CN103954758A

CN103954758A - 一种用于纤维蛋白和纤维蛋白原及其降解产物的检测方法和试剂盒

Info

Publication number: CN103954758A
Application number: CN201410204344.4A
Authority: CN
Inventors: 王弢
Original assignee: HAINAN SHIJI PHARMACEUTICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: HAINAN SHIJI PHARMACEUTICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2014-05-15
Filing date: 2014-05-15
Publication date: 2014-07-30

Abstract

本发明公开了一种检测方法，该方法可同时检测生物样品中纤维蛋白、纤维蛋白原和纤维蛋白或纤维蛋白原的降解中间体X、Y片段和降解最终产物D片段、D-dimer的含量。该方法形成的试剂盒可用于常见癌症的检测。

Description

一种用于纤维蛋白和纤维蛋白原及其降解产物的检测方法和试剂盒

技术领域

本发明涉及分子生物学和生物医药领域，具体涉及利用纤维蛋白（原）及其降解产物的含量来检测人体内肿瘤标志物DR-70含量的一种方法及试剂盒。

背景技术

癌症（恶性肿瘤）是威胁我国国民健康的头号杀手，一直是我国医疗卫生防治的重点领域之一。对于癌症防治的主要方法就是进行全民体检，实现早发现、早诊断和及时治疗的目的，提高治愈率。肿瘤标志物是常见的癌症筛查方法，在我国具有非常广泛的应用，但目前常见的肿瘤标志物筛查癌症的准确仅为30-40%，甚至更低。因此，需要开发新的肿瘤标志物和相关的检测/诊断试剂。为了满足肿瘤人群的需求，公司对DR-70（FDP）进行了进一步研究，重新确定了其中与肿瘤密切相关的蛋白片段并建立了相应的检测体系。

美国Donald Ronald医生于1970年在肿瘤病人血液中发现一种环形结构的大分子蛋白，为纪念他的这一发现，该物质用他的姓名首字母及发现年号命名为DR-70。美国AMDL公司于1991年研究证实DR-70是一组与恶性肿瘤密切相关的蛋白质，是肿瘤细胞分泌的一类蛋白水解酶。1992年Justice等人首先证明它为一种肿瘤标志物，并证实DR-70比其它肿瘤标志物如CEA和CA15-3等更加敏感。当恶性肿瘤发生时，人体血液内的DR-70含量就会升高，并异常激活纤溶系统，从而导致纤维蛋白（原）溶解。DR-70免疫测定法可定量检测体内纤维蛋白（原）降解产物（FDP）从而确定体内是否存在癌细胞。

目前，检测人血清中FDP的含量开发的癌症筛查和预后监控的产品已经在美国得到FDA批准，进入临床使用。但是我国尚未大规模开展这个肿瘤标志物的临床应用研究。

国际上的研究认为D、Dimer、E、Y和IPDP等纤维蛋白（原）降解片段是DR-70的直接反应，并开发出针对这些片段的多克隆抗体，用ELISA方法来定量检测血液中FDP的含量，进行癌症筛查。但由于多克隆抗体本身的特性和FDP各降解产物的高级结构等原因，定量检测的结果有一定偏差。

国内针对FDP的定量检测主要是检测D/Dimer降解产物，用胶乳免疫比浊法检测D/Dimer来进行血栓或凝血的检测，未见用于癌症筛查的报道。国外的研究显示，如果只检测D/Dimer进行肿瘤的筛查，会造成临床上50%以上的错误率。

因此，需要建立更加完善的DFP检测技术体系/方法。

发明内容

本文公开了一种检测纤维蛋白和纤维蛋白原及其降解产物的方法和应用，其包括对纤维蛋白、纤维蛋白原、纤维蛋白（原）降解中间体X片段、纤维蛋白（原）降解中间体Y片段、纤维蛋白（原）降解产物D片段和纤维蛋白（原）降解产物D-二聚体，总计六种纤维蛋白和纤维蛋白原及其降解混合物的同步检测。方法包括用特异性多克隆抗体和单克隆抗体对上述六种混合物进行同时检测，其中所述的多克隆抗体和单克隆抗体均是特异性的。

