CN113122550A - 编码布尼亚病毒内罗病毒科核蛋白的核酸、基因和表达载体及其应用 - Google Patents

Abstract

本申请涉及基因工程技术领域，具体提供一种编码布尼亚病毒内罗病毒科核蛋白的核酸、基因和表达载体及其应用。该编码布尼亚病毒内罗病毒科核蛋白的核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本申请对编码布尼亚病毒内罗病毒科核蛋白的原始密码子进行优化，使布尼亚病毒内罗病毒科核蛋白的编码序列中，大肠杆菌偏爱的密码子出现频率增加，而其编码的布尼亚病毒内罗病毒科核蛋白的氨基酸序列不发生变化，从而使其能更适合在大肠杆菌中表达，而且提高了布尼亚病毒内罗病毒科核蛋白的表达水平，具有很好的应用前景。

Description

编码布尼亚病毒内罗病毒科核蛋白的核酸、基因和表达载体 及其应用

技术领域

本申请属于基因工程技术领域，尤其涉及一种编码布尼亚病毒内罗病毒科核蛋白的核酸、基因和表达载体及其应用。

背景技术

近年来，随着全球气候变暖，携带病原体的蚊子、蜱虫等生物种群数量增加，虫媒传染病多发，我国位处东南亚热带、亚热带地区，幅员辽阔，地理环境多样，是布尼亚病毒(Bunya virus，BUNV)致病的主要区域。塔城1病毒(Tacheng Tick Virus 1，TcTV-1)是一种新发的布尼亚病毒，属于布尼亚病毒目内罗病毒科，其导致的临床症状表现为发热、皮疹、四肢及颈部僵硬、全身疼痛等症状，因此需要对此类病毒做好防控工作。而病毒感染的早期核酸和抗体检测技术的建立和完善是有效进行病毒防控的重要措施。

载体pET-21a是基因工程技术中重要的表达载体，其序列中具有诱导表达的调控元件，可以人为调控蛋白的表达，其表达重组蛋白的基因序列带有HIS-Tag(组氨酸标签)和SUMO-Tag(类泛素相关修饰物标签)。HIS-Tag能够被镍柱吸附，用于纯化重组蛋白；SUMO-Tag不仅可以做为重组蛋白表达的融合标签还具有分子伴侣的功能，能促进目的蛋白的正确折叠，保持目的蛋白的稳定性。此外SUMO-Tag有着配套的SUMO蛋白酶，这是一种具有较高活性的半胱氨酸蛋白酶，它能识别SUMO蛋白的三级结构而不是氨基酸序列，因此可以高效并且特异性地将SUMO蛋白从重组融合蛋白上切割下来，由于SUMO蛋白酶带有多聚HIS-Tag，便于融合蛋白切割后利用亲和层析去除该蛋白酶，因此SUMO-Tag非常适合重组蛋白的表达。因此，可以将塔城1病毒的核蛋白(Nucleocapsid protein，NP)构建在大肠杆菌表达载体pET-21a上进行表达，但目前布尼亚病毒核蛋白表达水平不高。

发明内容

本申请的目的在于提供一种编码布尼亚病毒内罗病毒科核蛋白的核酸、基因和表达载体及其应用，旨在解决如何提高布尼亚病毒核蛋白表达水平的技术问题。

为实现上述申请目的，本申请采用的技术方案如下：

第一方面，本申请提供一种编码布尼亚病毒内罗病毒科核蛋白的核酸，所述核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

第二方面，本申请提供一种布尼亚病毒的基因，所述基因为核蛋白基因，所述核蛋白基因含有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

第三方面，本申请提供一种表达载体，所述表达载体含有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

第四方面，本申请提供一种布尼亚病毒内罗病毒科核蛋白的制备方法，包括如下步骤：

提供本申请所述的表达载体；

将所述表达载体转入大肠杆菌中进行诱导表达，然后裂解细胞，分离纯化得到所述布尼亚病毒内罗病毒科核蛋白。

第五方面，本申请还提供一种上述基因表达的布尼亚病毒内罗病毒科核蛋白或上述表达载体表达的布尼亚病毒内罗病毒科核蛋白在制备塔城1病毒检测试剂盒中的应用。

本申请通过对编码布尼亚病毒内罗病毒科核蛋白的原始密码子进行优化，使布尼亚病毒内罗病毒科核蛋白的编码序列中，大肠杆菌偏爱的密码子出现频率增加，而其编码的布尼亚病毒内罗病毒科核蛋白的氨基酸序列不发生变化，从而使其能更适合在大肠杆菌中表达，而且提高了布尼亚病毒内罗病毒科核蛋白的表达水平，具有很好的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本申请实施例的塔城1病毒核蛋白镍亲和层析纯化后SDS-PAGE结果图：图中“诱导前”所示的泳道即为未加IPTG的pET-21a-TcTV-1-NP的泳道；“诱导后”所示的泳道即为加IPTG的pET-21a-TcTV-1-NP的泳道；“上清”所示的泳道即为菌体破碎并离心后的上清液的泳道；“沉淀”所示的泳道即为菌体破碎并离心后的沉淀物的泳道；“流穿”所示的泳道即为孵育后流过NI-NTA柱的流穿液的泳道；“洗脱液1”所示的泳道即为含5mM咪唑的蛋白洗脱液的泳道；“洗脱液2”所示的泳道即为含20mM咪唑的蛋白洗脱液的泳道；“洗脱液3”所示的泳道即为含40mM咪唑的蛋白洗脱液的泳道；“洗脱液4”所示的泳道即为含250mM咪唑的蛋白洗脱液的泳道；“洗脱液5”所示的泳道即为含500mM咪唑的蛋白洗脱液的泳道；“酶切后”所示的泳道即为sumo过夜酶切后含250mM咪唑的蛋白洗脱液的泳道；“Marker”所示的泳道即为蛋白Marker(Conventional range)的泳道；图中圈出部分为目的蛋白塔城1病毒核蛋白的条带。

