JP3472138B2 - モノクローナル抗体及びｆｄｐの測定方法 - Google Patents
モノクローナル抗体及びｆｄｐの測定方法Info
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規な２種類のモ
ノクローナル抗体、及びそれらを用いる血漿中のヒトフ
ィブリノーゲン及びヒトフィブリンのプラスミン分解産
物（以下、ＦＤＰという）の測定方法に関する。
ノクローナル抗体、及びそれらを用いる血漿中のヒトフ
ィブリノーゲン及びヒトフィブリンのプラスミン分解産
物（以下、ＦＤＰという）の測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】血液は、生理的状態では血管内を流動し
ており凝血塊を作ることはないが、外傷や動脈硬化等に
より血管壁が障害されると、血液の流動性が失われ、血
小板が付着して凝固反応がはじまる。また、血漿中では
凝固因子が順次活性化されてトロンビンが出現する。こ
のトロンビンはフィブリノーゲンに働き、その分子の一
部を切断しフィブリンモノマーに転化し、フィブリンモ
ノマーは重合して血栓が形成される。一方、血管内に形
成された血栓中のフィブリンは、蛋白分解酵素であるプ
ラスミンの作用を受けて溶解され、流血中にフィブリン
の分解産物が出現する（二次線溶）。また、血漿中のフ
ィブリノーゲンも、抗プラスミン物質により活性が阻害
されていないプラスミンが存在する場合には、その作用
を受けて分解される（一次線溶）。そしてこれら一次線
溶と二次線溶で生じた数種類の分解産物、すなわちＦＤ
Ｐの存在は、血管内で血栓が形成され、それに伴ってそ
の溶解が起こっていること、及び／又は線溶阻害因子の
低下等により血漿中のプラスミンが活性化し、抗プラス
ミン活性を超過していることを推測させる。
ており凝血塊を作ることはないが、外傷や動脈硬化等に
より血管壁が障害されると、血液の流動性が失われ、血
小板が付着して凝固反応がはじまる。また、血漿中では
凝固因子が順次活性化されてトロンビンが出現する。こ
のトロンビンはフィブリノーゲンに働き、その分子の一
部を切断しフィブリンモノマーに転化し、フィブリンモ
ノマーは重合して血栓が形成される。一方、血管内に形
成された血栓中のフィブリンは、蛋白分解酵素であるプ
ラスミンの作用を受けて溶解され、流血中にフィブリン
の分解産物が出現する（二次線溶）。また、血漿中のフ
ィブリノーゲンも、抗プラスミン物質により活性が阻害
されていないプラスミンが存在する場合には、その作用
を受けて分解される（一次線溶）。そしてこれら一次線
溶と二次線溶で生じた数種類の分解産物、すなわちＦＤ
Ｐの存在は、血管内で血栓が形成され、それに伴ってそ
の溶解が起こっていること、及び／又は線溶阻害因子の
低下等により血漿中のプラスミンが活性化し、抗プラス
ミン活性を超過していることを推測させる。
【０００３】したがって、血液中のＦＤＰの測定は、現
在、血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、血栓及び循環障害に
基づく疾患、出血傾向を呈する疾患、線溶活性亢進の著
しい疾患等の診断に広く用いられている。
在、血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、血栓及び循環障害に
基づく疾患、出血傾向を呈する疾患、線溶活性亢進の著
しい疾患等の診断に広く用いられている。
【０００４】ＦＤＰの免疫学的測定法においては、従来
から、抗ヒトフィブリノーゲンポリクローナル抗体をラ
テックス粒子に感作させたラテックス試薬を用いた免疫
学的凝集反応が一般に採用されている。この方法は、全
ての種類のＦＤＰ（トータルＦＤＰ）を測定することが
できるが、検体としてフィブリノーゲンが除去されてい
ない血液、すなわち血漿を用いた場合には、ＦＤＰが存
在していなくても、フィブリノーゲンにより擬似的に陽
性となってしまうので、血清を検体として測定しなけれ
ばならなかった。
から、抗ヒトフィブリノーゲンポリクローナル抗体をラ
テックス粒子に感作させたラテックス試薬を用いた免疫
学的凝集反応が一般に採用されている。この方法は、全
ての種類のＦＤＰ（トータルＦＤＰ）を測定することが
できるが、検体としてフィブリノーゲンが除去されてい
ない血液、すなわち血漿を用いた場合には、ＦＤＰが存
在していなくても、フィブリノーゲンにより擬似的に陽
性となってしまうので、血清を検体として測定しなけれ
ばならなかった。
【０００５】このため、フィブリノーゲンとは反応しな
い性質を有するモノクローナル抗体がいくつか提案され
ており（特公平５−８３２４０号、特公平４−６１６３
９号、特公平５−４８１１９号参照）、それらのモノク
ローナル抗体を用いたＦＤＰの測定法についてもいくつ
か提案されている（特公平５−３８９０６号、特公平５
−３８９０７号、特公平７−４６１０４号参照）。しか
しながら、これらのモノクローナル抗体を用いた方法で
は、特定の分画のＦＤＰを特異的に測定することはでき
ても、トータルＦＤＰを測定することはできなかった。
い性質を有するモノクローナル抗体がいくつか提案され
ており（特公平５−８３２４０号、特公平４−６１６３
９号、特公平５−４８１１９号参照）、それらのモノク
ローナル抗体を用いたＦＤＰの測定法についてもいくつ
か提案されている（特公平５−３８９０６号、特公平５
−３８９０７号、特公平７−４６１０４号参照）。しか
しながら、これらのモノクローナル抗体を用いた方法で
は、特定の分画のＦＤＰを特異的に測定することはでき
ても、トータルＦＤＰを測定することはできなかった。
