JP3857468B2 - Dダイマー及びdd/e複合体の免疫学的分析方法及び分析用キット - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒト安定化フィブリンのプラスミン分解産物であるDダイマー及びDD/E複合体(以下、前記Dダイマーと前記DD/E複合体とを併せて、「XDP」と称することがある)の免疫学的分析方法及び免疫学的分析用キットに関する。
【0002】
【従来の技術】
近年、血栓及び/又は塞栓により死亡する基礎疾患が増加する傾向にある。血栓形成の機序には未だに不明なことが多いけれども、血栓形成の臨床診断法は血栓症の増加につれて進歩している。
従来、ヒト安定化フィブリンのプラスミン分解産物であるXDPの定量的測定に抗ヒトフィブリノーゲンポリクローナル抗体を感作したポリスチレンラテックス粒子を用いた凝集法が一般的に用いられてきた。しかし、この方法は、検体中にフィブリノーゲンが混在すると、疑似的にXDPが陽性となる。このような疑似陽性反応をなくすため、検体は完全に脱フィブリノーゲン処理が行なわれることが要求される。けれども、このような操作は非常に煩雑であり、緊急性を要する臨床診断薬として適当でない。
【0003】
そのような観点から、臨床的にはフィブリノーゲンの存在下でも前記のような干渉を受けず、XDPを特異的にかつ簡便に測定するため、モノクローナル抗体を用いた方法及びその試薬が開発され、現在に至っている。しかしながら、臨床の現場において、特にこのような特異的なモノクローナル抗体を感作したラテックス凝集試薬を用いた場合、多数の患者検体の中で、希に分析結果が低値になるケースが認められるようになった。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の課題は、モノクローナル抗体を感作したラテックス凝集法を利用した免疫学的分析方法において、XDPを正確に測定することができる分析方法及び分析用キットを提供することにある。
【0005】
【課題を解決するための手段】
すなわち、本発明は、被検試料と、緩衝液を含む第1試薬とを混合し、次いで、ヒト安定化フィブリンのプラスミン分解産物であるDダイマー及びDD/E複合体と少なくとも結合するモノクローナル抗体を感作したラテックス試薬を含む第2試薬を、更に添加して反応させ、前記反応により生じる凝集を光学的に測定して被検試料中に含まれる前記Dダイマー及びDD/E複合体を免疫学的に分析する方法において、
前記第1試薬にヒトフィブリノーゲンのプラスミン分解産物であるDモノマーを共存させ、前記Dモノマーの濃度が、終濃度として0.15〜2μg/mLであることを特徴とする、前記Dダイマー及びDD/E複合体の免疫学的分析方法に関する。
【0006】
また、本発明は、(1)ヒトフィブリノーゲンのプラスミン分解産物であるDモノマー、及び緩衝液を含む希釈用第1試薬と、
(2)ヒト安定化フィブリンのプラスミン分解産物であるDダイマー及びDD/E複合体と少なくとも結合するモノクローナル抗体を感作したラテックス試薬を含む第2試薬と
を含み、前記Dモノマーの濃度が、終濃度として0.15〜2μg/mLであることを特徴とする、前記Dダイマー及びDD/E複合体の免疫学的分析用キットにも関する。
【0007】
本明細書において、単に「Dダイマー」と称する場合には、前記「Dダイマー」は、ヒト安定化フィブリンのプラスミン分解産物であるDダイマーを意味する。また、単に「DD/E複合体」と称する場合には、前記「DD/E複合体」は、ヒト安定化フィブリンのプラスミン分解産物であるDD/E複合体を意味する。
また、本明細書においては、前記Dダイマー(すなわち、ヒト安定化フィブリンのプラスミン分解産物であるDダイマー)と、前記DD/E複合体(すなわち、ヒト安定化フィブリンのプラスミン分解産物であるDD/E複合体)とを併せて、「XDP」と称する。