为实现上述发明目的，技术方案包括以下步骤。

制备和纤维蛋白（原），纤维蛋白（原）降解中间体X、Y片段和降解产物D、D-dimer等蛋白/多肽片段结合的多克隆抗体和单克隆抗体：

（1）利用大肠杆菌表达纤维蛋白（原）及其降解产物D、D-dimer及中间体X、Y等蛋白或蛋白片段；

（2）利用层析柱、蛋白凝胶、反相柱等方法将表达的蛋白纯化，冻干，形成冻干粉；

（3）将冻干粉作为抗原，免疫新西兰大白兔，制备并筛选多克隆抗体；

（4）将冻干粉作为抗原，免疫Balb/c小鼠，制备并筛选单克隆抗体。

建立ELISA检测体系。

以[0010]中制备的多克隆抗体为包被抗体，用来包被酶标板并与检测样本中的检测目标结合，将其固定在酶标板上。以[0010]中制备的单克隆抗体为捕捉抗体，与固定在酶标板上的检测目标结合，形成多克隆抗体-检测目标-单克隆抗体复合物，以购自HRP标记的山羊抗小鼠IgG（H+L）作为酶标抗体，检测复合物中的单克隆抗体，建立ELISA检测体系。

确定ELISA体系的线性范围。

确定上述的单抗比例后，根据常见的ELISA检测流程，确定本发明方法的现行检测范围：将标准品做成不同的检测梯度（0、12.5ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml、600ng/ml、800ng/ml）。检测结果显示：该方法在12.5ng/mL-400 ng/mL的含量范围内，该方法呈线性关系，线性相关系数R>0.990。

根据建立的ELISA体系，优化试剂盒中的各组分。

利用已知含量的由纤维蛋白（原）及其降解产物组成的标准品和建立的ELISA方法，选择合适的酶标抗体。

利用ELISA法和已知不同含量的由纤维蛋白（原）及其降解产物组成的标准品和空白值进行，选择合适的酶标板。

利用ELISA法和已知不同含量的由纤维蛋白（原）及其降解产物组成的标准品，对常见的缓冲液进行测试，选择合适的缓冲液。

以抗体制剂为检测目标，摸索并确定稀释液的组分。

验证试剂盒的检测人血清中纤维蛋白（原）及其降解产物的线性。

利用搜集常见癌症病人及正常人的血样，对形成的试剂盒进行验证。

附图说明

图1为纤维蛋白原的表达纯化蛋白图，由于纤维蛋白和纤维蛋白原的抗体可共用，因此，在本发明中未针对纤维蛋白的表达与纯化。图中从左至右分别为γ链（51KB）、β链（54KB）、α（91KB），括号内为蛋白的分子量大小。

图2为纤维蛋白原的降解产物D片段的表达纯化图，D片段大小为80KD，D片段和D-dimer可共用同一个抗体，因此，本发明未针对D-dimer单独进行表达纯化。

图3为纤维蛋白原的降解中间体X、Y的表达纯化图，其中X片段为220KD，Y片段为150KD。

图4为ELISA法检测血清FDP的标准曲线图。

图5为本发明建立的试剂盒检测血清FDP的标准曲线图。

图6为本发明建立的试剂盒法检测血清FDP在肺癌病人中的ROC曲线图，曲线下面积为90%，可初步说明利用本发明方法检测肺癌的准确率在90%左右。

图7为本发明建立的试剂盒法检测血清FDP在胃癌病人中的ROC曲线图，曲线下面积为84%，可初步说明本发明检测胃癌的准确率约84%。

图8为本发明建立的试剂盒检测血清FDP在肠癌病人中的RCO曲线图，曲线下面积为93%，可初步说明本发明建立肠癌的准确率约93%。

具体实施方式

以下结合具体实施实例对上述方案做进一步说明。这些实例适用于说明本发明，但不限于本发明的范围。实例中采用的实施条件可以根据具体的操作条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。