【０００６】一方、生体試料中の微量成分を測定する場
合、最近は機器を用いて数種類の検査項目を同時に自動
的に測定する方法が広く普及しており、血液凝固系ファ
クターの検査における検体としては、ほとんどの場合に
血漿が用いられているのが現状である。したがって、ト
ータルＦＤＰの測定においても、検体として血漿を用い
る測定方法の開発が強く望まれていた。
合、最近は機器を用いて数種類の検査項目を同時に自動
的に測定する方法が広く普及しており、血液凝固系ファ
クターの検査における検体としては、ほとんどの場合に
血漿が用いられているのが現状である。したがって、ト
ータルＦＤＰの測定においても、検体として血漿を用い
る測定方法の開発が強く望まれていた。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題及び手段】本発明者ら
は、全血より作製したＦＤＰを抗原として、フィブリノ
ーゲンと反応しない性質を有する２種類の新規なモノク
ローナル抗体を得ることに成功した。そしてこの２種類
のモノクローナル抗体を用いる免疫学的凝集反応によ
り、血漿を検体とした場合でも、血清を検体とした場合
と良好な相関をもって、トータルＦＤＰを測定できるこ
とを見い出した。
は、全血より作製したＦＤＰを抗原として、フィブリノ
ーゲンと反応しない性質を有する２種類の新規なモノク
ローナル抗体を得ることに成功した。そしてこの２種類
のモノクローナル抗体を用いる免疫学的凝集反応によ
り、血漿を検体とした場合でも、血清を検体とした場合
と良好な相関をもって、トータルＦＤＰを測定できるこ
とを見い出した。
【０００８】しかして、本発明によれば、（１）ヒトフ
ィブリノーゲン（以下、Ｆｇという）又はヒトフィブリ
ンのプラスミン分解産物中のＸ分画及びＹ分画とは特異
的に反応するが、Ｄ分画、Ｅ分画、ＤＤ分画及びＦｇと
は反応しない、性質を有するモノクローナル抗体、及び
（２）Ｘ分画、Ｙ分画、Ｄ分画、Ｅ分画及びＤＤ分画と
は反応するが、Ｆｇとは反応しない、性質を有するモノ
クローナル抗体、の２種類の新規なモノクローナル抗体
が提供される。
ィブリノーゲン（以下、Ｆｇという）又はヒトフィブリ
ンのプラスミン分解産物中のＸ分画及びＹ分画とは特異
的に反応するが、Ｄ分画、Ｅ分画、ＤＤ分画及びＦｇと
は反応しない、性質を有するモノクローナル抗体、及び
（２）Ｘ分画、Ｙ分画、Ｄ分画、Ｅ分画及びＤＤ分画と
は反応するが、Ｆｇとは反応しない、性質を有するモノ
クローナル抗体、の２種類の新規なモノクローナル抗体
が提供される。
【０００９】また、本発明によれば、抗体として上記
（１）及び（２）の性質を有する２種類のモノクローナ
ル抗体を用いる免疫学的凝集反応によりＦＤＰを測定す
る方法が提供される。
（１）及び（２）の性質を有する２種類のモノクローナ
ル抗体を用いる免疫学的凝集反応によりＦＤＰを測定す
る方法が提供される。
【００１０】本発明の新規なモノクローナル抗体を製造
するには、抗原として、全血より作製されたＦＤＰが用
いられる。該ＦＤＰは、通常ヒトの全血をトロンビンに
より凝固させた後、それにプラスミンを作用させ、溶解
させて凝固塊消化物とし、その消化物を抗Ｆｇ抗体及び
抗ＦＤＰ抗体をリガンドとして結合させた不溶性担体に
吸着後、溶出させることにより作製することができる。
するには、抗原として、全血より作製されたＦＤＰが用
いられる。該ＦＤＰは、通常ヒトの全血をトロンビンに
より凝固させた後、それにプラスミンを作用させ、溶解
させて凝固塊消化物とし、その消化物を抗Ｆｇ抗体及び
抗ＦＤＰ抗体をリガンドとして結合させた不溶性担体に
吸着後、溶出させることにより作製することができる。
【００１１】本発明のモノクローナル抗体は、例えば、
ケーラーとミルスタインの一般的方法（Nature,Vol.25
6,495-497(1975)) に従い、上記で作製したＦＤＰで免
疫されたマウスの脾臓細胞と骨髄腫細胞を融合させ、こ
れらの融合細胞から目的の抗体を産生するものを選択
し、選択された融合細胞を培養することにより取得する
ことができる。
ケーラーとミルスタインの一般的方法（Nature,Vol.25
6,495-497(1975)) に従い、上記で作製したＦＤＰで免
疫されたマウスの脾臓細胞と骨髄腫細胞を融合させ、こ
れらの融合細胞から目的の抗体を産生するものを選択
し、選択された融合細胞を培養することにより取得する
ことができる。
【００１２】本発明による２種類のモノクローナル抗体
を用いる免疫学的凝集反応は、例えば、上記（１）の性
質を有するモノクローナル抗体を感作させたラテックス
試薬と、上記（２）の性質を有するモノクローナル抗体
を感作させたラテックス試薬を調製しておき、この２種
類を混合したラテックス試薬と検体とを反応させて、そ
の凝集の程度を分光学的方法又は目視により測定するこ
とにより行うことができる。また、ラテックス試薬とし
て、上記（１）の性質を有するモノクローナル抗体と上
記（２）の性質を有するモノクローナル抗体とを混合し
たものを、ラテックス粒子に感作させた１種類のラテッ
クス試薬を用い、これを検体と反応させて、免疫学的凝
集反応を行うこともできる。担体としてのラテックス粒
子は、ポリスチレンラテックス粒子が好ましく、その粒
径は一般に０．０５〜２．０μm程度のものが好適であ
る。また、ラテックス粒子にモノクローナル抗体を感作
させる方法としては、それ自体公知の方法、例えばラテ
ックス粒子に抗体を物理的に吸着させる手法、及び化学
的に結合させる手法のいずれの手法も利用することがで
きる。
を用いる免疫学的凝集反応は、例えば、上記（１）の性
質を有するモノクローナル抗体を感作させたラテックス