更に、本明細書において、単に「Dモノマー」と称する場合には、前記「Dモノマー」は、ヒトフィブリノーゲンのプラスミン分解産物であるDモノマーを意味する。
【0008】
【発明の実施の形態】
本発明の原理は、少なくともヒト安定化フィブリンのプラスミン分解産物であるDダイマー及びDD/E複合体と反応するモノクローナル抗体を感作したラテックス粒子(以下、単に「抗体感作ラテックス粒子」ともいう)を用いて、被検試料中のXDPを分析する逆受身凝集反応である。なお、本明細書において、前記「分析」には、XDPの量を定量的又は半定量的に決定する「測定」と、XDPの存在の有無を判定する「検出」との両方が含まれる。
【0009】
この抗体感作ラテックス粒子は、被検試料中に存在するXDPと抗原抗体反応を起し、凝集を生ずる。従って、前記抗体感作ラテックスの一定量と被検試料の一定量とをスライド板やマイクロタイタープレート上で一定時間混和した後、凝集像の有無あるいは強弱を観察し、被検試料中のXDPの量又は存在の有無を判定することができる。あるいは、抗体感作ラテックスの一定量と被検試料の一定量とを混合し、一定時間後の吸光度の増大を適当な波長で光学的に測定することにより検体中のXDP量を定量することができる。
【0010】
本発明により分析可能な被検試料としては、例えば、液状生体試料、例えば、血液、血漿、血清、又は尿等を挙げることができる。
【0011】
本発明に用いるモノクローナル抗体としては、少なくともXDPと結合するモノクローナル抗体である限り、特に限定されるものではない。本発明においては、前記モノクローナル抗体として、ヒトフィブリノーゲン及び安定化フィブリン塊とは反応せず、XDPと結合するモノクローナル抗体を用いることが好ましい。
【0012】
本発明に用いるモノクローナル抗体は、公知の手段により得ることができる。具体的には、例えば、以下に示すとおりである。
モノクローナル抗体は、所望のモノクローナル抗体を産生するマウスハイブリドーマを、例えば、培地又はマウスの腹腔内で培養することによって製造することができる。ここで用いるマウスハイブリドーマは、一般的には、Dダイマーで免疫したマウスの脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞とを、Kohler及びMilsteinの細胞融合の基本方法[Nature,256,495(1975)参照]により細胞融合して得ることが可能である。
【0013】
前記ハイブリドーマを培養する培地としては、ハイブリドーマの培養に適した培地であればよく、好適にはダルベッコ氏変法イーグル氏最小必須培地(Dulbecco’s modified Eeagle’s minimum essential medium;以下、DMEと称する)にウシ胎児血清、L−グルタミン、L−ピルビン酸、及び抗生物質(ペニシリンG及びストレプトマイシン)を含む培地が用いられる。
前記ハイブリドーマの培養は、培地中で行なう場合には、5%CO2濃度且つ37℃の条件下で約3日間で行なうことができる。また、マウスの腹腔内で培養する場合には、約14日間で行なうことができる。
【0014】
このようにして得られた培養液又はマウスの腹水から、タンパク質の単離及び精製に一般的に用いられる方法により、前記モノクローナル抗体を分離及び精製することが可能である。
そのような方法としては、例えば、硫安塩析、イオン交換セルロースを用いるイオン交換カラムクロマトグラフィー、分子篩ゲルを用いる分子篩カラムクロマトグラフィー、プロテインA結合多糖類を用いる親和性カラムクロマトグラフィー、透析、又は凍結乾燥等を挙げることができる。
【0015】
こうして得られたモノクローナル抗体をラテックス粒子(好ましくはポリスチレンラテックス粒子)に感作して用いる。本発明に使用するポリスチレンラテックス粒子は、市販のものを使用することができ、その粒径は、0.1〜0.8μmであることが好ましい。
