CN102809653A - 一种检测新布尼亚病毒抗原的elisa试剂盒的制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测发热伴血小板减少综合征新布尼亚病毒抗原酶联免疫吸附试验试剂盒的制备和应用。试剂盒采用发热伴血小板减少综合征病毒，简称新布尼亚病毒JS-2007-001病毒株免疫家兔和小鼠获得抗血清。用兔抗体包被酶联反应板，小鼠抗体偶联辣根过氧化物酶(HRP)配以抗原定量参考品，酶底物TMB 显色剂等辅助试剂组成试剂盒。
Description
1.发明领域
本发明属于生物技术领域免疫诊断范畴。根据靶标分类的不同，目前针对传染病的诊断可分为分子生物学和免疫学诊断两类。分子生物学诊断具有快速、检出限低等优点，但是对于尖端仪器的依赖、易交叉污染以及对操作人员高素质的要求等，限制了其在基层的应用和推广。免疫学诊断(亦称血清学诊断)是以抗原抗体之间特异性结合为基础，如可以通过病原体特异性抗原检测其抗体，反之亦然。传统的免疫学诊断方法包括如病毒微量中和、免疫荧光、空斑减少等，但上述实验均涉及时间过长、需要操作活病毒、只能在高等级实验室内进行等问题。与上述各类实验方法相比，基于酶联免疫吸附试验ELISA原理开发的诊断试剂，具有敏感性高特异性强、操作简便、节约时间、价格低廉和适合基层使用等优点，市场的需求量也较大。
2.发明背景
新布尼亚病毒(Novel Bunyavirus，SFTS Bunyavirus)，是发热伴血小板减少综合症(Feverwith Throbocytopenia Associated Syndrome，SFTS)的病原，为布尼亚病毒科白
热病毒属的一种新型病毒，于2009年在中国首先发现，也是中国首例发现的新型病毒。患者出现以高热、血小板减少、白血球降低、多器官功能紊乱、出血等为特征的严重急性传染病，严重影响着人民的健康和生命安全。2010年中国中东部，包括安徽、江苏、湖北、河南、山东等省先后爆发多起由蜱虫叮咬而致人死亡公共卫生事件，造成社会恐慌，严重影响当地群众健康安全和经济发展。到目前为止，国内16个省发现300多病例，造成40余人死亡。经国家疾控中心、相关省疾控中心多家单位的联合攻关，现已查明引起该传染病的病原为一新型的出血热病毒，在分类学上属于布尼亚病毒科(Bunyaviridae)、白
病毒属(Phlebovirus genus)，目前命名为发热伴血小板减少综合征病毒(Severe Febrile and Thrombocytopenicyndrome Virus，SFTSV)目前该病毒序列已经阐明，基于RT-PCR的检测标准已经建立，但是对SFTSV的免疫学检测试剂还未建立，使得评价该病毒感染缺乏一个对PCR结果的验证方法。也无法评估群体的既往感染水平以及疫苗的保护作用。
由于该病毒引起的是一新发传染病，临床始发症状与普通流感无异，且病人多集中在卫生医疗水平薄弱的农村地区；同时基层医疗从业人员缺乏相关鉴别诊断的培训，当前迫切需要能适应基层临床检验人员操作的、快速检测方法，便于对病人的及时救治。另外，该病的流行病学特征、传播媒介、动物感染情况等目前均处于空白状态，也急需开发操作简单、方便快捷的检测试剂，以满足疾控系统对疫区人群、动物监测工作之需求，而目前市场无相关产品供应。
3.发明内容
本发明的目的之一在于提供了一株新的，用于检测发热伴血小板减少综合征病毒的新布尼亚病毒JS-2007-001，该病毒分类命名为新布尼亚病毒(Severe feverwith thrombocytopenia syndrome virus；NovelBunyaviridae)，其保藏号为CCTCC V201211；保藏时间为2012年3月1日；保藏单位为：中国典型培养物保藏中心；保藏地址为：武汉大学生命科学学院武汉市武昌珞珈山。
