion estandar con un sistema tampon discontinuo

5 despues de la separacion de aproximadamente 1 Ig de laminina carga II (Ejemplo 3) por electroforesis en gel SDS (gel acabado Novex 4 a 12 % de poliacrilamida) bajo condiciones reductoras (+ SH) y, respectivamente, no reductoras (-SH). La membrana de nitrocelulosa se corto en tiras y las tiras individuales se incubaron con los anticuerpos monoclonales A9/2/1, A27/2/1 y A33/2/20. Como segundo anticuerpo se utilizo fosfatasa alcalina antiraton (Sigma A 5153).

10 Es evidente que con los ensayos conformes a la invencion se obtienen motivos de distribucion de antigeno tipicos y en cada caso caracteristicos. Esto es un claro indicio de que los dos procedimientos de determinacion inmunologicos reconocen especificamente diferentes formas de laminina.

15 Ademas de esto, se puede ver que los anticuerpos monoclonales no presentan reaccion alguna con las estructuras desnaturalizadas formadas por reduccion. Por consiguiente, los anticuerpos monoclonales conformes a la presente invencion reconocen especificamente los motivos estructurales plegados de forma nativa de los dominios de la laminina-P1.

20 Ejemplo 10 Determinacion de las propiedades para union a diferentes preparados de laminina/laminina P1

Para poder estimar someramente que estructuras de laminina son reconocidas por los dos ensayos, se examinaron diferentes preparaciones de laminina. La siguiente Tabla no permite ciertamente clasificaciones univocas, pero

25 indica claramente que los dos ensayos enlazan determinadas variantes con prioridades diferentes (afinidades). La pregunta de cual de las isoformas de la laminina puede ser reconocida por los metodos de ensayo descritos no se puede aclarar mediante los datos mostrados. Una solucion de este problema solo seria posible si varias isoformas (en su forma nativa) estuvieran presentes de manera purificada.

Determinacion de la concentracion en %, referida A27/A9 A27/A33 a la concentracion total de proteinas de la muestra Laminina (Chemicon; Wewer 1983) �); 2,7 1,4 Merosina (Chemicon; Ehrig 1990) ��); 35,8 13,3 Laminina humana, purificacion vease Ejemplo 2 21,4 2,8 Laminina humana, purificacion vease Ejemplo 3 59,8 80,4 Lam-P1: RIA-gnost® Standard 7; % de union referido a los computos empleados 64,9 % 35,4 %

�) Wewer, U.; Albrechtsen, R.; Manthorpe, M.; Varon, S.; Engvall, E.; Burgeson, R.E. (1983a) J. Biol. Chem. 258; 12654 a 12660).

��) Ehrig, K.; Leivo, 1.; Argraves, S.W.; Ruoslahti, E.; Engvall, E.;1990 Proc. Natl. Acad: Sci. USA 87; 3264 a 3268).

30 Ejemplo 11 Reacciones cruzadas

La Tabla 8 muestra que en los dos nuevos ensayos de laminina no son detectables reacciones cruzadas dignas de

35 mencion en relacion con proteinas sericas y proteinas del tejido conjuntivo humano, seleccionadas. Igualmente, tampoco se pudo detectar ninguna reaccion cruzada en relacion con laminina/nidogeno y laminina P1 del tumor EHS del raton.

Ejemplo 12 40 Determinacion de los contenidos en suero, promediados, en colectivos de pacientes con diferentes enfermedades

Se analizaron diferentes colectivos sericos conforme a las prescripciones del Ejemplo 8, con ayuda de los ensayos inmunoradiometricos conformes a la invencion. Los resultados de las determinaciones cuantitativas se recopilan en las Tablas 9 a 17. Las dos variantes de analisis diagnostican en las indicaciones de enfermedades hepaticas 45 alcoholicas, PBC (cirrosis biliar primaria), CAH (hepatitis cronica activa), cirrosis hepatica descompensada, cirrosis de origen desconocido, asi como en sueros tumorales niveles incrementados de laminina, y en la indicacion de diabetes se encuentran contenidos de laminina claramente disminuidos. Con ayuda de las correlaciones de los ensayos conformes a la invencion con respecto a la Laminina P1 RIA-gnost®, indicadas en las Tablas, se ve claramente que los dos procedimientos inmunologicos se diferencian entre si y que los dos ensayos discrepan del

50 RIA-gnost® en cuanto a su dictamen diagnostico. Con ello se confirma el efecto descrito en el Ejemplo 9 -una diferencia en el motivo de distribucion del antigeno.

