CN110713986A - 一株维生素b1单克隆抗体杂交瘤细胞株cbdd及其应用 - Google Patents

一株维生素b1单克隆抗体杂交瘤细胞株cbdd及其应用 Download PDF

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Abstract

一株维生素B1单克隆抗体杂交瘤细胞株CBDD及其应用，属于食品安全免疫检测技术领域。本发明合成了维生素B1半抗原，制备了维生素B1完全抗原，并将它与等量弗氏佐剂混合乳化完全，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠，细胞融合及杂交瘤细胞筛选得到一株维生素B1单克隆抗体杂交瘤细胞株CBDD，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18512，保藏日期2019年10月14日。此细胞株分泌的单克隆抗体，对维生素B1具有较好的特异性和检测灵敏度（IC50为20 ng/mL）。本发明成果可用于建立婴幼儿食品、乳品和其他含有维生素B1的食品中维生素B1含量的免疫检测方法，具有实际应用价值。

Description

一株维生素B1单克隆抗体杂交瘤细胞株CBDD及其应用
技术领域
本发明涉及一株维生素B1单克隆抗体杂交瘤细胞株CBDD及其应用，属于食品安全免疫检测技术领域。
背景技术
维生素B1属于B族维生素，也称为盐酸硫铵，广泛存在于食品中并且可作为膳食添加剂，每日推荐的维生素B1摄入量成人通常为8-15mg。维生素B1以辅酶形式参与糖的分解代谢，有保护神经系统的作用，维生素B1是维持正常神经活动所必需的。此外，维生素B1还能促进肠胃蠕动，增加食欲。维生素B1在体内转变成硫胺素焦磷酸，参与糖在体内的代谢。维生素B1缺乏时，糖在组织内的氧化受到影响。还会抑制胆碱酯酶活性的作用，缺乏维生素B1时该酶活性过高，乙酰胆碱大量破坏使神经传导受到影响，可引起多种神经炎症，还可造成胃肠蠕动缓慢，消化道分泌减少，食欲不振、消化不良等障碍。因此，有必要建立快速、高效的维生素B1检测方法。
维生素B1含量分析方法有高效液相色谱法(HPLC)、液质联用 (LC-MS)、荧光分光光度法等仪器方法，这些检测方法具有耗时、步骤繁琐、无法进行现场快速检测、成本高等缺点，因此建立快速简便的维生素B1检测方法具有重要意义。酶联免疫法（ELISA）是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，适用于大量样本的现场快速检测，为维生素B1检测提供了一种新的检测途径。建立高效的免疫学检测方法，筛选高特异性的单克隆单体是重要前提。
发明内容
本发明的目的是克服上述不足之处，提供一株维生素B1单克隆抗体杂交瘤细胞株CBDD及其应用，由该细胞株制备的抗体对维生素B1具有较好的特异性和检测灵敏度，可以用来建立维生素B1的免疫学检测方法。
本发明的技术方案，一株维生素B1单克隆抗体杂交瘤细胞株CBDD，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年10月14日，保藏编号CGMCCNo.18512。
维生素B1单克隆抗体，由所述保藏编号为CGMCC No.18512的维生素B1单克隆抗体杂交瘤细胞株CBDD分泌产生。
所述维生素B1单克隆抗体的应用，建立维生素B1含量的免疫检测方法，应用于食品中维生素B1的检测。所述检测领域为婴幼儿食品、乳品或其他含有维生素B1的食品中。
所述维生素B1单克隆抗体杂交瘤细胞株CBDD的免疫原VB1-HS-BSA的制备方法，主要包括以下步骤：
（1）维生素B1半抗原的制备：称取332mg琥珀酸酐至含1000mg维生素B1的溶液中，将反应混合物加热至140℃，并将混合物在该温度下搅拌1h。随后，将反应混合物通过硅胶柱纯化，得到粗产物，制备型HPLC纯化粗产物，得到白色固体，即维生素B1半抗原。
（2）免疫原VB1-HS-BSA的制备： 称取4.9mg的维生素B1半抗原将其溶解在800μL的DMF中，然后加入7.6mg EDC， 4.6 mg NHS，该混合物在室温搅拌8h，得到反应液A；称取15mg BSA，溶解于0.1 M硼酸盐缓冲溶液中，得到溶液B；随后，逐滴将反应液A液加入到溶液B液中，室温反应过夜，即得偶联物VB1-HS-BSA混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原得到免疫原VB1-HS-BSA。
提供制备所述维生素B1单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选方法，主要包括以下步骤：
（1）小鼠的免疫：将免疫原VB1-HS-BSA与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠；首次免疫用完全弗氏佐剂，多次加强免疫用不完全弗氏佐剂，首次免疫与第二次加强免疫之间间隔28天，多次加强免疫之间间隔21天，最后一次用VB1-HS-BSA完全抗原（不含佐剂）冲刺免疫；通过间接竞争酶联免疫法（ic-ELISA）检测血清效价和抑制；
（2）细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇（PEG 4000）法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过HAT培养基培养，利用间接竞争酶联免疫法（ic-ELISA）检测阳性细胞孔，并进一步利用ic-ELISA测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制效果的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得维生素B1单克隆抗体杂交瘤细胞株CBDD；
（3）杂交瘤细胞株性质的鉴定：通过ic-ELISA测定灵敏度和特异性。
本发明的有益效果：本发明提供的维生素B1单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，对维生素B1具有较好的特异性和检测灵敏度（IC50值为20 ng/mL），为检测婴幼儿食品、乳品和其他含有维生素B1的食品中维生素B1含量提供了免疫学方法。本发明提供的维生素B1单克隆抗体杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体可制成用于检测维生素B1的试剂盒，具有实际应用价值。
生物材料样品保藏：一株维生素B1单克隆抗体杂交瘤细胞株CBDD，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年10月14日，保藏编号CGMCCNo.18512。
附图说明
图1是维生素B1单克隆抗体对维生素B1的抑制标准曲线。
具体实施方式
本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。
本发明通过将维生素B1完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过ic-ELISA筛选细胞上清，最终得到了对维生素B1有较好特异性和灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株。
实施例1 杂交瘤细胞株CBDD的制备
（1）完全抗原的制备：
a、半抗原合成路线如下：
Figure 139202DEST_PATH_IMAGE001
称取332 mg琥珀酸酐至含1000 mg维生素B1的溶液中，将反应混合物加热至140℃，并将混合物在该温度下搅拌1h。随后，将反应混合物通过硅胶柱纯化，得到粗产物，制备型HPLC纯化粗产物，得到白色固体，即维生素B1半抗原。