感作法は、従来公知の手段を用いることができ、例えば、物理的結合法、あるいは、共有結合させる化学結合法を用いることができる。こうして調製した抗体感作ラテックス粒子は、適当な溶液、例えば、緩衝液中に分散させて保存することができる。
【0016】
本発明の趣旨は、以下の点にある。すなわち、被検試料をまず適当な溶液で希釈した後、抗体感作ラテックス粒子を混合して免疫反応を行なう。このとき用いる希釈液(すなわち、第1試薬)に、人為的に、ヒトフィブリノーゲン由来のD分画(Dモノマー)を共存させて用いることで本発明の目的が達成される。
ここで共存させる前記Dモノマーは、ヒトフィブリノーゲンのプラスミン分解産物であるDモノマーである限り、その調製方法又は入手方法は特に限定されない。例えば、前記Dモノマーとしては、市販品[例えば、FDP−D Monomer(シグマ社)]を用いることもできるし、ヒトフィブリノーゲンをヒトプラスミンで分解し、特異抗体を固定化したカラムで分取及び精製することによっても得ることができる。
【0017】
本発明においては、こうして得たDモノマーを第1試薬に共存させる。その濃度としては、終濃度が好ましくは0.15〜2μg/ml、より好ましくは0.4〜1.5μg/mlとなるように添加する。0.15μg/mlより少ないと、被検試料に含まれるDモノマーの干渉を抑制することが不充分であることがあり、2μg/mlより高いと、ラテックス凝集系自体を抑制してしまうことがある。
【0018】
第1試薬自体は、検体希釈の目的のために用いるものであり、その組成としては、緩衝液をベースにする。また、前記緩衝液に、適宜、界面活性剤を添加することができる。前記界面活性剤としては、非イオン系の界面活性剤、例えば、Tween20又はTritonX100等が好適に用いられる。緩衝液としては、化学的に安定で、金属イオンとの錯形成能が小さく、酸解離定数pKaがpH6〜9の間にある点で、グッドバッファーを用いることが好ましい。前記グッドバッファー以外にも、例えば、トリスバッファー又はリン酸バッファー等を用いることもできるが、前記理由によりグッドバッファーを用いることが好ましい。
【0019】
本発明においては、このように予めDモノマーを含む第1試薬で被検試料を希釈した後に、抗体感作ラテックス試薬を加えて所望の免疫反応を行なう。この反応で生じる凝集は、被検試料中に含まれるXDP濃度依存的に増加するので、凝集像を光学的に検出すれば、XDPを定量することができる。
本発明では、被検試料由来の不確定なDモノマーの影響を、過剰量のDモノマーを予め人為的に共存させておくことで打ち消すことを特徴とする。そのため、測定に使用するモノクローナル抗体の反応特異性によっては、本来の凝集自体が抑制される可能性がある。すなわち、本発明で用いるモノクローナル抗体の反応特異性としては、少なくともXDPと結合する(好ましくはヒトフィブリノーゲン及び安定化フィブリン塊とは反応しない)抗体であれば充分であるが、前記抗体がDモノマーとの反応性を更に有する場合には、反応系に存在するDモノマー(被検試料中に含まれる可能性があるDモノマーも含め)が抗体と反応する。この場合、見かけ上の凝集量は減少するものの、XDPの濃度依存的に凝集量は増加している。
【0020】
本発明においては、第1試薬中に、更に、凝集促進剤、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、又はポリビニルピロリドン等を添加することができる。凝集促進剤を添加すると、低値での凝集が明瞭となるため、測定濃度範囲も低濃度側に拡大される。
【0021】
【作用】
以下、本発明の作用機序について説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