图2是本申请实施例的塔城1病毒核蛋白经阳离子亲和层析纯化后紫外吸收峰图：实线代表紫外A280吸收值，长虚线代表紫外A260吸收值，短虚线代表电导率。

图3是本申请实施例的塔城1病毒核蛋白阳离子亲和层析纯化后SDS-PAGE结果图：1-7泳道是未挂柱的蛋白峰泳道；8-10泳道是目的蛋白峰泳道，图中圈出部分为目的蛋白塔城1病毒核蛋白的条带。

图4是本申请实施例的塔城1病毒核蛋白凝胶过滤层析纯化后紫外吸收峰图。

图5是本申请实施例的塔城1病毒核蛋白凝胶过滤层析纯化后SDS-PAGE结果，图中圈出部分为目的蛋白塔城1病毒核蛋白的条带。

图6是本申请实施例的蛋白质印迹法(免疫印迹试验)即Western blot结果图：1泳道为蛋白Marker泳道，2泳道为1.5μg纯化的塔城1病毒核蛋白泳道。

具体实施方式

为了使本申请要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。

本申请实施例第一方面提供一种编码布尼亚病毒内罗病毒科核蛋白的核酸，所述核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，具体如下：

GCTCCTCTGCCGAAAAGCCTGCTGACCTTTAGCGATGCCAGCGGCCTGGATAGCTGGTTTAAAGATTTTGAAGCAAAAAACATCATGAGCGAAGAATATACCAATAGTAAAAGTTTCTGCTTCGATCTGCGTATGGCCACCCAGTGGAAAAAACTGCCGACCCGCGCCGAAAATGATGCCATGATTGCCCAGCTGGTGCATGAACGCCTGAAAACCTGCGCACCGATTAAGGAATTTGCCTGGACCGCATGTGATGGTATGGTTGAACGCGGTCTGAATTGGTTTGATCGTAATAAGGATAGTGAAACCATGACCTGGGCAGCAAATTATGAAGCCCTGAAAGGCCGTCTGCCGACCACCGCCGAAGTGAATCAGTATCAGAAAGCAGCACTGCAGTGGCGCACCGATACCAATTATGCAATTAATAAGTACACCGCCGCCATTAGCGATAGTGTGGTTAAAATCTATCAGGTGAATAATAAGATCGTGACCGATATTCGCGATCTGCTGAGTGATATGGTTGCACGCCGCAATAAGGCCCTGGGTATTAAGCCGGGTGAAGAACGCGTTCCGGCAGAACATGTTGATAGCTTTAGTAATTGGCTGAAACAGGGTGACTGGAGCGCCCCGTGTCCGTGGGGTGACTGGGAAAAGAAAAATAAGAAAGGTAATAGCCTGATCGTTACCGCCTGTGCCGGCGTTATTAATCGCGCCCTGTTTAAAGAAGAAGAACTGAAAGAACGTCTGAAAAGCCTGGCAGGCGATGCCAGTCTGGCAAGCAAAACCGAAGGTTTTGATCCGAAAAAATGTGAAGATACCGCCAAAATTCTGCTGGATCTGTATGGTAAAGCCAAAGCATTCATTAGCGGTGGCGATGGTAGCAGCCAGAGTGGTGGCTTTGTGCAGCAGGGCAGCGCCCTGGATACCGTGTTTAGTAGCTATTTTTGGGCCTGGAAATGTGGTGTGAAAAAAGATGTGTTTCCGGCCCTGAGTAGCATGCTGTATGCACTGGGCAAAAATCCGACCGGTAAAACCAAAATTATTAAGGTTCTGAAGGCAAGCCCGTATACCTGGGCCCATAAAATGACCGAAATGTTTAGCACCCTGAGCACCGATCCGATTCATATGCATCCGGGCGTGCTGACCGCAGGTCGTCTGACCACCGAAATGGTTGCAAGTTTTGGCGCATTTCCGGTTAGTGATCCGAGCAAAGCCGCCGATGGTGCAAGCAGCCCGCGCTTTCTGCTGAATCTGAAAAGTAGTGATATGAATCCGGCCGCCACCACCGTTAGTCGTATGTTTTATGAATATCGCCAGGGCTATCCGGATTGGCGCGATGAAGAAATTGTTCCGGTTGAACATCTGCTGCATCAGACCTTTCTGAGCAAACTGGGTCCGTATGTTAATGTGAGCCAGGTGCAGGGCAATGCCCTGGCCGTTAAAATTACCGAATATATTGTTACCAAGTAA。