Abreviaturas

EDTA: �cido etilendiamino-tetraacetico NEM: N-etilmaleinimida PBS: Solucion salina tamponada con fosfato (solucion tampon PM 16, Serva) PCMB: Sal sodica del acido 4-hidroximercurio-benzoico PMSF: Fluoruro de fenilmetilsulfonilo

Productos quimicos, enzimas Colagenasa, Worthington (CLSPA) Pepsina, Boehringer Mannheim (N° 108057) Benzonasa, Merck Darmstadt (N° 1654)

Todos los productos quimicos utilizados se especificaban con "p.A." (para analisis); se adquirieron de las razones sociales Riedel d.H. y Merck.

Medios de separacion Q-Sepharose® FF, Pharmacia Superose® 6 (16/50), Pharmacia Ultrasette® (300 kDa), Filtron Sepharose® activada con BrCN, Pharmacia ConA-Sepharose® 4B, Pharmacia Sephadex® S-400, Pharmacia

Aclaraciones en cuanto a las Tablas 1 a 3:

Examenes BIAcore

Con el sistema BIAcore® de la razon social Pharmacia Biosensor se pueden seguir on-line las interacciones bioespecificas. El principio de la medicion se basa en un fenomeno optico (resonancia de plasmon de superficie), el cual sufre la influencia de la masa unida a una pelicula de oro. Expresado de manera simplificada, en el caso de este sistema se trata de una cromatografia de afinidad miniaturizada sobre la superficie de un sensor de oro. La cantidad de un ligando especifico unido se puede representar fotograficamente en forma de una sefal de resonancia (Chaiken, I.; Rose, S.; Karlsson, R. (1992) Anal. Biochem. 201; 197 a 201. Karlsson, R. Altschuh, D.; van Regenmortel, M.H.V. (1992) Measurement of antibody affinity, en: Structure of Antigens; CRC Press (van Regenmortel, ed); Boca Raton, Fl.; 127 a 148).

1.

Rastreo directo sobre laminina P1 inmovilizada

La laminina P1 se inmovilizo sobre un chip sensor conforme a las instrucciones del manual del usuario con una concentracion de 200 Ig/ml en acetato de Na 10 mM, pH = 4,0. Para la regeneracion de la matriz de afinidad de la Lam-P1 se puede llevar a cabo un impulso doble con 4 Il de HCl 100 mM. La capa de laminina P1 es extremadamente estable y se puede utilizar durante 2 meses (> 300 analisis individuales) sin perdida de calidad. Para el rastreo en busca de potentes anticuerpos se condujeron directamente 4 a 25 Il del sobrenadante del cultivo de las respectivas colonias celulares sobre la matriz de afinidad, al cabo de 1 a 5 minutos se puede reconocer la union (fuerza relativa) en el RU y en la constancia de la sefal. Esto permite una seleccion rapida y al mismo tiempo de fuerte expresion de los clones interesantes. Inyecciones sucesivas con diferentes sobrenadantes de cultivos sin regeneracion intermedia hacen posible el rastreo de anticuerpos que se pueden unir al mismo tiempo a diferentes epitopos del antigeno.

2.

Determinacion de las subclases

Los sobrenadantes de hibridomas se condujeron sobre la capa de lam P1 del chip de BIAcore® tal como se ha descrito anteriormente. Tras la union del anticuerpo (caudal de la muestra) se inyectaron despues secuencialmente en cada caso 4 Il de anticuerpos de las subclases especificas anti-raton. Un incremento de la sefal es nuevamente la expresion de una union reciproca. Con ello, en el espacio de 5 minutos es posible una clasificacion univoca de la subclase.

3.

Determinacion de la concentracion

Para una union selectiva y reversible de anticuerpos de raton se puede inmovilizar sobre el chip sensor del BIAcore® un anticuerpo especial (Fc-especifico Rabbit anti mouse (anti-raton de conejo); RAM-Fc) con ayuda de un metodo estandar. Puesto que la sefal del sistema de medida depende directamente de la masa del ligando unido, es posible llevar a cabo determinaciones de concentracion, sobre todo cuando el material estandar y la muestra que se ha de analizar tienen pesos moleculares iguales. La determinacion de la concentracion de una proteina especifica es incluso posible en mezclas complejas, puesto que como en el ejemplo anterior por la especificidad de la union solo se capta en el chip sensor la masa del ligando deseado. Con ayuda de un anticuerpo monoclonal bien caracterizado (MAK 238), existente en el laboratorio, se creo una curva estandar para la determinacion de la cantidad de anticuerpos presente en los liquidos sobrenadantes del

