CN105085665A - 维生素b2的偶联物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种通式(I)的维生素B2的偶联物,由维生素B2半抗原与产生免疫原性的载体物质牛血清蛋白或卵清蛋白偶联构成。其中n为与一个牛血清蛋白分子结合的维生素B2的分子数,所述n为整数1～20，BSA为牛血清蛋白,分子量范围是6.6KDa～6.9KDa。本发明还公开了所述的偶联物的制备方法,即将维生素B2与产生免疫原性的载体物质连接起来，结合为具有诱发动物免疫系统产生抗体的偶联物。本发明的维生素B2的偶联物通过免疫新西兰大白兔,制备了效价达1∶256,000的抗血清,其最低检测限为1.07ng/ml。本发明具有方法简便,快速,特异,准确的特点,为制备维生素B2的酶联免疫检测试剂盒提供了基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种维生素B族维生素的偶联物及其制备方法与应用，尤其涉及一种维生素B2的偶联物及其制备方法与应用。属于营养素免疫检测领域。
背景技术
本发明涉及的下列名称适用于整个说明书和权利要求书：
BSA:血清蛋白（BovineSerumAlbumin），Sigma公司产品
PBS：磷酸缓冲液（PhosphateBufferedSaline）（0.01M，pH=7.40）
Sephadex-G75：葡聚糖凝胶，Sigma公司产品
cBSA：经乙二胺修饰的牛血清蛋白
透析膜：索莱宝科技有限公司
维生素B2：Sigma公司产品
CDI：N,N'-羰基二咪唑，Sigma公司产品
DMAP：4-二甲氨基吡啶，Sigma公司产品。
维生素B2，又名核黄素，早在1879年就被英国化学家布鲁斯于牛奶中发现，它是黄素辅酶的重要组成部分，主要参与细胞呼吸链的氢传递过程。饮食中缺乏维生素B2可能造成皮肤及粘膜炎症、贫血、以及畏光等症状。最近有报道指出，维生素B2还参与核酸修复过程以及细胞凋亡过程。由于维生素B2无法由人体自身合成，并且无法在体内蓄积，因此只能从日常饮食中摄取维生素B2。含维生素B2较多的食物有动物肝脏、蛋黄、牛奶、鳝鱼等。维生素B2的日常建议摄入量为男士1.3mg/天，女士1.1mg/天。在儿童发育期、妇女哺乳期、创伤、患有慢性消耗性疾病时，由于机体需求量增大，日常饮食摄入可能无法满足机体需要，可能会造成维生素B2缺乏症，此时需适当补充维生素B2。美国和加拿大人口的日平均摄入量为男性2mg/天，女性1.5mg/天。95%的美国人口每天从食物和保健品中摄入的维生素B2为4-10mg/天。虽然人体排泄维生素B2的能力较强，但大量摄入维生素B2仍有可能对肾功能产生影响。而维生素B2在中国的平均摄入量只有0.9mg/天，低于推荐的标准。因此，在儿童成长过程中检测维生素B2是十分必要的。
微生物法是维生素检测中历史久远的经典分析手段，它利用某类微生物对特定营养物质的特殊依赖作用进行检测。现今的许多标准中，仍将微生物法作为维生素检测的首选方法，如AOAC（AssociationofOfficialAnalyticalChemists）、AACC(AmericanAssociationofCerealChemists)等。但是，由于检测原理的特点，微生物法有着自身的局限与不足。首先，微生物法较其他分析方法耗时更长。由于分析结果由相应微生物的生长程度来指征，因此需预留微生物生长的足够时间，检测一般需要4到6天。第二，微生物法由于涉及微生物培养，对操作环境有一定的要求。