纤维蛋白原是一种由肝脏合成的具有凝血功能的蛋白质，是纤维蛋白的前体，分子量为430,000道尔顿。纤维蛋白原由α、β、γ三对不同多肽链所组成，多肽链间以二硫键相连。在凝血酶作用下，α链与β链分别释放出A肽与B肽，生成纤维蛋白单体。在癌症病人体内，癌细胞释放出大量的蛋白水解酶DR-70，异常激活纤维蛋白原或纤维蛋白的降解体系，经过降解中间体X、Y，将其降解为D或D-dimer，因此，血液中纤维蛋白原及其降解产物和降解中间体的含量可直接反映DR-70含量的高低。

实施例1免疫抗原制备。

免疫抗原为纤维蛋白、纤维蛋白原，纤维蛋白（原）的降解中间体X、Y蛋白片段，纤维蛋白（原）的降解产物D、D-dimer片段。由于D-dimer为降解产物D片段的二聚体，纤维蛋白原为纤维蛋白的前体，抗体可以共用。因此，只需要制备4种抗原：纤维蛋白、降解产物D片段和降解中间体X、Y片段。

将要表达的蛋白/多肽序列转化为DNA序列，进行原核表达的优化，送至基因合成公司进行合成。将合成的基因序列连接到表达载体PET-32a，转化到感受态细菌BL21（DE3）后，进行铺板、挑选菌落，扩增培养，测序验证，诱导表达，调整诱导条件，将蛋白表达至上清中；如果通过诱导条件仍然表达在包涵体的，通过更换表达载体和表达菌株的方式，将蛋白表达至上清中。

将表达的蛋白大规模培养，诱导，超声破碎，将含有表达蛋白的清液，用AKTA蛋白纯化系统，进行初步纯化，将初步纯化的蛋白进行SDS-PAGE电泳，并将含有纯化蛋白的PAGE条带割下，在Tris缓冲液中电泳过夜，得到二次纯化的蛋白，二次纯化蛋白上反相系统，进行三次纯化，得到较纯的纤维蛋白（原）及降解中间体和降解的最终产物，冻干，达到干粉。冻干粉即为制备的免疫抗原。

实施例2 纤维蛋白原及降解中间体X、Y和最终产物D、D-dimer多克隆抗体制备。

以实施例1中制备的抗原，免疫新西兰大白兔。具体步骤为：每只兔子接受由在1.0-1.5ml的磷酸盐缓冲液中的 1mg抗原和等体积的弗氏完全佐剂组成的乳液注射，注射部位在兔子双肩周围的皮肤下进行皮下注射和后大腿。在初次免疫后的三周，每一周进行加强免疫，加强免疫的乳液由1.0 到 1.5ml的磷酸盐缓冲液中的 1mg抗原和等体积的弗氏不完全佐剂组成，注射部位与初次免疫相同。

在第三次加强免疫后一周，兔子耳动脉取血于离心管中。37℃烘箱放置2h，转移到4℃沉淀过夜，第二天早上离心，10000rpm，10分钟，取上清的血清。在血清中加入NaN3 至终浓度0.02%，分装后-20℃保存。用环状沉淀试验测定抗体效价，如果达到1：5000以上(稀释抗原)，则该抗原可用，如果未达到该数值，则重新制备多克隆抗体。

实施例3纤维蛋白原及降解中间体X、Y和最终产物D、D-dimer单克隆抗体制备。

以实施例1中制备的免疫抗原，按照实施例2中抗原的量和等体积的弗氏完全佐剂，对6-8周龄雌性Balb/c小鼠，进行腹腔注射。以后每隔3周，加强免疫3次，免疫为静脉注射，抗原量减半，佐剂为弗氏不完全佐剂。

