JPS6379900A - モノクロ−ナル抗体と検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 「産業上の利用分野」 本発明は、新規なモノクローナル抗体に関するものであ
る。さらに詳細には、ヒトフィブリンのプラスミン分解
物中のＤダイマー、　（ＤＤ）Ｅ＆合体およびヒトフィ
ブリノーゲンのプラスミン分解物中のＤモノマーと特異
的に反応するけれどもフィブリノーゲン、フラグメント
Ｘ、フラグメントＹおよびフラグメントＥと反応しない
１［奇な性質をもつモノクローナル抗体に関するもので
あり、このモノクローナル抗体は血漿中あるいは血清中
のＤダイマー、　（ＤＤ）Ｅ′４複合体の免疫定量法の
ための試薬として有用である。

「従来の技術」 汎発性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）の臨床的診断方法ト
してフィブリノーゲン・フィブリン分解産物（ＦＤＰ　
）の測定が広汎に使用されている。従来ＦＤＰの測定は
抗ヒトフィブリノーゲン抗体を用いｆｃ感作ラテックス
による凝集反応が一般的に使用されている。この方法は
抗体が抗フィブリン抗体であるため、検体として゛血溶
あるいは脱フィブリンした検体を使用することが必須で
ま＊、ｉ＆近、Ｄダイマー％異的なモノクローナル抗体
感作ラテツクスを用いｆｃ凝集反応による血漿、血清中
Ｄグイマー測定法が報告されている。

「発明が解決しようとする問題点」 本発明者らは、血漿中のフィブリノーゲン、フラグメン
トＸおよびフラグメントＹの童に関係な（、Ｄダイマー
、　（ＤＤ）Ｅ複合体量を測定する方法を鋭意検討した
結果、本発明を完成した。

「問題を解決するための手段および原理」すなわち本発
明はヒトフィブリノーゲンのプラスミン分解物中のＤモ
ノマーおよびヒトフィブリンのプラスミン分解物中のＤ
ダイマーと特異的に反応するがフィブリノーゲン、Ｘ、
ＹおよびＥと反応しない性Ｊｘをもつモノクローナル抗
体である。

更に本発明は生物学的試料において、ヒトＤダイマーお
よび（ＤＤ）Ｅ複合体の存在を検出する方法において、
ヒトフィブリノーゲンのプラスミン分解物中のＤモノマ
ーおよびヒトフィブリンのプラスミン分解物中のＤダイ
マーと特異的に反応するがフィブリノーゲン、Ｘ、Ｙお
よびＥと反応しない性ＪＸヲもつモノクローナル抗体を
感作した支持体を前記試料と接触させ、前記Ｄダイマあ
るいは（ＤＤ）Ｅ複合体と前記モノクローナル抗体感作
支持体との凝集物の形成を、前記試料中における前記Ｄ
ダイマー、　（ＤＤ）Ｅｆ複合体の存在の指標として検
出することを特徴とする検出方法である。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明は、近年各方面で行なわれているノ１イブリドー
マによるモノクローナル抗体産生法で得られ几モノクロ
ーナル抗体である。このモノクローナル抗体ｔｉＤダイ
マー、　（ＤＤ）Ｅ複合体およびＤモノマーと特異的に
反応するけれどフィブリノーゲン、フラグメントＸ、、
フラグメントＹおよびフラグメン）Ｅとは反応しない新
奇な性＊’ｔもつ。

また、前記モノクローナル抗体感作ラテツクスは前記モ
ノクローナル抗体と反応する複数の抗原決定基をもつＤ
ダイマー、　（ＤＤ）Ｋｍ合体と凝集反Ｙ６を生じさせ
る、けれども単一の抗原決定基しかも九ないＤモノマー
とは凝集反応を生じさせない。

このような凝集反応における差異に基づいて血漿中Ｄダ
イマー、　（ＤＤＥ）複合体量を測定する。

抗ＤｆイーＹ−、Ｄモノマー、モノクローナル抗体は新
規なマウス・ハイプリドーマをそれぞれ培地またはマウ
スの腹腔内で培養することによって製造できる。ここで
用いるマウス・ハイグリドーマは一般的にはＤダイマー
で免疫し九マウスの膵臓細胞とマウス骨髄腫細胞とを、
Ｋ６’ｈｌ＠ｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｌｌの細胞融合の
基本方法［ｎａ　ｔｕ　ｒｅ第２５６巻４９５頁（１９
７５年）参照〕にニジ細胞融合して製造することが可能
である。詳細には、下記実施例に述べる如くである。