上述编码布尼亚病毒内罗病毒科核蛋白的核酸是对编码布尼亚病毒核蛋白的原始密码子进行优化后得到的，具体原始密码子对应的核苷酸序列如下所示，SEQ ID NO:2：

GCCCCACTGCCTAAGTCACTTCTCACTTTCTCGGATGCTTCCGGACTAGACAGTTGGTTTAAGGACTTTGAAGCCAAGAACATCATGTCTGAGGAGTATACTAACTCCAAGAGCTTCTGTTTTGACCTACGTATGGCCACACAGTGGAAGAAGCTTCCGACTAGGGCAGAGAATGATGCTATGATTGCCCAACTTGTCCATGAAAGGCTGAAGACATGTGCTCCAATAAAGGAGTTTGCATGGACTGCTTGCGACGGCATGGTTGAACGAGGACTCAACTGGTTTGATAGAAACAAAGATAGTGAAACCATGACGTGGGCAGCCAACTACGAAGCACTAAAAGGAAGGCTACCGACAACCGCTGAGGTCAACCAGTACCAGAAGGCAGCACTGCAGTGGCGCACGGACACCAACTATGCCATCAACAAGTACACTGCAGCGATCTCAGATAGCGTGGTCAAGATATATCAAGTGAACAACAAGATAGTGACTGACATCAGGGATCTCCTCTCTGACATGGTTGCAAGGCGCAACAAAGCTTTGGGCATCAAGCCAGGTGAAGAGCGGGTCCCAGCGGAACATGTCGACAGCTTCAGCAACTGGCTAAAACAGGGAGACTGGAGTGCACCCTGTCCATGGGGAGACTGGGAGAAGAAAAACAAAAAAGGAAACAGCCTCATTGTGACAGCCTGTGCTGGTGTCATCAACCGAGCCCTCTTCAAAGAGGAAGAATTGAAGGAGAGGCTGAAGAGCCTGGCAGGGGATGCCTCTCTGGCCAGCAAGACAGAAGGCTTCGACCCTAAAAAATGTGAAGACACAGCAAAGATACTCCTGGACCTTTATGGAAAGGCAAAAGCATTTATCTCTGGCGGGGACGGCAGCAGCCAGTCTGGTGGATTCGTACAGCAAGGGTCCGCCCTTGATACCGTCTTCTCTTCCTACTTTTGGGCCTGGAAATGCGGAGTGAAGAAGGATGTATTCCCTGCTCTGTCATCTATGCTGTATGCCCTGGGGAAGAACCCAACAGGCAAAACCAAAATAATCAAGGTTCTGAAAGCAAGCCCCTACACCTGGGCACACAAGATGACAGAAATGTTTTCCACCCTGTCCACTGACCCAATACACATGCACCCGGGGGTCCTCACCGCCGGCCGGCTGACCACAGAAATGGTTGCTTCCTTTGGTGCATTTCCAGTGTCTGACCCAAGCAAGGCAGCAGACGGTGCCTCCTCGCCACGGTTCTTACTGAACCTGAAAAGCTCTGACATGAACCCAGCAGCCACTACCGTGTCAAGGATGTTCTACGAGTACAGGCAGGGCTACCCCGACTGGCGCGATGAGGAGATTGTGCCAGTGGAGCACCTTCTGCATCAGACCTTTCTTAGCAAACTTGGCCCGTACGTCAATGTCAGTCAGGTGCAAGGCAATGCCCTTGCCGTTAAGATCACTGAATACATTGTCACCAAATAA。

因对基因序列的密码子优化尚没有统一的标准或原则，不同的研究人员会设计出不同的核苷酸序列用于目标蛋白质的表达，相应地表达效率也可能存在明显差异。而本申请通过对编码布尼亚病毒内罗病毒科核蛋白的原始密码子进行优化，意外地发现如SEQ IDNO:1所示的核苷酸编码序列，能更好地在大肠杆菌中表达，而且可以进一步地提高布尼亚病毒内罗病毒科核蛋白的表达水平，具有很好的应用前景。

进一步地，所述布尼亚病毒内罗病毒科核蛋白为塔城1病毒核蛋白，即编码布尼亚病毒内罗病毒科核蛋白的核酸是编码塔城1病毒核蛋白的核酸。

进一步地，所述塔城1病毒核蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，具体如下：

APLPKSLLTFSDASGLDSWFKDFEAKNIMSEEYTNSKSFCFDLRMATQWKKLPTRAENDAMIAQLVHERLKTCAPIKEFAWTACDGMVERGLNWFDRNKDSETMTWAANYEALKGRLPTTAEVNQYQKAALQWRTDTNYAINKYTAAISDSVVKIYQVNNKIVTDIRDLLSDMVARRNKALGIKPGEERVPAEHVDSFSNWLKQGDWSAPCPWGDWEKKNKKGNSLIVTACAGVINRALFKEEELKERLKSLAGDASLASKTEGFDPKKCEDTAKILLDLYGKAKAFISGGDGSSQSGGFVQQGSALDTVFSSYFWAWKCGVKKDVFPALSSMLYALGKNPTGKTKIIKVLKASPYTWAHKMTEMFSTLSTDPIHMHPGVLTAGRLTTEMVASFGAFPVSDPSKAADGASSPRFLLNLKSSDMNPAATTVSRMFYEYRQGYPDWRDEEIVPVEHLLHQTFLSKLGPYVNVSQVQGNALAVKITEYIVTK。

第二方面，本申请提供一种布尼亚病毒的基因，所述基因为核蛋白基因，所述核蛋白基因含有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。该基因含有布尼亚病毒核蛋白的密码子优化后的编码序列，可以进一步地提高布尼亚病毒内罗病毒科核蛋白的表达水平。