試薬と、上記（２）の性質を有するモノクローナル抗体
を感作させたラテックス試薬を調製しておき、この２種
類を混合したラテックス試薬と検体とを反応させて、そ
の凝集の程度を分光学的方法又は目視により測定するこ
とにより行うことができる。また、ラテックス試薬とし
て、上記（１）の性質を有するモノクローナル抗体と上
記（２）の性質を有するモノクローナル抗体とを混合し
たものを、ラテックス粒子に感作させた１種類のラテッ
クス試薬を用い、これを検体と反応させて、免疫学的凝
集反応を行うこともできる。担体としてのラテックス粒
子は、ポリスチレンラテックス粒子が好ましく、その粒
径は一般に０．０５〜２．０μm程度のものが好適であ
る。また、ラテックス粒子にモノクローナル抗体を感作
させる方法としては、それ自体公知の方法、例えばラテ
ックス粒子に抗体を物理的に吸着させる手法、及び化学
的に結合させる手法のいずれの手法も利用することがで
きる。
【００１３】本発明において、分光学的方法により測定
する場合は、一定量のラテックス試薬と検体とを混合
し、一定時間後の吸光度の増大を適当な波長で分光学的
に測定することにより行うことができる。また、目視に
より測定する場合は、スライド板又はマイクロタイター
プレート上に一定量のラテックス試薬と検体とを滴下
し、一定時間混合した後、凝集像の有無を目視により観
察することにより行うことができる。特に、分光学的方
法は、血漿を検体として用いた場合に、数種類の検査項
目を同時に自動的に測定することができるので、好まし
い方法である。
する場合は、一定量のラテックス試薬と検体とを混合
し、一定時間後の吸光度の増大を適当な波長で分光学的
に測定することにより行うことができる。また、目視に
より測定する場合は、スライド板又はマイクロタイター
プレート上に一定量のラテックス試薬と検体とを滴下
し、一定時間混合した後、凝集像の有無を目視により観
察することにより行うことができる。特に、分光学的方
法は、血漿を検体として用いた場合に、数種類の検査項
目を同時に自動的に測定することができるので、好まし
い方法である。
【００１４】これにより、血漿を検体として用いた場合
でも、血清を検体として用いた場合と同様に、良好な相
関をもってトータルＦＤＰの測定が可能となった。
でも、血清を検体として用いた場合と同様に、良好な相
関をもってトータルＦＤＰの測定が可能となった。
【００１５】
【実施例】以下、実施例により本発明を更に詳細に説明
する。
する。
【００１６】実施例１
免疫用ＦＤＰ抗原の製造
免疫用ＦＤＰ抗原の調製は、P.W.Koppert ら（Blood 6
8,437-441,1986)の方法に準じて行った。静脈穿刺によ
り得た健常者全血を、組織型プラスミノーゲンアクチベ
ータ（シグマ社）９００ＩＵを入れたプラスチック製チ
ューブ２本に、それぞれ１０mlずつ分注し、直ちに混和
した。次に、この血液を各々トロンビン（ナカライテス
ク社）１０ＮＩＨＵを入れたガラス製遠心管に移し、凝
固させた後、３７℃でインキュベーションした。凝固塊
が完全に溶解するまで（４５分間）インキュベーション
し、１本の遠心管にはアプロチニン（大蔵製薬）１，０
００ＫＩＵ及びジイソプロピルフルオロホスフェート
（シグマ）１０mMを添加して反応を停止させた。残りの
遠心管は、更に１２０分間インキュベーションを継続し
た後、同様に反応を停止させた。反応停止後、各遠心管
を２，３００ｇで２０分間遠心し、上清分離して、イン
キュベーション時間の異なる２種類の全血凝固塊消化物
ＢＣＬ−１（インキュベーション時間：４５分）及び
ＢＣＬ−２（インキュベーション時間：１６５分）各５
mlを得た。
8,437-441,1986)の方法に準じて行った。静脈穿刺によ
り得た健常者全血を、組織型プラスミノーゲンアクチベ
ータ（シグマ社）９００ＩＵを入れたプラスチック製チ
ューブ２本に、それぞれ１０mlずつ分注し、直ちに混和
した。次に、この血液を各々トロンビン（ナカライテス
ク社）１０ＮＩＨＵを入れたガラス製遠心管に移し、凝
固させた後、３７℃でインキュベーションした。凝固塊
が完全に溶解するまで（４５分間）インキュベーション
し、１本の遠心管にはアプロチニン（大蔵製薬）１，０
００ＫＩＵ及びジイソプロピルフルオロホスフェート
（シグマ）１０mMを添加して反応を停止させた。残りの
遠心管は、更に１２０分間インキュベーションを継続し
た後、同様に反応を停止させた。反応停止後、各遠心管
を２，３００ｇで２０分間遠心し、上清分離して、イン
キュベーション時間の異なる２種類の全血凝固塊消化物
ＢＣＬ−１（インキュベーション時間：４５分）及び
ＢＣＬ−２（インキュベーション時間：１６５分）各５
mlを得た。
【００１７】上記の全血凝固塊消化物１mlをホウ酸緩衝
液で４倍に希釈したものを、活性化ＣＨセファロース４
Ｂ（ファルマシア）に抗Ｆｇ、抗Ｄ、抗Ｅ、抗ＦｇＤＰ
及び抗ＦｂＤＰ抗体を結合させて作製した、抗ＦＤＰ／
ＣＨセファロース４Ｂカラム（ゲル容量：４ml) に添加
した。ホウ酸緩衝液１００ml、０．５M ＮａＣｌ含有ホ
ウ酸緩衝液２０ml及び１０倍希釈したホウ酸緩衝液２０
mlで順次洗浄した後、０．０１M ＮａＯＨ液にてカラム
吸着分画を溶出した。溶出分画は０．１M ＨＣｌ液で速
やかに中和し、精製水にて透析した後、凍結乾燥し、Ｂ
ＣＬ−１及びＢＣＬ−２各々５mlより免疫用ＦＤＰ抗
原、ＦＤＰ−１ １．２mg及びＦＤＰ−２１．０mgを得
た。
液で４倍に希釈したものを、活性化ＣＨセファロース４
Ｂ（ファルマシア）に抗Ｆｇ、抗Ｄ、抗Ｅ、抗ＦｇＤＰ
及び抗ＦｂＤＰ抗体を結合させて作製した、抗ＦＤＰ／