先に、従来技術の説明において述べたように、モノクローナル抗体を感作したラテックス凝集試薬を用いた場合、臨床の現場において、多数の患者検体の中で、希に分析結果が低値になるケースが認められるようになった。種々の原因が考えられるが、その主たる要因としては、従来、体内では1次線溶でのDモノマーの存在はほとんどないという考え方が一般的であったが、近年、医学の進歩、治療及び治療薬の進歩の影響等により、従来では予測し得なかったDモノマーの存在が影響しているものと、本発明者は考えている。
【0022】
この点を更に詳細に説明すれば以下のとおりである。
従来、このような場合に使用され得るモノクローナル抗体については、多くの報告がされており、例えば、Rylatt等[THROMBOSIS RESERCH,31,767−778(1983)]、Soria等[Fibrinogen,Structure;Functional Aspects;Metabolism,227−233(1983)]、又は特公平7−46104号公報等に開示されている。基本的に、XDPを分析するためのモノクローナル抗体としては、少なくともヒトフィブリノーゲン及び安定化フィブリン塊とは反応せず、XDPと結合する抗体を用いる。
【0023】
Marc Hoylaerts等[The Journal of Biological Chemistry,257,2912−2919(1982)]が述べているとおり、線溶酵素のプラスミンは、フィブリン上で効率よく生成されるので、生体内においては、局所のフィブリンのみを分解すると考えるのが一般的である。液相においては、プラスミンの生理的阻害剤であるα2−プラスミンインヒビターが高濃度に存在するので、プラスミンは瞬時に失活され、フィブリノーゲンの分解は起こらないものと考えられていた。従って、Dモノマーと反応するモノクローナル抗体を用いた場合であっても、XDPを測定することにおいては、重要視する必要はなかった。
【0024】
しかしながら、近年、医学の進歩、治療及び治療薬の進歩により、例えば、血栓症患者等の治療に血栓溶解剤が使われるようになり、前記のごとく生理的環境では起こり得ないと考えられていた態様で1次線溶がおこり、Dモノマーを含むフィブリノーゲン分解産物の存在が無視できないようになってきたものと考えられる。すなわち、従来では予測し得なかったDモノマーの存在がラテックス凝集系においてその測定値に影響していると考えられる。
このように、被検試料中にDモノマーが存在した場合、使用するモノクローナル抗体の特性によっては、ラテックス凝集反応に対してDモノマーが干渉し、本来の凝集が抑制されて、本来の値より低値の結果を与えてしまうものと思われる。本発明においては、被検試料由来の不確定なDモノマーの影響を、過剰量のDモノマーを予め人為的に共存させておくことで打ち消すものと、本発明者は考えている。
【0025】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例1】
《抗XDPモノクローナル抗体の製造》
(1)免疫用抗原(Dダイマー)の調製
Dダイマーの調製は、主に、Stephanie A.Olexa及びAndrei Z.Budzynskiの方法[Circulation,Suppl.58,119(1978)]並びにOlexaらの方法[Biochim.Biophys.Acta,576,39−50(1979)]に準じて行なった。
【0026】
すなわち、フィブリノーゲン(カビ社,スウェーデン)20mg(10mg/ml)に、ヒトトロンビン及び塩化カルシウムを、それぞれ終濃度が10単位/ml及び10mMとなるように加え、37℃で2時間反応させることにより、フィブリノーゲンをフィブリンに変換させた。続いて、18000×gで30分間遠心し、フィブリンを非凝固性物質から分離した。得られたフィブリンを、0.15Mトリス−塩酸緩衝液(pH7.8)−5mM塩化カルシウム−0.02%NaN3液20mlに浮遊させた。浮遊液にヒトプラスミン(1単位/ml,ミドリ十字社)を1時間毎に0.5mlずつ添加した。10時間経過後に、アプロチニン(Mobay Chemical Corp.)200単位を加えて分解反応を停止させた。反応液を容量10mlのリジンセファロースカラムに通過させ、プラスミンを除去した。