ま九、上記のハイブリドーマを培養する培地としては、
ハイプリドーマの培養に適し几培地であればよく、好適
にはダルベツコ氏変法イーグル氏最小必須培地（Ｄｕｌ
ｂｅｅｃｏ’ｓｍｏｄｉｆ　ｌｅｄ　Ｅ＠ａｇｌｅａｍ
ｉｎｉｍｕｍ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ｍｅｄｉｕｍ以下
ＤＭＥと記す。）にクシ［１ｔｆｆ、Ｌ−グルタミン、
Ｌ−ピルビン酸ｂｘび抗生物ｆＸ（ペニシリンＧとスト
レプトマイシン〕を含む培地が用いられる。

上記のハイブリドーマの培養は、培地中で行なう場合に
は５％Ｃｏ２閾度、３７℃で約３日間、ま友マウスの腹
腔内で培養する場合Ｉ／ｉｃに約１４日間で行なわれる
。

このようにして製造された培養液ま几はマウスの腹水か
ら、蛋白質の単離、ｆｌｒｇｉに一般的に用いられる方
法により、前述のモノクローナル抗体を分離、精製する
ことが可能である。

そのような方法としては、硫安塩析、イオン交換セルロ
ースを用いるイオン又換カラムクロマトグラフィー、分
子篩ｒルを用いる分子篩カラムクロマトグラフィー、プ
ロティンＡ結合多糖ａｔ用いる親和性カラムクロマトグ
ラフィー、透析、凍結乾燥等がある。

「実施例」 以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。

実施例Ｉ Ｄダイマーおよび（ＤＤ）Ｅの調製方法Ｄグイマーのｋ
ｇ法は、主に５ｔｅｐｈａｎｌｅ　Ａ。

０１　＠ＸｉとＡｎｄｒ＠ｉ　Ｚ、　Ｂｕｄｚｙｎｓｋ
ｉの方法、（１９７８）準じて行なった。フィブリノー
ゲン（カビ社、スウェーデン）２０η（１０１ｎ９／ｄ
）に、ヒトトロンビンおよび塩化カルシウムをそれぞれ
終濃度１０単位／ｍｌ　、　１０　ｍＭとなるよう加え
、３７℃、２時間反応させフィブリノーゲンをフィブリ
ンに変換させた。１８，０ＯＯＸＦ、３０分遠心しフィ
ブリンを非凝固性物質から分離し友。フィブリンは２０
−の０．１５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，８）　−
５ｍＭ塩化カルシウム−０，０２％　Ｎ息Ｎ、液に浮遊
させる。

浮遊液にヒトプラスミン（１単位／ｍｔ、ミドリ十字社
〕を１時間毎に０．５−添加し友。１０時間後、アプロ
チニン（Ｍｏｂａｙ　Ｃｈ＠ｍ１ｃａｌ　Ｃｏｒｐ、）
を２００単位加えて分解反応を停止させた。容量１０ゴ
のリジン・セファロースカラムに通過させプラスミンを
除去した。