在免疫小鼠的同时，制备饲养层细胞，制备完成后，将加强免疫后的小鼠，拉颈处死，制备脾淋巴细胞悬液；制备骨髓瘤细胞，将骨髓瘤细胞与脾细胞按照1:5的比例混合，37℃培养箱培养，并对杂交瘤细胞进行筛选。

杂交瘤细胞的第一次筛选是在培养过程中，在培养液中加入次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷酸。第一次筛选是将杂交成功的细胞筛选出来。第二次筛选是筛选能够产生足够抗体和的细胞。其方法为在超净工作台中，将杂交瘤细胞多被稀释，接种在多空的细胞培养板上，使每孔的细胞不超过一个，培养，增殖，利用常规的ELISA法检测各孔上清液中细胞分泌的抗体（HRP标记的山羊抗小鼠IgG(H+L)作为酶标抗体）。具体方法为：将10μg 的免疫原固定在 96 孔微量滴定板的孔中；用FBS封闭；然后与各孔的上清液进行反应，洗涤；用偶联辣根过氧化物酶 (HRP) 的山羊抗–鼠抗体检测，洗涤，用3,3’,5,5’ -四甲基联苯胺 (TMB) 溶液温育；在OD450nm下读数。通过读数和稀释倍数，筛选分泌抗体效价高的细胞株继续培养。将二次筛选实施3-4次。将筛选后的细胞，克隆化，-20℃保存，取出部分细胞株，进行规模化培养，生产单克隆抗体，生产出的单克隆抗体，按照二次筛选步骤进行验证。

实施例4 抗体纯化。

采用中科晨宇（北京）生物科技有限公司的抗体纯化试剂盒，将制备的多克隆抗体和单克隆抗体进行纯化，SDS-PAGE进行纯化验证。

实施例5 建立ELISA检测体系。

用纯化后的多克隆抗体包被酶标板，其作用为与检测样本中的检测目标结合，将其固定在酶标板上。其包被过程为：用包被液（北京鼎国昌盛生物技术有限公司）将多克隆抗体稀释为1μg/ml，取200μl加入到酶标板孔中，4℃过夜，洗板；酶标板稳定剂（湖州英创生物科技有限公司）37℃封闭2h，甩干，37℃烘干半小时；将已知含量的标准品（FDP）加入封闭好的酶标板中，37℃作用1h，洗板；将制备的单克隆抗体加入酶标板中，37℃作用1h，洗板；使用HRP标记的山羊抗小鼠IgG（H+L）酶标抗体，37℃作用1h，洗板；显色液TMB作用15min；2M浓硫酸终止反应，450nm读值。结果发现，该方法可以进行纤维蛋白原及其降解产物和降解中间体的检测。

实施例 6本发明方法中各检测单克隆抗体的比例确定。

由于该方法的检测的蛋白/多肽片段有很高的重叠性，各个抗体之间也有相互的干扰，因此，本发明对捕获抗体的各个比例进行摸索。摸索方法同建立的检测体系，各捕获抗体之间的比例不同。实验结果显示，当纤维素蛋白（原）单抗：降解产物D片段和D二聚体抗体：降解中间体X片段单抗：降解中间体Y片段单抗=1:5:2:3时，检测结果和真实值最为接近。

实施例 7 本发明方法的线性范围确定。

将制备的FDP多克隆抗体（1ug/ml）包被ELISA反应板，4℃过夜，洗板；酶标板稳定剂（湖州英创生物科技有限公司）37℃封闭2h，甩干，37℃烘干半小时；将已知含量的标准品（0、12.5ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml）及1:100稀释的血清样品加入封闭好的酶标板中，37℃作用1h，洗板；将制备的捕捉抗体抗FDP单克隆抗体加入酶标板中，37℃作用1h，洗板；使用HRP标记的山羊抗小鼠IgG（H+L）酶标抗体（碧云天生物技术研究所），37℃作用1h，洗板；显色液TMB作用15min；2M浓硫酸终止反应，450nm读值。结果显示，该方法在12.5ng/mL-400 ng/mL的FDP含量范围内，该方法呈线性关系，线性相关系数R>0.990。