进一步地，扩增所述基因的引物如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示，具体如下：

引物F1(SEQ ID NO.4)：GAACAGATTGGTGGAGCCCCCCTGCCTAAG；

引物F2(SEQ ID NO.5)：ATTGTCACCAAATAAACTCGAGCACCACCA。

可以通过上述引物扩增密码子优化后的核蛋白基因，然后插入pET-21a载体中进行重组表达。

第三方面，本申请提供一种表达载体，所述表达载体含有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

进一步地，所述表达载体为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列与pET-21a载体的融合质粒。该重组的融合质粒可以更好地在大肠杆菌中表达，进一步提高布尼亚病毒内罗病毒科核蛋白的表达水平，可以用于制备高产量、高纯度并用于检测抗原塔城1病毒的核蛋白，制备过程简单方便，检测活性高。

第四方面，本申请提供一种布尼亚病毒内罗病毒科核蛋白的制备方法，包括如下步骤：

S01：提供本申请所述的表达载体；

S02：将所述表达载体转入大肠杆菌中进行诱导表达，然后裂解细胞，分离纯化得到所述布尼亚病毒内罗病毒科核蛋白。

该制备方法操作方便，简单高效，所获的目的蛋白即布尼亚病毒内罗病毒科核蛋白的纯度高、产量大、可溶性强，易纯化，适合作为检测用的抗原，在人群中该抗原的检测方法灵敏度高，特异性强，检测周期短，可以用于ELISA检测人群血清中的抗体。

含有塔城1病毒核蛋白基因的融合质粒构建后，异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)作为诱导剂，IPTG是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，进一步地，本申请所述表达载体转入大肠杆菌中进行诱导表达的条件包括：异丙基-β-D-硫代半乳糖苷终浓度为0.45～0.55mM，诱导温度为14～18℃，诱导时间为16～20h。上述诱导条件效果更佳。

进一步地，本申请通过密码子优化得到塔城1病毒核蛋白基因，设计相应的引物进行PCR扩增获得目的基因，然后插入pET-21a载体中，得到融合表达载体pET-21a-TcTV-1-NP；将获得的融合载体转入大肠杆菌中进行培养，挑取转化有表达载体的克隆株Escherichia coli BL21(DE3)/pET-21a-TcTV-1-NP加入LB培养基过夜培养(加入氨苄青霉素抑制杂菌生长)，然后扩大培养并加入诱导剂IPTG诱导蛋白表达，最后分离得到菌体进行蛋白提取纯化得到目的蛋白。

第五方面，本申请还提供一种上述基因表达的布尼亚病毒内罗病毒科核蛋白或上述表达载体表达的布尼亚病毒内罗病毒科核蛋白在制备塔城1病毒检测试剂盒中的应用。

通过塔城1病毒检测试剂盒进行病原检测，通过上述方法得到的塔城1病毒核蛋白能与相应抗体特异性结合，该核蛋白抗原用于核蛋白抗体的检测时具有很高的灵敏度和显著的特异性，具有开发成为检测试剂盒的应用价值。具体地，可以使用western-blot、ELISA方法检测塔城1病毒核蛋白抗体。

进一步地，该塔城1病毒检测试剂盒为ELISA检测试剂盒，可以用于检测人群血清中抗体，ELISA法的敏感性和特异性好，因此可用于检测塔城1病毒抗原、特异性IgM、IgG抗体。这样为高危地区蜱咬患者的蜱传塔城1病毒提供了一个快速诊断的技术。检测具有灵敏度高、特异性强、操作简单、样本用量少等特色，无需特别仪器，可手工操作，也可全自动化检测，且检测成果准确度高，重复性好。而且检测的样本量大，它不只适用于蜱咬重症患者临床标本的快速检查，还适合于高危人群血清流行病学筛查。

下面结合具体实施例进行说明。

实施例1含塔城1病毒核蛋白基因的融合质粒制备

(1)密码子优化：以TC253株为参考序列(GenBank：KM817743)，选取TcTV-1核蛋白基因，全长1840bp；按照通用遗传密码表和大肠杆菌密码子偏好分析其基因序列，找出其与大肠杆菌密码子使用偏好不同的密码子位点，用大肠杆菌偏好的密码子替代TcTV-1核蛋白基因中使用偏好不同的密码子，设计并化学合成密码子优化后的TcTV-1核蛋白基因序列，编码序列如SEQ ID NO.1所示。

(2)引物设计：设计引物F1和F2扩增密码子优化后的塔城1病毒的核蛋白基因，设计引物R1和R2扩增pET-21a载体：引物F1如SEQ ID NO.4所示，引物F2如SEQ ID NO.5所示，R1为F2的反向互补序列，R2为F1的反向互补序列。

(3)PCR扩增目的基因和载体：PCR反应的试剂是KOD-Plus试剂盒(来自广州创伟生物科技有限公司)，具体步骤如下：

将5μL的10X的KOD-Plus聚合酶缓冲液、5μL的2mM dNTP混合物、3μL的25mM硫酸镁溶液、1.5μL的引物、1μL的扩增模板、1μL的KOD-Plus聚合酶和33μL的121℃、20min灭菌后的MiliQ超纯水混合，PCR反应条件：94℃预变性2min、94℃变性15s、54℃复性30s，68℃延伸3min，循环35次，最后68℃延伸10min，获得扩增产物。1％(m/v)琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物的条带大小。

(4)融合质粒的构建：将上述步骤扩增得到的目的基因25ul和载体10ul混合后加入1ul DpnI快切酶，37℃水浴30min。将连接产物全部转入100ul E.coli DH5α感受态细胞中进行转化，冰浴30min，42℃热激90秒，冰浴5min后，加入600ul LB液体培养基37℃复苏1小时，最后将菌液涂布在含有100ug/ml氨苄青霉素的琼脂糖平板上37℃培养过夜。挑取单克隆菌落于5ml新鲜LB培养基(加入氨苄青霉素抑制杂菌生长)中培养过夜，提取质粒，测序验证序列构建成功，获得该融合质粒。