5 cultivo (= rendimiento de la sintesis del clon). A traves de la curva estandar las sefales promediadas a partir de determinaciones dobles de muestras desconocidas (sobrenadantes de cultivos) se pueden convertir por calculo en concentraciones (Ig/ml de anticuerpos monoclonales). Para la elaboracion de esta serie de mediciones tan complejas y largas, el sistema BIAcore se sirve de un programa de randomizacion de manera que se niegan las fuentes de fallos que se podrian producir por la solicitacion de la matriz de afinidad o por los diferentes tiempos de

10 permanencia.

4. Screening en cuanto a las propiedades de union a la laminina humana

En virtud del tan solo escaso enriquecimiento de la laminina humana en la preparacion (laminina carga I) no se pudo

15 llevar a cabo ninguna inmovilizacion directa (como, por ejemplo, en el caso de Lam-P1). Por lo tanto, se tuvo que construir una matriz de afinidad que estuviera en condiciones de pescar la laminina a partir de la solucion heterogenea. Sobre el RAM-Fc inmovilizado (vease mas arriba) se ligaron anticuerpos especificos de los sobrenadantes de los cultivos y, con ello, se crearon matrices de afinidad (no covalentes) para la laminina humana. Sobre estas capas

20 especificas se pudo conducir la muestra de laminina. En el caso de un reconocimiento, se podia observar un nuevo incremento de la sefal.

5. Determinacion de las constantes de union

25 Con el sistema BIAcore® es posible determinar cuantitativamente la union de ligandos (Chaiken, I.; Rose, S.; Karlsson, R. (1992) Anal. Biochem. 201; 197 a 201. Karlsson, R. Altschuh, D.; van Regenmortel, M.H.V. (1992) Measurement of antibody affinity, en: Structure of Antigens; CRC Press (van Regenmortel, ed); Boca Raton, Fl.; 127 a 148), puesto que la fase de asociacion, el ajuste del equilibrio de union y la fase de disociacion se pueden representar como procesos separados en el tiempo. El software del instrumento hace posible una conversion

30 relativamente sencilla de los datos de la medicion en los correspondientes calculos de tablas. Para la determinacion de las constantes de union se tiene que conducir (por ejemplo) un anticuerpo especifico (una purificacion previa no es absolutamente necesaria) en varias diluciones sobre la matriz de afinidad. Durante la fase de asociacion el programa proporciona en intervalos definidos por el usuario los valores de RU y la pendiente actual de la curva, de manera que es posible un trazado de la pendiente/R. La constante de asociacion kas se puede

35 determinar si las pendientes de esta funcion para todas las concentraciones analizadas se relacionan con las actuales concentraciones presentes (en nM). En el experimento, la fase de disociacion se prolonga extremadamente en el caso de la concentracion maxima de anticuerpos. A partir del dato InR1/Rn frente al tiempo se puede obtener la constante de disociacion kdis. La constante de equilibrio KD se obtiene a partir de la formula kas/kdis.

40 Tabla 1:

Subclase

Union de laminina humana (BlAcore) Union de laminina serica pico 1 (de elevado peso molecular) Union de laminina serica pico 2 (de bajo peso molecular)

A27/2/1

IgG 2a 534 RU 19,5 Ig/ml (1 9,6 Ig/ml (1

A9/2/1

IgG 2a 601 RU 20,5 Ig/ml (2 2,4 Ig/ml (2

A33/2/20

IgG 1 154 RU 12,3 Ig/ml (2 1,9 Ig/ml (2

1) Procedimiento IRMA con RIA-Ak (= IgG policlonal de conejo; base para el RIA-gnost®) como anticuerpo estratificado y A27/2/1 yodado. 2) Procedimiento IRMA con A27/2/1 como anticuerpo estratificado y A9/2/1, A33/2/20 yodado.