【0027】
次に、通過液を、前もって50mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)−0.15M塩化ナトリウム−5mM塩化カルシウム溶液で平衡化したセファロースCL6B(ファルマシア社)のカラム(直径2.6cm,長さ90cm)に充填した。平衡化に使用した前記溶液で展開する分子篩クロマトグラフィーを行ない、オクテロニー法によりDD/E複合体の分画を同定及び分離した。
【0028】
このようにして得られたDD/E複合体を3M尿素−50mMクエン酸(pH5.5)溶液中で37℃で4時間保温した。次に、50mMトリス−塩酸緩衝液(PH7.4)−28mMクエン酸ナトリウム−0.1M塩化ナトリウム溶液で平衡化したセファロースCL−6Bのカラム(直径2.6cm,長さ90cm)に充填し、平衡化に使用した前記溶液で展開し、オクテロニー法により、Dダイマー分画を同定及び分離し、A280nm=2.0のDダイマー溶液10mlを得た。
このようにして調製したDダイマー溶液は、以下、免疫原として、あるいは、抗XDPモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを選別するためのエンザイムイムノアッセイ(ELISA)用抗原として使用した。
【0029】
(2)免疫化した脾臓細胞の調製
前記実施例1(1)で調製したDダイマー免疫原溶液(A280nm=2.0)を、等量のフロインド氏完全アジュバントと乳化するまで混合し、その混合液100μlをマウス腹腔内に投与することにより免疫を行なった(第1回免疫)。30日経過後、前記マウスに第1回免疫と同様の方法でマウス腹腔内に投与した(第2回免疫)。第2回免疫から21日経過後、Dダイマー免疫原溶液(A280nm=2.0)を等量の生理食塩水で希釈し、その希釈液100μlを、前記マウスの静脈内に投与した(最終免疫)。最終免疫から3日経過後、脾臓細胞をマウスから取り出し、細胞融合に使用した。
【0030】
(3)細胞融合
無菌的に摘出した前記脾臓を、10〜15%ウシ胎児血清を含むDME培地5mlを入れたシャーレに入れた。次に、脾臓を10〜15%ウシ胎児血清を含むDME培地約15mlで還流して脾細胞を流出させた後、この脾細胞懸濁液をナイロンメッシュに通した。この脾細胞を50ml遠心チューブに集めて500×gで10分間遠心した。こうして得たペレットにヘモライジング溶液[155mM−NH4Cl,10mM−KHCO3,1mM−EDTA−2Na(pH7.0]3〜5mlを加え、懸濁させた。0℃で5〜10分間放置することにより懸濁液中の赤血球を破壊した。10〜15%ウシ胎児血清を含むDME培地10〜20mlを加えてから遠心分離した。このようにして得た細胞ペレットをDME培地で遠心法によって洗浄し、生きている脾細胞数を測定した。
【0031】
一方、予め培養しておいたマウス骨髄腫細胞(ミエローマ細胞)SP2/0−Ag14約2×107個に1×108個の前記脾細胞を加え、DME培地中でよく混合し、遠心分離を行なった(500×g,10分間)。その上清を吸引し、ペレットをよく解きほぐし、38℃に保温しておいて40%ポリエチレングリコール4000溶液0.5mlを滴下し、遠心チューブを手で、1分間穏やかに回転することによってポリエチレングリコール溶液と細胞ペレットとを混合させた。次に、38℃に保温しておいたDME培地を、30秒間に1ml加えてチューブを穏やかに回転させた。この操作を10回繰り返した後、10〜15%ウシ胎児血清を含むDME培地20〜30mlを加えて、遠心分離(500×g,10分間)を行なった。
【0032】