本发明的目的之二在于提供了利用上述新布尼亚病毒JS-2007-001制备检测发热伴血小板减少综合征病毒抗原的ELISA试剂盒。
本发明的优点在于，经过适应性培养、免疫原性鉴定和免疫保护作用鉴定发现，本发明中分离的JS-2007-001病毒毒种具有最佳的生长特性和适应特性，在较短时间内达到生长高峰，可稳定获得较高滴度病毒，免疫动物获得抗体水平较高，从而能开发成为一种稳定的可商业化应用的检测发热伴血小板减少综合征病毒的试剂盒。
本发明涉及一种制备用于检测新布尼亚病毒抗原的ELISA试剂盒的制备方法，其包括如下步骤：将经细胞培养获得的该保藏号为CCTCCV201211的新布尼亚病毒JS-2007-001原液经灭活超滤浓缩后，分别用超速离心法和柱层析法进行纯化得到纯病毒抗原；用病毒抗原分别免疫家兔和小鼠获得特异性抗血清，再经柱层析纯化获得特异性纯抗体，将免疫获得的兔抗新布尼业病毒JS-2007-001抗体作为第一抗体包被酶联反应板；将免疫获得的小鼠抗新布尼亚病毒JS-2007-001抗体偶联辣根过氧化物酶HRP作为检测报告抗体；用灭活后的新布尼亚病毒JS-2007-001质控参考品；检测样本如果含有新布尼亚病毒，则会结合于所述的兔抗新布尼亚病毒JS-2007-001抗体包被的反应板，继而被HRP标记的小鼠抗新布尼亚病毒JS-2007-001抗体识别结合，构成抗体-抗原-抗体双抗体夹心检测系统，TMB显色结果。
按照本发明所述的方法制备得到的试剂盒，其能检测新布尼亚病毒特异性抗原的滴度范围为1ng/mL。
按照本发明所述的方法制备得到的试剂盒在制备用于新布尼病毒的检测的诊断试剂中的应用。
按照本发明所述的方法制备得到的试剂盒在制备用于人群感染情况评估和疫苗制备中抗原含量的检测和疫苗效果观察结果的评价的诊断试剂中的应用。
按照本发明所述的方法制备得到的试剂盒，可以用于新布尼亚病毒早期感染的检测，也可以用于新布尼亚病毒感染情况的流行病学调查的评价以及新布尼亚病毒灭活疫苗中抗原含量的测定和疫苗免疫效果的评价。
试剂盒的主要质量指标为：试剂质量指标达到2010版《中国药典》第三部，体外诊断类规程中的要求。其中包括灵敏性、特异性、精密性、稳定性、总符合率。
按照本发明所述的方法制备得到的试剂盒的检测灵敏度为：不高于1ng/mL；特异性验证：与其它同科布尼亚病毒无交叉反应；精密性验证：试剂批间差异(CV％)应不高于15％；其样品检测阳性率：与RT-PCR检出总符合率≥95％。
4.附图说明
图1为新布尼病毒抗原ELISA检测试剂盒制备流程图
5.具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。本实施例权权用于对本发明的说明，不构成对本发明的限制。
实施例1：新布尼亚病毒(JS-2007-001病毒株)免疫家兔以及血清抗体制备
7株新布尼亚病毒株分别分离自江苏和安徽疫区，6株直接分离于病人血清，1株来源于可疑病犬。分离时所有细胞为VERO细胞(表1)。
表1：7株新布尼亚病毒株的分离时间与来源
7株新布尼亚病毒株在VERO细胞做适应性培养、免疫原性鉴定和免疫保护作用鉴定发现，JS-2007-001病毒毒种具有最佳的生长特性和适应特性，在较短时间内达到生长高峰，可稳定获得较高滴度病毒，免疫动物获得抗体水平较高，免疫血清中和试验发现对所有7株病毒均有良好的保护作用。所以选JS-2007-001病毒毒种作制备毒种。来源于犬类的毒种(JS-2010-DOG)因为考虑到种属差异可能的潜在不确定性，尽管检测指标较好，依然没有选用(表2)。
表2：7株新布尼亚病毒株的培养特性和免疫特性鉴定