ＣＨセファロース４Ｂカラム（ゲル容量：４ml) に添加
した。ホウ酸緩衝液１００ml、０．５M ＮａＣｌ含有ホ
ウ酸緩衝液２０ml及び１０倍希釈したホウ酸緩衝液２０
mlで順次洗浄した後、０．０１M ＮａＯＨ液にてカラム
吸着分画を溶出した。溶出分画は０．１M ＨＣｌ液で速
やかに中和し、精製水にて透析した後、凍結乾燥し、Ｂ
ＣＬ−１及びＢＣＬ−２各々５mlより免疫用ＦＤＰ抗
原、ＦＤＰ−１ １．２mg及びＦＤＰ−２１．０mgを得
た。
【００１８】実施例２２−ａ）抗ＦＤＰモノクローナル抗体の製造
実施例１で製造したＦＤＰ−１抗原３０μg を完全フロ
インドアジュバントと共に、ＢＡＬＢ／Ｃマウス（６〜
８週令）に３週間おきに皮下投与し、最後に６０μg を
静脈注射した。
インドアジュバントと共に、ＢＡＬＢ／Ｃマウス（６〜
８週令）に３週間おきに皮下投与し、最後に６０μg を
静脈注射した。
【００１９】最終免疫から３日後にマウスの脾臓を摘出
して、脾細胞を採取し、デルベコのモディファイド最少
基本培地（以下、Ｄ ＭＥＭという）で３回洗浄した
後、細胞数を算定して、その２．８×１０8 個をマウス
ミエローマ細胞Ｐ3 −ＮＳ−１／１−Ａｇ４−１（以
下、ＮＳ−１という）５．６×１０7 個と混合して、遠
心し細胞を集めた。このペレットに、３７℃に温めてお
いたポリエチレングリコール溶液（ＰＥＧ−１００：
４．２５％、ＤＭＳＯ：１．５％含有Ｄ ＭＥＭ）１ml
を加え、１分間遠心管をゆっくり回転させて細胞融合さ
せた。３７℃のＤ ＭＥＭを３０秒毎に２mlずつ１０回
加えた後、遠心分離し、ペレットを２０％ウシ胎児血清
含有ＲＰＭＩ−１６４０培地で脾細胞数が４×１０6 個
／mlとなるように懸濁し、９６ウエルマイクロプレート
に０．１mlずつ分注し、５％ＣＯ2 培養器で培養した。
２４時間後各ウエルの上清の半量を捨て、ＨＡＴ培地
（ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン、１０％
ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地）を０．１ml
加え、その後３〜４日毎に、ＨＡＴ培地の半量を交換し
ながら２週間培養した後、増殖したウエル中の培養上清
の抗体活性を下記２−ｂ）のＥＬＩＳＡ法で測定した。
して、脾細胞を採取し、デルベコのモディファイド最少
基本培地（以下、Ｄ ＭＥＭという）で３回洗浄した
後、細胞数を算定して、その２．８×１０8 個をマウス
ミエローマ細胞Ｐ3 −ＮＳ−１／１−Ａｇ４−１（以
下、ＮＳ−１という）５．６×１０7 個と混合して、遠
心し細胞を集めた。このペレットに、３７℃に温めてお
いたポリエチレングリコール溶液（ＰＥＧ−１００：
４．２５％、ＤＭＳＯ：１．５％含有Ｄ ＭＥＭ）１ml
を加え、１分間遠心管をゆっくり回転させて細胞融合さ
せた。３７℃のＤ ＭＥＭを３０秒毎に２mlずつ１０回
加えた後、遠心分離し、ペレットを２０％ウシ胎児血清
含有ＲＰＭＩ−１６４０培地で脾細胞数が４×１０6 個
／mlとなるように懸濁し、９６ウエルマイクロプレート
に０．１mlずつ分注し、５％ＣＯ2 培養器で培養した。
２４時間後各ウエルの上清の半量を捨て、ＨＡＴ培地
（ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン、１０％
ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地）を０．１ml
加え、その後３〜４日毎に、ＨＡＴ培地の半量を交換し
ながら２週間培養した後、増殖したウエル中の培養上清
の抗体活性を下記２−ｂ）のＥＬＩＳＡ法で測定した。
【００２０】活性の認められたウエルの細胞を、ＢＡＬ
Ｂ／Ｃマウス胸腺細胞を含む１０％ウシ胎児血清含有Ｒ
ＰＭＩ−１６４０培地で希釈し、限界希釈法によりクロ
ーニングを行って、Ｘ分画及びＹ分画とは特異的に反応
し、Ｆｇ、Ｄ分画、Ｅ分画及びＤＤ分画とは反応しない
モノクローナル抗体〔ＦＤＰ１−１Ｈ１０〕産生融合細
胞を得た。１×１０7 個以上の細胞を、プリスタン０．
５mlを予め投与したＢＡＬＢ／Ｃマウスに腹腔内投与
し、腹水腫瘍を作らせて腹水を得た。この腹水をプロセ
ップ−Ａカラム（バイオプロセシング）により精製し、
凍結乾燥して白色粉末の抗ＦＤＰモノクローナル抗体
〔ＦＤＰ１−１Ｈ１０〕を得た。
Ｂ／Ｃマウス胸腺細胞を含む１０％ウシ胎児血清含有Ｒ
ＰＭＩ−１６４０培地で希釈し、限界希釈法によりクロ
ーニングを行って、Ｘ分画及びＹ分画とは特異的に反応
し、Ｆｇ、Ｄ分画、Ｅ分画及びＤＤ分画とは反応しない
モノクローナル抗体〔ＦＤＰ１−１Ｈ１０〕産生融合細
胞を得た。１×１０7 個以上の細胞を、プリスタン０．
５mlを予め投与したＢＡＬＢ／Ｃマウスに腹腔内投与
し、腹水腫瘍を作らせて腹水を得た。この腹水をプロセ
ップ−Ａカラム（バイオプロセシング）により精製し、
凍結乾燥して白色粉末の抗ＦＤＰモノクローナル抗体
〔ＦＤＰ１−１Ｈ１０〕を得た。
【００２１】ＦＤＰ−２抗原についても、マウスへの免
疫及び細胞融合を同様に行い、クローニングによりＸ分
画、Ｙ分画、Ｄ分画、Ｅ分画及びＤＤ分画と反応し、Ｆ
ｇとは反応しないモノクローナル抗体〔ＦＤＰ２−４Ｂ
３〕産生融合細胞を得た。次いで、腹水を作製、腹水か
ら精製して抗ＦＤＰモノクローナル抗体〔ＦＤＰ２−４
Ｂ３〕を得た。
疫及び細胞融合を同様に行い、クローニングによりＸ分
画、Ｙ分画、Ｄ分画、Ｅ分画及びＤＤ分画と反応し、Ｆ
ｇとは反応しないモノクローナル抗体〔ＦＤＰ２−４Ｂ
３〕産生融合細胞を得た。次いで、腹水を作製、腹水か
ら精製して抗ＦＤＰモノクローナル抗体〔ＦＤＰ２−４