上清を除去した後、細胞ペレットを10〜15%ウシ胎児血清を含むHAT培地(DME培地にアミノプテリン4×10-7M、チミジン1.6×10-5M、及びヒポキサンチン1×10-4Mになるように添加したもの)で、遠心法によって2回洗浄した後、前記HAT培地40mlに懸濁した。この細胞懸濁液を96ウェル細胞培養プレートの各ウェルに200μlずつ分注し、5%炭酸ガスを含む炭酸ガス培養器(37℃)で培養を開始した。培養中、2〜3日間隔で各ウェルの培地を約100μl除き、新たに前記HAT培地を100μl加えることにより、HAT培地中で増殖するハイブリドーマを選択した。8日目頃から10〜15%ウシ胎児血清を含むHT培地(DME培地にチミジン1.6×10-5M及びヒポキサンチン1×10-4Mになるように添加したもの)に交換し、ハイブリドーマの増殖を観察するとともに、約10日目に、後述のELISA法により、抗XDP抗体産生ハイブリドーマをスクリーニングした。
【0033】
(4)ハイブリドーマの樹立
ハイブリドーマ培養上清中の産生抗体の有無をELISA法により測定した。96ウェルELISA用プレート(Immulon II,日本ダイナテック株式会社)の各ウェルに、実施例1(1)で調製した精製Dダイマー溶液(A280nm=0.05,生理食塩水で希釈した)を50μlずつ分注し、25℃で2時間放置した。次に0.05%Tween20−生理食塩水で3回洗浄した後、各ウェルに培養上清を50μl加え、25℃で1時間反応させた。
次にTween20−生理食塩水で200倍希釈したペルオキシターゼ結合抗マウス抗体(ダコ社,デンマーク)50μlを各ウェルに加えた。反応終了後、0.05%Tween20−生理食塩水で各ウェルを3回洗浄し、0.5mMアミノアンチピリン、10mMフェノール及び0.005%過酸化水素水を含む溶液250μlを各ウェルに加え、25℃で30分間反応させ、各ウェルの490nmにおける吸光度を測定し、抗体産生が認められたものをピックアップした。同様にして、ヒトフィブリノーゲン、安定化フィブリン塊、及びDD/E複合体との反応性を確認した。
【0034】
前記ELISA法によって認められた培養上清中の抗XDP抗体中、ヒトフィブリノーゲン及び安定化フィブリン塊とは反応せず、XDPに特異的に反応する2ウェル中のハイブリドーマを24ウェルプレートに移し、10〜15%ウシ胎児血清を含むHT培地で4〜5日間培養した。その後、再度ELISA法によって抗XDP抗体の産生の有無を確認してから、限界希釈法によりクローニングした。限界希釈法は、HT培地でハイブリドーマが5個/mlとなるように希釈した細胞浮遊液を、予め正常BALB/C系マウスの腹腔細胞がウェルあたり2×104個分注してある96ウェルプレートの各ウェルに100μlずつ分注した。約10日後、ELISA法によって抗XDP抗体を産生するハイブリドーマのクローンをスクリーニングした。その結果、10〜20個の抗体産生クローンが得られた。
これらのクローンの中から、増殖性が高く、抗体分泌能が高く、しかも安定なクローンを選び、前述と同様の方法で再クローン化を行ない、抗XDP特異的抗体産生ハイブリドーマXDP−1及びXDP−2を樹立した。
【0035】
(5)モノクローナル抗体の製造(インビトロ法)
マウスハイブリドーマXDP−1を、15%ウシ胎児血清を含むDME培地で37℃且つ5%二酸化炭素雰囲気中において72〜96時間培養した。培養物を遠心分離(10000×g,10分間)した後、上清に固形の硫酸アンモニウムを50%最終濃度となるように徐々に加えた。混合物を氷冷下30分間撹拌した後、60分間放置し、遠心分離(10000×g,10分)し、得られた沈渣を少量の10mMリン酸緩衝液(pH8.0)に溶解し、1000倍量の10mMリン酸緩衝液に対して透析した。これを、10mMリン酸緩衝液で予め平衡化したDEAE−セルロースのカラムに充填した。モノクローナル抗体の溶出は、10mMリン酸緩衝液(pH8.0)と0.2M−NaClを含む10mMリン酸緩衝液(pH8.0)との間で濃度勾配法により行なった。