实施例2塔城1病毒核蛋白制备

(1)将上述获得的融合质粒转入大肠杆菌BL21 DE3感受态细胞进行转化，冰浴30min，42℃热激90秒，冰浴5min后，加入600μL LB液体复苏1小时，最后将菌液涂布在含有100ug/ml氨苄青霉素琼脂糖平板上37℃过夜培养。克隆菌株在LB固态培养下，呈2mm左右圆形、边缘光滑清晰、白色或米白色的小菌落。

(2)挑取转化有表达载体pET21a的阳性克隆菌株至50ml新鲜LB培养液中(加入氨苄青霉素抑制杂菌生长)，37℃过夜培养。

(3)取7ml培养物加至750ml新鲜LB液体培养液中(加入氨苄青霉素抑制杂菌生长)，37℃培养3.5-4h，测OD600＝0.4～0.6。

(4)加入诱导剂IPTG诱导蛋白表达，诱导条件为：IPTG终浓度0.5mM，诱导温度16℃，诱导时间18h。

(5)4200rpm离心35min收集菌体，倒尽培养基残液，裂解液(5mM咪唑,20mM Tris-Hcl pH7.5，300mM NaCl)重悬菌体，超声波破碎细胞，功率为400W，工作模式设定为超声2秒，间歇8秒，每个循环10分钟，共计三个循环。将破碎后的细胞裂解液在4℃条件下，以25000g的离心力离心35分钟，收集上清，弃去沉淀。

(6)镍亲和层析纯化

将得到的约50ml上清液与预先用裂解液平衡好的NI-NTA柱的beads在4℃下孵育1h。孵育后的上清液流过NI-NTA柱，用咪唑浓度为：5mM/L、20mM/L、40mM/L、250mM/L、500mM/L的缓冲液分别冲洗镍亲和层析柱，收集对应的蛋白洗脱液，全程处于4℃条件。分别取40μl蛋白洗脱溶液，加入10μl5×SDS上样缓冲液，100℃变性10min，用SDS-PAGE检测目的蛋白的纯化结果(如图1所示)。在咪唑浓度为250mM/L的蛋白洗脱液中加入SUMO蛋白酶，4℃酶切过夜。

(7)阳离子交换层析纯化

使用截留分子量为30k Da的超滤浓缩离心管(购自Millipore公司)对蛋白质进行浓缩，蛋白质浓缩的过程中加入低盐缓冲液(20mM Tris-Hcl pH7.5，50mM NaCl，1mM DTT)反复稀释，将蛋白的缓冲液换至低盐环境使其最终体积为5ml。将5ml蛋白溶液通过GEhealthcare公司的AKTA蛋白纯化系统上样至阳离子交换柱HiTrap SPHP中，再利用NaCl浓度梯度进行蛋白质的梯度洗脱。洗脱缓冲溶液分为低盐(20mM Tris-Hcl pH7.5，50mMNaCl，1mM DTT)和高盐(20mM Tris-Hcl pH7.5，1M NaCl，1mM DTT)。根据纯化过程中紫外吸收峰图(图2所示)及SDS-PAGE凝胶电泳(图3所示)鉴定目的蛋白TcTV1-NP。

(8)凝胶过滤层析纯化

将离子交换层析得到的目的蛋白峰收集起来，通过截留分子量为30kDa的超滤浓缩离心管(购自Millipore公司)将蛋白质浓缩并反复稀释后，换到凝胶层析缓冲液(20mMTris-Hcl pH7.5，300mM NaCl，1mM DTT)中，使其最终体积为0.5ml。使用GE healthcare公司的自动蛋白质纯化仪将浓缩好的蛋白上样至Superdex 200层析柱中，以0.5ml/min的流速洗脱目的蛋白。根据纯化过程中紫外吸收峰图(图4所示)及SDS-PAGE凝胶电泳(图5所示)鉴定目的蛋白TcTV1-NP。通过这三步纯化得到的目的蛋白纯度较高，纯度达到95％以上。至此便获得基因工程抗原塔城1病毒核蛋白NP。

实施例3western-blot检测塔城1病毒核蛋白抗体

(1)凝胶制备

刷洗并烘干配胶玻璃板和烧杯，安装好配胶架。根据Solarbio公司的SDS-PAGE凝胶制备试剂盒(P1200)说明书中的加样量配置10％的分离胶和5％的浓缩胶。

(2)上样、电泳

将配置好的凝胶安装至电泳架上放入电泳槽中，缓慢加入电泳液至覆盖加样孔，开始上样，上样孔加入10-20μg塔城1病毒核蛋白(即实施例2制备的塔城1病毒核蛋白)，最后补足电泳液至相应的量，在电泳槽周围放置冰袋开始电泳，80V恒压跑30min，紧接着调电压跑分离胶，120V恒压电泳1.5-2h，至溴酚蓝至底可停止电泳。

(3)转膜

电泳结束后，切去浓缩胶，保留分离胶，根据分离胶凝胶大小来裁剪PVDF膜和滤纸(滤纸尺寸大于凝胶)，PVDF膜首先在甲醇中浸泡0.5-1min使其激活，然后浸入电转液中。按照“黑胶白膜”原则海绵+四层滤纸+胶+PVDF膜+四层滤纸+海绵，放置。每一次保证排除气泡，然后将夹子轻柔放入转模仪中，冰浴恒压80V，转膜2h。