次に、通過液を前もって５０℃１Ｍトリス塩酸緩衝液（
ｐ）１７．５　）　−０，１５Ｍ塩化ナトリウム−賀α
塩化カルシウム溶液で平衡化したセフ丁ロースＣＬ６Ｂ
（７アルマシャ社、スウェーデン）のカラム（直径２．
６の、長さ９０　ｏｎ　）に充てんし几。前記の浴液で
展開する分子ふるいクロマトグラフィーを行った。分子
量マーカーおよび抗り、抗Ｅ抗血清（ヘキスト社、ドイ
ツ）を用いるオフテロニー法にエフ（ＤＤ）Ｅ複合体の
分ｉｉｈ＋を同定、分離し友。このようにして得られた
（ＤＤ）Ｅ複合体を３Ｍ尿素−５０ｍＭクエン酸（ｐＨ
５，５）の溶液中で３７℃、４時間保温する。次に５０
ｍＭ）！Ｊスス−酸緩衝液（ｐｉ−１７，４ン−２８ｍ
Ｍクエン酸ナトリウム−０，１Ｍ塩化ナトリウム溶液で
平衡化したセフ丁ロースＣＬ−６Ｂのカラム（直径２．
６　ｃｍ　Ｉ長さ９０α）に光てんし、上記の＃欲で展
開し文。分子量マーカーと抗り、抗Ｅ抗血清を用い友オ
クテロニー法により、Ｄダイマー（ＤＤ）分画とＥ、　
（Ｅ）分画を同定、分離した。Ａ　２８０　ｎｍ　＝　
２．０のＤダイマー１０ｄｔ得た。この工うにして調製
し几Ｄダイマーは免疫原として、また抗りダイマーモノ
クローナル抗体韮生性ハイプリドーマ全選別するための
エンデイムイムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ　）用抗涼とし
て使用する。

実施例２ 葎）免疫化した肺臓細胞の調製： 上記のＤダイマー免疫ｍ　’ｆｌ　’Ｍ、　（Ａ　２８
０　ｎｍ　＝２．０　）を等量のフロイント氏完全アジ
ーパントと乳化するまで混合し、その混合液１００μｌ
ｋマウス腹腔内に投与することにエフ免役全行なり九（
第１回免役）。３０日経過後、該マウスに上記の同様の
方法でマウス腹腔内に投与し九（第２回免疫）。

第２回免疫から２１日経過後、Ｄダイマー免疫原溶液（
Ａ２８０ｎｍ＝２．０）を等にの生理食塩水で希釈し、
その希釈＆２００μｌｋ、該マウスの静脈内に投与した
（最終免疫）。最終免疫から３日仙過後、肺臓細胞をマ
ウスから取り出し、細胞融合に使用し几。

（ｂ）　　細胞融合二 無菌的に摘出し几上記の肺臓を、１０〜１５％ウシ胎児
血′ｆｉを含むＤＭＥ培地５−を入れ九シャーレに入れ
る。次に、肺臓金１０〜１５％ウシ胎児血清を含むＤＭ
Ｅ培地約１５ｒ！ｔで還流して肺細胞を流出させ文後、
この肺細胞懸濁液をナイロンメツシュに通す。この肺細
胞を５Ｏｒ：Ｌｔ遠心チューブに集めて５ｏｏｘｙ、１
０分間遠心する。こうして得几ペレットに３〜５−のへ
モライジング溶液（１５５ｍＭ　ＮＨ＆Ｃ１，１０ｍＭ
　ＫＨＣｏ、　、　１　ｍＭ　Ｎａ２ＥＤＴＡｐ）１７
．０）を加え、懸濁させる。０℃で５〜１０分間放置す
ると懸濁液中の赤血球は破壊される。１０〜２０ｒＩＬ
ｔの１０〜１５チウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地を加え
てから遠心分離する。この工うにして得几細胞ペレット
をＤＭＥ培地で遠心法によって洗浄し、生きている牌細
胞数を測定する。

一方、予め培養しておい友マウス骨髄臘細胞（ミエロー
マ細胞）ＳＰ２１０〜Ａｇ１４約２×１０個に１×１０
　伽の上記牌細胞を加え、ＤＭＥ培地中で工く混合し、
遠心分離を行なっ７’（（５００ＸＮ。

１０分間）。その上清を吸引し、ペレットを工く解きほ
ぐし、３８℃に保温しておいｆｃ４０％ポリエチレンダ
リコール４０００溶液０．５ｄｙｆｃ滴下し、遠心チー
−ブ金手で、１分間穏やかに回転することに工ってポリ
エチレングリコール溶液と細胞ペレットを混合させ友。