【0036】
溶出されたモノクローナル抗体を限外ろ過法で濃縮し、0.1Mリン酸緩衝液(pH8.0)に対して透析した。ウシ血清IgGを除くために、透析物をヤギ抗ウシ血清IgG−セファロース4Bのカラムに通した。次に、通過液を0.1Mリン酸緩衝液(pH8.0)で平衡化したプロテインA−セファロース4Bのカラムに充填した。カラムをpH3.5の緩衝液で溶出して、精製した抗XDP特異抗体XDP−1を得た。
これと同様にして抗XDP特異抗体XDP−2も得て、以下の操作に付した。
【0037】
(6)モノクローナル抗体の免疫グロブリンクラスの同定
抗XDPモノクローナル抗体XDP−1及びXDP−2の免疫ブロブリン・クラスの同定をオクテロニー免疫拡散法により行なった。結果は表1に示すとおりである。
【0038】
《表1》
XDP−1 XDP−2
IgG1,κ IgG1,κ
【0039】
(7)モノクローナル抗体の認識部位の同定
モノクローナル抗体XDP−1及びXDP−2の認識部位の同定は、ウェスターンブロッティング法によって行なった。実験操作は主に、Zeta−Probe Blotting Membranes(バイオ・ラッド社,アメリカ)に添付の取り扱い説明書(Instruction Mannual)に従って、行なった。実験操作の概要は以下のようである。
フィブリノーゲンをCa2+の存在下でプラスミン処理し、30分間、60分間、及び24時間反応後のそれぞれのフィブリノーゲン分解物を、ジチオスレイトール(DTT)非存在下でSDSポリアクリルアミド電気泳動した。前記取り扱い説明書に記載の方法でブロッティング及びエンザイムイムノアッセイを行ない、この結果とSDSポリアクリルアミドゲルのクマジー・ブリリアント・ブルーG−250によるタンパク質染色との結果から、各モノクローナル抗体XDP−1及びXDP−2の認識部位の同定を行なった。フィブリノーゲン、精製Dダイマー、及びDD/E複合体に対しても前記と同様の方法で認識部位の同定を行なった。結果は表2に示すとおりである。表2において、「+」は、モノクローナル抗体が分解物を認識することを意味し、「−」は、モノクローナル抗体が分解物を認識しないことを意味する。
【0040】
【0041】
【実施例2】
《感作ポリスチレンラテックス粒子の調製》
モノクローナル抗体XDP−1及びXDP−2をそれぞれ0.5mg/mlの濃度で、10mM−Tris−HCl緩衝液(pH8.00)に溶解して調製した抗体液5mlに、平均粒径0.3μmのポリスチレンラテックス[積水化学工業(株),固形分5%(w/v)]5mlを添加して室温にて60分間撹拌した。
前記混合物に、ウシ血清アルブミン(BSA)を0.3%(w/v)含有する100mM−Tris−HCl緩衝液(pH8.00)を添加し、室温で60分間撹拌した後、前記混合物を20,000rpmで遠心分離した。得られた沈殿物に10mM−Tris−HCl緩衝液(pH8.00)−0.05%NaN310mlを添加し、ラテックスを懸濁させて各抗XDPモノクローナル抗体感作ラテックス試薬を調製した。
【0042】
【実施例3】
《第1試薬の調製(Dモノマー含有緩衝液の調製)》
0.2M−Tris−HCl緩衝液(pH8.00)−0.5%(w/v) BSA−0.15M−NaCl−0.1%EDTA−2Na−0.05%NaN3に、Dモノマー(シグマ社)を1テストあたりの反応時濃度で、0.76μg/mlになるように添加し、第1試薬(すなわち、Dモノマー含有緩衝液)を調製した。
対照試験では、Dモノマーを添加する前の前記緩衝液を、従来法による第1試薬として使用した。
【0043】
【実施例4】
《被検試料中のXDPの測定》
XDP標準品(入手先:ダイアヤトロン)を、0μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml、及び32μg/mlの濃度になるように、それぞれ蒸留水にて溶解し、XDP抗原標準溶液として使用した。また、患者から採取した血漿検体を、検体試料とした。