Tabla 2: Tabla 3:

Propiedades fisicas -constantes de union A) Constantes de union a una matriz de afinidad de Lam P1

A27/2/1

A9/2/1 A33/2/20

kas (1/Ms)

2,972x105 2,303x 105 1,72x105

kdis 1/s)

6,71x10-6 8,699x10-6 1,28x10-6

KD (1/M)

4,43x1010 2,65x1010 1,35x1010

B) Constantes de afinidad a una matriz de afinidad de laminina humana

A27/2/1

A9/2/1 A33/2/20

kas (1/Ms)

1,25x105 4,54x105 4,74x104

kdis 1/s)

en 30 min no medible l

KD (1/M)

- - -

Propiedades fisicas -constantes de union Constantes de union a una matriz de afinidad de MAK A27/2/1

Lam-P1:

Laminina� Laminina��

kas (1/Ms)

8,64x103 1,14x105 1,20x105

kdis 1/s)

2,24x10-4 1,52x10-4 1,17x10-4

KD (1/M)

3,85x107 7,49x108 1,03x109

� Laminina humana purificada tal como se describe en Metodos �� Laminina humana purificada por cromatografia de afinidad en un coctel de anticuerpos monoclonales

A partir de las tres tablas se deduce que los tres anticuerpos monoclonales poseen unas propiedades de union muy buenas, sobre todo que los anticuerpos se caracterizan por una union muy fuerte al antigeno inmovilizado. En el caso de la capa de laminina, por ejemplo, no se puede detectar una disociacion en ninguno de los anticuerpos

5 durante el espacio de tiempo del analisis (30 min). No obstante, si se conduce antigeno disuelto, por ejemplo sobre una capa de A27/2/1, entonces la asociacion tiene lugar con una cinetica rapida invariable (kas1,2x105 /Ms). Pero entonces se anexiona una clara fase de disociacion, de manera que se puede determinar una constante de equilibrio de aproximadamente 1x109 para la union de la laminina. De manera interesante, las constantes de union a la Lam P1 se diferencian en el factor 1000 en funcion de que la

10 LamP1 se presente inmovilizada (localmente en alta concentracion) o que tenga que ser ligada a partir de la solucion. Este efecto podria ser la base para el reconocimiento exclusivo del pico de alto peso molecular (laminina serica intacta) en el suero humano (vease mas abajo).

Tabla 4

Estrategia del rastreo para anticuerpos mk. anti LamP1/Laminina

Etapas de rastreo

Metodo de ensayo/criterio de seleccion Seleccion

Inmunizacion

Determinacion del titulo

Fusion � hibridomas

Rastreo con ELISA en cuanto a Lam P1 CRITERIOS DE SELECCI�N: Reconocimiento de Lam-P1 en ELISA (altura de los OD) Crecimiento de los clones en el cultivo celular 150 pos. clones

1. Seleccion Cultivo en placas para cultivo de 24 pocillos

Rastreo con ELISA en cuanto a Lam-P1 y respecto a un extracto de placenta humana enriquecido con laminina CRITERIOS DE SELECCI�N: fuerte union a Lam-P1 y/o reaccion positiva sobre laminina 56 pos. clones

2. Seleccion Primera caracterizacion bioquimica Individualizacion de los clones positivos (por clon aprox. 10-20 subcolonias) Segunda caracterizacion bioquimica

Determinacion de las subclases con rastreo BIAcore (exclusion de IgM) con electroforesis en gel SDS, Western-Blot, tincion inmune CRITERIOS DE SELECCI�N: Reaccion con laminina no reducida y/o con laminina reducida Determinacion de las subclases con rastreo BIAcore (exclusion de IgM) con electroforesis en gel SDS, transferencia Western, tincion inmune CRITERIOS DE SELECCI�N: Reaccion con laminina no reducida y/o con laminina reducida 18 pos. clones

Estrategia del rastreo para anticuerpos mk. anti LamP1/Laminina

Etapas de rastreo

Metodo de ensayo/criterio de seleccion Seleccion

3. Seleccion

11 pos. clones

Caracterizacion con BlAcore

Examen de la union de Lam-P1 ( fuerza relativa) Examen de la union de laminina ( fuerza relativa) Determinacion de las subclases (unidades de tipos de diferentes clones valoracion cualitativa de las cineticas de asociacion y disociacion CRITERIOS DE SELECCI�N: Union de maxima fuerza a Lam-P1 Union a laminina de extracto de placenta Exclusion de IgM (en 2 casos) clones con maximo rendimiento de sintesis Union simultanea al antigeno con otros anticuerpos monoclonales

4. Seleccion

5 pos. clones

Reaccion con suero

Deteccion de la forma serica de alto peso molecular (RIA) �Alta afinidad al antigeno serico"� (RIA) Primera etapa del desarrollo de los analisis (Tabla 5)

5. Seleccion Tercera caracterizacion bioquimica

Electroforesis, transferencia Western, tincion inmune Determinacion de las constantes de union con BIAcore Elaboracion de las condiciones de purificacion para anticuerpos monoclonales 3 pos. clones