b、免疫原VB1-HS-BSA的制备：称取4.9 mg维生素B1半抗原，1-乙基碳二亚胺盐酸盐7.6 mg，N-羟基琥珀酰亚胺4.6 mg，用800 μL无水N,N-二甲基甲酰胺溶解，得到A1液，室温搅拌反应8 h。取牛血清蛋白BSA15 mg（维生素B1半抗原与BSA摩尔比分别为30:1、60:1和90:1)，用6 mL0.1M硼酸盐缓冲溶液溶解，得到B1液，在室温条件，逐滴将A1液加入到B1液中，室温反应过夜，即得偶联物VB1-HS-BSA（30:1、60:1和90:1）混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，得到偶联物VB1-HS-BSA（30:1）、VB1-HS-BSA（60:1）和VB1-HS-BSA（90:1）。
（2）包被原VB1-HS-OVA的制备：称取7.3 mg 维生素B1半抗原，1-乙基碳二亚胺盐酸盐11.5 mg，N-羟基琥珀酰亚胺6.9 mg，用800 μL无水N,N-二甲基甲酰胺溶解，得到A2液，室温搅拌反应8h。称取5 mg鸡卵清白蛋白OVA（维生素B1半抗原与OVA摩尔比为180:1），溶解于2 mL 0.1 M硼酸盐缓冲溶液中，得到B2溶液，在室温条件下，逐滴将A2液加入到B2液中，室温反应过夜，即得偶联物VB1-HS-OVA混合液，通过透析分离包被原和未偶联的小分子半抗原。包被原用于单抗制备过程中小鼠血清效价和抑制的检测，并不直接用于小鼠，是制备单抗必需的。
（3）动物免疫：选择健康的6～8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。取三种不同摩尔比的维生素B1完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射分别免疫BALB/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐剂，之后都用不完全弗氏佐剂。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔28天，多次加强免疫之间间隔21天。第三次免疫后7天采血（小鼠断尾采血5μL + 995 μL抗体稀释液=抗血清），使用ic-ELISA测定小鼠血清效价和抑制，选择效价高抑制好的小鼠，在第五次免疫后21天冲刺免疫，腹腔注射，要求冲免剂量减半且不含任何佐剂。
（4）细胞融合：在冲刺免疫三天后，按照常规PEG（聚乙二醇，分子量为4000）方法进行细胞融合，具体步骤如下：
a、摘眼球取血，颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入75%酒精中消毒，浸泡5 min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器的胶头适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，收集，并离心（1200 rpm，8 min），用RPMI-1640培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；
b、收集SP2/0细胞：融合前7-10天，将SP2/0瘤细胞用含10% FBS（胎牛血清）RPMI-1640培养基在5% CO2培养箱中。融合前要求SP2/0瘤细胞数量达到（1~ 4）×107，保证融合前SP2/0瘤细胞处于对数生长期。融合时，收集瘤细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；
c、融合过程7 min。第1 min，将1 mL的PEG 1500由慢到快滴加到细胞中；第2 min，静置。第3 min和第4 min，在1 min内滴加1 mL RPMI-1640培养基；第5 min和第6 min，在1min内滴加2 mL RPMI-1640培养基；第7 min，每10 s滴加1 mL的RPMI-1640培养基。然后37℃温浴5 min。 离心（800 rpm，8 min），弃上清，重悬入含20%胎牛血清，2%的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，按照200μL/孔加到96孔细胞板，置于37℃，5% CO2培养箱中培养。
（5）细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合的第3天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20%胎牛血清，1%的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用ic-ELISA筛选出阳性细胞孔，第二步选用维生素B1为标准品，用ic-ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对维生素B1标准品均有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，获得细胞株CBDD。
（6）单克隆抗体的制备与鉴定：取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1 mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×106杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化。在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹水中除IgG免疫球蛋白外的其他杂蛋白，然后离心，弃沉淀；再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀IgG型的单克隆抗体，离心，弃上清，用0.01M PBS溶液（pH 7.4）溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的单克隆抗体置于-20℃保存。
实施例2 维生素B1单克隆抗体的IC50的测定
碳酸盐缓冲液（CBS）：称取Na2CO3 1.59 g，NaHCO3 2.93 g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000mL，4℃贮存备用；
磷酸盐缓冲液（PBS）：8.0g NaCl，0. 2g KCl，0.2g KH2PO4，2.9g Na2HPO4•12 H2O，溶于800mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000mL；
洗涤液（PBST）：1000mL的0.01 mol/LpH7.4的PBS溶液中加入0.5mL的Tween-20；
抗体稀释液：含有0.1%明胶的洗涤缓冲液；
TMB显色液：A液：Na2HPO4·12H2O 18.43g，柠檬酸9.33g，纯水定容至1000mL；B液：60mgTMB溶于100mL乙二醇中。A、B液按体积比1:5混合即为TMB。
显色液，现用现混。
（1）包被：将包被原VB1-HS-OVA用0.05M pH9.6 碳酸盐缓冲液从1μg/mL开始倍比稀释，100μL/孔，37℃反应2 h；
（2）洗涤：将板内溶液倾去，并用洗涤液洗涤3次，每次3 min；
（3）封闭：拍干后，加入200μL/孔封闭液，37℃反应2 h；洗涤后烘干备用；
（4）加样：将抗血清（小鼠断尾采血后，以抗体稀释液稀释相应倍数后即抗血清）从1:1000开始倍比稀释，并加入到各稀释度的包被孔中，100μL/孔，37℃反应30min；充分洗涤后，加入1:3000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃反应30min；
（5）显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光反应15min；
（6）终止和测定：每孔加入50μL终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD450值。
用ic-ELISA测定单克隆抗体维生素B1的IC50为20ng/mL，说明对维生素B1有很好的灵敏度，可用于维生素B1免疫分析检测。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (5)