Ｂ３〕を得た。
【００２２】２−ｂ）抗ＦＤＰモノクローナル抗体のス
クリーニング法 培養上清中の抗ＦＤＰ抗体活性のスクリーニングは、Ｅ
ＬＩＳＡ法にて行った。９６ウェルイムノプレート（Ｃ
９６ ＭＡＸＩＳＯＲＰ，Ｎｕｎｃ）にウサギ抗マウス
ＩｇＧを固相化し、次いで培養上清２５μl を各ウエル
に加え、室温で１時間放置した後、０．０５％Ｔｗｅｅ
ｎ２０含有１０mMリン酸緩衝液（pH７．４）で３回洗浄
した後、各ウエルに同緩衝液で調製した５μg/mlのＦｇ
又はＦＤＰ（ＤＤ、Ｘ、Ｙの混合抗原）を１００μl 加
え、室温で３０分反応させた。同緩衝液で３回洗浄後、
各ウエルにペルオキシダーゼ標識ウサギ抗Ｆｇ抗体１０
０μl を加え、室温で３０分反応させた。次に同緩衝液
で３回洗浄後、０．１M クエン酸緩衝液（pH４．２）で
調製した０．１３％２，２′−アジノビス（３−エチル
ベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）二アンモニウム及
び０．００７％過酸化水素水を含む基質溶液１００μl
を加え、室温で３０分放置した。次いで２mMアジ化ナト
リウム１００μl を加えて反応を停止させた後、各ウエ
ルの４０５nmにおける吸光度を測定した。このＥＬＩＳ
Ａ法によりＦｇと反応せず、ＦＤＰと反応する抗体を分
泌するハイブリドーマすなわち抗ＦＤＰ抗体産生融合細
胞を選別した。
クリーニング法 培養上清中の抗ＦＤＰ抗体活性のスクリーニングは、Ｅ
ＬＩＳＡ法にて行った。９６ウェルイムノプレート（Ｃ
９６ ＭＡＸＩＳＯＲＰ，Ｎｕｎｃ）にウサギ抗マウス
ＩｇＧを固相化し、次いで培養上清２５μl を各ウエル
に加え、室温で１時間放置した後、０．０５％Ｔｗｅｅ
ｎ２０含有１０mMリン酸緩衝液（pH７．４）で３回洗浄
した後、各ウエルに同緩衝液で調製した５μg/mlのＦｇ
又はＦＤＰ（ＤＤ、Ｘ、Ｙの混合抗原）を１００μl 加
え、室温で３０分反応させた。同緩衝液で３回洗浄後、
各ウエルにペルオキシダーゼ標識ウサギ抗Ｆｇ抗体１０
０μl を加え、室温で３０分反応させた。次に同緩衝液
で３回洗浄後、０．１M クエン酸緩衝液（pH４．２）で
調製した０．１３％２，２′−アジノビス（３−エチル
ベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）二アンモニウム及
び０．００７％過酸化水素水を含む基質溶液１００μl
を加え、室温で３０分放置した。次いで２mMアジ化ナト
リウム１００μl を加えて反応を停止させた後、各ウエ
ルの４０５nmにおける吸光度を測定した。このＥＬＩＳ
Ａ法によりＦｇと反応せず、ＦＤＰと反応する抗体を分
泌するハイブリドーマすなわち抗ＦＤＰ抗体産生融合細
胞を選別した。
【００２３】２−ｃ）抗ＦＤＰモノクローナル抗体の特
異性 抗ＦＤＰモノクローナル抗体の特異性は、上記２−ｂ）
と同様のＥＬＩＳＡ法にて確認した。すなわち、ウサギ
抗マウスＩｇＧ固定化プレートに培養上清の希釈列（１
〜１０7 倍）を２５μl 加え、ＦＤＰのＸ、Ｙ、ＤＤ、
Ｄ及びＥ分画を別々に添加して、各分画に対する反応性
を測定した。なお、Ｅ分画に対する反応性を測定する場
合は、ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗Ｆｇ抗体の代わり
に、ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗Ｅ抗体を使用した。
異性 抗ＦＤＰモノクローナル抗体の特異性は、上記２−ｂ）
と同様のＥＬＩＳＡ法にて確認した。すなわち、ウサギ
抗マウスＩｇＧ固定化プレートに培養上清の希釈列（１
〜１０7 倍）を２５μl 加え、ＦＤＰのＸ、Ｙ、ＤＤ、
Ｄ及びＥ分画を別々に添加して、各分画に対する反応性
を測定した。なお、Ｅ分画に対する反応性を測定する場
合は、ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗Ｆｇ抗体の代わり
に、ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗Ｅ抗体を使用した。
【００２４】上記２−ａ）で製造した抗ＦＤＰモノクロ
ーナル抗体〔ＦＤＰ１−１Ｈ１０〕及び〔ＦＤＰ２−４
Ｂ３〕の特異性は表１に示すとおりであった。
ーナル抗体〔ＦＤＰ１−１Ｈ１０〕及び〔ＦＤＰ２−４
Ｂ３〕の特異性は表１に示すとおりであった。
【００２５】
【表１】
【００２６】実施例３
抗ＦＤＰモノクローナル抗体感作ラテックス試薬の製造３−ａ）分光学的測定用試薬
上記２−ａ）で製造した抗ＦＤＰモノクローナル抗体
〔ＦＤＰ１−１Ｈ１０〕と〔ＦＤＰ２−４Ｂ３〕を、そ
れぞれグリシン緩衝液（０．２３M グリシン、０．９％
ＮａＣｌ、０．１％ＮａＮ3)に１mg/ml 濃度となるよう
に調製した。これらの抗体溶液と平均粒径０．１８１μ
m のポリスチレンラテックス（日本合成ゴム）の１０％
懸濁液を１０：１で混合した後、室温で１時間撹拌して
抗体をポリスチレンラテックス粒子に感作させ、ポリス
チレンラテックスに吸着されなかった末反応のモノクロ
ーナル抗体を遠心分離（２０，０００×ｇ、３０分間）
によって除去した後、０．４％ＢＳＡを含むトリス緩衝
液（０．１M トリス塩酸緩衝液）に１％となるように懸
濁した。室温で３０分間撹拌後、未反応のＢＳＡ溶液を
遠心分離（２０，０００×ｇ、３０分間）によって除去
した後、０．３３％懸濁液とした。これら２種の０．３
３％懸濁液を１：１で混合し、分光学的測定用試薬を製
造した。
〔ＦＤＰ１−１Ｈ１０〕と〔ＦＤＰ２−４Ｂ３〕を、そ
れぞれグリシン緩衝液（０．２３M グリシン、０．９％