第三，步骤繁琐，即便是商品化的微生物法试剂盒，在使用时也要进行严格的样品前处理、培养基配置、结果处理等等。因此，微生物法已渐渐被其他分析方法所取代。仪器分析方法如高效液相色谱法是应用广泛的方法。这些方法准确、稳定、可靠，可以作为标准方法。但仪器法价格昂贵，费时较长，且造成有机溶剂污染，需要大型仪器设备，需要专门的技术人员。酶联免疫检测法（ELISA）提供了一种极好的检测手段。该法具有快速，准确，简易，不需要专门人员操作等优点，这使得ELISA法成为一种理想的，可用于常规检测方法。酶联免疫检测法的核心是需要高质量的抗体。大部分维生素都是小分子有机化合物，不具有免疫原性，称之为半抗原。所以，必须把这些化合物转变为能引发动物免疫系统产生抗体的免疫原（又称之为完全抗原）。经检索，目前世界上尚未有维生素B2的免疫原的合成及抗体制备的报道，因此研究维生素B2的免疫原的合成及抗体制备就显得十分必要。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明要解决的问题是：提供一种能引发动物免疫系统产生针对维生素B2有特异反应的抗体的免疫原，即维生素B2的偶联物及其制备方法。同时，本发明还提供了所述的维生素B2的偶联物作为免疫原在制备维生素B2特异反应抗体中应用。
本发明的维生素B2的偶联物，由维生素B2半抗原与产生抗原性的载体物质牛血清蛋白或卵清蛋白偶联构成。
其中：上述产生免疫原性的载体物质优选是牛血清蛋白。
本发明所述的维生素B2的偶联物，其结构通式如（I）
（I）
其中：n为与一个牛血清蛋白分子结合的维生素B2的分子个数，所述n为整数1~20，BSA为牛血清蛋白（Bovineserumalbumin），分子量范围6.6KDa~6.9Kda；
上述偶联物显示出如下物化特征：
（1）外观：白色粉末固体；
（2）紫外吸收光谱：373nm，445nm
上述的维生素B2的偶联物，其特征是:所述n为整数5~15，BSA分子量范围6.6KDa~6.9Kda
上述的维生素B2的偶联物的制备方法是：将维生素B2与产生免疫原性的载体物质连接起来，结合为具有诱发动物免疫产生抗体的偶联物，并保持该偶联物的生物活性不变。
上述的维生素B2的偶联物的制备方法，由如下步骤完成：
（1）溶液A的制备：将维生素B2，N,N'-羰基二咪唑（CDI），4-二甲氨基吡啶（DMAP）以摩尔比1:2~8:0.2~1溶解于二甲基甲酰胺中，反应生成维生素B2与N,N'-羰基二咪唑的活性中间体，备用；
（2）cBSA的制备：在0~4?C条件下，先将乙二胺溶于pH为7.38~7.56，浓度为0.01M~0.02M磷酸缓冲溶液中，用浓盐酸调pH为7.38~7.56；以乙二胺:BSA:EDC的摩尔比为15~25:1:15~25的量称取BSA和EDC，然后加入乙二胺溶液中，在20±5?C条件下搅拌反应2~4小时；将乙二胺与BSA的反应溶液在0~4?C条件下，用上述磷酸缓冲液搅拌透析70~80小时，然后改用蒸馏水透析20~30小时，每6小时更换一次透析液；在0~4?C，以13000转/分钟离心上述透析后的溶液15分钟，取上清液；冻干上清液，得到白色粉末固体cBSA，备用；
（3）溶液B的配置：把cBSA溶于pH为7.38~7.56，浓度为0.01M~0.02M磷酸缓冲溶液中，配成10.0±5.0mg/ml的溶液，备用；
（4）按维生素B2与cBSA的摩尔比为15~50:1量分别取溶液A和溶液B，在20?C±5?C温度下，把溶液A逐滴加入到不断搅拌状态下的溶液B中，反应4~6小时，得到溶液C；