次に、３８℃に保温しておい７’ＣＤＭＥ培地、３０秒
毎に１−加えてチューブを穏やかに回転させる。この操
作を１０回繰り返しｔ後、２０〜３０１１ｔの１０〜１
５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地を加えて、遠心分離
（５００Ｘ、９゜１０分間）を行なった、上清を除去し
ｔ後、細胞ペレットを１０〜１５チウシ胎児血清を含む
ＨＡＴ培地（ＤＭＥ培地にアミノプテリン４Ｘ１０　　
、チミジン１，６×１０Ｍ、ヒポキサンチンｌＸｌ０　
Ｍになるように添加したもの）で、遠心法に工って２回
洗浄後、４０ｒ！ｔの上記）ＬＡＴ培地に懸濁する。こ
の細胞懸濁液を９６ウエル細胞培養プレートの各ウェル
に２００μｌずつ分注し、３７℃、５％炭酸ガスを含む
炭酸ガス培養器で培１＃を開始した。培養中、２〜３日
間隔で各ウェルの培地を約１００μｌ除き、新たに上記
のＨＡＴ培地を１００μ！力口えることにより）ＬＡＴ
培地培地層殖するハイプリドーマを選択した。８日目頃
から１０〜１５％ウシ胎児血ｆ＃を含むＨＴ培地（ＤＭ
Ｅ培地にチミジン１．６Ｘ１０−５Ｍ、ヒボキサンチン
ｌＸｌ０　Ｍになるように添刀口し九もの）に交換し、
ノ・イブリドーマの増殖を観察するとともに、約１０８
目に、下述のＥＬＩＳＡ法に工υ、抗Ｄモノマーかつ、
Ｄダイマー抗体産生ハイプリドーマをスクリーニングし
た。

（ｃ）　　ハイプリドーマの樹立 ハイプリドーマ培養上清中の産生抗体の有無はＥＬＩＳ
Ａ法により測定した。９６ウエルＥＬ　Ｉ　ＳＡ用プレ
ー）　（Ｉｍｍｕｌｏｎ　［、日本グイナテツク株式会
社）の各ウェルに、前述の精製Ｄダイマー溶液（Ａ２８
０ｎｍ＝０．０５＋生理食゛塩水で希釈した。）を５０
μｌずつ分注し、２５℃で２時間放置した。次に、０．
０５％Ｔｗｅｅｎ　２０−生理食塩水で３回洗浄し次後
、各ウェルに培養上清１ｒ５０μｌ加え、２５℃で１時
間反応させ友。

次にＴｗｅ＠ｎ　２０−生理食塩水で２００倍希釈し友
ペルオキシターゼ結合抗マウス抗体（ダコ社。

ダンマーク）５０μｌを各ウェルに加えた。反応終了後
、０，０５％Ｔｗｓｅｎ　２０−生理食塩水で各ウェル
を３回洗浄し、Ｑ、５ｍ？ｉｌｌアミノアンチピリン、
１０城フエノールおよびｏ、ｏｏｓ％過酸化水素水を含
む浴液２５０μｌを各ウェルに加え、２５℃で３０分間
反応させ各ウェルの４９０　ｎｍにおける吸光産金測定
した。その結果、１９２ウエル中１２ウエルに抗体産生
が認められた。

上記のＥＬＩＳＡ法によって認められ九培養上清中の抗
Ｄダイマー抗体が、Ｄモノマー、フラグメントＸ、フラ
グメントＹ、フラグメントＥおよびフィブリノーゲンと
反応するか否かを上記の抗原を感作し７？：９６ウエル
ＥＬＩＳＡ用プレートを用いて上記と同様の方法で測定
した。その結果Ｄダイマーと反応し几１２ウェルの培養
上清中、ｌウェルの培養上清がＤモノマーと反応し友。

他の１１ウエルの培養上清はＤモノマー、フラグメント
Ｘ、フラグメントＹおよびフィブリノーゲンのすべてに
反応し友。

Ｄダイマー、Ｄモノマーに特異的に反応するウェル中の
ハイプリドーマを２４ウエルプレートに移し、１０〜１
５％ウシ胎児血清を含むＨＴ培地で４〜５日間培養し友
。その後、再度ＥＬＩＳＡ法によＯテ抗Ｄダイマー、Ｄ
モノマー抗体の産生の有無ｋｍ認してから限界希釈法に
エルクローニングし念。限界希釈法はＨＴ培地でノ・イ
ブリドーマが５１し泗となるように希釈した細胞浮遊液
を、予め正常ＢＡＬＢ／Ｃ糸マウスの腹腔細胞がウェル
あたり２Ｘ１０’個分注しである９６ウエルプレートの
各ウェルに１００μノずつ分注した。約１０日後、ＥＬ
ＩＳＡ法に工つて抗Ｄダイマー、Ｄモノマー抗体を産生
ずるハイプリドーマのクローンをスクリーニングした。