ＮａＣｌ、０．１％ＮａＮ3)に１mg/ml 濃度となるよう
に調製した。これらの抗体溶液と平均粒径０．１８１μ
m のポリスチレンラテックス（日本合成ゴム）の１０％
懸濁液を１０：１で混合した後、室温で１時間撹拌して
抗体をポリスチレンラテックス粒子に感作させ、ポリス
チレンラテックスに吸着されなかった末反応のモノクロ
ーナル抗体を遠心分離（２０，０００×ｇ、３０分間）
によって除去した後、０．４％ＢＳＡを含むトリス緩衝
液（０．１M トリス塩酸緩衝液）に１％となるように懸
濁した。室温で３０分間撹拌後、未反応のＢＳＡ溶液を
遠心分離（２０，０００×ｇ、３０分間）によって除去
した後、０．３３％懸濁液とした。これら２種の０．３
３％懸濁液を１：１で混合し、分光学的測定用試薬を製
造した。
【００２７】３−ｂ）スライド用試薬
上記３−ａ）と同様にして、抗ＦＤＰモノクローナル抗
体〔ＦＤＰ１−１Ｈ１０〕と〔ＦＤＰ２−４Ｂ３〕感作
ポリスチレンラテックス粒子１．０％懸濁液を各々調製
後、１：１で混和し、スライド用試薬を製造した。
体〔ＦＤＰ１−１Ｈ１０〕と〔ＦＤＰ２−４Ｂ３〕感作
ポリスチレンラテックス粒子１．０％懸濁液を各々調製
後、１：１で混和し、スライド用試薬を製造した。
【００２８】実施例４
ＦＤＰ中の各ＦＤＰ分画との反応性
ＬＰＩＡ１００（三菱化学）を用いて、Ｘ分画、Ｙ分
画、ＤＤ分画、Ｄ分画、Ｅ分画及びＦｇとの反応性を調
べた。各ＦＤＰ分画溶液（１０μl)とトリス緩衝液（pH
８．２）２００μl を含む反応セルに、上記３−ａ）で
製造した抗ＦＤＰモノクローナル抗体感作ラテックス試
薬４０μl を注入後、９５０nmの吸光度を１０分間測定
し、その吸光度変化を算出した。結果は図１に示すごと
く、Ｘ分画、Ｙ分画、ＤＤ分画及びＤ分画に対して反応
性を示したが、Ｅ分画及びＦｇとは反応性を示さなかっ
た。
画、ＤＤ分画、Ｄ分画、Ｅ分画及びＦｇとの反応性を調
べた。各ＦＤＰ分画溶液（１０μl)とトリス緩衝液（pH
８．２）２００μl を含む反応セルに、上記３−ａ）で
製造した抗ＦＤＰモノクローナル抗体感作ラテックス試
薬４０μl を注入後、９５０nmの吸光度を１０分間測定
し、その吸光度変化を算出した。結果は図１に示すごと
く、Ｘ分画、Ｙ分画、ＤＤ分画及びＤ分画に対して反応
性を示したが、Ｅ分画及びＦｇとは反応性を示さなかっ
た。
【００２９】実施例５
血漿及び血清検体測定値の相関性
ＬＰＩＡ１００（三菱化学）を用いて、患者血漿及び患
者血漿よりＦＤＰ専用採血管（帝国臓器製薬）にて脱フ
ィブリン化することで調製した血清について、上記３−
ａ）で製造した抗ＦＤＰモノクローナル抗体感作ラテッ
クス試薬にて測定し、血漿と血清検体のＦＤＰの測定値
の相関を調べた。標準品としては、全血もしくは血漿よ
り作製したＦＤＰを使用した。検体５μl とトリス緩衝
液（pH８．２）２００μl を含む反応セルに、抗ＦＤＰ
モノクローナル抗体感作ラテックス試薬４０μl を注入
後、９５０nmの吸光度を１０分間測定し、その吸光度変
化から検体中のＦＤＰ濃度を定量した。結果は図２に示
すように、非常に良好な相関（相関係数０．９９３）を
示し、測定値も回帰式ｙ（血漿）＝０．９６９＋１．０
１０Ｘ（血清）（ｎ＝２０）とほぼ一致していた。
者血漿よりＦＤＰ専用採血管（帝国臓器製薬）にて脱フ
ィブリン化することで調製した血清について、上記３−
ａ）で製造した抗ＦＤＰモノクローナル抗体感作ラテッ
クス試薬にて測定し、血漿と血清検体のＦＤＰの測定値
の相関を調べた。標準品としては、全血もしくは血漿よ
り作製したＦＤＰを使用した。検体５μl とトリス緩衝
液（pH８．２）２００μl を含む反応セルに、抗ＦＤＰ
モノクローナル抗体感作ラテックス試薬４０μl を注入
後、９５０nmの吸光度を１０分間測定し、その吸光度変
化から検体中のＦＤＰ濃度を定量した。結果は図２に示
すように、非常に良好な相関（相関係数０．９９３）を
示し、測定値も回帰式ｙ（血漿）＝０．９６９＋１．０
１０Ｘ（血清）（ｎ＝２０）とほぼ一致していた。
【００３０】実施例６
抗Ｆｇポリクローナル抗体感作ラテックス試薬との相関
性６−ａ）分光学的測定 ＬＰＩＡ１００（三菱化学）を用いて、患者血漿及び患
者血漿よりＦＤＰ専用採血管（帝国臓器製薬）にて脱フ
ィブリン化することで調製した血清について、それぞれ
上記３−ａ）で製造した抗ＦＤＰモノクローナル抗体感
作ラテックス試薬及び従来法の抗Ｆｇポリクローナル抗
体感作ラテッスク試薬（商品名「エルピア・ＦＤＰ」：
帝国臓器製薬）にて測定し、本発明の試薬と従来法の試
薬による測定値との相関を調べた。標準品としては、全
血もしくは血漿より作製したＦＤＰを使用した。検体５
μl とトリス緩衝液（pH８．２）２００μl を含む反応
セルに、抗ＦＤＰモノクローナル抗体感作ラテックス試
薬又は抗Ｆｇポリクローナル抗体感作ラテックス試薬４
０μl を注入後、９５０nmの吸光度を１０分間測定し、
その吸光度変化から検体中のＦＤＰ濃度を定量した。結
果は図３に示すように、非常に良好な相関（相関係数
０．９８４）を示し、測定値も回帰式ｙ（本法）＝−
０．０７６＋０．９４０Ｘ（従来法）（ｎ＝４４）とほ
ぼ一致していた。
性６−ａ）分光学的測定 ＬＰＩＡ１００（三菱化学）を用いて、患者血漿及び患
者血漿よりＦＤＰ専用採血管（帝国臓器製薬）にて脱フ
ィブリン化することで調製した血清について、それぞれ
上記３−ａ）で製造した抗ＦＤＰモノクローナル抗体感
作ラテックス試薬及び従来法の抗Ｆｇポリクローナル抗
体感作ラテッスク試薬（商品名「エルピア・ＦＤＰ」：
帝国臓器製薬）にて測定し、本発明の試薬と従来法の試
薬による測定値との相関を調べた。標準品としては、全
