CN106929479B - 一株维生素b2单克隆抗体杂交瘤细胞株gz-4及其应用 - Google Patents

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Abstract

一株维生素B2单克隆抗体杂交瘤细胞株GZ‑4及其应用，属于食品安全免疫检测领域。本发明维生素B2单克隆抗体杂交瘤细胞株GZ‑4，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.13094。此细胞株分泌的单克隆抗体，对维生素B2具有较好的特异性和检测灵敏度（IC50值为11 ng/mL），可以用于对牛奶、维生素饮料、婴幼儿食品中维生素B2的检测，具有实际应用价值。

Description

一株维生素B2单克隆抗体杂交瘤细胞株GZ-4及其应用
技术领域
本发明涉及一株维生素B2单克隆抗体杂交瘤细胞株GZ-4及其应用，属于食品安全免疫检测领域。
背景技术
维生素B2，又名核黄素，为体内黄酶类辅基的组成部分（黄酶在生物氧化还原中发挥递氢作用）。当缺乏维生素B2时，就影响机体的生物氧化，使代谢发生障碍。其病变多表现为口、眼和外生殖器部位的炎症，如口角炎、唇炎、舌炎、眼结膜炎和阴囊炎等。维生素B2是水溶性维生素，容易消化和吸收，不能在体内蓄积，因此只有通过日常膳食摄取维生素B2，维生素B2广泛存在于酵母、肝、肾、蛋、奶、大豆等中。儿童生长发育期、妇女妊娠哺乳期、创伤期由于机体需求量大，日常饮食摄入可能无法满足需要，因此需要补充维生素B2。
中国居民膳食维生素B2推荐摄入量男士1.5 mg/天，女士1.2 mg/天，妊娠期间需要1.6 mg/天，哺乳6个月内要摄取1.8 mg/天，之后的6个月为1.7 mg/天。食品营养强化剂使用卫生标准GB14880-94规定了维生素B2的用量，维生素B2强化婴儿食品配方中需要8～14 mg/kg，妊娠食品配方4～22 mg/kg。
目前维生素B2含量分析方法有微生物法、分光光度法、色谱法。色谱法应用最为广泛，包括气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、气质联用(GC-MS)、液质联用 (LC-MS)、超临界流体色谱(SFC)、毛细管电泳(CE)等的仪器方法，但这些方法需要昂贵的仪器、专业的操作人员，且样品前处理复杂，成本高，时间长，不能实现大量样品的快速检测，因此建立快速简便的维生素B2检测方法具有重要意义。酶联免疫法（ELISA）是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测。建立高效的免疫学检测方法，筛选高特异性的单克隆抗体是重要前提。
发明内容
本发明的目的是提供一株维生素B2单克隆抗体杂交瘤细胞株GZ-4，由该细胞株制备的抗体对维生素B2具有较好特异性和检测灵敏度，可以用来建立维生素B2的免疫学检测方法。
本发明的技术方案：一株维生素B2单克隆抗体杂交瘤细胞株GZ-4，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.13094。
维生素B2单克隆抗体，它由所述保藏编号为CGMCC No.13094的维生素B2单克隆抗体杂交瘤细胞株GZ-4分泌产生。
所述维生素B2单克隆抗体的应用，用于食品安全检测中维生素B2的分析检测。
本发明提供的维生素B2单克隆抗体杂交瘤细胞株GZ-4的制备基本步骤为：
1）完全抗原的合成：
Figure 79693DEST_PATH_IMAGE002
称取8.42 mg VB2（维生素B2）于1 mL无水DMF中，加入18.15 mg CDI（羰基二咪唑），40℃水浴避光搅拌，活化1 h；另取5 mg BSA溶解于2 mL、0.05M、pH 9.6的CB溶液中，将上述活化后的VB2溶液缓慢逐滴加入BSA溶液中，室温搅拌反应过夜，即得VB2完全抗原混合液，4℃透析3天，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，并通过紫外吸收扫描方法鉴定；
2）小鼠的免疫：维生素B2完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。首次免疫（100 μg/只）用完全弗氏佐剂，多次加强免疫（50 μg/只）用不完全弗氏佐剂。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天。最后一次用维生素B2完全抗原（25 μg/只，不含佐剂）冲击免疫；通过间接竞争酶联免疫法（ic-ELISA）检测血清效价和抑制；
3）细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇（PEG 4000）法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过HAT培养基培养，利用间接竞争酶联免疫法（ic-ELISA）检测阳性细胞孔，并进一步利用ic-ELISA测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行3次亚克隆，最终筛选获得维生素B2单克隆抗体杂交瘤细胞株GZ-4；
4）杂交瘤细胞株性质的鉴定：通过ic-ELISA测定灵敏度和特异性。
本发明的有益效果：本发明提供的细胞株GZ-4分泌的单克隆抗体，对维生素B2具有较好的特异性和检测灵敏度（IC50值为11 ng/mL），可以用于对牛奶、维生素饮料、婴幼儿食品中维生素B2的检测，具有实际应用价值。
生物材料样品保藏：一株单克隆细胞株GZ-4，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.13094，保藏日期为2016年10月31日。
附图说明
图1 GZ-4所分泌单克隆抗体的抑制标准曲线。
具体实施方式
本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。
本发明通过将维生素B2完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过ic-ELISA筛选细胞上清，最终得到了对维生素B2有较好特异性和灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株。
实施例1 杂交瘤细胞株GZ-4的制备
（1）完全抗原的合成：称取8.42 mg VB2（维生素B2）于1mL无水DMF中，加入18.15mg CDI（羰基二咪唑），40℃水浴避光搅拌，活化1 h；另取5 mg BSA溶解于2 mL、0.05M、pH9.6的CB溶液中，将上述活化后的VB2溶液缓慢逐滴加入BSA溶液中，室温搅拌反应过夜，即得VB2完全抗原混合液，4℃透析3天，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，并通过紫外吸收扫描方法鉴定。