その結果、２０個の抗体産生クローンが得られた。

これらのクローンの中から、増殖のよい、抗体分泌能の
高い、しかも安定なりローンを選び、前述と同様の方法
で再クローン化を行い、抗Ｄグイマー、Ｄモノマー特異
的抗体並生ハイプリドーマＤＤ／Ｄ　−１を樹立した。

実験例３（モノクローナル抗体の製造）（インビトロ法
） マウスハイプリドーマＤＤ／Ｄ〜１を１５％ウシ胎児血
ｆｐｔを含むＤＭＥ培地で３７℃、５チ二酸化炭素雰囲
気中７２〜９６時間培養した。培養物を遠心分離後（ｘ
ｏｏｏｏｘ、！７．１０分）後、上清に固形の硫酸アン
モニウム’ｔ−５０％最ｐ：儀度となるように徐々に加
えた。混合物を水冷下３０分間攪拌した後６０分間放置
し、遠心分離（１００００Ｘ、９，１０分〕後、得られ
た沈渣を少量の１０　ｍＭ　ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ８，
０）に溶解し、１０００倍黛の１ＯｍＭリンｒＲ緩衝液
に対して透析した。これを、１０　ｍＭ　！７ン酸緩衝
液ですで−に平衡化したＤＥＡＥ−セルロースのカラム
に充填し几。モノクローナル抗体の溶出は１０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ８，０）と０．２　Ｍ　ＮａＣ１を宮む
Ｉ　Ｑ　ｍＭ　ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ８，０）の間でに
度勾配法により行なった。浴出されたモノクローナル抗
体を限外テ過法で濃縮し、０．１　Ｍ　ＩＪン酸緩衝液
（ｐｉ−１８，０）に対して透析し＊、ウシ血清ｘｇｃ
＊除くために、透析物音やぎ抗クシ血清１　ｇＧ−セフ
ァロース４Ｂの力ジムに通しｆｃ、、次に通過液を０６
１Ｍリン酸緩＠１（ｐｉ”１８．“０）で平衡化したプ
ロティンＡ−セファロース４Ｂのカラムに充填した。カ
ラムをｐ）１３．５の緩衝液で溶出して、精製した抗Ｄ
ダイマー、Ｄモノマー％異抗体ＤＤ／Ｄ−１を得友。

（イン・ビデ法） プリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタ
デカン〕０．５−を１０〜１２迦鈴のＢＡＬ騨糸マウス
の腹腔内に投与後１４〜２０日目のマウス腹腔内にイン
ビトロで増殖させたハイプリドーマＤＤ／Ｄ−１をマウ
ス−匹あた夛２×１０　細胞となるよりに接種した。

一匹のマウスから約ｌＯ〜１５−の腹水が得られ次。そ
の抗体濃度は、５〜１０Ｖ′ゴでおった。

腹水中のモノクローナル抗体の精製は、（但し、ヤギ抗
つシ血清１ｇＧ−セルファロース４Ｂのカラムを通す操
作を除く。）上記のインビトロｆＡｉＲ法と同様の方法
で行なった。

実験例４（モノクローナル抗体の免疫グロブリンクラス
および特異性の同定） 抗りダイマ、Ｄモノマー％異モノクローナル抗体ＤＤ／
Ｄ　−１の免疫グロブリン・クラスをオフテロニー免疫
拡散法により行った。結果は表１にしめす通りである。

実験例５（モノクローナル抗体のに２　ｋ部位の同定）
モノクローナル抗体、ＤＤ／Ｄ−１の認識部位の同定は
ウェスターンブロッティング法によって行なっ九。実験
操作は主に、バイオ−ラッド社、アメリカＺｅｔａ　−
Ｐｒｏｂｅ　Ｂｌｏｔｔｉｎｇ　Ｍｅｗｂｒａｕｅｓ　
ＩｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎＭａｎｎｕａｌ　ＦＣ１９行な
った。実験操作の概要は次のようである。