【0044】
測定は以下に示す手順で実施した。すなわち、検体押しだし液(生理食塩水)80μlで前記の各XDP抗原標準溶液5μlを反応チューブに分注し、そこに更に、前記実施例3で調製した第1試薬(Dモノマー含有緩衝液)180μlを添加し、混合して37℃で約5分間保持した。続いて、この混合液に、前記実施例2で調製した抗XDP抗体感作ラテックス液40μlを添加して撹拌し、約10分間経過するまでの間の吸光度変化を波長950nmにて測定し、検量線を作成した。次に、前記標準溶液5μlの代わりに、検体試料5μlを用いること以外は、前記操作を繰り返し、先に作成した検量線を用いて測定値を求めた。前記吸光度測定は、全自動免疫血清検査システムLPIA−200を用いて行なった。
また、比較試験(従来法)として、前記第1試薬(Dモノマー含有緩衝液)の代わりに、前記実施例3で調製した従来法による第1試薬(Dモノマー不含緩衝液)を用いること以外は、前記操作を繰り返した。
結果を表3に示す。なお、表3に示す数値の単位は「μg/ml」である。表3から明らかなように、本発明方法と従来法とでは、本実施例に用いた検体の結果が異なっていた。
【0045】
【0046】
本発明法と従来法とで結果が異なる前記検体1、2、及び3について、生理食塩水にて1/10〜10/10の10段階に希釈調製したものを検体として、希釈直線性を調べた。その結果を図1〜図3に示す。図1は、モノクローナル抗体XDP−1を用いた場合の検体1に関する結果を示し、以下、同様に、図2は、モノクローナル抗体XDP−1を用いた場合の検体2に関する結果を示し、図3は、モノクローナル抗体XDP−2を用いた場合の検体3に関する結果を示す。図1〜図3において、「黒丸」は本発明方法による結果を表わし、「白丸」は従来法の結果を表わす。
いずれの検体においても、従来法では、正確に測定されていないのに対し、本発明方法では直線性を示し、正確にXDPを測定していることが確認された。
【0047】
【発明の効果】
本発明によれば、被検試料中に存在する可能性のあるDモノマーの影響を受けることなく、XDPを正確に測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】実施例4で実施した本発明方法及び従来法による検体1の測定結果を示すグラフである。
【図2】実施例4で実施した本発明方法及び従来法による検体2の測定結果を示すグラフである。
【図3】実施例4で実施した本発明方法及び従来法による検体3の測定結果を示すグラフである。
Claims (2)
- 被検試料と、緩衝液を含む第1試薬とを混合し、次いで、ヒト安定化フィブリンのプラスミン分解産物であるDダイマー及びDD/E複合体と少なくとも結合するモノクローナル抗体を感作したラテックス試薬を含む第2試薬を、更に添加して反応させ、前記反応により生じる凝集を光学的に測定して被検試料中に含まれる前記Dダイマー及びDD/E複合体を免疫学的に分析する方法において、
前記第1試薬にヒトフィブリノーゲンのプラスミン分解産物であるDモノマーを共存させ、前記Dモノマーの濃度が、終濃度として0.15〜2μg/mLであることを特徴とする、前記Dダイマー及びDD/E複合体の免疫学的分析方法。 - (1)ヒトフィブリノーゲンのプラスミン分解産物であるDモノマー、及び緩衝液を含む希釈用第1試薬と、
(2)ヒト安定化フィブリンのプラスミン分解産物であるDダイマー及びDD/E複合体と少なくとも結合するモノクローナル抗体を感作したラテックス試薬を含む第2試薬と
を含み、前記Dモノマーの濃度が、終濃度として0.15〜2μg/mLであることを特徴とする、前記Dダイマー及びDD/E複合体の免疫学的分析用キット。
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