将经纯化灭活后的新布尼亚病毒抗原用生理盐水进行适量稀释其含量在0.1～200μg/mL，加入弗氏完全佐剂(Sigma)进行混合，选择1500～2500g的家兔，于后腿及脚掌部注射卡介苗1～20mg进行致敏，两周后于家兔两侧腹股沟分别注射上述配置的佐剂抗原，间隔2～4周以同样剂量不同免疫部位进行加强免疫，共进行3～5次免疫，末次免疫后15天采集家兔血清进行抗体效价测定，滴度大于1∶20000后采集全血，常规分离血清。用Protein G常规法纯化得到抗体。
实施例2：新布尼亚病毒(JS-2007-001病毒株)免疫小鼠以及血清抗体制备与HRP标记
将经纯化灭活后的新布尼亚病毒抗原用生理盐水进行适量稀释其含量在0.1～200μg/mL，加入弗氏完全佐剂(Sigma)进行混合，选择15～25g的小鼠，于后腿部注射卡介苗1～5mg，进行致敏。两周后于小鼠腹腔内注射上述配置的佐剂抗原，间隔2～4周以同样剂量不同免疫部位进行加强免疫，共进行3～5次免疫，末次免疫后10天采集小鼠血清进行抗体效价测定，达到大于1∶20000后采集全血，常规分离血清。用Protein G常规法纯化得到纯抗体。
HRP标记小鼠抗新布尼亚病毒抗体制备。采用改良过碘酸钠法(医学基础免疫学实验，金伯泉，李恩善。北京世界图书出版社，1990)标记抗体。将5mg HRP溶于0.5mL蒸馏水中，加入新鲜配制的0.06M的NalO4水溶液0.5mL，混匀置4℃冰箱30分钟，取出加入0.16M的乙二醇水溶液0.5mL，室温放置30分钟后加入含纯化小鼠抗新布尼亚病毒抗体的水溶液1mL，混匀并装透析袋，以0.05M、pH9.5的碳酸盐缓冲液于4℃冰箱中慢慢搅拌透析6小时使之结合，然后吸出，加NaBH4溶液(5mg/mL)0.2mL，置4℃冰箱2小时，将上述结合物混合液加入等体积饱和硫酸铵溶液，置4℃冰箱30分钟后离心，将所得沉淀物溶于少许0.02M、pH7.4PBS中，并4℃透析过夜，次日离心除去不溶物，即得到HRP标记的抗体蛋白，用0.02M、pH7.4PBS稀至5mL，加入含有稳定剂的甘油，终浓度50％，混匀后置低温保存备用。
实施例3：抗体包被板制备。
将纯化抗体用0.05M pH 9碳酸盐包被缓冲液进行适量稀释(1～10μg/mL)。将稀释好的抗体液加入酶联板孔内，每孔100μL，4℃包被18～20小时，弃去孔内液体，洗板数次，用酶稳定剂(山东，泰天和生物)加入各板孔内，每孔150～200μL。4℃反应4～6小时。弃去孔内保护剂，采用冻干法干燥包被板，用密封代封装酶联板，置2～8℃保存备用。
实施例4：质控参考品的配制，分装。
抗原阳性对照：将经纯化灭活后的新布尼亚病毒抗原用生理盐水进行适量稀释其含量在0.1～200μg/mL。将定量后的参考品精确分装，冷冻干燥后压盖密封置4℃保存。
抗原阴性对照：正常人血清。
洗涤缓冲液(0.15M KH2PO4pH7.4PBS)：0.2克，Na2HPO4·12H2O2.9g，NaCl 8.0g，KCl0.2g，Tween-20 0.5mL，加蒸馏水至1000mL。
样品稀释液：BSA 0.1g，加洗涤缓冲液至100mL。
底物显色液A1：底物缓冲液(pH 5.0磷酸棗柠檬酸)：0.2M Na2HPO425.7mL，0.1M柠檬酸 24.3mL，加蒸馏水 50mL。
底物显色液B1：TMB(10mg/5mL无水乙醇)0.5mL，底物缓冲液(pH5.5)10mL，0.75％H2O 32μL。
2M H2SO4终止液：蒸馏水178.3mL，逐滴加入浓硫酸(98％)21.7mL