フィブリノーゲンをＣａ　　あるいはＥＧＴＡの存在下
でデ２スミン処理全行ない、３０分、６０分。

２４時間反応後のフィブリノーゲンの分解物を、ＤＴＴ
　（ジチオスレイトール）存在および非存在下でＳＤＳ
ポリアクリルアミド電気泳動を行なった。

上記の方法でプロッティング、エニデイムイムノアッセ
イを行ない、この結果とＳＤＳポリアクリルアミドゲル
のクマジー・、ブリリアント・ブルー〇−２ｓｏｖｃよ
る蛋白染色の結果から、モノクローナル抗体ＤＤ／Ｄ　
−１の認識部位の同定を行なり穴。

フィブリノーゲンおよび梢ｉＤダイマー、（ＤＤ）Ｅに
対しても上記と同様の方法で行なった。結果は表２に示
すとおりである。

表２　　モノクローナル抗体ＤＤ−１，Ｄ−１，Ｆ−１
の種々な抗原との結合反応性 ＋：結結合反応性万 有二結合反応性、無 以上実験例５の諸結果から本発明のモノクローナル抗体
ＤＤ／Ｄ−１はＤモノマーのＤｅｇｔａ慣域を認識する
こと、ま九上記のモノクローナル抗体の認識する上記の
領域の立体構造はフィブリノーゲン。

Ｘフラグメント、Ｙフラグメントおよび・ａｒｌｙ　Ｄ
とは異なることが明白になった。

「発明の効果」 以上から明らかな如く、本発明によればヒトフィブリン
のプラスミン分解物中のＤダイマー、。

（ＤＤ）Ｅ複合体およびヒトフィブリノーゲンのプラス
ミン分解物中のＤモノマーと特異的に反応するけれども
フィブリノーゲン、フラグメントＸ、フラグメントＹお
よびモノクローナル抗体とヒトＤダイマーおよび（ＤＤ
）Ｅ複合体の存在を検出する方法を提供することができ
る。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒトフィブリノーゲンのプラスミン分解物中のＤ
   モノマーおよびヒトフィブリンのプラスミン分解物中の
   Ｄダイマーと特異的に反応するがフィブリノーゲン、Ｘ
   、ＹおよびＥと反応しない性質をもつモノクローナル抗
   体。
2. （２）フィブリノーゲンＸおよびＹと立体構造的に異な
   るＤモノマーのＤｅｇｔａ領域（Ｄ＿３）を特異的に認
   識する特許請求の範囲第１項記載のモノクローナル抗体
   。
3. （３）生物学的試料において、ヒトＤダイマーおよび（
   ＤＤ）Ｅ複合体の存在を検出する方法において、ヒトフ
   ィブリノーゲンのプラスミン分解物中のＤモノマーおよ
   びヒトフィブリンのプラスミン分解物中のＤダイマーと
   特異的に反応するがフィブリノーゲン、Ｘ、ＹおよびＥ
   と反応しない性質をもつモノクローナル抗体を感作した
   支持体を前記試料と接触させ、前記Ｄダイマあるいは（
   ＤＤ）Ｅ複合体と前記モノクローナル抗体感作支持体と
   の凝集物の形成を、前記試料中における前記Ｄダイマー
   、（ＤＤ）Ｅ複合体の存在の指標として検出することを
   特徴とする検出方法。
4. （４）前記試料中におけるＤモノマーは前記モノクロー
   ナル抗体と反応する抗原決定基を１つだけもつため、前
   記モノクローナル抗体感作支持体と凝集物を形成しえな
   いので凝集物の形成は前記試料中における前記Ｄダイマ
   ー、（ＤＤ）Ｅ複合体の存在に基づくことを特徴とする
   特許請求の範囲第３項記載の検出方法。
5. （５）前記凝集物を、前記試料中における前記Ｄダイマ
   ー、（ＤＤ）Ｅ複合体の定量的尺度として測定する、特
   許請求の範囲第３項又は第４項記載の検出方法。