Tabla 5

Primera etapa del desarrollo de los ensayos

Reconocimiento del antigeno serico

Ensayos de recubrimiento

Con ayuda de un procedimiento de

Produccion y purificacion de Diferentes tubitos RIA se

tubo recubierto sobre la base del

los anticuerpos monoclonales recubrieron con los anticuerpos

antisuero policlonal de RIA-gnost®

a escala de 1-5mg seleccionados (4a seleccion),

LamP1. Los 5 anticuerpos

como sonda para la union

monoclonales seleccionados (4a

superficial se utilizo LamP1

seleccion) se emplearon como

yodado. Optimacion del tampon

segundos anticuerpos yodados.

de recubrimiento y de las condiciones de bloqueo

Antigenos de ensayo: laminina serica purificada (alto p. mol. y formas de bajo p. mol.); LamP1 estandar de RIA-gnost® LamP1; Sueros normales Criterios de seleccion para ensayos con tubo recubierto: Reconocimiento de LamP1 estandar, suero laminina (alto p. mol.) clara reaccion con suero normal Autenticidad de la dilucion del ensayo

Produccion de A27/2/1 y A9/2/1 (escala 100mg) � mejor candidato como anticuerpo estratificado = A27/2/1 B2 Optimacion de los tiempos de incubacion, intervalos de incubacion, tampon, volumen serico para 3 variantes con tubo recubierto

Continuacion de las condiciones de ensayo para tres procedimientos con tubo recubierto Anticuerpos estratificados = A27/2/1 Segundo anticuerpo = A9/2/1 B2

= A33/2/20 = IgG policlonal anti LamP1

MEDICIONES DEL ENSAYO con el procedimiento de los tres tubos recubiertos

Determinacion de la distribucion del antigeno en sueros normales Determinacion de los contenidos normales Ensayos en cuanto a reactividades cruzadas Aplicacion en distintas indicaciones

Tabla 6

Caracterizacion de los anticuerpos monoclonales anti laminina P1 La determinacion de la concentracion y la determinacion de las subclases se efectuo con BlAcore.Los valores en la columna "ELISA" se indican como OD a 405 nm.En las columnas "Blot" -SH significa no reducido, +SH reducido, + + + reaccion muy potente, + + reaccion potente, + reaccion clara, -ninguna reaccion. Para losestudios de union en el BIAcore se emplearon respectivamente dos cargas de laminina P1 (C. 1, C. 2) y laminina (C. 1, C. II).En la columna "pares" se indican los anticuerpos o, respectivamente, clones que con los anticuerpos especificados en la columna 1, se pueden unir al mismo tiempo a la laminina P1.

Caracterización de los anticuerpos monoclonales anti laminina P1

Anticuerpos

Conc. Ig/mg Subtipo ELISALam-P1: Laminina (S) BorronLaminina - SH Laminina + SH BIAcore C.1,25Il Lam P1 C. 2,4Il C. 2,25Il Lamina H C.1 C. 2 Pares

27/1/1

10 1.57 1.061 +++ - 191 RU 584 RU A9/1/7A24/1/13; A25/1/2

A 27/1/2

20.9 1.224 0.942 638 RU

A 27/1/7

10.1 (5.2) IgG2a 1.488 1.058 231 RU 613 RU A50/1/4

A 27/1/8

12.8 IgG2a 1.503 1.038 +++ + + 650 RU 291

A 9/1/7

23.6 IgG2a 1.544 1.147 +++ debil 514 RU 1050 RU 332 A27/1/7A25/1/2A50/1/4

A 9/1/12

12.1 IgG2a 1.289 0.906 418 RU 774 300

A 9/1/4

11.3 1.556 1.046 794 309

A 9/1/9

31.0 1.559 1.141 (1:3)661 323

A 24/1/13

10.8 IgG2a 1.319 1.628 +++ debil 833 RU 345 RU 737 RU + A33/1;A27/1/7A25/1/2

A 24/1/5

21.3 1.266 0.922 280 A50/1/5A33/1/1A50/1/4

A 24/1/23

21.5 1.782 0.854 276

A 25/1/2

IgG2a:IgG1 2.079 2.125 ++(1:500) - 410 RU 443 RU 331/1/10 + - A24/1/6; A27/1/1A50/1/4