（5）溶液C用上述磷酸缓冲液搅拌透析70~80小时，再改用蒸馏水透析20~30小时，每6小时更换一次透析液；然后在0~4?C下，以13000转/分钟离心上述透析后的溶液15分钟，取上清液；
（6）冻干上清液，得到白色维生素B2的偶联物。
在上述的维生素B2的偶联物的制备方法中：步骤（1）所述的维生素B2，N,N'-羰基二咪唑（CDI），4-二甲氨基吡啶（DMAP）的摩尔比优选为1:5:1。
在上述的维生素B2的偶联物的制备方法中：步骤（2）所述乙二胺与牛血清蛋白、EDC的摩尔比为20:1:20。
在上述的维生素B2的偶联物的制备方法中：步骤（2）（3）所述的磷酸缓冲液pH优选为7.40，浓度优选为0.01M。
在上述的维生素B2的偶联物的制备方法中：步骤（4）所述维生素B2与牛血清蛋白的摩尔比为30:1。
本发明所述的维生素B2的偶联物作为免疫原在制备维生素B2特异反应抗体中的应用。
利用本发明的技术方案可以成功地把半抗原维生素B2与载体蛋白特别是牛血清蛋白BSA偶联起来，从而合成了能够在动物体内引发免疫反应，产生抗体的完全免疫原—维生素B2的偶联物。
利用本发明所述的维生素B2的偶联物作为免疫原免疫新西兰大白兔，成功地获得了对半抗原维生素B2有特异反应的抗体。经ELISA实验鉴定，利用本发明所述的维生素B2的偶联物作为免疫原制备的维生素B2特异反应抗体，其抗血清效价达到1:64000，其最低检测限为1.07ng/mL。
上述的维生素B2的偶联物以及高效价的维生素B2特异反应抗体的制备成功，为制备维生素B2的酶联免疫检测试剂盒提供了基础。在实际应用中，把所述制备的维生素B2特异反应抗体镀在微孔盘内，就可以快速检测儿童血样中维生素B2的含量。由于本发明所述方法具有简易，快速，特异，准确的特点，所以可以用于儿童血样中维生素B2的含量测定。这样不但可以节省大量的检测时间，还可以用于现场操作，从而弥补了仪器法费时较长，需要大型仪器设备支持，需要专门的技术人员操作，难用于现场的不足。所以，半抗原维生素B2与载体蛋白特别是牛血清蛋白BSA偶联物的合成及抗血清的成功制备为这种快速检测法奠定了基础。
具体实施方式
实施例1
（1）溶液A的制备：将维生素B219.4mg，N,N'-羰基二咪唑（CDI）25.0mg，4-二甲氨基吡啶（DMAP）0.6mg溶解于4ml二甲基甲酰胺中，反应生成维生素B2与N,N'-羰基二咪唑的活性中间体，备用；
（2）cBSA的制备：在0~4?C条件下，先将乙二胺18.0mg溶于20mlpH为7.40，浓度为0.01M磷酸缓冲溶液中，用浓盐酸调pH为7.40；分别称取1000.0mgBSA（分子量68,000）和57.51mgEDC，然后加入乙二胺溶液中，在20?C条件下搅拌反应2小时；将乙二胺与BSA的反应溶液在0~4?C条件下，用上述磷酸缓冲液搅拌透析70小时，然后改用蒸馏水透析24小时，每6小时更换一次透析液；在0~4?C，以13000转/分钟离心上述透析后的溶液15分钟，取上清液；冻干上清液，得到白色粉末固体cBSA，备用；
（3）溶液B的配置：把cBSA溶于pH为7.40，浓度为0.01M磷酸缓冲溶液中，配成10.0mg/ml的溶液，备用；
（4）按维生素B2与cBSA的摩尔比为20:1量分别取溶液A和溶液B，在20?C温度下，把溶液A逐滴加入到不断搅拌状态下的溶液B中，反应6小时，得到溶液C；
（5）溶液C用上述磷酸缓冲液搅拌透析70小时，再改用蒸馏水透析24小时，每6小时更换一次透析液；然后在0~4?C下，以13000转/分钟离心上述透析后的溶液15分钟，取上清液；