(4)封闭

转膜结束后，放置于摇床上，用0.1％TBST洗膜5min，然后将膜放入提前配置好的5％脱脂奶粉/0.1％TBST封闭液中至封闭液完全覆盖整张膜，室温放置于摇床上摇动封闭2h。

(5)结合一抗(人血清)

封闭结束后，按照相应的蛋白分子量裁剪膜然后放入0.1％TBST中保持膜湿润。将含有一抗的封闭液滴加在摇床的塑料膜上，从封闭液中取出Western膜，滤纸贴角吸干，正面朝下贴在一抗上，室温下摇孵育一小时或4℃静置过夜。在反应体系外面罩一湿润平皿以防止液体蒸发。

(6)洗膜

一抗孵育结束后，用0.1％PBST快洗膜6次，每次5min。

(7)孵育二抗

加辣根过氧化物酶标记的二抗稀释液(1：10000)，摇床上室温孵育2h。

(8)洗膜

二抗孵育结束后，用0.1％PBST漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。

(9)发光检测-HRP-ECL发光法：

将A发光液、B发光液按比例1:1配置ECL发光液，吹打混匀。膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，滴加配置好的ECL发光液至膜上，熄灯至可见淡绿色荧光条带(5min左右)后滤纸贴角吸干，置于保鲜膜内固定于片盒中，盖上胶片，关闭胶盒，根据所见荧光强度调整压片时间。取出胶片立即完全浸入显影液中1-2min，清水漂洗后放在定影液中至底片完全定影，清水冲净晾干，标定Marker，进行分析与扫描(如图6所示)。

实施例4ELISA检测塔城1病毒核蛋白抗体

(1)包被：用包被液将实施例2制备的塔城1病毒核蛋白稀释成5μg/mL的浓度的溶液，每孔加入50μL到ELISA反应板，确保所加液体覆盖ELISA底部，4℃过夜。

(2)洗涤：弃去孔内包被液，每孔加入洗涤液150μL置于脱色摇床上，洗涤3遍，5min/次。

(3)封闭：每孔加入配好的封闭液100μL，37℃恒温箱内孵育1h。

(4)洗涤：将封闭液甩干，每孔加入洗涤液100μL置于脱色摇床上，洗涤3遍，5min/次。

(5)加一抗：用稀释液将一抗按1：50稀释，即先加45μL稀释液，再加5μL血清吹打混匀，37℃恒温箱孵育1h。

(6)洗涤：弃去一抗，每孔加入洗涤液100μL置于脱色摇床上，洗涤3遍，5min/次。

(7)加二抗：用稀释液将辣根过氧化物酶标记山羊抗人二抗按1：20000进行稀释(每2板需预混12mL稀释液，0.6μL IgG/IgM)，稀释完的二抗震荡混匀，混匀后每孔加入50μL，置于37℃恒温箱孵育1h。

(8)洗涤：将二抗甩干，每孔加入100μL洗涤液置于脱色摇床上，洗涤5遍，5min/次。

(9)加TMB底物显色液：每孔加入50μL底物显色液(褐色瓶身，避光)，置于37℃恒温培养箱内部显色25min(此时将酶标仪打开)。

(10)加终止液：取2M H₂SO₄，每孔加入50μL，终止反应。

(11)测OD450值：在450nm处，用酶标仪测定各孔吸光度值。

(12)阴阳性结果判定：10份阴性血清OD值的平均值加上3倍的标准差得出临界值，EI(ELISA INDEX)＝样品OD值/临界值，高于1.2的样品EI为TcTV-1核蛋白血清阳性样品。

实施例5ELISA检测人群血清药物

利用上述制备的塔城1核蛋白NP构建的ELISA方法调查了玛纳斯县清水河乡5个村庄984份体检牧民的血清携带TcTV1-NP抗体的阳性率。其中，IgG抗体的阳性率分别为：3.52％(牙湖村)、22.45％(团庄村)、11.73％(坎苏瓦特村)、7.84％(巴斯陶村)、5.34％(贝母房子村)，总的阳性率为10.06％；IgM抗体的阳性率分别为：0％(牙湖村)、0.51％(团庄村)、6.15％(坎苏瓦特村)、13.73％(巴斯陶村)、3.40％(贝母房子村)，总的阳性率为4.78％。本实验调查了男性447人，IgG抗体的阳性率为10.07％，IgM抗体的阳性率为3.13％；女性537人，IgG抗体的阳性率为10.06％，IgM抗体的阳性率为6.15％，血清抗体的筛查结果如表1所示。

表1玛纳斯县清水河乡984份体检牧民的血清抗体筛查结果

通过上述实验证明，该检测方法灵敏度强、特异性好、设备要求低、检测周期短，具有广泛的应用。

以上所述仅为本申请的较佳实施例而已，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

序列表

<110> 中山大学

<120> 编码布尼亚病毒内罗病毒科核蛋白的核酸、基因和表达载体及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1470