实施例8 试剂盒酶标抗体选择。

对市面上可以购买的HRP标记的山羊抗小鼠IgG(H+L)作为选择对象，以常见的ELISA法为选择工具，已知含量的FDP标准品验证。验证结果发现，购自购自碧云天生物技术研究所生产的HRP标记的山羊抗小鼠IgG(H+L)为酶标抗体检测的结果最贴近真实值。

实施例9 试剂盒酶标板选择。

对国内生产的酶标板和国外进口corning公司和thermo生产的酶标板进行选择，同样以ELISA法和已知不同含量的FDP标准品和空白值进行验证。验证结果显示，thermo公司生产的酶标板具有教高的信噪比，能够明显区分空白值、阳性值和阴性值，适用于本发明的试剂盒。

实施例10 缓冲液的选择。

以ELISA法和已知含量的FDP标准品和空白值对磷酸盐缓冲液（PH7.5）、碳酸盐缓冲液（PH9.6）和tris缓冲液（PH11.0）进行选择。结果显示，用碳酸盐缓冲液（PH9.6）作为缓冲液进行检测能更接近真实值，也能有效区分阴性值和空白值。

实施例11 稀释液的选择与确定。

以制备的多克隆抗体和单克隆抗体（制备过程不赘述）为检测目标，对目前市面上商品化的稀释剂和自己配制的稀释剂进行选择。将上述两种抗体用各种稀释剂进行稀释后，置于室温，在第3天、7天、14天、28天进行抗体效价和溶液内蛋白含量检测，同样在4℃和-20℃条件下放置，同样对抗体效价和溶液内蛋白含量进行检测。检测结果发现：湖州英创生物科技有限公司提供的封闭液和稀释液为建立反应体系所需的试剂组分3mMEDTA、0.5%BSA、1×PBS、0.05%Tween-20、0.02%硫柳汞(PH6.2)。

试剂盒其他的试剂按照现行常见的试剂进行即可。

实施例12 验证试剂盒检测血清FDP的线性。

将形成的试剂盒检测对不同含量的标准品（0、12.5ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml）进行检测。结果显示，在12.5ng/mL-400 ng/mL范围内，试剂盒呈线性关系，线性相关系数R>0.990。

实施例13 正常人和癌症病人区分值的确定。

随机选择200例健康人和127例癌症病人，利用形成的试剂盒对这些样本进行检测，经过统计发现，当血液中纤维蛋白、纤维蛋白原及其降解产物的总含量低于1.0ug/ml时候，人的患癌风险较低；当其总含量高于该值时，预示人体内可能发现癌变，患癌的风险比较低。

实施例14 试剂盒在肺癌病人中的初步检测。

用本发明形成的试剂盒，对收集的治疗前肺癌病人血清样本150例，血站收集的正常人血清样本300例，检测其中的纤维蛋白（原）及降解产物浓度，RCO曲线统计，曲线下面积为0.9，即诊断准确性为90%。

实施例15 试剂盒在胃癌病人中的初步检测。

用本发明形成的试剂盒，对收集的胃癌病人血清样本300例，正常人血清样本290例，检测其中的纤维蛋白（原）及降解产物浓度，RCO曲线统计，曲线下面积为0.84，诊断准确性为84%。其中对于早期胃癌的检出率超过75%。

AJCC第七版临床分期	1A	1B	2A	2B	3	3A	3B	3C	4	不明
											阴性（〈96）	1	2	7	5	1	12	13	4	2	1
阳性（﹥96）	5	10	22	21	0	32	32	9	11	10
											检出率（%）	83.33	83.33	75.86	80.77	0	72.7	71.1	69.2	84.6	90.9