血もしくは血漿より作製したＦＤＰを使用した。検体５
μl とトリス緩衝液（pH８．２）２００μl を含む反応
セルに、抗ＦＤＰモノクローナル抗体感作ラテックス試
薬又は抗Ｆｇポリクローナル抗体感作ラテックス試薬４
０μl を注入後、９５０nmの吸光度を１０分間測定し、
その吸光度変化から検体中のＦＤＰ濃度を定量した。結
果は図３に示すように、非常に良好な相関（相関係数
０．９８４）を示し、測定値も回帰式ｙ（本法）＝−
０．０７６＋０．９４０Ｘ（従来法）（ｎ＝４４）とほ
ぼ一致していた。
【００３１】６−ｂ）スライド凝集法
上記３−ｂ）で製造した抗ＦＤＰモノクローナル抗体感
作ラテックス試薬（本法の試薬）と抗Ｆｇポリクローナ
ル抗体感作ラテックス試薬（商品名「ＦＤＰＬテス
ト」：帝国臓器製薬）を用いて、各々患者血漿及び患者
血漿からＦＤＰ専用採血管にて調製した血清を測定し、
比較した。希釈検体３０μl 、緩衝液３０μl 及びスラ
イド用試薬３５μl をスライド板上で混和して、２分間
揺動後の凝集像の有無を判定し、検体の希釈倍数よりＦ
ＤＰ濃度（μg/ml) を求めた。結果は表２に示すよう
に、本法による血漿測定値は、従来法による血清測定値
と一致していた。
作ラテックス試薬（本法の試薬）と抗Ｆｇポリクローナ
ル抗体感作ラテックス試薬（商品名「ＦＤＰＬテス
ト」：帝国臓器製薬）を用いて、各々患者血漿及び患者
血漿からＦＤＰ専用採血管にて調製した血清を測定し、
比較した。希釈検体３０μl 、緩衝液３０μl 及びスラ
イド用試薬３５μl をスライド板上で混和して、２分間
揺動後の凝集像の有無を判定し、検体の希釈倍数よりＦ
ＤＰ濃度（μg/ml) を求めた。結果は表２に示すよう
に、本法による血漿測定値は、従来法による血清測定値
と一致していた。
【００３２】
【表２】
【図１】反応速度とＦＤＰ中の各分画の濃度の関係を示
すグラフ。
すグラフ。
【図２】本発明の試薬による血清と血漿検体のＦＤＰの
濃度の相関関係を示すグラフ。
濃度の相関関係を示すグラフ。
【図３】従来法の試薬と本発明の試薬によるＦＤＰの濃
度の相関関係を示すグラフ。
度の相関関係を示すグラフ。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
Ｃ１２Ｒ 1:91）
(72)発明者 奥村 勇人
神奈川県川崎市多摩区菅馬場２−13−36
(72)発明者 大石 多津雄
神奈川県横浜市青葉区大場町851−13
(72)発明者 真仁田 英明
神奈川県相模原市御園１−11−20
(56)参考文献 特開 昭60−158353（ＪＰ，Ａ)
特開 昭52−12922（ＪＰ，Ａ)
特開 昭63−79900（ＪＰ，Ａ)
特表 平８−512136（ＪＰ，Ａ)
国際公開95／012617（ＷＯ，Ａ１)
国際公開96／041170（ＷＯ，Ａ１)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C07K 16/18 - 16/44
G01N 33/53 - 33/577
C12P 21/08
ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＰｕｂＭｅｄ
Claims (6)
- 【請求項１】 ヒトフィブリノーゲン又はヒトフィブリ
ンのプラスミン分解産物中のＸ分画及びＹ分画とは特異
的に反応するが、Ｄ分画、Ｅ分画、ＤＤ分画及びヒトフ
ィブリノーゲンとは反応しない性質を有するモノクロー
ナル抗体。 - 【請求項２】 ヒトフィブリノーゲン又はヒトフィブリ
ンのプラスミン分解産物中のＸ分画、Ｙ分画、Ｄ分画、
Ｅ分画及びＤＤ分画とは反応するが、ヒトフィブリノー
ゲンとは反応しない、性質を有するモノクローナル抗
体。 - 【請求項３】 血漿中のヒトフィブリノーゲン及びヒト
フィブリンのプラスミン分解産物を、免疫学的凝集反応
により測定する方法において、抗体として、ヒトフィブ
リノーゲン又はヒトフィブリンのプラスミン分解産物中
の （１）Ｘ分画及びＹ分画とは特異的に反応するが、Ｄ分
画、Ｅ分画、ＤＤ分画及びヒトフィブリノーゲンとは反
応しない、性質を有するモノクローナル抗体、及び （２）Ｘ分画、Ｙ分画、Ｄ分画、Ｅ分画及びＤＤ分画と
は反応するが、ヒトフィブリノーゲンとは反応しない、
性質を有するモノクローナル抗体、 の２種類のモノクローナル抗体を用いる測定方法。 - 【請求項４】 免疫学的凝集反応による測定方法が、ラ
テックス粒子にモノクローナル抗体を感作させたラテッ
クス試薬を用いて、その凝集の程度を測定する方法であ
る、請求項３に記載の測定方法。 - 【請求項５】 凝集の程度を分光学的に測定する、請求
項４に記載の測定方法。 - 【請求項６】 凝集の程度を目視により測定する、請求
項４に記載の測定方法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15274398A JP3472138B2 (ja) | 1998-06-02 | 1998-06-02 | モノクローナル抗体及びｆｄｐの測定方法 |
| EP99922492A EP1085088A4 (en) | 1998-06-02 | 1999-05-26 | MONOCLONAL ANTIBODIES AND THEIR DETERMINATION METHOD |