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gctcctctgc cgaaaagcct gctgaccttt agcgatgcca gcggcctgga tagctggttt 60

aaagattttg aagcaaaaaa catcatgagc gaagaatata ccaatagtaa aagtttctgc 120

ttcgatctgc gtatggccac ccagtggaaa aaactgccga cccgcgccga aaatgatgcc 180

atgattgccc agctggtgca tgaacgcctg aaaacctgcg caccgattaa ggaatttgcc 240

tggaccgcat gtgatggtat ggttgaacgc ggtctgaatt ggtttgatcg taataaggat 300

agtgaaacca tgacctgggc agcaaattat gaagccctga aaggccgtct gccgaccacc 360

gccgaagtga atcagtatca gaaagcagca ctgcagtggc gcaccgatac caattatgca 420

attaataagt acaccgccgc cattagcgat agtgtggtta aaatctatca ggtgaataat 480

aagatcgtga ccgatattcg cgatctgctg agtgatatgg ttgcacgccg caataaggcc 540

ctgggtatta agccgggtga agaacgcgtt ccggcagaac atgttgatag ctttagtaat 600

tggctgaaac agggtgactg gagcgccccg tgtccgtggg gtgactggga aaagaaaaat 660

aagaaaggta atagcctgat cgttaccgcc tgtgccggcg ttattaatcg cgccctgttt 720

aaagaagaag aactgaaaga acgtctgaaa agcctggcag gcgatgccag tctggcaagc 780

aaaaccgaag gttttgatcc gaaaaaatgt gaagataccg ccaaaattct gctggatctg 840

tatggtaaag ccaaagcatt cattagcggt ggcgatggta gcagccagag tggtggcttt 900

gtgcagcagg gcagcgccct ggataccgtg tttagtagct atttttgggc ctggaaatgt 960

ggtgtgaaaa aagatgtgtt tccggccctg agtagcatgc tgtatgcact gggcaaaaat 1020

ccgaccggta aaaccaaaat tattaaggtt ctgaaggcaa gcccgtatac ctgggcccat 1080

aaaatgaccg aaatgtttag caccctgagc accgatccga ttcatatgca tccgggcgtg 1140

ctgaccgcag gtcgtctgac caccgaaatg gttgcaagtt ttggcgcatt tccggttagt 1200

gatccgagca aagccgccga tggtgcaagc agcccgcgct ttctgctgaa tctgaaaagt 1260

agtgatatga atccggccgc caccaccgtt agtcgtatgt tttatgaata tcgccagggc 1320

tatccggatt ggcgcgatga agaaattgtt ccggttgaac atctgctgca tcagaccttt 1380

ctgagcaaac tgggtccgta tgttaatgtg agccaggtgc agggcaatgc cctggccgtt 1440

aaaattaccg aatatattgt taccaagtaa 1470

<210> 2

<211> 1470

<212> DNA

<213> Bunyamwera virus

<400> 2

gccccactgc ctaagtcact tctcactttc tcggatgctt ccggactaga cagttggttt 60

aaggactttg aagccaagaa catcatgtct gaggagtata ctaactccaa gagcttctgt 120

tttgacctac gtatggccac acagtggaag aagcttccga ctagggcaga gaatgatgct 180

atgattgccc aacttgtcca tgaaaggctg aagacatgtg ctccaataaa ggagtttgca 240

tggactgctt gcgacggcat ggttgaacga ggactcaact ggtttgatag aaacaaagat 300

agtgaaacca tgacgtgggc agccaactac gaagcactaa aaggaaggct accgacaacc 360

gctgaggtca accagtacca gaaggcagca ctgcagtggc gcacggacac caactatgcc 420

atcaacaagt acactgcagc gatctcagat agcgtggtca agatatatca agtgaacaac 480

aagatagtga ctgacatcag ggatctcctc tctgacatgg ttgcaaggcg caacaaagct 540

ttgggcatca agccaggtga agagcgggtc ccagcggaac atgtcgacag cttcagcaac 600

tggctaaaac agggagactg gagtgcaccc tgtccatggg gagactggga gaagaaaaac 660

aaaaaaggaa acagcctcat tgtgacagcc tgtgctggtg tcatcaaccg agccctcttc 720

aaagaggaag aattgaagga gaggctgaag agcctggcag gggatgcctc tctggccagc 780

aagacagaag gcttcgaccc taaaaaatgt gaagacacag caaagatact cctggacctt 840

tatggaaagg caaaagcatt tatctctggc ggggacggca gcagccagtc tggtggattc 900

gtacagcaag ggtccgccct tgataccgtc ttctcttcct acttttgggc ctggaaatgc 960

ggagtgaaga aggatgtatt ccctgctctg tcatctatgc tgtatgccct ggggaagaac 1020

ccaacaggca aaaccaaaat aatcaaggtt ctgaaagcaa gcccctacac ctgggcacac 1080

aagatgacag aaatgttttc caccctgtcc actgacccaa tacacatgca cccgggggtc 1140

ctcaccgccg gccggctgac cacagaaatg gttgcttcct ttggtgcatt tccagtgtct 1200

gacccaagca aggcagcaga cggtgcctcc tcgccacggt tcttactgaa cctgaaaagc 1260

tctgacatga acccagcagc cactaccgtg tcaaggatgt tctacgagta caggcagggc 1320

taccccgact ggcgcgatga ggagattgtg ccagtggagc accttctgca tcagaccttt 1380

cttagcaaac ttggcccgta cgtcaatgtc agtcaggtgc aaggcaatgc ccttgccgtt 1440