A/35/1/2

12.9 IgG1 0.816 0.01 debil + 148 RU 48 RU 129 RU

A/33/1/3

14.1 IgG1:IgM 1.004 0.122 143 RU 404 RU

A 33/1/1

7 IgM 1.214 0.02 debil - 161 RU

A 6/1/7

7 IgM 1.386 1.517 + + debil 622 RU 272 RU +

A 6/1/8

7 lgM:lgG1 1.632 1.46 640 RU 275 RU 495 RU

A 16/1/1

6.0 lgG1 0.561 0.628 debil - 26 RU 77 RU

A 16/1/6

8.6 lgG1 0,76 0.592 35 RU 103 RU

A 41/1/7

9.1 lpG1 0.327 0.416 debil - 6 RU

A 50/1/4

16.3 lgG1 1.289 - 681 RU 947 RU - A9/1/7A24/1/13; A27/1/8

A 50/1/5

16.6 lgG1 1.406 - debil 261 RU 157 RU 185 RU - A24/1/13; A28/1/1

A 48/1/5

18.5 lgG1 0.33 - 241 RU 372 RU

A 46/1/12

38.5 lgG1 0.319 - 380 RU 576 RU - A9/1/7A24/2/2;A27/1/8

A25/1/2

Tabla 7

Criterios decisivos definitivos para la seleccion de clones para el desarrollo de un ensayo

Sandwich con poli K4 (1/93)

Recubrimiento

Diluc./Ig/ml Estandar cpm % union Lam C.l Suero P1 Suero P2 Suero humano cpm

ng/ml

Ug/ml ug/ml ug/ml

200 ul

28/1/1 del 7.6.91

1:20 49 S0 70 10,6 14 1,7 300/90 699

S1 35,6

5632 Suero ensayo 1217

S4 284

29721 52/89 843

S7 2400

79393 51

200 ul

24/2/2 (075)

1:10 12,6 S0 116 5,7 9,6 1,6 300/90 145

S1 35,6

4073 3 Suero ensayo 489

S4 284

22989 16 52/89 172

S7 2400

58777 42

200 ul

27/2/1 (071)

1:10 190 S0 167 19,8 9,9 1,6 300/90 11621

S1 35,6

5155 Suero ensayo 19554

S4 284

30580 52/89 15602

S7 2400

71761 46

1:30 65

S0 193 300/90 (100ul) 11117

S1 35,6

5623

S4 284

29596

S7 2400

66547 47

200 ul

27/2/1 (074)

1:10 26 S0 66 19,3 9,4 1,7 300/90 9234

S1 35,6

4931 3 Suero ensayo 13258

S4 284

25524 18 52/89 13843

S7 2400

63453 45

200 ul

9/2/1 (072)

1:10 10 S0 91 12,7 11 1,3 300/90 1480

S1 35,6

5198 3,6 2995

S4 284

28286 20 1999

S7 2400

63388 45

Criterios decisivos definitivos para la seleccion de clones para el desarrollo de un ensayo

Sandwich con poli K4 (1/93)

"cpm estandar, respec. % de union" comparacion del reconocimiento estandar RIAgnost "Lam Cl" union a la laminina, que fue purificada como se describe en Metodos"Suero P1, Suero P2" antigeno serico de alto peso molecular, respec. antigeno serico de bajo peso molecular; purificado a partir de � 20 ml de suero humano normal "Suero humano" Union del antigeno en sueros humanos de ensayo. Los clones A28/1/1 y A24/2/2 no son adecuados en virtud de la insuficiente reaccion.

Tabla 8

Reacciones cruzadas

Marcador

A9/2/1 B2 A33/2/20

Antigeno

Concentracion de ensayo Recuentos % de union Concentracion recuentos % de union Concentracion

E/ml (Ig/ml)

calculado calculado

LamP1Estandar

00,17/0,0371,43/0,3112/2,64 289414032050142523 0,182,620,289,9 10216061306651264 0,091,4111,545

colageno 1 (Chemicon)

51 607340 0,380,21 807287 0,710,25

Colageno III(Chemicon)

51 331316 0,210,2 138114 0,120,1

Colageno IV(Chemicon)

51 527333 0,330,21 120114 0,110,1

Colageno V(Chemicon)

51 614455 0,390.29 241232 0,210.2

Colageno VI (Chemicon)

6.61,32 378533 0,240.34 262161 0.230,14

Fibronectina (Chemicon)

51 413463 0.260,29 141148 0,120,13

Fibrinogeno (Sigma)