| PCT/JP1999/002764 WO1999063075A1 (fr) | 1998-06-02 | 1999-05-26 | Anticorps monoclonaux et leur procede de determination |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15274398A JP3472138B2 (ja) | 1998-06-02 | 1998-06-02 | モノクローナル抗体及びｆｄｐの測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11349600A JPH11349600A (ja) | 1999-12-21 |
| JP3472138B2 true JP3472138B2 (ja) | 2003-12-02 |
Family
ID=15547197
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15274398A Expired - Lifetime JP3472138B2 (ja) | 1998-06-02 | 1998-06-02 | モノクローナル抗体及びｆｄｐの測定方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1085088A4 (ja) |
| JP (1) | JP3472138B2 (ja) |
| WO (1) | WO1999063075A1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012014997A1 (ja) | 2010-07-30 | 2012-02-02 | シスメックス株式会社 | 抗ｆｄｐモノクローナル抗体、それを用いたｆｄｐ測定用試薬及び試薬キット、並びにｆｄｐ測定方法 |
| WO2012014996A1 (ja) | 2010-07-30 | 2012-02-02 | シスメックス株式会社 | Ｆｄｐ測定用試薬及び試薬キット、並びに測定方法 |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2813395B1 (fr) * | 2000-08-28 | 2003-01-24 | Stago Diagnostica | Methode de dosage in vitro de la fibrine soluble par generation de produits de degradation specifiques |
| JP4616516B2 (ja) * | 2001-06-15 | 2011-01-19 | 積水メディカル株式会社 | 免疫学的測定法 |
| CN103954758A (zh) * | 2014-05-15 | 2014-07-30 | 海南世济医学技术有限公司 | 一种用于纤维蛋白和纤维蛋白原及其降解产物的检测方法和试剂盒 |
| CN104198724B (zh) * | 2014-08-14 | 2016-05-11 | 上海睿康生物科技有限公司 | 纤维蛋白或纤维蛋白原降解产物检测试剂盒 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60257363A (ja) * | 1984-06-05 | 1985-12-19 | Dai Ichi Pure Chem Co Ltd | Ｆｄｐの測定法 |
-
1998
- 1998-06-02 JP JP15274398A patent/JP3472138B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1999
- 1999-05-26 EP EP99922492A patent/EP1085088A4/en not_active Withdrawn
- 1999-05-26 WO PCT/JP1999/002764 patent/WO1999063075A1/ja not_active Application Discontinuation
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012014997A1 (ja) | 2010-07-30 | 2012-02-02 | シスメックス株式会社 | 抗ｆｄｐモノクローナル抗体、それを用いたｆｄｐ測定用試薬及び試薬キット、並びにｆｄｐ測定方法 |
| WO2012014996A1 (ja) | 2010-07-30 | 2012-02-02 | シスメックス株式会社 | Ｆｄｐ測定用試薬及び試薬キット、並びに測定方法 |
| US8865424B2 (en) | 2010-07-30 | 2014-10-21 | Sysmex Corporation | Anti-FDP monoclonal antibody, FDP measurement reagent and reagent kit using same, and FDP measurement method |
| US8865425B2 (en) | 2010-07-30 | 2014-10-21 | Sysmex Corporation | Reagent and reagent kit for measurement of FDP, and measurement method |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1999063075A1 (fr) | 1999-12-09 |
| EP1085088A4 (en) | 2001-11-28 |
| JPH11349600A (ja) | 1999-12-21 |
| EP1085088A1 (en) | 2001-03-21 |
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