（6）冻干上清液，得到白色维生素B2的偶联物。
实施例2
（1）溶液A的制备：将维生素B219.4mg，N,N'-羰基二咪唑（CDI）30.0mg，4-二甲氨基吡啶（DMAP）1.0mg溶解于5ml二甲基甲酰胺中，反应生成维生素B2与N,N'-羰基二咪唑的活性中间体，备用；
（2）cBSA的制备：在0~4?C条件下，先将乙二胺18.0mg溶于20mlpH为7.40，浓度为0.01M磷酸缓冲溶液中，用浓盐酸调pH为7.40；分别称取1000.0mgBSA（分子量68,000）和57.51mgEDC，然后加入乙二胺溶液中，在20?C条件下搅拌反应2小时；将乙二胺与BSA的反应溶液在0~4?C条件下，用上述磷酸缓冲液搅拌透析70小时，然后改用蒸馏水透析30小时，每6小时更换一次透析液；在0~4?C，以13000转/分钟离心上述透析后的溶液15分钟，取上清液；冻干上清液，得到白色粉末固体cBSA，备用；
（3）溶液B的配置：把cBSA溶于pH为7.40，浓度为0.01M磷酸缓冲溶液中，配成10.0mg/ml的溶液，备用；
（4）按维生素B2与cBSA的摩尔比为30:1量分别取溶液A和溶液B，在25?C温度下，把溶液A逐滴加入到不断搅拌状态下的溶液B中，反应4小时，得到溶液C；
（5）溶液C用上述磷酸缓冲液搅拌透析72小时，再改用蒸馏水透析30小时，每6小时更换一次透析液；然后在0~4?C下，以13000转/分钟离心上述透析后的溶液15分钟，取上清液；
（6）冻干上清液，得到白色维生素B2的偶联物。
实施例3
（1）溶液A的制备：将维生素B219.4mg，N,N'-羰基二咪唑（CDI）35.0mg，4-二甲氨基吡啶（DMAP）1.3mg溶解于7ml二甲基甲酰胺中，反应生成维生素B2与N,N'-羰基二咪唑的活性中间体，备用。
（2）cBSA的制备：在0~4?C条件下，先将乙二胺18.52mg溶于20mlpH为7.56，浓度为0.02M磷酸缓冲溶液中，用浓盐酸调pH为7.56；分别称取1000.00mgBSA（分子量68,000）和57.51mgEDC，然后加入乙二胺溶液中，在22?C条件下搅拌反应3小时；将乙二胺与BSA的反应溶液在0~4?C条件下，用上述磷酸缓冲液搅拌透析80小时，然后改用蒸馏水透析20小时，每6小时更换一次透析液；在0~4?C，以13000转/分钟离心上述透析后的溶液15分钟，取上清液；冻干上清液，得到白色粉末固体cBSA，备用；
（3）溶液B的配置：把cBSA溶于pH为7.56，浓度为0.02M磷酸缓冲溶液中，配成12.0mg/ml的溶液，备用；
（4）按维生素B2与cBSA的摩尔比为50:1量分别取溶液A和溶液B，在22?C温度下，把溶液A逐滴加入到不断搅拌状态下的溶液B中，反应5小时，得到溶液C；
（5）溶液C用上述磷酸缓冲液搅拌透析80小时，再改用蒸馏水透析20小时，每6小时更换一次透析液；然后在0~4?C下，以13000转/分钟离心上述透析后的溶液15分钟，取上清液；
（6）冻干上清液，得到白色维生素B2的偶联物。
（7）用Sephadex-G75（Sigma）进行纯化分离，以PBS（0.01M，pH=7.40）为洗脱液。收集维生素B2的偶联物纯品。冻干得到维生素B2的偶联物即维生素B2免疫原固体粉末。
实施例4
抗体的制备纯化及检测
1.抗体的制备
选择上述实施例2所制备的维生素B2的偶联物作为免疫原进行动物免疫实验以制备抗体。