（2）小鼠免疫：选择健康的6～8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。取维生素B2完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。第1次免疫用完全弗氏佐剂，之后都用不完全弗氏佐剂。首次免疫与第2次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天。第3次免疫后7天采血，使用ic-ELISA测定小鼠血清效价和抑制，选择效价高抑制好的小鼠，在第5次免疫后21天冲击免疫，腹腔注射，要求冲免剂量减半且不含任何佐剂。
（3）细胞融合：在冲击免疫三天后，按照常规PEG（聚乙二醇，分子量为4000）方法进行细胞融合，具体步骤如下：
a、摘眼球取血，颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入75% 酒精中消毒，浸泡 5 min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器的胶头适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，收集，离心（1200 rpm，8 min），用RPMI-1640培养基洗涤脾细胞3次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；
b、收集SP2/0细胞： 融合前 7～10 天，将 SP2/0 瘤细胞用含10% FBS（胎牛血清）RPMI-1640 培养基在5% CO2培养箱中培养。融合前要求SP2/0瘤细胞数量达到 1～4*107，保证融合前SP2/0瘤细胞处于对数生长期。融合时，收集瘤细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；
c、融合过程7 min。第1 min，将1 mL的PEG 4000由慢到快滴加到细胞中；第2 min，静置。第3 min 和第4 min，在1 min内滴加1 mL RPMI-1640培养基；第5 min 和第6 min，在1 min内滴加2 mL RPMI-1640 培养基；第7 min，每10 s 滴加1 mL 的 RPMI-1640 培养基。然后37℃温浴5 min。 离心（800 rpm，8 min），弃上清，重悬入含20%胎牛血清、2%的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，按照200μL/孔加到 96 孔细胞板，置于37℃、5% CO2培养箱中培养。
（4）细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合的第3天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20% 胎牛血清、1%的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用ic-ELISA筛选出阳性细胞孔，第二步选用维生素B2为标准品，用ic-ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对维生素B2标准品均有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复3次，获得细胞株GZ-4。
（5）单克隆抗体的制备与鉴定：取8～10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1 mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×106杂交瘤细胞，从第7天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化。在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹水中除IgG免疫球蛋白外的其他杂蛋白，然后离心，弃沉淀；再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀 IgG型的单克隆抗体，离心，弃上清，用0.01 M PBS溶液（pH7.4）溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的单克隆抗体置于-20℃保存。
6.1包被：将包被原VB2-OVA用0.05M pH9.6 碳酸盐缓冲液从1 µg/mL开始倍比稀释，100μL/孔，37℃反应2h；
6.2洗涤：将板内溶液倾去，并用洗涤液洗涤3次，每次3 min；
6.3封闭：拍干后，加入200μL/孔封闭液，37℃反应2h。洗涤后烘干备用；
6.4加样：将抗血清从1︰1000开始倍比稀释，并加入到各稀释度的包被孔中，100μL/孔，37℃反应1h；充分洗涤后，加入1︰3000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃反应1h；
6.5显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光反应15min；
6.6终止和测定：每孔加入50μL2M的H2SO4终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD 450值。
用ic-ELISA测定单克隆抗体维生素B2的IC50为：11 ng/mL，说明对维生素B2有很好的灵敏度，可用于维生素B2免疫分析检测。
溶液的配置：碳酸盐缓冲液（CBS）：称取Na2CO3 1.59 g，NaHCO3 2.93 g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000mL，4℃贮存备用；
磷酸盐缓冲液（PBS）：8.00g NaCl，0.2g KCl，0.2g KH2PO4，2.9g Na2HPO4·12 H2O，溶于800mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000mL；
PBST：含0.05 % 吐温 20的PBS；
TMB显色液：A液：Na2HPO4 .12H2O 18.43 g，柠檬酸 9.33 g，纯水定容至1000 mL；B液：60 mg TMB 溶于100 mL乙二醇中。A、B液按体积比1︰5混合即为TMB显色液，现用现混。

Claims (3)

1.一株维生素B2单克隆抗体杂交瘤细胞株GZ-4，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.13094。
2.维生素B2单克隆抗体，其特征在于：它由所述保藏编号为CGMCC No.13094的维生素B2单克隆抗体杂交瘤细胞株GZ-4分泌产生。
3.权利要求2所述维生素B2单克隆抗体的应用，其特征在于：用于食品安全检测中维生素B2的分析检测。
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