51 367279 0.230,18 171151 0,150,13

Col.VI a3NtDr. Timpl

3,30,66 349381 0,220,24 148130 0,130,11

NC 1Aislado propio

51 330407 0,210.26 122174 0,110,15

7S (DE10)Aislado propio

51 303311 0,190,2 159132 0,140,12

7S (DE6)Aislado propio

51 271336 0,170,21 160230 0,140,2

EHS-LNDr. Timpl

71,4 279306 0,180,19 186250 0,160,22

EHS-LamP1 Dr. Timpl

6,81,36 466381 0,290,24 270282 0,240,25

Laminina (Chemicon) Merosina (Chemicon)

6,731,35 182104290 11,52,7 0,176 Ig/ml0,039 Ig/ml 4009974 3,520.86 0,095 Ig/ml

51

12786735812 80,722,6 2,05 Ig/ml 0,36 Ig/ml 254685632 22,34,9 0,68 Ig/ml 0,13 Ig/ml

Tabla 9:

Valores normales:

n�

Valor medio E/ml Mediana E/ml

RIA-gnost® Lam-P1

126 1,32 � 0,18 1,31

A27/2/1 - J A9/2/1

23 0,864 � 0,212 0,849

A27/2/1-A33/2/20

24 0,073 � 0,038 0,065

Tabla 10:

Cirrosis biliar primaria

n�

Valor medio E/ml Mediana E/ml Incremento comparado con valor normal Correlacion con RIA-gnost® r2

RIA-gnost® Lam-P1

42 2,28 � 0,57 2,41 1,72

A27/2/1 - J A9/2/1

42 1,98 � 0,96 2,03 2,29 0,49

A27/2/1-A33/2/20

42 0,45 � 0,4 0,34 6,16 0,28

Tabla 11

Cirrosis hepatica toxica alcoholica

n�

Valor medio E/ml Mediana E/ml Incremento comparado con valor normal Correlacion con RIA-gnost® r2

RIA-gnost® Lam-P1

58 3,14 � 0,98 3,15 2,38

A27/2/1 - J A9/2/1

58 3,71 � 2,08 3,19 4,29 0,69

A27/2/1-A33/2/20

58 0,9 � 0,59 0,69 12,3 0,21

Tabla 12

Hepatitis cronica activa

n�

Valor medio E/ml Mediana E/ml Incremento comparado con valor normal Correlacion con RIA-gnost® r2

RIA-gnost® Lam-P1

26 2,20 � 0,58 2,45 1,7

A27/2/1 - J A9/2/1

26 2,35 � 1,09 2,16 2,7 0,26

A27/2/1-A33/2/20

22 0,53 � 0,45 0,38 7,3 0,05

10 Tabla 13

Cirrosis hepatica descompensada

n�

Valor medio E/ml Mediana E/ml Incremento comparado con valor normal Correlacion con RIA-gnost® r2

RIA-gnost® Lam-P1

23 2,71 � 1,29 2,26 2,05

A27/2/1 - J A9/2/1

19 3,05 � 1,77 2,84 3,53 0,93

A27/2/1-A33/2/20

19 0,664 � 0,556 0,38 9,14 0,41

Tabla 14

Cirrosis hepatica de origen indeterminado

n�

Valor medio E/ml Mediana E/ml Incremento comparado con valor normal Correlacion con RIA-gnost® r2

RIA-gnost® Lam-P1

15 3,25 � 1,03 3,18 2,46

A27/2/1 - J A9/2/1

14 4,52 � 1,99 4,48 5,23 0,43

A27/2/1-A33/2/20

14 1,09 � 0,564 1,14 14,9 0,8

Tabla 15 Tabla 16

Cirrosis hepatica posthepatitis

n�

Valor medio E/ml Mediana E/ml Incremento comparado con valor normal Correlacion con RIAgnost® r2

RIA-gnost® Lam-P1

26 2,96 � 1,03 2,93 2,24

A2712/1-A9/2/1

25 2,82 � 1,3 2,29 3,26 0,35

A2712/1-A3312120

25 0,583 � 0,452 0,45 7,99 0,28

Enfermedades cancerigenas A. Suero de un paciente con carcinoma hepatocelular

RIA-gnost® Lam-P1

A27/2/1 - J A9/2/1 A27/2/1-A33/2/20

Laminina E/ml

3,4 3,6 0,45

Incremento

2,6 4,2 6,2

B. Paciente con cancer de pulmon

Paciente

RIA-gnost® Lam-P1 A27/2/1 - J A9/2/1 A27/2/1-A33/2/20

E/ml

E/ml

E/ml

MC

3,01 1,81 0,183

JV

2,7 1,25 0,054

EU

2,8 2.4 0,200

Tabla 17

Diabetes

n�

Valor medio E/ml Mediana E/ml Discrepancia comparada con valor normal Correlacion con RIA-gnost® r2