分装：兔抗新布尼亚病毒抗体包被的酶联反应板1块(96孔)；HRP标记小鼠抗新布尼亚病毒抗体液1瓶(10mL)；抗原阳性对照1瓶(0.5mL)；抗原阴性对照1瓶(0.5mL)；样品稀释液1瓶10mL(含0.1％BSA 0.155M PBS缓冲液(pH7.4))；10倍洗涤液(1.5 MPBST缓冲液.pH7.4)1瓶200mL；底物显色液A1瓶6mL；底物显色液B1瓶6mL；2M H2SO4终止液1瓶6mL。
实施例5：试剂盒检测新布尼亚病毒特异性抗原，病毒滴度分析
本发明可对人类及各种动物血清体液进行抗原含量分析，可对灭活疫苗制备中的抗原含量进行测定。
定性检测：每孔加入样品稀释液50μL后，将阴性对照、阳性对照和待检样品分别加入相应孔内，50μL/孔。
定量检测：标本用样品稀释液在洁净小试管中做系列稀释，加入相应孔内，50μL/孔。每次实验设空白对照1孔(只加显色剂和终止液)，将反应板用封板膜封闭，置37℃水浴中孵育30min。
孵育终止后用洗涤液洗板4～5次，在洁净吸水纸上拍干孔内余液。
除空白孔外，于各孔内加入HRP标记小鼠抗新布尼亚病毒抗体工作液100μL/孔，在37℃水浴中孵育30min。
孵育终止后用洗涤液洗板4～5次，在洁净吸水纸上拍干孔内余液。
于各孔内加入显色剂A、B液各50μL/孔，在37℃水浴中孵育10min。
每孔加终止液50μL，轻柔震荡20s混匀。
将酶标板置酶标仪450nm波长下，以空白孔调零，测定各孔光吸收A值。
实验结果须满足以下有效参数，实验方可成立：阳性对照A值≥1.5；阴性对照A值≤0.1。若试验数据不符合上述试验有效性标准，则需重复试验。
定性判定：若阴性对照平均A值＜0.05，按0.05计算；若阴性对照平均A值＞0.05，按实际A值计算。cutoff 值的计算：cutoff＝阴性对照平均A值×2.1。检测结果≥cutoff值判为阳性，检测结果＜cutoff值判为阴性。
定量判定：标本经系列稀释后，测定各稀释度A值，以标本最高稀释释度A值≥cutoff值判为抗体效价终点，以标本稀释度作为抗体水平的定量单位。
实施例6.试剂盒质量控制。
以本发明制备的试剂其检测灵敏度为1ng/mL；特异性验证，与其它同科布尼亚病毒无交叉反应；精密性验证，试剂批间差异(CV％)应不高于15％；其样品检测阳性率，与RT-PCR检出总符合率≥95％。
Claims (5)
1.一种制备用于检测新布尼亚病毒抗原的ELISA试剂盒的制备方法，其包括如下步骤：将经细胞培养获得的该保藏号为CCTCC V201211的新布尼亚病毒JS-2007-001原液经灭活超滤浓缩后，分别用超速离心法和柱层析法进行纯化得到纯病毒抗原；用病毒抗原分别免疫家兔和小鼠获得特异性抗血清，再经柱层析纯化获得特异性纯抗体，将免疫获得的兔抗新布尼亚病毒JS-2007-001抗体作为第一抗体包被酶联反应板；将免疫获得的小鼠抗新布尼亚病毒JS-2007-001抗体偶联辣根过氧化物酶HRP作为检测报告抗体；用灭活后的新布尼亚病毒JS-2007-001质控参考品；检测样本如果含有新布尼亚病毒，则会结合于所述的兔抗新布尼亚病毒JS-2007-001抗体包被的反应板，继而被HRP标记的小鼠抗新布尼亚病毒JS-2007-001抗体识别结合，构成抗体-抗原-抗体双抗体夹心检测系统，TMB显色结果。
2.一种按照如权利要求1所述的方法制备获得的用于检测新布尼亚病毒抗原的ELISA试剂盒。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其能检测新布尼亚病毒特异性抗原的滴度范围为1ng/mL。
4.权利要求2所述的试剂盒在制备用于新布尼病毒的检测的诊断试剂中的应用。
5.权利要求2所述的试剂盒在制备用于人群感染情况评估和疫苗制备中抗原含量的检测和疫苗效果观察结果的评价的诊断试剂中的应用。
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