取1mg/ml的维生素B2的偶联物的溶液1ml，加入等体积的弗氏完全佐剂，充分乳化后，经皮下多点注射给四只体重2kg的雄性健康新西兰大白兔，1ml/只，15天后以同量抗原与弗氏不完全佐剂充分乳化后进行二免，二免以后，每隔15天加强免疫一次，抗原量减半，共免疫5次。最后一次免疫7天后，心脏取血，室温静置1小时，0-4?C过夜，13000转/分离心15分钟，收集血清，-20?C保存，备用。
2．抗体的纯化
搅拌状态下向上述制备的抗血清中加入饱和硫酸铵至硫酸铵溶液的终浓度为体积百分比50%，0-4?C放置过夜，有沉淀物析出；以13000转/分离心15分钟，弃上清液，向沉淀物中加入0.01M、pH7.4的PBS至沉淀溶解，然后加入饱和硫酸铵至硫酸铵溶液的终浓度为体积百分比33%，0-4?C放置过夜，有沉淀物析出；以13000转/分离心15分钟，弃上清液，向沉淀物中加入0.01M、pH7.4的PBS至沉淀溶解。将上述纯化物用0.01M、pH7.4的PBS，0-4?C透析，换透析液3次，然后加入质量体积百分比为0.02%的叠氮化钠，-20?C保存，备用。
3．抗体的酶联免疫检测
（1）效价测定:方法采用常规的间接酶联免疫吸附检测法；
在96孔的酶标板上，用100ul/孔的维生素B2与卵清蛋白的偶联物（10ug/ml）包被，0-4?C放置过夜，然后用PBST（1000mlpH7.4、浓度0.01M的PBS+体积百分比0.05%Tween20）洗板四次；用250ul/孔封闭液（1000mlPBST+质量体积百分比是1%卵清蛋白）封闭，室温放置3小时，洗板；在洗去封闭液后，加100ul/孔的抗血清，室温放置2小时，洗板；在洗去抗血清以后，每孔加入1:1000的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG100ul，室温放置1小时，洗板；加入底物邻苯二胺显色，室温放置10min，再加入2MHCL终止。酶标仪A492nm检测。
经测定：本发明所述维生素B2的偶联物抗体效价达1:64000。
效价的判定以P/N大于2:1的血清最高稀释倍数为该抗体的酶联免疫检测效价。
其中：上述P为待测血清在某一稀释倍数测定的吸光度值，上述N为阴性对照在相应倍数测定的吸光度值。
（2）特异性测定：
测定步骤与效价测定类似，在上述最佳的包被抗原与抗体浓度条件下，加抗体的同时加入维生素B2溶液（从100ppm—1ppt），与包被抗原竞争结合有限的抗体，维生素B2的浓度越高，抗体与包被抗原就结合的越少，从而显色越浅，吸光度值越低。再与空白对照（只加抗体，未加维生素B2的吸光度值）相比较，以确定抗体特异性。
通过测定抗体特异性较好，其最低检测限可达到1.07ng/ml，检测灵敏度较高，并且与其他维生素的交叉反应较少。
实施例5
制备维生素B2与卵清蛋白的偶联物
（1）溶液A的制备：将维生素B219.4mg，N,N'-羰基二咪唑（CDI）35.0mg，4-二甲氨基吡啶（DMAP）1.3mg溶解于7ml二甲基甲酰胺中，反应生成维生素B2与N,N'-羰基二咪唑的活性中间体，备用。
（2）溶液B的配置：把卵清蛋白溶于pH为7.40，浓度为0.01M磷酸缓冲溶液中，配成10.0mg/ml的溶液，备用；
（3）按维生素B2与卵清蛋白的摩尔比为30:1量分别取溶液A和溶液B，在25?C温度下，把溶液A逐滴加入到不断搅拌状态下的溶液B中，反应5小时，得到溶液C；
（4）溶液C用上述磷酸缓冲液搅拌透析72小时，再改用蒸馏水透析24小时，每6小时更换一次透析液；然后在0~4?C下，以13000转/分钟离心上述透析后的溶液15分钟，取上清液；