RIA-gnost® Lam-P1

78 1,70 � 0,30 1,66 1,3

A27/2/1 - J A9/2/1

80 0,73 � 0,37 0,58 0,84 0,61

A27/2/1-A33/2/20

80 0,057 � 0,064 0,039 0,53 0,05

Se examinaron los sueros de 80 diabeticos asignados de forma estacionaria (32% tipo l, 68% tipo II) con una duracion de la diabetes de 11-14 afos (Stracke, H.; Wiek, K.; G�nzler, V.; Federlin, K. (1993) Die Medizinische Welt 44; 383 a 385), en los cuales se diagnostico quiropatia (36%), retinopatia (48%), neuropatia (66%) y nefropatia (39%).

Claims (8)

1. REIVINDICACIONES

   1. Procedimiento para la preparacion de un anticuerpo monoclonal con especificidad por proteinas de la familia de las lamininas y el fragmento de laminina P1 el cual se puede preparar a partir de placenta humana por digestion con pepsina, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal se une al fragmento de laminina P1 y a laminina nativa, intacta, con aproximadamente la misma afinidad, estando excluido un anticuerpo que es producido por la linea celular de hibridoma DSM ACC2181, DSM ACC2180 o DSM ACC2182, caracterizado porque a) animales vertebrados, no humanos, se inmunizan con el fragmento de laminina P1, el cual se puede

   preparar a partir de placenta humana por digestion con pepsina,

   b) se obtienen linfocitos de los animales vertebrados inmunizados y se fusionan con celulas de mieloma,

   c) se seleccionan los hibridos en cuanto a la presencia del anticuerpo con las propiedades citadas y se clonan,

   y d) a partir de estos clones se obtiene el anticuerpo, en el que el anticuerpo une las estructuras plegadas nativas de los dominios de laminina P1 de la laminina y en el que el procedimiento se caracteriza porque el anticuerpo se forma por un hibridoma que resulta por fusion de celulas de una linea celular de mieloma y linfocitos de un animal vertebrado no humano inmunizado con fragmento de laminina P1 de placenta humana y a continuacion se selecciona y porque el anticuerpo formado muestra una propiedad de union a laminina humana purificada y a la forma de elevado peso molecular de la laminina obtenida a partir de suero humano.

2. 2.

   Procedimiento segun la reivindicacion 1, en el que el anticuerpo monoclonal se caracteriza por la capacidad de unirse, a pares, con otro anticuerpo conforme a la reivindicacion 1.

3. 3.

   Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal se le clasifica en la subclase lgG 2a.

4. 4.

   Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal se le clasifica en la subclase lgG 1.

5. 5.

   Procedimiento para la preparacion de una linea celular de hibridoma, la cual produce un anticuerpo conforme a la definicion en una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque a) se fusionan celulas de una linea celular de mieloma y linfocitos de un animal vertebrado, no humano, inmunizado previamente con laminina P1 y b) se seleccionan hibridos despues de que el anticuerpo producido por el hibrido presente una buena propiedad de union a la laminina de placenta humana purificada y a la forma de elevado peso molecular de la laminina obtenida a partir de suero humano.

6. 6.

   Procedimiento segun la reivindicacion 5, caracterizado porque los linfocitos se extraen de ratones de la cepa Balb/c inmunizados con laminina P1, y la linea celular de mieloma es la linea celular P3X63AG8.653 del mieloma de raton.

7. 7.

   Procedimiento para la determinacion inmunologica de laminina nativa utilizando un anticuerpo estratificado fijado de forma adhesiva o covalente a un material de soporte y un segundo anticuerpo marcado, el cual reconoce el antigeno unido al anticuerpo estratificado, caracterizado porque el anticuerpo estratificado es una anticuerpo monoclonal conforme a la definicion de una de las reivindicaciones 1 a 4.

8. 8.

   Procedimiento para la determinacion inmunologica de laminina nativa utilizando un anticuerpo estratificado fijado de forma adhesiva o covalente a un material de soporte y un segundo anticuerpo marcado, el cual reconoce el antigeno unido al anticuerpo estratificado, caracterizado porque el segundo anticuerpo marcado es un anticuerpo monoclonal conforme a la definicion de una de las reivindicaciones 1 a 4.