实施例 16 检测试剂盒在肠癌病人中的初步检测。

用本发明形成的试剂盒，对收集的肠癌病人血清样本100例，正常人血清样本150例，检测其中的纤维蛋白（原）及降解产物浓度，RCO曲线统计，曲线下面积为0.93，诊断准确性为93%。其中对于早期肠癌的检出率超过89%。

Claims

1.一种纤维蛋白和纤维蛋白原及其降解产物的检测方法，其所述方法包括以下步骤：

从受检者获得生物样品；

利用固定在酶标板上的多克隆抗体与生物样品反应，形成“多克隆抗体-检测目标”的复合物；

利用单克隆抗体捕获固定在酶标板上的“多克隆抗体-检测目标”复合物，形成“多克隆抗体-检测目标-单克隆抗体”的“夹心式”复合物；

检测目标“夹心式”复合物的含量；

评估受检者的患癌风险。

2.根据权利要求1的方法，其中所述的固定在酶标板上的多克隆抗体不仅能够与纤维蛋白和纤维蛋白原的降解产物D片段和D—dimer结合，还能与未降解的纤维蛋白和纤维蛋白（原）及其降解的中间体X、Y片结合。

3.根据权利要求1的方法，其中所述的用于捕获“多克隆抗体-检测目标”复合物的单克隆抗体能够与纤维蛋白和纤维蛋白原及其降解中间体X、Y片段和降解产物D、D—dimer结合。

4.根据权利要求1的方法，其中所述的捕获“多克隆抗体-检测目标”复合物的单克隆抗体的各组分比例为维素蛋白（原）单克隆抗体：降解产物D片段和D二聚体单克隆抗体：降解中间体X片段单抗：降解中间体Y片段单克隆抗体=1:5:2:3。

5.根据权利要求1的方法，其中所述的方法包括酶联免疫吸附检验。

6.根据权利要求1的方法，其中如果受检者体内的纤维蛋白和纤维蛋白原及其降解中间体和降解产物的含量高于平均水准，说明受检者的有较高的患癌风险，并且又很大可能已经形成癌症；如果其含量低于平均水准，说明受检者的患癌风险较低。

7.用于检测纤维蛋白和纤维蛋白原及其降解产物的试剂盒，其所述的试剂盒包括：

能够与纤维蛋白和纤维蛋白原及其降解中间体X、Y片段和降解产物D、D—dimer结合的多克隆抗体；

能够与纤维蛋白和纤维蛋白原及其降解中间体X、Y片段和降解产物D、D—dimer结合的单克隆抗体；

检测体系；

用于测量所述的纤维蛋白（原）及其降解中间体和降解产物的存在与癌症相关的指导。

8.根据权利要求7的试剂盒，其中所述的检测体系包括能够特异性针对纤维蛋白和纤维蛋白原及其降解中间体X、Y片段和降解产物D、D-dimer等6种抗原的检测抗体。

9.根据权利要求7的试剂盒，其中所述的多克隆抗体各组分比例为维素蛋白（原）单克隆抗体：降解产物D片段和D二聚体单克隆抗体：降解中间体X片段单抗：降解中间体Y片段单克隆抗体=1:5:2:3。

10.根据权利要求7的试剂盒，其中所述的抗体和所述的检测体系包括酶联免疫检验。

11.根据权利要求10的试剂盒，其中所述的酶联免疫检验用到的试剂包括：

HRP标记的山羊抗小鼠IgG(H+L)；

corning或thermo公司生产的酶标板；

碳酸盐缓冲液；

组分为3mMEDTA、0.5%BSA、1×PBS、0.05%Tween-20、0.02%硫柳汞(PH6.2)的稀释液。

12.根据权利要求11的试剂，其中所述的磷酸盐缓冲液为PH=9.6的磷酸盐缓冲液。

13.根据权利要求1-12的方法和试剂盒，可用于肺癌的初步检测。

14.根据权利要求1-12的方法和试剂盒，可用于胃癌的初步检测。

15.根据权利要求1-12的方法和试剂盒，可用于肠癌的初步检测。