（5）冻干上清液，得到白色维生素B2与卵清蛋白的偶联物。
Claims (10)
1.一种维生素B2的偶联物,由维生素B2半抗原与产生免疫原性的载体物质牛血清蛋白或卵清蛋白偶联构成。
2.如权利要求1所述的维生素B2的偶联物，其中所述产生免疫原性的载体物质牛血清蛋白。
3.如权利要求2所述的维生素B2的偶联物，其结构通式如（I）
（I）
其中：n为与一个牛血清蛋白分子结合的维生素B2的分子个数，所述n为整数1~20，BSA为牛血清蛋白（Bovineserumalbumin），分子量范围6.6KDa~6.9Kda；
上述偶联物显示出如下物化特征：
外观：白色粉末固体；
紫外吸收光谱：373nm，445nm。
4.如权利要求3所述的维生素B2的偶联物，其特征是:所述n为整数5~15，BSA分子量范围6.6KDa~6.9Kda。
5.权利要求1~4中任一项所述的维生素B2的偶联物的制备方法，其特征是：将维生素B2与产生免疫原性的载体物质连接起来，结合为具有诱发动物免疫产生抗体的偶联物，并保持该偶联物的生物活性不变。
6.如权利要求5所述的维生素B2的偶联物的制备方法，由如下步骤完成：
（1）溶液A的制备：将维生素B2，N,N'-羰基二咪唑（CDI），4-二甲氨基吡啶（DMAP）以摩尔比1:2~8:0.2~1溶解于二甲基甲酰胺中，反应生成维生素B2与N,N'-羰基二咪唑的活性中间体，备用；
（2）cBSA的制备：在0~4?C条件下，先将乙二胺溶于pH为7.38~7.56，浓度为
0.01M~0.02M磷酸缓冲溶液中，用浓盐酸调pH为7.38~7.56；以乙二胺:BSA:EDC的摩尔比为15~25:1:15~25的量称取BSA和EDC，然后加入乙二胺溶液中，在20±5?C条件下搅拌反应2~4小时；将乙二胺与BSA的反应溶液在0~4?C条件下，用上述磷酸缓冲液搅拌透析70~80小时，然后改用蒸馏水透析20~30小时，每6小时更换一次透析液；在0~4?C，以13000转/分钟离心上述透析后的溶液15分钟，取上清液；冻干上清液，得到白色粉末固体cBSA，备用；
（3）溶液B的配置：把cBSA溶于pH为7.38~7.56，浓度为0.01M~0.02M磷酸缓冲溶液中，配成10.0±5.0mg/ml的溶液，备用；
（4）按维生素B2与cBSA的摩尔比为15~50:1量分别取溶液A和溶液B，在20?C±5?C温度下，把溶液A逐滴加入到不断搅拌状态下的溶液B中，反应4~6小时，得到溶液C；
（5）溶液C用上述磷酸缓冲液搅拌透析70~80小时，再改用蒸馏水透析20~30小时，每6小时更换一次透析液；然后在0~4?C下，以13000转/分钟离心上述透析后的溶液15分钟，取上清液；
（6）冻干上清液，得到白色维生素B2的偶联物。
7.如权利要求6所述的维生素B2的偶联物的制备方法，其特征是：步骤（1）所述的维生素B2与N,N'-羰基二咪唑的摩尔比为1:2~8。
8.如权利要求6所述的维生素B2的偶联物的制备方法，其特征是：步骤（2）所述乙二胺与牛血清蛋白、EDC的摩尔比为20:1:20。
9.如权利要求6所述的维生素B2的偶联物的制备方法，其特征是：步骤（4）所述维生素B2与牛血清蛋白的摩尔比为30:1。
10.权利要求1~4中任一项所述的维生素B2的偶联物作为免疫原在制备维生素B2特异反应抗体中的应用。
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