1.一株维生素B1单克隆抗体杂交瘤细胞株CBDD，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年10月14日，保藏编号CGMCC No.18512。
2.维生素B1单克隆抗体，其特征在于，由权利要求1所述保藏编号为CGMCC No.18512的维生素B1单克隆抗体杂交瘤细胞株CBDD分泌产生。
3.权利要求2所述维生素B1单克隆抗体的应用，其特征在于：建立维生素B1含量的免疫检测方法，应用于食品中维生素B1的检测。
4.根据权利要求3所述维生素B1单克隆抗体的应用，其特征在于：所述检测领域为婴幼儿食品、乳品或其他含有维生素B1的食品中。
5.用于制备权利要求1所述维生素B1单克隆抗体杂交瘤细胞株CBDD的免疫原VB1-HS-BSA的制备方法，其特征在于步骤如下：
（1）维生素B1半抗原的制备：称取332mg琥珀酸酐至含1000mg维生素B1的溶液中，将反应混合物加热至140℃，并将混合物在该温度下搅拌1h；随后，将反应混合物通过硅胶柱纯化，得到粗产物，制备型HPLC纯化粗产物，得到白色固体，即维生素B1半抗原；
（2）免疫原VB1-HS-BSA的制备： 称取4.9mg的维生素B1半抗原将其溶解在800μL的DMF中，然后加入7.6mg EDC， 4.6 mg NHS，该混合物在室温搅拌8h，得到反应液A；称取15 mgBSA，溶解于0.1 M硼酸盐缓冲液中，得到溶液B；随后，逐滴将反应液A液加到溶液B液中，室温反应过夜，即得偶联物VB1-HS-BSA混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原得到免疫原VB1-HS-BSA。
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