aagatcactg aatacattgt caccaaataa 1470

<210> 3

<211> 489

<212> PRT

<213> Bunyamwera virus

<400> 3

Ala Pro Leu Pro Lys Ser Leu Leu Thr Phe Ser Asp Ala Ser Gly Leu

1 5 10 15

Asp Ser Trp Phe Lys Asp Phe Glu Ala Lys Asn Ile Met Ser Glu Glu

20 25 30

Tyr Thr Asn Ser Lys Ser Phe Cys Phe Asp Leu Arg Met Ala Thr Gln

35 40 45

Trp Lys Lys Leu Pro Thr Arg Ala Glu Asn Asp Ala Met Ile Ala Gln

50 55 60

Leu Val His Glu Arg Leu Lys Thr Cys Ala Pro Ile Lys Glu Phe Ala

65 70 75 80

Trp Thr Ala Cys Asp Gly Met Val Glu Arg Gly Leu Asn Trp Phe Asp

85 90 95

Arg Asn Lys Asp Ser Glu Thr Met Thr Trp Ala Ala Asn Tyr Glu Ala

100 105 110

Leu Lys Gly Arg Leu Pro Thr Thr Ala Glu Val Asn Gln Tyr Gln Lys

115 120 125

Ala Ala Leu Gln Trp Arg Thr Asp Thr Asn Tyr Ala Ile Asn Lys Tyr

130 135 140

Thr Ala Ala Ile Ser Asp Ser Val Val Lys Ile Tyr Gln Val Asn Asn

145 150 155 160

Lys Ile Val Thr Asp Ile Arg Asp Leu Leu Ser Asp Met Val Ala Arg

165 170 175

Arg Asn Lys Ala Leu Gly Ile Lys Pro Gly Glu Glu Arg Val Pro Ala

180 185 190

Glu His Val Asp Ser Phe Ser Asn Trp Leu Lys Gln Gly Asp Trp Ser

195 200 205

Ala Pro Cys Pro Trp Gly Asp Trp Glu Lys Lys Asn Lys Lys Gly Asn

210 215 220

Ser Leu Ile Val Thr Ala Cys Ala Gly Val Ile Asn Arg Ala Leu Phe

225 230 235 240

Lys Glu Glu Glu Leu Lys Glu Arg Leu Lys Ser Leu Ala Gly Asp Ala

245 250 255

Ser Leu Ala Ser Lys Thr Glu Gly Phe Asp Pro Lys Lys Cys Glu Asp

260 265 270

Thr Ala Lys Ile Leu Leu Asp Leu Tyr Gly Lys Ala Lys Ala Phe Ile

275 280 285

Ser Gly Gly Asp Gly Ser Ser Gln Ser Gly Gly Phe Val Gln Gln Gly

290 295 300

Ser Ala Leu Asp Thr Val Phe Ser Ser Tyr Phe Trp Ala Trp Lys Cys

305 310 315 320

Gly Val Lys Lys Asp Val Phe Pro Ala Leu Ser Ser Met Leu Tyr Ala

325 330 335

Leu Gly Lys Asn Pro Thr Gly Lys Thr Lys Ile Ile Lys Val Leu Lys

340 345 350

Ala Ser Pro Tyr Thr Trp Ala His Lys Met Thr Glu Met Phe Ser Thr

355 360 365

Leu Ser Thr Asp Pro Ile His Met His Pro Gly Val Leu Thr Ala Gly

370 375 380

Arg Leu Thr Thr Glu Met Val Ala Ser Phe Gly Ala Phe Pro Val Ser

385 390 395 400

Asp Pro Ser Lys Ala Ala Asp Gly Ala Ser Ser Pro Arg Phe Leu Leu

405 410 415

Asn Leu Lys Ser Ser Asp Met Asn Pro Ala Ala Thr Thr Val Ser Arg

420 425 430

Met Phe Tyr Glu Tyr Arg Gln Gly Tyr Pro Asp Trp Arg Asp Glu Glu

435 440 445

Ile Val Pro Val Glu His Leu Leu His Gln Thr Phe Leu Ser Lys Leu

450 455 460

Gly Pro Tyr Val Asn Val Ser Gln Val Gln Gly Asn Ala Leu Ala Val

465 470 475 480

Lys Ile Thr Glu Tyr Ile Val Thr Lys

485

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gaacagattg gtggagcccc cctgcctaag 30

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

attgtcacca aataaactcg agcaccacca 30

Claims (10)

1.一种编码布尼亚病毒内罗病毒科核蛋白的核酸，其特征在于，所述核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.如权利要求1所述的核酸，其特征在于，所述布尼亚病毒内罗病毒科核蛋白为塔城1病毒核蛋白。

3.如权利要求2所述的核酸，其特征在于，所述塔城1病毒核蛋白的氨基酸序列如SEQID NO:3所示。

4.一种布尼亚病毒的基因，所述基因为核蛋白基因，其特征在于，所述核蛋白基因含有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

5.如权利要求4所述的基因，其特征在于，扩增所述基因的引物如SEQ ID NO:4和SEQID NO:5所示。

6.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

7.如权利要求6所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列与pET-21a载体的融合质粒。

8.一种布尼亚病毒内罗病毒科核蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

提供权利要求6或7所述的表达载体；

将所述表达载体转入大肠杆菌中进行诱导表达，然后裂解细胞，分离纯化得到所述布尼亚病毒内罗病毒科核蛋白。

9.由权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述诱导表达的条件包括：诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷终浓度为0.45～0.55mM，诱导温度为14～18℃，诱导时间为16～20h。

10.如权利要求4或5所述的基因表达的布尼亚病毒内罗病毒科核蛋白或权利要求6或7所述的表达载体表达的布尼亚病毒内罗病毒科核蛋白在制备塔城1病毒检测试剂盒中的应用。

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